Brevet FR2731012A1 — publié le 19960830

La présente invention a pour objet de nouvelles souches de Brevibacterium linens, utiles dans l'industrie fromagère, notamment pour la fabrication de fromages à croûtes fleuries. Brevibacterium linens est une corynébactérie qui fait partie de la flore secondaire de surface de nombreux fromages. C'est un des agents essentiels de l'affinage. Sensible à l'acidité, elle ne s'installe sur le fromage qu'après sa "désacidification" par consomma- tion de l'acide lactique par les levures, Geotrichum candidum ou Penicillium camemberti. Elle présente aussi une bonne halotolérance voire même une certaine halophilie nécessaire à sa survie durant l'affinage. Elle participe activement au développement de l'arôme au cours de l'affinage, particulièrement des arômes soufrés. La pigmentation rouge-orangée est caractéris- tique de l'espèce B. linens. Elle joue un rôle esthétique pour de nombreux fromages (pates molles, croûtes morgées ou fleuries,...). Cependant, cette pigmentation variant de jaune-orangé à rouge n'est pas acceptable d'un point de vue esthétique pour des fromages ayant une croûte fleurie traditionnelle de couleur blanche, comme les fromages de type camembert, alors que les propriétés aromatiques de B. linens sont recherchées pour ce type de fromages. Conformément à l'invention, les inventeurs ont mis au point de nouvelles souches de B. linens qui sont caractérisées en ce qu'elles sont productrices de méthanethiol, donc aptes à développer les arômes soufrés typiques de l'espèce B. linens, et présentent une absence de pigmentation. Selon une caractéristique supplémentaire, les souches selon l'invention présentent un profil de restriction sensiblement identique à celui des souches pigmentées leur ayant donné naissance, pour les enzymes de restriction clivant les régions riches en bases A et T, notamment DraI, AseI, XbaI et SspI. Les enzymes de restrictions utilisées pour établir les profils de restriction des souches de B. linens sont des enzymes clivant des régions préféren- tiellement composées de bases A (adénine) et T (thymine). Ces enzymes sont préférées parce que l'ADN de B. linens renferme de 60 à 62% de bases G (guanine) et C (cytosi- ne), d'o l'obtention de fragments de restriction en nombre limité avec les enzymes citées. Par profils de restriction sensiblement identiques, on entend des profils ne différant que par un nombre restreint de bandes en nombre et en taille après électrophorèse des fragments de restriction, en champ pulsé, généralement des profils identiques à une bande près pour une ou deux enzymes sur les quatre mentionnées, généralement pour l'une seulement pour la souche mutante apigmentée par rapport à la souche parente pigmentée, le nombre de bandes obtenues et leurs poids moléculaires avec les deux autres ou les trois autres enzymes de restriction étant identiques. Des souches préférées ont été déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, Paris) le 18 mai 1994 sous les numéros 1-1415, 1-1416, 1-1417 et 1-1418. Les dépôts ont été fait conformément au traité de Budapest. Les souches de B. linens selon l'invention sont capables de croître dans les mêmes conditions de culture que les souches d'origine, par exemple pour les cultures de surface, sur un milieu BHI gélosé à une température de 25 à 30 C ou sur un milieu Eliker gélosé à une température de 25 à 30 C, ou pour des cultures liquides agitées (à 250 rpm) dans un milieu BHI à une température de 25 à 30 C ou un milieu Eliker à une température de 25 à 30 C. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche fromagère de B. linens telle que définie précédemment, dans lequel on cultive une souche sauvage pigmentée dans des conditions de culture aptes à la croissance de ladite souche sauvage et on sélec- tionne les colonies apigmentées (blanches) apparaissant par mutation, et éventuellement l'on compare les profils de restriction de ladite souche mutante et de ladite souche sauvage en vue de s'assurer de la parenté des deux souches. En effet, les variants apigmentés peuvent apparaître spontanément au cours de la culture des souches orangées, souvent par formation de secteurs visibles sur les colonies jaune-orangé à rouge. Lorsque les variations apparaissent très précocement lors du développement de la colonie, toute la colonie apparaît blanche. Il est alors souhaitable de s'assurer de la parenté des souches sauvages et mutantes, en comparant notamment leurs profils de restrictions respectifs obtenus avec les enzymes mentionnées ci- dessus. L'analyse des profils de restrictions repose sur la méthode du Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction (RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism) et est réalisée selon une technique connue par exemple par Electrophorèse en Champ Pulsé sur gel d'agarose et coloration des fragments d'ADN par le bromure d'éthidium. On décrira ci-après plus précisément, les caractéristiques des souches préférées selon l'invention en se référant aux figures annexées sur lesquelles: - la fig. 1 représente les courbes de crois- sance et de production de méthanethiol obtenues pour les souches 1-1415 (fig. lB), 1-1416 (fig. lC) et leur souche parente (fig. 1A) sur un milieu BHI à 25 C sous agitation (250 rpm). Pour la mesure de la croissance, la DO est lue à 580 nm et pour la mesure de production de CH3SH la lecture est faite à 412 nm; - la fig. 2 représente les profils de restriction obtenus avec l'enzyme XbaI. Le couloir 1 correspond au marqueur de poids moléculaire Lambda (référence: low range PFG Marker Biolabs) 2 à la souche parente de 1-1415 et de 1-1416, 3 à la souche 1- 1415, 4 à la souche 1-1416, 5 à la souche parente de 1-1417 et 6 à la souche 1-1417; - la fig. 3 représente les profils de restriction obtenus avec l'enzyme de restriction Dra-I. Les références 1 à 6 sont identiques à celles de la fig. 2; - la fig. 4 représente les courbes de croissance et de production de méthanethiol pour la souche 1-1417 (fig. 4B) et sa souche parente (fig. 4A); - la fig. 5 représente les profils de restriction obtenus avec l'enzyme AseI; les références sont les suivantes: 1: marqueur de poids moléculaire Lambda (référence ci-dessus); 2: souche parente de 1- 1417; 3: souche 1-1417; - la fig. 6 représente les profils de restriction obtenus pour la souche parente de 1-1418 et la souche 1-1418, respectivement avec les enzymes de restriction AseI (couloirs 2 et 3), SspI (couloirs 4 et ) et DraI (couloirs 6 et 7); le couloir 1 correspondant au marqueur de poids moléculaire Lambada (référence ci- dessus). (1) Souches LR1(2) (déposée à la CNCM sous le n 1-1415) et LR1(3) (déposée à la CNCH sous le n 1-1416). Ces souches ont été obtenues à partir de la souche sauvage orange LR1 commercialisée sous l'appella- tion souche O par les Laboratoires GRANDAY-ROGER. Cette souche est caractérisée par sa couleur orange-rouge typique de certains fromages de type Munster. Elle est acido-sensible (pH 6,2-7,0) et se développe même dans les solutions fortement salées (14%). On donnera ci-après les caractéristiques biochimiques des souches LR1, LR1(2) et LR1(3). Souches LR1 LR1(2) LR1(3) Pigmentation orange blanche blanche Méthanethiol(l) ++ ++ ++ Protéasez2> _ _ Aspect non filant filant non filant AntibioQgrammes identiques Cm(3) S/R S S Ery(4) S/R R R Am(5) S S S (1) Le dosage a été réalisé au cours de la croissance. Les résultats sont rapportés sur la fig. 1. (2) Test d'hydrolyse de la gélatine du système d'identi- fication des bactéries corynéformes api CORYNE (BIOME- RIEUX S.A. réf.: 2 090 0). (3) Chloramphénicol. (4) Erythromycine. (5) Ampicilline. Les profils de restrictions obtenus avec les enzymes XbaI et DraI sont rapportés sur les fig. 2 et 3 respectivement. Les profils de restrictions sont strictement identiques pour les deux enzymes (11 bandes pour DraI et 11 bandes principales pour XbaI). (2) Souche ULV (a) (déposée à la CNCM sous le n 1-1417). Cette souche a été obtenue à partir de la souche ULV (Collection privée SBI). On donnera ci-après les caractéristiques biochimiques des deux souches ULV et ULV(a). Souches ULV ULV(a) Pigmentation orange blanche Methanethiol' ++ ++ Lactose2) + Glucose(2) + Protéase + + Aspect non filant non filant Antibiogrammes identue CMM s s Cm|(4) ESS Km(5) S S Am(6) R/S R (1) Le dosage a été réalisé au cours de la croissance. Les résultats sont rapportés à la fig. 4. (2) Test api CORYNE (BIOMERIEUX) (3) Test api CORYNE d'hydrolyse de la gélatine (4) Chloramphénicol. (5) Kanamycine. (6) Ampicilline. Les profils de restriction obtenus avec les enzymes XbaI, DraI et AseI sont rapportés respectivement aux fig. 2, 3 et 5. Avec XbaI, les profils sont strictement identiques et montrent le même nombre de bandes en électrophorèse en champ pulsé (14 bandes principales). Avec DraI, les profils sont identiques cependant qu'une bande de 200 kb est absente pour le variant blanc ULV(a) par rapport à la souche parente ULV. Avec AseI, les profils sont relativement identiques si ce n'est l'absence d'une bande de 250 kb pour la souche variante ULV(a) par rapport à la souche ULV et au contraire la présence de deux bandes de 165 kb et 97 kb correspondant sensiblement au clivage de la bande de 250 kb pour le variant ULV(a) qui n'apparaît pas pour la souche sauvage ULV. (3) Souche RBL(1) (déposée à la CNCM sous le ne 1-1418). Cette souche a été obtenue à partir de la souche Reblochon (collection privée SBI). Les profils de restrictions pour les enzymes AseI, DraI et SspI sont identiques et montrent les mêmes bandes pour la souche sauvage et son variant apigmenté (fig. 6). La souche variante, tout comme la souche sau- vage contiennent un plasmide (pBP1) de 8,2 kb. REVENDICATIONS 1. Souches fromagères de Brevibacterium linens, caractérisées en ce qu'elles sont productrices de méthanethiol et présentent une absence de pigmenta- tion. 2. Souches selon la revendication 1, caracté- risées en ce qu'elles présentent un profil de restriction identique ou sensiblement identique à celui des souches pigmentées leur ayant donné naissance pour les enzymes de restriction clivant les régions riches en bases A et T, notamment pour DraI, AseI, XbaI et SspI. 3. Souches selon la revendication 1 ou la revendication 2, déposées auprès de la Collection Natio- nale de Culture de Microorganismes (CNCM) le 18 mai 1994 sous les n 1-1415, 1-1416, 1-1417 et 1-1418. 4. Procédé d'obtention d'une souche fromagère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on cultive une souche sauvage pigmentée dans des conditions de culture aptes à la croissance de ladite souche sauvage et l'on sélectionne les colonies apigmentées apparaissant par mutation, et éventuellement l'on compare les profils de restriction de ladite souche mutante et de ladite souche sauvage en vue de s'assurer de la parenté des deux souches. 5. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la fabrication de fromages affinés, notamment de fromage à pâte molle et à croûtes fleuries.