Brevet FR2739629A1 — publié le 19970411

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un système de sécrétion Sec-dépendant pour sécréter des protéines normalement sécrétées par un système de sécrétion Sec-indépendant. Elle a également pour objet les bactéries lactiques contenant ce système de sécrétion Sec-dépendant, en particulier les lactocoques appartenant à l'espèce Lactococcus lactis, I'utilisation de certaines souches de ces lactocoques pour transférer ledit système de sécrétion à des souches d'intérêt industriel, en particulier dans l'industrie laitière, et à l'emploi de certaines souches Lactococcus lactis pour obtenir ce système de sécrétion. La sécrétion de protéines chez les bactéries suit en général deux voies. La plus connue est le transport Sec-dépendant. Selon cette voie, la protéine est exportée grâce à la présence en position N-terminale d'un peptide-signal qui est clivé dans la protéine sécrétée. Chez E.coli, plusieurs protéines impliquées dans cette sécrétion ont été mises en évidence, en particulier SecA, SecY et SecE. Chez L.lactis, le gène secY a été mis en évidence: il possède une homologie importante avec le gène secY de E.coli indiquant que ce système de sécrétion est très vraisemblablement présent également chez Llactis(Koivulaetal., 1991, FEBS Lett. 228:114-118). La seconde voie de sécrétion chez les bactéries, ne dépendant pas des protéines Sec, implique des translocateurs transmembranaires, appelés famille des protéines A, B, C (Pugsley, 1993, Microbiol. Rev. 57: 50-108). Chez Llactis des translocateurs ont été mis en évidence ; ils sont impliqués dans la sécrétion des bactériocines LcnA, LcnB, LcnM1 et des antibiotiques lacticin 481, nisine A et nisine Z (de Vos et Simons, Genetics and Biotechnology of LA.B., Blackie Academic and Professional, 1994). L'étude de ces deux voies de sécrétion chez L.lactis a été mise à profit pour mettre au point différents systèmes de sécrétion de protéines hétérologues. L'ensemble des vecteurs de sécrétion mis au point est contenu dans la revue de de Vos et Simons, Genetics and Biotechnology of L.AB., Blackie Academic and Professionai, 1994. Les bactériocines mises en évidence chez les bactéries lactiques sont presque toutes sécrétées par le système Sec-indépendant (Dodd et Gasson, Genetics and Biotechnology of L.A.B., Blackie Academic and Professional, 1994). Cependant, pour des raisons d'augmentation de la sécrétion de ces bactériocines, il peut être important de faire sécréter ces bactériocines par un autre système de sécrétion. Des auteurs ont récemment montré que la Divergicin A, bactériocine produite par Camobacterium divergens, est sécrétée via un système Sec-dépendant yVorobo et al., J. Bacteriol. 177 : 3143-3149.). Il n'a toutefois jamais été montré chez les bactéries lactiques qu'une bactériocine sécrétée par un système Sec-indépendant pouvait être sécrétée par un système Sec-dépendant. La Demanderesse a effectué des travaux dans ce domaine et a trouvé de manière surprenante que l'on peut utiliser un système de sécrétion Sec-dépendant, pour sécréter des protéines normalement sécrétées par un système de sécrétion Sec-indépendant. Selon l'invention, le système de sécrétion Sec-dépendant est utilisé en combinaison avec la séquence d'ADN codant pour une protéine mature et normalement sécrétée par un système Sec-indépendant ainsi qu'avec un promoteur, une séquence-signal reconnue par le système de sécrétion Sec-dépendant et un terminateur appropriés. Ainsi l'invention a également pour objet les constructions d'ADN pour la sécrétion par un système Sec-dépendant de protéines normalement sécrétées par un système Sec-indépendant, qui comprennent un promoteur, une séquence-signal reconnue par le système de sécrétion Sec-dépendant, la séquence d'ADN codant pour une protéine mature et normalement sécrétée par un système Sec-indépendant, un terminateur. Ces constructions d'ADN peuvent être présentes sur un vecteur d'expression, tel qu'un plasmide, dans l'ADN génomique ou tout autre fragment d'ADN. Selon l'invention, on peut utiliser un système de sécrétion Sec-dépendant quelconque en combinaison avec un gène codant pour une protéine d'intérêt qui est normalement sécrétée par un système Sec-indépendant. Tout système de sécrétion Sec-dépendant convient aux fins de l'invention. Les systèmes de sécrétion Sec-dépendant particulièrement appropriés sont les systèmes Sec-dépendant de lactocoques, qui utilisent en particulier la séquence-signai sp de la protéase de lactocoque (protéine PrtP). On peut utiliser selon l'invention des promoteurs et terminateurs quelconques combatibles avec la souche-hôte dans laquelle le système de sécrétion de l'invention est utilisé. A titre d'exemples de gènes codant pour une protéine d'intérêt, on peut utiliser notamment les gènes codant pour les bactériocines en particulier la bactériocine Lcn B, qui est une bactériocine sécrétée par Llactis sous la dépendance d'un système de sécrétion Sec-indépendant (Van Belkum et al., 1992, Applied Environ. Microbiol., 58 : 572-577). Ainsi, selon une variante, I'invention a pour objet les vecteurs d'expression comprenant un promoteur, une séquence-signal reconnue par le système de sécrétion Sec-dépendant, la séquence d'ADN codant pour une bactériocine, telle que la bactériocine LcnB et un terminateur. Selon cette variante, le promoteur peut être avantageusement le promoteur P32 de lactocoque, la séquence-signal peut être la séquencesignal sp de la protéase (PrtP) de lactocoque et le terminateur peut avantageusement être celui du gène de l'immunité à LcnB (LcrB). L'invention a également pour objet les bactéries lactiques de préférence Llactis sécrétant une ou plusieurs bactériocines qui contiennent une construction, selon l'invention, telle que définie ci-dessus, qui permettent la sécrétion de ces bactériocines. Cette construction peut être introduite dans les bactéries lactiques par conjugaison, transformation, fusion de protoplastes ou par une autre méthode de transfert de gènes. Les bactéries lactiques qui peuvent avantageusement être transformées à l'aide de la construction selon l'invention sont par exemple Lactococcus lactis ssp cremoris, lactococcus lactis ssp lactis, lactococcus lactis ssp lactis var diacetylactis. Ces souches ainsi transformées peuvent être utilisées pour transmettre par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou une autre méthode de transfert de gènes, une construction selon l'invention à une souche d'intérêt d'intérêt industriel. Cette construction peut être portée par un plasmide ou par une autre partie du génome de la bactérie. L'invention a également trait aux souches d'intérêt industriel sécrétant des protéines ainsi obtenues telles que par exemple les bactériocines. Ces bactéries sécrétant des bactériocines peuvent être utilisées afin d'inhiber le développement de bactéries pathogènes, de lyser des bactéries afin que leur contenu enzymatique participe à l'affinage des produits fermentés par ces bactéries, ou afin d'avoir des bactéries pour tout usage impliquant une sécrétion de bactériocines par une construction selon l'invention. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après. Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook, Fritsch et Maniatis : "Molecular cloning ; a laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2e édition). La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 3 ci-après qui représentent respectivement: Figure 1: Construction du vecteur pSV123 Figure 2 : Construction du vecteur de sécrétion pSV Figure 3 : Construction du plasmide pSVLcnB permettant la sécrétion de LcnB ExemDle 1: Construction du Dlasmide vecteur de sécrétion DSV Afin de pouvoir sécréter une bactériocine dont la sécrétion est Secindépendante, il a fallu au préalable construire un vecteur de sécrétion Secdépendant. Cette construction a été faite de la façon suivante: Pour chacun des clonages où cela a été nécessaire, la technique PCR a été utilisée dans les conditions suivantes: 1 minute à 940C (dénaturation), 2 minutes à 450C (hybridation) et 2 minutes à 73-C (polymérisation), 30 cycles. Les oligonucléotides ont été synthétisés avec un synthétiseur Applied Biosystems 381A DNA (Applied Biosystems). Pour la construction du vecteur de sécrétion PSV, les oligonucléotides A, B, C, D ont été utilisés. Les séquences de ces oligonucléotides sont les suivantes (les sites de restriction utilisés pour le clonage sont soulignés, le RBS dans l'oligonucléotide B apparaît en gras): Oligonucléotide A: BgAl Bg/Il EcoRI 5'-AGATCTAGATCTGAATTC G GTCCTCG G GATATG -3' Oligonucléotide B: Pstl Pstl Clal RBS 5'-CTGCAGCTGCAGCATCGATAAATTCCTCCGMTA | ACC-3' Oligonucléotide C: Bglll Bgill Clal 5'-AGATCTAGATCTATCGATG CAAAG GAAAAAGAAAGGG CTCGATCTTG-3' Oligonucléotide D:: Pstl Pstl Sacl SacIl 5'-CTGCAGCTGCAGAGCTCGCCG CGGCCTTTGCTTGGATTTCGCCG-3' Des produits de PCR (Polymerase Chain Rection) contenant le promoteur et le site de liaison aux ribosomes RBS (Ribosome Binding Site) de l'ORF32 (Open Reading Frame = phase de lecture ouverte) ont été obtenus à partir du plasmide pMG36c (Van de Guchte et ail., 1989, Applied Environ. Microbiol., 55 : 224-228) qui dérive du plasmide pMG36e utilisé ci-après. La séquence-signal sp de la protéase de lactocoque PrtP a été obtenue à partir du gène prtP présent dans le plasmide pGKV5oO (Kok et 1988, Applied Environ. Microbiol, 54 : 221-228). Ces produits de PCR ont été clonés après digestion par les enzymes de restriction Bglll et Pstl, dans le plasmide pUK21 (Vieira et Messing, 1991, Gene, 100 :189-194), pour donner les plasmides pSV1 et pSV23 (figure 1). Ensuite, le plasmide pSV23 a été digéré par les enzymes de restriction à Clal et Ndel, et le fragment contenant la séquence-signal a été cloné dans le plasmide pSV1 préalablement digéré par les enzymes de restriction Clal et Ndel, pour donner le plasmide pSV123 (figure 1). Enfin, le fragment EcoRI-Sad de pSV123, contenant le promoteur P32 et la séquence-signal sp, a été cloné dans le plasmide pMG36e (Van de Guchte et al., 1989, Applied Environ.Microbiol., SS : 224.228), pour donner le vecteur de sécrétion pSV (figure 2) Exemple 2: Construction du olasmide pSVLcnB impliqué dans la sécrétion de la bactériocine LcnB Le plasmide pMB580 (plasmide conférant la résistance à l'érythromycine, dérivé du plasmide pGK210, contenant l'opéron de la lactococcine B, c'est-à-dire LcnB et IciB - Van Belkum et al, 1992 Applied Environ. Microbiol., 58: 572-577) a été digéré par les enzymes de restriction à Nsil et Hinolîl. L'extrémité Hinalil a été hydrolysée pour le transformer en extrémité franche.Le fragment Hinolll-Ns,l a été ligaturé au plasmide pSV préalablement digéré par les enzymes de restriction à Pstl et Sacil, et dont l'extrémité Sacil a été hydrolysée pour le transformer en extrémité franche, pour donner le plasmide pSVLcnB (figure 3).La séquence résultante en acides aminés de ce dérivé de LcnB avec la séquence-signal de la protéine PrtP est la séquence ci-après: N- MQRKKKGLSILLAG1VALGALAVLPVGEIQAKA SLOYVMSAGPYTWYKD ERTGKTEC KOTI DTASYTFGVMAEGWGKTFH -C Exemple 3: Sécrétion de LcnB Dar un svstème de sécrétion Sec-déoendant Le plasmide dérivé du plasmide pSV (pSVLcnB), contenant le gène de structure de la lactococcine LcnB (IcnB) et le gène de l'immunité à LcnB (,c/IB), ont servi à transformer la souche E. coll JM101 (Maniatis et ail., 1982, Molecular Cloning : a laboratory manual.Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), la souche Lactococcus lactis MG1363 (Gasson, 1983, J. Bacteriol., 154:1-9) et la souche Lactococcus lactis IL1403 (Chopin et al., 1984, Plasmid, 11, : 260-263). Dans ces constructions, I'extension N-terminale de la prébactériocine a été remplacée par le peptide signal de PrtP (figures 1, 2 et 3). Afin de tester l'activité bactériocine, les souches ont été recouvertes par une surcouche de la souche IL1043 contenant, soit pMG36e, soit pMG36c. Ce test a été réalisé de la façon suivante: Des colonies contenant la construction (pSVLcnB) ont été incubées 16h à 300 C sur des boîtes de M17 (Terzaghi et Sandine, 1975, Appl. Microbiol, 29 : 807-813) + glucose 5 g/l + agar 5 g/l. Après exposition à des vapeurs de chloroforme pendant 20 minutes, les boîtes ont été partiellement séchées à l'air pour éliminer les traces résiduelles de chloroforme. Puis, on a étalé sur ces boîtes 4 ml de gélose M17 + glucose 5 g/l + agar 7 9/1 inoculé avec 40 pI de culture de nuit de la souche indicatrice Llactis IL1403, contenant pMG36e ou pMG36c. Après incubation à 30- C pendant 12 à 18 h, les boîtes ont été analysées pour les zones d'inhibition (halos) autour des clones. Les essais de surcouche sur des gels de tricine ont été effectués selon le mode opératoire décrit par Van Belkum et al., 1992, dans Applied Environ. Microbiol., 58 : 572-577. Les résultats ont montré que l'on a un halo d'inhibition autour des clones contenant pSVLcnB. Ce halo est plus large autour des clones contenant pSVLcnBc. Cela indique que la bactériocine LcnB a bien été sécrétée grâce à pSVLcnB et pSVLcnBc. Afin de confirmer ce résultat, et surtout de savoir si l'activité bactériocine est due à une forme maturée (sans le peptide signal sp) ou non maturée (avec le peptide signal sp), des surnageants de culture de souche IL1403 contenant pSVLcnB ont été soumis à une précipitation au sulfate d'ammonium, et le précipité a été testé sur gel d'électrophorèse tricine SDS-PAA. Les gels ont ensuite été examinés pour l'activité bactéricide. Les résultats montrent que l'on a une inhibition de croissance dans la zone des 3, 4 KDa, correspondant à la taille de la bactériocine LcnB maturée, c'est-à-dire débarrassée de la séquence-signal sp. Comme la souche Lactococcus lactis MG1363 ne possède pas le système de sécrétion Sec-indépendant des bactériocines, la bactériocine LcnB produite grâce au plasmide pSVLcnB a bien été sécrétée via le système de sécrétion Sec-dépendant, en utilisant la séquence-signal sp de la protéase de lactocoque PrtP. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un système de sécrétion Sec-dépendant pour sécréter des protéines normalement sécrétées par un système de sécrétion Sec-indépendant. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le système de sécrétion Sec-dépendant utilise la séquence-signal sp de la protéase de lactocoque. 3. Construction d'ADN pour la sécrétion par un système Sec-dépendant d'une protéine normalement sécrétée par un système Sec-indépendant, caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur, une séquence-signal reconnue par le système de sécrétion Sec-dépendant, la séquence d'ADN codant pour une protéine mature et normalement sécrétée par un système Sec-indépendant, un terminateur. 4. Construction selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence-signal reconnue par le système de sécrétion Sec-dépendant est la séquence-signal sp de la protéase de lactocoque. 5. Construction selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que la séquence d'ADN codant pour la protéine est la séquence d'ADN codant pour une bactériocine. 6. Construction selon la revendication 5, caractérisée en ce que la bactériocine est la bactériocine IcnB. 7. Construction selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que le promoteur est le promoteur P32 de lactocoque et le terminateur est celui du gène de l'immunité à IcnB (IciB).