Brevet FR2729759A1 — publié le 19960726

La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque, effectué par chimiluminescence. L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardio-vasculaire dans le monde. Dans tous les cas, le traitement instauré a pour but de protéger le tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens thérapeutiques, comme les thrombolytiques ou l'angiopiastie de première intention, permettent aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à limiter la taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la morbidité. Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les cliniciens confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques de plus en plus performants. Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde et pour l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion. On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T. La troponine I cardiaque est une protéine contractile exclusivement présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271, p. 31-35 ; Wade R. et al, Genomics (1990), 7, p. 346-357]. Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium, l'activité ATPasique du complexe actine-myosine et donc d'empêcher la contraction musculaire [Perry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593617] Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de lune des artères nourricières du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose myocardique qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération de la troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur très spécifique de l'infarctus du myocarde. Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le diagnostic précoce de I'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981), 110, p. 1334-1344 Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278]. De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut être associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort subite. Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que l'apparition de ces complications était très souvent précédée de micro-infarctus cardiaques [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708]. Le dosage de la troponine I cardiaque semble donc être particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les patients atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des microinfarctus. Par ailleurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou l'échec de la reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en chirurgie cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la troponine I trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes cardiaques après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques utilisant par exemple des anthracyclines. On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin. Chem. (1993), 39/6, p. 972-979] décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H2O2. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 ugil. Un autre procédé immunoenzymométrique de la troponine I décrit par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 ug/l [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38/11, p. 2203-2214 ; Adams J. et al, Circulation (1993), 88(1), p. 101-106]. Ce dosage utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm. Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après le début des manifestations cliniques de l'infarctus du myocarde [Adams J. et al, Circulation (1993), 88(1), p. 101-106]. Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des méthodes très sophistiquées et difficiles à mettre en oeuvre, par exemple des dosages basés sur la mesure de la radioactivité [Am. Heart Journal, (June 1897), 113(6), p. 1333 1334]. On sait aussi que des dérivés cycliques d'hydrazines, notamment les diacylhydrazines, peuvent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 57, p. 409-423]. L'utilisation de ces réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosages immunoenzymatiques [Thrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 13351341 ; Thrope G.H.G. et al, Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353]- Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à de multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles (affinité des différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps, marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un choix adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose.Il est évident que l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de la mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le rapport signal/bruit de la mesure est trop petit. Or justement ce bruit de la mesure dépend des différents réactifs et conditions de dosage choisis. I1 a été maintenant trouvé qu'il était possible, en utilisant un certain type de substrat pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage de la troponine I avec une très grande sensibilité. En effet, en appliquant le procédé de l'invention il est possible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5 ng/l, ce qui représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des procédés immunoenzymométriques de la troponine I les plus sensibles connus jusqu'à présent. La présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque caractérisé en ce que le substrat utilisé pour la révélation enzymatique est un substrat chimiluminescent, choisi parmi un grand nombre de substrats chimiluminescents. La présente invention a plus précisément comme objet, un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux antitroponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps ont, soit naturellement, soit par coopérativité une grande affinité pour la troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. et - qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine. En effet, la présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type sandwich de la troponine I cardiaque, caractérisé en ce que l'on met en contact les échantillons à doser ou les standards avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un autre anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, ces anticorps monoclonaux, soit naturellement, soit par effet de coopérativité, ayant pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M, puis que l'on effectue la révélation enzymatique par addition d'un substrat chimiluminescent choisi et ensuite que l'on procède à la lecture directe du signal lumineux obtenu. Le procédé de l'invention peut être réalisé soit par un système manuel (kit de dosage de diagnostic) soit par un système automatisé. Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un temps, soit un dosage en deux temps. Pour le dosage en un temps, les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide. Après incubation, on procède à la révélation enzymatique. Cette dernière est effectuée selon l'invention par addition d'un substrat chimiluminescent. La quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. Pour le dosage en deux temps, on met en contact les échantillons à doser ou les standards, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis après incubation avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide et ensuite on incube de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un éventuel lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau. Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage, puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par addition d'un substrat chimiluminescent. La quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau. Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la troponine I cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser tout couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la troponine I cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre 10 M) lorsque la troponine I cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps. De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux llE12 et 8E1 de souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de manière surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal llE12 "bloque" la libération de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en évidence en utilisant le système BIACORE de PHARMACIE, et en mesurant les constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I cardiaque (cTnI) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de l'anticorps llE12. Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I. TABLEAU I AcM 8E1 : AcM 8E1 : cTnI seule cTnI + 11E12 CONSTANTE CINETIQUE DE DISSOCIATION 3,2.10-3 2.8.10-4 koff (s-1) CONSTANTE CINETIQUE D'ASSOCIATION 5,8.105 4,5.105 Ion (t'xS-l) s1) CONSTANTE DE DISSOCIATION A L'EQUILIBRE 5,7.10-9 0,6.10-9 koff / kon (M) Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1, l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence de l'anticorps monoclonal llE12. Plus précisément, la constante de dissociation à l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne varie pas). Il existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux anti-troponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de "blocage" de la dissociation du complexe il est possible de réaliser le procédé de dosage immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps monoclonaux. Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la phosphatase alcaline soit la peroxydase. On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou 11E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal llE12 avec la peroxydase et des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline. Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-troponine I cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques (notamment ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque (dosage automatisé). Les conjugués anticorps monoclonal antitroponine I - marqueur enzymatique sont préparés selon les méthodes connues [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p. 1084-1091]. La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée selon des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunologi- cal Methods, (1979), 31, p. 231-236]. Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des standards avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque et/ou un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le pH doit notamment être compris entre 5 et 6, plus précisément entre 5,4 et 5,7. Pour ajuster le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide succinique ayant un pH de 5,2 à 5,4. L'incubation entre le plasma ou le serum et les anticorps anti-troponine I ou les standards, est effectuée entre 200C et 370C et le temps d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes. Après incubation on procède à un ou plusieurs lavages qui sont effectués de préférence à une température inférieure à 100C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentielle une solution de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tris pH 8. Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat luminescent on utilise un dérivé de diacylhydrazine plus spécialement le luminol [5-amino-2,3dihydrophtalazine-1,4-dione]. Des substrats luminescents contenant du luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le Lumi-Phos (R) 530 commercialisé par Boehringer Mannheim, le luminol ECL-immunoessai signal reagent RPN 190 commercialisé par Amersham ou le luminol BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950 commercialisé par Boehringer Mannheim. On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de 4-iodophénol. La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température comprise entre 200C et 370C. La lecture de la chimiluminescence est effectuée de préférence après environ 2-10 minutes. Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque humaine purifiée [Larue C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979]. L'invention concerne aussi l'utilisation du luminol comme substrat chimiluminescent pour le dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps (soit naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-a M. L'invention a également pour objet un kit de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent l'invention. RsexPLE I Dosage de la troponine I cardiaque avec un nyst-e automatisé Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Accès s immuoessay, système commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur. Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du dosage sont introduits 50 pl de l'échantillon à doser, 25 iil dune solution d' immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 ul d'une solution d'acide succinique 0,1 M, 50 pl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 8El-phosphatase alcaline (C = 5 ug/ml). Après incubation pendant 5 minutes à 370C sont introduits 50 ul de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI-070/60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux antitroponine I cardiaque de souris lue12. Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 370C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à laide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8. On ajoute ensuite 200 p1 de substrat Lumi-Phos (R) 530. La révélation est effectuée à 370C et on mesure la luminescence générée par la réaction avec un luminomètre. Le temps total d'analyse est de 15 minutes. Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine purifiée. On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 pg/l. La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est de 3,5 ng/l. tr LE Il Dosage de la troponine I cardiaque avec un kit ise- zynt ique Dans des tubes en polystyrène revêtus d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, on introduit 150 pl d'une solution tampon succinate contenant du Tween 20 à 0,2 %, des immunoglobu lines de souris non spécifiques et 0,1 % de Rathon, 50 pl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris llE12-peroxydase, et 200 pl d'échantillon à doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage. Pour la gamme étalonnage on utilise du sérum humain contenant de 0 à 2 Wg/l de troponine cardiaque humaine purifiée. On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante - on renverse le contenu des tubes dans un récipient et on éponge les tubes sur un papier absor bant, - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6,8 contenant du Tween 20 à 0,1 % et 0,3 % de Kathon, en maintenant la température au plus à 80C. On répète cette étape 3 fois. Après avoir procédé au lavage et éliminé toute trace de la solution utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 300 pi d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent ELISA reagent Boehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée. On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30 secondes ou exactement 10 secondes. La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/l. Les valeurs des rapports signal/bruit de la mesure (S/B) obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/6 p. 972-979] sont données dans le Tableau II ciaprès. TABLEAU II Concentration en Procédé de l'exemple Procédé décrit Troponine I cardiaque par Larue et al 100 ng/l S/B = = 11,6 S/B = = 2,0 10 ng/l S/B = = 1,6 S/B = 0 (S=B) Les valeurs des rapports signal/bruit de la mesure obtenue en appliquant le procédé de l'invention prouvent sa grande sensibilité et sa spécificité. REVENDICATIONS Procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque caractérisé en ce que l'on met en oeuvre deux anticorps monoclonaux antitroponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-S M, de préférence égale ou inférieure à 10- M et que l'on utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine. 2-Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes a- les échantillons sont mis en contact avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, b- la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, c- la quantité de la troponine I cardiaque est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. 3-Procédé selon les revendications 1 ou 2 comprenant les étapes suivantes : a- les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque fixé éventuellement à un support solide, b- le mélange réactionnel est incubé, c- puis lavé, d- la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé d'une diacylhydrazine, e- la quantité de la troponine I cardiaque présente dans des échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. 4-Procédé selon les revendications 1 ou 2 comprenant les étapes suivantes a- les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis après incubation avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, et incubés de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide puis après incubation et lavage éventuel, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et incubés à nouveau, b- le mélange réactionnel est ensuite éventuellement lavé, c- la révélation enzymatique est effectuée par addition d'une diacylhydrazine, d- la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou dans les standards est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. 5-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le substrat chimiluminescent est le luminol. 6-Procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les anticorps anti-troponine I, sont les anticorps monoclonaux de souris llE12 et 8E1. 7-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le marqueur enzymatique couplé à l'anticorps monoclonal anti-troponine I, est la phosphatase alcaline ou la peroxydase. 8-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique est le conjugué anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque de souris llE12-peroxydase. 9-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 4 caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique est le conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 8El-phosphatase alcaline. 10-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le substrat chimiluminescent est un mélange de luminol et de 4-iodophénol. ll-Procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la mise en contact des échantillons à doser ou des standards, avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et éventuellement à un deuxième anticorps anti-troponine I, est effectuée à un pH légèrement acide compris entre 5 et 6, de préférence entre 5,4 et 5,7. 12-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les solutions de lavage utilisées avant révélation ont un pH égal à 6,8-8 et une température inférieure à lO0C. 13-Utilisation du luminol comme substrat chimiluminescent pour le dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M. 14-Kit de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol.