Brevet FR2735497A1 — publié le 19961220

La présente invention décrit un procédé d'obtention du gellane par croissance d'une bactérie appartenant à l'espèce Pseudomonas elodea (classifiée également Sphingomonas mobilis et dans certains cas Auromonas elodea) sur un milieu de culture contenant des concentrations notables de manganèse. Ce procédé permet en particulier d'augmenter la concentration en gellane dans le moût de fermentation final par rapport à celle obtenue après culture sur des milieux de fermentation contenant des traces ou dépourvu de manganèse. La production de gellane, encore appelé hétéropolysaccharide S60 par Pseudomonas elodea (ou Sphingomonas mobilis ou Auromonas elodea) ATCC 31461 est décrite principalement dans les brevets US-4.326.053, 4.326.052, 4.383.123, 4.377.636, et dans l'article intitulé "Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species: production and basic properties" publié dans "Applied and Environmental Microbiology", 1982, vol. 43 n05, pages 10861091. Le gellane est produit par fermentation aérobie sur des milieux de culture usuels contenant des sources de carbone, des sources d'azote organique et minéral et des sels minéraux. Les sels minéraux habituellement incorporés dans les milieux de culture pour bactéries sont des sources de phosphore (sous forme de phosphate), de soufre (sous forme de sulfate) qui sont des constituants minéraux importants des bactéries. Des sels de sodium, de potassium, de magnésium et de chlore, nécessaires à l'équilibre physico-chimique de la cellule bactérienne sont également souvent introduits dans le milieu de culture. D'autres éléments appelés oligoéléments doivent être également présents dans le milieu de culture, car ils jouent un rôle de cofacteurs ou d'activateurs enzymatiques. Parmi les oligoéléments, on retrouve principalement le fer, le calcium, le cobalt, le cuivre, le molybdène, le manganèse. Une très faible concentration en oligoéléments dans le milieu de culture suffit au développement des microorganismes. En fonction du milieu de culture utilisé, les oligoéléments sont soit introduits en quantité minime, soit omis en considérant que leur présence à l'état de traces dans les autres produits chimiques incorporés dans le milieu suffit à apporter une quantité suffisante pour la bactérie. Typiquement, les sels minéraux contenus dans le milieu de culture préconisé pour la production de gellane par Pseudomonas elodea ATCC 31461 sont du nitrate d'ammonium (en tant que source d'azote minéral), du phosphate de potassium ou de sodium, du sulfate de magnésium et des traces de différents sels comme du sulfate ferreux, des chlorures de cuivre, de zinc, de cobalt, de manganèse, et des sels de bore et de molybdène.Par exemple, le milieu de culture tel que décrit dans l'article intitulé "Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species : production and basic properties" publié dans "Applied and Environmental Microbiology", 1982, vol. 43 n05, pages 1086-1091, contient initialement 30 gjL de glucose, 0,5 g/L de promosoy (peptone de soja, source d'azote organique), 0,9 g/L de NH4NO3, 0,5 g/L de K2HPO4, 0,1 girl de MgS04-7H20 et 1 mVL d'une solution de sels contenant elle même 1,8 g/L de MnC12 4H2O, 2,487 g/L de FeSO4 7H2O, 0,285 g/L de H3BO3, 27 mg/L de CuC12, 21 mg/L de ZnC12, 74 mg/L de CoC12 6H20, 23 mg/L de MgMoO4 et 2,1 g/L de Na2C4H406-2H2O (tartrate de sodium dihydraté). Les solutions de sels décrites dans les brevets ayant trait à la production de gellane ont des compositions similaires. Dans de tels milieux, la concentration initiale de MnC12 4H20 est de 1,8 mg/L, soit 0,50 mg/L de Mn. Comme nous l'avons évoqué précédemment, l'incorporation de manganèse à l'état de traces dans les milieux de culture pour microorganismes est une technique courante. La présente invention concerne un procédé de production de gellane par culture du micro-organisme Pseudomonas elodea ATCC 31461 dans un milieu de fermentation contenant des concentrations notables de manganèse, c'est-à-dire des concentrations supérieures à 50 mg/L de Mn. De façon surprenante, l'ajout de telles concentrations de manganèse permet d'obtenir des concentrations de gellane plus élevées. Dans le procédé, le manganèse peut provenir de différents composés. Ces composés peuvent être par exemple de l'acétate de manganèse tétrahydraté, du chlorure de manganèse tétrahydraté ou anhydre, du nitrate de manganèse, du dioxyde de manganèse, du sulfate de manganèse tétrahydraté ou anhydre, ces exemples étant donnés à titre illustratif. La source de manganèse est en général introduite en une seule fois dans le milieu de fermentation, avant ensemencement. La concentration en manganèse dans le milieu de culture, comptée en manganèse Mn, est au moins égale à 0,05 glL, de préférence supérieure ou égale à 0,2 g/L. L'invention concerne également un milieu de culture pour produire du gellane. Le milieu de culture comporte une source de manganèse dont la concentration comptée en manganèse Mn est au moins égale à 0,05 g/L, de préférence supérieure ou égale à 0,2 g/L. Par ailleurs, en ce qui concerne les autres ingrédients du milieu de culture, le milieu nutritif permettant la croissance du microorganisme et la production de gellane par la souche peut être choisi parmi les milieux de culture décrits dans la littérature. Le milieu conventionnel contient un substrat carboné qui peut être un sucre tel que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le xylose ou le mannitol (cette liste n'étant pas limitative) ou un autre hydrate de carbone, utilisé seul ou en mélange. La concentration initiale en carbohydrate dans le milieu dépend en partie de la concentration des autres constituants du milieu, en particulier de la concentration en azote.Ainsi, pour favoriser la production de polysaccharide, il est préférable d'avoir des concentrations initiales en substrats carbonés et azotés telles que le rapport molaire des quantités de carbone et d'azote initiales (C/N) soit largement supérieur à 1. Cependant, la concentration initiale en carbohydrate doit être choisie de façon à minimiser le plus possible la concentration résiduelle (c'est-à-dire en fin de fermentation) en carbohydrate. La concentration initiale en carbohydrate varie en général de 10 à 60 g/l, de préférence de 20 à 40 g/l. La source d'azote du milieu nutritif peut être une source d'azote organique et/ou minéral. Les sources d'azote organique, composés riches en protéines ou en résidus d'hydrolyse de protéines, peuvent être de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, des extraits de viande, de la farine de poisson, de la farine de soja, de la farine de coton, de la liqueur de macération de maïs ("corn steep"), des résidus solubles de distillation, des hydrolysats de caséine, des peptones, etc. Une source d'azote minéral, sous forme de sel d'ammonium ou de sel de nitrate, peut également être utilisée seule ou en complément de sources d'azote organique. Ainsi, des milieux de culture tels que ceux décrits dans le brevet FR 94/15 742 qui comportent une source azotée constituée principalement d'ions nitrates, peuvent être utilisés dans la présente invention.La concentration en azote, comptée en azote N peut être comprise entre 0,01 et 5 g/l dans le milieu de culture. D'autres sels minéraux peuvent être introduits dans le milieu nutritif, tels que des sels de magnésium, potassium, sodium, soufre, fer, bore, zinc, cobalt, molybdène... Une composition typique du mélange de ces sels est donnée dans l'exemple 1. Cette composition est donnée à titre illustratif et n'est pas limitative. La fermentation selon la présente invention est réalisée à des températures comprises entre 25 et 350C, de préférence entre 28 et 320C. Le pH du milieu est initialement ajusté à une valeur comprise entre 6 et 8. Dans le cas de cultures en fiole agitée, le mileu est de préférence tamponné, par exemple par du tampon phosphate, pour éviter une chute excessive de pH qui inhiberait la croissance de la souche. Dans le cas de cultures en réacteur agité, le pH peut être régulé à une valeur comprise entre 6 et 8 tout au long de la fermentation. Le milieu de culture doit être agité et aéré. Lors de cultures en fioles, celles-ci sont mises à incuber sur des agitateurs à mouvement alternatif ou rotatif. Cette agitation assure également une aération du milieu. La surface d'échange entre l'air et le milieu liquide doit être suffisamment grande pour permettre de bons échanges. Les fioles dites de Fernbach sont bien adaptées à ce type de culture. Dans le cas de fermentations réalisées en réacteur, le milieu de production est agité à l'aide de modules d'agitation assurant un bon transfert au sein du réacteur. La vitesse d'agitation est en général comprise entre 50 et 1000 rpm. Le milieu est aéré à un taux compris entre 0,1 et 2 wm (volume d'air par volume de liquide et par minute). La fermentation s'effectue en général en batch. Pour cela, le milieu de culture contient tous les éléments nutritifs, puis est stérilisé et, une fois revenu à la température de fermentation, est ensuite ensemencé par une culture active. I1 est possible de stériliser séparément une solution aqueuse contenant le manganèse et le milieu nutritif. La solution de manganèse est ensuite ajoutée stérilement au milieu de culture en quantité telle que la concentration finale dans le milieu de culture soit celle désirée. L'introduction du manganèse dans le milieu de culture peut être pratiquée initialement ou en cours de fermentation. L'ajout de cette solution peut être réalisé en une seule fois ou en plusieurs opérations successives réparties en cours de culture. Le taux d'ensemencement, c'est-à-dire le rapport des volumes d'ensemencement et de milieu après ensemencement, est compris entre 0,1 et 10 %. Dans le cas de cultures en réacteur, celui-ci peut être équipé de sondes stérilisables permettant d'enregistrer et de réguler des paramètres tels que le pH, la température, le taux d'oxygène dissous. I1 est également possible de connaître les taux d'oxygène et de gaz carbonique dans les gaz de sortie à l'aide d'analyseurs placés sur la sortie des gaz du réacteur. Après 1 à 4 jours de culture, la culture peut être arrêtée. Le principal critère pour l'arrêt de la fermentation est la faible consommation de glucose. Le moût de fermentation contient du gellane brut. Celui-ci peut être récupéré par précipitation avec un solvant approprié, le plus souvent l'isopropanol. Le précipité récupéré peut être séché. La matière sèche totale contient à la fois du gellane dit natif et les cellules issues de la culture de Pseudomonas elodea. Cette méthode de précipitation à l'isopropanol suivie d'un séchage est la méthode classique de détermination de la concentration en gellane brut dans le moût de fermentation. La présente invention sera mieux comprise et ses avantages apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples suivants. Ceux-ci sont donnés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. Exemple 1: Préparation de gellane selon l'art antérieur. en présence de traces de manganèse (fermentation 1) La souche de Pseudomonas elodea ATCC 31461 est conservée en tubes, à -220C sur un milieu complexe gélosé (Nutrient Agar, Difco). Pour la remise en culture de cette souche, un tube est remis à la température ambiante pendant quelques heures et un prélèvement d'environ une ose est effectué sur la surface de la gélose et étalé sur une boite de Petri contenant du milieu gélosé (Nutrient Agar, Difco). Après 48 heures d'incubation à 30"C, on observe un développement de colonies jaunes à la surface du milieu gélosé. Une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 20 mL de milieu liquide (Nutrient Broth, Difco) en fioles d'Erlenmeyer. Ces fioles sont mises en agitation pendant environ 30 heures à 300C.La totalité du contenu d'une fiole, soit 20 mL, sert à ensemencer 180 mL de milieu de préculture placé dans une fiole de Fernbach. La composition de ce milieu de préculture est donnée dans le tableau 1. Toutes ces opérations de transfert sont effectuées en conditions stériles et les milieux et récipients ont auparavant été stérilisés dans des conditions habituelles pour l'homme de l'art. Les fioles de Fernbach sont mises en agitation pendant environ 40 heures à 300C. Après incubation, environ 180 mL du contenu d'une fiole de Fernbach sont utilisés pour ensemencer 1,82 litres de milieu de production contenus dans un fermenteur. La composition du milieu de production est indiquée dans le tableau 1 et correspond à la composition optimale donnée dans l'art antérieur.Les 20 mL de milieu restant sont utilisés pour effectuer des analyses courantes et vérifier le bon déroulement de la préculture. Le fermenteur utilisé est équipé d'un aérateur multi-trous, d'une régulation de température, d'une sonde pH reliée à un régulateur commandant l'injection de KOH 1N ou de H3P04 1N, d'une sonde à oxygène dissous, d'un système d'agitation consistant en un axe muni de deux turbines centripètes et entraîné par un moteur d'agitation. La température du milieu est régulée à 300C, le pH à 6,5, le débit d'air est de 2 vvm et la vitesse d'agitation est de 900 tours/minute. Les principaux paramètres déterminés en cours de fermentation sont les concentrations en glucose, en gellane brut et la densité optique du milieu lue à 620 nnt Tableau 1: Composition des milieux de préculture et de fermentation COMPOSANTS MILIEU DE MILIEU DE PRÉCULTURE FERMENTATION Glucose (R/L) 20 30 KH2P04 (g/L) 2,5 Na2HP04 12H20 (g/L) 10 K2HP04 (g/L) 0,5 MgS047H20 (g/L) 0,1 0,1 NH4NO3 (g/L) 0,9 0,9 Peptone papaïnique de soda (g/L) 1 0,5 Liqueur de maïs(corn steep) ( ) 2 2 Solution de sels (mil) 1 1 Eau désionisée litre 1 1 La solution de sels comporte: 1,8 g/L MnCl2 4H2o 2,5 g/L FeSO4 7H20 0,28 g/L H3BO3 0,027 g/L CuC12 0,021 g/L ZnCl2 0,074 g/L CoCl2-6H2O 0,010 g/L (NH4)6Mo7o24-4(H2o) 2,1 g/L tartrate de sodium n est important de noter que la concentration en manganèse est très faible. En effet, le milieu de culture contient initialement 1,8 mg"L de MnC12-4H20, soit 0,50 mg"'L de manganèse Mn. La concentration en glucose est déterminée à l'aide d'un analyseur automatique (Glucose Analyzer II, Beckman, U.S.A.) par une méthode enzymatique à la glucose oxydase. La concentration en gellane brut est déterminée sur le moût de fermentation par précipitation d'un volume de milieu avec deux volumes d'isopropanol. La précipitation est réalisée à chaud sous forte agitation. Le précipité est récupéré par filtration sur un filtre en microfibres de verre, de porosité 1,2 Rm préalablement séché et taré. Le précipité est lavé par l'isopropanol. Le précipité est ensuite séché et pesé dans un dessiccateur à infrarouge monté sur une balance. On a ainsi la concentration en gellane brut, c'est-à-dire le polysaccharide et les débris cellulaires. La concentration en gellane dit natif, c'est-à-dire ne contenant pas de débris cellulaires, est déterminée en retranchant de la concentration en gellane brut la concentration en matière sèche cellulaire. Celle-ci est évaluée d'après une corrélation établie entre la densité optique du milieu mesurée à 620 nm contre de l'eau et le poids sec de cellules. Pour établir cette corrélation, des échantillons de moût de fermentation de densité optique connue ont été dilués 20 fois dans de l'eau désionisée, longuement agités puis centrifugés. Les culots obtenus ont été ensuite remis en solution puis filtrés à chaud sur des filtres préalablement séchés et tarés. La matière sèche des rétentats permet de déterminer le poids sec des cellules, le gellane ayant été éliminé lors des opérations de centrifugation et de filtration.La corrélation obtenue donne : poids sec cellulaire (en g/l) = 0,26 x (Densité optique du milieu à 620 nm). Les résultats obtenus après 47 heures de culture sont les suivants: Glucose résiduel : 7 g/L Concentration cellulaire (poids de cellules sèches) : 3,3 g'L Gellane brut: 12,5 g/L Gellane natif: 9,2 g/L Exemple 2: Préparation de gellane dans des milieux de culture contenant des concentrations notables de manganèse (fermentations 2 à 5) Quatre autres fermentations (2, 3, 4 et 5) ont été réalisées dans des conditions rigoureusement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 à l'exception de la quantité de manganèse présente dans les milieux de préculture et de production. Les concentrations de manganèse utilisées sont indiquées dans le tableau 2. Tableau 2: Concentration en manganèse utilisée dans les milieux de préculture et de production des fermentations 2, 3,4 et 5 FERMENTATION 2 3 4 5 MnC12-4H20 dans le milieu de 0,16 g/L 1,6 g/L 2,4 g/L 3,2 g/L culture MnCl2.4H2O dans le milieu de 0,16 g/L 1,6 g/L 2,4 g/L 3,2 g/L production Équivalent Mn dans le milieu de 0,044 g/L 0,44 g/L 0,67 g/L 0,88 g/L production Les fermentations sont toutes arrêtées après environ 48 heures de culture, sauf la fermentation 3 pour laquelle la teneur en glucose résiduelle était nulle après 31,5 heures de culture. Les concentrations initiales en glucose étaient légèrement supérieures à 30 g/L dans le cas des fermentations 4 et 5. Les durées des fermentations, la concentration de glucose consommé et les concentrations finales en cellules, gellane brut et gellane natif déterminées selon les procédures décrites dans l'exemple 1 figurent dans le tableau 3. Tableau 3: Concentrations de glucose consommé, cellules, gellane brut et natif obtenues dans les fermentations 2 à 5 FERMENTATION 2 3 4 5 Durée (h) 47,5 31,5 48 47,5 Glucose consommé (g/L) 24,2 30,7 32,8 34,3 Poids sec de cellules (g/L) 3,4 3,8 4,2 4,3 Gellane brut (g/L) 12,5 18,3 16,8 14,8 Gellane natif (g/L) 9,1 14,5 12,6 10,5 On constate que les concentrations en gellane brut et gellane natif obtenues lors des fermentations 3, 4 et 5 sont nettement supérieures à celles obtenues lors de la fermentation 1. De plus, les durées des fermentations étant équivalentes, il y a donc également augmentation de la productivité en gellane (quantité de gellane produit par unité de volume réactionnel et par unité de temps). Cet exemple montre clairement l'influence bénéfique de l'ajout de quantités notables de manganèse dans le milieu de culture. Exemple 3: Préparation de gellane dans des milieux de culture dits synthétiques contenant différentes concentrations de manganèse (fermentations 6 à 8! Les fermentations 6, 7 et 8 ont été réalisées sur des milieux de culture ne contenant pas d'azote organique. Ce type de milieu est appelé milieu synthétique et sa composition exacte peut être parfaitement définie. Dans le cas présent, la source d'azote est du nitrate de potassium, KNO3, à la concentration de 2,3 g/L. Par rapport aux exemples précédents, seule la composition du milieu de fermentation est changée, toutes les autres conditions étant par ailleurs identiques à celles décrites dans l'exemple 1, y compris la composition du milieu de préculture. La composition des milieux de fermentation utilisés dans les fermentations 6 à 8 est décrite dans le tableau 4. Tableau 4: Composition des milieux de culture utilisés dans les fermentations 6 à 8. Milieu de Milieu de Milieu de COMPOSANTS fermentation 6 fermentation 7 fermentation 8 Glucose ) 27 28 30 K2HPO4 (gg) 0,5 0,5 0,5 MgSO4.7H20 (gt) 0,1 0,1 l 0,1 KNO3 (g/L) 2,3 2,3 0,9 MnC12 4H20 (g/L) 0 1,6 3,2 Équivalent Mn dans le milieu de traces 0,44 0,88 production (gel) Solution de sels (mL/L) 1 1 1 Eau désionisée (L) 1 1 1 La solution de sels employée est identique à celle donnée dans l'exemple 1. Les durées des fermentations 6 à 8 ainsi que les concentrations de glucose consommé et les concentrations finales en poids sec cellulaire, en gellane brut et natif sont indiquées dans le tableau 5. Tableau 5 : Concentrations de glucose consommé, cellules, gellane brut et natif obtenues dans les fermentations 6 à 8 FERMENTATION 6 7 8 Durée (h) 50 23 40 Glucose consommé (g/L) 19,7 26,7 28,5 Poids sec de cellules (g/L) 4,3 3,7 4,3 Gellane brut (g/L) 12,4 15,5 16,4 Gellanenatif(g/L) 8,1 11,8 12,1 On constate que les concentrations en gellane brut et gellane natif obtenues lors des fermentations 7 et 8, réalisées en présence de concentrations de MnC12 importantes, sont nettement supérieures à celles obtenues lors de la fermentation 6, réalisée en présence de traces de manganèse. Cet exemple montre clairement l'influence bénéfique de l'ajout de quantités notables de manganèse dans un milieu de culture ne contenant que de l'azote minéral, en l'occurence sous forme de nitrate, comme source d'azote. REVENDICATIONS 1) Procédé de production de gellane par culture dans un milieu réactionnel, caractérisé en ce que l'on ajoute audit milieu une quantité utile de manganèse supérieure ou égale à 0,05 g/L. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute audit milieu une quantité utile de manganèse supérieure ou égale à 0,2 g/L. 3) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute la source de manganèse en une seule fois et avant ensemencement. 4) Milieu de culture pour produire du gellane, caractérisé en ce qu'il comporte une quantité utile de manganèse supérieure ou égale à 0,05 g/L. 5) Milieu de culture selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte une quantité utile de manganèse supérieure ou égale à 0,2 glL. 6) Milieu de culture selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la source de manganèse provient de l'un au moins des composés suivants: l'acétate de manganèse tétrahydraté, le chlorure de manganèse tétrahydraté ou an hydre, le nitrate de manganèse, le dioxyde de manganèse, le sulfate de manganèse tétrahydraté ou anhydre. 7) Milieu de culture selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que la source azotée dudit milieu provient principalement d'ions nitrates.