Brevet FR2726912A1 — publié le 19960515

La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer un anticorps d'antistreptolysine O. Plus particulièrement,la présente invention vise un procédé pour déterminer immunologiquement un anticorps d'antistreptolysine O, qui consiste à mettre en contact une solution d'échantillon d'essai contenant un anticorps d'antistreptolysine 0 avec un agent de liaison capable de lier spécifiquement l'anticorps d'antistreptolysine O à celui-ci, de façon à lier sélectivement l'anticorps d'antistreptolysine 0 à l'agent de liaison par une réaction antigène-anticorps, et à déterminer une quantité de l'anticorps d'antistreptolysine O liée à l'agent de liaison, dans lequel procédé l'agent de liaison comprend un support de streptolysine O immobilisée obtenu par mise en contact d'une solution contenant de la streptolysine 0 avec un support ayant immobilisé sur lui au moins un stéroïde spécifique. L'agent de liaison à utiliser dans le procédé de la présente invention est capable de lier spécifiquement à lui l'anticorps d'antistreptolysine O, de sorte que la détermination d'un anticorps d'antistreptolysine O peut être facilement réalisée avec une précision et une spécificité élevées. En outre, le procédé de la présente invention ne nécessite pas l'utilisation d'érythrocytes, qui sont instables et ont différentes qualités en fonction du lot d'érythrocytes. Etant donné les avantages ci-dessus mentionnés, le procédé de la présente invention permet l'automatisation de la détermination précise et spécifique de l'anticorps d'antistreptolysine O, ce qui diffère des procédés de détermination classiques qui ne peuvent pas être utilisés pour automatiser la détermination précise ou spécifique de l'anticorps d'antistreptolysine O. Le procédé de la présente invention peut être avantageusement utilisé pour le diagnostic d'une infection avec des streptococci hémolytiques du groupe A. On fera ci-après une description de l'état connu de la technique. 2 2726912 L'anticorps d'antistreptolysine O est un anticorps contre la streptolysine O. La streptolysine O est une toxine (qui est un élément du groupe des cytolysines bactériennes activées par thiol) produite, par exemple, par les streptococci hémolytiques du groupe A classés suivant la classification sérologique de Lancefield (voir Lancefield, R.C., J. Exp. Med., Vol. 57, pp. 571-595, 1933), et est généralement connue comme étant une protéine ayant un poids moléculaire compris dans l'intervalle 50 000 à 70 000. La streptolysine O est connue comme interagissant avec le cholestérol et les stérols correspondants (voir Prigent, D. et autres, BBA, Vol. 443, pp.288-300, 1976), et exerce des effets cytolytiques sur un large spectre de cellules mammaliennes. La streptolysine O lyse les érythrocytes, habituellement sous des conditions réductrices, par exemple, en présence de mercaptoéthanol, sous l'effet d'une interaction avec le cholestérol de membrane. Il est connu que le niveau d'anticorps d'antistreptolysine O s'élève dans le sérum d'un patient infecté par des streptococci hémolytiques du groupe A. Les streptococci hémolytiques du groupe A sont des microorganismes pathogènes qui causent diverses maladies comprenant la tonsillite, la pharyngite, la purulence de la peau et la scarlatine, ainsi que des maladies secondaires, telles que les rhumastimes articulaires aigus, la glomérulonéphrite, et analogues. La plupart de ces maladies ne manifeste pas de symptômes cliniques spécifiques à partir desquels les microorganismes pathogènes provoquant les maladies peuvent être identifiés et, par conséquent, pour le diagnostic clinique des infections avec des streptococci hémolytiques du groupe A, la confirmation de la présence d'un anticorps d'antistreptolysine O et la détermination du titre d'anticorps ont généralement été utilisées [voir Tomika Nagata, "Rinshokensa (Laboratory Examinations)", Vol. 23, Supplementary Edition, pp.1172-1175, 1979]. Comme méthodes pour la détermination du titre d'antistreptolysine O, la méthode Rantz-Randall utilisant des 3 2726912 érythrocytes de lapin, des érythrocytes de mouton ou des érythrocytes humains type O (voir L.A. Rantz et autres, Proc. Soc.Exp. Biol. Med., Vol. 59, pp. 22-25, 1945), ainsi qu'une modification de la méthode RantzRandall, c'est-à-dire la méthode de microtitrage (voir Edwards, E.A.; J. Bacteriol., Vol. 87, p.1254-1255, 1964), ont été, d'une manière classique, largement utilisées dans des essais ou dosages de routine. Les deux méthodes de détermination sont basées sur le principe qu'un anticorps d'antistreptolysine O dans une solution d'échantillon d'essai neutralise l'activité hémolytique de la streptolysine O. Les streptococci hémolytiques, groupe A, qui ont infecté des corps vivants produisent non seulement de la streptolysine O mais également divers autres antigènes, tels que la toxine érythrogène, la streptokinase, la streptodornase, l'hyaluronidase, la ribonucléase et la neuraminidase et, en outre, divers anticorps contre ces antigènes se produisent dans le sang [voir "Rensakyukin- kansensho II: Sono Kiso-to- Rinsho (Streptococcicosis, Volume II: the basic and clinical)"; édité par Yuichi Shiokawa, Morimasa Yoshioka et Shigeyuki Hamada; pp. 317- 359, Hirokawa Shoten K.K., Japon, 25 Juin 1992]. Cependant, étant donné que les méthodes de détermination ci-dessus utilisent la caractéristique d'activité hémolytique de la streptolysine O, la streptolysine 0 à utiliser comme réactif pour les méthodes de détermination ci-dessus n'a pas besoin d'être nécessairement une streptolysine O purifiée, et dans les méthodes de détermination ci-dessus, la streptolysine O non purifiée peut être utilisée pour reconnaître spécifiquement et déterminer seulement l'anticorps contre la streptolysine O, c'est-à-dire l'anticorps d'antistreptolysine O, parmi les anticorps contre un certain nombre d'antigènes [Fujimoto et autres, "Rhinsho-byori (Clinical Pathology)", Vol. 40, pp.21-27, 1992]. Cependant, ces méthodes de détermination exigent l'utilisation d'érythrocytes frais. Les érythrocytes sont instables et différents en qualité entre les différents lots, 4 2726912 de sorte que ces méthodes de détermination utilisant des érythrocytes sont très probablement instables. En outre, ces méthodes de détermination impliquent nécessairement des opérations compliquées. Par conséquent, il est très difficile d'automatiser ces méthodes de détermination (voir demande de brevet européen publiée No. 0 475 786 A2 correspondant à la demande de brevet japonaise non examinée et publiée No. Hei 6-186233). Dans les années récentes, une méthode de détermination pour le dosage d'anticorps d'antistreptolysine O qui est basée sur le principe de l'immunoagglutination et utilise un support (tel que des particules de latex colloïdal) ayant de la streptolysine O immobilisée sur lui, a été utilisée [voir T. Miura et autres, "Eisei-kensa (Hygienic Examinations)", Vol. 36, pp 36-40, 1987]. Cette méthode de détermination classique utilisant un support de streptolysine O immobilisée est perfectionnée en ce que des érythrocytes instables n'ont pas besoin d'être utilisés et en ce que cette méthode peut être automatisée, ce qui diffère des méthodes de détermination classiques susmentionnées utilisant comme critère l'activité hémolytique de la streptolysine O. Cependant, la méthode de détermination classique utilisant un support de streptolysine O immobilisée possède les désavantages suivants. La streptolysine O est généralement préparée à partir d'un mélange de culture de streptococci hémolytiques, groupe A. Il est très difficile d'obtenir une streptolysine O hautement purifiée à partir d'un tel milieu de culture, de sorte que la streptolysine O obtenue d'un tel milieu de culture de streptococci hémolytiques groupe A contient habituellement une grande variété d'autres antigènes produits par les streptococci hémolytiques groupe A. Par conséquent, lorsqu'une telle streptolysine O est immobilisée sur un support, d'autres antigènes produits par les streptococci hémolytiques groupe A sont également immobilisés sur le support en même temps que la streptolysine O. Ainsi, le titre d'anticorps qui peut être obtenu par la méthode de détermination classique en utilisant 2726912 le support de streptolysine O immobilisée susmentionné est celui qui est obtenu pour tous les anticorps qui réagissent avec les divers antigènes immobilisés sur le support. Dès lors, cette méthode de détermination classique utilisant un support de streptolysine O immobilisée pose un problème en ce qu'elle n'est pas satisfaisante quant à la spécificité de réaction vis-à-vis de l'anticorps d'antistreptolysine O [voir Fujimoto et autres.,"Rinsho-byori (Clinical Pathology)", Vol. , pp.21-27, 1992]. Etant donné ces situations, on a désiré développer une méthode de détermination qui résoud les problèmes accompagnant les méthodes classiques pour la détermination d'un anticorps d'antistreptolysine O. Autrement dit, on a désiré développer un procédé pour la détermination d'un anticorps d'antistreptolysine O, qui peut être utilisé pour déterminer facilement et précisément l'anticorps d'antistreptolysine O avec une spécificité de réaction élevée, et qui peut être réalisé selon une opération automatisée aussi bien que selon une opération manuelle. On résumera maintenant l'invention dans ce qui suit. Les présents inventeurs ont fait des études intensive et exhaustive en vu de résoudre les problèmes susmentionnés de l'art antérieur. Il en a résulté qu'ils ont trouvé d'une manière inattendue qu'en mettant en contact une solution contenant de la streptolysine O avec un support sur lequel est immobilisé chimiquement ou physiquement au moins un stéroïde représenté par la formule (1): Ri R2 (1) OH 6 2726912 o R1 est choisi dans le groupe comprenant une fraction ou partie chaîne latérale du cholestérol et une fraction ou partie chaîne latérale de l'acide cholique, o chacune des fractions de chaîne latérale est indépendamment non substituée ou substituée et indépendamment saturée ou non saturée; R2 est hydrogène ou hydroxyle; et chaque trait pointillé représente indépendamment une simple liaison ou pas de liaison, de telle façon que chaque trait pointillé et un trait plein adjacent à celui-ci forment ensemble indépendamment une double liaison ou une simple liaison; seulement la streptolysine O dans la solution peut être sélectivement immobilisée sur le support, ce qui permet d'obtenir un support de streptolysine O immobilisée, et on a trouvé que la streptolysine O immobilisée possède encore la capacité de réagir à un anticorps d'antistreptolysine O et est capable de lier spécifiquement l'anticorps d'antistreptolysine o à celle- ci. Ils ont également trouvé qu'en utilisant le support ci-dessus de streptolysine O immobilisée, la détermination spécifique d'un anticorps d'antistreptolysine 0 peut être conduite de façon facile et précise. La présente invention a été effectuée sur la base des découvertes ci-dessus. Par conséquent, c'est un but principal de la présente invention que de proposer un procédé pour déterminer immunologiquement un anticorps d'antistreptolysine O, qui peut être utilisé pour déterminer un anticorps d'antistreptolysine O spécifiquement, précisément et facilement et peut être réalisé non seulement par une opération manuelle mais également par une opération automatisée. Ce qui précède ainsi que d'autres buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront pour les familiers de la technique dans la description et les dessins qui suivent en se réfèrant aux dessins annexes dans lesquels: - la figure 1 montre des motifs d'électrophorèse obtenus dans l'exemple 1, comprenant un motif (colonne 3) 7 2726912 obtenu en soumettant à une électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS, un mélange réactionnel qui est obtenu par mise en contact d'une solution contenant de la streptolysine O avec un support ayant du cholestérol immobilisé sur lui; - la figure 2 est un graphique montrant les résultats d'un essai conduit dans l'exemple 2 pour détecter un complexe immun de streptolysine O immobilisée avec un anticorps d'antistreptolysine O. La partie en forme de T à l'extrémité avant de chaque barre représente un intervalle d'erreur; - la figure 3 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage utilisée dans l'exemple 3, illustrant la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine O et l'absorbance à 590 nm, dans lequel la courbe d'étalonnage a été obtenue par la méthode de la présente invention, en utilisant une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O comme solution d'échantillon d'essai et en utilisant des particules de latex-de streptolysine O immobilisée comme agent de liaison; - la figure 4 est un diagramme montrant la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé dans l'exemple 3 par la méthode de la présente invention en utilisant des particules de latex de streptolysine O immobilisée comme agent de liaison, et le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé par la méthode Rantz-Randall; - la figure 5 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage utilisée dans l'exemple 4, illustrant la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine 0 et l'absorbance à 405 nm, dans lequel la courbe d'étalonnage a été obtenue par la méthode de la présente invention, en utilisant une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O comme solution d'échantillon d'essai et en utilisant une plaque de microtitrage de streptolysine O immobilisée comme agent de liaison; et la figure 6 est un diagramme montrant la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine 0 déterminé dans l'exemple 4 par la méthode de la présente invention en utilisant une plaque de microtitrage de streptolysine 0 8 2726912 immobilisée comme agent de liaison et le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé par la méthode Rantz-Randall. On fera ci-après une description détaillée de l'invention. Il est essentiellement proposé, selon la présente invention, un procédé pour déterminer immunologiquement un anticorps d'antistreptolysine O, qui consiste à: (a) mettre en contact une solution d'échantillon d'essai contenant un anticorps d'antistreptolysine O avec un agent de liaison capable de lier spécifiquement l'anticorps d'antistreptolysine O à celui-ci, pour sélectivement lier l'anticorps d'antistreptolysine 0 à l'agent de liaison par une réaction antigène-anticorps; et (b) déterminer une quantité de l'anticorps d'antistreptolysine 0 liée à l'agent de liaison, l'agent de liaison comprenant un support de streptolysine O immobilisée obtenu par mise en contact d'une solution contenant de la streptolysine 0 avec un support ayant immobilisé sur lui au moins un stéroïde représenté par la formule (1): R1 R2l (1) OH o R1 est choisi dans le groupe comprenant une fraction ou partie chaîne latérale du cholestérol et une fraction ou partie chaîne latérale de l'acide cholique, o chacune des fractions de chaîne latérale est indépendamment non substituée ou substituée et indépendamment saturée ou 9 2726912 insaturée; R2 est hydrogène ou hydroxyle; et chaque trait pointillé indépendamment représente une simple liaison ou pas de liaison, de telle sorte que chaque trait pointillé et un trait plein adjacent forment indépendamment ensemble une double liaison ou une simple liaison. Dans R1 de la formule (1), qui est choisi dans le groupe comprenant une fraction de chaîne latérale du cholestérol et une fraction de chaîne latérale de l'acide cholique, chacune des fractions ou parties de chaîne latérale est indépendamment non substituée ou substituée avec hydroxyle, un alkyle inférieur ayant de 1 à 4 atomes de carbone, préférablement 1 à 2 atomes de carbone, ou un acyle inférieur ayant de 2 à 4 atomes de carbone, de préférence 2 à 3 atomes de carbone et indépendamment saturée ou insaturée avec une ou deux doubles liaisons. Un exemple particulier d'une telle fraction de chaîne latérale de cholestérol est un groupe représenté par la formule (2): R3 R,4 (2) P1R5 o R3 est hydrogène, hydroxyle, un alkyle inférieur ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence 1 à 2 atmes de carbone, ou un acyle inférieur ayant de 2 à 4 atomes de carbone, de préférence 2 à 3 atomes de carbone; R4 est hydrogène, hydroxyle, un alkyle inférieur ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence 1 à 2 atomes de carbone, ou un acyle inférieur ayant de 2 à 4 atomes de carbone, de préférence 2 à 3 atomes de carbone; R5 est hydrogène, hydroxyle, un alkyle inférieur ayant de i à 4 atomes de carbone, de préférence i à 2 atomes de carbone, ou un acyle 2726912 inférieur ayant de 2 à 4 atomes de carbone, de préférence 2 à 3 atomes de carbone; et chaque trait pointillé indépendamment représente une simple liaison ou pas de liaison, de telle sorte que chaque trait pointillé et un trait plein adjacent forment indépendamment ensemble une double liaison ou une simple liaison. Suivant des exemples préférés, d'un tel groupe de formule (2), chacun des R3 et R4 est hydrogène et R5 est hydrogène, hydroxyle, méthyle ou éthyle. Des exemples spécifiques préférés de groupes de formule (2) comprennent les fractions de chaîne latérale correspondantes de cholestérol, 0-sitostérol, stigmastérol, campestérol, ergostérol, cérébrostérol et desmostérol. Un exemple spécifique d'une telle fraction de chaîne latérale d'acide cholique est un groupe représenté par la formule (3): t--- COOH (3) o le trait pointillé représente une simple liaison ou pas de liaison, de telle sorte que le trait pointillé et le trait plein adjacent forment ensemble une double liaison ou une simple liaison. Des exemples spécifiques de stéroïdes représentés par la formule (1) comprennent le cholestérol, le 7- déhydrocholestérol, le cholestanol, le coprostanol, le A7- cholesténol, le A7-coprosténol, le 0-sitostérol, le 7- déhydro-p-sitostérol, le stigmastérol, le 7- déhydrostigmastérol, le campestérol, le 7-déhydrocampestérol, le stigmastanol, le A7-stigmasténol, le lla-hydroxy- cholestérol, le A22-stigmasténol, l'c-spinastérol, le campestanol, le A7-campesténol, le 20a-hydroxycholestérol, le brassicastérol, l'ergostérol, le cérébrostérol, le 7- déhydrocérébrostérol, le cérébrostanol, le A7-cérébrosténol, 11 2726912 le desmostérol, le 7-déhydrodesmostérol, l'acide 3p- hydroxycholanique, et l'acide 33-hydroxy-A5-cholénique. Des exemples préférés de stéroides de formule (1) comprennent le cholestérol, le 7-déhydrocholestérol, le cholestanol, le coprostanol, le A7-cholesténol, le A7- coprosténol, le 3- sitostérol, le 7-déhydro-p-sitostérol, le stigmastérol, le 7- déhydrostigmastérol, le campestérol et le 7-déhydrocampestérol. Parmi ces stéroïdes, les plus préférés sont le cholestérol, le 7- déhydrocholestérol, le cholestanol le coprostanol, le A7-cholesténol, et le A7-coprosténol. Ces stéroides peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison. Le stéroïde de formule (1) peut être immobilisé sur la surface du support par une méthode bien connue dans la technique. Par exemple, l'immobilisation du stéroïde sur un support peut être réalisée par adsorption physique du stéroide sur une surface du support ou par liaison chimique d'un dérivé réactif du stéroïde sur une surface du support, laquelle surface a un groupe fonctionnel réactif avec le dérivé ou bien est activée pour être réactive avec le dérivé. Dans la méthode de la présente invention, on préfère que le stéroïde immobilisé soit présent suivant une quantité comprise entre 0,025 nmole/cm2 et 250 nmole/cm2, plus préférablement entre 0,25 nmole/cm2 à 25 nmole/cm2 eu égard à la surface spécifique du support. Pour ce qui concerne le matériau, la morphologie, les dimensions et analogues du support à utiliser dans le procédé de la présente invention, il n'y a aucune limitation particulière pour autant que le procédé de la présente invention puisse être réalisé de façon satisfaisante. Des exemples de matériaux pour les supports comprennent des polymères tels que le polystyrène, le polyethylene, le polypropylene, un copolymère acrylonitrile-butadiène-styrène, un copolymère butadiène- styrène, un polycarbonate, le chlorure de polyvinyle, le chlorure de polyvinylidène, un polyamide, un polyméthylméthacrylate, un polyméthylpentène, un polyacétal, un polyvinylacétate, un polyvinylalcool, un 12 2726912 polyvinyl butyral, un polyisobutylène, un copolymère vinyl chlorure- vinyl acétate, une résine fluoro (polytétrafluoroéthylène, un copolymère tétrafluoroéthylène- éthylène, un copolymère perfluoroalcoxy, ou analogues), du polyacrylonitrile, du polystyrène acrylate, du polyethylene, téréphtalate, du polybutylène téréphtalate, du polyuréthane une résine d'urée, une résine époxy, une résine mélamine, une résine phénolique, une résine de polyester insaturée, une résine de silicone, la nitrocellulose, l'acétate de cellulose, le buyrate acétate de cellulose, le propionate acétate de cellulose, le propionate de cellulose, l'éthylcellulose, le carboxyméthylcellulose et le difluorure de polyvinylidène; et des polymères contenant un groupe fonctionnel obtenus par exemple par un procédé suivant lequel dans la production des polymères susmentionnés, un composé ayant un groupe fonctionnel, tel que carboxyle, nitrile ou amino primaire ou secondaire, est introduit dans les polymères par copolymérisation, de façon à introduire un tel groupe fonctionnel dans les polymères, ou bien un procédé suivant lequel un tel groupe fonctionnel est introduit sur une surface des polymères susmentionnés par un traitement de surface. D'autres exemples de matériaux pour les supports sont le verre et les métaux. Dans la présente invention, le matériau, la morphologie, les dimensions et analogues du support peuvent être les mêmes que ceux des supports habituellement connus et qui sont usuellement employés dans les procédés de détermination immunologique classiques. On préfère que le support à utiliser dans la présente invention soit une particule colloïdale, un granulé, une bille, une plaque de microtitration, un tube à essai, ou une membrane. Le diamètre d'une particule colloïdale est généralement compris entre environ 0,01 pm à environ 10 pm. Le diamètre d'un granulé n'est généralement pas supérieur à environ 7 mm. Le diamètre d'une bille n'est généralement pas supérieur à environ 10 mm. 13 2726912 Un exemple parmi les procédés spécifiques pour immobiliser le stéroïde de formule (1) sur un support par adsorption physique est expliqué ci-après. Par exemple, lorsqu'une particule de latex colloïdale est utilisée comme support, le stéroïde est mis en contact avec les particules de latex colloïdales dans un solvant hydrophile ou lipophile, très commodément dans l'éthanol ou le méthanol, qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le stéroide sans affecter de manière néfaste la structure ou analogue de la particule de latex colloïdale. Le stéroïde et les particules de latex colloïdales sont alors mis en réaction l'un avec l'autre tout en agitant, en secouant ou bien en laissant au repos généralement entre 0 C et 60 C, de préférence entre 4 C et 30 C, généralement pendant 30 min. à 24 heures, de préférence 1 heure à 10 heures. Ensuite, si on le désire, les particules de latex résultantes ayant le stéroide immobilisé sur elles sont lavées avec de l'eau ou un tampon approprié. Dans la réaction susmentionnée, la concentration des solides, c'est-àdire la concentration des particules de latex dans le système réactionnel est généralement de 0,01 (p/v) % à 10 (p/v) %, de préférence 0,05 (p/v) % à 5 (p/v) %, et la concentration du stéroide dans le mélange réactionnel est généralement de 0,1 pg/ml à 10 mg/ml, préférablement 1 pg/ml à 1 mg/ml. Le système réactionnel peut contenir de l'eau, ou bien peut contenir tout autre solvant pour autant que la structure des particules de latex colloïdales et la réaction ne soient pas affectées de façon néfaste. Des exemples de tels autres solvants sont le chloroforme, l'acétone, l'hexane, le dicholoroéthane, le propanol, l'isopropanol, le xylène, le toluene, le benzene, l'éther, l'éther de pétrole,le méthylacétate et l'éthylacétate. Lorsqu'un granulé ou une bille est utilisé comme support, l'immobilisation du stéroide sur un support peut être conduite par un procédé similaire au procédé susmentionné pour immobiliser le stéroide sur la particule de latex colloïdale, sous des conditions de réaction qui n'affectent pas la structure du granulé ou de la bille, tout 14 2726912 en prenant en considération des facteurs tels que la surface spécifique, le volume et le nombre de granulés ou de billes. En outre, lorsqu'une plaque de microtitrage est utilisée comme support, l'immobilisation du stéroide sur un support peut être conduite, par exemple, selon la méthode suivante. Le stéroïde est dissous, dispersé ou mis en suspension dans un solvant hydrophile ou lipophile, très commodément l'éthanol ou le méthanol, qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le stéroïde sans affecter de manière néfaste la structure ou analogue de la plaque de microtitrage, généralement suivant une concentration de 1 pg/ml à 10 mg/ml, de préférence de 10 pg/ml à 1 mg/ml. Ensuite, la solution, la dispersion ou la suspension obtenue est placée dans les puits de la plaque de microtitrage suivant une quantité généralement comprise entre 25 m1 et M1 par puits, de préférence de 50 pi à 100 M1 par puits, et on la laisse au repos généralement entre 0 C et 60 C de préférence entre 4 C et 30 C, généralement pendant 30 min. à 24 heures, de préférence 1 heure à 6 heures, ce qui permet de réaliser une réaction. Ensuite, les puits sont lavés à l'eau ou un tampon approprié. Dans la réaction ci-dessus mentionnée, le système réactionnel peut contenir de l'eau, ou bien peut contenir tout autre solvant pour autant que la structure de la plaque de microtitrage et la réaction ne soient pas affectées d'une manière néfaste. Des exemples de tels autres solvants comprennent le chloroforme, l'acétone, l'hexane, le dichloroéthane, le propanol, l'isopropanol, le xylène, le toluène, le benzène, l'éther, l'éther de pétrole, le méthylacétate et l'éthylacétate. Un autre exemple de méthode pour immobiliser le stéroïde sur un support est expliqué ci-après. Le stéroïde est dissous, dispersé ou mis en suspension dans un solvant hydrophile ou lipophile, plus convenablement l'éthanol ou le méthanol, qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le stéroïde sans affecter de manière néfaste la structure ou analogue de la plaque de microtitrage, suivant 2726912 une concentration de 100 ng/ml à 1 mg/ml, de préférence de 1 Mg/ml à 100 Mg/ml. Ensuite, la solution, la dispersion ou la suspension obtenue est placée dans les puits de la plaque de microtitration suivant une quantité généralement comprise entre 25 p1 et 200 Ml par puits, de préférence entre 50 p1 et pl par puits, et on la laisse au repos entre 20 C et C, depréférence à une température comprise entre 40 C et C, ce afin d'évaporer et d'éliminer le solvant. Ensuite, les puits sont lavés avec de l'eau ou un tampon approprié. En outre, par exemple, lorsqu'un tube à essai est utilisé comme support, l'immobilisation du stéroïde sur un support peut être réalisée par une métode similaire à la méthode ci-dessus décrite pour immobiliser le stéroïde sur la plaque de microtitration, sous des conditions qui n'altèrent pas la structure du tube à essai, tout en prenant en considération des facteurs tels que le volume interne du tube à essai. En outre, suivant encore un autre exemple, lorsqu'une membrane est utilisée comme support, l'immobilisation du stéroïde sur un support peut être réalisée par exemple par la méthode suivante. Le stéroïde est dissous, dispersé ou mis en suspension dans un solvant hydrophile ou lipophile, d'une manière très appropriée l'éthanol ou le méthanol, qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le stéroïde sans affecter de façon néfaste la structure de la membrane. La solution, dispersion ou suspension obtenue est mise en contact avec la membrane par une méthode habituelle, par exemple une méthode suivant laquelle un buvardage en tâches est utilisé, de sorte que le stéroïde est immobilisé sur la membrane suivant une quantité généralement comprise entre 0,025 nmole/cm2 et 250 nmole/cm2, de préférence entre 0,25 nmole/cm2 et 25 nmole/cm2 eu égard à la surface spécifique de la membrane. Dans la méthode d'immobilisation susmentionnée utilisant un buvardage en tâches, la dimension de la tache n'est pas particulièrement limitée et peut être choisie suivant un intervalle approprié, et la solution, dispesion ou 16 2726912 suspension du stéroïde peut contenir de l'eau, et peut également contenir tout autre solvant pour autant que la structure de la membrane et la réaction ne soient pas affectées de façon néfaste. Des exemples de tels autres solvants sont le chloroforme, l'acétone, l'hexane, le dichloroéthane, le propanol, l'isopropanol, le xylène, le toluène, le benzène, l'éther, l'éther de pétrole, le méthylacétate et l'éthylacétate. La liaison chimique du stéroïde à un support peut être réalisée par un procédé suivant lequel un groupe fonctionnel tel que carboxyle, hydroxyle, thiol, amine primaire, amine secondaire, amido, nitro ou aldéhyde est introduit dans le stéroïde pour ainsi obtenir un dérivé réactif du stéroïde et ensuite, le dérivé réactif obtenu de stéroïde est chimiquement lié à une surface du support, la surface du support ayant un groupe fonctionnel réactif avec le groupe fonctionnel du dérivé réactif de stéroïde ou bien la surface de support étant activée de façon à être réactive avec le dérivé, selon une méthode classique, par exemple une méthode décrite dans "Jikken-to-oyo: Affinity Chromatography (Experiments and Application: Affinity Chromatography)", Chibata, I., Tosa, T., Matsuo, Y.:pp.30-109, Kodansha K.K., Japon, 10 Septembre 1976 ou bien une méthode décrite dans "Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immunoassay)"; édités par Ishikawa, E., Kawai, T., Muroi, K., Troisième Edition, pp.75- 151, Igaku Shoin K.K., Japan, 15 Mai 1987. Un exemple de méthode pour lier chimiquement le stéroïde à un support est expliqué ci-dessous. Un stéroïde représenté par la formule (4): 17 2726912 R6 R7 (4) OH o R6 est choisi parmi le groupe comprenant une partie ou fraction de chaîne latérale de cholestérol et une partie ou fraction de chaîne latérale d'acide cholique, o chacune des fractions de chaîne latérale est indépendamment non substituée ou substituée et saturée; R7 est hydrogène ou hydroxyle; et chaque trait en pointillés représente une simple liaison ou pas de liaison, de telle sorte que chaque trait en pointillés et un trait plein adjacent à celui-ci forment ensemble une double liaison ou une simple liaison, à la condition qu'au moins un trait en pointillés représente une simple liaison, est utilisé comme matériau de départ. Un groupe fonctionnel, tel que carboxyle, amino primaire, amino secondaire, amido, nitro ou aldéhyde est introduit dans le stéroïde de formule (4) par une méthode suivant laquelle un dérivé 5,6-époxy, 7,8-époxy ou 14,15- époxy du stéroïde est préparé et ensuite, un groupe fonctionnel est introduit et lié à la position 6, 7 ou 15 du stéroïde par l'intermédiaire d'une liaison thioéther suivant une réaction d'ouverture de cycle du dérivé époxy du stéroïde, selon une méthode décrite par Hosoda, H., et autres ; Chem. Phar. Bull., Vol. 28, pp.1294-1299, 1980. Ensuite, le dérivé résultant du stéroïde est lié à une surface d'un support, la surface du support ayant un groupe fonctionnel réactif avec le dérivé. 18 2726912 Cette méthode est plus précisément expliquée ci-dessous à titre d'exemple. C'est ainsi que, par exemple, un stéroïde représenté par la formule (4), ayant une double liaison entre les positions 7 et 8, tel que le A7cholesténol, A7-coprosténol, A7-stigmasténol, A7-campesténol ou A7cérébrosténol, est utilisé comme matériau de départ et ensuite, un groupe carboxyle est introduit à la position 7 du matériau de départ pour ainsi obtenir un dérivé réactif du stéroïde. A titre d'exemple, le stéroïde susmentionné comme matériau de départ est mis en contact avec un peroxyde (préférablement un peroxyde d'hydrogène) et un réactif alcalin (préférablement l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium) dans un solvant organique hydrophile (préférablement le méthanol ou l'éthanol) qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le stéroïde, et le mélange résultant est soumis à une réaction tout en agitant, en secouant ou en laissant au repos, généralement à une température entre 0 C et 40 C, de préférence 0 C et 10 C, généralement pendant 30 minutes à 12 heures, de préférence 1 heure à 6 heures pour ainsi obtenir un mélange réactionnel contenant un dérivé époxy du matériau de départ. Ensuite, le mélange réactionnel est neutralisé. La réaction susmentionnée est conduite sous des conditions telles que la concentration du stéroïde comme matériau de départ est généralement comprise entre 0,01 mmole/ml et 1 mmole/ml, de préférence 0,05 mmole/ml et 0,5 mmole/ml, la concentration du peroxyde est généralement comprise entre 0,1 (p/v)% et 10 (p/v)%, de préférence entre 0,5 (p/v)% et 5 (p/v)%, la concentration du réactif alcalin est généralement comprise entre 0,5 (p/v)% et 10 (p/v)%, préférablement entre 1 (p/v)% et 5 (p/v)%, et la teneur en eau est de préférence non supérieure à 20 (v/v)%. L'isolation du dérivé époxy produit peut être conduite suivant une méthode classique décrite par exemple dans "Sei- kagaku Kenkyu-ho I (Methods for Biochemical Research I)", Septième édition; édité par Ando E., Terayama, H., 19 2726912 Nishizawa, K., et Yamakawa, T. et publié par Asakura Shoten K.K. Japon, pp. 49-96 (20 Mars 1973). Ensuite, le dérivé époxy obtenu est mis en contact avec un acide mercaptomonocarboxylique (de préférence l'acide 2- mercaptoacétique, l'acide 3-mercaptopropionique ou analogue) et un réactif alcalin (de préférence hydroxyde de sodium ou hydroxyde de potassium) dans un solvant organique hydrophile, très commodément le méthanol ou l'éthanol, qui peut dissoudre, disperser ou mettre en suspension le dérivé époxy, et le mélange réactionnel est soumis à une réaction tout en agitant, en secouant ou en laissant au repos généralement à une température entre 0 C et 60 C, de préférence 10 C et C, généralement pendant 30 min. à 12 heures, préférablement 1 heure à 6 heures, suivi par un changement de la valeur de pH du milieu réactionnel jusqu'à une valeur dans la zone acide, ce afin d'obtenir un dérivé du stéroîde (qui doit être utilisé comme matériau de départ) qui possède un carboxyle lié à lui à la position 7 par l'intermédiaire d'une liaison thioéther. La réaction ci-dessus mentionnée est conduite sous des conditions telles que, dans le système réactionnel, la concentration du dérivé époxy est généralement comprise entre 0,01 mmole/ml et 1 mmole/ml de préférence 0, 05 mmole/ml et 0,5 mmole/ml, la concentration de l'acide mercaptomono- carboxylique est généralement comprise entre 0,05 mmole/ml et mmole/ml, de préférence 0,1 mmole/ml, et 1 mmole/ml,la concentration du réactif alcalin est généralement comprise entre 0,5 (p/v)% et 10 (p/v)%, de préférence 1 (p/v)% et 5 (p/v)%, et la teneur en eau est de préférence pas supérieure à 20 (v/v)%. Le système réactionnel peut contenir du dioxane ou analogue. L'isolation du dérivé produit contenant un groupe fonctionnel peut être faite selon la même méthode que celle pour l'isolation du dérivé époxy. Dans la méthode ci-dessus, parmi les stéroïdes représentés par la formule (4), un stéroïde ayant une double liaison entre les positions 7 et 8, tel que le A7- 2726912 cholesténol, A7-coprosténol, A7-stigmasténol, A7-campesténol ou A7cérébrosténol, est utilisé comme matériau de départ et ensuite, un carboxyle est introduit à la position 7 du matériau de départ, pour ainsi obtenir un dérivé réactif du stéroïde, tel qu'un dérivé de cholesténol, un dérivé de coprosténol, un dérivé de stigmasténol, un dérivé de campesténol ou un dérivé de cérébrosténol qui a un carboxyle lié à la position 7 par l'intermédiaire d'une liaison thioéther. En outre, selon la méthode ci-dessus, il est possible qu'un stéroïde, représenté par la formule (4), ayant une double liaison entre les positions 5 et 6, tel que le cholestérol, le P-sitostérol, le campestérol ou le cérébrostérol, soit utilisé comme matériau de départ et ensuite, un carboxyle est introduit à la position 6 du matériau de départ pour ainsi obtenir un dérivé réactif du stéroïde tel qu'un dérivé de cholestanol, un dérivé de stigmastanol, un dérivé de campestanol ou un dérivé de cérébrostanol qui a un carboxyle lié à la position 6 par une liaison thioéther. Le dérivé réactif à carboxyle introduit du stéroïde peut être mis en réaction avec et lié à un amino présent sur une surface d'un support par un procédé connu tel que le procédé à l'anhydride d'acide, le procédé au carbodiimide, ou bien le procédé au N-hydroxysuccinimide, pour ainsi immobiliser le stéroïde sur la surface du support. L'immobilisation de la streptolysine 0 sur la surface du support sur lequel est immobilisé le stéroïde peut être réalisée, par exemple en faisant réagir le support avec le stéroïde immobilisé sur lui avec de la streptolysine O dans l'eau ou un tampon approprié. Dans la présente invention, on préfère que la streptolysine 0 immobilisée du support de streptolysine 0 immobilisée soit présente suivant une quantité comprise entre 0,001 pmole/cm2 et 1 nmole/cm2, plus préférablement 0,01 pmole/cm2 et 100 pmole/cm2 eu égard à la surface spécifique du support. 21 2726912 La streptolysine O à utiliser dans la présente invention peut être d'un type quelconque, pour autant qu'elle présente une activité de liaison avec le stéroïde utilisé dans la présente invention et soit susceptible de réaction antigène-anticorps avec un anticorps d'antistreptolysine O. La streptolysine O, un dérivé de celle-ci et une variante de celle-ci peuvent être utilisés. Ces matériaux peuvent être ceux qui sont produits, par exemple, à partir de streptococci hémolytiques groupe A, B ou C, ou bien ceux qui sont produits par des techniques de recombinaisons génétiques, à partir de cellules hôte, par exemple des microorganismes transformés, tels que Escherichia coli, la levure, et analogue. Dans la présente invention, toute substance analogue à la streptolysine O qui présente une activité de liaison vis-à-vis du stéroïde utilisé dans la présente invention et est susceptible d'une réaction antigène- anticorps avec un anticorps d'antistreptolysine O, peut être utilisée au lieu de la streptolysine O. Par exemple, une protéine synthétisée ou un peptide synthétisé, qui a une structure d'amino acide telle que la streptolysine 0 manque en partie ou en totalité d'un site hémolytiquement actif, peut être utilisé. La streptolysine O utilisée dans la présente invention n'a pas nécessairement besoin d'être d'une haute pureté. Cependant, lorsque la streptolysine O contient une substance inhibitrice qui inhiberait une réaction de liaison de la streptolysine O à un stéroïde de formule (1) ou à un anticorps d'antistreptolysine O, il est désirable de purifier d'une façon appropriée la streptolysine O pour éliminer la substance inhibitrice. Il est convenable d'utiliser la streptolysine O disponible dans le commerce. Des exemples de produits de streptolysine O trouvés dans le commerce sont ceux qui sont respectivement vendus par Eiken Chemical Co., Ltd., Japon; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japon; Corporation Japan Lyophilization Laboratory, Japon; Difco Laboratories, U.S.A.; et Sigma Chemical Compagny, U.S.A.. 22 2726912 En ce qui concerne les tampons à utiliser dans la présente invention, il n'y a aucune limitation particulière, et les tampons qui sont couramment utilisés peuvent être employés. Il est désirable d'utiliser des tampons ayant une valeur de pH dans l'intervalle 5 à 9, de préférence 6 à 8. Par exemple, un tampon phosphate, un tampon acide borique, un tampon acide carbonique, un tampon tris, un tampon Veronal, et des tampons de Good (par exemple tampon HEPES, tampon PIPES, et tampons MES), peuvent être utilisés. Si on le désire pour la stabilisation de la streptolysine O ou la prévention d'adsorption non spécifique des protéines sur le support, des additifs tels l'albumine de sérum bovin (BSA), la gélatine, le lait écrémé, une protéine (par exemple une protéine dérivée du lait), le saccharide, le glycérol, l'éthylène glycol, un agent de chélation, et un agent réducteur peuvent être ajoutés à l'eau ou un tampon à utiliser. Ces additifs peuvent être utilisés suivant des quantités qui sont employées dans les méthodes de détermination immunologique classiques pour l'anticorps d'antistreptolysine O, lesquelles méthodes utilisent une réaction antigène-anticorps. La streptolysine O est relativement instable dans une solution aqueuse et, par conséquent, pour sa stabilisation, il est désirable d'ajouter, à l'eau ou un tampon qui doivent être utilisés, un additif, tel que l'albumine de sérum bovin (BSA), la gélatine, le lait écrémé ou une protéine (par exemple une protéine dérivée du lait) dans une concentration généralement comprise entre 0,01 (p/v) % et 10 (p/v) %, de préférence entre 0,1 (p/v) % et 1 (p/v) %. Si on désire empêcher une adsorption non spécifique des protéines sur le support, un support ayant immobilisé sur lui le stéroïde peut être traité avec une solution de traitement obtenue par dissolution d'un additif tel que l'albumine de sérum bovine (BSA), la gélatine, le lait écrémé ou une protéine (telle qu'une protéine dérivée du lait) dans l'eau ou un tampon. La concentration de l'additif dans la solution de traitement peut être choisie de façon appropriée à partir 23 2726912 des intervalles de concentration d'une telle solution de traitement habituellement utilisée, par exemple, dans les méthodes de détermination immunologique classiques utilisant une réaction antigène-anticorps. Par exemple, la concentration de l'additif dans la solution de traitement est généralement comprise entre 0,05 (p/v) % et 10 (p/v) %, de préférence 0,05 (p/v) % et 5 (p/v) %. Dans la présente invention, les conditions pour mettre en oeuvre le procédé pour immobiliser la streptolysine O sur un support sur lequel est immobilisé le stéroïde peuvent varier en fonction de facteurs tels que la pureté de la streptolysine O, la concentration en streptolysine O d'une solution contenant de la streptolysine 0 à utiliser, le type de support, et le principe d'une méthode de dosage respective pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O lié à l'agent de liaison. Par exemple, en prenant en considération les facteurs ci-dessus, l'immobilisation de la streptolysine O sur un support sur lequel le stéroïde est immobilisé peut être réalisée selon la procédure décrite ci-après. Si on désire que la streptolisine O soit immobilisée sur des particules de latex colloïdales avec le stéroïde immobilisé sur elles, l'immobilisation de la streptolysine O peut être réalisée, par exemple, par la méthode suivante. Une solution aqueuse ayant une teneur en protéine de 0,5 mg/ml à 1 mg/ml, dans laquelle la protéine a une teneur en streptolysine de 5 % à 10 % en poids, est réalisée, et la solution de streptolysine O est diluée avec de l'eau sur le tampon susmentionné 1 à 10 000 fois, de préférence 10 à 1 000 fois. Dans la solution résultante diluée de streptolysine O, sont mises en suspension des particules de latex avec le stéroïde immobilisé sur elles suivant une quantité telle que la concentration des particules de latex (c'est-à-dire la concentration en solide) soit généralement comprise entre 0,01 (p/v) % et 10 (p/v) %, de préférence 0,05 (p/v) % et 5 (p/v) %. La suspension résultante est soumise à une réaction tout en la laissant au repos, en agitant ou en secouant généralement entre 0 C et 40 C, de préférence entre 24 2726912 4 C et 30 C, généralement pendant 10 minutes à 24 heures, de préférence 30 minutes à 12 heures. Ensuite, si on le désire, les particules de latex résultantes avec streptolysine O immobilisée peuvent être lavées avec de l'eau ou un tampon. Les particules de latex de streptolysine O immobilisée obtenues par la méthode ci-dessus mentionnée peuvent être avantageusement utilisées pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysines O, sur la base par exemple du principe des essais d'agglutination immuns. Lorsqu'un grain de stéroïde immobilisé ou une bille de stéroïde immobilisé est utilisé comme support, l'immobilisation de la streptolysine O sur un support de stéroïde immobilisé peut être réalisée par une méthode similaire à la méthode ci-dessus décrite pour immobiliser la streptolysine O sur les particules de latex colloïdales avec stéroide immobilisé, tout en prenant en considération des facteurs tels que la surface spécifique, le volume et le nombre de grains ou de billes. Les grains ou billes de streptolysine O immobilisée obtenus par la méthode susmentionnées peuvent être avantageusement utilisés pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O, par exemple, par immunoenzymologie, radio-immunodosage ou fluoro immunodosage. Si on désire que la streptolysine O soit immobilisée sur une plaque de microtitrage avec le stéroïde immobilisé sur elle, l'immobilisation de la streptolysine O peut être réalisée, par exemple, par la méthode suivante. Une solution aqueuse ayant une teneur en protéine de 0,5 mg/ml à 1 mg/ml, dans laquelle la protéine a une teneur en streptolysine O de 5 % à 10 % en poids, est réalisée, et la solution de streptolysine O est diluée, avec de l'eau ou le tampon susmentionné, généralement 10 à 10 000 fois, de préférence 100 à 1 000 fois. La solution diluée est placée dans les puits de la plaque de microtitration de stéroïde immobilisé suivant une quantité de généralement 25 Ml à pl par puits, de préférence de 50 pl à 100 pl par puits, et on la laisse au repos généralement de 0 C à 40 C, de 2726912 préférence de 4 C à 30 C, généralement pendant 10 min. à 24 heures, de préférence 30 min. à 10 heures (ce qui permet de réaliser une réaction). Ensuite, les puits sont lavés avec de l'eau ou un tampon approprié. La plaque de microtitration de streptolysine O immobilisée obtenue par la méthode susmentionnée peut être avantageusement utilisée pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O, par exemple, par l'immunoenzymologie, le radio-immunodosage ou le fluoro immunodosage. En outre, par exemple, lorsqu'un tube à essai de stéroïde immobilisé est utilisé comme support, l'immobilisation de la streptolysine O sur un support de stéroïde immobilisé peut être réalisée par une méthode similaire à la méthode susmentionnée pour immobiliser la streptolysine O sur la plaque de microtitrage de stéroïde immobilisé, tout en prenant en considération des facteurs tels que le volume interne du tube à essai. Le tube à essai de streptolysine O immobilisée obtenu par la méthode cidessus mentionnée peut être avantageusement utilisé pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O, par exemple, par l'immunoenzymologie, le radio-immunodosage ou le fluoro immunodosage. En outre, lorsqu'on désire que la streptolysine O soit immobilisée sur une membrane avec le stéroïde immobilisé sur elle, l'immobilisation de la streptolysine O peut être réalisée, par exemple, par la méthode suivante. Une solution aqueuse possédant une teneur en protéine de 0,5 mg/ml à 1 mg/ml, dans laquelle la protéine a une teneur en streptolysine O de 5 % à 10 % en poids, est réalisée, et la solution de streptolysine O est diluée, avec de l'eau ou le tampon susmentionné, généralement 10 à 10 000 fois, de préférence 100 à 1 000 fois. La solution diluée est mise en contact avec la membrane de stéroïde immobilisé, par exemple, dans un récipient réactionnel approprié, ou bien est mise en contact avec la membrane de stéroïde immobilisé en faisant tomber goutte à goutte la solution sur des portions de la membrane. Ensuite, la membrane est laissée au repos ou 26 2726912 secouée généralement de 0 à 40 C, préférablement 4 C à 30 C, généralement pendant 5 min. à 24 heures, de préférence min. à 10 heures. Ensuite, la membrane résultante de streptolysine O immobilisée est lavée avec de l'eau ou le tampon susmentionné. La membrane de streptolysine O immobilisée obtenue par la méthode ci-dessus peut être avantageusement utilisée pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O, par exemple, par une méthode d'immunocoloration. Dans le procédé de la présente invention pour déterminer immunologiquement un anticorps d'antistreptolysine O, une solution d'échantillon d'essai contenant un anticorps d'antistreptolysine O est mis en contact et en réaction avec un agent de liaison spécifique (c'est- à-dire le support spécifique ci-dessus décrit de streptolysine O immobilisée), sous des conditions appropriées pour la formation d'un complexe antigène-anticorps, ce afin de lier sélectivement l'anticorps d'antistreptolysine 0 à l'agent de liaison par une réaction antigène- anticorps, et, ensuite, une certaine quantité d'anticorps d'antistreptolysine O liée à l'agent de liaison est déterminée. Des exemples de solutions d'échantillon d'essai à utiliser dans le procédé de la présente invention comprennent des fluides du corps tels que sérum, plasma, salive et urine, un extrait tissulaire, et un surnageant de culture de tissu. Ces solutions d'échantillon d'essai peuvent être utilisées telles qu'elles sont ou bien peuvent être utilisées après avoir été diluées de façon appropriée avec de l'eau ou le tampon susmentionné, en prenant en considération des facteurs tels que le principe pour la détermination de l'anticorps d'antistreptolysine O lié à l'agent de liaison, la sensibilité de détection et l'intervalle de mesure. Pour ce qui concerne les conditions de réaction sous lesquelles le procédé de la présente invention pour déterminer immunologiquement l'anticorps d'antistreptolysine O est mis en oeuvre, il n'y a aucune limitation particulière pour autant que la réaction antigène-anticorps ne soit pas 27 2726912 inhibée et les propriétés des réactifs à utiliser ne soient pas altérées (par exemple lorsqu'un substance marquée est utilisée, les propriétés détectables de la substance marquée ne doivent pas être altérées). En prenant en considération des facteurs tels que le principe pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O lié à l'agent de liaison, des conditions de réaction convenables peuvent être choisies d'une façon appropriée à partir des conditions de réaction généralement utilisées dans les méthodes de détermination classiques. Dans la présente invention, par exemple, lorsque des particules de latex colloïdales de streptolysine O immobilisée sont utilisées comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué, par exemple, à des essais d'agglutination de latex tels que la méthode d'agglutination sur lame de latex [voir Satomi Shibata et autres, "Kiki.Shiyaku (Equipment and Reagents)", Vol. 11, pp. 338-342, 1988]. En particulier, dans ce cas, les particules de latex de streptolysine O immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mélangées l'une avec l'autre sur une plaque d'évaluation, et la production ou la non production d'agglutination des particules de latex par la réaction antigène-anticorps est examinée visuellement. Egalement, lorsque des particules de latex colloïdales de streptolysine O immobilisée sont utilisées comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué à l'immunodosage photométrique de latex (LPIA) [voir Ikunosuke Sakurabayashi et al, "Nippon Rinsho (Japanese Journal of Clinical Medecine)", Vol. 48, Edition Supplémentaire (Vol. II), pp. 1356-1361, 1990]. Dans ce cas, les particules de latex de streptolysine O immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mélangées l'une avec l'autre, et un trouble produit par la réaction antigène-anticorps est mesuré optiquement. * L'anticorps d'antistreptolysine O est déterminé par référence à une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. 28 2726912 En outre, lorsque des particules de latex colloïdales de streptolysine 0 immobilisée sont utilisées comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué à l'immunodosage néphélométrique (NIA) [voir Yasuko Yamagishi, "Rinsho-kensa (Laboratory Examination)", Vol. 23, Edition Supplémentaire, pp. 1286- 1289, 1979]. Dans ce cas, les particules de latex de streptolysine 0 immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mélangées l'une avec l'autre, un aggrégat produit par réaction antigène-anticorps est irradié avec de la lumière (faisceau laser), et l'intensité du faisceau diffusé est mesurée, ce après quoi un anticorps d'antistreptolysine O est déterminé par référence à une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. En outre, lorsque des particules de latex colloïdales de streptolysine o immobilisée sont utilisées comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué à l'immunodosage par comptage [voir Kouichi Hashimot et autres, "Kensa-to-gijutsu (Examinations and Techniques)", Vol. 22, No. 5, pp. 67-68, Edition Supplémentaire 1994]. Dans ce cas, les particules de latex de streptolysine O immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mélangées l'une avec l'autre et ensuite, un aggrégat produit par réaction antigène-anticorps est mesuré en ce qui concerne les dimensions et le nombre. L'anticorpsd'antistreptolysine O est déterminé par référence à une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. D'un autre côté, lorsqu'une plaque de microtitrage de streptolysine O immobilisée, un grain de streptolysine O immobilisée, une bille de streptolysine O immobilisée ou un tube à essai de stretptolysine O immobilisée, est utilisé comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué, par exemple, au dosage par méthode immunoenzymologique. Dans ce cas, le support de streptolysine O immobilisée et une solution d'essai 29 2726912 d'échantillon sont mises en réaction l'une avec l'autre pour former un complexe antigène-anticorps et ensuite, un anticorps (contre l'anticorps d'antistreptolysine O) marqué avec un agent marqueur est mis en réaction avec le complexe, grâce à quoi l'activité de l'agent de marquage lié au support par le complexe est mesurée. L'anticorps d'antistreptolysine O est déterminé par référence à une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant de l'anticorps d'antistreptolysine O. En outre, en utilisant la propriété de la biotine (qui est un type de vitamine B) qui se lie spécifiquement à l'avidine, qui est une glycoprotéine basique présente dans l'albumine, la méthode de détermination susmentionnee par immunoenzymologie, peut être modifiée comme suit. Un anticorps (contre l'anticorps d'antistreptolysine O) avec de la biotine liée à lui est utilisé au lieu de l'anticorps marqué et de l'avidine ou de la streptoavidine marquée avec un agent de marquage est mise en réaction avec la biotine liée à l'anticorps, ce après quoi l'activité de l'agent de marquage lié au support par le complexe antigène-anticorps est mesurée. L'anticorps d'antistreptolisine O est déterminé par référence à une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. En ce qui concerne les types d'anticorps marqué et d'anticorps lié à la biotine pour une utilisation dans la méthode de détermination utilisant l'immunoenzymologie, il n'y a pas de limitation pour autant qu'ils puissent se lier à l'anticorps d'antistreptolysine O contenu dans la solution d'échantillon d'essai. Tout anticorps polyclonal, anticorps monoclonal et tous fragments enzymolytiques de ceux-ci [par exemple, F(ab')2, F(ab)2, Fab' et Fab] peuvent être utilisés. L'anticorps peut être un anticorps qui provient de n'importe quelle espèce animale, et peut être un anticorps qui a été produit par des techniques génétiques de recombinaison à partir de cellules hôte, par exemple, des microorganismes 2726912 transformés, tels que Escherichia coli, la levure et analogue. En ce qui concerne l'agent marqueur, il peut être choisi d'une façon appropriée à partir de ceux généralement utilisés dans l'immunoenzymologie. Des exemples préférés d'agents de marquage sont la peroxydase, la phosphatase alcaline, la 0-galactosidase, et la glucose oxydase. La détection de l'activité des enzymes peut être réalisée selon la procédure décrite, par exemple, dans Kouso Men-eki Sokutoei-ho (Enzyme Immunoassay)", "Tanpakushitsu- Kakusan-Kouso (Protein/Nucléic Acid/Enzyme)" Supplement, No. 31; édité par Tsunehiro Kitagaxa, Toshio Nambara, Akio Tsuji, et Eiji Ishikawa; et publié par Kyoritsu Shuppan K.K., Japon pp. 51-63 (10 Septembre 1987). En outre, lorsqu'une plaque de microtitration de streptolysine O immobilisée, un grain de streptolysine O immobilisée, une bille de streptolysine O immobilisée ou un tube à essai de streptolysine O immobilisée est utilisé comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué à l'immunoenzymologie, sur la base du principe de l'essai de liaison compétitif, qui est l'une des méthodes de détermination d'anticorps décrite dans "Koso-Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immunoassay)"; édité par Ishikawa, E., Kawai, T., et Muroi, K., Troisième Edition, publié par Igaku Shoin K.K., Japon, pp. 31-54 (15 Mai 1987). Dans le dosage par méthode immunoenzymologique, susmentionné, basé sur le principe de l'essai compétitif de liaison, un anticorps d'antistreptolysine O marqué par un enzyme est utilisé. L'anticorps d'antistreptolysine O marqué par enzyme peut être obtenu par marquage de l'anticorps dérivant du sérum d'un patient infecté par des streptococci hémolytiques du groupe A, ou par marquage d'un anticorps dérivant de l'antisérum obtenu par immunisation d'un animal avec un immunogène comprenant de la streptolysine O, selon les méthodes décrites dans "Kouso-Men-eki Sokutoei-ho (Enzyme Immunoassay)", "Tanpakushitsu-Kakusan-Kouso (Protein/Nucleic Acide/Enzyme)" Supplement, No. 31; édité par Tsunehiro 31 2726912 Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tsuju, et Eiji Ishikawa, et publié par Kyoritsu Shupan K.K., Japon, pp. 37-45 (10 Septembre 1987). L'anticorps d'antistreptolysine O marqué par enzyme peut également être obtenu par marquage d'un anticorps monoclonal préparé contre la streptolysine O selon les méthodes décrites dans "Men-eki-kenkyu-ho Handbook (Handbook for Immunological Research)"; édité par Hiromi Fujiwara et Junji Yodoi, et publié par Chugai-Iyaku-Sha K.K., Japon, pp. 61-75 (20 Septembre 1992). La détermination de l'enzyme marqué et la détection de l'activité de l'enzyme peuvent être réalisées selon les méthodes susmentionnées. En plus de l'immunoenzymologie ci-dessus, toute autre méthode classique, par exemple le radio-immunodosage le fluoro-immunodosage ou analogues peuvent également être employés. Dans le radio-immunodosage et le fluoro- immunodosage, une susbtance radio-active et une substance fluorescente sont utilisées respectivement au lieu de l'enzyme comme agent marqueur dans le dosage par immunoenzymologie. En outre, lorsqu'une membrane de streptolysine O immobilisée est utilisée comme agent de liaison, le procédé de la présente invention peut être avantageusement appliqué, par exemple, à la méthode d'immunocoloration. Dans ce cas, la membrane de streptolysine O immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mises en réaction l'une avec l'autre pour former un complexe antigène-anticorps et ensuite, l'anticorps, contre l'anticorps d'antistreptolysine O) marqué avec un agent marqueur est mis en réaction avec le complexe, grâce à quoi l'activité de l'agent de marquage lié au support par le complexe est examinée visuellement ou mesurée par un densitomètre. La méthode pour confirmer ou déterminer un produit de la réaction antigène-anticorps n'est pas particulièrement limitée. Non seulement des méthodes manuelles, mais également des méthodes automatiques utilisant un analyseur automatisé sont utilisables. Par exemple, lorsque la méthode de la présente invention est appliquée à l'immudosage photométrique 32 2726912 du latex (LPIA), des analyseurs automatiques, tels que les analyseurs Hitachi 705, 7050, 7150, 736, et 7070 (fabriqués et vendus par Hitachi Ltd, Japon) peuvent être utilisés. Ces analyseurs automatiques réalisent automatiquement des opérations telles que la distribution d'une solution d'échantillon d'essai, la distribution d'un réactif, le lavage, la mesure d'absorbance, et le traitement des données. En particulier, par exemple, ces analyseurs automatiques réalisent les opérations suivantes. Les particules de latex de streptolysine O immobilisée et une solution d'échantillon d'essai sont mélangées l'une avec l'autre dans une cellule réactionnelle. Après une période de temps prédéterminée, l'absorbance est mesurée à une longueur d'onde appropriée choisie parmi les conditions de mesure classiques, préférablement à une longueur d'onde de 400 nm à 950 nm, tout en réalisant une correction à blanc. Ensuite, les résultats de la mesure de l'absorbance sont comparés avec une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O, ce qui permet la détermination de l'anticorps d'antistreptolysine O dans la solution d'échantillon d'essai. En outre, par exemple, lorsque le procédé de la présente invention est appliqué à l'immunodosage enzymatique, en utilisant comme agent de liaison une plaque de microtitrage de streptolysine O immobilisée ou un tube à essai de streptolysine O immobilisée, un système d'essai automatique, tel que l'appareil BECKMAN Biomek 1000 Automated Laboratory Workstation (fabriqué et vendu par Beckman Instruments, Inc., U.S.A.) ou CELL ASSAY-2000 ROBOTIC ASSAY SYSTEM (fabriqué et vendu par Moritex Corporation, Japon), peut être utilisé. Ces systèmes automatiques d'essai réalisent automatiquement les opérations telles qu'une distribution de solution d'échantillon d'essai, une distribution de réactif, un lavage, la mesure de l'absorbance et le traitement des données. En particulier, ces systèmes d'essai automatiques réalisent, par exemple, les opérations suivantes. Une plaque de microtitrage de streptolysine O 33 2726912 immobilisée ou un tube à essai de streptolysine O immobilisée est successivement mis en réaction avec une solution d'échantillon d'essai, un anticorps marqué par enzyme et une solution de substrat, une opération de lavage étant insérée entre les réactions respectives ci- dessus. Si on le désire, une solution inhibitrice d'enzyme est ajoutée au mélange réactionnel résultant pour terminer la réaction. Ensuite, la coloration produite par la réaction d'enzyme entre l'enzyme marqueur et le substrat utilisé est mesurée à une longueur d'onde appropriée choisie des conditions classiques de mesure. Les résultats de la mesure de coloration sont comparés avec une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O, ce afin de déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O dans la solution d'échantillon d'essai. Lorsque le procédé de la présente invention est appliqué, par exemple, à l'immudosage enzymatique, en utilisant comme agent de liaison un grain de streptolysine O immobilisée, un système d'essai automatique, tel que l'appareil Aloka AEC-2000 POSEIDON II (fabriqué et vendu par Aloka Co., Ltd., Japon) peut être utilisé. Ce système d'essai automatique réalise automatiquement des opérations telles que la distribution d'une solution d'échantillon d'essai, la distribution d'un réactif, le lavage, la mesure de l'absorbance et le traitement des données. En particulier, ce système d'essai automatique réalise, par exemple, les opérations suivantes. Un grain de streptolysine O immobilisée est successivement mis en réaction avec une solution d'échantillon d'essai, un anticorps marqué à l'enzyme et une solution de substrat, étant entendu qu'une opération de lavage est insérée entre les réactions respectives ci-dessus. Si on le désire, une solution inhibitrice d'enzyme est ajoutée au mélange réactionnel résultant pour terminer la réaction. Ensuite, la coloration produite par la réaction d'enzyme entre l'enzyme marqueur et le substrat utilisé est mesurée à une longueur d'onde appropriée choisie à partir des conditions de mesure classiques. Les résultats de la mesure 34 2726912 de la coloration sont comparés avec une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine 0, ce afin de déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O dans la solution d'échantillon d'essai. Du point de vue de la commodité, on préfère que certains ou tous les réactifs nécessaires pour mettre en oeuvre la méthode de la présente invention soient fournis sous la forme d'un kit de réactifs. Un tel kit de réactifs est également avantageux lorsqu'un un analyseur automatique est utilisé pour mettre en oeuvre la méthode de la présente invention. Un exemple d'un tel kit de réactifs est un kit comprenant (A) un support sur lequel est immobilisé le stéroïde à utiliser dans la présente invention, et (B) une solution contenant de la streptolysine O. Il est particulièrement préféré que, en plus des ou au lieu des réactifs ci-dessus mentionnés (A) et (B), le kit comprenne (C) un support de streptolysine O immobilisée comme agent de liaison, qui a été préparé en faisant réagir les réactifs susmentionnés (A) et (B) l'un avec l'autre. Le kit de réactifs dans la présente invention peut également contenir d'autres réactifs appropriés, par exemple, un tampon, une substance standard, un anticorps marqué, un substrat, un solvant pour un substrat et un produit terminant la réaction. EXEMPLES La présente invention sera illustrée ci-dessous par référence aux Exemples suivants et aux figures 1 à 6, qui cependant ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention. Dans les figures 3 et 5, le terme "UI" (c'est-à-dire, unité internationale) est indiqué. Dans les figures 4 et 6, l'expression "Unité Todd" est indiquée. L'unité internationale est une unité définie par WHO. L'unité Todd signifie une quantité d'anticorps d'antistreptolysine O qui peut neutraliser la streptolysine O d'une quantité 2,5 fois une quantité minimale (dose hémolytique minimale) de streptolysine O à laquelle 0,5 ml de 5 (v/v) % d'érythrocyte 2726912 de lapin peut être complètement lysé. L'unité internationale est sensiblement équivalente à l'unité Todd. Exemple 1 Examen de la réactivité d'un stéroïde immobilisé avec la streptolysine O (1) Préparation de la streptolysine O Des streptocoques hémolytiques du groupe A (Streptococcus pyrogenes) type 3 souche D58X (ATCC 12383) furent inoculés dans 2 litres d'un Bouillon Todd-Hewitt (Difco Laboratories, U.S.A.) et incubés à 37 C pendant 12 heures, suivi par une centrifugation et une filtration pour récupérer un filtrat stérile. Ensuite, du sulfate d'ammonium saturé fût ajouté au filtrat jusqu'à une concentration de saturation à 40 %, pour former un précipité. Le précipité fût séparé, et dissous dans 100 ml d'eau purifiée pour obtenir une solution. La solution obtenue fût dialysée sur de l'eau purifiée et du PBS pour éliminer le sulfate d'ammonium. Pour ce qui est de la solution résultante, une filtration par gel fût conduite en utilisant du Sephadex G-100 qui avait été équilibré avec du PBS (contenant 1 litre de gel), et une fraction de streptolysine O fût récupérée en utilisant l'activité hémolytique comme critère. La fraction fût condensée our obtenir 11 ml d'une solution d'échantillon, qui contenait de la streptolysine 0 présentant une absorbance de 0,800 à 280 nm et une activité hémolytique de 8192 unités hémolytiques (UH)/ml. L'essai d'activité hémolytique fût conduit selon la méthode suivante. Des érythrocytes frais défibrinés obtenus d'un lapin (qui sont obtenus de Nippon Bio-Test Laboratories, K.K., Japon) furent lavés avec du PBS cinq fois par centrifugation et du PBS y fût ajouté pour préparer une suspension érythrocyte 1 v/v %. Pour ce qui est de la solution d'échantillon sus- mentionnée contenant de la streptolysine O, des dilutions successives deux fois avec du PBS furent réalisées. 1 ml de chaque dilution fût individuellement mélangé avec 2 ml de la 36 2726912 suspension d'érythrocyte 1 v/v % préparée ci-dessus dans un tube de verre, suivi par incubation à 37 C pendant 30 minutes. Ensuite, pour chaque tube, une mesure d'hémolyse fût faite pour déterminer le nombre maximum de fois de dilutions auxquelles 100 % d'hémolyse était visible. Le nombre obtenu fût défini comme une valeur UH par 1 ml de solution d'échantillon contenant la streptolysine O. (2) Production d'un support à cholestérol immobilisé. p1 d'une solution d'éthanol, contenant du cholestérol (trouvé chez Nakarai Chemical Ltd., Japon) dans une concentration de 1 mg/ml, furent placés dans chaque puits d'une plaque de microtitration (disponible chez Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japon) et ensuite, la plaque fût laissée au repos à 60 C pendant 2 heures pour évaporer et éliminer le solvant, de façon à préparer ainsi une plaque de microtitrage à cholestérol immobilisé. Le même processus que ci-dessus fût répété, sauf que de l'éthanol ne contenant pas de cholestérol fût utilisé au lieu de la solution d'éthanol contenant du cholestérol, pour obtenir une plaque de microtitrage n'ayant pas de cholestérol immobilisé sur elle, qui était destinée à une utilisation comme témoin. (3) Réaction d'un support de cholestérol immobilisé avec une solution contenant de la streptolysine O. La solution d'échantillon contenant la streptolysine O préparée au paragraphe (1) ci-dessus fût diluée 20 fois avec du PBS, et 50 p1 de la dilution résultante furent placés dans chaque puits de chacun des deux types de plaques de microtitrage produits au paragraphe (2) ci-dessus, en ayant du cholestérol immobilisé sur elle et n'ayant pas de cholestérol immobilisé sur elle, respectivement. Ensuite, pour ce qui concerne chaque plaque de microtitrage, on a laissé une réaction se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Le mélange réactionnel résultant fût récupéré de chaque puits, et soumis à des essais [c'est-àdire polyacrylélectrophorèse-SDS (SDS-PAGE) et essai d'activité hémolytique décrit dans le paragraphe (1) ci-dessus]. Les résultats des essais de chaque mélange réactionnel furent 37 2726912 comparés avec ceux obtenus pour la solution d'échantillon d'origine avant la réaction. Le SDS-PAGE ci-dessus fût réalisé, en utilisant un gel de polyacrylamide 12,5 p/v %, sensiblement selon la méthode de Laemmli, U.K. (Nature, 227; pp 680-685, 1970). D'un autre côté, en ce qui concerne le faible intervalle standard de poids moléculaire SDS-PAGE (qui comprend de la phosphorylase B de 92 500, de l'albumine de sérum bovine de 66 200, de l'ovalbumine de 45 000, de l'anhydrase carbonique de 31 000, de l'inhibiteur tripsine de soja de 21 500, et du lysozyme de 14 400: trouvé chez Bio- Rad Laboratories, U.S.A.), le même SDS-PAGE que mentionné ci- dessus fût réalisé, pour ainsi obtenir un marqueur de poids moléculaire (colonne 1 sur figure 1) de façon à estimer les poids moléculaires respectifs des protéines contenues dans les mélanges réactionnels cidessus obtenus et la solution d'échantillon d'origine, les protéines ayant été séparées dans le même gel. Pour ce qui concerne le gel, une coloration à l'argent fût réalisée en utilisant un kit Wako de coloration à l'argent (trouvé chez Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japon), de façon à visualiser les protéines dans le gel. (4) Résultats Un motif SDS-PAGE obtenu dans le paragraphe (3) ci- dessus est montré dans la figure 1. La colonne 2 dans la figure 1 montre un motif de séparation des protéines contenues dans la solution d'échantillon d'origine contenant la streptolysine O, o la solution d'échantillon a été préparée selon le paragraphe (1) ci- dessus et diluée 20 fois avec du PBS. La colonne 3 sur la figure 1 montre un motif de séparation des protéines contenues dans la solution récupérée à partir de la plaque de microtitrage de cholestérol immobilisé. La colonne 4 sur la figure 1 montre un motif de séparation des protéines contenues dans la solution récupérée à partir de la plaque de microtitrage n'ayant pas de cholestérol immobilisée sur elle. 38 2726912 A partir de la figure 1, il fût confirmé que les bandes de poids moléculaire de 66 000 à 69 000 et 55 000 à 58 000, qui sont caractéristiques de la streptolysine O, disparaissaient dans la colonne 3. Une activité hémolytique présentée par la solution récupérée de la plaque de microtitrage de cholestérol immobilisée était seulement de 0,8 %, sur la base de l'activité hémolytique présentée par la solution d'échantillon. Les résultats ci-dessus indiquent clairement que, parmi les protéines contenues dans la solution d'échantillon préparée dans le paragraphe 1, seulement la streptolysine O ayant une activité biologique était spécifiquement liée au support de cholestérol immobilisé. Exemple 2 Examen de la réactivité de la streptolysine O immobilisée avec un anticorps d'antistreptolysine O; (1) Production d'un support de cholestérol immobilisé. pl d'une solution d'éthanol, contenant du cholestérol suivant une concentration de 20 pg/ml, furent placés dans chaque puits d'une plaque de microtitrage (trouvée chez Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japon) et ensuite, la plaque fût laissée au repos à 60 C pendant 2 heures pour évaporer et éliminer le solvant, afin de préparer une plaque de microtitrage de cholestérol immobilisé. Du lait écrémé (trouvé chez Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Japon) fût dissous dans un tampon tris-chlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) de sorte qu'une solution 5 p/v % (ci-après fréquemment appelée "solution de blocage") fût préparée. Ensuite, 100 pl de la solution de blocage furent placés dans chaque puits de la plaque de microtitrage. Ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Les puits furent lavés deux fois avec du tampon tris- chlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) (fréquemment appelé ci-après "solution de lavage"), de façon à préparer un support de cholestérol immobilisé. 39 2726912 (2) Sensibilisation de la streptolysine O à un support de cholestérol immobilisé. Les mêmes solutions d'échantillon contenant de la streptolysine O que dans l'Exemple 1, paragraphe (1) ci- dessus, furent respectivement diluées 100 fois, 400 fois et 1600 fois avec du tampon tris-chlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) contenant 0,5 p/v % de lait écrémé (fréquemment appelé ci- après "solution de dilution"). 50 pl de chacune des dilutions ci-dessus préparées et la solution de dilution susmentionnée (comme témoin-à blanc) furent individuellement placées dans chaque puits de chacune des plaques de microtitrage et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, les puits de chaque plaque de microtitrage furent lavés 7 fois avec la solution de lavage, pour ainsi obtenir des plaques de microtitrage pour lesquelles la streptolysine O était sensibilisée suivant des quantités prédéterminées, et une plaque de microtitrage témoin. (3) Détection d'un complexe immun de streptolysine O avec un anticorps d'antistreptolysine O. Une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine 0 (131 UI/ml) (fréquemment appelée ci- après "solution standard d'anticorps d'antistreptolysine O") obtenue du Japanese National Institute of Health, fût diluée 500 fois avec la solution de dilution susmentionnée, et 50 pl de la dilution résultante furent placés dans chaque puits de chacune des plaques de microtitrage obtenues selon le paragraphe (2) ci-dessus et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, les puits de chaque plaque de microtitrage furent lavés 7 fois avec la solution de lavage susmentionnée. Un IgG anti-humain de chèvre F(ab')2 marqué par une phosphatase alcaline (trouvé chez Bio Source International, Inc.-Tago Products, U.S.A.) (anticorps secondaire marqué à l'enzyme) fût dilué 1000 fois avec la solution de dilution, et 50 pl de la dilution résultante furent placés dans chaque puits de 2726912 chaque plaque de microtitrage. Ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, les puits de chaque plaque de microtitrage furent lavés 7 fois avec la solution de lavage. 100 p1 d'une solution 0,5 mg/ml (substrats) de p-nitrophényl phosphate (disponible chez Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japon) dans un tampon de diéthanolamine (pH 9,5) furent placés dans chaque puits. Ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 15 minutes, suivie par une addition de 100 p1 d'hydroxyde de sodium aqueux 0,5 N dans chaque puits pour ainsi terminer la réaction enzymatique. En ce qui concerne chaque solution prélevée des puits, les absorbants (AE) à 405 nm furent mesurés. (4) Résultats Les résultats de détection d'un complexe immun de streptolysine O avec un anticorps d'antistreptolysine O sont donnés dans la figure 2. La figure 2 indique clairement que la streptolysine O immobilisée sur le support par le cholestérol maintenait une réactivité avec l'anticorps d'antistreptolysine O. Exemple 3 Détermination du titre d'anticorps d'antistreoptolysine O. (1) Production d'un support de streptolysine O immobilisée. Du latex de polystyrène ayant un diamètre de particule de 0,12 pm (trouvé chez Sekisui Chemical Co., Ltd., Japon) fût mis en suspension dans 10 v/v % d'éthanol aqueux de sorte qu'une suspension de latex de polystyrène 2 p/v % fût préparée. Une partie en volume d'éthanol aqueux 10 v/v % contenant du cholestérol (disponible chez Nakarai Chemical Ltd., Japon), suivant une concentration de 200 Mg/ml, fût ajoutée à une partie en volume de la suspension de latex préparée ci- dessus, et le contact entre les deux fût effectué à la température ambiante pendant 2 heures. A 1 partie en volume du mélange résultant furent ajoutées 9 parties en volume de PBS contenant 2 p/v % de BSA 41 2726912 et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Le mélange résultant fût centrifugé à 12 000 t.p.m. pendant 20 minutes pour ainsi récupérer les particules de latex. Les particules de latex récupérées furent remises en suspension dans PBS de sorte qu'une suspension de latex 0,2 p/v % fût préparée. La solution d'échantillon contenant de la streptolysine O, préparée dans l'Exemple 1, paragraphe (1) ci-dessus, fût diluée 50 fois avec du PBS contenant 0,4 p/v % de BSA, et une partie en volume de la dilution résultante fût ajoutée à une partie en volume de la suspension de latex obtenue ci-dessus et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, le mélange résultant fût centrifugé à 12 000 t.p.m. pendant 20 minutes pour ainsi récupérer les particules de latex. Les particules de latex récupérées furent remises en suspension dans PBS de sorte qu'une suspension de latex 0,1 p/v % fût préparée. Ainsi, des particules de latex de streptolysine O immobilisée furent obtenues sous la forme d'une suspension. (2) Détermination du titre d'anticorps d'anti- streptolysine O. 600 pl de PBS et 200 pl de sérum d'essai furent ajoutés à 200 p1 de la suspension de particules de latex de streptolysine O immobilisée, préparée selon le paragraphe (1) ci-dessus. Ensuite, une réaction a pu se développer à 37 C pendant 5 minutes et une absorbance (AE) à 590 nm du mélange réactionnel résultant fût mesurée. Un titre d'anticorps d'antistreptosyline O fût déterminé par référence à une courbe d'étalonnage précédemment obtenue par le procédé de la présente invention en utilisant une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. (3) Résultats La courbe d'étalonnage de la figure 3 obtenue par le procédé de la présente invention illustre la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine O et l'absorbance à 590 nm. On comprend de la figure 3 qu'une courbe d'étalonnage fiable peut être obtenue par le procédé de la présente 42 2726912 invention. La relation entre le titre d'anticorps d'anti streptolysine Odéterminé par le procédé de la présente invention et le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé par la méthode classique Rantz-Randall, est montrée sur la figure 4. La figure 4 indique clairement que les résultats obtenus par le procédé de la présente invention sont bien en accord avec ceux obtenus par la méthode Rantz- Randall pour déterminer l'anticorps d'antistreptolysine O. Exemple 4 Détermination du titre d'anticorps d'antistreptolysine 0. (1) Production d'un support de streptolysine O immobilisée. pl d'une solution d'éthanol aqueux 10 p/v % contenant du cholestérol (trouvé chez Nakarai Chemical Ltd., Japon) suivant une concentration de 100 pg/pl, furent placés dans chaque puits d'une plaque de microtitrage (disponible chez Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japon) et ensuite, la plaque fût laissée à la température ambiante pendant 2 heures, puis on a lavé les puits deux fois avec de l'eau purifiée. Du lait écrémé (trouvé chez Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Japon) fût dissout dans un tampon de tris-chlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) de sorte qu'une solution 5 p/v % (solution de blocage) fût préparée. Ensuite, 100 pl de la solution de blocage furent placés dans chaque puits de la plaque de microtitrage préparée ci-dessus. Ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Les puits susmentionnés furent lavés deux fois avec un tampon de trischlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) (solution de lavage). La solution d'échantillon contenant de la streptolysine O telle que préparée dans l'Exemple 1, paragraphe (1) cidessus, fût diluée 1000 fois avec un tampon de tris-chlorhydrate 20 mM (pH 7,6, contenant du chlorure de sodium 0,14 M) contenant 0,5 p/v % de lait écrémé (solution de dilution). 50 pl de la dilution préparée ci- dessus furent placés dans chaque puits 43 2726912 et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, les puits furent lavés 7 fois avec la solution de lavage, pour ainsi préparer une plaque de microtitrage de streptolysine 0 immobilisée. (2) Détermination d'un titre d'anticorps d'anti- streptolysine O. Un titre d'anticorps d'antistreptolysine O fût déterminé en utilisant l'appareil BECKMAN Biomek 1000 Automated Laboratory Workstation (trouvé chez Beckman Instruments, Inc., U.S.A.). 50 pl de sérum d'essai dilués 100 fois avec la solution de dilution susmentionnée furent placés dans chaque puits de la plaque de microtitrage obtenue selon le paragraphe (1) ci-dessus et ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, les puits furent lavés 7 fois avec la solution de lavage susmentionnée. 50 pl d'un réactif d'essai primaire [IgG antihumain de chèvre F(ab')2 marqué par une phosphatase alcaline (disponible chez Bio Source International, Inc. Tago Products, U.S.A.) (anticorps secondaire marqué à l'enzyme) dilué 1000 fois avec la solution de dilution], furent placés dans chaque puits de la plaque de microtitrage. Ensuite, une réaction a pu se développer à la température ambiante pendant 1 heure. Subséquemment, les puits furent lavés 7 fois avec la solution de lavage. 100 pl d'un réactif d'essai secondaire [solution 0,5 mg/ml (substrat) de p-nitrophényl phosphate (trouvé chez Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japon) dans un tampon de diéthanolamine (pH 9,5)], furent placés dans chaque puits. Ensuite, une réaction a pu se produire à la température ambiante pendant 15 minutes. 100 pl d'hydroxyde de sodium aqueux 0,5N furent ajoutés à chaque puits, pour ainsi terminer la réaction enzymatique. En ce qui concerne chaque mélange réactionnel prélevé des puits, les absorbances (AE) à 405 nm furent mesurées. Un titre d'anticorps d'antistreptolysine O fût déterminé par référence à une courbe d'étalonnage précédemment obtenue par le procédé de la 44 2726912 présente invention en utilisant une solution standard contenant un anticorps d'antistreptolysine O. (3) Résultats La courbe d'étalonnage de la figure 5 obtenue par le procédé de la présente invention illustre la relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine O et l'absorbance à 405 nm. On comprend de la figure 5 qu'une courbe d'étalonnage fiable peut être obtenue par le procédé de la présente invention. La relation entre le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé par le procédé de la présente invention et le titre d'anticorps d'antistreptolysine O déterminé par la méthode classique Rantz-Randall, est représentée sur la figure 6. La figure 6 indique clairement que les résultats obtenus par le procédé de la présente invention sont bien en accord avec ceux obtenus par la méthode Rantz-Randall pour déterminer l'anticorps d'anti- streptolysine O. 2726912 REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer immunologiquement un anticorps d'antistreptolysine O, qui consiste à: (a) mettre en contact une solution d'échantillon d'essai contenant un anticorps d'antistreptolysine O avec un agent de liaison capable de lier spécifiquement ledit anticorps d'antistreptolysine 0 à celui-ci, ce afin de lier sélectivement ledit anticorps d'antistreptolysine O audit agent de liaison par une réaction antigène-anticorps, et (b) déterminer une quantité dudit anticorps d'anti- streptolysine 0 liée audit agent de liaison, ledit agent de liaison comprenant un support de streptolysine O immobilisée obtenu par mise en contact d'une solution contenant de la streptolysine 0 avec un support ayant immobilisé sur lui au moins un stéroïde représenté par la formule (1): Rl (1) OH o R1 est choisi dans le groupe comprenant une fraction ou partie de chaîne latérale de cholestérol et une fraction ou partie de chaîne latérale d'acide cholique, chacune desdites fractions de chaîne latérale étant indépendamment non substituée ou substituée et indépendamment saturée ou non saturée; R2 est hydrogène ou hydroxyle; et chaque trait pointillé représente indépendamment une simple liaison ou pas de liaison, de sorte que chaque trait pointillé et un trait 46 2726912 plein adjacent forment indépendamment ensemble une double liaison ou une simple liaison. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit stéroïde immobilisé est présent suivant une quantité de 0,025 nmole/cm2 à 250 nmole/cm2 par rapport à la surface spécifique du support. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit stéroïde immobilisé est présent suivant une quantité de 0,25 nmole/cm2 à 25 nmole/cm2 par rapport à la surface spécifique du support. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite streptolysine O immobilisée est présente suivant une quantité de 0,001 pmole/cm2 à 1 nmole/cm2 par rapport à la surface spécifique du support. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite streptolysine O immobilisée est présente suivant une quantité de 0,01 pmole/cm2 à 100 pmole/cm2 par rapport à la surface spécifique du support. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit stéroïde immobilisé représenté par la formule (1) est du cholestérol, 7- déhydrocholestérol, cholestanol, coprostanol, A7-cholesténol, A7coprosténol, 0-sitostérol, 7-déhydro-0-sitostérol, stigmastérol, 7-déhydrostigmastérol, campestérol, 7- déhydrocampestérol, stigmastanol, A7-stigmasténol, 11U- hydroxycholestérol, A22-stigmasténol, a-spinastérol, campestanol, A7-campesténol, 20a-hydroxycholestérol, brassicastérol, ergostérol, cérébrostérol, 7- déhydrocérébrostérol, cérébrostanol A7-cérébrosténol, desmostérol, 7-déhydrodesmostérol, de l'acide 30- hydroxycholanique ou de l'acide 30-hydroxy-à5-cholénique. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support est choisi dans le groupe consistant en une particule colloïdale, un granulé, une bille ou une plaque de microtitrage, un tube à essai ou une membrane.