Brevet FR2746030A1 — publié le 19970919

PROCEDE POUR ELIMINER LES AGENTS TRANSMISSIBLES NON CONVENTIONNELS D'UNE SOLUTION D'ALBUMINE L'invention est relative au domaine de l'élimination des agents transmissibles non conventionnels (ATNC). Plus particulièrement, l'invention a trait à un procédé pour éliminer les ATNC d'une solution d'albumine. Les agents transmissibles non conventionnels (ATNC), parmi lesquels les prions sont à l'origine des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles qui sont des maladies lentes dégénératives du système nerveux central, dont l'évolution est toujours fatale et dont les agents responsables ne sont pas toujours identifiés. Ces encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles concernent aussi bien l'homme que l'animal: o chez l'homme : le Kuru, la maladie de Creutzfelt-Jakob, le Syndrome de Gerstmann Straussler-Scheinker, l'insomnie fatale familiale et, pour certains, la maladie d'Alpers. o chez l'animal : la tremblante naturelle du mouton, I'encéphalopathie transmissible du vison, le syndrome du dépérissement chronique des ruminants sauvages en captivité et en liberté, et l'encéphalopathie spongiforme bovine. Lorsqu'on extrait de l'albumine d'un matériel biologique, qu'il soit humain ou animal, et que cette albumine est destinée à un usage thérapeutique, il est indispensable de la traiter afin d'en éliminer les agents transmissibles non conventionnels qui y seraient éventuellement présents. On connaît par l'article "Viral Validation of the manufacturing process of high purity albumin from placentas" publié dans Brown F (ed) : Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives Dev. Bio Stand. Basel, Karger, 1993, vol 81, pp. 237-244, un procédé de purification d'albumine à partir de placentas humains, présentant toutes les garanties de sécurité vis-à-vis d'éventuelles contaminations virales. De même, ainsi que cela a été mentionné dans l'article intitulé "Safety ofplacental blood derivatives" publié au Lancet, Vol 343. January 15, 1994, ce procédé a été considéré particulièrement adapté à l'élimination des prions. En effet, les étapes de purification réalisées dans ce procédé comportent notamment trois étapes FC 1, FC2 et Hcol de précipitation alcoolique en milieu acide associées à des filtrations. Les prions ayant tendance à coprécipiter avec les protéines dénaturées, ces trois étapes, qui sont caractérisées par I'élimination de quantités importantes de précipités protéiques, sont particulièrement appropriées pour l'élimination des prions. Cependant, ce procédé, s'il est bien adapté à la purification d'albumine placentaire, ne convient pas du tout à la purification d'albumine d'origine plasmatique. L'étape de précipitation FC i, par exemple, est une étape dont les conditions de réalisation sont telles que l'hémoglobine elle-même est dénaturée et précipitée de manière spécifique ; dans le cas du plasma, la quantité d'hémoglobine est très faible cette étape n'aurait donc pas les mêmes caractéristiques et notamment l'albumine ellemême serait exposée à une dénaturation par l'agent chimique. Il est donc souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé pour éliminer les agents transmissibles non conventionnels d'une solution d'albumine, même sans procéder à ces étapes de précipitation. Dans ce but, l'invention propose un procédé pour éliminer les ATNC d'une solution d'albumine, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter la solution par chromatographie d'adsorption hydrophobe et électrostatique en 2 étapes, une étape étant effectuée à pH acide, L'autre étape étant effectuée à pH sensiblement neutre. Selon une caractéristique particulière, L'étape à pH acide est réalisée avant l'étape à pH sensiblement neutre. L'étape à pH acide réalise en effet l'essentiel de la purification, L'étape à pH neutre la complétant. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la solution d'albumine est traitée préalablement par chromatographie échangeuse d'anions. Ainsi, la solution d'albumine présente un très haut degré de pureté. Selon une autre caractéristique, le procédé selon l'invention consiste en outre à filtrer au préalable la solution d'albumine, au moyen d'un filtre dont le seuil de coupure est sensiblement égal à 0,2 pm. Ainsi, le rendement d'élimination des ATNC est encore augmenté. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre. La solution d'albumine pour laquelle il convient d'éliminer les ATNC éventuellement présents peut avoir des origines diverses. Il est cependant préférable, afin de la soumettre au procédé selon l'invention que son degré de pureté, exprimé en pourcentage d'albumine par rapport à l'ensemble des protéines, soit d'environ 98 % ou plus. Il peut notamment s'agir d'une solution d'albumine d'origine plasmatique obtenue par toute méthode appropriée, et notamment par une méthode incluant la technique de fractionnement de COHN. Selon l'invention, la solution d'albumine est passée successivement sur 2 colonnes de chromatographie d'adsorption à 2 pH différents: le passage dans l'une des colonnes étant effectué à un pH acide et le passage dans l'autre colonne à un pH sensiblement neutre. Le gel utilisé peut être le même pour les 2 colonnes. Il possède des groupements fonctionnels, tels que des réticulats de diethylaminopolystyrène, de diethylaminopolyphenyl ou toute autre association de radicaux porteurs d'une charge positive et de molécules hydrophobes, liés à une matrice inerte (silice, cellulose, sepharose, acrylamine...). On utilise par exemple pour chacune des 2 colonnes du DEASpherodex/LS fourni par BIOSEPRA (US). Dans ce cas, les impuretés sont retenues par adsorption hydrophobe et électrostatique sur les colonnes, alors que l'albumine traverse la colonne sans être fixée. Selon leur point isoélectrique, les ATNC sont retenus soit lors de la chromatographie à pH acide, soit lors de la chromatographie à pH sensiblement neutre. Parmi les autres impuretés fixées, on peut citer des pigments, de l'hémoglobine dégradée, des acides gras. De façon surprenante, bien que l'albumine ait, comme les prions, tendance à adsorber tout ce qui est hydrophobe, on a remarqué qu'en réalisant ces 2 étapes de chromatographie d'adsorption hydrophobe et électrostatique, on arrivait à séparer l'albumine des ATNC. Selon un mode particulier, la chromatographie à pH acide est réalisée préalablement à la chromatographie à pH neutre. Par sécurité, on réalise en outre une étape supplémentaire de chromatographie d'adsorption non spécifique au moyen par exemple d'une colonne de silice. On peut ainsi éliminer les éléments éventuellement relargués lors des étapes précédentes. De façon avantageuse, il est possible d'utiliser les mêmes colonnes plusieurs fois, ce qui permet de mettre en oeuvre ce procédé au niveau industriel. La solution d'albumine obtenue à l'issue de ce procédé est non seulement pure à plus de 99 % en ce qui concerne son contenu en albumine, mais également complè tement dépourvue de contaminants tels que les prions ou ATNC, ainsi que cela a pu être démontré lors de tests réalisés chez des animaux. Elle peut être directement concentrée à la concentration commerciale désirée. Selon un mode particulier de l'invention, la solution d'albumine est prépurifiée par chromatographie échangeuse d'anions, notamment par passage dans une colonne chargée en groupements diéthylaminoéthyl greffés sur une matrice inerte (dextran-silice, cellulose, Sepharose, acrylamide...) ; on utilise par exemple une colonne de DEAESphérodex/LSB fourni par BIOSEPRA que l'on équilibre au préalable par un tampon de manière à ce que la charge électrique en surface soit positive. On utilise par exemple un tampon phosphate monosodique de pH 6,8. On peut ainsi partir d'une solution d'albumine constituée par la fraction V obtenue par le fractionnement alcoolique de la méthode de COFIN ou de méthodes dérivées et dont le degré de pureté est d'environ 95 %. Lorsque la solution d'albumine est injectée au travers de la colonne, L'albumine est fixée, alors que certaines impuretés et l'alcool éventuellement présents dans la solution (notamment lorsqu'elle est obtenue par fractionnement de COHN) ne sont pas fixés. Après rinçage par une solution alcoolique puis par de l'eau, L'albumine est éluée en augmentant la force ionique, par exemple lors du passage dans la colonne d'une solution aqueuse de chlorure de sodium. La solution d'albumine obtenue est alors pure à environ 98 % ou plus. Avant même de traverser la colonne de chromatographie, la solution d'albumine est de préférence filtrée à l'aide d'un filtre dont le seuil de coupure est de 0,2 pm. Lorsque ce filtre est situé à l'entrée supérieure de la colonne de chromatographie, les conditions sont telles que l'aggrégation de particules hydrophobes permet déjà d'éliminer un certain nombre des ATNC éventuellement présents dans la solution. Exemple 1 On dispose de 150 ml d'une solution d'albumine d'origine placentaire purifiée partiellement selon les 4 étapes de précipitation et l'étape de dilution décrites p: 239 de l'article "Viral Validation of the Manufacturing Process of High Purity Albumin From Placentas" mentionné plus haut. Cette solution est une solution hydroéthanolique d'albumine à 50 g/l d'albumine. On contamine volontairement cette solution par 2 % (v/v) d'un inoculum contenant des ATNC. Cet inoculum est obtenu par broyage de cerveaux d'animaux (souris C 57BL/6 mâles) infectés par l'agent de la tremblante expérimentale de la souris (souche C 506/M3 au 7ème passage fourni par les Drs. D.C. Gajdusek et P. Broun, N.I.H. Bethesda USA dont le titre infectieux est environ 108 LD50 par gramme de cerveau) et arrivés au stade terminal de la maladie. Le broyat est effectué dans une solution stérile de glucose à 5 %, selon un rapport poids/volume de 10 %. L'inoculum est soniqué, puis clarifié par centrifugation et filtré sur filtre 0,45 pm avant utilisation. La solution d'albumine contaminée est filtrée sur filtre 0,2 ptm puis traitée successivement par chromatographie DEAE-Spherodex/LS, puis DEA-Spherosil/LSB à pH 4,8 et enfin DEA-Spherosil/LS(3) à pH 6,8. La 1ère colonne ou DEAE-Spherodex/LS(g) contenant 30 g de gel est tout d'abord équilibrée par du tampon phosphate monosodique à pH 6,8. On injecte ensuite la solution d'albumine dans la colonne. L'albumine, chargée négativement se fixe progressivement sur le support par interaction ionique. L'alcool et les impuretés protéiques qui sont électriquement neutres ou qui sont chargées positivement sont directement éliminées. La colonne est ensuite rincée par une solution alcoolique à 12,5 % puis par de l'eau purifiée. L'albumine est ensuite éluée de la colonne grâce au passage d'une solution à 10 g/l de NaCI. La colonne est ensuite régénérée au moyen d'une solution à 60 g/l de NaCI puis stérilisée grâce à une phase de régénération acide par lavage au HC1 0,1 N ; la colonne est ensuite rincée dans une solution alcoolique à 70 % et conservée dans cette solution. La solution saline d'albumine obtenue est alors soumise à une chromatographie sur colonne DEA Spherosil/LSs contenant 15 g de gel à pH 4,8. Cette chromatographie combine l'adsorption électrostatique grâce aux groupements DEA et l'adsorption hydrophobe grâce aux réticulats de polystyrène. Le support de la colonne est au préalable équilibré par une solution de NaCI à 0,7 g/l. Lors du passage de la solution d'albumine dans cette colonne, certaines impuretés hydrophobes sont fixées alors que l'albumine reste en solution. La colonne est ensuite rincée par passage d'une solution NaCI à 4 g/l. La colonne est ensuite régénérée par lavage avec de l'HCl 0,1 N, puis lavée par une solution alcoolique à 70 % et stockée dans l'alcool. La solution d'albumine obtenue à la sortie de cette colonne est ensuite soumise à une nouvelle étape de chromatographie sur un support identique, mais cette fois à pH 6,8. La colonne contient ici 3 g de gel et est associée à une colonne contenant 3 g de silice. Cette étape permet d'adsorber les impuretés hydrophobes, non fixées au pH auquel est réalisée l'étape précédente ; elle permet également d'éliminer d'éventuelles molécules de DEAE - dextran provenant de la 1 ère chromatographie. Les 2 colonnes sont ensuite soumises à un premier rinçage par une solution de NaCI à 6 g/l afin de récupérer l'albumine éventuellement retenue. Puis les colonnes sont soumises à un second rinçage avec une solution concentrée de NaCI à 60 g/l afin d'éliminer les traces éventuelles d'albumine dénaturée. On régénère ensuite les colonnes par lavage avec de l'HCl 0,1 N puis on les stérilise par lavage avec une solution alcoolique à 70 % et on les conserve dans de l'alcool. On obtient à la sortie de la colonne de silice une solution d'albumine pure concentrée ensuite à 7,6 ml. Afin de vérifier la présence d'ATNC, on effectue un test sur environ 200 souris saines C 57BL/6 mâles de 18-20 grammes à chacune desquelles on inocule 20 pI de solution d'albumine par voie intracérébrale au niveau de l'hémisphère droit. Les 24 premières souris reçoivent de la solution d'albumine concentrée. Ensuite, la solution d'albumine est diluée de 10 en 10 avant d'être injectée, chacune des dilutions étant injectée à 12 souris. On maintient les animaux sous observation afin de vérifier les signes d'apparition de la tremblante expérimentale de la souris. Une souris est considérée positive après la seconde évaluation positive d'un signe clinique. Lorsqu'une souris meurt, on congèle son cerveau à - 80"C et on effectue un examen histopathologique afin de confirmer l'origine de la mort. Les résultats obtenus montrent que, grâce au procédé selon l'invention, la réduction du titre infectieux de la solution d'albumine du départ exprimé en DL50 (qui est déterminée par la méthode de Reed et Muench pour des dilutions réalisées de 10 en 10 de l'échantillon testé), est de 10 5ç5, soit une différence de titre de 5,5 log. Exemple 2 Après avoir réalisé l'exemple 1, on dispose de 150 ml d'une solution d'albumine à 50 g/l identique à celle de l'exemple 1, exception faite de la contamination volontaire par un inoculum contenant des ATNC ; on fait passer cette solution d'albumine par les mêmes étapes de chromatographie que celles décrites à l'exemple 1, afin de vérifier que les ATNC adsorbés par les colonnes de chromatographie lors de l'exemple 1, ne sont pas relargués dans la nouvelle solution d'albumine. On obtient cette fois 6,6 ml de solution punfiée. On effectue donc le même test qu'à l'exemple 1, c'est-à-dire inoculation intracérébrale, à chaque animal, de 20 pI de la solution d'albumine ainsi obtenue, puis de la solution d'albumine diluée de 10 en 10. Environ 100 souris sont ainsi inoculées. Les résultats obtenus montrent que les souris ne sont pas contaminées ; la solution d'albumine est donc indemne de tout ATNC. I1 est donc possible d'utiliser les colonnes de chromatographie à plusieurs reprises. Exemple 3 On réalise la même expérience qu'à l'exemple 1, en partant cette fois d'une solution d'albumine constituée par la fraction V de la technique de COHN et filtrée sur filtre 0,45 zm. La solution d'albumine alors obtenue présente les mêmes caractéristiques que celle obtenue à l'exemple 1. REVENDICATIONS 1. Procédé pour éliminer les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) d'une solution d'albumine, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter la solution par chromatographie d'adsorption hydrophobe et électrostatique en 2 étapes, une étape étant effectuée à pH acide, L'autre étape étant effectuée à pH sensiblement neutre. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape à pH acide est réalisée avant l'étape à pH sensiblement neutre. 3. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée au moyen d'un support possédant des groupements diethylaminopolystyrène. 4. Procédé selon une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il consiste en outre à traiter au préalable la solution d'albumine par chromatographie échangeuse d'anions. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la chromatographie échangeuse d'ions est réalisée au moyen d'un support possédant des groupements diethylaminoéthyl. 6. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à filtrer au préalable la solution d'albumine, au moyen d'un filtre dont le seuil de coupure est sensiblement égal à 0,2 pm.