Brevet FR2746645A1 — publié le 19971003

Compositions de triterpènes à activité anticancéreuse L'invention a pour objet des compositions de triterpènes à activité anticancéreuse utilisables notamment en thérapeutique, en particulier en chimiothérapie. Le développement de la chimiothérapie anticancéreuse a connu un essor important au cours des vingt dernières années. Elle est actuellement considérée comme une arme à part entière dans le traitement des cancers, complémentaire de la chirurgie et de la radiothérapie. Les progrès réalisés dans ce domaine résultent d'une part d'une meilleure connaissance des stratégies d'administration des drogues, mais également de la découverte de nouvelles molécules cytotoxiques. L'année 1995 constitue à cet égard une étape importante avec la délivrance d'autorisations de mise sur le marché de deux nouvelles molécules originales : le CPT-ll (CamptoR), dérivé de la camptothécine et le paclitaxel (TaxolR). Ces deux molécules sont d'origine végétale. La camptothécine a été initialement extraite de Camptotheca acuminata, alors que le paclitaxel a été isolé de l'écorce d'un if du Pacifique, Taxus brevifolia. Le CPT-ll est un inhibiteur des topoisomèrases I, enzymes participant au métabolisme de l'ADN, alors que le paclitaxel a pour cible intra-cellulaire les micro tubules qui constituent en particulier le fuseau mitotique. Le CPT-11 possède une activité notable dans les cancers du colon métastatique après échec du 5fluoro-uracile ; quant au paclitaxel, il est actuellement indiqué dans le traitement des cancers de l'ovaire et du sein en phase métastatique. Un autre taxane, le docétaxel, issu de l'if européen Taxus baccata, est également commercialisé comme médicament anti-cancéreux. Ces différentes molécules viennent ainsi rejoindre d'autres molécules cytotoxiques issues de végétaux, comme les alcaloïdes de la pervenche, connues depuis environ 20 ans. La chimiothérapie connaît néanmoins a ce jour d'importantes limites. Certaines tumeurs malignes sont en effet résistantes d'emblée aux drogues cytotoxiques connues, comme les cancers du rein ou de la prostate. D'autres cancers, initialement chimio-sensibles, acquièrent en cours de traitement, des mécanismes de résistance qui les rendent secondairement insensibles à la chimiothérapie, comme les cancers pulmonaires à petites cellules, les cancers du sein ou de l'ovaire. Les voies de recherche permettant d'augmenter l'efficacité de la chimiothérapie comportent l'accroissement des doses administrées, le développement de molécules cherchant à diminuer les résistances et la recherche de nouvelles molécules cytotoxiques présentant des mécanismes d'action originaux. Dans le cadre d'une telle recherche, les inventeurs ont étudié des compositions de triterpènes obtenues à partir d'Iris. Par "compositions", on entend, selon l'invention, aussi bien les extraits obtenus à partir d'iris, que les fractions constitutives de ces extraits ou encore les iridals qu'elles renferment. Les iridals sont des composés triterpénoïdiques, présents dans les rhizomes, les feuilles et les racines de 1'Iris. Jusqu'à présent, une trentaine d'iridals a été isolée. Certains des coinventeurs de la présente demande se sont intéressés dans des travaux antérieurs à la fonction des iridals dans la plante et ont montré, notamment, l'intervention du cytochrome P450 au cours des réactions d'hydroxylation des iridals et le rôle de ces composés dans le maintien de l'intégrité membranaire par l'intermédiaire de leur fonction apparemment analogue à celle des stérols. La poursuite de ces études a montré que, d'une manière surprenante, des compositions d'iridals obtenues à partir d'irais possèdent des propriétés anticancéreuses vis-à-vis de lignées cancéreuses humaines. De plus, selon un aspect revêtant un intérêt majeur, de telles propriétés s'exercent avec pratiquement le même niveau d'efficacité vis-à-vis de lignées considérées comme résistantes dans l'art antérieur. L'invention vise donc la mise à profit desdites propriétés cytotoxiques de compositions triterpénoïdiques à base d'iridals, notamment, pour l'étude de mécanismes d'actions vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines et tout spécialement leur utilisation dans des préparations pharmaceutiques pour la thérapie des cancers. Les préparations pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment, en association avec un véhicule pharmaceutique, une quantité efficace d'au moins une composition tripernoïdique à base d'iridals possédant des propriétés cytotoxiques vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines. Selon un premier aspect, les compositions à base de triterpènes utilisées dans les préparations pharmaceutiques selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'extraits tels qu'obtenus par extraction alcoolique dans de l'éthanol à 70 * (v/v) d'un broyat de parties végétales d'iris, feuilles, racines et tout spécialement rhizomes, à température ambiante, suivie, le cas échéant, d'une étape de concentration de la phase éthanolique, de dilution dans l'eau et d'au moins une étape de lavage de la phase aqueuse résultante avec un solvant tel que l'éther diéthylique, la récupération de la ou des phases éthérées et, après évaporation à sec, leur reprise dans de l'éthanol à 70 % (v/v). Selon un autre aspect, les compositions de triterpènes utilisées selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de fractions des extraits définis ci-dessus, essentiellement constituées par des monocycloiridals, des bicycloiridals et des spiroiridals. Les monocycloiridals comprennent plus spécialement l'iridal (21-désoxy-iridogermanal), le 16-0acétyl-isoiridogermanal, le 17-hydroxyiridal, le 26hydroxyiridal, le 17, 26-dihydroxyiridal, le 21hydroxyiridal (iridogermanal), le l0-désoxy-21hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro-iridal, le 16,17didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17, 29-didéhydroiridal. Les bicycloiridals comportent l'iriflorental, l'iripallidal, l'a-irigermanal, le y-irigermanal et le désoxy-iripallidal. Comme dérivés spiraniques, on citera le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29acétoxyspiroiridal, et les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique D, le bélamcandal et le 28-déacétyl-bélamcandal. Selon encore un autre aspect, les compositions utilisées selon l'invention sont constituées par les iridals per se, en particulier l'un de ceux énumérés cidessus. Les formes énantiomères ou diastéréoisomères, seules ou en mélange, des iridals des compositions cidessus font également partie de l'invention. On notera que les iridals de ces différentes compositions peuvent exister sous forme réduite, ou le cas échéant sous forme oxydée, ou encore déshydratée, conduisant à des structures cycliques ou polymérisées. En particulier, la chaîne latérale des iridals peut comporter des doubles liaisons résultant de déshydratations ou de déshydrogénations des iridals naturels, ou peut être hydroxylée. Ils peuvent également être obtenus sous forme hydroxylée ou estérifiée, par exemple avec des acides gras, ou éthérifiée. Ces différents dérivés d'iridals entrent dans le champ des compositions utilisées selon l'invention. Ces compositions, grâce à la nature de leurs substituants, par exemple éthers ou esters, constituent avantageusement une prodrogue. Dans les préparations pharmaceutiques de l'invention, ces compositions sont utilisées, le cas échéant, en association avec des principes actifs. On citera, à titre d'exemple, leur association avec d'autres médicaments anticancéreux comme les anthracyclines. Elles sont, en outre, avantageusement utilisées en association avec des composés facilitant leur assimilation, tels que des sucres, ainsi que tous les composés entrant classiquement dans la composition galénique des différentes formes d'administration. L'étude des propriétés pharmacologiques des compositions de l'invention a mis en évidence leur effet cytotoxique in vitro. Sur des cellules tumorales humaines, on constate ainsi une activité anticancéreuse dans les extraits bruts, amplifiée dans les extraits purifiés, les fractions et les iridals. D'une manière avantageuse, l'effet anticancéreux est observé aussi bien vis-à-vis de lignées de tumeurs solides que de lignées de tumeurs liquides, correspondant à des cancers parmi les plus fréquents rencontrés chez l'homme. Des essais effectués in vivo sur l'animal ont confirmé les résultats obtenus in vitro et par voie de conséquence l'intérêt des compositions d'iridals utilisées selon l'invention. A ces propriétés avantageuses, s'ajoute celle d'une inocuité satisfaisante. Ces préparations sont donc particulièrement appropriées pour la chimiothérapie des cancers. Elles sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable, ou encore sous forme de liposomes. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélules, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif par unité de prise. D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, souscutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Ces formes injectables renferment par unité de prise de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif. A titre indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient 0,01 mg à 1000 mg/jour en une ou plusieurs prises. L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les compositions définies plus haut et renfermant les excipients ou véhicules nécessaires pour l'application envisagée. Ces réactifs peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études d'éventuelles activités antitumorales. Les compositions à base d'iridals définies cidessus peuvent être obtenues par extraction de parties végétales d'Iris à l'aide de solvants organiques. Les iridals libres, c'est-à-dire non estérifiés, sont solubles dans des solvants tels que l'éthanol à 50-100 %, le méthanol, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique ou encore des mélanges de chloroforme et de méthanol par exemple à raison de 2/1, 1/1 ou 1/2 v/v. On utilise avantageusement de l'éthanol à 50 à 100 % environ et, de préférence, de l'ordre de 70 % ce qui permet de faciliter la pré-purification des molécules d'iridals. Il s'avère en effet qu'on limite ainsi l'extraction des iridals aux formes libres et qu'on réduit l'extraction de lipides présents dans les parties végétales de 1'Iris. Selon des modalités optimales, l'extraction est réalisée à une température supérieure à 0C et allant jusqu'a une température ambiante. Les parties végétales de 1'Iris, les racines, les feuilles et tout spécialement les rhizomes, sont au prélable broyées. Cet extrait brut peut être purifié, si on le souhaite, de manière à disposer d'un extrait plus actif au regard de ses effets sur des cellules cancéreuses humaines. On procède avantageusement à l'élimination de l'éthanol, puis au traitement du mélange visqueux obtenu pour récupérer au moins la majeure partie des composés actifs. A cet effet, il s'est avéré approprié de diluer le mélange visqueux avec de l'eau et de laver la phase aqueuse avec un solvant éthéré. Comme solvant éthéré convenant pour cette étape, on citera l'éther diéthylique qui permet de laisser dans la phase aqueuse les molécules hydrosolubles et de récupérer les iridals dans la phase organique. Plus de la moitié de la matière sèche de l'extrait éthanolique est ainsi eliminée dans la phase aqueuse, ce qui permet un enrichissement important de la phase éthérée en iridals. La ou les phases ethérées obtenues à l'issue de la ou des étapes de lavage sont regroupées et, après élimination de l'éther, sont additionnées d'un solvant. Comme dans l'étape d'extraction, on a recours avantageusement à de l'méthanol de 50 à 100 % environ et, de préférence, de l'ordre de 70 % (v/v), ces solutions éthanoliques étant moins toxiques que d'autres solvants pour les cultures cellulaires. L'extrait purifié ainsi obtenu est fractionné, si on le désire, de manière à séparer les composés les plus actifs. En opérant par exemple par chromatographie sur couche mince, sur colonne, chromatographie contrecourant, chromatographie par fluide supercritique, on isole une fraction composée d'iridals, qui renferme l'essentiel de l'activité anti-tumorale recherchée, comme le montrent les tests sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines. Les iridals peuvent être à leur tour séparés et purifiés, en opérant, par exemple, par HPLC. La connaissance de la formule de ces iridals permet également de recourir aux procédés de synthèse chimique pour leur obtention. Il est également possible d'opérer par hémisynthèse, à partir d'une molécule d'une classe d'iridal, ou encore par biotransformation. On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. Dans ces exemples, relatifs à l'obtention de compositions de triterpènes et à l'étude de leur activité antitumorale, il sera fait référence à la figure unique A à D qui représente des formules d'iridals. Exemple 1 : Obtention d'extraits de dérivés de triterpènes. Des rhizomes d'Iris (1. germanica, I. pallida, I, pseudacorus, I. sp. ou variétés horticoles) sont broyés et soumis à une extraction à température ambiante dans l'éthanol 70 8. L'extrait ainsi obtenu est filtré à 0,6 pm et appelé Extrait Brut 70 ou EB70. Une partie d'ES70 est concentrée par élimination du solvant sous vide partiel. Le mélange visqueux obtenu est transféré dans une ampoule à décanter et dilué dans l'eau. On pratique alors plusieurs lavages de cette phase aqueuse avec de l'éther diéthylique. Les phases éthérées obtenues sont regroupées, évaporées à sec et reprises dans l'éthanol 70 %. On obtient ainsi une phase appelée Phase Organique 70 ou P070. La phase aqueuse obtenue après le lavage à l'éther d'EB70 est appelée : PA. L'extrait P070 est fractionné par chromatographie sur couche mince. On obtient trois fractions P070a, P070b et P070c, qui sont testées comme rapporté ci-après sur la prolifération des cellules cancéreuses humaines. On retrouve l'activité cytotoxique dans la fraction P070b. Cette fraction est presque exclusivement constituée d'iridals mono-, bi- et spirocycliques. Plusieurs molécules d'iridals sont purifiées par HPLC et répondent aux formules I à XXVI données sur la figure unique. I1 s'agit des composés suivants Monocycloiridals : l'iridal (21-désoxyiridogermanal), le 16-0-acétyl-isoiridogermanal, le 17hydroxyiridal, le 26-hydroxyiridal, le 17, 26dihydroxyiridal, le 21-hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21-hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le l0-désoxy-17-hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro- iridal, le 16,17-didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17,29didéhydroiridal. Les bicycloiridals comportent l'iriflorental, l'iripallidal, l'a-irigermanal, le y-irigermanal et le désoxy-iripallidal. Comme dérivés spiraniques, on citera le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29acétoxyspiroiridal, et les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique, D, le bélamcandal et le 28-déacétylbélamcandal. Exemple 2 : Etude de l'activité cytotoxique Méthode Différents tests de cytotoxicité ont été réalisés sur des extraits et fractions d'iridals et sur des iridals, en tant que composés individuels. Deux types de lignées cellulaires d'origine humaine ont été utilisés - A2780 (cancer de l'ovaire), lignée adhérente sensible à la doxorubicine et A2780 R, lignée fille rendue résistante à la doxorubicine et exprimant le mécanisme de chimiorésistance MDR. - K 562 (leucémie myéloïde chronique), lignée en suspension liquide sensible à la doxorubicine et K562 R, lignée fille rendue résistante à la doxorubicine et exprimant le mécanisme de chimiorésistance MDR. Le test de cytotoxicité utilisé pour mettre en évidence la prolifération cellulaire est le test MTT. La viabilité des cellules est vérifiée par le test au trypan bleu. La densité cellulaire est déterminée par un coulter counter. Les conditions de culture sont les suivantes milieu de culture : RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, glutamine et pénicilline/streptomycine. conditions de culture : les cellules sont cultivées à 37il, sous 95 % d'humidité relative, dans une atmosphère contenant 5 % de CO2. Résultats Dans les 2 tableaux qui suivent, on rapporte les résultats obtenus avec les extraits EB70, P070 et PA, ainsi que le composé de formule XXI. TABLEAU I Composés testés Activité cytotoxique (IC 50) en ug/ml Lignées cellulaires A2780 A2780R K562 K562R EB70 14,6 # 1,6 29,3 # 20,5 22,2 # 22 19 # 13,4 PO70 12,3 # 8,2 11,3 # 1,8 17 # 1,0 14 # 2,8 PA > 150 > 150 > 110 > 110 Doxorubicine 0,057 # 0,18 0,76 # 0,09 0,19 # 0,07 12,3 # 8,5 Taxol 0,001 0,87 # 0,04 3,2 # 0,39 29 # 9,2 TABLEAU Il Activité cytotoxique (IC 50 en pg/ml) Composés testés Lignées cellulaires A2780 A2780R K562 K562R composé XXI 2,92 4,93 1,44 2,55 (29 acétoxy-spiroiridal) doxorubicine 0,049 0,47 0,26 11,2 Ces résultats montrent que les extraits éthanoliques bruts d'iris présentent une activité cytotoxique aussi bien sur des lignées cancéreuses humaines sensibles que résistantes. On constate l'amplification de cet effet avec la fraction purifiée P070 et l'iridal. On notera avec intérêt que les valeurs des ICso (g/ml) sont sensiblement du même ordre de grandeur dans les tests sur cellules résistantes, alors qu'elles sont dix fois supérieures avec les principes actifs connus, la doxorubicine et le taxol. En revanche, la phase aqueuse obtenue lors de la purification de l'extrait brut est dépourvue d'activité. Exemple 3 : Solution injectable d'iridals. On utilise 2 g d'iridals provenant de la fraction P 070 b dans 1000 ml de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est répartie dans des ampoules de 10 ml. L'invention fournit donc de nouvelles compositions de grand intérêt pour les chimiothérapies anti-cancéreuses. REVENDICATIONS 1/ Préparations pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent en association avec un véhicule pharmaceutique une quantité efficace d'au moins une composition d'iridals possédant une activité antitumorale vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines. 2/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les compositions d'iridals sont élaborées à partir d'extraits, tels qu'obtenus par extraction alcoolique dans de l'éthanol à 70 % (v/v), d'un broyat de parties végétales d'iris, feuilles, racines et tout spécialement rhizomes, à température ambiante, suivie, le cas échéant, d'une étape de concentration de la phase éthanolique, de dilution dans l'eau et d'au moins une étape de lavage de la phase aqueuse résultante avec un solvant tel que l'éther diéthylique, la récupération de la ou des phases éthérées et, après évaporation à sec, leur reprise dans de l'éthanol à 70 % (v/v). 3/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que les compositions d'iridals sont élaborées à partir de fractions desdits extraits, essentiellement constituées par des monocycloiridals, des bicycloiridals et des dérivés spiraniques. 4/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 3, caractérisées en ce que les monocycloiridals comprennent l'iridal, le 16-0-acétylisoiridogermanal, le 17-hydroxyiridal, le 26hydroxyiridal, le 17, 26-dihydroxyiridal, le 21hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21hydroxyiridal (lO-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17 hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16, 17-didéhydro-iridal, le 16,17didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17, 29-didéhydroiridal, les bicycloiridals comprennent l'iriflorental, l'iripallidal, l'a-irigermanal, le y-irigermanal et le désoxy-iripallidal et les dérivés spiraniques, comprennent le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29-acétoxyspiroiridal, les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique D, le bélamcandal et le 28-déacétylbélamcandal. 5/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les iridals correspondent aux formes énantiomères ou diastéréoisomères, seules ou en mélange, des iridals des compositions selon l'une des revendications 2 à 4. 6/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 a 5, caractérisées en ce qu'elles renferment des dérivés d'iridals, choisis parmi les esters, éthers, les composés à chaîne latérale, hydroxylée, déshydrogénée ou déshydratée. 7/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendication 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable. 8/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules ou de liposomes et qu'elles renferment de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif par unité de prise. 9/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement par unité de prise de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif. 10/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 9, utilisées comme médicaments anti-tumoraux.