Brevet FR2727116A1 — publié le 19960524

La présente invention concerne de nacelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, lnvoetioei concerne des peptides capables de se lier au domaine SH3 de la protéine GAP. Les produits des gènes ras, généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Certaines modifications spécifiques de de ces protéines leur font perdre leur contrôle nonnal et les conduisent à devenir oncogéniques Ainsi, un gand nombre de tumeurs humaines ont été associées à la présence de gènes ras modifiés De même, une suoexession de ces protéines p21 peut conduire à un dérglement de la prolifération cellulaire. Globalement, les protéines p21 sont impliquées dans 30% des cancers humains. La compréhension du rôle exact de ces pruines p21 constitue donc un des objectifs cibles de la recherche dans le domaine de loncologie. Le modèle dont on dispose actuellement pour expliquer le fonctionnement des protéines p21 repose sur des analogies qu'elles partagent avec les potéines G de transduction. ll existe dans les cellules un équilibre entre les proteines p21 actives, liées à du GTP et les formes inactives, ayant fixé du GDP. Dans une cellule quiescente, où les p21 ne sont pas sollicitées, la majorité d'entre elles sont sous forme GDP. Lorsque la cellule est stimulée, le facteur d'échange des nucléotides, GEF, devient plus actif et facilite l'évacuation du GDP et son remplacement par du GTP. La protéine adopte alors une conformation active qui lui permet de reconnaître et de stimuler son effecteur, la protéine GAP "GTPase activating protein", vraisemblablement assoiée à d'autres protéines. Le complexe p21-GTP-GAP interagit vraisemblablement à son tour avec une ou d'autres protéine(s) permettant ainsi la transmission du signal qui entraîne une réponse biologique de la cellule. L'association de p21-GTP avec GAP déclenche simultanément l'hydrolyse du GTP et le retour de la p21 vers la forme inactive. Dans le cas des protéines p21 oncogènes, la mutation qu'elles portent empêche le retour à l'état inactif. L'équilibre est dans ce dernier cas, déplacé vers la forme active de p21. Cet équilibre complexe entre les formes active et inactive de p21 est contrôlé à la fois par des facteurs inhérents aux propriétés biochimiques des protéines p21 (affinité relative pour le GDP et le GTP, vitesse d'échange des nucléotides...) et des facteurs externes modulant leur activité comme notamment la protéine GAP. La protéine GAP est une protéine cytosolique présente chez tous les organi;smes eucaryotes qui possède donc la faculté accélérer fortement l'hydrolyse du GTP, lié à la protéine p21 normale ( Trahey et Mc Cormick 1987). Elle possède deux domaines assurant des fonctions distinctes, Son extrémité carboxy-termi:rale porte l'activité catalytique qui fixe les protéines p21 et augmente leur activité GTPase.Sur son autre extrémité, en aval de la partie aminoWmiSe, se trouve une juxtaposition de domaines SH2 et SH3 qui sont susceptibles de participer à des interactions avec d'autres protéines A l'heure actuelle, on coriit deux protéines interagissant avec la protéine GAP. ll s'agit des protéines dénommées p62 et p190, respectivement de 62kDa et 190kDa. Ces deux protéines étant immunoprécipitées par des anticorps dirigés contre différents épitopes de GAP, forment à évidence un complexe spécifique avec GAP. On sait en particulier que c'est au niveau de la région SH2 que se fait rinieraction de la protéine p62 avec la protéine GAP. En ce qui concerne plus particulièrement le domaine SH3, sa presen dans diverses protéines comme les phospholipases CT (PLC-y), la sous unité p85 de la phophatidyllinositol-3 kinase et la protéine grb-2, toutes impliquées au niveau de la transduction du signal p21-Ras, laisse à penser que ce domaine est tout particulièrement important pour diriger les interactions protéine-protéine et donc nécessaire au fonctionnement de la protéine correspondante et/ou à sa localisation cellulaire. Dans le cas particulier de la protéine GAP, ce domaine SH3 pourrait donc également participer à la transduction du signal Ras. n est clair que la coinpnsi du rôle exact de ce domaine SH3 serait particulièrement précieux sur le plan thérapeutique. La présente invention a précisément pour objectif de contribuer à l'éîucidation de la contribution du domaine SH3 à la transduction du signal ras. La demanderesse a ainsi mis en évidence l'existence de protéines capables de s'associer à la protéine GAP via une liaison directe à son domaine SH3. Plus précisément, la présente invention résulte de l'identification, isolement et la caractérisation de protéines capables d'interagir avec le domaine SH3 de la protéine GAP. Elle résulte également de la caractérisation structurale de ces protéines par identification de séquences peptidiques correspondantes. Plus particulièrement, le polypeptide de I'invetion comprend tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les svnees SEQ ID N"1, SEQ ID N 2, SEQ ID N"3 et SEQ ID N"4 ou d'un dérivé de celles CL Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique du polypeptide selon rinvention et conservant l'activité recherchée.Par modification de nature banque et/ou chimique, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différnts, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, icelui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. n peut également s'agir de fragments des séquences précitées de dérivés de cellesci. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base de la séquence donnée dans la figure 1, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de homme du métier. Bs peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique.La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir de la séquence donnée dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de llicffnme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de la SEQ ID N"1. n s'agit plus particulièrement d'un polypeptide comprenant la SEQ ID N01, SEQ ID N 2, SEQ ID N"3 ou SEQ ID N 4. De préférence, le polypeptide selon l'invention possède un poids moléculaire de l'ordre de 68kDa Selon un mode particulier de l'invention, il s'agit d'un polypeptide bongme humaine comprenant tout ou partie de la SEQ ID N05 ou de l'un de ses dérivés tels que définis précédemment n s'agit plus particulièrement d'un polypeptide comprenant la SEQ ID N05. De manière inattendue, cette protéine ne possède pas d'homologie avec une autre Protéine p68 déjà identifiée comme se liant au domaine SH3 de & . Elle n'est pas phosphorylée au niveau de ses motifs tyrosine dans les cellules en croissance ou à l'état de mitose. Un autre objet de Invention réside dans des anticorps ou hymb d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défmi ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de lSe du métier. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par inton dtun animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les SEQ ID N01, SEQ ID N 2, SEQ ID N03, SEQ ID N"4 et SEQ ID N05 ou tout fragment ou dérivé de cellesci, prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps de rinvention peuvent ainsi être utilisés pour réguler l'état d'activation du produit des gènes ras. Par ailleurs, ces anticorps peuvent également être utilisés pour détecter et/ou doser un peptide selon rinvention dans des échantillons biologiques, et de ce fait, pour renseigner sur l'état d'activation du produit des gènes ras. L'invention s'étend également aux antagonistes à savoir tout peptide capable de bloquer l'interaction d'un polypeptide selon l'invention avec le domaine SH3 de la protéine GAP. De tels peptides peuvent être mis en évidence dans des tests de compétition (cf exemple 23) ou d'inhibition de l'activité ras. La présente invention permet donc de générer des polypeptides dérivés des séquences identifiées ci-dessus ainsi que des anticorps dirigés contre ces polypeptides ou des protéines correspondantes, présentant des propriétés biologiques interessantes en vue d'une utilisation pharmaceutique. L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. n est en effet possible, à partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules inlubitrices de la voie de signalisation dépendante des protéines P21 P21 non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention tel que décrit ciavant pour la préparation de molécules non-peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non-peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques compremt une ou plusieurs molécules ainsi préparées. La présente invention a également pour objet toute sequence d'acide nucléique codant pour un polypeptide capable de se lier au domaine SH3 de la protéine GAP. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence comirenant: (a) tout ou partie de la SEQ ID N 6 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec la séquence (a) et codant pour mi polypeptide selon l'invention, et (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. De préférence, elle comprend la séquence SEQ ID N 6. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être artificielle ou non. n peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaires connues de l'homme du métier.Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des pho-raridi ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou oen de séquences obtenues par criblage de banques. Ces séquences nucléotidiques selon l'invention sont utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la production des polypeptides de rimiaL soit pour la réalisation de séquences antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la détection et le diagnostic. par des expériences d'hybridation, de l'activité de la protéine GAP dans des échantillons biologiques ou pour l'isolement de séquences homologues à partir d'autres sources cellulaires. Pour la production des polypeptides de l'invention, les séquences nucléiques définies ci-dessus sont généralement placées sous le contrôle de signal permettant leur expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (pr(, tenninateurs, sequence "leader" de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Préférentiellement, ces séquences nucléotidiques de l'invention font partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif.Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être pws en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de lute, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides de l'invention sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Panni les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les lettres du genre 5accharomyces, Kluyveromyces, Pichia, 5chwanzvomyces, ou Hansenula. ;gisssant de cenules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C1Z7, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergilles ssp. ou 7richaderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes Ecoli, Bczciltus, ou Streptomyces. Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent également servir à la réalisation d'acides nucléiques antisens utilisables comme agents pharmaceutiques. L'inhibition de l'expression de certains oncogènes par des acides nucléiques antisens s'est avérée être une stratégie utile dans la compréhension du rôle de ces oncogènes et une voie particulièrement prometteuse dans la réalisation d'un traitement anticancéreux. Les oligonucléotides antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hytxicer spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine. De tels oligonucléotides peuvent être constitués par tout ou partie des séquences nucléiques définies ci-avant. n s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides selon rinventiafL De tels oligonicléotides peuvent être obtenus à partir des séquences précitées, par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique. L'invention concerne également, comme séquences nucléotidiques, les sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour un polypeptide de rinvention, ou avec l'ARNm correspondant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic. De telles sondes doivent être préalablement marquées, et pour cela différentes techniques sont connues de llsomme du métier. Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont les conditions normales de stringence.Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour un polypeptide de rinvention, à partir d'autres sources cellulaires A titre illustratif de ces sondes, on peut plus particulièrement mentionner les sondes reelrésentées représentées par par les SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8, qui sont utilisées en exemple 3 ci-après. L'invention a encore pour objet toute composition -rIn comprenant comme pnncipe actif au moins un polypeptide tel que defini ci-avant. Elle a aussi pour o1Rjet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que défini ciavant, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un oligonucléotide antisens tel que défini ci-avant. Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les polypeptides, anticorps et oligonucléotides antisens définis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'activation des protéines p21 et de ce fait pour moduler la prolifération de certaines types cellulaires Plus particulièrement, ces compositions pharmaciques sont destinées au traitement de cancers. De nombreux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques.Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gènes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du pancréas, dont 90% ont un oncogène Ki-ras muté sur le douzième codon (Almogra et coll., Cell 53 (1988) 549), les adénocarcinomes du colon et les cancers de la thyroïde (50 o), ou les carcinomes du poumon et les leucémies myéloides (30%, Bos, J.L Cancer Res. 42(1989)4682). L'invention a encore pour objet l'utilisation des molécules décrites ci-avant pour moduler l'activité des protéines p21. En particulier, l'invention concerne l'ulisstion de ces molécules pour inhiber au moins partiellement l'activation des protéines p21. L'invention fournit également un procédé de détection de l'expression etlou d'une surexpression de la protéine p68 dans un échantillon biologique. Un tel procédé comprend par exemple la mise en contact d'un tel échantillon avec un anticorps ou fragment d'anticorps selon rinvention, la révélation des complexes antigène-anticorps, et la comparaison des résultats obtenus avec un échantillon standard. Dans un tel procédé, ranticorps peut être en suspension ou préalablement bili surin support Ce procédé peut également comprendre la mise en contact de réc avec une sonde nucléotidique selon l'invention, la mise en évidence des hybrides obtenus, et la comparaison avec ceux obtenus dans le cas d'un échantillon standai La présente invention peut être utilisée à plusieurs titres dans le domaine thérapeutique : les polypeptides, anticorps et séquences nucléotidiques de l'invention étant capables de moduler activité des gènes ras, ils permettent en effet d'intervenir dans le processus de développement des cancers. En raison de leur forte expression dans les cellules de muscles striés squelettique, ces peptides interviennent en outre vraisemblablement dans les pathologies liées à un défaut de signalisation comme le diabète par exemple.Un autre aspect de l'invention consiste à utiliser des séquences mcléotidiques ADN ou ARN capables d'interagir avec les polypeptides reverdit Ces séquences peuvent être préparées selon la méthode décrite dans la demande internationale WO 91/19813. L'invention peut également être utilisée dans le domaine du diagnostic et du tapage de cancers. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. MATERIEL ET MéTHODES Techniques générales de clonage Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de réthanol ou de risopropanol, la transformation dans Escherichia colt, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sping Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols m Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New ex England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon lesrecommarcoitionsdesfoumisseurs. Le plasmide pGEX 2T est d'origine commerciale. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PcR Polymérase-catalyzed chais Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Ezizynt 155 (1987) 335-350] est effecXée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications dti fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Pour les expériences d'hybridation, les conditions de astringence normales sont généralement les suivantes : hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à 65 C; lavage: 0,5 x SSC à 65 C. EXEMPLE 1 Préparation des protéines de fusion GlutathionStransférase SH3 Les séquences d'ADN codant pour les domaines SH3 des protéines GAP (résidus 275 à 350) et c.Src (résidus 84 à 148) sont amplifiées par la technique de P.C.R. et clonées dans un vecteur d'expression pGEXZr entre les sites de restriction Bam HI et ECORL Les bactéries ansi transformées sont cultivées, induites avec du IPTG (1-thio-ss-D galactopyranoside) et lysées par sonication. Les protéines de fusion GST SH3 sont purifiées par chromatographie d'affinité sur billes d'agarose glutathion (Pharmacia LJCB biotech) puis éluées avec îOmM de glutathion réduit. EXEMPLE 2 1)Préparation des lysats cellulaires Des cellules ER22 (fibroblastes de hamster surexprimant le récepteur EGF humain) ou des cellules NIH 3T3 exprimant pp60 C-Src(F-527) sont cultivées sur milieu DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium) enrichi avec 10% de sérum de veau foetal contenant l'antibiotique G418 (200 g/ml) et 2mM/l de glutamine (5GBICO-BRL), à 37 C sous 5% en C02. Dans chaque essais, les cellules ER22 sont cultivées dans des boites de 100mm jusqu'à confluence puis sans sérum pendant 18heures. De l'orthovanadate de sodium est ajouté à une concentration finale de 100 M et l'incubation poursuivie pendant 30 minutes. L'EGF est ensuite ajouté directement au milieu pour une concentration finale de 80nM en 10 minutes et à 37 C. Pour certains essais, les cellules mitotiques sont récupérées par traitement avec 0,4 g de nocodazole (SIGMA) par ml pendant 18heures. aies sont rapidement lavées avec un tampon salin à base de phosphate, refroidi dans la glace, puis solubilisées en 30 minutes à 4 C dans 1 ml de tampon de lyse, HNTG (50 mM d'Hepès, pH 7,5,150 mM de NaCl, 1% de Triton x 100, 10% de Glycérol, 1 mM de MgCl2, 1 mM d'EGTA, ai présence d'inhibiteurs de phosphatases (1 mM de Na3V04, 10 mM de Na4P2O7, 10 mM de NaF) et d'inhibiteurs de protéases (1 g/ml de leupeptine, 1 pg/ml d'inhOur de trypsine, 1 g/ml de pepstatine A, 2 Fg/ml d'aprotinine, 10 g/ml de beeeeunidee, 1 mM de phénylméthanesulfonyle fluorure, 1 g/ml g/ml d'antipalne, 1 g/ml de chymostatine). Les lysats sont décantés par centrifugation à 15000 tours/mn pendant 10 mne La concentration en protéines est ensuite détenninée (Bio-rad micro-test). 2) Test de liaisons directes L'ensemble des lysats cellulaires (200 iig) et des protéines immunoprécipitées sont séparés sur gel de polyacrylamide à 7,5% de dodécyl sulfate de sodium (SDSPAGE) puis transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF Miflipore Corpo.). La liaison non spécifique au niveau des filtres est bloquée par 2% de lait écrémé dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20, pendant 2 heures, à température ambiante. Les filtres sont incubés avec la protéine GST et des protéines GST-SH3 dans le tampon bloquant pendant 12H à 4 C.Après avoir été lavées avec du PBS- 0,05% Tween 20, les protéines liées sont détectées par incubation successive avec un anticorps monoclonal anti-GST (0,25 g/ml) (Hybridolab Pasteur Inst.), un anticorps anti-souris conjugué à une phosphatase alcaline et du sel 5 bromo-4 chloro-3 indolyphosphate toluidinium nitroblue tetrazolium oeROMEGA). 3)Test de compétition Des peptides synthétiques correspondant aux séquences (275-305), (299-326), (317326), (320-350) de GAP SH3 ou à la séquence putative de la dynamine (RRAPAVPPARPGS) se liant au domaine SH3 sont synthétisés sur un appareil Applied Biosystems 431 A, utilisant la chimie FMOC. La protéine p68 purifiée est isolée par électrophorèse sur gel de polyacrylarnide- dodécyl sulfate de sodium et transférée par électrophorèse sur meminne PVDF. Les membranes sont incubées avec des quantités croissantes en peptides. Le peptide Poly- Lrproline (SIGMA) est utilisé à 500 llM dans une réaction témoilL Après 1 H d'incubation, la protéine GST-GAP-SH3 (2 g/ml) est ajouté à chaque milieu réactionnel. Les filtrais sont sondés avec un anticorps monoclonal anti-GST comme décrit pécédemment. 4)lmmunopcccipitation et immunotransfert Les lysats cellulaires solubles (3 mg) sont décantés avec 50 il de protéine A sépharose CIr4B (Pharmacia Biotech) pendant 2 H à 4 C. Les lysats cellulaires décantés sont incubés avec l'anticorps monoclonal antiphosphotyrosine (anticorps monoclonal 4G10 - Upstate Biotechnology Incorporated) pendant 4 H à 4 OC. Puis, 50 m de protéine A Sépsoose sont ajoutés au complexe et l'incubation est poursuivie toute une nuit à 4 C. Les immunoprécipités sont lavés 3 fois avec un tampon HNTG et solubilisés dans un échantillon de tampon SDS (100 l). Les complexes sont ensuite séparés par SDS- PAGE et transférés par électrophorèse sur des membranes PVDF. Les membranes sont incubées avec l'anticorps monoclonal phosphotymaine dans du TBS (10 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 o de sérum albumine bovin) et en outre incubées avec des seconds anticorps conjugués à une phosphatase alcaline. Des substrats pour la phosphatase alcaline sont ensuite ajoutés pour un développement approprié de la couleur. 5) Purification et analyse de la séquence Environ 5.109 cellules ER22 sont lysées dans 200 ml de tampon HNTG. Le lysat est centrifugé à 15 000 g pendant 15 min et dilué 5 fois dans un tampon HNG (50 mM d'Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCI, 10% de Glycérol, 1 mM d'EGTA, inhibiteurs de phosphatase et inhibiteurs de protéase).Le lysate est incubé toute une nuit avec 6 ml de S-Sépharose Fast flow équilibré dans le même tampon Le complexe est transvasé sur colonne (2,5 x 1,3 cm - IBF). La colonne est lavée avec 10 fois son volume en tampon et les protéines liées sont ensuite éluées à une vitesse d'élution de 60 ml h-l, avec un gradient linéaire de 60 ml de 0 à 1 M de NaCI du même tampon Les fractions possédant l'activité de liaison déterminée dans les conditions de l'exemple 2.2 (0,150,37 M NaCl) sont rassemblées, diluées 10 fois dans un tampon HNG et chargées sur Héparine-Séphaose CIr6B (3ml) (Pharmacia LKB), pdiéquiEbrée avec le même tampon à une vitesse d'élution de 24 ml h-l. Après lavage avec le tampon HNG, la colonne est éluée avec un gradient de 24 ml, de 0 à 1 MdeNaCL Desfractionsactves de la chromatographie S Fast Flow sont rassemblées, diluées 4 fois dans un tampon MES (100 mM de MES, ph 6,8, 1 mM de MgS04 1 mM d'EGTA) et transférées sur une colonne ATP d'agarose (3 ml) (Sigma N A9264) prééquilibrée avec le tampon MES contenant 50 mM de NaCl à un débit d'élution de 6 mlii-1. La colonne est ensuite lavée avec 20 ml de tampon MES contenant 50 mM de NaCl et éluée à 30 ml.h-l avec un gradient linéaire de 50 mM à 2 M NaCI dans le tampon MES. La protéine p68 élue entre 0.3 M et 0.4 M de NaCl. Les fractions actives sont rassemblées, dialysées avec 20 mM de NH4HCO3 pH 8,3 et concentrées.Les protéines amenées à sec, sont resuspendues dans un tampon SDS, séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le gel est coloré avec du bleu de coomassie et la bande de poids moléculaire de 68kDA, correspondant à activité de liaison SH3 est recueillie. Elle est lavée pendant 1 heure avec les solutions suivantes: eau, eau/ méthanol (90/10), eau/CH3CN (80/20), eau/CH3CN (50/50). La bande de gel, contenant la protéine p68 purifiée, est ensuite divisée en petits fragments et séchée sous SPEED/VAC (SAVANT). On ajoute 400 l d'une solution contenant 25 mM Tris pH 8,5, 1 mM d'EDTA , 0,05% de SDS et Spg d'endoprotéinase Lys-c (Boehringer Mannheim) et l'ensemble est incubé toute une nuit à 37 C. L'hydrolysat est injecté sur colonne HPLC en phase inverse (Vydac C18: 2,1 x 250mm).La colonne est éluée à 0,2ml/min avec un gradient linéaire de 0 à 35% Ben 150 minutes. (A:H20 + TFA 0,07% et B: CH3CN + TFA 0,07%) et les pics d'éluvion observés à tr 113,7, 117,7 et 133,7 min sont recueillis et directement séquencés en utilisant un miquenceur Applied Bioestems 477k La séquence des peptides correspondants ainsi obtenus est présentée en SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N04. Ces séquences ne présentent aucune homologie avec des protéines référencées dans les bases de données de protéines TAPIR 33. SwioProt 33 (intelligenetics)). Afin de déterminer si la protéine p68 est phosphorylée au niveau de la tyrosine dans les cellules mitotiques ou non synchrones, les protéines des lysats issus de cellules ER22 cultivées dans 10% de sérum de veau foétal ou de cellules traitées avec le nocodazole sont immunoprécipitées avec des anticorps anti-phosphotyrosine. transférées sur membrane et soit immunodétectées avec des anticorps anti-phosphotyrosine soit incubées avec soit GST-GAP-SH3 ou GST-Src-SH3, dans les conditions décrites en exemples 2.2 et 2.4. Comme témoin, les protéines des cellules NIH 3T3, transformées avec un allèle activé de c-Src (c-Src Y5Z7E3 sont testées dans les mêmes conditions que celles décrites pour les protéines ER22. Les résultats obtenus montrent que des protéines sont phosphorylées au niveau de la tyrosine, plus particulièrement dans la région 6(70kDL Dans les cellules ER22 aucune liaison à une protéine phosphorylée p68 n'est détectée avec les sondes GST-GAP-SH3 ou GST-Src-SH3. Dans les cellules NIH3T3 (c-Src Y527F), la sonde GST-Src-SH3 se lie à une protéine de poids moléculaire de 68kDa phosphorylée en tyrosine alors que la sonde GST-GAP-SH3 n'interéagit avec aucune protéine. Afin de oenfim l'implication fonctionnelle de cette protéine dans la voie de signalisation ras, des expériences de compétition ont été réalisées dans les conditions décntes dans l'exemple 2.3. Les résultats obtenus montrent que les peptides dérivés de GAP capables de bloquer la rupture des vésicules germinales d'oeufs de xénope (GVBD) induite par ras, peptides (299-326) et (317-326) de GAPSH3 sont également capables de bloquer l'interaction entre la protéine p68 et GAP. Ces résultats confirment clairement que la capacité de bloquer ractivité de la protéine selon l'invention ou d'interférer avec son activité constitue une nouvelle approche particulièrement prometteuse pour le traitement du cancer. EXEMPLE 3 Isolement de la sequence SEO ID N"6 humaine à partir dune banque d'ADNc de placenta humain. On utilise à titre de sondes les SEQ ID N 7 et N 8, établies à partir des séquences peptidiques SEQ ID N"1 et SEQ ID N"3. L'ADN de la banque Clonetech HL1008B a été préparé et utilisé dans une réaction de PCR. 30 cycles d'amplificatian ont été réalisés dans les conditions suivantes: dénaturation 1 min à 94"C, appariement 1 min entre 35 et 40 C et élongation 1 min à 72"C. Cette réaction permet d'isoler un fragment d'ADN de 1,3kb dont une partie de la séquence est donnée en SEQ ID N06. Une analyse en Northern Blot montre que l'ARN correspondant (3,3kb) est ubiquitaire et exprimé très fortement dans le muscle squelettique adulte. LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATION GENERALE. (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PEPTIDE CAPABLE DE SE LIER AU DOMAINE SH3 DE LA PROTEINE GAP. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version Ni .25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 1. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Protéine (vi) ORIGINE: HAMSTER (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: VM(E)KPSPLLVGREF(V)RQYI(-)(G,L) (3) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 2. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Protéine (vi) ORIGINE: HAMSTER (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: (T,A) (-)EGD(D)RDNRL(L)GP t4) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Protéine (vi) ORIGINE: HAMSTER (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: LPNFGFVVFDDSEPVQK (5) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 4. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Protéine (vi) ORIGINE: HAMSTER (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: (S)A(T)PAPADVAPAQEDLR(-)F (6) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 5. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 68 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Protéine (vi) ORIGINE: HUMAIN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: REAGEQGDI EPRRMVRHPD SHQLF I GNLPHEVDKSELKDFFQSYGNVVE LRINS GPKLPNFAFVVFDD (7) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 6. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6: (A) LONGUEUR:204 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Humain (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: 5' CGTGAGGCTGGTGAGCAAGGTGACATTGAACCCCGAAGAATGGTGAGACAC CCTGACAGTCACCAACTCTTCATTGGCAACCTGCCTCATGAAGTGGACAAATCA GAGCTTAAAGATTTCTTTCAAAGTTATGGAAACGTGGTGGAGTTGCGCATTAAC AGTGGTGGGAAATTACCCAATTTCGCCTTCGTCGTCTTCGATGAT 3' (8) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 7. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 7: (A) LONGUEUR:32 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Humain (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: 5' GTIATGGAIAAICCITCCCCICTICTIGTIGG 3' (9) INFORMATION POUR LA SEO ID NO. 8. (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8: (A) LONGUEUR:26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Humain (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: 5' GAATCATCGAAIACIACGAAICCGAA 3' REVENDICATIONS 1. Polypeptide capable d'interagir avec le domaine SH3 de la protéine GAP. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID N01, SEQ ID N"2, SEQ ID N03 et SEQ ID N04 ou d'un dérivé de cellesci. 3. Polypeptide selon rune des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID N"1, SEQ ID N"2, SEQ ID N"3 ou SEQ ID N"4. 4. Polypeptide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il possède un poids moléculaire de l'ordre de 68kDa. 5. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N"5 ou d'un dérivé de celleci. 6. Polypeptide selon la revendication 1 ou 5 caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID N"5. 7. Polypeptide selon rune des revendications précédentes caractérisé en que ses motifs tyrosine ne se phosphorylent pas dans des cellules mitotiques ou en croissance. 8. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon rune des revendications 1 à 7. 9. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence choisie parmi les séquences peptidiques présentées en SEQ ID N"1, SEQ ID N"2, SEQ ID N"3 , SEQ ID N"4 et SEQ ID N"5. 10. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce qu'il possède la faculté d'inhiber l'interaction entre la protéine GAP et un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7. 11. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 7. 12. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 caractérisée en ce qu'elle comprend: (a) tout ou partie de la séquence SEQ ID N"6 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec la séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'invention, et (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. 13. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 ou 12 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID N06. 14. Acide nucléique antisns capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 7. 15. Utilisation d'une séquence selon l'une des revendications 11 à 13 pour la détection de rexpression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). 16. Utilisation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 pour la réalisation d'un composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable d'interagir avec la protéine GAP, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. 17. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 et/ou un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 8 à 10 et/ou un acide nucléique antisens selon la revendication 14 et/ou un composé préparé selon la revendication 16. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 destinée à moduler l'activation des protéines p21. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 destinée au traitement des cancers. 20. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 10 et"ou d'une séquence nucléotidique selon la revendication 11 pour la détection de l'exjression et/ou d'une surexpression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 amplifié, muté ou réarrangé dans un échantillon biologique. 21. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon Rune des revendications 8 à 10 et/ou d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 11 à 13 pour le typage de cancers ou de maladies liées à des défauts de signalisation. 22. Utilisation d'une séquence nucléotidique ARN ou ADN capable d'interagir avec un polypeptide selon Rune des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers.