Brevet FR2727679A1 — publié le 19960607

La présente invention concerne de nouveaux composés apparentés à la famille des lipopolyamines, des compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications pour la transfection in vivo etlou in vitro d'acides nucléiques. De nombreuses maladies génétiques sont associées à un défaut d'expression et/ou une expression anormale, c'est à dire déficiente ou excessive, d'un ou plusieurs acides nuciéiques La thérapie génique a pour principal objectif de corriger ce type d'anomalies génétiques par le biais de l'expression cellulaire in vivo ou in vitro de gènes clonés. Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance intracellulaire de ce type d'information génétique. L'une d'entre elle, en particulier, repose sur remploi de vecteurs chimiques ou biochimiques. Les vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires. Un progrès important a été accompli dans ce mode de transfection avec le développement d'une technologie basée sur remploi d'un lipide cationique. ll a ainsi été mis en évidence qu'un lipide cationique chargé positivement, le chlorure de N-[1-(2,= dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (D(IIMA), interférait, sous la forme de liposomes ou de petites vésicules, spontanément avec de l'ADN. qui est chargé négativement, pour former des complexes lipides ADN, capables de fusionner avec les membranes cellukires, et permettait ainsi la délivrance intracellulaire de l'ADN. Toutefois, bien que cette molécule soit efficace au niveau de la transfection, elle présente le désavantage d'être non biodégradable et de posséder un caractère toxique à l'égard des cellules. Depuis le DOTMA, d'autres lipides cationiques ont eté développés sur ce modèle de structure : groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer". Parmi ceux-ci, on peut plus particulièrement citer ceux comprenant à titre de groupement Lipoile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à à titre de groupement amino, un groupement d'anunonin quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques.D'autres composés, corme les DOSC et ChOSC, se caractérisent par la présence d'un groupement choline à la place du groupement d'ammonium quaternaire En général, I'activité transfectante de ces composés demeure toutefois assez faible Une autre catégorie de lipides cationiques, les lipopolyamines, a également été décrite. Dans ce type de composés, le groupement cationique est représente par le radical L-Scarboxyspermine qui contient quatre groupements d'a-oniuml deux primaires et deux secondaires. Les DOGS et DPPES en font notamment partie Ces lipopolyamines sont tout particuliérement efficaces pour la transfiction de cellules endocrines primaires. En fait, un agent de trfection synthétique idéal devrait présenter un haut niveau de transfection, et ce pour un large spectre de cellules, posséder une toxicité nulle ou à défaut une toxicité três minimisée aux doses d'utilisation, et enfin, être biodégradable pour s'affranchir de tout effet secondaire au niveau des cellules traitées. La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés susceptibles d'être utilisés efficacement dans la tranjection in vitro et ou in vivo de cellules et notamment pour la vectorisation d'acides nucléiques. Elle a pour premier objet des lipopolyamines, sous forme D, L ou LD et leurs sels, représentées par la formule générale I: dans laquelle - m est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclusivement, - n est un nombre entier compris entre 1 et 9 inclusivement et plus préférentiellement entre 1 et 5 avec un et unique groupement R différent de l'hydrogène présent dans la formule générale et des valeurs de m variables ou identiques au sein des différents groupements - R représente un atome d'hydrogéne ou un radical de formule générale II:: dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène -(CH2)q- avec q égal à 0, 1,2 ou 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en CI à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C1à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment run de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22 D'un intérêt tout particulier sont les composés avec R de formule générale II' dans laquelle R3, R4, R5, R6 et p répondent aux définitions précédentes et X représente un atome d'oxygne ou un groupement -(CH2)q- avec q étant égal å zéro. Cette famille de composés se catactense notamment par la présence dtme liaison ester interne, intéressante sur le plan de la biodégradabilité. A titre de lipopolyamines préférées selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner les composés suivants: H H 10 a1phaòleste HNH sous la forme D, L, DL au l'un de leurs sels. La présente invention a également pour objet toute application thérapeutique des lipopolyammes selon l'invention, soit directement, soit au sein de compositioas pharmaceutiques. Comme explicité précédemment, les composés de formule générale I s'avèrent tout particulièrement intéressants pour la transfection in vitro et in vivo d'acides nucléiques. Ils compactent efficacement RADON et présentent avantageusement une toxicité très réduite voire nulle à l'égard des cellules traitées. En outre, ils sont biodégradables notamment par hydrolyse de leur liaison ester. Pour obtenir un effet maximal des compositions de l'invention, les proportions respectives du composé de formule générale I et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de manière à ce que le rapport R, charges positives de la lipopolyamine considérée par charges négatives dudit acide nucléique soit optimal Ce rapport optimal variant en particulier selon le mode d'utilisation à savoir in nvo ou in vitro et selon le type cellulaire à transfecter, il est optimisé au cas par cas. Cette optimisation relève de la compétence de l'homme de l'art. Dans les compositions de la présente invention. le polynucléotide peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquenoes synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d' igme humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la rnfieoon chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peut par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques. Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule ciMe [c'est-à-dire un produit qui est normalement expimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente auclme pathologie). Dans ce cas, rexpression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification. ou encore de surexprimer ladite protéine.Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans h cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire, Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hamones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance. les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou où enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation :Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres traspOrurs protéiques, les enzymes du métabolisme, etc. L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la tran-ption d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des rlbozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201). Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou ranimai une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de trens immunothérapeutiques appliqués à l'honlne ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. n peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EF > 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres vins ou encre spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant rexpression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. n peut s'agir des séquences qui -t naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. n peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraw.Par exemple, il peut s'agir de séquences promo(rices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. ll peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou réprsssible. Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en p.rti-irr en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérti synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également stagir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielia L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne des compositions comprenant un acide nucléique, une Lipopolyamine telle que reeendiquêe et un adjuvant capable de s'associer au complexe lipopolyamine/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La demanderesse a en effet montré que le pouvoir transfectant des lipopolyamines peut être de manière inattendue augmenté en presse de certains adjuvants (lipides ou protéines par exemple), capables de s'associer au complexe lipopolyamine/acide nucléique. Plus préférentiellement, les compositions de l'invention adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport R est faible. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et, de manière surprenante, de favorrrer la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane. Plus préférentiellement, les lipides neutres utilises dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. ll peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), 1' oléoyl-palmitoylphos phatidylêthanolamine (POPE), les di-staroyl, -paimftoyl, -mirtyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2). Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple: le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry). Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,1 à 20 équivalents d'adjuvant pour un équivalent de composé de formule générale I et, plus préférentiellement, de 1 à 5. Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de invention cottiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). n peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particuliérement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. La présente invention fouit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un acide nucléique apte à corriger ladite maladie associé à un composé de formule générale I dans les conditions définies ci-avant. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou nucléique et l'acide nucléique administré code pour ledit produit protéique ou contient ledit produit nucléique. Elle s'étend à toute utilisation d'une lipopolyamine selon l'invention pour h transfection in vivo ou in vitro de cellules. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. ABREVIATIONS ET SYMBOLES AcOEt : Acétate d'éthyle BOP : Benzotriazol-1-yloxytris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate DCC : Dacydohex-bodilmide DCU : Dicyclohexylurée DMAP : 4-Diméthylaminopyridine DMF : Diméthylformamide DMSO : Diméthyle sulfoxide DODA : Dioctadécylamine EP : Ether de pétrole EtOH : Ethanol NEt3 : Triéthylamine Rf : Coefficient de rétention frontal TFA : Acide trifluofoacétique THF : Tétrahydrofurane TMS : Tétraméthylsilane UV : Ultra-Violets MATERIEL Er METHODES A.Produits utilisés La DODA, la NEt3, le TFA, la L-ornithine, l'hydroxyde de tétraméthylammonium, le nickel de Raney, l'anhydride diglycolique proviennent de chez Fluka ; le BOP, de Propeptide Fracce; la DMAP, le chloroformate d'isobutyle et la N-méthylmorpholine, de chez Aldrich. Le 'fliF provient de chez Merck ; tous les autres solvants utilisés sont des produits RP Prolabo. Les solutions de NaCl, de NaHCO3 sont saturées ; la solution de KHSO4 est à 0,5 M. B. Mesures physiques Les spectres de résonnance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H ) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au TMS. C. Chromatographies sur silice Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d'épaisseur. Révélations: - Aux UV (254nm) - A la ninhydrine, en vaponsant (spray léger) une solution éthanolique de ninhydrine (40 mg/ 100 ml EtOH) pour révéler les amines ou les amides en chauffant à 150 C. - A la fluorescanine, en vaporisant une solution (40 mg / 100 ml Acétone) pour révéler les amines primaires. - A l'iode, en recouvrant la plaque de poudre d'iode. .Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,063-0,200 mm. EXEMPLE 1. Synthèse du (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-aminopropylamino)-pentyle. 1.a Preparation du 2,5-Bis-(2-cyano-éthylamino)-pentanoate de tétraméthylammonium(1.a) Du monohydrochlorure de l'acide(s)-2,5-diaminopentanoïque (L-ornithine) $(6,74g; 40 mmol) et de l'hydroxyde de tétraméthylammonium pentahydraté (14,48g, 80 mmol) sont mis en solution dans du méthanol (20 ml). L'eau formée et le méthanol sont évaporés sous pression réduite (à l'aide d'une pompe à huile) de manière à obtenir un résidu sec. Du N,N-diméthylformamide (30 ml) est ajouté aux sels précédemment obtenus. Le mélange est dégazé avec de l'azote, puis agité fortement pendant dix minutes, ce qui permet au 2,5-diamino pentanoate de tétraméthylammonium de se solubiliser ne chlorure de tétraméthylammonium reste en suspension dans le DMF). L'acrylonitrile (6ml; 85,6 mol) est ajouté goutte à goutte; le ballon se réchauffe légèrement Le mélange réactionnel est laissé 1h à température ambiante, sous azote. Il est ensuite filtré pour éliminer le chlorure de tétraméthylammonium. Le DMF est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est un liquide huileux ; retiré de l'évaporateur rotatif, il se solidifie. De l'acétonitrile (100 ml) est ajouté et le ballon est légèrement chauffé jusqu'à obtention d'une solution translucide. Du 'fliF est ajouté jusqu'à obtention d'une solution trouble. Le ballon est stocké pendant deux jours au congélateur; le sel de tétraméthyl-ammonium du L-2,5-Bis-(2-cyano-éthylamino)- pentanoique de l'acide est récupéré par filtration sous forme de solide blanc fl est rincé au 'fliF sur fritté, puis séché sur P2O5. 6,06 g sont obtenus, soit un rendement de 49 % (brut). 1.b Preparation du sel de tétraméthyl ammonium de l'acide 2.5-Bis-(3-ammopropylamino)-pentanoïque (1.b) Le produit 1.a est solubilisé dans un mélange d'éthanol (18 ml), d'eau (2 mV et de potasse 2 M (5 ml). La solution est purgée à jargon. Du Nickel de Raney (2 ml de la suspension Fluka) est ajouté. L'hydrogénation est réalisée dans une autoclave, purgée à l'azote, à 260C. En 3h, la pression est passée de 50,6 bars à 44,7 bars, puis s'est stabilisée plus d'une heure. L'autoclave fait 250 ml et le mélange réactionnel, 30 mt La suspension obtenue est filtrée, rincée à l'eau et passée à l'évaporateur rotatif. Une huile jaune est obtenue. Le test à la fluorescamine est positif. 1.c Préparation de acide 25-Bis- tert-butoxvcarbonvl- 13-(tert butoxycarbonyl amino)-propyl]-amino}-pentanoïque (1.c) Le produit 1.b est dissous dans du dioxanne (30 ml). Du diterbutyldicarbonate (17,46g ; 80 mmol) est ajouté goutte à goutte. Le mélange est agité pendant une nuit. Le dioxanne est évaporé. Du KHSO4 est ajouté. Le produit est extrait par CHCl3 (3 x 100 ml). La phase organique est ensuite lavée successivement avec NaHCO3 (pH=7,5), NaCl, puis séchée sur MgSO4 et évaporée sous pression réduite. 10 g de produit sont obtenus (15,4 mmol, soit un rendement de 39% par rapport à l'ornithine). CLHP: MeCN/H2O: 0-3 min 50 % MeCN; 3-20 min 50-100 % MeCN, 2040 min 100 % MeCN, K'= 7.96 (Colonne RP-18, debit=1 ml/min) CCM: Rf (CHCl3: AcOEt; 95 : 5 (v: v)) =0,28 RMN(ppm): 1,3 (m, 8H, N+CH2-CH2-CH2-CHN+COO/ 2x N+CH2CH2CH2N+); 2,7-3.0 (m, 10 H 5x N+CH2); 3,8 (t, 1H, N+CHCOO) MS:MH+= 647, (PM= 646) 1.d Preparation du 2.5-Bis-{tert-butoxycarbonyl-[3-(tert butoxycarbonylamino) propyl]-amino}-pentan-1-ol (1.d) La L-5-carboxytétratert-butoxycarbonylspermine (1,94g; 3 mmol) est dissoute dans 30 ml de THF. 370 ml (3,1 mmol) de N-méthylmorpholine sont introduits à la micropipette. Le mélange réactionnel, mis sous azote, est refroidi à 15 C (dans un bain de carboglace et d'éthylène glycol ; 390 ml (3,1 mmol) de chîoroformate d'isobtle sont alors ajoutés. Au bout de trois minutes, le mélange réactionnel est versé dans un becher contenant le NaBH4 (2g) dissous dans 20 mi d'eau à 4 C. Le THF est évaporé. Du KHSO4 est ajouté (jusqu'à Ph=7).Le produit est extrait à l'AcOEt, rincé au NaHCO3, NaCl, séché sur MgSO4, filtré puis évaporé. 1,15g sont obtenus, soit un rendement de 61%. La CCM conduit à deux tâches ; une séparation sur colonne de silice, avec le même éluant, est donc réalisée et conduit à 0,97g de produit (huile jaune). Le rendement de la séparation est de 84 %. Le rendement de la réduction est de 51 %. CCM: Rf (EP: AcOEt; 1: 1 (v: v )) =0,24 RMN (ppm) : 1,42 (s, 4xBoc); 1,5-1,7 (m, 8H N+CH2-CH2-CH2-CHN/ 2x N+CH2CH2CH2N); 2,85-3,2 (m, 10H 5x NCH2), 3,4 (m, 1H, NCHCH2OH), 3,7 (d, 2H, CH2OH), 6.8 (m, 2H; NH) MS: MH+= 633, PM= 632 1.e Préparation de l'acide 2.5-Bis-[3-(tert-butoxycarbonylamino)-propyl]-{tert butoxycarbonylaminol-pentyloxycarbonylméffioxy-acétique (1.e) e) 0,51 g (0,806 mmol) du produit 1.d sont dissous dans 10 ml de CH2Cl2 ; 2 équivalents d'anhydride diglycolique (1,535 mmol ; 0,178 g), 2,2 équivalents de triéthylamine (1,687 mmol; 235 l) ainsi que 5 mg de DMAP sont ajoutés. Au bout d'une heure, la C.C.M. montrant que l'alcool a réagi, le mélange est additionné de CH2a2, puis lavé par 3 x 50 ml de KHSO4, 3 x 50 ml de NaCI, séché sur MgSO4, filtré puis évaporé. 0,26 g de solide sont obtenus, soit un rendement de 43 to. CCM: Rf (CHC13: MeOH: AcOH ;90:8:2(v: v: v )) =0,75 MS: MH+= 749, PM= 748 1.f Preparation du Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetate du 2-5-bis-{tertbutoxycarbonyl-[3-(tert-butoxycarbonyl-amino)-propyl]-amino}-pentyle (1.f) 0,123 g de produit précédent (0,164 mmol), 1 équivalent (0,0856g) de dioctadécylamine, 3 équivalents de triéthylamine (68,4 ml), 1,1 équivalent (0,0798 g) de BOP sont dissous dans du CHC13 Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Au bout de deux heures, le mélange est additionné de 100 ml de CH2Cl2, puis lavé par 3 x 100 ml de KHSO4, de NaHCO3, de NaCI (jusqu'à pH=7), séché, puis évaporé. 0,13 g de produit sont obtenus, soit un rendement de 63 %. CCM : Rf (EP : AcOEt ; 1 : 1 (v : v)) =0,62 ; révélation à l'iode, à la ninhydrine et à la fluorescamine. RMN (ppm): 0.90 (t, J=7.5 Hz, 6H: CH3, 1.20-1.75 (m, 108 H: CH2 / C(CH3)3), 3.05-3.35 (m, 14 H: CH2N), 4.154.35 (m, 3 H: NCHCH2OCO), 4.23-4.27 (2s, 2x 2H: OCH2CO), 4.5-5.5 (m, étalé, 2 H: NH) MS: MH+= 1252, P.M.= 1251 Analyse élémentaire: Fotmule brute: C71H137N5O12 % théoriques: C 68,06 H 11,02 N 5,59 % obtenus: C 67,14 H 11,93 N 5,86 1.g. Preparation du (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetate de 2-5-bis-(3-aminopropylamino)-pentyle (1.g) 1 ml de TFA est ajouté à 0,025 g de produit 1.f (0,02 mmol) dans un tube "Eppendorf" # de 1,5 ml et laissé une heure à température ambiante. Le TFA est évaporé. 500 l d'éthanol sont ajoutés de façon à obtenir une solution à 40 mM, nécessaire pour les tests biologiques. MS : MH+=852, P.M.= 851 EXEMPLE 2. Préparation du (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2 propyle (2.f.): 2.a Préparation du 1.3-Bis-(2-cyano-éthylamino)-propan-2-ol (2.a) 3,6 g (40 mmol) de 1,3-diaminopropan-2-ol sont dissous dans 75 ml de méthanol 5,76 ml (80 mmol) d'acrylonitrile sont ajoutés en 15 minutes. Le test à b fluorescamine est positif. Le mélange réactionnel reste incolore. n est laissé sous agitation, à température ambiante, pendant la nuit Le test à la fluorescamine est alors négatif. Le méthanol est évaporé. 7,9 g de produit sont recueillis (rendement de 100 46 pour le produit brut). 2.b Préparation du 1.3-Bis-(3-amino-propylamino)-propan-2-ol (2.b) L'hydrogénation est réalisée dans une autoclave, purgée à l'azote, à 27 C. Le produit 2.a est solubilisé dans un mélange de 15 ml de méthanol, 10 ml d'éthanol, 5 ml de KOH (2 M). La solution est purgée à l'argon et 4 ml de la suspension de nickel de Raney sont ajoutés dans l'autoclave. En 3h30, la pression est passée de 51,6 bar à 37,6 bar, puis s'est stabilisée plus d'une heure. L'autoclave fait 250 ml et le mélange réactionnel, 30 mL La suspension obtenue est filtrée, rincée à l'eau et passée à l'évaporateur rotatif. Une huile jaune est obtenue. Le test à la fluorescamine est positif. 2.c Preparation du 1.3-Bis-{3-tert butoxycarbonyl-amino-(tert butoxycarbonyl aminopropyl}2-propan-2-ol (2.c) Le produit 2.b est protégé de la même façon qu'en 1.c. 100 ml de CH2C12 sont ajoutés. 39,2 g (179 imnol) de di-tert-butyldicarbonate dissous dans 100 ml de dioxanne sont ajoutés goutte à goutte. La solution est laissée sous agitation pendant 72h. Le solvant est évaporé, du KHSO4 est ajouté. Le produit est extrait à l'AcOEt (3 x 100 ml) ; les phases sont rassemblées et rincées au KHSO4, au NaHCO3, au NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées. 20 g sont obtenus (rendement de 83 % par rapport au produit initial) Le produit est cristallisé dans l'EP. C.C.M. : Rf (EP : AcOEt ; 1:1 (v:v)) = 0,23 Rf (EP : AcOEt ; 1 : 2 (v : v)) = 0,63 RMN (ppm): 1,4 (2s, 36H : 4 x (CH3)3)); 1,65 (qt, 4H: 2 x NCH2CH2CH2NH); 2,95 (q, 4H : 2 x NHCH2CH2) ; 3,1 (2d, 4H : NCH2CHCH2N) ; 3,2 (t, 4H NCH2CH ; 3,85 (m, 1H : OH) ; 5,9 (s, 2H : NH) MS: MH+=605, PM= 604 2d Préparation de l'acide 1.3-Bis-{3-tert-butoxycarbonyl-amino-(tert- butoxycarbonyl-aminopropyl}2-propyl-2-éthoxycarbonylméthoxy-acétique (2.d.) 604 mg (Immol) de produit 2.c. sont dissous dans 20 mi de CH2C12. 2 équivals d'anhydride (2 mmol; 0,232 g), 2,2 équivalents de NEt3 ( 307 l, puis 100 l), 6,5 g de DMAP sont introduits.Après 24 h d'agitation à température ambiante, le mélange est additionné de CH2Cl2, lavé au KHSO4, au NaCl, séché sur MgSO4, filtré puis évaporé. 0,156 g de produit sont obtenus (rendement de 22 % ). CCM : Rf (CHCl3 : MeOH : AcOH ; 90 : 8 : 2 {v : v : v}) =0,71 RMN (ppm): 1,2-1,4 (2s, 36H : 4 X (CH3)3); 1,5 (m, 4H : 2 x NHCH2CH2CH2N) ; 2,85 (q, 4H : 2x NHCH2CH2) ; 3,1 (m, 8H : 4 x NCH2) ; 3,9-4,2 (2s, 4H : 2 x OCH2COO) ; 5,25 (m, 1H : CH2CHCH2) ; 6,7 (2H : NH) MS: MH+= 721, PM= 720 2.e Préparation du (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)- acetate du 1.3-Bis-{3-tertbutoxycarbonyl-amino-(tert-butoxycarbonyl-aminopropyl}2-propyle (2.e) 0,216 mmoles de l'acide 2.d sont dissoutes dans 3 ml de CHC13. 1 équivalent de DODA (0,113 g), 3 équivalents de NEt3 (100 l) et 1,1 équivalent de BOP (0,11 g) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 24 h. Le CHC13 est évaporé. 100 ml d'AcOEt sont ajoutés. La phase organique est lavée par de l'HCl (0,5 M), par NaHC03, par NaCl jusqu'à pH=7, séchée sur MgSO4 puis évaporée. 0,185 g sont obtenus (rendement 70 % ). Une colonne sur silice est réalisée. 110 mg de produit sont recueillis (rendement 42 %). CCM : Rf (CHCl3 : MeOH : AcOH ; 90 : 8 : 2 (v : v : v)) =0,81 Rf (EP : AcOEt ; 1 : 1 : (v : v)) = 0,67 RMN (ppm) : 0,85(t, 6H : 2 x CH3); 1,20-1,55 (m, 100H : CH2/C(CH3)3) ; 1,6 (m, 4H: 2 x NHCH2CH2CH2N) ; 3,05-3,4 (m, 16H: 2 x NHCH2CH2CH2N / NCH2CHCH2N / 2 x CH2N) ; 4,1 (s, 2H: NCOCH2O) ; 4,15 (s, 2H: OCH2COO) ; 5,25 (m, 1H : CH2CHCH2), 6,15 (m, 2H : NH) MS: MH+= 1224, PM= 1223 2.f Préparation du (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-acetate de 1.3-Bis-{3-tertbutoxycarbonyl-amino-(tert-butoxycarbonyl-aminopropyl}2-propyle(2.f.): 1 ml de TFA est ajouté à 0,0247 g de produit 2.e (0,021mmol) dans un tube "Eppendorf" # de 1,5 ml et laissé une heure à température ambiante. Le TFA est évaporé. 505 Ccl d'éthanol sont ajoutés de façon à obtenir une solution à 40 mM, nécessaire pour les tests biologiques. MS : MH+= 824, P.M.= 823 EXEMPLE 3 : Préparation du (N,N-Dioctadécyl)-succinamate de 2-(3-aminopropylamino)-1-(3-amino-propylamino-methyl)-éthyle Ce composé est préparé selon le protocole décrit précédemment en exemple 2, en substituant à l'acide diglicolique, l'acide succinique. L'analyse en spectrométrie de masse du produit ainsi obtenu indique un fragment MH+ de 808, ce qui est conforme à la masse attendue. UTILISATION DE LIPOPOLYAMINES SELON L'INVENTION POUR LA TRANSFECTION IN VITRO DE MATERIEL GENETIQUE A Plasmides utilisés pour le transfert de gènes in vitro On utilise le plasmide pCMV-LUC. n s'agit d'une construction comportant le gène rapporteur "luciférase", dérivée soit du plasmide pGL2-Basic Vector (Pr:mega) soit du plasmide pGL2-Control Vector (Promega) par insertion d'un fragment Miu I-Hind m contenant le promoteur du Cytomegalovirus humain (CMV), extrait du plasmide vecteur pcDNA3 (Invitrogen). B Protocole de preparation des solutions utilisées pour la trnsfection Des lipopolyamines préparées selon des exemples précédents sont mises en solution à 40 mM dans l'éthanol puis dilués dans un mélange éthanVeau en maintenant une concentration éthanolique inférieure à 10%. Les solutions d'acide nucléique à transfecter sont diluées en sérum physiologique (NaCl 0,15M) puis ajoutées aux solutions de lipopolyamine, dans un rapport 1/1 (v/v). Après homogénéisation au vortex et incubation 15 minutes à température ambiante, les solutions ADN/lipopolyamine sont distribuées à 9% (v/v) final dans les puits où les cellules ont été lavées par du milieu de culture dépourvu de protéines (sérum). EXEMPLE 4: Influence du rapport de charge (amines/phosphates) sur l'efficacité de transfectiofL Des échantillons de 1.105 cellules NM 3T3 en phase exponentielle de croissance sur 2 cm2 sont traités par des solutions lipopolyamines/pCMV-LUC, présentant des rapports de charges variables, pendant 4 heures à 37 C sous 5% CO2 ; chaque échantillon reçoit 1 g d'acide nucléique. La recherche de l'expression du gène reporter est effectuée après addition de sérum de veau foetal à 8% final suivie d'une incubation de 40 heures dans l'étuve à CO2. L'activité luciférase est dosée par l'émission de lumière [RLU = relative light unit] en présence de luciférine, coenzyme A et ATP pendant 20 secondes et rapportée au g de protéine dans le surnageant obtenu après lyse des cellules. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau I ci-dessous. Lipopolyamine de l'exemple 1 Lipopolyamine de l'exemple 2 rapport de charge luminescence coef. de var. (%) luminescence coef. de var. (%) 1 69 5 23 34 2 5091 3 252 6 4 3636 30 7890 3 6 21334 3 61401 5 8 40846 3 73224 2 10 55321 1 77633 2 12 53239 5 48634 5 14 36 10 52417 2 ADN seul 52 5 TABLEAU I Chaque valeur correspond à la moyenne de trois essais indépendants. Cette expérience montre clairement que les lipopolyamines selon l'invention permettent le transfert de gènes dans les conditions requises pour leur expression. EXEMPLE 5: Influence de la concentration en acide nucléique dans les mélanges ADN/lipopolyamine. Selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple précédent les cellules NIH 3T3 sont traitées avec des mélanges ADN/lipopolyamines dans les conditions où différentes concentrations d'ADN sont utilisées pour un même rapport de charge. Dans ce cas, l'activité luciférase est mesurée pendant 20 secondes et rapportée à 2,5.103 cellules traitées. Les résultats sont présentés en tableaux II et III cidessous. Lipopolyamine de l'exemple 1 Rapport de charge g DNA x 4 x 6 x 8 x 10 0,25 27 (19) 25 (20) 32 (31) 36 (15) 0,5 23 (5) 37 (54) 4476 (4) 4811 (19) 1,0 4945 (12) 19194 (14) 30933 (21) 39357 (3) 2,0 93937 (2) 105533 (1) 111167 (14) 8315 (15) 3,0 106293 (11) 100093 (8) 53475 (12) 4,0 98553 (10) 69863 (8) TABLEAU II Lipopolyamine de l'exemple 2 Rapport de charge g DNA x 4 x 6 x 8 x 10 0,25 40 (17) 52 (64) 122 (14) 51 (5) 0,5 28 (10) 204 (25) 36533 (7) 44473 (7) 1,0 3427 ((12) 48167 (13) 49363 (13) 50083 (9) 2,0 33377 (13) 44697 (18) 30670 (16) 9544 (4) 3,0 9686 (3) 31557 (2) 9157 (8) 4,0 4321 (9) 40105 (10) TABLEAU III Chaque valeur correspond à la moyenne de trois essais indépendants. Les valeurs portées entre parenthèses correspondent au coefficient de variation exprimé en REVENDICATIONS 1. Lipopolyamine sous forme D, L, ou DL ou l'un de ses sels caractérisée en ce qu'eile est représentée par la formule générale I dans laquelle - m est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclusivement, - n est un nombre entier compris entre 1 et 9 inclusivement et plus préférentiellement entre 1 et 5 avec un et unique groupement R différent de l'hydrogène présent dans la formule générale et des valeurs de m variables ou identiques au sein des différents groupements CH)m- ou -(CH2)m-, R - R représente un atome d'hydrogène ou un radical de formule générale II:: dans laquelle - X et XI représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'oxygène, un groupement méthylene -(CH2)q- avec q égal à 0, 1,2 ou 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement allyle en C1 à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C1à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22 2.Lipopolyamine selon la revendication 1 caractérisé en ce que R est représenté de preférence par la formule générale II' dans laquelle R3, R4, Rg, R6 et p répondent aux définitions proposées en revendication 1 et X représente un atome d'oxygène ou un groupement -(CH2)q- avec q étant égal à zéro. 3. Lipopolyamine selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du sous forme D, L, DL ou l'un de ses sels. 4. Lipopolyamine selon la revendication I ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du sous forme D, L, DL ou l'un de ses sels. 5. Lipopolyamine selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du sous forme D, L, DL ou l'un de ses sels 6. Lipopolyamine selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du 10 alpha. cholestéryle sous forme D, L, DL ou run de ses sels 7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moms une lipopolyamine selon l'une des revendications 1 à 6 et au moins un acide nucléique. 8. Composition selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxynbnucléique. 9. Composition selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 10. Composition selon la revendication 7, 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement. 11. Composition selon l'une des revendications 7 à 10 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens. 12. Composition selon l'une des revendications 7 à 10 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. 13. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique, une lipopolyamine selon l'une des revendications 1 à 6 et un adjuvant capable de s'associer au aBmplexe lipopolyarinelacide nucléique et d'améliorer son pouvoir transfectant. 14. Composition selon la revendication 13 caractérlsée en ce que l'adjuvant est un ou plusieurs lipides neutres. 15. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis panni les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. 16. Composition selon la revendication 15 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont des lipides à 2 chaînes grasses. 17. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), rdécyl- palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), le di- stéaroyl, -pamitoyl, -mirystayl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols. les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2). 18. Composition selon l'une des revendications 13 à 17 caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,1 à 20 équivalents d'adjuvant pour 1 équivalent de lipopolyamine, et, plus préférentiellement, de 1 à 5. 19. Composition selon lune quelconque des revendications 7 à 18 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 18 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses. 21 Utilisation d'une lipopolyamine selon l'une des revendications de 1 à 6 pour la transfection in vitro de cellules. 22 Utilisation d'une lipopolyamine selon l'une des revendications 1 à 6 pour la préparation d'une composition utile pour la transfection in vivo de cellules.