Brevet FR2747016A1 — publié le 19971010

I NT RO D U C T I ON Les nématodes, et plus particulièrement les espèces de Meloidogyne, constituent un des principaux problèmes qui se posent aux cultures intensives, conduites sous serres ou en plein champs, dans les pays méditerranéens. Les méthodes de lutte dont on dispose sont variées. L'amélioration des techniques culturales évite la propagation et l'aggravation des infestations du sol. L'introduction des variétés résistantes, qui se limite à quelques cultures, est généralement conseillée dans le cas de faibles infestations La lutte chimique est, par contre, le plus souvent réservée aux cas de fortes infestations. Les nématicides ne protègent, cependant, les cultures qu'en retardant le démarrage de l'infestation; les nématodes peuvent alors se développer par la suite sur le système radiculaire des cultures traitées. Ces traitements peuvent même aggraver le degré d'infestation du sol en fin de culture. Les produits chimiques sont en plus toxiques et posent beaucoup de problèmes d'ordre écologique. La lutte biologique contre les nématodes apparaît, dans ce contexte, comme une méthode d'avenir basée sur le rétablissement de l'équilibre biologique naturel des sols infestés . Malheureusement l'application de la lutte biologique pose, dans la pratique, différents problèmes techniques, qu'il a fallu résoudre pour améliorer la fiabilité de cette méthode de lutte. La méthodologie d'approche de la lutte biologique se base sur la compréhension de l'écosystème où les agents biologiques sélectionnés sont naturellement actifs et efficaces,pour pouvoir réussir l'application pratique de ce moyen de lutte dans d'autres écosystèmes agricoles. La mise au point d'une formulation industrielle de l'agent biologique sélectionné en milieu liquide. La production en masse des champignons prédateurs sur un support organique solide pose deux problèmes majeurs: ceux du stockage et de la distribution des agents biologiques. I1 est, par ailleurs, logique d'éviter l'évolution incontrôlée des agents biologiques dans les sols traités, comme on l'exige pour les produits chimiques polluants.Tout agent biologique, introduit dans le sol, devrait être bio-dégradable à plus ou moins long terme. La lutte biologique contre les nématodes apparait dans ce contexte comme une méthode d'avenir basée sur le retablissement de l'équilibre biologique naturelle des sols infestés. Actuellement, une souche de champignon prédateur, est commercialisée en FRANCE, à l'échelle industrielle, sous le nom de S 350 (Brevet INRA - Licence Anvar N07900625). Notre invention s' inscrit dans ce contexte, où nous avons mise au point une formulation originale d'agents biologiques pouvants être utilisées, plus efficacement, dans la lutte biologique contre les nématodes phytoparasites. L'objet de ce brevet d'invention est donc la protection d'associations originales de différentes souches agressives de champignons prédateurs (Monacrosporiuin salinum ) et de leurs bactéries , ainsi que du procedé de leur production industrielle. Ces souches ont été selectionnées pour leur éfficacité contre les nématodes phytoparasites, leur compétitivité et leur résistance aux conditions du milieux. Les bactéries associés stimulent l'activité prédatrice des champignons prédateurs et assurent leur biodégradation dans le sol en fin de culture. TECHNIQtJES D ' INVESTIGATION Les micro-organismes concernés par ce brevet: Les souches de champignons prédateurs,concernées par ce breve, appartiennent à l'espèce Monacrosporium salins. Les trois souches isolées en 1992 sont désignées par Pi 2, Pi 9, Pi 10 et celles isolés en 1984 par Cp 4, Cp 5, Cp 6. Celles-ci ont été maintenues depuis une dizaine d'années sur le Corn Meal Agar (CMA, Cf. Milieux de culture) Les nématodes concernés par ce brevet Il s'agit de nématodes phytoparasites appartenant aux genres suivants: Meloidogyne ( Nematoda, Tylenchida, Heteroderidae) Tylenchulus semipenetrans ( Tylenchulidae Pristionchus (Nematoda, Rhabditida, Diplogasteridae) Les Meloidogyne spp appartiennent aux trois espèces M. javanica , M. incognita, M. arenaria . Ils sont utilisés comme proies pour l'évaluation de l'agressivité des souches de Monacrosporium salinum. Le nématode bactériophage , isolés de la biocénose de M. salinum, appartient au genre (Mesodiplogaster ou Pristionchus ) .Ils'agit d' une nouvelle espèce qui se caractérise par un mode de reproduction hermaphrodite protérerandrique Cette espèce se nourrit des bactéries associées aux différentes souches de Monacrosporium salinum . Les bactéries concernées par ce brevet nous avons isolé deux espèces de bactéries dans la biocénose de Monacrosporium salinum. Ces espèces sont, à la fois, associées aux champignons prédateurs et aux nématodes bactériophages. Il s'agit de -Bacillus licheniformis : qui forme des colonies blanchâtres , larges , irrégulières , envahissantes, Gram +, ayant des cellules en bâtonnets isolées ou en chaînes sporulées. Cette espèce appartient à la famille des Bacillaceae - Ps e udomon a s vesicularis : qui forme des colonies jaunes oranges , petites lisses , convexes et arrondies, ayant des cellules en petits bâtonnets isolés non sporulés , Gram -. Cette espèce appartient à la famille des Pseudomonadaceae. Ces deux espèces de bactéries ont été purifiées et cultivées in vitro à 23"C sur le Nutrient Agar (NA, Cf. milieux de cultures). Les champignons "hyperparasites" associés Deux champignons hyperparasites ont été isolés sur les souches de Monacrosporium salinuin. Ces derniers se développent sur les hyphes mycéliens des champignons prédateurs. Il s'agit de - Penicillium sp Aspergillus parasiticus Ce sont des Septomycètes; Classe des Ascomycètes; sous classe des Eu-ascomycètes; Ordre des Plectascales; Famille des Aspergillacées. Les milieux de cultures *Le Corn Meal Agar-Agar,Difco ( CMA Ce milieu est constitué de 8,5 g de Corn Meal Agar et de 8,5 g d'Agar, soit 17 g / litre d'eau distillée. *Le Nutrient-Agar NA NA Ce milieu est constitué de 12 g d'agar et de 16 g de nutrient par litre . Le NA , préparé comme le CMA , est utilisé comme milieu de cultures pour les nématodes bactériophages et leurs bactéries associées. *L'Agar-Agar ( A ) : Ce milieu trophique pauvre, préparé à 0,5 ou 0,7% de gélose, est utilisé pour stimuler l'activité prédatrice de Monacrosporium salinum en présence des nématodes. Tous les milieux de cultures sont préparés sur un agitateur magnétique chauffant et sont stérilisés à l'autoclave pendant 20 minutes à 1200 C. Ils sont ensuite coulés dans des boites de pétri ou dans des tubes à essais, préalablement stérilisés. Recherche d'un milieu liquide pour la production en masse des agents biologiques: On a comparé trois milieux de culture liquides permettant la multiplication en masse des différentes souches de M. salinum *Milieu semi-synthétique Czapek Dox Ce milieu liquide est commercialisé par la Firme Oxoid Unipath.LTD (Angleterre)pour la multiplication des champignons et des bactéries capables d'utiliser le nitrate de sodium comme principale source d'azote. Ce milieu a un pH &num; 6.8 , il est utilisé à 33.4 g / litre d'eau distillée . Il se compose comme suit: - Nitrate de sodium 20.00 g - Chlorure de potassium 00.50 g - Glycerophosphate de magnesium 00.50 g - Sulfate ferreux 00.01 g - Sulfate de potassium 00.35 g - Saccharose 30.00 g Le Czapek Dox est autoclavé pendant 20 mn à 1150 C *Milieu liquide à base d'extrait de Malt L'extrait de malt en poudre est utilisé, à 20 g par litre d'eau distillée, pour la multiplication des champignons. Ce milieu est autoclavé pendant 20 mn à 1200 C. - Milieu liquide à base d'extrait de pois chiche Ce milieu nutritif se compose comme suit - Extrait liquide de pois chiche, obtenu après une cuisson de 20 minutes de 60 g de pois chiche dans un litre d'eau distillée. - Saccharose : 10 g / litre de milieu. - Carbonate de calcium : 30 g / litre. La composition de ce milieu liquide fait l'objet d'une revendication de ce brevet. Les techniques utilisées pour la mise au point de ce brevet: *Technique d'isolement à partir du sol des champignons prédateurs L' échantillonnage est réalisé dans la région de Tozeur (Oasis du sud tunisien), à partir des échantillons pris, à une profondeur de 30 cm, autour des racines de diverses cultures maraîcheres, on prélève quelques grammes de sol qu'on ensemence à la surface d'un milieu gelosé (A, Cf. Milieux de culture) coulé dans des boites de pétri de 50 mm de diamètre. Celles-ci sont placées en incubation pendant plusieurs semaines à 230C, selon la technique suivante le CMA a été remplacé par un milieu gélosé à 5 pour mille de manière à limiter la croissance d'autres microorganismes. Ceux-ci, également présents dans les prélèvements, peuvent envahir rapidement le milieu et masquer le développement des agents biologiques recherchés. *Technique de repiquage et de purification des souches de M. salinum Toutes les manipulations ont été effectuées sous hotte en milieu préalablement stérilisé aux rayons ultraviolet. Ce sont généralement les nématodes piègés qui révèlent la présence des champignons prédateurs dans le milieu de culture. Les souches qui développent sur ce milieu sont alors repiquées sur CMA La purifications des souches de M. salinum se fait par des repiquages successifs monospores. Le prélèvement des conidies se fait, sous loupe binoculaire, à l'aide d'une aiguille à bout aplati comportant à son extrémité un bout de gélose Les boites de culture sont mises en incubation dans une étuve à 230C qui est une température optimale pour le développement de M. salinum . Les repiquages se font une fois par semaine afin d'éviter le vieillissement des cultures et la perte des souches. *Technique de miniculture sur lames porte-objets des agents biologiques On place au centre d'une lame porte-objet un carré de milieu de culture contenant diverses souches de M. salinum . Ces lames sont disposées sur un support en verre, dans un récipient fermé hermétiquement, contenant de l'eau distillée. Le matériel utilisé est préalablement stérilisé à l'autoclave pendant une heure à 1200 C. Après le développement des hyphes mycéliens, directement sur les lames porte-objets, on peut ajouter des nématodes bactériophages ou des larves de Meloidogyne avant de placer les miniculture en incubation à 230C. Les préparations seront examinées et étudiées régulièrement sous loupe binoculaire et/ou sous microscope. Cette technique a pour objectif l'étude approfondie des champignons prédateurs et de leurs relations avec les autres composantes de leur biocénose. Le développement des champignons prédateurs se faisant directement sur la lame, dans un plan et non dans l'espace, permet de mieux visualiser les différents organes des champignons prédateurs et d'étudier les interactions avec leurs proies et leurs hyperparasites grâce à différentes techniques de coloration des lames porte-objets (Planche 1) Les lames contenant les minicultures sont placées pendant quelques minutes dans une solution classique de bleu coton chauffée à 600 C. Le surplus du colorant est éliminé à l'eau courante. On déshydrate ensuite la préparation dans différents bains d'alcool, avant de la monter directement dans de l'huile à immersion entre lame et lamelle On peut aussi faire une coloration différentielle des champignons prédateurs et de leurs proies. Cette technique permet de colorer les nématodes en jaune pâle ou en rouge vif selon la chronologie de leur capture et en bleu-vert les tissus du champignon prédateur (Planche 2). Les minicultures, précédemment décrites sont colorées comme suit Après une hydrolyse à froid dans une solution de HCl 5 N pendant 20 mn , les lames sont d'abord colorées dans le réactif de Schiff durant deux heures , puis rincées à l'eau courante . Les tissus des champignons prédateurs sont colorés au picro-indigocarmin. Les préparations sont ensuite déshydratées dans différents bains d'alcool et de toluène avant d'être montées dans du baume de Canada. *Méthode d'évaluation de la croissance de champignons prédateurs La croissance mycélienne linéaire des champignons prédateurs est un paramètre facilement mesurable, il est révélateur de 1' état physiologique de ces hyphomycètes. Cette croissance est estimée par la mensuration des diamètres de l'auréole formée par les colonies fongiques. On inocule, pour cela, des pastilles de 4 mm de diamètre provenant d'une culture mère dans des boites de pétri, ayant 10 cm de diamètre, contenant le milieu nutritif CMA. Ces pastilles sont découpées à l'emporte pièce et déposées au centre du milieu de culture, la face ensemencée en contact avec le milieu nutritif. Des mesures quotidiennes du diamètre de croissance sont effectuées à l'aide d'un double décimètre jusqu'à l'envahissement total du milieu de culture. *Technique de repiquage des bactéries Les souches de bactéries sont repiquées sur NA, à partir d'une culture mère à l'aide d'un fil de nichrome terminé par une boucle. Les boites de cultures, ensemencées en Z, sont placées en incubation dans une étuve à 23 OC. Les repiquages sont effectués périodiquement tout les 8 jours. *Technique de repiquage des bactériophages L'élevage des nématodes bactériophages est effectué en conditions aseptiques, sur milieux gélosé, afin d'éviter toute contamination exogène. A l'aide d'une aiguille munie d'un fil très fin et légèrement recourbé on préleve une jeune femelle que l'on dépose au centre d'une boite de pétri contenant le milieu NA. Au bout de 48 heures, on voit apparaître, sur ce milieu, des traînées de colonies bactériennes correspondant au déplacement des nématodes dans le milieu . En effet, ceux-ci sont très mobiles; ils contribuent ainsi à ensemencer rapidement les bactéries associées dans le milieu de culture. ETUDE COMPAREE DE LA SOUCHE S 350 COMMERCIALISEE EN FRANCE ET DES AGENTS BIOLOGIQUES FAISANT L'OBJET DE CE BREVET La vitesse moyenne de croissance des colonies fongiques de M. salinum (Agents biologiques, faisant l'objet de ce brevet) et de S 350 (A. irregularis ) sont comparables et présentent une croissance optimale entre 25 et 300C. Les deux champignons prédateurs présentent aussi une croissance mycélienne optimale entre les pH 6 et 6,5. M. salinum se développe, par contre, mieux que la souche S 350 en milieux acides (pH 5). La croissance mycélienne de M. salinum n'est pas altérée en sol salin à alcali (Conductivité électrique (C.E) > 4 mmho / cm3 et capacité d'échange cationique (C.E.C) > 15% comme c'est le cas pour S 350. En sols alcalins (C.E 15% ) la la croissance mycélienne de M. salinum est réduite. Si la souche S 350 semble mieux convenir pour les sols alcalins, les souches de champignons prédateurs isolées en Tunisie sont plus tolérantes aux sols salins que la souche commercialisée en France.. M. salinum présente, en outre, une préférence pour les sols pauvres en matières organiques ( 10 % Pour S 350, la croissance mycélienne est optimale dans les milieux de culture riches en eau ; les souches de M. salinum sont, par contre, moins éxigeantes en eau. Ces souches, faisant l'objet de ce brevet, sont donc plus résistantes au manque d'eau que la souche commercialisée en France. Dans le sol, les souches d'Athrobotrys spp ( dont la souche S 350 ) dé se développent en surface , alors que les souches de M. salinum sont plus fréquentes en profondeur (Figure nO 1). L'activité prédatrice des différentes souches de M. salinum est plus importante que celle de la souche S 350 (A. irregularis ) . Les agents biologiques,faisant l'objet de ce brevet, sont donc plus éfficaces dans la lutte contre les nématodes phytoparasites, dont Ditylenchus dipsaci et Meloidogyne spp. (tableau 1). Tableau n l:Pourcentage des nématodes piègés en fonction des espèces de champignons prédateurs. Champignons Meloidogyne spp Di tyl en ch us dipsaci prédateurs ~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 24 48 Heures 24 48 Heures S 350 02,3 38,5 15,3 53,2 M. salinum 21,5 60,7 36,5 79,6 PPds 1% 14,8 22,9 14,8 22,9 La rapidité de la formation des organes de capture des souches de M. salinum et la grande dispertion de leurs pièges dans le milieu permettent d'éxpliquer cette différence. ETUDE COMPARATIVE DES CARACTERES MORPHO BIOME.TRIQUES DES DIFFERENTES SOUCHES DE M. salinum (BIONEMATICIDE) Etude morphologique de souches de M. salinunt Les cultures, sur milieu CMA , des différentes souches de champignons prédateurs apparaissent incolores et présentent un aspect blanchâtre translucide. M. salinum forme des conidiophores dressés, simples ou géniculés sur lesquels sont attachées des conidies pouvant être, soit, groupées en verticilles, soit, isolées à l'extrémité distale du conidiophore . Ces derniers peuvent être aussi plus ou moins ramifiés (Figure n02 B; Planche 3 a, b, d) . Les conidies, piriformes et pluricellulaires, sont caractérisées par une cellule proximale qui se rétrécit vers une base largement tronquée, une cellule médiane renflée ayant une large vacuole centrale et une cellule distale présentant une extrémité arrondie (Figure n 2 A). Ces caractéristiques correspondent à ceux de l'espèce M. salinum telle que décrite par d'autres auteurs. Les conidies de cette espèce peuvent être réparties en différents groupes ayant une, deux, trois et quatre cellules; nous pensons que la répartition de ces catégories de conidies est liée à leur âge. Les conidies les plus jeunes sont monocellulaires, ensuite elles se cloisonnent progressivement une, deux et trois fois, pour se présenter avec deux, trois et quatre cellules (Figure nO 2 A; Planche 3 a; Planche 4 a, b Cette espèce d'hyphomycètes prédateurs forme des pièges en arceaux semi-circulaires tridimensionnels (Planche 2) qui capturent les nématodes par adhésion. Ces organes de capture se forment sur les hyphes mycéliens (Figure nO 2 C) .C'est la présence des nématodes dans le milieu de culture qui stimule la formation des systèmes de capture. Cet effet inducteur des nématodes est connu et signalé par plusieurs auteurs. Le réseau de mailles adhésives immobilisent la proie avant qu'elle ne soit envahie par un bulbe mycélien infectieux d'où se développe un enchevêtrement d'hyphes trophiques (Planche 1). Le nématode est alors complètement vidés de son contenu. Critères biométrique permettant l'identi- fication des souches de M. salinum. Les caractères biométriques de chaque souche de M. salinum sont mesurés sous microscope à l'aide d'une chambre claire. Chaque mensuration est répétée 50 fois afin d' évaluer les limites de variation de ces caractères pour les différentes souches étudiées. Nous avons mesuré, pour chaque souche de M. salinum la largeur et la longueur des conidies les plus agées (présentant quatre cellules ) . Les souches Pi présentent des conidies légèrement plus longues que les souches Cp. Mais seule la souche PilO se distingue significativement des souches Cp ( Figure n03) . Cette différence est encore plus nette pour la largeur des conidies (Figure n04). Ce caractère permet de distinguer significativement la souche Pi 10 de l'ensemble des autres souches étudiées. Les rapports entre la longueur et la largeur des conidies des différentes souches permettent de distinguer significativement la souche Pi 10 des souches Pi 2 et Pi 9 (Figure n"5) Une étude approfondie des caractères biométriques des souches Pi 10 et Cp 4, sélectionnées pour leur plus grande efficacité de capture, montre que les mensurations de ces deux souches sont statistiquement différentes ( tableau n02 > Tableau n02 : Mensurations moyennes des conidies de M. salinum en micromètres. Souches Longueurs largeurs Rapports L/l Cp04 40,8 a 18,9 b 2,18 c PilO 45,5 a' 23,6 b' 1,94 c' Les valeurs associées aux même lettres sont statistiquement comparables. Les mensurations des conidies de deux souches de M. salinum (Cp 4 et Pi 10) sont statistiquement différentes. Les conidies de la souches Cp 4 sont généralement de plus petite taille . La souche Cp 4 forme des conidies qui mesurent entre 30 et 53 Rm de longueur et 13 à 30 pm de largeur. La souche Pi 10 a des conidies mesurant de 33 à 57 Rm de long et 17 à 28 Rm de large . Le rapport longueur / largeur des conidies est aussi statistiquement différent entre ces deux souches (Tableau nO 2 Le mycélium des différentes souches est sépté. Il mesure entre 2,3 à 3,1 Rm de large.Cependant les caractéristiques biométriques du mycélium ne sont pas à notre avis , stables et ne permettent pas la distinction entre les souches . La largeur des hyphes mycéliens peut varier, en effet, en fonction de la richesse trophique du milieu. (Planche 5 a, b, c ). Le diamètre des chlamydospores des différentes souches est très variable , il peut mesurer de 12 à plus de 30 Am (Planche 5 d , e ) . Cette variabilité semble être liée à l'origine des organes (mycélieum ou conidies) qui évoluent en chlamydospores dans les conditions défavorables. ETUDE COMPAREE DE LA CROISSANCE MYCELENNE DES SOUCHES DE M. salinum Vitesse de croissance des différentes souches de M. salinum La croissance mycélienne des hyphomycètes prédateurs est linéaire sur les milieux de culture solides. Les souches de M. salinum peuvent se développer convenablement entre 20 et 300C; leur croissance mycélienne est optimale entre 25 et 30 OC Afin de comparer la croissance linéaire des différentes souches sur CMA, nous avons entrepris nos essais à 22 C dans une étuve réfrigérée. La vitesse de croissance de M. salinum est différente en fonction des souches étudiées (Figure ne6). La vitesse de croissance mycélienne permet de distinguer clairement les souches Cp isolées en 1984 des souches Pi isolées en 1992 ( Figure n06) . La souche Pi 10 a cependant une vitesse de croissance plus faible que les souches Pi 2 et Pi 9. La comparaison de la croissance des deux souches Cp 4 et Pi 10 montre que la vitesse de croissance de la première souche (Cp 4) est plus faible au cours du troisième et du huitième jours (Figure n"7 ) . Cette différence pourrait s'expliquer par l'effet inhibiteur des bactéries ( Bacillus sp.) associées à la souche Cp 4 Etude de la croissance mycélienne des souches de M. salinum en fonction du milieu de culture La croissance mycélienne des souches Cp 4 et Pi 10 a été comparée sur trois différents milieux de culture solides. Un milieu trophique pauvre constitué dagar- agar à 10 pour mille (A), le CMA, un deuxième milieu plus favorable au développement des champignons prédateurs et le NA milieu plus favorable au développement bactérien. Cet essai est conduit in vitro, dans des boites de pétri.Chaque traitement ( Milieu / Souche ) est répété dix fois. Les résultats de cet essai montrent que la vitesse de croissance mycélienne des deux souches de M. salinum varie selon le type de milieu de culture (Figure n08). La croissance la plus rapide s'observe sur le milieu le plus pauvre (A) , celui qui est le plus défavorable aux bactéries associées à M. salinum . Sur le NA, la croissance mycélienne des deux souches est la plus faible. Dans ce cas, le développement bactérien est plus dense, ce qui explique l'effet inhibiteur de ce milieu sur les champignons prédateurs ( Planche 8 c ). Par ailleurs, la croissance mycélienne est relativement plus lente sur le CMA par rapport au milieu gélosé (A. La densité des hyphes y est, par contre, nettement plus importante donnant aux cultures un aspect blanchâtre sur le milieu CMA; sur le milieu A, les cultures apparaissent plutôt translucides. On observe le développement de la bactérie blanche (B Bacillus licheniformis ) sur le milieu NA où on a repiqué la souche Cp 4 et celui de la bactérie jaune (J : Pseudomonas vesicularis ) dans les boites de pétri où on a repiqué la souche Pi 10 ( Planche 8c ) . Chaque souche de M. salinum serait donc associée à un complexe bactérien différent. La variabilité de la vitesse de croissance des deux souches de M. salinum pourrait être liée à l'effet plus ou moins important de leurs bactéries associées Effet antagoniste des bactéries associées sur la croissance mycélienne des souches de M. salinum Afin d'évaluer l'effet antagoniste des bactéries associées sur la croissance mycélienne des différentes souches de M. salinum , nous avons cultivé ces souches seules et en présence des différentes bactéries associées, en boites de pétri sur les trois milieux de culture A , NA et CMA. Le pourcentage de croissance des différentes souches en présence des bactéries est calculé par rapport au développement du témoin (en absence de bactéries L'effet inhibiteur des bactéries associées est variable en fonction du milieu et de la souche de M. salinum en question ( Figure n09 L'effet inhibiteur de Bacillus licheniformis (B) sur la croissance mycélienne des différentes souches de M. salinum est plus net que celui de Pseudomonas vesicularis (J) . Cet effet est cependant plus important sur les milieux NA et sur CMA .Plus le milieu est favorable au développement de cette bactérie plus son effet fongistasique est intense. Si la bactérie Pseudomonas vesicularis (J) n'a aucun effet inhibiteur sur les souches Pi elle présente cependant un certain antagonisme vis à vis des souches Cp , qui sont normalement associées à Bacillus licheniformis (B) Effet de l'association des souches de M. salinum sur leur croissance mycélienne Afin d'évaluer l'incidence de l'association de diverses souches de M. salinum sur la variabilité de leur croissance mycélienne dans un même milieu de culture, nous avons mis en place un essai sur CMA en boites de pétri. Cet essai comporte Quatre traitements, répétés dix fois chacun, où nous avons comparé pendant dix jours jusqu'à envahissement total du milieu de culture, les vitesses de croissance des souches Cp 4 et Pi 10 seules et en association (Figure n010 ). L'association des deux souches Cp 4 et Pi 10 sur le même milieu de culture augmente la variabilité de leur croissance mycélienne, tout en réduisant son intensité par rapport à celle observée lorsque ces deux souches sont séparées. Comment expliquer cette variabilité ? Est-elle liée à une compétition intraspécifique entre les deux souches et/ou à l'effet indirect de leurs bactéries associées ? C'est ce que nous avons essayé de montrer expérimentalement en modifiant les combinaisons entre les souches de M. salinum et leurs bactéries associées. Vitesse de croissance de M. salinum en présence de différentes associations bactériennes Pour évaluer l'incidence de différentes combinaisons d'associations bactériennes, sur la vitesse de croissance des souches de M. salinum, divers essais sur CMA en boites de pétri ont été mis en place. Nous avons utilisé la souche Cp 4 , normalement associée à B. licheniformis (B) et Pi 10, qui est associée à P. vesicularis (J. Ces deux types d'associations champignons-bactéries ont été inversées expérimentalement. L'inversion des associations bactériennes ne modifie pas significativement la vitesse de croissance des deux souches M. salinum (Figure n011). Les différentes combinaisons champignons-bactéries, précédemment étudiées, ont été associées expérimentalement à la fois aux deux espèces bactériennes, B. l icheni formis (B) et P. Tableau 3 : Effet de différentes associations bactériennes sur la vitesse de croissance des souches de M. salinum Bactéries associées Souches - Témoins Bactéries Bacillus (B) Pseudomonas (J) Cp 04 B 4,8 + 0,la* 4,9 + 0,la 5,3 + 0,2b Cp 04 J 4,8 + 0,2a 4,8 + 0,4ab 5,2 + 0,lb Pi 10 B 4,9 + 0,la 5,0 + 0,3ab 5,0 + 0,lab Pi 10 J 5,0 + 0,2ab 4,8 + 0,4ab 4,9 + 0,la *Les valeurs associées aux mêmes lettres sont significativement comparables. La souche Cp 4 (associée à la bactérie B ou J) est plus sensible à la présence simultanée des deux bactéries qui réduisent significativement sa vitesse de croissance. La souche Pi 10 est, par contre, moins sensible à la présence simultanée des deux bactéries dans le milieu de culture (Tableau 3. La variabilité de la vitesse de croissance est donc plus grande pour la souche Cp 4 , cette variabilité serait liée à une interaction inhibitrice entre les espèces bactériennes dans le milieu de culture. Vitesse de croissance des souches de M. salinum en milieu liquide Pour concevoir la produire en masse des complexes agents biologiques-bactéries associées, nous avons essayé divers milieux liquides. Sur milieu liquide classique, à base de malt, le développement des champignons prédateurs est faible dominé par celui de leurs bactéries associées. Les pourcentages de croissance mycéliennne des souches Cp 4 et Pi 10, inoculées dans des tubes à essais sur le milieu semi-synthétique Czapek Dox, sont représentés par la Figure n012 ( n = 6 répétitions ) Le pourcentage de croissance de la souche Cp 4 est significativement supérieur, dans ce milieu, à celui de la souche Pi 10, quelle que soit l'espèce de bactérie associée (Figure n012. Mais la vitesse de croissance des deux souches de M. salinum est, cependant,nettement plus faible par rapport à celle observée sur le milieu liquide à base de pois chiche, que nous avons mis au point au cours pour la production en masse de l'inoculum de l'agent biologique. Dans ce milieu liquide, la vitesse de croissance des deux souches de champignons prédateurs est très rapide. Ce milieu de culture est, en effet, envahi au bout de quelques jours (dans les boites de pétri de 20 cm de diamètre on obtient 1008 de croissance après 3 à 5 jours de développement) . La croissance mycélienne y est, d'abord linéaire , puis elle devient exponentielle après la formation et la dessimination des conidies dans ce milieu liquide (Figure ne29). Un litre de milieu liquide peut produire plus d'un Kg d'inoculum en moins d'une semaine à 230C. Cette technique de production industrielle en masse de l'inoculum des Bionématicides, à l'état pure ou en présence contrôlée de leurs bactéries associées, fait l'objet d'une revendication de ce brevet. ACTIVITE NEMATICIDE POTENTIELLE DES SOUCHES DE M. salinum Afin l'efficacité de l'activité nématicide des différentes souches de M. salinum , plusieurs essais ont été réalisés in vitro en boites de pétri et dans des sol naturellement infestés par les nématodes phytoparasites, sur une culture de tomate associée aux Meloidogyne et sur une jeune plantation de citronniers greffés sur bigaradier associée à T. semipenetrans Nous avons testé,aussi, cette activité prédatrice sur Pristionchus n.sp., le nématode bactériophage isolé de la biocénose naturelle de M. salinum Etude comparée de l'efficacité nématicide des différentes souches Cp de M. salinum Les souches Cp ont été isolées depuis une dizaine d'années et sont maintenues au laboratoire sur le CMA, un milieu solide gélosé. L'introduction des nématodes en présence des souches Cp dans des boites de pétri contenant de l'Agar à 7 pour mille n'a déclenché la formation des organes de capture et l'activité de piégeage qu'après plusieurs tentatives infructueuses. La perte de virulence des hyphomycètes prédateurs vis à vis des nématodes, après plusieurs repiquages sur milieu gélosé n'est donc pas durable comme le pensait certains auteurs. Nous avons montré que cette perte d'agressivité est, au contraire, temporaire et réversible. L'efficacité de capture est calculée, pour chaque répétition, par le rapport entre le nombre des nématodes piègés et celui des nématodes présents dans le milieu, au moment de l'observation. Tous les essais ont été conçus avec au moins 5 répétitions par traitement et chaque essai est confirmé plus d'une fois pour valider les résultats obtenus. Dans ces essais, on introduit le même nombre de nématodes par répétition. Il s'agit soit de larves du deuxième stades pour les nématodes phytoparasites soit des jeunes femelles pour le nématode bactériophage. Etude comparée de l'activité nématicide des souches Cp vis à vis de Pristionchus n Sp. Les souches Cp ont une activité prédatrice comparable vis à vis du nématode bactériophage ; cette activité atteint une valeur maximale après une semaine de l'inoculation de ce nématodes (Figure n013). Cette intensification de l'activité de capture coïncide avec le niveau le plus élevé des populations de bactériophages dans le milieu, qui est observé après une semaine de l'inoculation. La dissémination des bactéries associées à ce nématode, dans le milieu, se traduit par un certain effet inhibiteur sur le développement du champignon prédateur et sur son activité prédatrice qui diminuent progressivement; ces bactéries favorisent ensuite la formation des chlamydospores qui sont les organes de conservation de ces champignons (Planche 5 d, e Après 20 jours d'expérimentation, le pourcentage moyen de capture est, dans ce cas, de 26, 21, et 24 % respectivement pour les souches Cp 4, Cp 5 et Cp 6. Etude comparée de l'activité nématicide des souches Cp vis à vis des Meloidogyne spp. Les souches Cp présentent une activité prédatrice remarquable vis à vis des larves de Meloidogyne .La souche Cp 4 atteint 100% de capture dès le 6 ème jours de l'inoculation des nématodes , les souches Cp 5 et Cp 6 n'atteignent ce niveau de capture qu'à partir du 10 ème jour de l'expérimentation (Figure n014). Nous avons retenu la souche Cp 4, qui est la souche la plus représentative du groupe Cp et dont l'activité prédatrice est la plus stable La souche Cp 4 fait l'objet d'une revendication de ce brevet. Etude comparée de l'activité nématicide des souches Cp vis à vis de T. semipenetrans Ce nématode, parasite spécifique des citrus, est capable d'induire des transformations morphologiques et cytologiques au niveau de l'hôte, se traduisant par une diminution significative de sa productivité. Les souches Cp de M. salinum testées sont capables de capturer les larves infestantes de cette espèce de nématode. Mais, bien que la souche Cp 4 présente l'activité prédatrice la plus précoce, la souche Cp 6 serait, dans ce cas, la plus efficace contre T. semîpenetrans La notion de spécificité du piégeage des hyphomycètes prédateurs à l'égard des nématodes ne semble pas se confirmer dans ce cas; car toutes les souches de M. salinum sont capables de piéger des nématodes appartenant à des genres aussi différents que Pristionchus et Meloidogyne . La différence d'efficacité de capture entre divers hyphomycètes prédateurs est liée à différents facteurs, dont essentiellement, la mobilité des nématodes et la distribution des réseaux d'organes de capture dans le milieu. Etude comparée de l'efficacité nématicide des différentes souches Pi de M. salinum L'activité prédatrice des souches Pi a été testée dans les même conditions que celle des souches Cp Etude comparée de l'activité nématicide des souches Pi vis à vis de Pristionchus n sp. Contrairement aux souches Cp, qui ont une activité prédatrice comparable, la souche Pi 10 présente un comportement de prédation nettement distinct de celui des souches Pi 2 et Pi 9 (Figure ne16) Si le comportement de prédation des souches Pi 2 et Pi 9 sont comparables à ceux des souches Cp; la souche Pi 10 se distingue, donc, de toutes les autres souches de M. salinum par une plus grande rémanence de l'activité nématicide. L'activité prédatrice de la souche Pi 10 est d'abord très faible au début de l'inoculation des nématodes, elle atteint son maximum au douzième jour de l'expérimentation pour se maintenir par la suite constante jusqu'à épuisement du milieu Globalement, la souche Pi 10 capture plus de 36% des nématodes bactériophages, alors que les souches Pi 2 et Pi 9 atteignent respectivement 25 et 20 % de capture à la fin de l'expérimentation. Etude comparée de l'activité nématicide des souches Pi vis à vis des Meloidogyne spp. La particularité du comportement de prédation de la souche Pi 10 est confirmée en présence des larves de Meloidogyne spp. (Figure n017). Si la souche Pi 10 présente 1' activité de capture la plus rémanente à l'égard des nématodes du genre Meloidogyne , les souches Pi 2 et Pi 9 présentent une activité prédatrice plus précoces Etude comparée de l'activité nématicide des souches Pi vis à vis de T. semipenetrans. Dans ce cas, la souche Pi 10 se distingue encore une fois par sa plus grande efficacité de prédation contre T. semîpenetrans (Figure ne18). C'est pour ses caractéristiques, et pour la grande rémanence de son activité de piégeage qu'elle a été choisie et sélectionnée pour représenter le groupe Pi. La souche Pi 10 fait l'objet d'une revendication de ce brevet. Etude comparée de l'efficacité du nématicide de Cp 4 et Pi 10 à l'égard des Meloidogyne spp. Un essai comparatif du comportement de prédation des souches Cp 4 et Pi 10 a été mis en place in vitro sur le milieu A à 0,7. Chaque traitement comporte 5 répétitions et l'évaluation due l'activité nématicide est réalisée, pendant 14 jours, jusqu'à épuisement de l'inoculum constitué de 100 larves de Meloidogyne spp. par boite de pétri. La différence de comportement des deux souches Cp 4 et Pi 10 se confirment dans ce cas (Figure n"19) . La souche Cp 4 totalise respectivement 30 % et 100 % de capture à partir du 2 ème et du 6 ème jour de l'inoculation . Cette souche présente une activité prédatrice plus précoce que la souche Pi 10. Celle ci n'atteint les 30 % de capture qu'au 8 ème jour; elle totalise 100 % de capture à partir du 14 ème jour de l'expérimentation. La souche Pi 10 présente, cependant, l'avantage d'avoir une plus grande rémanence de son activité nématicide; elle serait potentiellement plus efficace que la souche Cp 4, car son agressivité pourrait coïncider avec l'échelonnement de l'éclosion des larves des Meloidogyne dans le sol. En associant ces deux souches dans le même milieu, nous pouvons imaginer une complémentarité de leur activité nématicide vis à vis des nématodes. La souche Cp 4 agirait sur les nématodes dans un premier temps la souche Pi 10 reprend la suite pour compléter cette action. Il s'agit de montrer la possibilité de cette action complémentaire , ou au contraire l'éventualité d'un effet antagoniste qui diminue l'efficacité de capture de l'association à l'égard des nématodes. Etude de la complémentarité de l'efficacité nématicide des souches Cp 4 et Pi 10 Afin de comparer l'efficacité de capture de l'association des deux souches Cp 4 et Pi 10, préalablement sélectionnées, par rapport à celle de chacune d'entre-elles, testées séparément , nous avons mis en place différents essais sur les milieux A et CMA. Ce dernier milieu est, à la fois, favorable aux champignons prédateurs et permet le développement de leurs bactéries associées. Dans l'essai réalisé sur milieu A à 0,7 %, où chaque traitement est répété quatre fois, nous avons comparé l'efficacité des souches Cp 4 et Pi 10 ainsi que leur association (Cp 4 + Pi 10 ) vis à vis des larves de Meloidogyne sp. Comme on sty attendait , l'association Cp 4 + Pi 10 se comporte à la fois comme la souche Cp 4, à 10 jours d'observation et comme la souche Pi 10, à 18 jours de l'expérimentation (Figure n020). Dans l'essai réalisé sur CMA, chaque traitement est répété 5 fois. La comparaison de l'efficacité des souches Cp 4 et Pi 10 et de leur association Cp 4 + Pi 10, vis à vis des larves de Meloidogyne spp., montre un résultat différent de celui obtenu précédemment.(Figure ne21) D'une façon générale, l'efficacité des hyphomycètes prédateurs est plus faible sur CMA que sur A. En effet, sur le milieu le plus riche (CMA) le % de capture maximale ne dépasse pas dans ce cas 50% alors qu'on atteint les 100% sur A pour la même période d'expérimentation. On observe aussi une plus grande variabilité de la croissance et de l'activité prédatrice des différentes souches, probablement à cause du développement des bactéries associées dans ce milieu de culture. L'association Cp 4 + Pi 10 présente dans ce cas des performances moins nettes que celles de chacune des deux souches testées séparément. Le même essai a été réalisé avec les nématodes bactériophages (Pristionchus n sp.) sur CMA, les résultats de cet essai sont représentés dans le tableau 4. La complémentarité entre les deux souches dans l'association Cp 4 + Pi 10 ne se confirme pas également dans cet essai Tableau nO 4: Effet de 1' association des souches Cp 4 et Pi 10 sur leur efficacité de prédation. Souches % de l'activité nématicide 7 jours 15 jours Cp 04 4,8 1 3,2 a* 11,5 t 4,1 ab Pi 10 09,5 I 3,7 b 19,0 t 4,6 c Cp 4 + Pi 10 16,0 + 8,8 a 07,9 t 2,3 b *Les valeurs associées aux même lettres sont significativement dcomparables Comment peut-on expliquer la grande variabilité de l'activité de piégeage des souches associées, après 7 jours de l'expérimentation, et la diminution de leur efficacité à 15 jours ? (Tableau 4) Nous avons essayé d'évaluer, pour cela, l'efficacité nématicide des différentes combinaisons Cp 4 + Pi 10 selon leurs associations bactériennes Etude comparée de l'efficacité nématicide des souches Cp 4 et Pi 10 en présence de différentes associations bactériennes L'activité prédatrice des différentes combinaisons, associant les champignons et les bactéries précédemment étudiées, a été testée à l'égard des Mel oídogyne spp., sur milieu CMA. L'activité nématicide (% de capture) des souches Cp 4 et Pi 10, testée séparément en présence de diverses associations bactériennes, est évaluée après 15 jours de l'inoculation des nématodes. Si l'activité prédatrice de la souche Cp 4, associée soit à B. licheniformis (B) ou P. vesicularis (J), reste statistiquement constante; celle de la souche Pi 10 présente, par contre, une plus grande variabilité de son activité nématicide en présence de B licheniformis (Figure n022) Les associations bactéries-champignons, précédemment étudiées, sont combinées deux à deux; la complémentarité de leur efficacité de capture est alors évaluée par rapport à celle des souches Cp 4 et Pi 10 (Figure n023). Après la première inoculation (Ino.1), l'activité prédatrice de la souche Pi 10 associée à P. vesicularis (J) est supérieure à tous les autres traitements, après 15 jours de l'introduction des nématodes dans le milieu. La combinaison de deux souches sur milieu CMA ne se traduit pas par une amélioration de la performance prédatrice de cette association (Figure n023). Un deuxième inoculum (Ino.2) de larves de Meloidogyne a été ensuite introduit dans le milieu de culture, après épuisement du premier inoculum. L' efficacité nématicide des différentes associations est alors évaluée après 24 et 48 heures de cette deuxième inoculation, étant donnée que les organes de capture du bionématicide sont déjà formés. L'activité nématicide de la souche Pi 10 est très réduite en présence de B. l icheni formis ( B), probablement à cause de sa sensibilité à l'effet de cette bactérie. La souche Cp 4 est, par contre, plus compétitive vis à vis de P. vesicularis (J). Tableau n 5: Effet de différentes associations bactériennes sur la variabilité de l'activité nématicide de diverses combinaisons des souches de M. salinum Souches/ Bactéries CV* de l'activité nématicide Ino.1 Ino.2 (24H) Ino.2 (48H) Cp 4B 01,50 08,9 03,4 Cp 4J 01,61 01,1 06,7 Pi lOB 03,7 18,9 03,5 Pi 10J 00,6 12,2 02,9 4B+10J 06,5 34,9 22,6 4B+10B 01,7 21,1 03,1 4J+10B 02,2 50,0 08,9 4J+10J 08,8 25,2 04,9 *CV: Coefficient de variation de l'activité nématicide en %. Les combinaisons des deux souches Cp 4 et Pi 10 sont plus performantes, lorsqu'elles sont associées à la même bactérie, après 48 heures d'activité de piégeage (Figure n023). La souche Pi 10 associée à P vesicularis (J), sa bactérie d'origine, est cependant la plus performante et son activité nématicide présente le moins de variabilité. La combinaison des deux souches, quelles que soient leurs bactéries associées, se traduit par une augmentation de la variabilité de l'activité du piégeage (Tableau n05). Ce résultat montre que la combinaison des souches Cp 4 et Pi 10, que nous avons sélectionnées, peut se traduire par une augmentation de la variabilté de leur efficacité bionématicide. Nous avons pu sélectionner, après diverses tentatives infructueuses, un complexe bactérien, constitué par l'association de P. vesicularis (J) et B. licheniformis (B), qui limite la variabilité de l'éfficacité nématicide de l'association Cp 4 + Pi 10. Ce complexe bactérien fait l'objet d'une revendication de ce brevet. La variabilité de l'efficacité de la lutte biologique contre les nématodes pourrait s'expliquer par l'effet antagoniste potentiel des populations bactériennes des sols traités. Les champignons prédateurs, qui semblent se développer dans les conditions naturelles en associations avec leur cortège bactérien, deviennent moins compétitifs si on élimine leurs bactéries associées avant de les appliquer dans des sols non stériles. Efficacité nématicide des souches cp 4 L Pi 10 de M. salinum dans un sol infesté par les Meloidogyne SDD. Pour tester l'efficacité des souches Cp 4 et Pi 10, un essai en pots a été réalisé sur une culture de tomate infestée par les Meloidogyne Spp. Cet essai comporte 3 traitements comparés à un témoin non traité, répétés 6 fois. L'essai a commencé par inoculation des souches Cp 4, Pi 10 et leur association Cp 4 + Pi 10. Le repiquage d'un plant de tomate par pot, au stade quatre feuilles, a été réalisé simultanément que l'inoculation du bionématicide dans le sol, préalablement stérilisé. L'infestation des plants de tomate par les larves de Meloidogyne a été réalisée mensuellement à 3 reprises au cours de l'expérimentation, totalisant près de 1000 larves par pot. L' effet des différentes souches de M. salinum sur l'infestation des plants de tomate a été évalué, comparativement au témoin non traité, trois mois après la plantation (Tableau n06). Tableau nO 6 : Effet du bionématicide sur le taux d'infestation des plants de tomate dans le sol. Traitements Infestations (Nombre de galles / plant Témoin 4,2 + 2,0 a* Cp 4 0,0 f 0,0 b Pi 10 0,0 + 0,0 b Cp 4 +Pi 10 0,0 + 0,0 b *Les valeurs associées aux mêmes lettres sont significativement comparables. Seul le témoin présente une infestation au niveau des racines, sous forme de galles, les plants de tomates cultivés dans les pots traités biologiquement sont indemnes de nématodes. Cet essai préliminaire confirme l'efficacité potentielle des souches sélectionnées dans un sol agricole stérilisé. Efficacité nématicide du complexe bionématicide Cp 4 + Pi 10 dans un sol naturellement infesté par T. semigenetrans . Le complexe bionématicide, constitué par l'associa-tion de P. vesicularis (J) et B. licheniformis (B), des souches Cp 4 et Pi 10 , a été produit en masse sur le milieu liquide à base d'extrait de pois chiche.Après un ultra-broyage à froid, les propagules du bionématicide ont été mis en suspension dans l'eau d'irrigation. On a traité, ensuite, le sol d' une jeune plantation de citronniers, greffés sur bigaradier, agée de quatre ans. Cette jeune plantation, réalisée en bacs cimentés de 2m3 chacun est naturellement infesté par T. semipenetrans .Le bionématicide a été appliqué à raison de 20 g de au m2 au mois d'octobre 1993.Chaque traitement est répété 12 fois. L'évolution de l'infestation et de la production des des citronniers dans les parcelles traitées et dans les parcelles, témoins non traitées, sont comparées, une année après l'inoculation du bionématicide (octobre 1994). Le bionématicide a pu maintenir le niveau de l'infestation des arbres traités à un taux très faible ( N/20 g différence du nombre de nématodes par 20 grammes de racines évaluée entre Novembre 1993 et 1994; ce qui a permis l'amélioration de la production des arbres ( Prod.g/arbre : la production est évaluée en grammes par arbre, évalués entre Novembre 1993 et 1994.Dans les parcelles témoins, non traités,le niveau de l'infestation a considérablement augmenté et la productivité des arbres a regressé (Figure n030). FACTEURS DETERMINANT L'ACTIVISTE ET LA BIODEGRADATION DU BIONEMATICIDE DANS SON MILIEU NATUREL L'efficacité des champignons prédateurs dans leur milieu naturel d'origine ne cadre pas avec la grande variabilité des résultats de l'application de la lutte biologique dans d'autres milieux. Dans le but d'expliquer cette controverse, nous avons essayé de comprendre les interactions entre les principaux éléments de la biocénose naturelle de M. salinum afin d'assurer la reconstitution de ce modèle d'équilibre biologique dans d'autres sols. Les champignons prédateurs vivent entre deux phases trophiques - Une phase saprophytique, où ils se nourrissent sur les substrats organiques. - Une phase prédatrice, où ces champignons capturent et se nourrissent sur les nématodes. C'est la présence des nématodes dans le milieu qui stimule la formation des organes de capture. Les nématodes constituent, ainsi donc, un des éléments essentiels de la biocénose des hyphomycètes prédateurs. Nous avons montré , dans ce qui précéde, la polyvalence de l'activité nématicide des différentes souches de M. salinum; ces prédateurs sont capables de s'attaquer à différents groupes de nématodes. Mais la variabilité de leur activité de capture pourrait être, cependant, directement liée aux interactions entre les différents éléments de la biocénose du sol traité. Nous avons isolé, dans la biocénose naturelle de M. salinurn; divers micro-organismes, dont les plus importants sont: Deux champignons "hyperparasites" associés aux hyphomycètes prédateurs, deux bactéries associées et un nématode bactériophage du genre Pristionchus. Un équilibre, plus ou moins stable et complexe, semble s'établir entre les différents éléments de cette Biocénose, dans le sol , où chaque élément joue un rôle particulier ( Figure n024 ). Effet des hyperparasites sur M. salinum Deux champignons hyperparasites ont été isolés dans le milieu naturel de M. salinum , Il s'agit de Penicillium sp., type biverticillata asymetrica (Planche 6 a, b, c, d) et d'Aspergillus parasiticus ( Planche 6 e, f ). Ces deux champignons sont des ectoparasites facultatifs de M. salinum . Ils présentent, cependant, différents modes de parasitisme. Aspergillus parasiticus forme des suçoirs qui collent au mycélium de M. salinum pour y prélever les substances trophiques (Planche 6 b, c d). Ces suçoirs correspondent à une spécialisation des extrémités des hyphes mycéliens, qui forment une large surface de contact avec ceux de l'hâte Le parasitisme de Penicillium sp. est moins perfectionné, ses hyphes mycéliens enveloppent simplement tous les organes de l'hôte, même les conidies, pour y puiser les substances nourricières (Planche 6 f). Le mycélium, ainsi parasité, présente de larges vacuoles; il semble éviter celles de l'hyperparasite et présente ainsi une croissance concentrique circulaire (Planche 6 b).Les champignons hyperparasites sont donc des consommateurs de troisième ordre , qui profitent de la phase prédatrice de leur hôte pour s'y développer, surtout lorsque le milieu est pauvres. Cette relation, entre les hyphomycètes prédateurs et ces hyperparasites a été déjà par d'autres auteurs; mais la précision de cet hyperparasitisme est signalée pour la première fois. Cette interaction pourrait expliquer, au moins en partie, le problème d'installation des tels bionématicides dans les sols traités. Le taux de parasitisme des hyperparasites à l'égard des champignons prédateurs est cependant, nettement plus important dans les milieux de culture contenant de la streptomycine à 0,25 gr / litre, un antibiotique utilisé pour limiter le développement des bactéries associées aux hyphomycètes prédateurs. Ainsi, les bactéries associées aux champignons prédateurs leur assurent une certaine protection contre les hyperparasites, grâce à leur effet antagoniste vis à vis de Penicillium sp. et Aspergillus parasiticus Rôle Les bactéries associées à M. salinum Les deux espèces bactériennes, isolées dans le milieu naturel de M. salinum , présentent un effet sur la croissance et l'activité prédatrice des souches bionématicides. Ces bactéries sont très difficile à éliminer des milieux de culture des champignons prédateurs ,surtout sur milieu solide. Elles jouent un rôle essentiel dans la protection des bionématicides appliqués dans le sol en inhibant et/ou en réduisant l'effet des micro-organismes antagonistes (Figure n024) . Ces bactéries associées peuvent aussi stimuler l'activité prédatrice de M. salinum par comparaison à celle des souches pures ou désinfectées Les bactéries associées assurent la bio-dégradation des bionématicides, dans conditions défavorables, tout en stimulant la formation des les chlamydospores qui sont des organes de résistance (Planche 3 d, e, f). Le mycélium (Planche IIId & VIIe) et les conidies (Planche 7 a, b, c, d) peuvent être complètement détruits dans les vieilles cultures de M. salinum B. pimilus, une bactérie du sol, est même capable de détruire les chlamydospores des hyphomycètes prédateurs. Les deux espèces de bactéries associées aux souches Cp 4 et Pi 10 servent de support trophique à Pristionchus n. sp., une nouvelle espèce de nématode bactériophage isolée de la biocénose de M. salinum (Figure ne24). Rôle des bactériophages associés à M. salinum Le nématode bactériophage le plus dominant dans la biocénose de M. salinum est un Rhabditide appartenant aux Diplogasterides , au genre Pristionchus. C'est très probablement une nouvelle espèce. La femelle holotype présente les mensurations suivantes L = 872 Clam; 1 = 43,4 clam; a = 20; Longueur de l'oesophage = 121 Rm; b = 7,2; Pore excréteur = 71 fm; Queue = 163 Rm; c = 5,3; V = 45% Les caractéristiques morphologiques de cette espèce s Le rôle de cette espèce de nématode dans la biocénose naturelle de M. salinum semble être très important présentant divers aspects * Ce nématode bactériophage se développe sur les bactéries associées aux souches de M. salinum ; son développement est plus rapide sur Cp 4 dans le milieu A (Figure ne26). Ce développement est, cependant, plus rapide dans les milieux favorables à la fois aux champignons et aux bactéries associées. Sur CMA, en présence de la souche Cp 4, le taux de croissance des populations de Pristionchus n. sp. est plus important que sur Agar (Figure n027). Sur NA , milieu favorable au développement des bactéries aux détriments des champignons , les populations des bactériophages présentent un taux de développement plus important sur Pi 10 associée à P. vesicularis, que sur Cp 4 associée à B. licheniformis (Figure n028) . Cette dernière association est, en effet, défavorable au développement de la souche Cp 4 sur le milieu NA (Planche 8 c Nous pouvons en déduire que le meilleur développement des bactériophages s'observe dans les milieux favorables à la fois aux champignons et à leurs bactéries associées. *Le nématode bactériophage est, par ailleurs, une proie de substitution pour M. salins, en absence de nématodes phytoparasites, dont la présence dans le sol est temporaire, liées aux cycles végétatifs des cultures. Ce nématode bactériophage stimule la formation continue des organes de capture, les champignons prédateurs maintiennent ainsi en continu leur phase nématicide. Nous avons évalué, in vitro, l'activité nématicide de la souche Pi 10 vis à vis des Meloidogyne en présence et en absence de Pristionchus (Tableau nO 7 ). Tableau nO 7 : Effet de la présence de Pristionchus n. sp. sur l'activité nématicide de Pi 10 à l'égard des Meloidogyne Traitements % de capture Pi 10 60,7 f 10,2 a Pi 10 + Pristionchus 81,0 + 07,lb Ce résultat confirme l'augmentation de la rapidité et de l'intensité de l'activité prédatrice de M. salinum en présence de bactériophage dans le milieu de culture Le nématode bactériophage permet aussi la dissémination des bactéries associées aux hyphomycètes prédateurs dans les milieux de culture (Planche 8e) grâce à leur mobilité. Ces animaux ne se limitent pas à assurer la dissémination des colonies bactériennes dans le milieu , ils exaltent leur développement grâce aux sécrétions qu'ils libèrent. Les nématodes bactériophages contribuent, de ce fait, à accélérer l'activité biodégradante des bactéries dans le milieu. CONCLUSION GENERALE La grande diversité morphologique, biométrique et biologique des différentes souches de Monacrosporiurn salinum permet leur identification en se basant soit, sur des critères morpho-métriques, soit en étudiant leur comportement de prédation et/ou leurs bactéries associés. Pour pouvoir approfondir certains aspects des interactions entre les champignons prédateurs et les autres éléments de leur biocénose, nous avons mis au point différentes techniques expérimentales, telles que la technique de miniculture directement sur lame porte objet, qui permet de visualiser plus nettement ces interactions. L'utilisation du réactif de Schiff, permet une coloration différentielle des nématodes en fonction de la chronologie de la prédation. La reconstitution du modèle de l'équilibre biologique de la biocénose de M. salinum à partir de son milieu naturel, nons a permis te cumpTendxe Ew interactions entre les différents éléments de cette biocénose. L'activité nématicide des champignons prédateurs, qui apparait exceptionnelle vis à vis des nématodes phytoparasites, dont la présence dans le milieu varie de façon saisonnière en fonction des cycles culturaux des plantes hôtes, peut être maintenue , en absence de cultures et de nématodes phytoparasites grâce à la présence de nématodes bactériophage dans le sol. Les champignons prédateurs peuvent aussi passer à une phase saprophytique avant d'être à leur tour une proie facile pour les champignons hyperparasites et leurs bactéries associées. Celles-ci stimulent la formation de leurs organes de résistance (les chamydospores), avant de contribuer à leur biodégradation. Quand l'humidité relative du sol est importante, les bactéries associées assurent la bio-dégradation des cultures seniles des bionématicides ; inversement, lorsque l'humidité relative est plus faible, les hyperparasites se chargent de la bio-dégradation des champignons nématophages Les bactéries associées, qui sont disséminées par les nématodes bactériophages , dont Pristionchus n. sp, favorisent l'installation des bionématicides dans le sol en assurant leur protection contre les mi c ro- organismes antagonistes. Pristionchus n. sp., qui est particulièrement prolifique constitue, en absence de nématodes phytoparasites, une proie de substitution pour les champignons nématophages. La phase prédatrice est ainsi maintenue, en attendant l'apparition des nématodes phytoparasites ; qui seront alors piègés en masse en quelques heures. C'est ce qui explique l'efficacité des bionématicides dans leur biocénose naturelle L'application dans le sol des cultures pures de bionématicides, en absence de leurs bactéries associées, limite incontestablement leur compétitivité dans les sols traités. L'absence des nématodes bactériophages dans les sols pauvres en matières organiques peut retarder le passage des bionématicides de la phase saprophytique à la phase prédatrice; la distribution de leurs organes de capture sera alors très localisée et moins fréquente. L' efficacité de la lutte biologique ne peut être dans ces conditions que très variables et peu fiable. L'un des principaux problèmes de la lutte biologique, utilisant les champignons prédateurs comme bionématicides , est la production en masse d'un inoculum facile à appliquer dans le sol. Nous avons pu mettre au point un milieu liquide à base de pois chiche, peu couteux, qui permet une croissance exponentielle des bionématicides, en présence de leurs bactéries associées. La production industrielle de grande quantité d'inoculum, facile à conserver dans de l'huile de paraffine, offre l'avantage de réduire les frais de transport et de conservation de ce produit par rapport à la méthode classique de production et de commercialisation des champignons prédateurs sur graines de céréales. L'ensemble de ces données font l'objet de ce brevet d'invention, qui est proposé pour une exploitation industrielle, afin d'être appliqué dans la lutte biologique contre les nématodes notamment contre les nématodes sous abris serres et en plein champs, ainsi que dans les vergers de citrus REVENDICATIONS : 1. Bionématicide caractérisé en ce que son efficacité vis-à-vis des nématodes et sa rémanence pour la lutte contre les nématodes associées aux cultures annuelles et/ou vivaces peuvent être modulées en fonction de sa composition et en ce qu'il peut être constitué de deux souches sélectionnées de champignons prédateurs, désignées Cp4 et PilO, appartenant à l'espèce Monacrosporium salinum et nécessairement associées à leurs bactéries compatibles respectivement Bacillus licheni formis et de Pseudomonas vesicularis, qui déterminent l'efficacité du bionématicide dans les sols agricoles traités. 2. Souche Cp4 du bionématicide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'efficacité de son activité prédatrice dans le sol est précoce mais sa rémanence est faible, ses conidies mesurent en moyenne entre 38 et 44 um de longueur et 18 à 22 vm de largeur (Rapport L/l variant entre 1,95 et 2,35); sa vitesse de croissance mycélienne sur CMA à 220c varie de 5,3 à 5,5 mm / jour. 3. Souche PilO du bionématicide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'efficacité de son activité prédatrice dans le sol est tardive mais sa rémanence est plus durable, ses conidies mesurent entre 44 et 48 um de longueur et 22 à 24 um de largeur (Rapport L/1 variant entre 1,85 et 2,01); sa vitesse de croissance mycélienne sur CM à 220c varie de 5,8 à 6,0 mm / jour. 4. Bionématicide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que son activité nématicide, dans les sols traités, est précoce grâce à la souche Cp4 et rémanente grâce à la souche PilO. 5. Bionématicide, selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu il présente un géotropisme positif et, est donc capable de s'établir en profondeur à 30-40 cm dans la plupart des sols agricoles, mêmes salins et/ou pauvres en matière organique. 6. Bionématicide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries associées stimulent le développement des bactériophages comme par exemple Pristionchus n sp. qui augmentent son efficacité et prolongent sa rémanence dans les sols traités. 7. Procédé de production industrielle massive du complexe bionématicide, selon la revendication 1,caractérisé en ce que les étapes essentielles sont: - (i) Inoculation du complexe bionématicide sur un milieu liquide à base d'extrait de Cicer arietinum (pois chiche) - (ii) Récupération du bionématicide sans adjuvant sur tamis - (iii) Broyage et conditionnement de la matière active du bionématicide dans de l'huile de paraffine. 8. Bionématicide, selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que sa croissance sur milieu liquide est exponentielle, 5 à 10 fois plus rapide que sur milieu solide à la même température de culture, permettant la production jusqu'à 1Kg d'inoculum par litre de milieu. 9. Bionématicide, selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les bactéries associées lui confèrent le caractère biodégradable après deux à six mois de son application dans le sol, évitant son développement incontrôlé et l'apparition d'une résistance aux bionématicides des sols traités avec succès une première fois.