Brevet FR2728904A1 — publié le 19960705

L'invention a pour objet l'utilisation d'un réactif peptidique permettant la détection, même â un stade très précoce, d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr, par recherche dans un échantillon biologique de la présence éventuelle d'anticorps IgM reconnaissant ledit réactif. L'invention concerne également un procédé de détection d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr à l'aide d'un tel réactif peptidique, ainsi qu'un nécessaire (trousse de détection) permettant la mise en oeuvre de ce procédé. On sait que le virus d'Epstein-Barr (en abrégé : EBV) est un virus capable d'infecter les cellules épithéliales et lymphoïdes humaines. Il est établi que ce virus est â l'origine de la mononucléose infectieuse (en abrégé. Moi). La primo-infection survient le plus souvent pendant l'enfance, généralement de façon asymptomatique, et le virus reste ensuite présent dans l'organisme, â l'état latent. On estime généralement que plus de 95% des humains adultes sont infectés par ce virus. Dans certains pays et/ou dans certains groupes sociaux, I'infection primaire peut n'avoir lieu qu'à l'âge de l'adolescence ou chez l'adulte jeune.Parmi ces cas d'infections primaires tardives, 50% environ sont des infections aiguës accompagnées des symptômes de la mononucléose infectieuse (MNI). On sait par ailleurs que dans certaines zones géographiques, I'EBV est étroitement associé avec certains cancers, notamment le cancer du nasopharynx et le lymphome de Burkitt. Chez les personnes immunodéprimées, et notamment les personnes ayant subi des greffes d'organes ainsi que chez les patients infectés par le virus HIV, on observe fréquemment une réactivation du virus, c'est-a-dire le passage d'un état de latence à un cycle lytique de réplication du virus. Il est connu que chez les sujets immunodéprimés, la réactivation du virus ou l'infection primaire conduit fréquemment au développement de divers lymphomes. L'étude de l'infection à EBV et la recherche de méthodes de diagnostic sérologique a permis de mettre en évidence plusieurs antigènes viraux les antigènes de capsides virales (VCA), les antigènes précoces (EA) et les antigènes nucléaires (EBNA). Le diagnostic sérologique ciassique des infections à EBV comprend d'une part la recherche d'anticorps hétérophiles (test de Paul-Bunnell-Davidsohn) et la recherche d'anticorps contre les antigènes VCA, EA et EBNq généralement par immunofluorescence indirecte. Ces tests sont difficiles à mettre en oeuvre et on observe une certaine proportion de faux négatifs et de faux positifs. On admet actuellement que les profils sérologiques peuvent être interprétés de façon non équivoque dans certains cas qui sont passés en revue ci-après. L'apparition d'anticorps anti-VCA suit généralement de près la primo-infection et on admet que l'absence d'lgG anti-VCA permet de conclure que le sujet n'a pas été infecté par l'EBV. On admet d'ailleurs que lorsqu'un sérum ne contient pas d'anti-VCA, il ne contient pas non plus d'autres anticorps anti-EBV. Chez les individus porteurs asymptomatiques, c'est-à-dire chez la presque totalité de la population qui a été infectée par le virus et chez qui le virus est à l'état de latence, on trouve à la fois des anticorps anti-VCA et anti-EBNA. Dans le cas de l'infection primaire symptomatique (MNi), la recherche d'anticorps hétérophiles (Test de Paul-Bunneil-Davidsohn, ou PBD) est généralement positive. On trouve généralement la présence d'IgG anti-VCA tandis que les anticorps anti-EBNA sont absents ou ne sont présents qu'en faible quantité. Les IgG anti-VCA diminuent progressivement après l'infection primaire et restent stables toute la vie, tandis que les anticorps anti-EBNA apparaissent plus tardivement, au bout de plusieurs mois avant de se stabiliser. A propos de l'état des connaissances sur les infections à EBV et leur diagnostic, on peut citer notamment J.-Nl. Seigneurin - Infections a Virus Epstein-Barr - Editions techniques - Encycl. Méd. Chir. (Paris-France), Maladies Infectieuses, S-071-A-10, Pédiatrie 4-310-A-30, pp. 1-7 (1993). On sait par ailleurs qu'une protéine appelée ZEBRA (ou EB1 ou Zta) joue un rôle primordial dans la régulation de la latence , voir notamment G. Miller, J. of Infectious Diseases, 161:838-844(1990) et I. Mikaclian et al., J. Virol., 67:734-742(1993). Cette protéine est un facteur de transcription qui joue notamment un role d'activateur dans la transcription de certains gènes et dans sa propre synthèse. La protéine ZEBRA est considérée comme étroitement associée a la transition entre l'état de latence et le cycle lytique du virus, et la recherche d'anticorps anti-ZEBRA a été étudiée comme un marqueur indirect d'une réactivation virale, notamment chez des sujets immunodéprimés HIV-séropositifs , voir par exemple I. Joab et al., J. ofInfectious Diseases. 163:53-56 (1991) et V. Maréchal et al., Res. Virol., 144:397-404 (1993). On a maintenant découvert que les anticorps anti-ZEBRA apparaissent très précocement lors des infections primaires, et que la détection de la présence d'anticorps IgM anti-ZEBRA permet de diagnostiquer de façon très précoce les primo-infections à EBV. On a découvert en outre que la recherche d'IgM dirigées contre le fragment 157-195 de la protéine ZEBRA permet de diagnostiquer sans faux négatifs les infections primaires à un- stade où aucun des marqueurs sérologiques classiques ne donnent 100% de résultats positifs. On rappelle que la séquence 157-195 de la protéine Zebra est un peptide répondant à la formule (I) Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Ars Val Ala Ser Mg Lys Cys Mg Ala Lys Phe Lys Gln. Par une étude systématique de recherche d'anticorps dirigés contre divers peptides plus courts que le peptide de formule (I) et dont la séquence est comprise dans la séquence représentée par la formule (I), on a remarqué que l'on détecte plus particulièrement, dans les infections primaires à EBV, des IgM dirigées contre une partie de l'extrémité carboxy-terminale de la séquence de formule (I). La séquence de cette partie est représentée par la formule (n) suivante: Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln. La présente invention a donc pour objet l'utilisation comme réactif peptidique permettant la détection, et notamment la détection très précoce, d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr chez un sujet, par recherche, selon une méthode connue en soi fondée sur la formation d'au moins un complexe du type antigène-anticorps, dans un échantillon biologique prélevé chez ledit sujet, d'anticorps IgM reconnaissant ledit réactif, caractérisée par le fait que ledit réactif contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (II) donnée ci-dessus.Compte tenu de la précocité de l'apparition des IgM dirigées contre le peptide de formule (II), I'utilisation du réactif selon l'invention permet aussi de confirmer, avec moins de risques d'erreur qu'en utilisant les méthodes connues jusqu'à présent, l'absence d'une infection primaire a EBV. On peut donc utiliser notamment comme réactif peptidique selon l'invention un peptide comprenant tout ou partie de la séquence de formule (II), y compris un peptide dont la séquence est plus courte que celle de formule (II), par exemple un peptide de formule (ici): Val Ala Ser Arg Lys Cys Mg Ala Lys Phe Lys Gin, ou encore un peptide dont la séquence est plus longue que celle de formule (II) (par exemple le peptide de formule (I)) ou bien un peptide dont la séquence comprend une partie de l'extrémité N-terminale du peptide Il complétée, du côté N-terminal, par une séquence adjacente présente dans la formule (I), par exemple un peptide de séquence: : Ser Glu Leu Glu Ile Lys Mg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Mg Ala Lys Phe. L'invention a également pour objet un procédé de détection d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr chez un suJet, caractérisé par le fait que l'on recherche, de façon connue en soi, dans un échantillon biologique prélevé chez ledit sujet, la présence d'anticorps IgM capables de reconnaitre le peptide de formule (II) Leu Glu Ile Lys Mg Tyr Lys Asn Mg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln. Bien entendu, la présence des anticorps IgM ainsi recherchés permet de conclure à l'existence d'une infection primaire à EBV, et l'absence desdits anticorps permet de conclure à l'absence d'une infection primaire détectable. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention est un procédé dans lequel: - on met en contact un échantillon biologique prélevé chez ledit sujet avec un réactif peptidique, dans des conditions permettant la formation d'un complexe de type antigene-anticorps entre ledit réactif peptidique et des anticorps qui reconnaissent ledit réactif s'ils sont présents dans ledit échantillon, - et on recherche la présence éventuelle d'un tel complexe, selon une méthode de révélation connue en soi, caractérisé par le fait que ledit réactif peptidique contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (II) . Leu Glu Ile Lys Mg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln, et par le fait que les complexes dont on recherche la présence sont des complexes formés entre ledit réactif et des anticorps de type IgM. Dans les procédés qui viennent d'être décrits, les réactifs peptidiques sont notamment ceux qui ont été définis précédernment. L'échantillon biologique est notamment un échantillon de sérum sanguin, ou un autre fluide biologique, par exemple le liquide céphalo-rachidien. La mise en oeuvre des tests de détection d'anticorps à l'aide d'un antigène est bien connue et ne sera donc pas décrite en détail ici. L'antigène peut être fixé, par adsorption ou par covalence, sur un support solide (puits d'une plaque de microtitration, paroi d'un tube, bille de matière plastique, particules de latex, etc). Lorsque l'antigène est fixé sur des microbilles, on peut opérer selon les méthodes d'immunofiltration, et avec des particules de latex, on peut procéder selon des techniques d'agglutination. On peut aussi opérer notamment selon les techniques en phase solide dites sandwich , ou encore par compétition avec des anticorps marqués spécifiques de l'antigène. Dans le cas des techniques sandwich, la révélation peut être effectuée de façon connue, à l'aide d'anticorps hétérologues (anticorps d'animaux) anti-(IgM humaines) marques.On peut également utiliser des anticorps hétérologues antigM humaines) non marqués et révéler leur fixation sur les IgM, si elles sont présentes, par des anticorps marques diriges contre les immunoglobulines de l'espèce animale dont proviennent les anticorps hétérologues utilisés. Le marquage des anticorps est effectué notamment par couplage avec une enzyme (par exemple une peroxydase) capable de catalyser une réaction colorée. On peut également utiliser un marqueur fluorescent ou luminescent On peut aussi mettre en évidence la formation de complexes de type antigène-anticorps sans utilisation d'anticorps marqués, par exemple à l'aide de mesures électriques (capadté, impédance), de façon connue. L'invention a également pour objet un nécessaire pour la détection d'une infecton par le virus d'Epstein-Barr, ledit nécessaire comprenant un réactif peptidique et des moyens pour i;v' la présence d'un complexe de type antigene-anticorps, susceptible de se former lorsque l'on ne en présence ledit réactif et des anticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique i & analyser, caractérisé par le fait qu'afin de détecter une infection primaire par ledit virus: - ledit réactif peptidique contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirige contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (I):: Arg Arg lllr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln, - et que lesdits moyens sont des moyens susceptibles de révéler la présence de com-Les de type antigene-anticorps formés par des anticorps de type IgM avec ledit réactif. Les exemples suivants illustrent l'invention EXEMPLE 1: On a effectué des tests ae diagnostic en utilisant comme antigène la protéine ZEBRA ou certains peptides contenus dans cette protéine. On a comparé les résultats à ceux obtenus avec les tests classiques de diagnostic sérologique. Les tests classiques utilisés sont les suivants: - recherche d'anticorps hétérophiles (test PBD) - recherche d'IgG dirigées contre les antigènes VCA, EA et EBNA par immunofluorescence indirecte. Le titrage des anticorps anti-VCA et anti-EA a été réalisé en utilisant les lignées cellulaires P3HRl et Raji, soumises à une induction (passage du cycle latent au cycle lytique) par le mélange phorbol myristateibutyrate respectivement. Le titrage des anticorps anti-EBNA a été pratiqué en utilisant la lignée Raji (non induite). Les lignées P3HRI et R;iï sont disponibles auprès de nombreux laboratoires et de l'ATCC. On a utilisé en outre deux kits commerciaux permettant une révélation immuno- enzymatique: - le test commercialisé sous la dénomination Biotest anti-EBV recombinant par Biotest AG (Allemagne) pour rechercher les anticorps anti-EA et anti-EBNA, - et le test commercialisé sous la dénomination Enzygnost par Behring (Allemagne) qui permet une recherche des anticorps IgG et IgM anti-EBV. Dans tous les cas, les sérums étudiés ont été adsorbés sur le réactif Gull-Sorb (Gull Laboratories, Salt lake City, USA) afin d'éviter les interférences dues au facteur rhumatcde. Définitions Une infection primaire à EBV est définie par la présence d'IgM anti-EBV et en partit d'IgM anti-VCA par immunofluorescence indirecte tatou par la présence d'anticorps hétérophiles. On observe ensuite successivement, au décours de l'infection, la présence d'IgG anti-VCA ( > 1:20) et d'IgG anti-EA ( > 1:10) avec absence d'anticorps anti-EBNA ( Une réactivation du virus EBV (infection secondaire) est définie par la présence d'anticorps anti-VCA ( > 1:320) et anti-EA ( > 1:40) avec présence (ou préexistence lorsqu'on a pu l'établir) d'anticorps anti-EBNA ( > 1:10). Une infection latente est définie par l'absence d'IgM anti-VCA et l'absence d'IgG anti-EA ( Peptides ulilisès comme antigènes Le peptide de formule (I) a été synthétisé selon les méthodes classiques. Ce peptide est appelé ici P130. On a également utilisé comme antigène la protéine ZEBRA clonée dans Eschertchia co?i. Après culture bactérienne, la protéine ZEBRA est extraite et purifiée selon les techniques usuelles. Réaction immuno-enzymatique On reveut les cupules (puits) de plaques de microtitration avec l'antigène de la façon suivante: le peptide est déposé dans chaque puits à raison de 100 ng/100 l (dilué en tampon carbonateWbicarbonate 50 mM, pH 9,6) et on laisse incuber pendant une nuit à 370C. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec du tampon phosphate-Tween 0,1% (PBST) pH 7,4. Les sérums sont dilués au 1:100 en tampon PBS (1 M NaCl)-sérum de veau fbelal 5Ye Tween 0,1 % (PBSST) On dépose dans les puits le sérum ainsi dilué à raison de 100 L/puits. Après incubation pendant 1 heure à 37 C suivie de 3 lavages avec PBST, on ajoute 100 FL de conjugué anti-IgG humaines/peroxydase (ou anti-lgM humaines/peroxydase). Ces conjugués commercialisés par Jackson-Immunoresearch Inc. sont dilués préalablement au 1:26.000 dam du PBST.Après incubation pendant 30 minutes à 37 C, puis lavage avec PBST, on procède â la révélation de l'enzyme pendant 10 minutes à l'abri de la lumière à l'aide d'une solution de tétraméthylbenzidine (0,5%) et de peroxyde d'hydrogène (0,05%) en tampon citrate pH 4 (100 FI/puits). La réaction colorée est stoppée à l'aide d'une solution acide sulfilrique IN. La lecture seyait dans un spectrophotomètre et l'absorbance est mesurée à 450 nm (A450). Chaque dilution de sérum est testée en double, d'une part vis-à-vis de l'antigène (peptide ou protéine ZEBRA purifiée) et d'autre part vis-à-vis de cupules sans antigène (puits témoin). La valeur finale retenue de l'absorbance est donc la valeur résultant de la différence entre l'absorbance moyenne des puits contenant l'antigène et l'absorbance moyenne des puits témoins. Des sérums de référence positifs (pool de 10 sérums de patients avec MNI) et négatif (pool de 20 sérums de patients séronégatifs et asymptomatiques) sont également testés en double et dans les mêmes conditions que les échantillons cliniques. La valeur-seuil de l'absorbance a été fixée à 0,200 pour la méthode Elisa utilisant le peptide de formule (I) et à 0,300 pour la méthode Elisa utilisant la protéine ZEBRA. 20 sérums provenant de patients avec mononucléose infectieuse ont été testés. Les IgM anti-P130 sont détectées dans 1000/o des sérums et les IgM anti-ZEBRA dans 55% des cas. Les IgG anti-P130 et anti-ZEBRA sont détectées dans 75% et 80 /. des cas, respectivement. Les anticorps IgG anti-VCA, anti-E A et anti-EBNA sont détectés en immunofluorescence dans 100%, 1000/. et 0% des cas, respectivement. On a par ailleurs recherché les IgM anti-EA, IgG anti-EA et 1gG anti-EBNA avec le test de Biotest. Les résultats sont positifs dans 90%, 80% et 0% des cas, respectivement. Avec le test ELISA anti-EBV Behring, les IgM et IgG ont été détectées dans 80Y a 1000/. des cas, respectivement. Dans 6 autres cas étudiés de patients semblant présenter des symptomes de MNI, avec absence d'anticorps anti-VCA, înti-EA et anti-EBNA en immunofluorescence, les IgM anti-EA (test ELISA Biotest) étaient détectées chez 4 patients sur 6, de meme que les IgM anti-EBV (Enzygnost), tandis que les IgM anti-P130 étaient détectées dans tous les cas. Ains, sur l'ensemble des sérums testés (MNI ou syndrome MNl-like), seuls les tests effectués avec l'antigène P130 ont permis de détecter une infection primaire et inne des infections non déclarées pour lesquelles les tests d'immunofluorescence donnaient des résultats négatifs tandis que les tests commerciaux ELISA ne détectaient pas tous les sérums positifs détectés par P130. EXEMPLE 2 : Utilisation de l'antigène dc formule (II) ou de formule (III). Ces peptides ont été synthétisés de façon classique. Avec ces peptides, on a réalisé des tests ELISA de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1. Les résultats sont analogues à ceux observés avec le peptide de formule (I). REVENDICATIONS 1. Utilisation comme réactif peptidique pour la détection d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr chez un sujet, par recherche, selon une méthode connue en soi fondée sur la formation d'au moins un complexe du type antigène-anticorps, dans un échantillon biologique prélevé chez ledit sujet, d'anticorps IgM reconnaissant ledit réactif, caractérisée par le fåit que ledit réactif contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (il) : Leu Glu ne Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la séquence dudit peptide contenu dans ledit réactif comprend tout ou partie de la séquence de formule (II). 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que ledit peptide contenu dans ledit réactif est reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont h séquence est représentée par la formule (III) suivante: Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln. 4. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que la séquence dudit peptide contenu dans ledit réactif comprend tout ou partie de la séquence de formule (III). 5. Procédé de détection d'une infection primaire par le virus d'Epstein-Barr chez un sqj , caractérisé par le fait que l'on recherche, de façon connue en soi, dans un échantillon biok*ique prélevé chez ledit sujet, la présence d'anticorps IgM capables de reconnaitre le peptide de fbrnnale : Leu Glu Be Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln. 6. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel: - on met en contact un échantillon biologique prélevé chez ledit sujet avec un peptidique, dans des conditions permettant la formation d'un complexe de type antigène-anticorps entre ledit réactif peptidique et des anticorps qui reconnaissent ledit réactif, s'ils sont présents dans ledit échantillon, - et on recherche la présence éventuelle d'un tel complexe, selon une méthode de révélation connue en soi, caractérisé par le fait que ledit réactif peptidique contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (Il):: Leu Glu ne Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln, et par le fait que les complexes dont on recherche la présence sont des complexes formés entre ledit réactif et des anticorps de type IgM. 7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit reaclif est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 4. 8. Nécessaire pour la détection d'une infection par le virus d'Epstein-Barr, ledit nécesilir; comprenant un réactif peptidique et des moyens pour révéler la présence d'un complexe de type antigène-anticorps, susceptible de se former lorsque l'on met en présence ledit réactif et des anticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique à analyser, caractérise par k fiit qu'afin de détecter, y compris à un stade précoce, une infection primaire par ledit virus: - ledit réactif peptidique contient un peptide reconnu par au moins un anticorps dirigé contre le peptide dont la séquence est représentée par la formule (II): : Leu Glu Be Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln, - et que lesdits moyens sont des moyens susceptibles de révéler la présence de complues de type antigene-anticorps formés par des anticorps de type IgM avec ledit réactif 9. Nécessaire selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit réactif est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 4.