Brevet FR2736642A1 — publié le 19970117

IMMUNOVECTEURS. NOTAMMENT ANTICORPS ET FRAGMENTS D'ANTICORPS UTILISABLES POUR LE TRANSPORT INTRACELLULAIRE ET INTRANUCLEAIRE DE PRINCIPES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS NOTAMMENT D'HAPTENES. DE PROTEINES ET D'ACIDES NUCLEIQUES La présente invention est relative au transfert actif d'haptènes, de protéines, d'acides nucléiques et autres molécules dans le noyau de cellules eucaryotes. Cette invention revêt une importance majeure puisqu'elle peut être appliquée à divers domaines, notamment celui de la thérapie génique et des vaccins. La thérapie génique demeure conditionnée par un nombre considérable de paramètres, parmi lesquels le développement de vecteurs capables de transporter à travers le cytoplasme de ces cellules de l'organisme de l'hôte des principes actifs doués de propriétés spécifiques prédéterminées dans les noyaux de cellules de l'organisme en l'absence d'altérations génétiques associé à l'utilisation de ces vecteurs, et la non-dégradation de l'activité biologique des principes actifs transférés. On sait qu'à ce jour toutes ces conditions sont loin d'être réunies (1). La présente invention a donc pour but de mettre à disposition un nouveau type de vecteurs à la fois plus efficaces et d'une plus grande innocuité que les vecteurs viraux dont l'utilisation est envisagée à ce jour. L'invention concerne donc un produit de couplage entre un principe biologiquement actif et un de ces nouveaux vecteurs, ci-après dénommés "immunovecteurs", ledit produit de couplage étant caractérisé, à la fois par la capacité de l'immunovecteur à permettre l'internalisation dans des cellules eucaryotes de principes biologiquement actifs liés de manière covalente ou non covalente à ces immunovecteurs, et par leur affinité pour l'ADN de ces cellules, au point de rendre ledit immunovecteur apte à transférer le principe biologiquement actif à proximité immédiate des noyaux de ces cellules ou dans les noyaux de ces cellules. Ces immunovecteurs consistent de préférence en des anticorps ou fragments d'anticorps aptes à reconnaitre des séquences d'ADN au sein de ces cellules, et auxquels peuvent être liés de manière covalente ou non covalente des principes biologiquement actifs, ces anticorps ou fragments d'anticorps étant en outre capables de transporter in vitro et in vivo ces principes biologiquement actifs à travers les membranes et le cytoplasme de ces cellules, et à les transférer à proximité ou même dans le noyau de ces cellules. II est entendu que dans la présente description le terme "principe biologiquement actif" concerne toute molécule, macromolécule, groupe de molécules possédant l'activité biologique du genre en question. L'invention est également relative à un procédé de transfert, notamment d'haptènes, de protéines etlou d'acides nucléiques dans le noyau de cellules particulièrement de cellules eucaryotes, ce procédé étant basé sur l'utilisation des propriétés desdits immunovecteurs. L'existence d'anticorps capables de pénétrer à l'intérieur de noyaux de lymphocytes humains lorsque ces cellules sont incubées in vitro dans un milieu de culture contenant un sérum provenant de malades atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), a été rapportée pour la première fois par Alarcon-Segovia et al. en 1978 (2). Par la suite, la même équipe a démontré que ces anticorps sont d'isotype IgG et sont capables de réagir avec des acides ribonucléiques, libres ou complexés avec des protéines (3). Récemment, ce type d'anticorps a été détecté chez la souris lupique MRL Ipr/lpr, mais également chez la souris NZB présentant un syndrome de maladie hémolytique autoimmune et même chez la souris normale BALB/c.Certains anticorps monoclonaux, préparés à partir de la rate de ces souris, se sont avérés capables de pénétrer in vitro dans le noyau de cellules maintenues en culture (58). Comme chez l'humain, il a été noté que ces anticorps monoclonaux étaient capables de reconnaître des acides nucléiques. De plus, il a été montré que ces anticorps sont aussi capables, lorsqu'ils sont injectés chez la souris, de pénétrer dans plusieurs types de cellules, pour se retrouver dans leurs noyaux (6). L'invention découle de la découverte que ce type d'anticorps ou des fragments de ces anticorps pouvaient aussi être utilisés comme vecteurs, ci-après immunovecteurs aptes à transporter des principes biologiquement actifs, tels que des haptènes, des protéines, et des acides nucléiques à travers les membranes et le cytoplasme des cellules correspondantes, et à assurer leur transfert dans le noyau desdites cellules. Ces anticorps peuvent être obtenus sous forme polyclonale à partir d'un sérum, en particulier d'un animal préalablement immunisé contre des fragments d'acide nucléique porteurs de l'épitope correspondant, ou sous forme monoclonale, à partir d'hybridomes sécréteurs de tels anticorps. Tout type de liaison, chimique ou non, peut être en oeuvre pour assurer le couplage d'un immunovecteur du type anticorps ou fragment d'anticorps ayant une affinité pour les acides nucléiques au principe biologiquement actif, par exemple un haptène ou un acide nucléique, aux fins de le transporter à travers les membranes et le cytoplasme des cellules, et à assurer le transfert de ces principes actifs dans le noyau. De façon préférée l'on aura recours à un mode de couplage chimique, permettant la réalisation de liaisons covalentes ou non covalentes. Des produits de couplage préférés sont ceux dont les immunovecteurs sont sélectionnables par un test de pénétration cellulaire comportant une première incubation de l'immunovecteur étudié en présence de cellules en culture dans le noyau desquelles le principe actif susceptible d'être associé à l'immunovecteur doit être transporté, suivie, après fixation et perméabilisation de ces cellules, d'une autre incubation avec des anticorps anti-immunovecteurs marqués, et enfin d'une détection à proximité immédiate du noyau ou même au sein de celui-ci de la réaction immunologique du type antigène-anticorps entre l'immunovecteur et l'anticorps anti-immunovecteur. Parmi les immunovecteurs préférés de la présente invention, on mentionnera les anticorps ayant une affinité pour un acide nucleique, ou un fragment de ceux-ci, ce dernier conservant cette affinité. Les anticorps ayant également la capacité de se fixer sur les cellules, en particulier des cellules lymphoïdes sont également utilisables. Cette dernière catégorie d'immunovecteurs peut également être sélectionnée par un test, lequel peut alors aussi comprendre l'incubation des immunovecteurs à l'étude avec des cellules lymphoïdes, le lavage desdites cellules lymphoïdes, I'incubation de ces dernières avec des anticorps antiimmunovecteurs marqués, et la détermination du nombre de cellules positives dans chaque population. Dans une réalisation, les cellules lymphoïdes utilisées sont des splénocytes de souris auto-immunes présentant un syndrome lupique. Un immunovecteur préféré pour le produit de couplage est choisi parmi les IgG monoclonales, les fragments (Fab')2 ou (Fab'), ou tous polypeptides correspondant au(x) site(s) des anticorps impliqué(s) dans la reconnaissance de l'acide nucléique correspondant. Préférentiellement, cet immunovecteur est une immunoglobuline, plus particulièrement une IgG portant une activité anti-ADN, et provenant d'individus normaux. En outre, cet immunovecteur peut être une IgG portant une activité anti ADN, et provenant d'individus présentant des syndromes auto-immuns, plus particulièrement des syndromes de lupus érythémateux disséminé. Dans une réalisation particulière de l'invention, I'immunovecteur couplé au principe actif est un anticorps bi-spécifique reconnaissant d'une part l'ADN, et d'autre part une proteine telle que Tat, Rev du rétrovirus VIH, ainsi que des marqueurs de surface tels que CD3, CD4, CD8, Cl19, et CD34. Préférentiellement, le principe biologiquement actif couplé à l'immunovecteur est une molécule choisie parmi notamment des acides nucléiques, des protéines notamment les enzymes, par exemple la peroxydase, des haptènes notamment la biotine ou la fluorescéine, les activateurs ou inhibiteurs d'enzymes et les médicaments. Dans une réalisation préférée, I' acide nucléique couplé est un polynucléotide, I'immunovecteur étant une IgG, le couplage s'effectuant par l'intermédiaire de la p-benzoquinone à raison d'une molécule d'immunovecteur pour 4 molécules de polynucléotide. De manière plus spécifique, un principe biologiquement actif utilisé préférentiellement est constitué par un gêne destiné à s'intégrer dans le génome des cellules cibles, notamment par recombinaison homologue, plus particulièrement un ADN "nu" contenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide originaire de cellules bactériennes ou eucaryotes, de cellules fongiques, ou de virus, ce polypeptide ayant des propriétés vaccinantes. Avantageusement, ce principe actif permet l'immortalisation de types cellulaires choisis, particulièrement les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules B et T, et les cellules hématopoïétiques, notamment d'origine humaine. De façon encore préférée, ce principe biologiquement actif est un oligonucléotide antisens permettant l'inhibition de la synthèse protéique ou nucléotidique, par exemple dans les cellules infectables par un rétrovirus VIH, ou dans des cellules tumorales. Ainsi, les inventeurs ont d'une part tenté d'obtenir à partir de la rate de souris autoimmunes (NZB x NZW)F1, présentant un syndrome lupique, des anticorps monoclonaux IgG qui ont été sélectionnés pour leur capacité à réagir avec l'ADN mais aussi, pour leur capacité à pénétrer jusqu'au noyau des cellules. Parallèlement, des anticorps polyclonaux réagissant avec l'ADN et pouvant pénétrer dans les noyaux des cellules ont été isolés.par chromatographie d'affinité. Cette chromatographie a été appliquée, soit à un "pool" de sérums de patients normaux ou à un sérum individuel normal, et de préférence à des sérums provenant de patients atteints d'infections, particulièrement à un sérum de patients normaux atteints de LED, soit à un sérum de souris (NZB x NZW)F1. Dans un procédé de sélection d'immunovecteurs selon la présente invention, le test de pénétration cellulaire des immunovecteurs comprend une première incubation de lignées cellulaires eucaryotes dans un milieu contenant lesdits immunovecteurs de préférence en concentration croissante, puis la fixation et, si besoin, la perméabilisation, ou vice-versa, de ces cellules, suivie d'une incubation desdites lignées cellulaires avec des anticorps anti-immunovecteurs marqués de préférence à la fluorescéine ou à la peroxydase, et la localisation des anticorps ainsi marqués à proximité des noyaux desdites cellules ou mieux encore à l'intérieur des noyaux. Les lignées cellulaires sont notamment choisies parmi les fibroblastes, les thymocytes ou les splénocytes. Sans que les conditions réactionnelles qui suivent aient un caractère limitatif, il peut-être mentionné que la première incubation est souvent effectuée à 37"C, durant environ 2 à 8 heures avec des concentrations d'immunovecteurs d'environ 1 à 70 pglml, sur des lignées cellulaires ensemencées à une concentration allant de 5 x 103 à 5 x 106 cellules par millilitre. Dans une des réalisations du procédé, la lignée cellulaire est une lignée fibroblastique en croissance exponentielle ensemencée à une concentration de 2 x 104 cellules par millilitre, ou des thymocytes ou des splénocytes de souris BALBlc lesquels sont mis en suspension à raison d'environ 106 cellules par millilitre. Par ailleurs, I'invention concerne un procédé de préparation de produit de couplage immunovecteur-molécule(s), les immunovecteurs étant choisis parmi les anticorps, plus particulièrement les IgG obtenus selon le procédé de sélection, les fragments (Fab')2 ou (Fab'), ou tout polypeptide correspondant au site des anticorps ou fragments d'anticorps impliqués dans le transport des molécules. Dans le procédé de préparation d'un produit de couplage selon l'invention, il est fait en sorte qu'à chaque immunovecteur est couplée au moins une molécule de produit biologiquement actif , ladite molécule étant liée à l'immunovecteur de préférence de façon covalente. Les exemples qui suivent illustrent des conditions dans lesquelles, des haptènes comme la fluorescéine et la biotine, des petites molécules comme des hormones, des protéines notamment des enzymes, des inhibiteurs ou activateurs d'enzymes et des médicaments, par exemple des antiviraux tels que l'acyclovir ou l'AZT, peuvent être activement transportées à travers le cytoplasme des cellules traitées et transférées dans le noyau desdites cellules. En particulier, la fluorescéine a été couplée aux groupements aminés libres des immunovecteurs par l'intermédiaire d'un groupement actif isothioyanate et la biotine par l'intermédiaire d'un ester succinimide actif.Le couplage des haptènes ou autres à l'immunovecteur peut être effectué par l'intermédiaire d'autres réactifs ou groupes de pontage homo- ou héterobifonctionnels connus dans la littérature comme les imidoesters et N-hydroxy succinimydil esters pouvant réagir avec les groupements aminés, par exemple des dérivés de groupes alkyle, haloaryle, haloacetyl et pyridyl disulfure réagissant préférentiellement maléimides, ou par l'intermédiaire de avec des groupements sulfhydryle, des carbodiimides, ainsi que des molécules portant des groupements photoactivables comme l'azidobenzoyl hydrazide (8). En outre, les inventeurs ont préparé des produits de couplage où l'immunovecteur est un anticorps bi-spécifique contre un antigène cible ,construit, soit par voie chimique soit par voie du génie génétique, et ont parallèlement immunisé des individus, par exemple des souris avec lesdits antigènes cibles, et sélectionné des immunovecteurs anticorps bispécifiques réagissant préférentiellement avec lesdits antigènes cibles, de sorte que l'action des immunovecteurs soit spécifiquement dirigée. Des techniques relatives à la synthèse d'anticorps bi-spécifiques ont été notamment décrites par Porstmann et al en 1984 (il), une étude intitulée "Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation" ayant été par ailleurs publiée en 1994 par Auriol et al (12). De manière avantageuse, les anticorps bi-spécifiques utilisés dans ce procédé reconnaissent entre autres les protéines Tat, Rev du rétrovirus VIH, ainsi que des marqueurs de surface, CD3, CD4, CD8, CD19, et CD34. Par ailleurs, la présente invention concerne un procédé de transfert d'un principe actif dans les noyaux de cellules eucaryotes choisies, caractérisé par le couplage de ce principe actif à un immunovecteur possédant à la fois la capacité à permettre l'internalisation de ce principe actif dans ces cellules eucaryotes et une affinité pour l'ADN de ces cellules, au point de le rendre apte à transporter ce principe biologiquement actif à proximité immédiate ou dans les noyaux de ces cellules. Ce principe biologiquement actif peut être couplé de façon covalente ou non covalente à l'immunovecteur. Préférentiellement, ce procédé de transfert est caractérisé en ce que l'immunovecteur entrant dans la constitution de ce produit est choisi parmi ceux qui sont sélectionnables par un test de pénétration cellulaire comportant une première incubation de l'immunovecteur étudié en présence de cellules dans le noyau desquelles le principe actif susceptible d'être associé à l'immunovecteur doit etre transporté, suivie après fixation et perméabilisation de ces cellules, d'une autre incubation avec des anticorps anti-immunovecteurs marqués, et enfin la détection à proximité immédiate du noyau ou même au sein de celui-ci de la réaction immunologique du type antigène-anticorps entre l'immunovecteur et l'anticorps anti-immunovecteur. Dans une réalisation préférée du procédé de tranfert selon l'invention, I'immunovecteur utilisé est formé d'un anticorps ayant une affinité pour un acide nucléique, ou d'un fragment de cet anticorps conservant cette affinité. Cet immunovecteur utilisé dans ce procédé est préférentiellement choisi parmi les anticorps, de préférence des IgG monoclonales, les fragments (Fab')2 ou (Fab'), ou tous polypeptides correspondant au(x) site(s) des anticorps impliqué(s) dans la reconnaissance de l'acide nucléique correspondant. Avantageusement, une fois le produit de couplage immunovecteur/principe actif préparé, il peut être utilisé pour le transfert intranucléaire d'autres molécules. Ainsi, au conjugué fluorescéinelimmunovecteur expérimenté, on peut associer un anticorps anti-fluorescéine couplé avec une molécule tierce, et ainsi transférer ladite molécule tierce dans les noyaux des cellules. De façon similaire, le conjugué biotinelimmunovecteur peut permettre la liaison d'un anticorps anti-biotine ou d'avidine-streptavidine couplé avec une molécule tierce à transférer dans les noyaux. Dans la présente invention, on a transféré dans le noyau une enzyme telle que la peroxydase de raifort, mais d'autres protéines possédant des activités biologiques variées peuvent aussi être utilisées. On a aussi utilisé la peroxydase couplée à l'immunovecteur par l'intermédiaire du glutaraldéhyde. Cependant, d'autres procédés connus dans la littérature, comme ceux décrits dans le cas des haptènes, peuvent être aussi utilisés. Comme dans le cas des conjugués haptèneslimmunovecteur, il peut être utilisé, en association avec les conjugués protéine/immunovecteurs, un anticorps anti-protéine couplé avec une molécule tierce pour le transfert intranucléaire de ladite molécule. Dans l'invention ici décrite, bien qu'on ait transféré un polynucléotide dans le noyau, une très grande variété d'acides nucléiques possédant des activités biologiques appropriées peut être également activement transférée au niveau intranucléaire. Ainsi un procédé de transfert de principes actifs selon l'invention permet notamment le transfert de gènes destinés à s'intégrer dans le génome des cellules cibles, notamment par recombinaison homologue plus particulièrement le transfert d'ADN "nu", ce demier pouvant être notamment utilisé en tant qu"'ADN vaccin". Une des techniques de recombinaison homologue possible est celle décrite par le Mouellic et al. en 1990 (13). De récents travaux effectués par Whalen R. G. et al ont permis de montrer l'existence d'une réponse immunitaire suite à un transfert d'ADN. Ces travaux qui ont fait l'objet de la demande de brevet WO 95111307, ont été plus particulièrement appliqués à l'expression de molécules monoclonales du type cytokine lL2 (14). En outre, ce procédé de transfert permet d'introduire des séquences nucléotidiques impliquées dans l'immortalisation de différents types cellulaires, particulièrement les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules B et T, et les cellules hématopoïétiques notamment d'origine humaine. A titre de séquences nucléotidiques on peut citer les séquences oncogènes ou des séquences virales associées à des phénomènes de transformation cellulaire. II permet également le transfert d'oligonucléotides antisens permettant l'inhibition de la synthèse protéique ou nucléotidique, par exemple dans les cellules infectables par un rétrovirus tel que VIH, ou les cellules tumorales. Dans la présente invention, le polynucléotide a été couplé à l'immunovecteur par l'intermédiaire de la p-benzoquinone. Cependant, d'autres procédés connus dans la littérature peuvent être aussi employés. Par ailleurs, la présente invention est aussi relative aux cellules eucaryotes contenant des molécules actives de préférence au niveau nucléaire, caractérisées en ce que lesdites molécules ne sont pas naturellement incorporables aux noyaux desdites cellules, ou ont un taux d'expression faible dans lesdites cellules. Ces molécules sont présentées dans ces cellules à proximité immédiate de leurs noyaux ou dans ceux-ci, et couplées à un immunovecteur caractérisé par son affinité pour l'ADN de ces cellules, à l'état de produit de couplage selon l'invention. Parmi les cellules visées par la présente invention, on retrouve notamment les cellules infectables par un virus ou les cellules tumorales. Entrent également dans le cadre de la présente invention les hybridomes produisant les anticorps selon la présente invention, tels que déposés à la CNCM le 30 juin 1995 sous les numéros 1-1605, 1-1606, 1-1607. En outre, I'invention est relative à une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, un produit de couplage selon l'invention, dans lequel le principe biologiquement actif est un principe actif de médicament ou de vaccin et l'îmmunovecteur est compatible avec l'organisme de l'hôte auquel le médicament est destiné. Entre également dans le cadre de la présente invention, I'utilisation du produit de couplage de l'invention pour l'expression dans des cellules réceptrices d'une séquence nucléotidique hétérologue par rapport à l'ADN de l'hôte. EXEMPLES I. PREPARATION D'IMMUNOVECTEURS A) Immunovecteurs r > olvclonaux Les IgG humaines ou murines sont d'abord isolées par passage d'un mélange de sérums provenant d'individus atteints de lupus érythémateux disséminé ou de souris lupiques (NZB x NZW)F1 - sur de la protéine A immobilisé sur Sepharose (9). Les IgG isolées sont passées sur une colonne d'ADN immobilisé sur de la cellulose. Les anticorps spécifiques anti-ADN présents dans ces IgG sont fixés sur cet immunoadsorbant ADN cellulose et élués avec un tampon carbonate bicarbonate de sodium 20 pM, pH 10, contenant 5 % de diméthylsulfoxide (10). On isole ainsi 1 à 2 mg d'anticorps à partir de 10 mg d'lgG. Les anticorps élués sont dialysés, concentrés et conservés à +4"C jusqu'à leur utilisation. B) Immunovecteurs monoclonaux murins Les splénocytes provenant de souris lupiques (NZB x NZW)F1 sont fusionnés avec le myélome X63 selon le procédé de Kôhler et Milstein. Les hybridomes produits sont testés en ELISA pour la sécrétion d'lgG et pour leur activité anti-ADN. Les hybridomes sécréteurs d'lgG anti-ADN sont sous-clonés au moins deux fois et les clones demeurés doublement positifs (IgG + anti-ADN) sont cultivés en masse ou bien des ascites sont préparés à partir de ces clones chez la souris. Dans une expérience typique à partir de la rate d'une souris (NZB x NZW)F1, on a obtenu approximativement 300 puits positifs sécrétant des IgG dont 60 étaient capables de réagir avec l'ADN. Après clonage, 20 clones sécrétait de l'lgG reconnaissant l'ADN.De ces 20 clones, approximativement la moitié sécrétaient des anticorps capables de pénétrer dans le noyau des cellules alors que les autres n'en étaient pas capables (voir C : test de pénétration intranucléaire des immunovecteurs). Les IgG monoclonales sont isolées à partir des surnageants de culture ou des liquides d'ascites par précipitation avec du sulfate d'ammonium à 45% suivi, après dialyse, par passage sur de la protéine A immobilisé sur Sepharose. Après neutralisation des IgG éluées, les préparations sont dialysées, concentrées et gardées à -20 C jusqu'à leur utilisation. Les anticorps de souris ci-dessus évoqués seront subséquemment humanisés par l'utilisation d'une des techniques connues, par exemple celle décrite par Riechmann et al. (15). C) Sélection des immunovecteurs 1) Test de pénétration intranucléaire des immunovecteurs Deux lignées de fibroblastes - PtK2 provenant de rein de rat kangourou et GMA-32 provenant de rein de hamster - ont été principalement utilisées. Les lames portant les fibroblastes en croissance exponentielle ensemencées à 2 x 104 cellules/ml, 24 heures auparavant et mises en culture dans du milieu RPMI 1640 ou MEM (contenant 10 % du sérum de veau foetal, 2mM-L-glutamine et 1 % de pyruvate de sodium) sont incubées à 37"C dans du milieu de culture renouvelé, contenant des quantités choisies d'immunovecteur (1 à 70 pg/ml). Après 2 à 4 heures d'incubation, les cellules sont lavées avec du PBS et fixées avec soit de I'éthanol pendant 10 minutes à -20 C, soit avec 0.2 % de glutaraldehide et 2 % de formaldehyde dans du PBS pendant 20 minutes. Après trois lavages avec du PBS, les cellules sont perméabilisées pendant 20 minutes dans du PBS contenant 0.2 % de sérum albumine bovine et 0.5 % de saponine. Les préparations cellulaires sont alors lavées avec du PBS et incubées pendant 45 minutes à 24"C avec des anticorps de lapin ou de mouton antiimmunoglobulines de souris (ou anti-immunoglobulines humaines) marqués avec la fluorescéine ou avec la peroxydase (20 IJg/ml). Après lavage, les préparations cellulaires incubées avec l'anticorps fluorescent sont examinées au microscope à fluorescence. Les préparations cellulaires incubées avec l'anticorps marqué avec la peroxydase sont d'abord incubées dans le substrat cytochimique de la peroxydase (diaminobenzidine (DAB) + H202) et, après lavage, la préparation est examinée au microscope optique (9). Le nombre de cellules positives est compté. Tel que précédemment décrit, des thymocytes de souris ont été aussi utilisés pour tester la pénétration des immunovecteurs dans le noyau. Des suspensions de thymocytes ont été préparées à partir de thymus de souris BALB/c. Les thymocytes, à une concentration de 1 x 106 cellules/ml, sont incubées à 37"C pendant 3 heures dans un milieu de culture contenant des quantités croissantes d'immunovecteur (1 à 70 ,ug/ml). Après lavage et fixation, les lymphocytes sont traités comme les préparations de fibroblastes ci-dessus pour la détection intranucléaire des anticorps. 2) Test de fixation des anticorps anti-DNA sur les cellules Ivmphoides De façon à mettre en évidence une réaction avec les membranes des cellules, 106 thymocytes ou splénocytes de souris ont été incubés à froid pendant 45 minutes avec 0,1 ml des différents anticorps monoclonaux dilués dans une solution d'albumine bovine à 0,1 % contenant 0,2 % d'azide de sodium. Après lavage, les cellules sont incubées avec des anticorps anti-lgG de souris fluorescent pendant 45 minutes à froid. Après lavage, les cellules sont examinées au FACS et le nombre de cellules positives déterminé dans chaque population. Des 20 anticorps monoclonaux examinés, approximativement la moitié sécrètent des anticorps qui sont capables de pénétrer dans le noyau des cellules alors que l'autre moitié n'en est pas capable. Une corrélation a pu être établie entre les anticorps monoclonaux pénétrant avec une grande efficacité dans le noyau des cellules (nombre de cellules marquées, dilution limite pour obtenir un marquage) et leur aptitude à marquer les thymocytes et les splénocytes. II PREPARATION D'IMMUNOVECTEURS PORTANT DES HAPTENES. PROTEINES OU ACIDES NUCLEIQUES A) Prénaration de fragments F(ab')2 et Fab' d'immunovecteurs Les fragments F(ab')2 des immunovecteurs sont préparés selon des procédés décrits impliquant une protéolyse par la pepsine suivie d'une réduction par la cystéine pour obtenir le fragment Fab' (9). Ainsi dans 5 ml de tampon citrate-acide citrique 0,1 M, pH 3,5, contenant 5 mg d'immunovecteur, on ajoute 150 pg de pepsine et on incube 2 heures à 37"C. Le milieu est ajusté à pH 8 et la préparation filtrée sur une colonne de protéine A-Sepharose pour éliminer les IgG non digérées. Après dialyse contre du PBS, cette préparation de F(ab')2 est conservée à -20 C jusqu' utilisation.Pour obtenir les fragments Fab' on ajoute de la cystéine à une concentration finale de 0.02 M dans la préparation du F(ab')2. Après 10 minutes d'incubation à 37 C, on ajoute 0.04 M d'iodoacétamide et on laisse incuber pendant 30 minutes. Cette préparation de Fab' est dialysée contre du PBS et est conservée à -20 C jusqu'à son utilisation. B) /mmunovecteurs/haptènes CouDlaae à la biotine Dans 0,5 ml de tampon phosphate 0,1M, pH7, contenant 1 mg d'anticorps, on ajoute 2 p1 d'une solution 0.1M de d-biotine-Nhydroxysuccinimide ester dans du dimethylformamide (1 mg de l'ester actif dans 30 pI de dimethylformamide). On laisse la solution pendant 1 heure à la température du laboratoire et on dialyse contre du PBS à +4 C toute la nuit. Couplage à la fluorescéine Dans 1 ml d'une solution de carbonate de sodium 0.1M contenant 1 mg d'anticorps, on ajoute 20 pI d'une solution d'isothiocyanate de fluorescéine dans le dimethylsulfoxyde (10 mg/ml). On laisse la solution 3 heures à la température du laboratoire et on dialyse contre du PBS à +4 C. C) lmmunovecteurslprntéines Couplage avec la peroxydase Dix milligrammes de peroxydase sont dissous dans 0.2 ml de glutaraldehyde à 1 % dans du tampon phosphate 0.1M pH 6,8. Après incubation à la température du laboratoire pendant 18 heures, la solution est filtrée sur une colonne de Sephadex G25 (0,9 x 60 cm) équilibrée avec NaCI 0.15M pour éliminer l'excès de glutaraldehyde. A cette solution de peroxydase activée, on ajoute 1 ml d'une solution de NaCI 0.15 M contenant 5 mg d'anticorps et 0,2 ml de tampon carbonate-bicarbonate 1 M pH 9.5.La solution est gardée à +4"C pendant 24 heures puis additionnée de lysine à la concentration finale de 0.1 M, puis dialysée contre PBS à 4"C. D) Immunovecteursiacide nucléiques Le polynucléotide utilisé était composé de 15 nucléotides et portait une fluorescéine en 5' et un groupement NH2 libre en 3'. Il a été préparé selon des procédés classiques de synthèse nucléique. Ce nucléotide a été couplé à l'immunovecteur par l'intermédiaire de la p-benzoquinone(9). Dans 0,4 ml de tampon phosphate 0.1 M pH 6 contenant 1 mg d'immunovecteur (molécule entière, F(ab')2 ou Fab') on ajoute 0,1 ml d'éthanol contenant 3 mg de p-benzoquinone. Après une incubation d'une heure à la température du laboratoire la préparation est filtrée sur colonne de Sephadex G-25. La fraction contenant l'immunovecteur activé est additionnée du polynucléotide dans un rapport d'une molécule d'immunovecteur pour 4 molécules de polynucléotide et la solution ramenée à pH 9.2 avec du tampon carbonate-bicarbonate. Après 18 heures d'incubation à la température du laboratoire, la réaction est arrêtée par addition de lysine à la concentration de 0.1 M finale et ensuite dialysée contre du PBS. Cette préparation est conservée à +4"C jusqu'à son utilisation. III. EXEMPLES DE TRANSFERT DE SUBSTANCES DANS LES NOYAUX DES CELLULES PAR DES IMMUNOVECTEURS ASSOCIES A CES SUBSTANCES A) Transfert in vitro de la fluorescéine Des fibroblastes de la lignée GM A-32 en culture sur des lamelles de verre sont incubés à 37"C pendant 2 à 4 heures dans du milieu de culture RPMI contenant des quantités croissantes d'immunovecteurs monoclonaux (anticorps J-20.8 ou fragments Fab'2) marqués avec la fluorescéine. Au bout de ce temps, les cellules sont lavées et fixées comme décrit dans IC1. Après inclusion dans le milieu Mowiol, elles sont examinées au microscope en fluorescence. La presque totalité des noyaux des fibroblastes montre un marquage fluorescent. Par contre, les noyaux de fibroblastes incubés avec un anticorps monoclonal témoin lg 2a sans activité anti-ADN, qui ne pénètre pas dans les noyaux, ne présentent pas de fluorescence (Figures 1 et 2). B) Transfert in vivo de la fluorescéine dans les lvmohocvtes nénshénaues de la souris Un mg d'immunovecteur (anticorps monoclonal C-2.1 ou F-4.1 ou d'anticorps témoin (anticorps monoclonal G-i 4) marqué avec la fluorescéine est injecté à deux souris à raison de 0,2 ml par voie intraveineuse et 0,3 ml par voie intrapéritonéale. Après 5 heures les souris sont saignées et sacrifiées et les lymphocytes du sang circulant sont analysés par FACS. On note que 60% des lymphocytes du sang périphérique provenant de la souris injectée avec l'immunovecteur sont fluorescents alors qu'aucun des lymphocytes de l'animal témoin ne le sont (Figure 3). L'examen au microscope montre une fluorescence au niveau des noyaux dans la majorité des cellules. C) Transfert de la biotine Des fibroblastes de la lignée PtK2 (105/ml) mis en culture 24 heures auparavant sont incubés dans un milieu de culture RPMI complet avec des IgG polyclonales anti-DNA humaines marquées avec la biotine en quantités croissantes (5-100 li9). Après 3 heures, les cellules sont lavées, fixées et perméabilisées comme décrit dans IC. Les cellules sont ensuite incubées avec du RPMI contenant 1 pglml de streptavidine marquée à la peroxydase. Après une heure, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et la peroxydase associée aux cellules est révélée en utilisant le milieu DAB + H202. Les préparations sont incluses dans du Mowiol et examinées au microscope optique.Un grand nombre de noyaux des fibroblastes incubés avec l'lgG anti-ADN sont positifs alors que les cellules incubées avec des IgG provenant d'individus normaux et marquées avec la biotine, sont négatives. D) Transfert de la peroxydase Dans les conditions définies en paragraphe IIIC, les fibroblastes PtK2 sont incubés avec des quantités croissantes de fragments Fab' d'un immunovecteur (anticorps J-20.8) marqué avec la peroxydase. Après 3 heures, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et fixées pendant 20 minutes avec 0.2 % de glutaraldehyde et 2 % de formaldehyde dans du PBS. Après lavage, on révèle l'activité de la peroxydase par le test coloré DAB + H202 et on examine les préparations au microscope optique. Une grande proportion de noyaux des fibroblastes incubés avec les fragments Fab' de l'anticorps J-20.8 sont positifs pour la peroxydase, alors que ceux incubés avec l'anticorps contrôle 48.9 sont négatifs. E) Transfert de oolvnucléotide maraué à la fluorescéine 3 x 106 splénocytes, préparés à partir de la rate de souris BALB/c, sont incubés dans 1 ml de RPMI contenant 40 pgiml d'immunovecteur (J-20.8) ou de son fragment Fab' couplé de manière covalente au polynucléotide. Après trois heures d'incubation à 37"C, les cellules sont lavées avec du PBS, fixées en 4% de paraformaldehyde et examinées au microscope. Huit à 10 % des cellules montrent une fluorescence intranucléaire (Figure 4). * * * Dans ce qui précède, les immunovecteurs préférés étaient essentiellement formés par des anticorps anti-ADN ou des fragments de ces anticorps, sous réserve que ces fragments retiennent le site de reconnaissance pour I'ADN entier. II va naturellement de soi que les immunovecteurs utilisables dans le cadre de l'invention pourraient être constitués de toute autre façon, dès lors qu'ils permettraient également le transport du principe biologiquement actif qui lui serait associé à travers les membranes de ces cellules et leur cytoplasme et son transfert à proximité du noyau des cellules, ou même à l'intérieur de ce noyau. A titre d'exemples de tels immunovecteurs, on peut citer des conjugués entre une protéine nucléaire, par exemple un histone, une protéine hnRNP, une polymérase ou un facteur associé à cette polymérase, et le produit actif, cette protéine nucléaire étant elle-même ( sauf à ce qu'elle soit à elle seule capable d'assurer l'internalisation et le transfert d'un principe biologiquement actif dans le noyau des cellules) conjuguée à l'anticorps anti-récepteur membranaire de la cellule ou à toute autre molécule permettant l'internatilisation dans la cellule du conjugué ainsi produit.Dès lors que ce conjugué est apte à diffuser jusque dans le noyau des cellules et que par ailleurs il pourrait à son tour transporter et transférer, comme cela a été défini plus haut, un principe biologiquement actif qui serait couplé à ce conjugué, il constitue un immunovecteur entrant dans le cadre de la prtésente invention. Les techniques de sélection qui ont été décrites, plus haut, pour le choix d'immunovecteurs efficaces pour le transfert d'un principe actif dans le noyau des cellules sont tout autant applicables à la sélection des conjugués susmentionnés. L'homme du métier comprendra qu'un critère de choix supplémentaire pourrait, pour au moins certains des conjugués utilisés, résider dans l'absence d'une intervention indésirable de la protéine nucléaire qu'il contient avec le fonctionnement de la cellule. II est d'ailleurs à noter que seule la partie de la protéine intranucléaire portant son site de reconnaissance de l'ADN correspondant est indispensable à la réalisation conforme à l'invention. LEGENDE DES FIGURES FIGURE 1 Transfert "in vitro" de la fluorescéine. - Marquage des noyaux des fibroblastes GMA 32 par un immunovecteur marqué à la fluorescéine (anticorps J-20.8) en A et B (grossissement x 100). - C : Absence de marquage avec l'anticorps contrôle fluorescent (x 100). - D: Un autre champ vu au faible grossissement (x 40). FIGURE 2 : Même préparation que celle de la Figure 1A analysée en microscope confocale. Les fibroblastes GMA 32 sont marqués essentiellement dans le noyau. Sur la figure 2A, on peut noter une fluorescence totale. La figure 2B correspond à l'analyse de l'intensité de fluorescence. FIGURE 3 : Transfert de la fluorescéine "in vivo. Analyse au FACS des cellules du sang périphérique des souris injectées 5 heures auparavant sur la figure 3A, I'anticorps contrôle fluorescent et sur la figure 3B avec un immunovecteur fluorescent l'anticorps (J-20.8). Histogrammes représentant en abcisse, I'intensité de fluorescence (en unité arbitraire) et en ordonnée, le nombre de cellules. FIGURE 4 : Analyse des cellules du sang périphérique (de la figure 3) en microscopie confocale. Sur la figure 4A, on peut noter une fluorescence totale. La figure 4B correspond à l'analyse de l'intensité de fluorescence. FIGURE 5: Transfert "in vitro" d'un nucléotide. Examen en microscopie confocale d'un splénocyte de souris dans lequel a pénétré le fragment Fab' d'un immunovecteur (anticorps J-20.8) couplé à un nucléotide fluorescent. Sur la figure 5A, on observe une fluorescence totale. La figure 5B correspond à l'analyse de l'intensité de fluorescence. REFERENCES (1) "Non-viral therapy", Current Opinion on Biotechnology, Vol. 5, p. 626-636, (1994), Ledley F.D. (2) "Antibody to nuclear ribonucleoptotein penetrates live human mononuclear cells through Fc receptors", Nature, Vol. 271 (1978), Donarto Alarcon-Segovia et al. 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(10) "DNA affinity column chromatography: application in the isolation of distinct antibody populations SLE sera., Clin. Exp. Immunol. Vol. 62, pp. 321-328, (1985) Kubota et al. (11) "An antibody chimera technique applied to enzyme immunoassay for human alpha-l-fetoprotein with monoclonal and polyclonal antibodies", J. Immunol. Methods, (1984) Vol. 66, p. 179-185, Porstmann B. et al. (12) "Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridization, J. Immunol. Methods, ((1994), Vol. 169, p. 123133, Auriol J. et al. (13) 'Targeted replacement of the homeobox gene Hox-3.1 by the Escherichia coli lacZ in mouse chimeric embryos", Genetics, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), Vol. 87, p. 4712-4716, Le Mouellic et al. (14) "DNA-mediated immunization and the energetic immune response to hepatitis B surface antigen", Clin. Immunology and Immunopathology, (1995), Vol. 75, p. 1-12, Whalen R. G. et al. (15) "Rehasping human antibodies for therapy", Nature, (1988), Vol. 332, p. 323-327, Riechmann et al. REVENDICATIONS 1. Produit de couplage entre un principe biologiquement actif et un immunovecteur ledit produit de couplage étant caractérisé à la fois par la capacité de l'immunovecteur à permettre l'internalisation dans des cellules eucaryotes du principe biologiquement actif, et par l'affinité de l'immunovecteur pour l'ADN de ces cellules1 au point de rendre ledit immunovecteur apte à transférer le principe biologiquement actif à proximité immédiate des noyaux de ces cellules ou dans ces noyaux. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le couplage entre le principe biologiquement actif et l'immunovecteur met en oeuvre une liaison covalente ou non-covalente. 3. Produit selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'immunovecteur entrant dans la constitution de ce produit est choisi parmi ceux qui sont sélectionnables par un test de pénétration cellulaire comportant une première incubation de l'immunovecteur étudié en présence de cellules dans le noyau desquelles le principe actif susceptible d'être associé à l'immunovecteur doit être transféré, suivie, après fixation et perméabilisation de ces cellules, d'une autre incubation avec des anticorps anti-immunovecteurs marqués, et enfin d'une détection à proximité immédiate du noyau ou même au sein de celui-ci de la réaction immunologique du type antigène-anticorps entre l'immunovecteur et l'anticorps anti-immunovecteur. 4. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'immunovecteur est formé d'un anticorps ayant une affinité pour un acide nucléique ou un fragment de cet anticorps conservant cette affinité. 5. Produit selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'immunovecteur est choisi parmi les IgG monoclonales, les fragments (Fab')2 ou (Fab'), ou tous polypeptides correspondant au(x) site(s) des anticorps impliqué(s) dans la reconnaissance de l'acide nucléique correspondant. 6. Produit selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que les immunovecteurs sont des immunoglobulines, notamment des IgG porteuses d'activité anti-ADN provenant d'individus normaux. 7. Produit selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que les immunovecteurs sont des immunoglobulines notamment des IgG porteuses d'activité anti-ADN, provenant d'individus présentant des syndromes autoimmuns, plus particulièrement des syndromes de lupus erythémateux disséminé. 8. Produit selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps bi-spécifique reconnaissant d'une part l'ADN et d'autre par une protéine telle que Tat, Rev du rétrovirus VIH, et, d'autre part, des marqueurs de surface tels que CD3, CD4, CD8, CD19, et CD34. 9. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le principe actif couplé à l'immunovecteur est une molécule choisie parmi des acides nucléiques, des protéines ou des haptènes. 10. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le principe actif est constitué par un gène destiné à s'intégrer dans le génome des cellules cibles, notamment par recombinaison homologue, plus particulièrement un ADN "nu" contenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide originaire de cellules bactériennes ou eucaryotes1 de cellules fongiques, ou de virus, ce polypeptide ayant des propriétés vaccinantes. 11. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le principe actif permet l'immortalisation de types cellulaires choisis, particulièrement les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules B et T, et les cellules hématopoïétiques, notamment d'origine humaine. 12. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le principe actif est un oligonucléotide antisens permettant l'inhibition de la synthèse protéique ou nucléotidique, par exemple dans les cellules affectées par un rétrovirus VIH, ou dans des cellules tumorales. 13. Cellules eucaryotes contenant des molécules actives de préférence au niveau nucléaire, caractérisées en ce que lesdites molécules ne sont pas naturellement incorporables aux noyaux desdites cellules, ou ont un taux d'expression faible dans lesdites cellules, lesdites molécules étant présentées dans ces cellules à proximité immédiate de leurs noyaux ou dans ceux-ci, et couplées à un immunovecteur caractérisé par son affinité pour l'ADN de ces cellules, à l'état de produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Cellules selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules infectables par un virus ou de cellules tumorales. 15. Hybridomes déposés à la CNCM le 30 juin 1995 sous les numéro d'enregistrement: 1-1605 1-1606 1-1 607 16 Procédé de transfert in vitro d'un principe actif dans les noyaux de cellules eucaryotes choisies, caractérisé par le couplage de ce principe actif à un immunovecteur possédant à la fois la capacité à permettre l'internalisation de ce principe actif dans ces cellules eucaryotes et une affinité pour l'ADN de ces cellules, au point de le rendre apte à transporter ce principe biologiquement actif à proximité immédiate ou dans les noyaux de ces cellules. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le principe biologiquement actif est couplé de façon covalente ou non covalente à l'immunovecteur. 18. Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que l'immunovecteur entrant dans la constitution de ce produit est choisi parmi ceux qui sont sélectionnables par un test de pénétration cellulaire comportant une première incubation de l'immunovecteur étudié en présence de cellules dans le noyau desquelles le principe actif susceptible d'être associé à l'immunovecteur doit être transporté, suivie après fixation et perméabilisation de ces cellules, d'une autre incubation avec des anticorps anti-immunovecteurs marqués, et enfin d'une détection à proximité immédiate du noyau ou même au sein de celui-ci de la réaction immunologique du type antigène-anticorps entre l'immunovecteur et l'anticorps anti-immunovecteur. 19. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'immunovecteur est formé d'un anticorps ayant une affinité pour un acide nucléique ou un fragment de cet anticorps conservant cette affinité. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'immunovecteur est choisi parmi les anticorps, de préférence des IgG monoclonales, les fragments (Fab')2 ou (Fab'), ou tous polypeptides correspondant au(x) site(s) des anticorps impliqué(s) dans la reconnaissance de l'acide nucléique correspondant. 21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, un produit conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le principe biologiquement actif est un principe actif de médicament ou de vaccin et l'immunovecteur est compatible avec l'organisme de l'hôte auquel le médicament est destiné. 22. Utilisation du produit selon la revendication 1 pour exprimer in vitro dans des cellules réceptrices une séquence nucléotidique hétérologue par rapport à I'ADN de l'hôte.