Brevet FR2733835A1 — publié le 19961108

L'invention concerne le domaine de la cytologie et notamment celui des analyses pratiquées en hématologie. Elle est relative à un procédé et un dispositif de détection du point de lyse de globules rouges, contenus dans un échantillon de sang déterminé. Les analyses pratiquées en hématologie ont pour objet une identification et un comptage de plusieurs catégories de cellules, afin d'établir un diagnostic. Les cellules à reconnaître sont usuellement des globules blancs qui se répartissent en plusieurs familles telles que lymphocytes, monocytes ou granulocytes Elles sont généralement réalisées au moyen d'un dispositif utilisant l'effet Coulter. Ce dispositif consiste à faire passer des cellules dans un liquide conducteur à travers un orifice de petit diamètre, au niveau duquel est appliqué un courant électrique maintenu constant. Le passage d'une particule y provoque une variation transitoire de conductivité, représentative du volume occupé par la particule traversante. Ces mesures de variations d'impédance sont cependant reconnues comme insuffisantes pour identifier les cellules. En effet, des cellules appartenant à des familles différentes ont parfois des volumes très voisins. C'est pourquoi, ces mesures de variations d'impédance sont classiquement complétées par des mesures issues d'un dispositif optique, du type diode laser. Dans un tel dispositif, des cellules passant par un orifice de petit diamètre sont illuminées par un faisceau laser et réfléchissent de la lumière. La lumière réfléchie par une cellule a une intensité en corrélation avec l'indice de réfraction de cette cellule. La mesure de la lumière réfléchie permet ainsi d'obtenir des informations sur l'état de surface de la cellule. On constate qu'à partir d'informations sur le volume et l'état de surface des cellules, on peut obtenir des analyses précises. Quel que soit le dispositif utilisé pour effectuer des analyses en hématologie, il est nécessaire de préparer préalablement des échantillons de sang à analyser. On sait qu'il est nécessaire d'éliminer les globules rouges présents dans l'échantillon pour que le dispositif d'analyse puisse identifier les globules blancs. De façon classique, on ajoute donc à l'échantillon de sang, un agent de lyse qui détruit les globules rouges. Ce réactif a également une action sur les globules blancs, même si ceux-ci sont plus résistants que les globules rouges. Il est nécessaire d'arrêter l'action de la lyse lorsque les globules rouges sont détruits, pour éviter que les globules blancs ne le soient également. Pour cela, on ajoute à l'échantillon un produit bloquant qui provoque l'arrêt de la lyse. Les techniques utilisées jusqu'ici sont basées sur une maîtrise chimique du processus de lyse. Ainsi, pour tous les échantillons, on maintient la température et les autres paramètres en cause constants et on injecte le produit bloquant à un moment déterminé et fixe d'un échantillon à l'autre. On constate que ces techniques donnent en général satisfaction. Cependant, dans environ 5 des cas, les échantillons ne sont pas convenablement préparés et ils ne peuvent pas être valablement analysés. Ces échantillons contiennent, soit trop de globules rouges, la lyse ayant été arrêtée trop tôt, soit des globules blancs qui ont été détruits par la lyse, celle-ci s'étant poursuivie trop longtemps. Dans le premier cas, le dispositif d'analyse ne peut pas détecter les globules blancs, compte tenu de la présence de globules rouges. Dans le second cas, les résultats d'analyse ne peuvent pas être retenus. En effet, comme indiqué précédemment, les dispositifs d'analyse classiquement utilisés sont basés sur des mesures d'impédance, pour déterminer le volume des cellules, ainsi que sur des mesures de réflexion de lumière, pour déterminer leur état de surface. Ces mesures ne peuvent donc être valablement réalisées que dans la mesure où les globules blancs sont indemnes et où en particulier, leurs membranes sont intactes. Ce pourcentage d'analyses imparfaites est très important pour un laboratoire. Il entraîne tout d'abord des risques d'erreur au niveau du diagnostic, avec les dangers qui en découlent pour le patient. D'autre part, lorsque le laboratoire a pu détecter des anomalies dans les résultats d'analyse, il doit en réaliser une nouvelle. Ainsi, ce pourcentage d'analyses imparfaites est très préjudiciable, tant en termes de risques médicaux que de surcoûts pour les laboratoires. L'invention a essentiellement pour objet de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé et un dispositif permettant de détecter avec précision le point de lyse des globules rouges. L'invention concerne tout d'abord un procédé consistant à : - préparer un mélange constitué de sang et d'un agent de lyse, - émettre des radiations lumineuses en direction dudit mélange, - recevoir la lumière émise à travers ledit mélange et - comparer la quantité de lumière reçue à un seuil prédéterminé, le point de lyse étant atteint lorsque la quantité de lumière correspond audit seuil. Ce procédé permet de déterminer le point de lyse pour tout type de sang et de prendre ainsi en compte les différences qui peuvent exister d'un type de sang à un autre. De façon avantageuse, le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire dans laquelle l'action de l'agent de lyse est bloquée, dès que le point de lyse est atteint. L'invention concerne également un dispositif de détection de point de lyse de globules rouges comprenant - un dispositif optique émettant des radiations lumineuses en direction d'un mélange constitué de sang et d'un agent de lyse, - des moyens pour recevoir la lumière émise à travers ledit mélange et - des moyens comparateurs dont une première entrée correspond à une valeur seuil, une deuxième entrée recevant un signal représentatif de la lumière reçue par lesdits moyens de réception, la sortie desdits moyens comparateurs étant sensiblement égale à 0 lorsque le point de lyse est atteint. Les caractéristiques suivantes du dispositif peuvent également être considérées, isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniques possibles - le dispositif optique comprend une diode électroluminescente dont les radiations lumineuses sont focalisées par des moyens appropriés, - les moyens de réception de la lumière émise à travers le mélange sont constitués par une photodiode, - la photodiode est reliée à des moyens délivrant un signal de tension représentatif de la lumière reçue par la photodiode, - le dispositif comprend une cuve destinée à contenir le mélange, - le dispositif comprend des moyens pour homogénéiser le mélange dans la cuve, - le dispositif comprend des moyens pour l'injection d'un agent de blocage de la lyse. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit d'exemples non limitatifs de réalisation de l'invention, la description étant faite au regard des dessins annexés sur lesquels - La figure 1 représente de façon schématique un dispositif selon l'invention et - La figure 2 illustre, en fonction du temps, trois exemples d'évolution de la tension de sortie de l'amplificateur de la photodiode illustrée sur la Figure 1. En référence à la Figure 1, le dispositif selon l'invention comprend une cuve 1 destinée à contenir un mélange 2, constitué d'un échantillon de sang et d'une quantité déterminée d'agent de lyse. Ces produits sont introduits par le conduit 3 et proviennent de moyens non représentés sur la Figure 1. La cuve est fermée par un couvercle 4. Le dispositif comprend des moyens 5 pour agiter le mélange et assurer ainsi une bonne homogénéité. Ces moyens sont constitués par une tige 6 s'étendant dans la cuve 1 et fixée en rotation dans le couvercle 4 au moyen d'un palier 7. Un système assurant la rotation de la tige 6 dans la cuve est prévu et n'est pas représenté sur la Figure. A son extrémité, la tige 5 comporte une partie 8 en forme de pale. Le dispositif de détection selon l'invention comprend également des moyens 9 émettant des radiations lumineuses. Ces moyens peuvent par exemple être constitués par une diode électroluminescente. Celle-ci est alimentée en courant électrique par des moyens classiques 10. Ces moyens 9 d'émission de radiations lumineuses sont disposés de façon à ce que les radiations traversent la cuve 1. Le dispositif comprend également des moyens de focalisation 11, tel qu'une lentille de focalisation qui est centrée sur l'axe principal d'émission des radiations lumineuses. Ainsi, la diode 9 émet des radiations lumineuses en direction de la lentille 11. Elles constituent un faisceau de lumière dirigé vers la cuve 1 et le mélange 2 qu'elle contient. Le dispositif comprend également des moyens 12 pour recevoir la lumière après son passage dans la cuve 3, ces moyens de réception peuvent notamment être constitués par une photodiode. Les moyens de réception de la lumière 12 sont reliés à un système 13 qui délivre un signal représentatif de la quantité de lumière reçue par les moyens 12. Dans le cas d'une photodiode, celle-ci peut être reliée à un amplificateur, délivrant une tension de sortie VO. La Figure 2 illustre les tensions de sortie obtenues, pour ce mode de réalisation. Suivant sa composition, le mélange absorbe plus ou moins la lumière émise par la diode électroluminescente et la lumière reçue par la photodiode 12 ainsi que la tension VO de sortie de l'amplificateur 13 sont également plus ou moins importantes. Le fonctionnement du dispositif est le suivant. Lorsque le mélange 2 est introduit dans la cuve 1, l'agent de lyse n'a pas encore eu d'effet sur les cellules sanguines. Ce mélange comprend en général environ 30 l de sang auxquels on a ajouté un agent de lyse. La turbidité du mélange est importante et celuici absorbe presque complètement les radiations lumineuses émises par la diode électroluminescente 9. La tension issue de l'amplificateur 13 est donc voisine de 0, comme l'indique la Figure 2. Au cours du temps, l'agent de lyse produit effet et des globules rouges sont détruits. La quantité de lumière reçue par la photodiode augmente alors, ainsi que la tension de sortie VO de l'amplificateur 13. Ceci est illustré par la Figure 2 qui montre trois exemples d'évolution de la tension de sortie VO. A la Figure 2 et à titre d'exemple, la valeur seuil de 3 volts est considérée comme représentative d'un mélange dans lequel les globules rouges sont détruits, les globules blancs étant encore intacts. Ce seuil correspond donc au point de lyse des globules rouges et au moment auquel la lyse doit être bloquée. La droite en trait plein ( ) correspond à un temps de lyse moyen, la valeur seuil de 3 volts étant atteinte en environ 8 secondes. La droite en trait plein interrompu de ronds (-o-o-) correspond à un temps de lyse plus faible, d'environ 5 secondes et la droite en trait plein interrompu de croix (-x-x-) à un temps de lyse plus important de l'ordre de 19 secondes. Le dispositif selon l'invention comporte des moyens permettant de détecter que la valeur seuil est atteinte. Ces moyens ne sont pas illustrés sur la Figure 1. Ils peuvent notamment consister en un comparateur dont une première entrée est fixée sur la valeur seuil préalablement déterminée, une deuxième entrée recevant le signal émis par les moyens 13, représentatif de la lumière reçue par les moyens de réception 12. Lorsque la sortie du comparateur est sensiblement égale à 0, le mélange présent dans la cuve 1 est prêt à subir une analyse, les globules rouges ayant été détruits et des globules blancs étant encore intacts. Dès que cette valeur a été détectée, il convient d'arrêter l'action de l'agent de lyse. Ceci est notamment obtenu par dilution avec une solution saline à 9 grammes par litre de NaCl. Les exemples illustrés à la Figure 2 montrent que le dispositif et le procédé selon l'invention permettent de s'adapter aux différences qui existent d'un échantillon de sang à l'autre. En effet, l'échantillon correspondant à un temps moyen de lyse de 8 secondes aurait pu être valablement préparé selon les techniques classiques, mais il n'en est pas de même pour les deux autres exemples dont les temps de lyse sont respectivement de 5 et de 19 secondes. En effet, ces techniques classiques sont basées sur un temps de lyse fixe, basé sur une valeur moyenne, notamment de 8 secondes. Ainsi, un sang dont le temps de lyse est de 5 secondes comporterait des globules blancs également détruits, s'il était préparé selon une technique classique qui poursuivrait la lyse pendant 3 secondes supplémentaires. De même, un échantillon de sang dont le temps de lyse est de 19 secondes comporterait encore des globules rouges s'il était préparé selon les techniques classiques, puisque la lyse serait arrêtée au bout de 8 secondes. Les nombreux essais réalisés en utilisant le procédé et le dispositif selon l'invention ne révèlent aucun cas de sang non lysé ou trop lysé. Ainsi, le procédé et le dispositif selon l'invention permettent de remédier aux inconvénients des techniques connues en n'utilisant plus un temps de lyse fixe mais en l'adaptant à chaque type de sang préparé. Ils permettent ainsi de prendre en compte les différences existant d'un échantillon de sang à l'autre, ces différences dépendant notamment de l'âge de l'échantillon, c'est-à-dire du moment auquel il a été prélevé sur le patient. On constate en effet que des phénomènes, dit d'autolyse, peuvent être constatés lorsque l'échantillon a été stocké trop longtemps. Les signes de référence insérés après les caractéristiques techniques mentionnées dans les revendications, ont pour seul but de faciliter la compréhension de ces dernières et n'en limitent aucunement la portée. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination du point de lyse de globules rouges consistant à - préparer un mélange constitué de sang et d'un agent de lyse, - émettre des radiations lumineuses en direction du mélange, - recevoir la lumière émise à travers ledit mélange, - comparer la quantité de lumière reçue à un seuil prédéterminé, le point de lyse étant atteint lorsque la quantité de lumière correspond audit seuil. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire consistant à bloquer l'action de l'agent de lyse, lorsque le point de lyse est atteint. 3. Dispositif de détection du point de lyse de globules rouges contenus dans un sang déterminé, comprenant - un dispositif optique (9, 10, 11) émettant des radiations lumineuses en direction d'un mélange (2) dudit sang et d'un agent de lyse, - des moyens (12) pour recevoir la lumière émise à travers ledit mélange, - des moyens comparateurs dont une première entrée est fixée à une valeur seuil prédéterminée, une deuxième entrée recevant un signal représentatif de la lumière reçue par lesdits moyens de réception (12), la valeur de sortie desdits moyens comparateurs étant sensiblement égale à 0 lorsque le point de lyse est atteint. 4. Dispositif selon la revendication 3 dans lequel le dispositif optique comprend une diode électroluminescente (9) dont les radiations lumineuses sont focalisées par des moyens (11). 5. Dispositif selon l'une des revendications 3 ou 4, selon lequel des moyens (12) de réception de la lumière émise à travers le mélange sont constitués par une photodiode. 6. Dispositif selon la revendication 5, selon lequel la photodiode (12) est reliée à des moyens (13) délivrant un signal de tension représentatif de la lumière reçue par la photodiode (12). 7. Dispositif selon l'une des revendications 3 à 6, comprenant une cuve (1) destinée à contenir ledit mélange (2). 8. Dispositif selon la revendication 7, comprenant des moyens (5) pour homogénéiser le mélange (2) dans ladite cuve (1). 9. Dispositif selon l'une des revendications 3 à 8, comprenant des moyens pour l'injection d'un agent de blocage de la lyse.