Brevet FR2738916A1 — publié le 19970321

Procédé d'identification précoce d'une maladie auto immune, utilisation dans le domaine du diagnostic et nécessaire dc dosage pour mettre en oeuvre ce procédé. Domaine de l'invention La présente invention a trait à la détection précoce de maladies ou désordres de nature auta-immune. Plus précisément, elle concerne un procédé d'identification de ces maladies ou désordres immunitaires, l'utilisation de ce procédé pour détecter la présence ou l'absence des anticorps responsables, et un nécessaire, kit ou trousse de dosage pour mettre en oeuvre ce procédé. Art antérieur On sait que la communication entre les différentes cellules du systeme immunitaire (lymphocytes T, lymphocytes B, macrophages, neutro- philes, progéniteurs hématopoïétiques, etc.) est assurée au moins partiel- lement par une cascade complexe d'interactions mettant en oeuvre, en tant que médiateurs, des protéines particulières à savoir les cytokines. Parmi les cytokines, on connaît une famille de produits, les "chémokines" (autres nomenclatures : "intercrines" ou "cytokines de la superfamille du PF4"), qui interviennent notamment dans les mécanismes inflammatoires et surtout proinflammatoires lors de la défense de l'organisme vis-à-vis d'un hôte étranger, se présentent sous forme monomère (structure monocaténaire ayant un poids moléculaire d'environ 8-10 kD) et surtout sous forme polymère (principalement la forme dimère et la forme tétramère), ont quare groupes Cys dans leur structure monocaténaire et sont réparties en deux sous-familles en fonction des deux premiers Cys rencontrés en allant de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale selon que les deux dits premiers Cys sont séparés ou non par un autre aminoacide. On distingue ainsi, notamment selon les articles de R. HORUK, Immunol. Today, 1994, 15 (No. 4), pages 169-174, de E. BRANDT et al., Platelets, 1992, X, pages 295-305, et de A.E. KOCH et al., J. Invest. Med., 1995, 43, pages 28-38, (i) la sous famille des chémokines de type CXC (où C est Cys et X un aminoacide différent de Cys), qui comprend en particulier les IL-8, PF4, GRO, IP-lO et NAP-2 [les définitions des abréviations sont données ciaprès], et qui est également dénommée sous-famille des a-intercrines, et (ii) la sous-flunille des chémokines de type CC (où C est Cys comme indiqué ci-dessus), qui comprend en particulier les RANTES et MCP-1, et qui est également dénommée sous-famille des ss-intercrines. En bref, les chémokines agissent principalement en tant qu'agents chémoattirants (i.e. "chémoattractants") et activants de leucocytes particuliers. A l'intérieur d'une même sous-famille, chaque chémokine a des activites qui sont uniques, d'une part, et qui recouvrent ou chevauchent celles d'autres chémokines. d'autre part. Ainsi, les chémokines qui présentent du côté de l'extrémité N-terminale une séquence ELR (i.e.Glu Leu-Arg) immédiatement avant le premier Cys (c'est-à-dire une structure El-RC), comme par exemple GRO, IL-8, PBP, CTAP-III, ssTG, NAP-2 et ENA-78 sont pour les neutrophiles des agents chémoattractants et activants; les chémokines CXC dépourvues de ladite séquence ELR ont en général des activites faibles voire nulles en ce qui concerne l'attraction des neutrophiles, comme cela est le cas notamment de PF4 et IP-lO ; et, les chémokines CC sont des agents chémoattractants et activants pour les monocytes et les cellules T, comme cela est le cas notamment de RANTES, MIP-1 et MCP-1. Selon l'article de A.E. KOCH et al. précité (voir notamment page 34, paragraphe "Conclusions"), il est indique que les chémokines jouent un rôle important dans les inflammations rhumatismales et, comme un grand nombre d'entre elles est détectable dans le sérum de patients rhumatismaux, elles peuvent servir de marqueurs pour l'identification ou le diagnostic desdites inflammations.Or, si l'homme de l'art est en mesure de détecter une chémokine dans un milieu biologique tel que le sérum par rtaction avec son anticorps spécifique anti(chémokine) puis révélation du complexe foret, il ne peut pas s'appuyer sur l'identification d'une chémokine ni sur une éventuelle différence de concentration d'une chémokine donnée par rapport à une valeur normale du sujet sain pour diagnostiquer une maladie autoimmune ou un risque d'une telle maladie. D'une part, cette façon de procéder serait contraire à la thérapeutique envisagée par d'autres auteurs qui consisterait à administrer au sujet atteint d'une maladie auto-immune la chémokine qui ferait défaut. D'autre part, elle ne permettrait pas de distinguer aisément la chémokine libre de la chémokine logiquement liée à (ou aux) récepteur(s) de sa cible. On sait par ailleurs, notamment de J. AMIRAL et al., Thromb. Haemost., 1992, 68, pages 95-96, J. AMIRAL et al., Tromb. Haemost., 1995, fl, pages 21-28, et EP-A-0 495 971, que les thrombopénies induites par l'héparine (HUl) de type II sont provoqués par un autoanticorps anti(HcpPF4) généré par l'organisme contre le complexe héparine-PF4. ll est rappelé que les HIT constituent la complication majeure des héparino-thérapies. On distingue le type 1, où la thrombopénie est modérée, réversible, non associée à des troubles cliniques, et le type II beaucoup moins fréquent (au plus 5 % des patients hospitalisés et soumis à une héparino-thérapie) qui est caractérisé par une crise sévère intervenant en moyenne 7 à 15 jours après le début de l'héparino-thérapie et pouvant conduire à une thrombose. On sait enfin que beaucoup de cytokines et d'anticorps anti(cytokine) sont à présents commercialisés dans des buts analytiques ; voir à cet effet les catalogues de 1994 et 1995 de la société R & D SYSIRS relatifs aux cytokines. L'art antérieur sus-visé ne décrit ni ne suggère que (i) des maladies auto-immunes résultent de l'action d'autoanticorps anti(cytokine), et que (ii) ces maladies auto-immunes peuvent être détectées précocement par l'intermédiaire de la réaction: cytokine + anti(cytokine) o cytokine-anti(cytokine) Buts de l'invention On vient de découvrir de façon surprenante que les matériaux responsables de certaines maladies auto-immunes, notamment celles qui sont susceptibles de conduire à une thrombose, sont des autoanticorps anti(cytokine) et en particulier des autoanticorps anti(chémokine). Ces maladies auto-immunes qui comprennent notamment les pathologies thrombopéniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, peuvent provoquer (en général trs rapidement) des crises sévères allant des thrombopénies et neutropéntes aux ischémies, thromboses et amputations. ll existe donc un besoin d'une nouvelle solution technique pour identifier ou détecter de façon précoce lesdites maladies auto-immunes. Selon un premier aspect de l'invention, on se propose de fournir un nouveau procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, qui met en oeuvre une réaction du type antigène-anticorps. Selon un second aspect de l'invention, on se propose d'utiliser ce procédé pour détecter l'autoanticorps responsable de ladite maladie autre immune. Selon un troisième aspect de l'invention, on se propose de fournir un nécessaire pour mettre en oeuvre ledit procédé. Objet de l'invention La solution technique que l'on préconise pour satisfaire le besoin sus-visé consiste à rechercher la présence ou l'absence d'un autoanticorps responsable dans un milieu biologique liquide provenant du patient. Selon l'invention, on recommande un procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, ledit procédé, qui met en oeuvre une réaction immunologique du type antigène-anticorps en vue de détecter le matériau immunitaire responsable de ladite maladie, étant caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la mise en contact d'une cytokine (Z) avec un échantillon biologique liquide susceptible de contenir ledit matériau i-uni- taire responsable, qui est un autoanticorps (anti(Z)) dirigé contre ladite cytokine (Z), afin de déclencher la réaction:: anti(Z) + Z - > anti(Z)-Z puis, (2) la révélation du produit de réaction ainsi obtenu, le complexe anti(Z)-Z, pour évaluer la présence ou l'absence dudit anticorps anti(Z) dans ledit échantillon. Selon l'invention, l'utilisation que l'on préconise est caractérisée en ce que l'on fait appel à une cytokine pour détecter un autoanticorps anti(cytokine) susceptible d'être pathogène par la réaction cytokine + anti(cytokine) - > cytokine-anti(cytokine) et la révélation du complexe cytokine-anti(cytokine) formé. Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on préconise un nécessaire, kit ou trousse de dosage qui comprend: - au moins une cytokine Z, - au moins un réactif pour la révélation de la formation du complexe anti(Z)-Z, et - le cas échéant, au moins un anticorps anti(Z) en tant que témoin positif. Ah,tutons Dans la présente description on a utilisé par commodité les abréviations et acronymes suivants, qui sont notamment illustrés dans les catalogues précités de 1994 et 1995 de la société R & D SYSTEMS relatifs aux cytokines. A492 (ou A 492 nm) mesure ou valeur de l'absorbance sous une lumière ayant une longueur d'onde de 492 nm BTG voir ssTG ci-après CSF facteur stimulant de colonies (en anglais : "colony stimulating factor"), on connaît notamment trois CSFs, à savoir les G-CSF, GM-CSF et M-CSF qui stimulent les colonies de granulocytes, de granulocytes-macrophages et respectivement de macrophages CTAP-E peptide d'activation du tissu conjonctif de type m (en anglais Zconnective tissue activating peptide III"), il s'agit d'un dérivé de PBP qui ne possède pas les 9 premier aminoacides de PBP mature EDTA acide éthylènediaminotétraacétique, le sel dîsodique de cet acide est écrit ici sous la forme Na2 EDTA EGF facteur de croissance épithéliale (en anglais : "épithelial growth factor"), on connaît plusieurs EGFs notamment les TGFe, et HB-EGF EIA essai enzymoimmunologique (en anglais : "enzyme immunoas- say") ENA-78 peptide activant les neutrophiles épithéliaux (en anglais : epithe lial neutoophil activating peptide-78") comportant 78 aminoacides FGF facteur de croissance de fibroblastes (en anglais : "fibroblast growth factor"), on connaît à l'heure actuelle sept molécules dans la famille des FGFs qui sont numérotées FGF-1 à FGF-7 FGFa facteur acide de croissance de fibroblastes (en anglais : "acidic fibroblast growth factor"), autre nomenclature FGF-1 FGFb facteur basique de croissance de fibroblastes (en anglais : "basic fibroblast growth factor"), autre nomenclature FGF-2 mA essai immunofluorescent (en anglais : "fluorescence immunoas say") GAG glycosaminoglycane GRO produit d'un gène de croissance (en anglais : growth-related gene") [autre nomenclature : MGSA], on connaît notamment plusieurs GROs :GRO aminoacides, GROss et GROy, (sauf indications contraires, GRO désignera ici GROa ou MGSA) HAT thrombopénie associée à l'héparine (en anglais "heparin- associated thrombocytopenia") HB-EGF facteur analogue au facteur de croissance épithéliale liant l'héparine (en anglais : "heparin-binding EGF-like factor"), il s'agit d'un EGF particulier Hep héparine, notamment l'héparine normale non-fractionnée et l'héparine fractionnée;Hep fait partie des GAGs Hep-PF4 complexe formé par l'héparine et le facteur plaquettaire 4 HGF facteur de croissance d'hépatocytes (en anglais : "hepatocyte growth factor") HIT thrombopénie induite par l'héparine, c'est-à dire une thrombopénie caractérisée par la présence d'un autoanticorpi anti(Hep-PF4) (en anglais : "heparin-induced thrombocytopenia") IP-10 protéine inductible par l'interféron y (en anglais : "interferon-&gamma;- inducible protein"), la protéine mature de IP-10 comporte 77 aminoacides Us 8 interleucine 8 (autre nomenclature NAP-1), la protéine exprinte par le cDNA correspondant comporte 99 aminoacides y compris un éventuel peptide signal, on connaît au moins 4 variants de IL 8 humaine selon les clivages de l'extrémité N-terminale contenant 79, 77, 72 et respectivement 69 aminoacides, le variant à 72 aminodeides (qui est le plus actif) a été utilisé ici. MBSS m-maléimido-benzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide MCP-1 protéine chémotactique de monocytes de type 1 (en anglais "monocytes chemotactic protein-l"), autre nomenclature: MCAF (de "monocyte chemotactic and activating factor") MGSA produit ayant une activité de stimulation de la croissance de mélanomes (en anglais: "melanoma growth-stimulating activity"), voir GRO ci-dessus MIP-1 protéine inflammatoire de macrophages de type 1 (en anglais "macrophage inflammatary protein-l"), on distingue depuis peu deux molécules voisines :MIP-l&alpha; et MIP-1ss MW poids moléculaire NAP-2 peptide activant les neutrophiles de type 2 (en anglais neutrophil-activating peptide-2"), NAP-2 mature humain comporte 70 aminoacides et peut notamment être obtenu par clivage de l'extrémité N-terminale de ssTG OPD orthophénylènediamine PBP protéine basique de plaquettes (en anglais "platelet basic protein"), la protéine mature humaine comporte 94 aminoacides, les clivages protéolytiques de l'extrémité N-terminale de PBP donnent CTAP-E (85 aminoacides), ssTG (81 aminoacides) et respectivement NAP-2 (70 aminoacides) PDGF facteur de croissance dérivé de plaquettes (en anglais: "platelet- derived growth factor") PF4 facteur plaquettaire 4 (en anglais: "platelet factor-4") RANTES chémokine CC dont le nom est l'acronyme de "Regulated upon activation, normal T cell Expressed and Secreted", la protine mature humaine comporte 68 aminoacides RIA essai radioimmunologique (en anglais: "radio immunoassay") RT température ambiante (15-25 ) ssTG ss-thromboglobuline (autre nomenclature:BTG), dérivé de PBP et CTAP-E, notamment par perte de 3 aminoacides à l'extrémité N terminale de CTAP-III TGF-a facteur de croissance transformant de type a (en anglais "transforming growth factor-a"), substance appartenant à l'ensemble des EGFs TGF-ss facteur de croissance transformant de type ss (en anglais "transforming growth factor-ss"), on connaît à l'heure actuelle cinq molécules TGF-ss1 (ou TGF-ss) et TGF-ss2 à TGF-ss5 qui présentent 30 à 80 % de similitude avec TGF-ss1 VEGF facteur de croissance endothélial vasculaire (en anglais: wvascular endothelial growth factor") Brève description des dessins Les dessins annexés sont fournis pour illustrer la présenlo invention en ce qui concerne la détection des autoanticorps responsables. Dans ces dessins: - les figures la, lb, lc, id et respectivement le représentent graphiquement la détection d'autoanticorps anti(chmokinc) dans le plasma des patients 1, 2, 3, 4 et respectivement 5 avec diverses chémokines et un témoin à blanc (C), en présence a) ou en l'absence (II) de Hep, et - la figure 2 représente l'évolution cinétique du nombre de plaquette (PC) dans le temps exprimé en jours (j). Dessnption dWe de 1'invenaon Les autoanticorps responsables ou caractéristiques des maladies et désordres auto-immuns sont dirigés contre les cytokines et parmi celles-ci principalement (d'un point de vue statistique) contre les chémokines. Le mécanisme conduisant à la formation desdits autoanticorps anti(cytokine) n'est pas encore élucidé ni déterminé. Néanmoins, le résultat global qui est observé est que les maladies auto-immunes, telles que les thrombopénies, les neutropénies et les pathologies proinflammatoires, sont caractérisées par la présence dans l'organisme des patients (principalement dans le plasma et le sérum) d'autoanticorps anti(cytokine). On présume, mais il s'agit là d'une théorie qui ne lie pas la Demanderesse, que (A) une cytokine donnée Z se lie à un corps Y, qui est (i) une cellule cible (Y1) de Z, (ii) une portion de paroi d'une cellule étrangère (Y2) comportant au moins un des récepteurs de Z (voir à cet effet l'article précité de R. HORUK qui fait état de la présence du récepteur érythrocytaire CK, qui fixe IL-8, sur le parasite de la malaria chez l'homme à savoir Plasmodium vivax) ou (iii) une molécule susceptible de fixer ladite cytokine, pour former un complexe Z-Y tel que Z-Y1, Z-Y2 ou Z-Y3; (B) le corps Y dudit complexe se lie à une autre cellule (X) de l'organisme (l'adhésion des neutrophiles aux plaquettes est décrite notamment par G.B. NASH dans Thrombos.Res., 1994, 1A, Suppl. 1, pages S3-S11), pour former un complexe Z-Y-X ; en variante ledit complexe Z-Y-X peut être obtenu par réaction de Z sur Y-X ; et, (C) l'organisme qui ne reconnaît pas Z-Y-X génère des anticorps et en particulier les autoanticorps anti(cytokine) caractéristiques selon l'invention, que l'on se propose de détecter rapidement avant le déclenchement ou l'arrivée de la crise sévère, qui amène la thrombose l'amputation (des doigts, des orteils ou des membres) ou le décès. Ce mécanisme comporte des similitudes avec celui qui conduit aux HTTs de type II, il en diffère cependant par la nature des anticorps responsables, à savoir les anti(cytokine), alors que lesdites HlTs sont héparino-dépendantes et caractérisées par la présence d'anticorps anti(He PF4). De plus, selon ledit mécanisme, la présence d'un GAG amplifie les manifestations et la sévérité des pathologies liées à l'existence d'anticorps anti(cytokine), dès lors que les GAGs se lient à un grand nombre de cytokines et pratiquement à toutes les chémoldnes. ll se trouve en effet pu'en particulier Hep [héparine de haut poids moléculaire (MW = 30000-6000 environ), héparine "standard" (MW = 12000 environ), héparine de bas poids moléculaire (MW = 6000-3000 environ)] et les acides chondroïtine- suiflirique (notamment le dermatan sulfate) ont une grande affinité pour les chémokines. Par ailleurs comme les GAGs tels que Hep fixent les cytokines, ils ont la possibilité de les convoyer vers d'autres cellules (par exemple érythrocytes, endothélium, etc. pour Hep) qui sont dépourvues de récepteurs desdites cytokines ; on obtient alors de nouvelles cibles pour des autoanticorps. Parmi les cytokines, à partir desquelles l'organisme peut géitrer des autoanticorps responsables (ou caractéristiques) de pathologies thrombose péniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, on peut mentionner les CSFs (notamment G-CSF, GM-CSF ct MCSF), EGFs (notamment TGF-a), FGFs (notamment FGFa et GFGb), HGF, PDGF, TGF-ss et VEGF. Eu égard à la fréquence de ces pathologies chez l'homme, la cytokine Z sera avantageusement choisie parmi l'ensemble constitué par les chémokines. Parmi lesdites chémokines à partir desquelles l'organisme génère des autoanticorps responsables (ou caractéristiques) de pathologies thrombose péniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, on peut citer - les substances du type CXC, où C désigne Cys et X un reste aminoacide différent de Cys, et - les substances du type CC, où C désigne Cys, à savoir: parmi les chémokines CXC comportant le fragment ELR comme Indiqué cidessus : les GROs (notamment GRO&alpha;, GROss et GRO&gamma;), IL 8, PBP, les dérivés de PBP (CTAP-III, ssTG et NAP-2) et ENA-78, parmi les chémokines CXC ne comportant pas ledit fragment ELR: les PF4 et IP-10, et parmi les chémokines CC : les RANTES, MCP-1 et MIP-2. Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention on fait appel à un échantillon biologique susceptible de contenir l'un des autoanticorps responsables ou caractéristiques. Cet échantillon biologique sera un liquide aqueux et plus précisément un liquide corporel. Si l'on peut effectivement rechercher et détecter un anticorps anti(cytokine) dans l'urine, la salive, le lie synovial ou le pus, il est plutôt recommandé que ledit liquide corporel soit le plasma ou le sérum qui ont par rapport aux autres liquides corporels, des concentrations en anticorps plus élevées. De façon pratique, on recherchera dans l'échantillon biologique liquide (avantageusement le plasma ou le sérum) la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous- famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble consttué par les PBP, CTAP-E et ss-TG, et mieux la présence ou l'absence d'un autoanticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les IL8, NAP-2, GRO, IP-10 et ENA-78. Le cas échéant, on pourra rechercher dans ledit échantillon la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémolees du type CC et choisie parmi l'ensemble constitué par les RANTES, MIP-1 et MCP-1. La révélation du complexe anti(Z)-Z, qui a été formé au stade (1), est mise en oeuvre au stade (2) selon une méthode connue en soi, notamment une méthode EIA, RIA, FIA. Dans les essais rapportés ci-après, une technique EIA sandwich, selon laquelle on fait réagir - l'anticorps anti(Z), susceptible d'être contenu dans le plasma ou le sérum, avec l'antigène correspondant Z immobilisé, - après rinçage, le complexe anti(Z)-Z avec un anti(anticorps) marqué [tel que anti(IgG), anti(IgA), anti(IgM) ou anti(IgG,A,M) couplé à la pero xydase], puis - après rinçage, le complexe résultant avec le système OPD/H202 pour révélation et mesure de A492. Les cytokines que l'on utilise selon l'invention sont des cytokines humaines (car les cytokines d'origine animale ne sont pas en général identiques à 100 96 aux cytokines humaines correspondantes). Ces cytolenes humaines sont préparées par génie génétique à partir des cDNA corres- pondants ; pour la préparation de PF4 on peut en outre utiliser le procédé d'extraction et de purification décrit dans le document EP-A-0 495 971 précité. L'utilisation du procédé selon l'invention a pour objet de détecter un anticorps anti(chémokine) dirigé contre une chémokine du type CXC ou CC, notamment dans un but de diagnostic précoce de maladies immunitaires ayant notamment pour conséquence des thrombopénies, neutropénies, syndromes inflammatoires et thromboses. En particulier ladite utilisation concerne la détection d'un anticorps anti(Il-8), anti(NAP-2), anti(GRO), anti(ENA-78) ou respectivement anti(IP-10), par réaction avec une chémokine choisie parmi les IL 8, NAP-2, GRO, ENA-78 et respectivement IP-10, en vue du diagnostic précoce de maladies immunitaires, notamment choisies parmi les pathologies thrombopéniantes, neutropénlantes, proinflammatoires et susceptibles d'induire une thrombose. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalistion et de résultats d'essais. Bien entendu l'ensemble de ces éléments est donné à titre d'illustration et n'est pas limitatif. Exempte 1 On a entrepris des essais sur le plasma de 5 patients, qui avaient été hospitalisés, soumis à une heparinthérapie avec Hep non fractionnée (CALCIPARINE#, héparine standard de MW = 12000 environ sous forme de sel de calcium) ou Hep fractionnée (FRAXIPARINE#, héparine de MW = 4500 environ) et présentaient les symptômes d'une HIT de type II mais sans la présence caractéristique d'anticorps anti(Hep-PF4).Ces patients étaient en fait atteints de HAT de type II. On a recherché sur leur plasma la présence ou l'absence d'autoanticorps anti(PF4)/anti(Hep-PF4) [i.e. principalement anti(PF4) quand Hep n'était pas présent dans le revêtement contenant PF4, ou anti(HepPF4) quand Hep était présent dans ledit revêtement], anti(IL-8), anti(NAP-2), anti(ssTG), anti(CTAP-III) et respectivement anti(PBP) selon une méthode EIA sandwich. Dans les microcuvettes de plaques d'analyse (COVALINK#) on introduit 200 ;d d'une solution de MBSS à 125 mg/l, incube pendant 4 h à RT préactivation des parois) et lave avec un 1M de tampon phosphate à pH 7,5. On introduit 200 ,d d'une solution de 20 yg/ml de protéine humaine mature (rhPF4, rhIL-8, rhNAP-2, rhssTG, rhCTAP-m ou respectivement rhPBP) en association avec des concentrations de Hep standard croissante (0 à 2 IU/ml) et laisse reposer pendant une nuit à RT. On rince pour écarter chaque protéine non fixée puis sature avec le tampon de revêtement contenant 10 % v/v de sérum de chèvre.Dans les microcuvettes ainsi revetues, on incube 200 s1 de plasma (prédilué à 1:100 au moyen d'un diluant constitué de 0,05 M de tampon phosphate de 0,15 M de NaCl et de 10 % de sérum de chèvre) pendant 1h à RT. On rince les microcuvettes avec une solution de 0,025 M de tampon phosphate, 0,15 M de NaCl, 0,1 % de TWEENS 20, à pH 7,5. On ajoute le conjugué [à savoir anti(IgG,A,M) global couplé à la peroxydase, à la concentration de 3 yg/ml dans le diluant du plasma dans les microcuvettes. Après rinçage, on procède au développement de la coloration avec le système OPD/H202 pendant 3 minutes à RT puis stoppe la réaction avec 3M d'acide sulforique. On mesure ensuite A492 en 0,5 h. L'essai contrôle négatif désigné C (absence d'anticorps) a été réalisé en remplaçant le plasma des patients, qui a été dilué, par le milieu de dilution. Si nécessaire, des essais contrôles positifs peuvent être entrepris avec ledit milieu de dilution contenant une quantité donnée d'un anticorps identique à celui que l'on veut rechercher. Pour la détermination du nombre de plaquettes, le sang de 5 patients a été recueilli sur Na2 EDTA. Pour tous les autres essais, le sang a été recueilli sur citrate trisodique, anticoagulant conventionnel (à raison de 9 volumes de sang pour 1 volume de citrate trisodique), et centrifugé pendant 20 minutes à 3000 g, le plasma citraté constituant le surnageant étant recueilli, réparti dans des fioles de volume déterminé et congelé à -800C pour stockage, ledit plasma étant décongelé à 37 C pendant 0,25 h avant utilisation. Pour la détection des anticorps anti(PF4)/anti(HepPF4) , anti(lL 8), anti(NAP-2), anti(ssTG), anti(CTAP-Ill) et respectivement anti(PBP), les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau I et représentés graphiquement dans les figures la à le pour les 5 patients (numérotés 1 à 5). Si la valeur mesurée pour l'absorbance est telle que (a) A492 dépourvu de l'anticorps recherché, (ss) 0,30 présence dudit anticorps, et (y) 0,50 recherché. De plus dans la figure 1, on a indiqué que le complexe anti(Z)-Z a été obtenu en présence (1) ou en l'absence (n) de Hep. Le tableau ll comporte les données cliniques desdits patients. La figure 2 représente, dans le système nombre de plaquettes (PC)/jours, la numérotation des plaquettes de chaque patient, chaque flèche (en gras dans ladite figure 2) indiquant le jour où l'on a cessé d'administrer Hep pour chacun des patients. L'ensemble de ces résultats met en évidence que les patients 1-3 (voir figures la-lc) présentaient dans leur plasma l'anticorps anti(I18) responsable de la thrombopénie HAT de type II, et que les patients 4-5 (voir figures ld-le) présentaient dans leur plasma l'anticorps anti(NAP-2) responsable de la thrombopénie HAT de type II. De plus des anticorps dirigés contre des "précurseurs" de NAP-2 (essentiellement CTAP-E et PBP), ont été détectés dans le plasma du patient 4. Par ailleurs, comme les figures la à le montrent que les résultats ne sont pas influencés par la présence de Hep, les valeurs A492 étant identiques en présence (I) ou en l'absence (II) de Hep, il est clair que les autoanticorps responsables sont dirigés contre des protéines (ici uS, NAP-2 et, le cas échéant, des précurseurs de NAP-2) et non contre des complexes de Hep avec lesdites protéines. TABLEAU I Absorbance à 492 nm lors de la détection des anticorps Patient Anti(IL-8) Anti(NAP-2) Anti(ssTG) Anti(CTAP III) Anti(PBP) C 1 1,80 0,13 0,08 0,09 0,12 0,12 2 1,04 0,23 0,10 0,12 0,26 0,10 3 0,83 0,20 0,18 0,30 0,12 0,12 4 0,28 1,73 0,80 1,52 1,72 0,08 5 0,17 0,82 0,09 0,11 0,18 0,10 Notes: pour la détection de l'anticorps anti(PF4)/anti(Hep-PF4), la valeur A492, qui est ici toujours inférieure ou égale à 0,30 n'a pas été donnée dans ce tableau ; elle est représentée dans les figures la à le. TABLEAU II Données cliniques Patient Age Sexe (1) PC(2) (3) (4) Etat clinique avant (an) (x109@@) anticoagulant J = O J = X i 64 F 7 178 56 + IL-8 thrombose de la jambe, ischémie 2 22 F 2 300 90 + IL4 ischémie, amputation(5), thrombo@e 3 91 F 14 275 40 + IL-8 remplacement de la hanche 4 64 M 19 71 62 + NAP-2 remplacement de valve mitrale 5 49 M 15 279 50 + NAP-2 rempiacement de la hanche, thrombo@e, amputation(6) Notes :: (1) intervalle de temps (en jours) entre (i) un jour avant le début de l'héparino-thérapie et (ii) le début de la thrombooénie (2) nombre de plaquettes à l'instant J = O (un jour avant 1e début de l'héparino-thérapie) et l'instant J = X (nadir plaquettaire) (3) test positif (+) ou négatif (-) d'agrégation plaquettaire (4) anticorps spécifiques responsables (5) amputation des doigts et des orteils (6) amputation d'un bras Exemple 2 Sur un lot de 815 patients atteints de thrombopénies ou de neutropénies on a recherché la présence dans le plasma d'anticorps anti(Hep- PF4), anti(PF4), anti(IL 8), anti(NAP-2), anti(ssTG), anti(CTAP-III) et respectivement anti(PBP).On a sélectionné 17 patients chez lesquels le plasma était dépourvu de ces anticorps puis, selon le procédé décrit à l'exemple 1 en remplaçant les produits PF4, IL-8, NAP-2, ssTG, CTAP-III et respectivement PBP par ENA-78, GRO, TFG-&alpha;, FGFa, FGFb, PDGF, et respectivement GM-CSF, on a déterminé la présence d'anticorps anti(ENA78), anti-(GRO), anti(TFG-&alpha;;), anti(FGFa), anti(FGFb), anti(PDGF), et respectivement anti(GM-CSF). La répartition des maladies auto-immula était celle consignée dans le tableau III TABLEAU III Nombre de patients Etat clinique Anticorps responsable 3 risque de thrombose anti(ENA-78) 4 risque de thrombose anti(GRO) 1 ris de thrombose anti(TGF-&alpha; ;) 2 risque de thrombose anti(FGFa) 1 de thrombose anti(FGFb 4 risque de thrombose anti(PDGF) 2 inflammation $anti(GM-CSF) REVEISIDICARIONS 1. Procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, ledit procédé, qui met en oeuvre une réaction immunologique du type antigène-anticorps en vue de détecter le matériau immunitaire responsable de ladite maladie, étant caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la mise en contact d'une cytokine (Z) avec un échantillon biologique susceptible de contenir ledit matériau immunitaire responsable, qui est un autoanticorps (anti(Z)) dirigé contre ladite cytokine (Z), afin de déclencher la réaction anti(Z) + Z - > anti(Z)-Z puis, (2) la révélation du produit de réaction ainsi obtenu, le complexe anti(Z)-Z, pour évaluer la présence ou l'absence dudit anticorps anti(Z) dans ledit échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Z est une cytokine choisie parmi l'ensemble constitué par les chémokines. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cytokine Z est une chémokine du type CXC, où C désigne Cys et X un reste aminoacide différent de Cys. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cytokine Z est une chémokine du type CC, où C désigne Cys. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on recherche la présence ou l'absence d'un autoanticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les IL-8, NAP-2, GRO, IP-10 et ENA-78. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on recherche la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les PBP, CTAP-ffl et B-TG. 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on recherche la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CC et choisie parmi l'ensemble constitué par les RANGES, MIP-1 et MCP-1. 8. Utilisation du procédé selon la revendication 1, ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une cytokine pour détecter un anticorps anti(cytokine) susceptible d'être pathogène par la réaction cytokine + anti(cytokine)- > cytokine-anti(cytokine) et la révélation du complexe cytokine-anti(cytokine) formé. 9. Utilisation selon la revendication 8, pour détecter un anticorps anti(chémokine) dirigé contre une chémokine du type CXC ou CC, notamment dans un but de diagnostic précoce de maladies immunitares ayant notamment pour conséquence des thrombopénies, neutropémcs, syndromes inflammatoires et thromboses. 10. Utilisation selon la revendication 8, pour détecter un anticorps anti(Il-8), anti(NAP-2), anti(GRO), anti(ENA-78) ou respectivement anti(IP10), par réaction avec une chémokine choisie parmi les IL-8, NAP-2, GRO, ENA-78 et respectivement IP-10, en vue du diagnostic précoce de meledies immunitaires, notamment choisies parmi les pathologies thrombopéniantes, neutropéniantes, proinflammatoires et susceptibles d'induire une thrombose. 11. Nécessaire de dosage pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une cytokine Z, - au moins un réactif pour la révélation de la formation du complexe anti(Z)-Z, et - le cas échéant, au moins un anticorps anti(Z) en tant que témoin positif.