Brevet FR2741075A1 — publié le 19970516

Sous l'influence de processus physiologiques internes "peptides neurotransmetteurs" ou externes "radiations ionisantes et ultraviolettes", les cellules de ltépiderme, en particulier les kératinocytes germinatifs sécrètent des facteurs de croissance et de coopération cellulaire, dont le rôle est de stimuler les synthèses cellulaires des molécules du cytosquelette et d'activer les interactions cellulaires. Ces propriétés physiologiques se traduisent par une activation des métabolismes cellulaires indispensables à la régénération des tissus conjonctifs du derme et de l'épiderme et des processus de cicatrisation. La présente invention a pour objet la réalisation de molécules peptidiques, dérivés homologues des séquences peptidiques actives des facteurs de croissance et de coopération cellulaires, sécrétés naturellement par les kératinocytes. Parmi les dérivés peptidiques faisant l'objet de la présente invention figurent notamment des dérivés peptidiques et métallo-peptidiques dont les activités pharmacologiques sont orientées - d'une part, vers les synthèses cellulaires des molécules composant le cytosquelette telles que les collagènes de type I et III, les glycosaminoglycanes, les fibronectines, - d'autre part, vers la synthèse des molécules dont le rôle est de stimuler et d'activer les phénomènes de coopération et d'interaction cellulaire "endothélines, intégrines". Ces activités étant complémentaires et indispensables à l'expression au niveau du derme et de l'épiderme, des processus de restructuration des tissus, cicatrisation, angiogénèse, mélanogénèse, etc... Un des objets de la présente invention est l'utilisation des dérivés peptidiques et métallo-peptidiques précédents, pour le traitement en application par voie topique, de la cicatrisation des plaies chroniques, telles que les lésions ulcéreuses du diabétique, les ulcères variqueux, la cicatrisation esthétique des plaies chirurgicales, le traitement préventif et curatif des vergetures et de leurs complications. Dans les indications précédentes, les dérivés peptidiques peuvent être utilisés en thérapeutique humaine et vétérinaire sous forme de "pommades, gels, solutions ou de spray". Une des applications privilégiée de l'invention est l'utilisation des dérivés peptidiques dans les différents domaines de la cosmétologie, pour le traitement préventif et curatif des rides, du visage, du cou, et des mains, sous forme de lotions, gels, laits, crèmes, ou de spray, en application locale. Une autre application des dérivés peptidiques de l'invention est leur utilisation comme agent d'activation et de potentialisation des mécanismes physiologiques de coopérations cellulaires. Les dérivés peptidiques peuvent être utilisés seuls ou de préférence en association, avec des biomolécules ou composés naturels ou leurs dérivés de synthèse, dont l'activité biologique spécifique, ne peut s'exprimer pleinement, que par la collaboration entre deux systèmes cellulaires complémentaires dont ils stimulent ou induisent qu'un seul élément. C'est le cas, en particulier, des hormones mélanotropes qui induisent la mélanogénèse dans les cellules mélanocytaires et dont l'expression au niveau de la surface de l'épiderme humain (race blanche) ne peut s'exprimer pleinement que par l'intime coopération entre les cellules mélanocytaires et les kératinocytes, formant ainsi une véritable unité fonctionnelle dénommée "Epidermal Nielanin Unit". Les mélanocytes activés par l'aMSH et ses dérivés sécrètent la mélanine, qui est transférée et dispersée, dans les kératinocytes, sous l'influence des facteurs peptidiques de coopération cellulaire et de leurs dérivés homologues. Une des applications de la présente invention est l'utilisation des dérivés peptidiques, précédemment décrits, dans les différents domaines de la dermatologie et de la cosmétologie. Les dérivés peptidiques peuvent être utilisés seuls ou en association avec d'autres molécules actives, tels que les dérivés homologues de synthèse de l'aMSH, ou autres substances, sous la forme de crèmes, laits, lotions, solutions ou sprays, en applications topiques (locales), pour l'accélération des processus de mélanogénèse de l'épiderme, accélération de la mélanisation de la peau par obtention d'un bronzage naturel et d'une protection totale contre les radiations solaires (UV). Plus particulièrement la présente invention concerne des conjugués comportant une séquence peptidique comprenant au moins trois acides aminés choisis parmi Lys-Lys-Gly, Gly-His-Lys et Glu-His-Lys, dans laquelle "Lys" représente la Lysine ou un dérivé halogéné de la Lysine, ou un dérivé méthylé de la Lysine, notamment Méthyl-Lysine et Dihydrobromo-Méthyl-Lysine, les acides aminés pouvant être sous la forme D, L ou DL Ces acides aminés étant sous leur forme naturelle ou non, ladite séquence étant utilisée sous forme peptidique, ou conjuguée chimiquement ou physiquement avec au moins un composé sélectionné parmi 1) les acides monocarboxyliques de formule générale HOOC-R (I) dans laquelle R représente un radical aliphatique en C1 à C20 droit ou ramifié, substitué ou non, notamment un radical aikyl, alkényl ou alkynyl pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux choisis dans le groupe comprenant: NH2, OH, oxo ou un radical cyclique non aromatique comportant de 5 à 6 atomes dans le cycle dont 1 ou 2 pouvant être différents du carbone, en particulier, S, O ou N, lesdits cycles pouvant être substitués par des radicaux alkyl en C1 à C3, notamment métal, ainsi que les dérivés alcool ou aldéhyde ou amide des acides de formule l;; à la condition que si la séquence peptidique comprend uniquement Gly His-Lys, elle n'est pas conjuguée à un seul résidu d'acide palmitique Parmi les cycles pouvant être substitués, il faut citer les cycles correspondant à des dérivés de l'acide rétinoïque et de l'acide lipoïque. Dans certains cas, la chaine aliphatique peut consister en une chaine polyalkényl. Parmi les composés de formule I il faut citer de préférence les composés de formule: R2-CH=CH-COOH de configuration cis ou trans dans laquelle R2 est un radical alkyl en C6 à C16, comportant éventuellement un ou plusieurs substituants -NH2, OH ou oxo. 2) les acides dicarboxyliques de formule générale HOOC-R1COOH (I I) dans laquelle R1 représente un radical aliphatique divalent notamment en C3 å C lo, droit ou ramifié, substitué ou non, notamment un radical alkyl, alkylène, alkénylène ou alkynylène, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux NH2, OH, oxo ou un radical alkyl en C1 à C3. Dans la formule générale I, il faut citer plus particulièrement les composés dans lesquels R représente: - un radical monoinsaturé de configuration cis ou trans, de formule générale R2-CH=CHdans laquelle R2 représente un radical aliphatique notamment alkyl, linéaire ou ramifié comprenant au moins 6 atomes de carbone, de préférence 6 à 16 atomes de carbone, substitué par un groupe amino, hydroxy ou oxo - un radical alkyl linéaire ou ramifié en C1-C20 éventuellement susbtitué par un ou plusieurs substituants choisi parmi : amîno, hydroxy, oxo, thiol, imino, cycloalkyl en C4-C7, éventuellement substitué et si au moins 2 substituants sont présents, ils peuvent former ensemble une liaison, notamment un pont disulfure. Les peptides conjugués selon l'invention sont liés sous forme de sels, d'esters, ou d'amides à des acides possédant des fonctions métaboliques essentielles dans l'activation du cycle tricarboxylique de Krebs. Les acides de formule générale (I) ou (11) sont plus particulièrement choisis parmi les acides carboxyliques pour lesquels R1 représente un alkylène en C4-C8 substitué ou non, en particulier, les acides acétiques, adipiques, a-amino-adipiques et dérivés, I'acide DL lipoïque et dérivés, I'acide dihydrolipoique et son dérivé N-Lipoyl-Lysine, l'acide pimélique et dérivés, l'acide sébacique et dérivés. Les acides gras pour lesquels R représente un reste alkylène linéaire ou ramifié, sont plus particulièrement les acides hydroxydécénoïques et décénoïliques, les acides rétinoïques et ses dérivés, le Rétinal et le Rétinol, I'acide myristique et ses dérivés, et l'acide palmitique, sous forme de sels d'esters, ou d'amides. Des composés spécialement adaptés à l'obtention de conjugués selon l'invention sont choisis parmi l'acide acétique et ses dérivés, l'acide a-DL-Upoïque et ses dérivés, I'acide dihydrolipoïque, la N-Lipoyl-Lysine, I'acide adipique, l'acide a-amino-adipique, l'acide pimélique, l'acide sébacique et ses dérivés, l'acide trans-10-hydroxy-52-décénoïque et l'acide trans-oxo-9-decene-2-oïque, I'acide rétinoïque et ses dérivés, le rétinol, et le rétinal, l'acide myristique et l'acide palmitique. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des peptides inducteurs des synthèses endocellulaires des collagènes de type I et III et des glycosaminoglycanes, à haute activité cicatrisante et métabolique, ainsi que des molécules d'induction et de stimulation des processus de coopération cellulaire. Les conjugués peptidiques selon l'invention comprennent de préférence au moins une des séquences peptidiques suivantes Lys-Lys-Gly Gly-His-Lys Glu-His-Lys dans laquelle Lys représente la lysine ou un dérivé halogéné de la lysine, ou un dérivé méthylé de la lysine, notamment Méthyl-Lysine et Dihydrobromo-Méthyl-Lysine, les acides aminés pouvant être sous la forme D, L ou DL De préférence, les conjugués peptidiques répondent à l'une des formules générales suivantes A-X-Gly-His-Lys-Y (III), ou A-X-Glu-His-Lys-Y (IV) dans laquelle .A est un composé de formule générale I ou Il ou le radical correspondant à ce composé X peut représenter une chaine de 1 à 3 résidus Lys, éventuellement méthylée, en particulier à l'extrémité N terminale, OH, NH2 ou une liaison Y peut représenter OH ou NH2, les acides aminés étant sous forme D, L ou DL A est de préférence l'acide acétique, I'acide adipique, l'acide a-amino-adipique, l'acide DL lipoïque, I'acide dihydrolipoïque, la N-Lipoyl-Lysine, I'acide pimélique, I'acide sébacique, l'acide trans-oxo-9-décéne-2 oïque et l'acide trans-hydroxy-10-décéne-2-oïque. La présente invention concerne particulièrement les conjugués peptidiques suivants 1- A-MeLys-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2 2- A-MeLys-Lys-Gly-His-Lys-NH2 3- A-MeLys-Gly-His-Lys-NH2 4- A-MeLys-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH 5- A-MeLys-Lys-Gly-His-Lys-OH 6- A-MeLys-Gly-His-Lys-OH 7 - A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-N112 8 - A-Lys-Gly-His-Lys-NH2 9 - A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH 10- A-Lys-Gly-His-Lys-OH 11- A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-NH2 12- A-Lys-Glu-HiS-LYS-NH2 13- A-Glu-His-Lys-NH2 14- A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-OH 15- A-Lys-Glu-His-Lys-OH 16- A-Glu-His-Lys-OH A étant défini comme précédemment, ainsi que les dérivés de ces molécules sous forme de sels, d'esters, ou d'amides. Les séquences d'acides aminés, mentionnés ci-dessus peuvent être des séquences d'acides aminés naturels ou non naturels. Les conjugaisons selon la présente invention peuvent être effectués en faisant réagir la fonction amine ou acide de l'acide aminé avec une fonction amine ou acide de l'acide A, ou même il est possible de mettre à profit la présence d'une fonction hydroxy sur l'acide. La présente invention concerne l'ensemble de ces conjugaisons ainsi que les conjugués non fonctionnels. Les conjugués peptidiques précédemment décrits dans l'invention, peuvent être utilisés sous leur forme peptidique, ou liés avec un métal sous forme de complexes équimoléculaires. Le métal utilisé pour la réalisation des complexes métallo-peptidiques de l'invention est de préférence un métal divalent notamment le Zinc (Zn), qui peut être couplé sous forme de sel, avec le groupement carboxylique de l'amino-acide terminal, la lysine (Lys). De même, dans certains cas, il est possible que certains amino-acides comportent par exemple des fonctions de glycosylation. I1 doit être entendu que la présente invention concerne également l'ensemble de ces formes. Selon un autre aspect, I'invention concerne des compositions galéniques contenant au moins un conjugué peptidique tel que défini précédemment, avec des excipients cosmétologiquement et/ou pharmaceutiquement acceptables. La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation à titre de médicament d'un, ou plusieurs des conjugués et dérivés peptidiques décrits précédemment selon l'invention. La présente invention concerne également des préparations cosmétiques, contenant un, ou plusieurs conjugués et dérivés peptidiques décrits précédemment selon l'invention. La présente invention concerne également des compositions galéniques, pharmaceutiques et cosmétologiques, comprenant au moins un des composés tels que défini précédemment. Un des objets de la présente invention est l'utilisation par voie topique ou injectable des conjugués peptidiques et de leurs dérivés, composition ou association avec des principes actifs connus. Ces conjugués peptidiques, leurs dérivés, composition ou association, peuvent être présentés sous forme d'ampoules injectables lyophilisées, et sous forme de crème, gels, laits, lotions ou sprays, et comporter des excipients connus. Les conjugués peptidiques de l'invention, leurs dérivés, compositions, ou associations avec des principes actifs connus, sont utiles pour le traitement et la cicatrisation des plaies et lésions chroniques du diabétique, les ulcères variqueux, la cicatrisation des plaies chirurgicales, le traitement préventif et curatif des vergetures. Le conjugé pourra notamment être associé à au moins une substance choisie parmi les antiseptiques, les antibiotiques à large spectre antimicrobien, ou les antifongiques à large spectre d'activité, pour la préparation d'une composition destinée au traitement par voie topique et à la cicatrisation des plaies infectées. Selon un autre aspect, le conjugué peptidique peut être présenté sous forme d'associations ou de composés, avec des molécules connues pour leurs activités anticoagulantes et phlébotoniques par voie topique, destinées au traitement préventif et curatif, des vergetures, des insuffisances veineuses (jambes lourdes), de la couperose, en applications locales, sous forme de crèmes de gels, de laits ou de sprays. Une des applications préférentielle de l'invention est l'utilisation des conjugués peptidiques, comme adjuvants, activateurs ou cofacteurs, en association avec des molécules choisies parmi 1' aNlSH ou ses dérivés homologues, 1'ACTH ou la propiomélanocortine et leurs analogues dans des compositions destinées au traitement préventif et curatif des troubles de la mélanogénèse, à la stimulation de la mélanogénèse épidermique, en vue de l'obtention d'un bronzage naturel rapide et d'une protection totale contre les radiations solaires ultraviolettes (DEM). Une autre des applications préférentielles de l'invention est l'utilisation des conjugués peptidiques dans les différentes formulations cosmétologiques pour le traitement préventif et curatif des rides, du visage, du cou et des mains, sous forme d'émulsions, de crèmes, de laits, de lotions, de gels, ou de sprays en application locale. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples on se référera aux Figures suivantes Figure 1 : Intensité de fluorescence de fibroblastes marqués à la rhodamine : mise en évidence du collagène de type I. Figures 2 et 3 : Mise en évidence par mesure de l'intensité de coloration de la synthèse de collagène par des cellules traitées ou non par le conjugué n" 7. Exemple n" 1 - Synthèse du conjugué 7 A- Lys- Lys-Gly-His-Lys-NH2 A = Acide Adipique = COOH-(CH2)4-CC6H La synthèse a été réalisée par la méthode de Merrifield adaptée à la structure du conjugué selon les étapes suivantes Z-Gly-His-Lys-NH2 A une solution dans la diméthylformamide (10 mL) contenant Z-Gly-OH (2.08 g, 10 mmoles), BOP (4.42 g, 10 mmoles), de la diisopropyléthylamine (DIEA, 22 mmoles) est additionné sous agitation et à 0 C, le chlorhydrate de H-His-Lys-NH2 (2.1 g, il mmoles). Après 6 heures d'agitation à la température ambiante, le solvant de la réaction est évaporé sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (200 mL). La phase organique est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL), avec une solution saturée de KHSO4 (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous vide pour conduire à une mousse blanche (3.1 g, 91%) homogène en chromatographie sur gel de silice. Z-Lys( Boc)-Gly-His-Lys-NH2 Le composé Z-Gly-His-Lys-NH22 (3.45 g, 10 mmoles) est dissout dans l'éthanol 95 (100 mL) contenant 20 mmoles d'acide chlorhydrique. Le mélange réactionnel est hydrogéné pendant 5 heures. Le catalyseur est filtré et le solvant concentré sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu restant est trituré plusieurs fois avec de l'éther, décanté. I1 est séché sous vide en présence de KOH. Ce résidu est dissout dans la diméthylformamide (10 mL) en présence de Z-Lys(Boc)-OH, (3,81 g, 10 mmoles), BOP (4.42 g, 10 mmoles), de la diisopropyléthylamine (DIEA, 22 mmoles). Le mélange réactionnel est agité 30 min à 0 C, puis 4 heures à la température ambiante. Le solvant de la réaction est évaporé sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (200 mL). La phase organique est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL), avec une solution saturée de KHSO4 (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous vide pour conduire à une mousse blanche (4.7 g, 82%) homogène en chromatographie sur gel de silice. Z-Lys-( Boc)-Lys-( Boc)-Gly-His-Lys-NHz Le composé ZLys(Boc)-Gly-His-Lys-NH22 (5.7 g, 10 mmoles) est dissout dans l'éthanol 95 (150 mL) contenant 10 mmoles d'acide chlorhydrique. Le mélange réactionnel est hydrogéné pendant 5 heures. Le catalyseur est filtré et le solvant concentré sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu restant est trituré plusieurs fois avec de l'éther, décanté. I1 est séché sous vide en présence de KOH. Ce résidu est dissout dans la diméthylformamide (10 mL) en présence de Z-Lys(Boc)-OH, (3,81 g, 10 mmoles), BOP (4.42 g, 10 mmoles), de la diisopropyléthylamine (DIEA, 22 mmoles). Le mélange réactionnel est agité 30 min à 0 C, puis 6 heures à la température ambiante. Le solvant de la réaction est évaporé sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (300 mL). La phase organique est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL), avec une solution saturée de KHIS04 (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous vide pour conduire à une mousse blanche (6.5 g, 81%) homogène en chromatographie sur gel de silice. A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2 Le composé ZLys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-His-Lys-NH2 (8 g, 10 mmoles) est dissout dans l'éthanol 95 (200 mL) contenant 20 mmoles d'acide chlorhydrique. Le mélange réactionnel est hydrogéné pendant 5 heures. Le catalyseur est filtré et le solvant concentré sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu restant est trituré plusieurs fois avec de l'éther décanté. I1 est séché sous vide en présence de KOH. Ce résidu est dissout dans la diméthylformamide (10 mL) en présence d'acide adipique (2.1 g, 10 mmoles), BOP (4.42 g, 10 mmoles), de la diisopropyléthylamine (DIEA, 22 mmoles). Le mélange réactionnel est agité 15 min à O C, puis 5 heures à la température ambiante. Le solvant de la réaction est évaporé sous vide à une température inférieure à 40 C. Le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (200 mL). La phase organique est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL), avec une solution saturée de KHSO4 (2 x 50 mL), à l'eau (2 x 50 mL). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous vide pour conduire à une poudre blanche (7.5 g, 76%) homogène en chromatographie sur gel de silice. Ce composé est dissout dans l'acide trifluoroacétique (50 mL). Après 30 min, le solvant est concentré sous vide à une température inférieure à 40 C et le résidu trituré plusieurs fois avec de l'éther anhydre. La poudre blanche obtenue (6.9 g, 88%) est séchée sous vide. Adipoyl-Lys-Lys-Gly-Hîs-L's-NH2 Exemple n 2 - Synthèse du conjugué 8 A-Lys-Gly-His-Lys-NH2 A = Trans-l 0-Hydroxy-déc2-enoïc-acide La synthèse a été réalisée par la méthode de Merrifield adaptée selon les étapes suivantes et la méthodologie décrite à l'exemple n"l 1- Z-Gly-OH + H-His-Lys-NH2 2- Z-Gly-HiS-LYS-NH2 3- Z-Lys-(Boc)-Gly-His-Lys-NH2 4- A-BOP, DIEA, DNIF 5- Decenoyl-Lys-Gly-His-Lys-NH2 Préparation du complexe métallo-peptidique avec le Zinc. On utilise le sel de Zinc sous forme de Zncl2. Le conjugué peptidique précédemment obtenu est mis en solution à pH.56 dans l'eau distillée dans les proportions suivantes 1 molécule du conjugué n 8 dans une solution de Zncl2 à 10%. Après chauffage à 20 C pendant 10 mn, le complexe est purifié sur colonne de Biogel P-2 pour éliminer l'excès de chlorure de Zinc non fixé sur le peptide, et élué avec de l'eau distillée. Après élution, on obtient une solution contenant 0,5% ce Zncl2 pour une molécule peptidique. La solution est ensuite congelée à basse température "-60 C" et lyophilisée. On obtient le complexe métallo-peptidique sous forme de poudre blanche dont la formule est la suivante HO(CH2) ,-CH=CH-CC=Lys-Gly-His-Lys-Zn ou (Trans-i 0-hydroxy-dec2-enoïc-Lys-Gly-His-Lys-Zn) dont les caractères analytiques sont les suivants Caractères organoleptiques : Lyophilisat blanc soluble dans l'eau. Pureté HPLC: 95%. Spectrométrie de masse "hors Zinc" PM 636.46363.6 Composition en acides aminés (% hors Zinc) Lysine 42.95% Histidine 21,55% Glycine 8,97% Exemple 3 - Etude du pouvoir cicatrisant du conjugué peptidique n 7 chez l'animal "rat" But de l'étude Déterminer le pouvoir cicatrisant du peptide n' 7 administré chez le rat-OFA par applications topiques aux doses de 0,75 Fg, 7,5 zg et 75 Fg par animal pendant cinq jours. Matériel et méthode I - Animaux: rats de souche OFA, OF1, IFFA-CREDO, pesant de 250 à 300 g. II - Produits à tester Conjugué peptidique n 7, correspondant la formule Adipoyl-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2. Mis en solution dans le propylène glycol aux doses de 1,5 Fg/ml, 15 crg/ml, 150 Fg/ml. III - Méthode Après anesthésie générale à l'éther, une incision de 5 cm de long a été pratiquée sur la flanc droit des animaux. Une suture en fil trinyl 2/0 a été effectuée à raison d'un point tous les 0,5 cm. Les animaux traités comme les témoins ont subi la même intervention dans les mêmes conditions. Le traitement a débuté le lendemain de l'intervention sur les lots d'animaux traités aux doses de 0,5 ml de solution peptidique sur chaque incision. Soit 0,75 sXg, 7,5 sAg et 75 g de peptide par animal et par application pendant la durée du traitement, soit 5 jours. Les animaux ont été mis en observation pendant 9 jours, ils ont ensuite été sacrifiés par une dose létale de penthiobarbital. Les zones de peau en cours de cicatrisation ont été prélevées et soumises aux "tests" d'étirement au dynamomètre, pour mesurer la résistance de la cicatrice à l'étirement. Analyse statistique des résultats Une analyse statistique a été effectuée sur les valeurs de résistance obtenue au dynamomètre. Une analyse de variance et un test de "T" student a été pratiqué sur les valeurs individuelles, afin de définir le seuil de signification des résultats. Résultats Le peptide n"7, administré aux doses de 0,75 crg, 7,5 Fg et 75 ccg, par jour et pendant 5 jours consécutifs, aux animaux en expérimentation, augmente de façon hautement significative, la cicatrisation des plaies chez les animaux traites par rapport aux témoins, aux doses de: 0,75 Fg l'augmentation est de 14,5%, 7,5 pg l'augmentation est de 30,99X, 75 zg l'augmentation est de 59,6%. On observe en particulier une cicatrisation totale chez les animaux traités, à partir du 3ème jour, alors que les témoins ne présentent pas de signe visible de cicatrisation. L'aspect des cicatrisations au 9ème jour présente chez les animaux traités, une cicatrisation parfaitement plate, avec absence de bourrelets cicatriciels. Tableau n 1 Animaux traités par 0,75 pg/jour/5 jours par peptide formule n7 Résistance des cicatrices à l'étirement 'dynamométrie" Groupe Témoin Groupe Traité Animaux Dynes Animaux Dynes 894923 26,2 894918 28,5 894924 23,7 894919 26,1 894925 22,5 894920 29,3 894926 25,4 894921 27,7 894927 24,8 894922 28,6 Moyenne 24,5 +/- 1,5 Moyenne 28,0 +/- 1,2 Tableau n 2 Animaux traités par 7,5 Fg/jour/5 jours par peptide formule n7 Groupe Témoin Groupe Traité Animaux Dynes Animaux Dynes 894923 26,2 894928 32,6 894924 23,7 894929 30,4 894925 22,5 894930 33,1 894926 25,4 894931 32,3 894927 24,8 894932 31,8 Moyenne 24,5 +/- 1,5 Moyenne 32,0 +/- 1,0 Tableau n" 3 Animaux traités par 7,5 Fg/jour/5 jours par peptide formule n7 Groupe Témoin Groupe Traité Animaux Dynes Animaux Dynes 894923 26,2 894933 39,8 894924 23,7 894934 41,3 894925 22,5 894935 37,5 894926 25,4 894936 36,2 894927 24,8 894937 40,7 Moyenne 24,5 +/- 1,5 Moyenne 39,1 +/- 2,2 Conclusions Les résultats obtenus au cours de cette étude permettent de conclure que le peptide n 7 possède une action cicatrisante hautement significative. Pour les doses de 75 zg par jour pendant 5 jours la différence entre le groupe traité et le groupe témoin est de 59,6%. Exemple 4 - Mise en évidence de l'activité du conjugué n" 7 sur la synthèse de collagène de type I par des fibroblastes en culture La mise en évidence de l'influence du conjugué n 7 sur la synthèse de collagène de type I par des cellules en culture a été réalisée sur deux types cellulaires - des fibroblastes humains de plastie mammaire au 3ème passage, obtenus dans notre laboratoire de culture cellulaire à l'lEB, - des MRC5, fibroblastes de poumon embryonnaire humain non transformés au passage p38, obtenus à p 25-30 chez ICN FLOW. Les cellules sont stimulées ou non avec le conjugué n 7, puis elles sont observées au microscope photonique à fluorescence après révélation du collagène de type I par une réaction d'immuno-fluorescence secondaire. Matériel et méthode Culture cellulaire Les cellules sont ensemencées à raison de 70 000 cellules par ml pour les fibroblastes de primoculture et 20 000 pour les NlRC5. La culture est réalisée en DMENl 10% SVF dans les tubes de Leigton contenant une lamelle dans le fond du tube, volume final: 1,6 ml. 8 tubes sont prévus par type cellulaire : 3 témoins et 5 concentrations. Préparation des produits Préparation d'une solution mère du conjugué n 7 à 2,34 10-3 M: M1 M Vol de M Vol de PBS-BSA Vol M M2 2ml M1 2,68 ml 193 M M3 0,01 ml M2 1 ml 105 M M4 0,01 ml M3 1 mol 107 M M5 0,01ml M4 1 ml 109M Ces différentes solutions mères seront ajoutées au milieu de culture au moment du contact produit. Les dilutions sont réalisées dans du PBS (Eurobio) - BSA 0,1% (Flucka) puis filtrées sur filtres 0,22 m (Sartorius). Méthodologie A JO, le milieu est éliminé et remplacé par du milieu frais auquel est ajouté le conjugué n 7 aux différentes concentrations selon le tableau suivant C Concentration Vol milieu Vol M finale a 1( > 4M 1,5 ml 0,15 ml M2 C2 105M 1,5 ml 0,015 ml M2 C3 10-7 1,5 ml 0,015 ml M3 C4 10-9M 1,5 ml 0,015 ml M4 C5 10-7M 1,5 ml 0,015 ml M5 Les témoins TO et T ne reçoivent que du milieu. T1 est traité comme Ci. Fixation des cellules Le milieu est éliminé ; les tubes sont rincés 3 fois avec du DMEM sans sérum à 37 C. Les cellules sont fixées 20 mn à 4 C en présence de PFA 2,5% (Prolabo) dans du Hanks (Eurobio). 3 rinçages en DMEM sans sérum sont effectués suivis de 2 lavages 10 mn en PBS sans calcium ni magnésium (Eurobio). Marquage des cellules * Réaction primaire : fixation du premier anticorps de souris anticollagène humain de type I dilué au 1/100ème dans du PBS. Les lamelles sont sorties des tubes et séchées. La face portant les cellules est repérée et signalée (un angle est cassé pour repère). 100 ml d'anticorps primaire sont mis au contact des cellules pour les conditions C1 à C5. Les lamelles T et T1 restent dans les tubes avec du PBS sans calcium ni magnésium car ce sont des témoins pour le deuxième anticorps. Les lamelles sont placées en chambre humide pour éviter la déshydratation à +4 C sous agitation douce durant toute la nuit. * Réaction secondaire : cette étape révèle la réaction primaire par un anticorps secondaire de chèvre anti-lg G de souris marqué TRITC Sigma réf. T-7782 lot 044H483 1. L'anticorps primaire est éliminé et les lamelles sont lavées 2 fois au PBS pendant 10 mn à température ambiante. Puis un lavage en PBS 0,1% BSA est réalisé 10 mn supplémentaires. 100 ml d'anticorps secondaire dilué au 1/120ème sont mis au contact des cellules de toutes les lamelles à température ambiante durant 1 heure. L'anticorps est ensuite éliminé et les lamelles sont lavées au PBS 0,1% BSA 10 mn, puis 4 fois 5 mn à l'eau osmosée. Une fois séchées les lamelles sont montées côté cellules sur une lame de microscopie contre une goutte de liquide de montage (Sigma). Les bords des lamelles sont lutés au vernis. Résultats Les observations microscopiques sont réalisées sur un microscope droit à fluorescence Zeiss (Axioplan), surmonté d'une caméra 3 CCD Sony (MC-3215 P/M) reliée à un moniteur vidéo Trinitron avec écran couleur Sony. L'ensemble est connecté à une imprimante couleur Sony (UP-7000p). Les observations des lames sont faites avec l'objectif Plan Apochromat x 63 à l'huile. Les cellules sont d'abord observées en contraste interférentiel et/ou de phase. Quand un champ est sélectionné, l'image est enregistrée, puis sans bouger d'endroit l'observation est réalisée en fluorescence et enregistrée. Ainsi pour chaque prise de vue nous disposons simultanément à l'écran ou superposées les 2 images mémorisées. Conclusions Comme le montre l'ensemble de ces résultats, le conjugué n 7 à 10-11 M stimule très significativement la synthèse de collagène de type I par des fibroblastes de primoculture. La couleur rouge indique la fixation des anticorps secondaires marqués à la rhodamine sur les anticorps anti-collagène de type I. Cette couleur témoigne donc de la présence de collagène de type I synthétisée par les fibroblastes en culture. La luminosité moyenne du rouge sur l'ensemble de l'image des cellules traitées avec le conjugué n" 7 à 10-1 1 b1 est de 54,8 alors que pour les cellules non traitées elle n'est que de 32,78. Le conjuguée n" 7 stimule la synthèse de collagène de type I par les fibroblastes humains de primocultures de manière significative : +67%. Les résultats non présentés ici, obtenus sur les MRC5 donnent les mêmes tendances. (Voir figures 1 à 3). REVENDICATIONS 1. Conjugué peptidique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 3 acides aminés choisis parmi Lys-Lys-Gly, Gly-His Lys et Glu-His-Lys, dans laquelle "Lys" représente la Lysine ou un dérivé halogéné de la Lysine, ou un dérivé méthylé de la Lysine, notamment Méthyl-Lysine et Dihydrobromo-Méthyl-Lysine, les acides aminés pouvant être sous la forme D, L ou DL, ladite séquence étant conjuguée chimiquement ou physiquement avec au moins un composé sélectionné parmi - les acides monocarboxyliques de formule générale HOOC-R ( I ) dans laquelle R représente un radical aliphatique en C1-C20, linéaire ou ramifié, éventuellement substitué, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, ainsi que les dérivés alcool ou aldéhyde ou amide des acides de formule I; à la condition que si la séquence peptidique comprend uniquement Gly His-Lys, elle n'est pas conjuguée à un seul résidu d'acide palmitique; - les acides dicarboxyliques de formule générale HOOC-R1CoeH (Il) dans laquelle R1 représente un radical aliphatique divalent, comprenant au moins 3 atomes de carbone, de préférence 3 à 10 atomes de carbone, droit ou ramifié, notamment un radical alkyl, alkylène, alkénylène ou alkynylène, pouvant comporter une ou plusieurs insaturations éventuellement substitué, notamment par un ou plusieurs groupes amino, hydroxy, oxo ou un radical aikyl en C1-C3. 2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la formule générale I, R peut représenter - un radical monoinsaturé de configuration cis ou trans, de formule générale R2-CH=CHdans laquelle R2 peut représenter un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant au moins 6 atomes de carbone, de préférence 6 à 16 atomes de carbone éventuellement, substitué par un groupe amino, hydroxy ou oxo;; - un radical aliphatique linéaire ou ramifié en C1-C20 substitué ou non, notamment un radical aikyl, alkényl ou alkynyl pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux choisis dans le groupe comprenant NH2, OH, oxo, thiol ou un radical cyclique non aromatique comportant de 5 à 6 atomes dans le cycle dont 1 ou 2 pouvant être différents du carbone, en particulier, S, O ou N, lesdits cycles pouvant être substitués par des radicaux alkyl en C1 à C3, notamment méthyl. 3. Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que lorsque R représente une chaine aliphatique en C1-C20 elle peut être susbtituée par un cycle choisi parmi 4. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la formule II, R1 représente un reste alkylène en C4-C8 éventuellement substitué. 5. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés est liée à l'acide de formule I ou Il ou à son dérivé sous forme de sel, d'ester ou d'amide. 6. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'acide de formule générale I est choisi parmi l'acide acétique, I'acide DL lipoïque, I'acide dihydrolipoïque, la N-lypoyl-lysine, les acides hydroxydécénoïques et décénoïliques, I'acide rétinoïque et ses dérivés, le rétinal et le rétinol, I'acide myristique et ses dérivés, I'acide palmitique, sous forme de sels, d'esters ou amides, et en ce que l'acide de formule générale Il est choisi parmi l'acide adipique, I'acide a-amino adipique, I'acide pimélique, I'acide sébacique et leurs dérivés. 7. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les acides de formules générales I ou Il sont de préférence choisis parmi l'acide acétique et ses dérivés, I'acide a-DL-Lipoïque et ses dérivés, I'acide dihydrolipoïque, la N-Lipoyl-Lysine, I'acide adipique, I'acide a-amino-adipique, l'acide pimélique, l'acide sébacique et ses dérivés, l'acide trans- 10-hydroxy-A2-décénoïque et l'acide trans-oxo-9-decene-2-oïque, I'acide rétinoïque et ses dérivés, le rétinol, et le rétinal, I'acide myristique et l'acide palmitique. 8. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il présente la formule générale A-X-Gly-His-Lys-Y (III), ou A-X-Glu-His-Lys-Y (IV) dans laquelle . A est un composé de formule générale I ou Il, ou le radical correspondant . X peut représenter une chaine de 1 à 3 résidus Lys, éventuellement méthylés, OH, NH2 ou une liaison . Y peut représenter OH ou NH2, les acides aminés étant sous forme D, L ou DL 9.Conjugué selon l'une des revendications de 1 à 8 caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les dérivés peptidiques suivants 1- A-MeLys-Lys-Lys-Glq-His-Lys-NHz 2- A-MeLys-Lys-Gly-His-Lys-NH2 3 - A-MeLys-Gly-His-Lys-NH2 4- A-MeLys-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH 5- A-MeLys-Lys-Gly-His-Lys-OH 6 - A-MeLys-Gly-His-Lys-OH 7- A-Lys-Lys-Gly-His-L > 's-NH2 8- A-Lys-Gly-His-Lys-NH2 9- A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH 10- A-Lys-Gly-His-Lys-OH 11 - A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-NH2 12- A-Lys-Glu-His-Lys-NH2 13- A-Glu-His-LYS-NH2 14- A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-OH 15- A-Lys-Glu-His-Lys-OH 16- A-Glu-His-Lys-OH "A" étant un acide de formule générale I ou Il telles que définies dans les revendications de 1 à 7, ainsi que les dérivés de ces molécules sous forme de sels d'esters ou d'amides. 10. Conjugué selon l'une des revendications de 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est sous forme de complexes métallopeptidiques liés physiquement ou chimiquement à un sel de Zinc. 11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un conjugué selon l'une des revendications 1 à 10 avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. 12. Composition galénique pharmaceutique, comprenant au moins un des conjugués peptidiques selon l'une des revendications 1 à 10, présentées sous forme de pommades, de crèmes dermiques, de gels, de lotions et de sprays, destinés à la médecine humaine et vétérinaire pour le traitement et la cicatrisation des plaies. 13. Composition galénique pharmaceutique, comprenant au moins un conjugué peptidique, selon l'une des revendications de 1 à 10, caractérisée en ce que le conjugué est associé à au moins une substance choisie parmi les antiseptiques, les antibiotiques à large spectre antimicrobien, ou les antifongiques à large spectre d'activité, destinée au traitement par voie topique et à la cicatrisation des plaies infectées. 14. Composition galénique à usage pharmaceutique et cosmétologique, comprenant au moins un des conjugués peptidiques selon les revendications de 1 à 10, présenté sous forme d'associations ou de composés, avec des molécules connues pour leurs activités anticoagulantes et phlébotoniques par voie topique, destinées au traitement préventif et curatif, des vergetures, des insuffisances veineuses (jambes lourdes), de la couperose, en applications locales, sous forme de crèmes de gels, de laits ou de sprays. 15. Composition galénique à usages pharmaceutiques et cosmétologiques, comprenant au moins un des conjugués peptidiques selon les revendications de 1 à 10 utilisés seuls, ou sous forme d'associations, de composés, ou de complexes, avec des molécules connues pour leur dérivés homologues de l'aMSH, de l'ACTH, et de la proopiomélanocortine, présentées sous forme de crèmes, de gels, de laits, de lotions ou de sprays, pour applications topiques, et destinées au traitement préventif et curatif des troubles de la mélanogénèse, à l'accélération de la mélanisation de l'épiderme, et à l'obtention d'un bronzage cutané naturel, et d'une protection totale contre les radiations solaires ultra-violettes (UVA-UVB). 16. Conjugué peptidique selon l'une des revendications 1 à 10, pour son utilisation à titre de médicament. 17. Composition cosmétologique contenant au moins un conjugué selon l'une des revendications 1 à 10 présentées sous forme de crèmes, de gels, de lotions, ou de sprays, pour applications par voie topique destinées au traitement préventif et curatif des rides du X visage, du cou et des mains.