Brevet FR2746814A1 — publié le 19971003

La présente invention est relative à des séquences nucléiques recombinées, codant pour des protéines comprenant au moins un domaine hydrophobe ou transmembranaire (telles que les protéines sécrétoires ou membranaires), lesquelles séquences nucléiques recombinées sont aptes à augmenter de manière significative, à la fois le rendement de production/assemblage et l'insertion correcte dans la membrane (adressage, ciblage vers, passage à travers ou insertion dans la membrane de réticulum endoplasmique, par exemple) de la protéine exprimée dans une cellule eucaryote hétérologue. La présente invention est également relative aux applications desdites séquences nucléiques, à la production de protéines sécrétoires ou membranaires dans une cellule eucaryote hétérologue. De nombreuses protéines qui sont synthétisées dans le cytosol des cellules vivantes, ont une localisation finale non-cytosolique, telle que les membranes. Presque toutes les protéines non-cytosoliques ont au moins un élément agissant en cis, qui sert comme signal pour leur positionnement correct. Les protéines destinées à l'exportation ou à la sécrétion portent, dans la plupart des cas, une extension amino-terminale hydrophobe, le peptide signal, qui est clivé lorsque la préprotéine traverse la membrane du réticulum endoplasmique eucaryote (MILSTEIN C. et al., Nature New Biologist, 1972, 239, 117120 ; BLOBEL et al., J. Cell Biol., 1975, 67, 835-851). Les protéines de membrane contiennent au moins un ancrage membranaire, typiquement une hélice transmembranaire composée de plus de 16 aminoacides consécutifs hydrophobes. Lorsque l'ancrage membranaire est amino-terminal, il diffère du peptide signal en ce qu'il n'est pas clivable et en ce qu'il contient une plus longue suite d'aminoacides hydrophobes. Le ciblage réticuloendoplasmique des protéines solubles ou membranaires qui portent un fragment amino-terminal hydrophobe implique l'interaction de ce fragment amino-terminal avec la particule de reconnaissance de signal (= Signal Recognition Particle ou SRP), une ribonucléoprotéine cytosolique. Un nombre croissant de développements biotechnologiques font appel à l'expression de protéines membranaires mammifères dans des hôtes micro biens, entre autres des micro-organismes eucaryotes comme la levure Il s'agit notamment de produire des protéines du manteau viral pour la production de vaccins, ou des récepteurs de surface pour cribler rapidement des médicaments ou des peptides. Or, ces approches connaissent une majorité d'échecs, dont les raisons n'ont pas souvent été analysées en détail. Une forte dégradation, un assemblage/repliement ou un adressage incorrects sont généralement incriminés. Tous ces symptômes pourraient découler d'une insertion défectueuse d'un ou plusieurs domaines transmembranaires. En effet, la membrane du réticulum est le lieu de l'adressage et de l'insertion, au fur et à mesure de la traduction de la protéine membranaire, et domaine par domaine. De plus, une protéine sécrétoire incorrectement repliée est destinée à la dégradation. Le repliement des protéines après ou simultanément à leur traduction, ainsi que les facteurs régulant ce repliement ont été étudiés. n a été en particulier montré que - dans certaines conditions, I'interaction de la SRP avec le peptide signal d'une chaîne protéique naissante et émergeant du ribosome, entraîne une inhibition transitoire de la traduction de la protéine. Cette inhibition est levée lorsque la SRP s'ancre à son récepteur membranaire réticuloendoplasmique et la traduction reprend alors dans des conditions dans lesquelles ladite protéine est simultanément transférée vers son site final, de manière à éviter un repliement prématuré du précurseur de la protéine dans le cytosol (WALTER P. et al., Cell, 1984, 38, 5-8). - les chaperons moléculaires (tels que les protéines heat-shock ou hsps) empêchent également le repliement prématuré des protéines des organites dans le cytosol, tandis que d'autres chaperons empêchent l'apparition d'un mauvais repliement dans les organites (ELLIS R. et al., Annu. Rev. Biochem., 1991, 60, 321347 ; NILSSON B. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1991, 45, 607-635 ; HENDRICK JP. et al., Annu. Rev. Biochem., 1993, 62, 349-384). - d'autres Auteurs ont émis l'hypothèse que le repliement des protéines se produit simultanément à la traduction (BALDWIN R.L., Ann. Rev. Biochem., 1975, 44, 453475 ; GOLDBERG M.E., Trends Biochem. Sci., 1985, 10, 388-391). Une confirmation expérimentale de l'hypothèse du repliement cotraduc tionnel a été observée pour la globine O(RASHENINNIKOV I.A. et al., J. Protein Chem., 1991, 10, 445453), la sous-unité ss de la tryptophane synthase (FEDOROV A.N. et al., J. Mol. Biol., 1992, 228, 351-358), quelques protéines du cytosquelette (FULTON A.B. et al., J. Cell Science, 1993, 105, 867-871) ou pour la luciférase bactérienne (FEDOROV A.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 12271231). Le repliement cotraductionnel pourrait également bénéficier, parfois, dans le cytosol, de chaperons associés aux ribosomes. Par exemple, la protéine chaperon hsp72 cosédimente avec les polysomes de cellules Hela (BECKMANN R.P. et al., Science, 1990, 248, 850-854) et une protéine assimilée aux chaperons, l'hsp70, codée par les gènes SSB, est associée aux ribosomes actifs de levure (NELSON R.J. et al., Cell, 1992, 71, 97105), dans lesquels elle régulerait le taux de passage de la protéine en formation à travers le canal du ribosome. Un principe de base de l'assemblage des protéines est que la structure primaire d'une protéine contient toutes les informations nécessaires à la mise en place de sa structure tridimensionnelle (ANFINSEN C.B., Science, 1973, 181, 223-230); néanmoins, la SRP, le complexe associé au polypeptide naissant (NAC, WIEDMANN B. et al., Nature, 1994, 370, 434-440), les chaperons moléculaires et des facteurs accessoires tels que la protéine disulfure isomérase ou la prolyl isomérase sont des facteurs à action trans, qui contiennent implicitement dans leur structure et leur activité, une partie de l'information requise pour diriger quelques protéines naissantes, vers leur compartiment correct et vers leur repliement correct. D'autres types de signaux localisés sur l'ARNm et agissant en cis sur la traduction d'une protéine sont envisageables. Il a été en particulier montré (BENNETZEN J.L. et al., J. Biol. Chem., 1982, 257, 3026-3031 , GOUY et al., Nucl. Acids Res., 1982, 10, 7055-7074, SHARP P.M. et al., Nucl. Acids Res., 1986, 14, 7737-7749, SHARP et al., Yeast, 1991, 7, 657-678) que des gènes fréquemment exprimés n'utilisent qu'un nombre limité de codons. Ces différents Auteurs ont, en particulier, montré l'existence d'une importante adaptation des codons: par exemple, chez Saccharomyces cerevisiae et chez Escherichia coli, il existe une corrélation importante et positive entre les codons préférés et la concentration en ARNt isoaccepteurs correspondant (IKEMURA T., Mol. Biol. Evol., 1985, 2, 13-34); lesdits ARNt isoaccepteurs affectent également la vitesse de l'élongation de la chaîne polypeptidique (VARENNE S. et al., J. Mol. Biol., 1984, 180, 549-576). En conséquence, un codon non-optimal entraînera une pause du ribosome, jusqu'à ce que l'ARNt aminoacylé correct atteigne son site (TALKAD V. et al., J. Mol. Biol., 1976, 104, 299-303). Le ralentissement alors observé dans le mouvement du ribosome doit être vraisemblablement inversement proportionnel à la concentration en ARNt aminoacylé correct (VARENNE et al., 1984). L'ARNm peut aussi porter d'autres types de signaux susceptibles d'agir en cis sur la vitesse de la traduction. Il s'agit de structurations secondaires conduisant à une bicaténarisation localisée de l'ARNm et constituant des obstacles à la progression du ribosome (par exemple, GUISEZ Y. et al., J. Theor. Biol., 1993, 162, 243-252). PURVIS I.J. et al. (J. Mol. Biol., 1987, 193, 413-417) ont, par exemple, émis l'hypothèse que les chaînes de codons non préférés positionnés aux limites interdomaines des protéines codées peuvent faciliter le repliement cotraductionnel correct des domaines successifs de la protéine, indépendamment l'un de l'autre. Bien que leur analyse s'appuie sur le gène de la pyruvate kinase de levure, qui après reséquençage, s'est avéré ne pas contenir de chaînes de codons rares (McNALLY T. et al., FEBS Letters, 1989, 247, 312-316), ce travail a inspiré d'autres travaux qui ont effectivement conclu à l'existence de pauses traductionnelles. CROMBIE T. et al. (J. Mol. Biol., 1992, 228, 7-12) par exemple, ont montré que le gène 1RP3 de levure code pour une enzyme bifonctionnelle et contient une pause traductionnelle au niveau du deuxième domaine. L'élimination de cette pause, en augmentant l'adaptation du codon à l'aide de mutations silencieuses entraîne une diminution d'un facteur 1,5 de l'activité enzymatique/I2P3 ARNm, suggérant que cette pause traductionnelle promeut le repliement correct de l'enzyme. GUISEZ Y. et al. (précité) ont, pour leur part, montré que la taille de certains intermédiaires naissants de la protéine d'enveloppe du bactériophage MS2 coïncide avec la présence de codons rares ou de régions d'ARN contenant des structures secondaires double-brin. Toutefois, ces connaissances théoriques n'ont donné lieu à aucune application pratique, notamment dans le but d'améliorer l'expression des protéines sécrétoires ou membranaires, exprimées par un vecteur d'expression hétérologue. La présente invention s'est en conséquence donné pour but d'obtenir, lors de l'expression d'une protéine sécrétoire ou membranaire par un vecteur d'expression, les conditions favorables pour qu'elle présente la structure tridimensionnelle des protéines natives et en particulier, un assemblage/repliement et un adressage corrects. La présente invention a pour objet des séquences d'acide nucléique, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un gène G naturel ou recombiné (dénommé ci-après séquence G), codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A, comprenant au moins un domaine hydrophobe ou transmembranaire, lesquelles séquences d'acide nucléique comprennent en aval d'une zone H codant pour ledit domaine hydrophobe ou transmembranaire et à environ 5085 codons de ladite zone H, une zone Z, apte à contrôler la vitesse de traduction de ladite protéine P dans un organisme eucaryote B hétérologue, dans lequel ladite protéine P est exprimée. De manière surprenante, l'inventeur a trouvé que des codons rares apparaissent fréquemment en moyenne à 50-85 codons en aval de la zone codant pour un domaine hydrophobe ou transmembranaire (zone H), par exemple d'une protéine membranaire eucaryote. Le ralentissement de traduction induit par cette baisse de l'adaptation des codons ( pause +70 ) se produit au moment où le domaine hydrophobe H émerge du ribosome et peut donc interagir avec la machinerie cellulaire responsable de son ciblage et de son insertion membranaire. A ce titre, cette pause +70 favorise l'interaction correcte, et donc le ciblage et l'assemblage/repliement corrects des domaines hydrophobes dans la membrane du réticulum endoplasmique eucaryote, en outre, I'adaptation de cette pause +70 , de l'hôte eucaryote d'origine A, vers le nouvel hôte hétérologue B, où l'expression est réalisée, permet effectivement, et ce de manière inattendue, de transposer le schéma des vitesses de traduction d'une protéine membranaire, tel qu'obtenu dans l'organisme A, dans l'organisme hétérologue B. En effet, cette pause +70 favorise l'assemblage correct des domaines membranaires dans la bicouche du réticulum eucaryote. Selon un premier mode de réalisation avantageux desdites séquences d'acide nucléique, ladite zone Z contient au moins 2 codons rares pour l'organisme eucaryote B, dans lequel ladite protéine est exprimée. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite zone Z comprend au moins huit codons, dont au moins 25 % sont rares. Une telle séquence correspond donc à une séquence G d'un organisme A, modifiée de telle sorte qu'elle comprend une zone Z pour un organisme hétérologue B. Certains codons sont optimaux pour l'appareil de traduction dans un organisme donné. Ce sont les codons reconnus par les espèces d'ARNt les plus abondants. A l'inverse, certains codons sont particulièrement non-optimaux, et sont caractérisés par leur rareté dans les gènes fortement exprimés. De tels gènes montrent donc un net biais des codons en faveur des codons optimaux. La présence de codons rares à la place des codons préférés, constitue donc un abaissement ou baisse de l'adaptation des codons pour l'appareil de traduction. Étant donné que les abondances relatives des ARNt varient selon les espèces, le biais des codons diffère aussi entre espèces. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites séquences d'acide nucléique, ladite zone Z code pour une portion d'un ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite structure secondaire correspond à une bicaténarisation localisée de l'ARNm. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, on obtient une structure locale dite en tige et boucle , stable thermodynamiquement. De manière avantageuse de telles séquences permettent de reproduire la pause traductionnelle, liée à une baisse de l'adaptation des codons, dans l'organisme A, en introduisant une structure secondaire dans l'ARNm codé par la zone Z, chez l'organisme B. Par exemple, la dégénérescence du code génétique fournit le moyen de réaliser des mutations silencieuses, c'est-à-dire ne changeant pas l'acide aminé codé, en introduisant des nucléotides qui, au niveau de l'ARNm transcrit, donneront lieu à des appariements (A-U, G-C, G-U) avec d'autres nucléotides de la même région. Les mutations doivent être choisies pour créer une série d'appariements consécutifs, résultant en ladite structure secondaire dite en tige et boucle. De telles séquences d'acide nucléique sont particulièrement utiles, dans les cas où dans la zone Z de l'organisme B, il n'existe pas, naturellement, un abaissement de l'adaptation des codons tel qu'observé pour l'organisme A, dans la même zone Z. Conformément à l'invention, l'organisme eucaryote A, organisme donneur du gène d'intérêt de la protéine à exprimer est sélectionné parmi l'ensemble des organismes eucaryotes; on peut citer à titre d'exemple, les mammifères, notamment l'homme, les hirudinés, telle que la sangsue etc. Également conformément à l'invention, l'organisme eucaryote hétérologue B, organisme hôte ou receveur du gène d'intérêt de l'organisme A, exprimant la protéine correspondante est également sélectionné parmi l'ensemble des organismes eucaryotes, de préférence, dans le groupe constitué par les levures (Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, etc. ), les champignons filamenteux (Aspergillus, etc.), les cellules d'insectes (Bombyx infectés par le baculovirus, etc.), les batraciens (Xenopus, etc.) ou de mammifères (CHO, etc.) De manière préférée, ce sont des séquences eucaryotes variées qui sont exprimées dans des levures. Conformément à l'invention, les séquences nucléiques selon l'invention peuvent être obtenues selon l'une des méthodes suivantes: L Préparation des séquences nucléiques selon l'invention. dans lesquelles la zone Z contient au moins deux codons rares pour l'organisme eucarvote hétérologue B. Méthode 1 Ladite méthode 1 d'obtention d'une séquence nucléique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) modification de ladite zone Z, enfonction du biais des codons de l'organisme B, par remplacement d'au moins deux codons de ladite zone Z par le même nombre de codons rares pour l'organisme B, et (d) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée, selon cette méthode 1, d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui contient au moins 2 codons rares pour un organisme eucaryote B. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 1, ladite zone Z comprend au moins 8 codons, dont au moins 25% sont rares. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 1, l'étape (a) comprend le repérage du peptide-signal ou des domaines transmembranaires (D.H.) de la protéine P. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre l'étape (a) comprend la réalisation du profil d'hydropathie de la protéine P codée par la séquence G. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 1, I'étape (b) comprend l'analyse de la séquence G en termes d'adaptation des codons, dans l'organisme A. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'étape (b) comprend la mesure de l'indice d'adaptation du codon CAI (SHARP et al., précité) ou la mesure d'un autre indice mettant en valeur le biais des codons ou le ralentissement de la traduction par les ribosomes, tel que l'index de pause ou pause index décrit dans GUISEZ et al. (1993, précité). Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 1, la modification de la zone Z selon l'étape (c) est réalisée par l'insertion de mutations strictement silencieuses (acides aminés correspondant inchangés) effectuée de préférence par mutagenèse dirigée par PCR. De manière avantageuse, la méthode 1 consiste à reproduire l'abaissement de l'adaptation des codons, observé dans la zone Z, pour l'organisme A, dans l'organisme B, en faisant usage pour cette zone Z, lorsqu'elle est transférée dans l'organisme B, du biais des codons spécifique de l'organisme B. Cet abaissement doit être si possible reproduit dans son amplitude moyenne, sa position médiane et sa longueur approximative. Il n'est pas utile de le reproduire dans tous ses détails. La dégénérescence du code génétique fournit le moyen de réaliser des mutations silencieuses (i.e. ne changeant pas l'acide aminé codé) en biaisant vers l'usage de codons rares pour B. Une fois définies les mutations souhaitées dans la zone Z, il convient d'appliquer les méthodes standards de la mutagenèse dirigée pour introduire lesdites mutations dans le gène G, comme précisé ci-dessus. Méthode 2: Ladite méthode 2 d'obtention d'une séquence nucléique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin incluant au moins deux codons rares pour un organisme B, (d) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P et (e) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 2, l'étape (d) d'insertion est réalisée à l'aide d'un des procédés suivants (dl) le clivage dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G de l'organisme A, à l'aide d'une endonucléase de restriction ayant un site unique ou rare dans Z et l'insertion de l'oligonucléotide double-brin obtenu en (c) au niveau dudit site clivé, par ligature appropriée ou (d2) I'insertion d'une séquence comprenant des codons rares par PCR ou par toute autre méthode de polymérisation convenable, si aucun site de restriction n'est présent dans la région de la zone Z. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 2, l'étape (e) d'obtention d'une séquence nucléotidique selon l'invention comprend: (el) le clonage de la séquence obtenue en (d) par introduction de ladite séquence dans un vecteur de clonage et d'expression pour l'organisme B; la séquence obtenue en (b) est liée opérationnellement à un promoteur actif dans l'organisme B, de manière à permettre son expression; l'ensemble est lié opérationnellement à un vecteur qui est réplicable dans B; B est ensuite transformé ou transfecté par la construction obtenue ou (e2) l'amplification de la séquence obtenue par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou toute autre méthode d'amplification convenable. Conformément à l'invention, l'oligonucléotide d'insertion doublebrin, mis en oeuvre dans la méthode 2, comprend au moins 2 codons rares pour l'organisme eucaryote B et doit de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion. Par exemple, si cette région a un caractère basique marqué, il est a priori préférable d'insérer un oligonucléotide double-brin codant pour des acides aminés basiques. Si cette région possède une structure secondaire marquée, il faut éviter un acide aminé défavorable à cette structuration. Si aucun caractère marqué n'est repérable, un oligonucléotide doublebrin neutre , codant par exemple pour des acides aminés hydrophiles mais non chargés (sérine, par exemple), ou de courts acides aminés aliphatiques (alanine, par exemple), est mieux adapté. Il en résulte qu'une collection d'oligonucléotides double-brin doit être prévue pour faire face à tous les cas. Pour vérifier si l'on obtient bien une séquence d'acide nucléique dans laquelle ledit oligonucléotide d'insertion est correctement inséré, on peut déterminer la présence d'un oligonucléotide d'insertion particulier dans un des clones par hybridation ADN-ADN entre ce clone et un oligonucléotide dont la séquence est celle d'un simple-brin dudit oligonucléotide double-brin. Si la mutagenèse a fait appel à une collection d'oligonucléotides double-brin, il faut disposer pour cette détermination de la collection des oligonucléotides simple-brin. Il suffit que ces oligonucléotides soient préalablement marqués par un procédé quelconque pour être repérés après hybridation, par exemple par radioactivité, fluorescence ou une méthode immunologique. II. Préparation des séquences nucléiques selon l'invention, dans lesquelles la zone Z code une Dortion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire assez stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm. Méthode 3 Ladite méthode 3 d'obtention d'une séquence nucléique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) modification de ladite zone Z, par remplacement de nucléotides par d'autres nucléotides, susceptibles de favoriser la bicaténarisation locale de l'ARNm résultant de la transcription de ladite zone Z et (d) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée, selon cette méthode 3, d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui code un ARNm susceptible de former dans l'organisme B une structure secondaire par bicaténarisation locale. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'étape (c) de ladite méthode 3, la modification de ladite zone Z est réalisée par remplacement de quelques nucléotides qui, au niveau de l'ARNm transcrit, donne lieu à des appariements (A-U, G-C ou G-U) avec d'autres nucléotides de la même région, résultant en une structure secondaire locale stable. De manière avantageuse, la méthode 3 consiste à reproduire la pause traductionnelle, liée à une baisse de l'adaptation des codons dans l'organisme A, en introduisant une structure secondaire dans l'ARNm codé par la zone Z chez l'organisme B. La dégénérescence du code génétique fournit le moyen de réaliser des mutations silencieuses, telles que définies ci-dessus, en introduisant des nucléotides qui, au niveau de l'ARNm transcrit, donneront lieu à des appariements (A-U, G-C ou G-U) avec d'autres nucléotides de la même région. Les mutations doivent être choisies pour créer une série d'appariements consécutifs, résultant en une structure secondaire dite en tige et boucle , qui soit thermodynamiquement stable. Une fois définies les mutations souhaitées dans la zone Z, il convient d'appliquer les méthodes standards de la mutagenèse dirigée pour introduire lesdites mutations dans le gène G, comme précisé ci-dessus. Méthode 4 Ladite méthode 4 d'obtention d'une séquence nucléique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin codant une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm, (d) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P, et (e) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 4, l'étape (d) d'insertion est réalisée à l'aide d'un des procédés suivants (dl) le clivage dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G de l'organisme A, à l'aide d'une endonucléase de restriction ayant un site unique ou rare dans Z et l'insertion de l'oligonucléotide double-brin obtenu en (c) au niveau dudit site clivé, par ligature appropriée ou (d2) l'insertion d'une séquence codant pour une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm, par PCR ou par toute autre méthode de polymérisation convenable, si aucun site de restriction n'est présent dans la région de la zone Z. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode 4, l'étape (e) d'obtention d'une séquence nucléotidique selon l'invention comprend: (el) le clonage de la séquence obtenue en (d) par introduction de ladite séquence dans un vecteur de clonage et d'expression pour l'organisme B; la séquence obtenue en (b) est liée opérationnellement à un promoteur actif dans l'organisme B, de manière à permettre son expression; l'ensemble est lié opérationnellement à un vecteur qui est réplicable dans B; B est ensuite transformé ou transfecté par la construction obtenue ou (e2) l'amplification de la séquence obtenue par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou toute autre méthode d'amplification convenable. Conformément à l'invention, l'oligonucléotide d'insertion doublebrin, mis en oeuvre dans la méthode 4, code au moins une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire et doit de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion. Par exemple, si cette région a un caractère basique marqué, il est a priori préférable d'insérer un oligonucléotide double-brin codant pour des acides aminés basiques. Si cette région possède une structure secondaire marquée, il faut éviter un acide aminé défavorable à cette structuration. Si aucun caractère marqué n'est repérable, un oligonucléotide double-brin neutre , codant par exemple pour des acides aminés hydrophiles mais non chargés (sérine, par exemple), ou de courts acides aminés aliphatiques (alanine, par exemple), est mieux adapté. Il en résulte qu'une collection d'oligonucléotides double-brin doit être prévue pour faire face à tous les cas. Dans les cas où la protéine P que l'on souhaite exprimer est codée par une séquence G dont les zones H et Z, telles que définies ci-dessus, sont connues, il n'est pas nécessaire de réaliser les étapes (a) et (b) des 4 méthodes décrites. La présente invention a également pour objet un procédé d'expression d'une protéine sécrétoire ou membranaire P dans un organisme hétérologue B et/ou une méthode de contrôle de la vitesse de traduction de ladite protéine P, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) l'insertion d'une séquence nucléique telle que définie ci-dessus dans un vecteur d'expression convenable, (b) la transformation ou la transfection d'un organisme eucaryote B convenable par ledit vecteur d'expression, (c) la culture desdits organismes transformés ou transfectés, pour l'expression de ladite protéine sécrétoire ou membranaire et (d) selon les besoins, la purification, l'évaluation de la localisation ou l'utilisation in situ de ladite protéine sécrétoire ou membranaire. La présente invention comprend également la cassette d'expression obtenue en associant une séquence d'acide nucléique selon l'invention à des séquences régulant l'expression de ladite séquence d'acide nucléique, au moins dans un organisme eucaryote convenable, tel qu'une levure. Par séquence régulant l'expression de la séquence nucléique selon l'invention, on entend des séquences de type promoteur et terminateur actives dans ledit organisme eucaryote B. L'invention englobe également des vecteurs d'expression comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus et utilisables pour l'obtention des organismes eucaryotes B transformés. De tels vecteurs d'expression, permettent de manière surprenante, d'augmenter le rendement de production et d'assemblage dans la membrane de protéines transmembranaires. Ces vecteurs sont sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. Les vecteurs contenant les séquences d'acide nucléique telles que définies ci-dessus, constituent des outils particulièrement intéressants pour l'analyse des récepteurs de surface et la production de vaccins. Préférentiellement, les vecteurs conformes à l'invention comportent des marqueurs de sélection dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie: URA3, LEU2, HIS3, TRIP1, ADE2, etc. et/ou des marqueurs de résistance aux antibiotiques (G418, cycloheximide etc.). Avantageusement, les vecteurs conformes à l'invention, comportent des éléments permettant leur intégration dans le génome de levure, ou leur réplication autonome dans la levure, tels que séquences autonomes de réplication ( ARS ), centromères ( CEN ) ou autres ( 2-micron , etc.); ces vecteurs conformes à l'invention sont, de préférence, des vecteurs navettes, notamment constitués par des plasmides, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie. Des plasmides préférés sont notamment ceux décrits dans Membrane protein expression systems, a user 's guide (édité par G. W. Gould, chapitre 5, page 187). Les vecteurs d'expression conformes à l'invention peuvent être introduits dans des souches de levures, par exemple, par différentes techniques de transformation. Parmi les techniques de transformation les plus courantes, on citera la technique des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et l'électroporation. De manière surprenante, les levures transformées par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus ont une production en protéine sécrétoire ou membranaire significativement supérieure à celle des vecteurs d'expression ne contenant pas une séquence d'acide nucléique modifiée telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet les outils de détection de l'expression de la protéine sécrétoire ou membranaire dans l'organisme B. Parmi ces outils, on peut citer: * ceux qui permettent de détecter la séquence G modifiée, tels que des oligonucléotides dont la séquence est celle d'un simple-brin d'un oligonucléotide d'insertion double-brin tel que défini ci-dessus; * ceux qui permettent de détecter la protéine exprimée, tels que des anticorps générés, séparément contre chacun des oligopeptides codés par les oligonucléotides d'insertion double-brin: une reconnaissance immunologique par un anticorps convenable indique directement, non seulement que ladite protéine modifiée est exprimée et assemblée, mais aussi quelle modification exacte a été introduite. Un tel anticorps permet aussi de connaître la localisation de la protéine modifiée et soit excrétée (dans le surnageant de culture), soit périplasmique (dans le surnageant de culture, à condition d'hydrolyser la paroi cellulaire), soit en surface cellulaire (accessible sans rompre la membrane plasmique), soit intracellulaire (accessible à condition de casser les cellules). La présente invention a, en outre, pour objet les oligonucléotides d'insertion double-brin, tels que définis ci-dessus, à savoir: - d'une part, des oligonucléotides d'insertion double-brin, qui comprennent au moins 2 codons rares pour l'organisme eucaryote B et qui doivent de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion et - d'autre part, des oligonucléotides d'insertion double-brin, qui codent au moins une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire et qui doivent de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion. La présente invention a également pour objet des organismes eucaryotes B, transformés ou transfectés par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. La présente invention a en outre pour objet des compositions thérapeutiques, vaccinales, caractérisées en ce qu'elles incluent un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 illustre le traitement des données pour l'obtention du CAI (Codon Adaptation Index, tel que défini par Sharp et al., 1987, précité)et de l'AAH (Amino Acid Hyaropathy, tel que défini par Kyte et al, J. Mol. Biol., 1982, 157, 105-132) du gène 1150RF: la séquence nucléotidique du cadre de lecture ouvert du gène 1 1 5ORF est d'abord soumise à l'analyse par le logiciel DNA Strider'39 qui implémente les représentations graphiques du CM et de l'AAH; les domaines hydrophobes et les zones dont le CAI est abaissé sont ensuite déterminés graphiquement comme indiqué à la figure; - la figure 2 représente un vecteur d'expression préféré; - les figures 3, 4 et 5 présentent des collections d'oligonucléotides double-brin, adaptés aux organismes B suivants : la levure Saccharomyces cerevisiae (figure 3), l'insecte Bombyx mori et son baculovirus (figure 4), le champignon filamenteux Aspergillus nidulans (figure 5); - la figure 6 représente une stratégie de remise en phase de la séquence G, dans laquelle a été inséré un oligonucléotide bicaténaire, - la figure 7 représente une série d'oligonucléotides dérivés à partir du premier oligonucléotide de la figure 3 - la figure 8 présente une collection d'oligonucléotides double-brin codant un ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire en tige et boucle; et - la figure 9 illustre la structuration secondaire de la portion d'ARNm codée par l'oligonucléotide d'insertion LS.SASASA, tel que représenté à la figure 8. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Préparation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention à l'aide de la méthode 1 et expression d'une protéine P d'un organisme A (homme) dans un organisme B (levure). 1) détermination des zones H et Z (uniquement dans les cas où elles sont inconnues) - analyse d'un gène G, pour son index d'adaptation des codons (codon adaptation index ou CAI) en utilisant l'algorithme de SHARP et LI (NAR, 1987, 15, 1281-1295) et recherche dans la protéine P correspondante d'au moins une zone hydrophobe, en mesurant l'hydropathie des aminoacides (aminoacid hyaropathy ou AAH), en utilisant l'algorithme de Kyte et Doolittle (J. Mol. Biol., 1982, 157, 105-132). Ces deux algorithmes sont mis en oeuvre en utilisant le logiciel DNA Stridors (Marck C., NAR, 1988, 16, 1829-1836), en utilisant une largeur de fenêtre de 7 codons. Des pics hydrophobes positifs significatifs sont enregistrés lorsque les valeurs du AAH sont supérieures à 3,2 ou lorsqu'elles présentent une valeur supérieure à 1,6 et comprennent au moins 17 aminoacides. Des pics d'adaptation des codons négatifs significatifs sont enregistrés lorsqu'ils comprennent au moins 17 codons successifs dont le CAI est inférieur à la valeur moyenne du CAI pour l'ensemble du gène G. La figure 1 montre, à travers l'exemple du gène 1150RF, comment des pics hydrophobes (AAH) et des pics de baisse du CAI (Indice d'Adaptation du Codon) sont enregistrés. On a donc repéré, conformément aux méthodes exposées cidessus, les pauses +70 d'un gène G codant une protéine membranaire P dans l'organisme A d'origine (Homo sapiens). On désire exprimer G dans l'organisme B (S. cerevisiae). Dans le schéma ci-dessous se trouve la séquence protéique de la zone Z, 70 codons en aval d'un domaine transmembranaire. Elle est codée chez H. sapiens par la séquence d'ADN inscrite au-dessus, qui contient une majorité de codons rares. Deux possibilités a) soit il se trouve que ce sont aussi pour S. cerevisiae des codons rares en majorité, alors aucune modification n'est souhaitable, b) soit ce sont pour S. cerevisiae des codons favoris en majorité, alors cette séquence devra être modifiée en celle inscrite en-dessous pour contenir une proportion semblable de codons rares. Cet exemple a été construit avec la Table II de WADA et al. (N.A.R., 1990, 18 Suppl., 2401-2403). a) CTr CTT CAG ATA CGA CCG GAG TCG AAG CAA GAT CGT GAA CTT TTC CAG ATA oeG H. sapiens L L QI R P E S K Q DR EL F Q I A CTT CTr CAG ATA CGA CCG GAG TCG AAG CAA GAT CGT GAA CTT TTC CAG ATA GCG S. cerevisiae b) AGA CGT CAA ATT AGA CcA GAA TCT AAG CAA GAT AGA GAA AGA TTC CAA ATT GCT H. sapiens L L QI R P E SK Q DR E L F QI A AGG CGG CAG ATA AGG CCT GAG TCA AAG CAG GAC AGG GAG AGG TTC CAG ATA ccc S. cerevisiae 2) expression de ladite protéine P dans un organisme B Le gène G, dont la zone Z est modifiée comme précisé ci-dessus est introduite dans un vecteur d'expression, de préférence un vecteur navette S. cerevisiae-E.coli, contenant un promoteur transcriptionnel inductible de levure (pGALl ou pGAL10, par exemple). Le vecteur d'expression tel que défini à la figure 2 peut, par exemple, être utilisé. Ce vecteur est un vecteur d'expression navette levure/bactérie comprenant : oriC, une origine de réplication dans E. coli; bla, le gène de résistance à l'ampicilline, marqueur de sélection chez E. coli; URA3, marqueur de sélection par prototrophie à l'uracile chez S. cerevisiae, 2-micron, élément de réplication en multiples copies chez S. cerevisiae ; pGALl0, promoteur transcriptionnel du gène GALlO de S. cerevisiae, inductible par le galactose; tPGKl, terminateur transcriptionnel du gène PGKl de S. cerevisiae. Le promoteur GALLO et le terminateur tPGKl sont séparés par un site de clonage multiple, dans lequel une séquence nucléique selon l'invention est insérée dans la bonne orientation (ATG du côté promoteur), par des techniques standards (voir G.W. Gould, précité). Une souche de levure S. cerevisiae est transformée par ce vecteur. Par exemple, la méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par Ito et al. (J. Bacteriol., 1983, 153, 163-168). Dans ce cas, I'induction de l'expression de G est réalisée en ajoutant 3% de galactose à une culture dépourvue de glucose, qui réprimerait l'expression, même en présence de galactose. La maintenance du plasmide est assurée par une croissance du transformant sur milieu sélectif. Le marqueur de sélection étant URA3, dans cet exemple, le milieu sera dépourvu d'uracile. Dans ces conditions, I'expression de la protéine est significativement meilleure . on obtient à la fois un rendement amélioré de production/ciblage et d'insertion/assemblage dans la membrane de la protéine exprimée dans une cellule eucaryote hétérologue. EXEMPLE 2: Préparation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention à l'aide de la méthode 2 et expression d'une protéine P d'un organisme A (homme) dans un organisme B (levure). 1) préparation d'oligonucléotides double-brin, pour différents organismes eucaryotes B et expression de la protéine P. Pour la mise en oeuvre de la méthode 2 selon l'invention, il convient de disposer d'une table indiquant la fréquence des usages de codon, pour l'organisme B choisi. Cette table peut dériver d'une compilation des codons de toutes les phases ouvertes de lecture séquencées ou préférentiellement d'une compilation des codons des gènes les plus exprimés dans B. Les figures 3, 4 et 5 ont fait usage de la compilation établie par WADA et al. (Nucleic Acids Research, 1990, 18 supplement, 2401-2403 (leur table II)), portant sur l'ensemble des gènes séquencés. Pour chaque acide aminé codé par plus d'un triplet, on note les codons dont la fréquence est nettement inférieure (par exemple Les codons rares peuvent entrer dans la composition d'un oligonucléotide destiné à l'insertion en Z. Il doit s'en trouver au moins 2, éventuellement voisins de codons non rares si c'est nécessaire pour que l'oligonucléotide doublebrin possède les bonnes caractéristiques (propriétés des acides aminés). Le sens d'insertion de l'oligonucléotide double-brin ne peut être contrôlé, sauf dans le cas improbable où elle serait bordée par deux bouts cohésifs différents. Donc, en général, elle s'insère dans une orientation ou l'autre. Il est donc avantageux de présenter des oligonucléotides double-brin dont les deux brins portent des codons rares. Comme démontré ci-dessous sur un exemple, on retient donc préférentiellement les codons rares de la liste dont le triplet antiparallèle est aussi dans la liste. Enfin, on établit la séquence d'un oligonucléotide double-brin à partir de cette liste restreinte en lui conférant une caractéristique utile, souvent homogène (propriétés des acides aminés). Ce principe est généralement applicable, comme montré aux figures 3, 4, 5 et 7. Dans certains cas cependant, la liste restreinte ne comprend plus d'acides aminés d'un certain type et il faut revenir à la liste complète des codons rares pour former des oligonucléotides double-brin dont un brin seulement est utile et code ces acides aminés. Démonstration de la méthode sur un exemple: Acide aminé Codon Fréquence pour 1000 Codons rares Thr ACA 6,9 * ACC 21,8 ACG 5,9 * ACT 11,4 Total 46 Phe TTC 29,3 TTT 5,2 * Total 34,5 Glu GAA 17,5 GAG 26 Total 43,5 Lys AAA 9,2 * AAG 27,7 Total 36,9 Parmi les codons rares ainsi repérés, on remarque que AAA (Lys) et TTT (Phe) sont antiparallèles et donc susceptibles de participer à une séquence d'ADN dont les deux brins portent des codons rares. Les figures 3, 4 et 5 présentent des collections d'oligonucléotides double-brin, adaptés aux organismes B suivants : la levure Saccharomyces cerevisiae (figure 3), I'insecte Bombyx mori et son baculovirus (figure 4), le champignon filamenteux Aspergillus nidulans (figure 5). Dans ces figures, les différents oligonucléotides double-brin sélectionnés, à titre d'exemple non limitatif, contiennent 4 codons. ll y a lieu de noter, que les figures 3, 4 et 5 ne sont pas exhaustives mais uniquement représentatives : elles présentent des choix avantageux, du fait que les deux brins de chaque oligonucléotide double-brin présentent des codons rares et sont donc utilisables, sauf exception repérée par un signe * La figure 3 illustre une collection d'oligonucléotides d'ADN double-brin portant 4 codons rares pour Saccharomyces cerevisiae, comprenant les versions de base, dans le cas d'une insertion entre deux codons du gène G après clivage à bouts francs. Les autres versions correspondant aux autres cas de clonage peuvent en être dérivées comme indiqué à la figure 7. De plus, il est possible de dériver des versions plus longues ou plus courtes de ces oligonucléotides double-brin en ajoutant ou en enlevant des triplets à l'endroit marqué par Y , et éventuellement en combinant plusieurs oligonucléotides double-brins entre eux pour obtenir des caractéristiques mixtes pour les oligopeptides codés. Chaque oligonucléotide doublebrin est constitué de 2 oligodésoxyribonucléotides antiparallèles. Pour chacun de ces oligonucléotides simple-brin, la traduction des codons en acides aminés est indiquée sur une ligne voisine en code à 3 lettres. Sur cette ligne est portée entre parenthèses une mention sur le caractère de l'oligopeptide. Le code de chaque oligonucléotide est constitué des initiales de l'organisme B, suivi d'un point et du code à une lettre des acides aminés codés. Le suffixe .oxo indique qu'il s'agit d'une version de base. L'orientation des brins d'ADN est indiquée en notant le côté 5' Celle des oligopeptides est indiquée en notant le côté amino-terminal (N-t). La figure 4 illustre une collection d'oligonucléotides d'ADN double-brin portant 4 codons rares pour Bombyx mori, comprenant les versions de base, dans le cas d'une insertion entre deux codons du gène G après clivage à bouts francs. Les autres versions correspondant aux autres cas de clonage peuvent en être dérivées comme indiqué à la figure 7. De plus, il est possible comme décrit à la figure 3, de dériver des versions plus longues ou plus courtes de ces oligonucléotides double-brin en ajoutant ou en enlevant des triplets à l'endroit marqué par X. Par ailleurs, les notations selon cette figure 4 sont les mêmes que celles employées à la figure 3. Il y a simplement lieu de noter que * BM.RIRI contient 4 codons fréquents. n a été conservé dans cette liste car son brin antiparallèle BM.DTDT permet de disposer du seul oligonucléotide double-brin à caractère acide de cette collection. La figure 5 illustre une collection d'oligonucléotides d'ADN double-brin portant 4 codons rares pour Aspergillus nidulans, comprenant les versions de base, dans le cas d'une insertion entre deux codons du gène G après clivage à bouts francs. Les autres versions correspondant aux autres cas de clonage peuvent en être dérivées comme indiqué à la figure 7. De plus, comme précisé cidessus, les notations sont les mêmes que celles utilisées à la figure 3. Il y a toutefois lieu de noter que * AN.RTRT, AN.PTPT et AN.TFTF contiennent 4 codons fréquents. Ils ont été conservés dans cette liste car leurs brins antiparallèles AN. SGSG, AN. STST et AN.ESES permettent de disposer d'oligonucléotides double-brin à caractère polaire, acide ou permettant un tournant. Neuf cas peuvent se présenter selon le site exact de clivage par l'endonucléase. Évidemment, la connaissance de la séquence de G permet de distinguer entre ces cas et de choisir par avance une collection parmi les 9 collections d'oligonucléotides double-brin répondant aux 9 cas. Le site exact de clivage par l'endonucléase peut tomber à l'intérieur d'un codon. Comme un codon est constitué de 3 nucléotides, il existe 3 cas : il faut donc ajouter 0, 1 ou 2 nucléotides sur le côté gauche, et le complément à 3 sur le côté droit, pour respecter la phase de lecture. Il convient donc de prévoir 3 collections d'oligonucléotides double-brin comme décrites précédemment, pour s'adapter aux 3 cas. D'autre part, une manipulation supplémentaire peut se révéler nécessaire pour adapter les extrémités générées par clivage. Par exemple, une mise à bouts francs après clivage par une endonucléase qui génère des bouts cohésifs va introduire 2 ou 4 nucléotides en trop: il faut donc ajouter ou enlever 1 nucléotide pour respecter la phase de lecture, ou bien aucun nucléotide si cette manipulation supplémentaire n'a pas eu lieu. n convient donc de prévoir 3x3 collections d'oligonucléotides double-brin au total. La figure 6 illustre la stratégie de remise en phase de la séquence G, subissant l'insertion d'un oligonucléotide bicaténaire. La grande majorité des endonucléases de restriction coupent soit à bouts francs (cas 3, selon cette figure 6), soit à bouts cohésifs de longueur 2 (cas 2, selon cette figure 6) ou 4 (cas 1, selon cette figure 6). Ces 3 cas sont envisagés ici. La première étape est le clivage par l'endonucléase dans une zone Z, générant deux fragments d'ADN bicaténaires distincts. La seconde étape consiste en la remise à bouts francs des fragments par action de l'enzyme de Klenow (ou d'autres enzymes), nécessaires dans les cas 1 ou 2. La dernière étape est la ligature de l'oligonucléotide d'insertion entre les deux fragments générés. A supposer qu'un codon se termine dans la séquence G d'origine, sur le nucléotide n le cas 3 n'impose pas de remise en phase; les cas 1 et 2 imposent une remise en phase, comme indiqué ci-après: dans le cas 1, il convient d'enlever un nucléotide (ou d'en ajouter deux); dans le cas 2, il faut ajouter un nucléotide (ou en enlever deux). Si le codon se termine un ou deux nucléotides avant n I'oligonucléotide d'insertion doit être adapté comme montré à la figure 7 et expliqué ci-dessus. A la figure 6, * indique un nucléotide qui borde l'oligonucléotide d'insertion , N indique n'importe quel nucléotide n indique le nucléotide final d'un codon. La stratégie d'insertion de l'oligonucléotide double-brin selon l'étape (b), consiste à déterminer laquelle des 9 collections (par exemple figure 7) est adaptée au type et à la position du clivage envisagé sur le gène G. Ce choix découle directement de l'examen de la séquence G, comme expliqué ci-dessus et à la figure 6. Un oligonucléotide double-brin de cette collection (par exemple figure 3) peut sembler particulièrement adapté d'après les données dont on dispose sur le produit de G, comme expliqué ci-dessus. Cet oligonucléotide double-brin sera alors inséré dans la région proche de Z. Si le choix délibéré d'un oligonucléotide double-brin est délicat par manque d'information sur le produit de G, il est recommandé d'insérer tous les oligonucléotides double-brin de la collection, réunis en créant une banque de G mutés qui va servir à transformer ou transfecter B. Puis il faut rechercher parmi les transformants ou transfectants ceux qui expriment et assemblent le mieux le produit modifié de G dans les membranes, ce qui suppose d'avoir un test fonctionnel ou de détection. Le test fonctionnel a l'avantage d'informer sur la conservation d'activité par la protéine modifiée. En effet, si la protéine est mal caractérisée, on peut avoir altéré malencontreusement une région-clé de la protéine, qui serait alors inactivée. La détection du produit modifié de G peut être immunologique si des anticorps dirigés contre cette protéine sont disponibles. A défaut, on peut envisager de produire autant d'anticorps que d'oligopeptides décrits dans les figures 3, 4 ou 5 . Les oligonucléotides double-brin doivent alors être allongés pour coder un bon épitope et assurer une spécificité suffisante de reconnaissance par l'anticorps. Les oligopeptides dérivés comme à la figure 7 peuvent être, bien sûr, reconnus par l'anticorps dirigé contre la version de base correspondante. Il n'y a donc qu'une collection d'anticorps pour 9 collections d'oligonucléotides double-brin. Pour un transformant ou transfectant donné, une reconnaissance immunologique par un certain anticorps indique directement, non seulement que la protéine est exprimée et assemblée, mais aussi quelle modification exacte a été introduite avec succès. A titre d'exemple, à la figure 7, les 9 dérivés du premier oligonucléotide double-brin présenté à la figure 3, sont représentés. Les mêmes manipulations permettraient de générer les 9 dérivés des autres oligonucléotides double-brin de la collection. Selon que l'oligonucléotide double-brin doit être inséré en position 0, 1 ou 2 d'un triplet-codon du gène G, on choisit le dérivé .0 , .1 ou .2 . Selon que l'oligonucléotide double-brin doit être inséré dans un site clivé à bouts francs, ou à bouts cohésifs de 2 ou 4 nucléotides, on utilise le dérivé ~0 +1 ou -1 . De plus, il est possible de dériver des versions plus longues ou plus courtes de ces oligonucléotides double-brin en ajoutant ou en enlevant des triplets à l'endroit marqué par Z. Les notations employées sont identiques à celles de la figure 3. S'il y a ambiguïté sur l'acide aminé codé, toutes les possibilités sont indiquées à la suite en code à une lettre. N indique n'importe quel nucléotide. 2) Expression de la protéine P Lorsque des séquences d'acides nucléiques selon l'invention sont obtenues comme précisé ci-dessus, elles peuvent être exprimées, par exemple, dans une cellule de levure, comme précisé à l'exemple 1. EXEMPLE 3: Préparation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention à l'aide de la méthode 4 et expression d'une protéine P d'un organisme A (homme) dans un organisme B (levure). 1) Préparation d'oligonucléotides double-brin. Pour la mise en oeuvre de la méthode 4 selon l'invention, il est fait usage des règles issues de la thermodynamique présidant à la création sur un ARN d'une structure locale dite en tige et boucle . En résumé, les tiges sont les zones bicaténaires et nécessitent des appariements entre nucléotides successifs de l'ARN. Les appariements préférés sont entre A et U, et entre G et C. Un appariement moins favorable peut se faire entre G et U. Les boucles sont les zones monocaténaires fermant les tiges. A cause de contraintes de repliement, les boucles terminales ne peuvent être très courtes. Une longueur de 6 nucléotides est acceptable. On établit la séquence d'un oligonucléotide double-brin en lui conférant une caractéristique utile, souvent homogène en ce qui concerne les propriétés des acides aminés codés. La figure 8 illustre des exemples d'oligonucléotides d'insertion présentant des propriétés variées au niveau de l'oligopeptide codé, mais ayant en commun de permettre la formation d'une tige et boucle au niveau de l'ARNm (voir figure 9). Il y a lieu de noter que la figure 8 n'est pas exhaustive mais uniquement représentative. De plus, elle ne présente que les oligonucléotides de base, correspondant au cas où le clivage par l'endonucléase se fait à bouts francs entre deux codons. L'adaptation aux autres cas s'opère ainsi qu'expliqué à la figure 7 (voir exemple 2 et figure 7). De plus, il est possible de dériver d structure secondaire de l'ARNm dépend de ses propriétés et non de celles de son hôte. Comme précisé aux exemples 1 et 2, lorsque les séquences nucléiques ci-dessus sont obtenues, elles peuvent être exprimées par exemple dans une cellule de levure. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1") Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un gène G naturel ou recombiné (dénommé ci-après séquence G), codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A, comprenant au moins un domaine hydrophobe ou transmembranaire, lesquelles séquences d'acide nucléique comprennent en aval d'une zone H codant pour ledit domaine hydrophobe ou transmembranaire et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, apte à contrôler la vitesse de traduction de ladite protéine P dans un organisme eucaryote B hétérologue, dans lequel ladite protéine P est exprimée. 2") Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite zone Z contient au moins 2 codons rares pour l'organisme eucaryote B, dans lequel ladite protéine est exprimée. 3 ) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce ladite zone Z comprend au moins huit codons, dont au moins 25 % sont rares. 4 ) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite zone Z code une portion d'un ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm. 5 ) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite structure secondaire correspond à une bicaténarisation localisée de l'ARNm. 6 ) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que l'on obtient une structure locale dite en tige et en boucle , stable thermodynamiquement. 7 ) Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'organisme eucaryote A, organisme donneur du gène d'intérêt de la protéine à exprimer est sélectionné parmi l'ensemble des organismes eucaryotes. 8 ) Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'organisme eucaryote hétérologue B, organisme hôte ou receveur du gène d'intérêt de l'organisme A, exprimant la protéine correspondante est sélectionné parmi l'ensemble des organismes eucaryotes. 9 ) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit organisme B est, de préférence, sélectionné dans le groupe constitué par les levures (Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, etc.), les champignons filamenteux (Aspergillus, etc.), les cellules d'insectes (Bombyx infectés par le baculovirus, etc.), les batraciens (Xenopus, etc.) ou de mammifères (CHO, etc.). 10 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) modification de ladite zone Z, enfonction du biais des codons de l'organisme B, par remplacement d'au moins deux codons de ladite zone Z par le même nombre de codons rares pour l'organisme B, et (d) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui contient au moins 2 codons rares pour un organisme eucaryote B. 11") Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend le repérage du peptide-signal ou des domaines transmembranaires (D.H.) de la protéine P. 12") Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend la réalisation du profil d'hydropathie de la protéine P codée par la séquence G. 13 ) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend l'analyse de la séquence G en termes d'adaptation des codons, dans l'organisme A. 14") Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend la mesure de l'indice d'adaptation du codon ou la mesure d'un autre indice mettant en valeur le biais des codons ou le ralentissement de la traduction par les ribosomes. 15 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que la modification de la zone Z selon l'étape (c) est réalisée par l'insertion de mutations strictement silencieuses. 16 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin incluant au moins deux codons rares pour un organisme B, (d) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P et (e) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. 17 ) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape (d) d'insertion est réalisée à l'aide d'un des procédés suivants (dl) le clivage dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G de l'organisme A, à l'aide d'une endonucléase de restriction ayant un site unique ou rare dans Z et l'insertion de l'oligonucléotide double-brin obtenu en (c) au niveau dudit site clivé, par ligature appropriée ou (d2) I'insertion d'une séquence comprenant des codons rares par PCR ou par toute autre méthode de polymérisation convenable, si aucun site de restriction n'est présent dans la région de la zone Z. 18 ) Procédé selon la revendication 16 ou la revendication 17, caractérisé en ce que l'étape (e) d'obtention d'une séquence nucléotidique selon l'invention comprend: (el) le clonage de la séquence obtenue en (d) par introduction de ladite séquence dans un vecteur de clonage et d'expression pour l'organisme B; la séquence obtenue en (b) est liée opérationnellement à un promoteur actif dans l'organisme B, de manière à permettre son expression; I'ensemble est lié opérationnellement à un vecteur qui est réplicable dans B ; B est ensuite transformé ou transfecté par la construction obtenue ou (e2) I'amplification de la séquence obtenue par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou toute autre méthode d'amplification convenable. 19 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) modification de ladite zone Z, par remplacement de nucléotides par d'autres nucléotides, susceptibles de favoriser la bicaténarisation locale de l'ARNm résultant de la transcription de ladite zone Z et (d) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui code un ARNm susceptible de former dans l'organisme B une structure secondaire par bicaténarisation locale. 20 ) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce pour la mise en oeuvre de l'étape (c), la modification de ladite zone Z est réalisée par remplacement de quelques nucléotides qui, au niveau de l'ARNm transcrit, donne lieu à des appariements (A-U, G-C ou G-U) avec d'autres nucléotides de la même région, résultant en une structure secondaire locale stable. 21 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) détermination sur un gène de séquence G d'un organisme A, d'au moins une zone H codant pour un domaine hydrophobe d'une protéine sécrétoire ou membranaire P, (b) détermination sur ladite séquence G dudit organisme A, d'au moins une zone Z, située en aval de la zone H à une distance d'environ 50-85 codons et dans laquelle l'adaptation des codons est abaissée, (c) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin codant une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm, (d) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P, et (e) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. 22 ) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'étape (d) d'insertion est réalisée à l'aide d'un des procédés suivants (dl) le clivage dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G de l'organisme A, à l'aide d'une endonucléase de restriction ayant un site unique ou rare dans Z et l'insertion de l'oligonucléotide double-brin obtenu en (c) au niveau dudit site clivé, par ligature appropriée ou (d2) I'insertion d'une séquence codant pour une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm, par PCR ou par toute autre méthode de polymérisation convenable, si aucun site de restriction n'est présent dans la région de la zone Z. 23 ) Procédé selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape (e) d'obtention d'une séquence nucléotidique selon l'invention comprend: (el) le clonage de la séquence obtenue en (d) par introduction de ladite séquence dans un vecteur de clonage et d'expression pour l'organisme B; la séquence obtenue en (b) est liée opérationnellement à un promoteur actif dans l'organisme B, de manière à permettre son expression; I'ensemble est lié opérationnellement à un vecteur qui est réplicable dans B; B est ensuite transformé ou transfecté par la construction obtenue ou (e2) I'amplification de la séquence obtenue par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou toute autre méthode d'amplification convenable. 24 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (1) modification de ladite zone Z, enfonction du biais des codons de l'organisme B, par remplacement d'au moins deux codons de ladite zone Z par le même nombre de codons rares pour l'organisme B, et (2) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui contient au moins 2 codons rares pour un organisme eucaryote B. 25 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (1) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin incluant au moins deux codons rares pour un organisme B, (2) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P et (3) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. 26 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (1) modification de ladite zone Z, par remplacement de nucléotides par d'autres nucléotides, susceptibles de favoriser la bicaténarisation locale de l'ARNm résultant de la transcription de ladite zone Z et (2) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière, constituée d'un gène G naturel ou recombiné, codant pour une protéine P d'un organisme eucaryote A comprenant au moins un domaine hydrophobe, laquelle séquence d'acide nucléique comprend en aval de la zone H codant pour ledit domaine hydrophobe et à environ 50-85 codons de ladite zone H, une zone Z, qui code un ARNm susceptible de former dans l'organisme B une structure secondaire par bicaténarisation locale. 27 ) Procédé de préparation d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (1) préparation d'un oligonucléotide d'insertion, constitué par une séquence d'ADN double-brin codant une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire suffisamment stable pour inhiber transitoirement la progression du ribosome le long dudit ARNm, (2) insertion dudit oligonucléotide d'insertion double-brin obtenu en (c), dans ou aux alentours de la zone Z de la séquence G, lequel oligonucléotide, lorsqu'il est inséré, n'empêche pas l'expression de ladite protéine P, et (3) obtention d'au moins une copie d'une séquence nucléique selon l'invention, suivie éventuellement de l'amplification de cette dernière. 28 ) Procédé d'expression d'une protéine sécrétoire ou membranaire P dans un organisme hétérologue B et/ou méthode de contrôle de la vitesse de traduction de ladite protéine P, caractérisé en ce qu'il comprend (a) I'insertion d'une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans un vecteur d'expression convenable, (b) la transformation ou la transfection d'un organisme eucaryote B convenable par ledit vecteur d'expression, (c) la culture desdits organismes transformés ou transfectés, pour l'expression de ladite protéine sécrétoire ou membranaire et (d) selon les besoins, la purification, I'évaluation de la localisation ou l'utilisation in situ de ladite protéine sécrétoire ou membranaire. 29 ) Cassette d'expression obtenue en associant une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à des séquences régulant l'expression de ladite séquence d'acide nucléique, au moins dans un organisme eucaryote convenable, tel qu'une levure. 300) Vecteurs d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 29 et utilisables pour l'obtention des organismes eucaryotes B transformés. 31 ) Oligonucléotides d'insertion double-brin, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 ou 25, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 2 codons rares pour un organisme eucaryote B dans lequel une protéine P issu d'un organisme A, est exprimée et en ce qu'ils doivent de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion. 32 ) Oligonucléotides d'insertion double-brin, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 ou 27, caractérisé en ce qu'ils comprennent une séquence qui code au moins une portion d'ARNm susceptible d'acquérir une structure secondaire et en ce qu'ils doivent de plus coder des acides aminés choisis pour perturber le moins possible la région d'insertion. 33 ) Outils de détection de l'expression de la protéine sécrétoire ou membranaire dans l'organisme B, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les réactifs qui permettent de détecter la séquence G modifiée, tels que des oligonucléotides dont la séquence est celle d'un simple-brin d'un oligonucléotide d'insertion double-brin tel que défini aux revendications 31 ou 32 et les réactifs qui permettent de détecter la protéine exprimée, tels que des anticorps générés, séparément contre chacun des oligopeptides codés par lesdits oligonucléotides d'insertion double-brin. 34 ) Organisme eucaryote B, caractérisé en ce qu'il est transformé ou transfecté par un vecteur d'expression selon la revendication 30. 35 ) Compositions thérapeutiques, vaccinales, caractérisées en ce qu'elles incluent un vecteur d'expression selon la revendication 30.