Brevet FR2735984A1 — publié le 19970103

La présente invention concerne de nouveaux types de vaccins et notamment des compositions destinées au traitement, à la prévention et au diagnostic des affections à HIV. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des peptides capables de produire une réponse immunitaire susceptible de directement ou indirectement neutraliser les virus HIV chez les mammifères et notamment chez l'homme. On a déjà décrit, notamment dans le brevet EP-B- 0470989 ainsi que dans différentes publications, I'importance des anticorps monoclonaux dirigés contre la p2 microglobuline (B2m) dans l'inhibition de la réplication de HIV-1. En particulier, il a pu être mis en évidence que ces anticorps agissaient sur deux mécanismes, à savoir, directement sur le virus et sur les cellules associées à la ,s2m. La présente invention constitue des développements de ces éléments préliminaires et repose sur la mise en évidence de séquences peptidiques provenant de p2m ou ayant une structure équivalente susceptibles de générer des anticorps neutralisant totalement ou partiellement les virus HIV. Compte tenu de la complexité des mécanismes mis en oeuvre on entendra par "neutralisation du virus HIV" tout mécanisme ayant pour effet in vivo de détruire et/ou d'empêcher la propagation des virus. In vitro, ces anticorps neutralisants peuvent être utilisés pour neutraliser tout fluide corporel destiné à être réinoculé ou réintroduit chez l'homme, comme le sperme d'un homme HIV séropositif pour l'insémination d'une femme séronégative. Mais, plus généralement, la présente invention repose sur une nouvelle approche vaccinale utilisable, en particulier, pour les agents infectieux type parasite ou virus à fort pouvoir de mutation. En effet, dans le cadre de la vaccination traditionnelle on cherche à générer des anticorps neutralisants dirigés contre des éléments de l'agent infectieux, mais lorsque celui-ci présente un fort pouvoir de mutation, tel que le HIV par exemple, cette stratégie ne donne, au mieux, que des résultats limités pour un isolat particulier qui sera remplacé très vite par un isolat mutant et résistant. La nouvelle approche vaccinante repose sur un concept différent et est applicable à un certain nombre d'agents infectieux qui présentent une phase intracellulaire lors de leur cycle. En effet, on sait pour certains agents, ou on peut mettre en évidence, notamment dans le cas de HIV, ce qui constitue une partie de la présente invention, que, lors de la multiplication des agents infectieux à partir des cellules infectées de l'hôte, les agents infectieux extracellulaires emportent des éléments de déterminants de la cellule hôte. L'un des objets de la présente invention consiste à prendre comme cible, non pas l'agent infectieux lui-même, mais les éléments du déterminant qu'il emporte avec lui et de prévoir une vaccination dirigée contre ces déterminants cellulaires qui resteront constants, même si l'agent lui-même a muté. Ce type d'approche présente bien entendu une limite immédiate, I'antigène étant lié aux cellules hôtes, il n'est possible de réaliser une telle vaccination qu'avec un épitope cryptique du déterminant cellulaire qui ne sera dévoilé que lorsqu'il sera emporté par l'agent infectieux extracellulaire, ou un épitope non-immunogène dans sa présentation naturelle par la cellule et modifié lorsqu'il est présenté à la surface du virion. Dans le cas de HIV par exemple, on a pu mettre en évidence que la ss2 microglobuline présentait plusieurs épitopes cryptiques, lesquels étaient dévoilés lors de la multiplication du virus HIV et son passage à l'extérieur de la cellule. I1 n'y a donc pas, en cas de vaccination, d'une part de réaction auto-immune, et, d'autre part, l'épitope étant lié aux différents isolats de HIV qui ont été testés, la vaccination est efficace, et ceci indépendamment des mutations du virus lui-même. Ce type de vaccination peut être retenu, notamment, pour les parasites intracellulaires et les virus enveloppés tels que CMV, HPV, HSV et HIV par exemple. I1 faut bien comprendre que si ce type de vaccination n'est pas utilisable dans tous les cas, il peut constituer une alternative très intéressante pour les agents infectieux résistant aux approches plus traditionnelles. C'est pourquoi la présente invention concerne un vaccin contre un agent infectieux, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un épitope cryptique d'un élément cellulaire emporté par un agent infectieux intracellulaire lors de son passage à l'extérieur de la cellule et qui est dévoilé par l'agent infectieux. De préférence, cet agent infectieux est un parasite ou un virus à enveloppe et l'épitope cryptique est situé au voisinage de la surface de la cellule. Par "épitope cryptique", on entend désigner un épitope d'un déterminant cellulaire de l'hôte qui est caché ou modifié et est donc reconnu comme étranger par le système immunitaire et ne produit donc pas de réaction auto-immune avec destruction du déterminant correspondant et peut être utilisé pour la vaccination. L'épitope cryptique doit évidemment être dévoilé, c'est-à-dire être accessible et reconnu par le système immunitaire lorsqu'il est emporté par l'agent infectieux (dans le cas où il resterait cryptique, la vaccination ne serait pas possible). Dans le cas de la ss2 microglobuline, on a pu mettre en évidence l'existence de ce type d'épitope qui d'ailleurs se découvre également sous forme naturelle lors de l'élimination de la ss2 microglobuline par voie urinaire. La présente invention concerne donc des compositions destinées au traitement ou à la prévention des infections à HIV, caractérisées en ce qu'elles comportent à titre de principe actif au moins un peptide correspondant aux séquences 1 à 22 ou une séquence équivalente. Par "séquence équivalente", on entend désigner une séquence qui lève la neutralisation du virus HIV par les anticorps monoclonaux B1G6 ou B262.2 in vitro. Ces peptides constituent des épitopes cryptiques de la ss2 microglobuline comme décrits précédemment. Les peptides selon la présente invention sont les suivants ol-P1 IQRTPKIQVYSRHPA ( lle-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-lle-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala) 02 - P4 FHPSDIEVDLLKDGE (Phe-His-Pro-Ser-Asp-lle-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Gly-Glu) 03 - P9 ACRVNHVTLSQPKIV (Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val) On peut également utiliser une partie plus petite (7 aminoacides) de ces 15 amino-acides qui lève la neutralisation du virus par les anticorps monoclonaux B1G6 ou B2G2.2: 04 - R-7-V RTPKIQV (Arg-Thr-Pro-Lys-lle-Gln-Val) 05 - S-7-K SQPKIVK (Ser-Gln-Pro-Lys-lle-Val-Lys) 06 - F-7-E FHPSDIE (Phe-His-Pro-Ser-Asp-lle-Glu) Une structure commune PKI (3 amino acides) semble être le motif responsable ; d'où les modifications d'amino-acides suivantes 07 - TLSRTPKIQV (Thr-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val) n t 185 08 - IYLTQPKIKV (Ile-Tyr-Leu-Thr-Gln-Pro-Lys-Ile-Lys-Val) n 186 90-IORTPKIQVY (Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr) n 187 10-TLSQPKIVKN (Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Asn) n 188 11-IQRTPQIVKW (Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Gln-Ile-Val-Lys-Trp) n 189 12 - IQRTPNIVKW (lle-Gln-Arg-Thr-Pro-Asn-lle-Val-Lys-Trp) n 190 On peut également introduire une cystéine et un site de glycosylation : 13 - CYNPSDIE (Cys-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asp-lle-Glu) 14- YCNPEST (Tyr-Cys-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr) 15 - NFLNCYVS (Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser) 16 - LNCYVSPSD (Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Pro-Ser-Asp) Enfin, on peut utiliser les peptides utilisant les différentes variations en fonction des espèces (souris, primates, lapins, cobayes) 17 - KTPQIQV (Lys-Thr-Pro-Gln-lle-Gln-Val) 18 - FHPPQIE (Phe-His-Pro-Pro-Gln-lle-Glu) 19 - FHPPHIE (Phe-His-Pro-Pro-His-lle-Glu) 20- AEPKTVY (Ala-Glu-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr) 21 - SQPKTVY (Ser-Gln- Pro- Lys-Th r-Val-Tyr) 22-ILSRTPKIQV (Ile-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val) Ces peptides de SEQ ID 1 à 22 ne contiennent que le choix préférentiel, il est possible comme cela a été indiqué précédemment de trouver des peptides équivalents. L'exemple 5 décrit un procédé permettant de mettre en évidence les peptides équivalents. Ces peptides sont, de préférence, liés à un système porteur ; il peut s'agir soit d'un ou plusieurs fragments de protéine liés à l'extrémité N et/ou C terminale desdits peptides afin de permettre notamment une réponse immunitaire, on parlera alors de "protéines conjuguées". Parmi les protéines utilisables il faut citer surtout les albumines, la KLH ("Keyhole Limpet Hemocyanin") la MAP ("Multiple Antigenic Peptide") ou d'autres protéines connues pour leur pouvoir immunogène. il est possible également de prévoir des protéines ou des fragments de protéine liés par des liaisons non peptidiques telles que pont disulfure ou liaisons par ion calcium. Lors de l'étude des différents peptides selon l'invention, il est apparu, bien qu'il ne s'agisse là que d'une théorie qui ne saurait en aucune façon limiter la présente invention, que la structure PKI joue un rôle essentiel. En effet, la proline est un amino-acide qui impose une conformation et qui limite la possibilité d'une configuration peptidique quaternaire. Dans ces conditions Kl (Lys, vile) est fixé dans une position qui est exposée à réagir avec un anticorps. Dans ces conditions, lors de la construction des protéines support, il conviendra de prévoir de préférence une structure qui laisse accessible la structure PKI. L'analyse de la structure des régions sélectionnées pour P1, P9 et P10 peut être effectuée par des méthodes telles que la sélection utilisant l'alanine pour remplacer chaque amino-acide séparément, notamment dans la région RTPKIQV, afin de mettre en évidence les acides aminés éventuels. On peut également utiliser les techniques mettant en oeuvre la biotinilation de chaque peptide puis la sélction par EIA avec les anticorps pour mettre en évidence la perte de fixation. Il est ainsi possible de prévoir de conjuguer les épitopes en cause avec des composants non protéiques, par exemple des polysaccharides et/ou des lipides, pour constituer des lipoprotéines présentant des activités vaccinantes améliorées ; là encore, il est possible de prévoir des liaisons covalentes ou non. Ces différents types de composés peuvent être obtenus, soit par synthèse chimique, soit par des voies recombinantes mettant en oeuvre des techniques connues dans le domaine de la production des protéines recombinantes. La souplesse des technologies recombinantes permet de réaliser des protéines comportant une pluralité d'épitopes identiques ou différents et susceptibles d'améliorer l'activité du produit final. il est également possible de prévoir la co-expression de différents éléments entrant dans les compositions selon l'invention. Selon l'un des aspects de l'invention, le peptide pourra être introduit dans une protéine de structure connue du HIV; en particulier des constructions dans lesquelles le peptide d'intérêt est inséré dans la région hypervariable de la boucle V3 de la gap120 peuvent être utilisées. La région V3 de la gp120 est le principal domaine de neutralisation de HIV-1 et l'un des déterminants majeurs du tropisme viral. En conséquence, ce type de mutant peut être utile pour étudier la neutralisation de HIV-1 liée au R7V et les modifications de son spectre d'hote. La haute variabilité de la région V3 de la gap120 parmi les isolats de HIV-1 est une autre raison de la préférence pour cette région. Il a été supposé que le remplacement de la séquence de sept amino-acides dans la région V3 avait de plus fortes chances de conduire à un recombinant viable qu'une mutation dans une autre région plus conservatrice du génôme de HIV-1. La protéine recombinante gpt20/R7V peut être exprimée en parallèle dans un système convenable d'expression d'une protéine pour obtenir une grande quantité d'immunogène R7V. L'utilisation de protéines porteuses n'est pas indispensable, il est possible de prévoir éventuellement d'autres systèmes porteurs. Par "système porteur", on entend désigner tout élément qui permet de conduire à un ensemble générant une réponse immunitaire contre le peptide en cause, ou bien qui permet de protéger le peptide d'une élimination, notamment d'une protéolyse rapide. Les compositions selon l'invention peuvent comporter également des composants augmentant l'immunogénicité des peptides et/ou protéines, notamment des adjuvants d'immunité spécifiques ou non tels que l'adjuvant de Freund, des polysaccharides ou des composés équivalents. il s'agit là de procédés qui sont connus dans le domaine de la vaccination. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées sous une forme quelconque compatible avec la voie d'administration choisie, en particulier la voie injectable. Toutefois les compositions selon la présente invention pourront être utilisées par d'autres voies, notamment per os ou par voie aérosol, pour induire une protection des muqueuses. La présente invention concerne également des compositions destinées à être administrées afin d'exprimer in situ les peptides et/ou protéines décrites précédemment. En particulier, la présente invention concerne des cassettes d'expression d'ADN permettant d'exprimer au moins un épitope cryptique tel que défini précédemment, et en particulier le peptide ayant la séquence 1 à 22 et/ou les protéines présentant ces peptides ou des protéines susceptibles de se coupler avec le peptide en cause tel que défini précédemment ou ayant des séquences équivalentes. Par "séquence équivalente", on entend désigner une séquence codant pour un peptide équivalent tel que cela a été décrit précédemment. Ces cassettes d'expression d'ADN peuvent, bien entendu, être utilisées soit directement pour une expression in situ, soit être utilisées pour produire un peptide ou une protéine utilisable comme cela a été décrit précédemment. Les systèmes de vaccination mettant en oeuvre des séquences d'ADN sont connus et sont déjà largement décrits dans la littérature. Il s'agit essentiellement de systèmes permettant l'expression de la protéine antigénique chez l'homme, ou bien l'expression de la protéine antigénique dans une cellule, laquelle est ensuite utilisée pour la vaccination ; lorsque la cellule transformée est une cellule de l'hôte traitée à l'extérieur on partie de traitement ex vivo. Les systèmes d'expression peuvent être très variés, il pourra s'agir notamment de systèmes de type "ADN nu " tels qu'ils sont décrits notamment dans les brevets et demandes de brevet de la société VICAL, WO 90/11092. Dans ce cas, I'ADN codant pour le peptide ou la protéine comportant le peptide est injecté tel quel, cette injection conduit dans un certain nombre de cas à l'expression de la protéine codée. Les informations contenues dans ces documents sont incluses explicitement dans la présente description par référence. On pourra utiliser également des systèmes d' "ADN nu" mais comportant leur propre système d'expression notamment afin d'améliorer l'expression. On pourra également utiliser des systèmes favorisant l'expression, soit par intégration, soit par réplication autonome, notamment des systèmes de type plasmidique ou viral. Parmi les systèmes d'expression de séquence peptidique que l'on peut mentionner, il faut citer les systèmes utilisant des poxvirus, des adénovirus, des rétrovirus et des virus de type herpès ou d'autres systèmes plus récents tels que les poliovirus. Parmi les vecteurs, on utilisera de préférence les vecteurs générant une réponse humorale et pour les muqueuses. D'autres virus peuvent être utilisés afin d'obtenir des vaccins en particulier: - les adénovirus comme cela est décrit dans N.R. Rabinovich et al. Science, 1994, 265, 1401-1404 et références citées; - les rotavirus comme cela est décrit par Sue E. Crowford, dans Journal of Virology, Sept. 1994, p. 5945-5952; - les poxvirus, notamment la vaccine virus, également les poxvirus animaux comme le canari pox tel que cela est décrit dans les travaux de Paoletti et de Moss; - influenza virus tel que décrit dans N.R. Rabinovich et al. (1994). La technologie permettant d'utiliser les poliovirus à titre de vecteur de vaccination pour différents antigènes est décrite notamment dans Raul Andino et al, Science, 265, 1448-51. Ce type de construction utilisable dans le cadre de la présente invention permet d'obtenir des vaccins utilisables par voie orale ; pour ce faire on clone la séquence codant pour le ou les peptides éventuellement les protéines porteuses dans un poliovirus, par exemple le virus Sabin atténué, il est possible également d'utiliser un cocktail de virus codant pour différents épitopes. L'utilisation de plasmides ou de virus pour l'expression de protéines dans les cellules d'un hôte, notamment humain, est connue et ne sera pas explicitée en détail. Les constructions spécifiques dépendent évidemment de l'hôte, de l'épitope et du vecteur retenu. On peut également utiliser des vaccins cellulaires, c'est-à-dire, par exemple comme cela est proposé dans le cadre de la thérapie génique, de prélever des cellules du patient, les transformer avec des vecteurs tels que décrits précédemment puis les réimplanter afin d'exprimer les protéines in situ. Toutefois, dans le cas d'une vaccination, ce procédé est peu commode. On préférera utiliser des cellules qui peuvent être obtenues en grand nombre, cellules bactériennes ou de levure par exemple, qui expriment la protéine en cause, par exemple en surface, ce qui dans certains cas augmente le pouvoir immunogène de la protéine. Il est possible, par exemple, d'utiliser les vaccins comportant comme système d'expression Salmonella comme cela est décrit dans T.R. Fouts et al., Vaccine (1995) 13 in press ; Tacket C.O. et al., Infect. Immun. (1992) 60, 536-541 et Hone et al., J. Chim. invest. (1992) 90, 412-420 (pour son évaluation chez l'homme comme support vaccinal). Ce type de vaccin implique l'utilisation de cellules notamment bactériennes produisant les peptides selon l'invention ou certaines souches d'autres vecteurs de vaccination et décrit dans Chad P Muller, Immunology Today. vol. 15 n" 20. 1994, p. 458-459. Les cellules produisant les peptides ou protéines selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles en particulier lorsque les protéines sont exprimées à la surface des cellules et lorsque les cellules sont non toxiques et non pathogènes (souche atténuée ou tuée), mais peut également être utilisé pour produire les peptides et/ou protéines qui seront utilisés après purification. Ainsi, il peut être intéressant d'obtenir des cellules bactériennes mais également des levures ou des cellules supérieures, cellules animale, végétale ou d'insecte notamment. Dans le cas de la présente invention, on peut prévoir l'utilisation de vaccins d'origine végétale en utilisant les technologies décrites notamment dans C.J. Arntzel et al. dans Vaccine 94. Les technologies permettant l'expression des peptides ou protéines par des systèmes cellulaires sont connues de même que les techniques de purification. Comme cela a déjà été mentionné, il est possible d'utiliser les compositions selon l'invention avec des adjuvants améliorant l'activité des séquences d'ADN, notamment des composants constituant des complexes avec l'ADN, tels que les lipides cationiques, ou des structures de type liposome ou microparticule. L'invention concerne également des compositions contenant des anticorps contre les peptides selon l'invention ou des compositions contenant des séquences codant pour des anticorps dirigés contre les peptides selon l'invention. Bien entendu l'utilisation de compositions à base d'anticorps nécessite que ceux-ci soient compatibles avec l'administration à l'être humain ; il peut notamment s'agir d'anticorps humanisés par des techniques connues ou directement exprimés in situ à partir de la séquence d'ADN. La présente invention concerne également l'utilisation des anticorps dressés contre les peptides de l'invention et susceptibles de neutraliser le virus HIV, en particulier la présente invention concerne des anti-sérums comportant ce type d'anticorps ou les anticorps obtenus, par exemple par immunopurification, à partir desdits sérums. La présente invention concerne également un procédé de diagnostic, caractérisé en ce qu'on met en évidence dans le sérum d'un patient la présence d'un anticorps dirigé contre l'un des épitopes selon l'invention. Ce procédé peut être mis en oeuvre par toute méthode connue d'identification des anticorps, notamment les méthodes ELISA et RIA et toutes les méthodes qui en dérivent. Toutes ces méthodes reposent de préférence sur la fixation des anticorps en cause sur les peptides antigéniques décrits précédemment puis mise en évidence de cette fixation. Ce diagnostic présente un intérêt considérable, en effet les exemples montrent que les séropositifs dans le cas de HIV qui présentent des anticorps selon l'invention sont dans un très grand nombre de cas non progresseurs, c'est-à-dire qu'ils ne développent pas de SIDA. Dans ce cas le pronostic est très favorable et on peut éviter les traitements lourds. Ceci est particulièrement vrai dans le cas d'une grossesse où la présence dc ces anticorps chez la mère (HIV +) semblerait conduire à une non infection du nouveau-né. La production des compositions selon la présente invention peut être réalisée par des techniques qui sont connues, synthèse de protéine par voie chimique, synthèse d'ADN par synthèse chimique ou multiplication par amplification type PCR. Pour les protéines, celles-ci peuvent être également obtenues par voie recombinante mettant en oeuvre des synthèses appropriées. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Dans les figures annexées, - les figures 1A et 1B représentent les ELISA montrant la réactivité du sérum de lapin immunisé avec R7V-KLH pour différents antigènes, - la figure 2 représente l'ELISA montrant la réactivité de l'antisérum de lapin immunisé avec notamment la 2m, - les figures 3A à 3D représente l'ELISA entre différents anti-sérums et des peptides sélectionnés, - la figure 4 représente I'ELISA de R7V avec différents anticorps anti-2m, - la figure 5 représente l'ELISA de R7V-BSA et ss2m avec des anticorps anti 2m et des sérums de lapin, - les figures 6 à 13 représentent des diagrammes montrant l'effet des sérums de différents patients sur la neutralisation de différents isolats du virus HIV sur MT4 et PBL ,EXEMPLE 1 Cet exemple permet de mettre en évidence la réponse immunitaire de lapins contre des peptides sélectionnés couplés à une protéine porteuse. L'antigène peptidique 7AA est couplé à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) et injecté aux lapins en présence d'adjuvant complet de Freund. Les animaux sont immunisés en présence d'adjuvant complet de Freund à JO, J14, J28, J42 et des saignées d'essai sont effectuées avant l'immunisation aux jours 35, 49, 56 et 70. Les peptides utilisés sont : RV7-KLH, S7K-KLH et F7E-KLH Le peptide R7V (RTPKIQV) a été allongé de 2 amino-acides pour permettre le couplage. La structure utilisée comme immunogène est la RTPKIQVGY. Les anticorps des lapins immunisés 618 ont été mesurés par ELISA, où le peptide couplé à différentes protéines porteuses a été utilisé au fond du puits (soit couplé à la KLH, à la BSA (Sérum Albumine Bovine) ou MAP (Multiple Antigenic Peptide)). Les diagrammes représentent les résultats obtenus à 2 dilutions dlOO et dlOOO, soit une dilution des sérums à 1/100 et 1/1000, ou à temps différents. La méthode ELISA est appliquée de la façon suivante Méthode ELISA 1) Fixation de l'antigène sur plaque 96 puits (Immulon IV-Dynatech) Diluer l'antigène dans du tampon carbonate pH 9,6 (Ag) finale = l llg/ml Distribuer 100 Cil/puits, soit 100 ng/puits Incuber 2 h à 37 C ou une nuit à 4 C (en atmosphère humide). 2) Lavages 5 lavages avec une solution de PBS/Tween 20 à 0,05 %. 3) Saturation des puits Distribuer 300 l/puits d'une solution de PBS/sérum de chevel (ou boeuf) à 10 % incuber 1 h à 37 C (en atmosphère humide). 4) Lavages (identiques au point 2) 5) Incubation avec antisérums spécifiques Diluer le sérum (1/50, 1/100, 1/1000) avec du PBS-10 % sérum de chevel Distribuer 100 l/puits et incuber 1 h à 37 C (en atmosphère humide). 6) Lavages (identiques au point 2) 7) Incubation avec l'anticorps second (Ig de moutons anti-lg humaines couplées à la peroxidase) Diluer l'anticorps second au 2/1000 dans du PBS/sérum de chevel 10% Distribuer 100 FI/puits et incuber 1 h à 37 C (en atmosphère humide). 8) Lavages (identiques au point 2) 9) Révélation par l'OPD Dissoudre 10 mg OPD dans 25 ml de tampon phosphocitrate (0,1 M, pH 5,5) . Ajouter au dernier moment 10 crl H202 Distribuer 100 l/puits et incuber 30 min à l'obscurité à température ambiante (peut être lu à 405 nm) Arrêter la réaction avec 50 cil H2S04 12,5 %. 10) Lecture à 492 nm. Les figures 1A et 1B montrent des résultats obtenus avec le lapin 618 immunisé avec R7V-KLH. Une réactivité anti R7V apparaît clairement en différentiel entre R7V-BSA et BSA par rapport à R7V-KLH et KLH où la réactivité anti R7V est masquée par la réponse anti KLH du sérum. Il est à noter que la réactivité anti R7V est plus forte à J68 qu'à J132. La spécificité de la réaction est plus grande si l'on utilise la protéine BSA. La figure 2 montre encore une bonne reconnaissance de la protéine d'origine, la D2m. Les anti-sera de lapins immunisés démontrent une réactivité importante avec R7V-BSA ainsi qu'avec les peptides d'origine dénommés P1, P4 et P9 et qui ont été utilisés pour sélectionner R7V, même si la réactivité avec P1 est plus faible (figure 3A - 3D). La figure 4 démontre que la reconnaissance de R7V par B1G6 et B2G2.2 est fonction de la dose et que la reconnaissance de C21.48 est moins bonne, c'est pourquoi on utilisera, de préférence, pour sélectionner des peptides équivalents les AcNl B1G6 et B2G2.2. Ces résultats démontrent que l'épitope R7V couplé à la BSA est capable de générer une bonne réponse immunitaire. EXEMPI.E 2 introduction de R7V dans la boucle V3 de la Yo120 de HN-1 LAV Construction de provirus recombinant L'objectif de cet exemple est d'introduire la séquence R7V dans la troisième région variable V3 de la gp120 de HIV-1 LAV. Méthodes Des virus recombinants chimériques ont été construits par mutagénèse dirigée par PCR. Deux constructions basées sur la séquence R7V et HIV-1 LAV ont été obtenues, dans lesquelles sept amino-acides de la région V3 de la gp120 ont été remplacés par la séquence R7V. Les positions des séquences mutées sont montrées dans le tableau suivant: HIV-1 LAV (V3) NNNTRKSIRIQRGPGRAFVT R7V RTPKIQV (1) RPL R7V RTPKIQV (2) PLG Le fragment ECoRI5278-Xhol84ol de HIV-1 LAV cloné dans le vecteur Bluescript a été utilisé comme matrice pour les constructions ultérieures.Dans la première étape, les fragments d'ADN flanqués des amorces contenant le site de restriction Bglll à une extrémité et la séquence nucléotidique codant pour R7V à l'autre extrémité ont été synthétisés pour les constructions RPL et PLG par amplification PcR. Les oligonucléotides de mutagénèse utilisés consistaient en une amorce (+) ACACCAAAGATACAAGTTGTTACAAATAGGAAAA et une amorce (-) TTGTATCTTTGGTGTTCTCTGGATCCGGATACTTT pour la construction RPL et d'une amorce (+) CGTACACCAAAAATCCAGGTCCAGAGAGGACCA et d'une amorce (-) GATT=GGTGTACGCGTATTGTTGTTGGGTCT pour la construction PLG. Dans la seconde étape, deux produits de PCR pour chaque construction ont été mélangés et amplifiés en utilisant les amorces contenant les sites de restriction BglII.Les fragments RPL et PLG ont été clivés par l'enzyme Bglll et insérés dans le vecteur Bluescript contenant le fragment EcoRI5278 Xhol840l de MIV-1 LAV, clivé par Bglll. Outre la séquence R7V, les amorces d'amplification contenaient des modifications dans la séquence nucléotidique conduisant à l'apparition de nouveaux sites de restriction BamHI et Miul dans les constructions RPL et PLG, respectivement, sans modifications supplémentaires dans la séquence en amino-acides. Les nouveaux sites de restriction ont été utilisés pour cribler les séquences mutées.Finalement, les fragments EcoRi5278-Xhoi8401 de HIV-1 LAV contenant les constructions RPL et PLG ont été insérés dans le plasmide pNL4-3 par recombinaison homologue en utilisant les sites de restriction EcoRI et Xhol. Les constructions ont été vérifiées par analyse par enzyme de restriction. Transfection de cellules eucarvotes L'ADN plasmidique de 200 ml de E. coli TG1 a été extrait et purifié par le kit de midipréparation Qiagen. Les cultures semiconfluentes de cellules COS (- 4 x 106) ont été transfectées avec 7 g de plasmide par la technique de coprécipitation au calcium. Le jour suivant, les monocouches de cellules ont été traitées par le glycérol et mises en culture avec une lignée cellulaire CEM ou avec des lymphocytes sanguins primaires activés par la PHA (PBL, 106 cellules/ml) provenant d'un donneur sain. Les cellules CEM ou PBL ont été séparées des COS en monocouches deux jours après et cultivées séparément. Production de virus 1 ml de surnageant cellulaire libre obtenu à partir des cellules COS ou PBL a été ultracentrifugé et le virus sédimenté à été contrôlé par la réaction standard de la réverse transcriptase. Dans certaines expériences, 100 zI de surnageant cellulaire a été testé pour la production de la protéine p24gag. Transfection des cellules COS et coculture avec les CEM J. post-transf. Activité Réverse Transcriptase (cpm/ml) RPL 1 PLG 2 NL 4-3 5 7282 7730 45838 9 3282 5302 326618 13 382 630 ND 16 200 300 ND 4 106 cellules COS ont été transfectées par 7 zg de plasmide par la technique de coprécipitation au calcium. Les cellules CEM ont été alors ajoutées à raison de 4 105 cellules/ml dans un volume final de 5 ml. Après deux jours de coculture les CEM en suspension ont été séparées des COS en monocouche. L'activité de la réverse transcriptase dans les surnageants de culture des CEM est donnée en cpm/ml. Infection des PBL J. post-inf. Activité Réverse Transcriptase (cpm/ml) RPL 1 PLG 2 NL4-3 4 734 782 20008 7 202 216 10 262 282 14 454 262 17 204 138 RPL 1 + PBL PLG 2 + PBL 2 1 350 336 276 636 24 230 282 296 284 27 588 510 620 980 2,5 106 PBL ont été infectées par les surnageants acellulaires du 19 décembre 1994 obtenus après transfection (tableau 1) à raison de 5000 cpm / 106 PBL Au jour 17 post-infection, 2 106 PBL nouvellement isolées ont été ajoutées à 2 106 PBL infectées (RPL 1 + PBL, PLG 2 + PBL). L'activité de la réverse transcriptase dans les surnageants de culture est donnée en cpm/ml. Transfection des cellules COS et coculture avec des PBL J. post-transf. Activité Réverse Transcriptase (cpm/ml) PLG 2-25 PLG 2-30 PLG 2-95 NL 4-3 3 25C0 8400 3500 2150 7 446 398 582 53000 10 174 336 306 74000 14 730 834 482 45778 J. post-transf. Activité R.T. (cpm/ml) RPL 1 PLG 2 3 20338 22000 7 682 418 11 552 466 4 106 cellules COS ont été transfectées par 7 crg de plasmide par la technique de coprécipitation au calcium. Les cellules PBL stimulées à la PHA ont été alors ajoutées à raison de 106 cellules/ml dans un volume final de 5 ml. Après deux jours de coculture les PBL en suspension ont été séparées des COS en monocouche. L'activité de la réverse transcriptase dans les surnageants de culture des PBL est donnée en cpm/ml. EXEMPLE 3 Cet exemple a pour but d'utiliser les peptides sélectionnés pour détecter dans le sérum des patients des anticorps potentiellement inhibiteurs de HIV (anticorps anti 2 microglobuline) et en particulier de mettre en évidence la présence d'anticorps protecteurs dans le sérum des patients non progresseurs. Par "patients non progresseurs" ou "NP", on désigne des patients séropositifs depuis plus de 10 ans et n'ayant pas développé de SIDA, en particulier dont le taux de cellules T4 est normal. Matériel et Méthode 1/ Les peptides utilisés ont été synthétisés et couplés à la BSA par Néosystem (France). 2/ Les sérums des patients sont stockés à -20" ou -80" C avant leur utilisation en Elisa. 3/ Les anticorps seconds anti-lg humaines ou de lapin ont été obtenus de Amersham (France). L'OPD provient de Sigma (France). ELISA avec les sérums de patients séronositifs 1/ Présence d'anticorps anti R7V dans le sérum des patients (titre 1/100 et 1/1000). 2/ Parmi les 46 sérums testés de personnes non progresseurs (pas de réplication virale en culture), 16 sérums sont positifs pour R7V (37%), 27 restent négatifs au 1/100 (63%) et 3 sérums sont indéterminables (Tableau 1). 3/ Parmi les 46 patients non progresseurs, 34 ont été testés pour la détection d'anticorps anti peptide : R7V, P1, P4, P9. 14 sérums sont positifs pour au moins un peptide (51.8%) et 13 restent négatifs au 1/100. Quatre sérums n'ont pas pu être classés positif ou négatif (Tableau 2). Tableau 1: ELISA R7V avec des sera NP NOM NOMBRE R7V ARASE 950 Négatif ARG CH 150 Non-déterminé AUD PA 1509 Négatif BAT AIL 134 Négatif BAR TE 342 Positif BER AL 704 Positif BER SE 1337 Négatif BES LA 287 Positif BEU PH 5.33 Négatif BOREM 194 Négatif BOU NA 5.36 Positif BRE FR 20.2.95-5.32 Négatif CAB MI 573 Négatif CAU BE 167/1113 Négatif CHI OL 353A Négatif COU DA 1531 Négatif DIB AN 872 Positif DUR JE 937 Positif GAR AI 986 Négatif GAS MA 549 Négatif GUI JE 60 Positif GUI PI 26.1.95-2.9 Négatif HAN SO 169/5.31 Positif HOL CH 4.25 Négatif IBE JU 6.39 Positif IMB PI 327 Non-déterminé MAG HE 143 Négatif MAN GU 26.1.95-2.8 Négatif MAN RO 89 Positif MAN XA 730 Négatif MART DO 1412 Négatif MAS SU 115 Négatif MEN JO 622/1382 Positif MON NA 1010 Négatif NIC GE 294 NéRatif OUM NA 1386 Négatif PAR FR 23.1.95-1.7 Négatif MEN JO 622/1382 Positif POI LI 3.14 NéRatif PUJ MA 23.1.95-1.2 Négatif QUI AL 23.1.95-1.5 Négatif RIO EM 3.16 Né atif RIS HE 2.10 Négatif ROY CH 5.35 Non-déterminé Positif SAL YA 13.3.95 Négatif SAN NA 2.11 Négatif SAU CH 171/4.27 Positif TEM ST 1343 Positif VIA TE 701 Non-déterminé ZUM AM 333 Positif Tableau 2 :ELISA des peptides avec des sera NP NOM NOMBRE POSITIF/ PEPTIDE NEGATIF R7V PI P4 P9 BEU PH 5.33 Négatif BOU NA 536 Positif Pos Pos. Pos. Nég. BRE FR 20.2.95-5.32 Positif Nég. Pos. Pos. Nég. CIF FR 6.38 Négatif (?) ETC MA 6.45 GEM SA 6.40 GUI JE 60 Positif Pos. Pos. Nég. Né GUI PI 26.1.95-2.9 Négatif HAN SO 169/5.31 Positif Pos. Pos. Nég. Pos. HOL CH 4.25 Négatif IBE JU 6.39 Positif Pos. Pos. Nég. Né LED DO 4.23 Positif Nég. POs. Nég. Nég. MAN GU 26.1.95-2.8 Négatif MEN O 622/1382/6.43 Positif Pos. Pos. ~ Pos. Pos. MOR JE 5.37 Positif Nég. Nég. Pos. Nég. PAR FR 23.1.95-1.7 Négatif PAT MA 166 Positif Nég. Nég. Pos. Né PIC CH 2.12 POI LI 3.14 Négatif PUJ MA 23.1.95-1.2 Négatif QUI AL 23.1.95-1.5 Négatif RIO EM 3.16 Négatif RIS HE 2.10 Négatif ROY CH 5.35 Positif Pos.(?) Pos. Nég. Né SAL YA 13/3.95 Négatif SAN NA 2.11 Négatif SAP MA 4.21 SAU CH 171/427 Positif Pos. Pos. Pos. Pos.(?) SEN AN 4.28 Positif Nég. Pos. Nég. Né TEM ST 5.34 Positif (?) Pos. (?) (?) (?) ZUM AM 333 Positif Pos. (?) (?) (?) (?) Non-déterminé EXEMPLE 4 Les essais suivants ont permis de mettre en évidence chez les patients non progresseurs des anticorps neutralisant différents isolats de HIV, notamment BRU et NDK, les mêmes patients présentant des anticorps anti-R7V. Ceci permet de montrer une bonne corrélation entre le caractère neutralisant et protecteur à l'encontre de HIV des anticorps générés par les traitements selon l'invention. Matériel et méthodes Culture des cellules MT4 Les cellules MT4 sont des cellules immortalisées (CD4 +) très sensibles à l'effet cytopathogène de HIV-1, dérivées à l'origine d'une leucémie T chez l'adulte. Les cellules sont cultivées en présence de milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, 1 % de glutamine et 1 % d'antibiotique. Culture des PBL Les lymphocytes sont stimulés pendant 3 jours avec de la phytohémagglutinine P (PHA P) dans du milieu RPMI complet comprenant 10 % de sérum de veau foetal, 1 % de glutamine, 1 % d'antibiotique, 2 Fg/ml de polybren, 20 Ul/ml d'lnterleukine 2 (IL-2). Les cellules sont ensuite lavées et cultivées à raison de 106 cellules/ml dans du milieu RPMI complet. Tests de neutralisation Les sérums sont décomplémentés et filtrés avant leur utilisation dans les tests. Neutralisation sur MT4 Les sérums sont dilués en plaques 24 puits (Costar) dans un volume total de 0,8 ml. les virus HIV-1 BRU (100 pI d'une dilution 10-1 de la solution stock) ou HIV-1 NDK (100 ctl d'une dilution 10-3 de la solution stock) sont ajoutés et le mélange est incubé pendant 1 h 30 à 37"C et 5 % C02. Les cellules sont ensuite distribuées à raison de 200 crl/puits et 1, 5 106 cellules/ml. Trois jours après l'infection, les cultures sont diluées (1/3) avec du milieu RPMI 10 %. L'infection des cellules par les virus HIV-1 est suivie tous les jours sous microscope par l'observation de la formation de syncitia (cellules géantes multinuclées). La neutralisation des virus par les différents sérums est définie par l'absence (-) de syncitia ou très peu de syncitia (+/-) en comparaison de la formation de syncitia induite par les HIV prototypes (+). Neutralisation sur PBL Les sérums (50 p1) sont mélangés avec les virus HIV-1 BRU (50 FI d'une dilution 2 10-1 de la solution stock) dans des plaques 96 puits et placés pendant 1 h 30 à 37"C et 5 % C02. Le mélange est alors ajouté à 106 PBL dans des plaques 24 puits (Costar) et la culture est maintenue pendant 3 jours à 37 C et 5 % C02. Les cellules sont ensuite lavées et cultivées à raison de 106 cellules/ml dans des flacons de culture de 25 cm2. La production de virus est suivie tous les 3 ou 4 jours par le dosage de l'activité enzymatique de la "Reverse Transcriptase". Dosage de l'activité reverse Transcrintasew (RT) Un ml de surnageant de culture centrifugé (1500 rpm), TA, 10 min) est concentré 100 fois par ultracentrifugation (95000 rpm, 4 C, 5 min) sur un rotor TL 100 (Beckman). Le culot obtenu est repris dans 10 crl de tampon NTEO,1 % Triton X100. La réaction enzymatique est réalisée dans 50 Crl du mélange réactionnel suivant : Tris 50 mM pH 7,8 ; MgCl2 20 mM KCl 20 mM : Dithiothreitol 2 mM; Oligo dT 12-18 0,25 OD/ml: poly rA 0,25 OD/ml et 2,5 Ci de 3HdTTP. Après 1 h d'incubation à 37 C, les produits de la réaction sont précipités avec de l'acide trichoracétique 20 %, filtrés sur des membranes Millipore et la radioactivité ss est mesurée. Les résultats sont exprimés en CMP/ml. Rapport des exneriences de neutralisation Des anticorps dirigés contre le peptide R7V ont été mis en évidence dans les sérums de patients HIV + au moyen d'un ELISA spécifique mis au point par la Demanderesse. On a cherché dans ces sérums l'existence d'une activité neutralisantes dirigée contre les deux souches de virus prototype HIV-1 BRU et NDK. Deux tests de neutralisation ont été réalisés, I'un sur une lignée cellulaire MT4 (suivi de la formation de syncitia) et l'autre sur des lymphocytes du sang périphérique sains, PBL (suivi de l'activité enzymatique "Reverse Transcriptase"). Résultats obtenus sur MT4 Parmi les 13 patients testés, une activité sérique neutralisante a été mise en évidence pour 6 d'entre eux (Tableaux 3 à 5) - Deux sérums neutralisent HIV-1 NDK: ZUM AM (ELISA positif) COC PH (ELISA négatif) - Deux sérums neutralisent HIV-1 BRU: MEC EV (ELISA positif) OUA VE (ELISA négatif) - Deux sérums neutralisent 11iV-1 BRU et HIV-1 NDK: SAU CH (ELISA positif) BUB JE (ELISA positif) Résultats obtenus sur PBL L'expérience a été réalisée avec les sérums de MEC EV, SAU CH et BUB JE (1/50) ainsi qu'avec un sérum de séronégatif. Aucune activité neutralisante n'a été détectée pour le sérum SAU CH ainsi que pour le sérum séronégatif. En revanche, une activité neutralisante contre les deux virus prototypes HIV-1 BRU et NDK a été mise en évidence pour les sérums MEC EV et BUB JE (figures 6 à 13). EXEMPLE 5 Méthode permettant de mettre en évidence des peptides équivalents Effet de peptides sélectionnés sur la neutralisation de HIV-1 NDK par l'anticorps monoclonal anti-ss2 B1G6 Protocole Les peptides à une concentration de 100 cig/ml ou 50 cig/ml (40 ctl ou 20 l de la solution mère à 5 mg/ml) sont préincubés avec 5 crg/ml de B1G6 (10 AI d'une solution mère à 1 mg/ml) dans un volume total de 110 p1 pendant 2 heures, dans des tubes au bain-marie à 37 C, sous agitation douce. Puis HIV-1 NDK est ajouté (100 cil d'une dilution à 2.10-4 d'une solution mère et les tubes sont incubés pendant 1 heure à 37 C au bain-marie. Les tubes sont ensuite séparés en deux et chaque 100 1ll est ajouté à 106 PBL sur une plaque à 24 puits. Les cellules sont cultivées pendant 3 jours à 37 C sous une atmosphère à 5 % de CO2. Au jour 3, les cellules sont lavées, mises en culture et propagées pendant au moins 20-25 jours dans un ballon de 25 cm3. La production de virus est suivie tous les 3 ou 4 jours, par dosage de la réverse transcriptase (RT). Résultats Les peptides R7V et F7E peuvent annuler l'effet de neutralisation de l'anticorps monoclonal B1G6 sur la production de HIV-1 NDK par les PBL La séquence du peptide R7V a été modifiée et parmi les 6 nouveaux peptides (185, 186, 187, 188, 189, 190), 3 ont perdu l'effet d'annulation du R7V: les peptides 185, 189 et 190. Tableau 3 N D K Jour / Post infection D4 D5 D6 D7 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 HIV+ ZUM AM - - - - - - - - - - - HAN SO - - - + - - + +/- +/- + + + SAU CH - - - + + + + + + + + + MEN JO - - - +/- - +/- + +/- + + +/- + PAT MA +/- - - +/- + - +/- +/- - +/- +/- + COC PH - - - - - - - - + - - + HIV- SER C - - - + + + + + + + + + DOUS - - - + + + + + + + + + AUB V - - - + + + + + + + + + NDK 10-4 +/- + + + Tableau 4a N D K Jour / Post infection D4 D5 D6 D7 1/50 1/100 1/50 1/100 1/50 1/100 1/50 1/100 HIV+ ZUM AM - +/- + + + + + + HAN SO + +/- + + + + + + SAU CH + + + + + + + + MEN JO + + + + + + + + MEC EV +/- - +/- + + + + + PAT MA +/- +/- +/- + + + + + COC PH +/- - +/- - + + + + HIV- AUB V + +/- + + + + + + NDK 10-4 + + + + Tableau 4b B R U Jour / Post infection D4 D5 D6 D7 1/50 1/100 1/50 1/100 1/50 1/100 1/50 1/100 HIV+ ZUM AM +/- +/- +/- + + + + + HAN SO +/- +/- +/- + + + + + SAU CH + + + + + + + + MEN JO - +/- +/- +/- + + + + MEC EV - - - - + + + + PAT MA +/- - +/- +/- + + + + COC PH - +/- +/- + + + + + HIV- AUB V + + + + + + + + BRU 10-2 +/- + + + Tableau 5a N D K Jour / Post infection D4 D5 D6 D7 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 HIV+ ZUM AM - +/- +/- - +/- + - + + - + + MEC EV - - - + +/- - + + + + + + SAU CH - +/- +/- - - - - - +/- - - + OUA VE - - +/- - +/- + +/- + + + + + QUI AL +/- +/- +/- + + + + + + + + + BUB JE +/- - +/- - +/- +/- - + + - + + PUJ MA +/- +/- +/- +/- +/- + +/- +/- + +/- + + SEN AN +/- +/- + + + + + + - + + + RIO EM +/- +/- +/- + + + + + + + + + HIV- AUB V + + + + + + + + + + + + NDK 10-4 +/- + + + Tableau 5b B R U Jour / Post infection D4 D5 D6 D7 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 1/25 1/50 1/100 HIV+ ZUM AM - +/- + - + + + + + + + + MEC EV - - - - - - - - - - +/ SAU CH - - - - + - + OUA VE - - - +/- - + + - + + QUI AL - - + + +/- + + + + BUB JE - - - - - - - +/- +/- - + + PUJ MA - - +/- +/- + + + + + + + + SEN AN - - +/- +/- +/- + + + + + + RIO EM +/- +/- +/- + + + + + + + + + + HIV- AUB V + + +/- + + + + + + + + + BRU 10-2 + + + + LISTE DE SEOUENCES Information pour la SEQ ID Ne 1 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 15 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-lle-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala Information pour la SEQ ID N 2 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 15 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 2 Phe-His-Pro-Ser-Asp-lle-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Gly-Glu Information pour la SEQ ID N 3 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 15 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 3 Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-lle-Val Information pour la SEQ ID Ne 4 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :SEQ ID N 4 Arg-Thr-Pro-Lys-lle-Gln-Val Information pour la SEQ ID N 5 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 5 Ser-Gln-Pro-Lys-lle-Val-Lys Information pour la SEQ ID N 6 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 6 Phe-His-Pro-Ser-Asp-lle-Glu Information pour la SEQ ID N' 7 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 7 Thr-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-lle-Gln-Val Information pour la SEQ ID N" 8 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :SEQ ID N" 8 Ile-Tyr-Leu-Thr-Gln-Pro-Lys-Ile-Lys-Val Information pour la SEQ ID N 9 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 9 Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr Information pour la SEQ ID N" 18 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 10 Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Asn Information pour la SEQ ID N" 11 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 11 Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Gln-Ile-Val-Lys-Trp Information pour la SEQ ID N 12 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 12 Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Asn-Ile-Val-Lys-Trp Information pour la SEQ ID N" 13 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 8 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 13 Cys-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu Information pour la SEQ ID N' 14 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 14 Tyr-Cys-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr Information pour la SEQ ID N 15 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 8 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :SEQ ID N 15 Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser Information pour la SEQ ID N' 16 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 9 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 16 Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Pro-Ser-Asp Information pour la SEQ ID N" 17 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 17 Lys-Thr-Pro--Gln-lle-Gln-Val Information pour la SEQ ID N' 18 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 18 Phe-His-Pro-Pro-Gln-lle-Glu Information pour la SEQ ID N" 19 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 19 Phe-His-Pro-Pro-His-lle-Glu Information pour la SEQ ID N' 28 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" 20 Ala-Glu-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr Information pour la SEQ ID N 21 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 7 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 21 Ser-Gln-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr Information pour la SEQ ID N' 22 TYPE : acide aminé LONGUEUR : 10 acides aminés CONFIGURATION : linéaire DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N 22 Ile-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val REVENDICATIONS 1) Vaccin destiné au traitement et/ou à la prévention de maladies d'origine infectieuse, I'agent infectieux ayant au moins une phase intracellulaire chez l'hôte lors de son cycle de multiplication, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un épitope cryptique d'un élément cellulaire emporté par un agent infectieux intracellulaire lors de son passage à l'extérieur de la cellule et qui est dévoilé par l'agent infectieux. 2) Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent infectieux est constitué par un parasite intracellulaire ou un virus à enveloppe. 3) Vaccin selon la revendication 2, caractérisé en ce que le virus est choisi parmi HIV, CMV et HPV. 4) Composition destinée au traitement ou à la prévention des infections à HIV, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un peptide correspondant aux séquences id n 1 à 22 ou une séquence équivalente. 5) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le peptide est lié à un système porteur. 6) Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le système porteur est constitué d'un ou plusieurs fragments de protéine liés à l'extrémité N ou C terminale du peptide par une liaison peptidique. 7) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le système porteur est lié au peptide par une liaison non peptidique. 8) Composition selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que le peptide a la séquence R7V. 9) Composition selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'elle comporte plusieurs peptides. 10) Composition selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisée en ce que le système porteur est choisi parmi les albumines, la KLH et la MPA. 11) Composition selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre les adjuvants d'immunité non spécifiques. 12) Composition destinée au traitement et à la prévention des infections à HIV, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'une des séquences id n" 1 à 22 ou une séquence équivalente. 13) Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que la séquence d'ADN code pour un peptide portant la séquence peptidique séquence id n" 1 à 22 ou une séquence équivalente. 14) Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que la séquence d'ADN est précédée de la séquence assurant son expression dans une cellule hote. 15) Composition selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que la séquence d'ADN est portée par un vecteur d'expression. 16) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que le vecteur d'expression est en réplication autonome. 17) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que le vecteur d'expression est un vecteur d'intégration chromosomique. 18) Composition selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que le vecteur d'expression est un plasmide bactérien. 19) Composition selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce que le vecteur d'expression est constitué de tout ou partie d'un virus défectif et/ou non pathogène. 20) Composition selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que le peptide est exprimé dans une cellule hôte. 21) Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule eucaryote ou végétale. 22) Anticorps dirigés contre un peptide utilisé dans l'une des compositions selon l'une des revendications 1 à 21. 23) Composition comportant au moins un anticorps selon la revendication 22. 24) Procédé de diagnostic de patients non progresseurs, caractérisé en ce que l'on détecte par un test immunologique la présence d'anticorps selon la revendication 19. 25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que le test immunologique est un test ELISA ou RIA.