Brevet FR2742767A1 — publié le 19970627

L'invention concerne généralement des polypeptides impliqués dans la régulation du métabolisme osseux. Plus particulière- ment, l'invention concerne un nouveau polypeptide, dénommé ostéoprotégérine, qui est un membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale. Le polypeptide est utilisé pour traiter des maladies osseuses caractérisées par une perte osseuse accrue, telles que l'ostéoporose. Les cytokines et les facteurs de croissance de polypeptides sont des facteurs sécrétés qui signalent une large variété de changements dans le métabolisme, la différenciation et la croissance cellulaire, en se liant, de façon spécifique, & des récepteurs discrets, liés en surface. Comme classe de protéines, les récepteurs varient en ce qui concerne leur structure et le mode de transduction des signaux. Ils sont caractérisés comme ayant un domaine extra-cellulaire qui est impliqué dans la liaison des ligands, et un domaine cyto- plasmique qui transmet un signal intracellulaire approprié. Les formes d'expression des récepteurs déterminent, de façon ultime, quelles cellules répondront à un ligand donné, tandis que la structure d'un récepteur donné dicte la réponse cellulaire induite par la liaison des ligands. Les récepteurs se sont révélés comme transmettant des signaux intracellulaires via leurs domaines cytoplasmiques en activant la phosphorylation de la sérine/thréonine de protéines ou de la tyrosine de protéines [par exemple le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) ou le récepteur-I du facteur-B de croissance de transformation (TGFBR-I)], en stimulant l'activation de la protéine G (par exemple le récepteur B- adrénergique), et en modulant des associations avec des protéines de transduction de signaux cytoplasmiques (par exemple TNFR-1 et Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)). La superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumo- rale (TNFR) est un groupe de protéines transmembranes du type I qui partagent un motif riche en cystéine conservé qui est répété trois à six fois dans le domaine extra-cellulaire (Smith, et al. Cell 76, 953- 962 (1994)). De façon collec- tive, ces unités de répétition forment les domaines de liaison des ligands de ces récepteurs (Chen et al., Chemis- try 270, 2874-2878 (1995)). Les ligands pour ces récepteurs sont un groupe structurellement apparenté de protéines homologues à TNFa. (Goeddel et al. Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata et al. Science 267, 1449-1456 (1995)). TNFa se lie à des récepteurs distincts, mais étroitement apparentés, TNFR-1 et TNFR-2. TNFa produit une varité de réponses biologiques dans des cellules portant des récepteurs, incluant la prolifération, la différencia- tion et la cytotoxicité et l'apoptose (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-518 (1988)). On pense que TNFa favorise les réponses inflammatoires aiguës et chroniques (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-508 (1988)). L'administration systémique de TNFa induit un choc toxique et une nécrose étendue des tissus. A cause de cela, TNFa peut être responsable de la sévère morbidité et mortalité associées à une variété de maladies infectieu- ses incluant la septicémie. Des mutations dans FasL, le ligand pour le récepteur apparenté à TNFR Fas/APO (Suda et al. Cell 75, 1169-1178 (1993)), sont associées à l'auto- immunité (Fisher et al. Cell 81, 935-946 (1995)), tandis que la surproduction de FasL peut être impliquée dans l'hépatite induite par des drogues. Ainsi, les ligands aux différentes protéines apparentées à TNFR servent souvent de médiateurs aux effets sérieux de nombreux états maladifs, ce qui suggère que des agents qui neutralisent l'activité de ces ligands présenteraient une valeur thérapeutique. Des récep- teurs de TNFR-1 solubles, et des anticorps qui lient TNFa, ont été testés concernant leur capacité à neutraliser TNFa systémique (Loetscher et al. Cancer Cells 3(6), 221-226 (1991)). Une forme existant naturellement d'un ARNm de TNFR-1 sécrété a été récemment clonée, et son produit a été testé pour sa capacité à neutraliser l'activité de TNFa in vitro et in vivo (Kohno et al. PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)). La capacité de cette protéine à neutraliser TNFa suggère que des récepteurs de TNF soluble fonctionnent pour lier et évacuer TNF en bloquant ainsi les effets cytotoxi- ques sur des cellules portant TNFR. Un objet de l'invention est d'identifier de nouveaux membres de la superfamille de TNFR. On pense que de nouveaux membres de la famille peuvent être des protéines transmembranes ou des formes solubles de celles-ci comprenant des domaines extracellulaires et dépourvues de domaines transmembranes et cytoplasmiques. On a identifié un nouveau membre de la superfamille de TNFR qui code une protéine sécrétée qui est étroitement apparentée à TNFR-2. Par analogie à TNFR-1 soluble, la protéine apparentée à TNFR-2 peut réguler de façon négative l'activité de son ligand et, ainsi, être utile dans le traitement de certaines maladies humaines. Un nouveau membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFR) a été identifié à partir d'une banque d'ADNc intestinal de rat foetal. On a obtenu et séquencé un clone d'ADNc de longueur complète. L'expression de 1'ADNc de rat dans une souris transgénique a révélé une augmentation marquée de la densité des os, en particulier des os longs, de l'os pelvien et des vertèbres. Le polypep- tide codé par l'ADNc est dénommé ostéoprotégérine (OPG) et joue un rôle pour favoriser l'accumulation osseuse. L'invention fournit des acides nucléiques codant un polypep- tide présentant au moins une des activités biologiques de OPG. Des acides nucléiques qui s'hybrident à des acides nucléiques codant des OPG de souris, de rat ou humaine, -w; 2742767 comme montré sur les figures 2B-2C (séquence nO 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124), sont également fournis. De préférence, OPG est une OPG de mammifère et, plus préférablement, une OPG humaine. Des vecteurs recombinants et des cellules hôtes exprimant OPG sont également pris en compte, comme le sont des procédés pour produire OPG recombinante. Des anticorps ou des fragments de ceux-ci qui se lient spécifiquement au polypeptide sont également révélés. Des procédés pour traiter des maladies osseuses sont également prévus par l'invention. Les polypeptides sont utiles pour éviter la résorption osseuse et peuvent être utilisés pour traiter toute condition ayant pour conséquence une perte osseuse, telle que - l'ostéoporose, l'hypercalcémie, la maladie osseuse de Paget et la perte osseuse due à l'arthrite rhumatoïde ou à l'ostéomyélite, et analogues. Les maladies osseuses peuvent être également traitées par une thérapie génique ou antisens en utilisant des acides nucléiques de l'invention. Des compositions pharmaceutiques comprenant des polypeptides et des acides nucléiques de OPG sont également incluses, ainsi qu'un multimère d'ostéoprotégérine essentiellement dépourvu de monomères d'ostéoprotégérine et de multimères inactifs. Les figures du dessin annexé feront bien comprendre comment l'invention peut être réalisée. Figure 1. A. Analyse FASTA du nouvel EST LORF. Il est montré la séquence d'acides aminés FRI-1 déduite, alignée à la séquence TNFR-2 humaine. B. L'analyse de profil du nouvel EST LORF montré est la séquence d'acides aminés FRI-1 déduite, alignée au profil TNFR. C. Vue structurelle de la superfamille TNFR indiquant la région qui est homologue au nouveau FRI-1. Figure 2. Structure et séquence du gène de OPG de rat de longueur complète, un nouveau membre de la superfamille de TNFR. A. Carte de l'insert pMOB-Bl.1. Le cadre indique la position de LORF à l'intérieur de la séquence d'ADNc (trait gras). Le cadre noir indique le peptide de signal, et les ellipses grises indiquent la position de séquences de répétition riches en cystéine. B, C. Séquence de protéine et d'acides nucléiques de l'ADNc de OPG de rat. Le peptide de signal prédit est souligné, et les sites potentiels de glycosylation N-liée sont indiqués en lettres soulignées grasses. D, E. Comparaison de séquences assemblées (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) de OPG avec d'autres membres de la superfamille de TNFR, fas (séquence n 128); tnfr 1 (séquence n 129); sfu-t2 (séquence n 130); tnfr2 (séquence n 131); ca 40 (séquence n 132); ostéo (sé- quence n 133); ngfr (séquence n 134); ox40 (séquence n 135); 4lbb (séquence n 136). Figure 3. Analyse PepPlot (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) de la séquence de protéine de OPG de rat prédite. A. Représentation schématique de OPG de rat montrant les acides aminés hydrophobes (en haut) et hydrophiles (en bas). Egalement montrés sont les acides aminés basiques (en haut) et acides (en bas). B. Affichage des résidus d'acides aminés qui forment des nappes bêta (en haut) et qui cassent des nappes bêta (en bas), comme défini par Chou et Fasman (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)). C. Affichage de mesures de propen- sion pour l'hélice alpha et la nappe bêta (Chou et Fasman, ibid). Les courbes au-dessus de 1,00 montrent la propension pour la structure d'hélice-alpha ou de nappe-bêta. La structure peut se terminer dans des régions de la protéine o les courbes chutent au-dessous de 1,00. D. Affichage de résidus qui forment alpha (en haut) ou cassent alpha (en bas). E. Affichage de parties de la séquence de protéine qui ressemblent à des séquences trouvées de façon typique à l'extrémité aminée de structures alpha et bêta (Chou et Fasman, ibid). F. Affichage de parties de la séquence de protéine qui ressemblent à des séquences trouvées de façon typique à l'extrémité carboxylée de structures alpha et bêta (Chou et Fasman, ibid). G. Affichage de parties de la séquence de protéine trouvées de façon typique dans des spires (Chou et Fasman, ibid). H. Affichage du moment hydrophobe hélicoïdal (Eisenberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984)) à chaque position dans la séquence. I. Affichage de l'hydropathie moyenne basée sur Kyte et Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) et Goldman et al. (revu dans Ann. Rev. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)). Figure 4. Formes d'expression d'ARNm pour l'ADNc de OPG dans des tissus humains. Des transferts d'ARN ont été sondés par un insert d'ADNc de rat marqué par 32P (A, les deux panneaux gauches) ou par l'insert d'ADNc humain (B, panneau droit). Figure 5. Création de souris transgéniques exprimant l'ADNc de OPG dans des hépatocytes. Expression de transfert d'ARN du transgène HE-OPG dans du foie de souris. Figure 6. Augmentation de la densité osseuse chez des souris transgéniques OPG. Panneaux A-F. Souris témoins. G-J, souris exprimant OPG. A la dissection, tous les animaux ont été radiographiés et des photographies ont été préparées. En A-F, les radiographies des animaux témoins et celle du non-expresseur transgénique (#28) sont montrées. On notera que les os ont un cortex clairement défini et une cavité de moelle centrale transparente. Au contraire, les animaux OPG (G-J) présentent un cortex faiblement défini et une densité accrue dans la zone de moelle. Figure 7. Augmentation de l'os trabéculaire chez des souris transgéniques OPG. A-D. Photomicrographies représentatives d'os à partir d'animaux témoins. En A et B, sont montrées des images à faible puissance (4X, 10X) des fémurs (colora- tion Masson Trichrome). Des colorations pour du phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP) démontrent des ostéoclas- tes (voir les flèches) résorbant à la fois le cartilage (C) et l'os trabéculaire (D). On notera l'apparence aplatie des ostéoclastes sur l'os trabéculaire. E-H. Photomicrographies représentatives d'os à partir d'animaux exprimant OPG. En E et F, des images à faible puissance (4X, 10X) des fémurs sont montrées (coloration Masson Trichrome). La région claire est le cartilage de plaque de croissance, la zone colorée en bleu est l'os et la zone rouge est la moelle. On notera que, par rapport aux témoins, l'os trabéculaire n'a pas été résorbé avec pour conséquence l'absence de la cavité de moelle usuelle. Egalement, les trabécules résultantes présentent une apparence bigarrée avec des zones bleues et claires. Les zones claires sont des restants du cartilage de plaque de croissance qui n'ont jamais été remodelés. En se basant sur des colorations TRAP, ces animaux présentent effectivement des ostéoclastes (voir les flèches) sur la plaque de croissance (G), qui peuvent être en un nombre réduit. Cependant, les surfaces des trabécules au loin de la plaque de croissance sont virtuellement dépourvues d'ostéo- clastes (H), une découverte qui est en contradiction directe avec les animaux témoins (voir D). Figure 8. Les expresseurs HE-OPG n'ont pas de défaut dans le développement des monocytes-macrophages. Une cause pour l'ostéopétrose chez des souris est le manque de production de M-CSF du fait d'une mutation ponctuelle dans le gène de M-CSF. Cela a pour conséquence un déficit marqué des macro- phages circulants et basés sur des tissus. Le sang périphé- rique des expresseurs OPG contenait des monocytes comme déterminé par analyse H1E. Pour affirmer la présence de macrophages tissulaires, une immunohistochimie a été réali- sée en utilisant des anticorps F480, qui reconnaissent un antigène de surface cellulaire sur des macrophages de murinés. A et C montrent des photomicrographies à faible puissance (4X) des rates à partir de surexpresseurs normaux et CR1. On notera que les deux animaux présentent de nom- breuses cellules positives F480. Des monocytes-macrophages étaient également présents dans la moelle des surexpresseurs normal (B) et HE-OPG (D) (40X). Figure 9. Structure et séquence de clones d'ADNc de OPG humaine et de souris. A, B. Séquence de protéine et d'ADNc de souris. C, D. Séquence de protéine et d'ADNc humain. Les peptides de signal prédits sont soulignés, et des sites potentiels de glycosylation N-liée sont indiqués en gras. E, F. Alignement des séquences et comparaison des séquences d'acides aminés de OPG de rat, de souris et humaine. Figure 10. Comparaison de séquences conservées dans le domaine extracellulaire de TNFR-1 et de OPG humaine. PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, version 8.1) de l'aligne- ment de TNFR1 et de OPG décrit dans l'exemple 6. Ligne supérieure, séquences humaines de TNFR1 codant les domaines 1-4. Ligne inférieure, séquences de OPG humaine codant les domaines 1-4. Les résidus conservés sont soulignés par des cadres rectangulaires. Figure 11. Représentation tridimensionnelle de OPG humaine. Vue de côté de l'affichage Molescript de la structure tridimensionnelle prédite des résidus de OPG humaine 25 à 163, (très large), cocristallisés avec TNFB humain (très fin). Comme référence pour l'orientation, les flèches en gras le long de l'ossature du polypeptide OPG pointent dans la direction N-terminale à C-terminale. Les emplacements des chaînes latérales de résidus de cystéine individuel sont insérés le long de l'ossature du polypeptide pour aider à montrer les domaines séparés riches en cystéine. La molécule TNFB est alignée comme décrit par Banner et al. (1993). Figure 12. Structure de domaines riches en cystéine de OPG. Alignement des séquences d'acides aminés de OPG humaine (ligne supérieure séquence n 136) et de souris (ligne inférieure) montrant la structure prédite des domaines de OPG. Le polypeptide est divisé en deux moitiés: la termi- naison N(A) et la terminaison C(B). La moitié N-terminale est prédite comme contenant quatre domaines riches en cystéine (marqués 1-4). Les liaisons de disulfure intra- chaînes prédites sont indiquées par des traits gras, marqués "SS1", "SS2" ou "SS3". La tyrosine 28 et l'histidine 75 (soulignées) sont prédites pour former une interaction ionique. Les acides aminés prédits pour interagir avec un ligand de OPG sont indiqués par des points gras au-dessus du résidu approprié. Les résidus de cystéine situés dans la moitié C-terminale de OPG sont indiqués par des cadres rectangulaires. Figure 13. Expression et sécrétion de protéines de fusion OPG-Fc de souris de longueur complète et tronquée. A. Carte indiquant les points de fusion au domaine IgGl Fc humain indiqués par des pointes de flèche. B. Coloration à l'argent et gel de SDS- polyacrylamide de milieux conditionnés obtenue à partir de vecteurs d'expression de protéine de fusion de Fl.Fc (OPG de longueur complète fusionnée à Fc au niveau de la leucine 401) et CT.Fc (OPG tronquéee à la terminaison carboxy fusionnée à Fc au niveau de la thréonine 180). Bande 1, lignée cellulaire du vecteur d'expression pCEP4 parent; bande 2, lignée cellulaire du vecteur Fl.Fc; bande 3, lignée cellulaire du vecteur CT.Fc. C. Transfert de protéine de milieux conditionnés obtenus à partir de vecteurs d'ex- pression de protéines de fusion Fl.Fc et CT.Fc sondés par le domaine IgGl Fc anti-humain (Pierce). Bande 1, lignée cellulaire du vecteur d'expression pCEP4 parent; bande 2, lignée cellulaire du vecteur F1.Fc; bande 3, lignée cellu- laire du vecteur CT.Fc. Figure 14. Expression de OPG humaine dans E. coli. A. Construction d'un vecteur d'expression bactérien. Le LORF du gène de OPG humaine a été amplifié par PCR, puis joint à un fragment de lieur d'oligonucléotide (le brin supérieur est la séquence n 137; le brin inférieur est la séquence n 127, et ligaturé dans l'ADN du vecteur pAMG21. Le vecteur résultant est capable d'exprimer les résidus de OPG 32-401 liés à un résidu de méthionine N-terminal. B. Analyse SDS-PAGE de bactéries induites et non-induites abritant le plasmide OPG-32-401 de pAMG21-humain. Bande 1, poids molé- culaires standards; bande 2, bactéries non induites; bande 3, induction à 30 C; bande 4, induction à 37 C; bande 5, lysat cellulaire entier à partir d'une induction à 37 C; bande 6, fraction soluble du lystat cellulaire entier; bande 7, fraction insoluble du lysat cellulaire entier; bande 8, corps d'inclusion purifiés obtenus à partir du lystat cellulaire entier. Figure 15. Analyse de OPG de muriné recombinante produite dans des cellules CHO par SDS-PAGE et transfert de protéine. Une quantité égale de milieux conditionnés de CHO a été appliquée à chaque bande montrée, et a été préparée par traitement avec soit un tampon échantillon réducteur (bande gauche), soit un tampon échantillon non-réducteur (bande droite). Apres électrophorèse, les protéines résolues ont été transférées à une membrane en Nylon, puis sondées avec des anticorps anti-OPG. Les positions relatives des formes monomère de 55 kd et dimère de 100 kd de OPG sont indiquées par des pointes de flèche. Figure 16. Analyse de OPG de muriné recombinante produite dans des cellules CHO. Des cellules CHO ont été marquées par impulsions avec 35S-méthionine/cystéine, puis chassées pendant le temps indiqué. Des cultures marquées de façon métabolique ont été séparées dans à la fois les cellules et les milieux conditionnés, et des extraits détergents ont été préparés à partir de chacune, clarifiés, puis immunoprécipi- tés avec des anticorps anti-OPG. Les immunoprécipités ont été alors résolus par SDS-PAGE, et exposés à un film. Panneaux supérieurs gauche et droit; échantillons analysés dans des conditions non réductrices. Panneaux inférieurs gauche et droit; échantillons analysés dans des conditions réductrices. Panneaux gauches supérieur et inférieur; extraits cellulaires. Panneaux droits supérieur et infé- rieur; extraits de milieux conditionnés. Les mobilités relatives des formes monomère de 55 kd et dimère de 100 kd de OPG sont indiquées par des pointes de flèche. Figure 17. Expression de OPG dans la lignée cellulaire CTLL-2. Un milieu conditionné dépourvu de sérum à partir des cellules CTLL-2 et des cellules transfectées CHO-mu OPG [1-401] a été préparé, concentré puis analysé par SDS-PAGE non réducteur et transfert de protéine. Bande gauche; milieu conditionné CTLL-2. Bande droite; milieu conditionné CHO-muOPG. Les mobilités relatives des formes monomère de 55 kd et dimère de 100 kd de OPG sont indiquées par des pointes de flèche. Figure 18. Détection de l'expression de OPG dans des échan- tillons de sérum et des extraits de foie obtenus à partir de souris témoins et transgéniques OPG. Les souris transgéni- ques ont été construites comme décrit dans l'exemple 4. L'expression de OPG a été visualisée après SDS-PAGE suivi par transfert de protéine utilisant des anticorps anti-OPG. Figure 19. Effets de la protéine de fusion huOPG [22-401]-Fc sur la formation d'ostéoclastes in vitro. Le test de forma- tion d'ostéoclastes a été réalisé comme décrit dans l'exem- ple 11A en absence (témoin) ou en présence des quantités indiquées de fusion huOPG [22-401]-Fc. La formation d'ostéo- clastes a été visualisée par coloration histochimique pour le phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP). A. OPG ajoutée à 100 ng/ml. D. OPG ajoutée à 0,1 ng/ml. E. OPG ajoutée à 0,01 ng/ml. F. OPG ajoutée à 0,001 ng/ml. G. Témoin. Pas de OPG ajoutée. Figure 20. Diminution de l'activité TRAP de la culture d'ostéoclastes avec des quantités croissantes de OPG. Des concentrations indiquées de la protéine de fusion huOPG [22-401]-Fc ont été ajoutées au test de formation des ostéoclastes et à l'activité TRAP quantifiée comme décrit dans l'exemple 11A. Figure 21. Effet de OPG sur une étape terminale de la différenciation des ostéoclastes. La fusion huOPG [22- 401]-Fc a été ajoutée au test de formation des ostéoclastes pendant l'étape intermédiaire de la maturation des ostéo- clastes (jours 5-6; OPG-CTL) ou pendant l'étape terminale de la maturation des ostéoclastes (jours 7-15; CTL-OPG). L'activité TRAP a été quantifiée et comparée à l'activité observée en absence de OPG (CTL-CTL) en présence de OPG tout le temps (OPG-OPG). Figure 22. Effets de IL-1B, IL-la et OPG sur du calcium ionisé du sang chez des souris. Les taux de calcium ionisé du sang ont été contrôlés après injection de IL-1B seul, IL-la seul, IL-1B plus muOPG [22-401]-Fc, IL-la plus muOPG [22-401]-Fc et muOPG [22-401]-Fc seul. Des souris témoins ont reçu des injections de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) seulement. L'expérience IL-1B est montrée en A; l'expérience IL-la est montrée en B. Figure 23. Effets de OPG sur des ostétoclastes chez des souris témoins et des souris traitées par ILl. Des méthodes histologiques pour analyser des échantillons osseux du sinciput de souris sont décrites dans l'exemple 11B. Des flèches indiquent des ostéoclastes présents chez des souris traitées au jour 2. Des échantillons de sinciput de souris recevant quatre injections de PBS de façon journalière (A), une injection de IL-1 et trois injections de PBS de façon journalière (B), une injection de PBS et trois injections de OPG de façon journalière (C), une injection de IL-1 et trois injections de OPG de façon journalière. Figure 24. Analyse radiographique de l'acculumation osseuse dans la cavité de moelle de souris normales. On a injecté, de façon sous-cutanée, chez des souris une solution saline (A) ou la fusion muOPG [22-401]-Fc (5mg/kg/a) pendant 14 jours (B), et la densité osseuse a été déterminée comme décrit dans l'exemple 11C. Figure 25. Analyse histomorphométrique de l'accumulation osseuse dans la cavité de moelle de souris normales. Expé- riences d'injection et histologie osseuse réalisées comme décrit dans l'exemple 11C. Figure 26. Analyse d'histologie de l'accumulation osseuse dans la cavité de moelle de souris normales. Expériences d'injection et histologie osseuse réalisées comme décrit dans l'exemple 11C. A. Injection de solution saline. B. Injection de fusion muOPG [22-401]-Fc. Figure 27. Activité de OPG administrée à des rats ayant subi une ovariectomie. Dans cette expérience de deux semaines, la tendance à une densité osseuse réduite apparaît être bloquée par OPG et d'autres thérapies anti-résorptives. Des mesures DEXA ont été réalisées au moment de l'ovariectomie et à la semaine 1 et la semaine 2 du traitement. Les résultats sont exprimés comme pourcentage de variation à partir de la densité osseuse initiale (moyenne l'erreur standard moyenne). Figure 28. La densité osseuse dans la métaphyse fémorale, mesurée par des méthodes histomorphométriques, tend à être plus faible chez des rats ayant subi une ovariectomie (OVX) que chez des animaux opérés de façon simulée (SHAM) 17 jours suivant l'ovariectomie. Cet effet a été bloqué par OPG-Fc, avec des rats ayant subi une ovariectomie traités par OPG-Fc (OVX+OPG) ayant une densité osseuse sensiblement plus élevée que des rats ayant subi une ovariectomie traités par un véhicule (OVX). (Moyenne l'erreur standard moyenne). Un nouveau membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFR) a été identifié comme un morceau de séquence exprimée (EST) isolé à partir d'une banque d'ADNc intestinal de rat foetal. Les structures des clones d'ADNc de rat de longueur complète et les clones d'ADNc de souris et humain correspondants ont été détermi- nées comme décrit dans les exemples 1 et 6. Les gènes de rat, de souris et humain sont montrés sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (sé- quence n 124), respectivement. Les trois séquences ont montré une forte similarité aux domaines extracellulaires des membres de la famille TNFR. Aucun des clones d'ADNc de longueur complète isolés ne codait des domaines transmembra- nes et cytoplasmiques qui seraient attendus pour des récep- teurs liés aux membranes, suggérant que ces ADNc codent des protéines sécrétées solubles plutôt que des récepteurs de surface cellulaire. Une partie du gène humain couvrant les nucléotides 1200-1353 montrés sur la figure 9D a été déposée dans la base de données Genebank, le 22 novembre 1995, sous le numéro d'accès 17188769. La distribution tissulaire de l'ARNm de rat et humain a été déterminée comme décrit dans l'exemple 2. Chez le rat, l'expression d'ARNm a été détectée dans les reins, le foie, le placenta et le coeur, avec la plus forte expression dans les reins. L'expression dans les muscles du squelette et le pancréas a été également détectée. Chez les humains, l'ex- pression a été détectée dans les mêmes tissus ainsi que les ganglions lymphatiques, le thymus, la rate et l'appendice. L'ADNc de rat a été exprimé chez des souris transgéniques (exemple 3) en utilisant le système d'expression à promoteur ApoE spécifique au foie. L'analyse des expresseurs a montré une augmentation marquée dans la densité osseuse, en parti- culier dans les os longs (fémur), les vertèbres, les os plats (bassin). L'analyse histologique de sections colorées d'os a montré une sévèreostéopétrose (voir exemple 4) indiquant un déséquilibre marqué entre la formation et la résorption osseuse qui entraîne une accumulation marquée d'os et de cartilage. Une diminution du nombre des ostéoclastes trabé- culaires dans les os d'animaux expresseurs de OPG indique qu'une partie significative de l'activité de la protéine apparentée à TNFR peut être d'éviter la résorption osseuse, un processus favorisé par les ostéoclastes. Au vu de l'acti- vité dans les expresseurs transgéniques, les protéines apparentées à TNFR décrites ici sont dénommées OPG. En utilisant la séquence d'ADNc de rat, des clones d'ADNc de souris et humain ont été isolés (exemple 5). L'expression de OPG de souris dans des cellules 293 et de OPG humaine dans E. Coli est décrite dans les exemples 7 et 8. OPG de souris a été produite comme une fusion de Fc qui avait été purifiée par chromatographie par affinité de protéine A. Egalement décrite dans l'exemple 7, est l'expression de polypeptides de OPG de souris et humaine de longueur complète et tronqués dans des cellules CHO et 293 soit comme polypeptides de fusion à la région Fc de IgGl humaine ou comme polypeptides non-fusionnés. L'expression de OPG de souris et humaine tronquée et de longueur complète dans E. Coli, soit comme polypeptides de fusion de Fc, soit comme polypeptides non fusionnés, est décrite dans l'exemple 8. La purification de OPG bactérienne et de mammifères produite de façon recombi- nante est décrite dans l'exemple 10. L'activité biologique de OPG a été déterminée en utilisant un test de maturation des ostéoclastes in vitro, un modèle in vivo d'hypercalcémie induite par l'interleukine-1 (IL-1) et des études d'injection de densité osseuse chez des souris normales.(voir l'exemple 11). Les protéines recombinantes OPG suivantes produites dans des cellules CHO ou 293 ont démontré une activité dans les tests de maturation des ostéoclastes dans E. Coli: muOPG [22-185]-Fc, muOPG [22- 194]-Fc, muOPG [22-401]Fc, muOPG [22-401], huOPG [22- 201]-Fc, huOPG [22-401]-Fc. muOPG [22-180]-Fc produites dans des cellules CHO et huOPG met[32-401] produites dans E. Coli n'ont pas démontré d'activité dans le test in vitro. OPG à partir de plusieurs sources a été produite comme un dimère ou, dans une certaine mesure, comme un multimère plus élevé. OPG [22-401] de rat produite chez des souris transgé- niques, muOPG [22-401] et huOPG [22-401] produites comme un polypeptide recombinant dans des cellules CHO et OPG expri- mée comme un produit existant naturellement à partir d'une lignée cellulaire cytotoxique T étaient de façon prédomi- nante des dimères et trimères analysés sur des gels SDS non réducteurs (voir exemple 9). Des polypeptides de OPG tron- qués ayant des délétions dans la région des acides aminés 186-401 (par exemple OPG [1-185] et OPG [1-194]) étaient, de façon prédominante, des monomères suggérant que la région 186-401 peut être impliquée dans l'auto-association des polypeptides de OPG. Cependant, huOPG met[32-401] produite dans E. Coli était largement monomère. OPG peut être importante pour réguler la résorption osseuse. La protéine apparaît agir comme un récepteur soluble de la famille TNF et peut empêcher une interaction récepteur- ligand impliquée dans la voie ostéolytique. Un aspect de la régulation apparaît être une réduction du nombre des ostéo- clastes. Acides nucléiques L'invention fournit un acide nucléique isolé codant un polypeptide ayant au moins une des activités biologiques de OPG. Comme décrit ici, les activités biologiques de OPG incluent, tout en y étant pas limitées, toute activité impliquant le métabolisme osseux et, en particulier, in- cluent une augmentation de la densité osseuse. Les acides nucléiques de l'invention sont choisis à partir des sui- vants: a) les séquences d'acides nucléiques comme montré sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n0 122) et 9C-9D (séquence n 124), ou des brins complémentaires de celles-ci; b) les acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions strictes, avec la région de codage du polypeptide sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124); et c) des acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions strictes, avec les nucleotides 148 à 337 inclus comme montré sur la figure 1A; d) les séquences d'acides nucléiques qui sont dégénérées par rapport aux séquences dans (a) et (b). L'invention fournit des acides nucléiques qui codent OPG de rat, de souris et humaine, ainsi que des séquences d'acides nucléiques s'hybridant à ceux-ci qui codent un polypeptide ayant au moins une des activités biologiques de OPG. Il est également fourni des acides nucléiques qui s'hybrident à OPG EST de rat englobant les nucleotides 148-337 comme montré sur la figure 1A. Les conditions pour l'hybridation sont généralement d'une grande rigueur, telles que 5xSSC, du formamide à 50% et 42 C, décrites dans l'exemple 1 de la description. Une rigueur équivalente à ces conditions peut être facilement obtenue en réglant la température et les concentrations du solvant organique et du sel. Les acides nucléiques dans (b) englobent des séquences codant des polypeptides apparentés à OPG qui ne subissent pas une hybridation détectable avec d'autres membres connus de la superfamille des récepteurs TNF. Dans une réalisation préférée, les acides nucléiques sont comme montré sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124). La longueur des acides nucléiques d'hybridation de l'inven- tion peut être variable, puisque l'hybridation peut se produire en partie ou dans toutes les régions codant le polypeptide, comme montré sur les figures 2B-2C (séquence n ), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124), et peut également se produire dans des régions non codantes adjacentes. En conséquence, les acides nucléiques d'hybrida- tion peuvent être des troncatures ou des extensions des séquences montrées sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124). Les acides nucléiques tronqués ou étendus font partie de l'in- vention pourvu qu'ils conservent une ou plusieurs des propriétés biologiques de OPG. Les acides nucléiques d'hy- bridation peuvent également inclure des régions non codantes adjacentes qui sont 5' et/ou 3' par rapport à la région codante de OPG. Les régions non codantes incluent des régions régulatoires impliquées dans l'expression de OPG, telles que des promoteurs, des amplificateurs, des sites d'initiation de traduction, des sites de terminaison de transcription et analogues. Les conditions d'hybridation pour les acides nucléiques sont décrites par Sambrook et al. Molecular Cloninq: A Labora- tory Manual, 2ème éd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). L'ADN codant OPG de rat a été fourni dans le plasmide pMO-Bl.l déposé auprès de la American Type Culture Collec- tion, Rockville, MD le 27 décembre 1995 sous le numéro d'accès ATCC 69970. L'ADN codant OPG de souris a été fourni dans le plasmide pRcCMV- muriné OPG déposée auprès de la American Type Culture Collection, Rockville, MD le 27 décembre 1995 sous le numéro d'accès ATCC 69971. L'ADN codant OPG humaine a été fourni dans le plasmide pRcCMV- humain OPG déposé auprès de la American Type Culture Collec- tion, Rockville, MD le 27 décembre 1995 sous le numéro d'accès ATCC 69969. Les acides nucléiques de l'invention s'hybrideront dans des conditions strictes aux inserts d'ADN des numéros d'accès ATCC 69969, 69970 et 69971 et présentent au moins une des activités biologiques de OPG. L'invention fournit également des dérivés des séquences d'acides nucléiques comme montré sur les figures 2B, 9A et 9B. Comme utilisés ici, les dérivés incluent des séquences d'acides nucléiques ayant une délétion, une insertion, une substitution ou une addition d'un ou plusieurs résidus, de sorte que les séquences résultantes codent des polypeptides ayant un ou plusieurs résidus d'acides aminés qui ont été ajoutés, supprimés, insérés ou substitués, et le polypeptide résultant présente l'activité de OPG. Les dérivés d'acides nucléiques peuvent exister naturellement, tels que par variation d'épissage ou polymorphisme, ou peuvent être construits en utilisant des techniques de mutagenèse dirigée disponibles pour l'homme du métier. Un exemple d'un variant existant naturellement de OPG est un acide nucléique codant une variation de lys à asn au résidu 3 à l'intérieur de la séquence de tête (voir l'exemple 5). On pense que les dérivés d'acides nucléiques coderont des changements d'aci- des aminés dans des régions de la molécule qui sont moins susceptibles d'interrompre l'activité biologique. D'autres dérivés incluent un acide nucléique codant une forme, liée & la membrane, de OPG ayant un domaine extracellulaire comme montré sur les figures 2B-2C (séquence n 120), 9A-9B (séquence n 122) et 9C-9D (séquence n 124), ainsi que des domaines transmembrane et cytoplasmique. Dans une réalisation, des dérivés de OPG incluent des acides nucléiques codant les formes tronquées de OPG ayant un ou plusieurs acides aminés supprimés à partir de la terminaison carboxy. Des acides nucléiques codant OPG peuvent présenter de 1 à 2.6 acides aminés supprimés de la terminaison car- boxy. Eventuellement, une région anticorps Fc peut s'étendre à partir de la nouvelle terminaison carboxy pour fournir un polypeptide de fusion OPG-Fc biologiquement actif (voir l'exemple 11). Dans des réalisations préférées, les acides nucléiques codent OPG ayant la séquence d'acides aminés à partir des résidus 22-185, 22-189, 22-194 ou 22-201 (en utilisant la numérotation sur les figures 9E-F) et, éven- tuellement, codant une région Fc de IgG humaine. Sont également inclus des acides nucléiques codant des formes tronquées de OPG ayant un ou plusieurs acides aminés supprimés à partir de la terminaison aminée. Des formes tronquées incluent celles dépourvues en partie ou en totali- té des 21 acides aminés comprenant la séquence de tête. De plus, l'invention fournit des acides nucléiques codant OPG ayant de 1 à 10 acides aminés supprimés de la terminaison aminée mature (au résidu 22) et, éventuellement, ayant de 1 à 216 acides aminés supprimés à partir de la terminaison carboxy (au résidu 401). Eventuellement, les acides nucléi- ques peuvent coder un résidu de méthionine à la terminaison aminée. Des exemples de tels polypeptides tronqués de OPG *sont décrits dans l'exemple 8. Des exemples des acides nucléiques de l'invention incluent i'ARN, l'ADN synthétique, 1'ADN génomique et l'ADNc. L'ADNc est obtenu à partir de banques préparées à partir d'ARNm isolé de différents tissus exprimant OPG. Chez les êtres humains, les sources de tissu pour OPG incluent les reins, le foie, le placenta et le coeur. L'ADN génomique codant OPG est obtenu à partir de banques génomiques qui sont commer- cialement disponibles à partir d'une variété d'espèces. L'ADN synthétique est obtenu par synthèse chimique de fragments d'oligonucléotide se chevauchant, suivie par l'assemblage des fragments pour reconstituer tout ou partie de la région codante et des séquences de flanquement (voir le brevet US-4 695 623 décrivant la synthèse chimique de gènes d'interféron). L'ARN est obtenu le plus aisément par des vecteurs d'expression procaryote qui dirigent une synthèse à taux élevé d'ARNm, tels que des vecteurs utili- sant des promoteurs T7 et de la polymérase d'ARN. Les séquences d'acides nucléiques de l'invention sont utilisées pour la détection de séquences OPG dans des échantillons biologiques de façon à déterminer quels cellu- les et tissus expriment l'ARNm de OPG. Les séquences peuvent être également utilisées pour cribler l'ADNc et les banques génomiques pour des séquences apparentées à OPG. Un tel criblage est tout à fait dans les capacités d'un spécialiste dans ce domaine utilisant des conditions d'hybridation appropriées pour détecter des séquences homologues. Les acides nucléiques sont également utiles pour moduler l'ex- pression des taux de OPG par thérapie antisens ou thérapie génique. Les acides nucléiques sont également utilisés pour le développement d'animaux transgéniques qui peuvent être utilisés pour la production du polypeptide et pour l'étude de l'activité biologique (voir l'exemple 3). Vecteurs et cellules hôtes Des vecteurs d'expression contenant des séquences d'acides nucléiques codant OPG, des cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs, et des procédés pour la production de OPG sont également fournis par l'invention. On trouve une vue générale de l'expression de protéines recombinantes dans Methods of Enzymology v. 185, Goeddel, D.V. éd. Academic Press (1990). Des cellules hôtes pour la production de OPG incluent des cellules hôtes procaryotes, telles que E. Coli, des cellules hôtes de levure, de plante, d'insecte et de mammifère. Des souches de E. Coli, telles que HB101 ou JM101, sont appro- priées pour l'expression. Des cellules hôtes de mammifère préférées incluent COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, des cellules de rein de bébé hamster (BHK) et d'autres. Les cellules hôtes de mammifère sont préférées quand des modifications après la traduction, telles que la glycosylation et le traitement des polypeptides, sont importantes pour l'activi- té de OPG. L'expression chez des mammifères permet la production de polypeptides sécrétés qui peuvent être récupé- rés à partir du milieu de croissance. Les vecteurs pour l'expression de OPG contiennent, au minimum, les séquences requises pour la propagation des vecteurs et pour l'expression de l'insert clone. Ces séquen- ces incluent une origine de réplication, un marqueur de sélection, un promoteur, un site de liaison de ribosome, des séquences d'amplificateur, des sites d'épissage d'ARN et un site de terminaison de transcription. Les vecteurs appro- priés pour l'expression dans les cellules hôtes mentionnées ci-dessus sont facilement disponibles, et les acides nucléi- ques de l'invention sont insérés dans les vecteurs en utilisant des techniques standards de recombinaison d'ADN. Les vecteurs pour l'expression spécifique aux tissus de OPG sont également inclus. De tels vecteurs incluent des promo- teurs qui fonctionnent de façon spécifique dans le foie, les reins ou d'autres organes pour la production chez des souris, et des vecteurs viraux pour l'expression de OPG dans des cellules humaines ciblées. En utilisant un système hôte-vecteur approprié, OPG est produite de façon recombinante en cultivant une cellule hôte transformée par un vecteur d'expression contenant des séquences d'acide nucléique codant OPG dans des conditions telles que OPG soit produite, et en isolant le produit d'expression. OPG est produite dans la phase surnageante de cellules de mammifère transfectées ou dans des corps d'in- clusion de cellules hôtes bactériennes transformées. OPG ainsi produite peut être purifiée par des procédures connues au spécialiste dans ce domaine, comme décrit ci-dessous. L'expression de OPG dans des systèmes hôtes bactériens et de mammifère est décrite dans les exemples 7 et 8. Des vecteurs d'expression pour des hôtes de mammifère sont exemplifiés par les plasmides tels que pDSRa décrit dans la demande de brevet PCT n 90/14363. Des vecteurs d'expression pour des cellules hôtes bactériennes sont exemplifiés par les plas- mides pAMG21 et pAMG22-His décrits dans l'exemple 8. Le plasmide pAMG21 a été déposé auprès de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, le 24 juillet 1996 sous le numéro d'accès 98113. Le plasmide pAMG22-His a été déposé auprès de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, le 24 juillet 1996 sous le numéro d'accès 98112. On notera que les cellules hôtes et les plasmides spécifiques décrits sont cités dans des buts d'illustration et que d'autres cellules hôtes et plasmides disponibles pourraient être également utilisés pour exprimer les polypeptides. L'invention fournit également l'expression de OPG à partir d'acides nucléiques engodènes par des recombinaisons in vivo ou ex vivo pour permettre la modulation de OPG à partir du chromosome hôte. L'expression de OPG par l'introduction de séquences régulatoires exogènes (par exemple des promoteurs ou des amplificateurs) capables de diriger la production de OPG à partir de régions de codage de OPG endogènes est également comprise. La stimulation de séquences régulatoires endogènes capables de diriger la production de OPG (par exemple par exposition à des facteurs d'amplification de transcription) est également prévue par l'invention. Polypeptides L'invention fournit OPG, un nouveau membre de la superfa- mille des récepteurs TNF, ayant une activité associée au métabolisme osseux et, en particulier, ayant l'activité d'inhiber la résorption osseuse en augmentant ainsi la densité osseuse. OPG se réfère à un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés de OPG de souris, de rat ou hu- maine, ou un dérivé de celle-ci, ayant au moins une des activités biologiques de OPG. Les séquences d'acides aminés de OPG de rat, de souris et humaine sont montrées, respecti- vement, sur les figures 2B-2C (séquence n 121), 9A-9B (séquence n 123) et 9C-9D (séquence n 125). Un dérivé de OPG se réfère à un polypeptide ayant une addition, délétion, insertion ou substitution de un ou plusieurs acides aminés, de sorte que le polypeptide résultant présente au moins une des activités biologiques de OPG. Les activités biologiques de OPG incluent, mais ne sont pas limitées à cela, des activités impliquant le métabolisme osseux. De préférence, dans les polypeptides, la séquence de tête terminale aminée de 21 acides aminés sera éliminée. Les polypeptides de OPG englobés par l'invention incluent rat [1-401], rat [22-180], rat [22-401], fusion rat [22- 401]-Fc, fusion rat [1-180]-Fc, souris [1-401], souris [1-180], souris [22-401], humain [1-401], souris [22-180], humain [22-401], humain [22-180], humain [1-180], fusion humain [22-180]-Fc, et humain met-32-401. La numérotation des acides aminés est comme montrée dans la séquence n 121 (rat), la séquence n 123 (souris) et la séquence n 125 (humain). Egalement compris sont des dérivés de polypeptide ayant des délétions ou des troncatures à la terminaison carboxy de tout ou partie des résidus d'acides aminés 180-401 de OPG; un ou plusieurs changements d'acide aminé dans les résidus 180-401; la délétion de tout ou partie d'un domaine riche en cystéine de OPG, en particulier la délétion du domaine distal (terminaison carboxy) riche en cystéine; et un ou plusieurs changements d'acide aminé dans un domaine riche en cystéine, en particulier dans le domaine distal (terminaison carboxy) riche en cystéine. Dans une réalisation, OPG présente de 1 à environ 216 acides aminés supprimés à partir de la terminaison carboxy. Dans une autre réalisation, OPG présente de 1 à environ 10 acides aminés supprimés à partir de la terminaison aminée mature (la terminaison aminée mature étant au résidu 22) et, éventuel- lement, présente de 1 à environ 216 acides aminés supprimés à partir de la terminaison carboxy. D'autres polypeptides OPG englobés par l'invention incluent les suivants: fusion humain [22-180]-Fc, fusion humain [22-201]-Fc, fusion humain [22-401]-Fc, fusion souris [22-185]-Fc, fusion souris [22-194]-Fc. Ces polypeptides sont produits dans des cellules hôtes de mammifère, telles que des cellules CHO ou 293. Des polypeptides OPG supplémen- taires englobés par l'invention qui sont exprimés dans des cellules hôtes procaryotes incluent les suivants: humain met[22-401], fusion Fc- humain met[22-401] (la région Fc est fusionnée à la terminaison aminée de la séquence de codage de OPG de longueur complète comme décrit dans l'exemple 8), fusion humain met[22-401]-Fc (la région Fc fusionnée à la séquence de OPG de longueur complète), fusion Fc-souris met[22-401], fusion souris met[22-401]-Fc, humain met[27- 401], humain met [22-185], humain met[22-189], humain met[22-194], humain met [22-194] (P25A), humain met[22-194] (P26A), humain met[27- 185], humain met[27-189], humain met[27-194], humain met-arg-gly- ser-(his)6 [22-401], humain met-lys [22-401], humain met-(lys)3-[22-401], humain met[22- 401]-Fc (P25A), humain met[22-401] (P25A), humain met[22- 401] (P26A), humain met[22-401] (P26D), souris met[22-401], souris met[27-401], souris met[32-401], souris met[27-180], souris met[22- 189], souris met[22-194], souris met[27-189], souris met[27-194], souris met-lys[22-401], souris HEK[22- 401] (A45T), souris met-lys-(his)7[22-401], souris met- lys[22-401]-(his)7 et souris met[27-401] (P33E, G36S, A45P). On comprend que les polypeptides OPG ci-dessus produits dans des cellules hôtes procaryotes présentent un résidu terminal aminé de méthionine, si un tel résidu n'est pas indiqué. Dans des exemples spécifiques, la fusion OPG-Fc a été produite en utilisant une région de 227 acides aminés de IgGl-Yl1 humaine a été utilisée en ayant la séquence comme montré par Ellison et al. (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)). Cependant, des variantes de la région Fc de IgG humaine peuvent être également utilisées. L'analyse de l'activité biologique des troncatures de OPG & la terminaison carboxy fusionnées à la région IgGl Fc humaine indique une portion de OPG d'environ 164 acides aminés qui est requise pour l'activité. Cette région englobe les acides aminés 22-185, de préférence ceux sur les figures 9C-9D (séquence n 125), et comprend quatre domaines riches en cystéine caractéristiques des domaines riches en cystéine des domaines extracellulaires de TNFR. En utilisant l'homologie entre OPG et les domaines de liaison de ligands extracellulaires des membres de la famille de récepteurs TNF, un modèle tridimensionnel de OPG a été engendré en se basant sur la structure cristalline connue du domaine extracellulaire de TNFR-I (voir exemple 6). Ce modèle a été utilisé pour identifier les résidus dans OPG qui peuvent être importants pour l'activité biologique. Des résidus de cystéine qui sont impliqués dans le maintien de la structure des quatre domaines riches en cystéine ont été identifiés. Les liaisons de disulfure suivantes ont été identifiées dans le domaine: domaine 1: cys41 à cys54, cys44 à cys62, tyr23 et his66 peuvent agir pour stabiliser la structure de ce domaine; domaine 2: cys65 à cys80, cys83 à cys98, cys87 à cyslO5; domaine 3: cyslO7 à cys 118, cysl24 à cysl42; domaine 4: cysl45 à cysl60, cysl66 à cysl85. Des résidus ont été également identifiés qui étaient à proximité étroite de TNFB comme montré sur les figures 11 et 12A-12B. Dans ce modèle, on suppose que OPG se lie à un ligand correspondant; TNFB a été utilisé comme un ligand modèle pour simuler l'interaction de OPG avec son ligand. En se basant sur ce modèle, les résidus suivants dans OPG peuvent être importants pour la liaison aux ligands: glu34, lys43, pro66 à gln91 (en particulier, pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, va186, lys88, glu90 et gln91), glu153 et serl55. Des altérations dans ces résidus d'acides aminés, soit individuellement ou en combinaison, peuvent altérer l'acti- vité biologique de OPG. Par exemple, des changements dans les résidus de cystéine spécifiques peuvent altérer la structure des domaines individuels riches en cystéine, tandis que les changements dans des résidus importants pour la liaison aux ligands peuvent affecter les interactions physiques de OPG avec le ligand. Des modèles structurels peuvent aider à identifier des analogues qui présentent des propriétés plus souhaitables, telles qu'une activité biolo- gique augmentée, une plus grande stabilité, ou une plus grande facilité de formulation. L'invention fournit également un multimère de OPG comprenant des monomères de OPG. OPG apparaît comme étant active comme multimère (par exemple dimère, trimère, ou un nombre plus élevé de monomères). De préférence, les multimères de OPG sont des dimères ou des trimères. Les multimères de OPG peuvent comprendre des monomères ayant la séquence d'acides aminés de OPG suffisante pour promouvoir la formation de multimères ou peuvent comprendre des monomères ayant des séquences hétérologues, telles qu'une région d'anticorps Fc. L'analyse des délétions à la terminaison carboxy de OPG suggère qu'au moins une partie de la région 186-401 est impliquée dans l'association de polypeptides de OPG. Une substitution de tout ou partie de la région des acides aminés 186-401 de OPG par une séquence d'acides aminés capable d'auto-association est également englobée dans l'invention. De façon alternative, des polypeptides de OPG ou des dérivés de ceux-ci peuvent être modifiés pour former des dimères ou des multimères par mutagenèse dirigée pour créer des résidus de cystéine non- appariés pour la formation de liaisons de disulfure interchaînes, par réticulation photochimique, telle qu'une exposition à de la lumière ultraviolette, ou par réticulation chimique par des molé- cules de lieurs bifonctionnels, tels que du polyéthylène- glycol bifonctionnel et analogue. Des modifications de polypeptides OPG font partie de l'in- vention et incluent des modifications après traduction (par exemple des chaînes de carbohydrates N-liées ou O-liées, le traitement des extrémités N-terminale ou C-terminale), la fixation de fractions chimiques à l'ossature des acides aminés, des modifications chimiques de chaînes de carbohy- drates N-liées ou O-liées, et l'addition d'un résidu de méthionine Nterminal comme conséquence d'une expression par des cellules hôtes procaryotes. Les polypeptides peuvent également être modifiés avec un marqueur détectable, tels qu'un marqueur enzymatique, fluorescent, isotopique ou par affinité, pour permettre la détection et l'isolation de la protéine. D'autres modifications de OPG incluent des protéines chimé- riques, dans lesquelles OPG est fusionnée à une séquence d'acides aminés hétérologue. La séquence hétérologue peut être toute séquence qui permet à la protéine de fusion résultante de conserver l'activité de OPG. Les séquences hétérologues incluent, par exemple, des fusions d'immunoglo- buline, telles que des fusions Fc, qui peuvent aider à la purification de la protéine. Une séquence hétérologue qui favorise l'association de monomères de OPG pour former des dimères, trimères, et autres formes multimères plus élevées, est préférée. Les polypeptides de l'invention sont isolés et purifiés à partir d'autres polypeptides présents dans des tissus, des lignées cellulaires et descellules hôtes transformées exprimant OPG, ou purifiés à partir de composants dans des cultures cellulaires contenant la protéine sécrétée. Dans une réalisation, le polypeptide est dépourvu d'association avec d'autres protéines humaines, telles que le produit d'expression d'une cellule hôte bactérienne. Egalement fournis par l'invention sont des dérivés chimique- ment modifiés de OPG qui peuvent présenter des avantages supplémentaires, tels qu'un temps de circulation et une stabilité accrus du polypeptide ou une diminution de l'immu- nogénicité (voir le brevet US-4 179 337). Les fractions chimiques de dérivation peuvent être choisies à partir de polymères solubles dans l'eau, tels que du polyéthylènegly- col, des copolymères éthylèneglycol/propylèneglycol, de la carboxyméthylcellulose, du dextran, de l'alcool polyvinyli- que, et analogues. Les polypeptides peuvent être modifiés à des positions aléatoires à l'intérieur de la molécule, ou à des positions prédéterminées à l'intérieur de la molécule, et peuvent inclure une, deux, trois ou plus fractions chimiques fixées. Le polymère peut être d'un poids moléculaire quelconque, et peut être ramifié ou non ramifié. Pour le polyéthylènegly- col, le poids moléculaire préféré est entre environ lkDa et 100kDa (le terme "environ" indiquant que, dans des prépara- tions de polyéthylèneglycol, certaines molécules seront plus lourdes, d'autres moins que le poids moléculaire indiqué) pour faciliter la manipulation et la fabrication. D'autres tailles peuvent être utilisées, selon le profil thérapeuti- que souhaité (par exemple la durée de la libération prolon- gée souhaitée, les effets, le cas échéant, sur l'activité biologique, la facilité de la manipulation, le degré ou manque d'antigénicité et d'autres effets connus du polyé- thylèneglycol sur une protéine thérapeutique ou analogue). Les molécules de polyéthylèneglycol (ou d'autres fractions chimiques) doivent être fixées à la protéine en considéra- tion des effets sur les domaines fonctionnels ou antigéni- ques de la protéine. Il existe un certain nombre de procédés de fixation disponibles aux spécialistes dans ce domaine, par exemple le brevet EP-0 401 384 (couplant PEG à G-CSF), voir également Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (rapportant la pégylation [fixation de polyéthylène- glycol (PEG] de GM-CSF utilisant du chlorure de trésyle). Par exemple, du polyéthylèneglycol peut être lié de façon covalente aux résidus d'acides aminés via un groupe réactif, tel qu'un groupe aminé libre ou un groupe carboxylé. Les groupes réactifs sont ceux auxquels une molécule de poly- éthylèneglycol activée peut être liée. Les résidus d'acides aminés ayant un groupe aminé libre peuvent inclure des résidus de lysine et des résidus d'acides aminés N-termi- naux; ceux ayant un groupe carboxylé libre peuvent inclure des résidus d'acide aspartique, des résidus d'acide gluta- mique, et le résidu d'acide aminé C-terminal. Des groupes sulfhydryles peuvent être également utilisés comme groupes réactifs pour fixer la ou les molécules de polyéthylènegly- col. Il est préféré, pour des buts thérapeutiques, la fixation à un groupe aminé, telle que la fixation à la terminaison N ou au groupe de lysine. On peut souhaiter, de façon spécifique, une protéine modi- fiée chimiquement de façon N-terminale. En utilisant du polyéthylèneglycol comme une illustration des présentes compositions, on peut choisir, à partir d'une variété de molécules de polyéthylèneglycol (par poids moléculaire, ramification, etc...), la proportion des molécules de polyéthylèneglycol par rapport aux molécules de protéine (ou peptide) dans le mélange réactionnel, le type de réaction de pégylation à réaliser, et le procédé pour obtenir la pro- téine choisie pégylée de façon N-terminale. Le procédé d'obtention de la préparation pégylée de façon N-terminale (c'est-à-dire séparer cette fraction d'autres fractions monopégylées si nécessaire) peut être par purification de la matière pégylêe de façon N-terminale à partir d'une popula- tion de molécules de protéines pégylées. Une modification chimiquement sélective N-terminale peut être réalisée par alkylation réductrice qui exploite la réactivité différen- tielle de différents types de goupes aminés primaires (lysine par rapport au N-terminal disponible pour la dériva- tion dans une protéine particulière). Dans les conditions réactionnelles appropriées, on obtient une dérivation sensiblement sélective de la protéine à la terminaison N avec un groupe carbonyle contenant le polymère. Des dimères de OPG synthétiques peuvent être préparés par différentes procédures de réticulation chimique. Des monomè- res de OPG peuvent être chimiquement liés, d'une façon quelconque, ce qui conserve ou augmente l'activité biologi- que de OPG. Une variété de réticulateurs chimiques peut être utilisée selon les propriétés du dimère de protéine qui sont souhaitées. Par exemple, les réticulateurs peuvent être courts et relativement rigides ou plus longs et plus sou- ples, peuvent être biologiquement réversibles, et peuvent fournir une immunogénicité réduite ou une demi-vie pharmaco- cinétique plus longue. Dans un exemple, les molécules de OPG sont liées par la terminaison aminée par une synthèse en deux étapes (voir l'exemple 12). Dans la première étape, OPG est chimiquement modifiée à la terminaison aminée pour introduire un thiol protégé, qui, après purification, est déprotégé et utilisé comme point de fixation pour une conjugaison spécifique au site par une variété de réticulateurs avec une seconde molécule de OPG. Les réticulations aminées terminales incluent, mais n'y sont pas limitées, une liaison de disul- fure, des liaisons thioéther utilisant des réticulateurs aliphatiques bifonctionnels à chaîne courte, et des liaisons thioéther à des réticulateurs de polyéthylèneglycol bifonc- tionnels de longueur variable ("haltères" PEG). Egalement englobé par la synthèse utilisant des haltères de PEG de dimères de OPG, est un sous-produit d'une telle synthèse, dénommé "monocloche". Une monocloche de OPG est constitué d'un monomère couplé à un PEG bifonctionnel linéaire avec une terminaison de polymère libre. De façon alternative, OPG peut être directement réticulée par une variété de techni- ques de réticulation homobifonctionnelles spécifiques aminées qui incluent des réactifs tels que: le dianhydride diéthylènetriaminepentacétique (DTPA), la p-benzoquinone (pBQ) ou le bis(sulfosuccinimidyl)subérate (BS3), ainsi que d'autres connus dans ce domaine. Il est également possible de thiolater OPG directement avec des réactifs tels que du iminothiolane en présence d'une variété de réticulateurs, spécifiques au thiol, bifonctionnels, tels que du bisma- léimide de PEG, et d'obtenir la dimérisation et/ou les "haltères" dans un processus à une étape. Un procédé pour la purification de OPG à partir de sources naturelles et à partir de cellules hôtes transfectées est également inclus. Le procédé de purification peut employer une ou plusieurs étapes de purification de protéine standard dans un ordre approprié pour obtenir la protéine purifiée. Les étapes de chromatographie peuvent inclure une chromato- graphie par échange d'ions, par filtration de gel, par interaction hydrophobe, par phase inverse, par concentration chromatographique par affinité, employant un anticorps anti-OPG ou un complexe d'affinité biotine-streptavidine, et analogue. Anticorps L'invention concerne également des anticorps se liant de façon spécifique à OPG. Les antigènes pour la génération des anticorps peuvent être des polypeptides de longueur complète ou des peptides couvrant une portion de la séquence de OPG. Des procédures immunologiques pour la génération d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux réagissant avec OPG sont connues du spécialiste dans ce domaine (voir, par exemple, Harlow et Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)). Les anticorps ainsi produits sont caractérisés par une spécifi- cité de liaison et une reconnaissance des épitopes utilisant des tests immunosorbants standards liés à une enzyme. Les anticorps incluent également des anticorps chimériques ayant des régions de domaines constants et variables dérivées d'espèces différentes. Dans une réalisation, les anticorps chimériques sont des anticorps humanisés ayant des domaines variables murinés et des domaines constants humains. Egale- ment comprises sont des régions de détermination complémen- taires greffées à une ossature humaine (dites anticorps greffés CDR). Les anticorps chimériques et greffés CDR sont réalisés par des méthodes de recombinaison connues par le spécialiste dans ce domaine. Egalement compris sont des anticorps humains réalisés chez des souris. Les anticorps anti-OPG de l'invention peuvent être utilisés comme un réactif d'affinité pour purifier OPG à partir d'échantillons biologiques (voir l'exemple 10). Dans un procédé, l'anticorps est immobilisé sur Sepharose CnBr- activé et une colonne de conjugués anticorps-Sepharose est utilisée pour éliminer OPG des échantillons liquides. Les anticorps sont également utilisés comme réactifs de diagnostic pour détecter et quantifier OPG dans des échantillons biologiques par des procédés décrits ci-dessous. Compositions pharmaceutiques L'invention fournit également des compositions pharmaceuti- ques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide de l'invention en même temps qu'un diluant, support, solubilisant, émulsifiant, conservateur et/ou adjuvant pharmaceutiquement acceptables. Le terme "quantité thérapeutiquement efficace" signifie une quantité qui fournit un effet thérapeutique pour une condition spécifiée et une voie d'administration spécifiée. La composition peut être sous une forme liquide ou lyophilisée et comprend un diluant (tampons de phosphate, d'acétate ou Tris) ayant différentes valeurs de pH et différentes forces ioniques, un solubilisant tel que Tween ou Polysorbate, des supports tels que de la gélatine ou de l'albumine de sérum humain, des conservateurs tels que du thimérosal ou de l'alcool benzyli- que, et des antioxydants, tels que de l'acide ascorbique ou du métabisulfite de sodium. Egalement comprises sont des compositions comprenant OPG modifiée par des polymères solubles dans l'eau pour accroître la solubilité ou la stabilité. Les compositions peuvent également comprendre l'incorporation de OPG dans des liposomes, des microémul- sions, des micelles ou des vésicules pour l'administration commandée sur une période étendue de temps. De façon spéci- fique, les compositions de OPG peuvent comprendre l'incorpo- ration dans des matrices polymères, telles que des hydro- gels, des silicones, des polyéthylènes, des copolymères acétate de vinyle-éthylène ou des polymères biodégradables. Des exemples d'hydrogels incluent des polyhydroxyalkylméta- crylates (p-HEMA), du polyacrylamide, du polymétacrylamide, de la polyvinylpyrrolidone, de l'alcool polyvinylique et d'autres complexes polyélectrolytiques. Des exemples de polymères biodégradables incluent de l'acide polylactique (PLA), de l'acide polyglycolique (PGA), des copolymères de PLA et PGA, des polyamides et des copolymères de polyamides et polyesters. D'autres formulations de libération commandée incluent des microcapsules, des microsphères, des complexes macromoléculaires et des perles polymères qui peuvent être administrées par injection. La sélection d'une composition particulière dépendra d'un certain nombre de facteurs, incluant la condition qui est traitée, la voie d'administration et les paramètres pharma- cocinétiques souhaités. Une étude plus intensive de compo- sants appropriés pour des compositions pharmaceutiques est fournie par Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 18ème éd. A.R. Gennaro, éd. Mack, Easton, PA (1980). Les compositions de l'invention peuvent être administrées par injection, soit sous-cutanée, intraveineuse ou intramus- culaire, ou par administration orale, nasale, pulmonaire ou rectale. La voie d'administration finalement choisie dépen- dra d'un certain nombre de facteurs et peut être déterminée par un spécialiste dans ce domaine. L'invention fournit également des compositions pharmaceuti- ques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace des acides nucléiques de l'invention en même temps qu'un adju- vant pharmaceutiquement acceptable. Les compositions d'acide nucléique seront appropriées pour l'administration de tout ou partie de la région de codage de OPG à des cellules et des tissus comme partie d'une thérapie génique ou antisens. Procédés de traitement Le tissu osseux fournit un support pour le corps et est constitué de minéraux (essentiellement du calcium et du phosphore), une matrice de protéines collagènes et non collagènes, et des cellules. Trois types de cellules trou- vées dans l'os, les ostéocytes, ostéoblastes et ostéoclastes, sont impliqués dans le processus dynamique par lequel l'os est continuellement formé et résorbé. Les ostéoblastes favorisent la formation du tissu osseux, tandis que les ostéoclastes sont associés à la résorption. La résorption, ou la dissolution des minéraux et de la matrice osseuse, est un procédé rapide et efficace comparé à la formation osseuse et peut libérer de grandes quantités de minéraux à partir de l'os. Les ostéoclastes sont impliqués dans la régulation du remodelage normal du tissu squelettique et dans la résorption induite par des hormones. Par exemple, la résorption est stimulée par la sécrétion de l'hormone de parathyroide en réponse à des concentrations décroissantes d'ions calcium dans des fluides extracellulaires. Au contraire, l'inhibition de la résorption est la fonction principale de la calcitonine. De plus, les métabolites de la vitamine D altèrent la capacité de réponse de l'os à l'hormone de parathyroïde et à la calcitonine. Après maturité du squelette, la quantité d'os dans le squelette reflète l'équilibre (ou le déséquilibre) de la formation osseuse et de la résorption. Une masse osseuse maximale existe après la maturité du squelette avant la quatrième décennie. Entre les quatrième et cinquième décen- nies, l'équilibre se décale et la résorption osseuse domine. La diminution inévitable de la masse osseuse au cours des années commence plus tôt chez les femmes que chez les hommes et est nettement accélérée après la ménopause chez certaines femmes (principalement celles d'origines européenne et asiatique). L'ostéopénie est une condition concernant généralement toute diminution de la masse osseuse au-dessous de niveaux nor- maux. Une telle condition peut se produire à partir d'une diminution du taux de synthèse osseuse ou une augmentation du taux de destruction osseuse, ou les deux. La forme la plus commune d'ostéopénie est l'ostéoporose primaire, également désignée comme ostéoporose postménopause et sénile. Cette forme d'ostéoporose est une conséquence de la perte osseuse universelle avec l'âge, et est généralement une conséquence de l'augmentation de la résorption osseuse avec un taux normal de formation osseuse. Environ 25 & 30% de toutes les femmes blanches aux Etats-Unis développent une ostéoporose symptomatique. Une relation directe existe entre l'ostéoporose et l'incidence de fractures de la hanche, du fémur, du cou et inter-trochantériennes chez les femmes de ans et plus. Les hommes âgés développent une ostéoporose symptomatique entre les âges de 50 et 70 ans, mais la maladie affecte principalement les femmes. La cause de l'ostéoporose postménopause et sénile est inconnue. Plusieurs facteurs ont été identifiés qui peuvent contribuer à cette condition. Ils incluent l'altération des taux d'hormones accompagnant le vieillissement et la consom- mation de calcium inadéquate attribuée à une diminution de l'absorption intestinale du calcium et d'autres minéraux. Les traitements incluent habituellement une thérapie hormo- nale ou des compléments alimentaires dans une tentative pour retarder le processus. A ce jour, cependant, un traitement efficace contre la perte osseuse n'existe pas. L'invention fournit un procédé de traitement d'un trouble osseux en utilisant une quantité thérapeutiquement efficace de OPG. Le trouble osseux peut être tout trouble caractérisé par une perte osseuse nette (ostéopénie ou ostéolyse). En général, le traitement par OPG est envisagé quand il est nécessaire de maîtriser le taux de résorption osseuse. Ainsi, le traitement peut être réalisé pour réduire le taux de résorption osseuse dans le cas o le taux de résorption est au-dessus de la normale ou pour réduire la résorption osseuse au-dessous des taux normaux de façon à compenser des taux inférieurs à la normale de formation osseuse. Les conditions qui peuvent être traitées par OPG incluent ce qui suit: Ostéoporose, telle que ostéoporose primaire, ostéoporose endocrine (hyperthyroïdisme, hyperparathyroïdisme, syndrome de Cushing et acromégalie), formes héréditaires et congéni- tales de l'ostéoporose ("osteogenesis imperfecta", "homocys- tinuria", syndrome de Menkes et syndrome de Riley-Day), et ostéoporose due à l'immobilisation des extrémités, Maladie osseuse de Paget ("oesteitis deformans") chez les adultes et les jeunes gens, Ostéomyélite, ou une lésion infectieuse de l'os, conduisant à une perte osseuse, Hypercalcémie résultant de tumeurs solides (sein, poumon et rein) et maladies malignes hématologiques (myélomes multi- ples, lymphome et leucémie), hypercalcémie idiopathique et hypercalcémie associée à l'hyperthyroïdisme et à des trou- bles des fonctions rénales, Ostéopénie suivant une chirurgie, induite par l'administra- tion de stéroïdes et associée à des troubles de l'intestin grêle et du gros intestin et à des troubles hépatiques et rénaux chroniques, Osteonécrose, ou mort des cellules osseuses, associée à une blessure traumatique ou à une nécrose non traumatique associée à la maladie de Gaucher, à l'anémie des drépano- cytes, au "lupus erythematosus" systémique et à d'autres conditions, Perte osseuse due à de l'arthrite rhumatoïde, Perte osseuse périodontale, Métastases ostéolytiques. * On comprend que OPG peut être utilisée seule ou en combinai- son avec d'autres facteurs pour le traitement de troubles osseux. Dans une réalisation, l'ostéoprotégérine est utili- sée en conjonction avec une quantité thérapeutiquement efficace d'un facteur qui stimule la formation osseuse. De tels facteurs incluent, en n'étant pas limités à cela, les facteurs morphogéniques osseux désignés BMP-1 à BMP-12, le facteur B de croissance transformant (TGF-B), et les membres de la famille TGF-13, les inhibiteurs de l'interleukine-1, les inhibiteurs de TNF-a, l'hormone de parathyroïde et des analogues de celle-ci, la protéine apparentée à la parathy- roïde et des analogues de celle-ci, des prostaglandines de la série E, des bisphosphonates (tels que l'alendronate et autres), et des minéraux favorisant la croissance osseuse, tels que du fluor et du calcium. Les exemples suivants sont indiqués pour illustrer plus complètement l'invention, mais ne sont pas considérés comme limitant sa portée. EXEMPLE 1 Identification et isolation de l'ADNc de OPG de rat Les matières et procédés pour le clonage d'ADNc et l'analyse sont décrits par Maniatis et al., ibid. Les réactions de chaîne de polymérase (PCR) ont été réalisées en utilisant un thermocycliseur Perkin-Elmer 9600 utilisant un mélange réactionnel PCR (Boehringer-Mannheim) et des concentrations d'amorces spécifiées par le fabricant. En général, des mélanges réactionnels de 25-50 pl ont été dénaturés à 94 C, suivis par 20-40 cycles à 94 C pendant 5 secondes, 50-60 C pendant 5 secondes et 72 C pendant 3-5 minutes. Les mélanges réactionnels ont alors été traités à 72 C pendant 3-5 minutes. Les mélanges réactionnels ont été alors analysés par électrophorèse sur gel comme décrit par Maniatis et al., ibid. Une banque d'ADNc a été construite en utilisant i'ARNm isolé à partir de l'intestin embryonnaire d20 pour l'analyse EST (Adams et al. Science 252, 1651-1656 (1991)). Des embryons de rat ont été disséqués, et l'ensemble de l'intestin grêle et du gros intestin se développant ont été retirés et lavés dans PBS. L'ARN cellulaire total a été purifié par extrac- tion acide au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme (Chomczynski et Sacchi Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). La fraction d'ARNm poly(A+) a été obtenue à partir de la préparation d'ARN total par adsorption à, et élution de, Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) utilisant les procédures recommandées par le fabricant. Une banque d'ADNc à amorces aléatoires a été préparée en utilisant le Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md). L'amorce d'ADNc aléatoire contenant un site de restriction interne Not I a été utilisée pour initier la première synthèse de brin et avait la séquence suivante: 'AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3' (séquence n0 1) Not I Pour la première synthèse de brin, trois réactions séparées ont été assemblées qui contenaient 2,5 pg d'ARN poly(A) et ng, 360 ng ou 1080 ng d'amorce aléatoire. Après une seconde synthèse de brin, les produits réactionnels ont été extraits de façon séparée avec un mélange de phénol:chloro- forme:alcool isoamylique (rapport 25:24:1), puis précipités par de l'éthanol. Les produits d'ADNc doubles brins (ds) des trois réactions ont été combinés et ligaturés à l'adaptateur d'oligonucléotide ds suivant: '-TCGACCCACGCGTCCG-3' (séquence n 2) 3'-GGGTGCGCAGGCp-5' (séquence n 3) Après ligature, l'ADNc a été digéré à la complétion par Not I, extrait par du phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et précipité par de l'éthanol. L'ADNc resuspendu a été alors fractionné par taille par filtration sur gel utilisant des colonnes préfabriquées munies du Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md), comme recom- mandé par le fabricant. Les deux fractions contenant les plus grands produits d'ADNc ont été rassemblées, précipitées par de l'éthanol, et ensuite ligaturées de façon direction- nelle dans de l'ADN de vecteur pMOB digéré par Not I et Sal I (Strathmann et al., 1991). L'ADNc ligaturé a été introduit dans ElectroMAX DH10B E. Coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) compétentes par électroporation. Pour l'analyse de séquence automatisée, approximativement 10.000 transformants ont été placés sur des plaques d'agar de 20 cm x 20 cm contenant de l'ampicilline complété par du milieu nutritif LB. Les colonies qui apparaissaient ont été recueillies et disposées sur des plaques de microtitrage à 96 puits contenant 200 ml de bouillon L, du glycérol à 7,5% et 50 pg/ml d'ampicilline. Les cultures ont été développées toute la nuit à 37 C, un jeu double de plaques de microtitrage a été réalisé en utilisant un outil de répliquation stérile à 96 broches, puis les deux jeux ont été stockés à -80 C pour une analyse ultérieure. Pour le clonage d'ADNc de longueur complète, approximativement un million de transformants ont été placés sur des plaques d'ampicilline bactériennes à 96 puits contenant environ 10 000 clones chaque. L'ADN de plasmide à partir de chaque lot a été isolé de façon séparée en utili- sant le Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen Corp. Allemagne) et disposé dans des plaques de microtitrage à 96 puits pour des analyses PCR. Pour séquencer des clones d'ADNc d'intestins de rat foetal aléatoire, des stocks de glycérol ont été décongelés, et de petites aliquotes diluées 1:25 dans de l'eau distillée. Approximativement 3,0 Ml des cultures bactériennes diluées ont été ajoutés au mélange réactionnel PCR (Boehringer- Mannheim) contenant les oligonucléotides suivants: 5'TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (séquence n 4) '-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (séquence n 5) Les mélanges réactionnels ont été incubés dans un thermocy- cliseur (Perkin-Elmer 9600) avec les conditions de cycle suivantes: 94 C pendant 2 minutes; 30 cycles de 94 C pendant 5 secondes, 50 C pendant 5 secondes et 72 C pendant 3 minutes; 72 C pendant 4 minutes. Apres incubation dans le thermocycliseur, les mélanges réactionnels ont été dilués avec 2,0 ml d'eau. Les fragments d'ADN amplifiés ont été encore purifiés en utilisant des colonnes Centricon (Princeton Separations) en utilisant les procédures recom- mandées par le fabricant. Les produits réactionnels PCR ont été séquencés dans un séquenceur d'ADN automatique Applied Biosystems 373A utilisant des réactions à amorce T3 (oligo- nucleotide 353-23; 5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3') (séquence n 6) Taq colorant-terminateur (Applied Biosystems) suivant les procédures recommandées par le fabricant. La séquence de nucleotides 5' résultante obtenue à partir de clones d'ADNc pris au hasard a été traduite et ensuite comparée à la base de données existante de séquences de protéines connues en utilisant une version modifiée du programme FASTA (Pearson et al. Meth. Enzymol. 183, (1990)). Les séquences traduites ont été également analysées en ce qui concerne la présence d'un motif de protéine spécifique riche en cystéine trouvé dans tous les membres connus de la superfamille de récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFR) (Smith et al. Cell 76, 959-962 (1994)), en utilisant le procédé de profil de séquence de Gribskov et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), modifié par Luethy et al. (Protein Science 3, 139-146 (1994)). En utilisant FASTA et les données de recherche de profil, un EST, FRI-1 (Fetal Rat Intestine-1), a été identifié comme un nouveau membre possible de la superfamille TNFR. FRI-1 contenait un insert d'approximativement 600 paires de bases (pb) avec un LORF d'environ 150 acides aminés. L'élément le plus proche dans la base de données était le TNFR humain du type II (TNFR-2). La région comparée a montré une homologie d'environ 43% entre TNFR-2 et FRI-1 sur ce LORF de 150 acides aminés. L'analyse de profil utilisant les première et seconde répétitions riches en cystéine de la superfamille TNFR a fourni un score Z d'environ 8, indiquant que le gène FRI-1 code sans doute un nouveau membre de la famille. Pour déduire la structure du produit FRI-1, la banque d'ADNc d'intestin de rat foetal a été criblée pour des clones de longueur complète. Les oligonucléotides suivants ont été dérivés de la séquence originale FRI-1: '-GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3' (séquence n 7) 5'-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3' (séquence n 8) Ces amorces ont été utilisées dans des réactions PCR pourcribler 96 lots d'ADN de plasmide, chaque lot contenant de l'ADN de plasmide à partir de 10 000 clones indépendants d'ADNc. Approximativement 1 pg de l'ADN de lot de plasmide a été amplifié dans un mélange réactionnel PCR (Boehringer- Mannheim) utilisant un thermocycliseur à 96 puits Perkin- Elmer avec les conditions de cycle suivantes: 2 minutes à 94 C, 1 cycle; 15 secondes à 94 C, puis 45 secondes à 65 C, cycles; 7 minutes à 65 C, 1 cycle. Les produits réac- tionnels de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel. 13 des 96 lots d'ADN de plasmide fournissaient des produits d'ADN amplifiés avec le poids moléculaire relatif attendu. De l'ADN à partir d'un lot positif a été utilisé pour transformer ElectroMAX DH10B E. Coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) compétentes, comme décrit ci-dessus. Approximativement 40 000 transformants ont été placés sur des filtres de nitrocellulose stériles (BA-85, Schleicher et Schuell), et ensuite criblés par hybridation de colonies en utilisant une version marquée par 32P-dCTP du produit PCR obtenu ci-dessus. Les filtres ont été pré- hybridés dans 5X SSC, du formamide désionisé à 50%, une solution de Denhardt X, SDS à 0,5 % et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 2-4 heures à 42 C. Les filtres ont alors été hybridés dans 5X SSC, du formamide désionisé à 50%, une solution de Denhardt 2X, SDS à 0, 1%, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, et environ 5 ng/ml de sonde marquée pendant environ 18 heures à 42 C. Les filtres ont alors été lavés dans 2X SSC pendant 10 minutes à température ambiante, 1X SSC pendant 10 minutes à 55 C, et finalement dans 0,5X SSC pendant 10- 15 minutes à 55 C. Des clones d'hybridation ont été détectés suivant une autoradiographie et ensuite replacés sur des filtres de nitrocellulose pour un criblage secondaire. Lors du criblage secondaire, un clone de plasmide (pBl.1) a été isolé, puis amplifié dans du milieu de bouillon L contenant 100 pg/ml d'ampicilline et l'ADN de plasmide obtenu. Les deux brins de l'insert de pBl.1 de 2,4 kilobases (kb) ont été séquences. La séquence d'insert pBl.1 a été utilisée pour une recherche FASTA de la base de données publique pour détecter toute correspondance et/ou similarité des séquences existantes. Aucune correspondance à un gène quelconque connu ou un EST n'a été trouvée, bien qu'il y avait une similarité d'appro- ximativement 45% vis-à-vis des gènes TNFR-2 de souris et humain. Un codon de départ de méthionine est trouvé au niveau de la paire de bases 124 de la séquence de nucléoti- des, suivi par un LORF codant 401 résidus d'acides aminés qui se termine au niveau de la paire de bases 1327. Le produit de 401 acides aminés est prédit comme ayant un peptide de signal hydrophobe d'approximativement 31 résidus à sa terminaison N, et 4 sites potentiels de glycosylation N-liée. Aucune séquence de chevauchement transmembrane hydrophobe n'a été identifiée en utilisant le programme PepPlot (Wisconsin GCG package, version 8.1). La séquence déduite de 401 acides aminés a été alors utilisée pour rechercher la base de données de la protéine. A nouveau, il n'y avait aucune correspondance existante, bien qu'il apparaissait exister une forte similarité vis-à-vis de nombreux membres de la superfamille TNFR, le plus notablement TNFR-2 de souris et humain. Un alignement de séquence de cette nouvelle protéine avec des membres connus de la superfamille TNFR a été préparé en utilisant le programme Pileup, et ensuite modifié par PrettyPlot (Wisconsin GCG package, version 8.1). Cet alignement montre une claire homologie entre le gêne FRI-1 de longueur complète et tous les autres membres de la famille TNFR. La région homologue correspond au domaine extracellulaire des membres de la famille TNFR, et correspond aux trois ou quatre répétitions riches en cystéine trouvées dans le domaine de liaison de ligand de ces protéines. Cela suggérait que le gène FRI-1 codait un nouveau membre de la famille TNFR. Comme aucune région de chevauchement transmembrane n'a été détectée, on a prédit que cela pouvait être un récepteur sécrété, similaire aux récepteurs solubles dérivés de TNFR-1 (Kohno et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990)). Du fait de l'activité biologique apparente du gène FRI-1 (voir ci-dessous), le produit a été dénommé ostéoprotégérine (OPG). EXEMPLE 2 Motifs d'expression d'ARNm de OPG dans des tissus De multiples transferts d'ARN de tissus humains (Clonetech) ont été sondés par un produit FRI-1 PCR marqué par 32P-dCTP pour détecter la taille du transcript humain et pour déter- miner des motifs d'expression. Les transferts d'ARN ont été préhybridés dans 5X SSPE, du formamide à 50%, une solution de Denhardt 5X, SDS à 0, 5% et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 2-4 heures à 42 C. Les transferts ont été alors hybridés dans 5X SSPE, du formamide & 50%, une solution de Denhardt 2X, SDS à 0,1%, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé et 5 ng/ml de sonde marquée pendant 18-24 heures à 42 C. Les transferts ont été alors lavés dans 2X SSC pendant 10 minutes à température ambiante, 1X SSC pendant 10 minutes à 50 C, puis dans 0,5X SSC pendant -15 minutes. En utilisant une sonde dérivée du gène de rat, une espèce d'ARNm prédominante ayant une masse moléculaire relative d'environ 2,4 kb est détectée dans plusieurs tissus, in- cluant les reins, le foie, le placenta et le coeur. Les taux les plus élevés sont détectés dans les reins. Une grande espèce d'ARNm de masse moléculaire de 4,5 et 7,5 kb a été détectée dans le muscle squelettique et le pancréas. Dans du tissu foetal humain, les reins ont révélé exprimer des taux relativement élevés de l'ARNm de 2,4 kb. En utilisant une sonde humaine (voir ci- dessous), seul le transcript de 2,4 kb est détecté dans ces mêmes tissus. De plus, des taux relativement élevés du transcript de 2,4 kb ont été détectés dans les ganglions lymphatiques, le thymus, la rate et l'appendice. La taille du transcript détecté par à la fois le gène d'ostéoprotégérine de rat et humaine est pratiquement identique à la longueur de l'insert pBl.1 FRI-1 de rat, suggérant que c'était un clone d'ADNc de longueur complète. EXEMPLE 3 Administration systémique de OPG chez des souris transgéniques Le clone d'OPG de rat pBl.1 a été utilisé comme matrice pour amplifier par PCR la région de codage pour le sous-clonage dans un vecteur d'expression spécifique ApoE-foie (Simonet et al. J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994), et demande PCT n US94/11675 et demande US n 08/221,767). Les amorces d'oligonucléotide 5' et 3' suivantes ont été utilisées pour l'amplification PCR, respectivement: '-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3' (séquence n 9) '-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAACAGCCCAGTGACCATTC-3' (séquence n 10) Le mélange réactionnel PCR (Boehringer-Mannheim) a été traité comme suit: 94 C pendant 1 minute, 1 cycle; 94 C pendant 20 secondes; 62 C pendant 30 secondes, et 74"C pendant 1 minute, 25 cycles. Suivant l'amplification, les échantillons ont été purifiés sur des colonnes Qiagen PCR et digérés toute la nuit par des enzymes de restriction SpeI et NotI. Les produits digérés ont été extraits et précipités et sous-clonés dans le vecteur d'expression du promoteur ApoE. Avant de microinjecter le clone résultant, HE-OPG, il a été séquencé pour garantir qu'il était dépourvu de mutation. Le plasmide HE-OPG a été purifié par deux cycles de centri- fugation par gradient de densité CsCl. L'ADN de plasmide purifié a été digéré par XhoI et Ase I, et l'insert trans- génique de 3,6 kb a été purifié par électrophorèse sur gel. Le fragment purifié a été dilué en une solution d'injection de stock de 1 pg/ml dans Tris 5 mM, pH 7,4, EDTA 0,2 mM. Des embryons à cellule unique à partir de souris engendrés à partir de BDF1 x BDF1 ont été injectés essentiellement comme décrit (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)), à l'exception que les aiguilles d'injection étaient chanfreinées et siliconées avant usage. Les embryons ont été cultivés toute la nuit dans un incubateur à CO2 et 15 à 20 embryons à deux cellules ont été transférés aux oviductes de souris femelle CD1 pseudo-gravides. Suivant la gestation à terme, 49 descendants ont été obtenus à partir de l'implantation des embryons micro-injectés. Les descendants ont été criblés par amplification PCR du trans- gène intégré dans les échantillons d'ADN génomique. La région cible pour l'amplification était une région de 369 paires de bases de l'intron Apo E humain qui était inclus dans le vecteur d'expression. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplificateur PCR étaient: '-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3' (séquence n 11) '-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (séquence n 12) Les conditions pour PCR étaient: 94 C pendant 2 minutes, 1 cycle; 94 C pendant 1 minute, 63 C pendant 20 secondes et 72 C pendant 30 secondes, 30 cycles. Des 49 descendants originaux, 9 ont été identifiés comme souches transgéniques positives PCR. A 8-10 semaines d'âge, cinq souches transgéniques (2, 11, 16, 17 et 28) et cinq témoins (1, 12, 15, 18 et 30) ont été sacrifiés pour dissection et analyse pathologique. Le foie a été isolé à partir des quatre souches restantes par hépatec- tomie partielle. Pour l'hépatectomie partielle, les souris ont été anesthésiées et un lobe du foie a été retiré chirur- gicalement. L'ARN cellulaire total a été isolé des foies de toutes les souches transgéniques, et 5 témoins négatifs d'une même portée comme décrit (McDonald et al. Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). Une analyse de transfert d'ARN a été réalisée sur ces échantillons pour déterminer le taux d'expression transgé- nique. Approximativement 10 Mg de l'ARN total de chaque foie d'animal ont été traités par électrophorèse par des gels dénaturants (Ogden et al. Meth. Enzymol 152, 61 (1987)), puis transférés à une membrane de Nylon HYBOND-N (Amersham), et sondés par l'ADN de l'insert pBl.1 marqué par 32p dCTP. L'hybridation a été réalisée toute la nuit à 42 C dans du formamide à 50%, 5X SSPE, SDS à 0,5%, une solution de Denhardt 5X, 100 Mg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé et 2-4 x 106 cpm de sonde marquée/ml de tampon d'hybridation. Suivant l'hybridation, les transferts ont été lavés deux fois dans 2X SSC, SDS à 0,1% à température ambiante pendant minutes chaque et, ensuite, deux fois dans 0,1X SSC, SDS à 0,1% à 55 C pendant 5-10 minutes chaque. L'expression du transgène dans les souches et les témoins d'une même portée a été déterminée suivant une autoradiographie. Les données de transfert d'ARN indiquent que 7 des souches transgéniques expriment des taux détectables de l'ARNm transgénique (animaux 2, 11, 16, 17, 22, 33 et 45). Les souris témoins négatives et une des souches (28) n'expri- maient aucun ARNm apparenté au transgène. Comme OPG est prédite comme étant une protéine sécrétée, la surexpression de i'ARNm transgénique doit représenter le taux du produit génétique administré de façon systémique. Parmi les souris positives par transfert d'ARN et PCR, les animaux 2, 17 et 22 exprimaient les taux les plus élevés d'ARNm transgénique, et peuvent montrer des effets biologiques plus intenses sur des cellules hôtes et des tissus. EXEMPLE 4 Activité biologique de OPG Cinq des souris transgéniques (animaux 2, 11, 16, 17 et 28) et cinq témoins d'une même portée (animaux 1, 12, 15, 18 et ) ont été sacrifiés pour la dissection et l'analyse pathologique en utilisant les procédures suivantes. Avant l'euthanasie, tous les animaux ont eu leurs numéros d'iden- tification vérifiés, puis ils ont été pesés, anesthésiés et saignés. Le sang a été conservé à la fois comme sérum et sang complet pour une analyse hématologique et chimique complète du sérum. Une radiographie a été réalisée juste après l'anesthésie terminale par inhalation létale de C02 et avant la dissection brute. Suivant cela, des tissus ont été retirés et fixés dans de la Zn-formaline tamponnée à 10% pour l'examen histologique. Les tissus recueillis incluaient le foie, la rate, le pancréas, l'estomac, le duodénum, l'iléum, le colon, les reins, les organes reproducteurs, la peau et les glandes mammaires, les os, le cerveau, le coeur, les poumons, le thymus, la trachée, l'oesophage, la thy- roïde, le jejunum, le caecum, le rectum, les glandes surré- nales, la vessie urinaire et le muscle squelettique. Avant la fixation, les poids globaux des organes ont été détermi- nés pour le foie, l'estomac, les reins, les glandes surréna- les, la rate et le thymus. Apres fixation, les tissus ont été traités dans des blocs de paraffine, et des sections de 3 pm ont été obtenues. Le tissu osseux a été décalcifié en utilisant une solution d'acide formique et toutes les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. De plus, on a réalisé une coloration par de la réticuline de Gomori et du trichrome de Masson sur certains tissus. L'histochimie enzymatique a été réalisée pour déterminer l'expression du phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP), une enzyme fortement exprimée par les ostéoclastes, des cellules multinucléaires résorbant les os de lignage monocyte-macrophage. L'immunohistochimie pour l'antigène de surface monocyte-macrophage BrdU et F480 a été également réalisée pour détecter les cellules répliquantes et les cellules du lignage monocyte-macrophage, respective- ment. Pour détecter l'expression de l'antigène de surface F480, des sections de 4 Mm noyées dans de la paraffine et fixées à de la formaline ont été déparaffinisées et hydra- tées avec de l'eau désionisée. Les sections ont été trempées avec du peroxyde d'hydrogène à 3%, bloquées avec Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA), et incubées dans F480 anti-souris monoclonal de rat (Harlan, Indianapolis, IN). Cet anticorps a été détecté par des immunoglobulines bioti- nylées de lapin anti-rat, de la strépavidine conjuguée à du peroxydase (BioGenex San Ramon, CA) avec DAB comme chromagè- ne (BioTek, Santa Barbara, CA). Les sections ont été contre- colorées avec de l'hématoxyline. Lors de la dissection brute et de l'obervation de tissus de viscère, aucune anormalité n'a été trouvée dans les expresseurs transgéniques ou les témoins d'une même portée. L'analyse du poids des organes indique que la taille de la rate augmente d'approximativement 38% chez la souris trans- génique par rapport aux témoins. Il existait une légère augmentation de la taille des plaquettes et une augmentation des cellules non colorées circulantes dans les expresseurs transgéniques. Il y avait une diminution marginale des taux de plaquettes dans les expresseurs transgéniques. De plus, les taux d'acide urique du sérum, d'azote de l'urée, et de phosphatase alcaline avaient tous tendance à être inférieurs dans les expresseurs transgéniques. On a trouvé que les expresseurs présentaient une radiodensité accrue du sque- lette, incluant les os longs (fémurs), les vertèbres et les os plats (bassin). Les tailles relatives des fémurs dans les expresseurs n'étaient pas différentes de celles des souris témoins. L'analyse histologique de sections colorées d'os à partir des expresseurs de OPG montre une sévère ostéopétrose avec la présence de résidus de cartilage à partir de la spongiose primaire observée à l'intérieur des trabécules osseuses dans la diaphyse du fémur. Un cortex clairement défini n'était pas identifiable dans les sections du fémur. Chez des animaux normaux, la diaphyse centrale est remplie de moelle osseuse. Des sections de vertèbre montrent également des changements relatifs à l'ostéopétrose impliquant que les changements du squelette induits par OPG étaient systémi- ques. La moelle osseuse résiduelle montrait, de façon prédominante, des éléments myéloïdes. Des mégacaryocytes étaient présents. Des colorations à la réticuline n'ont montré aucune preuve de dépôt de réticuline. L'immunohisto- chimie pour F480, un antigène de surface cellulaire exprimé par des cellules de dérivarion monocyte-macrophage chez la souris, a montré la présence de cellules positives F480 dans les espaces de moelle. Localement, des cellules positives F480 aplaties pouvaient être observées directement adjacen- tes aux surfaces osseuses trabéculaires. Les cellules de mésenchyme enrobant les trabécules osseuses étaient aplaties et apparaissaient inactives. En se basant sur des colorations H&E et TRAP, on a trouvé rarement des ostéoclastes sur les surfaces osseuses trabéculaires dans les expresseurs de OPG. Au contraire, des ostéoclastes et/ou des chondroclastes ont été observés dans la région de la plaque de croissance résorbant le cartilage, mais leurs nombres peuvent être réduits par rapport aux témoins. Egalement, des ostéoclastes étaient présents sur la surface corticale de la métaphyse o l'activité de modelage est habituellement importante. La différence prédominante entre les expresseurs et les témoins était la diminution profonde des ostéoclastes trabéculaires, à la fois dans les vertèbres et les fémurs. L'étendue de l'accumulation osseuse a été directement corrélée avec le taux d'ARNm transgénique de OPG détecté par transfert d'ARN de l'ARN de foie total. Les rates à partir des expresseurs de OPG présentaient une quantité accrue de pulpe rouge, l'expansion étant due à une augmentation de l'hématopoïèse. Tous les lignages hémato- poïétiques sont représentés. Les cellules positives F480 étaient présentes à la fois chez les témoins et les expres- seurs de OPG dans la pulpe rouge. Deux des expresseurs (2 et 17) présentaient des foyers d'hématopoïèse extramédullaire à l'intérieur du foie, et cela est probablement dû à la moelle ostéopétrotique. Il n'y avait aucune anormalité observable dans le thymus, les ganglions lymphatiques, la voie gastro-intestinale, la voie pancréatohépatobiliaire, la voie respiratoire, le système reproducteur, le système urino-génital, la peau, le système nerveux, le coeur et l'aorte, la poitrine, le muscle squelettique et la graisse. EXEMPLE 5 Isolation d'ADNc de OPG de souris et humaine Un clone d'ADNc correspondant à l'extrémité 5' de i'ARNm de OPG de souris a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de rein de souris (Clontech) par amplification PCR. Les oligo- nucléotides ont été dérivés à partir de la séquence d'ADNc de OPG de rat et sont montrés ci-dessous: '- ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3' (séquence n 13) '-GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG- 3' (séquence n 14) 5'-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3' (séquence n 15) '-TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3' (séquence n 16) 'AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3' (séquence n 17) 'AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3' (séquence n 18) Les produits d'ADNc de longueur complète et partielle obtenus dans ce processus ont été séquences. Le produit de longueur complète a été digéré par Not I et Xba I, puis clones de façon directionnelle dans le vecteur de plasmide pRcCMV (Invitrogen). Le plasmide résultant a été dénommé pRcCMV-Mu-OPG. La séquence de nucleotides du produit cloné a été comparée à la séquence d'ADNc de OPG de rat. Sur la région de 1300 paires de bases couvrant le LORF de OPG, les séquences d'ADN de rat et de souris sont identiques à approximativement 88%. La séquence d'ADNc de souris conte- nait un LORF de 401 acides aminés qui a été comparé à la séquence de protéine OPG de rat et trouvé comme étant identique à environ 94% sans espaces. Cela indique que la séquence d'ADNc de souris isolée code la protéine OPG de muriné, et que la séquence et la structure ont été largement conservées pendant toute l'évolution. La séquence de pro- téine OPG de souris contient un peptide de signal supposé identique à sa terminaison N, et tous les quatre sites potentiels de glycosylation N-liée sont conservés. Un ADNc de OPG humaine partiel a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de rein humain utilisant les oligonucléotides spécifiques du rat suivant: '-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3' (séquence n 19) '-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3' (séquence n 20) Ce produit PCR a été séquencé et utilisé pour concevoir les amorces pour amplifier l'extrémité 3' de l'ADNc humain en l0 utilisant un clone génomique de OPG humaine dans lambda comme matrice: '-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3' (séquence n 29) '-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3' (séquence n 21) Le produit PCR amplifié a été séquencé et, en même temps que la séquence d'extrémité 5', a été utilisé pour concevoir des amorces 5' et 3' spécifiques à l'homme utiles pour amplifier les séquences entières de codage d'ADNc de OPG humaine: '-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAAGTTG-3' (séquence n 22) '-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3' (séquence n 23) Le produit PCR humain de longueur complète a été séquence, puis cloné de façon directionnelle dans le vecteur de plasmide pRcCMV (Invitrogen) utilisant Not I et Xba I. Le plasmide résultant a été dénommé pRcCMV- humain OPG. La séquence de nucléotides du produit cloné a été comparée aux séquences d'ADNc de OPG de rat et de souris. Sur la région de 1300 paires de bases couvrant le LORF de OPG, les séquen- ces d'ADN de rat et de souris sont identiques à approximati- vement 78-88% à l'ADNc de OPG humaine. La séquence d'ADNc de OPG humaine contient également un LORF de 401 acides aminés et elle a été comparée aux séquences de protéine de rat et de souris. La protéine OPG humaine prédite est identique à approximativement 85% et identique à environ 90% aux pro- téines de rat et de souris, respectivement. L'alignement des séquences des protéines de rat, de souris et humaine montre qu'elles ont été fortement conservées pendant l'évolution. La protéine humaine est prédite pour avoir un peptide de signal Nterminal, et 5 sites potentiels de glycolsylation N-liée, 4 desquels sont conservés entre les protéines OPG de rat et de souris. La séquence d'acides aminés prédite et d'ADN de OPG de souris est montrée sur les figures 9A et 9B (séquence ne 122). La séquence d'acides aminés prédite et d'ADN de OPG humaine est montrée sur les figures 9C et 9D (séquence ne 124). Une comparaison des séquences d'acides aminés de OPG de rat, de souris et humaine est montrée sur les figures 9E et 9F. L'isolation de clones d'ADNc de OPG humaine supplémentaires a révélé la présence d'un changement de base de G à C en position 103 de la séquence d'ADN montrée sur la figure 9C. Ce changement de nucleotide a pour conséquence la substitu- tion d'une asparagine pour une lysine en position 3 de la séquence d'acides aminés montrée sur la figure 9C. Le restant de la séquence dans les clones ayant ce changement était identique à celle des figures 9C et 9D. EXEMPLE 6 Modelage de la structure tridimensionnelle de OPG La portion aminée terminale de OPG présentait une homologie à la portion extracellulaire de tous les membres connus de la superfamille TNFR (figure 1C). Le motif le plus notable dans cette région de gènes apparentés à TNFR est une sé- quence de répétition riche en cystéine d'environ 40 acides aminés qui se plie en structures distinctes (Banner et al. Cell 73, 431-445 (1993)). Ce motif est habituellement affiché en quatre répétitions tandem (domaines 3-6) (voir la figure 1C), et est connu pour être impliqué dans la liaison de ligand (Beutler et van Huffel Science 264, 667-663 (1994)). Chaque répétition contient habituellement six résidus de cystéine espacés, qui sont impliqués dans la formation de trois liaisons de disulfure intradomaines, dénommées SS1, SS2 et SS3 (Banner et al., ibid). Dans certains récepteurs, tels que TNFR2, CD30 et CD40, certains des domaines de répétition contiennent seulement deux liaisons de disulfure intrachaînes (SSl et SS3). La séquence de protéine OPG humaine a été alignée & un profil de domaine extracellulaire TNFR1 en utilisant les méthodes décrites par Luethy, et al., ibid, et les résultats ont été graphiquement affichés en utilisant le programme PrettyPlot du Wisconsin Package, version 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) (figure 10). L'alignement indique une claire conservation des résidus de cystéine impliqués dans la formation des domaines 1-4. Cet alignement a été alors utilisé pour construire un modèle tridimension- nel (3-D) du domaine N-terminal de OPG humaine, en utilisant la structure 3-D connue du domaine extracellulaire de p55 TNFR1 (Banner et al., ibid), comme la matrice. Pour faire cela, les coordonnées atomiques de l'ossature des peptides et des chaînes latérales des résidus identiques ont été copiées à partir des coordonnées structurelles cristallines de TNFR1. Suivant cela, les coordonnées restantes pour les insertions et différentes chaînes latérales ont été engen- drées en utilisant le programme LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). Le modèle 3-D a été alors affiné en minimisant son énergie conformationnelle en utilisant LOOK. Par analogie avec d'autres membres de la famille TNFR, on suppose que OPG se lie à un ligand. Dans le but de modeler l'interaction de OPG avec son ligand, la structure cristal- line de TNFB a été utilisée pour simuler une représentation 3-D d'un "ligand OPG". Cette donnée a été graphiquement affichée (voir la figure 11) en utilisant Molscript (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946-950, 1991). Un modèle pour le complexe OPG/ligand avec 3 molécules de TNFBI3 et trois molécules de OPG a été construit o les positions relatives de OPG sont identiques à TNFR1 dans la structure cristal- line. Ce modèle a été alors utilisé pour découvrir les résidus de OPG qui pourraient interagir avec son ligand en utilisant l'approche suivante: la zone accessible de solvant de tous les résidus dans le complexe et un modèle OPG unique ont été calculés. Les résidus qui présentaient des accessibilités différentes dans le complexe par rapport au monomère sont sans doute capables d'interagir avec le ligand. Les séquences d'acides aminés de OPG humaine et de souris ont été réalignées en utilisant cette information pour souligner les séquences comprenant chacun des domaines 1-4 riches en cystéine (figures 12A et 12B). Chaque domaine présente des caractéristiques structurelles individuelles qui peuvent être prédites: Domaine 1 I1 contient quatre cystéines impliquées dans les liaisons de disulfure SS2 (C41 à C54) et SS3 (C44 à C62). Bien qu'aucune liaison SS1 ne soit évidente en se basant sur des ponts de disulfure, la tyrosine conservée en position 28 est homolo- gue à Y20 dans TNFR10, qui est connu pour être impliqué dans l'interaction avec H66 pour aider à la formation du domaine. OPG présente une histidine homologue en position 75, suggé- rant que OPG Y28 et H75 s'empilent dans la protéine native, comme le font les résidus homologues dans TNFR1. En consé- quence, ces deux résidus peuvent en vérité être importants pour l'activité biologique, et des troncatures de OPG N-terminales jusqu'à et au-delà Y28peuvent présenter une activité altérée. De plus, les résidus E34 et K43 sont prédits pour interagir avec un ligand lié basé sur le modèle tridimensionnel précité. Domaine 2 I1 contient six cystéines et est prédit comme contenant des liaisons de disulfure SS1 (C65 à C80), SS2 (C83 à C98) et SS3 (C87 à C105). Cette région de OPG contient également une région s'étendant de P66-Q91 qui s'aligne avec la portion du domaine 2 de TNFR1 qui forme des contacts étroits avec TNFB (voir ci-dessus), et peut interagir avec un ligand de OPG. En particulier, les résidus P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 et Q91 sont prédits pour interagir avec un ligand lié basé sur les données structurelles précitées. Domaine 3 Il contient quatre cystéines impliquées dans des liaisons de disulfure SS1 (C107 à C118) et SS3 (C124 à C142), mais non une liaison SS2. En se basant sur les données structurelles précitées, les résidus E115, L118 et K119 sont prédits pour interagir avec un ligand de OPG. Domaine 4 I1 contient quatre cystéines impliquées dans des liaisons de disulfure SSl (C145 à C160) et SS3 (C166 à C185) mais non une liaison SS2, semblable au domaine 3. Les données struc- turelles précitées prédisent que E153 et S155 interagissent avec un ligand de OPG. Ainsi, le modèle structurel prédit pour OPG identifie un nombre de résidus fortement conservés qui sont susceptibles d'être importants pour son activité biologique. EXEMPLE 7 Production de protéine OPG sécrétée recombinante dans des cellules de mammifères Pour déterminer si OPG est réellement une protéine sécrétée, de l'ADNc de OPG de souris a été fusionné au domaine IgGl Fc humain comme morceau (Capon et al. Nature 337, 525-531 (1989)), et exprimé dans des fibroblastes 293 humains. Des fusions Fc ont été menées en utilisant le vecteur pFc-A3. pFc-A3 contient la région codant la portion Fc de la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine IgG-yl (Ellison et al. ibid) à partir du premier acide aminé du domaine charnière (Glu-99) vers la terminaison carboxylée et est flanqué par un site de fusion 5'-NotI et des sites 3'- SalI et XbaI. Le plasmide a été construit par amplification PCR de la banque d'ADNc de rate humaine (Clontech). Les réactions PCR étaient dans un volume final de 100 pl et employaient deux unités de polymérase d'ADN Vent (New England Biolabs) dans Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), KC1 10 mM, (NH4)2SO4 10 pM, MgSO4 2 mM, Triton X-100 à 0,1% avec 400 pM chaque de dNTP et lng de la banque d'ADNc à amplifier en même temps que 1 MM de chaque amorce. Les réactions ont été initiées par dénaturation à 950C pendant 2 minutes, suivies par 30 cycles de 95 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 30 secondes et 73 C pendant 2 minu- tes. L'amorce 5' 5' ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC 3' (séquence n 24) incorporait un site NotI immédiatement 5' au premier résidu (Glu-99) du domaine charnière de IgG-Y1. L'amorce 3' '-TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3' (séquence n 25) incorporait les sites SalI et XbaI. Le produit PCR de 717 paires de bases a été digéré par NotI et SalI, isolé par électrophorèse à travers de l'agarose à 1% (FMC Corp.), purifié par la procédure Geneclean (BIO 101, Inc.) et cloné dans le vecteur pBluescript II KS digéré par NotI, SalI (Stratagene). L'insert dans le plasmide résultant, pFc-A3, a été séquencé pour confirmer la fidélité de la réaction PCR. L'ADNc de souris cloné dans le plasmide pRcCMV-MuOPG a été amplifié en utilisant les deux jeux suivants de paires d'amorces: Paire 1 '-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (séquence n 26) '-CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3' (séquence n 27) Paire 2 '-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (séquence n 28) '-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3' (séquence n 30) La première paire amplifie LORF de OPG entière et crée un site de restriction NotI qui est compatible avec le site NotI intérieur dans le vecteur de fusion Fc pFcA3. pFcA3 a été préparé en traitant un site de restriction NotI 5' au résidu d'acide aspartique 216 de l'ADNc de IgG1 Fc humaine. Cette construction introduit un lieur qui code deux acides aminés non pertinents qui couvrent la jonction entre la protéine OPG et la région IgG Fc. Ce produit, quand il est lié à la partie Fc, coderait tous les 401 résidus de OPG directement suivis par tous les 227 résidus d'acides aminés de la région IgG1 Fc humaine (Fl.Fc). La secondaire paire d'amorces amplifie les séquences d'ADN codant les 180 premiers résidus d'acides aminés de OPG, qui englobe son domaine de liaison de ligand supposé. Comme ci-dessus, l'amorce 3' crée un site de restriction artificiel Not I qui fusionne le LORF de OPG tronqué C- terminal en position thréonine 180 directement au domaine IgGl Fc (CT.fc). La jonction de séquences d'acides aminés liant le résidu de OPG 401 et les résidus d'acide aseptique 221 à la région Fc humaine peut être modifiée comme suit: l'ADN codant les résidus 216-220 de la région Fc humaine peut être supprimé comme décrit ci-dessous, ou le résidu de cystéine correspondant à C220 de la région Fc humaine peut être transformé soit en sérine, soit en alanine. La protéine de fusion OPG-Fc codée par ces vecteurs modifiés peut être transfectée dans des cellules humaines 293, ou des cellules CHO, et la protéine de fusion OPG-Fc recombinante purifiée comme décrit ci-dessous. Les deux produits sont clones, de façon directionnelle, dans le vecteur de plasmide pCEP4 (Invitrogen). pCEP4 contient l'origine de réplication du virus Epstein- Barr et est capable de réplication épisomique dans des cellules 293- EBNA-1. Le parent pCEP4, et les vecteurs pCEP4-Fl.Fc et pCEP4-CT.Fc, ont été lipofectés dans des cellules 293-EBNA-1 en utilisant les procédés recommandés par le fabricant. Les cellules transfectées ont été alors choisies dans 100 pg/ml d'hygromycine pour choisir l'expression des vecteurs, et les cultures de masse résistant aux médicaments résultantes ont été développées à confluence. Les cellules ont été alors cultivées dans des milieux dépourvus de sérum pendant 72 heures, et les milieux conditionnés retirés et analysés par SDS-PAGE. Une coloration à l'argent du gel de polyacrylamide détecte les protéines principales des milieux conditionnés produites par les cultures 293 résistant aux médicaments. Dans les milieux conditionnés pCEP4-Fl.Fc et pCEP4-CT.Fc, des bandes uniques des tailles prédites étaient abondamment sécrétées (voir les figures 13B et 13C). La protéine de fusion Fc de longueur complète s'accumulait à une concentra- tion élevée, indiquant qu'elle peut être stable. Les deux protéines de fusion Fc ont été détectées par des anticorps IgGl Fc anti-humain (Pierce) sur des transferts de protéine, indiquant qu'elles sont des produits de OPG recombinante. * La protéine de fusion OPG-Fc de longueur complète a été purifiée par chromatographie sur colonne Protein-A (Pierce) utilisant les procédures recommandées par le fabricant. La protéine a été alors soumise à une analyse de séquence N-terminale par dégradation Edman automatisée comme essen- tiellement décrit par Matsudaira et al. (J. Biol. Chem. 262, -35 (1987)). La séquence d'acides aminés suivante a été lue après 19 cycles: NH2-E T L P P K Y L H Y D P E T G H Q L L-CO2H (séquence n0 31) Cette séquence était identique à la séquence d'acides aminés de OPG de souris commençant au résidu d'acide aminé 22, suggérant que le site de clivage de tête de mammifère naturel est entre les résidus d'acides aminés Q21-E22, non entre Y31-D32 comme prédit à l'origine. Les expériences d'expression réalisées sur des cellules 293-EBNA avec pCEP4-Fl.Fc et pCEP4-CT.Fc démontrent que OPG est une protéine sécrétée, et peut agir de façon systémique pour lier son ligand. Des procédures semblables à celles utilisées pour construire et exprimer les fusions muOPG[22-180]-Fc et muOPG[22-401]-Fc ont été employées pour des protéines de fusion OPG-Fc de souris et humaine supplémentaires. L'ADNc de OPG de muriné codant les acides aminés 1-185 fusionné à la région Fc de IgGl [muOPG Ct(185).Fc] humaine a été construit comme suit. L'ADNc de OPG de muriné à partir du plasmide pRcCMV Mu ostéoprotégérine (décrit dans l'exem- ple 5) a été amplifié en utilisant la paire d'amorces suivante dans une réaction de chaîne de polymérase comme décrit ci-dessus: 1333-82: '-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (séquence n 32) 1333-80: '-CCT CTG CGG CCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG C-3' (séquence n 33) Cette paire d'amorces amplifie la région d'ADNc de OPG de muriné codant les résidus d'acides aminés 63-185 (correspon- dant aux paires de bases 278-645) du cadre de lecture de OPG comme montré sur la figure 9A. L'amorce 3' contient un site de restriction Not I qui est compatible avec le site Not I du cadre du vecteur de fusion Fc pFcA3. Le produit couvre également un site de restriction unique EcoRI situé à la paire de bases 436. Le produit PCR amplifié a été purifié, clivé par NotI et EcoRI, et le fragment de restriction EcoRI-NotI résultant a été purifié. Le vecteur pCEP4 ayant l'insert de fusion 1-401 OPG-Fc de muriné a été clivé par EcoRI et NotI, purifié, et ligaturé au produit PCR engendré ci-dessus. Le vecteur d'expression résultant basé sur pCEP4 code les résidus de OPG 1-185 directement suivis par tous les 227 résidus d'acides aminés de la région IgG1 Fc hu- maine. Le vecteur de fusion OPG 1-185.Fc de muriné a été transféré dans des cellules 293, sélectionnées par des médicaments, et des milieux conditionnés ont été produits comme décrit ci-dessus. Le produit de fusion OPG 1-185.Fc de muriné sécrété résultant a été purifié par chromatographie sur colonne Protein-A (Pierce) en utilisant les procédures recommandées par le fabricant. L'ADN de OPG de muriné codant les résidus d'acides aminés 1-194 fusionné à la région Fc de IgG1 (muOPG Ct(194).Fc) humaine a été construit comme suit. L'ADNc de OPG de souris à partir du plasmide pRcCMV Muostéoprotégérine a été amplifié en utilisant les paires d'amorces suivantes: 1333-82: '-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (séquence n 34) 1333-81: '-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3' (séquence n0 35) Cette paire d'amorces amplifie la région d'ADNc de OPG de muriné codant les résidus d'acides aminés 70-194 (correspon- dant aux paires de bases 298-672) du cadre de lecture de OPG. L'amorce 3' contient un site de restriction Not I qui est compatible avec le site Not I du cadre du vecteur de fusion Fc pFcA3. Le produit couvre également un site de restriction unique EcoRI situé à la paire de bases 436. Le produit PCR amplifié a été cloné dans le vecteur de fusion OPG[1- 401] Fc de muriné, comme décrit ci-dessus. Le vecteur d'expression résultant basé sur pCEP4 code les résidus de OPG 1-194 directement suivis par tous les 227 résidus d'acides aminés de la région IgG1 Fc humaine. Le vecteur de fusion OPG 1-194.Fc de muriné a été transfecté dans des cellules 293, sélectionnées par des médicaments, et des milieux conditionnés ont été produits. Le produit de fusion sécrété résultant a été purifié par chromatographie sur colonne Protein-A (Pierce) utilisant les procédures recom- mandées par le fabricant. L'ADN de OPG humaine codant les acides aminés 1-401 fusion- nés à la région Fc de IgG1 humaine a été construit comme suit. L'ADN de OPG humaine dans le plasmide pRcCMV-hu ostéoprotégérine (décrit dans l'exemple 5) a été amplifié en utilisant les amorces d'oligonucléotides suivantes: 1254-90: 'CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (séquence n 36) 1254-95: 5'-CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3 (séquence n 37) Le produit PCR résultant code la protéine OPG humaine de longueur complète et crée un site de restriction Not I qui est compatible avec le vecteur de fusion Fc du site Not I du cadre FcA3. Le produit PCR a été cloné, de façon direction- nelle, dans le vecteur de plasmide pCEP4, comme décrit ci-dessus. Le vecteur d'expression résultant code les résidus de OPG humaine 1-401 directement suivis par les 227 résidus d'acides aminés de la région IgG1 Fc humaine. Des milieux conditionnés à partir de cellules transfectées et sélectionnées par des médicaments ont été produits et le produit de fusion huOPG Fl.Fc a été purifié par chromatogra- phie sur colonne Protein-A (Pierce) utilisant les procédures recommandées par le fabricant. L'ADN de OPG humaine codant les résidus d'acides aminés 1-201 fusionnés à la région Fc de IgG1 [huOPG Ct(201).Fc] humaine a été construit comme suit. L'ADNc de OPG humaine cloné à partir du plasmide pRrCMV-hu ostéoprotégérine a été amplifié par PCR utilisant la paire d'amorces d'oligonucléo- tides suivante: 1254-90: '-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (séquence n 38) 1254-92: '-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTA TTC CAC-3' (séquence n 39) Cette paire d'amorces amplifie la région d'ADNc de OPG humaine codant les résidus d'acides aminés 1-201 du cadre de lecture de OPG, et crée un site de restriction Not I & l'extrémité 3' qui est compatible avec le vecteur de fusion FcA3 de Fc du site Not I du cadre. Ce produit, quand il est lié à la partie Fc, code les résidus de OPG 1-201 directe- ment suivis par tous les 221 résidus d'acides aminés de la région IgGl Fc humaine. Le produit PCR a été cloné, de façon directionnelle, dans le vecteur de plasmide pCEP4, comme décrit ci-dessus. Des milieux conditionnés à partir de cellules transfectées et sélectionnées par des médicaments ont été produits, et les produits de fusion hu OPG Ct(201).Fc purifiés par chromatographie sur colonne Protein-A (Pierce), en utilisant les procédures recommandées par le fabricant. Les procédures suivantes ont été utilisées pour construire et exprimer OPG de souris et humaine non fusionnées. Un plasmide pour l'expression chez des mammifères de OPG de muriné de longueur complète (résidus 1-401) a été engendré par amplification PCR de l'insert d'ADNc de OPG de muriné à partir de pRcCMV Mu- ostéoprotégérine et sous-cloné dans le vecteur d'expression pDSRa (DeClerck et al. J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). Les amorces d'oligonucléotides suivantes ont été utilisées: 1295-26: '-CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3' (séquence n 40) 1295-27: '-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3' (séquence n 41) Le cadre de lecture de longueur complète de OPG de muriné a été amplifié par PCR comme décrit ci-dessus. Le produit PCR a été purifié et digéré par les endonucléases de restriction Hind III et Xba I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), dans les conditions recommandées par le fabricant, puis ligaturé à pDSRa digéré par Hind III et Xba I. Des clones recombinants ont été détectés par digestion par endonucléase de restriction, puis séquences pour garantir qu'aucune mutation s'était produite pendant les étapes d'amplification PCR. Le plasmide résultant, pDSRa-muOPG, a été introduit dans des cellules d'ovaires d'hamsters chinois (CHO) par transfection à base de calcium (Wigler et ai. Cell 11, 233 (1977)). Des colonies individuelles ont été choisies en se basant sur l'expression du gêne de réductase de dihydrofolate (DHFR) dans le vecteur de plasmide et plusieurs clones ont été isolés. L'expression de la protéine recombinante OPG de muriné a été contrôlée par analyse de transfert de protéine de milieux conditionnés de cellules CHO. Des cellules & forte expression ont été choisies, et l'expression de OPG a été encore amplifiée par traitement au méthotrexate comme décrit (DeClerck et al., ibid). Des milieux conditionnés à partir de lignées cellulaires CHO ont été produits pour purification ultérieure de la protéine OPG de muriné sécré- tée recombinante. Un plasmide pour l'expression chez les mammifères de OPG humaine de longueur complète (acides aminés 1-401) a été engendré en sous-clonant l'insert d'ADNc dans pRcCMV-hu ostéoprotégérine, directement, dans le vecteur pDSRa (DeClerck et al., ibid). Le plasmide pRcCMV-OPG a été digéré à la complétion par Not I, ses extrémités ont été rendues franches par Klenow, puis il a été digéré à la complétion par XbaI. L'ADN de vecteur a été digéré par Hind III, ses extrémités ont été rendues franches par Klenow, puis il a été digéré par Xba I, puis ligaturé à l'insert de OPG. Les plasmides recombinants ont été alors séquencés pour confir- mer l'orientation correcte de l'ADNc de OPG humaine. Le plasmide résultant pDSRa-huOPG a été introduit dans des cellules d'ovaires de hamsters chinois (CHO) comme décrit ci-dessus. Des colonies individuelles ont été choisies sur la base de l'expression du gène de réductase de dihydrofo- late (DHFR) dans le vecteur de plasmide et plusieurs clones ont été isolés. L'expression de la protéine recombinante OPG humaine a été contrôlée par analyse de transfert de protéine des milieux conditionnés de cellules CHO. Les clones à forte expression ont été choisis, et l'expression de OPG a été encore amplifiée par traitement au méthotrexate. Des milieux conditionnés à partir de lignées cellulaires CHO exprimant OPG humaine ont été produits pour la purification de la protéine. Des vecteurs d'expression pour l'ADNc de OPG de muriné codant les résidus 1-185 ont été construits comme suit. L'ADNc de OPG de muriné à partir de pRcCMV-Mu OPG a été amplifié en utilisant les amorces d'oligonucléotides suivan- tes: 1333-82: '-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (séquence n 42) 1356-12: '-CCT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3' (séquence n 43) Cette paire d'amorces amplifie la région d'ADNc de OPG de muriné codant les acides aminés 63-185 du cadre de lecture de OPG (paire de bases 278-645) et contient un codon d'arrêt artificiel directement après le codon de cystéine (C185), qui est suivi par un site d'endonucléase de restriction Sal I artificiel. Le produit prédit contient un site de restric- tion EcoRI interne utile pour le sous-clonage dans un vecteur préexistant. Après amplification PCR, le produit purifié résultant a été clivé par les endonucléases de restriction EcoRI et Sal I, et le grand fragment a été purifié sur du gel. Le produit purifié a été alors sous- cloné dans le grand fragement de restriction d'un produit de digestion de EcoRI et Sal I de pBluescript-muOPG Fl.Fc décrit ci-dessus. Le plasmide résultant a été digéré par Hind III et Xho I et le petit fragment a été purifié sur du gel. Ce fragment, qui contient un cadre de lecture ouvert codant les résidus 1-185 a été sous-cloné dans un produit de digestion Hind III et Xho I du vecteur d'expression pCEP4. Le vecteur résultant, pmuOPG [1-185], code un polypeptide de OPG tronqué qui se termine à un résidu de cystéine situé en position 185. Des milieux conditionnés à partir de cellules transfectées et sélectionnées par des médicaments ont été produits comme décrit ci-dessus. 1333-82: '-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (séquence n 44) 1356-13: 5'-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3' (séquence n 45) Cette paire d'amorces amplifie la région d'ADNc de OPG de muriné codant les acides aminés 70-194 du cadre de lecture de OPG (paires de bases 298-672) et contient un codon d'arrêt artificiel directement après le codon de lysine (K194), qui est suivi par un site d'endonucléase de restric- tion Sal I artificiel. Le produit prédit contient un site de restriction EcoRI interne utile pour le sous-clonage dans un vecteur préexistant. Après amplification PCR, le produit purifié résultant a été clivé par les endonucléases de restriction EcoRI et Sal I, et le grand fragment a été purifié sur du gel. Le produit purifié a alors été sous- cloné dans le grand fragment de restriction d'un produit de digestion EcoRI et Sal I de pBluescript-muOPG Fl.Fc décrit ci-dessus. Le plasmide résultant a été digéré par Hind III et Xho I et le petit fragment a été purifié sur du gel. Ce fragment, qui contient un cadre de lecture ouvert codant les résidus 1-185 a été alors sous-cloné dans le produit de digestion Hind III et Xho I du vecteur d'expression pCEP4. Le vecteur résultant, pmuOPG [1-185], code un polypeptide OPG tronqué qui se termine à une lysine en position 194. Des milieux conditionnés à partir des cellules transfectées et sélectionnées par des médicaments ont été produits comme décrit ci-dessus. Plusieurs mutations ont été engendrées à l'extrémité 5' du gène huOPG [22-401]-Fc qui introduisent des substitutions ou délétions d'acides aminés de OPG entre les résidus 22 et 32. Toutes les mutations ont été engendrées par le "QuickChange Site- Directed Mutagenesis Kit" (marque déposée) (Stratagene, San Diego, CA), en utilisant les conditions recommandées par le fabricant. Brièvement, le mélange réactionnel contenant la matrice d'ADN du plasmide huOPG [22401]-Fc et des amorces mutagènes ont été traités par la polymérase Pfu en présence de désoxynucléotides, puis amplifiés dans un thermocycliseur comme décrit ci-dessus. Une aliquote de la réaction a été alors transfectée dans E. colt XLl-Blue compétente par choc thermique, puis plaquée. L'ADN de plasmide à partir des transformants a été alors séquencé pour vérifier les mutations. Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour supprimer les résidus 22-26 du gène de OPG humaine, avec pour conséquence la production d'une protéine de fusion huOPG [27-401]-Fc: 1436-11: '-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3' (séquence n 140) 1436-12: 5'-GTC ATA ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3' (séquence n 141) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour supprimer les résidus 22-28 du gène de OPG humaine, avec pour conséquence la production d'une protéine de fusion huOPG [29-401]- Fc: 1436-17: '-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA C-3' (séquence n 142) 1436-18: 5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3' (séquence n 143) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour supprimer les résidus 22-31 du gène de OPG humaine, avec pour conséquence la production d'une protéine de fusion huOPG [32-401]- Fc: 1436-27: '-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3' (séquence n 144) 1436-28: 5'-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG TCC AC-3' (séquence n 145) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de tyrosine 28 en phénylala- nine du gène de OPG humaine, avec pour conséquence la production d'une protéine de fusion huOPG [22-401]-Fc Y28F: 1436-29: '-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3' (séquence n 146) 1436-30: '-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAA CG-3' (séquence n 147) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de proline 26 en alanine du gène de OPG humaine, avec pour conséquence la production d'une protéine de fusion huOPG [22-401]-Fc P26A: 1429-83: '-GGA AAC GTT TCC TGC AAA GTA CCT TCA TTA TG-3' (séquence n 148) 1429-84: '-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC-3' dans l'exemple 11. EXEMPLE 8 Expression de OPG dans E. coli A. Vecteurs d'expression bactérienne pAMG21 Le plasmide d'expression pAMG21 peut être dérivé du vecteur d'expression Amgen pCFM1656 (ATCC #69576) qui, à son tour, peut être dérivé du système de vecteur d'expression Amgen décrit dans le brevet US- 4 710 473. Le plasmide pCFM1656 peut être dérivé du plasmide pCFM836 décrit (brevet n 4 710 473) en: (a) détruisant les deux sites de restriction NdeI endogènes par remplissage des extrémités par l'enzyme de polymérase T4 suivi par ligature des extrémités franches; (b) remplaçant la séquence d'ADN entre les sites de restric- tion uniques AatII et ClaI contenant le promoteur PL synthé- tique avec un fragment semblable obtenu à partir de pCFM636 (brevet n 4 710 473) contenant le promoteur PL AatII ' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT- 3'TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA- -AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA- -TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT- -TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (séquence n 53) ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (séquence n 54) ClaI et, ensuite, (c) substituant la petite séquence d'ADN entre les sites de restriction uniques ClaI et KpnI par l'oligo- nucléotide suivant: ' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' (séquence n 48) 3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (séquence n 49) ClaI KpnI Le plasmide d'expression pAMG21 peut alors être dérivé de pCFM1656 en réalisant une série de changements de base dirigés par oligomutagenèse chevauchante PCR et substitu- tions de séquence d'ADN. En partant à partir du site BglII (plasmide pb # 180) immédiatement 5' au promoteur de repli- cation du plasmide PcopB et en procédant vers les gènes de réplication de plasmide, les changements de paires de bases sont comme suit: pb # pAMG21 pb dans pCFM1656 pb changées dans pAMG21 # 204 T/A C/G # 428 A/T G/C # 509 G/C A/T # 617 - - insert de deux pb G/C # 679 G/C T/A # 980 T/A C/G # 994 G/C A/T # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A # 1178 G/C T/A # 1466 G/C T/A # 2028 G/C délétion pb # 2187 C/G T/A # 2480 A/T T/A # 2499-2502 AGTG GTCA TCAC CAGT # 2642 TCCGAGC délétion 7 pb AGGCTCG # 3435 G/C A/T # 3446 G/C A/T # 3643 A/T T/A La séquence d'ADN entre les sites de restriction uniques AatII (position #4364 dans pCFM1656) et SacII (position #4585 dans pCFM1656) est substituée par la séquence d'ADN suivante: [extrémité cohésive AatII] 5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCC- (position #4358 dans pAMG21) 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG- -CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT- -GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA- -GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC- -CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG- -CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC- -GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG- -CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT- -GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCA- AatII -TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC- -AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG- -TTTTAAAGTATGGGCAATAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC- -AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG- -GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC- -CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG- -TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC- -ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG- -ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC- -TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG- -GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA- -CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT- -AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT- -TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA- -TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA- -ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT- -TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG- -AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC- -AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT- -TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA- -AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG- -TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC- -AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG- -TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC- -ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGT-' -TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA- -AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC- -TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG- -GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA- -CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT- -ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG- -TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC- -TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT- -ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA- -CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA- -GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCT- SacII -GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA- -CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT- -GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA- -CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT- -ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGA-GG -TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC- -AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' [extrémité coh6sive SacII] (séquence né 50) -TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5' (position 15904 dans pAMG21) (séquence né 46) Pendant la ligature des extrémités cohésives de cette séquence d'ADN de substitution, les sites externes AatII et SacII sont détruits. Il existe des sites uniques AatII et SacII dans l'ADN substitué. pAMG22-His Le plasmide d'expression pAMG22-His peut être dérivé du vecteur d'expression Amgen pAMG22 en substituant la petite séquence d'ADN entre les sites de restriction uniques NdeI (#4795) et EcoRI (#4818) de pAMG22 par le duplex d'oligonu- cléotides suivant: NdeI NheI EcoRI ' TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3' (séquence n 51) 3' ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAATTGCGCAACCTTAA 5' (séquence n 52) MetLysHisHisHisHisHisHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu (séquence n 168) pAMG22 Le plasmide d'expression pAMG22 peut être dérivé du vecteur d'expression Amgen pCFM1656 (ATCC #69576) qui, à son tour, peut être dérivé du système de vecteur d'expression Amgen décrit dans le brevet US-4 710 473 délivré le ler décembre 1987. Le plasmide pCFM1656 peut être dérivé du plasmide pCFM836 décrit (brevet n 4 710 473) en: (a) détruisant les deux sites de restriction NdeI endogènes par remplissage des extrémités par l'enzyme de polymérase T4, suivi par ligature des extrémités franches; (b) remplaçant la séquence d'ADN entre les, sites de restriction uniques AatII et ClaI conte- nant le promoteur PL synthétique par un fragment semblable obtenu à partir de pCFM636 (brevet n 4 710 473) contenant le promoteur PL' AatII 5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT- 3'TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA- -AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA- * -TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT- -TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (séquence n 53) ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (séquence n 54) ClaI et, ensuite, (c) substituant la petite séquence d'ADN entre les sites de restriction uniques ClaI et KpnI par l'oligonu- cléotide suivant: ' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' (séquence n 55) 3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (séquence n 56) ClaI KpnI Le plasmide d'expression pAMG22 peut alors être dérivé de pCFM1656 en réalisant une série de changements de bases dirigés par oligomutagenèse chevauchante PCR et substitu- tions de séquence d'ADN. En partant du site BglII (plasmide pb # 180) immédiatement 5' au promoteur de réplication du plasmide PcopB et en procédant vers les gènes de réplication du plasmide, les changements de paires de bases sont comme suit: pb # pAMG22 pb dans pCFM1656 pb changées dans PAMG22 # 204 T/A C/G # 428 A/T G/C # 509 G/C A/T # 617 - - insert de deux G/C # 679 G/C T/A # 980 T/A C/G # 994 G/C A/T # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A # 1178 G/C T/A # 1466 G/C T/A 2028 G/C délétion pb 2187 C/G T/A # 2480 A/T T/A # 2499-2502 AGTG GTCA TCAC CAGT # 2642 TCCGAGC délétion 7 pb AGGCTCG # 3435 G/C A/T # 3446 G/C A/T # 3643 A/T T/A La séquence d'ADN entre les sites de restriction uniques AatII (position 4364 dans pCFM1656) et SacII (position 4585 dans pCFM1656) est substituée par la séquence d'ADN sui- vante: [extrémité cohésive AatII] (position #4358 dans pAMG22) ' GCGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA- 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT- -ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG- -TATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC- -AACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG- -TTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC- -CCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG- -GGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC- -GCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT- -CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTA- AatII -ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC- -TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG- -TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTTT- -AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA- -TAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT- -ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACA- SacII -CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA- -GCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTCTT- -GAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC- -CTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG- -CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA- -GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGT- -CGCTCTTCACGC 3' (séquence n 58) -GCGAGAAGTG 5' (séquence n 57) [extrémité cohésive SacII] (position #5024 dans pAMG22) Pendant la ligature des extrémités cohésives de cette séquence d'ADN de substitution, des sites externes AatII et SacII sont détruits. Il existe des sites uniques AatII et SacII dans l'ADN substitué. B. OPG Met[32-4011 humaine Dans l'exemple, le vecteur d'expression utilisé était pAMG21. Un dérivé de pCFM1656 (numéro d'accès ATCC 69576), qui contient des sites de restriction appropriés pour l'insertion de gènes en aval du promoteur lux PR. (Voir le brevet US-5 169 318 pour la description du système d'expres- sion lux). La cellule hôte utilisée était GM120 (numéro d'accès ATCC 55764). Cet hôte présente le promoteur lacIQ et le gène lacI intégrés dans un second site dans le chromosome de l'hôte d'un hôte prototrophique E. coli K12. D'autres vecteurs d'expression dans E. coli communément utilisés et cellules hôtes sont également appropriés pour l'expression. Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 32-401 du polypeptide de OPG humaine a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans le vecteur d'expression de plasmide pAMG21 comme suit. Pour accomplir cela, PCR utilisant les oligonucléotides #1257-20 et #1257- 19 comme amorces, a été réalisé en utilisant comme matrice l'ADN de plasmide pRcCMV-Hu OPG contenant 1'ADNc de OPG humaine et en thermocyclisant pendant 30 cycles, chaque cycle étant: 94 C pendant 20 secondes, suivi par 37 C pendant 30 secondes, suivi par 72 C pendant 30 secondes. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agaro- se, le produit PCR a été excisé, purifié et soumis à une restriction par des endonucléases de restriction KpnI et BamHI, et purifié. Les oligonucléotides synthétiques #1257- 21 et #1257-22 ont été phosphorylés individuellement en utilisant la kinase de polynucléotide T4 et ATP, et ont été alors mélangés ensemble, chauffés à 94 C et on les a laissés se refroidir lentement à température ambiante pour former un duplex lieur d'oligonucléotides contenant des extrémités cohésives NdeI et KpnI. Le duplex lieur phosphorylé formé entre les oligonucléotides #1257-21 et #1257-22 contenant des extrémités cohésives NdeI et KpnI (voir la figure 14A), et le produit PCR purifié et digéré par KpnI et BamHI engendré en utilisant les oligo-amorces #1257-20 et #1257-19 (voir ci-dessus) a été inséré, de façon directionnelle, entre deux sites du vecteur de plasmide pAMG21, c'est-à-dire le site NdeI et le site BamHI, en utilisant une méthodologie d'ADN recombinant standard (voir la figure 14A et les séquences ci-dessous). Le lieur synthétique utilisait des codons de E. coli et fournissait une méthionine N-terminale. Deux clones ont été choisis et l'ADN de plasmide isolé, et l'insert de OPG humaine a été ensuite confirmé concernant la séquence d'ADN. Le plasmide résultant pAMG21 contenant les acides aminés 32-401 du polypeptide de OPG humaine immédia- tement précédé dans le cadre par une méthionine est référé comme pAMG21-huOPG met[32-401] ou pAMG21-huOPG met[32-401]. Oligo#1257-19 '-TACGCACTGGATCCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGAC-3' (séquence n 59) Oligo#1257-20 '-GTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAAC-3' (séquence n 60) Oligo#1257-21 '-TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCC GCCGGGTAC -3' (séquence n 61) Oligo#1257-22 '-CCGGCGGACATTTATCACACAGCAGCTGATGAGAAGTTTCTTCATCCA-3' (séquence n 47) Des cultures de pAMG21-huOPG met[32-401] dans E. coli GM120 dans du milieu 2XYT contenant 20 pg/ml de kanamycine ont été incubées à 30 C avant l'induction. L'induction de l'expres- sion du produit génétique huOPG met[32-401] à partir du promoteur luxPR a été achevée suivant l'addition de l'auto- inducteur synthétique, la lactone de N-(3-oxohexanoyl)-DL- homosérine, au milieu de culture à une concentration finale de 30 ng/ml, et les cultures ont été incubées à soit 30 C, soit 37 C, pendant encore 6 heures. Après 6 heures, les cultures bactériennes ont été examinées par microscopie en ce qui concerne la présence de corps d'inclusion et elles ont été alors mises en boulettes par centrifugation. Des corps d'inclusion réfringents ont été observés dans les cultures induites indiquant qu'une partie du produit généti- que recombinant huOPG met[32-401] était produite de façon insoluble dans E. coli. Certaines boulettes bactériennes ont été resuspendues dans TrisHCl lOmM/pH8, EDTA lmM et lysées directement par addition du tampon d'échantillon 2X Laemlli à 1X final, et du B-mercaptoéthanol à une concentration finale de 5%, et analysées par SDS-PAGE. Une bande colorée Coomassie sensiblement plus intense d'approximativement 42kDa a été observée sur un gel SDS-PAGE contenant des lysats de cellules totales de cultures induites à 30 C et 37 C par rapport à la bande 2 qui est un lysat de cellule totale d'une culture non induite à 30 C (figure 14B). Le produit génétique espéré aurait une longueur de 370 acides aminés et présenterait un poids moléculaire d'environ 42,2 kDa. Suivant l'induction à 37 C pendant 6 heures, une culture supplémentaire a été mise en boulettes et soit traitée pour l'isolation des corps d'inclusion (voir ci- dessous), soit traitée par microfluidisation. La boulette traitée par microfluidisation a été resuspendue dans Tris- HC1 25mM/pH8, du tampon NaCl 0,5M et passée 20 fois à travers un Microfluidizer Model 1108 (Microfluidics Corp.) et recueillie. Une aliquote a été retiree de l'échantillon recueilli (du lysat total microfluidisé), et le restant a été mis en boulettes à 20 000 x g pendant 20 minutes. La solution surnageante suivant la centrifugation a été retirée (fraction soluble microfluidisée), et la boulette resuspen- due dans Tris-HCl 25mM/pH8, NaCl 0,5M, solution d'urée 6M (fraction insoluble microfluidisée). A une aliquote de soit la fraction totale soluble, soit la fraction totale insolu- ble, on a ajouté un volume égal du tampon d'échantillon 2X Laemlli et du B-mercaptoéthanol à une concentration finale de 5%. Les échantillons ont alors été analysés par SDS-PAGE. Une quantité significative du produit génétique huOPG met[32- 401] recombinant apparaissait être trouvée dans la fraction insoluble. Pour purifier la protéine recombinante, les corps d'inclusion ont été purifiés comme suit: des cellules bactériennes ont été séparées du milieu par centri- fugation à gradient de densité dans une centrifugeuse Beckman J- 6B, équipée d'un rotor JS-4.2 à 4 900 x g pendant minutes à 4 C. La boulette bactérienne a été resuspendue dans 5 ml d'eau et, ensuite, diluée à un volume final de 10 ml avec de l'eau. Cette suspension a été transférée à une coupelle d'acier inoxydable refroidie dans de la glace et soumise à une rupture sonique en utilisant un Branson Sonifier équipé d'une extrémité standard (réglage de puis- sance = 5, cycle de travail = 95%, 80 éclatements). La suspension cellulaire soumise à sonication a été centrifugée dans une ultracentrifugeuse Beckman Optima TLX équipée d'un rotor TLA 100.3 à 195.000 x g pendant 5 à 10 minutes à 230C. La phase surnageante a été écartée et la boulette rincée par un courant d'eau à partir d'un flacon à seringue. Les boulettes ont été recueillies en grattant avec une microspa- tule et transférées à un homogénéiseur en verre (capacité de 15 ml). 5 ml d'une solution de Percoll (Percoll liquide à %, chlorure de sodium 0,15 M) ont été ajoutés à l'homo- généiseur et le contenu a été homogénéisé jusqu'à ce qu'il soit uniformément suspendu. Le volume a été augmenté à 19,5 mi par l'addition de la solution de Percoll, mélangé et distribué dans 3 tubes Beckman Quick-Seal (13 x 32 nmm). Les tubes ont été scellés selon les instructions du fabricant. Les tubes ont été mis en rotation dans un rotor Beckman TLA 100.3 à 23 C, 20 000 tours par minute (21 600 x g), 30 minutes. Les tubes ont été examinés concernant le motif de bandes approprié. Pour récupérer les corps réfringents, des fractions de gradient ont été récupérées et rassemblées, puis diluées avec de l'eau. Les corps d'inclusion ont été mis en boulettes par centrifugation, et la concentration de protéine a été estimée suivant SDS-PAGE. Une aliquote des corps d'inclusion isolés comme décrit ci-dessous a été dissoute dans le tampon d'échantillon 1X Laemlli avec du Bmercaptoéthanol à 5% et traitée sur un gel SDS-PAGE, et les corps d'inclusion isolés ont fourni un produit génétique recombinant très purifié huOPG[32-401]. La bande principale d'environ 42 kDa observée après avoir traité les corps d'inclusion sur un gel SDS- polyacrylamide a été excisée à partir d'un gel séparé et la séquence d'acides aminés N-terminale déterminée essentiellement comme décrit (Matsudaira et al. J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). La séquence suivante a été déterminée après 19 cycles: NH2 -MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH (séquence nO 62) On a trouvé que cette séquence était identique aux 19 premiers acides aminés codés par le vecteur d'expression pAMG21 Hu-OPG met[32-401], produit par un résidu de méthio- nine fourni par le vecteur d'expression bactérien. C. OPG met[22-401] humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 22 à 401 de OPG humaine a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans un vecteur d'expression de plasmide procaryote pAMG21, comme suit. L'ADN de plasmide isolé de pAMG21-huOPG met[32-401] (voir la section B) a été clivé par les endonucléases de restriction KpnI et BamHI et les fragments résultants ont été traités sur un gel d'aga- rose. Le fragment B (fragment d'environ 1064 paires de bases) a été isolé du gel en utilisant une méthodologie standard. Des oligonucléotides synthétiques (oligos) #1267- 06 et #1267-07 ont été phosphorylés individuellement et on les a laissé former un duplex de lieurs oligos, qui conte- nait des extrémités cohésives NdeI et KpnI, en utilisant les méthodes décrites dans la section B. Le duplex lieur synthé- tique utilisait des codons de E. coli et fournissait une méthionine Nterminale. Le lieur oligophosphorylé contenant les extrémités cohésives NdeI et KpnI et le fragment isolé d'environ 1064 paires de bases de pAMG21-huOPG met[32-401] digéré par les endonucléases de restriction KpnI et BamHI ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène huOPG-met[22-401]. Oligo #1267-06 '-TAT GGA AAC TTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TTC TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC-3' (séquence n 63) Oligo #1267-07 5'-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAG AAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3' (séquence n 64) Des cultures de pAMG21-huOPG-met[22-401] dans l'hôte E. coli 393 ont été placées dans un milieu 2XYT contenant 20 pg/ml de kanamycine et ont été incubées à 30 C avant l'induction. L'induction de l'expression du produit génétique recombinant à partir du promoteur luxPR du vecteur pAMG21 a été réalisée suivant l'addition de l'auto-inducteur synthétique, la lactone de N-(3-oxohexanoyl)-DLhomosérine, au milieu de culture à une concentration finale de 30 ng/ml et l'incuba- tion à soit 30 C, soit 37 C pendant encore 6 heures. Après 6 heures, les cultures bactériennes ont été mises en boulettes par centrifugation (=30 C I+6 ou 37 C I+6). Les cultures bactériennes ont été également soit mises en boulettes avant l'induction (=30 C PreI) ou, de façon alternative, aucun auto-inducteur n'a été ajouté à une culture séparée que l'on avait laissé incuber à 30 C pendant encore 6 heures pour fournir une culture non induite (UI) (=30 C UI). Les boulet- tes bactériennes des cultures soit 30 C PreI, 30 C UI, 30 C I+6 ou 37 C I+6 ont été resuspendues, lysées, et analysées par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (PAGE) comme décrit dans la section B. Les gels de polyacrylamide ont été colorés par du bleu de Coomassie et/ou transférés à de la nitrocellulose par transfert de protéine et immuno- sondés avec l'anticorps polyclonal anti-mu OPG-Fc de lapin, comme décrit dans l'exemple 10. Le taux du produit génétique suivant l'induction a été comparé à soit un échantillon non induit (30 C UI) ou un échantillon de pré-induction (30 C PreI). D. OPG met[22-4011 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 22 à 401 du polypeptide OPG (OPG) de muriné (mu) a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans un vecteur d'expression de plasmide procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé en utilisant les oligonu- cléotides # 1257-16 et #1257-15 comme amorces, l'ADN de plasmide pRcCMVMu OPG comme matrice, et des conditions de thermocyclage comme décrit dans la section B. Le produit PCR a été purifié et clivé par les endonucléases de restriction KpnI et BamHI, comme décrit dans la section B. Les oligos synthétiques #1260-61 et #1260-82 ont été phosphorylés individuellement et on les a laissé former un duplex lieur oligo avec des extrémités cohésives NdeI et KpnI en utili- sant les méthodes décrites dans la section B. Le duplex lieur synthétique utilisait des codons de E. coli et four- nissait une méthionine N-terminale. Le duplex lieur phospho- rylé formé entre les oligos #1260-61 et #1260-82 contenant les extrémités cohésives NdeI et KpnI, et le produit PCR digéré par KpnI et BamHI et purifié engendré en utilisant les amorces oligos #1257-16 et #1257-15 ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG 21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de MuOPG met[22-401]. L'expression du polypeptide recombinant MuOPG met[22-401] à partir de cultures de cellules 393 abritant le plasmide pAMG21-MuOPG met[22-401] suivant l'induction a été détermi- née en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1257-15 '-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA AC-3' (séquence n 65) Oligo #1257-16 '-GTG CTC CTG GTA CCT ACC TAA AAC AGC ACT GCA CAG TG-3' (séquence n 66) Oligo #1260-61 '-TAT GGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (séquence n 67) Oligo #1260-82 '-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CCA-3' (séquence n 68) E. OPG met[32-4011 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 32 à 401 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans un vecteur d'ex- pression de plasmide procaryote pAMG21 comme suit. Pour accomplir cela, des oligos synthétiques #1267-08 et #1267-09 ont été phosphorylés individuellement et on les a laissé former un duplex lieur oligo en utilisant des méthodes décrites dans la section B. Le duplex lieur synthétique utilisait des codons de E. coli et fournissait une méthio- nine N-terminale. Le duplex lieur phosphorylé formé entre les oligos #1267-08 et #1267-09 contenant des extrémités cohésives NdeI et KpnI, et le produit PCR digéré par KpnI et BamHI et purifié décrit précédemment (voir la section D), ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG- met[32-401]. L'expression du polypeptide recombinant muOPG-met [32- 401] à partir de cultures de cellules 393 abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1267-08 5'-TAT GGA CCC AGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (séquence n 69) Oligo #1267-09 '-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CTG GGT CCA-3' (séquence n 70) F. OPG met-lys[22-4011 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale suivie par un résidu de lysine et les acides aminés 22 à 401 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. Les oligos synthétiques #1282-95 et #1282-96 ont été phosphorylés de façon individuelle et on les a laissé former un duplex lieur oligo en utilisant les méthodes décrites dans la section B. Le duplex lieur synthétique utilisait des codons de E. coli et fournissait une méthionine N-terminale. Le duplex lieur phosphorylé formé entre les oligos #1282-95 et #1282-96 contenant des extrémités cohésives NdeI et KpnI et le produit PCR digéré par KpnI et BamHI et purifié décrit dans la section D ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI dans pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été trans- formé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utili- sant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélec- tionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de MuOPG-Met-Lys[22-401]. L'expression du polypeptide recombinant MuOPG Met-Lys[22- 401] à partir de cellules 393 transformées abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1282-95 5'-TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGS TCC GGG TAC-3' (séquence n 71) Oligo #1282-96 '-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TCA-3' (séquence n 72) G. OPG met-lys-(his)7r22-4011 de muriné Une séquence d'ADN codant pour les résidus N-terminaux Met-Lys-His-His-HisHis-His-His-His (=MKH) suivis par les acides aminés 22 à 401 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur luxPR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé en utilisant des oligonucléotides #1300-50 et #1257-15 comme amorces et l'ADN de plasmide pAMG21-muOPG-met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agarose, le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléases de restriction NdeI et BamHI et purifié. Le produit PCR digéré par NdeI et BamHI et purifié engendré en utilisant les amorces oligos #1300-50 et #1257- a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie d'ADN standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé et le séquençage d'ADN réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG-MKH[22- 401]. L'expression du polypeptide recombinant MuOPG-MKH[22-401] & partir de cultures 393 transformées abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1300-50 '-GTT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATC ATG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT ACG AT-3' (séquence n 73) Oligo #1257-15 (voir section D). H. OPG met-lys[22-4011 (his)7 de muriné Une séquence d'ADN codant pour met-lys N-terminal, les acides aminés 22 à 401 de OPG de muriné, et sept résidus d'histidine suivant l'acide aminé 401 (=muOPG MK[22-401]- H7), a été placée sous la commande du promoteur lux PR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé en utilisant les oligonucléotides #1300-49 et #1300-51 comme amorces et l'ADN de pAMG21-muOPG met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agarose, le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléases de restriction NdeI et BamHI, et purifié. Le produit PCR digéré par NdeI et BamHI et purifié a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI dans pAMG21 en utilisant une méthodolo- gie standard. La ligature a été transformée dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocle du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmi- de a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG MK[22-401]-H7. L'expression du polypeptide recombinant muOPG MK-[22-401]-H7 à partir de cellules 393 transformées abritant le plasmide pAMG21 recombinant suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1300-49 5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3' (séquence n 74) Oligo #1300-51 '-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGA TGT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA ACC TGA TTC CCT A- 3' (séquence n 75) I. OPG met[27-4011 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 27 à 401 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé avec les oligonucléotides #1309-74 et #1257-15 comme amorces et l'ADN de plasmide pAMG21-muOPG-met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agarose. Le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléases de restriction NdeI et BamHI, et purifié. Le produit PCR digéré par NdeI et BamHI et purifié a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabri- cant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour véri- fier la séquence d'ADN du gène de muOPG-met[27-401]. L'expression du polypeptide recombinant muOPG-met[27-401] à partir d'une culture 393 transfectée abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo#1309-74 '-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC AT-3' (séquence n 76) Oligo#1257-15 (voir section D) J. OPG met[27-4011 humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 27 à 401 de OPG humaine a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé en utilisant les oligonucléotides #1309-75 et #1309-76 comme amorces et l'ADN de plasmide pAMG21-huOPG-met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agarose, le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléases de restriction AseI et BamHI, et purifié. Le produit PCR digéré par AseI et BamHI et purifié ci-dessus a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de huOPG- met[27-401]. L'expression du polypeptide recombinant huOPG-met[27- 401] suivant l'induction à partir de cellules 393 transfectées abritant le plasmide recombinant pAMG21 a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1309-75 5'-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAA GAA ACT T-3' (séquence n 77) Oligo #1309-76 '-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACT GAT T-3' (séquence n 78) K. OPG met[22-1801 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 22 à 180 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé avec les oligonucléotides #1309-72 et #1309-73 comme amorces et l'ADN de plasmide pAMG21-muOPG-met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agarose, le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléoases de restriction NdeI et BamHI, et purifié. Le produit PCR digéré par NdeI et BamHI et purifié ci- dessus a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI de pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. La ligature a été transformée dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabri- cant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG-met[22-180]. L'expression du polypeptide recombinant muOPG-met[22-180] & partir de cultures 393 transformées abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1309-72 '-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3' (séquence n 79) Oligo #1309-73 '-TAC GCA CTG GAT CCT TAT GTT GCA TTT CCT TTC TGA ATT AGC A-3' (séquence n 80) L. OPG met[27-1801 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 27 à 180 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. PCR a été réalisé en utilisant les oligonucléotides #1309-74 (voir la section I) et #1309- 73 (voir la section K) comme amorces et l'ADN de plasmide pAMG21- muOPG met[22-401] comme matrice. Les conditions de thermocyclage étaient comme décrit dans la section B. L'échantillon PCR résultant a été traité sur un gel d'agaro- se, le produit PCR a été excisé, purifié, clivé par les endonucléases de restriction NdeI et BamHI, et purifié. Le produit PCR digéré par NdeI et BamHI et purifié ci-dessus, a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites NdeI et BamHI dans pAMG21 en utilisant une méthodologie standard. Le mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG met[27-180]. L'expression du polypeptide recombinant muOPG met[27-180] à partir de cultures de cellules 393 transformées abritant le plasmide recombinant pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. M. OPG met[22-189] et met[22- 1941 de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et soit les acides aminés 22 à 189, soit 22 à 194 de OPG de muriné, a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. La paire d'oligonucléotides synthétiques #1337-92 et #1337-93 (=lieur muOPG-189) ou #1333-57 et #1333-58 (=lieur muOPG-194) ont été phosphorylés individuellement et on les a laissé former une paire de duplex lieurs oligos utilisant les méthodes décrites dans la section B. L'ADN de plasmide purifié de pAMG21-muOPG-met[22-401] a été clivé par les endonucléases * de restriction KpnI et BspEI, et les fragments d'ADN résul- tants ont été traités sur un gel d'agarose. Le fragment B d'environ 413 paires de bases a été isolé en utilisant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. Les duplex lieurs oligos phosphorylés formés entre soit les oligos #1337-92 et #1337-93 (lieur muOPG-189), soit les oligos #1333-57 et #1333-58 (lieur muOPG-194) contenant les extré- mités cohésives BspEI et BamHI, et le fragment B d'environ 413 paires de bases isolé du plasmide pAMG21-muOPG-met[22- 401] digéré par les endonucléases de restriction KpnI et BspEI ci-dessus, ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites KpnI et BamHI de pAMG21-muOPG met[22-401] en utilisant une méthodologie standard. Chaque mélange de ligature a été transformé dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, le plasmide d'ADN a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN de soit les gènes de muOPG-met[22-189] ou muOPG-met[22-194]. L'expression des polypeptides recombinants muOPG-met[22-189] et muOPG- met[22-194] à partir des plasmides recombinants pAMG21 transformés dans des cellules 393 a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1337-92 '-CCG GAA ACA GAT AAT GAG-3' (séquence n 81) Oligo #1337-93 '-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3' (séquence n 82) Oligo #1333-57 5'-CCG GAA ACA GAG AAG CCA CGC AAA AGT AAG-3' (séquence n 83) Oligo #1333-58 '-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3' (séquence n 84) N. OPG met[27-1891 et met[27-194] de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et soit les acides aminés 27 à 189, soit 27 à 194 de OPG de muriné, a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. Les lieurs oligos phosphorylés, soit le "lieur muOPG- 189" soit le "lieur muOPG-194" (voir la section M) contenant les extrémités cohésives BspEI et BamHI, et le fragment B isolé d'environ 413 paires de bases du plasmide pAGM21-muOPG- met[22-401] digéré par les endonucléases de restriction KpnI et BspEI, ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites KpnI et BamHI du plasmide pAMG21-muOPG-met[27-401] en utilisant une méthodologie standard. Chaque ligature a été transformée dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN de soit les gènes de muOPG met[27-189] ou muOPG met[27-194]. L'expression des polypeptides recombinants muOPG met[27-189] et muOPG met[27-194] suivant l'induction de cellules 393 abritant les plasmides recombinants pAMG21 a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. O. OPG met[22-1851, met[22-1891, met[22-194] humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et soit les acides aminés 22 à 185, 22 à 189 ou 22 à 194 du polypeptide de OPG humaine a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. La paire d'oligonucléotides synthétiques #1331- 87 et #1331-88 (=lieur huOPG-185), #1331-89 et #1331-90 (=lieur huOPG-189), ou #1331-91 et #1331-92 (=lieur huOPG- 194) ont été phosphorylés, individuellement, et on a laissé chacun former une paire de duplex lieurs oligos utilisant les méthodes décrites dans la section B. De l'ADN de plasmi- de purifié de pAMG21-huOPG-met[27-401] a été clivé par les endonucléases de restriction KpnI et NdeI et les fragments d'ADN résultants ont été traités sur un gel d'agarose. Le fragment B d'environ 407 paires de bases a été isolé en utilisant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. Les duplex lieurs oligos phosphorylés formés entre soit les oligos #1331-87 et #1331-88 (lieur huOPG-185), les oligos #1331-89 et #1331-90 (lieur huOPG-189), ou les oligos #1331-91 et #1331-92 (lieur huOPG-194) [chaque lieur contient des extrémités cohésives NdeI et BamHI], et le fragment B isolé d'environ 407 paires de bases du plasmide pAMG21huOPG-met[27-401] digéré par les endonucléases de restriction KpnI et NdeI ci-dessus, ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites KpnI et BamHI du plasmide pAMG21-huOPG-met[22-401] en utilisant une méthodo- logie standard. Chaque ligature a été transformée dans l'hôte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide a été isolé, et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN de soit les gènes huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189] ou huOPG-met[22-194]. L'expression des polypeptides recombinants huOPG-met[22- ], huOPG-met[22-189] ou huOPG-met[22-194] dans des cellules 393 transformées abritant les plasmides recombi- nants pAMG21 suivant l'induction a été déterminée en utili- sant les méthodes décrites dans la section C. Oligo #1331-87 '-TAT GTT AAT GAG-3' (séquence n 85) Oligo #1331-88 '-GAT CCT CAT TAA CA-3' (séquence n 86) Oligo #1331-89 '-TAT GTT CCG GAA ACA GTT AAG- 3' (séquence n 87) Oligo #1331-90 '-GAT CCT TAA CTG TTT CCG GAA CA-3' (séquence n 88) Oligo #1331-91 5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AAA AAT AAG- 3' (séquence n 89) Oligo #1331-92 '-GAT CCT TAT TTT TGA GTT GAT TCA CTG TTT CCG GAA CA-3' (séquence n 90) P. OPG met[27-1851, met[27-1891, met [27-1941 humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et soit les acides aminés 27 à 185, 27 à 189 ou 27 à 194 du polypeptide de OPG humaine a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. Les lieurs oligos phosphorylés "lieur huOPG- ", "lieur huOPG-189" ou "lieur huOPG-194" (voir la section O), contenant chacun les extrémités cohésives NdeI et BamHI, et le fragment B isolé d'environ 407 paires de bases du plasmide pAMG21-huOPG-met[27-401] digéré par les endonucléases de restriction KpnI et NdeI (voir la section O) ont été insérés, de façon directionnelle, entre les sites KpnI et BamHI du plasmide pAMG21-huOPG-met[27-401] (voir la section J) en utilisant une méthodologie standard. Chaque ligature a été transformée dans l'hâte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide isolé, et le séquençage d'ADN réalisé pour vérifier la séquence d'ADN de soit les gènes de huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] ou huOPG-met[27-194]. L'expression des polypeptides recombinants huOPG-met[27- ], huOPG-met[27-189] et huOPG-met[27-194] à partir des plasmides recombinants pAMG21 transformés dans des cellules 393 a été déterminée en utilisant les méthodes décrites dans la section C. Q. OPG met[27-4011 (P33E, G36S, A45P) de muriné Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 27 à 48 de OPG humaine suivis par les résidus d'acides aminés 49 à 401 de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur lux PR du vecteur d'expression procaryote pAMG21 comme suit. De l'ADN de plasmide purifié de pAMG21- huOPG-met[27-401] (voir la section J) a été clivé par les endonucléases de restriction AatII et KpnI, et un fragment B d'environ 1075 paires de bases a été isolé d'un gel d'agarose en utilisant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. De plus, l'ADN du plasmide pAMG21-muOPG-met[22-401] (voir la section D) a été digéré par les endonucléases de restriction KpnI et BamHI et le fragment B d'environ 1064 paires de bases isolé comme décrit ci-dessus. Le fragment de restriction isolé d'environ 1075 paires de bases pAMG21- huOPG-met[27-401] contenant les extrémités cohésives AatII et KpnI (voir ci-dessus), le fragment de restriction d'environ 1064 paires de bases pAMG21-muOPG-met[22-401] contenant les extrémités cohésives KpnI et BamHI et un fragment de restriction d'environ 5043 paires de bases contenant les extrémités cohésives AatII et BamHI et correspondant à la séquence d'acide nucléique de pAMG21 entre AatII et BamHI ont été ligaturés en utilisant une méthodologie standard de recombi- naison d'ADN. La ligature a été transformée dans l'hâte E. coli 393 par électroporation en utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, et la présence de l'insert recombinant dans le plasmide vérifiée en utili- sant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. Le gène de muOPG27-401 (P33E, G36S, A45P). Les changements d'acides aminés dans muOPG de proline-33 à acide glutamique- 33, glycine-36 à sérine-36, et alanine-45 à proline-45, résultent du remplacement des résidus de muOPG 27 à 48 par les résidus huOPG 27 à 48. L'expression de muOPG-met[27-401] (P33E, G36S, A45P) recom- binant à partir de cellules 393 transformées abritant le plasmide recombinant pAMG21 a été déterminée en utilisant des méthodes décrites dans la section C. R. OPG met-lys-(his)7-ala-ser-(asp)4-lys[22- 401] (A45T) de muriné Une séquence d'ADN codant pour un morceau His N- terminal et la séquence de reconnaissance d'entérokinase qui est (termi- naison NH2 à COOH): Met-Lys-His-His-His-His-His-His- His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (=HEK), suivis par les acides aminés 22 à 401 du polypeptide de OPG de muriné a été placée sous la commande du promoteur Ps4 régulé par le répresseur lac comme suit. pAMG22-His (voir la section A) a été digéré par les endonucléases de restriction NheI et BamHI, et le grand fragment (le fragment A) a été isolé d'un gel d'agarose en utilisant une méthodologie de recombinaison d'ADN standard. Les oligonucléotides #1282-91 et #1282-92 ont été phosphorylés, individuellement, et on les a laissé former un duplex lieur oligo utilisant les méthodes précé- demment décrites (voir la section B). Le duplex lieur phosphorylé formé entre les oligos #1282-91 et #1282-92 contenant les extrémités cohésives NheI et KpnI, le produit PCR digéré par KpnI et BamHI et purifié décrit (voir la section D), et le fragment A du vecteur pAGM22-His digéré par NheI et BamHI ont été ligaturés en utilisant une métho- dologie de recombinaison d'ADN standard. La ligature a été transformée dans l'hôte E. coli GM120 par électroporation utilisant le protocole du fabricant. Des clones ont été sélectionnés, l'ADN de plasmide isolé, et le séquençage d'ADN réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de muOPG-HEK[22-401]. Le séquençage d'ADN a révélé une fausse mutation dans la séquence naturelle de muOPG qui avait pour conséquence un changement unique d'acide aminé de l'alanine- du polypeptide muOPG à une thréonine. L'expression du recombinant muOPG-HEK[22-401] (A45T) à partir des cellules GM120 abritant le plasmide recombinant pAMG21 a été déterminée en utilisant des méthodes semblables à celles décrites dans la section C, à l'exception que, à la place de l'addition de l'auto- inducteur synthétique, IPTG a été ajouté à 0,4 mM final pour compléter l'induction. Oligo #1282-91 '-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT AGC ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGT GTG ATA AAT GTG CTC CGG GTA C-3' (séquence n 91) Oligo #1282-92 '-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TGT CGT CGT CGT CG-3' (séquence n 92) S. OPG met-arq-gly-ser(his)6[22-4011 humaine Huit oligonucléotides (1338-09 à 1338-16 montrés ci-dessous) ont été conçus pour produire un fragment de 175 bases comme ADN double brin chevauchant. Les oligos ont été annelés, ligaturés, et les oligos 5' et 3' ont été utilisés comme amorces PCR pour produire de grandes quantités du fragment de 175 bases. Les produits génétiques PCR finals ont été digérés par les endonucléases de restriction ClaI et KpnI pour fournir un fragment qui remplace les 28 codons N-termi- naux de OPG humaine. Le produit PCR digéré par ClaI et KpnI a été inséré dans pAMG21-huOPG [27-401] qui avait été également clivé par ClaI et KpnI. L'ADN ligaturé a été transformé dans des cellules hôtes compétentes de souche E. coli 393. Des clones ont été criblés pour la capacité à produire la protéine recombinante et à posséder la fusion génétique ayant la séquence de nucléotides correcte. Les taux d'expression de protéine ont été déterminés à partir d'études dans des agitateurs de 50 ml. Le lysat de cellules entières et la boulette sonique ont été analysés pour l'expression du produit de construction par des gels PAGE colorés par Coomassie et analyse de transfert de protéine avec l'anticorps anti-OPG de muriné. L'expression de huOPG Met- Arg-Gly-Ser-(His)6 [22-401] résultant dans la formation de grands corps d'inclusion et de la protéine a été locali- sée sur la fraction insoluble (boulette). 1338-09 ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GA (séquence n 93) 1338-10 TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC (séquence n 94) 1338-11 CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC GAA GA (séquence n 95) 1338-12 AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA AAC A (séquence n 96) 1338-13 TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT (séquence n 97) 1338-14 CGC ACA GCA GCT GGT GGG AGG TTT CTT CGT CGT AGT GCA GGT ATT TCG GC (séquence n 98) 1338-15 GGG AAG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGC GAT CCT CTC ATA TTT TAT T (séquence n 99) 1338-16 CCT CCT TTA ATT AGT TAA AAC AAA TCT AGT ATC AAA TCG ATT GTG TTT GT (séquence n 100) T. OPG met-lys[22-4011 et met(lys)3[22-4011 humaine Pour construire les versions met-lys et met-(lys)3 de OPG[22-401] humaine, des oligonucléotides chevauchants ont été conçus pour ajouter le nombre approprié de résidus de lysine. Les deux oligos pour chaque produit de construction ont été conçus pour se chevaucher, permettant à deux séries de PCR de produire le produit final. La matrice pour la première réaction PCR était une préparation d'ADN de plas- mide contenant le gène de OPG 22-401 humaine. La première PCR a ajouté le ou les résidus de lysine. La seconde PCR utilisait le produit de la première réaction et ajoutait une séquence au premier site de restriction, ClaI. Les produits génétiques PCR finals ont été digérés par les endonucléases de restriction ClaI et KpnI, qui remplacent les 28 codons N-terminaux de OPG humaine, et ont été alors ligaturés dans le plasmide pAMG21-hu OPG [27-401] qui avait été également digéré par les deux endonucléases de restric- tion. L'ADN ligaturé a été transformé dans des cellules hôtes compétentes de la souche E. coli 393. Des clones ont été criblés pour la capacité à produire la protéine recombi- nante et à posséder la fusion génétique ayant la séquence de nucléotides correcte. Les taux d'expression de protéine ont été déterminés à partir d'études dans des agitateurs de 50 ml. Le lysat de cellules entières et la boulette sonique ont été analysés pour l'expression du produit de construction par des gels PAGE colorés par Coomassie et analyse de transfert de protéine par l'anticorps anti-OPG de muriné. Aucun produit de construction ne possédait un niveau détec- table d'expression de protéine et des corps d'inclusion n'étaient pas visibles. Les séquences d'ADN ont été confir- mées par séquençage d'ADN. Amorces d'oligonucléotides pour préparer Met-Lys huOPG[22- 401]: 1338-17 ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TG (séquence n 101) 1338-18 CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAG AAA CTT TTC CTC CAA AAT ATC (séquence n 102) 1338-20 TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (séquence n 103) Amorces d'oligonucléotides pour préparer Met-(Lys)3 huOPG[22-401]: 1338-17 ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TG (séquence n 104) 1338-19 CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTC CTC CAA AAT ATC (séquence n 105) 1338-20 TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (séquence n 106) U. Fusion de Fc par OPG [22-401] humaine et de muriné Quatre fusions OPG-Fc ont été construites o la région Fc de IgGl humaine était fusionnée à la terminaison N des acides aminés 22 à 401 de l'ostéoprotégérine de muriné ou humaine (référencée comme Fc/OPG[22-401]), ou à la terminaison C (référencée comme OPG[22-401]/Fc). Les fusions Fc ont été construites en utilisant le vecteur de fusion pFc-A3 décrit dans l'exemple 7. Tous les gènes de fusion ont été construits en utilisant une technologie PCR standard. Les matrices pour les réactions PCR étaient des préparations de plasmide contenant les gènes cibles. Des oligos chevauchants ont été conçus pour combiner la portion C-terminale d'un gène avec la portion N-terminale de l'autre gène. Ce processus permet de fusionner les deux gènes ensemble dans le cadre de lecture correct après que les réactions PCR appropriées ont été réalisées. Initiale- ment, un oligo de "fusion" pour chaque gène a été placé dans une réaction PCR avec une amorce universelle pour le vecteur portant le gène cible. L'oligo de "fusion" complémentaire a été utilisé avec une amorce universelle pour la réaction PCR avec l'autre gène. A la fin de cette première réaction PCR, deux produits séparés ont été obtenus, avec chaque gène individuel ayant le site de fusion présent, créant suffisam- ment de chevauchement pour entraîner la seconde série de PCR et créer la fusion désirée. Dans la seconde série de PCR, les deux premiers produits PCR ont été combinés ainsi que des amorces universelles et, via les régions chevauchantes, la séquence d'ADN de fusion de longueur complète a été produite. Les produits génétiques PCR finals ont été digérés par lesendonucléases de restriction XbaI et BamHI, et, ensuite, ligaturés dans le vecteur pAMG21 ayant été également digéré par les deux endonucléases de restriction. L'ADN ligaturé a été transformé dans des cellules hôtes compétentes de la souche E. coli 393. Des clones ont été criblés pour la capacité à produire la protéine recombinante et à posséder la fusion génétique ayant la séquence de nucleotides cor- recte. Les taux d'expression de protéine ont été déterminés à partir des études dans des agitateurs de 50 ml. Le lysat de cellule entière, la boulette sonique, et la phase surna- geante ont été analysés pour l'expression de la fusion par des gels PAGE colorés par Coomassie et analyse de transfert de protéine par un anticorps anti-OPG de muriné. Fc/huOPG [22-4011 L'expression du peptide de fusion Fc/hu OPG [22-401] a été détectée sur un gel PAGE coloré par Coomassie et sur un transfert de protéine. Les cellules présentent de très grands corps d'inclusion, et la majorité du produit est dans la fraction insoluble (boulette). Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire cette fusion OPG-Fc: 1318-48 CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TT (séquence n 107) 1318-49 CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGT GT (séquence n 108) Fc/muOPG [22-4011 L'expression du peptide de fusion a été détectée sur un gel coloré par Coomassie et sur un transfert de protéine. Les cellules présentent de très grands corps d'inclusion, et la majorité du produit est dans la fraction insoluble (bou- lette). Les amorces suivantes ont été utilisées pour cons- truire cette fusion OPG-Fc: 1318-50 CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAA AAT ACC TGC (séquence n 109) 1318-51 CCA TTT TAC CCG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT (séquence n 110) muOPG [22-4011/Fc L'expression du peptide de fusion a été détectée sur un gel coloré par Coomassie et sur un transfert de protéine. La quantité du produit recombinant était moindre que les protéines de fusion OPG ayant la région Fc dans la position N- terminale. Des corps d'inclusion évidents n'ont pas été détectés. La plupart du produit apparaissait être dans la fraction insoluble (boulette). Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire cette fusion OPG-Fc: 1318-54 GAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (séquence n 111) 1318-55 CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G (séquence n 112) huOPG r22-4011/Fc L'expression du peptide de fusion n'a pas été détectée sur un gel coloré par Coomassie, bien qu'un léger signal positif de transfert de protéine était présent. Des corps d'inclu- sion évidents n'ont pas été détectés. Les amorces suivantes ont été utilisées pour préparer cette fusion OPG-Fc: 1318-52 AAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (séquence n 113) 1318-53 CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG ATT GG (séquence n 114) V. Fusion OPG met[22-4011 humaine-Fc (P25A) Cette construction combine un changement d'acide aminé de proline à alanine en position 25 (P25A) avec la fusion huOPG met[22-401]-Fc. Le plasmide a été digéré par les endonu- cléases de restriction ClaI et KpnI, ce qui retire les 28 codons Nterminaux du gène, et le petit fragment résultant (inférieur à 200 paires de bases) a été purifié sur gel. Ce fragment contenant le changement de proline à alanine a alors été ligaturé dans la fusion plasmide pAMG21-huOPG [22-401]-Fc qui avait été digérée par les deux endonucléases de restriction. L'ADN ligaturé a été transformé dans des cellules hôtes compétentes de souche E. coli 393. Des clones ont été criblés pour la capacité à produire la protéine recombinante et à posséder la fusion génétique ayant la séquence de nucléotides correcte. Les taux d'expression de protéine ont été déterminés à partir d'études dans des agitateurs de 50 ml. Le lysat de cellule entière et la boulette sonique ont été analysés pour l'expression du produit de construction par des gels PAGE colorés par Coomassie et analyse de transfert de protéine par un anti- corps anti-OPG de muriné. Le taux d'expression du peptide de fusion a été détecté sur un gel PAGE coloré par Coomassie et sur un transfert de protéine. La protéine était dans la fraction insoluble (boulette). Les cellules présentaient de grands corps d'inclusion. W. OPG met[22-401] (P25A) humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 22 à 401 de OPG humaine avec la proline en position 25 étant substituée par l'alanine sous la commande du promoteur lux PR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 a été construite comme suit: les oligos synthétiques #1289-84 et #1289-85 ont été annelés pour former un duplex lieur oligo avec des extrémités cohésives XbaI et KpnI. Le duplex lieur synthétique utilisait des codons E. coli optimaux et codait une méthionine N-terminale. Le lieur incluait également un site de restriction SpeI qui n'était pas présent dans la séquence originale. Le duplex lieur a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites XbaI et KpnI dans pAMG21-huOPG-22- 401 en utilisant des méthodes standards. Le mélange de ligature a été introduit dans l'hôte E. coli GM221 par transformation. Des clones ont été initialement criblés pour la production de la protéine recombinante. L'ADN de plasmide a été isolé des clones positifs et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de HuOPG-Met[22-401](P25A). Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour engendrer le lieur XbaI KpnI: Oligo #1289-84 '-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TGC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC -3' (séquence nO 115) Oligo #1289-85 '- CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC TAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCA TAT GTT ATT CCT CCT T-3' (séquence n 116) X. OPG met[22-401] (P26A) et (P26D) humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N- terminale et les acides aminés 22 à 401 de OPG humaine avec la proline en position 26 étant substituée par l'alanine sous la commande du promoteur lux PR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 a été construite comme suit: des oligos synthétiques #1289-86 et #1289-87 ont été annelés pour former un duplex lieur oligo avec des extrémités cohésives XbaI et SpeI. Le duplex lieur synthétique utilisait des codons E. coli optimaux et codait une méthionine N-terminale. Le duplex lieur a été inséré, de façon directionnelle, entre les sites XbaI et SpeI dans pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) en utilisant des méthodes standards. Le mélange de ligature a été intro- duit dans l'hôte E. coli GM221 par transformation. Des clones ont été criblés initialement pour la production de la protéine recombinante. L'ADN de plasmide a été isolé des clones positifs et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de huOPG-met[22- 401] (P26A). Un des clones séquences a été trouvé posseder la proline en position 26 substituee par l'acide aspartique plutôt que l'alanine, et ce clone a été désigné par huOPG- met[22-401] (P26D). Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour engendrer le lieur XbaI - SpeI: Oligo #1289-86 ' - CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCC TGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA - 3' (séquence n 117) Oligo #1289-87 ' - CTA GTT TCT TCA TCA TAA TGA AGA TAT TTA GCA GGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT - 3' (séquence n 118) Y. OPG met[22-1941 (P25A) humaine Une séquence d'ADN codant pour une méthionine N-terminale et les acides aminés 22 à 194 de OPG humaine avec la proline en position 25 étant substituée par l'alanine sous la commande du promoteur lux PR dans le vecteur d'expression procaryote pAMG21 a été construite comme suit: les plasmides pAMG21- huOPG[27-194] et pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) ont été digérés chacun par les endonucléases KpnI et BamHI. Le fragment de 450 paires de bases a été isolé de pAMG21-huOPG[27-194] et le fragment de 6,1 kpb a été isolé de pAMG21-huOPG[22-401] (P25A). Ces fragments ont été ligaturés ensemble et intro- duits dans l'hôte E. coli GM221 par transformation. Des clones ont été initialement criblés pour la production de la protéine recombinante. L'ADN de plasmide a été isolé des clones positifs et le séquençage d'ADN a été réalisé pour vérifier la séquence d'ADN du gène de huOPG-Met[22- 194](P25A). EXEMPLE 9 Association de monomères de OPG Des cellules CHO traitées pour surexprimer muOPG [22-401] ont été utilisées pour engendrer des milieux conditionnés pour l'analyse de OPG recombinante sécrétée en utilisant des anticorps anti-OPG polyclonaux de lapin. Une aliquote de milieu conditionné a été concentrée 20 fois, puis analysée par SDS-PAGE réducteur et non-réducteur (figure 15). Dans des conditions réductrices, la protéine a migré comme un polypeptide Mr de 50-55 kd, comme cela serait prédit si le produit mature était glycosylé à un ou plus de ses sites de glycosylation concensus N-liés. De façon surprenante, quand les mêmes échantillons ont été analysés par SDS-PAGE non réducteur, la majorité de la protéine a migré comme un polypeptide d'approximativement 100 kd, deux fois la taille de la protéine réduite. De plus, il y avait une petite quantité du polypeptide Mr de 50-55 kd. Ce motif de migra- tion sur SDS-PAGE était cohérent avec la notion que le produit OPG était formé de dimères par oxydation d'un ou plusieurs groupes sulfhydryles libres. Le polypeptide OPG mature prédit contient 23 résidus de cystéine, 18 desquels sont prédits comme étant impliqués dans la formation de ponts de disulfure intrachaînes qui comprennent les quatre domaines riches en cystéine (figure 12A). Les cinq résidus de cystéine C-terminaux restants ne sont pas impliqués dans la structure secondaire qui peut être prédite en se basant sur l'homologie avec d'autres membres de la famille TNFR. Globalement, il existe un nombre net impair de résidus de cystéine, et il est formellement possible qu'au moins un des résidus soit libre pour former une liaison de disulfure intermoléculaire entre deux mono- mères de OPG. Pour aider à élucider les motifs de kinèse de OPG et l'asso- ciation de monomères, une étude de marquage par impulsion- chasse a été réalisée. Des cellules CHO exprimant muOPG [22-401] ont été marquées de façon métabolique comme décrit ci-dessus dans un milieu dépourvu de sérum contenant de la méthionine 35S et de la cystéine pendant 30 minutes. Après cette période, le milieu a été retiré et remplacé par du milieu complet contenant de la méthionine et de la cystéine non marquées à des taux approximativement 2000 fois en excès par rapport à la concentration originale des acides aminés radioactifs. A 30 minutes, 1 heures, 2 heures, 4 heures, 6 heures et 12 heures après l'addition, des cultures ont été récoltées par l'enlèvement du milieu conditionné, et des lysats du milieu conditionné et des monocouches adhérentes ont été préparés. Les milieux de culture et les lysats cellulaires ont été clarifiés comme décrit ci-dessus et, ensuite, immunoprécipités en utilisant des anticorps anti- OPG comme décrit ci-dessus. Après lavage des immunoprécipi- tés, ils ont été libérés par ébullition dans un tampon SDS-PAGE non-réducteur, puis séparés en deux moitiés égales. A une moitié, l'agent réducteur, le B-mercaptoéthanol, a été ajouté à une concentration finale de 5% (v/v), tandis que l'autre moitié était maintenue dans des conditions non réductrices. Les deux jeux d'immunoprécipités ont été analysés par SDS-PAGE comme décrit ci- dessus, puis traités pour l'autoradiographie et exposés à un film. Les résultats sont montrés sur la figure 16. Les échantillons analysés par SDS-PAGE réducteur sont montrés sur les deux panneaux inférieurs. Après synthèse, le polypeptide de OPG est rapidement traité en un polypeptide légèrement plus grand qui représente probablement la modification par la glycosyla- tion N-liée. Après approximativement 1-2 heures, le taux de OPG dans la cellule décroît dramatiquement, et elle appa- raît, de façon concomitante, dans la phase surnageante de la culture. Cela semble être le résultat du transport par vecteur de OPG de la cellule dans le milieu au cours du temps, cohérent avec la notion que OPG est une protéine naturellement sécrétée. L'analyse des mêmes immunoprécipités dans des conditions non réductrices révèle la relation entre la formation de dimères de OPG et la sécrétion dans le milieu conditionné (figure 16, panneaux supérieurs). Dans les 30-60 premières minutes, les monomères de OPG sont traités dans la cellule par glycosylation apparente, suivi par formation de dimères. Au cours du temps, le gros des monomères de OPG sont transformés en dimères, qui disparais- sent ensuite de la cellule. En commençant environ 60 minutes après la synthèse, les dimères de OPG apparaissent dans le milieu conditionné, et s'accumulent pendant la durée de l'expérience. Suivant cette période, des dimères de OPG sont formés, qui sont alors sécrétés dans le milieu de culture. Les monomères de OPG persistent à faible taux à l'intérieur de la cellule au cours du temps, et de petites quantités apparaissent également dans le milieu. Cela n'apparaît pas être le résultat d'une dissociation de dimères de OPG covalente, mais plutôt de la production de quantités sousstoechiométriques de monomères dans la cellule et une sécrétion subséquente. OPG produite de façon recombinante à partir de cellules CHO transfectées apparaît être de façon prédominante un dimère. Pour déterminer si la dimérisation est un processus naturel dans la synthèse de OPG, on a analysé le milieu conditionné d'une lignée cellulaire trouvée pour exprimer OPG naturelle- ment. La lignée cellulaire CTLL-2, une lignée cellulaire lymphocytique cytotoxique T de muriné (numéro d'accès ATCC TIB-214), a été trouvée exprimer l'ARNm de OPG dans un criblage d'ARN de lignée cellulaire et de tissu. Le trans- cript de OPG a été trouvé comme étant le même que l'ARN cloné et séquencé de 2,5-3,0 kb identifié à partir des reins et trouvé comme codant une molécule sécrétée. L'analyse de transfert de protéine du milieu conditionné obtenu à partir des cellules CTLL-2 montre que la plupart, sinon toute, de la protéine OPG sécrétée est un dimère (figure 17). Cela suggère que la dimérisation et la sécrétion de OPG n'est pas un artéfact de surexpression dans une lignée cellulaire, mais est probablement la forme principale du produit alors qu'il est produit par des cellules d'expression. Du sérum et des tissus de souris transgéniques et normales ont été analysés pour déterminer la nature de la molécule OPG exprimée chez des souris transgéniques OPG. Comme l'ADNc de OPG de rat était exprimé sous la commande d'un élément de commande des hépatocytes, des extraits réalisés à partir du parenchyme de souris témoins et transgéniques dans des conditions non réductrices ont été analysés (figure 18). Dans des extraits de souris transgéniques, mais non chez les témoins, des dimères de OPG ont été facilement détectés, ainsi que des quantités sous-stoechiométriques de monomères. Les monomères et les dimères de OPG apparaissaient identi- ques à la protéine de muriné recombinante exprimée dans les cellules CHO génétiquement traitées. Cela suggère fortement que les dimères de OPG sont en fait une forme naturelle du produit génétique, et sont probablement des composants actifs clés. Des échantillons de sérum obtenus à partir de souris témoins et transgéniques ont été, de façon similaire, analysés par analyse de transfert de protéine. Chez les souris témoins, la majorité de la protéine OPG migre comme un dimère, tandis que de petites quantités de monomère sont également détectées. De plus, des quantités significatives d'une protéine plus grande apparentée à OPG sont détectées, laquelle migre avec une masse moléculaire relative cohérente avec la taille prédite d'un trimère lié de façon covalente. Ainsi, OPG recombinante est exprimée de façon prédominante comme une protéine dimère chez des souris transgéniques OPG, et la forme dimère peut être la base pour le phénotype ostéopétrotique chez des souris OPG. La protéine recombi- nante OPG peut également exister sous des formes "trimêres" de poids moléculaire plus élevé. Pour déterminer si les cinq résidus C-terminaux de cystéine de OPG jouent un rôle dans l'homodimérisation, les codons de OPG de muriné pour les résidus de cystéine 195 (C195), C202, C277, C319 et C400 ont été changes en sérine en utilisant le QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (marque déposée) (Stratagene, San Diego, CA) comme décrit ci-dessus. Le gène de muOPG a été sous-cloné entre les sites Not I et Xba I du vecteur pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). Le plasmide résultant, pcDNA3.1-muOPG, et les amorces mutagènes ont été traités avec la polymérase Pfu en présence de désoxynucléotides, puis amplifiés dans un thermocycliseur comme décrit ci-dessus. Une aliquote de la réaction a été transfectée dans E. coli XL1-Blue compétente par choc thermique, puis plaquée. L'ADN de plasmide à partir des transformants a été alors séquencé pour vérifier les muta- tions. Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de cystéine 195 en sérine du gène de OPG de muriné, résultant dans la production d'une protéine muOPG[22-401] C195S: 1389-19: ' -CAC GCA AAA GTC GGG AAT AGA TGT CAC-3' (séquence n 150) 1406-38: ' -GTG ACA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3' (séquence n 151) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de cystéine 202 en sérine du gène de OPG de muriné, résultant dans la production d'une protéine muOPG[22-401] C202S: 1389-21: * ' -CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3' (séquence n 152) 1389-22: ' -GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3' (1389-22) (séquence n 153) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de cystéine 277 en sérine du gène de OPG de muriné, résultant dans la production d'une protéine muOPG [22-401] C277S: 1389-23: ' -TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3' (séquence n 154) 1389-24: 5' -TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3' (séquence n 155) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer le codon pour le résidu de cystéine 319 en sérine du gène de OPG de muriné, résultant dans la production d'une protéine muOPG [22-401] C319S: 1389-17: ' -CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3' (séquence n 156) 1389-18: 5' -CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3' (séquence n 157) Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour changer de codon pour le résidu de cystéine 400 en sérine du gène de OPG de muriné, résultant dans la production d'une protéine muOPG [22-401] C400S: 1406-72: ' -CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TAG GAA TGG-3' (séquence n 158) 1406-75: 5' -CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3' (séquence n 159) Chaque plasmide résultant de muOPG [22-401] contenant la mutation appropriée a été alors tranfecté dans des cellules humaines 293, la protéine de fusion OPG-Fc mutante a été purifiée à partir du milieu conditionné comme décrit ci- dessus. L'activité biologique de chaque protéine a été déterminée par le test de formation d'ostéoclastes in vitro décrit dans l'exemple 11. Le milieu conditionné & partir de chaque transfectant a été analysé par SDSPAGE non réducteur et transfert de protéine avec des anticorps anti-OPG. La mutation de l'un quelconque des cinq résidus de cystéine C-terminaux a pour conséquence la production de molécules de OPG de 55 kd monomères de façon prédominante (>90%). Cela suggère fortement que les résidus de cystéine C-terminaux jouent ensemble un rôle dans l'homodimérisation de OPG. Des mutants de délétion de OPG C-terminaux ont été cons- truits pour cartographier la ou les régions du domaine C-terminal de OPG qui sont importantes pour l'homodimérisa- tion de OPG. Ces mutants de OPG ont été construits par amplification PCR utilisant des amorces qui introduisent des signaux de traduction d'arrêt prématurés dans la région C-terminale de OPG de muriné. L'oligo 5' a été conçu au codon de départ de muOPG (contenant un site de restriction HindIII) et les oligonucléotides 3' (contenant un codon d'arrêt et un site XhoI) ont été conçus pour tronquer la région C- terminale de muOPG s'achevant à soit le résidu de thréonine 200 (CT 200), proline 212 (CT212), acide glutami- que 293 (CT-293) ou sérine 355 (CT-355). Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire muOPG [22-200]: 1091-39: ' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (séquence n 160) 1391-91: ' -CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT TGC GTG GC-3' (1391-91) (séquence n 161) Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire muOPG [22-212]: 1091-39: ' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (sequence n 162) 1391-90: ' -CCT CTC TCG AGT CAA GGA ACA GCA AAC CTG AAG AAG GC -3' (séquence n 163) Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire muOPG [22-293]: 1091-39: ' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (séquence n 164) 1391-89: 5' -CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG CC-3' (séquence n 165) Les amorces suivantes ont été utilisées pour construire muOPG [22-355]: 1091-39: 5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (séquence n 166) 1391-88: '-CCT CTC TCG AGT CAG GAT GTT TTC AAG TGC TTG AGG GC-3' (séquence n 167) Chaque plasmide muOPG-ct résultant contenant la troncature appropriée a été alors transfecté dans des cellules humaines 293, la protéine de fusion OPG-Fc mutante a été purifiée à partir du milieu conditionné comme décrit ci-dessus. L'acti- vité biologique de chaque protéine a été déterminée par le test de formation d'ostéoclastes in vitro décrit dans l'exemple 11. Les milieux conditionnés ont été également analysés par SDS-PAGE non réducteur et transfert de protéine en utilisant des anticorps anti-OPG. La troncature de la région C-terminale de OPG affecte la capacité de OPG à former des homodimères. CT 355 est monomè- re de façon prédominante, bien que quelques dimères soient formés. CT 293 forme ce qui apparaît être des quantités molaires égales de monomères et de dimères, et également des aggrégats de poids moléculaire élevé. Cependant, CT 212 et CT 200 sont monomères. EXEMPLE 10 Purification de OPG A. Purification de protéines de fusion OPG de mammifère-Fc L de milieu conditionné à partir de cellules 293 exprimant une protéine de fusion OPG-Fc ont été préparés comme suit. Un échantillon congelé de cellules a été décongelé dans 10 ml de milieu 293S (glucose à forte teneur en DMEM, L- glutamine lx, sérum bovin foetal inactivé à la chaleur à 10% (FBS) et 100 pg/ml d'hygromycine, et nourri avec du milieu frais après un jour. Après trois jours, les cellules ont été séparées en deux flacons T175 à des dilutions 1:10 et 1:20. Deux dilutions supplémentaires 1:10 ont été réalisées pour faire monter à 200 les flacons T175. A ce moment, les cellules étaient à cinq jours après la décongélation. Les cellules ont été cultivées à approximativement la confluence (environ trois jours) auquel moment du milieu contenant du sérum a été aspire, les cellules ont été lavées une fois avec 25 ml de PBS par flacon et 25 ml de milieu SF (glucose à teneur élevée en DMEM, L-glutamine lx) ont été ajoutés à chaque flacon. Les cellules ont été maintenues à 5% de CO2 pendant trois jours auquel moment le milieu a été récolté, centrifugé et filtré à travers des filtres de nitrate de cellulose 0,45 m (Corning). Les protéines de fusion OPG-Fc ont été purifiées en utili- sant une colonne Protein G Sepharose (Pharmacia) équilibrée dans PBS. La taille de la colonne variait selon le volume du milieu de départ. Le milieu conditionné préparé comme décrit ci-dessus a été chargé dans la colonne, la colonne lavée par PBS, et la protéine pure a été éluée en utilisant de la glycine 100 mM, pH 2,7. Les fractions ont été recueillies dans des tubes contenant Tris 1M pH 9,2, de façon à neutra- liser aussi rapidement que possible. Les fractions contenant la protéine ont été recueillies, concentrées dans soit un Amicon Centricon 10 ou Centriprep 10, et diafiltrées dans PBS. La protéine pure est stockée à -80 C. [22-401] de muriné-Fc, [22-180] de muriné-Fc, [22-194] de muriné-Fc, [22401] humaine-Fc et [22-201] humaine-Fc ont été purifiées par cette procédure. [22-185] de muriné-Fc est purifiée par cette procédure. B. Préparation d'anticorps anti-OPG Trois lapins blancs de NouvelleZélande (poids initial de -8 livres) ont été injectés de façon souscutanée par la protéine de fusion muOPG[22-401]-Fc. Chaque lapin a été immunisé au jour 1 avec 50 pg d'antigène émulsifié dans un volume égal de l'adjuvant complet de Freunds. D'autres rappels (jours 14 et 28) ont été réalisés par la même procédure avec la substitution de l'adjuvant incomplet de Freunds. Les titrages d'anticorps ont été contrôlés par EIA. Après le second rappel, les antisérums ont révélé des titres d'anticorps élevés et des saignées de 25 ml ont été obtenues à partir de chaque animal. On a fait tout d'abord passer les sérums sur une colonne par affinité, sur laquelle OPG-Fc de muriné avait été immobilisée. Les anticorps anti-OPG ont été élués avec Pierce Gentle Elution Buffer contenant de l'acide acétique glacial à 1%. La protéine éluée a été alors dialy- sée dans PBS et passée sur une colonne Fc pour retirer tout anticorps spécifique pour la partie Fc de la protéine de fusion de OPG. Les fractions passantes contenant les anti- corps spécifiques anti-OPG ont été dialysées dans PBS. C. Purification de OPG[22-4011 de muriné Chromatoqraphie par affinité d'anticorps Des anticorps anti-OPG purifiés par affinité ont été diafiltrés dans un tampon de couplage (carbonate de sodium 0,1M, pH 8, 3, NaCl 0,5M), et mélangés à des perles de Sepharose CNBr-activées (Pharmacia) pendant deux heures à température ambiante. La résine a alors été lavée avec le tampon de couplage de façon intensive avant le blocage du site non occupé par de l'éthanolamine 1M (pH 8,0) pendant deux heures à température ambiante. La résine a alors été lavée avec un milieu de lavage à faible pH (acétate de sodium 0,1M, pH 4,0, NaCl 0,5M), suivi par un milieu de lavage à fort pH (Tris-HCl 0,1M, pH 8,0, NaCl 0,5M). Les derniers lavages ont été répétés trois fois. La résine a été finalement équili- brée par PBS avant d'être disposée dans une colonne. Une fois mise en place, la résine a été lavée avec PBS. Une élution à vide a été réalisée avec glycine-HCl 0,1M, pH 2,5, suivi par rééquilibrage avec PBS. Du milieu conditionné concentré à partir de cellules CHO exprimant muOPG[22-401] a été appliqué à la colonne à un faible débit. La colonne a été lavée avec PBS jusqu'à ce que l'absorbance UV mesurée à 280 nm retourne à la ligne de base. La protéine a été éluée à partir de la colonne tout d'abord avec glycine-HCl 0,1M (pH 2,5), rééquilibrée avec PBS, et éluée avec un second tampon (CAPS 0,1M, pH 10,5, NaCl 1M). Les deux lots d'élution ont été diafiltrés séparé- ment dans PBS et filtrés de façon stérile avant congélation à -20 C. Chromatographie usuelle Du milieu conditionné de cellules CHO a été concentré 23x dans une cartouche enroulée en spirale Amicon (SlOY10) et diafiltré dans Tris 20mM, pH 8,0. Le milieu diafiltré a été alors appliqué à une colonne Q-Sepharose HP (Pharmacia), qui avait été équilibrée par Tris 20mM, pH 8,0. La colonne a été alors lavée jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm atteigne la ligne de base. La protéine a été éluée avec un gradient de volumes de colonne de NaCl de 0-300mM dans Tris pH 8,0. La protéine OPG a été détectée en utilisant un transfert de protéine des fractions de colonne. Des fractions contenant OPG ont été rassemblées et amenées à une concentration finale de NaCl 300mM, DTT 0,2mM. Une colonne NiNTA Superose (Qiagen) a été équilibrée avec Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, DTT 0,2mM, après quoi les fractions rassemblées ont été appliquées. La colonne a été lavée par un tampon d'équilibrage jusqu'à ce que l'absor- bance de la ligne de base soit atteinte. Les protéines ont été éluées de la colonne avec un gradient d'imidazole 0-30mM dans le tampon d'équilibrage. Les protéines restantes ont été lavées de la colonne avec de l'imidazole 1M. A nouveau, un transfert de protéine a été utilisé pour détecter les fractions contenant OPG. Les fractions recueillies à partir de la colonne NiNTA ont été dialysées dans du phosphaste de potassium lOmM pH 7,0, DTT 0,2mM. Le lot dialysé a été alors appliqué à une colonne céramique d'hydroxyapatite (Bio-Rad) qui avait été équili- brée dans du tampon de phosphate lOmM. Après lavage de la colonne, la protéine a été éluée avec un gradient de phos- phate de potassium 10-lOOmM sur 20 volumes de colonne. Cela a alors été suivi par un gradient de 20 volumes de colonne de phosphate 100-400mM. OPG a été détectée par coloration par bleu de Coomassie de gels de polyacrylamide-SDS et par transfert de protéine. Les fractions ont été rassemblées et diafiltrées sur PBS et congelées à -80 C. La protéine purifiée est sous forme de monomère et demeurera ainsi après diafiltration dans PBS. Le monomère est stable quand il est stocké sous forme congelée ou à pH 5 à 4 C. Cependant, s'il est stocké à 4 C dans PBS, des dimères et ce qui apparaît être des trimères et des têtramères se formeront après une semaine. l0 D. Purification de OPG met[22-4011 humaine à partir de E. coli La pâte cellulaire bactérienne a été suspendue dans EDTA mM à une concentration de 15% (p/v) en utilisant un homogénéisateur à faible cisaillement à 5 C. Les cellules ont alors été brisées par deux homogénéisations à 15 000 psi chaque à 5 C. L'homogénéisat résultant a été centrifugé à 5000 x g pendant 1 heure à 5 C. La boulette centrifugée a été lavée par homogénéisation à faible cisaillement dans de l'eau au volume d'homogénéisation original, suivi par centrifugation comme précédemment. La boulette lavée a été alors solubilisée à 15% (p/v) par une solution de (concentration finale) guanidine-HCl 6 M, dithiothréitol 10 mM, TrisHCl 10 mM, pH 8,5, à température ambiante pendant 30 minutes. Cette solution a été diluée 30 fois dans de l'urée 2M contenant CAPS 50 mM, pH 10,5, de la glutathione réduite 1 mM et, ensuite, agitée pendant 72 heures à 5 C. OPG a été purifiée à partir de cette solution à 25 C par, tout d'a- bord, ajustement à pH 4,5 avec de l'acide acétique et, ensuite, chromatographie sur une colonne de résine SP-HP Sepharose équilibrée par de l'acétate de sodium 25 mM, pH 4,5. L'élution sur la colonne a été menée avec un gradient de chlorure de sodium linéaire de 50 mM à 550 mM dans le même tampon en utilisant 20 volumes de colonne à un débit de 0,1 volume de colonne par minute. Les fractions de pic contenant seulement la forme de OPG souhaitée ont été rassemblées et stockées à 5 C ou échangées par tampon dans une solution saline tamponnée au phosphate, concentrées par ultrafiltration, et ensuite stockées à 5 C. Cette matière a été analysée par test de lysat de limulus amébocyte, SDS- PAGE, chromatographie liquide à haute pression en phase inverse, en ce qui concerne la présence d'endotoxine, et séquençage N-terminal. De plus, des techniques telles que la spectrométrie de masse, la stabilité pH/température, la fluorescence, le dichroïsme circulaire, la calorimétrie par balayage différentiel, et des tests de profilage de pro- téase, peuvent être également utilisées pour examiner la nature pliée de la protéine. EXEMPLE 1il Activité biologique de OPG recombinante En se basant sur l'histologie et l'histomorphométrie, il apparaît que la surexpression hépatique de OPG chez les souris transgéniques diminue de façon marquée le nombre des ostéoclastes, entraînant une augmentation marquée des tissus osseux (voir l'exemple 4). Pour examiner encore le ou les mécanismes potentiels soutenant cet effet in vivo, différen- tes formes de OPG recombinante ont été testées dans un modèle de culture in vitro de formation d'ostéoclastes (test de formation d'ostéoclastes). Ce système de culture a été originellement conçu par Udagawa (Udagawa et al. Endocrino- logy 125, 1805-1813 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7260-7264 (1990)) et emploie une combinaison de cellules de moelle osseuse et de cellules à partir des lignées cellulai- res stromales de moelle osseuse. Une description de la modification de ce système de culture utilisé pour ces études a été précédemment publiée (Lacey et al. Endocrino- logy 136, 2367-2376 (1995)). Dans cette méthode, des cellu- les de moelle osseuse, drainées à partir de fémurs et tibias de souris, sont cultivées toute la nuit dans des milieux de culture (alpha MEM avec du sérum bovin foetal inactivé à la chaleur à 10%) complétés par 500 U/ml CSF-1 (facteur de stimulation de colonies 1, également dénommé M- CSF), un facteur de croissance hématopoïétique spécifique pour les cellules du lignage des familles monocytes/macrophages. Suivant cette incubation, les cellules non-adhérentes sont recueillies, soumises à une purification par gradient, et ensuite cocultivées avec des cellules provenant de la lignée cellulaire de moelle osseuse ST2 (1 x 10 cellules non- adhérentes: 1 x 105 ST2/ml de milieu). Le milieu est complété par de la dexaméthasone (100 nM) et le métabolite biologiquement actif de la vitamine D3 connu comme la 1,25 dihydroxyvitamine D3 (1,25 (OH)2 D3, 10 nM). Pour favoriser l'apparition des ostéoclastes, la prostaglandine E2 (250 nM) est ajoutée à certaines cultures. La période de coculture varie habituellement de 8-10 jours et le milieu, avec tous les compléments fraîchement ajoutés, est renouvelé tous les 3-4 jours. A différents intervalles, les cultures sont évaluées en ce qui concerne la présence du phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP) en utilisant soit une colora- tion histochimique (Sigma Kit # 387A, Sigma, St. Louis, MO), soit le test de solution TRAP. Le procédé histochimique TRAP permet l'identification des ostéoclastes de façon phénotypi- que qui sont des cellules à noyaux multiples (trois noyaux ou plus) qui sont aussi TRAP+. Le test de solution implique la lyse des cultures contenant les ostéoclastes dans un tampon de citrate (100 mM, pH 5,0) contenant du Triton X-100 à 0,1%. L'activité du phosphatase acide résistant au tartra- te est alors mesurée en se basant sur la conversion du pnitrophénylphosphate (20 nM) en p-nitrophénol en présence de tartrate de sodium à 80 mM, ce qui se produit pendant une incubation de 3 à 5 minutes à température ambiante. La réaction est terminée par l'addition de NaOH à une concen- tration finale de 0,5 M. La densité optique à 405 nm est mesurée et les résultats sont notés. Des études précédentes (Udagawa et al. ibid) utilisant le test de formation des ostéoclastes ont démontré que ces cellules expriment des récepteurs pour la 125I-calcitonine (autoradiographie) et peuvent réaliser des cavités sur les surfaces osseuses qui, quand cela est combiné à la positivi- té TRAP, confirme que les cellules à noyaux multiples présentent un phénotype d'ostéoclaste. Une preuve supplémen- taire supportant le phénotype d'ostéoclaste des cellules à noyaux multiples qui apparaissent in vitro dans le test de formation des ostéoclastes, est que les cellules expriment des intégrines av et B3 par immunocytochimie et le récepteur de calcitonine et l'ARNm de TRAP par hybridation in situ (ISH). La fusion huOPG [22-401]-Fc a été purifiée à partir de milieux conditionnés de cellules CHO et, ensuite, utilisée dans le test de formation des ostéoclastes. A 100 ng/ml de huOPG [22-401]-Fc, la formation des ostéoclastes était inhibée virtuellement à 100% (figure 19A). Les taux de TRAP mesurés dans les cultures lysées dans des puits de plaque de microtitrage étaient également inhibés en présence de OPG avec ID50 d'approximativement 3 ng/ml (figure 20). Le taux d'activité TRAP dans les lysats apparaissait être corrélé avec le nombre relatif d'ostéoclastes observés par cytochi- mie TRAP (comparer les figures 19A-19G et 20). IgGl et TNFbp humaines purifiées ont été également testées dans ce modèle et on a trouvé qu'elles ne présentaient aucun effet inhibi- teur ou stimulateur suggérant que les effets inhibiteurs de huOPG [22401]-Fc étaient dus à la partie OPG de la protéine de fusion. Les formes additionnelles des molécules de muriné et humaine ont été testées et les données cumulatives sont résumées dans le tableau I. Tableau 1 Effets de différentes formes de OPG sur la formation in vitro d'ostéoclastes Construction OPG Bioactivité relative in vitro muOPG [22-401]-Fc +++ muOPG [22-194]-Fc +++ muOPG [22-185]-Fc ++ muOPG [22-180]-Fc muOPG [22-401] +++ muOPG [22- 401] C195 +++ muOPG [22-401] C202 + muOPG [22-401] C277 muOPG [22-401] C319 + muOPG [22-401] C400 + muOPG [22-185] muOPG [22- 194] ++ muOPG [22-200] ++ muOPG [22-212] muOPG [22-293] +++ muOPG [22-355] +++ huOPG [22-401]-Fc +++ huOPG [22-201]-Fc +++ huOPG [22-401]-Fc P26A +++ huOPG [22-401]-Fc Y28F +++ huOPG [22-401] +++ huOPG [27- 401]-Fc ++ huOPG [29-401]-Fc ++ huOPG [32-401]-Fc +/- +++, ED50 = 0,4-2 ng/ml ++, ED50 = 2-10 ng/ml + ED50 = 10-100 ng/ml -, ED50 ED > 100 ng/ml Les données cumulatives suggèrent que les séquences d'acides aminés 22-401 de OPG de muriné et humaine sont totalement actives in vitro, qu'elles soient fusionnées au domaine Fc ou non fusionnées. Elles inhibent d'une manière dépendante de la dose et possèdent des activités demi-maximales dans le domaine de 2-10 ng/ml. La troncature de la terminaison C de muriné au résidu de thréonine 180 inactive la molécule, tandis que des troncatures au niveau de la cystéine 185 et au-delà ont une activité complète. Le résidu de cystéine situé en position 185 est prédit pour former une liaison SS3 dans la région de domaine 4 de OPG. L'enlèvement de ce résidu dans d'autres protéines apparentées à TNFR s'est précédemment révélé comme supprimant l'activité biologique (Yan et al. J. Biol. Chem. 266, 12099-12104 (1994)). On a trouvé que muOPG[22-180]-Fc est inactive tandis que muOPG[22-185]-Fc est active, cela étant cohérent avec les découvertes précédentes. Cela suggère que les résidus d'acides aminés 22-185 définissent une région pour l'activi- té de OPG. Ces découvertes indiquent que, comme OPG exprimée de façon transgénique, la protéine OPG recombinante inhibe également la formation des ostéoclastes comme testé dans le test de formation des ostéoclastes. Des expériences au cours du temps examinant l'apparition des cellules TRAP+, des cellu- les B133+, des cellules F480+ dans des cultures continuelle- ment exposées à OPG démontrent que OPG bloque l'apparition des cellules TRAP+ et B3+, mais non des cellules F480+. Au contraire, les cellules TRAP+ et B3+ commencent à apparaître aussi tôt que 4 jours après l'établissement de la culture dans des cultures témoins. Seules les cellules 480+ peuvent être trouvées dans des cultures traitées par OPG et elles apparaissent être présentes, qualitativement, aux mêmes nombres que les cultures témoins. Ainsi, le mécanisme des effets de OPG in vitro apparaît impliquer un blocage dans la différenciation des ostéoclastes à une étape au-delà de l'apparition des monocytes-macrophages mais avant l'appari- tion des cellules exprimant soit les intégrines TRAP ou B3. Collectivement, ces découvertes indiquent que OPG n'inter- fère pas avec la croissance générale et la différenciation des précurseurs de monocytes-macrophages à partir de la moelle osseuse, mais suggère plutôt que OPG bloque de façon spécifique la différenciation sélective des ostéoclastes à partir des précurseurs de monocytes-macrophages. Pour déterminer plus spécifiquement quand, dans la voie de différenciation des ostéoclastes, cette OPG était inhibi- trice, une variation de la méthode de culture in vitro a été employée. Cette variation, décrite par Lacey et al. ci- dessus, utilise des macrophages de moelle osseuse comme précurseurs d'ostéoclastes. Les précurseurs d'ostéoclastes sont dérivés en prélevant les cellules de moelle osseuse non-adhérentes après une incubation toute la nuit dans CSF-1/M-CSF, et en cultivant les cellules pendant encore 4 jours avec 1000-2000 U/ml de CSF-1. Apres 4 jours de cul- ture, dénommés la phase de croissance, les cellules non- adhérentes sont retirées. Les cellules adhérentes, qui sont des macrophages de la moelle osseuse, peuvent alors être exposées pendant jusqu'à 2 jours à différents traitements en présence de 1000-2000 U/ml de CSF-1. Cette période de 2 jours est dénommée la période de différenciation intermé- diaire. Ensuite, les couches cellulaires sont à nouveau rincées et, alors, des cellules ST-2 (1 x 10 cellules par ml), de la dexaméthasone (100 nM) et 1,25 (OH) 2 D3 (10 nM) sont ajoutées pour les derniers 8 jours pour ce qui est appelé la période de différenciation terminale. Des agents de test peuvent être également ajoutés pendant cette période terminale. L'acquisition de marqueurs phénotypiques de la différenciation des ostéoclastes est obtenue pendant cette période terminale (Lacey et al. ibid). HuOPG [22-401]-Fc (100 ng/ml) a été testée concernant ses effets sur la formation des ostéoclastes dans ce modèle en l'ajoutant pendant soit les périodes intermédiaires, termi- nale ou, de façon alternative, les deux périodes de diffé- renciation. On a réalisé à la fois des tests de solution TRAP et de cytochimie TRAP. Les résultats du test de solu- tion sont montrés sur la figure 21. HuOPG [22-401]-Fc inhibait l'apparition de l'activité TRAP quand elle était ajoutée à, à la fois, les phases de différenciation intermé- diaire et terminale ou seulement à la phase de différencia- tion terminale. Quand elle est ajoutée à la phase intermé- diaire et ensuite retirée des cultures par rinçage, huOPG [22-401]-Fc ne bloque pas l'apparition de l'activité TRAP dans les lysats de culture. Les résultats cytochimiques sont parallèles aux données du test de solution. Collectivement, ces observations indiquent que huOPG [22-401]Fc a seulement besoin d'être présente pendant la période de différenciation terminale pour qu'elle exerce tous ses effets supresseurs sur la formation des ostéoclastes. B. Expériences comparatives in vivo sur IL1-a et IL1-B ILl augmente la résorption osseuse à la fois de façon systémique et localement quand elle est injectée de façon sous-cutanée sur le sinciput de souris (Boyce et al., Endocrinology 125, 1142-1150 (1989)). Les effets systémiques peuvent être évalués par le degré d'hypercalcémie et les effets locaux, de façon histologique, en évaluant la gran- deur relative de la réponse engendrée par les ostéoclastes. Le but de ces expériences était de déterminer si muOPG [22-401]-Fc recombinante pouvait modifier les actions locales et/ou systémiques de ILl quand elle est injectée de façon sous-cutanée sur la même région du sinciput que IL1. Expérience IL-1-3 Des souris mâles (blanches suisses ICR) âgées de 4 semaines ont été divisées en les groupes de traitement suivants (5 souris par groupe): groupe témoin: animaux traités par IL1 (les souris ont reçu une injection par jour de 2,5 Mg de IL1-B13); des animaux traités par une faible dose de muOPG [22-401]-Fc, les souris ont reçu trois injections par jour de 1 pg de muOPG [22-401]-Fc; muOPG [22- 401]-Fc et IL1-8 à faible dose; des animaux traités par muOPG [22-401]- Fc à haute dose (les souris reçoivent trois injections par jour de 10 pg de muOPG [22-401]-Fc); muOPG [22-401]-Fc et IL1-B à haute dose. Toutes les souris ont reçu le même nombre l0 total d'injections de soit le facteur actif, soit le véhi- cule (de l'albumine de sérum bovin à 0,1% dans une solution saline tamponnée au phosphate). Tous les groupes sont sacrifiés le jour après la dernière injection. Les poids et les taux de calcium ionisé du sang sont mesurés avant les premières injections, quatre heures après la seconde injec- tion, et 24 heures après la troisième injection de IL1, juste avant que les animaux soient sacrifiés. Apres le sacrifice, les sinciputs sont retirés et traités pour sectionnement dans de la parafine. Expérience ILl-a Des souris mâles (blanches suisses ICR) âgées de quatre semaines ont été divisées en les groupes de traitement suivants (5 souris par groupe): groupe témoin: animaux traités par ILi alpha (les souris ont reçu une injection par jour de 5 pg de ILl-a); des animaux traités par muOPG [22-401]-Fc à faible dose (les souris ont reçu une injection par jour de 10 mg de muOPG [22-401]-Fc); muOPG [22-401]-Fc et ILl alpha à faible dose, (dosage comme ci-dessus); des animaux traités par muOPG [22-401]-Fc à forte dose (les souris ont reçu trois injections par jour de 10 mg de muOPG [22-401]-Fc); muOPG [22-401]-Fc et IL1-a à forte dose. Toutes les souris ont reçu le même nombre d'injections par jour de soit le facteur actif, soit le véhicule. Tous les groupes ont été sacrifiés le jour après la dernière injec- tion. Les taux de calcium ionisé du sang ont été mesurés avant la première injection, quatre heures après la seconde injection, et 24 heures après la troisième injection de IL1, juste avant que les animaux soient sacrifiés. Les poids des animaux ont été mesurés avant la première injection, 4 heures après la seconde injection, et 24 heures après la troisième injection de ILl juste avant que les animaux soient sacrifiés. Apres le sacrifice, les sinciputs ont été retirés et traités pour sectionnement dans de la parafine. Méthodes histologiques Des échantillons osseux de sinciput ont été fixés dans de la formaline de zinc, décalcifiés dans de l'acide formique, déshydratés par de l'éthanol et montés sur de la parafine. Des sections (5pm d'épaisseur) ont été découpées à travers le sinciput de façon adjacente à la suture lambdoïde et colorées avec soit de l'hématoxyline soit de l'éosine ou on les a fait réagir concernant l'activité du phosphatase acide résistant au tartrate (Sigma Kit# 387A) et elles ont été colorées par de l'hématoxyline. La résorption osseuse a été évaluée chez les souris traitées par ILl-a par des méthodes hystomorphométriques, en utilisant Osteomeasure (Osteome- trics, Atlanta, GA), en traçant des caractéristiques histo- logiques sur un plateau de convertisseur analogique-numéri- que utilisant une fixation transparente de caméra montée sur microscope. Les nombres d'ostéoclastes, les surfaces revê- tues d'ostéoclastes et les surfaces érodées ont été détermi- nés dans les espaces de moelle du sinciput. Les côtés injecté et non injecté du sinciput ont été mesurés de façon séparée. Résultats ILl-a et ILl-13 ont produit de l'hypercalcémie aux doses utilisées, en particulier le second jour, sans doute par l'induction, de façon systémique, d'une résorption osseuse accrue. La réponse hypercalcémique a été bloquée par muOPG [22-401]-Fc chez les souris traitées par ILl- bêta et a diminué, de façon significative, chez les souris traitées par ILl-alpha, un effet le plus apparent au jour 2 (figures 22A-22B). L'analyse histologique des sinciputs de souris traitées par ILl-alpha et bêta montre que les traitements par ILl seul produisent une augmentation marquée dans les indices de résorption osseuse incluant: le nombre d'ostéoclastes, la surface revêtue d'ostéoclastes et la surface érodée (surfa- ces montrant une profonde dentelure due à l'action ostéo- plastique (figure 23B, tableau 2)). En réponse à IL1-a ou ILl-B, les augmentations de la résorption osseuse ont été semblables sur les côtés injecté et non injecté du sinciput. Des injections de muOPG [22-401]-Fc ont réduit la résorption osseuse à la fois chez les souris traitées par IL1-alpha et bêta et chez les souris recevant le véhicule seul, mais cette réduction était observée seulement sur les côtés injectés par muOPG [22-401]-Fc des sinciputs. L'explication la plus probable pour ces observations est que muOPG [22-401]-Fc inhibe la résorption osseuse, une conclu- sion supportée par la réduction d'à la fois le nombre total d'ostéoclastes et le pourcentage de surface osseuse disponi- ble subissant la résorption osseuse, dans la région du sinciput adjacent aux sites d'injection de muOPG [22-401]- Fc. Les actions de muOPG [22-401]-Fc apparaissaient être les plus marquées localement par histologie, mais le fait que muOPG [22-401]-Fc diminue également l'hypercalcémie induite par IL1 suggère que muOPG [22- 401]-Fc a des effets plus subtils sur la résorption osseuse, de façon systémique. Tableau 2. Effets de OPG sur des variables de résorption osseuse chez des souris ayant subi une injection de IL-1 Surface ostéoclastes Surface érodée Nombre d'ostéoclastes/mm2 % surface osseuse % surface osseuse surface tissu (moyenne déviation standard) (moyenne déviation standard) (moyenne déviation standard) Expérience 1 côté non injecté Côté injecté Côté non injecté Côté injecté Côté non injecté Côté injecté Témoin 12,36 3,44 9,54 2,46 8,07 3,90 9,75 3,16 32,51 11,09 23,50 10,83 IL1-B (2, 5pg/j) 17,18 1,30 16,40 2,16 40,66 4,28 37,53 10,28 71,80 18,76 60,89 5,16 OPG (40pg/j) 10,12 3,71 5,04 1,66 9,73 4,33 4,19 3,61 32,73 11,09 15,24 7,54 OPG+IL1-B 18,61 2,46 # 13,26 2,50 44,87 8,63 # 25,94 6,82 69,42 36,29 # 47,13 24,26 Expérience 2 Témoin 11,56 4,22 11,95 2,97 12,67 5,04 10,03 5,13 51,72 23,93 56,03 30,70 IL1-a (5pg/j) 28,81 4,84 23,46 5,76 37,51 5,16 41,10 12,53 113,60 18,04 102,70 32,09 OPG (40pg/j) 14,40 1, 00 # 4,26 2,54 11,55 4,14 # 4,29 3,16 72,28 14,11 # 22,65 16,68 OPG+IL1-a 29,58 8,80 # 17,83 3,34 33,66 9,21 # 24,38 8,88 146,10 42,37 # 66,56 15,62 # Différent au côté non injecté p radiographiées avant le traitement, au jour 7 et au jour 14. Les souris ont été sacrifiées 24 heures après l'injection finale. Le fémur droit a été retiré, fixé dans de la forma- line de zinc, décalcifié dans de l'acide formique et noyé dans de la parafine. Des sections ont été découpées à travers la région centrale de la métaphyse fémorale distale et de la tige fémorale. La densité osseuse, par histomorpho- métrie, a été déterminée dans six régions adjacentes s'éten- dant de la limite de la métaphyse de la plaque de crois- * sance, à travers les parties spongieuses primaire et secon- daire et dans la diaphyse fémorale (tige). Chaque région était de 0,5 x 0,5 mm2. Changements radiographiques Apres sept jours de traitement, il existait une preuve d'une zone de densité osseuse accrue dans les régions spongieuses associées aux plaques de croissance chez les souris traitées par OPG par rapport à ce qui était observé chez les témoins. Les effets étaient particulièrement frappants dans les métaphyses distales du fémur et les métaphyses proximales du tibia (figures 24A-24B). Cependant, des bandes de densité accrue étaient également évidentes dans les corps verté- braux, la crête iliaque et le tibia distal. Au 14ème jour, les régions d'opacité s'étaient encore étendues dans les tiges du fémur et du tibia bien que l'intensité de la radio-opacité avait diminué. De plus, il n'y avait aucune différence dans la longueur des fémurs à l'achèvement de l'expérience ou dans le changement en longueur sur la durée de l'expérience impliquant que OPG n'altère pas la crois- sance osseuse. Changements histologiques La métaphyse distale du fémur montrait une densité osseuse accrue dans une région à une distance de 1,1 à 2,65 mm de la plaque de croissance (figures 25 et 26A-26B). C'est une région o l'os est rapidement éliminé par résorption osseuse engendrée par les ostéoclastes chez les souris. Chez ces jeunes souris à croissance rapide, l'augmentation osseuse o10 dans cette région observée avec le traitement OPG est cohérente avec une inhibition de la résorption osseuse. D. Effets de l'ostéoprotégérine sur la perte osseuse induite par l'ovariectomie chez le rat Des rats Fisher femelles âgées de douze semaines ont été soumis à une ovariectomie (OVX) ou opérés de façon simulée et des mesures d'absorptiométrie aux rayons X duale (DEXA) de la densité osseuse dans la métaphyse distale du fémur ont été réalisées. Après une période de récupération de trois jours, les animaux ont reçu des injections journalières pendant 14 jours comme suit: dix animaux opérés de façon simulée ont reçu un véhicule (solution saline tamponnée au phosphate); dix animaux OVX ont reçu un véhicule (solution saline tamponnée au phosphate); six animaux OVX ont reçu OPG-Fc 5mg/kg SC; sixanimaux OVX ont reçu du pamidronate (PAM) 5mg/kg SC; six animaux OVX ont reçu de l'oestrogène (ESTR) 40pg/kg SC. Après 7 et 14 jours de traitement, la densité osseuse des animaux a été mesurée par DEXA. Deux jours après la dernière injection, les animaux ont été tués et les fémurs et tibias droits ont été prélevés pour évalua- tion histologique. Les mesures DEXA de la densité osseuse montraient une tendance à la réduction de la densité osseuse suivant l'ovariectomie, qui était bloquée par OPG-Fc. Ses effets étaient semblables aux agents antirésorptifs connus, oestro- gène et pamidronate (figure 27). L'analyse histomorphomé- trique a confirmé ces observations avec le traitement OPG-Fc produisant une densité osseuse qui était, de façon signifi- cative, plus élevée chez les rats OVX que celle observée chez des rats OVX non traités (figure 28). Ces résultats confirment l'activité de OPG dans la perte osseuse associée à l'élimination de l'oestrogène endogène suivant l'ovariec- tomie. Résumé in vivo Les actions in vivo de OPG recombinante sont parallèles aux changements observés chez des souris transgéniques OPG. La réduction du nombre d'ostéoclastes observés chez des souris transgéniques OPG est reproduite par l'injection de OPG recombinante, localement, sur le sinciput à la fois chez les souris normales et chez des souris traitées par ILl-a ou IL1-B. Les souris transgéniques OPG développent un phénotype ostéopétrotique avec remplissage progressif de la cavité de moelle par de l'os et du cartilage non remodelé s'étendant à partir des plaques de croissance à partir du jour 1 inclus après la naissance. Chez des souris normales de 3 semaines (en croissance), les traitements par OPG entraînent égale- ment une rétention de l'os et du cartilage non remodelé dans les régions de formation osseuse endochondrale, un effet observé de façon radiographique et confirmé de façon histo- logique. Ainsi, OPG recombinante produit des changements phénotypiques chez les animaux normaux similaires à ceux observés chez les animaux transgéniques, et les changements sont cohérents avec l'inhibition, induite par OPG, de la résorption osseuse. En se basant sur des essais in vitro de formation d'ostéoclastes, une partie significative de cette inhibition est due à la formation altérée des ostéoclastes. De façon cohérente avec cette hypothèse, OPG bloque l'os- téoporose induite par l'ovariectomie chez le rat. La perte osseuse dans ce modèle est connue pour être favorisée par des ostéoclastes activés, suggérant un rôle pour OPG dans le traitement de l'ostéoporose primaire. EXEMPLE 12 Dérivés de pégylation de OPG Préparation de conjugués PEG-OPG N- terminaux par alkylation réductrice HuOPG met [22-194] P25A a été échangée par tampon dans NaOAc -50 mM, pH 4,5-4,8 et concentrée à 2-5 mg/ml. Cette solution a été utilisée pour conduire une alkylation réduc- trice de OPG avec des aldéhydes PEG monofonctionnels à -7 C. Les aldéhydes monofonctionnelles PEG, linéaires ou ramifiés, poids moléculaire de 1 à 57 kDa (disponibles chez Shearwater Polymers) ont été ajoutés à la solution de OPG comme solides dans des quantités constituant 2-4 moles d'aldéhyde PEG par mole de OPG. Après dissolution du poly- mère dans la solution de protéine, du cyanoborohydrure de sodium a été ajouté pour fournir une concentration finale de à 20 mM dans le mélange réactionnel à partir d'une solution stock fraîchement préparée de 1-1,6 M dans de l'eau désionisée froide. Le progrès de la réaction et l'étendue de la pégylation de OPG ont été contrôlés par chromatographie liquide à haute pression par exclusion de taille sur une colonne G3000SWXL (Toso Haas) éluant avec NaPO4 100 mM, NaCl 0,5 M, de l'éthanol à 10%, pH 6,9. De façon typique, on a laissé la réaction se dérouler pendant 16-18 heures, après quoi le mélange réactionnel a été dilué 6-8 fois et le pH abaissé à 3,5-4. Le mélange réactionnel a été fractionné par chromatographie d'échange d'ions (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) éluant avec NaOAc 20 mM pH 4 avec un gradient linéaire à NaCl 0,75 M sur 25 volumes de colonne à un débit de 30 cm/h. Des fractions de OPG mono-, di- ou poly-pégylées ont été rassemblées et caractérisées par SEC HPLC et SDS- PAGE. Par séquençage N-terminal, il a été déterminé que le conjugué mono PEG-OPG, le produit réactionnel principal dans la plupart des cas, était à 98% OPG modifiée par PEG de façon N-terminale. Cette procédure a été généralement utilisée pour préparer les conjugués PEG-OPG N-terminaux suivants (o OPG est HuOPG met [22-194] P25A): 5 kD monoPEG, 10 kd monoPEG ramifié, 12 kD monoPEG, 20 kD monoPEG, 20 kD monoPEG ramifié, 25 kD monoPEG, 31 kD monoPEG, 57 kD monoPEG, 12 kD diPEG, 25 kD diPEG, 31 kD diPEG, 57 kD diPEG, 25 kD triPEG. Préparation de conjugués PEG-OPG par acylation HuOPG met [22-194] P25A a été échangée par tampon dans du tampon BICINE 50 mM, pH 8 et concentrée à 2-3 mg/ml. Cette solution a été utilisée pour conduire l'acylation de OPG avec des esters monofonctionnels PEG N- hydroxysuccinimidyles à température ambiante. Les esters N- hydroxysuccinimidyles de PEG, linéaires ou ramifiés, poids moléculaire de 1 à 57 kDa (disponibles chez Shearwater Polymers) ont été ajoutés à la solution de OPG comme solides dans des quantités consti- tuant 4-8 moles d'esters N-hydroxysuccinimidyles de PEG par mole de OPG. Le progrès de la réaction et l'étendue de la pégylation de OPG ont été contrôlés par chromatographie liquide à haute pression par exclusion de taille sur une colonne G3000SWxL (Toso Haas) éluant avec NaPO4 100 mM, NaCl 0,5 M, de l'éthanol à 10%, pH 6,9. De façon typique, on a laissé la réaction se dérouler pendant 1 heure, après quoi le mélange réactionnel a été dilué 6-8 fois et le pH a baissé à 3,5-4. Le mélange réactionnel a été fractionné par chromatographie d'échange d'ions (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) éluant avec NaOAc 20 mM pH 4 avec un gradient linéaire à NaCl 0,75M sur 25 volumes de colonne à un débit de 30 cm/h. Des fractions de OPG mono-, di- ou poly-pégylées ont été rassemblées et caractérisées par SEC HPLC et SDS- PAGE. Cette procédure était généralement utilisée pour préparer les conjugués PEG-OPG suivants: 5 kD polyPEG, 20 kD poly- PEG, 40 kD polyPEG ramifié, 50 kD polyPEG. Préparation de PEG-OPG dimère HuOPG met [22-194] P25A est préparée pour la thiolation à 1-3 mg/ml dans un tampon de phosphate sensiblement à pH neutre. De l'anhydride mercaptosuccinique S-acétyle (AMSA) est ajouté en un excès molaire de 3 à 7 fois tout en mainte- nant pH à 7,0 et agité à 4 C pendant 2 heures. OPG monothio- latée est séparée de OPG non modifiée et polythiolatée par chromatographie d'échange d'ions et le thiol protégé est déprotégé par traitement avec de l'hydroxylamine. Après déprotection, l'hydroxylamine est éliminée par filtration sur gel et OPG monothiolatée résultante est soumise à une variété de chimies de réticulation spécifiques au thiol. Pour engendrer un dimère lié par disulfure, OPG thiolatée à > 1 mg/ml est soumise à une oxydation à l'air par dialyse dans un tampon de phosphate légèrement basique. Le dimère de OPG de thioéther covalent a été préparé en faisant réagir le réticulateur bis-maléimide, N,N-bis(3-maléimido propionyl)- 2-hydroxy 1,3 propane avec OPG thiolatée à > 1 mg/ml à un rapport molaire de 0,6 du réticulateur et de OPG dans le tampon de phosphate à pH 6,5. De façon similaire, les "haltères" de PEG sont produits par réaction de quantités sous-stoechiométriques de réticulateur de PEG bis-maléimide avec OPG thiolatée à > 1 mg/ml dans un tampon de phosphate à pH 6,5. L'un quelconque des conjugués dimères ci-dessus peut être encore purifié en utilisant soit une chromatographie par échange d'ions, soit une chromatographie par exclusion de taille. Des conjugués PEG-OPG dimères (o OPG est HuOPG met [22-194] (P25A) préparés en utilisant les procédures ci-dessus incluent le dimère OPG lié par disulfure, le dimère OPG de thioéther covalent avec un réticulateur du type amine aliphatique, des haltères et monocloches de PEG de 3,4 kD et 8 kD. Les conjugués PEG-OPG ont été testés pour l'activité in vitro en utilisant le test de maturation des ostéoclastes décrit dans l'exemple 11A et pour l'activité in vivo en mesurant la densité osseuse accrue après injection chez les souris comme décrit dans l'exemple 11C. L'activité in vivo est montrée ci-dessous dans le tableau 3. Tableau 3 Activité biologique in vivo de OPG pégylée Construction OPG Auqmentation de la densité osseuse du tibia huOPG met [22-194] huOPG met [22-194] 5k PEG + huOPG met [22-194] 20k PEG + huOPG met [22-194] P25A huOPG met [22-194] P25A 5k PEG + huOPG met [22-194] P25A 20k PEG + huOPG met [22-194] P25A 31k PEG + huOPG met [22-194] P25A 57k PEG + huOPG met [22-194] P25A 12k PEG + huOPG met [22-194] P25A 20k PEG ramifié + huOPG met [22-194] P25A 8k PEG dimère + huOPG met [22-194] P25A réticulation disulfure + LISTE DES SÉQUENCES Séquence n 1: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 36 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 1: AAAGGAAGGA AAAAAGCGGC CGCTACANNN NNNNNT 36 Séquence n 2: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 16 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 2: TCGACCCACG CGTCCG 16 Séquence n 3: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 12 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 3: GGGTGCGCAG GC 12 Séquence n 4: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 18 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 4: TGTAAAACGA 18 Séquence n 5: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 18 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 5: CAGGAAACAG CTATGACC 18 Séquence n 6: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 20 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 6: CAATTAACCC TCACTAAAGG 20 Séquence n 7: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 23 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 7: GCATTATGAC CCAGAAACCG GAC 23 Séquence n 8: (i) Caractéristiques de la séquence (A) Longueur: 23 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 8: AGGTAGCGCC CTTCCTCACA TTC 23 Séquence n 9: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 30 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 9: GACTAGTCCC ACAATGAACA AGTGGCTGTG 30 Séquence n 10: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 45 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 10: ATAAGAATGC GGCCGCTAAA CTATGAAACA GCCCAGTGAC CATTC 45 Séquence n 11: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (DJ Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 11: GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C 21 Séquence n 12: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 12: CGCCGTGTTC CATTTATGAG C 21 Séquence n 13: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 13: ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24 Séquence n 14: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 14: GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG 24 Séquence n 15: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 15: CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG 24 Séquence n 16 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n0 16: TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC 24 Séquence n 17 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 17: AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG 33 Séquence n 18: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 18: AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C 31 Séquence n 19: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 19: GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG 24 Séquence n 20: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 20: ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24 Séquence n 21: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 21: CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG 24 Séquence h 22: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 22: AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG 33 Séquence n 23: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 23: AGTCCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC 33 Séquence n 24: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 39 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 24: ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCAC 39 Séquence n 25: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 45 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 25: TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45 Séquence n 26: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 26: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence n 27: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 43 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 27: CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTCA CGGATTGAAC CTG 43 Séquence n 28: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 28: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence n 29 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 29: TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC 24 Séquence n 30 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 30: CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G 31 Séquence n 31: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 19 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 31: Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Séquence n 32: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 32: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 Séquence n 33: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 34 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 33: CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC 34 Séquence n 34: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 34: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 Séquence n 35: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 34 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 35: CCTCTGCGGC CGCCTTTTGC GTGGCTTCTC TGTT 34 Séquence n 36: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 37 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 36: CCTCTGACCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 Séquence n 37: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 37: CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTA CTGAATGG 38 Séquence n 38: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 37 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 38: CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 Séquence no 39: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 39: CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC 33 Séquence n 40: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 35 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 40: CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC 35 Séquence n 41: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 40 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 41: CCTCTGTGCA CTATTATAAG CAGCTTATTT TCACGGATTG 40 Séquence n 42: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 42: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 Séquence n 43: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 35 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 43: CCTCTGTCGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC 35 Séquence n 44: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 44: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 Séquence n 45: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 35 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 45: CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT 35 Séquence n 46: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 1537 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 46: GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA 60 GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT CAGCTTCCTT 120 TCGGGCTTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC 180 CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT ATTCCTCCTT 240 TAATTAGTTA AAACAAATCT AGAATCAAAT CGATTAATCG ACTATAACAA ACCATTTTCT 300 TGCGTAAACC TGTACGATCC TACAGGTACT TATGTTAAAC AATTGTATTT CAAGCGATAT 360 AATAGTGTGA CAAAAATCCA ATTTATTAGA ATCAAATGTC AATCTATTAC CGTTTTAATG 420 ATATATAACA CGCAAAACTT GCGACAAACA ATAGGTAAGG ATAAAGAGAT GGGTATGAAA 480 GACATAAATG CCGACGACAC TTACAGAATA ATTAATAAAA TTAAAGCCTG TAGAAGCAAT 540 AATGATATTA ATCAATGCTT ATCTGATATG ACTAAAATGG TACATTGTGA ATATTATTTA 600 CTCGCGATCA TTTATCCTCA TTCTATGGTT AAATCTGATA TTTCAATTCT GGATAATTAC 660 CCTAAAAAAT GGAGGCAATA TTATGATGAC GCTAATTTAA TAAAATATGA TCCTATAGTA 720 GATTATTCTA ACTCCAATCA TTCACCGATT AATTGGAATA TATTTGAAAA CAATGCTGTA 780 AATAAAAAAT CTCCAAATGT AATTAAAGAA GCGAAATCAT CAGGTCTTAT CACTGGGTTT 840 AGTTTCCCTA TTCATACTGC TAATAATGGC TTCGGAATGC TTAGTTTTGC ACATTCAGAG 900 AAAGACAACT ATATAGATAG TTTATTTTTA CATGCGTGTA TGAACATACC ATTAATTGTT 960 CCTTCTCTAG TTGATAATTA TCGAAAAATA AATATAGCAA ATAATAAATC AAACAACGAT 1020 TTAACCAAAA GAGAAAAAGA ATGTTTAGCG TGGGCATGCG AAGGAAAAAG CTCTTGGGAT 1080 ATTTCAAAAA TATTAGGCTG TAGTAAGCGC ACGGTCACTT TCCATTTAAC CAATGCGCAA 1140 ATGAAACTCA ATACAACAAA CCGCTGCCAA AGTATTTCTA AAGCAATTTT AACAGGAGCA 1200 ATTGATTGCC CATACTTTAA AAGTTAAGTA CGACGTCCAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA 1260 ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG TCAGGATGGC CTTCTGCTTA 1320 ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC 1380 GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA GGAGAGCGTT CACCGACAAA 1440 CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT TTCGTTTTAT TTGATGCCTG 1500 GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATAC 1537 Séquence n 47: (iii) Description de la séquence n 47: CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA 48 Séquence n 48: 0 (i) Caractéristiques de la séquence: (iii) Description de la séquence n 48: CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 48 Séquence n 49: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 49 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 49: CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 Séquence n 50: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 1546 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 50: GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60 CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 120 CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 180 GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGCCATC 240 CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTTTCTACAA ACTCTTTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC 300 AAATATGGAC GTCGTACTTA ACTTTTAAAG TATGGGCAAT CAATTGCTCC TGTTAAAATT 360 * GCTTTAGAAA TACTTTGGCA GCGGTTTGTT GTATTGAGTT TCATTTGCGC ATTGGTTAAA 420 TGGAAAGTGA CCGTGCGCTT ACTACAGCCT AATATTTTTG AAATATCCCA AGAGCTTTTT 480 CCTTCGCATG CCCACGCTAA ACATTCTTTT TCTCTTTTGG TTAAATCGTT GTTTGATTTA 540 TTATTTGCTA TATTTATTTT TCGATAATTA TCAACTAGAG AAGGAACAAT TAATGGTATG 600 TTCATACACG CATGTAAAAA TAAACTATCT ATATAGTTGT CTTTCTCTGA ATGTGCAAAA 660 CTAAGCATTC CGAAGCCATT ATTAGCAGTA TGAATAGGGA AACTAAACCC AGTGATAAGA 720 CCTGATGATT TCGCTTCTTT AATTACATTT GGAGATTTTT TATTTACAGC ATTGTTTTCA 780 AATATATTCC AATTAATCGG TGAATGATTG GAGTTAGAAT AATCTACTAT AGGATCATAT 840 TTTATTAAAT TAGCGTCATC ATAATATTGC CTCCATTTTT TAGGGTAATT ATCCAGAATT 900 GAAATATCAG ATTTAACCAT AGAATGAGGA TAAATGATCG CGAGTAAATA ATATTCACAA 960 TGTACCATTT TAGTCATATC AGATAAGCAT TGATTAATAT CATTATTGCT TCTACAGGCT 1020 TTAATTTTAT TAATTATTCT GTAAGTGTCG TCGGCATTTA TGTCTTTCAT ACCCATCTCT 1080 TTATCCTTAC CTATTGTTTG TCGCAAGTTT TGCGTGTTAT ATATCATTAA AACGGTAATA 1140 GATTGACATT TGATTCTAAT AAATTGGATT TTTGTCACAC TATTATATCG CTTGAAATAC 1200 AATTGTTTAA CATAAGTACC TGTAGGATCG TACAGGTTTA CGCAAGAAAA TGGTTTGTTA 1260 i59 TAGTCGATTA ATCGATTTGA TTCTAGATTT GTTTTAACTA ATTAAAGGAG GAATAACATA 1320 TGGTTAACGC GTTGGAATTC GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAGGGTACC ATGGAAGCTT 1380 ACTCGAGGAT CCGCGGAAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG 1440 CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA 1500 Séquence n 51: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 47 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 51: TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGC TAGCGTTAAC GCGTTGG 47 Séquence n 52: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 49 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 52: AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGATGGTGAT GATGTTTCA 49 Séquence n 53: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 141 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 53: CTAATTCCGC TCTCACCTAC CAAACAATGC CCCCCTGCAA AAAATAAATT CATATAAAAA 60 ACATACAGAT AACCATCTGC GGTGATAAAT TATCTCTGGC GGTGTTGACA TAAATACCAC 120 TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T 141 Séquence n0 54: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 147 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 54: CGATGTGCTC AGTATCACCG CCAGTGGTAT TTATGTCAAC ACCGCCAGAG ATAATTTATC 60 ACCGCAGATG GTTATCTGTA TGTTTTTTAT ATGAATTTAT TTTTTGCAGG GGGGCATTGT 120 TTGGTAGGTG AGAGCGGAAT TAGACGT 147 Séquence n 55: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 55 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 55: CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 Séquence n 56: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 49 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 56: CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 Séquence n 57: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 668 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 57: GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA 60 GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT CAGCTTCCTT 120 TCGGGCTTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC 180 CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT ATTCCTCCTT 240 TAATTAGTTA ACTCAAATCT AGAATCAAAT CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA 300 TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGTCCAT 360 ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG 420 TCAGGATGGC CTTCTGCTTA ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC 480 ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA 540 GGAGAGCGTT CACCGACAAA CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT 600 TTCGTTTTAT TTGATGCCTG GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATACGTT 660 ACGCACGT 668 Séquence n 58: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 726 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 58: GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60 CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 120 CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 180 GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGGGCCT 240 CCCACCGCCC GTCCTGCGGG CGGTATTTGA CGGTCCGTAG TTTAATTCGT CTTCGCCATC 300 CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTTTCTACAA ACTCTTTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC 360 AAATATGGAC GTCTCATAAT TTTTAAAAAA TTCATTTGAC AAATGCTAAA ATTCTTGATT 420 AATATTCTCA ATTGTGAGCG CTCACAATTT ATCGATTTGA TTCTAGATTT GTTTTAACTA 480 ATTAAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GAGCTCACTA GTGTCGACCT 540 GCAGGGTACC ATGGAAGCTT ACTCGAGGAT CCGCGGAAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAAGC 600 CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG 660 GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACCGCTC TTCACGCTCT 720 TCACGC 726 S6quence n 59: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 44 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 59: TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT GGAC 44 TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT GGAC 4 Séquence n 60: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 27 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 60: GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACAAC 27 Séquence n 61: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 102 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 61: TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTACCCGGCG 60 GACATTTATC ACACAGCAGC TGATGAGAAG TTTCTTCATC CA 102 Séquence n 62: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 19 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 62: Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Séquence n 63: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 84 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 63: TATGGAAACT TTTCCTCCAA AATATCTTCA TTATGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT 60 GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 84 Séquence n 64: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 78 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 64: CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60 TTGGAGGAAA AGTTTCCA 78 Séquence n 65: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 44 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 65: TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC 44 Séquence n 66: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 66: GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG 38 Séquence n 67: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 84 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 67: TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG GAAACTGGTC ATCAGCTGCT 60 GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 84 Séquence n 68: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 78 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 68: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60 TTGGAGGCAG AGTTTCCA 78 Séquence n 69: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 54 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 69: TATGGACCCA GAAACTGGTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 54 Séquence n" 70: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 48 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 70: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGGGTCCA 48 Séquence n 71: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 87 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 71: TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCATTACGAT CCGGAAACTG GTCATCAGCT 60 GCTGTGTGAT AAATGTGCTC CGGGTAC 87 Séquence n 72: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 81 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 72: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60 TTGGAGGCAG AGTTTCTTTC A 81 Séquence n 73 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 71 paires de bases 1o (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 73: GTTCTCCTCA TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGA AACTCTGCCT CCAAAATACC 60 TGCATTACGA T 71 Séquence n 74 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 43 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 74: GTTCTCCTCA TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCA 43 Séquence n 75: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 76 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 75: TACGCACTGG ATCCTTAATG ATGGTGATGG TGATGATGTA AGCAGCTTAT TTTCACGGAT 60 TGAACCTGAT TCCCTA 76 Séquence n 76 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 47 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 76: GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT 47 Séquence n" 77 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 43 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 77: GTTCTCCTAT TAATGAAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT 43 Séquence n 78 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 40 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 78: TACGCACTGG ATCCTTATAA CGAGCTTATT TTTACTGATT 40 Séquence n 79 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 40 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 79: GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA 40 Séquence n 80: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 43 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 80: TACGCACTGG ATCCTTATGT TGCATTTCCT TTCTGAATTA GCA 43 Séquence n 81: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 18 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 81: CCGGAAACAG ATAATGAG 18 Séquence n 82: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 18 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 82: GATCCTCATT ATCTGTTT 18 Séquence n 83: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 30 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 83: CCGGAAACAG AGAAGCCACG CAAAAGTAAG 30 Séquence n 84: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 30 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 84: GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTCTGTTT 30 Séquence n 85: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 12 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 85: TATGTTAATG AG 12 Séquence n 86: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 14 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 86: GATCCTCATT AACA 14 Séquence n 87: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 21 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 87: TATGTTCCGG AAACAGTTAA G 21 Séquence n 88: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 23 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 88: GATCCTTAAC TGTTTCCGGA ACA 23 Séquence n 89: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 36 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 89: TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATAAG 36 Séquence ho 90: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 90: GATCCTTATT TTTGAGTTGA TTCACTGTTT CCGGAACA 38 Séquence n 91: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 100 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 91: CTAGCGACGA CGACGACAAA GAAACTCTGC CTCCAAAATA CCTGCATTAC GATCCGGAAA 60 CTGGTCATCA GCTGCTGTGT GATAAATGTG CTCCGGGTAC 100 Séquence n 92: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 92 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 92: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60 TTGGAGGCAG AGTTTCTTTG TCGTCGTCGT CG 92 Séquence n 93: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 26 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 93: ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGA 26 Séquence n 94: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 50 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 94: TTTGTTTTAA CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATATGAGAGG ATCGCATCAC 50 Séquence n 95: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 50 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 95: CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCGAAA TACCTGCACT ACGACGAAGA 50 Séquence n 96 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 49 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 96: AACCTCCCAC CAGCTGCTGT GCGACAAATG CCCGCCGGGT ACCCAAACA 49 Séquence n 97: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 26 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 97: TGTTTGGGTA CCCGGCGGGC ATTTGT 26 Séquence n 98: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 50 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 98: CGCACAGCAG CTGGTGGGAG GTTTCTTCGT CGTAGTGCAG GTATTTCGGC 50 Séquence n 99: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 49 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 99: GGGAAGGTTT CGTGATGGTG ATGGTGATGC GATCCTCTCA TATTTTATT 49 Séquence ho 100: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 50 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence no 100: CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 50 Séquence n 101: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 59 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 101: ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAATG 59 Séquence n 102: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 48 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 102: CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48 Séquence n 103 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 103: TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 Séquence n 104 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 59 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 104: ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 Séquence n 105 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 54 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 105: CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAAAAA AAGAAACTTT TCCTCCAAAA TATC 54 Séquence n 106 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 106: TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 Séquence n 107: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 44 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 107: CAGCCCGGGT AAAATGGAAA CGTTTCCTCC AAAATATCTT CATT 44 Séquence n 108: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 44 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 108: CGTTTCCATT TTACCCGGGC TGAGCGAGAG GCTCTTCTGC GTGT 44 Séquence n 109: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 45 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 109: CGCTCAGCCC GGGTAAAATG GAAACGTTGC CTCCAAAATA CCTGC 45 Séquence n 110: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 39 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 110: CCATTTTACC CGGGCTGAGC GAGAGGCTCT TCTGCGTGT 39 Séquence n 111: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 36 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 111: GAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36 Séquence n 112: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 34 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 112: CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34 Séquence n" 113: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 36 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc * (iii) Description de la séquence n 113: AAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36 Séquence n 114: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 35 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 114: CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG 35 Séquence n" 115: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 102 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 115: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60 AACTAGTCAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102 Séquence n" 116: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 94 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 116: CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACTAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60 TTGGAGCAAA AGTTTCCATA TGTTATTCCT CCTT 94 Séquence no 117: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 62 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 117: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TCCTGCTAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60 AA 62 Séquence n 118 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 62 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 118: CTAGTTTCTT CATCATAATG AAGATATTTA GCAGGAAAAG TTTCCATATG TTATTCCTCC 60 TT 62 Séquence n 119 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 51 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 119: Tyr His Tyr Tyr Asp Gln Asn Gly Arg Met Cys Glu Glu Cys His Met 1 5 10 15 Cys Gin Pro Gly His Phe Leu Val Lys His Cys Lys Gln Pro Lys Arg 25 30 Asp Thr Val Cys His Lys Pro Cys Glu Pro Gly Val Thr Tyr Thr Asp 40 45 Asp Trp His 50 Séquence n 120 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 2432 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molecule: ADNc (iii) Caractéristique: (iv) Description de la séquence n 120: ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTGTTGCCC AGACCTTATA TAAAACGTCA TGTTCGCCTG 60 GGCAGCAGAG AAGCACCTAG CACTGGCCCA GCGGCTGCCG CCTGAGGTTT CCAGAGGACC 120 ACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGT GCA CTC CTG GTG TTC TTG GAC ATC 168 Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile 1 5 10 15 ATT GAA TGG ACA ACC CAG GAA ACC TTT CCT CCA AAA TAC TTG CAT TAT 216 Ile Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr 25 30 182 2742767 GAC CCA GAA ACC GGA CGT CAG CTC TTG TGT GAC AAA TGT GCT CCT GGC 264 Asp Pro Glu Thr Gly Arg Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly 40 45 ACC TAC CTA AAA CAG CAC TGC ACA GTC AGG AGG AAG ACA CTG TGT GTC 312 Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val 55 60 CCT TGC CCT GAC TAC TCT TAT ACA GAC AGC TGG CAC ACG AGT GAT GAA 360 Pro Cys Pro Asp Tyr Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu 70 75 TGC GTG TAC TGC AGC CCC GTG TGC AAG GAA CTG CAG ACC GTG AAA CAG 408 Cys Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Thr Val Lys Gln 85 90 95 GAG TGC AAC CGC ACC CAC AAC CGA GTG TGC GAA TGT GAG GAA GGG CGC 456 Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg 105 110 TAC CTG GAG CTC GAA TTC TGC TTG AAG CAC CGG AGC TGT CCC CCA GGC 504 Tyr Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly 120 125 TTG GGT GTG CTG CAG GCT GGG ACC CCA GAG CGA AAC ACG GTT TGC AAA 552 Leu Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys 135 140 AGA TGT CCG GAT GGG TTC TTC TCA GGT GAG ACG TCA TCG AAA GCA CCC 600 Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro 150 155 TGT AGG AAA CAC ACC AAC TGC AGC TCA CTT GGC CTC CTG CTA ATT CAG 648 Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ile Gln 165 170 175 AAA GGA AAT GCA ACA CAT GAC AAT GTA TGT TCC GGA AAC AGA GAA GCA 696 Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala 185 190 ACT CAA AAT TGT GGA ATA GAT GTC ACC CTG TGC GAA GAG GCA TTC TTC 744 Thr Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe 195 200 205 AGG TTT GCT GTG CCT ACC AAG ATT ATA CCG AAT TGG CTG AGT GTT CTG 792 Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu 210 215 220 GTG GAC AGT TTG CCT GGG ACC AAA GTG AAT GCA GAG AGT GTA GAG AGG 840 Val Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg 225 230 235 183 2742767 ATA AAA CGG AGA CAC AGC TCG CAA GAG CAA ACT TTC CAG CTA CTT AAG 888 Ile Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys 240 245 250 255 CTG TGG AAG CAT CAA AAC AGA GAC CAG GAA ATG GTG AAG AAG ATC ATC 936 Leu Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile 260 265 270 CAA GAC ATT GAC CTC TGT GAA AGC AGT GTG CAA CGG CAT ATC GGC CAC 984 Gln Asp ILe Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gin Arg His Ile Gly His 275 280 285 GCG AAC CTC ACC ACA GAG CAG CTC CGC ATC TTG ATG GAG AGC TTG CCT 1032 Ala Asn Leu Thr Thr Glu Gin Leu Arg Ile Leu Met Glu Ser Leu Pro 290 295 300 GGG AAG AAG ATC AGC CCA GAC GAG ATT GAG AGA ACG AGA AAG ACC TGC 1080 Gly Lys Lys Ile Ser Pro Asp Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys 305 310 315 AAA CCC AGC GAG CAG CTC CTG AAG CTA CTG AGC TTG TGG AGG ATC AAA 1128 Lys Pro Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys 320 325 330 335 AAT GGA GAC CAA GAC ACC TTG AAG GGC CTG ATG TAC GCA CTC AAG CAC 1176 Asn Gly Asp Gin Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His 340 345 350 TTG AAA GCA TAC CAC TTT CCC AAA ACC GTC ACC CAC AGT CTG AGG AAG 1224 Leu Lys Ala Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys 355 360 365 ACC ATC AGG TTC TTG CAC AGC TTC ACC ATG TAC CGA TTG TAT CAG AAA 1272 Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys 370 375 380 CTC TTT CTA GAA ATG ATA GGG AAT CAG GTT CAA TCA GTG AAG ATA AGC 1320 Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser 385 390 395 TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT 1376 Cys Leu 400 GGAGCAGATG GCTGCTTCTC CGGCTCTTGA AATGGCAGTT GATTCCTTTC TCATCAGTTG 1436 GTGGGAATGA AGATCCTCCA GCCCAACACA CACACTGGGG AGTCTGAGTC AGGAGAGTGA 1496 GGCAGGCTAT TTGATAATTG TGCAAAGCTG CCAGGTGTAC ACCTAGAAAG TCAAGCACCC 1556 TGAGAAAGAG GATATTTTTA TAACCTCAAA CATAGGCCCT TTCCTTCCTC TCCTTATGGA 1616 TGAGTACTCA GAAGGCTTCT ACTATCTTCT GTGTCATCCC TAGATGAAGG CCTCTTTTAT 1676 TTATTTTTTT ATTCTTTTTT TCGGAGCTGG GGACCGAACC CAGGGCCTTG CGCTTGCGAG 1736 GCAAGTGCTC TACCACTGAG CTAAATCTCC AACCCCTGAA GGCCTCTTTC TTTCTGCCTC 1796 TGATAGTCTA TGACATTCTT TTTTCTACAA TTCGTATCAG GTGCACGAGC CTTATCCCAT 1856 TTGTAGGTTT CTAGGCAAGT TGACCGTTAG CTATTTTTCC CTCTGAAGAT TTGATTCGAG 1916 TTGCAGACTT GGCTAGACAA GCAGGGGTAG GTTATGGTAG TTTATTTAAC AGACTGCCAC 1976 CAGGAGTCCA GTGTTTCTTG TTCCTCTGTA GTTGTACCTA AGCTGACTCC AAGTACATTT 2036 AGTATGAAAA ATAATCAACA AATTTTATTC CTTCTATCAA CATTGGCTAG CTTTGTTTCA 2096 GGGCACTAAA AGAAACTACT ATATGGAGAA AGAATTGATA TTGCCCCCAA CGTTCAACAA 2156 CCCAATAGTT TATCCAGCTG TCATGCCTGG TTCAGTGTCT ACTGACTATG CGCCCTCTTA 2216 TTACTGCATG CAGTAATTCA ACTGGAAATA GTAATAATAA TAATAGAAAT AAAATCTAGA 2276 CTCCATTGGA TCTCTCTGAA TATGGGAATA TCTAACTTAA GAAGCTTTGA GATTTCAGTT 2336 GTGTTAAAGG CTTTTATTAA AAAGCTGATG CTCTTCTGTA AAAGTTACTA ATATATCTGT 2396 AAGACTATTA CAGTATTGCT ATTTATATCC ATCCAG 2432 Séquence n 121: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 401 acides aminés (B) Type: acide aminé (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 121: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:121: Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile Ile 1 5 10 15 Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 25 30 Pro Glu Thr Gly Arg Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro 55 60 Cys Pro Asp Tyr Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys 70 75 80 Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gin Thr Val Lys Gin Glu 90 95 Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr 105 110 Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Leu 120 125 Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg 135 140 Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys 150 155 160 Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys 170 175 Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr 185 190 Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg 200 205 Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val 210 215 220 Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile 225 230 235 240 Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu 245 250 255 Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln 260 265 270 Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala 275 280 285 Asn Leu Thr Thr Glu Gln Leu Arg Ile Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly 290 295 300 186 2742767 Lys Lys Ile Ser Pro Asp Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys 305 310 315 320 Pro Set Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu 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CTC CTG 209 Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His Gln Leu Leu 30 35 40 TGT GAC AAA TGT GCT CCT GGC ACC TAC CTA AAA CAG CAC TGC ACA GTG 257 Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val 50 55 AGG AGG AAG ACA TTG TGT GTC CCT TGC CCT GAC CAC TCT TAT ACG GAC 305 Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro Cys Pro Asp His Ser Tyr Thr Asp 65 70 AGC TGG CAC ACC AGT GAT GAG TGT GTG TAT TGC AGC CCA GTG TGC AAG 353 Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys 80 85 GAA CTG CAG TCC GTG AAG CAG GAG TGC AAC CGC ACC CAC AAC CGA GTG 401 Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val 95 100 TGT GAG TGT GAG GAA GGG CGT TAC CTG GAG ATC GAA TTC TGC TTG AAG 449 Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys 110 115 120 CAC CGG AGC TGT CCC CCG GGC TCC GGC GTG GTG CAA GCT GGA ACC CCA 497 His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser Gly Val Val Gin Ala Gly Thr Pro 130 135 GAG CGA AAC ACA GTT TGC AAA AAA TGT CCA GAT GGG TTC TTC TCA GGT 545 Glu Arg 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CTG CAC AGC TTC ACA 1217 Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr Met Arg Phe Leu His Ser Phe Thr 365 370 375 ATG TAC AGA CTG TAT CAG AAG CTC TTT TTA GAA ATG ATA GGG AAT CAG 1265 Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln 380 385 390 GTT CAA TCC GTG AAA ATA AGC TGC TTA TAACTAGGAA TGGTCACTGG 1312 Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu 395 400 GCTGTTTCTT CA 1324 Séquence n 123: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 401 acides aminés (B) Type: acide aminé (D) Topologie: linéaire (ii) Typ-e de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 123: Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile 1 5 10 15 Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 25 30 Pro Glu Thr Gly His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr 35 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro 55 60 Cys Pro Asp His Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys 70 75 80 Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu 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Ile Ser Pro Glu Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys 305 310 315 320 Ser Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn 325 330 335 Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu 340 345 350 Lys Thr Ser His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr 355 360 365 Met Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu 370 375 380 Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val GIn Ser Val Lys Ile Ser Cys 385 390 395 400 Leu Séquence n 124 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 1355 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Caractéristique: (A) Nom/clé: CDS (B) Emplacement: 94. .1296 (iv) Description de la séquence n 124: 191 2742767 GTATATATAA CGTGATGAGC GTACGGGTGC GGAGACGCAC CGGAGCGCTC GCCCAGCCGC 60 CGCTCCAAGC CCCTGAGGTT TCCGGGGACC ACA ATG AAC AAG TTG CTG TGC TGC 114 Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys 1 5 GCG CTC GTG TTT CTG GAC ATC TCC ATT AAG TGG ACC ACC CAG GAA ACG 162 Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile Lys Trp Thr Thr Gin Glu Thr - 15 20 TTT CCT CCA AAG TAC CTT CAT TAT GAC GAA GAA ACC TCT CAT CAG CTG 210 Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu 30 35 TTG TGT GAC AAA TGT CCT CCT GGT ACC TAC CTA AAA CAA CAC TGT ACA 258 Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr 45 50 55 GCA AAG TGG AAG ACC GTG TGC GCC CCT TGC CCT GAC CAC TAC TAC ACA 306 Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr 65 70 GAC AGC TGG CAC ACC AGT GAC GAG TGT CTA TAC TGC AGC CCC GTG TGC 354 Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys 80 85 AAG GAG CTG CAG TAC GTC AAG CAG GAG TGC AAT CGC ACC CAC AAC CGC 402 Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg 90 95 100 GTG TGC GAA TGC AAG GAA GGG CGC TAC CTT GAG ATA GAG TTC TGC TTG 450 Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu 110 115 AAA CAT AGG AGC TGC CCT CCT GGA TTT GGA GTG GTG CAA GCT GGA ACC 498 Lys His Arg Ser Cys Pro 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1170 Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys 345 350 355 ACT GTC ACT CAG AGT CTA AAG AAG ACC ATC AGG TTC CTT CAC AGC TTC 1218 Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe 360 365 370 375 ACA ATG TAC AAA TTG TAT CAG AAG TTA TTT TTA GAA ATG ATA GGT AAC 1266 Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn 380 385 390 CAG GTC CAA TCA GTA AAA ATA AGC TGC TTA TAACTGGAAA TGGCCATTGA 1316 Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu 395 400 GCTGTTTCCT CACAATTGGC GAGATCCCAT GGATGATAA 1355 Séquence n 125: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 401 acides aminés (B) Type: acide aminé (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 125: Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile 1 5 10 15 Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 25 30 Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys 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270 Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala 275 280 285 Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly 290 295 300 Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys 305 310 315 320 Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn 325 330 335 Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser 340 345 350 Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr 355 360 365 Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu 370 375 380 Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys 385 390 395 400 Leu 1.95 2742767 Séquence n 126: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 139 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 126: Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys 1 5 10 15 Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro 25 30 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Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 25 30 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 35 40 45 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro 55 60 Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro 70 75 80 *197 2742767 Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 90 95 Phe Set Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 105 110 Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg 120 125 Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp 135 140 Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr 145 150 155 160 Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp 170 175 Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg 185 190 Lys Glu Val Gin Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly 200 205 Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr 210 215 Séquence n 129: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 280 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 129: Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 90 95 Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 105 110 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu 150 155 160 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gin Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 200 205 Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp Lys 225 230 235 240 Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255 Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr 275 280 Séquence n 130: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 207 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 130: Met Leu Arg Leu Ile Ala Leu Leu Val Cys Val Val Tyr Val Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Asp Val Pro Tyr Ser Ser Asn Gln Gly Lys Cys Gly Gly His Asp 25 30 Tyr Glu Lys Asp Gly Leu Cys Cys Ala Ser Cys His Pro Gly Phe Tyr 40 45 Ala Ser Arg Leu Cys Gly Pro Gly Ser Asn Thr Val Cys Ser Pro Cys 55 60 Glu Asp Gly Thr Phe Thr Ala Ser Thr Asn His Ala Pro Ala Cys Val 70 75 80 Ser Cys Arg Gly Pro Cys Thr Gly His Leu Ser Glu Ser Gln Pro Cys 85 90 95 Asp Arg Thr His Asp Arg Val Cys Asn Cys Ser Thr Gly Asn Tyr Cys 105 110 Leu Leu Lys Gly Gln Asn Gly Cys Arg Ile Cys Ala Pro Gln Thr Lys 120 125 Cys Pro Ala Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Arg Ala Gly Asp Thr 135 140 Leu Cys Glu Lys Cys Pro Pro His Thr Tyr Ser Asp Ser Leu Ser Pro 150 155 160 Thr Glu Arg Cys Gly Thr Ser Phe Asn Tyr Ile Ser Val Gly Phe Asn 165 170 175 Leu Tyr Pro Val Asn Glu Thr Ser Cys Thr Thr Thr Ala Gly His Asn 185 190 Séquence n 131: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 227 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 131: Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 170 175 201 2742767 2o1 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 185 190 Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Séquence n 132: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 197 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 132: Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Leu Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu 25 30 His Asp Gly Gln Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr 40 45 Ser His Cys Thr Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser 55 60 Gly Glu Phe Ser Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His 70 75 80 Arg His Cys Glu Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr 90 95 Ala Glu Ser Asp Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr 105 110 Ser Lys Asp Cys Glu Ala Cys Ala Gln His Thr Pro Cys Ile Pro Gly 120 125 202 2742767 Phe Gly Val Met Glu Met Ala Thr Glu Thr Thr Asp Thr Val Cys His 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Gln Ser Ser Leu Phe Glu Lys 150 155 160 Cys Tyr Pro Trp Thr Ser Cys Glu Asp Lys Asn Leu Glu Val Leu Gln 170 175 Lys Gly Thr Ser Gln Thr Asn Val Ile Cys Gly Leu Lys Ser Arg Met 185 190 Arg Ala Leu Leu Val 1O 195 Séquence n 133: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 208 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 133: Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile Ile 1 5 10 15 Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 25 30 Pro Glu Thr Gly Arg Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro 55 60 Cys Pro Asp Tyr Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys 70 75 80 Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gin Thr Val Lys Gin Glu 90 95 Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr 105 110 Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Leu 120 125 Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg 135 140 Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys 150 155 160 Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys 170 175 Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr 185 190 Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg 200 205 Séquence n 134: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 224 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 134: Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 25 30 Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 40 45 Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys 55 60 204 2742767 Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 70 75 80 Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser 90 95 Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 105 110 Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys 120 125 Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gin Asn Thr 130 135 140 Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His 150 155 160 Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln 170 175 Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro 185 190 Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr 200 205 Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile 210 215 220 Séquence n 135: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 205 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine 3 (iii) Description de la séquence n 135: Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Phe Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Gly Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro 25 30 Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val 40 45 Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys His Pro Cys Glu Pro 55 60 Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gin Cys Thr 65 70 75 80 Gin Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gin Asn Cys Thr Pro 90 95 Thr Glu Asp Thr Val Cys Gin Cys Arg Pro Gly Thr Gin Pro Arg Gln105 110 Asp Ser Ser His Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly 120 125 His Phe Ser Pro Gly Ser Asn Gin Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys 135 140 Thr Leu Set Gly Lys Gln Ile Arg His Pro Ala Set Asn Ser Leu Asp 145 150 155 160 Thr Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr 170 175 Gin Arg Thr Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Pro Set Thr Thr Val Trp 185 190 Pro Arg Thr Set Gin Leu Pro Set Thr Pro Thr Leu Val 200 205 Séquence n 136: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 191 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine 206 2742767 (iii) Description de la séquence n 136: Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln 20 25 30 Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 40 45 Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys 55 60 Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr 70 75 80 His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro 90 95 Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu;ihr 100 105 110 * Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn 120 125 Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 135 140 Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro 150 155 160 Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu 170 175 Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu 180 185 190 Séquence n 137 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 54 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 137: TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 54 Séquence n 138: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 308 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 138: Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His 1 5 10 15 Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gin His 25 30 Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro Cys Pro Asp His Ser 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Val Tyr Cys Ser Pro 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser Gly Val Val Gln Ala 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Lys Cys Pro Asp Gly Phe 120 125 Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Ile Lys His Thr Asn 135 140 Cys Ser Thr Phe Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 150 155 160 Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr Gln Lys Cys Gly Ile 170 175 Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr 185 190 Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Ser Leu Pro Gly 200 205 Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Arg His Ser 210 215 220 Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn 225 230 235 240 Arg Asp Gin Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys 245 250 255 Glu Ser Ser Val Gin Arg His Leu Gly His Ser Asn Leu Thr Thr Glu 260 265 270 Gln Leu Leu Ala Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Ile Ser Pro 275 280 285 Glu Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys Ser Ser Glu Gin Leu 290 295 300 Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gin Asp Thr 305 310 315 320 Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu Lys Thr Ser His Phe 325 330 335 Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr Met Arg Phe Leu His 340 345 350 Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gin Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile 355 360 365 Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu 370 375 380 Séquence n 139 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 380 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 139: Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 25 30 cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gin Tyr Val Lys Gin Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile 170 175 Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr 185 190 Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly 200 205 210 2742767 Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser 210 215 220 Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn 225 230 235 240 Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys 245 250 255 Glu Asn Set Val Gln Arg His Ile Gly His Ala ASn Leu Thr Phe Glu 260 -265 270 Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala 275 280 285 Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Set Asp Gln Ile lO 290 295 300 Leu Lys Leu Leu Set Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr 305 310 315 320 Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Set Lys Thr Tyr His Phe 325 330 335 Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His 340 345 350 Set Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile 355 360 365 Gly Asn Gln Val Gin Set Val Lys Ile Ser Cys Leu 370 375 380 Séquence n 140: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 30 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 140: TGCACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC 30 Séquence n 141: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 30 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 141: GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA 30 Séquence n 142: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 142: GGACCACCCA GCTTCATTAT GACGAAGAAA C 31 Séquence n 143: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 31 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 143: GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C 31 Séquence n 144: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 29 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 144: GTGGACCACC CAGGACGAAG AAACCTCTC 29 Séquence hl 145 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 29 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 145: GAGAGGTTTC TTCGTCCTGG GTGGTCCAC 29 Séquence n 146 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 29 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 146: CGTTTCCTCC AAAGTTCCTT CATTATGAC 29 Séquence n 147 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 29 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 147: GTCATAATGA AGGAACTTTG GAGGAAACG 29 Séquence n 148: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 32 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 148: GGAAACGTTT CCTGCAAAGT ACCTTCATTA TG 32 Séquence n 149: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 32 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 149: CATAATGAAG GTACTTTGCA GGAAACGTTT CC 32 Séquence n 150: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 27 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 150: CACGCAAAAG TCGGGAATAG ATGTCAC 27 Séquence n 151: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 27 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 151: GTGACATCTA TTCCCGACTT TTGCGTG 27 Séquence n 152: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 25 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 152: CACCCTGTCG GAAGAGGCCT TCTTC 25 Séquence n 153: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 25 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 153: GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG 25 Séquence n 154: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n0 154: TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA 24 Séquence n 155: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 155: TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA 24 Séquence n 156: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 24 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 156: CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC 24 Séquence n 157: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 25 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 157: CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC 25 Séquence n 158: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 158: CCGTGAAAAT AAGCTCGTTA TAACTAGGAA TGG 33 Séquence n 159: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 159: CCATTCCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG 33 Séquence n 160: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 160: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence ne 161: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 44 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 161: CCTCTCTCGA GTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC 44 Séquence n 162: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 162: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence n 163: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 163: CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC 38 Séquence n 164: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 164: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence n 165: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 165: CCTCTCTCGA GTCACTCTGT GGTGAGGTTC GAGTGGCC 38 Séquence ho 166 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 166: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 Séquence n 167 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 38 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADNc (iii) Description de la séquence n 167: CCTCTCTCGA GTCAGGATGT TTTCAAGTGC TTGAGGGC 38 Séquence n 168 (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 16 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Brin: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (iii) Description de la séquence n 168: Met Lys His His His His His His His Ala Ser Val Asn Ala Leu Glu 1 5 10 15 REVENDICATIONS 1. Acide nucléique isolé codant un polypeptide comprenant au moins une des activités biologiques de l'ostéoprotégérine (OPG), caractérisé en ce que l'acide nucléique est choisi dans le groupe constitué de: a) les acides nucléiques montrés sur les figures 2B-2C (séquence No. 120), 9A-9B (séquence No. 122), et 9C-9D (séquence No. 124), ou des brins complémentaires de ceux-ci; b) les acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions strictes, avec les régions de codage de polypeptide comme montré sur les figures 2B-2C (séquence No. 120), 9A-9B (séquence No. 122), et 9C-9D (séquence No. 124); c) les acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions strictes, avec les nucléotides 148 à 337 inclusive- ment comme montré sur la figure 1A; et d) les acides nucléiques qui sont dégénérés en les acides nucléiques de (a), (b) et (c). 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est de l'ADNc, de l'ADN génomique, de l'ADN synthétique ou de 1'ARN. 3. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est codé par l'acide nucléique selon la revendication 1. 4. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il inclut un ou plusieurs codons préférés pour l'expression dans Escherichia coli. 5. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un marqueur détectable fixé à celui-ci. 6. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la région de codage de polypeptide des figures 2B-2C (séquence No. 120), 9A-9B (séquence No. 122) ou 9C-9D (séquence No. 124). 7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente la séquence comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 124) des nucleotides 158-1297. 8. Vecteur d'expression, O10 caractérisé en ce qu'il comprend l'acide nucléique de la revendication 1. 9. Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique comprend la région de codage de polypeptide comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 124). 10. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle transformée ou transfectée dans le vecteur d'expression selon la revendication 8. 11. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est une cellule eucaryote. 12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué des cellules CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 et BHK. 13. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est une cellule procaryote. 14. Cellule hôte selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est Escherichia coli. 15. Mammifère transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur d'expression selon la revendication 8. 16. Mammifère transgénique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est un rongeur. 17. Mammifère transgénique selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est une souris. 18. Procédé pour la production d'ostéoprotégérine (OPG), caractérisé en ce qu'il comprend: - faire croître, dans des conditions nutritives appro- priées, des cellules hotes transformées ou transfectées avec l'acide nucléique selon la revendication 1; et - isoler les produits polypeptidiques de l'expression des acides nucléiques. 19. Polypeptide isolé et purifié, caractérisé en ce qu'il comprend OPG. 20. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est OPG de mammifère. 21. Polypeptide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est OPG humaine. 22. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est sensiblement dépourvu d'autres protéines humaines. 23. Polypeptide selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés comme montré sur les figures 2B-2C (séquence No. 121), 9A-9B (séquence No. 123), ou 9C-9D (séquence No. 125), ou un dérivé de celle-ci. 24. Polypeptide selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 125) des résidus 22-401 inclusivement. 25. Polypeptide selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 125) des résidus 32-401 inclusivement. 26. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est un produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène. 27. Polypeptide selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'ADN est de l'ADNc, de l'ADN génomique, ou de l'ADN synthétique. 28. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il a été modifié par un polymère soluble dans l'eau. 29. Polypeptide selon la revendication 28, caractérisé en ce que le polymère soluble dans l'eau est du polyéthylèneglycol. 30. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés d'au moins environ 164 acides aminés comprenant quatre domaines riches en cystêine caractéristiques des domaines riches en cystéine de régions extracellulaires du récepteur du facteur de nécrose tumorale, et une activité de densité osseuse croissante. 31. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés comme montré sur les figures 2B-2C (séquence No. 121), 9A-9B (séquence No. 123), ou 9C-9D (séquence No. 125) ayant une terminaison aminée au résidu 22 et qui présente de 1 à 216 acides aminés supprimés à partir de la terminaison carboxy. 32. Polypeptide selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés des résidus 22-185, 22-189, 22-194, ou 22-201 inclusivement. 33. Polypeptide selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une région Fc de IgG1 humaine s'étendant à partir de la terminaison carboxy. 34. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés comme montré sur les figures 2B-2C (séquence No. 121), 9A-9B (séquence No. 123) ou 9C-9D (séquence No. 125), ayant une terminaison aminée au résidu 22, dans lequel de 1 à 10 acides aminés sont supprimés à partir de la terminaison aminée, et, éventuellement, de 1 à 216 acides aminés sont supprimés à partir de la terminaison carboxy. 35. Polypeptide selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés des résidus 27-185, 27-189, 27-194, 27-401, ou 32-401 inclusivement. 36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une région Fc de IgG1 humaine s'étendant à partir de la terminaison carboxy. 37. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est choisi à partir du groupe constitué de: huOPG [22-201]-Fc huOPG [22-401]-Fc huOPG [22-180]-Fc huOPG met [22-401]-Fc huOPG Fc-met [22-401] huOPG met [22- 185] huOPG met [22-189] huOPG met [22-194] huOPG met [27- 185] huOPG met [27-189] huOPG met [27-194] huOPG met [32-401] huOPG met-lys [22-401] huOPG met [22-401] huOPG met [22-401]-Fc (P25A) huOPG met [22-401] (P25A) huOPG met [22-401] (P26A) huOPG met [22-401] (P26D) huOPG met [22-194] (P25A) huOPG met [22-194] (P26A) huOPG met met-(lys)3 [22-401] huOPG met met-arg-gly-ser-(his)6 [22-401]. 38. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il code le polypeptide de la revendica- tion 37. 39. Anticorps ou fragment de celui-ci, caractérisé en ce qu'il se lie, de façon spécifique, à OPG. 40. Anticorps selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il est un anticorps monoclonal. 41. Procédé pour la détection de la présence de OPG dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation de l'échantil- lon avec l'anticorps de la revendication 39 dans des condi- tions qui permettent la liaison de l'anticorps à OPG et la détection de l'anticorps lié. 42. Procédé pour évaluer la capacité d'une substance candi- date à se lier à OPG, caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation de OPG avec la substance candidate dans les conditions qui permettent la liaison, et la mesure de la substance liée. 43. Composition pour réguler les taux de OPG chez un animal, caractérisée en ce qu'elle permet la modification de l'ani- mal par un acide nucléique codant OPG. 44. Composition selon la revendication 43, caractérisée en ce que l'acide nucléique favorise une augmentation du taux de OPG dans les tissus. 45. Composition selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'animal est un être humain. 46. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'il comprend une quantité thérapeutiquement efficace de OPG dans un support, adjuvant, solubilisant, stabilisant et/ou antioxydant pharmaceutiquement acceptables 47. Composition selon la revendication 46, caractérisée en ce que OPG est OPG humaine. 48. Composition selon la revendication 47, caractérisé en ce que OPG présente la séquence d'acides aminés comme montré sur la figure 9B. 49. Composition pour traiter un trouble osseux, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide selon la revendi- cation 19. 50. Composition selon la revendication 49, caractérisée en ce que le polypeptide est OPG humaine. 51. Composition selon la revendication 49, caractérisée en ce que le trouble osseux est une perte osseuse excessive. 52. Composition selon la revendication 51, caractérisée en ce que le trouble osseux est sélectionné à partir du groupe constitué de l'ostéoporose, la maladie osseuse de Paget, l'hypercalcémie, l'hyperparathyroïdisme, l'ostéopénie induite par des stéroïdes, la perte osseuse due à l'arthrite rhumatoïde, la perte osseuse due à l'ostéomyélite, les métastases ostéolytiques, et la perte osseuse périodontale. 53. Composition selon la revendication 49, caractérisée en ce qu'il comprend de plus l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance choisie dans le groupe constitué des protéines morphogéniques osseuses BMP-1 à BMP-12, des membres de la famille TGF-B, des inhibiteurs de IL-1, des inhibiteurs de TNFa, l'hormone parathyroïde et des analogues de celle-ci, la protéine apparentée à l'hormone de parathyroïde et des analogues de celle-ci, des prostaglandines de la série E, des bisphosphonates, et des minéraux favorisant la crois- sance osseuse. 54. Multimère d'ostéoprotégérine, caractérisé en ce qu'il est constitué de monomères d'ostéoprotégérine. 55. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce qu'il est un dimère. 56. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce qu'il est formé par des liaisons de disulfure interchaînes. 57. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce qu'il est formé par des régions Fc d'asso- ciation dérivées de IgG1 humaine. 58. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce qu'il est essentiellement dépourvu de monomères d'ostéoprotégérine et de multimères inactifs. 59. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce que les monomères comprennent la séquence d'acides aminés comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 125) des résidus 22-401, ou un dérivé de celle-ci. 60. Multimère selon la revendication 54, caractérisé en ce que les monomères comprennent la séquence d'acides aminés comme montré sur la figure 9C-9D (séquence No. 125) des résidus 22-194.