Brevet FR2735579A1 — publié le 19961220

La présente invention a pour objet un procédé de discrimination et d'isolement de sous-populations de leucocytes à partir d'échantillons sanguins par traitement par du polyoxyéthylène 9-lauryl éther. Elle est en outre relative à un réactif pour la mise en oeuvre de ce procédé. Les analyses pratiquées en hématologie ont pour objet une identification et un comptage de plusieurs catégories de cellules, afin d'établir un diagnostic. Les cellules à reconnaître sont usuellement des leucocytes qui se répartissent en trois familles tels que les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes. Ces derniers comprennent notamment les éosinophiles, les neutrophiles et les basophiles. Elles sont généralement réalisées au moyen d'un dispositif utilisant l'effet Coulter. Ce dispositif consiste à faire passer des cellules dans un liquide conducteur à travers un orifice de petit diamètre, au niveau duquel est appliqué un courant électrique maintenu constant. Le passage d'une particule y provoque une variation transitoire de conductivité, représentative du volume occupé par la particule traversante. Ces mesures de variations d'impédance sont cependant reconnues comme insuffisantes pour identifier les cellules. En effet, des cellules appartenant à des familles différentes ont parfois des volumes très voisins. C'est pourquoi, ces mesures de variations d'impédance sont classiquement complétées par des mesures issues d'un dispositif optique, du type diode laser. Dans un tel dispositif, des cellules passant par un orifice de petit diamètre sont illuminées par un faisceau laser et réfléchissent de la lumière. La lumière réfléchie par une cellule a une intensité en corrélation avec l'indice de réfraction de cette cellule. La mesure de la lumière réfléchie permet ainsi d'obtenir des informations sur l'état de surface de la cellule. On constate qu'à partir d'informations sur le volume et l'état de surface des cellules, on peut obtenir des analyses précises. Quel que soit le dispositif utilisé pour effectuer des analyses en hématologie, il est nécessaire de préparer préalablement des échantillons de sang à analyser. Le comptage des sous-populations de granulocytes basophiles est particulièrement délicat car elles sont présentes dans la majorité des échantillons de sang humain en proportions très faibles, généralement inférieures à 1% du nombre total de leucocytes. De plus, les cas d'hyperbasophilie, c'est-à-dire les cas dans lesquels les quantités de granulocytes basophiles sont importantes, sont très rares, ce qui rend l'étude de ces cellules d'autant plus difficile. Des solutions ont déjà été proposées pour résoudre le problème de l'isolement, de la discrimination et de la numération de ces cellules. Ainsi, la demande de brevet européen EP-177.137 décrit un réactif qui permet la destruction progressive de toutes les cellules sanguines, à l'exception des cellules polynucléaires basophiles. Le réactif utilisé pour traiter les échantillons sanguins comprend un agent tensioactif pouvant être un éther d'un alcool aliphatique en C6 à C16 et d'un polyalkylène glycol, mélangé avec un acide sulfonique, carboxylique ou chlorhydrique. Le seul composé dont la structure ait été précisément identifiée, et qui ait été testé dans cette demande de brevet, est le polyoxyéthylène 23-lauryl éther, commercialisé sous la dénomination Brij 35. Ce réactif présente néanmoins deux inconvénients majeurs. D'une part, le temps nécessaire pour obtenir une lyse complète des cellules autres que les granulocytes basophiles, est supérieur à 80 secondes, et de ce fait est trop long pour permettre une utilisation sur des automates de numération cytologique. D'autre part, ce réactif ne lyse que de manière incomplète les cellules sanguines, autres que les granulocytes. De nombreux débris cellulaires résultant de cette lyse incomplète sont donc présents dans les échantillons lysés, ce qui entraîne le bouchage des orifices de comptage des automates. Un réactif complexe contenant le polyoxyéthylène 23lauryléther, en mélange avec notamment du SDS, de l'acide phtalique et de l'acide chlorhydrique a été proposé dans la demande de brevet FR 2.658 300 afin de résoudre ce problème. Néanmoins, la qualité des préparations obtenues après traitement d'échantillons sanguins par ce réactif n'est toujours pas satisfaisante, du fait de la présence d'un trop grand nombre de débris et il est impossible d'obtenir des résultats reproductibles. Ainsi il a été observé un trouble après le mélange de l'échantillon sanguin et du réactif de lyse, empêchant toute mesure. En outre, cette méthode ne permet de distinguer que les granulocytes basophiles, et non les éosinophiles. La demanderesse s'est donc attachée à trouver un réactif lysant de manière efficace toutes les cellules sanguines, à l'exception des granulocytes basophiles ou des granulocytes éosinophiles, et présentant des caractéristiques compatibles avec l'automatisation des méthodes de numération cytologiques. Elle a mis en évidence qu'un éther de polyoxyéthylène et d'alcool gras permet d'obtenir une lyse spécifique et efficace des cellules sanguines autres que les granulocytes éosinophiles et basophiles, et suffisamment rapide pour être automatisable. Elle a en outre montré de manière surprenante, qu'en fonction du pH du milieu dans lequel est traité l'échantillon sanguin, il est possible de distinguer soit les granulocytes basophiles, soit les granulocytes éosinophiles. La présente invention a donc pour objet un procédé de discrimination et d'isolement de sous-populations de leucocytes à partir d'un échantillon sanguin caractérisé en ce que ledit échantillon est traité par du polyoxyéthylène 9lauryl éther. Cette méthode permet de distinguer diverses souspopulations de leucocytes en modulant la réaction de lyse. En outre, dans le cas où la lyse de la majorité des érythrocytes et des sous-groupes leucocytaires est effectuée, il est possible de distinguer, en fonction du pH du milieu de réaction, soit le sous-groupe de granulocytes basophiles, soit le sous-groupe de granulocytes éosinophiles. Ainsi si le procédé est mis en oeuvre à un pH acide, c'est-à-dire à un pH avantageusement compris entre 2 et 3,5 et préférentiellement entre 2,5 et 3,1, les granulocytes basophiles seront majoritairement isolées dans l'échantillon sanguin. On entend pour la présente invention qu'un échantillon comprend majoritairement un type cellulaire donné, lorsque ce type cellulaire constitue au moins 99% des cellules intactes des échantillons. Si le procédé est mis en oeuvre à un pH basique, c'està-dire avantageusement compris entre 9 et 10 et préférentiellement entre 9,50 et 9,70, les cellules majoritairement isolées à partir de l'échantillon sanguin sont des granulocytes éosinophiles. La présente invention est en outre relative à un réactif pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,1 à 10 g/l, et préférentiellement de 0,5 à 5 g/l, de polyoxyéthylène 9lauryléther. Un tel réactif peut ainsi être utilisé pour la discrimination et l'isolement des cellules granulocytes, éosinophiles et basophiles. Il comprend avantageusement, pour l'isolement des cellules granulocytes basophiles, de l'acide phtalique et/ou de l'acide chlorhydrique. Ainsi, il comprend avantageusement de 0,5 à 3 g/l, et préférentiellement de 1 à 2 g/l, d'acide phtalique. L'acide chlorhydrique peut être ajouté, en fonction des quantités d'acide phtalique, afin d'obtenir un pH acide, préférentiellement compris entre 2 et 3,5. Pour l'isolement des granulocytes éosinophiles, la solution de lyse peut comprendre, outre le polyoxyéthylène 9lauryl éther, de la soude et du tétraborate de sodium. La présente invention est enfin relative à un procédé de numération de sous-populations de leucocytes dans un échantillon sanguin, caractérisé en ce que ledit échantillon est traité selon le procédé décrit ci-dessus, et les cellules qui n'ont pas été lysées sont comptées. Le procédé de discrimination et d'isolement selon la présente invention peut être mis en oeuvre par simple mélange, préférentiellement entre 20"C et 60'C, notamment à 4OC, d'un échantillon sanguin et du réactif dont la composition a été donnée ci-dessus. De manière avantageuse, le rapport échantillon: réactif est compris entre 1:125 et 1:150. Les cellules qui n'ont pas été lysées peuvent être comptées par tout moyen à la portée de l'homme du métier, et en particulier par mesure d'impédance. Le polyoxyéthylène 9-lauryl éther peut être obtenu auprès de la Société Sigma (La Verpillière, France) qui le commercialise sous la référence P 9641. Le présent procédé peut être mis en oeuvre en particulier sur les appareils de comptage cytométriques commercialisés par les Sociétés Sysmex et ABX, ou par la demanderesse, et de manière générale ceux utilisant le principe de la mesure de la résistivité (impédance). Le présent procédé présente les avantages suivants: - il permet une lyse sélective et rapide de tous les globules rouges présents dans l'échantillon ainsi que des populations de globules blancs à l'exception des granulocytes basophiles, en milieu acide, et des granulocytes éosinophiles en milieu basique, - les lysats d'échantillons sanguins traités selon le procédé présentent des quantités négligeables de débris, par rapport aux procédés décrits dans l'état de la technique, et - il est reproductible, - il permet d'obtenir la lyse des cellules, autres que les éosénophiles ou les basophiles, dans un temps suffisamment court pour être adapté sur des automates de numération cytométrique, ou automates d'hématologie, - il ne nécessite qu'un seul produit de lyse, le polyoxyéthylène 9-lauryl éther, ce qui simplifie considérablement la formulation des réactifs. La présente invention est illustrée par l'exemple qui suit. EXEMPLE Isolement et discrimination de granulocytes basoPhiles L'échantillon sanguin d'un volume de 30p1 est traité par 4 ml d'un réactif présentant la composition suivante: - polyoxyéthylène 9-lauryl éther : 2 g/l - Acide phtalique : 1,5 g/l - HCl 1N : QSP pour obtenir un pH de 2,8 - Eau distillée : QSP 1 litre Ce réactif peut éventuellement être additionné d'un conservateur et d'un anti-oxydant. La réaction a été effectuée à une température de 40 C. Il a été observé une lyse immédiate des érythrocytes puis une lyse progressive de tous les leucocytes, à l'exception des cellules granulocytes basophiles. Le temps de lyse a été de 15 secondes. L'échantillon ainsi traité a été analysé sur le cytomètre de l'automate HYCEL HEMA 5. Il ressort de cette analyse que la méthode selon l'invention permet de discriminer les granulocytes basophiles des débris cellulaires. Un autre échantillon a été traité dans les mêmes conditions durant 30 secondes. Une observation au microscope a permis de vérifier que seuls les granulocytes basophiles sont restés intacts, ce qui a confirmé la sélectivité de ce réactif de lyse. REVENDICATIONS 1. Procédé de discrimination et d'isolement de souspopulations de leucocytes à partir d'un échantillon sanguin, caractérisé en ce que ledit échantillon est traité par du polyoxyéthylène 9-lauryl éther. 2. Procédé selon la revendication 1 pour différencier et isoler les granulocytes basophiles caractérisé en ce que ledit échantillon est traité en milieu acide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que le pH du milieu est compris entre 2 et 3,5, et préférentiellement entre 2,5 et 3,1. 4. Procédé selon la revendication 1 pour différencier et isoler les granulocytes éosinophiles caractérisé en ce que ledit échantillon est traité en milieu basique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 4 caractérisé en ce que le pH est compris entre 9 et 10, et préférentiellement entre 9,50 et 9,70. 6. Réactif pour lyser spécifiquement les érythrocytes, tout en conservant l'intégrité des sous-populations leucocytaires caractérisé en ce qu'il comprend de 0,1 à 10 g/l, et préférentiellement de 0,5 à 5 g/l, de polyoxyéthylène 9-lauryl éther. 7. Réactif selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il comprend en outre de l'acide phtalique et/ou de l'acide chlorhydrique. 8. Réactif selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend de 0,5 à 3 g/l, et préférentiellement de 1 à 2 g/l, d'acide phtalique. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'échantillon est traité par le réactif selon l'une des revendications 6 à 8. 10. Procédé de numération de sous-populations de leucocytes dans un échantillon sanguin, caractérisé en ce que: - ledit échantillon est traité par le procédé selon l'une des revendications 1 à 5 et 9, et - les cellules non lysées sont comptées.