Brevet FR2739628A1 — publié le 19970411

La présente invention a pour objet un procédé de synthèse de molécules hybrides consistant en la condensation d'au moins deux segments appartenant à des espèces chimiques différentes. Elle est en outre relative à des préparations contenant des activités acyltransférases concernant des espèces chimiques différentes. Elle concerne également des séquences nucléotidiques codant pour ces activités. Un grande nombre de peptides, tant chez les eucaryotes que chez les procaryotes, sont synthétisés, indépendamment de la traduction, par d'importants complexes enzymatiques, appelés peptides synthétases. Ces enzymes sont formés de modules d'environ 1000 acides aminés, chacun de ces modules catalysant l'activation et la condensation d'un des acides aminés constituant l'oligopeptide. Ces modules sont colinéaires avec les acides aminés entrant dans l'oligopeptide et ont pu être subdivisés en domaines d'activation et de liaison au groupement phosphopantéthéinyle. Ces enzymes peuvent aussi comporter un module d'épimérisation et un module de méthylation lorsque ces activités sont requises pour modifier un acide aminé de l'oligopeptide produit. Certaines peptides synthétases se sont révélées pourvues d'un domaine thioestérase, auquel on attribue la fonction de libération de l'oligopeptide synthétisé. On connaît aussi d'autres complexes biosynthétiques présentant des organisations comparables à celles des peptides synthétases. Ainsi, les polykétides synthétases sont organisées en modules, chacun de ces modules étant responsable d'une étape de condensation. L'élongation de la chalne est dictée par l'ordre des différents modules dans le gène. Un tel exemple d'organisation est en particulier décrit dans la demande internationale WO-93/13 663 (ABBOTT LABORATORIES) qui décrit l'organisation du gène eryA qui spécifie l'enzyme qui catalyse la biosynthèse du segment polykétide de l'érythromycine. Cette demande mentionne la possibilité de modifier le schéma de biosynthèse des polykétides en introduisant des mutations dans les séquences d'ADN codant pour les polykétides synthétases. La revue de Hutchinson (Biotechnology, 1994, volume 12, 375-380) décrit les possibilités de synthèse de médicaments nouveaux en modifiant par la génétique les voies de synthèse des polykétides. Elle mentionne aussi de manière succincte la possibilité d'interférer dans les voies de biosynthèses des peptides catalysées par les peptides synthétases. Des séquences de la région 159 du génome de Bacillus subtilis ont été étudiées par Albertini et al. (Microbiology, 1995, 141, 299-309). En particulier, ces auteurs ont analysé le locus pksX dont la fonction est inconnue. Ce locus est composé de six cadres de lecture ouverte (ORF) dont l'un, appelé pksorfx6 code pour un polypeptide de 4427 acides aminés. Albertini et al. ont montré que ce polypeptide est composé de deux régions: l'une de 1300 acides aminés présentant des similarités de séquence avec la séquence des polypeptides synthétases, l'autre de 3300 acides aminés présentant des similarités de séquence avec les polykétides synthétases. I1 s'agit néanmoins simplement de comparaisons de séquences, les activités réelles des différentes régions de la protéine susceptibles d'être obtenues à partir de ce cadre de lecture ouverte n'étant pas mises en évidence. Ainsi, le produit de transcription réel n'a pas été identifié. A fortiori, le produit final potentiel, qui pourrait éventuellement résulter de l'action d'enzymes codées par ce cadre de lecture ouverte, n'a pas non plus été décrit. Ainsi, il ressort de l'état de la technique le plus pertinent connu du demandeur que l'on ne connaissait en aucune manière des complexes enzymatiques présentant des activités acyl transférases concernant des espèces moléculaires différentes. On notera accessoirement que des métabolites hybrides polykétides-oligopeptides naturels, tels que la tristinamycineII, la rapamycine et le FK506 sont connus. Les séquences des enzymes catalysant la biosynthèse de ces produits n'ont pas été déterminées. L'industrie pharmaceutique se trouve confrontée depuis les années 1970 à un déclin important dans le nombre de nouvelles molécules naturelles découvertes chaque année, principalement à cause du manque de diversité des organismes sélectionnés par criblage. Il était donc nécessaire de fournir un moyen permettant de produire, à façon, des molécules hybrides comprenant des segments appartenant à des espèces chimiques différentes. Ce problème n'avait pas été résolu jusqu'à présent du fait de l'extrême complexité des réactions impliquées dans la synthèse par voie chimique de ce type de composé. Le demandeur a montré qu'il est possible d'obtenir ces molécules hybrides en combinant des activités enzymatiques acyl transférases. La présente invention a donc pour objet un procédé de synthèse de molécules hybrides consistant en la condensation d'au moins deux segments appartenant à des espèces chimiques différentes, caractérisé en ce que lesdites molécules hybrides sont produites par une cellule procaryote ou eucaryote portant au moins une séquence nucléotidique spécifiant au moins une activité enzymatique telle qu'une activité acyl transférase qui condense lesdites espèces chimiques. De manière avantageuse chacun des segments peut luimême être synthétisé de manière indépendante par des activités acyl transférase. La topologie desdits segments peut être cyclique, réticulée ou de type polymère. Des molécules présentant de telles topologies sont la cyclosporine (topologie cyclique), le peptidoglycanne (topologie réticulaire) et le polyhydroxybutyrate (polymère). La molécule synthétisée peut comporter une liaison dont la formation est catalysée par une acyl transférase et en ce que les segments de part et d'autre de cette liaison ne sont pas de même nature chimique. On entend par espèces chimiques les catégories de molécules qui ont un mode d'enchaînement comme par exemple: PKS : succession de carbonyles et de méthylènes, amide: succession de carbonyles et d'imides. On entend par cellules, les cellules eucaryotes dont les levures et les cellules mammifères et les cellules procaryotes dont les archaebactéries et les eubactéries. On entend par condensation la formation d'une chaîne d'atomes. On entend par molécule hybride une molécule caractérisée par une liaison formée par un acyl transférase et comportant de par cette liaison deux segments différents. On entend par molécule synthétique une molécule obtenue par voie chimique. On entend par module une séquence nucléotidique spécifiant au moins un domaine protéique pouvant catalyser au moins une réaction. Les espèces chimiques peuvent être notamment des acides aminés ou leurs dérivés, des peptides, des groupements prosthétiques, des sucres, des nucléotides, des acides gras, des polymères naturels ou leurs fragments. Les acides aminés et leurs dérivés peuvent en particulier être pris parmi les suivants: cystéine, D-valine, tyrosine, glycine, isoleucine, valine, glycine, alanine, D leucine azaleucine, tryptophane, proline, glutamine, glutamate, sérine, phénylalanine, asparagine, aspartate, cystéine, tyrosine, thréonine, D-phénylalanine, D-glutamate, D-alanine, lysine, histidine, D-aspartate, ornithine, Dornithine, L-a-aminoadipyl, acide 2-aminoadipique, acide 2aminobutyrique, (4R)-[E)-2-butényl]-4-méthyl-D-thréonine, Dallo-4-hydroxyproline, acide 2,4-diaminobutyrique, acide 2,4dihydroxybutyrique, acide 2,3-diaminoproprionique, acide 2hydroxyisovalérique, acide 3-hydroxypicolinique, Nméthylphénylglycine, acide 3-hydroxy-4-méthyl-anthralinique, N-3-diméthyl-D-leucine, et sarcosine. Ces acides aminés peuvent être activés sous forme de thioester. Les peptides peuvent présenter une topologie oligomérique ou cyclique ou encore être constitués de motifs répétés. Dans le cadre de la présente invention, on entend par peptides synthétases des protéines, ou des complexes protéiques, ayant entre autres fonctions l'activation d'une chaîne peptidique ou hybride, en cours d'élongation, par l'intermédiaire d'un thioester entre le carbonyle de la chaîne à allonger, ou substrat, et le SH d'un groupement phosphopantéthéinyle lié à l'enzyme sur un domaine ou une sous-unité dénommé ACP (Acyl Carrier Protein). Les autres activités de synthèse des parties non peptidiques des molécules hybrides peuvent être entre autres des polykétides synthétases, des synthétases des acides gras (Fatty Acyl Synthase ou FAS), des polyhydroxyalkanoates synthétases, des glycérol-3-phosphate acyltransférases, des chloramphénicol Acétyl Transférases (CAT), des dihydrolipoamide acyltransférases, des carnitine acyltransférases, des choline acyltransférases, des UDP-Nacétylglucosamine acétyltransférases ou des sérine acétyltransférases, et toutes autres activités de synthèse comprenant une activité acyltransférase due à une enzyme présentant un motif histidine susceptible de permettre la formation de molécules hybrides par l'intermédiaire d'un groupe carbonyl activé par un groupe thioesters. De manière générale, les diverses séquences nucléotidiques codant pour les activités peptides synthétases ou les autres activités de synthèse sont réparties le long de la séquence, dans l'ordre dans lequel les réactions d'addition des différentes unités constituant la molécule hybride vont être effectuées. Ainsi, si l'on désire obtenir une molécule simple constituée d'un peptide et d'un acide gras, deux solutions sont envisageables. Selon la première solution, la chaîne peptidique est formée puis l'acide gras est lui-même synthétisé. Dans ce cas, les segments génétiques codant pour les diverses activités sont organisés sur la séquence de telle manière que la série de réactions permettant la synthèse de la molécule hybride commence par la condensation du premier hydroxyacide activé, sous forme d'un thioester par l'intermédiaire de son carbonyle avec le résidu SH d'un groupement phosphopantéthéinyle lié à l'enzyme adéquat, avec le maillon suivant de la molécule hybride. Les divers acides aminés sont ainsi ajoutés l'un après l'autre, ce qui aboutit à une élongation de la chaîne peptidique de la molécule. L'organisation de la séquence doit être telle que le module correspondant au dernier acide aminé, ou à l'acide aminé, s'il est unique, de la chaîne peptidique soit adjacent à un module correspondant au premier chaînon, ou à la première unité, conduisant à la synthèse de la partie non peptidique de la molécule. Selon la seconde solution, la séquence est telle que la ou les enzymes synthétisant la partie non peptidique sont activées en premier, aboutissant à la formation de la partie non peptidique de la molécule, puis le ou les modules correspondant aux divers acides aminés de la chaîne peptidique poursuivent l'élongation de la molécule par addition des divers acides aminés. Selon cette deuxième solution, la première réaction consiste en une activation d'un groupement acyl amorce, qui est, par l'intermédiaire de la formation d'une molécule acyl S-ACP, condensé sur un groupement malonyl -S-co-enzyme-A. Une fois que le nombre d'unités d'acétyle condensées souhaité est atteint, les acides aminés constituant la partie peptidique sont ajoutés. Ces deux modes de mise en oeuvre de l'invention, développés ci-dessus spécifiquement pour des molécules constituées d'une partie peptidique et d'un acide gras, sont transposables à la synthèse de toute molécule hybride, auquel cas les modules conduisant à la synthèse des parties acide gras et peptide sont remplacés par d'autres modules conduisant à la synthèse des parties souhaitées. Chacune des parties de la molécule, qui peut comprendre plus de deux parties, peut être limitée à un maillon d'une espèce chimique donnée. I1 faut en effet souligner que l'invention concerne en fait la synthèse de toute molécule effectuée à partir d'unités pouvant former des groupements carbonyle actifs, pour autant que les acyltransférases correspondant à ces groupements carbonyle soient connues et disponibles. En outre, les modules correspondant à la condensation de chaque acide aminé peuvent comprendre des domaines spécifiques ayant des activités d'épimérisation, ou de méthylation, selon les caractéristiques souhaitées pour la partie peptidique. Ils peuvent aussi comprendre, ou être séparés, par une ou plusieurs protéines dites "Acyl Carrier Protein" (ACP), ou toute autre molécule ayant la même fonction de liaison de groupements carbonyle. Des modules pour la synthèse de la chaîne peptidique peuvent être par exemple ceux décrits par Turgay et al. pour la fabrication de la gramicidine (Mol. Microbiol., 1992, 6, 529-546). Des modules permettant la synthèse de la partie non peptidique peuvent être ceux décrits dans la demande WO 93/13 663, précédemment citée, faisant partie du segment chromosomique eryA conduisant à la synthèse de la partie polykétide de l'érythromycine ou dans l'article de Kao et al. (Science, 1994, 265, 509-512). Ils peuvent aussi être ceux décrits par Mathur et al (J. Biol. Chem., 1992, Vol.27, n 287, 19388-19396) qui interviennent dans la synthèse de l'acide mycocerosique par la mycocerosic acid synthétase (MAS) ou ceux décrits par Swan et al. (Mol. Gen-Genet. 1994, 242, 358-362) pour une autre polykétide synthétase. Un tel procédé selon l'invention permet ainsi la synthèse de nouvelles molécules hybrides pouvant être utilisées en particulier en thérapeutique, dans les industries agro-alimentaires, en agronomie, dans les industries des matières plastiques dans l'industrie textile ou dans celle des détergents. Une méthode permettant la création de nouvelles molécules, et leur sélection consiste à combiner de manière aléatoire divers modules, aboutissant ainsi à de nouvelles molécules hybrides, qui sont testées, à l'aide d'une batterie de tests adéquats mettant en évidence leurs activités. Une autre méthode consiste à combiner dans un microorganisme ou une cellule une séquence codant pour des modules avec différents substrats constituant des parties différentes des molécules hybrides. Ainsi, une telle méthode permet de pallier l'insuffisance de molécules nouvelles, qui est le problème rencontré dans l'industrie pharmaceutique en particulier. Ces molécules peuvent néanmoins être utilisées dans d'autres domaines que dans l'industrie pharmaceutique, sans limitation. Un autre procédé selon la présente invention consiste à fournir une des parties de la molécule hybride, par exemple la partie non peptidique, déjà synthétisée par la machinerie cellulaire du microorganisme ou de la cellule, et de l'utiliser comme substrat sur lequel va être effectuée l'élongation par des modules de peptides synthétases, spécifiques de chaque acide aminé à ajouter. Ainsi, la séquence peut comporter un module codant pour 1'ACP du microorganisme ou de la cellule en question et, contigu, un module codant pour une peptide synthétase. Avantageusement, le micro-organisme est une bactérie, un champignon ou une levure et les cellules sont animales ou végétales. On utilisera avantageusement des souches d'Escherichia coli ou de Streptomyces. La présente invention est en outre relative à une séquence nucléotidique spécifiant une enzyme permettant la synthèse d'une molécule chimique hybride comprenant une liaison catalysée par une acyl transférase. Une telle séquence peut spécifier un domaine qui catalyse un transfert d'acyl et présenter au moins à une de ses extrémités 5' et 3' des segments génétiques trouvés dans les organismes naturels faisant partie d'une même unité de traduction que les acyl transférases. Préférentiellement elle spécifie: - au moins une activité peptide synthétase, et - au moins une activité de synthèse spécifique de la partie non peptidique de la molécule et comprenant une activité acyltransférase. Elle peut être une séquence d'ADN simple ou double brin ou d'ARN simple ou double brin, en particulier d'ARN messager. Une telle séquence est avantageusement constituée de modules spécifiant chacun une ou plusieurs réactions rentrant dans la synthèse de la molécule hybride, lesdits modules étant organisés selon l'ordre chronologique des condensations. On notera que chaque module constituant cette séquence comprend notamment un site de catalyse de l'élongation de la partie peptidique. Ainsi, un tel site présente la séquence suivante: HIS-HIS-X1-X2-X3-ASP-GLY dans laquelle X1, X2 et X3 sont des acides aminés ou des dérivés d'acides aminés, choisis pour moduler l'activité de catalyse, ou une séquence similaire. Ce site est avantageusement situé à une distance de 170 à 190 résidus en aval du motif LEU-GLY-GLY-HIS-SER ou LEU-GLY GLY-ASP-SER. Le demandeur a montré de manière surprenante que ce motif jouait un râle catalytique. Les microorganismes sont avantageusement transformés par ces séquences, par l'intermédiaire de vecteurs, connus de l'homme du métier. Celui-ci peut se référer pour les techniques générales de biologie moléculaire au manuel suivant: The Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Sambrook et al., Cold Spring Harbor édit. (1982), ou l'une de ses récentes rééditions. L'assemblage de modules codant pour des activités acyltransférases de natures différentes permet la synthèse de complexes protéiques plurifonctionnels, en particulier catalysant d'une part la synthèse de parties peptidiques, et d'autre part la synthèse de parties non peptidiques. La présente invention est ainsi relative à des complexes enzymatiques ou à des enzymes catalysant la synthèse de molécules hybrides caractérisés en ce qu'ils présentent au moins une activité acyl transférases catalysant la condensation des espèces chimiques différentes constituant les molécules hybrides, et en particulier catalysant la synthèse de molécules comprenant une partie peptidique et une partie non peptidique présentant - au moins une activité peptide synthétase, et - au moins une autre activité de synthèse spécifique de la partie non peptidique de la molécule hybride. Un autre objet de l'invention est une molécule hybride constituée d'une ou plusieurs parties d'origine naturelle ou synthétique substituée par une autre partie synthétisée par le procédé selon l'invention. Avantageusement la partie d'origine naturelleou synthétique est protéique et est substituée sur un de ses acides aminés. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent dans lesquels La figure 1 représente le plasmide pENS10 ; La figure 2 représente le gène du complexe de synthétases des "Fatty Acid Synthase" (FAS) de type II d'Escherichia coli La figure 3 représente la stratégie d'amplification utilisée pour la construction d'un plasmide produisant une activité enzymatique permettant la synthèse de la molécule hybride constituée d'un acide gras lié à un dipeptide. Les fragments des gènes acpP et acvA sont amplifiés à l'aide des oligonucléotides (oll à à 018). Les produits de fusion Fus 34, Fus 5-6 et Fus 7-8 résultant de cette amplification sont clonés dans le vecteur pAMP, puis dans pTRC 99A afin d'exprimer le gène hybride. Le fragment BglII-SmaI correspondant à la fin du gène acvA est enfin cloné. EXEMPLE 1: Constructions d'un gène hybride entre l'acpP d'Escherichia coli et l'acvA de Pénicillium chDsogenum pour produire un acide aras lié à un peptide Cys-DVal. Le gène acpP d'Escherichia coli code pour 1'ACP, protéine qui lie le groupement phospopantéthéinyle, partie centrale du complexe des "Fatty acid synthase" (FAS) de type II chez Escherichia coli (Rawlings et al., (1992) J. Biol. Chem., 267, 5751-5754). Le gène acvA de P. chiysogenum code pour 1'ACV synthase, peptide synthétase qui synthétise le précurseur des céphalosporines: 1'ACV (6-(L-a-aminoadipyl)L-cysteinyl-Dvaline). 1. MATERIELS ET METHODES Plasmides, souches et milieux de culture pPEN5l0 : plasmide portant le gène acvA de P. ch,ysogénum (Smith et al., 1990, EMBO J., 9, 2743-2750) pAMP1: vecteur de clonage du fragment PCR système Clone Amp TM (Gibco BRL Référence 8381SA). pTRC99A: vecteur expression sous Ptac qui porte lacIq (Amann et al., 1988, Gene, 69, 301-315), Souche Eschenchia coli K12 MG 1655. Xllblue (Stratagène) pour clonage et expression. Les milieux de cultures utilisés sont le milieu LB additionné en cas de besoin de 100 pg/ml d'ampicilline ou du milieu minimum M63 (Miller, 1972, Experiments in Molecular genetics, CSH Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.) complémenté par la source de carbone (glucose (0,2%)). Technique de bioloqie moléculaire La préparation d'ADN plasmidique, les digestions par endonucléase de restriction, les ligations et les électrophorèses en gel d'agarose sont faites suivant Sambrook et al. (précédemment cité). La préparation d'ADN chromosomique d'Escherichia coli a été faite suivant Silhavy et al. (1984 Experiments with gene fusions, CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Les transformations sont menées selon la technique de Mandel et Higa (1970, J. Mol. Biol, 53, 159-162). Les séquences sont réalisées en utilisant le "Taq fluorescent dye-primer cycle sequencing kit de Amersham (RPN 2336) et le séquenceur : DNA Sequencer 725. Amplification des fragments des gènes acPP et acvA. La Taq DNA Polymérase de USB (réf. NK 9123) est utilisée dans les conditions conseillées par le fabricant. Les cycles utilisés sont: 1 cycle de 5 min. à 94 C, 30 cycles de 94 C pendant 45s, 55 C pendant 30 s et 72 C pendant 3 min. Une dernière incubation à 72 C pendant 15 min. termine les cycles d'amplification. L'amplification des fragments de l'acpP est faite sur 0,2 yg d'ADN chromosomique de la souche d'Escherichia coli K12 en utilisant les couples d'oligonucléotides o11/o13, oll/ol5 et oll/ol7, ce qui conduit à l'amplification de fragments de 110, 195 ou 233 pb respectivement. L'amplification des fragments du gène acvA est faite sur 0,05 pg d'ADN plasmidique de pPEN510 en utilisant les couples d'oligonucléotides o14/o12, o16/o12 et o18/o12, ce qui conduit à l'amplification de fragments de 324, 237 ou 207 pb respectivement . Les fragments de PCR obtenus sont purifiés en utilisant le système QUIAQUICK de Quiagen. Ol i gonucléotides Les oligonucléotides utilisés sont synthétisés par Genset (Quiagen). oll: oligo 5' pour l'amplification de l'acpP chromosomique d'Escherichiacoli, insertion d'un site NcoI à 1'ATG d'initiation. 5' -CUACUACUACUACCATGGGCACCATCGAAGAACGTGTAAAAAAAT-3' Ncol o12: oligo 3' pour l'amplification du fragment acvA de P. chsogenum au niveau du site Bg/II 5'-CUACUACUACUAGATCTGGAGACAATGTGG-3' BglII o13/o14, o15/o16, ol7/o18, oligonucléotides partiellement complémentaires pour l'amplification 3' du fragment du gène acpP et 5' acvA pour créer la fusion en phase entre acpP et acvA. 013 5'-UGCAGGUGAUAGAAUCCGCGCCCAGGTCTTCAAC-3' o14 5' -GAUUCUAUCACCUGCATCCAACTGATCGCT-3' ol5 5' -AAGAGUAGUGAUUTTCTCAGCTTC-3' o16 5' -AUCACUACUCUUGAGCGCATGGCAGAC-3' o17 5'-UAGUAGGUAAUCAATGGCAGCCTG-3' o18 5 '-GAUUACCUACUACAGAACAAGCAG-3' Clonage des fragments de PCR La méthode utilisant l'uracyl DNA glycosylase (UDG) a été utilisée pour cloner sans étape de ligation les produits de PCR et pour pouvoir aussi créer des fusions en phase. (Système pAMP Gibco BRRL). Les oligonucléotides oll et o12 sont synthétisés avec une queue 5' portant des résidus déoxyuridine complémentaires d'un fragment 3' débordant situé dans le vecteur pAMP1. Les couples ol3/014, o15/o16, o17/o18 portent en 5' des séquences se recouvrant qui contiennent des déoxyuridines, 50 ng du vecteur pAMP sont ajoutés à 50-100 ng des fragments de PCR purifiés. Le volume de réaction est ajusté à 19 ;l en utilisant le tampon fourni dans le système CloneAmp; 1 unité de 1'UDG est ajoutée. La réaction d'annealling est conduite pendant 30 min à 37 C. On utilise 1/10 du mélange pour transformer des bactéries Ll-blue compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur LB (Amp, 100 yg/ml). Analyse des Protéines exprimées. L'expression des clones portant les gènes fusions est faite suivant le protocole suivant. Des cultures de nuit (5 ml) à 37 C ou 30 C en milieu LB (Amp 100 pg/ml) ou M63 glucose (Amp 100pg/ml) sont diluées à 1/100 dans 10 ml du même milieu. Lorsque la DO(A600 nm) est de 0,8 de l'isopropyl-ss- thiogalactopyranoside (IPTG) est ajouté à une concentration finale de lmM afin d'induire le promoteur Ptac. L'incubation est poursuivie 2h , 6 h ou 12 h à 30 C ou 37 C. Pour l'analyse sur gel SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685) les échantillons sont préparés de la manière suivante: 1 ml de culture est centrifugé, repris dans 100 yl de tampon de dépôt (Laemmli, 1970 précédemment cité) et bouilli 5 min. Détection des produites obtenus La synthèse des métabolites hybrides entre lipides et peptides est démontrée par des méthodes radioisotopiques. La souche sauvage d'E.coli K12, MG1655, transformée avec les plasmides recombinants construits, est adaptée à la croissance à partir d'acides gras comme source de carbone en milieu minimum M63 additionné de palmitate de sodium (lg/l) en présence de désoxycholate de sodium (0,05 g/l), de valine (1 mM), d'isoleucine (1 mM), de lysine (lmM) et de lanthionine (1 mM) à 37 C ou 30 C en aérobiose. L'IPTG (104M) est ajouté à une culture de 100 ml en phase exponentielle dans ce milieu à la densité optique 0,8 (A600nm) et la culture poursuivie pendant une heure. Les cellules sont alors récoltées par centrifugation, lavées dans le même milieu mais dépourvu de palmitate et d'IPTG, centrifugées à nouveau, puis resuspendues dans 10 ml du milieu de lavage. 25 microcuries d'acide palmitique 14C(CEA) sont alors ajoutés à 1 ml de la suspension cellulaire incubée à 37 C. Des aliquotes 10 p1 sont prélevés à intervalles de 10 min et centrifugés. Le culot est dispersé dans de l'acétone contenant 1% de mercaptoéthanol, centrifugé à nouveau. Le surnageant est analysé par chromatographie sur couche mince de silice (Merck). La présence de matériel radioactif comigrant avec un témoin authentique de palmitoylcystéine-D-valine est détectée après pulvérisation des plaques de chromatographie avec l'agent de scintillation En3Hance (NEN) par autoradiographie. La confirmation de la présence d'un groupe thiol dans la molécule marquée est recherchée par réaction avec la vinylpyridine. On remplace dans ce cas le mercaptoéthanol par 1% de 4-vinylpyridine (Fluka) dans l'acétone utilisée pour l'extraction. La chromatographie est effectuée dans les mêmes conditions que celles décrites auparavant mais en présence d'un témoin authentique du Spyridin-4-yl-éthyl-palmitoyl-cystéine-D-valine. Synthèse organique des témoins Le composé palmitoyl-cystéine-D-valine est synthétisé suivant les méthodes courantes de la synthèse peptidique. Du S-trityl-cystéine (Fluka) est traité par du chlorure de palmitoyle (Fluka) dans la pyridine. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de silice. La N-palmitoyl-Strityl-cystéine obtenue est convertie en anhydride mixte par réaction stoechiométrique avec le chloroformiate d'éthyle (Fluka) dans un solvant comme par exemple le Nméthylmorpholine et immédiatement ajouté à un équivalent de Dvaline (Fluka). Après chromatographie sur colonne de silice par élution dans le dichlorométhane, le produit purifié est traité par un acide pour libérer le groupe thiol de la protection trytile. Une mmole de la palmitoyl-cystéine-Dvaline ainsi obtenue est alors traitée par la 4-vinyl-pyridine dans un solvant pour obtenir la S-pyridin-4-yl-éthyl- palmitoyl-cystéine-D-valine, qui est purifiée par chromatographie comme ses précurseurs synthétiques. 2. PROCEDE DE de acpP et acvA et le système CloneAmp (voir Matériel et méthodes et Figure 3), on clone dans pAMP trois fragments Nc ol-BglII de 440 pb générés par PCR (Fus 3-4, Fus 5-6 et Fus 78) qui portent les différentes fusions en phase entre acpP et acvA (figure 3). Après avoir vérifié la séquence des clones obtenus en utilisant les oligonucléotides universels et inverses, les trois fragments de 440 pb sont clonés dans les sites NcoI KpnI de pTRC99A, ce qui permet d'exprimer le gène hybride sous contrôle du promoteur et du Shine-Dalgarno du vecteur d'expression (Ptac). I1 reste ensuite à cloner le fragment BglII-SmaI de 9 kb pour reconstituer la fin du gène acvA et créer des fusions entre 1'ACP de Escherichia coli et les deux derniers modules de 1'ACV synthase de P. chiysogenum (figure 3). Vérification de l'obtention des protéines fusions. Les souches de X11-Blue portant les plasmides ainsi construits ainsi que le plasmide contrôle pTRC99A sans insert, sont soumises au protocole d'expression décrit précédemment dans la partie " matériels et méthodes". Les extraits protéiques obtenus sont analysés sur gel SDS-PAGE 0,6% après coloration au bleu de Coomassie. Une protéine de 350 kDa environ est mise en évidence dans les souches qui portent les plasmides recombinants. Détection des molécules produites Après s'être assuré qu'il y avait bien expression d'une protéine hybride, il reste à vérifier qu'elle est active, c'est-à-dire qu'elle permet de produire des molécules hybrides acides gras-Cys-D-val. Des extraits de MG1665 contenant le plasmide contrôle pTRC99A où les plasmides recombinants sont préparés après culture en présence d'acide palmitique marqué au 14C comme source de carbone comme décrit dans "Matériels et Méthodes". Les échantillons sont analysés par chromatographie en couche mince (matériels et méthodes) afin de détecter la présence de matériel radioactif comigrant avec le témoin authentique palmitoyl-cystéine-D-valine synthétisée chimiquement. EXEMPLE 2 Synthèse d'une molécule hybride mycocérosic acyl-Cys-D-Val Le gène (6333 pb) mas codant pour la mycocérosic acid synthase de Mycobacterium tuberculosis (Mathur et al. 1992 précédemment cité) qui catalyse la synthèse de l'acide mycocérosique est mis sous contrôle du promoteur tac (plasmide pTRC99A) après des étapes de PCR et de clonages similaires à celles décrites dans l'exemple 1. Une fusion en phase au niveau de la région spécifiant le domaine ACP C-terminal de MAS avec la région codant pour le premier domaine ACP de 1'ACV synthase de P. chiysogenum (PCR) est construite par ligation des produits de PCR. Des étapes de clonage successives permettent de reconstituer la totalité de la fin du gène acvA. La molécule finale produite par la protéine hybride ainsi construite est un hybride mycocérosic acyl-Cys-D-Val. EXEMPLE 3 Synthèse d'une molécule hybride L-a-aminoadipyl- chloramphénicol Une protéine est construite en fusionnant une région A correspondant au 2670 premiers nucléotide du gène acvA de P. chCsogenum spécifiant le domaine d'activation du L-aaminoadipyl et une région B correspondant au gène cat de Tn 9 d'E.coli qui spécifie la chloramphénicol acétyltransférase (Alton et Vapnek, Nature 1979, 282: 864-869). Les régions A et B sont amplifiées par PCR d'une manière similaire à l'exemple 1. Une enzyme susceptible de catalyser la synthèse du L-aaminoadipyl-chloramphénicol est recherchée parmi les fusions obtenues en reliant les régions A et B par des polynucléotides de liaison de tailles variables et placées sous contrôle du promoteur tac de pTRC99A. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de molécules hybrides, consistant en la condensation d'au moins deux segments appartenant à des espèces chimiques différentes, caractérisé en ce que lesdites molécules hybrides sont produites par une cellule procaryote ou eucaryote portant au moins une séquence nucléotidique spécifiant au moins une activité enzymatique, telle qu'une activité acyl transférase, qui condense lesdites espèces chimiques. 2. Procédé de synthèse de molécules hybrides selon la revendication 1 dont chacun des segments peut lui-même être synthétisé de manière indépendante par des activités acyl transférase. 3. Procédé de synthèse de molécules hybrides selon l'une des revendications 1 et 2 comprenant des segments dont la topologie est cyclique, réticulée ou de type polymère. 4. Procédé de synthèse de molécules hybrides selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la molécule synthétisée comporte une liaison dont la formation est catalysée par une acyl transférase et en ce que les segments de part et d'autre de cette liaison ne sont pas de même nature chimique. 5. Procédé de synthèse de molécules hybrides comprenant une partie peptidique et une partie non peptidique caractérisé en ce que lesdites molécules sont produites par une cellule eucaryote ou procaryote portant au moins une séquence d'ADN spécifiant: - une protéine de type acyl carrier protein (ACP), et - une protéine de type peptide synthétase. 6. Procédé de synthèse de molécules hybrides selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que au moins une des parties de la molécule est un polykétide, un polyhydroxyalkanoate, un acide gras, un groupement prosthétique, un sucre, un nucléoside, un acide aminé, ou un dérivé d'acide aminé ou un peptide ainsi que les analogues synthétiques de tous ces composés. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la cellule est une bactérie, un champignon, une levure ou une cellule animale ou végétale. 8. Séquence nucléotidique spécifiant au moins une enzyme permettant la synthèse d'une molécule chimique hybride. 9. Séquence nucléotidique selon la revendication 8 spécifiant une enzyme permettant la synthèse d'une molécule chimique hybride comprenant une liaison catalysée par une acyl transférase. 10. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 et 9 spécifiant un domaine qui catalyse un transfert d'acyl et présentant au moins à une de ses extrémités 5' et 3' des segments génétiques trouvés dans les organismes naturels faisant partie d'une même unité de traduction que les acyl transférases. 11. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 à 10 spécifiant - au moins une activité peptide synthétase, et - au moins une autre activité de synthèse d'une partie non peptidique. 12. Séquence selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'elle est une séquence d'ADN double ou simple brin ou d'ARN double ou simple brin, en particulier d'ARN messager. 13. Séquence selon l'une des revendications 8 à 12 caractérisée en ce qu'elle est constituée de modules nucléotidiques spécifiant chacun une ou plusieurs réactions rentrant dans la synthèse de la molécule hybride, lesdits modules étant organisés selon l'ordre chronologique des condensations. 14. Complexe enzymatique ou enzymes catalysant la synthèse de molécules hybrides, caractérisé en ce qu'ils présentent au moins une activité acyl transférase catalysant la condensation des espèces chimiques constituant les différentes molécules hybrides 15. Complexe enzymatique ou enzymes catalysant la synthèse de molécules hybrides comprenant une partie peptidique et une partie non peptidique présentant - au moins une activité peptide synthétase et, - au moins une autre activité de synthèse, spécifique de la partie non peptidique de la molécule hybride. 16. Molécule hybride constituée d'une ou plusieurs parties d'origine naturelle ou synthétique substituée par une autre partie synthétisée par le procédé selon l'une des revendications 1 a 7. 17. Molécule selon la revendication 16, caractérisée en ce que la partie d'origine naturelle est protéique et est substituée sur un de ses acides aminés. 18. Utilisation d'une molécule selon l'une des revendications 16 et 17 ou obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7 en thérapeutique, dans les industries agro-alimentaires, dans les industries des matières plastiques, dans l'industrie textile ou dans celle des détergents.