Brevet FR2740656A1 — publié le 19970509

VEGETAL POSSEDANT LA STERILITE CYTOPLASMIQUE MALE DE LA FAMILLE COMPOSITAE ET EGALEMENT PROCEDE D'OBTENTION DE CE VEGETAL L'invention concerne un végétal possédant la stérilité cytoplasmique mâle de la famille Compositae conforme à la revendication principale, c'est à dire, concerne de nouvelles lignées mères de ce végétal de ladite famille. L'invention concerne en outre un procédé d'obtention du végétal susmentionné possédant la stérilité cytoplasmique mâle, ainsi que la graine hybride obtenue des nouvelles lignées mères de la famille Comnositae. Dans le monde des phytogénéticiens il est habituel de combiner des propriétés héréditaires de deux lignées mères de l'hybride par croisement. Si les deux lignées mères sont à pollinisation directe, la pollinisation directe est empêchée, par exemple par retrait des anthères (appelé émasculation), afin de garantir que les propriétés héréditaires désirées des deux parents sont présentes dans l'hybride. Cet hybride est également appelé hybride F1, et est d'une grande importance dans le monde des phytogénéticiens. Les hybrides F1 sont habituellement caractérisés par un degré très élevé d'uniformité (couleur, goût, taille et similaires), une vigueur importante et un rendement élevé des parties végétales, telles que les fruits et similaires, qui peuvent être commercialisées.Un avantage supplémentaire d'un hybride F1 en particulier pour les sociétés spécialisées en phytogénétique est surtout le fait qu'il n'est pas possible de cultiver des produits de la même qualité par la lignée provenant de la graine obtenue de celui-ci (hétérogénéité plus importante et rendement plus faible), de telle sorte que la société est garantie d'une protection inhérente de son hybride F1, tel qu'il était.Avec les végétaux de la famille ComDositae le développement de lignées mères et la production commerciale de graine hybride pure F1 est très problématique, parce que ces végétaux sont en général à pollinisation directe et parce que les mesures d'anti-pollinisation directe qui ont été utilisées jusqu'à présent non seulement nécessitent beaucoup de temps et de travail, mais se sont surtout avérées être insuffisamment précises. En conséquence, ce dernier fait a pour résultat des lots de graines qui ne sont pas d'une qualité uniforme. Par exemple, avec des choux (Brassica oleracea) il n'est actuellement pas possible de produire des hybrides F1 purs à 100% en utilisant des techniques modernes. Le fait est qu'avec le radis (RaPhanus sativus), qui comme le chou appartient à la famille Cruciferae, il a été trouvé un cytoplasme entraînant la stérilité mâle, lequel cytoplasme est également connu sous le nom de cytoplasme Ogura à CMS. Les mitochondries du cytoplasme Ogura CMS sont introduites dans les végétaux Brassica oleracea par fusion des protoplastes, d'où il résulte que le noyau et les chloroplastes (granules de chlorophylle) proviennent tous de végétaux Brassica oleracea normalement fertiles. Ainsi les végétaux Brassica oleracea à CMS sont obtenus.Actuellement aucun hybride F1 de végétaux importants de la famille Composite n'est encore disponible, malgré la forte demande sur le marché. Le cytoplasme Ogura à CMS susmentionné ne peut pas être utilisé avec des végétaux de la famille Compositae, en raison de l'incompatibilité génétique entre les espèces desdites familles. L'objet de l'invention est d'introduire la stérilité cytoplasmique mâle dans un végétal de la famille Comositae, et à cette fin le cytoplasme de ce végétal est pourvu de mitochondries comprenant de l'ADN qui a pour origine au moins partiellement une autre espèce de la famille Compositae et qui est porteur de stérilité cytoplasmique mâle (CMS). De manière surprenante les recherches ont montré que malgré la forte incompatibilité génétique des espèces végétales de la famille Compositae, I'introduction de la CMS dans un végétal de la famille Composite provenant d'un végétal d'une autre espèce de la même famille, par fusion des protoplastes, est très possible.De préférence le végétal est phénotypiquement un végétal possédant la stérilité cytoplasmique mâle, c'est à dire la stérilité mâle (généralement définie comme étant l'incapacité d'un végétal à produire des graines de pollen fertiles) s'est manifestée elle-même dans le végétal. En raison de l'hérédité cytoplasmique de la CMS toute la lignée de cette plante stérile mâle possède cette propriété inchangée. II apparaîtra de manière évidente que la forme précédente d'une transmission héréditaire de la CMS génotypique est d'une grande importance pour le développement efficace de lignées mères des espèces végétales et pour la production subséquente d'hybrides F1. II faut noter que le végétal ne doit pas nécessairement posséder phénotypiquement la stérilité cytoplasmique mâle, mais qu'il est également possible pour le noyau de posséder ce qu'on appelle des "gènes réparateurs", qui phénotypiquement annihilent la stérilité mâle, c'est à dire l'empêchent de se manifester elle-même dans le végétal malgré la présence d'ADN dans le cytoplasme, qui est un porteur de la CMS. Dans ce cas il sera nécessaire de maintenir le croisement jusqu'à ce qu'une plante possédant la CMS phénotypique soit obtenue. Dans un premier mode de réalisation conforme à l'invention le cytoplasme du végétal comprend en outre un génome nucléaire et un génome chloroplastidial spécifiques de l'espèce qui sont normaux pour le végétal en question. En raison du fait qu'un noyau et des chloroplastes du végétal à fertilité normale sont présents à l'état non modifié (dans le cas du noyau c'est habituellement une situation de diploïdie), le produit est un produit pur à 100%. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention l'autre espèce de la famille Compositae a été choisie dans le groupe constitué de Helianthus spp et Circium spp. Ces espèces se sont avérées contenir la CMS. II a été choisi plus particulièrement Helianthus annuus (L.) (tournesol) avec la CMS du type pétiolaris. De manière surprenante l'introduction de la CMS à partir de ces plantes possédant génotypiquement la stérilité cytoplasmique mâle peut se faire d'une manière efficace par fusion des protoplastes, malgré l'incompatibilité génétique. A ce sujet il faut noter que la transmission de la CMS à partir des végétaux susmentionnés aux végétaux appartenant à la même famille ne peut pas être réalisée en utilisant des procédés classiques, en raison de barrières de croisement. Conformément à l'invention l'autre espèce introduisant la CMS (le "donneur"), qui appartient à la famille Compositae, peut également être une espèce qui ne contient pas la CMS, mais qui introduit ce qu'on appelle une forme "alloplasmique" de la CMS dans le végétal par fusion des protoplastes. Conformément à l'invention une espèce de ce type est de préférence choisie dans le groupe constitué de Chrvsanthenum, Senecio, Centaurea, Sonchus, Hieracium, Taaetes, Dahlia et Aster. De bons résultats ont été obtenus conformément à l'invention en particulier avec Chrvsanthenum, plus particulièrement avec Sonchus. Dans un autre mode de réalisation conforme à l'invention le végétal a été choisi dans le groupe constitué de Cichorium intvbus (L.) var. foliosum (Heai) (chicorée), Cichorium endivia (L.) (endive), Lactuca sativa (L.) (laitue), Scorzonera hisoanica (L.) (salsifis noir), Cvnara scolvmus (L.) (artichaut) et Taraxacum officinale (L.) (pissenlit). Des expériences approfondies ont montré qu'en particulier Lactuca sativa, mais particulièrement Cichorium intybus (L.) var. foliosum et Cichorium endivia possèdaient l'avantage important qu'il n'est perdu aucune autre propriété qui n'est pas caractéristique du végétal à la suite de l'introduction de la CMS. L'invention concerne en outre les graines ou parties végétales provenant du végétal conforme à l'invention. Les étapes générales du procédé d'obtention de végétaux, de graines ou de parties végétales possédant la CMS et appartenant à la famille ComDositae conforme à l'invention comprennent: - I'isolation de protoplastes (cellules végétales dont la membrane cellulaire a été retirée) de tissus de divers végétaux appartenant à la famille ComDositae, ci-après appelé "accepteur", et de tissus d'une autre espèce de la famille ComDositae, par exemple Helianthus soucies, ciaprès appelé "donneur" (voir l'exemple 1); - le traitement facultatif des protoplastes, par exemple par irradiation, cytoplastisation ou par des produits chimiques spécifiques, qui en outre dans le procédé a pour résultat une augmentation du rendement (voir exemple 2);; - la fusion des protoplastes (fusion in vitro de cellules), par exemple sous l'influence de substances chimiques, ou en utilisant l'électricité (voir exemple 3); - la réalisation subséquente et facultative d'un ou de plusieurs procédés dont le résultat est une certaine forme de sélection de cellules hybrides; cellules résultant de la fusion d'un ou de plusieurs protoplastes accepteurs avec un ou plusieurs protoplastes donneurs (voir exemple 4); - la culture subséquente de cellules et leur régénération pour donner des végétaux complets (voir exemple 5); - la sélection d'individus de la collection de régénérants ainsi obtenus par analyse d'ADN mitochondrial, chloroplastidial et génomique, suivi de l'évaluation phénotypique des propriétés du végétal (voir exemple 6); - le croisement spécifique des individus précédents, ou de leur lignée, avec d'autres génotypes de la même espèce et d'autres espèces (voir exemple 7); - la production de graines à grande échelle. L'invention sera expliqué plus en détail ci-après en se référant aux exemples (auxquels il a été déjà été fait référence brièvement cidessus) discutés cidessous, qui constituent tous les modes de réalisation préférés du procédé conforme à l'invention. Afin de ne pas compliquer ces exemples inutilement, les exemples sont fondés sur Helianthus annuus (L.) qui est le donneur. Comme cela a déjà été expliqué précédemment, I'invention conceme d'une manière générale un donneur de la famille ComDositae d'une espèce autre que le végétal et n'est par conséquent pas limitée au donneur cité en référence dans les exemples. Dans tous les exemples cidessous les opérations doivent être réalisées de manière aseptique et toutes les solutions, milieux (dont les compositions seront décrites à une étape ultérieure) et instruments à utiliser doivent être stériles. Les boîtes de Pétri sont en outre scellées avec une couche pelliculaire, telle que Fuji, Nesco ou Parafilm. Exemple 1: Culture de matériau accepteur; feuille in vitro de chicorée, d'endive et'ou de laitue Laver les graines avec de l'éthanol à 70% pendant 10 secondes, stériliser ensuite pendant 10 minutes dans du Na-hypochlorite à 1%, laver ensuite complètement avec de l'eau stérile. Ensemencer de manière aseptique dans un conteneur de culture tissulaire à usage unique avec environ 75ml de milieu MS (environ 8 graines/boîte). Cultiver à 25"C à la lumière (16 heures d'éclairement; environ 2000 lux/8 heures d'obscurité). Au bout de deux semaines environ les jeunes semis sont placés dans une boîte avec un milieu frais de MS (1 semis/boîte). Un mois après l'ensemencement les végétaux sont prêts à être utilisés comme matériau de départ. Isolation des protoplastes provenant de feuille de matériau accepteur; chicorée, endive et laitue Couper le matériau en feuille in vitro (+95cl2) avec un scalpel dans une boîte de Pétri (TC, diamètre 9 cm) avec environ 10ml de PPO. Remplacer la solution après avoir coupé à raison de 10ml de solution de macération. Incubation: immobile, sombre, 25"C, environ 16 heures. Filtration à travers un tamis de nylon de 45pm, lavage final et dilution de la suspension avec environ 3 volumes de solution de lavage. Centrifuger la suspension de protoplastes dans des tubes à centrifugation de 15ml pendant 5mn à 600 tours par minute (= 63 x g). Laver le dépôt deux fois avec 15ml de solution de lavage, centrifuger ensuite pendant 5mn à 600 tours par minute. Les protoplastes (pps) sont maintenant prêts pour la fusion ou pour la culture, maintenant une étape d'inactivation, de préférence un traitement à l'acétate d'iode, peut être réalisée, si on le souhaite. Culture du matériau donneur; hypocotyles de tournesol Les hypocotyles étiolés sont choisis comme matériau de départ du donneur duquel les protoplastes sont isolés. En comparaison avec la feuille, qui est choisie comme tissu "accepteur", ce matériau végétal contient une quantité bien plus grande de mitochondries. De plus, les hypocotyles ne contiennent aucun chloroplaste (ils contiennent certainement un certain nombre de proplastides), contrairement aux cellules de la feuille. Cette sélection tissulaire conduit à une chance plus importante d'obtenir la composition correcte en organelles d'un produit de fusion. De plus cette sélection tissulaire permet la sélection optique à la suite de la fusion; les produits de fusion des protoplastes donneur et accepteur sont reconnaissables. Stériliser les graines de tournesol dans du Na-hypochlorite à 1% pendant 1 Omn, laver ensuite complètement avec de l'eau stérile. Ensemencer dans des boîtes de réplication avec du milieu MS. Obscurité, 25"C. Isolation des protoplastes du matériau donneur; tournesol Couper la moitié supérieure des hypocotyles dans du PPO 15 au bout de 5 jours, couper les parties hypocotyles très finement dans une boîte de TC de 9cm avec 10ml de PPO, renouveler la solution de PPO après avoir coupé et laisser reposer pendant 1 heure, obscurité (température ambiante). Remplacer la solution de PPO par une solution de macération. Incubation: immobile, obscurité, 25"C, 16 à 18 heures (coloration possible au FITC/FDA; 2 gouttes de solution mère saturée, dans de l'acétone, dans 1 Oml de solution de macération). Filtration dans un tamis de nylon de 45pm, lavage final avec la solution de lavage. Centrifuger pendant 8 minutes à 600 tours par minute. Laver de nouveau le dépôt avec la solution de lavage; centrifuger pendant 8 minutes à 600 tours par minute. Les protoplastes (pps) sont maintenant prêts pour la fusion. Maintenant une étape d'inactivationlélimination du noyau, par exemple irradiation ou cytoplastisation, peut être réalisée, si on le souhaite. Les conditions de culture de la chicorée/endive ou de la laitue sont cependant telles que les chloroplastes de tournesol forment en fait des parties ou des cals, mais qu'il n'y a aucune régénération des pousses. Exemple 2: Inactivation du cytoplasme accepteur; traitement à l'acétamide d'iode Tout comme l'acétate d'iode, I'acétamide d'iode est un inhibiteur biochimique orienté vers le cytoplasme. II est utilisé ici pour inactiver les mitochondries des protoplastes accepteurs, en conséquence de quoi ces cellules peuvent à peine survivre, si tant est que ce soit possible. Cela donne aux mitochondries du donneur dans un produit de fusion un avantage sélectif sur celles de l'accepteur, tandis qu'en outre la croissance continue des produits de fusion est supportée de préférence à celle des protoplastes de l'accepteur en utilisant cette substance chimique.Le traitement des protoplastes avec l'acétamide d'iode se fera par exemple de la manière suivante: Solution mère de 60mM, utiliser 1 à 5mM (de préférence 2,5mM) dans la solution de lavage avec une densité de cellules comprise entre 104 et 106 (de préférence 1 0), incuber pendant 5 à 30 minutes. (de préférence 15 minutes) à une température comprise entre 2 et 22"C, plus particulièrement à 4"C. Laver ensuite les protoplastes traités complètement avec la solution de lavage. Introduire ensuite les protoplastes dans la solution de fusion. Inactivation du noyau donneur; irradiation L'irradiation par rayons X, gamma ou ultraviolets a pour but la fragmentation de l'ADN chromosomique des protoplastes donneurs, en conséquence de quoi ces cellules ne peuvent plus se diviser. De plus, à la suite de cela le noyau du donneur dans un produit de fusion aura un inconvénient sélectif en comparaison avec l'accepteur. L'avantage de l'irradiation est que les membranes protoplastidiales ne sont pas trop endommagées, ce qui est important parce que la fusion peut y avoir un effet désastreux. L'inconvénient est, cependant, que le noyau reste présent, même à l'état fragmenté, avec en corollaire le risque d'une transmission au moins partielle d'ADN chromosomique du donneur à l'accepteur. L'irradiation par rayons X se fera par exemple de la manière suivante: placer le pps à l'état suspendu dans un milieu de culture de pps à une densité d'environ 2,5 x 106 pps/ml dans une boîte de Pétri TC de 6cm (2ml) sous une source de rayons X (par exemple Baltobloc CE 100) à une distance appropriée, de telle sorte que la dose sera de 10rad par minute, pendant 3 à 20 minutes (de préférence 5 minutes). Laver ensuite les cellules deux fois avec la solution de lavage. L'irradiation gamma se fait habituellement au moyen d'une source de Cobalt 60. De même ici les protoplastes sont introduits dans du milieu de culture de pps. Une dose appropriée est de 2 à 30 krad. Suivi d'un lavage deux fois dans une solution de lavage. Elimination du noyau du donneur; cytoplastisation Lors de la cytoplastisation le noyau est retiré du protoplaste, de telle sorte que la seule chose qui reste est un cytoplaste qui contient des mitochondries et des protoplastides. II y a plusieurs moyens pour réaliser cela. Par exemple, la différence de masse spécifique entre le noyau et le cytoplaste peut être utilisée. Le noyau est littéralement chassé de la cellule par centrifugation à haute vitesse et un gradient discontinu (percolle/sucrose), avec possibilité de la présence de cytochalacine-B. Un procédé différent plus doux est d'effectuer une forte plasmolyse pendant l'incubation enzymatique, en utilisant une solution de macération ayant une osmolarité relativement élevée (par exemple 0,7M de Mannitol), dans cet état les cytoplastes sont formés spontanément; jusqu'à 40% des cellules.Ces cytoplastes peuvent ensuite être séparés des protoplastes en utilisant la différence de masse spécifique entre protoplastes et cytoplastes. Le mélange pps/cps est chargé sur un gradient percollelmannitol et refractionné par centrifugation à vitesse faible (160 x g; 10 minutes). Le succès de ces opérations dépend dans une large mesure de la sélection du matériau de départ. Une combinaison des procédés décrits précédemment est possible, si nécessaire. Bien sûr les cytoplastes sont lavés (solution de lavage) après purification, et sont introduits dans la solution de fusion. Un avantage essentiel des cytoplastes est que le noyau est éliminé, ce qui élimine la possibilité de transmission d'ADN chromosomique du donneur à l'accepteur. Un inconvénient de la fusion PEG est que les cytoplastes ont une masse spécifique faible, en conséquence de quoi ils sumagent. Exemple 3: La fusion PEG des protoplastes mésophyles de chicoréelendivellaitue avec des protopastes d'hypotocyles de tournesol Donner aux gouttes de 100cul (1 ou 2 pour la chicorée, 4 à 8 pour l'endive et la laitue) d'une suspension de pps une densité de 106, d'où il résulte que les partenaires de la fusion sont mélangés à raison de 1:1, pour rester non perturbés dans une solution de fusion dans des boîtes de Pétri non recouvertes (9cm de diamètre pour la chicorée, 6cm pour l'endive et la laitue) pendant 15 minutes.Pour chaque goutte de solution de pps deux petites gouttes (environ 20pl) de PEG1 sont chargées; au bout de 2 à 10 minutes, en fonction de la fragilité des pps (le plus souvent 4 minutes), la boîte est maintenue dans une position inclinée et le liquide peut être aspiré au niveau du bord au moyen d'une pipette pasteur, tandis que les protoplastes restent collés au fond où ils se sont établis. Quelques gouttes de PEG2 sont soigneusement chargées et au bout de 3 à 15 minutes (le plus souvent 7 minutes) elles sont retirées de la même manière que la solution de PEG1. Faire la même chose pour PEG3, ajouter et retirer au bout de 5 à 30 minutes (le plus souvent 10 minutes). Remplir ensuite de nouveau avec le milieu de culture de protoplastes (10ml de milieu WA pour la chicorée, 2ml de milieu AA pour l'endive ou 2ml de milieu SA pour la laitue), et cultiver de la manière décrite précédemment. La fusion de PEG est un procédé très approprié pour fusionner de grandes quantités de protoplastes en une seule fois. Electrofusion de protoplastes mésophyles de chicoréelendivellaitue avec des protoplastes hypotocyles de tournesol L'électrofusion doit être préférée à la fusion PEG lorsque les protoplastes des deux parents de la fusion ont par exemple des masses spécifiques assez différentes. C'est, par exemple, le cas lorsque les cytoplastes (voir l'exemple 2 précédent) sont utilisés comme matériau donneur; en conséquence de l'absence de noyau les cellules sont d'un poids relativement faible, ce qui les fait flotter, cela rend la fusion PEG impossible. Un avantage est que le processus d'électrofusion rend possible un travail de grande précision et avec grande maîtrise; même la fusion de seulement deux protoplastes est possible. Pour cela un appareil destiné à l'électrofusion et une chambre de fusion sont nécessaires.La procédure peut être la suivante: le mélange de protoplastes donneurs et accepteurs est suspendu dans une solution isotonique (0,5M de Mannitol + 0,2mM de CaCI2), et est chargé dans la chambre de fusion. Ensuite un champ électrique généré par un courant altematif à haute fréquence (oscillation comprise entre 0,3 et 1,5MHz) est appliqué, ce qui fait que les protoplastes se disposent eux-mêmes en chaînes; durée (10 secondes à 10 minutes). La densité de pps (104 à 2 x 106) et l'intensité du champ (1 à 150V RMSlcm) déterminent la longueur des chaînes et doivent constamment être optimisés. Ensuite les protoplastes sont exposés à une ou plusieurs pointes de courant fortes et courtes, ce qui peut provoquer la fusion des membranes qui sont en contact entre elles.L'amplitude de l'impulsion ou des impulsions (40 à 3000 V/cm) ainsi que la durée (10 microsecondes à 1 millisecondes), la forme (bloc), le nombre (1 à 10) et la largeur de l'impulsion ou des impulsions ont une influence sur la fréquence de fusion et la survie des cellules. Le champ généré par le courant alternatif sera maintenu pendant un certain temps, après quoi les cellules peuvent être introduites dans le milieu de culture pps. Exemple 4: Tri des cellules II est possible de séparer les produits de fusion désirés, de préférence 5 à 10% du nombre total de protoplastes, du mélange de fusion par purification directement après la fusion. II va sans dire que cela profitera au rendement de la procédure totale. Pour cela des techniques qui sont connues en soi peuvent être utilisées, telles que la micromanipulation, le tri par écoulement ou d'autres techniques. II n'est, cependant, pas nécessaire d'utiliser le tri de cellules, en particulier si l'inactivation (par exemple à l'acétamide d'iode), I'irradiation eVou les cytoplastes sont utilisés. De plus, les tournesols ne seront pas régénérés dans les conditions décrites pour la chicorée, L'endive ou la laitue. ExemPle 5 Culture des protoplastes de chicorée Ensemencer dans du milieu WA, la densité étant de 5 x 103 pps/ml, 10ml dans une boîte de Pétri TC de 9cm. Culture à 25"C, dans l'obscurité. La dilution avec le milieu WB se fait en 10 jours après isolation, afin d'empêcher le brunissement et la coloration des cellules. Diluer à 1/10 dans des boîtes de Pétri TC de 9cm (10ml par boîtes). Maintenir les boîtes de nouveau à 25"C, mais maintenant en lumière tamisée (16 heures à la lumière; environ 500 lux /8 heures dans l'obscurité). Lorsque les cals ont un diamètre raisonnable (à partir de 2mm), environ 1 à 2 mois après l'isolation des protoplastes, ils doivent être transférés dans un milieu de régénération des pousses; milieu WC, environ 50 cals par boîte de Pétri (diamètre 9cm) avec environ 20ml de milieu. 25"C, à la lumière (16 heures à la lumière; environ 1000 lux / 8 heures dans l'obscurité). Au bout d'un mois environ des pousses peuvent être coupées des cals et être transférées vers des conteneurs de culture tissulaire à usage unique (6 à 8 par boîte) avec environ 75ml de milieu D pour le développement des racines, à la lumière (16 heures à la lumière; environ 1000 lux 18 heures dans l'obscurité) à 25"C. Culture des protoplastes d'endive Ensemencer dans du milieu AA, densité de 104 à 105 pps/ml, 2ml dans une boîte de Pétri TC de 6cm. Culture à 25"C, dans l'obscurité. Lorsqu'il y a une division et qu'au moins une partie des protoplastes a atteint une étape de 4 cellules, il faut réaliser la dilution avec du milieu WB, par exemple 1/2. Maintenir les boîtes de nouveau à 25"C, mais maintenant à la lumière tamisée (16 heures à la lumière; environ 500 lux 18 heures dans l'obscurité). Lorsque les cals ont un diamètre raisonnable (à partir de 2mm) environ 2 à 4 mois après l'isolation des protoplastes, ils doivent être transférés au milieu de régénération des pousses; AC, environ 50 cals par boîte de Pétri (diamètre 9cm) avec environ 20ml de milieu. 25"C, à la lumière (16 heures d'éclairement; environ 1000 lux / 8 heures dans l'obscurité). Au bout de 2 à 4 mois des pousses peuvent être coupées des cals et être transférées aux conteneurs de culture tissulaire à usage unique (6 à 8 par boîte) avec environ 75ml de milieu D pour le développement des racines, à la lumière (16 heures d'éclairement; environ 1000 lux / 8 heures dans l'obscurité) à 25"C. Culture des protoplastes de laitue Ensemencer dans du milieu SA, densité 2,5 x 104 pps/ml, 2ml dans une boîte de Pétri TC de 6cm. Culture à 25"C, dans l'obscurité. Une semaine après l'isolation des pps la première dilution avec du milieu SB se fera, par exemple dans un rapport de 1:1 et ensuite tous les 5 jours, afin d'empêcher le brunissement et la coloration des cellules. Lorsque les cals ont un diamètre raisonnable (à partir de 2mm), environ 1 mois après l'isolation des protoplastes, ils doivent être transférés au milieu de régénération des pousses; milieu SC, environ 50 cals par boîte de Pétri (diamètre 9cm) avec environ 20ml de milieu. 25"C, à la lumière (16 heures d'éclairement; environ 1000 lux / 8 heures dans l'obscurité). Au bout de deux mois des pousses peuvent être coupées des cals et être transférées aux conteneurs de culture tissulaire à usage unique (6 à 8 par boîte) avec environ 75ml de milieu D pour le développement des racines, à la lumière (16 heures d'éclairement; environ 1000 lux / 8 heures dans l'obscurité) 25"C. ExemDle 6: Analyse de l'ADN mitochondrial et chloroplastidial L'ADN total est isolé du matériau de feuille des produits donneurs, accepteurs, de fusion et de la lignée au moyen du procédé Dellaporte (Plant Molecular Biology reporter, vol. 1, numéro 4 (1983)). L'ADN total comprend l'ADN génomique, mitochondrial et chloroplastidial. L'ADN total est digéré en fragments plus petits par des enzymes de restriction. L'ADN digéré est ensuite séparé selon la taille des fragments par électrophorèse dans un gel d'agarose. Après séparation, des fragments d'ADN monobrin sont transférés vers une membrane chargée positivement par blotting sous vide, ce qu'on appelle le "principe Southem blotting" (Journal Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)). Les diverses membranes comprenant les produits d'ADN monobrin sont hybridées avec: - des séquences d'ADN mitochondrial, codes: pEZMT22 et pEZMTA2; - la séquence d'ADN chloroplastidial, code: pEZCP64. Pour le marquage, I'hybridation et la détection il est utilisé le "système de détection et de marquage directs des acides nucléiques ECL n RPN3001" (Amersham). Toute modification de l'ADN mitochondrial des régénérants qui est détectée peut d'un côté être attribuée à l'apparition de réarrangements spécifiques pendant les procédures de fusion et de régénération qui ont suivi. Le produit de fusion et la lignée peuvent contenir de la même manière, au moins partiellement, I'ADN mitochondrial du donneur. La figure 1 présente un produit de fusion spécifique et la lignée de celuici contenant l'ADN mitochondrial, qui est le résultat des événements de recombinaison spécifique entre l'ADN mitochondrial du donneur (Helianthus) et celui de l'accepteur (cichorum). Figure 1: Hybridation avec pEZMTA2, enzyme de restriction bglll. La figure représente Helianthus (le donneur), Cichorium (I'accepteur) et divers produits de fusion (A à J). La figure montre clairement que les bandes spécifiques Helianthus sont présentes dans un certain nombre de produits de fusion (phénotype Cichorium). En raison des procédures qui ont été suivies les génomes mitochondriaux du donneur et de l'accepteur ont fusionnés. Figure 2: Hybridation avec pEZMT22, enzyme de restriction EcoRI. La figure représente Helianthus (le donneur), Cichorium (I'accepteur) et 1 produit de fusion à CMS. La figure montre également 5 plantes qui sont des rétrocroisements des produits de fusion (la mère) et le Cichorium/accepteur (le pollinisateur). Du profile de l'ADN mitochondrial du produit de fusion et de la lignée (rétrocroisements) il apparaît que l'ADN mitochondrial a changé. L'ADN mitochondrial ainsi modifié est transmis de manière stable à la lignée. Figure 3: Hybridation avec pEZCP64, enzyme de restriction Dral. La figure montre que le produit de fusion à CMS et sa lignée contiennent le type de chloroplaste de l'accepteur (Cichorium). Figure 4: La détermination de la ploïdie des produits de fusion tournesol-chicorée (CMS). Cela se fait au moyen de mesures relatives de la quantité d'ADN nucléaire par cytométrie par écoulement (Ulrich & Ulrich, Protoplasm, 1991, 165: 212-215). Les mesures relatives à la chicorée, au tournesol et à un produit de fusion à CMS de la chicorée. Cette comparaison montre clairement que le produit de fusion n'est pas différent de la chicorée en ce qui concerne le niveau de ploïdie. Figure 5: Fleur de chicorée à fertilité normale, avec les anthères et le pollen clairement discernable. Figure 6: Fleur de chicorée à stérilité cytoplasmique mâle, montrant clairement que les anthères ne sont pas développés et qu'aucun pollen n'est formé, alors que le reste de la fleur est normal. Figure 7: Détail de deux fleurs rayonnantes de chicorée (montrant une fleur à fertilité normale sur la gauche et une fleur à stérilité cytoplasmique mâle sur la droite), les anthères et le pollen étant présents dans la fleur fertile et manquant dans la fleur stérile. Exemple 7: Croisements II est naturellement nécessaire de multiplier les produits de fusion et d'adapter le génotype aux demières exigences de nouveau au moyen de procédés courants des phytogénéticiens. La graine doit être produite à cette fin. Cela peut se faire à grande échelle dans des cages en utilisant des abeilles ou des mouches, ou tout particulièrement par croisement manuel. Dans ce cas les pollens d'un pollinisateur approprié sont placés sur les pistils du produit de fusion (ou de sa lignée)1 après quoi les graines sont formées. En conséquence de l'hérédité maternelle toutes les propriétés codées par le cytoplasme, telles que la CMS, seront présentes dans toute la lignée.De cette manière il est possible de réaliser des combinaisons à la fois inter-spécifiques et intra-spécifiques. Un bon exemple de croisement simple intra-spécifique est la combinaison de chicorée et d'endive; aucune technique spéciale, telle que le sauvetage de l'embryon, n'est nécessaire pour réaliser ce croisement. Milieux et solutions PPO (solution-préplasmolyse) 54,64 gîl de sorbitol 7,35 gîl de CaCl2.H2O 0,59 g/l de MES pH 5,8, autoclave (20 minutes, 115 C) Solution de macération Dissoudre des enzymes dans du milieu WA Cellulase R-10 0,0667% Driselase 0,033% Macéro@yme R-10 0,013% Cellulysine 0,2% Macérase 0,03% MES 0,2 g/l 2,4D 0,33 mg/l BAP 0,16mg/l pH 5,6 filtre stérile (0,22 M) Solution de lavage CaCl2.2H2O 0,2% Kd 2,5% MES 0,06% pH 5,8 autoclave Solution de fusion Sorbitol 0,1 SM CaCl2.2H2O 0,03M KCI 0,075M Tris-HCI 0,05M pH 7,2 autoclave PEG1 PEG1500 40% Glucose 0,3M CaCI2.2H20 50mM Stérilisation du filtre (0,22 M) PEG2 PEG1500 13,3% Glucose 0,1M CaCl2.2H2O 0,067M Sorbitol 0,067M Stérilisation du filtre (0,22 M) PEG3 PEG1500 6,7% Glucose 0,05M CaCl2.2H2O 0,083M Sorbitol 0,083M Stérilisation du filtre (0,22 M) Abréviations utilisées PEG polyéthyléne glycol NAA acide a-naphtaléne acétique 2,4D acide 2,4dichlorophénoxy acétique BAP 6-benzyl amino purine IAA acide indole-3-acétique IBA acide indole3-butyrique MES acide (2(N-morpholino)éthanesulfonique FITC isothio cyanate de fluorescéine FDA diacétate de fluorescéine TC culture tissulaire Composition des milieux (mg/l) MS AA WA WB WC D SA SB SC AC KNO, 1900 1900 - . 1900 950 1900 1900 1900 1900 NH4NO3 1650 600 - - 1650 825 80 80 80 80 MgSO4.7H2O 370 300 123 123 370 185 370 370 370 370 KH2PO4 170 170 68 es 170 85 170 170 170 170 CaCl22H2O 440 600 440 440 440 220 440 440 440 440 KCI - 300 750 750 - - Kl 0,83 0,75 0,75 0,75 0,83 0,42 0,83 0,83 0,83 0,83 MnSO4.4H2O 22,3 10 10 10 22,3 11,15 22,3 22,3 22,3 22,3 H2BO2 6,2 3 3 3 e,2 3,1 e,2 e,2 e,2 e,2 ZnSO4.2H2O 8,6 2 2 2 8,6 4,3 8,6 8,6 8,6 8,6 NaMoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,25 0,25 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,013 0,025 0,025 0,025 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,013 0,025 0,025 0,025 0,025 Fe-EDTA 43 43 43 43 43 21,5 43 43 43 43 Thiamine-HCL 0,1 10 10 10 0,1 0,05 0,5 0,5 0,5 0,5 pyridcodine-HCl 0,5 1 1 1 0,5 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 Acide,nlcothnique 0,5 1 1 1 0,5 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 Acide ascorbique - 2 2 2 - - - - - Pyruvate de sodium - 20 20 20 Acide citrique - 40 40 40 Acide ma@que 40 40 40 Acide fumarique - 40 40 40 - - - - Glycine 2 - - - 2 1 2 2 2 2 Fructose - 250 - - - Ribose 250 Xylose 250 Mannose 250 Rhamnose 250 Cellobiose 250 Sorbitol 250 - - Mannitol - 250 80000 60000 - - 91000 - - inositol 100 100 100 100 100 50 100 100 100 100 Sucrose 10000 250 20000 20000 10000 10000 10000 10000 20000 10000 Glucose - 68400 - - - - - - - Acide casamine 250 Lait de coco ml/l - 20 - - - AGAR 8000 - - 8000 8000 8000 8000 1WEEN-20 - 8 - - - - - Glutamine 750 750 Amidon soluble - - - - 10000 - - NAA 0.1 0.1 - 0,1 0.5 0.5 2,4-D 0,25 - - - - IAA 1.0 Zéatine 1,0 1,0 BAP 0,1 - 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 0,1 IBA - - - - - - - - - 0,01 pH 5,7 5,6 5,8 5,8 5,7 5,7 5,8 5,8 5,8 5,8 N.B. Milieu autoclave avec AGAR: 20 minutes, 115 C Milieu de stérilisation du filtre sans AGAR/ 0,22 M REVENDICATIONS 1. Végétal appartenant à la famille Compositae, dont le cytoplasme est pourvu de mitochondries comprenant de l'ADN qui a au moins partiellement pour origine une autre espèce de la famille Comoositae. et qui est le porteur de la stérilité cytoplasmique male (CMS). 2. Végétal selon la revendication 1, dont les cellules comprennent un génome nudéaire et un génome chloroplastidial spécifiques de l'espèce qui sont normaux pour le végétal en question. 3. Végétal selon la revendication 1 ou 2, où ledit végétal possède phénotypiquement la stérilité cytoplasmique mâle. 4. Végétal selon la revendication 1, 2 ou 3, où l'autre espèce de la famille Compositae a été choisi dans le groupe constitué de Helianthus sop. et Cirsium spp. 5. Végétal selon la revendication 4, où l'autre espèce de la famille Compositae est Helianthus annuus (L.) avec CMS du type petiolaris. 6. Végétal selon la revendication 1, 2 ou 3, où l'autre espèce de la famille Compositae a été choisi dans le groupe constitué de Chrvsanthemum. Senecio, Centaurea, Sonchus, Hieracium. Taaetes. Dahlia et Aster. 7. Végétal selon l'une quelconque des revendications précédentes I à 6, où le végétal a été choisi dans le groupe constitué de Cichorium intvbus (L.) var. Foliosum (Heai), Cichorium endivia (L.). Lactuca sativa (L.), Scorzonera hispanica (L.), Canara scolvmus (L.) et Taraxacum officinale (L.). 8. Graines ou parties végétales provenant d'un végétal conforme à l'une quelconque des revendications précédentes. 9. Procédé de préparation d'un végétal selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en ce qu'il consiste à: - isoler des protoplastes de tissus de divers végétaux appartenant à la famille ComPositae. dits "accepteurs" et de tissus d'une autre espèce de la famille Comoositae. dits "donneud'; - traiter éventuellement des protoplastes, notamment par irradiation, cytoplastisation ou par des produits chimiques spécifiques; - fusionner des protoplastes, notamment sous l'influence de substances chimiques ou en utilisant l'électricité; - sélectionner éventuellement certaines cellules hybrides; - cultiver ensuite les cellules et les régénérer pour donner des végétaux complets; ; - sélectionner des individus de la collection de régénérants ainsi obtenus par analyse d'ADN mitochondrial, chloroplastidial et génomique, suivi de l'évaluation phénotypique des propriétés du végétal; - croiser spécifiquement des individus précédents ou de leur lignée avec d'autres génotypes de la même espèce et d'autres espèces; - produire des graines à grande échelle.