Brevet FR2739623A1 — publié le 19970411

La présente invention a pour objet des protéines d'Hélico17acter pylori nouvellement obtenues sous forme substantiellement purifiées, ainsi que les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. H. pylori est une bactérie à gram négatif retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratére des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori. Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à H. pJ'/Oti. Un tel vaccin serait très probablement de nature sous-unitaire. Différentes protéines d'JI. pylori ont été caractérisées ou isolées à ce jour. Il vagit notamment de l'uréase, composée de deux sous-unités A et B de 30 et 67 kD respectivement , de la cytotoxine vacuolaire de 87 kD (VacA) , d'un antigène immunodominant de 128 kD associé à la cytotoxine , des heat shock protéines HspA et HspB de 13 et 58 kD respectivement . d'une catalase de 54 kD , d'une hémaglutinine fibrillaire (HpaA) de 20kD , d'une protéine de 15 kD riche en histidine (Hpn) ; d'une protéine de la membrane externe de 30 kD , ainsi que d'une famille de porines HopA, HopB, HopC et HopD, de poids moléculaires compris entre 48 et 67 kD. Certaines de ces protéines ont déjà été proposées comme antigènes vaccinaux potentiels. Il reste que la recherche de nouveaux antigènes doit être poursuivie, notamment dans la mesure où l'on prévoit que, pour obtenir un effet vaccinal optimisé, plusieurs antigènes devront être vraisemblablement incorporés dans un vaccin. C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76 kD Par "forme substantiellement purifiée", on entend une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et pèriplasmiques d'H. pylori. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifùgation que l'on resuspend milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0,1 - 0,5 M, avantageusement en tampon carbonate pFl 9.5 à 0,1 0% de zwittergent 3- 14, (v) on récupère la fraction eluée en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCI 0 - 0,5 M, avantageusement en tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 0,25 - 0,35 M est d'abord dialysée contre du tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14); et (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0, 15 - 0,2 M. La protéine membranaire de 76 kD a pour fonction biologique présumée d'être une porine, vraisemblablement située au niveau de la membrane externe. Exner et al, Infect. Immun. (Apr. 1995) 63 1567 caractérise une famille de porines qui chacunes présentent en electrophorèse de SDS-Page, un profil de migration différent selon qu'elles ont été chauffées à 95"C (procédé conventionnel) ou non. Tel n'est pas le cas pour ce qui concerne la protéine de 76 kD selon l'invention, en reflet sa migration sur gel n'est pas modifiée avec un échantillon chauffé à 60"C et non à 98 C La séquence N-terminale de la protéine de 76 kD est comme suit (code un lettre) EDDOFYTSVGYQIGEAAQMV. Selon on mode particulier, une protéine selon l'invention peuvent être notamment obtenue par purification à partir d'H. ÊWflJ ou exprimée par voie recombinante dans un système hétérologue. Dans ce dernier cas, la protéine peut présenter des modifications post traductionnelles qui ne soient pas identiques à celles de la protéine correspondante issue de la souche d'origine. L'invention a aussi pour objet Line protéine t.ci d'H. pylori ou un polypeptide sous forme substantiellement purifiée, q qui est capable d'être reconnu par un antisérum ou d'un anticorps monoclonal établi à l'encontre d'une protéine selon l'inventions. Pour ce qui concerne les polypeptides, il s'agit notamment de polypeptides dérivés d'une protéine selon l'invention par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, e.g. par délétion. Enfin l'invention concerne également une composition pharmaceutique notamment destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'invention, l'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à H. p Joît , ainsi q'une méthode de prévention ou de traitement d'une infection a H. loll, selon laquelle on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiqiement efficace d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle.Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration De manière plus détaillée. on propose a titre d'exemple, d'administrer une protéine ou un polypeptide selon l'invention par voie orale A cet effet, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être encapsulée Seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 53). La protéine peut également être encapsulée dans des mîcrosphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit ailleurs (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immuno. (1989) 146 . 59-66) la protéine peut également être incluse dans des liposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes a practical approach, Ed. RRC New, D. Rickwood & B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1). Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est de l'ordre de I à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines. Alternativement, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être administré par voie parentérale. Pour ce faire, une protéine ou un polypeptide selon l'invention est adsorbée sur gel d'alumine de façon tout à fait conventionnelle. La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,5 est mise en contact pendant 1 heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré à AL La composition finale de la préparation est la suivante protéine à activité catalasique 50 lig/ml, AL"' 250 Fug/ml, merthiolate 1/10 000, le tout en PBS. Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées chacune espacée de 4 semaines de la précédente. L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes La Figure 1, colonne 4 presente l'analyse de la fraction membranaire CS2d par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. Les marqueurs de poids moléculaire apparaissent dans la colonne 1. La Figure 2, colonne 4, présente l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, de la protéines de 76 kD purifiée à partir d'un gel préparatif Les marqueurs de poids moléculaire apparaissent dans les colonnes I et 8. La Figure 3 présente, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, le profil électrophorétique de la fraction D issue de la chromatographie sur colonne de Q-Sépharose de la fraction membranaire Cs2d (colonne 3) et de la fraction D'issue de la chromatographie sur colonne de S-Sépharose de la fraction D (colonne 4). La colonne 1 con-espond aux marqueurs de poids moléculaire et la colonne 2, à la fraction membranaire CS2d EXEMPLE 1: Préparation des fractions membranaires lA - Culture La souche H. pilori ATCC 43579 est cultivée en milieu liquide dans un fermenteur de 101. Un congelat de germes en glycérol est utilisé pour ensemenser un flacon de 75 cm2 contenant du milieu dit "biphasique" (une phase solide en gélose Colombia contenant 6 % de sang de mouton fi-ais et une phase liquide en trypticase de soja contenant 20 % de sénim de veau foetal) Après 24 heures de culture dans des conditions microaérophiles, à 37 C, la phase liquide de cette culture est utilisée pour ensemenser plusieurs flacons de 75 cm2 en milieu biphasique en l'absence de sang de mouton. Après 24 heures de culture, la phase liqude permet d'ensemenser un biofermenteur de 2 1 en milieu liquide trypticase soja contenant de la bêta cyclodextrine à 10 g/l. Cette culture à DO 1,5-1,8 est inoculée dans un fermenteur de 10 1 en milieu liquide.Après 24 heures de culture, les bactéries sont récoltées par centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4"C. Une culture de 10 litres de H. pylori ATCC 43579 en fermenteur sous atmosphère microaérophile permet d'obtenir environ 20 à 30 g (poids humide) de bactéries. 1B - Extraction par le n octyl p-D glucopyranoside (OG) Le culot de germes obtenu précédemment est lavé avec 500 ml de PBS (Phosphate buffer saline , NaCI 7,650 g, phosphate disodique 0,724 g phosphate monopotassique 0,210 g pour un litre , pH 7,2) par litre de culture. Puis les germes sont à nouveau centrifugés dans les mêmes conditions. Le culot bactérien obtenu (C1) est remis en suspension dans une solution d'OG (Sigma) à 1 % (30 ml/litre de culture). La suspension bactérienne est incubée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation magnétique, puis centrifugée à 17 600 x g pendant 30 minutes à 4"C Le surnageant (S2) obtenu est dialysé (MWCO=10 000 Da, Spectra/por) pendant une nuit à 40C sous agitation magnétique contre 2 fois I litre de PBS dilué au 1/2. Le précipité formé au cours de la dialyse est récupéré par centrifugation à 2 600 x g pendant 30 minutes à 4"C Le surnageant (S2d) est éliminé et le culot (Cs2d) qui contient des protéines de membrane externe, est conservé à -200C. La remise en suspension du culot est effectuée dans du tampon Tris-HC1 20 mM pH 7,5 et Pefabloc 1001lu (tampon A). 1C - Analyse des fractions membl an.lil es La fraction membranaire C52d est analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Les protéines sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie. Le profil protéique de la fraction membranaire montre la présence de 4 bandes majeures à 76, 67, 50 et 30 kDa (Figure 1 colonne 4). EXEMPLE 2 Purification de la protéine de 76 kD par SDS-PAGE préparative Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide selon la méthode de Laemmli (1970) avec un gel de concentration de 5% et un gel de séparation de 10%. La fraction membranaire est remise en suspension dans du tampon A, puis diluée au demi dans le tampon échantillon 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95"C. Environ 19 mg de protéines sont déposés sur un gel de dimension 16 x 12 cm et d'épaisseur 5 mm. Une prémigration est effectuée à 50 V pendant 2 heures, suivie d'une migration à 65 V pendant la nuit. La coloration du gel au bleu de Coomassie R250 (0,05% dans de l'eau ultrafiltrée) permet une bonne visualisation des bandes. La bande majeure à 76 l Le filtrat est précipité avec 3 volumes d'un mélange 50 50 méthanol 75% et isopropanol 75%, puis ultracentrifugé à 240 000 x g pendant 16 heures à 10 C sur rotor 70 TFT (J8-55, Beckman). Le culot est repris par 2 mI de tampon de solubilisation NaP04 10 mM pH 7,0, NaCI M, Sarkosyl 0,1%, PMSF 100 ptNl, Pefabloc 100 ,uM et urée 6 M (tampon D). L'échantillon solubilisé est dialysé successivement contre 100 ml de tampon D à 4 M d'urée et 0,1% de Sarkosyl, contre 100 ml de tampon D à 2 M d'urée et 0,5% de Sarkosyl et contre 2 fois 100 ml de tampon D sans urée et à 0,5% de Sarkosyl. La dialyse est effectuée pendant 1 heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le dialysat final est incubé pendant 30 minutes dans un bain de glace, puis centrifugé à faible vitesse pendant 10 minutes à 4 C (Biofuge A, Heraeus Sepatech). Le surnageant est récupéré, filtré sur filtre Millipore à 0,45 m et conservé à -20"C. Une analyse SDS-PAGE est réalisée (Figure 2, colonne 4). L'analyse du profil électrophorétique de la fraction montre que celle ci est pure avec une seule bande sur gel. EXEMPLE 3 Purification de la protéine membranaire de 76 kD à partir de la fraction membranaire CS2d 3A - Séparation des protéilles de la fiction membranaire CS2d sur la colonne Q-Sépharose Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire CS2d préalablement solubilisée ont été déposées sur une colonne Q Sépharose préparée comme suit Une colonne de Q Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel de 40 ml (=2,5 cm, h=8 cm).La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon NaCO3 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 ,uM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie a été suivie par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne Après que la colonne ait été lavée avec le tampon d'équilibre (NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 plM et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'au retour à la ligne de base, un lavage avec NaCI 0, l M en tampon d'équilibre a été réalisé jusqu'au retour à la ligne de base (fraction A), suivi d'un gradient de NaCI de 0,1 à 0,5 M en tampon d'équilibre (fractions B, C, D et E), puis d'un lavage avec NaCI 1M en tampon d'équilibre (fraction F).Les résultats sont représentés dans le tableau ci-dessous. fractions élution protéines totales (mg) A lavage NaCl 0,1M 18 B NaCl0,1-0,2M 14 C NaClO,25M 10 D NaCI 0,25-0 35M 27 E NaCI 0,35-0,45M 26 F lavage NaCI 1M 20 Le bilan protéique nous montre que 55% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI 0,I-05N1, 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 0,1M et 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI IM. Les profils SDS-PAGE de chacune des fractions obtenues après passage de la fraction membranaire CS2d sur la colonne Q Sépharose, sont différents. De plus, certaines protéines sont enrichies par rapport à la fraction membranaire CS2d de départ. On observe notamment un enrichissement de la protéine de 76 kDa sur le profil correspondant à la fraction D dont la purification est poursuivie comme suit. 3B - Purification sur colonne S Sépharose, de la protéine de 76 kDa à partir de la fraction D obtenue sur colonie Q Sépharose Une colonne de S Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (=1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/ml de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 M et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La fraction D dialysée préalablement contre le tampon d'équilibre (acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 Cthl et Zwittergent 3-14 0,1%) est déposée sur la colonne de S Sépharose. La colonne est ensuite lavée avec le même tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Environ 3 volumes de colonne sont nécessaires pour le retour à la ligne de base. Les protéines sont éluées par un gradient de O à 0,5 M de NaCI en tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage avec le tampon d'équilibre contenant 0,5 et 112;1 de NaCI (4 fois VT). Les fractions collectées sont analysées, rassemblées et conservées comme précédemment. La fraction D' sortant au cours du gradient NaCI 0-0,5M, entre 0,15 et 0,20 M NaCI a été récupérée. Sur cette fraction, une analyse par SDS-PAGE et par western blot est effectuée. Les résultats sont représentés à la Figure 3. Ces résultats montrent qu'après deux colonnes échangeuses d'ions, la protéine de 76 kDa est enrichie , mais elle demeure contaminée avec une protéine de 54 kDa et une protéine de 67 kDa (colonne 4). La protéine de 54 kDa ne réagit pas avec les anticorps anti-catalase, par conséquent elle ne correspond donc pas à la catalase, de même la protéine de 67 kDa ne reagissant pas avec l'anticorps anti-ureB en western blot, par conséquent elle ne correspond pas à la sous-unité B de l'uréase. L'analyse par western blot en présence d'un ante sérum anti-76 kDa montre que les faibles bandes observées en dessous de la bande à 76 kDa correspondent à une dégradation de la protéine de 76 kDa, puisqu'elles réagissent faiblement avec cet antisérum (colonne 7). EXEMPLE 4 Préparation d'un sért l hyperinniun à l'encontre de la protéine memlvranail e de 76 kD. Un sérum polyclonal spécifique de la protéine membranaire majeure d'H. pylori est obtenu par hyperimmunisation des lapins respectivement avec l'antigène purifié par SDS PAGE préparative. La première injection JO (sous-cutanée multisites et intramusculaire) est effectuée avec une préparation contenant 50 L de protéine membranaire émulsionnée en adjuvant complet de Freund, puis les rappels J21 et J42 se font par injection de 25 pg de protéine membranaire en adjuvant incomplet de Freund. Les animaux sont sacrifiés à J60. Les sérums obtenus sont décomplémentés pendant 30 minutes à 56 C et stérilisés par filtration sur membrane de porosité 0,22 m (Millipore). L'antisérum réagit avec la protéine de 76kD telle qu'isolée selon l'Exemple 3. Revendications 1. Une protéine d'Helicobacter pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76 kD. 2. Une protéine selon la revendication 1, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel: (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation; (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation; (iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux; (iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaC1 0,1 - 0,5 M;; (v) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaC1 O - 0,5 M ; et (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,15 - 0,20 M. 3. Une protéine selon la revendication 1 ou 2, qui a pour fonction biologique d'être une porine. 4. Une protéine selon la revendicationl, 2 ou 3, qui a pour séquence N-terminale la séquence d'acide aminés EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV. 5. Une protéine ou un polypeptide dérivé par mutation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, sous fonne substantiellement purifiée, qui est capable d'être reconnu par un antisérum établi à l'encontre d'une protéine selon l'une des revendications I à 4. 6. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pjioii, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'une des revendications I à 5.