Brevet FR2730812A1 — publié le 19960823

CAPTEUR BIOCHIMIQUE Le domaine de l'invention est celui des capteurs moléculaires capables de reconnaître spécifiquement des molécules et d'en détecter des teneurs très faibles. Ce type de capteurs s'avère particulièrement intéressant dans des domaines aussi variés que la détection et l'identification de gaz de combat, de pollution diverse, de stupéfiants, de parfum..., dès lors que l'on recherche la présence de molécules spécifiques qu'elles soient d'architecture simple ou particulièrement sophistiquée. Les caractéristiques de tels capteurs sont principalement l'aptitude à reconnaître un type de molécule et ia possibilité d'amplifier cette reconnaissance moléculaire de manière à détecter une information suffisante pour pouvoir être exploitée. II existe déjà à l'heure actuelle des capteurs fonctionnant sur l'utilisation d'anticorps (pour la reconnaissance spécifique) et de processus d'amplification enzymatique pour la transmission de l'information. A titre d'exemple, certains tests de dépistages de molécules fonctionnent selon le principe suivant: Un anticorps spécifique (AC1) de la molécule à détecter est fixé sur une membrane ; on plonge l'ensemble dans une solution contenant des molécules à détecter (J), permettant l'appariement de l'anticorps (AC1) et de la molécule (J), I'appariement s'opérant à un endroit spécifique de ladite molécule. Dans un second temps l'ensemble AC1-(J) peut être plongé dans une autre solution contenant un autre anticorps anti J spécifique AC2 pouvant être lui-même fixé à une enzyme. On obtient alors la structure décrite à la figure 1. Ce groupement moléculaire peut via l'enzyme transformer une entité S en produit P à une vitesse dépendant du pouvoir catalytique de l'enzyme.L'amplification enzymatique ainsi obtenue permet de produire une quantité détectable de produit P même lorsque les molécules à capter sont en très faibles concentrations. On peut typiquement faire apparaître une acidité, une basicité, une coloration ou tout autre phénomène physico-chimique. Dans ce type de procédé, deux inconvénients majeurs persistent pour les applications ciblées dans la présente demande. En effet, ce procédé est limité à la détection en solution, de plus il nécessite d'opérer en deux temps. Pour envisager la conception de capteurs biochimiques sélectifs et capables de détecter de très faibles teneurs de molécule dans un milieu ambiant, un schéma consiste à utiliser une interface entre le milieu extérieur et un milieu réactionnel connecté à un détecteur, cette interface comprenant différents sites de capture des molécules ciblées et l'amplification enzymatique étant menée au sein du milieu réactionnel. Les différents sites de capture doivent être en mesure de déclencher le processus d'amplification enzymatique dès lors qu'ils ont capté les molécules que l'on cherche à détecter. Ils doivent donc remplir les deux fonctions suivantes : capturer sélectivement un type de molécules et transmettre l'information de cette capture à un milieu réactionnel qui lui génère par l'amplification enzymatique, un signal suffisant au détecteur (transducteur d'une information chimique en information physique). Pour assurer ces différentes fonctions, les milieux cellulaires vivants disposent de récepteurs transmembranaires intégrés au sein d'une membrane constituée de phospho-lipides. Ces récepteurs transmembranaires sont constitués d'éléments transversaux (type protéines organisées en hélice) reliés entre eux par des ponts moléculaires, comme illustrés en figures 2a et 2b. Cet ensemble réalise de chaque côté de la membrane un site d'accueil dont la forme stérique dépend des ponts moléculaires et de la position relative des éléments transversaux permettant, côté milieu extérieur, la capture d'un type de molécule (M) pour laquelle le récepteur transmembranaire est adapté, et transmettant la déformation associée à la capture, dans le milieu réactionnel.Cette distorsion au niveau du site sl est en mesure de déclencher au sein du milieu cellulaire, tout un processus de réactions via des enzymes notamment, présentes dans le milieu. Plus précisément, il est connu que certaines cellules voient leur processus de reproduction par mitose (division indirecte des cellules, en cellules identiques) perturbée lors de la capture de certaines molécules messager. Ainsi lors de la capture de molécules via des récepteurs transmembranaires, il est possible de modifier les mécanismes intracellulaires de manière à faire agir certaines protéines au niveau des gênes actifs en matière de reproduction cellulaire. D'autre part, parmi les microorganismes connus, les cellules de levure apparaissent comme de très bons candidats pour réaliser des capteurs biochimiques en raison de leur faible coût, de leur robustesse par rapport à d'autres cellules vivantes dont le maintien en état fonctionnel est problématique et surtout grâce à la connaissance actuelle de leur patrimoine génétique. Aussi, I'invention a pour objet un capteur biochimique à base de cellules de levure, dont le patrimoine génétique a été modifié de manière à ce que lesdites cellules de levure soient en mesure de capter un certain type de molécules et à l'issue de cette capture génèrent une information détectable. Plus précisément, I'invention propose un capteur biochimique caractérisé en ce qu'il comprend: - un substrat sur lequel sont déposées des cellules de levure capables de capturer un type de messager (M) et de produire à l'issue de cette capture une entité chimique (P); - des moyens de détection de l'entité chimique produite. L'entité chimique produite peut avantageusement être une protéine reconnaissable optiquement. Les moyens de détection peuvent être de type mesure de densité optique, mesure de fluorescence, mesure de la polarisation de la lumière etc... Le substrat est un milieu nourricier permettant la reproduction des cellules de levure. II peut s'agir avantageusement d'un gel anhydre chargé en minéraux, en sucre etc..., sur lequel sont déposées les cellules de levure activées ultérieurement par humidification. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre et grâce aux figures annexées parmi lesquelles: - la figure i illustre un schéma réactionnel utilisé dans un test de dépistage de molécules en solution, selon l'art connu; - la figure 2 schématise le principe de sites de captures existant dans des microorganismes vivants; * la figure 2a schématise une vue en coupe de récepteur transmembranaire * la figure 2b schématise une vue de dessus d'un récepteur transmembranaire; Le capteur biochimique selon l'invention comprend un couche sensible de détection réalisée à partir du dépôt de cellules dont on a modifié le patrimoine génétique.Ces modifications génétiques peuvent être effectuées par mutagénèse etlou par les techniques de génie génétique, suivies d'une sélection parmi les cellules obtenues de cellules sensibles à un composé chimique donné (ou à une gamme de composés). Ainsi peut-on arriver à leurrer une cellule de levure dont la reproduction par mitose peut être arrêtée lors de la capture d'un type bien particulier de molécules, et parvenir à stopper également ce processus de reproduction via la capture d'un autre type de molécule. La mutagénèse est un processus naturel qui consiste en la modification aléatoire de certains gènes. On peut par chauffage notamment accélérer ce processus naturel et ce sur un très grand nombre de fois pour arriver à provoquer des mutations génétiques naturelles en vue d'obtenir de nouveaux récepteurs transmembranaires adaptés à la capture de molécules ciblées. De préférence, les cellules de levure utilisées dans le capteur biochimique selon l'invention n'ont pas seulement été leurrées en vue de les rendre sensibles à différents types de molécules, mais elles l'ont également été pour les rendre capables de produire une entité particulière détectable attestant de la capture des molécules ciblées. A l'heure actuelle, le génome, ensemble du patrimoine génétique, des cellules de levure est de mieux en mieux maîtrisé, il devient ainsi possible par l'identification des gènes et de leurs fonctions de venir par manipulation génétique, perturber ce patrimoine pour en changer certaines caractéristiques. Ainsi peut-on venir insérer certains éléments dans ce patrimoine génétique, permettant d'adapter les récepteurs transmembranaires à différents types de molécules. La capture d'un type de molécule donnée peut à son tour déclencher toute une chaîne de réactions chimiques spécifiques conduisant à l'apparition spécifique d'une protéine notamment. Cette protéine peut être sélectionnée pour ses propriétés optiques. Ainsi en réalisant toute une série de tests, on isole les cellules de levure dont la manipulation génétique a conduit à rendre sensible la cellule de levure à d'autres molécules que celles qui naturellement sont susceptibles d'être capturées et a conduit de plus à la production d'entité spécifique. Cette expérimentation peut être effectuée et adaptée à différents types de molécules (M) de manière à disposer d'une série de capteurs à base de cellules de levures répondant spécifiquement à des molécules (Mi) avec production identique ou non d'entité (P) à détecter. Le capteur selon l'invention peut de façon plus générale identifier toute une série de molécules (M) lorsqu'il résulte de l'association de N capteurs biologiques élémentaires conçus pour reconnaître chacun un type précis de molécules (Mi). A titre d'exemple on peut réaliser une mosaïque de N capteurs élémentaires, capables de produire une même protéine colorée lors de leur capture d'une molécule (Mi). Ainsi en analysant l'ensemble de la réponse d'un tel capteur on peut remonter à l'identification de molécules spécifiques, présentes dans un milieu. REVENDICATIONS 1. Capteur biochimique caractérisé en ce qu'il comprend: - un substrat sur lequel sont déposées des cellules de levure capables de capturer un type de molécules (M) et de produire à l'issue de cette capture une entité chimique (P); - des moyens de détection de l'entité chimique produite (P). 2. Capteur biochimique selon la revendication i, caractérisé en ce que les cellules de levure sont des cellules de levure obtenues par mutagénèse de manière à adapter les sites de captures desdites cellules au type de molécules (M). 3. Capteur biochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de levure sont des cellules de levure obtenues par manipulation génétique du patrimoine desdites cellules de manière à adapter les sites de captures desdites cellules à un type de molécules (M). 4. Capteur biochimique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le substrat est un gel chargé de sucre et de sels minéraux. 5. Capteur biochimique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le substrat chargé de cellules de levure, est activable par humidification. 6. Capteur biochimique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'entité (P) est une protéine. 7. Capteur biochimique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que les moyens de détection physique sont des moyens optiques de type: mesure de densité optique, de variation de polarisation de la lumière, de fluorescence. 8. Capteur biochimique caractérisé en ce qu'il comprend une mosaïque de capteurs biochimiques élémentaires selon l'une des revendications 1 à 7, chaque capteur élémentaire étant adapté à la détection d'un type de molécule (Mi), L'ensemble des réponses fournies par les moyens de détections (mi) de chaque capteur permettant d'identifier des molécules présentes dans le milieu.