Brevet FR2725728A1 — publié le 19960419

i PROCEDE D'ANALYSE D'UN AMAS CELLULAIRE La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un amas cellulaire issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale par la mesure de la radioactivité résiduelle de cet amas cellulaire après son traitement au moyen d'au moins un nucléotide radioactif. Une des applications d'une analyse de ce type est la détermination d'un index d'hormonodépendance de biopsies mammaires ou prosta- tiques. A la découverte d'un nodule mammaire perçu à la palpation ou au cours d'une mammographie systématique, chez une femme de plus de ans, la biopsie s'impose généralement en fin de compte car l'histopathologie seule permet d'affirmer ou non le diagnostic de cancer du sein. C'est le cas pour une femme sur onze dans ce groupe d'âge. Mais pour plus de trois femmes sur dix, ce sera heureusement une mastopathie bénigne. Alors, se pose le problème de soigner ou non ces patientes. P. Mauvais-Jarvis et ses collaborateurs ont expliqué ce dilemme, dans "Hormones et Seins", P. Scali et R. Villet, Masson Ed. 1991, sur le "Traitement hormonal des mastopathies bénignes". Selon ce document, on peut admettre que seules deux méthodes permettent la guérison des mastopathies bénignes en même temps qu'elles évitent la cancérisation. D'une part la castration qui supprime la production d'hormones prolifératives, d'autre part, la mastectomie qui supprime les récep- teurs des hormones prolifératives. Cette schématisation quelque peu simpliste a au moins l'avantage d'avancer les bases physiopatho- logiques du traitement hormonal qui reposent en effet sur deux sortes d'actions, soit l'inhibition de la sécrétion des gonadotrophines qui aboutit à des degrés divers à une castration biochimique, soit l'utilisation d'antiestrogènes stéroïdiens ou non stéroïdiens empêchant les hormones de se lier à leur récepteur nucléaire au niveau mammaire. Sur le plan pratique, force est de reconnaître les difficultés rencontrées dès que l'on aborde en termes concrets le traitement médical des mastopathies bénignes. On dispose actuellement de certaines méthodes qui permettent de recueillir des informations sur l'index mitotique observé avant et après un traitement hormonal donné. Ces méthodes d'analyses sont pratiquées à partir d'une biopsie et consistent à effectuer un prélèvement d'un amas cellulaire, par exemple d'origine mammaire ou prostatique, que l'on écrase pour faire une pâte en vue de dissocier les récepteurs. On sépare cette pâte en deux parties dont l'une est mise en présence d'oestrogènes radioactifs et l'autre en présence de progestérones radioactives. Une autre méthode d'analyse connue consiste à mettre le prélèvement de l'amas cellulaire en culture pour libérer les cellules et à rajouter des enzymes. Ces méthodes couramment pratiquées actuellement présentent plusieurs inconvénients: elles sont longues et ne sont pas fiables parce qu'elles ne permettent pas de déterminer d'une manière infail- lible quelles sont les hormones favorables à la division cellulaire, donc à la prolifération incontrôlée des cellules, notamment à la forma- tion de mastoses dans les seins, et quelles sont les hormones défavo- rables à cette division cellulaire. Le but de l'invention est de développer une méthode rapide, efficace et fiable pour déterminer la ou les hormones qui sont les plus effi- caces pour enrayer la division cellulaire, afin de permettre la mise au point infaillible d'un traitement hormonal approprié en des masto- pathies bénignes correspondant à une hyperplasie cellulaire à prédo- minance épithéliale, notamment les adénomes, les fibroadénomes, les polyadénomastoses, ou conjonctive telle que la maladie fibrokystique. Ce but est atteint par le procédé selon l'invention caractérisé en ce que l'on divise ledit amas cellulaire en un nombre prédéterminé n d'échantillons de masse sensiblement égale, en ce que l'on dépose chacun de ces échantillons dans un récipient approprié contenant un milieu de culture adéquat, en ce que l'on introduit dans chacun de ces récipients une quantité identique dudit nucléotide radioactif, en ce que l'on introduit dans au plus n-1 desdits récipients respecti- vement au plus n-1 hormones spécifiques, et en ce que l'on effectue ladite mesure de la radioactivité résiduelle des échantillons préala- blement lavés et centrifugés après un temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucléotide radioactif. Selon un mode de réalisation préféré, ledit temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucléotide radioactif est compris entre 12 et 36 heures et de préférence sensiblement égal à 24 heures. En outre, ledit nucléotide radioactif est de préférence de la thymidine marquée au tritrium, ou thymidine tritiée. Lesdites n-1 hormones spécifiques sont soit du type oestrogène ou soit du type progestérone. D'une manière préférée, ledit amas cellulaire est prélevé par exérèse chirurgicale ou par ponction biopsique et déposé stérilement dans des flacons contenant du sérum salé isotonique au moins pendant le temps du transport dans un laboratoire. De façon avantageuse, ledit amas cellulaire est stérilisé sur sa zone externe parfaitement dans une substance telle que l'éthanol à 70% et transféré dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle sans calcium ni magnésium. Ledit amas cellulaire est de préférence découpé en lamelles fines de 0,1 à 0,2 mm d'épaisseur dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle. Après chaque coupe les cellules sont libérées dans la solution et en ce que l'on filtre de préférence cette solution à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres. Ensuite, l'on centrifuge la solution filtrée. D'une manière préférée, l'on conserve une partie des cellules à une température comprise entre - 80 C et - 100 C, et de préférence à environ 90'C dans un milieu de Mc Coy 5A modifié avec: % de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate), Unités/ml de pénicilline, 100 microgrammes/ml de streptomycine; appelé par la suite le milieu A. Dans ce contexte, l'on met ensuite en culture une partie des cellules en délayant environ 107 à 109 des cellules en milieu de Mc Coy 5A modifiée avec: % de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate), Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine, ou dans un milieu de Mc Coy 5A modifié avec 20% de sérum de foetus de bovin, Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine, appelé par la suite le milieu B, et on ajoute de la thymidine tritiée à la dose de 1 à 2 microcuries par ml pour constitué un mélange de culture. De façon préférée, l'on prélève une partie déterminée dudit mélange de culture que l'on dépose dans des tubes de Falcon pour culture cellulaire. Dans ce cas, les tubes de référence reçoivent de préférence 0,025 ml de sérum isotonique. Les tubes de culture sont avantageusement placés en étude d'incubation pendant 48 heures à environ +37 C dans une atmosphère contrôlée. Ladite atmosphère contrôlée contient de préférence 95% d'air et 5% de C02. En d'autres termes, il s'agit de déterminer l'index mitotique et l'hormonodépendance des biopsies mammaires ou prostatiques en culture tissulaire, en présence de marqueurs nucléotidiques, tels que la thymidine tritiée, nécessaires à la synthèse de l'ADN. Le procédé d'analyse ci-dessus mesure l'activité mitotique beaucoup plus efficacement que le dosage des récepteurs hormonaux sur les homogénéisats de prélèvements tissulaires, car il reflète mieux l'effet des hormones sur la cellule plutôt que la présence ou l'absence de tel ou tel récepteur sur la membrane cellulaire. Il permet de déterminer avec précision le taux d'incorporation de la thymidine tritiée dans la synthèse de l'ADN des échantillons tissu- laires étudiés, cette incorporation étant plus ou moins élevée par rapport à une culture de référence en présence d'hormones spéci- fiques. Il est ainsi possible de déterminer quelle est l'hormone dont la présence favorise ou inhibe la multiplication des cellules, ce qui permet de recommander le traitement qui pourrait résorber la lésion surtout quand la réponse de l'anatomie pathologique est négative, c'est-à-dire lorsque la lésion est non cancéreuse. L'invention sera mieux comprise en référence au dessin annexé dans lequel: la figure 1 représente une vue schématique illustrant les phases principales du procédé et son équipement de mise en oeuvre. En référence à la figure 1, le principe général du procédé comporte les étapes essentielles A à F suivantes. L'étape A consiste à effectuer un prélèvement d'un amas cellulaire 10 qui est divisé en deux parties 11 et 12 dont l'une 11 sert à effectuer une histopathologie classique au moyen d'un équipement conventionnel 13 représenté schématiquement par un microscope. L'autre partie 12 est divisée en n parts égales en poids, au cours de l'étape B. Chacune de ces n parts égales est introduite dans un tube à essais 14 contenant un milieu de culture, en l'occurrence du sérum physio- logique de la personne ou de l'animal sur lequel l'amas cellulaire a été prélevé. Au cours de l'étape C, on introduit dans chacun de ces tubes à essais une quantité prédéterminée égale d'un nucléotide radioactif, tel que par exemple de la thymidine marquée au tritium, schématiquement représentée par un récipient 15. Au cours de l'étape D, on sépare deux tubes à essais 16 qui consti- tuent les tubes de référence. Les n-2 autres tubes, dits tubes de culture, reçoivent chacun une hormone spécifique Hi, H2, H3.... H.-2 qui est introduite dans le tube à essais. L'étape E est une étape d'attente au cours de laquelle les hormones agissent soit pour stimuler, soit pour ralentir la division cellulaire. La durée de cette attente est comprise entre 12 et 36 heures et est de préférence de l'ordre de 24 heures. Au cours de l'étape F, les échantillons sont centrifugés et lavés et leur radioactivité résiduelle est mesurée au moyen d'un équipement 17 du type compteur Geiger ou similaire, par exemple un compteur liquide par scintillement du type Packard avec écran d'affichage 18. Des essais en laboratoire ont été effectués et sont décrits en détail cidessous. Les échantillons biopsiques sont prélevés soit par exérèse chirur- gicale, soit pas ponction biopsique. Ils sont immédiatement déposés stérilement dans des flacons spécialement préparés à cet effet conte- nant du sérum salé isotonique, et conservés à + 4 C pendant le transport jusqu'au laboratoire. La biopsie est étudiée macroscopiquement et microscopiquement par quelques coupes après congélation pour en déterminer le degré de cellularité. Parfois, il est nécessaire de stériliser la zone externe de l'échantillon en le plaçant pendant 5 minutes dans de l'éthanol à 70% avant d'être transféré dans un disque de Pétri contenant de la solu- tion d'Earle (EBSS) sans calcium ou magnésium. Pour des biopsies chirurgicales relativement substantielles, la partie extérieure et le tissu adipeux seront reséqués par dissection et séparés du tissu mammaire ou prostatique sain, et des parties nécro- sées ou hémorragiques. Pour les ponctions biopsiques, l'examen au microscope binoculaire permet d'effectuer les mêmes opérations de préparation du matériel prélevé. Toutes les dissections sont effectuées sous couvert d'un bain d'EBSS. La biopsie maintenant bien parée sera découpée en petites lamelles très fines de 0,1 à 0,2 mm d'épaisseur dans un nouveau disque de Pétri sous bain d'EBSS, les pièces seront taillées et non grattées avec la lame de bistouri tout en étant maintenues immobiles avec une pince de dissection. Après chaque coupe, des cellules seront libérées dans le milieu qui sera versé à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres éventuels. Le milieu filtré est centrifugé à 500G à + 4 C pendant 10 minutes. Une partie des cellules de la biopsie peut être conservée pour études ultérieures à - 90 C dans un milieu de Mc Coy SA modifiée avec: % de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate), Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine; L'autre partie peut être mise en culture immédiatement. Le filtrat de cellules biopsiques est étudié en numération d'éléments figurés pour déterminer sa teneur en cellules, selon la même tech- nique que celle des études de sang. Il devrait y avoir de 107 à 109 cellules à délayer dans 25 ml d'un milieu Mc Coy modifié A ou d'un milieu B, auquel il sera additionné de la thymidine tritiée H-thymidine à la dose de 1 à 2 microcuries par ml, soit 25 à 50 microcuries en tout. 4 ml d'aliquote de cette suspension seront mis dans des tubes de Falcon de 150 x 16 mm pour culture tissulaire, à raison de 4 tubes par hormone ou par substance étudiée. Les tubes de référence recevront 0,025 ml de sérum salé isotonique. Tous les tubes de culture sont placés dans l'étuve à incubation pendant 48 heures à +37 C dans une atmosphère de 95% d'air et 5% de C02. A la fin de la période d'incubation, les cellules seront centrifugées à 500G pendant 10 minutes à + 4 C, et lavées trois fois avec la solution de lavage. La petite boule de cellules sera congelée et dégelée deux fois pour rompre les membranes, puis 5 ml d'acide trichloracétique y seront ajoutés. Après 2 heures à +4 C, les tubes seront de nouveau centrifugés à 750G pendant 15 minutes à +4 C. La petite boule de cellules sera traitée avec 1,0 ml d'hydroxyde d'hyamine (10X) pendant 12 heures à +37 C pour digérer les membranes et libérer le cytoplasme et les noyaux. Le transfert des tubes de culture aux tubes de comptage se fera par addition de 1,5 ml de méthanol puis addition de 10 ml de solution de Bray modifiée. Les tubes seront comptés dans un compteur à scintillation liquide du type Packard. Après correction pour ajustement (quelching), les résultats du comptage de chaque groupe de tubes sont exprimés en désintégration par minutes, ou coups/min. Le taux d'incorporation de la thymidine tritiée dans les cellules de chaque groupe testé sera exprimé en pourcentage en plus ou en moins par rapport à la moyenne du groupe de contrôle, ou de réfé- rence, respectif de chaque série. Il faut une différence o p est supérieur ou égal à 0,05 pour être significatif. Les résultats issus de ces essais sont donnés en détail ci-dessous. Sur 20 biopsies chirurgicales, les résultats obtenus sont les suivants: Augmentation du taux d'incorporation de 3H-thymidine: 3 (cas N- 5, 7, 8, 19) en présence d'estradiol, 2 (cas N 5, 7) en présence de testostérone; Diminution du taux d'incorporation de 3H- thymidine: 7 (cas N9 4, 6, 10, 14, 15, 17, 19) en présence de testostérone, (cas N- 10, 14, 15, 17, 19) en présence de progestérone, 2 (cas N2 14, 17) en présence de contisol, 2 (cas N- 10, 14) en présence d'estradiol; Réponse au traitement: cas N- 19, qui est histomologiquement un carcinome du sein, montre une augmentation sous estradiol de +41% et une dimi- nution sous testérone de -33% et de -23% sous progestérone, et répond très favorablement sous traitement par androgène; sept cas de tumeur bénigne du sein sensible à l'estradiol ont régressé complètement après traitement par progestérone sous forme de pommade à applications locales. REVENDICATIONS 1. Procédé d'analyse d'un amas cellulaire issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale par la mesure de la radioactivité rési- duelle de cet amas cellulaire après son traitement au moyen d'au moins un nucléotide radioactif, caractérisé en ce que l'on divise ledit amas cellulaire en un nombre prédéterminé n d'échantillons de masse sensiblement égale, en ce que l'on dépose chacun de ces échantillons dans un récipient approprié contenant un milieu de culture adéquat, en ce que l'on introduit dans chacun de ces récipients une quantité identique dudit nucléotide radioactif, en ce que l'on introduit dans au plus n-1 desdits récipients respectivement au plus n-1 hormones spécifiques, et en ce que l'on effectue ladite mesure de la radioac- tivité résiduelle des échantillons préalablement lavés et centrifugés après un temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucléotide radioactif. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit temps prédéterminé de mise en présence des échantillons et du nucléotide radioactif est compris entre 12 et 36 heures et de préférence sensi- blement égal à 24 heures. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit nucléotide radioactif est de la thymidine marquée au tritrium, ou thymidine tritiée. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites n-1 hormones spécifiques sont du type oestrogène ou progestérone. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit amas cellulaire est prélevé par exérèse chirurgicale ou par ponction biopsique et déposé stérilement dans des flacons contenant du sérum salé isotonique au moins pendant le temps du transport dans un laboratoire. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit amas cellulaire est stérilisé sur sa zone externe par traitement dans une substance telle que l'éthanol à 70% et transféré dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle sans calcium ni magnésium. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit amas cellulaire est découpé en lamelles fines de 0,1 à 0,2 mm d'épaisseur dans un disque de Pétri contenant une solution d'Earle. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'après chaque coupe les cellules sont libérées dans la solution et en ce que l'on filtre cette solution à travers un filtre de gaze pour retenir les gros morceaux et les fibres. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on centrifuge la solution filtrée. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on conserve une partie des cellules à une température comprise entre - 80 C et 100 C, et de préférence à environ - 90 C dans un milieu de Mc Coy 5A modifiée avec: 20% de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate), Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine. 11. Procédé selon les revendications 3 et 8, caractérisé en ce que l'on met en culture une partie des cellules en délayant environ 10' à 109 des cellules en milieu de Mc Coy 5A modifiée avec: % de sérum de la patiente (sein) ou du patient (prostate), Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine, ou dans un milieu de Mc Coy 5A modifié avec % de sérum de foetus de bovin, Unités/ml de pénicilline, microgrammes/ml de streptomycine, et on ajoute de la thymidine tritiée à la dose de 1 à 2 microcuries par ml pour constituer un mélange de culture. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on prélève une partie déterminée dudit mélange de culture que l'on dépose dans des tubes pour culture cellulaire. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les tubes de référence reçoivent 0,025 ml de sérum isotonique. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les tubes de culture sont placés en étude d'incubation pendant 48 heures à environ 37 C dans une atmosphère contrôlée. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite atmosphère contrôlée contient 95% d'air et 5% de C02.