Brevet FR2724394A1 — publié le 19960315

PROCEDE D'OBTENTION D'ACIDE VANILLIQUE ET DE VANILLINE PAR BIOCONVERSION PAR UNE ASSOCIATION DE MICROORGANISMES FILAMENTEUX . La présente Invention est relative à l'obtention d'acide vanillique et de vanilline par bioconversion. Actuellement, la vanilline est l'arôme le plus utilisé dans les industries agro-alimentaires. Or, la production de vanilline naturelle à partir de gousses de vanille ne couvre que 20% des besoins du marché et son prix de revient est de l'ordre de 25 000F/kg. La vanilline peut également être obtenue par synthèse chimique ; toutefois, cette méthode d'obtention, si elle convient pour la fabrication des parfums et des cosmétiques, peut soulever dans les industries agroalimentaires des difficultés d'ordre législatif. En outre les arômes de synthèse ont tendance par ailleurs à être moins appréciés par les consommateurs que les arômes d'origine naturelle. C'est pourquoi l'on cherche à obtenir des composés aromatiques produits grâce à des procédés biologiques, qui mettent en oeuvre des microorganismes (bactéries, levures, champignons), des cellules animales ou végétales ou leurs systèmes enzymatiques. La vanilline est produite par certains végétaux et micooorganismes, en particulier des champignons, où elle constitue un des produits de dégradation de précurseurs à noyau aromatique (acide férulique et acide vanillique). La Demande de brevet européen 453 368 au nom de la Société PERNOD-RICARD, décrit la production de vanilline naturelle par bioconversion d'acide férulique ou d'acide vanillique, en présence d'un champignon filamenteux du groupe des Basidiomycètes, Pycnoporus cinnabarinus. Chez ce champignon, quatre voies métaboliques de transformation de l'acide férulique ont été identifiées - Voie 1 : l'acide férulique est réduit en aldéhyde coniférylique puis en alcool coniférylique ; différents dimères sont ensuite formés à partir de ce composé. Cette voie est mineure. - Voie 2 : il y a coupure de la chaîne propénoïque de l'acide férulique avec perte de deux carbones et formation d'acide vanillique. - Voie 3 : l'acide vanillique résultant de la voie 2 est réduit en vanilline par la Réductase I. La vanilline produite peut ensuite être réduite par la Réductase II en alcool vanillique. - Voie 4 : l'acide vanillique résultant de la voie 2 est hydroxylé et décarboxylé en méthoxyhydroquinone, par l'action d'une vanillate hydroxylase intracellulaire. Dans les conditions décrites dans la Demande EP 453 368, la production de vanilline par P. cinnabarinus MîCli, à partir de 300 mg/l d'acide férulique est au maximum de l'ordre de 45 mg/l (rendement molaire de conversion de 20,5 %), et à partir de 300 mg/l d'acide vanillique, cette production est au maximum de l'ordre de 81,4 mg/l (rendement molaire de conversion de 31%). La présente Invention a pour but d'améliorer le rendement de la production de vanilline naturelle par bioconversion à partir de précurseurs à noyau aromatique (acide férulique et acide vanillique). Dans ce but, les Inventeurs ont cherché à améliorer le rendement de conversion de l'acide férulique en acide vanillique, et le rendement de conversion de l'acide vanillique en vanilline. La présente Invention a pour objet un procédé d'obtention de l'acide vanillique par bioconversion à partir de l'acide férulique, lequel procédé est caracté risé en ce que ladite bioconversion est effectuée en utilisant une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète. La présente Invention a également pour objet un procédé d'obtention de vanilline par bioconversion à partir de l'acide férulique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de transformation de l'acide férulique en acide vanillique par le procédé défini cidessus - une étape de transformation de l'acide vanillique en vanilline par au moins un champignon filamenteux de la classe des Basidiomycètes. Selon une première variante du procédé d'obtention de vanilline conforme à l'Invention, les deux étapes sont effectuées séquentiellement. Dans ce cas le procédé conforme à l'Invention comprend: - une étape au cours de laquelle on ajoute de l'acide férulique à une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète, et l'on recueille l'acide vanillique produit - une étape au cours de laquelle on ajoute l'acide vanillique produit au cours de la première étape à une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux de la classe des Basidiomycètes, et l'on recueille la vanilline produite. Pour mettre en oeuvre cette variante, les champignons utilisés dans chacune des étapes sont cultivés séparément jusqu'à l'obtention d'une biomasse possédant les capacités nécessaires à la bioconversion (c'est à dire une biomasse d'au moins 0,5 g de matière sèche par litre de culture), et les cultures obtenues sont ensuite utilisées successivement. Selon une deuxième variante du procédé conforme à l'Invention, les deux étapes sont effectuées simultanément. Dans ce cas l'on ajoute de l'acide férulique à une culture comprenant, pour la transformation de l'acide férulique en acide vanillique, au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète, et, pour la transformation de l'acide vanillique en vanilline, au moins une souche de Basidiomycète qui peut être identique à ou différente de celle utilisée pour transformer l'acide férulique en acide vanillique, et l'on recueille la vanilline produite. Pour mettre en oeuvre cette deuxième variante, les champignons utilisés pour la transformation de l'acide férulique en acide vanillique et ceux utilisés pour la transformation de l'acide vanillique en vanilline sont cultivés séparément jusqu'à l'obtention d'une biomasse possédant les capacités nécessaires à la bioconversion, et les cultures obtenues sont ensuite regroupées pour obtenir une co-culture permettant de réaliser la bioconversion en une seule étape. Pour la bioconversion de l'acide férulique en acide vanillique, des Ascomycètes préférés appartiennent aux genres Eurotium, Penicillium, et Aspergillus des Basidiomycètes préférés appartiennent aux genres Bjerkandera, Nidula, Nidularia, Phanerochaete, Pycnoporus, Trame tes, Lentinus, et Ischnoderma ; des Actinomycètes préférés appartiennent aux Streptomyces. Pour la bioconversion de l'acide vanillique en vanilline, des Basidiomycètes préférés appartiennent aux genres Bjerkandera, Nidula, Nidularia, Phanerochaete, Pycnoporus, Trametes, Lentinus, et Ischnoderma. Le Tableau I ci-après mentionne, de façon non limitative, quelques espèces convenant à la mise en oeuvre du procédé selon l'Invention, et quelques souches testées par les Inventeurs, et qui se sont avérées particulièrement performantes dans ce cadre. TABLEAU I Espèces Exemple de souches utilisées Actinomycètes - Streptomyces setonii ATCC 25497 Ascomycètes - Eurotium chevalieri - Penicillium verrucosum cyclopium - Aspergillus oryzae - Aspergillus versicolor - Aspergillus niger LMTC N' 2.7 (CNCM I-1472) Basidiomycètes - Ischnoderma benzoïmum CBS 250.30 - Bjerkandera adusta CBS 595.79 - Nidula niveo-tomentosa ATCC 38357 - Phanerochaete sordida IHEM 3730 - Phanerochaete chrysosporium MIC 247 (CNCM I-1471) - Pycnoporus cinnabarinus MUCL 38467 - Trametes pini CBS 210.36 - Lentinus edodes CBS 454.59 I1 est possible, selon les cas, de se procurer les différentes souches citées, auprès de la collection MUCL, 3 place Croix du Sud, 1348, Louvain La Neuve, Belgique, auprès de la collection IHEM, 14 rue J. Wytsman, 1050, Bruxelles, Belgique, auprès de la collection CBS, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, et auprès de la collection ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA. D'autre part, la souche d'Aspergillus niger LMTC 2.7 et la souche de Phanerochaete chrysosporium MIC 247 ont été déposées le 31 août 1994 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du Docteur Roux, à Paris, sous les numéros respectifs I-1472 et I-1471. Les organismes peuvent être cultivés sous forme de cellules libres, ou sous forme de cellules immobilisées sur un support hydrophile ou hydrophobe, de préférence rugueux. Les cultures sont effectuées, de manière classique, à partir d'un inoculum qui peut être constitué par des spores, par des fragments de mycélium, ou par une préculture de mycélium. Le milieu de culture comporte une source de carbone, au moins une source d'azote, des sels minéraux, et est additionné d'extrait de levure. Les constituants de ce milieu peuvent être ceux qui sont classiquement utilisés pour la culture de l'espèce de champignon concernée. Toutefois, les Inventeurs ont constaté que lorsque la source de carbone utilisée comprend ou est constituée par au moins un phospholipide, on observe une accélération de la bioconversion, en particulier en ce qui concerne la bioconversion de l'acide férulique en acide vanillique. Avantageusement, le milieu de culture comprend au moins un phospholipide choisi dans le groupe constitué par la phosphatidylcholine, la lysophosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, l'acylphosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, et l'acide phosphatidique. Préférentiellement ce phospholipide ou mélange de phospholipides est utilisé à une concentration comprise entre 0,1 et 20 g/l. Par exemple on peut utiliser un mélange de phospholipides de soja comprenant - 12 % de phosphatidylcholine et lysophosphatidylcholine - 31 % de phosphatidyléthanolamine et acylphosphatidyléthanolamine - 27 % de phosphatidylinositol - 30 % d'acide phosphatidique. Pour améliorer le rendement de bioconversion de l'acide férulique en acide vanillique, on peut également activer la béta-oxydation peroxysomale. Les Inventeurs ont en outre observé que l'utilisation de cellobiose comme seule source de carbone du champignon, ou en complément d'une autre source de carbone, par exemple d'un sucre tel que le maltose, permet de limiter très significativement la production de méthoxyhydroquinone, et donc d'augmenter le rendement de bioconversion de l'acide vanillique en vanilline. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, la source de carbone utilisée comprend ou est constituée par du cellobiose. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, le milieu de culture comprend du cellobiose. Le cellobiose peut être ajouté dès le début de la culture, à une concentration comprise entre 0,5 g/l et 10 g/l, préférentiellement 5 g/l, et/ou peu de temps avant, ou simultanément à l'addition de l'acide férulique ou de l'acide vanillique, à une concentration comprise dans ce cas entre 0,5 g/l et 5 g/l, préférentiellement 2,5 g/l. Pour initier la bioconversion, on additionne à la culture le précurseur, à savoir soit l'acide férulique, puis l'acide vanillique, dans le cas de la première variante du procédé, soit l'acide férulique, dans le cas de la deuxième variante du procédé. I1 est avantageux d'ajouter en même temps que le précurseur, une quantité, comprise entre 0,01 et 5 g/l d'au moins un produit constituant une source de carbone, ou une source d'azote, ou de sels minéraux, ou de lipides, ou d'un mélange de ces différents produits. On citera parmi les sources de carbone utilisables dans ce but, le maltose, le cellobiose, l'acide galacturonique, le xylose, le rhamnose, l'arabinose ; parmi les sources d'azote, le tartrate diammonium, l'extrait de levure ; parmi les sels minéraux, les sels de calcium, de potassium, de magnésium ; parmi les lipides, les acides gras émulsifiés, et les phospholipides. L'acide férulique est une matière première aisément disponible, et peu coûteuse. I1 est présent par exemple dans la fraction pariétale de sous-produits agricoles tels que les pulpes de betterave (0,9% du poids sec) ou les sons de céréales (2,0% du poids sec dans les sons de maïs). L'acide vanillique peut en particulier être produit à partir de l'acide férulique au cours de la première étape du procédé conforme à l'Invention. L'acide férulique peut être utilisé sous forme libre ou bien sous forme liée ; on entend par acide férulique lié un ester d'un sucre ou d'un oligosaccharide avec l'acide férulique. L'acide férulique libre ou l'acide vanillique peuvent être ajoutés tels quels, sous forme de cristaux, ou sous forme d'une solution de leurs sels de sodium, potassium, ou ammonium. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'acide férulique ou l'acide vanillique sont ajoutés à raison de 0,1 à 2 g/l de culture, de préférence 0,3 g/l. Si l'on utilise l'acide férulique lié, ou bien un sel d'acide férulique, ou d'acide vanillique, on ajustera la concentration de manière à ce qu'elle corresponde à la gamme de concentra tions en acide férulique ou en acide vanillique indiquée ci-dessus. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'ajout de l'acide férulique ou de l'acide vanillique s'effectue après 12 à 96 h de culture. Toutefois, lorsque l'ajout en une seule fois aboutirait à des concentrations toxiques pour le champignon, à savoir des concentrations supérieures à 2 g/l pour l'acide férulique et à 2 g/l pour l'acide vanillique, des ajouts séquentiels ou en continu seront effectués. Les Inventeurs ont en outre observé qu'il était possible et particulièrement avantageux, de mettre en oeuvre le procédé selon l'Invention en présence d'une résine non-ionique, de préférence de type hydrophobe. En effet, non seulement l'acide vanillique, mais également la vanilline sont toxiques pour les champignons, à des concentrations supérieures à 2 g/l. L'utilisation de résine permet de piéger ces métabolites et de maintenir leurs concentrations en dessous du seuil de toxicité. D'autre part, l'utilisation de résine pour piéger la vanilline permet également d'éliminer celle-ci du mélange réactionnel avant qu'elle soit réduite en alcool vanillique. L'acide vanillique ou la vanilline fixés sur la résine peuvent être récupérés, par élution avec un solvant approprié, tel par exemple que l'éthanol. Des résines non-ioniques pouvant être utilisées sont, à titre d'exemple non-limitatif, les suivantes - Résines AMBERLITE : XAD2 ; XAD4 ; XAD7 - Résine DUOLITE : XAD761 - Résine DOWEX : S112 Les résines XAD761 et S112 sont préférées pour fixer l'acide vanillique, et les résines XAD2, XAD4, XAD7, et S112, sont préférées pour fixer la vanilline. A titre d'exemple, la résine XAD2 permet de fixer 98% de la vanilline ; la capacité d'adsorption de cette résine est de l'ordre de 20 mg de vanilline par gramme de résine. Préférentiellement, l'ajout de résine est effectué dès l'apparition de la vanilline. L'ajout de résine peut s'effectuer, par exemple, soit directement dans le récipient de culture, soit par circulation du milieu de culture dans une boucle externe contenant la résine. Pour éliminer l'acide vanillique et la vanilline du milieu de culture et les récupérer au fur et à mesure de leur production, il est également possible de faire appel à d'autres techniques, telles que l'ultrafiltration, l'osmose inverse ou la capture sur charbon actif. Pour améliorer de façon significative le rendement de bioconversion de l'acide vanillique en vanilline, on peut également choisir une souche de basidiomycète qui ne forme que très peu d'alcool vanillique, et accumule la vanilline produite. I1 s'agit par exemple de basidiomycètes de l'ordre des Nidulariales. La vanilline produite devenant très rapidement toxique pour le métabolisme du champignon, il est avantageux dans ce cas de la piéger en utilisant une résine, comme indiqué ci-dessus. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Réalisation des cultures A) Champignons La composition du milieu de base est donnée ci-dessous Composition du milieu Maltose 20 g/l Tartrate diammonium 1,842 g/l KH2PO4 0,2 g/l CaC12, 2 H2O 0,0132 g/l MgSO4, 7H2O 0,5 g/l Extrait de levure 0,5 g/l Le milieu est stérilisé par autoclavage 20 min à 120 C. L'inoculation est effectuée par des fragments mycéliens, des spores (2.105 spores/ml), ou une préculture de mycélium, comme décrit dans la Demande EP 453 368. Après inoculation, les cultures sont incubées à 30'C et soumises à une agitation de 120 tours/min. Après 12 à 96 h de culture, l'acide férulique ou l'acide vanillique (dans le cas de la mise en oeuvre du procédé en deux étapes) sont ajoutés. Ils sont utilisés sous forme de sel en solution dans l'eau ; la solution a été préalablement stérilisée par filtration (membrane de 0,2Rm). La solution est ajoutée en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale correspondant à 0,3 g d'acide férulique ou d'acide vanillique par litre de culture. B) Actinomycètes La composition du milieu de base est la suivante Glycérol 5 g/l Extrait de levure 2 g/l Le milieu est stérilisé par autoclavage 20 min à 120 C. L'inoculation est effectuée par des fragments de mycélium aérien prélevés sur un milieu solide malt/agar. Après inoculation, les cultures sont incubées à 30'C et soumises à une agitation de 120 tours/min. L'acide férulique, sous forme de sel, est ajouté en tout début de culture, à la concentration de 1 g/l. C) Suivi de la bioconversion La bioconversion, au cours de la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention est suivie par le dosage des métabolites produits. Pour procéder à ce dosage, un aliquot du milieu de culture est prélevé stérilement à intervalles de temps réguliers. Cet aliquot est ensuite filtré (membrane de 0,2Rm) et une analyse par HPLC du filtrat est réalisée, pour détecter et doser les métabolites produits. Conditions d'analvse HPLC - phase inverse = colonne BONDAPACK C18 - solvant : CH3COOH 0,01 % dans H2O/méthanol - détection en W à 280 nm EXEMPLE 2 : Bioconversion de l'acide féruliaue en acide vanilliaue A) Par un champignon La souche d'Aspergillus niger MIC 373, déposée le 31 août 1994 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro I-1472, a été mise en culture comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus. L'acide férulique a été ajouté en continu à raison de 430 mg/l par 24 heures. L'acide férulique et ses métabolites sont dosés comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats obtenus après 15 jours de croissance de la culture sont indiqués dans le Tableau II ci dessous. Légende du Tableau II Colonne 1 : Acide férulique consommé (mg/l) Colonne 2 : Acide vanillique produit (mg/l) Colonne 3 : Methoxyhydroquinone produite (mg/l) Colonne 4 : Rendement molaire (%) ; le rendement molaire est défini comme le nombre de moles d'acide vanillique produites pour 100 moles d'acide férulique consommées. TABLEAU II i 2 3 4 5055 3600 109 82 On observe une consommation totale de l'acide férulique ajouté. Celui-ci est transformé en grande majorité (82%) en acide vanillique qui est faiblement (2%) métabolisé en méthoxyhydroquinone, et pas du tout en vanilline et alcool vanillique. B) Par un actinomycète La souche de Streptomyces setonii ATCC 25497 a été mise en culture comme indiqué à l'exemple 1 cidessus. L'acide férulique, sous forme de sel, est ajouté en tout début de culture, à la concentration de 1 g/l. L'acide férulique et ses métabolites sont dosés comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats obtenus après 100 heures de croissance de la culture sont indiqués dans le Tableau III ci dessous. Légende du Tableau III Colonne 1 : Acide férulique consommé (mg/l) Colonne 2 : Acide vanillique produit (mg/l) Colonne 3 : Rendement molaire (%). TABLEAU II 3 880 332 43 zXRMPLE 3 : Activation de la bioconversion de l'acide féruliaue en acide vanillipue Dar ajout de DbOsDboliDideI de soia La source de phospholipides utilisée est le NAT 89 fourni par la Société Natterman Phospholipid Gmbh (Cologne, Allemagne).La composition du NAT 89 est la suivante 12 % de phosphatidylcholine et de lysophosphatidylcholine 31 % de phosphatidylethanolamine et acyl-phosphati dylethanolamine 27 % de phosphatidylinositol 30 % d'acide phosphatidique Le NAT89 (20 g/l) a été utilisé comme source de carbone à la place du maltose dans les cultures d' Aspergillus niger. Les résultats obtenus montrent une bioconversion plus rapide de l'acide férulique en acide vanillique. EXEMPLE 4 : Activation de la bioconversion de l'acide vanilliaue en vanilline par l'utilisation de résine Pour illustrer cet exemple, une souche représentative d'une espèce de Basidiomycète produisant principalement de l'alcool vanillique a été choisie. I1 s'agit de la souche MIC 247 de Phanerochaete chrysosporium, déposée le 31 août 1994 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro I-1471. Cette souche a été mise en culture comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus. L'acide vanillique a été ajouté séquentiellement, à savoir : 0,3 g/l au bout de 3 jours de culture, puis 0,3 g/l tous les jours. Pour l'expérience 2, de la résine XAD2 (AMBERLITE) stérile est ajoutée à raison de 10% (poids/volume) après 3 jours + 6h de culture du champignon, soit 6 h après l'ajout d'acide vanillique (à 300 mg/l). L'acide vanillique et ses métabolites sont dosés comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats, indiqués dans le Tableau Iv ci-dessous, sont donnés après 4 jours et 7 jours (Expérience 1), ou après 6 jours (expérience 2), de croissance de la culture. Légende du Tableau IV Colonne 1 : Numéro de l'expérience, et âge de la culture Colonne 2 : Acide vanillique consommé (mg/l) Colonne 3 : Vanilline produite (mg/l) Colonne 4 : Alcool vanillique produit (mg/l) Colonne 5 : Méthoxyhydroquinone produite (mg/l) Colonne 6 Rendement molaire (%) ; le rendement molaire est ici défini comme le nombre de moles de vanilline produites pour 100 moles d'acide vanillique consommées. TABLEAU IV 1 2 3 4 ~ 5 6 N'1 4 j 277 125 89 17 50 7 j 1545 3 762 175 0,2 N'2 6j 838 628 51 86 82 Dans l'expérience 1, on observe dès le quatrième jour une forte production d'alcool vanillique associée à la production de vanilline. Au septième jour, toute la vanilline produite a été métabolisée en alcool vanillique. Dans l'expérience 2, la vanilline a été fixée par la résine au fur et à mesure de sa production (94 % de la vanilline produite a été fixée sur la résine utilisée), avant qu'elle ne soit transformée en alcool vanillique. ZXKNPLE 5 : Activation de la bioconversion de l'acide vanillipue en vanilline par l'utilisation de cellobiose Pour illustrer cet exemple, une souche représentative d'une espèce de Basidiomycète produisant principalement de la méthoxyhydroquinone a été choisie. I1 s'agit de la souche MUCL 38467 de Pycnoporus cinnabarinus. Cette souche a été mise en culture comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus. L'acide vanillique a été ajouté séquentiellement, à savoir : 0,3 g/l au bout de 3 jours de culture, puis 0,3 g/l tous les jours. Pour l'expérience 1, la source de carbone utilisée est le maltose, à une concentration de 20 g/l. Pour l'expérience 2, la source de carbone utilisée est le cellobiose, à raison de 5 g/l. L'acide vanillique et ses métabolites sont dosés, comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats, après 7 jours de croissance de la culture, sont indiqués dans le Tableau V ci-dessous. Légende du Tableau V Colonne 1 : Numéro de l'expérience ; Colonne 2 : Acide vanillique consommé (mg/l) Colonne 3 : Vanilline produite (mg/l) Colonne 4 : Methoxyhydroquinone produite (mg/l) Colonne 5 : Alcool vanillique produit (mg/l) Colonne 6 : Rendement molaire (%) ; le rendement molaire est défini comme le nombre de moles de vanilline produites pour 100 moles d'acide vanillique consommées. TABLEAU V 1 2 3 4 5 6 N'1 1198 166 709 30 15 N-2 941 481 62 70 59 Dans l'expérience 1, on observe après 7 jours de culture des productions élevées en vanilline mais aussi en méthoxyhydroquinone. Dans l'expérience 2, l'utilisation de cellobiose comme source de carbone, a permis de limiter très significativement la production de méthoxyhydroquinone, et d'augmenter celle de vanilline. Dans une deuxième série d'expériences décrites ci-dessous, où le maltose est utilisé comme source de carbone principale, l'ajout de cellobiose avant l'ajout du précurseur permet également de limiter très significativement la production de méthoxyhydroquinone et d'augmenter celle de vanilline. Les milieux et conditions de culture suivants ont été utilisés: - Maltose 1 Seule source de carbone : maltose à 20 g/l. - Maltose 2 : Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,25% (p/v) de cellobiose après 3 jours d'incubation, 2 h avant l'ajout d'acide vanillique. - Maltose 3 Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,35% (p/v) de cellobiose après 3 jours d'incubation, 2 h avant l'ajout d'acide vanillique. - Maltose 4 : Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,5% (p/v) de cellobiose après 3 jours d'incubation, 2 h avant l'ajout d'acide vanillique. - Maltose 2C Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,25% (p/v) de cellobiose après 3 jours, 4 jours, 5 jours, et 6 jours d'incubation, chaque ajout précédant de 2 heures l'ajout d'acide vanillique. - Maltose 3C : Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,35% (p/v) de cellobiose après 3 jours, 4 jours, 5 jours, et 6 jours d'incubation, chaque ajout précédant de 2 heures l'ajout d'acide vanillique. - Maltose 4C : Source de carbone : maltose à 20 g/l + addition de 0,5% (p/v) de cellobiose après 3 jours, 4 jours, 5 jours, et 6 jours d'incubation, chaque ajout précédant de 2 heures l'ajout d'acide vanillique. Les résultats sont indiqués dans le Tableau VI ci-dessous. Légende du Tableau VI Colonne 1 : Numéro de l'expérience Colonne 2 : Acide vanillique consommé (mg/l) Colonne 3 : Vanilline produite (mg/l) Colonne 4 : Methoxyhydroquinone produite (mg/l) Colonne 5 : Alcool vanillique produit (mg/l) Colonne 6 : Rendement molaire (%) ; le rendement molaire est ici défini comme le nombre de moles de vanilline produites pour 100 moles d'acide vanillique consommées. TABLEAU VI 1 2 3 4 5 6 Maltosel 1198 166 709 30 14 Maltose2 1199 342 466 26 28 Maltose3 1192 447 350 27 37 Maltose4 1195 388 393 25 32 Maltose2C 1198 583 541 76 49 Maltose3C 1198 457 526 72 51 Maltose4C 1197 642 476 62 54 Izenle 6 : Utilisation d'une souche Droduistnt Drincina- lent de la vanilline Pour illustrer cet exemple, une souche représentative d'une espèce de Basidiomycète accumulant la vanilline a été choisie. Il s'agit d'une souche de Nidula niveo-tomentosa qui est accessible auprès de l'ATCC sous le numéro 38357. Cette souche a été mise en culture comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus. L'acide vanillique a été ajouté séquentiellement, à savoir : 0,3 g/l au bout de 3 jours de culture, puis 0,3 g/l tous les jours. L'acide vanillique et ses métabolites sont dosés comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats, au 8ème jour de croissance de la culture, sont indiqués dans le Tableau VII ci-dessous. Légende du Tableau VII Colonne 1 : Acide vanillique consommé (mg/l) Colonne 2 : Vanilline produite (mg/l) Colonne 3 : Alcool vanillique produit (mg/l) Colonne 4 : Méthoxyhydroquinone produite (mg/l) Colonne 5 : Rendement molaire (%). TABLEAU VII i 2 3 4 5 1252 444 20 334 1 39 Cette souche accumulant la vanilline produite, très peu d'alcool vanillique est obtenu. Pour optimiser l'utilisation de cette souche, on peut d'une part piéger la vanilline au fur et à mesure de sa production, par exemple en utilisant des résines comme décrit à l'exemple 4 ci-dessus, et d'autre part ajouter du cellobiose afin de limiter la quantité de méthoxyhydroquinone produite, comme décrit à l'exemple 5 ci-dessus. REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention de l'acide vanillique par bioconversion à partir de l'acide férulique, caractérisé en ce que ladite bioconversion est effectuée en utilisant une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète. 2) Procédé d'obtention de vanilline par bioconversion à partir de l'acide férulique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de transformation de l'acide férulique en acide vanillique par un procédé selon la revendication 1 - une étape de transformation de l'acide vanillique en vanilline par au moins un champignon filamenteux de la classe des Basidiomycètes. 3) Procédé d'obtention de vanilline selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape au cours de laquelle l'on ajoute de l'acide férulique à une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète, et l'on recueille l'acide vanillique produit - une étape au cours de laquelle on ajoute l'acide vanillique produit au cours de la première étape à une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux de la classe des Basidiomycètes, et l'on recueille la vanilline produite. 4) Procédé d'obtention de vanilline selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on ajoute de l'acide férulique à une culture comprenant au moins une souche d'un champignon filamenteux choisi dans le groupe constitué par les Ascomycètes et les Basidiomycètes, ou au moins une souche d'Actinomycète, et l'on recueille la vanilline produite. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre au moins une souche choisie dans le groupe constitué par : les souches d'Ascomycètes appartenant aux genres Eurotium, Penicillium, et Aspergillus ; les souches de Basidiomycètes appartenant aux genres Bjerkandera, Nidula, Nidularia, Phanerochaete, Pycnoporus, Trametes, Lentinus, et Ischnoderma, et les souches d'Actinomycètes appartenant au genre Streptomyces. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une souche d'Aspergillus niger déposée le 31 août 1994 auprès de la CNCM, sous le numéro I-1472. 7) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre, pour la deuxième étape au moins une souche choisie dans le groupe constitué par des Basidiomycètes appartenant aux genres Bjerkandera, Nidula, Nidularia, Phanerochaete, Pycnoporus, Trametes, Lentinus, et Ischnoderma. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une souche de Phanerochaete chrysosporium déposée le 31 août 1994 auprès de la CNCM, sous le numéro I-1471. 9) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le milieu de culture comporte une source de carbone qui comprend ou est constituée par au moins un phospholipide. 10) Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que ledit phospholipide est choisi dans le groupe constitué par la phosphatidylcholine, la lysophosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, l'acylphosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, et l'acide phosphatidique. 11) Procédé selon une quelconque des revendications 9 ou 10 caractérisé en ce que ledit phospholipide ou mélange de phospholipides est utilisé à une concentration comprise entre 0,1 et 20 g/l. 12) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le milieu de culture comporte une source de carbone qui comprend ou est constituée par du cellobiose. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend du cellobiose à une concentration comprise entre 0,5 g/l et 10 g/l. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend du cellobiose à une concentration d'environ 5g /1. 15) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'acide férulique est ajouté à raison de 0,1 à 2 g/l. 16) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 15, caractérisé en ce que l'acide vanillique est ajouté à raison de 0,1 à 2 g/l. 17) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en présence d'une résine hydrophobe. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite résine de type hydrophobe est choisie dans le groupe constitué par les résines XAD2, XAD4, XAD7, XAD761, et S112.