Brevet FR2745974A1 — publié le 19970919

La présente invention concerne l'obtention d'un animal mammifère, non humain, modifié, présentant une physiopathologie similaire à celle de patients atteints de sclérose en plaques (SEP), ainsi que les utilisations de l'animal ainsi obtenu. Une altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) semble être un élément crucial dans le développement des lésions de la sclérose en plaques (SEP) (Gay & Esiri 1991, Hawkins & col 1991, Thompson & col 1992, Poser 1993). Il semble qu'une prédisposition génétique, combinée à un agent pathogène, peut-être d'origine virale, puisse entraîner ces lésions puis que se développe un processus inflammatoire et auto-immun démyélinisant (Wasksman 1985). Les observations de Perron & col (1989, 1991) d'une activité transcriptase inverse (RT), et de la présence de particules virales dans des lignées de cellules leptoméningées et des monocytes en culture de patients atteints de SEP, apportent des arguments compatibles avec une étiologie virale, plus particulièrement rétrovirale, de la SEP. Une hypothèse récemment vérifiée par les présents inventeurs, est que, dans la SEP, des monocytes probablement infectés par un rétrovirus soient susceptibles de libérer des molécules gliotoxiques in vitro. En effet, le surnageant de monocytes prélevés chez des patients SEP en phase de poussée et mis en culture in vitro, ajouté au milieu de culture d'explants de cortex de rat embryonnaire a montré une toxicité ciblée préférentiellement sur les astrocytes (voir la demande de brevet PCT/FR95/00178 déposée au nom de la Demanderesse et dont le contenu est incorporé dans la présente description par référence). La purification du surnageant de monocytes de patients atteints de SEP, actif in vitro, a mis en évidence un facteur toxique représenté majoritairement par une fraction de 17 Kd et une bande associée minoritaire de 21 Kd. Ce facteur induit une mort par apoptose de lignées d'astrocytes, et aussi d'oligodendrocytes, in vitro (voir la demande de brevet PCT/FR95/00178). Ces deux fractions se retrouvent également dans le liquide céphalorachidien (LCR) et sérums de patients atteints de SEP (Dobransky & col soumis). La présente invention concerne un animal mammifère, non humain, modifié, susceptible d'être obtenu par inoculation du facteur toxique défini ci-dessus, et chez lequel on observe des lésions physiopathologiques en particulier cérébrales, de même nature que celles observées chez les patients atteints de sclérose en plaques. Par animal modifié selon l'invention, on entend un animal qui, par rapport à un animal témoin de même famille, de même genre et de même espèce, a subi une modification volontaire. Cette modification volontaire n'affecte pas le génome de l'animal et en particulier l'animal n'est pas transgénique. Elle se caractérise essentiellement par un état physiopathologique lié à une infection de l'animal par le facteur gliotoxique tel qu'obtenu à partir de liquide biologique prélevé chez des patients atteints de sclérose en plaques. Les différents objets de l'invention sont les suivants - un animal mammifère, non humain, modifié sans affecter son génome, possédant au moins l'un quelconque des signes ou anomalies suivants : une barrière hématoencéphalique ouverte ou perméable aux molécules hydrosolubles du sang non spécifiques du parenchyme cérébral ; une atteinte astrocytaire notamment révélée par la désorganisation des réseaux physiologiques, par une disparition des pieds astrocytaires autour des vaisseaux capillaires et par une gliose ; une activation des cellules microgliales ; des plaques de démyélinisation, notamment présentes dans le tronc cérébral et/ou la substance blanche cérébelleuse ; des lésions des cellules gliales et des cellules endothéliales du système nerveux central, en particulier une modification de la morphologie et/ou une fragmentation au moins partielle de 1'ADN des cellules gliales de type astrocytaire, à distance du point d'injection ; - un animal mammifère, non humain, modifié sans affecter son génome, susceptible d'être obtenu par inoculation du facteur gliotoxique tel qu'obtenu dans une culture de monocytes ou dans un liquide biologique de patients atteints de sclérose en plaques - un procédé d'obtention d'un animal tel que défini précédemment, comprenant les étapes consistant à * disposer d'une quantité infectante de facteur gliotoxique, tel qu'obtenu à partir d'une culture de monocytes ou à partir d'un liquide biologique d'un patient atteint de sclérose en plaques, * inoculer ladite quantité infectante à l'animal - l'utilisation d'un animal de l'invention pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique notamment d'un agent médicamenteux, anti-inflammatoire ou antitoxique - l'utilisation d'un animal de l'invention, pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique notamment d'un agent médicamenteux, destiné au traitement de la sclérose en plaques - l'utilisation d'un animal de l'invention pour déterminer la nocuité ou l'innocuité d'un procédé thérapeutique notamment d'un agent médicamenteux, sur le cerveau pathologique de l'animal décrit - un procédé pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique notamment d'un agent médicamenteux, anti-inflammatoire, comprenant les étapes consistant à * disposer d'un animal de l'invention, * administrer ledit procédé thérapeutique à 1 'animal, * mesurer l'efficacité du procédé thérapeutique en observant la réduction ou l'absence du ou des signes pathologiques décrits précédemment, par rapport à un animal témoin malade ayant reçu le facteur gliotoxique, mais n'ayant pas reçu le procédé thérapeutique, et en référence à un témoin normal traité par ledit procédé thérapeutique mais n'ayant pas reçu de facteur gliotoxique ; - un procédé pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique notamment un agent médicamenteux, destiné au traitement de la sclérose en plaques, comprenant les étapes consistant à * disposer d'un animal de l'invention, * administrer ledit procédé thérapeutique à 1 ' animal, * mesurer l'efficacité du procédé thérapeutique en observant la réduction ou l'absence du ou des signes pathologiques décrits précédemment, par rapport à un animal témoin malade ayant reçu le facteur gliotoxique, mais n'ayant pas reçu ledit procédé thérapeutique, et en référence à un témoin normal traité par ledit procédé thérapeutique mais n'ayant pas reçu de facteur gliotoxique - un procédé pour déterminer la nocuité ou l'innocuité d'un procédé thérapeutique notamment d'un agent médicamenteux, sur le cerveau pathologique de l'animal de l'invention, comprenant les étapes consistant a: * disposer d'un animal de l'invention, * administrer ledit procédé thérapeutique à l'animal, * mesurer la réponse au procédé thérapeutique par une observation histopathologique étudiant les critères précédemment décrits. Une autre utilisation de l'animal modifié selon l'invention réside dans l'obtention d'hybridomes susceptibles de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre le facteur gliotoxique et issus de lymphocytes B prélevés sur ledit animal et fusionnés avec des cellules tumorales adaptées à l'obtention d'hybridomes (hybridomes rat/rat ou rat/souris selon Kohler et Milstein 1975). Ainsi l'invention concerne un procédé de production d'anticorps monoclonaux dirigés contre le facteur gliotoxique et/ou contre des molécules induites ou modifiées par les effets du facteur gliotoxique, comprenant les étapes consistant à fusionner des lymphocytes B prélevés sur un animal de l'invention, avec des cellules tumorales appropriées, et à faire produire par l'hybridome issu après sélection, lesdits anticorps. L'invention a également pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre le facteur gliotoxique et/ou contre des molécules induites ou modifiées par les effets du facteur gliotoxique, susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus. De préférence l'animal modifié selon la présente invention appartient à la famille des muridés, en particulier il s'agit d'une souris ou d'un rat. Mais l'animal de l'invention pourrait être un singe ou un cochon d'Inde. La partie expérimentale ci-après regroupant les exemples 1 à 3 en relation avec les figures 1 à 11, illustre l'effet pathologique du facteur gliotoxique in vivo chez des rates, et la détermination de cet effet permet d'établir la liaison avec les processus lésionnels observés dans la SEP. Dans les exemples 1 à 2 on examine l'évolution des lésions affectant les astrocytes, après injection intraventriculaire de ce facteur chez le rat. La fiqure 1 est une photographie montrant l'organisation et l'orientation des astrocytes périventriculaires après injection du facteur toxique Fig. 1A : témoins : les cellules GFAP+ proches du ventricule latéral gauche sont de type fibreux ; les corps cellulaires sont densément marqués ; les prolongements sont relativement épais ; les cellules GFAP+ sont orientées parallèlement au plan de coupe (coupe verticofrontale) ; Fig. 1B : rates traitées par le facteur toxique les cellules GFAP+ observées à proximité du ventricule latéral gauche ont un soma hypertrophié et/ou polymorphe avec une désorganisation des extensions cytoplasmiques ; l'orientation de ces cellules est perpendiculaire au plan de coupe et l'organisation des cellules est palissadique ; Fig. 1C : à plus fort grossissement de Fig. 1B, on observe un astrocyte normal Fig. 1D : à plus fort grossissement de Fig. 1B, on observe un astrocyte dont les prolongements cytoplasmiques sont orientés vers le ventricule latéral gauche ; Barre : A, B (20 ssm) C,D (60 ssm) La Fiqure 2 illustre des nodules dans le SNC de rats traités par le facteur toxique Fig. 2A : dans le striatum des rates témoins, les cellules GFAP+ sont de petite taille, de forme étoilée, les prolongements sont courts et fins Fig. 2B : chez les rates traitées par le facteur, les corps astrocytaires sont hypertrophiés, et ont des prolongements cytoplasmiques anormaux (très fins et nombreux) ; Fig. 2C : chez les rates traitées par le facteur, on observe des nodules dans le striatum Barre : 20 ssm Fissure 3 représente l'organisation des astrocytes périventriculaires suite à l'injection du facteur gliotoxique Fig. 3A : chez les rats témoins, les prolongements astrocytaires forment des patchs immunoréactifs GFAP+ autour des vaisseaux Fig. 3B : chez les rates traitées, les prolongements astrocytaires autour des vaisseaux ont régressé ou disparu ; on observe en outre une "déplétion" de l'environnement vasculaire en astrocytes Fig. 3C : chez les rates traitées, a proximité de certains vaisseaux, des foyers de gliose astrocytaire se forment ; les astrocytes sont densément marqués à la GFAP ; les prolongements cytoplasmiques sont plus épais ; Barre : 40 ssm La Figure 4 montre la distribution des astrocytes dans le cortex, 10 jours après lésion Fig. 4A : chez les animaux témoins, dans la zone marginale du cortex piriforme, les astrocytes ont un aspect de "chandelles" et leurs prolongements cytoplasmiques sont orientés vers la pia perpendiculairement à sa surface Fig. 4B : dans la couche I du cortex piriforme chez les rates traitées, on observe une modification structurale des cellules GFAP+ qui ont perdu leur orientation physiologique ; on observe une désorganisation de la glia limitans établie par les prolongements astrocytaires Fig. 4C : chez les animaux témoins, dans les couches II et III du cortex, les cellules GFAP+ ont une forme étoilée ; les prolongements cytoplasmiques nombreux occupent l'espace intercellulaire Fig. 4D : chez les rates traitées, on observe une régression des prolongements cytoplasmiques, une augmentation de l'espace intercellulaire et une perte de la morphologie "étoilée" des astrocytes Barre : 40 ssm La Fissure 5 met en évidence la fragmentation de l'ADN cellulaire par la technique TUNEL après traitement par le facteur toxique Fig. 5A : chez les rates traitées, on observe les cellules TUNEL+ dans la paroi des ventricules latéraux Fig. 5B : chez les rates traitées, observation dans la substance blanche du cervelet Fig. 5C : chez les rates traitées, observation dans la couche des grains du cervelet Fig. 5D : chez les rates traitées, observation au niveau des vaisseaux arachnoïdiens Fig. 5E : chez les rates traitées, on observe que dans le cervelet, l'ADN fragmenté se retrouve dans le cytoplasme ; Fig. 5F : chez les rates traitées, on observe les cellules TUNEL+ dans les plexus choroïdes, avec une contre coloration à 1'hématoxyline Barre : 40 ssm La Fissure 6 : chez des rates traitées par le facteur toxique, des cellules GFAP positives sont TUNEL positives ; des cellules endothéliales sont parfois aussi TUNEL positives Fig. 6A : cellules GFAP+ (bleu), également TUNEL+ (marron) dans le cortex Fig. 6B : dans le striatum ; on observe l'absence des prolongements cytoplasmiques et l'atténuation du marquage GFAP Fig. 6C : cellule doublement marquée GFAP/TUNEL dans le cervelet Fig. 6D : cellules doublement marquées (FVIII/TUNEL) dans la paroi vasculaire ; le marquage du FVIII est très faible Barre : 40 ssm La Fiqure 7 est une photographie montrant l'ouverture de la barrière hématoencéphalique chez les rates traitées par le facteur toxique Fig. 7A : dans une large zone périventriculaire, une diffusion d'immunoglobulines du sang s'observe ; l'immunomarquage est diffus Fig. 7B : à plus fort grossissement, on observe une auréole d'IgG autour d'un vaisseau Barre : A 20 ssm, B 40 Um La Fissure 8 représente la réactivité microglialemacrophagique Fig. 8A : chez les témoins, on observe des cellules OX42+ dans le striatum ; la microglie est sous forme quiescente, le marquage est faible ; très peu de cellules sont observées Fig. 8B : chez les animaux traités, on note une modification morphologique des cellules OX42+ et une augmentation de leur nombre Fig. 8C : à plus fort grossissement de Fig. 8B, cellule microgliale quiescente Fig. 8D : à plus fort grossissement de Fig. 8B, cellule microgliale réactive de type ramifié barre : A, B, 20 ssm C, D, 40 Mm La Figure 9 illustre des foyers de microglie réactive dans le tronc cérébral Fig. 9A : foyer de cellules OX42+ dans le tronc cérébral Fig. 9B : à plus fort grossissement, les cellules OX42+ sont réactives de type ramifié et pseudopodique Barres : A 10 ssm B 20 ssm La Fiqure 10 illustre la dégradation myélinique Fig. 10A : substance blanche du cervelet où l'on note une atténuation de l'immunomarquage dans une large zone bien délimitée Fig. lOB : faisceau de myéline dans le cervelet où on observe une forte dégradation myélinique Fig. 10C : agrandissement de Fig. lOB : dégradation myélinique très nette Barre : A, B, 10 ssm C 20 ssm La Fiqure 11 représente une co-détection des astrocytes et des cellules TUNEL+ par rapport aux astrocytes dans des biopsies de patients (SEP) Fig. 11A : astrocyte réactif (bleu) entouré de cellules TUNEL+ (marron) Fig. llB : cellules GFAP+ de petite taille, faiblement marquées par l'anti-GFAP, dépourvues de prolongements cytoplasmiques et situées à la périphérie de la plaque Fig. 11C : cellules TUNEL+ dans la paroi vasculaire, à phénotype endothélial Barre : 40 ssm EXEMPLE 1 : DESCRIPTION DU MATERIEL ET DES TECHNIQUES UTILISES a) Le facteur gliotoxique Les échantillons de LCR ou d'urine, ou les monocytes sont prélevés chez des patients atteints de SEP. Le facteur toxique est purifié partiellement après traitement sur une colonne échangeuse d'ions, puis sur une colonne de séparation par exclusion, conformément à l'Exemple 11 de la demande de brevet PCT/FR95/00178. Le facteur gliotoxique est constitué majoritairement par une fraction légère de 17 Kd et par une fraction lourde de 21 Kd, qui ont toutes deux une forte affinité pour la concanavaline. La séparation du facteur gliotoxique est ci-après détaillée, à partir de surnageants bruts de culture de monocytes/macrophages de patients atteints de SEP. * Préparation des cultures de monocytes/macrophages de patients atteints de SEP Le milieu de culture comprend du RPMI1640 (Boehringer), de la pénicilline-streptomycine (bioMérieux), de la L-glutamine (bioMérieux), du pyruvate de sodium (Boehringer), des acides aminés non-essentiels 100x (Boehringer), du sérum humain AB prélevé chez des donneurs sains et séronégatifs pour tous les virus transmissibles par les dérivés sanguins connus (voir PERRON et al., The Lancet, vol 337, pages 862-863, 6 Avril 1991). Les cellules lymphoïdes sont cultivées dans des flacons de culture de 75 cm3 Primaria (Falcon) après avoir été séparées du plasma et des autres éléments figurés sanguins par centrifugation sur gradient de Ficoll (Lymphoprep, Flow). Pour obtenir ces cellules lymphoïdes, 50 ml de sang sont prélevés par ponction veineuse sur tube stérile hépariné (lithium héparine). Le sang et l'héparine sont bien mélangés aussitôt le sang prélevé. Alternativement, le sang peut être prélevé dans des tubes contenant de l'EDTA. Il est important ensuite, de transporter immédiatement les tubes maintenus à +4 OC au laboratoire, où ceux-ci seront manipulés sous hotte de culture à flux laminaire "biohazard" dans des conditions stériles. Pour une culture de monocytes, on prépare un milieu "RPMI" qui comprend 100-150 ml de milieu RPMI 1640, un mélange de pénicilline et streptomycine, 4% de Lglutamine, 1% de pyruvate de sodium, 1% d'acides aminés non-essentiels Boehringer (100X). On prépare également 3 tubes stériles à fond conique de 50 ml (Falcon) contenant 10 ml du milieu "RPMI" sus-décrit, et 4 tubes stériles de 50 ml avec 20 ml de Ficoll au fond. Les tubes héparinés sont ouverts pour pipeter le sang, le déposer dans les tubes contenant du milieu et le mélanger doucement au milieu sus-décrit. On prélève 5 ml de milieu "RPMI" et l'on rince la paroi des tubes héparinés. Il faut accompagner ce rinçage d'un grattage léger à l'aide du bout de la pipette plastique afin de décoller des cellules ayant éventuellement adhéré aux parois du tube, et le déposer dans les tubes contenant le sang dilué dans le milieu "RPMI", en mélangeant doucement le contenu par aspirations/refoulements successifs. Il faut répéter ces opérations jusqu'à ce que les tubes héparinés soient propres. Il faut ensuite déposer très doucement (sans remous) le sang dilué dans le milieu "RPMI", à la surface du Ficoll dans les tubes de 50 ml puis utiliser du milieu "RPMI" pour rincer le reste de sang dilué et le récupèrer comme précédemment pour le déposer délicatement à la surface des tubes avec le Ficoll. Ensuite, et sans secouer le Ficoll, il faut placer les tubes dans des godets pour centrifugeuse, équilibrer à l'aide de tubes remplis d'eau, et centrifuger à +150C pendant 20 minutes à 1800 tr/min, avec un mode de décélération lente. Après centrifugation, on récupère les tubes dans lesquels on enfonce doucement une pipette jusqu'à hauteur de l'interface supérieure "Ficoll/plasma" et l'on aspire doucement la couche blanchâtre située au dessus du Ficoll en décrivant des cercles concentriques depuis les parois, puis en décrivant des "zig-zags" d'un côté à l'autre de la surface du Ficoll. On place le milieu aspiré dans des tubes de 50 ml, on le dilue dans au moins 3 fois le volume de milieu RPMI et l'on mélange doucement par inversion des tubes bouchés stérilement. On centrifuge ensuite les tubes à +15 0C pendant 10 minutes à 1800 tr/min, avec un mode de décélération lente. Après centrifugation, on jette en versant lentement mais régulièrement le surnageant de ces tubes, tout en veillant à ce que le culot blanchâtre de cellules ne se détache pas. On resuspend le culot dans 10 ml de milieu "RPMI" par aspirations/refoulements successifs et on centrifuge la suspension à +15"C pendant 10 minutes à 1800 tr/min, avec un mode de décélération lente. Par prélèvement ou par 50 ml de sang prélevé, on prépare deux petits flacons de culture en plastique électropositif (Falcon "PRIMARIA") de 75 cm3 et 10 ml de milieu "RPMI" auquel on aura ajouté 15% de sérum humain "AB" (SH) sus-décrit. Après centrifugation, on élimine le surnageant comme précédemment, on resuspend doucement le culot dans 5 ml de milieu "RPMI" avec 15% de SH et l'on répartit les cellules resuspendues dans les flacons placés à plat et à peine soulevés. La suspension est aussitôt répartie en remuant chaque flacon à plat. Les tubes de centrifugation sont rincés avec 5 ml de milieu "RPMI" à 15% SH, et la suspension est ajoutée et répartie dans les deux flacons, comme précédemment. Avantageusement, tous les milieux utilisés pour ces étapes sont à 37"C (réchauffés au bain marie). Une fois les flacons refermés, ils sont tenus à plat dans une étuve humide à 370C avec 5% de C02 jusqu'au lendemain matin. Le lendemain matin, il convient de bien aspirer tout le surnageant avec les cellules en suspension, de rincer les flacons deux fois avec 4 ml de RPMI seul, en laissant "tremper" 5 minutes à chaque fois et en relevant lentement le flacon avant d'aspirer tout le milieu restant, afin d'éliminer les cellules non-adhérentes. On remplit ensuite les flacons de 5 ml de milieu RPMI à 15% de SH, on les replace à l'étuve et l'on veille à ne pas les bouger pendant 4 h. Dès cette étape, il convient de toujours remplir les flacons placés debout en dirigeant le jet sur la paroi supérieure afin de ne pas détacher les cellules en cours d'adhésion, puis, par la suite, affectées par un effet cytopathogène éventuel. Les suspensions cellulaires ainsi recueillies 24 h après la mise en culture, sont centrifugées à +150C pendant 10 minutes à 1800 tr/min, avec un mode de décélération lente. Eventuellement, le culot de cellules peut être repris dans du sérum de veau foetal avec 10% de DMSO (Diméthyl sulfoxide) pour être congelé à -800C ou dans l'azote liquide selon une procédure de maintien de cellules viables. Le surnageant correspondant est ensuite centrifugé à 3000 tr/min pendant 30 min afin d'éliminer les débris cellulaires, et le surnageant clarifié est aliquoté, répertorié comme échantillon à 24 h de culture, soit J1, puis stocké au congélateur à -800C. Après 48 h dans l'étuve, on sort les flacons, le surnageant est aspiré délicatement, et, comme précédemment, centrifugé à 3000 tr/min pendant 30 minutes afin d'éliminer les débris cellulaires. Le surnageant clarifié est aliquoté, répertorié comme échantillon à 3 jours de culture, soit J3, puis stocké au congélateur à -800C. Les flacons sont aussitôt remplis avec 5 ml de milieu RPMI à 5% SH et replacés dans l'étuve. A partir de ce moment, le milieu de culture ne contient plus que 5% de SH et cette proportion sera utilisée pour tous les renouvellements de milieu. Les milieux des flacons sont ensuite prélevés, stockés sous aliquots de milieu clarifié des débris cellulaires, à -800C comme précédemment, et remplacés par du milieu "RPMI" à 5% de SH, tous les trois ou quatre jours, jusqu'à ce que ne persiste plus aucune cellule adhérente et réfringente à l'observation microscopique dans le flacon. * Séparation du facteur gliotoxique Les échantillons de surnageants de culture sont regroupés (J1 à J final) après décongélation et sont préalablement chauffés 30 min à 560C et centrifugés 10 min à 1500 tr/min, puis le surnageant est récupéré et, éventuellement, dialysé à 40C dans 2 fois 20 volumes de tampon D-PBS, une première fois pendant 2 h, et une deuxième durant la nuit. Le surnageant ainsi recueilli constitue l'échantillon à partir duquel le facteur gliotoxique sera séparé, selon la technique décrite dans la demande de brevet PCT/FR95/00178. b) Injections cérébrales intraventriculaires Les expériences sont réalisées sur des rates Lewis, adultes (2 mois), pesant entre 200-250 g au début de l'expérience. Les animaux sont anesthésiés à l'hydrate de chloral (400 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Les injections de la solution toxique, 5 à 10 Mg de protéines actives dans 5 41 d'une solution de PBS (tampon phosphate salin) stérile sont réalisées par des méthodes stéréotaxiques, dans le ventricule latéral gauche, (AP:0,8, L:1,5. P:4). Les injections se font à l'aide d'une micropipette (22 ssm de diamètre) accrochée à une seringue Hamilton de 25 41. Les animaux sont sacrifiés, 10 jours (n=9) après l'opération. Six animaux témoins sont soumis à des injections dans les mêmes conditions par 5 41 d'une solution de PBS stérile, et sont sacrifiés au même temps. Tous les animaux reçoivent une dose létale d'hydrate de chloral (0,5 g/kg), puis perfusés par voie transcardiaque à travers l'aorte ascendante, par une solution de paraformaldéhyde 4 % dans du tampon phosphate 0,12 M. Les cerveaux avec moelles cervicales sont postfixés dans le même fixateur pendant une heure à 40C, ensuite cryoprotégés dans une solution de sucrose 10 % dans du tampon phosphate 0,12 M pendant 2 jours, puis congelés dans de l'isopentane refroidi dans l'azote liquide à -40 C et stockés à -80 C. Des coupes au cryostat verticofrontales, de 10 Um d'épaisseur, sériées toutes les 100 ssm sont recueillies sur des lames gélatinées 1 %. Certaines coupes sont colorées au violet de Crésyl, ou à l'hématoxyline éosine. c) Anticorps Pour marquer les astrocytes, on utilise un anticorps monoclonal anti-protéine gliale fibrillaire acide (anti-GFAP) (BOEHRINGER) dilué au 1/200. La myéline est visualisée par un anticorps anti-protéine basique de myéline (anti-MBP) (BOEHRINGER) dilué au 1/500. Des anticorps monoclonaux OX42 dilués au 1/500 (SEROTEC) sont utilisés pour identifier les cellules microglialesmacrophagiques. Lors d'une ouverture de la BHE, des éléments spécifiques du sang sont détectés dans le parenchyme cérébral telles que les immunoglobulines (Dusart & col 1993). Un anticorps anti-immunoglobuline de rat (AMERSHAM) dilué au 1/200 est utilisé pour visualiser une éventuelle rupture de la BHE. Un anticorps anti-FVIII est utilisé pour visualiser les cellules endothéliales. Dans tous les cas, les coupes sont incubées avec les anticorps primaires aux concentrations indiquées durant une nuit à 40C, ils sont dilués dans du PBS 0,1 M 2 % BSA (sérumalbumine bovine), 0,3% Triton-X. Les coupes destinées à être marquées par l'anti-MBP sont préalablement dégraissées dans de l'alcool absolu contenant 5 % d'acide acétique, pendant 25 minutes à 40C, ensuite immergées dans des bains d'alcools à 95 puis à 70, pendant 5 minutes pour chacun, et rincées plusieurs fois dans du PBS. L'anticorps secondaire (Anti-IgG de souris biotinylé, AMERSHAM) dilué au 1/200 est mis en présence des coupes, pendant environ 2 heures à température ambiante. Les coupes sont ensuite incubées avec le complexe streptavidine-biotine / peroxydase (1/200). L'activité peroxydase est révélée en présence de son substrat spécifique H202 et de la DAB. Pour saturer les peroxydases endogènes, les coupes sont incubées pendant 10 minutes dans du tampon phosphate 0,1 M (pH = 7,4) contenant 0,4 % d'eau oxygénée, ensuite sont immergées dans une solution de PBS contenant 2% de BSA pendant 30 minutes avant d'être incubées avec les anticorps primaires. Certaines coupes traitées par les anticorps anti GFAP, anti-FVIII sont révélées selon la technique ABC-AP. Ces coupes sont ensuite traitées selon la méthode TUNEL ci-après décrite. d) Méthode TUNEL (Gavrieli & col 1992) Les coupes sont traitées à la protéinase K (BOEHRINGER) (20 Ug/ml) pendant 15 minutes, ensuite incubées avec la TdT et l'UTp biotinylé, pendant une heu cellules gliales et de cellules endothéliales. A cet effet on décrit la progression de la réponse microgliale macrophagique, l'état de la BHE, de la myéline et de la morphologie astrocytaire. a) Impact du facteur toxique sur les astrocytes La lésion est bilatérale, et affecte la distribution, l'orientation et l'organisation de l'ensemble des astrocytes du SNC du rat. Les astrocytes présentent de profondes modifications morphologiques variables selon leurs localisations. Les lésions seront décrites, en partant des espaces périventriculaires vers les espaces subpiaux. Conformément aux figures 1B, 2B, 2C, 3B et 3C, on distingue plusieurs cas - les cellules GFAP-positives (GFAP+) de morphologie anormale, avec de longs prolongements cytoplasmiques, s'organisent en palissades et sont orientées vers les ventricules latéraux (Fig. 1B) ; - en s'écartant des espaces ventriculaires, notamment dans le striatum, on observe des cellules GFAP d'aspect fibreux densément imbriquées les unes dans les autres, formant des nodules (Fig. 2B, 2C). Ces nodules sont observés dans l'ensemble des régions télencéphaliques - les zones immunoréactives, formées normalement par les prolongements astrocytaires autour des vaisseaux, ne sont pas visibles autour de la plupart des vaisseaux chez les rates traitées par le facteur toxique (Fig. 3B) - on observe des astrocytes présentant des formes réactives, caractérisés par une hypertrophie de leurs somas et un épaississement de leurs prolongements, ils sont densément marqués à la GFAP et se disposent souvent en foyers cellulaires à proximité de certains vaisseaux (Fig. 3C) - dans le cortex, les cellules GFAP+ situées dans les couches profondes perdent leurs prolongements et se raréfient ; dans les couches superficielles, les astrocytes dont les prolongements cytoplasmiques s'orientent vers la pia normalement ont une morphologie anormale et une orientation anarchique (Fig. 4B). La distribution des astrocytes chez les rats témoins est normale et comparable à celle décrite par Kalman & Hajos 1989. L'astrogliose, chez les témoins sans gliotoxine (c'est-à-dire auxquels a été injecté un placébo), est limitée au niveau du site d'injection. b) Fragmentation de l'ADN cellulaire induite par le facteur toxique dans le SNC du rat (mise en évidence par la méthode TUNEL) Des cellules donnant une réponse positive dans la méthode de TUNEL (TUNEL+) sont observées dans tout le SNC du rat. Elles sont plus fréquentes dans la paroi des ventricules où elles correspondent à des cellules de type épendymaire (Fig. 5A). On les observe dans le cervelet (Fig. 5B), quelques-unes sont localisées dans la couche des grains (Fig. 5C), d'autres dans les parois des vaisseaux sanguins situés dans les espaces subarachnoïdiens (Fig. 5D) et intraparenchymateux, et aussi dans les plexus choroïdes (Fig. 5E). Certaines cellules TUNEL+ possèdent de l'ADN fragmenté dans leur cytoplasme. D'autres cellules TUNEL+ sont observées dans les plexus choroïdes (Fig. 5F). Des cellules GFAP+ sont TUNEL+. Elles sont observées dans l'ensemble du SNC (Fig. 6A, 6B, 6C). Des cellules TUNEL+ marquées au FVIII sont aussi observées (Fig. 6D). Il faut noter que le marquage du FVIII dans ce cas-là est très faible. Aucun cas de fragmentation d'ADN n'est observée chez les animaux témoins. Une ou deux cellules TUNEL+ sont parfois visibles au site d'injection de la solution placébo. Mais la présence des cellules TUNEL+ disséminées dans le parenchyme cérébral est spécifique des animaux gliotoxine+. c) Ouverture de la barrière hématoencéphalique Une diffusion d'immunoglobulines du sang est observée dans le parenchyme cérébral, chez tous les animaux traités par le facteur toxique. Elle est plus marquée dans les espaces périventriculaires, autour de certains vaisseaux (Fig. 7A, 7B). Ce phénomène n'est pas observé chez les témoins. d) Réactivité microgliale-macrophagique Les cellules OX42+ présentent des formes réactives caractéristiques, on distingue des formes ramifiées et pseudopodiques. Elles sont plus nombreuses par rapport à ce qui est observé chez les rates témoins (Fig. 8B). Dans certaines régions du tronc cérébral et du cervelet, on observe des petits foyers de cellules OX42+ (Fig. 9A, 9B). e) Demyélinisation induite par le facteur toxique chez le rat Des aires de démyélinisation sont visualisées par une atténuation du marquage de la MBP dans des foyers bien délimités. Ces foyers sont très nettement observables dans le tronc cérébral ainsi que la substance blanche cérébelleuse (Fig. 10A). Des cas de dégradation myélinique sont également observés épars dans pratiquement tout le SNC du rat (Fig. 10B, 10C). EXEMPLE 3 : INTERPRETATION DES RESULTATS ACQUIS Le facteur toxique isolé et purifié à partir du LCR, d'urine ou de culture de monocytes, de patients atteints de SEP, injecté dans le LCR du rat induit des lésions affectant des cellules de type glial et aussi endothélial du SNC. Le facteur toxique est probablement distribué par le LCR qui circule dans les ventricules, puis dans les espaces subarachnoïdiens. Il est absorbé par les vaisseaux arachnoïdiens, puis les sinus veineux. Des cellules TUNEL+ se situent dans les parois ventriculaires (cellules de type épendymaire) et dans les vaisseaux arachnoïdiens. Une atteinte des cellules épendymaires modifierait l'interface entre le LCR et le cerveau, ce qui est susceptible de favoriser la formation de lésions dans les espaces périventriculaires. Dans la SEP, les plaques de lésion sont situées à proximité du système ventriculaire et sont fréquentes autour des veinules. Certains auteurs ont évoqué l'existence d'un agent de nature enzymatique, ou immunitaire ou autre, diffusant du LCR ou du sang, dans le cerveau (voir Marburg 1936, Lumsden 1970). Le facteur toxique injecté semble circuler dans le LCR, et a une action ciblée sur certains types cellulaires. Il serait donc diffusible du LCR vers le parenchyme cérébral où il touche certaines populations cellulaires. La lésion affectant les astrocytes est complexe. On observe une fragmentation d'ADN d'astrocytes suggérant une mort par apoptose de ces cellules. Les astrocytes induisent la formation et le maintien de la BHE, par le biais de leurs extensions cytoplasmiques périvasculaires (pieds astrocytaires), même s'ils ne la constituent pas (Stewart & Wiley 1981). L'altération des astrocytes périvasculaires suggère une rétraction des pieds astrocytaires pouvant par conséquent modifier l'étanchéité de la BHE. Aussi la fragmentation de l'ADN de cellules endothéliales cérébrales suggère des modifications des propriétés intrinsèques de ces cellules qui pourraient conduire à une ouverture de la BHE. La détection d'immunoglobulines du sang dans le cerveau du rat en constitue une preuve. Il est possible que ce soit les modifications morphologiques des astrocytes périvasculaires, qui se produisent très tôt, qui conduisent à la modification du phénotype des cellules endothéliales et donc à l'altération de la BHE. Plusieurs auteurs insistent sur des anomalies au niveau des vaisseaux sanguins dans les plaques chroniques de SEP (Jellinger 1969, Weller 1985, Gay & Esiri 1991). Les cellules endothéliales des capillaires contiennent des immunoglobulines et l'a1-antiglobuline indiquant l'augmentation du transport vésiculaire transendothélial à la périphérie des plaques. On a noté également le passage de médiateurs immunitaires humoraux et cellulaires, témoignant aussi d'une ouverture de la BHE (Compston & col 1989). On a également observé une astrogliose, à proximité de certains vaisseaux, et une prolifération très marquée d'astrocytes fibreux dans l'ensemble du SNC du rat. Les astrocytes après stimulation, produisent une variété de molécules immunorégulatrices. Elles incluent IL-1 (Fontana & col 1982), 1'IL-6 (Frei & col 1989), IFN- (Tedeschi & col 1986) et aussi du TNF-a (Robbins & col 1987, Sawada & col 1989, Chung & col 1990). Le TNF-a est toxique pour les cellules endothéliales (Deguchi & col 1989, Ishii & col 1992). Il a un rôle important dans la progression des lésions dans la SEP (Sharief & col 1991). Il existe une corrélation entre l'ouverture de la BHE et le taux de production de TNF-a chez les patients atteints de SEP (Sharief & Tompson 1992). Le TNF-a a un effet cytotoxique direct sur les oligodendrocytes et provoque les destructions myéliniques (Selmaj & Raine 1988). Il induit une prolifération d'astrocytes in vitro (Barna & col 1990). On sait aussi que les astrocytes se retrouvent au carrefour des réactions inflammatoires. Ils représentent les cellules immunocompétentes résidentes dans le SNC (Fontana & col 1987). Une altération primaire des astrocytes dans les processus lésionnels de la SEP pourrait à la fois déstabiliser l'équilibre homéostatique du SNC, et déclencher une cascade d'événements de type inflammatoire qui aboutiraient à une démyélinisation. Des facteurs solubles d'origine monocytaire ou lymphoïde pourraient altérer l'activité biologique des astrocytes (Chung & col 1990) et induire des cytokines, certaines potentiellement démyélinisantes. On a observé une prolifération microgliale macrophagique chez les rates traitées par le facteur toxique. Cette réactivité s'observe sous forme de foyers OX42+ localisés dans la substance blanche, et plus dans le tronc cérébral. La microglie activée produit aussi des cytokines, tel le TNF-a (Frei & Fontana 1989, Hetier & col 1990), l'IL-6 (Frei & col 1989) et autres. Une réactivité microgliale macrophagique a été décrite dans la SEP et pourrait participer aux processus de démyélinisation (Woodroofe & col 1986, Esiri & col 1987). On observe également une démyélinisation. Les aires de démyélinisation sont très nettement délimitées dans le tronc cérébral et la substance blanche cérébelleuse. Ces aspects sont très proches de ceux qui sont observés dans la SEP. Les résultats obtenus suggèrent que le facteur toxique isolé à partir du LCR de patients SEP induit des lésions à large étendue dans le SNC du rat. Ces lésions se rapprochent par leur nature et leur distribution de certaines des lésions observées dans la SEP, notamment la démyélinisation, l'astrogliose fibrillaire, la réactivité microgliale macrophagique et l'ouverture de la BHE avec formation d'un oedème objectivé par la diffusion d'immunoglobulines plasmatiques intraparenchymateuse. Ces résultats montrent l'intérêt d'utiliser ce nouveau modèle animal expérimental pour étudier la neuropathologie de la SEP et mettre au point des stratégies à visée thérapeutique pour inhiber la synthèse ou bloquer l'action du facteur gliotoxique et à contrecarrer ses effets dans un modèle in vivo. EXEMPLE 4 : EVALUATION DE L'EFFICACITE THERAPEUTIQUE D'UN TRAITEMENT DE LA SCLEROSE EN PLAQUES A L'AIDE DU MODELE ANIMAL INDUIT PAR LA GLIOTOXINE Premièrement, un échantillon de facteur gliotoxique purifié est préparé selon la description faite dans l'Exemple 1 et dans la demande de brevet PCT/FR95/00178. Deuxièment, une série de rats Lewis femelles est sélectionnée selon les critères décrits dans l'Exemple 1. Une trentaine ou plus de ces animaux reçoivent au jour 0, une dose de facteur gliotoxique en injection stéréotaxique intraventriculaire, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1. Aux jours 0, 1, 3, 8, et 10 (par exemple) après injection du facteur gliotoxique, ils reçoivent une dose adéquate d'un agent thérapeutique tel que le Rolipram, l'interféron p, l'azathioprine, le cyclophosphamide, un antisérum anti-gliotoxine, ou tout autre moyen thérapeutique à évaluer. Cette série "A" correspond aux animaux malades (gliotoxine +) traités avec un produit ou procédé actif, et est susceptible d'être reproduite en plusieurs variantes pour évaluer un protocole d'administration quantitatif et qualitatif optimal parmi toutes les variantes. Une trentaine (ou plus) de ces animaux reçoivent au jour 0 une dose de facteur gliotoxique en injection stéréotaxique intravenculaire, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1, mais reçoivent un placebo inactif du traitement défini dans la série A, dans des conditions rigoureusement équivalentes. Cette série "B" correspond aux animaux malades (gliotoxine +) constituant un contrôle positif non-traité. Une trentaine (ou plus) de ces animaux reçoivent au jour 0, une injection placebo de facteur gliotoxique (tampon d'injection avec de la sérum-albumine), mais reçoivent le protocole thérapeutique actif défini dans la série A. Cette série "C" correspond aux animaux sains (gliotoxine -) constituant un contrôle négatif traité qui permet d'évaluer les effets éventuellement liés au traitement actif, en dehors de l'effet du facteur gliotoxique. L'efficacité thérapeutique est évaluée en sacrifiant des animaux des séries A, B et C, au jour 10, à un mois, trois mois, six mois, voire un an si nécessaire, après l'injection du facteur gliotoxique ou de son placebo, selon le protocole décrit l'Exemple 1. Les cerveaux des animaux sont étudiés selon les descriptions techniques de l'Exemple 1. Les critères suivants sont notamment retenus pour la comparaison entre les animaux des séries A, B et C: Aspects généraux - état général - perte de poids - modifications comportementales. Histopathologie cérébrale (à distance du point d'injection): - anomalies morphologiques et histologiques des astrocytes (tels que décrites dans les exemples précédents) - fragmentation de 1'ADN (technique TUNEL positive) dans des cellules astrocytaires principalement, mais éventuellement et notamment épendymaires ou endothéliales - ouverture de la BHE visualisée par au moins une zone de diffusion intra-parenchymateuse d'immunoglobulines sériques - activation macrophagique des cellules microgliales; - anomalies morphologiques et histologiques des structures myéliniques et/ou des oligodendrocytes - présence ou absence d'infiltrats lymphocytaires, notamment péri-vasculaires. L'efficacité thérapeutique est démontrée si une différence significative (reproductible sur un nombre d'animaux statistiquement analysable) existe entre la fréquence, l'intensité, la surface, la sommation, des anomalies sus-décrites observées chez les animaux de la série A (gliotoxine +/traitement actif) et ceux de la série B (gliotoxine +/traitement placebo). L'efficacité thérapeutique est d'autant meilleure que la différence entre les observations rapportées dans la série A et celles rapportées dans la série C, devient non-significative selon les mêmes critères que précédemment. Cette efficacité peut être ainsi évaluée selon les différents protocoles d'application des traitements (séries "A" avec variantes) et l'efficacité à terme, en fonction du temps écoulé après injection du facteur gliotoxique, est évaluée en sacrifiant des animaux de chaque série à des temps croissants comme mentionné cidessus. EXEMPLE 5 : OBTENTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES ANTI-FACTEUR GLIOTOXIQUE ET/OU DIRIGES CONTRE DES NOLECULES INDUITES OU MODIFIEES PAR LES EFFETS DU FACTEUR GLIOTOXIQUE Injection de facteur gliotoxique (intracérébrale, intrapéritonéale, ou IP, intraveineuse, ou IV, intramusculaire, ou IM, ou intradermique, ou ID) à une série d'animaux selon Exemple 1. Rappels par injections IP, IV, ID ou IM après un mois, deux mois, trois mois, voire plus. Prélèvement de la rate (organe) de l'animal après un mois, deux mois, trois mois, quatre mois, voire plus. Vérification des atteintes neuropathologiques selon l'Exemple 1. Conservation de coupes de cerveau fixées pour l'étude des anticorps produits. Extraction des lymphocytes de la rate et reprise dans milieu de culture en vue de fusion avec cellules transformées adéquates pour l'obtention d'hybridomes sécréteurs d'immunoglobulines. Sélection des clones fusionnés viables. Screening des spécificités des anticorps produits par les hybridomes Gliotoxine 1- test d'inhibition d'activité: Les suspensions d'anticorps produits par les différents clones sont ajoutées dans des puits de cultures contenant une solution de facteur gliotoxique tel que défini pour le bio-essai décrit dans la demande de brevet PCT/FR95/00178. Des suspensions d'anticorps contrôles d'animaux injectés avec un placebo de gliotoxine sont ajoutées à des puits témoins. L'activité gliotoxique est mesurée dans chaque puits conformément à la description de la demande de brevet précitée. Toute différence significative obtenue avec une suspension d'anticorps montrant une activité gliotoxique inférieure à la valeur témoin "plancher" (moyenne des puits avec anticorps témoins moins trois écart-types), montre une activité anti-gliotoxine inhibitrice. Ces anticorps inhibiteurs ont un intérêt pour la détection du facteur gliotoxique (ELISA, etc...), mais aussi pour la thérapeutique anti-gliotoxine (éventuellement, après humanisation des anticorps en substituant la partie constante de l'anticorps avec une chaîne d'Ig humaine et en conservant la partie variable de l'anticorps animal). 2- Test sérologique Une fraction de gliotoxine est exposée aux différentes suspensions d'anticorps selon une technique sérologique adaptée et les anticorps spécifiques sont révélés par une réaction positive. Alternativement, une source de gliotoxine recombinante ou des peptides synthétiques dérivés de sa séquence peuvent être utilisés pour ce screening. Les clones d'hybridome intéressants sont cultivés ultérieurement pour produire des anticorps monoclonaux. Antigènes tissulaires Les tests sérologiques peuvent être appliqués à des antigènes extraits des tissus des animaux malades et comparés avec des tissus équivalents d'animaux témoins pour identifier des molécules induites ou modifiées par l'effet du facteur gliotoxique. Ces anticorps peuvent avoir un intérêt diagnostique, voire thérapeutique. REFERENCES Barna B.P., Estes M.L., Jacobs B.S., Hudson S. (1990) Humain astrocytes proliferate in response to tumor necrosis facteor alpha J. Neuroimmunol. 30, 239-243. Chung I.Y. et E.N. Benveniste (1990) Tumor necrosis factor-alpha production by astrocytes, Induction by lipopolysaccharide, IFN-gamma and IL-lbeta. J. Immunol, Vol 144 n08 pp 2999-3007. Compston D.A.S., Morgan, B.P., Campbell, A.K., Wilkins, P, Gole, G., Thomas, N.D. et Jasani B. (1989) Immunocytochemical localization of the terminal complement complex in multiple sclerosis. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15, 307-316. Deguchi Y., Shibata, N., et Kishimoto, S. 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Animal mammifère, non humain, modifié sans affecter son génome, caractérisé en ce que les cellules gliales et les cellules endothéliales du système nerveux central de l'animal sont lésées, en particulier l'ADN des cellules gliales de type astrocytaire est au moins partiellement fragmenté. 4. Animal mammifère, non humain, modifié sans affecter son génome, caractérisé en ce qu'il possède au moins deux quelconques des signes pathologiques suivants une barrière hématoencéphalique ouverte ou perméable aux molécules hydrosolubles du sang non spécifiques du parenchyme cérébral ; des plaques de démyélinisation, notamment présentes dans le tronc cérébral et/ou la substance blanche cérébelleuse ; des lésions des cellules gliales et des cellules endothéliales du système nerveux central, en particulier une modification de la morphologie et/ou une fragmentation au moins partielle de l'ADN des cellules gliales de type astrocytaire. 5. Animal mammifère, non humain, modifié sans affecter son génome, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par inoculation du facteur gliotoxique tel qu'obtenu dans un liquide biologique de patients atteints de sclérose en plaques. 6. Animal selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il appartient à la famille des muridés, en particulier l'animal est un rat. 7. Procédé d'obtention d'un animal selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes consistant à - disposer d'une quantité infectante de facteur gliotoxique, tel qu'obtenu à partir d'un liquide biologique d'un patient atteint de sclérose en plaques, - inoculer ladite quantité infectante à 1 'animal. 8. Utilisation d'un animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour mesurer l'efficacité thérapeutique d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, anti-inflammatoire. 9. Utilisation d'un animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour mesurer l'efficacité thérapeutique d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, destiné au traitement de la sclérose en plaques. 10. Utilisation d'un animal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour déterminer la nocuité ou l'innocuité d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, sur le cerveau pathologique de l'animal. 11. Procédé pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, anti-inflammatoire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à - disposer d'un animal tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, - administrer ledit procédé thérapeutique notamment agent médicamenteux à l'animal, - mesurer l'efficacité du procédé thérapeutique en observant la réduction ou l'absence du ou des signes pathologiques définis dans les revendications 1 à 4, par rapport à un animal témoin malade ayant reçu du facteur gliotoxique, mais n'ayant pas reçu le procédé thérapeutique, et en référence à un témoin normal traité par ledit procédé thérapeutique mais n'ayant pas reçu de facteur gliotoxique. 12. Procédé pour mesurer l'efficacité d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, destiné au traitement de la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à - disposer d'un animal tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, - administrer ledit procédé thérapeutique à 1 'animal, - mesurer l'efficacité du procédé thérapeutique en observant la réduction ou l'absence du ou des signes pathologiques définis dans les revendications 1 à 4, par rapport à un animal témoin malade ayant reçu du facteur gliotoxique, mais n'ayant pas reçu le procédé thérapeutique, et en référence à un témoin normal traité par ledit procédé thérapeutique mais n'ayant pas reçu de facteur gliotoxique. 13. Procédé pour déterminer la nocuité ou l'innocuité d'un procédé thérapeutique, notamment d'un agent médicamenteux, sur le cerveau pathologique d'un animal tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à - disposer dudit animal - administrer ledit procédé thérapeutique à 1 'animal, - mesurer la réponse du procédé thérapeutique par une observation histopathologique du ou des signes pathologiques définis dans les revendications 1 à 4. 14. Procédé de production d'anticorps monoclonaux dirigés contre le facteur gliotoxique et/ou contre des molécules induites ou modifiées par les effets du facteur gliotoxique, comprenant les étapes consistant à fusionner des lymphocytes B prélevés sur un animal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6, avec des cellules tumorales adaptées à l'obtention d'hybridomes, et à faire produire par l'hybridome issu sélectionné lesdits anticorps. 15. Anticorps monoclonal dirigé contre le facteur gliotoxique et/ou contre des molécules induites ou modifiées par les effets du facteur gliotoxique, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 14.