Brevet FR2741350A1 — publié le 19970523

L'invention se rapporte à l'immunothérapie des leucémies associées à la translocation Phl, notamment les leucémies myéloïdes chroniques (CML) et les leucémies lymphoblastiques aigues. Elle concerne de nouveaux peptides dérivés de la protéine oncogène BCR-ABL exprimée par les cellules leucémiques et leurs utilisations. Les altérations de 1'ADN sont une caractéristique fréquente des transformations malignes. Le système immunitaire fonctionnant normalement en distinguant le "soi" du "non-soi", toute protéine résultant de l'expression d'un ADN altéré présentera une séquence étrangère à l'organisme et sera de ce fait un immunogène potentiel (néoépitope). La connaissance de la séquence des gènes impliqués dans les processus de cancérisation, offre la possibilité de vérifier si les protéines correspondantes, ou certains de leurs peptides, sont immunogéniques pour l'hôte, et donc, potentiellement utiles pour des protocoles d'immunothérapie. Les leucémies myeloïdes chroniques (CML) sont un exemple type de transformation maligne liée à une altération de 1'ADN. Celles-ci sont associées dans plus de 95 % des cas (1) à la présence d'un marqueur chromosomique, le chromosome Philadelphia (Phl), qui est le résultat de deux coupures sur les chromosomes 9 et 22, avec une translocation réciproque des deux fragments distaux respectifs, t(9 ; 22) (q34 ; qll). De nombreuses donnees soutiennent aujourdthui l'idée que la translocation Phl se produit chez des cellules souches pluripotentes, et on a pu montrer que des cellules appartenant à différentes lignées hémato poïétiques possedaient le chromosome Philadelphia durant la phase chronique de la maladie. La translocation du protooncogène ABL porté par le chromosome 9 sur la région de coupure ("Breakpoint cluster région" ou BCR) du chromosome 22, forme un gène de fusion dénommé BCR-ABL (2,7). I1 résulte de cette fusion une altération dans la structure et une activation de l'oncogène ABL qui code pour une tyrosine kinase. La coupure au niveau de BCR peut se produire à deux endroits: soit entre les exons 2 et 3, soit entre les exons 3 et 4. L'ARN messager (ARNm) correspondant aura alors une taille différente, en fonction de la présence ou l'absence dans sa séquence de celle correspondant à l'exon 3. Quel que soit le lieu de coupure, les régions codantes de BCR-ABL sont fusionnées en phase et sont transcrites en un ARNm codant pour une protéine chimérique fonctionnelle de 190 ou 210 kDa, constituée de 1004 acides aminés provenant de ABL et, selon le site de coupure BCR, de 902 ou 927 acides aminés, codés par ce gène. Chacune de ces deux formes protéiques présente une activité enzymatique de protéine kinase (8,9). On a pu montrer dans des modèles animaux de leucémie, que les lymphocytes T auxiliaires (T helper) et les lymphocytes cytotoxiques (CTL) (10,11) pouvaient participer à la réaction de rejet de tumeur. Ceci a été notamment observé dans le cas de tumeurs induites par le virus de la leucémie murine (MuLV). Par ailleurs, des expériences in vivo ont également montré que des antigènes de MuLV exprimés par des fibroblastes transfectés, étaient capables de provoquer une immunité tumorale et de permettre un rejet accéléré de la tumeur (12). Enfin, également chez la souris, on a mis en évidence qu'un transfert adoptif de CTL reconnaissant spécifiquement des antigènes associés à des leucémies codés par des rétrovi rus permettaient d'éradiquer des leucémies disséminées (13,14). L'absence d'antigènes bien caractérisés dans des leucémies humaines, qui soient en outre uniquement exprimés sur les cellules malignes et reconnaissables par des cellules T spécifiques, a jusqu'à présent limité le développement de thérapies basées sur des réactions de lymphocytes T dirigées contre les cellules tumorales. Or, compte tenu des potentialités des cellules du système immunitaire, il est indéniable que la mise au point de nouvelles méthodes immunothérapeutiques utilisant des populations de lymphocytes spécifiques constituerait un progrès important pour la thérapie anticancéreuse. Les CTL sont en effet de puissants effecteurs cellulaires du système immunitaire, qui, lorsqu'ils sont efficacement induits par un antigène spécifique d'une tumeur, peuvent provoquer une immunité protectrice à long terme. Les CTL reconnaissent des peptides de 8 à 14 acides aminés présentés à la surface de la cellule en association avec les molécules de classe I du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH), après avoir subi une maturation intracellulaire (15). Plusieurs critères doivent être pris en compte pour qualifier d'agent potentiellement immunothérapeutique un peptide dérivé du produit d'un protooncogène particulier. On peut vérifier tout d'abord que, non seulement le peptide est capable de se fixer à une molécule de classe I ou II du CMH, mais également qu'il possède des propriétés immunogéniques, car la fixation d'un antigène sur des molécules du CMH n'implique pas nécessairement l'effet immunogène spécifique recherché. Il est en outre particulièrement important que le complexe peptide/molécule du CMX soit présent IN VIVO à la surface des cellules cancéreuses, et ceci en quantités suffisantes pour permettre à des lymphocytes T spécifiques de reconnaître ces cellules. I1 est enfin nécessaire que le répertoire T des patients permette l'émergence de clones de cellules T capables de reconnaître le complexe peptide/molécule du CMX sur les cellules tumorales, que le peptide soit présenté dans des conditions qui permettent l'induction de ces clones spécifiques et qu'il n'existe aucune réactivité croisée avec des cellules normales de l'organisme. La CML et l'expression de la protéine BCR-ABL (p210) qui lui est associée, constituent un exemple caractéristique d'antigène spécifique de tumeur dans le système hématopoïétique. L'expression de la protéine p210 constituant un marqueur des cellules ayant subi la translocation, une mise en évidence d'antigènes de p210 exprimés uniquement à la surface des cellules leucémiques et capables d'induire une réponse cellulaire T cytotoxique, offre donc une nouvelle approche pour traiter cette pathologie. Compte tenu du fait que la zone de jonction entre BCR et ABL code pour une partie de p210 qui est étrangère à l'organisme normal, celle-ci est un candidat privilégié pour constituer un antigène spécifique des CML. Plusieurs études ont de ce fait ciblé les potentialités offertes par cette région, sans pouvoir toutefois démontrer que des antigènes particuliers de cette région étaient présentés IN VIVO par les cellules leucémiques ni mettre en évidence une réponse de CTL humains spécifiques à l'encontre des cellules exprimant ces antigènes. Ainsi, des travaux antérieurs réalisés chez la souris ont montré que plusieurs peptides sélectionnés sur la zone de jonction, étaient immunogènes, le plus intéressant étant un néoépitope constitué par 6 acides aminés de BCR, un acide aminé de fusion et 5 acides aminés de ABL (16). D'autres études antérieures ont également établi que ces peptides pouvaient provoquer des réponses anticorps dirigées contre BCR-ABL (17,18) et étaient capables de se fixer sur des molécules du CMX de classe II murines et induire une réponse de cellules T auxiliaires ("T helper") spécifiques chez la souris (16) et chez l'home (19). Aucune démonstration n'a toutefois été faite quant à la propriété des peptides décrits d'induire chez l'homme une réponse de lymphocytes T cytotoxiques qui soient capables de reconnaître spécifiquement des cellules malignes, présentes chez des patients atteints de leucémie et qui puissent donc être utilisés IN VIVO pour traiter les leucémies. D'autres études récentes ont montré que deux fragments peptidiques particuliers de BCR-ABL étaient capables de se fixer sur des molécules HLA B8 à la surface de cellules présentatrices humaines. Les potentialités de ces séquences à induire une réponse T spécifique des tumeurs n'a toutefois pas été analysée (20). Les auteurs de la présente invention ont cherché à identifier des peptides antigèniques présentés par des molécules HLA de classe I à la surface de cellules de patients atteints de CML, qui soient spécifiquement reconnus par des lymphocytes T cytotoxiques. Ceux-ci ont à présent mis en évidence que des peptides dérivés de la zone de jonction BCR-ABL étaient capables de se fixer sur des molécules HLA-A2.1 et d'induire, à partir de lymphocytes du sang périphérique (PBL) normaux ou de patients leucémiques, des CTL HLA-A2.1 restreints. De façon surprenante, les inventeurs ont également montré que ces CTL ainsi activés pouvaient lyser des cellules tumorales HLA-A2.1 exprimant p210, démontrant ainsi l'existence d'un épitope commun entre ces peptides particuliers et les antigènes exprimés par des cellules leucémiques. En outre, des CTL directement prélevés chez certains patients atteints de CML se sont avérés capables de lyser des cellules présentant les peptides identifiés par les inventeurs. Ceci indique qu'une immunisation naturelle existe IN VIVO chez certains patients, et que ces peptides spécifiques ont des propriétés immunogéniques leur permettant d'être utilisés pour développer des protocoles d'immunothérapie. La présente invention vise donc à fournir des moyens pour la prévention ou la thérapie des leucémies humaines associées à la translocation BCR-ABL. L'invention a pour objet des peptides qui comprennent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes - SEQ ID N0 i : S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 927 à 934 de p210) - SEQ ID N" 2 : S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 926 à 934 de p210) - SEQ ID N" 3 : Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 925 à 934 de p210) - SEQ ID N" 4 : K-Q-S-S-K-A- L-Q- R-P-V (résidu 924 à 934 de p210), ou toute séquence dérivée de l'une des précédentes, capable d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) humains HLA-restreinte spécifiquement dirigée contre des cellules exprimant la protéine de fusion BCR ABL (p210). Au sens de la présente invention, le terme "dérivé" désigne toute séquence obtenue par mutation, délétion, substitution ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, ainsi que toute séquence isoforme, c'est-à-dire une séquence identique à l'une des quatre séquences SEQ ID n" 1 à 4, contenant un ou plusieurs résidus, sous la forme d'énantiomère D. Ces peptides selon l'invention peuvent être notamment préparés par synthèse chimique classique ou par toute autre technique de synthèse connue de l'homme de l'art, y compris les techniques de génie génétique. Avantageusement, les peptides selon l'invention sont capables d'induire une réponse de lymphocytes T CD8+, restreints par des antigènes HLA de classe I, en particulier des antigènes HLA-A2.1 Une limite à l'immunothérapie basée sur une réponse cellulaire T dirigée contre des antigènes spécifiques, est liée au phénomène de restriction par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité. En effet, pour un antigène donné, les épitopes qui seront présentés aux cellules T et/ou l'efficacité de cette présentation par les molécules HLA des cellules présentatrices, seront dépendants du typage HLA de ces cellules présentatrices.On conçoit donc que des peptides qui pourront être efficacement être présentés par une molécule HLA couramment rencontrée seront particulièrement intéressants d'un point de vue thérapeutique, puisqu'ils pourront déclencher une réponse de lymphocytes T restreints chez une majorité d'individus. Or, l'allèle HLA-A2 fait précisément partie des antigènes HLA de classe I les plus fréquents, notamment parmi les populations caucasoïdes. Cet allèle est en effet exprimé chez plus de 50 % des individus, parmi lesquels 90 * au moins possèdent le motif HLA-A2.1. De ce fait, tout antigène de tumeur capable de se fixer sur des molécules HLA-A2.1 et de générer une réponse T spécifique, constituera une nouvelle approche thérapeutique pour une immunisation spécifique anti-tumorale, applicable chez un grand nombre de patients. Les peptides de l'invention ont par ailleurs la particularité de ne pas contenir le motif "canonique" tel que décrit par Ramensee et al. (21), qui est généra lement présent dans les séquences peptidiques capables de se fixer sur les molécules HLA-A2.1. La présence de ce motif au sein d'un peptide est en général considérée comme un indicateur de la capacité de ce peptide à se fixer sur la molécule HLA A2.1, si ce n'est comme élément indispensable à cette fixation. La propriété des peptides selon l'invention de se fixer sur les molécules HLA-A2.1 et de provoquer une réponse lymphocytaire T spécifique constitue donc un résultat surprenant par rapport aux connaissances de l'homme du métier sur le sujet. Selon une autre propriété avantageuse, les peptides selon l'invention possèdent au moins un épitope commun avec des antigènes spécifiquement exprimés par des cellules leucémiques possédant la translocation Phl, ledit épitope étant capable d'être spécifiquement reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques humains et/ou d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxiques humains. Comme cela l'a été indiqué précédemment, cette caractéristique correspond à l'un des critères particulièrement importants auxquels doit satisfaire un peptide dérivé d'une molécule oncogénique pour être qualifié d'agent potentiellement immunothérapeutique. En effet, des cellules spécifiquement activées IN VITRO par un tel épi tope pourront également reconnaître IN VIVO ce même épitope à la surface de cellules cancéreuses. Selon un autre aspect, l'invention vise également une méthode pour obtenir une population de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL) capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL, caractérisée en ce que - on cultive des lymphocytes humains provenant du sang périphérique, préférentiellement enrichis en lymphocytes T CD8*, dans un milieu contenant une quantité efficace d'au moins un peptide tel que précédemment défini, et des cellules présentatrices aptes à présenter aux lymphocytes T le ou lesdits peptide(s) en association avec leurs molécules HLA de classe I, et - on augmente le nombre et la spécificité des CTL par une ou plusieurs restimulations par le ou lesdits peptides prcédemment décrit(s) associé(s) aux molécules HLA de classe I des cellules présentatrices. Les populations de CTL humains obtenus par la méthode précédente font également partie de l'invention. Ces CTL sont avantageusement capables de lyser spécifiquement des cellules leucémiques possédant la translocation BCR-ABL, et plus particulièrement des cellules leucémiques d'un patient HLA-A2.1. L' invention vise également 1 'utilisation d'au moins l'un des peptides tels que décrits précédemment ou des CTL reconnaissant spécifiquement ces peptides, pour la fabrication de compositions pharmaceutiques pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL. Les compositions pharmaceutiques comprenant au moins un peptide tel que précédemment défini comme principe actif, avec tout véhicule, adjuvant, excipient ou ailuant pharmaceutiquement acceptable, font également partie de l'invention. Selon une variante avantageuse, qui vise à augmenter l'immunogénicité du peptide, celuici est associé à un lipide, sous forme d'un lipopeptide, greffé à une molécule porteuse (carrier) selon des méthodes utilisées dans les protocoles d'immunisation connues, ou inséré dans tout système non réplicatif (anatoxine tétanique par exemple). Suivant un mode de réalisation préféré, ces compositions comprennent comme principe actif au moins un peptide selon l'invention associé à des molécules HLA de classe I, ledit peptide étant capable d'être spécifi quement reconnu par des CTL restreints par les molécules HLA auxquelles il est associé. Avantageusement, l'un au moins des peptides de l'invention est associé à des molécules HLA de classe I exprimées à la surface de cellules humaines non tumorales HLA compatibles avec des CTL capables de le reconnaître spécifiquement. Préférentiellement, ces cellules humaines sont des cellules présentatrices autologues desdits CTL. Selon une variante préférée, l'association du peptide aux molécules HLA des cellules présentatrices peut être réalisée par la méthode de "stripping" décrite par Langlade-Demoyen et al. (22) qui permet d'obtenir une plus forte densité de peptide associé aux molécules HLA à la surface des cellules présentatrices. Les cellules présentant le peptide sont par exemple des cellules présentatrices "professionnelles", telles que les cellules dendritiques, ou d'autres types de cellules comme les cellules spléniques ou les lymphocytes B. Lorsque les compositions sont uniquement destinées à activer IN VITRO des CTL capables de reconnaître spécifiquement l'un au moins des peptides de l'invention, les cellules présentatrices du peptide peuvent être en outre des cellules de drosophile en culture, transfectées avec les gènes des molécules HLA, comme décrit dans la demande WO-A-93 17 095 publiée le 2 septembre 1993. Selon d'autres modes de réalisation, les peptides dans les copositlons selon l'invention sont associés à des molécules HLA solubles fixées sur des supports synthétirues biocompatibles et bioassimilables. Ces support s sont par exemple constitués par des billes de plastique ou autre polymère bioassimilable sur lesquelles sont fixées les régions extracytoplasmiques des molécules HLA. Les peptides peuvent également être associés à des molécules HLA ancrées dans des supports synthétiques de type "pseudo-membranaire", tels notamment les liposomes et tout autre système de membrane modèle connu de l'homme de l'art. Dans toutes ces compositions, le typage des molécules HLA associées aux peptides est compatible avec celui du patient auquel celles-ci sont destinées. Font également partie de l'invention des compositions pharmaceutiques pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif des CTL humains CD8 qui reconnaissent spécifiquement au moins un peptide dérivé de la région de jonction de la protéine BCR-ABL comprenant l'une des séquences d'acides aminés n 1 à 4 ou dérivée, comme précédemment définies. Les CTL desdites compositions sont HLA compatibles avec les cellules du patient auquel ces compositions sont destinées et sont restreints par un allèle HLA de classe I dudit patient capable de s'associer avec au moins un peptide spécifique de BCR-ABL. Préférentiellement, ces CTL sont des cellules autologues du patient. Ces différentes compositions peuvent être administrées selon plusieurs modes d'administration, que l'homme du métier pourra déterminer en fonction du type de composition concernée. Les compositions comprenant un peptide comme principe actif peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Les compositions comprenant des CTL comme principe actif sont préférentiellement administrées par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. Un autre type de composition, également objet de la présente invention, comprend, à titre de principe actif, des "mini-gènes", composés des séquences nucléotidiques codant pour au moins un peptide ayant l'une des séquences d'acides aminés n 1 à 4 ou une séquence dérivée, placées sous le contrôle de signaux nécessaires à l'expression du ou des peptides correspondants. Selon un premier mode de réalisation, les séquences nucléotidiques sont insérées dans un vecteur d'expression pour être exprimées dans un hôte cellulaire, le choix du vecteur d'expression étant fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Avantageusement, l'hôte cellulaire est choisi parmi les cellules du patient auquel la composition doit être administrée. Préférentiellement, ces cellules sont des cellules lymphocytaires ou myéloïdes. Le vecteur d'expression est choisi dans ce cas parmi les vecteurs utilisés par exemple dans des méthodes de thérapie génique lorsqu'une séquence nucléotidique spécifique est intégrée dans le matériel génétique d'une cellule pour palier un défaut ou un dysfonctionnement génétique particulier, ou parmi les systèmes viraux en général utilisés dans des protocoles de vaccination (vaccine, canarypox...). De telles compositions peuvent être administrées selon les modes d'administration utilisés pour des préparations vaccinales (voie sous-cutanée, intra-musculaire, orale, nasale, etc). Dans une variante, l'hôte cellulaire utilisé est une bactérie naturellement présent dans l'organisme, telle E. coli ainsi que des bactéries du type BCG, ou des salmonelles, etc. Le vecteur d'expression est dans ce cas un vecteur d'expression procaryote, obtenu à partir de plasmides disponibles dans le commerce et utilisés de façon courante par l'homme du métier dans des techniques de recombinaison génétique des bactéries. L'administra tion de ces compositions se fait de préférence par voie sous-cutanée, ce type d'administration n'étant cependant pas exclusif. Selon un second mode de réalisation, les séquences nucléotidiques contenues dans les compositions selon l'invention sont sous forme d'ADN "nu", c'est-àdire qu'elles sont insérées dans des séquences de type plasmidique contenant les éléments de régulation nécessaires à leur expression. Ces séquences sont en solution dans un milieu salin injectable, notamment dans le muscle ou la peau, par des moyens d'administration appropriés. Les différentes compositions couvertes par la présente invention peuvent être utilisées en association avec d'autres compositions pharmaceutiques, administrées de façon simultanée ou séquentielle, en vue d'une addition ou synergie des effets produits au plan thérapeutique. A titre d'exemple non limitatif, ces compositions additionnelles contiennent des agents activateurs de lymphocytes T, tels 1'IL2, 1'IL7, l'IL12, l'interfF- ron, etc. L'invention permet ainsi la réalisation d'une méthode de traitement thérapeutique comprenant 1 'adminis- tration d'au moins l'une des compositions pharmaceutiques telles que précédemment décrites à un patient atteint d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL. Les modes d'administration, les posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Les peptides selon la présente invention sont également utiles pour des applications dans le domaine du diagnostic IN VITRO des leucémies associées à la translocation BCR-ABL. Ils peuvent notamment être utilisés dans des tests IN VITRO basés sur une réactivité de CTL spécifiques pour diagnostiquer une CML ou pour suivre l'évolution de la réponse de CTL spécifiques au cours d'un traitement thérapeutique d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL et/ou mesurer l'efficacité d'un peptide selon l'invention à générer une réponse de CTL spécifique à l'encontre de cellules exprimant BCR-ABL. Une variante préférée consiste à rechercher des CTL spécifiques des cellules exprimant BCR-ABL chez un patient selon les étapes consistant à - mettre en culture les PBL de ce patient, avec au moins un peptide de l'invention associé à des molécules HLA compatibles avec les cellules T du patient; - observer la stimulation spécifique de lymphocytes T par le peptide associé aux molécules HLA. Les molécules HLA présentant le peptide sont avantageusement exprimées à la surface de cellules HLA compatibles avec les lymphocytes T du patient. Ce sont préférentiellement des cellules autologues normales ou leucémiques du patient, et plus particulièrement des cellules exprimant à leur surface des molécules HLA-A2.1. Selon d'autres modes de réalisation, les PBL testés peuvent être enrichis en cellules T préalablement à leur mise en culture en présence du peptide de l'invention, par exemple par une sélection positive des cellules CD8 selon des méthodes utilisées en routine par l'homme du métier. Préalablement à leur mise en culture avec les lymphocytes du patient dont on recherche des CTL spécifiques, les cellules présentatrices sont avantageusement chargées en peptide spécifique, par exemple selon le procédé de "stripping" décrit par Langlade-Demoyen (22). immunoréactivité des CTL recherchés est évaluée par exemple par une augmentation de la production de facteurs spécifiquement produits par des lymphocytes T activés (IL2, TNF...). Cette production de facteurs est par exemple mesurée par des méthodes telles que 1'ELISA ou la PCR. Alternativement, la cytotoxicité des CTL envers les cellules cibles présentant à leur surface le peptide spécifique associé à leurs molécules HLA de classe I, est évaluée en fonction de la quantité de chrome 51Cr libéré par ces cellules au cours de leur lyse, méthode couramment mise en oeuvre en immunologie cellulaire. Sont également classiquement utilisées par l'homme du métier, les méthodes de cultures cellulaires mixtes à court terme et les techniques basées sur 1'ELISA ou la PCR. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après. LEGENDE DES FIGURES - Figure 1 : Fixation du peptide sur HLA A2.1. L'efficacité des peptides décrits dans le tableau I à stabiliser les molécules HLA-A2.1 exprimées à la surface des cellules T2 est étudiée comme décrit ciaprès dans Matériel et Méthodes. La fluorescence moyenne observée en utilisant un anticorps monoclonal anti HLA-A (W6/32) est exprimée en unités arbitraires. - Figure 2a : CTL primaires spécifiques obtenus à partir des PBL de donneurs sains HLA-A2.1. La réactivité envers BCR-ABL de CTL provenant de donneurs sains a été mesurée en utilisant des cellules cibles chargées en peptide. Les CTL spécifiques provenant des PBL dedits donneurs ont été testés après un second cycle de stimulation IN VITRO. Le pourcentage de lyse spécifique est indiqué pour les deux rapports cellules effectrices/cellules cibles de 30/1 (barres blanches) et de 10/1 (barres grises). - Figure 2b : Analyse de la spécificité et de la restriction par le CMH de CTL réactifs envers BCR-ABL. Des CTL primaires spécifiques de BCR-ABL provenant de donneurs HLA-A2.1 ont été testés contre des cellules K562 (exprimant p210 BCR-ABL) transfectées avec les gènes des molécules HLA-A2.1 et non transfectées. - Figure 3a : Induction de CTL spécifiques primaires chez des patients atteints de CML. Des CTL antigène -spécifiques provenant de dix patients HLA-A2.1 positifs ont été induits et cultivés. Après trois cycles de stimulation avec des cellules autologues chargées en peptide en tant que stimulateurs, on a évalué la réactivité des CTL à l'encontre de cellules T2 chargées en peptide. Le pourcentage de lyse spécifique est indiqué pour deux rapports cellules effectrices/cellules cibles de 30/1 (barres blanches) et de 10/1 (barres grises). - Figure 3b : Test d'inhibition de CTL spécifiques de BCR-ABL par des cellules cibles froides. Des cellules cibles non marquées (froides) ont été ajoutées à différentes concentrations allant de 2.106 à 2.10a c'est-à-dire correspondant à des rapports cellules froides/cellules cibles chaudes allant de 0,5/1 à 20/1. Le même essai est réalisé trois fois. En l'ab sence de cellules cibles froides, la cytotoxicité spécifique correspond à 80 % de 51Cr libéré. Les cellules cibles froides ont été recouvertes avec du peptide BCR ABL ou avec un peptide provenant du virus de l'influenza utilisé à titre de contrôle, connu pour sa capacité à se fixer à la molécule HLA-A2.1 (flu). MATERIELS ET METHODES - Cellules et lignées cellulaires utilisées Les cellules utilisées dans ces études comprennent des cellules B lymphoblastoïdes transformées par le virus d'Epstein-Barr (EBV) de la lignée JY (HLA-A2 B7), la lignée cellulaire mutante CEMx721.174 (T2) et les cellules K562 cotransfectées avec le gène de la molécule HLA-A2.1 et le gène de la résistance à la puromycine. Toutes ces lignées cellulaires sont cultivées de façon continue dans du milieu RPMI (Gibco) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal. - Lymphocytes et leucocytes Les PBL sont récupérés après 20 mn de centrifugation sur une solution de Ficoll Paque à 600 g (Pharmacia Uppsala, Suède) à température ambiante. Toutes les cellules sont conservées en azote liquide. La viabilité cellulaire et les fonctions lymphocytaires sont préservées. Typage : les antigènes de transplantation HLA (haplotypes) sont identifiés de façon sérologique au laboratoire de typage cellulaire de l'Hôpital Salpétriè re. Les donneurs et les patients sont sélectionnés en fonction de l'expression de la molécule HLA-A2.1. - PePtides utilisés Les peptides synthétiques (tableau I) utilisés dans cette étude ont été synthétisés par la société NEOSYSTEM à Strasbourg et purifiés par HPLC par le fabricant. Le peptide 58-66 (GILGFVFTL) de la matrice du virus de l'influenza (flu) est utilisé comme contrôle. TABLEAU I Séquences d'acides aminés des peptides de la zone BCR ABL Peptide Résidus Séquence BCR3-ABL2 927-934 SKALQRPV BCR3-ABL2 926-934 SSKALQRPV BCR3-ABL2 925-934 QSSKALQRPV BCR3-ABL2 924-934 KQSSKALQRPV BCR3-ABL2 923-934 FKQSSKALQRPV BCR3-ABL2 922-934 GFKQSSKALQRPV BCR3-ABL2 921-934 TGFKQSSKALQRPV - Mesure de la fixation du peptide Les cellules T2 sont cultivées pendant 48 heures à 26"C dans un milieu sans sérum. 3.105 cellules sont ensuite placées à 37 pendant 15 heures en présence de 20 pM du peptide testé.L'expression de HLA A2.1 est ensuite mesurée par cytométrie de flux en utilisant l'anticorps monoclonal W6/32 dirigé contre l'ensemble de molécules HLA-A (23) et un cytofluoromètre de la marque Becton Dickinson. - Charqement du peptide ("peptide stripping") Le chargement du peptide à la surface des cellules présentatrices est réalisé dans 0,5 ml de tampon de chargement ("stripping buffer") contenant : de l'acide citrique 0,13M, du Na2HPO4 66 mM, du NaCl 150 mM et du rouge de phénol à 17 mg/ml selon le protocole décrit par Langlade-Demoyen et al. (22). - Induction d'une réponse CTL IN VITRO L'induction de CTL est réalisée comme cela a été précédemment décrit (22, 27). Brièvement, les PBL de donneurs sains ou de patients HLA-A2.1 atteints de CML, sont collectés par centrifugation douce à l'interface d'un Ficoll paque, les cellules sont lavées puis incubées soit avec de la concanavaline A et de 1'IL2 recombinante pour obtenir des lymphblastes T activés, soit avec la bactérie Staphylococcus aureus Cowan I, des IgM de lapin anti-homme couplées à une phase solide et de 1'IL-4 humaine recombinante pour induire des lymphoblastes B. Ces lymphoblastes sont ensuite soumis à la méthode de "peptide stripping" comme décrit précédemment et rechargés avec des peptides de BCR-ABL selon l'invention. Ultérieurement, les lymphoblastes chargés en peptides sont irradiés et mis en présence de PBL enrichis en lymphocytes CD8+ du même donneur dans un milieu de culture pour cellules T contenant de 1'IL-2 recombinante (10 U/ml) de l'IL1-ss (5 U/ml) et de 1'IL-7 recombinante (20 U/ml). En fonction des donneurs, (fréquence des précurseurs CTL spécifiques) les cellules effectrices peuvent nécessiter un temps de prolifération IN VITRO plus long avant qu'une activité de lyse spécifique puisse être détectée. Les cellules T sont ensuite entretenues par des restimulations hebdomadaires avec des monocytes autologues chargés en peptides et de 1'IL-2 recombinantes (10 U/ml) et de 1'IL-7 (10 U/ml). - Mesure de la cytoxicité par libération de 51Cr L'activité cytolytique à médiation cellulaire (CML) dans des cultures est évaluée dans un essai de mesure de libération de 51Cr de 6 heures. Le pourcentage de lyse spécifique de 10 000 cellules cibles marquées au 51cor dans un volume de 200 ul est déterminé pour différents rapports lymphocytes/cellules cibles. La libération spontanée de 51Cr varie entre 6 et 20 * du marquage incorporé total. - Tests de compétition de cytotoxicité à l'aide de cibles froides Des cellules K562 transfectées avec HLA-A2.1 ou des cellules T2 sont chargées pendant 6 h avec un peptide à une concentration de 100 ug/ml. Les cellules sont ensuite lavées pour éliminer le peptide non lié. Avant incubation avec les cellules cibles marquées, les cellules effectrices sont incubées avec une dilution en série de cellules compétitrices non marquées pendant 2 h à 37"C. Le surnageant est récupéré après 4 h d'incubation à 37 . - Méthode de dilution limite (LDA) Les fréquences relatives de précurseurs de CTL (CTLp) spécifiques pour BCR-ABL sont déterminées pour différentes populations lymphocytaires par l'analyse en dilution limite. La cytotoxicité d'échantillons contenant entre 50 et 10 000 lymphocytes est évaluée sur des cellules cibles marquées au 51Cr dans un volume final de 200 p1. Chaque dilution testée est répliquée dans 24 puits. Les surnageants sont prélevés après 9 h d'incubation à 37"C. Un puits est considéré comme positif si la libération de 51Cr excéde de 3 écarttypes la moyenne des puits contrôle contenant les cellules cibles seules. La fréquence de cellules effectrices est estimée par une analyse de distribution de Poisson (24,25). EXEMPLES EXEMPLE 1 Des Peptides synthétiques correspondant à la zone de ionction BCR-ABL de la protéine p210 stabilisent les molécules thermolabiles HLA-A.2.1 de cellules T2. Sept peptides correspondant à la région de fusion de la protéine chimérique p210 (tableau I) sont évalués pour leur capacité à se fixer aux molécules HLa-A2.1 en utilisant des cellules T2 selon un test de thermostabilisation précédemment décrit (26). Les cellules T2 sont déficientes pour les gènes codant pour les transporteurs de peptides TAP1 et TAP2 (26). De ce fait, elles ont une expression de surface des molécules du CMX de classe I qui est réduite à une température de 37"C. L'expression des molécules du CMX de classe I endogènes à la surface cellulaire peut être restaurée par une mise en culture à 26 C, mais ces molécules sont thermolabiles tant qu'elles ne sont pas stabilisées par la fixation d'un peptide exogène.En utilisant cet essai, 4 des 7 peptides testés se sont avérés capables d'induire une stabilisation significative des molécules HLA-A2.1 à la surface cellulaire (figure 1). EXEMPLE 2 Induction de CTL CD8+ spécifiques à Partir de PBL de donneurs sains HLA-A2.1 Les auteurs de la présente invention ont décrit précédemment que des CTL primaires spécifiques de peptides pouvaient être générés IN VITRO contre différents peptides chez la souris et chez l'homme (22,27). Dans les expériences illustrant la présente invention, les auteurs ont utilisé 2 protocoles différents pour vérifier si des CTL primaires spécifiques de peptides de BCR-ABL pouvaient être activés IN VITRO. En utilisant le peptide p926/p934 des CTL spécifiques primaires peuvent être induits à partir de PBL de plusieurs donneurs HLA A2.1 (figure 2a). Ces CTL reconnaissent non seulement des cellules cibles chargées en peptide (figure 2a) mais également des cellules tumorales K562 transfectées avec HLA-A2.1 exprimant la protéine chimérique (figure 3a). Ces CTL classiques sont restreints par HLA-A2.1 puisque les cellules parentes K562 HLA-A2.1 négatives et pHi positives ne sont pas lysées (figure 2b) et l'anticorps monoclonal W6/32 spécifique des molécules HLA inhibe l'activité lytique. Ces données démontrent que de courts peptides dérivés de BCR-ABL obtenus après maturation intracellulaire de la protéine de fusion peuvent être présentés en association avec HLA-A2.1 à une concentration suffisament élevée pour être reconnus par des CTL spécifiques. Le peptide 926-934 est choisi pour les études décrites ci-après. EXEMPLE 3 CTL CD8 ssécifiques de BCR-ABL obtenus IN VITRO à partir de PBL provenant des Patientes atteints de CML Des PBL ont été prélevés chez 10 patients HLA-A2.1 atteints de CML. Cinq de ces dix échantillons (2,5,8,9,10) ont pu générer des CTL spécifiques contre le peptide p926-934 après un second cycle de stimulation, en utilisant a) des cellules blastiques autologues chargées en peptide selon la méthode de "stripping" précédemment décrite pour la simulation initiale et b) des cellules adhérentes autologues pour la seconde stimulation.Pour quatre autres patients (1,3,4,7), plusieurs cycles de stimulation supplémentaires ont été nécessaires pour détecter une activité CTL spécifique, suggérant que la fréquence de précurseurs (CTLp) était plus faible (figure 3a) chez ces individus. Pour confirmer que les CTL reconnaissaient un épitope naturel associé avec HLA-A2. sur des cellules leucémiques, les différentes populations de CTL ont été testées avec des cellules tumorales provenant du même patient. Trois parmi les cinq patients (8,9,10) avaient des CTL qui lysaient leurs cellules tumorales autologues IN VITRO. I1 est important de noter que, la toxicité étant fortement diminuée dans un test d'inhibition par cible froide dans lequel des cellules compétitrices étaient chargées avec le peptide, ceci démontre que le peptide présenté était identique à celui qui était reconnu sur la cellule tumorale par une majorité de cellules spécifiques (figure 3b). Ces résultats dans leur ensemble établissent donc que des CTL réactifs pour BCR-ABL peuvent être induits pour reconnaître un épi tope commun sur les cellules leucémiques. EXEMPLE 4 Des CTL circulants spécifiques peuvent être détectées chez trois patients sur dix. Des analyses en dilution limite ont été réalisées pour quantifier des CTL circulant spécifiques chez des patients atteints de CML. Une haute fréquence de CTL spécifiques a été trouvée chez plusieurs patients (3 sur 10). Ces CTL étaient capables de lyser des cellules T2 recouvertes avec le peptide P926/934 aussi bien que des cellules K562 HLA-A2.1 (tableau II). Ce résultat indique que certains patients atteints de CML peuvent spontanément développer une réponse immunitaire contre le produit de translocation BCR-ABL. TABLEAU Il Fréquence des CTL précurseurs (CTLp) chez des patients atteints de CML et chez des donneurs sains. clip par 104 lympho- CI LU par 104 lym cytes phocytes Patients BCR- Influenza Donneurs BCR- Influenza atteints de ABL sains ABL CML i 0,02 0,5 1 0,1 1,2 2 0,07 0,6 2 0,09 0,9 3 N.D.* 0,21 3 0,06 0,1 4 0,09 0,9 4 0,04 1,3 5 0,05 0,5 5 0,08 1,6 6 N.D.* 0,9 6 0,15 1,1 7 0,07 0,6 7 0,9 1,2 8 15 1 8 0,06 1,5 9 18 1 9 0,9 1,2 10 20 1,2 10 0,08 1,5 Les CTL spécifiques de BCR-ABL sont obtenus par microcultures dans des conditions de dilution limite et détectés par un test de libération de 51Cr par des cellules T au bout de 18 heures. Les CTLp sont comptés après 10 jours de culture. * N.D. : non détectable DISCUSSION Les présents résultats démontrent que la même réactivité spécifique de CTL envers un peptide de la région de jonction BCR-ABL peut s'observer chez certains patients atteints de CML et qu'une réponse spécifique de CTL CD8 peut être observée IN VITRO à partir de PBL provenant de donneurs sains et de patients atteints de CML. Cette réponse de cellules T est dirigée de manière spécifique contre un peptide de la région de jonction comprenant 9 à 12 résidus d'acides aminés capables de se fixer IN VITRO sur la molécule HLA-A2.1. Aucun des peptides selon l'invention ne montre le motif canonique spécifique de la molécule HLA-A2.1. Ceci montre donc qu'une recherche de peptides antigéniques ne doit pas se limiter aux seuls peptides qui possèdent ce motif canonique. Des CTL 0D8 spécifiques de BCR-ABL ont été testés sur des cellules K562 transfectées avec HLA A2.1 et des cellules cibles tumorales autologues. Chacune de ces cibles cellulaires ont été lysées par des CTL spécifiques ce qui démontre donc 1. que la protéine BCR-ABL (p210) peut subir un processus de maturation par les cellules tumorales, et que 2. des CTL spécifiques générés IN VITRO peuvent reconnaître le peptide endogène. Le peptide le plus immunogène est un néopeptide composé de 2 acides aminés provenant de BCR, un acide aminé de la région de fusion et six acides aminés provenant de ABL. Chez certains patients, des cycles de stimulation supplémentaires ont été nécessaires pour révéler une activité CTLp ce qui suggère que la fréquence de leur CTL spécifiques était plus faible comparée à celle de donneurs normaux. Une interprétation est que cette fréquence plus faible serait due à une élimination de CTL de haute affinité par une surstimulation de réponses CTL causant une anergie ou une délétion (28,29). Bien qu'un plus grand nombre de patients ait besoin d'être évalués pour des conclusions définitives, chez trois sur dix patients leucémiques, une activité CTL spécifique a été directement détectée suggérant une surveillance immunitaire spécifique active contre le produit de translocation BCR-ABL. Toutefois, les patients leucémiques sont incapables de se débarrasser eux-mêmes de leur tumeur même en présence de cellules T spécifiques de cette tumeur détectables dans leur sang. Pour ces raisons, une immunothérapie adoptive à partir de cellules T et des vaccins IN VIVO conçus à partir de peptides, constituent de nouvelles approches thérapeutiques prometteuses. De façon significative, ces CTL circulants chez des patients ne montrent pas de toxicité détectable IN VIVO à l'encontre des tissus normaux, ce qui suggère que l'antigénicité des protéines BCR-ABL est principalement limitée à la région de jonction exprimée seulement par les cellules malignes ou les cellules prémalignes subissant une transformation. Une thérapie de transfert adoptif doit être donc sélective de façon à minimiser les probabilités d'une toxicité auto-immune. En d'autres termes, la destruction des clones malins ne doit pas affecter l'hématopoïèse normale, car des précurseurs normaux de la moelle osseuse coexistent normalement avec les clones malins dans la moelle osseuse de patients leucémiques. Une autre raison pour laquelle les peptides BCR-ABL selon l'invention sont des candidats privilégiés pour une vaccination et une immunothérapie adoptive à partir de cellules T est que contrairement aux autres translocations associées avec d'autres pathologies, la protéine BCR-ABL est un antigène commun chez 95 % des patients atteints de CML et 15 % des patients atteints d'une leucémie lymphoblastique aigue (15), Par ailleurs, la protéine BCR-ABL est associée de façon intime avec une transformation maligne aussi bien qu'avec la maintenance du phénotype malin (30,31). Des patients atteints de CML subissent une extension monoclonale d'une seule cellule pluripotente aberrante (32) et il est probable que la protéine BCR-ABL est présente chez le progéniteur malin le plus précoce (31,32). C'est seulement très rarement que des cellules CML positives pour la translocation Phl deviennent PHî négatives et il est également très rare que des cellules CML Phl positives perdent des transcrips détectables durant la progression de la maladie (33). Donc, des variants négatifs pour l'antigène qui pourraient pousser suite à une immunisation ne devraient pas avoir un phénotype malin. Les cellules T dans les CML sont presque toujours Phl négatives, au moins durant la phase chronique. De ce fait, une expansion de CTL spécifiques vis à vis de la tumeur IN VITRO et une réinjection chez des patients atteints de CML combinée avec une vaccination spécifique avec un épi tope essentiel minimum peut être envisagée. Cette étude démontre que la protéine chimérique BCR-ABL exprimée par les CML associée à la translocation Phl est immunogénique chez des individus HLA-A2.1 à cause de la séquence d'acides aminés de l'unique région de jonction entre BCR et ABL. Les propriétés décrites pour la présente invention peuvent être appliquées à l'évaluation de l'immunogénicité de la même région de jonction BCR-ABL chez d'autres individus porteurs d'allèles HLA et de protéines exprimées par d'autres gènes ayant subi une translocation communément associés avec les leucémies et les lymphomes. Les peptides antigéniques tels ceux de la présente invention peuvent être utiles pour développer IN VIVO et/ou EX VIVO des protocoles d'immunothérapie. BIBLIOGRAPHIE 1 Deisseroth, A. & Ariinghaus, R.B., Eds. (1991) Chronic myelogenous leukemia: molecular approaches to resea.ch and therapy. Dekker, New York, voi. 13. 2- Gale, R.P. & Canaani, E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 5648-5652. 3 - Konopka, J.P. & Witte, O.N. (1984) Cell, 37: 1035-1042. 4 - Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R.P. & Canaani, E. (1985) Nature (London) 315: 550-554. 5 - Stam, K., Hersterkamp, N., Reynolds, F.H., Jr. & Groffen, J. (1985) Mol. Cell. 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Peptides comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes - SEQ ID N0 i : S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 927 à 934 de p210) - SEQ ID N" 2 : S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 926 à 934 de p210) - SEQ ID N" 3 : Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 925 à 934 de p210) - SEQ ID N" 4 : K-Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 924 à 934 de p210), ou toute séquence dérivée de l'une des précédentes, capable d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) humains HLA-A2.1 restreinte spécifiquement dirigée contre des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL (p210). 2. Méthode pour obtenir une population de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL) capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL, caractérisée en ce que - on cultive des lymphocytes humains provenant du sang périphérique, préférentiellement enrichis en lymphocytes T CD8+, dans un milieu contenant une quantité efficace d'au moins un peptide selon la revendication 1, et des cellules présentatrices aptes à présenter aux lymphocytes T le ou lesdits peptide(s) en association avec leurs molécules HLA de classe I, et - on augmente le nombre et la spécificité des CTL par une ou plusieurs restimulations par le ou lesdits peptide(s) précédemment décrit(s) associé(s) aux molécules HLA de classe I des cellules présentatrices. 3. Population de lymphocytes T cytotoxiques humains obtenue par la méthode selon la revendication 2. 4. Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant au moins un peptide selon la revendication 1 comme principe actif avec tout véhicule, adjuvant, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA. 6. Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA de classe I de cellules humaines non tumorales présentatrices. 7. Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA de classe I fixées ou ancrées dans des supports biocompatibles et bioassimilables. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, destinée à être administrée à un patient, caractérisée en ce que le typage des molécules HLA est compatible avec celui dudit patient. 9. Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif une population de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) selon la revendication 3. 10. Composition selon la revendication 9 destinée à être administrée à un patient, caractérisée en ce que les CTL sont HLA compatibles avec les cellules dudit patient. 11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que les lymphocytes T de la composition sont restreints par un allèle HLA de classe I du patient. 12. Composition selon la revendication 6 ou la revendication 11, caractérisée en ce que les cellules présentatrices ou les lymphocytes T sont des cellules autologues dudit patient. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, destinée à être administrée à un patient porteur de l'haplotype HLA-A2.1. 14. Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif des séquences nucléotidiques codant pour l'un au moins des peptides selon la revendication 1, placées sous le contrôle de signaux permettant leur expression. 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques sont exprimées dans un hôte cellulaire transfecté par un vecteur d'expression approprié contenant lesdites séquences, ledit hôte cellulaire étant choisi parmi des cellules naturellement présentes dans l'organisme. 16. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques sont sous forme d'ADN nu. 17. Utilisation d'un peptide selon la revendication 1 pour activer IN VITRO des lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL. 18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que les lymphocytes T cytotoxiques sont restreints par HLA-A2.1. 19. Utilisation d'un ou plusieurs peptides selon la revendication 1 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL 20. Méthode de diagnostic IN VITRO d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL chez un patient, caractérisée en ce que l'on recherche des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques des cellules BCR ABL chez ledit patient selon les étapes consistant à - mettre en culture les lymphocytes du sang périphérique de ce patient, avec au moins un peptide de l'invention associé à des molécules HLA compatibles avec les cellules T du patient - observer la stimulation spécifique de lymphocytes T par le peptide présenté en association avec les molécules HLA. 21. Méthode selon la revendication 20 pour le diagnostic d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL chez un patient HLA A2.1.