Brevet FR2731230A1 — publié le 19960906

La présente invention concerne des anticorps monoclonaux et plus particulièrement des anticorps monoclonaux dirigés contre la région s'étendant du résidu 63 au résidu 75 de la protéine E2 ; leur procédé de fabrication et leur utilisation sous forme de médicament ou sous forme de kit en vue de la détection diagnostique ou thérapeutique de cellules présentant E2. Le premier gène pseudoautosomal connu chez l'homme est le gène MIC 2. Ce gène est localisé sur la partie terminale du bras court du chromosome X (Xp22.32-p ter) et sur la région distale du bras court du chromosome Y(Ypll.2p ter). Le gène MIC 2 et son produit, la protéine E2, sont à la base du groupe sanguin Xga chez l'homme dont l'expression est liée au sexe ; les femmes Xga négatives n'expriment pas la protéine E2 à la surface des érythrocytes mais présentent, à l'intérieur des globules rouges, la forme précurseur intracytoplasmique. En confirmation de cette localisation pseudoautosomale, il a été demontré que l'expression de MIC 2 échappe au phénomène d'inactivation du chromosome X chez les femmes. La molécule E2 a été classée au Ve Atelier International sur les Antigènes de Différenciation Leucocytaire à Boston (1993) CD99. Après clonage et séquençage, la séquence primaire de la molécule E2 a été déterminée (Gelin et al. The EMBC Journal vol. 8 n" 11 pp 3253-3259, 1989). La molécule E2 est une protéine transmembranaire intégrale, n'appartenant à aucune famille de protéines connues, mais présentant dans la partie proximale de son segment extracellulaire une région ressemblant au collagène et dans sa partie distale, une région riche en proline, donc vraisemblablement très pelotonnée. Son segment intracytoplasmique, fait de 32 résidus, est suffisamment long pour permettre la transduction d'un signal à l'intérieur de la cellule.Cette protéine a été mise en évidence à la surface des lymphocytes T et est impliquée dans le phénomène des rosettes : les anticorps monoclonaux anti E2, qui ont permis de découvrir cette molécule, bloquent les rosettes en se fixant à la surface du lymphocyte T. Sa masse moléculaire est de 32 kD et elle possède des propriétés biochimiques particulières : E2 est sialylée et surtout porte exclusivement des radicaux sucrés liés en O. Cette protéine E2 est présente à l'intérieur de la cellule sous la forme d'un précurseur de 28 kD. Par ailleurs, la protéine E2 provoque un ensemble de phénomènes fonctionnels liés de façon frappante à certaines régions structurelles de la molécule : les anticorps monoclonaux s'adressant à un épitope non restreint de la molécule, déclenchent sur la souspopulation de corticothymocytes "doubles positifs", et d'une sous-population de lymphocytes T périphériques - le phénomène de "flip-flop" de la phosphatidylsérine à la membrane cytosplasmique, - l'agrégation homotypique de ces cellules T. Compte tenu de ces observations, la protéine E2 paraît devoir jouer un rôle fonctionnel très particulier et vraisemblablement très important dans la fonction et les mécanismes de différenciation des lymphocytes T, ainsi que sur toute autre cellule porteuse de ladite molécule E2. Par les méthodes classiques, 4 épitopes ont été définis sur la protéine E2. Deux d'entre eux sont présents sur toutes les cellules T quel que soit leur degré de maturité ou leur spécialisation fonctionnelle (épitopes 0662 et L129) et les deux autres ont une expression restreinte (épitopes 12E7 et D44). La position exacte de l'épitope 12E7 sur la protéine E2 est connue. L'épitope D44 est très caractéristique des corticothymocytes, tandis qu'il n'est pas exprimé sur les thymocytes médullaires. En périphérie, l'expression de 12E7 et de D44 est restreinte sur les lymphocytes CD4 et CD8 au sein de la population CD8, l'expression des deux épitopes est mutuellement exclusive, les lymphocytes CD8+ D44+ étant très spécifiquement les lymphocytes T tueurs. Cette particularité de D44 a permis de démontrer l'existence de lymphocyte T cytotoxiques spécifiques du VIH chez les patients infectés. La position exacte des épitopes 0662 et L129 sur la protéine E2 a maintenant été déterminée par la présente invention. Les épitopes L129 et 0662 sont situés précisément entre une région riche en proline (acides aminés 45 à 62) et une région riche en glycine (acides aminés 76 à 90) de la protéine E2. Cette région s'étendant du résidu 63 au résidu 75 de la protéine E2 sera appelée par commodité dans le reste de la descritpion, région 63-75. En outre, il a précisément été démontré que les phénomènes précédemment décrits, à savoir notamment d'adhésion des cellules T, l'agrégation des corticothymocytes et le phénomène de flip-flop membranaire, sont étroitement liés aux épitopes L129 et 0662. Malgré l'importance du rôle de la protéine E2 et en particulier celui des épitopes L129 et 0662 dans de nombreux phénomènes impliquant les lymphocytes T, on ne dispose pas dans l'état de la technique d'anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662, et qui permettraient de continuer les recherches concernant la protéine E2 et de préciser son rôle au sein de l'organisme. Des anticorps monoclonaux 0662 et L129 ont bien été cités par les inventeurs dans la littérature, mais ni leurs structures ni leurs moyens d'obtention n'ont été divulgués. Un des buts de la présente invention est donc de fournir des anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662. D'une façon générale, la présente invention concerne les anticorps monoclonaux capables de reconnaître tout ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2. Dans un de ses modes de réalisation, la présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre toute ou au moins une partie de la région 66-75 de la protéine E2. En particulier, la présente invention concerne les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes L129 et 0662, plus particulièrement. Il est à noter que l'anticorps dirigé contre l'épitope 0662, et appelé ci-après Ac 0662, a été déposé le 02 mars 1995 sous forme d'hybridome auprès de la collection CNCM sous la référence 0662-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1551. De la même manière, l'anticorps dirigé contre l'épitope L129, et appelé ci-après Ac L129, a été déposé le 02 mars 1995 sous forme d'hybridome auprès de la collection CNCM sous la référence L129-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1552. Un procédé d'obtention des anticorps monoclonaux selon l'invention peut être le suivant On prépare tout d'abord une banque d'hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux contre la protéine E2 par des méthodes tout à fait classiques d'obtention d'anticorps monoclonaux. Une telle méthode peut, par exemple, consister en une immunisation de souches de souris de type "Biozzi" avec une population entière de thymocytes (la sélection des lignées étant basée sur la capacité de leur milieu de culture à inhiber les rosettes), suivie de l'étape classique de fusion. Puis, après 3 étapes de clonage successives, les anticorps monoclonaux produits en grande quantité dans les souris sont récoltés puis purifiés par HPLC. Les anticorps monoclonaux ainsi purifiés sont alors séparés par immunodiffusion et ensuite sont quantifiés par la technique de Mancini (Mancini et al. 1965. Immunochemistry 2:235). Selon une technique habituelle, les anticorps monoclonaux sont enfin biotinylés (Bernard et al., J. Exp. Med. 155:1317). Ensuite, on réalise une bibliothèque de peptides de E2, dont certains au moins, contiennent la région 63-75 ou 66-75 et on procède à un criblage de la banque de monoclonaux, par exemple en mettant les peptides en compétition avec des cellules exprimant E2 à leur surface, ou avec des cellules transfectantes exprimant une bibliothèque de fragments d'ADNc E2. On peut alors identifier, par comparaison, les clones reconnaissant spécifiquemennt les épitopes pertinents. A titre d'exemple, on peut utiliser la banque d'épitopes peptidiques correspondant aux séquences suivantes figurant dans le listage de séquences : SEQ ID n1 à 6. En outre, il peut être intéressant dans certains cas, de disposer d'anticorps polyclonaux dirigés contre toute ou partie de la protéine E2. En ce sens, la présente invention concerne également un procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre toute ou partie de la région extracellulaire de la protéine E2, notamment contre sa région 63-75, comprenant une injection d'un peptide correspondant à toute ou partie de ladite région extracellulaire de E2, notamment ladite région 63-75, à un mammifère, par exemple un lapin, et le recueil du sérum après immunisation. Ledit peptide peut être couplé à une molécule porteuse ou un support classique. De la même façon, la présente invention concerne également un procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine E2, comprenant une injection de cellules transfectées, notamment CHO ou COS, par ladite protéine E2 à un mammifère, par exemple un lapin, un recueil du sérum après immunisation, une élimination des anticorps non spécifiques de la protéine E2 par épuisement dudit sérum sur cellules non transfectées, notamment sur cellules CHO ou COS. Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le ou les épitopes L129 et/ou 0662 de la protéine E2 pour la préparation d'un médicament destiné à supprimer ou à réduire la prolifération de cellules tumorales présentant à leur surface la protéine E2 ou à modifier le fonctionnement des lymphocytes T ou de toute cellule normale ou anormale porteuse de la molécule E2. En effet, les inventeurs de la présente invention ont constaté que les anticorps selon l'invention, dirigés contre les épitopes de 0662 et L129 de la protéine E2, provoquent l'apoptose, ou mort cellulaire programmée, des cellule présentant la protéine E2 à leur surface, et en particulier, celle des cellules tumorales. La réalisation d'un médicament comprenant comme principe actif au moins un des anticorps selon l'invention, peut donc contribuer à lutter efficacement contre les proliférations tumorales ou des phénomènes pathologiques de natures diverses dans la mesure où ces cellules présentent la protéine E2 à leur surface. L'invention concerne également un tel médicament ayant une action dirigée contre toute ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2 comprenant une dose efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la présente invention. Une dose efficace in vivo d'un tel médicament selon la présente invention sera de préférence comprise entre 0,02 mg/jour/kg et 200 mg/jour/kg d'anticorps par jour. Un tel médicament pourra être utilisé notamment dans la lutte contre le sarcome d'Ewing ou contre toute autre tumeur ou désordre pathologique notamment ceux impliquant des cellules exprimant le gène MIC2. Selon un autre aspect de la présente invention, il est également possible de réaliser un kit en vue de la détection diagnostique ou thérapeutique de desordres pathologiques ou de tumeurs comprenant au moins un anticorps selon l'invention dirigé contre tout ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2. Afin de procéder à la vérification de la reconnaissance commune de la région 63-75 de E2 par Ac L129 et AC 0662, le protocole expérimental classique suivant est réalisé a) Criblage d'une bibliothèque d'épitopes de E2 contenant des inserts de 50 à 100 pb dans un test "blot" sur colonies en utilisant Ac L129 et Ac 0662 en tant que sonde b) Après 3 criblages successifs, 10 clones reconnus par Ac 0662 sont sélectionnés c) Ces 10 clones sont également reconnus par Ac L129 après criblage d) De manière analogue, 8 autres clones reconnus par Ac L129 et soumis à un criblage avec Ac 0662 sont également reconnus par ce dernier e) Les inserts inclus dans ces 18 clones reconnus à la fois par Ac 0662 et Ac L129 sont séquencés et leur séquence nucléotidique est comparée à celle du cDNA de E2. Après comparaison, on s'aperçoit que ces différens clones présentent bien une région commune de 12 acides aminés. Ac L129 et Ac 0662 reconnaissent donc bien la région de 12 acides aminés de la protéine E2 (région 6375). Cette région est totalement distincte de la région 12E7 de la protéine E2 (39-42). Afin de mettre en évidence les épitopes distincts reconnus par Ac 0662 et Ac 129 au sein de la region 63-75 de la protéine E2, 6 peptides différents B à G (SEQ ID ne 1 à 6 respectivement) sont synthétisés (voir figure II). Un septième peptide A contenant l'épitope 12E7 sert de témoin. Des quantités croissantes des différents peptides sont ajoutées à 10 pg/ml de Ac 0662 ou de Ac L129, puis incubées avec des cellues CHO présentant la protéine E2 après transfection par cDNA. La liaison des anticorps monoclonaux est analysée par cytofluorométrie. Comme attendu, le peptide A n'affecte en rien la reconnaissance par Ac L129 et Ac 0662 de la protéine E2. Au contraire, le peptide D contenant la région 63-75 complète, inhibe totalement la fixation de Ac 0662 et Ac L129 sur la protéine E2, ce qui confirme les résultats déjà obtenus précédemment. Par ailleurs, aucune inhibition de fixation de Ac 0662 et Ac L129 sur la protéine E2 n'est constatée après incubation avec les peptides B et C, ceci étant dû au fait que les régions de part et d'autre du résidu 70 nécessaires pour la fixation des deux anticorps sont absentes sur les peptides B et C. Ac 0662 se lie au peptide F, ce que ne fait Ac L129 qu'à très forte concentration. Ac 0662 et Ac L129 ne reconnaissent pas le peptide E. Ceci montre bien que l'épitope reconnu par Ac L129 est plus grand que celui reconnu par Ac 0662. Ceci est confirmé par un peptide G présentant les acides aminés 68 à 77 de la protéine. E2 empêche la liaison de Ac 0662 à E2 mais pas celle de Ac L129. L'anticorps monoclonal Ac 0662 reconnaît donc la région s'étendant du résidu 66 au résidu 75 de E2, alors que Ac L129 reconnaît une région de taille supérieure comprenant le résidu 70. Les deux anticorps, Ac 0662 et Ac L129, reconnaissent donc bien des régions distinctes comprises entre les résidus 63 et 75 de la protéine E2. Protocole exPérimental : Le vecteur d'expression utilisé est le vecteur pMAMneo (Clontech, Palo Alto, USA) qui confère une résistance à l'antibiotique G418. Le cDNA codant pour E2, a été inséré en site de clonage Nhe 1 ayant des extrémités "blunt" obtenues par traitement par Klenow. Le vecteur recombinant a été transfecté dans des cellules CHO en utilisant une précipitation au phosphate de calcium. Les cellules CHO sont maintenues en phase unique de culture dans un milieu HAM/F12 additionné de 10% de PCS activé à la chaleur, glutamine, pyruvate, pénicilline et streptomycine. On ajoute, 36 heures après la transfection, du G418 à une concentration de 1 mg/ml afin de sélectionner les cellules résistantes. Des cellules CHO résistantes au G418 sont, par ailleurs, sélectionnées par estimation de l'expression du produit du gêne par cytofluorimétrie. Le marquage cellulaire est réalisé comme décrit dans l'art antérieur (Gélin, 1991). On effectue 3 cycles de sélection de l'expression positive par tri des cellules activées par fluorescence, au moyen d'un cytomètre de flux Facstar Plus (Becton Dickinson). Les figures annexées au présent brevet sont données à titre illustratif et non limitatif de l'invention. La figure I représente la structure de la protéine E2 (CD99) et la localisation des épitopes 0662, L129 et 12E7. La figure II est une représentation schématique des régions de la protéine E2 correspondant aux différents peptides utilisés lors de la vérification de la reconnaissance par Ac 0662 et Ac L129 de deux épitopes distincts au sein de la protéine E2. Sur la figure I, on peut voir que la protéine est divisée en trois régions principales précédées d'un peptide signale La région (EC) comporte une région (P) riche en proline (acides aminés 45 à 62) et une région (G) riche en glycine (acides aminés 76 à 90). Les anticorps selon la présente invention reconnaissent la région 63-75 comprise entre la région (G) et la région (P). Cette région 63-75 est également visible sur la figure II (partie foncée). Informations concernant SEQ ID NO 1 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 12 B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence Pro-Ser-Ser-Gly-Ser -Phe- Ser- Asp-Ala-Asp-Len-Ala Informations concernant SEQ ID NO 2 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 10 B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence Asp - Ala - Asp - Leu- Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Gly Informations concernant SEQ ID NO 3 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 14 B.TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence pro-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Ala-Asp-Leu-Ala-Asp. Informations concernant SEQ ID NO 4 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 10 B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence Pro - Ser - Ser - Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - Ala - Asp Informations concernant SEQ ID NO 5 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 10 B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence Gly - Ser - Phe - Ser - Asp - ala - Asp - Leu - Ala - Asp Informations concernant SEQ ID NO 6 i) Caractéristiques de la séquence A. LONGUEUR 10 B. TYPE acides aminés ii) Type de molécule - Peptide iii) Type de fragment - fragment interne iv) Origine - Protéine E2 humaine (CD99) v) Séquence Phe - Ser - Asp - Ala - Asp - Leu - Ala - Asp - Gly - Val REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît toute ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2. 2. Anticorps monoclonal selon la revendiation 1, caractérisé en ce qu'il reconnaît toute ou au moins une partie de la région 66-75 de la protéine E2. 3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe formé par Ac L129 et Ac 0662. 4. Anticorps monoclonal Ac 0662 déposé sous forme d'hybridome auprès de la collection CNCM sous la référence 0662-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1551. 5. Anticorps monoclonal Ac L129 déposé sous forme d'hybridome auprès de la collection CNCM sous la référence L129-CD99 et le numéro d'enregistrement I-1552. 6. Procédé de production d'anticorps monoclonaux dirigés contre toute ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2 comprenant les étapes suivantes a/ préparation d'une banque d'hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux contre la protéine E2 ; b/ réalisation d'une bibliothèque de peptide de E2, dont certains au moins contiennent la région 63-75, ou 66-75 ; c/ criblage de la banque d'anticorps monoclonaux par compétition entre le peptides et des cellules exprimant E2 à leur surface ou des cellules transfectées exprimant une bibliothèque de fragments d'ADNc de E2. d/ identification des clones reconnaissant les épitopes 0662 et L129 par comparaison des résultats obtenus à l'étape c/. 7. Procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre toute ou partie de la région extracellulaire de la protéine E2 comprenant une injection d'un peptide, seul ou couplé à une molécule porteuse ou à un support classique, correspondant à toute ou partie de ladite région extracellulaire de E2, à un mammifère et le recueil du sérum après immunisation. 8. Procédé de production d'anticorps polyclonaux selon la revendication 7, caractérisé en ce que le peptide correspond à la région 63-75 de la protéine E2 et/ou en ce que le mammifère est un lapin. 9. Procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine E2 comprenant une injection de cellules transfectées par ladite protéine E2 à un mammifère, le recueil du sérum après immunisation et une élimination des anticorps non spécifiques de la protéine E2 par épuisement dudit sérum sur cellules non transfectées. 10. Procédé de production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine E2 selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules CHO ou COS. 11. Anticorps polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont fabriqués par un procédé selon l'une des revendications 7 à 10. 12. Anticorps polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre toute ou partie de la région 6375 de la protéine E2. 13. Utilisation d'anticorps monoclonaux selon l'une des revendications 1 à 5 dirigées contre le ou les épitopes L129 et/ou 0662 de la protéine E2 pour la préparation d'un médicament destiné à supprimer ou à réduire la prolifération de cellules tumorales présentant à leur surface la protéine E2. 14. Médicament à action dirigée contre toute ou au moins une partie de la région 63-75 de la protéine E2 comprenant une dose efficace d'au moins un anticorps monoclonal selon l'une de revendications 1 à 6, ou d'un anticorps polyclonal selon l'une des revendications 7 à 12. 15. Médicament selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est formulé en une dose efficace journalière de 0,02 mg/kg à 200 mg/kg d'anticorps. 16. Médicament selon l'une de revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il est destiné à lutter contre le sarcome d'Ewing ou toute autre tumeur ou désordre pathologique. 17. Kit en vue de la détection des tumeurs comprenant un médicament selon l'une des revendications 13 à 16 dont le principe actif comprenant au moins un anticorps selon l'une des revendications 13 à 15 dirigé contre la région 63-75 de la protéine E2.