Brevet FR2733754A1 — publié le 19961108

Frayent de l'ADN génomique de Clavibacter michianensis, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, réactif et procédé de détection de Clavibacter michianensis. La présente invention concerne un fragment de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, une sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, une amorce pour amplifier spécifiquement l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, un réactif et un procédé pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique ladite bactérie, mis en oeuvre avec la sonde ou l'amorce de l'invention. Les Clavibacter sont des bactéries Gram(+) appartenant aux actinomycètes, aérobies strictes non sporulantes. Jusqu'en 1988, les Clavibacter étaient classés dans les Corynébactéries (Collins et Bradbury, 1986), groupe taxonomique ayant subi de nombreuses modifications ces dernières années. Depuis 1988, ces Corynébactéries phytopathogènes ont été reclassées dans le nouveau groupe des Clavibacter suivant en cela les travaux de Cars son et Vidaver, qui, dès 1982, montraient que 7 des 14 corynébactéries phytopathogènes pouvaient former un groupe taxonomique comprenant 4 espèces différentes (aujourd'hui appelées Clavibacter michiganensis, tritici, rathayi et iranicum), les Clavibacter michiganensis se divisant euxmêmes en 4 sous espèces : Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis, nebraskense, sepedonicum et insidiusum. Une des principales caractéristiques des Clavibacter est que chaque espèce ou sous-espèce n'est pathogène que d'une seule plante, et qu'il est rare de pouvoir en isoler à partir d'autres plantes. Ainsi, le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis est un pathogène de la tomate (Lycopersicon esculantum), responsable de la maladie du chancre de la tomate, affection majeure des variétés de plein-champ et de serre. Le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis n'est transmis en général que par les semences de tomate, semences sur ou dans lesquelles on peut le retrouver (Tsiatos, 1986 ; Rat, 1984). Dans le cas d'une transmission par des techniques culturales (taille, rempotage, arrosage...), les effets plus tardifs du pathogène sont moins dommageables pour les cultures (Dullahide, 1983 Dhanvantari, 1989). Ce pathogène peut survivre en conservant son pouvoir pathogène pendant 18 mois dans des sols infestés par des cultures précédentes de tomates contaminées et quelques mois sur les structures et le matériel d'une exploitation (Strider, 1967 ; Moffet, 1984). Les symptômes externes, caractérisés par des tâches brunes entourées d'un halo blanc (dites en oeil d'oiseaux) se transformant en zones de nécroses, n' apparaissent, en général, que vers la maturité de la plante sur les feuilles, les tiges, les inflorescences et les fruits, bien que la bactérie puisse être présente dans la plante bien avant l'apparition de ces symptômes. Ceci rend son diagnostic precoce difficile. Les symptômes internes n'apparaissent eux aussi que sur les plantes adultes. Ils consistent en l'apparition de tâches jaunes ou brun foncé sur les vaisseaux du bois ; la moelle paraît intacte au début, mais peut se creuser par la suite. A terme, le feuillage devient grillé et les fruits verts ont tendance à tomber (Strider, 1969). Ces atteintes se répandent ensuite rapidement sur l'ensemble de la plante et conduisent à la perte des fruits (Lelliott, 1988). Ainsi, des pertes de récolte en champs de près de 70 % peuvent être observées (Lelliott, 1988). Décrite pour la première fois en 1910 par E.F. Smith, la maladie s'est étendue depuis dans toutes les zones du globe. Actuellement, la caractérisation des germes fait appel à des techniques biochimiques appliquées à des bactéries isolées de macérats de graines de tomate, méthodes complétées par des tests d'inoculation sur matériel végétal sain, pour vérifier le pouvoir pathogène des souches. Ceci nécessite 3 à 4 semaines de délai pour obtenir un résultat (Gardan et Luisetti, 1986). Bien que des tests de détection par immunofluorescence aient été décrits précédemment (Trigalet, 1974 ; De Boer, 1982), aucune technique d'enzymologie, d'immunologie ou de biologie moléculaire rapide et suffisamment fiable pour être homologuée n' a pu être développée pour le diagnostic des Clavibacter (Thompson et coll., 1988 ; Johansen et coll., 1989), et ce malgré l'existence de 2 sondes d'ADN spécifiques du Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis (Thompson et coll., 1988) et du Clavibacter michiganensis sous-espèce insidiusum (Rassmussen et coll., 1989).Ceci tient au fait que l'utilisation de ces sondes nécessite d'avoir recours au préalable à des techniques très lourdes d'extraction des acides nucléiques, comprenant en particulier des séparations par centrifugation en gradient de caesium. Aucune variété de tomate cultivée n'est aujourd'hui résistante à ce pathogène (Leterrot et coll., 1978), et aucun traitement n'a pu être mis au point pour combattre la maladie ou désinfecter de façon efficace les semences contaminées (Tsiantos, 1987 ; Dhanvantari, 1989). I1 apparaît donc aujourd'hui primordial de pouvoir diagnostiquer de manière fiable, rapide et économique la présence du Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis sur des lots de semences. Le but de la présente invention est donc de proposer une ou plusieurs séquences nucléotidiques utilisées sous forme de sonde, d'amorce ou de réactif à visée de diagnostic pour permettre de détecter la présence du Clavibacter michiganensis dans les semences de tomates, suffisamment spécifiques pour détecter le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis parmi d'autres espèces bactériennes les plus proches, simples à mettre en oeuvre et suffisamment fiables pour ne pas détecter en particulier des bactéries mortes. La présente invention concerne à cet effet un fragment monocaténaire de l'ADN genomique de Clavibacter michiganensis codant pour l'ARN 16S, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 * d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives. Par séquence complémentaire on entend toute séquence s'hybridant totalement avec la sequence représentée. Un second objet de l'invention concerne une sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, ladite sonde comprenant au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 et leurs séquences complémentaires respectives. Un troisième objet de l'invention est de réaliser une amorce (ou "primer") pour la polymérisation de l'ADN génomique de Clavibacter permettant une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis par différents moyens tels que par la technique de réaction en chaîne de la polymérase encore appelée PCR, par transcription inverse ou par réaction de ligation en chaîne. Cette amorce comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une partie d'une séquence de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, cette séquence étant choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 et leurs séquences complémentaires respectives. Selon les techniques d'amplification envisagées, il est préférable d'utiliser un couple d'amorces comprenant au moins une amorce de 1 invention. De préférence, pour obtenir le degré de specificité voulu, il est nécessaire d'utiliser une première amorce ayant au moins 70 % d'homologie avec la séquence N"1 et une deuxième amorce ayant au moins 70 % d'homologie avec la séquence N"2. Chaque amorce peut indifféremment jouer le rôle d'amorce de capture ou d'amorce de révélation. L'amorce de capture comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplée à un marqueur ou associée à une séquence nucléotidique particulière. L'amorce de révélation comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplee à un marqueur permettant la révélation. Le quatrième objet de l'invention est un réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique mettant en application une sonde ou un couple de sondes de l'invention telles que décrites cidessus. Dans ce cas, les techniques mises en oeuvre sont constituées par des techniques d'hybridation moléculaire comprenant une phase d'hybridation et une phase de detection. Pour permettre la mise en oeuvre de la phase de détection, la sonde nucléique est couplée au préalable à une molécule dont la présence pourra être révélée. De manière analogue, le procédé de détection sélectif de Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique peut consister à exposer 1'ADN génomique ou l'ARN des bactéries, contenu dans ledit échantillon sous forme de fragment monocatenaire, à au moins une sonde puis à detecter les zones d'hybridation de manière directe ou indirecte. En variante ce procedé peut consister à réaliser une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis en présence d'un système enzymatique adapte et au moins un couple d'amorces et indentifier les fragments amplifiés.Toutes les techniques d'hybridation moléculaire ou d'amplification génique connues à ce jour peuvent être mises en oeuvre dans les procédés cidessus et notamment les techniques dites "Dot Blot" "Southern" et d'hybridation sandwich ou les techniques de réaction de ligation en chaîne ou Ligase Chain Reaction (LCR), les techniques d'amplification par transcription inverse ou TAS et les techniques de réaction en chaîne de la polymérisation dites PCR. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels la figure 1 représente la structure secondaire de l'ARN 16S des procaryotes la figure 2 représente les séquences respectives de l'ADN codant pour l'ARN 16S de la zone variable V3 des bactéries Clavibacter michiganensis, Clavibacter non michiganensis et Curtobactérium et la figure 3 représente les séquences respectives de l'ADN codant pour l'ARN 16S de la zone variable V6 des bactéries Clavibacter michiganensis, Clavibacter non michiganensis et Curtobactérium. Il a été montré que les ARN de transfert, ARNt compris entre les séquences exprimant les ARNr, peuvent différer d'une bactérie à l'autre (Lewin, 1986) et que les séquences exprimant l'ARNr 16S présentent des régions variables, numérotées classiquement de V1 à V9 (la région V4 n' existant que chez les eucaryotes). Cette structure secondaire des ARNr 16S des procaryotes (établie d'après Gutell et coll., 1990) est représentée à la figure 1. L'extrémité 5'P est symbolisée par un cercle noir, l'extrémité 3'OH par une flèche. En gras sont représentées les régions relativement conservées. Les régions variables sont numérotées de V1 à V9. Les séquences N"1 et 2, objet de l'invention, ont été obtenues après séquençage des régions variables V3 et V6 des ADN codant pour les ARN 16S de différents Clavibacter michiganensis, Curtobactérium et Rhodococcus. Le positionnement de ces séquences d'ADN codant pour des ARN 16S est décrit par rapport à la séquence de référence de l'ARN ribosomique de E. Coli, telle que décrite dans : NEEFS J.M. VAN DE PEER Y. ; HENDRIKS L. ; de WACHTER R. (1990) "Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences". Nucleic Acids Research ; 18, supplement ; 2237-2317. La figure 2 représente les séquence s obtenues après séquençage des régions variables V3 à V6 des ADN codant pour des ARN ribosomiques ARNr 16S de trois groupes de souches différents correspondant chacun à une ligne de séquence. Le groupe N"1 correspondant à la liste de séquence de bases représentée à la première ligne.Les souches concernées, dont la numérotation correspond à celle de la collection française INRA de bactéries phytopathogènes, auprès de laquelle les souches peuvent être obtenues, comprennent Groupe N"1 1. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2352, souche type ; Lycopersicon esculentum (tomate) 2. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2499, Solanum nigrum 3. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2501, Capsicum annuum (piment) 4. le Clavibacter michiganensis sous-espèce insidiusum ; N" 2404, souche type ; Medicago sativa (tabac) 5. le Clavibacter michiganensis sous-espèce nebraskensis ; N" 2405, souche type ; Zea mays (maïs). Le groupe N"2 correspondant à la deuxième ligne de la liste des séquences établies dans la figure 2 comprend 7. le Clavibacter iranicus ; N" 807, souche type ; Triticum aestivum (blé) 8. le Clavibacter rathayi ; N" 2406, souche type ; Dactylis glomerata 9. le Clavibacter tritici ; N" 1385, souche type ; Triticum aestivum (blé) ; Le troisième groupe correspondant à la troisième ligne de séquence représentée comprend 10. Curtobactérium flaccumfaciens pv. betae ; n" 2402, souche type ; Beta vulgaris 11. Curtobactérium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens ; N" 1389 ; Phaseolus sp. (haricot) 12. Curtobactérium flaccumfaciens pv. oortii ; N" 1384, souche type ; Tulipa gesneriana 13. Curtobactérium flaccumfaciens pv. poinsettiae ; N" 2403, souche type ; Euphorbia pulcherrima. La séquence N"1 a été identifiée comme suit. La séquence cible constituée par l'ADNr (ribosomique) codant pour la région V3 de l'ARNr 16S a été amplifiée à partir de 105 bactéries appartenant à l'un des groupes 1, 2 ou 3 précités. Cette amplification a été réalisée à partir des amorces répondant aux séquence N"3, séquence N"4 dont les séquences sont représentées à la fin de la description. La dimension du fragment amplifié obtenu y compris les amorces est de 199 bases. Ce fragment est flanqué à son extrémité 5' de l'amorce correspondant à la séquence N"3 et à son extrémité 3'OH de l'amorce correspondant à la séquence N"4. La technique d'amplification retenue est la technique de la réaction en chaîne de la polymérase encore appelée PCR (Polymerase Chain Reaction, Sacki et Coll 1983). Cette technique de polymérase par réaction en chaîne comprend trois étapes - une première étape de dénaturation de l'ADN double brin en deux matrices simple brin - une hybridation avec un couple d'amorces (séquence N"3, séquence N"4) délimitant la région à amplifier - la synthèse par une enzyme, en général une polymérase thermorésistante, du brin complémentaire. La température de mise en oeuvre de la PCR est de 66"C. Les conditions de PCR sont telles que suit : milieu réactionnel 1,5 mM MgCL2, 30 ng de chaque amorce, 0,25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, marque déposée commercialisée par Eurogentec SA). Cette étape est suivie d'une étape de purification par filtration des produits d'amplification au moyen d'un système Centricon 100 (marque déposée) commercialisé par la Société Amicon SA. Dans une étape suivante, il est réalisé une amplification différentielle de ces fragments pour produire l'ADN simple brin.Cette étape d'amplification est réalisée dans les mêmes conditions que ci-dessus à l'exception des concentrations d'amorces qui sont telles que suit Amorce représentée par la séquence N"3 : 2 pmoles 13,4 ng Amorce représentée par la séquence N"4 : 50 pmoles 333 ng Une nouvelle étape de purification par filtration des produits est réalisée au moyen d'un système de type Centricon 100 (marque déposée) commercialisé par Amicon SA. Ensuite, la séquence nucléotidique complète des brins d'ADN complémentaires de chaque fragment est déterminée par la méthode de SANGER F. ; NICKLEN S. ; COULSON A.R. (1977) : DNA sequencing with chain-terminating inhibitors ; "Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 74 ; 5463". Les alignements de ces séquences permettent de mettre en évidence la série de bases encadrée sur la ligne N"1 correspondant à une séquence de Clavibacter michiganensis. Cette séquence correspond à la séquence N"1 représentée en fin de description. De manière analogue, on a obtenu les séquences représentées à la figure 3 après séquençage des régions variables V6 des ADN ribosomiques codant pour les ARNr 16S des trois groupes de souches suivants: Le groupe N"1 comprend 1. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2352, souche type ; Lycopersicon esculentum (tomate) 5. le Clavibacter michiganensis sous-espèce nebraskensis ; N" 2405, souche type ; Zea mays (maïs). Le groupe N"2 comprend 8. le Clavibacter rathayi ; N" 2406, souche type ; Dactylis glomerata 9. le Clavibacter tritici ; N" 1385, souche type ; Triticum aestivum (blé) Le groupe N"3 comprend 11. Curtobactérium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens ; N" 1389 ; Phaseolus sp. (haricot) 12. Curtobactérium flaccumfaciens pv. oortii ; N" 1384, souche type ; Tulipa gesneriana 13. Curtobactérium flaccumfaciens pv. poinsettiae ; N" 2403, souche type ; Euphorbia pulcherrima. Ces séquences ont été obtenues de la manière suivante : la séquence cible constituée par l'ADNr (ribosomique) codant pour la région V6 de l'ARNr 16S a été amplifiée par PCR à partir de 105 bactéries appartenant à l'un des groupes 1, 2 ou 3 précités. Cette amplification a été réalisée à partir d'un couple d'amorces correspondant aux séquences N"5 et 6 qui sont représentées à la fin de la description. La taille du fragment amplifié obtenu est de 173 bases.Ce fragment est flanqué à son extrémité 5' de l'amorce représentée par la séquence N"5 et à son extrémité 3'OH de l'amorce représentée par la séquence N"6. La température de mise en oeuvre de la PCR est de 60"C. Les conditions de PCR sont identiques à celles décrites pour l'obtention de la séquence N"1 cidessus. Les alignements des séquences obtenues permettent de mettre en évidence la série de bases encadrée sur la ligne N"1 correspondant à une séquence de Clavibacter michiganensis. Cette séquence correspond à la séquence N"2 représentée en fin de description. Ce séquençage de 1'ADN ribosomique codant pour les ARNr 16S des zones variables V3 à V6 permet d'identifier deux zones de séquences encadrées sur les figures 2 et 3 correspondant respectivement aux séquences cibles des séquence N"1 et séquence N"2 utilisées comme sondes ou comme amorces. On constate cependant que la sonde correspondant à la séquence N"1 ne permet pas d'établir une distinction entre les Clavibacter michiganensis et les Curtobactérium. Tel n'est pas le cas de la sonde correspondant à la séquence N"2. C'est pourquoi, pour obtenir le degré de spécificité voulu, on utilisera la plupart du temps un couple d'amorces ou de sondes qui correspondent respectivement aux séquences N"1 et N"2. L'identification de Clavibacter michiganensis au moyen de sondes ou d'amorces conformes à l'invention peut être obtenue au moyen de différentes techniques. Ainsi, on distingue les techniques d'hybridation et les techniques d'amplification. La technique d'hybridation retenue peut par exemple être celle dite d'hybridation "sandwich". Dans ce cas, l'ADN purifié est obtenu, selon par exemple la technique d'extraction de l'ADN des Clavibacter mettant en oeuvre le protocole décrit par Thompson dans : THOMPSON E. ; LEARY J.V.; CHUN W.W.WC. (1989) : "Specific detection of Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis by a homologous DNA probe". Gentics 79(3). 311-314. L'identification de Clavibacter michiganensis peut également être réalisée par hybridation directe sur colonies en utilisant un système de détection non-radioactif et semiautomatisé décrit dans le brevet français N" 90.07249 dont le contenu est incorporé à la présente description, si besoin est. L'identification des souches de Clavibacter michiganensis à partir des souches décrites dans les groupes 1 ci-dessus a été confirmée selon cette technologie de détection non radioactive. L'extraction de l'ADN total à partir des colonies est réalisée de la manière suivante. Une colonie bactérienne standardisée à un inoculum lO9 bactéries est reprise dans 400 pl d'une solution de citrate de sodium 0,1 M contenant 0,85 g de chlorure de sodium. On ajoute 40 ul de détergent désoxychlorate de sodium (1 %). Après incubation 5 minutes à température ambiante, 4 extractions phénol-chloroforme sont effectuées (Maniatis et coll. 1982). L'ADN est précipité à l'éthanol. Le culot est repris dans 100 ul de tampon citrate de sodium. Cette solution est soniquée avec un sonicateur 60 W (Société Bioblock sous la réf. C72442) utilisant une sonde de type "cuphorn" (Société Bioblock sous la réf. C72438) afin d'obtenir une population de fragments de taille majoritaire de 1 kilobase. Un aliquote correspondant à 108 bactéries dans 10 p1 est alors identifié par hybridation selon le protocole suivant. Dans une plaque de microtitration (Nom commercial Nunc 439454) est déposée une solution de la sonde oligonucléotidique de capture (sonde séquence N"1) à 1 ng/l dans du PBS 1X (0,15 M NaCl, 0,05 M phosphate de sodium, pH 7,0). La plaque est incubée 2 h à 37"C puis lavée 3 fois avec 300 pl de PBST (PBS + détergent de marque TWEEN de la Société MERCK). La cible constituée par 10 ul de l'ADN total soniqué est mélangée avec 70 pl de tampon PBS saumon [PBS3X + ADN de sperme de saumon 10 pg/ml, (Société Sigma sous la réf. D9156)j et 10 u1 de soude 2N. L'ensemble est neutralisé 5 minutes après, par l'addition de 10 ul d'acide acétique 2N. L'ensemble est ajouté dans le puits en plus de 50 pl d'une solution du conjugué composée de la sonde de détection (séquence complémentaire de la séquence N"2) marquée à la péroxydase à la concentration de 0,1 ng/ul dans un tampon PBS cheval [PBS3X + 10 % sérum de cheval, (Société bioMérieux SA réf. 55842)]. La plaque est incubée 1 h à 37"C et lavée par 3X 300 pl de PBS Tween [PBS1X + 0,5 % Tween 20 (Société Merck réf. 822184)]. 200 pl de substrat PPD (Sigma SA, réf. PS187) sont ajoutés par puits. Après 20 minutes de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 ul d'H2S04 1N et la lecture est effectuée sur un lecteur de microplaques à 492 nm. Le système ne génère pas de bruit de fond puisque le puits contenant l'ADN de saumon du tampon d'hybridation qui est soniqué de la même manière que l'ADN des souches testées, ne génère pas de signal. D'autres techniques d'hybridation moléculaire peuvent également être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention. Ces techniques d'hybridation moléculaire comportent toujours une phase d'hybridation suivie d'une phase de détection. La phase d'hybridation peut être réalisée dans des conditions très variées. Il s'agit le plus souvent d'hybridation sur membrane, comme dans le cas des dot-blot (où les acides nucléiques sont déposés et fixés directement en des endroits précis de la membrane) ou de Southern blot dans le cas desquels, après migration sur un gel d'électrophorèse, les acides nucléiques sont transférés puis fixés sur la membrane. Dans ce cas, ce sont les acides nucléiques cibles, correspondant dans le cadre de l'invention à 1'ADN génomique de Clavibacter michiganensis qui sont fixés sur la membrane. Au contraire, dans le cas d'hybridation sur des supports solides de type microplaques ou billes magnétiques, ce sont les sondes nucléiques correspondant aux séquences N"1 et N"2 qui sont fixées sur ledit support. Le support est sous toute forme appropriée telle que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, polymère soluble. Il est constitué par un matériau naturel, de synthèse, modifié chimiquement ou non et est, selon la technique retenue, choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques Nylon et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose. Après cette phase d'hybridation, une phase de détection intervient. Pour ce faire, la sonde nucléique est couplée au préalable à une molécule dont la présence pourra être révélée. Trois types de couplage existent a) les couplages avec un isotope radioactif (32p, 35sol ...), pour lesquels la révélation se fera par autoradiographie. b) les couplages avec une molécule enzymatique, pour lesquels la révélation se fait directement, comme la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (Jablonski et coll., 1986 ; Li et coll., 1987). c) les couplages avec des séquences nucléotidiques particulières, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques ou des molécules inertes (acétyl amino fluorène, biotine, groupement sulfoné, la digoxygénine, des stéroïdes naturels, la digitale), révélées de façon indirecte grâce à des anticorps liés à des systèmes de révélation reconnaissant la molécule couplée à la sonde (Urdea et coll., 1988 ; Heino et coll., 1989 ; Grimont et coll., 1989 ; King et coll., 1989, Cuppels et coll., 1990; Wood et coll., 1990). Dans les deux derniers cas b) et c), les systèmes de révélation font intervenir des réactions colorimétriques, la fluorescence ou la chimioluminescence. L'exemple précité faisait intervenir un couplage de type b. A ces techniques d'hybridation moléculaire, il est toutefois préféré, dans le cadre de l'invention, les techniques d'amplification génique. On citera pour mémoire la technique de réaction de ligation en chaîne et la technique d'amplification par transcription inverse. La technique de réaction de ligation en chaîne ou LCR (Ligase Chain Reaction ; Barany, 1991) est une technique proche de la PCR. Cette technique utilise les propriétés d'une ligase thermorésistante qui permet de lier deux amorces contigües hybridées à la matrice d'ADN, ces deux amorces étant constituées par les séquences N"1 ou N"2 et une amorce choisie parmi les séquences décrites des régions V3 et V6 contigües de celle-ci.L'intérêt de la technique réside dans le fait que si des mésapariments apparaissent lors de l'hybridation des amorces, la réaction de ligation ne peut avoir lieu. La technique d'amplification par transcription inverse, ou TAS (Transcription-based Amplification System, Kwoh et coll., 1989 ; Compton, 1991), est basée sur l'utilisation simultanée de deux enzymes - la transcriptase inverse du virus aviaire de la myéloblastose, qui permet la synthèse d'un ADN complémentaire à partir d'un hétéroduplex ARN/ADN constitué de la matrice ARN à amplifier, hybridée à un oligonucléotide choisi - l'ARN polymérase du phage T7, qui, à partir du cDNA cible hybridé à un deuxième obligonucléotide portant la séquence de reconnaissance de cette enzyme, synthétise de 10 à 1000 copies d'ARN. Ainsi, à chaque cycle, le coefficient d'amplification obtenu est bien supérieur à 2, comme dans le cas de la PCR, et à partir d'une seule copie de la séquence à amplifier, il est possible en 4 cycles seulement d'obtenir 106 copies identiques (Kowh et coll., 1989). Cependant, en raison du développement technique de ces différents procédés, il apparaît aujourd'hui que la technique la plus adaptée aux séquences objet de l'invention est la réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR (Polymerase Chain Reaction ; Saiki et coll., 1983). Un exemple de mise en oeuvre de cette technique va être décrit ci-après. 1. Préparation des échantillons Il convient tout d'abord dans un premier temps de préparer des échantillons sur lesquels les sondes pourront être testées. Ces échantillons sont obtenus à partir de lots de semences de tomates ayant été soumises à une macération. La macération s'effectue dans les conditions suivantes : 50 ml de semence, soit environ 25 g de semence, sont mises à macérer pendant 24 heures sous agitation à 28 dans une solution de macération constituée de tampon phosphate 0,01M ajusté à pH 7,2 et d'acide nalidixique d'une concentration de 4 mg/l. La solution mère de ce tampon phosphate lOX présente une composition telle que suit 32,626gNa2HP0412H20 1, 088gKH2P04 H2Oqspll 2.Préparation des amorces Il convient d'utiliser les séquences N"1 et N"2 spécifiques à l'identification de Clavibacter michiganensis. Ces séquences vont être utilisées sous forme d'amorce spécifique pour l'amplification par la polymérisation de l'ADN génomique codant pour l'ARN ribosomique 16S desdites bactéries. Ces amorces sont généralement utilisées sous forme de couple comportant la séquence N"1 et la séquence N"2. La séquence N"1 comme la séquence N"2 peuvent indifféremment constituer l'amorce de capture ou l'amorce de détection. Le test est basé sur le fait que, si la bactérie recherchée est présente dans l'échantillon, l'oligosonde spécifique correspondant aux séquences N"1 et N"2 va pouvoir s'hybrider à sa séquence cible et l'amplification aura lieu. Sinon, en l'absence de la bactérie recherchée, l'oligosonde ne pourra pas s'hybrider et l'amplification ne s'effectuera pas. Dans l'exemple décrit, le couple séquence N"1, séquence N"2 détermine une région à amplifier de 592 paires de bases. La température d'hybridation utilisée pour la PCR correspondante (Tm) doit être de 66"C pour assurer la spécificité du test. Conditions de PCR Milieu réactionnel : 1,5 mM MgCl2, 100 ng de chaque amorce, 0,25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, Eurogentec SA). 10 pL d'échantillon, volume final de 50 ,ul Cycles PCR 1 cycle : 10 mn, 95"C 30 cycles : 1 mn 95"C ; 1 mn 66 C ; 30 s 72 C 1 cycle : 10 mn, 72"C. On obtient ainsi en 2 heures correspondant à environ 30 cycles de réaction 230 séquences double brin théoriquement identiques à celle choisie initialement. Chaque amorce peut jouer indifféremment un rôle d'amorce de capture ou d'amorce de révélation. L'amorce de capture qui comprend ladite séquence N"1 ou N"2 est fixée sur un support par absorption passive ou couplée à un marqueur ou associée à une séquence nucléotidique particulière, par exemple, la séquence de reconnaissance spécifique de CGN4 comme cela est mis en oeuvre dans le kit captagène -GCN4 commercialisé par Amrad Corporation Australie. L'amorce de révélation comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplée à une molécule biochimique de révélation. Ainsi, dans l'exemple précité, l'amorce de capture (séquence N"1) était fixée directement sur la microplaque de révélation tandis que l'amorce de révélation (séquence N"2) était couplée à la péroxydase. Parmi les marqueurs susceptibles d'être couplés à l'amorce de capture ou à l'amorce de révélation, on peut citer notamment des isotopes radioactifs, des séquences nucléiques, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase ou la phosphatase alcaline, ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques ou des molécules inertes (acétyl amino fluorène, la biotine, groupement sulfoné, la digoxygénine, des stéroïdes naturels, la digitale), révélées de façon indirecte grâce à des anticorps liés à des systèmes de révélation reconnaissant la molécule couplée à la sonde (Urdea et coll., 1988 ; Heino et coll., 1989 ; Grimont et coll., 1989 ; King et coll., 1989, Cuppels et coll., 1990 Wood et coll., 1990). Il est ainsi possible, pour permettre l'automatisation de cette étape de révélation, de réaliser une révélation par hybridation sur support solide de type microplaque, pour visualiser les fragments amplifiés. Pour ce faire, deux sondes (par exemple, la séquence N"1 et la séquence complémentaire de la séquence N"2), du type de celles décrites ci-dessus, situées à l'intérieur de la séquence amplifiée, sont utilisées : la première, correspondant à l'amorce de capture, est fixée sur le support et permet de "capter" le fragment amplifié ; la seconde, correspondant à l'amorce de détection, couplée à un système de marquage non radioactif, entraînant une réaction colorimétrique, permet la révélation. Classiquement, la phase de révélation peut également être réalisée par coloration au bromure d'éthidium des fragments amplifiés séparés sur gel d'électrophorèse. Lorsque la PCR est réalisée sur des suspensions de Clavibacter michiganensis de concentrations connues, par exemple 5.106 bactéries/ml, le seuil minimum de détection atteint par cette méthode, en particulier par révélation au bromure d'éthidïum est de 1 bactérie pour 10 pl d'échantillon, soit une concentration de 100 bactéries / ml pour 30 cycles de PCR. La présence d'un grand nombre de bactéries contaminantes n'affecte pas la sensibilité et la spécificité du test. Pour obtenir des résultats fiables, il convient d'utiliser les séquences N"1 et N"2 simultanément, comme précisé ci-dessus. Séquence N"1 : GCGAAAGTGA CGGTACCTGC A Séquence N"2 : TATACCGACT TGCGCGGCAC A Séquence N"3 : CCAGACTCCT ACGGGAGGCA Séquence N 4 : GTATTACCGC GGCTGCTGGC Séquence N 5 : TTGACGGGGG CCCGCACAAG Séquence N 6 : TTGCGGGACT TAACCCAACA T REVENDICATIONS 1. Fragment monocaténaire de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis codant pour l'ARN 16S, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives. 2. Sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives. 3. Sonde de capture selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes de la revendication 2. 4. Sonde de détection selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes de la revendication 2. 5. Sonde selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi des isotopes radioactifs, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase et la phosphatase alcaline ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des séquences nucléotidiques spécifiques, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, des molécules inertes telles que la biotine, la digoxygénine, des stéroïdes. 6. Amorce spécifique pour l'amplification par la polymérisation de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives. 7. Couple d'amorce selon la revendication 6, caractérisé en ce que en ce qu'il est choisi parmi les couples d'amorce constitués par une amorce de capture et une amorce de détection, l'une répondant à une séquence N"1 ou à sa séquence complémentaire et l'autre répondant à une séquence N"2 ou à sa séquence complémentaire. 8. Amorce selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisée en ce que l'amorce est fixée sur un support ou marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi des isotopes radioactifs, des séquences nucléotidiques spécifiques, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase et la phosphatase alcaline ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, des molécules inertes telles que la biotine, la digoxygénine, des stéroïdes. 9. Réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une des revendications 2 à 5. 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce que chaque sonde est en milieu liquide ou fixée sur un support solide directement ou indirectement. 11. Réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon l'une des revendications 6 à 8. 12. Procédé de détection sélective de Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on expose l'ADN génomique ou l'ARN des bactéries contenu dans ledit échantillon sous forme de fragment monocaténaire à au moins une sonde et on détecte les zones d'hybridation avec ladite sonde. 13. Procédé de détection sélective de Clavibacter michiganensis selon l'une des revendications 1 et 7, caractérisé en ce qu'on réalise une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis en présence d'un système enzymatique adapté et au moins un couple d'amorces, en ce qu'on identifie les fragments amplifiés.