Brevet FR2746815A1 — publié le 19971003

La présente invention est relative à des séquences en amont d'un gène exprimé dans les cellules du muscle lisse, tel que SM 22, ainsi qu'à des vecteurs les contenant. Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces vecteurs et séquences en thérapeutique, par exemple pour la production de polypeptides actifs localement ou de manière systémique, notamment des polypeptides immunogènes, des polypeptides régulateurs endogènes tels que les cytokines, ou encore pour la production d'ARN d'intérêt thérapeutique, par exemple un ARN anti-sens . De manière particulière, l'invention a pour objet l'utilisation des vecteurs et séquences nucléiques dans le traitement des maladies vasculaires. L'athérosclérose est une maladie dégénérative des artères associant les lésions de l'artériosclérose et de l'athérome, et combinant ainsi un durcissement des artères et une dégénéréscence graisseuse de leur tunique interne. Cette insuffisance coronarienne est généralement remédiée par une angioplastie coronaire percutanée consistant à introduire dans le réseau artériel coronaire un cathéter muni à son extrémité d'un ballonnet, d'avancer le cathéter jusqu'au niveau de la sténose et de gonfler le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi et de rétablir ainsi un calibre coronaire permettant une perfusion myocardique suffisante. Cette technique de revascularisation myocardique est très largement utilisée (50 000 interventions par an en France et 500 000 interventions par an aux Etats-Unis) mais est cependant limitée par la réapparition, dans les mois suivants l'opération, d'une nouvelle lésion au site dilaté, ou resténose, dans environ 30 % des cas. Les divers traitements proposes pour traiter ce type de lésions sont résumées dans l'article de FELDMAN et STEG : "Perspective de la thérapie génique de la resténose" (Médecine/Sciences, synthèse 1996, 12, 47-55). Deux mécanismes sont responsables des resténoses l'hyperplasie intimale et le remodelage artériel. Le premier de ces mécanismes, l'hyperplasie intimale est due à la prolifération des cellules musculaires lisses dans l'intima, qui aboutit à la synthèse d'une volumineuse matrice extra cellulaire. Cette activation serait induite par la libération locale de facteurs de croissance, et de cytokines, ainsi que par la suppression de la synthèse de certains peptides endothéliaux antiproliférants. Le second mécanisme, le remodelage artériel, consiste en une réduction du calibre de l'artère sans modification de l'épaisseur de la paroi, et donc sans prolifération de cellules. Ces auteurs décrivent diverses tentatives destinées à inhiber l'hyperplasie intimale, par thérapie génique, mais dont les résultats se sont révélés peu satisfaisants, pour diverses raisons. L'inéfficacité du transfert est une des raisons généralement invoquée pour expliquer ces résultats. Ce problème a été partiellement résolu par l'utilisation de vecteurs adénoviraux, mais d'autres problèmes sont apparus, liés à l'immunogénicité de ces virus, au risque de recombinaison avec des adénovirus sauvages ou au risque de dissémination de ces vecteurs dans la circulation systémique. Ces auteurs citent l'utilisation de séquences promotrices spécifiques des cellules vasculaires, comme la préproendothéline, ou des complexes adénovirus-ligand, comme constituant des voies de recherche très intéressantes, sans pour autant développer ces aspects. La demande WO 96/05.321 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) décrit aussi des adénovirus recombinants défectifs comportant un gène suicide pour le traitement de la resténose. Le gène suicide peut être placé sous le contrôle d'un promoteur actif dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Seul le promoteur de l'actinie a du muscle lisse est cité dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre. Aucun exemple d'utilisation d'une telle construction ne vient illustrer cette demande. Les protéines constituant les muscles lisses ont fait l'objet d'études parcellaires. Ainsi, la protéine SM 22, qui constitue un des premiers marqueurs à apparaître lors de la différenciation des cellules de muscles lisses, a été étudiée et la partie codante de son gène a été séquencée chez la souris (SOLWAY et AL, 1995, J. Biol. Chem, 270,22, 13460-13469) et chez le rat (KEMP et AL, 1995, BIOCHEM. J. 310,1037-1043). Les séquences du gène de poulet et du gène humain ont aussi été déterminés (Nishida et al, 1991, Biochem. Int., 23,663-668 pour le gène de poulet ; Thweatt et al, 1992, Biochem. Biophyse. Res. Comm., 187,1-7 pour le gène humain). Le gène codant pour la protéine SM 22 alpha chez la souris est composé de cinq exons et comprend 6,2 kb. I1 est présent en une seule copie dans le génome. SOLWAY et al. ont montré que les 441 paires de base en amont de la région codante du gène étaient nécessaires et suffisantes pour induire un taux important de transcription d'un gène reporteur, dans des cultures cellulaires primaires d'aortes de rats et dans les lignées A7r5. Ils ont d'autre part mis en évidence que les ARN messagers de ce gène étaient exprimés à des taux importants dans l'aorte, dans l'utérus, dans les poumons et dans l'intestin. XEMP et al (1995, BIOCHEM. J. 310, 1037-1043.) ont cloné et séquencé le fragment de 1,9 kb en amont de la séquence codante du gène SM 22 de rat. Des délétions effectuées dans le fragment ont montré que la région du promoteur comprise entre les nucléotides +65 et -303 étaient plus actives qu'un fragment de 1,5 kb comprenant une partie importante de la région du gène non traduite, ce qui suggérerait la présence de séquences régulatrices à l'extrémité 5' du promoteur. OSBOURN et AL (1995, Gene, 154, 249-253) ont aussi étudié la région 5' en amont du gène SM 22 du rat. Ils ont mis en évidence la présence de deux introns dans cette région. On notera que ces études ont été faites in vitro en utilisant des cultures de cellules primaires de l'aorte, et non in vivo. Or, ces conditions d'expérimentation ne sont pas représentatives de l'activité des gènes dans les cellules de l'organisme. De plus, les études effectuées sur le gène de la souris ne concernent qu'une région très limitée de la partie non codante du gène située à l'extrémité 5', c'est-à-dire la partie en aval du nucléotide -441. Le demandeur s'est attaché à identifier in vivo l'activité des diverses régions constituant la région en amont de la séquence codante exprimée du gène de la protéine SM 22. Il s'est d'autre part attaché à déterminer si des modifications dans cette séquence induisait les changements dans l'expression du gène dans les différents tissus. Il a mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible , en modifiant la région en 5' du gène de la protéine SM 22 de souris, d'obtenir une expression spécifique d'un gène reporteur dans les muscles lisses des artères et en particulier de l'aorte. La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend - un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou dune séquence hybridant dans des conditions fortement stringentes à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo de ce gène dans des cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique L'invention concerne également toute séquence nucléotidique d'origine naturelle ou obtenue par synthèse chimique présentant une homologie avec la séquence SEQID n'l d'au moins 70 *. On entend par séquence nucléotidique d'origine naturelle, un fragment d'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse de 1'ARN messager cellulaire ou encore un fragment d'ADN génomique obtenu après clivage de 1'ADN cellulaire à l'aide d'enzymes de restriction. On entend par séquence nucléotidique obtenue par synthèse chimique un fragment d'ADN de séquence connue généré par synthèse automatique de polynulcéotides, par exemple à l'aide d'un appareil automatique adapté. Une protéine d'intérêt thérapeutique ou un ARN, est susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les artères et/ou capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale. Pour la présente invention, le terme "conditions fortement stringentes" est utilisé dans le sens donné par Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions. A titre préféré, les conditions d'hybridation sont telles que décrites par Maniatis (édition de 1982). Trois lavages destinés à éliminer les fragments non hybridés sont nécessaires et sont effectués à 65 C en présence de 0,2 SSC et 0,1 % SDS, en l'absence de formamide. De manière avantageuse, ladite séquence comprend un fragment de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +4135, dont la séquence SEQ ID n'l est donnée en annexe, ou de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +65 dont la séquence SEQID n 2 est donnée en annexe. Un tel fragment peut en particulier comprendre au moins une partie de la séquence SEQ ID N 3 qui correspond à la partie en amont de l'extrémité 5' de la partie codante comprise entre les nucléotides -2126 et -1340. Une telle séquence SEQ ID N 3 dont la séquence est donnée en annexe constitue un objet de la présente invention. Les séquences SEQ ID n 2 et SEQ ID n 1 sont comprises respectivement dans les plasmides p2126nlz et p2126INTnlz portées par les souches déposées le 25 mars 1996 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'institut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n I-1685 et I-1686. L'invention a également pour objet les séquences hybridant dans des conditions de forte stringence avec les séquences SEQ ID n 1, SEQ ID n 2 et SEQ ID n 3. La présente invention n'est néanmoins pas restreinte à des séquences contenant des fragments du gène de souris, mais concerne toute autre séquence de toute autre espèce ayant les mêmes propriétés, à savoir d'induire spécifiquement une expression d'un gène dans les cellules des artères. Ainsi, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'article de KEMP et AL (1995, précédement cité) qui décrit la séquence en amont du gène de rat de la protéine SM 22. La présente invention couvre aussi toute séquence comprenant des fragments des séquences en amont de gènes de la protéine SM 22, modifiées par exemple par délétion de certaines structures qui conservent des fonctions identiques ou similaires à celles de la séquence complète. La protéine d'intérêt thérapeutique peut être une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique, telle que la thymidine kinase du virus de l'herpès. Cette protéine présente la particularité de transformer le ganciclovir (Merck Index, référence 4262), un analogue de la guanosine, en un dérivé qui bloque la synthèse de 1'ADN dans les cellules en réplication. L'introduction d'un gène codant pour cette protéine dans les séquences selon la présente invention permet donc de bloquer la prolifération des cellules dans le cas de l'hyperplasie intimale. Une séquence codant la thymidine kinase est notamment décrite par Caruso et Klatzmann (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 182-186). Ladite protéine d'intérêt thérapeutique peut aussi être une protéine présentant un effet cytostatique, telle que la protéine codée par le gène Rb (Chang et al., 1995, Science, 267, 518-522), ou par le gène eNOS (Hamon et al., 1994, Circulation, 90, 1357-1362).. Elle peut aussi être une protéine présentant une activité lipolytique, telle qu'une lipoprotéine lipase. De telles protéines sont codées par les séquences décrites par Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) et Ming Sun Liu (1994, J. Biol. Chem, 269-11417). Elle peut aussi être un facteur de croissance des cellules endothéliales. Une telle protéine peut être en particulier une interleukine. Elle peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, ou l'actine, ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le collagène ou l'élastine. Elle peut être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90 11092, et en particulier un antigène viral tel que la glycoprotéine gpl20 ou la protéine Nef du VIH (virus de l'immunodeficience humaine). De manière générale, ladite protéine peut être une ou plusieurs protéines présentant un intérêt thérapeutique ou vaccinal, telles que des protéines d'intérêt immunothérapeutique, par exemple des interleukines, les facteurs de croissance, par exemple les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou le NGF (Nerve Growth Factor), des protéines pouvant induire une réponse immunitaire, que ce soit une immunité humorale, cytotoxique ou cellulaire, ou des protéines permettant de complémenter l'activité d'un gène normalement exprimé chez l'individu à traiter mais qui ne l'est plus, soit par mutation ou délétion de sa séquence. Cette séquence peut aussi coder pour un ARN d'intérêt thérapeutique. Un tel ARN peut être 1'ARN antisens de la protéine p 53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90 11092, déposée par la société VICAL. La présente invention a en outre pour objet des vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. Un tel vecteur peut contenir tout autre séquence d'ADN nécessaire à l'expression de la protéine, ou de 1'ARN, d'intérêt thérapeutique dans les tissus cibles, et en particulier peut contenir une origine de réplication efficace dans les cellules des artères, en particulier dans les cellules du muscle lisse. Un tel vecteur peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène à remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la séquence selon l'invention. Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité sera remplacé par le gène porté par le vecteur ou la séquence et que l'on désire voir s'exprimer dans l'organisme. Une telle méthode de recombinaison homologue peut être du type de celle décrite par Le Mouellic et al., (1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA , 87, 4712-4716) ou dans la demande PCT WO 91/06.667. Un tel vecteur peut être un vecteur dérivé d'un adénovirus. Des adénovirus adaptés à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux décrits par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité) ou OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781-784) ou encore dans la demande FR 94.03.151 (Institut Pasteur, Inserm). Ces virus sont généralement rejetés par l'individu, du fait de leur trop forte immunogénicité. Néanmoins, des souches de ces virus ont été sélectionnées afin de diminuer leur caractère immunogène. En tout état de cause, ces vecteurs, même présentant une forte immunogénicité, peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, car les artères sont traitées durant des périodes de temps relativement courtes, de l'ordre de quelques semaines, compatibles avec les temps de rejet des adénovirus par le système immunitaire de l'hôte. On notera néanmoins que l'introduction des séquences selon la présente invention dans les vecteurs décrits cidessus n'est pas indispensable, et que les cellules des artères peuvent être directement transfectées par de 1'ADN comprenant ces séquences. Les séquences nucléiques selon la présente invention peuvent être introduites après couplage covalent de l'acide nucléique avec des composés favorisant leur pénétration dans les cellules ou leur transport vers le noyau, les conjugués résultants étant éventuellement encapsulés dans des microparticules polymères, comme dans la demande internationale WO 94/27238 de Meidsorb Technologies International. Selon un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être incluses dans un système de transfection comprenant des polypeptides favorisant leur pénétration dans les cellules, comme dans la demande internationale WO 95/10534 de Seikagaku Corporation. Ces vecteurs ou séquences peuvent être administrés in situ par tout moyen connu de l'homme du métier. Ainsi, ils peuvent être délivrés in situ à l'aide d'un cathéter à ballonnet recouvert de canaux, tel que décrit par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité). Ils peuvent aussi être administrés au cours d'une opération, ou en dénudant l'aorte. Un autre mode d'administration consiste à introduire un grillage de faible maillage imprégné d'ADN comprenant ces séquences, le long de l'aorte ; tel que décrit par Feldman et al. (1995, J. Clin. Invest., 95, 2662-2671). Ces séquences ou vecteurs peuvent avantageusement être administrés sous la forme d'une composition les contenant, par exemple dans un gel facilitant leur transfection dans les cellules des artères. Un tel gel peut être un complexe de poly-L lysine et de lactose, tel que décrit par MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21, n 4, 871-878) ou du poloxamer 407 tel que décrit par PASTORE (1994, Circulation, 90, I-517). Ils peuvent aussi être mis en solution dans une solution tamponnée ou être associés à des liposomes. La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant de telles séquences, vecteurs ou compositions, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques les contenant en quantités pharmaceutiquement efficaces ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles. De tels séquences, vecteurs ou compositions peuvent être avantageusement utilisés pour la fabrication de médicaments pour la délivrance au niveau des artères d'un ADN (ADNc ou ADN génomique) pouvant exprimer notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, pour le traitement des maladies coronariennes, et en particulier pour le traitement de la resténose. Elles peuvent néanmoins être aussi utilisées pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de mutations fragilisant les vaisseaux. Un tel médicament pourrait, par exemple, comprendre une séquence ou un vecteur selon l'invention capable d'exprimer un gène codant pour une protéine normale de la desmine ou une protéine d'adhésion du muscle du type CAM. La présente invention a aussi pour objet des ARN exprimés à partir des séquences et vecteurs objets de la présente invention, et en particulier des ARN messager. La présente invention a aussi pour objet un procédé de criblage de molécules in vitro, en vue de tester leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM 22. Un tel procédé comprendra, par exemple, une première étape suivant laquelle on transfecte des cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'invention, comprenant un gène reporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la protéine SM 22. Dans une seconde étape, les cellules ainsi transfectées sont incubées en présence de la molécule à tester, puis l'expression du gène reporteur est quantifiée. Les cellules utilisées pour la transfection sont avantageusement des cellules de muscle lisse, en particulier des cellules de l'aorte, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme d'une lignée cellulaire stable. Dans le cas où les cellules sont transfectées par des constructions telles que p2126nlz ou p2126INTnlz, la quantification de la beta-galactosidase produite sera avantageusement effectuée par lecture optique, par exemple en utilisant la trousse de détection commercialisée par Boehringer sous la référence 1 669 893 (catalogue Boehringer-Mannheim - Biochemicals , 1996, page 236, béta-Gal Reporter Gene Assay, Chemiluminescent). Dans un autre mode de réalisation du procédé de criblage in vitro selon l'invention, le gène reporteur est le gène codant pour la luciférase. Dans ce cas, la quantification de l'expression de la luciférase est avantageusement effectuée par chimioluminescence, par exemple au moyen de la trousse de diagnostic commercialisée par Boehringer sous la référence 1 758 241 (catalogue Boehringer-Mannheim Biochemicals , 1996, Luciferase Reporter Gene Assay). La présente invention est aussi relative à des animaux transgéniques et en particulier des souris portant une séquence ou un vecteur tel que défini ci-dessus dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacée par un gène reporteur. La présente invention est enfin relative à un procédé de détection de mutations de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22. De telles mutations sont en effet susceptibles de modifier l'expression du gène codant pour la protéine SM22, en particulier diminuer ou même abolir l'expression de ce gène dans les muscles lisses. De telles mutations seraient de nature à entrainer une modification du fonctionnement du muscle lisse, la protéine SM22 étant apparentée à une famille de protéines impliquées dans la régulation de la fixation du calcium, du type calponine (Ayme-Southgate et al, 1989, J. Cell. Biol.). Un tel procédé de détection de mutations peut être avantageusement le procédé objet de la demande de brevet français FR-93 10821. De manière complémentaire, des séquences selon l'invention modifiées de telle sorte qu'elles permettent une augmentation de l'expression du gène SM22 font également partie de l'invention. De telles souris transgéniques peuvent être utilisées pour cribler des molécules pour leur activité sur les séquences régulatrices gène codant pour la protéine SM 22. Des molécules peuvent être administrées à des souris, puis après sacrifice, des coupes histologiques sont effectuées afin de mettre en évidence les tissus colorés par le gène reporteur. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer au manuel suivant : "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989), ou à l'une de ses récentes rééditions. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent La figure 1 représente la carte de restriction et la structure exon/intron du site SM 22, comprenant la région -2474 à +6030 (par rapport au site d'initiation de la transcription). Les exons sont représentés par des carrés blancs tandis que les flèches indiquent la position des séquences répétées de type B1. La figure 2 représente l'alignement de trois séquences répétées de type B1, dans lesquelles les échanges de base sont indiquées. La figure 3 est un autoradiogramme illustrant l'identification du site d'initiation de la transcription. Le puits P correspond à l'amorce utilisée. La figure 4 représente la séquence de la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription, et de l'exon du gène SM 22. Les sites de fixation des différents facteurs sont indiqués, ainsi que les différentes séquences concensus. Les lignes discontinues indiquent la position des séquences répétées de type B1. La figure 5 illustre la fabrication du plasmide p352nlz. La figure 6 illustre la fabrication du plasmide p2126 nlz. La figure 7 illustre la fabrication du plasmide p2126INTnlz. Les figures 8A et 8B illustrent l'expression du gène lacZ dans des embryons de souris transgéniques. Les figures 8A, 8B, représentent respectivement des embryons aux stades 12,5 et 15,5 jours. Les figures 9A à 9D représentent des coupes histologiques d'embryons colorés à l'aide de lacZ. La figure 9A représente une coupe d'un embryon au stade 12,5 jours au niveau du coeur, montrant une coloration intense exclusivement dans le myocarde du ventricule droit (RV) et dans les parois des artères. (abréviations : AA : coude de la quatrième artère aortique ; CA : artère carotidienne ; E : oesophage ; li : ventricule gauche ; PA : partie proximale de l'aorte ; PT : tronc pulmonaire ; RA : atrium droit ; RV : ventricule droit ; T : trachée ; V: veine cardinale droite et gauche). La figure 9B représente une coupe à travers la région abdominale d'un embryon au stade 14,5 jours, montrant une coloration des artères ombilicales (UA) et l'absence de marquage des viscères (B: vessie ; D : duodenum ; H : gros intestin ; L: foie ; M : intestin grêle ; ST : estomac). La figure 9D est une coupe à travers les segments de la queue au stade 12,5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a). La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant à l'artère ombilicale au stade de 12,5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m) et une absence de marquage de l'endothélium (e). Les figures 10A à 10C illustrent l'expression du transgène dans des souris adultes. La figure 10A représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc). Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma). Le marquage de lacZ (figure 10B) montre que l'expression du transgène est restreinte à l'artère, tandis que l'immunofluorescence avec des anticorps SM 22 (figure 10C) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon. La figure 11 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès. EXEMPLES Matériels et méthodes 1/ Clonaae et caractérisation du gène de la souris SM 22 Environ 106 phages recombinants d'une banque génomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D. Plachov, Münster, Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL I/Eco RV de 890 bp de 1'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 Almendral et al, 1989 ; Exp. Cell Res. 181, 518-530), comme sonde. La sonde a été marquée radioactivement par initiation aléatoire et 1'ADN a été hybridée sur des filtres laissés durant une nuit à 65-C dans un tampon de Church. Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0,1 % SDS à 65 c et des plaques positives ont été purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques. L'un des clones isolés s'est révélé contenir un locus SM 22 entier. I1 a été ensuite cartographie à l'aide d'enzymes de restriction et sous-cloné. Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de 1'ADN génomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées. La séquence du gène SM 22 a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad Sci. 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio). 2. Hvbridation de tvpe Northern extension par amorce, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse De 1'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18, 5294-5299) modifiés. Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex (Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilisé en suivant les instructions du fabricant. Les analyses par hybridation de type Northern ont été effectuées en utilisant des gels d'agarose contenant du formaldéhyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hybond-N (Amersham Life Science, Little Chalfont, Royaume Uni) selon les méthodes connus de l'homme du métier. Pour les analyses par extension d'amorce, un oligonucléotide synthétique de 30 nucléotides (P27N1) complémentaire de la séquence +36 à +65 de 1'ADN complémentaire du gène SM 22 (5'- AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGAAGGAG-3), a été marqué par de la polynucléotide kinase T4. 5 pg d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybridés à 55 C avec 1-2 X 105 cpm de sonde purifiée et la réaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier. Les résultats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamlde dénaturants à 6 %. Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription. La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +112 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1) de 1'ADN complémentaire SM 22, tel que decrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci, 85, 8998-9002). En vue des analyses de protection par la RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabriqué et cloné par la méthode des bouts collants dans le site HinC II du vecteur pBluescript SK+. La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée. Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I à la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32p-CTp, La sonde (3 X 105 cpm) a été hybridée avec 5 pg d'ARN messager d'utérus de souris à 42-C durant une nuit. Après hybridation, les échantillons ont été incubés avec des RNases A et T (1 heure à 37 C), précipités, et analysés comme décrits pour l'analyse par extension d'amorce. 3. Culture cellulaire et transfection Les lignées cellulaires NIH 3T3, 10T1/2 et 8/47 ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies, Inc, Vienne, Autriche) complémentées avec 10 % de sérum de foetus de veau (Hyclone Inc.,Etats-Unis) à 37 C, dans une atmosphère de Co2 à 7%. Pour les expériences de transfection, des cellules confluentes ont été étalées, repiquées dans des boites de Petri de 6 cm, et laissées croître jusqu'à obtenir approximativement une confluence de 75 % avant ajout du mélange de transfection. Les transfections ont été effectuees en utilisant le réactif Lipofectamine commercialisé par Life Technologies Inc.. En résumé 24 pg de Lipofectamine ont été ajoutés à 6 yg de plasmide portant le gène reporteur superenroulé et 2 g de PCMVss gal comme témoin interne. Après ajout de 3 ml de DMEM, le cocktail de transfection a été ajouté aux cellules. Au bout de 6 heures, ce mélange a été remplacé avec du milieu de croissance contenant 10 % de sérum et à nouveau changé au bout de 12 heures. L'expression du produit du gène reporteur a été analysée après 24 heures. Pour les expériences de stimulation par le sérum, des cellules transfectées ont été placées dans du DMEM contenant 20 % de sérum, 24 heures avant d'être récoltées. 4. Dosage de la CAT et de la B-aalactosidase Les cellules ont été prélevées sur des boîtes de pétri avec un racloir à cellules, centrifugées, resuspendues dans 150 l de tampon Z (100 mM de phosphate de sodium, pH 7,5, lmM MgCl2, 10 nM KC1, 50 nMss - mercaptoethanol) et lysées par trois cycles de congélation/décongélation. Les débris ont été éliminés par centrifugation à basse vitesse et l'activité de la ss-galactosidase a été déterminée à partir de 2 à 20 ul de surnageant selon les procédés connus de l'homme du métier. Pour la détermination de l'activité CAT selon GORMAN et al (1982 ), de 10 à 100 yl de lysat ont été utilisés. Afin de tenir compte des variations dans l'efficacité de transfection, l'activité CAT a été normalisée avec l'activité égal. 5. Production des souris transséniques Des inserts des plasmides pnlz2126 et p2126INTnlz, déposés auprès de la CNCM respectivement sous les n-I-1685 et n-I-1686, ont été isolés par digestion avec Sal I/Pme I, suivie d'une électrophorèse sur gel, puis d'une purification utilisant le kit Geneclean (Bio 101, la Jolla, CA) puis resuspendus dans 10 mM de Tris Hcl pH 7,5, 0,25mM EDTA. Les animaux transgéniques ont été produits comme décrits précédemment par LI et al (1993, Development, 177/3, 947-959). Des souris portant le transgène ont été identifiées par PCR et hybridation de type Southern en utilisant une sonde ADN. La construction pnlz2126 a permis d'obtenir trois animaux positifs sur 17 souris, deux d'entre elles transmettant et exprimant cette construction. Pour la construction p2126INTnlz deux animaux positifs sur les 28 testés ont été obtenus et à nouveau un seul exprime et transmet cette construction. Les souris transgéniques ont été retro-croisées avec des souris c57/bl et les colorations histochimiques ont été effectuées avec des souris hémizygotes pour le transgène. 6. Colorations histochimiaues Des embryons entiers ou des tissus d'adultes ont été fixés durant 15 à 30 minutes à 4 C dans du formaldéhyde à 1 % dans du tampon A (100 mM de phosphate de sodium , pH 7,3,2 mM Mgcl2, 0,18 de sodium de deoxycholate, et 0,2 8 NP-40). Après rinçage, les spécimens ont été colorés durant une nuit à 30 C dans du tampon A contenant 1 mg/ml de X gal (Sigma, St Louis, Missouri), 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5mM de ferricyanure de potassium, et 20 mM de Tris-Cl pH 7,3. Les échantillons colorés ont alors été rincés, déshydratés à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, clarifiés dans du xylène, et enrobés dans de la paraffine. Les coupes histologiques ont été effectuées avec une épaisseur de 7 à 10 ym et à nouveau colorées avec de l'hématoxline d'Ehrlich et de l'éosine. Les embryons ont d'autre part pu être à nouveau clarifiés à l'aide d'un mélange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle. Pour l'immunohistocoloration, les tissus de souris ont été fixes dans 3 * de paraformaldéhyde dans du tampon PBS à 4 C durant 3 heures, puis enrobés dans un milieu Tissue-Tek (Reichert-Jung, Vienne) et sectionnes sur un cryo-microtome à des épaisseurs de 5 à 10 pm. Les coupes sélectionnées ont été montées et colorées en utilisant un anticorps monoclonal dirigé à l'encontre de la SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations, 55, 1-11), à une dilution 1/30 ainsi qu'en utilisant un anticorps secondaire marqué Cy3 (Biological Detection Systems, USA). Les coupes ont été examinées à l'aide d'un microscope à fluorescence. Exemple 1 Caractérisation du locus SM 22 Le criblage par hybridation de la banque génomique de souris a conduit à l'isolement de trois clones se recouvrant, contenant le gène complet de la SM 22. Une carte de restriction, qui est partiellement reproduite sur la figure 1 a été établie et les exons ont été localisés par hybridation à l'aide de sondes oligonucléotidiques synthétiques. Les régions présentant un intérêt ont été sous clonées et séquencées. La séquence a été déterminée entre les positions -2474 et +110 en aval du site de polyadenylation et a été comparée dans la banque de données EMBL. Le gène couvre 5923 bp à partir du site de début de la transcription jusqu'au site de polyadenylation et la séquence codante est partagée en 5 exons (figure 1). Toutes les frontières exonintron correspondent à des séquences consensus. Le premier exon contient seulement une séquence leader en 5' et le codon de départ de la transcription est donc localisé dans le second exon séparé du site de départ de la transcription par plus de 4kbp de séquence d'intron. Deux signaux de polyadénylation potentiels ont été localisés au position 5905 et 5913 et plusieurs régions TGT placées en aval du site de polyadénylation, prennent vraisemblablement part dans la terminaison de la transcription. L'analyse de la séquence révèle de plus la présence de trois séquences répétées (figure 2) qui présentent des homologies importantes avec les éléments répétés de type B1, dont certains sont transcrits par la RNA polymérase III et codent pour des ARN 5S. On notera que toutes les séquences répétées sont dans une orientation inverse par rapport au locus SM 22. Le site de départ de la transcription a été cartographiée par analyse par extension d'amorce (figure 3). Un oligonucléotide antisens complémentaire de l'extrémité 3' de l'exon 1 conduit à l'obtention de quatre produits d'extension qui diffèrent seulement par une paire de bases (bp) en longueur, le plus long d'entre eux étant de 65 bp. Le produit de la transcription démarre donc avec un G, 77bp en amont du codon d'initiation de la transcription. Les produits d'extension les plus courts ont été vraisemblablement causés par une terminaison prématurée de l'extension de l'amorce dûe à des modifications (capping) à extrémité 5' de 1'ARN messager. Ces résultats ont été confirmés par l'analyse par protection par la RNAse , qui conduit à un fragment protégé de 65bp et par le clonage et le séquençage du produit d'extension dérivé d'une réaction indépendante avec une amorce antisens située dans le second exon du gène. Ces résultats sont en accord avec ceux de Solway et al (1995 précédemment cité). Des différences de séquences mineures entre ces deux résultats sont vraisemblablement dues à des variations alléliques entre les différentes souches de souris. La séquence TTTAAA en position -28bp (figure 4) est en relation étroite avec la séquence TATAAA et a vraisemblablement la fonction d'une boîte TATA. L'analyse par ordinateur de la séquence en 5' révèle la présence de plusieurs sites potentiels de liaison pour des facteurs ainsi que pour des éléments qui sont connus comme contribuant à la regulation de la transcription de gène musculaires (figure 4). Au total 11 boîtes de type E (CANNTG), quatre motifs du type Mef-2/rSRF (YTAWAAATAR), quatre éléments de liaison SRF potentiels (CC(A/T)6GG), cinq sites de liaision AP-2 (CCCMNSSS) et cinq motifs SP1 (GGGCGG) ont été localisés. Enfin, un élément similaire au motif TGT3-3, récemment identifié comme site de liaison d'un facteur nucléaire du muscle lisse et comme contribuant à la régulation de la transcription de l'actine alpha du muscle lisse, a été localisé (figure 4). Exemple 2 Clonaae et construction de plasmides recombinants pour la création de souris transeénicues 1/ Fabrication de Dnlz Le plasmide pGEM7 (Promega Inc., Madison, Wi) a été digéré avec Nae I/Bsp 120I. L'extrémité sortante Bsp 1201 du vecteur a été remplie avec l'enzyme de Klenow, et le plasmide a été refermé en présence d'un linker Sal I de 10 pb. Le fragment lacZ de pGEM 7 a donc été délété, un site Sal I introduit, et un site Bsp 120I restauré. Un site Pme I a été introduit par insertion d'un linker Pme I avec des extrémités simple-brin sortantes Nsi I, dans le site Nsi I de la construction. Finalement, le gène lacZ couplé au signal de localisation nucléaire a été isolé à partir de pDes2.2nlz (LI et al, 1993, précédemment cité) avec Hind III et Sac I donnant deux fragments du gène rapporteur. Les deux fragments ont été insérés entre les sites Hind III et Sac I du vecteur pGEM7 modifié et vérifies pour leur orientation. Cette procédure donne le vecteur pnlz sans promoteur. 2/ Fabrication de D352nlz La figure 5 illustre la fabrication de ce plasmide. Un fragment PCR de 417 pb couvrant la region -352 à +65 du gène SM 22 a été produit et inséré dans le site Hinc II rendu bout-franc du vecteur pBluescriptSK+. La séquence du fragment PCR a été vérifiée. Le fragment est récupéré par les sites Xba I et Xho I et inséré dans le plasmide pBLCAT 3 dans les sites correspondants, générant le recombinant p352CAT. Pour créer p352nlz, le fragment Xba I/XhoI de p352CAT a été inséré dans les sites correspondants de pnlz. 3/ Fabrication de D2126nlz Pour créer p2126nlz, un fragment Bsp 120I/Sph I de 1,9 kb recouvrant la région -2126 à -206 du locus SM 22 a été inséré dans les sites respectifs de p352nlz. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n I1685. Sa fabrication est illustrée par la figure 6. 4/ Fabrication de D2126INTnlz La fabrication de ce plasmide est illustrée par la figure 7. Un fragment Bsp 120I/Hind III de 5,8 kb recouvrant la région -2126 à +3651 du locus SM 22 a été inséré dans les sites correspondants de pnlz, donnant pINt-nlz. Ensuite un fragment PCR de 496 pb de la base +3648 à +4143 du locus SM 22 a été généré en utilisant une amorce en amont et une amorce en aval conçue pour introduire un site Hind III en position 4135-4140. Ce produit de PCR a été digéré avec Hind III et lié dans le site Hind III de pINT-nlz pour donner p2126INT-nlz. La construction p2126INT-nlz contient donc 2126 paires de bases de la région en 5' du début de transcription, le premier exon, le premier intron entier et 15 paires de bases du deuxième exon avec les quatre dernières paires de bases mutées de CATG en GCTT pour éliminer le codon d'initiation de traduction et introduire un site Hind III comme mentionné ci-dessus. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n-I- 1686. Sa fabrication est illustrée par la figure 7. Exemple 3 : Expression des constructions dans les animaux transceniaues Deux constructions utilisant le gène reporteur lacZ avec signal de localisation nucléaire du virus SV 40 ont été fabriquées, comme décrit dans l'exemple 2. La première construction, p2126nlz contient 2126 bp de la région en amont et le premier exon (65 bp). La seconde construction p2126INTnlz est identique à la première à l'exception de l'addition du premier intron et des premières 12bp du second exon. Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, chacune des constructions a donné naissance à au moins une souris transgénique exprimant le gène reporteur. Les embryons obtenus de 12,5 à 15,5 jours après le coit (dpc) ont été colorés de manière à mettre en évidence l'activité égal. Les expressions des deux constructions sont identiques, à tous les stades observés, bien que p2126INTnlz donne une coloration un petit peu plus intense. L'expression a été détectée en premier lieu au jour 8,5 dans la région du coeur de l'embryon et dans les vaisseaux de l'enveloppe cardiaque. Au jour 9,5, l'expression de lacZ dans le coeur augmente et est confinée au ventricule droit, aux artères. Entre 12,5 et 15,5 jours une ségrégation du marquage en fonction des régions devient évident, le marquage étant confiné au ventricule droit (figures 8A et 8B). Les coupes montrent que l'expression a lieu dans le myocarde du ventricule droit, avec des marquages mineurs dans le ventricule gauche et dans l'adrium droit (figure 9A). Cette expression dans le coeur est seulement transitoire, et n'apparaît pas chez l'adulte. Elle est vraisemblablement inhibée dans les phases tardives du développement des foetus. L'expression précoce est aussi observée dans les segments du rostre à partir de 9,5 jours qui s'étend aux segments caudaux à 10,5 jours, et atteint des niveaux importants & 11,5 jours. L'expression diminue à partir de 12,5 jours dans les segments du rostre (figure 8B) et finalement n'est plus détectable à 14,5 jours (figure 10E). Les coupes montrent que l'expression du transgène est restreinte à la région myotomale des segments (figure 9 D). La plus grande partie de l'expression a lieu dans le système vasculaire de l'embyron en développement. A partir de 9,5 jours, l'expression est détectée dans l'aorte dorsale. A 10,5 jours, la coloration de l'aorte dorsale et des coudes aortiques augmente et à 11,5 jours, l'expression lacZ est clairement visible dans l'aorte dorsale, les coudes aortiques, les artères iliaques, les artères ombilicales, les artères de la carotide et dans les vaisseaux majeurs de la tête. L'expression du transgène dans les vaisseaux augmente à partir de 12,5 jours, date à laquelle les vaisseaux intercostaux peuvent être facilement vus (Figure 8A). A 15,5 jours (figure 8B), lacZ est présent dans les vaisseaux majeurs, incluant ceux des membres et de la queue, et la coloration du tronc pulmonaire devient visible. L'expression dans le système vasculaire persiste chez l'adulte et est clairement visible dans l'aorte, dans le tronc pulmonaire et dans l'artère pulmonaire droite (figure 10A), ainsi que dans les vaisseaux des intestins (figure 10B), dans la vessie et dans l'utérus. Des coupes histologiques révèlent mieux les différences dans l'expression du transgène dans les artères et dans les veines. La section de l'embryon à 12,5 jours (figure 9A) montre un niveau d'expression très élevée dans les couches musculaires des artères de la carotide, de la quatrième artère du coude de l'aorte, du tronc pulmonaire proximal et de la partie proximale de l'aorte ascendante, tandis que les parties gauche et droite des veines cardinales antérieures restent non colorées. L'absence d'expression du transgène dans les veines musculaires ressort à l'évidence des coupes du ductus venosus, ainsi que des veines portales et ombilicales. La même situation est observée chez l'adulte, où l'expression ne peut jamais être détectée dans les veines caves (figure 10A) ni dans les veines pulmonaires. Ces observations mettent en évidence des différences qui n'avaient jusqu'alors pas été mises en évidence entre les couches de muscles lisses des artères et des veines. D'autres vues des artères montrent que l'expression est restreinte à la couche de muscles et est absente de l'endothelium (figure 9C). I1 est de plus évident, au vu de l'ensemble des observations (figures 8A, 8B), que l'expression du transgène est absente des muscles lisses des viscères. Ceci est inattendu, car le gène SM 22 endogène est supposé être exprimé dans les tissus musculaires lisses vasculaires et des viscères. Dans les coupes histologiques de la région abdominale d'embryon à 14,5 jours, les couches de muscles de l'estomac, de l'intestin et de la vessie en développement sont facilement reconnaissables (figure 9C). L'expression du transgène dans cette région est clairement détectée dans les artères ombilicales, mais pas dans les couches de muscles des viscères de l'estomac, du duodenum, de l'intestin grêle et du gros intestin, et de la vessie, où aucune expression lacZ n'est observée. En outre, aucune expression n'est observée dans l'oesophage et dans la trachée (figure 9A), ainsi que dans les bronches du poumon. La coloration du tissu musculaire de l'adulte donne essentiellement les mêmes résultats. La figure 10B montre que l'expression du transgène est absente dans les muscles du colon, alors que le vaisseau mésentère est très fortement coloré par lacZ. Par contre, la coloration par immunofluorescence de la coupe d'une région intestinale similaire montre que la protéine SM 22 endogène est présente dans les deux tissus (figure 10C). L'absence d'expression du transgène dans les muscles lisses des viscères de l'adulte est de plus confirmée par des colorations de l'oesophage, de la trachée, de la vessie, du canal déférent et de l'utérus pour l'activité égal. En aucun cas, il ne peut être détectée une expression Jugal dans les couches musculaires de ces tissus. Curieusement, une coloration importante est observée dans le cytoplasme des cellules épithéliales du lumen du canal déférent et dans l'épithélium des conduits rénaux. Ceci est vraisemblablement dû à une activité galactosidase endogène, la coloration étant aussi visible dans les animaux non transgèniques témoins. Exemple 4 - Fabrication d'une construction comportant des régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thvmidine kinase du virus de l'herpès (SM 22 INT-TK). Le fragment HIV-LTR (-167, + 80) est délété du plasmide pLTR-TK par digestion Hind III dont les extrémités sont rendues bout franc avec l'enzyme de Klenow, suivie d'une digestion Xho I. Le plasmide refermé en insérant un linker contenant les sites XhoI en 5', les sites Hind III et Bsp 120I dans l'ordre 5'- > 3' et une extrémité 3' bout franc pour donner le vecteur p-TK. Un fragment Bsp 120I/Hind III de 5,8 kb recouvrant la région -2126 à + 3648 du locus SM 22 est inséré dans p-TK pour obtenir SM 22 INT TK. Cette construction est schématiquement représentée sur la figure 11. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT PASTEUR (B) RUE: 28 RUE DU DOCTEUR ROUX (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75015 (A) NOM: UNIVERSITE PARIS 7 (B) RUE: 1 PLACE JUSSIEU (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75005 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES EN AMONT DU GENE SM22 (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release +1.0, Version &num;1.30 (OEB) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO; I: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6261 paires duc bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : double (D) CONFIGURATION : linéaire (ti) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE:NON (vi) ORIGINE (A) ORGANISME: SOURIS TCTAGAGGCC ACGGAACGGT GCCAAGCACA CAGTCCCTTT TGCCTCTTTC ACGGGAGCAG GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT GTCCTTGGCC CTGTCTCACC AAAGGACTCA GGGCTGGTTT CTGAGTTTCC GTCCAGTATT TAGCCAAGTC CTGTGTTAGT CACGTAGGCC TAAGAGCCTT GGCGTTTACG GAGTCACCCA GCTCTGGCCC CTGGCATTCT GGTCCTTGGC GTTTACAGAG TCACCCAGCT CCAGGCCCCT GGCACTTTGG TACTTGGTTG CCCTTCACTC CACCAGGTCC ATTCCAGATG CCAAGAGTGG GCCCCAGGAA TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA ATTGTTTTCT ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT ACTGATGTGT TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC CACCCATTGA TTCTGTAAAC AtGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC TGACTACCCA CCACGTATGT AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG TCCAGGCTGT GCATGATGCA CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC TGTTCAGGAA TGGATGGCAA GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC TGGAACCCAC TCTGTAGACC 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ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT GTTTTTTTGT TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG GCATTTGGAC ATACATATAT ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGAcTTTC TTGTATTTTT GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT GGACTTTCTA CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG CATGACCTGA CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG CTTGTTCTTA GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC TCTCCTCCCA TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG TTICTCTGTA TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT GGCCTCCAAC TCAGAAATCT GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG TCCAGTCAGG AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC WTGTGGTT CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC ACACAGTGGG GTGTGGGAGG GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT CACCTCAGGG AAGTAAGTTG CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC TCAATGTTGG TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG AAGATCAGTT TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGGTTTGC TCCCACTTCA CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT GCTCCTATAG CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA GGCCTTTGAG GCAACAGCTG GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC ACAACAGCGC ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG AGAACCCTTG GACTCTGGTG GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACTTTGCTC TTCTGGCTTC TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG CTACTGGCTG AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC TGTTGAAGCA CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT CTGGGGGTGT GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA AGAGAAGGCC GAGGACAAAG CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAGT ACTGCAGAAA GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA GGGGTTGTCA AAATAGTCCA CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA TTTTATTGGC ACACATTGGT TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT ATGGTCTGTA AAGTCTAAAA TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT TGCTCTAGAC TGACAAATAT CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT CCACACTCTA TACTTTAGCT CTGCCTCAACATG (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2190 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: SOURIS (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA 60 AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 120 CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 180 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 240 TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 300 GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 360 TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 420 CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 480 GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 540 AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 600 TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 660 ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 720 TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 780 GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTCA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 840 TCTAGAGGAG CTCCAGCTTA TTATGACCCT TCCTTCAGAT GCCACAAGGA GGTGCTGGAG 900 TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 960 TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 1020 CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 1080 CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT 1140 CAGTGAGTGT GTGAGACATA GCACAGATAG GGGCAGAGGA GAGCTGGTTC TGTCTCCACT 1200 GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 1260 TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 1320 GTGGGGACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 1380 AGGGTGACAC TGTCCTAGTC CTCTTACCCT AGTGTCTCCA GCCTTGCCAG GCCTTAAACA 1440 TCCGCCCATT GTCACCGCTC TAGAAGGGGC CACCCTTGAC TTGCTGCTAA ACAAGGCACT 1500 CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 1560 GCCTTGGAAA GGCCACTTTG AACCTCAATT TTCTCAACTG TTAAATGGAG TGGTAACTGC 1620 TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGCCTGGT TGCGGCCAGG 1680 CTGCAGTCAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGCAAGAA GGTGGCTTGT 1740 TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 1800 CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA 1860 AGGTTTTTCC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 1920 ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 1980 ATATGGAGCC TGTGTGGAGT GAGTGGGGCG GCCCGGGGTG GTGAGCCAAG CAGACTTCCA 2040 TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 2100 AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 2160 CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 2190 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 785 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: SOURIS (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No:3: GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA 60 AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 120 CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 180 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 240 TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 300 GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 360 TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 420 CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 480 GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 540 AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 600 TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 660 ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 720 TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 780 WATT: 785 References Almendral, J.M., Santaren, J.F., Perern, J., Zerial, M. and Brnvo, R. 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LI LI, J.M. MIANO, B. MERCER and E. OLSON J. OF CELL BIOLOGY 1996 - VOL 132 N 5, p. 849-859 REVENDICATIONS 1. Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend - un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d' intérêt thérapeutique. 2. Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend - un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo d'un gène dans les cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d' intérêt thérapeutique. 3. Séquence selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine , ou ledit ARN, est susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les parois des artères et/ou d'induire une réponse immunitaire. 4. Séquence selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides -2126 et +4135 du gène de souris de la protéine SM22 (SEQ ID n 1.) 5. Séquence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides - 2126 à +65 du gène de souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N-2). 6. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique. 7. Séquence selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite protéine est la thymidine kinase du virus de l'herpès. 8. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente un effet cytostatique. 9. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente une activité lipolytique. 10. Séquence selon la revendication 9, caractérisée en que ladite protéine est la lipoprotéine lipase. 11. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est un facteur de croissance des cellules endothéliales. 12. Séquence selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit facteur est une interleukine. 13. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine musculaire ou de structure tissulaire. 14. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'ARN d'intérêt thérapeutique est l'ARN antisens de la protéine p53. 15. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de souris de la protéine SM 22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID N-3 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG GGATT 16. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n 1 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes TCTAGAGGCC ACGGAACGGT GCCAAGCACA CAGTCCCTTT TGCCTCTTTC ACGGGAGCAG GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT GTCCTTGGCC CTGTCTCACC AAAGGACTCA GGGCTGGTTT CTGAGTTTCC GTCCAGTATT TAGCCAAGTC CTGTGTTAGT CACGTAGGCC TAAGAGCCTT GGCGmACA GAGTCACCCA GCTCTGGCCC CTGGCATTCT GGTCCTTGGC GTTTACAGAG TCACCCAGCT CCAGGCCCCT GGCACTTTGG TACTTGGTTG CCCTTCACTC CACCAGGTCC ATTCCAGATG CCAAGAGTGG GCCCCAGGAA TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA ATTGTrTTCT ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT ACTGATGTGT TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC CACCCATTGA TTCTGTAAAC ATGTGACCCT TG CTC CAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG TGTCTSTGCC CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC TGACTACCCA CCACGTATGT AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG TCCAGGCTGT GCATGATGCA CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC TGTTCAGGAA TGGATGGCAA GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC TGGAACCCAC TCTGTAGACC AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC CCGAGTGCTG GGATTAAAGG CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA AAAGGACGGG ATTTGGGGAA TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG TGCTGGAGTT CTATGCACCA ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG TCTGAGGCTG CACCTCTCTG GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA GAATTGGGGA TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA GTTGCATTCA GTGAGTGTGT GAGACATAGC ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TCTCCACTGT GTTTGGTCTT GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTAACCCTA ACCCTGAGCC TGTCTCACCT GTC CCTTC CC AAGACCACTG AAGCTAGGTG CAAGATAAGT GGGGACCCTT TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA AGGGAGGGAG GGTGACACTG TCCTAGTCCTCTTACCCTAGTGTCTCCAGCCTTGCCAGGCCTTAAACATC CGCCCATTGT CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGCACTCC CTAGAGAAGA TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA TCTCATAATA AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG GTTTTTCCCG GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAAAGCAT GCAGAGAATG TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG GGCAGGGAGG GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG CGGCCTTTAA ACCCCTCACC CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT CCTTCCAGTC CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA GAAGGGCTGT GGGCTCAATT AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA CCATTCTCTG TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC AAAAGAATAA ATGGGGTGAG AGGGAGGCTCAAATTCAGTCACTGTCCCACCCATAGGTGT ATGGGCTATG TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC AGGGCTAATG CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG ATCTTATTTT 77GTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG CTCCATCTAC CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC TGCTTTTTCT TTCCTTTTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT CTTTCCTTTT CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT CTTTAGACAG GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG CTGGCCTCGA ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGTGCCACCA CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG ACAGATAGGT GACAGGTGGA GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT TGCCACATCT ATATAAGAGG ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAAATGCTC ACCCTTACTG TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT TGTCCAGGGT CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA CAGGAGGGCT GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT GTTTTTTTGT TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG GCATTTGGAC ATACATATAT ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGAGTTTC TTGTATTTTT GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATGTCTCCA GCCCTTCTTT GGACTTTCTA CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG CATGACCTGA CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG CTTGTTCTTA GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC TCTCCTCCCA TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG TTTCTCTGTA TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT GGCCTCCAAC TCAGAAATCT GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG TCCAGTCAGG AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA CCGCAGTCAC CGGCTCCATGACTCTGTGACTTTTGTGGTTCCTTGTCGCA GCGGTTCCTG GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC ACACAGTGGG GTGTGGGAGG GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT CACCTCAGGG AAGTAAGTTG CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC TCAATGTTGG TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG AAGATCAGTT TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC AGGTGCACTG TAGTTCACAG AGTGCATCTT CCAGGTTTGC TCCCACTTCA CAAGCAGAGA ACTCATAACT GAAGGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA GCAAGATGTT TAGAGTCTGA CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC CACCTCCACG GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC CTGTCATCTG CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT GCTCCTATAG CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA GGCCTTTGAG GCAACAGCTG GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC ACAACAGCGC ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG AGAACCCTTG GACTCTGGTG GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACTTTGCTC TTCTGGCTTC TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG CTACTGGCTG AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC TGTTGAAGCA CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT CTGGGGGTGT GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA AGAGAAGGCC GAGGACAAAG CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAGT ACTGCAGAAA GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA GGGGTTGTCA AAATAGTCCA CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA TTTTATTGGC ACACATTGGT TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT ATGOTCTGTA AAGTCTAAAA TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT TGCTCTAGAC TGACAAATA CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT CCACACTCTA TACTTTAGCT CTGCCTCAAC ATG 47. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n 2 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci 5 dans des conditions stringentes GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA 6 AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 12 CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 18 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 240 TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 300 GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 360 TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 420 CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 480 GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 540 AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 600 TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 660 ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 720 TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 780 GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTCA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 840 TCTAGAGGAG CTCCAGCTTA TTATGACCCT TCCTTCAGAT GCCACAAGGA GGTGCTGGAG 900 TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 960 TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 1020 CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 1080 CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT 1140 CAGTGAGTGT GTGAGACATA GCACAGATAG GGGCAGAGGA GAGCTGGTTC TGTCTCCACT 1200 GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 1260 TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 1320 GTGGGGACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 1380 AGGGTGACAC TGTCCTAGTC CTCTTACCCT AGTGTCTCCA GCCTTGCCAG GCCTTAAACA 1440 TCCGCCCATT GTCACCGCTC TAGAAGGGGC CACCCTTGAC TTGCTGCTAA ACAAGGCACT 1500 CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 1560 GCCTTGGAAA GGCCACTTTG AACCTCAATT TTCTCAACTG TTAAATGGAG TGGTAACTGC 1620 TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGCCTGGT TGCGGCCAGG 1680 CTGCAGTCAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGCAAGAA GGTGGCTTGT 1740 TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 1800 CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA l860 AGGTTTTTCC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 1920 ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 1980 ATATGGAGCC TGTGTGGAGT GAGTGGGGCG GCCCGGGGTG GTGAGCCAAG CAGACTTCCA 2040 TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 2100 AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 2160 CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 2190 18. Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n I-1685 portant le plasmide p2126nlz comprenant la séquence selon la revendication 17. 19. Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le nO I-1686 portant le plasmide p2126INTnlz comprenant la séquence selon la revendication 16. 20. Vecteur caractérisé en qu'il contient une séquence selon l'une des revendications 1 à 15. 21. Vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il contient une origine de réplication efficace dans les cellules des artères. 22. Vecteur selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est un dérivé d'un adénovirus. 23. ARN caractérisé en ce qu'il est capable d'être exprimé par une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 22. 24. Composition caractérisée en ce qu'elle contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22. 25. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce que la séquence ou le vecteur sont compris dans une composition facilitant leur transfection dans les cellules. 26. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend un gel qui est un complexe de poly L-lysine et de lactose. 27. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22. 28. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une séquence nucléique ou d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22, et des excipients pharmaceutiquement compatibles. 29. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies coronariennes. 30. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de la resténose. 31. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des mutations fragilisant les vaisseaux. 32. Animaux transgéniques caractérisés en ce qu'ils portent une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur. 33. Procédé de criblage de molécules in vitro pour leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM22 comprenant les étapes suivantes: - transfection de cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et 20 à 22, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur, - incubation des cellules transfectées avec la molécule à tester, et - quantification de l'expression du gène réporteur. 34. Procédé de détection de mutations sur la région comportant la séquence selon l'une des revendications 1 à 15 ou le vecteur selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé par une altération de l'expression du gène placé en aval de ladite séquence. 35. Procédé d'expression de protéines d'intérêt thérapeutique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les produits selon l'une des revendications 1 à 23.