Brevet FR2728264A1 — publié le 19960621

La présente invention concerne un nouveau procédé pour la purification d'ADN. Le procédé selon l'invention permet de purifier rapidement de RADON double brin, utilisable pharmacologiquement. Plus particulièrement, le procédé de pnificatioa selon l'invention fait intervenir une hybridation spécifique entre une séquence de RADON et un oligonucléotide. Les techniques de thérapie génique et cellulaire connaissent actuellement un développement extraordinaire. Néanmoins, ces techniques impliquent la possibilfié de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans ces nouvelles thérapies, le médicament est souvent constitué par l'ADN même, et il est essentiel de pouvoir le fabriquer, dans des quantités adaptées, l'isoler et le purifier de manière appropriée à un usage thérapeutique chez l'homme. La présente invention décrit un nouveau procédé simple et particulièrement efficace pour la purification d'ADN. ll permet notamment d'obtenir des puretés particulièrement hautes, avec des rendements élevés. Le procédé selon l'invention repose essentiellement sur une interaction spécifique entre une séquence insérée sur l'ADN à purifier et un oligonucléotide composé de bases naturelles ou modifiées. n a récemment été montré que certains oligonucléotides sont capables d'interagir spécifiquement dans le grand sillon de la double-hélice d'ADN pour former localement des triple-hélices, conduisant à une inhibition de la transcription de genes- cible (Hélène et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Ces oligonucléotides reconnaissent sélectivement la double-hélice d'ADN au niveau de séquences oligopurine.oligopyrimidine, c'est-à-dire au niveau de régions possédant une séquence oligopurique sur un brin et une séquence oligopyrimidique sur le brin complémentaire, et y forment localement une triple-hélice. Les bases du troisième brin (l'oligonucléotide) forment des liaisons hydrogène (liaisons Hoogsteen ou Hoosteen inverse) avec les purines des paires de bases Watson-Crick. Une utilisation de ce type d'interaction pour isoler un plasmide à été décnte dans l'art antérieur. Ainsi, Ito étal. (PNAS 89 (1992) 495) décrivent l'utilisation d'oligonucléotides biotinylés capables de reconnaître une séquence déterminée d'un plasmide et de former avec celleci une triple hélice. Les complexes ainsi formés sont ensuite mis en contact avec des billes magnétiques revêtues de streptavidine. L'interaction entre la biotine et la shreptavidine permet alors d'isoler le plasnide par séparation magnétique des billes puis élution. Néanmoins, ce procédé présente certains inconvénients. En particulier, deux interactions spécifiques successives sont nécessaires, la première entre l'oligonucléotide et le plasmide, la deuxième entre le complexe biotinylé et les billes de streptavidine. De plus, la solution finale peut être contaminée par de l'oligonucléotide biotinylé, qui ne peut être utilisé dans une composition pharmaceutique. La présente invention décrit un nouveau procédé amélioré de purification d'ADN faisant appel à ce type d'interaction. Plus particulièrement, le procédé de l'invention met en oeuvre des oligonucléotides couplés de manière covalente à un support. Ce procédé est particulièrement rapide et il conduit à des rendements et à des degrés de pureté particulièrement élevés. Par ailleurs, il permet de purifier de RADON à partir de mélanges complexes comprenant notamment d'autres acides nucléiques, des protéines, des endotoxines (telles que des lipopolysaccrarides), des nucléases, etc.... les supports utilisés peuvent en outre être facilement recyclés, et les ADN obtenus présentent des propriétés de sécurité pharmaceutique améliorées. Enfin, ce procédé implique une seule étape contrairement à l'art antérieur. Un premier objet de l'invention réside donc dans un procédé pour la purification d'ADN double-brin, selon lequel on fait passer une solution contenant ledit ADN en mélange avec d'autres composants sur un support sur lequel est couplé de manière covalente un oligonucléotide capable de former par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ledit ADN. La séquence spécifique peut être une séquence présente naturellement sur l'ADN double-brin, ou une séquence synthétique introduite artificiellement dans celui-ci. Les oligonucléotides utilisés dans la présente invention sont des oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN en double-brin. Ces oligonucléotides peuvent contenir les bases suivantes: - thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets AT de l'ADN double-brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859); - adénine (A), qui est capable de former des triplets avec les doublets AT de l'ADN double-brin; - guanine (G), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin; - cytosine protonée (C+), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin (Rajagopal et al précitée);; Préférentiellement, l'oligonucléotide utilisé comprend une séquence homopyrimidique riche en cytosines et la séquence spécifique présente sur l'ADN est une séquence homopurique-homopyrimidique. La présence de cytosines permet d'avoir une triple hélice stable à pH acide, où les cytosines sont protonées, et déstabilisée à pH alcalin, où les cytosines sont neutralisées. Pour permettre la formation d'une triple-hélice par hybridation, il est important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleurs rendements et la meilleure sélectivité, on utilise dans le procédé de l'invention un oligonucléotide et une séquence spécifique parfaitement complémentaires. ll peut s'agir en particulier d'un oligonucléotide poly-ClT et d'une séquence spécifique poly-GAA. A titre d'exemple, on peut citer l'oligonucléotide de séquence GAGGaTCTTCTrCTrCTTCrTTT, dans lequel les bases GAGG ne forment pas de triple hélice mais permettent d'espacer l'oligonucléotide du bras de couplage. n est entendu toutefois que certains mésappariements peuvent être tolérés, dès lors qu'ils ne conduisent pas à une perte trop grande d'affinité. L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non modifiées) ou modifié chîm-nen En particulier, roligonucléotide peut présenter avantageusement certaines niiadicus chimiques permettant d'augmenter sa résistance ou sa protection vis à vis des nucléases, ou son affinité vis à vis de la séquence spécifique. Ainsi, l'oligonucléotide peut être rendu plus résistant aux nucléases par modification du squelette (ex. methylphosphonates, phosphorothiates, phosphotriester, phosphoramidate, etc...). Un autre type de modification a plus particulièrement pour objet d'améliorer l'interaction et/ou l'affinité entre l'oligonucléotide et la séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse selon l'invention consiste à méthyler les cytosines de l'oligonuclêotide (cf exemple 4). L'oligonucléotide méthylé présente la propriété remarquable de former une triple hélice stable avec la séquence spécifique à pH neutre. ll permet donc de travailler à des pH plus élevés que les oligonucléotides de l'art antérieur, c'est à dire à des pH où les risques de dégradation de l'ADN plasmidique sont bien inférieurs. La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'au moins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30. On utilise de manière avantageuse un oligonucléotide de longueur supérieure à 10 bases. La longueur peut être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la stabilité de l'intéraction recherchées. Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synurs d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut bien évidemment être utilisée. Pour permettre son couplage covalent sur le support, l'oligonucléotide est généralement fonctionnalisé. Ainsi, il peut être modifié par un groupement terminal thiol, amine ou carboxyle, en position 5' ou 3'. En particulier, l'ajout d'un groupe thiol, amine ou carboxyle permet, par exemple, de coupler l'oligonuciéotide sur un support portant des fonctions disulfure, maléimide, amine, carboxyle, ester, époxyde, brome de cyanogène ou aldéhyde.Ces couplages se forment par établissement de liaisons disulfure, thicether, ester, amide ou amine entre l'oligonuclêotide et le support. Tousse autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que des réactifs de couplage bifonctionnels, par exemple. Par ailleurs, pour améliorer l'activité de l'oligonucléotide couplé, il peut être avantageux d'effectuer le couplage au moyen d'un "bras". L'utilisation d'un bras permet en effet de fixer l'oligonucléotide à une distance choisie du support permettant d'améliorer ses conditions d'interaction avec l'ADN. Le bras est avantageusement constitué de bases nucléotidiques, n'interférant pas avec l'hybridation. Ainsi, le bras peut comprendre des bases puriques. A titre d'exemple, le bras peut comprendre la séquence GAGG. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, différents types de supports peuvent être utilisés. II peut s'agir de supports de chromatographie fonctionnalisés, en vrac ou préconditionnés en colonne, de surfaces plastiques fonctionnalisées ou de bines de latex fonctionnalisées, magnétiques ou non. Il s'agit préférentiellement de supports de chromatographie. A titre d'exemple, les supports de chromatographie pouvant être utilisés sont l'agarose, l'acrylamide ou le Dextran ainsi que leurs dérivés (tels que Séphadex, Sépharose, Superose,...), les polymères tels que le poly(styrènedivinylbenzène), ou la silice greffée ou non greffée, par exemple. Les colonnes de chromatographie peuvent fonctionner en mode de diffusion ou de perfusion. Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour purifier tout type d'ADN double brin. I1 s'agit par exemple d'ADN circulaire, tel qu'un plasmide portant généralement un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. Ce plasmide peut porter également une origine de réplication, un gêne marqueur, etc.... Le pocédé de l'invention peut être appliqué directement à un lysat cellulaire. Dans ce mode de réalisation, le plasmide, amplifié par transformation puis culture cellulaire, est purifié directement après lyse des cellules.Le procédé selon l'invention peut également être appliqué à un lysat clair, c'est à dire au surnageant obtenu après neutralisatioa et centrifugation du lysat cellulaire. ll peut bien évidement être appliqué également à une solution prépurifiée par des méthodes connues. Ce procédé permet aussi de purifier de l'ADN, linéaire ou circulaire, portant une séquence d'intérêt, à partir d'un mélange comprenant des ADN de différentes séquences. Le lysat cellulaire peut être un lysat de cellules procaryotes ou eucaryotes S'agissant de cellules procaryotes, on peut citer par exemple les bactéries X, coli B. subtilis. S. typhimurium ou Streptornyces. S'agissant de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules animales, les levures, les champignons, etc..., et plus particulièrement, les levures Kluvveromyces ou Saccharomyces ou les cellules CORS, CHO, C127, NIH3T3, etc.... Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux puisqu'il permet d'obtenir, de manière rapide et simple, de l'ADN plasmidique de très haute pureté. En particulier, comme illustré dans les exemples, ce procédé permet de séparer efficacement l'ADN plasmidique considéré de composants contaminants, tels que l'ADN chromosomique fragmenté, les endotoxines ou autres protéines, les nucléases, etc.... Le procédé permet ainsi d'obtenir de l'ADN plasmidique utilisable pharmaceutiquement notamment en thérapie génique ou cellulaire. A cet égard, I'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant de 1'ADN double brin, linéaire ou plasmidique, préparé selon le procédé décrit ci-avant. Les compositions peuvent comporter l'ADN plasmidique "nu" ou associé à des vecteurs de transport tels que les liposomes, les nanoparticules, les lipides cationiques, les polymères, des protéines ou virus recombinants, etc. La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Techniques générales de clonage et de biologie moléculaire. Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, la transformation dans E. coli. la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Loess, New York; Ausubel F. M., R Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. k Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York. ).Les séquences nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté (Ausubel et al., 1987). Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgC12 10 mM, D1T 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs, ). Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en '3par un groupement cyanoéthyl (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus and H. Ester. 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of frcyanoethyl-N,N- dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 45394557; Giles, J. W. 1985. Adances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.) avec le synthétiseur automatique d'ADN Biosearch 8600 en utilisant les recommandations du fabricant. Les ADN ligaturés ou à tester pour leur efficacité de transformation sont utilisés pour transformer la souche rendue compétente: E. çnll DHSa [F / endAl. hsdR17. supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, #(lacZYA-argF)U169, deoR, #80dlac(lacZ#M15)] Les minipréparations d'ADN plasmidique sont faites suivant le protocole de Plein et al., 1980. Le milieu de culture LB est utilisé pour la croissance des souches d'E. coli (Maniatis et al., 1982). Les souches sont incubées à 37 C. Les bactéries sont étalées sur des boites de mileu LB supplémentées avec des antibiotiques appropriés. Exemple 1. 1.1. Préparation de la colonne Matériel: La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS (N-hydroxysuccincnide, Pharmacia) de 1 ml, connectée sur une pompe péristaltique (débit L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2 en 5'. Sa séquence est la suivante: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' Les tampons utilisés dans cet exemple sont les suivants: Tampon de couplage : NaHC03 0,2 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3. Tampon A : éthanolamine 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. Tampon B: acétate 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4. Méthode: La colonne est lavée par 6 ml de HCl 1 mM, puis l'oligonucléotide dilué dans le tampon de couplage (50 nmoles dans 1 ml) est appliqué sur la colonne et laissé 30 minutes à température ambiante. La colonne est lavée 3 fois successives par 6 ml de tampon A pUs 6 ml de tampon B. L'oligonucléotide est ainsi lié covalemment à la colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4 C dans du PBS 0,1% NaN3 et peut être utilisée au moins quatre fois. 1.2. Construction des plasmides Les deux oligonucléotides suivants ont été synthétisés. oligonucléotide 4817: S GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGG-3' oligonucléotide 4818: 5' AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT TCG-3' Ces oligonucléotides, une fois hybridés et clonés sur un plasmide, apportent sur le plasmide correspondant une séquence homopurique-homopyrimidique (GAA)17, comme décrit cidessus. La sequence correspondant à ces deux oligonucléotides hybridés a été clonée au mSe de clonage du plasmide pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), qui porte un gène de résistance a l'ampicilline. Pour ce faire, les oligonucléotides ont été hybridés de la manière suivante. Un mg de ces deux oligonucléotides ont été mis ensemble dans 40 ml d'un tampon final 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgC12. Ce mélange a été chauffé à 95 C, puis il a été placé à la température ambiante de manière que la température s'abaisse lentement.Dix ng du mélange d'oligonucléotides hybridés ont été ligaturés avec 200 ng du plasmide pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) digérés par BamHI et aQRI dans 30 ml final. Après ligature une aliquote a été transformée dans DH5a. Les mélanges de transformation ont été étalés sur milieu L supplémenté avec de l'ampicilline (50 mg/l) et du X-gal (20 mg/l). Les clones recombinants doivent présenter une absence de coloration bleu sur ce mileu contrairement au plasnide parent (pBKSF) qui permet l'a-complémentation du fragment w de la b-galactosidase d' coli.Après minipréparation d'ADN plasmidique de 6 clones, ils ont tous présentés la disparition du site I, situé entre les sites EcoRI et BamHI de pBKS+, et une augmentation de poids moléculaire de la bande Pvull de 448 pb contenant le multisite de clonage. Un clone a été retenu et le plasmide correspondant a été nommé pXL2563. La séquence clonée a été vérifiée par séquence en utilisant le primer -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3') (Viera J. and J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259268. du plasmide pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). Le plasmide pXL2563 a été purifié selon le kit Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) en suivant les recommandations du founiisseur. Cette préparation d'ADN plasmidique a été utilisée par la suite dans des exemples décrits ci-après. 1.3. Purification de plasmide Matériel: Le plasmide pXL2563 (décrit en 1.2) a été purifié sur la colonne HiTrap couplée à l'oligonucléotide décrite en 1.1., à partir d'une solution contenant également le plasmide pBKS+. Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants: Tampon F: NaCl 2M, acétate 0,2 M, pH 4,5 à 5. Tampon E :Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM. Méthode: La colonne est lavée par 6 ml de tampon F, puis les plasmides (20 g de pXL2563 et 20 Fg de pBKS+ dans 400 l de tampon F) sont appliqués sur la colonne et incubés deux heures à température ambiante. La colonne est lavée par 10 ml de tampon F puis solution se fait par du tampon E. Les plasmides sont détectés après électrophorèse sur gel d'agarose 1% et coloration au bromure d'éthidium. La proportion des plasmides dans les solutions est estimée par mesure de leur activité transformante sur E.coli. Résultat: En partant d'un mélange contenant 30% de pXL2563 et 70% de pBKS+, on récupère en sortie de colonne une solution à 100% de pXL2563. Le rendement est supérieur à 50%. La pureté, estimée par le rapport de D.O. à 260 et 280 nm, passe de 1,9 à 2,5, ce qui indique que l'on élimine des protéines contaminantes par cette méthode. Exemple 2. Cet exemple décrit une expérience de purification d'ADN plasmidique réalisée dans les mêmes conditions que l'exemple 1, à l'exception de l'étape de fixation du plasmide sur la colonne. Celle-ci est en effet réalisée dans un tampon dont la molarité en NaCl varie de 0 à 2M (tampon F). Les résultats obtenus sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 1. Des résultats identiques sont obtenus avec un pH du tampon de fixation de 45 ou 5. Exemple 3. Experience sur lysat clair Cet exemple décrit la purification d'ADN plasmidique à partir d'un lysat clair de culture bactérienne, à l'échelle dite "miniprep": 1,5 ml d'une culture de nuit sont centrifugés et le culot est remis en suspension dans 100 l de glucose 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. On ajoute 200 IL' de NaOH 0,2 M, SDS 1%, les tubes sont agités par inversion, puis on ajoute 150 Cll d'acétate de potassium 3 M, pH 5 et les tubes sont agités par inversion. Après centrifugation, le surnageant est récupéré et chargé sur la colonne d'oligonucléotide obtenue comme décrit à l'exemple 1. La fixation, les lavages et lélution sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 1. On récupère environ 1 Fg de plasnide à partir de 1,5 ml de culture. Le plasmide obtenu, analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium, se présente sous la forme d'une seule bande d'ADN circulaire "super enroulé". Aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (chromosomique), ni dARN n'est détectable dans le plasmide purifié par cette méthode. Le rapport des densités optiques à 260 et 280 nm est supérieur à 2. Exemple 4. Cet exemple décrit une expérience de purification d'ADN plasmidique réalisée dans les mêmes conditions que l'exemple 3, à partir de 20 ml de culture bactérienne. Le culot cellulaire est repris dans 1,5 ml de glucose 50 mM, Tris 25 mMHClpH 8, EDTA 10 mM. La Iyse est faite par 2 ml de NaOH 0,2 M, SDS 1Z, et la neutralisation par 1,5 ni d'acétate de potassium 3 M, pH 5. L'ADN est ensuite précipité par 3 ml de pepranolol- 2, le culot est repris dans 0,5 ml d'acétate de sodium 0,2 M pH 5, NaCI 0,1M et chargé sur la colonne d'oligonucléotide obtenue comme décrit à l'exemple 1. La fixation, le lavage de la colonne et l'élution se font comme décrit à l'exemple 1, à l'exception du tampon de lavage dont la molarité en NaCI est 0,1M.On obtient environ 16 Fg d'ADN plasmidique. Le plasmide obtenu, analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium, se présente sous la forme d'une seule bande d'ADN circulaire "super enroulé". Aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (chromosomique), ni d'ARN n'est détectable dans le plasmide purifié. La digestion du plasmide par une enzyme de restriction donne une seule bande au poids moléculaire attendu de 3 kilobases. La concentration en protéines dans les échantillons passe de 125 pg/ml dans le lysat clair à moins de 1 pg/ml dans le plasmide purifié (dosage Micro BCA, Pierce). La concentration en endotoxines, estimée par le dosage LAL (Biosepra) est divisée par un facteur supérieur à 10 dans le plasmide purifié, par rapport au lysat clair de départ Exemple 5. Utilisation d'un oligonucléotide modifié Cet exemple décrit l'utilisation d'un oligonucléotide posant des cytosines méthylées. La séquence de l'oligonucléotide utilisée est la suivante: GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT Cet oligonucléotide possède un groupement NH2 en 5'. MeC = 5 méthyl-cytosine. L'intérêt de cet oligonucléotide est de former une triple hélice stable à pH neutre et donc de pouvoir travailler à des pH plus élevés (on diminue ainsi le risque de dégradation du plasmide). REVENDICATIONS 1. Procédé pour la purification d'ADN double brin caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape où l'on fait passer une solution contenant ledit ADN en mélange avec d'autres composants sur un support sur lequel est couplé de manière covalente un oligonucléotide capable de former par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ledit ADN. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution contenant ledit ADN est un lysat cellulaire. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le lysat cellulaire est un lysat clair. 4. Procédé selon la revendication 1 à 3 caractérisé en ce que RADON double-brin est pré--fié. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur l'ADN est une séquence homopurique-homopyrimidique et l'oligonucléotide comprend une séquence formant une triple hélice avec cette séquence homopurique homopyrimidique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence spécifique a été introduite artificiellement dans l'ADN double-briit 7. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend une séquence poly-CTF et la séquence spécifique présente sur l'ADN est une séquence poly-GAk 8. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'oligonucléocide possède la séquence GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'oligoeucléotide est couplé au support par liaison disulfure, thioéther, ester, amide ou amine. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ltoligonucléotide présente une modification chimique le rendant résistant aux, ou protégé vis-à-vis des nucléases, ou augmentant son affinité pour la séquence spécifique. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend une séquence homopyrimidique dans laquelle une au moins des cytosines est méthylée. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'ADN comprend en outre une ou plusieurs séquences d'intérêt thérapeutique. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'ADN double-brin est un ADN circulaire, tel qu'un plasmide. 14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support est choisi parmi les supports de chromatographie, les surfaces plastiques et les billes de latex fonctionnalisés. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le support est un support de chromatographie. 16. Composition pharmaceutique comprenant un ADN obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 15.