Brevet FR2747394A1 — publié le 19971017

La présente invention concerne un nouveau milieu d'isolement et d'identification des bactéries E Coli 0157 et/ou 011, et un procédé pour leur mise en évidence. Escherichi coli entérohémorragique (EHEC), en particulier le sérotype 0157, a été à l'origine de la plupart des cas d'intoxications alimentaires aux Etats-Unis, au Canada et en Europe. En Amérique du Nord, la viande de boeuf (crue notamment), les produits à base de boeuf, le lait cru, ont été impliqués dans ces épidémies. Les caractéristiques de virulence de ce germe, identiques à celles des E coli entéropathogènes et des E. coli vérotoxinogènes font de ce germe un problème majeur de santé publique. En effet, il provoque des colites hémorragiques caractérisées par des diarrhées sanguinolentes, symptômes pouvant évoluer vers des complications rénales très graves (syndrôme urémique hémolytique). Les recherches s'orientent donc, ces dernières années, vers la détection rapide des souches EHEC dans les produits alimentaires (FDA, 8th edition, 1995 - Bolton et al., 1995), et plus particulièrement vers une détection spécifique du sérotype 0157. Les milieux d'isolement de l'art antérieur sont - en particulier des milieux peu sélectifs, tels que le milieu MacConkey au sorbitol et examen de toutes les bactéries gram négatives, sorbitol négatives, - on a parfois ajouté des antibiotiques avec un succès limité car on peut obtenir une inhibition de la croissance des E. coli 0157 recherchés, - on a parfois ajouté un composé fluorogène ou chromogène permettant d'éliminer les colonies de bactéries possédant une ss-glucuronidase (essentiellement des E coli typiques). La plupart des souches d'Escherichia coli 0157 isolées d'épidémies ne fermente pas le sorbitol en 24 heures, n'a pas d'activité ,6-glucuronidase et ne se développe pas à 45,5 C. Aussi, beaucoup de méthodes de screening des souches EHEC d'échantillons cliniques ou alimentaires utilisent le sorbitol MacConkey agar (SNlAC) comme milieu d'isolement primaire. Les colonies suspectes sorbitol-négatif sont ensuite confirmées comme Escherichia coli 0157 par tests biochimiques et sérologiques. Parmi les autres milieux les plus couramment utilisés citons CT-SMAC: milieu dérivé du ShIAC, contenant deux inhibiteurs (céfixime et tellurite de potassium) le rendant plus sélectif. En effet, ces composés inhibent de nombreuses bactéries ne fermentant pas le sorbitol, telles que Proteus spp, Morganefla morganii, Providencia spp, Hafnia alvel Une étude réalisée en 1993 a montré que près de 400 souches d'E colis157 EHEC, toutes cultivaient sur le milieu CT-SMAC, permettant la mise en évidence des colonies sorbitol-négatif. CR-SMAC milieu dérivé du SSIAC, contenant du céfixime et du rhamnose, pour la mise en évidence des colonies sorbitol-négatif, rhamnose négatif. SUMAC + MUG (4-méthylhumbelliféryl-ss- > glucuronide), pour la mise en évidence des colonies sorbitol-négatif, ss-glucuronidase-négatif. SMAC + BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-D-glucuronide), pour la mise en évidence des colonies sorbitol-négatif, B-glucuronidase-négatif. Gélose Fluorocult E coli 0157 : H7 : milieu contenant du sorbitol, du MUG et du thiosulfate de sodium, pour la mise en évidence des colonies sorbitol négatif, MUG-négatif et H2S négatif. Les variantes du milieu SNlAC, milieu peu sélectif au départ, ont été réalisées par addition d'inhibiteurs, contribuant à augmenter la sensibilité d'isolement d'E. coli O157 par élimination des flores associées. Toutefois, les techniques de détection actuelles présentent des inconvénients majeurs, tant du point de vue de la sensibilité que de la spécificité, E coli 0157 étant présent en faible quantité dans les échantillons alimentaires, par rapport aux autres germes présents, et aux autres espèces telles que E hermanii ayant les mêmes phénotypes sur les milieux actuels. La présente invention apporte une solution à ce problème puisqu'il permet une sélectivité et une spécificité améliorée par rapport aux milieux de l'état de la technique, puisque l'addition dans un milieu incolore de chromogène détectant l'enzyme c-galactosidase permet de repérer rapidement et aisément les souches de sérogroupe 0157 et souvent celles de sérogroupe 011. Nous obtenons des colorations bien concentrées, dont la couleur dépend de la partie chromophore du chromogène choisi, localisées au niveau des colonies et qui permettent un repérage aisé. La présente invention concerne donc un nouveau milieu de culture pour la mise en évidence des bactéries E coli entérohémorragiques, en particulier des sérotypes 0157 et/ou 011, lequel comprend, outre un milieu de culture pour E coli, un composé chromogène substrat de l'enzyme agalactosidase. Pour augmenter la sélectivité, nous pouvons ajouter un composé chromogène substrat de la frglucosidase qui permet d'éliminer en particulier un grand nombre de bactéries coliformes. Pour augmenter la sélectivité, nous pouvons ajouter un composé chromogène substrat de la p-glucuronidase qui permet d'éliminer en particulier la plupart des E coli des sérogroupes autres que 0157 et gui 1. D'une manière avantageuse, le composé chromogène substrat de l'enzyme a-galactosidase est choisi parmi les dérivés de l'indoxyle- - galactoside, dont le chromophore est choisi parmi les radicaux indoxyle substitués ou non. De préférence, le composé chromogène substrat de la ss-glucosidase est choisi parmi les dérivés de l'indoxyle-ss-glucoside, dont le chromophore est choisi parmi les radicaux indoxyle substitués ou non. Le composé chromo gène substrat de la ss-glucuronidase est de préférence choisi parmi les dérivés de l'indoxyle-p- glucuronide, dont le chromophore est choisi parmi les radicaux indoxyle substitués ou non. Par indoxyle substitué ou non, on entend les radicaux indoxyle et indoxyle substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles ou halogènes. Il s'agit plus particulièrement des radicaux indoxyle alkylés, halogénés, di-halogénés ou tri-halogénés, de préférence choisis parmi les radicaux bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloroindoxyle et méthyl-indoxyle. D'une manière avantageuse, les composés chromophores indoxylés sont choisis parmi les radicaux 3-indoxyle, 6-chloro-indoxyle, 5-bromoindoxyle, 3-bromo-indoxyle, 4, 6-dichloro-indoxyle, 6,7-dichloro-indo,x-yle, 5bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle ou 4,6,7-trichloroindoxyle. D'une manière préférentielle, le composé chromogène substrat de l'enzyme a-galactosidase est choisi parmi les composés suivants 5-bromo-6-c hloro-3 -indoxyl-a-galactoside, et 6-chloro-3-indoxyl-a-galactoside. Pour les composés chromogènes substrats des enzymes p- glucosidase et/ou B-glucuronidase, le chromophore est de préférence choisi parmi les radicaux suivants 5-bromo-4-chloro-3-indoxyle, 5-bromo-3-indoxyle, et 3-indoxyle. D'une manière avantageuse, le milieu selon l'invention comprend entre 0,01 et 0,2 g/l de chromogène substrat de l' Le cas échéant, la concentration des composés chromogènes substrats de la ss-glucosidase et/ou ss-glucuronidase est également comprise entre 0,01 et 0,2 g/l, de préférence environ 0,05 g/l. D'autres caractéristiques des milieux selon l'invention apparaîtront à la lumière des exemples ci-dessous. Exemple 1: Formulation CHROMagar 0157 en g/l agar 15 peptone 5 extrait de levure 2 extrait de viande 1 NaCl 5 5-bromo-6-chloro-3-indoxyle-galactoside 0,05 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-ss-glucoside 0,05 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-p-glucuronide 0,05 désoxycholate 0,5 Exemple 2 : Colorations obtenues par différentes souches On inocule le milieu de culture avec différentes souches de bactéries, puis on laisse incuber 24 heures. Mac Conkey Sorbitol CHROMagar 0157 Coliformes rouge bleu E. coli typique rouge bleu E colis157 incolore violet E. hermanii incolore incolore Hafnia alvei incolore incolore Proteus mirabilis incolore incolore Pseudomonas incolore incolore On trouve même des souches de E coli 0157 qui sont pourtant SLT+ (Shigella Lîke Toxine positives) avec le caractère sorbitol positif et qui sont détectées par le milieu de l'invention, tandis qu'elles sont faussement négatives, rouges sur milieu Mac Conkey sorbitol, et donc manquées. Le milieu de l'invention apporte donc non seulement un avantage de spécificité (élimination de faux positifs) mais apporte un avantage de sensibilité (détection de souches faussement négatives sur milieu Mac ConE;ey sorbitol) ce qui est très important. De plus, le milieu de l'inventon donne un bon rendement de croissance car, sauf de manière élective pour inhiber les bactéries gram positives, le milieu n'est pas fondé principalement sur un principe de croissance sélective. La présente invention concerne également un procécé de mise en évidence de E coli entérohémorragiques dans un prélèvement, dans lequel on inocule le milieu de culture selon l'invention avec le prélèvement ou un inoculum dudit prélèvement, puis on détecte le cas échéant la présence de E. coli entérohémorragiques. Dans le domaine de la microbiologie alimentaire, on recherche par exemple à démontrer qu'il y a moins de dix bactéries E coli 0157:H7 dans un aliment. On emploie une méthode de croissance microbienne puis éventuellement une méthode d'enrichissement par immunocapture IMS avant étalement, à l'aide d'anticorps accrochés sur des billes. Cependant, cet enrichissement n'élimine pas plusieurs bactéries qui donnent des faux positifs sur les milieux de l'art antérieur. L'utilisation du milieu selon l'invention apporte donc un avantage crucial même si l'on utilise cette méthode IMS d'enrichissement par immunocapture. REVENDICATIONS 1/ Milieu de culture pour la mise en évidence des bactéries E coli entérohémorragiques, en particulier des sérotypes 0157 et/ou 011, caractérisé en ce qu'il comprend, outre un milieu de culture pour E coli, un composé chromogène substrat de l'enzyme a-galactosidase. 2/ Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé chromogène substrat de l'enzyme a-galactosidase est choisi parmi les dérivés de l'indoxyl-a-galactoside, dont le chromophore est choisi parmi les radicaux indoxyle substitués ou non. 3/ Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que le chromophore du composé chromogène substrat de l'enzyme Q- galactosidase est choisi parmi les radicaux suivants 5-bromo-6-chloro-3-indoxyle-galactoside, et 6-chloro-3-indoxyl-a-galactoside. 4/ Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un composé chromogène substrat de la ss glucosidase, et/ou un composé chromogène substrat de la p-glucuronidase. 5/ Milieu de culture selon la revendication 4, caractérisé en ce que le composé chromogène substrat de la ss-glucosidase est choisi parmi les dérivés de l'indoxyle-p-glucosîde, et/ou le composé chromogène substrat de la frglucuronidase est choisi parmi les dérivés de l'indoxyle-p-glucuronide, dont le chromophore est choisi parmi les radicaux indoxyle substitués ou non. 6/ Milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce que le chromophore du composé chromogène substrat de l'enzyme p- glucosidase et/ou du composé chromogène substrat de l'enzyme ss glucuronidase est choisi parmi les radicaux suivants 5-bromo-4-chloro-3 -indoxvle, 5-bromo-3-indoxyle, et 3-indoxyle. 7/ Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration du composé chromogène substrat de l'c-galactosidase est comprise entre 0,01 et 0,2 g/l, de préférence environ 0,05 g/l. 8/ Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration des composés chromogènes substrats de la ss-glucosidase et/ou de la B-glucuronidase est comprise entre 0,01 et 0,2 g/l, de préférence 0,05 g/l. 9/ Procédé de mise en évidence de E. coli entérohémorragiques dans un prélèvement, caractérisé en ce que l'on inocule le milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, avec le prélèvement ou en inoculum provenant dudit prélèvement et en ce que l'on détecte le cas échéant la présence de E coli entérohémorragiques. 10/ Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on emploie au préalable une méthode de croissance microbienne du prélèvement, puis éventuellement une méthode d'enrichissement par immunocapture IMS, avant d'inoculer le milieu de culture.