Brevet FR2741949A1 — publié le 19970606

Procédé de préparation de coupes de tissus végétaux et animaux sur lames de verre, destinées à l'examen au microscope, leur moyen de mise en oeuvre et lesdites coupes. La présente invention concerne un procédé de préparation de tissus végétaux et animaux sur lames de verre, destiné à l'examen au microscope, leur moyen de mise en oeuvre et lesdites coupes obtenues avec ledit procédé et lesdits moyens de mise en oeuvre. On connaît déjà un procédé classique de préparation de coupes biologiques ainsi que leur moyens de mise en oeuvre. L'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie impose de respecter au mieux les structures correspondant à l'état vivant que l'on veut observer. Les préparation cytologiques sont tranchées sur des appareils de tranchage, par exemple du type "MICROTOME", pour leur mise en oeuvre sur des lames de verre. Ces machines tranchent des pellicules de matière végétale ou animale préalablement incluses dans de la parafine, jusqu'à une épaisseur de l'ordre de 3 à 4Cl. A cette épaisseur, la pellicule de matière ainsi tranché se frippe. Avec ces machines il est quasiment impossible d'aller au-delà de cette épaisseur.Or le pouvoir de séparation des microscopes à photons est de 0,2Cl proportionnelle à la longueur d'onde du rayonnement. La profondeur de champ minimale de ce type de microscope est de 1,3 p. Cela rend délicat et plus long l'examen de coupes de 3 à 411 En outre le tranchage au "MICROTOME" présente d'autres inconvénients incontournables. Quelle que soit la qualité de l'affûtage et de la tenue des lames, le tranchant de l'outil en acier rapide présente une arête ayant toujours, même lorsqu'il est très bien affûté, un rayon au moins de l'ordre de grandeur du plus petit composant du métal.Dans le cas de l'acier rapide ou similaire, les agrégats de martensite et de ferrite, et la formation de grains réticulés, présentent une dimension limite du même ordre de grandeur que celui des éléments que l'on se propose de trancher. L'opération de tranchage ne peut donc pas couper correctement la matière biologique du fait de cette équivalence de dimensions entre l'arête et les composants de la matière biologique. n en résulte obligatoirement des arrachements et des déplacements de composants biologiques qui modifient la structure du matériau à observer ce qui représente la limite actuel des possibilités. Cela rend très difficile l'interprétation de ce que l'on "voit au mocroscope. En outre, la vitesse de coupe de l'outil est généralement définie manuellement.Ses variations induisent des différences d'épaisseur génantes et des modifications et variations locales dans l'arrachement et le déplacement de matière. Certains procédés lourds permettent d'obtenir de meilleurs résultats, mais dans la plupart des cas, le travail de l'outil est partiellement une coupe, et partiellement un repoussage avec arrachements et déplacement de matière, donc déformation de sa structure d'origine. En outre, la partie utilisable pour l'examen est celle qui est détachée du bloc. Elle se présente sous une forme plisée, chiffonnée, qui doit être soigneusement lissée pour pouvoir être ensuite collée sur une lame de verre. Ce mode opératoire perturbe encore dans la masse la coupe à examiner. Pour pallier cet inconvénient on a essayé le meulage de la surface avec des grains plus fins que ceux du couteau de tranchage. Le meulage présente l'inconvénient de boucher les creux et cavités avec des débris de matière enlevée, ce qui perturbe également l'examen de la coupe cytologique, en outre la meule est encrassée très rapidement. Pour éviter cet inconvénient, on a remplacé le meulage par le fraisage. Le brevet US-A4 060 440 revendique la préparation de coupes biologiques sur lame de verre, fraisées sur une fraiseuse classique, la coupe 15 étant fixé sur l'étau 14, les couteaux de la fraise pouvant être en diamant. La fraiseuse classique et les fraises disposnibles sur le marché ne conviennent pas lorsque l'on cherche à obtenir des épaisseurs de l'ordre du micromètre. Le serrage d'une lame dans un étau ou avec des moyens similaires la déforme et ne permet pas d'atteindre le micron. De très grandes précautions sont à prendre pour éviter la moindre déformation des lames pour conserver une régularité d'épaisseur de la coupe du matériau biologique. Cette précision doit être inférieure au micron. Le procédé classique de préparation de coupes cytologiquesde tissus végétaux et animaux sur lames de verre, destinées à l'examen au microscope, dans lequel les tissus à examiner subissent une succession de phases de préparation comprenant notamment une fixation en milieu toxique, une déhydratation dans un milieu alcoolique, un dégraissage dans un milieu solvant, une imprégnation dans la parafine, la solidification des tissus par refroidissement et le tranchage en lamelles très minces, le défrippage de la coupe, son dépôt et son collage sur une lame de verre, le déparafinage de la coupe, la réhydration dans un milieu alcoolique, le mordançage dans un milieu acide, la coloration de la coupe, le montage et le collage périphérique étanche d'une contre-lame de verre. Cette procédure courante, notamment en biopsie, est très longue, de l'ordre de trois à quatre jours et donc onéreuse. La solution au problème posé par ces inconvénients consiste donc, pour l'examen de coupes biologiques, à obtenir d'abord une épaisseur trés régulière de coupe de 1,3 micromètre sans arrachement de matière, sans déplacement ni déformation de la structure cellulaire et sans frippage, (cette épaisseur correspondant à la profondeur de champ des microscopes à photons), puis à immobiliser cette coupe sur une lame de verre sans modifier son épaisseur ni ajouter de surépaisseur de colle pour cette immobilisation, ni modifier la planéité de surface de la coupe. La durée des différentes opérations classiques de préparation de ces lames en vue de leur examen au microscope étant très longues et onéreuses, il est important de chercher à la raccourcir. Il est également important d'améliorer la qualité des photographies permettant de mémoriser les observations intéressantes effectuées au cours de l'examen des lames, et d'observer des détails non vus à l'examen direct, pour s'y reporter ultérieurement lorsque l'on veut effectuer des comparaisons. Le procédé selon l'invention a pour but de pallier ces inconvénients en apportant des solutions au problème posé, en réduisant notablement le temps de préparation des coupes de matériau biologique à examiner au microscope, en préparant des coupes d'épaisseur de l'ordre du micromètre, sans modifier la structure de la matière, avec une excellente qualité de surface et de précision d'épaisseur, en supprimant le collage des coupes sur les lames et en améliorant la qualité des photographies mémorisant les détails intéressants observés au cours de l'étude des coupes. Ces objectifs sont atteint avec le procédé selon l'invention. L'opération de collage des coupes sur une lame de verre est supprimée et remplacée par un nettoyage préalable desdites lames aux ultra-sons. Après cette opération, la coupe de matériau biologique adhère d'ellemême parfaitement sur la lame, sans risque de surépaisseurs irrégulières de colle. Grâce à l'utilisation de colorants qui ne nécessitent pas de mordançage, de nombreuses opérations du processus classique sont supprimées. L'obtention de coupes biologiques d'une épaisseur très précise, répétitive et d'un état de surface sans arrachement ni déformations de la structure de la cellule, s'effectue au moyen d'une machine spéciale de mise à épaisseur usinant la surface du matériau biologique à très grande vitesse. Elle utilise une fraise à pastilles de carbure de tungstène, de sillicium ou équivalents à grains très fins permettant d'obtenir une arête de coupe d'une extrême finesse, bien plus grande qu'avec des outils en acier rapide ou similaire, coupant convenablement le matériau biologique du fait que sont arète de coupe est plus petite que les composants du matériau à usiner évitant ainsi les arrachements et autres modifications de la structure à observer et donc de réalisant un surfaçage précis sur au moins un des côtés de la coupe. Le fraisage de mise à épaisseur des coupes à très grande vitesse s'effectue dans des conditions optimales. Trois variantes du procédé selon l'invention peuvent être mises en oeuvre: 1) à partir d'un matériau biologique inclu dans la parafine, comme dans la procédure classique, et découpé préalablement au MICROTOME en tranches de 10 à 201l, les phases suivantes sont mises en oeuvre : dépôt de l'échantillon découpé sur une lame de verre préalablement nettoyée aux ultra-sons, usinage d'une face d'appui de bonne qualité de planéité, retrait de la coupe et redépose sur sa face usinée, mise à épaisseur à 1,31l, déparafinage, réhydratation, mordançage, coloration, retrait de la grille, montage avec une deuxième lame; 2) à partir d'un morceau d'un matériau biologique frais de section correspondant aux coupes à déposer sur les lames, noyé dans un moule à parafine de Imm de profondeur, les phases sont les suivantes : dépôt direct de l'échantillon parafiné sur la table à dépression de la machine, obturation des trous de la table non utilisés, mise en dépression, usinage d'une face d'appui dépot direct, sans colle, de la face usinée de l'échantillon sur une lame préalablement nettoyée aux ultra-sons, mise à épaisseur à 1,3Cl par fraisage, coloration directe de l'échantillon avec un colorant ne nécessitant pas de mordançage, montage de la deuxième lame; 3) à partir d'un matériau frais congelé pouvant être lyophilisé ou non, coupé aux dimensions, les phases sont les suivantes: dépôt direct de l'échantillon frais sur la table à dépression, congélation locale de l'échantillon, usinage d'une face d'appui, dépose de l'échantillon congelé par sa face usinée sur une lame de verre préalablement nettoyée aux ultra-sons, mise à épaisseur de l'échantillon maintenu congelé, coloration après remise à température ambiante, avec un colorant nécessitant ou non mordançage, montage de la deuxième lame; 4) à partir d'un matériau biologique selon les préparations pour la microscoipie électronique. Les lames portant les coupes à fraiser sont immobilisées par dépression sur la surface d'un bloc à dépression d'une planéité parfaite. Les avantages du procédé selon l'invention et de son moyen de mise en oeuvre sont les suivants: - Respect de la structure cellulaire du matériau végétal ou animal à examiner au microscope par usinage à grande vitesse avec un outils muni de pastilles de carbure de tungstène ou similaire à arète très fine et angle de coupe aigu. - Obtention de coupes d'une épaisseur très régulière de 1,3 11 d'épaisseur et d'une surface parfaitement plane, sans arrachements, déplacements ou modification de sa structure. - La couche observable de la coupe est celle demeurant en place après l'opération de mise à épaisseur. - Réduction très importante du temps global de préparation des lames et du coût correspondant. - Amélioration de la qualité des photographies prises en cours d'examen microscopique des coupes à cause de l'ajustement de l'épaisseur de la coupe avec la profondeur de champ du microscope. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit en référence aux dessins annexés donnés à titre non limitatif, dans lesquels on a montré: - figure 1, un exemple de machine de mise à épaisseur du matériau biologique, vu de côté; - figure 2, une variante de la figure 1; - figure 3, une vue en coupe d'un bloc à dépression pour l'immobilisation des lames porteuses d'une coupe biologique; - figure 4, une vue partielle du bloc à dépression recevant simultanément au moins deux lames; - figure 5, une vue de dessus d'une version de bloc à dépression comportant deux groupes de trois lames. La préparation de la matière biologique, végétale ou animale à examiner, peut être effectuée selon l'une des trois variantes suivantes du procédé selon l'invention: 1) à partir d'un échantillon de matériau biologique inclu dans la parafine comme dans la procédure classique et découpé préalablement au MICROTOME en tranches de 10 à 2011 pour qu'elles soient faciles à manipuler sans déformation de structure.Les phases suivantes sont mises en oeuvre: dépôt de l'échantillon sur une lame de verre préalablement nettoyée aux ultrasons, les lames doivent être parfaitement parallèles et d'épaisseur constante étant donné la très faible épaisseur recherchée ainsi que pour éviter qu'elles ne soient attaquées par la fraise, dressage d'une face d'appui, retrait de la coupe et redépose sur sa face usinée, mise à épaisseur à 1,311, déparafinage de l'échantillon tranché, réhydratation, mordançage, coloration, montage avec une deuxième lame; 2) à partir d'un échantillon de matériau biologique frais de section correspondant aux coupes à déposer sur les lames et d'une épaisseur d'au moins lmm, noyé dans un moule à parafine ou autre produit similaire pour le solidifier; les phases sont les suivantes : dépôt direct de l'échantillon parafiné sur la table à dépression, obturation des trous de la table non utilisés, mise en dépression, usinage d'une face d'appui, dépot direct, sans colle, de la face usinée de l'échantillon sur une lame préalablement nettoyée aux ultra-sons, mise à épaisseur à 1,3Cl par fraisage, coloration directe de l'échantillon avec un colorant nécessitant ou non un mordançage, montage de la deuxième lame; 3) à partir d'un matériau frais congelé coupé aux dimensions, d'une épaisseur de moins de lmm, les phases sont les suivantes: dépôt direct de l'échantillon frais sur la table à dépression, congélation locale de l'échantillon, usinage d'une face d'appui, dépose de l'échantillon congelé par sa face usinée sur une lame de verre préalablement nettoyée aux ultra-sons, mise à épaisseur de l'échantillon maintenu congelé, coloration après remise à température ambiante, avec un colorant nécessitant ou non mordancage, montage d'une seconde lame. Les lames portant les coupes à fraiser sont immobilisées par dépression sur la surface de la table de fraisage. La double opération de surfaçage améliore notablement la qualité de la coupe du fait de la régularité de son épaisseur une fois amenée à l'épaisseur de l,3u correspondant à la profondeur de champ du microscope à photons. La suppression du collage de la coupe sur la lame de verre, étant donné la très faible épaisseur recherchée, élimine le risque de ne retrouver que de la colle en fin de mise à épaisseur à 1,3Cl. La coloration est effectuée directement sur l'échantillon à examiner, préférablement sans mordançage, dans une solution par exemple dEEMALUN-EOSINE, de teinture d'iode, de bleu de méthylène, de mercurochrome ou autre colorant non agressif. On évite le mordançage en utilisant des colorants qui ne nécessitent pas cette opération pour rendre visible la matière organique normalement translucide, donc invisible. On a recours au mordançage que si la coloration est insuffisamment performante. La machine de mise à épaisseur des coupes biologiques à 1,3Cl, représentée sur les figures 1, 2 et 5, 6 a été imaginée spécialement pour résoudre le problème posé par le tranchage des coupes. Les machines existant sur le marché ne permettent pas d'obtenir des résultats suffisamment fiables et répétitifs à cette épaisseur et pour ce type de coupe. On a montré sur la figure 1 un premier exemple d'une telle machine selon l'invention. Elle comporte: - Un bâti lourd et indéformable I constitué d'un bloc de fonte de caractéristiques mécaniques moyennes, stabilisé au four avant usinage et reposant sur des patins anti-vibratoire 2. - Une moto-broche 3 de très haute précision à 30.000 tr/mn, ou mieux encore, une broche tournant sur paliers fluide à une vitesse de l'ordre de 60.000 tr/mn. Le nez de broche reçoit une fraise 5 parfaitement équilibrée pour éviter les moindres dispersions d'usinage. Elle comporte des pastilles rapportées chacune sur un support 6 réglable en hauteur dans le corps d'outil 5. Les pastilles sont en matériau très dur et dont les grains sont les plus fins possibles, tels que le carbure de tungstène, de sillicium ou équivalents ou encore en diamant industriel.La très grande finesse des grains constitutifs permet d'obtenir une arète de coupe de la plus extrême finesse, bien supérieure à celle des outils en acier rapide ou similaire, utilisés sur les microtomes, pour éviter les arrachements et déformation de la structure du matériau et donc d'obtenir un surfaçage très précis et d'une excellente planéité. Bien entendu, de très grandes précautions doivent être prise pour son affûtage. L'angle de coupe de ces pastilles doit être très aigu, comme par exemple celui utilisé pour les outils de fraisage du bois. - Un chariot 7 à déplacement vertical sur lequel est fixée la broche 3. La vis de la glissière micrométrique de ce chariot est prévue avec une démultiplication de mouvement donnant une avance par tour de 1/10p. Elle peut être soit à déplacement manuel, soit motorisée. La position des arêtes de la fraise peut faire l'objet d'une référence zéro à partir d'une position haute calibrée, et son déplacement vertical pourra être commandée à partir des différences d'épaisseurs de la lame de verre et de l'épaisseur de coupe que l'on veut obtenir, ici 1,311. Cette épaisseur pourra être obtenue par exemple en deux passages de la fraise, un passage d'ébauche et un passage de finition à l'épaisseur recherchée. Dans le cas préférable où l'on désire effectuer une passe de surfaçage pour redéposer la coupe sur cette nouvelle surface de façon à conserver une épaisseur la plus régulière possible après l'usinage final, on peut prévoir trois passes en aller-retour d'une valeur prédéfinie. - Un chariot 8 à déplacement horizontal à glissières micrométriques, entraîné par un moteur pasà-pas comportant une avance rapide d'approche et une avance lente d'usinage. - un poste de contrôle d'épaisseur 10 à affichage numérique permettant d'apprécier le 1/10 de micron, - Un dispositif de maintien à température constante de l'ensemble de la machine au moyen dune circulation d'eau maintenue à 20 C. - Un bloc à dépression 20 qui sera présenté plus loin sur la figure 3, et son équipement d'aspiration et de réfrigération. - Une enceinte thermostatée à air sec en légère surpression pour éviter le givrage lors du fraisage de coupes réfrigérées. Sur la figure 2 on a montré une variante de constitution de la machine d'usinage des coupes. La broche 3 est montée fixe sur le bâti 1. Elle comporte un premier chariot 15 à déplacement vertical, fixé verticalement sur le bâti, son axe de déplacement micrométnque étant rigoureusement parallèle à celui de la broche. Ce chariot est également mû manuellement par une vis de très haute précision, par l'intermédiaire d'une poignée 16 à vernier différentiel indiquant le 1/10 de micromètre, et/ou comme le chariot 7 de la figure 1.. Un second chariot 17, à déplacement horizontal sur une glissière micrométrique, est fixé rigidement sur le la face d'appui verticale du chariot 15, rigoureusement perpendiculaire à l'axe de la broche 3 et à l'axe longitudinal du chariot 15. Ce chariot 17 est entraîné de la même façon que le chariot 9 de la figure 1.La face d'appui du chariot 17 est verticale alors que celle du chariot 9 est horizontale. On a également montré le bloc 20 à dépression recevant les lames avec leur coupe à usiner. La figure 3 montre une vue en élévation d'un bloc 20 à dépression fixé sur le chariot 9 ou 17 de la machine des figure 1 ou 2 par rapport à la position dégagée 21 de la fraise 5. On a montré une buse 22 de réfrigération de la coupe pendant la phase d'usinage et un palpeur micrométrique 23 à affichage numérique fournissant le 1/10 de micromètre. Le palpeur 23 est montré en cours de contrôle d'épaisseur de la coupe 24 adhérent à la lame de verre 25 en place sur la surface 26 de pose du bloc à dépression 20. Le bloc d'acier 20 est fixé sur le chariot horizontal 9 ou vertical 17 par l'intermédiaire d'une cale entretoise en matériau à faible coefficient de transmission thermique, évitant ainsi de modifier la température du chariot 9, luimême relié au circuit de maintien à température constante.En variante, ce bloc 20 peut être fixé sur des colonnes réduisant le pont thermique entre le bloc et le chariot 9 ou 17. Le bloc 20 comporte un ensemble de trous 28 débouchant sur la surface 26 de pose des lames 25. Ces trous peuvent être réunis, pour chaque lame, par une gorge de faible profondeur pour accroître la surface déprimée et donc la tenue des lames sur la surface de travail 26. Cette surface 26 est usinée de non à présenter une excellente correction géométrique de planéité et un poli miroir pour faciliter r Pour le maintien d'échantillons frais 24, posés directement sur la surface 26 en absence de lame de verre 25 on a prévus une série de trous plus petits, disposés dans un espace d'une surfice plus faible que celle desdits échantillons 24. Ces trous, non représentés, sont disposés à proximité des trous 28 d'immobilisation des lames de verre. On peut aussi utiliser une plaque intermédiaire lavable disposée au droit des trous 28, mais munis d'un nombre de trous plus importants et plus petits au droit de la zone de dépose des échantillons. Ces trous étant reliés par des rainures pour Iiiiiliter raspiration sur la totalité des trous de la plaque intennediaire. La figure 3 montre également un circuit de réfrigération constitué par exemple par des trous 40 d'arrivée du fluide réfrigérant et 41, 42 de sortie vers le recyclage, percés dans la partie infaieure du bloc 20. Ce circuit de réfrigération peut être remplacé par au moins une cellule à effet Peltier. La température de réfrigération est de l'ordre de - 20 . Le bloc 20 sera préalablement mis à température stabilisée avant de commencer l'usinage des coupes. I1 en sera de même pour la température constante de la machine. La machine sera disposée dans une enceinte thermostatée à hygromérie contrôlée pour conserver un air sec et en surpression, particulièrement au niveau des coupes à usiner pour éviter le givrage sur le bloc 20 en cours d'usinage d'échantillons réfrigérés. On peut remplacer le circuit de réfrigération ou la cellule à effet Peltier par une buse située au droit de la fraise et refroidissant localement la coupe à usiner par un jet de gaz uniquement pendant la durée de chaque passe de fraisage et seulement lorsque l'on utilise un matériau biologique frais. Ce jet de gaz peut être refroidi par une détente quasi adiabatique obtenue par des moyens connus, par exemple ceux utilisant une génération par vortex. Ce jet de gaz permet de provoquer un refoidissement local très rapide de la masse de l'échantillon à usiner en ne perturbant que très peu le positionnement des éléments mécaniques, mais créant une petite réserve de froid local sur le matériau biologique, sur la lame et sur son environnement très proche. Si le bloc à dépression 20 est également refroidi et bien isolé thermiquement par rapport au chariot sur lequel il est fixé, les variations dimensionnelles locales au voisinage de la lame induites par la détente du jet de gaz; ne devrait pas excéder 0,1CI et seront constantes. Lorsque les coupes biologiques sont incluses dans la paraffine, le système de refroidissement n'est pas utilisé. La mesure d'épaisseur de la coupe de matériau végétal ou animal, est réalisée par mesures différentielles hors de la zone d'usinage de la coupe, d'une part de la lame de verre 25 donnant une référence zéro, puis sur la matière à usiner ou déià usinée 24. Cette solution est insuffisante à cause de la dispersion dûe à la définition du palpeur qui est de 11l. lly a un risque d'atteindre la plaque de verre. Un dispositif de mesure par interférences lumineuses lui sera préféré du fait de sa précision pouvant atteindre 0,2p. Toutes les données numériques de mesures et de pilotage des différentes opérations d'usinage et de mesure sont regroupées sur un tableau d'affichage numérique coopérant avec un boîtier de commande à distance. Par ledit boîtier on commande: 1) le contrôle d'épaisseur des lames de verre, 2) I'épaisseur de chaque passe, 3) la valeur différentielle de la passe de finition entre le niveau toujours connu des arêtes de coupe de la fraise par rapport à son niveau de dégagement et le niveau relevé du dessus des lames de verre, 4) l'écartement de la fraise pour effectuer des mesures, 5) la programmation de la longueur des courses verticales et horizontales et leur mémorisation au tableau d'affichage. La mémorisation des différents paramètres sur le tableau d'affichage permet de rendre la machine entièrement automatique et de la piloter hors de l'enceinte thermostatée. Lorsque l'on veut obtenir une grande précision d'épaisseur du matériau végétal ou animal à déposer sur les lames et que cette épaisseur est voisine du micron tout produit de collage représente une épaisseur parasite qui risque de perturber la qualité de la coupe que l'on veut obtenir. Pour éviter l'opération de collage du matériau biologique sur la lame de verre on effectue un nettoyage de ladite lame aux ultra-sons. Après un tel nettoyage, le matériau biologique "adhère" de lui-meme sur la lame. Sur la figure 4, on a montré un exemple de bloc 20 dont la surface 26 est prévu pour recevoir simultanément et parallèlement par exemple trois lames 25 avec leur coupe à usiner. Le nombre possible de lames est limité par le diamètre de la fraise. On peut prévoir la longueur du bloc à dépression pour pouvoir juxtaposer, comme montré figure 5, au moins deux groupes de trois lames 25 parallèles lorsque c'est nécessaire. Les positions de lames inutilisées sont obturées par des fåussses lames. Lorsque l'on veut usiner plusieurs lames simultanément, ces lames de verre sont alors apariées en épaisseur. REVENDICATIONS: 1 - Procédé de préparation de coupes de tissus de végétaux et d'animaux sur lames de verre, destinées à l'examen au microscope, dans lequel les tissus à examiner subissent une succession de phases de préparation en vue de leur collage sur une lame de verre, le montage et le collage périphérique sur une contre-lame de verre; caractérisé en ce que la préparation du matériau végétal ou animal à examiner est effectuée à partir d'un échantillon de matériau biologique frais de section correspondant aux coupes à déposer sur les lames, les phases successives du procédé sont les suivantes: dépôt direct de l'échantillon frais (24) sur la table à dépression (26), congélation locale de l'échantillon, usinage d'une face d'appui, dépose de l'échantillon congelé par sa face usinée sur une lame de verre, mise à épaisseur de l'échantillon maintenu congelé, coloration après remise à température ambiante, avec un colorant nécessitant ou non un mordançage, montage de la contre-lame. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de matériau biologique frais de section correspondant aux coupes à déposer sur les lames, est noyé dans un moule à parafine ou similaire, puis pour le dressage de la première face d'appui sur une lame de verre, est déposé directement sur la surface (26) de la table à dépression dont les trous non utilisés sont préalablement obturés avant sa mise en dépression pour l'usinage par fraisage de cette première face d'appui avant mise à épaisseur à 1,311. 3 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon de matériau végétal ou animal à mettre à épaisseur par fraisage, est inclu dans la parafine ou similaire et découpé préalablement au MICROTOME en tranches de 10 à 2011 pour qu'elles soient faciles à manipuler, caractérisé en ce que les phases suivantes sont mises en oeuvre : dépôt de l'échantillon (24) sur une lame de verre (25), usinage d'une face d'appui retrait et redépose de la coupe par sa face usinée sur une lame de verre (25), mise à épaisseur à 1,3Cl, déparafinage de l'échantillon usiné, réhydratation, mordançage, coloration, montage de la contre-lame. 4 - Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les lames de verre devant recevoir le matériau biologique, sont nettoyées préalablement aux ultra-sons, en ce que la coupe biologique est ensuite directement posée sur ladite lame sur laquelle elle adhère. 5- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'échantillon frais est posé sur une plaque intermédiaire munie de petits trous d'asspiration pour effectuer son dressage de face avant mise en place sur une lame de verre. 6 - Machine de mise à épaisseur de la coupe à examiner selon les revendication I à 3, comprenant un bâti, une broche rotative munie d'une fraise à pastilles rapportées et de moyens de déplacement vertical et horizontal, manuels ou motorisés, caractérisée en ce qu'elle comporte:: -unbâti (1), - une moto-broche (3) de très haute précision à au moins 30.000 trlmn, dont le nez reçoit une fraise (5) à pastilles rapportées chacune sur un support (6) réglable en hauteur dans le corps d'outil, en ce que lesdites pastilles sont en matériau très dur et dont les grains sont les plus fins possibles, tels que le carbure de tungstène ou équivalents, en ce que l'angle de coupe de ces pastilles est très aigu, - Un chariot (7) à déplacement vertical sur lequel est fixée la broche (3), en ce que la vis motorisée de la glissière nanomêtrique de ce chariot, est prévue avec une démultiplication de mouvement donnant une avance de 0,1 ij, - un chariot (8) à déplacent horizontal à glissières micrométriques, entraîné par un moteur pas-à-pas comportant une avance rapide d'approche et une avance lente usinage, - un dispositif de maintien à température constante de l'ensemble de la machine au moyen d'une circulation d'eau. - un bloc à dépression (20) comportant des moyens de fixation anti-pont thermique sur le chariot (8) et un équipement d'aspiration et de réfrigération, - une enceinte thermostatée à air sec. 7 - Machine de mise à épaisseur de la coupe à examiner selon les revendication 1 à3, comprenant un bâti, une broche rotative (3) munie d'une fraise à pastilles rapportées et de moyens de déplacement vertical et horizontal, manuels ou motorisés, caractérisée en ce qu'elle comporte:: - une broche (3) solidaire du bâti (1), - un premier chariot (15) à déplacement vertical, fixé verticalement sur le bâti, son axe de déplacement micrométrique étant rigoureusement parallèle à celui de la broche, en ce que la vis motorisée de la glissière nanométrique de ce chariot, est prévue avec une démultiplication de mouvement donnant une avance de 0,1 p par tour, - un second chariot (17), à déplacement horizontal sur une glissière micrométrique, est fixé rigidement sur le la face d'appui verticale du chariot (15), rigoureusement perpendiculaire à l'axe de la broche (3) et à l'axe longitudinal du chariot (15), en ce qu'il comporte une glissières micrométriques, dont la vis est entraînée par un moteur pà-pas comportant une avance rapide d'approche et une avance lente d'usinage, - un dispositif de maintien à température constante de l'ensemble de la machine au moyen d'une circulation d'eau, - un bloc à dépression (20) comportant des moyens de fixation anti-pont thermique sur le chariot (8) et un équipement d'aspiration et de réfrigération, - une enceinte thermostatée à air sec en légère surpression. 8- Machine selon les revendication 6 et 7, caractérisée en ce que la position des l'arètes de la fraise fiait l'objet d'une référence zéro à partir d'une position haute calibrée, en ce que son déplacement vertical est commandé à partir des différences d'épaisseurs de la lame de verre et de l'epaissalr de coupe que l'on veut obtenir, en ce que cette épaisseur est obtenue en deux passages de la fraise, un passage d'ébauche et un passage de finition à l'épaisseur recherchée. 9 - Machine selon les revendications 6 et 7, caracterisée en ce que la lame de verre (25) comportant la coupe biologique (24) est immobilisée sur la surface (26) de la table de travail du bloc à dépression (20) relié à un réservoir tampon lui-même mis en dépression par une pompe à vide et fixé sur ie chariot à déplacement horizontal (8, 17) de la machine, en ce que la mise sous vide de la suuce (26) du bloc (20) est obtenu par rintermcdiaire d'une électrovanne, le maintien de la dépression de référence du réservoir tampon etant contrôlée et pilotée par un vacuostat. 10 - Machine selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que la surface du bloc à dépression, recevant et immobilisant la lame, présente des caractéristiques de planéité de l'ordre du 1/2 micron et est rectifiée en présentant un aspect de surface du type poli miroir. 11 - Machine selon l'une des revendications 6 à 10 caracténsée en ce que la surface de travail (26) du bloc à dépression est percée d'au moins une rangée de trous reliés à un trou collecteur comportant un ajutage recevant un tuyau de mise en communication avec un résetvoir tampon mis sous vide par une pompe à vide pilotée par un vacuostat, en ce que la mise sous vide du bloc à dépression est commandé par un interrupteur agissant sur une électrovanne. 12 - Machine selon l'une des revendications 1, 2 et 6 à 11 caractérisée en ce que le bloc à dépression, recevant la lame avec sa coupe biologique à usiner, est réfrigéré par un dispositif de refroidissement. 13 - Machine selon l'une des revendications 1, 2 et 6 11 caractérisée en ce que la coupe biologique est refroidie localement par un jet de gaz agissant uniquement pendant la phase d'usinage de la fraise. 14 Machine selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle comporte des moyens de mesure par interférences lumineuses, mesurant par différence, répaissalr résiduelle de la coupe biologique avec une précision de 0,2Cl. 15 - Machine selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que la fraise utilisée pour la mise à épaisseur des coupes biologiques, comporte des pastilles rapportées en carbure de tungstène ou similaire, comportant des angles de coupe très aigus et une arète de coupe extrêmement fine et régulière, en ce que la fraise 5 est parfaiternent équilibrée. 16 - Machine selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que toutes les données numériques de mesures et de pilotage des différentes opérations d'usinage et de mesures sont regroupées sur un tableau d'affichage numérique coopérant avec un boîtier de commande à distance de ces opérations. 17 - Machine selon les revendications 6 à 11 caractérisée en ce que la surface de travail (26) du bloc à dépression (20) est prévue pour recevoir au moins une rangée de trois lames disposées parallelement ete elles. 18 - Coupes de matériau biologique réalisées avec le procédé et son moyen de mise à épaisseur selon les revendications précédentes.