Brevet FR2742054A1 — publié le 19970613

La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques constituées d'agents anti-inflammatoires vectorisés par une base vectorisante contenant des céramides) et leur application à la prévention et au traitement des maladies parodontales. Les céramides utilisées selon l'invention sont des céramides végétales extraites de la farine de blé, commercialisées par INOCOSM. Elles sont constituées de 80 % de glycosylcéramides, de 10 % de gliadine et de 10 % de lipides apolaires. Les agents anti-inflammatoires utilisés selon l'invention sont les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et plus particulièrement la benzydamine, le kétoprofène et le lysinate de kétoprofène. On a recherché le rôle des céramides dans la prévention de la destruction de tissus conjonctifs qui se produit en particulier dans les maladies parodontales. Les maladies parodontales sont caractérisées par l'inflammation gingivale. Or, au cours de processus inflammatoires, les enzymes protéolytiques libérés peuvent, s'ils ne sont pas inactivés par des inhibiteurs de protéase, entraîner des destructions tissulaires. En particulier, le rôle de l'élastase dans la dégradation de la matrice extra-cellulaire gingivale lors d'une inflammation a été démontré. Des essais ont donc été réalisés in vitro et ex vivo, pour rechercher les effets des céramides sur l'élastase leucocytaire. L'essai in vitro a consisté à incuber l'élastase leucocytaire humaine avec des céramides végétales pendant 5 mn, temps nécessaire à la formation du complexe enzyme-inhibiteur, puis avec un substrat synthétique, le N-méthoxysuccinyl-Ala-Ala Pro-Val-p-nitroanilide. L'enzyme provoque l'hydrolyse du substrat synthétique en un produit coloré, la p-nitroaniline, dont l'apparition est suivie par son absorbance à 410 nm. La vitesse d'apparition du produit de la réaction est mesurée en présence ou en l'absence de céramides végétales et avec différentes concentrations de substrat et de céramides. Le rapport entre les vitesses initiales permet de déterminer le pourcentage d'inhibition de l'enzyme en fonction de la concentation en céramides dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus ont montré que les céramides sont des inhibiteurs de l'élastase leucocytaire et que la concentration en céramides produisant une inhibition de 50 % est de 32,7 ssg/ml. L'étude ex vivo a été réalisée sur des biopsies cutanées humaines et des biopsies gingivales de rats (les gencives de rats et les gencives humaines présentent une structure comparable à celle de la peau, comportant des fibres préélastiques dans la partie superficielle de la matrice extracellulaire et des fibres élastiques matures en profondeur, les fibres de collagènes étant le constituant majoritaire du tissu conjonctif). Les biopsies, en coupes de 8 ssm d'épaisseur, ont été réparties en 4 groupes soumis aux traitements suivants traitement 1 : incubation dans 200 p1 de tampon Tris-HCl, à pH = 8, pendant 12 heures à 370C (groupe témoin négatif). traitement 2 : incubation avec l'élastase leucocytaire seule pendant 12 heures à 370C (groupe témoin). traitement 3 : action de céramides végétales seules (200 pl d'une solution à 1 %), puis 2 lavages au PBS et enfin incubation avec l'élastase leucocytaire humaine (200 Zl d'une solution à 10 pg/ml pour la peau et à 2 Ag/ml pour les gencives) . Ce traitement permet l'étude de la formation d'un complexe substrat-céramide. traitement 4 : mélange de céramides végétales avec l'élastase leucocytaire humaine pendant 30 mn, puis incubation du mélange avec les coupes, à 37"C pendant 12 heures. Ce traitement permet l'étude de la formation d'un complexe enzyme-céramide. Les coupes sont ensuite rincées, fixées à l'alcool à 70 % et colorées soit à la catéchine-fuschine pour visualiser les fibres élastiques, soit au rouge Sirius pour visualiser les fibres de collagènes. La détermination, par analyse d'images informatisée, de la fraction volumétrique occupée par les fibres permet de mesurer le pourcentage d'inhibition de l'enzyme. Après le traitement 2, on a observé une destruction importante des fibres élastiques matures par l'élastase leucocytaire. Les résultats obtenus après le traitement 4 ont montré une protection des fibres élastiques de plus de 90 %, due à l'action inhibitrice des céramides végétales sur l'enzyme. On a également observé une protection des fibres de collagène après les traitements 3 et 4, ce qui indique une interaction des céramides végétales à la fois avec les fibres de collagènes et avec l'élastase leucocytaire humaine. D'autre part, on a étudié l'effet anti-inflammatoire des compositions de l'invention par détermination de leur pouvoir antiradicalaire vis-à-vis de l'anion superoxyde in vitro. Il est connu, en effet, que les polynucléaires activés au cours du processus anti-inflammatoire produisent des radicaux libres. On sait également que l'inflammation s'accompagne de l'activation d'enzymes comme la cyclooxygénase, qui activent la formation radicalaire. L'action antiradicalaire d'une composition anti-inflammatoire est donc un bon indice de son pouvoir anti-inflammatoire. La détermination du pouvoir antiradicalaire de compositions selon l'invention a été réalisée par mesure de la diminution de la vitesse de réduction du Cytochrome C lors de l'addition au milieu réactionnel du produit à étudier. L'anion superoxyde est généré par l'action de la xanthine oxydase sur la xanthine et entraîne, en l'absence d'une molécule capable de le capter, la réduction du Cytochrome C. L'apparition du Cytochrome C réduit est suivie au spectrophotomètre, à 550 nm. Pour réaliser ces essais, des émulsions contenant un AINS et une base vectorisante contenant des céramides ont été préparées. Ces émulsions, dont la composition était la suivante céramides végétales 0,5 g lécithine 0,5 g xanthane 0,3 g AINS 0,5 g eau qsp 100,0 g ont été préparées par addition, sous vive agitation, des céramides, de la lécithine et de l'AINS, puis refroidissement sous agitation et passage à l'autoclave. Elles ont ensuite été diluées au 1/2 et au 1/4 pour obtenir des concentrations de 2,5 mg/ml et 1,25 mg/ml en AINS. De telles compositions contenant respectivement du kétoprofène, du lysinate de kétoprofène et de la benzydamine ont été testées et les résultats comparés aux résultats obtenus avec des solutions contenant les mêmes constituants à l'exception des céramides. Les résultats obtenus ont montré que la protection antiradicalaire des compositions vectorisées augmentait de 6 à 22 % par rapport aux compositions non vectorisées, selon l'AINS et sa concentration. Des essais d'activité anti-inflammatoire ont également été réalisés in vivo. Ces essais consistent à provoquer une inflammation de la patte chez des rats adultes et à suivre l'évolution de l'oedème par mesure du volume de la patte. Les conditions expérimentales étaient les suivantes : des rats, d'un poids de 200 à 220 g, ont été traités par gavage, 18 heures et 1 heure avant l'administration de l'agent inflammatoire, par le produit AINS à étudier, non vectorisé ou vectorisé, administré sous un volume de 0,5 ml. Des groupes témoins ont reçu une solution de chlorure de sodium à 0,9%. La réaction inflammatoire est provoquée par injection souscutanée de 0,1 ml d'une suspension de carraghénine dans du sérum physiologique. Le volume de la patte est mesuré à l'aide d'un pléthismographe à mercure, avant le début de l'inflammation, une demi-heure après, puis toutes les heures jusqu'à la sixième heure et enfin 24 heures après. Les variations de volume sont mesurées en cm sur une échelle graduée. Les essais ont été faits avec le lysinate de kétoprofène, à 1 et 3 mg/kg, non vectorisé ou vectorisé par 0,5 % de céramides, et le kétoprofène, à 1 mg/kg, non vectorisé ou vectorisé par 1 % de céramides. Les résultats obtenus ont montré que le lysinate de kétoprofène vectorisé, à 1 et 3 mg/kg, induit un effet antiinflammatoire significatif par rapport au témoin, à partir du temps 3 heures, effet qui persiste jusqu'à 6 heures. Le lysinate de kétoprofène vectorisé, à 1 mg/kg, a un effet anti-inflammatoire significativement supérieur à celui du même composé non vectorisé, à 1 et 3 mg/kg (réduction d'environ 60 % par rapport au groupe traité par le composé non vectorisé à 1 et 3 mg/kg, au temps 4 heures). Le kétoprofène vectorisé ou non induit un effet antiinflammatoire significatif par rapport au témoin, à 1 mg/kg, à partir de 4 heures, cet effet persistant jusqu'à 5 heures. A 1 mg/kg, le kétoprofène vectorisé a un effet supérieur à celui du kétoprofène non vectorisé à la même dose (réduction d'environ 15 % par rapport au groupe traité par le composé non vectorisé, au temps 5 heures). Les céramides végétales ayant d'une part, une activité inhibitrice de l'enzyme leucocytaire humaine, enzyme responsable de la destruction du tissu conjonctif au cours de réactions inflammatoires et d'autre part, un effet vectorisant des agents AINS, c'est-à-dire induisant un effet antiinflammatoire supérieur à celui de 1'AINS utilisé seul a la même dose, les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent être utilisées dans la prévention et le traitement des maladies parodontales telles que gingivites ou parodontites. Ces compositions pharmaceutiques contiennent un agent AINS vectorisé, constitué d'un agent AINS et d'une base vectorisante sous forme d'émulsion aqueuse contenant 0,2 à 1 % (poids/volume) de céramides, en association avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. Elles peuvent être administrées par voie orale, sous forme de comprimés, gélules ou capsules contenant 0,01 à 1 g d'agent AINS par dose unitaire, et des excipients tels que amidons, talc, méthylcellulose, cellulose microcristalline, hydroxypropylméthylphtalate de cellulose, stéarate de magnésium, alginate de sodium, polyvinylpyrrolidone, silices, acide stéarique, alcool cétylique, lactose et saccharose. Elles peuvent également être utilisées par voie locale, par application cutanée sous forme de pommades, crèmes, baumes, gels ou solutions ou par application buccale, sous forme de dentifrices, bains de bouche ou gels, contenant 0,005 à 10 % en poids d'AINS, et des excipients tels que propylèneglycol, polyéthylèneglycol, acide citrique, alcool stéarylique, hexanetriol, propylène carbonate, lanoline et vaseline, pour les pommades ; vaseline, paraffine, collophane, huile de vaseline et huile de ricin, pour les baumes ; polymères d'acide acrylique, polymères carboxyvinyliques, silices, propylèneglycol, polyéthylèneglycols, esters d'acides gras, paraffine, éthanol, isopropanol, diéthanolamine, triéthanolamine, glycérol, hydroxyéthylcellulose et carboxyméthylcellulose (CMC), pour les gels ; carbonate ou phosphate de calcium, silices ou alumines hydratées, carboxyméthylcellulose, carraghénates, alginates, laurylsulfate ou laurylsarcosinate de sodium, dodécanediol polyglycérolé, glycérol, sorbitol et propylèneglycol, pour les dentifrices ; alcools tels que éthanol et glycérol, pour les bains de bouche. Ces compositions peuvent également contenir, selon le cas, des agents conservateurs, des émulsifiants, des sels tampons, des édulcorants, des arômes et des colorants. Les exemples suivants illustrent des formulations de compositions selon l'invention utilisables en applications buccales Exemple 1 : dentifrice AINS vectorisé 0,005 à 5 % fluorure (NaF, KF...) 1000 à 5000 ppm silices 18,00 g sorbitol 70 % 25,00 g CMC 1,50 g laurylsulfate de sodium 0,75 g dodécanediol polyglycérolé 0,75 g parabens 0,30 g arôme menthe 1,20 g eau qsp 100,00 g Exemple 2 : dentifrice AINS vectorisé 0,005 à 5 % silices 15,00 g glycérol 20,00 g carraghénate de sodium 2,00 g laurylsulfate de sodium 1,50 g parabens 0,30 g arôme menthe 1,20 g eau qsp 100,00 g Exemple 3 : bain de bouche AINS vectorisé 0,005 à 5 % alcool 5,00 g colorant 0,30 g arôme menthe 0,20 g saccharinate de sodium 0,20 g eau qsp 100,00 ml Exemple 4 : bain de bouche AINS vectorisé 0,005 à 5 % glycérol 2,00 g alcool 5,00 g Tween 80 0,50 g saccharinate de sodium 0,15 g arôme 0,12 g eau qsp 100,00 ml Exemple 5 : gel buccal AINS vectorisé 0,005 à 10 % glycérol 20,00 g hydroxyéthylcellulose 5,00 g arôme 0,30 g saccharinate de sodium 0,30 g eau qsp 100,00 g Exemple 6 : gel buccal AINS vectorisé 0,005 à 10 % alcool à 95C 40,00 g glycérol 10,00 g CXC 5,00 g arôme 0,30 g eau qsp 100,00 g Revendications 1. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un agent anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) vectorisé par une base vectorisante contenant des céramides végétales, en association avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent AINS est la benzydamine, le kétoprofène ou le lysinate de kétoprofène. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la base vectorisante est une émulsion aqueuse contenant 0,2 à 1 % (poids/volume) de céramides végétales. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 & 3, caractérisée en ce qu'elle est administrée par voie orale, sous forme de comprimés, gélules ou capsules. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle contient 0,01 à 1 g d'agent AINS par dose unitaire. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 & BR 7. Composition selon la revendications 6, caractérisée en ce qu'elle contient 0,005 à 10 % en poids d'agent AINS.