Brevet FR2735790A1 — publié le 19961227

PROCEDE POUR ADSORBER DES AGENTS ANTI-MICROBIENS CONTENUS DANS UN LIOUIDE BIOLOGIOUE ET APPAREIL POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCèDE. Domaine Technique L'invention concerne un procédé pour adsorber ou éliminer des agents anti-microbiens, également dénommés "inhibiteurs" ou "agents inhibiteurs", contenus dans un liquide biologique, tel que notamment du sang; elle concerne également un appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé. Technique antérieure Dans la description et dans les revendications, par "agents antimicrobiens", "agents inhibiteurs" ou "inhibiteurs", on désigne tout agent destiné à éviter la prolifération des microbes ou des germes pathogènes, tels que par exemple des antibiotiques, des antifongiques, des antiviraux, des antiseptiques. Par "liquide biologique", on désigne tout liquide contenant de la matière vivante, tel que du plasma, du liquide céphalorachidien, de l'urine, du liquide synovial, et de préférence du sang. Dans la suite de la description, l'invention sera essentiellement illustrée à son application préférée au sang. Pour de multiples applications, il est bien connu d'adsorber les antibiotiques contenus dans le sang, notamment en vue de les éliminer, pour analyser ensuite le sang ainsi épuré. La détection des micro-organismes pathogènes dans les liquides biologiques, doit être effectuée dans des délais aussi courts que possible, notamment dans le cas de septicémie, pour lequel la mortalité reste élevée en dépit du large éventail d'antibiotiques dont disposent les médecins. Pour augmenter les chances de survie des malades, les praticiens administrent souvent aux patients un antibiotique ou un mélange d'antibiotiques. Il importe toutefois de déterminer une antibiothérapie appropriée dans les meilleurs délais. Malheureusement, l'isolement et la caractérisation rapide des germes infectieux est difficile lorsque les échantillons de sang à analyser contiennent des agents inhibiteurs, tels que des antibiotiques, qui souvent ralentissent, voire même suppriment la croissance microbienne. I1 en est de même avec les germes responsables des méningites, dont la présence dans le liquide céphalorachidien doit être détectée avec une extrême rapidité. Là également, cette mise en évidence peut être perturbée par la présence d'antibiotiques. La bactériurie peut être également difficile à diagnostiquer lorsque le patient est placé sous antibiothérapie et excrète des antibiotiques dans l'urine. Fréquemment, l'isolement des germes infectieux peut être négatif. Pour pallier ces inconvénients et améliorer la détection des microbes et leur isolement dans des échantillons de liquides biologiques de patients sous antibiothérapie, on a déjà proposé plusieurs méthodes visant à retirer ou à neutraliser les antibiotiques présents dans le sang, avant d'analyser le sang ainsi épuré. On a tout d'abord proposé de faire passer le sang sur des résines échangeuses d'ions ou des polymères adsorbants. Pour ce faire, le sang prélevé chez le malade est mis dans un premier flacon contenant de telles résines ou de tels polymères et l'ensemble est légèrement agité pendant un temps approprié. Un volume de ce sang épuré est alors transféré dans un second flacon contenant le milieu de culture approprié pour la croissance des micro-organismes éventuellement présents. Cette technique permet une bonne adsorption de la plupart des antibiotiques. Toutefois, comme les matériaux adsorbants se présentent sous forme de granules ou de poudre inclus dans les premiers flacons, cette technique extérieure au prélèvement du sang lui-même nécessite une étape supplémentaire de reprise et de transfert du sang ainsi épuré, laquelle est coûteuse, parfois d'une efficacité contestable, d'autant qu'on n'adsorbe pas tous les antibiotiques présents, et entraîne parfois des relargages dans le temps. On a également suggéré de faire appel à des résines directement contenues dans des flacons d'analyse contenant le milieu de culture. Là également, on observe des risques de relargage des agents inhibiteurs dans le temps, et des risques d'inhibition dus à la composition même des résines. Dans le document EP-A-O 597 542, correspondant au document US-A-5 314 855, on a proposé une composition adsorbante constituée d'un mélange de charbon actif, de terre de fuller, d'une résine en poudre échangeuse d'anions, et d'un mélange de polyélectrolytes cationique et anionique. Cette technique présente toutefois les mêmes inconvénients que ceux des résines échangeuses d'ions. En effet, il s'agit d'un procédé dans lequel le sang est tout d'abord prélevé, puis, en dehors du lieu de prélèvement, est simultanément traité et analysé dans le flacon d'analyse contenant un bouillon de culture approprié et la composition adsorbante. En outre, puisque l'antibiotique reste dans le mélange, comme précédemment, on observe des risques de relargage. Par ailleurs, la présence de charbon actif en suspension perturbe l'analyse dans le flacon, car ce charbon peut adsorber d'autres composés, notamment des facteurs nécessaires à la croissance des micro-organismes, ce qui induit des résultats faussement négatifs. En outre, les surfaces d'échange s'avèrent souvent insuffisantes pour adsorber la totalité des agents inhibiteurs présents dans l'échantillon prélevé, de sorte que le flacon rempli doit être agité de manière significative pour obtenir une bonne efficacité d'échange. Enfin, cette technique du fait de la présence de charbon actif peut rendre les examens complémentaires difficiles, tels que notamment la lecture directe à l'oeil ou au microscope. L'invention pallie ces inconvénients. Elle vise un procédé d'adsorption, notamment des agents antimicrobiens contenus dans un liquide biologique, qui puisse être mis en oeuvre immédiatement de suite et en continu avec le prélèvement dudit liquide biologique et avant sa culture, ce qui évite toute interférence, et favorise la croissance des micro-organismes de l'échantillon à analyser. Celà revêt une importance toute particulière, car lorsque les prélèvements sont effectués puis conservés dans une étuve pendant plusieurs heures en vue de réaliser une culture et une analyse subséquente, il peut se développer une action inhibitrice des agents antibiotiques sur les micro-organismes du prélèvement. Comme précédemment, cela peut induire des résultats faussement négatifs. Description sommaire de l'Invention Le procédé selon l'invention pour adsorber des agents antimicrobiens contenus dans un liquide biologique, par passage de ce liquide sur un composé à base de charbon, se caractérise en ce que ledit composé se présente sous forme d'une matière textile fibreuse à base de fibres de carbone activé. En d'autres termes, l'invention consiste à adsorber les agents antimicrobiens ou inhibiteurs contenus dans un liquide biologique, non plus à l'aide d'une résine échangeuse ou d'une composition à base de charbon actif et de terre de fuller en grains ou en poudre, mais par passage d'un échantillon de sang immédiatement de suite après et en continu avec le prélèvement sur un matériau fibreux textile à base de fibres de carbone activé, avant d'introduire le sang ainsi épuré dans les flacons contenant le milieu de culture, pour le développement des micro-organismes susceptibles d'être présents. Comme on le sait, les fibres de carbone sont des matériaux qui présentent des caractéristiques mécaniques intéressantes, associées à une faible densité, qui permettent de les utiliser sous les formes textiles les plus variées, telles que filaments, fibres ou étoffes ou tresses, bi- ou tridimensionnelles. Le plus généralement, ces fibres sont fabriquées par pyrolyse d'un précurseur, notamment à base de fibres cellulosiques naturelles ou artificielles, voire synthétiques (fibres acryliques). Ces fibres de carbone étant bien connues, il n'y a pas lieu de les décrire ici en détail. On a observé de manière totalement surprenante que pour obtenir le résultat recherché, à savoir l'adsorption des agents anti-microbiens, il importe que ces fibres de carbone aient été activées, c'est-à-dire aient subi une oxydation ménagée, qui provoque une attaque en surface et en profondeur de chacune des fibres, qui deviennent alors plus ou moins poreuses. ll se développe alors à la surface et dans le coeur de ces fibres des canaux plus ou moins radiaux, capables d'adsorber des molécules indésirables. Ainsi, plus les pores sont fins, plus la surface spécifique est importante et plus l'efficacité d'adsorption augmente. Le plus généralement, l'activation des fibres de carbone s'effectue par oxydation ménagée à une température comprise entre 800 et 10000C en atmosphère inerte. Les fibres de carbone activé sont bien connues dans le domaine de la désodorisation ou de l'épuration, notamment des gaz. Il est suprenant que l'utilisation de ces fibres de carbone activé permette également d'obtenir une telle efficacité et une telle rapidité d'adsorption, alors que les particules de charbon activé ou les fibres de carbone non activé ne permettent pas d'obtenir des résultats comparables, et surtout présentent des difficultés certaines de mise en oeuvre. De la sorte, l'homme de métier du domaine de l'analyse des agents microbiologiques connaissant les inconvénients précités de l'adsorption sur fibres de carbone ou sur particules de charbon activé, était dissuadé de faire appel à des fibres de carbone spécifiques, à savoir les fibres de carbone activé. Grâce à un effet conjugué de rapidité et d'efficacité, le procédé selon l'invention devient compatible avec les vitesses de prélèvement du liquide biologique, et peut donc être effectué simultanément au prélèvement lui-même, et être incorporé ou intégré en continu dans le processus même de prélèvement, plus précisément entre le patient et en dehors du milieu analytique, évitant par là toute perturbation des analyses ultérieures. Ainsi, la sélection de fibres de carbone activé autorise l'adsorption des agents anti-microbiens ou inhibiteurs immédiatement de suite et en continu avec le prélèvement, ce que l'on ne savait pas faire jusqu'alors. Celà se traduit par une simplicité dans la mise en oeuvre et une meilleure fiabilité des résultats obtenus. Le matériau fibreux caractéristique de l'invention peut se présenter sous des formes les plus diverses. On peut faire appel par exemple à un faisceau de filaments parallèles. On peut également utiliser des fibres discontinues, des surfaces ou des étoffes textiles : tissées, tressées, tricotées, non tissées, bi- ou tridimensionnelles, de mousses à pores ouverts bi- ou tridimensionnelles, de la bourre, des voiles, des velours, etc... n importe que la surface spécifique des fibres (ou des filaments) soit élevée. On a constaté que l'on obtient de bons résultats avec des surfaces spécifiques supérieures à 500 m2 / g, de préférence supérieures à 1000 m2/g, pour un diamètre des fibres (ou des filaments) compris entre cinq et cinquante micromètres, de préférence voisin de dix micromètres. I1 importe que l'organisation de la matière fibreuse dans le dispositif permette le passage des grosses molécules ou de microorganismes du liquide biologique à analyser, mais permette de retenir des molécules plus petites, telles que les agents anti-microbiens ou inhibiteurs. On peut ainsi faire passer le liquide à adsorber au contact des fibres ou des filaments organisés sous les formes ou surfaces évoquées ci-dessus. Ainsi, le matériau fibreux permet, d'une part, par la structure microporeuse des fibres de carbone activé d'assurer une bonne adsorption des agents anti-microbiens, et d'autre part, grâce à la structure du matériau lui-même, d'opérer une séparation sélective des constituants du liquide à analyser. Selon la forme de présentation du matériau fibreux, le contact entre le liquide biologique s'effectue essentiellement en surface et/ou à coeur du matériau. On a observé que l'on obtient de bons résultats en faisant écouler le liquide biologique dans un catheter souple de prélèvement à l'intérieur duquel on a inséré un faisceau de quelques (de cinq à cinquante) filaments parallèles de fibres de carbone activé. L'écoulement peut également être effectué à travers des étoffes tridimensionnelles en forme de chicanes, de zig-zag, de spirales', de mousses à pores ouverts, ou autres pour augmenter le parcours et par là la surface et la durée, ainsi que l'efficacité du contact et de l'échange. On peut également utiliser des matériaux composites à structure ouverte (tricot à mailles lâches, structure cellulaire à pores ouverts). Le choix de la forme de présentation du matériau fibreux proprement dit tient compte essentiellement du liquide à traiter, de la vitesse d'écoulement et des agents anti-microbiens à adsorber. Le passage sur le matériau fibreux caractéristique à base de fibres de carbone activé, s'effectue par tous moyens connus. On peut faire appel à la gravité. De préférence, on fait passer le liquide sous une légère dépression, telle qu'une aspiration, suffisante pour attirer le liquide, à l'instar d'un prélèvement de liquide biologique sur un patient. L'invention concerne également un appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé. Cet appareil comprend: - un moyen de prélèvement d'un liquide biologique; - un conduit, relié d'un côté au moyen de prélèvement et de l'autre côté à un récipient destiné à recevoir le liquide biologique extrait à analyser; - un moyen destiné à amorcer le prélèvement du liquide biologique; Il se caractérise en ce que le conduit présente en son sein, et sur partie au moins de sa longueur, un matériau fibreux à base de fibres de carbone activé, au contact duquel passe le liquide biologique extrait au fur et à mesure du prélèvement. En pratique: - le moyen de prélèvement du liquide biologique est selon l'application envisagée, soit une aiguille (sang), soit une sonde (urine); - le conduit est un catheter souple en une matière biocompatible, par exemple en matière plastique; - le récipient est associé au moyen pour amorcer le prélèvement; ce peut être par exemple un flacon sous vide partiel ou un corps de pompe. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent à l'appui de la figure unique annexée. La figure 1 est une représentation schématique d'un appareillage conforme à l'invention. Manière de réaliser l'Invention Appareil Un appareil de prélèvement et de traitement pour la mise en oeuvre de l'invention comprend (voir figure 1) de manière connue, respectivement une aiguille (1) à ailettes (3) placée de manière connue dans un tube de protection (2). L'extrémité de l'aiguille (1) est reliée à un catheter souple (4) connectée à son autre extrémité à une aiguille (5) entourée d'un capot de protection (6). Ce capot (6) est destiné à venir se positionner sur un bouchon (7), généralement en caoutchouc, d'un flacon (8) contenant un bouillon (9) de culture. A l'intérieur du flacon (8), règne une dépression correspondant à quelques centaines de Pa. Selon l'invention, le catheter (4) est interrompu par un tube (10) avec lequel il communique, ledit tube contenant un faisceau (11) formé d'une pluralité de filaments parallèles (12) de carbone activé de dix micromètres de diamètre. Ce tube (10) est relié de manière connue par ses deux extrémités (13,14) au catheter (4). Lorsqu'on veut analyser le sang d'un patient, on insère l'aiguille (1) dans une veine. Lorsque le sang apparaît dans le catheter (4), on place le capot (5) sur le bouchon (7) du flacon (8), en enfonçant l'aiguille (5) à travers le bouchon (7). La dépression du flacon (8) aspire le sang dans le circuit (4,10) qui s'écoule alors dans le flacon (8) où il réagit avec le bouillon (9). Pendant ce prélèvement, le sang s'écoule sur et à travers le faisceau (11) de filaments parallèles de carbone activé qui retiennent alors les agents anti-microbiens ou inhibiteurs, puis le sang ainsi épuré est mis en contact avec le milieu de culture approprié, afin de permettre la croissance des micro-organismes éventuellement présents dans l'échantillon. Validation du procédé de l'invention Le pouvoir d'adsorption vis-à-vis des antibiotiques est déterminé par la technique classique de diffusion en gélose décrite ci-après. On prélève un échantillon de sang sur un patient normal et sain, c'est-à-dire exempt d'antibiotique. On ajoute ensuite dans ce sang une quantité prédéterminée d'un antibiotique majeur d'usage courant. On obtient ainsi un échantillon de référence, désigné ci-après S-ATB. A l'aide d'une seringue, on prélève une partie de l'échantillon de ce sang SATB que l'on introduit dans le catheter (4) pour le faire passer sur la matière fibreuse (11). L'échantillon de sang épuré tout comme l'échantillon de référence sont recueillis dans le bouillon (9). On laisse ensuite les hématies sédimenter pendant trente minutes dans des tubes à fond conique. On effectue ensuite un dosage bactériologique des antibiotiques. De manière connue, on prélève une fraction de sang à analyser que l'on pose sur un disque de papier que l'on sèche. On place ensuite ce disque dans une boite de Petri à la surface de laquelle on dépose des bactéries sensibles à l'agent antimicrobien que l'on veut mettre en évidence et quantifier. On place ensuite la boite de Petri à l'étuve. Durant l'incubation, l'agent antimicrobien, s'il est présent, diffuse dans la gélose, et l'on obtient un diamètre d'inhibition après vingt-quatre heures. On compare ensuite le diamètre obtenu à une gamme de référence pour pouvoir quantifier la quantité d'inhibiteurs présents, avant et après le traitement conforme à l'invention. Exemple 1 Dans cet exemple, le faisceau (11) est formé de huit brins de trente centimètres de longueur de fibres de carbone activé parallèles ayant un diamètre de dix micromètres, et présentant une surface spécifique de 1500 m2/g. Le diamètre interne du tube (10) est de 3,10 mm. La durée de passage d'un l'échantillon de cinq millilitres de sang est réglée par la dépression du flacon (8), ou par la dépression d'un piston, entre 15 et 45 secondes, pour correspondre à la durée d'un prélèvement normal de sang sur un patient. La quantité d'antibiotiques adsorbée sur le matériau fibreux (11, 12), est mesurée par dosage classique microbiologique par diffusion en gélose sur boite de Petri. Le pourcentage d'inhibiteurs adsorbés sur le matériau fibreux est égal: valeur de la référence - valeur de l'essai x100 valeur de la référence Les résultats sont rassemblés dans le tableau I ci-après. Exemple2 On répète l'exemple précédent en remplaçant le faisceau (12) par un faisceau de vingt-quatre brins identiques aux huit brins de l'exemple 1. Les résultats sont rassemblés dans le tableau I ci-dessous. Netilmicine Vancomyåne Pefloxacine Amoxicilline Concentration en mg/l de ragent 40 40 20 80 antibiotique dans I'échantillon Exemple 1 22 3 25 61 Exemple 2 80 39 50 79 Les chiffres indiqués correspondent à des pourcentages d'adsorption pour le matériau fibreux (11, 12) caractéristique. Exemple3 On répète l'exemple 1 en remplaçant les fibres de carbone activé (12) caractéristiques de l'invention par des fibres de carbone de même titre et de même longueur, mais non activé. On n'observe aucune adsorption. Exemple 4 On répète l'exemple 1 en remplaçant les fibres de carbone activé par des grains de charbon actif. On n'observe aucune adsorption significative. Le procédé et l'appareillage permettent d'épurer le liquide biologique au fur et à mesure de son prélèvement. De la sorte, l'invention peut être utilisée avec succès pour l'élimina- tion des agents anti-microbiens ou inhibiteurs, du plasma, du liquide céphalorachidien, de l'urine, du liquide synovial, et surtout du sang. REVENDICATIONS 1/ Procédé pour adsorber des agents anti-microbiens contenus dans un liquide biologique, par passage de ce liquide sur un composé à base de charbon, caractérisé en ce que ledit composé se présente sous forme d'une matière textile fibreuse à base de fibres de carbone activé. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau fibreux se présente sous forme d'un faisceau (11) de filaments parallèles continus (12). 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les filaments continus parallèles de carbone activé (12) présentent un diamètre compris entre cinq et cinquante micromètres. 4/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la surface spécifique des fibres est supérieure à 500 m2/gramme. 5/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau fibreux se présente sous la forme de surfaces ou d'étoffes textiles : tissées, tressées, tricotées, non tissées, bi- ou tridimensionnelles, de mousse à pores ouverts bi- ou tridimensionnelles, sous forme de bourre ou en voile, velours. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le matériau fibreux est une étoffe tridimensionnelle en forme de chicane, de zig-zag, de spirales, de mousses à pores ouverts. 7/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide biologique est du sang. 8/ Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7, du type comprenant: un moyen de prélèvement (1) d'un liquide biologique; un conduit (4), relié d'un côté (13) au moyen de prélèvement (1) et de l'autre côté (14) à un récipient (9) destiné à recevoir le liquide biologique extrait à analyser; un moyen destiné à amorcer le prélèvement du liquide biologique; caractérisé en ce que le conduit (4) est interrompue par un tube (10) avec lequel il communique, ledit tube (10) comprenant sur partie au moins de sa longueur, un matériau fibreux à base de fibres de carbone activé, au contact duquel passe le liquide biologique extrait au fur et à mesure du prélèvement. 9/ Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le matériau fibreux est constitué d'un faisceau (11) de filaments continus parallèles (12) de fibres de carbone activé. 10/ Appareil selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le liquide biologique est du sang, et en ce que le conduit (4) est un catheter souple. 11/ Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le récipient (8) destiné à recevoir le liquide biologique extrait à analyser est un flacon à l'intérieur duquel règne une dépression.