Brevet FR2740472A1 — publié le 19970430

La présente invention concerne de nouvelles souches de Bacillus thuringiensis, des compositions pesticides les mettant en oeuvre ainsi que l'utilisation de ces souches pour l'expression de protéines d'intérêt Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie gram positive qui produit des protéines ayant des propriétés insecticides, notamment à l'encontre des larves d'un grand nombre d'insectes. Ces bactéries, éventuellement après une inactivation, sont utilisées dans des compositions pesticides destinées à lutter contre les insectes nuisibles aux cultures ou vecteurs de maladies, notamment les moustiques. Actuellement, Bt sérotype 3a 3b notamment est utilisé contre les ravageurs des cultures, et le sérotype H14 est utilisé pour détruire les larves de moustiques. Les protéines à activité pesticide produites par Bacillus thuringiensis sont appelées ô-endotoxines et sont produites abondamment durant la sporulation. Elles s'accumulent sous forme d'inclusions cristallines parasporales, et peuvent représenter jusqu'à 25 % du poids sec des cellules sporulées. De nombreux gènes de & ndotoxines ont été clonés, séquencés et classifiés en cinq groupes et en divers sous-groupes sur la base d'homologies de séquence et du spectre de toxicité. Les gènes correspondants sont dénommés gènes cry. Les formulations à base de Bacillus thuringiensis sont utilisées à titre de biopesticides depuis près de 30 ans sous différentes appellations commerciales. L'utilisation de Bacillus thuringiensis comme agent de contrôle biologique présente de nombreux avantages par rapport aux pesticides chimiques ; en effet, il a un spectre d'hôte étroit et très spécifique et il est sans effet sur les insectes qui ne constituent pas les cibles et il est sans effet défavorable sur les vertébrés ou sur l'environnement. Toutefois, la faible persistance des ô-endotoxines dans l'environnement et la présence de spores dans les formulations représentent deux inconvénients pour la commercialisation des produits à base de Bacillus thuringiensis. Afin de résoudre ces deux problèmes, il a été proposé, dans la demande de brevet EP-192 319, d'encapsuler les toxines dans les membranes cellulaires, en particulier en utilisant des cellules de type Pseudom on as fluorescens exprimant la toxine CryIAc, ou bien, dans la demande de brevet PCT W094/25612, en exprimant la toxine CrylIIA dans un mutant non-sporulant affecté dans le gène spoOA.Cette dernière stratégie est possible car le mode d'expression du gène crylIIA est différent du mode d'expression des autres gènes cry, en effet, ce gène crylIIA est exprimé à partir d'un promoteur dont l'activation est indépendante de tous les gènes impliqués dans l'initiation de la sporulation ou des facteurs impliqués dans la sporulation. Chez Bacillus thuringiensis, la sporulation est dépendante de l'expression de deux facteurs sigma dénommés respectivement sigma (a)35 et sigma (a)28 ; compte tenu de leur grande homologie avec les facteurs sigma (a)E et sigma (a)K chez Bacillus subtilis , c'est cette dernière terminologie qui sera utilisée ci-après, de même que les gènes correspondants seront dénommés sigE et sigK. La présente invention concerne une souche de Bacillus thuringiensis qui exprime aE mais ne sporule pas ou peu ou ne produit pas de spores viables. La présente invention repose sur la mise en évidence du fait qu'un mutant de Bacillus thuringiensis qui exprime sigE et qui n'exprime pas sigK produit une quantité de toxines pratiquement identique à la souche sauvage correspondante, mais, d'autre part, ne sporule pas ou ne produit pas de spores viables. C'est en particulier le cas lorsque la souche est une souche sigK. La construction de telles souches présente deux intérêts : 1) éviter la dissémination de spores dans l'environnement lors de traitements avec des biopesticides ; 2) augmenter la persistance des toxines dans l'environnement en raison de leur encapsulation. Des essais ont montré qu'une souche de Bt n'exprimant pas le gène sigma K (sigK-) était capable d'accumuler une quantité de toxines équivalente à la souche d'origine en ne produisant pas de spores. Elle était capable de produire la quasi totalité des toxines codées par les gènes cry ou les gènes apparentés dont l'expression est dépendante de la production de la protéine aE. Afin d'obtenir des mutants sigK- de Bt il est particulièrement avantageux d'utiliser une technique d'interruption, par insertion ou délétion ou changement de phase, du gène sigK en introduisant une séquence d'ADN quelconque, cette séquence d'ADN pouvant, d'ailleurs, être choisie de façon à conférer au mutant un caractère de sélection ; il pourra s'agir, par exemple, d'une résistance à un antibiotique, notamment à la kanamycine, ce qui permettra de sélectionner les souches ayant subi l'interruption. Les mutants sigK- peuvent également être obtenus par la délétion de tout ou partie de la séquence nucléotidique correspondant à celle du gène sigK avec ou sans régions régulatrices. Les techniques d'interruption de gènes sont connues, elles consistent essentiellement à introduire au sein d'une séquence d'ADN portant le gène sigK une séquence d'ADN quelconque, l'ensemble étant introduit dans la souche, il se produit une recombinaison homologue, le gène sigK étant remplacé par le gène sigK interrompu. Le caractère de sélection permet à ce moment de sélectionner les mutants intéressants. Bien entendu, il est particulièrement intéressant de choisir, à titre de souches destinées à être transformées, des souches de Bacillus thuringiensis présentant une production de toxines très variées ou très importante. En effet, comme cela a été indiqué précédemment, le fait d'interrompre le gène sigK ne bloque que la sporulation mais ne bloque pas la production des toxines. Par Bt, on entend n'importe quelle souche de Bacillus th uringiensis. Ainsi, parmi les souches destinées à subir l'interruption, on pourra utiliser les souches industrielles. Par exemple, Bt subsp. kurstaki HD-1 décrite par Dulmage H.T. (1970), ou Bt israelensis, ou une souche sauvage telle que Bt aizawai 7-29 (cette souche est accessible à IEBC sous le n T07029). La présente invention concerne plus particulièrement la souche Bacillus thuringiensis 407 SigK- (pHT410) déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 26 octobre 1995 sous le n I-1634. Il est également possible, afin d'augmenter la production de toxines, d'introduire dans les souches sigK- selon l'invention des systèmes plasmidiques autoréplicatifs assurant l'expression desdites toxines selon des constructions qui sont également connues de l'homme du métier. Les protéines exprimées par la souche pourront dépendre du type d'activité pesticide recherché, ainsi, Cryl est toxique pour les lépidoptères, CryII contre les lépidoptères et les diptères et CryIV contre les diptères. De façon générale, il est possible de rendre sigK- des souches sauvages qui expriment de façon naturelle un certain nombre de toxines telles que cryIC, crylA, cryIVA,B,D. On peut également utiliser les souches mutantes telles que décrites selon l'invention qui sont sigK- et qui expriment, après intégration chromosomique ou plasmidique, des gènes codant pour des protéines homologues ou hétérologues vis à vis du génome de Bt. Une illustration de la technique utilisable est décrite dans Biotechnology, 1992, vol. 10, p. 418 (Lereclus et al.). On peut introduire dans la souche de Bt sigK-, par recombinaison homologue, un gène, par exemple le gène cryIC. Le recombinant acquiert le gène cryIC et ne retient pas d'ADN étranger. Plusieurs gènes de toxines peuvent être ainsi ajoutés, soit dans le chromosome bactérien par recombinaison homologue, ou intégrés sur des plasmides résidents. A titre d'exemple, une souche de Bt kurstaki exprimant à la fois le gène cryIAc sous contrôle de son propre promoteur et le gène cryIC sous contrôle du promoteur du gène cryIIIA. Parmi les gènes cry utilisables dans ces constructions, il faut citer: cryI, cry II, cry IV et cyt. Un autre mode d'introduction d'un gène à exprimer consiste à utiliser des plasmides de bactéries gram positive comportant une origine de réplication fonctionnelle chez Bt qui est décrit, par exemple, dans la demande de brevet PCT WO93/02199 concernant les plasmides pHT304 et pHT315. Les souches sigK- obtenues selon le procédé selon l'invention sont utilisables, éventuellement après inactivation, dans des compositions pesticides, en particulier dans les compositions insecticides destinées à être utilisées afin de détruire les larves, en particulier les larves d'insectes. Les compositions pesticides seront préparées selon des techniques elles-mêmes connues, c'est-à-dire, si cela est nécessaire, en mélange avec un support inerte ou non assurant une activité optimum des toxines de Bacillus en cause. L'inactivation des souches, qui est indispensable pour l'exploitation des souches sporulantes dans certains pays, est facultative dans le cas des mutants sigK- construits dans le cadre de la présente invention. Cette inactivation peut être réalisée par toute méthode physique ou chimique, notamment par une irradiation qui assure la non-viabilité des souches. Les souches selon l'invention ne comportent pas de spores viables, leur inactivation est plus aisée que dans le cas souches sporulées. Comme cela été indiqué précédemment, les toxines étant maintenues à l'intérieur des bactéries, ceci permet d'augmenter la durée de vie des toxines dans l'environnement (la toxine n'étant libérée que lors de la digestion de la bactérie par la larve). Toutefois, on a pu mettre en évidence le fait que certains mutants selon l'invention présentaient une résistance tout à fait exceptionnelle, dans ce cas il est nécessaire de prévoir, soit l'utilisation de souches spécifiques sélectionnées pour leur bonne digestibilité chez les insectes à traiter, ou bien prévoir des traitements chimiques, agents tensio-actifs par exemple, physiques, traitements par les ultrasons, ou biologiques, introduction d'éléments particuliers dans les parois du microorganisme (par technique de recombinaison génétique ou autres) afin d'assurer une meilleure digestibilité ou une accessibilité plus aisée de la toxine lorsque le microorganisme a été ingéré. Cette nouvelle souche de Bt est capable de fournir un des éléments à une composition pesticide, mais également utile comme vecteur pour exprimer des gènes homologues ou hétérologues vis à vis du génome de Bt, lesdits gènes étant clonés dans le mutant sigK- de Bt, soit à l'aide d'un plasmide autoréplicatif, soit par recombinaison homologue vis à vis du génome de la bactérie. La construction du système de vevteur pouvant exprimer, par exemple des protéases, des lipases, ou tout autre type de protéine, peut être similaire à celle décrite dans la demande de brevet PCT WO94/25612. L'invention concerne également une séquence nucléotidique contenant le gène SigE, ne contenant pas de gène SigK actif et contenant une séquence codant pour un gène d'intérêt. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après et en se référant aux figures sur lesquelles la figure 1 représente l'interruption des gènes chromosomiques sigE et sigK de Bacillus thuringiensis; les plasmides pAB1 et pAB2 sont intégrés dans le chromosome de Bt par recombinaison homologue, le second événement de recombinaison homologue conduit à la perte de toute la séquence de pRN5101 ; les flèches indiquent la direction de transcription des gènes ApR, EmR et KmR qui correspondent aux gènes conférant, respectivement, la résistance à l'ampicilline, l'érythromycine et la kanamycine, les triangles représentent, respectivement, I'origine de réplication de pBR322 (oriEc) et l'origine de réplication de pE194ts (orits) la figure 2 représente la construction des plasmides pour l'analyse de la transcription dans Bacillus thuringiensis ; pHT304-18Z est, comme cela a été préalablement décrit ( Agaisse et Lereclus 1994b) ; les flèches indiquent la direction de transcription de ermC, bla et lacZ et la direction de réplication fonctionnelle dans E. coli (oriEc) ; ori1030 est l'origine de réplication du plasmide de Bt pHT1030 (Lereclus et Arantes 1992); les flèches brisées indiquent la direction de transcription initiée à partir du promoteur psigE, psigK, Bt I et Bt II, comme cela a été indiqué précédemment (Rong et al. 1986 ; Sandman et al. 1988 ; Wong et al. 1983); les fragments HindlII-BamHI portant les régions promotrices des gènes spoIID, cotA et crylAa ont été clonés dans pHT304-18Z; la figure 3 représente l'expression de la p-galactosidase dans Bt sous contrôle des promoteurs des gènes spoIID et cotA ; les cellules sont mises en croissance sur milieu SP à 30"C ; le temps zéro indique la fin de la phase exponentielle, tn est le nombre d'heures avant ou après le temps zéro;A est l'activité p-galactosidase de la souche Bt portant pHTspoIID B est l'activité p-galactosidase de la souche Bt portant pHTcotA ; l'activité spécifique de p-galactosidase est déterminée aux temps indiqués dans Spo+ 407 (1), 407 SigE (+) et 407 SigK- (O) la figure 4 représente l'expression de la -galactosidase dirigée sous contrôle de crylAa dans les souches de Bt portant pHTcrylA2, mise en croissance sur milieu SP à 30"C et l'activité -galactosidase étant déterminée aux temps indiqués Spo+ 407 (), 407 SigE () et 407 SigK (O);; EXEMPLE 1 Matériel et méthodes Souches bactériennes et milieux La souche Bt 407 (sérotype H1) et son dérivé acristallifère (Cry-) ont été isolés par O. Arantes comme cela a été décrit précédemment (Lereclus et al. 1989). E coli K-12 souche TG1 (h (lac-proAB) supE thi hsd D5 (F'traD36 pro+ proB+ laclq lacZ AMiS)) est utilisé pour les expériences de clonage (Gibson 1984). Les souches de Bt sont cultivées à 30"C dans un milieu Luria (LB) et en milieu HCT (Lecadet et al. 1980) ou dans un milieu nutritif de sporulation (milieu SP) (Lereclus et al. 1995). Les souches de E. coli sont cultivées à 37"C dans un milieu LB.La concentration en antibiotique pour la sélection bactérienne est la suivante : ampicilline, 100 crg/ml (pour E. coli) erythromycine, 5 ,ug/ml (pour Bt) ; kanamycine, 10 zg/ml pour E. coli et 200,ug/ml pour Bt. Plasmides et fragments d'ADN Le plasmide pRN5î0l qui a été fourni par S. Gruss est un plasmide à origine de réplication thermosensible chez les gram positifs, il a été construit par insertion de pE194ts (Villafane et al. 1987) dans le site Clal de pBR322. Le plasmide Bluescript (pBS KS-) provient de la société Stratagène et les constructions des plasmides pHT304-18Z et pHT410 ont déjà été décrites (Agaisse et Lereclus 1994b ; Lereclus et al. 1989). Les oligonucléotides (CryIA-l et CrylA-2) utilisés pour l'amplification PCR du fragment de 362 bp contenant la région promoteur du gène crylAa (Wong et al. 1983) sont décrits dans le tableau 1.Le primer CryIA-l a une extension de 7 bp à l'extrémité 5' contenant le site de restriction HindIII et le primer CryIA-2 contient une extension de 8 bp avec le site de restriction BamHI. Les deux sites de restriction sont introduits pour faciliter le clonage dans pHT304-18Z. Pour interrompre les gènes Bt sigE et sigK, les régions 5' et 3' des gènes correspondants sont amplifiées par PCR en utilisant des oligonucléotides avec les sites de restriction appropriés à l'extrémité 5' (tableau 1) et sous-clonées séparément dans pBS KS-. Les régions 5' des gènes sigE et sigK sont des fragments de restriction de BamHI-XbaI de 857 et 611 bp respectivement. Les régions 3' sont des fragments de restriction EcoRI-BamHI de 807 et 606 bp respectivement. Les fragments d'ADN contenant les régions 5' et 3' de chacun des gènes sont purifiés et ligaturés avec un fragment de 1,5 kb XbaI-EcoRI portant le gène aphA3 d'Enterococcus faecalis (cassette KmR) (Trieu-Cuot et Courvalin 1983) dans le site de restriction BamHI du plasmide pRN5î0î. Les plasmides thermosensibles résultants pAB1 et pAB2 portent une copie interrompue par un gène de résistance à la kanamycine dans les gènes sigE et sigK respectivement. Les plasmides pDG675 et pDG676 portant respectivement la région promotrice des gènes spoIID et cotA de B. subtilis ont été fournis par le Dr. P. Stragier (Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris, France). pHTspoIID a été construit en sous-clonant le fragment de restriction de 300 bp HindIII-BamHI de pDG675 entre les sites de restriction Hindîll et BamHI de pHT304-18Z. pHTcotA a été construit comme suit : les 400 bp du fragment EcoRI-BamHI de pDG676 sont d'abord sous-clonées dans pBS KS-, donnant pKScotA. Le fragment de restriction HindlII-BamHI de pKScotA est alors sous-cloné entre les sites de restriction Hindilî et BamHI de pHT304 1 8Z, le plasmide résultant étant désigné sous la dénomination pHTcotA. Construction et transformation L'ADN plasmidique est extrait de E. coli par le procédé standard de lyse alcaline. L'ADN chromosomique est extrait de Bt comme cela a été décrit précédemment (Msadek et al. 1990). Les enzymes de restriction et la ligase T4 proviennent de New England Biolabs, beverly, NIA. Les fragments d'ADN sont purifiés sur gel d'agarose en utilisant le kit Prej > A-Gene (Bio- Rad Laboratories, Richmond, CA.). Les primers d'oligonucléotides sont synthétisés par Genset (Paris, France) et l'amplification PCR est effectuée en utilisant le Système GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer, Foster City, CA). La matrice d'ADN utilisée dans l'amplification PCR est soit le gène cryIAa déjà cloné à partir de la souche Bt 407 (Lereclus et al. 1989) soit l'ADN chromosomique extrait de la souche 407 Cry-. Les conditions de réaction sont les suivantes : une incubation de 5 min à 95 C, suivie par 30 cycles d'une min à 57"C pour l'hybridation, une min à 72"C pour l'extension et une min à 92"C pour la dénaturation; à la fin, une nouvelle incubation à 72"C pendant 10 min est effectuée. La Taq polymérase provient des Laboratoires USB (Cleveland, OH). La procédure standard est utilisée pour la transformation d'E coli et les souches de Bt sont transformées par électroporation, comme cela a déjà été décrit (Lereclus et al. 1989). L'analyse des protéines est effectuée après culture des souches de Bt et sonication, I'analyse étant effectuée sur 0,1% SDS - 12% PAGE. Bio-essais d'activité insecticide La toxicité des préparations est estimée en utilisant la larve de Plutella xylostella au second stade et la technique d'ingestion libre telle qu'elle a été décrite précédemment (Sanchis et al. 1988). EXEMPLE 2 Construction des mutants SigE et SirK de Bt Les plasmides thermosensibles pAB1 et pAB2 contenant la copie du gène interrompu par KmR de sigE et sigK respectivement sont introduits dans la souche Bt 407 Cry- par électroporation. Le remplacement des gènes sigE et sigK par la copie interrompue sigE::Km et sigK::Km est obtenu par cultures successives des transformants en présence de kanamycine à une température non permissive (40"C) (voir figure 1). Comme cela ressort de la figure 1, les souches de Bt transformées par les plasmides pAB1 ou pAB2 sont tout à la fois résistantes à l'érythromycine et à la kanamycine à 37"C. Les transformants dans lesquels le gène sigE ou sigK a été échangé pour sa copie interrompue sont cultivés à une température non permissive, c'est-à-dire à laquelle la réplication des plasmides a été bloquée. Ils peuvent être sélectionnés pour leur résistance à la kanamycine. Les mutants Spo- (ci-après 407-SigE et 407-SigK- sont résistants à la kanamycine mais sensibles à l'érythromycine. Le remplacement des gènes Bt sigE et sigK par leur copie interrompue est contrôlé par analyse PCR, 1'ADN chromosomique des mutants sélectionnés est utilisé comme matrice pour la PCR et les séquences externes complémentaires de chaque gène sont utilisées comme primer en association avec des oligonucléotides sigE-4 et sigK-4, respectivement. La taille des produits de PCR correspond à des gènes interrompus par KmR. Les souches de mutants Bt SigE- et SigK- sont incapables de sporuler. Aucune spore thermorésistante n'est produite après 72 heures de croissance à 30"C en milieu HCT ou SP. En utilisant des conditions similaires de croissance, au moins 90 % des cellules de la souche sauvage sporulent après 24 ou 48 heures. L'examen des cellules par microscopie en contraste de phase indique que la souche mutante sigE est bloquée à un stade de sporulation précoce (stade II), après la formation du septum asymétrique divisant la cellule mère et le compartiment des spores. La souche mutante sigK- est bloquée dans un stade de sporulation plus tardif (stade Fiv). Une préspore grise placée à l'un des pôles de la cellule peut être observé à l'intérieur des cellules. Les plasmides pHTspoIID et pHTcotA (voir figure 2) portant les régions promotrices des gènes spoIID et cotA de Bacillus subtilis fusionnées avec le gène lacZ sont construits pour suivre l'apparition et la disparition des facteurs aE et aK durant la sporulation de Bt. spoIID est transcrit par une ARN polymérase contenant le facteur aE (Lopez-Diaz et al. 1986 ; Rong et al. 1986). Ce gène est impliqué dans le développement morphologique des spores au stade Il (Young et Mandelstam 1979). Le gène cotA code pour une protéine d'enveloppe de spore (Donavan et al. 1987) et sa transcription dépend de aK (Sandman et al. 1988). Les plasmides pHTspoIID et pHTcotA sont introduits dans Bt 407 Cry- Spo+, 407-SigE- et 407-SigK- par électroporation et la synthèse de F-galactosidase est suivie durant la croissance en milieu SP (figures 3A et 3B). Dans la souche Spo+ la synthèse de -galactosidase sous le contrôle du promoteur de spoIID démarre à t2 pour atteindre un maximum d'environ 10 000 U/mg de protéines à t5 et décroît ensuite.Dans la souche dans laquelle la synthèse de B-galactosidase est sous le contrôle du promoteur cotA, celle-ci est détectée seulement à t6 et atteint un maximum de 4 000 U/mg de protéines à tell. Il n'y a aucune expression détectable de p- galactosidase (moins de 10 U/mg de protéines) dans le mutant 407-SigE- pour les fusions transcriptionnelles spoIID' ou cotA'-'lacZ. Comme la transcription de sigK dépend de aE (Sandman et al. 1988) il n'y a pas de production du facteur K dans cette souche mutante. Il n'y a pas d'expression détectable de lacZ à partir du promoteur cotA dans le mutant 407-SigK- et l'expression à partir du promoteur spoIID a un maximum à t6 comme dans la souche sauvage. EXEMPLE 3 Expression de crvlAa'-'lacZ dans les mutants SiE- et SigK: de Bt Pour déterminer la régulation temporelle des promoteurs du gène cryIAa dans la souche sauvage de Bt et dans les mutants Spo-, un plasmide contenant la fusion transcriptionnelle cryIAa'-lacZ a été construit. Une région contenant la région promotrice du gène cryIAa est amplifiée par PCR, comme cela a été décrit, puis clonée en amont du gène rapporteur lacZ dans pHT304-18Z. Le plasmide résultant, désigné sous la dénomination pHTcryIA2 (figure 2), est introduit dans les souches Bt 407 Cry Spo+, 407 SigE- et 407 SigK- par électroporation. La production de - galactosidase dans la souche Spo+ 407 Cry- débute à t2 et présente deux pics, le premier à t7 et le second tî 1 (figure 4).Comme cela a été indiqué pour les fusions spoIID'-'lacZ et cotA'-'lacZ, t7 et tî 1 correspondent avec les périodes d'expression maximale de aE et aK. L'expression de la synthèse de - galactosidase dirigée par la région promotrice de cryIAa est sévèrement réduite dans les mutants 407-SigE- (figure 4). Toutefois, une faible activité fr galactosidase est détectée à t2 avec un maximum de 200 U/mg de protéines à tri 0. La synthèse -galactosidase dirigée par la région promotrice de cryIAa démarre à t2 et montre un maximum de 9 000 U/mg de protéines à T7 dans le mutant 407-sigK- (figure 4).Le second pic d'expression à un temps de sporulation plus tardif dans la souche Spo+ n'est pas apparent dans le mutant SigK-, ce qui indique une participation du facteur aK dans la transcription du gène cryIAa durant la phase tardive de sporulation. EXEMPLE 4 Production de la toxine CrvIAa dans les mutants SigE et SigK de Bt Le plasmide pHT410 portant le gène cryIAa de la souche sauvage de Bt 407 (Lereclus et al. 1989) est introduit dans les souches Bt 407 Cry- Spo+, 407-SigE et 407-SigK- par électroporation. Les transformants sont cultivés sur milieu HCT et SP à 30"C et la production d'inclusions cristallines est examinée par microscopie en contraste de phase et microscopie électronique. Après 48 heures de croissance dans le milieu HCT, les cristaux larges bipyramidaux sont observés dans les transformants 407-Spo+ et 407-SigK-. Toutefois, les cristaux dans la souche Spo+ sont libérés tandis que ceux des mutants SigKdemeurent encapsulés dans la paroi cellulaire. Même après 72 heures de croissance dans le milieu HCT, il n'y a pas de libération des inclusions cristallines à partir du mutant SigK-. Aucun cristal n'est observé dans la souche 407-SigE portant le plasmide pHT410. Une analyse SDS-PAGE des protéines contenues dans les préparations cristal-cellule et spore-cristal à partir des cellules mises en croissance sur milieu HCT montre que la souche 407-SigE- portant pHT410 ne produit pas le polypeptide CryIAa de 130 kDa, au contraire de la souche 407 SigK- portant pHT410 qui produit une toxine similaire à celle obtenue à partir de la souche 407 Cry- Spo+ contenant le même plasmide. L'activité insecticide des préparations spore-cristal et cellulecristal est analysée en utilisant les larves de lépidoptère Plutella xylostella au second stade (tableau 2). Compte tenu de la présence d'autres protéines que CrylAa dans le mutant 407-SigK-, il n'est pas possible de déterminer la concentration précise de toxine dans la préparation cristalline de cette souche. C'est pourquoi la DL50 est définie en terme de volume de culture pour estimer l'activité insecticide de ces produits. Les bio-essais indiquent que la toxine CryIAa produite dans 407-sigK- est très toxique pour les larves de P. xylostella. Toutefois, l'activité insecticide de ces produits est augmentée de façon significative par sonication. La souche Bacillus thuringiensis, n'exprimant pas, ou très faiblement, la protéine sigma K, dans les conditions expérimentales cidessus, et déposée à la CNCM sous le n I-1634, est construite dans les conditions suivantes Souche bactérienne dont le gène sigK est interrompu par le gène aphA3 conférant la résistance à la kanamycine. La souche ainsi construite est transformée par le plasmide pHT410 portant le gène crylAa et le gène ermC, conférant la résistance à l'érythromycine. Cette souche non sporulante produit d'importantes quantités de toxine CryIAa pendant la phase stationnaire. Tableau 1 Séquences d'oligonucléotides utilisés comme amorce de PCR Position Site de Amorce Séquence en bpa restriction à l'extrémité 5' cryIA-1 5'CCCAAGCITTGAGGTAAATGGTTCTAAC3' 156-177* HindIII cryIA-2 5'CGCGGATCCATCTCTTTTATTAAGATACC3' 495-518* BamHI sigE- 1 5'CGGGATCCCGTTGAAAGCGTAGAGGTCAGAA3' 16-38** BamHI sigE-2 5'GCTCTAGAGCCAACGCGATGCATATGTTGCTA3' 834855** Xbal sigE-3 5'GGMTTCCATTGTCTGACGTGTTAGGTACA3' 961-982** EcoRI sigE-4 5'CGGGATCCCGATACGCAATATCTCGCAATGA3' 1730-1751** BamHI sigK- 1 5'CGGGATCCCGTCCAGTTATAATTTGAGCTCCAA3' 31-53** BamHI sigK-2 5'GCTCTAGAGCCCCGATTGTACCAATTGAAAT3' 603-623** XbaI sigK-3 5'GGAATTCCATTAAAGCGATCGAGAGCTATT3' 627-648** EcoRI sigK-4 5'CGGGATCCCGGCACCTTCTAATATTACAGATAGAA3' 1194121 7** BamHI sigE-Ch 5TrTwTAAAAAGCGTATTGAA3' 1-22** aucun sigK-Ch 5'GGAGAAACCATAGTTATGAA3' 1-20** aucun a la position des oligonucléotides est déterminée à partir de * Wong et al. 1983 et ** Adams et al. 1991 Tableau 2 Activité insecticide des souches Bt Souche DLSOa Ill/ml de nourriture pulvériséeb 407 Spo+ (pHT410) 14,7 (7,9 - 21,8) 407-SigK- (pHT410) 124,6 (68,6- 1358,7) 407-SigK- (pHT410) soniqué 1 minc 35,6 (15,2 - 71,2) 407-SigK- (pHT410) soniqué 5 mind 9,5 (6,2 - 12,6) a la DL50 est le volume de préparation nécessaire pour tuer 50% des larves d'insectes b > 1 de solution de spore-cristal ou cellule-cristal utilisée par ml de solution répandue sur les feuilles c les cellules sont partiellement cassées par sonication de 1 min, la majorité des inclusions cristallines demeure à l'intérieur des cellules d les cellules sont totalement cassées par sonication de 5 min, 95% des cristaux sont libérés Références Adams L.F., Brown K.L., Whiteley H.R. 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Demande de brevet Européen 0 178 151. Demande de brevet Européen 0 224 331. Demande de brevet Européen 0 192 319. Demande de brevet Européen 0 228 838. Demande de brevet Européen 0 295 156. Demande de brevet Européen 0 349 353. REVENDICATIONS 1) Bacillus thuringiensis caractérisé en ce qu'il exprime le gène sigma E (aE) et ne sporule pas ou peu ou ne produit pas de spores viables. 2) Bacillus thuringiensis selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche ne sporule pas. 3) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche n'exprimant pas le gène sigma K. 4) Bacillus thuringiensis selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène SigK a été interrompu par introduction d'une séquence d'ADN ou a été au moins partiellement délété. 5) Bacillus thuringiensis selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène sigK a été interrompu par introduction d'une séquence d'ADN conférant à la souche un caractère de sélection positif. 6) Bacillus thuringiensis selon la revendication 5, caractérisé en ce que le caractère de sélection positif est la résistance à un antibiotique. 7) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la souche de Bt exprime un ou plusieurs gènes Cry. 8) Bacillus thuringiensis selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ou les gènes Cry sont portés par un vecteur, par exemple un plasmide. 9) Bacillus thuringiensis selon la revendication 7, caractérisé en ce que les gènes Cry sont intégrés dans le chromosome. 10) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d'intérêt porté par un plasmide autoréplicatif ou par une séquence d'ADN intégrée dans le chromosome. 11) Bacillus thuringiensis selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN dans le gène SigK exprimant une protéine d'intérêt. 12) Bacillus thuringiensis selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en remplacement de tout ou partie du gène SigK, une séquence d'ADN exprimant une protéine d'intérêt. 13) Bacillus th uringiensis déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 26 octobre 1995 sous le n I-1634. 14) Composition pesticide, caractérisée en ce qu'elle contient une souche de Bt selon l'une des revendications 1 à 13. 15) Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que la souche de Bt a été inactivée. 16) Composition selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par des moyens physiques. 17) Composition selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par irradiation. 18) Composition selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par des moyens chimiques. 19) Composition selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que la souche de Bt a été traitée pour améliorer la digestibilité de la souche ou bien améliorer l'accessibilité de la protéine. 20) Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que la souche de Bt a été traitée par sonication. 21) Séquence nucléotidique contenant le gène SigE, ne contenant pas de gène SigK actif et contenant une séquence codant pour un gène d'intérêt.