Brevet FR2733763A1 — publié le 19961108

L'invention concerne un procédé de production de vanilline à partir de précurseurs benzéniques par bioconversion. Il est déjà connu de produire de la vanilline par voie microbienne. A titre d'exemple, le brevet EP 0 405 197 décrit un procédé de production de vanilline par fermentation microbienne d'eugénol ou d'isoeugénol. Pour cela, un microorganisme libre de l'espèce Serratia, Enterobacter ou Klebsiella est mis en oeuvre dans un milieu comprenant notamment une source de carbone ainsi que, le cas échéant, différents sels inorganiques, des organo-éléments et des vitamines. Cependant, ce procédé présente certains inconvénients. D'une part, l'eugénol et l'isoeugénol sont des substrats difficiles à manipuler puisqu'ils sont hydrophobes et, d'autre part, l'utilisation d'un milieu complexe n'est pas souhaitable, tant au niveau de la préparation que de l'isolement de la vanilline. Enfin, le rendement de ce procédé est faible, de l'ordre de 20 %. Le brevet EP 0 453 368 décrit un procédé de production de la vanilline par bioconversion de précurseurs benzéniques. Selon ce procédé, on met en oeuvre un champignon Basidiomycète qui est d'abord cultivé en milieu liquide et, après trois jours de culture, le substrat de bioconversion est ajouté dans le milieu de culture. Le substrat de bioconversion est un dérivé du benzène tel que l'acide férulique ou l'isoeugénol. Le microorganisme est libre dans le milieu de culture. Ce procédé présente un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord, l'utilisation de fungi n'est pas très commode, ensuite il serait préférable de pouvoir mettre en contact le milieu de culture et le substrat de bioconversion plus rapidement et, enfin, il serait souhaitable d'améliorer le rendement du procédé qui est, là encore, d'environ 20 eo. A cet égard, on peut remarquer que lorsque le substrat utilisé est particulièrement coûteux, il est important que le procédé présente un rendement maximum. Le brevet US 5 128 253 décrit un procédé de production de vanilline par conversion microbienne d'un substrat choisi dans le groupe comprenant notamment l'acide férulique, l'eugénol ou les dérivés coniféryliques, au moyen d'un microorganisme libre appartenant à l'espèce Pse udom on as, Corynebacterium, Rhodotorula glutinis et Aspergillus niger. La conversion est effectuée en présence d'un dérivé de type sulfhydryle et, le cas échéant, en présence d'une source de carbone. Là encore, le milieu de bioconversion est complexe et le rendement du procédé est de 20 % environ. Le but de l'invention est de fournir un procédé de production de vanilline présentant notamment les avantages suivants - la vanilline préparée est obtenue par bioconversion, cette bioconversion peut être réalisée à partir de substrats naturels sans mettre en jeu d'additifs ou de réactifs synthétiques - le procédé doit être simple à industrialiser, le milieu de bioconversion doit être un milieu défini (sans produits biologiques complexes comme les extraits de levures) et simple et la vanilline obtenue doit être facile à extraire du milieu de bioconversion - le procédé doit être rentable: le rendement de production par rapport au précurseur doit être amélioré par rapport à celui obtenu selon la technique antérieure, et le procédé doit pouvoir fonctionner suffisamment longtemps avec le même système de bioconversion. Pour ce faire, la présente invention a pour objet un procédé de production de vanilline par bioconversion de précurseurs benzéniques de la vanilline, en particulier l'acide férulique ou le férulate de sodium, caractérisé par le fait qu'on utilise une culture immobilisée de microorganismes Actinomycètes, notamment du genre Streptomyces, dans un milieu défini dans lequel le précurseur benzénique de la vanilline a été ajouté, ce milieu comprenant, en outre, un phosphate organique, et on récupère la vanilline produite par bioconversion dudit précurseur, la souche de Streptomyces étant sélectionnée pour sa propriété d'accumuler de la vanilline dans le milieu à partir du milieu contenant le précurseur benzénique de la vanilline. Le procédé selon l'invention met en oeuvre un microorganisme immobilisé. Cette immobilisation donne lieu à une production de vanilline beaucoup plus importante, plus reproductible, pouvant se réaliser sur de plus longues durées que lorsque le microorganisme est libre dans le milieu de bioconversion. En d'autres termes, elle confère au système une meilleure stabilité. Les bactéries selon la présente invention sont utilisées sous forme immobilisée, c'est-à-dire encapsulées dans une matrice appropriée comme cela est connu de l'homme du métier. Toutefois, on préférera utiliser des microparticules contenant les microorganismes et, bien que ces particules puissent être en polymère synthétique, on préférera utiliser des polymères tels que les alginates, la gélatine ou d'autres produits du même type, les alginates étant très largement préférés. La technologie de préparation des billes ou particules d'alginate contenant des microorganismes par réticulation avec Ca2+ est connue. On désignera par "procédé de bioconversion" un procédé dans lequel il n'y a pratiquement pas de croissance de la masse bactérienne et où les éléments du milieu sont essentiellement destinés à assurer la conversion enzymatique du substrat en vanilline. Le milieu dit "défini" est un milieu qui ne contient pas de mélanges de protéines complexes tels que les extraits de levures ou des peptones, lesquelles jouent un rôle dans la croissance bactérienne, ce milieu n'autorisant de préférence pas la croissance des microorganismes. Parmi les précurseurs de la vanilline, il faut citer en particulier l'acide férulique et ses sels, notamment de sodium, mais d'autres précurseurs benzéniques sont possibles, notamment l'eugénol, l'isoeugénol et l'alcool conyférilique, même si leurs propriétés ne sont pas toujours compatibles avec une bonne bioconversion. On peut également prévoir la production in situ des précurseurs à partir de sources naturelles, lesquels pourront être dégradés en dérivés de type férulique par des systèmes enzymatiques. Les sources naturelles de ces produits sont assez abondantes, notamment dans de nombreux sous-produits de l'industrie sucrière, tels que les cossettes de betteraves mais aussi des sons de blé ou de riz. Le milieu de bioconversion contiendra, en outre, des éléments assurant l'activité du système enzymatique et le maintien de cette activité, ainsi il est nécessaire de prévoir la présence de certains éléments tels que le magnésium, qui intervient parfois dans l'activité de synthèse enzymatique, ou d'autres sels tels que Nazi, ou, éventuellement des éléments permettant de modifier le pH ou la pression osmotique. L'élément clé du milieu de bioconversion est le phosphate organique. A titre de phosphate organique, on utilisera avantageusement l'un de ceux choisis dans le groupe comprenant les nucléotides, naturels ou non, ou les polyols phosphates tels que le glycérophosphate, particulièrement le glycérophosphate de calcium. De préférence, le phosphate organique est le glycérophosphate. En tant que nucléotide, on pourra utiliser l'inosine monophosphate, la guanosine monophosphate, l'uridine monophosphate ou la cytidine monophosphate. Les autres polyols phosphates ont en général un prix prohibitif. Des essais réalisés avec des phosphates minéraux ont montré que ceux-ci ont, en particulier sur l'immobilisation des microorganismes, notamment sur la matrice d'encapsulation, des effets néfastes. En effet, on observe dans certains cas, notamment lorsque la matrice est un alginate, une désagrégation partielle ou totale de la matrice ou un relâchement de ce milieu limitant ainsi la durée de vie du système. De plus, dans certains cas, on peut observer avec certains nucléotides une croissance cellulaire dans le milieu avec formation de micropellets, ce qui peut diminuer les performances du système. I1 s'ensuit qu'on préférera utiliser, en tant que phosphate organique, le glycérophosphate. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel du procédé selon l'invention, les microorganismes sont de l'espèce Streptomyces setonii, en particulier les souches Streptomyces setonii CNCM n 1-1555 ainsi que ses mutants ayant la capacité à convertir les précurseurs de la vanilline en vanilline, notamment ceux pouvant être obtenus par mutation/sélection à partir de ladite souche, cette souche est notamment décrite par Sutherland, Crawford et Pometto; Can. J. Microbiol. vol. 29, 1983. Ces microorganismes sont, de préférence, immobilisés dans des billes d'alginate, ces dernières étant réalisées en laissant tomber, goutte à goutte, les bactéries incorporées dans l'alginate de sodium liquide dans du chlorure de calcium (0,1 M) sous agitation, qui assure la réticulation de la matrice incorporant les bactéries. On peut également prévoir l'utilisation d'une matrice à coeur liquide contenant les bactéries ou d'autres modes de mise en oeuvre. On pourra également réaliser des billes comprenant une ou deux couches afin d'éviter l'échappement des bactéries. Selon un autre mode de réalisation préférentiel du procédé selon l'invention, le milieu est maintenu à un pH compris entre 5 et 7,5 et, de préférence, voisin de 6,2 à 6,4 ; la température est avantageusement comprise entre 30 et 50"C et, de préférence, voisine de 45"C. Le milieu contient, de préférence, du chlorure de sodium et du sulfate de magnésium et le phosphate organique est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 4 et 10 g/l et de préférence entre 7 et 8 g/l. Le procédé peut être mis en oeuvre par "batch", en continu ou en semi-continu. Avantageusement, on apporte le précurseur et on récupère la vanilline séquentiellement ou en continu. Dans le cas d'une bioconversion par "batch", l'ensemble du milieu est extrait en fin de conversion. En continu ou en semi-continu, on extrait la vanilline au fur et à mesure de sa production ou à des temps déterminés, puis on recycle le milieu après ajout éventuel d'éléments complémentaires. A ce sujet, un intérêt de ce procédé réside dans le fait que la vanilline formée demeure dans le milieu jusqu'à la consommation pratiquement totale du précurseur. Ce n'est qu'ensuite qu'elle se dégrade en acide vanillique. En d'autres termes, ce procédé donne pratiquement lieu à deux étapes distinctes dans le temps de formation et de dégradation de la vanilline. Ceci a pour effet de faciliter l'opération d'extraction et d'assurer un rendement industriellement intéressant. On pourra récupérer, de préférence, la vanilline lorsque le précurseur n'est plus détectable dans le milieu et avant la bioconversion de la vanilline en acide vanillique. La vanilline est récupérée, par exemple, par extraction liquide/liquide. Le solvant peut être l'éther, l'acétate d'éthyle ou le toluène. De préférence, le milieu comprend, en outre, un sel de magnésium. Avantageusement, on utilise des souches de Streptomyces setonii CNCM n" I-1555 dans un milieu comprenant du glycérophosphate à une concentration de 7,4 g/l, le pH du milieu étant de 6,4 et la température de 45"C. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. La description fait référence aux figures 1 à 3. La figure 1 représente les résultats de bioconversion en fiole de férulate de sodium en vanilline en milieu comprenant de 1'UMP. La figure 2 représente les résultats de bioconversion en fiole d'acide férulique en vanilline dans un milieu comprenant du glycérophosphate. La figure 3 représente les résultats de bioconversion d'acide férulique en vanilline en milieu comprenant du glycérophosphate, la bioconversion étant cependant réalisée en "batchs" successifs. Les symboles et abréviations utilisés sont les suivants: X : précurseur (acide férulique ou férulate de sodium) 0 : vanilline O : acide vanillique af : acide férulique Fna: férulate de sodium van: vanilline av : acide vanillique I - PROTOCOLE DE BIOCONVERSION 1 - lirincine On réalise deux types d'essais : en fiole ou en "bath". Pour les essais en fiole, la bioconversion est réalisée à partir de férulate de sodium en milieu comprenant de l'uridine monophosphate (UMP), et à partir d'acide férulique en milieu comprenant du glycérophosphate. Pour les essais en "batch", la bioconversion est réalisée à partir d'acide férulique en milieu comprenant du glycérophosphate. Les performances du procédé sont mesurées par un suivi dans le temps des concentrations en précurseur et en vanilline. 2 - Souche utilisée On utilise un microorganisme de l'espèce Streptomyces setonii déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur-Roux - 75015 Paris, sous le n" I-1555. 3 - Essais On prépare les milieux suivants Le milieu 1 comprend de l'UMP à une concentration de 12,95 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgSO4, 7H20 0,1 g/l, le pH est de 7,68. Le milieu 2 comprend du glycérophosphate à une concentration de 7,4 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgSO4, 7H20 0,1 g/l, le pH est de 6,4. On introduit dans 100 ml de milieux 1 et 2 10 ml de cellules en phase stationnaire (DO = 1,20) immobilisées dans 40 ml d'alginate. La concentration en billes d'alginate est de 140 billes pour 10 ml de mélange. Dans le milieu 1, on introduit du férulate de sodium (2,22 g/l) comme précurseur de la vanilline, dans le milieu 2, de l'acide férulique (1,62 g/l). Le milieu 3 est constitué de 1,25 1 de milieu comportant du glycérophosphate à une concentration de 7,4 g/l, NaCi 0,5 g/l et MgSO4, 7H20 0,1 g/l. On met en oeuvre 7 000 billes de microorganisme immobilisé et le précurseur utilisé est le férulate de sodium. On effectue un suivi de la bioconversion en fonction du temps au moyen d'une analyse HPLC. Pour cela, on prélève 0,5 ml du milieu de culture, on filtre ce milieu, on le dilue dix fois et on l'analyse par HPLC. Les figures 1 à 3 représentent les résultats de mesure des concentrations par HPLC en précurseur et en vanilline et en acide vanillique formés. Ces figures correspondent respectivement aux milieux 1 à 3. a) Svnthèse en fiole - milieux 1 et 2 A 45"C, on observe une consommation rapide du précurseur sur les deux figures. Cette consommation est quasi-totale pour le milieu à base d'UMP et avec le férulate de sodium comme précurseur (figure 1). Elle est totale pour le milieu à base de glycérophosphate avec l'acide férulique comme précurseur (figure 2). Dans les deux cas, la synthèse de vanilline est détectée dès la deuxième journée et la quantité de vanilline accumulée est croissante quasiment jusqu'à consommation totale du précurseur. Dans les deux cas, la concentration de la vanilline atteint environ 1 g/l, ce qui est une valeur élevée, et le rendement molaire maximal atteint environ 66 % en 90 heures, ce qui est également une valeur élevée. La concentration initiale en férulate de sodium est de 2,2 g/l. I1 apparaît enfin que les résultats obtenus en milieu comprenant du glycérophosphate et avec l'acide férulique comme précurseur sont particulièrement bons : la bioconversion dure seulement 3 jours, la concentration obtenue atteint 0,88 g/l et le rendement molaire maximal est de 69 %. La concentration initiale en acide férulique est de 1,62 g/l. b) Essais par "batch" - milieu 3 On observe que le système mis en oeuvre peut fonctionner pendant environ 3 semaines, ce qui correspond à une durée de fonctionnement intéressante d'un point de vue industriel. Pour tous les "batchs", on observe à 45"C une rapide diminution de la concentration en précurseur ; la disparition totale du précurseur correspond à une concentration maximale en vanilline. Pour tous les "batchs" (sauf le premier pour lequel se produit l'amorce de la réaction) la concentration maximale en vanilline est élevée (comprise entre 0,65 et 0,9 g/l) et le rendement molaire de bioconversion est également élevé puisqu'il varie entre 53 et 69 %. I1 apparaît donc que la mise en oeuvre du procédé selon l'invention en "batchs" successifs est particulièrement intéressante puisque le système fonctionne longtemps et donne lieu à une production de vanilline avec un rendement élevé et une forte concentration. REVENDICATIONS 1) Procédé de production de vanilline par bioconversion de précurseurs benzéniques de la vanilline, caractérisé par le fait que - on utilise une culture immobilisée de microorganismes Actinomycètes, notamment du genre Streptomyces dans un milieu défini dans lequel le précurseur benzénique de la vanilline a été ajouté, ce milieu comprenant, en outre, un phosphate organique, et - après la bioconversion, on récupère la vanilline produite, - la souche de Streptomyces étant sélectionnée pour sa propriété d'accumuler de la vanilline dans le milieu à partir du milieu contenant le précurseur benzénique de la vanilline. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le phosphate organique est choisi dans le groupe comprenant les polyols phosphates et les nucléotides naturels ou non. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que le phosphate organique est le glycérophosphate. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le microorganisme est de l'espèce Strep tomyces setonii. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les microorganismes sont immobilisés dans de l'alginate, de préférence dans des billes d'alginate. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le milieu est maintenu à un pH compris entre 5 et 7,5, de préférence voisin de 6,2 à 6,4, et à une température comprise entre 30 et 50"C et de préférence voisine de 45"C. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le phosphate organique est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 4 et 10 g/l, et de préférence entre 7 et 8 g/l. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on apporte le précurseur et on récupère la vanilline séquentiellement ou en continu. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on récupère la vanilline lorsque le précurseur n'est plus détectable dans le milieu et avant la bioconversion de la vanilline en acide vanillique. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on utilise des souches de Streptomyces setonii CNCM n" I-1555 dans un milieu comprenant du glycérophosphate à une concentration de 7,4 g/l, le pH du milieu étant de 6,4 et la température de 45"C. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le milieu comprend, en outre, un sel de magnésium.