Brevet FR2737412A1 — publié le 19970207

La présente invention a trait à un procédé de production d'un vaccin pour la prévention de l'encéphalite japonaise, à base de virus de l'encéphalite japonaise (JEV) inactivé, et notamment d'un vaccin utilisable chez l'homme. L'invention a également trait au vaccin obtenu par ce procédé. Le virus de l'encéphalite japonaise, dont le vecteur de transmission est un moustique, est la cause d'infections graves, dite encéphalites japonaises, dans de nombreux pays d'Extrême Orient ainsi que dans d'autres régions du monde. Les vaccins actuellement commercialisés contre le virus de l'encéphalite japonaise sont obtenus par des procédés consistant à injecter le virus JEV par voie intracrânienne chez le souriceau et à récupérer les tissus infectés. L'émulsion tissulaire que l'on obtient est ensuite purifiée, généralement par des méthodes de précipitation, notamment à la protamine.D'autres procédés de purification de ces préparations tissulaires ont également été proposées dans la littérature, tels que des procédés d'ultrafiltration, de filtration et centrifugation, ou de précipitation au polyéthylène glycol, ces étapes pouvant être combinées entre elles ou à des techniques de gel-filtration ou de chromatographie sur cellulose sulfate ou gel de polysaccharide sulfate réticulé (JP-B-65 000611, JP-A-53 133 627, JP-A50 048 118, JP-A-2 223 531, US-A-4 725 546, JP-A49 020 322 et B-81 005 204, JP-B-67 025 408). Les préparation virales sont inactivées par des agents classiques tels que le formol selon des procédures standardisées, à savoir inactivation de longue durée pendant cinquante à soixante jours à +4"C à une concentration de formol 1/2000, en raison de l'instabilité du virus aux températures plus élevées. Les vaccins du commerce ainsi inactivés sont efficaces mais difficiles et coûteux à préparer, purifier et inactiver. Des vaccins vivants atténués, obtenus par culture tissulaire, ont également été proposés par la littérature. I1 est donc souhaitable de pouvoir produire un vaccin inactivé par d'autres techniques de nature plus industrielle et notamment utilisant une culture de virus sur lignée cellulaire. Toutefois, la production d'un vaccin en grandes quantités, par des méthodes très industrialisées, est beaucoup plus difficile que dans le cas de la multiplication par voie intracrânienne, et ceci non seulement en raison des quantités importantes qui doivent être traitées, mais également des difficultés d'obtenir et de contrôler des rendements élevés, et des problèmes de purification posés par les contaminants qui sont alors rencontrés. On sait, par la littérature, que le virus de l'encéphalite japonaise est susceptible d'être propagé sur diverses cultures de cellules, y compris sur des cultures de lignées cellulaires, y compris les cellules Véro. Cependant les méthodes de culture qui ont été enseignées ne permettent pas d'obtenir des rendements satisfaisants dans des conditions de culture industrielle à grande échelle, qui seule permet une production à un coût raisonnable. Cette littérature ne permet pas non plus d'assurer une purification poussée des préparations virales provenant de ces cultures sur lignées cellulaires. Enfin, les méthodes d'inactivation actuellement connues sont fortement pénalisantes en délai et en coût. L'invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de production de vaccin inactivé contre l'encéphalite japonaise, qui puisse être mis en oeuvre à grande échelle, dans des conditions sûres, rapides, et économiques et qui permette d'obtenir un vaccin inactivé efficace et de pureté très élevée. L'invention a pour objet un procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise dans lequel on propage le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) sur la lignée cellulaire Véro, et l'on inactive la préparation virale à l'aide d'agents inactivants connus, notamment chimiques, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes, se succédant dans l'ordre de leur exposition - a. introduction dans une cuve de fermenteur contenant un milieu de culture et des particules de microporteurs, d'un inoculum de cellules Véro, - b. croissance cellulaire desdites cellules dans ledit fermenteur, - c. inoculation de la culture de cellules Véro sur lesdits microporteurs dans un milieu de culture par le virus JEV, avec une quantité de virus correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) inférieure à 0,1 et, de préférence comprise entre 0,1 et 0,001, le milieu de culture ayant, à ce stade, une teneur en protéines, de préférence de l'albumine humaine, inférieure à 5 g/l et de préférence supérieure à 0,1 g/l., - d. culture de multiplication virale dans le fermenteur, et récoltes successives des milieux de culture contenant le virus après chacune desdites cultures, un nouveau milieu de culture étant ajouté aux microporteurs portant les cellules Véro après chaque récolte, le nombre de récoltes étant supérieur à 1, de préférence supérieur à 3, et notamment de préférence compris entre 4 et 6, - e. inactivation à température non froide pendant une courte durée ne dépassant pas, de préférence, 15 jours, - f. purification de la préparation inactivée par chromatographie d'échange d'ions, - g. purification de la préparation purifiée par l'étape précédente, par chromatographie d'adsorption, - h. purification de la préparation purifiée par l'étape précédente, par perméation de gel, - i. récolte des virus inactivés et purifiés avant utilisation, stockage ou conditionnement. Le procédé de production permet ainsi d'obtenir des quantités très importantes d'un vaccin inactivé, très purifié et efficace, et ceci avec un rendement industriellement élevé. On peut ainsi obtenir un nombre important de récoltes à partir d'un même fermenteur sans changer les cellules Véro. On peut facilement obtenir jusqu'à six récoltes consécutives. L'invention a également pour objet un tel vaccin, ce vaccin ayant de préférence, à la sortie de la dernière purification, une teneur en protéines qui n'est pas supérieure à 30 pg/ml et une teneur en ADN cellulaire qui n'est pas supérieure à 200 pg/gl, et de préférence à 100 pg/ml. Les durées, températures et autres conditions de culture, et notamment la composition des milieux de culture, peuvent être facilement déterminées par l'homme de l'art qui connaît les conditions de multiplication des cellules Véro, y compris sur microsupport, et les principes généraux de la propagation virale sur les lignées Véro. Ainsi, par exemple, l'étape a. peut comporter une culture d'environ quatre jours permettant la croissance cellulaire, le milieu de culture étant de préférence ensuite changé. Les microsupports permettant la culture en suspension dans le fermenteur peuvent être différents microsupports déjà connus pour la culture de cellules Véro en fermenteur. Parmi ceux-ci, on peut citer les particules Cytodex à une concentration de un à trois grammes par litre de milieu de culture. On peut, grâce à l'invention, procéder à des cultures industrielles dans des fermenteurs de grand volume, par exemple des fermenteurs de 500 à 1 000 1. Par contre il est important de respecter la faible valeur de la multiplicité d'infection (multiplicity of infections : MOI), c'est-à-dire le rapport de la quantité de particules virales à la quantité de cellules présentes. De préférence, cette multiplicité d'infection est inférieure à 0,1 g/l. De même, il est important que les milieux de culture, successivement utilisés pour les différentes étapes successives de propagation virale aboutissant chacune à une récolte du milieu, contiennent des protéines en faibles quantités, de préférence inférieure à 3 g/l. De préférence la protéine présente dans le milieu est essentiellement de l'albumine humaine. La durée de chacune des cultures aboutissant à une récolte peut être déterminée par la surveillance du titre infectieux dans le milieu. De préférence, le prélèvement s'effectue lorsque le titre LD 50/ml est de l'ordre de 7 ou 8. Ceci peut être généralement obtenu par des durées de culture de deux à trois jours, et de préférence une première culture de trois jours après l'inoculation virale, puis des durées de culture de deux jours entre deux récoltes consécutives. Ainsi, un cycle complet dans un fermenteur peut avoir une durée de l'ordre de 18 jours qui peuvent être répartis, par exemple, de la façon suivante - JO démarrage de la culture de cellules Véro sur les microsupports dans les fermenteurs, - J4 remplacement du milieu de culture et inoculation de la quantité initiale de virus, - J7 première récolte, - J9 seconde récolte, - J11 troisième récolte, - J14 quatrième récolte, - J16 cinquième récolte, - J18 sixième récolte. Conformément à l'invention, l'inactivation, au moins dans sa plus grande partie, est menée à une température non froide. Par température non froide, on entend une température largement supérieure à la température habituelle de +4"C utilisée classiquement pour l'inactivation du virus JEV. Cette température peut avantageusement être comprise entre 20 et 37"C et on préfère des températures de l'ordre de 25"C. L'inactivation se produit rapidement à cette température et on a constaté que le virus, contenu dans son milieu de culture concentré, est extrêmement stable malgré la température élevée. Bien entendu, on peut avantageusement procéder préalablement à la filtration de chaque récolte afin d'éliminer les débris cellulaires (protéines, acides nucléiques...). De façon avantageuse, on concentre la récolte de façon à augmenter le titre en virus et la teneur en protéines du milieu liquide. Le facteur de concentration est de préférence au moins égal à 10 et, par exemple, de l'ordre de 1000. La concentration peut être effectuée par les moyens habituels et notamment ultrafiltration. De préférence, l'inactivation est effectuée à l'aide de formol ou de bétapropiolactone. Par exemple, l'inactivation à l'aide de formol peut être effectuée à 25 ou à 37"C et pendant une durée de l'ordre de quatorze jours ou moins. De préférence, la durée sera au moins égale à 7 jours. De façon avantageuse, la concentration de formol utilisé peut être même inférieure à celle classiquement utilisée dans l'inactivation du virus JEV, et elle peut être par exemple de l'ordre de 1/2000 à 1/8000 et notamment de 1/4000. L'inactivation à la bétapropiolactone, de préférence également à une concentration faible, de l'ordre de 1/4000, par exemple, peut être effectuée pendant une durée de quelques heures, de préférence 2 heures 30 minutes à +37 C. On peut aussi procéder successivement à ces deux inactivations. L'étape f. de purification par chromatographie d'échange d'ions est de préférence une chromatographie sur échangeur d'anions faibles ou forts. Le support peut être, et ceci de façon non limitative, par exemple du DEAE-Sphérodex (vendu par BioSepra, USA). Le support de chromatographie et d'échange d'ions retient sélectivement les particules virales et laisse passer l'essentiel des protéines contaminantes. L'étape g. de chromatographie d'adsorption peut être effectuée de préférence sur des supports, tels que l'hydroxyapatite ou les gels chélatants (cuivre, calcium). Le virus ne se lie pas au gel et est récupéré dans la fraction non fixée. L'étape h. de gel filtration ou tamisage moléculaire peut être effectuée sur des supports appropriés tels que, par exemple Sépharose 6FF, ou Fractogel. L'élution permet de récupérer les particules virales dans la première fraction, le pic suivant contenant des protéines virales qui ne sont pas utilisées, les impuretés résiduelles étant éluées ensuite. De façon avantageuse, on peut procéder à une concentration, de préférence par ultra filtration, entre l'étape g. et l'étape h., par exemple avec une membrane d'un seuil de coupure de 10 000 daltons. Le vaccin inactivé, purifié obtenu peut finalement être conditionné stérilement de façon classique, ou encore lyophilisé. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. 1. Matériels. - cellules Véro : les cellules Véro utilisées pour inoculer le fermenteur proviennent d'une banque cellulaire Véro au 137ème passage, banque ayant subi tous les contrôles nécessaires à sa caractérisation et à sa qualification observation de quatorze jours, hémadsorption sur hématies, test d'identité (Iso Enzyme), contrôle sur le surnageant, test stérilité, test mycoplasme, test mycoplasma hyorhinis, sous-culture sur cellules Véro, sous-culture sur cellules diploïdes humaines, sous-culture sur cellules PMK. - Le virus JEV La souche virale utilisée dans l'expérience est fournie par le NVSI (National Vaccin and Serum Institut, Beijing), souche P3 au 88ème passage mais le procédé décrit ci-dessous peut être mis en oeuvre de façon identique avec toute autre souche immunogène connue de JEV, par exemple les souches Nakayama ou Beijing ou toute souche publiquement disponible, y compris les souches prélevables sur les malades. Une ampoule de virus reçue est mise en suspension dans 100 ml de milieu et filtrée à l'aide d'un filtre 0,1 micromètres. La solution est utilisée pour infecter deux flacons en T de 75 cm3. Cinq jours après, le surnageant recueilli est filtré (diamètre de pore : 0,2 tm). Plusieurs récoltes ont été faites et le pool formant le lot maître présente un titre LD 50/ml = 8,16. On prépare le lot de travail à raison de 10 ml de lot maître pour infecter 12 flacons portatifs de 850 cm3. Plusieurs récoltes peuvent être effectuées et le pool de 30,2 litres titre LD 50/ml = 8,31. Les tests effectués sur le lot de travail sont test de stérilité, . test mycoplasme, . test mycoplasma hyorhinis, . détermination de titre infectieux, test d'identité, contrôle de stérilité virale sur cobaye et sur oeufs (cavité allantoïdienne), . test sur cellules Véro, MRC5, PMK, test de recherche de transcriptase réverse, test de recherche de virus murins. 2. Procédé de culture . a. On remplit la cuve d'un fermenteur de 500 1, avec un milieu de culture usuel pour cellules Vero contenant des microsupports Cytodex à une concentration de 1 à 3 g/l. On ensemence le milieu par un inoculum de cellules Véro (200 000 cellules Véro/ml). b. On laisse les cellules se fixer et croître pendant quatre jours. A la fin des quatre jours, le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture neuf. c. Un inoculum de virus est introduit dans la cuve avec une quantité de virus calculée pour avoir une multiplicité d'infection MOI égale à 0,01. Les différentes cultures sont effectuées à la température de 37"C. Trois jours après l'inoculation virale, on recueille le milieu de culture qui fournit la première récolte. Le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture neuf et une nouvelle récolte du milieu de culture est effectuée tous les deux jours, le nombre total de récoltes étant égal à six. Le tableau I montre les titres obtenus à chaque récolte. Tableau I Récoltes R1 R2 R3 R4 R5 R6 n Jours après 3 5 7 10 12 14 infection Titre 8,4 8,4 8,5 8,1 8,2 7,3 LD 50/ml Les récoltes sont filtrées sur filtre membrane (diamètre de pore 0,1 ou 0,2 pm). L'ensemble des récoltes est mélangé pour former un pool. e. La récolte est concentrée d'un facteur 100 par ultrafiltration sur membrane 10 000 dalton. On ajoute une solution de formaldéhyde à une concentration finale de 1/4000 et on maintient à température ambiante (de 20 à 25"C) sous agitation continue pendant 14 jours. On procède ensuite à une nouvelle filtration et l'on procède au contrôle de vérification de l'inactivation. A la place de cette procédure d'inactivation, on peut procéder à une inactivation par la bétapropiolactone à une concentration de 1/4000, suivie d'un stockage à +4"C sous agitation permanente pendant 24 h. On procède ensuite à un chauffage de 2h30min à +37 C puis on contrôle l'inactivation. Le contrôle d'inactivation peut être effectué sur des souriceaux nouveaux-nés. Le contrôle de l'activité après inactivation est fait par immunisation de souris par le protocole WHO. La première injection de virus inactivé est faite sur des souris de quatre semaines et la seconde, une semaine plus tard. Le sang est ensuite contrôlé pour des essais de séroneutralisation et les souris sont soumises à une épreuve par le virus infectieux. Toutes les préparations inactivées par le formaldéhyde se sont montrées satisfaisantes et l'efficacité d'inactivation du formaldéhyde apparaît meilleure que celle de la bétapropiolactone. f. La solution inactivée est passée sur une colonne chromatographique d'échange d'ions à groupements DEAE, par exemple la résine DEAE-Sphérodex. Le virus se lie à la colonne. Après lavage, le virus est élué par un tampon phosphate hyperosmotique. Au moins 90 % des contaminants protéines sont ainsi éliminés. g. L'éluat est purifié par affinité de chélation par interaction calcique en injectant l'éluat à travers une colonne de Chelatine Sepharose (Pharmacia). Le virus n'est pas fixé sur le gel et son élution se réalise pendant le chargement et le rincage de la colonne, dans la fractions non fixée. On procède ensuite à une concentration par ultrafiltration sur des membranes de seuil de coupure de 10 000 Da pour réduire le volume de la suspension virale d'un facteur d'environ 20. h. La solution concentrée de virus prépurifié est introduite dans une colonne de Sepharose 6FF. On procède à une élution par un tampon phosphate hyperosmotique. Les particules virales se trouvent éluées dans la première fraction. Les protéines virales suivent dans la fraction suivante et les impuretés résiduelles sont éluées ultérieurement. Les caractéristiques du procédé de purification figurent sur le tableau II. Tableau II étape DEAE Chélation Gel filtration protéines résiduelles 50 % 100 % 0,4 % teneur en DNA (pg/ml) Virus récupéré (ELISA E 90 % 76 % 20 % protéine) (Rendements étape par étape) La solution virale inactivée purifiée a été utilisée pour immuniser des souris par injection au jour 0 puis au jour 7. L'épreuve par le virus virulant est effectuée à l'aide d'une solution à 105 LD 50/ml au jour 30. Toutes les souris vaccinées par la préparation purifiée non diluée et par la préparation purifiée diluée ou 1/32 ont été protégées. Dans le même test, les souris vaccinées par le vaccin Biken (dilution 1/32) ont été éprouvées et seuls les 2/5 ont été protégées. 3. Formulation finale du vaccin. La solution virale inactivée purifiée est diluée pour ajuster le titre antigénique, réparti en flacons multidose ou dose individuelle puis lyophilisé. REVENDICATIONS 1. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise dans lequel on propage le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) sur la lignée cellulaire Véro, et l'on inactive la préparation virale à l'aide d'agents inactivants connus, notamment chimiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes - a. introduction dans une cuve de fermenteur contenant un milieu de culture et des particules de microporteurs, d'un inoculum de cellules Véro, - b. croissance cellulaire desdites cellules dans ledit fermenteur, - c. inoculation de la culture de cellules Véro sur lesdits microporteurs dans un milieu de culture par le virus JEV, avec une quantité de virus correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) inférieure à 0,1, ledit milieu de culture ayant, à ce stade, une teneur en protéines comprise entre 0,1 et 5 g/l, - d. culture de multiplication virale dans le fermenteur, et récoltes successives des milieux de culture contenant le virus après chacune desdites cultures, un nouveau milieu de culture étant ajouté aux microporteurs portant les cellules Véro après chaque récolte, le nombre de récoltes étant supérieur à 1, de préférence supérieur à 3, et notamment de préférence compris entre 4 et 6, - e. inactivation à température non froide pendant une courte durée ne dépassant pas, de préférence, 15 jours, - f. purification de la préparation inactivée par chromatographie d'échange d'ions, - g. purification de la préparation purifiée par l'étape précédente, par chromatographie d'adsorption, - h. purification de la préparation purifiée par l'étape précédente, par perméation de gel, - i. récolte des virus inactivés et purifiés avant utilisation, stockage ou conditionnement. 2. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fermenteurs contenant le milieu de culture sont des fermenteurs de grand volume, par exemple des fermenteurs de 500 à 1 000 1. 3. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu utilisé à l'étape a. comprend une culture d'environ quatre jours permettant la croissance cellulaire, le milieu de culture étant de préférence ensuite changé. 4. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microsupports permettant la culture en suspens ion dans le fermenteur peuvent être différents microsupports pour la culture de cellules Véro en fermenteur, notamment les particules Cytodex à une concentration de 1 à 3 g/l de milieu de culture. 5. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape c., la multiplicité d'infection est comprise entre 0,01 et 0,1. 6. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape c., la protéine présente dans le milieu est de l'albumine humaine. 7. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de chacune des cultures est déterminée par la surveillance du titre infectieux dans le milieu. 8. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1 ou 7, caractérisé en ce que le prélèvement s'effectue lorsque le titre LD 50/ml est de l'ordre de 7 ou 8. 9. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inactivation, au moins dans sa plus grande partie, est menée à une température non froide, c'est-à-dire largement supérieure à +4OC. 10. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1 ou 9, caractérisé en ce que l'inactivation est effectuée à une température comprise entre 20 et 37"C, de préférence de l'ordre de 25"C. 11. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1, 9 ou 10, caractérisé en ce que l'inactivation est effectuée à l'aide de formol ou/et de bétapropiolactone. 12. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1, 9, 10 ou 11, caractérisé en ce que l'inactivation à l'aide de formol est effectuée pendant une durée de l'ordre de quatorze jours ou moins, de préférence ladite durée sera au moins égale à 7 jours, à une concentration en formol de l'ordre de 1/2000 à 1/8000 et à une température de 25 à 37"C. 13. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1 ou 9, 10 ou 11 caractérisé en ce que l'inactivation à la bétapropiolactone est effectuée à une concentration de l'ordre de 1/2000 à 1/8000, pendant une durée de quelques heures, de préférence 2h30 à une température de 37"C. 14. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que la chromatographie de purification de l'étape f. est une chromatographie sur échangeur d'anions, notamment un support DEAE-Sphérodex. 15. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape g. de chromatographie d'adsorption est effectuée sur des supports, tels que l'hydroxyapatite ou les gels chélatants (cuivre, calcium). 16. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape h. de gel filtration ou tamisage moléculaire est effectuée sur des supports appropriés, tels que le Sépharose 6FF. 17. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 1, 15 ou 16, caractérisé en ce qu'on procède à une concentration, de préférence par ultrafiltration, entre l'étape g. et l'étape h., par exemple avec une membrane d'un seuil de coupure de 10 000 daltons. 18. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'entre l'étape d. et l'étape e., on procède à une filtration de chaque récolte. 19. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on concentre la récolte de façon à augmenter le titre en virus et la teneur en protéines du milieu liquide. 20. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon la revendication 19, caractérisé en ce que le facteur de concentration est de préférence au moins égal à 10 et, par exemple, de l'ordre de 1000. 21. Procédé de production industrielle de vaccin contre l'encéphalite japonaise selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que la concentration est effectuée par ultrafiltration. 22. Vaccin inactivé purifié contre l'encéphalite japonaise caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé selon l'une des revendications 1 à 21. 23. Vaccin inactivé et purifié selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'à la sortie de la dernière purification, sa teneur en ADN cellulaire n'est pas supérieure à 200 pg/ml. 24. Vaccin inactivé et purifié selon l'une des revendications 22 ou 23 caractérisé en ce qu'il est conditionné stérilement ou encore lyophilisé.