Brevet FR2739560A1 — publié le 19970411

La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus VIH. Deux types de récepteurs Fc-gamma III humains ou CD16, respectivement RFcyIII-1 (désigné aussi RFcyIIIB) et RFcyIII-2 (désigné aussi RFcyIIIA) qui possèdent des structures et des expressions cellulaires différentes, ont été décrits (J. V. Ravetch et al., J. Exp. Med., 170, 481, 1989). RFcyIII-1 est un récepteur à une seule chaine lié à la surface de la membrane cellulaire par un résidu glycosylphosphatidylinositol (GPI) et exprimé exclusivement par les neutrophiles qui représentent le type cellulaire le plus abondant du système immunitaire. RFcyIII-1 fixe les IgG1 et les IgG3 complexées, mais pas les IgG2 et les IgG4 (T. W. J. Huizinga et al., J. Immunol., 142, 2359, 1989). Deux allèles du gène codant pour le RFcyIII-1, appelés respectivement NA1 et NA2, ont été clonés (P. A. Ory et al., J. Clin. Invest., 84, 1688, 1989). RFcyIII-2 est un récepteur membranaire exprimé sur les cellules dites natural killer (NK), les macrophages et les monocytes en culture (J. C. Edberg et al., J. Immunol., 144, 4729, 1990). Les récepteurs Fc-gamma jouent un rôle important dans la régulation de réactions du système immunitaire (W. H. Fridman et al., Immunol. Rev., 125, 49, 1992). Une des propriétés des récepteurs Fc-gamma repose sur l'existence de formes solubles qui lient les IgG complexées. Il a été montré que les récepteurs Fc-gamma peuvent être libérés in vitro dans des surnageants de cultures de cellules T et conserver leur affinité spécifique pour le fragment Fc des IgG. Ces récepteurs solubles ont été appelés IgGBF (Immunoglobulin G Binding Factor) (W. H. Fridman et al., Cell. Immunol., 11, 442, 1974). Ces formes solubles circulent également dans les liquides biologiques humains. Ainsi des formes solubles de RFcyIII (RFcyIIIs), que l'on nomme aussi CD16 soluble (CD16s), sont elles détectées dans des surnageants de cultures de cellules du sang périphérique (W. H. Fridman et al., Immunol. Rev., 56, 51, 1981) et dans du sérum humain (T. W. J. Huizinga et al., J. Clin. Invest., 86, 416, 1990) ou dans la salive (C. Teillaud et al., Journal de Parodontologie, Vol 12, N01, 1, 1992). Chez des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humain (VIH), D. Kayat et al., J. Inf. Dis., 161, 430, 1990, ont montré une corrélation entre le taux de CD16s dans le sérum et le taux des paramètres biologiques les plus importants de la maladie (diminution des lymphocytes CD4+, augmentation de l'antigène p24 ainsi qu'avec le stade clinique de l'infection. Les CD16s ou RFcyIIIs sont produits par protéolyse des deux domaines extracellulaires des récepteurs membranaires (T. W. J. Huizinga et al., 1990, déjà cité). La préparation d'une forme soluble de RFcyIII recombinant humain constituée d'une chaine polypeptidique de 188 acides aminés a été décrite dans la demande de brevet européenne EP-A-0343950 ainsi que son utilisation dans le traitement du purpura thrombocytopénique immun. D'autre part, C. Teillaud et al., Blood, 82, 3081-3090, 1993, a décrit un CD16s recombinant humain ayant 194 acides aminés qui contient les deux domaines extracellulaires du RFcyIII exprimé par les neutrophiles. Ce récepteur a une activité immunosuppressive et se lie aux IgG humaines ainsi qu'à une fraction des cellules mononuclées du sang périphérique contenant des monocytes ainsi qu'un faible pourcentage de cellules T et NK et de lymphocytes B. L'activité du CD16s peut être déterminée selon les méthodes connues telle que le test de spécificité isotypique de la fixation des IgG décrit par Teillaud et al., 1993 (déjà cité) ou l'inhibition de la formation de rosettes entre des érythrocytes couverts d'IgG et des cellules exprimant des récepteurs RFcyIII selon la méthode décrite par W. H. Fridman et al., Meth. Enzymol., Vol. 116, 403, 1986. Les propriétés biologiques immunosuppressives décrites pour les CD16s permettent leur utilisation dans le domaine des maladies autoimmunes, des rejets de greffe et des lymphoproliférations malignes. Les inventeurs viennent de mettre en évidence de nouvelles propriétés biologiques du CD16s humain comprenant la fixation cellulaire au récepteur du fragment du complément C3bi ou CR3, désigné aussi CDllb/CD18, ainsi que l'inhibition de l'infection des monocytes par du virus VIH opsonisé, c'est-à-dire recouvert de complément, ainsi que par du virus VIH opsonisé par le complément et des anticorps anti-VIH. Une illustration de ces propriétés est donnée plus loin dans la partie expérimentale. En l'absence d'un traitement anti-viral capable d'éradiquer le VIH chez les personnes infectées, les stratégies thérapeutiques actuelles s'orientent vers des combinaisons de plusieurs traitements. Ces combinaisons cherchent à utiliser des médicaments agissant à différentes phases du cycle de l'infection virale : pénétration dans la cellule cible ; transcription inverse de l'ARN viral en ADN ; intégration de 1'ADN viral dans le génome de l'hôte ; transcription de l'ADN viral ; synthèse de nouvelles particules virales. L'obtention de nouveaux médicaments contribuant à ces approches thérapeutiques dans le domaine du SIDA est particulièrement recherchée, notamment l'approche thérapeutique au niveau de la pénétration du virus VIH. De nombreux travaux portant sur l'étude de la pénétration du virus VIH dans les cellules cibles n'ont pas abouti à définir des médicaments efficaces à ce niveau. Par exemple, D. Klatzmann et al., Science, 225, 59, 1984 ont montré le rôle du récepteur CD4 dans la pénétration du VIH in vitro et in vivo. Mais le blocage du récepteur CD4 par des anticorps dirigés contre le site de fixation du virus sur cette molécule ne prévient pas l'infection des cellules cibles exprimant le CD4 par le virus opsonisé par le complément seul ou par le complément et des anticorps anti-VIH. En raison de sa capacité inattendue à bloquer l'infection de monocytes humains par le virus VIH opsonisé, le CD16s peut donc être utilisé comme médicament, notamment comme agent de prévention de la pénétration du virus HIV dans les cellules cibles chez l'individu sain ou comme agent de diminution de la charge virale chez l'individu infecté par le virus VIH. L'invention concerne donc l'utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble pour préparer une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou la diminution de l'infection par le virus VIH chez l'homme. On entend par polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble un CD16s naturel, un CD16s obtenu par synthèse chimique ou un CD16s recombinant qui inhibe l'infection de cellules monocytaires par le VIH opsonisé. Des exemples d'inhibition de l'infection par un CD16s sont décrits plus loin dans la partie expérimentale utilisant un test in vitro dans lequel des cellules monocytaires THP1 sont infectées par le virus VIH-1 opsonisé. L'infection par le virus est mesurée par détection de l'antigène p24 à l'aide d'un test ELISA. Par prévention, on entend l'utilisation chez des individus sains exposés au virus VIH. L'utilisation selon l'invention permet notamment de diminuer la charge virale chez l'individu déjà infecté par le virus. L'invention a pour objet notamment l'utilisation caractérisée en ce que le polypeptide est un CD16 soluble recombinant, c'est-à-dire un CD16s ou RFcyIIIs obtenu par la technologie de l'ADN recombinant. Un exemple de préparation d'un récepteur RFcyIIIs recombinant et d'un variant de celuici sont décrits respectivement à l'exemple III et à l'exemple IV de la demande de brevet européenne EP 0343950. L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation caractérisée en ce que le CD16 soluble recombinant est un récepteur RFcyIII humain soluble ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N01 montrée à la figure 1. Le CD16 soluble recombinant peut être produit dans des cellules procaryotes, par exemple E. coli ou dans des cellules eucaryotes, par exemple une levure ou des cellules de mammifères telles que les cellules L, des cellules CHO, des cellules BHK ou des cellules COS. Un exemple de préparation d'un récepteur RFcyIIIs ayant la séquence en acides aminés de la figure 1 exprimé dans des cellules L est décrit à l'exemple 1 et 2 de la demande de brevet européenne EP 0614978. L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation pour réduire la pénétration ou l'infection des cellules cibles par le virus VIH-1. Les cellules cibles comprennent les cellules monocytaires ainsi que des cellules apparentées telles que par exemple les cellules de la microglie, les cellules dendritiques et les cellules de Langerhans de la peau. Les compositions pharmaceutiques de l'invention destinées à titre de médicament à de telles utilisations thérapeutiques sont préparées selon les méthodes usuelles et comprennent comme principe actif un CD16s et un excipient pharmaceutique inerte. Ces compositions peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes galéniques couramment utilisées, par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les capsules, les granules, les suppositoires, les ovules, les préparations injectables. Le principe actif peut être aussi incorporé dans des microsphères ou des liposomes. Dans le cas de formes galéniques habituelles propres à assurer au mieux un traitement préventif, on peut citer les crèmes, pommades, gels, lotions, poudres, émulsions, aérosols.Parmi celles-ci, les aérosols génitaux, les aérosols oraux, les gels vaginaux avec applicateur sont tout particulièrement recommandés. La dose dans ces compositions peut dépendre de la forme utilisée. Elle sera notamment comprise entre 0,01 et 1 % de principe actif. Les compositions pharmaceutiques permettent d'administrer une dose quotidienne de CD16s qui peut varier de 0,5 à 10 mg/kg selon la voie d'administration et le sujet à traiter. L'administration peut être faite, par exemple, par voie parentérale, orale, rectale, nasale, vaginale ou locale. Le CD16s peut être utilisé selon l'invention seul ou en mélange ou en association avec d'autres médicaments indiqués pour traiter l'infection par le virus VIH et qui agissent à la même phase de l'infection virale, par exemple le CD4 soluble, ou à des phases ultérieures du cycle de l'infection VIH tels que les médicaments inhibant la réplication virale, par exemple un médicament antirétroviral nucléosidique tel que la zidovudine (AZT), la didanosine (ddî) ou la zalcitabine (ddC) ou par exemple l'interféron alpha, qui peuvent être utilisés seuls ou en association ainsi que des médica ments visant à renforcer les défenses naturelles et spécifiques de l'hôte contre le virus, par exemple une cytokine telle que l'interleukine-2 ou un interféron. Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention La figure 1 représente la séquence en acides aminés (SEQ. ID NO 1) du récepteur RFCyIII soluble humain décrit dans la demande de brevet EP 0614978. La figure 2 représente l'analyse par FACS de la fixation du CD16 soluble (sCD16) aux monocytes de la lignée THP1 sans préincubation (2b) ou avec préincubation avec un anticorps anti-CR3 (2c) ou un anticorps anti-CD54 (2d) comparativement aux cellules-contrôles THP1 (2a). La figure 3 représente la cinétique de production d'antigène p24 par des monocytes humains soit directement infectés par VIH-1 (souche HTLV-III-B) opsonisé (VO), soit prétraités avant l'infection avec deux anticorps monoclonaux anti-CR3 (VO + anti-CR3) ou avec du CD16 soluble (VO + CD16S), la production étant mesurée à J3, J6, J9 et J12 après l'infection virale comparativement à une infection directe par du virus non opsonisé (V). La figure 4 représente la production d'antigène p24 à J10 par des monocytes humains soit directement infectés par VIH-1 opsonisé (VO) ou par VIH-1 opsonisé et recouvert d'anticorps anti-VIH (VO+anti-VIH), soit prétraités avant l'infection avec l'un ou plusieurs des agents suivants anticorps anti-CR3 (anti-CR3), anticorps contrôle (Ac Ctl), CD16 soluble (CD16S) ou CD16 soluble dénaturé (CD16SD). Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Exemple 1 : Capacité du CD16s à se fixer au récepteur CR3 (CDllb/CD18) La propriété du CD16s à utiliser comme récepteur cellulaire le récepteur du fragment du complément C3bi ou CR3 (CDllb/CD18) est mise en évidence par des expériences d'inhibition à l'aide de la technologie de l'analyse cytofluorimétrique. La fixation du CD16s aux cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) a été décrite par Teillaud et al., Blood, 82, 1993, 3081-3090, par incubation des cellules avec le CD16s couplé à la biotine puis avec le conjugat streptavidine-phycoerythrinine (SAPE) et par détection par analyse FACS. Le test d'inhibition de la fixation du CD16s aux PBMC ou à la lignée monocytaire THP1 a été réalisé de la façon suivante : 106 cellules de THP1 (ATCC TIB 202) préparées selon les méthodes usuelles sont incubées dans du PBS à 0,5 % BSA pendant 30 minutes à 40C avec 25 Zg/ml de CD16s recombinant préparé selon l'exemple 1 de la demande de brevet européen EP 0614978, dans des cellules BHK au lieu de cellules L, puis couplé à la biotine. Les cellules sont ensuite lavées puis incubées pendant 30 mn à 40C avec le conjugat SAPE (6 Ag/ml). Après trois lavages, 5000 cellules viables sont analysées sur un FACScan (Becton Dickinson) par rapport aux cellules-contrôles.Dans les expériences d'inhibition de la fixation, les cellules THP1 sont préincubées pendant 30 mn à 40C avec différents anticorps monoclonaux (10 Ag/ml), lavées puis incubées avec le CD16s couplé à la biotine puis avec le SAPE, comme indiqué ci-dessus. La figure 2 montre les résultats obtenus exprimés en moyenne d'intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules. L'intensité de la fluorescence à la figure 2b montre que CD16s se fixe sur les cellules cibles comparativement à l'intensité de la fluorescence contrôle (figure 2a). Lorsque les cellules sont préalablement pré incubées avec l'anticorps monoclonal anti-CR3 (OKM1 ; Orthodiagnotics), l'intensité moyenne de fluorescence est inhibée (figure 2c) alors que l'anticorps monoclonal contrôle anti-CD54 (LB-2 ; Becton Dickinson) n'a pas d'effet sur la fixation du CD16s (figure 2d). Les résultats obtenus indiquent que le CD16s se fixe sur les monocytes humains de façon inattendue en utilisant le récepteur CR3(CDllb/CD18). Exemple 2 : Capacité du CD16s à inhiber la libération de l'antigène p24 du virus VIH par les monocytes humains infectés. 1) Infection par le virus VIH opsonisé. La production de l'antigène p24, marqueur de l'infection virale et reflet de la réplication virale VIH, est faite par infection de monocytes humains avec le virus VIH-1 (souche HTLV-III-B) préalablement opsonisé par incubation des particules virales avec du sérum humain séronégatif selon le protocole expérimental décrit par N. Thieblemont et al., Clin. Exp. Immunol., 106-113, 1993. La mise en évidence de l'inhibition de la libération de l'antigène p24 est réalisée en prétraitant les monocytes avec le CD16s ou avec deux anticorps anti-CR3 comme contrôles, avant l'infection par VIH opsonisé, selon les conditions suivantes 5 X 105 monocytes humains sont incubés à 370C pendant 3 heures dans le milieu de culture seul ou en présence du CD16s recombinant ci-dessus (3 pg/ml) ou des anticorps anti CR3 (OHM1 ; Orthodiagnostics et 4B3 ; N. Thieblemont et al., déjà cité) (10 Ag/ml), puis incubés avec le virus VIH-1 opsonisé (noté VO). Les surnageants cellulaires sont prélevés aux jours J3, J6, J9 et J12 et remplacés par du milieu contenant les mêmes quantités de CDl6s ou des anticorps anti-CR3 ou de milieu seul.L'antigène p24 est dosé par la méthode ELISA (ELISA NEN) dans les surnageants cellulaires jusqu'à J12 après l'infection virale. La cinétique de production de l'antigène p24 représentée figure 3 montre une inhibition de la libération de celui-ci avec le prétraitement avec du CD16s. L'inhibition est comparable à celle observée lorsque les monocytes sont prétraités avec des anticorps anti-CR3-contrôles. Ces résultats montrent que le CD16s est capable de bloquer l'infection de monocytes humains par le VIH opsonisé. 2) Infection par le virus VIH opsonisé et recouvert d'anticorps anti-VIH. Des infections de monocytes ont été réalisées avec du virus VIH-1 ci-dessus opsonisé et recouvert d'anticorps anti VIH (noté VO + anti-VIH) obtenu par incubation de particules virales avec du sérum séronégatif humain et un mélange d'anticorps monoclonaux de souris anti-VIH, anti-gp 120 (clones 104.1, 119.1, 157.12 et 105.34 ) et anti-gp 41 (clone 9.11) (Institut Pasteur, laboratoire Hybridolab). La production de l'antigène p24 a été mesurée comparativement à une infection avec le virus opsonisé (noté VO). Les monocytes ont été incubés avant l'infection virale, comme indiqué ci-dessus, en présence des deux anticorps anti CR3 ci-dessus (noté anti-CR3) ou d'un anticorps contrôle W6/32 ATCC HB95 (noté Ac Ctl) ou du CD16s recombinant cidessus (noté CD16S), éventuellement préalablement dénaturé par chauffage (noté CD16SD). La production de l'antigène p24 est mesurée à J10 après l'infection. Les résultats représentés figure 4 montrent que le CD16s inhibe fortement (environ 90 %) la production d'antigène p24 par les monocytes infectés par du virus VIH opsonisé et recouvert d'anticorps anti-VIH alors que le CD16s dénaturé n'a pas d'effet inhibiteur. L'inhibition de l'infection des monocytes par le virus VIH-1 recouvert de complément et d'anticorps anti-VIH, ce qui est la situation des particules virales chez les individus séropositifs, permet de prévoir une efficacité de l'utilisation du CD16s chez les individus déjà infectés, tels que les individus séropositifs et les individus qui atteignent le stade SIDA de la maladie. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: ROUSSEL UCLAF (B) RUE: 102, Route de Noisy (C) VILLE: ROMAINVILLE (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 93230 (G) TELEPHONE: (33) 1.49.91.49.91 (H) TELECOPIE: (33) 1.49.91.46.10 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite du CD16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus VIH. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentin Release 11.0, Version 11.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 194 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (x) INFORMATION DE LA PUBLICATION: (H) NUMERO DU DOCUMENT: EP 0614978 Al (I) DATE DE DEPOT: 08-MAR-1994 (J) DATE DE PUBLICATION: 14-SEP-1994 (K) RESIDUES PERTINENTS DANS LA SEQ ID NO: 1: DE 1 JUSQU'AU 194 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp 1 5 10 15 Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala 20 25 30 Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu 35 40 45 Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asn 50 55 60 Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro 85 90 95 Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys Hie Ser 100 105 110 Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys 115 120 125 Aep Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys Ala 130 135 140 Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr île Thr Gln Gly Leu 165 170 175 Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Arg 180 185 190 Leu Val REVENDICATION8 1) Utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble pour préparer une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou la diminution de l'infection par le virus VIH chez l'homme. 2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le polypeptide est un CD16 soluble recombinant. 3) Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que le CD16 soluble recombinant est un récepteur RFcyIII humain soluble ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N01 de la figure 1. 4) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 pour réduire la pénétration ou l'infection des cellules cibles par le virus VIH-1.