Brevet FR2731016A1 — publié le 19960830

MOYENS POUR LA LUTTE ET LA PREVENTION CONTRE LA BIODETERIORATION DE MATERIAUX PAR DES MICROORGANISMES L'invention a pour objet des moyens pour la lutte et la prévention contre la biodétérioration de matériaux par des microorganismes. Elle vise plus particulièrement des méthodes et dispositifs pour le criblage de produits actifs vis-à-vis de microorganismes contaminants et pour la lutte et la prévention contre ces microorganismes. Par "microorganismes contaminants", on entend, selon l'invention, des microorganismes capables de s'attaquer à des matériaux organiques ou non organiques en provoquant des dégâts considérables. Il s'agit essentiellement de champignons filamenteux, ou moisissures, les espèces les plus incriminées appartenant aux genres Aspergillus, Penicillium et Trichoderma, ou encore d'insectes comme les acariens ou les mites. Les problèmes de contamination par ces microorganismes concernent de nombreux domaines allant des industries agro-alimentaires, pharmaceutiques, cosmétiques, aux hôpitaux et autres installations collectives et circuits d'aération de locaux divers. La lutte contre ces contaminations revêt également une grande importance pour les musées, bibliothèques et archives. Leurs collections, de provenance diverse, dans un état de propreté et de conservation très variable, sont stockées en partie dans des réserves, où elles sont exposées aux dégradations par les microorganismes qui se développent. Ainsi, les moisissures et insectes n'épargnent aucun type de matériau, qu'ils soient en céramique, métal, verre, cuir, papier ou en fibres. De même les peintures, ou encore l'arrière des tableaux, ou leurs supports, peuvent subir des contaminations impressionnantes. Diverses méthodes de désinfection ont été proposées, en particulier des traitements chimiques gazeux ou l'application de rayonnements. Les désinfectants chimiques gazeux les plus utilisés sont l'oxyde d'éthylène et de bromure de méthyle. Leur utilisation nécessite cependant des unités de traitement adaptées. et normalisées. De plus, l'oxyde d'éthylène présente l'inconvénient d'être un gaz très inflammable et toxique, dont l'utilisation impose un rinçage vigoureux par un gaz inerte. Les rayonnements possèdent des propriétés antimicrobiennes connues depuis longtemps. Les rayons UV sont utilisés couramment pour la désinfection de salles ou la stérilisation d'objets, ainsi que les rayons X et gamma. Mais leur champ d'utilisation est limité. Il existe donc un besoin en techniques effficaces, répondant aux contraintes d'innocuité pour les personnes destinées à les utiliser, ou à être en contact avec des produits traités, mais aussi pour l'environnement et les matériaux à traiter. Dans la recherche d'une solution à ce problème, les inventeurs ont étudié les effets d'huiles essentielles vis-à-vis de moisissures cellulolytiques. Les huiles essentielles, désignées ci-après par HE en abrégé, ont fait l'objet de plusieurs définitions, dont celle de Bruneton dans "Pharmacognosie - Phytochimie - Plantes Médicinales", Bruneton J. (Ed.), Tec & Doc Lavoisier, Paris, 1993, p 406-464 qui résume les définitions de la Pharmacopée (Réf. Biblio n0 8) et de l'AFNOR (Réf. Biblio n0 4) : une HE est un "produit obtenu à partir d'une matière première végétale soit par entraînement à la vapeur, soit par des procédés mécaniques à partir de l'épicarpe des citrus, soit par distillation à sec. L'huile essentielle est ensuite séparée de la phase aqueuse par des procédés physiques". Les HE sont principalement produites dans les végétaux supérieurs, dans des organes tels que, fleurs, feuilles, graines, écorce, racine, bois. La synthèse et l'accumulation des HE sont généralement associées à des tissus spécialisés, souvent localisés à la surface des organes végétaux, comme les poils, cellules, poches et canaux sécreteurs. La majorité des publications faisant état des propriétés antifongiques des HE rapportent des conditions d'études en milieu liquide ou solide gélosé, par incorporation des HE au milieu. Un nombre limité de recherches concerne les propriétés antifongiques de la phase volatile des HE utilisées pures. La technique d'étude la plus répandue à cet égard correspond à celle appelée technique de microatmosphère. Elle consiste à soumettre les moisissures, cultivées en gélose, à une HE adsorbée sur un disque de papier collé au couvercle d'une boite de Pétri et à évaluer les effets de la HE. Un dispositif en macro-atmosphère a également été proposé par CHAUMONT et al, dans les Annales Pharmaceutiques françaises, 1992, vol. 50, n" 3, p 156966, dans le cadre d'études sur la lutte contre les moisissures allergisantes présentes dans l'atmosphère. Des boites de Pétri ensemencees sont déposées au fond d'une enceinte, une huile essentielle, deposée sur papier, diffusant dans l'atmosphère de l'enceinte. L'effet sporicide est alors observe en ouvrant l'enceinte après un temps d'exposition préalablement défini. Les résultats de ces différentes techniques sont difficiles à comparer étant donné la disparité des paramètres de culture (milieu, température d'incubation, durée de traitement, taille de l'inoculum initial, etc). Les résultats obtenus dépendent de la technique d'étude: en effet, en atmosphère, ce sont les composants volatils des HE qui agissent, alors qu'incorpores au milieu, leur efficacité dépend de leur aptitude à diffuser à travers celui-ci. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à rechercher une HE efficace, ou spécifiquement active, contre des microorganismes contaminants, moisissures ou insectes, déterminés, en étudiant l'effet des composants volatils d'HE dans des conditions particulières de culture de ces microorganismes. Ils ont ainsi développé et mis au point des moyens permettant de suivre et de simuler le développement de microorganismes soumis à un traitement gazeux par les HE dans des conditions de culture déterminées et en atmosphère contrôlee. Ces travaux les ont également amenés à développer des méthodes analytiques pour quantifier les effets destructeurs des HE sur les microorganismes. L'invention a donc pour but de fournir une méthode et un dispositif pour le criblage de HE, actives vis-à-vis de microorganismes contaminants. Elle vise également à fournir une methode et un dispositif pour la lutte et la prévention contre la biodétérioration par de tels microorganismes, de grande fiabilité, facilement adaptables selon les espèces de microorganismes contaminants. La méthode pour le criblage, selon l'invention, des HE actives vis-à-vis de microorganismes donnés, contaminant des objets et/ou des atmosphères de locaux, est caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact des composés volatils d'une ou plusieurs HE avec les microorganismes contaminants, cultivés sur support solide, en atmosphère contrôlée, dans des conditions permettant leur germination et leur développement, et la sélection des HE exerçant un effet destructeur vis-à-vis de ces microorganismes. L'utilisation en combinaison, selon l'invention, de la diffusion des HE et de la technique de fermentation en milieu solide permet d'étudier les effets des HE sur des microorganismes déterminés dans des conditions contrôlées, correspondant avantageusement à celles de 1'environnement du microorganisme in site et fournit ainsi les moyens pour selectionner celles se revélant spécifiquement actives vis-à-vis des microorganismes. Par "NE actives", on désigne, selon l'invention, des HE capables d'arrêter la croissance des microorganismes et/ou ayant des propriétés létales vis-àvis de ceux-ci. Les microorganismes sont cultivés en fermenteur sur un support solide élaboré à partir d'un matériau permettant la diffusion des composés volatils de la ou des HE. Ce support solide est imprégné par une solution nutritive pour la croissance de différentes microorganismes. Des supports solides appropriés sont élabores à partir de son de blé, de rafle de maïs, de sciures de bois ou de bagasse de canne à sucre. Le milieu de culture, ou la solution nutritive, est choisi en fonction du microorganisme à cultiver, de manière à permettre son développement optimal. La taille de l'inoculum initial doit etre suffisante pour permettre d'apprécier les effets des HE, en particulier pour effectuer les tests de sporicidée écrits dans les exemples. Comme indiqué ci-dessus, les conditions de culture sont avantageusement choisies de manière à reproduire celles existant in situ pour le microorganisme Le plus generalement, la température correspond à l'ambiante, ou à des températures voisines, et le taux d'humidité est de l'ordre de 40 à 85 %, notamment de 70 pour les moisissures. La ou les HE utilisées sont imprégnées sur un support inerte vis-à-vis de la ou des HE. On utilise de préférence un support à l'état divisé, et capable d'absorber un volume important de HE, de façon homogène. Parmi les matériaux convenant pour l'élaboration de ce support, on citera la bagasse de canne à sucre, la rafle de maïs, les sciures de bois, et autres substrats solides naturels. L'étape de mise en contact des composes volatils des HE avec le microorganisme en culture est réalisée avantageusement par passage d'un flux d'air saturé d'humidité au travers du support imprégné de HE, puis de celui sur lequel est cultivé le microorganisme. Cet air renouvelé forme l'atmosphère normale de croissance du microorganisme. Ce flux d'air est à une température de 15 à 400C et son débit de 1 à 40 l/h. Les supports pour les HE d'une part et les microorganismes d'autre part sont placés dans des compartiments distincts d'un fermenteur, communiquant, mais séparés par des éléments filtrants. Selon une disposition supplémentaire, on mesure l'effet destructeur des HE utilisées sur les microorganismes. Vis-à-vis de moisissures, on considère les effets suivants exercés par les HE : - l'effet fongistatique, c'est-à-dire leur effet inhibiteur sur la croissance (se traduisant par exemple par un ralentissement de la croissance et des modifications morphologiques), - l'effet fongicide, qui entraine une inhibition définitive de la croissance, et - l'effet sporicide, qui produit une inhibition définitive de la germination des spores (on rappelle que selon 1'AFNOR, un effet sporicide est reconnu lorsque la population de microorganismes est réduite à au moins un quart de la population initiale). Chacun de ces effets peut donc être étudié et quantifié en rapport avec la HE étudiée. On peut avoir recours à une évaluation visuelle en comparant à un temoin non traité par la HE. Cette observation est effectuée par exemple à la loupe binoculaire. Ces évaluations peuvent être également effectuées par rapport à une activité donnée significative pour le microorganisme. Avec des moisissures cellulolytiques, on peut ainsi mesurer avec avantage l'activité cellulosique en dosant la quantité de cellulases produites dans le milieu extracellulaire. Les techniques de chromatographie en phase gazeuse permettent de mesurer les quantités de C02 et de 02 respectivement produits et consommés par le microorganisme, permettant ainsi de suivre l'effet de la HE sur son développement. On a egalement recours au comptage des spores sur des échantillons prélevés à des intervalles de temps définis. La mise en oeuvre des dispositions qui précèdent, seules ou en combinaison, permet de sélectionner des HE volatiles de grande efficacité vis-àvis de ces moisissures. Les résultats obtenus montrent qu'un débit d'air à 26 C de 2x10-3m3/h sur 0,5 ml de HE permet de neutraliser 6x106 spores. Les concentrations rencontrées dans des circonstances pratiques sont de l'ordre de 103 spores/m3, ce qui permet d'envisager un traitement de 6000 m3 d'air avec cette quantité de HE. L'invention vise notamment le criblage de HE actives vis-à-vis de moisissures cellulolytiques. Elle vise en particulier le criblage de HE actives vis-à-vis de moisissures dans le groupe comprenant Aspergillus niger, Chaetomium, globosum, Myrothecium verrucaria, Paecilomyces varioti, Penicillium funiculasum, Stachyhotris atra et Trichoderma harzianum. Comme illustré par les exemples, les HE de Citronnelle et de Chénopode se révèlent particulièrement fongistatiques vis-à-vis des moisissures indiquées plus haut. De plus, la HE de Chénopode s'avère sporicide, inhibant à 100 % la germination de ces souches pendant au moins 15 jours et pour des concentrations deux fois plus faibles qu'avec la HE de Palmarosa ou la HE de girofle. Les propriétés sporicides de la HE de Chenopode n'avaient jamais été rapportées auparavant. L'application de cette HE en tant qu'agent sporicide entre donc dans le champ de l'invention. L'invention vise également une méthode pour la lutte et la prévention contre la biodétérioration par des microorganismes contaminants, moisissures ou insectes. Selon cette méthode, on fait diffuser, dans l'atmosphère d'une enceinte susceptible de renfermer des microorganismes contaminants et/ou des objets contaminés, une ou plusieurs HE, cette ou ces HE étant capables d'arrêter le développement des microorganismes ou d'entrainer leur destruction, et on récupère de l'air venant de l'enceinte afin de vérifier s'il contient des microorganismes. La ou les HE diffusent à l'intérieur de l'enceinte à traiter et agissent selon leur effet propre sur le microorganisme en suspension dans l'air ou se développant sur des surfaces. En récupérant l'air de l'enceinte, et en retenant, par exemple à l'aide d'éléments filtrants les microorganismes éventuellement présents, il est possible d'assurer un contrôle régulier de l'efficacité du traitement et de le réajuster si nécessaire. Ce contrôle peut être effectué par exemple par colorimétrie ou par examen visuel des prélèvements. Les HE actives utilisées dans cette méthode sont avantageusement sélectionnées comme décrit cidessus, ce qui permet de disposer de produits à effets hautement specifiques. La HE de Citronnelle parait particulièrement indiquée pour un traitement préventif en raison de ses remarquables propriétés fongistatiques, de leur stabilité, et de son odeur agréable. Ses propriétés répulsives contre les insectes sont également avantageuses. De plus, elle présente l'intérêt d'un faible court, étant produite industriellement. L'invention vise également des dispositifs permettant la mise en oeuvre des méthodes ci-dessus. Des dispositifs appropriés pour le criblage d'huiles essentielles actives sur des microorganismes contaminant une atmosphère de locaux, des objets ou des matériaux sont caractérisés en ce qu'ils comprennent - au moins une colonne de fermentation avec un compartiment de fermentation, destiné à renfermer un support pour la culture en phase solide des microorganismes à inoculer, - au moins un récipient ou cartouche, destiné à renfermer un support imprégné d'une ou plusieurs huiles essentielles, le ou les récipients ou cartouches communiquant avec la colonne de fermentation à travers des éléments filtrants, - des moyens d'aération amenant un flux d'air saturé d'humidité à la base des cartouches, et assurant la diffusion de la ou des HE à travers les compartiments de fermentation, et le cas échéant, - un système d'analyse d'une activité liée au développement du microorganisme, par exemple des gaz produits pendant la fermentation solide. De manière avantageuse, la colonne de fermentation comporte ladite cartouche et comprend donc deux compartiments. Les supports pour les HE et la fermentation solide sont tels que définis ci-dessus. Les éléments filtrants sont constitués par exemple par du coton et/ou du papier filtre. Les colonnes de fermentation comportent des moyens permettant d'humidifier l'air avant l'entrée dans les colonnes, par exemple les bulleurs. Le système d'analyse couplé au dispositif de diffusion de la ou des HE de fermentation solide des microorganismes est, par exemple, un chromatographe en phase gazeuse, équipé d'un four à température variable pour l'analyse des HE. Selon un autre aspect, l'invention vise également des dispositifs pour la lutte et la prévention contre des microorganismes contaminants. Ces dispositifs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent une cartouche diffusant dans une enceinte à traiter, une ou plusieurs HE, actives vis-a-vis des microorganismes contaminants, et des éléments filtrants pour retenir les microorganismes en suspension dans l'air sortant de l'enceinte. De manière avantageuse, le diffuseur comprend un compartiment renfermant la ou les HE et un autre compartiment comportant les éléments filtrants. Ce dispositif permet la diffusion de la HE ou d'un mélange de HE à l'intérieur de l'enceinte à traiter, la ou les HE agissant selon leurs effets propres sur les microorganismes en suspension dans l'air ou se développant sur des surfaces. L'air récupéré de l'enceinte est amené vers- les éléments filtrants, où les microorganismes sont retenus. Un prélèvement périodique de ces éléments permet de contrôler de manière simple l'efficacité du traitement et de l'ajuster si nécessaire. Grâce à ces dispositifs, il est possible d'étudier le comportement de microorganismes contaminants, moisissures ou insectes, dans des conditions plus proches de la réalité que les techniques classiques sur milieu gélosé ou liquide. Il est également possible de sélectionner des HE ayant des composés volatils efficaces en tant que désinfectants et, si on le souhaite, de quantifier leurs effets destructeurs à l'encontre des microorganismes. Ces dispositifs présentent de plus l'avantage d'être facilement adaptables selon les espèces de microorganismes à cultiver et les supports à utiliser. L'invention vise également l'application de ces méthodes et dispositifs pour la lutte ou la prévention contre la prolifération de microorganismes dans des locaux favorisant leur développement, en raison de conditions particulières, notamment d'humidité et/ou de chaleur. Ces dispositifs sont aisément utilisables dans des installations de conditionnement d'air et peuvent être utilisés en combinaison avec des climatiseurs. D'une manière générale ils constituent une solution aux problèmes. de désinfection et de nettoyage pour les collectivités (piscines, gymnases, écoles et autres) ou les particuliers, comme pour les industries (notamment agro-alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques) en procurant des HE spécifiques pour les problèmes posés et permettant de préserver la santé humaine comme l'environnement Parmi les diverses applications, des dispositifs et méthodes de l'invention, on citera - la vérification de l'efficacité d'huiles essentielles, seules ou en mélange, en étudiant leurs effets sur un microorganisme donné, ce qui constitue des moyens de contrôle pour les fabricants de HE - le criblage d'huiles essentielles efficaces vis-à-vis de certains champignons, par exemple dans le domaine cosmétique - la vérification de la présence de microorganismes donnés dans un milieu, et du bon fonctionnement de systèmes de décontamination utilisés, ou encore de la présence d'huiles essentielles dans un milieu, dans le cas où l'huile essentielle est utilisée pour désinfecter et décontaminer, pour effectuer notamment des contrôles de qualité ou pour les hôpitaux ou autres collectivités, - l'utilisation dans des installations de conditionnement d'air, On mesurera de plus l'intérêt d'utiliser dans ces diverses applications des HE à la place des produits chimiques habituels, compte tenu de leurs effets généralement bénéfiques sur la santé et de leurs propriétés olfactives le plus souvent agréables. Les méthodes et dispositifs de l'invention constituent en particulier une solution aux problèmes de contaminations concernant les musees, bibliothèques et archives. Leur mise en oeuvre permet en effet de disposer de moyens de lutte et de prévention par voie aérienne de grande efficacité vis-à-vis des moisissures et insectes contaminants les oeuvres d'art et les archives. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont données dans les exemples qui suivent dans lesqels il est fait référence aux figures I à 6 qui représentent respectivement, - la figure 1, un dispositif de fermentation solide couplé à un système d'analyse de gaz, - la figure 2, un dispositif selon l'invention pour le criblage d'HE, - les figures 3A à 3C, les effets de différentes HE sur A. niger, - les figures 4A à 4C, les effets sporicides de HE sur A. nimer, - les figures 5A à 5F et 6A à 6F, les effets de HE sur différents champignons cellulolytiques. A) MATERNELS ET METHODES 1) Dispositif de fermentation La figure 1 représente un dispositif de fermentation. Ce dispositif comprend des colonnes de verres désignées globalement par (I) ou fermenteurs. Elles contiennent le milieu solide (2) préalablement inoculé et sont placées dans un bain thermostaté (3). Des moyens d'aération assurent la diffusion d'un flux d'air (4) à travers les colonnes, après avoir été contrôlé par l'intermédiaire de vannes à pointeaux (5). A la sortie de la canalisation d'air à haute pression (4), l'air est humidifié dans un ballon distributeur, puis dans des bulleurs (6), situés à l'entrée des colonnes de fermentation. Le débit d'air est stabilisé en sortie de canalisation par un manodétendeur et est ajusté en sortie de chaque colonne. On applique une pression de 2 bars pour des colonnes de fermentation de 40 mm de diamètre et de 200 mm de longueur, de volume utile de 250 ml. Ce système de fermentation permet de travailler aussi bien avec un milieu solide qu'avec un milieu liquide adsorbé sur support solide. Sur la figure 2, on a représenté le dispositif selon l'invention, les colonnes de fermentation comportent deux compartiments un compartiment de fermentation (12), dans la moitié supérieure de la colonne, et un compartiment contenant le composé volatil à tester (13) dans la moitié inférieure, appelé cartouche. Ces deux parties sont séparées par des moyens filtrants (14) constitués par un disque de papier filtre et un disque de coton. On dispose avantageusement un tampon de coton au fond et en sortie de colonne (15), pour éviter les éventuelles contaminations. 2) Système d'analyse des gaz Le dispositif de fermentation est relié à un système d'analyse de la composition des gaz qui sortent des colonnes des fermentateurs. Le système comprend un chromatographe en phase gazeuse (7), un échantillonneur (8), un boiter de commande de l'injection automatique (9), un ordinateur pilotant le tout (10). Le chromatographe en phase gazeuse, ou CPG, est par exemple constitué par l'appareil IGC 11 commercialisé par DELSI. Ce chromatographe est muni d'un détecteur à catharomètre et d'un four permettant de régler, de façon isothermique, la température de la colonne et celle du détecteur. Cet appareil est utilisé en continu grâce à un injecteur automatique, couplé aux vannes (9). La colonne utilisée pour séparer les composants gazeux est une colonne concentrique du type "Alltech" CTR1. La colonne extérieure est remplie d'un support jouant le rôle de e tamis moléculaire de 5A et la colonne centrale est remplie de PorapakR, polymère poreux ne retenant que les gaz.Les conditions opératoires de la chromatographie en phase gazeuse sont les suivantes Température 60"C Phase mobile hélium Débit de l'éluant 35 ml/mn Pression de l'éluant 1 bar Tension 160 mA Volume injecté 0,3 ml Chaque gaz présente une conductivité thermique différente, il est donc nécessaire d'étalonner le détecteur avec des melanges étalon. Des courbes étalon sont établies pour chacun des gaz à mesurer (C02, 02 et N2) et les temps de rétention sont enregistrés dans le programme d'intégration de la CPG. Le système permet d'analyser la composition gazeuse en sortie des colonnes de fermentation, pour des intervalles de mesure allant de 5 mn à plusieurs heures, et ceci tout au long de la fermentation. L'air effluent des colonnes est collecté, asséché à travers une colonne de silica gel (11), puis acheminé à l'échantillonneur via un cathéter. Le programme permet de stocker l'heure de départ de l'analyse, l'heure exacte d'injection, le pourcentage de gaz dans l'échantillon, dans un fichier correspondant à la voie d'analyse considérée. Après intégration et calcul des pourcentages de gaz, on trace les cinétiques de production de C02, rapportées au débit d'aération et par gramme de matière sèche. Les calculs sont effectués comme suit 10 La vitesse instantanée (dérivée) de la production ou de la consommation des gaz (C02 ou 02) est mesurée par un échantillonnage d'un flux d'air issu d'une colonne de fermentation. Les résultats sont exprimés par rapport à la matière sèche initiale selon l'équation suivante (Gaz)* débit * 60 = ml gaz/heure/ g MSI Poids initial x % MSI Gaz : teneur en C02 ou 02 dans l'air échantilloné, exprimée en % Debit : en ml/mn ; Poids initial : en grammes % MSI : pourcentage de Matière Sèche Initiale. 2- L'accumulation ou la consommation totale des gaz peut être calculée en intégrant les données de la vitesse par la méthode des trapèzes, selon la formulation suivante (ot*Ci)+((Ci+1 = Ci)*ot*O,5) ot : intervalle de temps entre 2 analyses i et i + 1 Ci : concentration en gaz au temps i et Ci+l concentration en gaz au temps i+l La mesure directe de la production ou de la consommation totale de gaz (intégrale) est réalisée dans un volume confiné, avec recirculation d'air. Le calcul des teneurs en gaz d'effectue de la manière suivante (Gaz)* débit * 60 * V = ml gaz/heure/ g MSI Poids initial * % MSI avec V : volume total d'air en ml 3) Estimation de la viabilité des spores Prélèvement et préparation des échantillons A partir d'une colonne, on prélève 5 grammes de milieu que l'on met en suspension dans 50 ml d'eau distillée stérile (Tween 80R ; 0,1 % (v/v). Le mélange est soumis à agitation pendant 10 mn, puis filtré à travers de la gaze stérile posée sur une passoire. Le rétentat est rincé avec 50 ml d'eau distillée tweenée stérile. Le filtrat est récolté dans des pots à prélèvements stériles. Tous les calculs sont exprimés en gramme par gramme de matière sèche (g/g/MS). Pour chaque échantillon, on mesure l'humidité par différence du poids humide et du poids sec après passage au four à 1000 C. Dénombrement sur milieu gélosé, en boites de Pétri Les échantillons sont ensuite dilués au dixième, en cascade. Les dilutions intéressantes sont repiquées dans de la gélose en surfusion. On prélève 1 ml de la dilution que l'on recouvre de 20 ml de gélose, en 2 exemplaires. Après séchage, on laisse incuber dans une étuve à 25 C, jusqu'à apparition des colonies. Le nombre d'unités formant colonie (UFC) est estimé en calculant la moyenne du nombre de colonies par boite. Le milieu utilisé est du Potato Dextrose Agar (PDA) (Difco réf. 0013-01-4) contenant 250 mg/l de chloramphénicol (SIGMA, réf. C-0378) et stérilisé par autoclavage (121"C, 20 mn). Dénombrement en milieu liquide sur microplaque La viabilité des spores est estimee par la méthode du nombre le plus probable (MPN). Cette méthode de comptage statistique est couramment utilisée pour la détermination des populations bactériennes dans les échantillons d'eau ou bien en industrie agro-alimentaire. Elle consiste en une estimation du nombre le plus probable d' unités formant colonie (UFC) à partir de la mise en culture d'au moins trois tubes par dilution, d'un échantillon dont on cherche à connaitre la population microbienne viable. On associe à cette méthode, la méthode de culture miniaturisée. Le milieu de culture liquide est du Potato Dextrose Broth (PDB) (Difco réf. 0549-01-7) contenant 250 mg/l de chloramphénicol, reparti dans des tubes à raison de 9 ml par tube et stérilisé par autoclavage (121ex, 20 mn). Les dilutions décimales de l'échantillon sont directement réalisées dans ce milieu, puis réparties dans des plaques stériles de microtitration. Une même dilution est distribuée dans 12 puits, à raison de 200 pl par puits. Une microplaque correspond à un échantillon. Pour chacune, une série de 12 puis est remplie avec du milieu stérile, pour servir de témoin de stérilité. Les microplaques sont mises à incuber à 25C jusqu'à apparition nette des colonies (puits positifs). En fonction du nombre de puits positifs et des modalités d'ensemencement, on estime le nombre le plus probable d'unités formant colonie dans l'échantillon de départ. On utilise un programme informatique permettant de calculer l'intervalle de confiance du MPN pour une probabilité de 95 % (Hernandez et al., Wat. Res., 1991, vol. 25, ne 9, p 1073-1078). 4) Estimaion de l'effet fongistatique Evaluation visuelle L'évolution de la croissance de chaque échantillon est suivie chaque jour par observation de la fermentation à la loupe binoculaire. L'etat des échantillons traités avec l'huile essentielle est comparé à celui d'un témoin non traité. L'observation à la loupe binoculaire sans prélèvement, permet de suivre la croissance en périphérie de la colonne. Etant donni l1homogénéité du développement mycélien à l'intérieur des colonnes de fermentation, on peut considérer que l'observation périphérique reflète correctement les conditions de développement au centre du fermenteur. On note aisément les effets fongistatiques dès le début de la phase exponentielle de croissance. Les observations sont notees sur des fiches de suivi et affectées de coefficients. Les HE étudiées dans les expériences des exemples ayant montre un effet tout ou rien", on notera soit une croissance normale soit aucune croissance. Les coefficients correspondent au taux d'envahissement de la colonne et sont exprimés en pourcentage d' inhibition. Mesure de l'activité cellulasique Pour evaluer la croissance des souches cellulolytiques utilisées, on dose la quantité de cellulases produites dans le milieu extracellulaire. La methode de dosage utilisée est celle rapportée par MANDELS et al (1976), Biotechnol. & Bioeng. Symp., 1976, n 6, p 21-33, et étendue à la fermentation solide par ROUSSOS et al. dans Micol. Neot. Apl. 1991, ne 4, p 8398. Le substrat est la carboxyméthyl cellulose (CMC) (SIGMA, réf. C-4888). Les échantillons subissent le même traitement que celui décrit précédemment. 1 ml d'échantillon est mis en contact avec 1 ml d'une solution à 1 % (lg/100 ml) de CMC dans du tampon citrate, à pH 4,8, pendant 30 mn. On dose ensuite les sucres réducteurs par la méthode de MILLER (1959). L'activité cellulasique est calculée par différence entre la quantité de sucres réducteurs produits lors de l'incubation de 30 mn et les sucres réducteurs presents dans une série témoin (incubation de O mn). L'activité est exprimée en unités internationales (U1). Le calcul est le suivant Activité (Ul) - ((C30-C0)*103) / (30*180) C30 : concentration de glucose (g/l) au bout de 30 mn d1 incubation; C0 : concentration de glucose (g/l) au bout de O mn d'incubation 180 : masse moléculaire du glucose 5) Test d'effet résiduel Méthode AFNOR NF T 72-281 L'AFNOR préconise pour la normalisation de tout désinfectant de realiser un essai d'effet résiduel. I1 consiste à récupérer les résidus de desinfectant présents à la surface des supports (porte-germes) et de tester leur éventuel effet anti-microbien. Dans une première étape, on met en contact le support imprégné de milieu nutritif stérile, avec le désinfectant, puis on le lave avec 100 ml d'eau tweenée stérile. Dans une boite de Pétri on dépose 1 ml de la solution de rinçage et 1 ml d'une dilution de suspension de spores d'une souche normalisée. Puis 20 ml de gélose en surfusion sont coules dans la boite. On compare le nombre de colonies nl obtenu, à celui trouvé par dénombrement en gélose, sans contact avec la solution de recueil des restes du désinfectant (N). Si nl Méthode appliquée à la fermentation en milieu solide Le milieu de culture utilisé est prépare à 70 % d'humidité et autoclavé (110 C, 20 mn). Les cartouches de 1'HE à tester sont préparées et les colonnes sont remplies comme pour une fermentation normale. On réalise donc une fermentation "témoin négatif", sans aucun microorganisme. Les conditions opératoires sont identiques aux conditions d'essai avec microorganisme. Une première colonne est prélevée au bout de 48 heures, la seconde au bout de 72 heures. Les échantillons prélevés subissent le traitement décrit précédemment. On prépare I' inoculum frais des souches à tester, de taille entre 106 et 107 spores/ml. Au préalable, on prepare des tubes contenant 9 ml d'eau distillée, stérilises par autoclavage. Dans des tubes stériles, on répartit 9 ml de la solution de recueil (S). Pour chaque souche on distribue 1 mi d'inoculum dans un tube d'eau distillée et 1 ml dans un tube contenant la solution S. Après homogénéisation au vortex et contact de 5 mn, on réalise 7 dilutions au dixième de la série témoin, comme de la série S. Chaque série subit le protocole de denombrement décrit cidessus. Après incubation à 25"C, jusqu'à apparition des colonies, on lit les plaques de microtitration. Pour chaque souche, on calcule le taux de réduction entre les deux séries t = Log (UFC (témoin)) - Log (UFC (S)) Lorsque t est inferieur à 1, on considère que l'huile essentielle testée n'a aucun effet résiduel. 6) Souches Les références des souches utilisées sont les suivantes (6 souches proviennent du Laboratoire de Cryptogamie du Muséum d'Histoire Naturelle (MNHN) et sont référencées selon le catalogue de la Mycothèque du MNHN). Aspergillus niger, réf MNHN ne 48-521, origine termitière, Congo Chaetomium globosum, réf MNHN n 87-3518, origine eau polluée, Paris ; Myrothécium verrucaria, réf MNHN n 812 Paecilomyces varioti, réf MNHN n 3210, sol Guadeloupe Penicillium funiculosum, ref MNHN n0 1527, origine sol Algerie ; Stachybotris astra, réf MNHN n 3227, origine jus de pomme Trichoderma harzianum, ORSTOM réf Th 15, origine CCM F-470. 7) Milieux Milieu de conservation Les souches sont conservées sur milieu Potato Dextrose Agar (Difco, réf 0013-01-4), cultivées dans un premier temps à 30 C, puis conservées au réfrigérateur, à 4 C. Milieu de Production des spores Les spores sont produites dans des erlenmeyers de 250 ml, sur 50 ml de milieu PDA, incubés à 30 C Milieu d'étude On utilise un milieu présentant la composition suivante, en g/100 g de support sec : KH2P04, 6,25 ; (NH4)2S04, 12, 13 ; urée, 3,00 ; son de blé, 25. L'humidité initiale est de 70 %, soit 341,25 ml d'eau pour 100 g de support. Le pH initial est égal à 6. On considère comme "milieu de fermentation", le milieu liquide plus le support. Les concentrations en eau donnees incluent le support, qui est considéré comme matière sèche. Un milieu de fermentation à 50 % d'humidité est préparé, puis stérilisé par autoclavage (llO-C, 20 mn). Le volume d'eau restant pour atteindre les 70 % d'humidité, n'est incorporé au milieu que pendant l'étape d'ensemencement. 8) Mise en oeuvre de la fermentation Préparation de 1' inoculum Les spores produites en erlens sont suspendues dans de l'eau tweenée stérile (0,1 * Tween 80R). Après avoir obtenu une dilution convenable, la quantité de spores est comptée sur cellule de Malassez. Un volume d'inoculum correspondant à une population initiale de 106 spores / g MSI est dilué dans le volume d'eau nécessaire pour l'ajustement du milieu à 70 % à'humidité, Cette suspension de spores est ensuite incorporée au milieu à 50 X à l'aide d'une spatule stérile, en plusieurs fois, de manière à bien homogénéiser l'ensemencement.Les spores sont prélevées au bout de 6 jours de culture pour toutes les souches sauf pour Penicilliurn funiculosum et Chaetomium globasum (12 jours). Préparation des cartouches d'huile essentielle On utilise , comme support, la partie ligneuse de la rafle de maïs telle que commercialisée sous la dénomination Eu-Grits 40/60 par EURAMA, Perpignan. Ce support permet une répartition homogène de l'huile et sa faible granulométrie offre une surface spécifique d'échange très importante.Les propriétés physiques et la composition du Eu-Grits sont les suivantes Propriétés Humidité d'équilibre 14,0 % Absorption d'huile à saturation 100,0 % Absorption d'eau à saturation 133,0 % Cellulose 47,1 % Hemicellulose 37,3 % Pentosan 36,5 % Lignine 6,8 % Cendres 1,2 % pH intérieur 4,9 pH extérieur 7,4 Tamisage 250 #t#560 Wm Durete "Mohs" 4,5 Ce produit est stérilisé avant utilisation. Juste avant l'ensemencement du milieu de culture, on prépare les différentes cartouches d'HE. On incorpore à l'aide d'un pilon, dans un mortier, 1'HE à tester à 25 g d'Eu-Grits sec et stérile. Après homogénéisation, on ajoute 25 ml d'eau distillée stérile. Une cartouche, dans une colonne pèse 20 g (50 % d'eau) et les concentrations d'HE sont exprimées par colonne, soit pour lOg d'Eu-Grits sec. Préparation des colonnes Les colonnes sont préalablement stérilisées à l'autoclave (121-C, 20 mn) avec les disques de papier filtre et les tampons de coton. Les colonnes témoins (non traitées), sont stérilisées avec une cartouche de 20 g d'Eu-Grits à 50 % d'humidité sans huile essentielle. Les cartouches sont pesées directement dans la colonne, puis le milieu de fermentation ensemencé est réparti de façon homogène dans le compartiment de fermentation de la colonne, à raison de 20 g par colonne. Les colonnes sont ensuite placées dans le bain thermostaté à 26"C. Paramètres de fermentation Température : 26"C ; débit d'air : 35 ml/mn/colonne. Le pH n'est pas contrôlé, sa valeur initiale est voisine de 6 et elle ne descend pas en dessous de 5 au cours de la fermentation. 9. Les huiles essentielles Les huiles essentielles utilisées dans les expériences rapportées dans les exemples sont les suivantes Huile essentielle de Palmarosa, Cymbopogon martini W., lot n" 16108 ; Géraniol 82,89 % Huile essentielle de Girofle bourbon, Eugenia caryophyllus, lot n" 39395, Eugénol 82,3 % Huile essentielle de Citronnelle, Cymbopogon nardus L., lot n" 16110, Citronnella 30,4 % Huile essentielle de Chenopode Antelmicum, (non chémotypée), lot n 10025, Ascaridol 67 % Huile essentielle de Leptospermum citratum, Zaïre B) Résultats Effet des huiles essentielles de Palmarosa, Girofle, Citronnelle et Chenopode sur la croissance de 7 champignons filamenteux cellulolytiques. Dans une série d'expériences, on a étudié les effets de différentes concentrations d'HE de Palmarosa, Citronnelle et Chenopode sur l'activité cellulasique d'A:niger, cultivé en fermentation sur milieu solide, en fonction du temps de traitement. Les résultats obtenus sont rapportés respectivement sur les figures 3A à 3C où les symboles des courbes ont les significations suivantes figure 3A : 1 ml, de Palmarosa, : 2 ml et : 3 ml ; figure 3B 0,25 ml de citronnelle, : 0,50 ml et : 1,00 ml, et figure 3C : 0,25 ml de Chenopode 0,50 ml, et : 1,00 ml. Dans ces figures, la courbe : correspond à l'échantillon non traité. L'étude de ces résultats montre que les HE de Palmarosa, de Citronnelle et de Chenopode ont toutes trois un effet inhibiteur sur la croissance d'A niger, aux concentrations étudiées. Pendant les premières 24 heures de culture, la HE de Palmarosa inhibe l'activité cellulasique, ensuite la production redevient identique à celle du témoin. La HE de Chenopode inhibe la germination des spores pendant au moins 15 jours à partir d'une concentration initiale de 0,25 ml/colonne. Le même effet d'inhibition est observé pour la Citronnelle, à partir de 0,5 ml/colonne, pour une durée de 21 jours. Il est important de noter, qu'au bout de 7 jours, on ne détecte plus l'odeur de Citronnelle en sortie de colonne. Pour 0,25 ml d'HE de Citronnelle/colonne, la germination est inhibée pendant seulement 48 heures de culture. Dans une autre série d'expériences, on a étudié les effets fongistatiques sur les 6 autres champignons cellulolytiques (T. harzianum, Myr. verrucarla, Stachybotris atra, P. funiculosum, Chaet globosum et Paec, varioti). Les résultats sont donnés pour les concentrations suivantes en HE : Palmarosa : 1 ml/colonne ; Citronnelle et Chenopode 5 ml/colonne. Pour chaque souche on a préparé deux colonnes témoins, et deux colonnes par HE testée. Une colonne témoin est branchée sur le système d'analyse des gaz. Les échantillons sont relevés à 48 et 72 heures. Les souches cultivées en conditions normales ont montré des cinétiques de croissance assez semblables : phase de latence d ' d'une durée voisine de 36 heures, phase exponentielle de 12 heures, sporulation à partir de 48 heures de fermentation. Les effets des 4 HE sur la germination des spores des 6 souches, traitées séparément sont présentés dans le tableau n 1. Les résultats sont exprimés en % dtinhibition de la germination dans le fermenteur. Ils correspondent à une observation visuelle à l'oeil nu et à la loupe binoculaire sur 72 h de traitement. Aniger Chact globorum M.rerrucar@a Pacc.@artoll P funlculosum Sinchybotris aira Tharzianum Palmarosa 40 30-50 (a) 40-50 50 50 50 (a) 25-30 1 ml/col Girofle 25-30 20-25 (a) 50 30 30-50 25-30 25 (b) 1 ml/col Citronnelle 100* 100* 100 100 100* 100* 100* 0.5 ml/col Chenopode 100* 100* 100 100 100* 100* 100* 0.5 ml/col *#chantillons stables pendant 144 heures; (a): croissance plus faible que le témoin après germination; (b): pas de frontière nette entre la partic inhibée et la partie non inhibée. Les effets des HE apparaissent identiques à ceux observes sur A.niger : les HE de Chenopode et de Citronnelle inhibent totalement la germination des spores des 6 souches, alors que la HE de Palmarosa n'est pas totalement fongistatique. On observe, par ailleurs, que les quatre HE testées agissent toutes avec un large spectre, puisqu'elles montrent une activité fongistatique quasiment identique sur l'ensemble des souches. Les HE de Citronnelle et de Chenopode inhibent à 100 % la germination des spores pendant au moins 144 heures pour des concentrations 2 fois inférieures à celles de Girofle et Palmarosa. La HE de Girofle montre une inhibition moyenne de 32 % et celle de Palmarosa de 43 %. Dans encore une autre série d'expériences, on a étudié l'effet sporicide des HE. - Effet de HE de Palmarosa, Citronnelle et Chenopode sur la viabilité des spores d'A.niger. On utilise différentes concentrations en HE. Les effets obtenus en fonction du temps de traitement sont rapportés sur les figures 4A à 4C. Sur ces figures, les symboles des colonnes correspondent aux concentrations suivantes en HE : pour HE de Palmarosa, # 1 ml 03 2 ml # 3 ml, pour HE de Citronelle Ef: 0,25 ml s 0,5 ml 1 ml, et pour HE de Chenopode # 0,25 ml # 0,5 ml # 1 ml. La viabilité est estimée en Log (UFC/g de matière sèche). L'examen de ces résultats montre que seule la HE de Chenopode exerce un effet sporicide sur A.niger. Au bout de 24 heures, pour une concentration de 0,5 ml/colonne, le taux de reduction de la population t = 4. Au bout de 48 heures, pour les trois concentrations testées, toute la population, c'est-à-dire 6 x 106 spores, a disparu, soit un taux de reduction t=6. L'application du test de sporicidie à des échantillons traités avec 0,5 et 1 ml/colonne d'HE de Citronnelle pendant 21 jours ne permet pas de détecter de viabilité. L'effet sporicide de la HE de Citronnelle semble s'exercer lentement, et nécessite au moins 72 heures de traitement dans ces conditions d'expériences. A partir de ces résultats, on peut conclure que l'activité sporicide d'une HE est indépendante de son activité fongistatique alors qu'elle dépend de la concentration en HE et de la durée de traitement. - Effet des HE de Citronnelle et de Chenopode sur les 6 autres souches. Les figures 5A à 5F et 6A à 6F donnent les résultats obtenus respectivement avec la HE de Citronnelle et la HE de Chenopode. On constate que, comme pour A. niger, la HE de Chenopode est la plus sporicide, la HE de Citronnelle ne montrant pas d'effet sporicide â la concentration testée. En effet, le taux de réduction moyen observé est s 2, même après 144 heures de traitement en atmosphère contrôlée, ce qui, d'après les normes AFNOR, est insuffisant pour conclure à une action sporicide. Par contre, pour 144 heures de traitement avec 0,5 ml/colonne d'HE de Chenopode, on ne détecte plus de spores viables sauf pour deux souches : Paecylomyces varlet; et Chaetomium globosum. Dans le cas de P. varioti, le taux de réduction, calculé pour 72 heures de traitement avec 1'HE de Chenopode (t C. alobosum, on sait que les spores sont contenues dans des asques claviformes, visibles au microscope, qui les protègent, ce qui peut expliquer ce résultat. L'action sporicide de HE de Chenopode a été vérifiée en réalisant un test d'effet résiduel sur toutes les souches. Les résultats obtenus ont montré que les résidus de HE de Chenopode, n'ont aucun effet inhibiteur sur les souches repiquées : l'inhibition de la viabilité est due uniquement à la diffusion de la HE dans le fermenteur. REVENDICATIONS 1/ Méthode pour le criblage d'huiles essentielles actives vis-à-vis de microorganismes contaminants des atmosphères de locaux et/ou de leur contenu, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact des composés volatils d'une ou plusieurs huiles essentielles avec les microorganismes contaminants cultivés sur support solide, en atmosphère contrôlée dans des conditions permettant leur développement, et la sélection des huiles essentielles ayant un effet destructeur vis-à-vis de ces microorganismes. 2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les microorganismes sont cultivés en fermenteur sur un support solide élaboré à partir d'un matériau permettant la diffusion des composés volatils de la ou des huiles essentielles. 3/ Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les supports solides sont élaborés à partir de son de blé ou de bagasse de canne à sucre. 4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracterisée en ce que la culture est réalisée à la température ambiante, ou à une température voisine de l'ambiante, et que le taux d'humidite est de l'ordre de 60 à 70 %, notamment de 70%. 5/ Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la ou les huiles essentielles sont imprégnées sur un support, en un matériau inerte vis-à-vis de la ou des huiles essentielles, ce support étant avantageusement à l'état divisé. 6/ Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il est élaboré à partir de bagasse de canne à sucre ou de rafle de maïs. 7/ Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite étape de mise en contact est réalisée par passage d'un flux d'air saturé d'humidité au travers du support imprégné de HE, puis de celui sur lequel est cultivé le microorganisme. 8/ Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les supports imprégnés d'huiles essentielles d'une part et sur lesquels sont cultivés les microoganismes d'autre part sont placés dans des compartiments distincts d'un fermenteur, communiquant l'un avec l'autre, mais séparés par des éléments filtrants. 9/ Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on mesure l'effet destructeur des huiles essentielles utilisées sur les microorganismes, en particulier leurs effets fongistatiques et/ou antifongiques et/ou sporicides 10/ Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au criblage d'huiles essentielles actives vis-à-vis de moisissures cellulolytiques, en particulier du groupe comprenant Aspergillus nager, Chaetomiiini globosum, Myrothecium verrucarla, Paecilomyces varioti, Penicillium funiculosum, Stachybotris atra et Trichoderma harzianum. 11/ Méthode pour la lutte et la prévention contre des microorganismes contaminants, moisissures ou insectes, dans des atmosphères de locaux caractérisée en ce qu'on fait diffuser une ou plusieurs huiles essentielles dans l'atmosphère d'une enceinte susceptible de renfermer lesdits microorganismes et/ou contenant des objets contaminés, cette ou ces huiles essentielles étant actives vis-à-vis de ces microorganismes, et on récupère de l'air venant de l'enceinte aux fins de vérification de la présence éventuelle de microorganismes. 12/ Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que les HE actives sont sélectionnées selon la méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 10. 13/ Méthode selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'on fait diffuser de l'huile essentielle de Citronelle ou de l'huile essentielle de Chenopode dans le cas d'une contamination par les moisissures cellulolytiques indiquées dans la revendication 10. 14/ Application de l'huile de Chenopode en tant qu'agent sporicide. 15/ Dispositifs pour le criblage d'huiles essentielles actives sur des microorganismes, moisissures et insectes, contaminant des atmosphères de locaux et/ou leur contenu, caractérisés en ce qu'ils comprennent - au moins une colonne de fermentation (2) avec un compartiment de fermentation destiné à renfermer un support pour la culture en phase solide des microorganismes à inoculer, - au moins un récipient (3) ou cartouche, destiné à renfermer un support imprégné d'une ou plusieurs huiles essentielles, le ou les récipients ou cartouches communiquant avec la colonne de fermentation à travers des éléments filtrants (4), - des moyens d'aération amenant un flux d'air saturé d'humidité à la base de la ou des cartouches, et assurant la diffusion de la ou des HE à travers les compartiments de fermentation, et le cas échéant, - un système d'analyse d'une activité liée au développement du microorganisme, notamment des gaz produits pendant la fermentation solide. 16/ Dispositifs selon la revendication 12, caractérisée en ce que la colonne de fermentation comporte le compartiment de fermentation (2) et la cartouche (3). 17/ Dispositifs selon la revendication 15 ou 16, caractérisés en ce qu'ils comportent des moyens pour humidifier l'air avant l'entrée dans les colonnes, par exemple bulleurs (7). 18/ Dispositifs pour la lutte et la prévention contre des microorganismes contaminants des atmosphères de locaux et/ou leur contenu, carctérisés en ce qu'ils comprennent une cartouche diffusant dans une enceinte à traiter, une ou plusieurs HE, actives vis-a-vis des microorganismes contaminants, et des éléments filtrants pour retenir les microorganismes en suspension dans l'air sortant de l'enceinte. 19/ Dispositifs selon la revendication 18, caractérisés en ce que le diffuseur comprend un compartiment renfermant la ou les HE et un autre compartiment comportant les éléments filtrants. 20/ Applications des méthodes et dispositifs selon l'une des revendications 11 å 13, 18 et 19 à la désinfection de locaux et/ou d'objets, produits ou matériaux. 21/ Application selon la revendication 20 à la .lutte et la prévention contre la biodétérioration d'objets de collections dans les musées, archives et bibliothèques. 22/ Application selon la revendication 20 ou 21, dans des installations de conditionnement d'air.