Brevet FR2730234A1 — publié le 19960809

La présente invention concerne le domaine des techniques de détection et/ou d'amplification, à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques, et leur application à la recherche de la présence ou à l'identification de bactéries du genre Lisieria. Les Listeria sont des bacténes gram positif qui appartiennent à la famille des Listeriaceae, qui est subdivisée en deux genres le genre Listeria et le genre Brochothrlx (Collins et al., 1991, International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 240-246). Le genre Listeria regroupe les espèces bactériennes suivantes Listeria mozocytogenes, Listera innocua, Llsteria seeligeri, Listeria welshimeri, Listeria Ivanovii, Listeria murrayl et Listeria grayl. Seule l'espèce Listeria monocytogenes présente un pouvoir pathogène pour l'homme. Cette espèce est notamment responsable chez l'homme de pathologies sévères telles que des méningo-encéphalites, septicémies ou avortements.Par ailleurs, depuis 198 1, l'espèce Listeria monocytogenes est reconnue comme agent responsable de plusieurs épidémies d'intoxications alimentaires, notamment au Canada en 1981, aux Etats Unis de 1983 à 1985, en Suisse de 1983 à 1987 et très récemment en France en 1992 et 1993. Le taux de mortalité associé à ces épidémies est très élevé, un tiers environ des cas aboutissant a un avortement ou à un décès. Il est donc important de développer un test de diagnostic bactériologique suffisamment spécifique et sensible pour permettre une détection rapide et sélective de l'espéce Listeria monocytogenes, utilisable notamment dans l'industrie alimentaire et le diagnostic médical. Une première génération de tests rapides a été proposée, basés sur la technique de cytométrie de flux (Donnelly C.W., G.J. Baigent, and E.H. Briggs, 1988 Flow cytometry for automated analysis ouf mil containing Listeria monocytogenes , J. Assoc. Off Anal. Chem.71. 655-658) ou sur la méthode ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay") (Mattingley J.A., B.T. Butman. M.C Planck, R.J. Durham. and B.J. Robinson, 1988 Rapid monoclonal antibodybased enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Listeria in food products , J. Assoc. Off Anal. Chem. 71: 679-681). Toutefois, ces techniques ne permettent que la détection des bactéries appartenant au genre Listeria sans aucune discrimination des espéces, et notamment de l'espèce pathogène Listerta mos70cytogenes. D'autres techniques de détection par hybridation d'acides nucléiques, utilisant des marqueurs génétiques, ont ensuite été développées II a ainsi été montré que certaines séquences d'acides nucléiques sont spécifiques de la seule espèce L. monocytogenes. Ces séquences font notamment partie des gènes codant pour des déterminants de virulence, tels que la région en aval du géne hlyA (listeriolysine O) ( íengaud J., M F. Vicente, J. Chenevert, J Moniz-Pereira, C Geoffroy, B. Gicquel-Sanzey, F Baquero, I.C. Perez-Diaz, and P.Cossart, 1988 Expression in Escherichia coli and sequence analysis ouf tue listeriolysin O determinant of Listeria monocylogenes , Infect. Immun 56 766-772) ou le gène top ("invasion-associated protein", encore appelée p60, Kohler S M Leimeister-Wachter, T Chakraborty, F. Lottspeich, and W Goebel, 1990 The gene coding for protem p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listerta moiioctogenes Infect. Immun. t8- 1943-19 > 0). Toutefois, l'utilisation de ces marqueurs nécessite une étape préalable d'amplification d'acide nucléique afin d'obtenir une sensibilité convenable des tests, car chacun de ces gènes n'est présent qu'en monocopie. La présente invention pallie les inconvénients précédemment cités pour la mise en évidence de la présence de bactéries du genre Listeria, et plus particulièrement de l'espèce Listeria monocytogenes, par utilisation d'un marqueur génétique dans un procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et rapidité. Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes appelées ARNr 5S, 16S et 23S. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par référence à leur vitesse de sédimentation, qui est reliée à la taille de ces molécules d'ARN Dans le procédé de l'invention, l'ARN ribosomique (ARNr) des bactéries peut être utilisé comme cible. Un des avantages de cette utilisation est que l'ARNr est retrouvé en abondance dans toutes les cellules des organismes vivants. L'utilisation de l'ARNr 16S de Listeria dans le diagnostic des listerioses a été décrite (voir notamment Wang R.-F.et al., 1991 Development of a 16S rRNA-based oligomer probe specific for Listeria monocytogenes, Appl. Environ. Microbiol. 57:3666-3670, les demandes de brevet n EP 314 294, n WO 90/0884 et le brevet des Etats Unis n US 5 089386). On a maintenant découvert sur 'ADN codant pour l'ARN ribosomique de la sous-unité 23S des zones variables selon les genres bactériens, mais qui apparaissent conservées parmi les espèces appartenant au genre des Listerta, ce qui permet de discriminer au moins un groupe d'espèces du genre Listera d'autres genres ou groupes de genres bactériens. Par ailleurs, il existe dans lesdites zones conservées parmi les espèces du genre Listeria, des variations mineures de séquence entre lesdites espèces Ces différents resultats ont permis de concevoir des sondes nucléiques spécifiques d'espèces ou de groupes d'espèces de Listeria. Avant d'exposer plus en détail l'invention. différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après - par "acide nucléique extrait de bactéries" on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 23S, soit 'ADN génomique, soit encore 'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'APN ribosomique 235 - un "fragment nucléotidique" ou un "oligonucléotide" sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucleiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire. dans des conditions prédéterminées L'enchainement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure differente de celle des acides nucléiques naturels Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques.Il contient généralement au moins 10. et en particulier au moins 12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, - un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut etre un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée, dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose selon qu'il s'agit d'ADN ou d'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, uracile, la cytosine, la thymine, ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs , à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2.6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E.Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates, - par "séquence informationnelle". on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information analogue à celle donnée par la séquence des acides nucléiques naturels, - par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin.Les conditions d'hybridation sont déterminées par la "stringence", c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mesappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées.Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminees dans chaque cas par des experiences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisees, la temperature pour la reaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 653C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à i M. - une "sonde" est un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 12 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN ribosomique, soit dans un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique, soit encore dans un ADN (appelé ici ADN ribosomique ou .ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription , une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie. - une "sonde de capture" est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide (voir notamment la demande de brevet WO 92 10092) - une "sonde de détection" peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine, - une "amorce" est une sonde comprenant par exemple de 10 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de sequençage, dans une méthode de transcription inverse, etc., Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, dans la recherche de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites "DOT-BLOT" (MANiATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., 98 503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "iL'ORTHERN BLOT", ou les techniques dites "sandwich" (DUNN A.R., HASSEL J.A, Cell, 12 23(1977)), on utilise en particulier la technique sandwich, avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) etant capable de s'hybrider avec une region de la cible qui est specltique de l'espece ou du groupe d'especes recherché, etant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doi-ent avoir des sequences nucléotidiques au moins partiellement différentes. Dans des conditions qui sont précisées dans l'exemple I ci-après, on a déterminé la séquence nucléotidique de l'ADNr correspondant à l'ARN ribosomique 23S de deux espèces de Listeria, ainsi que d'une espèce du genre phylogénique immédiatement voisin de celui des Listeria, à savoir le genre Brochothrix. Cette étude a porté sur les espèces L. monocytogenes, L. innocua et Brochothrix thermosphacta. On a recherché des régions fortement conserves pour le seul genre Lîsieria, permettant de le distinguer des autres genres bactériens, ainsi que des régions variables au sein du genre Listeria, et qui permettent donc de distinguer plusieurs especes ou groupes d'espèces de Listerici On a ainsi sélectionné, en faisant référence à la numérotation de la séquence nucléotidique de l'ARNr 23S de Lîsteria monocytogenes ATCC 19115, trois régions intéressantes, à savoir 664728, 1188-1251 et 2209-2275. On a déterminé les séquences de ces mêmes régions pour différentes souches des autres espèces de Listeria ainsi que pour l'espèce Brochothrlx campestris. Les résultats de ces différents séquençages sont resumés dans les figures 1 à 3 annexées dans lesqueiles le signe * représente un site vacant dont la representation est nécessaire pour l'alignement des séquences en tenant compte de certaines espèces possédant à ce site un motif nucléotidique supplémentaire. Les résultats de ces recherches, c'est-à-dire les alignements de séquences figurant dans les figures 1 à 3, ont permis de concevoir des sondes permettant de détecter des groupes d'espèces ou d'identifier certaines espèces du genre Listeria En choisissant des sondes dans les régions conservées chez toutes les espèces de Listerici, on peut détecter la présence ou l'absence d'au moins une bactérie quelconque du genre Llsterla En utilisant des sondes contenant des zones mutées pour une espèce particulière (par rapport a l'espèce de référence, ici L. rnoe)ocytogeiies), il est possible de détecter directement la présence d'une telle espèce.Dans les techniques d'hybridation sandwich, utilisant deux sondes en combinaison (sonde de capture et sonde de détection), on utilisera par exemple en combinaison une sonde spécifique du genre Listeria et une sonde spécifique de l'espèce considéree On peut aussi utiliser en combinaison deux sondes spécifiques de ladite espèce, lorsqu'elles existent, ces deux sondes étant complémentaires de régions non chevauchantes de l'ARNr 23S de ladite espèce Dans d'autres cas (notamment pour Listeria niotiocytogenes), il n'existe pas de sonde unique permettant de caractériser directement une espèce donnée. [| est alors possible d'utiliser en combinaison deux sondes, (notamment selon la technique d'hybridation sandwich), à savoir, par exemple d'une part, une première sonde permettant l'hybridation avec l'ARNr (ou l'ADNr) de Listeria nioeiocytogeiws et d'une seconde espèce de L Listeria, et d'autre part une deuxième sonde capable de s'hybrider avec l'ARNi'r ou l'ADNr de Lisieria monocytogenes et d'une ou plusieurs autres espèces de Listeria mais pas de ladite seconde espece.Si on observe une hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec un tel système de deux sondes, on peut conclure à la présence de Listeria monocytogeR7es Comme on l'a indiqué précédemment, les sondes nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées dans les méthodes classiques d'hybridation. L'acide nucléique à détecter (cible) peut etre de l'ADN (éventuellement obtenu après amplification) ou de l'ARS'. Dans le cas d'une cible nucléique double brin, il convient de procéder à sa dénaturation avant la mise en oeuvre du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner.La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut être effectuée par les méthodes connues de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80 C. Dans certains cas, la mise en évidence de la présence d'une espèce de Listeria donnée nécessite l'utilisation de sondes permettant la détection d'une mutation ponctuelle. Pour cela, il convient d'opérer avec des sondes d'une longueur (nombre de motifs nucléotidique) prédéterminée, dans des conditions elles-memes predéterminées. D'autres précisions sont données ci-après, en faisant référence plus particulièrement à la méthode d'hybridation sandwich qui constitue l'une des méthodes d'hybridation les plus pratiques actuellement.Cette méthode comprend la mise en contact d'une première sonde fixée sur un support solide avec une solution contenant l'acide nucléique à analyser, et la mise en contact dudit support avec la sonde de détection, l'incubation du mélange obtenu, le rinçage du support, pour éliminer les constituants non fixés sur le support par hybridation spécifique, et la détection qualitative ou quantitative, à l'aide d'une réaction de révélation du marqueur fixé sur le support, de la sonde de détection fixée. La révélation de la présence du marqueur peut être effectuée par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence. La mise en contact de la sonde de capture avec l'échantillon et avec la sonde de détection peut être effectuée de façon séquentielle, éventuellement avec rinçage intermédiaire du support. On peut également opérer par mise en contact simultanée ou quasisimultanée de la sonde de capture fixée sur le support avec une solution contenant l'échantillon et la sonde de détection qui peuvent être ajoutées sous forme de mélange ou séparément Les stades d'incubation et de lavage consécutif, qui constituent les étapes-clés du procédé d'hybridation sandwich, sont chacune effectuée a une température constante qui peut être par exemple comprise dans la gamme mentionnée plus haut (voir les "Définitions") On sait que les hybrides d'acides nucléiques ont une température de dissociation qui dépend du nombre de bases hybridées (la température augmentant avec la taille de l'hybride) et qui dépend également de la nature des bases hybridées et. pour chaque base hvbridée, de la nature des bases adjacentes La dissociation des hybrides se produit sur un Intervalle de température de quelques degrés et peut être facilement déterminée, par exemple en spectroscopie U V Il est possible de déterminer expérimentalement ia température de demi-dissociation de l'hybride formé par une sonde donnee avec la cible de séquence complémentaire, par de simples expériences de routine. La température d'hybridation utilisée dans la technique d'hybridation sandwich doit evidemment être choisie en-dessous de la température de demi-dissociation. Plus exactement, on opère à une température inférieure à la température de demi-dissociation de l'hybride le moins stable parmi les deux hybrides que forme la cible avec d'une part la sonde de capture et d'autre part la sonde de détection, afin que les deux hybrides soient stables à la température à laquelle on opère Une mutation ponctuelle, c'est-à-dire une mutation entraînant un mésappariement portant sur une seule paire de bases dans l'hybride, entraîne une modification, généralement un abaissement, de la température de demi-dissociation.En utilisant des sondes suffisamment courtes, un tel mésappariement unique peut entrainer un abaissement relativement important de la température de demi-dissociation, de l'ordre de quelques degrés Ainsi, en choisissant, à l'aide d'expériences de routine préalables, une sonde de longueur appropriée, en opérant dans une solution tampon donnée, il est possible de déterminer une température à laquelle il sera possible de n'observer l'hybridation que dans le cas où la sonde est strictement complémentaire de la cible.En outre, grâce au choix de sondes courtes de longueur prédéterminée, il est possible de mettre en oeuvre la technique d'hybridation sandwich à une température unique predeterminée, par exemple 370C Pour une discussion plus détaillée de la technique d'hybridation sandwich avec utilisation de sondes courtes, on peut se reporter notamment à la demande de brevet FR-?.663.040. L'invention a donc pour objet un oligonucléotique monocaténaire. caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les oligonucléotides, avant au moins 12 motifs nucléotidiques, dont la séquence est incluse dans l'une des séquences (a1) à (a10) de la liste suivante (a1) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGCATAAGT AACAGGTCGT AGACCCGAAA CCAGG (a2) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGAATAAGT AACAGGTCGT AGACCCGAAA CCAGG (a3) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGTATGAAG TAACAGGTCG TAGACCCGAA ACCAGG (a4) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTTAGAGGT TCGTGGTAGG AGAGCGTTCT AAGG (a5) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTCGGAGGT TCGTGGTAGG AGAGCGTTCT AAGG (a6) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTATAGAGG TTCGTGGTAG GAGAGCGTTC TAACG (a7) AAACGTATTA CCGAAACTGT GGATGAACAT CTTCGGATGT TCGTGCTAGG AGAGCGTTCT AAGG (as) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG (a9) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCACC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG (a10) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTAAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG ; ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide. Parmi les oligonucléotides de l'invention. certains peuvent être utilisés pour caractériser une espèce ou un groupe d'espèces du genre Listeria Ce sont notamment les oligonucléotides définis à l'aide des séquences (b1) a(b15) et (cl) à (c14) ci-après. L'invention concerne en particulier un oligonucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il comporte une séquence d'au moins cinq motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans une séquence comprise à l'intérieur des crochets figurant dans les séquences (b1) à(b15) de la liste suivante (b1) AGTCTGAATA GG[GCGCATA]A GTAACAGGTC GTAGA (b2) AGTCTGAATA GG[GCGAATA]A GTAACAGGTC GTAGA (b3) AGTCTGAATA GG[GCGTATGA AG]TAACAGGT CGTAGA (b4) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTTAGAG]GT TCGTGGTAGG (b5) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTCGGAG]GT TCGTGGTAGG (b6) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTATAG]AGG TTCGTGGTAG G (b7) CCGAAACTGT GGATGAACAT CTT[CGGATGT T[CGTGGTAGG (b8) A[AACGTAT]TA CCGAAACTGT GGATGAA (b9) CCGAAACTGT GGATG[AACAT CT]TCGGATGT TCGTGGTAGG (b10) TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCGCCA]CGC T (bll) CCAC[GCTTAG C]GCGTGGGGA GACAGTGTCA GG (b12) TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCACCA]CGC TTAGCGCGTG GGGAGACAGT GTCAGG (b13) TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCAC[GC TAAGC]GCGTG GGGAGACAGT GTCAGG (b14) [CCGCCA]CGCT TACCGCGTGG GGAGACAGTG TCAGGTGGGC AG (b15) TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCAC[GC TTAG] ; ainsi qu'un oligonucléotide complementaire dudit oligonucléotide L'invention concerne notamment un oligonucleotide tel que défini precedemment, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (cl) à (c14) suivantes (c1) GAATAGGGCG CATAAGTAAC A (c2) GAATAGGGCG AATAAGTAAC A (c3) ATAGGGCGTA TGAAGTAACA (c4) TGAACCTCTT TAGAGGTTCG TG (c5) TGAACCTCTT CGGAGGTTCG TG (c6) TGAACCTCTT ATAGAGGTTC G (c7) GTGGATGAAC ATCTTCGGAT GTTCGTGGTA (c8) AAACGTATTA CCGAA (c9) ATTCTAACCC GCCACGCT (c10) ATTCTAACCC ACCACCCTTA C (c11) CCACGCTTAG CGCGTGG G (c12) CCGCCACGCT AAGCGCGTGG G (c13) CCGCCACGCT TAGCGCGTGG G (c14) TTCTAACCCG CCACGCTTAG ; ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit nucléotide. Parmi les oligonucléotides de l'invention, certains sont utilisables comme sonde permettant de détecter toute bactérie du genre Listeria Ce sont notamment les oligonucléotides définis à l'aide des séquences (d1) à (d6) cl-après. L'invention a donc également pour objet un oligonucléotide tel que défini précédemment, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (d1) à (d6) Suivantes (d1) AACTAACAGG TCGTAGAC (d2) TATTACCGAA ACTGTGGATG AAC (d3) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCC (d4) AGCGCGTGGG GAGACAGT (d5) CAGTGTCAGG TGGGCAG (d6) GTTCGTGGTA GGAGAGCGTT. Pour l'utilisation dans les techniques d'hybridation classiques, les oligonucléotides de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide (c'est notamment le cas d'une sonde de capture) ou marqués avec un agent traceur (sonde de détection). L'invention a également pour objet un procédé de détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une bactene du genre L Listeria, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie. selon une méthode dans laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde nucléique, puis on détermine de façon connue en soi la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon, caractérisé par le fait que ladite sonde est un oligonucléotide choisi parmi ceux qui ont été définis précedemment. Pour la détermination de la présence ou de l'absence d'une espèce ou d'un groupe d'espèces de bactérie du genre Listera, on peut utiliser comme sondes nucléiques d'une part une première sonde telle que définie précédemment et d'autre part une sonde telle que définie par l'une des séquences (b1) à (b15) ou (cl) à (C4), étant entendu que lesdites première et seconde sondes sont capables de s'hybrider avec des régions non chevauchantes de l'ARNr 23S (ou son complémentaire) d'une bactérie du genre Listeria. La première sonde est par exemple immobilisée sur un support solide et la seconde sonde est marquée avec un agent traceur.Pour déterminer la présence ou l'absence d'au moins une bacterie (quelconque) du genre Listeria, on peut utiliser comme sonde au moins un oligonucléotide tel que défini par les séquences (d1) à (d6) On peut détecter la présence de certaines bactéries du genre Listeria, éventuellement avec une seule sonde, par exemple - Listeria seeligeri sonde incluse dans ia séquence (b2), (b12) (c2) ou (cio) -Listeria mno@@a sonde inchuse dans la séquence (b13) ou (c12) - Listeria ivanov@ sonde incluse dans la sequence (bó) ou (c6) - Listeria grayi et/ou Listeria mllrrasol (ces deux espèces ne pouvant pas être distinguées à l'aide des sondes de l'invention) sonde incluse dans la séquence (b), (b7), (bs), (b9), (c.), (C7) ou (c8) Lorsqu'on souhaite utiliser une sonde qui dérive de la figure 1, en vue de la détermination d'une espèce particulière, il convient de vérifier préalablement à l'aide des sondes (b6) ou (cc) si Listeria ivanovit est présente Dans l'affirmative. on ne peut pas utiliser une sonde dérivée de la figure 1 pour la détermination envisagée (car la sequence correspondant à la figure 1 n'a pas été déterminée pour L. ivanovti) Lorsqu'on utilise un système a deux sondes, on peut utiliser, pour déterminer les bactériens qui viennent d'être mentionnées, d'une part une sonde spécifique du genre Listeria (incluse dans l'une des séquences (d1) à (d6)) en combinaison avec les séquences spécifiques qui viennent d'être indiquées. Lorsqu'il existe plusieurs sondes spécifiques de l'espèce recherchée, on peut bien entendu utiliser la combinaison de deux telles sondes spécifiques de cette espèce. Pour la détermination de la presence ou de l'absence de Listeria monocytogenes. on utilise un système à deux sondes, en particulier dans un procédé caractérisé par le fait - que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (b1), (blo) (bol4) ou (bis) et l'autre sonde une séquence incluse dans la séquence (b4), - ou que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (c), (cl), (C13) OU (C14) et l'autre incluse dans la séquence (cul). Les divers oligonucléotides qui ont été définis précédemment peuvent également être utilisés comme amorces nucléotidiques pour la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase de façon connue en soi, et notamment dans des méthodes d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR RT-PCR, etc...). On peut utiliser notamment les oligonucléotides de l'invention comme amorces pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 23S d'au moins une espèce ou d'au moins un groupe d'espèces du genre Listeria pour obtenir une séquence d'ADN complémentaire correspondante. Une telle transcription inverse peut constituer le premier stade d'une RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN complémentaire obtenu. On peut également utiliser ces oligonucléotides comme amorces, notamment pour l'amplification spécifique par réaction de polymérisation en chaine de la séquence d'ADNr complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 23S d'au moins une espèce ou d'au moins un groupe d'espèces du genre Listeria. Les oligonucléotides définis précédemment peuvent être également utilisés comme sondes de thérapie pour traiter les infections provoquées par au moins une espèce ou un groupe d'espèces de bactéries du genre Listeria. Ces sondes de thérapie, capables de s'hybrider sur l'ARN ribosomique 23S et/ou sur l'ADN gnomique desdites bactéries peuvent bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou de réplication.Le principe des méthodes de thérapie génique est connu et repose notamment sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin antisens : la formation d'un hybride entre la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du décryptage de l'information génétique. La formation d'un duplex entre un oligonucléotide selon l'invention et 'ARN ribosomique 23S des bactéries-cibles est également susceptible de perturber la configuration spatiale dudit ARNr et/ou l'association dudit ARNr avec les protéines constitutives du ribosome. Les sondes de thérapie sont donc utilisables comme médicaments antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par des Listeria, y compris Listeria moflocytogeiles Les exemples suivants illustrent l'invention EXEMPLE 1: Détermination de la séquence nocléotidique des ARN ribosomique 23S de Lîsteria La séquence nucléotidique de 'ADN correspondant à l'ARN ribosomique de la sous-unité 23S pour les espèces suivantes a été déterminée L. monocytogenes ATCC 19115 L. mnocua ATCC 33090 L. seeligeri CCUG 15330 Brochopthrix thermosphacta ATCC 11509 Le séquençage a été réalisé selon les étapes suivantes extraction de l'ADN des souches par la méthode de Sjöbring et al. (1990.Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tlaberculosis. J. Clin. Microbiol. 28 (10):2200-2204), amplification par PCR de I'ADN ribosomique 23S à l'aide d'amorces eubactériennes définies dans les zones phylogéniquement conservées de ce type d'ARN. Les couples de sondes eubactériennes utilisés, correspondant à des séquences communes à toutes les bactéries, étaient les suivants a) 5' TCCGAATGGG GAAACCC 3' positions 115-130 5' GATCTGGGCT GTTTC 3' positions 988-1002 b) 5' AAGAGGGAAA CARCCCAGA 3' positions 982-1000 5' GGAACTTACC CGACAAGG 3' positions 1963-1982 c) 5' GAAATTCCTT GTCGGGT 3' positions 1957-1975 5' CTAGGTCTGA CCTATCAAT 3' positions 2864-2882 On rappelle que R signifie G ou A. Cette étape a permis l'amplification de 3 zones d'environ Ikb permettant de couvrir l'ensemble de la cible 23S et qui ont été séquencées sur chacun des 2 brins par la méthode de terminaison de chaîne sur un séquenceur Applied Biosystems ABI 360 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463-5467). On a ensuite sélectionné trois régions correspondant aux séquences nucléotidiques 664-728, 1188-1251 et 2209-2275 (référence à L. monocytogenes ATCC 19115 , voir figures 13). L'ARN 23S de ces régions a été séquencé pour diverses espèces et souches de Listeria et de Brochothrix. Les résultats sont présentés aux figures 1-3. EXEMPLE 2 : Utilisation de sondes dirigées contre l'ARN ribosomique 23S du genre Listeria pour l'identification spécifique de Listerin monocytogenes On a préparé la sonde suivante (complémentaire d'une séquence de la figure 2) ACGAACCTCT AAAGAG Cette sonde a été utilisée comme sonde de détection dans un test d'hybridation sandwich. Une autre sonde (complémentaire d'une séquence de la figure 3) a été préparée TAAGCGTGGC GGGTTAGAAT, et a été utilisée comme sonde de capture dans ce test. L'ARNr 23S d'une collection de souches de Listeria et d'autres espèces bactériennes (voir ci-dessous) a été testée par hybridation à l'aide de ces deux sondes - 23 souches de L. monocytogenes, de sérovars et de provenances variées - 17 souches de L. irnwczta - 8 souches de L. seeligeri - 9 souches de L. welshimeri - 16 souches de L. Ivanovii - 3 souches de L. grayi - 4 souches de L. murrayi - 2 souches de Brochothrix thermosphacia - 1 souche de Brochothrix campestris - I souche de Bacîllus subtilis - 1 souche de Bacillus cereits - l souche de Bacillus megaterium - 3 souches de Erysepelothrix rhiîsiopathiae - l souche de Lactobacillus acidophihis - 2 souches de Streptococcus groupe A - 1 souche de Streptococcus groupe B - 1 souche de Streptococcits groupe C - 1 souche de Streptococcus faecalis - I souche de Streptococcus suis - 1 souche de Escherichia colt L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection semi-automatisé décrit dans le brevet français n 2.663.040.La sonde de détection est conjuguée à la phosphatase alcaline. L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries Gram positif décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de I ng/pl de l'oligonuclèotide de capture, dont l'extrémité 5' est couplée avec le réactif Aminolink 2 (marque déposée, Applied Biosystems, Foster city, Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCI , 0.15 M phosphate de sodium, pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 370 C puis lavée 3 fois avec 300 ul de PBST (PBS lx, Tween 20: 0,5 100 (Merck 822184)).Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle L'utilisation d'une sonde couplée à un ligand possédant un groupement polaire (amine primaire) fixée de façon passive sur le support, permet d'obtenir un signal amélioré (demande FR 2.679.255). La cible (10 l d'ARN totaux) mélangée avec 40 l de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 ug/ml (Sigma D 9156) est déposée dans le puits en présence de 50 Cll d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/ l en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMèrieux 55842)). La plaque est incubée 1 h à 370 C puis lavée par 3 fois avec 300 1ll de tampon PBST.Dans chaque puits, on ajoute 100 ul de substrat OPD (ortho phénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) à la concentration de 4 mg/ml dans un tampon (0,055 M acide citrique, 0,1 M monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93), auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogene à 30% dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est arrétée par 100 ul d'acide sulfurique IN et la lecture est effectuée à 492 nm sur un appareil Axia Microreader (AXIA) (bioMèrieux) Les résultats des tests effectués ont montré que la combinaison de sondes utilisée est spécifique de L. monocytogenes. L'adaptation de la combinaison spécifique de sondes testées sur l'automate VIDAS (BIO MERIEUX-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR ("Solid Phase Receptacle") (BION Dans un premier temps, 'oligonucléotide de capture comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-réf400808) est fixé passivement sur la surface interne du SPR, à une concentration de I ng/pl dans un volume de 3 15 ,ul d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCI 600 mM).Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37 C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide La barrette associée à l'automate VIDAS contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire: - dans le premier puits de la barrette. 10 ul de 'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus - dans un second puits, 200 ul d'une solution a 0, I ng/ul du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, - dans un troisième et un quatrième puits, 600 l de solution de lavage PBS Tween - et enfin une cuvette avec 250 tii de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine. Les contenus du premier et du second puits sont aspirés dans le cône prétraité comme indiqué précédemment. Après incubation 30 minutes, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween et 250 l de substrat iVIUP (méthyl-4 umbellifèryl phosphate) sont aspirés puis relachés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette. Les résultats obtenus avec ce système sont identiques à ceux obtenus en plaque de microtitration. EXEMPLE 3: De façon analogue, on peut détecter la présence de L. innocua à l'aide de la combinaison des deux sondes suivantes pour la capture et la détection, respectivement lère sonde: GGGTTAGAAT GGTCATACAG CCAGGGT 2ème sonde CCACGCGCTT AGCGTGG EXEMPLE 4: De façon analogue, on peut détecter la présence de L. ivanovii à l'aide de la combinaison des deux sondes suivantes pour la capture et la détection, respectivement lère sonde TTCATCCACA GTTTCGGTAA TATGT 2ème sonde CGAACCTCTA TAAGAGGTTC A REVENDICATIONS 1. Oligonucléotide monocaténaire, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les oligonucléotides, ayant au moins 12 motifs nucléotidiques, dont la séquence est incluse dans l'une des séquences (a) à (al0) de la liste suivante (a1) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCCCATAAGT AACAGGTCGT AGACCCGAAA CCAGG (a2) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGAATAAGT AACAGGTCGT AGACCCGAAA CCAGG (a3) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGTATGAAG TAACAGGTCG TAGACCCGAA ACCAGG (a4) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTTAGAGGT TCGTGGTAGG AGAGCGTTCT AAGG (a5) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTCGGAGGT TCGTGGTAGG AGAGCGTTCT AAGG (a6) AAACATATTA CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTATAGAGG TTCGTGGTAG GAGAGCGTTC TAAGG (a7) AAACGTATTA CCGAAACTGT GGATGAACAT CTTCGGATGT TCGTGGTAGG AGAGCGTTCT AAGG (a8) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG (a9) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCACC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG (a10) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTAAGCG CGTGGGGAGA CAGTGTCAGG TGGGCAG ; ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide. 2. Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comporte une séquence d'au moins cinq motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans une séquence comprise à l'intérieur des crochets figurant dans les séquences (bl) à (b15) de la liste suivante (b1) AGTCTGAATA GG[GCGCATA]A GTAACAGGTC GTAGA (b2) AGTCTGAATA GG[GCGAATA]A GTAACAGGTC GTAGA (b3) AGTCTGAATA GG[GCGTATGA AG]TAACAGGT CGTAGA (b4) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTTAGAG]GT TCGTGGTAGG (b5) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTCGGAG]GT TCGTGGTAGG (b6) CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTATAG]AGG TTCGTGGTAG G (b7) CCGAAACTGT GGATGAACAT CTT[CGGATGT T]CGTGGTAGG (b8) A[AACGTAT]TA CCGAAACTGT GGATGAA (b9) CCGAAACTGT GGATG[AACAT CT]TCGGATGT TCGTGGTAGG (b10) TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCGCCA]CGC T (b11) CCAC[GCTTAG C]GCGTGGGGA GACAGTGTCA GG (b12) TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCACCA]CGC TTAGCGCGTG GGGAGACAGT GTCAGG (b13) TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCAC[GC TAAGC]GCGTG GGGAGACACT GTCAGG (b14) [CCGCCA]CGCT TAGCGCGTGG GGAGACAGTG TCAGGTGGGC AG (b15) TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCAC[GC TTAG] ; ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide. 3. Oligonucléotide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (c1) à (c14) suivantes (cl) GAATAGGGCG CATAAGTAAC A (c2) GAATAGGGCG AATAAGTAAC A (c3) ATAGGGCGTA TGAAGTAACA (c4) TGAACCTCTT TAGAGGTTCG TG (c5) TGAACCTCTT CGGAGGTTCG TG (c6) TGAACCTCTT ATAGAGGTTC G (c7) GTGGATGAAC ATCTTCGGAT GTTCGTGGTA (c8) AAACGTATTA CCGAA (c9) ATTCTAACCC GCCACGCT (c10) ATTCTAACCC ACCACGCTTA G (c11) CCACGCTTAG CGCGTGG G (c12) CCGCCACGCT AAGCGCGTGG G (c13) CCGCCACGCT TAGCGCGTGG G (c14) TTCTAACCCG CCACGCTTAG ; ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit nucléotide. 4. Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (d1) à (d6) Suivantes (d1) AAGTAACAGG TCGTAGAC (d2) TATTACCGAA ACTGTGGATG AAC (d3) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCC (d4 > AGCGCGTGGG GAGACAGT (ds) CAGTGTCAGG TGGGCAG (d6) GTTCGTGGTA GGAGAGCGTT ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide. 5. Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est immobilisé sur un support solide. 6. Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il est marqué avec un agent traceur. 7. Procédé de détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une bactérie du genre Listeria, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, selon une méthode dans laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde nucléique, puis on détermine de façon connue en soi la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon, caractérisé par le fait que ladite sonde est un oligonucléotide choisi parmi ceux qui sont définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Procédé selon la revendication 7, pour la détermination de la présence ou l'absence d'une espèce ou d'un groupe d'espèces de bactéries du genre Llsteria, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sondes nucléiques d'une part une première sonde telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 et d'autre part une seconde sonde telle que définie dans la revendication 2 ou 3, étant entendu que lesdites première et seconde sondes sont capables de s'hybrider avec des régions non chevauchantes de l'ARNr 23S (ou son complémentaire) d'une bactérie du genre Listeria. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on utilise ladite première sonde est telle que définie dans la revendication 5 et ladite deuxième sonde est telle que définie dans la revendication 6. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence d'au moins une bactérie quelconque du genre Listera, ou de l'absence d'une telle bactérie, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sonde un oligonucléotide tel que défini dans la revendication 4. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Lisieria seeligeri, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b2) ou (b12), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c2) ou (cl0) 12.Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Liswria @@ocna, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 7, incluse dans la sequence (b13), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c,2) 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour ia détermination de la présence ou de l'absence de Listeria ivoeiovii, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b6), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c6). 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria grayi et/ou Listeria mllrrayi, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que definie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b;), (b7), (bs) ou (b9), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c;), (C7) ou (c8). 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé par le fait que l'on utilise ladite sonde en combinaison avec une sonde telle que définie dans la revendication 4. 16. Procédé selon revendication 8, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria monocytogenes, caractérisé par le fait - que l'une des sondes est telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b1), (b10), (b14) ou (b15), et l'autre sonde est telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b4), - ou que l'une des sondes est telle que définie dansla revendication 3. incluse dans la séquence (c i), (c), (c13) ou (c14), et l'autre sonde est telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c4). 17. Utilisation comme amorce nucléotidique pour la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase, d'un oligonucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4. 18. Sonde de thérapie, caractérisée par le fait qu'elle comprend un oligonucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4