Brevet FR2747044A1 — publié le 19971010

La présente invention concerne un procédé d'extraction/purification d'une superoxyde dismutase à partir de graines de végétaux après germination, et de sa combinaison avec une peroxydase accompagnée de son cofacteur enzymatique. Ce complexe enzymatique stable dans une formulation cosmétique est utilisable dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou agroalimentaires. INTRODUCTION Plus précisément, I'invention vise à obtenir une superoxyde dismutase (en abrégé ci-après SOD) à partir de graines de végétaux germées, c'est-à-dire ayant subi une étape de germination, qui présente une activité enzymatique forte, ainsi qu'une stabilité supérieure lorsque cette SOD préparée après germination des graines de végétaux est utilisée dans des compositions antiradicalaires, en combinaison avec une autre enzyme capable de détruire les sous-produits de la réaction de dismutation des superoxydes, principalement l'eau oxygénée oui202), telle que catalases ou peroxydases. L'invention trouve ainsi une application avantageuse dans des compositions cosmétiques, des compositions pharmaceutiques ou dermatologiques, ou des compositions agroalimentaires. On sait que les radicaux libres sont des atomes ou des molécules qui comportent un électron non apparié sur leur orbitale externe. Ce sont des composés extrêmement instables qui peuvent réagir avec les molécules les plus stables pour apparier leur électron. Les radicaux libres oxygénés se forment en permanence dans l'organisme, dans les mitochondries ou lors des processus de phagocytose. Les facteurs physiques tels que l'exposition aux ultraviolets ainsi que l'environnement dans lequel l'homme évolue sont également des facteurs de forte production de radicaux libres au niveau des composés biologiques. Ces facteurs sont, par exemple, la pollution automobile, le tabac, les rayonnements ionisants, etc. Les radicaux libres oxygénés sont formés par réduction partielle de l'oxygène moléculaire. La capture d'un électron par l'oxygène, va générer le radical superoxyde o2A. Cet anion est peu réactif mais il peut générer des espèces radicalaires très réactives. La dismutation enzymatique de l'anion superoxyde réalisée par une SOD, conduit à la formation d'eau oxygénée qui en présence de fer ferreux, subit la réaction de Fenton pour former le radical hydroxyle OH-, très réactif. Du fait de leur grande réactivité, les radicaux libres sont capables de s'attaquer à tous les constituants cellulaires et de provoquer de graves altérations: au niveau de la peau, les radicaux libres, en particulier l'anion superoxyde, ont pour cible majeure le collagène mais également les fibres d'élastine, les glycosaminoglycannes et les protéoglycannes, 1'ADN intracellulaire, les phospholipides des membranes cellulaires, etc. Le collagène et les fibres élastiques captent directement les radicaux libres formés, au prix de dégradations diverses : rupture de chaînes et libération de petits peptides dégradés par des protéases non spécifiques, liaisons interchaines réduisant l'élasticité. Aussi, dans le but de faire face aux effets destructeurs des formes activées de l'oxygène, il est devenu de plus en plus nécessaire de préparer des compositions à base d'antioxydants dans tous les domaines, et en particulier en cosmétique, pharmacie ou agroalimentaire. En cosmétique, de telles compositions ont été mises sur le marché et sont dénommées produits antiâge ou antivieillissement. ETAT DE LA TECHNIQUE Les antioxydants utilisés actuellement en cosmétique ou en pharmacie sont soit des molécules chimiques capteurs de radicaux libres, soit des systèmes enzymatiques dont l'inconvénient majeur est une très mauvaise stabilité même à la température ambiante. Les capteurs lipophiles utilisés sont généralement la vitamine E et le carotène, composants des membranes cellulaires qui les protègent de la peroxydation lipidique en réduisant les radicaux peroxydes formés. Les antioxydants hydrophiles utilisés sont généralement constitués par la vitamine C, qui agit dans les milieux aqueux vis-à-vis des radicaux superoxydes et hydroxyles, mais aussi par des cofacteurs enzymatiques comme le glutathion et le zinc. Le glutathion, est le cofacteur de nombreuses enzymes impliquées dans la défense antiradicalaire (telles que glutathion peroxydase, la glutathion transférase, etc.) tandis que le zinc est le cofacteur de la SOD à cuivrezinc. L'enzyme utilisée en cosmétique ou pharmacie est la SOD dont le rôle est d'assurer la destruction quasi-instantanée des radicaux superoxydes potentiellement nuisibles pour l'organisme et les tissus de la peau. La réaction catalysée par la SOD est la dismutation de t'anion superoxyde en eau oxygénée ou peroxyde d'hydrogène selon la réaction chimique suivante: fi existe plusieurs enzymes aussi dénommées isozymes de superoxyde dismutase qui ont été principalement isolées de germe de blé ("wheat germ") et l'homme de l'art pourra se reporter à l'articule de Beauchamp publié dans la revue Biochimica et Biophysica Acta, 317 (1973), 50-64. Dans cet article, Beauchamp rapporte avoir isolé trois enzymes SOD, I'unc dite SOD Mn, sensible au manganèse qui n'est pas inhibée par du cyanure 0,2mM mais est inactivée par le traitement de Tsuchihashi à base de chloroforme plus éthanol, ainsi que deux autres SOD du type SOD Cu-Zn qui sont inhibées par le cyanure mais non affectées par le traitement avec le chloroforme plus éthanol. Ces dernières contiennent un ion cuivrique Cu2+ et un ion Zn2+ par protomère et ont un poids moléculaire de l'ordre de 30000 Dalton. On rappellera que la SOD Cu-Zn, présente au niveau des tissus cutanés, constitue la première ligne de défense enzymatique contre les radicaux libres générés par les ultraviolets. Mais il est intéressant de constater que l'enzyme voit son potentiel de détoxification diminuer fortement après irradiation par les ultraviolets. Cette constatation a, par ailleurs, conduit les professionnels de la cosmétologie ou de la pharmacie à incorporer la SOD dans des formulations afin de diminuer le taux des radicaux libres présents au niveau des tissus cutanés. fi a été ainsi proposé par la société l'Oréal dans le document US-A-4,129,644 d'utiliser une enzyme superoxyde dismutase dans une composition cosmétique et dans un procédé comportant des applications pour maintenir la structure kératinique de la chevelure ou pour protéger la peau et les cheveux par application d'une telle SOD. La SOD était principalement obtenue à partir de sang de boeuf ou de différentes souches bactériennes (revendications 2 à 5). La société l'Oréal a encore proposé dans le document WO 92/19224 une composition topique antiradicaux libres à base de SOD d'origines diverses (animale, humaine, bactérienne, levure ou biotechnologique) et d'un dérivé d'acide phosphonique en tant qu'agent complexant des métaux pour lutter contre le vieillissement cutané et la protection de la peau contre les irradiations en se basant sur la mise en évidence que certains agents complexant inactivateurs de métaux pouvaient, dans certains cas, atténuer la production des radicaux hydroxyles (OH') toxiques. n est encore connu par le document FR-A-2 634 125 Nippon une composition de superoxyde dismutase stabilisée comprenant de la SOD, un phosphate, un chlorure de métal alcalin ct du saccharose (voir le titre les revendications). La SOD est en fait extraite à partir de sang humain. fi est encore connu, par le document FR-A-2 693208 Inocosm, un procédé d'obtention d'une composition enzymatique de SOD d'origine végétale à partir de céréale telle que du germe de blé par extraction à l'aide d'un alcool liquide, élimination des polyphénols à l'aide d'un agent de fixation tel que polyamide ou polyvinylpyrrolidone, lavage puis enfin extraction des protéines et des enzymes à nouveau à l'alcool liquide. L'activité SOD obtenue est très faible et l'utilisation de solvants rend l'extrait de SOD difficile à utilise Jusqu'à présent, la SOD industrielle a été obtenue par extraction à partir d'érythrocytes bovins disponibles en quantité importante dans les abattoirs. D'autre part, bien qu'il soit connu depuis au moins l'articule de Beauchamp et al. dans Biochimica et Biophysica Acta, 317 (1973) pages 50-64, d'extraire la SOD à partir de germes de blé, et qu'au moins un brevet similaire ait été déposé par Inocosm en 1992 (FR-A-2 693 208), la proportion d'extraction en SOD d'origine végétale s'est révélée très faible en raison d'une part d'une faible proportion en SOD dans les germes de céréales et, d'autre part, par t'emploi d'un procédé d'extraction en milieu solvant de faible rendement. Ainsi, la présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution qui permette d'obtenir une SOD d'origine végétale en grande quantité avec un très bon rendement de manière à l'utiliser à l'échelle industrielle, en particulier dans le domaine cosmétique, pharmaceutique ou agroalimentaire. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution qui permette d'obtenir une SOD d'origine végétale extrêmement active et également extrêmement stable, de préférence en étant capable de conserver 80 % d'activité pendant 1 mois (35 jours) à température ambiante et une activité de t'ordre de 50 % à 45-C en permettant ainsi une incorporation efficace dans des compositions anti radicalaires, notamment dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou agroalimentaires. L'ensemble de ces problèmes techniques a été résolu pour la première fois d'une manière simple, sûre et fiable par la présente invention, ce qui constitue un résultat technique inattendu et non évident pour un homme de l'art. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne t'utilisation de graines de végétaux après germination, comme source d'extraction de SOD. Dans le cadre de l'invention, les termes grains ou graines sont équivalents. Selon un mode de réalisation particulier, ces graines de végétaux sont des graines de céréales ou des graines de plantes légumineuses ou des graines de plantes oléagineuses. Comme céréales, on peut utiliser toutes les céréales, en particulier le seigle, le maïs, le blé ou l'orge, de préférence l'orge, parmi les variétés d'orge utilisables, on peut utiliser des variétés de printemps ou d'hiver. Pour les légumineuses, on utilisera des graines d'une plante légumineuse quelconque mais de préférence les graines de lentille ou de pois. Pour les oléagineuses, on utilisera des graines d'une plante oléagineuse quelconque mais de préférence les graines de soja. Selon une autre variante de réalisation, l'étape de germination préalable comprend une germination pendant une période de temps suffisante pour augmenter l'activité SOD. Cette période de temps de germination est variable selon les céréales et les légumineuses mais est aisée à déterminer par l'homme de l'art une fois que celui-ci sait selon l'invention que la germination permet d'augmenter l'activité SOD. Selon un mode de réalisation actuellement préféré, la graine est mise en germination pendant plusieurs jours en suspension dans l'eau, de préférence en présence d'un agent favorisant la germination à la température ambiante. Un tel agent favorisant la germination est de préférence un composé appartenant à la famille des gibberellines. Selon un mode de réalisation davantage préféré, la germination de la graine est précédée par un trempage dans une solution aqueuse à la température ambiante ou à froid pendant un ou plusieurs jours, par exemple deux jours. Le déclenchement de l'étape de germination est de préférence réalisé par ajout d'un agent favorisant la germination de préférence un composé appartenant à la famille des gibberellines. D'autres caractéristiques de l'utilisation selon l'invention apparaîtront aussi clairement à partir des revendications et de la description prise dans son ensemble. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne également un procédé d'extraction de SOD caractérisé cn ce qu'on utilise comme source, des graines de végétaux ayant subi une étape de germination. Selon un mode de réalisation avantageux, l'étape de germination comprend une mise en suspension des graines de végétaux dans une solution aqueuse pendant plusieurs jours à la température ambiante. Selon un mode de réalisation préféré, cette étape de germination a lieu en présence d'un agent favorisant la germination, encore de préférence constitué par un composé appartenant à la famille des gibberellines. Selon une variante de réalisation avantageuse du procédé, l'étape de germination est précédée d'une étape de trempe dans une solution aqueuse à température ambiante ou à froid pendant un ou plusieurs jours, par exemple deux jours. Selon encore une autre variante de réalisation du procédé selon l'invention, l'étape d'extraction de la SOD à partir des graines germées comprend un broyage de la graine germée suivi d'une extraction dans une solution aqueuse tamponnée ayant un pH voisin de 8 à la température ambiante pendant une période de temps suffisante pour réaliser l'extraction de la SOD, en général de quelques dizaines de minutes à une ou plusieurs heures, suivie d'une filtration et récupération du filtrat contenant la SOD. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé d'extraction, on peut réaliser une purification plus poussée de la SOD par traitement du filtrat avec un agent de précipitation permettant d'éliminer les protéines indésirables incluant les protéases ou encore la lipoxygénase, et récupération de la fraction non précipitée ou constituant le surnageant qui contient la SOD. Selon une autre variante de réalisation encore plus avantageuse, on peut procéder à une dialyse de la fraction non précipitée contenant la SOD par dialyse contre de l'eau ou une solution aqueuse, avec une membrane ayant de préférence un seuil de coupure compris entre 6000 et 8000 Dalton. Selon encore une autre variante particulièrement préférée, on peut encore réaliser une purification complémentaire de la solution dialysée en procédant par une purification sur une colonne chromatographique qui sera de préférence constituée dans le cadre de l'invention par une colonne QAE Sephadex à l'aide d'une solution d'élution appropriée. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé selon t'invention, on peut réaliser une stabilisation de SOD obtenue directement après l'étape d'extraction précitée, c'est-à-dire avant une purification plus poussée, ou après purification, par ajout d'un agent piégeur de H202, comme une peroxydase avec de préférence un cofacteur de peroxydase encore dénommé substrat réducteur spécifique de peroxydase. De préférence, la quantité de peroxydase rajoutée à la SOD exprimée dans un rapport d'unité de peroxydase par rapport aux unités SOD est comprise selon l'invention entre 10 et 400 tandis que pour le cofacteur enzymatique de la peroxydase celui-ci est de préférence présent en une concentration comprise entre 0,001 M et 1M par rapport au complexe SOD/ peroxydase. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé selon t'invention, on peut aussi réaliser une stabilisation de la SOD par ajout après l'étape d'extration, ou après l'étape de purification, d'au moins un sucre, en particulier un monosaccharide ou un disaccharide et/ou d'au moins un polyol, en particulier un polyol ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 et 1000 g/mole. De préférence, le sucre ou le polyol sera ajouté à une concentration comprise entre 10 et 50 % en poids de la SOD ou du complexe final de SOD, sous forme d'extrait brut ou purifié. Après extraction sans ou avec purification, on obtient un extrait contenant une activité SOD que l'on peut doser par la méthode bien connue à l'homme de l'art de Nebot C., et al., publiée dans Analytical Biochemistry, 214 (1993) pages 442-451. Cette méthode de Nebot est basée sur la propriété qu'a tout catalyseur pourvu d'une activité SOD d'accélérer, à pH alcalin, l'autoxydation d'un réactif R1 en un chromophore absorbant la lumière visible, selon la réaction suivante: La méthode S0 > 525 exploite également un deuxième réactif R2 qui permet d'éliminer les interférences majeures dues aux mercaptans qui pourraient être présents dans l'échantillon à analyser, comme par exemple le glutathion, à t'aide d'une réaction d'alkylation très rapide, selon la réaction: La mesure de l'activité SOD est effectuée à un pH de 8,8, ce qui permet une sensibilité optimale du dosage sans inactivation des SOD naturelles connues, telles que par exemple les SOD cuivre-zinc, à manganèse ou à fer. n existe un kit de dosage, commercialisé par Oxis Intemational SA., (94385 BONNEUIVMARNE, FRANCE), permettant de réaliser un dosage spectrophotométrique de l'activité SOD par cette méthode SOD-525. Ce kit comprend deux réactifs, R1 et R2, et une solution tampon, tampon 3, qui sont respectivement: Roi : une solution de réactif chromogène R1 dans 3,2.10-2 M HC1 de la formule précitée; R2 : une solution du réactif R2 piégeur de mercaptans dans le DMSO contenant 25 % (P/V) d'éthylèneglycol; tampon 3 : un tampon à pH = 8,8 (à 37-C) contenant 0,11 mM d'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA). Avec ce kit de Oxis International, commercialisé sous le nom kit SOD-525, les mesures spectrophotométriques sont réalisées dans des cuves en verre de 1 cm de trajet optique, à une longueur d'onde de 525 nm. La mesure cinétique de l'évolution de l'absorbance est réalisée pendant 1 minute à 37-C. Pour chaque mesure, la vitesse de réaction est déterminée en évaluant la pente maximale de la courbe obtenue. Cette pente correspond à une phase d'autoxydation de R1. Les résultats sont exprimés en unités d'absorbance par minute. Le calcul de l'activité enzymatique est réalisé comme suit: Soient Vc et Vs les vitesses de réaction correspondant respectivement au contrôle et à l'échantillon. L'activité SOD de l'échantillon à analyser est déterminée en calculant la correspondance entre le rapport expérimental Vs/Vc et l'activité SOD, déduite de t'équation suivante: (1] Vs [SOD] avec a = 0,073 et b = 0,93 Vc a[SOD]+b Une unité d'activité SOD-525 définie par Oxis correspond à un rapport Vs/Vc égal à 2 dans les conditions ci-dessus. La valeur obtenue est alors multipliée par le facteur de dilution de l'échantillon (facteur 25) dans la procédure de dosage. Les résultats sont exprimés en unités d'activité SOD-525 par ml d'échantillon. Dans le cadre de l'invention, on mesure l'activité enzymatique SOD après dilution de la solution de SOD obtenue afin de rester dans des valeurs de rapport Vs/Vc permettant d'établir une correspondance correcte avec t'activité SOD. Dans le cadre de l'invention, on diluera en général la solution de SOD obtenue, en fonction du degré de purification résultant du procédé d'extraction jusqu'à un facteur de 300, afin d'obtenir un rapport Vs/Vc compris entre 1 et 2. L'activité de la solution de SOD est déterminée en tenant compte du facteur de dilution de l'échantillon de la procédure de dosage (facteur 25) et du facteur de dilution de la solution de SOD elle-même (par exemple jusqu'à un facteur de 300). Les exemples de dosage seront donnés en relation avec les exemples. L'invention couvre également des compositions notamment à activité antiradicaux libres, par exemple des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou agroalimentaires caractérisées en ce qu'elles comprennent comme l'un des ingrédients actifs une SOD végétale obtenue à partir de graines de végétaux ayant subies une étape de germination. Dans ce troisième aspect, la proportion d'incorporation est variable et dépendra de l'application envisagée. Généralement, la proportion d'incorporation de SOD sera de 0,01 à 30 % en poids, mieux de 0,1 à 10 % en poids et encore mieux de l'ordre de 1 à 5 %. Selon un mode de réalisation avantageux de cette composition, la SOD est présente sous forme de complexe SOD/peroxydase avec de préférence un cofacteur de peroxydase encore dénommé substrat réducteur spécifique de la peroxydase. Les peroxydases catalysent la destruction de l'eau oxygénée (H202) produite lors de la réaction de dismutation catalysée par la SOD de l'anion superoxyde en eau oxygénée comme rappelé en début de description en présence d'un substrat réducteur spécifique dit cofacteur de peroxydase. Les peroxydases sont nombreuses et bien connues à l'homme de l'art. Elles sont actuellement extraites à partir de la moelle épinière ou myelo peroxydase, du lait ou lactoperoxydase, des hématies bovines ou éventuellement humaines ou glutathion peroxydase ou encore de préférence selon l'invention à partir du radis noir ou peroxydase de raifort. Par ailleurs, les substrats réducteurs spécifiques des peroxydases sont bien connus à l'homme de l'art et sont de préférence choisis parmi le glutathion, phénol, guaiacol, pyrogallol, mésitol, acide 3,5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonique (DCHBS), aniline, p-toluidine, o-phénylène diamine, mésidine, acide ascorbique, acide dihydroxymaléique, cytochrome C, iodures, acide urique, phénolphtaléine, acide 2,2'-azido-di(3-éthylbenzo-thiazoline (6) sulfonique) (ABTS) et des composés tels que SCN-, Cl-, Br- ou I-. Dans le cadre de l'invention, et notamment pour une application en cosmétique ou en pharmacie ou en agmalimentaire, on préfere réaliser un complexe de SOD avec une peroxydase végétale extraite de préférence du radis noir, avantageusement accompagnée de son cofacteur, constitué de préférence par l'acide urique, l'acide ascorbique ou l'acide dihydroxymaléique. La quantité de peroxydase rajoutée à la SOD est fonction du taux d'eau oxygénée libérée par la SOD, donc de son activité enzymatique. Le nombre d'unités peroxydases à rajouter à la solution de SOD est exprimé dans un rapport d'unités peroxydases par rapport aux unités SOD compris selon l'invention entre 10 et 400. Le cofacteur enzymatique de la peroxydase tel que précédemment décrit, qui peut être de préférence l'acide urique est rajouté au complexe enzymatique à une concentration comprise entre 0,001 M et 1 M par rapport au complexe SOD/peroxydase. Selon une variante de réalisation préférée de l'invention, la SOD ou le complexe SOD/peroxydase/cofacteur de peroxydase peut être encore stabilisé par au moins un sucre et'ou au moins un polyol ajouté à une concentration comprise entre 10 et 50 % en poids de SOD ou du complexe final, sous forme d'extrait brut ou sous forme purifiée. Comme sucre, on utilisera en particulier un monosaccharide ou un disaccharide et notamment le tréhalose et comme polyol on utilisera en particulier un polyol ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 et 1000 g/mole, par exemple le glycérol, le sorbitol, le maltitol et le mannitol. L'ajout d'un sucre ou d'un polyol permet de stabiliser de manière particulièrement inattendue l'activité de la SOD. Par ailleurs, selon encore un autre mode de réalisation préféré de l'invention, on ajoute un agent antioxydant avantageusement lipophile, de préférence de la famille des tocophérols et leurs dérivés, tels que leurs esters comme les acétates, linoléates ou même les phosphates car il a été découvert de manière particulièrement inattendue qu'un tel agent antioxydant procure une stabilité accrue à la SOD. Les phosphates tocophérols sont, par exemple, décrits dans le brevet US NOS ,387,5 79 de LVMH RECHERCHE. Ce résultat est particulièrement inattendu étant donné que la stabilité de l'enzyme SOD n'est pas liée à des problèmes d'oxydation et de ce fait le mécanisme d'action est actuellement inconnu. Etant donné que cet agent antioxydant est avantageusement lipophile, celui-ci sera ajouté dans la composition dans une phase huileuse, c'està-dire en général dans le cadre de la formation d'une émulsion. La concentration en agent antioxydant sera généralement de 0,01 à 3 %, de préférence de 0,1 à 1 %, en poids par rapport au poids total de la composition finale. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, toutes les proportions sont données en poids sauf indication contraire. Les exemples font partie intégrante de l'invention et toute caractéristique des exemples qui apparaîtrait nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque constitue une caractéristique générale de l'invention revendiquée en tant que telle. Exemple 1 Extraction de SOD a partir d'orge germe Cette extraction de SOD a lieu de la manière suivante: a) Germination de l'orge: On prend de l'orge disponible dans le commerce, par exemple ta variété d'orge de printemps Dallas que l'on fait tremper dans une solution aqueuse, par exemple l'eau du robinet ou de préférence t'eau déminéralisée, à froid, par exemple à 15-C, pendant un ou plusieurs jours, par exemple deux jours. Après ce trempage, qui a pour but de faire gonfler les grains, et de préparer ainsi la germination, on procède à l'étape proprement dite de germination pendant plusieurs jours, par exemple cinq jours, de préférence en présence d'un agent favorisant la germination, tel que l'acide gibbérellique à une concentration de 0,1 mg/kg de grains de départ. b) Protocole d'extraction: Le protocole d'extraction à partir de l'orge germé, aussi dénommé malt est le suivant: Après germination des grains d'orge, le malt est broyé, puis extrait dans une solution aqueuse tampon ayant un pH de l'ordre de 8, qui est de préférence constituée par Tris HCI 50mM + EDTA lmM, pendant environ 1h à température ambiante. L'extrait est ensuite filtré pour éliminer l'écorce, puis centrifugé à 4000G pendant 20minutes pour éliminer la partie polysaccharidique et on récupère le filtrat ou surnageant sur lequel on détermine l'activité SOD par la méthode précitée de Nebot C., et al. (1993) à l'aide d'un kit commercial de Oxis International, 94385 BONNEUIUMARNE, FRANCE. On obtient une activité SOD-525/g de matière sèche de départ. L'activité SOD est mesurée après dilution de 1 ml de l'extrait de SOD dans 14 ml d'eau. 40 ssl de la solution diluée sont dosés. Le rapport Vs/Vc mesuré est de 1,95. D'après l'équation (1) précitée, page 9, l'activité SOD est de 0,95 unités SOD-525. L'activité SOD est donc égale à 0,95 x 25 x 15 = 356,25 unités SOD525/ml soit dans cet exemple 1482 unités SOD-525/g de matière sèche de départ. c) Punfication complementaire: Le filtrat ou surnageant obtenu à l'issue de la centrifugation ci-dessus est soumis à une précipitation par un agent précipitant éliminant les protéines indésirables telles que les protéases ou encore la lipoxygénase, par exemple du sulfate d'ammonium à une concentration de 390 g/l. On procède à une centrifugation à 4000 G pendant 20 minutes à 20C pour éliminer le précipité et l'on récupère la fraction liquide constituée par le surnageant qui contient la SOD. On peut avantageusement dialyser le surnageant pour éliminer des petites molécules et des sels présents en forte concentration ayant un poids moléculaire inférieur à 6000 Dalton. Cette dialyse est effectuée contre de l'eau déminéralisée avec des membranes dont le seuil de coupure est de 60008000 Dalton, par exemple 6000 Dalton. En effet, la SOD a un poids moléculaire de l'ordre de 30000, qui ne passe pas dans les pores de telles membranes, ce qui permet d'augmenter l'activité spécifique de l'enzyme. L'activité SOD mesurée sur le dialysat selon la méthode précédente est de 7500 unités S0D-525/g de matière sèche de départ. d) Punfication éventuelle complementalre sur colonne. A partir du dialysat obtenu à l'étape c) ci-dessus, il est encore possible de réaliser une purification beaucoup plus poussée en travaillant sur colonne chromatographique. On peut, par e Exemple 4 Extraction de SOD a partir de pois germes On utilise des pois blancs disponibles dans le commerce (Pisum sativum). On utilise le même protocole que celui décrit à l'exempte 1 et on mesure l'activité SOD sur le produit obtenu à l'étape b. On obtient une activité SOD de 80 UISOdg de matière sèche de départ. Exemple 5 Mesure de la variation de l'activité SOD a des temps de germination différents ou avec des variétés d'orge différentes en présence ou non d'agent activant la germes nation tel qu'une molécule issue de la famille des gibberellines Exemple 5-a Mesure de la variation de l'activité SOD a des temps de germination differents On a mesuré l'activité SOD à partir de l'orge germé de variété Dallas en faisant varier le temps de germination et en respectant les autres conditions générales du protocole des germinations de t'exempte 1-a. On obtient les résultats indiqués au tableau I ci-après. TABLEAU I Activité SOD en UISOdg Temps de germination (jour) de matière sèche SO 1 120 2 290 3 410 4 480 5 On constate à partir des résultats du tableau I que l'activité SOD est plus que doublée après 1 jour de germination et qu'elle est encore une fois plus que doublée au troisième jour de germination et qu'elle augmente encore de manière considérable les quatrième et cinquième jour. Exemple 5-b Mesure de l'influence de la variéte d'orge sur l'activité SOD On a mesuré l'influence de la variété d'orge sur l'activité SOD et les résultats obtenus sont rapportés au tableau II ci-après. Cette comparaison a été effectuée à temps de germination constant de 5 jours mais sans agent favorisant la germination, les autres conditions du protocole de germination étant identiques à celui de l'exempte 1-a. TABLEAU II Variété d'orge Activité SOD en UISOD/g de matière sèche Natasha 239 Felicie 271 Dallas 214 Magie 218 Puffin 247 On constate à partir du tableau II qu'il existe une légère variation dans les résultats obtenus en activité SOD pour diverses variétés d'orge mais que ces résultats sont parfaitement concordant, ce qui prouve la reproductibilité de la procédure de germination selon la présente invention. ExempleS-c Influence de la presence de molecule issue de la famille des gbberellmes n a également été déterminé t'influence de la présence d'un agent favorisant la germination, tel que l'acide gibbérellique et les résultats sont répertoriés au tableau m. Ces essais ont été réalisés avec de l'orge de printemps variété Natasha selon le protocole de l'exemple 1 avec un temps de germination de 5jours. TÂBT;FÂIIm Acide gibbérellique Activité SOD en UISOD/g de matière sèche sans 239 avec 0,1 mgSkg de grains 407 On peut constater à partir du tableau m que la présence d'un agent favorisant la germination permet d'accroître de manière particulièrement inattendue la quantité de SOD produite. Exemple6 Stabilisation de la SOD par un polyol La SOD sous forme d'extrait brut obtenue à t'exempte 1 étape b) conserve 60 % de son activité enzymatique après 46 jours à 20 C. On a constaté que si t'on ajoute à l'extrait brut 20 % en poids par rapport à la solution finale de cet extrait brut, c > est-à-dire extrait SOD de l'étape 1-b plus sorbitol à 20 % en poids de la solution finale, on améliore de manière inattendue la stabilité de l'enzyme SOD puisque 76 % de l'activité initiale est retrouvée après 46 jours à 20-C. Exemple 7 Stabilisation de la SOD par un sucre On a découvert que l'on pouvait stabiliser l'activité enzymatique de la SOD par ajout d'un sucre en particulier un monosaccharide ou un disaccharide. Dans cet exemple, on utilisera le tréhalose. Si l'on procède comme décrit à l'exemple 6, mais en ajoutant 30 % en poids de tréhalose à l'extrait brut de SOD obtenue à l'exemple 1 étape b), par rapport au poids de la solution finale, on constate que lton conserve 75 % d'activité initiale après 46 jours à 20-C, ce qui constitue une amélioration de stabilité remarquable. Exemple 8 Stabilisation de la SOD par une peroxydase et un cofacteur La solution concentrée en SOD obtenue à l'étape 1-d ou obtenue à une étape antérieure de t'exempte 1 est complexée ou combinée à une autre enzyme capable de détruire t'eau oxygénée formée. Les enzymes qui peuvent être utilisées dans ce sens peuvent être une catalase qui transforme H2 2 en H20 et O2mais la catalase n'est pas utilisée dans la mesure où celle-ci figure dans la liste des produits non autorisés en cosmétologie. On peut aussi utiliser une peroxydase qui catalyse aussi la destruction de H2 2 qui nécessite cependant la présence d'un substrat réducteur spécifique ou cofacteur. Les listes de peroxydases et de cofacteurs ont été données dans l'introduction de la description. Dans le cadre de cet exemple, on utilisera comme peroxydase une peroxydase végétale extraite du radis noir ou peroxydase de raifort, ci-après en abrégé dénommée HRP, combinée à un cofacteur enzymatique constitué par l'acide urique. Dans le cadre de cet exemple, la quantité de peroxydase rajoutée à la SOD est d'environ 10 unités peroxydases pour 400 unités SOD, l'unité SOD étant mesurée selon la méthode précédemment décrite et l'unité peroxydase étant déterminée par la méthode décrite par Bergmeyer H.U. dans Methods of Enzymatic Analysis (1974), vol. 1, 2nd ed. page 494. Le cofacteur enzymatique de la peroxydase constitué ici par t'acide urique est rajouté au complexe enzymatique SOD/peroxydase en une concentration comprise entre 0,01 et 1 M, et de préférence 0,5 M. De préférence, le complexe ainsi formé est encore stabilisé par l'ajout de sucre ou de polyol ajouté à une concentration choisie dans cet exemple à 30 % en poids de la solution finale. Ce complexe SOD/peroxydase/cofacteur peut être utilisé tel quel pour formuler des compositions à activité antiradicalaire ou de piégeage des radicaux libres, que ce soit des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou agroalimentaires ou autres. Ce complexe fait aussi l'objet d'essais de stabilité, de capacité antiradicalaire et de toxicologie objet respectivement des exemples 9, 10 et 11 ci-après. Exemple9 Essais de stabilité La stabilité de l'activité enzymatique du complexe formé à l'exemple 8 a été réalisée à 20'C et 45-C respectivement et les résultats obtenus sont répertoriés au tableau IV ci-après. TABLEAU IV Jours Activité SOD Activité SOD Unités SOD-525/ml Unités SOD-525/ml 2o.C 4 0 5025 5025 7 4800 4275 11 7575 3575 13 5925 3150 18 4500 2800 20 2475 2400 35 3975 2475 fi ressort du tableau IV que t'activité enzymatique est stable à 20'C pendant 1 mois, car à 35 jours on conserve 80 % de l'activité enzymatique, tandis qu'à 45-C on obtient une chute d'activité de l'ordre de 50 %, ce qui représente une chute d'activité remarquablement faible pour une enzyme à cette température. On observe ainsi que ce complexe de SOD végétale/peroxydase/ cofacteur présente une stabilité remarquable, particulièrement à 45-C, ce qui est inattendu pour un homme de l'art. Exemple 10 Mesure de l'activité antiradicalaire ou de piégeage des radicaux libres te On a utilisé 3 méthodes d'évaluation in vitro du piégeage des radicaux: a) la première méthode utilise un système enzymatique constitué par la xanthine oxydase qui, en oxydant son substrat, la xanthine, génère des radicaux superoxydes. Ces derniers sont capables de réduire le cytochrome C (Fe3+) en cytochrome C (Fe2+), réaction dont la cinétique peut être suivie par spectrophotométrie UV-visible à 550 nm. ns sont également les radicaux substrats des SOD qui peuvent ainsi entrer en compétition avec le cytochrome C pour la capture et t'élimination des radicaux superoxydes. En ajoutant une préparation contenant une activité SOD, cette cinétique de réduction est ralentie. Le calcul de l'activité SOD est réalisé par le calcul du pourcentage d'inhibition de la réduction du cytochrome C par la SOD testée. Une unité SOD exprimée dans le système international (1 UlSOD) correspond à l'activité nécessaire pour diminuer dc 50 % le taux de réduction du cytochrome C, à une température de 25-C et à un pH dc 7,8. L'échantillon à tester est dilué de façon à déterminer les conditions pour lesquelles on obtient 50 % d'inhibition de la réduction du cytochrome C, correspondant à 1 unité système international. L'activité SOD totale de l'échantillon testé est ensuite déterminée en ramenant le volume d'échantillon dosé au volume total de l'échantillon et en tenant compte du facteur de dilution initial de l'échantillon. L'activité SOD du complexe formé à l'exemple 8 déterminée par cette méthode est de 4455 unités UlsoD/ml. b) La seconde méthode est constituée par un kit de dosage commercialisé par la société OXIS INTERNATIONAL, sous le nom commercial kit SOD-525, basée sur la propriété qu'a tout catalyseur pourvu d'une activité SOD, d'accélérer lautoxydation d'un dérivé catéchol tétracyclique (5, 6, 6a, 11b-tétrahydro-3, 9, 10-trihydroxybenzofluorène). Cette méthode de dosage permet de mesurer l'activité SOD sous forme d'unité SOD-525 qui est définie comme la quantité de dismutase qui multiplie par 2 le taux d'oxydation du dérivé fluoré. L'activité SOD du complexe formé à l'exemple 8, mesurée par cette méthode, est de 4375 unités SOD-525/ml On constate ainsi que les valeurs d'activité SOD obtenues par les deux méthodes sont essentiellement identiques. c) La troisième méthode utilisée est la Résonance Paramagnétique de l'électron ou en abrégé RPE. La RPE est une technique permettant de caractériser les états de spin des électrons célibataires des molécules, plus particulièrement utilisée pour caractériser les radicaux libres. L'évaluation de l'activité antiradicalaire du complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 par RPE, permet de distinguer t'activité de piégeage des radicaux superoxydes et des radicaux hydroxyles (Rosen G. M. et Rauckman E. J. dans Methods In Enzymologie (1984), 105, pages 198209). Le temps de vie très court des radicaux timbres, environ 10-11 seconde pour OH-, limite la capacité de détection de ces derniers. Pour cette raison, les radicaux 2 et OH' sont mis en évidence grâce à une molécule sonde appelée spin-trap. Cette molécule résonne en présence des radicaux libres et stabilise ces derniers sous forme de complexes présentant un spectre caractéristique détectable en RPE. L'effet piégeur d'un produit à l'essai est directement mis en évidence par une diminution de l'intensité du signal émis par la molécule spin-trap. Les mesures RPE sont effectuées avec un spectromètre Brucker ESP 106, à température ambiante ; le spin-trap utilisé est le 5,5-diméthyl-1- pyrroline-1-oxyde (DMPO). L'anion superoxyde est produit par le système enzymatique xanthine (1,5 mM)/xanthine oxydase (12 mU/ml), en présence de DMPO (80 mM) et éthanol à 50 % (v/v). Le complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exempte 8 est dissous dans l'eau ultrapure à diverses concentrations. Le radical hydroxyle est produit par photolyse (UVB) du peroxyde d'hydrogène à 0,2 % (v/v) en solution aqueuse, en présence de DMPO (160 mM). Le complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 est dissous dans l'eau ultrapure à diverses concentrations. Les intensités du signal RPE sont calculées par double intégration de la raie de plus bas champ. Les pourcentages de protection du produit à l'essai sont obtenus à partir des valeurs des témoins sans produit à l'essai. % protection = - Sproduits - Stémoin | x 100 So - Stémoin Sproduit: intégration du signal RPE obtenu avec le produit à l'essai ou la référence Stémoin: intégration du signal RPE obtenu avec le témoin So : intégration du signal RPE obtenu en l'absence de radicaux libres Effet sur le radical superoxyde Le complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 diminue de façon dose-dépendante le signal RPE de l'anion superoxyde. A S et 10 % (v/v), le complexe inhibe le signal RPE à 44 % et 54 %. Effet sur le radical hydroxyle Le complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 diminue de façon dose-dépendante le signal RPE du radical hydroxyle. A la concentration de 0,3 % (v/v), l'effet est spectaculaire puisqu'il inhibe le signal RPE à 93 %. Le complexe SOD/peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 présente des effets antiradicalaires très intéressants vis-à-vis de l'anion superoxyde et du radical hydroxyle même à des concentrations faibles, généralement employées dans des formulations cosmétiques. 2 . On a utilisé une méthode d'évaluation ex vivo de l'activité antiradicalaire sur des fibroblastes humains normaux en culture. Après irradiation aux UVA, les radicaux libres formés dans une culture de fibroblastes humains sont quantifiés par une méthode appropriée. L'utilisation d'agents antiradicalaires permet de diminuer le stress oxydatif, et le calcul de l'efficacité du complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur selon l'exemple 8 à différentes concentrations est réalisé. Des fibroblastes humains normaux sont incubés pendant 1 heure en présence du complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur selon l'exemple 8, testé à 0,01, 1 et 10 % (v/v) dans l'eau déminéralisée. Les cellules sont soumises à un stress radicalaire provoqué par les rayonnements lumineux UVA (10 J/cm2). Les radicaux libres formés (hydroperoxydes) sont détectés à l'aide d'une sonde appropriée, qui se transforme en présence d'hydroperoxydes, en un dérivé fluorescent quantifiable. Les résultats sont tout d'abord exprimés en unité de fluorescence arbitraire par puits de culture. Puis une efficacité est calculée en appliquant la formule suivante: E (%) = [(;TI-FI) / (Fl-FNI)] x (-100) où: E : Efficacité en pourcentage FNI: Fluorescence observée avec les Fibroblastes Non Irradiés Fl: Fluorescence observée avec les Fibroblastes Irradiés Ffl: Fluorescence observée avec les Fibroblastes Traités et Irradiés Une solution aqueuse contenant 1 % de complexe SOD végétale/ peroxydase/cofacteur formé selon t'invention est capable de réduire de plus de 80 % les effets néfastes liés à un stress oxydatif généré par les UVA. Cette efficacité est supérieure à celle obtenue avec un mélange référence glutathion/vitamine C pourtant reconnu pour être particulièrement efficace, et qui de plus, présente d'énormes problèmes de stabilité. Dès les plus faibles concentrations d'utilisation, le complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur selon t'exempte 8 permet donc une protection efficace des fibroblastes humains, cultivés après un stress oxydatif aux UVA. 3*. On a utilisé une méthode d'évaluation in vivo de l'activité antiradicalaire sur les tissus cutanés de volontaires sains. Les radicaux libres formés suite à l'irradiation UVA peroxydent les lipides insaturés des tissus cutanés. Les stripping permettent de prélever les cornéocytes avec les entités peroxydées. Dans le milieu réactionnel, les peroxydes sont révélés à t'aide d'une sonde fluorescente qui émet une fluorescence directement proportionnelle au taux de peroxydes présents. Sept volontaires de sexe féminin, âgés entre 20 et 38 ans possédant un phototype II ou III, c'est-à-dire possédant une peau caucasienne normale sont sélectionnés. Trois zones de l'avant bras sont délimitées et deux de ces zones sont irradiées aux UVA (10 J/cm2) à l'aide d'une lampe UVA Sun 3000 St). La trace rouge fugace obtenue n'est pas visible le jour suivant l'irradiation et aucun processus inflammatoire n'est observé. Une solution aqueuse contenant 1 % de complexe SOD végétale/ peroxydase/cofacteur formé selon l'invention est appliquée 4 fois à 2heures d'intervalle (2,uVcm2). 24 heures après irradiation aux UVA, un prélèvement de la couche cornée est effectué par 2 stripping successifs. Les peroxydes formés sont révélés sur le second stripping à l'aide d'une sonde fluorescente qui donne une réponse globale au processus de peroxydation. Les résultats sont tout d'abord exprimés en unité de fluorescence arbitraire. Puis une efficacité est calculée en appliquant la formule suivante: E (%) = [(ZIT - Zl) / (ZI - ZNI)] x (-100) où: E () : Efficacité en pourcentage Z1T: Fluorescence mesurée sur la Zone Irradiée Traitée ZI : Fluorescence mesurée sur la Zone Irradiée ZNI : Fluorescence mesurée sur la Zone Non Irradiée. Une solution aqueuse contenant 1 % de complexe SOD végétale/ peroxydase/ cofacteur formé selon l'invention est capable de protéger avec une efficacité de 65 %, le stress radicalaire cutané induit par une irradiation UVA. Exemple 11 Toxicologie Les essais de toxicologie ont été réalisés sur le complexe selon l'invention obtenu à l'exemple 8 sur l'évaluation de l'irritation primaire cutanée chez le lapin (9a), sur l'évalution de l'irritation oculaire chez le lapin (9b), sur l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat (9c) et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le cobaye (9d). îîa- Evaluation de l'irritation primaire cutanee chez le lapin La préparation obtenue à l'exemple 8 a été appliquée sans dilution à la dose de 0,5 ml sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE n404 concernant l'étude de "l'effet irritant/ corrosif aigu sur la peau". Les résultats de cet essai ont permis de conclure que la préparation obtenue à l'exemple 8 selon l'invention peut être considérée comme non irritante pour la peau même à l'état non dilué. 11b- Evolution de l'irritation oculaire chez le tapin La même préparation obtenue à l'exemple 8 a été instillée pure en une seule fois, à raison de 0,1 ml, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de l'OCDE n0405 du 24 février 1987 concernant l'étude de "l'effet irritant/corrosif aigu sur les yeux". Les résultats de cet essai permettent de conclure que la préparation obtenue à l'exemple 8 selon l'invention peut être considérée comme non irritante pour les yeux au sens de la directive 91/326 CEE utilisée pure ou sans dilution. llc- Essai sur t'absence de toxicite anormale par administration orale unique chez lerat La préparation obtenue à t'exempte 8 selon l'invention a été administrée en une fois par voie orale à la dose de 5 g/kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques. Les résultats de cet essai permettent de conclure que, dans ces conditions expérimentales, la préparation obtenue à l'exemple 8 selon l'invention ne présente pas de toxicité anormale. îîd- Etude du pouvoir sensibilisant chez le cobave La solution de complexe de SOD obtenue à l'exemple 8 a fait l'objet d'une recherche de pouvoir sensibilisant selon la méthode de Magnusson et Kligman publiée dans J. invest. Derm. (1969), 52, pages 268-276. Cette solution de complexe de SOD a été appliquée telle quelle sur la peau de 35 cobayes préalablement traités à l'adjuvant de Freund et répartis en 2 lots expérimentaux, respectivement lot témoin et lot traité. Aucune réaction n'a été notée dans les deux lots expérimentaux. Les résultats obtenus montrent que le complexe SOD végétale/ peroxydase/cofacteur formé selon l'invention ne provoque l'apparition d'aucune réaction de sensibilisation. Exemple 12 Préparation d'une composition sous forme d'une émulsion cosmétique contenant la préparation SOD végetalelperoxydase/cofàcteur selon l'invention On incorpore la préparation obtenue à l'exemple 8 selon l'invention dans une crème à une concentration de 5 % en poids par rapport au poids total de cette crème. Cette crème présente la composition suivante: Nom INCI: A- Steareth-2 ...... 3% Steareth-21.... . ...... 2 % Polypropyleneglycol-15 stearylether ....... 9 % Cetearyl alcohot . . . ...... 2,5 % B- Butylene glycol ...... 4,5 % Water . ...... 73,3 % C- Conservateur comprenant des parabènes et du phenoxyethanol ..... 0,5 % D- Tocopherol ..... 0,2% E- Complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur selon l'invention de l'exemple 8....5 % L'activité enzymatique dans la crème est mesurée après une séparation des phases aqueuse et huileuse, réalisée dans des conditions spécifiques : 2 g de crème sont dilués 5 fois dans 8 g de tampon Tris (hydroxyméthyl) aminométhane 0,2 M, pH 8,5, puis 10 % de NaC1 sont ajoutés. Le mélange est soumis à une agitation violente (du type de celle obtenue à l'aide d'un Ultra-turax) pendant 5 minutes puis centrifugé à 5000 tr/mn pendant 25 minutes. L'activité enzymatique est dosée directement dans la phase aqueuse extraite. La stabilité de l'activité enzymatique de la préparation obtenue à l'exemple 8 incorporée dans une crème, dont la description est donnée ci-dessus, a été étudiée à 20'C et 45-C pendant 40 jours. Les résultats sont répertoriés dans le tableau V. TABLEAU V Activité SOD du Activité sOD du Activité SOD de complexe SOD complexe SOD la SOD brute stabilisée selon stabilisée selon d'txtraction Jours l'invention l'invention obtenue à obtenue à obtenue à t'exempte 1 étape l'exempte 8 l'exemple 8 b) (non (%) (%) stabilisée) (%) 20'C 45C 45C 0 100 100 100 1 100 100 0 3 89 83 0 6 69 83 0 18 92 64 0 25 70 66 0 40 60 50 0 L'activité enzymatique retrouvée dans la crème après 40 jours à 20'C est de 60 % pour la forme SOD stabilisée. Plus remarquable encore l'activité enzymatique retrouvée dans la crème stockée pendant 40 jours à 45C est de 50 % alors que la forme non stabilisée ne résiste pas à la température. Les études de stabilité du complexe selon l'invention, incorporé dans une crème, montrent que le complexe présente une stabilité remarquable à 20*C et particulièrement inattendue à 45in. Exemple 13 Préparation de complexe de SOD végétale avec diverses peroxydases Exemple 13A Complexe SOD/peroxydase de raifort On utilise la solution de SOD obtenue à l'étape îc de l'exempte 1 dans laquelle on introduit un nombre d'unités de peroxydase végétale de raifort, dite HRP, dans un rapport d'unités HRP par rapport aux unités SOD compris entre 10 et 400. La préparation de SOD végétale/peroxydase de raifort ainsi obtenue peut être utilisée telle quelle ou de préférence combinée avec un cofacteur enzy matique, par exemple l'acide urique ou l'acide ascorbique ou t'acide dihydroxymaléique. Exemple 13B Complexe SOD végétate/peroxydase d'Arthromyces ramosus On procède comme à t'exempte 13A si ce n'est que l'on utilise une peroxydase obtenue à partir d'Arthromyces ramosus disponible dans le commerce, par exemple sous la référence Sigma P 4794. Exemple 13C Complexe SOD végétale/peroxvdase de soja On procède comme décrit à l'exemple 13A si ce n'est que l'on utilise une peroxydase extraite à partir du soja disponible dans le commerce sous la référence Sigma P 1462. Exemple 14 Stabilisation du complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur avec un sucre ou oolvol On améliore la stabilisation du complexe enzymatique SOD végétale/ peroxydase/cofacteur obtenu à l'exemple 8 par ajout d'un sucre ou polyol au moins selon les variantes de réalisation suivante: Exemple 14A Ajout de ,lvcérol A la préparation obtenue à l'exempte 8 selon l'invention, on rajoute le glycérol à une concentration choisie dans cet exemple à 30 % en poids de la solution finale, sous agitation à température ambiante. .Exemple 14B Ajout de sorbitol On procède comme à l'exemple 14A, si ce n'est que l'on utilise du sorbitol. Exemple 14C Ajout de maltitol On procède comme à l'exempte 14A, si ce n'est que l'on utilise du maltitol. Exemole 14D Ajout de mannitol On procède comme à l'exemple 14A, si ce n'est que l'on utilise du mannitol. Exemple 14E Ajout de tréhalose On procède comme à l'exemple 14A, si ce n'est que t'on utilise du tréhalose. Exemple 15 Formation du complexe enzymatique avec différents cofacteurs de peroxydase On procède comme décrit à l'exemple 8, si ce n'est que l'on utilise des cofacteurs de peroxydase autres que l'acide urique qui était utilisé à l'exemple 8. Exemple 15A Acide ascorbique On procède comme décrit à l'exemple 8, si ce n'e Exempte 16 Composition cosmetigue de type émulsion huile-dans-eau, utilisable plus parti- culièrement pour des préparations cosmétiques antiradicalaires. à visée antiâge. antirides et antistress de la peau On prépare une composition sous forme d'émulsion huile-dans-eau de manière classique à partir des cinq fractions A, B, C, D et E suivantes ayant la composition centésimale indiquée: Nom INCI: A- Phase huileuse comprenant: Steareth-2 .. .... 3% Steareth-21... . . ...... 2 % Polypropylene glycol-15 stearyl ether ...... 9 % Cetearyl alcohol . . . ...... 2,5 % B- Butylene glycol ... ... 4,5 % Water . . .... . . ........... 73,3 % C- Conservateur comprenant des parabènes et du phenoxyethanol ...... 0,5 % D- Tocopherol ...... 0,2 % E- Complexe SOD végétale/peroxydase/cofacteur selon l'invention de l'exempte 8...........5 8 5 % Après avoir chauffé les phases grasse et aqueuse à 80-C séparément, on mélange la phase B dans la phase A, puis la phase C, la phase D et encore la phase E jusqu'à obtenir une émulsion huile-dans-eau. Exemple 17 Composition pharmaceutique à activité anti-inflammatolre Cette composition pharmaceutique comprend outre un principe actif pharmaceutique classique, une préparation telle qu'obtenue à l'exemple 8 selon l'invention, à raison de 5 % en poids, en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Exempte 18 Composition agmairmentarre stabilisée vis-à-vis de t'oxydation Cette composition agroalimentaire présente une stabilité vis-à-vis du rancissement et comprend, outre les principes actifs agroalimentaires classiques, 5 % en poids de préparation obtenue à l'exempte 8 selon l'invention qui sont incorporés en même temps que les autres ingrédients actifs. REVENDICATIONS 1. Utilisation de graines dc végétaux après germination comme source d'extraction de superoxyde dismutase ou SOD. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les graines de végétaux sont des graines de céréales ou des graines de plantes légumineuses ou des graines de plantes oléagineuses. 3.Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les céréales comprennent le blé ou l'orge, de préférence l'orge (variétés de printemps ou d'hiver) et les légumineuses comprennent les graines de lentille ou de pois et les oléagineuses comprennent les graines de soja. 4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que t'étape de germination comprend une germination pendant une période de temps suffisante pour augmenter t'activité SOD. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la période de germination est réalisée dans l'eau, de préférence en présence d'un agent favorisant la germination, à la température ambiante. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent favorisant la germination est constitué par une molécule issue de la famille des gibberellines. 7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la germination de la graine est précédée par un trempage dans une solution aqueuse à la température ambiante ou à froid pendant un ou plusieurs jours. 8. Procédé d'extraction de superoxyde dismutase ou SOD, caractérisé en ce qu'on utilise comme source des graines de végétaux ayant subi une étape de germination, notamment des graines de céréales ou des graines de plantes légumineuses ou des graines de plantes oléagineuses. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que t'étape de germination comprend une mise en suspension des graines de végétaux dans une solution aqueuse pendant plusieurs jours à la température ambiante. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'étape de germination a lieu en présence d'un agent favorisant la germination, encore de préférence constitué par l'acide gibbérellique. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'étape de germination est précédée d'une étape de trempe dans une solution aqueuse à température ambiante ou à froid pendant un ou plusieurs jours. 12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que t'étape d'extraction de la SOD à partir des graines germées comprend un broyage de la graine germée suivi d'une extraction dans une solution aqueuse tamponnée ayant un pH voisin de 8 à la température ambiante pendant une période de temps suffisante pour réaliser l'extraction de la SOD, en général de quelques dizaines minutes à une ou plusieurs heures, suivi d'une filtration et récupération du filtrat contenant la SOD. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on réalise une purification plus poussée de la SOD par traitement du filtrat avec un agent de précipitation permettant d'éliminer les puretés indésirables incluant les protéases ou encore la lipoxygénase, et récupération de la fraction non précipitée ou constituant le sumageant qui contient la SOD. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on procède à une dialyse de la fraction non précipitée contenant la SOD par dialyse contre de l'eau, avec une membrane ayant de préférence un seuil de coupure compris entre 6000 et 8000 Dalton. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on réalise une purification complémentaire de la solution dialysée en procédant par une purification sur colonne chromatographique. 16. Procédé selon l'une des revendications 8 à 15, caractérisé en ce qu'on stabilise la SOD par un agent piégeur de H202, comme une peroxydase avec de préférence un cofacteur de peroxydase encore dénommé substrat réducteur spécifique de peroxydase. 17. Procédé selon l'une des revendications 8 à 16, caractérisé en ce qu'on stabilise la SOD par ajout d'au moins un sucre, en particulier un monosaccharide ou un disaccharide, et/ou au moins un polyol en particulier ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 et 1000 g/mole. 18. Composition notamment à activité antiradicaux libres, par exemple composition cosmétique, pharmaceutique ou agroalimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend comme l'un des ingrédients actifs une superoxyde dismutase végétale obtenue à partir de graines de végétaux ayant subi une étape de germination. 19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que la proportion de SOD est comprise entre 0,01 et 10 % en poids, mieux de 0,1 à 10 % en poids et encore mieux de t'ordre de 5 %, sous forme stabilisée en présence d'un agent piégeur de H202, comme une peroxydase. 20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que la superoxyde dismutase est présente sous forme de complexe SOD/ peroxydase avec de préférence un cofacteur de peroxydase encore dénommé substrat réducteur spécifique de peroxydase. 21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que la peroxydase précitée est choisie parmi le groupe consistant d'une peroxydase de moelle épinière ou myelo peroxydase, une lactoperoxydase, une glutathion peroxydase ou une peroxydase de raifort et le substrat réducteur spécifique de peroxydase est de préférence choisi parmi te glutathion, phénol, guaiacol, pyrogallol, mésitol, acide 3,5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonique (DCHBS), aniline, p-toluidine, o-phénylène diamine, mésidine, acide ascorbique, acide dihydroxymaléique, cytochrome C, iodures, acide urique, phénolphtaléine, acide 2,2'-azido-di(3-éthylbenzo-thiazoline (6) sulfonique (ABTS) et des composés tels que SCN-, Cl-, Br- ou I-. 22. Composition selon l'une des revendications 18 à 21, caractérisée en ce que ladite composition est une composition cosmétique, pharmaceutique ou agroalimentaire et la SOD stabilisée par une peroxydase végétale extraite de préférence du radis noir, accompagnée d'un cofacteur de peroxydase constitué par t'acide urique, l'acide ascorbique ou l'acide dihydroxymaléique. 23. Composition selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisée en ce que la quantité de peroxydase rajoutée à la SOD, exprimée dans un rapport d'unités peroxydases par rapport aux unités SOD compris selon l'invention entre 10 et 400. 24. Composition selon l'une des revendications 19 à 23, caractérisée en ce que le cofacteur enzymatique de la peroxydase est présent en une concentration comprise entre 0,001M et 1M par rapport au complexe SOD/peroxydase. 25. Composition selon l'une des revendications 19 à 24, caractérisée en ce que la SOD ou le complexe SOD/peroxydase avec éventuellement cofacteur de peroxydase est stabilisé par au moins un sucre, en particulier un monosaccharide ou un disaccharide, et/ou au moins un polyol en particulier ayant un poids moléculaire compris entre 50 et 1000 g/mole, notamment à une concentration comprise entre 10 et 50 % en poids de SOD ou du complexe de SOD, sous forme d'extrait brut ou sous forme purifiée. 26. Composition selon t'une des revendications 18 à 25, caractérisée en ce qu'on ajoute un agent antioxydant avantageusement lipophile, de préférence de la famille des tocophérols et leurs dérivés, en particulier leurs esters tels que les acétates, linoléates ou même les phosphates, notamment à une concentration de 0,01 à 3 % en poids, mieux de 0,1 à 1 % en poids, par rapport au poids total de la composition finale.