Brevet FR2723103A1 — publié le 19960202

PROCEDE DE CULTURE DE BACTERIES THERMOPHILES ET HYPERTHERMOPHILES ANAEROBIES STRICTES NON SULFATO-REDUCTRICES. L'invention a pour objet un procédé de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles anaérobies strictes, non sulfato- réductrices, en vue de la production de métabolites, plus spécialement d'enzymes. Il existe aujourd'hui une dynamique scientifique importante autour des bactéries thermophiles et plus particulièrement hyperthermophiles, étant donné le caractère de thermostabilité de leurs enzymes dont un bon nombre présente un intérêt industriel, comme par exemple les xylanases, les protéases, les cellulases ou les amylases. On rappelle que les bactéries thermophiles sont capables de se développer à des températures comprises entre 45 C et 70 C. Les bactéries qui se développent à des températures supérieures, notamment entre 80 et 110 C sont appelées hyperthermophiles. Le plus souvent, les bactéries thermophiles du genre Thermoanaerobacter et les bactéries hyperthermo- philes de l'ordre des Thermotogales appartenant au domaine des Bacteria présentent des croissances faibles, voire lentes même en présence de soufre élémentaire (en particulier chez les Thermotogales). Cette croissance lente en présence de soufre élémentaire constitue un facteur limitant, en particulier pour des études biochimiques et la production industrielle d'enzymes. De ce fait, les recherches ont concerné l'isolement du ou des gène(s) codant(s) pour les enzymes thermostables afin de les cloner et de les exprimer chez Escherichia coli ou Bacillus sp. Les travaux des inventeurs sur des bactéries thermophiles et hyperthermophiles du type ci-dessus leur ont permis de mettre en évidence qu'elles étaient capables d'utiliser au cours de leur métabolisme, un composé soufré particulier et que ce dernier pouvait jouer un rôle de grand intérêt comme agent stimulateur de croissance. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé de culture de ces bactéries permettant d'augmenter les rendements cellulaires et ainsi la quantité d'enzymes produites. Ce procédé de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato- réductrices est caractérisé en ce qu'on met en oeuvre, dans des conditions d'anaérobiose stricte, un milieu de culture renfermant du thiosulfate comme agent de stimulation de croissance. Le thiosulfate est réduit en sulfures lors du métabolisme de ces bactéries. Cet effet du thiosulfate sur lequel repose l'invention se traduit par une amélioration significative des cinétiques bactériennes ainsi que des rendements cellulaires. On observe ainsi une diminution des temps de génération de l'ordre de 50 à 100 % et des rendements cellulaires améliorés d'environ 100 %. Les résultats sont toujours très supérieurs à ceux observés en présence de soufre élémentaire. Cet effet bénéfique se manifeste aussi bien sur l'ensemble des sucres qu'elles utilisent et notamment ceux en C6, du type glucose (monomère de la cellulose) ou ceux en C5, du type xylose (monomère du xylane). Cette stimulation, que l'on peut également observer lorsque les bactéries sont cultivées sur un polymère biologique tel que le xylane, est le résultat d'une déviation métabolique qui conduit à une production plus importante d'acétate en présence de thiosulfate, notamment au détriment du lactate et/ou de l'éthanol. En général, cette déviation du métabolisme s'accompagne d'une plus grande utilisation du substrat. Indépendemment des sucres, on utilise également comme substrat de culture, conformément à l'invention, des peptides et/ou des acides aminés. Leur utilisation se trouve améliorée en présence de thiosulfate. On observe ainsi une augmentation de la densité cellulaire du milieu de culture et/cu une production d'acides gras volatils plus importante. La mise en oeuvre de cette disposition permet d'isoler d'un milieu donné des souches peptido- ou acide amino- dépendantes qu'il renferme le cas échéant. Ce procédé d'isolement de souches bactériennes thermophiles et hyperthermophiles, qui fait donc également partie de l'invention, est caractérisé par la culture de souches prélevées d'un milieu donné, dans des conditions d'anaérobiose stricte, en présence de thiosulfate, sur support de peptides et/ou d'acides aminés, dans des conditions appropriées pour leur croissance. Ce procédé permet de rechercher des micro- organismes xylanolytiques, protéolytiques, amylolytiques ou cellulolytiques. On isole les souches qui se sont développées et on les soumet, si on le souhaite, à des traitements de purification. D'une manière générale, l'effet stimulant sur la croissance bactérienne, en présence de thiosulfate, s'accompagne en outre d'une amélioration de l'activité enzymatique totale. L'invention fournit donc des moyens d'obtention d'enzymes thermostables en quantités élevées, ce qui présente un intérêt majeur pour de nombreuses applications industrielles. Il est ainsi possible de produire avec les systèmes amplificateurs constitués par les milieux de culture renfermant le thiosulfate, divers enzymes thermostables d'intérêt comme par exemple des xylanases, des protéases, des amylases et des cellulases. On citera également d'autres exemples d'enzymes: glucose isomérase, xylose isomérase, cellobio hydrolase, amylosaccharidase, hydrogénases et alcool déshydrogénases. L'invention vise donc également un procédé de production d'enzymes thermostables, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de bactéries thermophiles ou hyperthermophiles en présence de thiosulfate comme défini ci-dessus et la récupération de ces enzymes du milieu de culture, suivie de leur purification si on le souhaite. L'invention permet notamment la production d'enzymes thermostables qui, le cas échéant, ne peuvent pas s'exprimer sous leur forme active via un clonage génétique chez d'autres organismes. On notera à cet égard que même si le clonage est possible, les protéines synthétisées par des microorganismes recombinés pourraient ne plus posséder les propriétés enzymatiques de l'organisme originel. De plus, il a été démontré, dans le cadre de l'invention, en ce qui concerne par exemple les xylanases des organismes thermophiles étudiés, qu'elles étaient directement liées à la paroi bactérienne, ce qui facilite leur récupération. Or, une telle répartition de l'enzyme n'a pas été rapportée lorsqu'on utilise la voie du clonage du gène codant pour cette protéine chez un autre microorganisme. Sa répartition pourrait bien être dans ce cas extracellulaire augmentant les coûts de production pour sa récupération contrairement à l'invention. Des bactéries capables d'utiliser le thiosulfate et ainsi d'être mises en oeuvre dans le procédé de l'invention sont choisies parmi les Bacteria: les Thermotogales et le genre Thermoanaerobacter. Des bactéries de l'ordre des Thermotogales avantageusement mises en oeuvre comprennent en particulier les genres Fervidobacterium, Thermosipho et Thermotoga. Par extension, les bactéries Geotoga et Petrotoga sont susceptibles d'avoir les mêmes propriétés. Ces bactéries, comme démontré selon l'invention, sont capables de réduire le thiosulfate en sulfures, ce qui n'avait pas été rapporté dans la littérature scientifique à ce jour. Parmi les Bacteria, on citera le genre Thermoanaerobacter. Les bactéries du genre Thermoanaerobacter sont des anaérobies thermophiles, hétérotrophes, saccharolytiques et sont capables de réduire le thiosulfate en sulfure. Elles ont comme habitat le sol, les jus d'extraction de betterave à sucre, les jus de canne à sucre, les sources thermales volcaniques et les puits de pétrole. Parmi ces bactéries, on citera T. finni, T. brockii, T. ethanolicus T. thermohydrosulfuricus et Thermoanaerobacter SEBR 5268. L'addition du thiosulfate à des cultures de ces bactéries augmente significativement les rendements cellulaires, et ce d'au moins 50 % et même jusqu'à 300 % selon les souches. De même, les productivités cellulaires, en mg de cellules/litre/heure sont considérablement augmentées. Des conditions avantageuses pour modifier, sous l'effet du thiosulfate, le métabolisme de ces bactéries vers des voies plus énergétiques, comprennent la réalisation de la culture à une température de 50 à 90 C, notamment de 60 à 80 C à un pH de 5,0 à 9,0, notamment de 6,5 à 8,0. On utilise de préférence le thiosulfate à raison de 5 à 30 mM, en particulier de 15 à 25 mM. Le procédé de culture de l'invention peut être réalisé en continu ou en discontinu. Pour illustrer l'invention définie ci-dessus, on rapporte à présent des exemples de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles en présence de thiosulfate. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 7, qui représentent respectivement, - les figures 1 et 2, la croissance de T. finnii respectivement sur glucose et xylose, avec ou sans thiosulfate, la figure 3, l'effet du thiosulfate sur la croissance de plusieurs bactéries de l'ordre des Thermotogales, - la figure 4, les activités xylanolytiques de bactéries de l'ordre des Thermotogales et du genre Thermoanaerobacter, et - la figure 5, les activités xylanolytiques sur xylane et xylose, avec ou sans thiosulfate chez Thermotoga SEBR 2665, et les figures 6 et 7, l'effet du thiosulfate sur l'oxydation de bio-trypcase R par T. brockii et T. ethanolicus, respectivement. Exe-z!1J: Culture de bactéries du genre Thermoanaerobacter sur glucose ou xylose. On rapporte les résultats obtenus avec les souches T. finnit (DSM n 3389) et Thermoanaerobacter SEBR 5268. T. finnii a été obtenu auprès de la Collection allemande de microorganismes DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen à Braunschweig (Allemagne). La souche Thermoanaerobacter SEBR 5268 a été isolée d'une eau de gisement pétrolier en France en utilisant le milieu de culture suivant (g/l): NH4Cl, 1; K2HPO4, 0,3; KH2PO4, 0,3; MgC12, 6H20, 1,3; CaC12. 2H20, 0,1; KC1, 0,2; CH3COONa 3H20, 0,5; NaCl, 2; bio- trypcase R (bioMérieux, France), 5; extrait de levure (Difco Lab., Detroit, Mich.), 5; glucose, 10; Resazurine, 1 mg; Cystéine-HCl, 0,5; Solution minérale de Balch, 10 ml. Le pH a été ajusté à 7,0 avec une solution de KOH 10 M. Le milieu a été préparé en anaérobiose avec N2: C02 (80/20) dans la phase gazeuse. Après stérilisation (110 C, 40 mn), 0,2 ml de Na2S. 9H20 (2 %), 1 ml de NaHCO3 (10 %), 0,1 ml d'une solution de vitamines de Widdel et 0,1 ml d'une solution de dithionite de sodium (0,2 %) sont ajoutés stérilement pour 20 ml de milieu. La purification de cette souche a été réalisée en utilisant la méthode de dilution en milieu gélosé développée par Hungate. Toutes les expériences ont été réalisées à 60 C dans un milieu de base supplémenté en extrait de levure 1 g/l, tel que décrit par Fardeau et al dans FEMS Microbiol. Lett., 1993, 113, 327-332. Les techniques anaérobies de Hungate ont été mises en oeuvre pour la réalisation de toutes ces expériences. Ces techniques sont décrites dans Methods in Microbiology (Norris J.R., Ribbons D.W., Eds.) vol 3B, pp 117-132. Academic Press, London. Après avoir préparé le milieu anaérobie, 5 ml ou 20 ml du milieu liquide sont répartis dans des tubes de Hungate ou dans des flacons sérum de 50 ml respectivement sous courant d'azote dépourvu d'oxygène. Techniques d'analyse. Les mesures de densité optique, de sulfure d'hydrogène, d'hydrogène et d'acides gras volatils sont analysés comme décrit dans l'article de Fardeau et al ci- dessus. On rapporte dans le tableau 1 les temps de division et la densité optique maximale obtenus avec ces cultures. p O t ' S I asoiAx sz'T ' aejlnsoTqz + 9soTlx Ug; ds S8'0 98'9 esoonI6 jeqDeqojaeueowaeqz I'T IL v4 vlnsoTg%+esoonI6 LL'0 Z6'S esolTx 'I SS'Iú felnsoTq% + esopAx TTUUT- SO'I 86'E esooni6 2e3oeqoeeueoujeql t 'I Sg'Z ae4ejnsoTq%+esoonI6 eTVWTxQW (ssangH) anbTZdo 9%TSuea uoTsTATp ep sdWal sgzasqns seqonos I neelq& L'examen de ce tableau montre que l'apport de thiosulfate permet de réduire le temps de division chez T. finnli de 6 h à 3 h 30. Les rendements cellulaires du genre Thermoanaerobacter augmentent de 30 à 200 %, avec une moyenne de l'ordre de 100 %. Cet effet bénéfique est observé avec les deux types de substrats chez le genre Thermoanaerobacter, comme illustré par les figures 1 et 2 qui donnent la densité optique à 580 nm en fonction du temps en heures. Les courbes --O-- correspondent à l'utilisation de glucose ou de xylose avec du thiosulfate et les courbes ---± à celle du glucose ou du xylose seuls. L'étude des métabolites produits dans une culture de T. finnii sur glucose avec ou sans thiosulfate montre les modifications du métabolisme de la bactérie. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 o "M" dans la première colonne signifie "milieu de culture" et "Thio", thiosulfate à 20 mM. Tableau 2 Traitement Glucose Acétate Lactate Ethanol H2S consomme (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) M+Thio 16,9 18,2 5,9 14,6 18 M 22,5 2,4 17,8 32,7 La déviation métabolique induite par le thiosulfate conduit à une production plus forte d'acétate au détriment du lactate et/ou de l'éthanol. Exemple 2: Culture de bactéries appartenant aux Thermotogales. La culture est réalisée dans un milieu constitué par 5 g/1 d'extrait de levure, 5 g/1 de biotrypcase R, 20 mM/1 de glucose et 5g/1 de NaCl lorsqu'on utilise Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana et Thermotoga SEBR 2665. Avec Fervidobacterium islandicum, on utilise un milieu renfermant 1 g/1 de NaCl au lieu de 5 g/l comme précédemment, les autres constituants étant utilisés dans les mêmes proportions. Toutes ces souches proviennent de la collection allemande de microorganismes (DSM), excepté Thermotoga SEBR 2665 isolée d'une eau de gisement pétrolier, en anaérobiose, en utilisant les techniques de dilutions successives en milieu solide développées par Hungate. On indique dans le tableau 3 suivant la quantité en mM de sulfures produits, les densités optiques maximales et les productivités cellulaires en mg de cellules poids sec.l-l.h -1. Pour le calcul des productivités cellulaires, on admet qu'une unité D.O. correspond à 0,5 g de cellules poids sec. par litre. Tableau 3 mMN de sulfurcs produit Densités opliques maximales Produclivités cellulaires en nig de cellules poids sec 'l.h Organismes TMinoin Tlhiosulfale 'l'érmoin Thiosulfate Témoin Thiosulfatc Thennosipho 1,4 24,6 0,9 1.3 23,85 28,.11 afiticams Tliennotoga 1,5 14,4 0.3 1,2 5.20 21,06 niaritimna Tlhernotooga 1,5 13,6 0,4 1,2 6,50 21,27 neap)lilana Thennologa 2,5 14,9 0,9 1,3 11,29 60,00 SEBR 2665 Fervidobaclelium 1.5 24.6 (0,9 1,8 14.63 38.15 isla.,diczu>a L'examen de ce tableau montre que dans ce cas également l'addition de thiosulfate conduit à une augmentation importante des rendements cellulaires des bactéries, de 50 à 300 % selon les souches et des productivités cellulaires. L'effet du thiosulfate sur la croissance de T. maritima est illustré par la figure 3 qui donne la variation de la densité optique à 580 nm en fonction du temps en heures. La courbe -- -- correspond à l'utilisation d'un milieu de base contenant 5 g/l d'extrait de levure, g/l de biotrypcase et 20 mmole/l de glucose, les autres courbes correspondant à l'utilisation de ce milieu additionné de 2 % de soufre élémentaire pour la courbe -- _ - -, de thiosulfate à raison de 20 mmole/l pour la courbe --e--, ou de sulfate à raison de 20 mmole/l pour la courbe --O --- La température d'incubation est dans chaque cas de 70 C. Cette figure met en évidence l'augmentation des rendements cellulaires. Ces résultats lorsqu'on utilise du thiosulfate sont toujours supérieurs à ceux observés en présence de soufre élémentaire. xmple 3: Etude de l'effet de l'addition de thiosulfate sur l'activité enzymatique. On rapporte dans cet exemple illustré par les figures 4 et 5 les résultats obtenus avec des bactéries de l'ordre des Thermotogales et du genre Thermoanaerobacter. Ces résultats concernent l'activité xylano- lytique en u/ml de culots remis en suspension. La figure 4 donne les valeurs obtenues après 92 heures de culture sur xylane à 70 C, sans thiosulfate (_) et avec 20 mM de thiosulfate (--) avec Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermotoga sp. SEBR 2665, et Thermoanaerobacter brockli. Dans la figure 5, les activités xylanolytiques, mesurées à pH 6,5 et à 75 C sont données en fonction du temps pour des cultures de Thermotoga SEBR 2665 sur xylose (--C--), sur xylose avec du thiosulfate à raison de mM (--l --), sur xylane (-- --), sur xylane avec du thiosulfate à raison de 20 mM (-- * --). L'examen de ces courbes met en évidence une amélioration de l'activité xylanolytique, exprimée en u/ml de cellules resuspendues de l'ordre de 100 % et même plus pour certaines souches, notamment en ce qui concerne Thermotoga neapolitana. Ces résultats montrent clairement que l'amélioration des activités enzymatiques, dans le cadre d'études effectuées sur le xylose, est directement liée à celle de la croissance bactérienne. Exemple 4: Culture de bactéries thermophiles sur substrats peptides et/ou acides aminés. Souches Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (DSM No 567), T. brockii (DSM n 1457), T. finnil (DSM Ne 3389) et T. ethanolicus (DSM N 2246! ont été obtenues auprès de la DSM. La souche SEBR 5268 correspond à celle indiquée dans l'exemple 1. Milieux de culture On opère dans les conditions rapportées dans l'exemple 1, mais les produits suivants ont été ajoutés: thiosulfate, casamino acides (Difco, EUA), gélatine (Sigma, EUA) et les peptones bio- Trypcase R (bioMérieux, France), peptone pancréatique, (Prolabo, France), bactopeptone R (Difco, EUA), bio-gélytoneR (bio Mérieux, France), peptone papaïnique de soja (Institut Pasteur, Production, France). On rapporte dans les tableaux 4 à 6 les résultats obtenus relatifs à l'effet du thiosulfate sur l'oxydation de peptides et d'acides aminés respectivement par les souches SEBR 5268, T. finnii et Thermoanaero- bacter sp brockii, T. Thermohydrosulfuricus et T. ethanolicus. Ces résultats correspondent à une incubation de 3 jours à 60 C avec addition de peptides, de casamino acides ou de gélatine à raison de 5 g par litre. Le milieu de base utilisé renferme un gramme par litre d'extrait de levure comme indiqué ci-dessus et du thiosulfate à raison de 20 mM. Dans ces tableaux, Thio signifie thiosulfate mM; Casa, casamino acides, Biot, la bio trypcase R, Pap, une peptone papaïnique de soja, Pan, une peptone pancréatique, Bact, la bactopeptone, Biogel, la bio- gélytone; et Gel, la gélatine. Lt't 00'0 tL'O 00 0 90' 0Z00 01,4L+10D 061 99'1 C'0 00o0 60'0 9, ' 0OOZ'O 1ID 11 '9 O' 000;t'Z Lt'0 l'l' S1I 06Z'0 Olq4+I$OIG 9,'0 OlI'L t'pO 0'0'O BI Os'O 1SO1G G'C 03'0!t'z; t'0 6'0 Z.f0 01ú'0 ol.+. 99'1 VC'9 96'0 03'0;,'O 999 091'0 GDU 61'ó C1"0 81'Z Z>'O L8'O 9L'11 6t'D0!lúL+ d CC'1 t,' 19'0 OD'O CU'O z 9'9 SlZ'O 'd FL'; 00'0 89't t'O ç l'O 6'1I1 CC'O tL+dd S9'1 000 B0 00'0 S0'0 09'9 9V"'O ded 88'9 t;'0 Z9'8 C6'1 ZI'O C9'! EZC'O o0lqL+lOl g'.01;1,' 1 1B'IO ZOil' 1 '0 Ol 'O 1 1i '9 t"'O SZ'9 LC l 00'0 L'l 1 0C6V0 O Zu'1 B6'; S;'I l1,'0 90'0 1 C'9 60Z'O D 1 i'l O0'O 1 'O 00'0 00'0 8'9 ' B0 'OOU+IA 09'1 00'0 00'0o o'O 0 0' 00;'9 Hi'Oi - _ IJ -J i l À - -- --i, _.... __ ilyW INtu IsNIIl 1-çu iqtu isl t1 ItlU "u jSZt Zlit mulu. tliUAO;l *l.tXlnqoç!1 ltuoldo.d s;lUa-y ' * O:l uatual'T g.l S.... s9'1 0O'0 9'0 0YO0 L00 00!9 0600 qlq.1+lID I0'1 6L'0 0g'0 000 90'0 O'L' 090'0 lPD 0;" 1 01.0 t'l' I 00 0 ' O 9C' S Io oqI4,+llog 011' Z' I' 'O 00l0 LoO f'9 0I '0!1olI ç OL'C 61'0 99'1 L l'O '0VO 99'8 0CI'0 oL+O3 { 0I'i L 'O1 çO 00'0;t,'O;ç9 çtl 0 e 0 ,z 00'0 OL'I 67'0 tZ'O T'01 t'0 ql-d 0301 lZ'' 11 0 00'0 LO'O 0P' 081'0 O0' 61'0 Zl'Z t''0 90'00 ';l O;C'0 qlqi+dcd 101 ZO'9 ICO 000 9I0V Z'OI 01'0 dcd :'Srt $'60 1';;'O 60'0 81 6 L61V'0., + 001 9L't ZL'O 000' 900 0O'9 001'0 101l C'ç CZ'O úC'9 c',. tSO0O 6'V01 081'0 Ol. +D cll 09'1, OL'O 0O' 0 '0080-9 091'0 'D 0'li 00 -0 00' 0oú0 C0o BG'9 911 '0 0!1,4+j 96'0 C'O 00'0 00'0 90'0 01 ' 11'0 1' Nutu I&ttt U l,%Iu Itu I.ytu(tuU 0BE) s'i tH,'I JiAO;I eloX. (nqorl *luoldoj suî.DV ' p(:lueaa::lTuaú S neaqI, Tableau 6 Ti'aitement 9'',Acette Propionate tsobutyrate tsovaler-tefL HS - Onm mM mM mM mM mn. mM? M 0.052 458 0,00 O.C00 0.C00 0,25 0,42 M+ 'Thjo 0,024 6,28 C0.0 0,00 0.00 0.C0 0, 5 Casa 0.033 6,63 0.05 0,60 0.,3 1,21 0,14 Cas-+Thlo 0.017 7.25 0.07 1,16 2,03 1. 5 1,06 Blct 0.030 6 5 O.C6 0,29 0.81t 1,51 0,64 BIoE+'Wxo 0.077 7,60 0,12 0.97 2,33 0,71 2.35 Gel 0.0268 628 0.C5 0,65 O.CO 0,79 0,21 Gól+Thio 0.033 6,73 0,C6 0.3 1 0 '0 0.23 0.S4 rI." '0.056 S,61 o, 7 0,:3 O.C0,o 0.24 o.45 M+TThlo 0.044 6,39 O.û 0 43 0.Co O.CO 0,46 Casa 0.067 7,00 0.047 C.a9 0.60 1.S6 0,45 CasanThio 0.060 7,20 0,065 0,62 1,84 3,32 I.C0 Biot 0. 025 6,51 0,054 0,22 C0,52 1,71 C,82 Biet - Thio O. ICO0 9.CO 0,0C3 1,19 2.50 2.41 I.!S Gcl 0.037 5,88.I42 0,45 0.CO 0.64 0,29 CQcl+thlo 0.040 6.65 o.043 0,24. o.C0 0,0 1, CS M[ 0.039 6,13 0.01 00 0,00C 14 0,u.. 0, 0,C0 0,C0 0,,* l.+Tio 0.050 7. 60 0.05O3 0.40 0,C0 0,C0O 0,4 Casa 0,OC6 7,17 0.014 C00 023 1.'8 0.21 CasatThio 01, t0 9.20 0,110 1.400 2J3 0,13 3.83 : Biot 0,057 7,42 O.C094 0,10 0,42 1,35 0,27 Biot-.Thlo 0.189 10,00 0.183 1.020 2,835 0,CO 4,50 (cI e 0,06 1 6,35 0.074 0,046 0,C0 0.63 0,30 ,(cl+t'hiQ0,050 6,65 0.029 0,028 0,29 O.C0 t, O Comme le montrent les résultats rapportés dans les tableaux 4 et 5, les acides aminés et les peptides de différentes sources biologiques sont utilisés de manière plus efficace lorsqu'on ajoute du thiosulfate au milieu. En présence de thiosulfate, on observe une augmentation de la densité optique et/ou de la production d'acides gras volatils comme l'acétate, le propionate, l'iso-butyrate, et l'iso-valérate. Au contraire, ces activités sont limitées en l'absence de thiosulfate. Les tableaux 4, 5 et 6 montrent que l'ensemble des isolats sont capables d'utiliser de manière significative les peptides et les acides aminés. L'examen de ces trois tableaux montre pour ces souches de Thermoanaerobacter, en même temps qu'une croissance améliorée et une augmentation de la production d'acides gras, également une production de sulfure et une diminution des niveaux d'hydrogène. L'effet du thiosulfate sur l'oxydation de la bio-trypcase R par T. brockii et T. ethanolicus est illustré par les figures 6 et 7. Ces figures donnent respectivement, en fonction du temps en heures, la variation de la production d'acides gras volatils (acétate E; isobutyrate l; isovalérate A; propionate(0) et celle de la production de H2 ( O) et de H2S (3). Ces résultats mettent donc en évidence pour la première fois, que les membres du genre Thermoanaerobacter font une meilleure utilisation des peptides et des acides aminés en présence de thiosulfate. Leur aptitude à croitre sur des substrats tels que les acides aminés et/ou les peptides en présence de thiosulfate indique qu'ils peuvent croitre par mixotrophie, puisque utilisant à la fois l'hydrogène et un substrat organique. Tous les membres du genre Thermoanaerobacter étudiés sont en effet, stimulés par le thiosulfate et la réduction ultérieure du thiosulfate durant la fermentation des acides aminés et/ou des peptides, qui se traduit par une augmentation en sulfure d'hydrogène. On a de plus déjà rapporté que les membres du genre Thermoanaerobacter sont capables d'oxyder l'hydrogène en présence de thiosulfate, ce qui signifie que les hydrogénases pourraient jouer un rôle dans le procédé de réduction du thiosulfate. REVENDICATIONS 1) Procédé de culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles, anaérobies strictes, non sulfato- réductrices, en vue de la production de métabolites, plus spécialement d'enzymes, caractérisé en ce qu'on utilise dans des conditions d'anaérobiose stricte un milieu de culture renfermant comme agent de stimulation de croissance du thiosulfate. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est réalisée sur des substrats comprenant des sucres, tels que le glucose, ou le xylose ou des polymères tels que le xylane. 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la culture est réalisée sur des substrats peptides et/ou acides aminés. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de récupération des enzymes produites, suivie le cas échéant d'une étape de purification. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise des bactéries choisies parmi les Bacteria avec les membres du genre Thermoanaerobacter ou de l'ordre des Thermotogales. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre des Thermotogales, notamment comme celles des genres Fervidobacterium, Thermosipho et Thermotoga, Geotoga et Petrotoga. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la culture est réalisée à une température de 50 à 90 C, notamment de 60 à 80 C, à un pH de 5,0 à 9,0, notamment de 6,5 à 8,0, le thiosulfate étant mis en oeuvre à raison de 5 à 30 mM, en particulier de 15 à 25 mM. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est réalisé en continu ou en discontinu. 9) Procédé de production d'enzymes thermostables, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de bactéries thermophiles et hyperthermophiles en présence de thiosulfate comme défini ci-dessus et la récupération de ces enzymes du milieu de culture, suivie de leur purification si on le souhaite. 10) Procédé d'isolement de souches bactériennes thermophiles et hyperthermophiles, caractérisé par la culture de souches prélevées d'un milieu donné, dans des conditions anaérobies strictes, en présence de thiosulfate, sur support de peptides et/ou d'acides aminés, dans des conditions appropriées pour leur croissance, notamment pour la recherche de micro- organismes xylanolytiques, protéolytiques, amylolytiques ou cellulolytiques.