Brevet FR2732339A1 — publié le 19961004

A/ 2732339 Nouveaux agents de clivage d'ADN à photo-induction La présente invention concerne une composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction, notamment l'utilisation de N-aryl-N-benzylhydroxylamine comme agent de clivage d'ADN à photo-induction. Les chimistes dans le domaine de la recherche et de la synthèse moléculaire ont consacré un effort considérable à développer des agents de clivage d'ADN. A titre d'exemples représentatifs récents, on peut citer: K.M. Hess et T.A. Dix, Anal. Biochem. 1992, 206, 309; K.C. Nicolaou, W.-M. Dai, S.-C. Tsay, V.A. Estevez et W. Wrasidlo, Science, 1992, 256, 1172; M. Sako, K. Nagai et Y. Maki, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1993, 750. Les agents de clivage d'ADN antérieurs sont en général difficiles à synthétiser et leur coût de fabrication est de ce fait élevé. En outre, les processus de clivage d'ADN en utilisant ces agents de clivage d'ADN exigent souvent des ions métalliques additionnels, un agent de sensibilisation extérieur ou H202, et de ce fait ces processus sont quelque peu compliqués ou difficiles à contrôler, de sorte que le rendement de clivage est faible et peut être encore amélioré. La présente invention procure une nouvelle composition efficace d'agent de clivage d'ADN à photo-induction, suscep- tibles de cliver l'ADN dans des conditions maîtrisables. La présente composition d'agent de clivage d'ADN à photo- induction comprend une N-aryl-N-benzylhydroxylamine, ayant la formule (I): Q-,NOH ru o R dans laquelle R est un alcoyle à 1 à 6 atomes de carbone, un phényle, un alcoxy à 1 à 6 atomes de carbone, un phénoxy, un alcoxycarbonyle à 1 à 6 atomes de carbone, un halogène ou un alcoyle à 1 à 6 atomes de carbone halogéné. De préférence, R est un halogène et notamment R est le fluor. La présente invention procure également un procédé pour un clivage monobrin d'ADN, qui consiste à exposer la N-a- ryl-N-benzylhydroxylamine de la formule précédente (I) et un ADN dans une solution tampon aqueuse ayant une valeur de pH de 5 à 8 à une lumière ultraviolette d'une longueur d'onde supérieure à 300 nm et en la présence d'oxygène pendant une durée de 1 à 6 heures, de préférence 2 à 3 heures. Cette solution tampon aqueuse contient de préférence 10% en volume d'éthanol. La concentration de la N-aryl-N-benzylhydroxyla- mine (I) dans cette solution tampon aqueuse est de préférence à 1000 MM. La N-aryl-N-benzylhydroxylamine (I) utilisée dans la présente invention est stable dans l'obscurité, mais elle peut réagir avec 02 pour former des radicaux HO. lorsqu'elle est exposée à une lumière ultraviolette. Les radicaux HO. sont connus comme agents de clivage efficaces d'ADN (T.D. Tullius, B.A. Dombroski, M.E.A. Churchill et L. Kam, Methods Enzymol. 1987, , 537; J.A. Imlay, S.M. Chin et S. Linn, Science, 1988, 240, 640; D.S. Sigman, Biochemistry, 1990, 29, 9097). On va maintenant décrire brièvement le dessin, sur lequel: - la figure 1 montre les résultats d'une électrophorèse sur gel d'un clivage monobrin d'un ADN cX174 RFI circulaire (forme I, 50 MM/paire de bases, poids moléculaire 3,50 x 106, 5386 paires de bases en longueur) en un ADN circulaire relaxé (forme II) sur 1% de gel d'agarose, suivi par une coloration au bromure d'éthidium, figure sur laquelle les pistes à numéros pairs représentent les essais dans lesquels on utilise 1000 MM d'un composé lc dans la méthode 1, et les numéros impairs représentent les essais dans lesquels on n'utilise pas la N-aryl-N- benzylhydroxylamine, les pistes 1 et 2 représentant les essais effectués à un pH de 5, les pistes 3 et 4 représentant les essais effectués à un pH de 6, les pistes 5 et 6 représentant les essais effectués à un pH de 7, et les pistes 7 et 8 représentant les essais effectués à un pH de 8; - la figure 2 montre les résultats d'une électrophorèse sur gel d'un clivage monobrin d'un ADN eX174 RFI circulaire (forme I, 50 pM/paire de bases, poids moléculaire 3,50 x 106, 5386 paires de bases en longueur) en un ADN circulaire relaxé (forme II) sur 1% de gel d'agarose, suivi par une coloration au bromure d'éthidium, figure sur laquelle la piste 1 représente l'essai o on n'utilise pas la N-aryl-N-benzylhy- droxylamine, la piste 2 représente l'essai o on utilise 1000 pM du composé lc dans la méthode 1, la piste 3 repré- sente l'essai o on utilise 1000 pM du composé 9c dans la méthode 1 sans exposition à une lumière UV, et les pistes 4 à 8 représentent les essais dans lesquels on utilise respec- tivement 500, 100, 50, 10 et 1 pM du composé 9c dans la méthode 1. Dans la présente invention, on utilise la N-aryl-N-benzylhy- droxylamine ayant la formule (I) suivante comme nouvel agent de clivage d'ADN efficace: A'% Nz OH R (I) dans laquelle R est un alcoyle à 1 à 6 atomes de carbone, un phényle, un alcoxy à 1 à 6 atomes de carbone, un phénoxy, un alcoxycarbonyle à 1 à 6 atomes de carbone, un halogène ou un alcoyle halogéné à 1 à 6 atomes de carbone. Un procédé approprié pour préparer la N-aryl-N-benzylhydroxy- lamine (I) avec des rendements élevés, comme illustré dans la méthode 1 suivante, consiste à effectuer une réaction de condensation de N-arylhydroxylamines la-12a et de benzaldé- hyde (PhCHO) dans de l'éthanol (EtOH) à 25 C pendant 18 à 24 heures pour former des nitrones correspondant lb-12b; et à réduire ces nitrones lb12b avec NaBH4 dans du méthanol (MeOH) à 5 C pendant 10 minutes pour former des N-aryl-N- benzylhydroxylamines lc-12c. Dans la méthode 1, Me représente le méthyle, Et représente l'éthyle et Ph représente le phényle; et les numéros dans les parenthèses après les composés lb-12b et lc-12c représentent le rendement de production. Y Y Y "/N - iDAz4 N x xI I x H Ph Ph la X= H, Y= H lb (87%) lc (86%) 2a X = 4-Me, Y = H 2b (91%) 2c (84%) 3a X = 4-Et, Y = H 3b (81%) 3c (90%) 4a X = 4-Me, Y = Me 4b (83%) 4c (87%) a X = 2-OMe, Y = H 5b (85%o) 5c (88%) 6a X = 4-OPh, Y = H 6b (90%) 6c (94%) 7a X = 2-Ph, Y = H 7b (90%o) 7c (92%) 8a X = H, Y = COMe 8b (94%) 8c (91%) 9a X = 4-F, Y = H 9b (97%) 9c (86%) a X = H, Y =iF 10b (97%) 10c (72%) lia X = H, Y = CF3 Ilb (85%) lic (75%) 12a X = 2-M e, Y = F 12b (91%) 12c (90%) Conditions: (i) PhCHO, EtOH, 25 C, 18-24 h; (ii) NaBlI4, MeOH, 5 C, 10 min. Méthode 1 Une composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction, préparée selon la présente invention, comprend 10-1000 pM de N-aryl-N-benzylhydroxylamine (I) dans une solution tampon aqueuse ayant une valeur de pH de 5 à 8. De préférence, cette solution tampon aqueuse contient en outre 10% en volume d'éthanol. La présente composition d'agent de clivage d'ADN à photo- induction convient pour un clivage monobrin d'un ADN de forme 1 circulaire en super-hélice, mais elle n'est pas limitée à cette opération. La présente invention procure également un procédé de clivage monobrin d'un ADN, qui consiste à exposer une N-aryl-N- benzylhydroxylamine de la formule ci-dessus (I) et un ADN dans une solution tampon aqueuse ayant une valeur de pH de 5 à 8 à une lumière UV ayant une longueur d'onde supérieure à 300 nm, de préférence 312 nm, et en la présence d'oxygène pendant une période de 1 à 6 heures, et de préférence de 2 à 3 heures. Cette solution tampon aqueuse contient de préfé- rence 10% en volume d'éthanol, par exemple un mélange constitué par un rapport en volume de 1 à 9 d'éthanol et d'une solution tampon de phosphate de sodium. La concentra- tion de cette N-aryl-N-benzylhydroxylamine (I) dans la solution tampon aqueuse est de préférence 10 à 1000 MM. La concentration d'ADN dans cette solution tampon aqueuse est de préférence environ 50 pM/paire de bases. La présente invention sera mieux comprise grâce aux exemples suivants, qui sont utilisés pour illustrer la présente invention et non pas pour en limiter la portée. EXEMPLE 1: Effet de la valeur du pH sur un clivage monobrin d'ADN avec et sans le composé lc. Le composé lc dans la méthode 1 et l'ADN OX174 RFI circulaire (forme I, poids moléculaire 3,50 x 106, 5386 paires de bases en longueur) sont ajoutés à quatre solutions mixtes différen- tes constituées par un rapport en volume de 1 à 9 d'éthanol et de quatre solutions aqueuses tampon de phosphate de sodium ayant diverses valeurs de pH, respectivement 5, 6, 7 et 8. Les concentrations du composé lc et de l'ADN (forme I) dans les solutions mixtes sont respectivement 1000 pM et MM/paire de bases. Les solutions résultantes sont exposées à une lumière UV (312 nm, 16-W) à la température ambiante dans des conditions aérobies pendant 3 heures et elles sont ensuite analysées par électrophorèse sur gel sur 1% de gel d'agarose, suivie par une coloration au bromure d'éthidium. Les résultats sont montrés sur le Tableau 1. On peut voir sur la figure 1 qu'un clivage monobrin d'ADN OX174 RFI circulaire (forme I) en un ADN circulaire relaxé (forme II) a lieu avec le composé lc pour une valeur de pH comprise entre 5 et 8 (pistes 2, 4, 6 et 8). D'autre part, il ne se forme aucun ADN circulaire relaxé (forme II) en l'absence du composé lc (pistes 1, 3, 5 et 7). EXEMPLE 2: Clivage monobrin d'ADN avec les composés lc-12c à diverses concentrations. On ajoute à une solution mixte avec un rapport en volume de 1 à 9 d'éthanol et d'une solution aqueuse tampon de phosphate de sodium (Na2HPO4 et NaH2PO4; 0,1 M; pH = 6) une N-aryl-N- benzylhydroxylamine (composés lc-12c) et un ADN OX174 RFI (forme I, poids moléculaire 3,50 x 106, 5386 paires de bases en longueur). La concentration d'ADN (forme I) dans la solution mixte est fixée à 50 pM/paire de bases. Les concen- trations des N-aryl-N-benzylhydroxylamines dans la solution mixte sont énumérées dans le Tableau 1. Les solutions résultantes sont exposées à une lumière UV (312 nm, 16-W) à la température ambiante dans des conditions aérobies pendant 2 heures, et elles sont ensuite analysées par électrophorèse sur gel sur 1% de gel d'agarose, suivie par une coloration au bromure d'éthidium. Les résultats sont indiaués sur le Tableau 1. Tableau 1 Benzyl- Conc, de benzy[- ADN forme I ADN forme Il Rapports hydroxylamine hydroxylamine, [zM % % forme H/forme I lc 1000 22t3 77t7 3 5 2c 1000 3611 6319 1, 8 3c 1000 68,3 31l7 0,46 4c 1000 6719 32 1 0,47 Sc 1000 52i3 4717 0O91 6c 1000 80,8 19)2 0,24 7c 1000 49,1 5019 1l0 8c 1000 80:8 1912 0124 9_a) 1000 8313 1617 0,20 9c!000 99,9 >999 9c 500 99t9 >999 9c 100 3 1;3 6817 212 9c 50 419 5811 1,4 9c 10 58,4 4116 0,71 9c 1 6815 31,5 0,46 lOc 1000 1;2 98,8 82 1lc 1000 69)9 30,1 0, 43 12c 1000 84j0 16,0 0119 néant 0 9613 3t7 0,04 a> dans l'obscurité Les résultats du Tableau 1 montrent que les composés lc- 12c ont une aptitude au clivage monobrin d'ADN dans des condi- tions aérobies et avec exposition à une lumière UV. Parmi les composés lc-12c, les p- et m-(fluorophényl)-hydroxylamines 9c et 10c présentent un potentiel beaucoup plus élevé que les autres. Dans des conditions aérobies avec 1000 MM du compo- sé 9c, les rapports de la forme II à la forme I d'ADN sont respectivement 0,20 et plus de 999, dans l'obscurité et avec exposition à une lumière UV. Dans l'essai témoin dans des conditions photolythiques pendant 2 heures sans addition de N-aryl-N- benzylhydroxylamine, le rapport est 0,04. Ainsi, la lumière UV peut être utilisée comme "déclencheur" pour initier une N-aryl-N- benzylhydroxylamine pour une coupure des brins d'ADN. La figure 2 montre une partie des résultats de l'électrophorèse sur gel dans le Tableau 1. La présente invention a au moins les avantages suivants. Tout d'abord, on peut aisément préparer et manipuler de nombreuses N-aryl-Nbenzylhydroxylamines; on dispose ainsi d'un grand choix d'équipements pour traiter un fragment intercalaire d'ADN ou un oligonucléotide avec une N-aryl-N-benzylhydroxy- lamine pour effectuer un clivage de l'ADN en un site spécifi- que. En second lieu, il est inutile d'utiliser des ions métalliques ou H202 extérieurs. En troisième lieu, le procédé de clivage de l'ADN peut être déclenché et contrôlé en utilisant comme "déclencheur" une lumière UV. Revendications 1.- Composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction, caractérisée en ce que cette composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction contient une N-aryl-N-benzylhydroxy- lamine ayant la formule (I): 1N0 OH (I) dans laquelle R est un alcoyle à 1 à 6 atomes de carbone, un phényle, un alcoxy à 1 à 6 atomes de carbone, un phénoxy, un alcoxycarbonyle à 1 à 6 atomes de carbone, un halogène ou un alcoyle halogéné à 1 à 6 atomes de carbone. 2.- Composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un halogène. 3.- Composition d'agent de clivage d'ADN à photo-induction selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est le fluor. 4.- Méthode de clivage monobrin d'ADN, caractérisée en ce qu'on expose une N-aryl-N-benzylhydroxylamine ayant la formule (I) de la revendication 1 et un ADN dans une solution tampon aqueuse ayant une valeur de pH de 5 à 8, à une lumière UV ayant une longueur d'onde supérieure à 300 nm et en la présence d'oxygène pendant une période de 1 à 6 heures. 5.- Méthode de clivage monobrin d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce que la concentration de cette N-aryl-N- benzylhydroxylamine (I) dans cette solution tampon aqueuse est comprise entre 10 et 1000 pM. 6.- Méthode de clivage monobrin d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce que cette solution tampon aqueuse contient 10% en volume d'éthanol. 7.- Méthode de clivage monobrin d'ADN selon la revendica- tion 4, caractérisée en ce que l'exposition à la lumière UV est comprise entre 2 et 3 heures.