Brevet FR2730744A1 — publié le 19960823

L'invention a pour objet un procédé de test d'une substance, ladite substance étant éventuellement active dans le domaine capillaire. Par domaine capillaire, on entend tout ce qui peut avoir trait au cheveu ou au poil d'un individu. Ainsi, par "substance éventuellement active dans le domaine capillaire", ou simplement par la suite dans le texte par "substance", on entend toute molécule ou ensemble de molécules présentant une activité potentielle dans le domaine du capillaire, et en particulier toute molécule ou ensemble de o molécules ayant potentiellement une activité sur la coloration, la survie, le ralentissement, I'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. La substance à tester peut être utilisée selon le procédé de l'invention soit sous sa forme moléculaire, soit sous la forme d'une composition contenant la molécule à tester. A ce jour, I'art antérieur évoque deux méthodes principales pour le test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire. La première consiste à pratiquer les essais sur des sujets volontaires et à constater de manière plus ou moins rapide les effets de la substance testée. Il est évident que cette méthode présente de nombreux désavantages dont en particulier celui de s'adresser à des êtres humains, ce qui à l'évidence limite pour des raisons d'éthique le champ d'application de la méthode. Ainsi le nombre et la qualité des substances testées se trouvent limités. De plus, ces essais sont en général lourds de mise en oeuvre et s'étalent sur des périodes de temps longues. Les résultats du test sont alors dans la plupart des cas des constatations de modifications phénotypiques du follicule pileux. La deuxième méthode connue dans l'art antérieur est celle décrite dans le brevet EP 434 319. Cette méthode consiste à pratiquer les essais suivant un procédé qui fait intervenir quatre étapes dont en particulier une étape d'isolement d'un follicule pileux viable ayant conservé un bulbe intact. Pour cela il s'avère nécessaire de pratiquer une microdissection du follicule pileux, à partir d'un prélèvement effectué sur un sujet. Celuici conserve de toute manière une trace de cette intervention. Cela limite l'approvisionnement en follicule pileux et la mise en oeuvre de la méthode de test est lourde et longue. 2 2730744 Après de nombreux travaux, la demanderesse a pu montrer qu'il est possible d'utiliser dans le domaine du capillaire au moins un follicule pileux épilé pour tester une substance éventuellement active dans le domaine capillaire. L'invention a donc pour objet un procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé par le fait que l'on épile au moins un follicule pileux d'un sujet, que l'on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat pendant un temps suffisant, que l'on met en contact ce follicule pileux épilé avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, que l'on dose un marqueur de l'activité de ladite substance testée et que l'on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. Le follicule pileux utilisé dans le procédé selon l'invention est isolé par épilation. L'épilation consiste en une séparation brutale du follicule pileux et du derme, généralement réalisée par une traction plus ou moins forte exercée sur la tige pilaire du follicule. Le follicule pileux épilé peut être intact, c'est à dire comporter toutes les parties reconnues par l'homme du métier comme le constituant (voir à ce titre "Science des traitements capillaires, Charles Zviak, Masson éditeur, 1987). On citera par exemple, et de manière non limitative, parmi ces parties, la papille dermique, le bulbe pilaire, les gaines épithéliales, la glande sébacée. Mais, bien entendu, I'invention ne se limite pas au follicule pileux épilé intact et concerne également tout follicule pileux épilé qui après isolement n'aurait conservé qu'une portion des parties le constituant. L'épilation pour isoler le follicule pileux est un mode opératoire particulièrement intéressant puisqu'il présente les avantages d'être non invasif et donc non traumatisant pour le sujet, et d'être simple et rapide de mise en oeuvre. Un avantage supplémentaire réside dans le fait que l'épilation peut-être pratiquée par le sujet lui-même et en n'importe quel lieu, ce qui n'ajoute pas pour le sujet de contrainte supplémentaire. Après isolement, le follicule pileux est mis à incuber dans un milieu de culture adéquat contenant éventuellement la substance à tester. Il est bien entendu que la substance à tester peut être ajoutée au milieu d'incubation à n'importe quel moment, c'est à dire avant ou après mise en contact des cheveux épilés avec ledit milieu d'incubation. Ce milieu qui est un milieu nutritif est au moins constitué des éléments nécessaires au maintien en survie du follicule pileux. 3 2730744 Bien entendu, il peut contenir tout autre élément nécessaire par exemple à la croissance du follicule pileux. On peut citer à titre d'exemple comme milieu de culture bien connu de l'homme du métier, le milieu MEM modifié Dulbecco, le milieu Williams E, le milieu F12, le milieu de HAM, ou encore le RPMI1640, vendus par les sociétés Gibco-BRL, Biomed, Boehringer ou encore Sigma. De manière générale, le temps d'incubation est conditionné par le temps qu'il faut au follicule pileux pour répondre à la substance éventuellement active dans le domaine capillaire avec laquelle il est mis en contact, c'est à dire au temps qu'il faut pour voir apparaître une modification du niveau d'expression du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on dose. i5 Ce temps d'incubation peut aller de quelques secondes à plusieurs jours. A titre indicatif, le temps d'incubation est généralement compris entre 5 secondes et 96 heures, et de préférence entre 12 et 24 heures. Par marqueur de l'activité de la substance éventuellement active dans le domaine capillaire testée, on entend selon l'invention, tout élément dont la présence, l'absence, la modification de l'expression ou la modification de la distribution peuvent être mesurées, en réponse à la mise en contact du follicule pileux épilé avec ladite substance à tester. On peut citer à titre d'exemple de marqueur, et sans limitation, protéine ou groupe de protéines liées ou non, ADN, ARN, organite, ion, métal, acide aminé, lipide et composé liposoluble ou polyoside. L'activité de la substance à tester est ainsi représentée par la variation du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on aura choisi de doser. Par variation, on entend toute modification de la quantité, de la concentration, de la répartition du marqueur que l'on dose. Pour cela, le procédé selon l'invention comprend une étape de dosage du marqueur de l'activité de la substance testée. Après incubation, ce dosage peut s'effectuer directement sur le milieu de culture pour les éléments excrétés par la cellule ou dans le follicule pileux pour les éléments non excrétés. 4 2730744 Ainsi, et plus particulièrement dans le cas o l'élément recherché n'est pas excrété, on peut envisager une étape supplémentaire avant le dosage, au cours de laquelle le follicule pileux est broyé, afin de rendre plus accessible le marqueur de l'activité de la substance testée à doser. Bien évidemment, quel que soit le mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, toute méthode de dosage connue par l'homme du métier peut être utilisée. On peut, à titre d'exemple et sans limitation, citer les méthodes de dosage des protéines ou des acides nucléiques par colorimétrie, par électrophorèse, par transcriptase reverse et amplification par la technique des polymérisations en chaîne, la spectrographie de masse, la chromatographie (en phase gazeuse ou sur plaque), méthodes immunologiques, ou encore la microscopie optique ou électronique pour la mesure de la quantité d'un organite. Le résultat du dosage, qui représente la variation du marqueur de l'activité de la substance testée que l'on a choisi de doser, n'est en soi pas exploitable directement. Il ne devient intéressant que dans la mesure o il est comparé au résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute mise en contact du follicule pileux épilé avec la substance à tester. C'est ainsi que le procédé selon l'invention inclut une étape au cours de laquelle on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. L'homme du métier détermine aisément, par habitude, la nature du témoin nécessaire dans la mise en oeuvre du procédé. Un avantage de l'invention est qu'elle procure, dans le domaine du capillaire, une méthode de test d'une substance éventuellement active à la fois simple, rapide et efficace, ne faisant pas intervenir d'étapes invasives. Dans le domaine capillaire, les substances éventuellement actives que l'on cherche à tester sont généralement en relation avec une modification de l'état de la chevelure du sujet et préférentiellement l'état présent ou futur de celle-ci. Généralement, les substances à tester ont éventuellement une influence soit sur la couleur des follicules pileux, soit sur la densité, sur la quantité ou sur la qualité de ceux-ci. Ce sont des substances qui ont éventuellement une influence par exemple sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance, la chute ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. 2730744 Ainsi la présente invention permet de tester des substances éventuellement actives dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, l'arrêt de la croissance, la chute, la coloration ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. Préférentiellement, le procédé selon l'invention permet de tester des substances ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance, la chute ou la coloration des follicules pileux. Si l'on s'en tient au ralentissement, à l'arrêt de la croissance ou à la chute des follicules pileux, la conséquence à terme pour le sujet est une alopécie plus ou moins prononcée, dont on sait qu'elle peut avoir des conséquences esthétiques et psychologiques et sociales pour le sujet atteint. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de tester des substances ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance ou la chute des follicules pileux. Le procédé selon l'invention permet donc de tester des substances éventuellement actives dans le domaine capillaire dans le traitement d'une alopécie. Le terme alopécie recouvre toute une famille d'atteintes du follicule pileux ayant pour conséquence, quelqu'en soit la raison, la perte définitive partielle ou générale des cheveux. On peut citer par exemple l'alopécie androgénétique, I'alopecia areata (la pelade), ou l'alopecia totalis, ou encore l'alopecia universalis. Sans vouloir se lier à une quelconque théorie de l'invention, il semble que certaines alopécies passent par au moins une phase inflammatoire. Une phase inflammatoire de l'alopécie se caractérise, entre autres, par une modification du niveau d'expression de médiateurs de l'inflammation. Ainsi, I'activité d'une substance éventuellement active sur au moins une phase inflammatoire d'une alopécie peut donc être évaluée par le procédé selon l'invention en dosant dans un follicule pileux au moins un des médiateurs connus 6 2730744 de l'inflammation, après incubation du follicule pileux avec ladite substance à tester. Par conséquent, avantageusement, après incubation du follicule pileux avec la substance à tester, le marqueur de l'activité de ladite substance est, dans le procédé selon l'invention, un des médiateurs de l'inflammation. Parmi ces médiateurs, on peut citer les cytokines, dont en particulier l'interleukine 1-a, I'interleukine 1-P, I'interleukine 6, les facteurs de nécrose tumorale-( et D 0o (TNF-x et f), les chémokines comme l'interleukine 8 ou le facteur chimiotactique et activateur des monocytes (MCAF), ou encore d'autres facteurs chimiotactiques responsables du recrutement des cellules lymphocytaires, monocytaires, de Langerhans ou basophiles au niveau du site inflammatoire, tels que les leukotriènes B-4 ou encore d'autres facteurs impliqués de la cascade inflammatoire, tels que l'acide arachidonique ou les prostaglandines, dont en particulier les prostaglandines E2. La demanderesse a en effet trouvé que chez certains sujets, et en particulier chez ceux présentant un début d'alopécie, le taux des interleukines est modifié. Le taux d'interleukine 1-a et d'interleukine 8, et plus particulièrement le taux d'interleukine 1-x, est augmenté chez la plupart des sujets présentant un début d'alopécie. Préférentiellement, le médiateur de l'inflammation à doser dans le procédé selon l'invention est l'interleukine 1-ax et l'interleukine 8, plus particulièrement le taux d'interleukine 1-(a La demanderesse a également trouvé que chez certains sujets présentant une alopécie avancée le taux des prostaglandines E2 est plus élevé que chez d'autres, suggérant une implication de ce médiateur dans la progression de ce désordre. Ainsi un dosage précoce d'une quelconque variation du taux de prostaglandines E2 permet de pronostiquer une aggravation de l'alopécie. Il est alors possible de suggérer un traitement approprié. Ainsi, les prostaglandines E2 sont un autre médiateur de l'inflammation lié à un désordre capillaire que le procédé selon l'invention peut doser. Un des avantages de l'invention est donc de procurer un procédé simple d'évaluation de l'activité d'une substance éventuellement active sur au moins une 7 2730744 phase inflammatoire d'une alopécie, substance qui par la suite pourrait être utilisée dans la préparation d'une composition cosmétique ou d'un médicament en vue de traiter au moins une phase inflammatoire de l'alopécie. Un autre avantage de l'invention est de procurer un moyen simple pour évaluer l'efficacité d'un traitement appliqué à un sujet, en mettant en oeuvre de manière répétitive et régulière à partir d'un follicule pileux épilé dudit sujet le procédé selon l'invention. De plus, le procédé selon l'invention peut permettre d'éviter un traitement contraignant, lourd et coûteux chez un sujet particulier (dont par exemple l'alopécie n'est pas ou n'est plus en phase inflammatoire) ou lorsque le test montre une réponse à cet actif sous la forme d'une hyperproduction de médiateurs inflammatoires (phénomènes d'allergie et ou d'irritation). De plus, le procédé selon l'invention permet d'évaluer l'activité d'une substance qui peut être utilisée pour la préparation d'une composition cosmétique ou d'un médicament en vue de traiter au moins une phase inflammatoire de l'alopécie. A ce titre, la demanderesse a montré, comme on le verra dans les exemples ci- après, que la vitamine D et ses dérivés, et plus particulièrement la 1, 25 dihydroxyvitamine D3, a une activité sur au moins un des médiateurs de l'inflammation lié à l'alopécie. Un autre objet de l'invention est l'utilisation du procédé selon l'invention, pour évaluer l'efficacité d'un traitement appliqué à un sujet. On va maintenant donner à titre d'illustration des exemples qui ne sauraient limiter en aucune façon la portée de l'invention. 8 2730744 Exemple 1: Effet inhibiteur de la vitamine D3 sur la production d'interleukine 1-cc, induite par de l'interleukine 1-P, dans un follicule pileux épilé. Afin de déclencher un processus mimant une phase inflammatoire dans le follicule pileux épilé, ce qui représente l'état du follicule chez un sujet en phase inflammatoire de l'alopécie, on incube au moins un follicule épilé en présence d'interleukine 1-j. Dix cheveux épilés sont prélevés dans la zone du vertex sur un sujet volontaire. Cinq de ces cheveux sont immédiatement mis en incubation dans du milieu William's E (vendu par la société Gibco BRL), milieu additionné (penicillin-G, 100 unités /ml; streptomycine-S, 100 pg/ml, amphotericine 250 ng/ml) et d'interleukine 1-j (recombinante commercialisée par Saxon Biochemicals Gmbh) à raison de 100 ng/ml. Les cinq autres cheveux sont mis en incubation dans le même milieu (additionné d'antibiotique et d'interleukine 1-D) en présence de 1,25 dihydroxyvitamine D3 (France Biochem) à la concentration de 0,1 nM. Après 20 heures d'incubation, les surnageants de culture sont collectés dans un tube puis centrifugés 5 minutes à 14000 tours/minute (Centrifugeuse Eppendorff, modèle 5415C). Les surnageants sont alors collectés dans un tube propre et placés à 4 C. La concentration en interleukine 1-ox est ensuite évaluée sur 100gl de surnageant au moyen d'un kit ELISA Biotrak commercialisé par la société Amersham, suivant les recommandations du fournisseur. Concentration en IL1-oc (en pg/ml) Témoin Témoin +Vit.D3 % Inhibition Sujet n 1 3,8 2,1 44 Sujet n 2 80,7 40,5 50 Sujet n 3 13,8 8,8 36 Sujet n 4 34,7 28,9 17 Sujet n 5 18 12 33 Des analyses statistiques ont été effectuées par comparaisons des médianes par le calcul du t de Student (D.Schwartz: Méthodes statistiques à l'usage des médecins et des biologistes. Flammarion médecine et sciences 1989). 9 2730744 On formule l'hypothèse nulle (H0) comme étant: Témoin + Vit.D3 > Témoin, dans le cadre d'un test unilatéral, tenant compte du fait qu'il s'agit de valeurs appariées. Selon Student pour le t calculé, il y a rejet de H0 au seuil de p = 5%. Ici p = 0,001. Conclusion: puisque H0 est rejetée, on peut conclure au seuil de 5% que les deux populations, (1: Témoin et 2: Témoin + Vit.D3), diffèrent de façon significative, les résultats obtenus pour la population 1 sont significativement supérieurs à ceux obtenus avec population 2. L'expérience montre que la vitamine D3 est un bon inhibiteur de la production d'interleukine 1-ca, dans un système reproduisant les conditions inflammatoires d'un follicule pileux. Par conséquent ce test peut être utilisé pour évaluer les capacités anti- inflammatoires d'autres analogues de la vitamine D3, par l'évaluation de leur capacité à inhiber la production d'interleukine-1-oe. Exemple 2: Effet inhibiteur de la vitamine D3 sur la production d'interleukine 8, induite par de l'interleukine 1-ax, dans un follicule pileux épilé. Quinze cheveux provenant de sujets volontaires sont prélevés dans la zone de la nuque. Ils sont immédiatement incubés dans du milieu William's E commercialisé par la société Gibco BRL additionné de glutamine (2 mM) et d'antibiotiques (penicillin-G, 100 unités/ml; streptomycine-S, 100 gg/ml, amphotérine 250 ng/ml) à raison de 200 gl de milieu par cheveu épilé. Ils sont ensuite divisés en trois lots: Lot n 1: Cheveux incubés dans le milieu William's E mentionné plus haut. Lot n 2: Cheveux incubés dans le milieu William's E mentionné plus haut, additionné d'interleukine 1-ax (Biosource International) à une concentration finale de 25 ou 100 ng/ml (25 ng/ml pour le sujet n 1 ou 100 ng/ml pour les sujets n 2 et 3). 2730744 Lot n 3: Cheveux incubés dans le même milieu que le lot n 2 additionné de 1-25 dihydroxyvitamine D3 à 0.1 nM. Au bout de 20 heures, les surnageants de culture sont collectés dans un tube puis centrifugés 5 minutes à 14000 tours/minutes (Centrifugeuse Eppendorff, modèle 5415C). Les surnageants sont ensuite collectés dans un tube propre et placés à 4 C. La concentration d'interleukine 8 est ensuite évaluée sur 100 Rl de surnageant au moyen d'un kit ELISA Biotrak commercialisé par la société Amersham en suivant les instructions du fabriquant. Lot n 1 Lot n 2 Lot n 3 IL-8 (en pg/ml) % Inhibition Sujet n 1 170 622 251 82 Sujet n 2 300 863 353 91 Sujet n 3 266 657 496 41 Sujet n 4 226 477 356 48 Des analyses statistiques ont été effectuées par comparaisons des moyennes ou des médianes par l'application du test t de Student (D.Schwartz/Méthodes statistiques à l'usage des médecins et des biologistes. Flammarion médecine et sciences 1989). On formule l'hypothèse nulle (H0) comme étant: Lot n 3 > Lot n 2, dans le cadre d'un test unilatéral, tenant compte du fait qu'il s'agit de valeurs appariées. Selon Student pour le t calculé, il y a rejet de H0 au seuil de p = 5%. Ici p = 0,025. Conclusion: puisque H0 est rejetée, on peut conclure au seuil de 5% que les deux lots diffèrent de façon significative, les résultats obtenus pour le lot 2 sont significativement supérieurs à ceux obtenus avec le lot 3. Dans ces 4 cas, on observe une inhibition de la production d'interleukine 8 par la 1-25 dihydroxyvitamine D3. I 2730744 L'IL-8 étant une chemokine inflammatoire induite par l'interleukine 1-oc, I'essai montre que la 1-25 dihydroxyvitamine D3, à 0.1 nM a un effet anti-inflammatoire sur le follicule épilé, incubé en présence d'interleukine 1-oE. Par conséquent ce test peut être utilisé pour évaluer les capacités anti- inflammatoires d'autres analogues de la vitamine D3, par l'évaluation de leur capacité à inhiber la production d'interleukine-8. Exemple 3: Effet inhibiteur du minoxidil sur la production de prostaglandines E2 (PGE2), dans un follicule pileux isolé par épilation. cheveux provenant de trois donneurs alopéciques et de deux donneurs non- alopéciques sont prélevés par épilation, dans la zone du vertex. Ils sont répartis immédiatement en deux lots: Lot n l: 5 cheveux incubés dans du milieu William's E (commercialisé par la société Gibco BRL) additionné de glutamine (2 mM) et d'antibiotiques (penicillin- G, 100 unités /ml; streptomycine-S, 100 tg/ml, amphotericine 250 ng/ml). Lot n 2: 5 cheveux incubés dans le même milieu que précédemment mais contenant en plus du minoxidil à la concentration finale de 10 gtM. Au bout de 18 heures, les épilats de chaque groupe (5 cheveux) sont collectés dans un microtube sous une atmosphère d'argon puis stockés à 80 C. Le jour du dosage, on rajoute 250 ffl de méthanol dégazé dans chaque tube puis chaque échantillon est broyé mécaniquement (10 rotations) à l'aide d'un pilon (tissue grind pestle SZ 20, commercialisé par la société Kontes). Le broyat est ensuite soniqué (20 impulsions d'une seconde; 50% d'amplitude) à l'aide d'un sonicateur "Vibra cell 72 434" (commercialisé par la société Bioblock Scientific). Le broyat soniqué est centrifugé à 4 C à 14000 tours/minutes pendant 10 minutes (Centrifugeuse Eppendorff, modèle 5415C). Le surnageant est ensuite collecté dans un tube propre et lyophilisé pendant une heure. Le lyophilisat est repris dans 60,ul de tampon phosphate pH 7.5 fourni dans le kit Biotrak (commercialisé par la société Amersham). Le contenu en PGE2 de 50,ul de cette préparation est ensuite évalué au moyen du KIT Biotrak selon les indications du fabriquant. 12 2730744 Lot n 1 Lot n 2 PGE2 en pg/ml % Inhibition Donneur#1 (alopécique) 15.2 5.6 63 Donneur #2 (alopécique) 13.7 8.5 38 Donneur #3 (alopécique) 15.7 15.3 2,5 Donneur #4 (non alopécique) 6,2 6,2 0 Donneur#5 (non alopécique) 10,7 11,2 0 Ces exemples montrent qu' in vitro, on est capable, au moyen d'un agent pharmacologique réputé comme favorisant la repousse du cheveu in vivo (i.e. le Minoxidil), de diminuer la quantité de PGE2 produite par les épilats de certains individus alopéciques en phase inflammatoire (donneurs 1 et 2 dans cet exemple). Cette observation peut orienter un traitement au minoxidil in vivo chez ces individus qui répondent au minoxidil in vitro et de façon générale, cette méthodologie peut orienter le choix d'un actif agissant, sur le critère étudié (ici, la production de PGE2) pour un donneur particulier. Inversement cette méthode d'évaluation permet d'éviter un traitement contraignant, lourd et coûteux chez un sujet particulier (exemple du donneur 3) ou lorsque le test montre une réponse à cet actif sous la forme d'une hyperproduction de médiateurs inflammatoires (phénomènes d'allergie et ou d'irritation). 13 2730744 REVENDICATIONS 1. Procédé de test d'une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, caractérisé par le fait que l'on épile au moins un follicule pileux d'un sujet, que l'on incube ce follicule pileux dans un milieu de culture adéquat pendant un temps suffisant, que l'on met en contact ce follicule pileux épilé avec une substance éventuellement active dans le domaine capillaire, que l'on dose un marqueur de l'activité de ladite substance testée et que l'on évalue les résultats du dosage par rapport à un témoin. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le milieu de culture comprend au moins un élément nécessaire au maintien en survie du follicule pileux. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que le milieu de culture comprend au moins un élément nécessaire à la croissance du follicule pileux. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 5 secondes et 96 heures. 5. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le temps d'incubation est compris entre 12 et 24 heures. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur de l'activité de ladite substance testée directement dans le milieu de culture. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur de l'activité de ladite substance testée dans le follicule pileux. 8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait qu'avant le dosage du marqueur de l'activité de ladite substance testée, on procède au broyage du follicule pileux. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le marqueur de l'activité de ladite substance testée est un acide 14 2730744 nucléique, une protéine ou un groupe de protéines liées ou non, un ion, un organite cellulaire, un lipide, ou un polyoside. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance éventuellement active dans le domaine capillaire ayant une influence sur le ralentissement, I'arrêt de la croissance, la chute, la coloration ou encore la pousse exacerbée des follicules pileux. 11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on 0o teste une substance ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, l'arrêt de la croissance, la chute ou la coloration des follicules pileux. 12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence sur le ralentissement, i5 lI'arrêt de la croissance ou la chute des follicules pileux. 13. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une influence dans le traitement de 1' alopécie. 14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dose au moins un des médiateurs de l'inflammation. 15. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dose au moins un médiateur choisi parmi les cytokines, dont en particulier l'interleukine 1-c, I'interleukine 1-P, I'interleukine 6, les facteurs de nécrose tumorale-oc et 13 (TNF-ec et 13), les chémokines comme l'interleukine 8 ou le facteur chimiotactique et activateur des monocytes (MCAF), ou encore d'autres facteurs chimiotactiques responsables du recrutement des cellules lymphocytaires, monocytaires, de Langerhans ou basophiles au niveau du site inflammatoire, tels que les leukotriènes B-4 ou encore d'autres facteurs impliqués de la cascade inflammatoire, tels que l'acide arachidonique ou les prostaglandines, dont en particulier les prostaglandines E2. 16. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dose au moins un médiateur choisi parmi les interleukines. 2730744 17. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dose l'interleukine 1-oc. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que l'on dose I'interleukine 8. 19. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'on dose les prostaglandines. 20. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dose les prostaglandines E2. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance ayant éventuellement une activité sur au moins une phase inflammatoire de l'alopécie. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on teste une substance éventuellement active dans le domaine capillaire permettant de diminuer, voire d'abolir, au moins une phase inflammatoire de l'alopécie. 23. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, pour évaluer l'efficacité d'un traitement appliqué à un sujet.