Brevet FR2736927A1 — publié le 19970124

De manière générale, la présente invention concerne l'hydrolyse enzymatique, d'amides notamment d'amides secondaires. Plus précisément, I'invention est relative à des enzymes et/ou à des micro-organismes susceptibles d'être mis en oeuvre dans l'hydrolyse enzymatique de fonctions amides, de préférence sur des substrats en contenant au moins une, comme par exemple les polyamides (PA). L'invention vise également le matériel génétique dans leur production, ainsi que les microorganismes contenant ce matériel génétique et présentant cette activité amidase. Dans ce domaine, SMITH R. et al. sont les auteurs d'un article paru dans "Journal of Biomedical Materials Research (1987), vol. 21, p. 991-1003", et divulguent la mise en présence d'échantillons de polyamide 66 marqués au carbone 14, avec des enzymes du genre papaïne, trypsine et a-chymotrypsine. Ces polypeptides connus dégradent légèrement le polyamide 66. Mais l'hydrolyse n'est pas suffisamment significative pour pouvoir être exploitée sur le plan industriel. On connaît, par ailleurs, au travers de l'article de KNOSESITA ET AL. (Eur. J. Biochem, 116, 547-551, 1981) I'aptitude de Flavobacterium sp KI 72 à produire, une première enzyme (El) catalysant l'hydrolyse de dimères cycliques d'acide 6-amino hexanoique, en dimères linéaires de ce même acide, ainsi qu'une deuxième enzyme (E2) apte à permettre la transformation de ce dimère linéaire en deux molécules d'acide 6-amino hexanolque ou acide amino caprolque. Le cheminement enzymatique considéré est résumé ci-après. (dimère cyclique d'acide (dimère linéaire d'acide (acide 6 aminohexanoique) 6-amino hexanoique) 6 amino hexanosque) L'activité de l'amidase linéaire E2 est optimale pour les dimères et décroît au fùr et à mesure que le degré de polymérisation augmente, pour ne plus être significative à partir des oligomères de degré de polymérisation (DP,,) = 7. TSUCHIYA ET AL. enseignent, dans leur article paru dans "Journal of Bacteriology, June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n 6", qu'il existe une grande homologie entre les enzymes EX de Flavobacterium sp Kh 72 et l'une de celles issues de Pseudomonas sp NK 87. Ces enzymes E, et homologues, ainsi que les enzymes E2, et plus particulièrement ces dernières, seraient actives sur des oligomères ou des polyamides (PA 6) de formule: -CO -FNH-(CIF), -C07NH- avec 2 Ces enzymes, issues de Flavobacterium ou de Pseudomonas ont l'inconvénient d'avoir des activités spécifiques vis-à-vis des oligomères relativement faibles, puisque celles-ci ne s'élèvent, au maximum, qu'à 1,05 micromoles d'acide amino-caprolque produit par minute et par milligramme de protéine et à partir d'un substrat constitué par un trimère. De plus, ces enzymes sont spécifiques d'homo-oligomères et s'avèrent peu actives vis-à-vis de cooligomères. La souche Flavobacterium sp KI 72 a, en outre, été le siège de la découverte d'un autre gène, dénommé nyl-c, et codant pour une polyamidase E3 active vis-à-vis de substrats type PA 6. L'une des références bibliographiques faisant état de E3 produite sous l'égide de nyl-c, est la suivante: "NEGORO et ai (1992) - "Journal ofbacteriology, Vol 174 p. 7948 - 7953. n apparaît que E3 est relativement peu spécifique des oligomères du nylon PA 66, relativement aux oligomères du nylon PA 6. Cela se traduit par un ratio Ra = activité enzymatique vis-à-vis de PA66 activité enzymatique vis-à-vis de PA6 de l'ordre de 2, les activités étant exprimées en quantité de substrat hydrolysé par unité de temps et par quantité de matière hydrolysante mise en oeuvre. Les substrats considérés sont par exemple des tetra et des trimères de PA66 et PA6. n apparaît ainsi que l'art antérieur ne comprend pas de moyens d'hydrolyse enzymatique de fonctions amides qui soient performants, rentables et qui puissent s'appliquer à des amides, dont notamment des amides secondaires, de natures variées, en particulier du type co-oligomères. Ainsi, I'un des objectifs essentiels de la présente invention est de proposer de nouvelles enzymes à activité amidase, un matériel génétique permettant leur production et des micro-organismes contenant ce matériel génétique, lesdits enzymes et micro-organismes se caractérisant, à la fois, par des rendements satisfaisants d'hydrolyse d'amides à partir de substrats de type co-oligomères et homo-oligomères et par une spécificité marquée, vis-àvis des co-oligomères (e.g. PA 66). Une telle activité est susceptible de donner accès à une voie de régénération des monomères, notamment du PA 66 (recyclage), industriellement intéressante. Aussi, c'est après de longues et laborieuses recherches que la Demanderesse est parvenue à isoler et à caractériser une nouvelle enzyme du genre amidase et formée par un ou plusieurs polypeptides qui peuvent, notamment, être issus de nouveaux microorganismes isolés du biotope et/ou de nouveaux micro-organismes recombinants obtenus à partir de ces micro-organismes naturels. Cette enzyme est utilisée, soit telle quelle, soit de préférence, sous la forme de microorganismes recombinés les générant. Il s'ensuit que la présente invention concerne une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats du type polyamide et répondant à au moins l'une des formules suivantes: dans laquelle: A, B sont des motifs monomères, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12, e R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones, X représente: * soit X' = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un allyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, * soit avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, Y représente: * soit Y1 = hydrogène, * soit avec R' tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à Ml ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes: -a- si X = Xl, alors Y = -b- si X = X2, alors Y = y2 OU yl et enfin p compris entre 1,5 et 10, de préférence entre 1,5 et 5, dans laquelle:: * R2, R3 sont tels que définis ci-dessus, * U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour Xl et Y1 dans la légende de la formule (I), * etq= 1 à20. L'une des particularités très avantageuse de l'enzyme selon l'invention, est révélée par une activité enzymatique spécifique (Us) beaucoup plus importante vis-à-vis des cooligomères de Formule (I) par rapport aux homo-oligomères de Formule (u). C'est ainsi que l'enzyme selon l'invention - également dénommée PAM I - est Activité Enzymatique vis-à-vis de substrats(poly)amide de formule (I) caractérisée par un ratio Ra = Activité Enzymatique vis-à-vis de substrats (poly)amide de formule (II) # supérieur à 2; # de préférence supérieur ou égal à 10; # et plus préférentiellement encore supérieur ou égal à 50. Dans le ratio Ra, l'activité enzymatique est exprimée en moles de substrat hydrolysé x h-1 x g-1 d'enzyme ou de cellules sèches produisant l'enzyme mis en oeuvre. Les conditions de mesure de ces activités sont données ci-après: - milieu réactionnel = tampon phosphate 100 mM, - volume = 400 'LI, - température = 30 C, -pH=7, - concentration en cellules sèches = 2,5 g/l. L'enzyme selon l'invention se caractérise également par sa structure primaire donnée par la séquence annexée d'acides aminés SEQ ID NO : 2. Cela vise également tout polypeptide ayant au moins 50 % d'homologie avec cette séquence SEQ ID NO : 2. La structure primaire voire même quaternaire de l'enzyme selon l'invention constitue l'une de ses nombreuses caractéristiques originales. Mais outre cette caractérisation structurelle, il est possible d'envisager l'enzyme selon l'invention au travers de son activité vis-à-vis de certains de ses substrats spécifiques. Comme décrit supra, ces derniers sont des polyamides et, plus précisément, des oligomères dont les unités récurrentes répondent aux formules (I) et/ou (II) mentionnées cidessus. Les unités récurrentes (I) sont, avantageusement, formées de deux motifs monomères A et B, respectivement dicarbonyle et diamine et reliés l'un à l'autre par une fonction amine secondaire. Selon une modalité préférée de l'invention: le monomère A est un reste: avec r compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 4, et le monomère B est un reste: -HN4CH2+NH avec s compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 6; Ainsi, pour les substrats (I), un exemple préféré de dimère est celui formé par: Acide Adipique Hexamê-êne diamine Le polyamide correspondant est le PA 6.6. S'agissant des unités récurrentes (II), elles sont préférablement formées par des motifs monomères notés et dans lesquels c est un squelette du genre aminoacide dont les terminaisons sont, respectivement, carboxylique et aminée. Un exemple typique de est un dérivé de l'acide -aminOcaproique, monomère du polyamide 6 (PA 6). Parmi les oligomères de type polyamide, susceptibles de convenir pour l'invention, on peut citer: - les oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides carboxyliques aliphatiques saturés ayant de 6 à 12 atomes de carbone avec des diamines primaires aliphatiques saturées ayant de 6 à 12 atomes de carbone, - les oligomères de polyaminoacides obtenus, soit par homopolycondensation directe d'acide #-aminoalcanoïque comportant une chaine hydrocarbonée ayant de 4 à 12 atomes de carbone, soit par ouverture hydrolytique et polymérisation des lactames dérivés de ces acides, - les oligomères de copolyamides obtenus à partir des monomères de départ des polyamides précités, le composant acide de ces copolyamides pouvant consister, en outre, en partie en acide aromatique, tel que l'acide téréphtalique et/ou l'acide isophtalique, - et les mélanges de ces oligomères de polyamides. A titre d'illustration des polyamides obtenus par polycondensation de diacides et de diamines, on citera, par exemple: - le polyamide 4,6 (polymère de tétraméthylène diamine et d'acide adipique), - le polyamide 6,6 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide adipique) (PA 6.6), - le polyamide 6,9 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide azélaique), - le polyamide 6,10 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide sébacique), - le polyamide 6,12 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide dodécanediolque). A titre d'illustration des polyaminoacides qui peuvent convenir, on citera: - le polyamide 4 (polymère d'acide amino-4 butanoique ou de y-butyrolactame), - le polyamide 5 (polymère d'acide amino-5 pentanoique ou de o-amylolactame), - le polyamide 6 (polymère d'e-caprolactame), - le polyamide 7 (polymère d'acide amino-7 heptanoique), - le polyamide 8 (polymère de capryllactame), - le polyamide 9 (polymère d'acide amino-9 nonanoique), - le polyamide 10 (polymère d'acide amino-l0 décanoique), - le polyamide 11 (polymère d'acide amino-1 1 undécanoique), - le polyamide 12 (polymère d'acide amino-12 dodécanoique ou de laurolactame). A titre d'illustration des copolyamides, on citera, par exemple: - le polyamide 6,6/6,10 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et d'acide sébacique), - le polyamide 6,6/6 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et de caprolactame). Sans que cela ne soit limitatif, les substrats préférés conformément à l'invention sont des oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides A et de diamines B et, en particulier, de PA 6.6. Le nombre des monomères A et B, d'une part, ou d'autre part, des substrats (1) et (11) selon l'invention est, avantageusement, compris entre 3 et 8, de préférence entre 2 et 6. Il est à noter que ce nombre de restes de monomères dans les molécules d'oligomères ou de polymères, sera également dénommé Dpn dans la suite du présent exposé. Des substrats (I) caractéristiques sont, e. g., des oligomères avantageusement hydrosolubles tels que : BAB et ABAB, à l'exclusion des trimères ABA. Ces substrats particuliers font partie de ceux (I) et (II) que l'enzyme de l'invention et/ou ses précurseurs biologiques sont aptes à hydrolyser, de manière tout à fait performante. Lorsque les substrats enzymatiques sont des oligomères contenant des monomères A et B, les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des dimères AB et des monomères B. Quand les substrats sont des oligomères (II) (monomères les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères L'enzyme conforme à l'invention peut également être caractérisée au travers de son activité et/ou son affinité vis-à-vis de certains des susdits substrats (I) et (II)@ Ainsi, selon une première caractéristique avantageuse, l'amidase considérée est:: en en premier lieu, active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de type ABAB, et, en second lieu, apte à transformer ce substrat en deux dimères AB avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en umoles de AB produit h-l. mg-1 de protéine et mesurée dans des conditions données - supérieure à 60, de préférence supérieure ou égale à 100, et plus préférentiellement encore à 1000. Une deuxième caractéristique avantageuse de cette amidase: est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I), formé par un trimère BAB, et et d'être apte à transformer ce trimère en un dimère AB et en un monomère B, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en ,umoles de AB produit/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données supérieure à 100 et, de préférence, supérieure ou égale à 500. Une troisième caractéristique avantageuse de cette amidase: est d'être active vis-à-vis des substrats (I) formés par des oligomères de DPn compris entre 3 et 20, de préférence entre 3 et 10, et et d'être apte à transformer ces oligomères en monomère B en dimère AB, et en trimère ABA. L'activité enzymatique de l'amidase pure est mesurée dans les conditions suivantes: - tampon phosphate - température = 30 C. - concentration en substrat = 1,4 g" -pH=7,5 Comme déjà indiqué supra, la mise en oeuvre de l'enzyme de l'invention dans l'hydrolyse enzymatique d'amides, peut consister à utiliser soit uniquement l'enzyme per se, soit uniquement des précurseurs biologiques (micro-organismes sauvages ou recombinants) producteurs de celle-ci, soit un mélange des deux. S'agissant de son origine, l'enzyme selon l'invention a, notamment, été isolée à partir d'un microorganisme naturel du genre Corynebacterîum. Partant de là, il a également été du mérite de la demanderesse, d'identifier le gène, sous l'égide duquel se produit la synthèse de l'amidase conforme à l'invention, ce gain technique permettant, justement, d'accéder aux recombinants. Il s'ensuit qu'un autre objet de l'invention est une séquence d'ADN codant pour une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats (I) et (II) tels que définis supra, caractérisé en ce qu'elle est choisie parmi les séquences suivantes: - la séquence d'ADN correspondant à SEQ ID Nu : 1 ci-annexée et codant pour une enzyme ayant une activité amidase, - un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, - une séquence d'ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci, possédant plus de 50 % d'identité avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci, et codant pour une enzyme ayant une activité amidase. Les enzymes résultant de la (sur)expression d'une séquence d'ADN du type de celle définie ci-dessus, sont naturellement comprises dans le champ de l'invention. La (sur)expression peut être obtenue au sein de recombinants (e.g. ceux incluant un ou plusieurs plasmides) en sélectionnant une cassette d'expression appropriée, comprenant un ou plusieurs promoteurs et un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes induisant une (sur)expression. A propos de recombinaison, l'un des microorganismes recombinés préférés, conformément à l'invention, est celui constitué par la souche E. Coli contenant le plasmide pXL 2564, dérivé de la souche référencée et déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, sous le n" 11495, le 29 Novembre 1994. Cette souche E. Coli contient le plasmide p XL 2564 porteur de SEQ ID NO : 1 et d'une cassette d'expression qui peut être, par exemple, celle représentée sur la Ft 2 annexée: Ptrp - RBSCII. De façon plus générale, la présente invention concerne tous les nouveaux microorganismes, recombinés ou non, aptes à produire l'amidase selon l'invention et, avantageusement dotés de l'information génétique contenues dans la ou les séquences, objets de l'invention et définies supra. n va de soi que les amidases produites par ces microorganismes sont contenues, à part entière, dans la présente invention. Ces micro-organismes ont notamment pour caractéristiques, d'une part, une capacité d'hydrolyse des fonctions amides d'un composé polyamide, comprenant au moins une fonction amide et, plus précisément, une sélectivité et une activité d'hydrolyse spécifiques, vis-à-vis des substrats (I) et (11) définis supra et, plus particulièrement encore vis-à-vis des substrats (I) par rapport aux substrats (il). Dans le cas des substrats (I), ces oligomères sont, par exemple, les hydrosolubles cités ci-dessus : ABAB et/ou BAB entre autres. Avantageusement, les micro-organismes selon l'invention sont aptes à permettre l'hydrolyse d'au moins un substrat formé par un oligomère de polyamide et, plus précisément, par un tétramère ABAB et ou un trimère BAB, voués à être transformés en monomères B et en dimères AB, les micro-organismes étant aptes à assurer l'hydrolyse, avec une activité: - exprimée en g de substrat hydrolysé/h.g. de cellules sèches et mesurée dans des conditions données, - supérieure ou égale à 50, de préférence à 80 et plus préférentiellement encore à 100. Cette activité est mesurée à une température de l'ordre de 30"C, à un pH de 7 dans un tampon phosphate (100 mM), sous agitation magnétique d'un volume de milieu réactionnel = 400 Ill et à une concentration en substrat de 2,5 gll. Pour optimiser les performances de ces microorganismes, il est intéressant de les équiper, conformément à l'invention: - d'au moins un agent protéique d'aide au repliement des polypeptides qu'il synthétise et, en particulier des enzymes telles que définies supra, - et/ou de gènes codant pour un tel agent. Cet agent est présent dans une quantité supérieure à celle correspondant au niveau de base du micro-organisme considéré. De préférence, l'agent est la chaperone GroE de E. Coli ou son homologue d'origine eucaryote ou procaryote. La présente invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (in), tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme et/ou au moins l'un des microorganismes tels que présentés supra. n peut être intéressant, conformément à l'invention, de disposer de plusieurs enzymes à spectres complémentaires. Aussi, l'une des variantes du susdit procédé peut être d'avoir recours à au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants et/ou analogues. Dans cette variante, les substrats sont, au moins en partie, constitués par des oligomères dont le DPn est inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et qui dérivent de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B). Le procédé d'hydrolyse selon cette variante est caractérisé: - en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (don) inférieur ou égal à 8 et, de préférence à 4 et, plus préférentiellement encore à des monomères A etB, - et en ce que l'on met en oeuvre: au moins une enzyme et/ou au moins un micro-organisme tels que définis ci dessus, et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant, de préférence, une enzyme E2, produite sous l'égide du gène nyl-B de Flavobacterium sp KI 72. L'enzyme complémentaire E2 produite par nyl-B est décrite dans KINOSHUFA et AL (EuT. J. Biochem, 116, 547-551, 1981) ou dans TSUCHIYA et AL ("Journal of Bacteriology, June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n" 6"). A défaut d'enzyme E2, le procédé conduirait en pratique et de préférence à des oligomères de DPn ' 4 et tout particulièrement à des dimères AB. Pour obtenir des oligomères hydrolysables par les enzymes ci-dessus, il est possible de faire intervenir une lyse thermique et/ou chimique (acide) des fonctions de type amide, notamment par lyse des polymères ou des oligomères de DPn élevé. Selon d'autres modalités avantageuses du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, notamment des précurseurs biologiques de la (ou des) enzyme(s) et un milieu de culture comprenant, par exemple: - une source de carbone comportant, de préférence au moins un composé comprenant au moins une fonction amide, ladite source de carbone comportant éventuellement un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbones, le saccharose étant particulièrement préféré, - et éventuellement un composé apte à induire la production des enzymes, sans être consommé par les precurseurs biologiques, ledit composé étant préférablement choisi parmi les amides. Le procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides selon l'invention peut trouver de nombreuses applications, par exemple en synthèse organique pour la fabrication de composés à partir de composés amides ou pour le traitement des matériaux contenant du polyamide. En particulier, il pourrait être intéressant dans le cadre de la régénération des matières premières des polymères polyamides. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques, les variantes et les avantages de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES ANNEXEES: - La liste de séquences établie selon la norme ST 23 de l'OMPI, comprend les séquences suivantes: + SEQ ID Nu : 1 : ADN codant pour l'amidase selon l'invention; + SEQ ID NO: 2: polypeptide formant l'amidase selon l'invention. - La Fig. 1 représente la carte de restriction du plasmide pXL 2297 contenant le gène codant pour l'amidase selon l'invention et hébergé par la souche déposée sous le n" 11495 à la CNCM le 29 Novembre 1994. - La Fig. 2 représente la carte de restriction du plasmide pXL2564 contenant le gène pam I codant pour l'amidase selon l'invention, un gène conférant de la résistance à l'ampicilline et la cassette d'expression Ptrp-RBScII contrôlant le gène de l'amidase. La signification des abréviations utilisées dans la suite de la description est donnée ciaprès. - SSC: tampon couramment utilisé pour les hybridations, il contient du citrate de sodium et du NaCI (20XSSC = NaCI 3M-citrate de sodium pH 7, 0,3 M), - SDS: dodécylsulfate de sodium, - SDS-PAGE: gel d'électrophorèse à base de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, -IPIG: isopropyl ss-D thio galactopyranoside, - cHL: : chromatographie liquide haute performance, EXEMPLES L'isolement des souches d'origine, la purification et le séquençage peptidique de la polyamide hydrolase selon l'invention (PAM I = SEQ ID NO : 2), de même que le clônage du Gène pam I codant pour PAMI, ont été effectués selon les techniques classiques en cours. EXEMPLE I: RECOMBINAISON: EXPRESSION DE PAM I DANS E. Coli Une construction a été réalisée dans laquelle le gène pam I (codant pour l'enzyme PAM I) précédé du site de fixation des ribosomes du gène Cl du page x est exprimée à partir du promoteur de l'opéron tryptophane dE. Coli. Pour ce faire, un site de restriction Ndel a été créé au codon d'initiation de pam I par la technique de la PCR en utilisant comme matrice le plasmide pXL2297 (figure 1) hébergé par la souche I 1495 déposé à la CNCM le 29 Novembre 1994.Le fragment Ndel-Apal de 208 pb contenant la partie 5' du gène pam I a été amplifié par PCR en prenant soin d'introduire un site Hindlll en amont du site Ndel grâce au couple d'amorces nucléotidiques (5'-AGCAAGCTTGGAGGCCATATGA ATACGAC-3')) et (5'-CACCGGTGGGCCCCTC-3). Le fragment amplifié Hindlll-Apal a été cloné dans pUC29 (Benes et al. (1993), Gene 130 151-152) digéré par Hindili et Apal et le gène pam I a été reconstitué par introduction au site Apal du fragment Apal de 867 pb de pXL2297. Un site Ncol se trouve ainsi placé à une trentaine de nucléotides en aval du codon stop de pam I.Les fragments adjacents Ndel-EcoR1 de 500 pb et EcoRI-Ncol de 600 pb de ce plasmide ont été insérés dans pXL2158 (Brevet FR 9209 882) digéré au site Ndel situé immédiatement en aval du promoteur trytptophane. Ainsi, le plasmide pXL2564 (décrit sur la figure 2), est un dérivé de pBR322 (Sucliffe (1978), Nucleic Acid. Res. 5 2721) contenant un gène conférant la résistance à l'ampicilline et le gène pam I sous contrôle de la cassette d'expression Ptrp-RBScll. Le plasmide pXL2564 a été introduit dans la souche d'E. Coli TG1, la sélection des microorganismes se faisant sur LB ampicilline. Un clone contenant pXL2564 (appelée souche PAMI) a été repiqué deux fois sur boites gélosées et mis en culture à 37 C en milieu M9 glucose contenant 100 ,xg/ml d'ampicilline selon la procédure décrite dans le brevet FR2 694 571. L'efficacité de la coexpression de la chaperone GroE pour l'obtention d'une forme soluble de la polyamidase I a été testée en introduisant le plasmide pXL 2035 (Brevet FR 2 694 571) dans la souche TGl (pXL2564). La souche résultante a été cultivée dans les mêmes conditions en présence de 50 mg/l de kanamycine. Les résultats montrent qu'avec cette nouvelle souche recombinante, la polyamidase I est produite essentiellement sous forme soluble et clivée. EXEMPLE 11: COMPARAISON DES ACTINITES AMIDASIQUES DE LA SOUCHE RECOMBINANTE EXPRIMANT E3 ET DE LA SOUCHE RECOMBINANTE EXPRIMANT PAM I TELLE QU'OBTENUE A L'EXEMPLE I 11.1 CULTURE DES SOUCHES: La souche exprimant PAM I a été cultivée comme indiqué dans exemple I. La souche exprimant E3 est obtenue en introduisant le plasmide pUCL 3, dans la souche E. Coli TGI, décrite dans la référence "NEGORO et al (1992) - "Journal of bacteriology, Vol 174 p.7948-7953. Cette souche a été mise en culture à 37 C dans le milieu M9 additionné d'ampécilline a 100 mg/l et ensemencée à 1% (v/v) avec une préculture. Un inducteur (IPTG 1 mM) a été ajouté après 4 heures 30 d'incubation. La préculture se compose de 10 ml du même milieu M9 additionné d'ampécilline à 100 mg/l et ensemencée avec des colonies provenant d'une boîte gélosée. En fin de culture, la production cellulaire est déterminée par un extrait sec, obtenu par séchage d'une nuit à 1050 C d'un culot cellulaire, obtenu après centrifugation (10 min à 12 000g). Le milieu M9 est composé de: glucose 4 g/l KH2PO4 3 g/l Na2HPO4 7 g/l MgSO4 1 m/M NH4Cl 1 g/l NaCI 0,5 g/I CaCl2 1 mM Casamino acides 4 g/l Thiamine, HCI 10 mg/l II.2 ACTIVITE DES SOUCHES: Les culots cellulaires, obtenus comme indiqués précédemment, sont repris dans un tampon 0,1 M Tris - HCI, 5 mM EDTA pH 8,0 contenant 1 % (v/v) de toluène et incubés 1 heure à 0 C. Après centrifugation, les culots ainsi traités sont resuspendus dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7. L'activité amidasique des suspensions cellulaires des souches exprimant E3 et PAM I a été testée sur les oligomères de DPn 2 à 6 pour le PA 6 et de DPn 2 à 4 pour le PA66. Les oligomères du PA 6 de DPn 2 à 6 sont nommés respectivement CAP 2 à CAP 6. Les résultats sont répertoriés dans le Tableau I ci-après: L'activité est exprimée en mmoles de substrat hydrolysé/heure/g de cellules sèches. TABLEAU I Substrat Réaction Activité dc la souche Activité de ta exprimant PAM I souche exprimant E3 ABAB ABAB# AB +AB 117 O 63 BAB BAB # AB + B 131 0,067 ABA ABA 0 0 AB AB o 0 0 CAP 2 CAP 2 # 0 0 CAP 3 CAP 3 # CAP 2 + CAP 1 0,29 0,040 CAP 4 CAP 4 # CAP 2 + CAP 2 1,79 0,140 CAP 5 CAP 5 # CAP 3 + CAP 2 0,92 0,089 CAP 6 CAP 6 # CAP 3 + CAP 2 0,49 0,024 Conditions opératoires: [Souche exprimant E3] = 2,5 g/l extrait sec ; [souche exprimant PAM I] = 2,5 g/I extrait sec pour les oligomères du nylon 6 et 0,125 g/I extrait sec pour les oligomères du nylon 66 ; [oligomères] &num; 2,5 g/I ; Tampon phosphate 0,1 M, pH = 7; Volume 400 l;T = 30 C ; agitation magnétique. Pour la souche exprimant E3, la cinétique a été effectuée sur 3 heures pour l'hydrolyse des oligomères du nylon 6 et 66. Pour la souche exprimant PAM I, la cinétique a été effectuée sur 1 heure pour l'hydrolyse des oligomères du nylon 6 et sur 15 minutes pour l'hydrolyse des oligomères du nylon 66. Les activités d'hydrolyse de la souche exprimant E3 vis-à-vis des substrats du nylon 6 et 66 sont du même ordre de grandeur: 0,263 mmole de ABAB hydrolysé/h/g cellules sèches et 0,140 mmole de CAP 4 hydrolysé/h/g cellules sèches (un facteur 2 entre ces activités). PAM I est plus spécifique des oligomères du nylon 66 par rapport aux oligomères du nylon 6: 117 n-oie de ABAB hydrolysé/h/g cellules sèches et 1,79 mmole de CAP 4 hydrolyselhlg cellules sèches (un facteur 65 entre ces activités). Cette caractéristique démontre l'originalité de l'enzyme selon l'invention vis-à-vis de celle connue produite sous l'égide de nyl C. EXEMPLE III: HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'OLIGOMERES DE PA 66, A L'AIDE D'UN MELANGE D'ENZYMES PAM I SELON L'INVENTION ET D'AMIDASES E2 EXPRIMEES PAR LE GENE nylon. Dans le présent exemple, ce ne sont pas les enzymes que l'on met en oeuvre, mais leurs précurseurs biologiques, à savoir: * la souche recombinée de l'exemple I exprimant PAM I * et la souche recombinée contenant le gène nyl-B de Flavobacterium Sp KI 72 et exprimant E2. m.l CULTURE DES SOUCHES: La souche exprimant PAM I a été cultivée comme indiqué dans l'Exemple I. La souche exprimant E2 est obtenue selon le mode opératoire décrit pour l'obtention de la souche exprimant E3, mais en introduisant le plasmide pHK4, décrit dans la référence "NEGORO et al - "Journal ofbiol. Chem (1984) 259 13648-13651. Cette souche a été mise en culture à 37 C dans le milieu M9 additionné d'ampécilline à 100 mg/l et ensemencée à 1% (v/v) avec une préculture. La préculture se compose de 10 ml du même milieu M9 additionné d'ampécilline à 100 mg/l et ensemencée avec des colonies provenant d'une boîte gélosée. En fin de culture, la production cellulaire est déterminée par un extrait sec, obtenu par séchage d'une nuit à 1050 C d'un culot cellulaire, obtenu après centrifugation (10 min à 12 000g). III.2 ACTIVITE DES SOUCHES : Les culots cellulaires, obtenus comme indiqués précédemment, sont repris dans un tampon 0,1 M Tris - HCl, 5 mM EDTA pH 8,0 contenant 1 % (v/v) de toluène et incubés 1 heure à 0 C. Après centrifugation, les culots ainsi traités sont resuspendus dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7. L'activité amidasique des suspensions cellulaires des souches exprimant E2 et PAM I a été testée sur les oligomères ABAB, BAB, ABA et AB. Les résultats sont répertoriés dans le Tableau II ci-après: L'activité est exprimée en mmoles de substrat hydrolysé/heure/g de cellules sèches. Conditions opératoires [Souche exprimant PAM I] = 0,125 g/l extrait sec [oligomères] = 2,5 g/l; Tampon phosphate 0,1 M, pH = 7; Volume 400 l; T = 30 C agitation magnétique. TABLEAU II Essais Oligomères de départ Activité et produits d'hydrolyse 1 AB# A + B 0,11 2 ABA # AB + A 0,04 3 BAB # AB + B 131 5 ABAB # 2 AB 117 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC CHIMIE (B) RUE: 25, Quai Paul Doumer (C) VILLE: Courbevoie (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 92400 (G) TELEPHONE: 47 68 12 34 (H) TELECOPIE: 47 68 16 56 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Enzymes ayant une activité amidase, micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procédé d'hydrolyse d'amides en faisant application (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT:'Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 11.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1068 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE:CDS (B) EMPLACEMENT: 1.... 1062 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: ATG AAT ACG ACA CCG GTC CAC GCA CTC ACC 30 Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr 1 5 10 GAC ATC GAC GGC GGG ATC GCC GTC GAT CCC GCA CCC CGG CTG GCC GGC 78 Asp Ile Asp Gly Gly Ile Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly 15 20 25 CCT CCG GTC TTC GGG GGT CCG GGC AAC GAC GCC TTC GAT CTC GCG CCG 126 Pro Pro Val Phe Gly Gly Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro 30 35 40 GTC AGG AGC ACG GGC CGC GAG ATG CTG CGG TTC GAC TTC CCC GGG GTC 174 Val Arg Ser Thr Gly Arg Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val 45 50 55 AGC ATC GGC GCG GCG CAC TAC GAG GAG GGG CCC ACC GGT GCG ACC GTG 222 Ser Ile Gly Ala Ala His Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val 60 65 70 ATC CAC ATC CCC GCC GGC GCC CGC ACC GCG GTG GAC GCG CGG GGC GGG 270 Ile His Ile Pro Ala Oly Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly 75 80 85 90 GCG GTG GGG CTC TCC GGC GGC TAC GAC TTC AAC CAC GCC ATC TGC CTG 318 Ala Val Gly Leu Ser Gly Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu 95 100 105 GCC GGC GGA GCC TGC TAC GGG CTC GAG GCG GGC GCC GGG GTG AGC GAC 366 Ala Gly Gly Ala Cys Tyr Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp 110 115 120 GCG CTC CTG GAA CGC CTC GAG CAT CGC ACC GGC TTC GCC GAG CTC CAG 414 Ala Leu Leu Glu Arg Leu Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln 125 130 135 CTG GTG TCG TCG GCG GTC ATC TAC GAC TTC TCG GCG CGC TCC ACC GCG 462 Leu Val Ser Ser Ala Val Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala 140 145 150 GTC TAC CCC GAC AAG GCG CTC GGC CGC GCG GCG CTC GAA TTC GCC GTT 510 Val Tyr Pro Asp Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val 155 160 165 170 CCC GGT GAG TTC CCG CAG GGG CGG GCG GGC GCG GGC ATG AGC GCG TCC 558 Pro Gly Glu Phe Pro Gln Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser 175 180 185 GCG GGC AAG GTG GAC TGG GAC CGC ACC GAG ATC ACC GGG CAG GGC GCG 606 Ala Oly Lys Val Asp Trp Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala 190 195 200 GCG TTC CGT CGT CTC GGC GAC GTG CGC ATC CTC GCC GTC GTC GTG CCG 654 Ala Phe Arg Arg Leu Gly Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro 205 210 215 AAC CCG GTC GGT GTG ATC GTG GAC CGC GCG GGC ACG GTG GTG CGC GGC 702 Asn Pro Val Gly Val Ile Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly 220 225 230 AAC TAC GAC GCG CAG ACC GGG GTC CGG CGC CAC CCG GTG TTC GAC TAC 750 Asn Tyr Asp Ala Gln Thr Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr 235 240 245 250 CAG GAG GCG TTC GCC GAG CAG GTC CCG CCC GTC ACC GAG GCC GGC AAC 798 Gln Glu Ala Phe Ala Glu Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn 255 260 265 ACC ACG ATC AGC GCG ATC GTC ACG AAC GTG CGG ATG AGC CCC GTC GAG 846 Thr Thr Ile Ser Ala Ile Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu 270 275 280 CTG AAC CAG TTC GCC AAG CAG GTG CAC AGT TCG ATG CAC CGC GGC ATC 894 Leu Asn Gln Phe Ala Lys Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile 285 290 295 942 CAG CCG TTC CAC ACC GAC ATG GAC GGC GAC ACG CTC TTC GCC GTC ACC Gln Pro Phe His Thr Asp Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr 300 305 310 ACC GAC GAG ATC GAT CTG CCG ACG ACC CCG GGG TCG TCG CGC GGG CGG 990 Thr Asp Glu Ile Asp Leu Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg 315 320 325 330 CTG TCG GTG AAC GCG ACC GCG CTC GGC GCG ATC GCC TCC GAG GTG ATG 1038 Leu Ser Val Asn Ala Thr Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met 335 340 345 TGG GAC GCC GTC CTC GAG GCC GGC AAG TAG 1068 Trp Asp Ala Val Leu Glu Ala Gly Lys 350 355 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile 1 5 10 15 Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly 20 25 30 Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg 35 40 45 Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His 50 55 60 Tyr Olu Glu Oly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly 65 70 75 80 Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly 85 90 95 Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr 100 105 110 Gly Leu Olu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Olu Arg Leu 115 120 125 Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser @ Ser Ala Val 130 135 140 Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala 145 150 155 160 Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln 165 170 175 Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp 180 185 190 Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly 195 200 205 Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile 210 215 220 Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr 225 230 235 240 Oly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile 260 265 270 Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys 275 280 285 Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp 290 295 300 Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu 305 310 315 320 Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr 325 330 335 Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu 340 345 350 Ala Gly Lys 355 REVENDICATIONS: 1 - Enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à au moins l'une des formules suivantes: dans laquelle # A, B sont des motifs monomères, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylêne, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12, # R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones, # X représente : * soit X1 = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, * soit avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, # Y représente * soit Y1 = hydrogène, * soit avec Rl tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à M' ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes -a- si X = Xl, alors Y = Yt, -b- si X = X2, alors y = Y2 ou et enfin p compris entre 1,5 et 10, de préférence entre 1,5 et 5, dans laquelle * R2, R3 sont tels que définis ci-dessus, * U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour X1 et Y' dans la légende de la formule (1), * et q = 1 à 8, ladite enzyme étant caractérisée par un ratio activité enzymatique vis-à-vis de substrats (poly)amide de formule (I) A.E.(I) Ra = = , activité enzymatique vis-à-vis de substrats (polu)amide de formule (II) A.E.(II) supérieur à 2, de préférence supérieur ou égal à 10, et plus préférentiellement encore supérieur ou égal à 50. 2 - Enzyme selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence peptidique donnée par SEQ ID NO: 2 annexée, # et/ou par un polypeptide présentant au moins 50 % d'homologie avec cette séquence. 3 - Enzyme selon la revendication 1 ou 2, caractérisée: - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de type ABAB, - et en ce qu'elle est apte à transformer ce substrat en deux dimères AB avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en llmoles de AB produit h-l. mg-l de protéine et mesurée dans des conditions données - supérieure à 60, de préférence supérieure ou égale à 100, et plus préférentiellement encore à 1000. 4 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée: - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un trimère BAB, - et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en un dimère AB et en un monomére B, avec une activité enzymatique spécifique (Us) exprimée en lmoles de AB produit/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données, supérieure à 100 et, de préférence, supérieure ou égale à 500. 5 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée: - en ce qu'elle est active vis-à-vis des substrats (I) formés par des oligomères de DPn compris entre 3 et 20, - et en ce qu'elle est apte à transformer ces oligomères en monomères B, en dimêres AB et en trimères ABA. 6 - Séquence d'ADN codant pour une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats (I) et (II) tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'elle est choisie parmi les séquences suivantes - la séquence d'ADN correspondant à SEQ ID NO: 1 ci-annexée et codant pour une enzyme ayant une activité amide, - un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, - une séquence d'ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci, possédant plus de 50 % d'identité avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci et codant pour une enzyme ayant une activité amidase. 7 - Enzyme résultant de la (sur)expression d'une séquence d'ADN selon la revendication 6 et ayant une activité amidase. 8 - Microorganisme constitué par la souche E. Coli contenant le plasmide PXL 2564, ladite souche étant référencée et déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, sous le n" I 1495, le 29 Novembre 1994. 9 - Microorganisme, apte à produire au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 5 et 7. 10 - Microorganisme selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il contient la séquence d'ADN selon la revendication 6. il - Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 caractérisé - en ce qu'il contient * au moins un agent protéique d'aide au repliement des polypeptides qu'il synthétise et, en particulier des enzymes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 7, * et/ou les gênes codant pour un tel agent. - et en ce que cet agent est présent dans une quantité supérieure à celle correspondant au niveau de base du micro-organisme considéré. 12 - Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'agent est la chaperone GroE de E. Coli ou son homologue d'origine eucaryote ou procaryote. 13 - Enzyme caractérisée en ce qu'elle est produite par les microorganismes selon l'une quelconque des revendications 8 à 11. 14 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (u), tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 7 et 13 et/ou au moins un microorganisme selon l'une quelconque des revendications 8 à 12. 15 - Procédé d'hydrolyse, de substrats, au moins en partie, constitués par des oligomères dont le DPn est inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et dérivant de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B). caractérisé: - en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DPn) inférieur ou égal à 8 et, de préférence à 4 et, plus préférentiellement encore à des monomères A et B, - et en ce que l'on met en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 7 et 12 et/ou au moins un micro-organisme selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, . et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant, de préférence, une enzyme E2, produite sous l'égide du gène nyl-B de Flavobacterium sp KI 72. 16 - Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il comprend une lyse thermique et/ou chimique permettant d'obtenir des substrats de DPn tel qu'ils soient hydrolysables par la voie enzymatique, telle que définie dans les revendications précédentes.