Brevet FR2746591A1 — publié le 19971003

Milieu et procédé pour la conservation de sperme, notamment de sperme d'équidé et semence en résultant. La présente invention concerne un milieu de conservation de sperme à basse température et un procédé de conservation in vitro de sperme, notamment de sperme d'équidé, tel que celui du baudet du Poitou, par congélation, en vue d'une insémination, ainsi que la semence résultant de l'utilisation d'un tel milieu. Un grand nombre de procédés de conservation ont été développés jusqu'à ce jour pour permettre la conservation in vitro de sperme. Le développement des techniques d'insémination artificielle et la nécessité de disposer, pour certaines espèces en voie de disparition, de banques de sperme, impose aujourd'hui de disposer de procédés qui permettent de maintenir vivants les spermatozoïdes hors de leur milieu naturel en vue d'une intervention de l'homme et qui permettent de les conserver prêts à l'emploi sur des périodes de temps prolongées. La conservation par cryogénie s'avère la meilleure méthode aujourd'hui pour conserver du sperme pendant une période de temps relativement longue. De tels procédés de conservation, en particulier pour la conservation de sperme d'étalon, ont déjà été décrits dans l'état de la technique (Martin et al., 1979 ; Palmer 1984). Tous ces procédés de conservation par congélation utilisent la centrifugation de la semence à des moments différents et à des températures différentes. Ces procédés consistent, après dilution de l'éjaculat, à centrifuger le mélange obtenu afin d'éliminer le plasma séminal et le dilueur. Pour l'espèce asine, aucun procédé n'a par contre été décrit à ce jour. D'autres procédés s'appliquant à d'autres ongulés ont été décrits. Ainsi, par exemple, un procédé de conservation de sperme de bélier est notamment décrit dans le brevet FR-A2.254.639. Ce procédé consiste à pratiquer au moins deux dilutions avant congélation. Ce procédé comporte notamment une première étape de dilution du sperme fraîchement recueilli dans un milieu de dilution aqueux, sans glycérol, une seconde étape de dilution dans un dilueur avec glycérol, une étape de refroidissement du mélange et une étape de conditionnement du sperme ainsi dilué. De telles étapes sont également décrites dans le brevet FR-A2.546.755. Les procédés utilisés jusqu'à maintenant pour l'étalon appliqués au baudet du Poitou n'ont pu donner de résultat satisfaisant, le taux de fertilité des spermatozoïdes étant insuffisant pour amener à une fécondation. Ces résultats médiocres sont dus, pour une grande part, aux milieux de conservation utilisés qui ne protègent pas suffisamment les spermatozoïdes des chocs osmotiques et/ou biochimiques qu'ils subissent au cours de ces variations de température. Ces milieux de conservation ne comportent généralement qu'un seul agent cryoprotecteur: le glycérol. Un premier but de la présente invention est donc de proposer un milieu de conservation de sperme qui maintient un taux de mobilité des spermatozoïdes acceptable et prolonge la survie des spermatozoïdes lorsqu'ils sont conservés à une température inférieure à 37 C. Un autre but de la présente invention est de proposer un milieu apte à la conservation du sperme, susceptible d'être utilisé avant ou après congélation, ce milieu comportant un mélange d'agents cryoprotecteurs permettant de prévenir suffisamment les lésions cellulaires se produisant au cours du processus de congélation/décongélation pour obtenir une semence à pouvoir fécondant. Un autre but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de conservation de sperme, notamment de sperme d'équidé, et en particulier de sperme du baudet du Poitou, par congélation de manière à obtenir, après décongélation, une fertilité des spermatozoïdes. Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé de conservation de sperme, notamment de sperme d'équidé et en particulier de sperme de baudet du Poitou, dont la mise en oeuvre ne nécessite pas d'étape de centrifugation, ce procédé pouvant être mis en oeuvre à partir de l'éjaculat total ou de la fraction riche dudit éjaculat. A cet effet, l'invention a pour objet un milieu pour la conservation de sperme, notamment de sperme d'équidé, tel que le sperme de baudet du Poitou, à une température inférieure à 37 C, ce milieu comprenant notamment au moins un agent de nutrition, un tampon et un antibiotique utilisés classiquement pour la conservation de sperme, caractérisé en ce qu'il renferme en outre au moins de la Lglutamine et du jaune d'oeuf, le jaune d'oeuf coopérant avec la L-glutamine pour augmenter de manière significative la mobilité et la durée de vie des spermatozoïdes. Selon une première forme de réalisation de l'invention, le milieu de conservation de sperme est utilisé comme milieu de dilution de sperme pour la réfrigération du sperme ou après congélation/décongélation du sperme. Selon une autre forme de réalisation de l'invention, le milieu de conservation de sperme est utilisé comme dilueur de congélation et contient au moins du glycérol en tant qu'agent cryoprotecteur, ce cryoprotecteur coopérant avec la L-glutamine et le jaune d'oeuf pour augmenter de manière significative la mobilité des spermatozoïdes après décongélation. Le jaune d'oeuf est du jaune d'oeuf de caille présent dans ledit milieu à une concentration (v/v) comprise dans la plage [5 % - 15 %] et de préférence voisine de 10 %. La glutamine est quant à elle présente dans le milieu à une concentration comprise dans la plage [80 mM -160 mM], de préférence égale à 80 mM. L'invention a encore pour objet un procédé de conservation in vitro de sperme, notamment de sperme d'équidé, en particulier de sperme de baudet du Poitou, par congélation, en vue d'une insémination, comprenant au moins une étape de dilution du sperme fraîchement recueilli dans un milieu de dilution aqueux pour obtenir une concentration finale de spermatozoïdes au moins égale à 60.106/ml, une étape de refroidissement du mélange ainsi obtenu pour obtenir une température réelle du sperme voisine de +4 C, une étape de conditionnement du sperme ainsi dilué de façon connue en paillettes, caractérisé en ce qu'on dilue le sperme avant congélation dans un milieu de dilution aqueux, dit dilueur de congélation, comprenant, outre notamment au moins un agent de nutrition, un tampon, un cryoprotecteur, tel que du glycérol et un antibiotique utilisés classiquement pour la conservation du sperme, au moins du jaune d'oeuf et de la L-glutamine, ces deux agents cryoprotecteurs coopérant entre eux pour augmenter de manière significative la mobilité des spermatozoïdes après décongélation. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, le contenu des paillettes est, en vue d'une insémination, décongelé puis à nouveau dilué dans un milieu de dilution comprenant, outre notamment au moins un agent de nutrition, un tampon et un antibiotique utilisés classiquement pour la conservation du sperme, du jaune d'oeuf et de la L-glutamine. L'invention concerne enfin une semence conservée dans un milieu conforme à l'un des milieux décrits ci-dessus. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'un exemple de réalisation, en référence à la figure unique qui représente, sous forme d'un graphique, les effets du jaune d'oeuf de caille 10 % (v/v) et de la glutamine (80 mM) utilisés seuls ou en combinaison sur la mobilité des spermatozoïdes du baudet du Poitou après décongélation. Le milieu de conservation de sperme, objet de l'invention, se caractérise par son aptitude à maintenir un taux de mobilité satisfaisant des spermatozoïdes et à prolonger la durée de vie de ces spermatozoïdes lorsque ces derniers ont dû, pour leur conservation, être stockés à une température inférieure à 37 C. Ce milieu est donc intéressant pour toute application dans laquelle il est nécessaire d'abaisser la température du sperme pour le conserver. Ce milieu de conservation peut donc être utilisé comme milieu de dilution pour la réfrigération du sperme, pour la congélation du sperme ou après décongélation du sperme. Ce milieu se caractérise par la présence de deux constituants essentiels qui sont le jaune d'oeuf et la L-glutamine, leur association dans un même milieu se révélant être très intéressante. On pense qu'au moins la L-glutamine remplit le rôle d'un agent cryoprotecteur. Lors d'une application de ce milieu à la réfrigération de sperme, c'est-à-dire du maintien du sperme à une température de +4 C, ce milieu est supplémenté en jaune d'oeuf et en L-glutamine. La L-glutamine et le jaune d'oeuf agissent en tant qu'agents cryoprotecteurs et préviennent les lésions cellulaires d'origine osmotique et/ou biochimique des spermatozoïdes. Il en résulte une augmentation de la mobilité des spermatozoïdes et une prolongation de leur durée de vie. Ainsi, un tel milieu de conservation se compose, par exemple, essentiellement de lait UHT demi-écrémé additionné de glutamine (80 mM), de jaune d'oeuf (10 % v/v), de pénicilline (environ 50 U.I./ml) et de gentamycine (50 pg/ml). Le lait qui joue à la fois le rôle de tampon et d'agent de nutrition et les antibiotiques constituent la composition de base de ce milieu. Le sperme est dilué dans ce milieu à un taux de dilution d'environ un quart. Comparé à un milieu de conservation classique, tel qu'un milieu de conservation à base uniquement de lait et d'antibiotiques, on constate que la survie des spermatozoïdes à +4 C est prolongée de deux jours, multipliant ainsi par deux la durée de vie des spermatozoïdes conservés à une température de +4 C. Ce résultat ne peut être obtenue qu'avec la combinaison jaune d'oeuf/L-glutamine. Ce milieu de conservation peut encore être utilisé comme milieu de dilution avant congélation ou après décongélation. Dans ce cas, sa composition de base diffère bien qu'elle comprenne toujours au moins un agent de nutrition, un tampon et un antibiotique. Le pH final de cette composition doit être ajusté à environ 6,8 et la pression osmotique doit être de l'ordre de 300 mOsm/kg. A titre d'exemple, il est fourni ci-après une composition de base d'un milieu de conservation utilisé comme milieu de dilution avant congélation ou après décongélation. Ce milieu comprend - lait écrémé UHT : environ 1 1 - eau distillée : environ 1 1 glucose : 40-60 g lactose : 2-4 g raf finose : 2-4 g citrate de sodium : 0,4-0,8 g citrate de potassium : 0,75-0,95 g pénicilline : environ 100 000 U.I. gentamycine : environ 100 000 U.I. Cette composition pourrait également être utilisée comme composition de base du milieu de réfrigération décrit cidessus. Le milieu INRA 82 utilisé pour la conservation de sperme de cheval répond à cette définition. Il comprend plus spécifiquement 1 litre de lait écrémé UHT, 1 litre d'eau distillée, 50 g de glucose, 3 g de lactose, 3 g de raffinose, 0,6 g de citrate de sodium, 0,82 g de citrate de potassium, 100 000 U.I. de pénicilline, 100 000 U.I. de gentamycine. Dans le cas d'une utilisation de ce milieu, comme dilueur de congélation, ou milieu de dilution avant congélation, ce milieu comporte, additionnée à la composition de base, une combinaison de trois agents cryoprotecteurs, à savoir la Lglutamine, le jaune d'oeuf et le glycérol. On sait que le glycérol est une molécule de faible poids moléculaire qui exerce ses propriétés cryoprotectrices en pénétrant à l'intérieur des cellules. Grâce à son radical hydroxyl, le glycérol fixe une partie de l'eau cellulaire. Ainsi, lors de la congélation et de la décongélation, il limite la déshydratation des cellules. Il abaisse la température de cristallisation, diminue la quantité de gaz intracellulaire qui se forme lors de la congélation/décongélation et arrondit semble-t-il la forme des cristaux. Il est aussi capable d'éviter la formation des cristaux induits lorsque la viscosité du milieu est élevée par passage à l'état solide, amorphe ou vitreux. On a constaté que le glycérol, utilisé à des concentrations élevées, produit une détérioration de l'acrosome. C'est pourquoi la concentration de glycérol dans le milieu de dilution est comprise dans la plage de concentration (v/v) [3 % - 5 %] et est de préférence égale à 4 %. On constate en outre à des concentrations élevées un effet toxique du glycérol qui contribue fortement à la diminution de la survie des spermatozoïdes. Les études qui ont été menées démontrent que le mécanisme de protection de la glutamine semble différent de celui des cryoprotecteurs conventionnels comme le glycérol. L'étude du mécanisme d'action de la L-glutamine au cours de la congélation des spermatozoïdes du baudet du Poitou montre que celui-ci s'exerce essentiellement au cours du processus de la congélation/décongélation et que cette molécule ne pénètre pas la membrane. Le mécanisme de protection est donc un mécanisme extra-cellulaire contrairement à celui décrit pour le glycérol. On pense donc que le fait d'associer trois cryoprotecteurs, à savoir le glycérol, la L-glutamine et le jaune d'oeuf, dont les mécanismes d'action sont différents, permet de réduire au maximum les lésions cellulaires d'origine osmotique et/ou biochimique. Cet effet est notamment illustré à la figure unique. Ce graphique montre que l'association de glycérol, de jaune d'oeuf et de L-glutamine dans un même milieu engendre par sommation partielle de leurs effets positifs individuels une amélioration significative de la mobilité et des caractéristiques de mouvement des spermatozoïdes du baudet du Poitou après décongélation. Dans ce graphique, il a été comparé trois milieux différents à un milieu témoin. Le milieu témoin est constitué par le milieu INRA 82 décrit ci-dessus modifié par 4 % (v/v) de glycérol et 2 % (v/v) de jaune d'oeuf de caille. Le premier milieu testé est le milieu témoin supplémenté en glutamine 80 mM, le second milieu testé est le milieu témoin supplémenté en jaune d'oeuf de caille 8 % (v/v) pour obtenir une concentration (v/v) finale en jaune d'oeuf égale à 10 %, le dernier milieu testé correspond au milieu témoin supplémenté de manière simultanée en glutamine (80 mM) et en jaune d'oeuf de caille 8 % (v/v). On constate que la mobilité des spermatozoïdes du baudet du Poitou, après décongélation, ne diffère pas significativement entre le milieu ne contenant que du jaune d'oeuf de caille et le milieu contenant essentiellement de la L-glutamine. Par contre, leur association à des concentrations déterminées additionne au moins partiellement leurs effets et augmente la mobilité des spermatozoïdes. On peut penser que la pression osmotique constitue un paramètre de réussite de leur association. En effet, la glutamine augmente la pression osmotique du milieu tandis que le jaune d'oeuf la diminue. En conséquence, l'addition de ces deux composants forme un milieu à pression osmotique acceptable et convenable pour les spermatozoïdes. Il est à noter que le jaune d'oeuf est du jaune d'oeuf de caille présent dans ledit milieu à une concentration (v/v) comprise dans la plage [5 % - 15 %] et de préférence voisine de 10 %. La L-glutamine est quant à elle présente dans le milieu à une concentration comprise dans la plage [80 mM - 160 mM] de préférence égale à 80 mM. Dans le cas d'une utilisation de ce milieu de conservation comme milieu de dilution après congélation/décongélation, ce milieu comporte, outre la composition de base décrite ci-dessus, de la L-glutamine et du jaune d'oeuf. On constate là encore que le jaune d'oeuf et la L-glutamine coopèrent entre eux et concourent en tant qu'agents cryoprotecteurs à une augmentation de la mobilité des spermatozoïdes après décongélation. Les concentrations en jaune d'oeuf et en L-glutamine dans ce milieu de dilution après décongélation sont identiques à celles précisées cidessus pour le dilueur de congélation. Il va à présent être décrit un procédé de conservation du sperme par congélation. Pour la mise en oeuvre d'un procédé de conservation de sperme, en particulier de sperme d'équidé, tel que du sperme du baudet du Poitou, il convient tout d'abord de disposer de sperme fraîchement recueilli. La récolte de sperme s'effectue généralement au moyen d'un vagin fermé ou ouvert tel qu'un vagin, par exemple, de type INRA (IMV, l'Aigle, France). Au cours de cette récolte, il est possible de récupérer dans un premier tube les trois premiers jets qui constituent la fraction riche de ltéjaculat, puis dans un second tube, le reste de l'éjaculat. Il est également possible de prélever l'éjaculat total sans distinguer la fraction riche du reste de l'éjaculat. Ceci constitue l'un des premiers intérêts de ce procédé qui n'oblige pas à disposer d'une fraction riche d'éjaculat pour permettre la conservation du sperme et l'obtention d'un sperme à pouvoir fécondant. Ce sperme est, immédiatement après récolte, filtré puis dilué à 34 C dans un milieu de dilution aqueux. Ce milieu est par exemple le dilueur de congélation, décrit cidessus. L'étape de dilution est réalisée de manière à obtenir une concentration finale de spermatozoïdes au moins égale à 60.106 ml. Le jaune d'oeuf utilisé dans le milieu de dilution peut être du jaune d'oeuf de poule ou du jaune d'oeuf de caille. Dans le cas d'une utilisation de jaune d'oeuf de poule, la concentration en volume préférée dans le milieu est comprise dans la plage [3 % - 8 %] et de préférence égale à 5 %. Après dilution du sperme fraîchement recueilli, le mélange obtenu est refroidi. Généralement, on refroidit le mélange ainsi obtenu d'une température voisine de +34 C à une température proche de +4 C suivant une pente de -1 refroidissement de -0,5 C mn pour obtenir une température du sperme voisine de +4 C. Il s'est avéré, au cours des différents essais réalisés, que la pente de refroidissement choisie est particulièrement importante. Ce refroidissement s'effectue au moyen d'une machine programmable, telle qu'une machine [Huber PD 410, Offenburg-Elgersweier, Allemagne]. Par la suite et de manière en soi connue, la semence est conditionnée en paillettes (IMV, L'Aigle, France), généralement de 0,5 ml. Ce sperme conditionné en paillettes est congelé dans des vapeurs d'azote liquide à une température voisine de -96'C pendant une période de temps prédéterminée, généralement de l'ordre de 10 mn, puis dans des vapeurs d'azote liquide à -140'C pendant environ 5 mn avant d'être immergé dans de l'azote liquide à -196-C. Les températures bien que fournies à titre indicatif constituent les températures les plus fréquemment utilisées. Le sperme ainsi congelé peut être conservé pendant une période de temps indéterminée. Lorsqu'une insémination doit être réalisée à partir du sperme ainsi conservé, il est nécessaire de procéder à une première étape de décongélation du sperme puis à une étape de dilution de ce sperme. Généralement, on décongèle le sperme par immersion des paillettes dans un bain-marie à 37 C pendant une période de temps prédéterminée de l'ordre de 30 secondes. On sait que la semence doit présenter au moins une mobilité de 35 % à l'analyseur d'image (ATS 40 JC Diffusion International - La Ferté-Fresnel - France). Si les essais ont été réalisés par exemple à partir de la fraction totale d'un éjaculat du baudet du Poitou, on immergera dans le bain-marie le contenu de trois paillettes. Une fois le sperme décongelé, ce dernier peut être préparé pour l'insémination. Lorsque l'étape de décongélation est achevée, il est nécessaire de pratiquer une nouvelle dilution du mélange obtenu. Cette nouvelle dilution s'impose pour au moins deux raisons. D'une part, l'effet nocif d'une forte concentration en spermatozoïdes amène une compétition pour les éléments nutritifs et/ou une accumulation de métabolites nocifs. D'autre part, le plasma séminal a un effet nocif sur la survie des spermatozoïdes. On constate donc une amélioration significative de la mobilité et de la motilité des spermatozoïdes congelés dans un dilueur contenant du glycérol en diluant le sperme après décongélation dans ce même dilueur sans glycérol. Ceci s'explique par une maîtrise du choc osmotique. La dilution avec le milieu sans glycérol permet d'abaisser la concentration en glycérol, diminuant ainsi sa toxicité pour les spermatozoïdes. De plus, le milieu de dilution apporte d'autres substrats énergétiques permettant de prolonger le métabolisme des spermatozoïdes du baudet du Poitou. Le sperme décongelé est donc dilué avec le milieu de dilution après congélation/décongélation décrit ci-dessus à un taux de un demi. Ce milieu de dilution utilisé est le même milieu que le milieu de dilution utilisé avant congélation à l'exception du fait qu'il ne contient pas de glycérol. 6 La dilution est réalisée comme suit : si une dose de 60.106 spermatozoïdes, correspondant au conditionnement de vingt paillettes, a été utilisée, le contenu de ces vingt paillettes, dont le volume total est égal à 10 ml, est utilisé après dilution dans un volume de 10 ml du milieu de dilution exempt de glycérol pour obtenir un volume total de 20 ml. Le procédé de conservation décrit ci-dessus a permis l'obtention d'une semence à partir de laquelle les premières gestations de baudet du Poitou avec trois à six inséminations utilisées en vingt paillettes à 60 millions/ml de spermatozoïdes ont été obtenues. Bien évidemment, bien que le procédé de conservation de sperme par congélation décrit ci-dessus ait été appliqué au sperme de baudet du Poitou, il peut s'appliquer au sperme de toute autre espèce humaine ou animale. Son application au baudet du Poitou démontre qu'il peut être utilisé avec réussite sur des espèces en voie de disparition et permettre la création de banques de sperme. REVENDICATIONS 1. Milieu pour la conservation de sperme, notamment de sperme d'équidé, tel que le sperme de baudet du Poitou à une température inférieure à 37 C, ce milieu comprenant notamment au moins un agent de nutrition, un tampon et un antibiotique utilisés classiquement pour la conservation de sperme, caractérisé en ce qu'il renferme en outre au moins de la Lglutamine et du jaune d'oeuf, ce jaune d'oeuf coopérant avec la L-glutamine pour augmenter de manière significative la mobilité et la durée de vie des spermatozoïdes. 2. Milieu de conservation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est utilisé comme milieu de dilution de sperme pour la réfrigération du sperme ou après congélation/décongélation du sperme. 3. Milieu de conservation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est utilisé comme dilueur de congélation et contient au moins du glycérol en tant qu'agent cryoprotecteur, ce cryoprotecteur coopérant avec la L-glutamine pet le jaune d'oeuf pour augmenter de manière significative la mobilité des spermatozoïdes après décongélation. 4. Milieu de conservation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le jaune d'oeuf est du jaune d'oeuf de caille présent dans ledit milieu à une concentration (v/v) comprise dans la plage [5 % - 15 %] et de préférence voisine de 10 %. 5. Milieu de conservation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la L-glutamine est présente dans le milieu à une concentration comprise dans la plage [80 mM 160 mM], de préférence égale à 80 mM. 6. Milieu de conservation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la composition de base de ce milieu supplémentée en L-glutamine, en jaune d'oeuf et éventuellement en glycérol est telle que suit - lait écrémé UHT : environ 1 1 - eau distillée : environ 1 1 glucose : 40-60 g lactose : 2-4 g raf finose : 2-4 g citrate de sodium : 0,4-0,8 g citrate de potassium : 0,75-0,95 g pénicilline : environ 100 000 U.I. gentamycine : environ 100 000 U.I. 7. Procédé de conservation in vitro de sperme, notamment de sperme d'équidé, tel que celui du baudet du Poitou, par congélation, en vue d'une insémination, comprenant au moins une étape de dilution du sperme fraîchement recueilli dans un milieu de dilution aqueux pour obtenir une concentration finale de spermatozoïdes au moins égale à 60.106/ml, une étape de refroidissement du mélange ainsi obtenu pour obtenir une température réelle du sperme voisine de +4 C, une étape de conditionnement du sperme ainsi dilué de façon connue en paillettes, caractérisé en ce qu'on dilue le sperme avant congélation dans un milieu de dilution aqueux, dit dilueur de congélation, comprenant, outre notamment des agents de nutrition, des tampons, un cryoprotecteur, tel que du glycérol et des antibiotiques utilisés classiquement pour la conservation du sperme, au moins du jaune d'oeuf et de la L-glutamine, ces deux agents cryoprotecteurs présentant un effet synergique sur la mobilité des spermatozoïdes après décongélation. 8. Procédé de conservation de sperme selon la revendication 7, caractérisé en ce que, en vue d'une insémination, le contenu des paillettes est décongelé puis à nouveau dilué dans un milieu de dilution comprenant, outre notamment au moins un agent de nutrition, un tampon et un antibiotique utilisés classiquement pour la conservation du sperme, du jaune d'oeuf et de la L-glutamine. 9. Procédé de conservation de sperme selon la revendication 8, caractérisé en ce que le sperme décongelé est dilué dans ledit milieu de dilution à un taux de un demi. 10. Procédé de conservation de sperme selon la revendication 7, caractérisé en ce que, après dilution du sperme fraîchement recueilli, on refroidit le mélange ainsi obtenu d'une température voisine de 34 C à une température proche de 4 C -1 selon une pente de refroidissement de -0,5 C mn 1 pour obtenir une température réelle du sperme voisine de +4 C. 11. Procédé de conservation de sperme selon la revendication 7, caractérisé en ce que le sperme, conditionné en paillettes, est congelé dans des vapeurs d'azote liquide à une température voisine de -96'C pendant une période de temps prédéterminée généralement voisine de 10 mn puis dans des vapeurs d'azote liquide à une température voisine de -140-C pendant environ 5 mn avant d'être immergé dans de l'azote liquide à -196-C. 12. Procédé de conservation de sperme selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on décongèle le sperme par immersion des paillettes dans un bain-marie à 37eC pendant une période de temps prédéterminée de l'ordre de 30 secondes.