Brevet FR2736928A1 — publié le 19970124

De manière générale, la présente invention concerne l'hydrolyse enzymatique, d'amides notamment d'amides secondaires. Plus précisément, I'invention est relative à des enzymes et/ou à des micro-organismes susceptibles d'être mis en oeuvre dans l'hydrolyse enzymatique de fonctions amides, de préférence sur des substrats en contenant au moins une, comme par exemple les polyamides (PA). Dans ce domaine, SSTH R. et al. sont les auteurs d'un article paru dans "Journal of Biomedical Materials Research (1987), vol. 21, p. 991-1003", et divulguent la mise en présence d'échantillons de polyamide 66 marqués au carbone 14, avec des enzymes du genre papaïne, trypsine et a-chymotrypsine. Ces polypeptides connus dégradent légèrement le polyamide 66. Mais l'hydrolyse n'est pas suffisamment significative pour pouvoir être exploitée sur le plan industriel. On connaît, par ailleurs, au travers de l'article de KINOSHITA ET AL. (Eur. J. Biochem, 116, 547-551, 1981) I'aptitude de Flavobacterium sp KI 72 à produire, une première enzyme (Ei) catalysant l'hydrolyse de dimères cycliques d'acide 6-amino hexanoique, en dimères linéaires de ce même acide, ainsi qu'une deuxième enzyme (E2) apte à permettre la transformation de ce dimère linéaire en deux molécules d'acide 6-amino hexanoique ou acide amino caproique. Le cheminement enzymatique considéré est résumé ci-après. (dimère cyclique d'acide (dimère linéaire d'acide (acide 6 aminohexanoique) 6-amino hexanoique) 6 amino hexanoique) L'activité de l'amidase linéaire E2 est optimale pour les dimères et décroît au fur et à mesure que le degré de polymérisation augmente, pour ne plus être significative à partir des oligomères de degré de polymérisation (don) = 7. On connaît, également, une enzyme E3 active vis-à-vis des oligomères cycliques et linéaires d'acide 6 aminohexanoïque de DPn 2 3 (PA.6). E3 est décrite par NEGORO et al. dans "Journal of Bacteriology, Dec. 1992, vol. 174, nO 24, p. 7948-7953. E3 provient, également, de Flavobacierium sp KI 72. TSUCSYA ET AL. enseignent, dans leur article paru dans "Journal of Bacteriology, June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n" 6", qu'il existe une grande homologie entre les enzymes El de Flavobacterium sp KI 72 et l'une de celles issues de Pseudomonas sp NK 87. Ces enzymes Eî et homologues, ainsi que les enzymes E2, et plus particulièrement ces dernières, seraient actives sur des oligomères ou des polyamides (PA 6) de formule: avec: 2 Ces enzymes, issues de Flavobacterium ou de Pseudomonas ont l'inconvénient d'avoir des activités spécifiques vis-à-vis des oligomères relativement faibles, puisque celles-ci ne s'élèvent, au maximum, qu'à 1,05 micromoles d'acide amino-caproique produit par minute et par milligramme de protéine et à partir d'un substrat constitué par un trimère. De plus, ces enzymes sont spécifiques d'homo-oligomères. U apparaît ainsi que l'art antérieur ne comprend pas de moyens d'hydrolyse enzymatique de fonctions amides qui soient performants, rentables et qui puissent s'appliquer à des amides, dont notamment des amides secondaires, de natures variées, en particulier du type co-oligomères et/ou homo-oligomères. Aussi, c'est après de longues et laborieuses recherches que la Demanderesse est parvenue à isoler et à caractériser une nouvelle enzyme du genre amidase et formée par un ou plusieurs polypeptides qui peuvent, notamment, être issus de nouveaux microorganismes isolés du biotope et/ou de nouveaux micro-organismes recombinants obtenus à partir de ces micro-organismes naturels. Il s'ensuit que la présente invention concerne une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats du type (poly)amide et répondant à au moins l'une des formules suivantes: dans laquelle: A, B sont des motifs monomères, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12. . R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones, X représente: * soit Xl = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un allyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, * soit X2 = avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, Y représente:: * soit Y' = hydrogène, * soit avec Rl tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à Ml ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes: -a- Si X = Xl, alors Y = Y' ou y2, -b- si X = X2, alors Y = y2 et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3, dans laquelle: * R2, R3 sont tels que définis ci-dessus, * U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour X' et Y1 dans la légende de la formule (1), * etq=1à8, ladite enzyme étant constituée:: opar au moins une des trois séquences peptidiques suivantes (1), (2) et (3) correspondant respectivement à SEQ ID NO: 1, 2 et 3 dans la liste de séquences annexée: * Séquence i : 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO: 1 dans la liste de séquence annexée: RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG * Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO : 2 dans la liste de séquences annexée: TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT * Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste de séquences annexée: GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN o et/ou par au moins un polypeptidique présentant au moins 50 % d'homologie à au moins l'une de ces séquences. L'invention a tout d'abord procédé de l'isolement d'une souche sauvage productrice de l'enzyme, à savoir: Comamonas acidovorans N 12. L'identification de cette souche sauvage résulte d'un travail de screening de longue haleine. Cette identification s'est faite à partir des caractères morphologiques, culturaux, biochimiques et antigéniques, qui ont pu être déterminés par référence aux critères officiels et internationaux de taxonomie microbiologique. Le mérite de la Demanderesse ne se limite pas à l'isolement de cette souche sauvage, mais s'étend également à l'isolement de l'amidase ci-dessus définie. Le micro-organisme Comamonas acidovorans N 12 n'est pas le précurseur biologique exclusif de cette amidase. Il faut en effet également considérer tous les recombinants et toute souche sauvage, présentant une activité enzymatique similaire. Les micro-organismes recombinants sont ceux possédant dans leur génôme une séquence d'ADN codant pour l'amidase considérée dans la présente invention. Conformément à un autre de ses aspects l'invention vise également un procédé d'hydrolyse enzymatique dans lequel on met en oeuvre la susdite enzyme et/ou le microorganisme sauvage visé supra et/ou au moins l'un de ses recombinants cités ci-dessus. Conformément à l'invention, les substrats de l'enzyme et/ou de leurs précurseurs biologiques (micro-organismes/recombinants) sont des polyamides et, plus précisément, des oligomères dont la fonction de polymérisation récurrente est une fonction amide secondaire -CO-NH- Ces oligomères ont des unités récurrentes de formule (I) et/ou (II). Les unités récurrentes (I) sont, avantageusement, formées de deux motifs monomères A et B, respectivement dicarbonyle et diamine et reliés l'un à l'autre par une fonction amine secondaire. Selon une modalité préférée de l'invention: le monomère A est un reste: avec r compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 4, et le monomère B est un reste: -HN#HtNH- avec s compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 6; Ainsi, pour les substrats (I), un exemple préféré de dimère est celui formé par: HOOCtCH2tCOI| NH ( CH2 tNH A II 1 Acide Adipique HcxuaCthytàu diamine Le polyamide correspondant est le PA 6.6. S'agissant des unités récurrentes (in), elles sont préférablement formées par des motifs monomères notés et dans lesquels c est un squelette du genre aminoacide dont les terminaisons (i) et ) sont, respectivement, carboxylique et aminée. Un exemple typique de est un dérivé de l'acide e-aminocaproïque, monomère du polyamide 6 (PA 6). Parmi les oligomères de type polyamide, susceptibles de convenir pour l'invention, on peut citer: - les oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides carboxyliques aliphatiques saturés ayant de 6 à 12 atomes de carbone avec des diamines primaires aliphatiques saturées ayant de 6 à 12 atomes de carbone, - les oligomères de polyaminoacides obtenus, soit par homopolycondensation directe d'acide oaminoalcanoïque comportant une chaîne hydrocarbonée ayant de 4 à 12 atomes de carbone, soit par ouverture hydrolytique et polymérisation des lactames dérivés de ces acides, - les oligomères de copolyamides obtenus à partir des monomères de départ des polyamides précités, le composant acide de ces copolyamides pouvant consister, en outre, en partie en acide aromatique, tel que l'acide téréphtalique et/ou l'acide isophtalique, - et les mélanges de ces oligomères de polyamides. A titre d'illustration des polyamides obtenus par polycondensation de diacides et de diamines, on citera, par exemple: - le polyamide 4,6 (polymère de tétraméthylène diamine et d'acide adipique), - le polyamide 6,6 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide adipique) (PA 6.6), - le polyamide 6,9 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide azélaïque), - le polyamide 6,10 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide sébacique), - le polyamide 6,12 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide dodécanedioïque). A titre d'illustration des polyaminoacides qui peuvent convenir, on citera: - le polyamide 4 (polymère d'acide amino-4 butanoique ou de butyrolactame), - le polyamide 5 (polymère d'acide amino-5 pentanoique ou de Samylolactame), - le polyamide 6 (polymère d'e-caprolactame), - le polyamide 7 (polymère d'acide amino-7 heptanoique), - le polyamide 8 (polymère de capryllactame), - le polyamide 9 (polymère d'acide amino-9 nonanoique), - le polyamide 10 (polymère d'acide amino-l0 décanoique), - le polyamide 11 (polymère d'acide amino-1 1 undécan6fque), - le polyamide 12 (polymère d'acide amino-12 dodécanoique ou de laurolactame). A titre d'illustration des copolyamides, on citera, par exemple: - le polyamide 6,6/6,10 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et d'acide sébacique), - le polyamide 6,6/6 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et de caprolactame). Sans que cela ne soit limitatif, les substrats préférés conformément à l'invention sont des oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides A et de diamines B et, en particulier, de PA 6.6. Le nombre des monomères A et B, d'une part, ou d'autre part, des substrats (I) et (11) selon l'invention est, avantageusement, compris entre 2 et 8, de préférence entre 2 et 6. I1 est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPn dans le présent exposé. Des substrats (I) caractéristiques sont, e. g., des oligomères avantageusement hydrosolubles tels que : AB, ABA et ABAB. n est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPn dans le présent exposé. Ces substrats particuliers font partie de ceux (I) et (11) que l'enzyme de l'invention et/ou ses précurseurs biologiques sont aptes à hydrolyser, car ils possèdent au moins une extrémité carboxyle. Lorsque les substrats enzymatiques sont des oligomères contenant des monomères A et B, les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères A et B. Quand les substrats sont des oligomères (II) (monomères les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères L'enzyme conforme à l'invention peut également être caractérisée au travers de son activité et/ou son affinité vis-à-vis de certains des susdits substrats. Ainsi, selon une première caractéristique avantageuse, l'amidase considérée est: - en premier lieu, active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de A et de B (DPn=4 i. e. p =2, X = X1 et Y = Y1), - et, en second lieu, apte à transformer ce substrat, d'une part, en un oligomère de DPn = 3 et, d'autre part, en monomère A, avec une activité enzymatique spécifique (IJs) - exprimée en pmoles de ABAB hydrolysé.h-l.mgl de protéine et mesurée dans des conditions données, supérieures ou égales à 1000. Une deuxième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I), formé par un trimère ABA et d'être apte à transformer ce trimère en un monomère A et un dimère AB, et ce avec une activité enzymatique spécifique supérieure ou égale à 1000 moles de substrat hydrolysé.h-l.mg-l de protéine. Une troisième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimère de type AB et d'être apte à transformer ce dimère en deux monomères A et B, avec une activité enzymatique spécifique supérieure à 1 500 llmoles de substrat hydrolysé.h-l.mg-l de protéine. L'activité enzymatique de l'amidase pure est mesurée dans les conditions suivantes tampon phosphate, pH 6 à 8 et température = 30 OC. L'enzyme amidase de l'invention présente au moins l'une de ces trois caractéristiques non limitatives. Comme déjà indiqué supra, la mise en oeuvre de l'enzyme de l'invention dans l'hydrolyse enzymatique d'amides, peut consister à utiliser uniquement l'enzyme per se au lieu des précurseurs biologiques (micro-organismes sauvages ou recombinants) producteurs de celle-ci ou bien encore un mélange des deux. A propos de producteurs d'enzyme, il est à souligner que l'enzyme objet de l'invention est également caractérisée en ce qu'elle est est produite par des micro-organismes du type Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, et/ou par les recombinants comme décrits supra. La présente invention concerne, également, de nouveaux micro-organismes aptes à produire l'enzyme amidase selon l'invention, telle que définie supra. De par cette aptitude, ces micro-organismes ont notamment pour caractéristiques, d'une part, une capacité d'hydrolyse des fonctions amides d'un composé polyamide, comprenant au moins une fonction amide et, en particulier, des oligomères. Plus précisément, ces micro-organismes ont une sélectivité et une activité d'hydrolyse spécifiques, vis-à-vis des substrats W et (II) définis supra. Dans le cas des substrats (I), les oligomères sont, par exemple, les hydrosolubles cités ci-dessus : ABAB et/ou ABA et/ou AB entre autres. Plus précisément, ces micro-organismes peuvent être, de préférence, constitués par Comamonas acidovorans sus-visé, de préférence par la souche référencée et déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, ou par des recombinants de celle-ci, tels que décrits supra. Avantageusement, les micro-organismes selon l'invention sont aptes à permettre l'hydrolyse d'au moins un substrat formé par un oligomère de polyamide et, plus précisément, par un dimère AB, voué à être transformé en deux monomères A et B, les micro-organismes étant aptes à assurer l'hydrolyse. La présente invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (il), tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme et/ou au moins l'un des microorganismes tels que présentés supra. n peut être intéressant, conformément à l'invention, de disposer de plusieurs enzymes à spectres complémentaires. Aussi, l'une des variantes du susdit procédé peut être d'avoir recours à au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants. Dans cette variante, les substrats sont, au moins en partie, constitués par des oligomères dont le DPn est inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et qui dérivent de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B). Le procédé d'hydrolyse selon cette variante est caractérisé: - en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (don) inférieur ou égal à 3 et, de préférence, aux monomères A et B, - et en ce que l'on met en oeuvre: . au moins une enzyme et/ou au moins un micro-organisme tels que définis ci dessus, . et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant: * une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacterium sp KI 72, * et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la séquence peptidique SEQ ID NO : 5 annexée, et dont la séquence d'ADN correspondant est donnée par SEQ ID NO : 4 annexée, une telle enzyme pouvant, entre autres, être produite par le micro organisme référencé et déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Micro organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1495, le 29 novembre 1994. Pour obtenir des oligomères hydrolysables par les enzymes ci-dessus, il est possible de faire intervenir une lyse thermique et/ou chimique (acide) des fonctions de type amide. Selon d'autres modalités avantageuses du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, notamment des précurseurs biologiques de la (ou des) enzyme(s) et un milieu de culture comprenant, par exemple: - une source de carbone comportant, de préférence au moins un composé comprenant au moins une fonction amide, ladite source de carbone comportant éventuellement un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbones, le saccharose étant particulièrement préféré, - et, éventuellement, un composé apte à induire la production des enzymes, sans être consommé par les precurseurs biologiques, ledit composé étant préférablement choisi parmi les amides. Le procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides selon l'invention peut trouver de nombreuses applications, par exemple en synthèse organique pour la fabrication de composés à partir de composés amides ou pour le traitement des matériaux contenant du polyamide. En particulier, il pourrait être intéressant dans le cadre de la régénération des matières premières des polymères polyamides. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques, les variantes et les avantages de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES ANNEXEES - La liste des séquences, est établie selon la norme ST 23 de l'OMPI et comprend: * SEQ ID NO 1 : séquence d'acides aminés correspondant à un premier fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention, * SEQ ID NO : 2 : séquence d'acides aminés correspondant à un deuxième fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention, * SEQ ID NO : 3 : séquence d'acides aminés correspondant à un troisième fragment de enzyme PAM II selon l'invention, * SEQ ID NO : 4: ADN (pam I) codant pour l'amidase PAM I, * SEQ ID NO : 5 : séquence d'acides aminés correspondant à PAM I. - La fig. 1 représente la carte de restriction du plasmide pXL2297 contenant le gène (pam I) codant l'amidase PAM I. - La fig. 2 représente la carte de restriction du plasmide pXL2564, contenant le gène (pam I) codant pour PAM I. EXEMPLES EXEMPLE 1: ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE LA SOUCHE SAUVAGE Coi;4MoN4sAaDovoR4Ns N 12. 1.1 CRIBLAGE MICROBIOLOGIQUE: Une vaste opération de criblage ou screening microbiologique a permis de sélectionner la souche Comamonas acidovorans N 12, à partir de divers biotopes. 1.2 SELECON-IDENTIFICACN DE CE MICRO-ORGANISME: La sélection de ce micro-organisme a été effectuée à l'aide d'un test d'activité amidasique sur des oligomères de synthèse du PA 6.6. L'évaluation d'activité sera vue en détail ci-après. Le micro-organisme sélectionné a ensuite été identifié sur la base de ses caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques et éventuellement antigéniques, de façon tout à fait traditionnelle, par le Laboratoire de Bactériologie de l'INsTITUT PASTEUR. Sur la base de ces résultats et des activités d'hydrolyse sur un mélange d'oligomères AB, ABA, BAB et ABAB, la souche naturelle sélectionnée a été soumise ensuite à une caractérisation plus poussée. EXEMPLE 2: CARACTERISATION POUSSEE DE COMAMONAS ACIDOVORANS N 12 2.1 OPTIMISATION DES CONDITIONS DE CULTURE : Le milieu de culture optimum est le M9YE3 présentant la composition suivante: - KH2PO4.. 0,75 g/I - K2HPO4.3H2O . 1,00 g/l - Na2HP04.12H20 . 1,00 g/l - (NH4)2SO4 . 2,50 g/l - Extrait de levure . 3,00 g/l - MgSO4.7H2O . 1,00 g/l - FeSO4.7H2O.. 2,30 mg/l - MnS04.7H20. 2,70 mg/l - CoCl2.2H2O . 2,30 mgA - CaCl2.2H2O .. 1,50 mg/l - CuSO4.5H2O. 0,25 mg - pH.. . 7,2 et additionné de sel d'acide adipique à 10 g/l. Les cultures sont réalisées dans des fioles Erlenmeyers remplies au 1/5ème de leur volume total. Les milieux sont incubés à 30 C et agités à 150 t/min. La préculture se compose de 10 ml de milieu LB: - Tryptone.. 10 g - Extrait de levure . 5 g/l - NaCl.. . . 10 g/l ensemencées par une colonie venant d'une boîte de Pétri contenant du milieu M9YE3 gélosé et 5 g d'un composé comprenant une fonction amide, tel que des oligomères penta aux décamères du PA 6.6. La culture est ensuite ensemencée à 1 % avec le milieu optimum (v/v). En fin de culture, la production cellulaire est déterminée par un extrait sec, obtenu par séchage d'une nuit à 105 C d'un culot cellulaire, obtenu après centrifugation (10 min à 12 000 g). Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide. Selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, la source de carbone comporte, conjointement aux solubles, un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbone, le saccharose étant particulièrement préféré. Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide. 2.2 HYDROLYSE ENZYMATIQUE - MESURE D'ACTIVITE DU MICRO-ORGANISME SAUVAGE: La mesure d'activité est déterminée à 28 C dans un tampon phosphate 10,5 immola, à pH 7,5 et avec un volume final de 1 ml. Le TABLEAU 1 ci-dessous donne les résultats obtenus. TABLEAU 1 SUBSTRATS Comamonas acidovorans N 12 co:e'tion dans l'essai en (1,4) AB o A+ B 280 mg de A/h.g de cellules sèches (2,6) ABA # AB + A 215 mg de AB/h.g de cellules sèches (1,4) ABAB BAB + A 410 mg de BAB/h.g de cellules sèches EXEMPLE 3: PURIFICATION DE LA POLYAMIDE HYDROLASE DE COMXMONAS ACIDOVORANS N 12 SELON L'INVENTION. Protocole type: Le suivi de l'activité de cette enzyme (PAM II) se fait en dosant l'activité d'hydrolyse deABABenBAB+A. 3.1. GLOSSAIRE: DTE = 1,4 dithioerythritol, Acide EDTA = Ethylène Diamine Tetra Acétique CHAPS = 3 [(3 cholamidopropyl)-diméthylammonio]- i -propanesulphonate SDS = sodium dodécyl sulphate 3.2 PREPARATION DES EXTRAITS ENZYMATIQUES: On part de cellules issues d'une culture âgée de 20 h en flasque de 2,5 I remplis par 500 ml de milieu M9YE3 décrit dans l'exemple 2 et additionné de sel d'acide adipique à 10g/I. PREMIERE EXTRACTION PAR TRAITEMENT AUX ULTRA-SONS: On remet en suspension 25 g de cellules de Comamonas acidovorans dans 75 ml de tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 1 mM DTE, S mM EDTA, 100 mM KCI et 15 % v/v de glycérol. On soumet ensuite la suspension à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultrasons dans la glace fondante pendant 70 min. Puis on centrifuge pendant 1 h 30 à 50 000 g (ultracentrifugeuse Beckman). On obtient: enfin: protéines d'activité spécifique 6 "lmoles/h/mg (11340 unités au total). 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15% v/v de glycérol. C'est ce culot qui contient également de l'activité polyamidase II qui est traité par la suite. On notera qu'il est possible après dessalage des 90 ml de surnageant dans le même tampon sans glycérol et nouvelle ultracentrifugation de purifier et de reconcentrer dans un nouveau culot trés fin l'activité polyamidase II apparemment soluble lors de la première centrifugation. En effet en diminuant la densité du tampon (par élimination du glycérol) on accélère la chute des très fines particules. Ces données sont en accord avec le fait que le premier surnageant n'est pas isolable par chromatographie, par exemple sur colonne MonoQ, puisque l'on retrouve l'activité tout au long du gradient. TRAITEMENT COMPLEMENTAIRE DU CULOT DE PREMIERE CENTRIFUGATION: On centrifuge le culot (C1) remis en suspension pendant 30 min à 4 000g, pour faire tomber les cellules non lysées par le premier traitement aux ultra-sons. On recueille ensuite le surnageant (S2) et on le soumet à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultra-sons dans la glace fondante pendant 20 min. Puis, on centrifuge à nouveau 2 h à 50 000 g et on recueille le surnageant (S3). ETAPES DE P URIFICA T'ON PAR CHROMATOGRAPHIE: 1ère Etape : Le surnageant S3 est chromatographié en trois fois sur une colonne de MonoQ HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 60 min de O à 0,6 M NaCI avec un débit de 3 ml/min. L'activité polyamidase II est éluée à environ 0,2 M NaCI en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 5 ml sur Centriprep 10 (Amicon). 2ème Stade: Aux 5 ml recueillis précédemment sont ajoutés 5 ml de tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 1 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1,5 M sulfate d'ammonium et 15 % v/v de glycérol. Puis ces 10 ml sont chromatographiés en deux fois sur une colonne de Phenylsuperose HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1M sulfate d'ammonium et 15% v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 70 min de 1 à O M sulfate d'ammonium avec un débit de 1,25 ml/min. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,8 M sulfate d'ammonium. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 400 Ill sur Centriprep 10 (Amicon). 3ème EtaDe : Les 400 ijI précédents sont chromatographiés en deux fois sur colonne TSK G3000 SW (Supelco) équilibrée dans le tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 150 mM NaCI et 15 % v/v glycérol et éluée à 0,5 ml/min. L'activité est retrouvée depuis l'exclusion jusqu'à un poids moléculaire d'environ 30 kDa. Les fractions les plus actives sont regroupées, amenées à un volume de 5 ml et déssalées sur colonnes (2,5 ml par colonne) de PD 10 Sephadex G25 (Pharmacia) équilibrées et éluées dans le tampon 25 mM Tris-HCI pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. 4ème EtalDe : Les 7 ml issus du dessalage sur PD10 sont chromatographiés sur colonne MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCI pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 30 min de O à 0,6 M NaCI avec un débit de 1 mUmin. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,15 M NaCl en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et après ajout de 0,05 % SDS sont concentrées à 200 Ill sur Centriprep 10 puis Centricon 10 (Amicon). 5ème EtaDe : Les 200 1ll recueillis sont injectés sur colonne de TSK G3000 SW équilibrée dans le tampon 40 mM sulfate de sodium, 20 mM phosphate de sodium pH 6,8 contenant 0,25 % p/v SDS et éluée à un débit de 0,25 ml/min. La polyamidase sort en un pic fin contrôlé par éléctrophorèse. Ce matériel est utilisé pour le séquençage. DETERMINATION DU POIDSMOLECULAIRE PAR ELECTROPHORESE Le poids moléculaire déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide varie selon le mode de préparation de l'échantillon de polyamidase 11. En présence de 2,5 % de SDS et 5 % de mercaptoéthanol, on trouve une bande située entre 36 et 40 kDa mais le même échantillon s'il est chauffé 5 min à 90 "C ne migre plus qu'à un poids moléculaire d'environ 150 kDa. D'après son protocole de purification, ce phénomène est caractéristique de certaines protéines associées aux membranes; or la polyamidase est bien une protéine membranaire. SEQUENÇAGE Un lot de 60 pg environ de polyamidase préparé par le protocole type, mais en partant de 60 g de cellules et en remplaçant l'étape de Phénylsuperose par une deuxième étape de MonoQ HR10/10), est digéré directement par 5 'Lg d'enzyme LysC, en présence de 0,25 % p/v SDS. Les fragments obtenus ont été purifiés sur colonne Vydac C18. Plusieurs séquences originales ont été obtenues: Séquence 1: 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquence annexée: RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée: TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste de séquences annexée: GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN EXEMPLE 4:HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'OLIGOMERES FORMES PAR DES MONOMERES A ET B RELIES LES UNS AUX AUTRES PAR DES LIAISONS AMIDES SECONDAIRES A L'AIDE D'UN MELANGE D'ENZYMES SELON L'INVENTION ET D'HYDROLASE PAM L Dans le présent exemple, ce ne sont pas les enzymes pures que l'on met en oeuvre, mais leurs précurseurs biologiques, à savoir la souche Comamonas acidovorans N12 selon l'invention et une souche hébergeant le gène pam I (SEQ ID NO : 4 annexée) et produisant l'enzyme PAM I (SEQ ID NO: 5 annexée), ladite souche étant construite selon le protocole donné ci-après. Cette construction vise à obtenir le gènepam I (codant pour l'enzyme PAM I) qui est précédé du site de fixation des ribosomes du gène cll du page x et qui est exprimé à partir du promoteur de l'opéron tryptophane d'E. Coli. Pour ce faire, un site de restriction Ndel a été créé au codon d'initiation de pan I par la technique de la PCR en utilisant comme matrice le plasmide pXL2297 (fig. 1) hébergé par la souche I 1495 déposée à la CNCM le 29 Novembre 1994. Le fragment Ndel-Apal de 208 pb, contenant la partie 5' du gène pam I, a été amplifié par PCR en prenant soin d'introduire un site Hindlll en amont du site Ndel grâce au couple d'amorces nucléotidiques (5'- AGCAAGCTTGGAGGCCATATGAATACGAC-3')) et (5'-CACCGGTGGGCCCCTC-3'). Le fragment amplifié HindlSl-Apal a été cloné dans pUC29 (Benes et al. (1993), Gene 130: 151-152) digéré par Hindlll et Apal et le gène pam I a été reconstitué par introduction au site Apal du fragment Apal de 867 pb de pXL2297. Un site Ncol se trouve ainsi placé à une trentaine de nucléotides en aval du codon stop de pam I. Les fragments adjacents Ndel EcoRl de 500 pb et EcoRI-Ncol de 600 pb de ce plasmide ont été insérés dans pXL2158 (Brevet FR 92-09 882) digéré au site Ndel situé immédiatement en aval du promoteur trytptophane. Ainsi, le plasmide pXL2564 (décrit sur la fig. 2), est un dérivé de pBR322 (Sucliffe (1978), Nucleic Acid. Res. 5 2721) contenant un gène conférant la résistance à l'ampicilline et le gène pain I sous contrôle de la cassette d'expression Ptrp-RBScll. Le plasmide pXL2564 a été introduit dans la souche d'E. Coli TG1, la sélection des micro-organismes se faisant sur LB ampicilline. Un clone contenant pXL2564 (appelée souche PAM I) a été repiqué deux fois sur boîtes gélosées et mis en culture à 37 "C en milieu M9 glucose contenant 100 llg/ml d'ampicilline selon la procédure décrite dans le brevet FR 2 694 571. La souche Comamonas acidovorans N12 a été cultivée 19 heures dans les mêmes conditions que celles définies au paragraphe 2.1 supra. Un lot d'oligomères, constitués par des monomères A = acide adipique et B = HexaMéthylèneDiamine (HMD) et de DPn moyen 4 a été mis en oeuvre. 25,25 g d'oligomères de DPn moyen 8 sont resuspendus dans 300 ml d'eau. 200 ml d'eau contenant les cellules (soit 3,1 g au total) sont ajoutés. Le tout est agité 18 heures sous courant d'azote. La solution est centrifugée et le surnageant (400 ml) est récupéré. Un poids sec de 14 g/l est mesuré sur le surnageant. Une fraction est donnée pour analyse des oligomères de l'acide adipique et de l HMD. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 2 ci-après. TABLEAU 2 nNEURDOSE(g/I) I HMD 13,8 I I Ac. ADIPIQUE 20 I AB 1 I BAB 3,6 I ABA 0,7 I ABAB 0,3 Le rendement molaire en monomère acide adipique formé est de 66 %, tandis que celui en HMD est de 58 %. Le rendement molaire en monomères et oligomères de Dp inférieur à 4, exprimé en moles de monomères, est de 72 %. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE POULENC CHIMIE (B) RUE: 25, Quai Paul Doumer (C) VILLE: Courbevoie (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 92400 (G) TELEPHONE: 47 68 12 34 (H) TELECOPIE: 47 68 16 56 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Enzymes ayant une activité amidase, micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procédé d'hydrolyse d'amides en faisant application (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Arg Gly Ala Thr Thr Met Pro Leu Lys Pro Pro His Val Val Leu Ala 1 5 10 15 Xaa Leu Thr Tyr Asp Thr Ala Gly 20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 34 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2: Thr Thr Asn Val Asp Asp Tyr Met Gln Arg Asn Arg Thr Ala Gly Leu 1 5 10 15 Leu Ile Leu Lys Gly Gly Ala Val Ala Leu Glu Arg Tyr Gly Met Gly 20 25 30 Xaa Thr (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Gly Ser Ala Tyr Glu Gln Asn Thr Ile Arg Glu Leu Xaa Arg Met Thr 1 5 10 15 Ser Gly Val Arg Xaa Ile Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Gly Asn 20 25 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:na8 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: i.."o6Z (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: ATG AAT ACG ACA CCG GTC CAC GCA CTC ACC 30 Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr 1 5 10 GAC ATC GAC GGC GGG ATC GCC GTC GAT CCC GCA CCC CGG CTG GCC GGC 78 Asp Ile Asp Gly Gly Ile Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly 15 20 25 CCT CCG GTC TTC GGG GGT CCG GGC AAC GAC GCC TTC GAT CTC GCG CCG 126 Pro Pro Val Phe Gly Gly Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro 30 35 40 GTC AGG AGC ACG GGC CGC GAG ATG CTG CGG TTC GAC TTC CCC GGG GTC 174 Val Arg Ser Thr Gly Arg Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val 45 50 55 AGC ATC GGC GCG GCG CAC TAC GAG GAG GGG CCC ACC GGT GCG ACC GTC 222 Ser Ile Gly Ala Ala His Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val 60 65 70 ATC CAC ATC CCC GCC GGC GCC CGC ACC GCG GTG GAC GCG CGG GGC GGG 270 Ile His Ile Pro Ala Gly Ala Arg Thr Ala Val Asp, Ala Arg Gly Gly 75 80 85 90 GCG GTG GGG CTC TCC GGC GGC TAC GAC TTC AAC CAC GCC ATC TGC CTG 318 Ala Val Gly Leu Ser Gly Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu 95 100 105 GCC GGC GGA GCC TGC TAC GGG CTC GAG GCG GGC GCC GGG GTG AGC GAC 3S3 Ala Gly Gly Ala Cys Tyr Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp 110 115 120 GCG CTC CTG GAA CGC CTC GAG CAT CGC ACC GGC TTC GCC GAG CTC CAG 414 Ala Leu Leu Glu Arg Leu Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln 125 130 135 CTG GTG TCG TCG GCG GTC ATC TAC GAC TTC TCG GCG CGC TCC ACC GCG 462 Leu Val Ser Ser Ala Val île Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala 140 145 150 GTC TAC CCC GAC AAG GCG CTC GGC Coe GCG GCG CTC OAA TTC GCC GTT Val Tyr Pro Asp Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val 155 160 165 170 CCC GGT GAG TTC CCG CAG GGG CGG GCG GGC GCG GGC ATG AGC GCG TCC 558 Pro Gly Glu Phe Pro Gln Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser 175 180 185 GCG GGC AAG GTG GAC TGG GAC CGC ACC GAG ATC ACC GGG CAG GGC GCG 806 Ala Gly Lys Val Asp Trp Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala 190 195 200 GCG TTC CGT CGT CTC GGC GAC GTG CGC ATC CTC GCC GTC GTC GTG CCG 654 Ala Phe Arg Arg Leu Gly Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro 205 210 215 AAC CCG GTC GGT GTG ATC GTG GAC CGC GCG GGC ACG GTG GTG CGC GGC 702 Asn Pro Val Gly Val Ile Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly 220 225 230 AAC TAC GAC GCG CAG ACC GGG GTC CGG CGC CAC CCG GTG TTC GAC TAC 750 Asn Tyr Asp Ala Gln Thr Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr 235 240 245 250 CAG GAG GCG TTC GCC GAG CAG GTC CCG CCC GTC ACC GAG GCC GGC AAC 798 Gln Glu Ala Phe Ala Glu Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn 255 260 265 ACC ACG ATC AGC GCG ATC GTC ACG AAC GTG CGG ATG AGC CCC GTC GAG 846 Thr Thr Ile Ser Ala Ile Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu 270 275 280 CTG AAC CAG TTC GCC AAG CAG GTG CAC AGT TCG ATG CAC CGC GGC ATC 894 Leu Asn Gln Phe Ala Lys Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile 285 290 295 CAG CCG TTC CAC ACC GAC ATG GAC GGC GAC ACG CTC TTC CGC GTC ACC 942 Gln Pro Phe His Thr Asp Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr 300 305 310 ACC GAC GAG ATC GAT CTG CCG ACG ACC CCG GGG TCG TCG CGC GGG CGG 990 Thr Asp Glu Ile Asp Leu Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg 315 320 325 330 CTG TCG GTG AAC GCG ACC GCG CTC GGC GCG ATC GCC TCC GAG GTG ATG 1.038 Leu Ser Val Asn Ala Thr Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met 335 340 345 TGG GAC GCC GTC CTC GAG GCC GGC AAG TAG 1068 Trp Asp Ala Val Leu Glu Ala Gly Lys 350 355 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide amine (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5: Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile 1 5 10 15 Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly 20 25 30 Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg 35 40 45 Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His 50 - 55 60 Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly 65 70 75 80 Ala -Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly 85 90 95 Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr 100 105 110 Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu 115 120 125 Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val 130 135 140 Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala 145 150 155 160 Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln 165 170 175 Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp 180 185 190 Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly 195 200 205 Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile 210 215 220 Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr 225 230 235 240 Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile 260 265 270 Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys 275 280 285 Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp 290 295 300 Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu 305 310 315 320 Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr 325 330 335 Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu 340 345 350 Ala Gly Lys 355 REVENDICAIIONS: I - Enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à au moins l'une des formules suivantes dans laquelle A, B sont des motifs monoméres, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkyléne, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les aikylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12, e R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones, X représente * soit Xl = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de l à 6 atomes de carbone, * soit X2 = avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, Y représente * soit Y' = hydrogène, * soit y2 = avec R' tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à Ml ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes -a- si X = X', alors Y = Y' ou y2, -b- si X = X27 alors Y = y2, e et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre I et 3, dans laquelle * R2, R3 sont tels que définis ci-dessus, * U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour X' et Y' dans la légende de la formule (I), * et q = l à 8, ladite enzyme étant constituée - correspondant respectivement à SEQ H) NO : 1, 2 et 3 dans la liste de séquences annexée: * Séquence 1: 24 résidus dont t non identifié (X) = SEQ ID NO 1 dans la liste de séquence annexée RGATTMP LKPPHVVLAXLTYDTAG * Séquence 2 34 résidus dont l non identifié (X) SEQ I:D NO : 2 dans la liste de séquences annexée TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT Séquence 3 : 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste de séquences annexée GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN au moins l'une de ces séquences. 2 - Enzyme selon la revendication l, caractérisée en ce qu'elle comporte les trois séquences peptidiques (1), (2) et (3). 3 - Enzyme selon la revendication l ou 2, caractérisée en ce qu'elle est apte à hydrolyser des substrats (I) et (II), comprenant au moins une extrémité carboxyle. 4 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisée - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de type ABAB, - et en ce qu'elle est apte à transformer ce substrat en trimére ABA + A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en moles de ABAB hydrolysé.h-'.mg-' et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égale à I 000. 5 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un trimère ABA, - et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en un dimére AB et un monomère A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en moles de AB hydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données supérieure ou égale à 1 000. 6 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimére de type AB, - et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en deux monomères A et B, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en moles de AB hydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égale à l 500. 7 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications l à 6, caractérisée en ce qu'elle est produite par des micro-organismes du type Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995 et/ou par leurs recombinants. 8 - Micro-organisme, caractérisé en ce qu'il est apte à produire l'enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 7. 9 - Micro-organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est constitué par Comamonas acidovorans, de préférence par la souche référencée et déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995 ou par des recombinants de celle-ci. 10 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (11), tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et/ou au moins un micro-organisme selon la revendication 8 ou 9. 11 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie constitués par des oligomères de DPn inférieur à 40. de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et dérivant de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B), caractérisé - en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DPn) inférieur ou égal à 3 et, de préférence, à des monomères A et B, - et en ce que l'on met en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 7 et/ou au moins un micro-organisme selon la revendication 8 ou 9, et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant * une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacternum sp K 172, et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la SEQ ID NO 5 annexée, une telle enzyme pouvant, entre autres, être celle produite sous l'égide du micro organisme référencé et déposé dans la Collection National de Cultures de Micro- organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1495, le 29 novembre 1994. 12 - Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend, outre la lyse enzymatique, une lyse thermique et/ou chimique permettant d'obtenir des substrats de DPn tel qu'ils soient hydrolysables par la voie enzymatique, telle que définie dans les revendications précédentes.