Brevet FR2722799A1 — publié le 19960126

L'invention a pour objet un procédé d'amplification d'une séquence d'acide nucléique utilisant un nucléoside triphosphate avec une base purique ou pyrimidique modifiée qui se trouve incorporée dans les brins d'acide nucléique néosynthétisés lors de l'opération d'amplification. A l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement la base modifiée, il est possible de détecter et/ou de quantifier le produit d'amplification. En outre, le produit d'amplification peut être utilisé dans la préparation de multimères contenant plusieurs copies de la séquence amplifiée avec base modifiée, et contenant en outre au moins une séquence spécifique d'une séquence d'intérêt. Un tel multimère peut être utilisé pour la détection et/ou la quantification d'une séquence polynucléotidique quelconque, avec amplification du signal. On sait que les méthodes d'amplification in vitro par voie enzymatique ont pour but notamment d'obtenir un grand nombre de copies d'une séquence d'un polynucléotide présent dans un échantillon en faible quantité, sans qu'il soit nécessaire d'isoler et de cloner ledit polynucléotide. La méthode d'amplification par voie enzymatique qui a été décrite en premier est l'amplification en chaîne par polymérase, plus connue sous la désignation PCR (Polymerase Chain Reaction). Dans cette méthode, on utilise deux amorces oligonucléotidiques dont chacune est complémentaire d'un segment d'un des brins d'un DNA contenant la séquence à amplifier, de telle sorte que lesdits segments encadrent ladite séquence. Après chauffage pour dénaturer le DNA les amorces s'hybrident avec leur séquence complémentaire et, en présence d'une DNA polymérase thermostable et de nucléosides triphosphates en excès, un brin de DNA, complémentaire du brin matrice est synthétisé par élongation à partir de l'extrémité 3' de l'amorce hybridée. Le mélange est alors dénaturé à nouveau par la chaleur, et au refroidissement les amorces s'hybrident sur les brins de DNA présents à l'origine ou nouvellement synthétisés, une nouvelle élongation des amorces a lieu, et ainsi de suite. Ces cycles successifs d'appariement des amorces, d'élongation et de dénaturation conduisent à un doublement du nombre de copies de la séquence d'intérêt à chaque cycle. Une méthode analogue à la PCR, dite RT-PCR consiste à utiliser comme produit de départ à amplifier un RNA, la méthode comportant alors une étape préalable de transcription inverse du RNA en DNA complémentaire. Cette méthode est utile notamment lorsque la cible est le génome d'un rétrovirus ou lorsqu'on utilise comme cible un RNA messager pour éviter d'amplifier les introns. Diverses autres méthodes d'amplification ont été décrites, et notamment celles qui consistent à utiliser une amorce contenant une séquence de promoteur de RNA polymérase, de façon à obtenir par élongation un double brin de DNA dont la transcription en présence de RNA polymérase conduira à l'obtention de plusieurs dizaines de copies, sous forme de RNA transcrit qui peut entrer dans le cycle d'amplification. La méthode comprend une transcription inverse du RNA pour former un hétéroduplex DNA-RNA, puis la dénaturation de l'hétéroduplex formé, I'hybridation d'une amorce sur le brin de DNA et l'élongation de l'amorce, suivie de la transcription du double brin obtenu, et ainsi de suite. Les brins de RNA formés précédemment peuvent chacun donner naissance à un double brin de DNA qui pourra à son tour être transcrit. L'un des inconvénients des méthodes précédentes est la nécessité de dénaturer les duplex. Cette opération qui se fait généralement à température supérieure à 900C, nécessite l'emploi d'enzymes thermostables. Pour éviter les étapes de dénaturation, on a imaginé des méthodes d'amplification pouvant être mises en oeuvre de façon isotherme. Une méthode isotherme consiste à partir d'une séquence cible de RNA et d'une amorce de DNA. A l'aide d'une transcriptase inverse, on obtient un hétéroduplex RNA-DNA. Par l'action d'une ribonucléase, on hydrolyse le RNA. Le DNA simple brin est transformé en double brin par élongation d'une amorce appropriée en présence d'une DNA polymérase. Le DNA double brin obtenu peut alors être transcrit et on obtient ainsi plusieurs copies du RNA cible qui peuvent à leur tour entrer dans le cycle d'amplification. Une autre méthode isotherme consiste à utiliser le phénomène de déplacement de brin à l'aide de deux amorces capables de s'hybrider avec un même brin d'acide nucléique cible : le produit d'élongation d'une première amorce situé du côté 5' par rapport à une seconde amorce, déplace le produit d'élongation de la seconde amorce qui est ainsi libéré sous forme de monobrin, tandis que le produit d'élongation de la première amorce forme un duplex avec le brin cible de départ. Le monobrin ainsi formé peut à son tour entrer dans un cycle d'amplification à l'aide d'un système analogue de deux amorces. En outre, la première amorce peut contenir du côté 5', par rapport au site de reconnaissance de la cible, un site de reconnaissance pour une RNA polymérase ou pour une enzyme de restriction, ce qui permet d'utiliser différentes voies pour le cycle d'amplification; voir EP-054 3612. Tous les spécialistes du domaine estiment que les techniques d'amplification sont appelées à jouer un rôle considérable, notamment dans le diagnostic des infections ou contaminations bactériennes ou virales. I1 existe donc un besoin de techniques simples et rapides permettant une évaluation quantitative des produits d'amplification, pour remplacer les techniques d'électrophorèse sur gel et de transfert sur membrane (blotting). Les techniques les plus sensibles actuellement consistent à utiliser un nucléoside triphosphate modifié, à savoir un désoxyuridine triphosphate (dUTP) biotinylé ou un dUTP lié à la digoxigénine. Les produits d'amplification contenant le nucléotide modifié sont détectés ou quantifiés par un conjugué avidine-enzyme dans le premier cas et par un anticorps monoclonal anti-digoxigénine dans le second cas. On a maintenant découvert qu'il est possible de mettre en oeuvre les méthodes d'amplification en utilisant un nucléoside triphosphate, ou NTP (NTP désignant ici aussi bien un désoxyribonucléoside triphosphate qu'un ribonucléoside triphosphate) dont la base purique ou pyrimidique est modifiée par une substitution simple telle qu'une substitution par un groupement méthyle, hydroxyméthyle ou acétyle. On a découvert que les NTP modifiés sont utilisables par les polymérases pour synthétiser in virro de nouvelles copies d'une matrice nucléotidique, sans perte d'efficacité. Avec des anticorps qui reconnaissent spécifiquement un nucléoside à base modifiée et qui ne reconnaissent pas un nucléoside contenant ladite base sous forme non modifiée, on peut ainsi détecter une séquence d'intérêt amplifiée dans laquelle le nucléoside modifié a été incorporé. En outre, de façon surprenante, la technique de détection avec des anticorps dirigés contre ces nucléosides modifiés particuliers est, comme on le verra dans la partie expérimentale ci-après, nettement plus sensible que les techniques de détection classique à l'aide d'un conjugué avidine-enzyme (dans le cas d'utilisation d'amorces biotinylées) ou à l'aide du système digoxigénine/anticorps anti-digoxigénine. L'invention a donc pour objet un procédé d'amplification, par voie enzymatique, d'une séquence nucléotidique, dans lequel on met en contact un polynucléotide contenant ladite séquence, des amorces oligonucléotidiques, les nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates contenant les diverses bases puriques et pyrimidiques nécessaires à la synthèse du produit d'amplification, et un système enzymatique ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA polymérase et/ou de transcriptase inverse, dans des conditions permettant d'effectuer, de façon connue en soi, une amplification de ladite séquence d'intérêt, caractérisé par le fait que l'un desdits nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates est présent soit sous une forme modifiée, soit à la fois sous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base pyrimidique ou purique est substituée par au moins un groupement méthyle, hydroxyméthyle ou acétyle. L'invention a également pour objet un procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique, et de détection et/ou de quantification du produit d'amplification, dans lequel, on met en contact un polynucléotide contenant ladite séquence, des amorces oligonucléotidiques, les nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates contenant les diverses bases puriques et pyrimidiques nécessaires à la synthèse du produit d'amplification, et un système enzymatique ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA polymérase et/ou de transcriptase inverse, dans des conditions permettant d'effectuer, de façon connue en soi, une amplification de ladite séquence d'intérêt, caractérisé par le fait que l'un desdits nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates est présent soit sous une forme modifiée, soit à la fois sous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base pyrimidique ou purique est substituée par au moins un groupement méthyle, hydroxyméthyle ou acétyle, et que, l'on détecte et/ou quantifie le produit d'amplification, selon des méthodes connues en soi, à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement ledit nucléoside modifié et ne reconnaissant pas ledit nucléoside non modifié. L'amplification peut être effectuée par toute méthode connue basée sur l'élongation d'amorces pour synthétiser un DNA double brin, un DNA complémentaire, ou pour synthétiser un RNA transcrit. On peut utiliser par exemple des méthodes d'amplification qui ont été décrites ci-dessus, et dont les détails de mise en oeuvre, qui sont bien connus, ne seront pas rappelés ici. Parmi les nucléosides modifiés, on peut citer notamment la 5-méthyl cytidine, la N4-acétyl cytidine, la 3-méthyl cytidine, la N6-méthyl adénosine, la N6,N6-diméthyl adénosine, la 1-méthyl guanosine, la N2-méthyl guanosine, la N2,N2-diméthyl guanosine, la 7-méthyl guanosine, la 3-méthyl uridine, la 5-hydroxyméthyl uridine, et la 1-méthyl inosine. Les triphosphates de ces nucléosides modifiés sont connus ou peuvent être préparés selon les méthodes connues. Les anticorps capables de reconnaître spécifiquement ces nucléosides modifiés peuvent être préparés selon les méthodes connues. Il s'agit de préférence d'anticorps monoclonaux. Certains de ces anticorps ont déjà été décrits ; voir C. Reynaud et al., Cancer Letters, 255-262 (1991). Lors de la préparation des anticorps monoclonaux, on a constaté qu'il est possible, de façon générale, d'obtenir des anticorps reconnaissant spécifiquement le nucléoside modifié. C'est ainsi que, par exemple, dans le cas des anticorps anti-5-méthyl cytidine, on a observé qu'environ 3 % des clones d'hybridomes testés sécrétaient des anticorps spécifiques reconnaissant la 5-méthyl cytidine et ne reconnaissant pas la cytidine. De même, dans le cas des anticorps anti-7-méthyl guanosine, 4 % des clones d'hybridome testés sécrétaient des anticorps reconnaissant le nucléoside modifié, mais pas la guanosine. Il résulte des études effectuées que le nucléoside triphosphate peut être utilisé au même titre que le nucléoside correspondant modifié dans l'élongation d'une amorce nucléotidique. Lorsque la séquence à amplifier ne contient qu'une faible proportion du nucléoside que l'on souhaite remplacer par l'incorporation du phosphate nucléosidique modifié, il est possible en principe d'utiliser le nucléoside triphosphate considéré sous forme modifiée uniquement. Toutefois, lorsque le nucléoside considéré est présent en plusieurs positions voisines dans la séquence à amplifier, l'incorporation du nucléoside triphosphate modifié seul peut s'avérer difficile. C'est pourquoi il est préférable en général d'utiliser, pour le nucléoside considéré, un mélange de la forme modifiée et de la forme non modifiée. La proportion de nucléoside triphosphate modifié par rapport à la proportion totale du nucléoside modifié et du nucléoside correspondant non modifié, peut varier généralement de 10 à 100 Sc en moles et en particulier de 20 à 75 % en moles. Bien entendu, lorsqu'on utilise un mélange de nucléoside modifié et de nucléoside non modifié, le produit d'amplification contiendra une proportion variable du nucléoside correspondant sous forme modifiée et sous forme non modifiée, cette proportion dépendant de la nature de la composition de la séquence à amplifier et des proportions de triphosphates (modifié et non modifié) présents lors de l'amplification. On a constaté que, pour une séquence à amplifier donnée, et pour une proportion donnée de triphosphates modifié et non modifié, les proportions respectives de nucléosides modifiés et non modifiés dans le produit d'amplification sont sensiblement constantes. Il en résulte que la détection du produit d'amplification à l'aide d'anticorps spécifiques du nucléoside modifié permet aussi une quantification. Pour détecter les produits d'amplification, on utilise les anticorps spécifiques mentionnés ci-dessus. On a constaté que les anticorps préparés par immunisation à l'aide des nucléosides modifiés, conjugués à une protéine, sont capable de reconnaître le nucléoside modifié incorporé dans un brin de DNA ou de RNA. Les anticorps peuvent être utilisés sous la forme d'anticorps marqués avec un agent traceur, par exemple avec une enzyme telle que peroxydase ou phosphatase alcaline, ce qui permet une révélation avec formation d'un produit coloré, selon les méthodes connues. La révélation de la fixation de l'anticorps spécifique sur le produit d'amplification peut également être faite avec un anticorps marqué anti-immunoglobuline, de façon connue. Par exemple si l'anticorps monoclonal utilisé est une IgG de souris, on utilisera pour la révélation un anticorps marqué anti-IgG de souris. La révélation et éventuellement la quantification à l'aide d'anticorps sont des opérations bien connues dont les détails de mise en oeuvre ne seront pas rappelés ici. Par ailleurs, en utilisant des amorces d'amplification liées, de façon connue, à un ligand (par exemple la biotine), il est possible d'effectuer la détection et/ou la quantification sur plaque de microtitration sur laquelle a été fixé un anti-ligand correspondant (par exemple l'avidine). Le procédé de l'invention peut donc être utilisé notamment dans le domaine du diagnostic médical ou dans le domaine agro-alimentaire, dans la recherche d'infections ou de contaminations bactériennes ou virales. Un autre intérêt du procédé d'amplification est qu'il conduit à des produits pouvant servir à la fabrication de multimères utilisables comme agents d'amplification de signal dans les méthodes d'hybridation à l'aide de sondes nucléiques. Le principe de l'amplification de signal est connu. Lorsque le nombre de copies du polynucléotide cible est faible, on peut, au lieu de multiplier par amplification le nombre de copies de la cible, utiliser une sonde de détection comprenant une quantité importante d'agent traceur, d'où une amplification de signal. La sonde de détection spécifique d'une cible à détecter, est greffée à un polymère sur lequel sont fixés plusieurs motifs contenant l'agent traceur. Des exemples de réalisation de multimères utilisables comme réactifs d'amplification de signal sont décrits notamment dans les demandes de brevet EP-0317077, EP-0450594, etc. Dans le cas où l'on souhaite utiliser le produit d'amplification obtenu selon le procédé d'amplification de la présente demande comme réactif d'amplification de signal, il convient de réaliser un multimère comprenant une pluralité de motifs constitués par le produit d'amplification et au moins un motif polynucléotidique capable de s'hybrider avec un polynucléotide d'intérêt. Dans ce cas, la séquence du produit d'amplification peut être quelconque : il suffit qu'elle ne soit pas capable de s'hybrider avec le polynucléotide cible. On peut réaliser le réactif amplificateur de signal par exemple sous la forme d'un polymère portant en ramification une pluralité de séquences nucléotidiques dans lesquelles est incorporé le nucléoside modifié. On peut préparer de façon connue des polymères portant des ramifications en fourchette, en peigne, etc. ; voir par exemple les demandes de brevet mentionnées ci-dessus. Le réactif d'amplification de signal contenant ainsi de nombreuses molécules du nucléoside modifié, la détection à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement le nucléoside modifié, conduira à l'obtention d'un signal d'intensité élevée. L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un produit d'amplification pouvant être obtenu selon le procédé d'amplification décrit ci-dessus. Cette utilisation consiste en la préparation, de façon connue en soi, d'un multimère comprenant une pluralité de motifs constitué par ledit produit d'amplification et au moins un motif polynucléotidique capable de s'hybrider avec un polynucléotide d'intérêt. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps dans la détection et/ou la quantification, selon une méthode connue en soi, d'un produit d'amplification obtenu selon le procédé décrit précédemment, ou dans la détection et/ou la quantification, selon une méthode connue en soi, d'un multimère pouvant être obtenu comme décrit ci-dessus, ledit multimère étant hybridé avec ledit polynucléotide d'intérêt. Cette utilisation est caractérisée par le fait que l'anticorps utilisé est un anticorps capable de reconnaître le nucléoside modifié sans reconnaître le nucléoside correspondant non modifié. L'exemple suivant illustre l'invention. EXEMPLE J : Amplification du génome du virus d'Epstein-Barr (EBV) a) Amorces On a synthétisé deux amorces situées aux extrémités d'un segment de 186 paires de bases choisies dans la région BamHIW du génome d'EBV qui est une région hautement conservée parmi les différentes souches d'EBV. Chaque amorce a été biotinylée à l'extrémité 5' lors de la synthèse selon la méthode décrite par P.R. Langer et al., P.N.A.S. USA Vol. 78 n0 11,6633-6637(1981). Les séquences des amorces sont les suivantes Amorce 1 1: 5' 7 "ITT GTC CCC ACG CGC GCA TA 3' Amorce 2 2:5' AGG TGG CGT AGC AAC GCG AA 3' La position de ces amorces par rapport à la région BamHIW du génome d'EBV est décrite dans l'article de R. Griffais et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, nO 14, 3887-3891 (1991). b) Préparation de la matrice de DNA On utilise des cellules de lymphome de Burkitt de la lignée Namalwa, qui possèdent le DNA d'EBV intact dans un chromosome ; voir Matsuo et al., Science 226, 1322-1325 (1984) et Gargano et al., Genes Chrom. Cancer 4 205-210 (1992). En fait, il a été montré que deux génomes d'EBV sont intégrés sur un site connu du chromosome 1; voir Lawrence et al., Cell 52, 51-61(1988). Les cellules sont lysées par la soude de façon connue. Des dilutions en série des lysats cellulaires sont préparées et utilisées comme matrices pour l'amplification selon la méthode PCR. c) Amplification Des fractions aliquotes de lysats cellulaires (10 microlitres) sont ajoutées à 100 ttî d'une solution tampon contenant 50 mM KCl, 10 mM HCl (pH 8,4)1,5 mM MgCl2, 100 llg/ml de gélatine, 200 pLM de chacun des nucléosides triphosphates dATP, dTTP et dGTP, 40 RM de dCTP, 40 ttM de 5-méthyl dCTP (ci-après : 5-MedCTP) (Boehringer Mannheim) 0,5 I1M de chaque amorce et 1 unité de Taq polymérase. On utilise un appareil thermocycleur Perkin-Elmer 180. Les cycles sont programmés de la façon suivante - 1 cycle consistant en 10 minutes à 990C, 2 minutes à 62"C et 2 minutes à 720C, - puis 35 cycles consistant en 30 secondes à 95"C, 1 minute à 62"C et 2 minutes à 72"C. A la fin de l'opération les échantillons sont maintenus pendant 5 minute à 72"C. d) Caractérisation On soumet des parties aliquotes (10 ,el) de chaque produit d'amplification à une électrophorèse sur gel d'agarose (3 % d'agarose NueSieve et 1 % d'agarose SeaKem). Après migration, on visualise le DNA par fluorescence du bromure d'ethidium sous irradiation UV. Le DNA est ensuite transféré sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham International). Pour vérifier la spécificité des produits d'amplification, on a effectué une hybridation avec une sonde de détection marquée à la digoxigénine et capable de s'hybrider avec une séquence d'un brin de DNA située à l'intérieur de la séquence encadrée par les amorces 1 et 2. On a obtenu cette sonde de détection par PCR, en présence de nucléosides triphosphates et d'un dUTP marqué à la digoxigénine (digoxigenin 11 dUTP - Boehringer Mannheim), avec les amorces suivantes - amorce 3 5' CCA CGA AGC CCG TCT ATG 3' - amorce 4: 5' CCT TTC GTG AAG TCA CAA ACA 3'. On obtient ainsi un amplimère de 106 nucléotides dont la séquence est incluse dans la séquence de 186 nucléotides amplifiée précédemment. On a vérifié que la sonde ainsi obtenue s'hybride spécifiquement avec les produits d'amplification PCR obtenus en c) ci-dessus. La révélation de la sonde hybridée marquée à la digoxigénine est effectuée à l'aide d'anticorps anti-digoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline, en présence de NBT!X-phosphate qui fournit un précipité bleu (kit de détection d'acides nucléiques, Boehringer Nlannheim). e) Immunodétection de la 5-méthvl cytidine L'incorporation de 5-méthyl cytidine dans le DNA amplifié a été démontrée de la façon suivante. Après électrophorèse, puis transferts sur membranes de nylon comme mentionné précédemment, les membranes sont immergées pendant 30 minutes dans une solution à 0,5 % de réactif bloquant (Boehringer Mannheim) dilué dans un tampon TRIS 0,05 M pH 7,4. Les membranes sont lavées trois fois avec du PBST (tampon phosphate contenant 0,2 gG de Tween 20) puis on laisse incuber pendant une heure à température ambiante avec un anticorps monoclonal anti-5-mhyl cytidine. L'anticorps monoclonal est celui décrit par C. Reynaud et al., Cancer Setters. Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd, 255-262 (1991). La solution d'anticorps est un surnageant non dilué de culture d'hybridome contenant entre 10 et 15 Aglml d'anticorps. Les membranes sont ensuite incubées pendant une heure à température ambiante avec des anticorps de chèvre anti-IgG (H+L) de souris conjugués à la peroxydase et purifiés par chromatographie d'affinité (Biorad Laboratories). On lave à nouveau trois fois avec du PBST puis on nnce avec du tampon phosphate (PBS). On ajoute alors le substrat (60 ml d'une solution de 4-chloro-1-naphtol à 0,3 % dans le méthanol, dans 100 ml de tampon phosphate contenant 0,02 % de peroxyde d'hydrogène) et on laisse incuber à température ambiante pendant 30 minutes. f) Préparation de microplaques On utilise des plaques de microtitration en polystyrène carboxylé; référence Niveleau et al. J. Immunol. Methods, 159, 177-189 (1993). On ajoute dans chaque puits 100 Al d'une solution à 10 pLg/ml de chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N ' -éthylcarbodiimide (Merck) dilué dans du tampon phosphate pH 7,2. Après 10 minutes à température ambiante, on ajoute dans chaque puits 100 1ll d'une solution à 10 KLg/ml d'avidine (Sigma) dans un tampon phosphate de pH 7,2. Au bout d'une heure, les plaques sont lavées avec du tampon phosphate pH 7,2 contenant 0,05 % de Tween 20, puis lavées 3 fois avec du tampon phosphate. Les produits d'amplification dénaturés par la chaleur sont ajoutés à raison de 50 Rl par puits. Après 15 minutes à température ambiante, les puits sont lavés 3 fois par du PBST. On ajoute alors 50 AI de la solution d'anticorps monoclonal anti-5-méthyl cytidine (surnageant de culture d'hybridome). On laisse incuber pendant 30 minutes à température ambiante puis on lave 3 fois avec du PBST contenant 1 % de sérum albumine bovine (PBST-BSA). On ajoute ensuite 50 ul d'anticorps de chèvre anti-IgG (H+L) de souris conjugué à la peroxydase (Biorad Laboratories). Après 30 minutes à température ambiante, on rince 3 fois avec du PBST-BSA puis on ajoute le substrat de la peroxydase qui est la 3,3',5,5'-tétraméthyl- benzidine, en solution dans le diméthylformamide, mélangé à 10 % (en volume) de peroxyde d'hydrogène. 100 AI de ce mélange sont ajoutés dans chaque puits et on laisse incuber à température ambiante pendant 17-20 minutes, jusqu'à ce qu'une coloration bleu intense du produit de réaction apparaisse. La réaction est stoppée par addition d'acide sulfurique 1N (100 u1 par puits). La densité optique à 655 nm est mesurée par spectrophotométrie. Résultats Les dilutions en série de 10 en 10 du DNA d'EBV qui ont été utilisées comme matrices dans l'amplification par PCR, contenaient de 2 à 20.000 copies du génome d'EBV. On a comparé les résultats d'amplification par PCR, effectuée comme en c) ci-dessus, avec un mélange de dCTP et de 5-MedCTP et des amorces biotinylées, et les résultats d'amplification par PCR effectuée de façon classique avec NTP non modifiés et amorces non biotinylées. Les produits d'amplification ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisés par fluorescence du bromure d'éthidium sous irradiation ultraviolette. L'analyse en électrophorèse montre que dans les deux cas les DNA amplifiés ont les tailles attendues, d'après les distances de migration. La sensibilité de la réaction, déterminée par l'intensité de la fluorescence sur le gel, atteint 200 molécules cibles de DNA, aussi bien avec la PCR selon l'invention qu'avec la PCR classique. Par ailleurs, à titre de comparaison, les produits d'amplification obtenus par PCR classique ont été analysés avec la sonde spécifique conjuguée à la digoxigénine (obtenue en d) ci-dessus), par hybridation de Southern et révélation avec un anticorps anti-digoxigénine (Boehringer Mannheim). La sensibilité de la réaction atteint 20 molécules de DNA cible. On a analysé le produit d'amplification PCR selon l'invention d'une part après électrophorèse et transfert de Southern (voir e) ci-dessus) et d'autre part sur plaque de microtitration revêtue d'avidine (voir f) ci-dessus). Dans le premier cas (électrophorèse et transfert de Southern) le produit d'amplification est dénaturé par la soude et on effectue la détection à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-5 MeC, dont la fixation est révélée comme indiqué précédemment par un anticorps anti-IgG de souris, marqué à la peroxydase. Le seuil de sensibilité de la méthode est alors de deux molécules de DNA cible. Lorsque l'analyse est faite par dépôt du produit d'amplification sur plaque de microtitration revêtue d'avidine, et détection à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-5 MeC comme précédemment, on a trouvé que le seuil de détection est cette fois inférieur à deux molécules de DNA cible. L'intensité du signal augmente avec la quantité de produit d'amplification, ce qui permet la quantification. REVENDICATIONS 1. Procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique, dans lequel on met en contact un polynucléotide contenant ladite séquence, des amorces oligonucléotidiques, les nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates contenant les diverses bases puriques et pyrimidiques nécessaires à la synthèse du produit d'amplification, et un système enzymatique ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA polymérase et/ou de transcnptase inverse, dans des conditions permettant d'effectuer, de façon connue en soi, une amplification de ladite séquence d'intérêt, caractérisé par le fait que l'un desdits nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates est présent soit sous une forme modifiée, soit à la fois sous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base pyrimidique ou purique est substituée par au moins un groupement méthyle, hydroxyméthyle ou acétyle. 2. Procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique, et de détection et/ou de quantification du produit d'amplification, dans lequel on met en contact un polynucléotide contenant ladite séquence, des amorces oligonucléotidiques, les nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates contenant les diverses bases puriques et pyrimidiques nécessaires à la synthèse du produit d'amplification, et un système enzymatique ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA polymérase et/ou de transcriptase inverse, dans des conditions permettant d'effectuer, de façon connue en soi, une amplification de ladite séquence d'intérêt, caractérisé par le fait que l'un desdits nucléosides triphosphates et/ou désoxynucléosides triphosphates est présent soit sous une forme modifiée, soit à la fois sous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base pyrimidique ou purique est substituée par au moins un groupement méthyle, hydroxyméthyle ou acétyle, et que l'on détecte et/ou quantifie le produit d'amplification, selon des méthodes connues en soi, à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement ledit nucléoside modifié et ne reconnaissant pas ledit nucléoside non modifié. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que ledit nucléoside modifié est choisi parmi la 5-méthyl cytidine, la N4-acétyl cytidine, la 3-méthyl cytidine, la N6-méthyl adénosine, la N6,N6-diméthyl adénosine, la 1-méthyl guanosine, la N2-méthyl guanosine, la N2,N2-diméthyl guanosine, la 7-méthyl guanosine, la 3-méthyl uridine, la 5-hydroxyméthyl uridine, et la 1-méthyl inosine. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la proportion de nucléoside triphosphate modifié par rapport à la proportion totale de nucléoside modifié et de nucléoside correspondant non modifié est de 10 à 100 % en moles. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ladite proportion est de 20 à 75 No en moles. 6. Utilisation d'un produit d'amplification pouvant être obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 5, dans la préparation, de façon connue en soi, d'un multimère comprenant une pluralité de motifs constitués par ledit produit d'amplification et au moins un motif polynucléotidique capable de s'hybrider avec un polynucléotide d'intérêt. 7. Utilisation d'un anticorps dans la détection et/ou la quantification, selon une méthode connue en soi, d'un produit d'amplification obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou dans la détection et/ou la quantification, selon une méthode connue en soi, d'un multimère pouvant être obtenu selon la revendication 6, ledit multimère étant hybridé avec ledit polynucléotide d'intérêt, caractérisée par le fait que ledit anticorps est un anticorps capable de reconnaître ledit nucléoside modifié sans reconnaître le nucléoside correspondant non modifié.