Brevet FR2741076A1 — publié le 19970516

L'invention se rapporte à de nouveaux dérivés synthétiques de deux hormones thymiques, la thymuline et la thymosine, et à leurs applications, en tant que médicament ou dans le domaine de la cosmétologie. Les nombreuses études sur le fonctionnement du système immunitaire, ont mis en évidence le rôle capital du thymus et des hormones thymiques, dans la stimulation des défenses immunitaires de l'organisme. Les hormones thymiques, en particulier la thymuline, "J.F. BACH et coll.", la thymopoïétine "GRANDSTEIN" et la Thymosine "DAYNE" ont été identifiées comme étant de nature polypeptidique et peptidique. Ces hormones et principalement la thymuline et la thymopoïétine, ont la propriété d'induire la maturation des lymphoc?tes T et de stimuler la réponse immunitaire de l'organisme. Il a été démontré scientifiquement qu'il existait une relation étroite entre la diminution des fonctions thymiques avec l'âge, et le vieillissement cutané sur le plan physiologique normal. Au niveau pathologique, la perte d'activité du thymus, "involution", se traduit par l'apparition de troubles physiologiques : "maladies auto-immunes, alopécies (chute anormale des cheveux) etc...". Il a également été démontré qu'il existait une relation entre les propriétés physiologiques du thymus et certaines cellules de l'épiderme. Il existe en effet une similitude de structure entre certaines cellules du thymus et les kératinocytes. Il a été démontré que les kératinocytes sécrètent également, dans certaines conditions, une hormone du type thymopoietine identique à celle sécrétée par le thymus, et sont capables d'induire une maturation lymphocytaîre post thymique, et de prendre ainsi le relais du thymus. Cette relation, entre les activités physiologiques des cellule du thymus et les kératinocytes, a été récemment confirmée par la mise en évidence dans les cellules du thymus, de la présence de kératine et de kératohyaline, de structures identiques à la kératine et à la kératohyaline sécrétée par les kératinocytes de l'épiderme. Par ailleurs la démonstration apportée sur le plan scientifique, que les kératinocytes en phase de différenciation sécrétaient une substance activant la croissance des thymocytes, l'EFAF confirme les relations physiologiques existant entre le thymus et les kératinocytes. (ETAF Epidermal Thymocyte Activating Factor). Il existe un parallèle entre "I'involution" du thymus et la diminution de la synthèse de l'ETAF par les kératinocytes en fonction de l'âge, avec toutefois un décalage fonctionnel en faveur des kératinocytes (maturation lymphocytaire post thymique). L'utilisation des hormones thymiques, en particulier la thymuline et la Thymopoïetine en thérapeutique, a fait l'objet de nombreux travaux pharmacologiques et cliniques, en vue de la stimulation et de la régulation des défenses immunitaires de l'organisme. Utilisées sous forme d'extraits ou de molécules obtenues par synthèse chimique, ces produits ont donnés des résultats irréguliers et décevants, par suite de leur manque de stabilité, et d'un effet ubiquitaire lié à l'absence de relations doses-effets. La présente invention a pour objet, I'obtention par synthèse chimique de dérivés peptidiques des hormones thymiques, dont la structure a été orientée de façon à leur assurer une grande stabilité physico-chimique, et une activité pharmacologique parfaitement définie. Utilisant l'ensemble des connaissances acquises et développées récemment par nos équipes, concernant le rôle primordial de l'épiderme dans les défenses immunitaires et ses relations avec le thymus (International Society of Development and Comparative Immunology), la présente invention a pour objet, la réalisation de dérivés peptidiques de synthèse, dont l'activité physiologique et thérapeutique est orientée vers la stimulation et la modulation des défenses immunitaires du derme et de l'épiderme préférentiellement à toute action systémique. La présente invention a pour objet la réalisation de molécules peptidiques, homologues, ou dérivés des séquences peptidiques actives des principales hormones thymiques "la thymuline et la thymopoïétine". Plus particulièrement la présente invention a pour objet des conjugués peptidiques comprenant une séquence d'au moins trois acides aminés dérivés de la séquence totale de la thymuline ou de la thymopoïétine, les acides aminés pouvant être sous forme D, L, ou DL, ladite séquence étant conjuguées chimiquement ou physiquement avec au moins un composé sélectionné parmi - les acides monocarboxyliques de formule générale HOOC-R (1) dans laquelle R représente un radical aliphatique en C1-C20, linéaire ou ramifié, éventuellement substitué, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, ainsi que les dérivés alcool ou aldéhyde ou amide des acides de formule l;; - les acides dicarboxyliques de formule générale HOOC-R1CoeH (Il) dans laquelle R1 représente un radical aliphatique divalent, comprenant au moins 3 atomes de carbone, de préférence 3 à 10 atomes de carbone, droit ou ramifié, notamment un radical alkyl, alkylène, alkénylène ou alkynylène, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations éventuellement substitué, notamment par un ou plusieurs groupes amino, hydroxy, oxo ou un radical alkyl en C1-C3. Les conjugués selon l'invention, sont des dérivés de faible poids moléculaire, qui sont obtenus notamment sous forme de sels, d'esters ou d'amides des composés de formule I ou Il. Parmi les composés de formule I, sont particulièrement préférés des acides carboxyliques, à activité métabolique essentielle du cycle tricarboxylique de Krebs, agissant au niveau des mitochondries, comme coenzyme de décarboxylation oxydative, et dont les propriétés sont de se fixer préférentiellement par covalence sur les fonctions E aminés de certains peptides, sous forme de lipo-amides, facilitant ainsi la présentation des conjugués peptidiques obtenus selon l'inventon au récepteur beta de classe G, des cellules de l'épiderme. Pour ces acides, et d'autres convenant à la mise en oeuvre de l'invention, R peut représenter un radical aliphatique linéaire ou ramifié en C1-C20 substitué ou non, notamment un radical alkyl, alkényl ou alkynyl, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux choisis dans le groupe comprenant NH2, OH, oxo, thiol ou un radical cyclique non aromatique comportant de 5 à 6 atomes dans le cycle dont 1 ou 2 pouvant être différents du carbone, en particulier, S, O ou N, lesdits cycles pouvant être substitués par des radicaux alkyl en C1 à C3, notamment méthyl. En particulier lorsque R représente une chaine aliphatique en C1 C20, elle peut être substituée par un cycle choisi parmi D'autres composés de formule I adaptés à la mise en oeuvre de l'invention sont ceux pour lesquels, dans la formule générale I, R peut représenter un radical monoinsaturé de configuration cis ou trans, de formule générale R2-CH=CHdans laquelle R2 peut représenter un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant au moins 6 atomes de carbone, de préférence 6 à 16 atomes de carbone, éventuellement substitué par un groupe amino, hydroxy ou oxo. De manière avantageuse, dans la formule Il, R1 représente un reste alkylène en C4-C8 éventuellement substitué. Des conjugués peptidiques selon l'invention sont notamment ceux pour lesquels l'acide de formule générale I est choisi parmi l'acide acétique, I'acide DL lipoïque, I'acide dihydrolipoïque, la N-lypoyl-lysine, les acides hydroxydécénoiques et décénoïliques, I'acide rétinoïque et ses dérivés, le rétinal et le rétinol, I'acide myristique et ses dérivés, I'acide palmitique, sous forme de sels, d'esters ou amides, ou bien l'acide de formule générale II est choisi parmi l'acide adipique, I'acide a-amino adipique, l'acide pimélique, I'acide sébacique et leurs dérivés. Les acides de formules générales I ou Il sont de préférence choisis parmi l'acide acétique et ses dérivés, I'acide a-DL-Lipoïque et ses dérivés, I'acide dihydrolipoïque, la N-Lipoyl-Lysine, I'acide adipique, I'acide a-amino-adipique, I'acide pimélique, I'acide sébacique et ses dérivés, l'acide trans- 10-hydroxy-52-décénoïque et l'acide trans-oxo-9-decene-2-oïque, I'acide rétinoïque et ses dérivés, le rétinol, et le rétinal, I'acide myristique et l'acide palmitique. La séquence en acides aminés des conjugués selon l'invention contiendra l'une des 3 séquences suivantes Gln-Gly-Gly Arg-Lys-Asp Lys-Asp-Val En effet plus spéciquement, la présente invention concerne la réalisation de deux séries de molécules peptidiques dont les activités sont complémentaires, au niveau des applications dans les domaines de la médecine humaine et de la dermoecosmétologie. La présente invention concerne préférentiellement des conjugués peptidiques, dérivés de l'hormone thymique circulante, la thymuline, et dont les activités physiologiques sont orientées vers la maturation du système immunitaire et des différents médiateurs du système immunitaire cutané. Ces conjugués peptidiques étant particulièrement orientés vers le traitement des maladies auto-immunes de la peau, et en particulier, la prévention et le traitement des alopécies quelles soient d'origine physiologique (vieillissement), traumatiques ou pathologiques. La présente invention concerne également la réalisation de conjugués peptidiques, dérivés de l'hormone thymique cellulaire, la thymopoïétine, et dont les activités physiologiques sont également orientées vers la maturation du système immunitaire de la peau, tout en possédant une activité préférentielle pour la stimulation des métabolismes, des cellules de l'épiderme, en particulier des kératinocytes germinatifs, dont ils stimulent les sécrétions et les synthèses endocellulaires des molécules de structures "kératines de bas poids moléculaires et kératohyalines". Cette série de conjugués peptidiques étant particulièrement indiquée, vers le traitement des maladies de la peau, liées à des déficits immunitaires, et en particulier, au traitement préventif et curatif, du vieillissement cutané d'ordre physiologique (âge) ou pathologique. De préférence la séquence en acides aminés des conjugués peptidiques dérivés de la thymuline répond à la formule générale suivante: X-Gln-Gly-Gly-Y dans laquelle Gln représente la glutamine ou un dérivé de la glutamine, Gly représente la glycine ou un dérivé de la glycine ; les dérivés comprennent notamment les dérivés halogénés des acides aminés en cause. Les acides aminés peuvent être sous forme naturelle ou non. Selon l'un des aspects de l'invention, les conjugués peptidiques présenteront donc la formule suivante A-X-Gln-Gly-Gly-Y (III) dans laquelle A est un composé de formule générale I ou Il tel que défini précédemment, en particulier l'acide DL lipoïque, I'acide dihydrolipoïque ou la N-lypoyllysine. - X est: Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, P > r-Ala-Lys-Ser, une liaison ou Gîx-Ala-Lys-Ser dans laquelle Glx est : Pyro-Glu, Glu ou Gly et ses dérivés - Y est : Ser-Asn-OH Ser-Asn-NH2 Ser-OH Ser-NH2 Les amino-acides étant sous la forme L D ou DL De préférence, les conjugués peptidiques de formule III comportent une séquence d'au moins 4 acides aminés, en particulier de 4 à 9 acides aminés, celle-ci comprenant avantageusement la séquence Gln-Gly-Gly Ser. La présente invention concerne tout particulièrement les conjugués suivants I A - Pyr - Ma - L's - Ser - GIn - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 Il A - Pyr - Ala - Lys - Ser - GIn - Gly - Gly - Ser - NH2 III A - Ala - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 IV A-Ala-Lys-Ser-Cln- Gly - Gly- Ser- NH2 V A - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 VI A - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - NH2 VII A-Ser-Gln-Gly-Gly- Ser- Asn- NH2 VIII A-Ser-Gln-Gly-Glv- Ser- NH2 IX A - Gîn - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 X A - Gln - Gly - Gly - Ser- NH2 A étant défini précédemment ainsi que les dérivés de ces molécules sous forme de sels, d'esters ou d'amides. Les séquences d'amino-acides mentionnées ci-dessus, peuvent être des séquences d'amino-acides naturels ou non naturels. Il est également précisé que les conjugués peptidiques mentionnés ci-dessus et faisant l'objet de la présente invention, peuvent être obtenus sous la forme terminale NH2 et sous la forme terminale OH. De même, dans certains cas, il est possible que certains de ces amino-acides comportent des fonctions par exemple des glycosylations. Selon un autre aspect, I'invention concerne des conjugués peptidiques dérivés de la thymopoiétine et répondant à la formule générale suivante A-W-Lys-Asp-Z (IV) dans laquelle A est un composé de formule générale I ou Il tel que défini précédemment ou le radical correspondant, et notamment l'acide acétique et ses dérivés, l'acide DLe-lipoïque et ses dérivés, I'acide dihydrolipoïque, la N-lipoyl-lysine, I'acide adipique, I'acide a-amino-adipique, I'acide pimélique, I'acide sébacique et dérivés, I'acide trans-oxo-9-décéne-2 oïque, l'acide trans-hydroxy- i 0-décéne-2-oïque W représente : Glu-Gln-Arg, Gln-Arg, Arg, Arg-Lys-, Arg-Lys-Asp ou une liaison Z représente :Val-Tyr-NH2, Val-Tyr-OH Val-NH2, Val-OH, Tyr-OH, Tyr-NH2, OH ou NH2 W et Z étant choisis de telle sorte que l'une au moins des séquences Arg Lys-Asp ou Lys-Asp-Val est présente dans les composés de formule IV. Des conjugués peptidiques de formule IV comportant la séquence Arg-Lys-Asp-Val donnent d'excellents résultats. Les acides aminés peuvent être sous forme D, L ou DL et peuvent être éventuellement glycosylés. Des conjugués peptidiques particulièrement adaptés, et dont les activités biologiques sont complémentaires des conjugués peptidiques de formule III, sont les conjugués de formule IV suivants XI A-Glu-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NHz XII A-Glu-Gln-Arg- Lys-Asp-Val-Tyr-OH XIII A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NHz XIV A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XV A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2 XVI A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XVII A-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2 XVIII A-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XIX A-Arg-Lys-Asp-Val-NH2 A-Arg-Lys-Asp-Val-OH XXI A-Arg-Lys-Asp-NH2 XXII A-Arg-Lys-Asp-OH "A" étant défini précédemment ainsi que les dérivés de ces molécules sous forme de sels, d'esters, ou d'amides. Les séquences d'amino-acides mentionnés ci-dessus peuvent être des séquences d'amino-acides naturels ou non naturels. Il est précisé que les conjugués peptidiques mentionnés ci-dessus peuvent être obtenus sous la forme terminale NH2 ou OH. Les conjugués peptidiques selon l'invention peuvent également se présenter sous forme de complexes moléculaires avec un métal, notamment le zinc. Les conjugués selon l'invention pourront être obtenus par synthèse, par des techniques connues de l'homme du métier. Les synthèses des peptides libres peuvent être effectuées d'après les techniques de MERRIFIElO, selon deux procédés. Dans un premier procédé, on utilise un dérivé de la Glutamine protégé dans sa fonction d'amide y par le "NIbh" 1,4-diméthoxybenzhydryl Dans un second procédé, la synthèse est effectuée sans protection de l'amide r des résidus de la Glutamine. En utilisant la première et la seconde procédure, la partie protégée C-terminale du dipeptide est associée respectivement au tétrapeptide protégé Ser-Gln-Gly et à l'hexapeptide protégé Ala-Lss-Gln-Gly-Gly. Ainsi, la préparation des polypeptides de séquence X-Gln-Gly-Gly-Y, dans laquelle Y représente Ser-Asn et X représente Ser ou Ala-Lys-Ser, est effectuée en associant le dipeptide protégé Ser-Asn avec le peptide protégé X-Gln-Gly-Gly et par l'élimination consécutive possible des groupes protecteurs. En utilisant la seconde procédure, c'est donc I'octapeptide Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn qui est obtenu, alors qu'en utilisant la première procédure, le même octapeptide est préparé à partir de l'hexapeptide Ser-Gln-Gls-Gly-Ser-Asn en passant par l'heptapeptide Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn. L'octapeptide Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn permet alors de préparer les deux formes, par association du premier résidu PyroGlu ou Gln. Le processus utilisé pour associer le résidu PyroGlu dans la séquence Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y est le même quelles que soient les significations possibles de Y, à savoir Ser et Ser-Asn, et les significations possibles qui en sont dérivées par la modification d'un acide aminé, par exemple pour Ser-Asp, Ala-Asn. Cette association est obtenue de manière avantageuse au moyen du dérivé PyroGlu-OTcp dans la séquence Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y, dans laquelle certains acides aminés ont la possibilité d'être protégés dans leur fonction sur la chaine latérale. Les dérivés peptidiques faisant l'objet de la présente invention et précédemment décrits, peuvent être utilisés sous leur forme peptidique ou sous forme de conjugués, avec les acides carboxyliques précédemment décrits répondant à la formule générale I. Ces mêmes conjugués peptidiques peuvent être utilisés sous forme de complexes moléculaires avec un métal. Le métal utilisé pour la réalisation des complexes métallo-peptidiques de la présente invention est par exemple le Zinc, sous forme de ZnCl2 qui peut être couplé sous forme de sel, avec un groupe carboxylique de I'amino acide terminal, ou sous forme de complexes "peptides-Zn2,, dans les proportions suivantes de 1% de Zncl2 par molécule peptidique. Ces proportions sont variables en fonction du poids moléculaire du conjugué peptidique. Le complexe métallo-peptidique peut notamment être obtenu en solution à 10% de Zncl2, pour une molécule peptidique, après chauffage à 20 C pendant 10 minutes. Le complexe est ensuite purifié, par exemple sur colonne de biogel P-2, et élué avec de l'eau distillée et lyophilisé. On obtient un colyophilisat stable contenant 1% de Zinc fixe à la molécule du peptide par affinité. L'ensemble des composés selon la présente invention peut être utile à titre de médicament. En particulier, les conjugués selon la présente invention peuvent servir à la préparation d'un médicament destiné à corriger les déficiences du système immunitaire. Des compositions pharmaceutiques peuvent contenir au moins un conjugué selon l'invention et des excipients adaptés à l'administration par voie parentérale ou par voie topique externe. Ces compositions sont utilisables aussi bien dans le domaine de la médecine humaine et vétérinaire, administrables par voie orale, ou parentérale, mais de préférence sous forme administ rab le par voie topique externe. Les conjugués peptidiques faisant l'objet de l'invention, leurs dérivés et leurs compositons galéniques peuvent être présentés sous forme de crèmes, de laits, de lotions ou de sprays, et comporter des excipients connus et éventuellement d'autres principes actifs. Ils peuvent être utilisés seuls, ou sous forme d'associations ou de compositions galéniques pour le traitement des maladies auto-immunes dans les différents domaines de la dermatologie. L'invention concerne également l'utilisation des conjugués peptidiques en dermocosmétologie et en cosmétologie. La présente invention a donc pour objet des compositions galéniques, pharmaceutiques, et cosmétologiques comprenant au moins un des conjugués peptidiques décrit précédemment. Les conjugués peptidiques de l'invention, leurs dérivés, leurs associations avec des principes actifs connus, peuvent être utilisés sous forme de préparations cosmétologiques et capillaires, notamment pour le rajeunissement et le renouvellement des couches superficielles de la peau, et en particulier pour le traitement cosméto-capillaire de la chute des cheveux. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention, et notamment l'activité immunostimulante des peptides thymiques de synthèse administrés par voie topique, sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes Figure 1: Action de l'ETF sur la synthèse de DNA. Figure 2 : Action de l'ETF sur les cellules NK par voie topique (cellules cibles: YAC1). Le pourcentage de lyse est représenté aux jours 1, 3, 6, 9, 15, 18 et 21 de l'injection, pour les différents rapports cellules effectrices/cellules cibles. Figure 3 : Action d'ETF sur les cellules NK par voie topique (cellules cibles P815). Figure 4 : Action de L'ETC sur les cellules NK in vitro. Le pourcentage de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles est donné pour différentes doses d'ETF. Figure 5: Action de l'ETF sur les cellules NK par voie injectable. Le pourcentage de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles est représenté après stimulation par 15 pg d'ETF, et pour des animaux témoins. Figure 6 : Rôle de l'interféron dans la stimulation des cellules NK par ETF par voie injectable. Le pourcentage de lyse est donné en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles, en présence ou non d'antiinterféron. Figure 7 : Action de l'~TF sur des cellules NK par voie injectable cinétique de la réponse 1, 3 et 8 jours après administration de 15 pg ETF par voie intra-péritonéale. EXEMPLE N" 1 - PREPARATION DU CONJUGUE N" II A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2 A = acide DL Lipoïque La synthèse est réalisée selon la méthodologie générale décrite selon les étapes suivantes 1- Boc-Gln-Gly-Gly-OMe 2- Trifluoroacetate-Gln-Gly-Gly-OMe 3 - Z-Ser-NH-NH2(But) - > Bop - > DIEA - > DMF 4- Z-Ser-Glu-Gly-GLy-Ser-NH2 5 - Acide Lipoïque - > BOP - > DIEA - > DNIF 6 - Lipoyl-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-G Ly-Ser-NH2 Analyse HPLC des amino-acides Asp-1,02 ; Ser-1,77 ; Glu-1,0 ; Gly-2,00 ; Ala-0,91. EXEMPLE N" 2 - PREPARATION DU CONJUGUE N" III A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2 A = Acide Adipique La synthèse a été réalisée selon la méthodologie générale selon les étapes suivantes 1- Z-D-Als-Lys-(Boc)-Ser(But) - > DNIF 2 - Lys-(Boc)-Ser(But)-Gln(Mbh) - > DNIF 3- Gly-Gly-Ser(But)-Asn-O-But 4- Me.OH - > CH3COOH - > D-Ala-Lys(Boc)-Ser(But)-Gln(Mbh) - > Gly-Gly-Ser-Asn(But) 5 - Acide Adipique - > BOP - > DIEA 6- Adipoyl-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2 Analyse HPLC des amino acides Asp-1,02 ; Ser-1,77 ; Glu-1,0 ; Gly-2,00 ; Ala-0,91. EXEMPLE N" 3 - PREPARATION DU CONJUGUE N" I A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2 A = Acide Acétique Ce conjugué est obtenu par la méthodologie décrite à l'exemple 1 à partir du dérivé: Ala-Lys(Boc)-Ser( But-Gln-NIbh)-Gly-GIy-Ser( But)-Asn( But) décrit précédemment. On obtient un produit homogène par chromatographie dans les solvants G et H, à pH 2, 3. Analyse HPLC des amino acides. Asp-0,97 ; Ser-1,67 ; Glu-1,84 ; Gly-2,00 ; Ala-0,98. EXEMPLE 4 - MESURE DE L'ACTIVITE SUR LES CELLULES DE LANGERHANS IA+ ET LES THYMOCYTES THY.1.2+ DE L'EPIDERME DES SOURIS C57-BL/6 I Résumé Les kératinocytes des souris "C57-BL/6" stimulés par les dérivés peptidiques des hormones thymiques libèrent les médiateurs (messagers cellulaires) tels que l'ETAF, l'IL1 et IL6, qui induisent une activation de la réponse immunitaire des cellules immunocompétentes de l'épiderme, les cellules de Langerhans la+ et les Thymocytes Thy 1.2+. La mesure de cette activation par les techniques d'immunofluorescence est caractéristique de l'activité immunomodulatrice des peptides thymiques. I I Matériel et Méthode 1 - Echantillons expérimentés - Code: ETF En solution dans propylène glycol à (c) = 105 M/ml ETF - Peptide - n I ETF - Peptide - n III ETF - Peptide - n XV ETF- Peptide - n XIX témoin = propylène glycol 2 - Méthodologie Des souris mâles C 57 - BL/6 âgées de 5 à 7 semaines, réparties à raison de 4 par cage, avec libre accès à l'eau et à la nourriture soumises à une photopériode de 12 h de lumière par 24 heures, reçoivent quotidiennement et pendant 5 jours consécutifs une application topique du peptide dans du propylène glycol (vol de 50 cil), sur la face dorsale de l'oreille. Le jour 6, les animaux sont sacrifiés. On procède au prélèvement des oreilles avec séparation de la face dorsale et de la face ventrale. Les tissus de la face dorsale sont immergés dans de l'EDTA de Na (0,020 M) pendant 2 h à 37 C. Après incubation, I'épiderme est prelévé sous forme de feuillet intact fixé à l'acétone et réhydraté dans du PBS (tampon phosphate). Les CED (cellules épidermiques dendritiques) Thy 1-2 + et la + sont identifiées par double marquage en immunofluorescence indirecte. Le nombre de cellules par mm2 est déterminé par les zones périphériques de même surface, pour chaque feuillet épidermique. Les CED (cellules épidermiques dendritiques) portant le marqueur Ia+ ont été identifiées par l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-Ia+. Les feuillets épidermiques sont fixés à l'acétone, puis incubés pendant 1 h à 37 C en présence de l'anticorps monoclonal anti-Ia+ et marqués par la méthode de l'immunoperoxydase indirecte (Kit). Après incubation pendant 10 minutes à 37 C avec une solution d'amino-éthyl-carbazol, la préparation est lavée au PBS. Les CED Thy 1.2+ ont été identifiées par double marquage en immunofluorescence indirecte. Les feuillets épidermiques ont été fixés à l'acétone puis réhydratés dans le PBS. Les tissus marqués simultanément par des anticorps de souris anti-Thy 1.2+ dilués au 1:100 pendant 16 h à 4 C. Les échantillons de tissus ont été lavés trois fois dans du PBS pendant 60 mn puis incubés 60 mn à 37" C, soit avec des anticorps de chèvre anti-souris couplés à la rhodamine, dilués au 1:20, soit avec des anticorps de chèvre anti-lapin couplés à la fluorescéine (fluorescine diluée au 1:20 dans le PBS. Les tissus ont ensuite été lavés dans le PBS avant d'être montés comme décrit précédemment). Les témoins comportaient des feuillets épidermiques non marqués à l'anticorps primaire et incubés uniquement en présence des réactifs secondaires, afin de mettre en évidence d'éventuelles réactions croisées avec les anticorps conjugués à la rhodamine et à la fluorescéine. Le nombre de cellules de Langerhans Ia+ ou de CED Thy 1.2+ par millimètre carré a été déterminé dans quatre zones périphériques de même surface pour chaque feuillet épidermique, par immunofluorescence, au microscope confocal Zeiss équipé à cet effet. Au moins quatre animaux ont été étudiés dans chacun des groupes. La densité de cellules de Langerhans Ia+ et de CED Thy 1.2 + est indiquée pour chaque mesure. 3 - Résultats Les résultats résumés dans le tableau I montrent que ETF et ses homologues, administrés par voie topique à des souris C 57 BM6 augmentent de façon hautement significative, I'activité des cellules résidentes du système immunitaire cutané. On observe notamment une augmentation significative des phénotypes des cellules dendritiques épidermiques de Langerhans Ia+ (HLADR) à des doses de 0,1 à 1 nanogrammes. Parallèlement, on observe également une augmentation significative de l'activité des thymocytes épidermiques de phénotype Thy 1.2 +, c'est à dire ETAF dépendants, à des doses identiques. La réponse immunitaire cutanée est sous la dépendance de l'activité des Kératinocytes nucléés qui secrètent l'ETAF et les médiateurs de l'immunité, c'est à dire le 2ème signal sans lequel il n'y a pas de fonction immunitaire physiologique normale (Immuno-dermatologie LD.H.). On peut considérer que l'ETF et ses homologues, rétablissent les fonctions immunitaires de l'épiderme par activation des Kératinocytes des couches basales de façon physiologique, par opposition à la stimulation antigènique exogène. Résultats exprimés sur 4 lots de 4 souris C 57 BL/6 Nombre de cellules Thy 1,2+ et la+ par mm2 d'épiderme Doses Echantillons Nanog. Cellules Thy 1,2+ Moyenne % Cellules la+ Moyenne % 1 2 3 4 T 1 2 3 4 Témoins PG 80 76 87 110 88,25 98 102 100 110 102,50 ETF-I 0,10 197 180 192 207 194,00 120 368 388 378 395 382,25 273 0,50 200 208 199 219 206,50 134 360 392 386 399 384,25 275 1,00 214 210 208 226 214,50 143 372 410 390 412 396,00 286 ETF-III 0,10 168 165 180 176 172,25 95 376 382 387 399 386,00 277 0,50 190 190 205 200 196,25 122 380 388 299 388 363,75 255 1,00 200 220 216 210 211,50 140 305 400 398 410 378,25 269 ETF-XV 0,10 160 158 160 170 162,00 84 315 326 320 330 322,75 215 0,50 176 168 170 186 175,00 98 305 345 330 345 331,25 223 1,00 198 180 188 199 191,25 117 348 360 348 350 351,50 243 ETF-XIX 0,10 216 210 219 212 214,25 143 360 390 378 320 362,00 253 0,50 220 215 228 216 219,75 149 388 398 386 400 393,00 283 1,00 227 238 230 225 230,00 161 400 410 438 415 415,75 306 EXEMPLE 5 - MESURE DE L'ACTIVITE ETF N" IX SUR LES KERATINOCYTES DE PEAU HUMAINE ISSUS DE PRIMOCULTURE I Matériel et Méthode 1 - Modèle Cellulaire Culture des Kératinocytes humains normaux - Sources : Plastie mammaire - Primoculture : Les tissus fraichement biopsiés, en asepsie totale, Sont digérés à + 4 C dans la trypsine 0,25%, afin de séparer l'épiderme du derme. L'épiderme est ensuite dissocié sous action mécanique douce ou enzymatique afin d'obtenir des cellules individualisées. Seules les cellules basales seront capables de se multiplier in vitro. La culture est réalisée en athmosphère humide contrôlée (95% oz seo cq) à 37 C. En culture monocouche, la concentration en calcium se situe entre 0,05 et 0,1 mNl. Dans ces conditions, les Kératinocytes prolifèrent rapidement mais ne forment pas de strates. La synthèse des kératinocytes est maintenue. Les espaces intercellulaires sont larges : les connections cellulaires sont assurées par les microvillosités et non par les tight-junctions. Les tonofilaments de l'espace périnucléaire sont visibles mais ils ne sont pas encore rattachés aux plaques d'encrage. La stratification peut être induite par une augmentation de la concentration finale en calcium dans le milieu de culture jusqu'à 1,2 mM. Alors la formation de desmosomes apparait au bout de 2 heures. Le taux de sodium et de potassium intracellulaire augmente dès la 12ème heure, de plus, il n'est pas bloqué par les inhibiteurs classiques du flux Ca2 +/Na+. La stratification verticale est visible au bout de 2 jours et la différentiation terminale s'achève par des cellules à enveloppe cornifiée. (Hennings et coll. 1980). 2 - Echantillons analvsés I- Dérivé ETF n" IX, lyophilisé-dans Dextran (40g/l) 10-6 M dans milieu de culture final. II - Thymopoïetine Crist. SIGNIA - 106 NI dans milieu de culture final. III - Témoin: Dextran 15.000 D - (40g/l). IV - Protéines cellulaires - Sol. de broyat cellulaire de référence à 50 microgrammes par ml. 3 - híéthodologie La culture de kératinocytes humains est réalisée comme décrit par Henning et coll (1983) ou Fuchs et coll (1981). On effectue également des cultures air-liquide selon la méthodologie suivante. - Lattices de collagène sur grille Du collagène de type I ou IV est incorporé au milieu de culture. Des fibroblastes 3T3 sont ajoutés à cette solution à la concentration de 1,5.105/ml et ensemmencés en boite de pétri de 35 mm qui sont ensuite placées à 37 C. Après la formation du gel, du milieu est rajouté de façon à recouvrir entièrement les lattices. Les kératinocytes sont ensemmencés et maintenus ainsi en culture immergée durant 7 jours. A ce stade les lattices sont transférées sur des grilles en acier inoxydable. Ces grilles sont placées dans des boites contenant du milieu pendant 7 à 24 jours. - Membrane basale artificielle Des cellules endothéliales de cornée de boeuf sont cultivées sur des filtres recouverts de collagène. Après stimulation avec un facteur de croissance type FGF, ces cellules sécrètent du collagène IV et de la laminine, ainsi que d'autres molécules qui se déposent sur le collagène reconstituant ainsi une pseudo-membrane basale. Après élémination des cellules endothéliales bovines, les kératinocytes sont ensemmencés sur ce support. - Derme artificiel Des fibroblastes sont incorporés dans un gel de collagène. Après rétraction du gel, les kératinocytes sont ensemmencés sur cette lattice. - Membrane basale du derme Des fragments de peau humaine sont désépidermisés par immersion pendant 5 jours dans du PBS à 37 C. Après un tel traitement l'épiderme se détache complètement au dessus de la membrane basale. Des congélations et décongélations successives vont tuer les fibroblastes. Ce tissu, comportant le derme et la basale, servira de couche nourricière pour les kératinocytes. Culture sur Kcratohyaline Kératine 67 kD I. Plastique + immersion 2. Filtre couvert de coll. I ou IV I E 3. Filtre couvert de mem -brane basale artificielle I E 4. Derme artificiel I E + t. Derny naturel désepider- -!fliSè et tué @ + E I = Immergé E = Emergé Le contrôle de différenciation de l'épiderme est effectué par microscopie éléctronique (Prunieras, 1988), par analyse biochimique (Tinois et coll, 1993) et par analyse immunologique (Woodcock et coll, 1982, Prunieras, 1988). Cette dernière peut mettre en jeu des anticorps antiinvolucrine, anti-transglutaminase épidermique, anti-fillagrine et antikératines (AE1, AE2, AE3). Les kératines 48 Kd sont les marqueurs de la prolifération. Les kératines 50 et 58 Kd sont les marqueurs permanents des kératines. Les kératines 56,5 et 65/67 Kd sont les marqueurs de la différenciation. Les marqueurs cellulaires choisis sont les Kératines de bas poids moléculaire 46/47 KD spécifiques de la croissance des cellules germinatives et de leur différentiation cellulaire. Les filaggrines marqueurs de la Kératohyaline. Marquage fluorescent indirect selon la technique de sandwich - 48 heures après l'apport de calcium au milieu de culture (stratification). 1- - Anticorps Drimaires "SIGMA" - Ac de rat antikératine humaine 46-47 KD. - Ac humain antikératine humaine 56,5/68 KD - Ac humain antikératohyaline (Filaggrine) II - Anticorps secondaires "SIGNIA" - Ac de souris anti Ig G2 de rat marqués FITC. - Ac de chèvre anti Ig G humaine marqué FITC. * Dosages microscopiques - "Microscope ZEISS Confocal Laser Scanner" - Epi-fluorescent - LSM 310 - Mesure des marqueurs cellulaires par immunofluorescence, avec enregistrement graphique. * Dosages spectrofluorimétriques - "Spectrofluorimètre Perkin Elmer LS - 50 B". - Sur broyat surnageants cellulaires. * Dosages des protéines cellulaires - Technique de LOWRY au spectrophotomètre UV Perkin Elmer (surnageants de broyats cellulaires). Il Résultats Les tableaux n 11 et III résument l'activité du peptide n IX "ETF" sur la croissance des cellules germinatives des couches basales et suprobasales de l'épiderme - "Kératinocytes jeunes". L'intensité de fluorescence des cellules traitées par ETF n lX est apprécié comparativement à l'intensité de fluorescence des témoins. On observe une augmentation significative des cellules pré-Kératinocytaires germinatives et de leur activité métabolique. En particulier au niveau des synthèses de Kératine de bas poids moléculaire et des Kératohyalines "Filaggrines", de structures semblables à celle de la medulla du thymus. Tableau II "Résumé" Action de l'ETF sur la synthèse kératinocytaire de la kératine 46-47 KD et des protéines cellulaires comparativement à un témoin (exprimés en microgrammes/ml). Produit Concentration Kératine Kératine Stimulation M /Protéine /Protéine Moyenne Ecart Type Thymo poïétine 10-6 94,8 3,4 19 10-6 151,5 14,9 90 ETF 1(}8 156,0 13,2 95 N -IX 1010 148,9 22,9 86 1012 113,0 5,6 41 Tableau III "Résumé" Action de l'ETF sur la synthèse kératinocytaire de la kératohyaline et des protéines comparativement à un témoin (exprimés en microgrammes/ml). Produit Concentration Kératohyaline Kératine Stimulation M /Protéine /Protéine Nloyenne Ecart Type Thymopoïétine 10-6 4,99 0,54 35 106 5,97 0,12 62 ETF 108 6,75 0,66 83 N -IX 10-10 5,13 0,25 39 1012 5,11 0,39 38 EXEMPLE N 6 - ACTION DE L'KIF SUR LES GRANULOCYTES "MONONUCLEAR PHAGOCYTE SYSTEM" I Introduction La réponse immunitaire de l'Epiderme est sous la dépendance des Kératinocytes et des cellules de Langerhans, en association avec d'autres lignées cellulaires "granulocytes-thymocytes" etc... Les cellules de Langerhans sont considérablement moins compétentes pour la phagocytose que les kératinocytes, Ce qui les différentie formellement des macrophages". Elles sont semblables, phénotypiquement et fonctionnellement des cellules "voilées" (Veiled Cells) de la lymphe afférente et des cellules interdigitalisées des nodules lymphatiques. L'action des cellules de Langerhans est le résultat d'une coopération cellulaire, en particulier avec les cellules granulocytaires "phagocytes" sous la dominante des kératinocytes. I1 était donc intéressant d'apprécier l'activité de l'ETF, sur l'activité phagocytaire des granulocytes polymorphonucléaires et des systèmes cellulaires voisins, notamment des cellules NK (ENKAF, Epidermal Cell derived Natural Killer Activating Factor). Il - Action de 1'ETF sur les wranulocvtes sanguins 1) Protocole: Des cellules polymorphonucléaires de sang périphérique humain (granulocytes neutrophiles), à une concentration de 106 cellules/ml, sont préincubées 20 mm à 37" C avant l'addition de luminolet de particules de zymosan opsonisées par du sérum. La chimiluminescence est mesurée toutes les 3 minutes après l'addition du dernier réactif. Les résultats représentent la moyenne de 5 mesures indépendantes pour chaque point. (Déviation standard inférieure à 5% de moyenne). Deux systèmes sont utilisés A. L'agent inducteur est le peptide ETF n I présent Pendant toute la durée de l'essai. Des granulocytes normaux de sang périphérique humain, enrichis par sédimentation en dextrane et débarrassées des érythrocytes par lyse hypotonique. L'KIF est testé à des concentrations de 10, 1 et 0,1 g/ml. B. L'axent inducteur ETF est éliminé par lavage après Dréincubation et avant l'addition des réactifs chimiluminescents. Granulocytes normaux de sang périphérique humain purifiés par décantation sur dextrane et lyse hypotonique des érythrocytes. ETF est incubé 20 mm à 37 C avec les granulocytes puis éliminés par lavage avant l'addition de zymosan opsonisé et de luminol. 2 - Résultats: (les valeurs représentent la moyenne de 5 mesures) Système A Traitement Valeurs de chimiluminescence à: (mm) des cellules 3 6 9 12 15 18 21 PBS 22966 77 598 140423 178951 198063 191781 188 531 ETF 10yg/ml 79358 140100 170947 183578 174710 160718 137798 1 g/ml 59 867 138 846 183 578 207 713 203 449 188 901 168 813 0,1pg/ml 29205 86761 143463 176924 193589 188573 179449 Système B Traitement Valeurs de chimiluminescence à: (mm) des cellules 6 9 12 15 18 PBS 69 924 114 751 144 838 162 594 164 750 ETF 10 g/ml 103 105 119 677 125 307 119 952 112 499 0,1 g/ml 100532 124819 134788 129950 133707 3 - Conclusions: A.ETF a un impact considérable sur la potentialisation de la chimiluminescence dès les premiers instants, à des concentrations de 10 et 1 cig/ml. B. Même après lavage, ETF induit une activation significative des granulocytes à 10 et 0,11lg/ml. EXEMPLE 7 - ACTION DE L'ETF SUR LA SYNTHESE DU DNA I - Protocole - Echantillon Peptide ETF n VII Un pool de cellules spléniques de souris normales est obtenu et incubé dans des microplaques avec ETF seul à des doses croissantes. Le DNA est dosé à J1, J3, J5. Les résultats sont présentés sur la figure 1. I I Conclusions L'ETF montre une réponse très nette, proportionnelle à la dose. La plus forte dose utilisée (10 mg/ml) donne la plus grande synthèse de DNA à tous les jours du contrôle avec un maximum au 3ème jour. Il faut noter, toutefois, que les valeurs de base sont supérieures au 3ème jour, la réponse spécifique est peut-être en réalité plus précoce. EXEMPLE 8 - ACTION D'ETF SUR LES CELLULES FORMANT DES PLAGES DE LYSE (PFC) I Protocole 50 souris Balb/C recevant 5 g d'ETF par voie s.c. 108 GRM (globules rouges de mouton) dans 0,1 ml de PBS sont injectés par voie i.v. 20, 10, et 3 jours après ETF ou 2 jours auparavant. Technique PFC de Cunningham et Szenberg. Il Résultats Nombre de PFC pour 106 cellules spléniques. Traitement Date d'immuno- Nombre de PFC à stimulation J+3 J+4 J+5 J+6 Témoins GRM 0 86 509 374 119 ETF 5 Fg s.c. J-20 69 438 318 84 J- 10 323 823 337 104 J-3 57 399 353 129 J+2 119 410 336 135 III Conclusions On observe une réponse qui présente un maximum à J + 4 avec une augmentation importante, très significative, du nombre de PFC chez les animaux ayant reçu de l'ETF 10 jours avant l'antigène. EXEMPLE 9 - ACTION D'ETF SUR LES CELLULES NK I Action d'ETF sur les cellules NK - voie topique 1 - Protocole général voie topique: souris CBA/H (90 souris) cellules cibles * YAC-1 sensibles aux NK * P 815 non sensibles aux NK * ETF n VII Les souris reçoivent chaque jour par voie topique 15 llg d'ETF en solution dans du Propylène Glycol à 10-5 Ni/ml, pendant 14 jours consécutifs. Une dose identique de rappel est administrée le 18ème jour. La mesure de l'activiste lytique est faite tous les 3 jours par comptage du 51Cr libéré pour des rapports cellules effectrices : cellules cibles de 200 1, 100:1, 50: 1, 25 1, pendant 4 heures d'incubation. Les résultats sur les cellules NK par voie topique sont présentés sur les figures 2 et 3. Les résultats sont extrêment nets. On constate, en fonction du temps, après le début du traitement par ETF, une augmentation hautement significative de l'activité NK. Cette activité qui est décelable dès le 3ème jour devient très importante au 6ème et au 9ème jour et se maintient à un niveau très élevé pendant toute la durée de l'expérimentation (21 jours). 2 - Conclusions Aucune cytotoxicité non spécifique sur les cellules P 815 n'est décelable à aucun moment de l'expérimentation. Ceci exclut que l'administration de l'ETF conduise à l'induction de cellules de nature cytolytique non spécifique ou à l'activation polyclonale des cellules T cytolytiques. Il Action d'ETF sur les cellules NK - In vitro 1 - Protocole de l'essai "in "itro" Cellules spléniques normales de souris CBA. Incubateur à 37 C + C02 107 cellules par ml de milieu RPNII 1640 + 5% de sérum foetal de veau. Incubation avec des quantités variables de la substance à étudier. Cellules cibles YAC-1. La mesure de la lyse est faite par comptage du 51Cr libéré pour des rapports cellules effectrices/cellules cibles de 200 :1,100 1, 50: 1, 25 : 1 pendant 4 heures d'incubation. Les résultats sont présentés sur la figure 4. 2 - Conclusions: ETF stimule très fortement l'activité des cellules NK in vitro de façon proportionnelle à la dose. A une concentration de 0,1 g/ml, l'activité de l'ETF est encore très supérieure à 25 g/ml de poly I: C. (Activité au moins 100 fois supérieure à celle du produit de référence poly I : C, inducteur d'interféron). III Action d'ETF sur les cellules NK - Voie injectable 1- Protocole général voie injectable: Souris CBA/H de 4 à 5 mois. (140 souris) cellules cibles *YAC-1 sensibles aux NK (lsmphome induit/virus moloney) * P 815 insensibles aux NK (DBA/2 mastoctoma) La substance à tester (ETF n VII) est injectée par voie i.p. dans 0,2 ml de PBS, 24 heures avant le test. La mesure de la lyse est faite par comptage du 51 Cr libéré pour des rapports cellules effectrices : cibles de 200:1, 100:1, 50:1, 25 : 1 pendant 4 heures d'incubation. 2 - Résultats NK/voie injectable Les résultats de l'activité de stimulation des cellules NK par EFF sont représentés sur la figure 5. Ils montrent une forte activation des cellules NK, très significative (P P815. Sur la figure 6, on voit que l'activation des cellules NK par ETF est due à un effet inducteur d'interféron. On observe une réduction drastique des cellules NK lors de l'administration simultanée d'anti-interféron (a-IF). La cinétique de la réponse des cellules NK aux jours 1, 3 ou 8 de l'injection, par rapport à un témoin PBS, est représentée sur la figure 7. La stimulation des cellules NK par EFT est de courte durée par voie injectable. Chez les animaux jeunes (7 à 9 mois), ETF stimule à la fois les cellules NK et pré-NK de façon identique à des doses de tilorone de 1 mg par animal. BIBLIOGRAPHIE E TINOIS, H. DUMAS, Q. GAETANI, D. DUPONT, X.POURADIER DUTEIL, A. ROUGIER Nouv. Dermatol. 12 n 7,510,1993. H. HENNING, K.A. HOLBROOK, S.H. YUSPA The J. of Invest. Dermatol. 81 50-55,1983. E FUCHS, H. GREEN CELL, 25 617-625, 1981. M. PRUNIERAS Méthodes in vitro en pharmaco-toxicologie, Colloque INSERM 170 67-76, 1988. J. WOODCOCK-MITCHELL, R. EICHNER, W.G. NELSON, T. SUN TheJ. of Cell Biol., 95 580-588, 1992. REVENDICATIONS 1. Conjugué peptidique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 3 acides aminés dérivés d'une hormone thymique choisie parmi la thymuline et la thymopoïétine, les acides aminés pouvant être indépendamment sous forme D, L ou DL ladite séquence étant conjuguée chimiquement ou physiquement avec au moins un composé sélectionné parmi - les acides monocarboxyliques de formule générale HCOC-R (I) dans laquelle R représente un radical aliphatique en C1-C20, linéaire ou ramifié, éventuellement substitué, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, ainsi que les dérivés alcool ou aldéhyde ou amide des acides de formule I;; - les acides dicarboxyliques de formule générale HOOC-R1CoeH (11) dans laquelle R1 représente un radical aliphatique divalent, comprenant au moins 3 atomes de carbone, de préférence 3 à 10 atomes de carbone, droit ou ramifié, notamment un radical alk\l, alkylène, alkénylène ou alkynylène, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations éventuellement substitué, notamment par un ou plusieurs groupes amino, hydroxy, oxo ou un radical alkyl en C1-C3. 2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la formule générale I, R peut représenter: - un radical monoinsaturé de configuration cis ou trans, de formule générale R2-CH=CHdans laquelle R2 peut représenter un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant au moins 6 atomes de carbone, de préférence 6 à 16 atomes de carbone éventuellement, substitué par un groupe amino, hydroxy ou oxo;; - un radical aliphatique linéaire ou ramifié en C1-C20 substitué ou non, notamment un radical alkyl, alkényl ou alkynyl pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux choisis dans le groupe comprenant NH2, OH, oxo, thiol ou un radical cyclique non aromatique comportant de 5 à 6 atomes dans le cycle dont 1 ou 2 pouvant être différents du carbone, en particulier, S, O ou N, lesdits cycles pouvant être substitués par des radicaux alkyl en C1 à C3, notamment méthyl. 3. Conjugué selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que dans la formule II, R1 représente un reste alkylène en C4-C8 éventuellement substitué. 4. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les acides de formule générale I ou Il sont choisis parmi l'acide acétique, l'acide DL lipoïque et ses dérivés, l'acide dihydrolipoïque et dérivés, la N-lypoyl-lysine, I'acide adipique, l'acide a-amino-adipique, l'acide pimélique, I'acide sébacique et dérivés, les acides gras a-monoinsaturés pour lesquels "R2" représente un reste alkyle, linéaire ou ramifié en C7, en particulier les acides hydroxydécénoiques et décénoïliques. 5. Conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que les acides de formule générale I ou II sont de préférence choisis parmi l'acide acétique et ses dérivés, l'acide DL-Lipoïque et ses dérivés, l'acide dihydrolipoïque, l'acide N-Lipoyl-Lysine, l'acide adipique, l'acide a-amino-adipique, l'acide pimélique, I'acide sébacique et ses dérivés, l'acide trans-10-hydroxy-A7-décénoïque et l'acide trans-oxo-9-décénoïque. 6. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence d'aminoacides est liée à l'acide ou au dérivé de formule I ou II, sous forme de sel, d'ester ou d'amide. 7. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il présente la formule générale A-X-Gln-Gly-Gly-Y (III) dans laquelle A est un composé de formule générale I ou II ou le radical correspondant - X est: Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Pyr-Ala-Lys-Ser, une liaison ou Glx-Ala-Lys-Ser dans laquelle Glx est : Pyro-Glu, Glu ou Gly et ses dérivés - Y est : Ser-Asn-OH Ser-Asn-NH2 Ser-OH Ser-NH2 les acides aminés étant sous forme D, L ou DL 8.Conjugué selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il présente la formule générale A-W-Lys-Asp-Z (IV) dans laquelle A est un composé de formule générale I ou Il ou le radical correspondant W représente Glu-Gln-Arg, Gln-Arg, Arg, Arg-Lys-, Arg-Lys-Asp ou une liaison Z représente : Val-Tyr-NH2, Val-Tyr-OH Val-NH2, Val-OH, Tyr-OH, Tyr-NH2, OH ou NH2 l'une au moins des séquences Arg-Lys-Asp ou Lys-Asp-Val étant présente, les acides aminés étant sous forme D, L ou DL 9.Conjugué selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les dérivés peptidiques suivants I A - Pyr - Ala - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 Il A - Pyr - Ala - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - NH2 III A - Ma - Lys - Ser - GIn - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 IV A-Ala- Lys- Ser- Gin - Gly- Gly - Ser- NH2 V A - Lys - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 VI A-Lys-Ser-Gln-Gly- Gly- Ser - NH2 VII A-Ser-Gln-Gly-Gly- Ser- Asn- NH2 VIII A - Ser - Gln - Gly - Gly - Ser - NH2 IX A - Gln - Gly - Gly - Ser - Asn - NH2 X A - Gln - Gly - Gly - Ser - NH2 XI A-Glu-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2 XII A-Glu-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XIII A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tvr-NH2 XIV A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XV A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2 XVI A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XVII A-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2 XVIII A-Lys-Asp-Val-Tyr-OH XIX A-Arg-Lys-Asp-Val-NH2 XX A-Arg-Lys-Asp-Val-OH XXI A-Arg-Lys-Asp-NH2 XXII A-Arg-Lys-Asp-OH A étant un composé de formule I ou II, ou le radical correspondant, les acides aminés pouvant être sous forme D, L ou DL 10. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins une partie des acides aminés est sous forme glycosylée. 11. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est sous forme de complexe métallopeptidique lié chimiquement ou physiquement à un sel de Zinc. 12. A titre de médicament, conjugué selon l'une des revendications 1 à 11. 13. Utilisation d'un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11 pour la préparation d'un médicament destiné à corriger les déficiences du système immunitaire. 14. Utilisation d'un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11 pour la préparation d'une composition destinée au traitement et à la prévention de la chute des cheveux. 15. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11 et des excipients pharmaceutiquement acceptables. 16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que les excipients sont adaptés à l'administration par voie parentérale. 17. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que les excipients sont adaptés à l'administration par voie topique externe. 18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu il s'agit d'une préparation à usage dermatologique, utilisable sous forme de crèmes, de laits, de lotions, de sprays, en administration topique pour le traitement préventif et curatif des alopécies. 19. Composition dermocosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11. 20. Préparations dermo-cosmétologiques et cosmétologiques, contenant un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11, utilisables sous forme de crèmes , de gels, de laits, de lotions et de sprays, caractérisés en ce qu'il s'agit de préparations cosmétiques à l'usage des soins de beauté et du rajeunissement cutané en applications locales. 21. Préparations cosméto-capillaires contenant un conjugué selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisées en ce qu'il s'agit de préparations destinées à la prévention et au traitement de la chute des cheveux, applicables localement sous forme de lotions, de sprays, et d'ampoules lyophilisées, avec solvant, pour applications locales.