Brevet FR2739867A1 — publié le 19970418

La présente invention concerne, d'une part, des milieux sélectifs de culture et d'isolement de bacté- ries Gram négatif (Gram-) et, d'autre part, des composi- tions antibiotiques utiles pour la culture et l'isolement de ces mêmes germes. On connaît de l'art antérieur le brevet euro- péen publié sous le numéro EP-A-243 015 qui revendique un milieu de culture pour l'isolement sélectif des bactéries Neisseria pathogènes, ledit milieu comprenant une composition antibiotique incluant le mélange de vancomycine et de lincomycine. L'association de ces deux antibiotiques, ayant une activité inhibitrice envers les bactéries Gram*, est utilisée, avec d'autres agents inhibiteurs, pour isoler de façon sélective les bactéries Nelserria pathogènes. D'autre part, la nisine est connue comme étant une bactériocine, c'est-àdire un antibiotique de type polypeptidique produit par certaines souches de Lactococcus lactis ou Strepcoccus lactis. Cet antibioti- que présente un large spectre vis à vis des microorganis- mes Gram', incluant les sporulés. On connaît également la publication de Stevens et al. (Nisin Treatment for inactivation of Salmonella Species and Other Gram- negative Bacteria, A.E.M. (1991), Déc., p 3613-3615) qui décrit l'activité de la nisine. Ainsi, en plus de son activité inhibitrice connue contre les bactéries Gram' et utilisée dans le domaine de l'agro- alimentaire pour la conservation de denrées sensibles comme les produits laitiers (Delves-Broughtonj., Nisin and its uses as a food preservative, Food Technol., (1990) 4, p. 100-112,) ou dans le but de contrôler un procédé de fermentation comme la production d'acide lactique dans le vin (Hanlin M.B. et al., Bacteriocins of lactic acid bacteria in combination have greater antibacterial activity, Journal of Food Protection, (1993), 56: p. 252-255), la nisine est décrite en combinaison avec un agent chélatant comme ayant une activité inhibitrice envers de nombreuses espèces de Salmonella et également envers d'autres entérobactéries, ces microorganismes étant tous des bactéries Gram- aérobies (anaérobies facultatives). Le problème de l'homme du métier, lorsqu'il met au point des milieux sélectifs de culture et d'isole- - ment de bactéries, est de trouver un compromis entre la spécificité et la sensibilité, la sensibilité étant définie comme la probabilité d'obtenir un test positif, et la spécificité comme l'aptitude du test à ne pas générer de faux positifs. La présente invention apporte une solution à ce problème pour la mise au point de milieux de culture spécifiques pour la croissance et l'isolement de bacté- ries Gram-. En effet, la Demanderesse a mis au point des milieux de culture sélectifs, lesdits milieux comprenant la combinaison d'une ou de plusieurs bactériocines actives contre les bactéries Gram+ et d'un ou plusieurs antibiotiques spécifiquement actifs contre les bactéries Gram+. Cette combinaison permet d'augmenter la sélecti- vité des milieux en améliorant l'efficacité et en élargissant le spectre d'inhibition des bactéries Gram, tout en préservant une très bonne sensibilité des milieux vis-à-vis des microorganisme à isoler. La présente invention concerne donc des milieux sélectifs de culture et d'isolement de bactéries Gram-, lesdits milieux comprenant la combinaison d'un ou de plusieurs antibiotiques spécifiquement actifs contre les bactéries Gram+ et d'une ou de plusieurs bactérioci- nes. Les milieux de culture de l'invention peuvent être des milieux de culture liquides ou gélosés. Une variante préférée de milieu sélectif selon l'invention est un milieu comprenant de la vancomycine et/ou de la teicoplanine en tant qu'antibio- tique spécifiquement actif contre les bactéries Gram et de la nisine en tant que bactériocine. Les milieux selon l'invention peuvent en outre contenir des antifongiques. Avantageusement, le milieu sélectif selon l'invention est un milieu de culture et d'isolement de bactéries anaérobies Gram- caractérisé en ce qu'il comprend en outre un antibiotique spécifiquement actif -- contre les bactéries aérobies Gram-. Selon une autre variante avantageuse, l'invention vise également un milieu spécifique pour la croissance et l'isolement des bactéries aérobies Gram' parasites que sont les bactéries Neisseria pathogènes. L'invention a donc également pour objet un milieu de culture sélectif pour la croissance et l'isole- ment des bactéries Neisseria pathogènes comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram et au moins une bactériocine, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un mélange composé d'anti- biotiques actifs contre les bactéries Gram- autres que Neisseria et/ou des antibiotiques actifs contre les proteus et/ou des agents actifs contre les levures. Préférentiellement, ce milieu comprend un mélange composé de colymycine, de triméthoprine et d'amphotéricine B. Dans la présente invention, on entend par: - "bactériocine", des toxines produites par certaines souches bactériennes, telles que par exemple la nisine, la pédiocine A, la lacticine; -"antibiotiques spécifiquement actifs contre les bactéries Gram, des antibiotiques tels que la vancomycine, la teicoplanine, et ceux de la famille des MLS (Macrolides, Lincosamides et Streptogramines); -"antibiotiques spécifiquement actifs contre les bactéries aérobies Gram-, des antibiotiques tels que bactéries anaérobies Gram-, caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries aérobies Gram-, choisi parmi l'acide nalidixique ou les aminosides, tels la kanamycine. Selon un autre mode de réalisation avanta- geux, lesdites compositions sont des compositions pour l'isolement et la culture de N. pathogènes comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram' et au moins une bactériocine caractéri- - sées en ce qu'elles comprennent en outre de la colymy- cine, de la triméthoprine, et de l'amphotéricine B. L'invention vise enfin les utilisations desdites compositions pour la fabrication de milieux sélectifs de culture et d'isolement de bactéries Gram-, plus particulièrement de bactéries Gram- anaérobies, ou de Neisseria pathogènes. Les exemples suivants permettent d'illustrer l'invention. EXEMPLE 1: Milieu sélectif pour la croissance et l'isolement des bactéries anaérobies Gram-. Des essais ont été réalisés pour comparer le milieu objet de la présente invention avec un milieu conventionnel ou un milieu comprenant, en tant que seul agent inhibant la croissance des bactéries Gram, une bactériocine. Le premier milieu ci après désigné "milieu A" contient tous les éléments de la base nutritive, un supplément d'enrichissement, de la vancomycine et de l'acide nalidixique. Le second milieu, désigné "milieu B" contient tous les éléments de la base nutritive, un supplément d'enrichissement, de l'acide nalidixique et de la nisine. Le troisième milieu, désigné "milieu C" cor- respond au milieu selon l'invention et contient tous les éléments présents dans le milieu A et le milieu B. Les concentrations indiquées sont les concen- trations finales pour un litre de préparation. TABLEAU I PRODUIT MILIEU A MILIEU B MILIEU C - Base nutritive3 % 3 % 3 % pour anaérobies supplément 8 mg/l 8 mg/l 8 mg/l d'enrichissement acide nalidixique 10 mg/l 10 mg/l 10 mg/l Vancomycine 2,5 mg/I O 2,5 mg/l Nisine O 60 mg/l 60 mg/l Agar 13g/ 13g/l 13 g/l Sang défibriné5% 5 % 5% La base pour anaérobies comprend des composés favorisant la croissance des bactéries anaérobies Gram-. On utilise le milieu Schaedler commercialisé par la société Sanofi Diagnostics Pasteur comme base pour anaérobies. La nisine utilisée provient du fournisseur Sigma (code N5764). Le supplément d'enrichissement comprend de l'hémine (5mg/l), de la vitamine K3(0,5 mg/1) et du succinate de sodium (2,5 mg/l). Le pH est ajusté à 7,6 + 0,2. Les souches testées en culture proviennent soit de souches déposées à l'ATCC ou à la collection de l'Institut Pasteur (CIP), soit provenant d'hôpitaux (notées "SDP"). Elles sont les suivantes: Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium sporogenes ATCC 11437, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Clostridium oedematiens SDP, Clostridium sphenoides SDP Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides fragiles SDP 385, Bacteroides fragiles SDP 1396, Bacteroides distaso- mis SDP 419, Bacteroides ATCC 130, Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Bacteroides vulgatus CIP 103714, et Fusobacte- rium nucleatum CIP 101130. Protocole: On met dans une solution d'un litre d'eau distillée la base de Schaedler et de l'agar dans des proportions telles qu'indiquées dans le tableau 1. On porte le mélange à ébullition puis on autoclave. On ajoute ensuite les autres éléments selon les milieux décrits ci- dessus, A, B et C, en utilisant des solutions stériles. Les préparations obtenues sont coulées alors en boite de Pétri (boîte ronde de 90 mm) avec 5 % de sang decheval défibriné. On ensemence les boîtes à l'oese à partir d'une suspension bactérienne. On incube alors les boites ensemencées en anaérobiose, à 37 C, pendant 48 heures. Dans le tableau 2 ci-dessous, les abrévia- tions des souches "Bact", "Fuso" et "Clost" signifient respectivement souches Bacteroides sp, Fusobacterium nucleatum et Clostridium sp. Dans le tableau 2 ci-dessous, les signes + et -, au niveau des différents milieux, signifient: - -: croissance nulle - +: croissance faible (quelques colonies ayant un diamètre faible) - ++: bonne croissance (nombreuses colonies ayant un diamètre important) - +++: très bonne croissance (on ne peut plus compter les colonies) TABLEAU II Souche Gra nombre Milieu A Miieu | Milieu C d de souche B a3cst | t0 | I utilisés selon l'invention. EXEMPLE 2 Milieu sélectif pour l'isolement de Neisseria pathogènes Des essais ont été réalisés pour comparer le milieu selon l'invention avec un milieu conventionnel et un milieu comprenant, en tant que seul inhibiteur des bactéries Gram, une bactériocine. Le premier milieu ci-dessous désigné "milieu A" contient tous les éléments de la base nutritive enrichie en hémoglobine, un supplément d'enrichissement, un supplément sélectif, dont la composition est donnée ci-dessous, et de la vancomycine et de la teicoplanine en tant qu'antibiotiques actifs contre les bactéries Gram'. Le second milieu, désigné "milieu B" contient tous les éléments de la base nutritive enrichie en hémoglobine, un supplément d'enrichissement, le même supplément sélectif que celui du milieu A, et une bacté- riocine. Le troisième milieu, désigné "milieu C" correspond au milieu selon l'invention et contient tous les éléments présents dans le milieu A et le milieu B. Protocole: La base gélosée nutritive est une base pour gélose chocolat enrichie en hémoglobine, commercialisée par la société Sanofi Diagnostics Pasteur, dont la composition est la suivante: Peptone de viande 20 g/l Extrait de levure 3 g/l Extrait de viande 3 g/l Amidon 2 g/l Chlorure de sodium 5 g/l L-cystéine 0,01 g/l Agar 15 g/l Cette base est préparée et autoclavée séparément des autres solutions et composés. La solution d'hémoglobine est préparée à partir d'hémoglobine en poudre et est présente dans le milieu à une concentration finale de 10 g/l. Elle est préparée et autoclavée séparément des autres solutions et composés pour être ensuite ajoutée stérilement à la base. Le supplément d'enrichissement est un supplé- ment polyvitaminique (SPV) commercialisé par la société Sanofi Diagnostics Pasteur sous la marque SPV . Cette solution est ajoutée au milieu à un volume final de 10 ml. La composition suivante est donnée pour la réalisa- tion d'un litre de milieu selon l'invention: Chlorydrate de cystéine 25,9 g Chlorydrate de guanine 0,03 g Chlorydrate de thiamine 0,003 g Chlorure de co-carboxylase 0,1 g NAD 0,25 g Nitrate ferrique 0,02 g Acide para-amino-binzoïque 0,013 g Adénine 1 g L-glutamine 10 g Vitamines B12 0,01 g Glucose 200 g Le supplément sélectif est un mélange composé d'un antibiotique actif contre les bactéries Gram- autres que Neisseria (colymycine) d'un antibiotique actif contre les Proteus (triméthoprime) et d'un agent actif contre les levures (amphotéricine B). Chaque antibiotique est préparé sous forme de solution stérile, soit à partir de flacons injectables réhydratés avec une solution appropriée, soit par pesée suivie d'une réhydratation et d'une filtration sur filtre 0,22 pm. Pour préparer 200 ml de chaque solution d'anti- biotique, on réhydrate chaque antibiotique dans une solution de réhydratation et eau stérile en quantité suffisante pour obtenir une solution finale de 200 ml. On utilise 500 mg de triméthoprine repris avec 500 p1 d'acide lactique, 300 mg d'amphotéricine et 15.106 U.I. de colymycine. Des solutions de vancomycine, teicoplanine et nisine sont préparées de la même façon en dissolvant respectivement 400 mg de teicoplanine, 400 mg de vancomy- cine et 5 g de nisine repris avec quelques gouttes d'acide chlorhydrique afin d'obtenir 200 ml de solution. On donne dans le tableau III ci-après une composition des milieux obtenus pour un litre. TABLEAU III Constituants MILIEU A MILIEU B MILIEU C Base gélose 60 g 60 g 60 g Supplément d'enrichissement 10 mi 10 mi 10 ml 2Supplément sélectif 6 mi 6 ml 6 ml Vancomyine/teicoplanine4/ 4 m 0I 4/4 mgii Ifise 0 50 mg 50 mg Les différents milieux réalisés sont répartis en boite de Pétri (diamètre 90 mm, volume de 18 ml) selon les pratiques courantes en bactériologie. Ces milieux peuvent être conservés pendant douze semaines entre 2 et 8 C. Les souches testées en culture proviennent de souches, soit déposées à l'ATCC, ou à la collection de l'Institut Pasteur (CIP), soit provenant d'hôpitaux (notées "SDP"). Certaines souches de Staphylocoque et Entérocoque testées ont des profils de résistance particuliers aux antibiotiques classiques contre les bactéries Gram (ces souches sont les plus représentati- ves possible des cas présents en milieu hospitalier, la concentration minimale inhibtrice (CMI) étant souvent élevée vis à vis de la vancomycine, teicoplanine et autres antibiotiques classiques). Les souches sont les suivantes: Neisseria meningitidis SDP 2161, Neisseria meningitidis SDP 7612, Neisseria meningitidis ATCC 13077, Neisseria meningitidis Tiron SDP, Neisseria meningitidis ATCC 1913, Neisseria gonorrhoae ATCC 1924, Neisseria lactamica SDP186, Neisseria Gonorrhoeae Adelaide SDP, Neisseria gonorrhoeae Hauch SDP, Neisseria gonorrheae SDP 345, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus SDP 13/93, Staphylo- coccus SDP 17/93, Staphylococcus SDP 18/93, Enterococcus SDP 21/93, Enterococcus faecalis ATCC 33186. Les cultures bactériennes sont ensemencées selon les méthodes standard en bactériologie. La crois- sance et l'inhibition sont observées après 48 heures d'incubation sous atmosphère de CO2 à 37 C. TABLEAU IV Souches nombre Mii Milieu B Milieu C + + + k-.-++ Vei.teria 13 - 3 10 - 33 10 !0- ----- 3r 102 S$aphylo$occs3 jI 2 IEnterZZZis 31 1 1 I - _ Dans le tableau IV ci- dessus, les signes - et + au niveau des différents milieux, ont la même signifi- cation que celle donnée dans l'exemple 1. On remarque que la croissance des bactéries Neisseria ne varie pas en fonction du milieu utilisé. Par contre, les bactéries Gram+ sont peu inhibées sur les milieu A et B, alors sur le milieu C, leur croissance est très inhibée. Les résultats démontrent que la combinaison des antibiotiques selon l'invention, dans le milieu C, permet d'obtenir une sélectivité plus importante que celle à laquelle on pouvait s'attendre par la simple addition des effets individuels des antibiotiques. En effet, les souches Staphylococcus et Enterococcus qui ne sont pas totalement inhibées par les milieux A et B, le - sont pour la plupart sur le milieu C. REVENDICATIONS 1. Milieu sélectif pour la culture et l'iso- lement de bactéries Gram- comprenant au moins un antibio- tique spécifiquement actif contre les bactéries Gram* et - au moins une bactériocine. 2. Milieu selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram' est choisi parmi la vancomyci- ne, la teicoplanine ou un mélange des deux,ou des antibiotiques du groupe des MLS, et la bactérioricine est choisie parmi la nisine, la pédiocine A ou la lacticine. 3. Milieu selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la concentration en antibiotiques spécifiquement actifs contre les bactéries Gram' est com- prise entre 1 et 10 mg/l et de préférence est de 2,5 mg/l, et celle de la bactériocine est comprise entre 10 et 100 mg/l, et de préférence entre 50 et 60 mg/l. 4. Milieu selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend de la vancomycine et/ou de la teicoplanine et de la nisine. 5. Milieu selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des antifongiques. 6. Milieu sélectif pour la culture et l'iso- lement de bactéries Gram- anaérobies comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram+ et au moins une bactériocine, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries aérobies Gram-. 7. Milieu selon la revendication 6 caractéri- sé en ce que l'antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries aérobies Gram- est choisi parmi l'acide nalidixique ou les aminosides, tels la kanamycine. 8. Milieu selon la revendication 6 ou la revendication 7 caractérisé en ce que l'antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries aérobies Gram- a une concentration comprise entre 5 et 50 mg/l, et de préférence 10 mg/l. 9. Milieu sélectif pour la culture et l'isolement de Neisseria pathogènes comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram' et au moins une bactériocine, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un mélange composé d'antibioti- ques actifs contre les bactéries Gram- autres que Neisse- ria, et/ou des antibiotiques actifs contre les Proteus et/ou des agents actifs contre les levures. 10. Milieu selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il contient de la colymycine, de la triméthoprine, et de l'amphotéricine B. 11. Milieu sélectif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un milieu liquide à base d'agar ou d'un milieu à base de gélose. 12. Composition bactéricide pour la culture et l'isolement de bactéries Gram- comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram' choisi parmi la vancomycine, la teicoplanine ou un mélange des deux,ou des antibiotiques du groupe des MLS, et au moins une bactériocine, choisie parmi la nisine, la pédiocine A ou la lacticine. 13. Composition bactéricide pour la culture et l'isolement de bactéries Gram- anaérobies comprenant au moins un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries Gram+ choisi parmi la vancomycine, la teicopla- nine ou un mélange des deux,ou des antibiotiques du groupe des MLS, et au moins une bactériocine, choisie parmi la nisine, la pédiocine A ou la lacticine, caracté- risée en ce qu'elle comprend en outre un antibiotique spécifiquement actif contre les bactéries aérobies Gram-, choisi parmi l'acide nalidixique ou les aminosides, tels la kanamycine. 14. Composition selon la revendication 12 pour la culture et l'isolement de Neisseria pathogènes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de la colymycine, de la triméthoprime, et de l'amphotéricine B. 15. Utilisation d'une composition selon la revendication 12 pour la fabrication d'un milieu sélectif de culture et d'isolement de bactéries Gram-. 16. Utilisation de la composition selon la revendication 13 pour la fabrication d'un milieu sélectif de culture et d'isolement de bactéries Gram- anaérobies. 17. Utilisation de la composition selon la revendication 14 pour la fabrication d'un milieu sélectif de culture et d'isolement de Neisseria pathogènes.