Brevet FR2723379A1 — publié le 19960209

La présente invention concerne un procédé de synthèse enzymatique du L- tryptophane au moyen d'un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur ainsi que ce système de bioréacteur commandé par ordinateur. Le tryptophane est l'un des acides aminés essentiels constituant le corps des animaux et c'est un acide aminé important en tant que médicament, nutriment ou additif pour l'alimentation des animaux. Les procédés connus pour la production du tryptophane font intervenir des processus de fermentation et des processus enzymatiques. Pour les processus de fermentation, le tryptophane peut être produit à partir de ses précusseurs par addition d'anthranilate ou d'indole et de sucre à une culture ou par fermentation directe du glucose dans la culture. Pour les processus enzymatiques, le tryptophane peut être produit à partir d'indole, d'acide pyruvique et d'ions ammonium à l'aide d'une tryptophanase produite par des micro-organismes. L'avantage d'un processus enzymatique est qu'il est plus simple de purifier le tryptophane et qu'il est possible d'obtenir un tryptophane de plus grande pureté si bien qu'il s'agit maintenant d'un procédé de choix pour produire du L-tryptophane de qualité médicinale. Dans la production du L-tryptophane à l'aide de bactéries produisant des niveaux élevés de tryptophanase, l'indole, qui est l'un des substrats, est toxique pour les bactéries et provoque une inhibition par le substrat même à faible concentration (18 mM). Il n'est donc pas avantageux d'utiliser la concentration de l'indole comme cause entraînant la réaction de synthèse. Par ailleurs, les concentrations de tryptophane supérieures à 50 mM provoquent une inhibition par le produit et le pyruvate de sodium se décompose en présence d'ions NH4+ à pH alcalin (pH 9,0). Compte tenu de ce qui précède, il est possible de mettre au point les procédés de production de L-tryptophane à concentration élevée en introduisant en continu ou de manière discontinue de l'indole concentré pour maintenir une concentration limitée d'indole, et il est possible d'obtenir une concentration plus élevée de L-tryptophane (>80 g/l) grâce au précipitant du tryptophane qu'est l'inosine. On connaît de nombreux procédés de production du L-tryptophane à l'aide de la tryptophanase. Le brevet japonais n' 56085291 décrit la production de L-tryptophane par la réaction de l'indole avec la sérine ou l'acide pyruvique et des ions ammonium au moyen d'une souche du genre Aeromonas, Vibrio ou Bacillus. Le brevet US n 4 349 627 décrit un procédé dans lequel le L-tryptophane est produit à partir d'indole et de sérine ou à partir d'indole, d'acide pyruvique et d'ions ammonium avec un micro-organisme particulier du genre Enterobacter. Des souches productrices de tryptophanase des espèces Proteus rettgeri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganil et Escherichia coli ont été utilisées pour préparer le L- tryptophane selon le brevet japonais n' 62134094. Le brevet japonais n 63137689 décrit l'utilisation de micro-organismes traités par la chaleur, y compris différentes espèces de Escherichia coli, pour préparer du L- tryptophane à partir d'indole, d'acide pyruvique et d'ions ammonium. Le brevet japonais n' 1104186 décrit un procédé de production de L- tryptophane à partir d'indole et de L-sérine ou de D,L-sérine au moyen de la tryptophane synthétase. Le brevet francçais n 2581 654 décrit un procédé pour faire réagir l'indole avec du pyruvate et des ions ammonium grâce à une tryptophanase immobilisée et pour recueillir le L- tryptophane par précipitation avec l'inosine. Le brevet japonais n' 64051093 décrit un procédé de préparation du L-tryptophane à l'aide de la tryptophanase avec apport discontinu d'indole pour maintenir sa concentration inférieure à 4 mM, ce procédé permettant de préparer 39 mM de L-tryptophane en 10 h de réaction. Le brevet japonais n* 01191692 décrit un procédé faisant intervenir des cellules immobilisées pour préparer du L- tryptophane à partir d'indole et d'acide pyruvique, dans lequel l'indole est introduit en continu pour maintenir sa concentration à 17 mM et dans lequel le L- tryptophane est retiré en continu ou de manière discontinue grâce à un séparateur, et qui permet d'obtenir 36,49 g de L-tryptophane en 120 h de fonctionnement dans un réacteur de 1 1, le taux de conversion de l'indole étant de 92 % et celui de pyruvate de 84 %. Le brevet européen n 381744 décrit un procédé à étapes multiples pour la production de L- tryptophane, dans lequel une cellule hôte bactérienne est transformée de manière à comporter de la tryptophanase qui est utilisée ensuite dans une étape de bioconversion subséquente pour provoquer l'accumulation de L-tryptophane par introduction contrôlée d'indole en continu pour maintenir sa concentration inférieure à 10 mM dans une réaction discontinue, ce qui permet de produire 24 g/l de L-tryptophane en 75 min, soit un taux de conversion d'indole supérieur à 99 %. Bien que des matières premières peu coûteuses telles que l'ammoniac puissent être utilisées pour synthétiser le L-tryptophane avec de l'indole et du pyruvate d'une manière qui présente des avantages économiques, il se pose toujours des problèmes graves tels que l'inhibition par l'indole, l'inhibition par le L-tryptophane et la décomposition du pyruvate. Actuellement, il existe certains procédés enzymatiques pour produire du L-tryptophane avec un rendement relativement élevé et une vitesse relativement élevée par introduction contrôlée d'indole et/ou d'acide pyruvique. Cependant, l'introduction simultanée d'indole, de pyruvate et de NH4Cl contrôlée par rétroaction en ligne n'est pas divulguée. En plus des problèmes connus, on a observé un phénomène selon lequel, sauf dans des conditions optimales, la tryptophanase se dégrade lorsqu'elle est incubée avec deux des substrats, à savoir le pyruvate de sodium et NH4Cl. Pour vaincre les problèmes ci-dessus, selon la présente invention, l'introduction d'indole, de pyruvate de sodium et de NH4CI est commandée par un ordinateur équipé d'un dispositif de dosage d'indole en ligne. L'ordinateur commande l'introduction d'indole et de NH4CI en fonction d'un profil prédéfini qui est en accord avec le profil d'activité de la tryptophanase. Le pyruvate de sodium est ajouté à un moment prédéterminé au cours de la réaction. L'inhibition par le produit est surmontée par addition d'inosine qui est un précipitant du L- tryptophane, qui est capable de séparer le L-tryptophane du système réactionnel en fermant d'un complexe insoluble avec le L-tryptophane. La combinaison de la commande à rétroaction de l'introduction du substrat et de l'introduction d'inosine dans le récipient réactionnel conduit à un procédé très efficace pour la synthèse enzymatique du L-tryptophane. Ainsi, la présente invention a pour but de fournir un procédé de synthèse enzymatique du L-tryptophane au moyen d'un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur pour commander l'introduction de l'indole, de l'acide pyruvique et/ou de l'un de ses sels et d'un sel d'ammonium, et d'une commande à rétroaction de la réaction. La présente invention a aussi pour but de fournir un procédé de synthèse enzymatique du L-tryptophane qui comprend la réaction de l'indole avec l'acide pyruvique et/ou l'un de ses sels et un sel d'ammonium en présence de tryptophanase au moyen d'un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur comprenant un bioréacteur relié à un ordinateur équipé d'un dispositif de dosage d'indole en ligne, dans lequel l'ordinateur commande l'introduction d'indole, l'acide pyruvique et/ou de son sel et d'un sel d'ammonium dans le bioréacteur et commande par rétroaction la réaction dans le bioréacteur par le biais de la concentration de l'indole déterminée par le dispositif de dosage de l'indole en ligne, dans lequel l'introduction de l'indole et du sel d'ammonium est commandée par un profil prédéfini qui est en accord avec un profil d'activité de la tryptophanase, et l'acide pyruvique et/ou son sel est ajouté à un moment prédéterminé. La présente invention a aussi pour but de fournir un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur destiné à être utilisé pour la synthèse enzymatique du L-tryptophane qui comprend un bioréacteur relié à un ordinateur équipé d'un dispositif de dosage d'indole en ligne, dans lequel l'ordinateur commande l'introduction de l'indole, de l'acide pyruvique et/ou de son sel et d'un sel ammonium dans le bioréacteur et commande par rétroaction la réaction dans le bioréacteur par le biais de la concentration de l'indole déterminée par le dispositif de dosage d'indole en ligne, dans lequel l'introduction de l'indole et du sel d'ammonium est commandée par un profil prédéfini qui est en accord avec un profil d'activité de la tryptophanase, et l'acide pyruvique et/ou son sel est ajouté à un moment prédéterminé. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux dans la description détaillée qui suit et se réfere aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels: La figure 1 montre un profil d'introduction de substrat dans la synthèse enzymatique du L-tryptophane par introduction d'indole à pentes multiples commandée par ordinateur. Les conditions initiales pour le bioréacteur sont les suivantes:48 mmoles de NH4CI, 60 mmoles de pyruvate de sodium et 72 mmoles d'inosine; 1 g de cellules humides à l'échelle de 120 ml. La figure 2 montre le profil d'introduction de substrat dans la synthèse enzymatique du L-tryptophane au moyen d'un bioréacteur automatique commandé par ordinateur. Les conditions initiales sont les suivantes: 180 mmoles de NH4CI, 300 mmoles de pyruvate de sodium et 390 mmoles d'inosine; 100 ml d'extrait brut d'enzyme (15 000 U) et 9 mmoles de L-tryptophane à l'échelle de 600 mi. L'introduction de pyruvate supplémentaire s'est déroulée pendant 3,3 min, 40 min après le début de la réaction. La figure 3 montre un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur selon l'invention. La figure 4 est une représentation graphique d'une synthèse enzymatique de L-tryptophane à introduction automatique par ordinateur et à commande par rétroaction en fonction d'un dosage d'indole en ligne. La présente invention concerne un procédé de préparation enzymatique du L-tryptophane permettant d'obtenir de grandes quantités de L-tryptophane (> 100 g/l) par une réaction d'accumulation catalysée par la tryptophanase dans un bioréacteur de type discontinu, en présence d'inosine. L'invention concerne aussi un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur comprenant un dosage d'indole en ligne et une commande par rétroaction de l'introduction et la détermination des profils de réaction optimaux. Une réaction discontinue typique à l'échelle de 600 ml faisant intervenir une enzyme brute donne des résultats satisfaisants. A titre d'exemple, environ 66,2 g (324 mmoles) de L-tryptophane ont été obtenus à partir de 38,3 g (327 mmoles) d'indole, de 50,8 g (462 mmoles) de pyruvate de sodium et de 104, 6 g (390 mmoles) d'inosine en 4 h. L'ensemble de l'opération peut être commandé automatiquement par ordinateur. Selon la présente invention, un bioréacteur de type discontinu comprenant une introduction automatique continue d'indole, d'acide pyruvique et/ou l'un de ses sels et d'un sel d'ammonium commandée par ordinateur est conçu et exploité pour obtenir les conditions optimales pour la réaction. Grâce à ce système, il est possible d'obtenir une concentration de L-tryptophane relativement élevée (> 100 g/l) et de maintenir un taux de conversion de l'indole supérieur à 96 % et un taux de conversion du pyruvate compris entre 65 et 82 %. Le complexe L- tryptophane-inosine formé peut être aisément isolé par filtration pour être purifié et l'inosine peut être recyclée pour être réutilisée. Il s'agit d'un système avantageux pour la production industrielle d'un L-tryptophane de haute pureté. Dans le procédé selon la présente invention, le débit d'introduction de l'indole est fonction du temps et le sel d'ammonium est introduit en même temps que l'indole. De préférence, l'acide pyruvique et/ou son sel est ajouté 40 à 60 min après le début de la réaction. La tryptophanase destinée à être utilisée dans le procédé de la présente invention peut être produite par un micro-organisme producteur de tryptophanase tel que E. coli. Dans les exemples suivants, la souche de E. coli PGT 67/N 4830 a été utilisée pour produire la tryptophanase. I) Fermentation dans un fermenteur avec la souche E. coli PGT 67/N 1. Conditions de culture: La souche de E. coli PGT 67/N 4830 a été cultivée sur une boîte de gélose Trp I contenant 1 % de peptone de soja, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de chlorure de sodium, 1 % de Tween 80, mM de tryptophane, 100 mg/ml d'ampicilline et 1,5 % de gélose à 30C pendant une nuit. Une seule colonie a été prélevée pour ensemencer 15 ml de milieu Trp I et elle a été cultivée pendant une nuit à 30C sous agitation vigoureuse. Du glycérol a été ajouté à la solution de cellules pour atteindre une concentration finale de 50 %, puis la solution de cellules a été répartie dans plusieurs petits tubes (1,0 ml/tube) et stockée à -70C. 2. Fermentation en fermenteur de 5 1: 2 ml de la solution mère de cellules ont été ensemencés dans ml de milieu Trp I et cultivés pendant une nuit à 30C sous agitation vigoureuse (150 tr/min), puis la culture d'une nuit a été transférée dans un fermenteur de 5 1 contenant 3,5 I de milieu Trp I et elle a été cultivée à 30C et 350 tr/min. La température a été portée à 42 C jusqu'à ce que la D.O.600 soit proche de 0,6. Au bout de 5 h, les cellules ont été centrifugées pendant 20 min à 8 000 tr/min et 4C puis lavées avec une solution de NaCI à 0,9 % (les cellules ont été remises en suspension dans la solution de NaCI à 0,9 % et centrifugées pendant 10 min à 16 000 tr/min et 4'C) et enfin stockées à -20C. 3. Fermentation en fermenteur de 20 1: 7 ml de culture mère ont été ensemencés dans 700 ml de milieu contenant 1 % de Tween 80, 1 % de peptone de soja, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de NaCI, 0,01 % d'ampicilline et 0,2 % de tryptophane et ont été cultivés pendant une nuit à 30 C. La culture d'une nuit a été ensemencée dans 13,3 1 de milieu et incubée à 30C sous agitation (600 tr/min), avec une aération d'environ 0,5 volume/volume/min (vvm: débit volumétrique d'air par litre de fermenteur et par min), la température a été portée à 42'C lorsque la D.O. a atteint 1,2, puis la culture a été prolongée pendant 5 h et l'aération a été ajustée à 0,63 vvm. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 6000 tr/min pendant 20 min, lavées une fois avec une solution de NaCI à 0,9 % puis centrifugées de nouveau à 13 000 tr/min pendant 30 min et enfin stockées à -20'C. I1) Préparation d'une solution d'enzyme brute: g de cellules E. coli PGT 67/N 4830 "au repos" (récoltées dans le fermenteur puis stockées à - 20C, c'est-à-dire qui n'étaient pas en phase de croissance) ont été mis en suspension dans 200 ml d'une solution contenant 3 % de Tween 80, 20 mM de phosphate de potassium (pH 9,0) et 0,2 mM de phosphate de pyridoxal puis lysés sous l'action d'une presse French. La centrifugation de cette solution à 13 000 tr/min pendant 15 min a permis d'obtenir une solution d'enzyme brute qui a été stockée à -20C. III) Détermination de l'activité spécifique de la trvptophanase mg de cellules ont été mis en suspension dans i ml d'une solution contenant 0, 2 mM de phosphate de pyridoxal, 20 mM de phosphate de potassium (pH 9,0) et 3 % de Tween 80, puis soumis à une sonication au niveau 14 à 4C pendant 30 s suivie par un arrêt de 1 min, ce processus étant répété cinq fois. Le surnageant, c'est-à-dire l'extrait d'enzyme brut, a été obtenu par centrifugation à 13 000 tr/min pendant 10 min. La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford (voir Bradford, M.B. (1976) Anal. Biochem, 72, 248). De l'eau distillée (0,395 ml) et du phosphate de potassium 1 M (0,1 ml) (pH 9,0) ont été mélangés dans une cuve en quartz de 1 ml et la valeur d'absorbance lue a été mise à zéro par actionnement du bouton de mise à zéro automatique, puis 0,5 ml de SOPC (S-0-nitrophényl- L-cystéine) a été ajouté à la cuve et mélangé. La réaction a été amorcée par addition de 5 ml d'échantillon et la variation de D.O. a été mesurée à 370 nm. L'activité spécifique a été définie comme étant l'hydrolyse de 1 /.mole de substrat par minute et par mg de protéine. IV) Synthèse du L-trvptophane: La synthèse du L-tryptophane a été réalisée dans un réacteur discontinu en appliquant différents procédés d'introduction de l'indole de manière à obtenir l'accumulation d'une grande quantité de L-tryptophane en une très courte durée, sur la base de la conversion enzymatique élevée de l'indole et du pyruvate de sodium. 1. Introduction manuelle discontinue: Dans les essais 1 à 3, de l'indole solide (essais 1 et 2) ou de l'indole concentré (4,6 M dans l'éthanol pour l'essai 3) a été introduit manuellement et de manière discontinue dans la solution réactionnelle constituée par 0,2 mM de phosphate de pyridoxal, mM de phosphate de potassium (pH 9,0), 3 % de Tween 80, avec ou sans addition d'inosine, la réaction étant conduite à 30'C et pH 9,0. 2. Introduction continue au moven d'une pompe actionnée manuellement Dans les essais 4 à 6, les conditions étaient les mêmes que celles décrites en 1, à ceci près que de l'indole concentré (4 M dans l'éthanol) a été introduit dans la solution réactionnelle au moyen d'une pompe actionnée manuellement. 3. Introduction continue commandée par ordinateur selon un radient à pentes multiples Dans les essais 7 à 12, de l'indole concentré (4 M dans l'éthanol) a été introduit en continu dans la solution réactionnelle, l'introduction étant commandée par ordinateur au moyen d'un logiciel de gradient à bandes multiples tel que celui qui est représenté sur la figure 1. Les conditions des essais 1 à 12 sont résumées dans le tableau I. Tableau I Résumé des conditions des essais 1 à 12 Essai Pyruvate NH4CI Ethanol Inosine ne (mM) (mM) (%) (mM) 1 500 600 5 2 100 300 5 - 3 400 500 4 400 4 400 500 -_ 350 1000 800 - 785 6 1000 1000 - 600 7 1100 1133 -_ 850 8 500 600 -_ 400 9 1200 1600 - 1100 700 900 -_ 600 1i 1 760 1270 _ 700 12 1700 1500 - 1000 4. Introduction continue avec commande à rétroaction Dans un réacteur en verre de 1,5 1 ont été introduits 20 ml de Tween 80, 13,3 ml de phosphate de potassium 1 M, pH 9,0, 13,3 ml de phosphate de pyridoxal 10 mM, 620 ml d'eau distillée et 60 ml de NH4CI 5 N (le pH a été ajusté à 9, 0 avec NH4OH) et le mélange résultant a ensuite été agité soigneusement. 174,3 g (650 mmoles) d'inosine et 3,06 g de L- tryptophane (15 mmoles) ont été ajoutés à la solution, la réaction a été amorcée par addition de 55,03 g (500 mmoles) de pyruvate de sodium et de 166,7 ml de solution d'enzyme brute (150 U/ml). La solution de NH4CI 5 N et d'indole 4 M (préparée dans l'éthanol) a été introduite dans le système réactionnel du début à la fin de la réaction, selon la courbe représentée sur la figure 2. Un supplément de 110ml (270 mmoles) de pyruvate de sodium (solution aqueuse 2,45 M) a été introduit dans la solution réactionnelle au moyen d'une pompe en 2 min au bout de 40 min de réaction, comme le montre la figure 2. Des échantillons ont été prélevés à certains intervalles pour surveiller la concentration résiduelle d'indole par CLHP. Le dispositif était agencé de la manière représentée sur la figure 3. Apres la fin de la réaction, le mélange a été filtré et lavé à l'eau froide pour donner un gâteau solide blanc qui a été identifié comme étant un complexe tryptophane-inosine. Le profil d'introduction en gradient représenté sur la figure 2 a été simulé par ordinateur pour suivre le profil de dégradation de l'activité de l'enzyme et a été commandé par un programme Labtech Notebook. On donne ci-dessous certains détails concernant l'appareillage représenté sur la figure 3. * Ordinateur: compatible IBM-PC portable 80486-33 32 b * Interfaces: carte de saisie de données à grande vitesse AXIOM (AX-5412-LG), voie 2 pour l'entrée des signaux du détecteur carte N/A à 8 voies (AX5212), voies 2 et 3 pour commander l'alimentation des pompes 1 et 2, respectivement panneau amplificateur/multiplexeur (AX-751) plaquette à bornes à vis à usages multiples (AX-752) * Logiciel: LTN Labtech Notebook Pompes: - P1: Masterflex Drive modèle n 7523-10 1- tr/min avec tête de pompe 7523-10 (pouvant commander 8 canaux d'alimentation) pour l'intro- duction de l'indole et du NH4Cl, tubes 7624-22 (silicone) ou 7605-26 (viton) - P2: Masterflex Drive modèle n'7520-35 1- tr/min avec tête de pompe 7518-10 (tête de pompe pouvant être facilement chargée) pour l'introduction de la solution de pyruvate de Na, tubes Masterflex 6411-16 - P3: pompe Eyela MP-3 fonctionnant avec des microtubes il - P4: pompe péristaltique Pharmacia P-1 -P5: pompe Eyela MP-3 fonctionnant avec des microtubes - P6: identique à P2 * Tubes & Débits: Pompes P1 P2 P3 P4 P5 P6 Tubes* 7624-22 (0,1-06L) 96410-16 96410-14 96410-14 96410-14 96410-14 7605-26 (0,6-1L) Réglage commandé par commandé par 1,5 6 4(x10) 1,8 ordinateur ordinateur _ Débit commandé par commandé par 0,375 ml/min 4,05 ml/min 0,37 ml/min 3, 2 ml/min ordinateur ordinateur * tous les tubes étaient de type Masterflex La vitesse prédéterminée d'introduction de l'indole est fonction du temps selon l'équation (1), et la relation entre le signal de rétroaction délivré par l'ordinateur et la densité optique du photodétecteur est exprimée par l'équation (3). F = 5,51 - 5,44 x 10-2T + 2,79 x 10-4T2 - 7,05 x 10-7T3 + 7,0 x 10-10T4 (1) S = (F x 6-33,167)/3,7257 (2) Sfb = S + 3,492 x DO- 29,34 x DO2 + 0,0308 (3) Avec F: débit d'introduction de l'indole (mmole/min/l) T: durée de la réaction (min) S: signal initial Sfb: signal de rétroaction DO: densité optique du photodétecteur Comme le montre le tableau II donné dans la suite, lorsque l'on a utilisé une introduction manuelle discontinue de l'indole, on a obtenu dans les essais 1 et 2 une faible concentration de L-tryptophane sans addition d'inosine, mais on a observé dans l'essai 3 l'accumulation d'une quantité relativement élevée de L-tryptophane (57,2g/l ou 280 mM) en présence d'inosine. Du fait de l'introduction à pentes multiples de l'indole par ordinateur dans les essais 4 à 6, la quantité de L-tryptophane s'est accrue manifestement au delà de 122,6g/1 (600 mM) en 7 h de réaction et on a observé un taux de conversion raisonnable du pyruvate de sodium (environ 60 %). Enfin, l'utilisation dans les essais 7 à 12 d'un profil d'introduction d'indole plus précis, prédéterminé en fonction du profil d'activité de l'enzyme, a permis d'améliorer encore le rendement de la biosynthèse en produisant plus de 102 g/1 (500 mM) de L-tryptophane en 3,5 h de réaction (essai 11) et de maintenir un taux de conversion du pyruvate de sodium de 70 %. Ce procédé a permis d'obtenir également la plus grande quantité de Ltryptophane (188,6 g/l ou 923 mM) dans l'essai 12. Lorsque l'introduction de l'indole était combinée à la commande par rétroaction par le biais d'un dosage d'indole en ligne par photodétecteur, il a été possible de maintenir pendant toute la durée de la réaction la concentration de l'indole inférieure à 0,59 g/l (5 mM) dans le mélange réactionnel, ce qui a donné finalement comme résultat favorable l'accumulation de 108,3 g/l (540 mM) de L- tryptophane tandis que la concentration de l'indole était maintenue inférieure à 4 mM. Le rendement était de 99,4 % par rapport à l'indole et de 62,7 % par rapport au pyruvate de sodium. Les données expérimentales correspondantes sont présentées sur la figure 4. Tableau II Résumé des résultats de la svnthèse enzvmatique de L-trvyptophane dans différentes conditions Taux de Biocatalyseur* L-Trp conversion du Inosine Essai accumulé Temps pyruvate Echelle Température utilisée n* (/1) (min) (%) (ml) (C) (/1) 1 19 90 18,6 cellules/41,4 mg 3 30 2 14,7 80 70,0 cellules/25 mg 3 30 - 3 57,2 250 70,0 cellules/50 mg 6 30 53,6 4 65,8 189 80,6 enzyme/1 g 120 25 107, 3 133,2 420 59,3 enzyme/1 g 120 25 210,8 6 127,5 428 62,4 cellules/5 g 600 25 160, 9 7 109,3 377 53,5 enzyme/S g 600 25 201,1 8 144,8 510 64,4 cellules/3 g 360 25 228 9 174,9 496 71,3 cellules/0,83 g 100 25 295 103,6 191 72,4 enzyme/0,83 g 100 25 160, 9 11 109,5 220 70,4 enzyme/1,3 g 160 25 187,7 12 188,6 1173 61,5 cellules/0,83 g 100 25 295 * cellules: cellules au repos; enzyme: surnageant d'extrait exempt de cellules REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse enzymatique du L-tryptophane caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de l'indole avec l'acide pyruvique et/ou l'un de ses sels et un sel d'ammonium en présence de tryptophanase au moyen d'un système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur comprenant un bioréacteur relié à un ordinateur équipé d'un dispositif de dosage d'indole en ligne, dans lequel l'ordinateur commande l'introduction de l'indole, de l'acide pyruvique et/ou de son sel et d'un sel d'ammonium dans le bioréacteur et commande par rétroaction la réaction dans le bioréacteur par le biais de la concentration de l'indole déterminée par le dispositif de dosage de l'indole en ligne, l'introduction de l'indole et du sel d'ammonium étant commandée par un profil prédéfini qui est en accord avec un profil d'activité de la tryptophanase, et l'acide pyruvique et/ou son sel étant ajouté à un moment prédéterminé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de dosage de l'indole en ligne est un photodétecteur. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ordinateur commande l'introduction de l'indole en fonction de l'équation suivante: F = 5,51 - 5,44 x 10-2T + 2,79 x 10-4T2 - 7,05 x 10-7T3 + 7,0 x 10-10T4 F: débit d'introduction de l'indole (mmoUl/min/l) T: durée de la réaction (min) 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'ordinateur commande la réaction par rétroaction en fonction de la relation suivante entre le signal de rétroaction délivré par ordinateur et la densité optique du photodétecteur: Sfb = S + 3,492 x DO - 29,34 x DO2 + 0,0308 avec S = (F x 6 - 33,167)/3,7257 et F = 5,51 - 5,44 x 10- 2T +2,79 x 10-4T2 - 7,05 x 10-7T3 + 7,0 x 10-10T4 avec F: débit d'introduction de l'indole (mmole/min/1) T: durée de la réaction (min) S: signal initial Sfb: signal de rétroaction DO: densité optique du photodétecteur. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le sel d'ammonium est introduit en même temps que l'indole. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide pyruvique et/ou son sel est ajouté au bout de 40 à 60 min de réaction. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la tryptophanase provient de cellules au repos ou d'un extrait exempt de cellules. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inosine est présente au cours de la réaction en tant que précipitant pour le Ltryptophane. 9. Système automatique de bioréacteur commandé par ordinateur destiné à être utilisé pour la synthèse enzymatique du L-tryptophane caractérisé en ce qu'il comprend un bioréacteur relié à un ordinateur équipé d'un dispositif de dosage d'indole en ligne, dans lequel l'ordinateur commande l'introduction de l'indole, de l'acide pyruvique et/ou l'un de ses sels et d'un sel ammonium dans le bioréacteur et commande par rétroaction la réaction dans le bioréacteur par le biais de la concentration de l'indole déterminée par le dispositif de dosage d'indole en ligne, l'introduction de l'indole et du sel d'ammonium étant commandée par un profil prédéfini qui est en accord avec un profil d'activité de la tryptophanase, et l'acide pyruvique et/ou son sel étant ajouté à un moment prédéterminé. 10. Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que le dispositif de dosage de l'indole en ligne est un photodétecteur. 11. Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'ordinateur commande le débit d'introduction de l'indole en fonction de l'équation suivante: F: 5,51 - 5,44 x 10-2T + 2,79 x 10-4T2 - 7,05 x 10-7T3 + 7,0 x 10-1lT4 F: débit d'introduction de l'indole (mmole/min/l) T: durée de la réaction (min). 12. Système selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'ordinateur commande la réaction par rétroaction selon une relation entre le signal de rétroaction délivré par ordinateur et la densité optique du photodétecteur exprimée de la manière suivante: Sfb = S + 3,492 x DO - 29,34 x DO2 + 0,0308 avec S = (F x 6 - 33,167)/3,7257 et F = 5,51 - 5,44 x 10-2T +2,79 x 10-4T2 - 7,05 x 10-7T3 + 7,0 x 10-10T4 avec F: débit d'introduction de l'indole (mmole/min/l) T: durée de la réaction (min) S: signal initial Sfb: signal de rétroaction DO: densité optique du photodétecteur. 13. Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que le sel d'ammonium est introduit en même temps que l'indole. 14. Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'acide pyruvique et/ou son sel est ajouté au bout de 40 à 60 min de réaction.