Brevet FR2733912A1 — publié le 19961115

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT DES DERIVES DE STEROIDES IMPLIQUES DANS LE DECLENCHEMENT DE LA REPONSE IMMUNITAIRE La présente invention est relative à des compositions pharmaceutiques contenant à titre de principe actif des nouveaux dérivés de stéroïdes qui ont une fonction de restauration des mécanismes agissant sur la réponse immunitaire et plus particulièrement des mécanismes liés à l'immunité cellulaire B et T. La formation des hormones stéroïdes, leurs interrelations et leurs fonctions ont été décrites dans un nombre très important d'articles et les fonctions plus précisément de la pregnènolone ou de la DHEA ou de certains dérivés de la DHEA sont résumées dans l'état de la technique de la demande de brevet PCT WO 94/08588 dont la description est incorporée ici par référence. Le rôle physiologique des stéroïdes 7-hydroxylés tel la 7ahydroxypregnenolone et les 7a/ss-hydroxy-DHEA ont été partiellement élucidés par la démonstration de leur effet promoteur de l'immunité chez la souris (MORFIN et COURCHAY, J Steroïd. Biochem. Molec. Biol., 50: 91100, 1994) , Dans le même ordre d'idée, la demande de brevet WO 93/20687 revendique le 5-DIOL et son dérivé 7Q-hydroxylé comme agent régulateur de la réponse immunitaire.Cependant toutes ces molécules décrites présentent un certain nombre d'inconvénients qui sont notamment leur hydrosolubilité élevée, et une biodisponibilité insuffisante due à une fuite cellulaire trop rapide, ce qui en particulier présente un inconvénient majeur lorsque l'on souhaite utiliser cette capacité de restauration ou de stimulation de l'immunité cellulaire dans un processus de vaccination. La présente invention est relative à l'utilisation dans la fabrication d'une composition stimulante de l'immunité, et en particulier pouvant conférer à un vaccin une immunité accrue, de composés 6a ou 7a substitués de la DHEA ou de la pregnenolone et plus particulièrement 6a ou 7a hydroxylés réduits ou non réduits en position 5 et répondant à l'une des trois formules générales suivantes: dans lesquelles:: R1 est choisi parmi H, les fonctions ester d'acide gras de 1 à 25 atomes de carbone, ester sulfurique, ester phosphorique ou ether carboné de 1 à 25 atomes de carbone comprenant un ou plusieurs atomes d'azote, les ethers d'hydrates de carbone de 3 à 100 atomes de carbone et leurs dérivés dont ceux comprenant ou non un ou plusieurs atomes d'azote, ou des oximes comprenant un ou plusieurs atomes d'azote et de 1 à 25 atomes de carbone; R2 est un hydrogène ou une fonction ester d'acide gras de 1 à 25 atomes de carbone; Les substitutions R1 et R2 étant différentes l'une de l'autre; R3 est choisi dans le groupe constitué de H2, -C O-R6. -CHOH-R6 =CH-CH3, = COH-CH3,= CR6-CH3, = O, le radical = 0 étant exclu quand R1 est un hydrogène. R4 est H2 ou un halogène ou un radical carbonitrile, R5 est choisi dans le groupe constitué de H2, CO-R6 CHOH-R6, =CH-CH3, = COH-CH3, = CR6-CH3, = O, -OH. R6 étant un groupe alcoyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence méthyle, substitué ou non, les substitutions en R3 et R4 ou R5 et R4 contiennent au moins un H2. De façon particulière, les composés utilisés selon l'invention sont des dérivés 6a ou 7a substitués de la DHEA ou de la pregnenolone et plus particulièrement encore des dérivés 6a ou 7a hydroxylés réduits ou non réduits en position 5. La composition stimulante de l'immunité comprenant un composé de formule (I) à (III) fait elle-même partie de l'invention, que le composé soit seul ou combiné à d'autres constituants, notamment à un antigène, ou à un autre adjuvant ou à une combinaison de ceux-ci ; en particulier, un vaccin contenant une composition de l'invention ou administré simultanément à ladite composition fait partie de l'invention, simultanément signifiant ici que les deux produits sont administrés à un patient dans la même forme galénique, ou dans deux formes galéniques distinctes et administrées dans un intervalle de temps autorisant un recouvrement partiel ou total des effets de chacun des produits. Ce qui est surprenant dans les résultats obtenus grâce à ces vaccins est que les stéroïdes utilisés dans la composition ne sont pas des adjuvants dans le sens classique du terme ils n'ont pas le pouvoir d'augmenter aussi considérablement la réponse immunitaire chez les souris saines adultes ou jeunes que les adjuvants classiques. Par contre les souris âgées souffrant d'une dérégulation du système immunitaire recouvrent une réponse immunitaire proche de la normale après traitement par les compositions de l'invention. Les effets de l'âge sur la réponse immunitaire sont actuellement connus au travers des travaux scientifiques publiés et concernant les domaines suivants: a) Capacité proliférative affaiblie pour les cellules T âgées: lorsque les cellules présentatrices d'antigène présentent un antigène étranger à une cellule T, celle-ci est stimulée et produit de l'interleukine-2 (IL-2).Cette production d'lL-2 et la réponse à l'IL-2 sont diminuées dans les cellules T de personnes âgées. Par ailleurs, chez la souris âgée, on observe aussi une diminution de l'lL-3, du GM-CSF, de la réaction type DTH et de l'induction de CTL. Par contre, IL-4, IL-5, lL6 et INFy sont augmentés par rapport aux souris adultes jeunes (Weskler, Immune Senescence, Annals of NeuroL, suppl. 35; S35-S37 (1994)). 11 a également été démontré que les cellules T de souris âgées proliféraient moins bien que celles des jeunes lorsque ces cellules sont stimulées par un anticorps anti-CD28 (Engwerda et al., J. Immunol. 153: 3740-3747 (1994)). En effet la CD28, qui est une protéine présente sur toutes les cellules T périphériques, est une molécule accessoire dans la présentation d'antigènes.Elle se lie à la molécule B7 (présente sur les cellules B activées, les macrophages, les cellules dentritiques, les cellules de Langerhans et les cellules T activées). II semble que la stimulation de la CD28 pourrait induire la sécrétion d'lL-2. Chez les souris âgées, I'expression de la CD28 sur les cellules T CD4+, CD8+, CD44+'0 (population naïve) et CD44+hi (population T mémoire) reste la même que sur les cellules T des jeunes. Cependant, la réponse proliférative de ces molécules vis à vis d'une stimulation avec un anticorps anti-CD28 est plus basse chez les souris âgées que chez les jeunes. Ceci suggère que le mécanisme de signalisation intracellulaire est défectueux chez les souris âgées.Par ailleurs, l'accumulation de cellules T mémoires et ne répondant pas aux stimuli pourrait être responsable de la carence immunitaire chez les personnes âgées (Flurkey et api., Eur. J. Immunol., 22 : 931 (1992)). L'ensemble de ces phénomènes suggère que le mécanisme de signalisation intracellulaire est défectueux chez les cellules âgées au travers d'effets directs sur la mémoire immunologique des compartiments B et T des populations âgées. Les stéroïdes hydroxylés de l'invention auraient une fonction de restauration de ces mécanismes. b) Affaiblissement de la réponse B chez les personnes âgées: bien que la littérature reste contradictoire sur ce point, certaines études montrent que le taux d'anticorps neutralisants, produits par des personnes âgées à la suite de vaccinations par le vaccin antigrippal trivalent, reste équivalent à celui induit chez les jeunes (Powers and Belshe, J. Infect. Dis., 167: 584-592 (1993)). Cependant, le consensus général sur ce point est que les vaccins inactivés employés aujourd'hui sont moins efficaces chez les personnes âgées que chez les jeunes pour induire des anticorps neutralisants. Cette inefficacité augmente avec l'âge des patients. c) Inefficacité des vaccins chez les personnes âgées de plus de 65 ans: après vaccination par le vaccin de la grippe, seulement près de 60% des personnes âgées saines répondent avec une immunité protectrice ; leur taux d'anticorps neutralisants et la réponse T cytotoxique restent faibles (Weskler, Immune Senescence, Ann. Neuro., Suppl. 35: S35-S37 (1994)). d) Augmentation de l'expression des autoanticorps chez les individus âgés: chez la souris, il apparaît que les cellules B CD5(-) produisent des anticorps contre un antigène étranger, alors que les cellules B CD5(+) produisent des autoanticorps. Chez les souris âgées, la stimulation de CD5(-) par un antigène étranger est moins efficace que chez les souris jeunes. Par contre, L'antigène étranger stimule de manière égale les CD5 (+) chez les souris jeunes et âgées. La résultante est une production d'autoanticorps proportionnellement plus élevée chez les âgées que chez les jeunes (Weskler, Immune Senescence, Ann. Neuro., Suppl. 35: S35 S37 (1994)). A partir de ces constatations diverses, il paraissait nécessaire de rechercher des traitements qui permettaient de combattre la carence immunitaire observée chez les populations âgées et de ramener la réponse immunitaire au niveau mesuré chez les jeunes. Les demandes de brevet WO 93/20696 et W0 94/08588 décrivaient un certain nombre de dérivés 7-hydroxylés naturels utilisables dans le déclenchement des processus immunitaires ; cependant ces dérivés présentaient un certain nombre d'inconvénients déjà décrits plus haut et qui en faisaient des candidats médiocres comme adjuvants de vaccination soit pour des raisons de toxicité, soit pour des raisons de bio-disponibilité non satisfaisante. Les composés de l'invention répondant aux formules (I), (II) ou (III) déjà données ci-dessus permettent d'envisager leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques ou des vaccins pour restaurer des déficiences immunitaires chez les sujets âgés. II faut remarquer que les formules (II) ou (III) sont des composés réduits en position 5 ce qui présente plusieurs avantages : ils sont plus faciles à synthétiser, et donc moins onéreux et ils présentent en outre une activité plus importante que les dérivés non réduits.Les substitutions en R1 par des acides gras leur confèrent enfin une liposolubilité accrue ce qui présente l'avantage d'améliorer la rétention de ces composés dans les cellules notamment au niveau de leurs membranes et par conséquent de prolonger leur activité et leur effet sur l'immunité cellulaire; Des composés préférés de l'invention sont ceux dans lesquels le substituant R2 est un hydrogène autrement dit les dérivés 6 ou 7 hydroxylés. Des dérivés préférés de l'invention sont ceux où l'ester d'acide gras en R1 est un oléate ou un palmitate, notamment le 3ss palmitoyl 7a - OH-DHEA, où les substitutions en R3 ou en R5 sont une cétone, et la substitution en R4 étant alors H2. D'autres dérivés selon l'invention sont ceux où la substitution en R4 est un halogène, la substitution en R3 ou R5 étant alors H2. Les compositions ci-dessus peuvent en outre contenir un principe actif de vaccin. La présente invention est également relative à des compositions vaccinales ou des vaccins comprenant outre le principe actif au moins un adjuvant constitué d'un des dérivés décrits ci-dessus. La dose d'adjuvant efficace est située entre 0,05 et îOmg par kg de poids corporel et par dose, et de préférence entre 0,05 et 5 mg. L'immunisation par administration de vaccin est réalisée soit par le mélange de l'antigène avec l'adjuvant dans la composition elle-même, soit l'immunisation est réalisée par administration simultanée de l'antigène et d'un adjuvant constitué d'au moins un composé de l'invention, simultanée ayant la même signification que ci-dessus. L'adjuvant dans les vaccins ou compositions vaccinales de l'invention est constitué d'au moins un dérivé des stéroïdes selon l'invention, associé le cas échéant, avec un autre dérivé décrit par exemple dans WO 93/20687 ou WO 94/08588, ou encore un adjuvant de type alum, le dérivé de l'invention en tout état de cause étant présent à la dose de 0,05 à 10 mg par kg et de préférence entre 0,05 et 5 mg par kg. Cet effet de restauration ou de stimulation de l'immunité notamment chez les personnes d'un certain âge peut être appliqué à tout traitement visant à restaurer l'immunité cellulaire B et T, et notamment dans les cas de cancers et de maladies autoimmunes. La nature même des dérivés de l'invention fait que les formes galéniques envisageables et leurs voies d'administration sont larges. Les voies d'administration peuvent être outre les voies classiques intramusculaires, sous-cutanées, intra-dermiques, intra-veineuses, intravaginales, intra-rectales, il est possible d'envisager des formes orales, intra-péritonéales, intra-pulmonaires, mucco-nasales ou transcutanées, aucun caractère limitatif n'étant donné à cette liste.Les formes galéniques correspondantes sont des formes résultant de l'addition aux principes actifs et aux adjuvants de composés acceptables pharmaceutiquement et permettant de réaliser des crèmes, des pâtes, des émulsions eau dans huile ou huile dans eau , ainsi que des formes composées de liposomes de micelles simples ou mixtes ou autre promoteur de pénétration tels des lyso-phospholipides, des cyclodextrines, du PEG (polyéthylène glycol), des tensioactifs, du DMSO, de l'acétone, des alcools, des acides gras, des huiles végétales ; d'autres formes galéniques envisageables sont des formes de type retard ou permettant un relargage contrôlé du principe actif ; des formes galéniques de type pro-drogue qui nécessitent l'adjonction d'un autre composé in vivo ou in vitro permettant de transformer un précurseur en dérivé de l'invention fait lui-même partie de l'invention. Des pilules ou capsules administrables par forme orale ou des implants sont d'autres formes galéniques utilisables pour les composés de l'invention. Cette liste de formes galéniques n'est pas non plus exhaustive dans la mesure où d'autres formes peuvent être mises au point et tout à fait adaptables aux dérivés stéroïdiens de l'invention qui en outre ont comme caractéristiques essentielles d'être à la fois liposolubles et hydrosolubles. Fait également partie de l'invention l'utilisation d'un stéroïde de l'invention dans la fabrication d'un vaccin ou une utilisation dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à compenser les effets du vieillissement sur la réponse immunitaire. Dans cette utilisation le dérivé de stéroïde est administré à une dose comprise entre 0,05 mg/kg et 10 mg/kg et de préférence entre 0,05 et 5 mg/kg, la composition pharmaceutique étant un vaccin humain ou vétérinaire. Quand il s'agit d'un vaccin humain, cela peut être un vaccin contre la grippe, ou un vaccin contre l'hépatite. Sans être limitatifs, les exemples ci-dessous montrent les performances obtenues par les dérivés de l'invention comme activateurs de l'immunité et comme adjuvants de vaccins. Exemple 1 : Utilisation du 3ss-nalmitovl -7aOH-DHEA ou du 3B-acétoxv- 7ccOH-DHEA en tant au'adiuvant de vaccin. seul ou en association avec de l'alum. Un protocole d'immunisation contre le vaccin monovalent de la grippe (souche AN1B16) (HA) est utilisé pour tester l'effet adjuvant du dérivé 3ss- palmitoyl de la 7aOH-DHEA et du dérivé 3ss-acétoxy de la 7aOH-DHEA mis en solution à 10 mg/ml dans le DMSO. Trois lots de 5 souris BALB/C âgées de 6 semaines (jeunes) et trois lots de 5 souris BALB/C âgées de 90 semaines (âgées) subissent le premier jour une injection sous-cutanée de 0,5 ml de sérum physiologique contenant: soit 8 pg de HA + 1,8 pmole (0,78 mg/kg) de 3ss-palmitoyl-7aOH-DHEA (lot 1) soit 8 pg de HA + 1,8 umole (0,56 mg/kg) de 7aOH-DHEA (lot 2) soit 8 pg de HA (lot 3) Après 28 jours, chaque souris de chaque lot subit un rappel, les injections décrites étant répétées pour chaque lot. Après 38 jours, chaque souris de chaque lot est sacrifiée et le sang prélevé. Les IgG totales anti-HA sont mesurées dans chaque sérum par une méthode immunoenzymatique. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous où l'effet du 3ss-palmitoyl-7aOH-DHEA rétablit la réponse immunitaire des souris âgées à un niveau proche de celui des souris jeunes. Tableau 1 Lot Traitement Souris jeunes Souris âgées 1 HA + 3ss-palmitoyl- 0,70 # 0,47 0,69 # 0,48 7aOH-DHEA 2 HA +7aOH-DHEA 1,34 + 0,35 0,21 + 0,09 3 HA 0,56+0,30 0,27 +0,16 Exemple 2:Utilisation de la 7 Un protocole d'immunisation contre le virus monovalent de la grippe (souche Taiwan A86) (HA) est utilisé pour tester l'effet adjuvant de la 7aOH-DHEA et du HA + 3ss-palmitoyl-7aOH-DHEA en complément de celui connu pour I'Alum. Deux lots de 5 souris BALB/C âgées de 6 semaines (jeunes) et trois lots de 5 souris BALB/C âgées de 90 semaines (âgées) subissent le premier jour une injection sous-cutanée de 0,5 ml de sérum physiologique contenant, pour les deux lots jeunes soit 5 pg HA soit 5 pg HA + 55,5 mg/kg Alum et pour les trois lots âgées , soit 5 pg HA soit 5 pg HA + 55,5 mg/kg Alum, soit 5 pg HA + 55,5 mg/kg Alum + 50 pg (2,8 mg/kg) 7aOH-DHEA + 50pg (2,8 mg/kg) 3ss-palmitoyl-7aOH-DHEA. Après 28 jours (réponse immunitaire), chaque souris subit un prélèvement sanguin par la voie exolacrimale, suivi d'un rappel, les injections décrites étant répétées pour chaque lot. Après 38 jours (réponse secondaire), chaque souris est sacrifiée et le sang prélevé. Les réponses primaires et secondaires correspondent aux titre anti-HA de chaque sérum et sont mesurées pour les IgGI par la méthode immunoenzymatique. Les résultats du tableau 2 montrent que le traitement des souris âgées par le mélange Alum+ 3ss-palmitoyl-7aOH-DHEA + 7aOH-DHEA aux doses indiquées confère aux souris âgées une protection anti-HA significativement supérieure à celle induite par les traitements sans stéroïde. Tableau 2 Traitement Réponse Réponse Réponse Réponse primaire, primaire, secondaire, secondaire, jeunes âgées jeunes âgées HA 1515 + 687 127 # 111 4905 + 2704 768 # 448 HA + Alum 2440 + 1556 153 + 140 8052 + 4518 1749+1656 HA+Alum+ 1435+1419 3811+2395 3ss-palmitoyl- 7aOH-DHEA +7aOH-DHEA Les résultats présentés dans les exemples ci-dessus montrent clairement et notamment à la lecture des tableaux 1 et 2 que l'addition de dérivés 3ss- palmitoyl-7aOH-DHEA a un effet sur la réponse immunitaire des souris âgées comparable à celui obtenu chez les souris jeunes ; la comparaison notamment avec les dérivés 7aOH-DHEA seul pour lequel cette réponse n'est pas obtenue montre l'effet inattendu et extrêmement prometteur comme adjuvant de vaccin des dérivés de l'invention. REVENDICATIONS 1. Composition pour utilisation dans un médicament stimulant de l'immunité ou dans un vaccin caractérisée en ce qu'elle contient un composé répondant à l'une des formules suivantes: dans lesquelles: R1 est choisi parmi H, les fonctions ester d'acide gras de 1 à 25 atomes de carbone, ester sulfurique, ester phosphorique ou ether carboné de 1 à 25 atomes de carbone comprenant un ou plusieurs atomes d'azote, les ethers d'hydrates de carbone de 3 à 100 atomes de carbone et leurs dérivés dont ceux comprenant ou non un ou plusieurs atomes d'azote, ou des oximes comprenant un ou plusieurs atomes d'azote et de 1 à 25 atomes de carbone; R2 est un hydrogène ou une fonction ester d'acide gras de 1 à 25 atomes de carbone; Les substitutions R1 et R2 étant différentes l'une de l'autre. R3 étant choisi dans le groupe constitué de H2, CO-R6 CHOH-R6 =CH-CH3, = COH-CH3, = CR6-CH3, = O, le radical = 0 étant exclu quand R, est un hydrogène. R4 est H2 ou un halogène ou un radical carbonitrile - C=N. R5 est choisi dans le groupe constitué de H2, -C O-R6 -CHOH-R6 CH-CH3, = COH-CH3, = CR6-CH3, = O, Q-OH. R6 est un groupe alcoyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence méthyle, substitué ou non, les substitutions en R3 et R4 ou R5 et R4 contiennent au moins un H2. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ester d'acide gras en R1 est un oléate ou un palmitate. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que R2 est un hydrogène. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le composé est le 3Q palmitoyl - 7a OH-DHEA. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que R3 ou Rs sont = CH-CH3 ou = COH-CH3. 6. Composition selon une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la substitution en R3 ou en R5 est une cétone, et la substitution en R4 est H2. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la substitution en R4 est un halogène. 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle est utilisée dans la fabrication d'un vaccin. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle est administrée simultanément à un vaccin. 10. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 8 dans la fabrication d'un vaccin humain ou vétérinaire. 11. Utilisation dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à compenser les effets du vieillissement sur la réponse immunitaire d'une composition selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Utilisation selon la revendication 10 ou 1 1 caractérisée en ce que le dérivé contenu dans la composition est une dose entre 0,05 mg/kg et 10 mg/kg par dose. 13. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que le dérivé contenu dans la composition est une dose entre 0,05 mg/kg et 5 mg/kg par dose. 14. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le vaccin est un vaccin contre la grippe. 15. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le vaccin est un vaccin contre un virus de l'hépatite.