Brevet FR2736066A1 — publié le 19970103

La présente invention concerne un procédé d'amplification d'un gène voulu dans le chromosome d'une bactérie coryneforme au moyen d'un transposon artificiel qui est transposable dans la bactérie corynefonnrme, une bactérie coryneforme obtenue par ce procédé et un procédé de production d'un acide aminé qui comprend l'incubation de cette bactérie coryneforme. Lorsque le gène voulu est un gène qui participe à la biosynthèse des acides aminés ou des acides nucléiques, il est possible de produire des acides aminés ou des acides nucléiques à l'aide de la bactérie coryneforme ainsi obtenue. Un tel procédé d'amplification d'un gène voulu dans un chromosome est important pour améliorer la culture des bactéries coryneformes qui sont utilisées dans la production industrielle d'acides aminés ou d'acides nucléiques. On a déjà réalisé des études approfondies pour améliorer la culture des bactéries coryneformes et pour produire de manière efficace des acides aminés ou des acides nucléiques. Un grand nombre de moyens de culture faisant intervenir le génie génétique ont été décrits. Le génie génétique pour la culture de bactéries coryneformes a été développé dans des systèmes utilisant des plasmides ou des phages. On connaît par exemple l'établissement d'une transformation à l'aide de protoplastes [J. Bacteriol., Katsumata R., Ozaki A., Oka T. et Furuya A., 159, 306 - 311, (1984); et J. Bacteriol; Santamaria R. I., Gil J. A. et Martin J.F., 161, 463 - 467 (1985)], le développement de différents vecteurs [Agric. Biol. Chem., Miwa K., Matsui H., Terabe M., Nakamori S., Sano K. et Momose H, 48, 2901 - 2903 (1984); J. Bacteriol., Katsumata R., Ozaki A., Oka T. et Furuya A., 159, 306 - 311 (1984); J. Gen. Microbiol., Santamaria R. I., Gil J. A., Mesas J. M. et Martin J. F., 130, 2237 - 2246 (1984); Gene, Yeh P., Oreglia J., Prevotos F. et Scicard A. M., 47, 301 - 306 (1986); et Appl. Microbiol. Biotechnol., Patek M., Nesvera J. et Hochmannova J., 31, 65 69 (1989)], le développement d'un procédé de contrôle de l'expression des gènes (Bio/Technology, Tsuchiya M. et Morinaga Y., 6, 428 - 430 (1988)], et le développement des cosmides [Gene, Miwa K., Matsui K., Terabe M., Ito K., Ishida M., Takagi H., Nakamori S. et Sano K., 39, 281 - 285 (1985)]. Le clonage de gènes provenant de bactéries coryneformes a été décrit dans les documents Nucleic Acids Res. , Matsui K., Sano K. et Ohtsubo E., 14, 10113 - 10114 (1986); J. Bacteriol; Follettie M. T. et Shinskey A. J., 167, 695 - 702 (1986), Nucleic Acids Res., Mateos L. M., Del R. G., Aguilar A. et Martin J. F., 15, 10598 (1987); Nucleic Acids Res., Mateos L. M., Del R. G., Aguilar A. et Martin J. F., 15, 3922 (1987); Nucleic Acids Res., Melumbres M., Mateos L. M., Guerrero C. et Martin J. F., 16, 9859 (1988); Agric. Biol. Chem., Matsui K., Miwa K. et Sano K., 52, 525 - 531 (1988); Mol. Microbiol., Peoples O. P., Liebl W., Bodis M., Maeng P. J., Follettie M. T., Archer J. A. et Shinskey A. J., 2, 63 - 72 (1988); Mol. Gen. Genet., Eikmanns B. J., Follettie M. T., Griot M. U., Martin U. et Shinskey A. J. , 218, 330 - 339 (1989); et Gene, O'Regan M., Thierbach G., Bachmann B., Vgilleval D., Lepage P., Viret J. F. et Lemoine Y., 77, 237 - 251 (1989). L'augmentation du rendement en différents acides aminés a été décrite dans le document Agric. Biol. Chem. Sano K., Miwa K. et Nakamori S., 51, 597 - 599 (1987). On a décrit récemment des éléments transposables de bactéries coryneformes [WO 92/02627; WO 93/18151; EP0445385; demande de brevet japonais mise à la disposition du public ("Kokai") n' 46 867/1994; Mol. Microbiol., Vertes A. A., Inui M., Kobayashi M., Kurusu Y. et Yukawa H., 11, 739 --746 (1994); Mol. Microbiol., Bonamy C., Labarre J., Reyer O. et Leblon G., 14, 571 - 581 (1994); Mol. Gen. Genet., Vertes A. A., Asai Y., Inui M., Kobayashi M., Kurusu Y. et Yukawa H., 245, 397 - 405 (1994); FEMS Microbiology Letters, Jagar W., Schafer A., Kalinowski J. et Puehler A., 126, 1 - 6, (1995); et demande japonaise Kokai n' 107 976/1995). Un élément transposable ou transposon est un fragment d'ADN qui peut être transposé dans un chromosome et on sait que de tels éléments transposables existent dans de nombreux organismes y compris les procaryotes et les eucaryotes. On a acquis une connaissance détaillée en ce qui concerne les eucaryotes tels que le maïs, les drosophiles, les levures et analogues, et les procaryotes tels que Escherichia coli et analogues [Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington D.C. (1989)]. Les éléments transposables des bactéries sont de deux types: les séquences d'insertion et les transposons. Une séquence d'insertion est un fragment d'ADN qui a une taille d'environ 760 à 2 000 pb, qui comporte des répétitions inversées d'environ 8 à 20 pb aux deux extrémités et qui code une transposase qui est une enzyme nécessaire à sa transposition. Un transposon est un élément transposable comportant des répétitions inversées et la transposase ainsi qu'un gène tel qu'un gène de résistance à un médicament qui ne participe pas directement à la transposition. D'une manière générale, il existe des transposons dans lesquels le gène de résistance à un médicament est situé entre deux séquences d'insertion et des transposons dans lesquels le gène de résistance à un médicament et inséré dans une séquence d'insertion. Une séquence d'insertion et un transposon sont caractérisés en ce que l'on observe une duplication d'une séquence nucléotidique d'environ 10 pb dans un site de gène cible dans lequel est introduit la séquence d'insertion ou le transposon [Mobil Genetic Elements, Academic Press, New York, pages 159 - 221 (1983)]. Les éléments transposables qui sont connus actuellement comprennent les transposons TnlO et Tn5S de Escherichia coli et du phage Mu qui sont très utiles dans l'ingéniérie des gènes chromosomiques. Par exemple, on envisage 1) de transposer un transposon dans un gène chromosomique pour détruire ce gène et réprimer l'expression de ce gène chromosomique, 2) d'insérer une séquence promoteur dans un transposon pour exprimer le gène chromosomique présent dans le site d'insertion et 3) d'insérer un gène hétérologue voulu ou un gène homologue voulu dans un transposon afin d'introduire par transposition le nouveau gène dans un chromosome [Mobil DNA, American Society for Microbiology, Washington D.C., pages 879 - 925 (1989)]. - On a récemment découvert un élément transposable qui est une séquence d'insertion dans les bactéries coryneformes mais on n'a pas découvert d'élément transposable qui soit un transposon ayant un gène de résistance à un médicament. Il a été possible de produire un transposon dans lequel un gène de résistance à la kanamycine est inséré artificiellement [WO93/18151; demande japonaise Kokai n 107 976/1995; et Mol. Gen. Genet., Vertes A. A., Asai Y., Inui M., Kobayashi M., Kurusu Y. et Yukawa H, 245, 397 - 405 (1994)] et de transposer celui- ci dans un chromosome. Les transposons artificiels ainsi produits comprennent un transposon dans lequel un gène de résistance à un médicament est situé entre deux séquences d'insertion (WO93/18151) et un transposon dans lequel un gène de résistance à un médicament est inséré dans une séquence d'insertion [demande japonaise Kokai n 107 976/1995; et Mol. Gen. Genet., Vertes A. A., Asai Y., Inui M., Kobayashi M., Kurusu Y. et Yukawa H., 245, 397 - 405 (1994)]. Cependant, on n'observe pas de transposition par copies multiples d'un tel transposon artificiel, ou bien l'augmentation du nombre de copies n'est pas satisfaisant. De ce fait une technique utile dans l'industrie des acides aminés ou des acides nucléiques pour amplifier des gènes à l'aide d'un tel transposon n'a pas encore été mise au point. La présente invention a pour but de fournir un procédé qui comprend la formation d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à un médica- ment et un gène utile voulu sur la base d'une séquence d'insertion d'une bactérie coryneforme, l'amplification du gène voulu dans le chromosome de la bactérie coryneforme et son utilisation pour la production industrielle d'acides aminés ou d'acides nucléiques à l'aide du transposon artificiel mentionné cidessus. La présente invention a aussi pour but de fournir une bactérie coryneforme dans le chromosome de laquelle un gène utile voulu est amplifié. La présente invention a aussi pour but de fournir un procédé de production d'une substance au moyen d'une bactérie coryneforme dans le chromosome de laquelle un gène utile voulu est amplifié. Pour atteindre les buts mentionnés ci-dessus, on s'est intéressé au fait qu'un transposon de Escherichia coli ou analogues connu est transposé de telle manière qu'une structure ayant les caractéristiques d'une séquence d'insertion et qui comprend un gène de résistance à un médicament qui ne participe pas à la transposition est situé entre des répétitions inversées aux deux extrémités. On a construit artificiellement différentes séquences analogues à des transposons ayant une structure telle qu'un gène de résistance à un médicament et un gène voulu qui ne participent pas à la transposition sont insérés entre des répétitions inversées aux deux extrémités d'une séquence d'insertion dérivée d'un ADN chromosomique d'une bactérie coryneforme. On a ainsi constaté que cette séquence analogue à un transposon (transposon artificiel) est transposée avec un rendement satisfaisant et qu'un micro-organisme à gène amplifié dans lequel de nombreuses copies du transposon artificiel sont transposées dans son chromosome peut être formé avec un bon rendement par un choix approprié d'un gène de résistance à un médicament et par la détermination de la concentration du médicament. Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour introduire et amplifier un gène voulu dans un chromosome qui comprend la formation d'un transposon artificiel qui a une structure telle qu'un gène de résistance à un médi- cament et le gène voulu sont situés entre des répétitions inversées et qui est transposable dans une bactérie coryneforme, l'introduction du transposon artificiel dans la bactérie coryneforme et la transposition dudit transposon dans le chromosome de la bactérie coryneforme. Un gène de transposase peut être présent également, dans le transposon artificiel, entre les répétitions inversées. De préférence, les répétitions inversées sont dérivées d'une séquence d'insertion d'une bactérie coryneforme. De préférence également, la séquence d'insertion a une séquence de bases représentée par l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 1, 5 et 9 du tableau de séquences qui figure dans la suite. De préférence encore, le gène de résistance à un médicament est un gène de résistance au chloramphénicol ou un gène de résistance à la tétracycline. Le gène voulu peut être un gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés. De préférence, le gène voulu est un gène d'aspartokinase ou un gène d'acide dihydrodipicolinique synthase (ou dihydrodipicolinate synthase). L'invention concerne également une bactérie coryneforme qui est formée par amplification du gène voulu dans le chromosome de la bactérie par le procédé évoqué ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de production d'un acide aminé qui comprend la culture d'une bactérie coryneforme obtenue par amplifica- tion d'un gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés dans son chromosome par le procédé ci-dessus dans un milieu de culture pour former et accumuler l'acide aminé dans le milieu de culture, et la récupération de l'acide aminé. - De préférence, le gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés est un gène d'aspartokinase ou d'acide dihydrodipicolinique synthase, et l'acide aminé et la lysine. Les répétitions inversées sont de préférence des répétitions qui existent aux deux extrémités d'un élément transposable isolé à partir d'une bactérie coryneforme. Les séquences d'insertion énumérées sous les numéros de séquence SEQ ID NO: 1, 5 et 9 dans le tableau de séquences qui figure ci-dessous, qui sont connues (W093/18151), sont des exemples d'éléments transposables dérivés d'une bactérie coryneforme. La séquence d'insertion IS714 dans la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 3 à l'extrémité 5' et la séquence SEQ ID NO: 4 à l'extrémité 5' du brin inverse, ce qui forme une répétition inversée. La séquence d'insertion IS719 dans SEQ ID NO: 5 a la séquence SEQ ID NO: 7 à l'extrémité 5' et la séquence SEQ ID NO: 8 à l'extrémité 5' du brin inverse, ce qui forme une répétition inversée. On peut former une répétition inversée en placçant à l'extrémité 5' du brin direct et à l'extrémité 5' du brin inverse une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 3, 4, 7 et 8. On peut former une répétition inversée en plaçant à l'extrémité 5' du brin direct et à l'extrémité 5' du brin inverse deux séquences choisies parmi SEQ IDNO:3,4, 7 et8. La séquence d'insertion IS903 dans la SEQ ID NO: 9 a la séquence SEQ ID NO: 10 à l'extrémité 5' du brin direct et la séquence SEQ ID NO: 11 à l'extrémité 5' du brin inverse, ce qui forme une répétition inversée. On peut former une répétition inversée en plaçant à l'extrémité 5' du brin direct et à l'extrémité 5' du brin inverse une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 10 et 11. On peut former une répétition inversée en plaçant à l'extrémité 5' du brin direct et à l'extrémité 5' du brin inverse deux séquences choisies parmi SEQ ID NO: 10 et 11. On peut former une répétition inversée selon la présente invention avec une séquence quelconque différente de celles qui sont énumérées dans SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 10 et 11 qui peut fonctionner dans un élément transposable. Le gène de résistance à un médicament qui doit être inséré dans la séquence d'insertion peut être un gène de résistance à la kanamycine, un gène de résistance au chloramphénicol ou un gène de résistance à la tétracycline, ou bien encore un gène qui confère une résistance à un autre médicament, tel qu'un gène de résistance à l'ampicilline, un gène de résistance au méthotrexate et analogues. Il est préférable d'employer un gène de résistance à un médicament pour lequel il existe une corrélation entre le degré de résistance au médicament et le nombre de copies du gène de résistance au médicament. Comme gènes destinés à être amplifiés, on peut mentionner les gènes qui participent à la biosynthèse de différents acides aminés et de différents acides nucléiques. Il s'agit par exemple d'un gène d'acide glutamique déshydrogénase pour la biosynthèse de l'acide glutamique, d'un gène de glutamine synthase pour la biosynthèse de la glutamine, d'un gène d'aspartokinase (dans la suite l'aspartokinase est désignée par "AK", et un gène codant une protéine AK est désigné dans la suite par "IySC", si nécessaire), un gène de dihydrodipicolinate synthase (dans la suite la dihydrodipicolinate synthase est appelée "DDPS", et un gène codant la DDPS est appelé dans la suite "dapA", si nécessaire), un gène de dihydrodipicolinate réductase (dans la suite la dihydrodipicolinate réductase est appelée "DDPR", et un gène codant la DDPR est appelé dans la suite "dapB", si nécessaire), un gène de diaminopimélate décarboxylase (dans la suite la diaminopimélate décarboxylase est appelée "DDC", et un gène codant la DDC est appelé dans la suite "ysA", si nécessaire) et un gène de diaminopimélate déshydrogénase (dans la suite la diaminopimélate déshydrogénase est appelée "DDH", et un gène codant la DDH est appelé dans la suite "ddh", si nécessaire) pour la biosynthèse de la lysine, un gène d'homosérine déshydrogénase pour la biosynthèse de la thréonine, un gène d'acétohydroxyacide synthase pour la biosynthèse de l'isoleucine ou de la valine, un gène d'acide 2-isopropylmalique synthase pour la biosynthèse de la leucine, un gène d'acide glutamique kinase pour la biosynthèse de la proline ou de l'arginine, un gène de phosphoribosyl- ATP pyrophosphorylase pour la biosynthèse de l'histidine, un gène de phosphate d'acide désoxyarabinohepturonique (DAHP) synthase pour la biosynthèse d'acides aminés aromatiques tels que le tryptophane, la tyrosine ou la phénylalanine, et un gène de phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) amidotransférase, un gène d'inosine guanosine kinase, un gène d'acide inosinique (IMP) déshydrogénase et un gène d'acide guanylique (GMP) synthase pour la biosynthèse d'acides nucléiques tels que l'acide inosinique et l'acide guanylique. De plus, on peut avoir aussi accès à des gènes codant des protéines physiologiquement actives telles que l'interleukine 2, l'interleukine 6 et analogues. Les bactéries coryneformes dont il est question dans la présente invention comprennent, selon le document Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8e ed., page 599 (1974), les bacilles aérobies à Gram positif, les bactéries qui appartiennent au genre Corynebacterium, les bactéries qui étaient classées auparavant dans le genre Brevibacterium mais qui sont maintenant classées dans le genre Corynebacterium [Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)], les bactéries du genre Brevibacterium proche du genre Corynebacterium, et les bactéries du genre Microbacterium. D'une manière générale, les micro-organismes suivants, qui sont connus comme étant des bactéries productrices d'acide L- glutamique, font partie des bactéries coryneformes: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) Corynebacterium melassecola Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) Microbacterium ammoniaphilum Corynebacterium thermoaminogenes. On mentionnera spécifiquement les souches sauvages suivantes et les souches mutantes dérivées de celles-ci: Corynebacterium acetoacidophilumn ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020 Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020 Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14067 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12340 (FERM BP-1539) Le transposon artificiel selon la présente invention a une structure telle qu'un gène de résistance à un médicament et un gène voulu sont situés entre des répétitions inversées et qu'il est capable de subir une transposition dans une bactérie coryneforme. La transposase selon la présente invention peut être par exemple une transposase qui a une séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO: 2 ou 6 du tableau de séquences indiqué dans la suite. Toutefois, la transposase de la présente invention comprend aussi une transposase qui a une délétion, une insertion, une addition, une substitution ou une inversion d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés dans la séquence ci- dessus, à condition qu'elle ait une activité de transposase. Le gène de transposase selon la présente invention a par exemple la séquence qui s'étend du 130e au 1437e nucléotide de la séquence SEQ ID NO: 1 ou la séquence qui s'étend du 130Q au 1 437e nucléotide de la séquence SEQ ID NO: 5. Toutefois, le gène de transposase de la présente invention peut aussi être un gène qui a une délétion, une insertion, une addition, une substitution ou une inversion d'un ou plusieurs nucléotides dans les séquences ci-dessus, à condition que le produit du gène ait une activité de transposase. Le gène de transposase peut être placé à l'intérieur d'un transposon artificiel, auquel cas le gène de transposase est situé entre des répétitions inversées et est placé en une position qui n'interfère pas avec les fonctions d'un gène de résistance à un médicament et d'un gène voulu. Le gène de transposase peut aussi être situé à l'extérieur d'un transposon artificiel, il peut être porté par un plasmide comportant un transposon artificiel ou par un plasmide dépourvu de transposon artificiel. Enfin, le gène de transposase peut être présent sur un chromosome. Le transposon artificiel selon la présente invention peut être construit aisément à partir d'un élément transposable. Dans la présente invention, il est possible d'utiliser une séquence d'insertion quelconque à condition qu'elle soit présente dans le chromosome de la bactérie coryneforme mentionnée ci-dessus, qu'elle ait une taille d'environ 760 à 2 000 pb, qu'elle comporte des répétitions inversées d'environ 8 à 20 pb et qu'elle code une transposase nécessaire pour sa transposition. Une telle séquence d'insertion est obtenue selon le procédé décrit dans le document W093/18151. En d'autres termes, un fragment d'ADN contenant une séquence d'insertion peut être obtenu en 1) introduisant le plasmide pEC701 dans une bactérie coryneforme pour la transformer, 2) en sélectionnant une souche transformée avec pEC701 en utilisant la résistance à la kanamycine comme marqueur, 3) en étalant les bactéries coryneformes contenant le plasmide pEC701 sur une boîte de gélose contenant de l'isopropyl-l-thiogalactoside (IPTG) et en sélectionnant une souche ainsi cultivée, 4) en analysant la région régulatrice ou la région structurale du gène de la chloramphénicol acétyltransférase dans le plasmide contenu dans la souche sélectionnée, et 5) en déterminant la séquence insérée dans ce gène. Ou bien encore, le fragment d'ADN mentionné ci-dessus peut être obtenu en 1) introduisant le plasmide pEC901 dans une bactérie coryneforme pour la transformer, 2) en sélectionnant une souche transformée avec pEC901 en utilisant la résistance à la kanamycine comme marqueur, 3) en incubant les bactéries coryneformes contenant pEC901 à 30 C et en sélectionnant une souche qui exprime la résistance au chloramphénicol même à 30 C, 4) en analysant le gène de répresseur cI du plasmide contenu dans la souche sélectionnée, et 5) en déterminant la séquence insérée dans ce gène. Des exemples spécifiques de séquences d'insertion des bactéries coryneformes comprennent trois types de séquences d'insertion représentés par les séquences SEQ ID NO: 1, 5 et 9 du tableau de séquences donné dans la suite, à savoir IS714, IS719 et IS903. Ces séquences nucléotidiques ne sont pas nécessairement des séquences strictes. Il est possible d'utiliser dans la construction du transposon artificiel une séquence d'insertion comprenant une séquence de répétition inversée dans laquelle une partie des bases sont remplacées par d'autres bases ou sont délétées ou dans laquelle une nouvelle séquence est insérée ou ajoutée, à condition qu'elle joue le rôle de séquence d'insertion. Sur la base de ces séquences d'insertion, il est possible de construire différents transposons artificiels dont les structures sont représentées sur la figure 1. Parmi ceux-ci, le transposon artificiel qui est utilisé dans la présente invention a une structure telle qu'un gène de résistance à un médicament et un gène voulu, qui est destiné à être amplifié, sont insérés dans la séquence d'insertion. Dans le cas de IS714 représenté dans la séquence SEQ ID NO: 1, il existe un site de coupure pour l'enzyme de restriction NheI aux positions 37 à 42 qui conviennent pour l'insertion d'un gène de résistance à un médicament et d'un gène voulu, qui doit être amplifié, étant donné que l'insertion en ces positions n'interfère pas avec les fonctions de répétition inversée et de transposase. - Dans le cas de IS719 représenté dans la séquence SEQ ID NO: 5, il existe un site pour l'enzyme de restriction Nhe I aux positions 37 à 42 qui conviennent pour l'insertion d'un gène de résistance à un médicament et d'un gène voulu, qui doit être amplifié, étant donné que l'insertion en ces positions n'interfère pas avec les fonctions de répétition inversée et de transposase. Dans le cas de IS903 représenté dans la séquence SEQ ID NO: 9, il existe un site de clivage pour l'enzyme de restriction Xcm I aux positions 34 à 48 qui conviennent pour l'insertion d'un gène de résistance à un médicament et d'un gène voulu, qui doit être amplifié, étant donné que l'insertion en ces positions n'interfère pas avec les fonctions de répétition inversée et de transposase. On va décrire dans la suite, en prenant IS714 comme exemple, un procédé de construction d'un transposon artificiel dans lequel est inséré un gène de résistance à un médicament tel que la kanamycine (néomycine), le chloramphé- nicol ou la tétracycline, et un procédé de construction d'un transposon artificiel dans lequel est inséré le gène de résistance à un médicament et un gène voulu utile pour la production d'acides aminés ou d'acides nucléiques (par exemple asparto- kinase). La séquence nucléotidique de IS714 est représentée par la séquence SEQ ID NO: 1 du tableau de séquences donnée dans la suite. (1) Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la kanamycine Le plasmide pEC701-IS14 qui comporte la séquence IS714 qui est une séquence d'insertion de Brevibacterium lactofermentum AJ12036 (FERM BP-734) qui est une souche sauvage d'une bactérie corynefonnrme (voir WO93/18151) est clivé avec les endonucléases de restriction Pvu II et Eco RI pour obtenir un fragment de 1,6 kb contenant IS714. En même temps, un fragment contenant IS714 est inséré dans un site de clivage pour l'endonucléase de restriction Sal I du plasmide pHSC4 ayant une origine de réplication sensible à la température Brevi TS ori provenant d'une bactérie coryneforme (voir la demande japonaise Kokai n 7 491/1993) pour construire le plasmide pHIS714. Le fragment de 1,6 kb contenant IS714 ci-dessus est inséré en outre dans le site Sma I de pHIS714 pour obtenir les plasmides pHTN7141 et pHTN7142 contenant des fragments IS714 dans des directions opposées, comme le montre la figure 2. Puis, pHTN7141 et pHTN7142 sont clivés avec l'endonucléase de restriction Pvu II, ce qui permet de couper un fragment contenant deux séquences IS714 et la séquence de l'origine de réplication sensible à la température de pHSC4. Un fragment de 2,3 kb contenant un gène de la néomycine phosphotrans- férase (gène de résistance à la kanamycine) peut être obtenu en clivant avec l'endonucléase de restriction Pvu II le vecteur plasmidique pHSG298 (produit par la société Takara Shuzo) qui contient deux sites de clivage pour l'endonucléase de restriction Pvu II. pHTN7141 et pHSG298 sont clivés avec l'endonucléase de restriction Pvu II et les fragments résultants sont ensuite ligaturés pour transformer Brevibacterium lactofermentum AJ12036.Le plasmide pHTN7143 est obtenu à partir de la souche qui présente une résistance à la kanamycine comme le montre la figure 3. Le plasmide pHTN7144 est obtenu à partir du plasmide pHTN7142 et du plasmide pHSG298 de la manière décrite ci-dessus, comme le montre la figure 4. pHTN7143 et pHTN7144 ont une structure telle que le gène de la néomycine phosphotransférase (Kmr) est situé entre deux séquences IS714. Les plasmides pHIS714K1 et pHIS714K2 sont construits à partir des plasmides pHIS714 et pHSG298 en tant que plasmides témoins de la manière mentionnée ci-dessus, comme le montre la figure 5. Dans pHIS714K1 et pHIS714K2, les orientations des fragments insérés contenant chacun le gène de la néomycine phosphotransférase sont opposées l'une à l'autre. Pour réduire la taille du transposon artificiel, on construit un transposon artificiel dans lequel un gène de néomycine phosphotransférase est inséré dans IS714. Dans IS714, il existe un site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I en une position dans laquelle la fonction de transposase n'est pas dégradée. Le plasmide pHIS714 est clivé avec l'endonucléase de restriction Nhe I et ses extrémités sont rendues franches. D'autre part, une région contenant un gène de néomycine phosphotransférase est retirée du plasmide pUC4K (produit par Pharmacia Biotech) par clivage avec l'endonucléase de restriction Pst I, et ses extrémités sont rendues franches. Les deux fragments sont ligaturés pour obtenir le plasmide voulu pHTN7145 comme le montre la figure 6. (2) Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance au chloramphénicol Un fragment d'environ 1,1 kb contenant un gène de chloramphénicol acétyltransférase peut être obtenu par clivage du vecteur plasmidique pHSG398 (produit par Takara Shuzo) avec l'endonucléase de restriction Acc II. Puis, ce fragment Acc II est inséré dans un site Sma I de pUC18 (produit par Takara Shuzo), et le plasmide ainsi obtenu est cloné. Le clone voulu est sélectionné pour obtenir le plasmide pUC18-CM. De plus, dans le plasmide pHIS714K2 ci-dessus, le site de clivage pour rendonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne dégrade pas la fonction de transposase est muni d'extrémités franches. Un fragment d'environ 1,1 kb contenant un gène de chloramphénicol acétyltransférase (Cmr) qui est retiré de pUC18-CM par clivage avec Eco RI et Hind III est ligaturé avec ce site Nhe I à extrémités franches de pHIS714K2 pour transformer Escherichia coli, et un clone dans lequel est inséré le fragment contenant le gène de chloramphénicol acétyltransférase est sélectionné. Le plasmide pHTN7151 voulu peut être obtenu à partir du clone résultant comme le montre la figure 7. (3) Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la tétracycline Un fragment d'environ 1,4 kb contenant un gène de résistance à la tétracycline (Tcr) peut être obtenu par clivage du vecteur plasmidique pBR322 (produit par Takara Shuzo) avec les endonucléases de restriction Eco RI et Ava I. Dans le plasmide pHIS714K2 ci-dessus, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne détériore pas la fonction de transposase est muni d'extrémités franches. Le fragment d'ADN formé ci-dessus est ligaturé avec ce site Nhe I muni d'extrémités franches pour trans- former Escherichia coli, et un clone dans lequel est inséré le fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline est sélectionné. Le plasmide pHTN7152 voulu peut être obtenu à partir du clone résultant comme le montre la figure 8. (4) Insertion d'un gène d'aspartokinase, qui est l'un des gènes de la biosynthèse de la lysine, dans le transposon artificiel contenant le gène de résistance à la tétracycline. Etant donné que le plasmide pHTN7152 construit selon la figure 8 ne possède pas de site approprié de clivage pour une endonucléase de restriction auquel il soit possible d'insérer un gène d'aspartokinase, le plasmide pHTN7156 dans lequel un site d'insertion est introduit est construit de la manière suivante. Un fragment d'environ 1,4 kb contenant un gène de résistance à la tétracycline peut être obtenu par clivage du vecteur plasmidique pBR322 (produit par Takara Shuzo) avec les endonucléases de restriction Eco RI et Ava I. Ce fragment est ligaturé avec un fragment obtenu par clivage du vecteur plasmidique pHY300PLK (produit par Takara Shuzo) avec l'endonucléase de restriction Sma I pour transformer Escherichia coli, après quoi un clone dans lequel est inséré le fragment de gène de résistance à la tétracycline est sélectionné. Le plasmide pHY300-TC est obtenu à partir du clone résultant. En outre, dans le plasmide pHIS714K2 construit de la manière indiquée cidessus, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne dégrade pas la fonction de transposase est muni d'extrémités franches. Un fragment contenant un gène de résistance à la tétracycline qui est obtenu par clivage de pHY300-TC avec les endonucléases de restriction Eco RI et Xba I est ligaturé avec ce site Nhe I muni d'extrémités franches pour transformer Escherichia coli, puis un clone dans lequel est inséré le fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline est sélectionné. Le plasmide voulu pHTN7156 est obtenu à partir du clone résultant de la manière représentée sur la figure 9. Ensuite, un gène d'aspartokinase qui est l'un des gènes de la biosynthèse de la lysine est inséré dans le plasmide pHTN7156 de la manière suivante. Le plasmide p399AK9B qui contient un gène d'aspartokinase (ou aspartate kinase), qui est dérivé d'un mutant producteur de lysine de Brevibacterium lactofermentum, une bactérie coryneforme, et qui est désensibilisé vis-à- vis de l'inhibition concertée par la lysine et la thréonine (voir W094/25605) est clivé avec l'endonucléase de restriction Bain HI et autoligaturé pour construire pHSG399AK duquel une origine de réplication qui fonctionne dans les bactéries coryneformes est retirée. Ce plasmide pHSG399AK est clivé avec les endonucléases de restriction Eco RI et Sphe I pour obtenir un fragment contenant le gène d'aspartokinase d'environ 1,7 kb. Ce fragment est inséré dans le site Bgl II à extrémités franches du plasmide pHTN7156 comportant le transposon artificiel contenant le gène de résistance à la tétracycline pour obtenir le plasmide pHTN7156-C comme le montre la figure 9. (5) Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la tétracycline et dépourvu de transposase dans une unité de transposon. Le plasmide pHIS714 est clivé avec les endonucléases de restriction Nhe I et Xba I pour obtenir un fragment contenant un gène de transposase. Ce fragment d'ADN est introduit dans un site Xba I du vecteur plasmidique pUC19 pour construire le plasmide Tnp/pUC19. De plus, TnppUC19 est clivé avec les endonucléases de restriction Mro I et Xba I pour déléter une séquence comprenant un codon de terminaison de IS714 et une répétition inversée (RI) du côté 3'. Un ADN double brin synthétique qui est conçu pour réintroduire le codon de terminaison est inséré par ligature dans la partie clivée ci-dessus. On obtient ainsi un gène de transposase qui n'est pas situé entre des répétitions inversées. Puis, le plasmide ORFLpUC19 obtenu est clivé avec les endonucléases de restriction Sma I et Xba I pour obtenir un fragment contenant le gène de transposase d'environ 1,5 kb qui est ensuite inséré dans une partie du vecteur plasmidique pHY300PLK obtenue par retrait d'une séquence située entre ses sites Sma I et Xba I, puis le plasmide pHY-ORF obtenu est clivé avec les endonucléases de restriction Eco RI et Kpn I. Le fragment obtenu est muni d'extrémités franches. En même temps, le vecteur plasmidique pHSG398 est digéré partiellement avec l'endonucléase de restriction Pvu II pour déléter un fragment contenant un site de clonage multiple et est ligaturé avec le fragment contenant le gène de transposase obtenu de la manière décrite ci-dessus pour former le plasmide pORF1 (figure 10). D'autre part, le fragment Nhe I - Xba I du plasmide pHIS714 qui contient un gène de transposase est obtenu, muni d'extrémités franches et introduit dans le site Pst I muni d'extrémités franches du vecteur plasmidique pUC19 pour obtenir le plasmide Tnp (Pst)/pUC19. Le gène de transposase de ce plasmide Tnp(Pst)/pUC19 est soumis à un remplacement de bases partiel au moyen d'une trousse de mutagenèse U. S. E. (produite par Pharmacia Biotech). La base remplacée est G qui est la 288e base de la séquence IS714. Cette base G est remplacée par C. Ce plasmide à remplacement de base est appelé Tnp(Pst)M/pUC19 et sa structure est représentée sur la figure 11, sur laquelle * indique la mutation introduite. La transposition d'un élément transposable est contrôlée par différents systèmes qui peuvent être par exemple les suivants (Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington D. C. (1989)): 1) Un gène inhibiteur ou un gène répresseur d'une transposase est situé à proximité d'un gène de transposase à l'intérieur d'un élément transposable (par exemple Tn 3); 2) Deux cadres ouverts de lecture coexistent et celui qui est le plus proche de l'extrémité 3' est codant. Un décalage traductionnel de cadre de lecture entre les deux cadres ouverts de lecture se produit à faible fréquence de sorte que les deux cadres ouverts de lecture sont traduits intégralement, ce qui conduit à l'expression d'une transposase (par exemple IS1); 3) Dans un cadre ouvert de lecture codant une transposase, il existe un autre codon d'initiation de la traduction (ATG, GTG) et la traduction commence à ce codon de manière à exprimer un inhibiteur (par exemple Tn5 (IS50)). Dans IS714, il existe un cadre ouvert de lecture qui correspond sensi- blement à la longueur totale de IS714, et il n'existe pas d'autre cadre ouvert de lecture. Ceci indique la possibilité que IS714 ait un cadre ouvert de lecture codant une transposase comme Tn5 et qu'un inhibiteur soit traduit à partir d'un autre codon d'initiation dans le cadre ouvert de lecture. La recherche d'une séquence analogue à un promoteur révèle la possibilité que la séquence GTG en position 286 à 288 soit le codon d'initiation d'un inhibiteur. La mutation introduite dans le plasmide Tnp(Pst)M/pUC19 a pour but de ne pas initier la traduction de l'inhibiteur. La séquence située entre les sites de clivage pour les endonucléases de restriction Sma I et Nae I qui est présente dans la première moitié du gène de transposase est délétée de pORF1. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de Tnp(Pst)M/pUC19 avec les endonucléases de restriction Sma I et Nae I est inséré par ligature dans la partie déletée ci-dessus pour obtenir le plasmide pORF2. La séquence située entre les sites Sma I et Xba I est délétée de pORF2 et le fragment résultant est muni d'extrémités franches. Un fragment d'ADN contenant un atténuateur d'opéron tryptophane est obtenu par clivage de pBSF2-SD7 avec les endonucléases de restriction Nae I et Hind III, et ce fragment est ensuite muni d'extrémités franches. Les deux fragments ci-dessus sont ligaturés entre eux pour obtenir le plasmide pORF3. Le plasmide pORF3 est clivé avec les endonucléases de restriction Sal I et Bpu 11021 pour déléter le fragment contenant la première moitié du gène de transposase. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de Tnp(Pst)/pUC19 avec les endonucléases de restriction Sal I et Bpu 11021 est inséré par ligature dans la partie délétée ci-dessus pour former le plasmide pORF4 comme le montre la figure 11. Le plasmide TnplpUC19 est clivé avec Sac I puis digéré avec la nucléase BAL31 à 30C pendant 20min pour déléter une séquence proche du codon d'initiation du gène de transposase du côté amont. Ensuite, le fragment contenant le gène de transposase est séparé par clivage à l'aide du site Sph I et est ligaturé avec pHSG398 qui est clivé avec Sma I et Sph I. Le plasmide ainsi obtenu est appelé delTnp5/398. Ce plasmide est clivé avec les endonucléases de restriction Kpn I et Hind III, et le fragment contenant la première moitié du gène de transposase ' obtenu est muni d'extrémités franches. Puis, le vecteur plasmidique pKK233-2 (produit par Pharmacia Biotech) est clivé avec NcoI et Hind III et muni d'extrémités franches. Les deux fragments précédents sont ligaturés entre eux pour former le plasmide pTrc-ORF. Ce plasmide pTrc-ORF est clivé avec Ssp I et Bpu 1102I pour former un fragment contenant le promoteur Trc et la première moitié du gène de trans- posase. pORF3 est clivé avec Xba I, muni d'extrémités franches et clivé encore avec Bpu 1102I pour déléter un fragment contenant la première moitié du gène de transposase. Le fragment obtenu par clivage de pTrc- ORF de la manière décrite ci-dessus est ligaturé avec pORF3 ainsi déleté pour former pORF7 comme le montre la figure 12. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de delTnp5/398 avec les endonucléases de restriction Kpn I et Hind III est cloné entre les sites KpnI et Hind III du vecteur plasmidique pUC18. La partie située entre les sites Bsm I et Nae I du plasmide delTnp5/18 obtenu est déletée, et le fragment obtenu est ligaturé avec le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de Tnp(Pst)M/pUC19 avec les endonucléases de restriction Bsm I et Nae I pour former le plasmide delTnpSM/18. Ce plasmide delTnp5M/18 est clivé avec Kpn I et Hind III, et le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu est muni d'extrémités franches. Le plasmide pKK233-2 est clivé avec Nco I et Hind III, et le fragment résultant est muni d'extrémités franches. Les deux fragments obtenus sont ligaturés entre eux pour former pTrc-TnpM. pORF8 est construit à partir de pTrc-TnpM et de pORF3 par le procédé utilisé pour construire pORF7 (figure 13). Les plasmides destinés à être introduits dans une bactérie coryneforme sont construits à l'aide des plasmides pORF3, pORF4, pORF7 et pORF8 mentionnés ci-dessus. On va décrire ci-dessous la construction de pORF41 à partir de pORF3. Tout d'abord, pHIS714 est clivé avec Nhe I et Sac II pour déléter la majeure partie du gène de transposase. Un ADN synthétique double brin conçu pour introduire un site de clonage est inséré dans la partie délétée ci-dessus pour former pHTN7160. -- pHTN7160 est clivé avec l'endonucléase de restriction Kpn I, muni d'extrémités franches puis clivé encore avec Bgl I pour obtenir un fragment contenant des répétitions inversées (RI) des deux côté de IS714 et une origine de réplication sensible à la température (Brevi.TS ori) qui fonctionne dans une bactérie coryneforme. pORF3 est clivé avec l'endonucléase de restriction Ear I, muni d'extrémités franches puis clivé de nouveau avec Bgl I. Le fragment de pHTN7160 mentionné ci-dessus est inséré dans pORF3 ainsi clivé pour former pORF41pre. Puis, pORF41-pre est clivé avec Eco RV dont le site est situé entre des répétitions inversées (RI) aux deux extrémités de IS714. Un fragment Eco RI-Ava I qui contient un gène de résistance à la tétracycline (Tc) de pBR322 est muni d'extrémités franches et ligaturé avec le fragment clivé avec Eco RV ci-dessus pour former pORF41 comme le montre la figure 14. Le procédé mentionné ci-dessus est mis en oeuvre de nouveau pour construire pORF31 à partir de pORF4 par l'intermédiaire de pORF31-pre, pORF71 à partir de pORF7 par l'intermédiaire de pORF71-pre, et pORF81 à partir de pORF8 par l'intermédiaire de pORF81-pre, respectivement. pORF3 est clivé avec Xba I et Ear I, muni d'extrémités franches et autoligaturé pour former pORFC0 qui ne contient pas de gène de transposase (figure 15). pORFC2 est construit à partir de pORFC0 par l'intermédiaire de pORFC2-pre de la même manière que pORF41 est formé à partir de pORF3. Ces plasmides ainsi obtenus contiennent un gène de structure de transposase, un gène de résistance au chloramphénicol (Cm), une origine de réplication qui fonctionne dans E. coli, une origine de réplication sensible à la température qui fonctionne dans une bactérie coryneforme et un gène de résistance à la tétracycline (Tc) situé entre des répétitions inversées de IS714, pORFC2 étant dépourvu de gène de structure de la transposase. L'unité contenant des répétitions inversées aux deux extrémités de IS714 et le gène de résistance à la tétracycline est appelée unité de transposon Tn7162. IS714 lui-même ou Tn7152 décrit ci-dessus a un gène de structure de transposase dans une région qui est susceptible de transposition, tandis que Tn7162 est caractérisé par une structure dépourvue de gène de structure de transposase dans une région qui est susceptible de transposition. On peut considérer que Tn7162 est transposé par une transposase exprimée par un gène de transposase situé à l'extérieur de l'unité sur le vecteur portant Tn7162 (figure 16), ou bien que Tn7162 est transposé par une transposase exprimée par un gène de transposase situé sur un chromosome. On va maintenant expliquer la construction d'un plasmide pour bactéries coryneformes qui contient un gène de transposase et qui est exempt d'unité de transposon. Le plasmide pHIS714K1 est clivé avec EcoO 109I et Mro I pour déléter IS714 puis autoligaturé pour former pHIS714Kdel. En même temps, pORF3 est clivé avec l'endonucléase de restriction Ear I, muni d'extrémités franches et clivé de nouveau avec Bgl I. pHIS714Kdel est clivé avec l'endonucléase de restriction Kpn I, muni d'extrémités franches puis clivé de nouveau avec Bgl I pour former un fragment qui contient une origine de réplication sensible à la température (Brevi.TS ori) qui fonctionne dans les bactéries coryneformes. Les fragments ainsi obtenus sont ligaturés entre eux pour former pORF40 comme le montre la figure 17. Ce procédé est mis en oeuvre de nouveau pour construire pORF30 à partir de pORF4, pORF70 à partir de pORF7, pORF80 à partir de pORF8 et pORFC1 à partir de pORFC0, respectivement. Concernant les séquences d'insertion des bactéries coryneformes telles que IS719 et IS903 qui comportent les séquences nucléotidiques représentées par les séquences SEQ ID NO: 5 et 9 du tableau de séquences donné dans la suite, qui sont différentes de IS714 mentionné ci-dessus, il est possible de construire des transposons artificiels en insérant des gènes de résistance à des médicaments tels qu'un gène de résistance au chloramphénicol et un gène de résistance à la tétracycline, et des gènes voulus tels qu'un gène d'aspartokinase, dans des sites appropriés de clivage pour des endonucléases de restriction à l'extérieur de la région régulatrice et de la région structurale du gène de transposase dans la séquence d'insertion. Lorsqu'il n'y a pas de site approprié de clivage pour une endonucléase de restriction à l'extérieur de la région régulatrice et de la région structurale du gène de transposase, il est possible de préparer à l'avance un site approprié de clivage pour une endonucléase de restriction dans une région qui n'inhibe pas la fonction de transposase en modifiant la séquence d'insertion par une mutation spécifique partielle de bases par amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR), ou par insertion d'un gène au moyen d'un oligonucléotide d'ADN synthétique (adaptateur). Le transposon artificiel ainsi construit est introduit dans une bactérie coryneforme hôte par l'intermédiaire d'un vecteur approprié, par exemple un plasmide qui n'est pas limité d'une manière particulière. Habituellement, on emploie un plasmide dérivé de bactéries coryneformes. Il peut s'agir par exemple de pHM1519 [Agric. Biol. Chem., 48, 2901 - 2903 (1984)], pAM330 [Agric. Biol. Chem., 48, 2901 - 2903 (1984)], et de plasmides contenant des gènes de résistance à des médicaments obtenus à partir des plasmides mentionnés ci-dessus. Pour amplifier le transposon artificiel introduit dans un chromosome avec un bon rendement, il est judicieux d'utiliser un plasmide ayant une origine de réplication sensible à la température comme indiqué en (1) [voir la demande japonaise Kokai n 7 491/1993]. Le plasmide contenant le transposon artificiel peut être introduit dans la bactérie coryneforme par le procédé aux protoplastes [Gene, 39, 281 - 286 (1985)] ou par le procédé d'électroporation [Bio/Technology, 7, 1067 1070 (1989)]. Le transposon artificiel peut être introduit dans le chromosome d'une bactérie coryneforme par l'intermédiaire du plasmide sensible à la température par transformation de la bactérie coryneforme avec ce plasmide, incubation du transformant à 25C, température à laquelle le plasmide peut être répliqué de manière à amplifier le plasmide contenant le transposon artificiel et à former des centaines de copies du plasmide par cellule qui sont introduites dans le chromosome, puis incubation à 34C pour retirer les plasmides en surnombre. L'amplification de gène est réalisée dans le chromosome avec un bon rendement par ce procédé. Il est possible d'utiliser un plasmide normal à la place du plasmide sensible à la température. Toutefois, il est souvent difficile de retirer les plasmides en surnombre après l'introduction du transposon artificiel dans le chromosome. Par ailleurs, on dispose également d'un procédé dans lequel un transposon artificiel est introduit dans une bactérie coryneforme au moyen d'un fragment d'ADN d'un transposon artificiel seul ou d'un vecteur plasmidique qui ne peut pas être répliqué dans les bactéries coryneformes (par exemple un vecteur plasmidique qui est répliqué dans Escherichia coli) [demande japonaise Kokai n 107 976/1995; et Mol. Gen. Genet., Vertes A. A., Asai Y., Inui M., Kobayashi M., Kurusu Y. et Yukawa H., 245, 397 - 405 (1994)]. Toutefois, dans ce procédé, le fragment d'ADN ne peut pas être amplifié dans la souche hôte après la transformation, et le rendement de transposition dans le chromosome hôte est relativement faible. La souche dans le chromosome de laquelle le gène voulu est introduit ou la souche dans le chromosome de laquelle le gène voulu est amplifié est sélectionnée à l'aide du degré de résistance à un médicament du gène de résistance à un médicament qui est introduit en même temps que le gène voulu. Le gène de résistance à un médicament qui doit être utilisé peut être par exemple un gène de résistance à la kanamycine, un gène de résistance au chloramphénicol, un gène de résistance à la tétracycline, un gène de résistance à l'ampicilline ou un gène de résistance au méthotrexate. On préfère en particulier un gène de résistance à un médicament dans lequel le degré de résistance est corrélé avec le nombre de copies du gène de résistance à un médicament. Dans ce cas, il est possible d'obtenir une souche dans le chromosome de laquelle le gène voulu est amplifié à partir du clone qui peut se développer en présence du médicament et qui, de ce fait, est présent en une concentration plus importante. Lorsque la bactérie coryneforme a été transformée au moyen du plasmide (par exemple pHTN7156-C) contenant le gène de résistance à un médicament, tel que le gène de résistance à la tétracycline, et le gène voulu, tel que le gène d'aspartokinase désensibilisé, et lorsque le transposon artificiel a été transposé dans le chromosome de l'hôte, il est possible d'évaluer le nombre de copies de transposition dans le chromosome après la transposition par le procédé suivant. Le transformant est incubé pendant une nuit à 25-C dans du milieu liquide CM2G contenant un médicament choisi tel que la tétracycline (Tc) à une concentration appropriée (de 1 à 20/ug/ml dans le cas de Tc), 10 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de tryptone, 5 g/1 de glucose et 5 g/l de NaCl. La culture est diluée de manière appropriée avec une solution de NaCL à 0,9 % et est étalée sur le milieu gélosé CM2G contenant la concentration appropriée de médicament en une quantité de 100 ul. La culture résultante est incubée à 34C. Plusieurs clones sont sélectionnés de manière aléatoire parmi les nombreuses colonies formées. L'ADN chromosomique est préparé, digéré totalement avec différentes endonucléases de restrictions appropriées comprenant Pvu II et soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Les fragments sont transférés sur un filtre de nitrocellulose, de Nylon ou de poly(difluorure de vinylidène) (PVDF). Ce filtre est soumis à une hybridation de Southern utilisant un fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline marqué avec 32p comme sonde pour détecter le nombre de bandes qui sont hybridées à cette sonde. Le transformant dans lequel le gène voulu est amplifié dans le chromosome ainsi obtenu peut être incubé selon un procédé et des conditions employés habituellement. Le milieu de culture pour l'incubation est un milieu de culture ordinaire contenant une source de carbone, une source d'azote et des ions inorganiques. Il est judicieux d'ajouter si nécessaire des micronutriments organiques tels que des vitamines, des acides aminés et analogues. La source de carbone peut être constituée par exemple par des glucides tels que le glucose et le saccharose, des acides organiques tels que l'acide acétique et des alcools tels que l'éthanol. La source d'azote peut être constituée par l'ammoniac, l'ammoniaque et les sels d'ammonium. Les ions inorganiques peuvent être par exemple des ions magnésium, des ions phosphate, des ions potassium ou des ions fer. Ces sources sont utilisées suivant les besoins. L'incubation est réalisée dans des conditions aérobies pendant 1 à 7 jours tandis que le pH est maintenu dans le domaine de 5,0 à 8,5 et que la tem- pérature est maintenue dans le domaine de 15 à 37C. Le gène est amplifié à l'aide du transposon artificiel de sorte que le rendement de production de la substance utile voulue est augmenté et que la substance voulue est produite et s'accumule à l'intérieur ou à l'extérieur de la souche cultivée. La substance voulue peut être recueillie par un procédé connu. Exemples La présente invention va être illustrée de manière plus détaillée au moyen des exemples suivants. Exemple 1 Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la kanamycine à l'aide de IS714 Le plasmide pEC701-IS14 qui contient la séquence IS714 qui est une séquence d'insertion de bactérie coryneforme a été clivé avec les endonucléases de restriction Pvu II et Eco RI pour obtenir un fragment de 1,6 kb contenant IS714. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12684 contenant le plasmide pEC701- IS14 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le n' de dépôt FERM P-12863 le 10 mars 1992 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 9 mars 1993 pour se voir attribuer le n de dépôt BP-4232. Par ailleurs, le plasmide sensible à la température pHSC4 a été digéré - avec l'endonucléase de restriction SalI et muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Sal I du plasmide sensible à la température pHSC4 est situé dans la région qui ne participe pas à la réplication. En outre, un fragment contenant IS714 a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le fragment résultant a ensuite été inséré dans le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Sal I par ligature pour produire le plasmide pHIS714 comme le montre la figure 2. La souche Escherichia coli AJ12571 contenant le plasmide pHSC4 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 11 octobre 1990 sous le numéro FERM P-11763 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 26 août 1991 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-3524. Le fragment de 1,6 kb contenant IS714 qui a été obtenu de la manière décrite ci-dessus a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I et a été inséré dans le site Sma I de pHIS714 par ligature pour former les plasmides pHTN7141 et pHTN7142, comme le montre la figure 2. L'analyse par clivage avec des enzymes de restriction a révélé que les deux fragments IS714 étaient insérés dans la même orientation dans le plasmide pHTN7141 mais dans des orientations opposées dans le plasmide pHTN7142. Des fragments contenant chacun deux séquences IS714 et la séquence de l'origine de réplication sensible à la température de pHSC4 qui est active dans les bactéries coryneformes peuvent être isolés par clivage de pHTN7141 et de pHTN7142 avec l'endonucléase de restriction Pvu II. D'autre part, le vecteur plas- midique pHSG298 (produit par Takara Shuzo) comporte aussi deux sites de clivage pour l'endonucléase de restriction Pvu II de sorte qu'un fragment de 2,3 kb contenant un gène de néomycine phosphotransférase (gène de résistance à la kanamycine) peut être obtenu par clivage de pHSG298 avec l'endonucléase de restriction Pvu II. PHTN7141 et pHSG298 ont été clivés avec l'endonucléase de restriction Pvu II puis ligaturés l'un à l'autre pour transformer Brevibacterium lactofermentum AJ12036. Le plasmide pHTN7143 a été obtenu à partir de la souche transformée qui était résistante à 25 #g/ml de kanamycine (Kmin) comme le montre la figure 3. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12826 qui contient le plasmide pHTN7143 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi i Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) en vertu du Traité de Budapest le 9 mars 1993 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt BP-4231. Le plasmide pHTN7144 a été obtenu à partir de pHTN7142 et de * pHSG298 de la manière mentionnée ci-dessus, comme le montre la figure 4. PHTN7143 et pHTN7144 ont une structure telle qu'un gène de néomycine phos- photransférase est situé entre deux séquences IS714. De plus, les plasmides pHIS714K1 et pHIS714K2 ont été préparés à partir des plasmides pHIS714 et pHSG298 en tant que plasmides témoins comme le montre la figure 5. Dans les plasmides pHIS714K1 et pHIS714K2, les fragments d'insertion contenant chacun le gène de néomycine phosphotransférase sont situés dans des sites opposés. Pour réduire la taille du transposon artificiel, on a construit un transposon artificiel dans lequel un gène de néomycine phosphotransférase est inséré dans une séquence IS714. Dans IS714, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I est présent dans une position qui n'a pas d'influence défavorable sur la fonction de transposase. De ce fait, le plasmide pHIS714 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Nhe I et ses extrémités ont été rendues franches. En même temps, la région du gène de néomycine phosphotransférase a été retirée du plasmide pUC4K (produit par Pharmacia Biotech) par clivage avec l'endonucléase de restriction Pst I et ses extrémités ont été rendues franches. Les deux fragments obtenus ont été ligaturés l'un à l'autre pour former le plasmide pHTN7145 comme le montre la figure 6. La souche Escherichia coli AJ13128 contenant le plasmide pHTN7145 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le numéro de dépôt FERM P-15011 le 29 juin 1995 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 16 mai 1996 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-5537. Evaluation des performances de transposition des transposons artificiels Les performances de transposition des transposons artificiels ainsi obtenus ont été évaluées de la manière suivante. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été transformée avec le plasmide pAJ43 comportant le gène de la chloramphénicol acétyltrans- férase pour produire Brevibacterium lactofermentum AJ1l1882 qui a été transformé avec le plasmide pHTN7145 contenant le transposon artificiel de sorte que le plasmide pAJ43 et le plasmide pHTN7145 coexistaient dans Brevibacterium lactofermentum. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ11882 contenant pAJ43 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le numéro de dépôt FERM P-6517 le 28 avril1982 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 22 mai 1982 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-136. La souche de Brevibacterium lactofermentum contenant pHTN7145 et pAJ43 obtenue de la manière décrite ci-dessus a été incubée pendant une nuit à 25C dans du milieu de culture CM2G contenant 25 /g/ml de kanamycine (Km), /ug/ml de chloramphénicol (Cm), 10 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de tryptone, g/l de glucose et 5 g/l de NaCl tout en étant secouée. La solution de culture a ensuite été diluée de manière appropriée, étalée sur du milieu gélosé CM2G contenant 25 fg/ml de Km et 5 ug/ml de Cm, et incubée à 34C. Les plasmides ont été extraits à partir de 100 souches parmi les colonies formées et leurs tailles ont été examinées par électrophorèse. Parmi ceux-ci, trois diffèrent des plasmides pHTN7145 et pAJ43 en ce qui concerne les masses moléculaires. Il s'agit de plasmides dont la masse moléculaire est la somme des masses moléculaires de pAJ43 et du transposon artificiel. Lorsque l'on a analysé ces plasmides par clivage avec des endonucléases de restriction, on a constaté que la séquence présente dans pHTN7145 était insérée dans pAJ43. En ce qui concerne l'un de ces plasmides, la séquence nucléotidique au voisinage de la partie insérée dans pAJ43 et du fragment d'insertion a été déterminée par le procédé aux didésoxy. Il est apparu que les séquences des deux extrémités du transposon artificiel étaient présentes et que la séquence cible GGTIATT (séquence SEQ ID NO: 12 du tableau de séquences donné dans la suite) sur pAJ43 qui a subi l'insertion était dupliquée. D'après ces résultats, on constate que lorsque l'on choisit la structure de transposon dans laquelle le gène qui ne participe pas à l'activité de transposition (gène de néomycine phosphotransférase) est inséré dans une séquence IS714, ' celle-ci est transposée à la manière d'un transposon en conservant cette structure. Evaluation de la fréquence de transposition d'un transposon artificiel La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été transformée avec pHTN714K1, un plasmide témoin, pHTN7143, pHTN7144 et pHTN7145, et la fréquence de transposition du transposon artificiel dans le chromosome hôte a été évaluée. pHTIN7143, pHTN7144 et pHTN7145 contenaient tous le transposon artificiel. Chacun des transformants a été incubé pendant une nuit à 25C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus, qui contient 25 ug/ml de Km. Puis, la culture a été diluée avec une solution de NaCl à 0,9 % et a été étalée sur du milieu gélosé CM2G contenant 25, ug/ml de Km en une quantité de 100,ul. La substance résultante a été incubée à 34C et 25 C, et la fréquence à laquelle une souche résistante à Km apparaissait à chaque température a été mesurée d'après le nombre de colonies. Le nombre de colonies à 34C a été divisé par le nombre de colonies à 25 C. La valeur résultante a été définie comme étant la fréquence de transposition. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1 Elément transposable ou transposon Fréquence de transpo- Rapport artificiel sition IS714 1,85 x 10- 3 1 Tn7143 3,52 x 10-3 1,9 Tn7144 2,38 x 10-3 1,3 Tn7145 2,08 x 10-2 11,2 D'après les résultats ci-dessus, on constate que les transposons arti- ficiels Tn7143 (contenu dans pHTN7143) et Tn7144 (contenu dans pHTN7144) avaient une fréquence de transposition dans le chromosome hôte qui était seulement 2 fois ou 1,3 fois supérieure à celle de IS714 (contenu dans pHIS714K1) en tant que plasmide témoin, mais que le transposon artificiel Tn7145 (contenu dans pHTN7145) avait une fréquence de transposition environ 11 fois supérieure, ce qui montre qu'il s'agit d'un transposon artificiel très efficace. Exemple 2 Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance au chloramphénicol à l'aide de IS714 Le vecteur plasmidique pHSG398 (produit par Takara Shuzo) a été clivé avec l'endonucléase de restriction Acc II pour obtenir un fragment d'environ 1,1 kb contenant un gène de chloramphénicol acétyltransférase. Ce fragment Acc II a été inséré dans un site Sma I de pUC18 (produit par Takara Shuzo) et cloné. Un clone voulu a été sélectionné à partir d'un transformant de Escherichia coli qui avait été cultivé dans du milieu L contenant 25,g/ml de Cm, 100/xg/ml d'ampicilline (Ap), 10 g/1 de tryptone, 5 g/l d'extrait de levure et 5 g/l de NaCl. Le plasmide a été appelé pUC18-CM. De plus, un fragment d'environ 1,1 kb qui a été retiré de pUC18-CM par clivage avec Eco RI et Hind III et qui contenait un gène de chloramphénicol acétyltransférase a été muni d'extrémités franches. Dans pHIS714K2 construit dans l'exemple 1, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne dégrade pas la fonction de transposase a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le fragment mentionné ci-dessus a été ligaturé avec ce site Nhe I pour transformer Escherichia coli. Les colonies qui ont été cultivées sur du milieu gélosé L contenant 25 tg/ml de Cm et 50/,g/ml de Km ont été prélevées. Un clone dans lequel était inséré le fragment contenant le gène de chloramphénicol acétyltransférase a été sélectionné. Le plasmide contenu dans ce clone a été appelé pHTN7151 et est représenté sur la figure 7. La souche Escherichia coli AJ13129 obtenue par transformation de Escherichia coli HB101 avec le plasmide pHTN7151 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le numéro de dépôt FERM P-15012 le 29 juin 1995 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 16 mai 1996 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-5538. Evaluation dans le chromosome du nombre de copies formées par transposition du transposon artificiel La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été transformée avec pHTN7151 et le nombre de copies du transposon artificiel dans le chromosome qui ont été formées par transposition du transposon artificiel dans le chromosome hôte a été évalué par le procédé suivant. Le transformant résultant a été incubé pendant une nuit à 25C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus, qui contenait 3 ug/ml de Cm, dilué de manière approprié avec une solution de NaCI à 0,9 %, et étalé sur du milieu gélosé CM2G contenant 3 /g/ml de Cm en une quantité de 100 Ul. La substance résultante a été incubée à 34C. Un clone sensible à la kanamycine a été sélectionné à partir des colonies formées. Ce clone a été incubé pendant une nuit à 30C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus, contenant 3,ug/ml de Cm, dilué de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 %, et étalé sur le milieu gélosé CM2G mentionné ci-dessus contenant 6/ug/ml de Cm en une quantité de 100 p1. La substance résultante a été incubée à 30'C et certains clones ont été sélectionnés de manière aléatoire à partir des colonies formées. Un ADN chromosomique a été préparé à partir de chacun des clones, digéré totalement avec l'endonucléase de restriction Pvu II, soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et transféré sur un filtre de poly(difluorure de vinylidène) (PVDF). Ce filtre a été soumis à une hybridation de Southern au moyen d'un fragment contenant le gène de chloramphénicol acétyltransférase marqué avec 32p comme sonde, et le nombre de bandes qui s'hybridaient à la sonde a été mesuré. Il est ainsi apparu que dans trois des quatre clones sélectionnés de manière aléatoire, deux copies du transposon artificiel comportant le gène de résistance au chloramphénicol étaient transposées dans le chromosome hôte. Exemple 3 Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la tétracycline à l'aide de IS714 Le vecteur plasmidique pBR322 (produit par Takara Shuzo) a été clivé avec les endonucléases de restriction Eco RI et Ava I pour obtenir un fragment d'environ 1,4 kb ayant un gène de résistance à la tétracycline. Puis, ce fragment a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4. Dans pHIS714K2 construit dans l'exemple 1, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne dégrade pas la fonction de transposase a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de - Klenow de l'ADN polymérase I. Le fragment mentionné ci-dessus a été ligaturé avec ce site Nhe I pour transformer Escherichia coli. On a obtenu des colonies dans du milieu gélosé L contenant 25 ug/ml de Tc et on a sélectionné un clone dans lequel était inséré le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide contenu dans ce clone, appelé pHTN7152, est représenté sur la figure 8. La souche Escherichia coli AJ13130 obtenue par transformation de Escherichia coli avec le plasmide pHTN7152 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi i Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le numéro de dépôt FERM P-15013 le 29 juin 1995 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 16 mai 1996 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-5539. Evaluation dans le chromosome du nombre de copies formées par transposition du transposon artificiel La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été transformée avec pHTN7152 et le nombre de copies qui ont été formées dans le chromosome par transposition du transposon artificiel a été évalué de la manière suivante. Le transformant a été incubé pendant une nuit à 25 C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus contenant 1,5 #g/ml de Tc, puis il a été dilué de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 % et étalé sur le milieu gélosé CM2G mentionné ci-dessus contenant Tc dans le domaine de 1,5 #g/ml à ,ug/ml. La substance résultante a été incubée à 34C. Certains clones ont été sélectionnés de manière aléatoire à partir des colonies formées. Un ADN chromosomique a été préparé à partir de chacune des colonies, digéré totalement avec l'endonucléase de restriction Pvu II, soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et transféré sur un filtre de poly(difluorure de vinylidène) (PVDF). Ce filtre a été soumis à une hybridation de Southern à l'aide d'un fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline marqué avec 32p comme sonde, et le nombre de bandes qui s'hybridaient à la sonde a été mesuré. Ainsi, comme le montre le tableau 2 ci-dessous, deux ou trois copies du transposon artificiel ayant le gène de résistance à la tétracycline ont été détectées avec une fréquence élevée. Il est donc apparu que le transformant de type à copies multiples voulu pouvait être obtenu avec une fréquence élevée en utilisant le gèni de résistance à la tétracycline comme gène de sélection par la résistance à un médicament. Tableau 2 Concentration de Tc Nombre de clones Nombre de clones testés (ug/ml) testés 1 copie 2 copies 3 copies 1,5 6 4 2 0 2,0 4 4 0 0 3,0 4 3 1 0 4,0 6 2 3 1 ,0 6 5 1 0 La souche Brevibacterium lactofermentum AJ13188 qui est résistante à 4 ug/ml de Tc et qui se révèle avoir 3 copies du transposon artificiel sur son chromosome a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) en vertu du Traité de Budapest le 14 mai 1996 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt BP-5536. Exemple 4 Construction d'un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la tétracvcline et un gène d'aspartokinase à l'aide de IS714 Un gène d'aspartokinase qui fait partie des gènes de biosynthèse de la lysine a été inséré dans un transposon artificiel contenant un gène de résistance à la tétracycline de la manière suivante. Le vecteur plasmidique pBR322 (produit par Takara Shuzo) a été clivé avec les endonucléases de restriction Eco RI et Ava I pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 1,4 kb contenant le gène de résistance à la tétracycline. Ce fragment a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4. Le fragment d'ADN ainsi obtenu a été ligaturé avec un fragment obtenu par clivage du vecteur plasmidique pHY300PLK (produit par Takara Shuzo) avec l'endonucléase de restriction Sma I pour transformer Escherichia coli. On a obtenu des colonies sur du milieu gélosé L contenant 25 ug/ml de Tc et on a sélectionné un clone dans lequel était inséré le fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide de ce clone a été appelé pHY300-TC. De plus, un fragment obtenu par clivage de pHY300-TC avec les endonucléases de restriction Eco RI et Xba I et contenant le gène de résistance à la tétracycline de pBR322 a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Dans pHIS714K2 construit de la manière indiquée ci-dessus, le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Nhe I de IS714 situé dans une position qui ne dégrade pas la fonction de transposase a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le fragment mentionné ci-dessus a été ligaturé avec ce site Nhe I pour transformer Escherichia coli. On a obtenu des colonies sur du milieu gélosé L contenant 25 ug/ml de Tc. Un clone dans lequel était inséré le fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline a été sélectionné et le plasmide contenu dans ce clone, qui a été appelé pHTN7156, est représenté sur la figure 9. Par ailleurs, la souche Escherichia coli AJ12691 (W094/25605) comportant le plasmide p399AK9B contenant un gène d'aspartokinase dérivé d'un mutant producteur de lysine de Brevibacterium lactofermentum et qui est désen- sibilisé vis-à-vis de l'inhibition concertée par la lysine et la thréonine a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba- shi Ibaraki-ken 305, Japon) le avril 1992 sous le numéro de dépôt FERM P-12198 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 10 février 1995 pour se voir attribuer le numéro de dépôt FERM BP-4999. Ce plasmide p399AK9B a été clivé avec l'endonucléase de restriction Bamn HI et a été autoligaturé pour construire pHSG399AK dont l'origine de réplication qui fonctionne dans les bactéries coryneformes a été retirée. Ce plasmide pHSG399AK a été clivé avec Eco RI et Sph I pour obtenir un fragment d'environ 1,7 kb contenant le gène d'aspartokinase. Ce fragment a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4. Le site de clivage pour l'endonucléase de restriction Bgl II du plasmide pHTN7156 qui comporte le transposon artificiel contenant le gène de résistance à la tétracycline a été muni d'extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le fragment formé de la manière indiquée ci-dessus a ensuite été inséré dans ce site Bgl II pour produire le plasmide pHTN7156-C représenté sur la figure 9. La souche Escherichia coli AJ13131 obtenue par transformation de Escherichia coli avec le plasmide pHTN7156-C a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 29juin 1995 sous le numéro de dépôt FERM P-15014 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 16 mai 1996 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP5540. Evaluation du nombre de copies formées dans un chromosome par transposition d'un transposon artificiel La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 ou Brevibacterium lactofermentum AJ3445 a été transformée avec pHTN7156-C. Le nombre de copies d'un transposon qui ont été formées dans un chromosome par transposition d'un transposon artificiel dans un chromosome hôte a été évalué. La souche AJ12036 contient dans son chromosome un gène d'aspartokinase de type sauvage tandis que la souche AJ3445 présente une résistance à la S-2amyléthyl- L-cystéine et comporte un gène d'aspartokinase qui est désensibilisé visà-vis de l'inhibition concertée par la lysine et la thréonine. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 26 mars 1984 sous le numéro de dépôt FERM P-7559 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 13 mars 1985 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-734. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ3445 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) le 2 mars 1973 sous le numéro de dépôt FERM P-1944 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 17 mai 1996 pour se voir attribuer le numéro de dépôt BP-5541. Tout d'abord, le transformant a été incubé pendant une nuit à 25 C dans du milieu CM2G contenant 0,7 /g/ml de Tc, 10 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de tryptone, 5 g/l de glucose et 15 g/l de NaCI. La culture a été diluée de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 % et a été étalée sur le milieu de culture gélosé CM2G mentionné ci-dessus contenant 1,5 /g/ml à 5 ug/ml de Tc en une quantité de 100 /l. La culture résultante a été incubée à 34'C. Certains clones ont été sélectionnés de manière aléatoire parmi les colonies formées et ont été répliqués dans du milieu gélosé CM2G contenant 25 #g/ml de Km. Les souches sensibles à Km ont ensuite été sélectionnées. Les ADN chromosomiques des souches sensibles à Km sélectionnées ont été produits, digérés totalement avec l'endonucléase de restriction Bgl II, soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur un filtre de poly(difluorure de vinylidène) (PVDF). Ce filtre a été soumis à une hybridation de Southemrn à l'aide d'un fragment contenant le gène d'aspartokinase marqué avec 32p (de 440 pb du site Hind III au site Eco RI de la seconde moitié du gène) comme sonde, et le nombre de bandes qui s'hybridaient à cette sonde a été détecté. On a ainsi constaté que lorsque AJ12036 était utilisé comme hôte, deux copies du transposon Tn7156-C étaient transposées dans 4 des souches analysées et que lorsque AJ3445 était utilisé comme hôte, deux copies du transposon Tn7156-C étaient transposées dans 8 des 22 souches analysées. Ceci montre que plusieurs copies du gène utile peuvent être introduites dans le chromosome à fréquence élevée lorsque l'on utilise un gène de résistance à la tétracycline comme gène de sélection par la résistance à un médicament. Evaluation de la quantité de lysine produite dans une souche dans laquelle un gène d'aspartokinase a été transposé au moven d'un transposon artificiel La quantité de lysine produite dans la souche mentionnée ci-dessus dans laquelle le transposon est transposé a été évaluée. La souche contenant le transposon a été étalée sur toute la surface d'un milieu gélosé CM2G contenant 0,7 tg/ml de Tc et a été incubée pendant une nuit à 34'C. Les cellules en une quantité qui était égale au 1/6 de la quantité initiale ont été inoculées dans 20 ml d'un milieu producteur de lysine contenant 100 g/l de glucose, 55 g/l de sulfate d'ammonium, 50 ml/1 d'hydrolysat de protéines de soja (appelé "Mamenou en japonais" (Ajinomoto Co., Inc.), 1 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium, 1 g/l de sulfate de magnésium, 2 mg/l de vitamine B1, 0,5 mg/1 de biotine, 5 mg/l d'amide de l'acide nicotinique, 2 mg/1 de sulfate de fer et 2 mg/l de sulfate de manganèse (ce milieu a été amené à un pH de 7,5 puis stérilisé dans un autoclave à 115'C pendant 15 min, après quoi 50 g/l de carbonate de calcium lui ont été ajoutés). La solution de culture a été incubée dans un flacon de Sakaguchi à 30 C pendant 72 h. La teneur de lysine formée dans la solution de culture a été analysée et la quantité de lysine produite dans la souche contenant le transposon artificiel a été évaluée. Comme le montrent les tableaux 3 et 4 ci-dessous, lorsque l'on utilise AJ12036 et AJ3445 comme souches parentales, on observe une augmentation de la quantité de lysine produite du fait de la transposition de Tn7156-C par rapport à la souche exempte de transposon. De plus, la quantité de lysine produite augmente avec le nombre de copies de transposition (1 copie et 2 copies) du transposon. Ceci montre que la quantité d'acide aminé produite dans la souche pêtre augmentée par introduction de copies du gène utile en utilisant le gène de résistance à la tétracycline comme gène de sélection par la résistance à un médi- cament. Tableau 3 Ouantité de lysine produite dans une souche contenant un transposon transposé. AJ12036 étant utilisée comme souche parentale Souche Nombre de copies de Quantité de lysine transposition de Tn7156-C produite (g/l) AJ12306 O 0,0 Tn7156-Cint-Y1 1 12,8 Tn7156-Cint-Y2 2 18,8 Tableau 4 Ouantité de lysine produite dans une souche contenant un transposon transposé. AJ3445 étant utilisée comme souche parentale Souche Nombre de copies de Quantité de lysine transposition de Tn7156-C produite (g/l) AJ3445 0 18,7 Tn7156-Cint-06 1 21,3 Tn7156-Cint- 019 2 25,2 Exemple 5 Construction du vecteur navette pVK7 Le plasmide pAM330 est un plasmide cryptique (c'est-à-dire un plasmide non modifié artificiellement et présent naturellement dans un micro- organisme) présent dans Brevibacterium lactofermentum, comme décrit dans la demande de brevet japonais publiée n' 11 280/1989 et dans le brevet US n4 788 762. Ce plasmide pAM330 est produit à partir de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 et peut être utilisé comme origine de réplication d'un vecteur navette qui est amplifiable dans Brevibacterium. Un nouveau vecteur navette a été construit en combinant pHSG299 (produit par Takara Shuzo), qui est un vecteur à usages multiples pour E. coli, avec pAM330. pAM330 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Hind III à un site qui a été muni d'extrémités franches avec l'ADN polymérase de T4. De plus, pHSG299 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Ava II à un site qui a été muni d'extrémités franches avec l'ADN polymérase de T4. Les fragments résultants ont été ligaturés l'un à l'autre pour obtenir un plasmide qui était une combinaison de pAM330 et de pHSG299. La construction de pVK7 est représentée schématiquement sur la figure 18. pVK7 est réplicable dans E. coli et Brevibacterium et confère à un hôte une résistance à la kanamycine. Ce vecteur a des sites de clonage Pst I, Sal I, Bamn HI, Kpn I, Sac I et Eco RI permettant chacun le clivage à un site parmi des sites de clonage multiple de pHSG299. Construction du vecteur navette pVC7 Le nouveau vecteur navette pVC7 a été construit, de même que pVK7, en combinant pHSG399 (produit par Takara Shuzo), qui est un vecteur à usages multiples pour E. coli, avec pAM330. pAM330 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Hind III à un site qui a été muni d'extrémités franches avec l'ADN polymérase de T4. De plus, pHSG399 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Bsa I à un site qui a été muni d'extrémités franches avec l'ADN polymérase de T4. Les fragments résultants ont été ligaturés l'un à l'autre pour obtenir un plasmide qui était une combinaison de pAM330 et de pHSG399. La construction de pVC7 est représentée schématiquement sur la figure 19. pVC7 est réplicable dans E. coli et Brevibacterium et confère à un hôte une résistance à la kanamycine. Ce vecteur a des sites de clonage Pst I, Sal I, Bam HI, Kpn I, Sac I, Eco RI, Sma I et Hind III qui permettent chacun le clivage à un site parmi des sites de clonage multiple de pHSG399. Production d'un plasmide contenant dapA. dapB et lysA (1) Préparation de lysA et construction d'un plasmide contenant lysA La souche de type sauvage Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a été utilisée comme donneur d'ADN chromosomique. L'ADN chromosomique a été préparé à partir de la souche ATCC 13869 selon un procédé habituel. Un fragment d'ADN contenant ar, lysA et un promoteur d'un opéron les contenant a été amplifié à partir de l'ADN chromosomique par amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR). Concernant les amorces d'ADN utilisées pour l'amplification, des ADN synthétiques 23-mères ayant les séquences nucléo- tidiques représentées dans SEQ ID NO: 13 et 14 du tableau de séquences donné dans la suite ont été utilisés pour amplifier une région d'environ 3,6 kb codant l'arginyl-ARNt synthase et la DDC diaminopimélate décarboxylase sur la base d'une séquence connue pour Corvnebacterium glutamicum (voir Molecular Microbiology. 4(11l 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics. 212. 112-119 (1988)). La synthèse d'ADN et la ACP ont été réalisées par un procédé conventionnel, c'est-à-dire que l'ADN a été synthétisé selon un procédé courant au moyen d'un synthétiseur d'ADN modèle 380B produit par Applied Biosystems et au moyen du procédé aux phosphoramidites (voir Tetrahedron letters (1981), 22, 1859). Le gène a été amplifié par ACP à l'aide de l'appareil DNA Thermal Cycler Modèle PJ2000 produit par Takara Shuzo et d'ADN Taq polymérase selon un procédé conçu par le fournisseur. La séquence du fragment d'ADN amplifié est représentée dans SEQ ID NO: 15 du tableau de séquences donné dans la suite. pHSG399 a été utilisé comme vecteur de clonage pour le fragment contenant le gène amplifié de 3579 pb. pHSG399 a été digéré avec l'enzyme de restriction SmaI et ligaturé avec le fragment d'ADN contenant lysA amplifié. Un plasmide obtenu de la manière décrite ci- dessus, qui contenait ys provenant de ATCC 13869, a été appelé p399LYSA. Un fragment d'ADN contenant ysA a été extrait par digestion de p399LYSA avec KpnI et BamHI. Ce fragment d'ADN a été ligaturé avec pHSG299 qui avait été digéré avec KpnI et BamHI. Le plasmide obtenu a été appelé p299LYSA. Le procédé de construction de p299LYSA est représenté sur la figure 20. p399LYSA a été clivé avec les endonucléases de restriction Kpn I et Bam HI pour extraire un fragment lysA. Ce fragment a été ligaturé avec pVK7 clivé avec Kpn I et Bam HI. Le plasmide ainsi produit est appelé pLYSAm (figure 21). (2) Préparation de dapA et construction d'un plasmide contenant dapA La souche de type sauvage Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a été utilisée comme donneur d'ADN chromosomique. L'ADN chromosomique a été préparé à partir de la souche ATCC 13869 selon un procédé habituel. Un fragment d'ADN contenant dapA a été amplifié à partir de l'ADN chromosomique par ACP. Concernant les amorces d'ADN utilisées pour l'amplification, des ADN 20-mères ayant les séquences nucléotidiques représentées dans SEQ ID NO: 16 et 17 du tableau de séquences donné dans la suite ont été synthétisés pour amplifier une région d'environ 1,5 kb codant DDPS sur la base d'une séquence connue pour Corvnebacterium glutamicum (voir Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); n' d'accès EMBL X53993). La synthèse d'ADN et l'ACP ont été réalisées par le procédé conventionnel. La séquence du fragment d'ADN amplifié est représentée dans SEQ ID NO: 18. pCR1000 (produit par Invitrogen, voir Bio/technology, 9, 657-663 (1991)) a été utilisé comme vecteur de clonage pour le fragment contenant le gène dapA amplifié de 1411 pb. La ligature de l'ADN a été réalisée à l'aide d'une trousse de ligature d'ADN (produite par Takara Shuzo) selon un procédé connu. On a ainsi construit un plasmide dans lequel le fragment dapA de 1411 pb amplifié à partir du chromosome de Brevibacterium lactofermentum était inséré dans pCR1000. Le plasmide obtenu de la manière décrite ci-dessus, dont dapA provenait de ATCC 13869, a été appelé pCRDAPA (figure 22). La souche transformante AJ13106 obtenue par introduction de pCRDAPA dans E. coli a été déposée au niveau international le 26 mai 1995 sous le numéro de dépôt FERM BP-5113 auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Trade and Industry (code postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon) en vertu du Traité de Budapest. Le plasmide pCRDAPA contenant daA a été digéré avec Kpn I et Eco RI et le fragment d'ADN contenant dapA a été isolé. Ce fragment a été ligaturé avec pHSG399 digéré avec KpnI et EcoRI pour obtenir p399DPS (figure 23). (3) Préparation de lvsC de type sauvage et mutant et préparation de plasmides les contenant La souche Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 et une souche mutante productrice de L-lysine AJ3445 obtenue à partir de la souche ATCC 13869 par un traitement de mutation ont été utilisées comme donneurs d'ADN chromosomique. La souche AJ 3445 avait été soumise à une mutation de manière que lvsC soit modifié pour présenter une désensibilisation sensible vis-à- vis de l'inhibition concertée par la lysine et la thréonine (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)). Un fragment d'ADN contenant lysC a été amplifié à partir de l'ADN chromosomique par ACP (White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Concernant les amorces d'ADN utilisées pour l'amplification, des ADN simple brin 23-mère et 21-mère ayant les séquences nucléotidiques représentées dans SEQ ID NO: 19 et 20 ont été synthétisés pour amplifier une région d'environ 1643 pb codant lys sur la base d'une séquence connue pour Co nebacterium glutamicum (voir Molecular Microbiologv (1991), 5), 1197-1204 et Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). La synthèse d'ADN et l'amplification d'ADN ont été réalisées par le procédé conventionnel. La séquence de l'ADN amplifié est représentée dans SEQ ID NO: 21. Le fragment contenant le gène amplifié de 1643 kb a été confirmé par électrophorèse en gel d'agarose. Puis, le fragment excisé du gel a été purifié selon un procédé habituel et a été digéré avec les enzymes de restriction NruI et EcoRI. pHSG399 a été utilisé comme vecteur de clonage pour le fragment contenant le gène. pHSG399 a été digéré avec les enzymes de restriction SmaI et EcoRI et a été ligaturé avec le fragment lysC amplifié. L'ADN a été ligaturé au moyen d'une trousse de ligature d'ADN (produite par Takara Shuzo) selon un procédé connu. On a ainsi préparé des plasmides dans lesquels les fragments IyâC amplifiés à partir de chromosomes de Brevibacterium lactofermentum étaient ligaturés avec pHSG399. Un plasmide comprenant lysC provenant de ATCC 13869 (souche de type sauvage) a été appelé p399AKY et un plasmide comprenant Jy.C provenant de AJ3445 (bactérie productrice de L-lysine) a été appelé p399AK9 (voir figure 24). (4) Préparation de dapB et construction d'un plasmide contenant dapB La souche de type sauvage Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a été utilisée comme donneur d'ADN chromosomique. L'ADN chromosomique a été préparé à partir de la souche ATCC 13869 selon un procédé habituel. Un fragment d'ADN contenant dapB a été amplifié à partir de l'ADN chromosomique par ACP. Concernant les amorces d'ADN utilisées pour l'ampli- fication, des ADN 23-mères ayant les séquences nucléotidiques représentées dans SEQ ID NO: 22 et 23 du tableau de séquences donné dans la suite ont été synthétisés pour amplifier une région d'environ 2,0 kb codant DDPR (la dihydrodipicolinate réductase) sur la base d'une séquence connue pour Brevibacterium lactofermentum (voir Journal of Bacteriologvy, 157(9) 2743-2749 (1993)). La synthèse d'ADN et l'ACP ont été réalisées par le procédé conventionnel. La séquence de l'ADN amplifié est représentée dans SEQ ID NO: 24. pCR-Script (produit par Invitrogen) a été utilisé comme vecteur de clonage pour le fragment contenant le gène dB amplifié de 2001 pb. On a ainsi construit un plasmide dans lequel le fragment dU de 2001 pb amplifé à partir du chromosome de Brevibacterium lactofermentum était inséré dans pCR-Script. Le plasmide obtenu de la manière décrite ci-dessus, dont dapB provenait de ATCC 13869, a été appelé pCRDAPB (figure 25). La souche transformante AJ13107 obtenue par l'introduction de pCRDAPB dans E. çcli a été déposée au niveau international le 26 mai 1995 sous le n de dépôt FERM BP-5114 auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (code postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon) en vertu du Traité de Budapest. (5) Construction d'un plasmide comprenant une combinaison de lvsC. dapA et dapB mutants p399DPS a été clivé avec EcoRI et SphI pour former des extrémités franches puis soumis à une extraction d'un fragment contenant le gène dapA. Ce fragment a été ligaturé avec p399AK9 qui avait été digéré avec SalI et muni d'extrémités franches pour construire un plasmide p399CA dans lequel lysC et dapA -mutants coexistaient. Le plasmide pCRDAPB comprenant dapB a été digéré avec EcoRI et muni d'extrémités franches puis digéré avec SacI pour extraire un fragment d'ADN de 2,0 kb contenant dapB. Le plasmide p399CA comprenant dapA et lysC mutants a été digéré avec SpeI et muni d'extrémités franches puis digéré avec SacI et ligaturé avec le fragment de 2,0 kb extrait ci- dessus du fragment dapB pour obtenir un plasmide comprenant ly, dapA et dapB mutants. Ce plasmide a été appelé p399CAB (figure 26). Ensuite, p399CAB a été clivé avec Sac II, et le fragmeng clivé a été muni d'extrémités franches. Puis, un fragment contenant "apA et dapB en a été extrait. En même temps, pLYSAm a été clivé avec Bain HI et le fragment clivé a été muni d'extrémités franches. Ces fragments ont été ligaturés l'un à l'autre pour produire un plasmide qui contenait dapA dapB et lyA et qui pouvait proliférer de lui-même dans les bactéries coryneformes. Ce plasmide est appelé pABLm. La construction de pABLm est représentée schématiquement sur la figure 21. Introduction du plasmide contenant dapA. dapB et lysA dans Brevibacterium lactofermentum Tn7156-Cint-Y2 Le plasmide pBALm produit de la manière décrite ci-dessus, qui contient dapA, dQ et lysA, a été introduit dans Brevibacterlium lactofermentum Tn7156-Cint-Y2 par le procédé aux impulsions électriques [demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 207 791/1990 au nom de Sugimoto et al.]. Le transformant a été sélectionné par le marqueur de résistance à un médicament, le gène de résistance à la kanamycine du plasmide et le gène de résistance à la tétracycline amplifiés dans le chromosome. Ainsi, la sélection du transformant a été réalisée dans un milieu de culture complet contenant 25,ug/ml de kanamycine et 1,5/ug/ml de tétracycline. Ce transformant est appelé Tn7156-Cint-Y2/pABLm. Introduction du plasmide contenant lvsC. dapA. dapB et lysA dans une souche sauvage de Brevibacterium lactofermentum Un fragment d'ADN (appelé dans la suite "Brevi.-ori") capable de rendre un plasmide réplicable de manière autonome dans les bactéries appartenant au genre Corynebacterium a été introduit dans p399CAB. Brevi.-ori a été préparé à partir d'un vecteur plasmidique pHK4 contenant Brevi.-ori et réplicable de manière autonome dans les cellules de Escherichia cQi et dans les bactéries appartenant au genre Corvnebacterium. pHK4 a été digéré avec l'enzyme de restriction BamHI et muni d'extrémités franches à - l'aide d'une trousse pour former des extrémités franches (produite par Takara Shuzo) selon un procédé connu. Après la formation des extrémités franches, un lieur Kpn I phosphorylé (produit par Takara Shuzo) a été ligaturé pour produire une modification de manière que le fragment d'ADN correspondant à la partie Brevi.-ori puisse être excisé de pHK4 par digestion avec Kpn I seulement. Ce plasmide a été digéré avec Kpn I et le fragment d'ADN Brevi.-ori obtenu a été ligaturé avec p399CAB qui avait été digéré aussi avec Kpn I pour former un plasmide contenant les gènes lyC , dapA et de et réplicable de manière autonome dans les bactéries appartenant au genre Coynebacterium. Ce plasmide a été appelé pCAB. La construction de pCAB est représentée schématiquement sur la figure 26. PHK4 a été construit par digestion de pHC4 avec KpnI et BamHI, extraction d'un fragment Brevi.-ori et ligature de celui-ci avec pHSG298 qui avait été digéré aussi avec KpnI et BamHI (voir demande de brevet mise à la disposition du public n 5-7491). pHK4 confère une résistance à la kanamycine à un hôte. Escherichia çoi contenant pHK4 a été appelé Escherichia ç AJ13136 et déposé le 1er août 1995 sous le n' de dépôt FERM BP-5186 auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (code postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon). Le plasmide p299LYSA comprenant ls a été digéré avec KpnI et BamHI et muni d'extrémités franches, puis un fragment contennat le gène lysA a été extrait. Ce fragment a été ligaturé avec pCAB qui avait été digéré avec HpaI pour construire un plasmide comprenant une combinaison de lysC. dapA dapB et lysA mutants réplicable de manière autonome dans les bactéries coryneformes. Le plasmide construit a été appelé pCABL. Le processus de construction de pCABL est représenté sur la figure 27. On note que le fragment de gène lysA est inséré dans un site HpaI dans un fragment d'ADN contenant le gène d dans pCABL. Toutefois, le site HpaI est situé en amont d'un promoteur pour le gène dapB (nucléotides n 611 à 616 dans la séquence SEQ ID NO: 24), de sorte que le gène dapB n'est pas désactivé. Le plasmide pCABL produit ci-dessus, qui contient lvsC dapA, dapB et lysA, a été introduit dans la souche sauvage de Brevibacterium lactofermentum AJ12036, et la sélection du transformant a été réalisée dans un milieu de culture complet contenant S 5g/ml de chloramphénicol. Ce transformant est appelé AJ12036/pCABL. Evaluation de l'incubation de la souche construite ci-dessus Les transformants AJ12036/pCABL et Tn7156- Cint-Y2/pABLm de la souche sauvage de Brevibacterium lactofermentum AJ12036 ont été incubés dans un milieu de culture de production de L- lysine, et la quantité de L-lysine produite a été évaluée. La composition du milieu de culture de production de L-lysine est indiquée ci-dessous. Milieu de culture de production de L-lysine: Les ingrédients ci-dessous (en quantités par litre) ont été dissous, sauf le carbonate de calcium, et la solution a été ajustée à pH 8,0 avec KOH. La solution résultante a été stérilisée à 115 C pendant 15 min, et 50 g de carbonate de calcium qui avaient été séparément stérilisés à sec ont été ajoutés à la solution. Glucose 100 g (NH4)2SO4 55 g KH2PO4 1 g MgSO4,7H20 1 g Biotine 500 #g Thiamine 2 000 ug FeSO4,7H20 0,01 g MnSO4,7H20 0,01 g Nicotinamide 5 mg Hydrolysat des protéines de soja (Mamenou) 30 ml Carbonate de calcium 50 g La souche parentale et le transformant ont été inoculés dans le milieu de culture ayant la composition mentionnée ci-dessus, et ont été incubés à 31,5C tout en étant secoués dans un sens et dans l'autre. La quantité de L-lysine produite au bout de 72 h d'incubation, la croissance (DO562) et la stabilité à la fin de l'incubation sont présentées dans le tableau 5 ci-dessous. La croissance a été évaluée en diluant la solution 101 fois et en mesurant la densité optique à 562 nm. En outre, concernant la stabilité, la solution de culture à la fin de l'incubation a été cultivée dans un milieu de culture complet après la dilution, les colonies formées ont été placées sur une boîte contenant un médicament et la stabilité a été exprimée sous forme de taux de croissance des colonies formées sur la boîte contenant un médicament. Tableau 5 Souche/plasmide Croissance Quantité de L-lysine Stabilité (%) produite (g/l) AJ12036 0,700 0,0 - AJ12036/pCABL 0,590 28,1 90 Tn7156-Cint-Y2/pABLm 0,608 28,5 100 Comme le montre le tableau 5, la quantité de lysine produite augmentait lorsque l'on a utilisé la souche dans laquelle lyC était amplifié dans le plasmide et lorsqu'on a utilisé la souche dans laquelle lyC était amplifié dans le chromosome. De plus, la stabilité de AJ12036/pCABL était de 90 % tandis que celle de Tn7156-Cint-Y2/pABLm était de 100 %. Exemple 6 Construction du plasmide pHTN7150 Etant donné que le transposon artificiel Tn7145 construit de la manière décrite ci-dessus, qui porte un gène de résistance à la kanamycine, ne présente pas de site approprié pour l'insertion d'un gène dacide dihydrodipicolinique synthase, un nouveau plasmide pHTN7150 dans lequel un nouveau site d'insertion a été introduit, a été construit de la manière suivante. Un gène de résistance à la kanamycine a été retiré du vecteur plasmidique pUC4K (produit par Pharmacia Biotech) par clivage avec l'enzyme de restriction PstI et a été muni d'extrémités franches. Le fragment contenant le gène de résistance à la kanamycine a été inséré dans le site Sma I de pHY300PLK (produit par Takara Shuzo) pour former pHY300-KM. Puis, pHY300-KM a été digéré avec les enzymes de restriction Eco RI et XbaI pour retirer par clivage un fragment contenant le gène de résistance à la kanamycine. Ce fragment a été muni d'extrémités franches et inséré dans le site Nhe I à extrémités franches de IS714 sur le plasmide pHIS714 pour former le plasmide pHTN7150. Le transposon artificiel Tn7150 de pHTN7150 comporte un gène de résistance à la kanamycine comme gène marqueur et un site BglII qui peut être utilisé comme site de clonage de gène. Combinaison de pHTN7150 et du gène dapA de Brevibacterium lactofermentum Un gène codant une acide dihydrodipicolinique synthase qui est un gène de biosynthèse de la lysine a été inséré dans le transposon artificiel de pHTN7150 contenant un gène de résistance à la kanamycine de la manière suivante. Après clivage avec Eco RI du plasmide p399DPS contenant dapA, le fragment résultant a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4, et un lieur Bain HI phosphorylé (produit par Takara Shuzo) a été lié à celui-ci pour modifier le fragment de manière que le gène dapA puisse être retiré par clivage avec Bam HI seule. Le plasmide obtenu est appelé p399DPS2. Un fragment contenant dapA de 1,4 kb formé par clivage de ce plasmide avec Bain HI a été combiné avec pHTN7150 clivé avec Bgl Il qui donne les mêmes extrémités cohésives que Bamn HI. Le plasmide ainsi construit est appelé pHTN7150A. La construction de pHTN7150A est représentée schématiquement sur la figure 28. Transposition du transposon artificiel Tn7150A dans un chromosome de Brevibacterium lactofermentum Une souche formée par transposition du transposon artificiel Tn7150A contenant dap dans la souche de Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été obtenue à l'aide de pHTN7150A de la manière suivante. La souche AJ12036 a été transformée avec pHTN7150A. Le trans- formant résultant a été incubé pendant une nuit à 25C dans du milieu liquide CM2S contenant 25,ug/ml de kanamycine, 10 g/1 d'extraits de levure, 10 g/1 de tryptone, 5 g/l de saccharose et 15 g/l de NaCl. La culture a été diluée de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 %. La culture diluée a été étalée sur le milieu gélosé CM2S mentionné ci-dessus contenant 25,ug/ml de chloramphénicol et a été incubée à 34C. Les souches sensibles au chloramphénicol ont été sélectionnées parmi les colonies formées, et certaines de ces souches ont été sélectionnées au hasard. Les ADN chromosomiques ont été préparés à partir de celles-ci et soumis à une hybridation de Southern à l'aide du fragment dapA comme sonde pour identifier la transposition du transposon artificiel. La souche ainsi obtenue, dans laquelle le transposon artificiel est transposé, est appelée AJ12036:: A. Construction de pCBLmnc et production d'une souche Un plasmide contenant lysC, dapB et IysA mutants a été construit à l'aide de pVC7, un vecteur navette de pAM330 et pHSG399, de la manière suivante. Apres traitement avec Sac I de pCRDAPB contenant dapB. le fragment résultant a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4 pour construire un plasmide combiné à un lieur Pst I phosphorylé (produit par Takara Shuzo). Le plasmide ainsi obtenu est appelé pCRDAPB2. Ce plasmide a été clivé avec Bam HI et Pst I, et le fragment dV de 2,0 kb résultant a été inséré dans pVC7 clivé avec Bam HI et Pst I. Ce plasmide est appelé pBmc. p399AK9 contenant lys a été clivé avec Bam HI et Eco RI, et le fragment ysC de 1,6 kb résultant a été lié à pBmc clivé aussi avec Bam HI et Eco RI pour construire un plasmide contenant dapB et IysC. Ce plasmide est appelé pCBmc. Après clivage avec Eco RI de p399LYSA contenant yA. le fragment résultant a été muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4, et a été combiné avec un lieur Kpn I phosphorylé pour être modifié de manière que lvsA soit clivé avec KpnI. Ce plasmide est appelé p399LYSA2. p399LYSA2 a été clivé avec KpnI. Le fragment lysA de 3,6 kb résultant a été ligaturé avec pCBmc qui avait été digéré avec Eco RI, muni d'extrémités franches par traitement avec l'ADN polymérase de T4 et combiné avec le lieur Kpn I phosphorylé. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pCBLmc. Ce plasmide était autoréplicable dans E. coli et les bactéries coryneformes, conférait une résistance au chloramphénicol à un hôte et contenaient IysC, dQ et IysA mutants. La construction de pCBLmc est représentée schématiquement sur la figure 29. Le plasmide pCBLmc construit de la manière mentionnée ci-dessus a été introduit dans la souche AJ12036:: A dans le chromosome de laquelle le transposon artificiel Tn7150A avait été transposé par le procédé aux impulsions électriques [demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 207 791/1990 au nom de Sugimoto et al.]. La sélection des transformants a été réalisée dans le milieu CM2S mentionné ci-dessus contenant 5,/g/ml de chloram- phénicol et 25 pg/ml de kanamycine. La souche ainsi construite est appelée AJ12036:: A/pCBLmc. Evaluation de l'incubation des souches construites La souche parentale et les transformants AJ12036/pCABL et AJ12036:: A/pCBLmc ont été incubés dans un milieu de culture de production de L-lysine, et la quantité de lysine produite a été évaluée. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 Souche/plasmide Croissance Quantité de lysine produite Stabilité _(gi') (%) AJ12036 0,700 0,0 - AJ12036/pCABL 0,590 28,1 90 AJ12036::A/pCBLmc 0,595 28,7 100 Comme le montre le tableau 6, la quantité de lysine produite était augmentée dans la souche dans le chromosome de laquelle d était amplifié et dans la souche dans le plasmide de laquelle lys était amplifié. De plus, la stabilité de AJ12036/pCABL était de 90 % tandis que celle de AJ12036:: A/pCBLmc était de 100 %. Exemple 7 Construction d'un transposon artificiel ne contenant pas de transposase dans une unité de transposon Construction d'un plasmide d'expression de transposase à l'aide d'un promoteur Trc de E. coli ou analogues Le plasmide pHIS714 a été clivé avec les endonucléases de restriction Nhe I et Xba I pour obtenir un fragment contenant un gène codant une transposase duquel la répétition inversée (RI) du côté 5' de IS714 était délétée. Ce fragment d'ADN a été introduit dans un site Xba I du vecteur plasmidique pUC19 pour construire le plasmide TnpL/pUC19. De plus, TnpIJpUC19 a été clivé avec les endonucléases de restriction MroI et Xba I pour déléter une séquence comprenant un codon de terminaison de IS714 et une répétition inversée (RI) du côté 3'. Un ADN double brin synthétique ayant la séquence suivante a été inséré par ligature dans la partie clivée ci-dessus. '-CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCrAAAAAGGTACCT -3' 3'TGTCGAGTGGGTG1TAGTrACGTGAGATITITCCATGGAGATC-5' (Séquence SEQ ID NO: 25 et 26) Ainsi a été construit le plasmide ORF/pUC19 dans lequel la répétition inversée présente du côté 3' du gène de transposase dans Tnp/pUC19 était déletée. Ensuite, ce plasmide ORFLpUC19 a été clivé avec les endonucléases de restriction Sma I et Xba I pour obtenir un fragment d'environ 1,5 kb contenant le gène de transposase. Ce fragment a été inséré dans une partie du vecteur plasmidique pHY300PLK (produit par Takara Shuzo) obtenue par retrait d'une séquence entre ses sites Sma I et Xba I, puis il a été clivé avec les endonucléases de restriction Eco RI et Kpn I. Ce fragment Eco RI-Kpn I contenant le gène de trans- posase a été muni d'extrémités franches avec l'ADN polymérase de T4. En même temps, le vecteur plasmidique pHSG398 (produit par Takara Shuzo) a été partiel- lement digéré avec l'endonucléase de restriction Pvu II pour déléter un fragment d'environ 0,3 kb contenant un site de clonage multiple. Le fragment contenant le gène de transposase obtenu ci-dessus a été inséré dans la partie digérée du vecteur plasmidique pHSG398 pour former le plasmide pORF1 représenté sur la figure 10. D'autre part, le fragment qui avait été obtenu auparavant par clivage du plasmide pHIS714 avec Nhe I et Xba I a été muni d'extrémités franches et introduit dans le site Pst I, muni d'extrémités franches, du vecteur plasmidique pUC19 pour former le plasmide Tnrip (Pst)/pUC19. Le gène de transposase de ce plasmide Tnp(Pst)/pUC19 a été soumis à un remplacement de bases partiel à l'aide d'une trousse de mutagenèse U. S.E. (produite par Pharmacia Biotech). La base remplacée était G qui était la 288e base de la séquence de IS714. Cette base G a été remplacée par C de sorte que GTG est devenu GTC, sans changement au niveau des acides aminés. Ce plasmide dont une base a été remplacée est appelé Tnp(Pst)M/pUC19. La séquence située entre les sites Sma I et Nae I dans la première moitié du gène de transposase a été délétée de pORF1. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase (qui comprend le changement GTG GTC) obtenu par clivage de Tnp(Pst)M/pUC19 avec les endonucléases de restriction Sma I et Nae I a été inséré par ligature dans la partie délétée ci-dessus pour former pORF2. La séquence située entre les sites Sma I et Xba I a été délétée de pORF2, et le fragment résultant a été muni d'extrémités franches. Un fragment d'ADN contenant un atténuateur d'opéron tryptophane a été obtenu par clivage de pBSF2-SD7 avec les endonucléases de restriction Nae I et Hind III puis il a été muni d'extrémités franches. Les deux fragments précédents ont été ligaturés l'un à l'autre. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pORF3. La souche E. coli HB101 transformée avec le plasmide pBSF2-SD7 (AJ12448) a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) sous le n' de dépôt FERM P-10758 le 1re juin 1989 et a fait l'objet d'un transfert de dépôt en vertu du Traité de Budapest le 19 février 1992 pour se voir attribuer le n' de dépôt BP-3753. pORF3 a été clivé avec les endonucléases de restriction Sal I et Bpu 1102I pour déléter le fragment contenant la première moitié du gène de transposase. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de Tnp(Pst)/pUC19 avec les endonucléases de restriction Sal I et Bpu 11021 a été inséré par ligature dans la partie déletée ci-dessus pour * construire pORF4 comme le montre la figure 11. TnpL/pUC19 a été clivé avec Sac I puis digéré avec la nucléase BAL 31 à 30 C pendant 20 min pour déléter une séquence proche du codon d'initiation du gène de transposase du côté amont. Après la transformation en extrémités franches des extrémités qui ont subi la déletion, le fragment contenant le gène de transposase a été retiré par clivage à l'aide du site Sph I et a été inséré dans un site de pHSG398 qui a été clivé avec Sma I et Sph I. Le plasmide ainsi construit est appelé delTnp5/398. Ce plasmide delTnp5/398 a été clivé avec les endonucléases de restriction Kpn I et Hind III, et le fragment contenant la première moitié du gène de transposase ainsi formé a été muni d'extrémités franches. Puis, le vecteur plasmidique pKK233-2 (produit par Pharmacia Biotech) a été clivé avec Nco I et Hind III et muni d'extrémités franches. Les deux fragments précédents ont été ligaturés l'un à l'autre pour former pTrc-ORF. pTrc-ORF a été clivé avec Ssp I et Bpu 1102I pour former un fragment contenant le promoteur Trc et la première moitié du gène de transposase. pORF3 a été clivé avec Xba I, muni d'extrémités franches et clivé encore avec Bpu 1102I pour déléter le fragment contenant la première moitié du gène de transposase. Le fragment formé ci-dessus a été inséré dans cette partie déletée de pORF3 pour former pORF7 comme le montre la figure 12. Le fragment contenant la première moitié du gène de transposase obtenu par clivage de delTnp5/398 avec les endonucléases de restriction Kpn I et Hind III a été cloné entre les sites KpnI et Hind III du vecteur plasmidique pUC18. La partie située entre les sites Bsm I et Nae I de ce plasmide a été délétée, et le fragment a été ligaturé avec le fragment contenant la première moitié du gène de transposase (type à remplacement G - C) obtenu par clivage de Tnp(Pst)M/pUC19 avec les endonucléases de restriction Bsm I et Nae I pour former delTnpSM/18. Ce plasmide delTnpSM/18 a été clivé avec Kpn I et Hind mI, et le fragment contenant la première moitié du gène de transposase résultant a été muni d'extrémités franches. pKK233-2 a été clivé avec Nco I et Hind III, et le fragment résultant a été muni d'extrémités franches. Ces fragments ont été ligaturés l'un à l'autre pour obtenir pTrc-TnpM. pORF8 a été construit à partir de pTrc-TnpM par le procédé de construction de pORF7 à partir de pTrc-Tnp (figure 13). Construction d'un plasmide contenant une unité de transposon artificiel et un système d'expression de transposase à l'extérieur de cette unité destiné à être introduit dans une bactérie coryneforme Des plasmides ont été construits à l'aide des plasmides pORF3, pORF4, pORF7 et pORF8 mentionnés ci-dessus. La construction de pORF41 à partir de pORF3 est décrite ci-dessous. Tout d'abord, pHIS714 a été clivé avec Nhe I et Sac II pour déléter la majeure partie du gène de transposase. Un ADN synthétique double brin ayant la séquence suivante a été inséré dans la partie délétée ci-dessus pour former pHTN7160. '-CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC-3'SEQ ID NO: 27 3'- - GAGCTCTATAGTCTAGATGATCAGCTGG -5' SEQ ID NO: 28 pHTN7160 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Kpn I, muni d'extrémités franches puis clivé de nouveau avec Bgl I pour obtenir un fragment contenant des répétitions inversées (RI) des deux côtés de IS714 et une origine de réplication sensible à la température qui fonctionne dans une bactérie coryneforme. pORF3 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Ear I, muni d'extrémités franches puis clivé de nouveau avec Bgl I. Le fragment de pHTN7160 mentionné ci-dessus a été inséré pour obtenir pORF41-pre. Puis, pORF41-pre a été clivé avec Eco RV. Un fragment Eco RI-Ava I qui contenait le gène de résistance à la tétracycline de pBR322 et qui a été muni d'extrémités franches a été inséré dans le fragment clivé par Eco RV pour former pORF41 comme le montre la figure 14. Le procédé mentionné ci-dessus a été appliqué de nouveau pour construire pORF31 à partir de pORF4 par l'intermédiaire de pORF31-pre, pORF71 à partir de pORF7 par l'intermédiaire de pORF71-pre, et pORF81 à partir de pORF8 par l'intermédiaire de pORF81-pre, respectivement. La souche E. coli AJ13208 contenant le plasmide pORF81 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, (1-3, Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japon) en vertu du Traité de Budapest le 3 juin 1996 et s'est vue attribuer le n' de dépôt BP-5557. pORF3 a été clivé avec Xba I et Ear I, muni d'extrémités franches puis autoligaturé pour obtenir pORFC0 ne contenant pas de gène de transposase (figure 15). pORFC2 composé uniquement d'une unité de transposon (ne contenant pas de gène de transposase) a été construit à partir de pORFC0 par l'intermédiaire de pORFC2-pre de la même manière que pour la construction de pORF41 à partir de pORF3. Ces plasmides ainsi obtenus contenaient un gène de structure de trans- posase, un gène de résistance à Cm, une origine de réplication qui fonctionne dans E. coli, une origine de réplication sensible à la température qui fonctionne dans les bactéries coryneformes et un gène de résistance à la tétracycline entre des répétitions inversées de IS714, pORFC2 étant dépourvu de gène de structure de transposase. L'unité contenant des répétitions inversées aux deux extrémités de IS714 et le gène de résistance à la tétracycline est appelée unité de transposon Tn7162. Evaluation du nombre de copies de l'unité de transposon avant le gène de résistance à la tétracvcline (Tc) dans le chromosome qui ont été obtenues par transposition de l'unité de transposon Le test de transposition a été réalisé à l'aide de pORF31, pORF41, pORF81 et pORFC2 parmi les plasmides construits ci-dessus. L'unité considérée comme transposée était l'unité de transposon Tn7162. Brevibacterium lactofermentum AJ12036 a été transformée avec chacun des plasmides mentionnés ci-dessus, et le nombre de copies de l'unité de transposon Tn7162 dans le chromosome hôte qui ont été formées par transposition de l'unité de transposon Tn7162 dans le chromosome hôte a été évalué. Pour ce faire, le transformant a été incubé pendant une nuit à 25C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus contenant 5 Mg/ml de Cm, et a été dilué de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 %. La solution diluée a été étalée sur le milieu gélosé CM2G mentionné ci-dessus contenant 1,5 /g/ml à 4 ug/ml de Tc en une quantité de 100,ul1 et a été incubée à 34 C. Les clones sensibles à Cm ont été sélectionnés parmi les colonies formées et ont été incubés à 34'C. Certains des clones ont été sélectionnés de manière aléatoire parmi les colonies formées. Des ADN chromosomiques ont été produits à partir de ceux-ci, digérés complètement avec l'endonucléase de restriction Pvu II, soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur un filtre de nitrocellulose (ou de Nylon ou de PVDF). Ce filtre a été soumis à une hybridation de Southern avec, comme sonde, un fragment contenant un gène de résistance à Tc marqué avec 32p ou avec un système de marquage direct a chimiluminescence augmentée (ECL) (produit par Amersham), et le nombre de bandes qui s'hybridaient avec la sonde a été détecté. On a ainsi constaté, comme le montre le tableau 7, qu'un grand nombre de copies de l'unité de transposon Tn7162 ayant le gène marqueur de résistance à Tc était transposé à une certaine fréquence. Ceci prouve que le gène de transposase de type à expression fonction- nait à l'extérieur de l'unité de transposon dans le plasmide (pORF31, 41 et 81) ou dans l'unité de transposon présente de manière inhérente dans le chromosome (pORFC2). Tableau 7 Plasmide Concentration de Tc Nombre de copies du gène de sélective Àg/ml) résistance à Tc pORFC2 1,5 > 8 2,0 > 12 pORF31 2,0 > 7 pORF41 1,5 > 11 pORF81 1,5 3 11_ 2,0 3 4,0 5 Exemple 8 Construction d'un plasmide pour bactéries corlneformes contenant un système d'expression de transposase seul et transposition d'une unité de transposon sur un chromosome Construction d'un plasmide pour bactéries coryneformes contenant un système d'expression de transposase seul Le plasmide pHIS714K1 a été clivé avec EcoO 1091 et Mro I pour déléter IS714, puis il a été autoligaturé pour construire pHIS714Kdel. En même temps, pORF3 a été clivé avec l'endonucléase de restriction Ear I, muni d'extrémités franches et clivé de nouveau avec Bgl I. pHIS714Kdel a été clivé avec l'endonucléase de restriction Kpn I, muni d'extrémités franches puis clivé de nouveau avec Bgl I pour former un fragment qui contenait une origine de réplication sensible à la température fonctionnant dans les bactéries coryneformes. Les fragments ainsi formés ont été ligaturés l'un à l'autre pour former pORF40 comme le montre la figure 17. Ce procédé a été mis en oeuvre de nouveau pour construire pORF30 à partir de pORF4, pORF70 à partir de pORF7, pORF80 à partir de pORF8 et pORFC1 à partir de pORFC0, respectivement. Evaluation du nombre de copies de l'unité de transposon avant le gène de résistance à Tc dans le chromosome qui ont été formées par trans- position de l'unité de transposon Le test de transposition a été réalisé à l'aide de pORF80 et pORFC1 parmi les plasmides construits ci-dessus. L'unité considérée comme étant transposée était l'unité de transposon Tn7162. Dans l'exemple 7, il a été démontré que Brevibacterium lactofermentum AJ12036 était transformée avec le plasmide contenant l'unité de transposon Tn7162, et qu'un grand nombre de copies de Tn7162 était transposé dans le chromosome hôte. On a examiné par analyse par hybridation de Southern de l'ADN chromosomique si Tn7162 était transposé ou répliqué encore dans le chromosome lorsque les plasmides pORF80 et pORFC1 construits ci-dessus ont été introduits dans une copie de la souche à transposition dans le chromosome utilisée ici comme hôte pour augmenter l'activité de transposase. Puis, le nombre de copies a été évalué. Ainsi, le transformant a été incubé pendant une nuit à 25C dans le milieu liquide CM2G mentionné ci-dessus contenant 5,ug/ml de Cm, puis il a été dilué de manière appropriée avec une solution de NaCl à 0,9 %. La solution diluée a été étalée sur le milieu gélosé CM2G mentionné ci- dessus contenant 6 /g/ml à 20,ug/ml de Tc en une quantité de 100,ul et elle a été incubée à 34C. Des clones sensibles à Cm ont été sélectionnés parmi les colonies formées. Certains clones ont été sélectionnés de manière aléatoire parmi ces clones sensibles à Cm. Des ADN chromosomiques ont été préparés à partir de ceux-ci, digérés totalement avec l'endonucléase de restriction Pvu II, soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur un filtre de nitrocellulose (ou de Nylon ou de PVDF). Ce filtre a été soumis à une hybridation de Southern avec, comme sonde, un fragment contenant le gène de résistance à Tc marqué avec 32p ou avec un système de marquage direct ECL (produit par Amersham), et le nombre de bandes qui s'hybridaient avec cette sonde a été détecté. Il en est résulté qu'un grand nombre de copies de l'unité de transposon Tn7162 ayant le gène marqueur de résistance à Tc était transposé et répliqué à une certaine fréquence. TabLeau de séquences (1) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1453 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Brevibacterium lactofermentum (B) SOUCHE: AJ12036 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:130..1440 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: repeat_region (B) EMPLACEMENT:1..15 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: repeat_region (B) EMPLACEMENT:1439..1453 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: -35_signal (B) EMPLACEMENT:71..76 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: -10_signal (B) EMPLACEMENT:92..97 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGCCCTTCCG GTITTGGGGT ACATCACAGA ACCTGGGCTA GCGGTGTAGA CCCGAAAATA 60 AACGAGCCTT TTGTCAGGGT TAAGGTTIAG GTATCTAAGC TAACCAAACA CCAACAAAAG 120 GCTCTACCC ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC ATC TGC 168 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys i 5 10 2736066 CGC ACT GCG GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT GCA GGT 216 Arg Thr Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly 20 25 GAT TAC ACC CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAT ACC TCC ACC TGC 264 Asp Tyr Thr Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys 35 40 45 CCA GAA TGC TTC CAA CCT GGG GTG TTT CGT CAT CAC ACC CAC COG ATG 312 Pro Glu Cys Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met 55 60 CTC ATT GAT TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT ATC CGT 360 Leu Ile Asp Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg 70 75 CTA CCT CGC TAC CGC TGC ACC AAC CCG ACA TGT AAG CAA AAG TAT TTC 408 Leu Pro Arg Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe 85 go90 CAA GCA GAA CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC CAC CGG 456 Gln Ala Glu Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg 100 105 GTC ACC CGC TGG ATTr TTG CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG AGT GTT 504 Val Thr Arg Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val 115 120 125 CAC GCA ACT GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC TGC CAA 552 His Ala Thr Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln 135 140 CTA GCC CTC GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT CAC CAT 600 Leu Ala Leu Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His 150 155 CTT GAT GGA GTG TAT GTC AFTT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG TCA CAT 648 Leu Asp Gly Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His 165 170 AAT AGG GCT AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC GAT ATG 696 Asn Arg Ala Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met 180 185 56 2736066 ACC GGG CAT CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA GAT GTC 744 Thr Gly His Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val 195 200 205 GTC CCA GGT CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCC TGG CTT GGC TCC CGC 792 Val Pro Gly Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg 210 215 220 GGT GAA CAG TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT GGA TTC 840 Gly Glu Gin Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe 225 230 235 CAA GGC TAC GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT CGT CGC 888 Gln Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg 240 245 250 GTG ATG GAT CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG CTC ACC 936 Val Met Asp Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr 255 260 265 GCC TGC CGG CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT GGT TTA 984 Ala Cys Arg Gin Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gin Arg Arg Gly Leu 270 275 280 285 AGC CAG GAT CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG ACC TTG TTG ACC ACG CAC 1032 Ser Gln Asp Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His 290 295 300 AAG TGG TTG AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG TGG GCG 1080 Lys Trp Leu Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala 305 310 315 TAT GAC AAA GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG TAT CAG 1128 Tyr Asp Lys Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln 320 325 330 GCG ATT ATT GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG AAG AAG 1176 Ala Ile Ile Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys 335 340 345 AAA ATG CGG ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG CCG AAT 1224 Lys Met Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn 350 355 360 365 57 2736066 AAG GAA CTC GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTr AAA CGA CTT GGT GAT 1272 Lys Glu Leu Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp 370 375 380 GTG TTO GCG TAT TTC GAC GTA GGA GTC TCC AAC GGA CCA GTC GAA GCC 1320 Val Leu Ala Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala 385 390 395 ATC AAT GGA CGC CTA GAA CAC CTC CGC GGA ATC GCG CTT GGA TTC CGC 1368 Ile Asn Gly Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg 400 405 410 AAC CTC ACC CAC TAC ATC CTT CGA TGC CTC ATC CAC TCC GGA CAG CTC 1416 Asn Leu Thr His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu 415 420 425 ACC CAC AAA ATC AAT GCA CTC TAA AAACGGAAGA GCC 1453 Thr His Lys Ile Asn Ala Leu * 430 435 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 437 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys Arg Thr Ala 1 5 10 15 Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly Asp Tyr Thr 25 30 Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys Pro Glu Cys 40 45 Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met Leu Ile Asp 55 60 Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg Leu Pro Arg 70 75 80 Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gin Lys Tyr Phe Gln Ala Glu 90 95 Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg Val Thr Arg 105 110 58 2736066 Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val His Ala Thr 120 125 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln Leu Ala Leu 135 140 Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His Leu Asp Gly 150 155 160 Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His Asn Arg Ala 170 175 Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met Thr Gly His 185 190 Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val Val Pro Gly 200 205 Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg Gly Glu Gln 210 215 220 Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe Gln Gly Tyr 225 230 235 240 Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg Val Met Asp 245 250 255 Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr Ala Cys Arg 260 265 270 Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu Ser Gln Asp 275 280 285 Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His Lys Trp Leu 290 295 300 Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala Tyr Asp Lys 305 310 315 320 Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln Ala Ile Ile 325 330 335 Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys Lys Met Arg 340 345 350 Thr Ile Ile Asp Gin Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn Lys Glu Leu 355 360 365 Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp Val Leu Ala 370 375 380 Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala Ile Asn Gly 385 390 395 400 Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg Asn Leu Thr 405 410 415 His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gin Leu Thr His Lys 420 425 430 Ile Asn Ala Leu (3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: 59 2736066 (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Brevibacterium lactofermentum (B) SOUCHE: AJ12036 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GGCCCTTCCG GTTTT 15 (4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Brevibacterium lactofermentum (B) SOUCHE: AJ12036 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GGCTCTTCCG T7TIT 15 (5) 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Asn Glu 550 555 73 2736066 CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly 560 565 570 575 GMT GTC ACC GTC OCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310 Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr 580 585 590 GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358 Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys 595 600 605 CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406 Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala 610 615 620 TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454 Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu 625 630 635 GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu 640 645 650 655 GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys 660 665 670 GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val 675 680 685 GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646 Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala 690 695 700 GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694 Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile 705 710 715 GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742 Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys 720 725 730 735 74 2736066 TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790 Phe Gly Phe Setr Leu Ala Setr Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala 740 745 750 GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838 Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val 755 760 765 GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA CA A GAA 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TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562 Ser Leu Glu Ala GTGGAGGC GTTTTGG 3579 (16) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique" (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23 (17) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: 76 2736066 (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique" (iv) ANTI-SENS: OUI (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23 (18) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1411 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) 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Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser 150 155 GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829 Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys 165 170 GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877 Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr 180 185 78 2736066 GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT' TGG CTT 925 Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu 195 200 205 GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973 Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro 210 215 220 ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021 Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val 225 230 235 CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069 Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gin 240 245 250 GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117 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Leu Asp Ala 135 14o CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC 1200 Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg 150 155 AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT 1248 Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu 165 170 83 2736066 GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC 1296 Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val 180 185 CGC ATG TCC GGC ATO GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TT GGC ACC CAO 1344 Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gin Val Ile Phe Gly Thr Gln 195 200 205 GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT 1392 Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe 210 215 220 GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC 1440 Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly 225 230 235 CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TITTCAGCAGC 1493 Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 240 245 GGGTGGAATT TT=TAAAAGG AGCGTITTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT 1553 GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTITGAGTGGT CAACTGATGT 1613 TGAGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA 1673 GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733 CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793 GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTCGT 1853 GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTrGCG 1913 TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTrAATGC 1973 GCTGGAAGAA AAACT'rTGGCG ATGAACCG 2001 (25) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique" (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: CCCGGACAGCT CACCCACAAA ATCAATGCAC TCTAAAAAGG TACCT 45 84 2736066 (26) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique" (iv) ANTI-SENS: OUI (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: CTAGAGGTAC CTTTTTAGAG TGCATTGATT TTGTGGGTGA GCTGT 45 (27) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique" (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: CTAGCTCGAG ATATCAGATC TACTAGTCGA CCGC 34 (28) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "ADN synthétique' 2736066 (iv) ANTI-SENS: OUI (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: GGTCGACTAG TAGATCTGAT ATCTCGAG 28 Brève description des dessins La figure 1 est une vue montrant les structures de différents transposons artificiels. Kmr représente un gène de néomycine phosphotransférase (gène de résistance à la kanamycine) et Tnp représente un gène de transposase. La partie noire indique une séquence de répétition inversée. La figure 2 est une vue montrant la construction des plasmides pHTN7141 et pHTN7142 contenant chacun un transposon artificiel. La figure 3 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7143 contenant un transposon artificiel. La figure 4 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7144 contenant un transposon artificiel. La figure 5 est une vue montrant la construction des plasmides pHIS714K1 et pHIS714K2. La figure 6 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7145 contenant un transposon artificiel. La figure 7 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7151 contenant un transposon artificiel. La figure 8 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7152 contenant un transposon artificiel. La figure 9 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7156-C contenant un transposon artificiel. La figure 10 est une vue montrant la construction du plasmide pORF1. La figure 11 est une vue montrant la construction des plasmides pORF3 et pORF4. La figure 12 est une vue montrant la construction du plasmide pORF7. La figure 13 est une vue montrant la construction du plasmide pORF8. La figure 14 est une vue montrant la construction du plasmide pORF41 contenant une unité de transposon. La figure 15 est une vue montrant la construction du plasmide pORFC0. La figure 16 montre la différence entre une séquence d'insertion, un transposon artificiel et une unité de transposon. TCr désigne un gène de résistance à la tétracycline, Tnp désigne un gène de transposase et les rectangles noirs désignent des séquences de répétitions inversées (RI). La partie soulignée en pointillé désigne une région qui doit être transposée. La figure 17 est une vue montrant la construction du plasmide pORF40. La figure 18 est une vue montrant la construction du plasmide pVK7. La figure 19 est une vue montrant la construction du plasmide pVC7. La figure 20 est une vue montrant la construction des plasmides p399LYSA et p299LYSA. La figure 21 est une vue montrant la construction du plasmide pABLm. La figure 22 est une vue montrant la construction du plasmide pCRDAPA. La figure 23 est une vue montrant la construction du plasmide p399DPS. La figure 24 est une vue montrant la construction du plasmide p399AK9. La figure 25 est une vue montrant la construction du plasmide pCRDAPB. La figure 26 est une vue montrant la construction des plasmides p399CAB et pCAB. La figure 27 est une vue montrant la construction du plasmide pCABL. La figure 28 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7150A. La figure 29 est une vue montrant la construction du plasmide pCBLmc. La figure 30 est une vue montrant la construction du plasmide pHTN7150. REVENDICATIONS 1. Procédé pour amplifier un gène voulu caractérisé en ce qu'il comprend la formation d'un transposon artificiel qui a une structure telle qu'un gène de résistance à un médicament et le gène voulu sont situés entre des répétitions inversées et qui est transposable dans une cellule de bactérie coryne- forme, l'introduction dudit transposon artificiel dans la cellule de bactérie coryneforme, la transposition dudit transposon dans le chromosome de la bactérie coryneforme et l'amplification dudit gène voulu dans ledit chromosome. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le transposon artificiel a une structure telle qu'un gène de transposase est situé également entre les répétitions inversées. - 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les répétitions inversées et le gène de transposase sont dérivés d'une séquence d'insertion d'une ' bactérie coryneforme. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence d'insertion a une séquence de bases représentée par l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 1, 5 et 9 du tableau de séquences. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène de résistance à un médicament est un gène de résistance au chloramphénicol ou un gène de résistance à la tétracycline. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le gène voulu est un gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène voulu est un gène d'aspartokinase et/ou un gène d'acide dihydrodipicolinique synthase. 8. Bactérie coryneforme caractérisée en ce qu'elle est obtenue par amplification d'un gène voulu dans le chromosome de la bactérie par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé de production d'un acide aminé caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation d'une bactérie coryneforme obtenue par amplification d'un gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés dans le chromosome de la bactérie par le procédé selon la revendication 6 dans un milieu de culture pour former et accumuler l'acide aminé dans le milieu de culture, et la récupération dudit acide aminé. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le gène qui participe à la biosynthèse d'acides aminés est un gène d'aspartokinase et/ou un gène d'acide dihydrodipicolinique synthase et l'acide aminé est la lysine.