Brevet FR2745718A1 — publié le 19970912

Composition antidiabétique à base de 4-hydroxyiso leucine La présente invention se rapporte à une composition antidiabétique apte à stimuler la sécrétion d'insuline et spécialement destinée au traitement du diabète de type II ou diabète non insulino dépendant. Il est connu que le diabète touche, aujourd'hui, plus de trente millions d'individus dans le monde, prenant la dimension d'un phénomène majeur sur le plan de la santé publique ; à titre d'exemple, on considère que, dans les pays européens, le diabète atteint entre 2 et 5 W de la population, et qu'en France, environ 3 à 4 % des habitants souffrent de diabète non insulino dépendant qui est de loin le plus fréquent et en particulier entre 5 et 10 W des sujets âgés de 60 à 70 ans souffrent de cette maladie. De plus, et pour diverses raisons liées notamment à la richesse alimentaire, l'obésité, le tabagisme ou encore la diminution de l'activité physique, le nombre de diabétiques aurait doublé en France en une vingtaine d'années, essentiellement du fait d'une augmentation du diabète non insulino dépendant. Cette affection est caractérisée par une altération de la sécrétion d'insuline associée ou non à une insulino résistance des tissus périphériques. L'altération du fonctionnement des cellules B pancréatiques qui synthétisent l'insuline, survient dès la phase initiale du diabète non insulino dépendant. Elle se traduit par une très nette diminution de la sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation glucosée. Pour traiter cette maladie, les spécialistes ont en conséquence été tout naturellement amenés à rechercher des produits susceptibles de stimuler la sécrétion d'insuline ; parmi ceux-ci, seuls les sulfamides (sulfonylurées) ont, dans un premier temps, révélé une efficacité. Cependant, malgré leurs avantages, les sulfonylurées présentent un certain nombre d'inconvénients avant tout liés aux difficultés rencontrées pour déterminer la posologie adéquate ; il en résulte des risques de surdosage pouvant provoquer fréquemment des hypoglycémies, avec risque de coma hypoglycémique, notamment chez les personnes âgées. Pour remédier à ces inconvénients, on a en conséquence cherché à proposer un médicament de nature à se substituer aux sulfonylurées pour stimuler la sécrétion d'insuline. C'est ainsi que, conformément au document EP0 587 476, on a pu mettre en lumière les propriétés antidiabétiques de certains acides aminés mono ou polyhydroxylés parmi lesquels le plus actif s'est révélé être la 4hydroxyisoleucine de formule et/ou sa forme lactonique. Conformément à cette publication, on a en particulier proposé un procédé d'extraction de la 4 hydroxyisoleucine à partir de graines d'une espèce particulière de trigonelles (Trigonella sp : le fenugrec Trigonella foenum-graecum L) qui est une légumineuse facilement cultivable dans les régions méditerranéennes. Ce procédé consiste à mettre en oeuvre les étapes suivantes - on soumet des graines de fenugrec à un broyage et à une extraction préalable à l'hexane, à température ambiante de façon à obtenir un tourteau délipidé, - on soumet ce tourteau à plusieurs extractions hydro alcooliques successives avec de l'éthanol à 70 W à tempé rature ambiante, - on concentre l'extrait obtenu sous pression réduite, - on fait passer le concentrat sur une colonne contenant une résine échangeuse de cations sous forme H de façon à retenir la 4-hydroxyisoleucine recherchée sur cette co lonne, - on élue celle-ci en utilisant une solution d'ammoniaque N ou 2N, - après concentration et reprise par de l'éthanol à 70 %, on soumet le mélange obtenu à une chromatographie d'adsorption sur gel de silice, et - on élue celui-ci avec de l'éthanol à 70 W avant de le concentrer sous vide et de le purifier par cristallisa tion avec addition d'éther diéthylique de façon à obtenir une 4-hydroxyisoleucine titrant 99 % de pureté. Pour permettre aux malades de pouvoir bénéficier des propriétés antidiabétiques toutes particulières de la 4-hydroxyisoleucine, il a été décidé de poursuivre les recherches sur ce produit : en effet, la mise sur le marché d'un médicament nouveau exige une connaissance et une description précise du principe actif ; or, le squelette de la 4-hydroxyisoleucine renferme trois carbones asymétriques successifs et comporte, par suite, huit stéréo-isomères pouvant être définis par les notations standardisées (2S, 3R, 4S) ; (2S, 3R, 4R) ; (2R, 3S, 4R) ; (2R, 3S, 4S) ; (2S, 3S, 4S) ; (2S, 3S, 4R) ; (2R, 3R, 4R) ; (2R, 3R, 4S). Compte tenu de cette situation, on a eu l'idée de rechercher, conformément à l'invention, au(x)quel(s) de ces isomères devaient être attribuées les caractéristiques antidiabétiques ou tout au moins l'essentiel de ces caractéristiques. On a, à cet effet, tenu compte des travaux de Fowden et al. (Phytochemistry, 1973, vol.13, pp. 1707 à 1711) et d'Alcock et al (Phytochemistry, 1989, vol.28, pp. 1835-1841) conformément auxquels on a pu établir qu'à l'état naturel, le Fenugrec ne renferme que deux isomères de la 4-hydroxyisoleucine (diastéréoisomères sur le carbone 2) à savoir les isomères suivants Isomère (2S, 3R, 4S) Isomère (2R, 3R, 4S) Plus précisément, il a été prouvé que le Fenugrec renferme environ 97 W d'isomère (2S, 3R, 4S) qui doit donc être considéré comme l'isomère majeur et environ 3 W d'isomère (2R, 3R, 4S) qui doit être considéré comme l'isomère mineur. Conformément à l'invention, on a constaté expérimentalement que lorsque l'on extrait des graines de Fenugrec par le procédé susmentionné, décrit dans le document EP-A-O 587 476, à petite échelle, on obtient la 4hydroxyisoleucine en conservant essentiellement les proportions susmentionnées d'isomère majeur et d'isomère mineur les caractéristiques physico-chimiques de l'isomère majeur ont été déterminées et correspondent à la structure (2S, 3R, 4S). Cette configuration a pu être attribuée grâce aux mesures suivantes et par analogie avec les travaux antérieurs - Pouvoir rotatoire (Perkin-Elmer) [&alpha;]D20 : + 31.3 (c=1.2, H20). - Spectrométrie infrarouge (Perkin-Elmer, FT-IR, Paragon -1 1000) dont les résonances sont les suivantes en cm 4max 3500-2000, 1634, 1490, 1415, 1356, 1312, 1270, 1180, 1104, 1053, 1017, 962, 931, 899, 858, 817, 794. - Spectrométrie de masse (JEOL, JMS-SX 102A) selon la tech nique fast atom bombardement en modes positif et né gatif avec une matrice de glycérol-thioglycérol FAB+ : 148 (M+H) 100 ; FAB- # 146 (M-H)+100 - Spectrométrie RMN H et C (Bruker AC 250 MHz) dont les déplacements chimiques sont les suivants (en ppm : H NMR 5 : 1 (d, 3H, J=7, CH3C-3) ; 1,29 (d, 3H, J=6,3, CH3C-4) 1,97 (qdd, 1H, J=7/4/8, CH-3) ; 3,88 ((qd, 1H, J)=8/6,3, CH-4) ; 3,94 (d, 1H, J=4, CH-2). C NMR 6 : 38,6(C6), 47,2(C5), 67,8(C3), 83,5(C2), 96,4(C4) , 200(C1) Les figures la à 1f ont permis d'établir les caractéristiques physico-chimiques de l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4-hydroxyisoleucine. Plus précisément, la figure la correspond à la chromatographie HPLC tandis que les figures lb à 1f représentent respectivement le spectre IR, le spectre de masse FAB mode positif, le spectre de masse FAB mode né 1 13 gatif, le spectre RMN H et le spectre RMN C. On s'est, en revanche, rendu compte que si l'on transpose le procédé susmentionné à une échelle supérieure pour laquelle les différentes étapes exigent des temps plus importants, on obtient un produit comportant environ 85 à 90 W d'isomère majeur et environ 10 à 15 W d'isomère mineur. Partant de ces constatations, on a cherché à séparer les deux diastéréoisomères par chromatographie en utilisant une colonne semi-préparative ultrabase C18 qui est caractérisée par une hydrophobicité élevée et un indice de silanol résiduel très faible, donc une capacité de rétention élevée ; il est connu que de telles colonnes sont adaptées pour effectuer la séparation de composés présentant des groupements fonctionnels très polaires, comme les substances acides ou basiques. On a ainsi purifié 2 grammes d'un mélange obtenu suite à la mise en oeuvre du procédé susmentionné dans les conditions suivantes - Support : colonne semi-préparative ultrabase C18, 5yM (10 mm x 15 cm) - Détecteur : W (190 à 220 nm) ou réfractomètre, - Eluant : eau pure, - Débit : 2 ml/min. I1 est à noter que l'utilisation d'eau pure comme solvant de dilution s'est avérée indispensable car l'alcool perturbe la séparation. Une étude analytique préalable effectuée sur 10 yg de mélange a permis de vérifier que le temps de rétention était de 9,6 min. pour l'isomère mineur et de 10,2 min. pour l'isomère majeur et qu'il était donc ainsi possible de séparer les deux isomères présents. Cette possibilité a été confirmée par l'expérience et, la mise en oeuvre du procédé de séparation a effectivement permis d'obtenir, à partir des deux grammes initiaux, et après purification, d'une part, plus de 400 mg d'isomère mineur pratiquement pur et d'autre part, environ 1,5 g d'isomère majeur avec une pureté de 97 à 98 W identique au composé isolé à partir du document EP-A-0 587 476. Conformément à l'invention, on a ensuite mis en oeuvre des tests pharmacologiques pour vérifier l'activité antidiabétique de chacun des isomères ainsi purifiés et on a constaté que le plus puissant (eutomer) renfermant la majeure partie de l'activité antidiabétique est l'isomère majeur tandis que l'isomère mineur s'avère nettement moins puissant (distomer). La présente invention a pour objet de tirer profit de ces constatations expérimentales en proposant une composition antidiabétique nouvelle apte à stimuler la sécrétion d'insuline et spécialement destinée au traitement du diabète non insulino dépendant. Conformément à l'invention, cette composition antidiabétique est caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant que substance active, l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4hydroxyisoleucine de formule et/ou sa forme lactonique, et en ce qu'elle est pratiquement exempte de tout autre stéréoisomère de ce composé. Selon une caractéristique préférentielle de l'invention, cette substance active est d'origine végétale, et est notamment obtenue à partir de trigonelles (Trigonella sD.) et plus particulièrement extraite de graines de fenugrec (Trisonella foenum-graecum L). L'activité antidiabétique toute particulière de l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4-hydroxyisoleucine sera mise en lumière grâce à l'exemple suivant, portant sur une investigation au niveau des îlots de Langherans isolés de pancréas de rat. Après digestion du pancréas par la collagénase, les îlots de Langerhans qui possèdent des cellules B sécrétant l'insuline ont été séparés des autres éléments du digestat, prélevés sous la loupe binoculaire, puis déposés dans des tubes d'incubation. Cette méthode, qui présente l'avantage de ne nécessiter qu'une faible quantité de substance, permet une étude directe des effets de la composition sur des cellules endocrines pancréatiques, en particulier des cellules B insulino sécrétrices, à l'exclusion de toute interférence avec les tissus exocrines et annexes. Sur des îlots isolés de rats Wistar, incubés en présence de 8,3 mM de glucose (1,5 g/l) pendant une heure, on a recherché l'effet de 200 pM d'isomère majeur de la 4 hydroxyisoleucine, d'une part, et de 500 HM et 1 mM d'isomère mineur d'autre part, sur la sécrétion d'insuline. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2, sur lequel les histogrammes représentent pour chaque dose d'isomère de 4-hydroxyisoleucine la sécrétion d'insuline mesurée sur 60 minutes. Les valeurs données correspondent à chaque fois à la moyenne de 16 à 20 déterminations. Sur ce schéma, on peut noter que pour l'isomère majeur, un effet stimulant significatif sur la sécrétion apparaît pour une concentration de 200 yM, alors que dans le cas de l'isomère mineur, cet effet n'est observé que pour une concentration de 1 mM. Cette étude pharmacologique permet donc bien de mettre en lumière l'activité supérieure de l'isomère maj eur. Ces résultats ont été confirmés par des expériences réalisées sur le pancréas isolé et perfusé en pré- sence de 8,3 mM de glucose. Conformément à ces expériences, dont les résultats sont reportés sur la figure 3, l'isomère majeur et l'isomère mineur de la 4-hydroxyisoleucine ont été introduits à une concentration de 200 yM dans le milieu de perfusion pendant 10 minutes. Les valeurs données correspondent à chaque fois à la moyenne de 4 à 6 expériences. Ce schéma montre clairement que, dans le cas de l'isomère majeur, la stimulation est immédiate et biphasique et persiste pendant toute la durée de la perfusion alors qu'au contraire, aucun effet notable n'est observé dans le cas de l'isomère mineur. REVENDICATIONS 10) Composition antidiabétique apte à stimuler la sécrétion d'insuline et spécialement destinée au traitement du diabète non insulino dépendant, caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant que substance active, l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4-hydroxyisoleucine de formule et/ou sa forme lactonique, et en ce qu'elle est pratiquement exempte de tout autre stéréoisomère de ce composé. 2") Composition antidiabétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance active est d'origine végétale. 30) Composition antidiabétique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la substance active est obtenue à partir de trigonelles (Trisonella sep). 4 ) Composition antidiabétique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la substance active est extraite de graines de fenugrec (Trigonella foenum-graecum L).