Brevet FR2737732A1 — publié le 19970214

TEST CO-DOMINANT DE DIAGNOSTIC GENETIQUE La présente invention porte sur un test de diagnostic génétique codominant, c'est-à-dire qu'il permet de distinguer dans une population des individus homozygotes et hétérozygotes pour un allèle polymorphe. Une méthode de détection rapide et efficace de mutation ponctuelle au niveau de l'ADN génomique est essentielle à l'identification des polymorphismes aussi bien pour des études génétiques et la prévision d'un risque de pathologie lié à ce polymorphisme, que pour l'étude des bases moléculaires des maladies héréditaires, et à la mise au point d'un test de diagnostic génétique. Dans tout ce qui suit on parlera de mutation ponctuelle, ce terme englobant un changement de séquence soit une transition, soit une transversion, soit une délétion ou une addition de nucléotides ; y sont incluses plus généralement les transitions, transversions, délétions ou additions de 1 à 6 nucléotides. Ce type de méthode de détection rapide, efficace, et peu onéreuse peut être, de façon plus générale, appliquée à la détection de mutations de toute organisme vivant, que ce soit des micro-organismes, ou des animaux ou des plantes, la méthode présentant essentiellement un intérêt pour les organismes diploïdes. Les domaines d'application de ce type de détection peuvent ainsi s'étendre du secteur agro-alimentaire, la médecine ou le diagnostic vétérinaire ou enfin la sélection animale ou végétale. La PCR (1) a fait faire un grand pas à l'analyse de 'ADN génomique. Sa technique a permis le diagnostic de maladies génétiques quand elles sont combinées avec d'autres techniques (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9); cela peut être la combinaison de la PCR et le séquençage direct (2, 3, 4, 10) ou, la technique appelée Oligo-nucléotide Spécifique d'Allèle (ASO) (11, 12). Dans certains cas, I'apparition d'une mutation ponctuelle peut créer ou détruire un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction (13); la présence ou l'absence de ce site de restriction peut être utilisée pour réaliser des diagnostics comme cela a été récemment démontré pour un diagnostic d'anémie falciforme (7); de la même manière un polymorphisme de restriction peut être lié à une mutation non caractérisée qui permet d'établir un diagnostic dans des familles par analyse de ce polymorphisme après amplification.De nombreuses techniques ont été développées avec pour objectif de permettre la détection de ces mutations en combinant la PCR avec d'autres types de réactions. II s'agit notamment: - de la technique appelée "PCR amplification of specific alleles" (PASA) qui est une modification de la technique PCR par l'utilisation soit d'une amorce oligo-nucléotidique qui s'hybride avec l'alléle sauvage mais qui ne s'hybride pas avec l'allèle mutant, soit l'inverse : le produit amplifié sera donc spécifique de l'allèle pour lequel ont été choisies les amorces et l'amplification se trouve alors inefficace si il n'y a pas d'hybridation de l'amorce avec l'allèle correspondant (14); - HEIM and al. (15) ont utilisé un jeu d'amorces différent pour amplifier les deux allèles, ces amplifications étant suivies par une PCR spécifique d'allèle; - SCHUSTER and al (16) ont combiné la PCR asymétrique avec la PCR spécifique d'allèle en utilisant un jeu de 3 amorces oligo-nucléotidiques dans un seul mélange réactionnel pour détecter une mutation ponctuelle dans le gêne de l'apoB ; mais cette technique, simple, ne permet pas de distinguer, pour les maladies récessives, les individus porteurs d'un seul allèle muté des individus malades qui ont leurs deux allèles mutés. D'autres méthodes ont été appliquées notamment pour mettre en évidence la création par mutation d'un site de restriction à partir d'un produit d'amplification. Ceci a été utilisé notamment pour la détection de l'hémophilie B (17) ou de l'hémophilie A (18). Dans toutes leurs mises en oeuvre, les techniques de test de diagnostic décrites sont peu propices à une utilisation large dans la population car elles nécessitent soit des étapes lourdes, complexes, chères et mettant en oeuvre un savoir-faire technique de haut niveau, soit ne permettent pas de différencier des individus homozygotes et hétérozygotes ; d'autres techniques telles les oligonucléotides spécifiques d'allèles sont de types dominants et ne permettent pas de différencier un individu homozygote d'un individu hétérozygote ayant un allèle normal et un allèle mutant. Or pour ce qui est du diagnostic génétique et notamment de la prévision du risque dans des populations données vis-à-vis de maladies génétiques, il est extrêmement important de pouvoir identifier ces deux populations sans mettre en oeuvre des techniques complexes et chères. La présente invention permet de surmonter les inconvénients des différentes techniques décrites dans la littérature et notamment de s'affranchir de l'utilisation de radio-éléments ; elle est relative à une méthode de détection de l'état homozygote ou hétérozygote d'une mutation présumée dans un acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre deux amplifications d'acides nucléiques, ces deux amplifications demandant en oeuvre respectivement au moins deux couples d'amorces:: - le premier couple est constitué d'un oligo-nucléotide spécifique de l'alléle sauvage (A) et d'un 2ème oligo-nucléotide (B) différent de (A), - le deuxième couple est constitué d'un oligo-nucléotide spécifique de l'allèle mutant (A') et d'un deuxième oligo-nucléotide (C), lui-même étant différent de (A') et de (B), la différence de longueur entre les fragments amplifiés entre (A) et (B) et entre (A') et (C) étant suffisante pour être détectée par des méthodes d'analyse classique. Ces deux amplifications sont simultanées. Par simultanée, il est entendu que les produits de la réaction sont analysés simultanément par des méthodes classiques notamment de séparation analytique ou préparative d'ADN notamment l'électrophorèse en gel de polyacrylamide ou en gel d'agarose ; néanmoins il va de soit pour l'homme du métier que toute autre méthode d'analyse, comme la chromatographie, de la taille des fragments amplifiés doit être considérée comme moyen équivalent dans la méthode de l'invention. Les deux réactions d'amplification peuvent être réalisées soit dans deux mélanges réactionnels différents si (A) et (A') sont complémentaires de la même chaine d'ADN, soit réalisées dans le même mélange réactionnel si (A) et (A') sont complémentaires des brins (+) et (-) de 'ADN respectivement. En particulier, les différences de longueurs peuvent être détectées par l'existence de deux bandes différentes après une migration en électrophorèse en gel d'agarose par exemple; mais il va de soi que à partir du moment où les méthodes de détection vont s'affiner, les différences de longueurs entre les fragments amplifiés pourront être réduites. De manière plus générale, toute technique d'amplification d'une séquence d'ADN qui comprend l'utilisation d'au moins deux amorces et d'une polymérase permettant de synthétiser la séquence complémentaire comprise entre les deux amorces, et quel qu'en soit son perfectionnement, peut être appliquée à la mise en oeuvre de l'invention qui, pour cette première, réside dans l'utilisation simultanée de deux couples d'amorces différents, et de la visualisation simultanée des produits de PCR. Des couples d'amorces (A) et (B) d'une part, (A') et (C) d'autre part, peuvent être symétriques ou inversés, autrement dit (A) et (A') hybridables avec un même brin de la double hélice, et (B) et (C) avec l'autre brin, ou au contraire, le couple (A) (B) d'une part, et le couple (A') (C) d'autre part, peuvent être inversés, c'est-à-dire (A) et (A') sont hybridables aux brins complémentaires de la chaîne d'ADN, tout comme (B) et (C). Dans la première branche de l'alternative, les deux amplifications réalisées par les deux couples d'amorces doivent être réalisées séparément, puis les produits de la réaction doivent être mélangés pour être analysés par les méthodes classiques. En revanche, dans la deuxième branche de l'alternative, les produits de la réaction peuvent être mélangés dès le départ, I'amplification entre (A) et (C) ne pouvant alors être réalisée. Mais, dans ce dernier cas, les amorces (A) et (A') devront avoir une séquence suffisamment différente pour éviter une hybridation parasite entre (A) et (A') dans le mélange réactionnel. Le seul impératif est que (A) et (A') soient porteurs du nucléotide correspondant à celui dont la mutation est recherchée. Enfin, cette technique peut être mise en oeuvre quel que soit l'organisme contenant l'ADN, à savoir micro-organisme, bactéries, virus, animaux ou plantes, mais présente un intérêt certain pour les organismes diploïdes ou polyploïdes. L'utilité de cette nouvelle technique a été démontrée pour identifier une mutation dans des populations Amish du Sud de l'lndiana porteuses d'un gêne codant pour une protéine impliquée dans une maladie autosomale récessive: de type dystrophie musculaire des ceintures. Si la méthode PCR classique s'est avérée extrêmement puissante pour amplifier des séquences cibles, notamment dans des génomes complexes, il arrive souvent que de petites bandes parasites artéfactuelles apparaissent dans le spectre des bandes obtenues après amplification. Cela est souvent interprété comme une erreur d'amorçage sur la chaîne cible ; aussi R.H. DON (19) a-t-il mis au point une technique dite "touchdown" qui permet d'éliminer ces artefacts d'une façon beaucoup plus rigoureuse que les techniques utilisées préalablement qui étaient essentiellement des ajustements en concentration de magnésium ou l'augmentation de la température d'hybridation de l'amorce avec l'ADN.La méthode de Touchdown . tire parti de la nature exponentielle de la réaction PCR qui peut commencer au-dessus de la température d'hybridation standard: la température de la réaction commence 5 à 10 C au-dessus de cette température d'hybridation (par exemple 65"C) puis décroît régulièrement de 1 à 2"C par cycle jusqu'à l'obtention de la température d'hybridation standard par cette technique ; toute différence de Tm entre les réappariements corrects et incorrects va donner un avantage au produit correct vis à vis du produit incorrect, toutes choses étant égales par ailleurs. Ainsi, une différence de 5 permet de donner un avantage de 45 fois (19). Afin d'éviter les risques d'erreurs inhérents aux techniques d'amplification, dans la méthode selon l'invention, les fragments amplifiés ont de préférence des longueurs respectives comprises entre 50 et 200 nucléotides ; en outre, et pour que l'identification des segments amplifiés entre (A) et (B) d'une part, et (A') et (C) d'autre part ne présente pas de caractère d'ambiguïté, la différence de longueur doit être de préférence d'au moins 10%. La méthode de l'invention est particulièrement intéressante à mettre en oeuvre pour la détection de mutations ponctuelles telle que définies ci-dessus. L'invention porte également sur une trousse, ou kit, de diagnostic de présumées mutations ponctuelles homozygotes ou hétérozygotes et est caractérisée en ce qu'elle contient au moins: a) une polymérase thermostable b) un premier couple d'amorces constitué d'un oligo-nucléotide (A) spécifique de l'allèle sauvage et d'un deuxième oligo-nucléotide spécifique (B), distinct de (A) c) un deuxième couple d'amorces constitué d'un oligo-nucléotide spécifique de l'allèle mutant (A') et d'un deuxième oligo-nucléotide (C) distinct de (A), la taille des fragments amplifiés entre les amorces (A) et (B) d'une part, et les amorces (A') et (C) d'autre part, différant de préférence d'au moins 10%. La trousse conformément à l'invention contient, outre les quatre amorces (A), (A'), (B), (C), ci-dessus, tous les éléments qui permettent de réaliser une amplification par PCR ou toute méthode perfectionnée et dérivée et notamment la méthode dite de 'Touchdown PCR. La trousse conformément à l'invention est plus particulièrement utilisable pour détecter ou identifier l'état homozygote ou hétérozygote de mutations ponctuelles, que ces mutations soient des transitions ou des transversions. De fait, par ces deux amplifications simultanées, on aboutit à une lecture aisément interprétable d'un test de diagnostic co-dominant qu'aucun des procédés précédents ne permettaient. Une telle trousse de diagnostic conformément à l'invention peut trouver aussi bien son application dans le domaine de la santé humaine, ou animale, que dans tout autre secteur d'application tel l'environnement, les semences ou l'agro-alimentaire pour lesquels la détection et le suivi de l'état sanitaire ou infectieux du milieu peut être important. Le diagnostic peut être également appliqué dans un processus de sélection d'animaux ou de semences. Les exemples suivant ainsi que les figures qui leur sont annexées, sans être limitatifs, montrent la performance de l'invention sur la détection d'une mutation ponctuelle dans le gène LGMD2E codant pour la protéine impliquée dans un type de dystrophie musculaire des ceintures. La figure 1 est un schéma qui illustre le système de l'invention quand les couples d'amorces sont symétriques. Dans cette figure, N correspond à l'allèle normal et M à l'allèle mutant. Les flèches représentent les amorces, et le sens reflète le sens 5' 3'. La figure 2 est un schéma qui illustre le système de l'invention quand les couples d'amorces sont antisymétriques. N et M et les flèches ont la même signification que dans ia figure 1. La figure 3 illustre la ségrégation de la substitution thréonine vers l'arginine dans une population Amish. Dans cette figure, la ligne A présente le pedigree de la famille A620 dans laquelle les individus affectés ou sains sont indiqués par des symboles noirs ou blancs respectivement. Par sains , il est entendu que les individus peuvent être non porteurs ou porteurs hétérozygotes; B représente le résultat obtenu en électrophorèse par gel d'agarose des mélanges des produits d'amplification par Touchdown PCR des fragments de 100 et de 158 paires de base respectivement ; C représente la ségrégation des haplotypes sur le chromosome 4 au sein de la famille; les chromosomes portant la mutation sont entourés, et le CA12T représente le micro-satellite intragénique. ExemPle de réalisation: Les Figures 1 et 2 illustrent la technologie de l'invention. Dans cet exemple, les amorces ont toutes une longueur de 20 nucléotides. a) Cas où les couples d'amorces (A)(B) d'une Dart et (A')(C) d'autre Dart sont symétriques: Ce cas est représenté dans la figure 1. Dans cette figure, le premier couple d'amorces (A)(B) spécifique de l'allèle normal permet d'obtenir un produit d'amplification de 180 pb ; en effet, L'amorce (B) est située à 140 pb en aval du nucléotide dont la mutation est recherchée et l'amorce (A) contient ledit nucléotide à son extrémité 3'. Le second couple d'amorces (A')(C), qui sert à identifier le génotype mutant, a une amorce identique à l'amorce (A), mais possède à la place du nucléotide normal en 3' le nucléotide muté M. L'autre amorce (C) en aval de la mutation sera choisie de telle façon que le produit obtenu par PCR soit significativement différent du produit (A)(B), ici de 120 pb. Lorsque les produits d'amplification sont mélangés après la phase de PCR, puis déposés sur un gel d'agarose à 4% contenant du bromure d'éthidium en tampon TBE1X, on obtient deux bandes dans la même piste lorsque l'échantillon de départ contenait un allèle normal et un allèle mutant. Ainsi, on a transformé le système de diagnostic dominant conventionnel avec une réponse de type tout ou rien pour chacune des réactions de PCR en un système co Les homozygotes ne produisent qu'une seule bande de 120 ou 180 pb selon que l'homozygote est muté ou est normal. b) Cas où les amorces sont antisymétripues: La figure 2 illustre ce cas. On voit clairement dans ce cas que les couples d'amorces (A)(B) d'une part et (A')(C) d'autre part conduisent, comme dans le cas précédent, à des produits d'amplification de 120 pb pour le mutant et de 180 pb pour le sauvage. II apparaît dans cette figure que, quand l'amplification PCR est conduite dans un seul milieu réactionnel contenant les 4 amorces, on obtient alors un mélange de 3 produits d'amplification les 2 produits correspondant aux allèles sauvages et mutant respectivement de 180 et 120 pb, et également un produit correspondant à une amplification entre les amorces (B) et (C) qui a une longueur de 260 pb. Le dépôt sur un gel d'agarose en 4% de bromure d'éthidium des produits de la réaction PCR va, quand 'ADN amplifié est hétérozygote et porte les deux allèles N et M à l'observation de 3 bandes correspondant respectivement aux produits de 120,180 et 260 pb. Si, au contraire, I'ADN est homozygote pour l'allèle normal, les produits d'amplification comporteront uniquement 2 bandes de 180 et 260 pb. Enfin, si l'ADN est homozygote mutant, le produit de la réaction comportera 2 bandes de 120 et 260 pb. Ce système de diagnostic a donc tous les avantages des autres systèmes utilisant la PCR, sensibilité, test non radio-actif, automatisable, etc..., mais surtout présentant en plus l'avantage de transformer des marqueurs dominants en marqueurs co-dominants. Exemple d'application : identification d'une mutation dans des patients Amishs porteurs de LGMD2E a) sélection des familles Six familles déjà décrites antérieurement (20) et comprenant 52 individus dont 13 affectés ont été analysées. Puis 5 familles additionnelles ont également été inclues comportant en tout 39 individus dont 13 affectés. Dans la recherche de l'identification de la protéine impliquée dans ces familles, des analyses en Northern blot ont été réalisées sur l'ARN total isolé de biopsie de muscle squelettique pour déterminer si l'ARN messager du gène LGMD2E était affecté dans sa taille ou dans la quantité produite. Or, la population de transcrits d'ARN, de taille de 4.4 Kb, sont présents en quantité et en taille normale aussi bien dans les échantillons provenant de patients affectés que dans les contrôles sains. Ceci suggérait très fortement que la mutation était probablement due à une mutation ponctuelle telle que définie ci-dessus. Pour vérifier cette question, des fragments d'ADNc du gène LGMD2E ont été amplifiés après une transcription reverse à partir de l'ARN total préparé de six biopsies de muscles. Les produits de RT-PCR ont été séquencés et une simple transversion de C vers G au nucléotide 461 a été détectée chez les deux patients dont les deux allèles sont mutés. Le changement de codon est de ACA vers AGA et résulte dans une substitution de la thréonine par l'arginine correspondant à une mutation faux sens au résidu 151. La ségrégation de cette mutation a été étudiée dans cette famille et dans d'autres familles porteuses de dystrophie des ceintures en séquençant puis en amplifiant le fragment correspondant par la technique de touchdown PCR décrite plus haut. b) Touchdown PCR 50 ng d'ADN ont été soumis à un procédé de touchdown PCR (19) dans un mélange réactionnel de 50 p litres contenant 10 mM Tris HCI, pH8.8, 50mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 200 mM de chaque dNTP, 100 ng de chaque amorce, et 2 unités de Taq Polymerase (Perkin Elmer).Après 5 minutes de dénaturation à 96"C, la première étape d'amplification est réalisée de la manière suivante :40 sec. à 94"C puis 30 sec. à 63"C (ceci constitue un cycle) avec une diminution de 1" tous les 2 cycles de 63"C à 59"C. Au total, 10 cycles de PCR seront faits à raison de deux cycles à chaque température de 63"C à 59"C compris. La deuxième étape est réalisée en 25 cycles additionnels d'amplification consistant en 40 sec. à 94"C et 30 sec. à 58"C. Couples d'amorces utilisés: Premier couple d'amorces: a) couple d'amorces de type AB permettant l'amplification de l'allèle sauvage: T461 5'G : 5'GTTTTTCAGCAAGGGACAAC-3' ml: 5'-CTT7TCACTCCACTTGGCAA-3'. Deuxième couple d'amorces permettant l'amplification de l'allèle mutant: A461 : 5'-GrrrrtCAGCAAGGGACAAG-3' m3: 5'TATTTTGAGTCCTCGGGTCA-3' On remarquera que dans le T461 le G en 3' a été substitué par le C en 3' correspondant à la transversion C vers G dans la séquence d'ADNc. Les produits d'amplification ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose à 4% coloré au bromure d'ethidium. c) Résultats Les résultats sont présentés dans la partie B de la figure 1 dont la légende est détaillée ci-dessus. La différence des tailles des segments amplifiés est de 58 paires de bases sachant que les produits d'amplification de la paire T461/ml est de 100 paires de bases et celui de la paire A461/m3 est de 158 paires de bases. L'analyse de la figure 1 montre que les parents qui ont un phénotype normal sont en fait des hétérozygotes puisque le produit d'amplification contient les deux types de fragments. II est clair que si l'un des individus était homozygote normal, le profil obtenu après cet ensemble d'opérations ne comporterait que des bandes correspondant à un poids moléculaire de 158 paires de bases. La technologie de l'invention permet donc, pour la première fois, de distinguer de manière non ambiguë l'état homozygote ou hétérozygote d'une mutation dans une population, tout en évitant des opérations complexes de type digestion enzymatique ou création de sites de restriction par exemple. Elle est rapide et affranchit l'expérimentation de l'utilisation de radio-éléments. La détection des hétérozygotes revêt une importance tout à fait considérable dans le cadre de ce qu'on appelle la médecine prédictive pour les maladies récessives liées au sexe, la possibilité de détecter des femmes conductrices dans des familles à risques est un progrès considérable. En ce qui concerne les maladies dominantes à expression tardive, les porteurs du trait génétique sont des malades en puissance et ce type d'analyse permet de détecter le risque quelle que soit la pénétrance de la tare et son degré d'expressivité. Dans ce cas, la méthode de l'invention permet de réaliser un diagnostic pré-symptomatique c'est-àdire avant l'apparition des premiers signes d'une maladie éventuelle. Enfin, il est évident pour l'homme du métier que si la maladie ou plus généralement le phénotype recherché résulte de la combinaison de différentes mutations ponctuelles, le principe même d'amplification par deux amorces et une polymérase thermostable donnant des produits d'amplification dont la taille varie pour chaque allèle permet d'associer plusieurs de ces couples d'amorces à partir du moment ou les produits d'amplification ont chacun une taille définie, et différente d'un produit à l'autre, visualisable. BIBLIOGRAPHIE 1- Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Hom, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, H.A. (1988) Science 239487491. 2- Newton, C.R., Kalsheker, N., Graham, A., Powell, S., Grammack, A., Riley, J. and Markham, A.F. (1988) Nucl. Acid. Res. 16 8233-8243. 3- Stoflet, E.S., Koeberl, D.D., Sarkar, G. and Sommer, S.S. (1988) Science 239 491-494. 4- Engelke, D.R., Hoener, P.A. and Collins, F.S. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85 544-548. 5- Bruun Petersen, Kolvraa, S., Bolund, L., Bruun Petersen, G., Koch, J. and Gregersen, N. (1988) Nucl. Acid. Res. 16 352. 6- Bugawan, T.L., R.K., Levenson, C.H., Watson, R.M. and Erlich, H.A. (1988) Biotechnology 6 943-947. 7- Chehab, F.F., Doherty, M., Cai, S., Kan, Y.W., Cooper, S. and Rubin, EM. (1987) Nature 329 293-294. 8- Kogan, S.C., Doherty, M. And Gitschier, J. (1987) New Engl. J. Med 317 985-990. 9- Levinson, B., Janco, R., Phillips, J.and Gitschier J. (1987) Nucl. Acid. Res. 15 9797-9805. 10- Wong, C., Dowling, C.E., Saiki, R.K., Higuchi, R.G., Erlich, H.A. and Kazazian, H.H. (1987) Nature 330 384-386. 11- Connor, B.J., Reyes, A.A., Morin, C. Itakura, K., Teplitz, R.L. and Wallace, R.B. (1983) Proc. Natal. Acad. Sci. USA. 80 278-282. 12- Orkin, S.H., Markham, A.F. and Kazazian, H.H. (1983) J. Clin. Invest. 71 775-779. 13- Southem, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98 503-517. 14- Sommer S.S. et al (1989) Mayo Clim. Proc 641361-1372. 15- Heim, M. et al (1990) Lancet. 336: 529-532. 16- Schuster, H. et al (1992) Analytical Biochemistry 204: 22-25. 17- Mttsushita, T. et al (1991) Trombosis Research 63: 355-361. 18- Pattinson J.K. et al (1990) British Journ. of Haeamatology 75: 33-77. 19- Don, R.H. et al (1991) Nucl. Ac. Research 19:4008. 20- Allamand, V. et al (1995) Human Molecular Genetic 4:459-464. REVENDICATIONS 1. Méthode de détection de l'état homozygote ou hétérozygote de mutations présumées dans un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre deux amplifications d'acides nucléiques, les deux amplifications mettant en oeuvre une polymérase et au moins deux couples d'amorces: - le premier couple est constitué d'un oligonucléotide spécifique de l'allèle sauvage (A) et d'un deuxième oligonucléotide (B), - le deuxième couple est constitué d'un oligonucléotide spécifique de l'allèle mutant (A') et d'un deuxième oligonucléotide (C). La différence de longueur entre les fragments amplifiés entre (A) et (B) et (A') et (C) respectivement étant suffisante pour être détectée par les méthodes d'analyse classiques de fragments d'acide nucléique. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que si l'amorce (A) du premier couple s'hybride avec un brin de l'ADN, L'amorce (A') du deuxième couple s'hybride au brin du complémentaire. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que si l'amorce (A) du premier couple s'hybride avec un brin de l'ADN, L'amorce (A') s'hybride avec le même brin de l'ADN. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR ou une méthode dérivée utilisant au moins deux amorces et une polymérase, notamment la Touchdown > PCR. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les mutations présumées sont des mutations ponctuelles. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'acide nucléique dans lequel on cherche à détecter une mutation présumée provient d'un homme, ou d'un animal, ou d'une partie de ceux-ci 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'acide nucléique dont on cherche à détecter l'existence d'une mutation présumée provient d'une plante ou d'une partie de celle-ci. 8. Trousse de diagnostic de mutations présumées homozygotes ou hétérozygotes dans un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient au moins: a) une polymérase thermostable, b) un premier couple d'amorces constitué d'un oligonucléotide (A) spécifique de l'allèle sauvage et d'un deuxième oligonucléotide (B), c) un deuxième couple d'amorces constitué d'un oligonucléotide (A') spécifique de l'allèle mutant et d'un deuxième oligonucléotide (C), les fragments amplifiés entre (A) et (B) d'unepart, et entre (A') et (C) d'autre part, ayant une différence visualisable par les méthodes classiques. 9. Trousse selon la revendication 8, caractérisée en ce que les différences de taille entre les fragments amplifiés sont d'au moins 10%. 10. Trousse selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient en outre les éléments permettant de réaliser une amplification par PCR ou toute méthode dérivée notamment la Touchdown PCR. 11. Trousse selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les mutations présumées susceptibles d'être diagnostiquées sont des mutations ponctuelles. 12. Utilisation d'une trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 à la détection de mutations génétiques chez l'homme ou l'animal. 13. Utilisation d'une trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, à la détection de mutations génétiques chez les plantes ou des parties de celles-ci. 14. Utilisation d'une trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, à la sélection d'espèces animales ou végétales.