Brevet FR2744725A1 — publié le 19970814

La présente invention a pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement les complexes matures entre les glycoprotéines El et E2 du virus de l'hépatite C (VHC) présentant une conformation stabilisée par des liaisons non covalentes. Elle est en outre relative à un procédé de détermination de la présence de ces complexes, ainsi qu'un procédé d'isolement ou de purification de ces complexes. Le virus de l'hépatite C (VHC) est le principal agent responsable des hépatites non-A, non-B. Le vHC qui appartient à la famille des Flavivindae, est un virus enveloppé présentant un génome à ARN simple brin de polarité positive d'environ 9.500 nucléotides. Son génome contient une région non codante hautement conservée à l'extrémité 5', suivie d'un long cadre ouvert de lecture de 9.030 à 9.099 nucléotides qui est traduit en une seule polyprotéine de 3.010 à 3.033 acides aminés. Cette polyprotéine est ensuite clivée par des protéinases virales ou de l'hôte, afin de produire au moins dix produits distincts. Cette polyprotéine présente ainsi la séquence suivante: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Les clivages dans la région structurale de la polyprotéine (C/E1, E1/E2, et E2/p7 et p7/NS2) sont catalysés par une signal-peptidase de l'hôte localisée dans le réticulum endoplasmique. Le clivage au site NS2/NS3 est effectué par une protéinase codée par le VHC, qui est incluse dans les régions NS2 et la sérine protéinase NS3. Les clivages aux sites C1, E1/E2 et NS2/NS3 sont cotraductionnels, tandis que ceux aux sites E2/P7 et p7/NS2 ont lieu après la traduction et donnent naissance à deux précurseurs pour E2: E2-NS2 et E2-p7. Les glycoprotéines du VHC, El et E2, interagissent afin de former un complexe que l'on suppose être une sous-unité fonctionnelle des virions VHC. Les complexes de glycoprotéines du VHC ont été récemment caractérisés par Dubuisson et al. ((1994), Journal of Virology, Vol.68, n'10, 6147-6160). En présence de détergents non ioniques, deux formes de complexes E1E2 sont détectées: d'une part un hétérodimère de El et E2 stabilisé par des liaisons non covalentes, et d'autre part une fraction constituée d'agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures, qui dans la majorité des cas présentent une conformation incorrecte. De plus, les cinétiques d'association entre El et E2 ont été étudiées et il s'avère que la formation de complexes E1E2 stables est lente et assez inefficace. Il a enfin été montré que El et E2 s'associent de manière rapide avec la calnéxine, mais se dissocient lentement (Dubuisson et Rice, 1996, Journal of Virology, 778-786). Le complexe glycoprotéique du VHC présent dans le virion n'a pas été caractérisé, en raison des faibles quantités de particules de VHC présentes dans les tissus du foie infecté ou dans le sang, et de l'absence d'un système cellulaire permettant la multiplication du VHC. Les anticorps dirigés contre les glycoprotéines du 'fliC actuellement disponibles reconnaissent des épitopes indépendants de la conformation des molécules, ou des mélanges d'épitopes dépendants et indépendants de la conformation. De ce fait, il n'est pas possible de distinguer les voies de synthèse conduisant à des complexes matures; c'est-àdire présentant une conformation correcte, de celles conduisant à des agrégats ayant des conformations incorrectes. Il est pourtant indispensable de pouvoir distinguer les complexes matures, c'est-à-dire présentant une conformation correcte, des agrégats dont la conformation est incorrecte. En particulier, une telle distinction est essentielle pour la fabrication de vaccins contenant El et E2 pour immuniser contre le VHC. La distinction de ces deux formes est aussi indispensable dans un cadre diagnostique, tant pour le dosage des complexes, dans le cas par exemple d'une infection par un virus, que pour la détection d'anticorps, par exemple pour déterminer le taux d'anticorps anti-VHC d'un individu. Enfin, la distinction des complexes et des agrégats permettrait d'améliorer les moyens d'étude de l'assemblage du VHC. Le demandeur s'est donc attaché à trouver un moyen permettant de distinguer, de manière efficace et dénuée d'ambiguité, les complexes présentant une conformation correcte et les agrégats présentant une conformation incorrecte. I1 a ainsi trouvé qu'il était possible de distinguer ces deux formes moléculaires à l'aide d'anticorps reconnaissant de manière spécifique des épitopes liés à l'état de conformation des protéines constituant ces complexes. I1 a aussi montré que les formes présentant une conformation incorrecte prédominaient par rapport aux formes correctement conformées. La présente invention est donc relative à un anticorps caractérisé en ce qu'il se fixe de manière spécifique sur les complexes formés entre les glycoprotéines El et E2 du 'fliC qui présentent une conformation correcte, c'est-à-dire une conformation stabilisée par des liaisons non-covalentes. De manière avantageuse cet anticorps est un anticorps monoclonal, produit par une lignée d'hybridomes. Il est préférentiellement l'anticorps H2 produit par le clone d'hybridome déposé le 9 Février 1996 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur (CNCM) sous le n'I-1673. Ces anticorps peuvent être avantageusement utilisés soit pour la détermination de la présence de ces complexes dans des préparations biologiques, soit pour la purification de ces complexes à partir de telles préparations. Ainsi, la présente invention est encore relative à un procédé de détermination de la présence de complexes formés entre les glycoprotéines El et E2 du 'fliC présentant une conformation correcte, dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes: - mise en présence dudit échantillon et d'un anticorps tel que défini ci-dessus, et en particulier de l'anticorps produit par la souche d'hybridome n0 1-1673, et - détermination de la présence d'immunocomplexes formés entre les glycoprotéines et les anticorps. Un tel procédé est particulièrement utile pour déterminer la pureté d'une préparation destinée à la vaccination, en particulier afin de déterminer la proportion de complexes présentant une conformation correcte et susceptibles d'induire la protection de l'hôte vis-à-vis du VHC. La présente invention a en outre pour objet un procédé de purification et/ou d'isolement de complexes présentant une conformation correcte comprenant les étapes suivantes: - mise en contact d'échantillons biologiques contenant ces complexes avec un anticorps tel que décrit ci-dessus, et en particulier avec un anticorps produit par le clone d'hybridome déposé sous le n0 1-1673. - isolement du complexe immunologique formé. Un tel procédé peut par exemple être mis en oeuvre par passage d'un échantillon biologique sur une colonne d'affinité sur laquelle est fixé un anticorps selon la présente invention. Les complexes immunologiques formés entre l'anticorps et les complexes E1E2 sont retenus sur la colonne et les complexes E1E2 sont avantageusement relargués par modification de la force ionique du tampon de la colonne. D'autres objets de la présente invention sont des trousses de diagnostic (ou kits) contenant en particulier un anticorps tel que décrit ci-dessus. La présente invention est de plus relative à des préparations caractérisées en ce qu'elles contiennent des complexes présentant une conformation correcte, stabilisée par des liaisons non-covalentes, sous une forme substantiellement pure, c'est-à-dire substantiellement dépourvue d'agrégats ne présentant pas une conformation correcte, en particulier présentant des ponts disulfures. Avantageusement, une telle préparation contient au minimum 80% de complexes présentant une conformation correcte, préférentiellement 90% et encore plus préférentiellement 95% de ces complexes. De telles préparations peuvent être utilisées comme vaccins, ou encore peuvent entrer dans la composition de trousses de diagnostic, par exemple afin de déterminer la quantité d'anticorps anti-VHC présente dans le sérum ou dans le sang d'un individu. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du métier pourra se référer aux ouvrages suivants Sambroock et al., ((1989), Molecular cloning: a laboratory manuel. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); et Harlow et Lane ((1988), Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) ou l'une de leurs récentes rééditions. La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants, dans lesquels: La figure 1 illustre les cinétiques de précipitation des glycoprotéines El et E2 par les anticorps monoclonaux A4 (figure la) ou H2 (figure lb). Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et HCVVl-1488 ont été marquées durant cinq minutes et une expérience de chasse a été ensuite effectuée durant le temps indiqué (en minutes). Après immunoprécipitation les échantillons ont été séparés sur gel SDS-10%PAGE dans des conditions réductrices ou non réductrices. Le vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin (M). Des protéines spécifiques du VHC sont indiquées à gauche. Les tailles en kilodaltons des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées à droite. La figure 2 illustre l'association des glycoprotéines du VHC avec la calnéxine. Dans cette figure , des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 ont été lysées par 1% de digitonine dans du tampon TBS puis le lysat a été immunoprécipité avec des anticorps anti-VHC (A4 et H2) ou anti-calnéxine. Les immunoprécipités ont été révélés par transfert de type Western à l'aide d'anticorps anti-calnéxine. La figure 3 illustre l'oxydation de la glycoprotéine El. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant 4- heures. La glycoprotéine El a été immunoprécipitée avec l'anticorps A4 anti-El ou coprécipitée avec l'anticorps H2 anti-E2. Les immunoprécipités ont été analysés dans des conditions non réductrices sur SDS10%PAGE. Le vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin (M). Les tailles ( en kilodaltons) des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées sur la droite de la figure. La figure 4 illustre la sensibilité de glycoprotéines du 'fliC au traitement par la protéase V8. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant quatre heures. Des lysats cellulaires ont été alors traités avec différentes concentrations de protéase V8 durant cinq minutes à 37'C et refroidis dans de la glace. Après immunoprécipitation avec les anticorps monoclonaux A4 ou H2, les échantillons ont été séparés sur un gel SDS-1O$PAGE. La figure 5 illustre la cinétique de mise en conformation de E2 et d'assemblage du complexe. Les cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 (vHCV) ont été marquées durant cinq minutes et une expérience de chasse a été effectuée durant les temps indiqués ( en heures). Après immunoprécipitation, les échantillons ont été séparés sur SDS 10%PAGE et analysés à l'aide du PosphorImager. vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin. La figure 6 est relative à la caractérisation des oligomères. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1-1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant quatre heures. Les cellules ont été lysées à l'aide de tampon contenant des NP-40 et sédimentées à travers des gradients de saccharose (5-20%). Les immunoprécipitations avec les anticorps A4 ou H2 ont été effectuées sur chaque fraction et les échantillons ont été séparés sur SDS-10%PAGE. Des marqueurs de masse moléculaire ont été sédimentés dans des gradients de saccharose parallèles et sont indiqués en haut de la figure. La figure 7 illustre la sensibilité de glycoprotéines du 'fliC au traitement par l'endo H. Des cellules HepG2 coinfectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 (vHCV) ou vTF7-3 seul (M) ont été marquées durant cinq minutes, puis une expérience de chasse a été effectuée durant les temps indiqués (en heures). Des lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec l'anticorps H2 puis traités par de l'endo H. Les échantillons ont été séparés sur SDS-13%PAGE. Des protéines déglycosylées sont indiquées à l'aide d'astérisque. Les migrations de marqueurs de poids moléculaire sont indiquées sur la droite de la figure. La figure 8 illustre la colocalisation de glycoprotéines du 'fliC (Fig.8B) et de PDI (Fig. 8A), analysée par immunofluorescence respectivement à l'aide d'anticorps anti-PD1 et de l'anticorps H2. EXEMPLES: Matériels et méthodes Plasmides: Les plasmides pour l'expression de segments d'ADN complémentaire de la souche H du VHC ont été fournis par C.M. Rice. Ils ont été construits comme suit. Le pTM3/HCVl-745(C E1-E2) a été assemblé par ligature de trois fragments, l'un dérivé de pTM3/HCVlC 966 (NcoI-StuI); et deux fragments dérivés de pTM3/HCV364-1207.A/746X (NcoI-HindIII, AscI-StuI). Avant la ligation, le site Hind III a été comblé avec 1'ADN polymérase de T4. Le pTM3/HCVl-809 (C-El-E2-p7) a été construit en plusieurs étapes en utilisant la technique de PCR jusqu'aux codons de terminaison TAA et TAG en positon tandem, suivant immédiatement l'extrémité C-terminale de p7 (résidu 809). La région amplifiée par PCR a été vérifiée par analyse de séquence. PSINrep5/HCV171-383(El) qui contient une séquence signal N-terminale (résidus 171-191) précédent El (résidus 192-383), a été construit en ligaturant les fragments appropriés de pSINrepS /HCVsigEl- myc (XhoI-SstI) et pSINrepS (XbaI-SstI); (Bredenbeek et al.; (1993) J. Virol. 67, 64396446). pSINrepS/HCV37O-745 (E2) a été assemblé par ligature des fragments appropriés de pTM3/HCV364-1207.A/746.X (AscI HindIII) et pSINrep5/HCV370-809 (AscI-StuI). Avant la ligature, le site HindIII a été rempli à l'aide de 1'ADN polymérase T4. Cellules et virus: Les lignées cellulaires CV-1 (ATCC CCL70), HepG2 (ATCC HB-8065) et BHK-21 (ATCC CCL10) ont été obtenues à l'American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules CV-1 et HepG2 ont été mises en culture dans du milieu essentiel de Dulbecco modifié (DMEM) complémenté avec du sérum de foetus bovin à 10% (FBS). Les cellules monocouches BHK-21 ont été mises en culture dans du milieu BHK complémenté avec 5% de FBS et 10% de milieu tryptose phosphate. Des stocks de vTF7-3, un virus de la vaccine recombinant exprimant 1'ARN polymérase ADN-dépendante de T7 (Fuerst et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 81228126), et des recombinants vaccine-VHC (vHCVl-746; vHCVl-809, vHCVl-1488; vHCV1-3011) qui contiennent des séquences de la souche H du VHC (Grakoui et al. (1993)J. Virol. 67, 13851395); Lin et al.,(1994) J. Virol., 68, 5063-5073 ) ont été mis en culture sur des monocouches de cellules CV-1, partiellement purifiés, (Hruby et al., (1979)J. Virol., 29, 705-715), et les titres en particules infectieuses ont été déterminés par des titrages en plages de lyse, sur cellules CV-1. Des stocks de virus recombinant Sindbis exprimant les glycoprotéines El (SINrepS/HCV-H171-383) ou E2 (SINrepS/HCV- H370-746) avec leurs séquences signal respectives ont été générés dans des cellules BHK-21 comme décrit précédemment par Bredenbeek et al.((1993) J. Virol. 67, 6439-6446 ). Anticorps. Des anticorps monoclonaux A4 anti-El et All anti-E2 ont été précédemment décrits par Dubuisson et al.( (1994) J. Virol. 68, 6147-6160 Pour produire d'autres anticorps monoclonaux antiglycoprotéine du VHC, des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVl-1488 ont été lysées avec 0,5% de NP-40 dans du TBS (pH 7,4). Les complexes glycoprotéiques du 'fliC ont été sédimentés à travers un gradient de sucrose comme décrit ci-après. Des fractions contenant des hétérodimères E1E2 (Dubuisson et al.(1994) J. Virol., 68, 6147-6160) ont été réunies et les complexes glycoprotéiques du 'fliC ont été purifiés par immunoaffinité sur des billes de protéine A Sépharose (Pharmacia-LKB) portant l'anticorps monoclonal A4 anti-El. Les complexes glycoprotéiques du VHC liés aux billes immunoréactives ont été injectés à des cellules BALB/c afin de produire des hybridomes secrétant des anticorps spécifiques des glycoprotéines du VHC, comme décrit par Harlow et Lane ((1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.).Le criblage a été effectué sur des plaques de 96 puits contenant des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV-1-1488, fixées avec du paraformaldéhyde et perméabilisées avec du Triton X-100 comme décrit par Dubuisson et al. ((1994) J. Virol., 68, 6147-6160). Des stocks d'anticorps monoclonaux concentrés ont été produits in vitro en utilisant un appareillage MiniPerm (Heraeus) et en suivant les recommandations du fabricant. L'anticorps monoclonal AF8 anti-calnexine a été fourni gracieusement par Mr. B. Brenner. I1 est décrit par Hochstenbach et al., (1992) Proc. National Acad. Sci. USA, 89, 4734-4738). Un antiserum de lapin à l'encontre de la protéine disulfure isomérase (PDI) a été-fourni par StressGen. Marquaqe métaboliaue et immunoPrécinitation. Des cellules ont été infectées et leurs protéines ont été marquées radioactivement par incorporation métabolique de (35 S) translabel (ICN), comme décrit précédemment par Dubuisson et al., ((1994) J. Virol. 68, 6147-6160), (1996) J. Virol., 70, 778-786). Des cellules infectées et marquées ont été ensuite lysées avec 0,5% de NP-40 dans 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 150 mM NaCl, et 2 mM d'EDTA. 20 mM d'iodoacétamide ont été inclus dans le tampon de lyse dans les expériences de mise en évidence de la formation des ponts disulfures intramoléculaires. Les immunoprécipitations ont été effectuées comme décrites précédemment (Dubuisson et al. (1996), J. Virol., 70, 778-786 précédemment cité). Dans le cas d'expériences quantitatives, les gels ont été analysés en utilisant le PhosphorImager commercialisé par Molecular Dynamics. Centrifugation à travers un gradient de saccharose. Les lysats de cellules infectées et marquées ont été déposés sur un gradient de 10 ml de saccharose 5-20% dans du TBS contenant 0,1% de NP-40. Après centrifugation à 40C durant 24 heures, à 36.000 rpm dans un rotor Beckman SW41, onze fractions ont été récoltées à partir du bas du gradient et analysées par immunoprécipitation comme décrit ci-dessus. Des marqueurs de masse moléculaire ( Combithek, protéine de calibration I; Boehringer-Mannheim) ont été centrifugés parallèlement dans un gradient de saccharose. Immunomarauase. Des cellules HepG2 co-infectées avec des recombinants vaccine-VHC ont été fixées quinze heures après l'infection avec de l'acide picrique et du formaldéhyde, enrobées dans du Tissue Tek (Miles Laboratories), congelées dans de l'azote liquide et coupées dans un cryostat comme décrit par Pillez et al.,( (1994) Neuroscience, 58, 207-215). Des sections de 2 à 3 d'épaisseur ont été ensuite révélées par immunofluorescence. Un double marquage simultané a été effectué en incubant les coupes toute la nuit à 4C avec de l'antisérum de lapin dirigé contre de la PDI (dilution 1/200) et contre l'anticorps monoclonal H2 (dilution 1/400) puis en les incubant à la température ambiante durant 1 heure avec des immunoglobulines d'âne anti-souris (FITC) et anti-lapin (TRITC) (dilution 1/100: Jackson Immunoreseach). Des coupes ont également été préparées pour la microscopie électronique, après révélation par une technique d'immunoperoxidase comme décrit par Pillez et al.(( 1994) Neuroscience, 58, 207-215). EXEMPLE 1: Identification d'un anticorPs monoclonal Qui reconnaît sélectivement les glyconrotéines du 'fliC associées de manière non covalente. Des complexes entre El et E2 ont été récemment caractérisés (Dubuisson et al., (1994) précédemment cité). En présence de détergents non-ioniques, deux formes des complexes E1E2 ont été détectées: d'une part un hétérodimère de El et E2 stabilisé par des liaisons non-covalentes et d'autre part des agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures qui représentent très probablement des complexes présentant une mauvaise conformation. Un anticorps monoclonal qui reconnaît sélectivement les complexes E1E2 correctement conformés et assemblés a donc été isolé et caractérisé. Des hétérodimères El et E2 ont été purifiés par sédimentation à travers un gradient de saccharose afin d'éliminer la plupart des agrégats et injectés à des souris BALB/c afin de produire des anticorps monoclonaux. I1 a été montré à l'aide d'expériences de chasse, qu'un anticorps monoclonal (H2), produit par une souche d'hybridome déposée auprès de la CNCM sous le n'I-1673, présente un motif d'immunoprécipitation diffèrent. de ceux précédemment décrits pour d'autres anticorps monoclonaux (figure 1, Dubuisson et al., (1994), précédemment cité). Les glycoprotéines du 'fliC précipitées par l'anticorps monoclonal H2 ne sont pas détectées avant 45 minutes après le début de la chasse, et leur intensité augmente durant la chasse. Cette absence de détection durant les premières 45 minutes des protéines précipitées par l'anticorps H2 suggère que la formation de l'épitope reconnu par cet anticorps dépend de la conformation de El et/ou E2. Le motif obtenu avec l'anticorps H2 est identique dans des conditions non réductrices ou réductrices. Par contre, dans les conditions non réductrices, les complexes liés par pont disulfure, et/ou les agrégats ont été détectés dans la partie supérieure du gel obtenu avec l'anticorps A4. L'expression séparée des glycoprotéines du 'fliC a montré que l'anticorps H2 reconnaît E2 ou le précurseur de E2, appelé E2p7, mais non El. De plus, l'anticorps monoclonal H2 ne reconnaît pas E2 dénaturé, comme le montrent des analyses effectuées par transfert de type Western. Ces résultats indiquent donc que les anticorps H2 reconnaissent un épitope présent sur E2 et précipitent de manière spécifique des glycoprotéines du 'fliC associées de manière non-covalente, qui forment un complexe natif. EXEMPLE 2: Propriétés des comnlexes qlvcoprotéiques du 'fliC précipités nar l'anticorPs monoclonal H2. I1 a été montré précédemment que les glycoprotéines du 'fliC s'associent très rapidement avec la calnexine puis se dissocient lentement (Dubuisson et al.,( 1996) précédemment cité). La calnéxine est une protéine dite "chaperon" du type lectine présente dans le réticulum endoplasmique, qui s'associe de manière transitoire avec des polypeptides néosynthétisés. Elle s'associe aussi avec des intermédiaires de conformation de glycoprotéines secrétées, durant leur maturation, jusqu'à ce qu'elles présentent une conformation correcte (Bergeron et al. (1994) Trends Biochem. Sci., 19, 124-129); (Hammond et Helenius, (1995) Curr. Opin. Cell Biol., 7, 523-529). Comme le montre la figure 2, l'anticorps H2 ne coprécipite pas la calnexine avec les glycoprotéines du 'fliC ce qui suggère qu'elles ont été dissociées de la calnexine et présentent une conformation correcte. I1 a été montré (Dubuisson et al., (1996) précédemment cité) que le repliement de El est lent, comme indiqué par l'apparition lente des ponts disulfures intramoléculaires. Dans des conditions non réductrices, l'anticorps A4 anti-El précédemment décrit précipite deux formes de El, qui correspondent aux formes réduites et oxydées. Seule la forme oxydée de El est immunoprécipitée par H2 (figure 3).La mobilité de cette dernière n'a pas été modifiée par un traitement in vivo par le DTT, ce qui indique que la co-précipitation de El par H2 se fait alors que la conformation est correcte On sait que l'acquisition de la résistance à des protéases est en corrélation avec l'état de repliement d'une protéine. La sensibilité des glycoprotéines de 'fliC à des digestions protéasiques a donc été testée. Comme le montre la figure 4, les glycoprotéines du 'fliC précipitées par l'anticorps H2 ne sont pas sensibles à l'action de la protéase V8, dans les conditions expérimentales indiquées pour la figure 8, tandis que celles précipitées par l'anticorps A4 sont partiellement dégradées.A une concentration de 100 yg/ml, seule une faible fraction (environ 5%) des glycoprotéines est résistante et peut être précipitée par l'anticorps A4. La quantité de ces formes résistantes est à peu près identique à la quantité précipitée par l'anticorps H2, avant ou après la digestion protéasique. Ces résultats indiquent que la majorité des glycoprotéines du 'fliC exprimées dans les vaccins sont dans une mauvaise conformation et sont sensibles à la protéase même après 4 heures de chasse. L'anticorps H2 reconnaît de manière sélective les complexes glycoprotéines qui sont dissociés de la calnexine et résistants à l'action protéasique, propriétés qui sont caractéristiques d'oligomères glycoprotéiques présentant une conformation correcte et correctement assemblés. EXEMPLE 3: Cinétique d'assemblage et comportement olisomérisue des complexes qlycoprotéiques du VHC . En utilisant l'anticorps H2, la cinétique de formation des oligomères des.glycoprotéines du VHC a été étudiée. Comme le montre la figure 5, le niveau d'anticorps H2 réagissant avec E2 devient détectable après une heure et montre un optimum après 4 heures de chasse. Les niveaux de protéine El coprécipitée sont parallèles à ceux de E2 et le rapport E1/E2 est similaire durant la totalité de l'expérience. Ces résultats suggèrent que l'apparition de la réactivité à H2 coïncide avec la formation tardive d'oligomères E1E2 correctement assemblés et présentant une conformation correcte. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des recombinants de la vaccine exprimant la polyprotéine du 'fliC entière ou des formes tronquées se terminant à l'extrémité C-terminale de E2 ou de p7, ce qui indique que les séquences en aval de E2 n'influencent pas de manière marquante l'assemblage des oligomères glycoprotéiques. La formation et la distribution en taille des oligomères reconnus par H2 ont été étudiées en effectuant des expériences de chasse suivies par une séparation des complexes, solubilisés dans un détergent non-ionique, par sédimentation dans des gradients de saccharose. Les protéines El et E2 précipitées par l'anticorps H2 sédimentent dans le gradient entre des masses moléculaires comprises entre 68 KDa et 158 KDa (figure 6) ce qui pourrait indiquer que des complexes hétérodimères sont formés, comme suggéré par (Dubuisson et al. (1994) précédemment cité). Aucun changement dans la sédimentation en gradient de saccharose de ce complexe n'est observé après différentes durées de chasse (1, 2 et 4 heures). La distribution des complexes E1E2 réagissant avec H2 est étroite, comparée à la distribution large observée pour les complexes précipités par l'anticorps A4. Ceci reflète probablement une homogénéité plus importante parmi les complexes E1E2 correctement assemblés et présentant une conformation correcte, par comparaison avec l'hétérogénéité en taille de ceux reconnus par l'anticorps A4, qui comprennent des complexes présentant une conformation incorrecte. EXEMPLE 4: Localisation cellulaire des complexes E1E2 réagissant avec l'anticorPs H2. L'acquisition de la résistance à l'endo-ss-N- acétylglucosaminidase H (endo H) dans des expériences de chasse, est considérée comme un marqueur du transit intracellulaire des complexes E1E2 réagissant avec l'anticorps H2. Aucune résistance endo-H n'a été détectée (figure 7) même après 8 heures de chasse, ce qui suggère que ce complexe n'est pas transporté à travers l'appareil de Golgi. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les constructions d'expression vaccine-VHC décrites ci-dessus. L'absence de reconnaissance de formes résistantes à l'endo-H n'est pas due au masquage de l'épitope reconnu par H2, puisque cet anticorps monoclonal peut précipiter une forme secrétée de E2 qui a acquis des glycannes complexes, comme le montre la résistance à l'endo-H. E2-p7 , qui est facilement distingué de E2 seulement après déglycosylation (Grakoui et al. (1993); Lin et al., (1994)) est aussi précipité par l'anticorps H2 (figure 7). Ceci suggère que deux complexes mature existent: E1E2 et E1E2p7. Des expériences d'immunomarquage indiquent que les complexes mature intracellulaires sont présents aux mêmes localisations que la protéine disulfure isomérase (PDI), une protéine qui est située dans le réticulum endoplasmique (figure 8). Des observations en microscopie électronique confirment la localisation dans le réticulum endoplasmique des glycoprotéines du 'fliC reconnues par l'anticorps H2. Aucun marquage de la surface cellulaire n'a été observé. De plus, la sécrétion de glycoprotéines du VHC à partir de cellules HepG2 n'est pas détectée en utilisant l'anticorps H2 ou d'autres anticorps monoclonaux spécifiques des glycoprotéines. Ces résultats indiquent que les complexes El et E2 (et ElE2-p7) présentant une conformation correcte ainsi que ceux ne présentant pas une conformation correcte sont retenus dans le réticulum endoplasmique. Les complexes matures identifiés par l'anticorps H2 seraient donc des complexes de prébourgeonnement. I1 est en effet suggéré que l'acquisition de l'enveloppe virale (bourgeonnement) a lieu au niveau du réticulum endoplasmique pour les Flavivindae (Pettersson, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 170, 67-104). REVENDICATIONS 1. Anticorps caractérisé en ce qu'il se fixe spécifiquement sur les complexes matures formés entre les glycoprotéines El et E2 du VHC qui présentent une conformation stabilisée par des liaisons non-covalentes. 2. Anticorps selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est monoclonal. 3. Anticorps selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il est produit par le clone d'hybridome déposé le 9 Février 1996 sous le N'I-1673 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur (CNCM). 4. Procédé de détermination de la présence de complexes formés entre les glycoprotéines El et E2 du VHC présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes: - mise en présence dudit échantillon et l'un des anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, et - détermination de la présence des immunocomplexes formés entre les glycoprotéines et les anticorps. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit échantillon est une préparation destinée à la vaccination. 6. Procédé de purification et/ou d'isolement de complexes formés entre les glycoprotéines El et E2 du VHC, présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, à partir d'un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes: - mise en contact dudit échantillon contenant ces complexes avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3 et, - isolement de l'immuno complexe formé. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les anticorps sont immobilisés sur une colonne d'affinité. 8. Préparation caractérisée en ce qu'elle contient des complexes formés entre les glycoprotéines El et E2 du VHC, présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, sous une forme substantiellement pure. 9. Préparation selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle contient au minimum 80%, préférentiellement 90% et encore plus préférentiellement 95% de complexes présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente. 10. Trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation selon l'une des revendications 8 et 9. ll.Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend une préparation selon l'une des revendications 8 et 9. 12. Trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3. 13. Utilisation de la préparation selon l'une des revendications 8 et 9 pour la fabrication d'un vaccin pour l'immunisation envers le VHC.