Brevet FR2742758A1 — publié le 19970627

L'invention concerne l'identification d'un segment chromosomiQue humain associé à une des ormes précoces de la maladie d'Alzheimer, et plus partculiereent de marqueurs génétiques portés par celui-ci, ainsi que leur utilisation comme sondes d'ADN pour le diagnostic de ladite forme de la maladie. La maladie d'Alzheimer est la forme la plus commune de démence. On distingue, selon l'âge de l'apparition des premiers symptômes, une forme "tardive" ("démence sénile", débutant aprés 60 ans) et une forme "précoce" ("démence présénile", avant 60 ans). Il s'agit d'une maladie multifactorielle, montrant dans 30 à 50% des cas une transmission héréditaire selon un mode dominant (McKusick, 1992) . La formation, au niveau du cerveau, de plaques amyloïdes est une des caractéristiques de la maladie. On y retrouve une accumulation, sous une forme précipitée, de plusieurs protéines, dont l'espèce majoritaire est le peptide A4 (St. George-Hyslop et coll.,1990; McKusick, 1992; Hardy and Higgins, 1992). La maladie d'Alzheimer est hétérogène : elle peut être engendrée par des anomalies génétiques variées, sur différents chromosomes - la forme tardive est la plus fréquente. Il semble que l'allèle ApoE4 porté par le chromosome 19 soit un facteur important de prédisposition pour cette forme de la maladie (Corder et coll.,1993). - la forme précoce représente environ 20% des cas familiaux. Cette forme se répartit en une forme majoritaire, associée à un locus situé sur le chromosome 14, en 14q24.3 (St. George-Hyslop et coll.,1992; Van Broeckhoven et coll.,1992; Schellenberg et coll. 1992; Mullan et coll., 1992) une forme minoritaire, associée à certaines mutations du gène de L'API (précurseur de la protéine amyloïde A4), situé sur le chromosome 21 (St. George-Hyslop et coll., 1987). enfin certaines familles ont été décrites pour lesquelles la maladie n'est liée ni au chromosome 14 ni au chromosome 21 ("Allemands de la Volga" par exemple, St George-Hyslop et coll.,1992) En raison du déclenchement tardif de la maladie, de nombreux cas apparaissent dans des familles trop restreintes (parents décédés, par exemple) pour permettre une analyse de liaison génétique. Les mécanismes biochimiques affectés par ces différentes formes génétiques de la maladie étant différents, il sera important, dans les tentatives de mises au point de thérapies, de disposer de méthodes diagnostiques simples permettant de distinguer, de manière non ambigüe, une forme particulière de la maladie d'Alzheimer, au sein des autres formes ou même parmi des pathologies voisines. La présente invention se rapporte à la forme précoce de la maladie d'Alzheimer associée au chromosome 14. Jusqu'à trés récemment (St. George-Hyslop et coll. 1992; Mullan et coll. 1992; Van Broeckhoven et coll. 1992; Schellenberg et coll. 1992) le locus responsable était circonscrit dans une région assez large du chromosome, localisée en 14q (estimée entre 15 et 18 cM), délimitée par les marqueurs D14S57 et D14S59 et centrée sur le marqueur D14S43 (ces marqueurs sont définis dans le rapport du Chromosome Coordinating Meeting 1992). La taille physique de cette région était estimée à 8-10 Mb. (cM = centi-Morgan, Mb = mégabases) La Demanderesse s'est attachée, tout d'abord, à établir la cartographie physique de la région D14S57-D14S43 D14S59 par la constitution d'un "contig" (ou assemblage continu) de clones YAC chevauchants (YAC: Yeast Artificial Chromosome, Burke et coll., 1987). Les clones YAC proviennent de la banque génomique humaine construite au CEPH (Centre d'Etude du polymorphisme humain - Paris) qui est décrite par Cohen et coll. (1993). La Demanderesse a observé que l'intervalle de 18 cM identifié précédemment se caractérise par l'absence d'événements de recombinaison génétique, dans les familles de malades ce qui l'a poussée à rechercher dans ce segment chromosomique, l'existence d'un accident génétique expliquant ce phénomène et qui pourrait être la cause de la pathologie. Dans la région 14q limitée par les marqueurs D14S57 et D14S59 et centrée sur D14S43, la Demanderesse a identifié un segment chromosomique d'intérêt, qui est limité par les segments suivants, clonés dans les YACs, orientés d'amont en aval dans le sens centromère -+ télomère 939A6.934A3 --- 905C2 --- 854F5.746B4 (les numéros correspondent à un clone représentatif de YAC, d'autres clones correspondant au même segment chromosomique sont disponibles dans la même banque). Les clones YAC 939A6 et 934A3 se chevauchent sur un segment qui contient le marqueur D14S251. Les clones YAC 854F5 et 746B4 se chevauchent sur un segment qui contient le marqueur D14S76. En utilisant des sondes d'ADN synthétisées par PCR ("polymerase chain reaction") sur chacun de ces YACs et marquées par différents fluorochromes, les différents segments chromosomiques ont pu être localisés les uns par rapport aux autres sur le chromosome 14, par la technique d'hybridation in situ (FISH : Fluorescent in situ hybridization) et l'observation et la photographie des chromosomes marqués au microscope à fluorescence. Chez des individus normaux, ils sont placés dans l'ordre indiqué plus haut. Par contre on observe chez des malades, et avec des sondes correspondant à plusieurs clones de chaque type, sur un des deux chromosomes 14, un déplacement du signal correspondant au marqueur de type 934A3 qui se rapproche du télomère et, du signal correspondant au marqueur 854F5 qui s'éloigne du télomère, les signaux correspondant aux marqueurs 936A6, 905C2 et 946B4 restant à la même place que sur les chromosomes des témoins. L'ensemble de ces observations correspond donc à une microinversion du segment 934A3 - 854F5, autour du pivot représenté par le marqueur 905C2. Ce remaniement génétique de petite taille n'est pas décelable en cytogénétique classique, les caryotypes effectués sur les préparations mitotiques des patients ne présentant aucun caractère anormal. En particulier aucun remaniement n'est visible au niveau du chromosome 14. La Demanderesse a ainsi mis en évidence l'existence d'un remaniement génétique portant sur un petit segment du locus 14q associé à une forme précoce de la maladie d'Alzheimer. La Demanderesse a tiré parti de ce phénomène surprenant pour faire de ce segment chromosomique, un marqueur génétique de la maladie. Dans ce but, elle a conçu des sondes d'ADN et la méthode d'utilisation de celles-ci pour révéler l'anomalie génétique sur des préparations de chromosomes métaphasiques de malades, cette méthode permettant un diagnostic simple et discriminatoire d'une forme de maladie d'Alzheimer. Selon un premier aspect, l'invention concerne donc un couple de sondes d'ADN permettant la détection d'un remaniement génétique dans le locus du chromosome 14 associé à une forme précoce de la maladie d'Alzheimer. L'ADN de ces sondes s'hybride sur des segments d'ADN chromosomique humain choisis, clonés et disponibles dans la banque de YACs du CEPH (cités plus haut). La première sonde s'hybride au YAC portant le nO d'accès 934A3, qui peut être identifié par le marqueur génétique D14S251 qui est proche de son extrémité amont (éloignée du télomère). La deuxième sonde s'hybride au YAC portant le nO d'accès 854F5, qui peut être identifié par le marqueur génétique D14S76 qui est proche de son extrémité aval (vers le télomère) . Ces marqueurs D14S.. sont répertoriés dans la nomenclature internationale du génome humain reprise par Gyapay et coll. 1994. Il est évident que les sondes ainsi définies s'hybrident également avec tous les segments portés par des YACs du même groupe, c'est-à-dire dont la localisation sur le chromosome chevauche largement le YAC choisi comme type. Elles s'hybrident également à des segments plus courts compris dans le segment choisi; de tels segments plus courts peuvent également être clonés dans un autre type de vecteur, par exemple dans un cosmide. La préparation des mêmes sondes peut être réalisée à partir de tels vecteurs, pour simplifier la manipulation (la sonde résultante s'hybridera toujours au segment du YAC qui définit la sonde selon l'invention). Le couple de sondes selon l'invention est rendu visible au microscope par un marquage distinct de chaque sonde, choisi pour permettre la détection simultanée des 2 sondes et leurs localisations relatives sur le chromosome, après hybridation in situ. Le marquage est effectué de préférence à l'aide de 2 fluorochromes à spectres distincts. Un autre type de marquage à l'aide de marqueurs chimiques ou d'isotopes radioactifs pourrait aussi être appliqué. L'invention concerne également l'utilisation du couple de sondes d'ADN pour le diagnostic de la forme de la maladie d'Alzheimer liée au chromosome 14. La mise en oeuvre du test de diagnostic comprend les étapes suivantes - la préparation sur lames de microscope de chromosomes métaphasiques de cellules lymphoblastoïdes prélevées sur le patient et mises en culture, - la mise en contact, sur cette préparation de chromo somes, du couple de sondes marquées dans les conditions habituelles permettant l'hybridation des ADNs, - la détection des sondes hybridées dans les conditions appropriées (au microscope à fluorescence muni des filtres adaptés aux fluorochromes choisis) et la localisation relative des 2 sondes sur un nombre significatif de paires de chromosomes 14. Ce test est réalisé par comparaison avec des préparations de chromosomes témoins; en outre 1 des 2 chromosomes du patient sert également de référence puisque l'accident génétique ne porte que sur 1 des 2 chromosomes. Des variantes de ce test peuvent être envisagées. Ainsi, dans le couple de sondes, on peut remplacer l'une des deux par une sonde qui s'hybride au segment considéré comme pivot dans le mouvement de microinversion et qui est représenté par le YAC 905C2. Dans ce cas on observera, sur l'un des chromosomes du malade, un déplacement de l'autre marqueur autour de ce pivot. Ce mode de réalisation du test peut être mis en oeuvre systématiquement en plus du test décrit plus haut, pour en confirmer le résultat. Selon un autre aspect, l'invention concerne également le segment d'ADN du locus du chromosome 14, tel qu'il a été identifié, et qui s'hybride à l'une au moins des sondes selon l'invention. Ledit segment d'ADN présente un remaniement génétique identifiable par une microinversion de marqueurs génétiques dont l'une ou l'autre des bornes est probablement située à l'intérieur d'un gène associé à la pathologie ou dans des régions régulatrices contrôlant l'expression de ce gène. Ce segment d'ADN associé à la pathologie est proche d'au moins un des deux marqueurs D14S251 et D14S76. En outre, il comprend au moins l'une des deux régions communes aux clones YAC chevauchants 939A6 et 934A3 ou 854F5 et 746B4, ou une partie desdites régions communes. L'identification du segment d'ADN selon l'invention ouvre des perspectives thérapeutiques pour la forme de la maladie d'Alzheimer qui lui est associée. Les exemples suivants illustrent un mode de caractérisation et de réalisation de l'invention, sans toutefois en limiter la portée. ExemDle I. Préparation des échantillons et des sondes pour l'hybridation in situ lFTSH) . Les préparations suivantes sont réalisées en vue de la localisation du fragment chromosomique identifié comme marqueur de la maladie d'Alzheimer sur le chromosome 14, par la technique de FISH. T 1 Préparation de chromosomes métaphasiques. On utilise des lignées lymphoblastoïdes dérivées de prélèvements sanguins de malades identifiés ou dont le diagnostic est à préciser. Les préparations de chromosomes métaphasiques à haute résolution sont obtenues en suivant le protocole expérimental décrit par Chérif et coll. (1990). La synchronisation est réalisée par addition, en phase de croissance exponentielle, de méthotrexate (10wu, pendant 17h), puis de 5-bromodéoxyuridine (0,1mu, pendant 6h). lmg/ml de colcémide est ajouté 15mn avant l'arrêt de la culture. L'étalement sur lames des chromosomes est effectué en solution hypotonique (75mM KC1). Après l'étalement et la fixation par une solution de méthanol/acide acétique glacial 3/1 (vol/vol), les lames sont conservées à -200C et à l'abri de la lumière, jusqu'à leur utilisation. T.2. Préparation de 1'ADN des clones YAC. Le clonage de grands fragments d'ADN dans des chromosomes artificiels de levure ou YAC a été décrit par Burke et coll. (1987) et la méthode a été appliquée pour construire des banques de matériel chromosomique humain (Cohen et coll. 1993). La banque construite au CEPH (Centre d'étude du polymorphisme humain - Paris) contient 33.000 clones avec des inserts d'une longueur moyenne de 0,9 mégabases et a été testée avec plus de 2.000 marqueurs génétiques distribués sur 90% du génome. Ce matériel est disponible pour la communauté scientifique en vue de l'établissement détaillé de la carte physique des chromosomes humains. Les références d'accès à cette banque sont données dans la publication de Cohen et coll. 1993 déjà citée. Les clones YAC utilisés ci-après sont issus de cette banque. L'ADN des clones YAC d'intérêt est préparé à partir de blocs d'inclusion dosés à 4x109 cellules de levure/ml, en 0,5% agarose à bas point de fusion (SeaPlaques GTG agarose, FMC BioProducts, USA) . Cinq blocs (environ 400 ml) sont équilibrés (3x30mn à 40C) par 5 volumes de tampon Agarase (Bis Tris-HCl pH 6,5 10mM; EDTA 5mM). Les blocs sont ensuite fondus 5mn à 650C, puis tempérés à 400C. Après adjonction de 4 unités de B-Agarase (New England Biolabs, USA) l'ensemble est incubé 4 heures à 400C, puis 1'ADN total est extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. I.3 Préparation des sondes par PCR. L'ADN total des clones YAC est utilisé pour préparer des sondes d'hybridation, par PCR (polymerase chain reaction), soit directement par "random primingw (1'initiation au hasard" de la réaction enzymatique de polymérisation, grâce à un mélange d'hexanucléotides), soit par Alu-PCR suivie de random priming. Dans ce dernier cas, les amorces SR1 (5'-CCACTGCACTCCAGCCTGGG-3', Romana et coll.,1993) et BK33 (5'-CTGGGATTACAGGCGTGAGC-3', Sinke et coll.,1992) sont utilisées simultanément, selon un protocole décrit par Romana et coll. (1993). L'utilisation de ces amorces qui correspondent à des séquences proches des extrémités des régions répétitives Alu permet d'éviter le marquage des régions Alu et le bruit de fond du à celles-ci, à la lecture du test FISH. Les produits de PCR sont précipités à l'éthanol, redissous en TE (Tris-HCl:EDTA) 10mM:lmM, quantifiés sur gel d'agarose 1,3% avant d'être utilisés pour le random priming. Pour les expériences réalisées en simple coloration le marquage des sondes est effectué en utilisant la dUTP-11biotine. Pour les expériences de double coloration le marquage des sondes est effectué en utilisant la dUTP-11biotine pour l'une des sonde et la digoxygénine pour l'autre sonde. I.4. Hybridation in situ (FTSH) . La technique de marquage non radioactif des chromosomes en métaphase, par hydridation in situ avec des sondes marquées par 2 colorants fluorescents différents, permet d'établir des cartes physiques à haute résolution, de localiser un marqueur choisi par rapport aux bandes R (Camargo et Cervenka 1980 et 1982; ISCN - 1991) ou un caractère nouveau par rapport à un marqueur de référence dont la position sur la carte physique est déjà connue. Depuis peu cette technique est couramment appliquée pour cartographier les segments de génome humain clonés dans des banques de cosmides ou de YACs. La technique de FISH est réalisée selon le protocole décrit par Chérif et colt. (1990). L'hybridation est réalisée dans un volume de 1OCL1 contenant 250ng de sonde (ou de chaque sonde pour les expériences de double coloration), 1201lu d'ADN Cotl (Gibco BRL) et 10mg d'ADN de sperme de saumon soniqué (SSS ADN). Après l'hybridation in situ, l'immersion dans une solution de Earle à 870C pendant 2 à 4 mn fait apparaitre un système de bandes R (Cherif et coll., 1990; bandes R selon la nomenclature internationale ISCN,1991). Les lames sont analysées au microscope à fluorescence et photographiées, comme décrit par Chérif et coll. Les signaux spécifiques apparaissent comme des spots symétriques sur les 2 chromatides d'au moins un des chromosomes homologues. La technique étant basée sur l'utilisation de 2 fluorochromes à spectres distincts permet l'identification des bandes et des signaux spécifiques (ou de 2 signaux spécifiques différents) sur la méme préparation, par simple changement de filtre. exemple Il Mise en évidence d'un micro-remaniement générique associé A une forme précoce de la maladie d'Àlzheimer. Les préparations chromosomiques ont été réalisées à partir de cultures de lignées lymphoblastoïdes de patients pour lesquels le diagnostic de maladie d'Alzheimer familiale précoce a été établi. II.1. Patients. Le patient nO 1 provient d'une famille française pour laquelle la mutation a pu être démontrée associée au chromosome 14, par une étude de liaison génétique réalisée à l'aide des marqueurs D14S43, D14S71 et D14S77 Les patients n02 (V-249; lignée AG 07877) et n03 George- Hyslop et coll., 1992). Les lignées lymphoblastoïdes des patients 2 et 3 (ainsi que la description des familles FAD4 et FAD1) ont été obtenues auprès du Coriell Institute for Medical Research (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, 401 Haddon Avenue,Camden NJ 08103, USA). Il.2. Carte génétique des marqueurs utiles du locus 14q24.3 Les travaux de différentes équipes (cités p.2) ont permis d'identifier un locus associé à une forme précoce de maladie d'Alzheimer sur le chromosome 14, en position 14q24.3, centré autour du marqueur D14S43, et délimité par les marqueurs D14S57 et D14S59. Cette région a été analysée de manière détaillée - La cartographie physique de la région D14S57 - D14S43 D14S59 a été précisée par la constitution d'un "contig" de clones YAC chevauchants. Les clones YAC proviennent de la banque génomique construite au CEPH. Les marqueurs génétiques D14S... sont décrits dans les références citées plus haut et dans "The 1993-94 Genethon human genetic linkage map", Gyapay et coll. (1994). - Les éléments de cette carte qui ont été utilisés dans les expériences de FISH sont résumés dans le schéma suivant CEN --//-- --1/-- A-B --//-- 90su2 --//-- C-D --//-- --/1-- TEL T T D14S57 T D14S43 t D14S59 D14S251 D14S76 dans lequel CEN représente le centromére TEL représente le télomère A, B, 905C2, C, D représentent des groupes de YACs tD14S.. représente la position des marqueurs génétiques. Les clones de YAC suivants font partie du groupe A : 939A6, 938E10, 707F8. Les clones de YAC suivants font partie du groupe B : 934A3, 676E4, 895B8, 924C7, 962D8. Les YACs du groupe A et du groupe B se chevauchent et ont en commun un segment contenant le marqueur microsatellite AFM203zb2 (D14S251). Le groupe C est représenté par le clone YAC 854F5 et le groupe D par le clone YAC 746B4. Ceux-ci se chevauchent et ont en commun un segment contenant les marqueurs microsatellites AFM214zg3 (D14S76) et AFM283va9 (D14S273) qui sont confondus sur la carte génétique (distance O cM). - La région D14S57 - D14S43 - D14SS9 a été plus particulièrement analysée sur les chromosomes 14 des 3 patients décrits plus haut. Dans des expériences de FISH effectuées en simple coloration, la distance des signaux d'hybridation a été évaluée pour les deux chromosomes du patient nO 1 par rapport au télomère et par comparaison aux signaux obtenus sur des préparations mitotiques de référence, provenant d'individus normaux. Les résultats montrent que le signal obtenu avec la sonde dérivée du clone 934A3 se rapproche légèrement du télomére pour l'un des chromosomes du patient 1, alors qu'il reste à la position indiquée par la préparation mitotique de référence pour l'autre chromosome. Le clone 939A6 par contre, ne montre aucune variation. De la même manière, le clone 854F5 présente un éloignement du télomère sur l'un des chromosomes du patient 1, par rapport à sa position de référence, alors que le clone 746B4 ne varie pas de sa position de référence. Des expériences de FISH en double coloration ont été réalisées en utilisant le clone 905C2 comme point pivot. Les résultats mettent en évidence un basculement des signaux d'hybridation pour tous les clones du goupe B en position télomérique par rapport au point pivot, sur l'un des chromosomes 14 du patient 1 (comparativement à la situation de référence observée sur des préparations mitotiques provenant d'individus normaux), alors que les signaux relatifs aux clones du groupe A ne présentent aucun déplacement. De même, le signal d'hybridation du clone 854F5 (groupe C) bascule en position centromérique par rapport au point pivot, sur l'un des chromosomes du patient 1, alors que le signal correspondant au clone 746B4 (groupe D) est invariant. Des expériences similaires effectuées sur les lignées provenant des patients 2 et 3, démontrent un phénomène de micro-remaniement chromosomique analogue (basculement des signaux pour les clones 934A3 (groupe B) et 854F5 (groupe C). Chez ces patients, aucun remaniement chromosomique n'était visible par l'analyse classique du caryotype. Les résultats des expériences d'hybridation in situ (FISH) indiquent clairement l'existence d'une microinversion d'un segment de l'un des chromosomes 14 des patients étudiés. Les limites proximale et distale de ce remaniement ont pu être localisées, pour le patient nO 1, à l'intérieur ou à proximité immédiate du segment d'ADN porté en commun par les clones YAC 939A6 et 934A3 (groupes A et B respectivement) pour la borne proximale; à l'intérieur ou à proximité immédiate du segment commun aux clones 854F5 et 746B4 du côté distal. Il est probable que l'une ou l'autre des bornes de l'inversion soit située à l'intérieur du gène associé à la pathologie ou dans des régions régulatrices, contrôlant son expression. Exemple III. Applicatlons diagnostiques. La caractérisation de l'événement de microinversion d'un segment du chromosome 14, décrite dans l'exemple II, peut être appliquée à la mise au point d'un test de diagnostic spécifique de la forme familiale de maladie d'Alzheimer liée au chromosome 14, selon le protocole suivant - Les clones YAC de référence 934A3(B), 854F5(C) et 905C2 (pivot) sont utilisés pour préparer des sondes fluorescentes pour test FISH, comme décrit dans l'exemple I, les sondes B et C ou les sondes B ou C et pivot étant marquées à l'aide de deux fluorochromes différents. - Des cellules lymphoblastoïdes sont prélevées chez les patients à diagnostiquer, elles sont mises en culture et synchronisées pour réaliser les préparations de chromosomes métaphasiques, comme décrit dans l'exemple I. On analysera environ 20 préparations chromosomiques par patient. - L'hybridation des sondes sur les préparations chromosomiques et leur analyse au microscope à fluorescence montrera une inversion des signaux fluorescents sur un des deux chromosomes 14, l'autre présentant la même image qu'une préparation de chromosomes témoin, en cas de diagnostic positif. Chez les sujets sains ou atteints d'une autre forme de la maladie d'Alzheimer, les 2 signaux fluorescents seront localisés au même endroit, comme chez les sujets témoins. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES D.T. Burke, G.F. Carle and M.V. Olson. Cloning of Large Segments of Exogenous DNA into Yeast By Means of Artificial Chromosome Vectors. Science (1987) 236: 806-812. Camargo M. et Cervenka J. Pattern of chromosal replication in synchronized lymphocytes. (1980) Hum. Genet. 54, 47-53. Camargo M. et Cervenka J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. (1982) Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780. D. Cherif, C. Julier, O. Delattre, J. 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REVENDICATIONS 1.- Couple de sondes d'ADN pour la détection d'un remaniement génétique dans le locus du chromosome 14 associé à une des formes précoces de la maladie d'Alzheimer, caractérisé en ce que chacune desdites sondes s'hybride à l'un des deux segments d'ADN chromosomique humain clonés et disponibles dans la banque de YACs (1Least Airtificial hromosomes) du CEPH (Centre d'étude du polymorphisme humain) sous les numéros d'accès YAC 934A3 et YAC 854F5, le YAC 934A3 pouvant etre identifié par le marqueur génétique D14S251 et le YAC 854F5 pouvant être identifié par le marqueur génétique D14S76. 2.- Couple de sondes selon la revendication 1, caractérisé en ce que les 2 sondes portent un marquage distinct choisi pour permettre la détection simultanée des 2 sondes et leurs localisations relatives sur le chromosome, après hybridation in situ. 3.- Couple de sondes selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le marquage est effectué à l'aide de 2 fluorochromes à spectres distincts. 4.- Utilisation du couple de sondes d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic de la forme de la maladie d'Alzheimer associée au chromosome 14, caractérisée en ce qu'elle comprend - la préparation sur lames de microscope de chromosomes métaphasiques de cellules lymphoblastoïdes du patient; - la mise en contact, sur cette préparation de chromosomes, du couple de sondes selon les revendications 1 à 3, dans des conditions qui permettent l'hybridation des ADNs; - la détection des sondes hybridées et la localisation relative des 2 sondes sur un nombre significatif de paires de chromosomes 14. 5.- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact, sur la préparation de chromosomes, d'une sonde choisie parmi l'une des 2 sondes selon les revendications 1 à 3 et d'une autre sonde qui s'hybride au YAC 905C2 de la même banque. 6.- Segment d'ADN du locus du chromosome 14 associé à une des formes précoces de la maladie d'Alzheimer, caractérisé en ce qu'il s'hybride à l'une au moins des sondes selon la revendication 1. 7.- Segment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente un remaniement génétique identifiable par une microinversion de marqueurs génétiques. 8.- Segment d'ADN selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'une de ses extrémités est proche du marqueur D14S251. 9.- Segment d'ADN selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'une de ses extrémités est proche du marqueur D14S76. 10.- Segment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend la région commune aux clones YAC chevauchants 939A6 et 934A3 de la même banque, ou une partie de ladite région. 11.- Segment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 6, 7 et 9, caractérisé en ce qu'il comprend la région commune aux clones YAC chevauchants 854F5 et 746B4 de la même banque, ou une partie de ladite région.