Brevet FR2730495A1 — publié le 19960814

La présente invention se rapporte à un dérivé de proinsuline humaine et à un procédé pour produire de l'insuline humaine en utilisant un vecteur d'expression comprenant un ADN encodant le dérivé de proinsuline humaine. Plus particulièrement, elle concerne un dérivé de proinsuline humaine qui a une séquence de peptide courte entre les chaînes A et B de l'insuline, au lieu du peptide C; un vecteur d'expression comprenant un ADN encodant le dérivé de proinsuline humaine; un microorganisme transformé avec le vecteur d'expression; et un procédé pour produire de l'insuline humaine par culture du microorganisme dans un milieu approprié. L'insuline est une hormone polypeptide sécrétée par les cellules 3 du pancréas et qui participe à la régulation du niveau de sucre dans le sang. Elle consiste de deux chaînes de peptide, c'est-à-dire, les chaînes A et B, qui sont liées par des ponts disulfure à leurs résidus cystéine et est produite par un traitement protéolytique de proinsuline dans les cellules t pancréatiques (Insulin: Molecular Bioloqy and Patholoqy, ed. Ashcroft, F. M. & Ashcroft, S. J. H., IRL Press, Oxford, 1992). Commercialement, l'insuline humaine a été produite soit par un procédé enzymatique dans lequel un résidu alanine en 30ème position de la chaîne B de l'insuline de porc est remplacé par un résidu thréonine par une réaction de transpeptidation en utilisant de la trypsine (Markussen, J., Proceedinqs 1st International Symposium 'Neue Insuline', pp 38-44(1982), ed. Petersen, K. G., et al., Freiburger Greaphische Betriebe, Freiburg); ou, par un procédé qui utilise E. coli génétiquement manipulé (Chance, R.E., et al., Peptides: Synthesis- Structure-Function, pp 721-728(1981), dans Proceedinqs of the Seventh American Peptide Symposium, ed. Rich, D.H. & Gross, E., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.; et Frank, B.H., et al., Peptides: Synthesis- Structure-Function, pp 729-738(1981), dans Proceedinqs of the Seventh American Peptide Symposium, ed. Rich, D.H. & Gross, E;, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.) ou Saccharomyces cerevisiae(Thim, L., et al., Proc. Natl, Acad. 2 2730495 Sci. U.S.A., 83, pp 6766-6770(1986); et Markussen, J., et al., Protein Enqineerinq, 1, pp 205-213(1987)). Comme le procédé enzymatique pour produire de l'insuline humaine à partir d'insuline de porc est limité par son coût élevé, les études récentes ont été focalisées sur des procédés pour produire de l'insuline humaine par des techniques de génie génétique. Chance et al. ont rapporté un procédé pour préparer de l'insuline par: production de chacune des chaînes A et B d'insuline sous la forme d'une protéine de fusion par culture de E. coli qui porte un vecteur comprenant un ADN encodant la protéine de fusion; clivage de la protéine de fusion par du bromure de cyanogène pour obtenir les chaînes A et B; sulfonation des chaînes A et B pour obtenir les chaînes sulfonées; réaction de la chaîne B sulfonée avec une quantité en excès de la chaîne A sulfonée; et ensuite, purification du produit résultant pour obtenir l'insuline (Chance, R.E., et al., supra). Cependant, ce procédé a des inconvénients en ce qu'il est ennuyeux de faire fonctionner deux procédés de fermentation et en ce que l'étape de réaction des chaînes A et B sulfonées donne un rendement faible d'insuline, rendant le procédé de façon inhérente non pratique. Frank et al. ont rapporté un procédé pour préparer l'insuline, qui comprend: la production de proinsuline sous la forme d'une protéine de fusion par culture de E. coli qui porte un vecteur comprenant un ADN encodant la protéine de fusion; la coupe de la protéine de fusion avec du bromure de cyanogène pour obtenir de la proinsuline; la sulfonation de la proinsuline et la séparation de la proinsuline sulfonée; le repliage de la proinsuline sulfonée pour former les liaisons disulfure correctes; le traitement de la proinsuline repliée avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B, et, ensuite, la purification du produit résultant pour obtenir l'insuline (Frank et al., supra). Cependant, le rendement de la proinsuline repliée ayant les liaisons disulfure correctes diminue de façon aigue lorsque 3 2730495 la concentration en proinsuline augmente. Ceci est dû à un mauvais pliage et à un certain degré de polymérisation impliqué et donc le procédé entraîne l'inconvénient de l'utilisation d'étapes de purification laborieuses pendant la récupération de la proinsuline. Thim et al. ont rapporté un procédé pour produire de l'insuline dans Saccharomyces cerevisiae, qui comprend: la production d'un analogue d'insuline à chaîne unique ayant une certaine séquence d'acides aminés par culture de cellules Saccharomyces cerevisiae; et l'isolement de l'insuline à partir de celles-ci via une série d'étapes, c'est-à-dire, une purification, une réaction enzymatique, une hydrolyse acide et une autre purification, (Thim, L., et al., supra). Ce procédé, quoique avantageux en ce que les procédures de purification sont relativement simples et qu'aucune procédure de repliage n'est nécessaire, donne toujours un faible rendement en insuline, en raison d'un niveau d'expression intrinsèquement faible du système de levure en comparaison avec E. coli. Le rôle du peptide C dans le pliage de la proinsuline n'est pas précisément connu. Un des livres de biochimie dit que le peptide C est nécessaire pour que le procédé de pliage se produise (Biochemistry, 3e ed., p 41(1988), Freeman), mais d'autres études ont montré qu'environ 30 à 50 % d'insuline correctement pliée peuvent être obtenus en utilisant les chaînes A et B seules en l'absence du peptide C à une très faible concentration (Katsoyannis, P. G., et al., Biochemistry, 6, pp 2642-2655(1967); et Chance, R.E., et al., supra). On a également montré qu'un rendement élevé de produit plié correctement, comparable au rendement qui peut être obtenu en utilisant la proinsuline, peut être obtenu en utilisant un peptide dans lequel les chaînes A et B sont directement jointes (Steiner, D.D. & Clark, J.L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, pp 622-629(1968); et Varandani, P.T. & Nafz, M.A., Arch. Biochem. Biophys., 141, pp 533- 537(1970)). Ces résultats suggèrent que le rôle du peptide C 4 2730495 est simplement d'amener les chaînes A et B en contact proche de façon à faciliter le procédé de pliage. Selon les structures tridimensionnelles connues des insulines dans la Banque de Données de Brookhaven, la distance entre le carbone a du C terminal de la chaîne B (Thr-30) et le carbone a du N terminal de la chaîne A (Gly-1) est grossièrement de 5 à 11 A, ce qui est une distance appropriée pour l'insertion d'une structure à rotation p. Il a longtemps été reconnu que certaines séquences d'acides aminés ont une probabilité élevée d'être une partie d'une conformation en rotation dans les protéines (Chou, P.Y. & Fasman, G.D., J. Mol. Biol., 115, 135-175(1977)), et ceci a été plus récemment démontré être vrai également pour les peptides dans une solution aqueuse (Dyson, H.J., et al., J. Mol. Biol., 201, 161-200(1988); et Shi, H.C., et al., Biochemistry, 32, 6348- 6355(1993)). On a trouvé que la proline en seconde position et la glycine en troisième position donnent la population à rotation C la plus élevée, et une étude extensive a révélé que la nature de l'acide aminé en position 4 influence la stabilité de la rotation 1 en position trans, et qu'il y a une préférence pour une chaîne latérale Asp 4 déprotonée (Wright, P.E., et al., Biochemistry, 27, 7167-7175(1988); et Dyson, H.J., et al., supra). Les rotations 1 sont probablement les sites de l'initiation du pliage de la protéine, puisqu'elles sont déterminées par des interactions à intervalle court, elles limitent l'espace conformationnel disponible pour la chaîne du polypeptide, et en amenant plus de parties à distance de la chaîne de polypeptide ensemble, elles peuvent être un instrument pour la direction des évenements de pliage suivants (Zimmerman, S. S. & Scherage, H.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 4126-4129(1977); et, P.E., et al., supra). Ces rotations 1 sont également connues pour jouer un rôle significatif dans le clivage enzymatique. La trypsine est une sérine protéase typique et hydrolyse une protéine ou un peptide au terminal carboxyle 2730495 d'un résidu arginine ou lysine (Enzymes, pp 261-262(1979), ed. Dixon, M. & Webb, E.C., Longman Group Ltd., Londres). En particulier, une hydrolyse facile se produit à un site dibasique lorsque deux résidus arginine ou lysine successifs existent, et on sait que l'hydrolyse se produit plus facilement lorsque le site dibasique est situé dans ou près d'une structure à rotation i (Rholam, M., et al., FEBS Lett. 207, 1-6(1986)). Comme décrit ci-dessus, il existe un besoin pour un procédé à rendement élevé pour produire de l'insuline humaine dans un microorganisme, et les présents inventeurs ont fait tous leurs efforts pour développer un procédé de production d'insuline amélioré et ont réussi en établissant un nouveau procédé à rendement élevé au moyen de l'utilisation d'un dérivé de proinsuline à faible poids moléculaire ayant une structure à rotation C facilement hydrolysable. Conformément, un objet de la présente invention est de fournir un dérivé de proinsuline humaine qui a un rendement de pliage élevé et est facilement hydrolysable. Selon l'invention, ce dérivé de proinsuline humaine est caractérisé en ce qu'il a la formule (1): chaîne B-Z-chaîne A (I) o lesdites chaînes A et B sont respectivement des chaînes d'insuline humaine; Z est un peptide de formule U-U-X-P-J-(X')n-U-U; U est un résidu arginine ou lysine; X et X' sont indépendamment un résidu acide aminé; P est un résidu proline; J est un résidu glycine, arginine ou lysine; et n vaut 0 ou est un entier valant de 1 à 5. Selon une caractéristique de l'invention, dans ce dérivé, X est un résidu alanine, tyrosine, histidine ou glycine; X' est un résidu acide aspartique, valine, arginine ou glycine et n vaut 2. 6 2730495 De préférence, X est un résidu alanine, J est un résidu glycine; et (X')n est un acide aspartique-valine. Selon un autre mode de réalisation préféré, dans le dérivé de l'invention, X est un résidu tyrosine; J est un résidu glycine; et (X')n est l'acide aspartique-valine. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, dans ce dérivé, X est un résidu histidine; J est un résidu glycine; et (X')n est l'acide aspartique- valine. Selon toujours un autre mode de réalisation, dans le dérivé de l'invention, X est un résidu glycine; J est un résidu arginine; et X' est l'arginine-glycine. Selon un mode de réalisation supplémentaire de l'invention, X est un résidu glycine; J est un résidu glycine; et n vaut 0. L'invention a également pour objet l'ADN encodant le dérivé de proinsuline humaine tel que défini ci-dessus. Toujours un autre objet de l'invention est le vecteur d'expression comprenant l'ADN défini ci-dessus. Selon une caractéristique de l'invention, ce vecteur d'expression est le plasmide pTl-MlPI (KCCM-10059) ou le plasmide pT2-M2PI (KCCM-10060). L'invention a encore pour autre objet le microorganisme transformé avec le vecteur de l'invention. Ce microorganisme est plus particulièrement E. coli BL21 (DE3) transformé avec le plasmide pTl-M2PI (KCMM-10059). I1 peut également être, dans l'invention, E. coli BL21 (DE3) transformé avec le plasmide pT2-M2PI (KCCM-10060). Un objet supplémentaire de l'invention est de fournir un procédé pour préparer de l'insuline humaine qui comprend la préparation d'un ADN encodant un dérivé de proinsuline humaine ayant la formule (I); l'insertion de l'ADN dans un vecteur pour construire un vecteur d'expression pour l'expression du dérivé de proinsuline humaine; la transformation d'une cellule hôte avec le vecteur d'expression; la culture du transformant résultant sous une condition qui permette l'expression du dérivé de proinsuline 7 2730495 humaine; la purification du dérivé de proinsuline humaine de la culture; et la préparation de l'insuline humaine à partir du dérivé de proinsuline humaine par une hydrolyse enzymatique. Les objets et caractéristiques ci-dessus et d'autres de la présente invention deviendront apparents à partir de la description de l'invention qui suit, lorsque prise en conjonction avec les dessins d'accompagnement, dans lesquels: - la figure 1 montre un diagramme schématique pour préparer des plasmides pT7-T1 et pT7-T2; - la figure 2 décrit un diagramme schématique pour préparer les plasmides pTl-hPI et pT2-hPI; - la figure 3 représente un diagramme schématique pour préparer les plasmides pT1-M1PI, pT1-M2PI, pT1-M3PI et pT1- M4PI; - la figure 4 fournit un diagramme schématique pour préparer les plasmides pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI et pT2- M4PI; - la figure 5 montre les chromatogrammes HPLC de M1PI, M2PI, M3PI, M4PI et hPI; et - la figure 6 présente les chromatogrammes d'HPLC des insulines formées par l'hydrolyse des miniproinsulines (MiPIs) repliées et hPI. Selon la présente invention, il est fourni un dérivé de proinsuline humaine ayant la formule (I), ci-après référencé "miniproinsuline", o un peptide, qui consiste en 12 ou moins acides aminés et forme une structure à rotation 3, est inséré entre les chaînes A et B de l'insuline humaine à la place du peptide C consistant de 35 acides aminés: chaîne B-Z-chaîne A (I) o, Z est un peptide de formule U-U-X-P-J-(X')n-U-U, U est un résidu arginine ou lysine, X et X' sont indépendamment tout résidu acide aminé; P est un résidu proline; 8 2730495 J est un résidu glycine, arginine ou lysine; et n vaut 0 ou est un entier valant de 1 à 5. Les miniproinsulines préférables sont celles dans lesquelles X est un résidu alanine, tyrosine, histidine ou glycine; X' est un résidu acide aspartique, valine, arginine ou glycine; et n vaut 0 ou 2. Des miniproinsulines préférables exemplaires sont celles dans lesquelles Z est Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 1); Arg-Arg- Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 2); Arg-Arg-His-Pro- Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 3); ou Arg-Arg-Gly-Pro-Gly- Lys-Arg(SEQ ID NO: 4). La miniproinsuline de la présente invention peut être produite en tant que telle ou sous la forme d'une protéine de fusion o elle est fusionnée avec une protéine partenaire de fusion, de préférence, une protéine formant une feuille à plis Y. Les protéines partenaires exemplaires de fusion qui peuvent être employées dans la présente invention inluent tout ou partie du facteur de nécrose tumorale humain (TNF) ayant une séquence d'acides aminés telle que montrée ci-après (SEQ ID NO: 5); tout ou partie des mutéines de TNF o certains des acides aminés dans la SEQ ID NO: 5 sont substitués par d'autres; et ces polypeptides dans lesquels 1 à 7 acides aminés, de préférence 7, ont été enlevés du terminal N de TNF: Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 9 2730495 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Un ADN encodant le TNF humain ou une mutéine de TNF peut être chimiquement synthétisé en utilisant un synthétiseur d'ADN, ou préparé via une réaction de chaîne polymérase ("PCR")(Saiki, K. K., et al., Science, 230, pp 1350-1354(1985)) en employant un ADNc de TNF humain en tant que matrice et des amorces appropriées synthétisées chimiquement. Par exemple, l'ADN encodant la totalité ou une partie de la mutéine TNF peut être préparé par: obtention d'ADN de TNF humain par PCR d'une bibliothèque d'ADNc de monocytes humains préparé à partir de la ligne de cellules U937 (Clontech, U.S.A.), et mise en oeuvre d'un autre PCR en employant l'ADN de TNF en tant que matrice et des amorces synthétisées chimiquement, c'est-à-dire, une amorce sens portant un site de reconnaissance pour un enzyme de restriction et des séquences de nucleotide modifiés à son extrémité 5', et une amorce anti-sens portant un site de reconnaissance pour un enzyme de restriction à son extrémité '. La miniproinsuline de la présente invention peut être chimiquement synthétisée par un synthétiseur de peptides selon une méthode conventionnelle, ou préparée dans un microorganisme en utilisant une technique de génie génétique conventionnelle. Dans le but de produire une miniproinsuline dans un microorganisme, une cellule hôte compatible, par exemple, une cellule E. coli ou Saccharomyces cerevisia est transformée avec un vecteur d'expression contenant un ADN encodant la miniproinsuline seule, ou un ADN fusionné encodant une protéine de fusion consistant d'une protéine partenaire de fusion et la miniproinsuline; et la cellule transformée est cultivée sous une condition qui permette l'expression de la miniproinsuline. Ensuite, la miniproinsuline produite est 2730495 repliée, hydrolysée par une protéinase et purifiée pour obtenir de l'insuline humaine. Conformément, la présente invention fournit un procédé pour la préparation d'insuline, qui comprend les étapes de: préparation d'un ADN encodant une miniproinsuline; insertion de l'ADN seul ou avec un ADN encodant une protéine partenaire de fusion en un vecteur approprié pour construire un vecteur d'expression pour l'expression de la miniproinsuline; transformation d'une cellule hôte avec le vecteur d'expression; culture du transformant résultant sous une condition qui permette l'expression de la miniproinsuline; purification de la miniproinsuline provenant de la culture; et préparation d'insuline à partir de la miniproinsuline. Un système de vecteur d'expression peut être construit par insertion de l'ADN encodant la miniproinsuline seule ou par insertion successivement des ADN encodant la protéine partenaire de fusion et la miniproinsuline, en un vecteur contenant un promoteur approprié, par exemple, lac, trp, tac, pL, T3, T7 SP6, SV40, et l(pL/pR); ou par ligation de l'ADN encodant la miniproinsuline ou la protéine de fusion avec un ADN comprenant un de ces promoteurs et une région de liaison de ribosome puis insertion de l'ADN ligaturé dans un plasmide approprié, par exemple pBR322. Les vecteurs d'expression préparés comme ci-dessus peuvent être introduits dans une cellule hôte appropriée, par exemple, E. coli, qui est choisie en considérant un nombre de facteurs bien connus dans l'art, par exemple, la compatibilité avec le vecteur choisi, la facilité de récupération du polypeptide souhaité, les caractéristiques du polypeptide, la biosécurité et les coûts, selon des méthodes conventionnelles, par exemple, la méthode de Cohen comme décrit dans Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110(1972) pour obtenir une cellule de E. coli transformée. Deux de tels transformants ont été désignés E. coli BL21(DE3+pT1MlPI) et E. coli (DE3+pT2M2PI) et déposés le 29 Décembre 1994 auprès du Korean Culture Center of Microorganism (KCCM) (Adresse: Department of Food 1il 2730495 Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Corée) sous les numéros d'accès KCMM-10059 et KCCM-10060, respectivement, selon les termes du Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt des Microorganismes aux fins de la Procédure de Brevets. La cellule transformée est cultivée sous une condition qui permet l'expression de la miniproinsuline. Les polypeptides produits dans une cellule hôte peuvent être isolés et la miniproinsuline désirée peut être purifiée de ceux-ci par utilisation combinée des méthodes conventionnelles, par exemple, une rupture de cellules, une centrifugation, une sulfitolyse, une dialyse, un traitement avec du bromure de cyanogène, et une HPLC. Spécifiquement, la miniproinsuline produite dans E. coli sous la forme d'un corps d'inclusion comprenant la protéine de fusion peut être purifiée par le procédé suivant. Les cellules dans la culture sont rompues par l'emploi d'ultra-sons, et les corps d'inclusion comprenant la protéine de fusion sont collectés par centrifugation. Les corps d'inclusion sont dissous dans un solvant approprié, par exemple, de la guanidine-HCl 6M, les groupes - SH des résidus cystéine dans la protéine sont convertis en groupe -SSO3 par sulfitolyse; et les protéines sont ensuite précipitées par dialyse ou chromatographie par filtration sur gel. Les protéines précipitées sont collectées par centrifugation et lavées plusieurs fois avec une solution aqueuse. La protéine résultante est traitée avec du bromure de cyanogène et le produit résultant est purifié par HPLC pour obtenir la miniproinsuline. Ensuite, la miniproinsuline est traitée avec du O- mercapto-éthanol pour la replier et la miniproinsuline repliée est traitée avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B, préférablement en des quantités telles que les rapports en poids trypsine: carboxypeptidase B: miniproinsuline deviennent 1:5:12500, pour obtenir de l'insuline à partir de cela. 12 2730495 Comme décrit ici auparavant, la présente invention a rendu possible l'amélioration du rendement en insluine humaine par rapport à l'art antérieur au moyen de l'expression d'une miniproinsule humaine, o un peptide court est inséré entre les chaînes A et B de l'insuline humaine au lieu du peptide C volumineux dans la proinsuline. Le peptide court consiste en seulement 7 à 12, de préférence 9 acides aminés, mais il est capable de former une structure à rotation J plus étroite que le peptide C. Donc, les procédés de repliage et d'hydrolyse peuvent être mis en oeuvre plus efficacement avec la miniproinsuline qu'avec la proinsuline. Les Exemples suivants sont entendus illustrer plus la présente invention sans limiter son étendue. De plus, les pourcentages donnés ci-après pour un solide dans un mélange solide, un liquide dans un liquide, et un solide dans un liquide sont sur une base pds/pds, vol/vol et pds/vol, respectivement, sauf s'il en est indiqué autrement. Les PCR dans les Exemples ont été mis en oeuvre selon la méthode PCR conventionnelle telle que décrite dans Saiki, K. K., et al., supra. Exemple 1: Construction du Plasmide pT7-T150 Préparation d'ADN de TNF Pour obtenir un ADN de TNF, une réaction en chaîne de polymérase (PCR) a été mise en oeuvre selon la méthode de Saiki, K. K. et al. supra en employant une bibliothèque d'ADNc de monocytes humains (Clontech, U.S.A.), qui a été préparé à partir de la ligne de cellules U937 en tant que matrice et d'amorces P1 ayant les séquences de nucléotides suivantes: Amorce P1 amorce sens (SEQ ID NO: 6): '-GCATACATA TGGTCAGATC ATCTTCTCGA ACC-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO: 7): 13 2730495 3'-TGAAA CCCTAGTAAC GGGACACTAT TCCTAGGTGT-5' Préparation du plasmide pT7-T150 contenant l'ADN de mutéine de TNF Pour obtenir un ADN de mutéine de TNF, une série de PCR ont été mis en oeuvre en employant 1'ADN de TNF préparé à l'Etape 1 en tant que matrice et les amorces P2 et P3 ayant les séquences de nucléotides suivantes: Amorce P2 (comprenant la substitution de nucléotides désirée) amorce sens (SEQ ID NO: 8): '-GTGGTGCCAA TAGAGGGCCT GTTCCTCATC TAC-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO: 9): 3'-CAC CACGGTTATC TCCCGGACAA GGAGTAGATG-5' Amorce P3 (complémentaire aux extrémités 5' et 3' de l'ADN de TNF) Amorce sens (SEQ ID NO: 10): 5'-ATACATATGC CGAGTGACAA GCCTGTA-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO: 11): 3'-A TGAAACCCTA GTAACGGGCC CCTAGGTACA-5'. Spcécifiquement, le premier PCR a été mis en oeuvre en employant l'ADN de TNF préparé à l'Etape 1 en tant que matrice, l'amorce sens P2 et l'amorce anti-sens P3, et le second PCR a été mis en oeuvre selon la même procédure que dans le premier PCR sauf que l'amorce anti-sens P2 et l'amorce sens P3 ont été employées. Les deux produits de PCR obtenus ont été mélangés ensemble et ensuite recuits. Ensuite, l'ADN de mutéine de TNF a été amplifiée par un PCR employant l'amorce sens P3 ayant un site de reconnaissance NdeI à son extrémité 5', et l'amorce anti-sens P3 ayant des sites de reconnaissance SmaI et BamHI à son extrémité 3'. Le produit PCR résultant, qui a été nommé T150, encode une mutéine de TNF o 7 acides aminés ont été effacés du terminal N de TNF, et la sérine en 52ème position, la 14 2730495 tyrosine en 56ème position et la leucine en 157ème position du TNF ont été substituées par l'isoleucine, la phénylalanine et l'arginine, respectivement. T150 a été digéré avec NedI et BamHI, et ensuite ligaturé dans le site NdeI/BamHI d'un vecteur, qui a été préparé par digestion du plasmide pT77 (Department of Biological Chemistry, Harvard Medical School) avec NdeI et BamHI, en utilisant une ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné pT7-T150. Exemple 2: Préparation du Plasmide pT7-T1 Un PCR a été mis en oeuvre en employant l'ADN de TNF préparé à l'Etape 1 en tant que matrice, l'amorce sens P3 et une amorce anti-sens ayant la séquence de nucléotides suivante: Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 12): 3'-G ACATGGAGTA GATGAGGGCC CCTAGGTACA-5' Le produit PCR résultant, qui a été nommé T1, encode une mutéine de TNF o 7 acides aminés ont été effacés du terminal N de TNF et la sérine en 52ème position et la glutamine en 6lème position ont été substituées par l'isoleucine et l'arginine, respectivement. T1 a été digéré avec NdeI et BamHI, et ensuite ligaturé dans le site NdeI/BamHI d'un vecteur, qui a été préparé par digestion du plasmide pT77 avec NedI et BamHI, en utilisant une ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné pT7- T1, et son procédé de construction est montré en figure 1. Exemple 3: Construction du Plasmide pT7-T2 Un polynucléotide T2 synthétique qui encode un polypeptide comprenant les 8ème aux 12ème acides aminés du N- terminal de TNF, ainsi que dix résidus histidine qui facilitent leur purification, a été synthétisé. La séquence 2730495 d'acides aminés encodée dans T2 est comme suit (SEQ ID NO: 13): H2N-Pro Ser Asp Lys Pro His His His His His His His His His His Ser Ser-COOH Un PCR a été mis en oeuvre en employant des amorces T20-I, T20- II et T20-III avec le rapport 10:1:10, pour obtenir un ADN comprenant un polynucléotide T2 et ayant des sites de reconnaissance NdeI et BamHI à leurs extrémités 5' et 3', respectivement; T20-I(amorce sens; SEQ ID NO: 14): '-TATACATATG CCGAGTGACA AGCCT-3' T20-II(amorce sens; SEQ ID NO: 15): '-AGTGACAAGC CTCATCATCA TCATCATCAT CATCATCATC ACAGCAG-3' T20-III(amorce sens; SEQ ID NO: 16): 5'-TAGT AGTGTCGTCG CCTAGGTACA-5' Le produit résultant du PCR a été digéré avec NdeI et BamHI et ensuite ligaturé avec le plasmide pT7-7 traité par NdeI/BamHI, en utilisant l'ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné pT7-T2, dont le procédé de construction est montré en figure 1. Exemple 4: Construction du plasmide pT150-hPI Préparation de l'ADN de proinsuline humaine Sur la base des informations sur les séquences d'acides aminés de la proinsuline humaine (Ullich, A., et al., Science, 612-615(1980)), un ADN synthétique encodant la proinsuline humaine, qui a la séquence de nucléotides suivante (SEQ ID NO: 17), a été préparé en utilisant les 16 2730495 codons hautement préférés dans E. coli de façon à augmenter le taux d'expression de l'ADN: '- TTC GTT AAT CAG CAC CTG TGC GGC TCT CAC CTG GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT GAA CGT GGT TTT TTC TAC ACC CCG AAA ACC CGT CGC GAG GCT GAA GAC CTG CAG GTA GGT CAG GTT GAA CTG GGC GGT GGT CCG GGT GCA GGC TCT CTG CAG CCG TTG GCG CTG GAA GGT TCC CTG CAG AAA CGT GGC ATC GTT GAA CAA TGC TGT ACT AGC ATC TGC TCT CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAT TCT AAC -3' Spécifiquement, les oligonucléotides ayant les séquences de nucléotides suivantes pour utilisation dans la synthèse du gène de proinsuline ont été préparés en utilisant un synthétiseur automatique d'ADN ABI (modèle 392) en employant la méthode de synthèse au phosphite en phase solide: pTA(SEQ ID NO: 18): 3'- GATCATGT CGTAACAAGT TGCTACGGTG CAAAGACGTC CCTTGGAAG GTCGCGGTTGC CGACGTCTCT-5' pTB(SEQ ID NO: 19): '- AAGCTTTTAC TAGTTACAAT AGTTCTCCAG CTGGTAGAGA GAGCAGATGC TAGTACAGCA TTGTTCAA-3' pTC(SEQ ID NO: 20): 3'- ACGTC CAGAAGTCGG AGCGCTGCCC AAAAGCCCCA CATCTTTTTT GGTGCAAGTG GCTTTGGTC-5' pTD(SEQ ID NO: 21): 5'- CAGAGAGCCT GCACCCGGAC CACCGCCCAG TTCAACCTGA CCTACCTGCA GGTCTTCAGC CTCGC-3' pTE(SEQ ID NO: 22): '- CATGTTCGTT AATCAGCACC TGTGCGGCTC TCACCTGGTA GAAGCTCTGT ACCTGGTTTG CGGTGAAC-3' 17 2730495 p31(SEQ ID No: 23): 5'-GTACCTGGTT TGCGGTGAAC GTGGT-3' p112(SEQ ID NO: 24): 3'-TAAC ATTGATCATT TTCGAAGCAT-5' pBAM(SEQ ID NO: 25): 5'- GCAGGATCCA TGTTCGTTAA T-3' pHIN(SEQ ID NO: 26): 3'-ATAA CATTGATCAT TTTCGAAACG-5' p71(SEQ ID NO: 27): 5'-GGTGCAGGCT CTCTGCAGCC GTTGG-3' p72(SEQ ID NO: 28): 3'-CCGAG AGACGTCGGC AACCGCGACC-5' Un fragment d'ADN a été préparé par un PCR en employant les oligonucléotides PTD et PTB en tant que matrices et les oligonucléotides p71 et pll2 en tant qu'amorces et ensuite désigné fragment pAB. Un autre fragment, désigné fragment pCD, a également été préparé selon les mêmes procédures en utilisant les oligonucléotides pTC et pTD en tant que matrices et les oligonucléotides p31 et p72 en tant qu'amorces. Des quantités égales des fragments pAB et pCD ont été mélangées ensemble et ensuite recuites. Un troisième fragment, désigné fragment pABCD, a ensuite été préparé par un PCR en employant ledit oligonucléotide recuit en tant que matrice et les oligonucléotides p31 et 112 en tant qu'amorces. De plus, des quantités égales du fragment pABCD et de l'oligonucléotide pTE ont été mélangées ensemble et ensuite recuites. Un ADN encodant la proinsuline humaine entière a été préparé par PCR en employant ledit oligonucléotide recuit en tant que matrice et les oligonucléotides pBAM et pHIN en tant qu'amorces. Construction du plasmide pT150-hPI L'ADN de proinsuline humaine obtenu à a été digéré avec BamHI et HindIII pour obtenir un ADN à double brins ayant des extrémités adhésives et contenant des sites 18 2730495 de reconnaissance pour BamHI et HindIII à ses extrémités 5' et 3', respectivement. Le plasmide pT7-T150 préparé à l'Exemple 1 a été digéré avec BamHI et HindIII et ensuite ligaturé avec l'ADN de proinsuline humaine traité par BamHI/HindIII obtenu ci- dessus, en utilisant l'ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné plasmide pT150-hPI. Exemple 5: Construction du plasmide pTl-hPI L'ADN hPI obtenu à de l'Exemple 4 a été digéré avec BamHI et HindIII pour obtenir un ADN à double brins ayant des extrémités adhésives et contenant des sites de reconnaissance pour BamHI et HindIII à ses extrémités 5' et 3', respectivement. Le plasmide pT7-T1 préparé à l'Exemple 2 a été digéré avec BamHI et HindIII et ensuite ligaturé avec l'ADN hPI traité par BamHI/HindIII obtenu ci-dessus, en utilisant une ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné pTl-hPI, et le procédé de construction de celui-ci est montré en figure 2. Exemple 6: Construction du plasmide pT2-hPI L'ADN hPI obtenu à de l'Exemple 4 a été digéré avec BamHI et HindIII pour obtenir un ADN à double brins ayant des extrémités adhésives et contenant des sites de reconnaissance pour BamHI et HindIII à ses extrémités 5' et 3', respectivement. Le plasmide pT7-T2 préparé à l'Exemple 3 a été digéré avec BamHI et HindIII et ensuite ligaturé avec l'ADN hPI traité par BamHI/HindIII obtenu ci-dessus, en utilisant l'ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné pT2-hPI, et le procédé de construction de celui-ci est montré en figure 2. Exemple 7: Construction du plasmide pTl-MiPI 19 2730495 Les ADN encodant les miniproinsulines, qui chacun comprennent une rotation j formant un peptide situé entre les chaînes A et B, ont été préparées d'une manière telle que le second acide aminé dudit peptide est un résidu proline, qui est connu pour induire une structure à rotation 3 serrée (Dyson, H.J. et al., J. Mol. Biol., 201, pp 161-200 (1988)). Ledit peptide est Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 1) (M1PI); Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 2)(M2PI); ArgArg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO: 3) (M3PI); ou Arg-ArgGly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 4) (M4PI). Spécifiquement, les amorces ayant les séquences de nucléocides suivantes ont été préparées en utilisant un synthétiseur d'ADN automatique: Amorce pBAM(SEQ ID NO: 25): 5'-GCAGGATCCA TGTTCGTTAA T-3' Amorce pHIN(SEQ ID NO: 26): 3'-ATAA CATTGATCAT TTTCGAAACG-5' Amorce psMl Amorce sens (SEQ ID NO: 29) '-GCTCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3' Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 30) 3'-TGG GGCTTTTGGG CAGCGCGAGG CCCACTGCAA-5' Amorce psM2 Amorce sens (SEQ ID NO: 31) '-TACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3' Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 32) 3'-TGG GGCTTTTGGG CAGCGATGGG CCCACTGCAA-5' Amorce psM3 Amorce sens (SEQ ID NO: 33) '-CACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3' Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 34) 2730495 3'-TGG GGCTTTTGGG CAGCGGTGGG CCCACTGCAA-5' Amorce psM4 Amorce sens (SEQ ID NO: 35) 5'-GGTCCGGGTA AACGTGGCAT CGTTGAACAA-3' Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 36) 3'-TGGGGCT TTTGGGCAGC GCCAGGCCCA-5' Un ADN encodant la miniproinsuline M1 a été préparé comme suit. Un fragment d'ADN comprenant une région d'extrémité 5' de la miniproinsuline l("sml-A") a été préparé par PCR en employant le gène de proinsuline preparé & l'Exemple 4 en tant que matrice et l'amorce pBAM et l'amorce anti-sens de psMl. Un fragment d'ADN comprenant une région d'extrémité 3' de la miniproinsuline l("sml-B") a également été préparé par PCR en employant le gène de la proinsuline préparé à l'Exemple 4 en tant que matrice et l'amorce pHIN et l'amorce sens de psMl. Des quantités égales de sMl-A et sM1-B ont été mélangées et recuites. Un ADN encodant la miniproinsuline M1 a été préparé par PCR en employant ledit ADN recuit en tant que matrice et les amorces pBAM et pHIN. L'ADN M1 de miniproinsuline a été digéré avec BamHI et HindIII pour obtenir un ADN à double brins ayant des extrémités adhésives et contenant des sites de reconnaissance pour BamHI et HindIII à ses extrémités 5' et 3', respectivement. Le plasmide pT7-Tl préparé à l'Exemple 2 a été digéré avec BamHI et HindIII et ensuite ligaturé avec l'ADN de miniproinsuline M1 traité BamHI/HindIII obtenu ci- dessus, en utilisant une ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné plasmide pTl-MlPI. Les ADN encodant la miniproinsuline M2, M3 et M4, respectivement, ont été préparés selon les mêmes procédures que ci-dessus sauf que chacune des amorces psM2, psM3 et psM4 a été utilisée à la place de l'amorce psMl, et ensuite, les plasmides pT1-M2PI, pTl-M3PI et pT1-M4PI, qui comprennent les ADN des miniproinsulines M2, M3 et M4, respectivement, ont 21 2730495 également été préparés selon la même procédure que ci-dessus. Les procédés de construction des plasmides pTl-M1PI, pTl- M2PI, pTl-M3PI et pT2-P4DI sont montrés en figure 3. Exemple 8: Construction du plasmide pT2-MiPI Le plasmide pT7-T2 préparé à l'Exemple 3 a été digéré avec BamHI et HindIII et ensuite ligaturé avec l'ADN de miniproinsuline traité BamHI/HindIII obtenu à l'Exemple 7, en utilisant une ADN ligase T4. Le plasmide résultant a été désigné plasmide pT2-M1PI. Les plasmides pT2-M2PI, pT2-M3PI et pT2-M4PI, qui comprennent les ADN des miniproinsulines M2, M3 et M4, respectivement, ont également été préparés selon les mêmes procédures que ci- dessus. Les procédés de construction des plasmides pT2-M1PI, pT2- M2PI, pT2-M3PI et M4PI sont montrés en figure 4. Exemple 9: Expression de la protéine de fusion de miniproinsuline-TNF Du bleu de E. coli XL-1 a été transformé avec les plasmides pTl-MlPI, pTl-M2PI, pTl-M3PI, pTl-M4PI, pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI, pT2-M4PI, pTl-hPI et pT2-hPI, respectivement, selon la méthode de Hanahan comme décrit dans DNA Cloninq, vol. 1, Ed. D.M. Glover, IRS Press, 109- (1985). Après cela, les colonies résistantes à l'ampicilline formées sur le milieu solide ont été sélectionnées et ensuite inoculées dans 1 ml de milieu LB (10 g de tryptone Bacto , 5 g d'extrait de levure Bacto et 10 g de NaCl par e) contenant 50 pg/ml d'ampicilline. Les colonies ont été incubées à 37 C pendant 12 heures et la culture résultante a été centrifugée à 8 000 x g pendant 2 mn pour obtenir des pastilles de cellules de E. coli. Les plasmides ont été séparés des pastilles en employant une méthode de lyse alcaline (Methods in Molecular Bioloqy, Eds. Leonard G. Davis, et al., Elsevier, pp 99- 101(1986) et 1 pg du plasmide a été dissous dans 50 p1 de 22 2730495 tampon TE (pH 8,0). 0,1 pg de la solution de plasmide a été mélangé avec 2 pl de 10 x tampon One-phor-all à (100 mM Tris-acétate, 100 mM acétate de magnésium, 500 mM acétate de potassium), 1 unité de NdeI et 5 unités de HindIII, et de l'eau distillée a été ajoutée au mélange à un volume final de pl. La solution a été mise à réagir à 37 C pendant 2 heures et ensuite soumise à une électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer l'insertion d'un fragment d'ADN. Les plasmides confirmés pour comprendre le fragment d'ADN ont été utilisés pour transformer la cellule hôte d'expression E. coli BL21(DE3) selon la même procédure que ci-dessus, et les colonies résistantes à l'ampicilline ont *été sélectionnées. Les cellules E. coli BL21(DE3) avec les plasmides pTl- M1PI et pT2-M2PI, respectivement, c'est-à-dire, E. coli BL21(DE3+ pT1-M1PI) et E. coli BL21(DE3+pT2-M2PI) ont été déposés auprès du Korean Culture Center of Microorganism le 29 Décembre 1994, sous les numéros d'accès KCCM-10059 et KCCM-10060, respectivement. Les colonies choisies ci-dessus ont été inoculées dans 1 ml de milieu LB et ensuite cultivées à 37 C pendant plus de 12 heures. La culture a été transférée dans 50 ml de milieu LB contenant 50 pg/ml d'ampicilline et, lorsque la D.O. à 600 nm de la culture était de 0,1 à 0,4, de 1'IPTG (isopropyl thiogalactopyranoside) a été ajouté à la culture à une concentration finale de 1 mM. La culture a été continuée à 37 C pendant 4 heures avec secousses à 200 rpm, et centrifugée à 8 000 rpm pendant 2 mn pour obtenir des pastilles de cellules de E. coli. Exemple 10: Séparation et purification de la miniproinsuline Les pastilles de cellules de E Coli obtenues à l'Exemple 8 ont été mises en suspension dans 5 ml de tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) et ensuite soumises à un traitement aux ultrasons pour rompre les cellules. Le lysat de cellules a été centrifugé à 4 C, 6 000 x g pendant 10 mn 23 2730495 pour obtenir des pastilles. Les pastilles ont été lavées avec fois le volume de tampon Triton X-100 à 4 C (50 mM Tris- HC1, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,5 % (v/v) Triton X-100, 100 mM NaCl) et ensuite centrifugées à 8 000 x g pendant 5 mn pour séparer les pastilles. Ce lavage et les étapes de récupération ont été répétés deux fois. Les pastilles ont été dissoutes dans 1 ml de Tris HC1 0,1 M (pH 8,9) contenant de la guanidine-HCl 6M, et 50 mg de sulfite de sodium et 25 mg de tétrathionate de sodium ont été ajoutés à la solution. Le mélange résultant a été mis à réagir à température ambiante pendant 20 heures et ensuite centifugé à 12 000 x g pendant 30 mn pour obtenir un surnageant. Le surnageant a été placé dans une membrane de dialyse Spectra Por N 3 et ensuite dialysé contre de l'eau distillée à 4 C pendant 24 heures. Le dialysat résultant a été centrifugé à 10 000 x g pendant 30 mn pour obtenir des précipités. Aux précipités ont été ajoutés de l'urée et de l'acide chlorhydrique à des concentrations finales de 8 M et 0,1 M, respectivement. 5 mg de bromure de cyanogène ont ensuite été ajoutés au mélange et la solution résultante a été mise à réagir à température ambiante pendant 20 heures. Le mélange réactionnel résultant a été purifié en utilisant un système d'HPLC (Hitachi, Japon) et une colonne à phase inverse C-18 (Pharmacia). Exemple 11: Repliage de la miniproinsuline et production d'insuline à partir de celle-ci La miniproinsuline sulfonée obtenue à l'Exemple 10 a été séchée, et ensuite dissoute dans un tampon glycine 50 mM (pH 11,0) à une concentration de 53 pM. La solution résultante a été refroidie dans de la glace et du 2- mercaptoéthanol 50 mM a été ajouté à cela à une concentration finale de 636 pM. Le mélange a été agité à 4 C pendant 19 heures tout en maintenant le récipient de réaction scellé avec un parafilm . 100 mM d'acide phosphorique ont été ajoutées au mélange de réaction pour stopper la réaction et 24 2730495 ensuite les produits ont été analysés à 215 nm avec une HPLC. Le résultat est montré en figure 5, o (a), (b), (c), (d) et (e) représentent les chromatogrammes de MIPI, M2PI, M3PI, et M4PI, et hPI correctement repliés. Comme on peut le voir à partir de la figure 5, chacune des miniproinsulines de la présente invention présente une surface de pic plus élevée, c'est-à-dire, un rendement plus élevé, que la proinsuline humaine (hPI). Les rendements de repliage des diverses miniproinsulines et de la proinsuline humaine sont listés au Tableau 1. Tableau 1 Protéine Rendement de repliage (%) M1PI 59 M2PI 74 M3PI 64 M4PI 53 hPI (proinsuline) 30 De plus, de l'hydroxyde de sodium 0,5 M a été ajouté au mélange réactionnel à pH 7,5 à 8,0. De la trypsine et de la carboxypeptidase ont été ajoutées au mélange en des quantités telles que le rapport trypsine, carboxypeptidase B et miniproinsuline devenait de 1:5:12500. Le mélange a été mis à régir à 16 C pendant 20 heures et ensuite ajusté à pH 2 à 3 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 1M pour stopper la réaction. Les solutions résultantes ont été analysées à 215 nm avec une HPLC. Le résultat est montré en figure 6, o (a), (b), (c), (d) et (e) représentent les chromatogrammes des insulines préparées par traitement de M1PI, M2PI, M3PI, M4PI et hPI repliés avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B. Le résultat confirme que les miniproinsulines de la présente invention donnent des rendements plus élevés d'insuline que la proinsuline humaine. 2730495 LISTE DES SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEMANDEUR: SHIN, Hang Cheol CHANG, Seung Gu KIM, Dae Young KIM, Chong Suhl (ii) TITRE DE L'INVENTION: Dérivé de Proinsuline et Procédé pour la Production d'Insuline Humaine (iii)NOMBRE DE SEQUENCES: 36 (iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE: (A) DESTINATAIRE: CABINET WEINSTEIN (B) RUE: 20 Avenue de Friedland (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75008 (vi) REFERENCE DE LA PRESENTE DEMANDE: (A) NUMERO DE DEMANDE: (B) DATE DE DEPOT: (C) CLASSIFICATION: (vii) DONNEES CONCERNANT LA DEMANDE DE PRIORITE (A) NUMERO DE LA DEMANDE: KR 95-2751 (B) DATE DE DEPOT: 15 FEVRIER 1995 (viii) MANDATAIRE: (A) NOM: Yves DURAND (B) NUMERO D'ENREGISTREMENT: 92-1081 (C) REFERENCE NUMERO DOSSIER: 48448 (ix) INFORMATION TELECOMMUNICATION: (A) TELEPHONE: 45 63 22 31 (B) TELEFAX: 45 62 04 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 1 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé 26 2730495 (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Arg Arg Ala Pro Gly Asp Val Lys Arg 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 2 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Arg Arg Tyr Pro Gly Asp Val Lys Arg 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 3 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Arg Arg His Pro Gly Asp Val Lys Arg 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 4 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 7 acides aminés 27 2730495 (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Arg Arg Gly Pro Gly Lys Arg 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 5 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 157 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) PROPRIETES: Facteur de Nécrose Tumorale (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 1 5 10 15 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn 25 30 Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp 40 45 Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser 55 60 Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 70 75 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys 85 90 Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr 100 105 Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu 115 120 28 2730495 Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 130 135 Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val 145 150 Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 6 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6 GCCATACATA TGGTCAGATC ATCTTCTCGA ACC 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 7 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 35 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TGTGGATCCT TATCACAGGG CAATGATCCC AAAGT 35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 8 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire 29 2730495 (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GTGGTGCCAA TAGAGGGCCT GTTCCTCATC TAC 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 9 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GTAGATGAGG AACAGGCCCT CTATTGGCAC CAC 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 10 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 27 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: ATACATATGC CGAGTGACAA GCCTGTA 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 11 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 31 bases (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN 2730495 (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ACATGGATCC CCGGGCAATG ATCCCAAAGT A 31 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 12 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 31 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: ACATGGATCC CCGGGAGTAG ATGAGGTACA G 31 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 13 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 17 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: Pro Ser Asp Lys Pro His His His His His 1 5 10 His His His HIs His Ser Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 14 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 25 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire 31 2730495 (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: TATACATATG CCGAGTGACA AGCCT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 15 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 47 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: AGTGACAAGC CTCATCATCA TCATCATCAT 30 CATCATCATC ACAGCAG 47 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 16 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 24 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: ACATGGATCC GCTGCTGTGA TGAT 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 17 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 258 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique 32 2730495 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc à ARNm (iii) PROPRIETES: encodant la proinsuline humaine (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TTC GTT AAT CAG CAC CTG TGC GGC TCT CAC 30 CTG GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT 60 GAA CGT GGT TTT TTC TAC ACC CCG AAA ACC 90 CGT CGC GAG GCT GAA GAC CTG CAG GTA GGT 120 CAG GTT GAA CTG GGC GGT GGT CCG GGT GCA 150 GGC TCT CTG CAG CCG TTG GCG CTG GAA GGT 180 TCC CTG CAG AAA CGT GGC ATC GTT GAA CAA 210 TGC TGT ACT AGC ATC TGC TCT CTC TAC CAG 240 CTG GAG AAC TAT TGT AAC 258 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 18 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 68 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: TCTCTGCAGC CGTTGGCGCT GGAAGGTTCC CTGCAGAAAC 40 GTGGCATCGT TGAACAATGC TGTACTAG 68 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 19 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 68 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: 33 2730495 AAGCTTTTAC TAGTTACAAT AGTTCTCCAG CTGGTAGAGA 40 GAGCAGATGC TAGTACAGCA TTGTTCAA 68 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 20 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 65 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CTGGTTTGCG GTGAACGTGG TTTTTTCTAC ACCCCGAAAA 40 CCCGTCGCGA GGCTGAAGAC CTGCA 65 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 21 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 65 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: CAGAGAGCCT GCACCCGGAC CACCGCCCAG TTCAACCTGA 40 CCTACCTGCA GGTCTTCAGC CTCGC 65 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 22 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 68 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: oligonucléotide (iii) ANTI-SENS: non 34 2730495 (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: CATGTTCGTT AATCAGCACC TGTGCGGCTC TCACCTGGTA 40 GAAGCTCTGT ACCTGGTTTG CGGTGAAC 68 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 23 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 25 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: GTACCTGGTT TGCGGTGAAC GTGGT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 24 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 24 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: TACGAAGCTT TTACTAGTTA CAAT 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 25 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 21 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non 2730495 (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: GCAGGATCCA TGTTCGTTA T 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 26 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 24 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: GCAAAGCTTT TACTAGTTAC AATA 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 27 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 25 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: GGTGCAGGCT CTCTGCAGCC GTTGG 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 28 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 25 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: 36 2730495 CCAGCGCCAA CGGCTGCAGA GAGCC 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 29 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 36 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29: GCTCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA 36 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 30 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: AACGTCACCC GGAGCGCGAC GGGTTTTCGG GGT 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 31 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 36 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31: TACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA 36 37 2730495 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 32 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32: AACGTCACCC GGGTAGCGAC GGGTTTTCGG GGT 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 33 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 36 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: non (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33: CACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA 36 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 34 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34: AACGTCACCC GGGTGGCAGAC GGGTTTTCGG GGT 33 38 2730495 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 35 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 30 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI- SENS: non * (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35: GGTCCGGGTA AACGTGGCAT CGTTGAACA 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE ID NO: 36 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 27 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: unique (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce d'ADN (iii) ANTI-SENS: oui (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36: ACCCGGACCG CGACGGGTTT TCGGGGT 27 39 2730495 REVENDICATIONS 1. Dérivé de proinsuline humaine caractérisé en ce qu'il a la formule (I): chaîne B-Z-chaîne A (I) ou: lesdites chaînes A et B sont respectivement des chaînes d'insuline humaine; Z est un peptide de formule U-U-X-P-J-(X')n-U-U; U est un résidu arginine ou lysine; X et X' sont indépendamment un résidu acide aminé; P est un résidu proline; J est un résidu glycine, arginine ou lysine; et n vaut 0 ou est un entier valant de 1 à 5. 2. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu alanine, tyrosine, histidine ou glycine; X' est un résidu acide aspartique, valine, arginine ou glycine; et n vaut 2. 3. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu alanine; J est un résidu glycine; et (X')n est un acide aspartique-valine. 4. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu tyrosine; J est un résidu glycine; et (X')n, est un acide aspartique-valine. 5. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu histidine; J est un résidu glycine; et (X')n, est un acide aspartique-valine. 6. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu glycine; J est un résidu arginine; et (X')n, est l'arginine-glycine. 7. Dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un résidu glycine; J est un résidu glycine; et n vaut 0. 2730495 8. ADN caractérisé en ce qu'il encode le dérivé de proinsuline humaine selon la revendication 1. 9. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend l'ADN selon la revendication 8. 10. Vecteur d'expression selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est un plasmide pT1-MlPI(KCCM-10059) ou un plasmide pT2-M2PI(KCCM-10060). 11. Microorganisme caractérisé en ce qu'il est transformé avec le vecteur selon la revendication 9. 12. Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est E. coli BL21(DE3) transformé avec le plasmide pT1-MlPI(KCCM-10059). 13. Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est E. coli BL21(DE3) transformé avec le plasmide pT2-M2PI(KCCM-10060). 14. Procédé pour préparer de l'insuline humaine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: préparation d'un ADN encodant un dérivé de proinsuline humaine ayant la formule (I); insertion de l'ADN dans un vecteur pour construire un vecteur d'expression pour l'expression du dérivé de proinsuline humaine; transformation d'une cellule hôte avec le vecteur d'expression; culture du transformant résultant sous une condition qui permet l'expression du dérivé de proinsuline humaine; purification du dérivé de proinsuline humaine de la culture; préparation de l'insuline humaine à partir du dérivé de proinsuline humaine par une hydrolyse enzymatique.