Brevet FR2745088A1 — publié le 19970822

La présente invention a pour objet un procédé pour tester une substance éventuellement active dans ie domaine capillaire. Par domaine capillaire, on entend tout ce qui peut avoir trait au cheveu ou au poil d'un individu. Ainsi, par "substance éventuellement active dans le domaine capillaire", ou simplement par la suite dans le texte par "substance", on entend toute molécule ou ensemble de molécules présentant une activité potentielle dans le domaine du capillaire, et en particulier toute molécule ou ensemble de molécules ayant potentiellement une activité sur la survie, le ralentissement, l'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. La substance à tester peut être utilisée selon le procédé de l'invention soit sous sa forme moléculaire, soit sous la forme d'une composition contenant la molécule à tester. A ce jour, I'art antérieur évoque deux méthodes principales pour le test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire. La première consiste à pratiquer les essais sur des sujets volontaires et à constater de manière plus ou moins rapide les effets de la substance testée. II est évident que cette méthode présente de nombreux désavantages dont en particulier celui de s'adresser à des êtres humains, ce qui à l'évidence limite pour des raisons d'éthique le champ d'application de la méthode. Ainsi le nombre et la qualité des substances testées se trouvent limités. De plus, ces essais sont en général lourds de mise en oeuvre et s'étalent sur des périodes de temps longues. Les résultats du test sont alors dans la plupart des cas des constatations de modifications phénotypiques du follicule pileux. La deuxième méthode connue dans l'art antérieur est celle décrite dans le brevet EP 434 319. Cette méthode comprend une étape de dissection du follicule pileux consistant, à partir d'un prélèvement de peau contenant des follicules, à couper la tige pilaire au-dessous de la jonction dermo-épidermique, puis à isoler le follicule de la peau environnante sans endommager son bulbe. Une modification de cette méthode a été proposée par Williams et Stenn (Dev. Biol. 165, 469479 (1994)) qui consiste à préalablement découper la biopsie en lamelles verticales de 1 mm d'épaisseur, puis à pratiquer la dissection selon la méthode décrite dans le brevet EP 434319 en extirpant le follicule de son environnement à l'aide de pinces. Cette deuxième méthode, et sa variante, implique de conserver impérativement au follicule pileux l'ensemble des caractéristiques qui le rendent viable, c'est à dire apte à régénérer une tige pilaire in vitro (voir à ce titre Science des traitements capillaires , Charles Zviak, Masson éditeur, 1987 dans lequel il est possible de trouver la description de ces caractéristiques). Ainsi, il est impératif que ce follicule ait conservé entre autres, son bulbe et sa papille dermique. Ceci ne s'obtient que par une dissection minutieuse qui alourdit la mise en oeuvre du procédé. On comprend aisément que le rendement d'une telle dissection, en terme de follicules pileux viables utilisables, est extrêmement faible. La demanderesse a donc cherché un nouveau procédé pour tester une substance éventuellement active dans le domaine capillaire qui conserve l'efficacité des méthodes connues tout en facilitant la mise en oeuvre du procédé. La demanderesse a découvert qu'il est possible d'utiliser, pour tester une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, un fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée. Cette découverte est à la base de la présente invention. Un des nombreux avantages qui en découle est que désormais il n'est plus nécessaire de disséquer avec grande précaution le follicule pileux, puisque dans le test selon l'invention, le follicule pileux peut ne pas être viable au sens indiqué ci-dessus, à savoir être apte à régénérer une tige pilaire in vitro. Cela facilite grandement la tâche de la personne chargée de préparer les éléments nécessaires à la réalisation du test et augmente d'une manière non négligeable la rentabilité, en terme de follicules utilisables, d'un prélèvement de peau contenant des follicules. L'invention a donc pour objet un procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées: - (i) on isole un fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée, - (ii) on incube ce fragment dans un milieu de culture adéquat, - (iii) on met en contact ce fragment avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire pendant un temps suffisant, - (iv) on dose un marqueur de l'activité de ladite substance testée et on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. Par la suite dans le texte le terme fragment doit être compris comme "fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée". Le fragment de follicule pileux utilisable selon l'invention peut provenir d'un follicule pileux isolé selon l'une quelconque des méthodes de dissection connues par l'homme du métier. La dissection peut être pratiquée selon les méthodes classiques connues comme par exemple celle décrite dans "Cultivation of Murine Hair Follicules as Organoïdes in a Collagen Matrix", (Journal of Investigative Dermatology, 89, n"4, (1987), 369-379), méthode par laquelle le follicule est isolé par digestion du derme par de la collagénase, ou comme celle décrite dans le brevet EP 434 319 (cité ci-dessus) ou encore celle décrite dans la publication de Williams et Stenn (également citée cidessus) ou enfin celle décrite par la demanderesse dans la demande de brevet déposée en France sous le numéro 9508465 qui consiste à dégager, sur un prélèvement de peau intact, la papille et le bulbe des follicules pileux de leur environnement dermique tout en lui préservant son environnement épidermique. Ces trois dernières méthodes ne font intervenir que des moyens mécaniques. Préférentiellement, selon l'invention, on utilise la méthode décrite par la demanderesse dans la demande de brevet déposée en France sous le numéro 95-08465. Selon l'invention le follicule pileux peut ne pas être viable. Il n'est pas nécessaire pour la bonne réalisation du procédé que le fragment utilisé présente les caractéristiques de viabilité qui sont essentielles dans la mise en oeuvre des procédés connus de l'art antérieur. II n'est donc pas nécessaire qu'il comporte toutes les parties reconnues par l'homme du métier comme le constituant ( Science des traitements capillaires., Charles Zviak, Masson éditeur, 1987). II en découle que toute autre méthode de dissection connue et n'aboutissant pas forcement à l'isolement d'un follicule pileux viable peut être utilisé pour préparer le follicule pileux. Ainsi, le fragment de follicule pileux utilisable selon l'invention peut être dépourvu de bulbe. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le fragment de follicule pileux utilisé est dépourvu de bulbe. Chez l'être humain, la croissance des cheveux et leur renouvellement sont principalement déterminés par l'activité des follicules pileux. Leur activité est cyclique et comporte essentiellement trois phases, à savoir la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. A la phase anagène active ou phase de croissance, qui dure plusieurs années et au cours de laquelle les cheveux s'allongent, succède une phase catagêne très courte et transitoire, puis une phase de repos1 appelée phase télogène, qui dure quelques mois. A la fin de la période de repos, les cheveux tombent et un autre cycle recommence. La chevelure se renouvelle donc en permanence, et sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, à chaque instant, 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois. II est clair que le test objet de la présente invention peut être réalisé avec un fragment issu de n'importe quel follicule pileux, quelque soit la phase du cycle pilaire dans laquelle celui se trouve au moment du prélèvement. Préférentiellement, le fragment utilisé dans le procédé de l'invention est un fragment provenant d'un follicule pileux en phase anagène. Ainsi, le fragment utilisé selon l'invention se caractérise par la présence de l'un au moins des caractères morphologiques particuliers suivants: i) épaississement de la membrane basale en une couche réfringente éosinophile, dite hyaline, située à l'interface entre la gaine externe du follicule pileux et la gaine conjonctive; ii) programme de différenciation spécifique des kératinocytes de la gaine exteme, différent de celui des kératinocytes de la partie supérieure du follicule pileux ou de ceux de l'épiderme; iii) absence dans la gaine externe d'antigène reconnu par un anticorps antidesmogléine; iv) présence dans la gaine externe d'une distribution baso-latérale des intégrines a2ss1 et a3ss1 au niveau de la couche des kératinocytes basaux; v) présence du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF) à la surface des kératinocytes basaux et des kératinocytes supra-basaux de la gaine externe. Préférentiellement le fragment utilisé selon l'invention se caractérise par la présence de tous les caractères morphologiques particuliers ci-dessus décrits. Après isolement, le fragment est placé dans un milieu de culture adéquat. Ce milieu qui est un milieu nutritif est au moins constitué des éléments nécessaires au maintien en survie du fragment. Bien entendu, il peut contenir tout autre élément nécessaire par exemple à la croissance du follicule pileux comme de l'insuline, de la glutamine ou encore de l'hydrocortisone. On peut citer à titre d'exemple comme milieu de culture bien connu de l'homme du métier, le milieu MEM modifié Dulbecco, le milieu Williams E, le milieu F12, le milieu de HAM, ou encore le RPMlI640, vendus par les sociétés Gibco-BRL, Biomed, Boehringer ou encore Sigma. Préférentiellement, on utilise le milieu Williams E. De manière générale, le temps de mise en contact du fragment de follicule pileux avec la substance éventuellement active dans le domaine capillaire à tester est conditionné par le temps qu'il faut au fragment pour répondre à ladite substance, c'est à dire au temps qu'il faut pour voir apparaître une modification du niveau d'expression du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on dose. Ce temps d'incubation peut aller de quelques secondes à plusieurs jours. A titre indicatif, le temps d'incubation est généralement compris entre 10 secondes et 120 heures, et de préférence entre 1 et 72 heures. Par marqueur de l'activité de la substance éventuellement active dans le domaine capillaire testée, on entend selon l'invention, tout élément dont la présence, I'absence, la modification de l'expression ou la modification de la distribution peuvent être mesurées, en réponse à la mise en contact du fragment de follicule pileux avec ladite substance à tester. On peut citer à titre d'exemple de marqueur, et sans limitation, les acides nucléiques (acide ribonucléique ou désoxyribonucléïque), les protéines ou groupe de protéines liées ou non, les ions, les organites cellulaires, les lipides ou les polyosides. L'activité de la substance à tester est ainsi représentée par la variation du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on aura choisi de doser. Par variation, on entend toute modification de la quantité, de la concentration, de la répartition du marqueur que l'on dose. Pour cela, le procédé selon l'invention comprend une étape de dosage du marqueur de l'activité de la substance testée. Après incubation, ce dosage peut s'effectuer directement sur le milieu de culture pour les éléments excrétés par le fragment ou dans le fragment de follicule pileux pour les éléments non excrétés. Ainsi, et plus particulièrement dans le cas où l'élément recherché n'est pas excrété, on peut envisager une étape supplémentaire avant le dosage, au cours de laquelle le fragment de follicule pileux est broyé, afin de rendre plus accessible le marqueur de l'activité de la substance testée à doser. Bien évidemment, quel que soit le mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, toute méthode de dosage connue par l'homme du métier peut être utilisée. On peut, à titre d'exemple et sans limitation, citer les méthodes de dosage des protéines ou des acides nucléiques par colorimétrie, par électrophorèse, par transcriptase reverse et amplification par la technique des polymérisations en chaîne, la spectrographie de masse, la chromatographie (en phase gazeuse ou sur plaque), méthodes immunologiques, ou encore la microscopie optique ou électronique pour la mesure de la quantité d'un organite. Le résultat du dosage, qui représente la variation du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on a choisi de doser, n'est en soi pas exploitable directement. II ne devient intéressant que dans la mesure où il est comparé au résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute mise en contact du follicule pileux avec la substance à tester. C'est ainsi que le procédé selon l'invention inclut une étape au cours de laquelle on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. L'homme du métier détermine aisément, par habitude, la nature du témoin nécessaire dans la mise en oeuvre du procédé. La demanderesse a également découvert que le fragment préférentiellement utilisé dans l'invention, c'est à dire le fragment de follicule pileux en phase anagène qui présente l'ensemble des caractères morphologiques décrits par ailleurs dans le texte, présente une particularité biologique tout à fait particulière. Incubé dans un milieu de culture adéquat pendant un temps suffisant ce fragment ne secrète parmi les collagènase, que de la collagènase de type IV de 72 kilodaltons (encore connue sous le nom de gélatinase A ou MPP 2). Mais, lorsque ce fragment est incubé en présence d'un facteur de croissance comme par exemple le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance tumorale de type a (TGFa), la synthèse de la collagènase de type IV de 92 kilodaltons (encore connue sous le nom de gélatinase B ou MPP 9) est induite. Cette synthèse est inhibée lorsque le milieu de culture contient en outre du 2,4-diamino 6-piperidinopyrimidine 3-oxyde ou "Minoxidil" décrit dans US 4 596812. Ce composé est bien connu de l'homme du métier pour ses effets sur la pousse etlou la repousse du cheveux. La demanderesse propose donc d'utiliser cette propriété du fragment pour évaluer l'activité d'une substance dans le domaine capillaire. Ainsi, selon un mode particulier de l'invention, le procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire est caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées: -(i) on isole un fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée, -(ii) on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) ou de facteur de croissance tumorale de type a (TGFa) pendant un temps (T1) suffisant, - (iii) on met en contact pendant un temps suffisant ce follicule pileux avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, - (iv) on dose la collagènase de type IV de 92 kilodaltons et on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. Le facteur de croissance est utilisé selon l'invention à une concentration comprise entre 0,001 ng/ml et 100 ng/ml et de préférence entre 0,1 ng/ml et 10 nglml. Préférentiellement, le facteur de croissance utilisé est le facteur de croissance épidermique (EGF). Le milieu de culture adéquat utilisé selon l'invention est identique à celui décrit par ailleurs dans le texte. Selon l'invention, le temps d'incubation (T1) du follicule pileux et du facteur de croissance épidermique (EGF) ou du facteur de croissance tumorale de type cx (TGFa) est compris entre 5 secondes et 45 jours et préférentiellement entre 1 heure et 72 heures. Sans reprendre l'énumération faite par ailleurs, il est évident que toute méthode de dosage connue par l'homme du métier peut être utilisée pour évaluer le niveau d'expression de la collagènase de type IV de 92 kilodaltons. On citera à titre d'exemple le dosage protéique par toute méthode connue ou encore le dosage de la quantité d'acide ribonucléique messager de la collagènase de type IV de 92 kilodaltons. Le témoin par rapport auquel, selon l'invention, on évalue les résultats du dosage est bien évidement le niveau d'expression de la collagènase de type IV de 92 kilodaltons dans les mêmes conditions expérimentales, mais en l'absence de toute mise en contact du follicule pileux avec la substance à tester. Dans le domaine capillaire, les substances éventuellement actives que l'on cherche à tester sont généralement en relation avec une modification de l'état de la chevelure du sujet et préférentiellement l'état présent ou futur de celleHci. Généralement, les substances à tester ont éventuellement une action soit sur la densité des follicules pileux, sur la quantité ou sur la qualité de ceux-ci. Ce sont des substances qui ont éventuellement une influence par exemple sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. Ainsi, la présente invention permet de tester des substances éventuellement actives dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, l'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. Si l'on s'en tient au ralentissement, à l'arrêt de la croissance ou à la chute des follicules pileux, la conséquence à terme pour le sujet est une alopécie plus ou moins prononcée, dont on sait qu'elle peut avoir des conséquences esthétiques, psychologiques etlou sociales pour le sujet atteint. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de tester des substances ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance ou la chute des follicules pileux. Le procédé selon l'invention permet donc de tester des substances éventuellement actives dans le domaine capillaire dans le traitement d'une alopécie. Le terme alopécie recouvre toute une famille d'atteintes du follicule pileux ayant pour conséquence, quelqu'en soit la raison, la perte définitive, partielle ou générale des cheveux. On peut citer par exemple l'alopécie androgénétique, I'alopecia areata (la pelade), ou I'alopecia totalis, ou encore l'alopecia universalis. L'invention concerne également l'utilisation d'un fragment tel que défini ci-dessus dans un procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire. Particulièrement, I'invention concerne l'utilisation d'un fragment tel que défini cidessus dans un procédé de test d'une substance éventuellement active sur la croissance du follicule pileux etlou sur la repousse du follicule pileux, plus particulièrement active dans le traitement de l'alopécie. Un des avantages de l'invention est de procurer un procédé simple d'évaluation de l'activité d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, particulièrement sur la croissance du follicule pileux etlou sur la repousse du follicule pileux et plus particulièrement dans le traitement de l'alopécie. La substance ainsi testée pourrait par la suite être utilisée dans la préparation d'une composition cosmétique ou d'un médicament en vue de traiter les désordres capillaire, particulièrement ceux liés à la croissance etlou la repousse du follicule pileux et plus particulièrement en vue de traiter l'alopécie. On va maintenant donner à titre d'illustration des exemples qui ne sauraient limiter en aucune façon la portée de l'invention. Exemple 1: Mesure de l'effet du Minoxidil sur la collapénase 72 kD et sur la collaaénase 92 kD en présence de facteur de croissance épidermique : 150 fragments de follicule pileux dépourvu de papille dermique, situés sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée, ont été préparés selon la méthode décrite par la demanderesse dans la demande de brevet déposée en France sous le numéro 95-08465, à partir de follicules pileux disséqués à partir d'un prélèvement de peau provenant d'un plastie faciale. A partir du prélèvement de peau, une bande assez fine a été isolée à l'aide d'un scalpel. Le tissu adipeux entourant les follicules pileux a été éliminé avec une micropince. Sous un microscope, les fragments de follicules ont alors été coupés à l'aide d'un scalpel. Les fragments sont ensuite incubés dans du milieu William's E additionné de pénicilline et streptomycine à la concentration finale de 50 Ul/ml, de glutamine à de 2 mM, d'lnsuline de boeuf à 0,01 mg/ml, et d'hydrocortisone à 0,04 zg/ml, dans les puits de plaques 24 puits de type Costar, à raison de 1 fragment par puits. Chaque puits contient 1 ml de milieu. 4 séries sont ainsi constituées: A: série témoin: 6 fragments dans milieu William's E. B : 6 fragments dans milieu William's E additionné de facteur de croissance épidermique (EGF) à la concentration finale de 10 ng/ml. C : 6 fragments dans milieu William's E additionné de Minoxidil à la concentration finale de 1 mM. D : 6 fragments dans milieu William's E additionné de facteur de croissance épidermique (EGF) à la concentration finale de 10 ng/ml et de Minoxidil à la concentration finale de 1 mM. Les 4 séries sont incubées à 37 "C. Chaque jour 0,5 ml de milieu est prélevé et analysé pour son activité collagénolytique par la technique de zymographie (Huessen C. et Dowdle E.B., Analytical Biochemistry (1980), 102, 196-202). Les protéines recueillies dans le milieu sont séparées selon leur poids moléculaire par la technique classique d'éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant contenant de dodécylsulfate de sodium (SDS) (technique PAGE-SDS). Le gel de séparation est un gel à 10 % d'acrylamide contenant de la gélatine à la concentration de 0,5 mg/ml. Le gel de concentration est un gel à 4 % d'acrylamide. Préalablement au dépôt, les protéines contenues dans chaque échantillon à analyser sont dosées à l'aide d'un kit Biorad DC protein, selon les spécifications du fabriquant. Pour chaque échantillon à tester, 10 g de protéines sont déposés sur le gel d'éléctrophorèse. L'électrophorèse est pratiquée à la température de 4"C, durant une nuit à ampérage constant de 10 mA, dans un système Lagon de la société Bioblock. Après arrêt de l'électrophorèse et démoulage, les gels sont lavés dans de l'eau distillée contenant 2,5 % de Triton x 100. 2 lavages de 30 minutes sont effectués afin d'éliminer totalement le SDS et de restaurer l'activité enzymatique. Les gels sont ensuite placés dans un incubateur à 37"C pendant 24 heures dans une solution contenant du TRIS HCI 5 mM pH 7,5, du SDS à 4 %, du chlorure de calcium à 5 mM et du Brij 35 à 0,02 %. Ils sont ensuite colorés au bleu de coomassie pendant un 1/2 heure puis décolorés pendant une heure. La présence de protéines actives est révélée par l'apparition de bandes claires sur fond bleu qui correspondent à la digestion par les collagénases de la gélatine contenue dans le gel. Résultats: +: marque l'apparition d'une bande de collagènase de type IV de 72 kilodaltons ou de collagènase de type IV de 92 kilodaltons. -: indique l'absence de telle bande. collagènase de type IV de 72 collagènase de type IV de 92 kilodaltons kilodaltons A + B + + C + D + La synthèse de la collagènase de type IV de 92 kilodaltons est induite dans le fragment de follicule pileux incubé en présence d'EGF. Cette synthèse est inhibée par le Minoxidil. REVENDICATIONS 1. Procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées: -(i) on isole un fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée, - (ii) on incube ce fragment dans un milieu de culture adéquat, - (iii) on met en contact ce fragment avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire pendant un temps suffisant, - (iv) on dose un marqueur de l'activité de ladite substance testée et on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le follicule pileux est préparé par dissection. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le follicule pileux n'est pas viable. 4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le follicule pileux est dépourvu de bulbe. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le fragment présente l'un au moins des caractères morphologiques et de préférence tous les caractères morphologiques suivants: i) épaississement de la membrane basale en une couche réfringente éosinophile, dite hyaline, située à l'interface entre la gaine la gaine externe du follicule pileux et la gaine conjonctive; ii) programme de différenciation spécifique des kératinocytes de la gaine exteme, différent de celui des kératinocytes de la partie supérieure du follicule pileux ou de ceux de l'épiderme; iii) absence dans la gaine exteme d'antigène reconnu par un anticorps antidesmogléine; iv) présence dans la gaine exteme d'une distribution baso-latérale des intégrines a2ss1 et jazz au niveau de la couches des kératinocytes basaux; v) présence du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF) à la surface des kératinocytes basaux et des kératinocytes supra-basaux de la gaine externe 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le follicule pileux est un follicule pileux en phase anagéne. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le milieu de culture comprend au moins un élément nécessaire au maintien en survie du fragment. 8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le milieu nutritif est choisi parmi le milieu MEM modifié Dulbecco, le milieu Williams E, le milieu F12, le milieu de HAM, ou encore le RPM11640. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le milieu nutritif est du milieu Williams E. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 10 secondes et 120 heures. 11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 1 et 72 heures. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le marqueur de l'activité de ladite substance testée est un acide nucléique, une protéine ou un groupe de protéines liées ou non, un ion, un organite cellulaire, un lipide, ou un polyoside. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur de l'activité de ladite substance testée directement dans le milieu de culture. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur de l'activité de ladite substance testée dans le fragment. 15. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait qu'avant le dosage du marqueur de l'activité de ladite substance testée, on procède au broyage du fragment. 16. Procédé selon lune quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées: - (i) on isole un fragment d'au moins un follicule pileux dépourvu de papille dermique, situé sous l'abouchement de la glande sébacée et excluant la partie de la tige pilaire située au dessus de l'abouchement de la glande sébacée, -(ii) on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) ou de facteur de croissance tumorale de type a (TGFa) pendant un temps (T1) suffisant, - (iii) on met en contact pendant un temps suffisant ce follicule pileux avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, - (iv) on dose la collagènase de type IV de 92 kilodaltons et on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. 17. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le facteur de croissance est utilisé à une concentration comprise entre 0,001 ng(ml et 100 nglml et de préférence entre 0,1 nglml et 10 ng/ml. 18. Procédé selon lune quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisé par le fait que le facteur de croissance est le facteur de croissance épidermique (EGF). 19. Procédé selon lune quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé par le fait que le temps d'incubation (Tî) du follicule pileux et du facteur de croissance épidermique (EGF) ou du facteur de croissance tumorale de type a (TGFa) est compris entre 5 secondes et 45 jours et préférentiellement entre 1 heure et 72 heures. 20. Procédé selon lune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance éventuellement active dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, I'arret de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, l'arrêt de la croissance, la chute des follicules pileux. 22. Procédé selon lune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence dans le traitement de l'alopécie.