Brevet FR2731277A1 — publié le 19960906

La présente invention conceme des procédés pouvant être mis en oeuvre par un appareil simple pour améliorer la reproductibilité de la purification, du comptage et de la mesure de l'activation des leucocytes sanguins. De nombreuses méthodes permettent de compter et de purifier les leucocytes sanguins ou d'apprécier leur activation. Cependant, notamment lorsque des automates sont utilisés, on constate souvent des variations d'un échantillon à l'autre, dues essentiellement à la capacité des leucocytes sanguins, surtout lorsqu'ils sont activés, d'adhérer aux surfaces, quelle que soit la nature de ces demières. L'invention propose des procédés et un appareil rudimentaire capables de s'opposer à cette variabilité, l'ensemble constituant un moyen nouveau. Le sang, qui a pour objet d'être utilisé tel quel ou dilué (sang total, sang total dilué) ou fractionné pour obtenir des leucocytes sanguins purifiés, est prélevé sur un mélange EDTA-héparine dans le cas d'utilisation finale de sang pur ou dilué, ou EDTA seul dans le cas de purification cellulaire. L'EDTA est un chélateur de calcium ionisé (Ca2+). Il n'y a pas d'activation cellulaire possible en l'absence de Ca2+, pas de mouvements, donc pas d'adhésion (un excès de Ca2+, en concentration finale 5 mM, sera donc ajouté au moment de déclencher l'activation des cellules). L'héparine a pour rôle d'empêcher, en cas de sang pur ou dilué, l'activation des facteurs de coagulation lors de l'ajout du Ca2+, la présence de caillots compromettant tout comptage ou mesure biochimique. Si l'on n'active pas les cellules, donc si l'on n'ajoute pas de Ca2+, l'héparine n'est pas indispensable. L'anticoagulant EDTA-héparine se prépare en effectuant d'abord un mélange EDTA disodique Na2 et tétrasodique Na4 (0,2 M) pH 7,4 (Merck): EDTA-Na2 (PM = 372,24) 3,7 g à dissoudre à chaud dans 50 ml d'eau distillée. Ensuite EDTA-Na4 (PM = 452,24) 4,3 g à dissoudre à froid dans 50 ml d'eau distillée ; on ajoute 4.000 U d'héparine ne contenant pas de phénol (Choay, Paris soluté injectable i.v. flacon de 5 ml = 25.000 U) aux 100 ml de ce mélange, soit 40 U/ml. L'anticoagulant obtenu s'utilise à raison de 250 cL1 pour 10 ml de sang. Une fois le sang prélevé, il existe de nombreuses méthodes de punficaison pour séparer les leucocytes sanguins du plasma et des globules rouges. Ces méthodes sont par exemple des centrifugations à différentes vitesses, suivies de prélèvements étagés, ou des gradients de densité. Une des méthodes les plus simples et les plus efficaces en terme de rendement cellulaire est la sédimentation spontanée des cellules, dite méthode 1 x g. Cependant, cette méthode nécessite l'inclinaison des tubes à environ 30 , laquelle permet, à condition de ne pas agiter les tubes, d'aspirer le plasma riche en cellules au fur et à mesure qu'il se dégage au-dessus de la couche des globules rouges sédimentés. Les moyens artisanaux jusqu'ici utilisés pour maintenir les tubes inclinés et prélever le plasma donnent des résultats précaires et se sont souvent soldés par des variations de l'angle d'inclinaison des tubes, avec mauvais rendement, agitations intempestives, voire même une perte de l'échantillon par renversement. I1 convient de mettre en oeuvre un support préférentiellement en matière plastique, dans le but de soutenir les tubes à prélèvement sur toute leur longueur. Ce support doit permettre d'accommoder des tubes de 5, 15 ou 50 ml en nombre variable (12, 24, 36 par exemple). I1 a trois particularités: 1) les tubes sont accrochés par des clips en plastique sur un portoir amovible en plastique transparent, chaque type de portoir correspondant à un type de tube (figure unique, a), 2) le portoir repose sur un support en verre dépoli autorisant un rétroéclairage, figure unique (b), 3) ce support est tenu à chaque extrémité par deux axes à vis permettant de faire varier à la demande l'angle d'inclinaison des tubes, figure unique (c). Dans une version plus élaborée, cet appareil pourrait recevoir un dispositif de prélèvement automatique par pipettage pouvant être guidé par exemple par cellule photoélectrique. Un réglage adéquat permettrait d'obtenir l'aspiration du plasma translucide et pas des globules rouges opaques à la lumière. Lorsqu'on déclenche une activation, les leucocytes sanguins vont devenir très adhérents à toute surface et aux autres cellules présentes, ce qui causera une perte apparente de ces cellules qui ne seront pas pipettée lors du prélèvement manuel ou automatique aux fins de comptage ou de mesure. Le prélèvement automatique, pratiqué le plus souvent en série, aggrave ce phénomène de par le délai d'attente qui accroît encore le temps d'adhésion.Afin de compter les cellules dans des conditions optimales, il est nécessaire de les fixer d'une façon assez douce pour ne pas modifier leur morphologie mais assez puissante pour les empêcher de s'accrocher sur les surfaces aoes Cette fixation pourra se faire selon deux modes : si l'on désire conserver les globules rouges (sang total ou dilué), on utilisera de méthanol à 30 % dans du sérum physiologique (NaCI à 0,9 %). Si l'on désire les lyser (cas précédent ou leucocytes sanguins "purifiés" parmi lesquels peuvent persister quelques globules rouges) on utilisera de l'éthanol à 30 % dans de l'eau distillée, additionnée d'acide acétique glacial (400 p1 pour 100 ml d'éthanol 30 %). Si l'on désire colorer les cellules, on utilisera le mélange précédent additionné de 50 à 100 mg % de bleu de toluidine. REVENDICATIONS 1) Procédés facilitant la purification, le comptage et la mesure de l'activation des leucocytes sanguins, caractérisés en ce que le sang est recueilli sur un mélange d'EDTA-héparine avant de laisser les cellules sédimenter spontanément (méthode à 1 x g) dans des tubes inclinés à 30 environ, et en aspirant le plasma riche en cellules au fur et à mesure de la sédimentation des globules rouges. 2) Procédés facilitant le comptage, la purification et l'activation des leucocytes sanguins selon la revendication précédente, caractérisés en ce qu'un support inclinable reçoit des tubes de sang de différentes tailles qu'il soutient sur toute leur longueur, les tubes reposant sur un portoir accroché à une paroi en verre dépoli rétroéclairée (figure unique). 3) Procédés facilitant le comptage la purification et l'activation des leucocytes sanguins selon la première revendication, caractérisés en ce que dans la nécessité d'activer les leucocytes sanguins on ajoute, au moment du déclenchement de l'activation, du calcium en excès à la concentration finale de 5 mM ; le prélèvement sur EDTA-héparine et cette addition tardive du calcium permettant de disposer de cellules non activées qui sont alors beaucoup plus sensibles au moment du déclenchement de l'activation.