Brevet FR2738842A1 — publié le 19970321

La présente invention concerne une nouvelle molécule d'ADN à réplication conditionnelle, utilisable en thérapie génique. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie en introduisant une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe et ensuite réinjectée dans l'organisme soit in vivo, directement dans le tissu visé. S'agissant d'une molécule de haut poids moléculaire et de charge négative, I'ADN a des difficultés pour traverser spontanément les membranes cellulaires phospholipidiques. Différents vecteurs sont donc utilisés afin de permettre le transfert de gène : les vecteurs viraux d'une part, les vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques, d'autre part. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno-associés,...) sont très efficaces, notamment pour le passage des membranes, mais présentent un certain nombre de risques tels que la pathogénicité, la recombinaison, la réplication, I'immunogénicité, .. Les vecteurs chimiques et/ou biochimiques permettent d'éviter ces risques (pour revues, voir Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Ce sont par exemple des cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. n peut également s'agir de liposomes dans lesquels l1ADN est incorporé et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou des polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. A titre illustratif de cetype de vecteurs, on peut notamment citer le dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS, TransfectamTM) ou le chlorure de N-[l (2,3 -dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA, LipofectinTM). Toutefois, I'utilisation de vecteurs chimiques et/ou biochimiques ou d'ADN nu implique la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans les techniques de thérapie génique, le médicament est constitué par l'ADN même et il est essentiel de pouvoir fabriquer, dans des quantités adaptées, des ADN ayant des propriétés appropriées à un usage thérapeutique chez l'homme. Dans le cas de la vectorologie non virale, ce sont des plasmides d'origine bactérienne qui sont mis en oeuvre. Les plasmides généralement utilisés en thérapie génique portent (i) une origine de réplication, (ii) un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampicilline...) et (iii) un ou plusieurs transgènes avec des séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...). Toutefois, la technologie actuellement disponible ne donne pas entière satisfaction. D'une part, il demeure un risque de dissémination dans l'organisme. C'est ainsi qu'une bactérie présente dans l'organisme peut, à une fréquence faible, recevoir ce plasmide. Ceci a d'autant plus de chances de se passer qu'il s'agit d'un traitement de thérapie génique in vivo dans lequel l'ADN peut être disséminé dans l'organisme du patient et peut se trouver au contact de bactéries qui infectent ce patient ou bien de bactéries de la flore commensale. Si la bactérie receveuse du plasmide est une entérobactérie, telle quE coli ce plasmide peut se répliquer. Un tel événement conduit alors à la dissémination du gène thérapeutique.Dans la mesure où les gènes thérapeutiques utilisés dans des traitements de thérapie génique peuvent coder par exemple pour une lymphokine, un facteur de croissance, un antioncogène, ou une protéine dont la fonction fait défaut chez l'hôte et permet donc de corriger un défaut génétique, la dissémination de certains de ces gènes pourrait avoir des effets imprévisibles et préoccupants (par exemple si une bactérie pathogène acquérait le gène d'un facteur de croissance humain). D'autre part, les plasmides utilisés généralement en thérapie génique non virale possèdent aussi un marqueur de résistance à un antibiotique (ampicilline, kanamycine...). La bactérie acquérant un tel plasmide a donc un avantage sélectif indéniable puisque tout traitement antibiothérapique, utilisant un antibiotique de la même famille que celui sélectionnant le gène de résistance du plasmide, va conduire à la sélection du plasmide en question. A cet égard, I'ampicilline fait partie des ss- lactames qui est la famille d'antibiotiques les plus utilisés au monde. L'utilisation de marqueurs de sélection chez la bactéries qui ne soient pas des gènes de résistance à des antibiotique serait donc particulièrement avantageuse. Elle éviterait la sélection de bactéries ayant pu recevoir un plasmide portant un tel marqueur. Il est donc particulièrement important de chercher à limiter au maximum la dissémination des gènes thérapeutiques et des gènes de résistance. La présente invention a précisément pour objet de proposer de de nouvelles molécules d'ADN, utilisables en thérapie génique, ne se répliquant que dans des cellules pouvant complémenter certaines fonctions de ces vecteurs non viraux. L'invention concerne également une méthode particulièrement efficace pour la préparation de ces molécules d'ADN. Les molécules d'ADN revendiquées ont pour avantage d'éliminer les risques liés à une dissémination du plasmide, tels que (1) la réplication et la dissémination, pouvant entraîner une surexpression non contrôlée du gène thérapeutique, (2) la dissémination et l'expression de gènes de résistance. L'information génétique contenue dans les molécules d'ADN selon l'invention comprend en effet le(s) gène(s) thérapeutique(s) et les signaux de régulation de son (leur) expression, une origine de réplication conditionnelle fonctionnelle limitant très fortement le spectre d'hôte cellulaire de ce plasmide, un marqueur de sélection de taille réduite de préférence différent d'un gène conférant la résistance à un antibiotique et le cas échéant, un fragment d'ADN permettant la résolution de multimères de plasmide.La probabilité que ces molécules (et donc l'information génétique qu'elles contiennent) soient transférées à un microorganisme, et maintenues de manière stable, est très limitée. Enfin les vecteurs selon l'invention, également désignées miniplasmides en raison de leur structure circulaire, de leur taille réduite et de leur forme superenroulée, présentent les avantages supplémentaires suivants: En raison de leur taille réduite par rapport aux plasmides dérivés de ColEl classiquement utilisés, les molécules d'ADN selon l'invention ont potentiellement une meilleure biodisponibilité in vivo. En particulier, elles présentent des capacités de pénétration et de distribution cellulaires améliorées. Ainsi il est reconnu que le coefficient de diffusion dans les tissus est inversement proportionnel au poids moléculaire (Jain, 1987). De même, au niveau cellulaire, les molécules de haut poids moléculaire ont une moins bonne perméabilité à travers la membrane plasmique. En outre, pour le passage du plasmide au noyau, indispensable à son expression, le poids moléculaire élevé est également un inconvénient, les pores nucléaires imposant une limite de taille pour la diffusion vers le noyau (Landford et al 1986). La réduction de la taille des parties non-thérapeutiques de la molécule d'ADN (origine de réplication et gène de sélection notamment) selon l'invention permet également de diminuer la taille des molécules d'ADN. La partie permettant la réplication et la sélection de ce plasmide chez la bactérie (1,1 kb) est diminuée par un facteur 3, en comptant par exemple 3 kb pour l'origine de réplication et le marqueur de résistance partie vecteur.Cette diminution (i) de poids moléculaire et (ii) de charge négative, confère aux molécules de l'invention des capacités améliorées de diffusion et de biodisponibilité tissulaires, cellulaires et nucléaires. Plus précisément, la présente invention concerne une molécule d'ADN sous forme circulaire, utile en thérapie génique, comprenant au moins une séquence nucléique d'intérêt, caractérisée en ce que la région permettant sa réplication comprend une origine de réplication dont la fonctionnalité dans une cellule hôte requiert la présence d'au moins une protéine spécifique et étrangère à ladite cellule hôte. Cette molécule d'ADN peut se présenter sous forme mono ou double brin et avantageusement possède une forme superenroulée. Au sens de la présente invention, les cellules hôtes mise en oeuvre peuvent être de diverses origines. I1 peut s'agir de cellules eucaryotes ou procaryotes. Selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, il s'agit de cellules procaryotes. Classiquement, la réplication des plasmides bactériens nécessite la présence d'au moins une protéine codée par l'hôte cellulaire de type ARN polymérase, Rnase, ADN polymérase.... Pour les raisons déjà exposées précédemment, on ne peut totalement s'affranchir, avec ce type de réplication, d'éventuels risques de dissémination dans l'organisme traité. Avantageusement, la fonctionnalité de l'origine de réplication de la molécule d'ADN selon l'invention exige la présence d'une protéine spécifique et étrangère à la cellule hôte. Cette caractéristique a pour intérêt de réduire le spectre d'hôte du plasmide revendiqué à des souches spécifiques exprimant cette protéine initiatrice. La molécule d'ADN, mise au point dans le cadre de la présente invention, possède donc avantageusement une origine de réplication dite conditionnelle. L'origine de réplication conditionnelle mise en oeuvre selon la présente invention peut provenir de plasmides ou bactériophages, partageant les caractéristiques suivantes: ils contiennent dans leur origine de réplication des séquences répétées, ou itérons et ils codent pour au moins une protéine initiatrice de la réplication (Rep) qui leur est spécifique.A titre d'exemple, on peut citer les systèmes de réplication conditionnelle des plasmides et bactériophages suivants: plasmide ou bactériophage protéine initiatrice spicifrque RK2 (Stalker et au 1981) TrfA R1 (Ryder et al., 1981) RepA pSC101 (Vocke and Bastia,1983) RepA F (Murotsu et al.. 1981) protéine E Rts1 (Itoh et al., 1982,1987) RepA RSF1010 (Miao et al., 1995) RepC P1 (Abeles et aL. 1984) RepA P4 (Flensburg and Calendar,1987) protéine alpha lambda (Moore et aL 1981) protéine O phi 82 (Moore etal. 1981) protéine O de phi 82 phi 80 protéine O de phi 80 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'origine de réplication mise en oeuvre dans les molécules d'ADN revendiquées est issue d'un plasmide naturel d'E. coli appelé R6K. Les fonctions de réplication de R6K sont regroupées dans un fragment d'ADN de 5,5 kpb (figure 1) comprenant 3 origines de réplication ci, sset y (y et ss assurant 90% de la réplication) et un opéron codant pour les protéines initiatrices de réplication n et la protéine Bis. L'information génétique minimale nécessaire au maintien de ce plasmide à son nombre de copies caractéristique (15 copies par génome) est contenue dans deux éléments : les 400 pdb de 1' ori y et le gène pir, dont le produit est la protéine initiatrice n. L'ori y peut être divisée en deux parties fonctionnelles: la partie-coeur et l'élément activateur (figure 1). La partie-coeur, essentielle pour la réplication contient les itérons (7 répétitions directes de 22 pdb) où se lie la protéine n représenté en SEQ ID N 1, et des segments flanquants, cibles de protéines de l'hôte (IHF, DnaA). Selon un mode préféré de l'invention, l'origine de réplication du vecteur revendiqué est constituée en tout ou partie par cette origine de réplication y du plasmide R6k et plus préférentiellement en tout ou partie par la SEQ ID N01 ou l'un de ses dérivés. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée à l'égard de la protéine initiatrice de la réplication, s. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type.De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées. L'origine de réplication décrite ci-dessus qui présente l'avantage d'être de taille très limitée, est fonctionnelle uniquement en présence d'une protéine initiatrice spécifique, la protéine Pi, produit du gène pir (SEQ ID N02). Cette protéine pouvant agir en trans, il est possible de dissocier physiquement l'ori gamma du gène p. qui pourra être introduit dans le génome de la cellule choisie comme hôte spécifique de ces plasmides. Des mutations dans z peuvent altérer ses fonctions inhibitrices (Inuzuka et Wada, 1985 ) et entraîner une augmentation du nombre de copies des dérivés de R6K, jusqu'à plus de 10 fois le nombre de copies initial. Ces substitutions sont toutes comprises dans un domaine de 40 acides aminés, qui semble donc responsable du contrôle par K du nombre de copies plasmidiques (figure 2). Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la protéine x, exprimée dans la cellule hôte, résulte de l'expression du gène représenté en SEQ ID N"2 ou l'un de ses dérivés tels que définis précédemment et plus particulièrement du gène pir 116 qui comprend une mutation par rapport au gène pir. Cette mutation correspond à la substitution d'une proline par une leucine. Dans ce contexte, le nombre de copies des dérivés de R6K est de l'ordre de 250 copies par génome. Outre une origine de réplication conditionnelle telle que définie précédemment, les molécules d'ADN revendiquées contiennent une région comprenant un (ou plusieurs) gène(s) permettant d'assurer la sélection de la molécule d'ADN chez l'hôte choisi. ll peut s'agir d'un marqueur classique de type gène conférant une résistance à un antibiotique, tels la kanamycine, I'ampicilline, le chloramphénicol, la streptomycine, la spectinomycine, la lividomycine ou autres. Toutefois, selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, cette région est différente d'un gène conférant une résistance à un antibiotique. ll peut ainsi s'agir d'un gène dont le produit est indispensable à la viabilité de l'hôte envisagé, dans des conditions de cultures définies. ll peut-être par exemple: -un gène codant pour un ARNt suppresseur, d'origine naturelle ou synthétique. ll s'agit plus préférentiellement d'un ARNt de codon ambre (TAG) -un gène dont le produit est nécessaire au métabolisme de la cellule, dans certaines conditions de culture: gène intervenant dans la biosynthèse d'un métabolite (acide aminé, vitamine,...) , gène de catabolisme permettant d'assimiler une substance présente dans le milieu de culture (source d'azote ou de carbone particulières)... Selon un mode privilégié de l'invention, cette région contient une cassette d'expression d'un gène codant pour un ARNt suppresseur de codons spécifiques. Celui-ci peut être notamment choisi parmi ceux codant pour les bases Phénylalanine, Cystéine, Proline, Alanine et Histidine. Il s'agit plus préférentiellement d'un ARNt suppresseur des codons ambre (TAG). Dans ce cas particulier, le système utilisé pour sélectionner, chez les hôtes cellulaires, les molécules d'ADN sujets de la présente invention comporte deux éléments: I)sur la molécule d'ADN, un gène codant pour un ARN de transfert suppresseur de codon ambre (TAG) qui constitue le marqueur de sélection, dit gène (suD) et 2) un hôte spécifique dont un des gènes, essentiel dans certaines conditions de culture, contient un codon ambre TAG. Cette cellule pourra croître, dans les conditions de culture pour lesquelles le produit du gène contenant le codon TAG est essentiel, uniquement si le plasmide permettant l'expression de sup est présent dans la cellule. Les conditions de culture constituent donc la pression de sélection de la molécule d'ADN. Les gènes sup utilisés peuvent être d'origine naturelle (Glass et al.. 1982) ou provenir de construction synthétique (Normanly et al., 1986; Kleina et al.. 1990). Un tel système offre une grande flexibilité dans la mesure où, suivant le gène comportant une mutation ambre, il est possible de déterminer différents milieux sélectifs. Chez la bactérie Lactococcus lactis, par exemple, le codon ambre est localisé dans un gène de biosynthèse des purines. Ceci permet la sélection du plasmide porteur du gène codant pour l'ARNt suppresseur lorsque les bactéries se multiplient dans le lait. Un tel marqueur a l'avantage d'être de taille très réduite et de ne pas contenir de séquences "étrangères", provenant de phages ou de transposons. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la molécule d'ADN comprend en outre un fragment d'ADN, cible de recombinases site-spécifiques, qui permet la résolution des multimères de plasmides. Ainsi, un tel fragment, introduit sur une molécule d'ADN circulaire et dont l'origine de réplication est par exemple ori gamma permet de résoudre les multiméres d'un tel plasmide. De tels multimères sont notamment observés lorsque la molécule d'ADN est préparée dans une souche portant un allèle muté de plr qui permet d'augmenter le nombre de copies des dérivés de R6K, comme pir-116 Cette recombinaison peut être réalisée grâce à divers systèmes qui entraînent la recombinaison site-spécifique entre des séquences. Plus préférentiellement, la recombinaison site-spécifique de l'invention est obtenue au moyen de séquences de recombinaison intramoléculaire spécifique qui sont capables de recombiner entre elles en présence de protéines spécifiques, généralement désignée recombinase.Dans ce cas précis, il s'agit des recombinases XerC et XerD. Pour cette raison, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence permettant cette recombinaison site spécifique. Le système de recombinaison spécifique présent dans les constructions génétiques selon l'invention (recombinases et site de reconnaissance spécifique) peut être de différentes origines. En particulier, les séquences spécifiques et les recombinases utilisées peuvent appartenir à différentes classes structurales, et notamment à la famille de résolvase du transposon Tn3 ou à la famille de l'intégrase du bactériophage lambda.Parmi les recombinases appartenant à la famille du transposon Tn3, on peut citer notamment la résolvase du transposon Tn3 ou des transposons , Tn21 et Tn522 (Stark et al., 1992); I'invertase Gin du bactériophage mu ou encore les résolvases de plasmides, telle que celle du fragment PNL de RP4 (Abert et al Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Parmi les recombinases appartenant à la famille de l'intégrase du bactériophage X, on peut citer notamment rintégrase des phages lambda (Landy et aL, Science 197 (1977) 1147), P22 et (p80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HPI de Haemophilus influenzae (Hauser et al J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), lintégrase Cre du phage P1, I'intégrase du plasmide pSAM2 (EP 350 341) ou encore la FLP recombinase du plasmide 2p et les recombinases XerC et XerD d'E coli. Préférentiellement, les molécules d'ADN objets de la présente invention contiennent le fragment cer du plasmide naturel d'E. coli ColEl. Le fragment cer utilisé est un fragment HpaII de 382 pdb de ColEl dont il a été montré qu'il permettait, en cis. la résolution de multimères de plasmides (Summers et al.* 1984; Leung et al.. 1985). ll est aussi possible d'utiliser un fragment HpaII-TaqI de taille plus réduite (280 pdb) ou un fragment plus petit (environ 220 pdb), compris dans le fragment HpaII, et qui possèdent les mêmes propriétés (Summers and Sherratt, 1988). Cette résolution passe par une recombinaison intramoléculaire spécifique, qui fait intervenir quatre protéines codées par le génome d'E. coli: ArgR, PepA, XerC et XerD (Stirling et al.. 1988,1989; Colloms et al., 1990; Blakely et al.. 1993) A ce titre, il particulièrement avantageux d'utiliser tout ou partie du fragment cer de ColE 1 ou de l'un de ses dérivés tels que définis précédemment. A titre de molécule d'ADN représentative de la présente invention, on peut tout particulièrement revendiquer le plasmide pXL2774 et ses dérivés. Au sens de l'invention on entend par dérivé toute construction dérivant du pXL2774 et comportant un ou plusieurs gènes d'intérêt autres que le gène luciférase. La présente invention se rapporte également à la mise au point d'un procédé, de constructions d'hôtes cellulaires spécifiques, particulièrement efficaces pour la production de ces molécules d'ADN thérapeutiques. Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de production de molécule d'ADN circulaire caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte contenant au moins un molécule d'ADN telle que définie précédemment et une protéine, exprimée in situ ou non, conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication deladite molécule d'ADN, spécifique et étrangère à ladite cellule hôte, dans des conditions permettant la sélection des cellules hôtes transformées par lesdites molécules d'ADN. Plus préférentiellement, la protéine conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication de la molécule d'ADN est exprimée in situ à partir d'un gène correspondant. Le gène codant pour la protéine initiatrice de la réplication peut être porté par unréplicon annexe, compatible avec les dérivés de l'origine de réplication conditionnelle utilisée ou bien introduit dans le génome de la cellule-hôte par recombinaison, grâce à un transposon, un bactériophage ou tout autre vecteur.Dans le cas particulier où le gène exprimant la protéine est placé sur un réplicon annexe, ce dernier contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celleci est susceptible de fonctionner dans la cellule. n peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de ltexpression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes procaryotes ou bactériophages. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule. A titre de gènes codant pour la protéine initiatrice de la réplication, pourront être utilisés soit les gènes sauvages, soit des allèles mutés permettant d'obtenir un nombre de copies augmenté des plasmides (ou dérivés) spécifiques de la protéine initiatrice conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication mise en oeuvre dans la molécule d'ADN. De tels mutants ont été notamment décrits pour les plasmides R6K (Inuzuka and Wada, 1985; Greener et al., 1990), Rtsl(Terawaki and Itoh, 1985; Terawaki et ai 1990; Zeng et al.. 1990), F (Seelke et al., 1982; Helsberg çoeal, 1985; Kawasaki et ai 1991), RK2 (Durland et aI., 1990; Haugan et al.. 1992, 1995), pSC101 (Xia étal. 1991; Goebel et al.. 1991; Fang et al., 1993). Dans le cas particulier où lamolécule d'ADN mise en oeuvre possède une origine de réplication dérivant du plasmide R6k, la protéine initiatrice est ou dérive de la protéine x de ce même plasmide. Il est particulièrement avantageux d'exprimer une forme mutée de cette protéine capable d'augmenter notablement le nombre de copies initiales. Pour ce faire, le gène intégré au niveau de la cellule hôte est de préference représenté par tout ou partie de la séquence représentée en SEQ ID N 2 ou l'un de ses dérivés et plus préférentiellement par le gène pir 16. La mutation associée, correspond à la substitution d'une proline par une leucine.Selon un mode de réalisation particulier de 'invention, ce gène piri 16 est directement incorporé dans le génome de la cellule hôte. Avantageusement, un des gènes de l'hôte cellulaire spécifique, indispensable dans les conditions de culture choisies contient un codon spécifique, reconnaissable par I'ARNt suppresseur sélectionné au niveau de la molécule d'ADN. Selon un mode privilégié de l'invention, il s'agit d'un codon ambre TAG. Dans ce cas particulier, la cellule pourra croître, dans les conditions de culture pour lesquelles le produit du gène contenant le codon TAG est essentiel, uniquement si le plasmide permettant l'expression de sup est présent dans la cellule hôte. Les conditions de culture constituent donc la pression de sélection de la molécule d'ADN. De préférence, le gène comportant le codon ambre est un gène intervenant dans la biosynthèse d'un acide aminé, I'arginine. Ce gène, argue code pour une Nacétylornithinase (Meinnel et al., 1992) et comporte dans ce cas un codon TAG correspondant à une mutation ponctuelle Gln-53 (CAG)- > TAG; la pression de sélection du plasmide portant le gène sup est alors assurée par culture en milieu minimum M9 (Maniatis et a1.,1989). Toutefois ce pourrait être aussi par exemple, un gène de biosynthèse d'une vitamine, d'une base nucléique ou bien un gène permettant d'utiliser une source de carbone ou d'azote particulière ou tout autre gène dont la fonctionnalité est indispensable à la viabilité cellulaire dans les conditions de culture choisies. La cellule hôte est de préférence choisie parmi les souches E.coli et représentée plus préférentiellement par la souche E. coli XAC-1. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la cellule hôte mise en oeuvre dans le procédé revendiqué est une cellule de la souche E. coli XAC-I, comprenant dans son génome le gène pir 116 et transformée par le plasmide pXL2774 ou l'un de ses dérivés. L'invention concerne également toute cellule recombinante contenant une molécule d'ADN telle que définie ci-avant. Il peut s'agir de cellule d'origines diverses, de type eucaryotique, procaryotique... Ces cellules sont obtenues par toute technique connue de l'homme du métier permettant l'introduction dudit plasmide dans une cellule donnée. Il peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent être utilisées dans toute application de vaccination ou de thérapie génique et cellulaire, pour le transfert d'un gène à un organisme, un tissu ou une cellule donnée. En particulier, elles peuvent être utilisées pour une administration directe in vivo ou pour la modification de cellules in vitro ou ex vivo, en vue de leur implantation à un patient. A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne toute composition pharmaceutique comprenant au moins une molécule d'ADN telle que définie ci-avant. Cette molécule peut y être ou non associée à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. Il peut s'agir notamment de cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,..), de liposomes. Les vecteurs synthétiques associés peuvent être des lipides ou polymères cationiques. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le DOGS (Transfectam TM) ou le DOTMA (lipofectin TM); Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.De préférence, le plasmide revendiqué est utilisé sous une forme injectable ou en application. il peut être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. ll peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. n peut s'agir notamment de tampons Tris ou PBS dilués dans du glucose ou du chlorure de sodium. Une injection directe dans la région atteinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. Les molécules d'ADN de l'invention peuvent comporter un ou plusieurs gènes d'intérêt, c'est-à-dire un ou plusieurs acides nucléiques (ADNc, ADNg, ADN synthétique ou semi-synthétique, etc) dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire. Parmi les gènes d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotémes: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gênes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, Ix, etc, les gènes suicides :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (WO91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le gène d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'ammal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. ll peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, dans les molécules d'ADN de l'invention, le gène d'intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celleci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. ll peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des genes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoique, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majontaire. Par ailleurs, le gène d'intérêt peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Selon le gène d'intérêt, les molécules d'ADN de l'invention peuvent être utilisées pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures: Figure 1: Organisation fonctionnelle de la région de R6K impliquée dans la réplication. Figure 2: Organisation des domaines fonctionnelles de la protéine 7r du plasmide R6k. Figure 3: Représentation du protocole d'introduction du gène pir dans le génome d'E. cotiXACI. Figure 4: Schéma de contruction des vecteurs pXL2666, 2730 et 2754. Figure 5: Construction du pXL2760. Figure 6: Construction du pXL2774. I MATERIELS ET METHODES A) Matériels 1) Milieux de culture Les milieux complets LB, 2XTY et SOC, le milieu minimum M9 (Maniatis et al., 1989) ont été utilisés. Les milieux gélosés ont été obtenus par addition de 15 g d'agar Difco. De plus, si nécessaire, ces milieux ont été supplémentés avec des antibiotiques, ampicilline ou kanamycine, aux concentrations respectives de 100 mg/l et de 50 mg/l. Les substrats chromogènes X-Gal et X-Gluc ont été utilisés à la concentration de 40 mg/l. 2) Souches d' E coli, plasmides et bactériophages Les souches d'E. coli, les plasmides et les bactériophages utilisés sont identifiés respectivement dans les exemples ci-après. B) Méthodes 1) Manipulation de PADN L'isolement d'ADN bactérien (plasmidique, génomique) et phagique (forme réplicative de M13), les digestions par les endonucléases de restriction, les ligatures de fragments d'ADN, l'électrophorèse en gel d'agarose (en tampon TBE) et autres techniques standard ont été réalisées suivant les recommandations des fournisseurs, pour l'utilisation d'enzymes, ou en se conformant aux protocoles décrits dans "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989). Les marqueurs de taille d'ADN utilisés lors des électrophorèses sont les suivants: échelle 1 kpb (BRL) pour les fragments linéaires et le marqueur d'ADN surenroulé (Stratagène) pour les plasmides non digérés. Le séquençage a été réalisé selon la technique de Sanger (Sanger et ai., 1977) adaptée à la méthode automatisée utilisant des didéoxynucléotides fluorescents et la Taq ADN polymérase (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems). Les oligodésoxynucléotides utilisés (désignés par "seq+n ", voir ci-dessous) ont été synthétisés sur le synthétiseur "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" par la méthode des phosphoramidites, utilisant des groupements protecteurs B-cyanoéthyles (Sinha et aL, 1984). Après synthèse, les groupements protecteurs sont éliminés par traitement à l'ammoniaque. Deux précipitations au butanol permettent de purifier et de concentrer l'oligonucléotide (Sawadogo et al, 1991). Sèquenche des oligonucléotides utilisés pour l'amplification par PCR: SEQ ID N03 S'GACCAGTAITATATCTTAATGAG-3' SEQ ID N 4 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3' SEQ ID N 5 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3' SEQ ID N 6 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3' Les réactions de PCR (Saiki et al., 1985) ont été réalisées dans les conditions suivantes, dans un volume total de 100 pl. Le mélange réactionnel comprend 150 ng d'ADN génomique de la souche à étudier, 1 g de chacun des 2 oligonucléotides-amorces (24-mer), 10 1ll de tampon 10XPCR, dont la composition est la suivante "500 mM KCl, 0,1% gélatine, 20 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,5", et 2,5 unités de Taq ADN polymérase (Amplitaq Perkin-Elmer).Les conditions de PCK sur l'appareil Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler, sont les suivantes: 2 min à 91 C, 30 cycles successifs de dénaturation (1 min à 91 C), d'hybridation (2 min à 42 C) et d'élongation (3 min à 72 C), et enfin 5 min à 72 C. Les produits ainsi obtenus, digérés ou non par une enzyme de restriction, sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. L'analyse de différentes espèces plasmidiques par les ADN topo-isomérases a été réalisée selon le protocole suivant: Les enzymes, purifiées dans son laboratoire, sont incubées pendant 1 heure à 37 C. Les mélanges réactionnels (volume total: 40 l) ont la composition suivante: 150 ng de plasmide, 300 ng d' ADN topo- isomérase I, ou 150 ng d'ADN gyrase d' E. coli, ou 160 ng d' ADN topo-isomérase IV de S. aureus et 20 1ll de tampon spécifique de chaque enzyme.La composition de ces tampons est indiquée ci-dessous: pour l'ADN topo-isomérase I: 50 mM Tris-HCI pH 7.7, 40 mM KCI, I mM DTT, 100 g/ml SAB, 3 mM MgCl2, I mM EDTA; pour l'ADN topo-isomérase IV: 60 mM Tris-HCl pH 7.7,6 mM MgCl2, 10 mM DTt, 100 pg/ml SAB, 1.5 mM ATP, 350 mM glutamate de potassium; pour l'ADN gyrase. 50 mM Tris-HCI pH 7.7,5 mM MgCl2, 1.5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 g/ml SAB, 20 mM KCl. 2) Transformation d'E. coli Elle a été réalisée en routine selon la méthode TSB (Transformation and Storage Buffer) décrite par Chung et Miller (1988). Pour une souche comme TG1 (Gibson et al. 1984), I'efficacité de transformation obtenue est de l'ordre de 105-106 transformants par g de pUC4K (Vieira et Messing; 1982). Lorsqu'une efficacité de transformation plus élevée était nécessaire, les bactéries ont été transformées par électroporation selon le protocole préconisé par le fabricant de l'électroporateur (Biorad). Cette méthode permet d'atteindre des efficacités de 1 Os à 1010 transformants par g de pUC4K. 3) Transfection cellulaire médiée par un lipofectant cationique Les cellules utilisées sont des fibroblastes murins NIH 3T3, ensemencées le jour précédent en plaques 24 puits, à une densité de 50 000 cellules par puits. Le milieu de culture utilisé est le milieu DMEM, contenant 4,5 gel de glucose, complété avec 10% de sérum de veau foetal et 1% des solutions de glutamine 200 mM et d'antibiotiques (streptomycine 5.103 u/ml, pénicilline 5.103 g/ml) (Gibco). L'ADN plasmidique (1 pg dans 25R1 de NaCI 9%o) est mélangé, volume à volume, à une suspension de lipofectant. Quatre rapports "charges du lipofectant / charges de l'ADN" sont testés: 0, 3, 6 et 9. Ces rapports sont calculés en considérant que 1 g d'ADN plasmidique porte 3,1 nmoles de charges négatives et que le lipofectant comporte 3 charges positives par molécule. Après un contact de 10 minutes permettant la formation du complexe ADN/lipide, 50 > 1 de mélange ADN-lipofectant est introduit sur les cellules en milieu de culture sans sérum (500 Ill). Les cellules ont été préalablement rincées 2 fois avec ce même milieu. L'inhibition de la transfection par le sérum est ainsi évitée. Après incubation (2 heures à 37 C dans l'incubateur à CO2), le milieu est additionné de 1ouzo de sérum de veau foetal. Les cellules sont ensuite remises à incuber pendant 24 heures. 4) Mesure de l'activité luciférase de cellules eucaryotes Elle est effectuée 24 heures après la transfection. La luciférase catalyse l'oxydation de la luciférine, en présence d'ATP, de Mg2+ et d'O2, avec production concomitante d'un photon. L'émission totale de lumière, mesurée par un luminomètre, est proportionnelle à l'activité luciférase de l'échantillon. Les réactifs utilisés sont fournis par Promega (Luciferase assay system) et utilisés selon le protocole conseillé. Après lyse des cellules, la fraction insoluble de chaque extrait est éliminée par centrifugation. Le dosage est effectué sur 5 'LI de surnageant, dilué ou non dans le tampon de lyse des cellules. 3) Mesure de la concentration protéique des extraits cellulaires Elle est effectuée selon la méthode BCA (Pierce) utilisant l'acide bicinchoninique (Wiechelman et al., 1988). La gamme- étalon de SAB est réalisée dans le tampon de lyse (cfm-B4). Les échantillons à doser et ceux de la gamme sont pré-traités, volume à volume, avec de l'iodoacétamide 0,1 M/tampon Tris 0,1 M pH 8,2, pendant 1 heure à 37"C. Ce traitement permet d'éviter l'interférence, lors du dosage, de l'agent réducteur (DTT) présent dans le tampon de lyse. La lecture du dosage s'effectue à 562 nm. EXEMPLE I: Construction des souches-hôtes XAC-lpir et pir-116 par recombinaison homologue. La souche mise en oeuvre est la souche E. coli XAC-1(Normanly et al; 1980. Avantageusement, le gène argE de cette souche comporte une mutation Glutamine-53 (CAG) en codon ambre (TAG) (Meinnel et al., 1992). Le gène argE appartient à l'opéron divergent argECBH et code pour une enzyme de biosynthèse de l'arginme, la N-acétylornithinase. XAC-I ne peut donc synthétiser l'arginine et, en conséquence, croître en milieu minimum. Cette auxotrophie sera levée si la souche abrite un plasmide permettant l'expression d'un ARNt suppresseur. fl sera donc possible, par culture en milieu minimum, de sélectionner les bactéries qui portent un tel plasmide. Pour y permettre la réplication des plasmides dérivés de R6K, il a été nécessaire d'introduire, par recombinaison homologue, le gène pir dans le génome de XAC- 1. Le gènepir (sauvage ou muté) est introduit au locus uid4 par échange entre le gène uidA sauvage et une copie interrompue par le gène pir (ou pir-116). Le gène muid4 code pour une aglucuronidase, enzyme d'hydrolyse des eglucuronides. Ce gène peut être inactivé sans problème puisqu'il n'est pas essentiel à la croissance dans les milieux synthétiques classiques, dans lesquels les ss-glucuronides ne sont pas utilisés.De plus, I'activité B-glucuronidase peut être suivie grâce à un substrat chromogène, le X-Gluc, dont l'hydrolyse libère un pigment bleu. 1) Construction d'un vecteur-suicide portant la cassette "KmR-uid4::pir (ou pir-116) Nous avons utilisé une stratégie impliquant un seul hôte bactérien et minimisant les modifications du génome de la souche d'intérêt. Le phage M13mplO (Messing et vieira; 1982) a été utilisé comme vecteur-suicide (Blum et al., 1989). Une mutation ambre dans le gène II, essentiel pour la réplication, réduit le spectre d'hôte de ce M13 aux souches, telle TGI (supE), qui produisent un ARNt suppresseur d'ambre; il ne pourra donc se répliquer dans les souches d' E. coli sup+, comme XAC- 1. Les cassettes BamHI de 3,8 kpb, contenant le gène de résistance à la kanamycine de Tn5 et uidA::pir oupir-116, ont été purifiées, respectivement, à partir de M13wm34 et 33 (Metcalf et al; 1994). Elles ont été clonées dans M13mplO linéarisé par BamHI. Les clones recombinants ont été sélectionnés par étalement sur milieu gélosé LB + Km, après électroporation dans TG1 des mélanges de ligature. La conformité des clones obtenus a été montrée par analyse du profil de restriction et par séquençage de la région correspondant à la mutationpir-116. 2) Introduction par recombinaison homologue des gènes pir ou pir-116 dans le génome d'E. coli XAC-1 La stratégie adoptée et les différents événements impliqués sont présentés dans la figure 3. a) Premier événement de recombinaison La souche XAC-I a été transformée par électroporation avec 10, 100 ou 2000 ng de chaque RF (mplO-~uid4::pir ou pir-116). Un tiers de chaque mélange d'expression a été étalé sur boites LB contenant de la kanamycine et incubé la nuit à 370C. Les phages mpl O-~uid4:.pir ou pir-116 ne peuvent se répliquer dans la souche XAC-I (sup+). Le marqueur KmR ne peut donc se maintenir que par intégration dans le génome de la bactérie, via une recombinaison homologue avec la copie sauvage du gène uidA. Les résultats des électroporations de XAC-I sont présentés dans le tableau 1. L'efficacité de transformation obtenue était de 4.109 transformants par llg de pUC4K. CONSTRUClION Nombres de colonies obtenues avec les quantité d'ADN transformé 10 ng 100 ng 2000 ng M13mp10- uidA::pir 1 41 146 M13mp10- uidA::pir-116 0 16 124 TABLEAU 1 Dans les conditions testées, le nombre d'intégrants croît de façon non linéaire avec la quantité d'ADN. Connaissant l'efficacité de transformation et la taille des RF (11,7 kpb), on peut avoir une idée approximative du taux de recombinaison. En considérant le point à 100 ng, on obtient une fréquence de recombinaison de l'ordre de 104. b) Deuxième événement de recombinaison Le deuxième événement de recombinaison sera ensuite sélectionné par la résistance des souches au désoxycholate (DocR). Pour ce faire, 5 intégrants de chaque construction ont été mis en culture en milieu 2XTY additionné de 0,2% de désoxycholate de sodium. Deux populations distinctes sont apparues. Certains clones donnent un trouble bien visible après environ 8 heures à 37 C (deux clones pour la constructionpir et trois pour la construction pir-116). Les autres clones ont donné une culture dense seulement après la nuit à 370C. ns étaient quasiment tous KmS, comme attendu. Pour chacun des électroporants étudiés, 50 descendants KmS ont été striés sur LB additionné de X-Gluc.Après 48 heures à 37 C, les clones UidA+ étaient bleu pâle alors que ceux qui avaient subi un remplacement d'allèle (cas n 1, figure 3), sont restés blancs sur ce milieu (UidA-). Le tableau 2 résume 1' analyse des phénotypique des recombinants doubles obtenus. De 18 à 30% des doubles recombinants ont subi un remplacement d'allèle. nombre de KmS noureentaae de UidA souche parmi les DocR parmi les Kias XAC-1 pir-2 50/50 18 XAC-I pir-3 50/50 24 XAC-I pir-4 50/50 34 XAC-1pir-116-1 50/50 32 XAC pir-1164 35/50 30 TABLEAU 2 3) Contrôle du caractère Pir+ des souches obtenues par recombinaison Afin de s'assurer du caractère Pir+ des souches obtenues par double recombinaison, nous avons transformé trois clones de chaque construction par pBW30 (Metcalf et al., 1994). L'obtention de transformants pour toutes les souches testées a permis de montrer la fonctionnalité des gènes pir et pir-116 intégrés dans le génome de XAC-1. Dans les mêmes conditions, aucun transformant n'est obtenu avec la souche parentale XAC-1. Nous avons poursuivi l'étude de 2 clones XAC-lpir (B et C) et 2 clones XAC-lpîr-116 (E et D). 4) Contrôle par amplification par PCR des souches obtenues par recombinaison Pour confirmer le remplacement d'allèle, nous avons contrôlé par amplification par PCR les régions génomiques de part et d'autre du locus uid4. Chaque couple d'oligonucléotides est constitué d'un oligonucléotide correspondant à une région interne de pir et d'un deuxième oligonucléotide correspondant à une région, proche de uidA chromosomique, mais non comprise dans le fragment qui a servi à la recombinaison. La séquence de ce dernier oligonucléotide a été déterminée grâce à la séquence ECOUIDAA de Genbank (numéro d'accès : M14641). Nous avons ainsi pu vérifier le positionnement exact du gène pir dans le génome de la bactérie.La nature des fragments amplifiés, dont la taille est conforme à celle que l'on pouvait prévoir, a été confirmée par digestion par MluI. EXEMPLE 2 Construction de vecteurs plasmidiques dérivés de R6K portant le marqueur de sélection sup Phe Nous avons construit des vecteurs comportant 1' ori y de R6K et le gène de résistance à la kanamycine (pXL2666). L'observation de multimères de pXL2666 dans la souche BW19610 (pîr-J16) 5 (Metcalf et al; 1993 nous a amené à étudier l'effet du fragment cer de ColEl sur ce phénomène. Nous avons ensuite introduit sur le vecteur ori y KmR-cer (pXL2730) la cassette d'expression de l'ARNt suppresseur Phénylalanine (sup Phe). Ce vecteur, pXL2760, sert de base à la construction de vecteurs utilisables en thérapie génique. 1) Construction et analyse des vecteurs comportant 1' ori y de R6K et le gène de résistance à la kanamycine a) Constructions Dans le premier plasmide construit, pXL2666, le gène de résistance à la kanamycine provient de pUC4K (Vieira et messing; 1982) et l' origine de réplication, contenue dans un fragment EcoRI-BamHI de 417 pdb, provient du vecteur-suicide pUT-T7pol (Herrero et al; 1990) (figure 4). Le transfert de pXL2666 dans les souches BW19094 et 19610 (Metcalf et al; 1994) a permis de montrer que la quantité de plasmide est bien augmentée dans une souche pir-116, par rapport au même plasmide dans une souche pir. Toutefois, I'analyse par électrophorèse des plasmides non digérés montre que cette augmentation va de pair avec l'apparition de quelques formes multimériques. Vraismenblablement, ce phénomène est lié à une recombinaison intermoléculaire entre les multiples copies du plasmide. Aussi avons nous construit pXL2730 en clonant sur pXL2666 le fragment cer du plasmide naturel d'E. coli ColEl, dont il avait été montré qu'il permettait, en cis, la résolution des dimères de plasmides (Summers and Sherrat, 1984). Le fragment utilisé correspond à un fragment Hpan de 382 pdb de ColEl (Leung et al., 1985). fi contient un site de recombinaison intermoléculaire spécifique; il implique uniquement, pour être fonctionnel, des protéines de l'hôte dont les recombinases XerC et XerD, et les facteurs accessoires ArgR et PepA (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990).Pour s'assurer que les effets observés sont bien dus au fragment cer, nous avons aussi construit le plasmide contrôle pXL2754 dans lequel le fragment cer est délété de 165 pdb. Cette délétion a été montrée comme abolissant l'action de cer sur la résolution des multimères (Leung et al., 1985). Les différentes étapes de clonage conduisant à la construction de ces plasmides sont présentées sur la figure 4. b) Analyse quantitative et qualitative des espèces plasmidiques analyse par électrophorèse en gel d'agarose L' analyse par électrophorèse des différents plasmides construits a permis la mise en évidence de diverses espèces plasmidiques, variables suivant les souches utilisées. La taille des plasmides non digérés a été évaluée par rapport au marqueur d'ADN surenroulé. Dans la souche pir (BW19094), les plasmides pXL2666, 2754 et 2730 sont pratiquement entièrement sous forme monomérique. Les bandes au dessus de chaque bande principale correspondent à différents topo-isomères, légèrement moins surenroulés, comme le confirme le profil observé après action de l'ADN gyrase avec pXL2730. Dans le cas de la souche pir-116 (BW19610), les profils sont différents : on observe avec les plasmides pXL2666 et 2754 différentes espèces allant du monomère aux multimères (2, 3 ou 4 unités), la forme majoritaire étant le dimère. Après digestion par EcoRl, on ne retrouve que l'ADN plasmidique linéaire; ces espèces plasmidiques correspondent soit à des multimères de plasmides, soit à des topo-isomères divers. Toutefois, la taille des formes déterminée d'après le marqueur d'ADN surenroulé étant un produit entier de celle du plasmide monomère, il est fort probable qu'il s'agisse de multimères. La formation des multimères est très probablement imputable à la mutation pir-116, bien que les deux souches BW19094 et BW19610 ne soient pas strictement isogéniques (BW19610 est recA). Le profil obtenu avec pXL2730 est différent : bien que des formes multimériques soient encore visibles, la forme majoritaire est la forme monomérique. Le fragment cer peut donc faciliter la résolution des multiméres de plasmide que nous avons construit et ceci de façon indépendante de recA, dansBW19610. analyse après traitement par les ADN topo-isomérases Afin d'écarter l'hypothèse selon laquelle les formes observées dans les souches portant l'allèlepir-116 seraient des topo-isomères particuliers, chaque préparation de plasmide a été soumise à l'action d'ADN topo-isomérases. Les activités des différentes enzymes, dans les conditions expérimentales sont les suivantes : relâchement de RADON pour l'ADN topo-isomérase I d'E. coli, surenroulement négatif de l'ADN relâché pour l'ADN gyrase d'E. coli, et désenchevêtrement des ADN entrelacés et relâchement de l'ADN surenroulé par l'ADN topo-isomérase IV de S. aureus.L' action de l'ADN topo-isomérase IV a permis de montrer que les formes plasmidiques de haut poids moléculaire ne résultaient pas de l'enchevêtrement de plusieurs molécules de plasmides; dans ce cas, elles auraient alors été converties en l'espèce monomérique. La fonctionnalité de l'enzyme a bien sûr été contrôlée sur une préparation d'ADN de kinétoplastes, composée de molécules d'ADN enchevêtrées (non montré). L'activité de relâchement est aussi visible puisqu' on obtient des espèces migrant moins que dans les témoins non traités. L'action de l'ADN gyrase a permis de convertir les topo-isomères légèrement relâchés en l'espèce la plus surenroulée extraite de la bactérie (monomère ou dimère principalement). De plus, elle a permis de vérifié que les ADN préparés sont majoritairement sous forme surenroulée.Les échantillons ainsi traités permettent de confirmer les résultats précédents quant aux espèces majoritaires pour chaque construction. L'ADN topo-isomérase I a bien relâché l'ADN mais de façon partielle. Ceci pourrait être dû au fait que les plasmides étudiés ne comportent que peu de zones simples brins, sur lesquelles cette enzyme se lie préférentiellement (Roca, 1995). 2) Introduction du marqueur de sélection sup Phe sur pXL2730 Nous avons utilisés la cassette d'expression du gène d'ARNt suppresseur synthétiques (Phe) (Kleina et al., 1990). Celui-ci introduit dans la chaîne polypeptidique en formation une Phénylalanine en réponse à un codon TAG. De plus, il permet la production dans XAC-1 d'une protéine ArgE suffisamment active pour permettre une bonne croissance en milieu carencé en arginine. Sur le plasmide pCT-2-F (Normanly et al; 1986), sup Phe est exprimé de manière constitutive à partir d'un promoteur synthétique dérivé de la séquence du promoteur du gène Ipp d' E. coli, Plpp. En aval de ce gène, l'arrêt de transcription est assuré par le terminateur synthétique de l'opéron rrnC d' E. coli, Tm,C (Normanly et al., 1986). Les différentes étapes de clonage sont indiquées sur la figure 5. Les différents sous-clonages ont été réalisés dans XAC-1. La fonctionnalité de la cassette d'expression de l'ARNt suppresseur est ainsi contrôlée grâce à l'activité egalactosidase de cette souche qui n'existe que s'il y a suppression du codon ambre du gène lacZullgam. La dernière étape consiste en l'introduction de la cassette d'expression de sup Phe sur pXL2730. Les résultats obtenus avec le fragment cer (B-l-b) nous ont fait choisir ce plasmide plutôt que pXL2666. Nous avons conservé le gène de résistance à la kanamycine pour des facilités de clonage ultérieur, notamment pour disposer d' un criblage supplémentaire lors du clonage final (perte de KmR). EXEMPLE 3: Validation du vecteur plasmidique pour des applications en thérapie génique par transfection de fibroblastes murins 1) Construction du vecteur rapporteur pXL2774 Afin de tester la validité en thérapie génique du système de production d'ADN plasmidique, nous avons introduit sur pXL2760 un gène rapporteur, utilisable dans les cellules eucaryotes. Nous avons utilisé le gène luc codant pour la luciférase de Photinuspyralis car le test de mesure de bioluminescence est très sensible, linéaire sur une large gamme et le bruit de fond dû à l'activité endogène des cellules eucaryotes est très faible. Le gène luc est sous contrôle des séquences promotrices-amplificatrioes d'un gène précoce du cytomégalovirus humain (promoteur CMV) qui permet une expression à taux élevé.En 3' de luc se trouve une région non traduite, provenant du virus SV40, qui contient le signal de polyadénylation (poly(A)+). Après un clonage intermédiaire permettant d'augmenter le nombre de sites de restriction disponibles, la cassette "promoteur CMV-luc-poly(A)+" est introduite sur le vecteur minimal ori y cer-sup Phe (pXL2760) à la place du marqueur KmR. Le plasmide résultant a été appelé pXL2774. La figure 6 rassemble les diverses étapes de clonage. Les mélanges de ligature ont été transformés par électroporation dans XAC-îpir-1J6. L'incubation permettant aux bactéries l'expression des marqueurs de sélection s'effectue en milieu riche (milieu SOC); il a donc été nécessaire de laver les cellules deux fois avec du milieu M9 avant l'étalement.Ceci a permis d'éliminer le milieu résiduel qui aurait entraidé un bruit de fond de culture sur milieu minimum. Le milieu choisi pour étaler les cellules électroporées est le milieu minimum M9, qui permet de sélectionner les bactéries exprimant un ARNt suppresseur et donc la présence de nos plasmides. L'addition de X-Gal permet, par la coloration bleue, de visualiser l'expression de l'ARNt suppresseur. Les boites sont analysées après environ 20 heures à 37"C. L'absence de colonies sur le témoin sans ADN nous assure que la sélection est correcte, même avec des ensemencements denses. Tous les clones examinés par restriction (8) portent bien un plasmide, correspondant au profil attendu. Le plasmide ainsi construit, pXL2774, a été préparé à partir d'un clone cultivé dans un litre de milieu liquide M9 (environ 18 heures à 37"C), par une technique faisant appel entre autre à un échange d'ions (kit Promega, MegaPreps). La quantité d'ADN recueillie est de 2 mg. 2)Analyse du vecteur rapporteur pXL2774 transfecté dans les cellules de mammiSeres La capacité de pXL2774 à transfecter les cellules eucaryotes et à permettre Pexpression de la luciférase est évaluée par transfection dans les fibroblastes murins NIH 3T3. Le vecteur choisi comme référence est le plasmide pXL2622 (il s'agit du plasmide pGL2 de Promega dont le promoteur SV40 a été remplacé par le promoteur CMV) qui porte la même cassette d'expression de la luciférase que pXL2774, mais sur un réplicon différent. C'est un dérivé de CoEl, de 6,2 kpb, qui porte le gène de résistance à l'ampicilline. Ce plasmide nous sert de témoin. Les activités luciférase (exprimée en RLU, ou unités relatives de luminescence) sont indiquées dans le tableau 3. Les résultats les meilleurs ont été obtenus avec un rapport " charges lipofectant/charges ADN" de 6; dans ces conditions, pXL2622 et 2774 semblent équivalents. pXL2622 pXL2774 RLU/ g de Coefficient RLU/ g de Coefficient rapports de de protéines de Moyenne protéines et Moyenne de variation variation charges par puits (%) par puits (%) 0,0 0,0 0 0,0 non 0,0 non détectable détectable 0,0 0,0 9,9 106 3,3 106 3 6,2 106 7,6 106 22 2,9 106 2,9 106 13 6,6 106 2,4 106 1,2 107 9,4 106 6 1,5 107 1,5 107 19 9,9 106 1,0 107 7 1,9 107 1,1 107 9,5 106 1,1 107 9 7,5 106 1,0 107 26 8,3 106 6,4 106 13 1,4 107 8,5 106 TABLEAU 3 BIBLIOGRAPHIE Alting-Mees, M. A., J. A. Sorge, and J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216:483 495. Blum, P., D. Holzschu, H. S. Kwan, D. Riggs, and S. Artz. 1989. J. Bacteriol. 171:538 546. Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216:469483. Chambers, S. P., S. E. Prior, D. A Barstow, and N. P. Minton. 1988. Gene 68:139 149. Chung, C. T., and R. H. Millier. 1988. Nucleic Acids Res. 16:3580. Colloms, S. D., P. Sykora, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1990 J. Bacteriol. 172:6973 6980. Datta, N., and P. Kontomichalou. 1965. Nature 208:239-241. Dickely, F., D. Nilsson, E. B. Hansen, and E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15:839 847. Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu, and D. York. 1994. Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48:239-273. Gibson, T. J. 1984. Ph.D Thesis. University of Carnbridge. Greener, A., M. Filutowicz, M. McEachern, and D. Helinski. 1990. Mol. Gen. Genet. 224:24-32. Herrero, M., V. de Lorenzo, and K. N. Timmis. 1990. J. Bacteriol. 172: 6557-6567. Hodgson, C. P. 1995. Bio/Technology 13:222-225. Inuzuka, M., and Y. Wada. 1985. EMBO J. 4:2301-2307. Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, and and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213:705-717. Kowalczykowski, S. C., and A. K. Eggleston. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63:9991 10043. Leung, D. W., E. Chen, G. Cachianes, and D. V. Goeddel. 1985. DNA 4:351-355. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, and S. Blanquet. 1992. J. Bacteriol. 174:2323 2331. Messing, J., and J. Vieira. 1982. Gene 19: 269-276. Metcalf, W. W., W. Jiang, and B. L. Wanner. 1994. Gene 138:1-7. Miller, V. L., and J. J. Mekalanos. 1988. J. Bacteriol. 170:2575-2583. Normanly, J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, and J. H. Millier. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6548-6552. Normanly, J., L. G. Kleina, J. M. Masson, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213: 719-726. Roca, J. 1995. TIBS 20:156-160. Saïki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Amheim. 1985. Science 230:1350-1354. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 5467. Sawadogo, M., and M. W. Van Dyke. 1991. Nucleic Acids Res. 19: 674. Scott, J. R. 1984. Microbiol. Rev. 48:1-23. Simoes, D. A., M. Dal Jensen, E. Dreveton, M. O. Loret, S. Blanchin-Roland, J. L. Uribelarrea, and J. M. Masson. 1991. Ann. N. Y. Acad. Sci. 646:254-258. Simon, R., U. Priefer, and A. Pühler. 1983. Bio/Technology 1:784-791. Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus, and H. Poster. 1984. Nucleic Acids Res. 12:4539-4557. Stirling, C. J., G. Stewart, and D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. Genet. 214:80-84. Stirling, C. J., S. D. Colloms, J. F. Collins, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8:1623-1627. Summers, D. K., and D. J. Sherrat. 1984. Cell 36: 1097-1103. Vieira, J., and J. Messing. 1982. Gene 19:259-268. Wiechelman, K., R. Braun, and J. Fitzpatrick. 1988. Anal. Biochem. 175:231-237. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Molécule d'ADN circulaire à origine de réplication conditionnelle, leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapie génique (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 358 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: 1 TGTCAGCCGT TAAGTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGAGGCTC TAAGGGCTTC 61 TCAGTGCGTT ACATCCCTGG CTTGTTGTCC ACAACCGTTA AACCTTAXAA GCTTTAAAAG 121 CCTTATATAT TCTTTTTTTT CTTATAAAAC TTAAAACCTT AGAGGCTATT TAAGTTGCTG 181 ATTTATATTA ATTTTATTGT TCAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG 241 TACGTTAGCC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGGGT TTAGTTCGTT AAACATGAGA 301 GCTTAGTACG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG TACGTACTAT 329 CAACAGGTTG AACTGCTGAT CTTCAGATC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1659 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: 541 TATACAGAAT GATGAGGTTT TTTTATGAGA CTCAAGGTCA TGATGGACGT GAACAAAAAA 601 ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGAGCTAAAT CACACCCTGG CTCAACTTCC TTTGCCCGCA 661 AAGCGAGTGA TGTATATGGC GCTTGCTCCC ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG 721 CGAGTTTTCA AAATTAGGGC TGAAGACCTT GCAGCGCTCG CCAAAATCAC CCCATCGCTT 781 GCTTATCGAC AATTAAAAGA GGGTGGTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAT TTCGCTAAGA 841 GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCTAAAGAG CTTAACCTGC CCTTTACTGC TAAAAACTCC 901 CCTGAAGAGT TAGATCTTAA CATTATTGAG TGGATAGCTT ATTCAAATGA TGAAGGATAC 961 TTGTCTTTAA AATTCACCAG ID=31.8>AACCATAGAA CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAÇUÇAA 1021 AATAAATTCA CAACGCAATT GTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA GTATTCATCT 1081 TCTCTTTATC AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA AGAAGAAAAA TTAT m ATT 1141 ATTTCCGTTG ATGAGTTAAA GGAAGAGTTA ACAGCTTATA CTTTTGATAA AGATGGAAAT 1201 ATTGAGTACA AATACCCTGA CTTTCCTATT TTTAAAAGGG ATGTGTTAAA TAAAGCCATT 1261 GCTGAAATTA AAAAGAAAAC AGAAATATCG TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA 1321 GGAAGAAAAA TTAGTAAGCT GAAGTTCGAA TTTGTCGTTG ATGAAGATGA ATTTTCTGGC 1381 GATAAAGATG ATGAAGCTTT TTTTATGAAT TTATCTGAAG CTGATGCAGC TTTTCTCAAG 1441 GTATTTAATG AAACCGTACC TCCCAAAAAA GCTAAGGGGT GATATATGGC TAAAATTTAC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GTATTTAATG AAACCGTACC TCCC 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GCGACGTCAC CGAGGCTGTA GCCG 24 REVENDICATIONS 1. Molécule d'ADN de forme circulaire, utile en thérapie génique, comprenant au moins une séquence nucléique d'intérêt, caractérisée en ce que la région permettant sa réplication comprend une origine de réplication dont la fonctionnalité dans une cellule hôte requiert la présence d'au moins une protéine spécifique et étrangère à ladite cellule hôte. 2. Molécule d'ADN selon la revendication I caractérisée en ce que l'origine de réplication conditionnelle est issue d'un plasmide ou bactériophage qui possède une origine de réplication, représentée par plusieurs itérons, et qui code pour au moins une protéine spécifique, conditionnant la fonctionnalité de son origine de réplication 3. Molécule d'ADN selon la revendication I ou 2 caractérisée en ce que l'origine de réplication conditionnelle peut être issue des plasmides ou bactériophages suivants RK2, R6iC, R1, pSC101, Rtsl, F, RSF1010, P1, P4, lambda, Phi82 et Philo. 4. Molécule d'ADN selon l'une des revendications I à 3 caractérisée en ce que ladite origine de réplication est issue du plasmide bactérien R6K. 5. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite origine de réplication est constituée en tout ou partie par l'origine de réplication y du plasmide R6K. 6. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite origine de réplication est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID N"1 ou l'un de ses dérivés. 7. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la région permettant la sélection des cellules hôtes incorporant ladite molécule d'ADN est différente d'un gêne de résistance à un antibiotique. 8. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la région permettant la sélection des cellules hôtes incorporant ladite molécule d'ADN est représentée en tout ou partie par une cassette d'expression d'un ARN de transfert suppresseur de codons spécifiques. 9. Molécule d'ADN selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cassette d'expression d'un ARNt suppresseur de codons ambre (TAG). 10. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une région cible de recombinase site-spécifique. 11. Molécule d'ADN selon la revendication 10 caractérisée en ce que cette région cible de recombinase site-spécifique peut être choisie parmi les résolvases des transposons T-, Tn21 ou Tn522; invertase du bactériophage mu, les resolvases de plasmides, comme celle codée par le fragment par de RP4, les recombinases de la famille de l'intégrase du bactériophage lambda, comme les intégrase de lambda, phi80, P22, HPl, intégrase Cre de Pi, intégrase du plasmide pSAM2, FLP recombinase du plasmide 2p, et les recombinases XerC et XerD dE. coli. 12. Molécule d'ADN selon la revendication 10 ou 11 caractérisée en ce que cette région cible de recombinase site-spécifique comprend tout ou partie du fragment cer de ColEI ou d'un de ses dérivés. 13. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il s'agit du plasmide pXL2774 ou l'un de ses dérivés. 14. Molécule d'ADN selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique, agroalimentaire ou utilisable en biocatalyse. 15. Molécule d'ADN selon la revendication 14 caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique d'intérêt code pour une protéine choisie parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques comme BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, les apolipoprotéines comme ApoAl, ApoAIV, ApoE, la dystrophine ou une minidystrophine, les gènes suppresseurs de tumeurs comme p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation comme Facteurs VII, VIII, IX, les gènes suicides comme Thymidine kinase, cytosine désaminase, tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle commeFab, ScFv, un ARN ligand, une séquence anti-sens ou des peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B, du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs. 16. Procédé de production de molécule d'ADN de forme circulaire caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte contenant au moins: - une molécule d'ADN selon l'une des revendications 1 à 15, et, -une protéine, exprimée in situ ou non, conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication présente dans ladite molécule d'ADN, spécifique et étrangére à ladite cellule hôte, dans des conditions permettant la sélection des cellules hôtes transformées par lesdites molécules d'ADN. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le gène codant pour la protéine initiatrice de la réplication est présent sur un réplicon annexe ou incorporé dans le génome de ladite cellule. 18. Procédé selon la revendication 16 ou 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ADN incorporant une origine de réplication telle que définie en revendications 4 à 6 et en ce que ladite protéine est ou dérive de la protéine it du plasmide R6K. 19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que la protéine x ou l'un de ses dérivés est exprimée in situ à partir du gène pir représenté en SEQ ID N"2 ou l'un de ses dérivés présent dans la cellule hôte. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que la protéine est exprimée à partir du gène pirl 16 incorporé dans le génome de ladite cellule. 21. Procédé selon l'une des revendications 16 à 20 caractérisé en ce que l'un des gènes indispensables dans les conditions de culture choisies, de la cellule hôte, contient un codon spécifique, reconnaissable par l'ARNt suppresseur sélectionné au niveau de la molécule d'ADN. 22. Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que ce gène contient un codon ambre TAG. 23. Procédé selon l'une des revendications 16 à 22 caractérisé que la cellule est choisie parmi les souches d'E. coli. 24 . Procédé selon l'une des revendications 16 à 23 caractérisé en ce caractérisé en ce que la cellule est issue de la souche E. coli XAC-I. 25. Procédé selon l'une des revendications 16 à 24 caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la souche E. coli XAC-I, intégrant dans son génome le gène pir 116 et transformée par le plasmide pXL2774 ou l'un de ses dérivés. 26. Cellule recombinante transformée par au moins une molécule d'ADN selon l'une des revendications 1 à 15 ou telle que définie selon l'une des revendications 16 à 25. 27. Composition pharmaceutique comprenant une ou plusieurs molécule(s) d'ADN selon l'une des revendications 1 à 15. 28. Utilisation d'une molécule d'ADN selon l'une des revendications 1 à 15 pour la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo d'un gène d'intérêt, dans une cellule hôte.