Brevet FR2729972A1 — publié le 19960802

La présente invention concerne l'extraction des protéines recombinées produites par des microorganismes procaryotes, en particulier par E. Coli. On fait de plus en plus appel aux techniques de génie génétique pour la production de protéines d'intérêt, telles que par exemple l'insuline, les interleukines, l'hormone de croissance, etc. Généralement le microorganisme est transformé par un vecteur d'expression comportant un gène codant pour la protéine d'intérêt et des moyens nécessaires à son expression, tels que les signaux de régulation. Ensuite le microorganisme est cultivé sur un milieu de culture approprié et suivant des paramètres de culture appropriés et lorsqu'un nombre suffisant de cellules de microorganismes a été atteint, I'addition d'un inducteur déclenche la phase dite d'expression au cours de laquelle la protéine recherchée est produite à haut niveau et s'accumule. En fin de culture les cellules en suspension sont séparées du milieu de culture, par exemple par centrifugation ou microfiltration, puis sont soumises à un procédé d'extraction qui commence fréquemment par une opération de cassage des parois des microorganismes. L'expression d'un gène codant pour une protéine d'intérêt dans un microorganisme procaryote peut être cytoplasmique, périplasmique ou sécrétoire selon la nature des moyens d'expression mis en oeuvre avec ledit gène (promoteur, terminateur, site de fixation des ribosomes, peptide-signal, etc.). L'expression cytoplasmique permet d'obtenir des quantités importantes de protéines. Toutefois, préalablement à l'extraction de la protéine d'intérêt, il est nécessaire pour les protéines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures de procéder à une étape de dénaturation/renaturation, ce qui représente une étape particulièrement lourde et délicate lors de la production à l'échelle industrielle. L'étape de dénaturation/renaturation est réalisée selon des moyens classiques bien connus de l'homme du métier, en utilisant un agent de dénaturation en présence d'un agent réducteur, puis des conditions de renaturation comprenant notamment un contrôle du redox de la solution. Parmi les agents dénaturants utilisés il faut surtout citer le chlorhydrate de guanidine qui a été proposé dans un procédé d'obtention de l'interleukine-2 humaine. A cet effet, on peut se référer par exemple au document EP-A2-0 145 390. Les systèmes d'expression sécrétoires dans lesquels la protéine d'intérêt se retrouve dans le milieu de culture de manière active sont peu ou pas utilisés avec les bactéries Gram négatives en raison de leur faible productivité. Il faut remarquer ici que le milieu d'une culture bactérienne à forte densité dans un bioréacteur n'est pas un lieu de séjour idéal pour des protéines recombinées sensibles en raison par exemple des risques de dénaturation interfaciale. L'expression périplasmique permet d'obtenir directement des protéines recombinées en principe correctement repliées dans un espace protégé de l'environnement et de ce fait représente un choix judicieux pour l'obtention des protéines, notamment des protéines non glycosylées. Dans ce cas, il n'est donc pas nécessaire de soumettre les protéines à une étape de dénaturation- renaturation. Les méthodes de cassage des cellules généralement utilisées dans ce domaine sont par exemple la lyse des cellules par sonication ou par pression (French Pressure cell), la lyse chimique ou la lyse enzymatique, le choc osmotique et le traitement à l'aide d'agents chaotropiques ou de détergents. Les difficultés rencontrées au cours des opérations d'extraction varient selon le type d'expression et les méthodes d'extraction utilisées et sont notamment: - la perte en rendement de la protéine recombinée - la perte d'activité biologique de la protéine recombinée - la dégradation protéolytique de la protéine recombinée - la toxicité des agents d'extraction et le contrôle obligatoire de leur élimination - la difficulté de mise en oeuvre industrielle - le mélange des protéines périplasmiques avec les protéines cytoplasmiques. De plus, lorsque les protéines d'intérêt produites sont hydrophobes, elles s'associent à des composants cellulaires qui sont eux-mêmes hydrophobes, ce qui rend l'extraction particulièrement difficile. La production industrielle de protéines recombinées d'intérêt par génie génétique représente un enjeu considérable, mais nécessite la mise au point de méthodes d'extraction qui évitent ou minimisent les inconvénients cidessus. En effet, il est non seulement important de produire des quantités importantes de protéine d'intérêt, mais encore faut-il que ces protéines ne soient pas contaminées par les agents d'extraction et conservent toute leur activité biologique. Différents procédés ont été proposés à cet effet, en particulier pour l'interleukine-2. Le document EP-A2-0 145 390 décrit un procédé pour l'obtention d'interleukine-2 (IL-2) non glycosylée humaine ayant une activité spécifique supérieure à 104 U/mg qui met en oeuvre une étape de séparation par chromatographie sur colonne pour extraire l'IL-2. Ce procédé fait également intervenir une étape de dénaturation à l'aide du chlorhydrate de guanidine. Le document EP-A2-0 147 819 propose un procédé d'obtention d'interleukine-2 recombinante homogène et pure. Ce procédé consiste à cultiver un microorganisme transformé à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour l'interleukine-2, à provoquer la lyse des cellules, à récupérer les débris cellulaires, à extraire l'IL-2 par lavage des débris cellulaires avec une solution de lavage appropriée, puis à purifier par chromatographie la solution de lavage. Les solutions de lavage utilisees peuvent contenir un sel, tel que le chlorure de sodium ou le chlorhydrate de guanidine, ou un détergent, tel que par exemple le produit connu sous la dénomination commerciale 'Triton X -100". Selon une variante préférée, on préconise la mise en oeuvre successive de trois solutions de lavage à savoir: une solution de lavage contenant du chlorure de sodium, une solution de lavage contenant un détergent et une solution contenant du chlorhydrate de guanidine. Le document EP-A1 -0 337 243 décrit un procédé pour purifier l'interleukine-2 humaine qui utilise un système de deux colonnes de chromatographie liquide en phase inverse. Avant l'étape de purification par chromatographie, la fraction insoluble du lysat de cellules bactériennes est extraite avec une solution contenant du chlorhydrate de guanidine pour obtenir un extrait bactérien, lequel est ensuite dilué à l'aide d'un tampon exempt de chlorhydrate de guanidine puis chromatographié, l'élution étant réalisée avec un gradient d'acétonitrile. On a maintenant trouvé de façon surprenante que l'extraction d'une protéine d'intérêt produite par un microorganisme procaryote, transformé par un vecteur d'expression comportant un gène codant pour la protéine d'intérêt et des moyens pour son expression, tels que les signaux de régulation nécessaires à son expression périplasmique, peut être réalisée par mise en suspension du culot de cellules du microorganisme, provenant de la culture dudit microorganisme, dans une solution tampon, ladite solution contenant avantageusement de larginine. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de l'arginine comme agent d'extraction des protéines périplasmiques. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'extraction d'une protéine d'intérêt péririplasmique qui consiste: 1/ à mettre en suspension le culot de cellules provenant de la culture d'un microorganisme transformé par un vecteur d'expression comportant un gène codant pour ladite protéine et tous les signaux de régulation nécessaires à son expression périplasmique dans une solution tampon contenant de l'arginine et après un temps de contact dans des conditions de pH, de température, de concentration bactérienne etc...; adéquates; 2/ à récupérer la protéine d'intérêt dans le surnageant de la suspension bactérienne ainsi obtenue. L'extraction des protéines périplasmiques est particulièrement efficace quand le tampon d'extraction est constitué par une solution aqueuse d'arginine à la concentration de 0,4 à 0,8 M d'arginine (limite de solubilité de l'arginine dans l'eau à température ambiante) et que son pH est ajusté autour de 8. L'arginine est un acide aminé naturel qui a été proposé comme agent auxiliaire de dénaturatiorVn/renaturation/substitution de deux chaînes de l'Abbokinase (activateur urinaire du plasminogène) dans lequel un peptide natif est remplacé partiellement par un peptide synthétique au cours de cette opération. A cet effet, on peut se référer à l'article de GA Homandberg et T. Wai dans Biochimica et Biophysica Acta, 1038, 1990, 209-215. Dans le procédé de l'invention, on ne procède pas à la dénaturation/renaturation de la protéine et l'arginine intervient uniquement au niveau de l'extraction d'une protéine à partir d'un culot de cellules de microorganismes. L'arginine procure des effets remarquables sur l'extraction de la protéine tant au niveau du rendement que de l'activité biologique de la protéine. On a en effet trouvé que, par exemple, la forme mature de 'I'L-13 est récupérée avec le procédé de l'invention avec des rendements supérieurs à 95 % tout en conservant l'activité biologique de celle-ci. Il faut noter que des essais d'extraction par choc osmotique sur le même système d'expression n'aboutissent pas à des rendements comparables. Des essais comparatifs ont montré que la guanidine.HCI utilisée dans les mêmes conditions permet aussi de récupérer la protéine IL-13 avec un rendement supérieur à 95%, par contre l'activité biologique de la protéine ainsi récupérée est altérée d'avantage que par la méthode à l'arginine. Sans vouloir se limiter à une quelconque théorie, on pense que l'arginine agit comme un agent choatropique doux et biologique par opposition aux agents chaotropiques puissants et dénaturants aux concentrations élevées nécessaires, égales ou supérieures à 5 M, pour assurer l'extraction, tel que le chlorhydrate de guanidine. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à la suite d'un procédé quelconque de culture d'un microorganisme transformé avec un vecteur d'expression contenant un gène codant pour la protéine d'intérêt, et des moyens pour une expression périplasmique de ladite protéine, tels que tous les signaux de régulation nécessaires. Il est évident pour l'homme du métier que la méthode est applicable aux bactéries proches de E.coli, c'est-à-dire aux bactéries dites Gram négatives anaérobies facultatives constituant le groupe des Entérobactéries. Dans cette famille des Entérobactéries on peut citer en particulier les espèces: Escherichia, Salmonella, Erwinia mais aussi Shigella, Klebsiella, Serratia, Proteus et Enterobacter. Compte-tenu du caractère chaotropique de l'arginine il apparaît également que l'arginine peut selon les cas se substituer avantageusement à d'autres agents chaotropiques. Sans pouvoir exemplifier sur toutes les familles de bactéries en raison de la diversité des systèmes vivants en cause, I'homme du métier saura appliquer et adapter la méthode d'extraction à l'arginine à son cas particulier. s De tels procédés de culture sont bien connus de l'homme du métier. Des procédés décrivant la culture de bactéries Gram négatives en fermenteur sont décrits par exemple dans le brevet EP- 360641 et EP-356335 relatant l'obtention et l'utilisation d'une souche E.coli dite SEBR 1250. Lorsque le nombre de cellules désiré a été atteint, la culture est centrifugée ou microfiltrée pour récupérer les cellules et extraire la protéine d'intérêt. La biomasse ainsi récupérée est mise en contact avec une solution tampon contenant de l'arginine selon le procédé de l'invention. En général, le milieu de culture est soumis à une centrifugation et le culot de centrifugation obtenu est mis en contact avec une solution tampon contenant de l'arginine selon le procédé de l'invention. En général on opère à une température comprise entre la température ambiante d'environ 25 C et 2'C, de préférence à 4'C. Le temps de contact du culot de cellules avec la solution tampon contenant de l'arginine doit être suffisant pour permettre le passage de la protéine d'intérêt dans la solution tampon. En général, lorsqu'on opère à 4C, le temps de contact est avantageusement de 1 heure environ. L'extraction, c'est-à-dire le passage de la protéine périplasmique dans le milieu, se poursuit au cours de la mise en contact de la biomasse et du tampon d'extraction à l'arginine. Le temps de contact assurant une extraction complète ou n'évoluant plus est comprise entre 30 minutes et 16 heures. Des essais montrent que des rendements d'extraction satisfaisants peuvent être obtenus en l'espace de quelques heures à la température de 4 C. Il a été noté également qu'une agitation douce de la biomasse dans son tampon d'extraction de manière à éviter la sédimentation du culot de microorganismes donne des résultats supérieurs, c'est-à-dire des taux d'extraction plus élevés en fonction du temps. Le procédé d'extraction selon l'invention convient pour extraire aussi bien les protéines hydrophobes, telles que par exemple les interleukines, en particulier l'IL-13 décrite dans le document EP-A1-0 506 574, que les protéines hydrophiles, telles que par exemple l'hormone de croissance (hGH). Le procédé de l'invention simplifie l'obtention de l'hGH qui nécessite normalement pour son extraction la mise en oeuvre d'un choc osmotique. Par ailleurs, on a trouvé que l'arginine exerce un effet bénéfique considérable sur les rendements en protéine recombinée périplasmique si elle est ajoutée à des concentrations adaptées dans le milieu de culture. Ainsi, selon un autre aspect la présente invention a pour objet l'utilisation de l'arginine comme agent favorisant l'expression des protéines périplasmiques. L'invention concemrne également un procédé de culture d'un microorganisme procaryote transformé à l'aide d'un vecteur d'expression contenant un gène codant pour une protéine d'intérêt, qui consiste à cultiver ledit microorganisme en présence d'arginine. Dans ce procédé de culture, I'arginine doit être présente à des concentrations supérieures à 2 g/I, de préférence à 8 g/I dans le milieu de culture, sachant que l'homme du métier optimisera cette concentration en arginine au cas par cas. Ce procédé est particulièrement approprié pour la production de protéines à activité de type cytokine, en particulier l'IL-13, telle que décrite dans le document EP-A1 -0 506 574. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide des EXEMPLES ci-après donnés uniquement à titre illustratif. EXEMPLE 1 Extraction de l'IL-13 périplasmique de E.coli en présence d'arginine 1/ culture en fiole: Dans cet exemple, on a utilisé la souche E.Coli RB 791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981) p. 4204-4208) transformée par le plasmide p922 obtenu selon des procedés analogues à ceux définis dans les brevets EP 360 641 et 356 335 et dont la séquence d'ADN est la séquence SEQ ID No.1. Les différentes séquences qui constituent ce plasmide p922 sont indiquées ci-après. SEQUENCE DU PROMOTEUR Les hexanucléotides TTGCTT et TATAAT caractéristiques des promoteurs chez E.coli sont indiqués en caractère gras Xhol 1 TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC 51 ATCTCGACTG CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA 101 AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC 151 TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGT TITTTGCGCCG ACATCATAAC -35 201 GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA CTGACTGTTG -10 251 CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GG SEQUENCE DE LA REGION 5 PRIME NON TRADUITE DU MESSAGER Le site de fixation au ribosome est indiquée en caractère gras. La sequence CAT située à 1'extrèmité 3 prime de cette séquence est une partie de l'héxanucléotide reconnu par l'enzyme de restriction Nde 1 RBS 283 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTTCGCGAA GAAGGAGATA 333 TACAT SEQUENCE CODANT POUR LE PRECURSEUR DE L' IL13 La séquence en italique correspond à la séquence de l'IL-13 mature. La séquence qui n'est pas en caractère gras est une séquence de liaison liant la fin de la séquence codant pour l ' IL-13 & l'héxanucléotide reconnu par l'enzyme de restriction BamHI 338 ATGAAAAAGA TCrWrr AGCTGCGCITG ACTACCGTTG TA'rTCrGC 388 GCCGCTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCCTC AGGGAGCTCA 438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGGCTCC GCTCTGCAAT 488 GGCAGCATGG TATGGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC 538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTGCCATC GAGAAGACCC 588 AGAGGATGCT GAGCGGATTC TGCCCGCACA AGGTCTCAGC TGGGCAGTTT 638 TCCAGCTTGC ATGTCCGAGA CACCAAAATC GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA 688 GGACCTGCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCGCGAGGGA CGGTTCAACT 738 GAAACITCGA AAGCATCATT ATTTG SEQUENCES DE TERMINAISON 763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA TERMINATEUR DU GENE 10 DU PHAGE T7 813 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCITTG GGGCCTCTAA ACGGGTCTTG Hind3 863 AGGGGIT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTrGG 913 CCGGATCAAA GTTGTCGT CrTTCCAGAC GTTAGTAAAT GAATTTTCTG 963 TATGAGGTTT TGCTAAACAA CTTTCAACAG TTTCAGCGGA GTGAGAATAG TERMINATEUR DU PHAGE fd 1013 AAAGGAACAA CTAAAGGAAT TGCGAATAAT AATITrTCA CGTTGAAAAT 1063 CTCCAAAAAA AAAGGCTCCA AAAGGAGCCT TTAATTGTAT CGGTTTATCA 1113 GCTTGCTTTC GAGGTGAATT TCTrAAACAG CTTGATACCG ATAG'TTGCGC 1163 CGACAATGAC AACAACCATC GCCCACGCAT AACCGATATA TCGGTCGCTG 1213 AGGCTTGCAG GGAGTCAAAG GCCGCTITTTG CGGGATCGAT GENE CODANT POUR LE REPRESSEUR DE L' OPERON LACTOSE Sac2 1254 CCGCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC 1304 TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG 1354 TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTr 1404 GCGTATTGGG CGCCAGGGTG G'TTITC=TT TCACCAGTGA GACGGGCAAC 1454 AGCTGATTGC CCTTCACCGC CTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTrC 1504 CACGCTGGTT TGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGITTGCTG GTGGTAACG 1554 GCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCC CACTACCGAG 1604 ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCG GTAATGGCGC GCATTGCGCC 1654 CAGCGCCATC TGATCGTTGG CAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT 1704 CATTCAGCAT TTGCATGGTT TG'ITTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCG 1754 CCTTCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATrGA TTGCGAGTGA GATATTATG 1804 CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA 1854 ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT 1904 CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAATAATA CTG'TTGATGG GTGTCTGGTC 1954 AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG 2004 CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG 2054 CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGG CT CGACGCCGCT 2104 TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG 2154 ATrAATCGC CGCGACAAMT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG 2204 GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC 2254 GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTrTTTCCC 2304 GCGTITrCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC 2354 TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT 2404 CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGCGCTAT CATGCCATAC 2454 CGCGAAAGGT =TTGCGCCAT TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGCCGCA 2504 AA SEQUENCE DE pBR 327 Pflml 2506 CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC 2556 ACGCGGCGCA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTCCAT AGGCTCCGCC 2606 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 2656 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT 2706 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC 2756 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC 2806 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC 2856 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA 2906 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 2956 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG 3006 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT A'TrGGTATC TGCGCTCTGC 3056 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAG'rTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA 3106 CAAACACCGC TGGTAGCGGT GGTIT7TITG =TGCAAGCA GCAGATTAC 3156 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC =TTGATCTrr TCTACGGGGT 3206 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTT GGTCATGAGA 3256 'TrATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTT 3306 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TGGTCTGAC AGTTACCAAT 3356 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATr TCGTTCATCC 3406 ATAiGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT 3456 ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG 3506 CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA 3556 AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ArGTTGCCG 3606 GGAAGCTAGA GTAAGTAGT'rT CGCCAG'TrAA TAGT'TGCGC AACGTTGTTG 3656 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGT'rGG TATGGCTTCA 3706 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GITACATGAT CCCCCATGTT 3756 GTGCAAAAAA GCGTrAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTI GTCAGAAGTA 3806 AGTTGGCCGC AGTGI'rATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT 3856 CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCT TCTGTGACTG GTGAGTACTC 3906 AACCAAGTCA 'TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTrGCC 3956 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTAAAAGTG 4006 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC 4056 GCTGTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT 4106 CAGCATCTT TACTITCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG 4156 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT 4206 CATACTCTTC CTTITTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC 4256 TCATGAGCGG ATACATATT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG 4306 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT 4356 TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTC 4406 GTCCC Cette souche E.Coli RB 791/p922 a été a été mise en préculture une nuit à C sous agitation à 200 tr/min sur du milieu L (Luria broth décrit dans Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambrook, Fnritsch, Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press) à 100 mg/I d'Ampicilline. A partir de cette préculture une nouvelle fiole de milieu L a été inoculée de telle sorte que la D.O (D.O=Densité Optique à 600 nm, D.O=1 correspond à 450 mg biomasse/litre) initiale soit de 0,6. Après une heure d'attente la culture a été induite avec 1 mM d'lIPTG (isopropyl-I-D-1- thiogalactopyranoside) et poursuivie pendant 3 heures. Les échantillons de la suspension bactérienne ont été centrifugés et les culots bactériens ainsi récupérés ont été mis en suspension dans les tampons d'extraction ci-après, de telle sorte que la D.O finale soit de 10, ce qui équivaut à 4,5 g biomasse/ litre, au moment de l'extraction. Les tampons d'extraction utilisés dans cet exemple sont les suivants: A: Arginine 0,8 pH 8,0 corrigé par HCI dans eau Milli-Q (Millipore) B: Guanidine.HCI 5 M dans eau Milli-Q sans correction de pH. L'extraction a été effectuée en 1 heure à 4C sous agitation magnétique légère. Pour mesurer l'efficacité d'extraction, des échantillons équivalents à 1 ml de suspension de culture à D.O 0,2 ont été prélevés et les culots bactériens correspondants obtenus par centrifugation à 5 000 g pendant 10 min ont été déposés sur gel de polyacrylamide à 16,5 % après dénaturation au SDS. Les suspensions bactériennes ont été également centrifugées et leurs surnageants ont été dessalés par ultrafiltration (dispositif de filtration Ultrafree-MC.de seuil de coupure 5 000 Da Millipore) avant d'être déposés sur gel. Le gel lui même a été révélé par Westemrn bloc en utilisant un anticorps anti-lL-13 CHO et quantifié au PhosphorImager ( Molecular Dynamics). L'anticorps anti-lL-13 CHO (Chinese Hamster Ovary) utilisé dans cet exemple a été obtenu par immunisation de lapins. On a constaté dans cet exemple que l'extraction en présence de guanidine. HCI ou bien en présence d'arginine est quasiment complète pour la forme mature avec des rendements d'extraction supérieurs dans les deux cas à 99%. On a également noté que dans le surnageant extrait en presence d'arginine la forme précurseur de l'IL-13 n'apparaît pas à la différence de l'extrait obtenu en présence de guanidine.HCI. 2/ culture en fermenteur: La souche E.coli RB 791/ p922 a été lancée sur milieu L avec Ampicilline mg/i et incubée à 30'C sous agitation pour constituer une préculture. Un volume de 100 ml de cette préculture a servi d'inoculum à un fermenteur de 2,5 litres de volume total de marque MBR. La culture a été effectuée dans un volume de 1,2 litre sur un milieu dont la composition et dans les conditions définies ci-après. Milieu pour fermenteur - souche E.coli RB 791/ p922 La formule est donnée pour 1 litre final, le volume de l'inoculum est à retrancher. 1. Dissoudre dans 700 ml deau Milli-0 : Composant Masse/litre EDTA lg FeSO4, 7H2O 45 mg MgSO4, 1,5 g 7H20 K2S04 0,75 g CaCI2,2H20 32 mg NaCI 1,45 g KCI 5g HY-SOY 75 g L-méthionine 1,4 g tryptophane 19 g oligoéléments* 2 ml extrait de levure 10 log Compléter à 800 ml avec de l'eau Milli-Q , autoclaver 30 min. à 120(C. 2. Filtrer sur 0.2 mm dans 100 ml d'eau Milli-Q : glycérol 15g K2HPO4 7,1 g La concentration en glycérol sera maintenue entre 10 et 15 g/I au cours de la culture. 3. Au moment de l'induction ajouter: IPTG lg ac. aminocaproîque 0,65 g HY-SOY9 40 g L- cystine 0,3 g Le volume de cet ajout n'est pas inclus dans les autres calculs. * Solutions d'olicioéléments Elle est utilisée à 1 ml/litre. Pour 1 litre d'eau Milli-Q final, dissoudre dans 800 ml: masse/I H3BO3 3 mg NaMoO4, 2 H20 4,8 mg MnSO4, H20 59 mg CoCI2, 6 H20 23,8 mg CuSO4,5 H20 8,7 mg ZnSO4. 7H20 13 mg AICI3, 6 H20 60 mg KCr(SO4), 12 H20 6 mg KI (extemporanément) 60 mg NiSO4. 6 H20 2,6 mg Ajouter 100 ml d'HCI concentré. Compléter à I 000 ml avec eau Milli-0Q. Une fois la D.O de 58 atteinte, l'expression de l'IL-13 est déclenchée par l'addition d'IPTG à 1 g/I et poursuivie pendant 5 heures. Les paramètres de culture en fermenteur étaient les suivants: pH = 7,4 T = 30C p02 = 40 mm Hg régulée par l'agitation, avec un débit d'aircompris entre 1 et 3 litres/min. Les méthodes d'extraction et de mesure de l'activité biologique appliquées sont les mêmes que celles décrites au paragraphe 1 ci-dessus. On a constaté que l'extraction - sur un culot bactérien obtenu en fermenteur et non plus en fiole - en présence de guanidine.HCI ou bien en présence d'arginine, est quasiment complète pour la forme mature de l'IL-13 avec des rendements d'extraction supérieurs dans les deux cas à 97%. EXEMPLE 2 Activité biologique de I'IL-13 ainsi extraite Les extraits obtenus en présence de guanidine.HCI ou d'arginine dans l'exemple 1 ont été dessalés par ultrafiltration comme décrit ci-dessus. ls ont été mis après dilution en série en présence d'un sous-clone IL-13-dépendant de la lignée cellulaire B9. L'activité IL-13 des échantillons dilués induit la croissance des cellules B9 et la concentration de demi- prolifération a été déterminée. La croissance cellulaire a été arrêtée après 3 jours de contact par addition de MTT bromure de 3-(4,5- diaméthylthiazol-2,5-diphényl têtrazolium) et mesurée au spectrophotomètre par absorption de la coloration bleue provoquée à 565 nm. L'activité biologique IL-13 a été exprimée en ng/ml par rapport à un standard IL-13 lui même calibré sur le standard international candidate obtenu à partir de culture IL-13 CHO obtenu par immunisation de lapin selon N. Vita, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 225, 2, 436-445. Les résultats obtenus figurent dans le TABLEAU II ci-après. TABLEAU II Essai sur lignée IL-13 en ng/ml Activité biologique Activité biologique cellulaire B9 en ng/ml spécifique Témoin 500 500 100 Arginine 3 200 1376 43 Guanidine 4 300 I1 098 25 0 Les résultats ci-dessus montrent que l'activité biologique spécifique de l'extrait à l'arginine est, avant toute autre opération de purification ultérieure, supérieure à celle de l'extrait au chlorhydrate de guanidine. EXEMPLE 3 Extraction de l'hGH périplasmique de E.coli en présence d'arginine La souche SEBR 1250 (EP-360641 et EP-356335) a été mise en préculture une nuit à 3rC sous agitation à 200 tr/min sur du milieu L (Luria broth) à 100 mg/l d'Ampicilline. A partir de cette préculture, une nouvelle fiole de milieu L a été inoculée de telle sorte que la D.O (D.O=Densité Optique à 600 nm, D.O=1 correspond dans ce texte à 450 mg biomasse/litre) initiale soit de 0,2. Après une heure d'attente la culture a été induite avec 1 mM d'IPTG et 2o poursuivie pendant 3 heures. Les échantillons de la suspension bactérienne ont été centrifugés et les culots bactériens ainsi récupérés ont été mis en suspension dans les tampons d'extraction de telle sorte que la D.O finale soit de 10, ce qui équivaut à -4,5 g biomasse/ litre, au moment de l'extraction. Les conditions d'extraction ont été les suivantes: Agent chaotropique pH T durée arginine 0,8 M 8,0 22C 20 heures arginine 0,8 M 8,0 4 C 20 heures Pour mesurer l'efficacité d'extraction, des échantillons équivalents à 1 ml de suspension de culture à D.O 0,2 ont été prélevés et les culots bactériens correspondants obtenus par centrifugation à 5 000 g pendant 10 min ont été déposés sur gel de polyacrylamide à 16,5 % après dénaturation au SDS. Les suspensions bactériennes ont été également centrifugées et leurs sumrnageants déposés sur gel. Le gel lui même a été révélé par Western anticorps anti-hGH et quantifié au PhosphorImager ( Molecular Dynamics). Les anticorps anti- hGH utilisés ont été obtenus par immunisation de lapins. L'analyse des bandes obtenues par Phosphorlmager permet de conclure que l'extraction de l'hGH périplasmique humaine produites chez E.coli en présence d'arginine est efficace. Dans cet exemple un rendement d'extraction supérieur à 80% peut être atteint en présence d'arginine 0, 8 M, pH 8,0, T 4 C et heures d'attente. L'hGH étant une protéine hydrophile, on peut en conclure que des protéines recombinantes de nature très différentes accumulées dans le périplasme de E.coli peuvent être extraites simplement en présence d'arginine. EXEMPLE 4 Expression de 'I1L-13 en présence d'arginine dans le milieu de culture. La souche E.coli RB 791/p922 a été cultivée sur milieu L avec Ampicilline mg/I en présence de différentes concentrations en arginine. L'induction a été déclenchée 1 heure après inoculation par l'addition d'IPTG à 1 mM et la culture a été poursuivie pendant 3 heures. Les échantillons de culots bactériens- équivalents de 1 ml de suspension de culture à D.O 0,2- et les échantillons de surnageant correspondants ont été déposés sur gel, révélés et quantifiés comme décrit ci-dessus. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après: Echantillon D.O fin de culture IL-13 en ng/l D.O 1 Témoin 1,17 388 Arginine 2 g/I 1,24 455 Arginine 4 g/I 1,24 600 Arginine 8 g/I i 720 Il apparaît que dans les conditions d'expérience et le système d'expression considéré: - l'arginine augmente l'expression de l'IL-13 périplasmique de manière sensible dès 4 g/l, - la croisssance de la bactérie est ralentie à la concentration de 8 g/I - I'arginine ne provoque pas de fuite de l'IL-13 dans le sumrnageant. L'intérêt du procédé d'extraction à l'arginine selon l'invention est de pouvoir utiliser les extraits de protéines tels que ou avec un traitement minimum dans des tests d'activité biologique. Cette simplification de la méthode d'extraction apporte un avantage tant pour la production industrielle de protéines recombinées périplasmiques que pour le criblage par dosage de l'activité biologique à l'échelle du laboratoire portant par exemple sur des protéines mutées. L'intérêt d'exprimer une protéine périplasmique en présence d'arginine à forte concentration dans le milieu de culture - en particulier au-delà de 2 g/I, c'est-à-dire à des concentrations non usuelles dans les hydrolysats de protéines du commerce - est mis en évidence par l'augmentation des rendements obtenus in-vivo. 18 2729972 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: SANOFI (B) RUE: 32-34 rue Marbeuf (C) VIiLLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75008 (G) TELEPHONE: 53.77.41.31 (H) TELECOPIE: 53.77.42.16 * (ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé d'extraction de protéines périplasmiques de E.Coli en présence d'arginine (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4410 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG 60 CACGGTGCAC CAATGCITCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA 120 GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT 180 T'ITGCGCCG ACATCATAAC GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA 240 CTGACTGTrG CTATATATAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 300 ATTTCACACA GTTTTTCGCG AAGAAGGAGA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTAGC 360 TGCGCTGACT ACCGTTGTAT TCTCTGCGTC CGCCTTCGCT GGCCCTGTGC CTCCCAGTAC 420 TGCCCTCAGG GAGCTCATTG AGGAGCTGGT CAACATCACC CAGAACCAGA AGGCTCCGCT 480 19 2729972 CTGCAATGGC AGCATGGTAT GGAGCATCAA CCTGACAGCT GGCATGTACT GTGCAGCCCT 540 GGAATCCCTG ATCAACGTGT CAGGCTGCAG TGCCATCGAG AAGACCCAGA GGATGCTGAG 600 CGGATTCTGC CCGCACAAGG TCTCAGCTGG GCAGI'TTCC AGCTTGCATG TCCGAGACAC 660 CAAAATCGAG GTGGCCCAGT 'TTGTAAAGGA CCTGCTCTTA CAT'AAAGA AACTTTTTCG 720 CGAGGGACGG TrCAACTGAA ACTrCGAAAG CATCATTATr TGGGATCCGG CTGCTAACAA 780 AGCCCGAAAG GAAGCTGAGT TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCT 840 TGGGCCTCT AAACGGGTCT TGAGGGGT TTrGCTGAAA GGAGGAACTA TATCCGGATG 900 TACCAAGCTT GGCCGGATCA AAGTT'rGTC GTCT'TCCAG ACGTTAGTAA ATGAAMTTC 960 TGTATGAGGT TTTGCTAAAC AACTrCAAC AG'ITrCAGCG GAGTGAGAAT AGAAAGGAAC 1020 AACTAAAGGA ATTGCGAATA ATAATTTT CACGTTGAAA ATCTCCAAAA AAAAAGGCTC 1080 CAAAAGGAGC CTTTAATTGT ATCGGTTAT CAGCTTGCTT TCGAGGTGAA TTTCTT'AAAC 1140 AGCTTGATAC CGATAGTTGC GCCGACAATG ACAACAACCA TCGCCCACGC ATAACCGATA 1200 TATrCGGTCG CTGAGGCTTG CAGGGAGTCA AAGGCCGCTT TGCGGGATC GATCCGCGGA 1260 AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCG'TTG 1320 CGCTCACTGC CCGCTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA AGAATCGGC 1380 CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TITGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTC 'TTCACCAG 1440 TGAGACGGGC AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTr GCAGCAAGCG 1500 GTCCACGCTG GrrTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTG'rTG CTiGGTGTA ACGGCGGGAT 1560 ATAACATGAG CTGTCTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG 1620 CAGCCCGGAC TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG 1680 CATCGCAGTG GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG G-rrrGTTrGAA AACCGGACAT 1740 GGCACTCCAG TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT 1800 ATGCCAGCCA GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTTrr AATGGGCCCG CTAACAGCGC 1860 GATTTGCTGG TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG 1920 GGAGAAAATA ATACTGTrGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC 1980 AITAGTGCAG GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTrAATGAT 2040 CAGCCCACTG ACGCGTTGCG CGAGAAGAT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC 2100 GCTrCGCT ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTMAAT 2160 CGCCGCGACA ATTrGACGAC GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG 2220 CAACGACTGTr TTGCCCGCCA GTTGrTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC 2280 CATCGCCGCT TCCACTTTTT CCCGCGTT'T CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GTTrCACCAC 2340 GCGGGAAACG GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG 2400 TTTCACATTC ACCACCCTGA AFTTGACTCTC TT'CCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA 2460 GGiTITIGCCC CATTCGATCT ACGCCGGACG CATCGTGGCC GCAAACCAAC CCTTGGCAGA 2520 ACATATCCAT CGCGTCCGCC ATCTCCAGCA GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCCGCGTTG 2580 CTGGCGTTTr TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT 2640 CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 2700 CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTCTCCCT 2760 TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC 2820 GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA 2880 TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA 2940 GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 3000 TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 3060 CCAGTTACCT TCGGAAAAAG ATTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3120 AGCGGTGGTT TTTT'G G CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA 3180 GATCCTTrGA TCTITTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACG'TTAAGGG 3240 2729972 AITITGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC rTTCACCTAGA TCCTTTTAAA 'TTAAAAATGA 3300 AG'TrTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGT'TA CCAATGC'TTA 3360 ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTAITrCGTr CATCCATAGT TGCCTGACTC 3420 CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG 3480 ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA 3540 AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTrANITGT 3600 TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT 3660 GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC 3720 CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATG'rGTGCA AAAAMGCCGGT TAGCTCCTTC 3780 GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTITG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA 3840 GCACTGCATA ATCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTCTGT GACTGGTGAG 3900 TACTCAACCA AGTCATICTG AGAATAGTGT ATCGCCGAC CGAGTGCTC TTGCCCGGCG 3960 TCAACACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTrrTAA AAGTGCTCAT CATrGGAAAA 4020 CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC 'TTrACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA 4080 CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA 4140 GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTrTGA 4200 ATACTCATAC TCTTCC'ITT TCAATATTAT TGAAGCAITr ATCAGGGTTA TTGTCTCATG 4260 AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACAT 4320 CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA ACCATTrATTA TCATGACATT AACCTATAAA 4380 AATAGGCGTA TCACGAGGCC CTTTCGTCCC 4410 REVENDICATIONS 1. Utilisation de l'arginine comme agent d'extraction de protéines recombinées périplasmiques. 2. Procédé d'extraction d'une protéine d'intérêt périplasmique qui consiste: 1/ à mettre en suspension le culot de cellules provenant de la culture d'un microorganisme procaryote transformé à l'aide d'un vecteur d'expression contenant un gène codant pour ladite protéine et des moyens pour son expression dans le périplasme de celui-ci dans une solution tampon contenant de l'arginine; 2/ à récupérer la protéine d'intérêt dans le sumrnageant de la suspension bactérienne ainsi obtenue. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution tampon contenant de l'arginine est une solution aqueuse pH = 8, ayant une concentration de 0,4 à 0,8 M en arginine. 4. Utilisation de l'arginine comme agent favorisant l'expression des protéines recombinées périplasmiques. 5. Procédé de culture d'un microorganisme procaryote transformé à l'aide d'un vecteur d'expression contenant un gène codant pour une protéine d'intérêt, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la culture en présence d'arginine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'arginine est utilisée à raison de 2 à 8 g/l de milieu de culture.