Brevet FR2733514A1 — publié le 19961031

ANIMAL TRANSGENIQUE NON HUMAIN DANS LEQUEL L'EXPRESSION DU RECEPTEUR D2 EST MODIFIEE. L'invention a pour objet un animal transgénique on humain dans lequel l'expression du gène codant pour le récepteur D2 est modifiée. La dopamine est un neuromédiateur qui assure la régulation de beaucoup de fonctions physiologiques. Dans le système nerveux central, la dopamine est impliquée dans la coordination des mouvements, la perception visuelle, le savoir, l'émotion et dans le contrôle neuroendocrinien de la glande pituitaire (hypophyse). L'activation par la dopamine des récepteurs de membrane génère la formation de messagers secondaires intracellulaires. Les récepteurs de la dopamine appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G du domaine 7TM (J. A. Gingrich et M. G. Caron, Annu. Rev. Neurosci., 16: 299 (1993)). Des études pharmacologiques et biochimiques ont décrit l'existence de deux classes de récepteurs dopaminergiques D1 et D2.Le récepteur D1 a été identifié comme activateur de l'adénylate cyclase (AC), au contraire de D2 qui est décrit comme inhibiteur du même effecteur cellulaire. Ces deux types de récepteurs diffèrent dans leur affinité pharmacologique pour les antagonistes du récepteur de la dopamine classique tels que SCH23390 pour D1 et spipérone pour D2. Le clonage moléculaire de l'ADNc du récepteur D2 (J. R. Bunzow et al., Nature, 336: 783 (1988)) a permis des criblages dans des conditions d'hybridation non stringentes d'ADNc et de banques génomiques avec l'isolement de 4 récepteurs dopaminergiques supplémentaires. Deux d'entreeux, D3 (P. Sokoloff et al., Nature, 347:146 (1990)) et D4 (H. H. M. Van Tol et al., Nature, 350: 610 (1991)) montrent des caractéristiques similaires au récepteur D2, c'est-à-dire une affinité picomolaire à nanomolaire pour la spipérone. Les deux autres dénommés D1 (A. Dearry et al., Nature, 347: 72 (1990)) et D5 (D. K. Grandy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9175 (1991)) présentent des caractéristiques pharmacologiques typiques des récepteurs D1 classiquement décrits.Les ADNc des récepteurs clonés ont été exprimés dans des lignées cellulaires et leur profil pharmacologique a été défini ainsi que leurs propriétés à transduire le signal à l'intérieur de la cellule. Comme prévu, les récepteurs D1 et D5 sont des stimulateurs de l'adénylate cyclase. Le récepteur D5 a une affinité supérieure pour la dopamine à D1. Le schéma est moins clair pour le groupe des récepteurs du type de D2. A présent, le mécanisme par lequel les récepteurs D3 et D4 transduisent le signal, reste incertain, bien qu'ils présentent un profil pharmacologique proche de D2. Un rôle pour D3 comme autorécepteur a été proposé sur la base d'une affinité supérieure pour la dopamine, en comparaison de D2 (J. A. Gingrich et M. G. Caron, Annu. Rev. Neurosci., 16: 299 (1993)). Le récepteur D4 a une affinité supérieure (environ dix fois) à D2 et D3 pour la clozapine, un antipsychotique, à des concentrations qui sont actives in vivo, et il a été proposé comme cible de ce médicament.L'absence d'identification d'une voie de transduction pour ces récepteurs pourrait être due à l'absence de protéines G spécifiques dans les lignées cellulaires testées. La sous-famille entière des récepteurs à la dopamine est largement exprimé dans le système nerveux central, en particulier dans le caudateputamen, le nucleus accumbens, l'hypothalamus et les tubercules olfactives. Les caractéristiques pharmacologiques communes entre les groupes D1 et D2 des récepteurs dopaminergiques sont également reflétées au niveau amino acide où une homologie de plus de 40% est observée sur la séquence totale entre les membres de chaque groupe. L'ADNc du premier récepteur D2 isolé code pour une protéine de 415 amino acides et a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de cerveau de rat (J. R. Bunzow et al., Nature, 336: 783 (1988)). Le profil pharmacologique obtenu à partir de cellules transfectées l'identifie clairement comme un récepteur dopaminergique D2. Peu de temps après, un autre ADNc a été isolé à partir de sources différentes qui est 100% homologue au premier, à l'exception d'une insertion de 29 amino acides dans le troisième domaine intracellulaire du récepteur. Cet ADNc code une protéine de 444 amino acides, que l'on a trouvé chez le rat, la souris, les bovins et l'humain (l'ADNc humain a 445 amino acides). (J. A. Gingrich et M. G. Caron, Annu. Rev. Neurosci., 16: 299 (1993); J.-P. Montmayeur et al., Febs lett., 278: 239 (1991)). Les analyses d'ADN génomique ont démontré que les deux ADNc sont des produits du même gène générés par un mécanisme d'épissage alternatif qui ajoute un exon de 87 paires de base dans le plus grand des ARN messagers. Ces récepteurs ont été désignés par D2S pour la forme la plus courte, et par D2L pour la forme la plus longue. La structure du fragment génomique contenant le gène D2 a été déterminée. On a trouvé 8 exons dans toutes les espèces analysées, avec une caractéristique surprenante représentée par la présence d'un très grand intron situé en amont du premier exon codant. La présence d'une aussi grande séquence intronique correspond à un mécanisme de contrôle de l'expression du gène D2. Le clonage de la région du promoteur du gène D2 a été rapporté; étant donné qu'aucun trait caractéristique n'a été décrit, il semble correspondre aux caractéristiques d'un promoteur ubiquitaire. De façon intéressante, les deux isoformes du récepteur D2 sont coexprimés dans tous les tissus testés avec un rapport qui favorisent normalement l'expression de D2L. (J.-P. Montmayeur et al., Febs lett., 278: 239 (1991)). S'agissant de la pharmacologie, ces deux isoformes ont des profils similaires et se lient à l'antagoniste spipérone avec une affinité semblable. L'activation de ces deux récepteurs D2 résulte principalement dans l'inhibition de l'adénylate cyclase. Cependant, il apparaît qu'ils sont également capables d'activer d'autres voies de transduction de signal. (J. A. Gingrich et M. G. Caron, Annu. Rev. Neurosci., 16: 299 (1993)). Ces observations, ainsi que le fait que les deux récepteurs diffèrent seulement d'une insertion dans la troisième boucle intracellulaire, suggèrent que les deux récepteurs peuvent différer dans leur capacité à se coupler à une ou plusieurs protéines G. L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains susceptibles de surexprimer l'un et/ou l'autre isoforme du récepteur D2. L'un des autres aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels soit l'isoforme D2L n'est plus exprimé, soit les deux isoformes D2L et D2S ne sont plus exprimés. L'un des autres aspects de l'invention est de fournir un modèle animal susceptible de cribler des médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs D2. L'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour le récepteur dopaminergique D2 est modifiée, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, par rapport à une expression normale, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant le récepteur D2. Le terme "mammifère" inclut tous les mammifères à l'exception des humains, avantageusement les rongeurs et notamment les souris. L'expression normale du récepteur dopaminergique D2 peut être définie par plusieurs méthodes: 1) Détermination de 1' ARNm correspondant au gène D2: ceci est possible par la technique de transfert d'ARN (Northern blot) dans laquelle les ARNm sont séparés sur gel d'agarose dénaturant par électrophorèse, puis les ARN sont transférés et fixés sur une membrane de type nitrocellulose ou nylon. Pour révéler la présence des ARN correspondants au gène D2, on utilise une sonde correspondant à la totalité de l'ADNc du gène. (On peut utiliser indifféremment l'ADNc de D2L ou de D2S). 2) Détermination de la quantité de protéine correspondant au récepteur D2: ceci est possible en étudiant la liaison d'un ligand spécifique vis à vis de D2 (agoniste ou antagoniste) tel que spipérone marquée, aux récepteurs présents dans un homogénat de tissu (striatum ou hypophyse). En particulier, la constante de dissociation Kd de plusieurs ligands D2 spécifiques est connue. On sait, par exemple, que le Kd pour le ligand 3H-spipérone est dans les valeurs picomolaires (pM). On sait donc qu'une courbe de saturation avec ce ligand sur des extraits de membranes contenant les récepteurs D2 de striatum, d'hypophyse ou de substantia nigra et l'analyse par la méthode de Scatchard (détermination du nombre de sites du récepteur) des résultats obtenus à partir des courbes de saturation, doit donner des valeurs d'affinité (Kd) pour la spipérone de l'ordre du picomolaire, pour que l'on puisse affirmer qu'il s'agit d'une liaison D2. Ceci permet donc de quantifier la quantité correspondant au récepteur D2 dans l'extrait. Par ailleurs, pour discriminer entre la forme D2S et D2L du récepteur D2, on utilise la méthode de protection à l'enzyme RNAse. Pour cela, on a cloné le fragment AccI de 370 paires de bases (positions de sites AccI: 700 et 1070 de l'ADNc de D2 de souris), à partir de l'ADNc du récepteur D2L dans le vecteur plasmidique pBluescript dans le site AccI. Pour la préparation de la sonde, ce plasmide est ensuite linéarisé par coupure à l'enzyme Bsu36I et transcrit in vitro à l'aide de la polymérase T3 en utilisant des nucléotides marqués au 32p, pour avoir une sonde à ARN marquée. La taille de cette sonde est de 300 nucléotides. Les fragments protégés sont de 202 nucléotides pour D2L et de 130 nucléotides pour D2S. (Voir figures 7 ou 8). Cette sonde est utilisée pour l'hybridation avec les ARN provenant des régions exprimant le récepteur D2 (striatum, hypophyse). Les hybrides sont ensuite digérés avec l'enzyme RNAse et on obtient deux fragments: l'un correspondant à D2L de 202 paires de bases, et l'autre correspondant à D2S de 130 paires de base. Cette analyse est dite quantitative car elle permet d'évaluer exactement la proportion des ARN correspondant à l'un ou l'autre des isoformes. Pour déterminer s'il y a modification de l'expression du gène D2, on peut procéder comme indiqué ci-après. La modification de l'expression du gène codant pour le récepteur dopaminergique D2 correspond soit à une surexpression du gène, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, par rapport à l'expression normale ci-dessus définie, soit à l'absence d'expression du gène D2. La surexpression de D2 peut être déterminée de la façon suivante. On vérifie tout d'abord la présence d'un transgène. Un transgène est défini comme un fragment d'ADN qui est inséré de façon artificielle (c'est-àdire autrement que par reproduction sexuelle) dans une cellule et qui devient partie intégrante au génome de l'animal qui se développe à partir de cette cellule, ou qui est modifié par rapport à l'ADN normalement présent dans la cellule. Un tel transgène peut être un gène homologue à un gène naturel de l'animal transgénique mais qui est inséré dans le génome de l'animal à une position qui diffère de celle de l'homologue naturel. Pour vérifier la présence du transgène, on analyse l'ADN extrait d'un échantillon par exemple de queue de souris dérivé de l'injection du transgène dans des ovocytes fertilisés. Cet ADN est digéré par des enzymes de restriction, notamment PstI, et ensuite la présence du transgène est révélé par hybridation par exemple dans les conditions d'hybridation stringentes de cet ADN à une sonde marquée correspondant à une partie du transgène qui est hétérologue par rapport au génome de l'animal, par exemple au fragment de SV40 présent seulement dans la construction servie pour introduire le transgène, et par exemple le fragment BamHI-BglII de SV40. Les conditions d'hybridation sont les suivantes: les membranes de nylon sont hybridées dans une solution contenant: 50% de formamide, 5x SSC, 5x Denhardt's, 1 % SDS, ADN de sperme de saumon 100 mg/ml, pendant une nuit à 42"C. Les lavages sont effectués deux fois avec 2x SSC, 0,1% SDS à 42"C, puis deux fois avec 0,dix SSC à 65"C. Afin de vérifier que les souris contenant l'ADN transgénique expriment le transgène, on sacrifie l'animal transgénique ainsi qu'un animal contrôle et on prépare l'ARN à partir de différents tissus. On analyse L'ART par la technique de transfert d'ARN (Northern blot) et on utilise comme sonde toujours la même sonde que celle définie ci-dessus, et notamment le même fragment de SV40 que celui qui a servi pour déterminer la présence du transgène. Une bande correspondant à l'expression du transgène est retrouvée seulement dans l'hypophyse des souris transgéniques et non pas dans l'animal contrôle. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain, susceptible de surexprimer, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, l'isoforme D2L et/ou l'isoforme D2S du récepteur dopaminergique D2. Pour fixer les idées, la surexpression de D2L par rapport à l'expression normale peut être d'environ 7 fois. Pour fixer les idées, la surexpression de D25 par rapport à l'expression normale peut être d'environ 10 fois. La surexpression est dépendante du promoteur utilisé, mais aussi du lieu d'insertion du transgène dans le génome. Ceci signifie que même en utilisant le même promoteur, on n'est pas sûr d'obtenir la même expression dans deux animaux indépendants, car dans un animal on peut avoir intégration du transgène dans une partie du génome plus active par rapport à l'autre, ou avoir plusieurs copies insérées dans un cas mais pas dans l'autre. C'est seulement un criblage entre plusieurs lignées transgéniques qui permet d'éventuellement sélectionner deux animaux avec des taux d'expression similaires pour le même gène ou pour deux gènes différents ayant le même promoteur. La surexpression de l'isoforme D2L ou la surexpression de l'isoforme D2S peut être déterminée en utilisant la technique de protection à la digestion par l'enzyme RNAse, en comparant l'intensité de la bande correspondant à chaque isoforme dans une souris contrôle et une souris transgénique. On soustrait la valeur de l'intensité de la bande obtenue avec des ARN provenant de souris contrôles (car il y a l'ARN normalement présent dans l'animal contrôle) à celle obtenue à partir de souris transgéniques. Afin d'étudier la surexpression des protéines correspondantes aux récepteurs D2L et D2S, on procède à des études de liaison (établissement des courbes de saturation: méthode de Scatchard (The attraction of proteins for small molecules and ions; PNAS, 1949, 51: 660) d'un agoniste ou d'un antagoniste marqué, de préférence la spipérone, à des homogénats de tissus provenant des hypophyses de souris transgéniques et normales. La comparaison entre les valeurs (nombre de sites) obtenues avec les deux groupes donne une indication de la surexpression du récepteur. Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain qui n'exprime plus l'isoforme D2L, ou qui n'exprime plus ni l'isoforme D2L, ni l'isoforme D2S. L'absence d'expression de l'isoforme D2L peut être déterminée de la façon suivante. Des souris où l'expression de la forme D2L a été éliminée sont d'abord identifiées relativement à l'ADN par analyse avec la méthode de transfert d'ADN (Southern blot), à l'aide d'une sonde consistant en un fragment contenant tout ou partie de la région du récepteur D2 qui contient l'insertion de 87 paires de base définie cidessus, notamment une sonde génomique montrée dans la figure 4, EcoRI-BglI. Afin d'analyser que l'expression de la forme D2S est toujours présente dans ces animaux, on analyse 1 'ARN extrait à partir du striatum et de l'hypophyse ainsi que d'autres tissus, par exemple la substantia nigra, par la technique de protection à la digestion par l'enzyme RNAse. On utilise aussi des tissus qui n'expriment pas le récepteur et qui servent de contrôle comme par exemple, le cervelet. Afin de vérifier que la protéine D2S est toujours présente, on analyse les propriétés pharmacologiques par liaison d'un ligand D2 spécifique, par exemple dans les homogénats de striatum ou d'hypophyse. L'absence d'expression de l'isoforme D2L et de D2S peut être déterminée par l'une des méthodes suivantes: 1) Des souris où l'expression de la forme D2L et D2S a été éliminée, sont vérifiées par transfert d'ADN (Southern blot) avec de 1 'ADN extrait de la queue de souris coupé avec l'enzyme SpeI et hybridé avec la sonde PstI correspondant au fragment indiqué dans la figure 3. L'hybridation de cette sonde montre clairement que la bande correspondant au récepteur D2 de type sauvage (c'est-à-dire normalement présent chez les animaux) n'est plus présente dans les animaux homozygotes pour la mutation. 2) L'analyse par transfert d'ARN (Northern blot) des ARN extraits des tissus exprimant D2, notamment striatum, montre qu'il n'y a plus d'expression d'ARN correspondant au gène sauvage. La sonde utilisée dans ce cas comprend la partie 5' de l'ADNc du gène D2, en particulier on peut utiliser un fragment SmaI-PvulI de 454 paires de bases (Figure 9A). 3) Enfin on peut démontrer aussi que la liaison de ligands spécifiques D2, notamment spipérone, est complètement absente dans ces souris (Figure 9B, cercles blancs). Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant dans leur génome une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation; - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation;; - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation, et un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation. Par ADNc de D2L ou ADNc de D2S, on englobe également toute séquence nucléotidique dérivée des séquences respectivement représentées sur les figures 5 et 6, à savoir par addition, délétion ou mutation d'une ou plusieurs bases sous réserve que la protéine codée correspondante à cette séquence nucléotidique présente des propriétés biologiques équivalentes à celles des récepteurs D2. Par ADNc de D2L ou de D2S, on désigne également toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider respectivement avec les séquences représentées sur les figures 5 et 6, ou en tenant compte de la dégénérescence du code génétique, susceptible de coder pour les protéines respectivement représentées sur les figures 5 et 6. Les animaux mammifères transgéniques non humains sont tels qu'il y a surexpression de D2L et/ou D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse. L'invention concerne un animal mammifère transgénique non humain ou des cellules de mammifères contenant le gène du récepteur D2 dans lequel un fragment du gène de D2 contenant l'exon 2 ou un fragment du gène de D2 contenant l'exon 6 est remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1). Dans le cas d'un animal mammifère transgénique non humain dont le gène du récepteur D2 est tel qu'un fragment contenant 1 'exon 2 est supprimé, l'expression de D2L et de D2S est supprimée. Dans le cas d'un animal mammifère transgénique non humain dont le gène du récepteur D2 est tel qu'un fragment contenant 1' exon 6 est supprimé, l'expression de D2L est supprimée, mais l'expression de D2S est maintenue. L'invention concerne également les constructions transgéniques choisies parmi: a) un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-Hindll(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglIl de SV40, b) un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, c) un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, et un promoteur permettant la surexpression de 1' isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, d) le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène de la résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant l'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo. e) le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant l'exon 6 est remplacé par la cassette PGKneo. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des cultures cellulaires contenant l'une des susdites constructions transgéniques. Ces cultures cellulaires peuvent être obtenues soit à partir de cellules prélevées sur des animaux transgéniques tels que définis cidessus ou soit à partir de lignées cellulaires en utilisant les susdites constructions transgéniques à l'aide de techniques standard de transfection cellulaire. L'invention concerne également des cultures cellulaires, dans lesquelles les cellules sont telles que l'on a enlevé sur l'un des deux allèles l'exon 2, ou ltexon 6 du gène de D2. L'invention concerne également un mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction, notamment microinjection dans un ovocyte fécondé, de l'une des susdites constructions transgéniques, insertion de l'embryon dans une mère de substitution et développement de l'embryon à terme. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les susdits mammifères transgéniques non humains contiennent l'une des constructions a), b) ou c), telles que définies précédemment. L'invention concerne également un mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des susdites constructions transgéniques, obtenue par recombinaison homologue, sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57 Black 6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des susdites constructions et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des susdites constructions. On choisit de façon avantageuse les souris C57 Black 6, car elles sont classiquement utilisées dans des expériences de comportement. De façon avantageuse, les constructions visées dans les susdits animaux transgéniques sont les constructions d) et e), telles que définies précédemment. L'invention concerne également un mammifère transgénique tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant l'une des constructions transgéniques définies cidessus. En particulier, les animaux transgéniques contenant la construction c), peuvent être obtenus soit par introduction des constructions a) et b) dans leur génome, soit par croisement d'un animal transgénique contenant la construction a) avec un animal transgénique contenant la construction transgénique b). L'invention concerne également un procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant les récepteurs D2, et de leur traitement, comprenant l'introduction dans les cellules ou des embryons de mammifères non humains d'une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/ +33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BgllI de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine, + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BgllI de SV40, - et un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant l'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo. - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant l'exon 6 est remplacé par la cassette PGK-neo. L'invention concerne également un procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs D2, notamment les prolactinomes, ou certaines pathologies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Huntington ou la schizophrénie, comprenant: * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - et un promoteur permettant la surexpression de I' isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHJ-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant l'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant 1' exon 6 est remplacé par la cassette PGK-neo du composé à tester, * et la détermination de la diminution du taux de prolactine (dans le cas des prolactinomes) ou de l'amélioration de l'état neurodégénératif (dans le cas des pathologies neurodégénératives) Les prolactinomes sont des tumeurs très fréquentes chez la femme. On ne connaît pas encore les origines de ces tumeurs, mais un mauvais fonctionnement du contrôle dopaminergique au niveau des lactotropes est impliqué. En particulier les animaux transgéniques de l'invention pourront servir de modèle pour l'étude et la détermination du traitement d'une telle pathologie.En effet, dans ces animaux, l'équilibre normal entre l'expression de la forme D2L et D2S est altéré, ce qui permet d'étudier le phénotype correspondant à une telle altération. En même temps, des agonistes et antagonistes dopaminergiques D2 peuvent être testés dans leur efficacité à augmenter ou supprimer les phénotypes obtenus. Par exemple la surexpression de la forme D2S provoque une diminution importante du taux de prolactine avec pour conséquence un déficit de lactation chez les femelles. Le remoxipride est un antagoniste connu pour avoir une forte spécificité de liaison avec D2S, ce qui permet de tester si l'injection de cette substance permet d'abolir le déficit du taux de prolactine chez les animaux transgéniques surexprimant D2S. S'agissant des animaux qui n'expriment plus ni D2S, ni D2L, ils peuvent servir de modèle pour l'étude du traitement de certaines maladies neurodégénératives. Les récepteurs D2 sont impliqués dans le contrôle de plusieurs fonctions physiologiques telles que la coordination du mouvement, la vision, la régulation de la synthèse de certaines hormones etc. On pourra donc mettre en évidence les déficits liés à l'absence de ces récepteurs. Par exempte, un des phénotypes liés à l'absence du récepteur D2 peut être une mauvaise coordination des mouvements. Ces animaux peuvent alors servir pour tester des composés agissant au niveau de la stimulation du mouvement, afin de voir si ce déficit peut être compensé. Du point de vue pharmacologique, les animaux transgéniques de l'invention sont intéressants pour cribler les substances actuellement utilisées avec une spécificité D2 afin de définir si tel est vraiment le cas. Comme il existe in vivo, plusieurs récepteurs dopaminergiques qui présentent des affinités très voisines pour les agonistes et antagonistes dopaminergiques existant; les animaux transgéniques de l'invention constituent donc un outil remarquable dans ce sens. S'agissant des animaux transgéniques qui n'expriment plus que la forme D2S du récepteur, la recherche de phénotypes peut être faite et on pourra après songer aux possibles traitements. De plus, les animaux transgéniques de l'invention n'exprimant plus que la forme D2S du récepteur, peuvent être utilisés pour développer des antagonistes D2S spécifiques, avec la possibilité de pouvoir tester ces antagonistes in vivo en absence du récepteur D2L. L'invention concerne un procédé de criblage de médicaments actifs sur un modèle animal où les taux de prolactine sont diminués par rapport à l'état normal à l'aide d'animaux transgéniques surexprimant D2S, comprenant: * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, du composé à tester, * et la détermination de l'augmentation du taux de prolactine. L'invention concerne un procédé de criblage de médicaments actifs sur des prolactinomes à l'aide d'animaux transgéniques surexprimant D2L, comprenant: * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier: fragment BamHI-Hindll(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, du composé à tester, * et la détermination de la diminution du taux de prolactine. L'invention concerne un procédé de criblage de médicaments actifs sur des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Huntington ou la schizophrénie à l'aide d'animaux transgéniques dans lesquels D2S et D2L ne sont plus exprimés, comprenant * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi:: - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant i 'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant ltexon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo du composé à tester, * et la détermination de l'amélioration de l'état neurodégénératif. S'agissant de l'amélioration de l'état neurodégénératif chez les Parkinsoniens, on s'attend à une diminution du tremblement de repos et aussi à une amélioration de la posture et des mouvements volontaires. On attend principalement que ces souris puissent représenter un modèle d'étude pour les maladies comme la maladie de Parkinson ou la schizophrénie. Il n'est pas exclu que des drogues qui pourraient être testées chez les animaux transgéniques de l'invention puissent aussi améliorer des maladies qui n'ont pas d'anomalies du récepteur D2 à leur base. Un transgène est défini comme un fragment d'ADN qui est inséré de façon artificielle (c'est-à-dire autrement que par reproduction sexuelle) dans une cellule et qui devient partie intégrante au génome de l'animal qui se développe à partir de cette cellule, ou qui est modifié par rapport à l'ADN normalement présent dans la cellule. Un tel transgène peut être un gène homologue à un gène naturel de l'animal transgénique mais qui est inséré dans le génome de l'animal à une position qui differe de celle de l'homologue naturel ou bien un tel transgène peut correspondre au gène homologue modifié, notamment par une délétion d'un fragment d'ADN dudit gène naturel. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un animal transgénique, portant le susdit transgène, qui peut être élevé de façon stable pour donner des descendants comportant des cellules qui contiennent le gène de façon stable. Ce procédé peut comprendre: - le prélèvement d'un ovocyte fécondé à partir d'un premier animal femelle, - le transfert d'un transgène dans l'ovocyte fécondé, - le transfert de 1' ovocyte fécondé contenant le transgène dans l'oviducte d'un deuxième animal femelle de la même espèce que le susdit premier animal, - le maintien du deuxième animal femelle dans un état tel que: - ledit animal femelle commence une gestation par rapport à l'embryon dérivé de l'ovocyte fécondé contenant le transgène, - l'embryon se développe en animal transgénique, - l'animal transgénique naît du deuxième animal femelle. Description des figures: - La figure 1A représente la construction PRLD2L. - La figure 1B représente la construction PRLD2S. - la figure 1C représente le fragment BamHI-BglII qui sert de sonde pour déterminer s'il y a eu intégration du transgène. Dans ce qui précède et ce qui suit, on désigne par "construction ou transgène PRLD2L", la construction transgénique ou le gène contenant ladite construction, permettant la surexpression de D2L, et par "construction ou transgène PRLD2S", la construction transgénique ou le gène contenant ladite construction, permettant la surexpression de D2S. On désigne par "souris transgéniques PRLD2L ou PRLD2S", les souris contenant la construction transgénique PRLD2L ou PRLD2S. - La figure 2 représente l'analyse par PCR de souris comportant à la fois la construction PRLD2L et PRLD2S. Afin d'analyser les souris provenant de l'accouplement entre les lignées trasngéniques PRLD2L et PRLD2S, on prépare l'ADN à partir d'un petit fragment de queue de ces animaux. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est faite en présence de deux amorces, l'une correspondant aux séquences communes des ARNm de D2L et D2S comprises, par exemple, entre les nucléotides 830 à 850 des ADNc de souris et l'autre correspondant, par exemple, aux nucléotides compris entre les positions 4457 et 4477 des séquences du virus SV40 qui sont présentes dans le fragment qui a servi pour la construction du transgène. L'utilisation de ces amorces conduit à l'obtention de deux fragments: l'un de 1722 paires de bases correspondant au transgène D2L et l'autre de 1635 paires de bases correspondant au transgène D2S. L'intérêt de cette méthode est que seules les séquences correspondant aux transgènes sont amplifiées, tandis que le gène endogène ne l'est pas car il ne contient pas les séquences de SV40. La présence simultanée des deux fragments montre que l'animal en question a les deux transgènes D2L et D2S intégrés dans son génome. - La figure 3 représente la recombinaison homologue conduisant à la préparation de souris transgéniques n'exprimant plus ni D2S ni D2L. - La figure 4 représente la recombinaison homologue conduisant à la préparation de souris transgéniques n'exprimant plus D2L. - La figure 5 représente la séquence amino acide et nucléotidique de D2L. - La figure 6 représente la séquence amino acide et nucléotidique de D2S. - La figure 7 représente l'analyse de l'ARN provenant d'hypophyses de souris transgéniques PRLD2L et PRLD2S comparé à des souris sauvages, et montre la surexpression des isoformes D2L ou D2S. On effectue la protection par la digestion avec l'enzyme RNAse provenant d'hypophyses de souris transgéniques PRLD2L, PRLD2S et de leur contrôles (C) (frère non transgénique, de la même portée), de la sonde à ARN hybridé à l'ARN correspondant à l'ARN messager du gène D2, cette sonde étant décrite dans le texte (fragment AccI dans pBluescript, plasmide linéarisé par Bsu36I). Les flèches indiquent les bandes correspondant à la taille attendue pour D2L (202 nucléotides) et D2S (130 nucléotides). On peut observer dans la ligne correspondant à I'ARN de souris contrôle que la forme D2L est bien plus exprimée dans l'hypophyse de l'animal contrôle que la forme D2S. Le contraste de la photographie augmente encore plus cette différence, de telle façon que l'on ne voit plus que la forme D2L dans le contrôle. De plus longues expositions du gel permettent de visualiser un signal aussi pour D2S dans le contrôle. La quantification de la surexpression de D2L dans la ligne correspondant à l'hypophyse de souris PRLD2L, donne une augmentation de 7 fois de l'expression de D2L dans les souris transgéniques par rapport aux souris contrôle. En ce qui concerne la ligne correspondant aux souris PRLD2S, la quantification nous donne une augmentation de 10 fois de D2S dans ces souris transgéniques par rapport à leur contrôle. Il faut noter que la surexpression des transgènes PRLD2L ou PRLD2S se rajoute à l'expression du gène endogène. La figure 8 représente la protection à l'enzyme RNAse de l'ARN provenant de tissus de souris (souris normales ou sauvages, hétérozygotes ou homozygotes) dans lesquelles on a éliminé la forme D2L du récepteur. Les ARN de striatum, substantia nigra, cortex et cerebellum de souris normales (+/+), hétérozygotes (+/-) et homozygotes (-/-) ont été hybridés avec la sonde correspondant au plasmide contenant le fragment AccI coupé par Bsu36I et transcrit par l'enzyme T3. On observe clairement la disparition de la bande correspondant à la forme D2L, chez les souris homozygotes. Sur cette photographie, on n'observe des bandes correspondant au transcrit D2 que dans le striatum, et la substantia nigra comme attendu, les autres régions du cerveau utilisées (cortex, cerebellum) servant de contrôle négatif. La figure 9 représente l'absence d'expression de D2 dans les souris transgéniques obtenues par recombinaison homologue. A) Analyse par la technique de Northern des ARN provenant du striatum de souris normales (+/+), hétérozygotes (+/-) et homozygotes (-/-) pour l'élimination de l'expression du gène du récepteur dopaminergique D2. La sonde utilisée correspond au fragment SmaI-PvuII décrit dans le texte. B) Analyse par la méthode de Scatchard d'une courbe de saturation obtenue par liaison de 3H-spipérone à des membranes de striatum de souris. Cette analyse montre que dans les souris hétérozygotes, le nombre de sites D2 est diminué par rapport à la souris sauvage, et est complètement absent dans les souris homozygotes qui n'ont plus les récepteurs D2. Méthode: les striata provenant de souris sauvages (carré blanc), hétérozygotes (triangle noir), et homozygotes (rond blanc) sont homogénéisés avec un homogénéisateur Ultra-Turrax dans 1 ml de Tris-HCl, 10 mM, pH 7,5 froid, contenant 5 mM EDTA. Les membranes sont centrifugées à 1000 g pendant 10 min, le surnageant est récupéré puis centrifugé à 45 000 g pendant 40 min à 4"C. Le culot est lavé puis repris dans 50 mM Tris-HCl pH 7,7. Pour l'analyse du récepteur D2, 15 yg de membranes sont incubés dans une solution de Tris-HCl 50 mM, pH 7,7, contenant 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM Cal2, 1 mM MgCl2, 0,1% acide ascorbique et 3H-spipérone (10-600 pM; activité spécifique 114 Ci/mmol; Amersham) à 37"C pendant 60 min. La liaison non spécifique est déterminée en présence de 1 yM (+)butaclamol (RBI, Natick, MA). Le ligand radioactif lié aux membranes est récupéré par filtration rapide à travers des filtres en fibres de verre Whatmann GF/B. Les filtres sont lavés trois fois avec 5 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,7 froid. Les données sont analysées avec le programme LIGAND (BIOSOFT). En abscisse, on a indiqué la quantité de 3H-spipérone liée au récepteur (f mol/mg de protéine). En ordonnées, on a indiqué le rapport 3H-spipérone liée/3H-spipérone libre. Exemples: Exemple 1: Préparation de souris transgéniques surexprimant D2L ou D2S. Afin de générer des souris transgéniques surexprimant l'une des deux formes des récepteurs dopaminergiques D2 sur des cellules lactotropes pituitaires (de l'hypophyse) de souris, on a utilisé le promoteur du gène de la prolactine. Un fragment de 3,03 Kb BamHI-HindE (- 3000/+33) du promoteur du gène de la prolactine (Borrelli, E., Sawchenko, P. et Evans, R. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2764-2768) a été fusionné avec le fragment de 2,261 Kb d'ADNc SmaI-EcoRV de D2L (Montmayeur, J.-P., Bausero, P., Amlaiky, N., Maroteaux, L., Hen, R. et Borrelli, E. (1991) Febs lett., 278: 239-243) ou avec le fragment de 2,174 Kb d'ADNc de D2S (Montmayeur, J.-P., Bausero, P., Amlaiky, N., Maroteaux, L., Hen, R. et Borrelli, E. (1991) Febs lett., 278: 239-243); le site de polyadénylation et les séquences d'intron du petit antigène T du virus SV40 contenues dans le fragment de 847 paires de base BamHI-BglII (Subramani, S. et Southern, P. J. (1983) Anal. Biochem., 135: 1-15) ont été fusionnées en aval des ADNc du récepteur D2, générant les constructions de fusion PRLD2L et PRLD2S. Ces fragments ont été excisés aux sites Not I flanquant les constructions et injectés dans le pronucleus mâle d'ovocytes fertilisés de souris C57 Black 6/SJL (provenant de Jackson Laboratory, Barharbor, Maine, 04609, USA). Les souris qui naissent de ces injections sont testées pour la présence de la construction transgénique en analysant l'ADN génomique obtenu à partir d'un petit échantillon de la queue. L'ADN obtenu est testé par analyse de transfert d'ADN (Southern blot) digéré par PstI, mis en contact avec une sonde constituée d'un fragment de SV40 BamHI-BglII marqué au 32p; seules les souris transgéniques sont révélées de cette façon, étant donné que l'ADN des souris sauvages (c'est-à-dire non transgéniques) ne s'hybride pas avec cette sonde. Des lignées de souris sont obtenues en croisant des souris mâles ou femelles transgéniques avec des souris C57 Black 6 provenant de Jackson Laboratory. Les souris hétérozygotes sont testées pour l'expression du transgène par analyse de l'ARNm pituitaire par la méthode de protection à la RNAse, en utilisant une sonde spécifique (fragment AccI dans pBluescript linéarisé par Bsu36I) du récepteur D2 et par analyse de transfert d'ARN (Northern blot), en utilisant le fragment SV40 BamHI-BglII marqué au 32P. Deux lignées surexprimant les constructions PRLD2L sont obtenues; une lignée est obtenue pour la construction PRLD2S. Exemple 2: Préparation de souris transgéniques surexprimant D2L et D2S. Afin d'obtenir des souris surexprimant les deux isoformes des récepteurs D2, on croise des femelles PRLD2L hétérozygotes avec des mâles PRLD2S. Pour tester les souris positives vis à vis de ces deux transgènes, on utilise une technique d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). L'ADN génomique de la queue de souris est amplifié en utilisant des oligonucléotides synthétiques appartenant au fragment ajouté SV40 et par exemple s'étendant du nucléotide en position 4457 au nucléotide en position 4477 du génome du virus SV40, et à I' ADNc des récepteurs de la dopamine. Des amorces oligonucléotidiques sont choisies dans la région des ADNc des récepteurs D2 en amont de la présente insertion dans D2L (par exemple de la position 830 à la position 850 de l'ADNc de souris). Deux fragments de longueur différente sont obtenus, mettant en évidence le caractère doublement transgénique (voir figure 2). Exemple 3: Préparation de souris transgéniques n'exprimant plus ni D2S ni D2L (recombinaison homologue). Pour supprimer l'expression totale du récepteur D2, de l'ADN génomique cloné correspondant au site du récepteur D2 est isolé à partir d'une banque génomique de souris ES/EMBL3: (Sambrook J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, 2ème édition, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. 2, chapitre 9). Les cellules ES proviennent de la souris souche 129 de couleur agouti (Jackson Laboratory). Un fragment génomique de souris de 6,5 Kb KpnI-SalI contenant l'exon 2 (Karen L. O'Malley et al. (1990). Organization and Expression of the Rat D2A Receptor Gene: Identification of Alternative Transcripts and a Variant Donor Splice Site. Biochemistry, 29: 1367-1371) du gène D2 est souscloné dans pBlueScript. A partir de ce plasmide, le fragment NcoI de 0,9 Kb contenant l'exon 2 est éliminé et remplacé par un segment de 1,4 Kb du gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase-1 (PGK-1) dans la direction transcriptionnelle opposée. Le vecteur ciblant est linéarisé aux sites uniques KpnI ou SalI présent dans le site de clonage multiple avant électroporation des cellules P1 ES, qui peuvent être obtenues auprès de l'IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France). Pour l'électroporation, 1.107 cellules P1 ES sont mélangées avec 10 jug de construction linéarisée dans 0,5 ml de DMEM (DMEM = Dulbecco modified Eagle's medium) plus 15% de FCS (FCS = sérum de veau foetal) dans une cuvette pour l'électroporation de 0,4 cm et électroporée à 400 Volt (1000 V/cm), à 125 farads en utilisant un appareil d'électroporation commercialisé sous le nom Gene Pulsar (Bio-Rad). Les cellules sont ensuite transférées dans un milieu non sélectif (Dulbecco) pendant 2 jours et sélectionnées dans 150 yg/ml de gentamycine (G418) pendant 10 jours. Les clones ES résistants sont isolés et mis dans des micropuits contenant une couche nourricière cellulaire (fibroblastes irradiés) et ensuite multipliés pour l'analyse d'ADN par la technique de transfert d'ADN (Southern blot). La digestion d'ADN avec SpeI a donné un fragment de 12,5 Kb à partir de type sauvage et de 9,5 Kb à partir de l'allèle ciblée, lorsqu'elle est hybridée avec une sonde externe, à la partie de D2 impliquée dans la recombinaison homologue, et notamment la sonde comprenant ou constituée par le fragment situé entre les exons 3 et 4 de D2, coupé par l'enzyme PstI (figure 3). Les cellules ES portant le gène D2 généré par recombinaison homologue sont injectées dans des embryons de C57BL/6 provenant de Jackson Laboratory à l'état de blastocytes, en utilisant des techniques standard (Bradley, A. (1987) Production and analysis of chimaeric mice.In teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical Approach, Robertson, E. J., ed. (Oxford: IRL Press Limited)). Les descendants chimères sont identifiés grâce à la couleur du poil correspondant au phénotype chimérique (couleur grise et noire) et sont croisés avec des souris C57BL/6. La transmission de la lignée germinale de l'allèle mutante est déterminée par transfert d'ADN (Southern blot) de l'ADN prélevée dans la queue isolée de la progénie "agouti" par digestion avec SpeI. Des souris homozygotes vis à vis de la mutation D2 sont obtenues en croisant des souris mutantes hétérozygotes. Exemple 4: Préparation de souris n'exprimant plus D2L par recombinaison homologue. Pour obtenir les souris transgéniques n'exprimant plus D2L, un fragment génomique de 4,8 Kb EcoRI et contenant l'exon 3 et l'exon 4 est sous-cloné dans pBlueScript, un fragment de 1,5 Kb BglII entourant l'exon 6 est supprimé et remplacé par le gène cassette PGK-neo. A ce plasmide, un autre fragment génomique de 5,8 Kb EcoRI allant de l'exon 5 à l'exon 7 est fusionné pour fournir un fragment de plus grande homologie. Pour éliminer l'intégration au hasard, le gène viral de la thymidine kinase (TK) de l'herpès simple sous le contrôle du promoteur PGK, est inclus à l'extrémité 3' du vecteur. Le vecteur ciblant est linéarisé au site NotI unique dans le site de clonage multiple avant électroporation des cellules ES D3 (Dr. Kemler Institut Max Planck, Fribourg, Allemagne). Les cellules ES D3 électroporées sont sélectionnées dans 150 yg/ml de gentamycine (G418) + gancyclovir 2 iM pendant 10 jours. Les clones ciblés sont identifiés par transfert d'ADN génomique (Southern blot) coupé avec BglI et hybridés à une sonde externe provenant d'un fragment de D2 entourant l'exon 8 et digéré par ECoRI-BglI (figure 4). La digestion d'ADN avec BglI a donné un fragment de 6,8 Kb à partir de type sauvage et 4,5 Kb à partir d'allèle ciblée. Le procédé pour générer des souris mutantes ne possédant plus l'isoforme D2L est effectué selon ce qui a été décrit à partir des souris n'exprimant plus ni le récepteur D2S ni le récepteur D2L. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour le récepteur dopaminergique D2 est modifiée, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, par rapport à une expression normale, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant le récepteur D2. 2. Utilisation selon la revendication 1, d'un animal mammifère transgénique non humain susceptible de surexprimer, notamment sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, l'isoforme D2L et/ou l'isoforme D2S du récepteur dopaminergique D2. 3. Utilisation selon la revendication 1, d'un animal mammifère transgénique non humain qui n'exprime plus l'isoforme D2L, ou qui n'exprime plus ni l'isoforme D2L, ni l'isoforme D2S. 4. Animal mammifere transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant dans leur génome une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation, et un promoteur permettant la surexpression de 1' isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation. 5. Animal mammifère transgénique non humain contenant l'une des constructions selon la revendication 4, et dont les cellules lactotropes surexpriment D2L et/ou de D2S. 6. Animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur D2 dans lequel un fragment du gène de D2 contenant l'exon 2 ou un fragment du gène de D2 contenant l'exon 6 est remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1). 7. Animal mammifère transgénique non humain contenant l'une des constructions selon la revendication 6, et dans lequel soit l'expression de D2L est supprimée, l'expression normale de D2S étant maintenue, soit l'expression de D2L et de D2S est supprimée. 8. Cellules cultivées à partir des animaux mammifères transgéniques non humains selon l'une des revendications 4 ou 6. 9. Mammifère transgénique non humain produit par introduction, notamment microinjection dans un ovocyte fécondé, de l'une des constructions selon la revendication 4, insertion de l'embryon dans une mère de substitution et développement de l'embryon à terme. 10. Mammifère transgénique non humain obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des constructions selon la revendication 6, obtenu par recombinaison homologue, sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57 Black 6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon la revendication 6 et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon la revendication 6. 11. Mammifère selon l'une des revendications 4 ou 6, produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant différentes constructions. 12. Procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant les récepteurs D2, et de leur traitement, comprenant l'introduction dans les cellules ou des embryons de mammifères non humains d'une construction choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ +33) du promoteur de la prolactine, + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, et un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant 1 'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant 1' exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant l'exon 6 est remplacé par la cassette PGK-neo. 13. Procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs D2, notamment les prolactinomes ou certaines pathologies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Huntington ou la schizophrénie comprenant: * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi:: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ +33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-Bgln de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ +33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, et un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ +33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant 1 'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant l'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant 1 'exon 6 est remplacé par la cassette PGK-neo du composé à tester, * et la détermination de la diminution du taux de prolactine (dans le cas des prolactinomes) ou de l'amélioration de l'état neurodégénératif (dans le cas des pathologies neurodégénératives). 14. Procédé de criblage de médicaments actifs sur un modèle animal où les taux de prolactine sont diminués à l'aide d'animaux transgéniques surexprimant D2S, comprenant l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi:: - un promoteur permettant la surexpression de 1' isoforme D2S sur les cellules lactotropes des glandes pituitaires, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI BglII de SV40, du composé à tester, * et la détermination de l'augmentation du taux de prolactine. 15. Procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Huntington ou la schizophrénie à l'aide d'animaux transgéniques dans lesquels D2S et D2L ne sont plus exprimés, comprenant: * l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant une construction choisie parmi:: - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant 1' exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant 1' exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo du composé à tester, * et la détermination de l'amélioration de l'état neurodégénératif. 16. Construction transgénique choisie parmi: - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/+33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - un promoteur permettant la surexpression de l'isoforme D2L sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2L + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-HindII(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2L + fragment BamHI-BglII de SV40, et un promoteur permettant la surexpression de 1' isoforme D2S sur les cellules lactotropes de l'hypophyse, notamment le promoteur de la prolactine, + ADNc de D2S + un terminateur de transcription, notamment une partie du génome du virus SV40 contenant le site de polyadénylation et en particulier fragment BamHI-Hindll(-3000/ + 33) du promoteur de la prolactine + fragment SmaI-EcoRV de l'ADNc de D2S + fragment BamHI-BglII de SV40, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant l'exon 2 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique de 0,9 Kb NcoI, contenant l'exon 2 est remplacé par la cassette PGK-neo, - le gène de D2 dans lequel un fragment contenant 1' exon 6 est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment par une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier le gène de D2 dans lequel le fragment génomique BglII-BglII contenant l'exon 6 est remplacé par la cassette PGK-neo.