Brevet FR2743891A1 — publié le 19970725

La présente invention concerne un nouveau procédé pour l'identification ou le dosage immunologique d'antigènes polypeptidiques. Parmi les antigènes peptidiques et protéiques, certains peuvent avoir un caractère faiblement immunogénique. Autre- ment dit, lorsqu'ils sont injectés à certains animaux par les méthodes d'immunisation classiques, il est rare d'observer une réponse anticorps contre ces antigènes. C'est par exemple le cas pour les hormones peptidiques humaines ACTH (hormone corticotrope) et PTH (parathormone), lorsque l'on immunise par exemple des souris, des rats, ou des lapins. Les quelques anticorps dirigés contre ces molécules, possédant les qualités requises pour une application dans un dosage immunologique, ont été obtenus le plus souvent avec beaucoup de difficulté par immunisation avec la molécule complète ou un fragment, couplé à une protéine porteuse par la méthode à la carbodiimide ou la méthode à la glutaraldéhyde. Ces deux exemples ne sont évidemment pas limitatifs, et de nombreux autres antigènes protéiques solubles, ou membranaires à la surface de cellules, peuvent également être considérés comme peu immunogéniques. La faible immunogénicité va dépendre à la fois des propriétés physico-chimiques de l'antigène et des caractéris- tiques du système immunitaire de l'animal immunisé. Deux causes principales peuvent entraîner une absence de réponse anticorps chez un animal immunisé par un antigène peptidique. La première est une mauvaise stabilité de la molécule in vivo: la demivie de l'antigène après une injection chez l'animal sera alors trop courte pour stimuler une réponse anticorps. La deuxième est un "trou" dans le répertoire anticorps de l'animal immunisé. Ce "trou" dans le répertoire peut être lié, en particulier, à une forte homologie de structure entre l'immunogène protéique et la protéine endogène correspondante de l'animal immunisé. Cette res- semblance conduira le système immunitaire à ne pas recon- naître l'immunogène comme étranger au soi, et donc à ne pas produire d'anticorps en réponse à l'injection du peptide. Ceci est évidemment particulièrement vrai dans le cas ou l'on veut immuniser un animal avec une protéine strictement identique à la sienne. Ces deux explications peuvent être illustrées par le cas de l'ACTH humaine. La demi-vie de cette hormone injectée par voie intraveineuse chez le rat, est de l'ordre de 5 minutes; c'est donc une molécule très instable. Sur les 39 acides aminés qui la composent, 3 résidus seulement sont différents entre les protéines humaine et murine; c'est donc un antigène très bien conservé entre ces deux espèces. Lorsqu'il est injecté à une souris, cet antigène ne conduit donc que rarement à la production d'anticorps. En dépit de leur caractère faiblement immunogénique, il serait souhaitable de disposer d'un procédé facilitant l'obtention d'anticorps utilisables par exemple à la détec- tion ou au dosage de ces antigènes. Ce procédé devrait conduire à une plus grande variété d'anticorps, qui devrait permettre de développer notamment des systèmes de dosage et de détection plus performants que ceux qui utilisent actuel- lement les rares anticorps obtenus par les méthodes classi- ques. En particulier, dans le cas de la plupart des dosages immunologiques de l'ACTH et de la PTH humaines, les sensibi- lités requises ne sont atteintes que pour des temps d'incuba- tions très longs (souvent plus de 12 heures), et il y aurait donc intérêt à produire, à l'aide d'un tel procédé, des anticorps permettant de développer des dosages beaucoup plus rapides. Par ailleurs, on a vu ci-dessus que le caractère faiblement immunogénique d'un antigène peptidique pouvait être lié à une mauvaise stabilité in-vivo. Cette mauvaise stabilité peut se traduire in-vitro par une dégradation rapide de l'antigène dans l'échantillon à doser. Cette dégradation peut donc conduire à une sous estimation de la concentration réelle de l'antigène. Il y aurait donc grand intérêt à disposer d'un procédé qui permette de stabiliser de tels antigènes pour faciliter la manipulation des échantil- lons et éviter la dégradation. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un nouveau procédé d'identification ou de dosage d'un antigène X de nature polypeptidique, résolvant les problèmes ci- dessus, dans lequel on procède à une détermination im- munologique de la présence dudit antigène polypeptidique X dans un échantillon, caractérisé en ce que l'on traite l'échantillon à l'aide d'au moins un agent réactif sur une fonction epsilon -NH2 d'un reste lysine ou sur une fonction alpha-NH2 d'un peptide pour effectuer le couplage d'un reste dudit agent réactif sur ledit antigène polypeptidique X et ainsi obtenir un antigène polypeptidique X modifié, (antigène polypeptidique Xm), puis procède à la détermination immunologique de la présence dudit antigène polypeptidique X dans ledit échantillon à l'aide d'au moins un anticorps produit par immunisation contre un antigène polypeptidique Y identique à l'antigène polypeptidique Xm ou à un fragment antigènique de cet antigène Xm. Autrement dit, pour produire et utiliser des anticorps pour la détection immunologique d'antigènes peptidiques faiblement immunogéniques, la demanderesse a mis au point une méthode dont le résultat est la modification de la structure de l'antigène. La demanderesse a découvert de manière suprenante que cette modification de structure permettait d'une part de stimuler au cours des immunisations de nouvel- les cellules capables de sécréter des anticorps contre cet antigène modifié, et d'échapper ainsi à l'incapacité de l'animal immunisé à produire des anticorps contre l'antigène naturel, et d'autre part d'améliorer dans certains cas la stabilité de l'antigène, en particulier en lui conférant une meilleure résistance aux enzymes protéolytiques. En effet, l'absence de réponse anticorps chez un animal immunisé n'est pas obligatoirement liée à une identité stricte entre l'antigène polypeptidique et la protéine endogène de l'animal, mais plus généralement à une incapacité génétique à produire des anticorps contre cet antigène, ou à un phénomène de tolérance qui va se traduire par la suppres- sion de cette capacité à produire ces anticorps. L'important dans le présent procédé est donc de modifier l'antigène pour le rendre différent et échapper ainsi à cette incapacité génétique ou à cette suppression. Cette méthode repose sur une modification chimique de l'antigène polypeptidique naturel X pour obtenir une antigène polypeptidique Xm. Un antigène polypeptidique Y qui est identique à l'antigène peptidique Xm, ou correspond à un fragment de cet antigène sera utilisé au cours des im- munisations, dans la mesure o ce fragment correspond à au moins la taille d'un épitope (4 acides aminés) de l'antigène Xm et porte au moins un groupement modifié chimiquement. La modification chimique de certains acides aminés induit donc un changement de structure du polypeptide faisant apparaître des déterminants antigéniques différents et permet dans certains cas de protéger ou même supprimer les sites de clivage des enzymes protéolytiques, responsables de la dégradation de l'antigène in-vivo et dans les échantillons biologiques, notamment dans les cas o la modification intervient au voisinage de ces sites. Dans le cadre de la modification chimique de l'échantillon biologique avant le dosage, le changement de structure de certains enzymes protéolytiques peut entraîner une perte d'activité de ces enzymes, ce qui peut se traduire également par une augmentation de la stabilité de l'antigène dans l'échantillon modifié. Les immunisations avec l'antigène Y conduisent donc à la production d'anticorps dirigés contre l'antigène polypep- tidique Xm, qui sont ensuite utilisés par exemple pour doser ou détecter l'antigène X dans un échantillon auquel on fait subir la même modification. Par "antigène polypeptidique X", l'on entend un polypep- tide constitué d'au moins 10 acides aminés, de préférence au moins 25 acides aminés, et par "fragment" d'un antigène polypeptidique l'on entend un peptide constitué d'au moins 4 acides aminés et de préférence de moins de 80% de la totalité des acides aminés de l'antigène polypeptidique complet. Par "antigène polypeptidique X modifié" Xm, l'on entend qu'une réaction de modification chimique a été réalisée sur l'antigène X à l'aide d'un ou plusieurs agents chimiques réactifs sur un ou plusieurs groupements - NH2 d'un ou de plusieurs acides aminés comme défini ci-dessus. Pour modifier ces groupements -NH2 on peut utiliser un ou plusieurs agents réactifs spécifiques. Les conditions expérimentales utilisées peuvent favoriser la modification soit de la majorité des groupements -NH2 réactifs, soit la modification d'une partie seulement de ces groupements, en jouant en particulier sur les quantités de réactifs utilisées, comme le sait l'homme de l'art. La modification chimique d'un groupement -NH2 réactif de l'antigène par couplage d'un reste de l'agent réactif utilisé doit être suffisamment petite pour obtenir des anticorps spécifiques de l'antigène polypeptidique modifié et non des anticorps spécifiques de la modification. Le reste couplé devrait avoir de préférence un poids moléculaire inférieur à 400 daltons et notamment inférieur à 200 daltons. On peut contrôler la spécificité de l'anticorps vis à vis de l'antig- ène en vérifiant que les anticorps ne reconnaissent pas d'autres antigènes polypeptidiques ayant subi la même modifi- cation. Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé ci- dessus décrit, l'antigène polypeptidique Y utilisé dans les immunisations pour préparer des anticorps peut être obtenu comme suit: L'antigène polypeptidique purifié complet, naturel X, ou un fragment de cet antigène, est modifié par le ou les agents réactifs sélectionnés. L'antigène polypeptidique Y peut également être synt- hétique, ou semi synthétique. On peut en particulier préparer par synthèse un polypeptide ayant la séquence en acides aminés du polypeptide X ou d'un fragment X et le modifier en le soumettant à l'action de l'agent, ou des agents réactifs choisis. L'antigène Y est ensuite injecté directement, ou après couplage à une protéine porteuse, à un animal pour im- munisation et obtention d'anticorps monoclonaux ou polyclona- ux, suivant les méthodes connues de l'art antérieur. Après une modification préalable de l'échantillon par le, ou les réactifs sélectionnés mentionnés ci-dessus, ces anticorps seront alors utilisés suivant les méthodes connues de l'art antérieur, pour détecter ou doser l'antigène modifié. Dans le cas o les anticorps produits contre l'antigène Y reconnaissent également l'antigène naturel X non modifié avec une affinité suffisante, le dosage, ou la détection de l'antigène polypeptidique X, peut être effectué sur des échantillons non modifiés. Le réactif de modification peut être avantageusement choisi pour son efficacité (pour modifier les groupements - NH2 portés par l'antigène, il doit également modifier les nombreux groupements -NH2 réactifs portés par les autres protéines présentes dans l'échantillon), pour la rapidité de la réaction de modification, pour la simplicité de la mise en oeuvre de la réaction et pour sa compatibilité avec la réalisation ultérieure d'un dosage immunologique, et enfin pour sa stabilité et sa disponibilité à un moindre coût. Comme réactifs de modification des groupements epsilon - NH2 des lysines et alpha -NH2 des polypeptides, on retiendra préférentiellement les réactifs d'acylation comme les an- hydrides d'acides carboxyliques tels que l'anhydride succinique, l'anhydride acétique, ou l'anhydride citraconi- que, ou les esters activés tels que les dérivés de N-hydroxy- succinimidyl ester. En particulier avec l'anhydride succinique, la réaction d'acylation est rapide et efficace (on peut modifier prati- quement instantanément la quasi totalité des groupements -NH2 réactifs dans un échantillon biologique); le nombre de charges portées par la protéine est conservé puisque les groupements -NH2 sont remplacés par des groupements - COOH, ce qui favorise des interactions antigène- anticorps de haute affinité. Comme exemple d'antigène, on peut citer l'ACTH, ou la PTH humaine, ou leurs fragments biologiquement actifs, par exemple le fragment 1-24 de l'ACTH, et de manière générale tout antigène polypeptidique soluble ou membranaire compor- tant des groupements -NH2 réactifs susceptibles d'être modifiés chimiquement. Le procédé selon l'invention est bien sûr particulièrement intéressant pour les antigènes peu im- munogéniques. La présente invention a également pour objet les hybridomes obtenus selon les méthodes classiques de l'art antérieur, en utilisant comme antigène l'antigène Y défini ci-dessus, lesdits hybridomes permettant la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, et notamment un hybridome produisant des anticorps monoclonaux anti-ACTH acylée par l'anhydride succinique, choisi parmi les hybrid- omes déposés à la Collection Nationale de Culture de Microor- ganismes le 12 décembre 1995 sous les numéros 1-1648, 1-1649 et 1-1650. La présente invention a encore pour objet un anticorps monoclonal produit par un hybridome tel que défini ci-dessus. L'échantillon peut être par exemple un fluide biologi- que, tel que le sang, le sérum, l'urine, la sueur, les larmes, etc., ou encore un prélèvement de cellules ou de tissus. La méthode de dosage ou de détection ci-dessus peut utiliser un ou plusieurs anticorps monoclonaux ou polyclonaux et peut être par exemple: un dosage radioimmunologique par compétition, ou radioimmunométrique utilisant un traceur radioactif, luminescent, fluorescent ou enzymatique, ou un dosage immunoenzymométrique. Elle peut être aussi un dosage immunologique par agglutination de particules. Elle peut être encore une détection immunohistochimique sur un prélèvement de tissu, ou une analyse par cytométrie de flux d'un antigène cellulaire, réalisée sur une suspension cellulaire. Les exemples qui suivent illustrent la présente inven- tion. Exemple i: Synthèse d'ACTH succinylée. A lmg d'ACTH 1-39 de synthèse en solution dans 1 ml de tampon Hepes 0,2M, pH 8,2, on ajoute 180 ul d'anhydride succinique en solution à 3mg/ml dans du diméthyl formamide. Après une heure d'incubation à 20-25 C, le mélange réaction- nel est acidifié par addition de 4 ml d'acide trifluoroacéti- que (TFA) à 1 % dans l'eau. L'ACTH succinylée est ensuite purifiée par chromatographie liquide haute performance en phase reverse (CLHP-PR), à l'aide d'une colonne C18 micro- bondapack (Waters, USA) éluée par un gradient d'acétoni- trile dans une solution de TFA à 0,05 % dans l'eau. Exemple 2: Préparation des immunogenes ACTH L'ACTH succinylée est couplée d'une part à la sérum albumine bovine (BSA) et d'autre part à la thyroglobuline porcine (TG) par la méthode à la carbodiimide. A 500 lg d'ACTH succinylée en solution dans 0.5 ml d'eau on ajoute successivement: 1.25 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en solution dans 10 gl d'eau, et 1,5 mg de BSA ou de TG en solution dans 500 1l d'un tampon Mes (acide 2-(N-morpholino) éthane sulfonique) 0,1 M, pH 5,5. Après 4 heures d'incubation à 20-25 C, l'immunogène est purifié par tamisage moléculaire sur une colonne Superdex 200 16/60 (Pharmacia, Suède) éluée en tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCl 150mM, pH: 7,2 (PBS), à un débit de 1 ml/minute. Exemple 3: Immunisation et production des anticorps monoclonaux anti ACTH. Des souris Balb/c reçoivent des injections mensuelles de 500 ul d'émulsion à volumes égaux de 25 ug d'immunogène obtenu à l'exemple 2 en solution dans du tampon phosphate (PBS) avec de l'adjuvant de Freund. La première injection est réalisée en adjuvant complet et les suivantes en adjuvant incomplet. La moitié du volume est injectée par voie intrapé- ritonéale et l'autre moitié par voie sous cutanée. Pour chaque souris, 3 à 4 immunisations avec de l'ACTH succinylée couplée à de la BSA sont suivies par 4 à 5 immunisations avec de l'ACTH succinylée couplée avec de la TG. Des prélèvements de sérum sont réalisés 10 jours après chaque immunisation, pour suivre le taux en anticorps anti-ACTH succinylée. Cinq jours avant le prélèvement de leur rate, les animaux sélec- tionnés pour réaliser une hybridation lymphocytaire reçoivent il par voie intraveineuse, et 100 il par voie intra- péritonéale, d'une solution à 1 mg/ml d'ACTH succinylée couplée à de la TG en tampon PBS. Trois hybridations lympho- cytaires avec des cellules de myélome X63 AG3 réalisées à partir de trois animaux différents, ont permis d'obtenir 40 hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux anti-ACTH succinylée. Parmi ces hybridomes, après criblage des an- ticorps dans les surnageants de culture pour leur capacité à reconnaître l'ACTH succinylée marquée à l'Iode 125, et l'ACTH succinylée immobilisée dans les puits d'une plaque de microtitration, on retient les hybridomes IMMU 148, IMMU 299, et IMMU 314 qui ont été déposés à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes à Paris, le 12 décembre 1995, sous les Numéros I - 1648; I - 1649, et I - 1650. Les anticorps monoclonaux utilisés ci-dessus sont d'isotype IgGl pour IMMU148, et IgA pour IMMU299 et IMMU314. Leur constante de dissociation pour l'ACTH succinylée est respectivemenet de 1,9 x 10-10 M, 1,3 x 10-"M, et 3,4 x 10-10 M. Il ont la propriété de pouvoir se lier simultanément et sans compétition à l'ACTH succinylée. Exemple 4: Modification de 1'ACTH en solution dans un échantillon plasmatique et dans un standard d'ACTH. 250 gl d'échantillon plasmatique sont déposés dans un tube contenant 6, 15 mg d'anhydride succinique et 4 mg de rouge de phénol lyophilisés. 125 1il d'une solution alcaline composée de KOH 0,42 M et de KH2P04 0, 166 M à pH: 6,7 sont ensuite distribués dans chaque tube. La réaction de succiny- lation est pratiquement immédiate, et se traduit par la modification du colorant de la couleur rouge à la couleur jaune. On opère de même avec des solutions standards contenant des quantités connues d'ACTH. Exemple 5: Dosage de l'ACTH modifiée Après avoir subi le traitement par l'anhydride succini- que décrit ci-dessus, 300 M1 d'échantillon plasmatique, ou de solution standard contenant une quantité connue d'ACTH dans du sérum humain, sont déposés dans un tube recouvert de deux anticorps monoclonaux IMMU 148 et IMMU 314 anti-ACTH modifiée capables de se lier simultanément à l'ACTH succinylée. Les tubes sont alors incubés pendant 1 heure à 20-25 C sous agitation constante. Apres avoir été vidé de son contenu par aspiration, chaque tube est lavé par 2 ml d'une solution de NaCl à 9 g/l dans l'eau contenant 0,005 % de Tween 20. 100 p1 d'une solution contenant 250000 cpm d'un troisième anticorps monoclonal IMMU 299 marqué à l'iode 125, capable de se lier à l'ACTH succinylée donc simultanément aux deux autres, dans un tampon PBS contenant 0,1 % de BSA, sont distribués dans chaque tube. Après 3 heures d'incubation à 20-25 C sous agitation constante, les tubes sont à nouveau vidés de leur contenu par aspiration, et lavés par 2 ml de la solution de lavage. La radioactivité liée à chaque tube, proportionnelle à la quantité d'ACTH dans l'échantillon, est mesurée sur un compteur gamma pendant 1 minute. La concentration de chaque échantillon est calculée en rapportant la mesure de radio- activité effectuée sur la courbe standard tracée à l'aide des solutions d'ACTH standards. Ce dosage possède la même sensibilité que les meilleurs kits commerciaux tels que, mais il est réalisé en 4 heures alors que ceux-ci réclament 20 heures d'incubation. Exemple 6: Stabilité de i'ACTH succinylée Des solutions calibrées d'ACTH dans du sérum humain sont été dosées suivant le protocole ci-dessus. Une partie de ces solutions est ensuite modifiée par l'anhydride succinique, puis conservée 24 heures à 20-25 C, et enfin dosée suivant le protocole ci-dessus; l'autre partie est directement conser- vée à 20-25 C pendant 24 heures, puis modifiée par l'anhy- dride succinique, et enfin dosée suivant le même protocole. Les résultats de ces dosages montrent que, après conservation 24 heures à 20-25 C, on retrouve environ 61 % de 1'ACTH modifiée, et seulement 2.7 % de l'ACTH native. La modifica- tion de l'ACTH en solution dans du sérum par l'anhydride succinique, entraîne donc une augmentation de la stabilité de la molécule. L'homme de l'art appréciera qu'il est également possible de traiter un échantillon avec un agent réactif - sur une fonction -COOH d'un reste acide aspartique ou glutamique ou - sur une fonction -COOH terminale d'un peptide, ou encore - sur une fonction -SH, d'un reste cystéine pour effectuer le couplage d'un reste dudit agent réactif sur ledit antigène polypeptidique X et ainsi obtenir un antigène polypeptidique X modifié, (antigène polypeptidique Xm). Parmi les agents réactifs, on pourra donc citer également les réactifs d'alkylation des groupements -SH portés par les cystéines comme les haloacétates et les amides correspondan- tes tels que iodoacétate, bromoacétate, chloroacétate, iodoacétamides, bromoacétamide et chloroacétamide ou comme les dérivés maléimides tel que le N-éthylmaléimide, et citer enfin les carbodiimides, telles que la (1 éthyl 3 diméthylam- inopropyl) carbodiimide (EDC) associées à un composé nucléop- hile approprié, tel que la glycinamide, qui permettent de modifier les groupements -COOH des acides glutamique et aspartique et les groupements -COOH terminaux des polypep- tides. On peut donc aussi utiliser un ou plusieurs agents réactifs de modification chimique pour modifier deux ou plus de deux types de groupement réactif. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification ou de dosage d'un antigène polypeptidique X dans lequel on procède à une détermination immunologique de la présence dudit antigène polypeptidique X dans un échantillon, caractérisé en ce que l'on traite l'échantillon à l'aide d'au moins un agent réactif - sur une fonction epsilon -NH2 d'un reste lysine ou - sur une fonction alpha - NH2 d'un peptide, pour effectuer le couplage d'un reste dudit agent réactif sur ledit antigène polypeptidique X et ainsi obtenir un antigène polypeptidique X modifié, (antigène polypeptidique Xm), puis procède à la détermination immunologique de la présence dudit antigène polypeptidique X dans ledit échantillon à l'aide d'au moins un anticorps produit par immunisation contre un antigène polypeptidique Y identique à l'antigène polypeptidique Xm ou à un fragment antigénique de cet antigène Xm. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise un antigène polypeptidique Y identique à l'antigène polypeptidique Xm complet pour effectuer les immunisations. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise un antigène polypeptidique Y correspondant à un fragment de l'antigène polypeptidique Xm pour effectuer l'immunisation et ainsi obtenir des anticorps dirigés contre une région particulière de l'antigène Xm. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 carac- térisé en ce que l'on immunise un animal avec l'antigène polypeptidique Y, ledit antigène étant couplé à une protéine porteuse. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 carac- térisé en ce que l'on utilise un seul agent réactif. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que l'on utilise plusieurs agents réactifs. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 carac- térisé en ce que le, ou les agents réactifs sont sélectionnés parmi: l'anhydride succinique, l'anhydride acétique, les dérivés des esters de N-hydroxy succinimide. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 carac- térisé en ce que l'échantillon est un fluide biologique tel que le sang, le sérum, l'urine, la sueur, les larmes. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 carac- térisé en ce que l'antigène polypeptidique X est l'hormone corticotrope humaine (ACTH). 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'antigène polypeptidique est la parathormone humaine (PTH). 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la méthode de dosage est un dosage immunologique par compétition ou un dosage radioimmunométrique, utilisant un traceur radioactif ou luminescent ou fluorescent ou enzymatique, ou - un dosage immunologique par agglutination de par- ticules, - ladite méthode utilisant un ou plusieurs anticorps monoclonaux ou polyclonaux. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'échantillon est un prélèvement de tissus et l'antigène polypeptidique X est détecté par une méthode immunohistochimique. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'échantillon est une suspension cellulaire et o l'antigène polypeptidique X est détecté par une méthode de cytométrie en flux. 14. Un hybridome produisant des anticorps monoclo- naux anti-ACTH acylée par l'anhydride succinique, choisi parmi les hybridomes déposés à la CNCM le 12 décembre 1995 sous les numéros 1-1648, 1-1649 et 1-1650. 15. Un anticorps monoclonal anti-ACTH acylée produit par un hybridome tel que défini à la revendication 14.