Brevet FR2742163A1 — publié le 19970613

La présente invention a pour objet un procédé d'identification d'espèces bactériennes. Ce procédé est basé sur une comparaison des profils de migration d'hydrolases du peptidoglycane. L'identification de l'espèce à laquelle appartient une bactérie revêt une importance capitale lorsque cette bactérie est la cause d'une pathogénie ou d'un défaut technologique dans un produit biologique, agro-alimentaire notamment. L'identification doit alors être la plus rapide et la plus fiable possible pour, dans le premier cas, traiter de manière adéquate la pathogénie, et dans le deuxième cas, éliminer efficacement la cause du défaut et donc limiter les pertes financières pour l'industrie. Les méthodes d'identification des espèces bactériennes existantes à ce jour reposent sur un ensemble d'observations et de tests, dont il est difficile d'établir une liste exhaustive. Néanmoins, les méthodes suivantes sont couramment utilisées: coloration de Gram, morphologie, paramètres physiques de croissance (température, pH, aérobiose ou anaérobiose), propriétés de resistance à un certain nombre de traitements (sel, chauffage ), propriétés hémolytiques, présence de certaines activités enzymatiques (catalase, oxydase), capacité à sporuler, nature des acides aminés constitutifs du peptidoglycane, profil de fermentation des sucres (type galerie API) et des produits du métabolisme, détermination du GC%, aptitude à croître sur un milieu sélectif donné, profil électrophorétique des protéines totales de la cellule (SDS-PAGE), mobilité électrophorétique de certaines enzymes en conditions non dénaturantes (lactate déshydrogénase, aldolase....), analyse des acides gras de la cellule, spectroscopie infra-rouge, étude des antibiogrammes, sérotypage avec anticorps spécifiques, utilisation de sonde spécifique avec ou sans étape préalable d'amplification génique, ribotypage, et hybridation ADN-ADN. Cette dernière méthode demeure la méthode de référence mais son application est très lourde. Une identification fiable nécessite souvent d'utiliser simultanément ou successivement plusieurs de ces méthodes. Par ailleurs, certaines d'entre elles n'ont été développées que pour certains genres bactériens, ou certaines espèces spécifiquement, et toutes ne sont donc pas employées avec la même fréquence. D'une manière générale, lorsqu'on ignore tout à fait à quel genre bactérien une souche appartient, l'approche la plus couramment employée est de déterminer s'il s'agit d'une bactérie Gram (+) ou d'une Gram(-) par la coloration du même nom, d'observer la morphologie et la mobilité (coques, bâtonnets droits ou non droits), d'observer les paramètres physiques principaux de la croissance (dont le type respiratoire), de rechercher la présence de catalase et de déterminer l'aptitude à la sporulation. Les résultats de cette première approche permettent de définir un petit nombre de genres possibles. Pour la détermination définitive du genre et de l'espèce, les autres méthodes plus fines citées dans le paragraphe précédent viennent s'ajouter. L'état de la technique enseigne d'autre part des méthodes d'étude des hydrolases du peptidoglycane. Les hydrolases du peptidoglycane sont des enzymes localisées dans la paroi bactérienne et associées à cette paroi par des liaisons non covalentes. Comme leur nom l'indique, elles hydrolysent le peptidoglycane, constituant essentiel de la paroi qui assure notamment sa rigidité. La nature des liaisons hydrolysées détermine la spécificité de ces hydrolases (figure 1) et leur classement dans la nomenclature officielle: coupure des chaînes glycanes (E.C.3.2.1.17 et E.C.3.2.1.52), coupure entre l'acide muramique et la partie peptidique (E.C.3.5.1.28), ou encore au sein même des chaînes peptidiques du peptidoglycane (peptidases). Plusieurs hydrolases du peptidoglycane de spécificités différentes, et même parfois plusieurs hydrolases de même spécificité mais différentes biochimiquement, peuvent coexister au sein d'une même paroi. Certaines de ces hydrolases appelées autolysines (ou parfois "suicidases") sont capables d'induire l'autolyse, et de conduire à l'éclatement de la bactérie. Les hydrolases du peptidoglycane semblent jouer un rôle dans toutes les circonstances où le remodelage du peptidoglycane est nécessaire à la vie de la cellule (division, sporulation, élongation...). Mais leur rôle exact demeure encore souvent controversé dans la littérature. Leur caractère ubiquitaire en revanche semble au fil des publications de plus en plus probable.A ce jour, des hydrolases de peptidoglycane ont été décrites chez au moins 50 espèces bactériennes entrant dans une vingtaine de genres bactériens différents, appartenant aux bactéries Gram(+) et Gram ( -) : Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Listena, Arthrobacter, Propionib acteriu m, Enterococcus, Eschenchia coli, Micrococcus, Myxobacter, Neisseiria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Lactococcus, Streptomyces, kSebsiella. (Rogers,H.J., Perkins H.R. and Ward J.B., 1980; The bacterial autolysins, dans: Microbial cell walls and membranes. Chapman and Hall, London; Schockman G.D. and J.V. Holtje, 1994, Microbial peptidoglycan (murein) hydrolases. Comprehensive biochemistry, dans: Bacterial cell wall (Ghuysen J.M. Hakenbeck R. eds), Elsevier, London; Bernardsky G., Beveridge T.J. and Clarke A., 1994. Analysis of the sodium dodecyl-sulfate stable peptidoglycan autolysins of select gram-negative pathogens by using renaturing gel electrophoresis J. Bacteriol. 176, 5225-5232. Buist G., Kok J., Leenhouts K.J., Dabrowska M., Venema G., and Haandrikman A.J., 1995, Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the major peptidoglycan hydrolase of Lactococcus lactis, a muramidase needed for cell separation. J. Bacteriol., 177, 1554-1563). Les méthodes d'étude des hydrolases du peptidoglycane ont longtemps impliqué une étape d'extraction de ces enzymes à partir de la paroi bactérienne, suivie de différentes étapes classiques de purification par chromatographie. Plus récemment, le clonage et le séquençage des gènes codant pour ces enzymes ont été décrits dans la littérature pour un certain nombre d'espèces. En 1989, une nouvelle méthode d'étude des hydrolases du peptidoglycane a été publiée (Leclerc et Asselin, 1989, Detection of bacterial cell wall hydrolases after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Can. J. Microbiol, 35, 749-753). Cette méthode est elle-même une adaptation pour les bactéries d'une méthode utilisée pour la détection des lysozymes dans les tissus animaux Asselin A., 1989 . Lysozyme activity in animal extracts after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Comp. Biochem. Physiol., 92B, 523-527). Elle consiste à réaliser une électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) d'un extrait des protéines d'enveloppe d'une bactérie en ayant inclus dans le gel d'acrylamide, lors de sa confection, un substrat sensible à l'action lytique des hydrolases bactériennes du peptidoglycane. Dans cet article, le substrat utilisé est constitué par des parois de Micrococcus luteus. Le substrat incorporé rend le gel opaque. Après migration, le gel est rincé dans l'eau distillée puis transféré dans un tampon contenant 1% de Triton X100, tampon dit de renaturation. Les hydrolases du peptidoglycane lysent le substrat qui les entoure là où leur migration s'est arrêtée. On obtient ainsi des bandes translucides au sein d'un gel trouble. L'électrophorèse étant réalisée en conditions dénaturantes et en présence de protéines marqueurs, on peut déterminer le poids moléculaire apparent (PM app.) des activités lytiques ainsi visualisées. Cette méthode a été utilisée depuis 1989 pour caractériser d'un point de vue fondamental les hydrolases du peptidoglycane (et plus particulièrement les autolysines) de nombreuses bactéries Gram(+) et Gram(-)(tableau 1). I1 ressort donc de l'analyse de l'état de la technique connu du demandeur que l'on ne connaissait pas de méthode fiable et pratique permettant à elle seule d'identifier l'espèce à laquelle appartient une bactérie donnée. La technique de migration des hydrolases du peptidoglycane n'avait été utilisée qu'à des fins de recherche fondamentale et en tout état de cause aucune corrélation n'avait été faite entre un profil de migration des hydrolases du peptidoglycane et l'appartenance à une espèce bactérienne Le demandeur a montré de manière surprenante qu'il était possible de corréler un certain profil d'activité des hydrolases du peptidoglycane avec une espèce bactérienne donnée. Une telle corrélation n'était en rien évidente au vu de l'état de la technique. En effet, de manière générale, les profils d'hydrolyse des diverses enzymes connues de l'homme du métier, autres que les hydrolases du peptidoglycane, ne permettent pas de telles corrélations. La mise en évidence par le demandeur de cette corrélation ne ressortait donc pas à l'évidence de l'état de la technique. Le demandeur a en outre montré la spécificité de ces profils d'hydrolase du peptidoglycane, un profil donné ne correspondant qu'à une seule espèce bactérienne. I1 a encore trouvé que ces profils étaient stables au sein d'une espèce donnée. La présente invention a pour objet un procédé d'identification d'un échantillon bactérien comprenant la succession d'étapes ci-après: a) obtention de manière connue en soi d'une préparation contenant les hydrolases du peptidoglycane de l'échantillon; b) migration de manière connue desdites hydrolases sur un gel contenant des substrats de ces enzymes; c) révélation par des moyens connus des bandes correspondant respectivement auxdites hydrolases; d) comparaison des distances de migration des bandes représentatives du poids moléculaire des enzymes et des formes respectives desdites bandes avec les distances et formes obtenues dans les mêmes conditions et sur le même type de gel à partir de souches connues ou de marqueurs de poids moléculaire, mis en mémoire;; e) analyse des résultats de ladite comparaison, conduisant à l'identification directe desdites espèces bactériennes contenues dans l'échantillon. Si l'espèce bactérienne fait partie des bactéries Gram(+), le substrat consiste avantageusement en des cellules entières de Micrococcusluteus. Si par contre l'espèce appartient au groupe des bactéries Gram(-), le substrat consiste avantageusement en des cellules entières, des parois ou du peptidoglycane de l'espèce bactérienne à identifier, ou d'une espèce proche. Préférentiellement, un marqueur de poids moléculaire protéique est mis à migrer sur le même gel que les hydrolases. Un tel mode de mise en oeuvre permet de vérifier la bonne marche de la migration. Néanmoins, dans des analyses effectuées en routine, l'addition d'un marqueur de poids moléculaire peut ne pas se révéler indispensable. Les hydrolases de peptidoglycane sont obtenues à partir de cultures de souches ou à partir de colonies de bactéries, par traitement des bactéries dans du tampon de Laemmli dont la composition est donnée dans le tableau 3. La suspension est centrifugée et le surnageant contenant les hydrolases est mis à migrer. L'électrophorèse est effectuée en conditions dénaturantes sur un gel, préférentiellement d'acrylamide, dans lequel a été inclus, lors de sa confection, un substrat sensible à l'action lytique des hydrolases du peptidoglycane. Elle est effectuée pendant une période adéquate, et les bandes correspondant aux hydrolases sont révélées par incubation du gel dans une solution contenant du Triton X 100. Les distances de migration des différentes bandes constituant le profil sont alors mesurées. Une comparaison entre ces distances de migration, et celles de bactéries déjà connues est alors effectuée. Cette comparaison peut avantageusement être mise en oeuvre à l'aide d'un moyen de comparaison informatique. Elle peut néanmoins être aussi effectuée par un opérateur, bien que la première solution soit préférable. Cette comparaison conduit alors à l'identification de l'espèce bactérienne à laquelle appartiennent les bactéries de l'échantillon. Diverses modifications peuvent être apportées à la méthode, en fonction des espèces bactériennes à identifier. Ainsi, la nature du substrat inclus dans le gel, le pourcentage d'acrylamide, le pH et la composition du tampon de renaturation, les conditions de migration, d'obtention et de préparation de l'échantillon à analyser peuvent être modifiés. Les profils d'hydrolases du peptidoglycane de nombreuses espèces bactériennes appartenant au genre Lactobacillus, Prnpionibacterium, Citrobacter, Leuconostoc, Lactococcus, Micrococcus, Pseudomonas, ont été établis en analysant plusieurs souches par espèce et notamment, de manière systématique, les souches types de ces espèces. Au sein d'une même espèce, le profil est extrêmement bien conservé, ce qui est caractéristique d'un bon marqueur taxonomique. Par exemple, chez Lactobacillus helveticus, 30 souches d'origines géographiques variées ont été analysées. Les profils obtenus caractérisés par les poids moléculaires apparents des bandes des hydrolases de peptidoglycane détectées sont identiques; seule l'intensité respective des bandes de lyse varie d'une souche à l'autre (figure 2). La même observation a été faite en comparant les profils de 12 souches de Lactobacillus acidophilus (figure 4), et 10 souches de Propionibacterium freudenreichii. De plus, pour chaque espèce, le profil des hydrolases du peptidoglycane est suffisamment différent pour être reconnaissable et pour permettre la distinction entre des espèces proches et de ce fait l'identification desdites espèces. C'est à la fois l'allure du profil (nombre de bandes, incurvation éventuelle, bandes majeures toujours présentes et bandes mineures plus aléatoires) et la mesure précise des poids moléculaires apparents de ces bandes de lyse qui permettent ensemble l'identification. I1 est intéressant de noter que la méthode selon la présente invention permet aussi l'identification de bactéries Gram(-) . Ceci est très important en vue d'une utilisation de l'invention dans le domaine médical, car nombre de pathogènes sont des bactéries Gram(-). Même dans un cas difficile où les espèces sont tellement proches qu'aucun critère phénotypique, obtenu par les méthodes décrites dans l'état de la technique, ne permet de les différencier en une seule étape avec certitude, l'utilisation de la méthode selon la présente invention a permis d'effectuer une telle différenciation. Ainsi, les souches des espèces Lactobacillus acidophllus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus et Lactobacillus gallinamm, du fait de leur extrême ressemblance phénotypique, étaient identifiées et classées comme des L.acidophilus jusqu'en 1980,date à laquelle l'hybridation ADN-ADN (Johnson J.L., Phelps C.F. Cummins C.F., London J., and Gasser F., 1980. Taxonomy of the Lactobacillusacidoplzilus group . Intern. J. System. Bacteriol., 30, 53-68 ; Lauer et al. (1980), a démontré une grande hétérogénéité dans cette espèce et la présence de six groupes d'homologie distincts. Quatre d'entre eux, les groupes Al, A2, A3 et A4, correspondent aujourd'hui à quatre espèces différentes L. acidophilus, L. crispatus, L. amylovorus et L. gallinarum respectivement.Or de nombreuses souches de L. acidophilus sont utilisées industriellement dans des laits fermentés ou des produits probiotiques et il convient de s'assurer qu'il s'agit bien de L. acidophilus et non d'une souche appartenant à l'une des trois autres espèces citées plus haut. I1 s'agit donc d'un cas de figure de différenciation difficile. La méthode phénotypique la plus performante décrite à ce jour pour les différencier (Uemora et al. 1994. Identification of species among the Lactobacillus acidophilus group by electrophoresis of lactate deshydrogenase. Anim.. Sci. Technol., (Jpn) 65, 112-119) est basée sur l'analyse des lactate deshydrogénases par électrophorèse en conditions natives. Toutefois, la méthode de Uemura et al. ne permet pas de différencier L. amylovonts de L. gallinantm sans expériences complémentaires. Or, comme le montre la figure 7, la méthode selon la présente invention permet, en une étape, la différenciation de ces quatre espèces de lactobacilles extrêmement proches. Un autre avantage du procédé objet de la présente invention est de permettre une identification très rapide des bactéries contenues dans un échantillon, puisque la réponse peut être obtenue en quelques heures. En outre, la mise en oeuvre de ce procédé ne nécessite aucun équipement lourd et coûteux et de ce fait est aisément réalisable. L'échantillon peut quant à lui être toute culture liquide ou toute colonie, ce qui constitue un autre aspect pratique intéressant du présent procédé. Enfin, cette méthode est non seulement fiable mais est universelle, puisqu'elle permet d'identifier toute bactérie. La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent. Dans ces exemples, de nombreuses souches bactériennes ont été utilisées afin d'illustrer les larges possibilités d'application du procédé de l'invention. Chaque fois a été indiqué le nom de l'organisme propriétaire de la collection où se trouve la souche considérée. I1 s'agit principalement de la collection CNRZ (Centre National de Recherche Zootechnique, CNRZ, Jouy en Josas France), laquelle appartient au réseau européen "MINE" des collections de microorganismes et de la collection CIP (Institut Pasteur, Paris). Certaines de ces souches sont également répertoriées dans d'autres collections internationales, et, dans ce cas, les numéros correspondants ont été également indiqués. Par exemple la souche CNRZ 223 T est une souche représentative de l'espèce L.Helveticus, qui porte également le numéro ATCC 15009. L'aptitude à la mise en oeuvre du procédé de l'invention a été ainsi illustrée très complètement. Les figures illustrant la présente invention sont les suivantes La figure 1 représente une molécule de peptidoglycane. Les sites d'attaque des différentes glycosidases, amidases et peptidases sont identifiés I à IV, correspondant aux activités suivantes I: Glycosidase, Endo-N-acétyl-muramylhydrolase (muramidase) (E.C.3.2.1.17): hydrolyse les liaisons acide Nacétylmuramoyl ss 1-4-N acétyl glucosamine. II. Glycosidase, endo-P-N-acétyl-glucosaminidase (glucosaminidase): hydrolyse les liaisons acide Nacétylglucosaminyl ss 1-4-acide N-acétyl muramique (E.C. 3.2.1.52). III. Amidase, N-acétylmuramyl-L-alanine amidase (E.C.3.5.1.28): hydrolyse la liaison entre la chaîne d'hexosamine et le pentapeptide. IV. Peptidase, endo- ou exopeptidase: hydrolyse les liaisons peptidiques au sein du pentapeptide ou les liaisons de pontage entre les pentapeptides. La figure 2 représente le profil de migration des hydrolases au sein de l'espèce Lactobacillus helveticus. Les hydrolases des souches suivantes ont été mises à migrer respectivement dans les puits a à k: a: CNRZ 32; b: CNRZ 67 (NCDO 384); c; CNRZ 223 T (ATCC 15009); d: CNRZ 241; e: CNRZ 243; f: LRTL 430; g: LRTL 590; h: LRTL 735; i: LRTL 1235; j: LRTL 1236; k: CNRZ 414. Les bandes retrouvées dans l'ensemble de ces souches migrent majoritairement entre 30 et 43 kD et sont schématisées sur la figure 2. La figure 3 est un profil de migration d'hydrolases de l'espèce Lactobacillus acidophilus . Les souches 1: CNRZ 204T (puits 1) ; 2: CIP 103600 (puits 2); 3: CIP 103595 (puits 3); 4: CIP 103691 (puits 4) et 5: CNRZ 55 (puits 5) ont été mises à migrer respectivement dans les puits 1 à 5. Les bandes retrouvées dans l'ensemble de ces souches migrent majoritairement entre 28,5 et 43 kD et sont schématisées sur la figure. La figure 4 correspond aux profils de migration d'hydrolases de 12 espèces du genre Lactobacillus. Les nombres de souches testées sont indiqués et les profils de migration sont schématisés. La figure 5 représente les profils de migration de trois espèces de Propionibacterium : P.acidipropionici, P. jensenii et P. thoenii. Les marqueurs de poids moléculaires sont aussi représentés sur la figure. La figure 6 représente un profil de migration d'hydrolases de bactéries appartenant aux genres Pseudomonas et Citrobacter et à 1 'espèce Esdzeridiia coli. La figure 7 est un profil de migration de quatre espèces appartenant au genre Lactobacillus: L. acidophilus (puits Al), L. cnspatus (puits A2) , L. amylovorus (puits A3) et L.gallinoum (puits A4). EXEMPLES: Protocole général d'obtention des profils d'hydrolases de peptidoglycane a) PréParation de l'échantillon: Les souches sont cultivées dans un milieu et à une température adéquate pour leur croissance (en bouillon, ou en gélose) jusqu'a une densité optique à 650 nm de 1 environ ou une taille de colonie de 2 à 5 mm. Dans le cas d'une colonie à identifier, celle-ci est placée directement dans 30 ijl à 50 p1 de tampon de Laemmli (tableau 2). L'ensemble est chauffé 2 minutes à 100'C, puis centrifugé (1000g, 10 min.) et 20p1 de surnageant sont chargés sur le gel. Dans le cas d'une culture liquide à identifier, au moins 5 ml de culture sont centrifugés (10.000g x 10 min.), le surnageant est écarté et le culot est resuspendu dans 1 ml d'eau distillée, puis centrifugé à nouveau (10000g x 10 min). Le surnageant est de nouveau écarté. 50 pl de tampon de Laemmli (tableau 2) sont ajoutés au culot cellulaire, la suspension est mélangée au vortex, puis chauffée 2 min à 100 C à l'exception de l'exemple 3. La suspension est ensuite centrifugée (10000g x 10 min, température ambiante) et 20 pi du surnageant sont finalement chargés sur le gel. Ce surnageant peut être stocké, congelé à -20'C, en vue d'une analyse ultérieure. b) Préparation du gel d'acrvlamide pour l'électrophorèse et nature du substrat inclus: La composition des gels réalisés pour les exemples 1 à 4 est donnée dans le tableau 2. La nature du substrat inclus et, lorsque c'est nécessaire, la préparation de celui-ci sont indiquées dans chacun des exemples 1 à 4. Pour une bactérie Gram(+) inconnue, on peut utiliser comme substrat des cellules entières de M. luteus, comme indiqué dans l'exemple 1. Pour une bactérie Gram(-), on peut utiliser les parois de la souche considérée comme indiqué dans l'exemple 3. c) Conditions de migration et d'incubation du gel aPrès électrophorèse pour la révélation des hydrolases: L'électrophorèse a été réalisée à l'aide d'un système Biorad (mini-proteanII). La migration est effectuée au potentiel de 180V constant pendant 45 min, à température ambiante. Après électrophorèse le gel est aussitôt rincé sous agitation dans de l'eau distillée (30 min) à température ambiante puis incubé dans des solutions de natures variables (précisées dans chacun des exemples 1 à 4) mais qui contiennent toutes de 0,1 à 1% de Triton X100, sous agitation douce. La température d'incubation est également indiquée dans chaque cas.Pour une bactérie inconnue, on incube le gel dans un tampon tris-HC1 50mM ayant un pH entre 7,0 et 8,0, pH 8,0 à 30 C si la souche est mésophile, à 37 C si elle est thermophile. Après électrophorèse, les gels sont colorés au bleu de méthylène si l'on désire les prendre en photos (le bleu de méthylène permet d'augmenter le contraste des bandes de lyse). loyal d'un marqueur de poids moléculaire (marqueur précoloré, de 20 à 112 kDa, référence Biorad 161-0305) est chargé sur chaque gel, ce qui permet d'estimer le poids moléculaire apparent (PM app) des bandes de lyse observées. La présence d'un marqueur est très importante. d) Lecture des Profils: Dès que les bandes de lyse sont révélées, on note leur nombre, leur intensité, et on détermine précisément leurs poids moléculaires apparents. Le profil des hydrolases de peptidoglycane est alors comparé au profil de référence, que l'on a établi au préalable pour la ou les espèces suspectees. EXEMPLE 1: Identification de 12 espèces différentes appartenant au genre Lactobacillus. Espèces: L. acidophilus, L. bavaricus, L. brevis, L. curvatus, L. delbrueckii L. fennentum, L. gasseri, L. helveticus, L. jensenii, Ljohnsonii, L. reuteri, L. sake. - Les gels et la migration sont réalisés comme indiqué dans le protocole général. - Substrat inclus dans le gel: cellules entières lyophilisées de Micrococcus luteus; à raison de 0,2% (p/v). - Préparation de l'échantillon: les souches sont cultivées sur bouillon MRS (de Man J.C., Rogosa M., and E. Sharpe, 1960. A medium for the cultivation of the Lactobacilli., (1960) J. Appl. Bacteriol., 23, 130-135) à 37 C pour les espèces thermophiles et à 30 C pour les espèces mésophiles, jusqu'à une densité optique (D0650) de 1 environ, mesurée par un spectrophotomètre à 650 nm (ce qui correspond grossièrement à un poids sec cellulaire de 0,3 mg/ml). 8 ml de culture sont centrifugés (10000g x 10 min), le surnageant est écarté et le culot est resuspendu dans 1 ml d'eau distillée puis centrifugé à nouveau (10000g x 10 min).Le surnageant est de nouveau écarté. 8Opl de tampon de Laemmli (composition indiquée dans le tableau 2) sont ajoutés au culot, la suspension est mélangée à l'aide d'un vortex, puis chauffée 2 min à lOOeC. La suspension est ensuite centrifugée (10000g x 10 min, température ambiante). 20p1 de surnageant sont finalement chargés sur le gel. - Conditions d'incubation du sel après électrophorèse: tris-HCl pH 8,0, 25 mM contenant 1% de Triton X100, à 37 C; les bandes de lyse apparaissent au bout d'une minute à 3 heures d'incubation. Les résultats sont présentés sur les figures 2,3 et 4. Il ressort clairement des figures 2 et 3 que les profils sont identiques d'une souche à l'autre à l'intérieur d'une même espèce. La figure 4 montre que les profils sont différents d'une espèce à une autre et clairement reconnaissables. EXEMPLE 2: Identification de 3 espèces appartenant au genre Propionibacterium. Espèces: P. jensenii, P. acidipropionici et P. thoenil Ces trois espèces de bactéries propioniques laitières sont rencontrées dans les milieux laitiers (lait, fromages divers....). - Les gels et la migration sont réalisés comme indiqué dans le protocole général. - Substrat inclus dans le gel: cellules entières de Propionibactenum jensenii; ce substrat est préparé comme suit: une souche de P. jensenii est ensemencée dans 500 ml de milieu YEL (bouillon lactate de sodium classique pour la croissance des propioniques) et incubée à 30 C jusqu'à une densité optique 650nm de 1 environ. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (10000g x lOmin), lavées une fois dans de l'eau distillée (10000g x lOmin) et remises en suspension dans 5 ml d'eau distillée. La suspension est ensuite autoclavée (121 C, 15min) et conservée à 4 C après autoclave. 200pl de cette suspension sont ajoutés au mélange des différents constituants du gel d'acrylamide (tableau 2). - Préparation de l'échantillon: les souches sont cultivées sur bouillon YEL à 30"C jusqu'à une densité optique (D00650) d' environ 1. Les cellules de 8 ml de culture sont récoltées par centrifugation (10000g x lOmin), lavées une fois à l'eau distillée (10000g x 10 min) et soumises à un traitement d'extraction des hydrolases du peptidoglycane (au culot sont ajoutés 100p1 de LiCl 1M, lh, à 4 C, sous agitation douce). La suspension est à nouveau centrifugée (10000g x lOmin), le surnageant est mélangé volume à volume avec le tampon de Laemmli, et l'ensemble est chauffé pendant 2 min, à 100"C. 20p1 sont ensuite chargés sur le gel d'électrophorèse. - Tampon d'incubation du sel après électrophorèse: KCl 0,lM à 1M contenant 1% de Triton X100, à 40 C. Les bandes de lyse apparaissent au bout d'une minute à 24 heures. - Les résultats sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que l'on peut distinguer les bactéries de ces 3 espèces par le procédé selon l'invention. EXEMPLE 3: Identification de bactéries Gram(-): Pseudomonas fluorescens. Citrobacter diverses. Citrobacter freundii et Escherichia coli. Les gels et la migration sont réalisés comme indiqué dans le protocole général. Substrat inclus dans le gel: Parois de Citrobacterdiversus préparées comme suit: la souche CNRZ 57.41 est cultivée dans 500 ml de milieu BHI (Biokar) à 37 C, jusqu a une densité optique à 650 nm de 0,7. Les cellules sont récoltées par centrifugation, lavées une fois en eau distillée et remises en suspension dans 2 ml d'eau distillée. La suspension est ensuite autoclavée (121 C, 15 min). Cette suspens ion est soumise à deux passages successifs (1000 bars) dans une presse de French afin d'entraîner la rupture des cellules.Après ce traitement, les cellules encore entières sont éliminées par une centrifugation basse vitesse (3000g, 15 min) et le surnageant est centrifugé (50 000g, 30 min à 4 C). Le culot obtenu, contenant les enveloppes bactériennes, est remis en suspension dans 20 ml de Tris-HCl 10 mM pH 8,0, contenant 5mM MgCl2 et 2% (v/v) de Triton X100. L'incubation est maintenue 30 minutes à température ambiante. La suspension est de nouveau centrifugée (50 000 g, 30 min à 4 C), et le culot remis en suspension dans 1 ml d'eau distillée. 500 pl de cette suspension sont ajoutés lors de la confection du gel. PréParation de l'échantillon: Les souches sont cultivées dans 30 ml de milieu BHI, à 37 C jusqu'à une densité optique de 1 environ, mesurée avec un spectrophotomètre à 650 nm. La culture est centrifugée (20 000 g, 15 min à 4 C) et lavée dans de l'eau distillée. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans 1 ml de tampon phosphate de sodium 25 mM, pH 7,0, puis soumises à l'action de la presse de French (1000 bars, 15 min), et centrifugées (50000 g, 15 min à 4 C). Le culot est remis en suspens ion dans 70 pî de tampon de Laemmli et incubé à température ambiante au moins 1 heure. L'échantillon n'est pas chauffé à 100 C contrairement aux autres exemples.La suspension est centrifugée à 20 000g x 30 min, et 20 pi de surnageant sont chargés aussitôt sur le gel. Conditions d'incubation du gel après électrophorèse: Tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,0, contenant 10 mM MgCl2 et 0,18 de Triton X100, à 37 C sous agitation douce; les bandes de lyse apparaissent au bout de 2 heures d'incubation et sont plus nettes après stockage du gel à 4 C. Les résultats sont présentés dans la figure 6. EXEMPLE 4: Identification de auatre espèces extrêmement proches phyllogénétiquement: Lactobacillus acidophilus, L. crispants. L. amylovorus, L. gallinarum. - Les gels et la migration sont réalisés comme indiqué dans le protocole général. - Substrat inclus dans le gel: cellules entières de Lactobacillus helveticus préparées comme suit: la souche ISLC5 est cultivée en bouillon MRS jusqu'à une densité optique (DO) de 1 environ, à 37 C, centrifugée, lavée une fois en eau distillée et remise en suspension dans un volume d'eau distillée 100 fois inférieur au volume initial de culture puis la suspension est autoclavée (121 C, 15min). 200 pî de cette suspension sont ajoutés lors de la confection du gel (tableau 2). - PréParation de l'échantillon: les souches sont cultivées sur bouillon MRS (de Man et al précédemment cités), à 37 C jusqu'à une densité optique (DO650) de 1 environ mesurée par un spectrophotomètre à 650 nm. 8 ml de culture sont centrifugés (10000g x lOmin), le surnageant est écarté et le culot, resuspendu dans 1 ml d'eau distillée est centrifugé à nouveau (10000g x lOmin). Le surnageant est de nouveau écarté (ce lavage à l'eau distillée est facultatif). 80p1 de tampon de Laemmli sont ajoutés au culot, la suspension est mélangée à l'aide d'un vortex, puis chauffée 2min à 100'C. La suspension est ensuite centrifugée (10000g x lOmin, température ambiante). 20p1 de surnageant sont finalement chargés sur le gel. - Conditions d'incubation du gel aPrès électrophorèse: tris-HCl pH 8.0, 25mM contenant 1% de Triton X100, à 37 C; les bandes de lyse apparaissent au bout d'une minute à trois heures. Les résultats sont présentés dans la figure 7. Ils montrent que lon peut distinguer par la méthode selon l'invention les diverses espèces anciennement regroupées sous l'unique appellation d 'Acidophilus. TABLEAU 1 Bactéries où les hydrolases du peptidoglycane ont été visualisées sur gel d'acrylamide conformément à la méthode de Leclerc et Asselin (1989) Référence Espèce Nature du substrat inclus dans le gel Leclerc et Asselin, 1989 Micrococcus luteus Cellules M. luteus (*) ou parois de l'es Bacillus cereus pèce correspondante Bacillus megaterium* Bacillus subtilis Clostridium perfringens* Streptococcus faecalis* Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Sugai et al., 1990 Staphylococcus aureus (x10) M.luteus ou cellules de S.aureus Jayaswal et al., 1990 Staphylococcus aureus parois ou parois-SDS de S.aureus Foster, 1992 Bacillus subtilis parois B. subtilis ou cortex de spores de B.megaterium Watt and Clarke, 1994 Pseudomonas aeruginosa parois-SDS de P.aeruginosa Bernadsky et al., 1994 Pseudolmonas aeruginosa parois-SDS de P. aeruginosa Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Buist et al., 1995 Lactococcus lactis ( x n) cellules M.luteus ou parois L.lactis (cremoris & diacetylactis) TABLEAU 1 (suite) Bactéries où les hydrolases du peptidoglycane ont été visualisées sur gel d'acrylamide conformément à la méthode de Leclerc et Asselin (1989) Smith and Foster, 1995 Bacillus subtilis probablement parois de B. subtilis Bacillus megaterium Bacillus licheniformis Bacillus circulans Bacillus amyloliquefaciens Yabu and Kaneda, 1995 Staphylococcus aureus cellules S. aureus autoclavées Valence and Lortal, 1995 Lactobacillus:19 espèces cellules M.luteus ou cellules L.helveticus autoclavées Wuenscher et al., 1995 Listeria monocytogenes cellules de M. luteus Lemée et al. 1995 Propionibacterium cellules autoclavées freudenreichii P.freudenreichii TABLEAU 2 Composition des gels Gel de séparation (14%) Gel de concentration(4%) Solutions de base Substrat= Substrat autre, cellules lyo- nclus sous forme philisées de liquide (200 l) M. luteus (20 mg) Eau distillée 2,7 2,5 3,05 Tris HCl 1,5M pH 8,8 2,5 2,5 Tris HCl 0,5M pH 6,8 - - 1,25 SDS (10% p/v) 0,1 0,1 0,05 PAA 4,66 4,66 0,65 APS 0,05 0,05 0,025 Temed 0,005 0,005 0,005 PAA : Solution stock de polyacrylamide (Acrylamide/bis: 30% T, 2,67% C) APS: Persulfate d'ammonium (10% p/v) Les quantités (ml) sont données pour la fabrication de deux minigels d'un système miniprotean II Biorad. TABLEAU 3 Composition du tampon dit de Laemmli* Eau distillée 4 ml Tris HCl 0,5M pH 6,8 1 ml Glycérol 0,8 ml SDS (10% p/v) 1,6 ml ss-mercaptoéthanol 0,4 ml Bleu de bromophénol 0,2 ml (*) Laemmli, U.K. Nature, 227, 680 (1970). Références bibliographiques citées dans le Tableau 1. (l)Leclerc et Asselin, 1989. Detection of bacterial cell wall hydrolases after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Can. J. Microbiol., 35, 749-753. (2) Sugai M., Akiyama T., Komatsuzawa H., Miyake Y., and H. Suginaka, 1990. Characterization of sodium dodecyl sulfate stable Staphylococcusaureus bacteriolytic enzymes by polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacteriol., 172, 6494-6498. (3) Jayaswal R.K., Lee Y. and B.J. Wilkinson, 1990. Cloning and expression of a Staphylococcus aureus gene encoding a peptidoglycan hydrolase activity. J. Bacteriol., 172, 57835788. (4) Foster S.J., 1992. Analysis of the autolysins of Bacillussubtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacteriol., 174, 464-470. (5) Watt S.R. and A.J. Clarke, 1994. Initial characterization of two extracellular autolysins from Pseudoenonasaemginosa PAO1. J. Bacteriol., 176, 4784-4789. (6) Bernadsky G., Beveridge T.J., and Clarke A., 1994. Analysis of the sodium dodecyl-sulfate stable peptidoglycan autolysins of select gram-negative pathogens by using renaturing gel electrophoresis . J. Bacteriol., 176, 52255232. (7) Buist G., Kok J., Leenhouts K.J., Dabrowska M. Venema G., and Haandrikman A.J., 1995. Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the major peptidoglycan hydrolase of Lactococcus lactis, a muramidase needed for cell separation. J. Bacteriol., 177, 1554-1563. (8) Smith T.J. and S.J. Foster, 1995. Characterization of the involvement of two compensatory autolysins in mother cell lysis during sporulation of Bacillus subtilis 168. J. Bacteriol., 177, 3855-3862. (9) Yabu K. and S. Kaneda, 1995. Salt-induced cell lysis of Staphylococcus aureus. Current Microbiol., 30, 299-303. (10) Valence and Lortal, 1995. Zymogram and preliminary characterization of Lactobacillus helveticus autolysins. Appui. Environ. Microbiol., 61, 3391-3399. (11) Wuensher M.D., Kölher S., Bubert A., Gerike U., and W. Goebel, 1993. The iap gene of Ltsteriamonocytogenes is essential for cell viability, and its gene product, p60, has bacteriolytic activity. J. Bacteriol., 175, 3491-3501. (12) Lemée R., Lortal S., and J. van Heijenoort, 1995. Autolysis of dairy propionibacteria: isolation and renaturing gel electrophoresis of the autolysins of Propionibacterium freudenreichii CNRZ 725, Lait, 75, 345-364. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification d'un échantillon bactérien comprenant la succession d'étapes ci-après: a) obtention de manière connue en soi d'une préparation contenant les hydrolases du peptidoglycane de l'échantillon; b) migration de manière connue desdites hydrolases sur un gel contenant des substrats de ces enzymes; c) révélation par des moyens connus des bandes correspondant respectivement auxdites hydrolases; d) comparaison des distances de migration des bandes représentatives du poids moléculaire des enzymes et des formes respectives desdites bandes avec les distances et formes obtenues dans les mêmes conditions et sur le même type de gel à partir de souches connues ou de marqueurs de poids moléculaire, mis en mémoire; e) analyse des résultats de ladite comparaison, conduisant à l'identification directe desdites espèces bactériennes contenues dans l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'espèce bactérienne est une Gram(+) auquel cas le substrat consiste en des cellules entières de Micrococcus luteus. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'espèce bactérienne est une Gram(-) auquel cas le substrat consiste en des parois de Citrobacter diversus ou d'une autre espèce Gram(-). 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'un marqueur de poids moléculaire est mis à migrer sur le même gel que les hydrolases.