Brevet FR2734844A1 — publié le 19961206

La présente invention concerne une méthode de détection rapide de microorganismes eucaryotes thermorésistants pouvant contaminer certains produits dans le domaine agro-alimentaire, notamment des produits à base de fruits. Plus particulièrement, les microorganismes étudiés sont deux champignons filamenteux, Byssochlamys nivea et Neosartorya fischeri et une levure, Zygosaccharomyces bailli. Ces contaminants de produits alimentaires peuvent se développer sur des produits à base de fruits, leur communiquant, notamment pour Byssochlamys nivea, des notes désagréables de type plastique ou antiseptique, la croissance de Neosartorya fischeri est responsable d'une altération et de l'apparition de mycotoxines, alors que celle de Zygosaccharomyces bailii provoque une formation de gaz. Ces microorganismes, notamment sous forme de spores, présentent une thermorésistance très élevée qui leur permet de se maintenir, même après les traitements classiques de pasteurisation qui sont appliqués dans l'industrie agro-alimentaire. Les tests permettant la mise en évidence de ces microorganismes existant à l'heure actuelle consistent à cultiver les échantillons sur un milieu sélectif en mettant à profit, comme élément de sélection, la thermorésistance des champignons filamenteux ou la résistance de la levure à certains agents conservateurs utilisés classiquement dans le domaine tels que l'acide benzoïque. Toutefois, ce type de détection implique des cultures et, qui plus est, des cultures assez longues, à savoir de plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui les rend pratiquement inutilisables dans le domaine agro-alimentaire puisque cela impliquerait de conserver les produits éventuellement contaminés pendant des temps très longs. On est donc à la recherche d'un test de détection permettant la mise en évidence très rapide de ces microorganismes, ledit test pouvant être effectué en quelques heures au plus, afin de savoir rapidement si le produit échantilloné peut ou non continuer à être traité dans les étapes ultérieures. C'est pourquoi, la présente invention propose un procédé permettant la mise en évidence dc Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri et Zygosaccharomyces bailii par amplification de l'ADN génomique des microorganismes ciblés en utilisant comme amorces un couple de séquences comprises dans les espaceurs transcrits internes (ITS) de l'unité ribosomique: - pour Byssochlamys nivea, - sur ITS1 correspondant à SEQID 1, - sur ITS2 correspondant à SEQID 2, - pour Neosartorya fischeri, - sur ITS1 correspondant à SEQID 3, - sur ITS2 correspondant à SEQID 4, - pour Zygosaccharomyces bailii - sur ITS1 correspondant à SEQID 5 - sur ITS2 correspondant à SEQID 6. Dans les séquences ITS1 et ITS2 on choisira plus particulièrement, - pour Byssochlamys nivea la séquence SEQID 7 et ID 8, - pour Neosartorya fischeri SEQID 9 et ID 10, - pour Zygosaccharomyces bailii SEQID 11 et ID 12. Parmi les méthodes d'amplification utilisables, on utilisera plus particulièrement la méthode dite "PCR" ( Polymerase Chain Reaction"). Les essais, rapportés notamment dans les exemples, montrent que ces amorces sont parfaitement discriminantes et permettent de distinguer les microorganismes recherchés et les microorganismes, même très voisins, et apparentés. La présente invention concerne également un procédé de mise en évidence de ces microorganismes dans des produits agro-alimentaires, notamment des produits agro-alimentaires à base de fruits et plus particulièrement des produits alimentaires à base de fraises, dans lequel on prétraite l'échantillons contenant les fruits afin de libérer et concentrer les spores ou les cellules, de diminuer ou de supprimer l'action des inhibiteurs de la Taq Polymérase et d'extraire l'ADN des spores ou des cellules. Plus particulièrement, les échantillons contenant des produits solides seront traités par un mélange de cellulase/hémicellulase afin de les liquéfier puis filtrés et centrifugés dans des conditions permettant d'obtenir un produit contenant les cellules dont on pourra extraire l'ADN. Les échantillons contenant la plupart du temps des inhibiteurs de la Taq Polymérase, il est nécessaire de prévoir une étape permettant de diminuer l'activité des inhibiteurs, soit par dilution, soit par traitement de l'échantillon au phénol-chloroforme et précipitation à l'alcool. Bien que la présente invention soit plus particulièrement destinée à l'industrie agro-alimentaire, il est évident qu'elle pourra également être utilisée afin de mettre en évidence les microorganismes en cause dans d'autres échantillons qui pourraient n'avoir aucun rapport avec l'industrie agro-alimentaire. Enfin, la présente invention concerne des amorces telles que définies précédemment ainsi que des trousses de détection mettant en oeuvre lesdites amorces. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples ci-après. EXEMPLE 1 - PROCEDE D'EXTRACTION D'ADN ET D'AMPLIFICATION 1) A partir d'environ 5 mm2 de mycelium de champignon, 105 spores de champignon ou 106 cellules de levure: - dans un microtube à vis (type Eppendorf 1,5 ml), mise en suspension des microorganismes dans 200 l de tampon Tris 50 mM EDTA 20 mM SDS 0,8 %, pH 8,5, auxquels sont ajoutés 100 ,al de billes de verre (diamètre 0,25 - 0,5 mm), - vortexer 1 minute à fréquence maximum, - incubation du mélange pendant 15 minutes à 100 C (eau bouillante), * pour le traitement des spores, on remplace le vortexage et l'incubation par - congélation dans N2 liquide, ébullition 100"C 5 minutes, - recongélation dans N2 liquide, ébullition 100 C 10 minutes, - centrifugation 1 minute à 10 000 g (centrifugeuse de paillasse), - récupération du surnageant, - dilution du surnageant par 10 dans l'eau. Ce surnageant dilué est utilisé directement pour l'amplification. II) L'amplification est faite dans un volume final de 25 Fl contenant 20 mM Tris-HCl pli 8,5, (NlS4)2SO4 16 mPçI, MgCl2, 2,5 mM, 150 Fg/ml de sérum albumine bovine, 0,2 I1M de chaque dNTP et 100 zM de chacun des oligo nucléotides amorce. Deux unités de Taq DNA polymérase (BioTaq, Bioprobe systems, France) sont utilisées par réaction.La réaction d'amplification est effectuée dans le thermocycler perkin Elmer 2400 (Perkin Elmer Corp., USA) de la façon suivante - pour Zygosaccharomyces, Byssochlamys et Neosartoria .15 secondes à 94"C .10 secondes à 58 C .20 secondes à 72"C Ce cycle est répété 30 fois. Il est suivi par une élongation terminale de 5 minutes à 72"C. III) Les produits obtenus sont visualisés sous UV après migration sur gel d'électrophorèse de composition suivante : tampon TBExî, Bromure d'éthidium 1 lg/ml, agarose 0,8 %. EXEMPLE 2 Ci-après on trouvera les résultats observés par mise en oeuvre du procédé selon la présente invention sur différentes souches proches des souches à détecter montrant l'excellente discrimination apportée par les jeux d'amorces revendiqués. Les amorces utilisées sont - SEQID 7 et 8 pour Byssochlamys nivea, - SEQID 9 et 10 pour Neosartorya fischeri, - SEQID 11 et 12 pour Zygosaccharomyces bailli. Il convient de noter que A. fumigatus répond à la sonde car il s'agit de la forme asexuée de N. fischeri. Olizonucléotides-amorce spécifiques de Neosartoria fischeri Genre Espèce Souche T an. Réponse PCR Aspergillus floriformis M 93 2663 57 C négative Aspergillus fumigatus M 70 665 57 C positive Aspergillus fumigatus M 88 2521 57 C positive Byssochlamys nivea M 90 1496 57 C négative Byssochlamys nivea M 93 2932 57 C négative Emericella nidulans M 88 2519 57 C négative Ernericella nidulans var.acristata M 842558 57 C négative Emericella nidulans var.dentata M 842556 57 C négative Emericella nidulans var.lata M 68 1987 57 C négative Emericella nidulans var.shinulata M 849557 57 C négative Eupenicillium brefeldianum M 892573 57 C négative Eurotium amstelodami M 50 142 57 C négative Eurotium amstelodami M 88 2536 57 C négative Eurotium repens M 662534 57 C négative Mariannae elegans M 95 3777 57 C négative Monascus ruber M 65 1079 57 C négative Neosartoria fennelliae M 93 2982 57 C positive Neosartoria fennelliae M 95 3781 57 C positive Neosartoria fennelliae M 953780 57 C positive Neosartoria pseudofischeri M 93 2986 57 C positive Neosartoria pseudofischeri M 953784 57 C positive Neosartorya aurata M 93 2980 57 C positive Neosartorya aureola M 90 3623 57 C positive Neosartorya aureola M 93 2981 57 C positive Neosartorya aureola M 95 3785 57 C positive Neosartorya fennelliae M 93 2983 57 C positive Neosartorya fischeri M 902660 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 882482 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 892707 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 90 3618 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 90 3619 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 903620 57 C positive Neosartorya fischeri var.fischeri M 90 3621 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 87 3513 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 88 2480 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 883577 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 903622 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 92 2891 57 C positive Neosartorya fischeri var.glabra M 92 2925 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 882480 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 88 3574 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 90 2749 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 92 2862 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 92 2910 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 92 2924 57 C positive Neosartorya fischeri var.spinosa M 93 2935 57 C positive Neosartorya hiratsukae M 95 3782 57 C positive Neosartorya quadricincta M 93 2984 57 C positive Neosartorya quadricincta M 95 3786 57 C positive Neosartorya spathulata M 93 2978 57 C positive Neosartorya spathulata M 93 2979 57 C positive Neosartorya stramenia M 93 2985 57"C positive Neosartorya tatenoï M 95 3783 57 C positive Paecilomyces carneus M 52907 57 C négative Paecilomyces carneus M 95 3776 57 C négative Paecilomyces elegans M 79 1670 57 C négative Paecilomyces farinosus M 75 3028 57 C négative Paecilomyces fumoso-roseus M 52 597 57 C négative Paecilomyces inflatus M 57 1387 57 C négative Paecilomyces javanicus M 69 3302 57C négative Paecilomyces javanicus M 90 2684 57 C négative Paecilomyces lilacinus M 2689 57 C négative Paecilomyces lilacinus M 70 3099 57 C négative Paecilomyces marquandii M 50 85 57 C négative Paecilomyces niphetodes M 79 3238 57"C négative Paecilomyces niphetodes M 95 3778 57 C négative Paecilomyces variotii M 93 3701 57C négative Paecilomyces zolerniae M 93 3648 57C négative Penicillium chrysogenum M 47 673 57C négative Penicillium islandicum M 73 2233 57"C négative Penicillium islandicum M 73 2233 57C négative Penicillium purpurogenum M 90 2600 57 C négative Penicillium variabile M 78 3162 57 C négative Penicillium viridicatum M 88 2485 57 C négative Talaromyces bacilliformis M 88 1497 57 C négative Talaromyces bacilliformis M 88 2511 57 C négative Talaromyces bacilliformis M 90 1493 57 C négative Talaromyces bacilliformis M 902646 57 C négative Talaromyces bacillisporus M 88 2511 57 C négative Talaromyces flavus M 83 1179 57 C négative Talaromyces flavus M 88 2481 57 C négative Talaromyces flavus M 89 1489 57 C négative Talaromyces flavus M 93 2944 57 C négative Talaromyces helicus var. helicus M 882510 57 C négative Talaromyces luteus M 61 1858 57 C négative Talaromyces sp. M 92 2885 57"C négative Talaromyces sp. M 92 2887 57 C négative Talaromyces sp. M 92 2888 57 C négative Thermoascus crustaceus M 88 2540 57 C négative Les souches proviennent du Museum National d'Histoire Naturelle de Paris Olizonucléotides-amorce spécifiques de Zygosaccharmoyces bailii Genre Espèce Souche T an.Réponse PCR Candida inconspicua M EGO 50 C négative Candida magnoliae M E14 50"C négative Candida mogii M 95 3795 55 C négative Clavispora lusitaniae M E9 50 C négative Clavispora lusitaniae SIAS 58 C négative Cytofilobasidium M E13 50"C négative Debaryomyces hansenii SIAS 58 C négative Debaryomyces hansenii M E18 50 C négative Hyphopichia M E6 50"C négative Kluyveromyces marxianus M 95 3788 55 C négative var.lactis Kluyveromyces marxianus M 95 3789 55"C négative var.lactis Kluyveromyces marxianus M 95 3790 55 C négative var.marxianus Kluyveromyces marxianus M 95 3791 55"C négative var.marxianus Kluyveromyces var.lactis P 8 57 C négative Moniliella M E2 50 C négative Pichia anomala M E12 50 C négative Pichia anomala SIAS 58 C négative Pichia fermentans SIAS 58 C négative Pichia guilliermondii SIAS 58 C négative Pichia guilliermondii M E17 50 C négative Pichia pastoris M 95 3792 55 C négative Pichia pastoris M 95 3793 55 C négative Rhodoturola mucilaginosa M E15 50 C négative Saccharomyces bayanus M 95 3796 55 C négative Saccharomyces bayanus P 562 57 C négative Saccharomyces bayanus P 563 57 C négative Saccharomyces capsularis M 95 3807 55 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5035 57 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5090 57 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5130 57 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5160 57 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5200 57 C négative Saccharomyces cerevisiae H 5334 57 C négative Saccharomyces cerevisiae M E16 50"C négative Saccharomyces cerevisiae P 1 57 C négative Saccharomyces cerevisiae P 575 57 C négative Saccharomyces cerevisiae SIAS 58 C négative Saccharomyces exiguus M 95 3797 55 C négative Saccharomyces kluyveri M 95 3798 55 C négative Saccharomyces ludwigii M 95 3806 55 C négative Saccharomyces servazii M 95 3799 55 C négative Saccharomyces stellatus M 95 3803 55 C négative Saccharomyces stellatus M 95 3804 55 C négative Saccharomyces unisporus M 95 3805 55 C négative Schyzosaccharomyces pombe H 5096 57"C négative Souche osmophile H 1 1 077 57 C négative Souche osmophile H 37080 57 C négative Torulaspora delbruckii M 953794 55 C négative Torulaspora delbruckii Pu121 57 C négative Torulaspora delbruckii SIAS 58 C négative Trichosporum capitatum SIAS 50 C négative Zygosaccharomyces bailii M 90 2638 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 90 2639 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922895 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922896 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2897 58"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2899 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922900 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922901 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922902 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2903 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2904 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2905 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2906 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2907 55"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2908 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 922909 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2911 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2912 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2913 58"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2914 55"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2915 58"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2916 55"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2917 58 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2918 58"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2920 55"C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2921 55 C positive Zygosaccharomyces bailii M 92 2922 58"C positive Zygosaccharomyces bailii M 922923 58 C positive Zygosaccharomyces bailii ME11 55"C positive Zygosaccharomyces bailii P L443 58 C positive Zygosaccharomyces bisporus DBVPG 6382 58"C négative Zygosaccharomyces cidri DBVPG 6385 55"C négative Zygosaccharomyces fermentati DBVPG 6297 55C négative Zygosaccharomyces florentinus DBVPG 6186 55 C négative Zygosaccharomyces rnicroellipsoides DBVPG 6188 55 C négative Zygosaccharomyces mrakii DBVPG 6289 55 C négative Zygosaccharomyces rouxii MUCL 30008 55"C négative Zygosaccharomyces rouxii SIAS 58 C négative PROVENANCE DES SOUCHES DBVPG: Dipartemento di Biologia Vegetale Perugia (Italie) H: Société Heudebert M:Museum National d'Histoire Naturelle de Paris MUCL Mycothèque de l'Université Catholique de Louvains P: Société Pernod-Ricard SIAS: Société SIAS france LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: UNIR (B) RUE: 46 RUE DU BAC (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75007 (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 12 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 186 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: CCGAGTGCGG GTCCCTCGTG CCCCAACCTC CAACCCGTGT TGACCGACAC CTGTTGCTTC 60 GGCGGGCCCG CCCATGGGCT CCCGCCCGGC CGCCGGGGGG CCTCGTCGCC CCCGGGCCCG 120 CCGCCCGCCG AAGACCCCTC GAACGCTGCC TTGAAGGTTG CCGTCTGAGT ATAAAATCAA 180 TCGTTA 186 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 187 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2: GCTAACCCTC CAGCCCGGCT GGTGTGTTGG GCCGCCGTCC CCTCCGGGGG ACGGGCCCGA 60 AAGGCAGCGG CGGCGCCGTC CGGTCCTCGA GCGTATGGGG CTTTGTCACA CGCTCTGGTA 120 GGCCCGGCCG GCTTGCTGGC AAACGACCTC ACGGTCACCT AACTTCTCTC TTAGGTTGAC 180 CTCGGAT 187 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 183 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 3: CCGAGTGAGG GCCTCTGGGT CCAACTTCCC ACCCGTGTCT ATCGTACCTT GTTGCTTCGG 60 CGGGCCCGCC GTTTCGACGG CCGCCGGGGA GGCCTCGCGC CCCCGGGCCC GCGCCCGCCG 120 AAGACCCCAA CATGAACGCT GTTCTGAAAG TATGCAGTCT GAGTTGATTA TCATAATCAG 180 TTA 183 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 176 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4: GCTGCCCTCA GGCACGGCTT GTGTGTTGGG CGTCCCCTCT CCCGGGAACG GGCCCGAAAG 60 GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG CGTATGGGGC TTTGTCACCC GCTCTGTAGG 120 CCCGGCCGGC GCCAGCCGAC ACCCAACTTT ATTTCTAAGG TTGACCTCGG ATCAGG 176 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 279 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TAGAAAAATT TCTGATTGAC GAGTCTGGAG CAGTTGTGTT CTTTCTGTTT TTTTTAAGGC 60 CTGCGCTTAA TTGCCGTCTA GAGCGGAGGG AGTTAAGCAT AGTTGCCTTT GGCTTTCAAT 120 TTACACACAG TGGAGTTTCT ACTTTTTTTA TTCTTCTTTG GGAGGATGGG TTCGTCCCGC 180 TCCCAGAGGT AAACACAAAC AATTTTTTTT ATTTTATTTT ATTTTATTAT TATAATAATA 240 ATAATACAGT CAAAACGAAT ACTAAAAAAA AAATATTCA 279 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 237 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6: CCTTCTCAAA CATTCGTGTT TGGTAGTGAG TGATACTCTG TTTTATATTT GGGTTAACTT 60 GAAATTGCAA GCCTTTTGGG ACGCGTGTGG GTGAGTTTTA GGCCGGAAAC GTCTTGCTCT 120 CCTCTTTCCT AACCAAATGT CGTATTAGGT TTTACCGACT CCGACAGACG GGACTAGGAG 180 ATTGGGTGAG TGATAGCAAT ATCGAGCTCT GCCTAATTTT TTTTTTTGCG CGCCTTG 237 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GGTTGCCGTC TGAGTATAAA ATCAA 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8: GAAGTTAGGT GACCGTGAGG TCGTT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: AAGACCCCAA CATGAACGCT GTTCT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TCCGAGGTCA ACCTTAGAAA TAAAGTT 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: TAGAGCGGAG GGAGTTAAGC ATAGT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TGGTTAGGAA AGAGGAGAGC AAGAC 25 REVENDICATIONS 1) Procédé permettant la mise en évidence de Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri et Zygosaccharomyces bailii par amplification de l'ADN génomique des microorganismes ciblés en utilisant comme amorce une séquence comprise dans les espaceurs transcrits internes (ITS) de l'unité ribosomique - pour Byssochlamys nivea, - sur ITS1 correspondant à SEQID 1, - sur ITS2 correspondant à SEQID 2, - pour Neosartorya fischeri, - sur ITS1 correspondant à SEQID 3, - sur ITS2 correspondant à SEQID 4, - pour Zygosaccharomyces bailii - sur ITS1 correspondant à SEQID 5 - sur ITS2 correspondant à SEQID 6. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans les séquences ITS1 et ITS2 on choisit plus particulièrement, - pour Byssochlamys nivea les séquences SEQID 7 et 8, - pour Neosartorya fischeri les séquences SEQID 9 et 10, - pour Zygosaccharomyces bailii les séquences SEQID 11 et 12. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée par la méthode PCR. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 pour la mise en évidence de ces microorganismes dans des produits agro-alimentaires, notamment des produits agro-alimentaires à base de fruits et plus particulièrement des produits alimentaires à base de fraises, dans lequel on prétraite l'échantillon contenant les fruits afin de libérer et concentrer les spores ou les cellules, de diminuer ou de supprimer l'action des inhibiteurs de la Taq Polymérase et d'extraire l'ADN des spores ou des cellules. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les échantillons contenant les fruits sont traités par un mélange de cellulase/hémicellulase afin dc les liquéfier, puis filtrés et centrifugés dans des conditions permettant d'obtenir un produit contenant les cellules dont on pourra extraire l'ADN. 6) Amorce ayant une séquence choisie dans les séquences SEQ ID 1 à 12. 7) Trousse de détection par amplification d'ADN et destinée à la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle comporte des amorces selon la revendication 6.