Brevet FR2745008A1 — publié le 19970822

RECENSEUR NUCLEAIRE DE GLUCOCORTICOIDES NIODI FI E, PROTEINE DE FUSION, FRAGNIENTS D'ADN CODANT POUR LEDIT ACCEPTEUR El. LADITE PROTEINE DE FUSION, VECTEURS, CELLULES ET ANINIAUX EN CONIPRENANT ET PROCEDES DANS LESQUEIS ILS SON @ NIIS EN OEUVRE La présente invention concerne un fragment d'ADN codant pour un récepteur nucléaire de glucocorticoïdes (GR) modifié, et un fragment d'ADN codant pour un domaine de liaison du ligand (LBD) dudit récepteur, ainsi qu'un fragment d'ADN codant pour une protéine de fusion comportant ledit récepteur ou ledit domaine de liaison du ligand dudit récepteur fusionné à une protéine dont l'activité est induite en présence de ligands glucocorticoïdes. La présente invention concerne également un récepteur nucléaire de glucocorticoïdes modifié, notamment le récepteur humain et son domaine de liaison du ligand modifié, ainsi qu'une protéine de fusion comportant ledit récepteur ou ledit domaine de liaison du ligand. La présente invention concerne également un vecteur d'expression conditionnelle d'une protéine, notamment une protéine étrangère dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment des cellules de mammifères. La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'expression d'une protéine dans lesdites cellules. Par ailleurs, la présente invention concerne un procédé d'excision, insertion, inversion, ou translocation conditionnelle d'un fragment d'ADN dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment de mammifères. La présente invention concerne en outre un vecteur de transfert d'un fragment d'ADN dans lesdites cellules hôtes humaines ou animales, notamment de mammifères, et son utilisation comme médicament, comme outil d'analyse et étude du fonctionnement d'un gène ainsi qu'une méthode de traitement de cellules ex vivo ou in vitro. Enfin, la présente invention concerne les cellules humaines ou animales transfectées par un vecteur d'expression et/ou de transfert selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques qui en dérivent. Le récepteur des glucocorticoïdes (GR) est une protéine régulatrice de transcription de gènes qui médie l'action des glucocorticoïdes dans les cellules cibles. Le GR et d'autres membres de la superfamille des récepteurs nucléaires (facteurs de transcription activés par des ligands) présentent une structure modulaire commune. I.a région N-terminale variable contient l'activité de transactivation constitutive AF-i. Le domaine central de liaison à l'ADN (DBD) est hautement conservé entre les différentes espèces et permet la liaison du récepteur à son élément de réponse ADN apparenté (GRE dans le cas du GR). Le domaine de liaison du ligand (LBD), localisé dans la région C-terminale du GR, non seulement fixe le ligand, mais également comporte de multiples activités distinctes une surface pour l'interaction avec hsp90 et une surface distincte pour l'homodimérisation, un signal de localisation nucléaire et une fonction de transactivation AF-2 dépendant du ligand (pour les articles de synthèse et références, voir (1-5)). Le domaine LBD est fortement conservé entre les différentes espèces. Une fonction de transactivation AF-2 a été identifié dans la partie C-terminale de divers LBD (6-1 O). L'intégrité de la partie centrale de la région contenant AF-2 est requise pour l'activation de transcription, dépendante de ligand, par les récepteurs nucléaires correspondants, et pour l'interaction, entre cette région et des facteurs intermédiaires transcriptionnels apparentés (TIF, également dénommés co-activateurs ou médiateurs) (11-19).Il a été proposé un modèle général (19) dans lequel la liaison du ligand induit un changement conformationnel du domaine de liaison du ligand en faisant intervenir en particulier la région C-terminale hébergeant la partie centrale de AF-2, en engendrant ainsi une surface pour une interaction efficace avec les TIF. Les LBD des récepteurs nucléaires contiennent des régions conservées possédant une structure canonique en hélice. Ces données structurales ont permis d'effectuer un alignement commun pour les 113D de tous les récepteurs nucléaires. L'hélice 1-112 contient la fonction de transactivation AF-2 (19).Les acides aminés des hélices Hll et 1112, notamment des récepteurs des glucocorticoïdes de différentes espèces telles que l'homme, le rat, la souris et le xénope, sont conservés. Plusieurs mutations dans le LBD de GR ont été décrites précédemment. On peut distinguer deux types majeurs de mutations - le premier type consiste en mutations qui affectent positivement ou négativement l'affinité de liaison au ligand. Par exemple, les remplacements du résidu cystéine G5G par la glycine dans le GR de rat (20) et du résidu méthionine 5G5 par l'arginine ou du résidu alanine 573 par la glutamine dans le GR humain (hOR)(21) augmentent l'affinité de liaison au ligand et conduisent à un décalage de la courbe de réponse en fonction de la dose pour la transactivation en direction des plus basses concentrations de ligand.Ces mutants sont par conséquent désignés par "super GR". De me me, on a rapporté des mutants ayant une affinité de liaison au ligand plus faible (21-24). Les mutations de LBD qui décalent la courbe de réponse en fonction de la dose de ligand en direction des plus hautes concentrations de ligand, résultent d'une affinité altérée de liaison de l'hormone (25-26); - le second groupe de mutants LBD comprend ceux affectant la fonction d'activation transcriptionnelle (AF-2), sans altérer la liaison au ligand. Comme exemples, on peut citer des mutations dans la région contenant AF-2 qui sont liées à une perte ou une diminution du potentiel de transactivation, mais n'affectent pas l'affinité de liaison au ligand (6-10). La fusion du domaine de liaison du ligand (LBD) de récepteurs nucléaires à des protéines hétérologues a permis de controler, dans de nombreux cas, I'activité de ces dernières. Les activités de Níyc, c-Abl, Src, erbB1, Raf, E1A Cre et FLP, peuvent étre modulées en réalisant des protéines de fusion avec le LBD de récepteurs nucléaires (27-29). Cependant, les ligands de ces récepteurs sont présents dans de nombreux systèmes biologiques, pouvant ainsi induire un niveau d'activité basal. Pour éviter de tels problèmes, un LBD muté du récepteur des oestrogènes (RE), a été fusionné à la protéine c-Nlyc (30), ou aux recombinases Cre et FLP (28 et 29). Les recombinases de la famille des intégrases x catalysent l'excision, I'insertion, I'inversion ou la translocation de fragments d'ADN au niveau de sites spécifiques de reconnaissance desdites recombinases (31-36). Les recombinases sont actives dans les cellules animales (35). La recombinase Cre, une intégrase de 38 KDa du bactériophage P1, catalyse la recombinaison entre deux séquences d'ADN de 34 paires de bases appelées loxP en l'absence de cofacteurs (32, Figure 1). La position sur une ou plusieurs molécules d'ADN et l'orientation de sites loxP l'un par rapport à l'autre déterminent le ty'pe de fonction de la recombinase, excision, insertion, inversion ou translocation notamment, la recombinase Cre (figure 1). Ainsi l'activité recombinase de Cre est une inversion lorsque deux sites LoxP sont tête-bêche sur un même fragment d'ADN et une excision, lorsque les sites LoxP sont en répétition directe sur un même fragment d'ADN. L'activité de la recombinase est une insertion lorsqu'un site loxP est présent sur un fragment d'ADN, une molécule d'ADN telle qu'un plasmide contenant un site loxP pouvant être insérée au niveau dudit site loxP (figure 1).La recombinase Cre peut également induire une translocation entre deux chromosomes à condition qu'un site loxP soit présent sur chacun d'eux (37) (figure 1). De manière plus générale, la recombinase Cre est donc capable d'induire la recombinaison entre une ou plusieurs molécules d'ADN différentes, à condition qu'elles soient porteuses de sites loxP. De même la recombinase FLP, une recombinase de 43 KDa de Saccharomvces cerevisiae, est capable du même type d'action sur les fragments d'ADN contenant des sites de reconnaissance FRT (34). En réalisant une protéine de fusion (chimère) entre la recombinase Cre et la région C-terminale du récepteur humain des oestrogènes contenant une Valine en position 400, on obtint une molécule capable d'exciser, en présence du ligand du récepteur, l'oestradiol, les séquences d'ADN localisées entre deux sites loxP, ainsi qu'un des sites loxP, lorsque ceux-ci sont en répétition directe, alors qu'en absence de ligand, l'excision n'a pas lieu (28). L'activité de la recombinase FLP est également régulable, en réalisant des chimères entre la FLP et le domaine de liaison de récepteurs nucléaires. En fusionnant la I:LI' avec le LBD du récepteur des oestrogènes ou du récepteur des glucocorticoïdes en l'absence de ligand, l'activité recombinase est très faible, alors qu'elle est rapidement induite par les ligands respectifs des LBD (29). Toutefois, I'utilisation de protéines de fusion entre des recombinases et des LBD de récepteurs nucléaires pour exciser de façon contrôlée des fragments d'ADN situés entre des sites de reconnaissance desdites recombinases peut poser problème, étant donné que les concentrations de ligand présentes chez l'animal ou dans les milieux de culture des cellules peuvent être suffisantes pour induire au moins partiellement, l'activité recombinase. La présente invention fournit un système de recombinaison inductible chez les animaux, notamment les mammifères, grâce à l'utilisation d'une protéine de fusion réalisée entre une recombinase, et le domaine de liaison du ligand, dérivé du récepteur des glucocorticoïdes, dont l'activité est inductible par des glucocorticoides synthétiques, mais pas par des glucocorticoides naturels notamment à des concentrations inférieures à 10-6 NI c'est-à-dire physiologiques. Pour éviter l'induction de l'activité recombinase de la protéine chimère par les ligands endogènes, la présente invention se propose de fournir en effet une mutation dans le LBD du récepteur des glucocorticoïdes lui permettant d'être plus fortement activé en présence de ligands glucocorticoïdes synthéthiques, qu en présence de ligands glucocorticoïdes naturels aux concentrations physiologiques La présente invention a en effet pour objet un récepteur nucléaire des glucocorticoides modifié, notamment muté dans la région du domaine de liaison du ligand, de sorte que l'activité dudit récepteur est inductible plus fortement par un ligand glucocorticoïde synthétique que par un ligand glucocorticoïde naturel. Selon la présente invention on entend par "récepteur (muté) des glucocorticoïdes inductible plus fortement par un ligand glucocorticoïde synthétique que par un ligand glucocorticoïde naturel" que l'activité du récepteur muté selon l'invention est induite plus fortement par des ligands glucocorticoïdes synthétiques que par des ligands glucocorticoïdes naturels à une concentration donnée et que le récepteur muté des glucocorticoïdes selon l'invention est beaucoup moins sensible aux glucocorticoïdes naturels que le récepteur sauvage. Par "activité dudit récepteur" on entend ici l'activité transcriptionnelle dudit récepteur et/ou le cas échéant l'activité de régulation de l'activité d'une protéine fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand, induite en présence de glucocorticoides. On cite plus particulièrement l'activité d'une protéine recombinase fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand dudit récepteur. Par "glucocorticoïdes naturels", on entend ici des hormones stéroïdes sécrétées par le cortex des glandes surrenales telles que le cortisol, la corticostérone, ou l'aldostérone. Par "glucocorticoïdes synthétiques", on entend des agonistes de synthèse chimique dudit récepteur pour l'activité concernée. On cite parmi ceux-ci, la dexamethasone, le triamcinolone acetonide, le RU 486, le RU 28362, le bimedrazol, le fluocinolone acetonide. Certains ligands synthétiques seront agonistes pour induire unedite activité particulière du récepteur et antagonistes par rapport à une autre activité du récepteur. Ainsi, le composé RU 48G induit l'activité d'une protéine recombinase fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand du récepteur mais n'induit pas l'activité transcriptionnelle du récepteur. Le ligand glucocorticoïde synthéthique peut se lier au récepteur nucléaire sauvage (non muté), mais il se peut que ledit ligand synthétique se lie au récepteur muté et pas au récepteur naturel. II se peut aussi que si ledit ligand synthétique se lie au récepteur sauvage, I'activité de celui-ci ne soit néanmoins pas induite par liaison au ligand s'nthétique. On a en particulier, identifié une mutation dans le domaine LBD des récepteurs nucléaires des glucocorticoïdes (isoleucine -- > thréonine) située entre les hélices Il 1 1 et H12 (19). Cette mutation entraille une perte d'activité du récepteur en présence de glucocorticoïdes naturels. Plus précisément, ce récepteur des glucocorticoïdes muté entre H11 et 1-112 n'a pas ou très peu d'activité transcriptionnelle en présence de glucocorticoïdes naturels aux concentrations physiologiques naturelles de ceux-ci notamment des concentrations inférieures à 10-6 M. Son activité peut cependant être induite par des ligands glucocorticoïdes synthétiques, notamment la dexamethasone (dex). La présente invention a plus particulièrement pour objet un récepteur humain muté appelé hGR (1747/T) caractérisé en ce qu'il a pour séquence, la séquence en acides aminés du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes sauvage avec une mutation isoleucine -- > thréonine en position 747, et plus particulièrement encore un récepteur nucléaire humain modifié qui a pour séquence en acides aminés, une séquence substantiellement telle que représentée dans L'IDES n 1. La mutation de l'isoleucine 717 en thréonine dans la partie Cterminale du domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur des glucocorticoïdes altère la capacité des ligands naturels à en induire l'activité de transactivation. Les glucocorticoïdes naturels tels que le cortisol, l'aldostérone ou la corticostérone sont très faiblement actifs ou totalement inactifs avec le mutant GR (1747/T), tandis que des glucocorticoïdes synthétiques tels que la dexaméthasone (Dex) stimulent efficacement la transactivation médiée par GR (1747/T). Toutefois, la courbe correspondante de réponse en fonction de la dose de ligand, pour la transactivation induite par Dex, est décalée vers les plus fortes concentrations, par comparaison avec celle obtenue avec le GR de type sauvage (TS).Ni le décalage, ni l'inaptitude du cortisol à activer efficacement GR (1717/T) ne sont dûs à une affinité altérée de liaison au ligand in vitro. En effet, la mutation dans le LBD de GR (1747/T) n'altère pas sensiblement l'affinité de liaison au ligand in vitro. Toutefois, ce mutant présente un important décalage par rapport au Gll ZIZIS dc la courbe d'activité vers les fortes concentrations de ligands. Aussi des concentrations dites physiologiques de ligands glucocorticoides naturels suffisantes pour activer Ic GR IS, n'entraînent qu'une activité résiduelle ou nulle chez le GR mutant. Ce mutant diffère des autres mutants de LBD dc GR décrits précédemment (22, 38), dont la fonction d'activation altérée est cn étroite corrélation avec une modification de leurs propriétés de liaison au ligand in vitro. La présente invention a aussi pour objet un domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire de glucocorticoïdes selon l'invention et particulièrement, le domaine LBD [GR(1747/T)] caractérisé en ce qu'il a une mutation isoleucine -- > thréonine entre les hélices H11 @ et H12. Plus particulièrement il a pour séquence, la séquence cn acides aminés du domaine de liaison du ligand du récepteur des glucocorticoïdes humain substantiellement telle que représentée dans l'IDS n 1 dc l'acide aminé 532 à l'acide aminé 777 avec une mutation isoleucine -- > thréonine en position 747. La présente invention fournit également un fragment d'ADN codant pour un récepteur nucléaire de glucocorticoïdes modifié, notamment muté dans la région du domaine de liaison du ligand (LBD) selon l'invention, ainsi qu'un fragment d'ADN codant pour un domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur modifié selon l'invention. La présente invention a donc plus précisément pour objet un fragment d'ADN codant pour un récepteur nucléaire des glucocorticoïdes sauvage avec une mutation de l'isoleucine en thréonine située entre les hélices 1111 et H12 de la séquence d'acides aminés dudit récepteur, et plus particulièrement encore un fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codante du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes dont la séquence en acides aminés est substantiellement telle que représentée dans L'IDES n 1. Dans un mode de réalisation, la présente invention a pour objet un fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, la séquence de l'ADNc du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes substantiellement telle que représentée dans l'IDS n 1 comportant le codon ACC codant pour la thréonine en position 747 de la séquence d'acides aminés dudit récepteur. De méme la présente invention a pour objet un fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes modifié avec une mutation isoleucine -- > thréonine située entre les hélices 1111 et 1-112 et notamment en position correspondant à la position 747 de la séquence en acides aminés du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes. Plus particulièrement, la présente invention fournit un fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes modifié, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codant pour les acides aminés du domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes dont la séquence en acides aminés est substantiellement telle que représentée dans L'IDES n" 1 de l'acide aminé 532 à l'acide aminé 777. Plus particulièrement encore, la présente invention fournit un fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, la séquence d'ADNc codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes substantiellement telle que représentée dans L'IDES n" 1 du codon 532 au codon 777 avec le codon ACC en position 747. La présente invention a en outre pour objet un système vectoriel d'expression conditionnelle d'une protéine notamment une protéine étrangère dans des cellules hôtes comportant un élément de contrôle de la transcription inductible par un complexe forme par un récepteur nucléaire des glucocorticoides et un ligand, caractérisé en ce qu'il comprend - un premier fragment d'ADN consistant en un fragment d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans lesdites cellules hôtes, lesdits éléments assurant son expression comprenant une séquence de contrôle de transcription (RE) inductible par le récepteur selon l'invention complexé à un ligand glucocorticoïde synthétique, et - un deuxième fragment d'ADN consistant cn un fragment d'ADN fonctionnel codant pour ledit récepteur selon l'invention ou seulement une partie dudit fragment comprenant la région qui reconnaît le ligand (LBD) selon l'invention, et la région de liaison à l'ADN (D13D) qui se fixe sur ladite séquence de contrôle de la transcription (RE). - lesdits premier et deuxième fragments d'ADN pouvant être portés par un même vecteur ou deux vecteurs séparément. Dans un mode de réalisation, le système vectoriel comporte l'ADNc codant pour: - la région LBD, représentée par des codons codant les acides aminés n" 532 à 777 dans L'IDES n" 1, et - la région DBD, représentée par des codons codant les acides aminés n" 421 à 487 dans L'IDES n 1. Certaines cellules ont du GR endogène qui peut étre activé par des ligands naturels et des ligands synthétiques. Si on veut activer un gène donné à volonté dans de telle cellules, sans qu'il puisse cotre activé par les ligands endogènes ni par les récepteurs endogènes, il faut que ce gène contienne un RE différent du GRE et utiliser un activateur chimérique comportant le DBD correspondant et un LBD muté selon l'invention. Ce gène pourra donc être activé par des ligands synthétiques, mais non par des ligands naturels. C'est pourquoi dans un mode de réalisation, on remplace le domaine de liaison à l'ADN (DBD) du récepteur des glucocorticoïdes par celui d'un autre transactivateur, notamment celui de la protéine de levure Gal 4 et on remplace la séquence de contrôle de transcription (RE) du récepteur des glucocortieoïdes par celle d'un autre transactivateur, notamment la séquence 17 mère (17m) reconnue par la protéine Gal4. La présente invention a donc également pour objet un procédé d'expression d'une protéine étrangère dans des cellules humaines ou animales notamment de mammifères, caractérisé cn ce que l'on cultive des cellules qui contiennent un système vectoriel d'expression selon l'invention, et en ce qu'on ajoute ledit ligand synthétique, dans le milieu dc culture, puis on récupère la protéine synthétisée. Les ligands glucocorticoïdes synthétiques diffusent librement dans les cellules lorsqu'ils ajoutés dans le milieu de culture ou injectés dans un animal. Dans ce procédé on utilisera en particulier un ligand synthétique choisi parmi la dexaméthasone, le triamcinolone acétonide le RU2836, le bimétrazole, le déacylcortivazol et le fluocinolone acetonide. La présente invention a en outre pour objet une protéine de fusion comprenant un récepteur selon l'invention ou un domaine de liaison du ligand selon l'invention et une protéine dont l'activité est inductible plus fortement par liaison dudit récepteur ou dudit domaine de liaison du ligand (LBD) dudit récepteur avec undit ligand glucocorticoïde synthétique qu'avec un ligand glucocorticoïde naturel. En particulier, la présente invention a pour objet une protéine de fusion qui comprend une protéine recombinase et plus particulièrement de la famille des intégrases X et plus particulièrement encore, la protéine Cre du bactériophage PI. Dans un mode de réalisation, la protéine de fusion comporte la partie C-terminale de la région charnière D du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes, intercalée entre la protéine Cre et ledit domaine de liaison du ligand du récepteur modifié selon l'invention. L'activité recombinase proprement dite de la protéine de fusion est similaire à celle de Crc. Ellc permet donc, comme Cre, d'exciser ou d'inverser des séquences d'ADN localisées entre des sites loxP, d'insérer un plasmide contenant un site loxI > au niveau d'un site loxP localisé dans le génome, ou d'effectuer une translocation entre deux chromosomes contenant chacun un site loup. La présente invention a également pour objet un gène de fusion codant pour la protéine dc fusion selon l'invention comprenant un fragment d'ADN codant pour un récepteur nucléaire de glucocorticoïdes modifié ou un domaine de liaison du ligand dudit récepteur selon l'invention, ainsi qu'un fragment d'ADN codant pour une protéine dont on veut réguler l'activité, ladite activité étant inductible par liaison dudit récepteur ou dudit domaine de liaison du ligand avec undit ligand glucocorticoïde synthétique mais pas par liaison avec un ligand glucocorticoïde naturel lorsque ladite protéine se trouve fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand dudit récepteur. Plus particulièrement la présente invention a pour objet un gène de fusion comprenant dans le sens 5'-- > 3': - un fragment d'ADN codant pour la recombinase Cre du bactériophage P1; - un fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la région charnière D du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes, région située entre le domaine DBD et le domaine LBD, et - le fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) modifié, notamment muté, du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes selon l'invention. Et plus particulièrement encore, la présente invention a pour objet, un gène de fusion, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codant pour la séquence d'acides aminés de L'IDES n" 2 comprenant - les acides aminés 1 à 343 qui correspondent à la recombinaison Cre; - les acides aminés 346 à 377 qui correspondent à la région C terminale de la région D du récepteur humain des glucocorticoïdes; - les acides aminés 378 à G23 qui correspondent au LBD [GR(1747/T)]. Dans un mode de réalisation particulier, le gène de fusion a substantiellement pour séquence, la séquence Cre-LBD[GR(1747/T)] telle que représentée dans L'IDES n 2 dont les acides aminés 626 à G67 correspondent à la région F du récepteur humain des oestrogènes. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression de la protéine dc fusion codée par le gène dc fusion selon l'invention, dans des cellules hôtes animales notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte le gène de fusion selon l'invention, placé sous le contrôle d'éléments d'expression assurant son expression dans lesdites cellules hôtes. Le vecteur d'expression de la protéine de fusion peut également être un vecteur d'intégration dans le génome des cellules hôtes. Dans les vecteurs selon l'invention, pour exprimer le récepteur, le LBD ou la protéine de fusion selon l'invention, il faut que les fragments d'ADN codant pour ces molécules soient placées sous le controle de séquence de régulation, notamment des séquences promotrices/ enhancer. On peut utiliser en particulier des séquences promotrices/enhancer du virus SV40. La présente invention a en outre pour objet un procédé de recombinaison, notamment d'excision, insertion, inversion ou translocation conditionnelle au niveau d'un fragment d'ADN contenant un ou deux sites de reconnaissance spécifique d'une protéine recombinase dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes dans lesquelles 1) on introduit une protéine de fusion selon l'invention ou un vecteur d'expression de ladite proteine de fusion selon l'invention dans lesdites cellules hôtes dans des conditions permettant l'expression de la protéine dc fusion selon l'invention et, 2) on complexe ladite protéine de fusion avec undit ligand glucocorticoïde s! nthétique, en mettant ledit ligand en présence desdites cellules hôtes. La présente invention fournit donc un procédé de délétion conditionnelle d'un fragment d'ADN dans lequel on met en oeuvre un procédé d'excision selon l'invention, et dans lequel ledit fragment d'ADN à exciser est intégré entre deux sites de reconnaissance de protéine recombinase orientés en répétition directe. En particulier, ledit fragment d'ADN peut être choisi de telle sorte que l'excision dudit fragment d'ADN a pour effet, l'inactivation dudit gène. L'excision dudit fragment d'ADN peut également permettre la synthèse d'une protéine fonctionnelle, si ledit fragment contient par exemple un codon stop ou un signal de polyadenylation. Dans le mode préféré de réalisation selon l'invention, lesdits sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase sont les sites loxP et ladite protéine recombinase est la protéine Cre du bactériophage P1. Ledit fragment d'ADN que l'on veut recombiner, notamment exciser et le ou lesdits sites de reconnaissance spécifiques d'une protéine recombinase peuvent être portés par un vecteur plasmidique ou viral, ou intégrés dans le chromosome des cellules hôtes. L'intégration d'un gène portant des sites loxP dans un génome peut être aléatoire ou ciblée, En particulier, I'intégration des sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase, notamment du ou des sites loxP pour la recombinase Cre, peut se faire par recombinaison homologue du gène comportant ledit fragment d'ADN à exciser ou inverser (2 sites loxP) ou respectivement inserer ou transloquer (1 site loxP) avec undit gène modifié comportant ledit fragment d'ADN à exciser flanqué en 5' et/ou 3' par le ou lesdits sites de reconnaissance de recombinase en fonction de l'application désirée, notamment les sites loxP. On a construit une protéine chimérique, Cre-LBD[GR(1747/T)l de L'IDES n" 2, composée de la recombinase Cre fusionnée au LBD de GR (1747/T). La protéine de fusion Cre-LBD[GR(1747/T)] permet de réaliser une recombinaison entre des sites loup, dans une cellule de mammifère, suite à un traitement par des glucocorticoïdes synthétiques. En l'absence de traitement, ou en présence de concentrations de glucocorticoïdes naturels allant jusqu'à 10-6 NI aucune excision n'est observée.Cette chimère est capable d'exciser les séquences d'ADN situées entre des sites loxP intégrés préalablement dans le génome de cellules F9 (embryocarcinome de souris) ou présents sur un plasmide après transfection de ces cellules avec un vecteur exprimant Cre LBD[GR(1747/T)], suite à un traitement à la Dex à 10-6 NI ou 10-7 NI, alors qu'à de telles concentrations, le cortisol n'induit pas d'activité recombinase. Comme on l'a déjà mentionné, le vecteur d'expression de Cre-LBD[GR(1747/T)] peut également être un vecteur d'intégration dans le génome des cellules hôtes. Ce système permet donc de libérer l'activité recombinase de protéine chimérique à un moment donné et choisi. La protéine de fusion Cre-LBD[CR(l747/T)j peut étre exprimée dans des cellules contenant des sites loxP, sans modifier le locus contenant les sites loxP. La recombinaison au niveau des sites loxP a lieu uniquement après traitement aux glucocorticoïdes synthétiques. De plus en exprimant la protéine de fusion Cre-LBD[GR(1747/T)] dans un animal sous le controle d'un promoteur à spécificité cellulaire, on peut obtenir une recombinaison entre des sites loxP, spécifiquement dans ces cellules. La présente invention a également pour objet un vecteur de transfert d'un fragment d'ADN dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte undit fragment d'ADN à transférer comprenant des sites de reconnaissance spécifiques de la recombinase, notamment deux sites loxl > , orientés à répétitions directe et une cassette d'expression d'un gène de fusion selon l'invention. De façon appropriée les deux sites sont placés à chaque extrémité dudit fragment d'ADN. De préférence, le gène de fusion est placé sous le controle d'éléments d'expression spécifiques des cellules hôtes, en particulier, il comporte la séquence du plasmide pCre-LlJD[GIt(1747/1)1 de l'ILS n 3. Dans le procédé d'excision selon l'invention, ledit fragment d'ADN à exciser peut être transféré dans les cellules hôtes a-ant, en même temps, ou après l'étape d'introduction de la protéine de fusion ou d'un vecteur de transfert. Le vecteur de transfert selon l'invention peut entre, un vecteur plasmidique ou un vecteur viral. Le mode de transfert varie en fonction du type de cellule cible et de l'efficacité recherchée. Lorsque le matériel est transféré dans les cellules germinales, on utilise de préférence la microinjection du pronucléus màle d'un ovocyte fécondé. Pour introduire l'ADN dans des cellules embryonnaires pluripotentes (cellules ES), la technique appropriée sera plutôt l'électroporation ou l'utilisation de vecteurs retroviraux Pour des expériences portant sur les cellules somatiques, on cherche à obtenir une efficacité maximale, d'où l'utilisation préférentielle de vecteurs viraux rétrovirus et adenovirus, principalement. Ces virus doivent être défectifs, notamment pour une application en santé humaine pour empecher toute multiplication et tout risque de révertion. Après intégration ou non de ce type de vecteurs dans le génome, le système Cre-lox permet d'exciser certaines séquences virales, qui pourraient éventuellement présenter un risque quant à la propagation ultérieure du virus. Ceci est très avantageux pour l'utilisation de tels vecteurs en thérapie génique. Des vecteurs contenant une cassette d'expression du gène Cre-L13D[GR(1747/T)] et des sites lox encadrant un gène potentiellement "dangereux" et cette cassette permettent, le cas échéant après intégration dans le génome du virus recombiné, d'éliminer ces éléments. Inversement, on peut également activer un gène que l'on a intégré sous forme inactive. Cette activation peut résulter de la délétion d'un fragment dudit gène par exemple un codon stop ou un signal dc polyadénylation encadré de sites loxP. Lorsquc l'on veut transférer du matériel génétique dans une cellule, on utilise en général des constructions comportant Ic gène à transférer, auquel on a adjoint éventuellement un gène auxiliaire, conférant un avantage sélectif (par exemple, le gène nco, conférant la résistance à l'antibiotique G4 18). Les marqueurs de sélection peuvent également être excisés par le procédé d'excision selon l'invention. En utilisant des techniques classiques, on peut modifier par recombinaison homologue des gènes de mammifères, notamment de souris. Un site loxP peut être introduit dans un gène qu'on veut modifier, ou deux sites loxP peuvent encadrer des séquences que l'on veut modifier. En particulier, le marqueur de sélection utilisé pour permettre d'identifier les évènements de recombinaison homologue peut être gênant, et peut dans un premier temps être éliminé, si nécessaire, s'il est lui meme encadré de sites de reconnaissance de recombinase tels que des sites loxP ou FRT, en microinjectant la proteine recombinase correspondante, en transfectant les cellules, notamment des cellules ES, avec un vecteur d'expression pour une protéine recombinase, ou en croisant des souris portant le marqueur de sélection avec des souris exprimant la recombinase désirée, notamment la recombinase Cre.Ceci permet d'obtenir des souris dont la seule modification au niveau du locus modifié est l'insertion de sites de reconnaissance tels que loxP. Ces souris peuvent par la suite être croisées avec des souris exprimant Cre-LBD[GR(1747/T)] et la modification du locus obtenue par traitement avec le ligand tel que la Dex. Ceci permet d'inactiver ou de modifier un gène à un moment déterminé, et donc d'étudier la fonction de ces gènes à différents moments du développement. Ceci est particulièrement intéressant pour l'étude des gènes qui sont indispensables au bon déroulement du développement embryonnaire. En effet, dans certains cas, les techniques classiques de recombinaison homologue entraînent la mort de l'embryon et nc permettent pas d'étudier la fonction du gène à des stades plus tardifs. Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base de la thérapie génique. Les vecteurs les plus efficaces à cet égard sont des vecteurs viraux, en particulier rétroviraux ou adénoviraux (39). La présente invention a donc également pour objet un vecteur de transfert selon l'invention comportant ledit fragment d'ADN à transférer comportant deux sites loxP orientés en répétition directe pour une utilisation comme médicament en thérapie génique, lorsque celui-ci est administré en combinaison avec undit ligand glucocorticoïde synthétique tel que la dexaméthasone. Ce type de vecteur permet de transférer le fragment d'ADN désiré comportant deux sites de reconnaissance spécifique de recombinase dans un gène de sorte que les séquences d'ADN situées entre les deux sites loxP pourront être excisées de façon conditionnelle après administration dudit ligand glucocorticoïde synthétique. La présente invention fournit en outre des cellules humaines ou animales notamment de mammifères, transfectées par un vecteur d'expression et de transfert d'une protéine de fusion selon l'invention, ou des cellules humaines ou animales notamment de mammifères, dans lesquelles un fragment d'ADN a été transféré à l'aide d'un vecteur de transfert selon l'invention, ou encore des cellules humaines ou animales, notamment de mammifères exprimant de façon constitutive la protéine de fusion selon l'invention. La présente invention a enfin pour objet supplémentaire, un animal transgénique, notamment une souris comportant un gène fonctionnel de la protéine de fusion selon l'invention, celui-ci étant notamment intégré dans un de ses chromosomes. Ou encore un animal transgénique comportant un gène fonctionnel de la protéine de fusion selon l'invention, dans lequel un gène d'intérêt est modifié par insertion de site(s) loxP, notamment intégré(s) dans un ou plusieurs chromosomes. La présente invention a enfin pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression ou de transfert de cellules ou d'un animal selon l'invention comme outil d'analyse ou d'étude du fonctionnement d'un gène donné d'une cellule hôte et une méthode de traitement de cellules ex vivo ou in vitro impliquant la misc en ocuvrc d'un procédé d'excision, insertion, inversion ou translocation selon l'invention et l'utilisation d'un vecteur d'expression ou de transfert selon l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. L'IDS n 1 représente les séquences nucléotidique et peptidiquc de de GR(l747/T) avec le DBD correspondant aux aa 421-487 et le LBD correspondant aux aa 532-777; L'IDS n 2 représente les séquences nucléotidique et peptidique de Cre-LBD[GR(l747/T)] Les nucléotides 1-1029 codent pour la recombinase Cre (aa 1-343). Les nucléotides 1036-1131 codent pour la région C-terminale de la région D du récepteur humain des glucocorticoides [aa 500-531 de GR(1747/T) ; aa 346-377 de Cre-LBD[GR(l747/T)J. Les nucléotides 1132-1869 codent pour le LBD de GR(l747/T) [aa 532777 de GR(1747/T); aa 378-623 de Cre-LBD[GR(1747/T)]. Les nucléotides 1876-2001 codent pour la région F du récepteur humain des oestrogènes [aa 554-595 de HEGO ; aa 626-667 de Cre LBD[GR(1747/T)]. Les nucléotides 1777-1779 correspondent à la mutation qui remplace l'isoleucine par une thréonine. L'IDS n 3 représente la séquence nucléotidique du plasmide pCrc L13D[GR( 1747/T)] La Figure 1 est une représentation schématique d'activités recombinases de Cre. La Figure 2 représente l'activité transcriptionnelle de récepteur GR mutant et de type sauvage en réponse à la dexaméthasone et la capacité de fixation de la dexaméthasone aux deux récepteurs. La Figure 3 représente une analyse de Scatchard de la liaison de [3H]-dexaméthasone aux récepteurs de type sauvage et mutant 1747/T. La Figure 4 représente la compétition par RU 486 des activités de liaison de Dex et de transactivation du récepteur de type sauvage (TS) et G R( 1747ST) . La Figure 5 est une représentation schématique des protéines Cre, hER, Cre-ER, hGR et Cre-LBD[GR(1747/T)]. La Figure 6 est une représentation schématique du plasmide pCre LBD[GR(1747/T)]. La Figure 7 représente la séquence nucléotidique de pCre LBD[GR(1747/T)] et la séquence peptidique de Cre-LBD[GR(1747/T)] La Figure 8 représente la stratégie PCR utilisée pour détecter les allèles sauvages, mutés et recombinés dans le test d'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)]. La Figure 9 représente l'analyse par PCR de l'excision des séquences situées entre les sites loxi > après transfection transitoire de pCre-LBD[GR(1747/T)] dans les cellules murines RXR&alpha;+/-(LNL) sans ajout de ligand, ou traitées au cortisol (106 M) ou à la dexaméthasone (10-6 M). La Figure 10 représente l'analyse par PCR de l'activité recombinase de Cre-GR(1747/T) dans les cellules RXR&alpha;+/-(LNL) : Cre-GR(1747/T) non traitées ou traitées avec du cortisol ou de la dexaméthasone à 1a6N1. La Figure 11 récapitule l'activité recombinase de Cre LBD[GR(1747/T)] dans la lignée RXR&alpha;+/-(LNL) e.xTprimant la recombinase de façon constitutive, en présence de concentrations croissantes de différents ligands. La Figure 12 représente l'analyse par PCR de l'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] induite par des ligands synthétiques malgré la présence de ligands naturels. La Figure 13 représente le test de l'activité recombinase de Cre LBD[GR(1747/T)] dans les cellules humaines HeLa. DCEMPLE 1: Remplacement de l'isoleucine 747 par la thréonine dans le récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes. On a obtenu un mutant GR humain comportant un seul remplacement d'acide aminé, celui du résidu isoleucine 747 par un résidu thréonine, localisé entre les hélices Hil et H12, dans la partie C-terminale du domaine de liaison du ligand. Cette mutation est apparue spontanément dans les vecteurs dérivés de HG 1 (40). Ce mutant diffère des autres mutants de LBD de GR décrits précédemment (22, 38), dont la fonction d'activation altérée est en étroite corrélation avec une modification de leurs propriétés de liaison du ligand in vitro. 1. Mutation dans le GR humain Le vecteur d'expression du GR humain de type sauvage (pSGrIIG0) a été obtenu en clonant le fragment BamH@ d'environ 2.9 kb (contenant le cadre de lecture ouvert du hGR de type sauvage) isolé du vecteur lIG0 précédemment décrit (40), dans le site BamlIl du v vecteur d'expression pSG5 (41). Toutes les constructions d'ADN ont été effectuées au moyen de techniques classiques (42). Le vecteur d'expression GR (1747/T)hGR codant pour un mutant portant la mutation 1 747- > T, a été obtenu à partir du fragment de digestion Pstl-PflM@ du vecteur d'expression HGI (40) muté qui était ligaturé dans les sites I > stî et PflM@ correspondants de pSG51-lG0. En plus de la mutation du résidu isoleucine 747 en un résidu thréonine présente dans IlGi, ce mutant contient également une mutation du site EcoRi qui n'entraine pas d'altération de la séquence peptidique. La présence de la mutation a été confirmée par séquence (protocole Sequenase 2.0, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, HO). 2. Résultats 2.1. Le remplacement de I'isoleucine 747 par la thréonine conduit à un décalage de la courbe de réponse en fonction de la dose de dexaméthasone pour la transactivation, sans affecter sensiblement l'affinité de liaison du ligand. On a comparé les caractéristiques transcriptionnelles du hGR de type sauvage (TS) et d'un mutant dans lequel l'isoleucine 747 a été remplacée par la thréonine [désigné ci-après par GR(l747/T)]. Les récepteurs ont été exprimés transitoirement dans des cellules CV-1 exemptes de GR, conjointement avec un gène reporter de luciférase sous le contrôle du promoteur de l'aminotransférase de la tyrosine (pTAT-tk-Luc). La Figure 2 montre les courbes correspondantes de réponse en fonction de la dose de ligand utilisée, permettant de détermincr les valeurs de la CE50 (la concentration de ligand donnant 50 % dc la réponse transcriptionnelle maximale).La courbe de réponse en fonction de la dose pour hGR TS présente une réponse maximale à 108 NI dc Dex et une réponse égalc à la moitié de la réponse maximale à 4x10-10 NI, alors que la courbe dc réponse transcriptionnelle du mutant GR(1747/T) est nettement décalée vers les plus fortes concentrations de ligand, entraînant des valeurs 100 fois plus élevées de la CEso pour Dex (4x10-8 M) (voir tableau I ci-après). La stimulation maximale méditée par GR(1747/T) a été atteinte à environ 106 M Dex.Toutefois, il est important de noter que le récepteur GR(1747/T) est capable d'activer la transcription du pTAT-tk-Luc au même degré que le GR TS. En conséquence, le remplacement du résidu isoleucine par la thréonine à la position 747 ne diminue pas l'aptitude du GR å activer la transcription mais a modifié spécifiquement la sensibilité au ligand de la réponse. L'effet de cette mutation est indépendant de la région A/B N-terminale ct de sa fonction de transactivation associée AF-i. Les mutants de délétion dépourvus de AF-1 mais contenant la mutation 1747/T[#A/B- GR(l747/T)J nécessitent 3x10-8 NI de Dex pour une stimulation représentant la moitié de la stimulation maximale, tandis que seulement 6x10-10 M sont suffisants pour le #A/B-GR dérivé de TS (données non représentées; voir également le tableau il pour les chimères GAL correspondantes). Ainsi, la mutation 1747/T exerce un effet similaire sur le GR complet et le GR à délétion N-terminale.On peut en conclure que le décalage observé dans la réponse en fonction de la dose de ligand n'est pas la conséquence d'une interaction modifiée entre AF-1 et AF-2. Pour déterminer l'effet de la mutation 1747/1 sur la liaison dU ligand, on a mesuré la liaison de Dex dans un cytosol de cellules Cos-7 exprimant transitoirement le hGR mutant et Ic hGR de type sauvage. Les valeurs dc Kd obtenues à partir d'une analyse de Scatchard sont très semblables, puisque le mutant 1747/T ne manifeste qu'une affinité pour la Dex deux fois plus faible que le GR TS (Figure 3). Ainsi, I'ordre de grandeur du décalage des courbes dose-réponse vers les fortes concentrations dc hGR (1747/T), par rapport au hGR TS (environ 100 fois) est peu susceptible de résulter d'une diminution d'affinité pour Ic ligand du hGR muté (facteur 2 seulement ; comparcr les Figures 2 et 3). 2.2. hGR(1747/r) ne répond pas aux ligands naturels Pour caractériser davantage les caractéristiques de liaison du mutant 1747/T, on en a comparé l'activation par divers agonistes synthétiques connus pour le CR 15 (triamcinolone acétonide, RU28362, bimédrazol), un agoniste partiel (fluocinolone acétonide) et des glucocorticoïdes naturels (cortisol, cortico-stérone).Avec Ic récepteur mutant, le triamcinolone acétonide et le RU28362 donnent la même transactivation qu'avec le récepteur de type sauvage, tandis que le bimédrazol et la fluocinolone acétonide ont manifesté une plus forte activité (tableau 1). Pour tous ces analogues, le mutant 1747/T manifeste un décalage de la courbe de réponse en fonction de la dose, en direction des plus fortes concentrations de ligand, bien que ce décalage soit moins prononcé pour des ligands à forte affinité (tableau 1). Les ligands naturels, tels que le cortisol ou la corticostérone ou l'aldostérone, le ligand naturel du récepteur de minéralocorticoïdes, se lient au GR avec une plus faible affinité que Dex. Avec le GR de type sauvage, ces ligands sont aussi efficaces que la Dex pour stimuler le reporter de la luciférase (tableau 1). Toutefois, en présence de ces ligands naturels, et en contraste notable avec les effets observés avec Dex, la transactivation par le mutant 1747/T est fortement diminuée (cortisol) ou supprimée (corticostérone, aldostérone). 2.3. Activités agonistes et antagonistes similaires dc RU486 avec hGR de type sauvage et hGR mutant RU486 est un puissant inhibiteur de l'expression des gènes dépendant des glucocorticoides. En présence de cet antagoniste, la fonction AF-2 de GR est bloquée, mais on a pu observer une certaine activité agoniste dépendant de AF-t [(43) et références qui y sont contenues]. Une mutation ou une délétion de la partie C-terminale du LBD peuvent altérer la réponse à des ligands agonistes/antagonistes, bien que les rôles de AF-1 et de AF-2 n'aient pas été clairement définis dans les études rapportées (44-46). Pour tester l'affinité de liaison relative de RU486 pour le mutant 1747/T et le type sauvage, on a examiné l'aptitude de RU486 à entrer en compétition avec la Dex pour la liaison aux récepteurs. Des cellules transfectées avec hGR mutant ou TS ont été traitées par 10 nNI de [31-I]-Dex, une concentration suffisante pour engendrer essentiellement des récepteurs mutants et TS complexés avec la Dex, conformément aux essais de liaison de ligand in vitro (voir plus haut), et par des concentrations croissantes de RU486 (Figure 4) . On a obtenu des valeurs de la Clso (la concentration d'antagoniste bloquant 50 % de la transactivation maximale) très similaires pour les deux récepteurs (10-8M pour le hGR TS et 6x10-9N1 pour le hGR mutant). Ces résultats sont en accord avec les essais de liaison à Dex et montrent que les affinités de liaison à Dex et RU486 ne sont pas modifiées par la mutation 1747/T. 2.4. Le décalage de l'activité transcriptionnelle du récepteur mutant est indépendant du promoteur On a obtenu les résultats décrits ci-dessus dans des cellules transfectées, en utilisant un gène rapporteur contenant un fragment promoteur du gène TAT qui héberge deux éléments de réponse aux glucocorticoïdes (GRE). Pour distinguer entre une modification des propriétés intrinsèques de transactivation du récepteur et une modification de l'activité coopératrice résultant de la liaison de plusieurs molécules de récepteur, on a comparé les activités transcriptionnelles du récepteur mutant GR(l747/T) et du récepteur de type sauvage, en utilisant un promoteur synthétique contenant un seul GRE, palindromique et parfait.Les courbes correspondantes de réponse en ponction de la dose présentent les mêmes profils que celles obtenues avec le promoteur TAT. La réponse correspondant à la moitié de la réponse maximale est obtenue à 1010 M pour le GR TS et à 2xt0-8 M pour GR(1747/T) (tableau 11). Cela indique que le décalage observé avec le récepteur mutant reflète les propriétés de transactivation intrinsèques du mutant GR(1747/T) et ne sont pas le résultat d'une altération de la coopération entre les récepteurs. Le remplacement du domaine de liaison d'ADN de GR par les 147 premiers acides aminés du transactivateur de Gal4 de levure donne une protéine activatrice hybride ayant une nouvelle spécificité de promoteur. Les hybrides Gal l-GR consistent en le domaine de liaison d'ADN (DBD) de Gal4 (1-147) fusionné avec le LBD de hGR TS ou mutant. Leurs aptitudes à activer la transcription ont été testées dans des essais de transfection transitoires dans des cellules Hela. On a constaté le méme décalage qu'avec le mutant GR(1747/T) complet (tableau 11). Ces résultats montrent que le décalage de la réponse transcriptionnelle en fonction de la dose du ligand est indépendant de promoteur et d'élément de réponse (RE). En outre, cet effet est apparemment non spécifique des souches de cellules utilisées, comme on l'a constaté à la fois dans des cellules humaines HeLa et des cellules simiennes Cos.Pour exclure davantage une implication possible de facteurs se liant au promoteur tk ou -globine du gène rapporteur (47), on a utilisé un gène rapporteur contenant un élément de réponse Gal4 précédant un promoteur minimal. Bien que la transactivation par la protéine chimérique Ga14 ait été diminuée avec ce gène rapporteur minimal, on a encore pu observer un décalage de la courbe de réponse vers les doses croissantes pour la protéine chimérique mutante Gal4-GR(1747/T) (tableau 11). 2.5. Activité transcriptionnelle de récepteurs GR mutant et de type sauvage en réponse à la dexaméthasone ( Figure 2). Des cellules CV-1 ont été transitoirement transfectées avec 0,5 g de vecteurs d'expression de GR de type sauvage (0) ou de GR(1747/T) (o), 2,5 sLg de pTAT-tk-Luc en tant que plasmide raporteur et 0,5 g de pCMV-ssGal en tant que témoin interne. Après la transfection, on a mis les cellules à incuber pendant 24 heures avec des concentrations croissantes de Dex, et on les a ensuite soumises à un essai des activités ,8-galactosidase et luciférase, comme décrit daims "Nîatériels et Méthodes". L'activité luciférase a été normalisée avec l'activité gS-galactosidase, et la valeur obtenue en absence de ligand a été soustraite pour chaque point.Les résultats ont été exprimés en pourcentage de l'activité luciférase maximale obtenue pour chaque récepteur. Chaque point est la moyenne + écart-type de la moyenne, de quatre déterminations séparées effectuées en double. Les analyses de liaison à saturation ont été effectuées avec des cytosols provenant de cellules Cos-7 transfectées avec 40 g de vecteur d'expression de hGR de type sauvage (I) ou de hGR(1747/T) (e), avec 20 g de pCMV-ssGal mis à incuber pendant une nuit à 4 C en présence de concentrations croissantes de [3H]-dexaméthasone + un excès de 100x de Dex radio-inerte. Le stéroïde [31-l] fixé a été mesuré après traitement au charbon enrobé de dextran. Les résultats représentes sont ceux d'un seul essai effectué en double et représentatif de trois essais séparés. Les courbes de saturation de la liaison de [3H]-dexaméthasone sont représentées en pourcentage de la capacité de liaison maximale obtenue pour chaque récepteur.La capacité de liaison du mutant GR(1747/T) est diminuée pour atteindre environ 40-60 % de celle du hGR de type sauvage (623 + 65 fmoles/mg de protéine, par rapport à 1 340 + 285 fmoles/mg de protéine). 2.6. Analyse de Scatchard de la liaison de [3H] -dexaméthasone aux récepteurs de type sauvage et mutant 1747/T (Figure 3). On a appliqué l'analyse de Scatchard à la liaison effectuée comme décrit sur la Figure 2. La constante de dissociation apparente du mutant GR(1747/T) (o) n'est que deux fois plus élevée que celle du hGR de type sauvage (0) (Kd = 5,1 + 1,9 par rapport à 2,7 + 1,3 nNl). 2.7. Tableau I Activités transcriptionnelles et CEso de divers stéroïdes avec hGR de type sauvage et hGR(1747/T) Activité luciférase % CE50 Ligand Type hGR Type Glu %CE50 sauvage (1747/T) sauvage (1747/T) Dexaméthasone 100 100 4x10-10M 4x108N1 100 TA 98 102 5x10-10M 2xt08NI 40 RU28362 90 88 3x10-10M 7xl0.9NI 23 Fluocinolone 75 100 1,5x1010NI 3x10-9M 20 Bimédrazol 100 180 lOlONI 2x10-9M 20 Cortisol 110 15 7x109NI nm Corticostérone 100 0 7x10-8M nm Aldostérone 90 0 5x10-8M nm Les co-transfections ont été effectuées et les courbes de réponse en fonction de la dose ont été construites comme décrit sur la Figure 2. On a testé à six concentrations croissantes, en double, le triamcinolone acétonide (TA), RU28362, le fluocinolone acétonide (fluocinolone), le cortisol, la corticostérone et l'aldostérone. Les essais de l'activité luciférase et de la ss-galactosidase ont été effectués comme décrit dans "Matériels et Méthodes". Les moyennes de trois essais indépendants sont données dans ce tableau. nm = non mesurable. 2.8. Compétition des activités de liaison de Dex et de transactivation par RU486 (Figure 4). Des cellules Cos-7 transfectées avec le hGk de type sauvage (I) ou mutant l747T (o) ont été mises à incuber pendant I heure à 37 C avec de la [311]-dexaméthasone 10 nM seule ou en présence de la concentration indiquée de RU486 non marqué, comme décrit dans Matériels et Nléthodes". Les données sont exprimées en pourcentage de la liaison spécifique observée sur le témoin non soumis à la compétition. Ces données représenoent la moyenne de déterminations effectuées en double pour chaque concentration d'antagoniste. L'activité antagoniste a été déterminée sur des cellules CV-1 transfectées comme décrit sur la Figure 4 et traitées simultanément par Dex 10-7M et la concentration indiquée de RU486, 24 heures avant la récolte pour l'essai des activités luciférase et ss-galactosidase. 100 96 d'activité sont définis pour chaque récepteur comme l'activité luciférase des cellules traitées par la Dex seule. Chaque point représente la moyenne d'au moins deux essais indépendants effectués en double. (0): hGR de type sauvage; (o): mutant 1747T. 2.9.Tableau II CE50 obtenue avec divers gènes reporter Récepteur Gène rapporteur CF50 GR de type sauvage pGRE-tk-Luc 10-10M GR(1747/T) " 2x10-8M Ga14-GR p(17M)5-ssGlob-Luc 1,7x10-9M Ga14-GR(1747/T) " 1,5x10-7M Ga14-GR p(17M)5-tata-Luc 2x10-9M Ga14-GR(1747/T) " 2x10-7M Des cellules HeLa (pour les chimères Gal4) ou des cellules CV-1 ont été cotransfectées transitoirement avec divers vecteurs d'expression et gènes reporter. L'efficacité de la transfection a été standardisée en cotransfectant par 0,5 g de vecteur pCMV-ssgal. Les cellules ont été traitées pendant 24 heures par des concentrations croissantes de dexaméthasone. Les essais de la luciférase et de la ss-galactosidase ont été effectués comme décrit dans "Nîatériels et Méthodes".L'activité luciférase est exprimée en pourcentage de l'activité maximale obtenue pour chaque récepteur et chaque gène reporter. Les valeurs de la CE,o ont été déterminés graphiquement. 2.10. Récapitulatif La mutation de l'isoleucine 747 du récepteur humain des glucocorticoïdes en thréonine résulte en une très forte diminution, voire une abolition de l'activité de transactivation du récepteur, en présence de glucocorticoïdes naturels, alors qu'à des concentrations similaires, des glucocorticoïdes synthétiques stimulent de façon cfficacc l'activité de transactivation de ce récepteur muté. II est important de souligner que hGR(1747/T) répond totalement à une forte concentration de Dex, ce qui indique qu'il peut en principe transactiver aussi efficacement que sa contrepartie de type sauvage. En conséquence, la fonction d'activation transcriptionnelle de AF-2 elle-même n'est apparemment pas altérée par la mutation, comme c'est le cas pour des récepteurs comportant des mutations dans la partie centrale de AF-2 (voir l'introduction pour les références). 3. Matériels et méthodes 3.1. Cultures cellulaires et transfection Les cellules CV-1 et Cos-7 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbeco (DMEM) contenant 10 % (v/v) de sérum de veau foetal (SVF) (Gibco, Grand Island, NY), dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02. Les cellules HeLa ont été cultivées dans les mêmes conditions.Les transfections transitoires ont été effectuées dans des multi-plaques à 6 puits, selon le mode opératoire au phosphate de calcium déjà décrit (42). Un plasmide recombinant de référence, pCMV-pGal, exprimant la -galactosidase bactérienne, a été transfecté conjointement avec le vecteur d'expression du récepteur et le gène reporter correspondant, afin de corriger d'éventuelles variations de l'efficacité de la transfection. Le précipité a été éliminé par lavage au bout de 24 heures, et les cellules ont été maintenues dans du DMEM sans SVF mais contenant de l'hormone.Au bout d'encore 24 heures, les cellules ont été rincées et lysées pendant 15 minutes avec 0,3 ml de tampon de lyse [Tris.phosphate 25mM, pH 7,8, MgCl2 8 mNl, 1% de Triton X100, 10 % de glycérol (48)]. L'activité luciférase correpondante a été déterminée sur une fraction aliquote (0,1 ml), par évaluation du pic de luminescence (pour un temps d'intégration de 15 secondes), après injection de 0,1 ml de luciférine 1 mM dans un luminomètre LKB. La -galactosidase a été déterminée par la méthode modifiée par Bocquel et al. (49), pour le contrôle de l'efficacité de chaque transfection. 3.2. Plasmides utilisés Les GR à délétion N-terminale, #A/B-GR ou #A/B-GR51747/T), qui exprimaient seulement les acides aminés 368 à 777, ont été obtenus à partir du fragment de digestion PstI-Pf/MI du vecteur d'expression lIGO ou pGR(1747/T), respectivement, ligaturé dans les sites correspondants dc HG8 (49). Le plasmide pGAL-GR (don de T.Lerouge) était constitué du domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal de levure (aa1-147) et du domaine de liaison à une hormone de GR (a500-777); pGal-GR(1747/T) a été construit par insertion de la mutation dans pGal-GR. Le gène reporter pTAT-tk-Luc a été fourni par D. Gagne et a été construit comme Suit: on a d'abord engendré un plasmide intermédiaire pTAT, par insertion du segment EcoRI-BamHI de 9G6 pb, provenant de pKT531 [fourni gracieusement par T. Grande (50)] dans les sites correspondants du vecteur pUCI9 (Pharmacia). Le fragment contenant la séquence codant pour la luciférase de luciole et le promoteur minimal thymidine kinase (tk) provenant du virus Herpes simplex a été isolé sous forme d'un fragment BamHI à partir de pvit-tk-Luc (51) et inséré, en aval du promoteur TAT, dans le site correspondant de pTAT. Le plasmide reporter pGRE-tk-Luc a été construit par ligature du fragment de digestion HindIII-BgIII de pGRE-tk-CAT (52), qui contient un GRE synthétique (AGAACAcagTGTTCT) en amont du promoteur minimal tk, dans les sites Hindlll-Bglll de pLuc (53). le gène reporteur p(17M)5-ssGlob-Luc a été décrit précédemment (5 1) Le plasmide reporter p(17M)5-tata-Luc a été construit à partir du plasmide p(17M)5-tata-CAT (55) par digestion par Xhol-Bamlll et isolement du fragment contenant (17M5)-tata. Ce fragment a été ensuite inséré dans le vecteur pGL2 (Promega) digéré par les mêmes enzymes de restriction. Le vecteur d'expression de la ss-galactosidase pCMV-ssGal contient la séquence codant pour la ss-galactosidase, sous contrôle du puissant promoteur constitutif de cytomégalovirus (CNlV). 3.3. Essai de liaison à une hormone Des cellules Cos-7 transfectées avec pCMV-ssGal et hGR de type sauvage ou mutant 1747/T ont été récoltées 48 heures après la transfection, dans une solution salée tamponnée au phosphate (STP), par grattage à l'aide d'une spatule en caoutchouc. Les cellules ont été lavées deux fois dans de la STP glacée.Toutes les étapes de la préparation de cytosols ont été effectuées à 4 C. On a remis les cellules en suspension dans 3 volumes de tampon de liaison [Na-HEPES 20 mbí, pH 7,3, molybdate de sodium 20 mM et EDTA 5 mNl (22) et avec des inhibiteurs de protéase [leucopeptinc (5 g/ml), aprotinine (5 g/ml), PAíSF ( 10 stg/ml) et pepstatine A (5 Fg/ml)l, et on les a placées pendant 15 minutes sur de la glace.Les cellules ont ensuite été lysées par 30-40 coups de piston dans un homogénéisateur en verre Dounce, et l'homogénat résultant a été ensuite centrifugé à 110 000 g pendant 30 minutes. Le surnageant, dénommé cytosol, a été utilisé immédiatement pour l'essai de liaison à une hormone. Les concentrations de protéine ont été déterminées par le dosage de protéine Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Pour l'essai de liaison à une hormone, on a mis à incuber pendant une nuit à 4 C un cytosol, contenant 1-3 mg de protéine/ml, avec de la [3H]-Dex (49 Cl/mmole; Radiochemical Center, Amersham, Angleterre) ou du cortisol (67 Ci/mmole; Radiochemical Center, Amersham, Angleterre) sans (liaison totale) ou avec (liaison non spécifique) un excès de 100 fois de composé radio-inerte (10-5 M, Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo, USA). On a ensuite traité les échantillons par 1 volume de charbon-dextran (5% de charbon, 0,5% de dextran dans la solution de liaison) pendant 15 minutes dans de la glace, sous agitation constante, puis on les a soumis à une centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 g. Le ligand [3H] fixé a été mesuré dans une partie aliquote du surnageant, par comptage de scintillation. La constante de dissociation à l'équilibre (Kd) du récepteur pour la dexaméthasone ou le cortisol a été déterminée par analyse de Scatchard. Pour l'analyse de liaison compétitive, on a mis les cytosols à incuber avec 10 nM de [3H]-Dex et diverses concentrations dc stéroïdes compétitifs non radioactifs, dans les mêmes conditions que précédemment. Après traitement au charbon-dextran et comptage dc scintillatioll, la liaison spécifique a été exprimée en pourcentage du témoin non soumis à une compétition, et portée en fonction de la concentration du stéroïde en compétition. Des essais de liaison compétitive dans des cellules entières ont été effectués sur 106 cellules mises à incuber pendant 1 heure à 37"C avec 10 nNí de [311]-Dex et diverses concentrations de stéroides en compétition. Après sonication dans 1 ml de tampon KCI (EDlA 1,5 mM, Tris.llCl 20 mM, pli 7,4, KCl 0,) M), on a éliminé le stéroïde non lié par addition de deux volumes de charbon enrobé de dextran, dans du tampon KCI à la gélatine (0,05 % de dextran, 0,5% de charbon, 0,1% de gélatine). On a mis le mélange à incuber pendant 30 minutes à 4 C et on l'a centrifugé à 3 000 g pendant 5 minutes. La radioactivité a été déterminée par comptage de scintillation en liquide et on a porté sur une courbe comme précédemment la liaison spécifique. EXEMPLE 2 : Recombinase Cre chimérique dont l'activité est inductible par des glucocorticoïdes synthétiques, mais pas par des glucocorticoïdes naturels 1. Matériel et méthodes 1.1. Construction du vecteur pCre-LBD[GR(1747/T)] Un fragment d'ADN Clal-Xbal d'environ 1300 paires de base (pb), contenant la séquence codant pour le domaine de liaison du ligand du récepteur humain des glucocorticoïdes a été isolé du plasmide HGI (voir Exemple 1 (40)) et ses extrémités ont été remplies par la T4 polymérase. Ce fragment a été muté de sorte que les nucléotides ATT codant pour une isoleucine en position 747 du récepteur sauvage (oG) sont remplacés par les nucléotides ACC, codant pour une thréonine.Ce fragment muté a été cloné dans le vecteur pCre-ER (28) digéré par Xhol et Pstl, dont les extrémités ont également été remplies par la T4 polymérase [plasmide pCre+GR(1747/T)+F; séquence codante du LBD de hGR(1747/T) dans la même orientation que celle de Crel. pCre-LBD[GR(1747/T)] a été obtenu par mutagénèse dirigée réalisée sur l'ADN simple brin préparé à partir du plasmide pCre + GR(1747/T) + F, avec les oligonucléotides de synthèse - SG5 2 ( 5 '-CTGGAAGATGGCGATCTCGAGATTCAGCAGGCCACT-3') - SG5 3 (5' -CTGTTTCATCAAAAGGGTACCAGCCGTGGAGGGGCAT 3') permettant de fusionner d'une part la séquence d'ADN codant pour la Cre [amino acides (aa) 1-343 (orf2 (cre) ; (31)], et celle qui code pour la région contenant le LBD muté de 11G1 [aa 500-777], d'autre part la séquence d'ADN précédemment modifiée et celle codant pour la région F du récepteur humain des oestrogènes (ER) [aa 553-595 (57)] (Figure 5). Cette opération restaure le site de restriction Xhol si tué à la fin des séquences Cre dans pCre-ER et introduit un site de restriction KpnI entre les séquences codant pour GR et la région F du ER (Figures 6 et 7). 1.2. Mutation du gène RXRa Le vecteur (pRXRa(LNL)), utilisé pour muter le gène RXRa (58) par recombinaison homologue dans les cellules F9 a été construit de la façon suivante Un phage x contenant un fragment génomique de 11.8 kb, comprenant les exons 2,3 et 4 de RXRa, a été isolé à partir d'une banque génomique réalisée avec de l'ADN génomique de l'embryocarcinome murin P19, cloné dans le vecteur # ENIBL3. Un fragment Sall isolé de ce phage (dont les extrémités ont été remplies par la T4 polymérase) a été sous cloné dans le site BamlAl (après traitement à la T4 polymérase) d'un dérivé du vecteur pBluescriptllSK+ (Stratagène). Dans ce dérivé, le site Xhol a été supprimé.Un site Xhol a été introduit dans l'exon 4 de RXRa au niveau du site Accl correspondant au nucléotide 535 de l'ADNc de RXRa (la séquence de l'ADNc de IXRa est donnée dans Genbank référence : M 84817), en clonant dans le site Accl les oligonucléotides synthétiques suivants -5'-ATTATTATTACTCGAGTGATGATG-3' et, -5'-ATCATCATCATCCGAGTAATAATA~3'. Enfin, le fragment XhoI, contenant la cassette d'expression du gène dc résistance à la néomycine, entourée de sites loxl', isolé du vecteur pHR56 (28) a été cloné dans le site Xhol du vecteur précédent. La mutation d'un allèle du gène lRa dans des cellules F9 a été effectuée par recombinaison homologue à l'aide du vecteur pRXR&alpha;(LNL) (28). Cette lignée a été appelée RXR&alpha;+/-(LNL). 1.3. Expression de Cre-LBD[GR(1747/T)j dans des cellules comportant un fragment d'ADN modifié : RXRa(LNL) - Transfection transitoire: 5 10G cellules RXR&alpha;+/-(LNL) OU cellules HeLa resuspendues dans 500 cil de PBS ont été électroporées avec 5 g de plasmide pCre-LBD[GR(1747/T)] [éventuellement cotransfectées avec 5pg du vecteur pRXRa(LNL) pour les cellules Hela] à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad gene pulser), réglé à 200 V et 960 F. Les cellules ont ensuite été ensemensées à 106 cellules par boite de 100 mm et traitées, si nécessaire, avec des ligands. - Transfection stable : 5. 106 cellules RXR&alpha;+/-(LNL), resuspendues dans 500 I de PBS ont été électroporées avec 5 g de pCre-LBD[GR(1747/T)] et 1 g de pPGK-Hyg (59), digérés respectivement par Sall et PvuII, à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad gene pulser), réglé à 200 V et 960 F. Les clones résistants ont été obtenus selon la procédure décrite par Metzger et al. (28). 1.4. Amplification par "PCR" d'une région d'ADN génomique localisée dans l'exon l de RXR&alpha; Les amplifications d'ADN ont été réalisées en utilisant la technique de "Polymérase Chain Reaction" (PCR), selon le protocole décrit par Chen and Evans (60). Les amorces utilisées sont : SB211 et PZ105, ayant respectivement comme séquence nucléotidique 5'-GGCAAACACTATGG-3' et 5'-TTGCGTACTGTCCTCTT-3'. Après dénaturation pendant 8 min à 94 C, 2,5 unités de Taq polymérase sont ajoutées. L'amplification est effectuée en réalisant 35 cycles (30 sec. à 94 C, 30 sec. à 50 C suivi d'un cycle (30 sec. à 94'C, 30 sec. à 50 C, 5 min à 72 C) dont le produit est conservé à 4 C. Les produits des réactions ont été séparés sur gel de polyacrylamide (10 %) ou dagarose (2,5%). L'ADN a été visualisé par UV suite à une coloration au bromure d'éthidium, ou par Southern Blot (42). 1.5. Test d'excision des séquences situées entre les sites LoxP L'ADN de cellules RXRa+/-(LNL), transfectées avec pCre LBD[GR(1747/T)] ou le vecteur parental pSG5, non traitées ou traitées avec du cortisol (10-6M) ou de la dexaméthasone (10-6M) pendant 72 heures, a été soumis a une réaction PCR selon la stratégie décrite en Figure 8. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel d'acrylamide et colorés au bromure d'ethidium. La piste M sur la Figure 9 correspond au dépôt du marqueur de taille pBR322 digéré par Hinfl. La position des allèles sauvage et recombiné est indiquée. 1.6. Analyse par PCR de l'activité recombinase de Cre LBD[GR(1747/T)] dans la lignée RXR&alpha;+/-(LNL) exprimant la protéine chimérique de façon constitutive. Pour la Figure 10, I'ADN préparé à partir de cellules RXR&alpha;+/- (LNL):Cre-GR(1747/T) non traitées ou traitées au cortisol (10-6M) ou à la dexamethasone (10-6NI) a servi de matrice pour réaliser une amplification par PCR, selon la procédure décrite en Figure 8. L'ADN amplifié a été séparé sur gel d'acrylamide et coloré au bromure d'ethidium. Les pistes 1, 2, 3 et 4 contiennent respectivement les produits de PCR réalisés avec de l'ADN extrait de cellules F9 sauvages (WT), RXR&alpha;+/-(LNL), RXR&alpha;+/-(L) et de C2RXR&alpha;-(L)/-(L) (73). La piste 8 contient un marqueur de taille (échelle de tub ; GibcoBRL). Sur la Figure 11, I'ADN préparé à partir de cellules RXR&alpha;+/-(LNL):Cre- GR(I747/T) non traitées ou traitées avec de l'aldostérone, du cortisol, de la corticostérone, de la dexamethasone, dc la triamcinolone acetonide ou du RU486, à des concentrations allant dc 10-9 à t0-6Nl, a servi dc matrice pour réaliscr une amplification par PClt, selon la procédure décrite cn Figure 8. L'ADN amplifié a été séparé sur gel d'agarose et analysé selon la technique de Southern. Les fragments amplifiés correspondant aux allèles sauvage et recombiné ont été détectés par hybridation à l'aide de l'oligonucléotide de synthèse (5'-AAGAAGCCCTTGCAGCCCTC-3'), radiomarqué à l'extrémité 5' par de la T4 polynucléotide kinase. Le signal a été visualité et quantifié à l'aide d'un "phospho-imager" (Fujix bas2000). Pour la Figure 12, des cellules RXR&alpha;+/-(LNL):Cre-GR(1747/T) ont été cultivées pendant 72 h dans du milieu de culture auquel ont été ajoutés trois ligands naturels (I'aldosterone, le cortisol et la corticostérone) à la concentration de 10-9 M ou 108 NI et de la dexaméthasone (10-7 ou 10-6 M) comme indiqué. L'allèle recombiné a été détecté selon la procédure décrite en Figure 8. L'ADN amplifié a été séparé sur gel d'agarose et analysé selon la technique Southern. Les fragments amplifiés correspondant à l'allèle recombiné ont été détectés par autoradiographie, suite à une hybridation avec l'oligonucléotide de synthèse 5'-AATTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTC-3', (contenant un site loxP) radiomarqué au Phosphore 32 à l'extrémité 5' par la T4 polynucléotide kinase. Pour la Figure 13, des cellules HeLa ont été cotransfectées par les plasmides pRXRa(LNL) et pCre-LBD[GR(1747/T)], puis cultivées pendant 72 heures avec ou sans addition des ligands indiqués, à la concentration de 10-7N1. L'ADN de ces cellules a ensuite été soumis à une amplification PCR selon la stratégie décrite. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel d'acrylamide et colorés au bromure d'éthidium. La piste 1 correspond au dépôt du marqueur de taille 1 kb ladder (échelle de lkb, GibcoBRL). 2. Résultats Afin d'exprimer une recombinase Cre dont l'activité soit inductible par des ligands synthétiques du récepteur des glucocorticoides, mais non par des ligands glucocorticoïdes naturels aux concentrations "physiologiques", on a construit un vecteur d'expression, pCre LBD[GR(1747/T)], dérivé du vecteur pCre-ER (28) en remplaçant la séquence d'ADN codant pour les acides aminés 344-618 contenant le LBD du récepteur des oestrogènes (RE), par celle codant pour les acides aminés 500-777 d'un récepteur des glucocorticoïdes (GR) muté contenant le domaine de liaison (LBD) muté du GR(1747/T). La construction de ce plasmide a conduit à l'insertion de la séquence GGTACC, codant pour les aa Gly-Thr en position 624-625 de Cre-L13D[GR(1747/1)] (Figure 7). L'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] a été testée dans une lignée cellulaire murine RXR&alpha;+/-(LNL). Cette lignée a été obtenue en intégrant par recombinaison homologue le gène TK-neo, encadré de sites loxP (en répétition directe) (LNL), dans l'exon 4 d'un allèle du gène RXRa (28). Le gène TK-neo est un gène chimérique permettant l'expression d'une protéine de fusion thymidine kinase/gène de résistance à la néomycine.L'électroporation de cette lignée avec le vecteur pCre LBD[GR(1747/T)] a permis d'évaluer son activité recombinase sans ajout de ligand, ou après addition de conisol (ligand naturel) ou de dexamethasone (Figure 9) (Dex; ligand synthétique) L'ADN des cellules ainsi traitées est en effet soumis à une PCR avec des oligonucléotides synthétiques localisés dans l'exon 4, I'un en amont du site Accu, I'autre en aval de ce site. La taille des fragments PCR obtenus avec cette paire d'oligonucléotides, est de 65 pb pour l'allèle sauvage, de 3345 pb pour l'allèle muté (après intégration de LNL) et de 191 pb pour l'allèle recombiné (après excision des séquences situées entre les deux sites lox et d'un des sites lox, voir figure 8).Suite à un traitement des cellules transfectées à la dexaméthasone (10-6 NI), un fragment de 191 pb est observé, reflétant la présence dc séquences correspondant à l'allèle recombiné, alors qu'en l'abselice de traitement ou suite à un traitement au cortisol (10-6 NI), aucun fragment dc cette taille n'est observé. Ces résultats montrent donc que l'activité recombinase de la protéine de fusion étudiée peut être induite en traitant des cellules exprimant cette protéine avec un ligand synthétique du GR tel que la dexamethasone mais pas avec un ligand naturel tel que le cortisol, à la concentration de 106 NI. On a également établi une lignée RXR&alpha;+/-(LNL) exprimant de façon constitutive Cre-LBD[GR(1747/T)], en cointégrant la cassette d'expression du gène Cre-LBD[GR(1747/T)] avec un vecteur exprimant le gène de résistance à l'hygromycine (RXR&alpha;+/-(LNL) : Cre-GR(1747/T) ; voir "Matériel et Niéthodes" ; données non présentées). L'activité recombinase a été testée suite à un traitement de ces cellules avec de la Dex (10-6M) pendant 72 heures. L'analyse des produits des PCR effectuées sur l'ADN de ces cellules révèle un fragment de 191 pb correspondant à l'allèle recombiné uniquement après traitement à la Dex (Figure 10). Ainsi, il est montré que Cre-LBD[GR(1747/T)] est inactive sans ajout de ligand ou en présence de cortisol à 10-6 121, mais active en présence de Dcx, lorsque sa cassette d'expression est intégrée dans le génome. On a également évalué la cinétique d'action de la recombinase : son activité est détectable dès 12h de traitement à la dexaméthasone à 10-6 M, mais elle est beaucoup plus forte après 72h de traitement (résultats non présentés), L'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] a aussi été testée suite à l'addition de différentes concentrations de ligands. Aucune activité recombinase n'a pu être observée dans les cellules RXRa+/-(LNL):Cre- GR(I747/T) traitées à l'aldostérone, au cortisol ou à la corticostérone (concentration des ligands allant de 10-9 à 10-6 NI), alors qu'en présence de dex, de triamcinolone acetonide ou de RU486, une activité recombinase est observée dès 10-9M (Figure 11). On a également montré à l'aide de cette lignée cellulaire que l'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] peut être induite par des ligands synthétiques, même lorsque les cellules sont cultivées cn présence de ligands naturels (aldostérone, cortisol et corticostérone) à 10-9 ou 10-8 NI. L'excision de séquences localisées entre les sites loxl' est obtenue suite à un traitement de 72h à la dexaméthasone à 10-7M ou 10-6M (Figure 12). L'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] a enfin été testée dans des cellules humaines : des cellules HeLa ont été cotransfectées transitoirement avec les vecteurs pCre-LBD[GR(1747/T)] et pRXR&alpha;(LNL), puis cultivées soit sans ajout de ligand, soit en présence des ligands indiqués sur la Figure 13.Comme dans les cellules B9, une bande de 191 pb, correspondant au fragment recombiné, est amplifiée à partir d'ADN isolé des cellules traitées avec des ligands synthétiques (Dexamethasone, Triamcinolone acetonide ou RU 186 à 10-7 M), alors que sans ajout de ligand, ou en présence de ligands naturels tels que l'aldostérone, la corticostérone ou le cortisol aux memes concentrations, seul le fragment correspondant à l'allèle sauvage peut être détecté. Ces résultats montrent donc que l'activité recombinase de la protéine de fusion Cre-LBD[GR(1747/T)] est induite par des ligands synthétiques du récepteur des glucocorticoïdes, alors qu'elle est insensible aux ligands naturels tels que le cortisol, la corticostérone ou l'aldostérone, mème à des concentrations aussi élevées que 106 NI. Dc plus, la présence de ligands naturels n'empêche pas l'induction de l'activité recombinase de Cre-LBD[GR(1747/T)] par les ligands synthétiques. REFERENCES 1. Evans RNI, 1988, The steroid and thyroid hornlonc receptor superfamily. Science 240:889-895. 2. Beato M., 1989, Gene regulation by steroid hormones. Cell 56:335-344. 3. Green S, Chambon P., 1988, Nuclear receptors enhance our understanding of transcription regulation. Trends Genetique 4:309-314. 4. Parier NIG, 1993, Steroid and related receptors. Curr. Opin. Cell. Biol. 5:499-504. 5. Simons SSJr, 1994, Function/activity of specific amino acids in glucocorticoid receptors, New York. Vitam. 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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: ASSOCIATION POUR LE DEVELOPPEMENT DE LA RECHERCHE GENETIQUE MOLECULAIRE (B) RUE: 26 RUE MONTPENSIER (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 751 (ii) TITRE DE L' INVENTION: "RECEPIEUR NUCLEAIRE DE GLUCOCORTICOIDES MODIFIE, PROTEINE DE FUSION, FRAGMENTS D'ADN CODANT POUR LEDIT RECEPTEUR ET LADITE PROTEINE DE FUSION,VECTEURS, CELLULES ET ANIMAUX EN COMPRENANT ET PROCEDES DANS LESQUELS ILS SONT MIS EN OEUVRE" (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL:PatentIn Release &num;i.e, Version &num;1.3 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2334 nucléotides (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: GR(I747/T) (Récepteur humain des glucocorticoïdes muté en position 747) (B) EMPLACEMENT:1..2331 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 777 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: ATG GAC TCC AAA GAA TCA TTA ACT CCT GGT AGA GAA GAA AAC CCC AGC 48 Met Asp Ser Lys Glu Ser Leu Thr Pro Gly Arg Glu Glu Asn Pro Ser 1 5 10 15 AGT GTG CTT GCT CAG GAG AGG GGA GAT GTG ATG GAC TTC TAT AAA ACC 96 Ser Val Leu Ala Gin Glu Arg Gly Asp Val Met Asp Phe Tyr Lys Thr 20 25 30 CTA AGA GGA GGA GCT ACT GTG AAG GTT TCT GCG TCT TCA CCC TCA CTG 144 Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Lys Val Ser Ala Ser Ser Pro Ser Leu 35 40 45 GCT GTC GCT TCT CAA TCA GAC TCC AAG CAG CGA AGA CTT TTG GTT GAT 192 Ala Val Ala Ser Gln Ser Asp Ser Lys Gln Arg Arg Leu Leu Val Asp 50 55 60 UT CCA AAA GGC TCA GTA AGC AAT GCG CAG CAG CCA GAT CTG TCC AAA 240 Phe Pro Lys Gly Ser Val Ser Asn Ala Gln Gin Pro Asp Leu Ser Lys 65 70 75 80 GCA GTT TCA CTC TCA ATG GGA CTG TAT ATG GGA GAG ACA GAA ACA AAA 288 Ala Val Ser Leu Ser Met Gly Leu Tyr Met Gly Glu Thr Glu Thr Lys 85 90 95 GTG ATG GGA AAT GAC CTG GGA UC CCA CAG CAG GGC CAA ATC AGC CTT 336 Val Met Gly Asn Asp Leu Gly Phe Pro Gln Gln Gly Gln Ile Ser Leu 100 105 118 TCC TCG GGG GAA ACA GAC TTA AAG CTT TTG GAA GAA AGC ATT GCA AAC 384 Ser Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asn 115 120 125 CTC AAT AGG TCG ACC AGT GTT CCA GAG AAC CCC AAG AGT TCA GCA TCC 432 Leu Asn Arg Ser Thr Ser Val Pro Glu Asn Pro Lys Ser Ser Ala Ser 130 135 140 ACT GCT GTG TCT GCT GCC CCC ACA GAG AAG GAG UT CCA AAA ACT CAC 480 Thr Ala Val Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Glu Phe Pro Lys Thr His 145 150 155 160 TCT GAT GTA TCT TCA GAA CAG CAA CAT TTG AAG GGC CAG ACT GGC ACC 528 Ser Asp Val Ser Ser Glu Gln Gln His Leu Lys Gly Gln Thr Gly Thr 165 170 175 AAC GGT GGC AAT GTG AAA TTG TAT ACC ACA GAC CAA AGC ACC UT GAC 576 Asn Gly Gly Asn Val Lys Leu Tyr Thr Thr Asp Gln Ser Thr Phe Asp 180 185 190 ATT TTG CAG GAT TTG GAG UT TCT TCT CGC TCC CCA GGT AAA GAG ACG 624 Ile Leu Gin Asp Leu Glu Phe Ser Ser Gly Ser Pro Gly Lys Glu Thr 195 200 205 AAT GAG AGT CCT TGG AGA TCA GAC CTC TTG ATA GAT GAA AAC TGT TTG 672 Asn Glu Ser Pro Trp Arg Ser Asp Leu Leu Ile Asp Glu Asn Cys Leu 210 215 220 CTT TCT CCT CTG CCC GGA GAA GAC GAT TCA TTC CTT TTG GAA GGA AAC 720 Leu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Asp Asp Ser Phe Leu Leu Glu Gly Asn 225 230 235 240 TCG AAT GAG GAC TGC AAG CCT CTC ATT TTA CCG GAC ACT AAA CCC AAA 768 Ser Asn Glu Asp Cys Lys Pro Leu Ile Leu Pro Asp Thr Lys Pro Lys 245 250 255 ATT AAC GAT AAT GGA GAT CTC GTT TTG TCA AGC CCC AGT AAT GTA ACA 816 Ile Lys Asp Asn Gly Asp Leu Val Leu Ser Ser Pro Ser Asn Val Thr 260 265 270 CTG CCC CAA CTC AAA ACA GAA AAA GAA GAT TTC ATC GAA CTC TGC ACC 864 Leu Pro Gln Val Lys Thr Glu Lys Glu Asp Phe Ile Glu Leu Cys Thr 275 280 285 CCT CGC GTA ATT AAG CAA GAG AAA CTG CCC ACA GTT TAC TGT CAG GCA 912 Pro Gly Val Ile Lys Gln Glu Lys Leu Gly Thr Val Tyr Cys Gln Ala 290 295 300 AGC TTT CCT GGA GCA AAT ATA ATT GGT AAT AAA ATC TCT GCC ATT TCT 960 Ser Phe Pro Gly Ala Asn Ile Ile Gly Asn Lys Met Ser Ala Ile Ser 305 310 315 320 GTT CAT GGT GTC AGT ACC TCT GGA GGA CAG ATG TAC CAC TAT GAC ATG 1008 Val His Gly Val Ser Thr Ser Gly Gly Gln Met Tyr His Tyr Asp Met 325 330 335 AAT ACA GCA TCC CTT TCT CAA CAG CAG GAT CAG AAG CCT ATT UT AAT 1056 Asn Thr Ala Ser Leu Ser Gln Gln Gln Asp Gln Lys Pro Ile Phe Asn 340 345 350 GTC ATT CCA CCA ATT CCC GTT GGT TCC GAA AAT TGG AAT AGG TGC CAA 1104 Val Ile Pro Pro Ile Pro Val Gly Ser Glu Asn Trp Asn Arg Cys Gln 355 360 365 GGA TCT GGA GAT GAC AAC TTG ACT TCT CTC GGG ACT CTC AAC TTC CCT 1152 Gly Ser Gly Asp Asp Asn Leu Thr Ser Leu Gly Thr Leu Asn Phe Pro 370 375 380 GGT CGA ACA GTT UT TCT AAT GGC TAT TCA AGC CCC AGC ATG AGA CCA 1200 Gly Arg Thr Val Phe Ser Asn Gly Tyr Ser Ser Pro Ser Met Arg Pro 385 390 395 400 GAT GTA AGC TCT CCT CCA TCC AGC TCC TCA ACA GCA ACA ACA GGA CCA 1248 Asp Val Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Pro 405 410 415 CCT CCC AAA CTC TGC CTG GTG TGC TCT GAT GAA GCT TCA GGA TGT CAT 1296 Pro Pro Lys Leu Cys Leu Val Cys Ser Asp Glu Ala Ser Gly Cys His 420 425 430 TAT GGA GTC TTA ACT TGT GGA AGC TGT AAA GTT TTC TTC AAA ACA GCA 1344 Tyr Gly Val Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala 435 440 445 GTG GAA GGA CAG CAC AAT TAC CTA TGT GCT GGA AGG AAT GAT TGC ATC 1392 Val Glu Gly Gln His Asn Tyr Leu Cys Ala Gly Arg Asn Asp Cys île 450 455 460 ATC GAT AAA ATT CGA AGA AAA AAC TGC CCA GCA TGC CGC TAT CGA AAA 1440 île Asp Lys Ile Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ala Cys Arg Tyr Arg Lys 465 470 475 480 TGT CTT CAG GCT GGA ATG AAC CTG GAA GCT CGA AAA ACA AAG AAA AAA 1488 Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys Lys Lys 485 490 495 ATA AAA GGA ATT CAG CAG GCC ACT ACA GGA GTC TCA CAA GAA ACC TCT 1536 Ile Lys Gly Ile Gln Gln Ala Thr Thr Gly Val Ser Gln Glu Thr Ser 500 505 510 GAA AAT CCT GGT AAC AAA ACA ATA GTT CCT GCA ACC TTA CCA CAA CTC 1584 Glu Asn Pro Gly Asn Lys Thr Ile Val Pro Ala Thr Leu Pro Gln Leu 515 520 525 ACC CCT ACC CTC GTC TCA CTG TTG GAG GTT ATT GAA CCT CAA GTG TTA 1632 Thr Pro Thr Leu Val Ser Leu Leu Glu Val Ile Glu Pro Glu Val Leu 530 535 540 TAT GCA GGA TAT GAT AGC TCT GTT CCA GAC TCA ACT TGC ACC ATC ATC 1680 Tyr Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Val Pro Asp Ser Thr Trp Arg Ile Met 545 550 555 560 ACT ACC CTC AAC ATG TTA GGA CGC CGC CAA CTC ATT GCA GCA GTG AAA 1728 Thr Thr Leu Asn Met Leu Gly Gly Arg Gln Val Ile Ala Ala Val Lys 565 570 575 TGG GCA AAG GCA ATA CCA GGT UC AGG AAC TTA CAC CTG GAT GAC CAA 1776 Trp Ala Lys Ala Ile Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Leu Asp Asp Gln 580 585 590 ATG ACC CTA CTG CAG TAC TCC TGG ATG UT CTT ATG GCA UT GCT CTG 1824 Met Thr Leu Leu Gln Tyr Ser Trp Met Phe Leu Met Ala Phe Ala Leu 595 600 605 GGG TGG AGA TCA TAT AGA CAA TCA AGT GCA AAC CTG CTG TGT UT GCT 1872 Gly Trp Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Asn Leu Leu Cys Phe Ala 610 615 620 CCT GAT CTG AH ATT AAT GAG CAG AGA ATG ACT CTA CCC TGC ATG TAC 192 Pro Asp Leu Ile Ile Asn Glu Gln Arg Met Thr Leu Pro Cys Met Tyr 625 63 635 640 GAC CAA TGT AAA CAC ATG CTG TAT GTT TCC TCT GAG TTA CAC AGG CTT 1968 Asp Gln Cys Lys His Met Leu Tyr Val Ser Ser Glu Leu His Arg Leu 645 650 655 CAG GTA TCT TAT GAA GAG TAT CTC TGT ATG AAA ACC TTA CTG CTT CTC 2016 Gln Val Ser Tyr Glu Glu Tyr Leu Cys Met Lys Thr Leu Leu Leu Leu 660 665 670 TCT TCA GTT CCT AAG GAC GGT CTG AAG AGC CAA GAG CTA UT GAT GAA 2064 Ser Ser Val Pro Lys Asp Gly Leu Lys Ser Gln Glu Leu Phe Asp Glu 675 680 685 AH AGA ATG ACC TAC ATC AAA GAG CTA GGA AAA GCC AU GTC AAG AGG 2112 Ile Arg Met Thr Tyr Ile Lys Glu Leu Gly Lys Ala Ile Val Lys Arg 690 695 700 GAA GGA AAC TCC AGC CAG AAC TGG CAG CGG UT TAT CAA CTG ACA AAA 2160 Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Trp Gln Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys 705 710 715 720 CTC TTG GAT TCT ATG CAT GAA GTG GTT GAA AAT CTC CTT AAC TAT TGC 2208 Leu Leu Asp Ser Met His Glu Val Val Glu Asn Leu Leu Asn Tyr Cys 725 730 735 TTC CAA ACA UT TTG GAT AAG ACC ATG TCC ACC GAG TTC CCC GAG ATG 2256 Phe Gln Thr Phe Leu Asp Lys Thr Met Ser Thr Glu Phe Pro Glu Met 740 745 750 HA GCT GAA ATC ATC ACC AAT CAG ATA CCA AAA TAT TCA AAT GGA AAT 2304 Leu Ala Glu Ile Ile Thr Asn Gln Ile Pro Lys Tyr Ser Asn Gly Asn 755 760 765 ATC AAA AAA CTT CTG UT CAT CAA AAG TGA 2334 Ile Lys Lys Leu Leu Phe His Gln Lys 770 775 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2004 nucléotides (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN de phage et ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CRE-LBD[GR(I747/T)] protéine de fusion du domaine LBD du récepteur humain des glucocorticoldes muté en position 747 et de la protéine recombinase Cre (B) EMPLACEMENT:1..2001 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 667 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2: ATG TCC AAT TTA CTG ACC GTA CAC CAA AAT TTG CCT GCA TTA CCG GTC 48 Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gîn Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 GAT GCA ACG AGT GAT GAG GTT CGC AAG AAC CTG ATG GAC ATG HC AGG 96 Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg 20 25 30 GAT CGC CAG GCG UT TCT GAG CAT ACC TGG AAA ATG CTT CTG TCC GTT 144 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 TGC CGG TCG TGG GCG GCA TGG TGC AAG TTG AAT AAC CGG AAA TGG UT 192 Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe 50 55 60 CCC GCA GAA CCT GAA GAT GTT CGC GAT TAT CH CTA TAT CTT CAG GCG 240 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gîn Ala 65 70 75 80 CGC GGT CTG GCA GTA AAA ACT ATC CAG CAA CAT TTG GGC CAG CTA AAC 288 Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn 85 9 95 ATG CTT CAT CGT CGG TCC GGG CTG CCA CGA CCA AGT GAC AGC AAT GCT 336 Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala 100 105 110 GTT TCA CTG GTT ATG CGG CGG ATC CGA AAA GAA AAC GTT GAT GCC GGT 384 Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly 115 120 125 GAA CGT GCA AAA CAG GCT CTA GCG HC GAA CGC ACT GAT TTC GAC CAG 432 Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 GTT CGT TCA CTC ATG GAA AAT AGC GAT CGC TGC CAG GAT ATA CGT AAT 480 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn 145 15 155 160 CTG GCA UT CTG GGG ATT GCT TAT AAC ACC CTG TTA CGT ATA GCC GAA 528 Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu 165 170 175 ATT GCC AGG ATC AGG GTT AAA GAT ATC TCA CGT ACT GAC GGT GGG AGA 576 Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 190 ATG TTA ATC CAT ATT GGC AGA ACG AAA ACG CTG GTT AGC ACC GCA GGT 624 Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 GTA GAG AAG GCA CTT AGC CTG GGG GTA ACT AAA CTG GTC GAG CGA TGG 672 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 AH TCC GTC TCT GGT GTA GCT GAT GAT CCG AAT AAC TAC CTG UT TGC 720 Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 CGG GTC AGA AAA AAT GGT GTT GCC GCG CCA TCT GCC ACC AGC CAG CTA 768 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 255 TCA ACT CGC GCC CTG GAA GGG ATT UT GAA GCA ACT CAT CGA TTG ATT 816 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile 260 265 270 TAC GGC GCT AAG GAT GAC TCT GGT CAG AGA TAC CTG GCC TGG TCT GGA 864 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly 275 280 285 CAC AGT GCC CGT GTC GGA GCC GCG CGA GAT ATG GCC CGC GCT GGA GTT 912 His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 TCA ATA CCG GAG ATC ATG CAA GCT GGT GGC TGG ACC AAT GTA AAT ATT 960 Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile 305 310 315 320 GTC ATG AAC TAT ATC CGT AAC CTG GAT AGT GAA ACA GGG GCA ATC GTG 1008 Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val 325 330 335 CCC CTC CTG GAA GAT CCC GAT CTC GAG ATT CAG CAG GCC ACT ACA GGA 1056 Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Leu Glu Ile Gln Gln Ala Thr Thr Gly 340 345 350 CTC TCA CAA GAA ACC TCT GAA AAT CCT GGT AAC AAA ACA ATA GTT CCT 1104 Val Ser Gln Glu Thr Ser Glu Asn Pro Gly Asn Lys Thr Ile Val Pro 355 360 365 CCA ACG TTA CCA CAA CTC ACC CCT ACC CTC GTG TCA CTG TTG GAG GTT 1152 Ala Thr Leu Pro Gln Leu Thr Pro Thr Leu Val Ser Leu Leu Glu Val 370 375 380 ATT GAA CCT GAA GTG TTA TAT GCA GGA TAT GAT AGC TCT GTT CCA GAC 1200 Ile Glu Pro Glu Val Leu Tyr Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Val Pro Asp 385 390 395 400 TCA ACT TGC AGG ATC ATG ACT ACC CTC AAC ATC TTA GGA GGG CGG CAA 1248 Ser Thr Trp Arg Ile Met Thr Thr Leu Asn Met Leu Gly Gly Arg Gln 405 410 415 GTC ATT GCA GCA GTG AAA TGG GCA AAC GCA ATA CCA GGT TTC AGG AAC 1296 Val Ile Ala Ala Val Lys Trp Ala Lys Ala Ile Pro Gly Phe Arg Asn 420 425 430 TTA CAC CTC GAT GAC CAA ATG ACC CTA CTC CAG TAC TCC TGG ATC UT 1344 Leu His Leu Asp Asp Gln Met Thr Leu Leu Gln Tyr Ser Trp Met Phe 435 440 445 CTT ATC GCA TTT GCT CTC GGG TGG AGA TCA TAT AGA CAA TCA AGT GCA 1392 Leu Met Ala Phe Ala Leu Gly Trp Arg Ser Tyr Arg Gin Ser Ser Ala 450 455 460 AAC CTC CTC TGT UT GCT CCT GAT CTC ATT ATT AAT GAG CAG AGA ATC 1440 Asn Leu Leu Cys Phe Ala Pro Asp Leu Ile Ile Asn Glu Gln Arg Met 465 470 475 480 ACT CTA CCC TGC ATC TAC GAC CAA TCT AAA CAC ATC CTG TAT GTT TCC 1488 Thr Leu Pro Cys Met Tyr Asp Gln Cys Lys His Met Leu Tyr Val Ser 485 49 495 TCT GAG TTA CAC AGG CTT CAG GTA TCT TAT GAA GAG TAT CTC TCT ATC 1536 Ser Glu Leu His Arg Leu Gln Val Ser Tyr Glu Glu Tyr Leu Cys Met 500 505 510 AAA ACC TTA CTC CTT CTC TCT TCA GTT CCT AAG GAC GGT CTG AAG AGC 1584 Lys Thr Leu Leu Leu Leu Ser Ser Val Pro Lys Asp Gly Leu Lys Ser 515 520 525 CAA GAG CTA UT GAT GAA ATT AGA ATC ACC TAC ATC AAA GAG CTA GGA 1632 Gln Glu Leu Phe Asp Glu Ile Arg Met Thr Tyr Ile Lys Glu Leu Gly 530 535 540 AAA GCC ATT GTC AAC AGG GAA GGA AAC TCC AGC CAG AAC TGC CAG CGC 168 Lys Ala Ile Val Lys Arg Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Trp Gln Arg 545 550 555 560 UT TAT CAA CTG ACA AAA CTC TTG GAT TCT ATC CAT GAA GTG GTT GAA 1728 Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Met His Glu Val Val Glu 565 570 575 AAT CTC CTT AAC TAT TGC TTC CAA ACA TTT TTG GAT AAC ACC ATC TCC 1776 Asn Leu Leu Asn Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Leu Asp Lys Thr Met Ser 58 585 59 ACC GAG TTC CCC GAG ATC TTA GCT GAA ATC ATC ACC AAT CAG ATA CCA 1824 Thr Glu Phe Pro Glu Met Leu Ala Glu Ile Ile Thr Asn Gln Ile Pro 595 600 605 AAA TAT TCA AAT GGA AAT ATC AAA AAA CTT CTG UT CAT CAA AAG GGT 1872 Lys Tyr Ser Asn Gly Asn Ile Lys Lys Leu Leu Phe His Gln Lys Gly 610 615 620 ACC AGC CGT GGA CGC GCA TCC GTG GAG GAG ACG GAC CAA AGC CAC TTG 1920 Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu 625 63 635 64 GCC ACT CCC GGC TCT ACT TCA TCG CAT TCC TTG CAA AAG TAT TAC ATC 1968 Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile 645 65 655 ACC GGG GAG GCA GAG GGT TTC CCT GCC ACA GTC TGA 2004 Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro Ala Thr Val 660 665 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 694 nucléotides (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: circulaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: pCRE-LBD[GR(I747/T)] plasmide d'expression de la protéine de fusion CRE-LBD[GR(I747/T)] (B) EMPLACEMENT:1..6091 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GTCGACTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG TGGAATGTGT GTCAGTTAGG GTGTGGAAAG 6 TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC 120 AGCTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCGAAGTA TGCAAAGCAT CCATCTCAAT 18 TAGTCAGCAA CCATAGTCCC GCCCCTAACT CCGCCCATCC CGCCCCTAAC TCCGCCCAGT 24 TCCGCCCATT CTCCGCCCCA TGGCTGACTA ATTTTTTTTA TTTATGCAGA GGCCGAGGCC 300 GCCTCGGCCT CTGAGCTATT CCAGAAGTAG TGAGGAGGCT TTTTTGGAGG CCTAGGCTTT 360 TGCAAAAAGC TGGATCGATC CTGAGAACTT CAGGGTGAGT TTGGGGACCC TTGATTGTTC 42 TTTCTTTTTC GCTATTGTAA AATTCATGTT ATATGGAGGG GGCAAAGTTT TCAGGGTGTT 480 GTTTAGAATG GGAAGATGTC CCTTGTATCA CCATGGACCC TCATGATAAT TTTGTTTCTT 540 TCACTTTCTA CTCTGTTGAC AACCATTGTC TCCTCTTATT TTCTTTTCAT TTTCTGTAAC 600 TTTTTCGTTA AACTTTAGCT TGCATTTGTA ACGAATTTTT AAATTCACTT TTGTTTATTT 660 GTCAGATTGT AAGTACTTTC TCTAATCACT TTTTTTTCAA GGCAATCAGG GTATATTATA 720 TTGTACTTCA GCACAGTTTT AGAGAACAAT TGTTATAATT AAATGATAAG GTAGAATATT 780 TCTGCATATA AATTCTGGCT GGCGTGGAAA TATTCTTATT GGTAGAAACA ACTACATCCT 840 GGTCATCATC CTGCCTTTCT CTTTATGGTT ACAATGATAT ACACTGTTTG AGATGAGGAT 900 AAAATACTCT GAGTCCAAAC CGGGCCCCTC TGCTAACCAT GTTCATGCCT TCTTCTTTTT 960 CCTACAGCTC CTGGGCAACG TGCTGGTTAT TGTGCTGTCT CATCATTTTG GCAAAGAATT 1020 GTAATACGAC TCACTATAGG GCGAATTCCA CCATGTCCAA TTTACTGACC GTACACCAAA 1080 ATTTGCCTGC ATTACCGGTC GATGCAACGA GTGATGAGGT TCGCAAGAAC CTGATGGACA 1140 TGTTCAGGGA TCGCCAGGCG TTTTCTGAGC ATACCTGGAA AATGCTTCTG TCCGTTTGCC 1200 GGTCGTGGGC GGCATGGTGC AAGTTGAATA ACCGGAAATG GTTTCCCGCA GAACCTGAAG 1260 ATGTTCGCGA TTATCTTCTA TATCTTCAGG CGCGCGGTCT GGCAGTAAAA ACTATCCAGC 1320 AACATTTGGG CCAGCTAAAC ATGCTTCATC GTCGGTCCGG GCTGCCACGA CCAAGTGACA 1380 GCAATGCTGT TTCACTGGTT ATGCGGCGGA TCCGAAAAGA AAACGTTGAT GCCGGTGAAC 1440 GTGCAAAACA GGCTCTAGCG TTCGAACGCA CTGATTTCGA CCAGGTTCGT TCACTCATGG 1500 AAAATAGCGA TCGCTGCCAG GATATACGTA ATCTGGCATT TCTGGGGATT GCTTATAACA 1560 CCCTGTTACG TATAGCCGAA ATTGCCAGGA TCAGGGTTAA AGATATCTCA CGTACTGACG 1620 GTGGGAGAAT GTTAATCCAT ATTGGCAGAA CGAAAACGCT GGTTAGCACC GCAGGTGTAG 1680 AGAAGGCACT TAGCCTGGGG GTAACTAAAC TGGTCGAGCG ATGGATTTCC GTCTCTGGTG 1740 TAGCTGATGA TCCGAATAAC TACCTGTTTT GCCGGGTCAG AAAAAATGGT GTTGCCGCGC 1800 CATCTGCCAC CAGCCAGCTA TCAACTCGCG CCCTGGAAGG GATTTTTGAA GCAACTCATC 1860 GATTGATTTA CGGCGCTAAG GATGACTCTG GTCAGAGATA CCTGGCCTGG TCTGGACACA 1920 GTGCCCGTGT CGGAGCCGCG CGAGATATGG CCCGCGCTGG AGTTTCAATA CCGGAGATCA 1980 TGCAAGCTGG TGGCTGGACC AATGTAAATA TTGTCATGAA CTATATCCGT AACCTGGATA 2040 GTGAAACAGG GGCAATGGTG CGCCTGCTGG AAGATGGCGA TCTCGAGATT CAGCAGGCCA 2100 CTACAGGAGT CTCACAAGAA ACCTCTGAAA ATCCTGGTAA CAAAACAATA GTTCCTGCAA 2160 CGTTACCACA ACTCACCCCT ACCCTGGTGT CACTGTTGGA GGTTATTGAA CCTGAAGTGT 2220 TATATGCAGG ATATGATAGC TCTGTTCCAG ACTCAACTTG GAGGATCATG ACTACGCTCA 2280 ACATGTTAGG AGGGCGGCAA GTGATTGCAG CAGTGAAATG GGCAAAGGCA ATACCAGGTT 2340 TCAGGAACTT ACACCTGGAT GACCAAATGA CCCTACTGCA GTACTCCTGG ATGTTTCTTA 2400 TGGCATTTGC TCTGGGGTGG AGATCATATA GACAATCAAG TGCAAACCTG CTGTGTTTTG 2460 CTCCTGATCT GATTATTAAT GAGCAGAGAA TGACTCTACC CTGCATGTAC GACCAATGTA 2520 AACACATGCT GTATGTTTCC TCTGAGTTAC ACAGGCTTCA GGTATCTTAT GAAGAGTATC 2580 TCTGTATGAA AACCTTACTG CTTCTCTCTT CAGTTCCTAA GGACGGTCTG AAGAGCCAAG 2640 AGCTATTTGA TGAAATTAGA ATGACCTACA TCAAAGAGCT AGGAAAAGCC ATTGTCAAGA 2700 GGGAAGGAAA CTCCAGCCAG AACTGGCAGC GGTTTTATCA ACTGACAAAA CTCTTGGATT 2760 CTATGCATGA AGTGGTTGAA AATCTCCTTA ACTATTGCTT CCAAACATTT TTGGATAAGA 2820 CCATGTCCAC CGAGTTCCCC GAGATGTTAG CTGAAATCAT CACCAATCAG ATACCAAAAT 2880 ATTCAAATGG AAATATCAAA AAACTTCTGT TTCATCAAAA GGGTACCAGC CGTGGAGGGG 2940 CATCCGTGGA GGAGACGGAC CAAAGCCACT TGGCCACTGC GGGCTCTACT TCATCGCATT 3000 CCTTGCAAAA GTATTACATC ACGGGGGAGG CAGAGGGTTT CCCTGCCACA GTCTGAGAGC 3060 TCCCTGGAAT TCGGATCTTA TTAAAGCAGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA 3120 AATAAAGCAA TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT 3180 GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GTCGACTCTA GACTCTTCCG 3240 CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC 3300 ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT 3360 GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC 3420 ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA 3480 ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC 3540 CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG 3600 CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC 3660 TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC 3720 GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA 3780 GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT 3840 ACGGCTACAC TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG 3900 GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT 396# TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT 4#2# TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA 4#8# GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA 414# TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC 42## CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA 426# TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC 432# CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA 438# GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA 444# GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG 45## TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC 456# GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG 462# TTGTCAGAAG TAACTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT 468# CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT 474# CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA 48## ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC 486# GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC 492# CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA 498# GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT 5#4# TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT 51## TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC 516# CACCTGACGT CTAAGAAACC ATTATTATCA TGACATTAAC CTATAAAAAT AGGCGTATCA 522# CGAGGCCCCT TTCGTCTCGC GCGTTTCGGT GATGACGGTG AAAACCTCTG ACACATGCAG 528# CTCCCGGAGA CGGTCACAGC TTGTCTGTAA GCGGATGCCG GGAGCAGACA AGCCCGTCAG 534# GGCGCGTCAG CGGGTGTTGG CGGGTGTCGG GGCTGGCTTA ACTATGCGGC ATCAGAGCAG 54## ATTGTACTGA GAGTGCACCA TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGGGT AAGGAGAAAA 546# TACCGCATCA GGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT 552# AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG 558# AATAGACCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA 564# ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG 57## AACCATCACC CTAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC 576# CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG 582# AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC 588# GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC CGCCATTCGC 504# CATTCAGGCT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCG CTATTACGCC 6### AGCTGGCGAA AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA GGGTTTTCCC 6#6# AGTCACGACG TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AATT 6#94 REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN codant pour un récepteur nucléaire de glucocorticoïdes modifié, notamment muté dans la région codait pour le domaine de liaison du ligand, de sorte que l'activité dudit récepteur est inductible plus fortement par un ligand glucocorticoïde synthétique que par un ligand glucocorticoïde naturel. 2. Fragment d'ADN codant pour le récepteur nucléaire des glucocortieoïdes sauvage avec une mutation isoleucine -- > thréonine située entre les hélices H1 l et 1112 de la séquence d'acides aminés dudit récepteur. 3. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codant pour le récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes dont la séquence en acides aminés est substantiellement telle que représentée dans L'IDES n 1. 4. Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il a pour séquence la séquence de l'ADNc du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes substantiellement telle que représentée dans l'IDS n 1 5. Fragment d'ADN codant pour un domaine de liaison du ligand (LBD) d'un récepteur nucléaire des glucocorticoides comportant une modification, notamment une mutation de sorte que l'activité dudit domaine de liaison du ligand est inductible plus fortement par liaison à un ligand glucocorticoïde synthétique que par liaison à un glucocorticolde naturel. 6. Fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes naturel avec une mutation isoleucine -- > thréonine en position correspondant à la position 747 de la séquence en acides aminés dudit récepteur complet. 7. Fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codant pour les acides aminés du domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes dont la séquence en acides aminés est substantiellement telle que représentée dans l'IL)S n 1 de l'acide aminé 532 à l'acide aminé 777. 8. Fragment d'ADN selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il a pour séquence la séquence codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) du récepteur nucléaire humain des glucocorlieoïdes substantiellement telle que représentée dans l'lDS n 1 du codon 532 au codon 777. 9. Récepteur nucléaire des glucocorticoides modifié, notamment muté dans la région du domaine de liaison du ligand, de sorte que l'activité dudit récepteur est inductible plus fortement par un ligand glucocorticoïde synthétique que par un ligand glucocorticoïdc naturel. 10. Récepteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, la séquence en acides aminés du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes sauvage avec une mutation isoleucine -- > thréonine située entre les hélices H1 l et et 2. 11. Récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il a pour séquence en acides aminés, une séquence substantiellement telle que représentée dans l'IDS n"l. 12. Domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire des glucocorticoldes selon l'une des revendications 9 à 11. 13. Domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes LBD [GR(1747/T)], caractérisé en ce qu'il a pour séquence, la séquence en acides aminés du domaine de liaison du ligand du récepteur des glucocorticoïdes humain substantiellement telle que représentée dans l'IDS n 1 de l'acide aminé 532 à l'acide aminé 777. 14. Système vectoriel d'expression conditionnelle d'une protéine notamment une protéine étrangère dans des cellules hôtes comportant un élément de contrôle de la transcription inductible par un complexe formé par un récepteur nucléaire des glucocorticoïdes et un ligand, caractérisé en ce qu'il comprend - un premier fragment d'ADN consistant en un fragment d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans lesdites cellules hôtes, lesdits éléments assurant son expression comprenant une séquence de contrôle de transcription (RE) inductible par le récepteur selon l'une des revendications 9 à 11, complexé à un ligand glucocorticoïde synthétique, et - un deuxième fragment d'ADN consistant en un fragment d'ADN fonctionnel codant pour ledit récepteur selon l'une des revendications 1 à 4 ou seulement une partie dudit fragment comprenant la région qui reconnait le ligand (L13D) selon l'une des revendications 5 à 8, et la région de liaison à l'ADN (DBD) qui se Fixe sur ladite séquence de contrôle de la transcription (RE), - lesdits premier et deuxième fragments d'ADN pouvant être portés par un même vecteur ou deux vecteurs séparément. 15. Système vectoriel selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte I'ADNc codant pour: - la région LBD, représentée par des codons codant les acides aminés n 532 à 777 dans L'IDES n 1, et - la région DBD, représentée par des codons codant les acides aminés n 421 à 487 dans L'IDES n 1. 16. Système vectoriel selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on remplace la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN (DBD) du récepteur des glucocorticoïdes par celle d'un autre transactivateur, notamment celui de la protéine dc levure Gal 4 et on remplace la séquence de contrôle de transcriptioi (RE) du récepteur des glucocorticoïdes par celle reconnue par ledit autre transactivateur, notamment la séquence 17m reconnue par le transacti'ateur Gal 4. 17. Procédé d'expression d'une protéine étrangère dans des cellules humaines ou animales notamment de mammifères, caractérisé en ce que l'on cultive des cellules qui contiennent un système vectoriel selon l'une des revendications 14 à 16, et en ce qu'on ajoute ledit ligand synthétique, dans le milieu de culrure, puis on récupère la protéine synthétisée. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé cn cc que ledit ligand synthétique est choisi parmi la dexaméthasone, le triamcinolone acétonide, le RU2836, le bimétrazole, le déacylcortivazol et le fluocinolone acetonide. 19. Gène de fusion comprenant un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 8 et un fragment d'ADN codant pour une protéine dont on veut réguler l'activité, ladite activité étant inductible plus fortement par liaison dudit récepteur ou dudit domaine de liaison du ligand du récepteur avec undit ligand glucocorticoide synthétique qu'avec un ligand glucocorticolde naturel, lorsque ladite protéine se trouve fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand dudit récepteur. 20. Gène de fusion selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine recombinase. 21. Gène de fusion selon la revendication ZO, caractérisé en ce que ladite protéine est une recombinase de la famille des intégrasses L 22. Gène de fusion selon la revendication 21, caractérisé en ce que la protéine recombinase est la recombinase Cre du bactériophage P1. 23. Gène de fusion selon la revendication 22, comprenallt un fragment d'ADN codant pour la protéine recombinase Cre du bactériophage P1, et le fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire humain des glucocorticoides modifié selon l'une des revendications 5 ou 8. 24. Gène de fusion selon la revendication 23, comprenant dans le sens 5'-- > 3': - un fragment d'ADN codant pour la recombinase Cre du bactériophage 1'1; PI - un fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la région charnière D du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes, région située entre le domaine DBD et le domaine LBD, et - le fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) modifié, notamment muté, du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes selon l'une des revendications 5 ou 8. 25. Gène de fusion selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il a pour séquence une séquence codant pour les acides aminés de l'IDS n" 2 comprenant - les acides aminés 1 à 343 qui correspondent à la recombinase Cre - les acides aminés 34G à 377 qui correspondent à la région C terminale de la région D du récepteur humain des glucocorticoïdes; - les acides aminés 378 à 623 qui correspondent au LBD [GR(l747/T)]. 26. Gène de fusion selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il a substantiellement la séquence Cre-LBD[GR(1747/T) telle que représentée dans L'IDES n" 2 dont les acides aminés 626 à 667 correspondent à la région F du récepteur humain des oestrogènes. 27. Vecteur d'expression de la protéine de fusion codée par le gène de fusion selon l'une des revendications 19 à 26 dans des cellules hôtes animales notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte le gène de fusion selon l'une des revendications 19 à 2G, placé sous le contrôle d'éléments d'expression assurant son expression dans lesdites cellules hôtes. 28. Protéine de fusion comprenant un récepteur selon l'une des revendications 9 à 11 ou un domaine de liaison du ligand selon l'une des revendications 12 ou 13 et une protéine dont l'activité est inductiblc plus fortement par liaison dudit récepteur ou dudit domaine dc liaison du ligand (LBD) avec undit ligand glucocorticoïde synthétique qu'avec un ligand glucocorticoïdc naturel. 29. Protéine de fusion selon la revendication 28, caractérisée en ce que la protéine est une protéine recombinase. 30. Protéine de fusion selon la revendication 2Ö, caractérisée cn ce que la protéine est une protéine recombinase de la famille des intégrases s. 31. Protéine de fusion selon la revendication 30, caractérisée en ce que la recombinase est la protéine Crc du bactériophage Pl. 32. Protéine de fusion selon la revendication 31, comportant en outre la partie C- terminale de la région charnière D du récepteur nucléaire humain des glucocorticoïdes, intercalée entre la protéine Cre et ledit domaine de liaison du ligand du récepteur modifié selon l'une des revendications 12 ou 13. 33. Procédé de recombinaison, notamment, d'excision, insertion, inversion ou translocation conditionnelle au niveau d'un fragment d'ADN contenant un ou deux sites de reconnaissance spécifique d'une protéine recombinase dans des cellules hotes animales, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes dans lesquelles 1) on introduit une protéine de fusion selon l'une des revendications 29 à 32 ou un vecteur d'expression dc ladite proteine de fusion selon la revendication 27 dans lesdites cellules hôtes dans des conditions permettant l'expression d'une protéine de fusion selon l'une des revendications 29 à 32 et, 2) on complexe ladite protéine dc fusion avec ledit ligand glucocorticoïde synthétique, cn mettant ledit ligand cn présence desdites cellules hôtes. 34. Procédé de délétion conditionnelle d'un fragment d'ADN dans un gène dans lequel on met en oeuvre un procédé d'excision selon la revendication 33, et dans lequel ledit Fragment d'ADN à exciser est intégré entre deux sites de reconnaissance dc protéine recombinase orientés en répétition directe. 35. Procédé selon l'une des revendications 33 ou 34, caractérisé en ce que lesdits sites de reconnaissance spécifique de protéine recombinase SOIlt les sites loxP et ladite protéine recombinase est la protéine Cre du bactériophage PI. 36. Procédé selon l'une des revendications 33 à 35, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN que l'on veut exciser et lesdits sites de reconnaissance spécifiques d'une protéine recombinase sont portés par un vecteur plasmidique ou viral, ou intégrés dans un chromosome des cellules hôtes. 37. Procédé selon l'une des revendications 33 à 36, caractérisé en ce que l'intégration des sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase, notamment du ou des sites loxP, se fait par recombinaison homologue du gène comportant ledit fragment d'ADN à insérer ou transloquer ou respectivement à exciser ou inverser avec undit gène modifié comportant ledit fragment d'ADN flanqué en 5' et/ou 3' par le ou lesdit(s) site(s) de reconnaissance de recombinase, notamment site(s) loxP. 38. Vecteur de transfert d'un fragment d'ADN dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte undit fragment d'ADN à transférer comprenant des sites de reconnaissance spécifiques dc la recombinase, notamment deux sites loxP orientés à répétition directe et une cassette d'expression d'un gène de fusion selon l'une des revendications 19 à 26. 39. Vecteur selon la revendication 38, caractérisé en ce que le gène de fusion est placé sous le contrôle d'éléments d'expression spécifiques des cellules hôtes. 40. Vecteur selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence du plasmide pCre-LBD[GR(1747/T)] de l'IDS n 3. 41. Procédé selon l'une des revendications 33 à 37, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN à exciser a été transféré, notamment intégré dans le chromosome desdites cellules, à l'aide d'un vecteur de transfert selon la revendication 38. 42. Vecteur selon la revendication 27 ou 38 pour une utilisation comme médicament en thérapie génique en combinaison avec un ligand glucocorticoïde synthétique, notamment la dexaméthasone. 43. Cellule humaine ou animale, notamment de mammifères transfectée par un vecteur d'expression d'une protéine de fusion selon la revendication 27. 44. Cellule humaine ou animale, dans laquelle un fragment d'ADN a été transféré à l'aide d'un vecteur, selon l'une des revendications 38 ou 39. 45. Cellule animale, notamment de mammifères exprimant de façon constitutive la protéine de fusion selon I'une des revendications 28 à 32. 16. Animal transgénique, notamment souris, comportant un gène fonctionnel de la protéine de fusion selon l'une des revendications 28 à 32 notamment intégré dans un de ses chromosomes. 47. Animal transgénique selon la revendication 46 dans lequel un gène d'intérét est modifié par insertion dc un ou plusieurs sites loxP, notamment intégré(s) dans un ou plusieurs de ses chromosomes. 48. Utilisation d'un vecteur, de cellules ou d'un animal selon l'une des revendications 45 à 47, comme outil d'analyse ou étude de fonctionnement d'un gène donné d'une cellule hôte. 49. Méthode de traitement des cellules ex vivo ou in vitro impliquant la misc en oeuvrc d'un procédé selon l'une des revendications 33 à 37 ou 41 et l'utilisation d'un vecteur selon la revendication 42.