Brevet FR2734843A1 — publié le 19961206

NOUVEAU PROCEDE DE BIOCONVERSION MICROBIENNE. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de bioconversion enzymatique, et ses applications, notamment dans le cadre de l'obtention d'arômes. Les arômes tiennent une place importante dans l'industrie agroalimentaire et représentent un marché de plusieurs milliards de francs. Le marché mondial des arômes alimentaires est en progression constante depuis plusieurs années. A l'intérieur de ce marché, les arômes dits "naturels" bénéficient d'un préjugé favorable auprès de l'opinion publique. Ces arômes "naturels" sont actuellement produits soit par extraction de matières végétales, soit par bioconversion enzymatique ou microbienne. Parmi les arômes, les lactones qui confèrent le goût de pêche ou celui de noix de coco sont très recherchées et ont une grande importance économique pour les industries aromatiques et agro-alimentaires. Ces lactones sont à l ' origine des odeurs fruitées des cultures de certaines levures et de champignons filamenteux. Parmi les champignons, les basidiomycètes tels que Polyporus durus, Bjerkandera adusta, Poria aurea, Ischnoderma benzoinum et Tyromyces sambuceus sont capables de produire des lactones (Gross et Asther, 1989, Sciences des aliments, 9: 427454). Dans tous les cas, il s'agit d'une production de lactones par biosynthèse et les rendements restent faibles (de l'ordre de quelques milligrammes par litre). La capacité des levures à effectuer la bioconversion de certains acides gras en lactones a été décrite dès 1963 (Okui et al., 1963, J. Biochem., 54: 536-540). La levure modèle Saccharomyces cerevisiae peut également produire certaines lactones à des teneurs industriellement intéressantes (Boog et al., 1990, brevet EP 0371 568; Boog et al., 1991, brevet EP 0409 321; Van der Schaft et de Laat, 1991, brevet EP 0425 001). Par ailleurs, plusieurs publications (Cardillo et al., 1989, J. Org. Chem., 54: 49794980; Albrecht et al., 1992, J. Org. Chem., 57: 1954-1956; Ercoli et al., 1992, Biotech. Letters, 14: 665-668) et brevets (Farbood et Willis, 1983, brevet WO 8301072; Cardillo et al., 1990, brevet EP 0356 291; Cardillo et al., 1991, brevet EP 0412 880) mettent en évidence la capacité de champignons (Cladosporium suaveolens) et de levures (Sporidiobolus salmonicolor, Yarrowia lipolytica, Pichia guillermondii, Pichia etchellsii, Kluyveromyces lactis) à effectuer la bioconversion d'acides gras en lactones et notamment l'acide ricinoléique (acide 12-hydroxy octadec-9-énoique) en y-décalactone. Comme précédemment dans le cadre de l'utilisation de champignons, dans tous les cas où la production est obtenue par biosynthèse à partir des levures susmentionnées, celle-ci reste très faible (quelques milligrammes par litre). Dans les cas de bioconversion, si la production est industriellement intéressante (quelques grammes par litre), ce sont les rendements de bioconversion qui sont faibles. Actuellement seule la y-décalactone (R) est produite par l'industrie aromatique par biotransformation microbienne. Actuellement, seule la y-décalactone (R) est produite par l'industrie aromatique par biotransformation microbienne. Farbood et collaborateurs (WO 8301072) ont obtenu à partir d'huile de ricin une production de l'ordre de 1 g/l de y-décalactone après une fermentation de 7 jours. Plus récemment, la société BASF a développé un procédé de production de y-décalactone en utilisant Yarrowia lipolytica. Par bioconversion en fermenteur de 14 litres sur ricinoléate d'éthyle (70 g/l), une production de 5 g/l de -décalactone (DE 4126997 Al) après 3 jours de fermentation a ainsi été obtenue par BASF. L'Institut National de la Recherche Agronomique (I.N.R.A.) utilise S. ruinenii pour réaliser la bioconversion du ricinoléate de méthyle en R y-décalactone (FR 2705971 Al). Une production de 6,9 g/l après 14 jours de fermentation a ainsi été obtenue par l'I.N.R.A. D'autres lactones peuvent aussi être obtenues par bioconversion d'autres substrats. Par exemple, après culture de Yarrowia lipolytica en présence d'acide hydroxylinoléique pendant 24 heures, on obtient des huiles brutes comportant les lactones suivantes: y-décanolide (19,7%), 6-décanolide (1,5%) et y-6-dodécénolide (0,66%) (brevet EP 412 880 A2), toutefois les rendements de bioconversion restent faibles. Les procédés de bioconversion microbienne actuellement proposés dans le cadre de la production d'arômes font appel à un grand nombre de souches, majoritairement des levures, et présentent des productions situées en général entre 1 et 2 g/l d'arôme, au bout de cinq à sept jours de culture sur milieu de biotransformation. Quelques productions plus importantes (autour de 5 g/l) ont été obtenues à l'aide des souches Yarrowia lipolytica, Candida petrophilum et Cladosporium suaveolens (Farbood et Willis, 1983, Farbood et al., 1990, Cardillo et al., 1990, susmentionnés). Cependant, ces valeurs ne sont atteintes qu'après une durée importante de culture (7 à 1 1 jours), sur des milieux qui contiennent souvent des substances potentiellement néfastes pour la note aromatique comme des extraits de viande (Farbood et Willis, 1983 susmentionné).Les plus fortes productivités ont été obtenues par Farbood et Willis, 1983, susmentionné (0,9 g/l/j), Boog et al., 1990, susmentionné (0,75 g/l/j), et Cardillo et al., 1990, susmentionné (0,33 g/i/j). La présente invention a pour but de fournir un procédé de bioconversion microbienne permettant d'obtenir des produits déterminés, notamment des lactones, dans des quantités aussi importantes, sinon plus importantes, et en un temps nettement plus court, que le permettent les méthodes actuellement proposées dans ce domaine. La présente invention a également pour but de fournir un procédé de bioconversion microbienne dans lequel les produits déterminés obtenus sont, à l'état brut, en mélange avec des quantités plus faibles de constituants de milieux de culture, et sont donc plus faciles à purifier, que les produits obtenus par les méthodes actuelles. A ce titre, la présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé de bioconversion microbienne dans lequel les milieux de culture utilisés n'affectent pas la note aromatique des lactones ou autres produits obtenus, car ne comprenant pas ou peu de substances telles que des extraits de viande, néfastes pour la qualité aromatique de ces produits. L'invention a pour objet l'utilisation d'une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé, dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de bioconversion microbienne de substrats déterminés, en vue de l'obtention de produits déterminés, l'étape de bioconversion de ces procédés étant effectuée dans un milieu de culture pour micro-organismes comprenant au moins un substrat susceptible d'être bioconverti par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), ledit milieu de culture ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, ou en comprenant en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) permette(nt) I'induction de la production de l'(ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative (à savoir une multiplication significative) de ladite (ou desdites) souche(s) dans le milieu de culture. Parmi les micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé, susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer principalement les bactéries, les virus, les levures et les champignons. Parmi les produits déterminés susceptibles d'être obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer les lactones telles que celles obtenues par bioconversion d'acides gras par des levures, notamment la y-décalactone obtenue par bioconversion d'huile de ricin ou du ricinoléate de méthyle, par des levures du genre Yarrowia (telles que Y. lipotytica), ou du genre Sporidiobolus (telles que S. ruinenii), ou encore du genre Fusarium. Toujours parmi les lactones susceptibles d'être produites dans le cadre de la présente invention, on peut citer également la y-décanolide, la 8décanolide, ou la y-6-dodécénolide obtenues par bioconversion d'acide hydroxylinoléique par des levures du genre Yarrowia (telles que Yarrowia lipotytica). L'acide citrique peut également être cité en tant que produit déterminé susceptible d'être obtenu dans le cadre de la présente invention, par bioconversion de glucose ou de saccharose par des levures du genre Yarrowia (telles que Yarrowia lipolytica). L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de la souche de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour un composé déterminé, notamment pour l'uracile, dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de bioconversion du ricinoléate de méthyle en vue de l'obtention de y-décalactone, l'étape de bioconversion dudit procédé étant effectuée dans un milieu de culture comprenant le ricinoléate de méthyle, mais ne comprenant pas d'uracile, ou autre composé déterminé susmentionné, ou comprenant de l'uracile, ou autre composé déterminé susmentionné, en quantité suffisante pour permettre l'induction de la production des enzymes de ladite souche nécessaires à la bioconversion du ricinoléate de méthyle en y-décalactone, sans pour autant permettre une croissance significative de la souche dans le milieu de culture. L'invention a également pour objet tout procédé de bioconversion microbienne d'un (ou plusieurs) substrat(s) déterminé(s), caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganismes avec une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes, pour un (ou plusieurs) composé(s) déterminé(s), ce milieu de culture comprenant un (ou plusieurs) substrat(s) susceptible(s) d'être bioconverti(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), mais ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susm entionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes, ou comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) et, le cas échéant, ces autres composants, permette(nt) l'induction de la production de l' (ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative de la (ou des) souche(s) dans le milieu de culture, - l'extraction et, le cas échéant, la purification, du (ou des) produit(s) résultant de la réaction de bioconversion du (ou des) substrat(s) déterminé(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s). Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend, préalablement à l'étape d'ensemencement du milieu de culture comprenant le (ou les) substrat(s) mais ne comprenant pas, ou en faible quantité, le (ou les) composé(s) déterminé(s) pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, une étape de production d'une biomasse comprenant ladite (ou lesdites) souche(s) auxotrophe(s) susceptible(s) d'être mise(s) en culture dans le milieu susmentionné, cette étape de production de biomasse étant réalisée par mise en culture de la (ou des) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s) dans un milieu de culture susceptible de permettre une croissance significative de ladite (ou desdites) souche(s) susmentionnée(s), le milieu de culture comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), mais ne comprenant pas le (ou les) substrat(s) susceptible(s) d'être converti(s) par des enzymes produites par le (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s). Cette étape préalable de production d'une biomasse importante de souches de micro-organismes a essentiellement pour but de permettre un ensemencement à haute densité des milieux de culture ne comprenant pas ou peu de composés pour lesquels lesdites souches sont auxotrophes, dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés susmentionnés de l'invention. Les souches de micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé et susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention sont avantageusement choisies parmi celles décrites ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, les micro-organismes utilisés sont des levures, et les produits obtenus sont des lactones issues de la bioconversion d'acides gras utilisés en tant que substrats, lesdites lactones étant susceptibles d'être utilisées en tant qu'arômes. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la souche utilisée est une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour un composé déterminé, notamment pour l'uracile, et le substrat utilisé est le ricinoléate de méthyle. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un procédé de production de hy-décalactone comprenant les étapes suivantes: - une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganismes, avec une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, ce milieu de culture ne comprenant pas d'uracile, ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes tels que principalement du glucose et du lactate, ou comprenant de l'uracile et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour permettre l'induction des enzymes produites par Yarrowia lipolytica, et plus particulièrement des enzymes impliquées dans la '3-oxydation, telles que l'Acyl-CoA oxydase (EC.6.2. 1.3) ou la 3-cétoacyl-CoA thiolase (EC.2.3.1.16), ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle, - l'extraction et, le cas échéant, la purification de la y-décalactone produite par bioconversion du ricinoléate de méthyle par les enzymes produites par Yarrowia lipolytica. Avantageusement, dans le cadre du procédé de production de y-décalactone susmentionné, l'ensemencement du milieu de culture avec la souche mutante de Yarrowia lipolytica est effectué à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle à raison d'environ 15 g à environ 150 g par litre de milieu de culture, et comprenant de l'uracile à raison d'environ 5 à environ 100 mg par litre de milieu de culture, et le cas échéant, du glucose à raison d'environ 0,1 g à environ 1 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 0,1 g à environ 5 g par litre de milieu de culture. Avantageusement encore, le procédé susmentionné de production de y-décalactone comprend une étape préalable de production de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, en quantité suffisante pour permettre l'ensemencement du milieu de culture tel que défini ci-dessus, avec cette dernière souche à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, cette étape préalable étant effectuée par mise en culture d'environ 3 g à environ 100 g en poids humide de levures (ce qui correspond à environ 1 g à environ 30 g en poids sec) par litre de milieu de culture, de l'espèce Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, dans un milieu comprenant de l'uracile à raison d'environ 100 mg à environ 500 mg par litre de milieu de culture, et d'autres composants nécessaires à la croissance de ces levures, tels que du glucose à raison d'environ 10 g à environ 50 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 20 g à environ 50 g par litre de milieu de culture. Le procédé d'obtention de y-décalactone selon l'invention permet avantageusement d'obtenir entre environ 5 g/l à environ 15 g/l de y-décalactone dans un intervalle de temps d'environ 48 à environ 80 heures. L'invention a également pour objet la souche de Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophe pour l'uracile, telle qu'obtenue par mutation du gène URA3 de la souche Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 24060), selon le protocole figurant dans la description détaillée qui suit de l'invention. L'invention vise également l'utilisation de la souche de Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophe pour l'uracile, susmentionnée, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention de y-décalactone, tel que décrit ci-dessus. L'extraction, et le cas échéant, la purification des produits déterminés, notamment de la y-décalactone, obtenus dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés selon l'invention, peuvent être effectuées selon les techniques décrites dans les exemples qui suivent de réalisation de l'invention, ou encore par extraction à l'éther (US 3.076.750), par distillation (EP-A-0.371.568), par extraction par un solvant tel que le butylacétate (EP-A-0.409.321), par l'hexane (WO 83/01072), par séparation chromatographique et en particulier par HPLC (WO 89/12104). L'invention sera davantage illustrée dans les exemples qui suivent visant à améliorer la productivité du système de bioconversion, par l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica POlD auxotrophe pour l'uracile combinée avec un ensemencement à haute densité du milieu de bioconversion et en jouant sur les conditions du milieu pour obtenir à la fois une faible croissance et une induction maximale des enzymes impliquées dans la ss-oxydation (enzymes impliquées dans ladite bioconversion). A) Obtention de la souche de Yarrowia lipolytica PO1D. Le gène URA3 de la souche Yarrowia lipolytica (W29, ATCC 24060) a été remplacé par un gène de fusion XPR2-SUC2 (fragment SalI du plasmide pINA302, voir figure 1). Les transformants sont sélectionnés en fonction de leur pouvoir d'utilisation du saccharose (phénotype Suc +, Nicaud et al., Current Genet., 1989, 16: 253-260). Toutes les souches sauvages de Y. lipolytica testées jusqu'à ce jour sont Suc-. Les transformants Suc+ (1000 2000/yg de fragment) ont été criblés en fonction de leur phénotype Ura- (à savoir en fonction de leur incapacité à utiliser l'uracile). 10 à 20% des transformants sont Ura- et la présence de copies discontinues du gène URA3 (ura 3-302) a été confirmée par hybridation selon la technique de Southern. Afin d'obtenir d'autres dérivés de ces souches Ura-Suc+, les plasmides pINA 270 et pINA 322 ont été construits; ils portent le gène URA3 et soit le gène LEU2 délété, soit le gène XPR2 délété (voir figure 1). Ces délétions dans les gènes LEU2 et XPR2 ont été effectuées de la manière suivante. Les transformants Ura+ (105/yg de plasmide) ont été obtenus à l'aide de pINA 270 coupé au site unique NotI situé après le gène LEU2. Cinq transformants ont été ensemencés sur milieu YNB (Difco) contenant 15 mg/l d'uracile, 100 mg/l de leucine et 1,25 g/l d'acide fluoroorotique (5-FOA), à raison de 106 cellules par boîte d'ensemencement.Cinq clones 5-FOAR sont apparus à raison de 104/cellules en culture; l'analyse par Southern a permis de détecter que ces clones résultent de la ré-excision du plasmide intégré. 2% des clones 5-FOAR étaient Leu- et porteurs du gène délété LEU2. Ces souches (Ura-, Suc+, Leu-) ont été transformées en Ura+ en utilisant pINA 322 coupé au site unique MluI. La ré-excision du plasmide a été sélectionnée de la manière indiquée ci-dessus, et les dérivés XPR2- ont été isolés et leurs délétions LEU2 et XPR2 vérifiées (analyse par Southern). En utilisant la procédure décrite ci-dessus, les souches POlA (Mat A, ura 3.302, leu 2.270) et PO1D (Mat A, ura 3.302, leu 2.270, xpr 2.322) ont été obtenues à partir de la souche W29. B) Principes Généraux du procédé de l'invention. Le procédé de l'invention vise à améliorer la productivité du système de bioconversion. Pour cela, des souches mutantes de la levure Yarrowia lipolytica sont utilisées (souches YIP). Elles sont auxotrophes pour un composé X, tel que l'uracile. Il a été constaté, dans le cadre de la présente invention, que ces souches continuent à produire de la lactone en l'absence du composé X dans un milieu contenant 5 g/l de ricinoléate de méthyle (fig. 4). Cette auxotrophie des souches permet de développer un procédé original conduisant à une augmentation des teneurs en y-décalactone par unités de volume et de temps. Pour ce faire, un protocole en deux étapes est utilisé: - production d'une quantité importante de biomasse par une préculture courte (16 h) dans un milieu glucosé comportant le composé X; - inoculation d'un milieu à 30 g/l de ricinoléate de méthyle et dépourvu du composé X par une quantité élevée de biomasse (10 g/l) permettant de conduire la bioconversion dans un milieu à densité élevée en cellules en un temps court. Les premiers essais ont été menés en fioles de culture de 250 ml contenant 100 ml de milieu à 27"C, pendant 7 jours avec une agitation de 110 tours/min. La cinétique de production de lactone est représentée sur la figure 5. La production obtenue en final était de 420 p.p.m., ce qui est une valeur élevée lors d'une culture en fiole (de l'ordre de 250 p.p.m. pour la levure Pichia guilliermondii utilisée comme modèle, par exemple). Une expérience utilisant un protocole similaire a ensuite été effectuée en fermenteur (27"C, agitation 200 tours/min., aération 0.2 v/v/m), de façon limitée dans le temps. 1,3 g/l de y-décalactone après 48 h de culture ont ainsi été obtenus. Ces résultats sont particulièrement intéressants pour les raisons suivantes: 1) le milieu utilisé est simple et ne comprend pas de substances telles que des extraits de viandes, qui risqueraient d'entraîner la production de molécules indésirables; 2) la production d'arôme démarre très tôt sur le milieu de bioconversion (après 24 heures de culture, on retrouve déjà 0,7 g/l de lactone dans le milieu); 3) après 48 heures de culture, on obtient déjà une quantité d'arôme équivalente ou supérieure à la majorité des exemples actuellement connus dans ce domaine, qui généralement concernent des durées de culture nettement plus longues (Farbood et al., 1983; Cheetham et al., 1988; Page et al., 1989; Boog et al. 1990; Cardillo et al., 1990). C) Exemples détaillés. I. Matériel et méthodes. 1. Les milieux de culture. - Préculture. On effectue une préculture des souches de Yarrowia lipolytica POlD étudiées sur gélose M.E.A. (gélose au malt) pendant 48 h à 27"C. - Milieu de culture = milieu de bioconversion: voir exemples 1 à 6 ciaprès. Milieu de préculture gélose M.E.A. (g/l). - Extrait de malt 30 - Peptone farine soja 3 - Agar-agar 15 2. Extractlon et dosage de r-décalactone. Extraction des molécules volatiles. L'extraction de la fraction volatile à partir du milieu de culture se fait grâce à un appareil de type "Flath et Forrey" car les composés d'arôme sont en général très fortement liés au matériel biologique et une ébullition est nécessaire pour les extraire du milieu. L'extraction est basée sur un système de codistillation-réfrigération. D'un côté on place le milieu de culture, de l'autre, on place le solvant (dichlorométhane). On chauffe les deux solutions, les vapeurs se mélangent et se condensent au contact du réfrigérant. Le solvant s'enrichit ainsi en molécules volatiles. Chromatographie: dosage de la y-décalactone. L'extrait aromatique est injecté dans un chromatographe en phase gazeuse pour quantifier les molécules produites par les micro-organismes et en particulier la -décalactone. Le chromatographe utilisé est un Packard 437 A muni d'un détecteur à ionisation de flamme (300"C), d'un injecteur spitless (200"C), d'une colonne capillaire Spirawax (25 m de long, diamètre interne 0.32 mm) avec comme gaz vecteur, l'azote. 3. Etude de la consommation du ncmoléate de méthyle. Le dosage de méthyle présent dans le milieu se fait également par chromatographie en phase gazeuse. Le chromatographe utilisé est un Delsi Di200 muni d'un détecteur à ionisation de flamme (300"C), d'un injecteur spitless (200"C), d'une colonne capillaire Spirawax (50 m de long, diamètre interne 0.32 mm). Le gaz vecteur est l'azote. 4. Modes opératoires. 4.1 Ensemencements-prélevements. On réalise une préculture de 48 h en boîtes de Pétri sur gélose M.E.A. de la souche étudiée. Ensuite, la surface de la gélose est lavée avec de l'eau physiologique stérile, on obtient alors une suspension concentrée en levures. Une numération sur cellule de Malassez permet de déterminer le volume de suspension nécessaire à l'ensemencement. Six fioles sont ensemencées: une correspond au temps 0, les 5 autres fioles sont placées sur une table d'agitation (220 tpm, 27"C) pendant une durée de bioconversion de 6, 12, 24, 48 ou 81 heures. 4.2 Sulvl de la biomasse. Pour chaque fiole prélevée (correspondant à un temps de bioconversion donné), on peut évaluer la quantité de levures, soit en mesurant la biomasse totale (cellules/ml), la biomasse viable (cellules/ml) ou la biomasse sèche (g/l). La biomasse totale est déterminée grâce à une numération sur cellule de Malassez: nombre de cellules par ml de milieu. La biomasse viable est déterminée par ensemencement sur boîtes de Pétri de dilutions décimales (afin d'obtenir un nombre de colonies La biomasse sèche est déterminée par prélèvement de 2 fois 50 ml de milieu: - 50 ml serviront au dosage de la quantité de ricinoléate présent à la fois dans le milieu et la biomasse. - 50 ml de milieu sont centrifugés 15 min à 5000 g pour séparer la biomasse du milieu de culture. Le culot est lavé 2 fois dans de l'eau physiologique stérile puis passé sur un filtre Millipore (diamètre des pores 0.45 ym) préalablement taré. Le filtre est alors mis à l'étuve à 105"C jusqu'à poids constant afin de déterminer la biomasse sèche (g/l). Le surnageant permettra, quant à lui, l'extraction des molécules volatiles et le dosage de la y-décalactone. 4.3. Extractlon de la fraction volatile et dosage de la y-décalactone. L'extraction de la fraction volatile à partir du surnageant obtenu précédemment se fait grâce à l'appareil de Flath et Forrey précédemment décrit (2). Le pH du milieu est auparavant amené à une valeur inférieure à 2 (par ajout d'HCl concentré) pour permettre une lactonisation complète de l'acide 4-hydroxy-décanoïque. L'extraction se fait sur un volume précis de surnageant (environ 50 ml) auquel on ajoute 3 gouttes de Triton X100 (anti mousse) et 1 ml d'étalon interne (y-undécalactone) de concentration connue. 20 ml de dichlorométhane sont co-distillés pendant 40 min puis seul le solvant est chauffé pendant encore 20 min (rinçage). Le dichlorométhane enrichi en molécules volatiles est récupéré: cet extrait est ensuite injecté en chromatographie. 1 pl d'extrait aromatique est injecté dans le chromatographe décrit en 2. Les conditions chromatographiques sont les suivantes: - température initiale: 40"C, température finale: 230"C, - programme de température: 100min pendant 6 min puis 2"C/min. L'étalon interne y-undécalactone (y-C11), qui a un comportement analogue à la y-décalactone (y-C 10), permet de déterminer la concentration en y-décalactone dans le milieu. 4.4 Etude de la consommatlon de ricinoléate de méthyle. Le dosage de la quantité totale de ricinoléate de méthyle (présent dans le milieu et la biomasse) au temps 0 et après 81 heures de bioconversion permettra de déterminer si cet acide gras a été consommé par les levures. On effectue une extraction des lipides totaux sur le milieu et la biomasse selon le protocole suivant puis le ricinoléate est dosé en chromatographie en phase gazeuse. Extraction des lipides totaux. 15 ml de milieu contenant la biomasse sont passés dans un broyeur à billes afin de casser les cellules de levures. 1 ml de ce broyat est prélevé pour faire l'extraction des lipides totaux. A ce 1 ml de broyat sont ajoutés 2 ml de méthanol puis quelques gouttes de HCl 1 M pour ajuster le pH à 3 puis enfin 4 ml de chloroforme: à chaque étape, le tube est vortexé. Après décantation, la phase aqueuse (phase supérieure) est éliminée, la phase chloroformique contenant les lipides. A une partie aliquote (200 y1) de cette phase chloroformique sont ajoutés 40 yg d'étalon interne (acide heptacanoïque) et on réalise une méthylation de la façon suivante: le tout est séché sous azote et les acides gras sont repris dans 1 ml de méthanol. Après addition de 5 gouttes de H2SO4 concentré, les tubes sont fermés sous azote et placés au bain marie à 100"C pendant une heure. Après refroidissement, on ajoute 1 ml de K2CO3 5% (neutralisation) puis 2 ml d'hexane: l'hexane contient alors les acides gras. Après concentration sous azote de cet extrait, 1 yl est injecté dans le chromatographe décrit en 3. N.B. On utilise des tubes ou des pipettes en verre car on travaille avec du chloroforme et le travail se fait sous hotte aspirante. Les conditions chromatographiques sont les suivantes: - température initiale: 50"C, température finale: 230"C, - programme de température: 20min de 50"C à 230"C. II. Exemples. EXEMPLE 1. Production de y-décalactone par incubation de Yarrowia lipolytica PO1D sur milieu B. Une fiole Erlenmeyer de 250 ml contenant du milieu B de composition suivante: ricinoléate de méthyle 5 g/l, extrait de levure 0,1 g/l, NH4C1 2,5 g/l, KH2P04 2,1 g/l, Na2HP04 3,6 g/l, MgSO4, 7H20 0,2 g/l, NaCi 0,1 g/l, FeSO4 0,005 g/l, ZnC12 5.104 g/l, CuSO4 0,001 g/l est ensemencée à raison de 7.106 cellules/ml. L'agitation et la température sont fixées respectivement à 110 tours/min et 270C. Le taux de croissance mesuré par évaluation de la biomasse sèche est de 0.003 h-1. La production de y-décalactone après 48h de culture est de 82 mg/l de milieu, avec une productivité de la biomasse de 24 mg/g de biomasse sèche/h pendant les premières 24 h. EXEMPLE 2. Production de y-décalactone par incubation de Yarrowia lipolytica PO1D sur milieu A2 et B2. On prépare une préculture de Yarrowia lipolytica POlD dans des conditions indiques à la culture de l'exemple 1, à l'exception du ricinoléate de méthyle contenu dans le milieu B qui est remplacé par 15 g/l de glucose (milieu A), de 5 g/l de casaminoacides et de 500 mg/l d'uracile qui sont ajoutés au milieu (milieu A2). La totalité de la biomasse obtenue sur le milieu A2 en fin de phase exponentielle de croissance est transférée sur un volume équivalent de milieu B2 (milieu B additionné de 5 g/l de casaminoacides et de 500 mg/l d'acides d'uracile), et cultivée dans des conditions identiques à l'exemple 1. Le taux de croissance maximal observé est de 0,081 h-1. La production de y-décalactone après 48 h de culture est de 128 mg/l. La productivité de la biomasse observée est de 1 mg/g/h. EXEMPLE 3. Production de y-décalactone par culture de Yarrowia lipolytica sur milieu A2 suivie d'une incubation sur milieu B3. Une préculture de Yarrowia lipolytica PO1D est menée dans 0,5 I de milieu A2, dans des conditions similaires à celles de l'exemple 2 pendant 20 heures. La totalité de la biomasse obtenue est transférée dans 100 ml de milieu B3, identique au milieu B mais contenant 30 g/l de ricinoléate de méthyle. Après six jours d'incubation, on obtient 420 mg/l de y-décalactone dans le milieu. EXEMPLE 4. Production de y-décalactone par une culture de Yarrowia lipolytica PO1D sur milieu A2 en fermenteur suivie d'une incubation sur milieu B3 en fermenteur. Une préculture de Yarrowia lipolytica POlD est menée dans 5 l de milieu A2 en fermenteur de 7 l (T = 27"C, agitation 200 tpm, aération 0.1 v/v/m). La totalité de la biomasse (15 g) obtenue lorsqu'un tiers du glucose est consommé est transférée dans 2 I de milieu B3 dans un fermenteur de 2,5 1 (agitation 200 tpm, 27"C, aération 0.1 v/v/m). Après 162 heures d'incubation, on retrouve 115 mg/l de y-décalactone dans le milieu. La productivité du dispositif observée pendant les premières 24 h est de 1 mg/l/h. EXEMPLES. Production de y-décalactone par une culture de Yarrowia lipolytica POlD sur milieu A2 suivie d'une incubation sur milieu B3 additionné de glucose en fermenteur. Une préculture de Yarrowia lipolytica est menée dans 5 1 de milieu A2 répartis dans 10 fioles Erlenmeyer de Il. La totalité de la biomasse obtenue (6,5 g) en fin de phase exponentielle de croissance est transférée dans 500 ml de milieu B3, additionné de 0,25 g de glucose, contenu dans un fermenteur de 2,5 1. L'incubation est menée à 270C, agitation 200 tpm, aération 0.2 v/v/m. Après 48 h de culture, on obtient une concentration en y-décalactone de 1,28 g/l de milieu. La productivité du dispositif observée durant les premières 20 heures atteint 35 mg/l/h. EXEMPLE 6. Production de y-décalactone par production de biomasse de Yarrowia lipolytica PO1D suivie d'une culture en conditions limitantes sur milieu B4. Une préculture de Yarrowia lipolytica est menée dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 2, mais sur un milieu A3 identique au milieu A2 à l'exception d'une concentration en glucose de 20 g/l. La biomasse est transférée (21,5 g/l) puis cultivée en fermenteur de 5 1 (conditions identiques à celles de l'exemple 4) sur 1 l d'un milieu B6 de composition suivante: ricinoléate de méthyle 30 g/l, extrait de levure 0,5 g/l, NH4C1 2,5 g/l, KH2PO4 2,1 g/l, Na2HPO4 3,6 g/l, MgSO4, 7H2O 0,2 g/l, NaCI 0,1 g/l, FeSO4 0,005 g/l, ZnCl2 5.104 g/l, CuSO4 0,001 g/l, casaminoacides 5 g/l, uracile 20 mg/l. Après 75 h de culture, on obtient une concentration en y-décalactone de 9,5 g/l de milieu. Légende des figures. - les figures 1, 2 et 3 représentent les plasmides pINA302, pINA270 et pINA322 respectivement; - la figure 4 représente la croissance de la levure Yarrowia lipolytica PO 1 D, ainsi que la production de lactone (y-décalactone) par cette dernière; la biomasse sèche est indiquée en g/l sur l'axe de gauche des ordonnées; la quantité de lactone obtenue est indiquée en p.p.m. sur l'axe de droite des ordonnées; le temps de culture est indiqué en heures en abscisse; la courbe -A- représente la croissance d'Y. lipolytica en milieu supplémenté en uracile; la courbe -± représente la production de lactone en milieu supplémenté en uracile; la courbe -*- représente la croissance d'Y. lipolytica en milieu non supplémenté en uracile; la courbe -*- représente la production de lactone en milieu non supplémenté en uracile; - la figure 5 représente la production de lactone par culture d'Y. lipolytica PO1D en fioles, la concentration en ricinoléate de méthyle (RM) étant de 30 g/l; la quantité de lactone produite est indiquée en g/l en ordonnées; le temps de culture est indiqué en heures en abscisse. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé, dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de bioconversion microbienne de substrats déterminés, en vue de l'obtention de produits déterminés, l'étape de bioconversion de ces procédés étant effectuée dans un milieu de culture pour micro-organismes comprenant au moins un substrat susceptible d'être bioconverti par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), ledit milieu de culture ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, ou en comprenant en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) permette(nt) l'induction de la production de l'(ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative (à savoir une multiplication significative) de ladite (ou desdites) souche(s) dans le milieu de culture. 2. Procédé de bioconversion enzymatique d'un (ou plusieurs) substrat(s) déterminé(s), caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganisme s avec une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes, pour un (ou plusieurs) composé(s) déterminé(s), ce milieu de culture comprenant un (ou plusieurs) substrat(s) susceptible(s) d'être bioconverti(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), mais ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits microorganismes sont auxotrophes ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes, ou comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) et, le cas échéant, ces autres composants, permette(nt) l'induction de la production de 1' (ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative de la (ou des) souche(s) dans le milieu de culture, - l'extraction et, le cas échéant, la purification, du (ou des) produit(s) résultant de la réaction de bioconversion du (ou des) substrat(s) déterminé(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s). 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape d'ensemencement du milieu de culture comprenant le (ou les) substrat(s) mais ne comprenant pas, ou en faible quantité, le (ou les) composé(s) déterminé(s) pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, une étape de production d'une biomasse comprenant ladite (ou lesdites) souche(s) auxotrophe(s) susceptible(s) d'être mise(s) en culture dans le milieu susmentionné, cette étape de production de biomasse étant réalisée par mise en culture de la (ou des) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s) dans un milieu de culture susceptible de permettre une croissance significative de ladite (ou desdites) souche(s) susmentionnée(s), le milieu de culture comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), mais ne comprenant pas le (ou les) substrat(s) susceptible(s) d'être converti(s) par des enzymes produites par le (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s). 4. Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce que la souche de micro-organismes auxotrophes utilisée est une souche de levures, et en ce que les produits obtenus sont des lactones issues de la bioconversion d'acides gras utilisés en tant que substrats. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la souche utilisée est une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour un composé déterminé, notamment pour l'uracile, et en ce que le substrat utilisé est le ricinoléate de méthyle. 6. Procédé de production de y-décalactone par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5, ce procédé comprenant les étapes suivantes: - une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganismes, avec une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, ce milieu de culture ne comprenant pas d'uracile, ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes tels que principalement du glucose et du lactate, ou comprenant de l'uracile et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour permettre l'induction des enzymes produites par Yarrowia lipolytica, et plus particulièrement des enzymes impliquées dans la ss-oxydation, telles que l'Acyl-CoA oxydase (EC.6.2. 1.3) ou la 3cétoacyl-CoA thiolase (EC .2.3.1.16), ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle, - l'extraction et, le cas échéant, la purification de la y-décalactone produite par bioconversion du ricinoléate de méthyle par les enzymes produites par Yarrowia lipolytica. 7. Procédé de production de y-décalactone selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ensemencement du milieu de culture avec la souche mutante de Yarrowia lipolytica est effectué à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle à raison d'environ 15 g à environ 150 g par litre de milieu de culture, et comprenant de l'uracile à raison d'environ 5 à environ 100 mg par litre de milieu de culture, et le cas échéant, du glucose à raison d'environ 0,1 g à environ 1 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 0,1 g à environ 5 g par litre de milieu de culture. 8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de production de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, en quantité suffisante pour permettre l'ensemencement du milieu de culture tel que défini ci-dessus, avec cette dernière souche à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, cette étape préalable étant effectuée par mise en culture d'environ 3 g à environ 100 g en poids humide de levures (ce qui correspond à environ 1 g à environ 30 g en poids sec) par litre de milieu de culture, de l'espèce Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, dans un milieu comprenant de l'uracile à raison d'environ 100 mg à environ 500 mg par litre de milieu de culture, et d'autres composants nécessaires à la croissance de ces levures, tels que du glucose à raison d'environ 10 g à environ 50 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 20 g à environ 50 g par litre de milieu de culture. 9. Souche de Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophe pour l'uracile, telle qu obtenue par mutation du gène URA3 de la souche de Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 24060). 10. Utilisation de la souche selon la revendication 9, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention de y-décalactone, notamment selon l'une des revendications 6 à 8.