Brevet FR2724936A1 — publié le 19960329

La présente invention concerne la prévention et le traitement des infections gastriques dues à la bactérie Hélicobacter. Elle a pour objet une protéine de surface nouvellement identifiée et purifiée à partir d'Hélicobacter ainsi que son usage à titre de vaccin. Cette protéine a la capacité de se lier à la lactoferrine d'origine humaine. Hélicobacter pylori est une bactérie gramnégative retrouvée à la surface de la muqueuse gastrique chez l'homme. Cette bactérie est associée à un certain nombre de pathologies gastroduodénales dont elle serait, du moins pour certaines, l'agent pathogène responsable. I1 s'agit en particulier des gastrites aiguës ou chroniques (inflammation de la muqueuse), des ulcères (destruction de la muqueuse), des dyspepsies et de certains cancers tel que 1' adénocarcinome gastrique. A cet égard, il est déjà apparu hautement souhaitable de mettre au point un vaccin pour prévenir et lutter contre les infections à Hélicobacter. Différents antigènes ont déjà été proposés comme agent vaccinal potentiel : il s'agit notamment de l'uréase (WO 90/4030), de la cytotoxine et de la protéine heat-shock (WO 93/18150) et des adhésines. Néanmoins, on prévoit qu'un vaccin anti Hélicobacter, pour atteindre un maximum d'efficacité, devra contenir plus d'un antigène. Il est donc nécessaire de poursuivre l'identification des protéines d'Hélicobacter susceptibles d'être employées à cet effet. On a maintenant mis en évidence dans un extrait membranaire d'Hélicobacter, la présence d'une protéine capable de se lier à la lactoferrine humaine. De manière surprenante, cette protéine est constituée de deux sousunités et peut être reconnue par des anticorps monoclonaux initialement dressés contre le récepteur transferrine de Neisseria meningitidis. C'est pourquoi l'invention a pour objet (i) une protéine d'Hélicobacter sous forme substantiellement purifiée, ladite protéine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 98 kD ou d'environ 70 kD, tel que défini après migration sur gel de SDS-PAGE à environ 10 % de polyacrylamide et susceptible d'être substantiellement purifiée à partir d'un extrait membranaire d'Hélicobacter par chromatographie d'affinité sur une colonne de lactoferrine ; ainsi (ii) qu'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'une infection à Hélicobacter qui comprend à titre de principe vaccinant, au moins une protéine selon l'invention. Par "protéine de 98 ou 70 kD substantiellement purifiée", on entend une préparation de cette protéine dépourvue de la majeure partie des constituants cellulaires d'Hélicobacter. Bien évidemment, des contaminants mineurs ne sont pas exclus. Une protéine selon l'invention peut être obtenue à partir d'Hélicobacter ou être obtenue par voie recombinante par expression du fragment d'ADN correspondant, dans un système hétérologue, bactéries, levures ou cellules de mammifères. De manière avantageuse, une protéine selon l'invention est susceptible d'être obtenue à partir d'H. pylori. Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration. L'invention est illustrée ci-après, en se référant à la Figure 1 qui présente le profil électrophorétique sur gel de SDS-PAGE (polyacrylamide 10 %) d'une préparation éluée d'une colonne de Sépharose 4Blactoferrine, après application d'un extrait membranaire d'H. pylori, tel que révélé au bleu de Coomassie (colonne A) et au nitrate d'argent (colonne B). Les étalons des poids moléculaires sont la phosphorylase B (94 kD), l'albumine bovine (67 kD), l'ovalbumine (43 kD), l'anhydrase carbonique (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine isolé du soja (soybean trypsin inhibitor) (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD). Exemple 1 : Purification du récepteur de la lactoferrine à partir d'H. pylori. 1.1 Culture. A partir d'une souche d'H. pylori n ATCC 43579 (disponible auprès de l'ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD - U.S.A) conservée en glycérol à - 70 C, on ensemence un flacon de 25 cm2 contenant un milieu biphasique. Le milieu biphasique comprend une phase solide constituée de 10 ml de gélose Colombia (bioMérieux) additionnée de 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide constituée de 3 ml de bouillon Trypticase soja (Difco) contenant 20 % de sérum de veau foetal. Les flacons sont placés dans un sac étanche dit "generbag" (BBL) et incubés sous agitation rotative douce à 37 C pendant 48 heures en condition de microaérophilie (8-10 % C02, 5-7 % O2 et 85-87 % N2) obtenu par le System Microaer (BBL). Après 48 heures de culture, une sous-culture est réalisée en ensemençant à partir de cette culture liquide, des boîtes de Pétri contenant un milieu solide gélosé (gélose Colombia additionnée de 6 % de sang de mouton frais). A partir d'une culture obtenue dans un flacon de 25 cm2, on ensemence environ 50 boîtes de Pétri. Ces boites sont placées dans des jarres d'anaréobiose en conditions de microaérophilie obtenues par le système Anaérocult C (Merck). Les boîtes de Pétri sont ainsi incubées pendant 4 jours à 37 C. Les nappes bactériennes sont récoltées par raclage en présence d'un faible volume de PBS (bioMérieux) et par centrifugation. Les germes sont ensuite lavés par du PBS dans le but d'éliminer les résidus de milieu de culture. 1.2 Purification. Le culot bactérien lavé est mis en suspension dans de l'eau distillée et est soumis à une agitation vigoureuse. Cette suspension est centrifugée à 18 000 x g pendant 30 min. On rajoute au surnageant recueilli un certain volume de N-Lauroyl Sarkosine à 25 % (p/v) de façon que la concentration finale en Sarkosyl soit de 0,1 % (p/v). La fraction est placée dans un boyau de dialyse (Spectrum, seuil de coupure 10 000 daltons) et dialysée contre 10 volumes du tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant NaCl 0,15M, EDTA lOmM, Sarkosyl 0,1 %. En parallèle, on prépare une colonne de Sépharose 4B (Pharmacia) sur lequel a été immobilisée de la lactoferrine humaine (Sigma). Le greffage de la lactoferrine sur la résine de Sépharose 4B CNBr se fait selon les recommandations du fabricant. La densité de ligand est d'environ 5 mg de lactoferrine par ml de gel. Le mélange est incubé une nuit à +4'C sous agitation rotative. Le gel est conditionné dans une colonne de 10 ml; après décantation, le gel est lavé par environ 20 volumes de colonne de tampon A (Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant EDTA 10 mM, Sarkosyl 0,1 %, PMSF 100MM (phényl méthyl sulfonyl fluoride Sigma)) contenant du NaCl 0,15M, puis environ 6 volumes de colonne de tampon A contenant du NaCl 0,5M, enfin par environ 6 volumes de colonne de tampon A contenant du NaCl 1M. L'élution est réalisée en appliquant à la colonne le tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant EDTA 10 mM, Sarkosyl 0,05 %, PMSF 100 M et un gradient de guanidine HCl de 0 à 2M. Les fractions éluées dans la gamme de guanidine de 0,75 à 2M sont regroupées. Cette préparation est dialysée contre le tampon Tris-HCl 50mM pH 8,0 et concentrée par évaporation rotative sous vide. 1.3 Analyse de la fraction purifiée. La préparation obtenue après chromatographie d'affinité sur colonne de Sépharose 4B-lactoferrine humaine est analysée par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE à 10 % d'acrylamide, selon la technique de Laemmli, Nature (1970), 227 : 680. Après migration, le gel a été coloré au bleu de Coomassie. Cette coloration comprend plusieurs étapes : (1) étape de fixation : incubation du gel dans une solution de méthanol (50 ml), acide acétique (25 ml), acide trichloroacétique (25 ml) et eau distillée (900 ml) ; (2) étape de coloration : incubation du gel dans un mélange de méthanol : acide acétique : eau (30:10:60) contenant du bleu de Coomassie R250 0,25% (p/v) ; (3) étape de décoloration dans le mélange méthanol : acide acétique eau (30:10:60). Tel que montré à la figure 1, colonne A, cette coloration révèle un certain nombre de bandes, aucune n'étant révélée aux alentours de 100 kD. La préparation obtenue a été analysée par la méthode de coloration au nitrate d'argent. Cette coloration s'effectue sur les protéines transférées préalablement sur nitrocellulose (Schleicher and Schuell BA 0,45), selon la méthode décrite par Kovarik et al, J. Folia Biologica (Praha) 1987, 33 : 253. Tel que montré à la figure 1, colonne B, la révélation au nitrate d'argent a permis de mettre en évidence deux bandes supplémentaires, non révélées par la coloration au bleu de Coomassie. Néanmoins, parmi ces bandes, il n'était pas possible d'indiquer si l'une d'entre elles correspondait au récepteur lactoferrine. Pour surmonter cette déficience, on a eu l'idée à tout hasard, de soumettre une préparation telle que précédemment obtenue à une révélation par immunoaffinité en utilisant des anticorps monoclonaux initialement dressés contre le récepteur transferrine de N. meningitidis. Pour ce faire, une préparation a été soumise à une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, puis transférée sur nitrocellulose. Un gel de SDS-PAGE est préparé comme précédemment et, après électrophorèse, transféré sur nitrocellulose. La nitrocellulose est saturée dans un tampon bloquant (lait écrémé 1% (p/v), NaCl 0,9 % (p/v) dans Tris-HCl 50 mM pH 8), puis incubée dans une solution d'anticorps antirécepteur de la transferrine de N. meningitidis (25 Hg IgG/ml dans du tampon bloquant) pendant 1 heure à 37'C sous agitation, puis lavée 3 fois avec du tampon bloquant et enfin incubée avec un deuxième anticorps (anti-espèce du premier) conjugué à la peroxydase. La nitrocellulose est enfin révélée avec un subtrat précipitant de la peroxydase : le 4-chloro-1-naphtol en présence de H202. De manière surprenante, deux bandes ont été ainsi révélées : l'une ayant un poids moléculaire apparent de 98 000 daltons, l'autre de 70 000 daltons. L'étude aux anticorps monoclonaux permet d'indiquer que ces deux bandes correspondent à deux sous-unités d'un même récepteur alors qu'il est connu que le récepteur lactoferrine de N. meningitidis est un récepteur simple chaîne (Schryvers & BR Morris, Infect. Immun. (1988) 56:1144). Exemple 2 : Composition pharmaceutique destinée à une administration orale. La protéine de 98 ou 70 kD susceptible d'être obtenue comme dans l'exemple 1 peut être encapsulée seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 53). La protéine peut également être encapsulée dans des microsphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit ailleurs (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1989) 146:59). La protéine peut également être incluse dans desliposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes: a practical approach, ed. RRC New, D. Rickwood & B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1). Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est de l'ordre de 1 à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines. Exemple 3 : Composition pharmaceutique destinée à une administration parentérale. La protéine de 98 ou 70 kD susceptible d'être obtenue comme dans l'exemple 1, est adsorbée sur gel d'alumine de façon tout à fait conventionnelle. La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,5 est mise en contact pendant 1 heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré en Al+++. La composition finale de la préparation est la suivante : une protéine selon l'invention 50 pg/ml, Al+++ 250 Hg/ml, merthiolate 1/1000, le tout en PBS. Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées, chacune espacée de 4 semaines de la précédente. REVENDICATIONS 1. Une protéine d'Hélicobacter sous forme substantiellement purifiée, ladite protéine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 98 kD ou d'environ 70 kD, tel que défini après migration sur gel de SDS-PAGE à environ 10 % de polyacrylamide et susceptible d'être substantiellement purifiée à partir d'un extrait membranaire d'Hélicobacter par chromatographie d'affinité sur une colonne de lactoferrine. 2. Une protéine selon la revendication 1, susceptible d'être purifiée à partir d'un extrait membranaire d'H. pylori par chromatographie d'affinité sur une colonne de lactoferrine. 3. Une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'une infection à Hélicobacter qui comprend à titre de principe vaccinant une protéine selon la revendication 1 ou 2.