Brevet FR2735126A1 — publié le 19961213

PROCEDE DE PREPARATION DES FORMES ENANTIOMERES DE L'ACIDE AMINO ALKYLAMINOPHENYL PROPANOIQUE La présente invention concerne un procédé de préparation d'une forme énantiomère de l'acide amino-2 (alkylamino-4 phényl)-3 propanoïque de formule générale dans laquelle Alk représente un radical alcoyle contenant 1 à 2 atomes de carbone et ses sels. La préparation de l'acide amirlo-2 (méthylamino-4 phényl)-3 propanoïque (2S) a été décrite dans la demande de brevet WO 94/08014 par action d'une N-méthyltransférase sur la p.amino-(L)-phénylalanine. Cependant elle ne serait pas exploitable industriellement en raison des rendements très faibles. La préparation d'acide amino-2 (méthylamino-4 phényl)-3 propanoïque rac2mique a été décrite par B.L. MOLDAVER et Z.V. PUSHKAREVA, Chem. Abstr., 55, 22226g ; de plus la spécificité de cette réaction ne garantit pas la production de composé N-monométhylé (en synthétisant le diéthyl p-diméthylaminobenzyl-N-acétylaminomalonate, on observe, après cristallisation, la présence d'un mélange de p-aminophénylalanine et de ses dérivés mono et diméthylé dans les eaux mères de cristallisation). Il a été maintenant trouvé que les formes énantiomères de cet acide peuvent être préparées directement à partir de la (L)-phénylalanine ou de la (D)-phénylalanine, selon que l'on souhaite obtenir respectivement la forme (S) ou (R) de l'acide, avec des rendements élevés et une bonne qualité de produit. Selon l'invention la (L) ou la (D)-phénylalanine, dont la fonction amine est éventuellement protégée, est nitrée, puis le radical nitro de la nitro-4 phénylalanine obtenue, de formule générale dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical protecteur, est transformé en un radical alcoylamino, après protection (si R est hydrogène), de la fonction amine de la phénylalanine. La nitration s'effectue par l'acide nitrique en milieu sulfurique, à une température comprise entre -10 et -200C. La protection du radical amino s'effectue selon les méthodes connues, par un radical protecteur R dont la mise en place et l'élimination n'altère pas le reste de la molécule. Notamment, on opère selon les méthodes décrites par T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, A. Wiley-Interscience Publication (1981), ou par Mc OMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973). De préférence le radical amino est protégé à l'état d'amide par un radical R = acyle, plus particulièrement par un radical acétyle ; ou bien le radical amino est protégé à l'état de carbamate par un radical R = alcoyloxycarbonyle. La transformation du radical nitro en un radical alcoylamino s'effectue par réduction alkylante lorsque le radical Alk est un radical méthyle ou éthyle, ou par réduction, formylation de l'amine obtenue et réduction subséquente du radical formylamino lorsque le radical Alk représente méthyle. La réduction alkylante est mise en oeuvre par hydrogénation, sous pression d'hydrogène en présence de nickel de Raney, en opérant dans le méthanol à une température comprise entre 20 et 400C et sous une pression comprise entre 100 et 200 kPa. L'alkylation est effectuée sous pression d'hydrogène par addition de benzaldéhyde puis de formaldéhyde dans le cas où Alk est un radical méthyle ou d'éthanal dans le cas où Alk est un radical éthyle. L'élimination du radical protecteur de l'amino et l'élimination du radical benzyle s'effectuent successivement. Lorsque le radical protecteur de 1 'amino est un radical acétyle, l'élimination s'effectue par traitement en milieu acide aqueux, notamment par l'acide chlorhydrique. Lorsque Alk est un radical méthyle ou éthyle, l'élimination du radical benzyle s'effectue par hydrogénation sous hydrogène en présence de palladium sur charbon en milieu acide aqueux, notamment l'acide chlorhydrique aqueux à une température comprise entre 50 et 600C et sous une pression comprise entre 100 et 200 kPa. Dans ce cas le dérivé de phénylalanine de formule générale (I) est obtenu sous forme de sel. Eventuellement il peut être libéré de son sel selon les méthodes habituelles qui n'altèrent pas le reste de la molécule. Lorsque l'on veut obtenir un dérivé de phénylalanine de formule générale (I) pour lequel Alk est méthyle par réduction puis formylation, la réduction du radical nitro s'effectue sur la nitro-4 phénylalanine de formule générale (II) dont la fonction amine est protégée par un radical R et dont la fonction acide a été préalablement protégée, en opérant en milieu réducteur comme par exemple par traitement par le zinc et le chlorure d'ammonium dans un mélange méthanol-eau. La formylation de l'amine obtenue s'effectue par l'acide formique, selon les méthodes habituelles de réaction d'un acide sur une amine, qui n'altèrent pas le reste de la molécule. Notamment on opère dans le tétrahydrofuranne à une température comprise entre 0 et 250C. La réduction du radical formylamino ainsi formé est effectuée avantageusement par les boranes. Par exemple on opère au moyen de borane methyl sulfure dans le tétrahydrofuranne, à une température inférieure à 250C. La protection de l'amine s'effectue comme décrit précédemment. La protection de la fonction acide carboxylique s'effectue selon les méthodes connues qui n'altèrent pas le reste de la molécule, notamment par estérification. L'élimination du radical protecteur de l'amine et du radical protecteur de l'acide sont effectuées simultanément par traitement en milieu acide aqueux notamment par l'acide chlorhydrique. Le produit de formule générale (I) peut être éventuellement purifié par des méthodes physiques telles que la cristallisation ou la chromatographie. Le produit préparé selon l'invention peut être soit obtenu directement sous forme de sel soit transformé en sel d'addition avec les acides, en sel métallique ou en sel d'addition avec les bases azotées selon les méthodes connues en soi. Ces sels peuvent être obtenus par exemple par action d'une base métallique (par exemple alcaline ou alcalino-terreuse), de l'ammoniac ou d'une amine sur un produit selon l'invention dans un solvant approprié tel qu'un alcool, un éther ou l'eau ou par réaction d'échange avec un sel d'un acide organique. Le sel formé précipite après concentration éventuelle de sa solution, il est séparé par filtration, décantation ou lyophilisation. Comme exemples de sels, peuvent être cités les sels avec les métaux alcalins (sodium, potassium, lithium) ou avec les métaux alcalinoterreux (magnésium, calcium), le sel d'ammonium, les sels de bases azotées (éthanolamine, diéthanolamine, triméthylamine, triéthylamine, méthylamine, propylamine, diisopropylamine, NN-diméthyléthanolamine, benzylamine, dicyclohexylamine, N-benzyl phénéthylamine, NN'-dibenzyléthylènediamine, diphénylènediamine, benzhydrylamine, quinine, choline, arginine, lysine, leucine, dibenzylamine), ainsi que les sels d'addition avec des acides minéraux (chlorhydrates, bromhydrates, sulfates, nitrates, phosphates) ou organiques (succinates, fumarates, maléates, méthanesulfonates, p.toluènesulfonates, iséthionates, tartrates, acétates, propionates, citrates, ou avec des dérivés de substitution de ces composés). La forme énantiomère de l'acide amino-2 (alkylamino-4 phényl)-3 propanoïque ainsi préparée par le procédé selon l'invention peut être utile en synthèse chimique. Notamment elle peut être utilisée dans la préparation de produits biologiquement actifs et plus particulièrement de dérivés de synergistines comme la pristinamycine IB ou le dérivé éthylamino correspondant, en opérant à partir d'une souche d'un microorganisme producteur de streptogramines possèdant au moins une modification génétique affectant la biosynthèse d'un précurseur des streptogramines du groupe B ; ladite souche mutante est cultivée dans un milieu de culture adéquat, complémenté avec le produit préparé selon l'invention, à titre de précurseur original autre que celui dont la biosynthèse est altérée. Les souches mises en oeuvre sont des souches productrices de streptogramines naturelles (pristinamycine, virginiamycine ...), mutées. Notamment, les souches mutantes possèdent une ou plusieurs modifications génétiques au niveau d'au moins un de leurs gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs des streptogramines du groupe B. Cette ou ces modifications génétiques altèrent l'expression dudit gène c'est-à-dire rendent ce gène, et le cas échéant un autre des gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs, partiellement ou totalement incapable de coder pour l'enzyme naturelle impliquée dans la biosynthèse d'au moins un précurseur. Les exemples suivants donnés à titre non limitatif illustrent l'invention. Exemple A une suspension de 200 g de (L)-phénylalanine dans 1660 cm3 d'eau à 200C sont ajoutés, sous agitation, 340 cm3 de triéthylamine. Le mélange est maintenu sous agitation à une température voisine de 200C pendant 30 minutes jusqu'à la solubilisation complète puis refroidi à 50C. A cette solution sont additionnés 126 cm3 d'anhydride acétique goutte à goutte en conservant une température interne voisine de 50C. En fin d'addition, le mélange est maintenu à 50C pendant une heure puis refroidi à OOC. A cette solution sont ajoutés goutte à goutte 200 cm3 d'une solution d'acide chlorhydrique à 36 % en maintenant la température voisine de OOC. En fin d'addition la suspension est agitée une heure à OOC, puis filtrée. Le précipité blanc obtenu est rincé par 400 cm3 d'eau, essoré, puis séché sous pression réduite (20 kPa) à environ 500C. On obtient ainsi 227 g d'acide acétamido-2 phényl-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide blanc fondant à 1600C. Préparation de l'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) A une solution agitée de 32,0 g d'acide acétamido-2 phényl-3 propanoïque (2S) dans 46,1 cm3 d'acide sulfurique à 90 % et refroidie à -150C, sont ajoutés goutte à goutte 6,4 cm3 d'acide nitrique à 100 % en maintenant une température du mélange voisine de -150C. A la fin de l'addition, la solution est maintenue à -150C pendant une heure supplémentaire puis portée à 400C, température à laquelle sont ajoutés 70,4 cm3 d'eau. En fin d'addition d'eau on laisse la solution revenir à une température voisine de 200C. Le précipité obtenu est filtré, rincé par 2 fois 3 cm3 d'eau, essoré puis séché sous pression réduite (20 kPa) à environ 500C. On obtient ainsi 18,2 g d'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide blanc se décomposant à 1910C. Préparation du dichlorhydrate de l'acide acétamido-2 ((N-méthylbenzylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) A 5,50 g de nickel Raney est ajoutée, à 200C sous agitation, une solution de 5,00 g d'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoique (2S) dans 100 cm3 de méthanol. La solution ainsi obtenue est purgée trois fois à l'azote puis trois fois à l'hydrogène avant d'être placée sous une pression d'hydrogène de 100 kPa sous agitation vigoureuse à une température voisine de 300C pendant 2,5 heures. A la solution ramenée à 25"C sont additionnés goutte à goutte 2,90 cm3 de benzaldéhyde. Le mélange est maintenu sous agitation et sous pression d'hydrogène de 100 kPa pendant 2 heures puis 1,65 cm3 d'une solution aqueuse de formaldéhyde à 35 % y sont ajoutés.L'agitation sous pression d'hydrogène est poursuivie encore 2 heures puis la solution est purgée à l'azote, filtrée sur clarcel avant d'être concentrée à sec sous pression réduite (20 kPa) à une température voisine de 400C. On obtient ainsi 6,06 g d'acide acétamido-2 ((N-méthylbenzylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide beige se décomposant à 1600C. Préparation du dichlorhydrate de l'acide amino-2 ((N-méthylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) A une suspension de 1,60 g d'acide acétamido-2 ((N-méthylbenzylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) dans 4,80 cm3 d'eau à 200C sont ajoutés sous agitation 9,60 cm3 d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 36 %. La solution ainsi obtenue est portée à reflux pendant 2,5 heures, ramenée à 20"C, puis coulée sur une solution de 0,16 g de palladium sur charbon à 5 % dans 1,60 cm3 d'eau.Le mélange ainsi obtenu est purgé trois fois à l'azote puis trois fois à l'hydrogène avant d'être placé sous une pression d'hydrogène de 100 kPa sous agitation vigoureuse à une température voisine de 500C pendant 2 heures puis ramené à 200C, filtré sur clarcel, rincé par 2 fois 5,00 cm3 d'eau avant d'être concentré à sec sous pression réduite (20 kPa) à une température voisine de 400C. Sur l'extrait sec sont ajoutés 12,90 cm3 de propanol-2. La suspension ainsi obtenue est portée à reflux pendant 1 heure, ramenée à une température voisine de 200C, filtrée, rincée par 3,00 cm3 de propanol-2, essorée puis séchée sous pression réduite (20 kPa) à environ 400C. On obtient ainsi 1,11 g du dichlorhydrate de l'acide amino-2 ((Nméthylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide beige se décomposant à 2080C. [ee = 96,5 % par chromatographie en phase liquide sur une phase stationnaire chirale composée d'un éther couronne imprégné sur silice (CROWNPAK CR j. Exemple2 Préparation de l'acide amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) A une solution agitée de 33,37 g de (L)-phénylalanine dans 56,1 cm3 d'acide sulfurique à 95 % et refroidie à -150C, sont ajoutés goutte à goutte 9,95 cm3 d'acide nitrique à 100 % en maintenant une température du mélange voisine de -160C. A la fin de l'addition, la solution est maintenue à -160C pendant 2,5 heures, 250 cm3 d'eau y sont ajoutés goutte à goutte en laissant la solution revenir à une température voisine de -100C, puis 180 cm3 environ d'une solution aqueuse de soude à 30% y sont ajoutés goutte à goutte jusqu'à pH = 4,70 en laissant la solution revenir à une température voisine de 250C.Le précipité obtenu est filtré, repris par 350 cm3 d'eau, porté à une température voisine de 500C pendant 0,5 heure, ramené à une température voisine de 200C, filtré, essoré puis séché sous pression réduite (20 kPa) à environ 400C. On obtient ainsi 24,35 g d'acide amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'Ln solide blanc se décomposant à 2300C. Préparation de l'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) A une suspension de 19,9 g d'acide amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) dans 78,6 cm3 d'eau à 200C sont ajoutés, sous agitation , 20,9 cm3 d'une solution aqueuse de soude à 30 %. Le mélange est maintenu sous agitation à une température voisine de 200C pendant 30 minutes puis refroidi à 50C. A cette solution sont additionnés 13,7 cm3 d'anhydride acétique goutte à goutte en conservant une température interne voisine de 5"C. En fin d'addition, le mélange est maintenu à 50C pendant 0,25 heure puis 9,5 cm3 d'une solution aqueuse de soude à 30 % sont ajoutés jusqu'à une complète solubilisation.A cette solution sont ajoutés goutte à goutte 26,0 cm3 d'une solution d'acide chlorhydrique à 36 % en laissant la température remonter à 150C. En fin d'addition la suspension est agitée 0,5 heure à 150C, filtrée, essorée, puis séchée sous pression réduite (20 kPa) à environ 40"C. On obtient ainsi 19,5 g d'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide blanc se décomposant à 1910C. L'acide amino-2 ((N-méthylamino)-4 phényl]-3 propanoïque (2S) peut être obtenu à partir de l'acide acétamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S), comme décrit à l'exemple 1. Exemple 3 Préparation du chlorhydrate de l'amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S): A une suspension de 177,4 g d'acide amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoïque (2S) dans 1800 cm3 de méthanol à OOC sont ajoutés goutte à goutte, sous agitation, 69,8 cm3 de chlorure de thionyle en maintenant la température du mélange entre 0 et 100C. En fin d'addition le mélange est porté à reflux pendant 6 heures. Sur le mélange à reflux sont ensuite additionnés 900 cm3 de propanol-2 puis distillés 1600 cm3 de méthanol. La suspension ainsi obtenue est ramenée à température ambianter maintenue une heure à l'ambiante sous agitation, filtrée, rincée par 180 cm3 de propanol-2, essorée puis séchée sous pression réduite (20 kPa) à environ 400C. On obtient ainsi 188,1 g de chlorhydrate de l'amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) sous forme d'un solide blanc fondant à 2180C. Préparation de l'éthanamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) A une suspension de 186,1 g de chlorhydrate de l'amino-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) dans 930 cm3 de tétrahydrofuranne à 20"C sous agitation sont ajoutés 83 cm3 d'anhydride acétique. Le mélange est ramené à 50C puis 241 cm3 de triéthylamine sont additionnés goutte à goutte de telle sorte que la température du mélange réactionnel soit maintenue inférieure à 200C. En fin d'addition le mélange est maintenu sous agitation à 200C pendant une heure puis refroidi à 50C. A 50C sont additionnés 460 cm3 d'eau. Le mélange est ramené à 200C, agité pendant 30 minutes à cette température puis décanté. La phase inférieure aqueuse est soutirée et la phase supérieure organique est coulée sur 2300 cm3 d'eau à 200C. Le mélange est porté à reflux et 600 cm3 de tétrahydrofuranne sont distillés. La suspension obtenue est ramenée à 200C sous agitation, filtrée, rincée trois fois par 200 cm3 d'eau, essorée puis séchée sous pression réduite (20 kPa) à environ 500C. On obtient ainsi 171,2 g d'éthanamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) sous forme d'un solide blanc cotoneux fondant à 1260C. Préparation de 1' l'(amino-4 phényl)-3 éthanamido-2 propanoate de méthyle (2S): A une suspension de 170,0 g d'éthanamido-2 (nitro-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S), 417,5 g de zinc en poudre et 850 cm3 de méthanol à 100C, sous agitation, est additionnée une solution de 341,6 g de chlorure d'ammonium dans 850 cm3 d'eau de telle sorte que la température du mélange soit maintenue inférieure à 25 CC. A 250C, la suspension est filtrée, rincée par 850 cm3 de méthanol puis rincée par 450 cm3 d'eau. Le filtrat et les deux lavages sont réunis, portés à reflux pour fractionner la totalité du méthanol puis ramené à température ambiante. A 200C sont ajoutés 2000 cm3 de dichlorométhane. Le mélange est agité à 200C pendant 30 minutes puis décanté. La phase inférieure organique est soutirée, séchée sur sulfate de sodium anhydre.Après filtration du sulfate de sodium, la solution est concentrée à 300C sous pression réduite (20 kPa) puis séchée sous pression réduite (20 kPa) à environ 250C. On obtient ainsi 123,4 g d' (amino-4 phényl)-3 éthanamido-2 propanoate de méthyle (2S) sous forme d'un solide jaune fondant à 1410C. Préparation de l'éthanamido-2 (méthanamido-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S): A 158 cm3 d'anhydride acétique à OOC sont additionnés goutte à goutte sous agitation 76,7 cm3 d'acide formique. La solution est ensuite chauffée à 500C pendant 2 heures puis ramenée à OOC, température à laquelle sont additionnés 150 cm3 de tétrahydrofuranne. A ce mélange est additionnée une solution de 148,6 g d'(amino-4 phényl)-3 éthanamido-2 propanoate de méthyle (2S) dans 1500 cm3 de tétrahydrofuranne de telle sorte que la température du mélange réactionnel soit maintenue inférieure à 100C. En fin d'addition, on laisse le mélange revenir à 250C, puis on ajoute 1500 cm3 d'eau. Le mélange est porté à reflux, le tétrahydrofuranne est fractionné puis le mélange est ramené à 250C et maintenu à cette température pendant 3 heures.La suspension obtenue est filtrée, rincée par 150 cm3 d'eau, essorée, séchée sous pression réduite (20 kPa) à 400C. On obtient ainsi 123,5 g d'éthanamido-2 (méthanamido-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) sous forme d'un solide beige fondant à 1260C. Préparation de l'éthanamido-2 [(N-méthylamino)-4 phényl]-3 propanoate de méthyle (2S) A une solution de 100,0 g dgéthanamido-2 (méthanamido-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) dans 3000 cm3 de tétrahydrofuranne à 200C sous agitation sont additionnés sous azote 378 cm3 d'une solution 2M de borane methyl sulfure dans le tétrahydrofuranne de telle sorte que la température du mélange réactionnel soit maintenue inférieure à 250C. En fin d'addition, l'agitation du mélange réactionnel est maintenue 1 heure à 250C puis 1000 cm3 de méthanol sont additionnés goutte à goutte. En fin d'addition du méthanol, le mélange est agité à 250C sous azote pendant 16 heures puis concentré sous pression réduite (20 kPa) à une température de 400C. En fin de concentration, on laisse revenir à 250C sous azote puis 1000 cm3 de dichlorométhane et 1000 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium sont additionnés. Le mélange est agité 30 minutes à 250C puis décanté. La phase organique inférieure est soutirée et séchée sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration du sulfate de sodium, la solution est concentrée à 300C sous pression réduite (20 kPa) à environ 350C. On obtient ainsi 95,1 g d'éthanamido-2 (N-méthylamino-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2S) sous forme d'un solide blanc fondant à 151 0C. Préparation du dichlorhydrate de l'acide amino-2 ((N-méthylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) Une solution de 95,0 g d'éthanamido-2 (N-méthylamino-4 phényl)-3 propanoate de méthyle (2s) dans 285 cm3 d'eau et 570 cm3 d'acide chlorhydrique à 36 % est portée à reflux pendant 5 heures puis concentrée. Au mélange concentré refroidi à 800C sont additionnés 900 cm3 de propanol-2. La suspension obtenue est maintenue à 800C pendant 2 heures puis ramenée à température ambiante. Le précipité est filtré, rincé deux fois par 200 cm3 de propanol-2, essoré puis séché sous pression réduite (20 kPa) à environ 400C. On obtient ainsi 77,5 g de dichlorhydrate de l'acide amino-2 ((Nméthylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S) sous forme d'un solide blanc fondant à 210 C. UTILISATION DE L ACIDE AMINO-2 ((N-METHYLAMINO)-4 PHENYL)-3 PROPANOIQUE Préparation de la pristinamycine 1B [4-méthylamino-dés(4-diméthylamino) pristinamycine IA] On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers, comme décrit ci-après, une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16 heures de 1 ml d'une solution à 10 g/l dans l'eau de l'acide amino-2 ((N-méthylamino)-4 phényl)-3 propanoïque (2S). Au terme de 40 heures de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66 % de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34 % d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volume de dichlorométhane.Les phases chlorométhyléniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30 g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de O à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la pristinamycine 1B sont regroupées et concentrées à sec. Le résidu sec est repris par 6 ml d'un mélange 65 % eau et 35 % acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7u C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 65 % de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 35 % d'acétonitrile. Les fractions contenant la pristinamycine 1B sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane.La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis concentrée à sec. On obtient 52 mg de pristinamycine 1B Spectre de R.M.N. 1 H (400 MHz, CDC13, 6 en ppm, ref. TMS): 0,71 (dd, J = 16 et 6 Hz, 1H, 5 (32) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 y) ; de 1,10 à 1,40 (mt, 2H: 3 ss2 et 3 2) ; 1,34 (d, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 1 y) ; de 1,50 à 1,85 (mt, 3H: 3 Y1 et CH2 2 ss) ; 2,03 (mt, 1H, 3 ss1) ; 2,22 (mt, 1H, 5 62) ; 2,33 (d large, J = 16 Hz, 1H: 5 61) ; 2,40 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 ss1) ; 2,82 (mt, 1H: 5 E2) ; 2,81 (s, 3H: 4 NCH3 en para du phényle) ; 2,90 (dd, J = 12 et 4 Hz, 1H: 4 ss2) ; 3,29 (s, 3H: 4 NCH3) ; de 3,20 à 3,45 et 3,60 (2 mts, 1H chacun:CH2 3 6) ; 3,40 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 ss1) ; 4,7 (dd, J = 7 et 8 Hz, 1H, 3 a) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 7 Hz, 1H: 5 e1) ; 4,83 (mt, 1H: 2a), 4,89 (d large, J = 10 Hz, 1H: laj ; 5,24 (dd, J = 12 et 4 Hz, 1H: 4 a) 5,32 (d large, J = 6 Hz, 1H: 5 a) ; 5,89 (d, J = 9 Hz, 1H: 6 a) 5,90 (q large, J = 7,5 Hz, 1H: 1(3) ; 6,53 (d, J = 9 Hz, 1H: NH 2) ; 6,53 (d, J = 8 Hz, 2H: 4e) ; 7,03 (d, J = 8 Hz, 2H: 46) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H: H Aromatiques 6) ; 7,46 (mt, 2H: 1' H5 et 1' H4) ; 7,85 (dd, J = 5,5 et 2 Hz, 1H: 1' H6) ; 8,44 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1) 8,76 (d, J = 9 Hz, 1H: NH 6) ; 11,63 (s, 1H: OH). Culture de la souche SP92::DVRC508 Le mutant SP92::pVRC508 a été cultivé en milieu de production liquide. La fermentation a été réalisée comme suit : 0,5 ml d'une suspension de spores de la souche précitée est ajouté en conditions stériles à 40 ml de milieu inoculum dans un erlenmeyer chicané de 300 ml. Le milieu inoculum est constitué par 10 g/l de Corn Steep, 15 g/l de saccharose, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de K2HP04, 3 g/l de NaCl, 0,2 g/l de MgSO4-7H20 et 1,25 g/l de CaC03. Le pH est ajusté à 6,9 par de la soude avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlenmeyers sont agités pendant 44 heures à 270C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 rpm. 2,5 ml de la culture précédente âgée de 44 heures sont ajoutés stérilement à 30 ml de milieu de production dans un erlenmeyer de 300 ml. Le milieu de production est constitué par 25 g/l de farine de soja, 7,5 g/l d'amidon, 22,5 g/l de glucose, 3,5 g/l de levure fourragère, 0,5 g/l de sulfate de zinc et 6 g/l de carbonate de calcium. Le pH est ajusté à 6,0 par de l'acide chlorhydrique avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlenmeyers sont agités à 270C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 rpm. REVENDICATIONS 1 - Un procédé de préparation d'une forme énantiomère de l'acide amino-2 (alkylamino-4 phényl)-3 propanoïque de formule générale dans laquelle Alk représente un radical alcoyle contenant 1 à 2 atomes de carbone, sous forme (S) ou (R), ainsi que de ses sels, à partir respectivement de la (L)-phénylalanine ou de la (D)phénylalanine, par nitration, puis transformation du radical nitro de la nitro-4 phénylalanine obtenue, de formule générale dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical protecteur, en un radical alcoylamino, après protection le cas échéant de la fonction amine de la phénylalanine. 2 - Utilisation de la forme énantiomère de l'acide amino-2 (alkylamino-4 phényl)-3 propanoïque pour la préparation de produit biologiquement actif. 3 - Utilisation de la forme énantiomère de l'acide amino-2 (alkylamino-4 phényl)-3 propanoïque, selon la revendication 2, pour la préparation de pristinamycine IB ou du dérivé éthylamino correspondant.