Brevet FR2739853A1 — publié le 19970418

La présente invention est du domaine de ltextractien de substances notamment destinées au traitement du corps humain, et elle a plus particulièrement pour objet des procédés d'obtention de céramides On rappelle l'importance grandissante qu'on pris récemment les céramides dans les traitements dermatologiques et cosmétologiques, céramides étant le nom utilisé pour désigner les dérivés résultant de la condensation de la sphingosine et d'un acide gras; certains céramides dits simples, ont une formule générale qui peut s'écrire On rappelle aussi que les céramides les plus recherchés sont les céramides simples car ce sont les aramides simples qui entrent dans la composition de la couche cutanée externe dite "stratum corneum", et qui confèrent au tissu cutané ses propriétés de souplesse, de résistance et de perméabilité. A la connaissance du Demandeur on n' a jusqu'à présent isolé de céramides simples que dans seul monde animal et généralement dans un contexte de recherches fondamentales. Aussi s'est on satisfait, pour les traitements susvisés, de céramides complexes, par exemple acylcéramides, glycosylcéramides, etc., car, en fait, certains enzymes présents dans le tissu cutané libèrent en quantité plus ou moins grande les céramides simples entrant dans la constitution des céramides complexes, et ce sont ces ceramides complexes que, à défaut de céramides simples trop coûteux, l'on utilise comme agents de traitements cutanés;Il faut observer à ce stade que le vieillissement de la peau est généralement concomitant de l'appauvrissement du capital enzymatique d'un individu; ainsi il serait préférable d'utiliser les céramides simples eux-mêmes, s'ils pouvaient être obtenus commodément. Or le Demandeur, qui a proposé un mode d'obtention de céramides à partir du ver à soie (cf FR2672605 et W092/13543) s'est longuement interrogé sur la question de savoir pourquoi on retrouvait des céramides simples dans les extraits du ver à soie, lequel ne se nourrit que de végétaux, alors que, comme indiqué cidessus, de tels céramides simples étaient réputés ne se rencontrer que dans le seul monde animal, notamment dans son tissu nerveux. C'est le mérite de sa démarche inventive que d'avoir, à l'encontre des doctrines établies, conclu, et ultérieurement réussi à prouver, que de tels céramides simples devaient être présents dans l'aliment du ver à soie que constitue la feuille du mûrier Selon la présente invention un procédé d'obtention de céramides végétales, plus particulièrement de céramides dites simples répondant à la formule générale sus visée, et propres à entrer directement dans la composition lipidique de la couche la plus externe, dite "stratum corneum", de la peau, est caractérisé dans sa généralité en ce qu'il consiste à soumettre la feuille du mûrier (morus alba) à une extraction par solvant, de préférence polaire.Le solvant utilisé pour l'extraction est avantageusement l'un des solvants du groupe de solvants comprenant l'anhydride carbonique (C02) liquide par application de la méthode dite CO2-supercriti- que, et le mélange chloroforme-méthanol par application de la méthode dite de FOLCH; Selon le mode de mise en oeuvre du procédé sus defini, dans lequel le solvant est le C02 liquide, les conditions opératoires sont les suivantes: - pression : 300 bar (plage :100 à 400) - température : 35"C (plage : 20 à 50) - durée : 5 heure (plage ; 2 heure); Selon le mode de mise en oeuvre du procedé sus défini, dans lequel le solvant choisis est le chloroforme-méthanol par application de la méthode dite de FOLCH, les conditions opératoires sont les conditions habituelles de cette méthode. L'invention a également, et principalement, pour objet la composition résultant de la mise en oeuvre d'un procédé tel que ci dessus défini, c'est à dire la composition résultant de l'extraction par solvants, de la feuille du mûrier (morus alba), cette composition comprenant des sphingolipides dont des céramides simples, à une proportion comprise entre 4 et 10% de la matière sèche, identifiés et mesurés par spectrométrie RMN. A titre indicatif la mesure spectrométrique RMN (type BRUCXER AM400WB, fonctionnant à 400MHz en proton / technique d'impulsion unique, largeur de pulse à 90", 5s, largeur spectrale de 650Hz, sur 16 Kpoints, 128 acquisitions avec délai de répétition de 3 sec.) a conduit à détecter la double liaison C=C de la Sphingosine à raison de 4% des chaînes d'Ac. Gras (CH3 terminaux). Les diagrammes des fig.1 (ver à soie, VAS,) et fig.2 (feuille de mûrier, Fmur) rendent compte comparativement de ces identification et mesure avec comme témoin le Céramide 3 référence Sigma; le tableau I suivant en fournit les résultats chiffrés. On remarquera sur la fig.2 que l'extrait Fmur présente un double pic A à 1,1 ppm et un pic B à 1,6 ppm que ne comporte pas l'extrait VAS TABLEAU I Spectrométrie RMN 1H des extraits lipidiques (neutres N, polaires P) de ver à soie (VAS) et de feuilles de mûrier (Fmur) Résonances identifiées :: ppp 0,87 1,35 2 0,95 2,7 nH 3 2 2 2 2 1 *mol 1 1 2 1 1 2 CH3 CH2 Insat Polyinsat insat 2 CH= données bruies VAS N 15833 165200 19880 6376 9480 19500 VAS P 2730 34494 3510 1139 1090 2390 Fmur N 5954 41176 7400 2049 2850 5650 Fmur P 4722 67820 6230 2230 1650 4340 fraction longueur fraction fraction fraction nombre moyenne moyen VAS N 1 15,6509 0.9417 0.60405 0.89812 1.84741 VAS P 1 18.9527 0.96429 0,62582 0.5989 1.31319 Fmur N 1 10.3735 0.93215 0.51621 0.718 1.42341 Fmur P 1 21.5438 0.98952 0.70839 0.52'14 1.37865 La composition résultant de l'ex- traction par la méthode de FOLCH comporte les teneurs sui vantes: en lipides totaux / matière sèche: 8+2 % relative des lipides neutres : 23+2 % relative des lipides polaires : 76+2 % acides gras des lipides polaires saturés : 30#3% acides gras des lipides polaires insaturés: 6#1 % acides gras polyinsaturés : 65+6 % dont Acide linoléique : 12+1 % dont Acide linolénique: 45+4 % Les lipides polaires extraits de la feuille de mûrier ont été identifies par HPLC sur colonne de silice non greffée, sur une durée de 23 minutes en un seul passage; une quinzaine de pics ont été séparés; le diagramme de la fig.3 est le chromatogramme obtenu; le tableau II suivant en fournit les donnée chiffrées TABLEAU Il N pic T teintions T rétentions(mn) (mn) % des lipides polaires nature cilimi ne 1 6.5 31 mélange contenant des céramides 2 7.5 17 3 8.5 6 4 8.7 1.2 monogalactosyl diglvceride S 13.0 8.2 ? 6 14.2 3.7 9 7+8 15.1 20.8 mélange comenant des cérébrosides 9+10 18.0 4.7 h hatidvl inositol serine 11 20.5 6.2 ss PhosDhatidvlcholine La présence de céramides et galactocérébrosides a été recherchée par spectrophotométrie infrarouge à l'aide de standards purifiés à partir de cerveau de mammifères. Les Céramides libres du standard présentent deux bandes d'absorption à 1632 et 1530 cm1 Les galactocérébrosides du standard présentent trois bandes d'absorption à 1646, 1626 et 1542 cm-1 La séparation des lipides polaires par HPLC révèle deux pics (1 et 2) dont les temps de rétention sont identiques à ceux des céramides libres; la récupération semi préparative, après séparation par HPLC de ces deux pics, a permis leur analyse par Infrarouge. De même les pics 7 et 8 présentent des temps de rétention comparables à ceux des galactocérébrosides et ont été, comme les pics 1 et 2 récupérés après séparation par HPLC. L'analyse IR des pics 1,2,7 et 8 a révélé la présence des mêmes bandes caracteristiques des céramides et galactocéramides respectivement. La composition de l'invention trouve des applications particulièrement avantageuses dans la fabrication des produits dermatologiques dont elle peut soit être considérée comme matière première et principe actif, soit telle quelle comme produit de traitement dermatologique. RvsNDrcATrpNs 1.-Procédé d'obtention de céramides végétales, plus particulièrement de céramides dites simples répondant à la formule générale propres à entrer directement dans la composition lipi dique de la couche la plus externe, dite "stratum cor neum", de la peau, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre la feuille du mûrier (morus alba) à une extraction par solvant; 2.-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour l'extraction est l'un des solvants du groupe de sol vants comprenant l'anhydrie carbonique (CO2) liquide par application de la méthode dite CO2 supercritique, et le mélange chloroforme-méthanol par application de la méthode dite de FOLCH;; 3.-Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant étant le C02 liquide, les conditions opératoires sont les suivantes: - pression : 300 bar (-200, +100) - température : 350C (-15, +15) - durée : 5 heure (-2, +2); 4.-Composition résultant de la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comporte une propor tion de lipides totaux par rapport à la matière sèche de 8 t 2%; 4.-Composition selon la revendication 4, la méthode d'extraction utilisée étant la methode de FOLCH, caractérisée en ce qu'elle comporte une propor tion de lipides dits neutres comprise dans la plage 23 r 2%:et une proportion complementaire de lipides polaires, soit une proportion de 76 - 2%. 5.-Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la distribution en % des lipides polaires selon leur insaturation est comprise dans la plage: - lipides satures : 30 t 3% - lipides mono-insatures : 6 - 1% - lipides poly-saturés : 65 = 6%. 6.-Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que les lipides polyinsatu rés comportent en % de leurs acides gras totaux - acide linoléique : 12 t 1% - acide linolènique : 45 t 4. 7.-Composition selon la revendication 5, caractérisée : en ce qu'elle présente dans une identification RMN 400MHz en proton / technique d'impulsion unique, largeur de pulse à 90', un double pic (A) à 1,1 ppm et un pic (B) à 1,6 ppm.