Brevet FR2741881A1 — publié le 19970606

NOUVEAUX DÉRIVÉS DE PURINE POSSÉDANT NOTAMMENT DES PROPRIÉTÉS ANTI-PROLIFÉRATIVES ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES. L'invention a pour objet de nouveaux dérivés de purine possédant des propriétés anti-prolifératives et leurs applications biologiques. Elle vise en particulier des dérivés de purine dotés d'un effet inhibiteur visà-vis de protéines kinases cycline-dépendantes, ou cdk en abrégé. L'étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent le cycle cellulaire a permis de mettre en évidence le rôle régulateur des cdk. Ces protéines sont constituées d'au moins deux sous-unités, une sous-unité catalytique (dont cdc2 est le prototype) et une sous-unité régulatrice (cycline). Huit cdk ont été décrites, cdkl (=cdc2), cdk2-cdk8. A l'exception de cdk3, pour laquelle aucune cycline associée n'est connue, ces cdk sont régulées par association transitoire avec un membre de la famille des cyclines cycline A (cdc2, cdk2), cycline B1-B3 (cdc2), cycline C (cdk8), cycline Dl -D3 (cdk2cdk4-cdk5-cdk6), cycline E (cdk2), cycline H (cdk7). Chacun de ces complexes est impliqué dans une phase du cycle cellulaire. L'activité des cdk est régulée par modification post-traductionnelle, par associations transitoires avec d'autres protéines et par modification de leur localisation intracellulaire. Les régulateurs des cdk comprennent des activateurs (cyclines, cdk7/cycline H, phosphatases cdc25), les sous-unités p9cKs et pl5Cdk-BP et les protéines inhibitrices (p16INK4A,p15INK4B,p21Cipl,p18,p27Kipl) Parallèlement aux recherches purement fondamentales sur les mécanismes régulateurs de la division cellulaire, I'importance des dérégulations des kinases cyclinesdépendantes dans le développement des tumeurs humaines a été démontrée par de nombreuses études. Ainsi, ont été observées la surexpression de cyclines D et E dans de nombreuses tumeurs, la surexpression de cdc2, les propriétés oncogéniques des cyclines D et A, I'expression temporelle anormale de kinases cyclines-dépendantes, la dérégulation majeure des inhibiteurs protéiques (mutations, délétions). Les régulateurs du cycle de division cellulaire font l'objet de très nombreuses études cliniques (utilisation en tant que marqueurs indicatifs pour le traitement). Ces résultats encouragent très fortement les efforts de compréhension détaillée des mécanismes régulateurs du cycle cellulaire. Ils conduisent également à rechercher, par criblage, des molécules inhibitrices de kinases cyclines-dépendantes. Plusieurs inhibiteurs de kinases ont été décrits, comme la butyrolactone, le fiavopiridol et la 2(2-hydroxyéthylamino)-6-benzylamino-9-méthylpurine, appelée olomoucine. Les travaux concernant l'olomoucine sont rapportés par Vesely et al. dans l'article portant la référence (1) dans la liste des références bibliographiques donnée en fin de description. Cet inhibiteur de cdc2, de grande efficacité (son IC50 est de 7 pM) et très sélectif (plus de 35 kinases ont été testées), répond à la formule Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à élaborer de nouvelles molécules particulièrement intéressantes, inhibant cdc2 à doses faibles, tout en conservant la spécificité enzymatique de l'olomoucine. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux dérivés de purine possédant notamment des propriétés anti-prolifératives. L'invention vise également un procédé d'obtention de ces dérivés par voie de synthèse, permettant de les préparer à l'échelle industrielle. Elle vise également leur application en thérapeutique. Les dérivés de purine de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule I dans laquelle, - R2, R6 et R9, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical R-NH-, R-NH-NH-, NH2-R'-NH- ou R-NH-R'-NH-, dans lequel R représente un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, ou un hétérocycle, et R' un groupe alcoyléne à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, ou un groupe arylène ou cycloalcoylène, R et R' renfermant chacun de 1 à 8 atomes de carbone, et étant substitués, le cas échéant, par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou aryle, - R2 et R9 pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène, à l'exception des dérivés dans lesquels lesdits substituants présentent respectivement les significations suivantes: R6 et R9, un groupe benzylamino et méthyle,. R2 et R6 , un groupe 2-hydroxyéthylamino et benzylamino, R2, R6 et R9, un groupe amino, benzylamino et méthyle, ou chlore, amino et méthyle, ou chloro, benzylamino et méthyle, ou chloro, 3-hydroxybenzylamino et méthyle, ou chloro, 5-hydroxypentylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et isopropyle, ou 2- hydroxyéthylamino, amino et méthyle, ou 2hydroxyéthylamino, isopentényl et méthyle, ou 2- hydroxyéthylamino, isopenténylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et 2-hydroxyéthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et isopropyle, ou 2-hydroxyéthylamino, (3-hydroxybenzyl)amino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, (3hydroxybenzyl)amino et isopropyle, ou 2-hydroxyisobutylamino, 6-benzylamino et méthyle. Les dérivés exclus de l'invention, mentionnés ci-dessus, sont décrits dans la référence (1). D'une manière générale, les dérivés de l'invention constituent des inhibiteurs de protéines kinases de grand intérêt. De préférence, I'atome d'halogène est choisi parmi le chlore, le brome ou le fluor, le radical alkyle parmi les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et isobutyle, pentyle, hexyle et heptyle, le radical alcoylène parmi les radicaux méthylène, éthylène, propylène, isopropylène, butylène, isobutylène, pentène ou isopentène, le radical aryle est un groupe benzylène, le radical cycloalkyle est un groupe cyclohexyle, le radical arylène est un groupe benzylène, le radical cycloalcoylène est un groupe cyclohexylène, I'hétérocycle est un hétérocycle azoté et/ou oxygéné tel qu'un imidazole, un oxadiazole, une pyridine, une pyndazine ou une pyrimidine. Selon une disposition de l'invention, R2 est choisi parmi les radicaux capables de se lier dans un complexe cdk2/ATP, à une région du domaine de liaison de l'ATP occupée par le ribose. n s'agit avantageusement de radicaux choisis parmi un atome de chlore, un radical amino, méthylamino, éthylamino, n-heptylamino, aminoéthylamino, aminopropylamino, diméthyl aminoéthylamino, hydroxyéthylamino, hydroxypropylamino, hydroxyisobutylamino, hydroxypentylamino, diméthylhydrazino ou hydroxyméthylpropylamino. Des dérivés particulièrement préférés renferment comme groupe R2, un radical hydroxypropylamino. Selon une autre disposition de l'invention, R6 est choisi parmi un groupe amino, isopenténylamino, hydroxypentylamino, 4-hydroxy-3 -méthyl-trans-2- buténylamino, benzylamino, hydroxybenzylamino, hydroxyéthylbenzylamino, cyclohexylméthylamino ou isopentène. De préférence, R6 comporte un résidu hydrophobe, tel que benzyle, hydroxybenzyle, ou isopentényle. Selon encore une autre disposition de l'invention, le substituant R9 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical méthyle, isopropyle ou hydroxyéthyle. De manière avantageuse, R9 est un groupe hydrophobe, en particulier le groupe isopropyle. Des dérivés de purine préférés de l'invention sont choisis parmi les composés dans lesquels R2,R6 et R9 sont tels qu'indiqués le tableau 1 suivant R2 R6 R9 IC50 chloro o-(2-hydroxyethyl) isopropyl 40( M) benzylamino chloro isopentenylamino méthyl 40 ethylamino 4-hydroxy-3-méthyl- trans- méthyl 48 2-butéylamino chloro benzylamino isopropyl 17 3-aminopropylamino benzylamino isopropyl 7,5 3-hydroxypropylamino benzylamino isopropyl 1 2-hydroxypropylamino benzylamino isopropyl 0,9 5-hydroxypropentylamino benzylamino isopropyl 7,5 dimethylhydrazino benzylamino isopropyl 30 1-D,L-hydroxymethylpropylamino benzylamino isopropyl 0,65 aminoethylamino benzylamino isopropyl 1 2-hydroxypropylamino isopentenyl isopropyl 1 2 2-hydroxyéthylamino cyclohexylmethylamino méthyl 6 2-hydroxypropylamino cyclohexylmethylamino méthyl 4 2-hydroxyéthylamino isopenténylamino isopropyl 8,5 chlor isopenténylamino isopropyl 2,5 Les dérivés suivants sont particulièrement préférés, à savoir la 2-(3 hydroxypropylamino)-6-benzylarnino-9-isopropylpurine, la 2-D,L-(2 hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-aminoéthyla-minoéthylamino-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-bis-(2-hydroxyéthy- lamino)-6 benzylamino-9-isopropylpurine, et la 2-(2-hydroxypropylamino)-6-isopenténylamino-9 isopropylpunne. L'invention vise également les isomères optiques et les mélanges racémiques, le cas échéant les isomères géométriques des dérivés définis ci-dessus. Les dérivés définis ci-dessus sont obtenus selon les méthodes classiques de la synthèse organique. On utilise un dérivé de purine de départ dont les substitutions permettent d'introduire les groupements souhaités. En utilisant par exemple un dérivé de purine 2-chloro, 6-benzylamino, il est possible d'introduire un groupe allyle en position 9, par réaction avec par exemple l'halogénure d'alkyle correspondant. La réaction avec un aminoalcool permettra ensuite d'introduire, en position 2, un groupe alkyl-hydroxyalkylamiho à la place du groupe chloro. Selon un aspect de grand intérêt, les dérivés de l'invention possèdent des propriétés inhibitrices de kinases de grande sélectivité. Ces effets inhibiteurs sont réversibles. Les kinases plus spécialement sensibles aux effets inhibiteurs de ces dérivés sont les cdc2, les cdk2 et les cdk5. Leur inhibition est obtenue avec des doses très faibles en dérivés de purine. Ainsi, on observe le plus généralement une IC5o vis-à-vis de cdc2 inférieure à 50 I1M, et même à celle de l'olomoucine (7 IlM), considérée cependant comme un inhibiteur puissant. L'invention vise en particulier des dérivés de purine présentant une IC50 ne dépassant pas 211M et tout spécialement la 2-(1-D,L-hydroxyméthylpropylamino-)-6- benzylamino-9-isopropylpurine, appelée aussi ci-après roscovitine, dont la 1C50 est de 0,6511M. Ce dérivé, qui constitue un inhibiteur de grande efficacité et de grande sélectivité vis-à-vis des cdk, cdc2, cdk2 et cdk5 présente en revanche, d'une manière inattendue, des effets sur les kinases erk 1 et erk 2 similaires à ceux de l'olomoucine. La sélectivité est donc nettement supérieure vis-à-vis des kinases cyclines dépendantes. Cet avantage, que l'on retrouve avec les autres dérivés de purine de l'invention, permet d'éliminer les interférences avec les voies de transduction des signaux plus en amont qui impliquent les kinases erk 1 et erk 2 dans de nombreuses réponses cellulaires autres que la division cellulaire. L'invention vise également les complexes des dérivés de purine avec les cdk et tout spécialement la forme cristallisée du complexe de cdk2 et de roscovitine. Les études réalisées sur les dérivés de l'invention ont montré, en plus de leurs propriétés inhibitrices spécifiques de kinases, des effets cellulaires et sur l'apoptose de grand intérêt. Ainsi, à très faible concentration (micromolaire pour la roscovitine et bon nombre de dérivés), ils sont capables d'inhiber la transition prophase/métaphase, comme montré par les expériences réalisées sur des ovocytes d'étoile de mer et des embryons d'oursin, et qui sont rapportées dans les exemples. Sur des extraits acellulaires de Xénope, ils sont capables d'inhiber à la fois le facteur promoteur de la phase M et la synthèse d'ADN. De manière avantageuse, ces effets cellulaires sont obtenus à des concentrations très faibles en dérivés. On sait que divers travaux portent sur les rapports existant entre le cycle cellulaire et l'apoptose. Diverses voies conduisent à l'apoptose des cellules dont certaines sont dépendantes de kinases et d'autres ne semblent pas au contraire nécessiter ces enzymes. On a montré que l'apoptose peut être induite au stade G1 ou G2 et qu'à la suite de dommages de l'ADN, certaines cellules s'arrêtent au stade G1 et une voie apoptique dépendante de p53 est alors induite. Dans d'autres situations, il apparaît que les cellules s'arrêtent au stade G2/M, en réponse à des dommages causés à l'ADN et on observe l'activation d'une voie apoptotique p53 indépendante. Cette voie se révèle particulièrement importante pour la thérapie de tumeurs dans lesquelles on observe une perte de p53 active. On mesure donc l'intérêt de disposer, avec les dérivés de l'invention, de moyens pour stimuler une apoptose p53-indépendante dans des cellules arrêtées au stade G2 par endommagement de l'ADN à l'aide d'agents tels que la mitoxantrone ou le cisplatine. Les inhibiteurs de cdc2 de l'invention peuvent ainsi augmenter les effets thérapeutiques d'agents anti-tumoraux couramment utilisés. En tant qu'inhibiteurs de cdk5, les dérivés de l'invention peuvent également jouer un rôle pour réduire l'hyperphosphorylation anormale de tau observée durant la maladie d'Alzheimer. A ces différentes propriétés avantageuses, s'ajoute l'intérêt d'une absence de cyto-toxicité des dérivés de l'invention. L'invention vise donc la mise à profit des propriétés de ces dérivés en particulier leurs propriétés antimitotiques, pour l'élaboration de compositions pharmaceutiques. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un dérivé de purine tel que défini cidessus, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. Les compositions de l'invention sont particulièrement appropriées comme médicaments antimitotiques, en particulier pour la chimiothérapie des cancers, ou encore pour le traitement de psoriasis, de parasitoses telles que celles dues à des protistes ou à des champignons, ou de la maladie d' Alzheimer. Ces compositions renferment le cas échéant des principes actifs d'autres médicaments. On citera notamment leur association avec des médicaments antimitotiques, tels que.ceux à base de taxol, cis-platine, les agents intercalant de l'ADN, et autres. Les conditionnements en vue de la vente, en particulier l'étiquetage et les notices d'emploi, et avantageusement l'emballage, sont élaborés en fonction de l'application thérapeutique prévue. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélules, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de. 1 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 10 à 40 mg. D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Ces formes injectables renferment par unité de prise de 1 à 50 mg de principe actif, de préférence de 10 à 30 mg. A titre indicatif la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient en une ou plusieurs prises 10 à 50 mg/jour pour le traitement de tumeurs, ou pour traiter les psoriasis ou des parasitoses. L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les dérivés de purine définis plus haut. Ces réactifs peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études de la division cellulaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 6, dans lesquelles - la figure 1, représente les résultats de cinétiques en conditions linéaires à partir d'essais concernant l'activité de la p34Cdc2/cycline B à différentes concentrations de roscovitine, - la figure 2, le pourcentage de rupture de vésicule germinale d'ovocytes d'étoile de mer en fonction de la concentration en rascovitine, - les figures 3 et 4, représentent respectivement les effets de la roscovitine sur la maturation d'ovocytes d'étoiles de mer et la déphosphorylation de la tyrosine de p34Cdc2 invivo, - la figure 5, ces embryons arrêtés au stade prophase tardif, et - la figure 6, les effets de la roscovitine sur la synthèse d'ADN in vitro et l'activité MPF. MATERIEL ET METHODES Produits chimiques Ortho-vanadate de sodium, 1-méthyladénine (1merde), EGTA, EDTA, MOPS, ss-glycérophosphate, dithiothréitol (DTT), fluorure de sodium, nitrophénylphosphate, leupeptine, aprotinine, inhibiteur de trypsine de soja, benzamidine, histone H1 (type E-S), protéine basique de myéline, caséine, protamine sulfate, isopropyl ss-D- thiogalactopyranoside (lPTG), Sépharose 4B activé par CNBr, milieu LB, glutathione et billes de glutathione-Sépharose tous ces produits sont tels que commercialisés par Sigma Chemicals. Les analogues de purine sont généralement dissous de manière à disposer de solutions de stockage de 100 mM dans du DMSO. La concentration finale en DMSO dans le mélange réactionnel est inférieure à 1% (v/v). Le [y-32P]-ATP est un produit d'Amersham. La protéine GST-Rétinoblastome est exprimée dans des bactéries et purifiée sur des billes de glutathione-Sépharose comme décrit précédemment dans (1) et (2). Tampons Tampon d'homogénéisation: 60 mM de 13-glycérophosphate, 15 mM de p-nitrophényl-phosphate, 25 mM de MOPS (pH 7,2), lSmMd'EGTA, 15 mM de MgC12, 1 mM de DTT, 1 mM de vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylphosphate, 10 g de leupeptine/ml, 10 g de aprotinine/ml, 10 g d'inhibiteur de trypsine de soja ml et 100 M de benzamidine. Tampon C: composition du tampon d'homogénéisation, mais avec 5 mM DELTA, sans NaF et sans inhibiteurs de protéase. Préparation des extraits d'ovocytes d'étoile de mer en phase M Pour obtenir des préparations d'extraits d'ovocytes à grande échelle, on enlève les gonades de Marthasterias glacials matures et on les fait incuber avec 10 pM de l-MeAde dans de l'eau de mer naturelle filtrée sur Millipore jusqu'à la ponte. Les ovocytes sont alors tous entrés en phase M. On les sépare du milieu d'incubation par centrifugation, on les congèle directement dans de l'azote liquide et on les maintient à 800C (voir (1) et (3)). Les ovocytes en phase M sont homogénéisés dans le tampon d'homogénéisation à raison de 2 ml/g d'ovocytes. Après centrifugation pendant 45 minutes à 100 000 g, le surnageant est récupéré et directement utilisé pour purification par chromatographie d'affinité de la kinase p34cdc2/ cycline B sur des billes de p9CKShsl-Sépharo (voir (1) et (4)). Enzymes Les activités des kinases sont déterminées à 30 C dans le tampon C, à moins d'indication contraire. Les valeurs des blancs sont soustraites des données et les activités sont calculées en pmoles de phosphate incorporé dans l'accepteur de protéine pour une incubation de 10 minutes. Les témoins sont utilisés avec des dilutions appropriées de DMSO. La phosphorylation du substrat est, le cas échéant, déterminée par autoradiographie après SDS-PAGE. On purifie la p34dC2 / cycline B à partir des ovocytes de la phase M des étoiles de mer par chromatographie d'affinité sur les billes de p9CKShsl-Sépharo d'où elles sont éluées à l'aide de p9CKShsl comme décrit ci-dessus (voir (2), (3) et (5)). Pour la détermination, on utilise 1 mg d'histone H1 (Sigma type III-S)/ml, en présence de 15 M de [y~32p] ATP (3,000 Ci/mmole, 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 l (voir (1) et (6)). Après un temps d'incubation de 10 minutes à 30 C, on dépose des aliquotes de 25 Ill de surnageant sur du papier de phosphocellulose Whatman P81 et, après 20 secondes, on lave les filtres 5 fois (pendant au moins 5 minutes à chaque fois) dans une solution de 10 ml d'acide phosphorique par litre d'eau. Les filtres humides sont transférés dans des ampoules de scintillation en plastique de 6 ml, puis on ajoute 5 ml de fluide de scintillation ACS (Amersham) et on mesure la radioactivité dans un compteur Packard. L'activité kinase est exprimée en pmoles de phosphate incorporé dans l'histone H1 pour 10 minutes d'incubation ou en pourcentage d'activité maximale. Pour réaliser les expériences de cinétique en conditions linéaires, on utilise, comme décrit ci-dessus, le système d'essai à point final pour la kinase p34dC2 mais, sur la base d'essais préliminaires, on utilise des concentrations appropriées, non saturantes, en substrat. La kinase p34Cdc2 /cycline B est ajoutée de manière à obtenir une activité linéaire par rapport à la concentration en enzyme et au temps. Dans la plupart des cas, ceci nécessite une dilution enzymatique de 3 à 10 fois dans le tampon C. Les données de vitesse sont exprimées en pmoles incorporées dans le substrat par seconde, par quantité d'enzyme ajoutée. Les constantes d'inhibition apparentes sont déterminées par analyse graphique. .Les p3 3 cdk2/cycline A et p33 cdk2/cycline E sont reconstituées à partir d'extraits de cellules d'insectes sf9 infectées par différents baculovirus. Les cyclines A et E sont des protéines de fusion de GST-cyclines et les complexes sont purifiés sur des billes de glutathione-Sépharose. Les activités kinases sont déterminées avec 1 mg/ml d'histone H1 (Sigma, type IIIS), en présence de 15 M de [y~32p] ATP, pendant 10 minutes, dans un volume final de 30 l, comme décrit pour la kinase p34cdc2/cycline B. La p33 cdk5/p25 est purifiée à partir de cerveau bovin (7), mais on n'utilise pas l'étape de chromatographie Mono S. Les fractions actives récupérées à partir de la colonne de Superose 12 sont réunies et concentrées jusqu'à une concentration finale d'environ 25 g d'enzyme/ml. La détermination de la kinase est effectuée avec 1 mg/ml d'histone H1 (Sigma, type ES), en présence de 15 M de [y~32p] ATP, durant 10 minutes dans un volume final de 30 Cll, comme décrit pour la p34cdc2/cycline B. La p3 3 cdk4/cycline D1 , est obtenue à partir de lysats de cellules d'insectes. Cdk4 est un produit de construction GST-cdk4 et le complexe actif est purifié sur des billes de glutathione-Sépharose. Son activité kinase est déterminée avec une protéine purifiée GSTrétinoblastome en présence de 15 M de [y~32p] ATP, dans un volume final de 30 l. Après 15 minutes d'incubation on ajoute du tampon de Laemnli (2 x 30 Le substrat phosphorylé est résolu par SDS-PAGE 10% et analysé par autoradiographie par exposition durant environ 14 heures à MP Hyperfilm et densitométrie. La p33 Cdk6/cycline D2) est obtenue à partir de lysats de cellules d'insectes (8). Pour les essais, on opère comme indiqué ci-dessus pour la protéine p33 cdk4/cycline D1. Les kinases MAP La GST-erkl (9), clonée à partir d'une banque humaine HepG2, est exprimée dans des bactéries, purifiée sur des billes de glutathione Sépharose et testée avec 1 mg de protéine basique de myéline par ml en présence de 15 M de [y~32p] ATP comme décrit ci-dessus pour la kinase p34cdc2/cycline B. Les protéines erkl et erk2 marquées à l'aide de l'histone sont activées in vitro par MAPKK, purifiées (affinité-Ni et Mono Q) et testées comme décrit ci-dessus durant 10 minutes, dans un volume final de 30 l. La sous-unité catalytique de la kinase cAMP-dépendante purifiée à partir de coeur de bovin est testée avec 1 mg d'histone H1 par ml, en présence de 15 pM de [y 32p] ATP, comme décrit ci-dessus pour la p34cdc2/cycline B. La kinase cGMP-dépendante (10), purifiée jusqu'à l'homogénéité à partir de muscle lisse de trachée d'origine bovine est testée avec 1 mg d'histone H1 par ml, en présence de 15 M de [y~32p] ATP, comme décrit ci-dessus pour la p34cdc2/cycline B. .La caséine kinase 2 est isolée de cytosol de foie de rat (11) et testée avec 1 mg de caséine par ml et 15 M de [y-32P] ATP. Le substrat est déposé sur des filtres Whatman 3MM et lavé avec 10 % de TCA (W/V). La kinase de la chaîne légère de mvosine purifiée à partir de gésier de poule (12) est testée en présence de 100 nM de calmoduline, 100 pM de CaCI2, 50mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT et 0,1 mg de BSA/ml à pH 7,5, en utilisant un peptide de synthèse à base du site de phosphorylation de la chaîne légère de myosine de muscle lisse (KKRPQRATSNVFAM, 50 M) et en présence de 15 pM de [&gamma;-32P] ATP, dans un volume final de 50 l. L'incorporation de phosphate radioactif est contrôlée sur filtres de phosphocellulose comme décrit ci-dessus. . L'ASK-y. homologue chez la plante de GSK-3, est exprimée en tant que protéine de fusion GST dans E. coli (13) et purifiée sur glutathione-Sépharose. L'activité de la kinase ASK-y est déterminée, pendant 10 minutes à 30 C, avec 5 gm, de protéine basique de myéline, en présence de 15 M de [7-32P] ATP, dans un volume final de 30 pl. La protéine basique de myéline phosphorylée est récupérée sur papier de phosphocellulose Whatman P81 comme décrit ci-dessus pour la p34cdc2/cycline B. Le domaine tyrosine kinasique du récepteur de l'insuline (14) est surexprimé dans un système à baculovirus et purifié jusqu'à l'homogénéité. Son activité kinase est déterminée pendant 10 minutes à 30 C avec 5 g de Raytide (Oncogéne Sciences), en présence de 15 pM de [y-32P] ATP, dans un volume final de 30 pl. Le produit Raytide phosphorylé est récupéré sur papier de phosphocellulose Whatman P8 1 comme décrit ci-dessus pour la p34Cdc2/cycline B. Exemple 1: Synthèse de la roscovitine La synthèse est effectuée en 3 étapes et comporte la préparation 1) tout d'abord de la 6-benzylamino-2-chloropurine, puis 2) de la 6-benzylamino-2-chloro-9isopropylpurine, et 3) de la 6-benzylamino-2-R-( 1 -éthyl, 2-hydroxyéthylamino)-9isopropylpurine. 1) Synthèse de la 6-benzylamino-2-chloropurine: On opère comme décrit par Hocart dans Phytochemistry 1991, 30, 24772486. 2) Synthèse de la 6-benzylamino-2-chloro-9-isopropylpurine (I): On soumet à agitation à température ambiante, pendant trois jours, un mélange de 6-benzylamino-2-chloropurine (3,7 g; 14,2mmole), de carbonate de potassium (1 lg; 80/mmole) et de bromure d'isopropyle (8,2 ml; 87mmole) dans 100 ml de DMSO absolu. Par chromatographie en couche mince [CHCl3-MeOH (98:2)], on constate l'absence de 6-benzylamino-2-chloropurine. On élimine par distillation sous vide en-dessous de 50 C le DMSO et l'excès de bromure d'isopropyle. Le résidu est partagé entre de l'eau et de l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et évaporée sous vide. Par cristallisation dans MeOH, on obtient 3,51 g (82%) de produit ; P.F. 181-182 C; UV (MeOH) 4, 273,5;IR (Nicolet 205, KBr, DRIFT cm 1713,1626,1572,1537,1497,1471,1456,1425,1398,1355,13 14,1292,1255,1228, 1202. 3) Synthèse de la 6-benzylamino-2-R-(1-éthyl-2-hydroxyéthylamino)- 9-isopropylpurine (II), dérivé racémique: On chauffe dans un four à 160-165"C, pendant 3 h 30, une ampoule scellée, dans laquelle on a fait le vide, contenant 2,7 g (8,95 mmole) de I et 17 ml (0,18 mole) de R(-)-2-amino-l-butanol (Fluka 90%, R:S > 9:1). On évapore l'excès d'amine à une température inférieure à 50"C, et on purifie le produit II sur une colonne de chromatographie en utilisant des quantités croissantes de MeOH dans CHCI3, à savoir 0, puis 2, et 3%. Par cristallisation dans de l'acétate d'éthyle, on obtient de 2,2 g de II (69%); P.F. 132-134 C, [a] = + 35,1 (c = 0,29, CHCl3). Spectographie de masse [Finnigam MAT 90, BE géométrie 70 eV, température de la source 2500C, courant d'émission 1 mA, voltage d'accélération 5 keV, entrée directe, DIP température entre 190-220"C. HRMS a été effectué par la méthode de chevauchement de pics en utilisant Ultramark 1600 F (PCR Inc.; Fl., USA) comme standard] 354.2167 (M+, C19H26N60 calc. 354.2168, 27%), 325 (7%), 324 (29%), 232 (100%), 295 (3%), 282 (7%), 281 (3%), 217 (6%), 185 (5%) 134 (3%), 91 (34%). FTIR (Nicolet 205, KBr, DRIFT, cm1): 1622,1610,1547,1540,1452,1389,1370,1261,1068. Exemple 2 : Etude des propriétés inhibitrices de kinases de la roscovitine et de ses effets sur le cycle cellulaire. a) étude des propriétés inhibitrices de kinases. Les activités des enzymes rapportées dans le tableau suivant ont été mesurées, après addition de roscovitine ou d'olomoucine, selon des concentrations croissantes. Ces activités activités ont été mesurées avec des substrats appropriés (histone H1, protéine basique de myéline, caséine, etc...) avec 15 M d'ATP. Les 1C50 ont été calculées à partir des courbes doses-réponses obtenues. L'indication (--) signifie qu'aucun effet inhibiteur n'a été observé. La concentration la plus élevée testée est donnée entre parenthèses. Enzyme IC50( M) Roscovitine Olomoucine cdc2/cycline B 0.65 7 cdc2/cycline A 0.7 7 cdc2/cycline E 0.7 7 cdc4lcyclin Dl > 1000 > 1000 cdk5/p35 0.16 3 cdk6/cycline D3 > 500 > 250 GST-erkl 30 30 erkl 34 50 erk2 14 40 PK cAMP-dependant > 1000 > 2000 PK cGMP-dependant - (1000) > 2000 Kinase de la chaine légère de myosine 90 > 1000 caséine kinase 2 -(1000) > 2000 ASK-y (plante GSK-3) 220 130 insuline-récepteur tyrosine kinase 70 400 inhibition de cdc2, cdk2 et cdk5. L'examen de ces résultats montre que la roscovitine présente une activité 10 fois plus élevée que l'olomoucine vis-à-vis des cibles cdc2 et cdk2 et 20 fois plus élevée vis-à-vis de cdk5. Comparativement, son effet apparaît limité, comme observé avec l'olomoucine sur les kinases cdk4/cycline Dlet cdk6/cycline D2 (les ICio sont supérieures à 100 zM). Cette absence d'effet a été confirmée avec cdk4 provenant de différentes sources. En opérant dans des conditions identiques, la GST-pl6^4A inhibe la cdk4/cycline D 1. spécificité de l'effet inhibiteur Comme on peut le constater, la plupart des kinases sont faiblement ou pas du tout inhibées. Bien que la roscovitine présente une efficacité au moins 10 fois supérieure à celle de 1' olomoucine vis-à-vis de ses cibles cdk, son effet inhibiteur est très similaire à celui de l'olomoucine vis-à-vis de erk 1 et de erk 2. Une concentration 40 fois plus élevée en roscovitine apparaît ainsi nécessaire pour inhiber erkl (20 fois pour erk 2) de manière similaire à l'inhibition de cdc2. - b) Effet sur l'ATP Pour étudier le mécanisme d'action de la roscovitine, on a réalisé des expériences de cinétique en présence de concentrations croissantes en roscovitine, avec variation des niveaux de l'ATP (de 0,1 à 0,5 mM), la concentration en histone H1 est maintenue constante à 0,7 mg/ml. Les résultats sont rapportés sur la figure 1. Ces résultats montrent que la roscovitine agit en tant qu'inhibiteur compétitif pour l'ATP. Compte tenu de la linéarité des pentes en fonction des concentrations en roscovitine, on la qualifie d'inhibiteur linéaire. La constante d'inhibition apparente Ki est de 1,2 1M. L'analyse de la structure du co-cristal de roscovitine et de cdk2 confirme que la roscovitine se lie, comme l'olomoucine, dans la poche de liaison à l'ATP et que son cycle purine est orienté comme celui de l'olomoucine, à savoir de manière totalement différente du cycle purine de l'ATP. c) Etude de l'effet sur la synthèse d'ADN et l'activité MPF. On rapporte les résultats d'expériences réalisées sur plusieurs types cellulaires. effet sur la maturation d'ovocytes d'étoile de mer et sur la déphosphorylation de la tyrosine de p34Cdc2 in vivo. Des ovocytes d'étoiles de mer, arrêtés à la prophase, sont traités, pendant 15 minutes, avec des concentrations croissantes de roscovitine avant d'ajouter l'hormone 1-MeAde (1 M). Après 30 minutes, on note le % de rupture de vésicule germinale (GVBD). Ces valeurs sont rapportées sur la figure 2 en fonction de la concentration en roscovitine (en M). La roscovitine inhibe la rupture de l'enveloppe nucléaire avec une 1C50 de 5 RM (la ICi0 de l'olomoucine, en opérant dans les mêmes conditions, est de 30 Cil). Ces résultats sont donnés sur la figure 2. Comme déjà observé avec l'olomoucine, la roscovitine diminue, mais n'inhibe pas, la déphosphorylation de la tyrosine de p34CdC2 in vivo. On traite des ovocytes avec 10 pM de roscovitine pendant 15 minutes avant d'ajouter 1 IlM de 1-MeAde au temps 0. Les extraits sont préparés à différents temps et chargés sur une colonne de bille de p9ckshsl-Sépharose Les protéines qui se sont liées aux billes sont résolues par SDS-PAGE avant d'effectuer un Western blot avec des anticorps anti-PSTAIRE. Une photo du Western blot est présentée sur la figure 3. Les formes phosphorylées de p34Cdc2 apparaissent dans la partie supérieure et les formes déphosphorylées dans la partie inférieure. La roscovitine n'inhibe donc pas l'activation de cdc2, mais son activité. La déphosphorylation de la tyrosine de p34Cdc2 est catalysée par cdc25 et précède normalement l'activation de la kinase cdc2 à la transition G2/M. De plus, la kinase cdc2 phosphoryle et surractive la phosphotase de cdc25. La roscovitine a donc pu provoquer une interruption au niveau cdc2 kinase, entraînant une diminution de la déphosphorylation. effets sur le cycle mitotique d'embryons d'oursins. On ajoute de la roscovitine 60 minutes après la fertilisation. Le pourcentage d'embryons divisés est relevé 120 minutes après la fertilisation. Les résultats sont donnés sur la figure 4. On constate qu'elle provoque un arrêt au stade prophase tardif, qui est dose-dépendant. La IC50 est de 10 M. (Même à 100 IlM, l'olomoucine ne provoque qu'un ralentissement de la transition préphase/métaphase, mais n'arrête pas les cellules en prophase). On observe un large noyau dans les oeufs ainsi arrêtés par la roscovitine comme représenté sur la figure 5. Cet arrêt s'avère totalement réversible. En effet, après plusieurs lavages avec de l'eau de mer, les oeufs entrent à nouveau dans les cycles mitotiques et se développent en larves pluteus normales. Ces résultats sont obtenus même à des concentrations élevées en roscovitine de 100 pM. effets sur la synthèse de l'ADN in vitro et l'activité MPF chez des extraits d'oeufs de Xénope. Les essais sont réalisés selon (15), en opérant comme décrit dans (1) pour l'olomoucine. On fait incuber des extraits de Xénope arrêtés au stade métaphase avec de la roscovitine et de la chromatine de sperme. Avec des concentrations en roscovitine allant de O à 5 pM, les chromosomes restent fortement condensés et aucune enveloppe nucléaire n'est visible. A une concentration de 10 RM, et au-dessus, apparaissent des noyaux d'interphase avec de la chromatine partiellement décondensée et une enveloppe nucléaire intacte, montrant que l'activité MPF a été inhibée (la IC50 est de 5 Ils). On a également étudié l'inhibition de la synthèse de l'ADN en opérant comme décrit dans (1) pour l'olomoucine. On a ainsi ajouté à un extrait d'oeufs, arrêtés au stade métaphase, de la roscovitine et de la chromatine de sperme. L'extrait a ensuite été abandonné au stade interphase par addition de CaC12 (15) et (16). La synthèse de l'ADN total a été mesurée 3 h plus tard par incorporation de [y-32P]-dATP dans du matériel précipitable par le TCA. Comme le montre la figure 6, la réplication est inhibée par la roscovitine avec une IC50 de 15 pM. L'invention fournit ainsi de nouvelles purines dotées de propriétés inhibitrices de cdc2/cycline B de spécificité élevée. Références Bibliographiques 1 - Vesely et al((1994) Eur. J. Biochem. 224, 771-786.11. 2 - Azzi et al(1994)J. Biol. 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Cell-Biol. 122, 993-1002 REVENDICATIONS 1- Dérivés de purine biologiquement actifs, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) dans laquelle - R2, R6 et R9, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical R-NH, R-NH-NH-, NH2-R'-NH- ou R-NH-R'-NH-, dans lequel R représente un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, ou un hétérocycle, et R' un groupe alcoylène à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, ou un groupe arylène ou cycloalcoylène, R et R' renfermant chacun de 1 à 8 atomes de carbone, et étant substitués, le cas échéant, par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle, - R2 et R9 pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène, à l'exception des dérivés dans lesquels lesdits substituants présentent respectivement les significations suivantes: R6 et R9, un groupe benzylamino et méthyle, R2 et R6 , un groupe 2-hydroxyéthylamino et benzylamino, R2, R6 et R9, un groupe amino, benzylamino et méthyle, ou chloro, amino et méthyle, ou chlore, benzylamino et méthyle, ou chloro, 3-hydroxybenzylamino et méthyle,ou chlore, 5-hydroxypentylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et isopropyle, ou 2- hydroxyéthylamino, amino et méthyle, ou 2hydroxyéthylamino, isopentényl et méthyle, ou 2- hydroxyéthylamino, isopenténylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et 2-hydroxyéthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, benzylamino et isopropyle, ou 2-hydroxyéthylamino, (3-hydroxybenzyl)amino et méthyle, ou 2-hydroxyéthylamino, (3hydroxybenzyl)amino et isopropyle, ou 2-hydroxyisobutylamino, 6-benzylamino et méthyle. 2- Dérivés de purine selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'atome d'halogène est choisi parmi le chlore, le brome ou le fluor, le radical alkyle parmi les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et isobutyle, pentyle, hexyle et heptyle, le radical alcoylène, parmi le radical méthylène, éthylène, propylène, isopropylène, butylène, isobutyléne, pentène ou isopentène, . le radical aryle est un groupe benzyle, . le radical cycloalkyle est un groupe cyclohexyle, . le radical arylène est un groupe benzylène, . le radical cycloalcoyléne est un groupe cyclohexylène, . l'hétérocycle est un hétérocycle azoté et/ou oxygéné tel qu'un imidazole, un oxadiazole, une pyndine, une pyridazine ou une pyrimidine. 3- Dérivés de purine selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que R2 est choisi parmi les radicaux capables de se lier, dans un complexe cdk2/ATP, à une région de la poche de liaison à l'ATP occupée par le ribose. 4. Dérivés de purine selon la revendication 3, caractérisés en ce que R2 est choisi parmi un atome de chlore, un radical amino, méthylamino, éthylamino, n heptylamino, aminoéthylamino, arninopropylamino, diméthylaminoéthylamino, hydroxyéthylamino, hydroxypropylamino, hydroxyisobutylamino, hydroxypentylamino ou hydroxyméthylpropylamino . 5- Dérivés de purine selon la revendication 4, caractérisés en ce que R2 est un groupe hydroxy propylamino. 6- Dérivés de purine selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que R6 est choisi parmi un groupe amino, isopenténylamino, hydroxypentylamino, 4 hydroxy-3 -méthyl-trans-2-buténylamino, benzylamino hydroxybenzylamino, hydroxyéthyl benzylamino, cyclohexylméthylamino ou isopentène. 7. Dérivés de purine selon la revendication 6, caractérisés en ce que R6 comporte un résidu hydrophobe, tel que benzyle ou hydroxybenzyle. 8- Dérivés de purine selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que R9 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical méthyle, isopropyle ou hydroxyéthyle. 9. Dérivés de purine, selon la revendication 8, caractérisés en ce que R9 est un groupe hydrophobe tel que le groupe isopropyle. 10- Dérivés de purine, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi la 2 chloro-6-(3 hydrnxybenzylamino)-9-méthylpurine, la 2-(3 -amino-propylamino-6- benzylamino-9-isopropylpurine, la 2 -(3 -hydroxypropyla-mino)-6-b enzylamino-9- isopropylpurine, la 2-D,L-(2-hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-(5-hydroxypentylamino)-6-benzy-lamino-9-isopropylpurine, la 2-(1-D,Lhydroxyméthylpropylamino)-6-benzy-lamino-9-isopropylpurine, la 2-(aminoéthylamino)6-benzylamino-9-iso- propylpurine, la 2-bis(2-hydroxyéthylamino)-6-benzylamino-9isopropyl-purine, la 2-(2-hydroxypropylarnino)-6-isopenténylamino-9-isopropylpurine, la 2-(2-hydroxyéthylamino)-6-cyclohexylméthylamino-9-méthylpurine, la 2-(2hydroxypropylamino)-6-cyclohexylméthylamino-9-méthylpurine, la 2-(2hydroxyéthylamino)-6-benzylamino-9-méthylpurine, la 2-(2-hydroxyé-thylamino)-6benzylamino)-9-(2-hydroxyéthyl) purine,la 2-(2 -hydroxyéthyl-amino)-6-benzylamino-9- isopropylpurine, la 2-(2-hydroxyéthylamino)-6-isopenténylamino-9-isopropylpurine, la 2 chloro-6-isopenténylamino-9-isopropylpurine, la 2-(2-hydroxyéthylamino-6-(3 hydroxybenzylamino)-9-méthylpurine, la 2-(2-hydroxyéthylamino)-6-(3hydroxybenzylamino)-amino-9-isopropylpurine, la 2-(2-hydroxyisobutylamino)-6 benzylamino-9-méthylpurine. 11- Dérivés de purine selon la revendication 10, caractérisés en ce que qu'ils sont choisis parmi la 2-(3-hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-D,L-(2-hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2 (aminoéthylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-bis-(2-hydroxyéthylamino)-6 benzylamino-9-isopropylpurine, la 2-(2-hydroxypropylamino)-6-isopenténylamino-9- isopropylpunne. 12- Les isomères optiques et les mélanges racémiques, le cas échéant les isomères géométriques, des dérivés selon l'une des revendications 1 à 11. 13- La 2-(1-D,L-hydroxyméthylpropylamino)-6-benzylamino-9isopropylpurine. 14- Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité efficace d'au moins un dérivé de purine selon l'une des revendications 1 à 13, en association avec un véhicule pharmaceutique. 15- Compositions pharmaceutiques selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable. 16- Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules et qu'elles renferment de 1 à 100. mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 10 à40 mg. 17- Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement, par unité de prise, de 1 à 50 mg de principe actifs, de préférence de 10 à 30 mg. 18- Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 14 à 1 7,caractérisées en ce qu'elles sont utilisées comme médicaments antimitotiques, en particulier pour la chimiothérapie de cancers, ou encore pour le traitement de psoriasis, de parasitoses telles que celles dues à des champignons ou à des protistes, ou de la maladie d'Alzheimer.