Brevet FR2733513A1 — publié le 19961031

La présente invention est relative à des lignées immortalisées de cellules issues du tissu adipeux humain, à leur procédé de préparation et à leurs applications en tant que modèle d'étude de la physiopathologie du métabolisme et notamment de l'obésité et du diabète, comme outils pour le développement de médicaments pour le traitement des états pathologiques liés aux troubles du métabolisme tels que l'obésité et le diabète et comme médicaments. L'obésité et le diabète constituent des problèmes de santé majeurs dans le monde occidental et des facteurs de risque importants de mortalité précoce. Les facteurs considérés comme responsables du développement de l'obésité et du diabète ne sont pas encore tous bien connus. Toutefois, il est maintenant bien admis que les défauts de thermogenèse (par exemple des défauts de dissipation d'énergie sous forme de chaleur, avec comme conséquence une accumulation de lipides) interviennent dans les mécanismes de l'obésité ; il est également bien admis que le tissu adipeux et notamment le tissu adipeux brun est l'effecteur principal de la thermogenèse facultative chimique. Le tissu adipeux (brun et blanc) est essentiellement constitué d'adipocytes (3/4 du nombre total de cellules du tissu adipeux). Les autres cellules présentes dans le tissu adipeux appartiennent notamment aux cellules précurseurs, également dénommées cellules interstitielles (cellules sans lipides) et comprennent en particulier les adipoblastes (cellules mésenchymateuses sans lipides) et les préadipocytes (cellules estérase-positives sans lipides). Le tissu adipeux blanc (ou WAT pour white adipose tissue) est considéré comme un organe distinct du tissu adipeux brun (ou BAT pour brown adipose tissue) ces deux tissus adipeux se distinguent, notamment en ce que leurs cellules précurseurs sont différentes ; la pré sence de protéines mitochondriales découplantes (ou UCP pour uncoupling protein) est spécifique au BAT (tissu adipeux brun). Pour ce qui concerne plus particulièrement le tissu adipeux brun, la chronologie de la différenciation cellulaire apparaît être la suivante : cellules interstitielles, adipocytes bruns peu différenciés, adipocytes bruns matures. Les adipocytes bruns sont caractérisés par la présence de gouttelettes de triglycérides et de nombreuses mitochondries ainsi que par la présence d'une protéine particulière, la protéine découplante, précitée. La stimulation de la prolifération et de la différenciation du tissu adipeux brun dépend notamment des récepteurs B-adrénergiques. Le récepteur t33-adrénergi- que humain a été caractérisé dans les dépôts adipeux blancs de l'adulte et dans le tissu adipeux brun des nouveaux-nés et des malades atteints de phéochromocytome. Le BAT est un tissu spécialisé dans la dissipation d'énergie, sous forme de chaleur. On le trouve chez la plupart des mammifères nouveau-nés. Il est le site majeur du stockage et de la mobilisation de l'énergie ; son rôle en tant qu'organe endocrine, autocrine et intracrine a également été établi. Aussi bien des lignées cellulaires réalisées chez la souris [lignée murine 3T3, lignée F44-2A (Green et al., Cell, 1975, 5, 19-27 et Cell, 1976, 7, 105-113), que des cellules vasculaires stromales du tissu adipeux ont également fait l'objet d'études, dans la mesure où les préadipocytes sont présents dans le compartiment vasculaire-stromal (G. Ailhaud et al., Int. J. Obesity, 1992, 16, (suppl. 2), S17-S21). Toutefois, ces différentes lignées ou cellules ne sont pas adaptées à l'étude de la physiopathologie du métabolisme humain. En conséquence, il existe un besoin pour le contrôle des maladies du métabolisme et notamment de l'obésité et du diabète chez l'homme, tant du point de vue pharmacologique (modèle d'étude pharmacologique des agents lipolytiques) que du point de vue thérapeutique. Or, jusqu'à présent, il a été impossible d'obtenir des lignées de préadipocytes humains, aptes à être maintenus en culture suffisamment longtemps, pour pouvoir d'une part, effectivement servir de modèle à l'étude d'agents lipolytiques et d'autre part être également aptes à être utilisés en tant qu'agent thérapeutique (en thérapie génique, par exemple). En effet, les expériences réalisées sur des adipocytes humains en culture primaire sont difficilement reproductibles et difficilement réalisables de manière systématique. La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des lignées de cellules, issues du tissu adipeux brun ou blanc, utiles à la fois en tant que modèle d'étude des agents lipolytiques et comme agent thérapeutique (surexpression de la protéine découplante, par exemple) et qui ne présentent pas les inconvénients des adipocytes en culture primaire. La présente invention a pour objet des lignées cellulaires, issues du tissu adipeux, caractérisées - en ce qu'elles sont constituées par des préadipocytes contenant un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral et au moins un promoteur sélectionné dans le groupe qui comprend le promoteur dudit oncogène viral et un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine, - en ce qu'elles expriment au moins l'une des protéines suivantes : récepteurs ssl et ss2 adrénergiques, protéine découplante (UCP), transporteurs du glucose, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL) et - en ce qu'elles sont aptes à être converties en adipocytes matures, qui produisent des lipides (graisse) et expriment en outre les récepteurs Les marqueurs spécifiques des adipocytes matures (tissu adipeux brun et tissu adipeux blanc) sont notamment: Glut4, adipsine, LPL, enzyme de la lipolyse (hormone sensitive lipase HSL), récepteurs ssl-, ss2- et ss3-adrénergiques. Selon un mode de réalisation avantageux, lesdites lignées sont issues du tissu adipeux brun. Conformément à ce mode de réalisation avantageux desdites lignées, le fragment immortalisant est constitué par un fragment de l'oncogène T SV40, codant pour l'antigène T du virus SV40. Egalement conformément à ce mode de réalisation desdites lignées, le promoteur est sélectionné parmi le promoteur de l'oncogène T SV40 et le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine compris entre les bases -878 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à -539 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site CAP. De telles lignées, dénommées PAZ 6, ont été déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 7 février 1995 sous le nO I-1531. De telles lignées de préadipocytes humains immortalisés présentent au moins les propriétés suivan tes - elles expriment au moins les protéines suivantes : récepteurs pi et 2 adrénergiques, protéine découplante, Glutl et Glut4 - elles sont aptes à être converties en adipocytes matures qui produisent de la graisse multilobaire, qui contiennent de nombreuses mitochondries, qui expriment les récepteurs a2A et ss3 adrénergiques, et qui présentent un rapport Glut4/Glutl inversé, par rapport auxdits préadipocytes immortalisés. Un fragment d'acide nucléique hybride (oncogène T de SV 40 associé au promoteur de la vimentine) a été décrit (Demande de Brevet européen 90402009.6). L'introduction de ce fragment linéaire recombinant dans le noyau de cellules en cultures primaires telles que cellules musculaires, cellules épithéliales et cellules endothéliales est suivi d'une intégration et de l'expression de l'antigène grand T, induisant une prolifération cellulaire, conduisant à des lignées cellulaires permanentes. Toutefois, les travaux de l'Art antérieur ne suggèrent pas la possibilité que des cellules de préadipocytes, issues du tissu adipeux (brun ou blanc) humain puissent effectivement être immortalisées, en gardant toutes leurs caractéristiques (marqueurs et possibilité de différenciation). En effet, aucune lignée humaine de ce type n'a jamais pu être obtenue, qu'elle soit d'origine pathologique (par exemple cancéreuse) ou expérimentale. Bien au contraire, de nombreuses tentatives (H. HAUNER et al., J. Clin. Invest., 1989, 84, 1663-1670) d'immortalisation ont toutes échouées, ce qui distinguait, jusqu'à présent, les adipocytes humains de nombreux autres types cellulaires. Or, de manière inattendue, les lignées de préadipocytes immortalisés, conformes à l'invention, présentent effectivement les fonctionnalités des préadipocytes humains : expression des marqueurs des préadipocytes et maturation en adipocytes dans des conditions appropriées, notamment en présence d'insuline, de glucocorticoïdes et éventuellement d' IGF-I. En particulier, les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, permettent - l'étude des différentes étapes de maturation de la différenciation en adipocytes : apparition des marqueurs spécifiques des adipocytes tels que récepteurs a2A et ss3 adrénergiques et présence de gouttelettes lipidiques, - l'analyse de l'influence de différentes conditions de culture sur la différenciation des adipocytes : insuline, glucocorticoïdes, triiodothyronine, éventuellement associée à la pioglitazone et ses dérivés, agonistes ss-adrénergiques, NPY, mélatonine. - une étude plus proche de la réalité que ne sont les cellules CHO-RAB3, pour l'étude des récepteurs intervenant dans les processus de lipolyse, tels que les récepteurs ss2 et ss3 adrénergiques. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de préadipocytes immortalisés, issus de tissus adipeux (bruns ou blancs) humains, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de préadipocytes issus du tissu adipeux (brun ou blanc) humain par une séquence d'acide nucléique telle que définie cidessus. La présente invention a également pour objet un procédé de conversion des préadipocytes conformes à l'invention en adipocytes matures, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, dans un milieu contenant au moins de l'insuline. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé il comprend en outre au moins l'un des composés suivants : glucocorticoïde, triiodothyronine (T3), éventuellement associée à de la pioglitazone ou à ses dérivés, agonistes des récepteurs B-adrénergiques, NPY, mélatonine. De manière avantageuse, les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention constituent également un outil pour la sélection de substances intervenant dans l'activation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse ; conformément à l'invention, le procédé de sélection et d'identification de substances capables de réguler la lipolyse et/ou la thermogenèse comprend - la mise en contact des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention avec au moins une substance apte à les transformer en adipocytes, - la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec une substance agissant sur au moins un récepteur tel que les récepteurs a2A ou ss3 adrénergiques, les récepteurs de l'insuline et de 1'IGF et les récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) desdits adipocytes matures, en vue de la modulation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur. Un tel procédé permet donc la sélection de ligands spécifiques des différents récepteurs cités : ou ss3 adrénergiques, récepteurs de l'insuline et de l'IGF et récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) des adipocytes matures, lesquels ligands agissent en outre sur la modulation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse. La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des protéines exprimées par les adipocytes, notamment les récepteurs a2A ou ss3 adrénergiques, les récepteurs de l'insuline, de l'IGF et les récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) humains, caractérisé en ce qu'il est constitué par des adipocytes matures obtenus à partir des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention. Un tel modèle permet l'étude, d'un point de vue pharmacologique, des récepteurs impliqués dans les processus de lipolyse et de thermogenèse, qui lorsqu'ils présentent des anomalies, induisent des états pathologiques tels que le diabète et/ou l'obésité. Un tel modèle, particulièrement proche de l'état physiologique humain permet l'identification de ligands, plus affins pour ces récepteurs et ainsi la mise au point de médicaments actifs dans les maladies précitées. La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de la régulation des gènes présents dans les adipocytes humains, caractérisé en ce qu'il est constitué par des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention ou des adipocytes matures obtenus à partir desdits préadipocytes immortalisés. La présente invention a, en outre, pour objet un procédé pour l'étude de l'affinité d'un récepteur exprimé par des adipocytes, pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé comprend - la mise en contact des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, avec au moins une substance apte à les transformer en adipocytes, - la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec les ligands déterminés, et - la détection d'une réaction affine entre lesdits adipocytes et lesdits ligands déterminés. La présente invention a, également, pour objet des compositions lipolytiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes matures obtenus à partir des préadipocytes immortalisés conformes à 1' invention. La présente invention a, en outre, pour objet des compositions pharmaceutiques destinées à combattre l'obésité, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes bruns matures, obtenus à partir des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, éventuellement associées à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a également pour objet des anticorps anti-adipocytes, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié avec des adipocytes matures obtenus conformément au procédé de conversion des préadipocytes immortalisés en adipocytes matures selon l'invention. De tels anticorps sont particulièrement adaptés à leur utilisation pour l'immunothérapie de l'obésité, notamment en supprimant les adipocytes en excès. La présente invention a également pour objet des séquences d'acide nucléique, issues des lignées conformes à l'invention, caractérisées en ce qu'elles sont aptes à exprimer au moins lune des protéines suivantes récepteurs ssl et ss2 adrénergiques, protéine découplante, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL). La présente invention a, en outre, pour objet un kit ou trousse de détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine exprimée par un adipocyte, caractérisé en ce qu'il comprend - une culture de préadipocytes conformes à 1' invention, - des moyens de conversion desdits préadipocytes en adipocytes matures, et - un ou plusieurs ligands témoins. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre les produits exprimés par les préadipocytes immortalisés conformes à 1' invention, - la figure 2 montre la différenciation des préadipocytes en culture, - la figure 3 montre les produits exprimés par les adipocytes obtenus à partir des préadipocytes conformes à l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Lignée de préadipocytes bruns moins conforme à l'invention. 1) Isolement de préadipocytes d'origine humaine Du tissu adipeux brun est prélevé sur un enfant âgé de 18 mois, atteint d'un néphroblastome. Les cellules vasculaires stromales sont obtenues à partir de ce tissu par une digestion à la collagénase, conformément à la méthode décrite par HAUNER et al. (J. Clin. Invest., 1989, 84, 1663-1670). Le traitement du tissu adipeux brun est réalisé comme suit 2 mg/ml de collagénase A (Boehringer) dans un tampon KRBH (Krebs Ringer Bicarbonate) comprenant en outre 20 mg de sérum albumine bovine (BSA)/ml sont mis en contact avec ledit tissu ; la digestion est réalisée pendant 40 min à 370C sous agitation (bain-marie 100 t/min). Une première filtration sur nylon (diamètre des pores : 190 Fm) est réalisée, puis les fragments restants sont à nouveau digérés pendant 30 min avec la même solution à base de collagénase et filtrés également sur une membrane de nylon dont le diamètre de pores est de 190 un. Les suspensions cellulaires obtenues sont centrifugées à 200 g pendant 10 min. Le culot cellulaire est lavé avec un tampon Krebs Ringer contenant de la sérumalbumine bovine (BSA), puis avec le milieu de culture ; le culot contient les préadipocytes. Les cellules sont traitées avec une solution de Gey, afin d'éliminer les hématies. Les cellules obtenues (préadipocytes) sont ensemencées dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre contenant 2 ml d'un milieu de culture comprenant DMEM/HAM F12 (1:1 vol/vol) contenant : pénicilline 100 U/ml, streptomycine 0,1 mg/ml, sérum de veau à 7,5 %, sérum de veau de nouveau-né à 2,5 % (Boehringer). La densité d'ensemencement est de 20 000 cellules/cm2. Les cultures sont maintenues à 370C pendant 16 heures, dans une atmosphère contenant 10 % de CO2 et 90 % d'air. Après adhésion, les cellules sont lavées dans un tampon PBS et additionnées de 2 ml d'un milieu ITT (DMEM/F12 et glutamax I, contenant 33 WM de biotine, 17 AM de pantothénate, 15 mM d'hépès, 0,2 nM de triiodothyronine (T3), de la pénicilline 100 U/ml, de la streptomycine 0,1 mg/ml), du sérum de veau à 7,5 % et du sérum de veau nouveau né à 2,5 %. Le milieu est changé tous les 2 jours. 2) Immortalisation Les cellules ainsi obtenues sont transfectées par microinjection avec une construction comprenant la séquence codant pour l'antigène T de SV40 sous le contrôle du promoteur de la vimentine (Hu Vim 830-T/t). Le plasmide contenant cette séquence est décrit dans la Demande de Brevet européen nO 90402009.6 il exprime l'antigène T et l'antigène t du virus SV40 et est obtenu comme suit Le fragment -830-+93 du promoteur de la vimentine est cloné dans un plasmide pUC18 ; les clones sont obtenus par digestion de la séquence 5 du gène de la vimentine au niveau du site de l'enzyme de restriction PvuII. Le plasmide pUC18 contenant le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine est linéarisé par l'enzyme de restriction XbaI ; on obtient une extrémité 3' cohésive, qui est ajustée de manière à obtenir une extrémité franche, puis on lie le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine ainsi obtenu avec le fragment d'ADN de l'antigène T, par ligation de l'extrémité 3' XbaI du promoteur avec l'extrémité SfiI du fragment SV40. Les extrémités BamHI 5' et 3' sont liées en présence de T4 ligase. Les séquences codant pour l'antigène T sont ainsi sous le contrôle de la région régulatrice de la vimentine de 830 paires de bases. Les cellules ainsi transfectées sont cultivées sur le même milieu, sans T3 ; lorsqu'elles atteignent la confluence, elles sont trypsinisées une fois par semaine, de manière à permettre un passage hebdomadaire. On obtient ainsi la lignée cellulaire de préadipocytes immortalisés, dénommée PAZ-6. 3) Caractéristiques de la lignée cellulaire de préadipocytes immortalisés PAZ-6 Les préadipocytes bruns immortalisés, dénommés PAZ-6, peuvent être mis en culture (passage hebdomadaire) pendant plusieurs mois sans perdre leurs caractéristiques morphologiques ou leurs marqueurs moléculaires qui peuvent être identifiés par PCR. - différenciation en adipocytes matures A n'importe quel moment, les préadipocytes bruns immortalisés obtenus peuvent être convertis en adi pocytes par traitement avec de l'insuline et de la dexaméthasone ; cette conversion est caractérisée par l'accumulation de graisses multilobaires et par l'expression des marqueurs spécifiques des adipocytes que sont les récepteurs a2A et ss3 adrénergiques, ainsi que l'expression de la lipoprotéine lipase. Les conditions de la conversion sont les suivantes les cellules sont ensemencées à une densité de 10 000 cellules/cm2 et cultivées pendant 3 jours dans un milieu contenant du sérum, de manière à obtenir la confluence ; on additionne ensuite auxdites cellules un milieu ITT (milieu DMEM/HAM F12 supplémenté avec de la biotine, du pantothénate, de l'hépès, de la T3, de la pénicilline et de la streptomycine, tel que défini cidessus), lequel milieu contient, en outre, 0,1 WM de dexaméthasone, 850 nM d'insuline, 0,25 mM d'IBMX (3isobutyl-l-méthyl-xanthine) et 10 % de sérum de veau foetal. Le milieu de culture est changé tous les 2 jours; la différenciation est obtenue en deux semaines. a. Marqueurs des préadipocytes bruns immortalisés et des adipocytes matures obtenus à partir de ces préadipocytes récepteurs B1 et ss2 adrénergiques, protéine découplante (UCP), GLUT1 et GLUT4 (voir figure 1) ; marqueurs spécifiques des adipocytes matures obtenus récepteurs a2A et ss3 adrénergiques et lipoprotéine lipase (figure 3). - Matériel et méthode Après différenciation, les adipocytes matures sont cultivés 24 à 48 heures dans le milieu ITT supplémenté avec 10 Fg/ml de transferrine. Les conditions opératoires sont les suivantes L'ARN total des cellules PAZ-6 à analyser (préadipocytes immortalisés ou adipocytes matures) est extrait (CATHALA, 1983, DNA, 2, 329-335) et traité pendant 15 min à 370C avec 0,3 U de DNase I sans RNase (RQ1 DNase, Promega) par Rg d'acide nucléique, dans un milieu comprenant 40 mM de tampon Tris-HCl à pH 7,9, 10 mM de NaCl et 6 mM de MgCl2 en présence de 2 U/l d'inhibiteur de RNase placentaire (RNasin, Promega). L'ARN est ensuite extrait par un mélange phénol/chloroforme et précipité. La synthèse de l'ADNc est effectuée avec 100 U de transcriptase inverse de MLV (Gibco BRL) avec 200 ng d'ARN DNasé dans 10 Rl de tampon de transcriptase inverse (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2 et 10 mM DTT) contenant 0,4 mM de chaque dNTP, 10 WM d'hexanucléotides aléatoires (Pharmacia, France) et 2 U/Rl d'inhibiteur de RNase placentaire. Pour les gènes sans introns, un contrôle sans transcriptase inverse a été effectué pour vérifier que l'amplification ne résulte pas d'ADN génomique résiduel. Les échantillons sont ensuite supplémentés avec 4 fl de tampon lOxPCR (tampon lxPCR : 50 mM KCl, 10 mM Tris-HC1 pH 9,0 à 250C, 0,1 % Triton X-100 et 1,5 mM MgCl2), 0,5 Fl de chaque dNTP 25 mM, 10 F1 de DMSO à 50 % (pour les récepteurs 1, ss2, ss3, a2 et l'adipsine), 0,5 Rl d'oligonucléotides sens et antisens à 25 mM chacun, 1 U de Taq-ADN polymérase (Promega) et de l'eau jusqu'à 40 Fl. Les ADNc sont dénaturés pendant 2 minutes à 940C et amplifiés avec 29 cycles de températures (940C, 15 s ; 600C, 30 s ; 720C, 30 s) suivis par 3 minutes d'extension finale à 720C dans un thermocycleur (GeneAmpPCR System 9600, Perkin-Elmer Cetus). Les séquences des oligonucléotides sens et antisens et la taille des produits d'amplification sont les suivantes - RA-ssl : séquence oligonucléotidique 5' TCGTGTGCACCGTGTGGGCC-3' et 5 ' -AGGAAACGGCGCTCGCAGCTGTCG- 3 ; taille du produit amplifié : 265 pb - RA-ss2 : séquence oligonucléotidique 5' GCCTGCTGACCAAGAATAAGGCC-3' et 5'-CCCATCCTGCTCCACCT-3' ; taille du produit amplifié : 329 pb - RA-B3 : séquence oligonucléotidique 5'-ATGGCTCCGTGGCCT CAC-3' et 5'-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3' ; taille du produit amplifié : 316 pb (KRIEF, J. Clin. Invest., 1993, sa, 344-349). - UCP séquence oligonucléotidique 5'-TAGGTATAAAGGTGT CCTGG-3' et 5'-CACTTTTGTACTGTCCTGGTGG-3' ; taille du produit amplifié : 590 pb (CASSARD et al., J. Cell Biochem., 1990, 43, 255-264). Selon le type d'amplification on obtient deux produits U = 29 cycles PCR U' = 39 cycles PCR. - ss-actine : séquence oligonucléotidique 5' GAGACCTTCAACACCCC-3' et 5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAG-3' ; taille du produit amplifié 236 pb (FEVE et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 15909-15915) - a2-A séquence oligonucléotidique 5' CGAGCGAGCCAGGTGAAGCC-3' et 5' -GCCAGCGGAAACCTCACACG-3' taille du produit amplifié : 403 pb (KOBILKA et al., Science, 1987, 238, 650-656) - GLUTl séquence oligonucléotidique 5' TGCTGGCTGTGGGAGGA-3' et 5' -GAGGATGCCGACGACGAT-3' ; taille du produit amplifié : 470 pb (MUECKLER et al., Science, 1985, 229, 941-945) - GLUT4 séquence oligonucléotidique 5' TCCTGCTGCCCTTCTGTC-3' et 5'-GGCCTACCCCTGCTGTCT-3' ; taille du produit amplifié 309 pb (FUKUMOTO & al., J. Biol. Chem., 1989, 264, 7776-7779) - adipsine séquence oligonucléotidique 5' CGGCTGGGGCATAGTCA-3' et 5 '-GCACGCCCCCGCACACC-3' ; taille du produit amplifié : 200 pb (WHITE et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 9210-921) - lipase (hormono-sensible) (HSL) séquence oligonucléotidique 5' GGGGCTGAGTTTGAGCG-3' et 5'-GCTCCTCACTGTCCTGTCC-3' ; taille du produit amplifié - 286 pb (LANGIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4897-4901) - lipase (lipoprotéine) : 5' CCTGCTCGTGCTGACTCTG-3' et 5'-GGGCTCCAAGGCTGTATC-3' ; taille du produit amplifié 473 pb (WION KL. et al., Science, 1987, 235, 1638-1641). Les séquences nucléotidiques subséquentes ont toutes été déterminées en employant le programme d'analyse élémentaire Oligo 4.0 (National Biosciences, Plymouth, MN 5547, USA). En RT-PCR, les mêmes ARN messagers sont identifiés dans le clone et dans la lignée. La figure 1 illustre les produits exprimés par les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention (lignée PAZ-6) : ces préadipocytes expriment les récepteurs adrénergiques ssl (265 pb), 2 (329 pb) et (403 pb), UCP (protéine découplante) (U et U' : 590 pb), HSL (Hormone Sensitive Lipase) (H) (286 pb), adipsine (Ad) (200 pb), GLUT1 (G1) (470 pb), GLUT4 (G4) (309 pb) et ss-actine (Ac) (336 pb). Chaque trace correspond à 200 ng d'ARN total initial, à partir duquel l'ADNc a été amplifié comme suit : RT-PCR de 29 cycles (sauf U', PCR de 39 cycles) effectuée avec (+) ou sans (-) reverse transcriptase. M correspond à l'échelle de marqueur 123 pb. La figure 2 montre la différenciation des préadipocytes en culture après confluence dans un milieu ITT supplémenté en T3, insuline et dexaméthasone, pendant 3 semaines. La figure 3 montre les marqueurs exprimés par les adipocytes et notamment les récepteurs ss3 (ss3, 316 pb) et a2A adrénergiques et la LPL ; en outre les niveaux d'expression d'adipsine, de HSL, LPL et GLUT4 sont plus importants que ceux des préadipocytes. La RT-PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles de la figure 1 (Ub=U'). 5 l sur 50 Rl total ont été déposé sur gel. L'image du gel est en négatif. Les mêmes fragments sont amplifiés. b. mise en évidence des récepteurs adrénergiques ss (RA-ss). * détermination des sites de liaison au ligand antagoniste '3. l'iodocyanopindolol (I-CYP), dans la lignée cellulaire PAZ-6. Dans la lignée non différenciée PAZ-6, la quantité de sites au I-CYP est d'environ 70 fmol, en présence de 500 pM de I-CYP et de 0,05 mM de bupranolol (qui bloque tous les sites de liaison ss-spécifiques : B1-, ss2 et ss3 RA), de manière à déterminer le pourcentage de liaisons non-spécifiques. Les sites de liaison spécifiques au I-CYP représentent la différence entre les sites de liaison totaux au I-CYP et les sites de liaison en présence de bupranolol 50 CLAM (antagoniste des RA-ssl, ss2, '33) . Ces sites de liaison ss-spécifiques correspondent à 100 %.En présence de 50 nM d'ICI118551, antogoniste spécifique des récepteurs adrénergiques ss2 (RA-ss2), 26 % des sites de liaison au I-CYP sont inhibés, indiquant la présence de sites ss2-adrénergiques. La présence de sites RA-ssl est vérifiée en utilisant du CGP 20712A, antagoniste spécifique des RA ssl, à une concentration de 1 CLAM. Dans ces conditions, 33 % des sites de liaison au I-CYP sont inhibés. Les deux antagonistes, lorsqu'ils sont présents en même temps, entraînent une diminution (inhibition) des sites de liaison de 49 %. Après différenciation de la lignée PAZ-6, on détermine la présence d'environ 40 fmol de sites de liaison au I-CYP, dans les mêmes conditions que celles exposées ci-dessus. En présence de 1antagoniste spécifique des RA-B2, ICI118551, le nombre de sites de liaison est réduit de 28 %. En présence de l'antagoniste spécifique des RA-ssl, CGP20712A, une diminution de 29 % est observée. Les deux antagonistes, lorsqu'ils sont présents en même temps, diminuent le nombre de sites de liaison de 53 %. En conclusion, près de la majorité des sites de liaison au I-CYP, dans les cellules différenciées, est représentée par des RA-B3 (Tableau I). TABLEAU I Type différen- Sites de Inhibition des sites de cellulaire ciation liaison spéci- liaison I-CYP fiques au I-CYP (% de sites de liaison (fmol/mg) spécifiques) ICI118551 CGP20712A ICI/CGP PAZ-6 non 70 26 33 49 PAZ-6 oui 40 28 29 53 Dans ce Tableau, les sites de liaison spécifiques au I-CYP représentent la différence entre le nombre total de sites de liaison au I-CYP et le nombre de sites de liaison en présence de bupranolol 50 mM. * accunulation d'AMPc dans la 1lignée cellu laire PZ-6. Dans la mesure où il n'existe pas d'antagoniste spécifique des RA-B3, une preuve directe de la présence de RA-ss3 ne peut pas être obtenue à partir de la détermination des sites de liaison au I-CYP. Toutefois, il existe un agoniste partiel, spécifique des RA-B3 (CGP12177A), qui antagonise les RA-ssl et ss2 ; en conséquence, une accumulation d'AMPc, après stimulation avec le CGP12177A, donnera une preuve directe de la présence de RA-B3. La stimulation de la lignée cellulaire PAZ-6 différenciée avec de 1'isoprotérénol (0,1 mM) active tous les RA-B, tandis que la stimulation avec du CGP12177A entraîne seulement une stimulation de 20 % (par comparaison avec celle obtenue avec l'isoprotérénol). Cette stimulation partielle peut s'expliquer par la présence de RA-ssl et -ss2, qui ne sont pas stimulés par le CGP12177A et par les propriétés agonistes partielles de ce composé. Ce résultat est compatible avec la conclusion ci-dessus qui précise que les sites de liaison au I-CYP, qui ne peuvent pas être bloqués par les antagonistes des RA-ssl et -ss2 mais peuvent être bloqués par le bupranolol, représentent des sites de liaison aux RA-ss3. c. Essai de lipolyse (sur la lignée PAZ-6) Le test de lipolyse consiste à mesurer la quantité de glycérol généré par les adipocytes matures traités par des ligands lipolytiques. Les adipocytes différenciés en plaques de culture (6 puits) sont incubés 16 h dans du DMEM/Ham's F12 (1:1, v/v) comprenant 0,2 % de BSA sans acide gras. Les cellules sont ensuite incubées dans un tampon Krebs Ringer phosphate (pH 7,4) comprenant 0,2 % de BSA sans acide gras, 4,5 g/l de glucose, 50 Ag/ml de Na2S2Os et les ligands ss-adrénergiques, dans un volume de 500 1, pendant 90 min à 370C. Le taux de glycérol est mesuré sur 100 l de milieu d'incubation en suivant la réduction du NAD en NADH à 340 nm en présence de 10 Rg/ml de glycérol déshydrogénase dans le tampon de réaction suivant : K2CO3/NaHCO3 125 mM, NAD 3,5 mM et (NH4)SO4 330 mM. Les résultats sont reportés dans le Tableau II ci-dessous % Effet/effet maxi Io-4Miso Basale 85 % Forskoline 100 % Isoprotérénol 10 100 % Isoprotérénol 10 95 % Isoprotérénol 10' 80 % Isoprotérénol 10 65 % Salbutamol 115 % Norépi 85 % CGP 12177 98 % Isoprotérénol 104 : isoprotérénol 10 M Isoprotérénol 108 : isoprotérénol 10-8 M Isoprotérénol 108/CGP/ICI : isoprotérénol 10-8 M + CGP 20712A + ICI 118551 Isoprotérénol 108/Pro : isoprotérénol 10-8 M + propranolol 10-4 M Salbutamol : Salbutamol 10-6 M Norépi : Norépinéphrine 10-7 M CGP 12177 : CGP 12177 10-4 M I : isoprotérénol. Les résultats présentés dans ce Tableau montrent clairement que même en présence d'antagonistes pi et p2 (CGP, ICI, Pro ou CGP 12177), simultanément, on continue d'observer la lipolyse induite par les agonistes tels que l'isoprotérénol. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 10) Lignées cellulaires, issues du tissu adipeux, caractérisées - en ce qu'elles sont constituées par des préadipocytes contenant un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral et au moins un promoteur sélectionné dans le groupe qui comprend le promoteur dudit oncogène viral et un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine, - en ce qu'elles expriment au moins l'une des protéines suivantes : récepteurs B1 et ss2 adrénergiques, protéine découplante (UCP), transporteurs de glucose, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL) et - en ce qu'elles sont aptes à être converties en adipocytes matures, qui produisent de la graisse et expriment en outre les récepteurs a2A et ss3 adrénergiques et présentent un rapport Glut4/Glutl inversé, par rapport auxdits préadipocytes immortalisés. 20) Lignées cellulaires selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont issues du tissu adipeux brun. 30) Lignées cellulaires selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que le fragment immortalisant est constitué par un fragment de 1'oncogène T SV40, codant pour l'antigène T du virus SV40. 40) Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que le promoteur est sélectionné parmi le promoteur de l'oncogène T SV40 et le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine compris entre les bases -878 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine. 50) Lignées cellulaires selon la revendication 4, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à -539 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site CAP. 60) Lignées cellulaires selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles ont été déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par l' INSTITUT PASTEUR, en date du 7 février 1995 sous le nO I-1531. 70) Séquences d'acide nucléique, issues des lignées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont aptes à exprimer au moins l'une des protéines suivantes : récepteurs B1-, ss2- ou ss3-adrénergiques, protéine découplante, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL). 80) Procédé d'obtention de préadipocytes immortalisés, issus de tissus adipeux (bruns ou blancs) humains, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de préadipocytes issus du tissu adipeux (brun ou blanc) humain par une séquence d'acide nucléique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 6. 90) Procédé de conversion des préadipocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en adipocytes matures, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 100) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins l'un des composés suivants glucocorticoïde, triiodothyronine (T3), éventuellement associée à de la pioglitazone ou à ses dérivés, agonistes des récepteurs ss-adrénergiques, NPY, mélatonine. 110) Procédé de sélection et d'identification de substances capables de réguler la lipolyse et/ou la thermogenèse, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, avec au moins une substance apte à les transformer en adipocytes, - la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec une substance agissant sur au moins un récepteur tels que les récepteurs a2A ou ss3 adrénergiques, les récepteurs de l'insuline et de 1'IGF et les récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) desdits adipocytes matures, en vue de la modulation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur. 120) Modèle d'étude des protéines exprimées par les adipocytes, caractérisé en ce qu'il est constitué par des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou des adipocytes matures obtenus à partir desdits préadipocytes immortalisés. 130) Compositions lipolytiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes matures obtenus à partir des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 140) Anticorps anti-adipocytes, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié avec des adipocytes matures obtenus conformément au procédé de conversion des préadipocytes immortalisés en adipocytes matures selon la revendication 9 ou la revendication 10. 150) Utilisation des anticorps anti-adipocytes selon la revendication 14 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de l'obésité. 160) Modèle d'étude de la régulation des gènes présents dans les adipocytes humains, caractérisé en ce qu'il est constitué par des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou des adipocytes matures obtenus à partir desdits préadipocytes immortalisés. 170) Compositions pharmaceutiques destinées à combattre l'obésité, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes bruns matures, obtenus à partir des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, éventuellement associées à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 180) Procédé pour l'étude de l'affinité d'un récepteur exprimé par des adipocytes, pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé comprend - la mise en contact des préadipocytes immortalisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, avec au moins une substance apte à les transformer en adipocytes, - la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec les ligands déterminés, et - la détection d'une réaction affine entre lesdits adipocytes et lesdits ligands déterminés. 190) Kit ou trousse de détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine exprimée par un adipocyte, caractérisé en ce qu'il comprend - une culture de préadipocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, - des moyens de conversion desdits préadipocytes en adipocytes matures, et - un ou plusieurs ligands témoins.