Brevet FR2740347A1 — publié le 19970430

La présente invention concerne la décontamination biologique de milieux contaminés par des composés organophosphorés neurotoxiques. Les composés organophosphorés inhibiteurs des cholinestérases tels que les organophosphates, les amidophosphates, les aminophosphates, les thiophosphates, les phosphonates, les thiolophosphates, les thiolophosphonates, les phosphinates sont utilisés notamment comme pesticides et insecticides en agriculture et aussi comme toxiques de guerre potentiels. On peut citer notamment le parathion ou O,O-diéthyl, O-pnitrophénylthiophosphate, le demeton ou O,O-diméthyl, S-12- (éthylthio)-éthyl]thiolophosphate, le malathion ou 2- (0,0- diméthyl-dithiophosphate) succinate d'éthyle, le VX ou O- éthyl,S-2-(diisopropylaminoéthyl)méthylthiolophosphonate qui bloquent de façon irréversible la transmission nerveuse en se liant de manière covalente à l'acétylcholinestérase. On connaît de nombreux produits efficaces pour éliminer ces toxiques. Cependant, les produits les plus actifs actuellement disponibles tels que la soude en milieu aqueux ou en présence d'amine et l'hypochlorite de calcium sont très agressifs vis-àvis des surfaces contaminées. En outre, ces procédés mettant en oeuvre des molécules chimiques impliquent une dissolution des agents toxiques des surfaces contaminées dans les liquides de décontamination.De grandes quantités de liquides sont nécessaires à la décontamination, étant donné que les composés organophosphorés sont généralement peu solubles dans l'eau et qu'il est prohibé d'utiliser des solvants organiques polluants. Même après décontamination par voie chimique, des agents toxiques persistent dans l'environnement. L'utilisation de substances biologiques, en particulier des enzymes, permet de répondre à ces préoccupations. Les enzymes sont des molécules d'origine naturelle possédant la capacité de dégrader spécifiquement des composés donnés.Elles respectent ainsi les autres molécules et peuvent être utilisées sur des matériels fragiles, sur la peau, sur les plaies. La première enzyme capable de dégrader les composés organophosphorés a été mise en évidence dans un axone de calamar. La fonction de cette enzyme n'est toujours pas connue. D'autres enzymes ont été découvertes dans des bactéries, des protozoaires, des coquillages et dans des tissus de mammifères, foie de rat, rein de cochon. En particulier, de nombreux auteurs et, parmi eux, Hirosoko en 1968, Behki et Khan en 1991, se sont intéressés à la biodégradation d'un pesticide, le parathion, par des microorganismes: bacilles Gram+, bacilles Gram-, coques Gram+, champignons et levures. Ces microorganismes sont capables de dégrader ce composé utilisé comme source de carbone ou de phosphore. Ces chercheurs ont tenté d'isoler l'enzyme responsable de la biodégradation du parathion, la parathion hydrolase. Celle-ci est active vis-à-vis d'autres pesticides organophosphorés. Fu and Sun (Aérobic metabolism of VX and mixed function oxidases, Zhongguo Yaoli Xuebao;1990, 11:123-126 ) ont mené des études sur la dégradation biologique du VX par des enzymes de différents tissus et de sérum. Ils ont découvert deux catégories d'enzymes:une enzyme aérobie, la VX oxydase, présente dans le foie du rat, et une enzyme anaérobie, présente dans le foie de lapin et le sérum de rat. Cependant, à ce jour, aucune enzyme extraite de bactéries n'est active vis-à-vis du VX. Le VX est le plus stable de tous les organophosphorés susceptibles d'être utilisés comme agents de guerre chimique. A température et pression ambiante, il se présente sous la forme d'un liquide incolore et inodore, peu soluble dans l'eau (lg/l à 20il). La dose létale DL50, c'est-à-dire la dose qui tue 50* des animaux auxquels la molécule est administrée, est par voie percutanée de 105pg/kg chez le rat. Le VX peut être hydrolysé ou oxydé. Sa durée de demi-vie, en milieu aqueux, varie en fonction du pH, la température, et la nature de l'eau. A des pH et températures voisins, le taux d'hydrolyse est supérieur dans de l'eau naturelle ( eau de mer, nappe phréatique) à celui dans de l'eau distillée. De façon générale, le VX est stable en milieu acide, le taux d'hydrolyse augmentant en milieu alcalin. La présente invention a pour objet un procédé visant à transformer le VX en composés dénués de toxicité à l'aide de microorganismes. Parmi les procédés de transformation du VX, on peut citer l'hydrolyse et l'oxydation. L'hydrolyse du VX fait appel à des mécanismes différents selon la zone de pH considérée. Ainsi, pour des pH inférieurs à 6 ou supérieurs à 10, c'est essentiellement la rupture de la liaison P-S qui est à prendre en compte, alors que pour des pH compris entre 7 et 10, les ruptures des liaisons P-S, C-O et C-S sont à considérer. Mais la disparition du VX ne signifie pas forcément détoxication; en effet, un des métabolites réactionnels, l'acide S(diisopropylaminoéthyl)méthylthiolo phosphonique ou deséthyle VX, est aussi toxique que le VX puisque la DL50 chez le lapin est de 15,4g/kg pour le VX d'après Merck index et de 17pg/kg pour le deséthyle VX selon Epstein et al. en voie intraveineuse. L'oxydation du VX en tant que moyen de décontamination a été étudiée par Yang Y.C., Baker J.A. and Ward J.R. dans Chem.Rev.,1992,92:1729-1743. Le VX possède deux sites possibles d'oxydation:l'atome de soufre et l'atome d'azote. Les réactions d'oxydation sont donc très variées. Yang estime qu'une oxydation sélective du soufre serait indispensable à la détoxication chimique du VX. Si les produits de dégradation ne sont pas encore clairement définis, un mécanisme de destruction du VX par un oxydant tel que l'hypochlorite est toutefois proposé: Etant donné qu'au niveau pratique, selon l'ouvrage de Pelmont J. "Bactéries et environnement:adaptations physiologiques", Presse universitaire de Grenoble, 1993, le métabolisme des micro-organismes aérobies les fait désigner comme les meilleurs candidats potentiels pour la détoxication oxydative, on a donc choisi des bactéries aérobies. Des essais de biodégradation du VX par des populations mixtes de bactéries issues de boues de fosse septique n'ont pas donné jusqu'à présent de résultats satifaisants. Des souches pures ont été testées. Les cultures de ces souches, utilisant le VX comme source de carbone et de phosphore, n'ont pas confirmé d'aptitude à dégrader le toxique lors d'essais complémentaires. On a alors étudié l'aptitude de ces souches à dégrader le VX en cométabolisme, c'est-à-dire, en présence d'une source de carbone additionnelle facilement biodégradable. On sait que la croissance des bactéries requiert à la fois des composés capables de fournir de l'énergie, tels que le glucose, et des composés nécessaires au fonctionnement cellulaire, tels que des oligoéléments, des vitamines. En microbiologie, on utilise , soit des milieux généraux, soit des milieux spécifiques convenant mieux que les autres à une espèce de bactérie donnée. La source d'énergie la plus fréquemment utilisée dans les milieux généraux est le glucose. Cependant, en utilisant du glucose, on n' a pas observé de dégradation significative du VX en présence de divers microorganismes, à l'exception de Rhodococcus ruber et Corynebacterium glutamicum. Certains auteurs comme, Horvath R.S. in "Microbiological cometabolism and the degradation of organic compounds in nature", Bacteriological Reviews, 1972, 36(2):146-155, ont montré que l'apport d'une source de carbone facilement biodégradable telle que de l'acétate, du fumarate ou du glucose, peut entraîner la dégradation de pesticides dits récalcitrants. De manière surprenante, il est apparu qu'un substrat autre que le glucose permettait la biodégradation du VX en présence d'une grande variété de microorganismes. I1 semble que l'utilisation d'un milieu de culture à base de glucose, si elle permet la croissance optimale des germes, n'aboutit pas à la synthèse d'enzymes capables de biodégrader le VX, aux deux exceptions près précitées. Ce phénomène semble être lié au fait que les microorganismes dégradent le VX grâce à l'action d'enzymes qu'ils ne synthétisent qu'en l'absence de glucose. I1 est connu que les microorganismes unicellulaires que sont les bactéries dégradent les substrats mis à leur disposition grâce à des enzymes , en plusieurs étapes, au long d'une chaîne de dégradation spécifique à chacun d'eux. Il serait aberrant pour l'économie cellulaire que tous les types de chaînes de dégradation fonctionnent en permanence. Les processus de dégradation font eux aussi l'objet d'une régulation. C'est la présence du substrat qui active la synthèse des enzymes de la chaîne de dégradation. Le glucose constitue pour la bactérie le substrat le plus économique et généralement le plus abondant. Pour cette raison, la chaîne enzymatique correspondant à la dégradation du glucose est toujours fonctionnelle. Lorsque le glucose est fourni à la bactérie en quantité suffisante, les chaînes de dégradation correspondant aux autres substrats ne fonctionnent pas. La synthèse des enzymes participant à ces chaînes de dégradation est inhibée,il s'agit de la répression catabolique. L'invention a pour objet un procédé de transformation d'un composé organophosphoré toxique en composés dénués de toxicité à l'aide de microorganismes, caractérisé en ce qu'il consiste à faire agir sur ce composé organophosphoré, en solution, une ou plusieurs bactéries, en présence d'oxygène, dans un milieu de culture inhibant la répression catabolique qui se produit en présence de glucose. Ce procédé s'applique tout particulièrement au VX, au demeton et au malathion. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture contient un sel d'acide organique. De manière préférentielle, le sel d'acide organique est un acétate. Avantageusement, le milieu de culture est enrichi en nutriments connus. Selon un mode de réalisation préféré, le milieu de culture contient de l'acétate de sodium, de l'extrait de levure et est tamponné à un pH de 7,5. L'emploi d'extrait de levure dans le milieu de culture permet d'apporter différents cofacteurs ou oligoéléments de manière globale, au lieu de les ajouter un par un. On a étudié diverses bactéries appartenant à des familles différentes. Parmi celles-ci, on peut citer Bacillus globigii, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Rhodococcus ruber, Esterichia coli. La biodégradation du VX semble être liée au fait que les microorganismes libèrent une ou plusieurs enzymes qu'ils ne synthétisent qu'en l'absence de glucose. L'enzyme ou les enzymes responsables de la dégradation du VX sont vraisemblablement des enzymes banales, car présentes chez toutes ces bactéries. Un exemple de milieu de base retenu pour la croissance des bactéries est celui décrit par Touzel et Albagnac (1983). I1 comprend une solution macrominérale, une solution d'oligoéléments, une solution de vitamines, du chlorure d'ammonium et de l'eau distillée. La solution macrominérale est constituée de: KC1 6g/l NaCl 12g/l MgCl2, 2H20 6g/l CaC12,2H2O 1,6g/l La solution d'oligoéléments se compose de: Acide nitrilotriacétique 12,8g/l FeC13,6H20 1,35g/l MnC12,4H20 0,1g/l CoCl2, 6H2O 0,024g/l CaCl2,2H2O 0,1g/l ZnCl2 0,lg/l CuCl2,2H20 0,025g/l H3BO3 0,01g/l Na2MoO4,2H2O 0,024g/l NaCl 1g/l NiC12,6H2 0,12g/l Na2SeO3,5H2O 0,026g/l La solution de vitamines a la composition suivante:: D(+) Biotine 2mg/l Acide folique 2mg/l Pyridoxal-HCl îOmg/l Riboflavine 5mg/l Acide nicotinique 5mg/l Thiamine-HCl 5mg/l Calcium D(+) panthoténate 5mg/l Vitamine B12 0,lmg/1 Acide 4-aminobenzoïque 5mg/l Acide lipoïque DL- 5mg/l Le milieu de base est stérilisé de manière classique. Afin de mesurer l'avancement de la biodégradation du VX, on dose le VX restant dans le milieu. Le VX est séparé du milieu de culture par une extraction liquide-liquide puis est dosé par chromatographie en phase gazeuse. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description suivante d'exemples non limitatifs. EXEMPLE l:Dégradation du VX (lmg/l) par divers microorganismes dans un milieu de culture contenant du glucose (5g/l) et de l'extrait de levure (0,2g/l) Les micro-organismes utilisés dans cette étude ainsi que leur provenance sont indiqués dans le tableau ci-dessous: Microorganismes origine Bacillus globigii 77.17 Institut Pasteur Bacillus sphaericus ATCC 12123 American Type culture Collection Bacillus sphaericus ATCC 12300 American Type culture Collection Bacillus thuringiensis ATCC 10792 Institut Pasteur Corynebacterium glutamicum ATCC 13745 American Type culture Collection Pseudomonas fluorescens ATCC 6972 Institut Pasteur Pseudomonas putida ATCC 12842 Institut Pasteur Rhodococcus ruber DSM 43252 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Escherichia coli HB 101 Institut Pasteur Le milieu de culture de base est tamponné à pH de 7,5 avec du trishydroxyaminométhane/HCl 100mM. Sa composition , par litre, est la suivante: solution macrominérale, 50ml; solution d'oligoéléments, 10ml; solution de vitamines, 10ml; NH4C1, lg;KHC03, 1,5g(Touzel et Albagnac, 1983). Le milieu de base est enrichi de 5g/l de glucose et de 0,2g/l d'extrait de levure. Ce milieu est stérilisé par filtration(unité de filtration avec une membrane nitrate de cellulose de porosité 0,2pro). Le VX, dissout dans le milieu et stérilisé par filtration, est ajouté juste avant l'inoculation à une concentration de lmg/l. La culture bactérienne est ajustée à une densité optique initiale de 0,05 à 600nm. Chaque culture pure est réalisée en erlenmeyer de 250ml contenant 100ml de milieu, agité à 200 tours/mn et incubé à 28-C pendant 7 jours. La croissance des bactéries est évaluée par mesure de densité optique à 600nm. La concentration en VX est déterminée par la méthode de dosage, précédemment mentionnée, mettant en jeu une extraction liquide-liquide suivie d'un dosage par chromatographie en phase gazeuse. Dans le tableau ci-dessous sont consignés les pourcentages de dégradation du VX par les différentes bactéries testées. Microorganismes % de dégradation du VX après 7 jours d'incubation Bacillus globigii 77.17 O Bacillus sphaericus ATCC 12123 N. D. Bacillus sphaericus ATCC 12300 N. D. Bacillus thuringiensis ATCC 10792 O Corynebacterium glutamicum ATCC 13745 60,76 Pseudomonas fluorescens ATCC 6972 Pseudomonas putida ATCC 12842 n Rhodococcus ruber DSM 43252 53 Escherichia coli HB 101 O N.D. signifie non déterminé. Un témoin abiotique anaérobie ne présente pas d'hydrolyse significative du VX durant 7 jours d'incubation. Dans un milieu enrichi en glucose et extrait de levure, seules deux bactéries , Corynebacterium glutamicum et Rhodococcus ruber dégradent le VX: elles éliminent respectivement 53 et 60,76% de la concentration initiale après 7 jours d'incubation, le taux d'oxygène dissout dans les milieux de culture demeurant égal à zéro une fois atteinte la phase stationnaire. EXEMPLE 2: Dégradation du VX (lmg/l) par divers microorganismes dans un milieu de culture contenant de l'acétate (6,87g/1) et de l'extrait de levure (0,2g/l) Le mode opératoire est identique à celui de l'exemple 1 en enrichissant le milieu de base avec 6,87g/l d'acétate de sodium et 0,2g/l d'extrait de levure. Les pourcentages de dégradation du VX par les différentes bactéries testées sont consignés dans le tableau ci-dessous: Micro-organismes % de dégradation du VX après 7 jours d'incubation Bacillus sphaericus 82,81 Bacillus globigii 75,77 Escherichia coli HB 101 63,00 Après 7 jours d'incubation et suivi du pH au pH-mètre, on observe: - une variation de pH de 7,7 à 8,1 identique quelle que soit la souche étudiée; par conséquent, les différences dans les cinétiques de disparition du VX ne peuvent être attribuées à une variation de pH; - 24,65 X 3,64% d'hydrolyse du VX dans le témoin abiotique anaérobie ( ce témoin a été réalisé uniquement en point terminal et non en cinétique); - 63 + 2,10% de disparition du VX avec Escherichia coli; la courbe traduisant la cinétique de disparition est une droite de pente -8,54*/j. Ce germe avait pourtant été choisi à l'origine en tant que témoin négatif, compte tenu du fait qu'il ne dégraderait probablement pas le VX; - 75,77 + 5,19% de dégradation avec Bacillus globigii; la courbe traduisant la cinétique de disparition est une droite de pente -10,51%/j; - 82,81 s 0,40% avec Bacillus sphaericus; la cinétique initiale de dégradation est lente et traduit une phase de latence.Celle-ci pourrait correspondre à une induction de l'expression génétique de la synthèse de l'enzyme. Après cette phase, la vitesse de disparition du VX augmente de façon Les résultats de cette étude confirment donc l'efficacité de l'utilisation de l'acétate de sodium associé à de l'extrait de levure dans la production d'une biomasse bactérienne capable de dégrader un agent toxique organophosphoré tel que le VX. EXEMPLE 4: Dégradation du déméton (20mg/l) par Corynebacterium glutamicum ATCC 13745 Le milieu de culture sélectif utilisé a été défini par H. Dominguez dans Croissance et flux métabolique de Corynebacterium glutamicum sur divers sucres: interaction entre transporteurs PTS et voies métaboliques, DEA INSA Toulouse, 1994. Ce milieu contient les éléments suivants: Acide nitrilotriacétique 0,19g/l Déféroxamine mésylate lmg/l FeSO4, 7H20 30mg/l CuSO4,5H2O 2mg/l ZnS04,7H20 îOmg/l MnS04, H20 50mg/l NH4C1 4g/l Source de carbone 300mM de carbone (glucose, acétate, fumarate) Ajouts: KH2PO4/K2HPO4 19,6g/l Extrait de levure 0,5g/l Déméton-S-méthyle 20mg/l Le milieu de culture est tamponné à pH égal à 7. Le témoin abiotique ne présente pas de dégradation significative. Quantitativement et en moyenne, les vitesses maximales de biotransformation du déméton, en présence de Corynebacterium glutamicum, selon les trois sources de carbone sont les suivantes: - acétate: 2,40 + 0,73mg/l de déméton/g de biomasse/jour - fumarate: 1,95 + 0,8mg/l de déméton/g de biomasse/jour - glucose: 1,25 + 0,93mg/l de déméton/g de biomasse/jour. importante. La cassure dans la courbe de cinétique de disparition du VX ne peut être attribuée à une variation de pH. En conclusion et par comparaison avec les résultats d'un témoin abiotique anaérobie, on peut considérer que les trois souches étudiées dégradent le VX. EXEMPLE 3: Dégradation du VX (lmg/l) par divers microorganismes dans un milieu de culture contenant de l'acétate (15g/l) et de l'extrait de levure (0,2g/l) Le mode opératoire est identique à celui de l'exemple 1 en enrichissant le milieu de base avec 15g/l d'acétate de sodium et 20g/l d'extrait de levure. Dans le tableau ci-dessous, sont consignés les pourcentages de dégradation du VX par les différentes bactéries testées. Micro-organismes % de dégradation du VX après 7 jours d'incubation Bacillus globigii 77.17 76,23 Bacillus sphaencus ATCC 12123 92,6 Bacillus sphaericus ATCC 12300 96,33 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 98,78 Corynebacterium glutamicum ATCC 13745 95,71 Pseudomonas fluorescens ATCC 6972 95,77 Pseudomonas putida ATCC 12842 93,42 Rhodococcus ruber DSM 43252 93,33 75 Escherichia coli HB 101 La teneur en oxygène influence la cinétique de dégradation du VX. Dans les cultures bactériennes le taux d'oxygène dissout mesuré diminue rapidement. Par comparaison avec les résultats précédents, un abiotique anaérobie ne présente pas de dégradation significative du VX. Au vu des résultats, on constate que le déméton est biotransformé, quelle que soit la source de carbone auxiliaire utilisée. Toutefois, la disparition du déméton-S-méthyle est nettement plus importante en présence d'acétate qu'en présence de glucose, le taux de disparition en présence de fumarate étant intermédiaire. Les résultats de cette étude confirment donc l'efficacité de l'emploi de l'acétate de sodium, dans divers milieux de culture, pour la production d'une biomasse bactérienne capable de dégrader un neurotoxique organophoshoré. REVENDICATIONS l-Procédé de transformation d'un composé organophosphoré toxique en composés dénués de toxicité à l'aide de microorganismes, caractérisé en ce qu'il consiste à faire agir sur ce composé organophosphoré, en solution, une ou plusieurs bactéries, en présence d'oxygène, dans un milieu de culture inhibant la répression catabolique qui se produit en présence de glucose. 2-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé toxique est le O-éthyl, S-2 (diisopropylaminoéthyl )méthylthiolophosphonate, dénommé VX. 3-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé organophosphoré toxique est le O,O-diméthyl, S-t2- (éthylthio ) -éthyl J thiolophosphate, dénommé déméton. 4-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé organophosphoré est le 2-(O,O-diméthyldithiophosphate) succinate d'éthyle, dénommé malathion. 5-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient un sel d'acide organique. 6-Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le sel d'acide organique est un acétate. 7-Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le milieu de culture est enrichi en nutriments connus. 8-Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le milieu de culture contient de l'acétate de sodium, de l'extrait de levure et est tamponné à un pH de 7,5. 9-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie est choisie parmi Bacillus globigii, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Rhodococcus ruber, Escherichia coli.