Brevet FR2729944A1 — publié le 19960802

SYNTHESE DE NUCLEOTIDES MARQUES A HAUTE ACTWITE SPECTHQ!JE Les nucléotides marqués en position spécifique par les isotopes 35S, 32P, 33P sont nécessaires pour l'étude de cinétique enzymatique, pour la génétique et pour l'étude du métabolisme énergétique des cellules. 11 existe déjà dans la littérature plusieurs procédés de synthése de nucléotides marqués. Dans les années 50-60, la seule méthode permettant la biosynthèse des nucléotides marqués était l'incubation de diverses préparations cellulaires (chloroplastes, fraction initochondriale etc.) en présence d'acide orthophosphorique radioactif. Le temps d'incubation variait entre 30s et i Omin. Cette technique présente beaucoup de défauts, le principal est une activité spécifique (AS) très basse des radionucléotides obtenus. De plus, cette méthode ne permet de produire que des nucléotide-triphosphates marqués en position y. Vers la fin des années 70, Schendel et Wells [P.F. Schendel, RD. Wells J.Biol.Chem. 248 (1973) 8319-9321] ont proposé la synthèse enzymatique du (y32P)ATP avec un rendement quasi-quantitatif Cette méthode est basée sur la phosphorylation de l'ADP par le phosphate inorganique radioactif dans une réaction enzymatique couplée catalysée par 2 enzymes la glycéraldéhyde-3-phosphatedéshydrogénase catalyse l'incorporation d'un groupement phosphate marqué dans le 1,3diphosphoglycérate et la phosphoglycérate kinase catalyse le transfert de ce groupement marqué vers l'ADP. La réaction est rendue irréversible grâce à l'introduction d'un circuit de régénération de la ss-NAD+, catalysé par la lactate-déshydrogénase.Le substrat initial de cette réaction, le D,L-glycéraldéhyde-3-phosphate, est un produit chimiquement très instable et sa décomposition provoque l'apparition dans le milieu réactionnel de phosphate inorganique (Pi) qui induit la diminution de l'AS des produits finaux. Walseth et Johnson [T. F.Walseth, RA.Johnson Biochem & iophys.Acta 526 (1979) 11-31] ont modifié cette méthode en ajoutant la synthèse du D-glycéraldéhyde3-phosphate "in situ" à partir de L-ct-glycérophosphate. Ce dernier est un produit beaucoup plus stable chimiquement et moins cher que le D,L-glycéraldéhyde-3phosphate. Les défauts essentiels de cette méthode sont dus à la fragilité de la glycérophosphate-déshydrogénase. En effet, cette enzyme semble être particulièrement sensible aux rayonnements radioactifs et son utilisation limite considérablement les possibilités offertes par ce schéma de synthèse [Brevet RDA Na212 391].Cette fragilité des mélanges enzymatiques oblige les utilisateurs à diminuer sensiblement l'activité volumique des radionucléides dans la réaction ( 50 mCi/ml), ce qui pose des problèmes lors de la purification ultérieure (injection de volumes trop élevés). Une méthode bien plus simple est décrite par Gilbert & Maxam [W. Gilbert, A.M. Maxam, I.M. Glynn, J.B. Chappell Biochem.J. 90 (1964) 147-149] mais elle ne permet pas d'obtenir des activités spécifiques aussi élevées que la technique de Walseth. Le procédé décrit par R. Gibbs, P.M. Roddy & E. Titus [J.Biol.Chem. 240 (1965) 2181] permet d'obtenir du (y32P)ATP à une basse activité spécifique. ICN a développé une méthode de préparation de nucléotides marqués au 32P par conversion enzymatique du dihydroxyacétone phosphate (DHAP) en glycéraldhéhyde-3-phosphate en présence de triosephosphate isomérase (TPI) [Brevet européen N"O 577266 A2] mais cette méthode peut provoquer la dilution de l'activité spécifique par le phosphate contaminant le DHAP. De plus, elle nécessite la préparation "systématique" de solutions fraîchement préparées diminuant ainsi son potentiel d'automatisation. n existe également un procédé breveté en RDA, N"212 391 utilisant le fructose 1,6-diphosphate (FDP) comme substrat de départ. La FDP-aldolase génère "in situ" la DHAP nécessaires à I synthèse des (d)NTP marqués en position y selon la méthode de Schendel et Wells. Le rendement de cette réaction est relativement bas car la conversion du DHAP en D-glycéraldéhyde-3-phosphate est limitée et peut être réversible, ce qui diminue les rendements. Cette invention se rapporte à la description d'une synthèse de nucléotides triphosphates marqués en position y par le 33P, 32P, 35S de la façon la plus simple possible, du point de vue technique, tout en garantissant des activités spécifiques élevées. Le nucléotide diphosphate que l'on marque est sélectionné à partir du groupe ADP,.CDP, dADP, dCDP, UDP, ou autres nucléotides diphosphates.Pour cela, nous proposons trois modifications qui permettent d'éviter les limitations du schéma de Sohnson et Walseth: 1) générer du D-glycéraldéhyde 3-phosphate "in situ" par la réaction catalysée soit par les aldolases (EC 4.1 .2.X), en présence de TPI soit par transaldolases et transcétolases (EC 2.2.1.X) (schémas ND17, ND18) à partir des substrats à faible teneur en Pi contaminant ( 2)- préparer des kits de réactifs en mélangeant tous les composants non enzymatiques du milieu réactionnel sauf le radionucléide et l'ADP (pour éviter le démarrage prématuré de la réaction pendant la décongélation) et les stocker à une température inférieure -70 OC; - préparer des kits enzymatiques, les stocker à 4"C. 3) mélanger tous les composants sauf le radionucléide pendant 3 à 8 min avant l'ajout de ce dernier afin de limiter les effets d'inhibition de certaines enzymes par irradiation ou la présence d'impuretés éventuelles du substrat marqué. L'utilisation des aldolases permet la génération "in situ" d'intermédiaires phosphorés nécessaires à la synthèse des nucléotides triphosphates marqués en position y. Toutes les aldolases produisent le dihydroxyacétone phosphate (DHAP) à partir de sucres phosphatés (qui sont acceptés par ces enzymes en qualité de substrats). On utilise préférentiellement la fructose 1 ,6-diphosphate aldolase car elle génère le Dglycéraldéhyde-3-phosphate en même temps que le DHAP. L'utilisation de la TPI permet de convertir tout le DHAP en D-glycéraldéhyde 3-phosphate et ainsi d'augmenter le taux de conversion des substrats. On diminue ainsi les quantités de réactifs nécessaires et on obtient un rendement final de - 98 % . Un tel rendement change radicalement les perspectives industrielles de la synthèse. Pour simplifier le processus et diminuer le temps d'exposition des opérateurs aux rayonnements, on réduit au maximum les manipulations humaines au cours de la synthèse. En plus, chaque opération manuelle à l'échelle des synthèses industrielles représente un risque d'erreur de la part des opérateurs. Cette simplification maximale dans la production des nucléotides triphosphates marqués en position y peut être obtenue par la diminution du nombre de solutions-mères nécessaires pour chaque manipulation. Pour éviter tout risque de dégradation des produits ou de baisse de l'activité enzymatique, les enzymes et les réactifs sont stockés séparément.Le mélange enzymatique, est préparé tous les 6 mois et stocké à + 4 "C. Le mélange des réactifs sans l'ADP est préparé tous les 3 mois à partir des solutions-mères fraîches et stocké à une température inférieure à -70 C. L'ADP purifié est préparé tous les 6 mois, et stocké à-18 OC. Le démarrage des réactions quelques minutes avant l'ajout du radioélément permet l'accumulation dans le milieu des intermédiaires nécessaires à la synthèse en l'absence des rayonnements ou des impuretés éventuelles du radionucléide qui peuvent entraver la synthèse du D-glycéraldéhyde-3-phosphate. Ces mesures permettent la synthèse efficace des nucléotides marqués en position y à l'échelle industrielle (quelques centaines de mCi). Exemple: Synthèse de ATP (y33P) On prépare un mélange composé de Tris-HC1 50mM pH=8, de ss-NAD+ 0.8mM, d'ADP O.lmM, de fructose-1,6-diphosphate 0,6mM, de MgC12 20mM, dEGTA lmM, de pyruvate de sodium 2mM, de dithiothreitol lOmM, 0,2U de fructose 1,6-diphosphate aldolase, 0,4U de glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase, 0,6U de phosphoglycérate kinase, 2U de TPI, et 2U de lactate déshydrogénase. On solubilise lOmCi d'H3PO4 (33P) lyophilisé dans 80cul de ce mélange. On laisse réagir pendant 5-25mn à température ambiante et on porte à ébullition pour arrêter la réaction. Le rendement de cette synthèse est supérieur à 95%. HO O O OH Sucre phosphaté Aldolase t Y OH O HC Ri (si Ri = - / alors HO alors HOH ) O 0 O OH H2C- Pi Dihydroxyacétone phosphate Sous-produit Triosephosphate isomérase ! D-glycéraldéhvde-3 -phosphate CHO OH A H3C ho Lactate HO \COO H2C- ot A A Pi À. "Pj NAD Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase i Lactate déshydrogénase Y > NADHHT-M 1,3 COOt o Pvate Pvruvate HO t H \COO HoC-O't A (d)NDP Phosphoglycérate kinase y- XP-(d)iVTP 3 -phosphoglycérate COO HO-H H2C-OPi Schéma ND17. Biosynthèse des y-*P-(d)NTP-s a partir des sucres phosphatés à l'aide des aldolases. Substrat 1: cétose-phosphate OH Oh ouzo HO ~ > ~~ O OH O OH Substrat 2: aldose-phosphate 3-phosphoglycérate Xylulose-5-Phosphate OH A + R1 'l t;Àoetoiase H 7-*J(d)NTP I]I Iu OH OH HoMMRl O OH v OH xpi Glycéraidéhyde-3 -phosphate- OH 0PX déshydrogénase o zO H O. * O ,NADH H' D-gîycéraldéhyde-3 - i 3-diphosphoglycérate Phosphate Lactate déshydrogénase N\Df OH J/O H3C#0 OH OH Lactate Pyruvate Schéma ND18. Synthèse des y-*P-(d)NTP avec la transcétolase. REVENDICATIONS 1. Une méthode de préparation du (y33P)ATP caractérisée par le fait que le substrat initial est un sucre phosphoré al générant, "in situ" par une réaction enzymatique catalysée par des aldolases, du DHAP transformé en D-glycéraldéhyde-3-phosphate en présence de triosephosphate isomérase, b/ générant, "in situ" par une réaction enzymatique catalysée par des transaldolases ou transcétolases, directement du D-glycéraldéhyde-3 -phosphate. 2. Une méthode selon la revendication l.a/, caractérisé par le fait que le substrat initial est le fructose 1,6-diphosphate générant, sous l'action de la fructose 1,6-diphosphate aldolase, du D-glycéraldéhyde 3-phosphate en même temps que du DHAP. 3. Une méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée par le fait que pratiquement tous les réactifs se trouvent sous forme de kits (3 ou plus) à utiliser directement au moment de la synthèse. 4. Une méthode selon la revendication 1, 2, ou 3 caractérisée par le fait que le nucléotide diphosphate est sélectionné à partir du groupe ADP, CDP, dADP, dCDP, UDP ou autres nucléotides diphosphates. 5. Une méthode selon la revendication 1 2, 3, ou 4 caractérisée par le fait que l'isotope radioactif marquant le nucléotide diphosphate en position y est le 33p, 32p, ou