Brevet FR2745569A1 — publié le 19970905

La présente invention concerne de nouveaux composés apparentés à la famille des amidiniums dont en particulier les guanidiniums, des compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications. Plus précisément, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels dans laquelle: - Rl représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22,. R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale Il avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, dans laquelle: - n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4, - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III dans laquelle p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à O ou 1, avec pour r égal à I X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2. avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5. A titre de sous-famille préférée, on citera plus particulièrement dans le cadre de la présente invention les composés de formule générale I dans laquelle R2 ou R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule IV dans laquelle n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V avec q et r définis comme précédemment, et avec m, n, p q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3. Ces nouveaux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaccutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine). A titre représentatif des composés selon l'invention on peut plus particulièrement citer les composés de sous-formules générales suivantes: (H2N)2+ C- NH - (CH2)2 -NH -COO- Rl VI [(H2N)2+ C- NH - (CH2)3] [(H2N)2 C± NH - (CH2)4] -N-COO - Rl VII [(H2N)2+ C- NH - (CH2)2] 2- N-( CH2)2 -NH -COO- Rl VIII [(H2N)2+ C- (CH2)2 ] 2 N - COO - Rl IX [[(H2N)2+ C- (CH2)2 ] 2 - N-( CH2)2] 2N - COO - Rl X dans lesquelles R1 possède la définition précédente. A titre représentatif des guanidiniums et amidiniums revendiqués, on peut plus particulièrement citer les composés des sous formules précédentes VII ,VIII et IX avec R1 y représentant un groupement cholestéryle. Les trois composés seront respectivement identifiés ci-après sous la désignation BGSC ( Bis Guanidino Spermidine Cholesterol) et BGTC ( Bis Guanidino Tren Cholesterol) et B.A.D.C..(bis chlorhydrate de bis amidinium Diéthylènetriamine cholesterol). Les composés revendiqués sont tout particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique pour leurs caractères non toxiques et leur propriétés amphiphiles. Compte -tenu de ces qualités, il peuvent notamment être utilisés pour la complexation d'acides nucléiques dans la perspective d'une transfection cellulaire de ceux-ci. Ces composés peuvent donc être avantageusement employés en thérapie génique. La thérapie génique a pour principal objectif de corriger des maladies génétiques associées à un défaut d'expression et/ou une expression anormale, c'est à dire déficiente ou excessive, d'un ou plusieurs acides nucléiques. On tente de suppléer à ce type d'anomalies génétiques par le biais de l'expression cellulaire in vivo ou in vitro de gènes clonés. Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance intracellulaire de ce type d'information génétique. L'une des technologies actuellement mises en oeuvre, repose précisément sur l'emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires. Des lipides cationiques chargés positivement comme le chlorure de N-[î-(2,3- dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammoniu (DOTMA) ont ainsi été proposés. Avantageusement, ils interagissent, sous la forme de liposomes ou de petites vésicules, spontanément avec de l'ADN, qui est lui chargé négativement, pour former des complexes lipides-ADN, capables de fusionner avec les membranes cellulaires, et permettent ainsi la délivrance intracellulaire de l'ADN. Toutefois, dans le cas particulier du DOTMA, sa bonne efficacité au niveau de la transfection demeure malheureusement associée à un défaut de biodégradabilité et un caractère toxique à l'égard des cellules. Depuis le DOTMA, d'autres lipides cationiques ont été développés sur ce modèle de structure : groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer". Parmi ceux-ci, on peut plus particulièrement citer ceux comprenant à titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques. De part leur structure chimique et leur caractère biodégradable, les composés revendiqués répondent précisément aux exigences requises pour un vecteur de transfection d'acides nucléiques. La présente invention vise donc également toute application de ces nouveaux composés dans la transfection in vitro et/ou ex vivo de cellules et notamment pour la vectorisation d'acides nucléiques. Elle se rapporte en particulier à toute composition pharmaceutique comprenant, outre au moins un composé selon l'invention, un acide nucléique. Dans les compositions de la présente invention, I'acide nucléique associé à au moins un composé revendiqué peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils comportent de préférence un gène thérapeutique. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-å-vis de la cellule cible (c'est-à Outre cette application potentielle des dérivés d'amidinium revendiqués, il est également possible d'envisager leur valorisation dans les applications suivantes: interférence au niveau d'interactions entre acides nucléiques et protéines résultant dans une inhibition ou stimulation de certains processus par exemple de régulation d'expression génétique ou d'activité enzymatique ( polymérase, transcriptase, etc....), complexation sélective d'espèces anioniques pour leur extraction, leur élimination ou leur détection à l'aide de sondes/électrodes à membrane par exemple. En conséquence, la présente invention a également pour objet toute application thérapeutique des dérivés d'amidinium tels que décrits précédemment, soit directement, soit au sein de compositions pharmaceutiques. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent également un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. FIGURES Figure 1: Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BGSC et BGTC. Figure 2: Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BADC. MATERIEL ET METHODES A. Mesures physiques Les spectres de résonnance magnétique nucléaire du proton ( RMN 1H ) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AC200. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au TMS. B. Chromatographies sur silice .Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d'épaisseur .Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,040-0,063mm. EXEMPLE 1: PREPARATION DU GUANIDINO SPERMIDINE CHOLESTEROL"BGSC" -1; Préparation du Di-Boc carbamate (1) On ajoute une solution de chloroformate de cholesteryle(0,9g, 2mmol) et de Et3N (0,214g, 2mmol) dans CH2Cl2 (40ml) à une solution de 'N,8N-Boc2-spermidine (0,690g, 2mmol) dans CH2Cl2 (20ml). Après reflux pendant 5 heures, le mélange est lavé à l'eau (2x50ml), séché sur Na2SO4 et le solvant est évaporé. Le produit brut est purifié par chromatographie sur un gel de silice utilisant CH2C12/MeOH 95/5 comme éluant pour donner du pur carbamate (1,3g, 86%). 'H NMR, G(CDC1,. 200 Mhz) 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl, Boc signal et groupes centraux CH2 depuis le spermidine), 3,1-3,3(m, 8H, N-CH2), 4,50(m,1H,H3&alpha;), 5,37(d, 1 H,H6). - 2. Préparation de l'aminocarbamate(2) On dissout le composé (1) (1,3g) dans 20ml de CH2Cl2 et l'on ajoute à cette solution refroidie (lit de glace) 2ml de CF3CO2H fraîchement distillé pour libérer les groupes protecteurs BOC. Après agitation à température ambiante pendant 3 heures, on ajoute 50ml de 'N NaOH et le mélange est extrait avec CH2Cl2 Les couches organiques sont lavées à l'eau, séchées sur Na2SO4 et évaporées pour obtenir l'aminocarbamate (2) brut (0,945g, 98%). H NMR, #(CDCl3, 200 Mhz) ; 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl et groupes centraux depuis le spermidine), 2,7(m, 4H, CH2-N-C0-), 3,25 (large m,4H,N-CH2), 4,49(m,1H,H3&alpha;), 5,35(d, 1 H,H6). 3.- Synthèse du B.G.S.C. On dissout le carbamate (2) brut (0,94g) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Puis on ajoute du lH-pyrazolecarboxamidine (0,495g, 3,4mmol) et du diisopropylethylamine (0,436, 3,4mmol) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Après agitation à température ambiante pendant 18 heures on ajoute lentement 250 ml de diethylether et on sépare le précipité obtenu par décantation. Le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation pour donner du GSC pur (0,570g, 47%). 1H NMR 6(DMSO d6) 200 MHz ; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl et CH2 central), 3,l(m, 8H, N-CH2), 4,3(m,1H,H3&alpha;), 5,3(d,1H,H6) ; 7,2 (large s, 8H,NH2+), 7,8(s,2H,NH), Anal. Calc. pour C37H67N7O2,2HCl,C,62,15; H,9,67; N,13,71. Résultat d'analyse élémentaire: C,62,28 ; H,9,8l 1; N,N,13,15. EXEMPLE 2: PREPARATION DU GUANIDINO TREN CHOLESTEROL, BGTC 1 préparation de l'Aminocarbamate (5) On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (1,8g, 4mmol) dans 100ml de CH2CI2 à une saturation de tris(2-aminoethyl)amine(TREN) (11,68g, 80mmol) dans 400ml de CH2C12. Après agitation à température ambiante pendant deux heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3xlOOml) et après séchage sur Na2SO4 on évapore le solvant.On isole 6 dans sa forme pure trihydrochloride - de la manière suivante : on dissout le produit brut dans 10ml de MeOH et l'on ajoute goutte à goutte une solution saturée de Hcl methanolique (5 mi); le précipité obtenu est séparé par décantation et, pour obtenir un composé pur, est mis en suspension trois fois dans MeOH et séparé par décantation. Après séchage sous vide du pur trihydrochloride(6) est obtenu (1,71g, 64%). 1H NMR #(CDCl3 + #CDl3OD, 200MHz). 0,5-2,4(m, structure de cholesteryl), 2,5(m,2H,CH2NHCO), 2,8(large s,4H,+HN-CH2), 3,06(large s,4H,CH2NH3+), 3,20(m,2H,+HN-CH2), 4,4(m, 1 H,H3a), 5,3(d, 1 H,H6), Anal. Calc. pour C34H62N402,3HCI ;C,61,10 ; H,9,80 ; N,8,38. Résultat: C,61,25 ; H,9,96 ; N,8,22. 2- Préparation du B.GTC On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (2,24g, Smmol) dans 100ml de CH2Cl2 à une large saturation de tris(2aminoéthyl)amine(TREN)(29,2g, 200mmol) dans 250ml de CH2Cl2. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3xl00ml) et après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé. Le produit brut (3,2g) est dissous dans THF/MeOH 50/50 (20ml) ; puis l'on ajoute au mélange du 1H pyrazole- 1-carboximidine (1,465g,10mmol) et du diisopropylamine (1,3g, 10mmol). Après agitation à température ambiante pendant 18 heures, on ajoute du diethylether et le précipité obtenu est séparé par décantation. Afin d'obtenir un échantillon pur, le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation (2,1 5g), 60% après séchage sous vide. 1H NMR(DMSOd6 200MHz) 0,5-2(m, structure du cholesteryl), 2,2(m,2H,N CH2), 2,6(large s,4H,N-CH2), 3.0(d,2H,N-CH2), 3 ,2(large s,4H), 4,3(m,1H,H3&alpha;), 5,3(d,1H,H6), 7,3(large s,8H,NH2+), (7,8(large s,2H,NH). Anal. Calc. pour C36H66N802,2HCI; C,60,39 ; H,9,57 N,15,65. Résultat: C,60,38 ; H,9,67 N,15,56. EXEMPLE 3: PREPARATION DU BIS-CHLORHYDRATE DE BIS AMIDINIUM 4 B.A.C.D. 1.Préparation du dinitrile On ajoute une solution de chloroformate de cholestéryle (8,97g; 20mmol.) dans du CH2Cl2 (lOOml) goutte à goutte à une solution d'iminopropionitrile (2,46g, 20mmol.) et Et3N dans du CH2CI2 (lOOml). Après agitation à la température ambiante, pendant 6 heures, on lave à l'eau (2x 100ml) et sèche sur Na2S04. Le solvant est évaporé et le produit brut (10,5g) est recristallisé dans le méthanol. (8,59g; 80%). 1H NMR G(CDC13, 200MHz). 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl), 2?7 5M. 4H; CH2CN), 3,62 (m;H; -CH2-N-), 4,50 (m,lH,H3a), 5,39(d,1H,H6). 2. Préparation du dithioamide Dans une solution du dinitrile, préparé comme décrit précédemment, ( 0,324g, 6mmol.) et de diéthylamine ( 0,884g; 12mmol) dans du DMF (30ml), maintenue à 50"C, on fait barboter pendant 2 heures un léger courant de H2S. On verse la solution bleue sur de la glace et on sépare le précipité aainsi obtenu par filtration. On dissout ce produit brut dans du CH2C12 et lave à l'eau (2x50ml). Après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé et le produit obtenu recristallisé deux fois dans du méthanol (1,86g; 51,5%). 1H NMR(DMSOd6* 200MHz); 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl), 2,67(t,4H,N CH2), 3,50(t,4H,S=C-CH2), 3,2(large s,4H), 4,3(m,lH,H3,),5 ,33(0 1H,Hs). 3. Préparation du bis-iodure de dithioamidate A une solution de dithioamide (0,603g; Immol) dans de l'acétone (20ml), on ajoute de l'iodure de méthyle (2ml) et on laisse reposer à la température ambiante pendant 48 heures. On filtre le précipité obtenu (0,741g; 83,5%). Ce produit est utilisé directement sans purification annexe. 4. Préparation du bis chlorhydrate de bis amidinium B.A.D.C. Dans une suspension au reflux du bis-iodure (0,741g; 0,83mmol.), tel qu'obtenu précédemment, dans de l'isopropanol (1 Omi) on fait barbotter un courant de NH3 pendant 2 heures puis on continue de chauffer au reflux 4 heures supplémentaires. On évapore l'isopropanol et le résidus est repris dans du méthanol (10mol). Cette solution est récupérée sous forme basique. On fait ensuite passer un courant d'acide chlorhydrique dans l'éluant et on évapore à sec. Le bis chlorhydrate ainsi obtenu, est dissous dans le minimum d'éthanol ( environ 5ml). On filtre un léger insoluble et on rajoute au filtrat un large excès d'éther diéthylique. On obtient une poudre que l'on filtre et l'on sèche (320mg; 60%). Une recristallisation dans l'isopropanol permet d'isoler le produit attendu, sous une forme analytiquement pure. 1H NMR(DMSOd6, 200MHz); 0,5-2,6(m, structure du cholesteryl -CH2-amidinium), 3,57 (s, large, N-CH2 4,3(m,1H,H3(t),5,3(d,1H,H6), 8,64 (s; large; 2H; NH2), 9,07 (s; large; 1H; NH), 9,18 (s; large; 2H). Anal. Cal. Pour C34H56N402, 2HC1: C, 65,25. H, 9,32; N, 8,94. Résultat C, 65,40. H, 9,87; N, 9,55. REVENDICATIONS 1. Composé de formule générale I et ses sels dans laquelle: - Rl représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22. R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, dans laquelle: - n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4 - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III dans laquelle p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à 0 ou 1, avec pour r égal à 1 X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2. avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R2 et R3 y représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale IV dans laquelle n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V avec q et r définis comme précédemment. et avec m, n, p q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit préférentiellement d'un composé représenté par l'une des sous formules générales suivantes: (H2N)2+ C- NH - (CH2)2 -NH -COO- R1 VI [(H2N)2+ C- NH - (CH2)3] [(H2N)2+ C- NH - (CH2)4 ] -N-COO - R1 VII [(H2N)2+ C- NH - (CH2)2 ] 2-N-( CH2)2 -NH -COO- R1 VIII [(H2N)2+ C - (CH2)2] 2 N - COO - R1 ou IX [[(H2N)2+ C- (CH2)2 ] 2 - N-( CH2)2] 2N - COO - R1 X dans lesquelles Rlest défini selon la revendication 1. 4. Composé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en qu'il est choisi parmi [[(H2N)2+ C - (CH2)2] 2-N-( CH2)2] 2N - COO - R1 [(H2N)2+ C- NH - (CH2)3 ] [(H2N)2+ C- NH - (CH2)4 ] -N-COO - R1 et [(H2N)2+ C - (CH2)2] 2N - COO - Rt dans lesquels R1 représente un groupement cholesteryle. 5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications précédentes. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un acide nucléique. 7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique. 8. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 9. Composition selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 9 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 9 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses. 12. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications de 1 à 4 pour la transfection ex vivo et/ou in vitro de cellules.