Brevet FR2735496A1 — publié le 19961220

NOUVEAU DISPOSITIF DE CULTURE DE CELLULES ET LES TISSUS AINSI RECOLTES La présente invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement à celui des cultures de cellules. Elle a plus précisément pour objet un nouveau dispositif qui permet la culture de cellules dissociées ou de cultures organotypiques, c'est-à-dire d'explants tissulaires, sur des morceaux de membrane découpées à l'avance. Spécifiquement, elle a pour objet un dispositif de cultures de cellules constitué d'une boîte en plastique transparent formé de deux parties assemblées et pouvant fermer hermétiquement, dont la partie inférieure est séparée en deux compartiments par une membrane perméable délimitant un compartiment inférieur qui sert de réservoir pour le milieu de culture et un compartiment supérieur recevant une ou plusieurs pastilles cerclées ou oeillet servant d'emplacement de culture des cellules. Dans le dispositif selon l'invention, le compartiment inférieur comporte une membrane qui permet par capillarité de maintenir irriguées et d'amener le développement d'une ou plusieurs cultures de cellules disposées sur les pastilles cerclées à plat sur la membrane perméable. Les cultures de cellules placées dans ces pastilles peuvent être irriguées malgré les deux épaisseurs de membrane, c'est-à-dire la membrane de la nursery " ou du puits de culture conventionnel et la membrane de l'oeillet. La membrane est transparente et peut avoir une porosité variant de 0,02 à 10 pm. Dans le compartiment inférieur, on a disposé deux septum stériles permettant de perfuser un milieu nutritif. Le compartiment est pourvu d'orifices obturables destinés à permettre au liquide de perfusion d'entrer d'un côté et de sortir de l'autre côté. La perfusion du milieu nutritif peut se faire soit par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique externe soit par une pompe péristaltique intégrée au boîtier de la nursery . Le réservoir contenant le milieu nutritif peut être de la même façon, soit indépendant (externe), soit faire partie de la nursery . Ces orifices sont connectables les uns avec les autres de sorte qu'il est possible de disposer en série plusieurs dispositifs selon l'invention, I'orifice de sortie de l'un étant relié à l'orifice d'entrée d'un autre dispositif. De ce fait, il est possible de mettre en culture simultanément avec un même milieu de culture des cultures de cellules identiques ou différentes avec un même milieu de culture. Le boîtier du dispositif peut être fermé hermétiquement tout en présentant un orifice pour l'admission ou la sortie d'un mélange gazeux (par exemple, 5% C02 dans l'air). On prévoit à cette fin une valve ou un évent obturable. Le gaz inerte diffuse à travers une membrane placée dans le couvercle ou par un système de chicanes. Une des caractéristiques importantes de l'invention se situe dans le fait que les cultures de cellules sont disposées sur une ou plusieurs pastilles cerclées (oeillet) pourvues d'une membrane perméable et que ces pastilles cerclées sont ellesmêmes disposées sur la membrane perméable qui forme la séparation entre le compartiment inférieur et le compartiment supérieur. De cette façon, le milieu nutritif baigne la membrane de séparation, diffuse par capillarité à travers celle-ci et vient finalement imprégner lesdites pastilles cerclées pour maintenir en vie les cultures de cellules. Ainsi, les cultures de cellules sont entièrement localisées sur les pastilles cerclées, elles peuvent se développer d'une manière autonome et être retirées ou replacées à des moments différents. Les cultures de cellules sont ainsi réalisées sur des morceaux de membrane perméable prédécoupés, de dimensions standardisées. Typiquement, les oeillets sont formés par un cercle de plastique ayant de 6 à 25 mm de diamètre et de 0,1 à 1 mm d'épaisseur sur lequel une membrane perméable de culture, commerciale telle que Millicell ou Falcon ou Millipore ou Membrane Anopore Whatman, est soudée ou collée. Ainsi, il est possible de tendre suffisamment la membrane, de faciliter les manipulations et les traitements nécessaires en microscopie électronique, en microscopie optique, en électrophysiologie et pour des études ou des mesures biochimiques. Ces pastilles cerclées sont placées sur des culture insert standard, commercialisées normalement ou conçues spécialement pour retenir plusieurs pastilles cerclées, disposées sur la membrane médiane, et formant ce qui est désigné ci-après par le terme nursery . Ces pastilles cerclées sont préparées à l'avance et sont présentées dans des emballages stériles individuels, prêts à l'emploi. Dans un mode d'exécution préféré de l'invention, le dispositif se présente tel que figuré à la planche 1 sous la forme d'un boîtier transparent (1) en matériau rigide formé d'une partie inférieure (2) et d'un couvercle emboîtant (3) pourvu de dispositifs d'étanchéité (4)(4'). La partie inférieure du boîtier est traversée par une membrane perméable (5) tendue entre deux parois opposées sur laquelle repose une ou plusieurs pastilles cerclées (6) formées d'un anneau rigide (7) encerclant une surface de membrane perméable (8). En fonction des besoins et des dimensions du boîtier, le nombre de pastilles cerclées est variable. Dans le dispositif représenté à la planche 1, trois pastilles cerclées sont disposées sur la membrane perméable (5). L'ensemble de ces pastilles est désigné sous le nom d'élevage ou Nursery . Le boîtier comporte à sa partie inférieure un ajutage d'entrée (11) et un ajutage de sortie (11') permettant la circulation du milieu de culture. A la partie supérieure un évent (10) permet l'introduction de gaz pendant la culture. La planche 2 montre, vue par en-dessus, la pastille cerclée (8) entourée du cercle plastique de maintien (7) et vue de profil la membrane (9) de la pastille cerclée (8). Le dispositif selon l'invention présente, par rapport aux systèmes existants, les avantages suivants: facilités de manipulation e on évite de découper la culture de cellules qui a poussé sur les membranes pour des traitements ultérieurs on a la possibilité d'effectuer des prélèvements individuels de tissu, ce qui n'est pas possible dans le cas des puits standard on a la possibilité, en cas de contamination du puits, de replacer l'oeillet dans un puits sain gain de temps économie de cellules car avec la même surface totale de cellule, on pourra effectuer différents tests. REVENDICATIONS 1. Dispositif de cultures dissociées ou de cultures organotypiques sur des morceaux de membrane découpés à l'avance, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un boîtier en matériau plastique transparent formé de deux parties assemblées pouvant fermer hermétiquement, dont la partie inférieure est séparée en deux compartiments par une membrane perméable délimitant un compartiment inférieur qui sert de réservoir pour le milieu de culture et un compartiment supérieur destinées à recevoir une ou plusieurs pastilles de membrane cerclées ou oeillet servant d'emplacement pour la culture des cellules. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la membrane perméable permettant l'irrigation par capillarité des cultures de cellules, par le milieu de culture. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel les pastilles cerclées sont également irriguées par le milieu de culture. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la membrane est transparente et a une porosité variant de 0,02 à 10 um. 5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les pastilles cerclées sont constituées par un morceau de membrane transparente entouré et fixé dans un cercle de matériau plastique rigide. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les pastilles cerclées sont faîtes d'un cercle de matériau plastique ayant une épaisseur de 0,1 à 2 mm et un diamètre extérieur de 6 à 25 mm. 7. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel la membrane perméable est fixée au cercle de matériau plastique par soudure ou collage. 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le compartiment inférieur est pourvu d'un orifice d'entrée et d'un orifice de sortie pour la circulation du milieu de culture. 9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes dans lequel le compartiment supérieur est pourvu d'une valve permettant l'introduction d'un courant de gaz. 10. Utilisation du dispositif selon l'une des revendications 1 à 9 en vue de la culture de cellules dissociées ou de culture organotypiques en milieu stérile.