Brevet FR2727866A1 — publié le 19960614

La présente invention concerne un procédé pour produire une superovulation chez les bovins. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé pour établir la superovulation à un niveau plus élevé et régulier, afin de recueillir efficacement, des embryons normaux. La présente invention concerne également un procédé de reproduction des bovins, dans lequel un nombre significativement élevé d'ovules ou d'embryons peut être recueilli lorsqu'une vache ayant un nombre accru de follicules ovariens réagissant à une hormone folliculo-stimulante qui sera injectée au cours d'un traitement de superovulation est produite et soumise au traitement de superovulation. Les animaux sont classés en deux catégories, à savoir les animaux unipares (par exemple la vache, la jument et la femme) qui donnent naissance à un seul petit par portée et les animaux multipares (par exemple la truie et la chienne qui mettent bas plusieurs petits par portée. On considère que le nombre d'ovulations est contrôlé par des hormones issues du système hypothalamus-hypophyse-gonades. Afin de recueillir le plus possible d'embryons de la vache, qui est un animal unipare, il a été fait appel à la technique de la superovulation pour provoquer l'ovulation d'ovules multiples. Le procédé usuel de superovulation pour les bovins comprend l'injection d'une hormone exogène C hormone folliculo-stimulante (FSH) porcine ou gonadotropine chorionique équine (eCG; autrefois appelée gonadotropine de sérum de jument gravide)1, C'est-à-dire que le procédé d'induction de superovulation dans la technique de transfert des embryons s'est largement répandu comme technique pour une reproduction bovine efficace.Le traitement de superovulation chez le bail peut être effectué par injection d'hormone folliculo-stimulante au 9ème - 13ème jour du cycle oestral afin de provoquer le développement d'un grand nombre de follicules ovariens, et par injection de prostaglandine F2a 48 à 6O heures après l'injection d'hormone folliculo-stimulante afin de déclencher la lutéolyse des corps jaunes existants. La lutéolyse conduit à l'ovulation par suppression de l'effet inhibiteur de la progestérone sur l'action de l'hypothalamus et de l'hypophyse. D'autre part, il a été signalé que l'inhibition immunologique de l'inhibine, qui supprime la sécrétion d'hormone folliculo-stimulante par l'hypophyse des bovins, accélère la sécrétion d'hormone folliculostimulante par l'hypophyse et, en conséquence, permet le développement de follicules ovariens et l'ovulation d'ovules multiples. L'inhibine est une hormone peptidique qui est sécrétée dans les testicules ou les follicules ovariens et qui supprime la production et la sécrétion de FSH dans l'hypophyse. Dans les années 1980, le développement rapide du génie génétique a révélé peu à peu l'aspect complet et l'action de l'inhibine, dont l'existence et a structure n'avaient pas été élucidées. I1 se révèle que, chez les vaches matures, l'inhibine supprime spécifiquement la sécrétion de FHS par l'hypophyse. Si un contrôle inhibitoire de l'inhibine est possible chez la vache, la sécrétion de FSH endogène est accélérée. En conséquence, on peut s'attendre à ce que l'ovulation d'ovules multiples puisse être provoquée dans chaque cycle oestral.Au cours de ces dernières années, des tentatives actives ont été faites sur des brebis et des vaches pour supprimer l'inhibine par immunisation et, de la sorte, augmenter le nombre d'ovules ovulés. Toutefois, lorsque le procédé classique de superovulation, comprenant l'injection de FSH ou d'eCG, est utilise, on observe, d'un traitement ou d'une vache à l'autre, une grande variation du nombre de follicules ovariens réagissant à l'hormone. Cette variation est l'un des problèmes maJeurs dans la technique, car il est difficile de recueillir des embryons å un niveau plus élevé et régulier, avec une excellente qualité, sur des vaches que l'on peut qualifier de donneuses supérieures et qui ont une excellente nature génétique, qu'elles soient laitières ou de boucherie. En conséquence, cette variation accroît les frais de production par embryon. On pourrait donc tirer certainement un avantage économique considérable, dans la technique de transfert d'embryons bovins, si l'on pouvait produire des vaches qui réagissent à un niveau plus élevé et régulier au traitement de superovulation, en élucidant la relation entre la sensibilité à la superovulation et l'état des follicules ovariens ou les hormones impliquées dans le développement folliculaire, et en appliquant un traitement déterminé. I1 a été signalé qu'il existe une corrélation positive entre le nombre de follicules ovariens ayant un diamètre de 4 à 6 mm à l'instauration du traitement de superovulatlon et le nombre d' ovules ovulés lors de la superovulation (Romero, A. , Albert, J. , Brink, Z. et Seider, G.E. Jr., Theriogenology, 35, 265 (abrégé) 1991). I1 a également été signalé que le nombre d'ovules ovulés décroît lorsque le traitement de superovulation est exécuté dans la phase lutéale dans laquelle des follicules dominants fonctionnels sont présents (Guilbaut, LA. , Grasso, F., Lussier, J.G. , Rouillier, P. et Maton, P., J. Reprod. rertil., 9L, 81-89, 1991; Huhtinen, M. , Raino, V. Analto, J. , Bredbacka, P. et Maki-Tanila, A., Theriogenology, 37, 457-46:3, 1992). En outre, il a été signalé que la sécrétion d'inhibine augmente avec le développement folliculaire (Martin, T.L., Fovwell, R.L. et Ireland, J.J., Biology of Reproduction, 44, 693-700, 1991). Récemment, les auteurs de la présente invention ont découvert que le nombre de follicules dénombrés était augmenté par la vaccination d'une vache contre l'inhibine.Bien qu'il n'ait pas encore été mis en lumière un processus par lequel les follicules dominants ont une influence sur la réponse au traitement de superovulation, les publications précitées suggèrent la séquence causale suivante: présence des follicules dominants o accélération de la sécrétion d'inhibine diminution du nombre de follicules dénombrés @ abaissement de la réponse au traitement de superovulation. Adoptant un point de vue nouveau, les auteurs de la présente invention ont découvert que le nombre d'ovules ovulés est augmenté de façon significative lorsqu'une vache mature, vaccinée contre l'inhibine afin qu'elle ait un nombre accru de follicules ovariens d'un diamètre de 4 à 6 mm, est soumise au traitement de superovulation classique. Lorsque cette technique est appliquée, la sécrétion d'hormone folliculo-stumulante endogène est accélérée. En conséquence, il n'est pas produit d'anticorps anti-hormone folliculo-stimulante par répétition du traitement, ce qui fait qu'il n'y a pas à craindre une diminution de l'effet. L'invention fournit donc un procédé pour produire une superovulation chez les bovins, comprenant les opérations consistant à vacciner une vache contre l'inhibine présente dans son organisme pour y produire des anticorps, puis à injecter une hormone folliculostimulante exogène ainsi qu'un procédé pour l'ovulation d'un nombre significativement grand d'ovules chez les bovins, comprenant les opérations consistant à soumettre une vache, vaccinée contre l'inhibine, à un traitement de superovulation usuel par injection d'hormone folliculo-stimulante à la vache au 9ème - 13ème jour de la phase lutéale ou après 7 à 12 jours de présence d'une préparation d'hormone du corps Jaune dans le corps de la vache, inJection d'une préparation lutéolytique ou élimination de la préparation d'hormone du corps jaune 2 ou 3 jours après l'injection et, de la sorte, déclenchement du rut. La fig. 1 illustre la variation du titre d'anticorps anti-inhibine causée par la vaccination contre 1' inhibine. La présente invention est illustrée ci-après en détail par un exemple. Sxempleî Les expériences suivantes ont été menées pour compter les ovules ovulés par des vaches soumises à un traitement de superovulation après immunisation contre 1' inhibine. 1. Méthode expérimentale (1) L'expérience 1 et l'expérience 2 ont été menées. - Expérience 1 Cinq vaches n'ayant pas mis bas plusieurs fois (Holstein) ont été utilIsées pour confirmer les variations du titre d'anticorps anti-inhibine et du nombre de follicules dénombrés, produites par la vaccination contre l'inhibine. - Expérience 2 On a utilisé 30 vaches (Holstein et Japanese Black) pour étudier l'influence de la vaccination contre l'inhibine sur le résultat du traitement de superovulation. Cinq vaches Holstein primipares et 9 vaches Japanese Black ayant mis bas plusieurs fois ont été vaccinées contre l'inhibine, puis soumises à une superovulation par utilisation de FSH suivant un procédé usuel. A titre de témoins, 5 vaches Holstein primipares et il vaches Japanese Black ayant mis bas plusieurs fois ont été soumises au traitement de superovulation sans vaccination contre l'inhibine. Ces groupes ont été comparés en ce qui concerne le nombre d'ovules recueillis. (2) Antigéne Produit obtenu par conjugaison de sérumalbumine de lapin à un polypeptide synthétisé en copiant la séquence d'acides aminés des positions 1 à 26 (en numérotant à partir de l'extrémité N-terminale) de la sous-unité a d'inhibine porcine. (3) Animaux expérimentaux Vaches Holstein primipares et Japanese Black ayant mis bas plusieurs fois et ayant des cycles oestraux normaux. (4) Méthode d'immunisation On a pratiqué une vaccination. La première injection a été effectuée de la manière suivante: un mélange de 1 mg du peptide (correspondant à un fragment d'inhibine) et d'adjuvant de Freund complet a été injecté à chaque animal expérimental par voie sous-cutanée en 3 à 4 endroits. 8 semaines et 15 semaines après la première injection, des injections de rappel du peptide ont été pratiquées à oraison de 0,5 mg, , de façon semblable à l'injection décrite ci-dessus. (5) Hormone folliculo-stumulante Extrait d'hypophyse (6) Substance chimique lutéolytique Cloprosténol. (7) Traitement de superovulation Le traitement de superovulation a débuté par l'injection de FHS au 10ème - 12ème jour du cycle oestral. La FHS a été injectée par voie intramusculaire 6 fois à intervalles de 12 h, aux doses dégressives suivantes: 6, 6, 5, 5, 3 et 3 mg. 48 h après le début des injections de FHS, 750 Klg de cloprostênol ont été injectés par voie intramusculaire. Les animaux présentant un oestrus ont été inséminés artificiellement à deux reprises pendant l'oestrus. (8) Détermination du nombre d'ovules ovule et d'embryons recueillis Au 7ème - 8ème jour de rut après le traitement de superovulation, des embryons ont été recueillis non chirurgicalement dans l'utérus. Le nombre des embryons recueillis, le nombre des embryons normaux et le pourcentage des embryons normaux ont été déterminés. 2. Résultats Dans cette étude, la vaccination contre l'inhibine a donné lieu avec succès à une élévation des titres d'anticorps anti-inhibine. Avec l'élévation des titres d'anticorps, le nombre de follicules dénombrés (de 5à 10 mm de diamètre) a manifesté une tendance a augmenter. Avec cette augmentation du nombre de follicules dénombrés, liée à une élévation des titres d'anticorps anti-inhibine, le traitement de superovulation appliqué aux vaches a augmenté le nombre d'ovules et d'embryons recueillis, sans baisse du pourcentage d'embryons normaux. Variation du nombre de follicules dénombrés pendant la vaccination contre l'inhibine Tableau 1,- Nonbre de follicules de 5 à 10 @@ de dia@ètre Se@aines après Vacne le cébut de la 0 3 6 10 13 18 21 27 29 trattée vaccination Preatère Pre@ier Second Traitement injection rappel rappel 530 2 6 2 8 1 6 7 1 5 534 3 3 4 2 5 5 8 6 8 13 536 1 6 3 12 2 6 5 7 4 537 4 8 4 9 3 10 11 13 8 539 t 7 4 14 3 9 9 10 10 Moyenne i E.T. 3,2# 6,2# 3,0# 9,5# 2,8# 7,8# 7,6# 7,8# 8,0# 1,0 1,3 0,9 3,1 1,3 1,6 2,2 4,0 3,3 D'après les résultats présentés dans le tableau 1, on peut voir que le nombre de follicules dénombrés ayant un diamètre de 5 à 10 min a manifesté une tendance à augmenter apres la première injection et les rappels. Amélioration de la réponse au traitement de superovulation, produite par l'immunisation contre l'inhibine Tableau 2.- Résultats de la superovulation et de la collecte d'embryons Résultats de la superovulation et de la collecte d'embryons Groupe Nombre Nombre + Nombre t Pourcentage de d'ovules/ d'embryons d'embryons vaches embryons normaux normaux recueillis (a) (b) (b/axlOO) Témoin 14 5,9#4,1@ 3,7#3,5@ 62,7 Expéri- 16 12,9#6,8@ 8,9#4,0@ 69,0 mental L'exposant p indique qu'il y a une différence significative (p ( 0,01) dans la colonne en question test T de Student). # moyenne # E.T. (écart-type) Le traitement de superovulation a donné lieu a un nombre augmenté, tant des embryons recueillis que des embryons normaux dans le groupe immunisé contre l'inhibine, en comparaison du groupe non traité (témoin). REVENDICATIONS 1.- Procédé pour produire une superovulation chez les bovins, comprenant les opérations consistant à vacciner une vache contre 1 Inhlbine présente dans son organisme pour y produire des anticorps, puis à injecter une hormone folliculo-stimulante exogène. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hormone folliculo-stimulante est la folliculostimuline (FSH) ou la gonadotropine chorionique équine (eCG). 3.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la vache est une vache laitière ou de boucherie qui a des cycles oestraux normaux après la maturité. 4.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la vaccination contre l'inhibine est effectuée en utilisant, comme antigène, un produit obtenu en fixant de l'albumine à un polypeptide synthétisé en copiant la séquence d'acides aminés des positions 1 à 26 (numérotées à partir de l'extrémité N-terminale? de la sous-unité a de l'inhiblne porcine ou bovine, et en injectant un mélange de l'antigène et d'un adjuvant à la vache, plusieurs fois par voie sous-cutanée. 5.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la vaccination contre l'inhibine est effectuée par injection de l'antigène. 6.- Procédé pour ''ovulation d'un nombre significativement grand d'ovules chez les bovins, comprenant les opérations consistant à soumettre une vache, vaccinée contre l'inhlbine, à un traitement de supercvulation usuel par injectIon d'hormone folliculostimulante à la vache au 9ème - 13ème jour de la phase lutéale ou après 7 à 12 jours de présence d'une préparation d'hormone du corps @ aune dans le corps de la vache, injection d'une préparation lutéolytique ou élimination de la préparation d'hormone du corps jaune 2 ou 3 jours après i' iniection et, de la sorte, déclenchement du rut. 7.- Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'antigène utilisé pour la vaccination est de l'inhibine bovine ou porcine naturelle (extraite), un fragment d'inhibine synthétisé ou une inhibine copiée.