Brevet FR2741077A1 — publié le 19970516

VACCIN POLYVALENT ANTI-DENGUE La présente invention est relative à un vaccin sous unités polyvalent contre des virus de la famille des Flaviviridiae et notamment contre des flavivirus tels les virus de la Dengue, de la fiévre jaune, de l'encéphalite japonaise, ou autres Flaviviridiae, ou Flavi-like comme le virus de I' hépatite C, ainsi que des mélanges de ceux-ci (18). Les fiavivirus sont des virus de la famille des arbovirus (anciens arbovirus du groupe B). Ce sont des virus de vertébrés transmis par des arthropodes hématophages (moustiques, tiques, phlébotomes), chez qui ils se multiplient avant la transmission. Le cycle de maintien fait donc intervenir un vertébré réservoir et un arthropode. Certains arbovirus peuvent concerner l'homme et induire des pathologies, les arboviroses que l'on trouve surtout dans les régions tropicales. Si il existe un vaccin contre la fièvre jaune depuis 1930, les autres flavivirus n'ont actuellement aucun vaccin; c'est le cas notamment de la Dengue. Des dizaines de millions d'individus sont affectés annuellement par la Dengue, en particulier dans les régions intertropicales où la maladie sévit à l'état de pandémie ininterrompue. Le virus responsable de la Dengue s'est propagé de façon concomitante à son vecteur, le moustique Aedes aegypti. La maladie se caractérise par une forte fièvre accompagnée de maux de tête, de nausées et de douleurs articulaires et musculaires qui s'effacent après quelques jours. Les symptomes peuvent cependant s'intensifier pour conduire à des manifestations hémorragiques parfois mortelles lorsque la maladie est associée à un choc hypovolémique, surtout chez l'enfant. L'agent responsable de la Dengue est un flavivirus à ARN de la famille des Flaviviridae, tout comme le virus de la fièvre jaune ou celui de l'encéphalite japonaise. On en connaît 4 sérotypes.La Dengue hémorragique pourrait être une conséquence d'un phénomène immunologique mal connu, impliquant sans doute une cascade de cytokines liées à l'induction d'une immunité cellulaire cytotoxique pouvant résulter d'une infection séquentielle par plusieurs sérotypes. L'absence de modèle animal freine la conception d'un vaccin car il n'est pas possible d'explorer en détail les facteurs impliqués dans les manifestations graves de la maladie. Un premier vaccin contre la Dengue est actuellement expérimenté. II s'agit d'un vaccin à base des 4 sérotypes vivants, atténués par passages successifs du virus en culture de cellules. L'inconvénient majeur de ce type de vaccin est la possibilité des virus atténués de reverser vers la virulence, par réversion génétique ou recombinaison entre génomes. II présente également un risque potentiel pour les nouveaux-nés et pour les personnes immunodéprimées. De plus, certains enfants vaccinés au moyen du vaccin tétravalent semblent ne pas être protégés contre les 4 sérotypes. La structure du génome est la séquence d'amino-acides du virus de la Dengue notamment celui du sérotype 2 a été décrite par V. Deubel et al. (1). Le virus de la Dengue est un virus à ARN enveloppé d'environ 50 nanomètres. Comme le virus de la fièvre jaune, toutes les protéines virales sont codées par un segment d'environ 10,5 kilobases dont la structure est la suivante: 5' C-preM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3'. Les protéines structurales sont C (capsides), prématrix/matrix(preM/M) et la protéine d'enveloppe (E). Ces protéines sont codées par le fragment en 5', suivi par des protéines non structurales (NS) codées par le reste du génome. Les protéines sont produites par un processus protéolytique induit par une peptidase cellulaire et d'éventuelles protéinases. La glycoprotéine d'enveloppe (E) est la protéine de surface majoritaire. La structure du stérotype 1 a été décrite par Mason et al. (2). Le sérotype 2 a été décrit dans (1), et est le mieux connu des 4 sérotypes; le sérotype de type 3 a été décrit par Osatomi K. al. (3) et le sérotype de type 4 a été décrit par Zhao et al., (4). De nombreuses tentatives ont été faites pour développer des vaccins sous unités, généralement exprimés en tant que peptides ou protéines recombinantes par utilisation d'un vecteur baculoviral exprimé dans des cellules d'insectes. En effet, les baculovirus sont très attractifs pour ce type de production grâce au haut niveau d'expression génétique qu'ils peuvent atteindre et pour leur absence de pathogénicité pour l'homme. Le baculovirus a déjà été utilisé pour l'expression de protéines flavivirus: le sérotype 1 de la Dengue (5), le sérotype 4 de la Dengue tDEN-4) (6) et le sérotype 2 (DEN-2) ont été décrits (7), (8), (9) et les sérotypes 2 et 3 ont été décrits par C. Delenda et al. (10). L'homologie de séquence entre les 4 génomes correspondant aux 4 sérotypes du virus est relativement importante; à titre d'exemple, la protéine E de ces virus présente un pourcentage d'homologie tel que présenté dans le tableau 1 ci-dessous: Dengue 2 Dengue 3 Dengue 4 Dengue 1 78 % 82 % 67 % Dengue2 78 % 73 % Dengue3 68 % Malgré cela aucune des constructions décrites dans l'état de la technique ne permet d'éliciter une réponse immunologique efficace contre les 4 sérotypes: généralement le titre obtenu est bas, et la résistance induite à un challenge contre une infection par le virus virulent ne peut être considérée comme suffisante. Certaines constructions ont permis néanmoins une bonne induction de l'immunoginicité, et notamment dans le cas décrit dans (11) où une glycoprotéine d'enveloppe délétée dans sa partie carboxyterminale de 100 acides aminés, permet d'obtenir une immunogénicité augmentée. Mais celle n'est pas efficace contre les autres sérotypes de la Dengue. Enfin, Delenda et al. (9, 10) ont effectivement montré qu'une troncature dans la partie carboxy-terminale de la protéine était susceptible d'augmenter la réponse immunitaire. La purification des protéines recombinantes obtenues par l'expression dans un système hétérologue pose toujours un problème de compatibilité entre le rendement recherché et la préservation de la structure de ladite protéine et notamment de ses motifs glycosylés. Une technique performante est la purification d'affinité de peptides ou protéines couplés de façon covalente à une courte séquence d'amino-acides qui joue le rôle de marquage (tag). Des exemples de techniques exploitant cette approche sont : la glutathione-S-transférase (GST) purifiée sur des billes de sépharoseglutathion (12), I'association de la protéine Mal E au maltose et à ses dérivés (13), une fusion de la protéine A avec des colonnes d'immunoglobulines (14), ou le marquage à l'histidine qui présente une affinité pour des colonnes de métal chélate (15). Schmidt et al. (16) décrit dans un article récent les avantages et les limites de cette technique. Mais il est à noter que l'homme du métier cherche systématiquement à éliminer les résidus histidine après l'étape de purification notamment en utilisant la carboxypeptidase A. La présente invention résulte de la découverte selon laquelle un polypeptide ou un glycopeptide constitué d'un polypeptide ou glycoprotéine issu d'une protéine d'un Flaviviridiae, à savoir le virus de la Dengue dans laquelle une délétion de son extrémité carboxylée a été substituée par un résidu d'acides aminés choisi parmi l'histidine, le tryptophane ou la cystéine présentait un caractère immunogéne beaucoup plus important que le même polypeptide ou glycopeptide n'ayant pas ce résidu d'acides aminés ajoutés, ce résidu ayant pour effet d'améliorer la présentation antigènique et par conséquent d'induire une réponse cellulaire et humorale beaucoup plus importante qu'en l'absence de ce résidu. Dans tout ce qui précède et suit, I'expression polypeptide doit être comprise au sens large, c'est-à-dire incluant des séquences d'au moins 15 acides aminés comprenant ou non des motifs glycosylés ou des glycolipides, et quelle que soit sa structure, primaire, secondaire ou tertiaire. La présente invention porte plus généralement sur des polypeptides, à pouvoir immunogène accru, issus de Flaviviridiae, caractérisés par l'existence d'un résidu d'acides aminés à leur extrémité carboxy-terminale, lequel résidu d'acides aminés contient de 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, le tryptophane ou la cystéine. Dans le texte de la présente demande, le résidu d'acides aminés peut être homogène dans le sens où il est constitué de 2 à 8 histidines, 2 à 8 tryptophanes ou 2 à 8 cystéines. il peut être également constitué d'un mélange de 2 ou 3 de ces acides aminés ; il peut enfin comporter quelques acides aminés autres que l'histidine, le tryptophane ou la cystéine à partir du moment où leur nombre n'excède pas 25 % du résidu. Ces constructions permettent de résoudre le problème du manque d'immunogénicité de certains peptides issus de ces virus, comme par exemple certains sérotypes du virus de la Dengue contre lesquels les techniques actuelles ne permettaient pas de faire des vaccins de type sous-unité. La présente invention porte sur de tels polypeptides immunogènes, constitués d'un polypeptide issu de la protéine E, de la protéine preM, de la protéine NS1 ou NS3 du virus de la Dengue et dans laquelle pour la protéine E l'extrémité carboxylée a été délétée de 70 à 105 acides aminés pour être substituée par un résidu de 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, la cystéine ou le tryptophane. II peut en être de même pour la protéine preM délétée de 30 à 50 acides aminés dans son extrémité carboxy-terminale pour être substituée par le même type de résidu. Pour les autres protéines cette délétion n'est pas nécessaire; et le polypeptide de l'invention issu de NS1 ou NS3 comporte un résidu de 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, la cystéine ou le tryptophane. De façon avantageuse, le polypeptide est issu de la protéine E et la délétion est de environ 100 acides aminés; si en outre, le résidu d'acides aminés contient 2 à 8 histidines, cela confère au peptide la propriété de se fixer sur des cations divalents ou trivalents ou trivalents. Les polypeptides ou les peptides de l'invention peuvent être issus de chacun des 4 sérotypes de la Dengue, sachant que le pourcentage d'homologie entre les 4 sérotypes est élevé et se situe entre 67 % et 80 % pour la protéine E comme cela est indiqué dans le tableau 1 ci-dessus. La présente invention porte également sur des compositions constituées de mélanges de polypeptides de l'invention. Ces mélanges peuvent constituer un principe actif de vaccin polyvalent, soit contre différents sérotypes d'un même virus, comme la Dengue, soit contre différents virus de la même famille des Flaviviridiae ou Flavi-like et susceptibles d'affecter les mêmes populations. La présente invention est également relative à une composition apte à stimuler l'immunité d'individus susceptibles d'être affectés par le virus de la Dengue, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 3 polypeptides ou glycopeptides de l'invention. Une composition préférée sera celle contenant au moins un polypeptide de l'invention issu d'une protéine de la Dengue provenant de chacun des 4 sérotypes; la protéine E est un bon candidat elle a une fonction essentielle dans l'infectiosité virale et est l'intermédiaire entre le virus et les récepteurs celluiaires; la protéine E semble également être une cible essentielle de la réponse immunitaire protectrice dans les hôtes affectés dans la mesure où elle induit des anticorps neutralisants et une réponse immunocellulaire. Une composition de l'invention particulièrement avantageuse pourrait être un mélange de 3 ou 4 polypeptides ou glycopeptides décrits ci-dessus dont une partie est issue de la protéine E de chacun des 4 sérotypes, délétée d'une centaine d'acides aminés, à laquelle est greffé de façon covalente un résidu contenant 2 à 8 histidines, et de préférence de chacun des sérotypes connus du virus. Afin que la composition immunogène de l'invention soit efficace vis-à-vis des 3 ou 4 sérotypes en question ou plus si des nouveaux sérotypes étaient amenés à apparaître, chaque peptide ou glycopeptide y est présent dans une proportion de 10 à 50 % en poids par rapport à l'ensemble des peptides de la composition, et de préférence un pourcentage sensiblement égal pour chacun des peptides. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent également être constituées, d'un mélange de polypeptides issus de la protéine E, preM, NS1 ou NS3 et comportant au moins 3 antigènes de 3 sous-types du virus de la Dengue, chacun étant muni du résidu d'acides aminés à l'extrémité carboxy-terminale. De façon plus générale, I'invention porte sur des compositions immunogènes constituées d'un mélange de polypeptides ou glycopeptides issus de la protéine E, preM, NS1 ou NS3 du virus de la Dengue et comportant au moins 3 antigènes de 3 sérotypes de ce virus et plus généralement un antigène correspondant à chacun des sérotypes connus, ne comportant pas nécessairement le résidu d'acides aminés à leur extrémité carboxy-terminale, mais caractérisés en ce que chacun des peptides, polypeptides ou glycopeptides présente la capacité d'induire une réaction immunitaire chez l'hôte. La composition selon l'invention peut en outre contenir des polypeptides, glycopeptides ou protéines provenant d'autres flavivirus comme ceux de la fièvre jaune, de l'encéphalite japonaise, de l'encéphalite à tiques ou de l'hépatite C ou plus généralement d'autres Flaviviridiae des fièvres hémorragiques présents dans les zones tropicales d'Afrique, d'Asie ou d'Amérique, ainsi que le cas échéant issus d'autres antigènes viraux, bactériens ou parasitaires, à partir du moment où ils sont munis du résidu d'acides aminés tel que défini cidessus à leur extrémité carboxy-terminale. L'invention porte également sur les séquences d'acides nucléiques recombinants codant pour des peptides immunogènes des Flaviviridiae et notamment du virus de la Dengue, délétés en 3' de 210 à 315 bases, auxquels a été ajoutée en 3' une séquence codant pour 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, le tryptophane ou la cystéine dans le sens défini plus haut. Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention codent plus particulièrement pour des glycopeptides issus de la protéine E de la Dengue de sérotype 1, 2, 3 ou 4, et la séquence ajoutée en 3' code préférentiellement pour une séquence contenant 6 histidines. L'invention porte également sur des vecteurs d'acides nucléiques appropriés pour une utilisation dans l'expression de gènes exogènes chez un eucaryote ; ces vecteurs portent, outre une séquence d'acides nucléiques telle que décrite cidessus, une séquence signal homologue de celle de la protéine codée, I'ensemble étant sous la dépendance d'un promoteur susceptible d'être activé dans ladite cellule eucaryote. Un type de cellule eucaryote préféré est celui des cellules d'insectes et notamment les cellules de Spodoptera frugiperda SF 9. Le vecteur est un vecteur navette pVLd susceptible de réaliser une recombinaison homologue avec un baculovirus, et porteur, en amont de la séquence signal, d'un promoteur de gènes endogènes au baculovirus par exemple celui de la polyédrine. Les baculovirus recombinants peuvent être obtenus par différentes techniques connues de l'homme du métier mais une technique particulièrement avantageuse est celle de la recombinaison homologue en utilisant des vecteurs navettes entre E. Coli et le baculovirus. Des vecteurs d'expressions tels qu'obtenus par cette technique, et décrite plus en détails dans la partie expérimentale cidessous ont été déposés à la CNCM; il s'agit -d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1497, le 1 er décembre 1994 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n" 2 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines; -d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1624, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n" 4 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines;; -d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1625, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n" 3 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines; -d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1626, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n" 1 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines. L'invention porte également sur des compositions aptes à induire une réponse immunitaire, cellulaire ou humorale chez un hôte susceptible d'être infecté par le virus de la Dengue et comprenant un mélange d'acides nucléiques codant respectivement pour les polypeptides de l'invention, à savoir ceux issus de la protéine de la Dengue, telle la protéine E, preM, NS1 ou NS3, et portant à leur extrémité carboxyterminale un résidu de 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, la cystéine ou le tryptophane, ou plus généralement codant pour des polypeptides issus d'autres Flaviviridiae comme la fièvre jaune, I'encéphalite japonaise, encéphalite à tiques ou autres Flavi-like comme le virus de l'hépatite C.En effet, il a été montré que l'injection chez I'animal d'un plasmide contenant les séquences nécessaires à l'expression de protéines ou de polypeptides déclenche une réponse immunitaire cellulaire et humorale chez l'hôte permettant dans certains modèles animaux de protéger ces derniers contre une charge virale léthale; de tels résultats ont été décrits par J.A. Wolff et al. (1990), Science 247: 14651468 ou par E.F. Fynan et al (1993), DNA cell biol. 12: 785-789. Les compositions immunogènes comprenant de telles séquences d'acides nucléiques et les vaccins constitués de ces compositions, avec le cas échéant un adjuvant, font également partie de l'invention. L'invention est également relative à des vaccins sous-unités polyvalents contre le virus de la Dengue notamment contre les 4 sérotypes dudit virus et comprenant une composition immunogène telle que décrite ci-dessus, avec le cas échéant un adjuvant de vaccination qui peut être notamment un adjuvant porteur d'ions divalents ou trivalents tels l'hydroxide d'aluminium ou le phosphate de calcium ou encore un adjuvant de type adjuvant de Freund, un dérivé du muramylpeptide ou un iscom (Immunostimulating Complex), (19). L'effet immunogène des compositions de l'invention peut être la conséquence d'un captage des polypeptides ou glycoprotéines de l'invention par les ions divalents ou trivalents et la formation éventuelle de multimères qui présenteraient un pouvoir immunogène accru par rapport aux polypeptides issus de la Dengue et déjà décrit dans la littérature (références 3, 7, 8, 9). Les vaccins sous-unités de l'invention peuvent être également constitués de compositions aptes à induire une réaction immunogène contre d'autres Flaviviridiae. Ils peuvent être destinés à la prophylaxie ou la thérapie d'infection par une ou plusieurs espèces virales simultanément. Un vaccin polyvalent sous unités selon l'invention, et contenant de 1 à 4 glycopeptides ou polypeptides immunogènes de l'invention, le cas échéant associés à des glycopeptides immunogènes provenant d'autres flavivirus ou virus de fièvres hémorragiques, présente à la fois l'avantage de la polyvalence liée à l'effet immunogène du principe actif contre les différents sérotypes du virus et celui de l'innocuité totale. En effet, il existe actuellement des vaccins contre la Dengue à base des 4 sérotypes vivants atténués par passage successifs du virus en culture mais comme nous l'avons vu plus haut, ce vaccin présente parfois un risque pour des personnes immuno-déprimées ou des nouveaux-nés, et n'est pas toujours efficace contre les différents sérotypes et notamment sur les 4 sérotypes de la Dengue. II peut être également envisagé dans les vaccins de l'invention d'additionner les vaccins actuellement en expérimentation clinique d'1, 2, 3 ou 4 polypeptides selon l'invention. La description détaillée ci-après d'un mode de réalisation particulier utilisant la protéine E des sérotypes 1 à 4 (DEN1 à DEN4) illustre, sans être limitative, les propriétés structurelles et fonctionnelles des polypeptides, compositions polypeptidiques et vaccins de l'invention. La figure 1 représente le profil électrophorétique des polypeptides E recombinés DEN1 à DEN 4 secrétés dans le surnageant des cellules Sf9 infectées. Les protéines radioimmunoprécipitées ont été traitées par de l'endoglycosidase F (F) ou H (H) ou non traitées (O). I. Construction des baculovirus recombinants: 1" Préparation des fragments de gène codant pour la protéine d'enveloppe E des virus de la Dengue Les souches de virus de la Dengue ayant servi au clonage des gènes E sont inscrites dans le tableau 2 ci-dessous: tableau 2: VIRUS ORIGINE ANNEE TAILLE E (aa) native recombinée Dengue 1: Guyane 1989 485 395 FGA/89 Française Dengue 2: Jamaïque 1983 7 495 395 JAM/83 Dengue 3: Thaïlande 1988 493 393 Pah881 Dengue 4: Birmanie 1976 494 394 63632 2" Préparation des baculovirus recombinants exprimant les protéines tronquées du virus de la Dengue: La préparation des gènes de E a été réalisée par transcription réverse/réaction en chaîne par polymérase (RT/PCR) à partir des ARN extraits de cellules de moustiques Aedes pseudoscutellaris AP61 infectées par les différents virus. La taille en acides aminés attendue des protéines E délétées de 100 acides aminés à leur extrémité C-terminale (ex100) est indiquée dans la colonne de droite du tableau 2. L'amorce oligonucléotidique située en 5' du gène à amplifier possède un site de restriction (sauf pour la Dengue 2), le codon d'initiation ATG suivi des nucléotides codant pour les 6 premiers acides aminés parmi les 15 correspondant à la séquence signal de chaque protéine. L'amorce oligonucléotidique située en 3' du gène à amplifier possède la séquence correspondant à 6 acides aminés de la protéine E du virus suivie de 6 codons pour l'histidine, d'un codon stop et d'un site de restriction.La séquence des oligonucléotides est celle indiquée ci-dessous: Extrémité 5' (sens positif) Dengue 1; 5'CGGGATCCATGGGGATCATTTTCATTTTGCTGATG-3' Dengue 2: 5'-GGCCTTGATTTTCATCTTAC-3' Dengue 3: 5'-CGGGATCCATGGTGGTTATTTTTATACTATTAATG-3' Dengue 4: 5'-CGGGATCCATGACTGTCTTCTTTGTCCTAATG-3' Extrémité 3' (sens négatif) Dengue 1: 5'-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCnTCTTGAACCAGCTTAG-3' Dengue 2: 5'-GGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCTTTCTTAAACCAGTTG-3' Dengue 3: 5'-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCCTTCTTGTACCAGTTAAT-3' Dengue 4: 5'-CGGAGCTCAATGATAATGATAATGATACCCHTCCTGAACCAATGGAG-3' Les fragments amplifiés à partir d'ARN viral extrait de cellules d'Aedes pseudoscutellaris AP61 ont ensuite été clonés dans le vecteur navette pVL-poly (17). Dengue 1 Dengue 2 Dengue 3 Dengue 4 Sites de BamH1/ q BamHI/ BamHI/ coupure du Sacl Sacl Sacl fragment amplifié Sites de BamHI/ Smal/ BamH1/ BamHI/ coupure du Sacl Sacl Sacl Smal vecteur pVL poly D (1,2,3 ou 4)Eå100His6 correspond à la protéine E du sérotype 1, 2, 3, 4 délétée de 100 acides aminés à son extrémité carboxyle et à laquelle ont été ajoutés 6 résidus histidine. Les gènes codant pour les protéines D.(1 ,2,3 ou 4)EA100 His6 et leur séquence signal sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur de la polyédrine. Le nombre de nucléotides compris entre la fin du promoteur et le codon d'initiation est de 42 (Dengue 1, Dengue 3, Dengue 4) ou de 50 (Dengue 2) nucléodides. Les baculovirus recombinés Ac.D(1,2,3 ou 4)EA100His6 ont été obtenus par recombinaison homologue dans les cellules Spodoptera frugiperda Sf9 entre les vecteurs navettes pVL.D(1,2,3 ou 4)EA100His6 et le baculovirus AcRP23lacZ linéarisé au site unique Bsu361. Les baculovirus recombinés ont été sélectionnés par 3 clonages successifs par la méthode des plages. 3 Caractéristiques structurelles des protéines recombinées obtenues: La figure 1 montre le profil électrophorétique des 4 protéines recombinées correspondant aux virus de la Dengue 1, 2, 3 ou 4. Le profil des protéines traitées à l'endoglycosidase F ou H indique qu'elles sont toutes glycosylées, sans doute à un seul des deux sites de glycosylation car la différence de poids moléculaire n'excède pas 4000 daltons. II. ExPression et purification des protéines DE100His6: 1) Infection des cellules Sf9 : dix milliards de cellules Sf9 en suspension sont infectées par le baculovirus recombiné AcD(1,2,3 ou 4)EA100His6 à une multiplicité d'infection de 2 à 5. La durée de l'infection est d'une heure à 28"C. L'inoculum est ensuite retiré et les cellules sontincubées pendant 3 jours à 28"C dans 2 litres de milieu TC100 (GIBCO) sans sérum de veau foetal. 2) Préparation des surnageants de cellules infectées: 2 litres de surnageant de culture cellulaire sont récupérés 3 jours après I'infection, centrifugés à 2500 rpm à 4"C pendant 30 minutes. Le surnageant est additionné de 400 g/litre d'acétate d'ammonium sous agitation entre 3 et 14 heures à 4"C. Le précipité est centrifugé à 10.000 rpm pendant 20 minutes à 4"C et redissous dans 1/20sème du volume initial (100 ml) de tampon chromatographie (0,5M NaCI; 20mM Tris-HCI pH 7,9) contenant de l'aprotinine à une concentration finale de 20pg/ml et du phenyl methyl sulfonyl fluoride à 1 mM final. Le surnageant concentré est ensuite dialysé deux fois contre 100 volumes de tampon de chromatographie. 3) Chromatographie: le milieu dialysé est additionné d'imidazole 5mM final puis incubé 30min (sous agitation douce) à température du laboratoire en présence de 5 ml de résine TALON (Clontech). La résine est lavée trois fois avec 30 ml de tampon de chromatographie contenant de l'imidazole à 1 0mM. La résine est ensuite placée dans une colonne, lavée avec 10 volumes de tampon de chromatographie, et la protéine est éluée avec 10 ml de tampon de chromatographie contenant de l'imidazole à 50mM. Des fractions de 1 ml sont récupérées avec un collecteur de fractions. Une deuxième élution est pratiquée à l'aide de tampon de chromatographie contenant de l'imidazole à 100 mM.Les fractions contenant la protéine E recombinée sont déterminées par dot-blot à l'aide d'anticorps de souris anti-E et de conjugué anti-souris couplé à la phosphatase alcaline, ou à l'aide de conjugué Ni-NTA couplé à la phosphatase alcaline (Qiagen). 4) Contrôle de purification: Un aliquote de chaque fraction est déposé sur gel de polyacrylamide. La présence de la protéine d'intérêt est vérifiée par Western-blot et après coloration au nitrate d'argent. immunogènes: Les protéines virales à concentration de 5z9 de protéine pure sont mélangées à 100 Klg d'hydroxyde d'aluminium (Alugel-S, Serva) et inoculées à des souris SWISS par voie intrapéritonéale. Les souches virales de Dengue ayant servi à l'immunisation sont titrées sur cellules AP61 (détection des foyers par immunocytochimie) et inoculées à raison de 103 particules formant plage (PFU) par souris. L'antigène contrôle injecté aux souris correspond à un peptide contenant les trois derniers acides aminés de la protéine E (KKG) suivis de six histidines (KKG His6). L'inoculum de chaque injection contient 100 9 de peptide mélangé à de l'Alu-gel. Calcul de la dose d'épreuve: I'activité létale des virus de la Dengue pour le souriceau de 5 jours est analysée par inoculation intracérébrale de 0,02 ml de suspension virale à différentes dilutions. La dose létale tuant 50 % des souris (DL50) est calculée par la méthode de Reed et Muench. Immunisation des souris: Les souris de trois semaines sont vaccinées par une injection intrapéritonéale d'un mélange de produits correspondant aux 4 sérotypes de Dengue (DEA100His6 ou virus) à 3 semaines, 4 semaines et 6 semaines, puis saignées individuellement une semaine après la dernière injection. Le peptide vaccinant du contrôle négatif est identique pour les 4 sérotypes. Les anticorps neutralisants de ces sérums sont titrés vis-à-vis de chaque virus homologue. Les sérums servent aussi au test de protection après transfert passif au souriceau. Test de neutralisation: Les anticorps des souris vaccinées sont titrés par séroneutralisation dans des plaques 24 cupules en présende de 50 PFU de virus homologue sur des cellules Vero. Le titre d'anticorps neutralisants correspond à la dilution neutralisant 80 % des foyers de virus détectés par immunocytochimie à l'aide d'anticorps antiprotéines virales et de conjugué anti-lgG de souris marqué à la peroxidase. Test de protection des souriceaux:100 DL50 de virus sont inoculées à des groupes de souriceaux de 5 jours ayant reçu la veille une injection intrapéritonéale de 0,05 ml de sérum de souris immunisées (transfert passif). Chaque groupe de souriceaux du transfert passif est soumis à une dose d'épreuve par un des 4 sérotypes de virus. Les souris sont observées pendant 3 semaines et les signes de paralysie ou la mort sont notés. Résultats: Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 cidessous. Ce tableau rassemble les résultats obtenus quant au titre d'anticorps neutralisant d'une part et quant au pourcentage de souriceaux survivants après un challenge par des virus virulents selon les conditions décrites ci-dessus. Pour chacun des sérotypes sont comparés les résultats obtenus avec les peptides de l'invention comprenant le résidu histidine avec les virus vivants, et avec les peptidesKKG His6 comprenant le résidu histidine, et ce aux doses respectives d'antigènes de 5p9 103 Pfu et 100 p9. Le titre de neutralisation a été mesuré sur des sérums prélevés à 7 semaines après les 3 injections d'antigène. Le titre de neutralisation correspond à l'inverse de la dilution de sérum conduisant à une réduction de 80 % des unités formant foyers (UFF) de la souche de virus homologue sur cellules VERO. Les virus homologues ont été utilisés pour le test de neutralisation et de challenge. Les souris ont été immunisées par le mélange tétravalent dans les 3 cas de figures. tableau 3: Mélange des DEA100His6 Virus Peptide 4 sérotypes: KKG H6 quantité d'antigènes; (5 clg) (103 PFU) (100 cul9) Sérotype: D1 D2 D3 D4 D1 D2 D3 D4 Dl D2 D3 D4 Anticorps neutralisants 200 800 100 400 800 800 200 400 chez la souris vaccinée %souriceauxsurvivants 80 90 80 90 90 100 90100 0 20 0 10 postchal lenge Ces résultats indiquent que la formulation contenant les 4 protéines recombinées induit des anticorps neutralisant dirigés contre les 4 sérotypes de virus. Ce mélange peut donc constituer la base d'une composition ou d'un principe actif d'un vaccin sous unités polyvalent contre la Dengue. Le titre élevé d'anticorps neutralisants produits après 3 injections de 5 g de protéines est remarquable. Aucune des protéines recombinées produites précédemment sans histidine n'avait abouti à l'induction de titres aussi élevés d'anticorps neutralisants. Deux hypothèses sont avancées pour expliquer ces résultats : soit la purification imparfaite des protéines précédentes contenait des constituants immunosuppresseurs, soit la séquence de 6 histidines contenue dans les protéines actuelles en présence de particules formées d'ions divalents ou trivalents lui confère une présentation spatiale multimérique et en conséquence des propriétés immunogènes particulières. REFERENCES (1)V. Deubel, R.M. Kinney, D.W. Trent (1986). Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype. Virology, 155: 365-377. (2) (Mason P.W., McAda P.C., Mason T.L., Fournier M.J. (1987). Virology 161: 262-267. (3) OSATOMI K. et al. (1990). Virology 176: 643 647. (4) Zhao B. et al. (1986). Cloning full cength Dengue type 4 virol DNA sequences : analysis of genes coding for structural proteins. Virology, 155: 77-88. (5) Putnak R. et al (1991). Dengue 1 virus envelop glycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicits virusneutralizing antiboding in mice and products them from virus challenge Am. J. trop. Med. thig., 45:159-167. (6)Y.M. Zhang, E.P. Hayes, T.C. McCarty, D.R. Dubois, P.L. Summers, K.H. Eckels, R.M. Chanock, C.J. Lai (1988). Immunization of mice with Dengue structural proteins and nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistance to Dengue virus encephalitis. J. Virol., 62: 3027-3031. (7) Deubel V. et al. (1991). Processing secretion and immunoreactivity of carboxyterminally truncated Dengue 2 enveloppe proteins expressed in insect celas by recombinant baculoviruses. Virology 180: 442447. (8) R. Feighny, J. Burrous, R. Putnak (1994). Dengue type 2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg., 50: 322-328. (9) C. Delenda, M.P. Frenkiel, V. Deubel (1994). Protective efficacy in mice of a secreted form of recombinant Dengue-2 virus envelope protein produced in baculovirus infected insect cells. Arch. Virol., 139:197-207. (10) C. Delenda, I. Staropoli, M.P. Frenkiel, L. Cabanié, V. Deubel (1994). Analysis of C. terminally truncated Dengue 2 and Dengue 3 virus envelope glycoproteins: processing in insect cells and immunogenic properties in mice. J. Gen. Virol., 75; 1569-1578. (11) R. Men, M. Bray, C.J. Lai (1991). Carboxy-terminally truncated Dengue virus envelope glycoproteins expressed on the cell surface and secreted extracellularly exhibit increased immunogenicity in mice. J. Virol., 65, :1400-1407. (12) Nikolow D.B. et au (1992). Nature 360 4046. (13) Maina E. et ai. (1988). A vector to express and punfy foreign proteins in E. Coli by fusion to, and separation from, maltose binging protein. Gene 74.. 365373. (14) Moks T et al. (1987). Biotechnology 5 379-382. (15) HOCHULI E. et ai. (1987). J. chromatography 411:177- 184 (16) J. Schmitt, H. Hess, H.G. Stunnenberg. Affinity purification of histidine-tagged proteins. Mol. Biol. Reports, 18 : 223-230 (17) Flamand M. et al. (1992). Expression and secretion of Japanese encephalites virus nonstructural protein NS1 by insect cells using a recombinant baculovirus Virology 191: 826-836. (18) Brevet européen n" 0 318 216. (19) Morein B. (1987). Potentiation of immune response by immunization with antigens in defined multimeric physical forms. Vet. Immunol. Immunopathol. 17:153-159. REVENDICATIONS 1. Polypeptide ou glycopeptide immunogène caractérisé en ce qu'il est constitué d'un polypeptide ou glycoprotéine issu d'un Flaviviridiae notamment de la protéine E, ou preM, ou NS1 ou NS3 du virus de la Dengue, ledit polypeptide portant à son extrémité carboxylée un résidu de 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, le tryptophane ou la cystéine. 2. Polypeptide ou glycopeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le glycopeptide est constitué de la protéine d'enveloppe E délétée de 70 à 105 acides aminés à son extrémité carboxylée. 3. Polypeptide ou glycopeptide selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le séquence à l'extrémité carboxylée est constituée d'un résidu de 6 histidines lui conférant ainsi la propriété de se fixer sur des cations divalents ou trivalents. 4. Composition apte à stimuler l'immunité d'individus susceptibles d'être infectés par le virus de la Dengue caractérisée en ce qu'elle contient au moins un polypeptide ou glycopeptide selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que le glycopeptide est issu de la glycoprotéine E du virus de la Dengue. 6. Composition selon les revendications 4 ou 5 caractérisée en ce que les polypeptides ou glycopeptides sont un mélange d'au moins 3 polypeptides selon l'une des revendications 1 à 3 issus de au moins 3 sérotypes du virus de la Dengue, et de préférence de chacun des sérotypes connus. 7. Composition selon les revendications 4 à 6 constituée de polypeptides ou glycopeptides issus de la protéine E ou preM ou NS1 ou NS3 du virus de la Dengue, et de préférence la protéine E. 8. Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que chaque peptide est présent dans une proportion de 10 à 50 % en poids par rapport à l'ensemble des peptides de ladite composition. 9. Composition selon l'une des revendications 4 à 8 caractérisée en ce qu'elle contient en outre des polypeptides, glycopeptides ou protéines provenant d'autres flavivirus comme la fièvre jaune ou l'encéphalite japonaise, ou l'hépatite C. 10. Composition, selon l'une des revendications 4 à 8 caractérisée en ce qu'elle contient en outre des antigènes viraux, bactériens ou parasitaires portant à leur extrémité carboxy-terminale un résidu de 2 à 8 acides aminés choisis par l'histidine, le tryptophane et la cystéine. 11. Séquence d'acides nucléiques constituée d'une séquence codant pour une protéine du virus de la Dengue, délétée en 3' de 210 à 315 bases, auxquelles a été ajoutée en 3' une séquence codant pour 2 à 8 acides aminés choisis parmi l'histidine, le tryptophane ou la cystéine. 12. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 11 caractérisée en ce que la séquence code pour une protéine E de la Dengue de sérotype 1, 2, 3 ou 4. 13. Séquence d'acides nucléiques selon les revendications Il ou 12 caractérisée en ce que la séquence en 3' code pour 6 histidines. 14. Vecteur d'acides nucléiques approprié pour une utilisation dans l'expression de gènes exogènes chez un eucaryote, caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 11 à 13, pourvue en 5' d'une séquence signal homologue de celle de la protéine codée par ladite séquence, l'ensemble étant sous la dépendance d'un promoteur susceptible d'être activé dans ladite cellule eucaryote. 15. Vecteur d'expression selon la revendication 14 caractérisé en ce que la cellule eucaryote est une cellule d'insecte notamment de Spodoptera frugiperda SF9, le vecteur est un vecteur navette susceptible de réaliser une recombinaison homologue avec un baculovirus, et porteur, en amont de la séquence signal, d'un promoteur d'un gène endogène au baculovirus notamment celui de la polyédrine, 16. Vecteur d'expression selon les revendications 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1497, le 1er décembre 1994 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n 2 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines. 17. Vecteur d'expression selon les revendications 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1624, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n 4 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines. 18. Vecteur d'expression selon les revendications 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1625, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n 3 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines. 19. Vecteur d'expression selon les revendications 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un baculovirus recombinant déposé à la CNCM sous le numéro 1-1626, le 11 octobre 1995 et porteur d'une séquence codant pour un peptide constitué du gène E du virus de la Dengue sérotype n 1 dans laquelle l'extrémité COOH a été délétée de 100 acides aminés et substituée par 6 histidines. 20. Composition apte à induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale chez un hôte susceptible d'être infecté par le virus de la Dengue caractérisée en ce qu'elle contient un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3. 21. Procédé de préparation d'un polypeptide ou d'un glycopeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de chromatographie par affinité sur un support présentant une affinité pour la séquence de 2 à 8 acides aminés. 22. Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que le support est une colonne contenant des ions divalents ou trivalents notamment du nickel, du cuivre, du cobalt ou du zinc présentant une affinité pour l'histidine, le tryptophane ou la cystéine riches en électrons. 23. Vaccin polyvalent contre le virus de la Dengue caractérisé en ce qu'il comprend une composition immunogène selon l'une des revendications 4 à 10 et 20, avec le cas échéant un adjuvant de vaccination qui peut être notamment un adjuvant porteur d'ions divalents ou trivalents tels l'hydroxide d'aluminium ou du phosphate de calcium, ou un adjuvant de type adjuvant de Freund, ou un dérivé du muramylpeptide ou un iscom. 24. Vaccin polyvalent selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il contient en outre des polypeptides ou glycopeptides immunogènes provenant d'autres flavivirus comme la fièvre jaune ou l'encéphalite japonaise, ou l'encéphalite à tiques ou l'hépatite C. 25. Vaccin polyvalent selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il contient 4 peptipes ou glycopeptides correspondant à chacun des sérotypes du virus de la Dengue avec un adjuvant contenant des ions divalents ou trivalents. 26. Vaccin polyvalent selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il contient 1, 2 ou 3 peptides ou polypeptides selon la revendication 1 à 3 et des virus atténués. 27. Vaccin polyvalent selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il contient outre les polypeptides selon l'une des revendications 1 à 3, un ou plusieurs antigènes virales, bactériens ou parasitaires. 28. Vaccin polyvalent caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'acides nucléiques porteurs de séquences codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3. 29. Composition antigènique constituée de polypeptides ou glycopeptides issus de la protéine E, preM, NS1 ou NS3 du virus de la dengue, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 3 antigènes de 3 sérotypes différents de ce virus, et de préférence un antigène pour chacun des 4 sérotypes.