Brevet FR2731711A1 — publié le 19960920

PROCEDE DE DETECTION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DE LESIONS DE L'ADN La présente invention a pour objet un procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'Acide DésoxyriboNucléique dues à des agents physiques ou chimiques. Pour la suite de la description et pour les revendications, on appelle "produit lésant", tout agent chimique pur spécifique, tout mélange artificiel d'agents chimiques, ou toute composition naturelle d'agents chimiques ou encore tout agent physique tel que les rayonnements notamment les rayonnements ionisants et les rayonnements ultraviolets. On sait que 'ADN sert de support à l'information génétique et qu'il peut être lésé par des produits lésants avec des conséquences importantes si ces lésions ne sont pas réparées. En effet, la division cellulaire est dépendante de ces informations et la vie même de la cellule est concernée puisque les gènes exprimés dans la cellule sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire. Aussi une lésion peut conduire à une mutation sur l'ADN, qui peut entraîner un dysfonctionnement de la cellule et par conséquent induire un problème au niveau de l'organisme. II est donc important d'analyser les réactions de l'ADN d'un individu vis à vis de produits lésants pour en tirer des informations intéressantes, notamment pour le suivi de l'évolution de certaines maladies ou pour en prévenir les conséquences. II faut donc, à partir de cellules contenues dans le sang ou dans un quelconque tissu, récupérer l'ADN puis le purifier et analyser son comportement en regard des produits lésants en dosant les conséquences induites par ces lésions. Ainsi, dans l'industrie du médicament, on peut avoir besoin de déterminer qualitativement et quantitativement la génotoxicité ou l'antigénotoxicité d'un composé ou d'un mélange de composés vis à vis de l'ADN, et si possible les capacités de réparation des lésions ainsi générées. Une telle détermination est utile à partir de cellules développées et cultivées in vitro ou isolées ex vivo. Des applications de ce type de détermination sont la détection de xénobiotiques génotoxiques, le suivi des patients en chimiothérapie, ou le suivi des personnes travaillant au contact des génotoxiques. II est un autre but du procédé selon l'invention qui, dans le cas d'agents lésants chimiques, cherche à vérifier les capacités d'inhibition d'un composé vis à vis de ce produit, c'est notamment le cas des oxydants et antioxydants. On connaît différents tests concernant l'ADN et notamment la demande de brevet EP 0.472.482 au nom du présent demandeur, qui concerne le dosage de microquantités d'ADN présentes en position extracellulaire dans un liquide biologique, notamment dans le plasma sanguin. Ce procédé consiste à fixer, par adsorption, I'ADN sur un support solide grâce à des substances présentant une grande affinité pour 'ADN. Ainsi on peut choisir cette substance notamment parmi les complexes macromoléculaires cationiques. Le support solide est généralement une plaque de microtitration comprenant des puits, qui est sensibilisée par incubation dans un milieu contenant ces complexes macromoléculaires cationiques. Cette plaque est incubée avec l'échantillon dont on cherche à doser la proportion d'ADN. L'ADN est adsorbé et la plaque est lavée en tampon Borate avec un tensioactif ou en tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane. L'ADN ainsi fixé est soumis à une réaction de biologie moléculaire mettant en jeu plusieurs enzymes spécifiques de 'ADN afin d'incorporer au moins un nucléotide marqué chimiquement par une substance pouvant être ultérieurement révélée, par exemple par réaction enzymatique. Une telle incorporation est prévue dans ce procédé antérieur de dosage par la réaction de "Nick translation", c'est-à-dire par une réaction de déplacement de coupure haplotomique. Un tel marqueur décrit dans cette demande précédente est la biotine et l'enzyme est un composé avidine/enzyme ou streptavidine/enzyme, l'enzyme étant la péroxydase. Après interruption de la réaction enzymatique, la révélation du marqueur incorporé est obtenue au moyen d'un appareillage susceptible de quantifier le signal émis. On mesure ainsi au moyen d'un spectrophotomètre la réaction colorée obtenue avec la biotine. Un tel procédé de dosage de l'ADN présent en très petite quantité dans un échantillon apporte de nombreux avantages, notamment pas d'extraction de l'ADN préalablement à son dosage, pas d'utilisation obligatoire de marqueur "chaud" c'est-à-dire radioactif, pas d'appareillage spécifique lourd, . grande sensibilité, . mise en oeuvre simultanée sur plus de cent échantillons, et obtention de résultats en quelques heures. Un tel procédé a donc un but bien déterminé qui est le dosage de l'ADN en vue de déterminer les éventuelles variations du taux d'ADN, plus particulièrement chez l'homme mais aussi en conditions expérimentales pour quantifier les phénomènes de mort cellulaire. On connaît un test décrit par Wood et coll [(1988) Cell, 53, 97-106] et Sancar et coll. [Sibghat-Ullah et al (1989) Nucleic Acids Res., 17, 4471 4484], qui permet de détecter les lésions sur de I'ADN. Cet essai consiste à placer deux plasmides très purs et de tailles différentes, I'un lésé et l'autre non lésé en tant que référence, en présence d'un extrait cellulaire, transcriptionnellement actif, en présence, entre autres, d'une composition connue de dNTP, de dATP marqué et de Magnésium. Les lésions sont reconnues, incisées, et la synthèse d'ADN réparatrice subséquente permet l'incorporation de dNTP radio-marqués dont la présence sera ensuite quantifiée. Un certain pourcentage de lésions est réparé par ce mécanisme d'incision-excision et resynthèse, de l'ordre de 7 %. On linéarise les plasmides, on fait migrer sur un gel d'électrophorèse afin d'assurer la séparation et on étudie le signal radioactif émis par les chaînes réparées dans lesquelles un marqueur "chaud" est présent. Le rapport des signaux donne un taux de réparation. L'activité d'incision-excision peut aussi être directement mesurée [Calsou et Salles (1994) Biochem.Biophys.Res.Comm.,202. 788-795]. Un tel test présente de nombreux inconvénients et notamment le fait que l'application à l'industrie dans des conditions d'automatisation satisfaisantes est difficile si bien que cet essai reste réservé aux laboratoires. Les délais d'obtention des résultats, (de l'ordre de deux jours), sont trop longs et les coûts trop élevés. Comme autre contrainte, on peut citer la nécessité de disposer de plasmides purifiés, avec des quantités de l'ordre 200-300 ng et à ce sujet, on remarque que ce test ne paraît pas transposable à l'analyse de lésions d'ADN de toute provenance in vitro ou ex vivo. De plus on constate que les marqueurs sont des isotopes dont la manipulation est moins aisée et que le remplacement par des marqueurs d'autre nature semble délicat. En outre, dans le domaine des marqueurs, une tendance forte est de penser que les marqueurs radioactifs sont plus sensibles que les autres si bien que tout chercheur est amené instinctivement à recourir à de tels marqueurs et même à être dissuadé d'utiliser des marqueurs froids. On connaît bien sûr des tests permettant ensuite de détecter les mutagènes puisqu'une relation existe entre lésions et mutagénèse. Ce sont plus particulièrement le test d'AMES [Ames et al (1973) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,70,2281-2285)1 complété par le test dit du micronoyau [Mac Grégor et al. (1987) Mutat. Res. 189,103-112] qui permet l'analyse des cassures chromosomiques et des tests permettant de détecter des mutations dans des gènes tels que HPRT codant pour une enzyme de biosynthèse des bases de 'ADN. Dans l'industrie pharmaceutique, on utilise très souvent et surtout en cas de doute avec les tests précédents, le test UDS "Unscheduled DNA Synthesis" qui consiste également à mesurer l'incorporation d'un ou plusieurs nucléotides marqués dans 'ADN de cellules soumises à des agents potentiellement génotoxiques. Ce test présente à nouveau l'inconvénient de prévoir la manipulation de radio-isotopes et d'être semi-quantitatif. Un perfectionnement de l'UDS a proposé un marqueur non radioactif [Selden et al.(1994) Mutat.Res.,315, 147-167], mais cet intérêt est rendu moins pertinent par le fait que l'analyse des résultats nécessite la mise en oeuvre de la cytométrie de flux, qui est une technique très lourde. Le procédé selon l'invention a donc pour but de pallier les inconvénients de l'art antérieur en permettant de déterminer qualitativement et quantitativement les lésions induites dans de l'ADN, qu'il provienne de cellules ex vivo (cellules, tissus) ou qu'il s'agisse d'ADN in vitro (purifié ou issu de cellules en culture). Le procédé selon l'invention permet aussi de déterminer la capacité d'une substance ou d'un mélange de substances à inhiber l'effet lésant d'un produit lésant. Le procédé selon l'invention permet également de tester des agents modulateurs de la réparation. De plus la présente invention permet par une mise en oeuvre d'une étape supplémentaire spécifique de traiter directement des cellules par un produit chimique lésant et de déterminer, toujours qualitativement et quantitativement, les lésions subies par l'ADN de ladite cellule. Le procédé contribue à simplifier ce type d'étude des lésions, il peut être automatisé ce qui lui donne une connotation industrielle certaine, il s'applique à tout type d'ADN et sur des quantités très réduites grâce à une très grande sensibilité du test. La rapidité de la réponse est également un avantage prépondérant, notamment pour l'industrie, puisque l'ordre de grandeur est de quelques heures. La possibilité d'utilisation de marqueurs "froids" et la non nécessité de recourir à des marqueurs "chauds" tout en la laissant possible est un avantage supplémentaire. Ceci a pour corollaire l'emploi d'un matériel spécifique pour la lecture certes, matériel qui correspond au marqueur incorporé mais ces appareillages sont d'un usage courant et d'une mise en oeuvre relativement simple pour l'homme de l'art, sans commune mesure avec un appareil de cytométrie de flux. Enfin, on peut noter comme avantage évident la possibilité d'analyser simultanément un nombre d'échantillons beaucoup plus important, avec un coefficient proche de 10. On entend pour la suite de la description les définitions complémentaires suivantes Support sensibilisé : tout support notamment solide y compris la gélatine, ayant été traité par des substances présentant une très forte affinité pour le matériel nucléique (ADN ou ARN). Extrait cellulaire : extrait cellulaire partiellement purifié, composants purifiés et isolés avec recombinaison éventuelle au sein d'une composition de certains de ces composants purifiés ou encore composant obtenu par biologie moléculaire. Maraueur : nucléotide modifié avec un marqueur radioactif ou non radioactif, du type greffé chimiquement. A cet effet, le procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de 'ADN, se caractérise en ce qu'il comprend les différentes étapes suivantes . fixation de l'ADN cible sur un support sensibilisé, notamment un support solide, action d'une composition à tester comprenant au moins un produit lésant, action d'une composition à tester comprenant au moins un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant des marqueurs, . révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage. Un tel support solide peut être une plaque de microtitration à puits ou une plaque enduite de billes de "latex". Selon une caractéristique particulière du procédé, le support est sensibilisé par des substances présentant une très forte affinité vis à vis de l'ADN de façon à provoquer une fixation de cet ADN par adsorption, notamment les substances cationiques ou les protéines, au pH utilisé pour l'adsorption du matériel nucléique. Dans le cas des substances cationiques, on choisit parmi les polyacides aminés de type polylysine ou polyargine, lévogyre, dextrogyre ou lévogyre/dextrogyre, plus particulièrement, dans le cas de la polylysine, son poids moléculaire retenu se situe dans la fraction 1 5 000 à 30 000 Daltons. Selon une autre caractéristique du procédé, la sensibilisation du support est réalisée par incubation en tampon phosphate 10mM, chlorure de sodium 137 mM et un pH compris entre 6,5 et 8, plus particulièrement 7,2. Dans le cas d'un produit lésant chimique, celui-ci est dilué dans une solution tamponnée et peut être bioactivé. La solution de lavage utilisée est une solution en tampon phosphate 10 mM, chlorure de sodium 137mM et un tensioactif non ionique. Quant au tensioactif non-ionique, on choisit plutôt du "Tween 20" en proportion égale 0,05 à 0,15 % et plus particulièrement 0,1%. La présente invention a aussi pour objet un procédé de capture d'ADN issu directement à partir de cellules vivantes traitées ou non traitées qui se caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes action d'un produit lésant directement sur les cellules, lyse des cellules dans une solution adaptée, . fixation de l'ADN sur un support sensibilisé. Ce procédé de capture peut être accompagné par la mise en oeuvre des étapes du procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de 'ADN et dans ce but, il comprend, en outre, les étapes suivantes action d'un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant des marqueurs, . révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage. Selon un mode préférentiel, la lyse des cellules dans la solution adaptée s'effectue en présence du support sensibilisé. Un milieu de lyse selon l'invention est préférentiellement composé d'une solution en tampon phosphate 10mM, chlorure de sodium 137 mM, urée 5 à 20%, bromure d'hexadecyltrimethyl ammonium 0,1 à 0,5%, protéinase K, de 200 à 500 lg/ml. Le présent procédé de détermination des lésions d'ADN et le procédé associé de capture et de purification de l'ADN en vue de la détermination des lésions sont décrits ci-après, assortis d'exemples d'essais réalisés avec les résultats obtenus. Les graphes annexés permettent d'illustrer la description du procédé selon l'invention en association avec les résultats indiqués dans la description qui va suivre, et les figures de ces dessins représentent . figures 1A à 1F, un schéma illustrant les étapes du procédé, . figure 2, graphe du rapport du taux de capture de l'ADN par adsorption en pourcentage sur un support rigide sensibilisé à la polylysine par rapport à un support non sensibilisé, . figure 3, graphe de la cinétique de réparation d'ADN lésé, . figure 4, graphe du taux de réparation en fonction de la quantité d'extrait cellulaire, . figure 5, graphe du taux de réparation en fonction de la concentration de KCI, . figure 6, graphe du taux de réparation en fonction de différentes doses de produit lésant, en l'occurrence des rayons ultraviolets, et Les essais menés à l'aide du procédé selon l'invention ont consisté à réaliser les étapes suivantes a/ à f/, représentées schématiquement sur les figures 1A à 1 F et détaillées ci-après Figures 1A - 1B : adsorption de l'ADN sur des Duits sensibilisés et action d'un produit lésant a/ préparation d'un support solide, en l'occurrence une plaque de microtitration à puits du type Microlite II, commercialisée par la société Dynatech. Les puits de cette plaque sont ensuite sensibilisés pendant une nuit avec 50 ;1L de poly-L-lysine dans la fraction moléculaire comprise entre 1 5 000 et 30 000 Daltons dans une solution tampon phosphate avec un sel, ceci à une température de 40C. Cette plaque est lavée deux fois avec une solution de lavage comprenant un tampon phosphate avec un sel auquel on rajoute un tensioactif non ionique, du "Tween 20", dans une proportion de 0,1%. b/ Un plasmide 2959 bp résistant à l'ampicilline est préparé par la méthode de lyse alcaline à partir d'Escherichia coli, JM109, suivi, par exemple, par une chromatographie sur colonne Qiagen. La solution d'ADN est soumise à une agitation douce pendant 30 minutes à 300 C, puis lavée deux fois avec une solution de lavage identique à la solution de lavage des plaques. Figure 1C : formation de dommages à l'ADN Dar l'action du produit lésant c/ Génération de lésions sur l'ADN ainsi adsorbé, avec un rayonnement ultraviolet germicide à 254 nm. Le taux d'émission est mesuré par un dosimètre pour rayonnement ultraviolet et le rayonnement est émis avec des puissances comprises entre 50 et 600 J/m. Des agents aikylants sont dilués en tampon phosphate 10mM, au pH 7,2 et incubés avec 'ADN pendant 1 heure à 300 C. Du monoazide d'éthidium est dissout dans une solution 10mM Tris-HCI, 1 mM acide éthylènediamine tétra-acétique et incubé avec 'ADN (80 lg/ml) avec différents rapports molaires (drogue/nucléotide) compris -3 -2 entre 1.10 et 4.10 pendant 10 minutes et soumis ensuite pendant 270 secondes à l'action d'une lampe ballon de 500 W. A la suite de ce traitement chimique, l'ADN est, par exemple, précipité à l'éthanol. c'/ Génération de lésions sur de l'ADN fixé sur plaque sensibilisée. Les étapes sont les mêmes mais les puits de la plaque sensibilisée sont rincés deux fois avec une solution en tampon phosphate avec sel et un tensioactif "Tween 20" à 0,1%. Fiaure 1D : réaction de réparation et incorporation de DlG-1 1 dUMP aux sites de dommage. en présence d'un extrait cellulaire d/ Réparation en présence d'un extrait cellulaire et d'agents de type connu, comprenant, par exemple, pour un volume de milieu réactionnel (MR), de 50 Cil :: 150 ug d'extraits protéiniques extraits de cellules HeLa, . 50 mM de KCI dans un milieu tampon contenant 40 mM Hepes KOH (pH 7,6), 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de DTT, 10 mM de phosphocreatine, 2,5 ug de phosphocreatine kinase, 2 mM EGTA, 3,4% de glycérol, 18 Cig d'albumine sérique bovine, 0,4 BM de dGTP, de dCTP, de dATP et de DIG-11 dUTP. Cette réparation est obtenue par une incubation de 3 heures à 300C et les puits sont lavés trois fois avec la même solution que précédemment. L'ADN marqué est incubé 30 minutes avec un anticorps anti-digoxygénine couplé associé à une phosphatase alcaline diluée à 1/10 000 dans un tampon phosphate avec sel, plus 0,025% d'albumine sérique bovine acétylée et 0,1% de "Nonidet P40". Les plaques sont lavées trois fois avec la même solution que précédemment. Figure 1E : incubation avec un anticorDs anti-DIG coniuaé à la ohosohatase alkaline et reconnaissance de l'anti-DIG par l'anticorps suivie d'une incubation avec un agent luminescent e/ Incubation avec un substrat chimioluminescent, "Lumi-Phos 530", pendant 15 minutes. Figure 1F : émission de la lumière due à la deDhosDhorvlation enzvmatigue du "Luni-Phos 530" f/ Mesure de la lumière émise avec un luminomêtre ("Luminoskan") et exprimée en unités relatives de lumière (Relative Light Unit, RLU). On a pu constater que les plaques sensibilisées avec de la polylysine permettent l'adsorption d'ADN alors que les plaques test non sensibilisées ne retiennent pas l'ADN après lavage. Ceci est indiqué sur la figure 2, sur laquelle la courbe avec les carrés représente le pourcentage d'accrochage de l'ADN sur les plaques avec polylysine tandis que la courbe avec des cercles représente le pourcentage d'accrochage de l'ADN sur les plaques non sensibilisées. Ces courbes sont obtenues par une mesure de la radioactivité utilisant des marqueurs isotopiques, lors d'une manipulation spécifique visant à déterminer uniquement les possibilités d'accrochage de l'ADN. Ces courbes sont le reflet de la moyenne de trois essais successifs. La saturation de la plaque avec une solution de 50 ul d'ADN est atteinte avec une concentration de 1 à 2 tg/ml d'ADN correspondant à sensiblement à 40-80 ng d'ADN fixé. Ainsi, la fixation sur un support solide tel qu'une plaque de microtitration à puits autorise maintenant les réactions de réparation permettant de quantifier la capacité de l'ADN à être réparé, comme cela est maintenant décrit. La présence de lésions de l'ADN est détectée par la réaction de réparation par excision adaptée en milieu in-vitro. Après incubation de l'ADN lésé et de l'ADN non lésé en présence d'un extrait cellulaire, on peut déterminer le taux de réparation par chimioluminescence. Les essais ont consisté à faire varier les paramètres suivants : temps d'incubation, importance de la lésion, concentration de l'extrait cellulaire, concentration en sels, ou quantité d'ADN, de façon à optimiser la réaction de réparation. Ainsi, la cinétique de réparation avec un extrait cellulaire HeLa, représentée par le graphe de la figure 3, montre que le maximum de réparations est obtenu en 3 heures, durée à l'issue de laquelle la cinétique de réparation stagne. Ainsi, avec un ADN ayant été soumis à une dose de 300 J/m2 de rayonnement ultraviolet, le maximum de synthèse de réparation de lésions en présence de 300ut d'extrait cellulaire, comme le confirment les figures 3 et 5. Sur la figure 5, la courbe avec les carrés correspond à la soumission de I'ADN au rayonnement ultraviolet avant l'étape d'adsorption et la courbe avec les cercles correspond à la soumission de l'ADN au rayonnement ultraviolet après l'étape d'adsorption. Afin d'optimiser encore la synthèse réparatrice, la figure 4 montre des essais avec différentes concentrations de sel, en l'occurrence du chlorure de potassium, KCI. La courbe présente un maximum avec 70 mM de KCI. Pour la suite des essais, les valeurs optimales retenues sont . durée d'incubation : 3 heures, quantité d'extrait cellulaire : 150 > 9, et 70 mM de KCI. Le procédé selon l'invention consiste ensuite à révéler les lésions ainsi générées et deux possibilités sont offertes, la première dans laquelle les lésions sont générées préalablement à l'étape d'adsorption et, la seconde, dans laquelle les lésions sont générées postérieurement à l'étape d'adsorption. Des résultats similaires ont été trouvés en ce qui concerne le taux de réparation des lésions. De façon complémentaire, d'autres essais ont été menés en utilisant comme produit lésant des génotoxines qui conduisent à la formation d'adduits. Là aussi, la synthèse réparatrice s'effectue dans les mêmes proportions, que les lésions soient générées avant ou après l'adsorption. On peut remarquer que le procédé sur plaque selon l'invention est un test d'une grande sensibilité puisque la détection est opérée sur 40 ng d'ADN au lieu de 200 à 300 ng, dans le cadre d'un travail en tube. De plus, le test selon l'invention peut être automatisé. Ce même test peut également être utilisé pour cribler des composés génotoxiques, certains d'entre eux pouvant être activés par des enzymes. De même, on peut tester l'action de composés oxydants comme l'effet inhibiteur d'agents antioxydants. Des essais ont été menés avec des lésions générées par deux types d'agents oxydants - du péroxyde d'hydrogène H202, - du bleu de méthylène. a/ Le péroxyde d'hydrogène est connu pour produire des radicaux libres par la réaction de FENTON. Des plaques de microtitration à puits comportant de l'ADN fixé sont incubées pendant différentes périodes de temps avec des quantités variables de péroxyde d'hydrogène dilué en solution tampon phosphate à 370C. Des essais ont montré que le taux maximum de réparation est obtenu pour une quantité de 0,27 mM de péroxyde d'hydrogène, soit une dilution de -4 1,6.10 de H202 à 30 %. Les plaques sont ensuite rincées deux fois avec la même solution de lavage que précédemment utilisant le tensioactif non ionique "Tween 20" à raison de 0,1%. b/ Le bleu de méthylène est connu pour libérer par photoactivation, un atome d'oxygène. Pour les essais à suivre, le bleu de méthylène a été soumis à un rayonnement en lumière visible pendant 20 minutes avec deux lampes ballons de 100 W, une distance entre les lampes et les plaques support de 30 cm et une concentration de bleu de méthylène de 15 ng/ml. L'étape de réparation des lésions est réalisée suivant l'enseignement indiqué ci-avant, à l'aide du même milieu réactionnel MR. De la même façon, les plaques, après action du milieu réactionnel MR sont lavées trois fois avec la solution de lavage précédemment indiquée et incubées 15 minutes avec un substrat chimioluminescent ("Lumi-Phos 530"). Connaissant les actions de tels oxydants sur l'ADN, les essais ont permis de tester l'efficacité de composés antioxydants en analysant la luminescence correspondant à la réparation qui doit être d'autant plus faible que l'antioxydant est efficace. Pour le premier essai, comme la production de radicaux libres à partir du péroxyde d'hydrogène requiert la présence de fer, il a été utilisé un chélatant métallique, mésylate déferroxamine, afin de vérifier si la production de lésions peut être inhibée. On a pu constater que 10 uM de ce chélatant métallique inhibent totalement les effets du péroxyde d'hydrogène. Pour le second essai, avec le bleu de méthylène, on a calculé l'activité relative AR d'un antioxydant qui est égale à (contrôle RLU - test RLU) AR = (contrôle RLU - référence RLU) formule dans laquelle * contrôle RLU correspond à la valeur du signal du bleu de méthylène seul soumis au rayonnement, * test RLU correspond à la valeur du signal du bleu de méthylène soumis au rayonnement ultraviolet plus une molécule antioxydante, et * référence RLU correspond à la valeur du signal de la molécule antioxydante seule. Les calculs montrent ainsi que cela est regroupé dans le tableau suivant que la silymarine présente une haute activité antioxydante tandis que le plasma et la vitamine A n'ont aucun effet antioxydant. silymarine A.R. A.R. vitamine C A.R. A.R. (mM) (avec BM) (avec H2O2) ( M) (avec BM) (avec H2O2) 105 0,44 ND 10 0,22 0,12 104 0,47 ND 104 0,39 0,20 103 0,43 ND 10-3 0,21 0,19 10.2 0,49 ND 10.2 0,24 0,30 101 0,94 0.66 10-1 0,28 0,45 1 1 1 1 -1,2 (a) 0,56 Vitamine A A.R. A.R. Plasma A.R. A.R. ( M) (avec BM) (avec H2O2) (dilution) (avec BM) (avec H2O2) 10 0,07 0,06 3.10 0 0 10-3 0,24 0,15 1.10-5 0,07 0,40 10.2 0,25 0,20 2.1 0,12 0,69 10-1 0,14 0,21 5.10-5 0 0,85 1 0,21 0,18 2.104 0 0,95 10 0,18 0,20 4.10-4 0 0,98 (a) une valeur négative signifie que la valeur test est supérieure à la valeur référence ND : non déterminé BM : bleu de méthylène La modulation de réparation des lésions par des agents peut également être mesurée.Par exemple, les effets respectifs de la doxorubicine et de la camptothécine, des inhibiteurs de topoiosomérases, sont quantifiables par les mesures d'une baisse du signal de réparation sur un ADN lésé lorsque ces molécules sont ajoutées au mélange de réparation. On peut aussi capter l'ADN directement à partir de cellules ayant subies l'action d'un composé susceptible d'induire des lésions sur l'ADN de ces cellules, par exemple un génotoxique, ou un mélange de composés. Parmi les composés, on peut citer les produits oxydants car ils génèrent des radicaux libres de type oxygène singulet 102, et le radical hydroxyl OH-, comme cela a été indiqué lorsque les tests sont produits directement sur de l'ADN fixé sur support solide. On opère de la même façon que précédemment pour l'analyse des lésions et la détection mais le problème posé est la capture de l'ADN. Selon l'invention, les cellules sont donc soumises à l'action du composé à tester, par exemple un agent génotoxique puis, après une durée d'incubation variable, en présence de cet agent génotoxique, les cellules sont incubées en présence d'un agent de lyse directement dans les puits d'une plaque de microtitration sensibilisée, afin de capter l'ADN ainsi généré, qui doit être analysé. On peut citer comme composition de lyse une solution en tampon phosphate 1OmM, chlorure de sodium 137 mM, urée 5 à 20% (préférentiellement 10%), bromure d'hexadecyltrimethyl ammonium 0,1 à 0,5% (préférentiellement 0,2%), protéinase K, de 200 à 500 lg/ml. L'étape de lyse est comprise entre 30 minutes et 2 heures. On a ainsi pu fixer de l'ADN sur un support solide, concomitamment à la lyse des cellules, et cet ADN peut ensuite subir toute analyse nécessitant sa mise sur support. En particulier, on peut analyser les lésions éventuellement subies, en appliquant à cet ADN l'étape de réparation et de marquage à froid ou à chaud et l'étape de révélation qualitative et quantitative, telles qu'elle viennent d'être décrites précédemment dans la description. Dans ce cas, les lavages sont effectués de la même façon que précédemment, avec une solution adaptée, puis les puits de la plaque sont incubés avec un extrait cellulaire en vue de permettre une éventuelle réparation. La révélation, notamment par chimioluminescence dans le cas d'un recours à des marqueurs froids de ce type, permet l'étude des lésions générées sur l'ADN lorsque la cellule qui le porte est soumise à l'action d'un composé à tester. Ce procédé de capture et de fixation de l'ADN sur un support solide est utile pour de nombreuses applications. En effet, il s'applique plus généralement à la capture et à la purification d'ADN ou d'ARN en vue d'amplifier enzymatiquement des séquences nucléotides particulières, à la capture d'ADN de cellules soumises à des agents génotoxiques en vue d'une analyse par un test UDS avec marqueur froid ou encore, à la capture et à l'analyse des coupures sur l'ADN de cellules soumises à un stress chimique ou physique. Un tel procédé présente un intérêt pris isolément et plus particulièrement dans le cas du procédé d'analyse précédemment indiqué. On remarque qu'il nécessite une faible de quantité de matière initiale, ainsi, l'ADN génomique provenant de 104 à 105 cellules peut être capté et les lésions quantifiées lorsque la cellule a été traitée par un génotoxique quelconque. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend les différentes étapes suivantes . fixation de l'ADN cible sur un support sensibilisé, action d'une composition à tester comprenant au moins un produit lésant, action d'une composition comprenant au moins un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant des marqueurs, . révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage. 2. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est un support solide. 3. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce que le support solide est une plaque de microtitration à puits ou une plaque enduite de billes de "latex" . 4. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le support est sensibilisé par des substances présentant une très forte affinité vis à vis de l'ADN de façon à provoquer une fixation de cet ADN par adsorption. 5. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce que les substances sont choisies parmi les substances cationiques ou les protéines, au pH utilisé pour l'adsorption du matériel nucléique. 6. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce que les substances cationiques sont choisies parmi les polyacides aminés de type polylysine ou polyargine, lévogyre, dextrogyre ou lévogyre/dextrogyre. 7. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce que, dans le cas de la polylysine, son poids moléculaire retenu se situe dans la fraction 1 5 000 à 30 000 Daltons. 8. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 5,6 ou 7, caractérisé en ce que la sensibilisation du support est réalisée par incubation en tampon phosphate 10mM, chlorure de sodium 137 mM et un pH compris entre 6,5 et 8, plus particulièrement 7,2. 9. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit lésant, dans le cas d'un produit lésant chimique, est dilué dans une solution tamponnée. 10. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit lésant, dans le cas d'un produit lésant chimique, est bioactivé. 11. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de lavage est une solution en tampon phosphate 10 mM, chlorure de sodium 137mM et un tensioactif non ionique. 12. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de 'ADN selon la revendication 11, caractérisé en ce que le tensioactif nonionique est du "Tween 20" en proportion égale 0,05 à 0,15 % et plus particulièrement 0,1%. 13. Procédé de capture de l'ADN issu directement à partir de cellules vivantes traitées et caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes . action d'un produit lésant directement sur les cellules, . lyse des cellules dans une solution adaptée, fixation de l'ADN sur un support sensibilisé. 14. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN issu directement à partir de cellules vivantes traitées, selon la revendication 13, et mise en oeuvre des étapes du procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, les étapes suivantes action d'un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant des marqueurs, . révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage. 15. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN issu directement de cellules vivantes traitées, selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que les étapes de fixation et de lyse sont effectuées simultanément, la lyse des cellules dans la solution adaptée s'effectuant en présence du support sensibilisé. 1 6. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur de l'ADN issu directement de cellules vivantes traitées, selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le milieu de lyse est préférentiellement composé d'une solution en tampon phosphate 1 OmM, chlorure de sodium 137 mM, urée 5 à 20%, bromure d'hexadecyltrimethyl ammonium 0,1 à 0,5%, protéinase K, de 200 à 500 ssg/ml.