Brevet FR2725991A1 — publié le 19960426

PROCEDE DE SYNTHESE PEPTIDIQUE A PARTIR DES N-[N'-(R' )-N' -NITROSOCARBAMOYLS] AMINOACIDES L'invention concerne un nouveau procédé de synthèse peptidique. Les peptides sont des molécules biologiquement actives d'un intérêt considérable et leur synthèse a été étudiée depuis fort longtemps, cette synthèse pouvant s'effectuer par des méthodologies diverses, aussi bien en phase homogène qu'en phase solide ou supportée. Dans un cas comme dans l'autre, ces méthodologies utilisent des acides aminés protégés sur une fonction, créent ou allongent le peptide sur la fonction libre restante en utilisant un acide aminé activé bloqué, débloquent cette dernière fonction et poursuivent ainsi pas à pas la construction de la chaîne. Pour avoir un peptide libre les fonctions terminales doivent évidemment être débloquées. Le solvant utilisé est toujours un solvant organique. De telles méthodologies tout en étant efficaces sont néanmoins très lourdes. L'invention a pour objectif la mise au point d'un procédé de synthèse peptidique en solution aqueuse, tolérant l'utilisation d'acides aminés non protégés et conduisant directement à un peptide libre. Dans le cadre de recherches sur les conditions de synthèse prébiotique de ces macromolécules informatives, les inventeurs ont mis en évidence que, de façon inattendue, l'on peut obtenir des peptides libres par action des N-[N'-(R')-N'-nitrosocarbamoyls] Aminoacides (I) sur un acide aminé libre et ceci en solution aqueuse. Le procédé de l'invention pour opérer la synthèse peptidique consiste donc à faire réagir en solution aqueuse ou aquo-organique un N-[N'-(R' )-N'-nitrosocarbamoyls] Aminoacides possédant la formule (I) sus-visée sur un amino acide libre ou ayant au moins sa fonction aminée terminale libre. Le procédé de l'invention permet de créer un dipeptide libre ou d'allonger d'une unité le peptide initial. Dans le cas où la fonction carboxylique de l'acide aminé (ou du peptide à n fragments d'amino acides) initial, présent dans la solution est bloqué, le dipeptide ou le peptide à (n + 1) acides aminés formé, peut conserver le blocage de cette fonction. Selon la présente invention, pour obtenir une liaison peptidique il suffit donc d'ajouter (I) à une solution aqueuse ou aquo-organique contenant soit un acide aminé (II) soit un peptide (III) ayant au moins leur fonction aminée libre. La synthèse des (N-[N'-(R')-N'- nitrosocarbamoyls] Aminoacides) (I) est décrite dans la littérature (DE OS 2,615,594, Japan Kokai 78 103,441, EPA 88 105 584 2 pour R' = H) et Bul Chem Soc Japan vol 48 (4), 1333-1334 (1975), Arch. Pharm. Weinheim) 314,910-917 (1981), 317,481-487 (1984), 322,863-872 (1989), pour R' = CH3, ClCH2CH2-...). En solution aqueuse ces composés sont instables. Ils sont décrits dans le cas de R' = H comme se décomposant en milieu acide en donnant l'acide aminé correspondant, de l'azote et de l'anhydride carbonique (voir par exemple EPA 88 105 584 2). Il sont jusqu'à présent utilisés pour hydrolyser la fonction carbamoyle. Les dérivés substitués (R' = CH3, ClCH2CH2-...) font quant à eux partie de la famille des nitrosourées N'-alkylées.Leurs propriétés antitumorales ont été étudiées, elles résulteraient de leur pouvoir alkylant (ex Arch Pharm 322,863-872 (1989). Selon une caractéristique de l'invention, le pH de la solution est de préférence ajustée à une valeur comprise entre 7 et 14, et la température à une valeur comprise entre 0 et 1000 C, en particulier entre 100 et 500 C. Dans la réaction de synthèse conforme à l'invention, la liaison peptidique formée est celle liant la fonction aminée de l'acide aminé (ou du peptide) présent dans le milieu avec le groupement carboxyle de (I). En présence d'un excès de (II) ou (III) par rapport à (I) la réaction se limite à l'addition d'un seul amino acide sur (II) ou (III). On peut donc par cette technique construire pas à pas un peptide de constitution donnée à l'avance. Dans le cas contraire où (I) est en excès par rapport à (II) ou (III), on observe l'addition successive de plusieurs aminoacides sur (II) ou (III). On peut dans ce cas, si (I) est un mélange de N-[N'-(R')-N'nitrosocarbamoyls] Aminoacides obtenir une sélectivité chimique au cours de l'allongement de la chaîne peptidique. Il est à noter que le procédé de l'invention n'exige pas que la solution aqueuse ou aquoorganique contienne initialement un acide aminé pour que la synthèse peptidique se déclenche. En effet, la décomposition spontanée du composé (I) peut fournir le premier acide aminé du milieu qui devient l'élément amorceur du processus. Selon une caractéristique de l'invention, les composés (I) peuvent être préparés séparément en milieu anhydre par action d'un agent de nitrosation tel que ONO, NO2H, N203, N204,... utilisé pur ou en mélange avec un agent oxydant (oxygène, ou tous autres agents tels que Fe3+, Cu2+, couples métalliques, ou oxydation électrochimique) et introduits dans le milieu réactionnel comme il a été dit précédemment.Ils peuvent également être préparés in situ en milieu aqueux en une seule étape, également par action d'un agent de nitrosation (tel que ONO, NO2H, N203, N204.... utilisé pur ou en mélange avec de l'oxygène, ou tous autres agents oxydants) sur les N-[N'-R')-N'-carbamoyls] Aminoacides, ou en deux étapes par action de l'acide isocyanique ou d'un isocyanate d'alkyle sur un amino acide conduisant aux N-[N'-(R')-N'-carbamoyls] Aminoacides suivie de l'étape de nitrosation. Le radical R' peut en particulier être un hydrogène ou un groupement alkyl ; le radical R peut être un résidu d'acide aminé naturel ou modifié. Le solvant utilisé peut être l'eau pure ou un solvant aquo-organique de miscibilité totale ou partielle. Dans ce dernier cas la réaction peut avoir lieu à l'interface. Les aminoacides utilisés peuvent être de chiralité D ou L ; ils peuvent également être utilisés comme racémiques. La figure unique du dessin propose un mécanisme de la synthèse peptidique visée par l'invention. Bien entendu il ne s'agit la que d'une interprétation des résultats obtenus. Selon ce mécanisme quel que soit son degré de substitution, (I) se décompose en libérant de l'azote, de l'eau (ou de l'alcool selon la nature de R' ) et en donnant un N-carboxy anhydride (NCA). Les NCA sont des molécules bien connues et très utilisées dans la synthèse peptidique. Ils ont jusqu'à la présente invention toujours été synthétisés et utilisés en milieu anhydre. Dans la présente invention, ils sont générés en milieu aqueux par décomposition de (I). Malgré leur sensibilité à l'hydrolyse, les NCA réagissent concurremment en milieu aqueux sur les fonctions aminées libres des acides aminés en donnant précisément un peptide dont la fonction aminée terminale perd spontanément l'anhydride carbonique. Le mécanisme proposé ci-dessus est tout à fait compatible avec un processus de synthèse peptidique prébiotique. Il pourrait avoir fonctionné dans les conditions de la terre primitive pendant les milliers voir des millions d'années en même temps que continuaient à se former les amino acides. Ce mécanisme donne même une approche expérimentale pour aborder la question de l'origine de l'homochiralité des acides aminés. En effet, si la synthèse protéique n'a consommé que des quantités toujours inférieures à 50 % des acides aminés formés le mécanisme proposé a pu conduire à la sélection d'un des énantiomères. (Voir par exemple les travaux de Bonner et Coll. Origin of life 10(1980) 255-263 et 11 (1981)331-335.). On peut même compléter ce mécanisme en y rajoutant une possibilité de racémisation de l'énantiomère non utilisé dans la synthèse peptidique. Cette étape de racémisation pourrait s'être produite au niveau des NCA formés ainsi que cela est montré dans le dessin. Les amino acides au moins en partie racémiques ainsi régénérés lors de l'hydrolyse ont pu être recyclés en NCA par réaction avec l'acide isocyanique et la nitrosation subséquente. L'acide isocyanique et le monoxyde d'azote pouvant en effet être considérés comme des molécules prébiotiques. Le monoxyde d'azote qui a dû être produit en continue sur la terre primitive apparaît comme le carburant initial ayant permis d'entretenir cette synthèse et donc de créer avec les premières protéines, les premiers catalyseurs enzymatiques (les prébiozymes). Le procédé de l'invention est illustrée ciaprès au moyen de quelques exemples de mise en oeuvre. Ces exemples devant bien entendu être considérés comme non limitatifs. Exemple 1 : Préparation de Ala-Phe par action N-[N'-(Chloroethyl)-N'-nitrosocarbamoyl] alanine (IA) sur la phenyl-alanine en solution aqueuse. 5 mg de (IA) sont ajoutés à 10 cm3 d'une solution aqueuse contenant 31 mg de phenyl-alanine à pH 9. Après 15 minutes à 200 C, la solution est analysée en HPLC et montre la formation de 30 % de Ala-Phe par rapport à la quantité de (IA) utilisée. Ala-Phe est alors extrait et identifié (HPLC, RMN et masse) en le comparant à un échantillon authentique. Exemple 2 : Préparation de Ala-Phe par action de N-[N'-(H)-N'nitrosocarbamoyl] alanine (IB) sur la phenyl-alanine en solution aqueuse. 5 mg de (IB) sont ajoutés à 10 cm3 d'une solution aqueuse contenant 18,8 mg de phenyl-alanine à pH 9. Après 15 minutes à 200 C, la solution est analysée en HPLC et montre la formation de 50 % de Ala-Phe par rapport à la quantité de (IB) utilisée. Ala-Phe est alors extrait et identifié (HPLC, RMN et masse) en le comparant à un échantillon authentique. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de synthèse peptidique caractérisé en ce que l'on fait réagir, en solution aqueuse ou aquo-organique, sur un amino acide libre ou ayant au moins sa fonction terminale libre, un N-[N'-(R')-N'nitrosocarbamoyl] Aminoacide de formule 2/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le radical R est un résidu d'acide aminé naturel ou modifié. 3/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le radical R' soit en hydrogène ou un alkyl. 4/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'aminoacide lié au nitrosocarbamoy présente la configuration D, L, ou racémique. 5/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'aminé acide est issu de la décomposition du N-[N'-(R')-N'nitrosocarbamoyl] Aminoacide. 6/ - Procédé de synthèse peptidique caractérisé en ce que l'on fait réagir, en solution aqueuse ou aquo-organique, sur un peptide libre ou ayant au moins sa fonction aminée terminale libre, un N-[N'-(R' )-N'nitrosocarbamoyl] Aminoacide de formule 7/ - Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le pH de la solution aqueuse est ajustée à une valeur comprise entre 7 et 14. 8/ - Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la température de la réaction est ajustée à une valeur comprise entre 0 et 1000 C, en particulier entre 10 et 500 C. 9/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le N-[N'-(R')-N'nitrosocarbamoyl] Aminoacide est synthétisé en milieu anhydre ou directement dans le milieu réactionnel aqueux ou aquo-organique par action d'un agent nitrosant utilisé pur ou en mélange avec un agent oxydant, sur un N-[N'-(R')-N'carbamoyl] Aminoacide. 10/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le N-[N'-(R')-N' nitrosocarbamoyl] Aminoacide est synthétisé directement en milieu réactionnel en deux étapes en faisant réagir d'abord l'acide isocyanique ou un isocyanate d'alkyle sur un aminoacide et ensuite un agent nitrosant sur le N-[N'-(R')-N'carbamoyl] Aminoacide obtenu. 11/ - Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les N-[N'-(R')-N' nitrosocarbamoyls] Aminoacides sont décomposés en solution aqueuse en donnant des N-carboxyanhydrides.