Brevet FR2746012A1 — publié le 19970919

DESCRIPTION Indication du domaine technique La présente Invention concerne l'utilisation de la tiamuline. dénué semi-synthétique de l'antibiotique naturel pleuromutiline, pour la réversion du phénotype de multichimiorésistance (dit phénotype MDR pour Multidrug Resistance) développé par certaines cellules tumorales soit d'emblée, soit après chimiothérapie anticancéreuse. Indication de La résistance clinique que des cellules cancéreuses opposent à des agents chimiothérapeutiques est actuellement un obstacle majeur à leur potentialité curatives dans le traitement des cancers humains ou animaux. Le phénotype de multichimiorésistance, dit aussi MDR (pour multidrug résistance) est un mécanisme très étudié par lequel les cellules cancéreuses parviennent à résister aux effets cytotoxiques des agents antinéoplasiques. Les cellules tumorales sélectionnées in vitro pour leur phénotype MDR surexpriment le gène mdrl, ce qui se traduit par la surproduction d'une glycoprotéine de la membrane plasmique, dite glycoproteine-P, ou Pgp, ou Pgp170, de poids moléculaire 170 kDa , elle agit comme une pompe expulsant les drogues vers le milieu extracellulaire ce qui confère la résistance vis à vis d'une large gamme de drogues chimiothérapiques communément utilisées. De nombreux composés ayant la capacité d'inhiber l'activité d'expulsion des drogues par la Pgp ont été identifiés : ils inversent la résistance cellulaire vis à vis des agents cytotoxiques utilisés dans des systèmes expénmentaux [1]. Cette observation a conduit à l'idée que la résistance clinique des tumeurs humaines et animales vis à vis des drogues de la chimiothérapie, qui souvent se traduit par la surproduction de la Pgp, pouvait être potentiellement vaincue par l'administration aux patients d'inhibiteurs de la Pgp en mème temps que des drogues chimiothérapiques. Cette stratégie a déjà commencé dans des essais cliniques !2]. Depuis la découverte, il y a 10 ans. de la possibilité de blocage pharmacologique de la Pgp, un grand nombre de ces inhibiteurs, aussi dénommés chimiosensibilisateurs ou modulateurs-MDR, a pu être identifie à partir d'une grande variété de classes chimiques (revues . 3,4). Nombreux sont, parmi ces produits, ceux qui se sont avérés toxiques (en particulier cardiotoxicité importante pour les inhibiteurs de canaux (calciques)) ou inefficacité in vivo. Ceci a conduit à un redoublement d'intérèt pour l'identification de nouvelles ciasses d'agents chimiosensibilisateurs à usage clinique potentiel. Histodque de l'invention Au cours de notre travail de recherche, une lignée de cellules tumorales résistantes a été Infectée par Mycoplasma honnis. En traitant cette lignée avec la tiamuline pour ia désinfecter, nous avons constaté qu'à la concentration requise pour assurer l'effet antimycoplasmique. les cellules résistantes mourraient alors que les cellules sensibles n'étaient pas affectées La différence résidait dans le fait que pour maintenir le phénotype de résistance, il était nécessaire de cultiver les cellules résistantes en présence de la drogue anticancéreuse contre laquelle ces cellules résistaient. Nous avons constaté que le fait d'enlever momentanément cette drogue pendant le traitement des cellules avec la tiamuline n'entrainait plus la mort cellulaire et permettait à la tiamuline d'agir contre le mycoplasme. Nous avons testé ce produit sur toutes nos lignées tumorales résistantes l'utilisation conjointe de tiamuline et de drogue anticancéreuse conduit rapidement à la mort des cellules tumorales résistantes. Ces constatations nous a ainsi amenés à proposer la tiamuline comme agent chimiosensibilisateur inversant le phénotype MDR de cellules tumorales résistantes issues de différentes espèces y-compris l'homme, grâce d'une part à son effet fortement et rapidement cytotoxique vis à vis de ces cellules en conjonction avec l'utilisation d'une drogue anticancéreuse, et d'autre part, à son effet non cyctotoxique sur les cellules saines, en particulier sur les canaux calciques de cellules myocardiaques. Exposé de Invention Cette invention concerne l'utilisation d'un antibiotique semi-synthétique dérivé de la famille des pleuromutilines, la tiamuline ou (2-(Dlethylamino)ethyl) thlo]acetjc acid 6-ethenyidecahydro-Shydroxy- 4, 6, 9, 1 0-tetramethyl- thy/-1 -oxo-3a, 9-propano-3aH-cyclopentacyctoocten-8-yl ester, comme agent chimiosensibilisant dans la réversion du phénotype de multichimiorésistance (MDR) des cellules cancéreuses animales et humaines, une utilisation originale en ce sens que la tiamuline est actuellement utilisée en thérapeutique vétérinaire contre les infections bactériennes et mycoplamsiques des animaux de ferme destinés à la consommation humaine [64] [Pour cette utilisation, la tiamuline est couverte par un brevet . German Patent 2,248,237 correspondant à US Patent 3,919. 290 (1973 et 1975 resp., les deux à Sandoz)]. Ce produit possède aussi une action inhibitrice du cytochrome P450 [9,10]. La structure de cette molécule est présentée dans la figure 1. Figure 1. Nous avons testé son effet cytotoxique sur trois lignées cellulaires tumorales fortement résistantes. Dans la mesure ou des lignées présentant un niveau trés élevé de résistance ne sont pas disponibles dans le marché scientifique, nous avons dû les produire à partir de souches parentales sensibles ou déjà faiblement résistantes en augmentant progressivement la quantité de drogue anticancéreuse dans leur milieu de culture, et ceci sur une période de deux ans, suivie d'une période de stabilisation phénotypique de huit mois. II s'agit des iignées suivantes une lignée de leucémie lymphoide de souns P388 résistante à 25 ,ug/ml d'adnamycine (Figure 2A). une lignée d'hépatocarcinome de rat AS30-D résistante a 5 et 10 ,ug/ml de colchicine (Figures 28 et 2C respectivement) et une lignée de leucémie lymphoblastique humaine CEM résistante à 0.45 et 3.6 ugimi de vinblastine (Figures 2D et 2E respectivement). Ces cellules expnment le phénotype MDR par la surproduction de la glycoprotéine-P qui peut représenter 36 à 40% des protéines membranaires [11]. II est alors possible de caracténser le niveau de résistance vis a vis de la drogue anticancéreuse que ces cellules ont atteint en mesurant l'IC5 de chaque drogue utilisée. c'est a dire la quantité de drogue nécessaire pour induire 50% de cytotoxicité. Pour une drogue donnée. le rapport de l'IC50 obtenu avec une lignée résistante à celui obtenu avec la lignée parentale sensible donne l'index de résistance (ou IR) qui est une caractérisation du niveau de résistance que les cellules ont atteint. L'IR obtenu pour chaque lignée résistante est représenté dans le Tableau Tableau I Lignée Drogue inductrice lC de la drogue inductrice Daunorubicine (pgiml) ICso (pg/ml) IR 1C50 ( g/ml) IR AS30-DIS - 0.17 # 0.08 0.055 + AS30-DlCOLl0 colchicine (10) 17.48 2.35 cci 103 20.35 t 7.52 370 P388/S 0.0054 t 0.003 0.0037 t 0.0023 P3881ADR25 adriamycine (25) 42.28 t 8.8 adr 7830 7.68 t 2.01 2075 CEM/S 0 0.00058 - - 0.00034 - - 0.0030 # 0.0027 - CEMNLB3.6 vinblastine (3,6) 8.44 t 3.7 vlb 14552 1.80 t 1.03 600 CEMNLB5 vinblastine (5) 10.9 t 2.11 vlb 18793 3.25 t 1.65 1083 De la même manière, afin de connaitre l'effet cytotoxique in vitro de la tiamuline utilisée en conjonction avec une drogue anticancéreuse. sur les cellules tumorales résistantes. on établit des courbes dose-réponse pour chacune des lignées résistantes. Celles-ci sont présentées dans la figure 2. On en déduit l'IC50 de la tiamuline pour chacune des lignées testées. Les valeurs moyennées des l'IC50 (en Jg/ml) issues de 4 expénences sont P3881ADR25 0.31 t 0,26 , AS30-D/COL5 . 1.01 t 0,61 , AS30-DICOL10 0.85 + 1.0 , CEMNLB0.45 1.8 t 0,39 . CEMNLB3.6 . 0.83 t 0,45 CEMNLB0.45: 1.8 t 0.39. L'addition de tiamuline à une concentration de 1 pM dans une culture de cellules résistantes en présence de la drogue anticancéreuse aux concentrations indiquées, conduit rapidement (24 à 48 heures en fonction de la lignée cellulaire) à la mort cellulaire. L'addition de tiamuline seule aux cultures de cellules tumorales résistantes ou sensibles n'a aucun effet. suggérant bien que la tiamuline exerce dans ces conditions un effet chimiosensibilisant sur les cellules résistantes. Nous avons montré, par des expériences de cytométne de flux que la tiamuline pouvait induire la rétention intracellulaire de la drogue anticancéreuse, ce qui conduit a son effet cytotoxique. Un résultat typique est montré dans la figure 3 où. pour chaque lignées testée. on voit clairement que l'addition de tiamuline å des cellules pré-traitées par la daunorubicine conauit instantanément à une augmentation importante de la rétention intracellulaire de la drogue anticancereuse Dans la mesure ou la plupart des chimiosensibilisateurs testés se sont avérés toxiques, en particulier par leur effet calcibloquant, nous avons testé l'effet de la tiamuline sur les canaux calciques de cellules myocardiaques de rat. La figure 4 montre qu'il faut atteindre 10 uM de tiamuline pour obtenir 25% d'inhibition des canaux calciques L. Aucun effet n'est mesurable à des concentrations inférieures, et par conséquent aux concentrations qui se sont avérées cytotoxiques dans les essais de chimiosensibiiisation (0.01 à 2 sg/ml). Description des figures et tableau Figure 1: : formule chimique de la tiamuline. Figure 2: courbes dose-réponse pour déterminer l'index de cytotoxicité 50% de la tiamuline (il,). Le pourcentage de viabilité est porté en fonction de la concentration de tiamuline utilisée. La viabilité est déterminée par l'exclusion du bleu trypan. Les cellules de leucémie lymphoïde murine P388 et d'hépatome de rat AS30-D sont cultivées dans le milieu DMEM et les cellules de leucémie lymphoblastique humaine sont cultivées dans le milieu RPM11640. Les milieux de culture sont enrichis avec 10% de sérum de veau foetal, 100 Ulml de pénicilline, 100 uglmi de streptomycine, 0,25 ugiml d'amphotéricine B. Les cellules sont incubées à 37"C dans une atmosphère saturée d'humidité en présence de 5% de CO2. Le milieu de culture des cellules AS30-D est enrichi avec 0,5% de glucose comme décrit précédemment [12]. Les cellules fortement résistantes P388/ADR25 (figure 2A), AS30NICOLS (figure 2B), AS30-D/COL10 (figure 2C), CEMNLB0.45 (figure 2D) et CEMNLB3.6 (figure 2E) ont été obtenues par incubation des lignées parentales sensibles en présence de quantités croissantes de drogue anticancéreuse inductrice correspondante adriamycine, colchicine et vinblastine, sur une période de 24 mois , leur phénotype a ensuité été stabilisé pendant 8 mois supplémentaires. Les cellules ainsi sélectionnées peuvent croitre dans un milieu contenant la plus grande quantité de drogue possible, soit 25 ,ug/ml d'adriamycine pour P388/ADR25, 5 et 10 ,ug/ml de colchicine pour AS30-D/COL5 et AS30-D/COL10 et 0,45 et 3,6 pg/ml de vinblastine pour CEMNLB0.45 et CEMNLB3.6. La détermination de l'index de cytotoxicité 50% (IC,) pour la tiamuline est effectuée comme suit : les cellules sont passées dans dans du milieu frais à une concentration de 0,2 106/ml 24 heures avant le test. La viabilité de chaque lignée en présence de la drogue anticancéreuse (pour les cellules résistantes) ou en son absence (pour les cellules sensibles) est prise comme 100%. La tiamuline est ajoutée alors à des concentrations croissantes comme indiqué sur les courbes, sur quelques décades en fonction des lignées concernées. L'les pour la tiamuline est calculé à partir des courbes dose-réponse représentant la viabilité mesurée en fonction de la concentration de tiamuline utilisée. Figure 3 cytogrammes montrant l'effet de la tiamuline sur la rétention de la daunorubicine par les lignées AS30-D (cytogrammes 1, 2), CEM (cytogrammes 3, 4) et P388 (cytogrammes 5, 6). Les cytogrammes représentent la population cellulaire en fonction de l'intensité de fluorescence émise dans le rouge par les cellules. Pour chaque lignée, les cytogrammes impairs représentent la lignée parentale sensible alors que les cytogrammes pairs représentent la lignée dérivée résistante. Le nom complet de chaque lignée est indiqué au sommet de chaque cadre. La prise de mesure a été effectuée 6 heures après l'addition de tiamuline. Dans chaque cytogramme figurent trois courbes : T = témoin d'autofluorescence (cellules incubées en absence de daunorubicine), D = cellules incubées en présence de 2 g/ml de daunorubicine, D+TM = cellules incubées en présence de 2 uglml de daunorubicine et de 1 Cig/ml de tiamuline. Les essais de rétention de la tiamuline par cytométrie de flux sont réalisés de la façon suivante après un test de viabilité au bleu Trypan, les cellules résistantes ou sensibles. en phase exponentielle sont lavées deux fois dans du tampon PBS et incubées pendant 1 heure dans du milieu frais à une concentration de 0,3 106/ml, à 37tu, avant l'addition du marqueur daunorubicine à 1 uglml. La tiamuline est ajoutée à une concentration finale de 2,5 Hg/ml. Les cellules sont ensuite incubées pendant 5 heures à 37"C. Des aliquotes de 300 ul contenant 105 cellules sont immédiatement prélevées (pour le temps zéro), puis au temps indiqués, centrifugées pendant 1 minute à 1009, rincées deux fois dans le PBS, reprises dans 100 ul de PBS et enfin analysées par cytométrie de flux. La viabilité cellulaire est testée extemporanément par l'iodure de propidium (5 ng/ml). La source d'excitation pour la daunorubicine et l'iodure de propidium est un laser ionique à argon émettant un faisceau de 488 nm à 15 mW. La fluorescence rouge de la daunorubicine (Rex max: 484 nm; k max 560 nm) et de l'iodure de propidium (ex max: 540 nm; Xem max: 625 nm) est collectée à travers un filtre de 585/42 nm de bande passante (FL2) et est mesurée sur une échelle logarithmique de 4 décades dans laquelle 10 000 événements sont pris en compte. Figure 4 : effet de 10 uM de tiamuline sur l'intensité des courants calciques de type L de cellules du myocarde de rat. Les variations de l'intensité du courant L sont portées en fonction du temps. Susceptibilite d'application industrielle Vu Vu la non toxicité de la tiamuline utilisée seule sur les cellules sensibles ou résistantes, vu vu son faible impact à forte concentration sur les canaux calciques, vu vu son effet cytotoxique sélectif très important et rapide sur les cellules tumorales résistantes par augmentation de la rétention intracellulaire de la ou des drogues anticancéreuses utilisées conjointement, la tiamuline - et probablement ses dérivés et ses antécédents - peut être susceptible d'être utilisée en cancérologie animale et humaine afin de réverser le phénotype de multichimiorésistance qui s'est manifesté soit d'emblée au moment du diagnostic, soit au décours de la progression tumorale et/ou du traitement anticancéreux. Références citées 1- Ford J.M., Hait W.N., Pharmacol. Rev. 42: 156-199, 1990 "Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer'') 2- Lum B.L., Fisher G.A., Brophy N.A., et al., Cancer, 72: 3502-3514, 1993 "Clinical trials of modulation of multidrug resistance" 3- Ford J.M., Hait W.N., Cytotechnology, 12:171-212, 1993 "Pharmacologic circumvention of multidrug resistance 4- Lum B.L., Gosland M.P., Kaubish S. et al, Pharmacotherapy, 13: 88-109, 1993 "implications of the multidrug resistance gene" 5- McOrist S.; Mackie R.A.; Lawson G.H., J. Clin. Microbiol. 33: 1314-7, 1995 "Antimicrobial susceptibility of ileal symbiont intracellularis isolated from pigs with proliferative enteropathy." 6- Laak E.A.; Noordergraaf J.H., Verschure M.H., Antimicrob. Agents Chemother. 37: 317-21, 1993 "Susceptibilities of Mycoplasma bovis, Mycoplasma dispar, and Ureaplasma diversum strains to antimicrobial agents in vitro." 7- McOrist S.; Mackie R.A.; Lawson G.H., J. Clin. Microbiol. 33: 1314-7, 1995 "Antimicrobial susceptibility of ileal symbiont intracellularis isolated from pigs with proliferative enteropathy." 8- Uphoff C.C.; Gignac S.M.; Drexler H.G., J. Immunol. Methods 149: 55-62, 1992 "Mycoplasma contamination in human leukemia cell lines. il. Elimination with various antibiotics." 9- Witkamp R.F., Nijmeijer S.M., Monshouwer M. and Van Miert A.S., Drag. Me ta b. Dispos. 23: 542 547. 1995 'The antibiotic tiamulin is a potent inducer and inhibitor of cytochrome P450A via the formation of a stable metabolic intermediate complex. Studies in primary hepatocyte cultures and liver microsomes of the pig" 10- De Groene E.M., Nijmeijer S.M., Horbach G.J. et Witkamp R.F. Biochem. Pharmacol. 50: 771-773, 1995 "Tiamulin inhibits human CYP3A4 activity in an NIH/3T3 oeil line stably expressing CYP3A4 cDNA" 11- Dong M., Penin F. and Baggetto L.G., "Complete purification of P-glycoprotein for functional and structural studies" soumis pour publication, 1996 12- Baggetto L.G. and Lehninger A.L., "Formation and utilization of acetoin, an unusual product of pyruvate metabolism by Ehrlich and AS30-D tumor mitochondria" J. Biol. Chem. 262: 9535-9541, 1987 REVENDICA TIONS 1) Utilisation de la tiamuline, antibiotique semi-synthétique (Fig. 1) de la famille des pleuromutilines pour la préparation d'un médicament dans la traitement des cancers. 2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'antibiotique réverse le phénotype de multichimiorésistance des cellules tumorales (Fig. 2, 3) résistantes aux traitements chimiothérapiques. 3) Utilisation selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que l'antibiotique est actif à des concentrations faibles (0.5 à 50 pg/ml) in vitro sur des lignées tumorales hautement résistantes. 4) Utilisation selon les revendicatione 1, 2 et 3 caractérisée en ce que l'antibiotique est sans effet ionotoxique à ces doses. 6) Utilisation selon la revendication 1 dans les cellules issues d'hémopathies malignes et de tumeurs cancéreuses. 7) Utilisation selon les revendications 1 à 6 chez les mammifères. 8) Utilisation selon les revendications 1 à 7 avec les médicaments chimiothérapiques anticancéreux connus. 9) Extension de l'utilisation selon les revendications 1 à 8 aux dérivés actifs des pleuromutilines, de la tiamuline et de ses dérivés.