Brevet FR2740344A1 — publié le 19970430

La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de traitement des cancers par blocage de la prolifération cellulaire laquelle peut être dérégulée dans les cellules tumorales exprimant un oncogéne tel que ras muté ou déficientes pour un gène suppresseur de tumeur tel que p53. Elle concerne également l'utilisation des vecteurs de thérapie génique permettant de réguler celleci, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant. Les produits des gènes ras, généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines a été associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. Dans un contexte cellulaire normal, cette prolifération des oncogènes est vraisemblablement contrée, au moins en partie, par la génération de gènes dits suppresseurs de tumeurs comme p53 et Rb. On sait ainsi que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement la croissance et la division cellulaire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où l'intégrité de 1'ADN cellulaire est menacée, p53 a été suggérée être un gardien du génome . Toutefois, certains phénomènes peuvent venir perturber ce mécanisme d'autorégulation cellulaire et favoriser alors le développement d'un état néoplasique. Un de ces évènements consiste en des mutations au niveau des gènes suppresseurs de tumeurs. C'est ainsi que des formes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et notamment dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateux comme les ostéosarcomes et qu'il a été noté la présence de p53 mutées dans environ 40 to des tumeurs humaines, tous types confondus (pour revues, voir Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992 ; Zambetti and Alevine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). En conséquence, la mise en évidence de composés biologiques susceptibles d'interférer à l'encontre de ce type de dérèglement de la prolifération cellulaire et/ou de suppléer à ce type de déficience en gènes suppresseurs de tumeurs est par conséquent d'un intérêt majeur dans l'approche thérapeutique de la cancérogenèse. La présente invention résulte précisément en partie de la mise en évidence que la protéine GAX constitue un inhibiteur potentiel de la prolifération cellulaire induite par les protéis ras. Elle résulte en particulier de la mise en évidence qu'une prolifération cellulaire, dérégulée dans des cellules tumorales, peut être rétablie en y exprimant la protéine GAX. La protéine GAX est une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax(growth arrest specific homeobox) appartient à la famille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnels qui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des régions spécifiques de 1'ADN (ou homéoboîtes) (revue : Gehring et al. Cell, 78 : 211-223, 1994). L'homéodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. Ce gène possède certaines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la transition G0/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est donc réprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Ces observations ont leur contrepartie in vivo puisque chez le rat, l'hyperplasie intimale provoquée par l'abrasion de la carotide est associée à une forte baisse de l'expression de gax (Weir et al. J. Biol. Ehem. 1995,270, 5457-5461). L'expression du gène gax a été mise en évidence dans le système cardiovasculaire, notamment le coeur et l'aorte et jusqu'ici l'utilisation en thérapie génique de ce gène était donc limitée au niveau de ces cellules, l'exprimant naturellement. De manière inattendue, la demanderesse a découvert qu'il était possible de valoriser avantageusement une activité inhibitrice de la protéine GAX à l'égard de la prolifération cellulaire dans des cellules tumorales c'est à dire des cellules qui n expriment pas le gène gax de manière endogène. La presente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement efficace pour le traitement des tumeurs associées à un dérèglement de la prolifération cellulaire telles que les tumeurs du poumon non à petites cellules, les carcinomes pancréatiques et coliques, les ostéosarcomes etc. La présente invention décrit également des systèmes particulièrement efficaces permettant la délivrance in vivo, directement dans les tumeurs, de tels composés et ainsi de lutter contre le dblwement des can - Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation de la protéine GAX ou d'un variant de celleci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. Plus précisément, elle se rapporte à l'utilisation d'au moins une séquence nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celiez pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique de GAX, ainsi que tout homologue de GAX obtenu à partir d'autres espèces. Ces fragments et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par hybridation ou par clonage par expression, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques incluent les suppressions, délétions, mutations, etc. La séquence nucléique mise en oeuvre peut coder pour tout ou partie la protéine GAX de rat ou un de ses variants. Le gène utilisé au sens de l'invention est préférentiellement le gène codant pour la protéine GAX de rat ou de son homologue humain. n s'agit plus préférentiellement d'un ADNc ou d'un ADNg. La séquence nucléique revendiquée peut être injectée telle quelle au niveau du site à traiter, ou incubée directement avec les cellules à détrre ou traiter. n a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité exta- et intracellulaires. Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. n peut s'agir de vecteurs wiraux ou non viraux. Le vecteur selon l'invention peut ainsi être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expession la séquence nucléique dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (lXLK)n, (UCKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser 1'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfoetam, etc) et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ou liposomes. Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser 1'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La séquence nucléique utilisée dans la présente invention peut être formulée en vue d'adminîstrtions par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, elle est utilisée sous une forme injectable. Elle peut donc être mélangée à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. n peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de la séquence nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses en séquence nucléique toisées peuvent être adaptées fonction dvdiSefents paramètres, fonction du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. Pour la mise en oeuvre de la présente invention il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un virus recombinant défectif. n est ainsi possible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et plus récemment les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection. La présente invention a donc pour second objet l'utilisation d'un virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celleci. Invention réside également dans l'utilisation d'un tel virus pour le traitement des cancers. Dans les vecteurs de l'invention, le gène inséré et/ou présent peut être un fragment d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs cintrons. n peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. n peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptbles de fonctionner dans la cellule infectée. n peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, -actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CP 1 K, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (promoteur de l'actinie des cellules du muscle lisse), les promoteurs préférentiellement activés dans les cellules en division, ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur desoenones stéddes, réoepteur de racide rétinoïque, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, le gène inséré comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de GAX, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle (oelle du gène de la thymidine kinase par exemple), ou d'une séquence signal artificielle. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule amble. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'enoepsidation des particules virales. ll existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'enoepsidation et l'acide nucléique d'intérêt Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de rinvention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de RADON isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et 15 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour GAX (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinason homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de radénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovurus Ad5 (12 to) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n WO 94/26914 et W095/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de rn stabie et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. I1 comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'exsion des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (riz) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc également un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une séquence codant pour GAX bordée des 11 R de l1AAV. L'invention concerne également un plasmide comprenant une séquence codant pour GAX bordée de deux 1TR d'un AAV. Un tel plasmide peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de GAX, éventuellement incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-virus). Concernant les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence ed wcBqa-e hétérologue d'intérêt Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour GAX selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (W090/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Pour le traitement des cancers, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. ll est possible d'utiliser des quantités relativement faiblies de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à hauts niveaux le gène gax introduit, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé et de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et alhniniSs sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfuhnl peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et tnesum,alement après 48-es, du nombtde plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. La présente invention est avantageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale). Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales. Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogène activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, etc. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc. La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés commue illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Représentation du plasmide pCO1. Figure 2 : Représentation du plasmide pXL-CMV-Gax HA Flgure3: Représentation de l'effet de l'expression de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales H460. Figure 4: Cellules tumorales H460 traitées par l'adénovirus AdCMV gax à M.O.L. 1000 (Figure 4A), M.O.I. 100 (Figure 4B) et M.O.L 1000 (Figure 4C). Figure 5 : Représentation de l'effet de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales Saos. Figure 6: Représentation de l'effet de l'expression de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales H358. TECHNIOUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, l ~extraAion~de profs au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'méthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et aL (eds), "carrent Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de RADON ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du faJrnirur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977)5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. EXEMPLE 1 : construction du vecteur pXLoCMV-Gax HA portant le gène codant pour la protéine gax de rat sous le contrôle du promoteur CMV. Cet exemple décrit la construction d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la protéine gax (espèce: rat) et des séquences sénovirales-pennettant une recombinaison L'épitope de l'hémagglutinine du virus influenza (épitope HA1), comprenant 18 acides aminés, est ajouté à l'extrémité N-tenninale de la protéine gax (Field et al., Mol.Cell.Biol. 8 : 2159-2165, 1988). Ce procédé d'addition d'épitope permet de suivre, notamment par des techniques d'immunofluceeseence, l'expression de gax à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitope HA1. Outre sa sensibilité, cette méthode permet de s'affranchir du bruit de fond corespondant à l'expression de protéines gax endogènes à la fois in vitro et in vivo. 1.1. Construction du plasmide pCOl (Figure 1) A - Construction du plasmide pCE Le fragment EcoRI-XbaI correspondant à Extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et XbaI du vecteur pIC19H. Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hindi, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et SmaI du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB. Le plasnide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de Ecoli, puis il a été coupé par BamHL Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites NruI et BgIll du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage. B - Construction du plasmide pCD' Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - NarI (5519) du génome de l'adênovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites ClaI et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment SalI-TaqI du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovuus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et TaqI (5207) a ensuite été cloné entre les sites SalI et ClaI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment TaqI (5207) - NarI (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-Tat plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC'. Le fragment NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment SalI-NarI du plasmide pCC' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'. C - Construction du plasmide pC01 Une digestion partielle par XhoI puis une digestion complète par SalI du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été cloné dans le site SalI du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pC01 (figure 1), qui contient la partie gauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hindi (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5. 1.2. Construction du vecteur pXCCMV-Gax HA (cf. figure 2) L'ADNc de Gax a été cloné entre les sites XbaI-BamHI du vecteur pCGN (Tanaka et Herr, Cell 60:375-386,1990). Le vecteur pGCN-Gax résultant contient les promoteur précoce et séquence enhancer du cytomégalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart et al, Cell, 41 : 521-530, 1985), la séquence leader de la thymidine kinase de l'Herpes simplex virus incluant le codon d'initiation AUG ainsi que les trois premiers acides aminés (+55, +104; Rusconi et Yamamoto, EMBO J., 6: 1309-1315, 1987), la séquence codant pour l'épitope HA1, l'ADNc de gax de rat et enfin la séquence de poly adénylation du gène de globine de Lapin (Päbo et al, cell, 35 : 445-453, 1983). Le vecteur pCGN-Gax a ensuite été coupé par XmnI et SfiI et le fragment obtenu, contenant promoteur, ADNc et séquence de polyadénylation, préalablement traité à la Klenow, a été introduit au site EcoRV du vecteur navette pCO1 contenant les séquences adénovirales nécessaires à la recombinaison. Le plasmide obtenu a été désigné pCMV-Gax HA (cf. figure 2). EXEMPLE 2: Construction de l'adénovirus recombinant Ad-CMVgax Le vecteur pXL CMV-Gax HA préparé dans l'exemple 1 est ensuite linéarisé et cotransfecté pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en crans le=bnctions codees par les régions i:1 (E1A et E1B) d'adénovirus. L'adénovirus Ad-CMVgax a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVssgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le vecteur pXLCMV-Gax HA selon le protocole suivant: le vecteur pXLo CMV-Gax HA linéarisé par l'enyme XmnI et l'adénovirus Ad.RSVBgal linéarisé par ClaI ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovinis recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-CMVgax est conservé à -800C dans 10 % de glycérol. EXEMPLE 3: Contrôle de l'expression de l'Ad-CMVgax dans des cellules tumorales humaines H460. Les cellules tumorales humaines H460 dérivées d'un cancer du poumon non à petites cellules ont été transduites par l'adénovirus recombinant Ad-CMV gax et par un virus contrôle exprimant la frgalactosidase (Ad-RSV- (ssgal) à multiplicités d'infection (M.O.I.) croissantes (figure 3). Après 1 heure 30 d'incubation en présence de la solution adénovirale, le milieu de culture comprenant 10 % de sérum foetal est renouvelé et les cellules incubées pendant une période de 48 heures. La viabilité cellulaire étant contrôlée par test d'exclusion de bleu trypan, le nombre de cellules viables par puits de culture est alors déterminé. Deux lots d'adénovirus AdCMV gax, Ad-gax et Ad-gax(2), ont été utilisés et correspondent à deux productions indépendantes dans les cellules 293. Les activités des deux lots s'avèrent comparables et bien distinctes de l'adènovirus contrôle AdRSV (3gal. L'utilisation de Ad-RSV - pgal a préalablement permis de démontrer la capacité d'un adénovirus recombinant à transduire de manière efficace les cellules H460. Ainsi l'activité pgal nucléaire a été détectée dans plus de 75 % des cellules traitées par Ad-RSV- pgal (M.O.I. 1000). En parallèle, l'expression de la protéine gax a été mise en évidence dans les cellules transduites par Ad-CMV gax par immunofluorescence. Les efficacit6s de transduction X virus *d-COgazA et Ad RSV- ssgal se sont avérés comparables. Le traitement des cellules H460 par Ad-CMV gax est associé à une réduction de la prolifération cellulaire mais également à une cytotoxicité massive détectée 48 heures après la transduction par l'adénovirus (cf. figures 4A, 4B et 4C). Un tel effet n'est pas observé avec l'adénovirus contrôle. Ces données démontrent donc que la surexpression de la protéine gax s'accompagne d'un arrêt de la croissance des cellules H460. De manière intéressante, les cellules H460 expriment une protéine ras mutee (Ki-ras). Nos données démontrent de manière surprenante que l'expression de la protéine gax permet de rétablir le contrôle de la prolifération cellulaire initialement dérégulée par la protéine ras modifiée, Le caractère dominant du facteur gax vis-à-vis des mutations oncogéniques de ras n'est pas restreint aux carcinomes du poumon. Des résultats similaires, à savoir un arrêt de croissance par AdCMV gax, ont été obtenus sur les cellules HCT116 dérivés d'un carcinome du côlon. Une mutation de l'oncogène ras (G13C) et du gène DCC ont été décrites dans cette lignée cellulaire (Brattain et al., Cancer Research, 41:1751-1756, 1981). EXEMPLE 5: Contrôle de l'expression de l'Ad-CMV-gax dans des cellules tumorales humaines à environnement p53 nul Les cellules H358, également dérivées d'un carcinome du poumon non à petites cellules, constituent un modèle de déficience pour la protéine p53. Cette lignée cellulaire présente en effet une délétion homozygote pour le gène p53 (Maxwell and Roth, Oncogene 8: 3421, 1993). De manière avantageuse, l'adénovirus Ad-gax bloque de manière efficace la croissance des cellules H358 et provoque une cytotoxicité massive 48 heures après la transduction adénovirale (figure 5). Cette mort cellulaire n'est pas détectée en présence d'un adénovirus contrôle Ad-RSV-ssgaL Ces données démontrent que la surexpression de gax bloque de manière spécifique et efficace la croissance des cellules tumorales déficientes pour p53. De manière intéressante, ces données ne se limitent pas aux cellules dérivées de carcinomes du poumon. En effet, la croissance des cellules humaines Saos, dérivées d'un ostéosarcome, est également bloquée après traitement par Ad-CMV gax. Les cellules Saos constituent un modèle cellulaire à environnement p53 et pRb nuls. De nouveau, cet arrêt de croissance est dépendant de la concentration de virus utilisée et n'est pas observée après transduction des cellules cancéreuses par le virus contrôle (Figure 6). Ainsi plus de 9 % des cellules Saostsont positives pour l'activité ssgal après induction par AdRSV pgal à une multiplicité d'infection de 250. Dans les mêmes conditions expérimentales (multiplicité d'infection 250), AdCMV gax entraite une baisse de la viabilité cellulaire supérieure à 70tu. Gax ayant été initialement décrit comme un gène d'arrêt de croissance, la demanderesse a observé de manière surprenante que l'arrêt de croissance est suivi par une mort cellulaire s'apparentant à l'apoSse. La contrepartie in vivo de la mort cellulaire induite par la surexpression de Gax peut de manière avantageuse être associée à un bénéfice thérapeutique chez le patient cancéreux. REVENDICATIONS 1. Utilisation de la protéine GAX ou d'un variant de celleci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. 2. Utilisation d'au moins une séquence nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant dè celleci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. 3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique est utilisé sous forme complexée avec du DEAE-dextran, avec des protéines récepteurs, ou avec des lipides ou polymères cationiques, sous forme de liposomes ou encore tel quel. 4. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral recombinant. 5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral, choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés. 6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2. 7. Utilisation selon la revendication 4, 5 ou 6 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine. 8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour tout ou partie de la protéine GAX de rat ou d'un variant de celle-ci. 9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour la protéine GAX de rat ou son homologue humain. 10. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNc. 11. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNg. 12. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 11 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. 13. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 12 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.