Brevet FR2724459A1 — publié le 19960315

La présente invention concerne un perfectionnement relatif à une technique d'analyste dite électrophorèse capillaire d'affinité, également dénommée électrophorèse capillaire haute performance (ECHP), et un support d'affinité pour la mise en oeuvre de cette technique et à un procédé pour la fabrication de ce support. Cette technique d'analyse est actuellement réalisée au moyen d'un appareil qui consiste en un capillaire de silice, qui a un diamètre intérieur compris entre 25 et 100 um, et dont chaque extrémité plonge dans des récipients rempli de tampons. Un voltage de l'ordre de 20 à 30 kV est appliqué par l'intermédiaire de deux électrodes plongeant dans ces récipients. En électrophorèse, I'homme du métier sait que des champs électriques élevés permettent des séparations rapides. Dans le cas de l'électrophorèse capillaire où l'injection et le volume de détection sont minimaux, le seul facteur d'élargissement des pics est do à la diffusion axiale. Plus la rapidité de la migration des espèces chimiques à l'extérieur du capillaire est importante, plus les pics sont résolus.Cette vitesse électrique est obtenue pour des champs électriques de l'ordre de 150 à 300 V/cm. Dans la technique d'électrophorèse capillaire d'affinité, I'homme du métier propose de remplir le capillaire d'un gel d'agarose couplé avec un ligand ou de réaliser une dérivatisation de la paroi du capillaire et d'y coupler le ligand. Mais ces techniques connues d'électrophorèse capillaire d'affinité sont difficiles à mettre en oeuvre avec tous types de ligands bio-spcifiques, groupes spécifiques ou pseudo-bi-spécifiques, y compris les chélates métalliques tels que l'iminodiacétate de cuivre (II) ou IDA-Cu (II) En particulier, cette technique actuelle a pour inconvénient le fait que le ligand reste fixé dans le capillaire la régénération de ce dernier après chaque sé paration peut se révéler être très difficile voire même impossible. Ceci est tout particulièrement le cas pour les chélates métalliques car un relargage du métal (du fait du champ électrique ou d'une grande affinité pour la protéine utilisée) ne pourra etre compensée et les propriétés du capillaire seront par conséquent modifiées. Aussi un des buts de la présente invention est-il de foumir une technique d'électrophorèse capillaire d'affinité qui permet de pallier ces inconvénients. Un autre but de la présente invention est de fournir une telle technique d'électrophorèse permettant une préparation, une régénération et une stabilité satisfaisante du capillaire. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparattrnnt par la suite, sont atteints par une électrophorèse capillaire d'affinité qui est caractérisée, selon la présente invention, par le fait qu'on utilise comme support d'affinité un ligand d'affinité couplé à un polymère soluble. Avantageusement, le polymère soluble est le polyéthylène glycol (PEG) ou un de ses dérivés. La présente invention a également pour but de fournir un support d'affinité pour la mise en oeuvre de cette électrophorèse capillaire d'affinité ainsi qu'un produit pour la fabrication de ce support Ce support d'affinité est constituée par un ligand d'affinité couplé à un polymère soluble par covalence. Selon la présente invention; le polymère soluble est un composé organique aliphatique, à chaîne linéaire ou cyclique, non ramifié, biocompatible et ayant une masse supérieure à 4,996.10.24 kg (3.000 daitons). La viscosité de ce polymère soluble est inférieure à 5 mPa.s. Par ailleurs, I'ultra-violet est faiblement at > sorbé par ce polymère, ce qui permet une détection des protéines à des longueurs d'onde comprises entre 214 et 280 nm. Le polymère soluble est de préférence le polyéthylene glycol (ou PEG) ou un de ses dérivés, tel que le méthoxy-polyéthylèneglycol (ou m.PEG). Le PEG présente une masse de l'ordre de 8,302.10.24 kg. (5.000 daltons) et est linéaire et non ramifié. La viscosité est inféneure a 5 mPa.s. II est Io lubie dans l'eau, le benzène, I'acétonitrile et, à chaud, dans l'acétone, le dioxane, le toluène, par exemple. On peut utiliser, jusqu'à une mole dans 5 % de PEG, différents additifs . soit des sels tels que le chlorure de sodium (NaCI), le suifate de potasium (K2S04), soit la glycine-bétaine, ces additifs étant cités de façon non limitative. Le couplage de différents ligands au PEG ou à des dérivés de celuici a été réalisé. Cecl est regroupé dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 Dérivé du PEG Groupe fonctionnel Réaction de couplage de ligand R anrie secondaire ou PECCI HN Direct R tertiaire PEG-NH2 R-COOH DCC, catalyse possible par HOBT dans des solvants organiques EDC, possible via NHS-ester dans H2O R-CHO Base de Schiff, réduite par Na BH4 (sucres, nucléotides) o R-CHO pKa = 3, réaction possible en conditions (sucres, nucléotides) acides PEG-O-CH2-C-NH-NH2 (Hydrazide) O R-NH2 Catalyse par amine, éther ou thioéther PEG-O-OH2-CH-CH2 R-OH (Epoxyde) R-SH PEG-O-OH2-CH-CH2-CHO R-NH2 Base de Schiff, réduite par NcBH4 (Aldehyde) PEG-O-Succ R-NH2 DCC, possible HOBT- catalyse possible par HOBTdans un solvant organique PEG-O-CH2-COOH (CM-PEG) EDC, possible via NHS-Ester dans H20 PEG-Gly-OH (= dérivés carboxylés) On couple à ce polymère un ligand d'affinité tel que, par exemple, des lectines, des ions métalliques immobilisés. Le support d'affinité ainsi obtenu se présente sous forme liquide et constitue le tampon remplissant les récipients de l'appareil d'électrophorèse Deux exemples seront cl-après donnés à titre non limitatif, pour mieux faire comprendre les avantages de la présente invention. Exemple 1 PEG couplé à une lectine On utilise comme support d'affinité du méthoxy-PEGSuccinyi onA afin de séparer les RNases A et B de pancréas bovin. Ces deux RNases ont des séquences identiques en acides animés, mais la RNase B est glycolysée en Asn 34 alors que la RNase A n'est pas glycolysée. Dans le tableau 2 a-après sont regroupés les résultats d'électrophorèse capillaire d'affinité réalisée l'une sans ligand d'affinité, l'autre avec le ligand d'afinité ci-dessus. Tableau 2: Temps de migration des différentes protéines étudiées. to = temps de migration sans le ligand mPEG4on A dans le méthoxy - PEG 5000 t = temps de migration avec le ligand mPEG-Con A dans le méthoxy - PEG 5000 IDA-Cu (II) Protéine to(min) t(min) t-to (min) RNase A 9,9 10,2 0,3 RNase B 12,5 15,7 3,2 II apparaît que les temps de migration sont bien distincts, ce qui se traduit lors de la mesure par l'obtention de pics bien identifiables. Exemplaire 2: PEG couplé à un ion métallique immobilisé On utilise comme support d'affinité le méthoxy-PEG 5000 IDA-Cu (II) et comme support de référence le méthoxy PEG 5000. Par électrophorèse on veut séparer les cytochromes c de coeur de thon, de coeur de cheval et de Candida Krusei : ces différentes espèces de cyto- chrome c sont des protéines qui ont sensiblement le même poids moléculaire et le même point isoélectrique. On sait qu'ils diffèrent, néanmoins, de par leurs nombres de résidus histidine accessibles en surface. Dans le tableau 3 ci-après, sont regroupés les temps de migration de chaque cytochrome c en fonction du support utilisé. Tableau 3 Temps de migration des différents cytochromes étudiés to = temps de migration dans le méthoxy-PEG 5000 t = temps de migration dans le méthoxy-PEG 5000-lDA-Cu (II) Protéine to(min) t(min)a t-to (min) Cytcdecoeurdethon 12,6 12,6 0 Cytcde coeur de cheval 12,2 13,2 1,0 Cyt c Candida Krusei 17,3 20,5 3,2 a) Les valeurs sont corrigées en fonction des différences de flux électroosmotiques pour les deux supports polymères avec ou sans ligand. II apparalt que la présence du ligand couplé permet une bonne identification des protéines de structure très voisine, leur caractérisation et, par suite, leur séparation. REVENDICATIONS 1. Electrophorèse capillaire d'affinité, caractérisée par le fait qu'on utilise comme supportd'affinité un ligand d'affinité couplé à un polymère soluble. 2. Electrophorèse capillaire d'affinité selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le polymère soluble est du polyéthylène glycol (PEG) ou un de ses dérivés. 3. Support d'affinité pour électrophorèse capillaire d'affinité selon les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il est constitué par un ligand d'affinité couplé à un polymère soluble. 4. Support d'affinité selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le polymère soluble est le polyéthylène glycol (PEG). 5. Procédé pour la préparation du support d'affinité selon les revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait qu'on couple un ligand d'affinite à un polymère qui est soluble à température ambiante dans l'eau, le dichlorure de méthane, I'acétonitrile et, à chaud, dans l'acétone, le dioxane, le toluène et dont la masse est supérieure à 4,996.10.24 kg et la viscosité inférieure à 5 mPa.s.