Brevet FR2740684A1 — publié le 19970509

La présente invention concerne l'utilisation de fractions résiduelles du raisin après foulage pour la prépara- tion d'une composition prophylactique absorbable ayant un effet protecteur contre les ondes électromagnétiques à effet ionisant ou non ionisant. La production de radicaux libres et, en particu- lier, de radicaux libres oxygénés est un processus physiologi- que normal au niveau cellulaire n'ayant, normalement, pas de conséquences délétères vu que l'organisme humain est pourvu de systèmes de protection: ces systèmes de protection sont cons- titués soit par des systèmes enzymatiques piégeurs de radicaux libres oxygénés tels la SOD ou susceptibles de décomposer des produits toxiques secondaires (H202) tels la catalase, soit par des systèmes non enzymatiques tels la vitamine E ou le gluta- thion. Il arrive toutefois que le niveau de production des radicaux libres oxygénés excède les capacités des systèmes pro- tecteurs et que ceux-ci réagissent avec d'autres molécules des cellules vivantes, ce qui peut avoir pour conséquence de pro- fondes perturbations de l'intégrité membranaire, l'inactivation de nombreux systèmes enzymatiques et de profondes modifications de la structure des acides nucléiques. Cette hyperproduction de radicaux libres oxygénés peut résulter: - soit d'une activation de mécanismes endogènes connus comme générateurs de radicaux libres oxygénés tels le métabolisme énergétique au niveau des chaînes respiratoires ou l'activité des macrophages particulièrement stimulés en cas d'inflammation, - soit d'une genèse induite par des facteurs exogènes tels que les ondes électromagnétiques (radiations ionisantes ou non ionisantes) ou une hyperoxygénation. Parmi les mécanismes induits par une production ex- cessive de radicaux libres oxygénés, les scientifiques s'accordent à considérer que le plus important est la lipope- roxydation qui correspond à la dégradation sous l'effet de réactions radicalaires des acides gras poly-insaturés présents dans les phospholipides constitutifs des membranes des cellules vivantes; en conséquence, ces espèces moléculaires sont la ci- ble privilégiée des attaques radicalaires. On a pu déterminer expérimentalement que sous l'effet des radicaux libres oxygénés, les molécules d'acide gras poly-insaturés tendent à s'oxyder et à générer de nombreux produits de dégradation parmi lesquels les plus importants sont des aldéhydes, notamment le malondialdéhyde. Ce catabolisme a pour conséquence une perte de l'intégrité et de la stabilité des acides gras poly-insaturés, ce qui se traduit par une alté- ration profonde de l'intégrité cellulaire. Il est généralement admis que ces phénomènes sont impliqués dans des pathologies aussi variées que la polyar- thrite rhumatoide, certains cancers, certaines maladies neuro- dégénératives (Alzheimer, Parkinson), les ischémies cérébrales et cardiaques et, d'une façon générale, le vieillissement et la mort cellulaire. A côté des systèmes de protection classiques sus- mentionnés (SOD, catalase, vitamine E,...), il est connu de- puis plusieurs années que certains flavonoides d'origine végétale sont d'excellents piégeurs de radicaux libres. On a pu constater que dans ce groupe, les plus intéressants semblent être les procyanidols ou les proanthocyanidines qui correspon- dent à des tanins hydrolysables constitués par une molécule glucidique sur laquelle est estérifié de l'acide gallique ou un de ses dérivés et qui sont capables de libérer du cyanidol par hydrolyse en milieu acide. Suivant leur degré de polymérisation croissant, les procyanidols sont caractérisés par les termes suivants: mono- mères, dimères, trimères, tétramères, oligomères et condensés; parmi les monomères, les plus courants sont l'épigallocatéchine et l'épigallocatéchine-gallate. On a en effet constaté que ces composés ont une très haute efficacité intrinsèque et sont en particulier nettement plus actifs que la vitamine E. A partir de ces connaissances générales, on a déjà proposé, conformément à la publication JP-A-04/164 030, une composition prophylactique pour la protection contre les trou- bles liés à la radioactivité - tels qu'ils peuvent par exemple surgir chez des patients qui sont soignés par radiothérapie ou chez les manipulateurs permanents d'appareils émettant des rayonnements radioactifs - susceptible d'être absorbée par voie orale et dont les constituants actifs sont l'épigallocatéchine ou l'épigallocatéchine-gallate monomères préalablement puri- fiées. Cette publication japonaise indique que cette composi- tion prophylactique peut être constituée par un mélange d'épigallocatéchine et d'épigallocatéchine-gallate dans le rap- port 1/3 obtenu à partir de feuilles de thé vert. La préparation de cette composition présente, tou- tefois, l'inconvénient de nécessiter des opérations d'extraction et de purification longues et coûteuses, donc par- ticulièrement incommodes. Conformément à l'invention, on a eu l'idée de remé- dier à ces inconvénients grâce à l'utilisation, pour la prépa- ration d'une composition prophylactique absorbable ayant un effet protecteur contre les radiations ionisantes ou non ioni- santes, non pas d'une composition à base de constituants préa- lablement isolés mais d'un extrait brut des fractions résiduelles du raisin après foulage, c'est-à-dire d'un produit disponible en grandes quantités et donc peu onéreux. Selon l'invention, un tel extrait brut peut renfer- mer des pépins et/ou des rafles et/ou des pellicules. Il peut également être obtenu à partir de tourteaux résiduels provenant de la fabrication de l'huile de pépins de raisins. Il est à noter qu'au cours des opérations de vini- fication, les grappes de raisin sont foulées, c'est-à-dire écrasées en partie afin de libérer le moût qui contient environ % de jus et 20 % de matières solides essentiellement consti- tuées par les pépins, les rafles et les pellicules. Ce moût est ensuite transféré dans une cuve de fermentation dans laquelle se produisent les différentes réactions chimiques de macération et de fermentation qui permettent la transformation du raisin en vin. Au cours de ces réactions, une partie des constituants initialement contenus dans les matières solides diffuse dans le jus. Les matières solides résiduelles sont ensuite séparées du jus puis pressées de manière à obtenir un vin dit " de presse " et un résidu nommé marc. Ce résidu peut être distillé pour la production d'eau de vie, ou encore être utilisé en alimentation animale. Un autre débouché des marcs de vinification plus ou moins séchés correspond à la fabrication de l'huile de pépins de raisins par une opération de pressage au cours de laquelle la partie grasse est séparée d'un tourteau. Il est à noter que l'on a déjà proposé d'utiliser des sous-produits de la vinification pour la préparation après purification d'un médicament destiné au traitement des problè- mes de circulation veineuse: l'Endotelon . Malgré les diverses possibilités susmentionnées, la majeure partie des marcs de vinification et des tourteaux pro- venant de la fabrication de l'huile de pépins de raisins est aujourd'hui mal rentabilisée.15 Or, différentes études antérieures ont permis de démontrer que les pépins de raisins présents dans ces résidus, sont particulièrement riches en procyanidols et renferment, en particulier, d'importantes quantités d'épigallocatéchine et d'épigallocatéchine-gallate pouvant se trouver sous forme mono- mère mais également sous forme dimère, trimère, et oligomère. Conformément à l'invention, on a vérifié que ces procyanidols sont également au moins partiellement présents dans les sous-produits de vinification susmentionnés, ce à côté de constituants autres tels la catéchine, ou encore l'acide gallique ou l'acide caféique. On a, par suite, proposé d'utiliser un extrait brut de toutes ou parties des fractions résiduelles du raisin après foulage pour la préparation d'une composition prophylactique absorbable ayant une action protectrice contre les ondes élec- tromagnétiques à effet ionisant ou non ionisant. On a pu constater qu'un tel extrait brut a, de ma- nière surprenante, une efficacité nettement supérieure à celle de l'épigallocatéchine et de l'épigallocatéchine-gallate iso- lées ou même associées entre elles sur la prévention des alté- rations lipidiques induites par les radiations. Compte tenu de ce qui précède, l'utilisation con- forme à l'invention présente l'avantage de permettre de valori- ser les sous-produits des cépages vinicoles. L'invention se rapporte également à une composition prophylactique absorbable ayant un effet protecteur contre les ondes électromagnétiques ionisantes ou non ionisantes. Selon l'invention, cette composition prophylactique est caractérisée en ce qu'elle est constituée par un extrait brut de toutes ou parties des fractions résiduelles du raisin après foulage renfermant essentiellement de la catéchine, de l'épicatéchine et de l'acide gallique, la catéchine et l'épicatéchine pouvant soit être associées à l'acide gallique, soit être sous une forme non galloylée et ces composés se pré- sentant sous forme de monomères ou sous forme d'oligomères ho- mogènes ou hétérogènes ayant différents degrés de polymérisation, et en ce qu'elle renferme 10 à 30 % de monomè- res, 10 à 30 % de dimères, 10 à 30 % de trimères et 30 à 60 % de tétramères. Selon une autre caractéristique de l'invention, la composition renferme des traces d'acide caféique. A titre d'exemple non limitatif, un tel extrait brut peut être obtenu par un procédé connu en lui même par le- quel: - on pulvérise une préparation à base de pépins de raisins, - on soumet la poudre ainsi obtenue à une première extraction par de l'acétone, - on sépare l'extrait ainsi obtenu par filtration, - on lui ajoute du chlorure de sodium jusqu'à saturation, - on évapore l'acétone, - on reprend l'extrait par de l'eau distillée, - on soumet la solution ainsi obtenue à une seconde extraction par de l'acétate d'éthyle, - on sépare la phase organique et on soumet celle-ci à une lyo- philisation de manière à obtenir l'extrait brut. Il est à noter qu'il est avantageux d'effectuer la pulvérisation de la préparation de base en présence de neige carbonique pour la facilité et obtenir une meilleure homogénéi- té. Il est en outre à noter que cette préparation de base est en règle générale relativement riche en composés apo- laires qu'il convient d'éliminer pour obtenir en fin de proces- sus une composition satisfaisante. A cet effet, il est avantageux de soumettre la so- lution à une extraction intermédiaire par de l'éther diéthyli- que avant la mise en oeuvre de la seconde extraction. Une préparation à base de pépins de raisins d'origine bordelaise a à titre d'exemple été traitée par le procédé susmentionné en utilisant de l'acétone à 70 % pour la première extraction.10 Après lyophilisation, on a ainsi obtenu une compo- sition renfermant 34 % de catéchine, 36 % d'épicatéchine, 11,6 % d'acide gallique et 0,007 % d'acide caféique. On a en outre constaté que cette composition ren- fermait 19 % de monomères, 18 % de dimères, 21 % de trimères et 42 % de tétramères. Compte tenu de sa bonne absorption intestinale et de sa diffusion rapide dans l'organisme, l'apport quotidien " per os " de l'extrait brut susmentionné représente une sup- plémentation nutritionnelle régulière permettant de lutter con- tre la production de radicaux libres oxygénés induite sous l'action de rayonnements ou d'un stress oxydatif dépassant les capacités endogènes de protection. En ce qui concerne les recommandations d'emploi, la quantité d'extrait à ingérer peut varier selon les cas, mais il est en règle générale souhaitable d'utiliser chez l'homme adulte des doses quotidiennes de 20 mg à 3 g. La limite inférieure de cette fourchette s'applique à titre d'exemple aux personnes régulièrement exposées à de faibles radiations, tandis que la limite supérieure est plus spécialement adaptée à des personnes soumises à une irradiation intense, mais de courte durée. Différents tests ont permis de démontrer l'efficacité de l'extrait brut conforme à l'invention contre les altérations induites par les radiations ionisantes (rayons X) et les radiations non ionisantes (UV-C). L'efficacité de cet extrait a d'abord été étudiée sur les acides gras poly- insaturés purs en solution aqueuse après induction du stress oxydatif par les rayons UV-C (200 gW/cm; 24 h). On a ainsi pu obtenir une protection totale de ces molécules à partir de 2 mg/l d'extrait dans le milieu. On a ensuite étudié l'effet de cet extrait sur les atteintes induites par les rayons UV-C sur les lipides membra- naires du cerveau et du foie de souris. On a, là encore, appor- té la preuve de l'efficacité totale de cet extrait à partir d'une concentration de 4 mg/1. Dans une troisième étape, on a étudié l'effet des radiations UV-C et X sur des cellules fibroblastiques humaines en culture ainsi que la protection apportée par l'extrait brut conforme à l'invention. Le suivi de la lyse cellulaire après irradiation UV-C (200 yW/cm; 1 h) a montré que la protection exercée par cet extrait sur les cellules en culture était dose- dépendante et qu'elle est supérieure à 50 % pour une concentra- tion en extrait de 40 mg/l. Pour les rayons X, la viabilité cellulaire a été prise en considération. Cet index a été évalué par dénombrement cellulaire mais également par suivi du pouvoir de prolifération des cellules remises en culture après irradiation aux rayons X20 (30 Grays à raison de 2 Gy/min). Ceci a permis de constater que, à partir de 20 mg/l d'extrait brut dans le milieu, le nom- bre de cellules mortes est significativement réduit. En outre, la prolifération des cellules qui est bloquée chez les cellules irradiées en l'absence d'extrait est en grande partie restaurée chez les cellules irradiées en présence de cet extrait. On a, enfin, étudié l'effet de l'extrait conforme à l'invention sur le système hématopoiétique après irradiation totale de rats mâles avec des rayons X (5 Gy en 3 séances). Au- paravant, une série de rats ont été gavés avec 60 mg/jour d'extrait. Six jours après la dernière irradiation, les animaux ont été anesthésiés et le sang a été prélevé au niveau de la carotide. Une analyse sanguine a été réalisée sur chacun des échantillons. Avant irradiation, aucun effet toxique n'a été ob- servé chez les animaux ayant ingéré la préparation conforme à l'invention. Les résultats de cette expérience ont montré qu'il y avait une diminution de tous les constituants et paramètres sanguins (hématies, plaquettes, hématocrites, hémoglobine, po- lyneutrophiles, lymphocytes et monocytes) chez les rats irra- diés sans prétraitement et qu'il y avait une nette amélioration chez les animaux préalablement gavés avec l'extrait brut con- forme à l'invention. A titre d'exemple on a effectué un dénombrement plaquettaire chez des animaux témoins, des animaux irradiés et des animaux irradiés préalablement traités avec l'extrait con- forme à l'invention. On a ainsi obtenu les résultats suivants:10 - animaux témoins 327,5 103,5 G/l - animaux irradiés 152,66 + 49,93 G/l - animaux traités puis irradiés 277,66 78,54 G/l Ces résultats montrent clairement l'efficacité in vivo de l'extrait conforme à l'invention. Pour mettre en lumière la supériorité de l'extrait brut conforme à l'invention par rapport à l'épigallocatéchine et l'épigallocatéchinegallate isolées, conformément à la pu- blication JP-A-04/164 030, on a irradié par des UV-C 2 (200 pW/cm) durant 15 h une préparation de microsomes de foie de babouins en présence d'épigallocatéchine (EGC), d'épigallocatéchine-gallate (EGCG) ou de l'extrait brut con- forme à l'invention (I). Les additions ont été effectuées de façon à avoir toujours la même quantité d'épicatéchine, à savoir 1,45 mg/l. On a ensuite procédé à la quantification des acides gras poly-insaturés résiduels (AGPI) (20:4 n-6 et 22:6 n-3) ainsi que du malondialdehyde (MDA) qui est un produit de leur dégradation. Ce test a permis d'aboutir aux résultats suivants: Concentration MDA (gM) AGPI :4 n-6(lg/ml) 22:6 n-3 (gg/ml) Témoins fnon 0 137.85 2. 65 42.43 14.0 irradiés Echantillons irradiés sans 34.17 4.07 081. 73 7.65 15.40 1.57 additif Echantillons 22.66 1.75 136.29 0.08 45.25 9.61 irradiés + I Echantillons 32.02 2.60 094.53 9.11 24.05 2.36 irradiés + EGC Echantillons irradiés + 32.25 0.76 098.59 21 31.40 1.48 EGCG Ces résultats prouvent que l'irradiation des micro- somes entraîne une dégradation des acides gras poly-insaturés et une augmentation de la production de malondialdéhyde. L'extrait conforme à l'invention semble apporter une protection significative des microsomes contre ces altéra- tions ce qui n'est pas le cas de l'épigallocatéchine et de l'épigallocatéchine-gallate isolées. On a ensuite repris ce même test en irradiant une préparation de microsomes de foie de babouin à plus faible con- centration protéique en présence de l'extrait brut de pépins de raisins conforme à l'invention et d'un mélange constitué de 1/4 d'épigallocatéchine et de 3/4 d'épigallocatéchine-gallate. Les additions ont là encore été réalisées de façon à avoir 1,45 mg/l d'épicatéchine dans tous les cas. Les analyses effectuées similaires au test susmen- tionné ont permis d'aboutir aux résultats suivants: Concentration MDA (gM) AGPI :4 n-6(ig/ml) 22:6 n-3 (gg/ml) Témoins non 0.378 0.05 18.96 0.86 8.21 1.85 irradiés Echantillons irradiés sans 14.93 0.35 6.66 + 0.11 indétectable additif Echantillons 5.91 1.76 16.59 0.01 7.51 0.47 irradiés + I Echantillons irradiés + mé- 14.186 0.37 09.59 + 1.15 2.95 0. 99 lange EGC/EGCG Ce test a permis encore une fois de prouver que l'extrait conforme à l'invention permet une protection des mi- crosomes contre les altérations induites par les rayons UV-C5 alors que le mélange épigallocatéchine/épigallocatéchine- gallate semble totalement inefficace aux doses utilisées. ll R E V E N D I C A T IONS 1 ) Utilisation d'un extrait brut des fractions résiduelles du raisin après foulage pour la préparation d'une composition pro- phylactique absorbable ayant une action protectrice contre les ondes électromagnétiques à effet ionisant ou non ionisant. 2 ) Composition prophylactique absorbable ayant un effet pro- tecteur contre les ondes électromagnétiques à effet ionisant ou non ionisant caractérisée en ce qu' elle est constituée par toutes ou parties d'un extrait brut is- su des fractions résiduelles du raisin après foulage renfermant essentiellement de la catéchine, de l'épicatéchine et de l'acide gallique, la catéchine et l'épicatéchine pouvant soit être associées à l'acide gallique, soit être sous une forme non galloylée et ces composés se présentant sous forme de monomères ou sous forme d'oligomères homogènes ou hétérogènes ayant dif- férents degrés de polymérisation, et en ce qu'elle renferme 10 à 30 % de monomères, 10 à 30 % de dimères, 10 à 30 % de trimè- res et 30 à 60 % de tétramères. 3 ) Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu' elle renferme des traces d'acide caféique.