Brevet FR2736721A1 — publié le 19970117

L'invention a pour objet un procédé de test d'une substance, ladite substance étant éventuellement active dans le domaine capillaire. Le domaine capillaire a trait au cheveu ou au poil d'un individu. Ainsi, par "substance éventuellement active dans le domaine capillaire", ou simplement par la suite dans le texte par "substance", on entend toute molécule ou ensemble de molécules présentant une activité potentielle dans le domaine du capillaire, et en particulier toute molécule ou ensemble de molécules ayant potentiellement une activité sur la coloration, la survie, le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. La substance à tester peut être utilisée selon le procédé de l'invention soit sous sa forme moléculaire, soit sous la forme d'une composition contenant la molécule à tester. A ce jour, I'art antérieur évoque deux méthodes principales pour le test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire. La première consiste à pratiquer les essais sur des sujets volontaires et à constater de manière plus ou moins rapide les effets de la substance testée. II est évident que cette méthode présente de nombreux désavantages dont en particulier celui de s'adresser à des êtres humains, ce qui à l'évidence limite pour des raisons d'éthique le champ d'application de la méthode. Ainsi le nombre et la qualité des substances testées se trouvent limités. De plus, ces essais sont en général lourds de mise en oeuvre et s'étalent sur des périodes de temps longues. Les résultats du test sont alors dans la plupart des cas des constatations de modifications phénotypiques du follicule pileux. La deuxième méthode connue dans l'art antérieur est celle décrite dans le brevet EP 434 319. Cette méthode comprend une étape de dissection du follicule pileux consistant, à partir d'un prélèvement de peau contenant des follicules, à couper la tige pilaire au-dessous de la jonction dermo-épidermique, puis à isoler le follicule de la peau environnante sans endommager son bulbe. Une modification de cette méthode a été proposée par Williams et Stenn (Dev. Biol. 165, 469479 (1994)) qui consiste à préalablement découper la biopsie en lamelles verticales de 1 mm d'épaisseur, puis à pratiquer la dissection selon la méthode décrite dans le brevet EP 434319 en extirpant le follicule de son environnement à l'aide de pinces. On trouve dans les ouvrages traitant du cheveu et de sa biologie tous les renseignements concernant la constitution complète du follicule pileux. Nous citerons par exemple l'ouvrage de C. ZVIAK, Sciences des traitements capillaires, Edition Masson (1987). Les méthodes de test in vitro précédemment décrites ne permettent pas l'étude des réactions du follicule pileux dans son environnement épidermique vis-à-vis de la substance à tester. En effet, dans chacune de ces méthodes la biopsie est en premier lieu sectionnée sous la jonction dermo-épidermique, séparant ainsi le follicule pileux de son environnement épidermique. Par environnement épidermique il faut entendre la couche supérieure de la peau (épiderme), au niveau de l'abouchement du canal pilo-sébacé qui entoure la tige pilaire dans sa partie profonde. L'épiderme s'invagine le long du canal et constitue ainsi les premiers éléments des gaines épithéliales qui sont en contact étroit avec la tige pilaire. Cette séparation du follicule pileux de son environnement épidermique présente de nombreux inconvénients. En effet, dans les méthodes in vitro décrites dans l'art antérieur, au cours de la dissection, I'absence du contact étroit entre le follicule et son environnement épidermique a pour effet de provoquer au niveau du follicule des contraintes mécaniques dues aux efforts induits par la dissection, préjudiciabies à l'obtention d'un follicule intact, et plus particulièrement de son bulbe. Ainsi, la probabilité d'obtenir un bulbe intact, condition primordiale à la survie du follicule in vitro, est faible. Le rendement d'obtention d'un bulbe intact en est alors diminué. De plus, dans les modèles in vitro de l'art antérieur, I'absence du contact étroit entre le follicule et son environnement épidermique rend ces modèles éloignés de la réalité. En effet, ces modèles n'incluent pas les paramètres liés au contact étroit existant entre le follicule et son environnement épidermique, ces paramètres étant éliminés avant même le début de la dissection. Ainsi, les résultats obtenus dans l'étude d'une substance éventuellement active dans le domaine du capillaire sur ces modèles ne tiennent pas compte des interactions entre le follicule et son environnement épidermique et ainsi ne représentent pas la réalité. Par ailleurs, il est connu que le follicule pileux se développe au travers d'un cycle pilaire que l'on décrit généralement par les trois phases essentielles qui le constituent. La première phase est une phase active appelée phase anagène qui dure plusieurs années. Au cours de cette phase, le follicule pénètre profondément dans le derme. On constate une intense activité des cellules du bulbe qui se différencient pour donner un cheveu. La seconde phase appelée phase catagène est une phase de régression qui dure environ trois semaines et au cours de laquelle se produit un arrêt des mitoses et un arrêt de la croissance du cheveu. Pendant cette phase, le follicule remonte dans la direction de la phase supérieure du derme tandis que ta papille dermique reste dans des couches plus profondes avec formation et élongation à la base du bulbe d'une colonne épithéliale à l'extrémité inférieure de laquelle se trouve la papille dermique. La troisième phase ou phase télogène est une phase de repos qui dure environ trois mois. Au cours de cette phase la papille donne naissance à un germe secondaire qui par division cellulaire va s'allonger et former un nouveau bulbe ce qui permet l'initiation d'une nouvelle phase anagène, tandis que le cheveu mort précédant reste en place quelque mois et finit par tomber, poussé à l'extérieur de sa gaine par le cheveu naissant. II peut être important de pouvoir réaliser le test d'une substance éventuellement active dans le domaine du capillaire en fonction de la phase du cycle que traverse le follicule. Or, un désavantage supplémentaire commun aux deux méthodes in vitro de l'art antérieur est de ne pas permettre le choix du follicule pileux en fonction de la phase de développement dans laquelle il se trouve. Les deux méthodes connues de l'art antérieur passent par des étapes en aveugle ne permettant pas un choix préalable de tel ou tel follicule selon la phase du cycle dans laquelle il se trouve, I'identification exacte de la phase se faisant généralement par constatation de l'état du follicule (partie invisible) et non par l'état du cheveu (partie visible). L'invention a pour but de palier les inconvénients des méthodes de l'art antérieur. L'invention a pour objet un procédé pour tester une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées - (i) on prépare par microdissection au moins un follicule pileux viable et son environnement épidermique dont la continuité est préservée mais dont le tissu adipeux est éliminé; - (ii) on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat pendant un temps suffisant, - (iii) on met en contact ce follicule pileux avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, - (iv) on mesure un marqueur de l'activité de ladite substance testée et on évalue les résultats de la mesure par rapport à un témoin. Description des figures: Figure 1 : représente de manière shématique les étapes (i) et (ii) du procédé selon l'invention. Sur cette figure, a représente l'épiderme, b le derme, c le tissu adipeux, d la glande sébacée, e la tige pilaire, f la papille dermique, g le milieu nutritif et h le support. Figure 2 : courbe de croissance des follicules pileux (exprimée en nanomètre) en fonction du temps de culture (exprimé en nombre de jours). Figure 3 : courbe de pourcentage de survie des follicules pileux en fonction du temps de culture (exprimé en nombre de jours). Par continuité préservée du follicule pileux et de son environnement épidermique, il faut entendre que le follicule pileux et son environnement épidermique ne sont pas séparés par la microdissection. De plus, selon le procédé de la présente invention, il est possible que, en plus de son environnement épidermique, le follicule pileux obtenu après l'étape (i) conserve tout ou partie de son environnement dermique (voir figure 1). Selon l'invention, par follicule pileux, on entend un ensemble comprenant une papille dermique, un bulbe et une tige pilaire entourée de ses gaines. Ce follicule correspond généralement à un poil, un cheveu, un cil ou un sourcil. Le follicule pileux peut également comprendre certaines de ces annexes, comme en particulier la glande sébacée. On utilise dans le procédé selon l'invention une biopsie de peau, c'est à dire un prélèvement de peau humaine ou animale contenant au moins un follicule pileux. De préférence, on utilise un prélèvement de peau issu des jambes ou du cuir chevelu et encore plus préférentiellement issu du cuir chevelu. Le follicule pileux viable doit présenter un bulbe non endommagé. Le follicule pileux intact viable in vitro est obtenu à partir d'une biopsie de peau, en éliminant le tissu adipeux de la biopsie. Toute méthode connue permettant l'élimination du tissu adipeux de la biopsie peut être utilisée dans le procédé selon l'invention. Particulièrement, le tissu adipeux est éliminé à l'aide d'au moins un instrument de microchirurgie, comme une micropince ou un scalpel. De préférence, on utilise une m icropince. Pour assurer le maximum de sécurité vis-à-vis du bulbe, la dissection s'effectue sous une loupe binoculaire en présence d'un éclairage adéquat. A l'aide de l'outil choisi, on élimine généralement le tissu adipeux en commençant par retirer en premier les parties les plus éloignées de la surface cutanée. La dissection complète est obtenue en retirant l'ensemble du tissu adipeux en l'éliminant petit à petit en remontant vers la surface de la peau et en le séparant avec précaution du follicule pileux. Le procédé selon l'invention permet de visualiser directement le follicule pileux puisque celui-ci est débarrassé du tissu adipeux qui l'entourait. Ainsi, dès la fin de la première étape, il est possible de faire un choix en fonction de l'état de développement du follicule. On peut ainsi isoler aisément des follicules pileux soit en phase anagène, soit en phase catagène, soit en phase télogène. De plus, dans le cas de la coloration, le procédé permet de suivre l'évolution d'une substance éventuellement active pour la coloration ou la recoloration du cheveu au sein du follicule et de comparer simultanément cette évolution avec celle de son environnement épidermique. Bien évidement, les exigences des études à réaliser peuvent faire que seule une partie du follicule pileux soit nécessaire. Une fois le follicule pileux avec son environnement épidermique isolé, il est possible de couper la tige pilaire au niveau désiré afin de ne récupérer que les éléments essentiels à l'étude à réaliser. Ainsi, le procédé selon l'invention présente l'avantage de pouvoir choisir à volonté de disposer de tout ou partie du follicule pileux, éventuellement lié à son environnement épidermique. Selon un mode particulier de l'invention, le procédé peut comprendre, après l'étape (i), une étape supplémentaire dans laquelle on sépare le follicule pileux de son environnement épidermique, et éventuellement dermique. On peut ainsi couper la tige pilaire afin d'isoler le bulbe de son environnement épidermique, et éventuellement dermique. La figure 1 illustre ce mode opératoire. Après l'étape (i), le follicule pileux lié ou non à son environnement épidermique est mis à incuber dans un milieu de culture adéquat contenant éventuellement la substance à tester. II est bien entendu que la substance à tester peut être ajoutée au milieu d'incubation à n'importe quel moment, c'est à dire avant ou après mise en contact du follicule pileux avec ledit milieu d'incubation. Ce milieu qui est un milieu nutritif est au moins constitué des éléments nécessaires au maintien en survie du follicule pileux. Bien entendu, il peut contenir tout autre élément nécessaire par exemple à la croissance du follicule pileux. On peut citer à titre d'exemple comme milieu de culture bien connu de l'homme du métier, le milieu MEM modifié Dulbecco, le milieu Williams E, le milieu F12, le milieu de HAM, ou encore le RPM11640, vendus par les sociétés Gibco-BRL, Biomed, Boehringer ou encore Sigma. De préférence, on utilise du milieu Williams E. Dans le milieu de culture, un support peut être présent pour maintenir en surface le follicule pileux lié à son environnement épidermique, et éventuellement dermique (voir figure 1). De manière générale, le temps d'incubation est conditionné par le temps qu'il faut au follicule pileux pour répondre à la substance éventuellement active dans le domaine capillaire avec laquelle il est mis en contact, c'est à dire au temps qu'il faut pour voir apparaître une modification du niveau d'expression du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on dose. Ce temps d'incubation peut aller de quelques secondes à plusieurs jours. A titre indicatif, le temps d'incubation est généralement compris entre 10 secondes et 30 jours, et de préférence entre 1 et 96 heures. On peut citer à titre d'exemple de marqueur, et sans limitation, protéine, ADN, ARN, organite, ion, métal, acide aminé, lipide et composé liposoluble. II faut également comprendre que le marqueur de l'activité de la substance éventuellement active dans le domaine capillaire testée peut être l'aspect, tel que la longueur, du follicule et plus particulièrement de la tige pilaire. L'activité de la substance à tester est ainsi représentée par la variation du marqueur de la dite activité que l'on aura choisie de mesurer. Cette variation peut donc correspondre à une modification de la quantité, de la concentration ou de la répartition du marqueur ou encore à une modification de l'aspect du follicule. Pour cela, le procédé selon l'invention comprend une étape de mesure du marqueur de l'activité de la substance testée. Après incubation, cette mesure peut s'effectuer directement sur le milieu de culture pour les éléments excrétés par la cellule, dans le follicule pileux pour les éléments non excrétés ou encore directement sur le follicule pileux pour une modification de l'aspect de ce follicule, tel que la longueur de sa tige. Ainsi, et plus particulièrement dans le cas où l'élément recherché n'est pas excrété, on peut envisager une étape supplémentaire avant la mesure, au cours de laquelle le follicule pileux est broyé, afin de rendre plus accessible le marqueur de l'activité de la substance testée à mesurer. Bien évidemment, quel que soit le mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, toute méthode de dosage connue par l'homme du métier peut être utilisée. On peut, à titre d'exemple et sans limitation, citer les méthodes de dosage des protéines ou des acides nucléiques par colorimétrie, par électrophorèse, par transcriptase reverse et amplification par la technique des polymérisations en chaîne, la spectrographie de masse, la chromatographie (en phase gazeuse ou sur plaque), méthodes immunologiques, ou encore la microscopie optique ou électronique pour la mesure de la quantité d'un organite. Le résultat du dosage n'est en soi pas exploitable directement. II ne devient intéressant que dans la mesure où il est comparé au résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute mise en contact du follicule pileux épilé avec la substance à tester. C'est ainsi que le procédé selon l'invention inclut une étape au cours de laquelle on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. Dans le domaine capillaire, les substances éventuellement actives que l'on cherche à tester sont généralement en relation avec une modification de l'état de la chevelure du sujet et préférentiellement l'état présent ou futur de celle-ci. Généralement, les substances à tester ont éventuellement une influence soit sur la couleur des follicules pileux, soit sur la densité, sur la quantité ou sur la qualité de ceux-ci. Ce sont des substances qui ont éventuellement une influence par exemple sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. Ainsi, la présente invention permet de tester des substances éventuellement actives dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute, la coloration ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. Préférentiellement, le procédé selon l'invention permet de tester des substances ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute ou la coloration des follicules pileux. De plus, le procédé selon l'invention permet d'évaluer l'activité d'une substance qui peut être utilisée pour la préparation d'une composition cosmétique ou d'un médicament en vue de traiter l'alopécie. Un autre objet de l'invention est l'utilisation du procédé selon l'invention, pour évaluer l'efficacité d'un traitement appliqué à un sujet. On va maintenant donner à titre d'illustration un exemple qui ne saurait limiter en aucune façon la portée de l'invention. Exemple A partir d'une biopsie de scalp, une bande de cuir chevelu assez fine a été isolée à l'aide d'un scalpel. Avec une micropince, le tissu adipeux autour des follicules a été éliminée, en évitant d'endommager le bulbe pilaire. Sous un microscope, le follicule a été coupé avec un scalpel pour le séparer de son environnement épidermique et dermique. Le fragment obtenu a été maintenu en culture dans du milieu Willams E, à 37"C, en atmosphère humide en présence de 5% de CO2. La figure 2 montre que le fragment ainsi obtenu maintenu en histoculture s'allonge régulièrement à une vitesse voisine de 0,3mm par jour, ce qui est comparable à la vitesse d'allongement du cheveu in vivo. Cette croissance a été observée pendant 10 jours avec un taux de survie de 100% à 5 jours et encore supérieur à 50% à 9 jours (figure 3). Ce remarquable taux de survie peut s'expliquer par le fait que la technique de dissection permet de choisir les follicules pileux intacts et donc d'optimiser le taux de réussite de l'histoculture. REVENDICATIONS 1. Procédé pour tester une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé en ce que les étapes suivantes sont réalisées: - (i) on prépare par microdissection au moins un follicule pileux viable et son environnement épidermique dont la continuité est préservée mais dont le tissu adipeux est éliminé, - (ii) on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat pendant un temps suffisant; - (iii) on met en contact ce follicule pileux avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire; - (iv) on mesure un marqueur de l'activité de ladite substance testée et on évalue les résultats de la mesure par rapport à un témoin. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le follicule pileux préparé selon l'étape (i) présente tout ou partie de son environnement dermique. 3. Procédé selon lune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le tissu adipeux est éliminé en commençant par retirer les parties les plus éloignées de la surface cutanée. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'élimination complète du tissu adipeux est obtenue en l'éliminant petit à petit en remontant vers la surface de la peau. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après l'étape (i) on sépare le follicule pileux de son environnement épidermique, et éventuellement dermique. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le milieu de culture comprend au moins un élément nécessaire au maintien en survie du follicule pileux. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le milieu de culture comprend au moins un élément nécessaire à la croissance du follicule pileux. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 10 secondes et 30 jours. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 1 et 96 heures. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance éventuellement active dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute, la coloration ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. 11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance, la chute ou la coloration des follicules pileux. 12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, L'arrêt de la croissance ou la chute des follicules pileux. 13. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour évaluer l'activité d'une substance utilisable dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'un médicament en vue de traiter l'alopécie. 14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour évaluer l'efficacité d'un traitement appliqué à un sujet.