Brevet FR2724181A1 — publié le 19960308

La présente demande a pour objet un récepteur de poisson de la prolactine, en particulier d'une espèce de poisson dénommée tilapia. Elle est en outre relative a des ' séquences nucléotidiques codant pour cette protéine. Un autre objet de la présente demande est l'utilisation de cette protéine pour déterminer l'activité agoniste ou antagoniste d'un composé vis-à-vis de la prolactine. La prolactine est une hormone polypeptidique hypophysaire impliquée à divers niveaux physiologiques chez les vertébrés. Chez les poissons, il a été montré que cette hormone était nécessaire pour le maintien des équilibres osmotiques. Chez le tilapia deux formes distinctes de la prolactine, ayant une identité de séquence de 69% seulement, ont été caractérisées et appelées tiPRL188 ( ou tiPRLI) et tiPRL177 ( ou tiPRLII) . Ces deux prolactines sont différemment régulées lors de l'adaptation à un environnement hyper osmotique et de plus présentent des effets biologiques en partie différents. Chez le tilapia des études initiales utilisant la prolactine ovine comme ligand ont montré la présence de sites de liaison de la prolactine dans différents tissus, (Dauder et al. (1990) Gen. Comp. Endocrinol. 77,378-385). En utilisant des prolactines de tilapia recombinantes, on a mis en évidence très récemment une forte liaison dans les branchies et les reins de ce poisson (Compte Rendu du Symposium d'Endocrinologie des poissons, 2 Septembre 1991, Université de Tokyo). Des ADN complémentaires de récepteurs de la prolactine ont été clonés chez diverses espèces de mammifères. I1 a été montré que ces récepteurs appartiennent à une super famille incluant les récepteurs d'hormones de croissance, des cytokines et de l'érythropoiétine. Ces récepteurs présentent des caractéristiques structurelles communes, et en particulier la conservation de deux paires de cystéines du domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire unique et une région intracellulaire riche en proline. Chez les vertébrés inférieurs, aucun ADN complémentaire codant pour un récepteur à la prolactine n'a été cloné à la connaissance du demandeur et toutes les tentatives utilisant des approches classiques par utilisation de sondes nucléotides ont été infructueuses. I1 ressort de l'état de la technique, que si l'on connaissait l'existence de sites de liaison de la prolactine dans différents organes des poissons, il n'avait jamais été possible, à la connaissance du demandeur, d'obtenir des récepteurs sous forme purifiée, ou même sous forme isolée. La détermination de la structure du récepteur à la prolactine est pourtant d'un grand intérêt chez les poissons en raison des rôles physiologiques importants que joueraient cette hormone lors de la reproduction, ainsi que d'autres hormones susceptibles de se lier à ce récepteur. I1 était donc indispensable, afin de pouvoir tester des molécules agonistes ou antagonistes de la prolactine pouvant agir sur ce récepteur, de disposer de vecteurs permettant d'exprimer ce récepteur dans des cellules et rendant possible sa production par génie génétique. Le demandeur s'est ainsi attaché à déterminer la structure du récepteur à la prolactine de tilapia. I1 a montré que si les techniques classiques basées sur l'utilisation de sondes n'avaient pas donné de résultat, une technique basée sur le clonage de fragments d'ADN de tilapia et la mise en évidence des clones liant la prolactine de tilapia permettait d'isoler un clone contenant un ADN complémentaire codant pour ce récepteur. I1 a en outre montré, par comparaison avec les séquences des autres récepteurs de la prolactine connus, que la séquence du récepteur de tilapia présentait des régions conservées mais aussi des régions présentant des structures différentes par rapport aux régions des autres récepteurs déj & séquencés. La présente invention a pour objet un récepteur de poisson de la prolactine et d'autres hormones sous une forme substantiellement pure. On entend par forme substantiellement pure, une forme dépourvue des impuretés habituellement retrouvées dans les préparations de protéines obtenues & BR De telles formes sont particulièrement utiles lorsque l'on veut étudier la structure d'une protéine, par exemple par cristallographie par rayons X, et son interaction avec des effecteurs tels que des agonistes ou des antagonistes. On soulignera que l'obtention d'une forme substantiellement pure d'un récepteur n'est en rien évidente pour l'homme du métier car d'une part l'isolement à partir de préparations cellulaires est effectué avec des faibles rendements, et d'autre part il est difficile, voire impossible, d'obtenir des préparations de récepteurs sous une forme substantiellement dépourvue d'impuretés telles que des débris membranaires. Le clonage d'ADN complémentaire suivi d'une détection du clone recherché par hybridation avec une sonde déduite de la séquence d'une protéine de structure proche est la méthode la plus couramment utilisée. Cependant, comme indiqué ci-dessus, cette méthode n'a pu être utilisée dans le cas présent. Préférentiellement, un tel récepteur est celui d'un poisson du genre des téléostéens, et plus particulièrement de la famille des cyprinidés, tels que le tilapia. Un tel récepteur présente avantageusement au moins une partie de la séquence SEQ ID N 3 suivante, correspondant à la séquence de la protéine mature. His Tyr Ser Leu Pro Gly Lys Pro Thr Glu Ile Lys Cys Arg Ser Pro Glu Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Lys Pro Gly Ser Asp Gly Gly Leu Pro Thr Thr Tyr Ala Leu Tyr Tyr Arg Lys Glu Gly Ser Asp Val Val His Glu Cys Pro Asp Tyr His Thr Ala Gly Lys Asn Ser Cys Phe Phe Asn Lys Asn Asn Thr Leu Ile Trp Val Ser Tyr Asn Ile Thr Val Val Ala Thr Asn Ala Leu Gly Lys Thr Tyr Ser Asp Pro Gln Asp Ile Asp Val Val Tyr Ile Val Gln Pro His Pro Pro Glu Lys Leu Glu Val Thr Val Met Lys Asp Gln Gly Trp Pro Phe Leu Arg Val Ser Trp Glu Pro Pro Arg Lys Ala Asp Thr Arg Ser Gly Trp Ile Thr Leu Ile Tyr Glu Leu Arg Val Lys Leu Glu Asp Glu Glu Ser Glu Trp Glu Asn His Ala Ala Gly Gln Gln Lys Met Phe Asn Ile Phe Ser Leu Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Leu Ile Gln Val Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Ser Thr Ser Tyr Val Lys Val Pro Glu Tyr Leu His Arg Glu Lys Ser Val Trp Ile Leu Val Leu Val Phe Ser Ala Phe Ile Leu Leu Leu Leu Thr Trp Leu Ile His Met Asn Ser His Ser Leu Lys His Cys Met Leu Pro Pro Val Pro Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Lys Gln Leu Leu Lys Ser Gly Lys Ser Asp Glu Val Phe Ser Ala Leu Val Val Ser Asp Phe Pro Pro Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Tyr Met Pro Glu Gln Gln Glu Leu Met Val Asp Lys Gly Lys Asp His Asp Gly Cys Leu Lys Ser Ile Gly Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly Ser Cys Asp Ser Asp Asn Leu Leu Met Asp Lys Ser Gly Ala Pro Lys Glu Glu Gln Gln Gln Gln Asn Gln Glu Gly Asp Gln Ile Gly Lys Glu Thr Gln Gly Pro Lys Glu Ala Trp Glu Lys Glu Ala Met Pro Cys Ala Asn Glu Asp Val Val Ser Pro Asp Ala Ser Ser Glu Lys Val Lys Thr Trp Pro Ser Val Phe Ser Pro Val Thr Pro Tyr Ser Pro Leu Asp Pro His Asn Ser Leu Glu Met His Lys Gln His Cys Leu Ser Asn Thr Gln Phe Pro Pro Gly Ser Pro Ser Ser Asp His Tyr Ile Lys Glu Ala Leu Gln Ser Ser Tyr Trp Glu Val Cys Phe Asn Asn Asn Gln Pro Tyr Pro Gln Thr Glu Val His Pro Gln Leu Gln Ala His Ser Asp Arg Asn Ile Ser Ala Val Asn Asp Arg Asn Ala Pro Thr Gly Leu Leu Leu Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr Val Glu Val Gln Arg Val Asn Glu Glu Asn Lys Val Leu Leu His Pro Ile Pro Ser Gly His Ser Arg Glu Lys Ala Cys Pro Trp Val Gly Gln Arg Asp Asp Tyr Ser Lys Val Lys Gly Val Asp Ser Asp Asn Gly Leu Leu Leu Gln Arg Glu Val Val Glu Glu Glu Ser Met Glu Met Ala Gly Ala Ala Glu Ser Cys Tyr Thr Ser Ser Ile Ala Phe Thr Thr Pro Lys Gln Thr Ala Cys Ser Pro Val Ala Leu Pro Val Gln Asp Glu Arg Val Leu Ala Val Ser Gly Tyr Val Asp Thr Ala Thr Val Phe Ser Val His Thr La protéine de séquence SEQ ID N@3 se distingue des autres récepteurs de la prolactine ou de l'hormone de croissance déjà connus. En raison du faible taux d'homologie et de similitude avec ces molécules déjà connues, il n'était en rien évident de déduire la séquence SEQ ID N@3 de celles de ces autres protéines. On notera que la présente invention concerne non seulement la protéine dont la séquence est indiquée ci-dessus mais aussi ses fragments ainsi que tous les variants de cette protéine qui consisteraient en des modifications dans sa structure ne modifiant pas sa fonction, et en particulier sa fonction en tant que récepteur d'hormone telle que la prolactine ou l'hormone de croissance. Notamment de tels variants peuvent consister en des substitutions d'un acide aminé par un autre acide aminé présentant une formule différente mais une fonction sensiblement équivalente. L'ouvrage de Lehninger ( Biochimie, Bases Moléculaires de la structure et des fonctions cellulaires, 2ème édition 1979, Flamarion, Médecine Science éditeur) précise que les vingt acides aminés les plus fréquemment rencontrés peuvent être subdivisés en quatre groupes, en fonction de leurs structures chimiques. On notera que selon la présente invention, la substitution d'un acide aminé de la protéine décrite ci-dessus par un autre acide aminé appartenant au mêle groupe n'introduit pas un changement fonctionnel dans la structure de la protéine, et que les protéines dans lesquelles il existe une simple substitution de ce type, appelée aussi substitution conservative rentrent dans le cadre de la présente invention. Ceci n'implique pas pour autant que des substitutions d'un acide aminé d'un groupe donné par un autre acide aminé appartenant à un autre groupe aient pour effet d'écarter de telles protéines modifiées du cadre de la présente invention. En effet, la présente invention concerne toute moléculaire présentant une structure similaire et dont la fonction telle que définie ci-dessus est conservée. La présente invention est en outre relative à une séquence oligonucléotidique codant pour l'un des récepteurs tels que définis ci-dessus et est relative en particulier à la molécule d'ADN comprenant au moins une partie de 1'ADN complémentaire présentant la séquence SEQ ID N 1 suivante. AATTCTGGAT GTTGGCGATA ACCTCGCTGA CAGGACGGCT GAGCTGACCG GCGCGCGCTC CTCTCCTCAG CTGTCGGTGA AACGCGTTAA ATCACAGACA CAGGTCGGTG TCTAAAAGCC GGCTCTCCCG GGAGCCTGCA GCGAAGTCGC TACGGCGGCG GAGACTGAAA AACTTTCGAT CCAGCCCAAC AAGGTTTTGT GGTGCAATGA TGACGAAAGT CGGAGAAGTT CTCCTGCTGT TGTTGCTGCC AGCCTTTGTG CCGCACACAG ACGGAACACA TTATAGCTTA CCTGGCAAGC CCACAGAGAT CAAATGCCGT TCTCCAGAGA AAGAGACCTT CACATGCTGG TGGAAGCCGG GATCTGATGG GGGACTGCCT ACTACATACG CTCTCTACTA TCGAAAAGAA GGTTCTGACG TAGTGCACGA GTGCCCTGAC TACCACACAG CCGGGAAGAA CTCCTGCTTC TTTAACAAGA ACAACACCCT TATCTGGGTC AGCTACAACA TCACCGTGGT GGCCACCAAC GCACTGGGCA AGACCTACTC TGACCCTCAG GATATAGACG TGGTCTACAT TGTCCAGCCC CATCCTCCAG AAAAGCTAGA AGTGACAGTA ATGAAGGATC AGGGCTGGCC CTTTCTTCGA GTGTCTTGGG AACCACCTCG TAAGGCTGAC ACTCGCTCTG GCTGGATCAC TCTAATCTAT GAGCTCCGCG TCAAGTTGGA GGATGAGGAA AGCGAATGGG AGAATCACGC TGCAGGCCAG CAGAAGATGT TTAACATTTT CAGCCTGCGG TCAGGTGGTA CATACCTTAT TCAGGTGCGG TGTAAGCCCG ATCACGGCTT TTGGAGTGAA TGGAGTTCCA CTTCCTACGT CAAAGTTCCT GAGTATCTCC ATCGGGAAAA GTCTGTCTGG ATCCTCGTTT TAGTCTTTTC TGCCTTCATT TTACTGCTCC TCACATGGCT GATACACATG AATAGCCACA GTCTGAAGCA CTGCATGCTG CCACCAGTCC CAGGGCCTAA AATCAAAGGC TTTGACAAGC AGCTTCTCAA GAGTGGCAAG TCTGACGAGG TGTTCAGCGC ACTGGTGGTG TCTGACTTCC CACCAACCAC GTCTAACTAT GAGGACTTGC TGGTAGAATA CTTAGAAGTG TATATGCCAG AACAGCAGGA ACTGATGGTC GACAAAGGCA AGGATCATGA CGGCTGCCTG AAATCCATAG GCTCGGCATC TGACAGTGAC TCTGGCCGGG GCAGCTGTGA CAGTGACAAT CTGCTGATGG ATAAGAGTGG CGCGCCGAAA GAGGAACAGC AGCAACAAAA TCAGGAGGGA GATCAAATTG GGAAGGAGAC ACAAGGGCCC AAAGAAGCCT GGGAGAAGGA AGCGATGCCA TGTGCTAATG AGGATGTAGT TAGC C C C GAT GCATCAAGTG AGAAGGTTAA GACCTGGCCT TCTGTGTTTT CCCCAGTGAC TCCGTACAGC CCACTGGATC CCCACAACTC ACTTGAGATG CACAAACAGC ATTGCCTTTC TAACACCCAG TTTCCTCCGG GCTCCCCATC CTCAGACCAC TACATCAAAG AGGCTCTCCA ATCAAGCTAC TGGGAGGTCT GCTTTAATAA TAATCAACCT TATCCCCAGA CAGAGGTCCA CCCGCAACTC CAGGCTCACA GCGATCGCAA CATCTCAGCC GTCAACGACA GGAATGCACC CACTGGTCTG CTGTTGCCCA CCCGGATGAC TGAGTACGTT GAAGTGCAAA GGGTCAATGA GGAGAATAAA GTGCTTCTCC ATCCTATTCC TTCAGGCCAT AGCCGTGAAA AAGCCTGTCC CTGGGTAGGA CAGAGAGACG ATTATAGCAA AGTGAAAGGG GTAGACAGTG ACAATGGGCT GCTGCTCCAG AGAGAGGTGG TGGAAGAAGA GAGCATGGAG ATGGCTGGAG CAGCCGAGAG CTGC TACACA TCTTCCATCG CTTTTACCAC TCCTAAGCAA ACAGCCTGCA GTCCCGTTGC CCTGCCGGTC CAGGATGAAA GGGTTCTGGC AGTAAGTGGA TATGTCGACA CTGCCACTGT ATTCTCAGTG CACACCTAGT AGACGTGACA GCCCAAACTG GCAGTTGTAG AACGTTGCAA GAGGTGGGGA CTGAGACACA CGAAAAAGCA CTAACACTCC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAT TGCCAAGACA ATGTATATTT ATTTTTTTAT CTTCTTCTCC TGTAAGAGAC A La présente invention a encore pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes contenant au moins une partie d'une des séquences nucléotidiques, et en particulier d'un des ADN, telles que décrites ci-dessus. Un autre objet de la présente invention est un procédé d'obtention d'un récepteur dans lequel une séquence nucléotidique, comme décrite ci-dessus, est exprimée dans une cellule. On notera que si le récepteur peut ainsi être obtenu par génie génétique, par exemple dans une cellule procaryote ou préférentiellement dans une cellule eucaryote, il peut être aussi synthétisé par voie chimique. Pour l'expression dans des cellules eucaryotes, telles que des cellules COS-7 ou dans la lignée fibroblastique humaine 293 (disponible auprès de la Collection ATCC sous le n CRL 1573), on utilisera avantageusement le plasmide pcDNA1 commercialisé par In Vitrogen (San Diego, USA) dans lequel 1'ADN complémentaire de séquence SEQ ID N'1 a été intégré entre les sites BstX1/EcoR1 et Notl, ou le pcDNA3 commercialisé par In Vitrogen et portant le promoteur du CMV. La présente invention est en outre relative à un procédé de détermination de l'activité agoniste ou antagoniste d'un composé vis-à-vis de la prolactine ou d'une autre hormone chez les poissons consistant à - mettre en contact ledit composé avec des cellules eucaryotes exprimant un récepteur tel que décrit ci-dessus, et - mettre en évidence l'effet dudit composé sur l'activation des cellules par la prolactine. De telles cellules peuvent être notamment des cellules de mammifères et en particulier des cellules COS-7. L'activation des cellules peut être mise en évidence en étudiant l'expression d'un gène codant pour une protéine du lait, tellee que la ss-caséine du rat, qui a été transduit dans la cellule avec 1'ADN exprimant le récepteur. Les modalités pratiques de mise en oeuvre de ce procédé peuvent être, en particulier, celles décrites par Ali et al. (Mol. Endocrinol, 1992, 6, 1242-1248) ou Lesueur et al. (Proc. Natl. Acad. USA, 1991, 88, 824-828). L'activation des cellules peut aussi être mise en évidence en étudiant leur régulation osmotique. On notera que la prolactine de tilapia et de poisson en général présentent de très faibles liaisons et activités physiologiques vis-à-vis des récepteurs de la prolactine de mammifères et d'oiseaux déjà connus dans l'état de la technique. I1 n'était donc pas envisageable d'utiliser ces récepteurs pour déterminer l'activité agoniste ou antagoniste de composés vis-à-vis de la prolactine de poisson. L'isolement du récepteur de tilapia et la détermination de sa structure constituent donc une avancée technologique importante puisqu'ils permettent la recherche d'agonistes et d'antagonistes de la prolactine chez les poissons. La prolactine intervient dans la reproduction des poissons . La maîtrise des cycles de reproduction des poissons constitue un des problèmes des pisciculteurs. En effet, pour des raisons d'ordre pratique, il est particulièrement intéressant que tous les poissons d'un élevage se trouvent au même stade de développement. I1 est donc nécessaire de synchroniser les cycles de reproduction des différents individus. La prolactine du fait de ses effets sur la reproduction pourrait être mise en oeuvre en vue d'aboutir à cette synchronisation, mais il est impossible de l'utiliser en raison des volumes trop importants des bassins d'élevage. I1 serait particulièrement avantageux d'utiliser des composés chimiques plus simples que la prolactine, ou plus actifs, permettant d'obtenir une telle synchronisation et d'une synthèse suffisamment facile pour être répandus dans les élevages en grandes quantités. Les pisciculteurs sont aussi confrontés de façon continue à des épizooties mettant en péril la santé de leurs élevages. Une des actions connues de la prolactine est la stimulation de la synthèse du mucus chez les poissons. Le mucus permet de protéger les animaux à l'encontre des agressions, en particulier virales et bactériennes. I1 serait donc particulièrement intéressant de trouver des composés plus simples que la prolactine et présentant des effets similaires sur la synthèse du mucus. De manière générale, l'homme du métier se référera pour la mise en oeuvre de la présente invention au manuel général: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor N.Y., 2ème édition) et à ses rééditions récentes. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par l'exemple qui suit dans lequel: La figure 1 est une photographie d'une cellule COS-7 transfectée par 1'ADN complémentaire codant pour le récepteur de la prolactine de tilapia et marquée par la prolactine de tilapia 125I-tiPRLl88. Le grossissement est de 40 fois. La figure 2a illustre la liaison de 125I-tiPRL188 a des membranes de cellules COS transfectées par 1'ADN complémentaire codant pour le récepteur de la prolactine de tilapia. Les membranes sont incubées en présence de ligand 125I-tiPRL188 et de concentrations variables de prolactine de tilapia PRL188 de prolactine de tilapia PRL177, de prolactine ovine et d'hormones de croissance de tilapia. Les résultats sont exprimés comme le pourcentage de liaison spécifique maximale observé en l'absence de compétiteur. La figure 2b est la représentation de Scatchard du test de compétition effectué dans la figure 2a avec la prolactine de tilapia non marquée Pal188. Les figures 3a et 3b représentent un transfert de Northern (Northern-blot) d'ARN issus de divers tissus de tilapia. La membrane a été successivement hybridée avec la sonde correspondant au domaine extracellulaire du récepteur de la prolactine de tilapia ( tiPRLR) ( figure 3a) et une sonde issue de la séquence de la ss-actine de truite arc-enciel (figure 3b). Les ARN polyadénylés ont été purifiés à partir d'un pool de deux adultes et de cinq jeunes ( puits 1: peau; puits 2: intestin; puits 3: muscle; puits 4: foie; puits 5: branchies; puits 6: gonade: puits 7: rein). La figure 3c est un diagramme illustrant l'effet du transfert de tilapia de l'eau douce (FW) dans de l'eau saumâtre (BW) sur la quantité d'ARN messager codant pour le récepteur de la prolactine de tilapia (en ordonnée). La figure 4 illustre les différences de séquences entre les récepteurs de la prolactine de tilapia (TIL ROAA2), de bovin (BOVPRLAA), humain (HPRLAA), de souris (MPRLAA), de lapin (RABPRLAA), de poulet (CHKAA) et de pigeon (PIGEONPRLR). La figure 5 illustre les différences de séquences entre le récepteur de la prolactine de tilapia (TILROAA2) et les récepteurs de l'hormone de croissance de bovin (BOVGHRAA), humain (JFMHAA), de souris (MGHRAA), de lapin (RABGHRAA) et de poulet (JFMCKAA). Sur ces deux figures (*) indique la position d'un acide aminé strictement conservé, tandis que (.) indique la présence d'une substitution conservatrice. EXEMPLE: Clonaqe et séquençaqe de 1'ADN complémentaire du récepteur de la prolactine. MATERIELS ET METHODES 1) Hormones et préparation des hormones marquées par des isotoPes. Les prolactines de tilapia (tiPRL) recombinantes, fournies par F. (Rentier-Delrue Université de Lièges, Belgique) ont été produites dans Escherichia coli. L'hormone de croissance de tilapia recombinante ( tiGH) est un don de Monsieur Smal, Eurogentec, Lièges, Belgique. La prolactine Ovine ( oPRL, NIDDK-oPRL-l9) est un don du NIDDK et du National Hormone and Pituitary Program ( Bethesda, MD ). L'hormone de croissance humaine recombinante ( hGH) a été fournie par (Serono Genève, Suisse). L'hGH est marqué selon la méthode de la chloramine-T (Tanaka, et al. 1992 Biochem. Biophys. Res. Commun. 188, 490-496) et le tiPRI.188 a été marqué conformément à (Aupérin et al. 1994 J. Mol. Endocrinol. 12, 13-24). L'activité spécifique était de 80à 140 mCi/mg pour la 1251-hGH et de 30 à 40 mCi/mg pour la 125In tiPRL188(1 Ci= 37 GBq). 2) Construction et subdivision de la banque d'ADN complémentaire. L'ARN total a été extrait à partir de reins de tilapia (Oreochromis niloticus) mis dans l'eau douce, en utilisant la technique de Chomczynski et Sacchi (1987 Anal. Biochem. 162, 156-159) et 1'ARN polyadénylé a été préparé selon la technique d'Aviv et Leder (1972 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.69, 14081412). Une banque d'expression de 1'ADN complémentaire a été construite par Invitrogen (San Diego, California) et ligaturée entre les sites BstXl/EcoR1 et Notl du vecteur d'expression pcDNAl. On obtient 1,2 x 106 recombinants primaires. La stratégie de clonage a été mise en oeuvre selon la méthode modifiée de Matthews et Vale (1991 Cell 65, 973-982). Des pools de clones ont été mis en croissance dans 2 ml de milieu LB ampicilline-tétracycline. 0,54 ml du milieu de culture a été congelé dans du glycérol à 80% (V/V) et le restant a été utilisé pour la préparation d'ADN plasmidique selon la méthode de lyse alcaline (Maniatis et al 1982 Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). Après la précipitation, la moitié de chaque préparation ( miniprep de 5 ml) a été utilisée pour une transfection transitoire. 18 heures après la transfection, 2 x 105 cellules COS-7 ont été incubées dans des chambres à lames ( Nunc), prérecouvertes avec de la gélatine et de la polylysine (Sigma), dans du milieu MEM contenant 10 % (V/V) de sérum de veau foetal (Gibco). Les cellules ont été transfectées à une confluence de 80% selon le procédé au DEAE-dextranchloroquine. Quatre heures après les cellules ont été soumises à un choc dans du diméthyl sulfoxide à 10 % durant 2 minutes et du milieu neuf a été ajouté. 65 heures après , le milieu a été éliminé et les cellules ont été incubées avec 6,5 x 105 125I-tiPRLl88 (= 800 pM/chambre) dans 0,6 ml de DMEM/Hepes 20 mM/glucose/0,1%/ sérum albumine bovine (BSA) 0,1 %, pH 7,4, durant 4 heures, à la température ambiante. Après deux lavages avec du milieu MEM, les lames ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% et déshydratées par deux lavages avec de l'méthanol à 95%. Les séparations verticales ont été enlevées et les parois ont été séchées sous vide, trempées dans de l'émulsion NTB2 (Kodak) et exposées dans le noir à 4 C durant 72 heures. L'émulsion a été développée et les cellules ont été teintes avec de l'hématoxyline et de l'éosine, déshydratées par des bains d'éthanol et a étalées à l'aide de colle DPC ( Electron Microscopy Sciences).Les parois ont été examinées sous un microscope à contraste de phase (Nikon). Le même procédé a été mis en oeuvre de manière simultanée avec 1'ADN complémentaire des récepteurs à la prolactine de rats exprimés dans des cellules COS-7 (Boutin et al. 1988 Cell 53, 69-77) en utilisant la 125I-hGH, comme témoin. 3 ExPression de 1'ADN complémentaire des récenteurs de la prolactine de tilapia dans des cellules COS. Dans des boîtes de culture de 100 ml, des cellules COS7 confluentes à 80% ont été transfectées en utilisant le même protocole que décrit ci-dessus et 5 mg de clones d'ADN complémentaire par bolte ont été préparés par purification sur une colonne Qiagen. 48 heures après le choc au DMSO, les cellules ont été lavées avec 2 ml de tampon salin, tamponné par du phosphate ( PBS) froid 1 x, fragmentées dans 2 ml de PBS 1 x froid et centrifugées durant 30 minutes à 15.000 g. Les cellules ont été resuspendues dans 0,5 ml de Tris HC1 25 mM, pH 7,5/MgC12 10 mM, lysées dans des tubes Eppendorf durant trois cycles de congélation-décongélation et centrifugées durant 20 minutes à 15.000 g. Le précipité est resuspendu du Tris-HCl 25 mM, pH 7,5/ MgCl2 lOmM et la concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford (1976 Anal. Biochem. 72, 248-254). 10 mg de la préparation membranaire, ont été incubés durant 15 heures à 20'C dans de la BSA 0,1 %/Tris-HCl 25 mM, pH 7,5/MgC12 l0mM, en présence de 21.000 cpm de 125I-tiPRLl88 (33 pM/tube) et différentes concentrations d'hormones non marquées (volume final : 0,4 ml). Les réactions sont stoppées par l'addition de 2 ml de tampon de liaison froid. L'hormone liée est séparée de l'hormone non liée par centrifugation à 3.000 g durant 30 minutes, et le surnageant est éliminé. La radioactivité des culots est comptée en utilisant un spectromètre-gamma commercialisé par LKB Pharmacia. Les paramètres de liaison sont déterminés en utilisant le programme LIGAND (Munson et Rodbard,1980 Anal. Biochem. 107, 220-259). 4) Sépuencaqe de 1'ADN et analvse des séquences. L'ADN double brin est séquencé par la méthode de terminaison de chaîne (Sanger et al. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) en utilisant 1'ADN polymérase T7 (Sequenase, United States Biochemical). La comparaison des séquences est effectuée en utilisant le programme BISANCE (Dessen et al. 1990 Comput. Appl. Biosci. 6, 355-356). 5) Analyse de 1'ARN des récepteurs de la prolactine de tilania. Des transferts de Northern (Northern-blot) d'ARN messager poly(A)+ de tilapias jeunes et adultes, élevés en eau douce ou adaptés durant six jours dans de l'eau saumâtre (20 % de salinité) ont été effectués par électrophorèse dans un gel d'agarose 1 %/formaldéhyde 2,2 M et transférés par capillarité sur des membranes de nylon ( Biodyn Pall) dans du SSC 20 x (SSC x 1 / NaCl 0,15 M/citrate de sodium 0,015 M, pH 7). Après fixation par les ultraviolets, 1'ARN est hybridé selon Church et Gilbert, (1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995) successivement avec une sonde de 0,9 kb correspondant au domaine extracellulaire du récepteur de la tiPRL et avec 1'ADN complémentaire de la ss-actine de truite arc-en-ciel marqué par du [a32P]-dCTP en utilisant le système de marquage de 1'ADN Megaprime (Amersham). L'hybridation de 1'ARN est effectuée à 65'C dans BSA 1% /EDTA 1 mM/NaHP04 0,5 M, pH 7,2/ SDS 7% (34). La membrane est lavée 2 fois à la température ambiante avec une solution de SSC 2 x/SDS 0,1%, puis deux fois à 65 C dans SSC O,1/SDS 0,1 %, puis finalement exposée à -80'C sur des films spéciaux pour rayons X Konica durant 4 à 72 heures. La membrane est alors réhybridée à 45 C avec l'ADNc de la ss-actine de truite arc-en-ciel, comme témoin et lavée deux fois dans SSC x 2/SDS 0,1 % à 45 C, et une fois à 65 C. Les clichés sont lus à l'aide d'un densitomètre utilisant PhosphorImager (Molecular Dynamics). L'expression de 1'ARN messager du récepteur de la tiPRL est déterminée en calculant le rapport entre l'intensité du signal de 1'ARN messager du récepteur de la tiPRL et l'intensité du signal de 1'ARN messager de la p-actine utilisé comme témoin. Ces mesures sont analysées statistiquement en utilisant le test de Duncan. RESULTATS 1) Clonage. Une banque de 1,2 x 106 recombinants primaires a été construite avec des ARN messagers poly(A)+ de reins de tilapias et criblés dans des cellules COS-7 en utilisant le clonage par expression. Cette méthode est basée sur la détection autoradiographique de complexes formés entre un ligand radioactif et son récepteur spécifique. Parmi les 40 pools des 2000 à 2500 clones testés par transfection transitoire, on a trouvé un seul pool, contenant quatre cellules positives ( figure la). Ce pool a été subdivisé en 14 sous-pools contenant environ de 200 à 300 colonies. Deux sous-pools sont positifs et l'un a été à nouveau sousdivisé en 15 sous-pools ( 30-40 colonies) parmi lesquels deux sont positifs. L'un d'eux a été étalé selon la méthode de Wong et al (1985, Science, 228, 810-815) et il s'est avéré qu'il contenait deux clones positifs identiques présentant un insert de 3 kilobases environ. 2) Analyse de la séquence nucléotidipue et de la séquence en acides aminés. L'insert d'ADN complémentaire de séquence SEQ ID N'1 a une longueur de 3000 paires de bases et comprend une région non transcrite du côté 5' de 206 paires de bases et un cadre de lecture ouverte de 1890 paires de base correspondant à la séquence SEQ ID N 2 suivante Met Met Thr Lys Val Gly Glu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Phe Val Pro His Thr Asp Gly Thr His Tyr Ser Leu Pro Gly Lys Pro Thr Glu Ile Lys Cys Arg Ser Pro Glu Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Lys Pro Gly Ser Asp Gly Gly Leu Pro Thr Thr Tyr Ala Leu Tyr Tyr Arg Lys Glu Gly Ser Asp Val Val His Glu Cys Pro Asp Tyr His Thr Ala Gly Lys Asn Ser Cys Phe Phe Asn Lys Asn Asn Thr Leu Ile Trp Val Ser Tyr Asn Ile Thr Val Val Ala Thr Asn Ala Leu Gly Lys Thr Tyr Ser Asp Pro Gln Asp Ile Asp Val Val Tyr Ile Val Gln Pro His Pro Pro Glu Lys Leu Glu Val Thr Val Met Lys Asp Gln Gly Trp Pro Phe Leu Arg Val Ser Trp Glu Pro Pro Arg Lys Ala Asp Thr Arg Ser Gly Trp Ile Thr Leu Ile Tyr Glu Leu Arg Val Lys Leu Glu Asp Glu Glu Ser Glu Trp Glu Asn His Ala Ala Gly Gln Gln Lys Met Phe Asn Ile Phe Ser Leu Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Leu Ile Gln Val Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Ser Thr Ser Tyr Val Lys Val Pro Glu Tyr Leu His Arg Glu Lys Ser Val Trp Ile Leu Val Leu Val Phe Ser Ala Phe Ile Leu Leu Leu Leu Thr Trp Leu Ile His Met Asn Ser His Ser Leu Lys His Cys Met Leu Pro Pro Val Pro Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Lys Gln Leu Leu Lys Ser Gly Lys Ser Asp Glu Val Phe Ser Ala Leu Val Val Ser Asp Phe Pro Pro Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Tyr Met Pro Glu Gln Gln Glu Leu Met Val Asp Lys Gly Lys Asp His Asp Gly Cys Leu Lys Ser Ile Gly Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly Ser Cys Asp Ser Asp Asn Leu Leu Met Asp Lys Ser Gly Ala Pro Lys Glu Glu Gln Gln Gln Gln Asn Gln Glu Gly Asp Gln Ile Gly Lys Glu Thr Gln Gly Pro Lys Glu Ala Trp Glu Lys Glu Ala Met Pro Cys Ala Asn Glu Asp Val Val Ser Pro Asp Ala Ser Ser Glu Lys Val Lys Thr Trp Pro Ser Val Phe Ser Pro Val Thr Pro Tyr Ser Pro Leu Asp Pro His Asn Ser Leu Glu Met His Lys Gln His Cys Leu Ser Asn Thr Gln Phe Pro Pro Gly Ser Pro Ser Ser Asp His Tyr Ile Lys Glu Ala Leu Gln Ser Ser Tyr Trp Glu Val Cys Phe Asn Asn Asn Gln Pro Tyr Pro Gln Thr Glu Val His Pro Gln Leu Gln Ala His Ser Asp Arg Asn Ile Ser Ala Val Asn Asp Arg Asn Ala Pro Thr Gly Leu Leu Leu Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr Val Glu Val Gln Arg Val Asn Glu Glu Asn Lys Val Leu Leu His Pro Ile Pro Ser Gly His Ser Arg Glu Lys Ala Cys Pro Trp Val Gly Gln Arg Asp Asp Tyr Ser Lys Val Lys Gly Val Asp Ser Asp Asn Gly Leu Leu Leu Gln Arg Glu Val Val Glu Glu Glu Ser Met Glu Met Ala Gly Ala Ala Glu Ser Cys Tyr Thr Ser Ser Ile Ala Phe Thr Thr Pro Lys Gln Thr Ala Cys Ser Pro Val Ala Leu Pro Val Gln Asp Glu Arg Val Leu Ala Val Ser Gly Tyr Val Asp Thr Ala Thr Val Phe Ser Val His Thr I1 comprend de plus une région non transcrite du côté 3' longue d'environ 550 paires de base qui présente un signal consensus de polyadénylation (AATAAA) et une queue poly(A). Aucune séquence consensus Kozak n'a été clairement déterminée autour du codon ATG. Ce codon est suivi d'une séquence de 24 résidus qui a toutes les caractéristiques d'un peptide signal. La protéine mature de séquence SEQ ID N 3 comprend ainsi 606 acides aminés et a une masse moléculaire théorique de 68,2 kDa ainsi qu'un point isoélectrique de 5,53. La séquence du récepteur peut être divisée en trois parties: 1. un domaine extracellulaire de 210 acides aminés comprenant 5 cystéines et un motif Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser dont l'importance a été démontrée pour la liaison du ligand et deux séquences consensus (Asn-Xaa-Ser/Thr) qui sont des sites de glycosylation potentiels, 2. un domaine transmembranaire unique de 24 résidus hydrophobes, et 3. un domaine cytoplasmique de 372 résidus, qui est sensiblement plus long que la forme longue des récepteurs de la prolactine des mammifères. La région proximale membranaire contient une région riche en proline ( PPVPGP) appelée Box 1 , qui est hautement conservée parmi la famille des récepteurs aux cytokines, à l'hormone de croissance et à la prolactine et est critique pour la transduction du signal du récepteur de la prolactine. Box 2, une région moins conservée, est aussi présente et contient deux résidus tyrosine. Aucun signal de transduction connu n'a été mis en évidence dans le domaine intracellulaire de ce récepteur. Comme le montre le tableau 1 et les figures 4 et 5, la similitude globale en acides aminés est de 34,8% à 38,4 8 avec les récepteurs de la prolactine d'autres espèces, et de 26 à 28,1 % avec les récepteurs d'hormones de croissance. Cette similitude avec les récepteurs de la prolactine peut être expliquée par une forte identité de séquences dans le domaine extracellulaire ( 49-56,7 %) par rapport au domaine extracellulaire du récepteur de l'hormone de croissance ( 28,9 - 35,8%). De manière surprenante l'identité de séquence entre le domaine intracellulaire du récepteur de la tiPRL et les récepteurs de la prolactine des oiseaux et des mammifères est faible (26,6 - 30,6 %), dans la même gamme que celle trouvée pour le domaine intracellulaire de divers récepteurs de l'hormone de croissance ( 21,8- 23,9 %). 3) ComPétition et analyse de Scatchard. Les membranes ont été préparées à partir de cellules COS-7 transfectées de manière transitoire avec le clone du récepteur de la tiPRL entier et ont été utilisées dans des expériences de liaison (figure 2). La constante d'association (Ka) du récepteur exprimé est de 1,74 109 M 1 en utilisant le 125I-tiPRL188 comme traceur, ce qui est inférieur, de manière significative, à la constante d'association (Ka= 2,3 x 101 M-1) signalée précédemment pour le rein de tilapia. Des hormones de poisson non marquées et de l'oPRL ont été utilisées pour effectuer les courbes de compétition. Comme attendu, l'hormone de croissance de tilapia ne rentre pas en compétition avec le 125I-tiPRLl88, même à des concentrations importantes. Aussi bien le tiPRL177 que l'oPRL sont capables de rentrer en compétition avec le ligand, mais de manière différente de celle observée avec des microsomes de reins de tilapia. 4) Analvse par transfert de Northern de 1'ARN messaaer du récepteur à la Prolactine de tilania. En utilisant une sonde d'ADN complémentaire correspondant au domaine extracellulaire du récepteur, on a déterminé la distribution tissulaire du récepteur de la prolactine de tilapia dans différents tissus de tilapias adaptés à l'eau douce. Comme le montrent les figures 3a et 3b, une bande simple de 3,8 kb a été observée dans tous les tissus où il y a hybridation: les reins, les branchies, la peau, les intestins et les gonades mâles. Aucun transcript n'a été détecté dans le foie ou dans le muscle. Le taux de transcription dans les branchies a été aussi déterminé après des changements de salinité. Dans des tilapias six jours après leur transfert dans des eaux saumâtres, aucune bande additionnelle n'apparaît par rapport aux poissons adaptés à l'eau douce, alors que le taux d'ARN messager codant pour le récepteur à la prolactine du tilapia, décroît de manière significative par rapport au taux d'ARN messager de p- actine. TABLEAU 1 Comparaison des séquences du récepteur de la prolactine de tilapia et des réacteurs de la prolactine et de l'hormone de croissance de divers vertébrés Récepteur de la prolactine de tilapia Domaine Domaine Totalité extracellulaire Cytoplasmique de la molécule RECEPTEURS PFL GH PRL GH PRL GL BOVIN 49,0 28,9 27,7 22,6 34,8 26,7 HUMAIN 51,4 30,5 30,6 22,6 38,1 27,0 SOURIS 52,4 32,9 27,1 21,8 35,7 26,0 LAPIN 56,2 32,1 28,8 23,4 38,1 27,7 POULET 49,0/56,7 35,8 29,3 23,9 38,4 28,1 PIGEON 47,6/55,2 -- 27,4 -- 37,0 --- REVENDICATIONS 1. Récepteur de poisson de la prolactine sous une forme substantiellement pure. 2. Récepteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poisson est du genre des téléostéens. 3. Récepteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le poisson appartient à la famille des cyprinidés. 4. Récepteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le poisson est de l'espèce tilapia. 5. Récepteur selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il présente au moins une partie de la séquence SEQ ID N 3 suivante: His Tyr Ser Leu Pro Gly Lys Pro Thr Glu Ile Lys Cys Arg Ser Pro Glu Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Lys Pro Gly Ser Asp Gly Gly Leu Pro Thr Thr Tyr Ala Leu Tyr Tyr Arg Lys Glu Gly Ser Asp Val Val His Glu Cys Pro Asp Tyr His Thr Ala Gly Lys Asn Ser Cys Phe Phe Asn Lys Asn Asn Thr Leu Ile Trp Val Ser Tyr Asn Ile Thr Val Val Ala Thr Asn Ala Leu Gly Lys Thr Tyr Ser Asp Pro Gln Asp Ile Asp Val Val Tyr Ile Val Gln Pro His Pro Pro Glu Lys Leu Glu Val Thr Val Met Lys Asp Gln Gly Trp Pro Phe Leu Arg Val Ser Trp Glu Pro Pro Arg Lys Ala Asp Thr Arg Ser Gly Trp Ile Thr Leu Ile Tyr Glu Leu Arg Val Lys Leu Glu Asp Glu Glu Ser Glu Trp Glu Asn His Ala Ala Gly Gln Gln Lys Met Phe Asn Ile Phe Ser Leu Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Leu Ile Gln Val Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Ser Thr Ser Tyr Val Lys Val Pro Glu Tyr Leu His Arg Glu Lys Ser Val Trp Ile Leu Val Leu Val Phe Ser Ala Phe Ile Leu Leu Leu Leu Thr Trp Leu Ile His Met Asn Ser His Ser Leu Lys His Cys Met Leu Pro Pro Val Pro Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Lys Gln Leu Leu Lys Ser Gly Lys Ser Asp Glu Val Phe Ser Ala Leu Val Val Ser Asp Phe Pro Pro Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Tyr Met Pro Glu Gln Gln Glu Leu Met Val Asp Lys Gly Lys Asp His Asp Gly Cys Leu Lys Ser Ile Gly Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly Ser Cys Asp Ser Asp Asn Leu Leu Met Asp Lys Ser Gly Ala Pro Lys Glu Glu Gln Gln Gln Gln Asn Gln Glu Gly Asp Gln Ile Gly Lys Glu Thr Gln Gly Pro Lys Glu Ala Trp Glu Lys Glu Ala Met Pro Cys Ala Asn Glu Asp Val Val Ser Pro Asp Ala Ser Ser Glu Lys Val Lys Thr Trp Pro Ser Val Phe Ser Pro Val Thr Pro Tyr Ser Pro Leu Asp Pro His Asn Ser Leu Glu Met His Lys Gln His Cys Leu Ser Asn Thr Gln Phe Pro Pro Gly Ser Pro Ser Ser Asp His Tyr Ile Lys Glu Ala Leu Gln Ser Ser Tyr Trp Glu Val Cys Phe Asn Asn Asn Gln Pro Tyr Pro Gln thr Glu Val His Pro Gln Leu Gln Ala His Ser Asp Arg Asn Ile Ser Ala Val Asn Asp Arg Asn Ala Pro Thr Gly Leu Leu Leu Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr Val Glu Val Gln Arg Val Asn Glu Glu Asn Lys Val Leu Leu His Pro Ile Pro Ser Gly His Ser Arg Glu Lys Ala Cys Pro Trp Val Gly Gln Arg Asp Asp Tyr Ser Lys Val Lys Gly Val Asp Ser Asp Asn Gly Leu Leu Leu Gln Arg Glu Val Val Glu Glu Glu Ser Met Glu Met Ala Gly Ala Ala Glu Ser Cys Tyr Thr Ser Ser Ile Ala Phe Thr Thr Pro Lys Gln Thr Ala Cys Ser Pro Val Ala Leu Pro Val Gln Asp Glu Arg Val Leu Ala Val Ser Gly Tyr Val Asp Thr Ala Thr Val Phe Ser Val His Thr 6.Séquence oligonucléotidique codant pour l'un des récepteurs selon l'une des revendications 1 à 5. 7. ADN selon la revendication 6 codant pour l'un des récepteurs selon l'une des revendications 1 à 5. 8. ADN selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il présente au moins une partie de la séquence SEQ ID N@ suivante: AATTCTGGAT GTTGGCGATA ACCTCGCTGA CAGGACGGCT GAGCTGACCG GCGCGCGCTC CTCTCCTCAG CTGTCGGTGA AACGCGTTAA ATCACAGACA CAGGTCGGTG TCTAAAAGCC GGCTCTCCCG GGAGCCTGCA GCGAAGTCGC TACGGCGGCG GAGACTGAAA AACTTTCGAT CCAGCCCAAC AAGGTTTTGT GGTGCAATGA TGACGAAAGT CGGAGAAGTT CTCCTGCTGT TGTTGCTGCC AGCCTTTGTG CCGCACACAG AGCCAACACA TTATAGCTTA CCTGGCAAGC CCACAGAGAT CAAATGCCGT TCTCCAGAGA AAGAGACCTT CACATGCTGG TGGAAGCCGG GATCTGATGG GGGACTGCCT ACTACATACG CTCTCTACTA TCGAAAAGAA GGTTCTGACG TAGTGCACGA GTGCCCTGAC TACCACACAG CCGGGAAGAA CTCCTGCTTC TTTAACAAGA ACAACACCCT TATCTGGGTC AGCTACAACA TCACCGTGGT GGCCACCAAC GCACTGGGCA AGACCTACTC TGACCCTCAG GATATAGACG TGGTCTACAT TGTCCAGCCC CATCCTCCAG AAAAGCTAGA AGTGACAGTA ATGAAGGATC AGGGCTGGCC CTTTCTTCGA GTGTCTTGGG AACCACCTCG TAAGGCTGAC ACTCGCTCTG GCTGGATCAC TCTAATCTAT GAGCTCCGCG TCAAGTTGGA GGATGAGGAA AGCGAATGGG AGAATCACGC TGCAGGCCAG CAGAAGATGT TTAACATTTT CAGCCTGCGG TCAGGTGGTA CATACCTTAT TCAGGTGCGG TGTAAGCCCG ATCACGGCTT TTGGAGTGAA TGGAGTTCCA CTTC CTAC GT CAAAGTTCCT GAGTATCTCC ATCGGGAAAA GTCTGTCTGG ATCCTCGTTT TAGTCTTTTC TGCCTTCATT TTACTGCTCC TCACATGGCT GATACACATG AATAGCCACA GTCTGAAGCA CTGCATGCTG CCACCAGTCC CAGGGCCTAA AATCAAAGGC TTTGACAAGC AGCTTCTCAA GAGTGGCAAG TCTGACGAGG TGTTCAGCGC ACTGGTGGTG TCTGACTTCC CACCAACCAC GTCTAACTAT GAGGACTTGC TGGTAGAATA CTTAGAAGTG TATATGCCAG AACAGCAGGA ACTGATGGTC GACAAAGGCA AGGATCATGA CGGCTGCCTG AAATCCATAG GCTCGGCATC TGACAGTGAC TCTGGCCGGG GCAGCTGTGA CAGTGACAAT CTGCTGATGG ATAAGAGTGG CGC GC C GAAA GAGGAACAGC AGCAACAAAA TCAGGAGGGA GATCAAATTG GGAAGGAGAC ACAAGGGC C C AAAGAAGC C T GGGAGAAGGA AGC GATGC CA TGTGCTAATG AGGATGTAGT TAGCCCCGAT GCATCAAGTG AGAAGGTTAA GACCTGGCCT TCTGTGTTTT CCCCAGTGAC TCCGTACAGC CCACTGGATC CCCACAACTC ACTTGAGATG CACAAACAGC ATTGCCTTTC TAACACCCAG TTTCCTCCGG GCTCCCCATC CTCAGACCAC TACATCAAAG AGGCTCTCCA ATCAAGCTAC TGGGAGGTCT GCTTTAATAA TAATCAACCT TATCCCCAGA CAGAGGTCCA CCCGCAACTC CAGGC TCACA GCGATCGCAA CATCTCAGCC GTCAACGACA GGAATGCACC CAC TGGTCTG CTGTTGCCCA CCCGGATGAC TGAGTAC GTT GAAGTGCAAA GGGTCAATGA GGAGAATAAA GTGCTTCTCC ATCCTATTCC TTCAGGCCAT AGCCGTGAAA AAGCCTGTCC CTGGGTAGGA CAGAGAGACG ATTATAGCAA AGTGAAAGGG GTAGACAGTG ACAATGGGCT GC TGC TC CAG AGAGAGGTGG TGGAAGAAGA GAGCATGGAG ATGGCTGGAG CAGCCGAGAG CTGCTACACA TCTTCCATCG CTTTTACCAC TCCTAAGCAA ACAGCCTGCA GTCCC GTTGC CCTGCCGGTC CAGGATGAAA GGGTTCTGGC AGTAAGTGGA TATGTCGACA CTGCCACTGT ATTCTCAGTG CACACCTAGT AGACGTGACA GCCCAAACTG GCAGTTGTAG AACGTTGCAA GAGGTGGGGA CTGAGACACA CGAAAAAGCA CTAACACTCC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAT TGCCAAGACA ATGTATATTT ATTTTTTTAT CTTCTTCTCC TGTAAGAGAC A 9. Cellule eucaryote ou procaryote contenant au moins une partie de l'un des oligonucléotides selon l'une des revendications 6 à 8. 10. Procédé d'obtention d'un récepteur selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel un fragment oligonucléotidique selon l'une des revendications 6 à 8 est exprimé dans une cellule. 11. Procédé de détermination chez les poissons de l'activité agoniste ou antagoniste d'un composé, vis-à-vis de la prolactine ou d'une autre hormone consistant à - mettre en contact ledit composé avec des cellules eucaryotes exprimant l'un des récepteurs selon l'une des revendications 1 à 5, - mettre en évidence l'effet dudit composée sur l'activation des cellules par la prolactine. 12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules de mammifères en particulier des cellules COS-7.