Brevet FR2726286A1 — publié le 19960503

La présente invention concerne un procédé d'amplification d'acides nucléiques en phase solide, ainsi qu'une trousse de réactifs utile pour la mise en oeuvre du procédé. La présente invention a également pour objet un procédé d'immobilisation d'une amorce sur phase solide. L'amplification sur une phase solide consiste en l'élongation, au cours d'une réaction de PCR ou d'autres types d'amplifications, telle que LCR, SDA etc... d'une amorce préalablement fixée à un support solide. Une telle technique permet d'obtenir un produit d'amplification dont un brin spécifique est attaché de façon covalente à la phase solide, sans avoir recours à d'autres étapes que la PCR Ceci permet d'effectuer la détectionr avant dénaturation sur de l'ADN double brin, ou après dénaturation sur un brin spécifique du produit d'amplification en enchainant PCR et détection sans changer de support. Des méthodes d'amplification d'acides nucléiques en phase solide ont été décrites dans WO 89/11546, AU 47144/89 et WO 93/09250. Ce type d'amplification sur support peut être très utile pour toutes les applications de diagnostic en biologie moléculaire, notamment pour la détection de cibles infectieuses ou de cibles génomiques. Cette technique permet de réduire les temps de détection de même que les risques d'erreurs, puisque l'échantillon n'est pas transféré d'un puits à un autre mais que toute l'expérience se passe sur le même support. Par ailleurs, pour toutes les applications ne nécessitant qu'un seul brin spécifique d'ADN, comme le clonage ou le séquençage, cette technique peut permettre un réel gain de temps et une grande facilité d'utilisation évitant beaucoup d'étapes intermédiaires. L'amorce participant à la PCR fixée par son extrémité 5' au support solide doit faire partie du brin que l'on souhaite allonger sur le support solide. L'extrémité 3' de l'amorce doit être libre, non modifiée et homologue à la cible pour permettre son extension par une polymérase. Toutefois, un inconvénient majeur de l'amplification en phase solide est le faible rendement de l'élongation sur la phase solide. Afin de diminuer les interactions stériques support solideoligonucléotides et d'améliorer l'accessibilité de la Taq polymérase à l'hybride formé par l'amorce fixée et le produit d'amplification complémentaire, un bras de liaison ou clinker est placé à l'extrémité 5' de l'amorce fixée. Ce bras de liaison est aussi appelé Zbras espaceur" car il sert à éloigner physiquement du support solide l'extrémité 3' de l'amorce fixée pour ne pas gêner la coopération des différents réactifs d'amplification avec l'amorce. On a découvert, selon la présente invention, que l'un des paramètres influençant le rendement d'élongation, réside dans le mode de fixation de l'amorce sur le support solide. Les nucléotides de l'amorce euxmêmes sont susceptibles d'être impliqués dans une fixation covalente avec le support dans les conditions de couplage utilisées entre le "linker" et le support solide, ce qui contribue au faible rendement d'élongation de l'amorce. Plus précisément, on a découvert que plus que la taille du bras de liaison, c'est la réactivité ou la mutiplicité des sites potentiels de fixation du bras de liaison sur le support qui augmente le rendement d'élongation de l'amorce. La présente invention a pour objet un procédé d'amplification d'acides nucléiques en phase solide dans lequel on utilise une amorce immobilisée sur un support solide thermo-résistant fonctionnalisé, caractérisé en ce que ladite amorce est immobilisée sur le support solide par l'intermédiaire d'un lien covalent entre le support solide et un groupe fonctionnel d'une molécule polyfonctionnelle, ladite molécule étant ellemême liée à l'extrémité 5' de ladite amorce. Plus précisément ladite amorce est immobilisée sur le support solide par l'intermédiaire d'un bras de liaison (ou "linker") consistant en un reste de ladite molécule polyfonctionnelle intercalé entre le support solide et l'extrémité 5' de l'amorce et établissant un lien covalent entre un groupe fonctionnel du support solide et un premier groupe fonctionnel de ladite molécule polyfonctionnelle, d'une part, et entre l'extrémité 5' de l'amorce et un deuxième groupe fonctionnel de ladite molécule polyfonctionnelle d'autre part. En augmentant le nombre de groupes fonctionnels dans le bras de liaison on augmente le rendement d'élongation. On pense que cela est dû au fait que l'on augmente ainsi la probabilité que la fixation sur le support solide se fasse par l'intermédiaire du bras de liaison, c'est-à-dire sans que l'amorce proprement dite, soit elle-même impliquée. On entend ici par groupe fonctionnel de ladite molécule polyfonctionnelle, un groupe susceptible d'établir un lien covalent avec le support solide. On cite en particulier, comme groupes fonctionnels, les groupes amine, hydroxyl, carboxyl, aldehyde, thiol ou phosphate. Lorsque le bras de liaison comporte un groupe très réactif tel qu'un groupe phosphate terminal à son extrémité non liée à l'amorce, il n'est pas nécessaire que la molécule polyfonctionnelle comporte un nombre élevé de groupes fonctionnels. Toutefois, de préférence ladite molécule polyfonctionnelle comporte au moins cinq, de préférence encore, au moins dix groupes fonctionnels. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite molécule polyfonctionnelle comprend un fragment polymère. De préférence chaque unité monomérique dudit fragment polymère comporte au moins un groupe fonctionnel. Dans ce cas l'augmentation de la taille du bras de liaison, c'est-à-dire du polymère, se traduit par l'augmentation du nombre de sites potentiels de fixation terminale de l'amorce et permet d'augmenter le rendement d'élongation et ce, alors que le taux global de fixation de l'amorce sur le support solide reste constant. De préférence le fragment polymère rajouté à l'extrémité 5' de ladite amorce comporte plus de 5 monomères de préférence encore plus de 10 monomères, notamment jusqu'à 50 monomères. Avantageusement ledit fragment polymère selon l'invention, comprend un fragment homopolynucléotidique ou un fragment d'un analogue de polynucléotides. On entend ici par analogue de polynucléotides" un polymère dont les unités monomériques sont reliées par un lien phosphodiester semblable au lien phosphodiester des polynucléotides naturels. En d'autres termes, il s'agit d'un polymère dans lequel les restes nucléosidiques des monomères nucléotidiques sont remplacés par des restes non nucléosidiques, notamment aliphatiques. On cite en particulier des fragments polymères de formule (I) suivante: dans laquelle R est un reste aliphatique, notamment de 2 à 20 atomes de carbone, tel qu'un reste alkylène, R comportant au moins un groupe fonctionnel selon l'invention et n est un entier notamment de 2 à 50. De préférence le fragment polymère de type analogue de polynucléotides selon l'invention comporte plusieurs groupes réactifs greffés sur chaque monomère, en particulier des groupes amine ou hydroxyl, dans ce cas n peut être plus particulièrement compris entre 2 et 10 seulement. Lorsque le bras de liaison consiste en un fragment homopolynucléotide, il comporte de préférence plus de 5 nucléotides, de préférence encore plus de 10 nucléotides notamment jusqu'à 50 nucléotides. Les analogues de polynucléotides selon l'invention, peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse similaires aux méthodes de synthèse d'ADN, notamment par synthèse automatique sur support solide. En effet, ces fragments polymères peuvent être obtenus par condensation des synthons monomériques adaptés aux procédés de synthèse nucléotidique impliquant l'utilisation de synthons phosphoramidites, c'est-à-dire un synthon comportant de façon classique deux groupes OH terminaux, protégés, I'un par un groupe Diméthoxytrityl (Dmtr) et l'autre par un groupe phosphoramidite. Le fragment polymère de type analogue de polynucléotide correspond alors à la condensation de synthons similaires aux synthons nucléotidiques classiques dans lesquels le reste nucléosidique divalent en 5' et 3', est remplacé par un reste aliphatique, notamment alkylène. Plus particulièrement, pour obtenir les fragments de polymères analogues de polynucléotides de formule (I), on peut utiliser des synthons phosphoramidites de formule: Ainsi lorsque le bras de liaison est un fragment polynucléotide ou analogue de polynucléotide, on peut avantageusement préparer directement par synthèse de type nucléotidique le bras de liaison ou l'amorce conjugée au bras de liaison, ledit conjugué étant ultérieurement couplé au support solide selon l'invention. Le fragment polymère, notamment homopolynucléotide ou analogue de polynucléotides, peut être un fragment ramifié, c'est-à-dire comportant plusieurs branches. Ce type de fragment peut être obtenu en utilisant un monomère pouvant servir de base à la condensation avec plusieurs monomères sur le même synthon. On cite en particulier le synthon phosphoramidite suivant (Ref. 525S1 de Clontech) qui peut servir dans le procédé de synthèse du type synthèse automatique d'ADN et peut se condenser avec deux monomères en parallèle. Avantageusement, ledit polymère et en particulier le fragment homopolynucléotidique ou analogue de polynucléotide intercalé entre le support solide et l'amorce comporte à son extrémité qui n'est pas liée à l'amorce, un groupe fonctionnel terminal réactif pouvant établir un lien covalent avec le support solide. On cite en particulier comme dit groupe fonctionnel terminal réactif du fragment polymère, un groupe hydroxyl ou une amine et de préférence encore un groupe phosphate. L'utilisation d'un groupement phosphate terminal est particulièrement recommandée lorsque le bras de liaison est un poly-T. En l'absence de groupe phosphate, un bras de liaison poly-A ou poly-C est plus efficace. Les méthodes de synthèse automatique d'ADN sur support solide permettent de phosphoryler chimiquement l'extrémité 5' terminale de quantités importantes d'oligonucléotides. On peut donc par ces méthodes préparer des bras de liaison de type homopolynucléotides ou analogues de polynucléotides ou des conjugués de ces bras de liaison et de l'amorce, phosphorylés à l'extrémité 5' du bras de liaison. Selon l'invention, le support solide est constitué de polymère organique ou inorganique fonctionalisé. Selon la présente invention certaines caractéristiques du support solide sont avantageuses pour pouvoir allonger une amorce oligonucléotidique fixée à un support solide en un produit d'amplification. Tout d'abord, ce support solide doit être thermo-résistant, c'est-à-dire capable de résister aux fortes températures d'une PCR (100"C) et doit avoir une bonne conduction thermique. Il doit être fonctionalisé, c'est-à-dire comporter des fonctions chimiques, afin de permettre la fixation stable d'une amorce oligonucléotidique sur le support solide. Cette liaison amorce-support solide doit être également résistante aux fortes températures. C'est pourquoi selon la présente invention, une liaison covalente est préférée. La Taq polymérase ou autre enzyme responsable de l'élongation ne doit pas être inhibée par des composants du support. Enfin, un tel support doit avoir des propriétés optiques permettant une détection colorimétrique ou fluorescente sans bruit de fond. Un support transparent est préféré car il permet l'utilisation de tous les types de lecteurs. On utilise donc de préférence des types de plastique qui possèdent une grande résistance aux fortes températures. On cite en particulier les matières plastiques, notamment à base de polystyrène modifié thermorésistant, de copolymère styrène-acrylonitrile, de polycarbonate, de polypropylène ou de verre. On peut utiliser des supports plastiques solides fonctionalisés par traitement UV pour induire l'apparition de groupes fonctionnels NH2 (ref. 1). Toutefois, selon la présente invention, le support solide peut être un support polyfonctionalisé c'est-à-dire comportant une multiplicité de groupes fonctionnels, notamment aldéhyde, carboxyl, amine, hydroxyl ou thiol qui favorisent l'établissement d'un lien covalent stable avec le bras de liaison consistant dans ladite molécule polyfonctionnelle liée à l'amorce. De façon appropriée, on utilise des supports plastiques qui ont été traités par traitement corona ou irradiation gamma pour induire l'apparition d'une multiplicité de groupes fonctionnels. Ce type de traitement est aisé et évite l'utilisation de réactifs chimiques de fonctionalisation. Comme support thermo-résistant préféré on utilise en particulier du polycarbonate ou un copolymère de styrène-acrylonitrile fonctionalisés entre autre par traitement corona ou irradiation gamma. Des méthodes de fixation covalente d'oligonucléotides sur des supports solides fonctionalisés par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel terminal de l'oligonucléotide sont connues (Réf. 1 à 5). Toutefois, selon l'invention, les fragments homopolynucléotidiques peuvent se fixer sur le support solide par les groupes fonctionnels naturels, notamment amine et hydroxyl des bases nucléotidiques ellesmêmes, ou par un groupe fonctionnel terminal notamment phosphate. De même les fragments de type analogue de polynucléotides peuvent aussi se fixer sur le support solide par un groupe terminal ou l'un des groupes fonctionnels, notamment amine ou hydroxyle substitués sur les monomères. Ce couplage entre les groupes fonctionnels du bras de liaison, notamment du fragment homopolynucléotidique ou analogue de polynucléotides, et les groupes fonctionnels du support peut se faire par couplage chimique en présence d'agents d'activation conventionnels. En particulier on réalise un couplage chimique à un support polyfonctionnel en présence d'un agent d'activation de type carbodiimide, telle que l'EDC. La présente invention a également pour objet un procédé d'immobilisation sur phase solide d'une amorce utile dans la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon la présente invention, caractérisé en ce que l'on réalise un couplage covalent entre ledit support fonctionalisé et ladite molécule polyfonctionnelle liée à l'extrémité 5' de ladite amorce. Le support solide peut être la surface intérieure du récipient de réaction de PCR, ou un élément solide que l'on introduit dans le récipient avant la réaction, tel que des billes. On cite en particulier comme support solide les surfaces intérieures des puits de microplaques de microtitrage ou des tubes de dosages. Le format préféré est celui de la microplaque. En effet, sa large utilisation et tous les appareils existant déjà autour de ce format en permettent rapidement et aisément l'automatisation. Deux types de microplaque sont couramment utilisés. Le premier est de type standard avec des cupules cylindriques à fond plat. Le second comporte non pas des cupules cylindriques comme précédemment, mais des puits en forme de petit tube tronqué à fond plat. Cette forme de tube permet de s'adapter facilement au cycleur thermique et permet une excellente conduction thermique. La présente invention a également pour objet un procédé d'immobilisation sur phase solide d'une amorce utile dans la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon la présente invention, caractérisé en ce que l'on réalise un couplage covalent entre ledit support fonctionalisé et ladite molécule polyfonctionnelle liée à l'extrémité S' de ladite amorce. L'amplification en phase solide permet d'effectuer l'amplification et la détection sur le même support. La détection du produit d'amplification allongé sur la surface solide peut se faire de différentes façons. Le double brin fixé au support peut être détecté soit par la mise en évidence d'un marqueur incorporé lors de la PCR, notamment par l'intermédiaire d'une deuxième amorce marquée, soit par l'utilisation d'un agent intercalant de type bromure d'éthidium, YOYO, TOTO, POPO (Molecular Probes Réf. 6 à 8). Après dénaturation, le simple brin spécifiquement fixé au support solide peut etre également détecté par une sonde marquée. La détection consiste par exemple en l'hybridation d'une sonde oligonucléotidique biotinylée qui reconnaît spécifiquement le produit d'amplification allongé sur la plaque. Un conjugué Streptavidine-Alkaline Phosphatase reconnaît l'entité biotine de la sonde hybridée et génère après déphosphorylation d'un substrat, un produit colorimétrique ou fluorescent. Le mode de fixation de l'amorce selon la présente invention est déterminant pour l'élongation. En effet, si celle-ci possède un bras de liaison selon l'invention, le rendement d'élongation peut être augmenté de 15 fois suivant le type de bras, alors que le taux de fixation demeure constant quelque soit le bras de liaison. La quantité d'amorce présente en solution dans la réaction d'amplification joue elle aussi un rôle important pour le rendement d'élongation. Afin d'avoir un rendement optimal d'élongation de l'amorce fixée, une PCR déséquilibrée est utilisée ( Réf. 9). Lors de la PCR, l'amorce fixée au support solide (amorce A) est également présente en solution mais en quantité inférieure, notamment 8 à 16 fois moins importante que l'autre amorce d'amplification (amorce X). L'amplification s'effectue en deux étapes ; l'amplification est d'abord exponentielle jusqu'à ce que l'amorce A en solution soit épuisée, les amorces A fixées au support solide sont ensuite allongées, l'amplification devient alors arithmétique. La première étape permet d'avoir un nombre de copies important, et permet ainsi une élongation sur le support solide plus efficace.La quantité d'amorce mis en solution est critique car elle détermine à quel moment l'amplification arithmétique commence. Une quantité de l'ordre de 5 à 10 pmole pour l'amorce X et de 8 à 16 fois moins pour l'amorce A donne de bons rendements d'élongation. Le procédé d'amplification selon la présente invention apporte une réelle amélioration par rapport aux techniques habituelles de diagnostic utilisant la PCR, que ce soit pour les maladies infectieuses ou génétiques. Par ailleurs, le procédé selon l'invention permettant d'attacher spécifiquement un seul brin à la phase solide, il peut être aussi intéressant pour le séquençage, spécialement lorsque de grosses quantités doivent être séquencées et qu'une simplification des protocoles et une automatisation s'avèrent indispensables. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de l'exemple détaillé de réalisation qui va suivre. La figure 1 représente les différentes étapes de la PCR en phase solide. X : amorce X en solution : : amorce A en solution X=======A : produit d'amplification vvvA : amorce A fixée La figure 2 représente le rendement de fixation en pM de l'amorce en fonction de différents bras de liaison. La figure 3 représente les taux d'élongation en unité de fluorescence en fonction de différents bras de liaison. La figure 4 représente le rendement d'élongation en fMole d'antisonde hybridée. La figure 5 représente l'influence de la taille du bras de liaison sur le taux d'élongation. La figure 6 représente l'influence de différentes fonctions chimiques du bras de liaison sur le taux d'élongation. Le procédé selon l'invention a été appliqué sur un modèle HLA-DRB (Réf. 10 et 11). Des clones de M13 comportant un insert de 280 pb correspondant au produit d'amplification ont été utilisés comme cible. Ce modèle HLA-DRB a permis de mettre en évidence les paramètres importants intervenant dans l'élongation et d'étudier tout particulièrement le problème de spécificité de cette technique. 1) Exemples de différents bras de liaison utilisés. A, A-Ph A-ST, A-1OT A-20T A-30T A-ST-Ph, A-1OT-Ph A-SA, A-1OA A-SA-Ph, A-1OA-Ph A-SC, A-1OC A-SC-Ph, A-tOC-Ph A = amorce fixée : CCCCACAGCACGTETC(T,C)TG Ph = Groupement phosphate 5' terminal xT, xA, xC = queue en position 5' terminal de x base T, de x base A ou de x base C respectivement. On a aussi utilisé (figure 6) les bras de liaison comprenant des fragments polymères du type analogues de polynucléotides: A- NH2 A-ST-S NH2* A- (TEG)3* A- (TEG)3tPh Le bras - NH2* correspond ici à un bras alkyl aminé introduit via le synthon Unilink&commat; Amino Modifier de Clontech de formule Le bras - ST - S NH2* correspond à la condensation successive de S nucléotides T puis 5 synthons Unilink dans une synthèse du type phosphoramidite. La condensation de synthons Unilink conduit à un fragment analogue de polynucléotide avec des restes alkylamines greffées sur les monomères. - (TEG)3* correspond à la condensation du synthon de Glen Research (Ref: 10 -1909 x) de formule: - (TEG)3* - Ph est obtenu par une phosphorylation en 5' terminale du conjugué A - (TEG)3* selon la synthèse phosphoramidite. 2) Support solide Deux types de support thermo-résistants polyfonctionalisés fournis par la société Nunc, ont été utilisés pour effectuer l'évaluation des différents bras de liaison. Le type I est un polystyrène modifié thermorésistant et le type II est un copolymère styrène-acrylonitril. Ils ont un format de microplaque et sont mis à cycler dans un thermocycleur fournis par Nunc. Ces supports plastiques ont été fonctionalisés par un traitement Corona ou irradiation gamma, qui consiste de façon classique à envoyer des décharges électriques dans une enceinte à atmosphère controlée et à pression fixe. Cette fonctionalisation permet de rendre le support plastique capable de fixer des amorces oligonucléotidiques. Ce traitement fait apparaitre, à la surface du plastique, des groupements fonctionnels de type amine, alcool, aldéhyde, cétone, acide carboxylique, thiol... qui réagissent chimiquement avec l'oligonucléotide pour former une liaison stable. Les types de liaisons formées, quoique très thermorésistantes, sont toutefois pour l'instant mal connues. On réalise le couplage chimique en présence d'un agent activateur selon le protocole suivant. 10 à 100 pmole d'oligonucléotides sont mis à fixer par puits en présence d'éthyl carbodiimide (EDC) 10 à SOmM final et de N-Méthyl Imidazole 10 à 50mM final pH 7, dans un volume final de 100 Fl. Les plaques sont incubées 5 à 15 heures à 50 C puis lavées 4 fois avec une solution 0,4 N NaOH et 0,25 % tween 20 chauffées à 50"C. 3) Elongation de l'amorce sur la phase solide L'élongation se fait dans un volume final de 50 Fl par puits. L'ADN cible 15 à 100 ng est amplifié dans un mélange comprenant du tampon 1X PCR Buffer II (Perkin Elmer), 0,25 mM MgCl2 (Sigma), 200 'LM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia), 80 ng d'amorce X (CCGGCACTGTGAAGCTCT) et lOng d'amorce A avec ou sans linker et 1,2 unité de Taq polymérase (Perkin Elmer). L'amorce X se trouve en solution uniquement alors que l'amorce A est fixée au support solide et en solution.L'amplification se fait sur un thermocycleur adapté au format microplaque en utilisant la méthode suivante: cycle 1: S min. à 94"C cycle 2 à 30: 30 sec à 94 C 30 sec. à 55"C 30 sec. à 72C cycle 31: 5 min. à 72C 4"C La figure 1 représente les différentes étapes de la PCR en phase solide. Après amplification, les produits d'amplification allongés sur la phase solide sont dénaturés. Les puits sont vidés puis lavés 3 fois avec de la soude 0,4M pendant 10 min. 4) Détection Deux types de détection ont été utilisés. Une détection enzymatique semisuantitative et une détection radioactive quantitative. La détection enzymatique se réalise comme décrit dans la littérature (9). Dans cette méthode, après dénaturation lpM de sonde biotinylée complémentaire à une région du brin allongé sur le support solide est hybridée. L'hybride est révélée par un conjugué streptavidine - alkalyne phosphatase qui transforme un substrat en un produit colorimétrique fluorescent ou chimiluminescent. Pour la détection radioactive, une sonde marquée au P32 est hybridée sur le brin allongé au support solide et la radioactivité est comptée dans un compteur ss. S) Résultats La capacité de fixation de l'amorce sur le support solide a été quantifiée par fixation d'amorces kinasés radioactivement en 5' et a permis de montrer que le type I fixait de l'ordre de 1 pM d'amorce par puits, tandis que le type II fixait 0,2 pM. La figure 2 représente la capacité de fixation de l'amorce aux deux supports microplaque en fonction des différents types de bras de liaison. Pour untype de support donné, la capacité de fixation ne varie pas de façon significative en fonction des bras utilisés. Par contre, le rendement d'élongation varie énormément en fonction du bras de liaison employé. Les résultats sont présentés aux figures 3 et 5 qui représentent les taux d'élongation des supports en fonction des différents bras utilisés. L'influence du bras attaché à l'amorce est déterminante pour le rendement d'élongation qui peut être augmenté de 15 fois suivant le type de linker utilisé, le taux de fixation demeurant constant. Les fragments poly-A et poly-C sont plus efficaces que les poly-T. En effet, pour des bras de liaison de même taille ils donnent, pour l'élongation, des signaux plus forts. L'ajout d'un groupement phosphate améliore toujours le rendement d'élongation et cette augmentation est plus sensible avec les bras de liaison poly-T qu'avec les bras de liaison poly-A ou poly-C. L'élongation a été quantifiée indirectement par hybridation de sondes radioactives complémentaires à la partie allongée par PCR. Le taux d'hybridation a été vérifié en hybridant des sondes radioactives à des puits ayant une quantité connue d'amorces fixées. Le taux d'élongation varie suivant le type de bras de liaison utilisé, entre 2fM et 38fM ou entre 1fM et 17 fM pour type I et type II, respectivement. Ces résultats sont présentés à la figure 4. La présence de plusieurs groupes fonctionnels au sein du bras de liaison permet d'augmenter le taux d'élongation de l'amorce fixée au support solide. Ainsi comme le montre la Figure 6, on remarque une augmentation de 45 % l'orsqu'on intercale lOT entre l'amorce et un groupement phosphate terminal. De même, le fait de rajouter une fonction phosphate à un bras de liaison (TEG)3t permet d'augmenter le signal de 40 % et de 350 % par rapport à l'amorce seule sans bras de liaison. Le même phénomène est constaté lorsqu'un bras 5T5NH2* est utilisé, le taux d'élongation est augmenté de 110 % par rapport à un bras NH2*. L'utilisation de plusieurs fonctions chimiques différentes permet donc de favoriser l'élongation de l'amorce sur la phase solide en augmentant les types de liaisons terminales. La quantité d'oligonucléotides allongées est en fait très faible par rapport à la quantité fixée sur le support. Malgré cette faible quantité, on parvient à des rapports signal sur bruit de l'ordre de 30 avec la technique de détection enzymatique décrite ce qui est tout à fait suffisant pour une application diagnostique. BIBLIOGRAPHIE 1. ' Biochem. 198, 138-142, (1991). 2. ' G. H. KELLER, et al. Anal. Biochem. 177, 27-32 (1989). 3. ' Nucleic Add Res. Vol. 15, Num.7, 2891-2909, (1987). 4. 'détection of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma from high risk pediatric patients by using the self sustained sequence replication reaction". C.E Bush, J. Clin. Microbiol. 30, 281-286, (1992). S. iGenetic analysis of amplified DNA with immobilized sequencespecific oligonucleotide probes". R.K. Saiki, et al. pNAS 86, 6230-6234 (1989). 6. "Use of the fluorescent dye YOYO-1 to quantifie oligonucleotides immobilized on plastic plates". M. Ogura, et al. Biotechniques 16, 1032 (1994). 7. 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Procédé d'amplification d'acides nucléiques en phase solide dans lequel on utilise une amorce immobilisée sur un support solide thermorésistant fonctionnalisé, caractérisé en ce que ladite amorce est immobilisée sur le support solide par l'intermédiaire d'un bras de liaison consistant en une molécule polyfonctionnelle établissant un lien covalent entre le support solide et un premier groupe fonctionnel de ladite molécule polyfonctionnelle, et entre l'extrémité S' de ladite amorce et un deuxième groupe fonctionnel de ladite molécule polyfonctionnelle. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite molécule polyfonctionnelle comprend un fragment polymère. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque unité monomérique dudit fragment polymère comporte au moins un groupe fonctionnel. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit fragment polymère comporte au moins S de préférence au moins 10 monomères. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits groupes fonctionnels de la molécule, notamment du fragment polymère sont choisis parmi les groupes amine, hydroxyl, carboxyl, aldehyde, thiol ou phosphate. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits groupes fonctionnels sont choisis parmi les groupes amine, hydroxyl ou phosphate. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite molécule polyfonctionnelle comprend un fragment polymère de type homopolynucléotide ou un fragment d'un analogue de polynucléotide. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fragment polymère est un homopolynucléotide comportant entre 10 et 50 nucléotides. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite molécule polyfonctionnelle comprend un fragment polymère analogue de polynucléotide de formule: où R est un reste aliphatique portant au moins un groupe fonctionnel et n est un entier de 2 à 50. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit fragment polymère analogue de polynucléotide comporte plusieurs groupes amine ou hydroxyl greffés sur chaque monomère. 11. Procédé selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que le fragment polymère comporte un groupe phosphate terminal à son extrémité qui n'est pas liée à l'amorce. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le support solide est constitué d'un polymère organique ou inorganique. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le support solide est un matériau plastique thermo-résistant fonctionnalisé par traitement corona ou irradiation gamma. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le support solide est constitué par du polystyrène modifié thermorésistant tel qu'un copolymère styrène-acrylonitrile ou du polycarbonate. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'amorce fixée au support solide est également présente en solution, mais en quantité moins important que l'autre amorce en solution lors de la réaction d'amplification. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'amorce fixée au support solide est également présente en solution en quantité 8 à 16 fois inférieure à celle de l'autre amorce en solution. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le support solide est constitué par la surface intérieure du récipient dans lequel on effectue l'amplification. 18. Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comporte ledit support solide sur lequel est immobilisée une amorce par l'intermédiaire d'un lien covalent avec unedite molécule polyfonctionnelle notamment undit fragment polymère. 19. Procédé d'immobilisation sur phase solide d'une amorce utile dans la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'on réalise un couplage covalent entre ledit support fonctionalisé et ladite molécule polyfonctionnelle liée à l'extrémité 5' de ladite amorce