Brevet FR2728586A1 — publié le 19960628

La présente invention décrit un procédé d'obtention du gellane par croissance d'une bactérie appartenant à l'espèce Pseudomonas elodea (encore appelée Auromonas elodea) sur un milieu de culture approprié. Ce procédé permet en particulier d'augmenter la concentration de gellane dans le milieu de culture tout en abaissant le coût du milieu de production. La production de gellane, encore appelé hétéropolysaccharide S60 par Pseudomonas elodea ATCC 31461 est décrite principalement dans les brevets US-4.326.053, 4.326.052, 4.385.123, 4.377.636 et dans l'article intitulé "'Agar- like polysaccharide produced by a Pseudomonas species : production and basic properties" publié dans "Applied and Environmental Microbiology-, 1982, vol. 43 n"5, pages 1086-1091. Le gellane est produit par fermentation aérobie sur des milieux de culture usuels contenant des sources de carbone, des sources d'azote organique et minéral et des sels minéraux. Par le passé, dans la plupart des cas, la source d'azote pour la production de gellane est constituée d'un ou de plusieurs composés amenant de razote organique et éventuellement d'un sel minéral, par exemple du NH4NO3. Ces sources d'azote organique sont des composés riches en protéines ou en résidus d'hydrolyse de protéines. Ces sources d'azote organique peuvent étre de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, des extraits de viande, de la farine de poisson, de la farine de soja, de la farine de coton, de la liqueur de macération de maïs ("corn steep"), des résidus solubles de distillation, des hydrolysats de caséine, des peptones, etc. L'introduction de telles sources d'azote dans un milieu de fermentation lui confère la dénomination de milieu complexe.Dans l'art antérieur, une source d'azote minérale, sous forme de sel d'ammonium est parfois rajoutée au milieu. Ces sels peuvent être du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium ou du nitrate d'ammonium. La présente invention concerne un procédé pour la production de gellane par culture du micro-organisme Pseudomonas elodea ATCC 31461 dans un milieu de fermentation dont la source d'azote est constituée principalement d'ions nitrates. Dans ce cas, la production de gellane, c'est-à-dire la concentration finale en gellane dans le moût de fermentation, est améliorée. Par ailleurs, la productivité globale en gellane, c'est-à-dire la quantité de gellane produit par unité de volume de milieu de fermentation et par unité de temps de fermentation, ainsi que le rendement en gellane, c'est-à-dire la quantité de geilane produit divisée par la quantité de substrat carboné consommée, peuvent également être améliorés. De plus, I'omission des sources d'azote organique du milieu de fermentation permet de diminuer le cout du milieu et donc de diminuer le prix de revient du gellane. La présente invention concerne un procédé de production du gellane dans lequel le milieu de culture comporte une source d'azote constituée principalement d'ions nitrates. Dans le procédé, les ions nitrates peuvent provenir du groupe constitué par le nitrate de potassium, le nitrate de sodium, I'acide nitrique dilué, et leur mélange. Des formes moins purifiées, telles que celles présentes dans certains engrais peuvent également être envisagées. La source d'azote est en général incorporée en une seule fois dans le milieu de fermentation, avant ensemencement. La concentration en azote, comptée en azote N peut être compnse entre 0,05 et 1 g/l dans le milieu de culture, et de préférence comprise entre 0,2 et 0,8 g/l. La source d'azote peut ne pas contenir en quantité sensible d'azote organique, ni d'ions ammonium. L'invention concerne également un milieu de culture pour produire du gellane. Le milieu de culture comporte une source d'azote constituée principalement par des ions nitrates. Le gellane (encore appelé hétéropolysaccharide S60) est produit par culture du micro-organisme Pseudomonas elodea ATCC 31461 sur des milieux contenant des sources de carbone, d'azote et des sels minéraux. Le substrat carboné contient de préférence des hydrates de carbone tels que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le xylose ou le mamitol (cette liste n'étant pas limitative), qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange. La concentration en carbohydrate dans le milieu dépend en partie de la concentration des autres constituants du milieu, en particulier de la concentration en azote. Ainsi, pour favoriser la production de polysaccharide, il est préférable d'avoir des concentrations initiales en substrats carbonés et azotés telles que le rapport molaire des quantités de carbone et d'azote initiales (C/N) soit largement supérieur à 1. Cependant, la concentration initiale en carbohydrate doit être choisie de façon à minimiser le plus possible la concentration résiduelle (c'est-à-dire en fin de fermentation) en carbohydrate. La concentration initiale en carbohydrate varie en général de 10 à 60 glui, de préférence de 20 à 40 g/l. D'autres sels minéraux peuvent être introduits dans le milieu de culture, tels que des sels de magnésium, potassium, sodium, soufre, manganèse, fer, bore, zinc, cobalt, molybdène... Une composition typique du mélange de ces sels est donnée dans l'exemple 1. Cette composition est donnée à titre illustratif et n'est pas limitative. La fermentation selon la présente invention est réalisée à des températures comprises entre 25 et 35"C, de préférence entre 28 et 32"C. Le pH du milieu est régulé à une valeur comprise entre 6 et 8 tout au long de la fermentation. Le réacteur de production est agité à l'aide de modules d'agitation assurant un bon transfert au sein du réacteur. Le milieu doit être aéré, le taux d'aération étant compris entre 0,2 et 2 wm (volume d'air par volume de liquide et par minute). La fermentation s'effectue en batch. Pour cela, le réacteur contient tous les ingrédients du milieu de culture, puis est stérilisé et, une fois revenu à la température de fermentation, est ensuite ensemencé par une culture active. Le taux d'ensemencement, c'est-à-dire le rapport des volumes d'ensemencement et de milieu après ensemencement, est compris entre 0,1 et 10 %. Des sondes stêrilisables permettant d'enregistrer et de réguler des paramètres tels que le pH, la température, le taux d'oxygène dissous, équipent le réacteur. II est également possible de connaître les taux d'oxygène et de gaz carbonique dans les gaz de sortie à l'aide d'analyseurs placés sur la sortie des gaz du réacteur. Après 1 à 4 jours de culture en fermenteur, la culture peut être arrêtée. Le principal critère pour l'arrêt de la fermentation est la faible consommation de glucose. Le moût de fermentation contient du gellane brut. Celuici peut être récupéré par précipitation avec un solvant approprié, le plus souvent l'isopropanol. Le précipité récupéré peut être séché. La matière sèche totale contient à la fois du gellane dit natif et les cellules issues de la cuRure de Pseudomonas elodea. Cette méthode de précipitation à l'isopropanol suivie d'un séchage est la méthode classique de détermination de la concentration en gellane brut dans le mout de fermentation. La présente invention sera mieux comprise et ses avantages apparaltront plus clairement à la lecture des exemples après Exemple 1: Préparation de gellane selon l'art antérieur (fermentation 1) La souche de Pseudomonas elodea ATCC 31461 est conservée en tubes, à -22 C sur un milieu complexe gélosé (Nutrient Agar, Difco). Pour la remise en culture de cette souche, un tube est remis à la température ambiante pendant quelques heures et un prélèvement d'environ une ose est effectué sur la surface de la gélose et étalé sur une boite de Petri contenant du milieu gélosé (Nutrient Agar, Difco). Après 48 heures d'incubation à 300C, on observe un développement de colonies jaunes à la surface du milieu gélosé.Une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 20 ml de milieu liquide (Nutrient Broth, Difco) en fioles d'Erlenmeyer. Ces fioles sont mises en agitation pendant environ 30 heures à 30au. La totalité du contenu d'une fiole, soit 20 ml, sert à ensemencer 180 ml de milieu de préculture placé dans une fiole de Fembach. La composition de ce milieu de préculture est donnée dans le tableau 1. Toutes ces opérations de transfert sont effectuées en conditions stériles et les milieux et récipients ont auparavant été stérilisés dans des conditions habituelles pour l'homme de l'art. Les fioles de Fernbach sont mises en agitation pendant environ 40 heures à 30"C. Après incubation, environ 180 ml du contenu d'une fiole de Fernbach sont utilisées pour ensemencer 1 ,82 litres de milieu de production contenus dans un fermenteur. La composition du milieu de production est indiquée dans le tableau 1 et correspond à la composition optimale donnée dans l'art antérieur.Les 20 ml de milieu restant sont utilisés pour effectuer des analyses courantes et vérifier le bon déroulement de la préculture. Le fermenteur utilisé est équipé d'un aérateur mufti-trous, d'une régulation de température, d'une sonde pH reliée à un régulateur commandant l'injection de KOH 1N ou de H3PO4 1N, d'une sonde à oxygène dissous, d'un système d'agitation consistant en un axe muni de deux turbines centripètes et entrainé par un moteur d'agitation. La température du milieu est régulée à 30 C, le pH à 6,5, le débit d'air est de 2 vvm et la vitesse d'agitation est de 900 tours/minute. Les principaux paramètres déterminés en cours de fermentation sont les concentrations en glucose, en ions ammonium et nitrate, en gellane brut et la densité optique du milieu lue à 620 nm. Tableau 1 : Composition des milieux de préculture et de fermentation Composants Milieu de Milieu de préculture fermentation Glucose (g/l) 20 30 KH2P04 (g/l) 2,5 Na2HPO4, 12H2O (g/l) 10 K2HPO4 (g/l) 0,5 MgSO4, 7H2O (g/l) 0,1 0,1 NH4 NO3 (g/l) 0,9 0,9 Peptone papainique de soja (g/l) 1 0,5 Liqueur de mals (g/l) 2 2 (corn stee Solution de sels (m/l) 1 1 Eau désionisée litre 1 I La solution de sels comporte : 1,8 gil MnCI2, 4H20 2,5 g/l FeS04, 7H20 0,28 g/l H3 BO3 0,027 g/l CuCI2 0,021 g/l ZnCI2 0,074 9/l CoCl2, 6H20 0,010 9/l (NH4)6 Mo7 024, 4(H2O) 2,1 9/l tartrate de sodium La concentration en glucose est déterminée à l'aide d'un analyseur automatique (Glucostat, Beckmann) par une méthode enzymatique à la glucose oxydase. Les concentrations en ions ammonium et en nitrates se font à l'aide de kits enzymatiques Boehringer (respectivement référencés 1112732 et 905658). La concentration en gellane brut est déterminée sur le moût de fermentation par précipitation d'un volume de milieu avec deux volumes d'isopropanol. La précipitation est réalisée à chaud sous forte agitation. Le précipité est récupéré par filtration sur un filtre en microfibres de verre, de porosité 1,2 wm préalablement séché et taré. Le précipité est lavé par l'isopropanol. Le précipité est ensuite séché et pesé dans un dessiccateur à infrarouge monté sur une balance. On a ainsi la concentration en gellane brut, c'est-à-dire le polysaccharide et les débris cellulaires. La concentration en gellane dit natif, c'est-à-dire ne contenant pas de débris cellulaires, est déterminée en retranchant de la concentration en gellane brut la concentration en matière sèche cellulaire. Celle-ci est évaluée après une corrélation établie entre la densité optique du milieu mesurée à 620 nm contre de l'eau et le poids sec de cellules. Pour établir cette corrélation, des échantillons de moût de fermentation de densité optique connue ont été dilués 20 fois dans de l'eau désionisée, longuement agités puis centrifugés. Les culots obtenus ont été ensuite remis en solution puis filtrés à chaud sur des filtres préalablement séchés et tarés. La matière sèche des rétentats permet de déterminer le poids sec des cellules, le gellane ayant été éliminé lors des opérations de centrifugation et de filtration.La corrélation obtenue donne : poids sec cellulaire (en g/l) = 0,26 x (Densité optique du milieu à 620 nm). Après 45 heures de culture, la concentration en gellane natif ainsi déterminée est de 6,3 g/l. La productivité en gellane natif est de 0,14 g.l-l.h-l. Le rendement en gellane natif par rapport au glucose consommé est de 0,24. Exemple 2 : Préparation sur des milieux sans azote organique. Trois autres fermentations (2, 3, 4) ont été réalisées dans des conditions rigoureusement identiques à celles décrites dans rexemple 1 à l'exception de b source d'azote présente dans le milieu de production. Dans les trois cas (2, 3, 4), aucune source d'azote organique (peptone papainique de soja et corn steep) n'a été incorporée dans le milieu de production. Dans les trois fermentations (2, 3, 4) la concentration initiale en azote (comptée en azote N) est identique. Par contre, différents sels ont été utilisés : du nitrate d'ammonium dans la fermentation 2, du sulfate d'ammonium dans la fermentation 3, et du nitrate de potassium dans la fermentation 4. Les concentrations utilisées sont détaillées dans le tableau 2 où il est rappelé les conditions de la fermentation 1 en ce qui concerne la source d'azote. Tableau 2 : Composition azotée des milieux de culture utilisés dans les fermentations 1, 2, 3 et 4 Fermentation Source d'azote Concentration en Concentration en sel full) azote N NH4NO3 0,9 1 cors stem 2,0 total = 0,53 peptone de soia 0,5 2 NH4NOs 0,9 0,32 3 (NH4)2So4 1,5 0,32 4 KNO3 2,28 0,32 Les fermentations sont toutes arrêtées après 45 à 50 heures de culture.Les concentrations en gellane natif déterminées selon la procédure décrite dans l'exemple 1 ainsi que les productivités et rendements figurent dans le tableau 3. Tableau 3 Concentration, productivité et rendement en gellane natif obtenus dans les fermentations 1 à 4 Concentration en Productivité en Rendement Fermentation gellane natif (g/l) gellane natif gellane/glucose .l-1.h-1 1 - 6,3 0,14 0,24 2 6,5 0,12 0,25 3 6,4 0,13 0,32 4 8,1 0,16 0,41 On constate que les concentrations en gellane natif obtenues dans les conditions de fermentations 2 et 3 sont similaires à la concentration de gellane obtenue dans ia fermentation 1 de l'exemple 1.Par contre, la fermentation 4, réalisée avec KNO3 comme seule source d'azote amène une amélioration d'environ 30% de la concentration finale de gellane natif dans le moût de fermentation. D'autre part, ces conditions sont d'autant plus avantageuses qu'aucune source d'azote organique n'est utilisée, ces ingrédients étant considérés comme onéreux. Exemple 3 : Préparation de gellane avec différentes concentrations de nitrate dans le milieu de fermentation Les fermentations 5, 6, 7 et 8 sont réalisées dans des conditions identiques à celles de la fermentation 4, c'est-à-dire avec du KNO3 comme seule source d'azote dans le milieu de fermentation, la concentration initiale en KNO3 étant variable. Les concentrations initiales en KNO3 ainsi que les concentrations en gellane natif obtenues et les productivités et rendements sont récapitulés dans le tableau 4. Les résultats de la fermentation 4 sont également rappelés dans le tableau 4. Tableau 4: Conditions et résultats des fermentations 4 à 8 utilisées à différentes concentrations initiales en KNO3. Fermentation 4 5 6 7 8 Concentration en KNO3 2,28 0,57 1 ,i4 3,42 4,56 (9z) Concentration en azote 0,32 0,08 0,16 0,47 0,62 N (9/l) Temps de culture (h) 50 48,5 50 30 31,5 Concentration en gellane 8,1 3,7 4,1 10,8 8,6 natif (g/ll Productivité en gellane natif 0,16 0,08 0,08 0,36 0,27 Rendement 0,41 0,30 0,36 0,35 0,31 gellane/glucose Par rapport à la fermentation 4, on constate que la fermentation 7, pour iaquelle la concentration en KNO3 a été portée à 3,42 g/l, amène un gain d'environ 33% de la concentration en gellane. A des concentrations en KAN03 encore supérieures, la concentration en gellane natif n'est pas améliorée de manière conséquente. REVENDICATIONS 1. - Procédé de production du gellane, caractérisé en ce que le milieu de culture comporte une source d'azote constituée principalement d'ions nitrates. 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ions nitrates proviennent du groupe constitué par le nitrate de potassium, le nitrate de sodium, l'acide nitrique dilué, et leur mélange. 3. - Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en azote, comptée en azote N est comprise entre 0,05 et 1 g/l dans le milieu de culture, et de préférence comprise entre 0,2 et 0,8 9/l. 4. - Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source d'azote ne contient pas de quantité sensible d'azote organique, ou d'ions ammonium. 5. - Milieu de culture pour produire du gellane, caractérisé en ce qu'il comporte une source d'azote constituée principalement par des ions nitrates.