Brevet FR2726471A1 — publié le 19960510

Le VRS est la cause la plus fréquente d'hospitalisation des nourrissons de moins d'un an pour les infections respiratoires aiguës. Les enfants atteints de laryngotrachéobronchites, bronchiolites et pneumonies nécessitent des soins hospitaliers et chez les nourrissons présentant des maladies cardiaques congénitales, le taux de mortalité est supérieur à 37 96. D'autres troubles comme les dysplasies bronchopulmonaires, les maladies rénales et l'immunodéficience sont autant de facteurs responsables de mortalités élevées. Les infections au VRS peuvent également être une cause de mortalité chez les personnes ragées. Dans les pays tempérés, I'épidémie du VRS se manifeste pendant la période hivernale de novembre à avril et la plus grande incidence de sérieuses maladies survient chez le nourrisson de 2 à 6 mois. On distingue deux types de VRS: VRS-A et VRS-B par la variation antigénique de la glycoprotéine G du VRS: sous-groupe A et sous-groupe B, qui circulent concurremment. Une étude récente en France de 1982 à 1990 a montré une alternance d'un sous-groupe à l'autre sur une période de 5 ans. La souche A est souvent la cause des atteintes d'infections plus graves que la souche B. Dans les années 60, la tentative de mise au point de vaccins classiques, c'est-à-dire le VRS inactivé par le formol, analogue à des vaccins antirougeoleux, a échoué. Au lieu de conférer une protection chez l'enfant vacciné, ce type de vaccin a eu pour effet de potentialiser la maladie virale naturelle. Le VRS humain appartient au genre pneumovirus, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le génome du virus est constitué d'un brin d'ARN à polarité négative, non segmenté, codant pour 10 protéines distinctes: NS1, NS2, N, P, M, SH (ou 1A), G, F, M2 (ou 22K) et L De nombreuses expériences publiées ont démontré que les protéines majeures impliquées dans la protection sont: F, G et N. La glycoprotéine de fusion F synthétisée comme précurseur Fo est scindée en deux sous-unités F1 (48 kDa) et F2 (20 kDa) reliées par des ponts disulfures. la protéine F est conservée entre le VRS-A et le VRS-B (91 % homologie). A l'inverse, la glycoprotéine d'attachement G est très variable d'un sous-groupe à l'autre. Seulement une région de 13 acides aminés (aa 164 à aa 176) est hautement conservée et quatre résidus cystéine (173, 176,182 et 186) sont maintenus dans chaque sous-groupe. Il a été démontré sur les modèles animaux que les deux glycoprotéines F et G jouent un rôle majeur dans l'immunologie du VRS. Les anticorps monoclonaux dirigés contre G et F sont capables de neutraliser le virus in vitro et passivement administrés, ils protègent le rat des cotonniers contre l'infection par le VRS. Les traitements actuels contre l'aggravation de la maladie due au VRS chez le nourrisson sont les dégagements de l'encombrement des voies respiratoires par aspiration de mucosités et l'assistance respiratoire par ventilation. Un antiviral, la Ribavirine semble être efficace dans les cas gravement atteints. Cependant, son utilisation dans la thérapie pédiatrique est encore mal définie. L'immunisation passive avec des immunoglobulines anti-VRS est une voie alternative dans les traitements des infections graves au VRS : aucun effet secondaire indésirable n'a été observé. Néanmoins, ce type de traitement est très coûteux et difficilement extrapolable à grande échelle. Les différentes approches de vaccination contre le VRS humain ont été entreprises : soit le vaccin protège contre l'infection du VRS chez l'animal (rongeurs, primates) mais induit une pathologie pulmonaire, soit le vaccin n'est pas assez immunogénique et ne protège pas (Connors et col, Vaccine 1992; 10: 475-484). C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour améliorer l'immunogénicité d'un immunogène ou d'un haptène, lorsqu'il est administré à un hôte, indépendamment du mode d'administration, caractérisé en ce que ledit immunogène ou haptène est couplé de façon covalente à une molécule support, pour former un complexe, et en ce que cette molécule support est un fragment polypeptidique capable de se lier spécifiquement à la sérumaîbumine de mammifère. L'administration peut notamment étre entérale, parentérale, ou orale. Un complexe particulièrement adapté pour la mise en oeuvre de la présente invention est obtenu par l'utilisation d'un conjugué avec un polypeptide dérivé de la protéine G du streptocoque ; cette protéine a été caractérisée par Nygren et col (J.Mol. Recognit. 1988; 1 : 69-74). L'invention a pour objet un procédé dans lequel la molécule support présente la séquence en acides aminés notée séquence ID n" 3 ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence ID n" 3. Le complexe entre la molécule support et le composé dont on souhaite améliorer l'immunogénicité peut être produit par les techniques d'ADN recombinant, notamment par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour le support, de l'ADN codant pour l' immunogène ou l'haptène. Selon un autre mode de mise en oeuvre le couplage covalent entre la molécule support et l'immunogène est réalisé par voie chimique, selon des techniques connues de l'homme du métier. L'invention a également pour objet un gène de fusion permettant la mise en oeuvre du procédé d'amélioration de l'immunogénicité caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la molécule support, de l'ADN codant pour l'immunogène ou haptène, fusionnée avec un promoteur; elle comprend également un vecteur contenant un tel gène, ledit vecteur pouvant avoir notamment pour origine un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide. Un vecteur présentant la séquence ID n" 1 ou 2 fait partie de l'invention, ainsi que le polypeptide correspondant. La molécule d'ADN codant pour le complexe entre l'immunogène et la molécule support peut être intégrée dans le génome de la cellule hôte. Le procédé selon l'invention comprend, dans l'un de ses modes de mise en oeuvre, une étape de production du complexe, par génie génétique, dans une cellule hôte. La cellule hôte peut être de type procaryote et être notamment choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus; il peut également s'agir d'une levure. Selon un autre aspect, la cellule hôte provient d'un mammifère. Le gène de fusion codant pour le complexe ayant une immunogénicité améliorée peut notamment être introduit dans la cellule hôte par l'intermédiaire d'un vecteur viral. L'immunogène utilisé provient de préférence de bactéries, de parasites et de virus. Cet immunogène peut être un haptène : peptide, polysaccharide. Le procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour un polypeptide de surface d'un agent pathogène. Lorsque celui-ci est exprimé sous forme de protéine de fusion, par les techniques d'ADN recombinant, la protéine de fusion est avantageusement exprimée, ancrée et exposée à la surface de la membrane des cellules hôtes. L'immunogène peut notamment dériver d'une glycoprotéine de surface du VRS: F et/ou G. Des résultats particulièrement avantageux sont obtenus avec des fragments de la protéine G du VRS, sous-groupes A ou B. Les protéines dérivées de la glycoprotéine G du sous-groupe A et du sous-groupe B du VRS peuvent être génétiquement fusionnées ou chimiquement couplées à BB. L'invention a donc pour objet un complexe obtenu à partir de la séquence comprise entre les amino acides 130 et 230 de la protéine G du VRS, ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence de la protéine G. Cette séquence peut être obtenue à partir de VRS humain ou bovin, appartenant aux sous-groupes A ou B. La séquence comprise entre les amino acides 130 et 230 de la protéine G peut subir divers types de modifications destinées à moduler son activité immunogénique et son expression par le système hôte. La Demanderesse a, en particulier, montré l'intérêt des polypeptides dans lesquels - I'acide aminé Cys en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par un aminoacide ne formant pas de pont disulfure en particulier la serine, et/ou - les acides aminés en positions 176 et 182 sont susceptibles de former un pont covalent autre qu'un pont disulfure notamment l'acide aspartique et l'ornithine, et/ou - les acides aminés phénylalanine correspondant aux positions 163, 165, 168 et/ou 170 de la séquence de la protéine G sont remplacés par un acide aminé polaire, en particulier la sérine, et/ou - la séquence comprise entre les acides aminés numérotés 162 et 170 est délétée. D'autres immunogènes adaptés à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention comprennent un dérivé de la protéine de surface du virus de l'hépatite A, B et C, une protéine de surface du virus de la rougeole, une protéine de surface du virus parainfluenza 3, en particulier une glycoprotéine de surface telle que hémaglutinine, neuraminidase HN et la protéine de fusion F. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un gène de fusion ou d'un complexe entre un immunogène (P) et une molécule support tels que définis précédemment, à titre de médicament. Les compositions pharmaceutiques contenant le gène ou le complexe avec des excipients physiologiquement acceptables font également partie de l'invention. Ils sont particulièrement adaptés à la préparation d'un vaccin. L'immunisation pourra être obtenue par l'administration de la séquence nucléotidique, seule ou par l'intermédiaire d'un vecteur viral. On peut également utiliser la cellule hôte, notamment une bactérie inactivée. Enfin, le complexe obtenu par couplage chimique ou sous forme de protéine de fusion induit une réponse d'anticorps très forte comparée à (P) seul couplé à l'adjuvant de Freund. Dans le cadre d'un vaccin contre le VRS, la Demanderesse a montré l'efficacité de la protéine de fusion BBG2A, où G2A est un fragment de 101 acides aminés de la protéine G du VRS-A (G aa 130 - aa 230) Seq id n"l. Immunisés chez les rongeurs, BBG2A et BBG2A6C couplés à l'Alum (Hydroxyde d'Aluminium) confèrent une protection totale contre l'épreuve de challenge contre le VRS-A (souche Long). Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples on se référera à la figure suivante - Figure 1 : Construction de pVABBG2(A). EXEMPLE 1 :CLONAGE DE GENE G2A ET G2AaC DANS VECTEUR D'EXPRESSION DVABB308 ET PRODUCTION DE PROTEINES DE FUSION BBG2A. BBG2AbC DANS ENCHERICHIA COLI 1) Vecteur d'expression pVABB308 Le vecteur d'expression dans E coli, pVABB308 (5,4 Kpb) renferme le promoteur de l'opéron tryptophane (Trp), suivi du gène codant pour la région de liaison à l'Albumine humaine BB, d'origine de la protéine G du Streptocoque (Nygren et col, J. Mol. Recognit. 1988 ; 1: 69-74) et un site de clonage multiple mp8, auquel on peut insérer divers gènes hétérologues (voir figure 1). Le plasmide pVABB308 contient un gène de résistance à l'Ampicilline (AMP), un gène de résistance à la Tétracycline (Tet) et l'origine de réplication de E. coli.L'expression du gène est induite par addition de l'I.A.A. (Indole Acrylic Acid) dans le milieu de culture de E coli en phase de croissance exponentielle. 2) Clonage de gène G2A et G2AbC dans pVABB308 2.1. BBG2A Le gène codant pour G (130-230) du VRS-A a été obtenu par la méthode d'assemblage de gènes synthétiques en phase solide (selon Stahl et col, Biotechniques 1992 ; 14 : 424-434) et cloné dans le vecteur d'expression pVABB par les sites de restriction EcoRI et Hind 111. Le vecteur résultant est nommé pVABBG2A (5791 pb). Le produit de fusion BBG2A est purifié à partir du cytosol de E coli transformé par le vecteur pVABBGZA sous deux formes: - une forme soluble, BBG2A (sol), après désintégration des cellules et centrifugation, le surnageant contenant les protéines solubles est directement chargé sur colonne d'affinité. Les produits sont récupérés après élution à pH acide. - une forme insoluble, BBG2A (insoluble), obtenue après renaturation dans un milieu oxydant des corps d'inclusion dissous dans un agent chaotropique (Guanidine HCl) (31, 93) puis purifiée par affinité. 2.2. BBG2ADC Les deux résidus cystéine (173, 186) sont remplacés par des sérines (Ser). Lors de l'assemblage de gènes, l'oligonucléotide qui renferme les 2 résidus Cys codés par le triplet (TGC) est substitué tout simplement par un autre oligonucléotide dont un des nucléotides a changé: (TCC) codant pour Ser.Nous avons voulu délibérément altérer un pont disulfure dans cette version pour garder uniquement le pont disulfure formé par les Cys (176,182), qui est critique pour la protection (Trudel et col, Virology 1991; 185: 74g757)- Nous avons introduit un résidu Met entre la queue d'affinité BB et G2A ou BB et G2AbC : BBMet-G2A, BBM et G2AdC, ce qui permet d'effectuer un clivage chimique du produit de fusion par le bromure de cyanogène (CNBr) ; le mélange est passé sur colonne d'afinité HSA-Sepharose. Le peptide clivé G2A (G2AbC) n'est pas fixé et donc récupéré dans l'éluat, ensuite purifié par HPLC phase réverse. 3) Fermentation et purification de protéines de fusion Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Triptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 Fg/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 rg/ml, Sigma), on inocule avec E coli RV308 transformés avec les plasmides pVABBG2A et pVABBG2AC respectivement. On incube pendant 16 heures à r = 32"C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermenteur (CHEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres de milieu de culture.Le milieu contient (g/l) = glycérol, 5 ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphate de potassium, 3 hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1; Ampicilline, 0,1; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/l de solution de traces éléments et 0,65 ml/l de solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé à 7,3. La température est fixée à 32"C. La croissance est contrôlée en alimentant du glycérol à un débit constant pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %.Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (environ après 27 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (I.A.A.) à la concentration finale de 25 mg/l. Trois heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 150 g/l de culture. Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70 ml de solution de TST (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, 0,05 % Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication (Vibracell 72401, Sonics & Materials). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant est filtré (1,2 rm) et dilué dans 500 ml de TST. Les protéines de fusion ainsi obtenues sous formes solubles sont purifiées sur colonne d'affinité: HSA-Sepharose (human serum albumin) selon le protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol. Methods, 1989; 124: 43-52). Le lysat insoluble, après centrifugation, est lavé une fois avec un tampon (Tris-HCl 50 mM pH 8,5 ; MgCl2 5 mM). Après lavage, le culot est solubilisé dans 30 ml de chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris-HC1 25 mM (pH 8,5), Dithiotreitol (D1T) 10 mM, suivi d'une incubation à 37 C pendant 2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon de renaturation (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5); NaCl 150 mM et 0,05 % Tween 20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE (12 %) dans des conditions réduites, sur l'appareil MINI PROTEAN II SYSTEM (BIORADS). Les protéines sont visualisées avec du Coomassie brilliant blue R250. EXEMPLE 2 : EFFET PORTEUR DU POLYPEPTIDE BB ET IMMUNOGENICITE DE BBG2AbC 1. Schéma d'immunisations Des souris C57BI/6 (5 par lot) ont reçu 2 injections sous-cutanée de 10 rg d'équivalent G2A#C en présence d'adjuvants de Freund à JO (adjuvant complet) et J14 (adjuvant incomplet). A J21, les sérums ont été testés individuellement en ELISA pour la production d'anticorps spécifiques de G2A6C. Le titre anticorps est déterminé comme étant l'inverse de la dilution du sérum donnant 2 fois l'absorbance du sérum de l'animal avant immunisation. Les résultats présentés sont la moyenne arithmétique des titres anticorps antiX2AbC obtenus pour chacun des lots. TABLEAU DE RESULTATS ANTIGENE Titre moyen d'anticorps anti G2AbC 1)G2AôC+AF 180 2) BBG2AC + AF 92800 3) G2A#C + BB + AF 1200 2. Résultats Le tableau ci-dessus montre que G2AbC est un faible immunogène même en présence d'adjuvant de Freund. La protéine BB a un faible pouvoir adjuvant, puisqu'additionnée à G2A#C le titre anticorps anti-G2AbC n'augmente que d'un log. En revanche, la fusion de BB à G2AbC accroit la production d'anticorps anti-G2AbC d'environ 3 log. Nous pouvons donc conclure que BB est une excellente protéine porteuse pour G2AC et que la protéine de fusion BBG2AC est très immunogène. EXEMPLE 3 :ETUDE DE PROTECTION INDUITE PAR DES PROTEINES DE FUSION BBG2A ET BBG2AC CHEZ LES RONGEURS a) Protocoles d'étude Des souris BALB/c et des rats des cotonniers (Sigmodon hispidus) femelles (IFFA-CREDO), modèles animaux pour l'infection par le VRS, sont utilisés dans les expériences d'immunisation. Les groupes d'animaux reçoivent 1, 2, ou 3 doses de 200 g, 20 g, 2 g ou 0,2 rg de candidat vaccin VRS-A dans 20 % d'hydroxyde d'aluminium (Al(OH)3) (v/v) à 2 semaines d'intervalle. Les souris sont immunisées par voie intrapéritonéale (i.p.), les rats des cotonniers par injections intramusculaires (i.m.). Les groupes contrôles reçoivent 105 DICT5o de VRS-A ou du PBS-A (PBS sans Ca2+ ni Mg2+) dans 20 % d'hydroxyde d'aluminium (v/v). Trois à quatre semaines après la dernière immunisation, les animaux sont challengés par voie intranasale (i.n.) avec environ 105 DICT50 VRS-A. Ils sont sacrifiés 5 jours plus tard, après ponction sanguine intracardiaque. La présence du virus dans leurs poumons est testée selon Trudel et col, Virology 1991; 185: 749-757). Les différents produits testés sont BBG2A, BBG2AoC et BB seul. b) Tableau de résultats Résultats de protection chez les rondeurs Tableau 3.1 Souris Rat des cotonniers Antigènes Protection* Protection Protection Protection complète0 complète BBG2A 41/41+ 38/41 22/22 22/22 BBGZMC 32/34 27/34 8/13 7/13 BB 0/20 0/20 0/3 0/3 RSV-A 28/28 28/28 17/17 17/17 PBS-A 0/29 0/29 0/21 0/21 * Protection = une réduction de virus dans les poumons de 2 log102 par rapport au titre moyen de virus dans les poumons des souris immunisées avec PBSA. e Protection complète = aucun virus détecté dans les poumons. + X/Y où X= nombre des animaux protégés ou complètement protégés Y= nombre des animaux testés Détails de protection chez la souris Tableau 3.2 3 doses d'antigènes 2 doses d'antigènes 1 dose d'antigènes BBG2A BBG2#C BBG2A BBG2#C BBG2A BBG2#C 200 Ug/dose Protection* 9/9+ 9/9 4/4 4/4 4/4 2/4 Protection complète 9/9 8/9 4/4 3/4 3/4 1/4 20 ug/dose Protection* 4/4 4/4 3/3 NT NT NT Protection complète 4/4 4/4 2/3 NT NT NT 2 ug/dose Protection* 4/4 4/4 2/2 NT NT NT Protection complète 3/4 3/4 2/2 NT NT NT 0.2 ug/dose Protection 4/4 4/4 NT NT NT NT Protection complète 4/4 3/4 NT NT NT NT * Protection = une réduction de virus dans les poumons de #log 102 par rapport au titre moyen de virus dans les poumons des souris immunisées avec PBS-A. Protection complète - aucun virus détecté dans les poumons. +X/Y où X = nombre de souris protégées ou complètement protégées; Y= nombre de souris testées NT = Non testées Résultats des test immunologiques chez les souris Tableau 3.3 Antigènes ELISA(LOGlOmoyen) Anticorps neutralisants (titre moyen/25ul) BBG2A 5.09 (28) 2 512(15) BBG2AbC 3.71 (29) 2 256 (12) RSV-A 5.32(21) r 512 (12) ( ) = nombre d'animaux testés c) Discussion Les résultats expérimentaux de protection sont présentés dans les tableaux 3.1. et 3.2. Chaque molécule a été testée au cours de 2 expériences indépendantes au moins. Les résultats montrent clairement que, indépendamment des protocoles d'immunisation utilisés, BBG2A protège les rongeurs contre une infection pulmonaire par le VRS-A.Dans nos conditions expérimentales, une injection unique de 200 g, 2 de 2 rg, ou 3 de seulement 0,2 rg de BBG2A sont suffisantes pour protéger les souris contre l'infection (Tableau 3.2). Du virus a été détecté chez un troisième animal du même groupe mais à la limite de détection. Ces résultats suggèrent que BBG2A présente un potentiel et une efficacité très comparables à ceux du VRS-A chez les animaux immunisés contrôles et à ceux des vaccins candidats sous-unitaires du VRS-A décrits dans la littérature. BBG2AbC a aussi été efficace chez la souris, protégeant 32 animaux sur 34 contre l'infection pulmonaire. Deux doses de 200 ,ug se sont révélées efficaces, tout comme 3 injections de 0,2 g. Ainsi, dans ces schémas d'immunisation comportant plusieurs injections, BBG2AC s'est montré comparable en activité et en efficacité chez la souris aux candidats vaccins sous-unitaires du VRS-A déjà décrits. Les résultats des tests immunologiques de la réponse humorale et cellulaire, chez la souris BALB/c, sont présentés sur le tableau 3.3. En général, les titres moyens d'anticorps spécifiques anti-VRS-A obtenus en technique ELISA sont considérés comme un des reflets de l'activité protectrice des vaccins candidats. Les sérums des souris immunisées avec le VRS-A ont montré de façon constante des titres d'anticorps anti-VRS-A élevés. Le virus nta jamais été détecté dans les poumons de ces animaux. Les souris immunisées par BBG2A ont montré des titres moyens d'anticorps anti-VRS-A semblablement élevés et ont toujours été protégées lors d'un challenge par le VRS-A. BBG2AC a permis d'induire des titres moyens d'anticorps anti-VRS-A inférieurs par rapport aux molécules mentionnées ci-dessus. De plus, les animaux immunisés par cette molécule ont montré une protection légèrement réduite. Si les sérums de quelques animaux immunisés par BBG2AC ont montré des titres d'anticorps spécifiques anti-VRS-A très faibles (données non représentées), certains de ces animaux ont néanmoins été totalement protégés lors d'un challenge par le VRS-A. Les études de protection mettent en évidence l'efficacité protectrice des vaccins candidats sous-unitaires anti-VRS A. Deux molécules, BBG2A et BBG2A5C, se sont révélées très efficaces dans deux modèles de rongeurs pour l'infection au VRS-A, lors du challenge avec le virus homologue. LISTE DE SEQUENCES Information pour la SEQ ID n 1 TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 349 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire AUTRES INFORMATIONS: BBG2N(A) TYPE DE MOLECULE : protéines L(1-8) # E'(9-14) # Fra@e 3 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GOC GTA GAC 308 317 326 335 344 linker (15-23) # BB(24-242) Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu GOG AAT TTC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GCA GIA AGT GAC TAT TAC AAG AAT CTA 356 365 374 383 392 401 Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val ATC AAC AAT GOC AAA ACT GTT GAA GGC GIA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT 410 419 428 437 446 455 Glu Ser Ala Lys Lys Ala Ary Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC 464 473 482 491 500 509 Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Gly Leu Ala Glu TTG AAA TCA CAA ACA OCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA 518 527 536 545 554 563 Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GIA AGT GAC TAT CAC 572 581 590 599 608 617 Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala AAG AAC CTA ATC AAC AAT GOC AAA ACT GTT GAA GGT GIA AAA GAC CTT CAA GCA 626 635 644 653 662 671 Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA 680 689 698 707 716 725 Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thn pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA 734 743 752 761 770 779 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser TTA GCT GAA GCT AAA GIC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GIA AGT 788 797 806 815 824 833 Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala GAC TAT TAC AAG AAC AIA ATC AAC AAT GOC AAA ACT GTT GAA GGT GIA AAA GCA 842 851 860 869 878 887 Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile CTG AIA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT AAG ACT GAC ACT TAC AAA TTA ATC 896 905 914 923 932 941 Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT OCT GCT 950 959 968 977 986 995 # linker(243-246) # Thr Ala Arg Ser Fhe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Met Thr Val Lys Thr ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC CCT ATC CTC GAG AAT TCC ATG ACC GTG AAA ACC 1004 1013 1022 1031 1040 1049 G2A(247-347) Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lsy pro Thr Thr Lys Gln Arg AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CCG ACC ACC AAA CAG CGT 1058 1076 1076 1085 1094 1103 Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC 1112 1121 1130 1139 1148 1157 Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys TTC CCG TGC AGC ATC TGC AGC CCG AGC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA 1166 1175 1184 1193 1202 1211 Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Lly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA 1220 1229 1238 1247 1256 1265 Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys OCG AOC TTC AAA AOC AOC AAA AAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA 1274 1283 1292 1301 1310 1319 # 349 Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro Val Asp Ter GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG GTC GAC TAA 1328 1337 1346 BBG230N(A) : 349 aa Poids Moleculaire: 38681 Gly: 11 (3.15 %); Ala: 31 (8.88 %); Ser: 18 (5.16 %); Thr: 37 (10.60 %); Val 25 (7.16 %); Leu: 23 (6.59 %); Ile: 15 (4.30 %); Pro 19 (5.44 %); Cys: 4 (1.15 %); Met: 2 (0.57 %); His: 4 (1.15 %); Tyr: 9 ( 2.58 %); Asp: 22 (6.30 %); Glu: 22 ( 6.30 %); Lys: 48 ( 13.75 %); Arg: 7 (2.01 %); Asn: 26 ( 7.45 %); Gln: 13 ( 3.72 %); Phe: 12 (3.44 %); Trp: 1 ( 0.29 %). Information pour la SEQ ID n 2 TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides LONGUEUR DE LA SEQUENCE :356 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION: linéaire AUTRES INFORMATIONS : BBG2A#C TYPE DE MOLECULES : protéine L(1-8) # E'(9-14) # Franre 3 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTA GAC 306 317 326 335 344 linker (15-23) # BB(24-242) Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser ASp Tyr Tyr Lys Asn Leu GCG AAT TIC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAT CTA 356 365 374 383 392 401 Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val AIC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GIA AAA GAC CTT CAA OCA CAA GTT GTT 410 419 428 437 446 455 Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC 464 473 482 491 500 509 Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA 518 527 536 545 554 563 Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His GCT AAA GIC TIA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GIA AGT GAC TAT CAC 572 581 590 599 608 617 Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala AAG AAC CIA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA 626 635 644 653 662 671 Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TIA 680 689 698 707 716 725 Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA 734 743 752 761 770 779 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser TTA GCT GAA GCT AAA GTC TIA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GIA AGT 788 797 806 815 824 833 Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala GAC TAT TAC AAG AAC CIA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GIA AAA GCA 842 851 860 869 878 887 Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile CTG ATA GAT GAA ATT TIA GCT GCA TTA CCT AAG ACT GAC ACT TAC AAA TIA ATC 896 905 914 923 932 941 Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Sap Ala Ala CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT 950 959 968 977 986 995 # linker (243-253) Thr Ala Arg Ser Phe ASn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC OCT ATC CTC GAG AAT TCG AGC TCG GTA OOC GGG 1004 1013 1022 1031 1040 1049 # G2A#C (254-354) Asp Pro Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser GAT CCT ATG ACC ATG AAA ACC AAA AAC AOC ACG AOC CAG ACC CAG CCG AGC 1058 1067 1076 1085 1094 1103 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp AAA CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC GAT 1112 1121 1130 1139 1148 1157 Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Asn Asn Pro TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GIG CCG AGC AIC TGC AGC AAC AAC CCG 1166 1175 1184 1193 1202 1211 Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr ACC TGC TGG GCG AIC AGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG OOC AAA AAA ACC 1220 1229 1238 1247 1256 1265 Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys ACG ACC AAA CCG AOC AAA AAA CCG AOC TTC AAA AOC AOC AAA AAA GAT CAT AAA 1274 1283 1292 1301 1310 1319 354# Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro Val Asp Ter CCG CAG ACC AOC AAA CCG AAA GAA GIG CCG ACC AOC AAA CCG GTC GAC TAA 1328 1337 1346 1355 1364 BBG2A#C : 356 aa Poids Moléculaire: 39288 Gly: 12 (3.37 %); Ala: 31 (8.71 %); Ser: 22 ( 6.18 %); Thr: 37 (10.39 %); Val: 26 (7.30 %); Leu: 23 ( 6.46 %); Ile: 15 (4.21 %); Pro: 21 (5.90 %); Cys: 2 ( 0.56 %); Met: 2 (0.56 %); His: 4 (1.12 %); Tyr: 9 ( 2.53 %); Asp: 23 (6.46 %); Glu: 22 (6.18 %); Lys: 48 ( 13.48 %); Arg: 7 (1.97 %); Asn: 26 (7.30 %); Gln: 13 ( 3.65 %); Phe: 12 (3.37 %); Trp: 1 (0.28 %). lnformation pour la SEQ ID n 3 TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 242 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire AUTRES INFORMATIONS : BB TYPE DE MOLECULE : protéine L(1-8) # E'(9-14) # Frame 3 Met Lys Ala Ile Fhe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GOC GIA GAC 308 317 326 335 344 linker (15-23) # BB(24-242) Ala Asn Fhe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu GCG AAT TTC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAT CTA 356 365 374 383 392 401 Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT 410 419 428 437 446 455 Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Glu Leu Ser Asp Phe GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC 464 473 482 491 500 509 Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA 518 527 536 545 554 563 Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His CCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC 572 581 590 599 608 617 Lys Asn Leu Ile As Asn Ala Lys Thr Val Glu Glu Val Lys Asp Leu Gln Ala AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA 626 635 644 653 662 671 Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu CAA CTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT OOC TTA 680 689 698 707 716 725 Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA 734 743 752 761 770 779 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT 788 797 806 815 824 833 Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GOC AAA ACT GTT GAA GTT GTA AAA GCA 842 851 860 869 878 887 Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile CTG ATA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT AAG ACT GAC ACT TAC AAA TTA ATC 896 905 914 923 932 941 Leu Asn Gly Lys thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr thr Glu Ala Val Asp Ala Ala CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA ACT GTT GAT GCG GCT 950 959 968 977 986 995 Thr Ala Arg Ser Fhr Asn Phe Pro Ile Leu ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC CCT ATC CTC BB : 242 aa Poids Moléculaire: 26529 Gly: 10 ( 4.08 %); Ala: 30 (12.24 %); Ser: 14 ( 6.12 %); Thr: 16 ( 6.53 %); Val: 20 ( 8.16 %); Cys: 23 ( 9.39 %); Ile: 12 ( 4.90 %); Pro: 4 ( 1.63 %); Cys 0 ( 0.00 %); Met: 1 ( 0.41 %); His: 2 ( 0.82 %); Lys: 9 ( 3,67 %); Asp: 19 ( 7.76 %); Glu: 19 ( 8.15 %); Lys: 27 (11.02 %); Arg: 5 ( 2.04 %); Asn: 16 ( 6.94 %); Gln 8 ( 3.27 %); Phe: 7 ( 2.86 %); REVENDICATIONS 1. Procédé pour améliorer l'immunogénicité d'un immunogène ou d'un haptène, lorsqu'il est administré à un hôte, indépendamment du mode d'administration, caractérisé en ce que ledit immunogène ou haptène est couplé de façon covalente à une molécule support, pour former un complexe, et en ce que cette molécule support est un fragment polypeptidique capable de se lier spécifiquement à la sérumalbumine de mammifère. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment polypeptidique est issu de la protéine G du streptocoque. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la molécule support présente la séquence en acides aminés notée séquence ID n" 3 ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence ID n" 3. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le couplage covalent est réalisé grâce à la technologie de l'ADN recombinant. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le complexe est produit par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour le support, de l'ADN codant pour 1' immunogène ou l'haptène. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit couplage covalent est réalisé par voie chimique. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule hôte un gène de fusion, ledit gène de fusion comprenant une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la molécule support, de l'ADN codant pour l'immunogène ou l'haptène, fusionné avec un promoteur. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on introduit le gène de fusion par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le gène de fusion est intégré dans le génome de la cellule hôte. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la cellule hôte est un procaryote. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cellule hôte est choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacillus, lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus. 12. Procédé selon les revendications 7 à 10, caractérisé en ce que la cellule hôte est une levure. 13. Procédé selon les revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère. 14. Procédé selon les revendications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on utilise un vecteur viral. 15. Procédé selon l'une des revendications 7 à 12 ou 14, caractérisé en ce que la molécule de fusion est exprimée, ancrée et exposée à la membrane des cellules hôtes. 16. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'immunogène est dérivé de bactéries, de parasites et de virus. 17. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que l'immunogène est un haptène: peptide, polysaccharide. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'immunogène est dérivée d'une glycoprotéine de surface du RSV: F et/ou G. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'immunogène consiste en la séquence comprise entre les aminos acides 130 et 230 inclus, de la protéine G du RSV humain, sous-groupes A ou B, ou en une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence de la protéine G. 20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'immunogène consiste en la séquence comprise entre les aminos acides 130 et 230 inclus, de la protéine G du RSV bovin, sous-groupes A ou B, ou en une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence de la protéine G. 21. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'immunogène est dérivé de la protéine de surface du virus de l'hépatite A, B et C. 22. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'immunogène est une protéine de surface du virus de la rougeole. 23. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'immunogène est la protéine de surface du parainfluenza virus 3. 24. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'immunogène est une glycoprotéine de surface en particulier hémaglutinine neuraminidase HN et la protéine de fusion F. 25. Procédé selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que les protéines dérivées de la glycoprotéine G du sous-groupe A et du sous-groupe B RSV sont génétiquement fusionnées ou chimiquement couplées à BB. 26. Gène de fusion permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 4, 5 ou 7 à 24. 27. Vecteur d'ADN caractérisé en ce qu'il comprend un gène de fusion selon la revendication 26. 28. A titre de médicament produit susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 25 ou vecteur d'ADN selon la revendication 27. 29. Utilisation pour la préparation d'un vaccin d'un complexe entre un immunogène et une molécule support susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 25 ou d'une molécule d'ADN comprenant un gène selon la revendication 26.