Brevet FR2730734A1 — publié le 19960823

La présente invention concerne une souche de microorganisme et de nouveaux composés manifestant des propriétés inhibitrices de farnésyl transférase. Différents gênes, appelés proto-oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras et leurs produits généralement désignés protéines Ras, jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. C'est ainsi qu'un grand nombre de tumeurs humaines (environ 10 à 30%) ont été associées à la présence de gènes ras modifiés. L'élucidation du rôle exact de ces protéines Ras dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse. La protéine correspondante est synthétisée in vivo sous la forme d'un précurseur cytosoluble puis modifiée de façon post-traductionnelle de manière à lui conférer son activité biologique et lui permettre de transformer les cellules de mammifères. La première et obligatoire étape de ces modifications posttraductionnelles consiste en une farnésylation du groupe thiol d'un motif cystéine, localisé au niveau du groupement carbonyle terminal de Ras. Ce motif cystéine fait partie de la séquence d'identification de la prénylation, CAAX, où C représente la cystéine, A un résidu aliphatique et X un acide aminé quelconque. C'est la protéine farnésyl transférase qui catalyse le transfert d'un groupement farnésyle du diphosphate farnésyle au composé CAAX Ras et donc qui confère, à l'issue de cette prénylation, I'activité biologique requise à la protéine pour transformer les cellules. La découverte de composés inhibant cette modification post-traductionnelle est vite apparue comme un des moyens possibles pour la mise au point de nouveaux traitements anti-cancéreux. L'inhibition de la farnésylation de Ras empêcherait la localisation de la protéine Ras au niveau membranaire et par conséquent bloquerait sa faculté à transformer les cellules normales en cellules cancéreuses. La présente invention a pour objet principal de proposer de nouveaux inhibiteurs de farnésyl transférase. Plus précisément, la présente invention résulte de l'isolement d'une souche de microorganisme apparentée au genre Chrysosporium plus préférentiellement à l'espèce lobatum possédant des propriétés particulièrement avantageuses pour la production de composés manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase. Un aspect de l'invention concerne donc une souche Chrysosporium caractérisée en ce qu'il s'agit du microorganisme Chrysosporium CBS 123.95, d'un de ses dérivés ou de ses mutants. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé ou mutant, toute souche obtenue à partir de la souche Chrysosporium CBS 123.95 et susceptible d'être utilisée pour la production de composés selon l'invention et plus particulièrement manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase. En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par modifications génétiques (altération au niveau de l'ADN) ou biochimiques. A cet effet, différents outils de mutagénèse peuvent être utilisés, comme par exemple des outils non spécifiques: - agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet...) ou - agents chimiques (agents alkylants ou bialkylants, agents intercalants...), ou des outils spécifiques tels que les systèmes d'insertions mutationnelles dirigés sur l'ADN (transposons, rétrotransposons, plasmides intégratifs, etc). La fermentation de cette souche sur un milieu de culture convenable et l'extraction subséquente du moût de fermentation correspondant permet d'isoler des composés qui, quoique possédant une structure originale comparativement aux inhibiteurs classiques de farnésyl transférase, se révèlent, de manière inattendue, intéressants à ce titre. La présente invention concerne également des composés susceptibles d'être obtenus par fermentation de la souche Chrysosportum CBS 123.95 ou d'un de ses mutants via l'extraction du moût de fermentation correspondant. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de métabolites actifs selon lequel on cultive la souche Chrysosporîum CBS 123.95 ou l'un de ses dérivés ou mutants et l'on récupère au moins un métabolite actif. La fermentation de la souche est réalisée de manière classique à savoir sur un milieu de culture contenant les susbtrats nécessaires au développement dudit microorganisme et dans des conditions de température et d'aération adéquate. Il est clair que la mise au point de ces conditions optimales pour le développement du microorganisme fait appel à de simples opérations de routine, familières à l'homme du métier. A titre indicatif, le milieu de culture peut comprendre de l'extrait de malt et de la gélose. La fermentation est réalisée de préférence à une température supérieure à la température ambiante et plus particulièrement de l'ordre de 20"C à 30"C. Le pH est de l'ordre de 7 et le milieu est aéré et agité. A l'issue de la fermentation, on récupère le moût de fermentation et on procède à son extraction. Cette extraction est effectuée à un pH acide, à l'aide d'un solvant organique adéquat. Il s'agit de préférence d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont recueillies, concentrées et réextraites avec une solution aqueuse alcalinisée à pH de l'ordre de 9. Les phases aqueuses correspondantes sont réunies, réacidifiées et extraites par un solvant organique. Le composé selon l'invention est récupéré par précipitation à l'issue de la concentration de la phase organique correspondante. L'exemple 1, présenté ci-après, rend compte de manière détaillée de ce processus d'isolement de composés selon l'invention à partir d'un moût de fermentation. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels dans laquelle: - R1 représente un groupement alkoxy en C1 à Cg, un groupement aldéhyde, carboxylique, un ester d'alkyle en C1 à C5 ou un groupement alkyle-hydroxyle en C1 à C5. - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en C1 à C4 et - R3 représente un groupement alkyle en C1 à C4, un groupement hydroxyle ou un groupement alkoxy en C1 à C4. Plus préférentiellement, il s'agit de composés de formule générale II: dans laquelle R2 et R4 répondent à la définition présentée ci-dessus pour R2 et R5 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à Cg, le cas échéant substitué par un groupement choisi parmi les groupements hydroxyle ou phényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements méthyle, méthoxy, hydroxyle ou halogène. A titre de composés préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner le composé suivant ainsi que ses sels: De manière inattendue, il présente une activité significative in vitro dans le test d'inhibition de la farnésyl transférase. Le principe de la technologie SPA ( Scintillation Proximity Assay) est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase. Selon cette méthode, I'activité inhibitrice farnésyl transférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyle transférée à partir du (3H) farnésyl pyrophosphate 3H FPP sur un substrat accepteur biotinylé. La présente invention se rapporte également à l'utilisation des composés selon l'invention dans les traitements anticancéreux. Elle concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant une quantité suffisante d'au moins un composé selon l'invention en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs. 1 MATERIELS ET METHODES Un échantillon de la souche Chiysosporium selon l'invention et mise en oeuvre dans l'exemple présenté ci-après, a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmel culturen (CBS) à Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 123.95. Méthode employée pour détecter les métabolites actifs : test d'inhibition de la farnésvl transférase par scintillation proximity assav (SPA). Le principe de la technologie SPA ( H.E. Hart and E.B. Greenwald, J. Nucl Med, 20, 1062-1065, 1979 et Nelson N., Analytical Biochemistry, 165, 287-293,1987.) est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase (Ftase). Cette enzyme a été partiellement purifiée à partir de cellules THP1 humaines (Fromage N., Guitton J.D., Joyeux C., Desanlis F., Boniface O., Soria H.M., Boucher F., Clerc F.F., Crespo A., Duchesne M., Lavayre J., Tocque B;, Van Der Pyl D., Mayaux J.F., Becquart J., 5th European Meeting of GFBC on bio-chromatography and molecular biology, May 12-14, 1992, France). Le substrat accepteur, biotinylé, est un peptide de 11 acides aminés correspondant à la séquence terminale de la lamine-B (BLB). Le substrat donneur, le farnésyl pyrophosphate est marqué au tritrium 3H FPP.L'enzyme transfère le 3H FPP au substrat accepteur biotinylé et une fois la réaction arrêtée, le peptide farnésylé est capturé par des billes encapsulant un scintillant fluorescent et couplées à la streptavidine (kit Amersham, TRKQ7010(E)). Le peptide radio-marqué, excite les billes qui émettent alors de la lumière que l'on quantifie dans un compteur à scintillation solide-liquide (TopcountB, Packard). La réaction SPA est démarrée en ajoutant 40111 de Ftase (2g) dans une microplaque contenant 20 Ill de BLB (0,1 M), 20 RI de 3H FPP (0,12 ,uM) et 20 Cil de tampon d'essai 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgC12, 5 mM DTT, 20 mM KCl, 0.01 % triton X100 (témoin) ou 20 ;il d'échantillon dilué dans le tampon d'essai (screening). La plaque est incubée 60 minutes à 37"C et la réaction est stoppée par l'ajout de 150 ,ul de réactif d'arrêt contenant les billes SPA. La plaque est scellée avec un film adhésif et laissée 30 minutes à température ambiante pour atteindre l'équilibre, puis comptée dans le compteur Topcount.Les résultats sont comptés en désintégration par minute, dpm, et exprimés en % d'inhibition par rapport au témoin enzyme (après soustraction du blanc). Les CI50 des composés sont calculées par régression non linéaire. EXEMPLE 1 Préparation d'un métabolite actif selon l'invention à partir de la souche Chrvsosporium CBS 123.95. Trois erlenmeyers de 250 ml remplis avec 50 ml de milieu préalablement stérilisé (peptone 5g"l, extrait de viande 5g'l, glucose 10g/l, chlorure de sodium 5g'l, agar Ig/l, tween 85 Ig/l, pH 7,2) sont ensemencés par une culture du Chrysosporium CBS 123.95 sous forme de culture liquide congelée. Ils sont agités à 240 trs/min dans un agitateur thermostaté à 28"C. Après 5 jours, 100 ml de ces cultures sont transférés dans un ballon de 6 I rempli par 21 du même milieu. Ce ballon, muni de 2 tubulures latérales (une pour l'ensemencement, l'autre pour l'inoculation du fermenteur) est mis en agitation à 22"C sur un tambour magnétique à 600 tours par minutes environ. Après 72 heures d'incubation, la totalité de cette culture est transférée stérilement dans un fermenteur de production de 100 litres rempli avec 60 litres de milieu préalablement stérilisé (extrait de malt 20go, agar Ig/l, tween 85 Ig/l). Pendant 142 heures la culture est maintenue à une température de 230C, une pression de 0,5 bar, agitée à 200 trs/min et aérée à raison de 1,5 m3/hr. 1-3 Extraction et purification 58,2 kg de moût sont acidifiés à pH 3 puis agités pendant 1 heure avec 1 volume d'acétate d'éthyle. Après séparation de la phase organique par centrifugation l'ensemble des opérations précédentes est renouvelé 1 fois. Les 2 phases organiques sont réunies et concentrées sous pression réduite à 5 litres. L'extrait acétate d'éthyle obtenu est extrait à son tour par agitation pendant une heure avec 1 volume d'une solution aqueuse alcalinisée à pH 9. La phase organique est écartée par décantation et centrifugation. La phase aqueuse est acidifiée à pH 3 et extraite par 2 fois 1 volume d'acétate d'éthyle. Après décantation et centrifugation, la phase organique est concentrée sous pression réduite à 1,5 litre; à ce stade de concentration une précipitation apparaît.Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité formé est séparé par filtration sur verre fritté N04. Nous obtenons après séchage une nuit à l'étuve sous vide un extrait de 1,7 g présentant une Cîso inférieure à 3 Zg/ml. L'étape suivante de purification consiste en une chromatographie de perméation sur support Sephadex LH208 (Pharmacia) effectuée sur des parties aliquotes de cet extrait sec. Par exemple, 500 mg sont dissous dans 10 ml d'un mélange MeOH/H20 1/1 v/v puis déposés au sommet d'une colonne cylindrique en verre de 30 mm de diamètre interne et de 100 cm de hauteur contenant le support préalablement gonflé dans le méthanol. L'élution s'effectue dans le méthanol à 0,5 ml/min. Des fractions de 2 mi sont collectées. A ce stade, les fractions obtenues peuvent être analysées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice Merck 60 F 2548 avec l'éluant AcOEt/EtOH/H20 40:15:15, v:v:v.Dans ce système le métabolite recherché migre à un rapport frontal (Rf) compris entre 0,4 et 0,50, et se révèle de couleur bleu après pulvérisation du réactif de Dittmer ( bleu de molybdène Sigmas). Le métabolite actif est localisé dans les fractions 25 à 45 qui sont réunies, évaporées sous vide pour donner au total 1,1 g de poudre beige présentant une Cîso inférieure à I ,ug/ml. La purification peut être poursuivie par chromatographie liquide haute performance: le produit actif précédent (1, lg), remis en solution dans un mélange MeOH/H20 50:50 est injecté à raison de 0,5 ml pour chaque chromatographie dans un appareil HPLC équipé comme suit: colonne : BioSil HL90-10 (Biorad), C18 10m, 250x10 mm débit de 3 ml/min élution isocratique A/B, 20:80, v:v A: H20 avec 0,1 % TFA B : CH3CN / H20, 95: 5, avec 0,1 % TFA détection UV à 210 nm. Le métabolite actif est collecté au temps de rétention de 6,6 min. A l'issue de multiples injections et séparations par HPLC dans les conditions citées ci-dessus, les fractions renfermant le produit actif sont réunies. Après évaporation de l'acétonitrile sous pression réduite, I'extrait actif est percolé sur une colonne Mega Bond Elut (E)Clg Varian qui est ensuite rincée par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre de l'effluent I'élution s'effectue ensuite par environ 20 ml de méthanol.Après évaporation sous pression réduite de l'éluat méthanolique, nous obtenons 1 g de poudre beige clair correspondant au métabolite actif suivant Propriétés physico-chimiques Formule moléculaire C30 9O9 P S.M (m/z) 583 (M-H) Caractérisation par RMN de ce composé dans le DMSO-d6 (T=300K) Position No #c (150 MHz) #H (600 MHz) 1 82 2.98 (1H,d,6Hz) 2 74 3.70(11l,t,7Hz) 3 77.5 3.50 (1H,d,7Hz) 4 52.7 4a 47 2.05 (1H,m) 5 27 2.10 (1H,m) 1.77 (1H,m) 6 117 5.28 (lH,m) 6a 147 6b 42.6 7 31.3 1.35 (lH,m) 1.50 (lH,m) 8 37 1.64 (1H,m) 1.40 (1H,m) 8a 43.5 9 60 0.94(1H,m) 10 29 1.15(1H,m) 1.74 (1H,m) 11 20.7 1.20(îH,m) 1.35 (îH,m) lla 55 1.35(1H,m) 11b 36.3 12 33.7 1.29(2H,t,3Hz) 13 20.7 2.19 (1H,m) 1.75 (lH,m) 13a 50.5 2.63 (lH,m) 13b 45.7 14 180 15 11.8 1.17(3H,s) 16 25 0.99(3H,s) 17 15 0.67(3H,s) 18 31.4 1.40(3H,m) 19 23 0.83 (3H,d,6Hz) 20 24 0.79 (3H,d,6Hz) 21 22 0.81(3H,s) 22 60.5 3.60(1H,d,6Hz) 4.02(lH,t,6Hz) EXEMPLE 2 Détermination de l'activité inhibitrice de la protéine farnésyl-transférase. Cette activité est appréciée pour le métabolite de l'exemple 1 selon la méthode décrite dans le chapitre précédent intitulé materiels et méthodes. CVFM* 1 CI50 52nM 830nM * Peptide ( Cystéine-Valine-Phénylalanine-Méthionine) utilisé à titre de témoin dans les mesures d'activité farnésyl transférase. REVENDICATIONS 1. Souche Chrysosporium NO CBS 123.95 et ses mutants ou dérivés. 2. Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale I dans laquelle: - R1 représente un groupement alkoxy en C1 à Cg, un groupement aldéhyde, carboxylique, un ester d'alkyle en C1 à C5 ou un groupement alkyle-hydroxyle en C1 à C5. - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en C1 à C4 et - R3 représente un groupement alkyle en C1 à C4, un groupement hydroxyle ou un groupement alkoxy en C1 à C4. et leurs sels. 3. Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale II: dans laquelle: R2 et R4 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en C1 à C4 et R5 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à Cg, le cas échéant substitué par un groupement choisi parmi les groupements hydroxyle ou phényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements méthyle, méthoxy, hydroxyle ou halogène, et ses sels. 4. Composé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé de formule et ses sels. 5. Composé selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisé en ce qu'il présente une activité inhibitrice de farnésyl transférase. 6. Composé susceptible d'être obtenu par fermentation de la souche Chrysosporium CBS 123.95 ou d'un de ses mutants selon la revendication 1 via l'extraction du moût de fermentation correspondant. 7. Procédé de production de métabolites actifs caractérisé en ce que l'on cultive la souche Chiysosponum CBS 123.95 selon la revendication 1 et l'on récupère au moins un métabolite par extraction du moût de fermentation correspondant. 8. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité suffisante d'au moins un composé selon la revendication 2, 3 ou 4 en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs. 9. Utilisation d'un composé selon la revendication 2, 3 ou 4 pour la préparation d'unt composition pharmaceutique destinée aux traitements anti-cancéreux.