Brevet FR2724182A1 — publié le 19960308

OBTENTION D'UN ANTICORPS MoMOcLOflL RECOMBINANT A PARTIR D'UM ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN ANTI-IHESOS D, SA PRODUCTION EN CELLULES D'INSECTE, ET SES UTILISATIONS. La présente Invention est relative à l'obtention en cellules d'insecte, d'un anticorps monoclonal recombinant anti-Rhésus D. On désigne communément sous le terme "Rhésus positif11 ou "Rh-positif" les sujets dont les hématies sont agglutinées par des alloanticorps dirigés contre l'antigène D (qui est l'un des antigènes du système RH), et sous le terme "Rhésus négatif", ou "Rh-négatif" les sujets dont les hématies ne sont pas agglutinées par ces alloanticorps. La maladie hémolytique du nouveau né est due dans la majorité des cas, à la présence, chez une mère Rh-négatif, d'alloanticorps anti-RhésusD (l'allo- immunisation contre d'autres antigènes du système RH est beaucoup plus rare), qui provoquent chez un foetus Rhésus positif une anémie hémolytique qui va nécessiter, soit des transfusions in utero, soit une exsanguinotransfusion à la naissance dans les cas graves. L'allo-immunisation de la mère intervient généralement lors d'un accouchement précédent ; des hématies foetales passent dans la circulation maternelle, et induisent une immunisation si l'enfant est Rh-positif. La prévention de la maladie hémolytique du nouveau né consiste en l'injection d'anticorps anti Rhésus D, aux fermes Rhésus négatif, immédiatement après un accouchement ou une interruption de grossesse. Actuellement, les anticorps anti-Rhésus utilisés dans ce but sont des immunoglobulines polyclonales provenant de donneurs volontaires Rhésus négatif, immunisés à plusieurs reprises contre des hématies Rh-positif. Ceci pose des problèmes, d'une part du fait de la nécessité de disposer de volontaires en nombre suffisant pour répondre aux besoins, et d'autre part du fait des risques de contamination par des virus ou autres pathogènes qui pourraient être présents dans les préparations d'immunoglobulines obtenues à partir du sang des volontaires. Cependant, ce mode de production n'a à l'heure actuelle aucune alternative. En effet, bien qu'il existe des essais de culture de lignées lymphoblastoïdes, issues de lymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, et secrétant des anticorps monoclonaux, aucun produit obtenu à partir de ce type de cultures n'a reçu l'autorisation de mise sur le marché du fait des risques impliqués par l'utilisation du virus Epstein-Barr. Afin d'obtenir une source d'iinrnunoglobulines anti-Rhésus D ne présentant pas les inconvénients des immunoglobulines utilisées jusqu'à présent, les Inventeurs se sont fixé pour but la production d'un anticorps monoclonal humain anti-Rhésus recombinant dans des cellules d'insecte, en utilisant un vecteur d'expression dérivé d'un baculovirus. Dans ce but les Inventeurs ont d'abord sélectionné une lignée produisant un anticorps monoclonal anti-Rhésus D, dénommé D7C2. Cet anticorps appartient à la classe des IgM, agglutine les hématies de phénotype Rhésus courant, les Rhésus faibles, et la plupart des Rhésus partiels à l'exception des DVI ; cet anticorps se lie à un polypeptide de 30 à 32 Kda de la membrane des hématies. Les Inventeurs ont ensuite cloné les séquences codant pour les régions variables des chaînes lourde (H) et légère (L) de D7C2, et ont construit des cassettes d'expression permettant l'expression de chacune desdites séquences sous contrôle d'un promoteur fort de baculovirus. La présente Invention a pour objet un fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par - un fragment d'ADN qui comprend une séquence qui code pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2 - un fragment d'ADN qui comprend une séquence qui code pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2. Par . "séquence qui code pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2", on entend en particulier la séquence identifiée dans la liste de séquences en annexe sous le numéros SEQ ID NO:1, qui code pour le polypeptide SEQ ID NO:2. Par . "séquence qui code pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2", on entend en particulier la séquence SEQ ID N0:3 qui code pour le polypeptide SEQ ID N0:4. Cependant, il apparaîtra à l'homme de 1'art que cette définition englobe également des séquences fonctionnellement équivalentes aux séquences SEQ ID NO:1 et SEQ ID N0:3, à savoir, en particulier - toute séquence codant pour les polypeptides SEQ ID N0:2 et SEQ ID N0:4, et également - des séquences codant pour des polypeptides qui peuvent différer des polypeptides SEQ ID N0:2 et SEQ ID N0:4 par quelques acides aminés, à condition que cette variation ne se situe pas au niveau d'une séquence peptidique impliquée dans la reconnaissance de l'épitope. Ceci englobe par exemple une séquence codant pour un polypeptide dont la séquence diffère de celle du polypeptide SEQ ID NO: 4 par le remplacement du résidu Thr en position 23, par un résidu Ala, ce qui résulte du remplacement d'un A en position 67 dans la séquence SEQ ID NO: 3, par un G. Des séquences fonctionnellement équivalentes aux séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3, sont également des séquences résultant d'une modification des extrémités de celles-ci en vue d'y créer des sites de restriction, ou de modifier ou supprimer ceux qui y sont présents. Ceci englobe par exemple une séquence codant pour un polypeptide dont la séquence diffère de celle du polypeptide SEQ ID NO: 2 par le remplacement des trois premiers résidus, Asp-Ile-Glu, par les résidus Gln-Ser Val, ce qui résulte du remplacement d'un A en position 67 dans la séquence SEQ ID NO: 3, par un G. La présente Invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2, ou une séquence codant pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2, laquelle séquence est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit promoteur est un promoteur de baculovirus. A titre d'exemple de promoteurs de baculovirus utilisables pour la mise en oeuvre de la présente Invention, on citera les promoteurs de la polyédrine et de P10 des baculovirus AcMNPV ou SlMNPV, ou des dérivés de promoteurs de baculovirus, constitués par des promoteurs synthétiques ou recombinants, obtenus à partir d'un promoteur de baculovirus, et fonctionnels en cellules d'insectes, tel que par exemple celui décrit par WANG et al, [Gene, 100, 131-137, (1991)]. Une cassette d'expression conforme à ce mode de réalisation comprend par exemple: - un promoteur de baculovirus, tel que défini ci-dessus - une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion - une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2 et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline ; ou - une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2 et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline. Un grand nombre de séquences codant pour des peptides signal fonctionnels en cellules d'insecte sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente Invention. A titre d'exemple non limitatif, on citera les séquences codant pour les peptides signal de l'acétylcholinestérase de Drosophile, de la trophoblastine ovine, ainsi que les séquences codant pour les peptides signal des chaînes H et L d'immunoglobulines murines ou humaines, etc.. Chacune des cassettes conformes à l'invention permet l'expression, soit de la chaîne légère, soit de la chaîne lourde, d'un anticorps recombinant, dénommé ciaprès r-D7C2, possédant la spécificité de l'anticorps monoclonal D7C2. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, les séquences codant pour les domaines constants des chaînes légères et lourdes d'immunoglobuline sont des séquences d'origine humaine. On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes légères kappa (K) et lambda (X). On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes lourdes 71, , , 4, a, , et p. On peut ainsi obtenir un anticorps recombinant appartenant à la classe d'immunoglobuline (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM) que l'on souhaite. Très avantageusement, on choisira une séquence codant pour le domaine constant Ct d'une chaîne lourde r. L'anticorps recombinant r-D7C2 obtenu de la sorte, appartient à la classe des IgG, et sera dénommé ci-après r-IgG-D7C2. Les séquences codant pour la chaine légère et pour la chaîne lourde d'un anticorps r-IgG-D7C2, d'isotype IgG1, sont respectivement représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:5 et SEQ ID N0:7 ; les séquences polypeptidiques correspondantes portent les numéros d'identification respectifs SEQ ID N0:6 et SEQ ID NO:8. La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, portant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ; dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier des baculovirus recombinants permettant l'expression de l'anticorps r-D7C2, ainsi que des plasmides de transfert permettant la construction desdits baculovirus recombinants. Les plasmides de transfert conformes à l'invention portent un insert comprenant : une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome viral en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette. Selon un mode de réalisation préféré des plasmides de transfert conformes à la présente Invention, lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine. Selon une disposition particulièrement avantageuse de ce mode de réalisation, la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps r-D7C2 est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps r-D7C2 est flanquée des régions entourant le gène P10 dans le baculovirus sauvage. Schématiquement, la construction des plasmides de transfert conformes à l'invention se fait en insérant dans un plasmide capable de se répliquer chez un hôte bactérien (en général E. colt) la région du gène de baculovirus (par exemple plO ou polyédrine, ou tout autre locus du baculovirus) à la place duquel on souhaite insérer les gènes codant pour les chaînes H ou L d'immunoglobuline. Dans cette région, la séquence codante du gène de baculovirus (et éventuellement la séquence promoteur dudit gène) est remplacée par la séquence codant pour la chaîne d'immunoglobuline à exprimer (et éventuellement par la séquence du promoteur sous contrôle duquel on souhaite exprimer cette chaîne d'immunoglobuline, s'il s'agit par exemple d'un promoteur "dérivé").Le plasmide de transfert ainsi obtenu contient donc un insert comprenant une séquence hétérologue (séquence d'une chaîne de l'anticorps r-D7C2) flanquée de séquences de baculovirus. Pour permettre l'expression simultanée de la chaîne lourde (chaîne H) et de la chaîne légère (chaîne L) et leur réassociation pour former la molécule d'anticorps recombinant, les Inventeurs ont inséré les deux cassettes sur un même vecteur d'expression. Ils ont ainsi obtenu un baculovirus double recombinant dans lequel la séquence codante de chacune des chaînes H et L est sous le contrôle d'un promoteur fort. Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, permettant l'expression de l'anticorps r D7C2, peut être construit selon le principe suivant - l'on prépare séparément deux plasmides de transfert, tels que définis ci-dessus : un pour la chaîne H, et un pour la chaîne L. On cotransfecte ensuite les cellules d'insecte avec l'ADN des vecteurs de transfert ainsi réalisés et 1'ADN du baculovirus. Cette cotransfection est effectuée en deux étapes Le plasmide de transfert contenant la cassette d'expression pour le gène de la chaîne légère flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, est utilisé, avec l'ADN de baculovirus sauvage AcMNPV, pour cotransfecter des cellules d'insecte en culture. Par recombinaison homologue entre l'ADN viral et le plasmide, les séquences codantes de la chaîne légère de l'immunoglobuline recombinante sont transférées dans le génome viral. Après réplication de 1'ADN viral dans les cellules transfectées, l'on procède à la sélection des baculovirus recombinants ayant intégré la séquence de la chaîne légère de l'immunoglobuline recombinante. Ces baculovirus recombinants sont sélectionnés selon deux critères leur incapacité à produire des polyèdres et leur capacité à exprimer la chaîne légère La Figure 1 illustre l'obtention du baculovirus exprimant la chaîne légère lambda de l'anticorps recombinant r-IgG-D7C2. Dans une deuxième étape, les cellules sont cotransfectées avec 1'ADN du baculovirus recombinant obtenu à l'issue de la première étape, et avec celui du plasmide de transfert contenant la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de 1 'anticorps recombinant r-D7C2 flanquée des régions entourant le gène P10 du baculovirus. Par recombinaison homologue, comme précédemment, le gène de la chaîne lourde est transféré dans 1'ADN viral. L'on sélectionne alors les virus doublerecombinants qui sont capables de produire simultanément une chaîne lourde et une chaîne légère d'immunoglobuline. La détection de la chaîne lourde et de la chaîne légère d'immunoglobuline est effectuée par ELISA. La Figure 2 illustre cette deuxième étape qui permet d'obtenir un baculovirus exprimant la chaîne légère lambda et la chaîne lourde gamma de l'anticorps recombinant r-IgG-D7C2. La présente Invention a pour objet un baculovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression, telle que définie ci-dessus, comprenant une séquence codant tout ou partie de la chaîne H ou une séquence codant pour tout ou partie de la chaîne L de l'anticorps r-D7C2, laquelle séquence est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fort de baculovirus. Selon un mode de réalisation d'un baculovirus recombinant conforme à l'invention il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne L, de l'anticorps monoclonal r-D7C2. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps monoclonal r-D7C2, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps monoclonal r-D7C2, sont deux promoteurs différents. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'un dedits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et l'autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la P10. Selon encore une autre modalité avantageuse de cette disposition, l'un des promoteurs est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et l'autre est le promoteur de la plO ou l'un de ses dérivés. Avantageusement, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps r-D7C2 est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps r-D7C2 est le promoteur de la P10 ou l'un de ses dérivés. Selon une autre disposition de ce mode de réalisation, la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps monoclonal r-D7C2, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps monoclonal r-D7C2, sont deux séquences différentes. Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, qui comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne X et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne t1 de l'anticorps monoclonal r-IgG-D7C2, a été déposé le 19 août 1994, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur ROUX, Paris), sous le numéro I-1468. La présente Invention englobe également des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant conforme à l'invention. L'expression et la production de l'anticorps monoclonal recombinant r-D7C2 est obtenue in vitro dans des cellules d'insecte conformes à l'invention. L'infection des cellules par un baculovirus double recombinant conforme à l'Invention résulte dans la production simultanée des chaînes H et L. Ces chaînes s'assemblent pour reconstituer l'anticorps monoclonal recombinant r-D7C2 qui est par la suite sécrété dans le milieu de culture. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte infectées avec un, baculovirus recombinant conforme à l'invention, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture. La présente Invention a également pour objet un anticorps monoclonal recombinant, caractérisé en ce que ses domaines variables ont la séquence des domaines variables de l'anticorps monoclonal D7C2 ; ceci englobe en particulier les préparations d'anticorps monoclonal recombinant r-D7C2 susceptibles d'être obtenues par le procédé conforme à l'invention, défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de l'anticorps monoclonal recombinant r-D7C2, il appartient à la classe des IgG. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit anticorps r-D7C2 est d'isotype IgG1. Un anticorps recombinant conforme à l'Invention peut être utilisé pour le diagnostic, ou pour la thérapeutique. Une utilisation particulièrement intéressante concerne l'obtention de médicaments destinés à la prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né. Dans ce but, on utilisera en particulier, un anticorps recombinant r-IgG-D7C2, de classe IgG, qui possède une activité effectrice ADCC, dont est dépourvu l'anticorps parental D7C2, qui est une IgM. La production d'un anticorps monoclonal anti Rhésus D en cellules d'insecte permet d'éviter les risques et les problèmes liés à l'immunisation de volontaires masculins Rh-D négatifs par injection de globules rouges humains RhD positifs, et de diminuer les risques de contamination par des virus ou autre pathogènes qui pourraient être présents dans les préparations d'immunoglobulines extraites du sang des volontaires. En outre, ce mode de production présente les avantages suivants - sécurité pharmaceutique : l'utilisation de lignées cellulaires d'insecte et de baculovirus ne comporte pas le risque de virus adventices ou d'oncogènes qui se présente lorsque l'on utilise des lignées humaines - standardisation du procédé de production, et du produit qui en est issu - source d'approvisionnement en quantité quasi-illimitée. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de baculovirus recombinants conformes à l'invention, et à leur utilisation pour la production d'un anticorps recombinant d'isotype IgGî, dénommé ci-après r-IgG-D7C2, dans des cellules d'insectes. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1. : Obtention de l'anticorps D7C2, et clonage des chaînes lourdes et légères. A) DescriDtion de l'anticoros D7C2 La lignée humaine D7C2 a été obtenue après immortalisation par le virus Epstein-Barr de lymphocytes de sang périphérique provenant d'un donneur Rhésus négatif (dce/dce) immunisé à 5 reprises avec des hématies Rhésus positif (DCe/DCe). L'anticorps secrété par cette lignée est d'isotype IgM. Cet anticorps qui sera dénommé ci-après IgM-D7C2, agglutine les hématies de phénotype Rhésus positif DCcee, DCCee, DccEE, Dccee, et n'agglutine pas les hématies Rhésus négatif ddccee, ddCcee, ddccEe. I1 agglutine les rhésus faibles, et la plupart des rhésus partiels (agglutination de DIIIa, DIIIc, DIVa, DVa, DVc, DVII, et Rh33), à l'exception des DVI. I1 agglutine les hématies LW(a-b+), et n'agglutine pas les hématies rG et Rhmod. Les tests d'immuno-précipitation effectués sur des préparations de membranes de globules rouges Rhésus positif DCe/DCe solubilisées au TRITON X-100 ont montré une liaison de l'anticorps IgM-D7C2 avec un polypeptide de 30 à 32 Kda environ. B) Clonaae et séauencaae des Parties variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère L'ARN total est extrait des cellules du clone D7C2 par le thiocyanate de guanidine, puis précipité à l'isopropanol. Après élimination de 1'ADN par digestion à la Nase, 1'ARN est précipité par NaCl (concentration finale 0,2M) L'ADNc est synthétisé à partir de lFg d'ARN par transcription inverse, en utilisant une amorce oligodT. les parties variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) sont amplifiées par ACP (amplification en chaîne par polymérase) à partir de 1CLg d'ADNc simple brin, en utilisant la Taq DNA polymérase. Les amorces utilisées sont les suivantes * Pour VEI :. VH1 : CCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG VH2 : TCCTGCGCTGGTGAAAGCCACACA VH3 : GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA; VH4a : TCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA VH4b : CGCTGTCTCTGGTTACTCCATCAG VH5 : GAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAA VH6 : CCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTG ; * Pour VL: VkFW1 : CAGTCTGTGCTGACTCAG Ck : CACACYAGTGTRGCCTGGTT. Trente cycles d'amplification sont ainsi effectués. Après phosphorylation, le fragment amplifié est purifié sur gel d'agarose, puis ligaturé dans le plasmide PTZ18R. Le plasmide obtenu est utilisé pour transformer Escherichia coli KL1 blue. La sélection des bactéries transformées est faite par un test de résistance à l'ampicilline. La séquence nucléotidique des inserts des vecteurs plasmidiques respectivement dénommés PTZ-VL D7C2 et PTZ-VHD7C2 est déterminée à l'aide du kit de séquencage PROMEGA. La séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal humain IgM- D7C2 est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO 1 ; la séquence polypeptidique correspondante est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2. La séquence codant pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal humain IgM- D7C2 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3 ; la séquence polypeptidique correspondante est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. Les emplacements des CDR (régions déteminant la complémentarité) sont indiqués dans les caractéristiques des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO 3. Exemple 2 : Construction de plasmides de transfert portant les séquences variables de D7C2 A) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LEGERE LAMBDA 1) Obtention du lasmlde DBCX a- Plasmide pGmAcll6T Ce vecteur est dérivé du plasmide pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], luimême dérivé du plasmide pAcl [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] contenant le fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d'Autographa californica (AcMNPV), et donc le gène polyédrine, et les séquences flanquant ledit gène.Pour obtenir pGmAc116T, le plasmide pGmAcll5T a été délété d'un fragment de 1900pb allant d'un site EcoRI situé en amont du gène polyédrine à un site XhoI situé 1900pb en aval de ce site EcoRI. 5 Rg du plasmide pGmAcll5T ont été digérés pendant 2 heures à 37 C par 15 unités d'enzyme XhoI (BOEHRINGER), dans un volume réactionnel de 50 1 et dans les conditions préconisées par le fournisseur. Après extraction au phénol/chloroforme, l'ADN plasmidique a été précipité à l'alcool. Cet ADN a été ensuite partiellement coupé par EcoRI (BOEHRINGER) dans un volume réactionnel de 50 Fl en présence de 0,5 unité d'enzyme. L'incubation a été faite à 37 C pendant 20 minutes.Après une nouvelle extraction au phénol/chloroforme, les extrémités générées par les coupures XhoI et EcoRI ont été rendues franches par l'enzyme de Klenow (BIOLABS) en présence des 4 dNTPs selon le protocole préconisé par le fournisseur. L'ADN plasmidique a enfin été précipité à l'alcool et incubé avec la ligase du phage T4 (BOEHRINGER) dans les conditions préconisées par le fournisseur. Des bactéries E. coli compétentes ont été transformées par une partie du mélange de ligation ; le criblage des colonies issues de cette transformation a permis de sélectionner le plasmide pGmAcll6T. Ce plasmide contient un site BalII en aval du promoteur de la polyédrine. b- Peptide signal La séquence codante choisie pour le peptide signal a été synthétisée chimiquement sous forme de deux oligonucléotides complémentaires ayant des extrémités permettant l'insertion du duplex dans un site BalII. Pour l'appariement, 15 'Lg de chacun des deux oligonucléotides sont incubés dans 50 Rl de tampon (Tris 1 mM pH 7,5, EulA 0,1 mM), pendant 5 minutes dans un bain marie à 70'C. Le bain est ensuite laissé refroidir jusqu'à température ambiante (22 à 25 C). Le produit d'appariement est utilisé directement dans les réactions de ligation avec le plasmide pGmAcll6T préalablement coupé par AglII. Les conditions de ligation sont les suivantes lFg du plasmide pGmAcll6T coupé par AglII l'Lg de l'oligonucléotide bicaténaire portant la séquence codant pour le peptide signal ; 2 1 de tampon ligase 10X (BOEHRINGER) ; eau distillée q.s.p. 19 l ; 1 unité (îLLl) de ligase (BOEHRINGER). L'incubation est effectuée à 22 C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes. c- Région constante Ck : La séquence codante de la région constante de la chaîne légère # humaine a été amplifiée par ACP en utilisant comme matrice de l'ADNc de lymphocytes B humains. Les lymphocytes humains (environ 5x108) ont été préparés à partir de 200 ml de sang en utilisant HISTOPAQUE# (SIGMA). L'ARN total a été extrait de ces lymphocytes en utilisant un kit PHARMACIA (RNk extraction kit). Le premier brin d'ADNc a été préparé à partir de l'ARN total à l'aide du kit "First-Strand cDNA synthesis kit de PHARMACIA. L'amplification par ACP de la région Ck a été réalisée en présence de l'amorce OPP-HuCk3' complémentaire de l'extrémité 3' des régions C# et apportant le site de restriction BglII et de l'amorce OPP-HuCk5' complémentaire de l'extrémité 5' des régions C# et apportant le site de restriction XhoI. Les séquences des deux amorces sont les suivantes *OPP-HuC#3': 5'-CCT GTC AGA TCT ATG AAC ATT CTG TAG GGG-3' (site BglII souligné) *OPP-HuC': 5'-CCG CCC TCC CTC GAG CTT CAA-3' (site XhoI souligné) Le produit de l'amplification a été digéré par BalII et XhoI avant d'être cloné dans les sites XhoI- BalII du plasmide pGmAc portant la séquence codant pour le peptide signal. La composition du mélange de ligation est la suivante lRg du plasmide pGmAc coupé par XhoI et BalII ; 200 ng du fragment Ck amplifié et digéré par BalII et XhoI, 2F1 de tampon ligase 10X (BOEHRINGER), eau distillée q.s.p. 19R1, 1 unité (1R1) de ligase (BOEHRINGER). L'incubation est effectuée à 22'C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes. Le plasmide obtenu est dénommé pBC. 2) Clonaae de la région variable de la chaîne # de D7C2 Le clonage de la région variable de la chaine légère X de l'anticorps monoclonal humain IgM-D7C2 a été réalisé de la manière suivante La région variable # de l'anticorps monoclonal IgM-D7C2 a été amplifiée par ACP en utilisant - comme matrice, 1'ADN du plasmide PTZ-VLD7C2 décrit à l'exemple 1 ci-dessus, qui porte la région variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal IgM-D7C2 - une amorce représentant une séquence consensus à l'extrémité 5' des gènes VL humains (OPP HuVX5'), et une autre amorce complémentaire de la région 5 de la séquence codant pour la région constante lambda (OPP-HuV#3'), et qui permet d'amplifier toute région variable de chaîne B). Ces amorces apportent en outre respectivement les sites de restriction enzymatiques SacI et XhQI. Les séquences nucléotidiques de ces amorces sont les suivantes * OPP-HuV#5': 5' -CA(GC)TCTGAGCTCAC(GT)CAG- 3' (site SacI souligné) L'utilisation de cette amorce provoque la modification de la séquence Gln-Ser-Val des trois premiers aminoacides de la charpente 1 de l'anticorps parental IgM-D7C2 en Asp-Ile-Glu dans l'anticorps recombinant. * OPP-HuVX3': 5' -TTGAAG2Dgh9GGAGGGCGGGAA- 3' (site XhoI souligné) La composition du mélange d'amplification est la suivante 10 gl de tampon 10X de l'ADN polymérase ; 100 ng de plasmide PPTZ-VLD7C2 ; 4 Rl du mélange de déoxynucléotides (mélange contenant 5 mM dATP + 5 mM dCTP + 5 mM dGTP + 5 mM dTTP, BOEHRINGER) ; 2 mM MgSO4 ; 1000 pmoles de l'amorce OPP-HuVX5' et 200 pmoles de l'amorce OPP-HuVX3'; 1 l d'ADN polymérase thermostable, et eau distillée q.s.p. 100 Rl. L'amplification a été réalisée en 30 cycles successifs d'incubation à 95 C pendant 30 secondes, 40'C pendant 30 secondes, et 72 C pendant 30 secondes, puis a été suivie d'une incubation à 72 C pendant 10 minutes. L'amplification a permis d'obtenir un fragment d'environ 360 pb contenant la région variable VL de l'anticorps D7C2 ainsi que la séquence codant pour les 16 premiers acides aminés de la région constante humaine k. Après amplification de la région VL, une digestion par les enzymes SacI et XhoI du produit d'amplification a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites SacI et XhoI du plasmide pBC# pour donner le plasmide pBXD7C2. La composition du mélange de ligation est la suivante 2 Fl de tampon 10X pour la T4-DNA ligase (BOEHRINGER) ; 100 ng du fragment VLD7C2 traité par les enzymes SacI et XhoI, 1 Rl du plasmide pBC# coupé par SacI et XhoI ; 1 1 de ligase (1 unité), et eau distillée q.s.p. 20 Fl. L'incubation est effectuée à 16-C pendant 8 heures puis le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes. Les étapes de construction du plasmide pBXD7C2 sont représentées à la Figure 1. La séquence de l'insert du plasmide pBXD7C2 qui code pour la chaine légère lambda d'un anticorps r D7C2, et pour le peptide signal, est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID N0:5 ; la séquence polypeptidique de la chaîne légère lambda codée par cet insert est représentée sous le numéro SEQ ID NO : 6. B) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LOURDE 1) Obtention du Dlasmide DBC"1 a- Plasmide de transfert Le plasmide pGml6 [BLANC et al, Virology, 192, 651-654, (1993)] dérive d'un plasmide dans lequel a été cloné le fragment EcoRI-P du baculovirus AcMNPV contenant le gène plO. La quasi-totalité de la séquence codante a été délétée et remplacée par un site BalII permettant l'insertion de séquences à exprimer sous le contrôle du promoteur p10. b- Peptide signal La séquence codante de ce peptide est celle d'un gène VH de souris (NEUBERGER M.S., 1983. EMBO J,2, 1373-1378). Elle a été synthétisée chimiquement sous forme de brins complémentaires, de manière à ce qu'elle puisse être insérée dans un site BalII (Figure 1). Les conditions d'appariement et de ligation sont identiques à celles utilisées pour la chaîne légère. c- Régions constantes humaines (c&gamma;1): Le cDNA de la séquence codante de la région Ct1 humaine a été amplifié par ACP en utilisant les amorces suivantes *HuC','lBAC 5' CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC - 3' (site RsnI souligné). Cette amorce correspond à une séquence consensus des régions JH murines (extrémités 3' des régions variables des chaînes lourdes murines), et comprend un site KDnI. *HuCtlFOR : 5'-GAqTCA ta TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3' (site BalII souligné). La séquence a été déterminée à partir de séquences Ct1 humaines. L'amorce est complémentaire de l'extrémité 3' des Cyl humaines, et permet de reconstituer après amplification un site BalII en aval du codon stop. La matrice utilisée pour amplifier la région cyl humaine est le même mélange d'ADNc que celui utilisé pour l'amplification des séquences codantes C# Le produit d'amplification a été séquencé et cloné dans le vecteur de transfert pGm16 portant la séquence codant pour le peptide signal. La construction obtenue a été appelée pBC&gamma;1. 2) Clonaae de la région variable de la chaîne lourde de l'anticoros D7C2 Le clonage de la région variable VH de la chaîne lourde de l'anticorps D7C2 a été réalisé de la manière suivante La région variable VH de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal IgM-D7C2 a été amplifiée par ACP en utilisant - comme matrice l'ADN du plasmide PTZ-VHD7C2 portant la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal IgM-D7C2, - une amorce reconstituant l'extrémité 5' des régions variables de la famille VH4 (OC15-HuVH4) et une seconde amorce complémentaire de la partie 3' des gènes JH humains (OPP-HuJH). Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction enzymatiques PstI et KDnI. Les séquences nucléotidiques de ces amorces sont les suivantes * OC15-HuVH4 5' - GTC CAA CTG CAG CAG TGG GGC GCA GGA CTG TTG AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC - 3' (le site PstI est souligné) Cette amorce a été déterminée pour reconstituer la séquence codant pour les 14 premiers acides aminés de la charpente 1 des régions variables de la famille VH4 des chaînes k1 humaines, qui manquait dans le plasmide PTZ-VHD7C2. * OPP-HuJH 5'- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GC- 3' (Le site KDnI est souligné). Cette amorce est complémentaire de la séquence consensus à l'extrémité 3' des régions JH humaines et comprend un site KDnI La composition du mélange d'amplification est la suivante 10 1 de tampon 10X de 1'ADN polymérase, 100 ng de plasmide PTZ-VHD7C2, 4 Rl du mélange de déoxynucléotides (mélange contenant 5 mN dATP + 5 mM dCTP + 5 mM dGTP + 5 mM dTTP, BOEHRINGER), 75 pmoles de l'amorce OC1S-HuVH4 et 100 pmoles de l'amorce OPP-HuJH, 1R1 de DNA polymérase thermostable et eau distillée q.s.p. 100 Fl. L'amplification a été effectuée en 30 cycles successifs d'incubation à 95 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 30 secondes et 72 C pendant 30 secondes et a été suivie d'une incubation à 72 C pendant 10 minutes. Après amplification de la région VHD7C2, une digestion Pst I-KDnI du fragment d'amplification obtenu (taille environ 360 pb) a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites PstI et KgnI du plasmide cassette chaîne lourde pBCtl pour donner le plasmide chargé pBylD7C2. La composition du mélange de ligation est la suivante 2 pl de tampon 10X de la ligase (BOEHRINGER), 20 ng du fragment VlD7C2 traité par les enzymes PstI et KgnI, 500 ng du plasmide pBCAl coupé par PstI et KpnI, 1 l de ligase (BOEHRINGER) et eau distillée q.s.p. 20 Lil. La ligation et la transformation des bactéries E. coli compétentes sont effectuées comme décrit cidessus. Les étapes de construction du plasmide pBtlD7C2 sont représentées à la Figure 2. La séquence de l'insert du plasmide pBylD7C2 qui code pour la chaine lourde gamma 1 d'un anticorps r IgG-D7C2, et pour le peptide signal, est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:5 ; la séquence polypeptidique de la chaîne lourde gamma 1 codée par cet insert est représentée sous le numéro SEQ ID NO:6. Exemple 3 : Construction d'un baculovirzs recoibinant produisant 1 'anticorps r-D7C2 a - Insertion de la chaîne légère Le plasmide chargé pBAD7C2 a été utilisé pour co-transfecter des cellules d'insecte avec de 1'ADN du baculovirus sauvage AcMNPV. Les conditions de transfection sont les suivantes : 500 ng d'ADN viral et 4 Rg d'ADN plasmidique en présence de 40 F1 de DOTAP (BOEHRINGER) dans 3 ml de milieu de culture sans sérum de veau pour cellules d'insectes. La cotransfection a été réalisée sur 4 x 106 cellules d'insectes Sf9 (ATCC35CRL 1711). Après quatre heures de contact à 28 C, le mélange de cotransfection est remplacé par 4 ml de milieu de TGV5 (milieu complet pour cellules d'insectes avec 5% de sérum de veau). La culture est continuée pendant 6 jours à 28 C. Le virus produisant la chaîne légère de l'anticorps r-IgG-D7C2 sous le contrôle du promoteur polyédrine a été sélectionné dans un premier temps sur son incapacité à produire des polyèdres, puis sur sa capacité à exprimer une chaîne légère d'environ 25 kDa détectable par Western blot à l'aide d'anticorps antichaîne x humaine du commerce (CALTAG, TEBU). L'ADN du virus recombinant obtenu (appelé AcMNPV-kD7C2) a été préparé à partir des surnageants de cellules infectées. b - Insertion de la chaîne lourde Le plasmide chargé pEtlD7C2 a été utilisé en cotransfection avec l'ADN du baculovirus modifié AcMNPV-A D7C2. La cotransfection a été réalisée avec 500 ng d'ADN viral et 5 'Lg d'ADN plasmidique, sur cellules Sf9. Les doubles recombinants ont été sélectionnés par la technique de la dilution limite, associée à la technique ELISA. Après une semaine de culture, le surnageant de cotransfection est dilué (10-4 à 10-10) puis distribué en plaques de 96 puits sur des cellules Sf9 (100 F1 de surnageant/puits), après une heure de contact, 100 1 de milieu sont rajoutés dans chaque puits. La sécrétion d'immunoglobulines y1 est recherchée dans le surnageant de chaque puits par ELISA après une semaine de culture à 28'C. Le test ELISA est réalisé comme indiqué cidessous 50 Rl de surnageant de culture de chaque puits sont déposés sur une plaque ELISA (NUNC) recouverte d'anticorps anti-IgG humaines totales (CALTAG, TEBU). L'adsorption des anticorps anti-IgG (100 'Ll d'une dilution 1/2000 par puits) a été réalisée en tampon PBS (137 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 4,3 mM Na2HPO4 ; 1,4 mM KH2PO4) pendant une nuit à 4 C, après une saturation préalable pendant une heure à 37 C avec du PBS additionné de 5% de sérum de veau. Après l'ajout des surnageants de culture, 50 F1 de PBS additionné de 1% de sérum de veau et 0,1% de Tween 20 sont rajoutés dans chaque puits. L'ensemble est incubé à 37 C et trois lavages en PBS additionné de 1% de Tween 20 sont effectués. Les plaques sont recouvertes d'anticorps anti-IgG humaines couplés à la biotine (CALTAG), à raison de 100 Zl/puits d'une dilution 1/10 000 faite dans du PBS additionné de 1% de sérum de veau et 0,1% de Tween 20, pendant une heure à 37 C. Après trois nouveaux lavages, les plaques sont incubées en présence du conjugué streptavidine/ phosphatase alcaline (dilution 1/10 000, CALTAG) puis révélées par le substrat p-nitrophényl-phosphate (lmg/ml, SIGMA) dilué en tampon alcalin (9 volumes de solution NaCl 3M et 1 volume de tampon Tris-HCl 1M pH 9,6). La densité optique de chaque puits est mesurée par spectrophotométrie à 405 nm.Les surnageants des puits positifs aux dilutions virales les plus fortes sont recueillis et conservés. L'isolement d'un clone viral recombinant exprimant la chaîne légère et la chaîne lourde est assuré par deux autres séries d'infections en plaques de 96 puits et recherche de l'anticorps par ELISA, suivies d'un clonage par la technique des plages de lyse. Le virus sélectionné a été baptisé Acl0HRh-33LRh (313). 13tle 4 : Production et xwrification d 1 'anticorps onocl0Ml recalibinsnt r-IgG-D7C2 a) Culture et purification Le virus sélectionné Acl0HRh-33LRh (313) est multiplié sur cellules d'insectes Sf9 en milieu TGV2 (2% de sérum de veau foetal). La concentration d'anticorps produit et sécrété est évaluée par ELISA ; elle est d'environ 3 mg/l. Une fraction du surnageant viral obtenu est concentrée 10 fois à l'aide de concentrateurs CENTRIPREP 30 (AMICON), à une vitesse de rotation de 1800 tours par minute. Ce concentré est directement utilisé pour les tests d'activité biologique in vitro. La concentration d'anticorps recombinant est évaluée à 30 mg/l dans le concentré. D'autre part, une fraction (50 ml) de surnageant viral est déposée sur une colonne de chromatographie de protéine A (gel SEPRACOR) préalablement équilibrée avec du PBS, afin de purifier l'IgGl recombinante. Après deux rinçages successifs de la colonne avec du PBS et une solution citrate/acide citrique 0,1M pH5, l'immunoglobuline est éluée avec une solution citrate/acide citrique 0,1M pH3. L'élution est suivie en mesurant la DO à 280 nm. Enfin, les fractions recueillies sont neutralisées à pH7 avec une solution de Tris-HCl pH8 et conservées à 4 C. La solution d'anticorps purifié est testée pour l'activité biologique parallèlement à la solution concentrée. b) Contrôle de l'assemblage et de la taille des chaînes d'immunoalobuline La qualité de l'anticorps produit par le virus recombinant Ac 10HRh-33LRh(313) a été contrôlée par migration électrophorétique dans un gel SDS-PAGE 12,5% en utilisant comme témoin une IgGX humaine monoclonale du commerce (SIGNA). Cette expérience a montré que l'anticorps humain non réduit migre au même niveau que l'anticorps humain témoin. Après réduction par le dithiotréitol (DTT), on observe l'apparition de deux sous-unités correspondant aux chaînes lourdes et légères, et migrant au même niveau que les chaînes de l'anticorps humain contrôle traité de la même façon. Pour confirmer ces résultats, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose, et les chaînes lourde et légère ont été détectées par des anticorps spécifiques anti-IgG ou anti- humaines. Izele 5 : Activité biologique de 1 'anticorps monocloul recoibinant r-IgG-D7C2 L'activité biologique de l'anticorps recombinant a été mesurée en utilisant le surnageant de culture des cellules d'insectes productrices de r-IgG D7C2, concentré 10 fois. Les mesures ont été effectuées par rapport à un anticorps recombinant (IgGl,) "nonpertinent" (irrelevant) dirigé contre une protéine autre que l'antigène Rhésus (contrôle négatif) et produit dans les mêmes conditions en cellules d'insectes, et par rapport à l'anticorps monoclonal parental humain IgM-D7C2 (IgM,). L'activité biologique de l'anticorps recombinant r-IgG-D7C2 a été évaluée 1 Par des tests d'agglutination en tubes, avec le surnageant des cultures de cellules d'insectes concentré 10 fois (30g/ml) et un panel de globules rouges humains papaïnés Rh-positif (Rl/r, Rl/Rl, R2/R2, Ro/r), et Rh-négatif (r/r) (G.N.R.G.S.). 50 1 de surnageant de culture concentré, contenant r-IgG-D7C2, et 50 111 de la suspension à 2% de globules rouges ont été incubés pendant 45 minutes à 37 les agglutinations sont appréciées de + à +++ selon l'intensité de la réaction. Les résultats figurent dans le Tableau I cidessous. TABLEAU I GLOBULES ROUGES Rl/r Rl/Rl R2/R2 Ro/r r/r PAPAINES INTENSITE + ~ +++ ++ = Le titre de l'anticorps recombinant r-IgG D7C2, estimé en incubant le surnageant avec un pool de globules rouges Rl/r, traité à la papaïne, pendant une heure à 37 C est de 1/512ème. 2 Par un test d'ADCC * Cellules effectrices (lymphocytes humains): La couche mononuclée est récupérée à partir du sang périphérique hépariné et séparé sur gradient de Ficoll Hypaque. Les cellules sont incubées à 37, pendant une nuit, dans une boîte de culture cellulaire en plastique (pour supprimer les monocytes) avec 1% de sérum de veau foetal ; les cellules non adhérentes sont ensuite récupérées et utilisées pour le test de cytotoxicité à raison de 8 x 106 cellules/ml. * Cellules cibles (globules rouges) - Le sang veineux de donneurs normaux, de groupe Rl/Rl (Rhésus positif) et de groupe r/r (Rhésus négatif), est prélevé sur citrate, puis les globules sont mis en suspension à 2% dans du NaCl et papaïnés. - Marquage au chrome Cr51 20 x 106 globules rouges papaïnés sont incubés à 37- pendant une heure avec 200Ci de Cr51, lavés 4 fois et resuspendus dans du NaCl à 9 pour mille. - Test ADCC Les expériences sont effectuées en triple, incluant les combinaisons suivantes globules rouges marqués au Cr51 suspendus dans du NaCl à 9 pour mille, pour mesurer le relargage spontané du chrome. globules rouges marqués au Cr51, suspendus dans de l'eau distillée pour mesurer le relargage maximum du chrome. globules rouges marqués au Cr51 sans anticorps, pour mesurer la cytotoxicité éventuelle des cellules effectrices. - globules rouges marqués au Cr51, sensibilisés avec : - 1 'anti-D recombinant r-IgG-D7C2 - un anticorps anti-D polyclonal spécifique (gammaglobulines, CNTS) à titre de contrôle positif - l'anticorps recombinant "non-pertinent1, à titre de contrôle négatif. Les anticorps sont utilisés à deux concentrations différentes (7,5g/ml, 3,5g/ml). Les cellules préparées, effectrices et cibles sont distribuées dans des microplaques à fond rond de la manière suivante 50 pl de lymphocytes (8.106 cellules/ml) et 50 l de la suspension de globules rouges marqués au Cr51 (8.105 cellules/ml) sont mis dans chaque puits avec un ratio de 10/1 ; 50 fol des différents anticorps sont ajoutés ensuite pour l'étude comparative. La quantité de Cr51 relargué est mesurée pour chaque suspension de globules rouges, et le % de lyse spécifique est calculé selon la formule suivante (% relargage d'un test) - (% relargage spontané) x 100 (% relargage maximum) - (% relargage spontané) Les résultats figurent sur les tableaux II (hématies Rl/Rl) et III (hématies r/r)ci-dessous. TABLEAU II Concentration % de Lyse d'anticorps spécifique Lymphocytes + Hématies 0,65% Lymphocytes + Hématies + Anticorps témoin 3,5 Fg/ml 0% (IgG1) recombinant Lymphocytes + Hématies 7,5 llg/ml 76,6% r-IgG-D7C2 3,5 g/ml 93,3% Lymphocytes + Hématies 7,5 g/ml 66,9% + Anti-D polyclonal (y globulines) 3,5 Rg/ml 76,0% TABLEAU III Concentration % de Lyse d'anticorps spécifique Lymphocytes + Hématies 0,76% Lymphocytes + Hématies + Anticorps témoin 3,5 g/ml 0% (IgGl) recombinant Lymphocytes + Hématies 7,5 g/ml 1,3% + r-IgG-D7C2 3,5 pg/ml 0% Lymphocytes + Hématies 7,5 llg/ml 0% + Anti-D polyclonal (y globulines) 3,5 llg/ml 0,1% Ces résultats montrent que l'anticorps r-IgG D7C2 induit une lyse spécifique des hématies Rh-positif Rl/Rl. LISTE DE SEQUENCES NOMBRE DE SEQUENCES: 8 1 > lirOinTici POICIR aQ ID Mo: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 312 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..312 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /produit= Region variable d'Immunoglobuline (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 67..99 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR1 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 145..165 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR2 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 262..279 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: GAC ATC GAG CTC ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA ACC TAT TAT GCA 96 Thr Val Arg Ile Thr cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala 20 25 30 AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCA CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TTC TGT AAC AGC GGT GGG AAG GTG TTC GGC GGA 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Ser Gly Gly Lys Val Phe Gly Gly 85 90 95 GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 312 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 2) ISiORYATION POUR ZA gZQ ID Mo: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 104 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2: Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Ser Gly Gly Lys Val Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 3) INFORMATION POUR LA 9EQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 369 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..369 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /produit= Region variable d'immunoglobuline (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 91..105 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR1 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 148..195 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR2 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: 292..336 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /label= CDR3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 3: CAG GTC CAA CTG CAG CAG TGG GGC GCA GGA CTG TTG AAG CCT TCG GAG 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC TAT GGT GGG TCC TTC AGT GGT TAC 96 Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 TAC TGG AGC TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG ATT 144 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 GGG GAA ATC AAT CAT AGT GGA AGC ACC AAC TAC AAC CCG TCC CTC AAG 192 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTA GAC ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 AAA CTG AAC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG 288 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 AGG GCC CCA GAG TAT AAA TGG AAG TAT CAT GGG GAC TGG TTC GAC CCC 336 Arg Ala Pro Glu Tyr Lys Trp Lys Tyr His Gly Asp Trp Phe Asp Pro 100 105 110 TGG GGC CAA GGT ACC ACT GTC ACC GTC TCC TCA 369 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 4) rNtORh=TIOH POUR LA aQ ID Mo: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 123 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4: Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Pro Glu Tyr Lys Trp Lys Tyr His Gly Asp Trp Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 5) ISPORMSIoN PoUR LA 8eQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 717 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: matpeptide (B) EMPLACEMENT: 58..717 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /produit= Chaine légère d'immunoglobuline (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: sigpeptide (B) EMPLACEMENT: 1..58 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5: ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAC TCC GAC ATC GAG CTC ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC 96 Val His Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 1 5 10 TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA ACC 144 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr 15 20 25 TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCA CCT GTA CTT 192 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 30 35 40 45 GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC 240 Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 55 60 TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT 288 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TTC TGT AAC AGC GGT GGG AAG GTG 336 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Ser Gly Gly Lys Val 80 85 90 TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCT GCC 384 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala 95 100 105 CCC TCG GTC ACT CTG TTC CCG CCC TCC CTC GAG GAG CTT CAA GCC AAC 432 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Ala Asn 110 115 120 125 AAG GCC ACA CTC GAG GAG CTT CAA GCC AAC AAG GCC ACA CTA GTG TGT 480 Lys Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 130 135 140 CTG ATC AGT GAC TTC TAC CCG GGA GCT GTG ACA TTG GCT TGG AAG GCA 528 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Leu Ala Trp Lys Ala 145 150 155 GAT GGC AGG CCC GTC AAG GCG GGA GTG GAG ACC AAC AAA CCC TCC AAA 576 Asp Gly Arg Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Asn Lys Pro Ser Lys 160 165 170 CAG AGC AAC AAC AAG TAC GCG GCC AGC AGC TAC CTG AGC CTG ACG CCC 624 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 175 180 185 GAG CAG TGG AAG TCC CAC AGA AGC TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA 672 Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu 190 195 200 205 GGG AGC ACT GCA GAG AAG ACG GTG GCC CCT GCA GAA TGT TCA TA 717 Gly Ser Thr Ala Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 220 6) IN-ORYATION Pool LA Uq ID Mc: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 238 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 Val His Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 1 5 10 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr 15 20 25 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 30 35 40 45 Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Ser Gly Gly Lys Val 80 85 90 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala 95 100 105 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Ala Asn 110 115 120 125 Lys Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 130 135 140 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Leu Ala Trp Lys Ala 145 150 155 Asp Gly Arg Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Asn Lys Pro Ser Lys 160 165 170 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 175 180 185 Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu 190 195 200 205 Gly Ser Thr Ala Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 7) INVOREASIOX POUR LA SZQ IDMO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1419 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: matpeptide (B) EMPLACEMENT: 58..1419 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /produit= Chaine lourde d' irnrnoglobuline (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: sigqeptide (B) EMPLACEMENT: 1..57 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 7: ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG CAG TGG GGC GCA GGA CTG TTG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 1 5 10 CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC TAT GGT GGG TCC TTC 144 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe 15 20 25 AGT GGT TAC TAC TGG AGC TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGG CTG 192 Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGG GAA ATC AAT CAT AGT GGA AGC ACC AAC TAC AAC CCG 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 50 55 60 TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTA GAC ACG TCC AAG AAC CAG 288 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 TTC TCC CTG AAA CTG AAC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCT GTG TAT 336 Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 80 85 90 TAC TGT GCG AGG GCC CCA GAG TAT AAA TGG AAG TAT CAT GGG GAC TGG 384 Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Glu Tyr Lys Trp Lys Tyr His Gly Asp Trp 95 100 105 TTC GAC CCC TGG GGC CAA GGT ACC ACT GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC 432 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 110 115 120 125 ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC 480 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC 528 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG 576 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 160 165 170 CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC 624 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 175 180 185 AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTC GGC ACC CAG ACC TAC ATC 672 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 190 195 200 205 TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GCA 720 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala 210 215 220 GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA 768 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC 816 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 240 245 250 AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG 864 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 255 260 265 GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG 912 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 270 275 280 285 GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG 960 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 TAC AAC AGC ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC AAA GTC CTG CAC CAG 1008 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Lys Val Leu His Gln 305 310 315 GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC 1056 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 320 325 330 CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC 1104 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 335 340 345 CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CGA TCC CGG GAT GAG CTG ACC 1152 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 350 355 360 365 AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC 1200 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC 1248 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC 1296 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 400 405 410 AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC 1344 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 415 420 425 TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG 1392 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 430 435 440 445 AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TG 1419 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 8) XSYORYSIoY POOR LA SZQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 472 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 1 5 10 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe 15 20 25 Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 80 85 90 Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Glu Tyr Lys Trp Lys Tyr His Gly Asp Trp 95 100 105 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 110 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 160 165 170 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 175 180 185 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 190 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala 210 215 220 Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 240 245 250 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 255 260 265 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 270 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Lys Val Leu His Gln 305 310 315 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 320 325 330 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 335 340 345 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 350 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 400 405 410 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 415 420 425 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 430 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 REVENDICATIONS 1) Fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par - un fragment d'ADN qui code pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2 - un fragment d'ADN qui code pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2. 2) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'ADN selon la revendication 1, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur de baculovirus. 3) Cassette d'expression selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments permettant l'expression de la chaîne lourde ou de la chaîne légère d'un anticorps monoclonal recombinant dénommé r-D7C2, lesdits éléments étant constitués par - un promoteur de baculovirus, sous contrôle transcriptionnel duquel sont placés - une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion ; et - une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal D7C2 et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline ; ou bien - une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal D7C2 et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline. 4) Cassette d'expression selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère ou de la chaîne lourde d'immunoglobuline est une séquence d'origine humaine. 5) Cassette d'expression selon une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le promoteur de baculovirus est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, ou bien le promoteur de la pi0 ou l'un de ses dérivés. 6) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon la revendication 1. 7) Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 2 à 5. 8) Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il constitue un vecteur de transfert, portant un insert comprenant . une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 2 à 4, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome de baculovirus en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette. 9) Vecteur de transfert selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine. 10) Vecteur de transfert selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps r-D7C2 est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps r-D7C2 est flanquée des régions entourant le gène P10 dans le baculovirus sauvage. 11) Baculovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 2 à 5. 12) Baculovirus recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps r-D7C2, et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps r-D7C2. 13) Baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps monoclonal r-D7C2, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps monoclonal r-D7C2, sont deux promoteurs différents. 14) Baculovirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'un desdits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et l'autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la P10. 15) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps r-D7C2 est sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de l'un de ses dérivés, et la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps r-D7C2 est sous contrôle du promoteur de la P10 ou de l'un de ses dérivés. 16) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps monoclonal r-D7C2, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps monoclonal r-D7C2, sont deux séquences différentes. 17) Baculovirus recombinant selon la revendication 16, déposé le 19 août 1994, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro I-1468. 18) Cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 11 à 17. 19) Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte selon la revendication 18, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture. 20) Anticorps monoclonal recombinant, caractérisé en ce que ses domaines variables ont la séquence des domaines variables de l'anticorps monoclonal D7C2. 21) Anticorps monoclonal recombinant selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 19. 22) Anticorps monoclonal recombinant selon une quelconque des revendications 20 ou 21 caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de sa chaîne légère et la séquence polypeptidique de sa chaîne lourde sont des séquences humaines. 23) Anticorps monoclonal recombinant selon une quelconque des revendications 20 à 22 caractérisé en ce qu'il appartient à la classe des IgG. 24) Utilisation d'un anticorps monoclonal recombinant selon une quelconque des revendications 20 à 23 pour l'obtention de médicaments.