Brevet FR2736831A1 — publié le 19970124

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ET PEPTIDIQUES POUR LE TRAITEMENT DE LA MYASTHENIE. La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques et peptidiques pour l'obtention de médicaments destinés à la prévention ou au traitement de la myasthénie autoimmune acquise. L1 invention concerne également les compositions pharmaceutiques et les vaccins comprenant les séquences nucléotidiques et peptidiques susmentionnées. La myasthénie (Myasthenia Gravis) est une maladie autoimmune qui se caractérise par un état de fatigabilité à l'effort et de faiblesse musculaire. Cette maladie est causée par des autoanticorps reconnaissant le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (RACh) sur le muscle, entravant ainsi la transmission neuromusculaire (1). Ces autoanticorps sont retrouvés dans les sérums de 85 % des patients (2) et une partie au moins d'entre eux sont pathogènes (3, 4). La présence et l'activation de cellules T helper participent à la pathogénèse de la myasthénie (5-9). Le thymus est supposé jouer un rôle direct dans la physiologie de cette pathologie, comme le confirme l'effet favorable de la thymectomie sur l'évolution clinique (10,11) et ses fréquentes anomalies morphologiques (5070 % d'hyperplasie, 10-15 % de thymome) (12-14). Plusieurs résultats expérimentaux sont fortement en faveur du rôle du thymus dans l'autosensibilisation primaire et/ou dans le déclenchement et la perpétuation du processus autoimmun : hyperactivité des cellules thymiques T et B (15-18), autoréactivité vis à vis du récepteur à l'acétylcholine au niveau des cellules B et T (18-23), présence de l'autoantigène (24), anomalies fonctionnelles des cellules épithéliales et en particulier un dérèglement de la production d'IL-6 (25). En bref résumé, la production des autoanticorps anti-RAch susmentionnés, est sous le contrôle des cellules T helper CD4+ restreintes au CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) de classe II. Les peptides issus de la dégradation de l'autoantigène, à savoir du RAch, dans les macrophages ou autres cellules présentant l'antigène, sont couplés à la molécule du CMII de classe 11, HLA DR. Les cellules T sont stimulées en reconnaissant ce complexe peptide-HLA DR, par l'intermédiaire d'un récepteur, encore désigné récepteur des cellules T, ces dernières ainsi stimulées pouvant à leur tour stimuler les cellules B qui vont produire des anticorps reconnaissant les RAch. L'aspect immunogénétique de la pathologie a été étudié par typage HLA sur un grand nombre de patients. Les haplotypes HLA DR3 ou DR5 ont été sérologiquement définis en corrélation avec la pathologie (26-28). Une forte association avec HLA DR3 a été trouvée chez les jeunes patients, avec une hyperplasie thymique (27). Le typage moléculaire a confirmé ces résultats (29) et a identifié les allèles HLA-DQ (DQA1*0501 et DQB1*0201) comme étant fréquemment exprimés chez les patients avec une hyperplasie thymique (30). De même que l'autoantigène RAch impliqué dans la myasthénie est bien caractérisé aux niveaux moléculaire et fonctionnel (31), et que de nombreux anticorps monoclonaux ont été produits (32), des épitopes B immunodominants ont été identifiés sur la sous-unité a (MIR, HIR) (33-35). Les épitopes des cellules T ont également été identifiés en utilisant des fragments recombinants et des peptides synthétiques (3640), révélant ainsi la nature multiépitopique de l'autoantigène. Le but de la présente invention est de fournir des médicaments destinés au traitement ou à la prévention de la myasthénie autoimmune acquise, ces médicaments comprenant des molécules susceptibles de se lier spécifiquement soit au segment du récepteur des cellules T capable de reconnaître et de se lier au complexe peptide-HLA DR susmentionné, soit au gène ou à l'ARN, notamment l'ARNmessager (ARNm), codant pour ce segment, et ce de manière suffisamment stable (ou dans un équilibre suffisamment durable) pour que soit le complexe susmentionné ne puisse plus se lier audit segment, soit le gène ou ARNm susmentionné ne puissent plus être traduits en séquence peptidique correspondant audit segment. Un autre but de la présente invention est de fournir des médicaments susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme de molécules capables de se lier spécifiquement au segment du récepteur des cellules T ou au gène ou à l'ARN codant pour ce segment. Un autre but de la présente invention est de fournir des médicaments utilisables en tant que vaccins contre la myasthénie, ces vaccins comprenant soit des molécules susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme d'anticorps capables de se lier spécifiquement au segment du récepteur des cellules T, soit des vecteurs contenant des séquences nucléotidiques codant pour des molécules susceptibles d'engendrer la production dans l'organisme d'anticorps tels que décrits ci-dessus. Il convient toutefois de noter que le récepteur T est très polymorphe. Il se compose de deux sous-unités a et ss, chacune codée par la combinaison de plusieurs gènes (V, D, J, C). 24 familles de gènes V ont été décrites pour la chaîne ss. Aucune corrélation entre les familles particulières de gènes codant pour les différentes régions des sous-unités a et 13 d'une part, et la myasthénie d'autre part, n'a été mise en évidence jusqu'à ce jour, si bien qu'aucune approche thérapeutique par blocage d'un segment spécifique du récepteur des cellules T ou d'un gène codant pour un tel segment spécifique, n'a pu être envisagée jusqu'à présent. La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs du fait que le segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T est étroitement lié à la myasthénie, et ce plus particulièrement chez les patients d'haplotype HLA DR3, à savoir chez les patients exprimant des molécules du complexe d'histocompatibilité de classe Il (HLA DR) du type HLA DR3. Il convient de préciser que l'on entend par myasthénie dans ce qui précède et ce qui suit, la myasthénie autoimmune acquise. Il sera fait référence dans la suite de ce texte aux figures 1 à 5 suivantes: - figure 1: séquence d'ADN (encore désignée SEQ ID NO 1) codant pour le segment Vu5.1 du récepteur des cellules T; - figure 2: séquence en acides aminés (encore désignée SEQ ID NO 2) comprenant le segment Vs5.1 susmentionné, ledit segment étant délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113, et étant précédé par un peptide signal délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 19; - figure 3: séquence d'ARNm (encore désignée SEQ ID NO 3) codant pour la séquence SEQ ID NO 2 susmentionnée, notamment pour le segment Vu5.1 susmentionné; - figure 4: séquence d'ADN antisens (encore désignée SEQ ID NO 4) complémentaire de la séquence représentée par SEQ ID NO 1; - figure 5: séquence d'ARNm antisens (encore désignée SEQ ID NO 5) complémentaire de la séquence représentée par SEQ ID NO 3. La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques ou peptidiques, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi - celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou - celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment V13 5.1, - celles susceptibles de coder pour un ARNm antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, ou - celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi - celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou - celles correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de séquences nucléoditiques ou peptidiques telles que décrites ciaessus, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie chez les patients d'haplotype HLA DR3. De préférence, les patients chez lesquels les médicaments susmentionnés sont susceptibles d'être utilisés pour prévenir ou traiter la myasthénie, sont des patients: - démarrant la maladie généralement avant d'avoir atteint une quarantaine d'années environ, - présentant une myasthénie généralisée, le plus souvent de forme sévère: grade IIB tel que défini selon la classification d'Osserman (41), - présentant un thymus hyperplasique, I'hyperplasie thymique étant définie à la fois par une masse thymique importante et la présence de follicules lymphoïdes (12-14), - présentant un taux d'anticorps dirigés contre le récepteur RAch supérieur à environ 10 nM (et susceptible d'être mesuré par la méthode décrite dans la référence (42). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléoditiques utilisées sont celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines.Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi: - la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 (voir figure n" 1), comprenant notamment la séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite séquence peptidique étant constituée par l'enchaînement de 94 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2 (voir figure n" 2), - tout fragment d'ADN d'au moins environ 15 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, susceptible de coder pour un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment peptidique étant luimême susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, - toute séquence d'ADN dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, ou d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 ou du fragment d'ADN susmentionnés, ladite séquence d'ADN dérivée étant susceptible de coder soit pour une séquence peptidique identique à la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou identique à un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, soit pour une séquence peptidique dérivée de celle représentée par SEQ ID NO 2, ou dérivée d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou d'un fragment peptidique tel que défini dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1. Il va de soi que par séquence peptidique susceptible d'engendrer la formation d'anticorps, on entend dans ce qui précède et ce qui suit, toute séquence peptidique capable, notamment lorsqu'elle se trouve dans la circulation sanguine d'un individu, d'élliciter une réponse immunitaire chez cet individu par production d'anticorps par le système immunitaire de ce dernier, ces anticorps étant capables de reconnaître spécifiquement et de former un complexe immunologique stable avec la séquence peptidique susmentionnée ou avec la séquence en acides aminés du segment Vss 5.1 susmentionné. Avantageusement, les fragments d'ADN susmentionnés comprennent environ 15 nucléotides à environ 408 nucléotides contigus, de préférence d'environ 60 nucléotides à environ 300 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, susceptibles de coder respectivement pour un fragment peptidique d'environ 5 acides aminés à environ 136 acides aminés contigus, de préférence d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2. Des fragments d'ADN préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et 339 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le segment Vss 5.1 délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, ledit segment étant précédé par un peptide signal délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 58 et 339 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le segment Vss 5.1 délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et 117 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et codant pour le peptide signal susmentionné délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 39 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. Des fragments d'ADN préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, sont ceux susmentionnés d'environ 60 nucléotides à environ 300 nucléotides comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la région CDR1 du segment Vss 5.1 et/ou tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la région CDR2 du segment Vss 5.1. Les régions CDR1 et CDR2 susmentionnées du segment VQ 5.1 ont pu être déterminées à partir des articles suivants: - Kronenberg et al., Ann. Rev. Immunol., 4: 529 à 591 (1986), - Novotny et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83: 742-746 (1986), - Chothia et al., The EMBO Journal, 7, n" 12, 3745-3755 (1988), - Claverie et al., Immunology Today, vol. 10, 10-14 (1989), - Davis et al., Nature, 334, 395402 (1988), - Jorgensen et al., Ann. Rev. Immunol., 10, 835-873 (1992), - Bellio et al., J. Exp. Med., 129, 1087-1097 (1994), - Prochnika-Chalufour, International Immunology, vol. 3, n" 9, 853-864 (1991), - Chien and Davis, Immunology Today, vol. 14, n" 12, 597-602 (1993). Des fragments d'ADN susmentionnés particulièrement préférés sont ceux comprenant: - tout ou partie de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 133 et 150 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1, et codant pour la région CDR1 de 6 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 45 et 50 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, et/ou - tout ou partie de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 199 et 243 de la séquence représentée par SEQ ID NO 1, et codant pour la région CDR2 de 15 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 67 et 81 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ADN dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, ou les fragments d'ADN susmentionnés, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les acides aminés constituant les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou les fragments peptidiques susmentionnés, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont choisies parmi celles susceptibles de coder pour un ARNm antisens, cet ARNm antisens étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 (voir figure n" 3), ledit ARNm étant codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment VP 5.1, à savoir par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1.Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi: - la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4 (voir figure n" 4), ladite séquence d'ADN codant pour l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5 (voir figure n" 5), susceptible de s'hybrider avec l'ARNm représentée par SEQ ID NO 3, - tout fragment d'ADN antisens d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, susceptible de coder pour un fragment d'ARNm antisens d'au moins environ 15 nucléotides contigus de l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5, ledit fragment d'ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini dessus, - toute séquence d'ADN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, ou d'un fragment d'ADN antisens tel que défini cidessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN antisens du fragment d'ADN antisens susmentionnés, ladite séquence d'ADN antisens étant susceptible de coder soit pour un ARNm antisens identique à celui représenté par SEQ ID NO 5, ou identique à un fragment d'ARNm antisens tel que défini cidessus, soit pour un ARNm antisens dérivé de celui représenté par SEQ ID NO 5, ou dérivé d'un fragment d'ARNm antisens tel que défini cidessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment d'ARNm antisens tel que défini ci-dessus, ledit ARNm antisens dérivé étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus. Il va de soi que les séquences nucléotidiques de l'invention représentées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 et SEQ ID NO 5, les séquences dérivées et les fragments de séquences de l'invention mentionnés cidessus, doivent être pris en considération comme étant représentées dans le sens 5' 3'. Ainsi, le premier nucléotide d'une séquence complémentaire dans le sens 5' X 3' telle que décrite ci-dessus, est le complément du dernier nucléotide de la séquence dans le sens 5' o 3' codant pour la séquence peptidique Vss 5.1 (ou par un fragment de cette séquence peptidique ou un peptide dérivé), le second nucléotide de cette séquence complémentaire est le complément de l'avantdernier nucléotide de la séquence codant pour la séquence peptidique Vss 5.1, et ainsi de suite, jusqu'au dernier nucléotide de ladite séquence complémentaire qui est le complément du premier nucléotide de la séquence codant pour la séquence peptidique Vss 5.1. L'ARNm antisens codé par la séquence complémentaire représentée par SEQ ID NO 4 susmentionnée est tel que, lorsque cet ARNm est représenté dans le sens 5' X 3', son premier nucléotide correspond au dernier nucléotide de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 codant pour la séquence peptidique Vss 5.1, et donc s'hybride avec le dernier nucléotide de 1' ARNm représenté par SEQ ID NO 3 codé par cette dernière, tandis que son dernier nucléotide correspond au premier nucléotide de la séquence d'ADN codant pour la séquence peptidique Vss 5.1, et donc s'hybride avec le premier nucléotide de l'ARNm codé par cette dernière. Ainsi, on entend par ARNm antisens dans ce qui précède et ce qui suit, tout ARNm codé par la susdite séquence complémentaire et représenté dans le sens inverse (3' o 5') du sens dans lequel est représenté l'ARNm codé par la séquence codant pour la séquence peptidique VP 5.1 (ou fragment ou peptide dérivé), ce dernier ARNm étant encore désigné ARNm sens (5' o 3'). Le terme d'ARN antisens s'adresse donc à une séquence d'ARN complémentaire de la séquence en bases de l'ARN messager, le terme complémentaire devant être compris en ce sens que chaque base (ou une majorité de bases) de la séquence antisens (lue dans le sens 3' o 5') est capable de s'apparier avec les bases correspondantes (G avec C, A avec U) de l'ARN messager (séquence lue dans le sens 5' o 3'). L'ARN antisens est un ARN produit par la transcription du brin d'ADN non codant (brin non-sens). Cette stratégie antisens est plus particulièrement décrite dans le brevet européen n" 240 208, ou dans "Antisense strategies" Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 660 (1992), Editors: Renato Baserga, David T., Denhardt, ou encore dans Médecine/Sciences, 10: 250-281 (1994), ou encore dans Grooke S.T., Lebleu B.: Antisens Research and Applications, New York: CRC Press Inc., 1993. On pense que l'inhibition de la synthèse d'une protéine selon la stratégie antisens, en l'oecurrence de la séquence peptidique Vss 5.1 dans le cas présent, est la conséquence de la formation d'un duplex entre les deux ARN complémentaires (sens et antisens) empêchant ainsi la production de la protéine. Le mécanisme cependant reste obscur. Le complexe ARN-ARN peut interférer soit avec une transcription ultérieure, soit avec la maturation, le transport ou la traduction ou bien encore conduire à une dégradation de l'ARNm. Avantageusement, les fragments d'ADN antisens susmentionnés comprennent environ 12 nucléotides à environ 30 nucléotides contigus, de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, susceptibles de coder respectivement pour un fragment d'ARNm antisens d'environ 12 à environ 30 nucléotides, de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides de la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5. Des fragments d'ADN antisens préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARNm antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 73 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARNm antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 355 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 4 et codant pour l'ARNm antisens délimité par les nucléotides situés aux positions 355 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5. Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ADN antisens dérivés susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, ou les fragments d'ADN antisens susmentionnés, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ARN antisens dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Avantageusement, les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique ou pour un ARNm antisens telles que décrites dessus, et utilisées dans le cadre de la présente invention, sont contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes comprenant les éléments nécessaires pour permettre la transcription des séquences nucléotidiques susmentionnées, notamment un promoteur et un terminateur de transcription. A ce titre, la présente invention a pour objet toute séquence nucléotidique recombinante contenant une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) de l'invention codant pour une séquence peptidique ou pour un ARNm antisens telles que décrites ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires pour la transcription de ces séquences, notamment un promoteur ou un terminateur de transcription. Le cas échéant, les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention comprennent une séquence nucléotidique codant pour une séquence en acides aminés, ladite séquence nucléotidique étant située en amont et/ou en aval de la séquence nucléotidique de l'invention, lesdites séquences nucléotidiques recombinantes codant ainsi pour une protéine hybride contenant une séquence peptidique telle que décrite ci-dessus de l'invention précédée et/ou suivie par une séquence en acides aminés, notamment une séquence en acides aminés susceptible d'augmenter le caractère immunogène de la protéine hybride par rapport à la seule séquence peptidique susmentionnée de l'invention. Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes susmentionnées de l'invention sont insérées dans des vecteurs, notamment dans des plasmides, susceptibles de permettre l'expression desdites séquences nucléotidiques recombinantes dans l'organisme. A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, contenant une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) telle(s) que définie(s) ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de vecteurs tels que décrits ci-dessus, notamment de plasmides, contenant des séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention, ces dernières contenant ellesmêmes au moins une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une séquence peptidique, telle que décrite ci-dessus, susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, pour l'obtention de vaccins contre la myasthénie, susceptibles notamment d'être utilisés en prophylaxie ou thérapie dans le cadre du traitement des patients décrits ci-dessus, ces vaccins étant encore désignés vaccins à ADN nu. A titre d'illustration, on peut citer les revues générales et celles plus spécifiques sur les vaccins à ADN nu suivantes: Ladenheim, Biofutur, mai 1995, pp. 15-21; Xiang et al., Virology, 199, 132-140 (1994); Xu and Liew, Vaccine, vol. 12, n" 16, 1534-1536, (1994); Cichutek, Vaccine, vol. 12, n" 16, 1520-1525, (1994); Danko and Wolff, Vaccine, vol. 12, n" 16, 1499-1502 (1994); Davis et al., Vaccine, vol. 12, n" 16, 1503-1508 (1994); Spooner et al., Gene Therapy, 2, 173-180 (1995); Manthorpe et al., Human Gene Therapy, 4, 419431 (1993); Whalen and Davis, Clinical Immunology and Immunopathology, vol. 75, n" 1, April, pp. 1-12 (1995); Ulmer et al., Science, 259, 1745-1749 (1993). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi celles complémentaires de tout ou partie de l'un des brins de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, notamment parmi des séquences nucléotidiques comprenant au moins environ 12 nucléotides contigus jusqu'au nombre maximum de nucléotides de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4 complémentaire de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, ou parmi des fragments d'ADN antisens tels que décrits ci-dessus, ou encore parmi des séquences d'ADN dérivées de tout ou partie de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4 ou des fragments d'ADN antisens susmentionnés, notamment par substitution, suppression et/ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées sont celles s'hybridant avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d 'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ces séquences nucléotidiques représentent elles-mêmes un ARNm antisens, cet ARNm antisens étant avantageusement constitué d'au moins environ 12 nucléotides contigus complémentaires de nucléotides de l'ARNm susmentionné.Avantageusement, de telles séquences nucléotidiques sont choisies parmi - la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, - tout fragment d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, ledit fragment étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 défini ci-dessus, - toute séquence d'ARNm antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ARNm antisens ou du fragment susmentionnés, ladite séquence d'ARNm antisens dérivée étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus. Avantageusement, les fragments d'ARNm antisens susmentionnés comprennent environ 12 nucléotides à environ 30 nucléotides contigus, de préférence d'environ 15 nucléotides à environ 20 nucléotides contigus de la séquence d'ARNm représentée par SEQ ID NO 5, susceptibles de s'hybrider avec l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 défini dessus. Des fragments d'ADN antisens préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 73 et 354 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, - de la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 355 et 411 de la séquence représentée par SEQ ID NO 5. Avantageusement, le pourcentage d'homologie entre les nucléotides constituant les séquences d'ARNm antisens dérivées susmentionnées et ceux constituant la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 5, ou les fragments d'ARNm antisens susmentionnés, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences peptidiques utilisées sont celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment V13 5. 1 du récepteur des cellules T humaines - Avantageusement, les séquences peptidiques susmentionnées sont choisies parmi:: - la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, - tout fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1 susmentionnée, - toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment VP 5.1. Avantageusement, les fragments peptidiques susmentionnés comprennent environ 5 acides aminés à environ 136 acides aminés contigus de préférence, d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps tels que définis ci-dessus. Des fragments peptidiques préférés sont ceux comprenant tout ou partie: - de la séquence peptidique de 114 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, cette séquence peptidique étant constituée successivement d'une part par les 40 acides aminés délimités par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2 et correspondant au peptide signal, et d'autre part, par les 94 acides aminés délimités par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - de la séquence peptidique de 94 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, - de la séquence peptidique de 19 acides aminés délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 19 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2. Des fragments peptidiques préférés sont ceux d'environ 20 acides aminés à environ 100 acides aminés comprenant tout ou partie de la région CDR1 et/ou de la région CDR2 susmentionnées du segment Vu5.1. Des fragments peptidiques susmentionnés particulièrement préférés sont ceux comprenant: - tout ou partie du peptide de 6 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 45 et 50 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, et correspondant à la région CDR1, et/ou - tout ou partie du peptide de 15 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 67 et 81 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2, et correspondant à la région CDR2. Avantageusement encore, le pourcentage d'homologie entre les acides aminés constituant les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, et ceux constituant la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou les fragments peptidiques susmentionnés, est d'au moins environ 60%, de préférence d'environ 90%. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les séquences peptidiques utilisées en tant qu'anticorps sont celles susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines.Avantageusement, lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec des séquences peptidiques choisies parmi - la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, - tout fragment environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, notamment tout fragment peptidique tel que décrit ci-dessus, ledit fragment étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, - toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment VP 5.1. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, codant pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ciaessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, codant pour un ARNm antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus. L'invention vise également les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que décrite(s) ciaessus, susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines. L'invention concerne également les vaccins, encore désignés vaccins à ADN nu tels que décrits ci-dessus, et comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telles que décrite(s) ci-dessus, susceptible(s) de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies ci-dessus, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis ci-dessus. L'invention a également pour objet les vaccins comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, susceptible(s) d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques et vaccins selon l'invention se présentent sous forme de préparations injectables, notamment par voie intraveineuse, de préférence par voie intramusculaire. L'invention concerne également les complexes formés entre les séquences nucléotidiques susmentionnées utilisées dans le cadre de la présente invention, et la séquence d'ADN ou d'ARN codant pour ledit segment Vss 5.1. A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet: - les complexes formés entre la séquence d'ADN complémentaire représentée par SEQ ID NO 4, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour ledit segment Vss 5.1; - les complexes formés entre la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière tels que définis dessus, avec tout ou partie de la séquence d'ARNm codant pour ledit segment Vss 5.1. L'invention concerne également les complexes formés entre les séquences peptidiques susmentionnées utilisées dans le cadre de la présente invention, et la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1. A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet les complexes formés d'une part entre les anticorps, soit directement administrés à un patient, soit engendrés par l'introduction dans l'organisme, ou par la production dans l'organisme (cas du vaccin à ADN nu), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou d'un fragment ou d'une séquence dérivée de cette dernière tels que définis dessus, et d'autre part tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1. Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont obtenues par toute méthode classique bien connue de l'homme du métier de clonage ou de synthèse nucléotidique. S'agissant de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, cette dernière a été clonée par Kimura et al., J. Exp. Med., 184, 739-750 (1988); son numéro d'accès dans Gene bank est le X04927. Les séquences peptidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont obtenues par toute méthode classique bien connue de l'homme du métier de synthèse peptidique en phase liquide ou solide. L'invention a plus particulièrement pour objet les polypeptides recombinants, et notamment la séquence peptidique correspondant au segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, à savoir la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou les fragments ou les séquences peptidiques dérivées susmentionnées, tels qu'obtenus par transformation de cellules (telles que des bactéries, notamment E. EAQiL des levures, des cellules d'insectes infectées par un Baculovirus, des cellules eucaryotes telles que les cellules Cos ou CHO) avec une séquence nucléotidique recombinante telle que définie cidessus, contenant une séquence d'ADN selon l'invention, notamment à l'aide d'un vecteur tel que décrit dessus. Par l'expression "polypeptides recombinants", on doit entendre toute molécule possédant une chaîne polypeptidique susceptible d'être produite par génie génétique, par l'intermédiaire d'une phase de transcription de l'ADN du gène correspondant, ce qui conduit à l'obtention d'ARN qui est par la suite transformé en ARNm (par suppression des introns), ce dernier étant ensuite traduit par les ribosomes, sous forme de protéines, le tout étant effectué sous contrôle d'éléments de régulation appropriés à l'intérieur d'une cellule hôte. Par conséquent, I'expression "polypeptides recombinants" utilisée n'exclut pas la possibilité que lesdits polypeptides comprennent d'autres groupements, tels que les groupements glycosylés. Bien entendu, le terme "recombinant" indique que le polypeptide a été produit par génie génétique, car il résulte de l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, de la séquence nucléotidique correspondante qui a été auparavant introduite dans un vecteur d'expression utilisé pour transformer ledit hôte cellulaire. L'invention concerne également les anticorps tels que décrits ci-dessus dirigés contre les séquences peptidiques utilisées dans le cadre de l'invention, et plus particulièrement ceux dirigés contre les polypeptides recombinants susmentionnés, notamment ceux dirigés contre la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière tels que définis ci-dessus. De tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec ces polypeptides, suivie de la récupération des anticorps formés. Il va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux. Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide susmentionné initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux. A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps humanisés ou chimériques tels qu'obtenus à partir de l'ADN codant pour les anticorps susmentionnés selon les méthodes classiques d'obtention de ces anticorps, ces méthodes étant décrites et commentées notamment dans: Winter G., Harris W.J., Immunology Today, vol. 14, n" 6, 243-246 (1993); Bach J.F. et al., Immunology Today, vol. 14, n" 9, 421425 (1993); Bach J.F., The Immunologist, 214, 135-137 (1994). Ces anticorps humanisés sont plus particulièrement caractérisés en ce que leur partie spécifique reconnaissant le fragment Vu5.1 est constituée d'une séquence en acides aminés d'origine animale, notamment de souris, tandis que leur partie non spécifique ne reconnaissant pas le segment Vu5.1 est constituée d'une séquence en acides aminés d'origine humaine. L'invention vise également les compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps humanisés susmentionnés en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention sera davantage illustrée dans la description détaillée qui suit de la mise en évidence de l'implication du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T dans la myasthénie autoimmune acquise chez des patients d'haplotype HLA DR3. Maternel et methodes Patients Les patients ont été suivis à l'hôpital Marie Lannelongue. Le diagnostic de la myasthénie a été effectué sur la base de caractéristiques cliniques, du décrément électromyographique et de l'effet positif de médicaments anticholinestérasique. Sept patients ont été sélectionnés dans cette étude, en fonction de critères précis. Ils sont jeunes, presque tous de sexe féminin, présentant une maladie généralisée, un thymus hyperplasique et un titre élevé en anticorps anti-RACh et ont de préférence développé récemment la pathologie. L'utilisation d'anticholinastérasique a été l'unique traitement. Les patients suivis par corticothérapie ont été exclus, car ce traitement modifie considérablement les populations thymiques (14). Le typage HLA a été déterminé par oligotypage selon la méthode décrite par (référence 29). L'hyperplasie est limitée au thymus caractérisé par la présence de centres germinatifs, tels que décrits par Rosai et Levine (13). La classification modifiée d'Osserman a été utilisée pour graduer la sévérité de la pathologie (41). Tous les patients ont une forme généralisée de la pathologie. Les patients présentant un degré de sévérité IIA, présentent une activité fonctionnelle modérément déréglée et une faiblesse modérée des muscles des membres ou oculaires. Les patients avec un degré de sévérité IIB présentent un grand dérèglement de l'activité fonctionnelle et des signes importants de faiblesse de la musculature des membres et bulbaire. Les anti-RACh ont été titrés en utilisant l'anti-RACh de muscle humain complexé avec l'a-bungarotoxine iodée telle que décrite dans (42). Isolement des cellules T thymiques et du sang périphérique Les thymus ont été obtenus à partir de patients myasthéniques ayant subi une thymectomie après prescription thérapeutique de cette dernière à l'hôpital Marie Lannelongue (Le Plessis-Robinson, France). Tous les thymus des sept patients étaient hyperplasiques et contenaient des follicules lymphoïdes tels que décrits dans (13,18). Les thymus ont été rincés dans du HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) et des suspensions cellulaires ont été obtenues par broyage en douceur du tissu thymique, suivi par un passage à travers une gaze stérile, lavage et congélation dans l'azote liquide jusqu'à utilisation. Après décongélation, une perte d'environ 15-20 % des thymocytes corticaux immatures CD1+ (CD4+ CD8+) a été observée, entraînant une augmentation proportionnelle du pourcentage de thymocytes médullaires matures CD4+CD8- et CD4-CD8+. Comme cette étude est essentiellement axée sur les cellules thymiques matures CD4 + (thymocytes sans CD8), ceci n'était pas préjudiciable. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues par centrifugation en gradient de densité de sang veineux recueilli sur EDTA. Les cellules isolées ont été lavées dans HBSS et congelées jusqu'à utilisation. Aucune altération des sous-populations de PBMC n'a été observée après décongélation, et la viabilité confirmée par exclusion de la coloration au bleu trypan, est supérieure à 95% au moment de l'utilisation. Svnthèse peptidique La synthèse et la purification des peptides correspondant aux positions 169-181 et 351-368 de la sous-unité a du RACh a été réalisée par la méthode en phase solide (43). La composition des acides aminés des peptides a été vérifiée par analyse en acide aminés. Les séquences en acides aminés de ces peptides sont décrites dans la référence 36. Les deux peptides correspondent à des domaines sélectionnés de la sous-unité cx du RACh. Le peptide 165-181 est extra cytoplasmique et correspond à une séquence avoisinant le site de liaison de l'cx- bungarotoxine sur la sous-unité a. Il contient un motif de 5 résidus (séquence 175-179) que l'on retrouve généralement dans les sites antigéniques connus des cellules T (44).Le peptide 351-368 est intracytoplasmique et correspond à une région fortement immunogène désignée HIR (35). Sa séquence est dans une conformation hélicoïdale dans la protéine intacte et par conséquent, présage d'un site antigénique selon Delisi et al. (45). De plus, les deux peptides contiennent un à deux résidus d'ancrage en position adéquate pour la liaison à la molécule HLA-DR3 qui, par ailleurs, représente un allèle HLA de classe II associé à la myasthénie, selon l'un ou l'autre des motifs de liaison décrits (46-50). Fragments recombinants RACh a L'ADNc de la sous-unité a du RACh humain contient l'exon P3A (51). Le plus grand fragment extracytoplasmique correspondant aux acides aminés 1-210, a été cloné sous forme de protéine de fusion dans un vecteur disponible commercialement (pMAL-C2, New England Biolabs, Beverly, MA) en aval du gène mal E qui code pour une protéine de liaison au maltose (MBP), et a été fortement exprimé dans E. coli. Un codon stop a été placé en position 211, afin d'assurer la terminaison de la traduction. La majorité (90 %) de la protéine de fusion était insoluble et trouvée sous forme de corps d'inclusion. Après extraction dans l'urée 8M des corps d'inclusion lavés, puis dialyse étape par étape dans des tampons avec des concentrations décroissantes d'urée pour la renaturation, la protéine de fusion était pure à 70 %. La protéine de fusion a ensuite été purifiée en une étape en utilisant l'affinité de la MBP pour le maltose, puis scindée en utilisant le facteur de coagulation Xa selon les recommandations du fabricant. Le fragment rl-210 a été purifié par électrophorèse préparative à élution continue avec un haut rendement (80-90 %) et un haut niveau de pureté. La pureté est un facteur critique car elle permet de minimiser le risque d'observer des réactions faussement positives aux protéines recombinantes en raison de contamination par des protéines bactériennes.Le fragment arl-120 a été stérilisé par filtration à travers des membranes de 0,22 ym et stocké à - 20"C jusqu'à utilisation dans des expériences de prolifération. Il entraîne l'apparition de réponses prolifératives des PBMC et des thymocytes de nombreux patients MG inclus ou non dans cette étude. Expériences de déplétion des sous-populations CD8 et Vss Les sous-populations de PBMC et lymphocytes thymiques exprimant CD8 (ainsi que les cellules doublement positives CD4+CD8+ de thymus) ont été déplétées par sélection positive des cellules CD8 +, en utilisant des billes paramagnétiques couplées à des anti-CD8 + (IObeads, Immunotech, Marseille, France), en suivant les instructions du fabricant. Pour les expériences de déplétion de la sous-population Vss, des billes paramagnétiques couplées à des immunoglobulines de souris liées à des anti-VssS ou des anti-Vss8 ont été utilisées selon les recommandations du fabricant (Immunotech) tout de suite après déplétion des CD8, et la culture a été effectuée selon la méthode décrite ci-dessus. Culture cellulaire pour l'analyse de l'expression du segment Vss des recepteurs des cellules T (TCR) Les PBMC ou les cellules T thymiques déplétées en CD8 ont été mises en culture pendant 6 jours dans des plaques à 48 puits (Falcon, Becton Dickinson) dans un milieu (RPMI 1640) complété avec 5 % de sérum AB humain, glutamine 2 mM, pénicilline 100 IU/ml, streptomycine 100 yg/ml, 1 % MEM acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, tampon hepes 10 mM (tous provenant de Gibco, Detroit, MI), ss-mercaptoéthanol 5 x 10-5M avec ou sans un peptide de synthèse sélectionné (5 yg/ml) ou le fragment rl-210 (5 pg/mi), puis de 1'IL-2 naturelle purifiée (10 U/ml) (Boehringer Mannheim, GmbH, Mannheim, Allemagne) est ajoutée pendant 2 jours.Au moins 10 puits (jusqu'à 15 puits) ont été préparés pour chacune des conditions de culture et ont été regroupés pour le procédé de marquage fluorescent. Dans les expériences d'inhibition utilisant les alloantisérums anti-DR3 spécifiques, le sérum a été additionné au début de la culture à une concentration variant de 0,1 % à 10 %. Immunofluorescence et cytometrie de flux Les analyses de cytométrie de flux à deux couleurs ont été réalisées 8 jours après stimulation avec l'IL-2 seule, ou peptide + IL-2, en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques anti-CD4 et anti-TCR-Vss. Les anticorps monoclonaux (mAbs) suivants, dirigés contre la région V du TCR ont été utilisés : anti-VssSa (reconnaissant VP5-2 et 5.3), anti-VssSb (reconnaissant Vss5-3 seulement), anti-Vss5c (reconnaissant Vus5.1 seulement), anti-Vss6a (reconnaissant un allèle allotypique, Vss6.7), anti-Vss8a (reconnaissant la famille Vss8), anti-Vssl2a (reconnaissant la famille Vss12), tous disponibles commercialement chez T Cell Sciences, Cambridge, MA. Tous les anticorps étaient couplés au FITC. L' immunofluorescence directe a été réalisée selon les instructions du fabricant.Pour le double marquage, après 3 lavages, une étape additionnelle consiste en une coloration avec un anti-CD4 conjugué à la phycoérythrine (Immunotech) pendant 30 minutes à 4"C. Après lavages, les cellules ont été incubées pendant 20 minutes avec 2 jg/ml d'iodure de propidium (PI, Becton Dickinson, Mountain View, CA) (52). Les cellules mortes ont été éliminées par coloration positive au iodure de propidium. Expérience de prolifération et de déplétion de la sous-population Vss Les cellules T périphériques ou thymiques déplétées en cellules CD8 ont été cultivées dans des puits de plaque de microtitration (Costar) (0,2 x 105 cellules/puits) dans le milieu décrit ci-dessus avec ou sans 5 Hg/ml de peptide. Après 6 jours, rIL-2 (10 U/ml) est additionnée et 2 jours après 1 yCi de thymidine tritiée (activité spécifique 6,7 Ci/mmole : New England Nuclear, Boston, MA) est ajouté à chaque puits pendant 18 heures. Les cellules sont ensuite récoltées et l'incorporation de thymidine tritiée détectée par comptage de la radioactivité sur des filtres de fibre de verre dans un compteur à liquide de scintillation (LKB, Bromma, Suède). Six puits identiques sont préparés pour chaque condition de culture. Les résultats sont exprimés en index de stimulation défini par: cpm avec peptide pour 106 cellules/cpm sans peptide pour 106 cellules. Lorsqu'indiqué, un alloantisérum anti-DR3 a été ajouté pour inhiber la prolifération cellulaire telle que décrite ci-dessus. Résultats Stratégie expérimentale. Afin de déterminer le répertoire des cellules T impliquées dans la réponse à des peptides de la sous-unité a du RACh, les thymocytes ou PBMC déplétés en CD8 provenant de patients myasthéniques ont été stimulés avec un peptide puis par 1'IL-2 pour permettre la régénération de récepteurs potentiellement modulés (53, 54). Les cellules furent ensuite récoltées et analysées par Immunofluorescence à deux couleurs et cytométrie de flux pour l'expression de CD4 et de Vss d'une part sur les petites cellules (au repos) et d'autre part sur les grandes cellules (activées). L'épuisement en cellules CD8+ a été très efficace dans les lymphocytes sanguins ainsi que dans les lymphocytes thymiques. L'analyse par cytométrie de flux donne moins de 0,5 % de cellules CD8+ ou de cellules CD4+CD8+ après déplétion. De plus, aucune expansion de cellules CD8 + n'a été observée après neuf jours de culture avec le peptide et IL-2. L'activation in vitro des cellules thymiques T CD4+ conduit à une blastogénèse qui peut être facilement identifiée par des paramètres de taille (FSC) et de granulosité (SSC). Les cellules blastiques activées apparaissent plus grandes et plus granuleuses que les cellules non blastiques, ces dernières ayant une taille et une granulométrie typique des lymphocytes pris ex-vivo non stimulés. Les cellules activées représentent environ 5 % à 12 % de la population totale dans la culture, sur la base de l'expression de DR et de CD25.L'analyse de l'expression de Vss par les cellules CD4+ après stimulation avec les peptides, a été réalisée avec des anticorps contre les membres des familles Vss5, Vss8, V136 et Vu12. Il est important de noter que, dans toute les analyses cytométriques, les cellules mortes ont été exclues par coloration à l'iodure de propidium. De plus, la spécificité de la liaison de l'anticorps à la région Vss des TCR a été confirmée par utilisation d'anticorps témoins de même isotype qui colorent moins de 0,5 % de cellules T dans les cultures. Une augmentation de la proportion de cellules blastiques, ainsi que des variations de la distribution des segments Vss au sein des cellules blastiques, sont considérées comme représentant une réponse significative au peptide. Lorsque l'analyse est effectuée sur l'ensemble des cellules vivantes, aucune différence mesurable n'est observée dans les cultures stimulées par les peptides du RACh en comparaison avec les cultures témoins non stimulées. Une augmentation mesurable de sous-populations Vss sélectives ne peut être observée que dans les cellules blastiques activées. C'est pourquoi l'analyse cytofluorographique a été effectuée sur une accumulation d'événements (plusieurs milliers) correspondant à la population activée vivante, permettant ainsi une détermination plus précise des cellules CD4 + exprimant un Vss donné. Expansion spécifique des cellules exprimant un VQ donne dans les cellules T thymiques matures CD4+ provenant de patients MG en réponse aux peptides synthétiques. Les expériences décrites ci-dessus ont été réalisées pour analyser l'expression du segment Vss en réponse aux antigènes dérivés du RACh chez 7 patients MG. L'analyse cytofluorographique de l'utilisation de la région Vss en réponse aux peptides 169-181 et 351-368 et au fragment recombinant rorl-210 du RACh, conduit aux observations suivantes. Chez un patient pris comme exemple (patient n" 2), la stimulation des cellules thymiques CD4+ avec le peptide 169-181 entraîne une augmentation spécifique et mesurable des cellules Vu5.1+ (de 5,3 à 14,4 %) et des cellules Vss8+ (de 7,4 à 10,4 %) alors que ce même peptide n'induit aucune augmentation des autres familles Vss testées.Le peptide 351-368 induit également une augmentation significative des Vu5.1+ dans les thymocytes CD4+ de ce patient. Le fragment recombinant rccl-210 a été utilisé initialement en tant que source de peptides susceptibles de pouvoir être naturellement générés. Toutefois, l'engagement de nombreux segments de gènes V13 dans la réponse des thymocytes et PBMC à ce fragment a conduit les inventeurs à utiliser une autre stratégie par utilisation de peptides sélectionnés pour étudier le répertoire de cellules T impliquées dans la réponse à l'autoantigène chez les patients MG. Quoiqu'il en soit, les expériences utilisant le fragment rl-210 confirment la nature multidéterminante de l'autoantigène RACh et spécialement celle de la chaîne cx qui a été intensément étudiée (3640). Afin de visualiser la stimulation spécifique de la région Vss par les peptides chez tous les patients de même que pour comparer de façon appropriée parmi différents patients les sous-populations de cellules T portant un segment Vss donné après stimulation peptidique, les résultats ci-après sont exprimés sous forme de différences calculées entre le pourcentage de cellules blastiques T CD4 + portant un segment Vss particulier après stimulation et le pourcentage de cellules T CD4 + portant ce segment Vss dans les cultures témoins (sans peptide). En terme de variation du répertoire des cellules T en réponse à un peptide, il est raisonnable de considérer qu'une différence de 2 % est significative. Par conséquent les différences supérieures à 2 % constituent des expansions significatives. Cela prend également en compte le fait que la fréquence des cellules répondant au peptide dans la myasthénie se situe entre 1/100 000 à 1/200 000 (55, 56) et que les variations dues aux erreurs d'analyse par FACSX sont habituellement évaluées à 0,5 %. Par conséquent, il est très signifiant que les cellules T portant Vu5.1 et, à un moindre degré Vss8, soient enrichies en grandes cellules après activation par les peptides. Sur les 6 patients étudiés, 5 présentent cette expansion de la région Vu5.1 dans les thymocytes. Le sixième patient qui ne présente pas d'expansion a des caractéristiques cliniques et biologiques qui sont précisées plus loin. Les différences négatives observées dans d'autres sous-populations Vss sont probablement dues à une compensation due à l'enrichissement en cellules Vu5.1+ (et Vu8+). L'expansion des Vu5.1 varie approximativement de 2 à 10 % dans les thymocytes stimulés avec p169-181, et de 2 à 4 % dans les thymocytes stimulés avec p351-368. Utilisation de segments V13 dans la réponse aux peptides synthétiques dans les PBMC De même que pour l'étude des thymocytes, les expansions n'ont pu être détectées que parmi les cellules activées, de sorte que seuls les résultats sur les cellules activées sont présentés. La prévalence de l'expansion des cellules exprimant Vu5.1 en réponse au peptide 169-181 est très nette dans les PBMC et concerne 6 des 7 patients étudiés, bien que des niveaux d'expansion moindres soient observés en comparaison avec les thymocytes. Par ailleurs, la restriction à Vu5.1 est plus marquée ; les autres familles ou autres membres de la famille V135 sont moins fréquemment utilisés, à l'exception de V138 qui est augmenté chez 3 patients sur 7. Peu d'expansions significatives ont été observées avec le peptide 351-368; elles n'ont impliqué que la famille Vus. 1 (sur 1 patient parmi les 7 étudiés, MG). Encore une fois, I'expansion des cellules exprimant Vu5.1 a uniquement été observée chez les cellules CD4+ activées en réponse aux peptides. La prolifération spécifique en réponse aux peptides est supprimée dans les cellules thymiques CD4 + après déplétion en Vus5.1 Des expériences de déplétion ont été effectuées pour étudier davantage la spécificité et la sélectivité de l'implication de Vu5.1 dans la réponse aux peptides synthétiques. Les cellules T thymiques CD4+ déplétées en cellules exprimant Vss5.1 ont été comparées aux cellules T thymiques CD4+ totales du point de vue de leur capacité proliférative en réponse aux peptides. Plus de 86 % d'épuisement en cellules exprimant Vss5.1 chez deux patients suppriment les réponses prolifératives aux peptides ainsi qu'au fragment recombinant rcrl-210. Analyse des résultats chez tous les patients étudiés Un résumé de l'analyse de l'utilisation des fragments VQ par les cellules T CD4+ de patients myasthéniques en réponse aux peptides 169-181 et 351-368, est représenté sur le tableau 2. Les différences d'expression de Vss calculée de la manière indiquée cidessus, et représentant la stimulation d'une population exprimant un Vss donné, révèlent la prévalence de l'expansion des cellules exprimant Vss5.1 en réponse au peptide 169-181 dans le thymus et à la périphérie. L'implication de Vss5.1 est moins nette en réponse au peptide 351-368. Elle apparaît au niveau des thymocytes ou PBMC provenant de patients chez lesquels la maladie s'est récemment déclarée. Dans tous les cas, et au moins en ce qui concerne les thymocytes, l'utilisation de Vu5.1 en réponse à ce peptide est observée exclusivement chez les patients sévèrement affectés. L'haplotype DR3 est fortement associé à l'utilisation de Vss5.1 dans la reponse au peptide 169-181 Tous les patients, sauf un, expriment l'haplotype DR3 (patient 7). Chez ce patient, le pourcentage de cellules Vu5.1 + CD4+ (thymocytes ou PBMC) n'est pas augmenté en réponse aux peptides 169-181 ni au peptide 351-368. De plus, lorsque les alloantisérums anti-DR3 spécifiques sont ajoutés dans les cultures, à la fois la prolifération consécutive au peptide 169-181 et l'expansion des cellules exprimant Vu5.1 ont été inhibées, ce qui indique que la molécule DR3 joue un rôle majeur dans le cadre de la présentation du peptide. En concluslon. Les cellules T reconnaissent un complexe formé d'un antigène peptidique lié à des molécules du CMII par l'intermédiaire d'un récepteur spécifique en tant que troisième composant d'un complexe trimoléculaire. Ces travaux fournissent pour la première fois des résultats montrant une association entre l'expression d'un gène TCR et la spécificité pour une combinaison particulière peptide du soi/CMH dans la myasthénie autoimmune acquise humaine. Ces résultats montrent l'utilisation récurrente d'un segment de gène du TCR encore appelé Vu5.1, en réponse au peptide synthétique 169-181 (et à un moindre degré au peptide p351-368) par les cellules T CD4+ thymiques et du sang périphérique dans un sous-groupe de patients myasthéniques partageant 1' haplotype DR3. Par conséquent, les interactions invivo impliquant le peptide 169-181 de la sous-unité a du RACh, les récepteurs des cellules T constitués du segment Vu5.1, et la molécule HLA DR3 sont fortement probables, ce qui autorise une immuno-intervention potentielle dans un sous-groupe de jeunes patients myasthéniques. Cette étude sur un groupe homogène sélectionné de patients myasthéniques présentant des signes cliniques communs tels qu'un thymus hyperplasique, une maladie généralisée et un titre élevé en anticorps, démontre une sélectivité Vss partagée entre différents patients dans la réponse immune cellulaire au peptide synthétique 169-181, (et à un moindre degré au peptide 351-368), de la sousunité a du RACh, qui est fortement associée à l'haplotype HLA DR3. La spécificité de cette expansion originale, mesurable, en réponse au peptide est appuyée par plusieurs arguments expérimentaux. Tout d'abord, elle est observée exclusivement dans la population des cellules blastiques activées, indiquant un effet réel du peptide sur l'expansion cellulaire, et pas seulement une sélection d'une population préexistante dans la culture.Deuxièmement, les artefacts dans l'analyse des résultats ont été soigneusement évités en excluant les cellules mortes des cultures en utilisant l'incorporation de l'iodure de propidium. De plus, les expériences de marquage fluorescent ont été réalisées avec des anticorps directement couplés au fluorochrome, et ont toujours inclus des contrôles négatifs. Troisièmement, I'expansion de Vu5.1 est comprise dans l'expansion de la population entière CD4+. Quatrièmement, les cellules T des patients répondent aux peptides par prolifération, et la déplétion en cellules exprimant Vu5.1 a inhibé cette prolifération. Cinquièmement, un alloantisérum anti-DR3 inhibe non seulement la prolifération au peptide 369-391, mais également l'expansion des cellules exprimant Vu5.1 en réponse à ce peptide. Il peut être apprécié que l'augmentation spécifique des cellules T CD4+ exprimant Vu5.1 après stimulation peptidique, est plus importante dans le thymus. Il est possible que les cellules T répondant au peptide proviennent du thymus au stade d'initiation de la maladie et migrent vers la périphérie où elles se trouvent à l'état actif chez les patients à début récent de la maladie. Le RACh est un autoantigène multiépitopique comme l'indique le grand nombre d'épitopes de cellules T, trouvés par différents groupes de recherche sur la sous-unité cx ainsi que sur les autres sous-unités (3640). L'approche des inventeurs est basée sur la sélection de deux peptides de la sous-unité a du RACh pour lesquels la réponse proliférative mémoire T chez les patients est corrélée aux données cliniques (titre en anticorps, sévérité de la maladie).Ces peptides sont par conséquent potentiellement pathogènes et impliqués dans la maladie (36) lorsque l'on prend en considération les arguments suivants 1) le rôle de ces peptides dans la réponse proliférative in vitro des cellules T mémoire de patients myasthéniques a également été confirmée par deux études indépendantes réalisées sur des patients italiens (39) et israéliens (40); 2) d'autres études ayant pour but de définir des épitopes de cellules T chez des patients myasthéniques, n'ont pas pris en compte la variation des formes cliniques de la maladie et les sous-populations de patients, et ont fourni des données sur peu de patients dont des patients âgés avec de faibles taux en anticorps, représentant une minorité parmi la population totale de patients myasthéniques (37, 57-59); ; 3) à la différence de plusieurs épitopes décrits dans la littérature, les peptides susmentionnés ne génèrent en général pas de réponse chez les témoins (22, 40,60). Le répertoire immun normal contient des cellules T autoréactives pour le RACh et d'autres autoantigènes (56, 61, 62,63), et il peut être admis que les spécificités des cellules T autoréactives les plus fréquentes dans le répertoire immun normal sont moins impliquées dans la maladie et vice versa; 4) le suivi, après thymectomie, de la réaction de PBMC de trois patients myasthéniques (non inclus dans cette étude) répondant au peptide p169-181 avant l'intervention, ne révèle aucune réponse proliférative une à deux années après l'intervention chirurgicale;; 5) l'expansion des cellules CD4 en réponse au peptide implique les cellules exprimant Vu5.1 chez tous les patients partageant l'allèle HLA-DRB 1*03. Le partage de spécificité de cellules T par différents patients myasthéniques exprimant un allèle HLA DR B1 commun (HLA-DR3), qui est par ailleurs associé à la maladie, démontre que les cellules ayant proliféré en réponse au peptide sont caractéristiques de la maladie. Tous ces points pris ensemble indiquent que les deux peptides sélectionnés dans cette étude présentant une réactivité associée aux données cliniques, sont susceptibles d'être impliqués dans la pathogenèse de cette maladie. La myasthénie est associée à une augmentation de la fréquence de l'allèle DR3 (26-30). cette association est plus évidente chez les femmes, chez les patients jeunes et chez les patients présentant une hyperplasie thymique (27). Par ailleurs, l'hyperplasie thymique est associée à un titre élevé en anticorps et à une forme généralisée de la maladie (1, 10, 14). Ceci expliquerait l'importance de l'expression de l'haplotype HLA-DR3 chez les patients sélectionnés uniquement sur la base des critères cliniques ci-dessus. Il faut noter que le seul patient n'exprimant pas l'haplotype HLA DRB1*03, ne présente pas d'expansion des cellules exprimant Vu5.1, que ce soit exvivo ou en culture après stimulation avec le peptide.Tous les patients HLA-DR3 expriment également HLA DQA1 501 et HLA DQB1 201, qui sont fortement liés avec HLA DRB 1*03. Plusieurs arguments sont en faveur du rôle d'HLA-DR3 dans la présentation du peptide de p169-181. Tout d'abord, toutes les lignées et les clones cellulaires dérivés de patients myasthéniques pour lesquels la restriction HLA a été examinée, sont restreints à la molécule DR, mais pas DQ ni SB (61, 64, 65). Deuxièmement, plusieurs lignées ou clones cellulaires dirigés contre la molécule RACh entière, ou de façon plus importante aux fragments extracytoplasmiques de la sous-unité a du RACh, ont été trouvés comme étant restreints à DR3 (60, 63, 66, 67). Toutefois, aucune donnée n'était disponible sur l'utilisation du récepteur des cellules T par de telles lignées cellulaires. Troisièmement, les deux peptides sélectionnés dans cette étude contiennent les résidus clés proposés et disposés selon les motifs consensus définis pour les peptides associés à HLA-DR3 (46-50). Enfin, la démonstration directe de l'implication de HLA-DR3 dans la présentation du peptide 169-181, est apportée par nos expériences d'inhibition de l'expansion des cellules CD4+ Vu5.1+ et de la prolifération en réponse au peptide par un alloantisérum anti DR3 spécifique chez deux patients testés. Par conséquent, les peptides utilisés dans cette étude sont des composants importants dans le complexe ternaire pour diriger l'expansion Vu5.1 observée. Finalement, cette étude a montré que des peptides potentiellement impliqués dans la maladie, présentés par la molécule HLA DR3 qui représente par ailleurs un allèle dominant dans la sous-population de patients myasthéniques de cette étude, sont responsables invitro de l'expansion spécifique et récurrente des cellules exprimant Vu5.1. Ceci peut être relié au fait que l'expression de Vus5.1 par des cellules de patients myasthéniques est généralement augmentée dans les populations T CD4+ thymiques analysées ex vivo.De plus, cette augmentation dans le thymus peut être le résultat d'un mécanisme de sélection actif conduisant à l'échappement de cellules autoréactives durant l'étape de différenciation de la population de cellules doubles positives CD4 + CD8 + exprimant faiblement CD3 vers celles exprimant fortement CD3. Ces résultats soulignent l'importance de l'interaction moléculaire dans le complexe ternaire représenté par la molécule HLA-DR3, le peptide 169-181 et les récepteurs des cellules T utilisant Vu5.1, dans la maladie, et ouvrent des perspectives à de nouveaux moyens thérapeutiques dans le cadre du traitement de la myasthénie, au moins dans la sous-population de patients décrite ci-dessus. Les moyens thérapeutiques actuels de la myasthénie sont la thymectomie, I'utilisation de composés anticholinestérasiques en association ou non avec des corticostéroides. Il n'a jamais été démontré que ces moyens thérapeutiques diminuent le processus de propagation de cette maladie, ou conduisent à des rémissions. Seule la thymectomie est bien admise pour les jeunes patients avec un thymus hyperplasique, et peut agir en supprimant la source de cellules T et B potentiellement autoréactives, ainsi que le site potentiel de réactivation du processus autoimmun (25). L'amélioration clinique après thymectomie est apparente après seulement une ou deux années. L'utilisation de composés anticholinestérasiques constitue seulement un traitement symptomatique difficile à équilibrer et pour lequel le risque de surdosage est permanent.Quant au traitement par les corticostéroïdes, celui-ci est accompagné d'effets secondaires sérieux. La suppression de la réponse immune au RACh chez les patients myasthéniques avec des moyens plus spécifiques améliorerait la prise en charge de ces patients. La fraction de cellule T spécifique de la maladie est probablement très petite chez les myasthéniques, et pourrait inclure les cellules portant Vu5.1 chez les patients HLA-DR3. Ceci pourrait expliquer la raison pour laquelle les approches expérimentales globales sur le répertoire Vss dans le cadre des maladies autoimmunes humaines ont connu un succès très limité. L'intérêt de notre étude a été de définir l'implication dans la pathogenèse d'une petite population de cellules T exprimant le Vu5.1 et représentant au maximum 5% des cellules T CD4+ comme cible potentielle d'une thérapeutique sélective et spécifique de la myasthénie chez un sous-groupe de patients homogène chimiquement et biologiquement et expriment l'haplotype HLA-DR3. Tableau 1 Données cliniques des patients myasthéniques Patient (a) Sexe Age(b) Début de la Titre en Histologie du Sévérité de la Typage HLA (f) maladie (c) anti-RACh Thymus (d) maladie (e) DRB1* DQA1* DQB1* 1 F 32 1 mois 752 hyperplasie (2) IIB 0301-1501 501-102 201-601 2 M 20 6 mois 21.8 hyperplasie (4) IIB 0301-04 501-301 201-301 3 F 31 8 mois 12.6 hyperplasie (3) IIA 03-13 501-102 201-604 4 F 20 9 mois 6.8 hyperplasie (2) IIB 03-1101 501-501 201-301 5 F 31 12 mois > 10.5 hyperplasie (2) IIA 0301-0101 501-101 201-501 6 F 22 13 mois 54.9 hyperplasie (4) IIB 0301-04 501-301 201-302 7 F 22 10 ans > 30 hyperplasie (4) IIB 0103-0101 501-101 501-301 (a) Tous les patients ont reçu un traitement anticholinestérasique. Les patients traités avec des corticoïdes ont été exclus de l'étude. (b) Au moment de la thymectomie. (c) Intervalle de temps entre l'apparition des premiers signes de myasthénie et la thymectomie. (d) Degré d'hyperplasie défini par la taille et le nombre de follicules lymphoïdes. (e) Graduation selon la classification d'Osserman. (f) Oligotypage par PCR. Tableau 2 Résumé des données chez tous les patients testés. r PBMC oc famille Vss | famille Vp EA 5.1 S.2 1 5.3 6.7 X 12 s S3 6.7 s Lll DRB1* HLA B10 MGl MGl ~ 51q53 6=1 II 301-150 501.102 DQB1, MG2~ I MG: ~ =~ 501-102 2,Q-301 Z MG3 MG3 O13 1 .1o2 --301 M MG4 ~ H~ ~ ~ ~ 03-1101 0-501 201.302 M MGS Wl MGåLB d 201-301 MG MCS ni ni ni ni ni ni 30110 501-301 201.301 MG? | ~ ~ == MC7| MG? 103010 501-101 501.301 MGl MCII 301-150 -l02 4OL M MG2 ~ l l Yiv 030144 | -301 MG3 c MG3 O13 501-102 201.604 Mninininini 03-1101 '' 501.501 | 20il301 MGS MG5 MG5| d | ni | d | 03014104 501-101 1201.501 MGd ~ ~ | 2 Muge 01 0301-04 | 501-301 201.302 MG? ~ l L Mi71 | olo3 103010 501-101 | Les cases remplies représentent une différence significative (d > 3%) en pourcentage de cellules exprimant VD entre les cultures témoins sans peptide et les cultures avec peptide. Noter la récurrence de l'utilisation du segment Vss5.1 chez tous les patients HLA DR3 testés (et pas chez le patient MG 7, non DR3), en réponse au peptide 169-181 à la fois au niveau des thymocytes et des PBMC. REFERENCES 1. Engel, A.G. 1986. Acquired autoimmune Myasthenia Gravis. In "Miology" (A.G. Engel and B.Q. Banker, Eds. pp. 1925-1954. Mac Graw-Hill, New York. 2. Fambrough, D.M., D.B. Drachman, and S. Satyamuri. 1973. Neuromuscular junction in myasthenia gravis: Decreased acetylcholine receptor. Science 182: 293-295. 3. Patrick, J., J. Lindstrom. 1973. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science 180: 871-872. 4. Gomez, C.M., and D.P. Richman. 1987. Chronic experimental autoimmune myasthenia gravis induced by monoclonal antibody to acetylcholine receptor: Biochemical and electrophysiologic criteria. J. Immunol. 139: 73-76. 5. Shinomiya, N. and J. Yata. 1981. B and T cell involvement in antiacetylcholine receptor antibody formation in myasthenia gravis. Clin. Exp. 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T cells from normal and myasthenic individuals recognize the human acetylcholine receptor: heterogeneity of antigenic sites on the cx-subunit. Ann. Neurol. 31: 311-318. 64. Hohlfeld, R., B.M. Conti-Tronconi, I. Kalies, J. Bertrams and K.V. Toyka. 1985. Genetic restriction of autoreactive acetylcholine receptor specific T lymphocytes in myasthenia gravis. J. Immunol. 135: 2393-2399. 65. Manfredi, A.A., M.H. Yuen, L. Moiola, M.P. Protti and B.M. Conti Tronconi. 1994. Human acetylcholine receptor presentation in myasthenia gravis. DR restriction of autoimmune T epitopes and binding of synthetic receptor sequences to DR molecules. J. Immunol. 152: 41654174. 66. Melms, A., J.R. Oksenberg, G. Malcherek, R. Schoepfer, C.A. Müller, J. Lindstrom and L. Steinman. 1993. Tell receptor gene usage of acetylcholine receptor-specific T-helper cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 681: 313314. 67. Hohlfeld, R., K.V. Toyka, K. Heininger, H. Grosse-Wilde and I. Kalies. 1984. Autoimmune human T lymphocytes specific for acetylcholine receptor. Nature. 310: 244-246. REVENDICATIONS 1. Utilisation de séquences nucléotidiques ou peptidiques, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie autoimmune acquise, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi - celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou - celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment V13 5.1, - celles susceptibles de coder pour un ARN messager (ARNm) antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment VP 5.1, ou - celles susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment VP 5.1, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi - celles susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ou - celles correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T. 2. Utilisation de séquences nucléoditiques ou peptidiques selon la revendication 1, pour l'obtention de médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la prévention ou du traitement de la myasthénie chez les patients d'haplotype HLA DR3, à savoir chez les patients exprimant des molécules du complexe d'histocompatibilité de classe II (HLA DR) du type HLA DR3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléoditiques susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, sont choisies parmi - la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 (voir figure n" 1), comprenant notamment la séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique du segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite séquence peptidique étant constituée par l'enchaînement de 94 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 20 et 113 de la séquence représentée par SEQ ID NO 2 (voir figure n" 2), - tout fragment d'ADN d'au moins environ 15 nucléotides contigus de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, susceptible de coder pour un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment peptidique étant luimême susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, - toute séquence d'ADN dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, ou d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 ou du fragment d'ADN susmentionnés, ladite séquence d'ADN dérivée étant susceptible de coder soit pour une séquence peptidique identique à la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou identique à un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, soit pour une séquence peptidique dérivée de celle représentée par SEQ ID NO 2, ou dérivée d'un fragment peptidique tel que défini cidessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1. 4. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour un ARNm antisens, cet ARNm antisens étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm représenté par SEQ ID NO 3 (voir figure n" 3) et codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, sont choisies parmi:: - la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4 (voir figure n" 4), ladite séquence d'ADN codant pour l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5 (voir figure n" 5), - tout fragment d'ADN antisens d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, susceptible de coder pour un fragment d'ARNm antisens d'au moins environ 12 nucléotides de l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5, ledit fragment d'ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus, - toute séquence d'ADN antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ADN antisens représentée par SEQ ID NO 4, ou d'un fragment d'ADN antisens tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ADN antisens du fragment d'ADN antisens susmentionnés, ladite séquence d'ADN antisens étant susceptible de coder soit pour un ARNm antisens identique à celui représenté par SEQ ID NO 5, ou identique à un fragment d'ARNm antisens tel que défini ci-dessus, soit pour un ARNm antisens dérivé de celui représenté par SEQ ID NO 5, ou dérivé d'un fragment d'ARNm antisens tel que défini cidessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de l'ARNm antisens représenté par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment d'ARNm antisens tel que défini ci-dessus, ledit ARNm antisens dérivé étant lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de 1' ARNm défini ci-dessus. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques choisies parmi celles susceptibles de coder pour une séquence peptidique ou pour un ARNm antisens, sont contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes comprenant les éléments nécessaires pour permettre la transcription des séquences nucléotidiques susmentionnées, notamment un promoteur et un terminateur de transcription. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques recombinantes sont insérées dans des vecteurs, notamment dans des plasmides, susceptibles de permettre l'expression desdites séquences nucléotidiques recombinantes dans l'organisme. 7. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés de la région V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, sont choisies parmi celles complémentaires de tout ou partie de l'un des brins de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, notamment parmi des séquences nucléotidiques comprenant au moins environ 12 nucléotides contigus jusqu'au nombre maximum de nucléotides de la séquences d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, complémentaire de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1, ou encore parmi des séquences d'ADN dérivées de tout ou partie de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 4, notamment par substitution, suppression et/ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s). 8. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques s'hybridant avec tout ou partie de l'ARNm codé par la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés de la région Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, représentent ellesmêmes un ARNm antisens, cet ARNm antisens étant avantageusement constitué d'au moins environ 12 nucléotides contigus complémentaires de tout ou partie de l'ARNm susmentionné, lesdites séquences nucléotidiques étant choisies parmi:: - la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, - tout fragment d'au moins environ 12 nucléotides contigus de la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, ledit fragment étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus, - toute séquence d'ARNm antisens dérivée, par exemple par mutation, de la séquence d'ARNm antisens représentée par SEQ ID NO 5, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) de la séquence d'ARNm antisens ou du fragment susmentionnés, ladite séquence d'ARNm antisens dérivée étant susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm défini ci-dessus. 9. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences peptidiques susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, lesdites séquences peptidiques étant choisies parmi - la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, - tout fragment peptidique d'environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment V13 5.1 susmentionnée, - toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique étant susceptible d'engendrer la production d'anticorps chez un patient, ces anticorps étant capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1. 10. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences peptidiques en tant qu'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec la séquence en acides aminés dudit segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaine, lesdits anticorps étant des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, le cas échéant, humanisés, tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec des séquences peptidiques choisies parmi - la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, - tout fragment d'environ 5 à environ 136 acides aminés contigus de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2, ledit fragment étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment V13 5.1, - toute séquence peptidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), de la séquence peptidique représentée par SEQ ID NO 2 ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ladite séquence peptidique dérivée étant susceptible de permettre la production par le système immunitaire d'un animal, d'anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1. 11. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) codant pour une séquence peptidique représentant elle-même un anticorps capable de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication 5, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6. 12. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ARNm antisens, lui-même susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour le segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 4, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication 5, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6. 13. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés dudit segment Vss 5.1, ou avec tout ou partie de l'ARNm codé par cette séquence d'ADN, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que définie(s) dans les revendications 7 et 8. 14. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) correspondant à des anticorps susceptibles de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 10. 15. Vaccins caractérisés en ce qu'ils comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) susceptibles de coder pour une séquence peptidique, elle-même susceptible d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec tout ou partie de la séquence en acides aminés du segment V13 5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 3, ladite (ou lesdites) séquence(s) nucléotidique(s) étant avantageusement contenues dans des séquences nucléotidiques recombinantes telles que définies dans la revendication 5, ces dernières étant elles-mêmes insérées dans des vecteurs tels que définis dans la revendication 6. 16. Vaccins caractérisés en ce qu'ils comprennent, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps capables de reconnaître et de former un complexe immunologique avec le segment Vss 5.1 du récepteur des cellules T humaines, et plus particulièrement une (ou plusieurs) séquence(s) peptidique(s) telle(s) que définie(s) dans la revendication 9.