Brevet FR2735372A1 — publié le 19961220

NOUVELLES UTILISATIONS D'UN COURANT DE DIOXYDE DE CARBONE SUPERCRITIQUE A TITRE D'AGENT ANTIVIRAL L'invention concerne des nouvelles utilisations du dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique, dans le cadre du traitement d'un tissu à trame collagénique (c'est-à-dire d'un tissu osseux, tendineux, cartilagineux ou ligamenteux) d'origine humaine ou animale pour l'obtention d'un biomatériau implantable dans le corps humain ou animal destiné à être utilisé comme ou dans une prothèse de tissu de soutien (os, cartilage, tendon, ligament), c'est-à- dire incorporé dans une telle prothèse ou constituant une telle prothèse. Le dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique est connu en tant que tel, et pour diverses utilisations. On rappelle que les fluides à l'état supercritique peuvent être définis comme des gaz placés dans des conditions de température et de pression telles que leurs propriétés sont intermédiaires entre celles des gaz et celles des liquides. On les nomme encore "gaz denses" ou "liquides expansés". Pour un corps chimique donné, le point précis du diagramme température- pression pour lequel les deux phases liquide et vapeur n'en forment plus qu'une est appelé point critique. Au-delà de cette température critique (Tc) et de cette pression critique (Pc), le fluide est en l'état dit "supercritique". Les fluides à l'état supercritique sont connus pour leur grande aptitude à extraire les matières organiques, notamment lipidiques, des tissus. Ainsi, EP-A-0.603.920 décrit un procédé de traitement de tissus osseux dans lequel on fait pénétrer un fluide à l'état supercritique dans la totalité du tissu osseux, ce qui a pour effet d'en extraire les matières organiques essentiellement lipidiques et d'en renforcer la résistance mécanique. D'autres étapes du procédé sont prévues pour l'obtention du biomatériau implantable, à savoir des étapes préalables de nettoyage mécanique et découpe, et des étapes subséquentes de traitement chimique (par le peroxyde d'hydrogène) et/ou enzymatique (protéase) pour en extraire les protéines résiduelles, lavage, déshydratation et désinfection dans des bains d'éthanol (cette dernière étape permettant d'accroître la sécurité infectieuse du biomatériau compte tenu de ses propriétés virucides). En outre, les procédés utilisés jusqu'à maintenant pour limiter les risques de contamination virale des tissus osseux (tels que les os provenant des banques d'os) consistent soit à soumettre le tissu à un rayonnement gamma ou beta, soit à le stériliser à l'oxyde d'éthylène ou par traitement thermique. L'irradiation aux rayons gamma ou beta ne permet pas de détruire avec certitude tous les virus. En effet, certains virus sont radiorésistants. En outre, cette irradiation diminue, selon la dose de rayons appliquée, la résistance mécanique de l'os. La stérilisation à l'oxyde d'éthylène pose le problème de la toxicité de ce composé chimique, et du produit qu'il forme en présence d'eau (éthylène glycol). En outre, l'oxyde d'éthylène modifie la structure osseuse et affecte les propriétés d'ostéoinduction. La stérilisation à la chaleur détruit les propriétés mécaniques du collagène et donc des tissus osseux. Par ailleurs, la destruction mécanique de cellules microbiennes par une décompression brutale dans le dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique a déjà été décrite ("Disruption of Microbial Cells by the Flash Discharge of High-Pressure Carbon Dioxyde", Kozo Nakamura et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58(7), 1297-1301, 1994). Néanmoins, aucun document antérieur n'enseigne que le dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique pourrait, en lui-même, avoir un effet antiviral au sein d'un tissu à trame collagénique tel qu'un tissu osseux. Or, les inventeurs ont maintenant mis en évidence, de façon surprenante, la nouvelle fonction antivirale du dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique vis à vis de ces tissus. L'invention vise donc à proposer de nouvelles utilisations du dioxyde de carbone à l'état supercritique. L'invention vise également à proposer un procédé de traitement de tissus à trame collagénique, notamment de tissus osseux, dans lequel le dioxyde à l'état supercritique est utilisé dans sa fonction d'inactivation virale. L'invention vise en outre à proposer un nouveau procédé de traitement prophylactique antiviral des tissus à trame collagénique, et plus particulièrement des tissus osseux, d'origine humaine ou animale, pour l'obtention de biomatériaux implantables exempts de toute contamination virale et aptes à être utilisés comme prothèses de tissu de soutien ou dans des prothèses de tissu de soutien. En particulier, l'invention vise à proposer un procédé de traitement antiviral d'un tissu osseux (tel qu'un tissu osseux provenant d'une banque d'os), avant son implantation dans le corps humain ou animal lors d'une greffe (allogreffe ou xénogreffe) osseuse, procédé qui assure l'élimination de toute contamination virale éventuelle et préserve, voire renforce, les propriétés biomécaniques du tissu osseux (résistance, ostéoinduction...). L'invention concerne donc l'utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine (et séparé du corps humain ou animal) destiné à servir de biomatériau comme prothèse implantable de tissu de soutien ou dans une prothèse implantable de tissu de soutien, utilisation dans laquelle le dioxyde de carbone à l'état supercritique présente une fonction d'inactivation virale c'est-à- dire d'élimination de la contamination virale du tissu. L'invention concerne l'utilisation, à titre d'antiviral, du dioxyde de carbone à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique apte à supporter des conditions de pression et de température o le dioxyde de carbone est à l'état supercritique. Le tissu à trame collagénique est en phase solide, divisé (en poudre) ou non divisé (en morceaux ou blocs), et poreux. L'invention concerne aussi l'utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine destiné à être utilisé comme ou dans une prothèse implantable de tissu de soutien à titre de biomatériau, à raison de 100 à 500 -notamment de l'ordre de 300- grammes de dioxyde de carbone supercritique par gramme de tissu à trame collagénique à traiter. L'invention concerne aussi l'utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique dans laquelle on laisse ledit courant au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine destiné à servir de biomatériau implantable comme ou dans une prothèse de tissu de soutien, pendant une durée déterminée en fonction du débit dudit courant pour permettre le passage de 100 à 500 -notamment de l'ordre de 300- grammes de dioxyde de carbone supercritique par gramme de tissu. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'un courant de dioxyde de carbone CO2 supercritique comme indiquée ci-dessus, dans laquelle le dioxyde de carbone supercritique est placé à une pression comprise entre 1.107 et 5.107 Pa -notamment de l'ordre de 2,5.107 Pa- et à une température comprise entre 40 C et C, -notamment de l'ordre de 50 C-. Ainsi, l'invention concerne un procédé de traitement, dans un but de prophylaxie antivirale, d'un tissu à trame collagénique -notamment d'un tissu osseux- d'origine humaine ou animale destiné à servir de biomatériau comme ou dans une prothèse implantable de tissu de soutien (os, cartilage, tendon ou ligament), caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape au cours de laquelle on place le tissu à trame collagénique au contact d'un courant de dioxyde de carbone C02 à l'état supercritique qui présente une fonction d'élimination ou de prévention de la contamination virale au sein du tissu. Ainsi, l'invention concerne les applications du dioxyde de carbone C02 à l'état supercritique dans lesquelles il peut exercer une fonction d'agent antiviral, c'est-à-dire une fonction d'élimination de l'activité virale ou de prévention de l'activité virale au sein d'un tissu à trame collagénique d'origine humaine ou animale tel qu'un tissu osseux. Les inventeurs ont en effet démontré que lorsqu'un tissu à trame collagénique -notamment un tissu osseux- susceptible d'être contaminé par des virus est mis au contact d'un courant de dioxyde de carbone à l'état supercritique, ce fluide exerce la fonction de supprimer ou de prévenir l'activité virale. Le dioxyde de carbone à l'état supercritique permet donc de lutter contre les virus et procure un traitement préventif antiviral des tissus à trame collagénique d'origine humaine ou animale tels que les tissus osseux. Aucune explication théorique ne peut être donnée avec certitude à l'effet antiviral ou virucide du dioxyde de carbone à l'état supercritique dans les tissus à trame collagénique. Néanmoins, il est probable que la molécule du dioxyde de carbone, de nature organique, présente aux conditions supercritiques, d'une part la faculté de diffuser à travers la totalité de la matière poreuse du tissu à trame collagénique, et d'autre part une réactivité biochimique forte avec les molécules organiques des composés biochimiques nécessaires au développement et à l'activité des virus (enzymes, constituants protéiniques, capsides, acides nucléiques, enveloppes...). En outre, l'invention concerne aussi l'utilisation du dioxyde de carbone à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique comme indiqué ci-dessus conjointement et en combinaison avec au moins une autre étape choisie parmi les étapes suivantes: - mise en contact du tissu à trame collagénique avec une solution de peroxyde d'hydrogène H202 présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu, plus particulièrement une solution de H202 dont le titre massique est supérieur à 1 %, notamment de l'ordre de 35 %, et à une température comprise entre 30 C et 50 C, notamment de l'ordre de 40 C, - mise en contact du tissu à trame collagénique avec une solution d'hydroxyde de sodium NaOH présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu, notamment une solution dont le titre massique est compris entre 3 % et 15 % -notamment de l'ordre de 4 %- de NaOH, de préférence suivie d'un ou plusieurs rinçage(s) à l'eau et d'une neutralisation par passage dans une solution neutralisante, par exemple une solution de NaH2PO4, - mise en contact du tissu à trame collagénique avec une solution d'éthanol CH3CH2OH présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu, notamment successivement dans une solution d'éthanol dont le titre en volume est supérieur à 90 %, notamment de l'ordre de 95 %, puis dans une solution d'éthanol dont le titre en volume est supérieur à 95 %, notamment de l'ordre de 100 %. L'invention concerne aussi un procédé de traitement qui comprend au moins l'une des étapes mentionnées ci-dessus. Selon l'invention, on utilise une étape de traitement par un courant de dioxyde de carbone CO2 supercritique en premier lieu, c'est-à- dire avant d'effectuer les autres étapes sus-décrites au peroxyde d'hydrogène, et/ou à l'hydroxyde de sodium et/ou à l'éthanol. Avantageusement et selon l'invention, pour effectuer la mise en contact du tissu à trame collagénique avec les solutions sus-mentionnées, on plonge le tissu dans ladite solution. Avantageusement, on effectue successivement les étapes de: 5. traitement par le dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique, puis traitement au peroxyde d'hydrogène H202, puis traitement à l'hydroxyde de sodium NaOH, puis traitement à l'éthanol. La succession de ces étapes garantit en effet l'élimination de toute présence virale et de toute forme d'activité virale dans le tissu traité. L'invention est plus particulièrement applicable pour lutter contre les virus de la famille des Togaviridae, notamment du genre Alphavirus, tels que le virus de l'Hépatite C, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus; pour lutter contre les virus de la famille des Picorviridae, notamment du genre Enterovirus, plus particulièrement le virus Polio Sabin, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus; pour lutter contre les virus de la famille des Herpesviridae et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus; pour lutter contre les virus de la famille des Retroviridae, notamment du genre Lentivirus, plus particulièrement les virus de l'Immunodéficience humaine VIH, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus. Les exemples ci-après illustrent l'invention. PROTOCOLE EXPERIMENTAL: Dans les exemples, on teste la capacité de chaque étape du traitement à éliminer et/ou inactiver les virus: 1) en contaminant les échantillons avec une quantité significative de virus, puis 2) en effectuant l'étape de traitement considérée sur les échantillons, puis 3) en déterminant la quantité de virus éliminée et/ou inactivée durant cette étape. Les échantillons testés sont des quarts de tête de fémur d'origine humaine. Les expérimentations sont conduites par l'Institut Pasteur (PARIS, FRANCE) selon le protocole n 5151-A1, et conformément aux réglementations communautaires françaises, américaines et de l'O.C.D.E., des Bonnes Pratiques de Laboratoire. Pour chaque expérimentation (c'est-à-dire pour chaque étape testée et chaque virus), on réalise des contrôles positifs (stock de virus de même concentration que celle utilisée pour la contamination de l'échantillon, immédiatement congelé à -75 C; stock de virus de même concentration, ultracentrifugé, aliquoté et congelé à -75 C; stock de virus de même concentration, laissé à température ambiante pendant le temps de l'expérience, puis ultracentrifugé, aliquoté et congelé à -75 C; échantillon contaminé dans les mêmes conditions et dont l'activité virale est immédiatement testée; échantillon contaminé dans les mêmes conditions, non soumis à l'étape de traitement mais laissé sous hotte à température ambiante pendant la durée de l'étape de traitement, puis dont l'activité virale est testée) et des contrôles négatifs (milieu de culture utilisé pour les titrages; échantillon mis en présence de milieu de culture, puis soumis à l'étape de traitement, puis dont l'activité virale est testée). L'activité virale d'un échantillon osseux est testée par un protocole dont la fiabilité est préalablement vérifiée sur un échantillon de même nature que ceux utilisés dans l'étape de traitement à tester, et contaminé avec un virus de résistance moyenne aux traitements physico-chimiques (virus de la pseudorage porcine). Ce protocole est le suivant. Les quarts de tête de fémur sont morcelés et incubés dans le milieu de culture pendant une heure à 4 C. Un premier volume Vl de surnageant est récupéré. Les morceaux sont ensuite centrifugés à 400 g pendant 2 min, et on récupère un deuxième volume V2 de surnageant. Le mélange des deux volumes V1+V2 de surnageant est centrifugé à 1 550 g pendant 10 min pour éliminer les débris osseux, et le surnageant est ultracentrifugé, aliquoté et congelé à - 75 C. L'activité virale est titrée selon une procédure normalisée pour chaque virus, par dosage de l'activité transcriptase inverse (pour le virus VIH-1), ou par dénombrement des plages de lyse sur tapis cellulaire monocouche (pour les virus Sindbis, Polio Sabin 1, pseudorage porcine). Pour le titrage, on utilise des parties aliquotées décongelées extemporanément à 37 C et placées dans de la glace fondante. Un contrôle de cytotoxicité est effectué à chaque expérimentation. La limite de détection est déterminée par le plus faible titre théorique obtenu, ou selon la formule de Poisson si aucune production virale n'est observée. Tous les essais sont réalisés en double. Pour tester l'effet antiviral de l'étape n 1 de traitement par un courant de dioxyde de carbone à l'état supercritique, on procède de la façon suivante. On réalise des perçages de 4 mm de diamètre et de 1 à 1,5 cm de profondeur dans les blocs osseux que l'on lave dans deux bains successifs de 100 ml de milieu de culture à 1 %(v/v) de sérum de veau foetal pendant 10 min sous agitation douce. On sèche les blocs osseux en étuve pendant 2 ou 3 jours, puis on teste la capacité des perçages à retenir les liquides en y introduisant du milieu de culture. Si une fuite est observée après 1 à 2 min, soit le perçage est colmaté avec du ciment biologique (dont l'absence d'effet inactivant sur les virus a été préalablement vérifiée), soit l'échantillon est éliminé. Les échantillons retenus sont séchés pendant une durée complémentaire de 2 à 3 jours. Chaque échantillon est ensuite contaminé par introduction d'une suspension virale dans les perçages qui sont ensuite rebouches avec le ciment biologique. Les échantillons contaminés sont ensuite traités par un courant de dioxyde de carbone à l'état supercritique pendant une durée de 10 min par gramme de l'échantillon. Pour ce faire on utilise le procédé et le dispositif décrit dans EP-A-0.603.920. L'étape n 2 du traitement est un passage dans un bain de solution à 35 % (m/m) de peroxyde d'hydrogène H202 à 40 C dont la durée est déterminée par un test de flottaison (jusqu'à ce que l'échantillon de contrôle négatif coule). Pour tester l'effet antiviral de l'étape n 2, on utilise des quarts de tête de fémur ayant été préalablement traités au dioxyde de carbone supercritique (10 min par gramme d'échantillon) comme indiqué ci-dessus. Les échantillons sont lavés dans deux bains successifs de milieu de culture puis séchés 24 h avant d'être contaminés en ajoutant 1 ml de la suspension virale (ou du milieu de culture pour l'échantillon de contrôle négatif) goutte à goutte sur chacune des faces de l'échantillon. La pénétration de la suspension virale dans un échantillon est préalablement vérifiée avec un colorant. L'activité virale est mesurée avant et après le traitement au peroxyde d'hydrogène comme indiqué ci-dessus. L'étape n 3 du traitement est un passage dans un bain de solution de NaOH 1M à 20 C pendant 1 h, suivi d'un rinçage à l'eau et d'une neutralisation par passage dans un bain de NaH2PO4 (12 g/l) pendant 10 min. Pour tester l'effet antiviral de l'étape n 3, on utilise des quarts de tête de fémur ayant été préalablement traités successivement par le CO2 supercritique, puis par le peroxyde d'hydrogène H202 comme indiqué ci-dessus. Les échantillons sont ensuite contaminés comme indiqué ci- dessus pour l'étape n 2. L'activité virale est mesurée avant et après le traitement à l'hydroxyde de sodium comme indiqué ci-dessus. L'étape n 4 du traitement consiste en un passage dans un bain d'éthanol à 95 % (v/v) pendant 3 h à température ambiante, suivi d'un passage dans un bain d'éthanol à 100 % (v/v) pendant 2 h à température ambiante. Pour tester l'effet antiviral de l'étape n 4, on utilise des quarts de tête de fémur ayant été préalablement traités successivement par le C02 supercritique, le peroxyde d'hydrogène et l'hydroxyde de sodium comme indiqué ci-dessus. Les échantillons sont ensuite contaminés comme indiqué pour l'étape n 2 et l'activité virale est mesurée avant et après traitement par l'étape n 4 comme indiqué ci-dessus. A partir des résultats expérimentaux, on calcule, pour chaque étape de traitement, le facteur de réduction représenté par le logarithme en base 10 du rapport entre la quantité totale de virus contaminant l'échantillon avant l'étape de traitement et la quantité totale de virus contaminant l'échantillon après l'étape de traitement. Le facteur de réduction de l'étape de traitement est la somme du logarithme en base 10 du rapport de la charge virale totale dans le milieu de culture sur la charge virale totale dans l'échantillon avant l'étape de traitement (si ce logarithme est supérieur à 1), et du logarithme en base 10 du rapport de la charge virale totale dans l'échantillon avant l'étape de traitement sur la charge virale totale dans l'échantillon après l'étape de traitement. Un traitement est inactivant sur un virus à partir d'un facteur de réduction de 4, et totalement inactivant si le facteur de réduction est supérieur à 6. Chaque essai est considéré comme valide lorsque le titre viral attendu est obtenu avec le contrôle positif (stock de virus de même concentration immédiatement congelé), et si aucune plage ou aucune production virale n'est obtenue avec les contrôles négatifs. EXEMPLE 1 L'effet du traitement antiviral selon l'invention est testé sur le virus du SIDA HIV-1, qui est un rétrovirus à ARN enveloppé de la famille des Retrovividae, sous-famille des Lentivirinae, genre Lentivirus, sphérique de 80 à 130 nm, dont le génome est constitué de deux molécules d'ARN simple brin identiques de 9,2 kb. Ce virus est faiblement résistant aux traitements physico- chimiques. Il est obtenu à partir de surnageants de culture de cellules humaines infectées. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1 suivant: TABLEAU 1 Etape n l Etape n 2 Etape n 3 Etape n 4 Total Teneur en virus introduite 4,56 107 3,03 106 2,24 107 1,59 107 Charge virale avant traitement 3,92 105 9,06 103 1,84 104 7,5 105 Charge virale après traitement Facteur de réduction > 4,12 > 1,28 > 2,19 > 4,37 > 11, 96 Dans tous les cas la limite de détection après traitement n'est pas atteinte, aucun virus n'ayant pu être récupéré. En conséquence les facteurs de réduction sont des valeurs minimales. Les vraies valeurs peuvent être largement supérieures. Bien qu'aucun virus n'ait été détecté après traitement, les facteurs de réduction obtenus aux étapes n 2 et 3 sont relativement faibles du fait de la faible charge virale avant traitement liée à un effet inactivant de l'os lui-même. Comme on le voit, l'effet d'inactivation virale de l'étape n 1 est démontré. On constate ainsi que l'effet du dioxyde de carbone supercritique est équivalent à celui de l'éthanol. En outre, le procédé complet (étapes 1 à 4) a un facteur de réduction supérieur à 11,96, et est donc totalement inactivant vis-à-vis du virus. EXEMPLE 2 L'effet du traitement antiviral de l'invention est testé sur le virus Sindbis, qui est un togavirus à ARN enveloppé. Ce virus est considéré comme un modèle pour celui de l'Hépatite C qui est, après le SIDA, la deuxième maladie infectieuse la plus menaçante pour la santé publique dans le cadre des risques liés aux greffes de tissus. Ce virus appartient à la famille des Togaviridae, genre Alphavirus. C'est un virus enveloppé, sphérique de 60 à 70 nm de diamètre. Son génome est constitué d'une molécule d'ARN simple brin de 12 kb. Il est faiblement résistant aux traitements physico-chimiques. Il est obtenu à partir de surnageants de culture de cellules rénales de singe infectées. Le tableau 2 suivant donne les résultats obtenus. TABLEAU 2 Etape n l Etape n 2 Etape n03 Etape n 4 Total Teneur en virus introduite 1,75 107 6,05 106 9,47 106 1,09 107 Charge virale avant traitement 2,24 105 2,93 106 4,17 105 3,81 106 Charge virale après traitement Facteur de réduction > 4,34 > 5,52 4,17 5,08 > 19, 11 Dans les étapes n 1 et n 2, la limite de détection après traitement n'est pas atteinte, aucun virus n'ayant pu être récupéré. En conséquence les facteurs de réduction sont des valeurs minimales. Les vraies valeurs peuvent être largement supérieures. On constate aussi que le procédé complet (étapes 1 à 4) a un facteur de réduction supérieur à 19,11, et est donc totalement inactivant vis-à- vis du virus. EXEMPLE 3 L'effet du traitement antiviral de l'invention a été testé sur le virus Polio Sabin 1, qui est un picornavirus à ARN non-enveloppé. Comme tous les virus non-enveloppés, il est plus résistant vis-à-vis des traitements physico-chimiques que les virus enveloppés. Ce virus appartient à la famille des Picornaviridae, genre Enterovirus. C'est un virus non-enveloppé, de symétrie icosaédrique de 28 à 30 nm de diamètre. Son génome est constitué d'une molécule d'ARN simple brin de polarité positive de 7,4 kb. Sa résistance aux traitements physico- chimiques est moyenne à forte. Il est obtenu à partir de surnageants de culture de cellules humaines infectées. Le tableau 3 suivant donne les résultats obtenus. TABLEAU 3 Etape nl| Etape n02 Etape n03 Etape n04 Total Teneur en virus introduite 1,00 108 7,01 10 7,20 10 5,41 107 Charge virale avant traitement 6,90 107 2,21 108 5,65 107 6,66 107 Charge virale après traitement Facteur de réduction > 6,60 > 7,14 4,46 > 6,61 > 24, 81 Dans les cas oû le chiffre de la charge virale après traitement est précédé du signe EXEMPLE 4 L'effet du traitement antiviral de l'invention est testé sur le virus de la pseudorage porcine, qui est un herpèsvirus à ADN enveloppé. Ce virus appartient à la famille des Herpesviridae, sous-famille des alphaherpesvirinae, genre Varicellavirus. C'est un virus enveloppé, de symétrie icosaédrique dont la taille varie de 100 à 200 nm. Son génome est constitué d'une molécule d'ADN double brin linéaire de 150 à 200 kb. Il a une résistance moyenne aux traitements physico-chimiques. Il est obtenu à partir de surnageants de culture de fibroblastes d'embryons de lapin infectés. Le tableau 4 suivant donne les résultats obtenus. TABLEAU 4 Etape n'l Etape n02 Etape n03 Etape n04 Total Teneur en virus introduite 1,04 07 5,65 106 1,01 107 1,02 107 Charge virale avant traitement 1,36 105 8,40 105 3,76 105 1,5 105 Charge virale après traitement Facteur de réduction > 4,03 > 5,00 > 4,66 > 4,22 > 17, 91 Dans tous les cas la limite de détection après traitement n'est pas atteinte, aucun virus n'ayant pu être récupéré. En conséquence, les facteurs de réduction sont des valeurs minimales. Les vraies valeurs peuvent être largement supérieures. Là encore, le traitement au dioxyde de carbone supercritique inactive ce virus et le procédé complet a un facteur de réduction (supérieur à 17,91) qui assure l'élimination de toute contamination virale. Les exemples 1 à 4 ci-dessus démontrent l'effet antiviral du traitement au dioxyde de carbone supercritique et des étapes n 1 à 4 successives sur des virus de référence variés (virus à ARN ou à ADN, enveloppés ou non, résistants ou non aux traitements physico- chimiques...), dans des conditions normalisées et donc l'efficacité del'invention à titre d'antiviral. En effet, les virus testés sont choisis en conformité avec la réglementation européenne sur les validations virales (Guideline III/8115/89) et sur les dérivés du sang (Guideline III/83179/89). REVENDICATIONS 1/ - Utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine destiné à être utilisé comme ou dans une prothèse implantable de tissu de soutien à titre de biomatériau, dans laquelle le dioxyde de carbone à l'état supercritique présente une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu.10 2/ - Utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine destiné à être utilisé comme ou dans une prothèse implantable de tissu de soutien à titre de biomatériau, à raison de 100 à 500 -notamment de l'ordre de 300- grammes de dioxyde de carbone supercritique par gramme de tissu. 3/ - Utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique dans laquelle on laisse ledit courant au contact d'un tissu à trame collagénique d'origine animale ou humaine destiné à être utilisé à titre de biomatériau implantable comme ou dans une prothèse de tissu de soutien, pendant une durée déterminée en fonction du débit dudit courant pour permettre le passage de 100 à 500 -notamment de l'ordre de 300- grammes de dioxyde de carbone supercritique par gramme de tissu. 4/ - Utilisation d'un courant de dioxyde de carbone CO2 supercritique selon l'une des revendications 2 et 3, dans laquelle le dioxyde de carbone CO2 supercritique est placé à une pression comprise entre 1.107 et 5.107 Pa - notamment de l'ordre de 2,5.107 Pa- et à une température comprise entre 40 C et 55 C, -notamment de l'ordre de 50 C-. 5/ - Utilisation dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique, selon l'une des revendications 2 à 4, et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution de peroxyde d'hydrogène H202 présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu. 6/ - Utilisation, selon la revendication 5, dans un but de prophylaxie virale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution de peroxyde d'hydrogène H202 dont le titre massique est supérieur à 1 %, notamment de l'ordre de 35 %. 7/ - Utilisation, selon l'une des revendications 5 et 6, dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution de peroxyde d'hydrogène à une température comprise entre 30 C et 50 C, notamment de l'ordre de 40 C. 8/ - Utilisation, selon l'une des revendications 2 à 7, dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution d'hydroxyde de sodium NaOH présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu. 9/ - Utilisation, selon la revendication 8, d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution d'hydroxyde de sodium NaOH dont le titre massique est compris entre 3 % et 15 %, -notamment de l'ordre de 4 %-. / - Utilisation, selon l'une des revendications 8 et 9, dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution d'hydroxyde de sodium, puis on rince le tissu à l'eau, puis on le plonge dans une solution neutralisante. 11/ - Utilisation, selon l'une des revendications 2 à 10, dans un but de prophylaxie antivirale d'un courant de dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique et d'au moins une étape au cours de laquelle on met le tissu à trame collagénique en contact avec une solution d'éthanol présentant une fonction d'élimination de la contamination virale du tissu. 12/ - Utilisation, selon la revendication 11, dans laquelle on plonge une première fois le tissu dans une solution d'éthanol dont le titre en volume est supérieur à 90 %, notamment de l'ordre de 95 %, et en ce qu'on plonge ensuite une deuxième fois le tissu dans une solution d'éthanol dont le titre en volume est supérieur à 95 %, notamment de l'ordre de 100 %. 13/ - Utilisation, selon l'une des revendications 5 à 12, dans laquelle on utilise le traitement par courant de dioxyde de carbone CO2 supercritique en premier lieu. 14/ - Utilisation, dans un but de prophylaxie antivirale, d'un courant de dioxyde de carbone C02 à l'état supercritique selon l'une des revendications 2 à 4, d'au moins une étape selon l'une des revendications 5 à 7, d'au moins une étape selon l'une des revendications 8 à 10 et d'au moins une étape selon l'une des revendications 11 et 12, dans laquelle on effectue successivement le traitement par le dioxyde de carbone CO2 à l'état supercritique, puis le traitement au peroxyde d'hydrogène H202, puis le traitement à l'hydroxyde de sodium NaOH, puis le traitement à l'éthanol. 15/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, dans le but de lutter contre les virus de la famille des Togaviridae, notamment du genre Alphavirus, et de prévenir leur transmission lors des greffes de tissus. 16/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, dans le but de lutter contre les virus de la famille des Picorviridae, notamment du genre Enterovirus, plus particulièrement le virus Polio Sabin, et de prévenir leur transmission lors des greffes de tissus. 17/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, dans le but de lutter contre les virus de la famille des Herpesviridae, et de prévenir leur transmission lors des greffes de tissus. 18/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, dans le but de lutter contre les virus de la famille des Retroviridae, notamment du genre Lentivirus, plus particulièrement les virus de l'Immunodéficience humaine VIH, et de prévenir leur transmission lors des greffes de tissus.