Brevet FR2736929A1 — publié le 19970124

Séquence ADN isolée pouvant servir de zone de régulation dans un gène chimère utilisable pour la transformation des plantes. La présente invention concerne l'utilisation de zone de régulation isolées de gènes transcrits de plantes, de nouveaux gènes chimères les contenant et leur utilisation pour la transformation des plantes. De nombreux caractères phénotypiques associés à l'expression d'un ou quelques éléments géniques peuvent être intégrés dans le génome de plantes et conférer ainsi à ces plantes transgéniques des propriétés agronomiques avantageuses. De façon non extensive on peut citer: les résistances à des agents pathogènes des cultures, la résistance à des produits phytosanitaires phytotoxiques, la production de substances à intérêt alimentaire ou pharmacologique. En plus de l'isolement et la caractérisation des éléments géniques codant pour ces différents caractères, une expression appropriée doit être assurée. Cette expression appropriée peut se situer aussi bien au niveau qualitatif que quantitatif.Au niveau qualitatif, par exemple spatial: expression préférentielle dans un tissu particulier, ou temporel: expression inductible. Au niveau quantitatif par la quant accumulée du produit d'expression du gène introduit. Cette expression appropriée dépend pour une large part de la présence d'éléments géniques de régulation associés aux transgènes, en particulier pour ce qui concerne les éléments quantitatifs et qualitatifs. Parmis les éléments primordiaux assurant cette régulation appropriée, I'utilisation de zones promotrices homologues ou hétérologues, simples ou combinées a été largement décrite dans la littérature scientifique. L'utilisation de zone de régulation en aval du transgène ont été utilisées a seule fin de mettre une borne permettant d'arrêter le processus de transcription du transgène, sans présupposé quant à leur rôle sur la qualité ou la quantité de l'expression du transgène. La présente invention concerne l'utilisation d'un intron 1 comme zone de régulation isolé de gènes de plantes, de nouveaux gènes chimères les contenant et leur utilisation pour la transformation des plantes. Elle concerne une séquence d'ADN isolée, pouvant servir de zone de régulation dans un gène chimère utilisable pour la transformation des plantes et permettant l'expression du produit de traduction du gène chimère en particulier dans les régions de la plante en croissance rapide, qui comprend dans le sens de la transcription du gène chimère, au moins un intron tel que le premier intron (intron 1) de la région 5' noncodante d'un gène d'histone végétale. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation conjointe de l'intron 1 comme zone de régulation et de promoteurs isolés d'un même gène végétal.Elle permet l'expression appropriée à la fois quantitative et qualitative des transgènes sous le contôle de ces éléments de régulation génique. Cette expression appropriée obtenue par l'utilisation de la présente invention peut concerner des caractères tels que: la résistance à des agents pathogènes des cultures, la résistance à des produits phytosanitaires phytotoxiques, la production de substances à intérêt alimentaire ou pharmacologique. En particulier, elle permet de conférer aux plantes transgéniques une tolérance accrue à des herbicides par une expression préférentielle, qualitative et quantitative, du produit d'expression des gènes chimères dans les régions de la plante en croissance rapide.Cette expression appropriée particulière du gène de résistance herbicide est obtenue par utilisation conjointe des éléments de régulation promoteur et d'au moins un intron 1 comme zone de régulation du gène d'histone de type "H3.3-like". Un tel profil d'expression peut être obtenu pour tous les caractères présentant un intérêt, tels que décrit cidessus, avec les éléments de régulation utilisés pour conférer une tolérance herbicide accrue. La présente invention concerne également les cellules végétales transformées à l'aide de ces gènes et les plantes transformées régénérées à partir de ces cellules ainsi que les plantes issues de croisements utilisant ces plantes transformées. Parmi les produits phytosanitaires utilisés pour la protection des cultures, les produits systémiques sont caractérisés en ce qu'ils sont véhiculés dans la plante après application et, pour certain d'entre eux, s'accumulent dans les parties en croissance rapide, notamment les apex caulinaires et racinaires, provoquant, dans le cas des herbicides, l'altération, jusqu'à la destruction, des plantes sensibles. Pour certain des herbicides présentant ce type de comportement, le mode d'action primaire est connu et résulte d'une inactivation d'enzymes caractérisées impliquées dans des voies de biosynthèse de composés nécessaires au bon développement des plantes cibles.Les enzymes cibles de ces produits peuvent être localisées dans différents compartiments subcellulaire et l'observation du mode d'action de produits connus montre le plus souvent une localisation dans le compartiment plastidial. La tolérance des plantes sensibles à un produit appartenant à ce groupe d'herbicides, et dont la cible primaire est connue, peut-être obtenue par introduction stable dans leur génome d'un gène codant pour l'enzyme cible, d'origine phylogénétique quelconque, mutée ou non quant aux caractéristiques d'inhibition par l'herbicide du produit de l'expression de ce gène. Une autre approche consiste à introduire de façon stable dans le génome des plantes sensibles un gène d'origine phylogénétique quelconque codant pour une enzyme capable de réaliser une métabolisation de l'herbicide en un composé inactif et non toxique pour le développement de la plante. Dans ce dernier cas, il n'est pas nécessaire d'avoir caractérisé la cible de l'herbicide. Etant donné le mode de distribution et d'accumulation des produits de ce type dans les plantes traitées, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ces gènes de façon à permettre leur expression préférentielle et leur accumulation dans les régions de la plante en croissance rapide où ces produits s'accumulent. De plus, et dans le cas où la cible de ces produits est localisée dans un compartiment cellulaire autre que le cytoplasme, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ces gènes sous forme d'un précurseur contenant une séquence polypeptidique permettant l'adressage de la protéine conférant la tolérance dans le compartiment adéquat, et en particulier dans le compartiment plastidial. A titre d'exemple illustrant cette approche on peut citer le glyphosate, le sulfosate ou la fosamétine qui sont des herbicides systémiques à large spectre de la famille des phosphonométhylglycines. Ils agissent essentiellement comme inhibiteurs compétitifs vis à vis du PEP (phosphoénolpyruvate) de la 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS, EC 2.5.1.19). Après leur application sur la plante, ils sont véhiculés dans la plante où ils s'accumulent dans les parties en croissance rapide, notemment les apes caulinaires et racinaires, provoquant l'altération, jusqu'à la destruction, des plantes sensibles. L'EPSPS, cible principale de ces produits est une enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques localisée dans le compartiment plastidial. Cette enzyme est codée par un ou des gènes nucléaires et synthétisée sous forme d'un précurseur cytoplasmique puis importée dans les plastes où elle s'accumule sous sa forme mature. La tolérance des plantes au glyphosate et aux produits de la famille est obtenue par l'introduction stable dans leur génome d'un gène d'EPSPS d'origine végétale ou bactérienne, mutée ou non quant aux caractéristiques d'inhibition par le glyphosate du produit de ce gène. Etant donné le mode d'action du glyphosate, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ce gène de façon à permettre son accumulation importante dans les plastes et de plus, dans les régions de la plante en croissance rapide où les produits s'accumulent. Il est connu, par exemple d'après le brevet américain 4 535 060, de conférer à une plante une tolérance à un herbicide du type ci-dessus, en particulier la Nphosphonomethylglycine ou glyphosate, par introduction dans le génome des plantes d'un gène codant pour une EPSPS portant au moins une mutation rendant cette enzyme plus résistante à son inhibiteur compétitif (le glyphosate), après localisation de l'enzyme dans le compartiment plastidial. Ces techniques demandent cependant à être améliorées pour une plus grande fiabilité dans l'emploi de ces plantes lors d'un traitement par ces produits dans des conditions agronomiques. Dans la présente description, on entend par "plante" tout organisme multicellulaire différentié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, ou des tissus différentiés tels que des embryons ou des parties de plantes ou des plantes ou des semences. On entend par "l'intron 1 d'arabidopsis comme zone de régulation" une séquence d'ADN isolée de longueur variable, située en amont de la partie codante ou correspondant à la partie structurale d'un gène transcrit.On entend par gène de tolérance à un herbicide tout gène, d'origine phylogénétique quelconque, codant soit pour l'enzyme cible de l'herbicide, présentant ou non une ou des mutations quant aux caractéristiques d'inhibition par l'herbicide, soit pour une enzyme capable de métaboliser l'herbicide en un composé inactif et non toxique pour la plante. On entend par zones de la plante en croissance rapide, les régions qui sont le siège de mutiplications cellulaires importantes, en particulier les régions apicales. La présente invention concerne la production de plantes transformées ayant notamment une tolérance accrue à des herbicides s'accumulant dans les zones en croissance rapides des plantes traitées, par régénération de cellules transformées à l'aide de nouveaux gènes chimères comportant un gène de tolérance à ces produits. L'invention a également pour objet la production de plantes transformées ayant une tolérance accrue aux herbicides de la famille des phosphonométhylglycines par régénération de cellules transformées à l'aide de nouveaux gènes chimères comportant un gène de tolérance à ces herbicides. L'invention concerne également ces nouveaux gènes chimères, ainsi que des plantes transformées plus tolérantes en raison d'une meilleure tolérance dans les parties en croissance rapide de ces plantes, ainsi que les plantes issues de croisements utilisant ces plantes transformées. Elle a également pour objet du nouvel intron 1 d'histone végétale et son utilisation comme zone de régulation pour la construction des gènes chimères ci-dessus. Plus particulièrement, I'invention a pour objet un gène chimère pour conférer aux plantes notamment une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide ayant pour cible l'EPSPS, comprenant, dans le sens de la transcription, une zone promotrice, une zone peptide de transit, une séquence codant pour une enzyme de tolérance aux produits de la famille des phosphonométhylglycines et une zone de régulation, caractérisé en ce que la zone de régulation est constituée d'un fragment d'un l'intron 1 d'un gène d'histone végétale dans une orientation quelconque relativement à son orientation initiale dans le gène duquel il dérive, permettant l'expression préférentielle et l'accumulation de la protéine de tolérance à l'herbicide dans les zones d'accumulation du dit herbicide. Le gène d'histone, dont est issu le l'intron 1 selon l'invention, provient d'une plante monocotylédone telle que par exemple le blé, le maïs ou le riz ou de préférence d'une plante dicotylédone telle que par exemple la luzerne, le tournesol, le soja, le colza ou de préférence Arabidopsis thaliana. On utilise de préférence un gène d'histone du type "H3.3like". La zone peptide de transit comprend, dans le sens de la transcription, au moins un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de la séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, de préférence le gène de la petite sousunité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylaseloxygénase (RuBisCO) selon la demande de brevet européen/ PCT 508 909. Cette zone caractéristique a comme rôle de permettre le relargage dans le compartiment plastidial d'un polypeptide mature avec une efficacité maximale, de préférence sous forme native. La séquence codante utilisable dans le gène chimère selon l'invention provient d'un gène de tolérance herbicide d'origine phylogénétique quelconque. Cette séquence peut être notamment celle de 1'EPSPS mutée ayant un degré de tolérance au glyphosate. La zone promotrice selon la demande de brevet européen/ PCT 507 698 peut être d'origine quelconque, sous forme simple ou dupliquée ou combinée d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes, c'est à dire, par exemple bactérienne telle que celle du gène de la nopaline synthase, ou virale telle que celle du transcrit 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou de préférence végétale telle que celle de la petite sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase ou de préférence telle que celle d'un gène d'histone végétale et de préférence d'A rab idopsis thaliana. On utilise de préférence un gène d'histone du type "H4". Le gène chimère selon l'invention peut comprendre, en plus des parties essentielles ci-dessus, une zone intermédiaire non traduite (linker) entre la zone promotrice et la zone codante ainsi qu'entre la zone codante et l'intron 1 et qui peut être d'origine phylogénétique quelconque. Les exemples suivants illustrent à titre limitatif mais non limitatif plusieurs aspects de l'invention: l'isolement des introns selon l'invention et leur utisation pour la transformation génétiques des plantes ainsi que les qualités améliorées d'expression des gènes hétérologues dse plantes transformées à l'aide de ces introns. EXEMPLE 1: 1. Obtention d'un fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thalfana a) deux oligonucleotides 20-mers de séquences respectives: 5'- GCTCTGCTCATGTCTGCTCC -3' 5'- GCCCGCCLrTGACAAAGAAA- 3' ont été synthétisés à partir de la séquence d'un gène d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana (Klee H.J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437442). Ces deux oligonucleotides sont respectivement en position 1523 à 1543 et 1737 à 1717 de la séquence publiée et en orientation convergente. b) L'ADN total d'Arabidopsis thaliana (var. columbia) a été obtenu chez Clontech (référence catalogue: 6970-1) c) On mélange 50 nanogrammes(ng) d'ADN avec 300ng de chacun des oligonucleotides et soumis à 35 cycles d'amplification avec un appareil Perkin-Elmer 9600, dans les conditions de milieu standard pour l'amplification préconisées par le fournisseur. Le fragment de 204pb résultant constitue le fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana. 2. Construction d'une bibliothèque d'un ADNc à partir d'une ligne cellulaire de mals BMS . a) On broye 5 g de cellules filtrées dans l'azote liquide et les acides nucléiques totaux extraits selon la méthode décrite par Shure et al. avec les modifications suivantes: - le pH du tampon de lyse est ajusté à PH = 9,0; -après la précipitation par l'isopropanol, le culot est repris dans l'eau et après dissolution, ajusté à 2,5 M LiCl. Après incubation pendant 12h à "C, le culot de la centrifugation d 15 min. à 30000g à 4"C est resolubilisé. L'étape de précipitation par LiCl est alors répétée. Le culot resolublisé constitue la fraction ARN des acides nucléiques totaux. b) La fraction ARN-polyA+ de la fraction ARN est obtenue par chromatographie sur colonne oligo-dT cellulose telle que décrite dans "Current Protocols in Molecular Biology". c) Synthèse d'ADNc double brin à extrémité synthétique EcoRI: elle est réalisée en suivant le protocole du fournisseur des différents réactifs nécessaires à cette synthèse sou forme d'un kit:le "copy kit" de la société In Vitrogen. Deux oligonucleotides simples brins et partiellement complémentaires de séquences respectives: 5'- AATTCCCGGG -3' 5'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé) sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches. Cette ligation des adaptateurs résulte en la création de sites Sma I accolés aux ADNc double brin et EcoRI sous forme cohésive à chaque extrélité des ADNC double brin. d) Création de la bibliothèque: Les ADNc présentant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI sont ligués avec le ADNc du bactériophage hgtl0 coupé par EcoRI et déphosphorylé selon le protocole du fournisseur Naew England Biolabs. Une aliquote de la réaction de ligation a été encapsidée in vitro avec des extraits d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette librairie a été titrée en utilisant la bactérie E.coli C600hfl. la librairie ainsi obtenue est amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et constitue la librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS. 3. Criblage de la bibliothèque de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS avec la sonde EPSP d'Arabiflopsis thaliana: Le protocole suivi est celui de "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989)(CPMB). En bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité moyenne de 100 phages /cm2 Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane Hybond N d'Amersham. h) L'ADN a été fixé sur les filtres par traitement UV 1600kJ (Stratalinker de Stratagene). Les filtres iont été préhybridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait écrémé pendant 2h à 65"C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-dCrP par "random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de Pharmacia). L'activité spécifique obtenue est de l'order de 108 cpm par pg de fragment. Après dénaturation pendant 5 min à 100"C, la sonde est ajoutée dans le milieu de préhybridation et l'hybridation est poursuivie pendant 14 heures à 55"C. Les filtres sont fluorographiés 48h à -80 C avec un film KodakXAR5 et des écrans renforçateurs Hyperscreen RPN d'Amersham. L'alignement des spots positifs sur le filtre avec les boîtes d'où ils sont issus permet de prélever, sur la boîte, des zones correspondant aux phages présentant une réponse d'hybridation positive avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Cette étape d'étalement, transfert, hybridation, récupération est répétée jusqu'à ce que tous les spots de la boîte des phages successivement purifiés se révèlent positifs à 100% en hybridation. Une plage de lyse par phage indépendant est alors prélevée dans du milieu X diluant (Tris-Cl pH= 7,5; MgSO4 îOmM; NaCl 0,1M; gélatine 0,1%), ces phages en solution constituant les clones positifs de 1' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. 4. Préparation et analyse de l'ADN des clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. On ajoute environ 5.108 phages à 20 ml de bactéries C600hfl à 2 OD 600nm/ml et incubés 15 minutes à 37"C. Cette suspension est alors diluée dans 200ml de milieu de croissance des bactéries dans un Erlen de 1 1 et agitée dans un agitateur rotatif à 250 rpm. La lyse est constatée par clarification du milieu, correspondant à 1 lyse des bactéries turbides et se produit après environ 4 h d'agitation. Ce surnageant est alors traité comme décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN obtenu correspond aux clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS. Un à deux g de cet ADN sont coupés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTAfIflE (réf. CPMB) à 0,8%. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fragment EcoRI a une taille estimée sur gel à environ 1,7kpb. 5. Obtention du clone pRPA-ML-711: Dix pg de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de 1,7kpb sont digérés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert de 1,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est traité à la ss-agarse selon le protocole du fournisseur New England Biolabs. L'ADN purifié du fragment de 1,7kpb est ligué à 12"C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England Biolabs) coupé par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology".Deux Cll du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la transformation d'une aliquote d'E.coli DH1OB électro compétentes ; la transformation se fait par électroporation en utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et et de milieu de ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2cm (Biorad) prélablement refroidie à 0 C. Les conditions physiques de l'électroporation utilisant un électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 farad et 200 Q. Dans ces conditions, le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2 millisecondes. Les bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf. CPMB) et agitées pendant 1 heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Corning de 15 ml.Après étalement sur milieu LB/agar supplémenté à 100 llg/ml de carbéniciline, les mini-préparations des clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 "C est réalisée selon le protocole décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Après digestion par EcoRI de l'ADN et séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%, les clones présentant un insert de 1,7kpb sont conservés. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology".Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant un insert de 1,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été préparé à plus grande échelle et l'ADN résultant de la lyse des bactéries purifié sur gradient de CsCl ainsi que décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN purifié a été partiellement séquencé avec un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur et en utilisant comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées chez le même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La séquence dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50 résidus acides aminés) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante de 1'EPSPS mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908). Ce clone correspondant à un fragment EcoRI de 1,7kpb de l'ADN de 1' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a été réalisée sur les deux brins en utilisant le protocole du kit Pharmacia et en synthétisant des oligonucléotides complémentaitres et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence complète de ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N" 1. 6. Obtention du clone pRPA-ML-715: L'analyse de la séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison de la séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de séquence de 92 pb en amont du codon GCG codant pour 1'Alanine NH2-terminale de la partie mature de 1'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908). De même une extension de 288 pb en aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux parties pourraient correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un peptide de transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-terminale à la région 3' non traduite de l'ADNc. Afin d'obtenir un ADNc codant pour la partie mature de 1'ADNc de 1'EPSPS de maïs, telle que décrite dans 1' USP 4971 908, les opérations suivantes ont été réalisées: a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712: Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les extrémités résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par l'enzyme de restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTAfrBE (réf. CPMB) 1%. Le fragment de gel contenant l'insert "AseI-extrémités franches/SacII" de 0,4 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. L'ADN du clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction Hindm située dans le polylinker du vecteur de clonage pUC 19 et les extrémités résultant de cette coupure ont été rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTAPtBE (réf. CPMB) 0,7%. Le fragment de gel contenant l'insert Hindm-extrémités francheslSacll de environ 3,7kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Les deux inserts ont été ligués, et 2 pi du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHlOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. On analyse le contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite pour pRPA-ML-711. Un des clones plasmidique retenu contient un insert EcoRI Hincilli de 1,45 kpb environ. La séquence des extrémités terminales de ce clone révèle que I'extrémité 5' de l'insert correspond exactement à l'extrémité correspondante de pRPA-ML711 et que l'extrémité 3' terminale présente la séquence suivante: " 5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3' " La séquence soulignée correspond au codon de l'acide aminé COOH-terminal asparagine, le codon suivant correspondant au codon stop de la traduction. Les nucléotides en aval correspondent à des éléments de séquence du polylinker de pUCI9.Ce clone comprenant la séquence de pRPAML-711 jusqu'au site de terminaison de la traduction de 1'EPSPS mature de maïs et suivie de séquences du polylinker de pUC 19 jusqu'au site Hindi a été nommé pRPA-ML-712. b) Modification de l'extrémité 5' de pRPA-ML-712: construction de pRPA ML-715 Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et Hindi. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert PstI/EcoRI de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence de quantité équimoléculaire de chacun des deux oligonucléotides partiellement complémentaires, de séquence: Oligol: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par les enzymes de restrictions BamHI et HindE. Deux pi du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DH1OB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence de l'extrémité 5' terminale du clone retenu révèle que la séquence ADN dans cette région est la suivante: séquence du polylinker de pUC19 des sites EcoRI à BamHI, suivi de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage, suivi du reste de la séquence présente dans pRPAML-712. Ce clone a été nommé pRPA-ML-713. Ce clone présente un codon methionine ATG inclu dans un site NcoI en amont du codon Alanine N-terminal de l'EPSPSynthase mature.De plus, les codons alanine et glycine de l'extrémité Nterminale ont été conservées, mais modifiées sur la troisième base variable : GCGGGT initial donne GCÇGGÇ modifié. Le clone pRPA-ML-713 a été coupé par l'enzyme de restriction Hindi et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de la ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTAUBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert "HindE-extrémités franches/SacI" de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par l'enzyme de restriction XbaI et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. Deux il du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHlOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite cidessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence des extrémités terminales du clone retenu révèle que la séquence ADN est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI à SacI, suivie de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage délétée des 4 pb GATCC de l'oligonucléotide 1 décrit ci-dessus, suivi du reste de la séquence présente dans pRPA-ML-712 jusqu'au site Hindm et séquence du polylinker de pUCl9 de XbaI à Hindi. Ce clone a été nommé pRPA-ML-715. 7) Obtention d'un ADNc codant pour une EPSPS de mas mutée Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis kit de Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce système de mutagénèse est le suivant: l'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et réassocié en présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et d'autre part d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction unique présent dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin complémentaire est réalisée par l'action de la T4 ADN polymérase en présence de T4 ADN ligase et de protéine du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé en présence de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par mutagénèse. La souche d'E. coli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte pour la transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN plasmidique total est préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment. Après ces traitements, la souche d'E. coli DHlOB est utilisée comme hôte pour la transformation. L'ADN plasmidique des clones isolés est préparé et la présence de la mutation introduite vérifiée par séquençage. A)- modifications de sites ou de séquence sans incidence a priori sur le caractère de résistance de l'EPSPS de mas aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase: élimination d'un site NcoI interne de pRPA-ML-715. La séquence de pRPA-ML-715 est numérotée arbitrairement en plaçant la première base du codon Alanine N-terminal GCC en position 1. Cette séquence présente un site NcoI en position 1217. L'oligonucléotide de modification du site présente la séquence: 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'. Après séquençage selon les références données ci-dessus, la séquence lue après mutagénèse correspond à celle de l'oligonucléotide utilisé. Le site NcoI a bien été éliminé et la traduction en acides aminés dans cette région conserve la séquence initiale présente sur pRPA-ML-715. Ce clone a été nommé pRPA-ML-716. La séquence de 1340 bp de ce clone est présentée SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3. B) modifications de séquence permettant l'augmentation du caractère de résistance de l'EPSPS de mais aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase. Les oligonucléotides suivants ont été utilisés: a) mutation Thr 102 11e. 5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3' b) mutation Pro 106 - Ser. 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutations Gly 101 # Ala et Thr 102 # Ile. 5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3' d) mutations Thr 102 # Ile et Pro 106 l Ser. 5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments mutés est identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la région mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse utilisés.Ces clones ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 '* 11e, pRPA-ML-718 pour la mutation Pro 106- Ser, pRPA-ML-719 pour les mutations Gly 101 1 Ala et Thr 102 # Ile et pRPA-ML-720 pour les mutations Thr 102 # Ile et Pro 106 # Ser. La séquence de 1340 bp de pRPA-ML-720 est présentée SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5. L'insert NcoI-HindE de 1395 pb sera nommé dans la suite des descriptions "le double mutant de 1'EPSPS de maïs". EXEMPLE 2: Construction de gènes chimères On effectue la construction de gènes chimères selon l'invention à partir des éléments suivants: 1). On isole le clone génomique (clone cosmide c22) d'Arabidopsis thaliana contenant deux gènes du type "H3.3-like" comme décrit dans Chaubet et al (J. Mol. Biol. 1992. 225 569-574). 2). intron n 1: On purifie un fragment d'ADN de 418 paires de bases à partir de la digestion du clone cosmide c22 avec l'enzyme de restriction Ddel suivie d'un traitement avec un fragment de Klenow d'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité tranche puis coupé avec Msel. Le fragment ADN purifié est ligaturé à un adaptateur oligonucléotide synthétique ayant la séquence suivante: adaptateur 1: 5' TAATTTGTTGAACAGATCCC 3' TAAACAACTTGTCTAGGG Le produit de ligation est cloné dans pGEM7Zf(+) (catalogue Stratagene n" P2251) qui a été digéré par Smal. Ce clone, appelé "intron n"l", est vérifié par séquençage (SEQ In6). 3). intron n"2: On purifie un fragment d'ADN de 494 paires de bases à partir de la digestion du clone cosmide c22 avec les enzymes de restriction Alul et Cfol. Le fragment ADN purifié est ligaturé à un adaptateur oligonucléotide synthétique ayant la séquence suivante: adaptateur 2: 5' CAGATCCCGGGATCTGCG 3' GCGTCTAGGGCCCTAGACGC Le produit de ligation est cloné dans pGEM7Zf(+) (catalogue Stratagene n P2251) qui a été digéré par Smal. Ce clone, appelé "intron ne2", est vérifié par séquençage (SEQ ID 7). 4). pRA-1 La construction de ce plasmide est décrite dans la demande française 9308029. Ce plasmide est un dérivé de pBI 101.1 (Catalogue Clonetech n 6017-1) qui contient le promoteur d'histone d'Arabidopsis H4A748 régulant la synthèse du gène de la ss- glucoronidase de E.coli et du site de polyadénylation de la nopaline synthase (NOS"). Ainsi on obtient un gène chimère de structure: "promoteur H4A748- gène GUS- NOS" 5). pCG-1 Ce plasmide contient l'intron n"l ci-dessus placé entre le promoteur H4A748 et la région codante GUS de pRA- 1. Ce plasmide est obtenu par digestion de clone cosmide c22 avec BamHI et Smal. L'intron n"l de 418 paires de bases est directement ligaturé dans pRA-lqui a été digéré avec BamHI et Smal. Ainsi on obtient un gène chimère de structure: "promoteur H4A748- intron ne gène GUS- NOS" 6). pCG-13 Ce plasmide contient l'intron n"2 ci-dessus placé entre le promoteur H4A748 et la région codante GUS de pRA- i. Ce plasmide est obtenu par digestion de clone cosmide c22 avec BantHI et Smal. L'intron n"2 de 494 paires de bases est directement ligaturé dans pRA- 1 qui a été digéré avec BamHI et Smal. Ainsi on obtient un gène chimère de structure: " promoteur H4A748- intron n 2-gène GUS- NOS" 7). pCG-15 Ce plasmide contient seulement l'intron n0 1 devant la séquence codante GUS de cidessus placé entre le promoteur H4A748 et la région codante GUS de pCG- 1. Ce plasmide est obtenu par digestion de pCG-1 avec BamHI et HmdHI suivie d'un traitement avec un fragment de Klenow d'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche. Ce vecteur est alors religaturé pour donner un gène chimère de structure: "intron n 1-GUS-NOS" 8). pCG-18 Ce plasmide contient seulement l'intron n 2 ci-dessus devant la séquence codante GUS de pCG-13. Ce plasmide est obtenu par digestion partielle de pCG-13 avec BùHI et Sphl. suivie d'un traitement avec un fragment de d'ADN polymérase de phage T4, selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche. Ce vecteur est alors religaturé et vérifié par digestion enzymatique pour donner un gène chimère de structure: "intron n 2-GUS-NOS" 9). pRPA-RD-124 Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS double mutant de maïs (Thr 102 e 11e et Pro 106 e Ser). pRPA-ML-720 est digéré avec Hind m, traité avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour produire une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le fragment EPSPS est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une cassette de clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour donner pRPA-RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui soit préalablement digéré par SalI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow, puis digéré une seconde fois avec NcoI. 10). pRPA-RD-125 Addition d'un peptide de transit optimisé (PTO) à pRPA-RD-124 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS ciblé sur les plasmides. pRPA-RD-7 (demande de brevet européen EP 652 286) est digérée avec Sph I, traité avec la T4 ADN polymérase, puis digérée avec Spe 1 et le fragment PTO est purifié. Ce fragment PTO est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow pour enlever la partie protubérante 3', puis digérée par Spe I. Ce clone est alors séquencé pour assurer la fusion traductionnelle correcte entre le PTO et le gène d'EPSPS. On obtient alors pRPA-RD-125. 11). pRPA-RD-196 Dans ce plasmide, la partie "intron n 1 + gène de la Fglucoronidase de E.coli." de pCG-1 est remplacée par un gène chimère de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé de gène d'EPSPS double mutant (IlelO2 + Ser106) et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") isolé de pRPA-RD-125. Pour obtenir pRPA-RD-196, on effectue la digestion de pCG-1 avec EcoRI et BamHI, suivie d'un traitement avec un fragment de klenow d'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche.Le fragment d'ADN de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé de gène d'EPSPS double mutant (Ilel02 + Ser106 et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") est obtenu à partir de pRPA RD-125 par digestion avec NcoI et Notai, suivie d'un traitement avec l'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche. Ce fragment à extrémité franche est alors ligaturé dans pCG-1 préparé ci-dessus. Ainsi on obtient un gène chimère de structure: "promoteur H4A748 - PTO - gène EPSPS de maïs - NOS" 12). pRPA-RD-197 Dans ce plasmide. la partie "gène de la ss-glucoronidase de E.coli." de pCG-1 est remplacée par un gène chimère de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé, un gène d'EPSPS double mutant (Ilel02 + Serlos) et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") isolé de pRPA-RD-125.Pour obtenir pRPA-RD-197, on effectue la digestion de pCG- 1 avec EcoRI suivie d'un traitement avec un fragment de Klenow d'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche puis coupé avec Signal Le fragment d'ADN de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé, un gène d'EPSPS double mutant (Ile102 + Ser106) et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") est obtenu à partir de pRPA-RD-125 par digestion avec NcoI et Note, suivie d'un traitement avec l'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche. Ce fragment à extrémité franche est alors ligaturé dans pCG- 1 préparé ci-dessus. Ainsi on obtient un gène chimère de structure: "promoteur H4A748 - intron n 1 - gène EPSPS de maïs - NOS" 13). pRPA-RD-198 Dans ce plasmide, la partie "gène de la ss-glucoronidase de E.coli." de pCG-13 est remplacée par un gène chimère de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé, un gène d'EPSPS double mutant (Ilel02 + Ser106) et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") isolé de pRPA-RD-125.Pour obtenir pRPA-RD-198, on effectue la digestion de pCG-13 avec EcoRI suivie d'un traitement avec un fragment de Klenow d'ADN polymérase de E. coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche puis coupé avec Smal. Le fragment d'ADN de 2 kilobases contenant un peptide de transit optimisé, un gène d'EPSPS double mutant (gel02 + Sert06) et un site de polyadénylation de la nopaline synthase ("NOS") est obtenu à partir de pRPA RD-125 par digestion avec NcoI et Notl, suivie d'un traitement avec l'ADN polymérase de E.coli., selon les instructions du fabricant pour créer un fragment d'ADN à extrémité franche. Ce fragment à extrémité franche est alors ligaturé dans pCG-13 préparé ci-dessus. Ainsi on obtient un gène chimère de structure: " promoteur H4A748 - intron n 2- PTO- gène EPSPS de maïs - NOS" EXEMPLE 3. Expression de l'activité d'un gène rapporteur 1) Transformation et régénération Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 disponible sur catalogue (Clontech &num;6027-1) par croisement triparental à l'aide du plasmide "helper" pRK 2013 dans Escherichia coli HB101 selon la procédure décrite par Bevan M. (1984) Nucl.Acids Res., 12, 8711-8721. La technique de transformation à partir d'explants racinaires d'Arabidopsis thaliana L.-écotype C24 a été effectuée selon la procédure décrite par Valvekens D. et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA, 85, 5536-5540. Brièvement, 3 étapes sont nécessaires: induction de la formation des cals sur milieu B5 de Gamborg complémenté de 2,4-D et de kinétine; formation de bourgeons sur milieu B5 de Gamborg complémenté de 2iP et d'1AA; enracinement et formation de graines sur MS sans hormones. 2) Mesure de l'activité GUS dans les plantes a- observations histochimiques La révélation de l'activité GUS par tache histochimique (Jefferson R.A. et al. (1987) EMBO J., 6, 3901-3907) sur des plantes transgéniques de 10 jours montre une augmentation de l'intensité du patron histochimique spécifique de tissu pour les plasmides contenant les séquences d'intron (pCG-1 et pCG-13) par rapport à ceux sans ces introns (pRA-1). En particulier le patron de tache pour pCG-1 et pCG-13 est identique, montrant une augmentation d'intensité des taches des tissus vasculaires et méristématiques, feuilles et racines par rapport à celui de la construction pRA-l. Les contructions contenant seulement les séquences d'intron n"l (pCG-15 et pCG-18 montrent une tache histochimique extrêmement claire seulement dans la région du meristem apical. b- mesures fluorométriques L'activité GUS mesurée par fluorométrie sur des extraits de bourgeons floraux et de feuilles de la rosette (Jefferson R.A. et al. (1987) EMBO J., 6, 3901-3907) à partir de 12 plantes, montre que l'activité du promoteur H4A748 est augmentée sous l'influence des introns n" 1 et 2. Par rapport à la construction pRA-l, l'activité GUS de pCG-1 et pCG-13 sont au moins six fois supérieures dans les bourgeons floraux, vingt fois supérieures dans les feuilles de la rosette et vingt six fois supérieures dans les racines. Ces mesures montrent clairement que l'introns n"l and 2 de gènes d'histone d'arabidopsis de type "H3.3-like" utilisé comme zone de régulation induit une augmentation de l'activité de l'expression du gène chimère. EXEMPLE 4. Tolérance de plantes transgéniques à un herbicide 1) Transformation et régénération Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacteriwn tumefaciens LBA 4404 disponible sur catalogue (Clontech &num;6027-1) par croisement triparental à l'aide du plasmide "helper" pRK 2013 dans Escherichia coli HB101 selon la procédure décrite par Bevan M. (1984) Nucl.Acids Res., 12, 8711-8721. La technique de transformation à partir d'explants foliaires de tabac est basée sur la pocédure décrite par Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229-1231. La régénération du tabac PBD6 (provenance SElTA-France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30gon de saccharose ainsi que 20011gel de kanamycine en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g de saccharose contenant 0,05mg d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30gon de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS dilué au demi, à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. 2) Mesure de la tolérance au glyphosate: Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chacune des constructions pRPA-RD-196, pRPA-RD-197 et pRPA-RD-198. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de l'herbicide, vendu sous la marque RoundUp, correspondant à 0,8kg de matière active glyphosate par hectare. Les résultats correspondent à l'observation d'indices de phytotoxicité relevés 3 semaine après traitement. Dans ces conditions, on constate que les plantes transformées par les constructions présentent en moyenne une tolérance acceptable (pRPA-RD-196) voire bonne (pRPA-RD-197 et pRPA-RD-198) alors que les plantes témoins non transformées sont complètement détruites. Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportée par l'utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate. Les plantes transformées selon l'invention peuvent être utilisées comme parents pour l'obtention de lignées et d'hybrides ayant le caractère phénotypique correspondant à l'expression du gène chimère introduit. Liste des séquences. SEQ ID N 1 AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60 ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120 CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180 TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240 AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300 AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360 AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420 CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480 AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540 TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600 AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660 CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720 TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780 GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840 AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900 TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960 TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020 CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080 CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140 GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200 TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260 AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320 CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380 CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440 ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500 CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560 TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620 GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713 SEQ ID N 2. CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile 1 5 10 TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95 Ser Gly Thr Val Lus Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 40 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 3 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 3 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro llS 120 125 AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 4 Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 5 Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 5 Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 6 Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser 195 200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 6 Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly 225 230 235 SEQ ID N 2 (suite). CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 7@ Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 2.40 245 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 8@ Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 9@ Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 10@ Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 10@ Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 11 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 11@ Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr r Cys Ile e Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 12@ Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 12@ Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lus Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 132 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 TAA 1340 SEQ ID N 3. Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Net Thr Leu Arg Leu Net Glu Arg Ph. Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys A.n Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350 Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 405 410 415 Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 SEQ ID N 4. CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile 1 5 10 TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95 Ser Gly Thr Val Lus Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 40 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Ary Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro 115 120 125 AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 52@ Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 57@ Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 62@ Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser 195 200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 67@ Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 71@ Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly 225 230 235 SEQ ID N 4 (suite). CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 76@ Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 245 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAC TTT 863 Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 91 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 100 Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 105 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 110 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151 Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG cCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr Cys Ile île Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala île Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 124 Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT 'GGG TGC ACC CGG AAG ACC , 1295 Ala Glu Val Pro Val Thr île Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 133 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 TAA 1340 SEQ ID N 5. Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr @et Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 L@u Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350 Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 405 410 415 Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 SEQ ID N 6. TGAGGTACGA TTCTTCGATC CTCTTTGATT TTCCTGGAAA TATTTTTTCG GTGATCGTGA 60 AACTACTGGA ATCGCTCGAT AGGTGGTACG AAATTAGGCG AGATTAGTTT CTATTCTTGG 120 CCATTATCTT GTTTCTTCGC CGAATGATCT TCCGTATAAA GATTTTAGGT TAGAGATGAA 180 TCGTATAGCT AGATTTCATC ACCAGATAGT TTCTTTGTCT AGAATCTCTG AAATTCTCGA 240 TAGTTTTCAC ATGTGTAAAT AGATTGTTCT TATTCGGCGA TTGTTGATTA GGGTTTTGAT 300 TTTCTTGATT ATGCGATTGC AATTAGGGAT TTTCTTTGGT TTTGTGTTGA TCTTACGATA 360 CATTCCTGCA ATTGAATACG TATGGATCTA AATCTTGTTA ATTTGTTGAA CAGATCCC 418 SEQ ID N 7. CTCAGGCGAA GAACAGGTAT GATTTGTTTG TAATTAGATC AGGGGTTTAG GTCTTTCCAT 60 TACTTTTTAA TGTTTTTTCT GTTACTGTCT CCGCGATCTG ATTTTACGAC AATAGAGTTT 120 CGGGTTTTGT CCCATTCCAG TTTGAAAATA AAGGTCCGTC TTTTAAGTTT GCTGGATCGA 180 TAAACCTGTG AAGATTGAGT CTAGTCGATT TATTGGATGA TCCATTCTTC ATCGTTTTTT 240 TCTTGCTTCG AAGTTCTGTA TAACCAGATT TGTCTGTGTG CGATTGTCAT TACCTAGCCG 300 TGTATCGAGA ACTAGGGTTT TCGAGTCAAT TTTGCCCCTT TTGGTTATAT CTGGTTCGAT 360 AACGATTCAT CTGGATTAGG GTTTTAAGTG GTGACGTTTA GTATTCCAAT TTCTTCAAAA 420 TTTAGTTATG GATAATGAAA ATCCCCAATT GACTGTTCAA TTTCTTGTTA AATGCGCAGA 480 TCCCGGGATC TGCG 494 REVENDICATIONS 1) Séquence ADN isolée pouvant servir de zone de régulation dans un gène chimère utilisable pour la transformation des plantes et permettant l'expression du produit de traduction du gène chimère en particulier dans les régions de la plante en croissance rapide, caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription du gène chimère, au moins un intron tel que le premier intron (intron 1) de la région 5' non-codante d'un gène d'histone végétale. 2) Séquence ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'intron 1 d'histone provient d'un gène d'histone végétale du type "H3.3-like" 3) Séquence ADN selon l'une des revendications let 2, caractérisée en ce que l'intron 1 d'histone provient d'une plante dicotylédone. 4) Séquence ADN selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'intron 1 d'histone provient d'Arabidopsis thaliana. 5) Séquence ADN selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'intron 1 d'histone provient d'une plante monocotylédone. 6) Séquence ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'intron 1 d'histone provient de Zea mays. 7) Séquence ADN selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'intron 1 est orienté, dans le sens de la transcription du gène chimère, de façon directe ou inversée relativement à son orientation initiale dans le sens de la transcription du gène dont il est issue. 8) Séquence ADN selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la zone de régulation comprend deux introns-l, identiques ou différents, associés. 9) Gène chimère pour la transformation des plantes comprenant au moins, dans le sens de la transcription, une zone de régulation comprenant une zone promotrice, une séquence d'un gène de tolérance herbicide et une zone de régulation, caractérisé en ce que la zone de régulation comprend en outre un intron 1 selon l'une des revendications 1 à 8. 10) Gène chimère selon la revendication 9, caractérisé en ce que la zone promotrice provient d'un promoteur de gène d'histone végétale. 11) Gène chimère selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la zone promotrice provient du même gène d'histone végétale que le l'intron 1. 12) Gène chimère selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la zone promotrice comprend un promoteur d'histone végétale dupliquée. 13) Gène chimère selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que la zone promotrice contient au moins un promoteur d'un gène d'histone végétale associé à un promoteur différent issu d'un gène pouvant s'exprimer naturellement dans les plantes. 14) Gène chimère selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que le gène codant permet de conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide. 15) Gène chimère selon la revendication 14, caractérisé en ce que le gène de tolérance herbicide est fusionné à une séquence ADN codant pour une zone peptide de transit permettant l'accumulation du produit de la traduction du gène de tolérance herbicide dans un compartiment subcellulaire. 16) Gène chimère selon la revendication 15, caractérisé en ce que la zone peptide de transit permet l'accumulation du produit de la traduction du gène de tolérance herbicide dans le compartiment plastidial. 17) Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la zone peptide de transit comprend, dans le sens de la transcription, au moins un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, éventuellement une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis éventuellement un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. 18) Gène chimère selon l'une des revendications 9 à 17, caractérisé en ce que le gène de tolérance herbicide code pour une enzyme active vis à vis d'herbicides dont la cible est 1'EPSPS. 19) Gène chimère selon la revendication 18, caractérisé en ce que le gène de tolérance herbicide code pour une enzyme active vis à vis du glyphosate. 20) Vecteur pour la transformation des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère selon l'une des revendications 9 à 19. 21) Souche d'Agrobacterium sp., caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur selon la revendication 20. 22) Cellule végétale transformée, caractérisée en ce qu'elle contient un gène chimère selon l'une des revendications 9 à 19. 23) Plante ou partie de plante transformée obtenue à partir d'une cellule selon la revendication 22. 24) Procédé de construction d'un gène chimère selon l'une des revendications 9 à 23, caractérisé en ce qu'on isole respectivement un l'intron 1 d'un gène dbistone végétale selon l'une des revendications 1 à 8, une zone promotrice, une zone peptide de transit, ainsi qu'au moins un transgène, et que ensuite on les assemble dans le sens de la transcription du transgène.