Brevet FR2736652A1 — publié le 19970117

LEVURES ET BACTÉRIES TRANSFORMÉES POUR OPÉRER LA FERMENTATION MALOLACTIQUE DANS LES VINS L'objet de la présente invention est relatif à des souches de bactéries ou de levures transformées de manière à opérer la fermentation malolactique dans les vins. La fermentation malolactique fait suite à la fermentation alcoolique réalisée par les levures Saccharomyces cerevisiae dans la production de différents types de vins. Cette fermentation correspond à la décarboxylation en une seule étape du L-malate en L-lactate et CO2. Elle a pour conséquences une diminution de l'acidité du vin, de favoriser la stabilité microbienne par épuisement des substrats et en général d'améliorer la qualité organoleptique du vin, bien que dans certains cas, cette fermentation bactérienne associée se révèle néfaste en raison des autres métabolites qu'elle produit. Les bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus et Lactococcus sont capables de réaliser cette fermentation. Toutefois en milieu vin, l'espèce Leuconostoc oenos est la mieux représentée en raison de ses propriétés physiologiques telles que son caractère acidophile et sa résistance à de fortes concentrations d'éthanol. L'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos présente donc un intérêt tout particulier comparé aux enzymes malolactiques des bactéries lactiques de niches écologiques différentes et moins acidophiles comme par exemple Lactococcus. Par opposition à la fermentation alcoolique qui est maîtrisée, l'initiation de la fermentation malolactique est une étape mal contrôlée en vinification. Lorsque cette fermentation est désirée, un ensemencement à l'aide de bactéries sélectionnées s'avère nécessaire. Cependant ce processus, qui n'est pas toujours efficace, est relativement coûteux et nécessite une période d'adaptation complexe et longue du ferment au milieu vin. L'enzyme malolactique a été purifiée à partir des souches de Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc oenos, Lactobacillus plantarum et Lactococcus lactis. Il s'agit d'une protéine multimérique constituée de deux ou quatre sous-unités de 60 à 70 kDa. La réaction enzymatique nécessite du NAD et du Mn2+ et comprend un stade de décarboxylation du L-malate en pyruvate avec réduction du NAD et ensuite la transformation du pyruvate en L-lactate avec réoxydation du NADH en NAD. Chez Leuconostoc oenos, l'enzyme malolactique a un poids moléculaire apparent de 60 kDa et un point isoélectrique égal à 4,8. Le pH optimal de l'enzyme se situe aux alentours de 5,5. Ces propriétés physico-chimiques montrent que cette enzyme est tout à fait adaptée aux conditions de croissance des microorganismes à pH acide.En effet, il a été montré que le pH interne, dans les conditions physico-chimiques du vin des levures oenologiques de l'espèce Saccharomyces cerevisiae et de la bactérie Leuconostoc oenos avoisine une valeur de 5,6. La construction d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae capable de réaliser les deux fermentations : la fermentation alcoolique et la fermentation malolactique, est un objectif ancien de la recherche. On peut citer à cet égard - le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 4 472 502. Les inventeurs ont isolé le gène malolactique de Lactobacillus delbrueckii et l'ont cloné dans une levure Saccharomyces cerevisiae. Celle-ci ensemencée dans un jus de raisin a transformé 1,5 % de l'acide L-malique présent en acide L-lactique, transformation insuffisante pour avoir un intérêt pratique. - les demandes de brevet français n" 93 06003 et 93 06478. Les inventeurs ont isolé et séquencé le gène malolactique de Lactococcus lactis et l'ont cloné dans une levure Saccharomyces cerevisiae, les résultats obtenus conduisaient toujours à une transformation faible et insuffisante de l'acide malique. Jusqu'à maintenant, tous les essais d'isolation et de clonage du gène malolactique de Leuconostoc oenos, la bactérie lactique qui opère normalement la fermentation malolactique dans les vins, avaient échoué. L'échec de ces travaux est notamment relaté dans "Cloning of malic acid assimilating activity from Leuconostoc oenos in Escherichia coli A. Lautensach and R.E. Subden, Microbios 1984, 39, 29-39. Jusqu'à maintenant, à notre connaissance, aucun gène de Leuconostoc oenos codant pour une protéine d'intérêt biotechnologique n'avait été cloné et séquencé. Un des objets de l'invention est le clonage et l'expression du gène malolactique de Leuconostoc oenos. Un autre objet est son expression dans des souches de Saccharomyces cerevisiae susceptibles de dégrader au moins 80 % et de préférence au moins 90 % de l'acide malique présent. Un autre objet de l'invention est l'expression de ce gène dans des bactéries lactiques, ou d'autres bactéries résistant à l'alcool et ne présentant pas les inconvénients des bactéries lactiques en vinification, ou encore la surexpression de ce gène dans Leuconostoc oenos. Une description plus détaillée de l'invention est la suivante. L'isolement du gène malolactique et de la malateperméase associée a été réalisé à partir de la souche de Leuconostoc oenos Lo 84-13 (Institut d'Oenologie de Bordeaux). Il sera fait référence dans ce qui suit aux tableaux et aux figures dans lesquels - le tableau 1 (annexe 1) indique les souches de microorganismes et les plasmides utilisés. - le tableau 2 (annexe 2) donne l'activité malolactique spécifique, en mg de L-lactate formé par mg de protéine, trouvée dans la fraction protéique de minicellules d'E. coli AR 1062 après précipitation à 60 % de sulfate d'ammonium pour 15, 30 et 60 minutes d'incubation pJF119EH : minicellules transformées avec le plasmide vide pJFED6 : minicellules portant le gène MLEA de Leuconostoc oenos. - le tableau 3 (annexe 3) donne l'activité malolactique de la souche de Saccharomyces cerevisiae RH 100-4 transformée avec le plasmide vide pYeDP1/8-2 et le plasmide pYMLEA portant le gène MLEA de Leuconostoc oenos. - la figure 1 décrit la carte de restriction des fragments d'ADN de Leuconostoc oenos Lo 84.13 insérés dans pJ6D5 (insert de 5,5 kb) et pJ2C3 (insert de 3 kb) couvrant une région de 3001 pb portant le gène de structure MLEA de l'enzyme malolactique et le gène de structure MLEP de la perméase de l'acide malique (malate perméase). - la figure 2 représente la séquence nucléotidique SEQ ID n01 de 3001 pb ainsi que la séquence polypeptidique déduite de cette séquence nucléotidique, de la région d'ADN de la souche Lo 84.13 de Leuconostoc oenos portant le gène de structure MLEA de l'enzyme malolactique et le gène de structure MLEP de la malate perméase. - la figure 3 est un profil électrophorétique de protéines radiomarquées au 35S synthétisées dans les minicellules d'E.coli AR 1062 contenant pJF119EH (piste 1), pJFED6 en absence (piste 2) ou en présence d'ITPG (piste 3) ou pJFHD6 en absence (piste 4) ou en présence dITPG (piste 5).Le produit du gène MLEA est indiqué par une flèche. La forme mature et les précurseurs de la ss-lactamase et le produit d'expression du gène lacis sont également indiqués. Les nombres à gauche représentent les poids moléculaires standard. - la figure 4 est un profil électrophorétique de protéines radiomarquées au 35s, synthétisées dans les minicellules d'E.coli AR 1062 contenant pJF119HE (piste 1) et pJFHC3 portant MLEP : sur protéines totales en absence dITPG (piste 2), et en présence d'ITPG sur protéines totales (piste 3), sur protéines périplasmiques (piste 4), sur protéines cytoplasmiques (piste 5) et sur protéines membranaires (piste 6). Le produit du gène MLEP est indiqué par une flèche. La forme mature et les précurseurs de la ss-lactamase et le produit d'expression du gène lacis sont également indiqués. Les nombres à droite représentent les poids moléculaires standard. - la figure 5 montre la cinétique d'entrée en fonction du temps du L-malate en nanomoles/mg de protéines dans des minicellules d'E.coli AR 1062 transformées avec le plasmide vide pJF119HE (carré noir) et le plasmide pJFHC3 portant MLEP (losange noir). Les cinétiques ont été menées en présence de valinomycine 4M. Les travaux de recherche ont abouti à l'obtention d'un fragment d'ADN de 3001 pb portant le gène de structure MLEA de l'enzyme malolactique et le gène de structure MLEP de la malate perméase. La partie codante du MLEA comporte 1626 nucléotides et code pour un polypeptide de 542 acides aminés. La partie codante du gène MLEP comporte 942 nucléotides et code pour un polypeptide de 314 acides aminés. L'invention concerne d'une part toute fraction de l'acide nucléique précédent dont la séquence est modifiée, dès lors que le polypeptide codé par cette fraction d'acide nucléique présente au moins une activité enzymatique malolactique ou une activité malate perméase, ces séquences modifiées étant reconnaissables par le fait qu'elles sont capables de s'hybrider en conditions stringentes avec tout ou partie de l'ADN SEQ ID n01, ces conditions stringentes correspondant de préférence à la recherche d'une homologie d'au moins 80 %. De telles modifications, de manière non limitative, conduisent par exemple à des acides nucléiques variants qui se distinguent de l'acide nucléique de l'invention par addition et/ou suppression d'un ou de plusieurs nucléotides et/ou modifications d'un ou plusieurs nucléotides. Toutes utilisations de la région promotrice ou d'une partie de celle-ci en vue d'exprimer un polypeptide chez les bactéries comme par exemple les bactéries lactiques des genre Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus et Lactococcus, ou d'autres bactéries alimentaires ou GRAS (Generally Recognised As Safe), notamment les espèces Bacillus subtilis et Escherichia coli GRAS (ex. Escherichia coli K12) entrent dans le cadre de cette invention. L'invention a aussi pour objet toute séquence de polypeptide issue au moins partiellement de la séquence du polypeptide originel, dès lors que la protéine modifiée possède au moins une propriété enzymatique malolactique ou malate perméase. De manière non limitative, des polypeptides entrant dans le cadre de l'invention peuvent se distinguer de ceux définis dans la figure 2 par addition et/ou suppression d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, par exemple par les procédés consistant - à traiter le polypeptide originel avec une protéase clivant le polypeptide au niveau de sites précis. - à modifier le gène de structure par les outils de génie génétique (par exemple enzymes de restriction) afin d'obtenir un polypeptide tronqué. L'invention a aussi pour objet tout acide nucléique recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique du type sus-indiqué codant pour l'enzyme malolactique associée et/ou la malate perméase associée avec au moins un promoteur et/ou un terminateur de transcription reconnu par les polymérases de l'hôte dans laquelle ledit acide nucléique recombinant est introduit. L'acide nucléique peut être maintenu sur un vecteur permettant l'expression de l'enzyme ou être introduit directement dans le génome par des techniques de génie génétique. Les microorganismes hôtes dans lesquels l'acide nucléique recombinant est susceptible d'être introduit sont préférentiellement des cellules procaryotes appartenant aux genres Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bacillus ou Escherichia, mais peuvent être aussi des eucaryotes comme les levures. Tout particulièrement, l'utilisation d'un ferment composé de microorganismes, dans lesquels a été introduit un acide nucléique tel que défini ci-dessus en vue de réaliser la fermentation malolactique dans des produits agro-alimentaires et notamment les boissons fermentées, fait partie de l'invention. L'objet principal de l'invention est l'expression du gène de structure de l'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos dans des souches de Saccharomyces cerevisiae transformées ou non pour lesquelles l'entrée de l'acide malique dans la cellule n'est pas un facteur limitant à la transformation de l'acide malique présent en acide lactique. De telles souches sont par exemple - de préférence des souches de Saccharomyces cerevisiae dans lesquelles a été cloné et s'exprime au moins un gène codant pour une malate perméase, comme par exemple le gène codant pour la malate perméase de Schizosaccharomyces pombe ou d'autres espèces de levures performantes dans l'utilisation du malate. On peut citer comme autre gène codant pour une malate perméase celui de Leuconostoc oenos qui est un des objets de l'invention. Ces transformations supposent que ces gènes de structure ont été mis sous promoteur fort de Saccharomyces cerevisiae comme par exemple les promoteurs PGK ou ADH1, et éventuellement en cas de transformation par un ou des gènes de bactéries lactiques, que ceux-ci aient été associés ou fusionnés avec une séquence signal dirigeant le produit d'expression vers les membranes ou avec un gène codant pour une protéine membranaire - ou encore des souches de Saccharomyces cerevisiae présentant un transport du malate soit par diffusion facilitée (mutant de perméation) soit du fait qu'elles possèdent des perméases d'acides organiques peu spécifiques.De telles souches peuvent être sélectionnées parmi les souches de Saccharomyces cerevisiae dites "démaliquantes" capables de transformer une grande partie de l'acide malique en alcool, souches qui sont en général trop déacidifiantes pour l'élaboration des vins. De préférence, toutes les transformations seront faites par intégration de l'ADN recombinant codant pour les propriétés ajoutées et strictement limitées à cet ADN en absence de tout gène marqueur hétérologue. L'invention concerne donc spécifiquement des souches de Saccharomyces cerevisiae transformées pour exprimer à la fois au moins un gène codant pour une malate perméase et au moins un gène codant pour l'enzyme malolactique. L'invention vise également des bactéries transformées pour exprimer à la fois ces 2 types de gènes. De plus l'invention concerne aussi l'exploitation de l'acide nucléique défini ci-dessus en vue d'une production de l'enzyme malolactique par un quelconque procédé biotechnologique à un niveau industriel. L'invention pourra être mieux comprise à laide des exemples suivants qui ne sont pas limitatifs. EXEMPLE l : Isolement, sXquençage et identification des gènes MLEA et MLEP de Leuconostoc oenos 1) Matériel et méthodes a) Souches et plasmides utilisés Les souches de microorganismes et les plasmides utilisés pour le clonage des gènes sont donnés dans le tableau 1. La souche Leuconostoc oenos Lo 84-13 a été cultivée à 30"C sur un milieu FT80 modifié (Extrait de viande 5g/l; Extrait de levure 4g/l; KH2PO 0,6 g/l; KCl 0,45 g/l; CaCl2,2H2O 0,13 g/l; MgSO4,7H2O 0,13 g/l; MnSO4,H2O 0,003 g/l; Tween 80 1 ml; Acide malique 10 g/l; D-fructose 4 g/l et D-glucose 1 g/l). Escherichia coli TGI (Gibson, T.J., PD Thesis, Cambridge University 1984) et AR 1062 (D'Enfert et al, Embo J. 1987, 6, 3531-8) ont été cultivés sur milieu Luria-Bertani (LB) ou sur milieu minimum M9 à 370C. Si nécessaire, de l'ampicilline (50 pg/ml) ou de lérythromycine (200 pg/ml) sont ajoutés dans les cultures d'E.coli. La souche de levure RH100-4 (Nuoffer et al., Mol. Cell. Biol. 1991, 11, 27-37) a été cultivée sur milieu YPD ou YPG (1 % d'extrait de levure, 2 % en bacto-peptone, 2 % glucose ou galactose) à 30"C ou sur milieu semi-synthétique (0,67 % "yeast nitrogen base" Difco sans acides aminés, 2 % glucose ou galactose). b) Clonage moléculaire et manipulation d'ADN Les plasmides et l'ADN chromosomique ont été préparés selon les techniques connues (Maniatis et al., Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982). La transformation des cellules d'E.coli a été réalisée selon une procédure standard au TSB (Chung et Miller, Nucleic acids res., 1988, 16, 3580). La méthode utilisée pour la transformation de la levure est celle à l'acétate de lithium décrite par Gietz et Schiestl, (Yeast 1991, 7, 253-263). Les southern blots, les hybridations d'ADN et d'une façon générale, toutes les autres techniques de Biologie Moléculaire (PCR, analyse de restriction) ont été réalisées comme décrit par Maniatis et al. (ibid). c) Détermination de la séquence d'ADN Les clones d'E.coli XL1 blue (Bullock et al, Biotechniques, 1987, 15, 376) mis en oeuvre pour le séquençage ont été obtenus par sous-clonage de fragments d'ADN dans les plasmides de la famille pBluescript. Les acides nucléiques double brin ont été purifiés à l'aide du Kit Qiagen - Tip 100 (Diagen) et dénaturés pendant 4 minutes par chauffage à 100"C puis rapidement refroidis dans l'azote liquide pendant 45 secondes. Les réactions de séquence ont été réalisées selon la méthode de Sanger avec le Kit de séquençage T7 de Pharmacia. Les séquences nucléotidiques ont été déterminées sur les deux brins. 2) Isolement des fragments d'AD1 portant le gène de structure de l'enzyme malolactique et le gène de structure de la malate perméase a) Construction de la banque génomique de Leuconostoc oenos et criblage de la banque L'ADN total de Leuconostoc oenos a été partiellement digéré avec l'endonucléase Sau3A et séparé selon la taille sur gradient de saccharose 10-40 %. Les fractions contenant les fragments d'ADN de 5 à 10 kb ont été identifiées sur gel d'électrophorèse 0,6 % et utilisés pour construire la banque génomique. Le vecteur pJDC9 (Chen et Morrisson, Gene, 1988, 64, 155-64) a été digéré par BamH1 et déphosphorylé au moyen de la phosphatase alcaline bovine (Boehringer). Le vecteur et l'ADN génomique hydrolysé par BamH1 ont été ligaturés selon un rapport molaire insert-vecteur d'approximativement 3:1. Le mélange ligaturé a été utilisé pour transformer Escherichia coli TGI. Les clones de la banque (2990 clones) ont été cultivés sur membranes de nylon placés sur boîte de Pétri à 370c pendant une nuit. Les filtres portant les colonies sont traités pour lyser les cellules et l'ADN est dénaturé et fixé à la membrane selon le protocole suivant: - Lyse avec SDS 10 % - Dénaturation avec NaOH 0,5M; NaCl 1,5 M; 5 minutes - Neutralisation avec 0,2 M Tris pH 7.5, 2 x SSC 2 fois 15 minutes - Digestion à la protéinase K, 100 pg/ml 15 minutes à 370C - Fixation de l'ADN 2 h à 80-850C Le marquage de la sonde, les étapes d'hybridation, de détection et de révélation sont réalisés avec le Kit DIG de marquage et de détection de Boehringer selon le protocole standard préconisé par le fournisseur. b) Amplification par PCR et clonage des gènes de structure de l'enzyme malolactique et de la malate perméase Deux amorces oligonucléotidiques dégénérées ont été synthétisées à partir de deux régions très conservées présentes dans la séquence de protéines enzymatiques utilisant le NADH comme facteur et utilisant l'acide malique comme substrat. La première région de séquence Ile-Leu-Gly-X-Gly-Asp-Y-Gly (où X = Ile ou leu et Y = Trp, Gln ou leu) correspond au site d'attache du NAD à la protéine enzymatique. La seconde région correspond à une séquence d'acides aminés (Phe-Asn-Asp-Asp-Ile-Gln-Gly-Thr) très conservée de fonction non encore connue trouvée dans la famille des enzymes maliques (malate déshydrogénase). Les deux amorces ont été utilisées pour amplifier un fragment du gène de l'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos à partir de l'ADN total isolé de cette souche ; la taille du fragment amplifié est de 324 paires de bases. Les deux amorces (SEQ ID n"2 et SEQ ID n03) de 24 acides nucléiques de séquence suivante ont été employées - SEQ ID n02 : 5'-ATHYTNGGNATHGGNGAYTGGGGN-3' correspondant à la première région conservée - SEQ ID n"3 : 5'-NGTNCCYTGDATRTCRTCRTTRAA-3' correspondant à la seconde région conservée dans ces séquences, R = A ou G ; Y = C ou T ; H = A, T ou C ; N = A, G, C ou T. L'amplification a été réalisée comme suit Amorce SEQ ID n02 1,3 pl (20 pmoles) Amorce SEQ ID n"3 1,4 p1 (20 pmoles) Taq Buffer 10 x (Eurogentec) 10 pl Taq (Eurogentec) 0,5 pl (5 U/pl) dNTP (4 mM) 5 pl ADN Leuconostoc oenos 5 pl (50 ng) H2O 57 pl MgCl2 25 (mM) 8 pl (2 mM) Conditions d'amplification : 40 secondes à 92"C, 1 min à 37"C, 1 min à 72"C pendant 35 cycles, sur amplificateur Hybaid Omnigène. Le produit d'amplification est analysé sur gel d'agarose 1,2 % et la bande correspondante (324 pb) prélevée et purifiée par le Kit Prep A (Biorad). Après remplissage des extrémités à la Klenow (BRL), le fragment amplifié a été dans un premier temps ligaturé au site SmaI du plasmide pBluescript et séquencé pour contrôle. Ce fragment interne du gène de l'enzyme malolactique a été utilisé comme sonde pour la recherche du gène complet dans la banque génomique réalisée chez Escherichia coli. Des expériences d'hybridation sur colonies ont permis de mettre en évidence 7 clones donnant un signal d'hybridation. Deux d'entre eux ont été étudiés de façon plus approfondie : les clones TGI/pJ6D5 et TGI/pJ2C3 décrits dans la figure 1. 3) Séquence nucléotidipue des gènes MLEA et MLEP et identification de leur produit d'expression La séquence d'une région de 3001 nucléotides a été déterminée à partir de pJ6D5 et pJ2C3 dont les cartes de restriction sont présentées dans la figure 1. Cette séquence est indiquée figure 2 et notée comme SEQ ID n01. Elle comporte 2 phases de lecture ouverte (ORF). Une analyse informatique avec PC-Gene et Geneworks a montré que la première phase de lecture ouverte a une taille de 1626 pb codant pour une protéine de 542 acides aminés. Le codon d'initiation ATG est précédé par un site possible de fixation de ribosome qui présente des similitudes de séquences avec les séquences consensus des RBS décrites chez E.coli et Lactococcus lactis. Le poids moléculaire prédit de la protéine codée par cette première phase est de 59 kDa et correspond à celui de la protéine purifiée à partir de Leuconostoc oenos (Batterman et Radler, Can. J. Microbiol. 1990, 37, 211-7) estimé sur gel SDS-PAGE à 60 kDa. De plus, le point isoélectrique déduit de la séquence protéique est de 4,55 et apparaît tout à fait compatible avec celui déterminé par électrofocalisation (pHi 4,8) à partir de la protéine de Leuconostoc oenos. Pour confirmer le clonage, des expériences en minicellules, permettant d'identifier les protéines codées par la fraction de DNA séquencée, ont été entreprises. Pour ce faire, un fragment EcoRI-SalI de 2,7 kb issu de pJ6D5 a été inséré dans les deux orientations sous le promoteur tac en utilisant les vecteurs d'expression pJF119EH et pJF119HE (Furste et al, Gene 1986, 48, 119131) pour obtenir les plasmides pJFED6 et pJFHD6. Ces plasmides ont servi à transformer une souche d'E.coli AR 1062. Le résultat est présenté figure 3. L'expérimentation a permis de mettre en évidence chez E.coli le produit d'expression du gène cloné qui correspond bien 2à une protéine de poids moléculaire égal à 60 kDa. Une activité malolactique 10 fois supérieure à celle du témoin (tableau 2) a été également mise en évidence chez les minicellules exprimant le gène cloné. L'absence d'un signal d'arrêt de transcription après la première ORF et l'existence d'une seconde phase de lecture ouverte (ORF) de 942 nucléotides, détectée au niveau du codon stop du premier ORF, suggèrent l'existence d'une structure opéronique. La séquence de 314 acides aminés déduite de ce second ORF indique que ce gène code pour une protéine de poids moléculaire 34190 Da. Cette protéine possède 59 % de résidus non polaires et 41 % de résidus polaires dont 65 % sont basiques, donnant à la protéine un pI théorique de 10,1. L'analyse informatique du second ORF comparativement aux protéines de séquence connue présentes dans les bases de données, montre une similitude significative avec d'autres protéines membranaires. Le profil d'hydrophobicité de la protéine codée par ce second ORF montre une structure caractéristique de protéine membranaire qui a déjà été observée chez des transporteurs de glucose ou de citrate, avec des segments hydrophobes organisés autour d'un noyau hydrophile. Le produit d'expression du gène de ce second ORF possède 10 segments hydrophobes entourant un noyau hydrophile de 24 acides aminés. Cette organisation est typique des protéines catalysant le transport transmembranaire de composés organiques ou inorganiques. Un fragment SalI-XbaI de 1,6 kb issu de pJ2C3 a été inséré dans les 2 orientations, sous promoteur tac en utilisant les vecteurs d'expression pJF119EH et PJF119HE pour obtenir les plasmides pJFEC3 et pJFHC3. Après transformation d'E.coli AR 1062, les minicellules portant pJFHC3 ont exprimé une protéine de poids moléculaire apparent de 20 kDa qui a été localisée dans le cytoplasme et dans les membranes des minicellules (figure 4). Afin de déterminer si le produit d'expression du gène du second ORF code bien pour une activité malate perméase, des mesures de transport transmembranaire du L-malate ont été effectuées sur minicellules. Les minicellules ont été incubées pendant 1 h en présence d'IPTG lmM afin d'induire l'expression du gène malate perméase supposé. Après lavage en tampon phosphate 50mM pH 4,5, les cellules sont concentrées à D06oonm = 5 dans un tampon phosphate 50mM, 10mM MgS04 pH 4,5. De la valinomycine est alors introduite dans le milieu réactionnel en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 4 pM. Les minicellules sont incubées 5 minutes puis mises en présence de glucose (quantité suffisante pour obtenir 10 mM en concentration finale). Après 1 minute d'incubation, 1,4 pcurie de L-malate radiomarqué au 14C est ajouté dans le milieu réactionnel. Les cinétiques de transport sont mesurées selon le protocole de Olsen et al (J. bacteriol.1991, 173, 6199-6206).La figure 5 montre que l'entrée du L-malate est nettement supérieure chez les cellules transformées portant le gène du second ORF. Ce gène, nommé MLEP, code bien pour une protéine catalysant le transport transmembranaire de l'acide malique. EXEMPLE 2 : Expression de 1enzyme malolactique de Leuconostoc oenos chez la levure Saccharoivces cerevîsiae Dans le but d'étudier l'expression du gène MLEA codant pour l'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos chez une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, la souche RH100-4 a été choisie. Pour ce faire, la partie codante du gène MLEA a été préalablement amplifiée par PCR à partir du plasmide pJF119ED6, en utilisant des amorces incluant un site de restriction KpnI ou EcoRI afin de facilité le clonage ultérieur du gène dans les vecteurs. Les amorces suivantes ont été utilisées SEQ ID nO 4 : 5'-GTTCTTGGGTACCAAATATGACAGATC-3' SEQ ID n" 5 : 5'-AAAGAATTCATTAGTATTTCGGATCCC-3' Les sites KpnI et EcoRI sont soulignés. La PCR a été effectuée selon le protocole décrit plus haut, avec les paramètres suivants : 1 min à 92"C, 4 min à 30"C et 3 min à 720C. Le gène MLEA a été inséré grâces aux sites de restriction uniques introduit par PCR, dans le vecteur d'expression pYeDPl/8-2 (Cullin et al., Gene, 1988, 65, 203-17) et le plasmide recombinant pYMLEA ainsi obtenu a été introduit dans la levure par transformation. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu glucosé dépourvu d'uracile puis repiqués sur le même milieu. L'activité malolactique de la souche de levure RH100-4 transformée au moyen du plasmide pYMLEA portant le gène codant pour l'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos a été mesurée par comparaison avec une souche témoin transformée avec un plasmide vide (pYeDPl/8.2). Les levures ont servi à inoculer un milieu YPG à 20 g/l de galactose et 10 g/l de L-malate. La culture a été menée à 30cC, pH 3.1 pendant 48 h dans des fioles de Erlenmeyer agitées. La teneur en L-malate résiduel et la teneur en L-lactate formé ont été mesurés au temps initial, après 24 h d'incubation et après 48 h. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 où R est le rapport molaire L-lactate formé/L-malate consommé. Ce rapport est peu différent de 1, signe qu'une activité malolactique vraie s'est développée. Les résultats du tableau confirment que la souche tranformée portant le plasmide pYMLEA possède une activité malolactique très significativement supérieure à celle du témoin, mais encore loin du niveau nécessaire dans la pratique, le facteur limitant étant la vitesse de pénétration du L-malate dans la cellule. En conséquence, les mêmes constructions ou des constructions similaires avec notamment des vecteurs intégrables doivent être réalisées sur des souches de Saccharomyces cerevisiae pour lesquelles la pénétration du malate n'est pas limitante, par exemple - souches de Saccharomyces cerevisiae transformées avec le gène codant pour la malate perméase de Schizosaccharomyces pombe ou d'autres espèces de levures performantes dans l'utilisation du malate, mis sous promoteur fort levure - souches de Saccharomyces cerevisiae transformées avec le gène MLEP codant pour la malate perméase de Leuconostoc oenos sous promoteur fort levure, ce gène étant de plus éventuellement associé avec une séquence signal de Saccharomyces cerevisiae dirigeant le produit d'expression vers les membranes ou fusionné avec un gène codant pour une protéine membranaire de Saccharomyces cerevisiae - souches de Saccharomyces cerevisiae dites "démaliquantes" capables de convertir l'acide malique en éthanol - souches de Saccharomyces cerevisiae possédant une ou des perméases mutées capables d'effectuer le transport transmembranaire des ions organiques de manière non spécifique l'ensemble de ces constructions relevant du travail normal de l'homme de l'art. Comme il résulte de ce qui précède, l'invention n'est pas limitée aux exemples et englobe notamment - Les souches de Leuconostoc oenos surexprimant, éventuellement de manière dérégulée, un ou plusieurs gènes codant pour une malate perméase et/ou une enzyme malolactique de manière à remédier aux difficultés actuelles d'emploi de Leuconostoc oenos en vinification. - Les bactéries transformées exprimant au moins un gène codant pour une malate perméase et/ou le gène codant pour l'enzyme malolactique de Leuconostoc oenos. - Les souches de Saccharomyces cerevisiae transformées de manière à opérer au moins 80 % et de préférence au moins 90 % de la transformation de l'acide malique présent dans les moûts servant à l'élaboration de boissons fermentées comme par exemple le vin en acide lactique, et notamment les souches de Saccharomyces cerevisiae exprimant à la fois un ou plusieurs gènes codant pour une malate permease et un ou plusieurs gènes codant pour une enzyme malolactique. - les procédés de transformation desdites souches, les boissons fermentées obtenues à partir desdites souches, la préparation d'enzyme malolactique à partir desdites souches et les enzymes malolactiques ainsi produites ANNEXE 1 Tableau 1. Souches et plasmides utilisés Souches Caractéristiques Références ou sources E.coli TGI supE hsd#5 thi# Vac- proAB) Gibson (1984) F'(traD36 proAB+/aclq lacZL\M15) E.coli XL1 Blue supE44 hsdR17 recAl endAl Bullock et al. (1987) thi gyrA46 thi lac F (proAB + lacS lacZ#M 15) TnlO(tetr) E coli AR1062 F- thr leu ara azi fhuA lacY tsx D'Enfert et al. (1987) minA gai rpsL xyl mtl thi hsdR Leuconostoc oenos MLE+ (type sauvage) Institut d'Oenologie Lo 84.13 de Bordeaux Saccharomyces MATa ura3 his3 bar 1-1 Nuoffer et al. (1991) cerevisiae suc29 RH 100-4 Plasmides Caractéristiques Références ou sources pJDC9 Emr.AlacZ( 6.95kb) Chen and Morrisson (1988) pJ6D5 Fragment Sau3A de 5,5 kb ce travail du chromosome de Leuconostoc oenos Lo84. 13 dans pJDC9 pJ2C3 Fragment Sau3A de 3 kb ce travail du chromosome de Leuconostoc oenos Lo84. 13 dans pJDC9 pBluescript SK+ Ampr 2.96kb, lacZ reporter gene, Stratagene M13 ori, pBR322 ori pJF119EH/pJF119HE laclq rrnB Ampr (vecteur d'expression Furste et al (1986) avec promoteur tac) pJFED6/pJFHD6 Fragment EcoRI-Pstl de 2,7 kb ce travail issu de pJ6D5 inséré dans les 2 orientations dans pJF119EH/pJF119HE pJFEC3/pJFHC3 Fragment Sall-Xbal de 1,6 kb ce travail issu de pJ2C3 inséré dans les 2 orientations dans pJF119EH/pJF119HE pYeDP1/8-2 Vecteur d'expression de levure Cullin et Pompon Ampr ura3 (1988) pYMLEA pYeDP1/8-2 portant le gène MLEA ce travail ANNEXE 2 Tableau 2.Expression du gène MLEA dans E.coli AR 1062 (Activité spécifique en mg de L-lactate formé par mg de protéine) temps en minute pJF1 1 9EH pJFED6 (plasmide vide) (avec le gène MLEA) 15 0.05 0.18 30 0.03 0.26 60 0.03 0.42 Tableau 3 :Activité malolactique chez la levure RH 100-4 transformée au moyen des plasmides pYeDP1/8.2 et pYMLEA Levure pYeDP1/8-2 (témoin) pYMLEA Temps (h) 0 24 48 0 24 48 DO 600 nm 2,68 70,2 1,84 6 Biomasse 1,2 3,16 0,8 2,7 g/l g/I 10 9,7 9,2 10 9,2 7,9 L-malate résiduel 75 72 69 75 69 59 mM g/l 0,14 0,15 0,52 1 L-lactate formé 1,5 1,6 5,8 11 mM L-malate consommé g/l 0,5 1,3 (pYMLEA-témoin) mM 3,7 9,7 L-lactate formé g/l 0,38 0,85 (pYMLEA-témoin) mM 4,2 9,4 R = - 1,13 0,97 CHAMP NON VALIDE: Objet REVENDICATIONS 1 - Séquence d'ADN comprenant un gène ou une partie d'un gène codant pour une enzyme malolactique et/ou un gène ou une partie d'un gène codant pour une malate perméase, consistant en a) tout ou partie de la séquence d'ADN SEQ ID n01, b) toute séquence d'ADN capable d'hybrider sous conditions stringentes avec la séquence de a) et codant pour une enzyme malolactique ou une malate perméase c) une séquence d'ADN codant pour une séquence d'acides aminés identique aux séquences d'acides aminés codées par a) ou b) 2 - Séquence d'ADN selon la revendication 1 isolée de Leuconostoc oenos. 3 - Vecteur de transformation capable de transformer une cellule hôte, ledit vecteur contenant tout ou partie d'une séquence d'ADN définie selon l'une des revendications 1 ou 2. 4 - Vecteur de transformation selon la revendication 3 où le gène codant pour l'enzyme malolactique est placé sous contrôle de promoteurs et de terminateurs permettant une expression forte de ces gènes dans la cellule hôte. 5 - Vecteur de transformation selon la revendication 3 où le gène codant pour la malate perméase est placé sous contrôle de promoteurs et de terminateurs permettant une expression forte de ces gènes dans la cellule hôte. 6 - Vecteur de transformation selon l'une des revendications 3 à 5 de type intégratif. 7 - Microorganisme transformé au moyen d'au moins une séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 ou 2. 8 - Microorganisme transformé au moyen d'au moins un vecteur selon l'une des revendications 3 à 6. 9 - Souche de Saccharomyces cerevisiae caractérisée par le fait qu'elle est capable de transformer au moins 80 % et de préférence au moins 90 % de l'acide malique présent dans les moûts viniques en acide lactique. 10 - Souche de Saccharomyces cerevisiae selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée par le fait qu'elle possède un transport transmembranaire passif ou facilité (mutant de perméation) non limitant de l'acide malique. 11 - Souche de Saccharomyces cerevisiae selon l'une des revendications 7 à 10 caractérisée par le fait qu'elle possède un transport transmembranaire actif de l'acide malique. 12 - Souche de Saccharomyces cerevisiae selon l'une des revendications 7 à 11 caractérisée en ce qu'elle exprime à la fois au moins un gène codant pour une malate perméase et au moins un gène codant pour une enzyme malolactique. 13 - Souche de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle est capable d'exprimer au moins un gène codant pour la malate perméase de Leuconostoc oenos. 14 - Souche de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle est capable d'exprimer au moins un gène codant pour la malate perméase de Schizosaccharomyces pombe ou d'autres espèces de levures performantes dans l'utilisation du malate 15 - Souche de bactérie transformée selon l'une des revendications 7 ou 8 de manière à transformer au moins 90 % de l'acide malique présent dans les moûts viniques en acide lactique. 16 - Procédé de transformation d'un microorganisme, notamment du type susceptible d'être utilisé comme ferment ou levain pour l'élaboration des boissons fermentées, caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme au moins un acide nucléique selon les revendications 1 à 2. 17 - Procédé de transformation d'un microorganisme, notamment du type susceptible d'être utilisé comme ferment ou levain pour l'élaboration des boissons fermentées, caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme au moins un vecteur selon les revendications 3 à 6. 18 - Utilisation des souches selon les revendications 7 à 15 pour l'élaboration de boissons fermentées 19 - Utilisation des souches selon les revendications 7 à 15 pour la fabrication d'enzyme malolactique.