Brevet FR2739622A1 — publié le 19970411

La présente invention a pour objet des protéines d'Hélicobacter pylori nouvellement obtenues sous forme substantiellement purifiées, ainsi que les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. H. pylori est une bactérie à gl-am négatif retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori. II apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à H. pylori. Un tel vaccin serait très probablement de nature sous-unitaire. Différentes protéines d'H. RJ-InvIi ont été caractérisées ou isolées à ce jour. Il s'agit notamment de l'uréase, composée de deux sous-unités A et B de 30 et 67 kD respectivement , de la cytotoxine vacuolaire de 87 kD (VacA) , d'un antigène immunodominant de 128 kD associe à la cytotoxine , des heat shock protéines HspA et HspB de 13 et 58 kD respectivement , d'une catalase de 54 kD , d'une hémaglutinine fibrillaire (HpaA) de 20kD , d'une protéine de 15 kD riche en histidine (Hpn) , d'une protéine de la membrane externe de 30 kD , ainsi que d'une famille de porines HopA, HopB, HopC et HopD, de poids moléculaires compris entre 48 et 67 kD. Certaines de ces protéines ont déjà été proposées comme antigènes vaccinaux potentiels. Il reste que la recherche de nouveaux antigènes doit être poursuivie, notamment dans la mesure où l'on prévoit que, pour obtenir un effet vaccinal optimisé, plusieurs antigènes devront être vraisemblablement incorporés dans un vaccin. C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori, et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS apparaît de l'ordre de 76 54, 50 ou 30 kD. Lorsque la protéine a un poids moléculaire d'environ 54 kD on précise en outre qu'elle ne réagit pas avec un ante sérum anti-catalase Un antisérum anti-catalase d'H. pylori peut être notamment préparé selon le procédé d'immunisation décrit dans l'Exemple 5 ci-après, en utilisant une préparation de catalase obtenue par chromatographie, tel que décrit dans l'Exemple 6. Par "forme substantiellement purifiée", on entend une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et pèriplasmiques d'H. pylori. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD est susceptible d'être obtenue pal- Lin procêde dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation, (iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend milieu aqueux, avantaU,eusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14, (iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0,1 - 0,5 M, avantageusement en tampon carbonate pH 9.5 à o, % % de zwittergent 3-14, (v) on récupère la traction cluse en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M, avantageusement en tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 0,25 - 0,35 M est d'abord dialysée contre du tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14); et (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0, I 5 - 0,2 M. La protéine membranaire de 76 kD a pour fonction biologique présumée d'être une porine, vraisemblablement située au niveau de la membrane externe. Exner et al, Infect. Immun. (Apr.1995) 63 . 1567 caractérise une famille de porines qui chacunes présentent en electrophorèse de SDS-Page, un profil de migration différent selon qu'elles ont été chauffées à 95 C (procédé conventionnel) ou non Tel n'est pas le cas pour ce qui concerne la protéine de 76 kD selon l'invention, en eflbt sa migration sur gel n'est pas modifiée avec un échantillon chauffé à 60 C et non à 950C La séquence N-terminale de la protéine de 76 kD est comme suit (code une lettre) EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 54 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pyh i par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1% suivie dune centrifugation (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation, (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation, (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0 - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pli 9,5 à 0,1 0,o de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en NaCI 1M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI 1M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HCl pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI l M est d'abord dialysée contre du tampon Tris-HCI pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3 14) , et (vii) on récupère la fraction éluée en NaCI O, 1 - 0,25 M. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 50 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside I%, suivie d'une centrifugation, (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation, (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation, (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (v) on soumet la fi-action membranaire a une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépllal-ose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en NaCI 1M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI IM que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - O,sNi, avantageusement en tampon Tris-HCl pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est d'abord dialysée contre du tampon Tris-HCl pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3 14) , et (vii) on récupère la fi-action éluee en NaCI 0,3 - 0,4 M. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 30 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14, (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0 - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,28 - 0,35M, que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5N1, avantageusement en tampon Tris-HCl pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est d'abord dialysée contl-e du tampon Tris-HCl pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3 14), et (vii) on récupère la fi-action correspondant à l'éluat direct (absence de NaCI). Les protéines de 54, 50 et 30 kD selon l'invention sont vraisemblablement des protéines membranaires intrinsèques. La proteine de 54 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase, ni en western blot, ni en dot blot La protéine de 30 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-sous unité A de l'uréase, ni en western blot, ni en dot blot. Selon un mode particulier, les protéines selon l'invention peuvent être notamment obtenues par purification à partir d'H. /))'/()J'i ou exprimées par voie recombinante dans un système hétérologue. Dans ce demier cas, les protéines peuvent présenter des modifications post traductionnelles qui ne soient pas identiques à celles des protéines correspondantes issues de la souche d'origine L'invention a aussi pour objet une protéine i.cr. d'H. pylori ou un polypeptide sous forme substantiellement purifiée, qui est capable d'être reconnu par un antisérum ou d'un anticorps monoclonal établi à l'encontre d'une des protéines précédemment décrites.Pour ce qui concerne les polypeptides, il s'agit notamment de polypeptides dérivés d'une protéine selon l'invention par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, e.g. par délétion. Enfin l'invention concerne également une composition pharmaceutique notamment destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à E1. pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'invention, I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique , I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une intèction à H. pylori , ainsi q'une méthode de prévention ou de traitement d'une infection à H. pylori, selon laquelle on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle.En particulier on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration. De manière plus détaillée, on propose a titre d'exemple, d'administrer une protéine ou un polypeptide selon l'in'ention par voie orale A cet effet, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut etre encapsulee selle ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 53). La protéine peut également etre encapsulée dans des microsphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit ailleurs (Eldridge et al, Curr. Top Microbiol. Immuno (19S9) 146 59-66) la protéine peut également être incluse dans des liposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes a practical approach, Ed. RRC New, D. Rickwood & B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1) Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est de l'ordre de 1 à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines. Alternativement, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être administré par voie parentérale. Pour ce faire, une protéine ou un polypeptide selon l'invention est adsorbée sur gel d'alumine de faucon toit à fait conventionnelle. La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,5 est mise en contact pendant l heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré à AL- La composition finale de la préparation est la suivante protéine à activité catalasique 50 tig/ml, AL+++ 250 g/ml, merthiolate 1/10 000, le tout en PBS. Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées chacune espacée de 4 semaines de la précédente L'invention est illustree ci-apres par référence aux figures suivantes La Figure I est un schéma récapitulatif du protocole de préparation des fractions membranaires I, II et III d'H. pylori. La Figure 2 présente l'analyse des fi-actions membranaires I, II et III par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. Les échantillons déposées sont la fraction membranaire I (colonne 2), la fraction membranaire II (colonne 3), la fraction membranaire 111 (colonne 4) et les marqueurs de poids moléculaire (colonne 1). La Figure 3 présente l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, des protéines purifiées à partir d'un gel préparatif (colonnes 3 à 7) Les échantillons deposés sont la fraction HpPI (colonne 3), la fraction HpP2 (colonne 4), la fraction HpP4 (colonne 5), la fraction HpP5 (colonne 6), la fraction HpP6 (colonne 7), les marqueurs de poids moléculaire (colonnes I et 8) et la fraction membranaire I (colonne 2) La Figure 4 présente l'analyse des fractions issues du passage sur DEAE Sépharose, des fractions 7 et 9 (obtenues après elution sur Q Sépharose). Les fractions ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% ou 12,5% et colorées au bleu de Coomassie.Les échantillons déposés sont la fraction 7 (colonne 2A), la fraction 7.1 (colonne 3A), la fraction 7 2 (colonne 4A), la fraction 9 (colonne 2B), la fraction 9.1 (colonne 3B), la fraction 9.2 (colonne 4B), la fraction 9.3 (colonne 5B) et les marqueurs de poids moléculaire (kDa) (colonne I A et I B) La Figure 5 présente, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, le profil électrophorétique de la fraction D issue de la chromatographie sur colonne de Q-Sépharose de la fraction membranaire III (colonne 3) et de la fraction D' issue de la chromatographie sur colonne de S-Sépharose de la fraction D (colonne 4). La colonne 1 correspond aux marqueurs de poids moléculaire et la colonne 2, à la fraction membranaire III. EXEMPLE I - Préparation des fractions membranaires 1A- Culture La souche H. pylori ATCC 43579 est cultivée en milieu liquide dans un fennenteur de 10 I Un congelat de germes en glycérol est utilisé pour ensemenser un flacon de 75 cm2 contenant du milieu dit "biphasique" (une phase solide en gélose Colombia contenant 6 % de sang de mouton fi-ais et une phase liquide en trypticase de soja contenant 20 % de sérum de vexai foetal) Après 24 heures de culture dans des conditions microaérophiles, la phase liquide de cette culture est utilisée pour ensemenser plusieurs flacons de 75 cm2 en milieu biphasique en l'absence de sang de mouton.Après 24 heures de culture, la phase liqude permet d'ensemenser un biofermenteur de 2 1 en milieu liquide tlwpticase soja contenant de la bêta cyclodextrine à 10 g/l. Cette culture à DO 1,5-1,8 est inoculée dans un fermenteur de 10 1 en milieu liquide. Après 24 heures de culture, les bactéries sont récoltées par centrifugation à 4000 x ; pendant 30 minutes à 4 C. Une culture de 10 litres de H. pylori ATCC 43579 en fermenteur sous atmosphère microaérophile permet d'obtenir environ 20 à 30 g (poids hcimide) de bactéries IB - Extraction par le n octyl p-D gliicopyranoside (OG) Le culot de germes obtenu précédemment est lavé avec 500 ml de PBS (Phosphate buffer saline , NaCI 7,650 g, phosphate disodique 0,724 g phosphate monopotassique 0,210 = pour un litre , pH 7,2) par litre de culture. Puis les germes sont à nouveau centriffigès dans les mêmes conditions. Le culot bactérien obtenu (C1) est remis en suspension dans une solution d'OG (Sigma) à I % (30 ml/litre de culture) La suspension bactérienne est incubée pendant I heure à température ambiante sous agitation magnétique, puis centrifugée à 17 600 x g pendant 30 minutes à 4 C Le culot (C2) est conserve pour être traité par la suite. Le surnageant (S2) obtenu est dialysé (MWCO=10 000 Da, Spectra/por) pendant une nuit à 40C sous agitation magnétique contre 2 fois 1 litre de PBS dilué au 1/2. Le précipité fonné au cours de la dialyse est récupéré par centrifugation à 2 600 x g pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant (S2d) est éliminé et le culot (Cs2d) qui contient des protéines de membrane externe, est conservé à -200C. lC - Cassage des germes Le culot (C2) obtenu après centrifugation des germes traités par l'OG est remis en suspension dans du tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 et Pefabloc 100 I1M (tampon A) puis homogénéisé à l'aide de l'ultra-turrax (3821, Janke & Kungel). L'homogénat obtenu est mis en présence de lysosyme (0,1 mg/ml final) et d'EDTA (1mM final). L'homogénat est sonique 3 fois 2 minutes à 4 C (+ sonde=0,5 cm, puissance=20%, Sonifier 450 Branson), puis ultracentrifugé à 210 000 x g pendant 30 minutes à 4 C Le surnageant (S3) qui contient des protéines cytoplasmiques et périplasmiques, est éliminé, alors que le culot (C3) est récupéré, lavé en tampon A, puis ultracentrifugé à 210 000 x , pendant 30 minutes à 4 C Après élimination du surnageant (S4), le culot (C) est conservé à -20 C. Ce culot contient des protéines intrinsèques et périphériques. La procédure peut être poursuivie par un double lavage du culot C4 pour éliminer les protéines membranaires périphériques. Le culot C4 est remis en suspension dans du tampon NaCO3 50 mM pH 9,5, Pefabloc et 100 pM (tampon B). La suspension est ultracentrifiigee à 210 000 x g pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant (sus) est éliminé puis le culot (C5) est lavé et ultracentrifugé dans les mêmes conditions que précédemment. Après élimination du surnageant (S6), le culot (C6) qui contient essentiellement des protéines membranaires intrinsèques, est conservé à -20 C. Les fractions C4, C6 et CS2d sont appelées par la suite respectivement fractions membranaires I, II et III. ID- Analyse des fractions membranaires Les différentes fractions membranaires sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en presence de SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Les protéines sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie. Si on considère les protéines majeures de chaque fraction, les profils SDS PAGE (Figure 2) montrent que la fi-action membranaire I est très proche de la fraction membranaire II. Par contre ces deux dernières diffèrent sensiblement de la fraction membranaire III. Le profil de la fraction membranaire I présente 7 bandes protéiques majeures de poids moléculaires respectifs 87, 76 67, 54, 50, 47 et 35 kDa (colonne 2). Par western blot en présence d'anticorps anti-ureB ou d'anticorps anti-catalase, on a montré que la bande à 67 kDa correspondait à la sous-unité B de l'uréase et la bande à 54 kD correspondait à la catalase.Ces deux protéines ne se retrouvent pas dans le profil de la fraction II (colonne 3) puisque le lavage en tampon carbonate élimine les protéines faiblement associées à la membrane Quant au profil protéique de la fraction membranaire III, il montre la presence de 4 bandes majeures à 76, 67, 50 et 30 kDa (colonne 4) AMPLE 2 Purification des protéines de la fraction membranaire I par SDS-PAGE préparative Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide selon la méthode de Laemmli (1970) avec un gel de concentration de 5% et un gel de séparation de 10%. La fraction membranaire est remise en suspension dans du tampon A, puis diluée au demi dans le tampon échantillon 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95 C.Environ 19 mg de protéines sont déposés sur un gel de dimension 16 x 12 cm et d'épaisseur 5 mm. Une prémigration est effectuée à 50 V pendant 2 heures, suivie d'une migration à 65 V pendant la nuit. La coloration du gel au bleu de Coomassie R250 (0,05% dans de l'eau ultrafiltrée) permet une bonne visualisation des bandes Les bandes majeures HpP 1, HpP2, HpP4, HpP5 et HpP6 sont découpées au scalpel et broyées à l'ultra-turrax en présence de 10 ou 20 ml de tampon d'extraction Tris-HCl 25 mM pH 8,8, urée 8 M, SDS 10%, phényl méthyl sulfonyl fluorique (PMSF) 100 FuM et Pefabloc 100 pM (tampon C).Chaque broyat est filtré sur un préfiltre Millipore AP20 (#filtre = 4,7 cm, spore = 20 m) à l'aide d'un extrudeur à une pression de 7 bars, à température ambiante. Chaque broyat est lave avec 5 a 10 ml de tampon C et filtré comme précédemment. Les deux filtrats obtenus à partir de chaque broyat correspondant sont rassemblés. Chaque filtrat est précipité avec 3 volumes d'un mélange 50 50 méthanol 75% et isopropanol 75%, puis ultracentritigé a 210 000 x g pendant 16 heures à 10 C sur rotor 70 TFT (J8-55, Beckman). Chaque culot est repris par 2 n1l de tampon de solubilisation NaPO4 10 mM pH 7,0, NaCI 1 M, Sarkosyl 0,1%, PMSF 100 M, Pefabloc 100 M et urée 6 M (tampon D). L'échantillon solubilisé est dialyse successivement contre 100 ml de tampon D à 4 M d'urée et 0,1% de Sarkosyl, contre 100 ml de tampon D à 2 M d'urée et 0,5% de Sarkosyl et contre 2 fois 100 ml de tampon D sans urée et à 0,5% de Sarkosyl. La dialyse est effectuée pendant 1 heure sous agitation magnetiqite à température ambiante. Le dialysat final est incubé pendant 30 minutes dans un bain de glace, puis centrifugé à faible vitesse pendant 10 minutes à 4 C (Biofuge A, Heraeus Sepatech). Le surnageant est récupéré, filtré sur filtre Millipore à 0,45 pm et conseivé à -203C. Une analyse SDS-PAGE a été réalisée pour chaque fraction (Figure 3). L'analyse du profil électrophorétique de chaque fraction montre que les fractions HpPI, HpP2 et HpP4 sont pul-es avec une seule bande sur gel pour chacune de ces fractions (respectivement à 87, 76 et 54 kDa), Par conte les fractions HpP5 et HpP6 sont partiellement purifiées dans la mesure ou leurs profils montrent deux bandes respectivement à 47 et 50 kDa pour HpP5 et 32 et 35 kDa pour HpP6. EXEMPLE 3 Purification des protéines membranaires de 30, 50 et 54 kD à partir de la fraction membranaire I 3A - Chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose Une colonne de Q Sepharose de 40 ml (#=2,5 cm, h=8 cm) est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon NaCO3 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 M et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie a été suivie par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne. Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire I préalablement solubilisée sont déposées sur la colonne qui est ensuite lavée avec le tampon d'équilibre (NaCO3 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100pM et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un gradient de 0,1 à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage en tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1 M de NaCI (2 fois VT). Les fractions collectées sont analysées par SDS-PAGE et rassemblées en différents pools selon leur profil électrophorétique, puis conservées à -20 C.Les fractions sont comme suit fractions solution fractions élution eluat direct 6 NaCl 0,25-0,28M 2 lavage tam p équilibre 7 NaCl 0,28-0,35M J NaCI O -0,1 M 8 NaCI 0,35-0,5M 4 NaCl 0,1-0,2M 9 début lavage NaCl 1M 5 NaCl 0,2-0,25M 10 fin lavage NaCl 1M Le bilan protéique montre que 53% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI 0-0,5M, 14% des protéines ne se sont pas fixées sur la colonne et 33% des protéines sont éluées au cours dii lavage en NaCI IM (tableau 5). Les protéines non fixées sur la colonne, correspondent à des protéines alcalines chargées positivement à pH 7,5, alors que les protéines éluées en 1M NaCI correspondent à des protéines acides fortement chargées à ce pH. La purification des fractions 7 et 9 est poursuivie comme suit. 3B - Séparation des protéines des fractions 7 et 9 par chromatographie échangeuse d'anions sur DEAE Sépharose Une colonne de DEAE Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (=1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/ml de gel) La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Pefabloc 100 ZN1 et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie est suivie comme précédemment par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne. La fraction 7 dialysée au préalable contre le tampon d'équilibre (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Pefabloc OU p et Zwittergent 3-14 0,1%) contenant 10 mg de protéines, est deposée sur la colonne de DEAE Sépharose. La colonne est lavée en tampon d'équilibre jusclu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un gradient de o à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage en tampon d'équilibre contenant 1 M de NaCI (2 fois x VT). Les fractions collectées sont analysées par SDS-PAGE, puis rassemblées en différents pools selon leur profil protéique et conservées à -20 C. Par SDS-PAGE, on montre que la fraction 7. 1 (éluat direct) est d'intérêt. Une purification identique est reconduite avec la fraction 9 contenant 31 mg de protéines. Par SDS-PAGE on montre que les fi-actions 9.1, 9.2 et 9.3 respectivement éluées à 0, 1 -0,25 M NaCI, 0,3 -0,4 N/I NaCI et 1 M NaCI sont d'intérêt. Pour la fraction 7 (Figure 4A), les résultats obtenus montrent que seulement une protéine de 30 kDa (colonne 3 , fraction 7 1) a été enrichie et partiellement séparée après passage sur la colonne de DEAE Sépharose, les autres protéines n'ont pas été séparées. Pour la fi-action 9 (Figure 4B), les profils electrophorétiques montrent que deux protéines de 54 et 15 kDa (colonnes 3 et 5 , fractions 9.1 et 9.3) ont été séparées et une protéine de 50 kD a ete enrichie (colonne 4 , fraction 9.2). La protéine de 54 kD de la fraction 9 1 ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase. EXEMPLE 4 . Purification de la protéine membranaire de 76 kD à partir de la fraction membranaire 111 4A - Séparation des protéines de la fraction membranaire 111 sur la colonne Q Sépharose Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire III préalablement solubilisée ont été déposées sur une colonne Q Sépharose préparée comme précédemment en 3A.Apres que la colonne ait été lavée avec le tampon d'équilibre (NaCO3 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 M et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'au retour à la ligne de base, un lavage avec NaCl 0, I M en tampon d'équilibre a été réalisé jusqu'au retour à la ligne de base (fi-action A), suivi d'un gradient de NaCI de 0,1 à 0,5 M en tampon d'équilibre (fi-actions B, C, D et E), puis d'un lavage avec NaCI 1M en tampon d'équilibre (fraction F). Les résultats sont représentés dans le tableau cidessous. fractions solution protéines totales (mg) A lavage NaCl 0,1M 18 B NaCl 0,1-0,2M 14 C NaCl 0,25M 10 D NaCI 0,25-0,35M 27 27 E NaCI 0,35-0,45Ni 26 F lavage NaCl 1M 20 Le bilan protéique nous montre que 55% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI 0,1-0,5M, 15% soit éluees au cours du lavage avecNaCl0,1Met 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 1M Les profils SDS-PAGE de chacune des fractions obtenues après passage de la fraction membranaire 111 sur la colonne Q Sépharose, sont différents.De plus, certaines protéines sont enrichies par rapport à la fraction membranaire III de départ. On observe notamment un enrichissement de la protéine de 76 kDa sur le profil correspondant à la fraction l) dont la pcirification est poursuivie comme suit. 4B - Purification sur coloiiiie S Sépharose, de la protéine de 76 kDa à partir de la fraction D obtenue sur coloniie Q Sépharose Une colonne de S Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (Q=1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/ml de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 M et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La fraction D dialysée préalablement contre le tampon d'équilibre (acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 M et Zwittergent 3-14 0,1%) est déposée sur la colonne de S Sépharose La colonne est ensuite lavee avec le meme tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 2SO nni soit stabilisee Environ 3 volumes de colonne sont nécessaires pour le retour à la ligne de base Les proteines sont éluées par un gradient de 0 à 0,5 M de NaCI en tampon d'equilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage avec le tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1M de NaCI (4 fois VT). Les fractions collectées sont analysées, rassemblées et conservées comme précédemment. La fraction D' sortant au cours du gradient NaCI 0-0,5M, entre 0,15 et 0,20 M NaCI a été récupérée. Sur cette fraction, une analyse par SDS-PAGE et par western blot est effectuée. Les résultats sont représentes à la Figure 5. Ces résultats montrent qu'après deux colonnes échangeuses d'ions, la protéine de 76 kDa est enrichie, mais elle demeure contaminée avec une protéine de 54 kDa et une protéine de 67 kDa (colonne A). La protéine de 54 kDa ne réagit pas avec les anticorps anti-catalase, par conséquent elle ne correspond donc pas à la catalase, de même la protéine de 67 kl)a nc réagissant pas avec l'anticorps anti-ureB en western blot, par conséquent elle ne correspond pas a la sous-unité B de l'uréase. L'analyse par western blot en présence d'telle antiserum anti-76 kDa montre que les faibles bandes observées en dessous de la bande a 76 kDa correspondent à une dégradation de la protéine de 76 kDa, puisqu'elles reagissent faiblement avec cet antisérum (colonne 7). EXEMPLE 5 Préparation de sérums hyperimmuns à l'encontre des protéines membranaires de 76, 50 et 35 kD. Des sérums polyclonaux spécifiques des protéines membranaires majeures H. pylori sont obtenus par hyperimmunisation des lapins respectivement avec les antigènes purifiés par SDS-PAGE préparative HpP2, HpP5 et HpP6. La première injection JO (sous-cutanée multisites et intramusculaire) est effectuée avec une préparation contenant 50 g de protéine membranaire émulsionnee en adjuvant complet de Freund, puis les rappels J21 et J42 se font par injection de 25 g de protéine membranaire en adjuvant incomplet de Freund. Les animaux sont sacrifies a Jóü. Les serums obtenus sont décomplémentés pendant 30 minutes à 56 C et stérilisés par filtration sur membrane de porosité 0,22 um (Millipore). L'antisérum anti-HpP2 réagit avec la protéine de 76kD telle qu'isolée selon l'Exemple 4, tandis que l'antisérum anti- HpP5 réagit avec la protéine de 50kD isolée dans la fraction 9.2 obtenue dans l'Exemple 3 Bien evidemment, le protocole d'immunisation décrit ci-avant peut être utilisé de manière similaire pour produii-e des antisérums à l'encontre de chacune des protéines purifiées aux Exemples 3 et 4. Les préparations obtenues dans ces exemples pourront être avantageusement soumises à une electrophorése préparative sur gel de SDS-PAGE. Les bandes protéiques seront traitees comme precédemment afin d'obtenir une préparation destinée à l'immunisation. EXEMPLE 6 Purification d'une catalase à partir d'H. pylori Une culture est réalisée comme décrit dans l'Exemple 1A Le culot bactérien lavé est remis en suspension dans du tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7,5 contenant du PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma) 100 M (tampon A) à concentration finale de 0,1 g (poids humide) par millilitre. La suspension est homogénéisée à l'aide d'un mixeur de type Ultraturrax. Les cellules bactériennes sont ensuite cassées par sonication avec un appareil de type Sonifier (Branson) équipé d'une sonde de diamètre 1,8 cm. La sonication s'effectue par intermittence, 1 min de sonication et 1 min de repos sur glace. Une sonication de 10 min est suffisante pour casser complètement 5 g de germes en suspension.Le lysat ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 Inin a 4 C à 4 000 g. Le surnageant est récupéré puis, centrifugé à nouveau à 100 000 g pendant 30 min à A C. Le surnageant de cette deuxième centrifugation (S2) est recupére pour une purification chromatographie. La fraction S2 préparée de cette façon conserve environ 90% de l'activité enzymatique "catalase" totale, telle que mesurée selon la technique de Hazell et al (supra) ou Beers & Sizer, J. Biol. Chem. (1952) 195 133. La fraction S2 est chargee sur itne colonne S-Sepharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec du tampon A La colonne est lavee avec le même tampon. La chromatographie est suivie avec un détecteur UV à 280 nm pour les protéines et par I'activité enzymatique pour la catalase Après élimination des protéines non-fixées (I'absorption à 280 nm revient à la ligne de base), la colonne est ensuite lavée avec un gradient de NaCl, O à I NI dans CIL tampon A Les fractions correspondant au pic de l'activité catalase sont recueillies, concentrees dans une cellule de concentration de type Amicon équipée de membrane dont le seuil de coupure est de 100 000 Daltons.La fraction concentrée ainsi obtenue est chargé sur une colonne Séphacryl S-300 HR préalablement équilibrée avec du tampon PBS. Les fi-actions contenant de l'activité catalase sont recueillies, concentrées à I mg/ml et dialysées contre le tampon PBS. La solution finale est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 um et conservée à -70 C. La protéine ainsi purifiée presente les caractéristiques suivantes: (i) Une activité enzymatique de catalase typique, en l'absence d'activité peroxydase. (ii) Un spectre visible typique d'une hémoprotéine, un pic de Soret à 406 nm et les pics d'alpha et de bêta entre 520 nm et 550 nm. (iii) Une forme monomemque à 54 l\D en SDS-PAGE avec la séquence N-terminale suivante MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG Revendications 1. Une protéine d'Helicobacter pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76, 54, 50 ou 30 kD, à condition que lorsque le poids moleculaire est de 54 kD, la protéine ne réagisse pas avec un antisérum anti-catalase 2.Une protéine selon la revendication 1, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation, (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux. (iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d 'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0,1 - 0,5 M, (v) on récupère la fraction cluse en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une chromatographie echangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 Ni , et (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0, 15 - 0,20 M. 3. Une protéine selon la renendication 2, qui a pour fonction biologique d'être une porine. 4. Une protéine selon la revendication 2 ou 3, qui a pour séquence N-terminale la séquence d'acide aminés EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV. 5. Une protéine selon la revendication 1, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 54 kD et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel: (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation; (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation; (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HC1 20 mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation; (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux;; (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl O - 0,5 M, suivi d'un lavage en NaCl l M; (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCl t M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M ; et (vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,1 - 0,25 M. 6. Une protéine selon la revendication 1, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 50 kD et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation;; (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20 mM ptl 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d 'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M, suivi d'un lavage en NaCI I (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI 1 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI 0 - 0,5 NI ,et (vii) on récupère la fraction fluée en NaCI 0,3 - 0,1. M 7.Une protéine selon la revendication I, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 30 kD et qlll est susceptilble d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère iin culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20 mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de Q-Sephar-ose en gradient de NaCI O - 0,5 M, (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,28 - 0,35 M, que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI 0 - 0,5 M , et (vii) on récupère la fraction correspondant à l'éluat direct (absence de NaCI). 8. Une protéine ou un polypeptide 50115 forme substantiellement purifiée, qui est capable d'etre reconnit par un antisérum établi à l'encontre d'une protéine selon l'une des revendications I à 7 9. Une composition pharmaceutique destinee à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'une des revendications I à 8.