Brevet FR2736926A1 — publié le 19970124

5*énol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutée, gène codant pour cette protéine et plantes transformées contenant ce gêne. La présente invention concerne une nouvelle 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (ou EPSPS), qui présente une tolérance accrue vis à vis des herbicides inhibiteurs compétitifs vis à vis du phosphonoenolpyruvate (PEP) de l'activité EPSPS. Cette EPSP synthase plus tolérante présente au moins une substitution "Thréonine par Isoleucine". Elle concerne également un gène codant pour une telle protéine, des cellules végétales transformées par des constructions gènes chimères contenant ce gène, les plantes régénérées à partir de ces cellules ainsi que les plantes issues de croisement utilisant ces plantes tranformées. Le glyphosate, le sulfosate ou la fosamétine sont des herbicides systémiques à large spectre de la famille des phosphonométhylglycines. Ils agissent essentiellement comme inhibiteurs compétitifs de la 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EC 2.5.1.19) ou EPSPS vis à vis du PEP(phosphoenolpyruvate). Après leur application sur la plante, ils sont véhiculés dans la plante où ils s'accumulent dans les parties à croissance rapide, notamment les apex caulinaires et racinaires, provoquant l'altération jusqu'à la destruction des plantes sensibles. L'EPSPS plastidiale, cible principale de ces produits est une enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques, qui est codée par un ou des gènes nucléaires et synthétisée sous forme d'un précurseur cytoplasmique puis importée dans les plastes où elle s'accumule sous sa forme mature. La tolérance des plantes au glyphosate et aux produits de la famille est obtenue par introduction stable dans leur génome d'un gène d'EPSPS d'origine végétale ou bactérienne mutée ou non quant aux caractéristiques d'inhibition par le glyphosate du produit de ce gène. Etant donné le mode d'action du glyphosate et le degré de tolérance au glyphosate du produit des gènes utilisés, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ce gène de façon à permettre son accumulation importante dans les plastes. I1 est connu, par exemple d'après le brevet américain 4 535 060, de conférer à une plante une tolérance à un herbicide du type ci-dessus, en particulier la Nphosphonométhylglycine ou glyphosate, par introduction dans le génome des plantes d'un gène codant pour une EPSPS portant au moins une mutation rendant cette enzyme plus résistante à son inhibiteur compétitif (le glyphosate) après localisation de l'enzyme dans le compartiment plastidial. Ces techniques demandent cependant à être améliorées pour obtenir une plus grande fiabilité dans l'emploi de ces plantes en conditions agronomiques. Dans la présente description, on entend par "plante" tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals ou des tissus différenciés tels que des embryons ou des parties de plantes ou des semences. La présente invention a pour objet la production de plantes transformées ayant une tolérance accrue aux herbicides de la famille des phosphonométhylglycines par régénération de cellules transformées à l'aide de nouveaux gènes chimères comportant un gène de tolérance à ces herbicides. L'invention a également pour objet un gène chimère pour conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide ayant pour cible l'EPSPS, comprenant, dans le sens de la transcription: une zone promotrice, éventuellement une zone peptide de transit, une séquence d'un gène codant pour une enzyme de tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation non traduite en 3', caractérisé en ce que le gène de tolérance au glyphosate comporte, par rapport au gène dont il est dérivé, une substitution "Thréonine 102 par Isoleucine" dans la zone "aroA"(EPSPS). De manière préférée, elle comprend en outre, dans la même zone une substitution "Proline 106 par Sérine". Ces substitutions peuvent être introduites, ou être présentes, dans une séquence d'EPSPS d'origine quelconque: notamment végétale, bactérienne, d'algues ou de champignon. Les peptides de transit utilisables dans la zone de peptide de transit peuvent être en soi connus, d'origine végétale, par exemple issus de maïs, de tournesol, de pois, de tabac ou autres. Le premier et le second peptide de transit peuvent identiques, analogues ou différents. Ils peuvent en outre comprendre chacun une ou plusieurs unités peptide de transit selon la demande de brevet européen EP 0 508 909. Cette zone caractéristique a comme rôle de permettre le relargage d'une protéine mature et native, et en particulier l'EPSPS mutée ci-dessus, avec une efficacité maximale dans le compartiment plasmidique. La zone promotrice du gène chimère selon l'invention peut être composée avantageusement d'au moins un promoteur ou un fragment d'un promoteur de gène s'exprimant naturellement dans les plantes...(tubuline, introns actine, histone). La zone signal de terminaison de la transcription non traduite en 3' du gène chimère peut être d'origine quelconque, par exemple bactérienne telle que celle du gène de la nopaline synthase, ou végétale telle que celle du gène histone H4A748 d' Arabidopsis thaliana selon la demande de brevet européen (demande européenne 633 317). Le gène chimère selon l'invention peut comprendre, en plus des parties essentielles cidessus, au moins une zone intermédiaire non traduite (linker), qui peut être localisés entre les différentes régions transcrites décrites ci-dessus. Cette zone intermédiaire peut être d'origine quelconque, par exemple bactérienne, virale ou végétale. Isolement d'un ADNc codant pour une EPSPS de mais: Les différentes étapes, qui ont conduit à l'obtention de l'ADNc d'EPSPS de maïs, qui a servi de substrat à l'introduction des deux mutations, sont décrites ci-dessous. Toutes les opérations décrites ci-dessous sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat.La plupart des méthodes d'ingéniérie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989)(Par la suite, les références à des protocoles décrits dans cet ouvrage seront notées "réf. CPMB"). Les opérations concernant l'ADN, qui ont été effectuées selon les protocoles décrits dans cet ouvrage sont, en particulier les suivantes: ligation de fragments d'ADN, traitements par l'ADN polymérase de Klénow et la T4 ADN polymérase, préparation d'ADN de plasmides et de bactériophages X soit en minipréparation soit en maxi préparation, analyses d'ADN et d'ARN respectivement selon les techniques de Southern et Northern.D'autres méthodes décrites dans cet ouvrage ont été suivies, et seules les modifications ou ajouts significatifs à ces protocoles ont été décrits cidessous. Exemple 1: 1. Obtention d'un fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana a) deux oligonucleotides 20-mers de séquences respectives: 5'- GCTCTGCTCATGTCTGCTCC -3' 5'- GCCCGCCCTTGACAAAGAAA- 3' ont été synthétisés à partir de la séquence d'un gène d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana (Klee H.J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437442). Ces deux oligonucleotides sont respectivement en position 1523 à 1543 et 1737 à 1717 de la séquence publiée et en orientation convergente. b) L'ADN total d'Arabidopsis thaliana (var. columbia) a été obtenu chez Clontech (référence catalogue: 6970-1) c) On mélange 50 nanogrammes(ng) d'ADN avec 300ng de chacun des oligonucleotides et soumis à 35 cycles d'amplification avec un appareil Perkin-Elmer 9600, dans les conditions de milieu standard pour l'amplification préconisées par le fournisseur. Le fiagment de 204pb résultant constitue le fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana. 2. Construction d'une bibliothèque d'un ADNc à partir d'une ligne cellulaire de mais BMS . a) On broye 5 g de cellules filtrées dans l'azote liquide et les acides nucléiques totaux extraits selon la méthode décrite par Shure et al. avec les modifications suivantes: - le pH du tampon de lyse est ajusté à PH = 9,0; -après la précipitation par l'isopropanol, le culot est repris dans l'eau et après dissolution, ajusté à 2,5 M LiCl. Après incubation pendant 12h à "C, le culot de la centrifugation d 15 min. à 30000g à 4"C est resolubilisé. L'étape de précipitation par LiCI est alors répétée. Le culot resolublisé constitue la fraction ARN des acides nucléiques totaux. b) La fraction ARN-polyA+ de la fraction ARN est obtenue par chromatographie sur colonne oligo-dT cellulose telle que décrite dans "Cuerent Protocols in Molecular Biology". c) Synthèse d'ADNc double brin à extrémité synthétique EcoRI: elle est réalisée en suivant le protocole du fournisseur des différents réactifs nécessaires à cette synthèse sou forme d'un kit:le "copy kit" de la société In Vitrogen. Deux oligonucleotides simples brins et partiellement complémentaires de séquences respectives: 5'- AATTCCCGGG -3' 5'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé) sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches. Cette ligation des adaptateurs résulte en la création de sites Sma I accolés aux ADNc double brin et EcoRI sous forme cohésive à chaque extrélité des ADNC double brin. d) Création de la bibliothèque: Les ADNc présentant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI sont ligués avec le ADNc du bactériophage hgtl0 coupé par EcoRI et déphosphorylé selon le protocole du fournisseur Naew England Biolabs. Une aliquote de la réaction de ligation a été encapsidée in vitro avec des extraits d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette librairie a été titrée en utilisant la bactérie E. coli C600hfl. la librairie ainsi obtenue est amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et constitue la librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS. 3. Criblage de la bibliothèque de ADNc de suspension cellulaire de mals BMS avec la sonde EPSP d'Arabidopsis thaliana: Le protocole suivi est celui de "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al, publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989)(CPMB). En bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité moyenne de 100 phages /cm2 Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane Hybond N d'Amersham. h) L'ADN a été fixé sur les filtres par traitement UV 1600kJ (Stratalinker de Stratagene). Les filtres iont été préhybridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait écrémé pendant 2h à 65"C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-dCTP par "random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de Pharmacia). L'activité spécifique obtenue est de l'order de 108 cpm par Fg de fiagment. Après dénaturation pendant 5 min à 1000C, la sonde est ajoutée dans le milieu de préhybridation et l'hybridation est poursuivie pendant 14 heures à 55"C. Les filtres sont fluorographiés 48h à -80 C avec un film KodaW(AR5 et des écrans renforçateurs Hyperscreen RPN d'Amersham. L'alignement des spots positifs sur le filtre avec les boîtes d'où ils sont issus permet de prélever, sur la boîte, des zones correspondant aux phages présentant une réponse d'hybridation positive avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Cette étape d'étalement, transfert, hybridation, récupération est répétée jusqu'à ce que tous les spots de la boîte des phages successivement purifiés se révèlent positifs à 100% en hybridation. Une plage de lyse par phage indépendant est alors prélevée dans du milieu x diluant (Tris-CI pH= 7,5; MgS04 l0mM; NaCl 0,1M; gélatine 0,1%), ces phages en solution constituant les clones positifs de 1' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. 4. Préparation et analyse de l'ADN des clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. On ajoute environ 5.108 phages à 20 ml de bactéries C600hfl à 2 OD 600nm/ml et incubés 15 minutes à 370C. Cette suspension est alors diluée dans 200ml de milieu de croissance des bactéries dans un Erlen de 1 1 et agitée dans un agitateur rotatif à 250 rpm. La lyse est constatée par clarification du milieu, correspondant à l lyse des bactéries turbides et se produit après environ 4 h d'agitation. Ce surnageant est alors traité comme décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN obtenu correspond aux clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. Un à deux g de cet ADN sont coupés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTA'TBE (réf. CPMB) à 0,8%. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fiagment EcoRI a une taille estimée sur gel à environ 1 ,7kpb. 5. Obtention du clone pRPA-ML-711: Dix g de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de 1,7kpb sont digérés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert de 1,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est traité à la B-agarse selon le protocole du fournisseur New England Biolabs. L'ADN purifié du fragment de 1,7kpb est ligué à 12"C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England Biolabs) coupé par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology".Deux Ill du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la transformation d'une aliquote d'E.coli DHlOB électro compétentes ; la transformation se fait par électroporation en utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et et de milieu de ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2cm (Biorad) prélablement refroidie à 0 C. Les conditions physiques de l'électroporation utilisant un électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 ,uFarad et 200 Q. Dans ces conditions, le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2 millisecondes.Les bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf. CPMB) et agitées pendant 1 heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Corning de 15 ml. Après étalement sur milieu LB/agar supplémenté à 100 Zg/ml de carbéniciline, les mini-préparations des clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 "C est réalisée selon le protocole décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Après digestion par EcoRI de l'ADN et séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%, les clones présentant un insert de 1 ,7kpb sont conservés. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana.Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant un insert de 1,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été préparé à plus grande échelle et l'ADN résultant de la lyse des bactéries purifié sur gradient de CsCI ainsi que décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN purifié a été partiellement séquencé avec un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur et en utilisant comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées chez le même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La séquence dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50 résidus acides aminés) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante de l'EPSPS mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908). Ce clone correspondant à un fragment EcoRI de 1,7kpb de l'ADN de 1' EPSP de la suspension cellulaire de mais BMS a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a été réalisée sur les deux brins en utilisant le protocole du kit Pharmacia et en synthétisant des oligonucléotides complémentaitres et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence complète de ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N 1. 6. Obtention du clone pRPA-ML-715: L'analyse de la séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison de la séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de séquence de 92 pb en amont du codon GCG codant pour l'Alanine NH2-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908). De même une extension de 288 pb en aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux parties pourraient correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un peptide de transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-tenninale à la région 3' non traduite de l'ADNc. Afin d'obtenir un ADNc codant pour la partie mature de l'ADNc de 1'EPSPS de maïs, telle que décrite dans 1' USP 4 971 908, les opérations suivantes ont été réalisées: a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712: Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les extrémités résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par l'enzyme de restriction SacH a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTHfBE (réf. CPMB) 1%. Le fragment de gel contenant l'insert "AseI-extrémités franches/SaclI" de 0,4 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 cidessus. L'ADN du clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction Hindi située dans le polylinker du vecteur de clonage pUC 19 et les extrémités résultant de cette coupure ont été rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LOTAPUBE (réf. CPMB) 0,7%. Le fragment de gel contenant l'insert Hindffl-extrémités franches/SacII de environ 3,7kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Les deux inserts ont été ligués, et 2 1ll du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHlOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. On analyse le contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite pour pRPA-ML-711. Un des clones plasmidique retenu contient un insert EcoRI Hindm de 1,45 kpb environ. La séquence des extrémités terminales de ce clone révèle que I'extrémité 5' de l'insert correspond exactement à l'extrémité correspondante de pRPA-ML711 et que l'extrémité 3' terminale présente la séquence suivante: "5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'". La séquence soulignée correspond au codon de l'acide aminé COOH-terminal asparagine, le codon suivant correspondant au codon stop de la traduction. Les nucléotides en aval correspondent à des éléments de séquence du polylinker de pUCI9. Ce clone comprenant la séquence de pRPAML-711 jusqu'au site de terminaison de la traduction de l'EPSPS mature de maïs et suivie de séquences du polylinker de pUC 19 jusqu'au site Hindi a été nommé pRPA-ML-712. b) Modification de l'extrémité 5' de pRPA-ML-712: construction de pRPA ML-715 Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et Hindm. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorése sur gel d'agarose LGTAPfl3E (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert PstI/EcoRI de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence de quantité équimoléculaire de chacun des deux oligonucléotides partiellement complémentaires, de séquence: Oligol: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUC19 digéré par les enzymes de restrictions BamHI et Hindi. Deux 1ll du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHlOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence de l'extrémité 5' terminale du clone retenu révèle que la séquence ADN dans cette région est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI à BamHI, suivi de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage, suivi du reste de la séquence présente dans pRPAML-712. Ce clone a été nommé pRPA-ML-713. Ce clone présente un codon methionine ATG inclu dans un site NcoI en amont du codon Alanine N-terminal de l'EPSPSynthase mature.De plus, les codons alanine et glycine de l'extrémité N-terminale ont été conservées, mais modifiées sur la troisième base variable : GCbGGT initial donne GCCGGÇ modifié. Le clone pRPA-ML-713 a été coupé par l'enzyme de restriction Hindi et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de la ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert "HincIllI-extrémités franches/SacI" de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par l'enzyme de restriction XbaI et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. Deux Crl du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHIOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite cidessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence des extrémités terminales du clone retenu révèle que la séquence ADN est la suivante: séquence du polylinker de pUC19 des sites EcoRI à SacI, suivie de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage délétée des 4 pb GATCC de l'oligonucléotide 1 décrit ci-dessus, suivi du reste de la séquence présente dans pRPA ML-712 jusqu'au site Hindi et séquence du polylinker de pUCl9 de XbaI à Hindi. Ce clone a été nommé pRPA-ML-715. 7) Obtention d'un ADNc codant pour une EPSPS de mais mutée Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis kit de Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce système de mutagénèse est le suivant: l'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et réassocié en présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et d'autre part d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction unique présent dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin complémentaire est réalisée par l'action de la T4 ADN polymérase en présence de T4 ADN ligase et de protéine du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé en présence de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par mutagénèse.La souche d'E. coli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte pour la transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN plasmidique total est préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment. Après ces traitements, la souche d'E. coli DHlOB est utilisée comme hôte pour la transformation. L'ADN plasmidique des clones isolés est préparé et la présence de la mutation introduite vérifiée par séquençage. A)- modifications de sites ou de séquence sans incidence a priori sur le caractère de résistance de l'EPSPS de mais aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase: élimination d'un site NcoI interne de pRPA-ML-715. La séquence de pRPA-ML-715 est numérotée arbitrairement en plaçant la première base du codon Alanine N-terminal GCC en position 1. Cette séquence présente un site NcoI en position 1217. L'oligonucléotide de modification du site présente la séquence: 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'. Après séquençage selon les références données ci-dessus, la séquence lue après mutagénèse correspond à celle de l'oligonucléotide utilisé. Le site NcoI a bien été éliminé et la traduction en acides aminés dans cette région conserve la séquence initiale présente sur pRPA-ML-715. Ce clone a été nommé pRPA-ML-716. La séquence de 1340 bp de ce clone est présentée SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3. B) modifications de séquence permettant l'augmentation du caractère de résistance de l'EPSPS de mas aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase. Les oligonucléotides suivants ont été utilisés: a) mutation Thr 102 11e. 5 '-GAATGCTGGAATCGCAATGC GGCCATTGACAGC-3 ' b) mutation Pro 106 # Ser. 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutations Gly 101 1 Ala et Thr 102#Ile. 5 '-CTTGGGGAATGCTGCCATC GCAATGCGGCCATTG-3 ' d) mutations Thr 102 -11e et Pro 106 - Ser. 5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments mutés est identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la région mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse utilisés.Ces clones ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 1 Ile, pRPA-ML-718 pour la mutation Pro 106 - Ser, pRPA-ML-719 pour les mutations Gly 101 * Ala et Thr 102 '*11e et pRPA-ML-720 pour les mutations Thr 102 # Ile et Pro 106- Ser. La séquence de 1340 bp de pRPA-ML-720 est présentée SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5. L'insert NcoI-HindE de 1395 pb est à la base de toutes les constructions utilisées pour la transformation des plantes pour l'introduction de la résistance aux herbicides inhibiteurs compétitifs de l'EPSPS et en particulier la résistance au glyphosate. Cet insert sera nommé dans la suite des descriptions "le double mutant de l'EPSPS de maïs". Exemple 2: Tolérance au glyphosate des différents mutants in vitro. 2.a: Extraction de l'EPSP synthase. Les différents gènes d'EPSP synthases sont introduits sous forme d'une cassette NcoI-HindE dans le vecteur plasmidique pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01) coupé par NcoI et Hindi. Les E. coli DHlOB recombinantes surexprimant les différents EPSP synthases sont soniquées dans 40 ml de tampon par 10 g de cellules culottées et lavées avec ce même tampon (tris HCl 200 mM pH 7,8, mercaptoethanol 50 mM, EDTA 5 mM et PMSF 1 mM), auxquels on rajoute 1 g de polyvinylpirrolidone. La suspension est agitée pendant 15 minutes à 4"C, puis centrifugée 20 minutes à 27000g et 40C. Le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à 40% de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 20 minutes à 27000g et 40C. Le nouveau surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à 70% de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 30 minutes à 27000g et 4"C. L'EPSP synthase, présente dans ce culot protéique, est reprise dans 1 ml de tampon (tris HCI 20 mM pH 7,8 et mercaptoethanol 50 mM). Cette solution est dialysée une nuit contre deux litres de ce même tampon à 4"C. 2.b: Activité enzymatique. L'activité de chaque enzyme ainsi que sa résistance au glyphosate est mesurée in vitro sur 10 minutes à 37 C dans le mélange réactionnel suivant: acide maléique 100 mM pH 5,6, phosphoénol pyruvate 1 mM, shikimate-3-phosphate 3 mM (préparé selon Knowles P.F. et Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 à partir de Aerobacter aerogenes strain ATCC 25597) et fluorure de potassium 10 mM. L'extrait enzymatique est ajouté au dernier moment après l'addition de glyphosate dont la concentration finale varie de O à 20 mM. L'activité est mesurée par dosage du phosphate libéré selon la technique de Tausky H.A. et Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685. Dans ces conditions, l'enzyme sauvage (WT) est inhibée à 85% dès la concentration de 0,12 mM de glyphosate. A cette concentration, l'enzyme mutante connue Serl06 n'est inhibée qu'à 50% et les trois autres mutants Ile102, Ile102/Ser106, Ala101/Ile102 ne sont pas ou peu inhibées. I1 faut multiplier la concentration de glyphosate par dix, soit 1,2 mM, pour inhiber l'enzyme mutante Ile102 à 50%, les mutants Ile 102/Ser106, Ala/Ile et Ala n'étant toujours pas inhibés. Il faut noter que l'activité des mutants Maille et Ala n'est pas inhibée jusqu'à des concentrations de 10 mM de glyphosate, et que celle du mutant lle102/Serl06 n'est pas réduite même si la concentration en glyphosate est multipliée par 2, soit 20 mM. Exemple 3: Résistance des plantes de tabac transformés. 1-1- Transformation. Le vecteur pRPA-RD-173 est introduit dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al.,l987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari et al.,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al.(1985). 1-2- Régénération. La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 200 Fg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in z vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Science,1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30g/l de saccharose contenant 0,05 mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. 1-3- Résistance au glyphosate. Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-173. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension acqueuse de RoundUp correspondant à 0,8kg de matière active glyphosate par hectare. Les résultats correspondent à l'observation d'indices de phytotoxicité relevés 3 semaine après traitement. Dans ces conditions, on constate que les plantes transformées par la construction pRPA-RD-173 présentent une très bonne tolérance alors que les plantes témoins non transformées sont complètement détruites. Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportée par l'utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate. Exemple 4: Transformation et sélection de cellules de mais. Des cellules de maïs BMS (Black Mexican Sweet) en phase exponentielle de croissance sont bombardées avec la contruction pRPA-RD-130 selon le principe et le protocole décrit par Klein et al 1987 (plein TM, Wolf ED, Wu R and Sandford JC (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into livings cells NATURE vol 327p 70-73) Deux jours après le bombardement, les cellules sont transférées sur le même milieu contenant 2mM de N(phosphométhyl)glycine. Après 8 semaines de sélection sur ce milieu, des cals se développant sont sélectionnés puis amplifiés et analysés par PCR et révèlent clairement la présence du gène chimère PTO-EPSPS. Les cellules non bombardées et mises en croissance sur le même milieu contenant 2mM de N(phosphométhylglycine) sont bloquées par l'herbicide et ne se développent pas. Les plantes transformées selon l'invention peuvent être utilisées comme parents pour l'obtention de lignées et d'hybrides ayant le caractère phénotypique correspondant à l'expression du gène chimère introduit. Description des constructions des plamides pRPA-RD-124: Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS double mutant de maïs (Thr 102 o ne et Pro 106 e Ser). pRPA-ML-720 est digéré avec Hind ffl, traité avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour produire une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le fragment EPSPS est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une cassette de clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour donner pRPA-RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui-ci soit préalablement digéré par SalI, traité avec 1'ADN polymérase de Klenow, puis digéré une seconde fois avec NcoI. pRPA-RD-125: Addition d'un peptide de transit optimisé (PTO) à pRPA-RD-124 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS ciblé sur les plasmides. pRPA-RD-7 (demande de brevet européen EP 652 286) est digérée avec Sph I, traité avec la T4 ADN polymérase, puis digérée avec Spe 1 et le fragment PTO est purifié. Ce fragment PTO est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow pour enlever la partie protubérante 3', puis digérée par Spe I. Ce clone est alors séquencé pour assurer la fusion traductionnelle correcte entre le PTO et le gène d'EPSPS. On obtient alors pRPA-RD-125. pRPA-RD-130: Addition du promoteur d'histone de mais H3C4 et de séquences d'intron 1 adhl de pRPA-RD-123 (demande de brevet EP 507 698) à pRPA-RD-125 avec création d'une cassette pour expression dans les plantes pour l'expression du gène d'EPSPS double mutant dans les tissus de monocotylédones. pRPA-RD-123 (une cassette contenant le promoteur d'histone de maïs H3C4 fusionné avec l'intron 1 adhl) est digérée avec Nco I et Sac I. Le fragment d'ADN contenant le promoteur dérivé de pRPA-RD-123 est ensuite purifié et ligué avec pRPA-RD-125, qui a été préalablement digéré avec Nco I et Sac I. pRPA-RD-159: Addition du promoteur double d'histone de d'arabidopsis H4A748 (demande de brevet EP 507698 ) à pRPA-RD-125 avec création d'une cassette pour expression dans les plantes pour l'expression du gène "PTO- gène d'EPSPS double mutant" dans les tissus de dicotylédones. pRPA-RD-132 (une cassette contenant le promoteur double H4A748 (demande de brevet EP 507 698)) est digérée avec Nco I et Sac I. Le fragment purifié du promoteur est ensuite cloné dans qui a été digéré avec Eco I et Sac I. pRPA-RD-173: Addition du gène "promoteur H4A748-PTO-gène d'EPSPS double mutant" de pRPA-RD-159 dans plasmide pRPA-BL-l50A (demande de brevet européen 508 909) avec création d'un vecteur de transformation Agrobacterium tumefaciens. pRPA RD-159 est digéré avec Not I et traité avec la polymérase de Klenow. Ce fragment est ensuite cloné dans pRPA-BL-l5OA avec Sma I. Liste des séquences: SEQ ID N 1. AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60 ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120 CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180 TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240 AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300 AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360 AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420 CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA TGAATGAGGG 480 AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540 TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600 AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660 CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720 TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780 GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840 AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900 TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960 TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020 CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080 CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140 GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200 TAACCAAGCT GGGACCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260 AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320 CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380 CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440 ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500 CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560 TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620 GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713 SEQ ID N 2. CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile 1 5 10 TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95 Ser Gly Thr Val Lys Léu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 40 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Mat Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 3 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro llS 120 125 AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 4 Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 4 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 5 Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 5 Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 6 Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser 195 '200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Vla 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly 225 230 235 SEQ ID N 2 (suite). CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 7 Gly Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 245 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GGT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 8 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 8 Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Gly Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007 Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151 Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247 Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295 Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 TAA 1340 SEQ ID N 3. Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 L@u Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp L@u Val Val Gly L2u Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Il@ Ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350 Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr @@@ 300 385 400 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala 405 410 415 Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 SEQ ID N 4. CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile 1 5 10 TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ACT 95 Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 40 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro 115 120 125 AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527 Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575 Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623 Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser 195 200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly 225 230 235 SEQ ID N 4 (suite). CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767 Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 245 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863 Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007 Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 115 Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 115 Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 124 Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 125 Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 133 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 TAA 1340 SEQ ID N 5. Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Gly Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Gly Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350 Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 405 410 415 Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 REVENDICATIONS 1. Gène ADN codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) mutée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution Thréonine 102 o Isoleucine. 2. Gène ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en plus au moins une seconde mutation dans l'EPSPS, distincte de la première. 3. Gène ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en plus une mutation constituée par une substitution Proline 106 par la Sérine. 4. Gène ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en plus une mutation constitué par une substitution de la Glycine 101 par l'Alanine. 5 Gène ADN selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est d'origine bactérienne. 6. Gène ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est issu d'une bactérie du genre Salmonella typhimurium. 7. Gène ADN selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est d'origine végétale. 8. Gène ADN selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est d'origine de maïs. 9. Protéine EPSPS mutée caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une substitution de la Thréonine 102 par l'isoleucine. 10. Gène chimérique comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, caractérisé en ce qu'il comprend, comme séquence codante, au moins une séquence selon l'une des revendications 1 à 8. 11. Gène chimérique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur de virus de plante. 12. Gène chimérique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur de plante (ex: a tubuline, histone, introns, actine...). 13. Vecteur pour la transformation des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend, au moins un gène selon l'une des revendications 10 à 12. 14. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gêne selon l'une des revendications 10 à 12. 15. Plante, caractérisée en ce quelle est obtenue par régénération à partir d'une cellule selon la revendication 14. 16. Procédé pour la production de plantes de tolérance améliorée à un herbicide ayant pour cible 1'EPSP synthase, caractérisé en ce qu'on transforme des cellules végétales ou protoplates avec un gène selon l'une des revendications 1 à 8 et qu'on soumet les cellules transformées à une régénération. 17. Procédé de traitement des plantes avec un herbicide ayant 1'EPSPS pour cible, caractérisé en ce qu'on applique l'herbicide à des plantes selon la revendication 15. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on applique du glyphosate ou un précurseur du glyphosate.