Brevet FR2724931A1 — publié le 19960329

HYDROLYSE ENZYMATIQUE DES 4METHYLTHIOBUTYRONITRILE La présente invention concerne l'utilisation d'une nitrilase comme catalyseur d'hydrolyse d'un groupe nitrile en groupe carboxylique. Elle concerne plus précisement l'utilisation de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis déposée sous le numéro ATCC 8750. Cette nitrilase est décrite par exemple dans les brevets européens et japonais publiés sous les numéro respectifs EP 348 901 et JP 03 224 496, tous deux appartenant à la société ASAHI. Dans ces brevets, et particulièrement dans le brevet européen, la nitrilase est utilisée pour produire à partir de nitriles racémiques des acides optiquement actifs. Les nitriles préférés de départ sont a substitués comportent une chaîne alkyle contenant de préférence 1 à 3 atomes de carbone ou un radical aromatique. L'exemple 11 du brevet européen sus mentionné décrit l'hydrolyse du mandélonitrile racémique par Alcaligenes faecalis, L'acide mandélique R-(-) est obtenu avec un excès énantiomérique de 91 %. Le brevet européen 486 289 de la société NITTO CHEMICAL décrit l'utilisation d'Ak y7erBs sp.BC35-2 (FERM No 11265) pour hydrolyser le mandélonitrile en présence d'un sulfite, L'acide mandélique est obtenu dans ce cas avec un excès énantiomérique d'environ 98%. Le brevet J 04 341185 décrit encore la préparation et l'utilisation de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750 pour résoudre les problèmes de préparation de composés optiquement purs à partir de leur nitrile racérnique. La nitrilase énantiosélective décrite dans le brevet japonais ci,dessus référencé est capable plus préférentiellement d'hydrolyser les 2-hydroxynitrile de formule générale (I) suivante en acide 2-hydroxycarboxylique de formule (II) suivante: dans lesquelles R représente un groupe aryle éventuellement substitué ou un groupe hétérocyclique éventuellement substitué. Il est indiqué dans ce brevet que l'hydrolyse du nitrile de l'acide mandélique par ladite nitrilase permet d'obtenir 100 % d'excès énantiomérique en acide R-(-) mandélique. II est indiqué dans l'exemple 5 que ladite nitrilase peut être utilisée pour hydrolyser des nitriles aliphatiques comme le valéronitrile, I'acrylonitrile, les 2-halogénopropionitriles, le chloroacétonitrile.Rien n'est précisé en ce qui concerne l'énantiosélectivité de cette hydrolyse sur les nitriles aliphatiques ayant un centre d'asymétrie. Ce texte précise aussi que la nitrilase d'Alcaligenes faecalis présente un optimum d'activité à un pH compris entre 6.5 et 8.0, la température de mise en oeuvre de la dite enzyme doit toujours, selon cette référence, être située en-dessous de 45"C. II est apparu de façon tout à fait étonnante que ladite enzyme d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750, lorsqu'elle était utilisée pour hydrolyser le 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile, réalisait cette hydrolyse sans aucune sélectivité du point de vue de la pureté optique. Cette enzyme hydrolyse ledit nitrile en produisant un mélange racémique des deux acides sans aucune prépondérance de l'un ou de l'autre des isomères. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'acides 4-méthylthio butyrique a substitués racémiques par hydrolyse des 4-méthylthio butyronitrile a substitués racémiques par la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750. On préfère parmi les 4-méthylthio butyronitriles a substitués utiliser le 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile qui permet de préparer l'hydroxyanalogue de la méthionine racémique. Cette technologie de préparation des dérivés de la méthionine permet d'éviter la formation de produits secondaires minéraux en quantités importantes dont les rejets posent de plus en plus de problèmes à cause des contraintes en ce qui concerne la protection de l'environnement. Cette enzyme qui présentait dans le dernier brevet précédemment cité des caractéristiques optimales d'activité à certains pH et à certaines températures, présente dans le cadre de la présente invention une activité nitrilase dans une zone de pH comprise entre 7 et 11 et un optimum d'activité à un pH compris entre 8 et 9. Sa température optimale de mise en oeuvre est comprise entre 40 et 600C, on préfère néanmoins l'utiliser à environ 50 C. On préfère travailler avec une concentration en nitrile dans la solution de départ comprise entre 10 mmoles et 400 mmoles par litre et de préférence entre 50 et 200 mmoles par litre. La concentration en sel d'ammonium de l'acide obtenu a peu d'influence sur l'activité de renzyme lorsqu'elle est inférieure à 1 mole par litre et de préférence intérieure à 800 mmoles par litre. L'invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. EXEMPLE 1 Le micro-organisme Alcaligenes faecalis ATCC 8750 est cultivé dans le milieu suivant: Acétate d'ammonium 10 g/I Extrait de levure 5 g/I Peptone 5 g/l K2HPo4 5 g/l MgSO4, 7H2O 0,2 g/l FeSO4,7H2O 30 mg/l NaCI 1 g/l Benzonitrile 0,5 g/I pH 7,2 La culture est réalisée à 300C dans des fioles d'Erlenmeyer de 2 litres contenant 600 ml de milieu. Le tout est agité à 150 tours par minute durant 30 heures. Le culot cellulaire est récupéré, lavé avec une solution de NaCI à 9g/l puis congelé. Conditions opératoires pour l'hydrolyse du butyronitrile: 4-méthylthio 2.hydroxy butyronitrile 50 mM Cellules 5 mg/ml Tampon phosphate 200 mM Température 30"C Durée 4 heures L'étude cinétique d'hydrolyse du 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile montre une production linéaire de 2,8 pmoles d'hydroxy analogue de la méthionine par heure et par mg de cellules sèches. L'excès énantiomérique de l'acide formé a été mesuré par chromatographie liquide, il est égal à 0 % pour un rendement en acide de 80 96. EXEMPLE 2 On a évalué la stabilité de l'enzyme en suivant la cinétique de production de l'hydroxy analogue de la méthionine pendant 180 heures avec des cellules libres. Les conditions opératoires sont les suivantes: 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile 100 mM Cellules 10 mg/ml Tampon phosphate 300 mM 5 ml Température 25"C Le nitrile est ajouté séquentiellement par ajout de 100mmoles de nitrile après épuisement. La formation de l'acide correspondant est indiqué dans le tableau l: Acide Formé Activité TEMPS (mmoles/litre) ( moles/h.mg de cell. s. 0 0 0 17h 230 1,3 24h 312 1,7 47h 466 1,2 70 h 556 0,4 172h 860 0,6 180h 940 0,6 L'activité initiale est de 2 limoles/h.mg de cellules séchez. Cet exemple prouve la stabilité de l'enzyme malgré la présence de fortes concentrations en acide (0,9 mole d'hydroxy analogue de la méthionine) EXEMPLE 3 La stabilité de l'enzyme en fonction de la quantité de substrat et de la quantité d'acide formé a aussi été mesurée dans les conditions suivantes: : Stabilité de l'enzyme en fonction de la quantité de substrat Nitrile cf Tableau résultats Cellules 10 mu/ mil Tampon phosphate 300 mM pH 7,0 5 ml Température 25"C Durée 1 heure Concentration en nitrile Activité (mM) ( moles/ h. mg de cell. s.) 50 2 100 2 150 2 200 2 500 0 Stabilité de l'enzyme en fonction de la quantité d'acide formé Conditions opératoires: Nitrile 50 mM Cellules 2,5 mg/ ml Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température 30"C Durée 2 heures Concentration en acide Activité (mM) ( moles/ h. mg de cell. s.) 0 3,2 100 4,5 200 3,8 300 4,1 400 4 500 4 600 3,4 700 2,8 EXEMPLE 4 Purification de la nitrilase Les cellules d'Alcaligenes faecalis sont cultivées 24 heures à 3tC dans le milieu décrit à l'exemple 1. Après centrifugation de la culture, le culot est repris dans le tampon pH 7,5 (25mM trisHCI, 10 96 (p/v) glycérol). La suspension cellulaire est traitée aux ultrasons puis centrifugée afin d'obtenir l'extrait brut L'extrait brut est ensuite traité avec du sulfate d'ammonium jusqu'à 30 % de la saturation. Le précipité obtenu est resuspendu dans le tampon pH 7,5 puis dialysé contre 2 litres du même tampon durant une nuit. La solution obtenue est ensuite déposée sur une colonne échangeuse d'anions Q Sepharose Fast Flow HR 26/10Q) préalablement équilibrée avec le tampon pH 7,5. L'activité est ensuite éluée avec un gradient de 0 à 1 M de NaCI. Les fractions actives sont ensuite déposées sur une colonne échangeuse d'anions Mono Q HR 5/5 préalablement équilibrée avec du tampon pH 7,5. La nitrilase est éluée à l'aide d'un gradient de 0 à 1 M de NaCI. Pour finir, les fractions contenant l'activité sont réunies, puis est ajouté 1 M de sulfate d'ammonium. Cette solution est déposée sur une colonne d'intéractions hydrophobes Phényl sepharose HR 5/ préalablement équilibrée avec le tampon pH 7,5 additions de 1 M de (NH4)2SO4. L'activité est ensuite éluée avec un gradient de 1 à 0 M en sulfate d'ammonium. Le poids moléculaire de la protéine est déteminé par gel filtration. II est d'environ 260 kDa. Sur gel de SDS-PAGE, on observe une unique bande de 43 kDa (pureté de 95 %). La cinétique d'hydrolyse du 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile en hydroxy analogue de la méthionine par la nitrilase d'A. faecalis est linéaire Temps Activité RR (Heure) ( moles/ h. mg de prot.) (%) o O i 0,5 150 3 1 171 5 21,5 150 68 24,8 150 77 29 150 87 EXEMPLE 5 Influence du pH Conditions opératoires:: nitrile 50 mM protéine 50 pg/ml tampon acétate 100 mM de pH 4 à 5 tampon phosphate 100 mM de pH 6 à 7 tampon TRIS-HCI 100 mM de pH 8 à 9 tampon borate 100 mM de pH 10 à 11 1 ml température 30 C Durée 1 à 2 heures pH Activité ( moles/ h. mg de prot.) 4 0 5 42 6 232 7 272 8 405 9 412 10 158 11 O EXEMPLE 6 Influence de la température Conditions opératoires nitrile 50 mM protéine 50 pg/ml tampon phosphate100 mM de pH 7,0 températures variables de 4 C à 60"C durée 1 heure La température optimale de fonctionnement de l'enzyme est de 50 C. Température Activité en C ( moles/ h. mg de prot.) 4 45 10 67 20 140 30 272 40 419 50 570 60 333 EXEMPLE COMPARATIF AVEC LE MANDELONITRILE Conditions opératoires: Mandélonitrile 7 mM Protéine 5 p9/ ml Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température 30 C Temps Activité ee (minute) ( moles/ h. mg de prot.) 15 1000 1 60 1030 1 La nitrilase purifiée est donc énantiosélective sur le mandélonitrile mais pas sur le 4-méthylthio 2-hydroxybutyronitrile. REVENDICATIONS - 1 - Procédé de préparation d'acides 4-méthylthio butyrique a substitués racémiques caractérisé en ce qu'on hydrolyse les 4-môLhyfthio butyronitrile a substitués racémiques par une nitrilase d'Alcaligenes faecalk ATCC 8750. - 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le 4-méthylthio butyronitrile a substitués racémiques est le 4-rnéthylthio 2-hydroxy butyronitrile - 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le pH du milieu est compris entre 7 et 1 1 et de préférence entre 7 et 9. - 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la température d'hydrolyse est comprise entre 40 et 600C - 5 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la concentration en 4-méthylthio butyronitrile a substitué dans la solution de départ est comprise entre 10 et 400 mmoles et de préférence entre 50 et 200 mmoles par litre.