Brevet FR2743367A1 — publié le 19970711

La présente invention se rapporte à une séquence nucléique de StaphyLococcus pasteuri et de Staphylococcus capitis, ainsi qu'aux applications de ces séquences en tant que sondes nucléiques spécifiques pour la détection de séquences de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus capitis ou de fragments de cette séquence comme amorces nucléiques pour l'amplification d'ADN et d'ARN de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus capitis dans un échantillon biologique ou un prélèvement clinique. Les inventeurs ont à présent isolé des séquences nudéiques utilisables pour la détection spécifique des espèces Staphylococcus pasteuri et Staphylococcus wapitis. La présente invention a ainsi pour objet des séquences nucléotidiques qui hybrident spécifiquement et respectivement avec une séquence d'acide nucléique génomique de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus Capitis. La présente invention a ainsi pour objet une séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 (STAPAST468), la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec une séquence d'acide nudéique de Staphylococcus wapitis, caractérisée en ce quelle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n" 2 (STACAPCAP205), la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. L'invention a également pour objet les produits d'amplification de séquences telles que définies ci-dessus. L'invention a également pour objet les vecteurs de clonage contenant les séquences nudéotidiques telle que définies ci-dessus. Les séquences nucléotidiques définies ci-dessus peuvent être des séquences d'ADN ou des séquences d'ARN. La taille exacte du fragment de séquence SEQ ID nO 1 (STAPAST468) est de 468 pb. Cette séquence est spécifique de l'espèce Staphylococcus pasteuri, et n'hybride pas avec 34 autres espèces du genre Staphylococcus. La taille exacte du fragment de séquence SEQ ID n" 2 (STACAPCAP205) est de 205 pb. Cette séquence est spécifique de l'espèce Staphylococcus wapitis, et n'hybride pas avec 34 autres espèces du genre Staphylococcus. Une interrogation des banques de données (GENEBANK) n'a fait ressortir aucune homologie significative entre d'une part les séquences SEQ ID nO 1 et SEQ ID nO 2 et d'autres part les séquences d'ADN connues. Les séquences SEQ ID nO 1 et SEQ ID nO 2, des parties ou des variants fonctionnellement équivalentes de celles-ci, peuvent être utilisés dans des techniques d'hybridation moléculaire pour la détection et l'identification de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus wapitis. Les variants fonctionnellement équivalents comprennent des séquences dans lesquelles des paires de bases ont été mutées, délétées, insérées ou substituées, sans que les propriétés essentielles à la spécificité de ces fragments soient affectées. Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont des applications diagnostiques et épidémiologiques en médécine humaine et vétérinaire, comme en microbiologie de l'environnement, notamment comme sondes nucléiques spécifiques de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis ou comme amorces nucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence spécifique de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis. Les sondes selon l'invention comprennent avantageusement 20 nucléotides consécutifs, mais de préférence au moins 10 nudéotides parmi les séquences ou les fragments de séquences mentionnés ci-dessus. Les sondes sont des fragments d'ADN ou des sondes d'ARN. Les séquences nucléotidiques décrites dans cette invention peuvent être ainsi utilisées comme sondes pour détecter spécifiquement et de manière directe des souches de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus capitis dans des échantillons biologiques. Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (p32, S35, H3, I125) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromodésoxyuridine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications. Dans ce dernier cas on pourra utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses. La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des souches de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis sur un support (nitrocellulose, nylon, polystyrène, ...) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique immobilisé avec la sonde. Après hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les hybrides (ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN) sont détectetes par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde...). Les sondes d'acide nucléique décrites ici peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce procédé, la sonde est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybrida ton spécifique l'acide nucléique cible extrait de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis . Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde de détection marquée par un élément facilement détectable. Lorsqu'une quantité suffisante d'acide nudéique de Staphylococcus pasteuri et de Staphylococcus capitis peut être extraite à partir des prélèvements à analyser, les séquences décrites dans le brevet sont utilisables pour détecter et identifier les souches de Staphylococcus pasteur et de Staphylococcus capitis directement dans ces prélèvements. Dans le cas contraire, une culture rapide en milieu liquide peut être réalisée avant l'extraction de l'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis, ou bien la petite quantité d'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis extrait du prélèvmeent peut être soumise à une technique d'amplification comme par exemple la technique PCR. Les séquences SEQ ID n"l et SEQ ID n 2 ou les fragments obtenus à partir de ces séquences peuvent être utilisés pour sélectionner les amorces oligonucléotidiques, notamment pour la technique PCR. Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié (brevet US n"4 683 202). Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont avantageusement une longueur comprise entre 10 à 30 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaire du brin (+) de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-). Il est important que ces amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nudéiques des staphylocoques n'appartenant pas à l'espèce pasteuri ou capitis et avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer le prélèvement. Les amplimères sélectionnés comme amorces spécifiques pour l'amplification des séquences nucléiques de souches appartenant à Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis sont choisis par exemple en suivant la méthode décrite par Griffais et col. (Nudeic Acids Researdh, 1991; 19: 3887-3891). A partir de la séquence SEQ ID n01, les inventeurs ont choisi des oligonudéotides pour réaliser un test PCR. Grâce à ces oligonucléotides, ils ont obtenu une amplication spécifique de Staphylococcus pasteuri, aucune amplification n'était visible avec un acide nucléique d'autres espèces de staphylocoques. Un couple d'amorces tout particulièrmeent préféré est représenté par les oligonucléotides PA1 et PA2 issus de la séquence SEQ ID n01 dont les séquences respectives sont: PA1 : 5' - GCA TGT ATG GTA CGA AAC C - 3' PA2 : 5' - AAA TCT AAT TAC AGG GAC CG - 3' A partir de la séquence SEQ ID n02, les inventeurs ont choisi des oligonudéotides pour réaliser un test PCR. Grâce à ces oligonucléotides, ils ont obtenu une amplication spécifique de Staphylococcus capitis, aucune amplification n'était visible avec un acide nucléique d'autres espèces de staphylocoques. Un couple d'amorces tout particulièrmeent préféré est représenté par les oligonucléotides CAP1 et CAPI: issus de la séquence SEQ ID n"2 dont les séquences respectives sont: CAP1 : 5' - CCC ATT ACC ATT ATT AG - 3' CAP2 : 5' - GCT AAA TCA CCA TTT G - 3' Les fragments amplifiés peuvent être identifiés par une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après électrophorèse capillaire ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel), chromatographie hydrophobe ou sur échangeur d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant les séquences nudéotidiques SEQ ID n"l ou SEQ ID n02, des fragments de celles-å, des plasmides contenant ces séquences ou des fragments de cellesci, des oligonucléotides complémentaires de ces séquences ou fragments de séquences ou des produits d'amplification. Ces sondes peuvent être marquées par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. La présente invention a également pour objet une méthode de détection de la présence des souches de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes 1) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple de fragments oligonucléotidiques dits amorces, tels que définis précédemment, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique des souches appartenant à Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus Capitis 2) amplification de l'acide nucléique des souches de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis 3) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant aux fragments encadrés par les amorces; 4) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié, par exemple par hybridation de sondes spécifiques, par séquençage ou par analyse de sites de restriction. La présente invention a en outre pour objet un kit ou coffret pour la détection de la présence de souches appartenant à Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments suivants: - un couple de fragments oligonucléotidiques tels que définis précédemment; - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'acide nucléique de souches appartenant à Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis ; - éventuellement un composant permettant de vérifier la séquences du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde nucléique telle que définie précédemment. Ce kit contient plus avantageusement la ou les sondes marquées ou non. Celles-ci peuvent être en solution ou immobilisées sur un support. Le kit peut également contenir les réactifs nécessaires pour la lyse des bactéries et l'extraction des acides nucléiques cibles, ainsi que les solutions d'hybridation et de lavage correspondants à la méthode choisie. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une sonde nucléique telle que définie ci-dessus comme outil épidémiologique, en épidémiologie moléculaire. En effet, si les fragments spécifiques sont présents plusieurs fois sur le génome de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis, sa répétitivité peut être la source d'un polymorphisme qui peut servir d'outil pour repérer et classer des souches identiques et pour établir des liens quant à la source et la propagation de l'infection. USTEDES SÉQUENCES L'invention concerne donc des séquences nucléotidiques hybridant spécifiquement avec respectivement une séquence nucléotidique génomique de Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis, application comme sondes nucléiques et amorces oligonucléotidiques, et dans le diagnostic d'une infection à Staphylococcus pasteuri ou de Staphylococcus capitis . Le nombre de séquence est de 2. Les caractéristiques de la séquence n l sont les suivantes - type : nucléotide -longueur 468 paires de base - nombre de brins : simples - configuration : linéaire - type de molécule : ADN - organisme: Staphylococcus pasteuri - nom : STAPAST468 - description de la séquence: 1 GTGAATCCCCAGGAGCTTACATAACAATCCCAAGCATGTATGGTACGAAACCACCTAATA 61 TTGAGATGTGTGAAGGAAAAATAAATCCAAGCACAGCAGCAAATAACATCTAAAATATAA 121 ATGTTTTTCGTTCGCAAATTGACTGATTCGATTTAACATATAAACGCACCCTTAATAGTT 181 AATAATGACAAATATTATCATAACTATTTATAATGGACAATGTTATTTTCAGAATTTTCT 241 TATATTTTAAGTTATTTACGGTCCCTGTAATTAGATTTTAATAAAGTCCTTTAATCCATG 301 ATACTCATAGTATTGGCTAATGAAATATTCTTTTTTACTAGTCTTCATTCAAAAGTCCTA 361 GTGAATATCAAAAAGAAGCATGGTACAATCATTTTAAAGTCAACAAAAACTATTACCCTA 421 CTTAACAATAAATTTCTAAACCATGAATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC Les caractéristiques de la séquence n 2 sont les suivantes: - type: nudéotide -longueur 205 paires de base - nombre de brins: simples configuration linéaire - type de molécule: ADN - organisme: Shphylococcus capitis - nom : STACAPCAP205 - description de la séquence: 1 GTGAATCCCC AGGAGCTTAC ATTATAAACC CATTACCATT ATTAGAAATG 51 AAACAGCATT GTTTATAGTA TGCATCGTAA TGGTAGCTGC TAAATTTCTA 101 CCAGTTTTGT GATAAACAAA AACGATCATG GACGCGATGA TAATATAGGG 151 GCCTATTTCA AATGGTGATT TAGCACCCAC ACAATGTAAG CTCCTGGGGA 201 TTCAC REVENDICANONS 1) Séquences nucléotidiques qui hybrident spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique génomique de Staphylococcus pasteuri, caractérisées en ce qu'elle sont choisies parmi la séquence nudéotidique SEQ ID n01, les séquences complémentaires de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. 2) Séquences nucléotidiques comportant tout ou partie des séquences nucléotidiques selon la revendication 1. 3) Produits d'amplification de l'une des séquences selon les revendications 1 et2. 4) Vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il contient une séquence nucléotidique selon les revendications 1 et 2. 5) Sondes nucléiques spécifiques des acides nucléiques de Staphylococcus pasteuri, caractérisées en ce qu'elle comprennent au moins 10 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences nucléotidiques selon les revendications I à 3. 6) Sonde nucléique spécifique des acides nucléiques de Staphylococcus pasteuri selon la revendication 5 caractérisée en ce qu elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n"l, les séquences complémentaires de celleci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. 7) Sonde nucléique selon la revendication 5 ou 6 caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support et utilisée comme sonde de capture. 8) Couple d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Staphylococcus pasteuri , caractérisé en ce qu'il comprent des paires d'oligonucléotides ayant de 10 à 30 nucléotides choisis parmi laséquence selon l'un des revendications 1 à 3. (9) Couple d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Staphylococcus pasteuri selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est constitué par les paires oligonucléotidiques de séquence: PA1 : 5' - GCA TGT ATG GTA CGA AAC C - 3' PA2 : 5' - AAA TCT AAT TAC AGG GAC CG - 3' 10) Méthode de détection de la présence de Staphylococcus pasteuri dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes: a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon les revendications 8 ou 9, l'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, été rendu préalablement accessible à une hybridation, et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique appartenant à Staphylococcus pasteuri b) amplification de l'acide nucléique appartenant à Staphylococcus pasteuri; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri correspondants aux fragments encadrés par les amorces; d) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié, par exemple par hybridation de sonde spécifique, par séquençage ou par analyse de sites de restriction. 11) Kit de détection de la présence de Staphylococcus pasteuri dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants - un couple d'amorces selon la revendication 8 ou 9; - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'acide nucléique de Staphylococcus pasteuri; - éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde nucléique selon l'une des revendications 5 à 7. 12) Utilisation d'une sonde nucléique selon l'une des revendications 5 à 7 comme outil épidémiologique pour repérer et classer des souches de Staphylococcus pasteuri à des souches particulières de Staphylococcus pasteuri