Brevet FR2724173A1 — publié le 19960308

La présente invention concerne un procédé pour obtenir des produits actifs riches en acide désoxynbonucléique (ADN) a partir d'une source animale. L'acide désoxynbonuc@éique est une molécule d'importance capitale en biologie pLaque c'est la molécule génératrice de la vie elle renferme sous forme codee les informations génétiques dont l'émission programmée est b base de la formation de tout organisme vivant Depuis quelques années, I'ADN est devenue une molécule d'intérêt cosmétologique en particulier pour ses pro-ès d'absorption des rayonnements 'onisints et, après dépolymérisation biologique au cor de l'épiderme humein, par sa capacité à foumir en qualité et en quantité des nutriments essentiels au renouvellement et à la régénération de l'épiderme Pour les laboratoires de recherche, l'ADN, pertiellement ou totalement dépolyménsé, est un produit de consommation courante notamment comme étalon, précurseur ou amorce de biosynthèse Actuellement, les sources usuelles de l'ADN sont les levures, certains végétaux et quelques produits animaux tel que le sperme de poisson ou lethymus de veau. Des procédés d'extraction à partir de ces différentes sources sont no tamment décrits dans les documents suivants FR-A-2.511.243, WO-A-8 403 835, FR-A2.628 440 et CH-A-678 489. Toutes ces sources connues ont pour principal inconvénient de néces- siter l'élimination des macromo@écules contaminantes tels que protéines structurelles, polysacchandes, acides nbonucléiques (ARN), lipides, enzymes, ainsi que des résidus des parois cellulaires Par exemple, une difficuité majeure rencontrée lors de la produchon d'ADN â partir de cellules végétales concerne l'inhibition de la désoxyribonucléase (DNAse) afin que I'ADN ne soit pas dégradé avant son extrac- tion Aussi un des buts de la présente invention est-il, d'une part, de sélectionner une source d'ADN comportant a pnon peu de produits d'être considérés comme contaminants et, d'autre part, de fournir un procédé d'extraction de l'ADN contenu dans cette source ai dsobtemr des produits actifs riches en ADN Un autre but de l'invention est de foumir un tel procédé d'obtention simple et économique permettant de produire des produits actifs riches en ADN de bonne qualité et d'un faible pnx de revient Ces buts, ainsi que d'autres qu apparaltront par la suite, sont atteints par un procédé pour obtenir des produits actifs nches en acide désoxynbonucléique (ADN) à partir d'une source animale, qui est caracténsé, se Ion la présente invention, par le fait que cette source est le sang de volaille ou de camélidés. Selon l'invention, ce procédé d'obtention comporte les étapes sui- vantes - récupération et conservation du sang - séparation des cellules sanguines, dont les érythrcc du plaiima - Isolement du noyau des érythrocytes - éclatement de ces noyaux - récupération d'une solution de chromatine renfermant I'ADN Ainsi qu'il a été dit ci-dessus, la source animale utilisée pour obtenir de rADN, selon la présente invention, est le sang de volaille ou de camélidés. En e,- fet, les oiseaux et les camélidés sont les seuls animaux homéothermes possédant des érythrocytes, ou globules rouges, nucléés et dont l'ADN est métaboliquement inactif De plus, le sang d'oiseaux tel que le sang de volaille, est actuellement un soupwduit dsbâttage difficllement valonsable et n'ayant aucune valeur rnar- chande du fait de son caractère polluant. Le sang est collecté au moment de la salgnée de la volaille directement sur la chatne d'abattage, pus acheminé vers une cuve de stoclcage dans laquelle le sang est mélangé å un conservateur ou anti-coagulant telle qu'une solution de citrate de sodium à 3 % L'introduction de l'anti-coegulant peut se faire dans le flux de sang lors de son acheminement vers la cuve de stockage. La température de celle a est maintenue à une température de l'ordre de 4 C ai d'assurer une servation correcte du sang. La séparation des cellules sanguines, constituées å erwiion 98 % d'érythrocytes, est réalisée par centrifugation le sumageant ou plasma est éliminé et récupéré en vue de la valorisation de ses composants dont certains constituent des substituts intéressants des composants du plasma bavin. Cette séparation des cellules sanguines, dont les érythrocytes, est re- lisée par centrifugation à 3 000g pendant 5 mmutes à une température de +4 C: on utillse une solution tampon à raison, d'un litre de tampon par litre de sang à centrifuger La solution tampon utilisée est composée, par exemple, de : 150mM de chlorure de sodium (NaCl), 1mM de Tns (hydoxy méthyl) amino - méthane chlorhydnque (Tns-Hcl), et son pH est de 7,2 A l'issue de cette centrifugation, on élimine le sumageant comprenant essentiellement le plasma du sang et on récupère un culot renfermant les cellules sangunes dont les érythrocytes Si nécessaire, on peut remettre ce culot en solution dans le tampon ci els "s et le soumettre à une nouvelle certIkigebon Du culot récupéré à l'étape précédente, @ but isoler les noyaa qui renferment l'ADN Pour cela, on mélange ce culot avec un détergent en faible concentration (par exemple Triton X 100, 1 %, v/v) sous agitation Selon une première vanante de réalisation, la solution ainsi obtenue est centrifugée à 250g pendant 5 minutes à une température de +4 C le culot de centrifugation est remis en suspension dans la solution tampon Cl-dessus et la suspension obtenue est de nouveau ces Ceci est répété Juqu'à obtenir un produit parfaitement blanc et donc dépourvu d'hémoglobine qui est éliminée dans le surnageant à chaque centrifugation ce produit ne renferme donc que les noyaux. Selon une seconde variante de réalisation de la présente invention, la solution ainsi obtenue est soumise à une étape de f@@tration tangentielle, permettant de récupérer ainsi les noyaux Afin de libérer l'ADN, on fan éclater la membrane de ces noyaux par choc osmotique en eau distillée et on mixe à haute vitesse On obtent an une solution de chromatine renfermant environ ign d'ADN et environ 1g/l d'histones, soit un rendement par litre de sang traité d'environ 4g/l d'ADN et d'environ 4g/l d'histones Les fragments d'ADN ainsi obtenus peuvent être classés selon leur taille en deux catégories une partie hautement polymérisée renfermant plue de 2 500 paires de bases, et une partie moyennement polyménsée renfermant environ 1 000 à 2 500 paires de bases L'analyse de cette solution de chromatine montre une absence totale d'hémoglobine et d'AR N Cette solution de chromatine qu est un actif mixte d'ADN et d'histones, constitue un nutriment nche en nucléotides et en leurs composants acide phosphonque, bases azotées, ribose et acides animés Cet actif peut efficacement ennchir les formulations diététiques et cosmétiques De cette solution de chromatine, on peut extraire, selon le procédé de la présente invention, deux catégones d'ADN l'une à poids moléculeire élevé ou type A, l'autre à faible poids moléculaire ou type B. L'ADN de type A est obtenu par chromatographie eri phase liquide en présence d'enzymes immobilisés sur support, à partir de la solution de chromatine. Le produit ainsi obtenu contient un actf punfié à 90 % et constitue une source de produits de laboratoire, d'une part, et de nucléotides, d'autre part La solution de chromatine et l'ADN de type A peuvent être corrar- cialisés sous forme lyophilisée ou de précipitation alcoolique L'ADN de type B est obtenu par précipitation acide et conditionnée sous cette forme les fragments d'ADN sont de petites tailles (oligomères). REVENDICATIONS 1 Procédé pour obtenir des produits actifs riches en acides désoxynbonucléiques (ADN) à partir d'une source animale, caractérisé par le bit que ladite source est du sang de volaille ou de camélidés. 2 Procédé selon la revendication 1. caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes - récupération et conservation du sang, -séparation des cellules sanguines, dont les érythrocytes du plasma ; - isolement du ncooi des érythrocytes, - éclatement desdits noyaux , et, - récupération d'une solution de chromatine renfermant rADN 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que pour conserver le sang, on lul ajoute un anti-coagulant tel que du citrate de sodium 4.Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le bit que la sépa- ration des éléments figurés du plasma est réalisée par centrifugation et que l'on récupère un culot renfermant les cellules sanguines dont les érythrocytes. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ron mé- lange le culot issu de b séparation dans un détergent en faible concentration ai de récupérer après centrifugation un produit dépourvu d'hémoglobine. 6. Procédé selon la revendication 4, caracténsé par le fait que l'on mélange le culot issu de la séparation dans un détergent en faible concentration et que l'on soumet la solution ainsi obtenue à une filtration tangentielle afin de récupérer un produit dépourvu d'hémoglobine 7 Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé per le bit que l'on soumet le produit dépourvu d'hémoglobine ainsi obtenu à un choc osmo- tique et que l'on récupère une solution de chromatine renfermant de l'ADN 8 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la solution de chromatine est lyophilisée ou soumise à une précipitation alcoolique. 9 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la solu bon de chromatine est soumise à une chromatographie en phase liquide en prG sence d'enzymes immobilisées sur support afin d'en extraire un ADN à poids moléculaire élevé. 10 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le bit que la solu- tion de chromatine est soumise à une précip@tation acide afin d'en obtenir un ADN à faible poids moléculaire