Brevet FR2740473A1 — publié le 19970430

La présente invention concerne essentiellement des particules comprenant au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, contenant un matériel vivant dans leur masse, tel que des microorganismes, de préférence des microorganismes de fermentation, en particulier des levures, lesdites particules comprenant au moins en surface une membrane formée par le produit de la réaction de transacylation avec formation de liaisons covalentes amide entre le polysaccharide estérifié et ladite polyamine au sein d'un gel, ladite particule étant de préférence séchée. Plus précisément, la présente invention concerne des particules, notamment sous forme de billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, comprenant au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, additionnée d'au moins un polysaccharide gélifiable lorsque ni le polysaccharide estérifié, ni la polyamine ne sont gélifiables dans les conditions opératoires choisies, lesdites particules contenant dans leur masse des microorganismes de biotransformation, notamment de fermentation, en particulier des levures, notamment des levures utilisées pour la fermentation alcoolique, par exemple pour la préparation de boissons fermentées ou refermentées et, de préférence, pour la prise de mousse du champagne, ou des levures de boulanger. Ainsi, l'invention trouve une application intéressante dans le cadre de productions biotechnologiques, par exemple la production d'éthanol, ou la production de boissons fermentées telles que la bière, le vin, et les procédés de refermentation de vins, comme pour la prise de mousse de vin pour obtenir des vins mousseux ou de préférence du champagne. Ainsi, la présente invention concerne aussi l'utilisation de ces particules dans le cadre d'un procédé de biotransformation, en particulier de fermentation, les procédés de biotransformation, en particulier de fermentation ainsi que les compositions contenant de telles particules. Le déposant a décrit dans sa demande de brevet précédente, publiée sous le numéro WO 94/23832, l'utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine pour former en milieu aqueux une membrane au moins en surface de particules gélifiées, les particules ainsi réalisées ainsi que les procédés, et les compositions en contenant. Cette demande précédente envisageait de manière générale les particules contenant divers principes actifs et notamment des microorganismes, en particulier dans les revendications 12 et 13. Dans le cadre de ce document, le déposant n'avait pas envisagé la possibilité de soumettre les particules obtenues contenant le matériel vivant à une opération de séchage. La présente invention est basée sur la découverte inattendue que la préparation de particules contenant un matériel vivant tel que des microorganismes de biotransformation, en particulier de fermentation, en particulier des levures, notamment des levures utilisées pour la fermentation alcoolique, par exemple pour la préparation de boissons fermentées ou refermentées et, de préférence, pour la prise de mousse de vins mousseux ou de préférence du champagne, ou des levures de boulanger, par la méthode décrite dans la demande antérieure WO 94/23832, avec obtention d'une membrane au moins en surface, par une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine, en milieu aqueux, permettait d'obtenir une membrane présentant simultanément les avantages suivants a) une bonne rétention du matériel vivant, en particulier des microorganismes dans les particules grâce à cette membrane, sans besoin d'une couche externe sans matériel vivant tel que microorganisme ; toutefois dans le cadre de l'invention, il est naturellement possible de prévoir aussi que la membrane se forme dans une couche externe sans microorganisme; b) une possibilité de préparer des particules sèches avec maintien de la viabilité et de la fonctionnalité du matériel vivant tel que des microorganismes de biotransformation, par exemple de fermentation, en particulier des levures, la membrane jouant un rôle de protection pendant le séchage, ce séchage présentant la particularité de pouvoir être réalisé par diverses méthodes et notamment par lyophilisation, la membrane ayant alors un effet cryoprotecteur; et c) une possibilité d'utiliser les particules sèches telles quelles et notamment pour réaliser la biotransformation, par exemple la fermentation, sans stade de réactivation préalable, contrairement à toutes les particules sèches, qui avaient été réalisées au préalable dans le cadre de procédés de biotransformation, par exemple de fermentation. Ainsi, la présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de réaliser des particules contenant un matériel vivant tel que des microorganismes de biotransformation, par exemple de fermentation, telles que des levures, en particulier des levures de boulanger, ou des levures de fermentation alcoolique pour la préparation de boissons fermentées et, de préférence pour la prise de mousse de vins mousseux et de préférence pour la prise de mousse du champagne, présentant simultanément une bonne rétention du matériel vivant, tel que des microorganismes, un maintien de la viabilité de ce matériel vivant, tel que des microorganismes, lors d'un séchage, ainsi qu'une conservation de leur fonctionnalité pour la mise en oeuvre du procédé de biotransformation, en particulier de fermentation, même sans stade de réactivation préalable après séchage. La présente invention résout pour la première fois ce problème d'une manière particulièrement simple, sûre et fiable, utilisable à l'échelle industrielle. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit des particules, notamment billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, additionnée d'au moins un polysaccharide gélifiable, lorsque ni le polysaccharide estérifié, ni la polyamine ne sont gélifiables dans les conditions opératoires choisies, ladite particule comprenant au moins en surface une membrane formée par le produit de la réaction de transacylation avec formation de liaisons covalentes amide entre le polysaccharide estérifié et ladite polyamine au sein d'un gel, et ladite particule comprenant au moins en partie dans sa masse un matériel vivant tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, par exemple de fermentation, tel que des levures, lesdites particules étant de préférence sèches, c'est-à-dire qu'elles ont subi une opération de séchage. Dans le cadre de l'invention, le matériel vivant est de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier de fermentation, telles que des levures, en particulier des levures du boulanger, comme par exemple Saccharomyces cerevisiae, ou des levures de fermentation alcoolique pour la préparation de boissons fermentées, telles que de la bière ou du vin, et, de préférence des levures de prise de mousse pour réaliser une deuxième fermentation alcoolique pour la préparation de vins mousseux, et, de préférence des levures de prise de mousse pour la fabrication de champagne. Dans le cadre de l'invention, les microorganismes de biotransformation sont constitués par tous microorganismes capables de réaliser une biotransformation, sans aucune limitation. De tels microorganismes de biotransformation sont bien connus à l'homme de l'art. Par exemple, dans le cadre de productions biotechnologiques, il peut s'agir de microorganismes de biotransformation de sucre en alcool, principalement l'éthanol, ou de microorganismes, par exemple des levures, capables de réaliser des réactions chimiques, par exemple des réductions stérosélectives de cétones en alcools comme cela est bien connu à l'homme de l'art. Dans le cadre de l'invention, selon une variante de réalisation particulière, des particules fraîches contenant des bactéries lactiques sont exclues, celles-ci faisant déjà l'objet de l'exemple 21 de la demande antérieure du déposant WO 94123832. Selon un mode de réalisation préféré, les particules selon l'invention sont des particules sèches, c'est-à-dire qu'elles ont subi une procédure de séchage. Comme il est indiqué plus loin dans la description, en référence au procédé, les procédures de séchage peuvent être quelconques. On peut utiliser une procédure de séchage par lyophilisation, par nébulisation, par séchage en séchoir à lit d'air fluidisé, par séchage en étuve, techniques qui sont bien connues à l'homme de l'art. Le séchage par lyophilisation est actuellement préféré. Selon un autre mode de réalisation préféré, le matériel vivant est un microorganisme capable d'effectuer une fermentation, en particulier une fermentation alcoolique. Encore de préférence, ce microorganisme est une levure, en particulier du genre Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Le polysaccharide estérifié est tel que décrit dans la demande précédente WO 94/23832 et est un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, en particulier un alginate de propylène glycol, une pectine, en particulier une pectine fortement méthoxylée, ou tout autre composé obtenu par estérification de carboxyles d'un polysaccharide porteur de carboxyles. Egalement, la polyamine utilisée est telle que décrite dans la demande précédente WO 94/23832 et comprend une protéine, un polypeptide, un polyaminoacide, un polysaccharide porteur de groupements aminés, tel que le chitosan, une substance organique, aliphatique, alicyclique ou aromatique porteuse de plusieurs groupements aminés primaires ou secondaires, telle que l'éthylènediamine, la pentaméthylènediamine, l'hexaméthylènediamine, la pipérazine, la phénylènediamine ou la polyéthylèneimine. Selon une autre variante de réalisation, le polysaccharide précité est un polysaccharide gélifiable, en particulier choisi parmi le groupe consistant d'un alginate, d'un carraghénane, en particulier le kappa-carraghénane, une pectine gélifiable, en particulier une pectine faiblement méthoxylée, le chitosan. Ces polysaccharides présentent l'avantage d'être gélifiables, par exemple par un cation mono ou polyvalent, tel que le sodium, le potassium ou le calcium, présent dans un bain de gélification. L'épaisseur de la membrane peut varier dans certaines limites et est conditionnée par les conditions de réaction, en particulier le pH et le temps de réaction comme cela était indiqué dans la demande précédente WO 94/23832. Cette épaisseur sera de préférence au minimum de 1 % du rayon de la particule pour empêcher tout relargage du microorganisme contenu dans la particule, ainsi que pour assurer une protection contre le séchage, en particulier une cryoprotection lors d'une lyophilisation, qui implique une procédure de congélation à des températures aussi basses que - 30 à - 40 C ou même -80iC. L'épaisseur maximale de la membrane n'est pas critique, mais sera de préférence limitée à 50 % du rayon de la particule, encore mieux de 4 à 10 % du rayon de la particule. La dimension des particules n'est également pas critique et dépendra généralement du procédé utilisé pour l'extrusion des gouttes. Habituellement, cette dimension, pour être obtenue, pourra varier entre quelques microns et plusieurs millimètres. Des particules particulièrement intéressantes, notamment dans le cadre des procédures de fermentation, en particulier des prises de mousse du champagne, auront un diamètre de l'ordre de 1 à 5 millimètres. Les particules peuvent présenter à l'intérieur de la membrane un contenu solide ou liquide. Cependant, la présence d'un contenu solide constitué par un gel s'avère préférable, en particulier dans le cadre de l'emploi de microorganismes de fermentation alcoolique, tel que des levures de fermentation alcoolique, notamment pour la prise de mousse de vins, en particulier la prise de mousse de champagne. Avantageusement, les proportions de polysaccharides gélifiables par rapport aux polysaccharides estérifiés peuvent varier de 0 à 300 % en poids. Les proportions en polysaccharides estérifiés par rapport à la polyamine peuvent varier de3 %à500%enpoids. L'invention couvre aussi, à titre de produits nouveaux, des particules précitées contenant des matériels vivants, en particulier des microorganismes de biotransformation, en particulier de fermentation, tels que des levures, en particulier des levures du genre Saccharomyces, telles que Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces bayanus, ou des levures du genre Schizosaccharomyces, pour la préparation de boissons fermentées ou refermentées, par exemple bière ou vin, en particulier pour la prise de mousse du vin, de préférence pour la prise de mousse du champagne, ou encore des levures dites levures du boulanger, ou des levures du genre Saccharomyces telles que Saccharomyces cerevisiae, pour la production d'éthanol, ou pour d'autres productions biotechnologiques comme par exemple la production stéréosélective d'alcools à partir de cétones. Les matériaux utilisés pour la fabrication des particules sont de préférence une protéine choisie parmi le groupe consistant d'albumines comme la sérumalbumine, I'ovalbumine, l'alphalactalbumine, des globulines, le fibrinogène, la caséine, des scléroprotéines solubilisées, le collagène, I'atélocollagène, la gélatine, les hydrolysats de gélatine, les peptones, I'hémoglobine, des protéines végétales, telles les protéines du soja ou du blé, des gluténines, qui de préférence auront été dégradées, ou des mélanges de telles protéines existant tels quels ou étant préparés par mélange, tels que les mélanges d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes, le lait entier ou écrémé totalement ou partiellement, le lait condensé, le lait en poudre, les protéines du lactosérum, I'oeuf entier, le blanc d'oeuf, le jaune d'oeuf, la farine de soja, les concentrés protéiques de soja, les préparations alimentaires liquides au soja ou les laits de soja, ou le lait de coco, à titre d'exemples et sans limitation. Des matériaux polyaminés davantage préférés sont l'ovalbumine, des protéines de lait animal, ou des protéines végétales, telles que des protéines du soja. Comme polysaccharide gélifiable, on peut utiliser de préférence tout alginate. Divers alginates contenant des proportions variables de séquences polyguluroniques sont disponibles dans le commerce et présentent en outre l'avantage d'être compatibles avec les procédés de biotransformation, de préférence de fermentation, en particulier alcoolique, envisagés selon l'invention. Un matériau polysaccharide estérifié préféré est constitué par l'alginate de propylène glycol, en abrégé PGA, et, de préférence fortement estérifié, et le polysaccharide gélifiable est de préférence l'alginate de sodium et de préférence un alginate de sodium contenant une proportion élevée de séquences polyguluroniques. La présente invention couvre également à titre de produits nouveaux des particules, notamment billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent un alginate sous forme gélifiée, tel que l'alginate de calcium, de l'alginate de propylène glycol, et une protéine pure ou en mélange, ladite particule comprenant au moins en partie dans sa masse un matériel vivant, tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier des levures de boulanger, ou des levures de fermentation alcoolique, de préférence de prise de mousse, telles que des levures du genre Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, lesdites particules comprenant au moins en surface une membrane formée par le produit de la réaction de transacylation avec formation de liaisons covalentes amide entre l'alginate de propylène glycol et la protéine au sein du gel d'alginate, ladite particule étant de préférence sous forme sèche. Selon un deuxième aspect, la présente invention couvre également un procédé de fabrication des particules précitées, tel que décrit dans la demande précédente du déposant WO 94/23832, et en particulier décrit de la page 10, ligne 24 à la page 14, ligne 25, qui est incorporé ici dans sa totalité par référence. En particulier, un procédé de fabrication préféré de ces particules, en particulier billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, est caractérisé par les étapes successives suivantes: a) on prépare une première solution aqueuse initiale gélifiable par un agent de gélification contenant au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, additionnée d'au moins un polysaccharide gélifiable, lorsque ni le polysaccharide estérifié, ni la polyamine ne sont gélifiables dans les conditions opératoires choisies; b) on prépare une suspension de matériel vivant, tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier de fermentation, par exemple une levure, c) on mélange de manière sensiblement homogène la suspension obtenue en b) à la première solution aqueuse initiale gélifiable obtenue à l'étape a), en obtenant ainsi une première solution aqueuse initiale gélifiable contenant le matériel vivant, tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier de fermentation; d) on fait tomber des gouttes de cette première solution dans une deuxième solution aqueuse formant bain de gélification, contenant un agent de gélification, de manière à individualiser des particules par gélification à l'aide dudit agent de gélification; e) on met ensuite en contact les particules gélifiées obtenues avec une solution aqueuse alcaline, de manière à déclencher la réaction de transacylation, au moins à la surface des particules gélifiées entre le polysaccharide estérifié et la polyamine contenue dans les particules, pendant une période de temps prédéterminée pour former une membrane au moins en surface des particules; f) on ajoute au milieu réactionnel un agent acide de manière à stabiliser les particules, que l'on peut ensuite séparer par tout moyen de séparation bien connu à l'homme de l'art, et en particulier par décantation ou centrifugation; g) on rince les billes à l'eau. De préférence, on réalise une étape h) de séchage des particules contenant le matériel vivant. D'autre part, les procédures de séchage peuvent etre quelconques. On peut utiliser une procédure de séchage par lyophilisation, par nébulisation, par séchage en séchoir à lit d'air fluidisé, par séchage en étuve, techniques qui sont bien connues à l'homme de l'art. Le séchage par lyophilisation est actuellement préféré. Par exemple, une température de congélation de l'ordre de - 30'C peut être utilisée et permet d'obtenir une viabilité élevée des microorganismes après séchage, pouvant dépasser 80 % de la viabilité initiale. Naturellement, une température de congélation plus basse pouvant atteindre - 70-C ou - 80in, qui donne une congélation plus rapide, peut être également utilisée. Les conditions générales de réalisation d'un séchage par lyophilisation sont bien connues à l'homme de l'art et il n'est donc pas nécessaire de les préciser ici. Selon une variante de réalisation, la concentration en microorganismes de biotransformation, en particulier de fermentation, par exemple de levures, dans la suspension, ou dans la première solution aqueuse les contenant, est choisie de manière à obtenir une concentration suffisante en microorganismes par particule, similaire à celle qui a été utilisée dans le cadre de particules contenant des microorganismes de fermentation de la technique antérieure, en général de l'ordre de 1 à 6 000 000 de microorganismes, et en particulier des levures, par particule, sans limitation. D'autres caractéristiques particulières du procédé résultent de la description précédente concemant les matériaux à utiliser pour la fabrication des particules, ainsi que leurs proportions relatives, ainsi que de la description de la demande précédente du déposant WO 94/23832, qui est incorporée ici dans sa totalité par référence. Dans le cadre du procédé selon l'invention, on peut utiliser les protéines pures ou diluées. Par exemple, dans le cas de laits, en particulier des laits de soja, ils peuvent être employés purs ou dilués jusqu'à 30 % de lait et 70 % d'eau en volume, et en particulier utiliser une dilution d'environ 2/3 de lait et environ 1/3 d'eau en volume. Selon une autre variante de réalisation du procédé selon l'invention, dans l'étape f) de stabilisation des particules par addition d'un agent acide, on peut réaliser cette addition jusqu'à obtenir un pH du milieu aqueux de dispersion des particules voisin de la neutralité ou acide dans le cas où le milieu acide est favorable au matériel vivant encapsulé, en particulier les microorganismes. Le temps de contact des particules avec le milieu réactionnel contenant ledit agent acide permettant d'obtenir un pH voisin de la neutralité ou acide n'est pas critique. En général, on maintiendra un temps de contact de l'ordre de 15 min. Selon un troisième aspect, la présente invention couvre également l'utilisation des particules précitées dans un procédé de biotransformation, par exemple dans une procédure de fermentation alcoolique, pour la fabrication de boissons fermentées ou refermentées, en particulier de vins ou de la bière, ou de préférence pour la prise de mousse de vins, en particulier la prise de mousse de champagne, et pour la production d'éthanol. Selon un quatrième aspect, la présente invention couvre encore un procédé de biotransformation, de préférence de fermentation, caractérisé en ce qu on introduit une quantité suffisante de particules précitées dans le milieu où l'on veut réaliser la biotransformation, de préférence la fermentation, on réalise la procédure de biotransformation, de préférence la fermentation, et on sépare ensuite les particules de ce milieu. Selon une autre variante pour la fermentation alcoolique, en particulier pour fabriquer des boissons fermentées ou refermentées, telles que le vin ou la bière, les particules contiennent des microorganismes de fermentation telles que des levures, en particulier des levures de prise de mousse. Selon une autre variante du procédé, on réalise une biotransformation, par exemple la production d'éthanol à partir de sucres, ou la réduction stéréospécifique de cétones en alcools. Dans le cadre de cette biotransformation, on peut utiliser des microorganismes quelconques capables d'effectuer des biotransformations, bien connus à l'homme de l'art, tels que la levure de boulanger. Dans le cadre de l'un quelconque des aspects de l'invention, les particules sont de préférence sous forme sèche, ce qui permet de les conserver pendant une longue période de temps, et d'en faciliter la manipulation, en particulier la distribution. Ces particules sèches présentent l'avantage déterminant de conserver la viabilité des microorganismes, en particulier des levures, encapsulés. Ainsi, l'invention permet par exemple de multiplier par trois le taux de viabilité de levures de boulanger après séchage de billes simples, c'est-à-dire sans présence d'une couche exteme dépourvue de microorganismes, par comparaison à des levures encapsulées selon la technique antérieure. Pour des levures telles que des levures de prise de mousse de champagne, encapsulées dans des billes simples préparées selon l'invention puis séchées par lyophilisation, la viabilité des levures est égale à au moins 50 % de la viabilité initiale des levures, et peut même dépasser 80 % de cette viabilité initiale. Ce résultat inattendu est attribué à un effet protecteur, en particulier cryoprotecteur, de la membrane. L'invention permet de réaliser un séchage très important des particules, jusqu'à obtenir une perte en eau de 90 % ou même au-delà, ce qui donne un poids de particules sèches égal à moins de 10 % de celui des particules fraîches ou humides, brutes de fabrication. La fonctionnalité des particules est préservée d'une façon telle qu'il est même possible d'utiliser les billes sèches directement dans le milieu où l'on veut réaliser la biotransformation, en particulier la fermentation, sans réaliser une étape de réactivation, contrairement à ce qui était nécessaire auparavant. Les particules obtenues dans le cadre de l'invention sont particulièrement intéressantes pour la fabrication du champagne, pour réaliser l'étape de prise de mousse. En effet, il a été observé de manière inattendue que les particules de l'invention, fraîches ou sèches, à structure simple, c'est-à-dire sans présence d'une couche exteme dépourvue de microorganismes, ici des levures de fermentation alcoolique, ou encore les particules comprenant une couche externe dépourvue de microorganismes qui comprend la membrane selon l'invention, permettent d'obtenir des courbes de concentration en sucres, et des courbes de pression en fonction du temps comparables à celles obtenues avec des bouteilles témoin ensemencées avec des levures libres. Elles permettent d'autre part d'obtenir de manière inattendue des valeurs comparables à celles obtenues avec des bouteilles témoin ensemencées avec des levures libres en ce qui concerne le degré alcoolique, le pH, l'acidité totale, l'acidité volatile, la teneur en SO2, et sans modification détectable des caractères organoleptiques. Ces particules présentent une densité permettant une sédimentation rapide. De plus, elles empêchent le relargage des microorganismes grâce à la membrane périphérique, sans la nécessité de fabriquer une couche exteme dépourvue de microorganisme. De ce fait, elles n'entraînent pas de trouble repérable dans le milieu d'utilisation. Naturellement, dans le cadre de l'invention, il est également possible de préparer des particules comprenant une région interne ou noyau contenant le matériel vivant, de préférence un microorganisme, et une couche externe dépourvue de matériel vivant, tel que microorganismes, par exemple par un procédé de coextrusion, comme cela est bien connu à l'homme de l'art et comme cela est décrit également dans la demande précédente du déposant WO 94/23832 en page 10, lignes 1 à 23, avec la procédure décrite précisément en page 12, ligne 10 à page 14, ligne 25, procédure qui est incorporée ici par référence dans sa totalité. Par ailleurs, dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des matières premières naturelles autorisées dans le domaine alimentaire, tel que l'alginate de sodium (E401), l'alginate de propylène glycol (E405), des laits de soja du commerce, notamment ceux présentés en briques stériles. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention peuvent répondre clairement à la lumière de la description explicative, qui va suivre, faite en référence à divers exemples de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne saurait donc en aucune façon limiter la portée de l'invention, ainsi qu'à l'aide des figures annexées. Dans les dessins: - la figure 1 représente des essais de prise de mousse avec des billes en gel d'alginate de calcium, alginate de propylène glycol et protéines de soja, selon l'exemple 4, sous forme de courbes des concentrations en sucre en gramme par litre en ordonnée en fonction du temps en jours en abscisse. La courbe joignant les cercles blancs référencée T représentant le témoin obtenu avec des levures libres la courbe joignant les cercles noirs référencée A étant obtenue avec des billes fraîches réactivées ; la courbe joignant des carrés blancs référencée B étant obtenue avec des billes sèches réactivées, et la courbe joignant les carrés noirs référencée C étant obtenue avec des billes sèches non réactivées, ces courbes étant obtenues à partir des données du tableau 9, avec des protéines de soja du commerce de marque BJORGS disponibles chez DISTRIBORG, SAINT GENIE LAVAL, FRANCE, et l'alginate étant initialement de l'alginate de sodium référence MANUGELX GHB disponible dans le commerce chez KELCO INTERNATIONAL, division de MERCK & CO, San Diego, Californie USA ou en France à Bagnolet: - la figure 2 est une figure similaire à la figure 1, obtenue avec les données du tableau 10, avec des protéines de soja du commerce de marque CEREAL29 disponibles chez SAPRO, ANNONAY, FRANCE. - la figure 3 représente des essais de prise de mousse avec des billes préparées selon l'exemple 4, sous forme de courbes des pressions mesurées (en bars) en ordonnée, en fonction du temps (en jours) en abscisse, obtenues avec les données du tableau 1 1; - la figure 4 est une figure similaire à la figure 3, obtenue avec les données du tableau 12; - la figure 5 est un cliché en microscopie électronique à balayage d'une bille en gel d'alginate de calcium, alginate de propylène glycol et protéines du soja selon l'exemple 5, lyophilisée et coupée en deux; - la figure 6 est une courbe similaire aux figures 1 et 2, obtenue avec les données du tableau 15; - la figure 7 est une courbe similaire aux figures 3 et 4, obtenue avec les données du tableau 16; - la figure 8 est une courbe similaire aux figures 1, 2 et 6, obtenue avec les données du tableau 19 ; et - la figure 9 est une courbe similaire aux figures 3, (Manucol DH (Kelco International), 1,56 g d'ovalbumine (Crude egg white, from chicken egg, SIGMA). Le mélange est soumis à une agitation magnétique rapide pendant 15 min. La solution est ensuite centrifugée à 5000 rpm pendant 10 min pour élimination des bulles d'air. *Préparation du mélange à extruder On prélève 12 ml de ladite solution de polymères, auxquels on ajoute le culot de levures remis en suspension dans 1 ml d'eau distillée. Préparation des billes (gélification) La solution de polymères avec levures est placée dans une seringue qui va permettre l'extrusion des gouttes. Celles-ci tombent dans un bain calcique (50 ml de chlorure de calcium à 10 %) et donnent des billes par gélification. On laisse sous agitation magnétique pendant 10 min, puis les billes sont rincées plusieurs fois à l'eau distillée. Formation de la membrane (transacvlation! Les billes sont ensuite remises en suspension dans 50 ml d'eau distillée et on alcalinise par 600 ssl de NaOH N. On laisse en contact pendant 15 min sous agitation magnétique. Puis on ajoute 225 ul D'HUI N pour stabiliser la membrane précédemment formée. On laisse en contact pendant 15 min sous agitation magnétique, puis les billes sont rincées plusieurs fois à l'eau distillée. Les billes rincées peuvent être conservées fraîches en suspension dans de l'eau distillée, ou bien elles sont dispersées dans de l'eau distillée, congelées puis lyophilisées. Etudes de viabilité La viabilité est determinée par une technique de coloration au bleu de méthylène (Painting K. and Kirsop B., World J. Microbiol. Biotechnol., 1990, 6, 346-347).): Les cellules sont mises en suspension dans une solution du colorant. Tandis que les cellules viables restent incolores, les cellules mortes prennent une coloration bleue. * Détermination de la viabilité initiale des levures: La viabilité de la suspension initiale de levures est déterminée après dilution au 1/10ème de la suspension de levures ou levain avec de l'eau distillée. On mélange, au vortex pendant 1 min, 1 ml de cette dilution avec 1 ml d'une solution de bleu de méthylène préparée par dissolution de 10 mg de bleu de méthylène dans 100 ml d'une solution de citrate de sodium à 20 g/l. On dépose une goutte de ce mélange sur une cellule de Malassez et on compte au microscope optique le nombre de cellules mortes (bleues) et le nombre de cellules vivantes (blanches) présentes. Le pourcentage de viabilité des levures est donné par le pourcentage de cellules blanches dénombrées. * Détermination de la viabilité des levures dans les billes et du nombre total de levures encapsulées: On place 20 billes fraîches dans 5 ml d'eau distillée et on les broie à l'aide d'un homogénéiseur à tissu de type Potter. On reprend ensuite 1 ml de cet homogénéisat que l'on mélange avec 1 ml de la solution de bleu de méthylène au vortex pendant 1 min. Le comptage se fera de la même façon sur cellule de Malassez. On compte généralement les levures présentes dans 2 colonnes de la cellule de Mal assez. On obtient par exemple N cellules dans ces deux colonnes. Pour déterminer le nombre total de levures présentes dans une bille, on rapporte ce nombre N à la totalité des levures présentes dans la cellule soit 5 fois plus; on a donc 5xN levures dans 1 ssl (volume total de la cellule). Dans les 2 ml de mélange (contenant 1 ml de l'homogénéisat) on a donc (5 x N x 2000) cellules présentes. Donc, dans les 5 ml de l'homogénéisat, il y a (5 x N x 2000 x 5) levures pour 20 billes. Le nombre total de cellules par bille est donc: 5xNx2000x5 =2500xN 20 La viabilité des levures sèches sera déterminée de la même manière mais les billes seront préalablement réhydratées dans 5 ml d'eau sucrée à 5 % à 3538 0C, au repos, pendant 15 min. *Résultats obtenus avec les billes de levures de boulanger à membrane ovalbumine PGA Cinq lots de billes à environ 1 million de levures par bille ont été fabriqués avec l'ovalbumine comme protéine dans les conditions du protocole défini plus haut. Une moitié de chaque lot a été gardée humide, tandis que l'autre partie a été lyophilisée (tableau 1). Viabilité: Les résultats sont regroupés dans le tableau 1. * On note que la viabiiité des levures dans les billes fraîches est élevée: la valeur mOyenne, pour 99% de viabilité initiale, est de 96 % * Pour les billes sèches, la viabilité des levures est abaissée à environ 30 % Etude comparative effectuée avec des billes simples d'alginate Cinq nouveaux lots de billes ont été préparés, en appliquant aux levures de boulanger la méthode classique d'inclusion dans des billes d'alginate de calcium. Préparation des lots * Préparation du mélange à extruder: On dissout 195 mg d'alginate de sodium (Manucol DH) dans 18 ml d'eau distillée par agitation magnétique. La solution est centrifugée pendant 5 min à 5000 rpm. On prélève 12 ml de cette solution auxquels on incorpore le culot de levures repris dans 1 ml d'eau distillée comme décrit ci-dessus. * Préparation des billes: La suspension de levures est ajoutée goutte à goutte (à la seringue) à 50ml d'une solution de chlorure de calcium à 10%. On laisse sous agitation magnétique pendant 10 min, puis les billes sont rincées plusieurs fois à l'eau distillée. Les lots de billes ont été divisés en deux fractions, dont l'une a été gardée humide et l'autre a été lyophilisée. La viabilité des levures incluses a été déterminée et les résultats ont été comparés aux résultats obtenus ci-dessus avec les levures encapsulées dans des billes à membrane. Résultats de l'étude de viabilité Les résultats sont regroupés sur le tableau 1. * On observe que les deux méthodes donnent pour les levures une viabilité identique de 96% dans les billes fraîches. * En revanche les résultats sont très différents dans le cas des billes lyophilisées: tandis que la viabilité était de 30% pour les billes à membrane, elle n'est plus que de 9 % pour les billes simples d'alginate. La nouvelle méthode apporte donc une amélioration en protégeant les levures pendant la lyophilisation. Exemple 2 - Encapsulation de levures de prise de mousse de champagne: billes à membrane d'ovalbumine-PGA Viabilité des levures dans les billes fraîches et sèches, prise de mousse conduite avec billes sèches directement ajoutées aux bouteilles (sans réactivation préalable) Protocole d'encapsulation des levures * Préparation du levain de levures de prise de mousse On réhydrate 5 g de levures sèches actives (LSA DV 10 Saccharomyces bayanus LALVIN, Station Oenotechnique de Champagne) dans 50 ml d'eau distillée, à 35-38iC, au repos, pendant 15 à 20 min. On ajoute à ce mélange 50 ml de vin de base et 50 ml de liqueur (vin de base sucré à 500 g/l). * Préparation de la suspension de levures Pour préparer les billes contenant environ 5 millions de levures par bille, on prend 5 ml de ce levain, qui sont centrifugés pendant 1 min à 5000 rpm. Le surnageant éliminé, le culot est repris dans 1 ml d'eau distillée et mélangé à 12 ml de la solution de polymères préparée comme décrit à l'exemple 1. Si l'on veut diminuer la charge en levures des billes, on diminue en conséquence le volume de levain à centrifuger. * Préparation des billes: On prélève 12 ml de la suspension de levures dans la solution de polymères et on applique le protocole de préparation des billes à membrane décrit à l'exemple 1. Des lots de billes ont été ainsi préparés, les uns chargés à environ 3 millions de levures par bille, les autres à environ 5 millions de levures par bille. Chaque lot a été divisé en deux fractions, dont l'une est gardée humide et l'autre est lyophilisée. Résultats de l'étude de viabilité Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 2 et 3. Les viabilités moyennes sont de 71 %, soit 89 % de la viabilité initiale (billes fraîches), et 41 %, soit 51 % de la viabilité initiale (billes sèches), pour une charge de 3 millions de levures par bille (viabilité initiale des levures: 80 %), et de 74 %, soit 91 % de la viabilité initiale (billes fraîches ) et 48 %, soit 59 % de la viabilité initiale (billes sèches), pour une charge de 5 millions de levures par bille (viabilité initiale des levures: 81%). Incorporation aux bouteilles pour étude de prise de mousse Les billes ont été réparties en deux groupes (LOTS) de la façon suivante: - LOT A: 10 bouteilles reçoivent chacune 1 g de billes sèches non réactivées, à environ 3 millions de levures par bille. - LOT B: 15 bouteilles reçoivent chacune 0,650 g de billes sèches non réactivées, à environ 5 millions de levures par bille. - Un LOT témoin est préparé: 10 bouteilles sont ensemencées avec 5% de levures libres (non incluses dans des billes). Après addition des billes ou du levain, les bouteilles sont capsulées et placées sur lattes dans des locaux thermorégulés à 14in. Suivi de la prise de mousse: méthodes d'étude On compare la cinétique de prise de mousse avec celle obtenue avec des levures libres: La diminution de la concentration en sucres et l'augmentation de pression dans les bouteilles sont contrôlées à intervalles réguliers. Etude de la concentration en sucres * Avant de mettre le vin en bouteilles et d'incorporer les levures, libres ou sous forme de billes, on détermine la concentration en sucre par dosage des sucres réducteurs (à la liqueur de Fehling) avant et après hydrolyse acide. * Les dosages sont répétés à des temps échelonnés pendant la prise de mousse. Evolution de la pression La mesure de pression est effectuée sur une ou deux bouteilles de chaque lot. On met en place un aphromètre en transperçant la capsule de la bouteille. On note également la température du vin. La pression finale (en bars) est alors corrigée de manière à exprimer le résultat à la température de 10-C. Expression des résultats: Les résultats obtenus sont exprimés de deux manières: - la pression mesurée, ramenée à 10*C, comme indiqué ci-dessus, - et la pression calculée par rapport à la quantité de sucres consommée. En effet, compte tenu des difficultés liées à la mesure de la pression, il arrive que l'on note une pression faible alors que la consommation de sucres témoigne d'une bonne activité des levures. On donne donc en parallèle la pression correspondant à la quantité de sucres consommée sachant qu'à 4 g/l de sucres consommés correspond une pression de 1 bar. Donc avec une concentration initiale de 25 g/l, la pression Pt au temps t, pour une concentration en sucre de Ct, correspond à: (25 - C)/4 bars. Résultats: Dosages de sucre et détermination de pression Les résultats de dosage de sucres et de détermination de pression sont rassemblés dans le tableau 4. - Après 12 jours: tandis que la concentration en sucre du témoin a déjà chuté à 16,85g/1, les bouteilles A et B ont des teneurs élevées en sucre: 22,15 et 21,25 g/l respectivement. Les pressions calculées ont été portées sur le tableau 4. - Après 27 jours, la teneur en sucres des témoins n'est plus que de 4,5 g/l, tandis que les valeurs sont toujours élevées pour les LOTS A et B (21,30 et 20,20 g/l respectivement). La pression n'a que très légèrement augmenté pour les LOTS A et B. - Après 105 jours, la teneur en sucres des LOTS A et B a fortement diminué: elle est de 6,7 g/l pour le LOT A et 3,3 g/l pour le LOT B. La diminution de la teneur en sucres s'accompagne d'une élévation de pression à 4,5 bars et 5,4 bars respectivement pour les LOTS A et B (pressions mesurées). -Après 168 jours, la prise de mousse est complète pour les deux LOTS A et B: les teneurs en sucres ont diminué jusqu'à 0,9 et 0,6 g/l, tandis que les pressions mesurées atteignent 6 et 6,10 bars respectivement. Une valeur comparable de pression (6,20 bars) a été obtenue avec une bouteille témoin, qui ne renferme plus que des traces de sucre. Analyse finale du vin Les résultats de l'analyse finale du vin après 168 jours sont rassemblés dans le tableau 4. La comparaison avec le LOT témoin ensemencé avec des levures libres montre que les résultats obtenus avec les billes sont comparables en ce qui concerne le pH, l'acidité totale et l'acidité volatile. Le degré alcoolique est légèrement inférieur tandis que la teneur en S02 se trouve diminuée. Examen des autres caractéristiques des billes *Sédimentation: parfaite sédimentation des billes dans les bouteilles. *Trouble: aucun trouble apparent dans les bouteilles en fin de prise de mousse. Cet exemple montre que les billes de levures lyophilisées peuvent déclencher une prise de mousse et la conduire jusqu'à son terme. Un autre point intéressant est que les billes sèches ont été ajoutées au vin sans stade de réactivation préalable. Exemple 3 - Encapsulation de levures de prise de mousse de champagne dans des billes de protéines du soja-PGA Utilisation de laits de soja du commerce comme source de protéines, viabilité dans les billes fraîches et sèches, évaluation du relargage. Les laits de soja Trois laits de soja commerciaux ont été utilisés comme source de protéines: lait BJORG (3,6g de protéines/100g), lait CEREAL (3,8g de protéines/100g), lait GAYELORD HAUSER (3,9g protéines/100g). Protocole d'encapsulation des levures Préparation de la suspension de levures *Préparation du levain: Elle est effectuée comme décrit à l'exemple 2. *Pour préparer les billes, on centrifuge 5 ml du levain. Le culot est repris dans 1 ml d'eau distillée et mélangé à 12 ml de la solution de polymères. On obtiendra ainsi des billes renfermant environ 6 millions de levures par bille. * Préparation de la solution de polymères Le lait de soja est dilué à raison de 13,5 ml de lait pour 4,5 ml d'eau distillée soit 18 ml au total. Ce mélange est placé sous agitation magnétique, et on ajoute 390 mg de PGA et 195 mg d'alginate de sodium Manucol DH. Après 15 min d'agitation, la solution obtenue est centrifugée à 5000 rpm pendant 10 min pour élimination des bulles d'air. * Préparation du mélange à extruder On prélève 12 ml de la solution de polymères auxquels on mélange le culot de levures remis en suspension dans 1 ml d'eau stérile. Préparation des billes Elle est effectuée en utilisant le mélange de solution de polymères et de levures décrit ci-dessus et en opérant comme décrit à l'exemple 2. Formation de la membrane Les billes sont ensuite remises en suspension dans 50 ml d'eau distillée et on alcalinise par 600 ul de NaOH N. On laisse la réaction se poursuivre pendant 15 min sous agitation magnétique, puis on ajoute 330 u1 d'HCl N (pH final : 5). On laisse en contact pendant 15 min sous agitation magnétique puis les billes sont rincées plusieurs fois à l'eau distillée. Les billes rincées sont conservées fraîches, en suspension dans l'eau distillée, ou encore congelées puis lyophilisées. Trois séries de 3 lots de billes ont été ainsi préparées à partir des 3 laits de soja du commerce. Etudes de viabilité La viabilité des levures a été déterminée dans les billes fraîches et sèches. Les résultats sont regroupés dans le tableau 5. On note une viabilité élevée des levures dans les billes lyophilisées: 68 % ou 70 %, soit 80 % ou 82 % de la viabilité initiale (85 %). Les résultats sont voisins dans les 3 séries d'essais utilisant les différents laits de soja. Relargage: Les pourcentages de relargage de chaque lot de billes ont été déterminés. * Méthode d'étude: On utilise des échantillons de 20 billes. Après 24 h d'incubation des billes dans 5 ml d'eau sucrée à 5 %, on prélève une goutte de cette eau de suspension et on dénombre les cellules présentes dans le volume total d'une cellule de Malassez (1 fol). On rapporte ensuite aux 5 ml du départ pour obtenir le relargage de levures pour 20 billes en 24 h. Enfin on peut calculer le pourcentage de relargage en faisant le rapport du nombre de cellules relarguées par le nombre moyen de cellules théoriquement en présence (20 billes à environ 6 000 000 levures / bille) * Résultats: Ils sont regroupés dans le tableau 5. Le pourcentage de relargage est voisin de 0,03% Exemple 4 - Encapsulation de levures de prise de mousse de champagne dans des billes de protéines du soja-PGA Préparation de deux séries de billes à partir de deux laits de soja du commerce, et en remplaçant le Manucol DH par le Manugel GHB. Viabilité, relargage. Essais de prise de mousse avec des billes fraîches réactivées, des billes sèches réactivées, et des billes sèches ajoutées directement, sans réactivation préalable. Protocole d'encapsulation des levures Deux séries d'essais ont été conduites, en utilisant deux laits de soja différents (Lait CEREAL et lait BJORG), et en remplaçant le Manucol DH (alginate de sodium) par le Manugel GHB (Kelco International). Préparation des lots * Préparation de la solution de polymères: Lait de soja (BJORG ou CEREAL) dilué à raison de 13,5 ml de lait + 4,5 ml d'eau distillée. Ajout de 390 mg de PGA et 195 mg de Manugel GHB dans les 18 ml de lait dilué. Dissolution par agitation magnétique de 15 min. Elimination des bulles d'air de la solution par centrifugation de 10 min à 5000 rpm. On prélève 12 ml de cette solution. * Préparation des levures à encapsuler: Préparation du levain: réhydratation de 5g de levures sèches actives dans 50 ml d'eau stérile à 35-40iC au repos pendant 15-20 min. On ajoute 50 ml de vin de base et 50 ml de liqueur (vin de base sucré à raison de 500g/l: soit 25 g de sucre dans 50 ml de vin de base). Pour la fabrication de billes chargées à environ 6 millions de levures par bille, on prélève 5 ml de ce levain que l'on centrifuge 1 min à 5000 rpm. Le culot de levures est mis en suspension dans 1 ml d'eau distillée. * Préparation du mélange à extruder: On mélange la suspension de levures (1 ml) aux 12 ml de la solution de polymères, on homogénéise par agitation magnétique pendant 2 min à vitesse réduite. * Formation des billes par gélification: On extrude le mélange à la seringue en faisant tomber les gouttes dans 50 ml d'une solution de CaC12 à 10%. Agitation magnétique pendant 10 min. Rinçage des billes 3 fois à l'eau distillée. * Formation de la membrane par transacylation: Les billes sont remises en suspension dans 50 ml d'eau distillée. Alcalinisation: addition de 600 ssl de NaOH N. Agitation magnétique de 15 min. Addition de 330 ,ui de HCI N. Agitation magnétique de 15 min. Rinçages des billes 3 fois à l'eau distillée. Les billes peuvent être ensuite congelées et lyophilisées. Les viabilités des levures encapsulées et les pourcentages de relargage ont été déterminés. Etude de viabilité Le tableau 6 rassemble les résultats obtenus. On note que les viabilités des levures dans les billes fraîches et sèches sont élevées: - dans les billes fraîches, elles sont compnses entre 76 et 80 %, soit 90 à 94 % de la viabilité initiale - dans les billes sèches, elles sont comprises entre 65 et 68 %, soit 78 à 81 % de la viabilité initiale. Relargage L'utilisation de Manugel GHB permet de réduire de manière très importante la fuite cellulaire: ainsi par exemple aucun relargage n'a été détecté (0% de relargage) pour les lots 140, 144 et 145, tandis qu'un pourcentage de relargage maximum de 0,009% a été observé avec les lots 137, 139 et 143. En variante et pour comparaison, dans chacune des deux séries, des billes ont été préparées en utilisant, au lieu du lait de soja dilué à raison de 13,5 ml de lait pour 4,5 ml d'eau, le même lait de soja non dilué (pur): les résultats de viabilité (Tableau 6) sont comparables à ceux obtenus avec les laits dilués. Essai de prise de mousse Des lots de billes de levures chargées à environ 6 millions de levures par bille ont été préparés respectivement à partir de deux laits de soja commerciaux: BJORG et CEREAL dans les conditions décrites ci-dessus (avec des laits dilués à raison de 13,5 ml de lait pour 4,5 ml d'eau). Différents modes d'incorporation des billes, fraîches et sèches, ont été essayés, utilisant ou non un stade préalable de réactivation par contact avec une solution sucrée. Des bouteilles-témoins ont été ensemencées pour comparaison avec des levures libres. Préparation des billes * Des lots de billes ont été préparés à partir de lait BJORG puis répartis en trois groupes: A, B, C (groupes de lots= LOTS) Le tableau 7 regroupe leurs caractéristiques de viabilité, de charge en levures, ainsi que le nombre moyen de billes pour 1 g (billes fraîches) ou 0,1g (billes sèches). Les billes ont été utilisées fraîches: LOT A (viabilité moyenne: 79%), ou lyophilisées: LOTS B et C (viabilité moyenne: 65%). * Des lots de billes ont été préparés à partir de lait CEREAL et répartis en trois LOTS (D, E, F) Leurs caractéristiques de viabilité, de charge en levures ainsi que le poids moyen de billes pour îg (billes fraîches) et 0,1g (billes sèches) sont regroupés dans le tableau 8. Les billes ont été utilisées fraîches: LOT D (viabilité moyenne: 78%), ou lyophilisées: LOTS E et F (viabilité moyenne: 69%) Répartition des billes et incorporation aux bouteilles - Billes fraîches du LOT A: 10 bouteilles reçoivent chacune 7 g de billes humides (soit environ 270 billes de poids moyen 26,2 mg) réactivées 1 h avant mise en bouteille dans une solution nutritive. - Billes sèches du LOT B: 10 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches (soit environ 650 billes de poids moyen 2,3 mg) réactivées 12 h avant mise en bouteille. - Billes sèches du LOT C: 3 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches non réactivées - Billes fraîches du LOT D: 10 bouteilles reçoivent chacune 7 g de billes humides (soit environ 290 billes de poids moyen 24,2 mg) réactivées 1 h avant mise en bouteille dans une solution nutritive. - Billes sèches du LOT E: 10 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches (soit environ 750 billes de poids moyen 2 mg) réactivées 12 h avant mise en bouteille. - Billes sèches du LOT F: 4 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches non réactivées. Composition de la solution utilisée pour la réactivation: 200 ml d'eau distillée, 200 ml de vin de base, et 200 ml de liqueur sucrée à 500 g/l. * Parallèlement on prépare 10 bouteilles d'un LOT témoin T (LOT à levures libres), qui reçoivent du levain, ajouté à raison de 5% en volume, comme pour un tirage traditionnel. Toutes les bouteilles contiennent un vin additionné de sucre à raison de 22 à 25 g/l. Après addition des billes ou des levures libres, les bouteilles sont capsulées, et placées sur lattes dans des locaux thermorégulés à 14-C. Résultats obtenus: suivi de la prise de mousse A des temps échelonnés, une bouteille est prélevée dans chaque lot pour mesurer la teneur en sucres résiduels et la pression développée. Evolution de la teneur en sucres *Billes BJORG (tableau 9 et figure 1) * La cinétique de consommation des sucres est plus lente avec les trois LOTS de billes qu'avec les levures libres (LOT témoin T), le retard concernant essentiellement les trois premières semaines de fermentation. Cependant les billes fraîches comme les billes sèches se sont montrées capables d'assurer une prise de mousse complète. * Comme il était attendu, la consommation de sucres est plus lente avec les billes sèches (LOTS B et C) qu'avec les billes fraîches (LOT A). Rappelons que la viabilité des billes sèches est légèrement inférieure à celle des billes fraîches. * Pour les billes sèches, de manière surprenante, après une période initiale de consommation plus lente, les billes non réactivées du LOT C paraissent "rattraper" les billes sèches réactivées et même être plus efficaces après 38 jours (5,8gon de sucres résiduels pour le LOT C au lieu de 8,10 g/l pour le LOT B). Cet essai n'a pu être suivi plus longtemps faute d'échantillons disponibles du LOT C. * Billes CEREAL (tableau 10 et figure 2) Toutes les conclusions rapportées ci-dessus pour les billes BJORG s'appliquent également aux billes CEREAL. Ici encore, on observe que la courbe obtenue avec les billes sèches non réactivées (LOT F) s'intercale entre celle des billes fraîches (D) et celle des billes sèches réactivées (E). Evolution de la pression Les résultats d'évolution des pressions sont présentés: - sur le tableau 11 et la figure 3, pour les billes BJORG - sur le tableau 12 et la figure 4, pour les billes CEREAL *Dans les deux séries, l'évolution des pressions est en accord avec les résultats de la consommation de sucres: - Un retard est observé dans la montée de pression pour toutes les billes par comparaison avec les levures libres. - Après un certain délai (de 21 jours pour les billes CEREAL, de 38 jours pour les billes BJORG), les billes sèches non réactivées des deux séries donnent une pression plus élevée que les billes sèches réactivées. * A l'exception des LOTS C et F, pour lesquels nous n'avons pas de valeur finale de pression (faute d'avoir prévu suffisamment de bouteilles ensemencées) mais une valeur intermédiaire de 4,8 bars après 38 jours, tous les autres lots de billes ont permis d'atteindre une pression 2 6 en fin d'essai. Analyse finale du vin après prise de mousse (Tableau 13) Le tableau 13 rassemble les résultats d'analyse du vin effectuée en fin de prise de mousse: - sur les bouteilles du LOT A (billes fraîches réactivées 1 h, BJORG) - du LOT B (billes sèches réactivées 12 h, BJORG) - du LOT D (billes fraîches réactivées 1 h, CEREAL) - du LOT E (billes sèches sèches réactivées 12 h, CEREAL) La comparaison avec le LOT témoin ensemencé avec des levures libres montre que les résultats obtenus avec les billes sont en général proches des valeurs témoins pour ce qui concerne les pressions, concentrations en sucres, degrés alcooliques, valeurs de pH, d'acidité totale. Pour le LOT D, la pression, légèrement inférieure, s'accompagne d'une teneur en sucres résiduels plus élevée et d'un degré alcoolique légèrement inférieur. Les valeurs d'acidité volatile et de S02 des LOTS avec billes sont un peu plus élevées que celles du témoin. Examen des autres caractéristiques des billes *Densité: La densité des billes permet une sédimentation rapide. *Relargage: Aucun trouble important n'a été noté, à l'examen visuel, en cours de prise de mousse. * Respect des caractérisfiques organoleptiques du vin: Les caractéristiques gustatives du vin après prise de mousse par les billes sont satisfaisantes. Cet exemple montre que les levures en billes à membrane peuvent déclencher une prise de mousse en un temps convenable, sans trouble appréciable ni dénaturation du goût, et qu'elles sédimentent correctement. - Non seulement les billes fraîches se montrent actives, mais aussi les billes lyophilisées, comme le laissait prévoir l'excellente viabilité des levures incluses démontrée précédemment. - Les billes sèches non réactivées se montrent actives, ce qui confirme les résultats obtenus avec les billes d'ovalbumine-PGA, et rend la méthode particulièrement intéressante: le procédé peut en effet non seulement résoudre le problème de conservation des billes, mais encore permettre une incorporation aux bouteilles extrêmement simple puisqu'il s'agit de la distribution d'un produit solide. Exemple 5- encap - fraîches: LOT 1 (viabilité moyenne des levures : 75 %) - ou lyophilisées: LOT 2 (viabilité moyenne des levures : 67 %) *Toutes les billes ont été réactivées pendant 24 h par contact avec une solution sucrée. * De manière à étudier l'évolution de la turbidité, nous avons utilisé du vin filtré pour ces essais (membrane 0,65 Fm)- Incorporation aux bouteilles: - Billes fraîches du LOT 1: 10 bouteilles reçoivent chacune 7 g de billes humides (soit environ 285 billes de poids moyen 24,4 mg) réactivées 24 h avant mise en bouteille. - Billes sèches du LOT 2: 10 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches (soit environ 720 billes de poids moyen 2,1 mg) réactivées 24 h avant mise en bouteille. Résultats: prise de mousse Evolution de la consommation en sucres: (Tableau 15 et figure 6) Avec les billes fraîches (LOT 1), la courbe de consommation des sucres est très proche de la courbe témoin, avec seulement une fin de prise de mousse un peu plus lente. Avec les billes sèches (LOT 2), le retard est un peu plus important mais ces billes donnent de bons résultats puisque la concentration en sucre tombe en dessous de 1 g/l au 56ème jour. Evolution de la pression (Tableau 16 et figure 7) Les courbes de montée de pression obtenues avec les billes ne s'écartent pas beaucoup de la courbe témoin, en particulier pour ce qui conceme les billes fraîches (LOT 1). Les valeurs mesurées au 56ème jour sont de 6,4 bars pour les billes fraîches (LOT 1) et 5,9 bars pour les billes sèches (LOT 2). Analyse finale du vin après prise de mousse Le tableau 17 rassemble les résultats d'analyse du vin effectuée en fin de prise de mousse après 102 jours sur des échantillons des LOTS 1 et 2. Sont intégrés à ce tableau les résultats d'une dernière mesure de la teneur en sucre (traces résiduelles) et de la pression (montée à 6,8 et 6,5 bars respectivement pour les LOTS 1 et 2). Par rapport au témoin avec levures libres, on obtient le même résultat final pour la teneur en sucre, la pression finale, le degré alcoolique, le pH, l'acidité volatile, l'acidité totale, le S02. Examen des autres caractéristiques des billes * Densité Malgré la dilution plus importante du lait de soja, les billes restent suffisamment denses pour permettre une sédimentation rapide *Evolution de la turbidité Les valeurs mesurées sont rassemblées dans le tableau 15. Par rapport à la valeur limite acceptable de 0,75 NTU, les mesures effectuées permettent de conclure à une absence de trouble important au cours de la prise de mousse. Ainsi une prise de mousse quasi-complète est obtenue après 56 jours avec les billes fraîches. Avec les billes sèches, il reste encore une petite quantité de sucres, qui disparaissent ensuite, comme l'indiquent les résultats des essais réalisés après 102 jours: la prise de mousse est alors complète. Les mesures de turbidité permettent de conclure à une absence de relargage important au cours de la prise de mousse. Exemple 6 - Encapsulation de levures de prise de mousse, billes de soja-PGA Billes de soja-PGA lyophilisées : prise de mousse conduite avec des billes sèches réactivées et des billes sèches non réactivées. Préparation des billes Le protocole de préparation des billes est celui décrit à l'exemple 5 avec du lait de soja CEREAL dilué à raison de 12 ml pour 6 ml d'eau. Toutes les billes ont été lyophilisées. Caractéristiques des billes Elles sont rassemblées dans le tableau 18. La viabilité moyenne des levures dans les billes sèches est de 64%, soit 76 % de la viabilité initiale (85 %). Répartition des billes Incorporation aux bouteilles: - Billes sèches du LOT 1: 20 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches (soit environ 790 billes de poids moyen 1,9 mg) réactivées 24 h avant mise en bouteille. - Billes sèches du LOT 2: 20 bouteilles reçoivent chacune 1,5 g de billes sèches non réactivées. Résultats de l'étude de prise de mousse Evolution de la consommation des sucres Elle est présentée dans le tableau 19 et la figure 8. On note un retard pour les bouteilles contenant des billes par rapport aux valeurs témoins (avec levures libres), retard plus prononcé avec les levures non réactivées (LOT 2): Après 63 jours, les 2 courbes obtenues avec les billes, réactivées (LOT 1) et non réactivées (LOT 2), se rejoignent: la concentration en sucre devient inférieure à 1g/l. Après 70 jours: la concentration en sucre est de 0,40 ou 0,50 g/l: la prise de mousse est complète. Evolution des pressions Elle est présentée dans le tableau 20 et la figure 9. Malgré une montée en pression plus lente qu'avec les levures libres, on peut noter avec les billes réactivées ou non réactivées, une augmentation progressive de la pression jusqu'à atteindre une valeur voisine de 5 bars à 63 jours, supérieure à 5 bars après 70 jours (pressions mesurées). Cet essai montre à nouveau que les billes sèches peuvent conduire la prise de mousse jusqu'à son terme, et que la réactivation n'est pas nécessaire. Examen des autres caractéristiques des billes *Turbidimétrie: Au 56ème jour, aucun trouble important n'est noté: la turbidité est en moyenne de 0,8 NTU (LOT 1) et 0,44 NTU pour le LOT 2. * Analyses finales après prise de mousse après 70 jours. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 21.0n note que les résultats obtenus avec les billes des LOTS 1 et 2 sont comparables à ceux du lot témoin avec levures libres. Cet essai de prise de mousse confirme la fonctionnalité des levures encapsulées dans des billes à membrane lyophilisées: une prise de mousse complète est observée après 70 jours pour les deux lots de billes. Les billes sèches n'ont pas besoin d'être réactivées avant la mise en bouteille: après un démarrage plus lent, les courbes d'évolution des sucres et des pressions rejoignent, au bout de deux mois, les courbes obtenues avec les billes réactivées. Bilan des essais de prise de mousse Les paramètres des quatre séries d'essais et les résultats de fin de prise de mousse sont regroupés pour comparaison sur le tableau 22. La méthode d'encapsulation en billes de protéine-PGA se montre compatible avec la viabilité des levures en billes sèches (avec les protéines de soja, viabilité : 65 à 70 %, soit 78 à 82 % de la viabilité initiale) aussi bien qu'en billes fraîches (viabilité: 75 à 80 %, soit 88 à 94 % de la viabilité initiale). La possibilité de séchage des billes est un résultat complètement nouveau. En effet, les levures ne survivent pas au séchage lorsqu'elles sont encapsulées dans des billes d'alginate préparées par les procédés connus de simple extrusion ou de co-extrusion dans une solution calcique. Le séchage des billes est d'un grand intérêt car il permet de préparer les billes à l'avance et de les stocker. De plus, la membrane prévient tout relargage de levures en cours de prise de mousse. Enfin les billes sèches peuvent être ajoutées aux bouteilles directement, sans stade de réactivation préalable, ce qui simplifie considérablement le mode d'introduction des billes dans les bouteilles. Tableau 1: Comparaison des viabilités des levures de boulanger dans des billes simples d'alginate et dans des billes à membranes de PGA-ovalbumine BILLES SIMPLES BILLES A MEMBRANE D'ALGINATE PGA-OVALBUMINE Levures de boulanger Levures de boulanger Viabilité Viabilité des Viabilité des Viabilité Viabilité des Viabilité des initiale levures dans levures dans initiale levures dans levures dans Lots Lots des les billes les billes des les billes les billes levures fraiches sèches levures fraiches sèches 1 95,50% 94,10% 9,5% 56 99,40% 96,40% 35,70% 2 98,30% 97,10% 9,10% 57 98,70% 97,40% 16,90% 3 98.80* 96.90% 12.90% 58 99,20% 96,15% 39.15* 4 97,70% 95,90% 7% 59 99,60% 97,50% 18,90% 5 95,90% 96,90% 5,50% 60 99% 95,20% 37,95% moyenne 98% 96% 8,80% moyenne 99% 96% 30% Tableau 2: Levures de prise de mousse de champagne - Viabilité dans les billes Ovalbumine-PGA chargées à environ 3 millions de levures par bille BILLES FRAICHES BILLES SECHES Viabilité Lots initiale des Nombre de Viabilité Nombre de Viabilité levures cellules par cellules par des levures des levutres bille bille Lot 83 79,65% 73,70% 2 850 000 44,50% 3 362 500 Lot 84 79,60% 70,70% 2 910 000 41,20% 2 810 000 Lot 85 79,60% 72,15% 2 512 000 40,60% 2 600 000 Lot 86 79,60% 68,60% 2 640 000 39,80% 2 925 000 Lot 87 79,60% 69,90% 2 450 000 40,60% 2 987 500 Lot 88 79,60% 69,40% 2 540 000 39,70% 2 872 500 Lot 89 79,60% 74,45% 2 807 500 40,15% 2 877 500 Moyenne 80% 71% 2 672 785 41% 2 905 000 Tableau 3: Levures de prise de mousse de champagne. Viabilité dans les billes Ovalbumine-PGA chargées à environ S millions de levures par bille Viabilité BILLES FRAICHES BILLES SECHES initiale des Viabilité des Nombre de Viabilité des Nombre de levures levures cellules par bille levures cellules par bille Lot 73 81,75% 73,60* 4 862 500 47,80% 5 075 000 Lot 74 81,35% 70,60% 5 070 000 47,00% 5 040 000 Lot75 81,35* 76,70% 4825000 45,40% 5675000 Lot 76 81,35% 76,10% 5 125 000 47,50% 4980000 Lot 77 81,35% 77,40% 4 650 000 54,90% 4 825 000 Lot 78 81,35% 73,60% 4 740 000 48,20% 5 075 000 Lot 79 79,70% 75,90% 4 875 000 47,90* 5 425 000 Lot 80 79,70% 71,20% 5 900 000 45,85% 4 850 000 Moyenne 81% 74% 5 005 940 48% 4 495 625 Tableau 4: Essai de prise de mousse avec billes sèches PGA-ovalbumine Evolution de la concentration en sucre et des pressions (bars) en fonction du temps et analyses finales LOT TEMOIN LOT A LOT B 10 bouteilles avec 15 bouteilles avec 10 bouteilles 1,00g de billes sèches 0,650g de billes avec 5% non réactivées sèches non réactivées de levures (3 millions de (5 millions de libres levures par bille) levures par bille) Concentration en 16,85 22,15 21,25 sucre (g/l) 12 jours Pression calculée 2,05 0,7 0,95 Concentration en 4,50 21,30 20,20 sucre (g/l) 27 jours Pression calculée 5,60 0,275 0,60 Pression mesurée 5,125 0,90 1,20 Concentration en 6,70 3,30 sucre (g/I) 105 jours Pression calculée 4,40 5,30 Pression mesurée 4,575 5,425 Concentration en traces 0,90 0,60 sucre (g/l) 168 jours Pression calculée 6,20 5,60 6,20 Pression mesurée 6,20 6,00 6,10 éthanol % 12,40 11,80 11,75 168 jours acidité 0,30 0,23 0,22 volatile (H2SO4 g/l) acidité 4,95 4,80 4,75 totale (H2SO4 g/l) S02 total 60 47 39 mg/l pH 3,10 3,13 3,15 Tableau S - Levures de prise de mousse de champagne. Viabilité dans les billes soja-PGA et relargage en fonction du lait de soja utilisé Taux en Viabilité Lait de Viabilité Viabilité % de protéine billes Lots soja initiale des billes relargage pour sèches utilisé levures fraîches 100g 126 85% 73% 66% 0,045 131 BJORG 3,6g 87% 76,5% 67% 0,019 134 83,5% 75,5% 71% 0,036 MOYENNE 85% 75% 68% 0,03 127 85% 75% 70% 0,019 132 CEREAL 3,8g 87% 75% 70% 0,036 135 83.5% 74,5% 70% 0,027 MOYENNE 85% 75% 70% 0,027 128 85% 78% 71% 0,019 GAYELORD 133 HAUSER 3,9g 87% 74% 69% 0,027 136 83,5% 73% 70% 0,027 MOYENNE 85% 75% 70% 0,024 Tableau 6 - Levures de prise de mousse de champagne- Viabilité dans les billes soja-PGA-Manugel Dilution Viabilité Viabilité Viabilité du lait Lots initiale des billes billes levures FRAICHES SECHES lait eau 137 84% 72,5% 67% 139 83% 79% 66,5% 13,5mol 4,5mI 140 83% 76,5% 67,5% C E R Moyenne 84% 76% 67% E 68% A 138 84% 78% L 141 83% 79% 67% 18rn1 (pure 142 83% 74% 70% Moyenne 84% 77% 68% 143 85% 80% 70% 144 85% 80% 67 13,5ml 4,5mol 145 85% 80% 67% B J Moyenne 85 80% 68% O R G 146 83% 78% 65,5% îgml 147 83% 78% 65% (pur) ~ l4S 83% 76% 65% Moyenne 835b 77,5% 659b Tableau 7 - Billes PGA-soja BJORG, levures de prise de mousse Nombre et viabilité des levures dans les billes, nombre de billes rapporté au poids Nombre Nombre de Viabilité Nombre de Viabilité Nombre de Lots de billes billes billes cellules billes cellules n fraîches sèches fraîches par bille sèches par bille dans 1 g dans 0,1g 169 82% 5 812 500 41 64% 5 865 000 47 170 80,5% 6150000 37 64% 6 050 000 44 171 77% 5 655 000 42 64% 6 390 000 44 172 82% 5 775 000 35 63% 6 400 000 42 173 78% 5 817 500 38 69% 6 225 000 43 174 79% 6 032 500 38 69% 5 952 500 44 175 79% 6 180 000 37 65% 6 600 000 42 176 77% 6 077 500 35 65% 6 477 500 43 177 77% 6 120000 40 66% 6 145000 42 178 76% 6 270 000 40 61% 6510000 41 Moyenne 79% 5 989 000 38 65% 6 261 500 43 Tableau 8 - Billes PGA-soja CEREAL, levures de prise de mousse Nombre et viabilité des levures dans les billes, nombre de billes rapporté au poids Nombre Nombre de Viabilité Nombre de Viabilité Nombre de Lots de billes billes billes cellules billes cellules n fraîches sèches fraiches par bille pour 1 g sèches par bille dans 0,1g 159 78% 5 810 000 47 64% 6 100 000 57 160 78% 5 287 500 45 63% 7 100 000 54 161 80,5% 5700000 40 72% 5880000 49 162 81,5% 5890000 35 73% 5900000 45 163 75% 6 570 000 46 67% 6 600 000 55 164 76,5* 6110000 41 63,5% 6262500 49 165 76% 5 915 000 43 70% 6 420 000 51 166 82B 5 680000 37 70% 6 555 000 44 167 76% 6 150 000 43 71% 6 195 000 50 168 80% 5 785 000 37 73% 6 700 000 46 Moyenne 78% S 826 750 40 69% 6 371 250 50 Tableau 9 - Billes PGA-Soja BJORG-Manugel: essai de prise de mousse Evolution de la concentration en sucres en fonction du temps LOT TEMOIN LOT A | LOT B LOT C 10 bouteilles 10 bouteilles avec 7g 10 bouteilles avec 3 bouteilles avec avec 5% de de billes fraîches 1,5g de billes 1,5g de billes levures libres réactivéesl heure sèches réactivées sèches non 12h réactivées JOUR 0 25 25 25 25 jours 14 24 | 23 23 21 jours 5,25 13,40 18,30 21,40 28 jours 2,40 11.85 17.20 38 jours 0,20 3,45 8,10 5,80 48jours - 1,40 7,70 54 jours - 0,80 6,70 74 jours - - 1,30 Tableau 10 Billes Soja CEREAL-Manugel: essai de prise de mousse Evolution des concentralions en sucres en fonction du temps LOT TEMOIN LOT D LOT E LOT F 10 bouteilles 10 bouteilles avec 7g 10 bouteilles avec 4 bouteilles avec avec 5% de de billes frainches 1,5g de billes 1,5g de billes levures libres réactivées 1 heure sèches réactivées sèches non 12h réactivées JOUR 0 25 25 25 25 11 jours 14 23 23 23 21 jours 5,25 14.60 18,30 15.40 28 jours 2,40 10,50 17.20 13,90 38 jours 0.20 4.30 7.20 5,70 48jours - 2.30 4,50 54 jours - 1,20 4,30 74 jours - 2,50 Tableau 11 Billes Soja BJORG-Manugel: essai de prise de mousse Evolution des pressions en fonction du temps LOT TEMOIN LOT A LOT B LOT C 10 bouteilles 10 bouteilles avec 7g 10 bouteilles avec 3 bouteilles avec avec 5% de de billes fraîches 1,5g de billes 1,5g de billes levures libres réactivées 1 heure sèches réactivées sèches non 12h réactivées pression pression pression pression pression pression pression pression mesurée calculée mesurée calculée mesurée calculée mesurée calculée (P M) (P C) (P M) (P C) (P M) (P C) (P M) (P C) Il jours 250 2.75 0,01 0,25 0.10 0.S0 0,01 0,50 21 jours 4,68 4,94 2.65 2,90 1,425 1,675 0,65 0,90 28jours 6,00 5,65 3.30 3.30 2,00 1.95 38 jours 6,30 6,20 5,40 5,40 4,30 4,225 4,80 48jours - 6,10 5,90 4,50 4,325 54 jours - - 6,60 6,05 5,10 4,575 74 jours - - 6,30 5,925 Tableau 12 Billes Soja CEREAL-Manugel: essai de prise de mousse Evolution des pressions en fonction du temps LOT TEMOIN LOT D LOT E LOT F 10 bouteilles 10 bouteilles avec 7g 10 bouteilles avec 4 bouteilles avec avec 5% de de billes fraîches 1,5g de billes 1,5g de billes levures libres réactivées 1 heure sèches réactivées sèches non 12h réactivées pression pression pression pression pression pression pression pression mesurée calculée mesurée calculée mesurée calculée mesurée calculée (P C) (P M) (P M) (P C) (P M) (P C) (P M) (P C) 11 jours 2,50 2,75 0,10 0,50 0,10 0,50 0,10 0,50 21 jours 4,68 4,94 2,35 2,60 1,425 1,675 2,15 2,40 28 jours 6,00 5,65 3,60 3,625 2,00 1,95 2,60 2,775 38 jours 6,30 6,20 5,30 5,175 4,40 4,45 4,80 4,80 48jours - 6,00 5,675 5,00 5,125 54 jours - - 6,60 5,95 5,70 5,175 - 74 jours - - - 6,50 5,625 Tableau 13 - Billes de soja-PGA-Manugel: analyses après 130 jours de prise de mousse LOT LOT A LOT B LOT D LOT E TEMOIN bouteilles avec bouteilles avec bouteilles avec 10 bouteilles avec bouteilles 1,5g de billes 7g de billes 1,5g de billes 7g de billes avec 58 BJORG fraîches BJORG seches CEREAL fraîches CEREAL sèches de levures réactivées 1h BJORG sè l'h réactivées 1h réactivées 12h libres pression mesurée 6,70 6,50 6,50 6, 00 6,50 (bars) concentration en sucre traces 0.40 traces 1.40 traces (g/l) Ethanol 12.10 12.10 12.10 11.95 12.10 (%) acidité volatile 0.24 0.35 0.26 0,47 0.34 (H2SO4 g/l) acidité totale 4.90 4,90 4,65 4.95 4.75 (H2SO4 g/l) S02 total (mg/l) 40 46 49 46 49 pH 3.12 3.19 3.16 3,19 3.16 Tableau 14 - Billes PGA-soja BJORG, levures de prise de mousse, nombre et viabilité des levures dans les billes, nombre de billes rapporté au poids Nombre Nombre Nombre Nombre Viabilité Viabilité de de billes de de billes Lots billes billes levures fraîches levures sèches fraiches par bille pour 1g sèches par bille pour 0,1g 183 66% 6120000 47 61,5% 6075000 49 184 71% 5 500 000 40 65% 5 927 500 47 185 71% 5 182 500 40 65% 6 007 500 43 186 73% 5 700 000 38 64% 6 305 000 45 187 80% 5 425 000 37 62% 5 957500 47 188 73% 6 317 500 39 64,5% 5 422 500 45 189 69% 6 487 500 49 61% 5 577 500 48 190 74,5% 5 980 000 43 64% 6 352 500 54 191 73% 5 750 000 43 68% 5 967 500 52 192 76% 6190000 44 67% 5 420 000 49 193 71% 6040000 42 62% 6 530 000 51 194 70% 6 335 000 46 66% 6 097 500 49 195 803i 5 500 000 39 - - 1% 76% 4 885 000 37 - - 197 74% 5 897 500 38 - - 198 79% 5425 000 37 - - * Moyenne 73,5% 5 858 430 41 64% 5 970 000 48 Tableau 15 Billes Soja BJORG-Manugel: essai de prise de mousse Evolution des sucres et de la turbidité en fonction du temps LOT 1 LOT2 billes fraîches réactivées 24h billes sèches réactivées 24h 7g par bouteille 1,5 par bouteille concentration en turbidité concentration en turbidité sucre (g/l) (NTU) sucre (g/l) | (NTU) Jour 0 25 - 25 12 jours 10.15 0,65 14,60 0,77 24jours 3.80 0,55 12,10 0.62 29 jours 3,10 0,52 6,70 0,49 42 jours 2,30 0,49 3.50 0.86 49jours 1,10 0,70 2,90 1.04 56jours 0,60 0,72 1,50 0,79 Tableau 16 - Billes Soja BJORG.Manugel: essai de prise de mousse Evolution des pressions en fonction du temps LOT 1 LOT 2 billes fraîches réactivées 24h billes sèches réactivées 24h 7g par bouteille 1,5g par bouteille Passion Pression Pression Pression mesurée (PM) calculée (PC) mesurée (PM) calculée (PC) 12 jours 3.00 3,70 2.10 2,60 24 jours 4,80 5,30 3,90 3,225 29 jours 5,30 5,475 4,40 4,575 42 jours 5,70 5.675 5.40 5.375 49jours 6.00 5,975 5,45 5,525 56jous 6,40 6,10 5,90 5,90 Tableau 17 - Billes de PGA-soja BJORG: analyses après 102 jours de prise de mousse LOT 1 TOT 2 10 bouteilles avec 7g 10 bouteilles avec 1,5g de billes fraîches de billes sèches réactivées 24h réactivées 24h pression mesurée 6,80 6,50 (bars) concentration en sucre traces traces (g/l) éthanol 12.05 12,00 (%) 12,00 acidité volatile 0,30 0,29 (H2S04 g/l) acidité totale 4,95 4.95 (H2S04 g/l) SO2 total 40 46 (mg/l) pH 3,13 3,13 Tableau 18 - Billes de PGA-soja CEREAL: viabilité des levures de prise de mousse dans les billes Lots Viabilité dans Viabilité dans Lots Viabilité dans Viabilité dans doubles billes fraîches billes sèches triples billes fraîches billes sèches 202 74% 62% 230 67% 61% 203 71,5% 59% 231 70% 62% 204 76% 61% 232 66% 62% 205 72% 63% 233 70% 60,5% 206 74% 62% 234 72% 62% 207 75% 61% 235 76,5% 65% 208 75% 60% 236 75% 66% 209 73,5% 60 5% 237 72% 70% 210 73% 59% 238 76% 65% 211 70% 63% 239 73% 64% 212 76,5% 64% 240 72% 71,5% 213 72% 69% 241 71% 64% 214 75% 63% 242 68% 62% 215 73% 63% 243 73% 64,5% 216 71% 60% 217 69% 60% 218 72% 60% 219 76% 61% 220 75% 61,5% 221 76% 62% 222 71% 61% 223 73% 60% 224 70% 60,5% 225 72% 63% 226 72% 59% 227 76% 63% 228 70% 60% 229 70,5% 60% Moyenne 75% 64% 71% 64% Tableau 19 - Billes soja CEREAL: essai de prise de mousse Evolution de la concentration en sucres en fonction du temps LOT 1 LOT 2 LOT 20 bouteilles avec 1,5g 20 bouteilles avec 1,5g de TEMOIN de billes sèches billes sèches non 10 bouteilles réactivées24 heures réactivées avec 5% de levures libres bouteille bouteille bouteilles bouteille moyenne moyenne n 1 n 2 n 1 n 2 jour 0 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 7 jour 13,25 13,90 14,60 14,25 17,20 17,20 17,20 14 jours 5,30 9,90 9,90 9,90 15,80 15,80 15,80 21 jours 3,30 7,80 7,50 7,65 14,60 14,60 14,60 28 jours 1,40 4,80 4,10 4,45 13,00 13,00 13,00 35 jours 0,20 530 6.60 5,95 11.10 12,70 11,00 42 jours 2,70 1.90 2,30 16,10 11.90 14,00 49 jours 4,20 1,50 2,85 10,90 12,70 11,80 56 jours 2,20 2,95 2,575 14,05 11,00 12,58 63 jours 0,60 0,90 70 jours 0,20 0,40 0,50 Tableau 20 - Billes soja CEREAL: essai de prise de mousse Evolution des pressions en fonction du temps LOT LOT 1 LOT 2 TEMOIN 20 bouteilles avec 1,5g 20 bouteilles avec 1,5g 10 bouteilles de billes sèches de billes sèches non avec 5% de réactivées24 heures levures libres réactivées pression pression pression pression mesurée calculée mesurée calculée pression pression (P M) (P C) (P M) (P C) mesurée calculée (P M) (P C) bouteille bouteille moyenne bouteille bouteille moyenne bouteille bouteille moyenne bouteille bouteille moyenne n 1 n 2 n 1 n 2 n 3 n 4 n 3 n 4 7 jours 1,85 2,90 0,45 0,25 0,35 2,70 2,60 2,65 0,1 0,1 0,1 1,95 1,95 1,95 14 jours 5,10 4,90 2,10 2,10 3,80 0,1 0,1 2,30 2,30 21 jours 5.40 5.40 3.40 3.40 3,40 4.30 4.40 4,35 0,55 0,55 0,5s 4,30 2,60 3,45 28 jours 6,30 5.90 3.60 3.60 3,60 5.05 5,20 5,10 0.80 0.60 0,70 3.00 3.00 3,00 35 jours 6,30 6,20 4,20 4,00 4,10 4,90 4,60 4,75 2,60 2,20 2,40 3,50 3,10 3,30 42 jours - - 4,80 5,10 5,00 5,60 5,80 5,70 1,40 2,50 1,95 2,20 3,30 2,75 49 jours - 4,50 5,20 4,85 5,20 5,90 5,55 2,60 2,20 2,40 3,50 3,10 3,30 56 jours - 4,90 4,60 4,75 5,70 5,50 5,60 1,90 2,70 2,30 2,75 3,50 3,10 63 jours 5.20 - 6.10 4.80 - 6.00 70 jours 6,10 6,20 5,50 6.15 - 5,30 - - 6.15 Tableau 21 - Billes de PGA-soja CEREAL: analyses après 70 jours de prise de mousse LOT TEMOIN LOT 1 LOT 2 20 bouteilles avec 1,5g 20 bouteilles avec 1,5 g 10bouteilles avec 5% de billes sèches de billes sèches non de levures libres réactivées 24h réactivées pression mesurée 6,10 5,50 5,30 (bars) concentration 0,20 0,40 0,50 en sucre (g/l) éthanol 12,45 12,00 11,90 (%) acidité volatile (H2SO4 g/l) 0,26 0,39 0,36 acidité totale (H2SO4 g/l) 4,75 4,80 4,75 SO2 total 55 48 47,5 (mg/l) pH 3,21 3,19 3,19 Tableau 22 - Bilan des essais de prise de mousse. Billes PGA-protéine chargées à environ 6 millions de levures par bille* FIN PRISE DE MOUSSE Poids/ Etat des Viabilité Pression Exemple Protéine LOTS Réactivation N bouteille billes % Sucres Jour mesurée g/l (bars) A* 1g sèches 41 NON 168 0,90 6,00 2 OVALBUMINE B* 0,65g sèches 48 NON 168 0,60 6,10 A 7g fraîches 76 1h 54 0,80 6,60 SOIA BJORG B 1,5g sèches 67 12h 74 1,3 6,3 (13,5ml+ 4,5ml eau) C** 1,5g sèches 67 NON 38 5,8 4,8 4 D 7g fraîches 80 1h 54 1,2 6,6 SOJA CEREAL E 1,5g sèches 68 12h 74 2,5 6,5 (13,5ml + 4,5ml eau) F** 1,5g sèches 68 NON 38 5,7 4,8 SOJA 1 7g fraîches 75 24 h 56 0,6 6,4 BJORG 5 (12ml+ 2 1,5g sèches 67 24 h 56 1,5 5,9 6ml eau) SOJA 1 1,5g sèches 64 24 h 70 0,4 5,5 CEREAL 6 (12ml+ 2 1,5g sèches 64 NON 70 0,5 5,3 6ml eau) *Sauf LOTS A et B de l'exemple 2: chargées respectivement à 3 millions et à 5 millions de levures par billes ** LOTS C et F: prise de mousse arrêtée au 38ème jour. REVENDICATIONS 1. Particules, notamment billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, additionnée d'au moins un polysaccharide gélifiable, lorsque ni le polysaccharide estérifié, ni la polyamine ne sont gélifiables dans les conditions opératoires choisies, ladite particule comprenant au moins en surface une membrane formée par le produit de la réaction de transacylation avec formation de liaisons covalentes amide entre le polysaccharide estérifié et ladite polyamine au sein d'un gel, et ladite particule comprenant au moins en partie dans sa masse un matériel vivant tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, par exemple de fermentation, tel que des levures, lesdites particules étant de préférence sèches, c'est-à-dire qu'elles ont subi une opération de séchage. 2. Particules selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont sèches, de préférence lyophilisées. 3. Particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que le matériel vivant est un microorganisme capable d'effectuer une fermentation, en particulier une fermentation alcoolique. 4. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que le microorganisme est une levure, en particulier du genre Saccharonqyces ou Schizosaccharomyces. 5. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que le polysaccharide précité est porteur de groupements carboxyliques estérifiés, en particulier un alginate de propylène glycol, une pectine, en particulier une pectine fortement méthoxylée, ou tout autre composé obtenu par estérification de carboxyles d'un polysaccharide porteur de carboxyles. 6. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la polyamine précitée comprend une protéine , un polypeptide, un polyaminoacide, un polysaccharide porteur de groupements aminés, tel que le chitosan, une substance organique, aliphatique, alicyclique ou aromatique porteuse de plusieur groupements aminés primaires ou secondaires, telle que l'éthylènediamine, la pentaméthylènediamine, l'hexaméthylènediamine, la pipérazine, la phénylènediamine ou la polyéthylèneimine. 7. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que le polysaccharide précité est un polysaccharide gélifiable, en particulier choisi parmi le groupe consistant d'un alginate, d'un carraghénane, en particulier le kappa-carraghénane, une pectine gélifiable, en particulier une pectine faiblement méthoxylée, le chitosan, ces polysaccharides présentant l'avantage d'être gélifiables, par exemple par un cation mono ou polyvalent, tel que le sodium, le potassium ou le calcium présent dans un bain de gélification. 8. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que l'épaisseur de la membrane précitée est comprise entre 1 % et 50 % du rayon de la particule, encore mieux de 4 à 10 % du rayon de la particule, en particulier cette particule ayant un diamètre compris entre quelques microns et plusieurs millimètres, et dans le cas de procédure de fermentation, en particulier de prise de mousse de champagne, un diamètre de l'ordre de 1 à 5 millimètres. 9. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que les proportions de polysaccharide gélifiable par rapport au polysaccharide estérifié sont comprises entre 0 et 300 % en poids, les proportions de polysaccharide estérifié par rapport à la polyamine étant comprises entre 3 et 500 % en poids. 10. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la protéine précitée est une protéine choisie parmi le groupe consistant d'albumines comme la sérumalbumine, I'ovalbumine, l'alphalactalbumine, des globulines, le fibrinogène, la caséine, des scléroprotéines solubilisées, le collagène, I'atélocollagène, la gélatine, les hydrolysats de gélatine, les peptones, I'hémoglobine, des protéines végétales, telles les protéines du soja ou du blé, des gluténines, qui de préférence auront été dégradées, ou des mélanges de telles protéines naturelles existant telles quelles ou étant préparées par mélange, tels que les mélanges d'atélocollagène et de giycosaminoglycannes, le lait entier ou écrémé totalement ou partiellement, le lait condensé, le lait en poudre, les protéines du lactosérum, I'oeuf entier, le blanc d'oeuf, le jaune d'oeuf, la farine de soja, les concentrés protéiques de soja, les préparations alimentaires liquides au soja ou les laits de soja, ou le lait de coco, à titre d'exemples et sans limitation. 11. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la protéine précitée est choisie parmi le groupe consistant de l'ovalbumine, des protéines de lait animal, des protéines végétales, telles que des protéines du soja. 12. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que le polysaccharide gélifiable précité est un alginate, en particulier un alginate de sodium, de préférence contenant une proportion élevée de séquences polyguluroniques; le matériau polysaccharide estérifié préféré précité est constitué par l'alginate de propylèneglycol, en particulier l'alginate de propylèneglycol fortement estérifié. 13. Particules selon l'une des revendications précédentes, notamment billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent un alginate sous forme gélifiée, tel que l'alginate de calcium, de l'alginate de propylène glycol, et une protéine pure ou en mélange, ladite particule comprenant au moins en partie dans sa masse un matériel vivant, tel qu un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier des levures de boulanger, ou des levures de fermentation alcoolique, de préférence de prise de mousse, telles que des levures du genre Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, lesdites particules comprenant au moins en surface une membrane formée par le produit de la réaction de transacylation avec formation de liaisons covalentes amide entre l'alginate de propylène glycol et la protéine au sein du gel d'alginate, ladite particule étant de préférence sous forme sèche. 14. Procédé de fabrication préféré de ces particules, en particulier billes, capsules, microcapsules, sphères ou microsphères, caractérisé par les étapes successives suivantes: a) on prépare une première solution aqueuse initiale gélifiable par un agent de gélification, contenant au moins un polysaccharide estérifié et au moins une polyamine, additionnée d'au moins un polysaccharide gélifiable, lorsque ni le polysaccharide estérifié, ni la polyamine ne sont gélifiables dans les conditions opératoires choisies; b) on prépare une suspension de matériel vivant, tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier de fermentation, par exemple une levure, c) on mélange de manière sensiblement homogène la suspension obtenue en b) à la première solution aqueuse initiale gélifiable obtenue à l'étape a), en obtenant ainsi une première solution aqueuse initiale gélifiable contenant le matériel vivant, tel qu'un microorganisme, de préférence un microorganisme de biotransformation, en particulier de fermentation; d) on fait tomber des gouttes de cette première solution dans une deuxième solution aqueuse formant bain de gélification, contenant un agent de gélification, de manière à individualiser des particules par gélification à l'aide dudit agent de gélification; e) on met ensuite en contact les particules gélifiées obtenues avec une solution aqueuse alcaline, de manière à déclencher la réaction de transacylation au moins à la surface des particules gélifiées entre le polysaccharide estérifié et la polyamine contenue dans les particules, pendant une période de temps prédéterminée pour former une membrane au moins en surface des particules; f) on ajoute au milieu réactionnel un agent acide de manière à stabiliser les particules, que l'on peut ensuite séparer par tout moyen de séparation bien connu à l'homme de l'art, et en particulier par décantation ou centrifugation; g) on rince les billes à l'eau. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on réalise une étape h) de séchage des particules contenant le matériel vivant, par exemple une lyophilisation, une nébulisation, un séchage en séchoir d'air fluidisé, un séchage en étuve, de préférence un séchage par lyophilisation. 16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que la concentration en microorganismes de biotransformation, en particulier de fermentation, par exemple de levures, dans la suspension, ou dans la première solution aqueuse les contenant, est choisie de manière à obtenir une concentration suffisante en microorganismes par particule, similaire à celle qui a été utilisée dans le cadre de particules contenant des microorganismes de biotransformation, en particulier de fermentation de la technique antérieure, en général de l'ordre de 1 à 6000000 de microorganismes, par exemple des levures, par particule, sans limitation. 17. Utilisation des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans un procédé de biotransformation, par exemple dans une procédure de fermentation alcoolique, pour la fabrication de boissons fermentées ou refermentées, en particulier de vins ou de la bière, ou de préférence pour la prise de mousse de vins, en particulier la prise de mousse de champagne, et pour la production d'éthanol. 18. Procédé de biotransformation, de préférence de fermentation, caractérisé en ce qu'on introduit une quantité suffisante de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans le milieu où l'on veut réaliser la biotransformation, de préférence la fermentation, on réalise la procédure de biotransformation, de préférence la fermentation, et on sépare ensuite les particules de ce milieu. 19. Procédé de biotransformation, de préférence de fermentation, selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on réalise une fermentation alcoolique, en particulier pour fabriquer des boissons fermentées ou refermentées telles que le vin ou la bière, les particules contenant des microorganismes de fermentation telles que des levures, en particulier des levures de prise de mousse.