Brevet FR2723950A1 — publié le 19960301

La présente invention relève du domaine des techniques de détection et/ou identification des bactéries du genre Rickettsia et plus particulièrement de celles utilisant un marqueur génétique. Les rickettsies sont des bactéries gram négatif qui appartiennent à l'ordre des Rickettsiales et à la famille des Rickettsiaceae comprenant notamment la sous-famille des Rickettsieae sous divisée en trois genres : les Coxiella, dont la seule espèce connue est Coxiella burnetti ; les Rickettsia, groupant l'ensemble des autres espèces pathogènes pour 1' homme et les animaux ; et les Rochalimea. Le genre Rickettsia comprend trois sous groupes : le groupe du typhus auquel appartient R. typhi responsable du typhus endémique, R. prowazekii, responsable du typhus épidémique et R. canada ; le groupe du typhus de brousse auquel appartient R. tsutsugamushi ; et le groupe des fièvres éruptives auquel appartiennent notamment R. rickettsii, R. sîberica, R. conorli, R. australis, R. akari, R. montana et R. rhipicephali. Les rickettsies sont des bactéries parasites intracellulaires qui se multiplient dans le noyau et le cytoplasme des cellules hôtes pour les souches du groupe des fièvres éruptives et dans le cytoplasme de ces cellules pour les souches des autres groupes. La transmission à l'homme de la bactérie se fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages tels que la tique pour R. tsutsugamushi (rickettsie du groupe des fièvres éruptives), le pou pour R. prowazekii ou la puce pour R. typhi, lors d'un repas sanguin suivi de déjections à l'endroit de la piqûre. Le typhus épidémique dû à R. prowazekii caractérisé par une fièvre élevée, des céphalées importantes, une éruption généralisée est aujourd'hui devenu une maladie rare. Néanmoins, le risque existe toujours de la survenue d'une épidémie, dès lors que les conditions requises sont réunies, en particulier lorsque la population est dense et que les conditions d'hygiène font défaut. Le typhus murin, ou typhus endémique, dû à R. typhi est répandu dans le monde entier. Le rat est le réservoir et sa présence conditionne l'apparition de la maladie chez l'homme. L'infection se caractérise par des céphalées, des myalgies et de la fièvre mais, le plus souvent, la maladie est bénigne. Certaines des infections associées aux rickettsies du groupe des fièvres éruptives, et notamment la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses dûe à R. rickettsii, peuvent avoir une issue fatale pour le malade ou tout au moins s'accompagner de sévères complications telles que myocardite, phlébites, syndrome méningé, encéphalite, myélite et coma. Le typhus de brousse est une maladie aiguë fébrile dont l'agent causal est R. tsutsugamushi. La maladie se caractérise par une élévation de la température et des céphalées importantes, auxquelles peut être associée une pneumopathie au cours de la première semaine de la maladie. Par ailleurs, la maladie peut porter atteinte au système nerveux central, avec des manifestations cliniques telles que délire, stupeur et fibrillation musculaire. Le taux de mortalité varie de 1 à 60 % selon les régions géographiques. Il est particulièrement élevé en Asie du Sud-Est, Corée, Australie, Japon et Inde. Aujourd'hui, aucune technique de détection n'est à la fois assez spécifique, sensible et rapide pour diagnostiquer une infection due aux bactéries du genre Rickettsia dans un échantillon biologique. Le contrôle de l'infection se fait essentiellement soit par diagnostic direct, très lourd à mettre en oeuvre car il suppose l'inoculation à partir d'échantillons biologiques d' animaux ou d'oeufs embryonnnés ; soit par diagnostic sérologique, souvent difficile en raison du manque de spécificité des techniques utilisées ou en raison de l'apparition retardée des anticorps dans les séra des patients. La présente invention concerne une technique de diagnostic des infections dues aux bactéries du genre Rickettsia, et plus particulièrement celles dûes à R. tsutsugamushi, utilisant un marqueur génétique dans un procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et rapidité. Plus particulièrement, 1'ARN ribosomique des bactéries est utilisé comme cible. En effet, cette molécule est retrouvée en abondance dans toutes cellules de tous les organismes vivants. Par ailleurs, elle présente une séquence nucléotidique particulière faite d'une succession de régions caractérisées par une vitesse d'évolution variable. Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes référencées ARNr(s) 5S, 16S et 23S. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par référence à leur vitesse de sédimentation qui reflète la taille de ces molécules d'ARN. Cependant, la taille réelle de ces constituants ribosomiques varie sensiblement, pour un type donné, d'un organisme cellulaire à un autre. Néanmoins, la terminologie ARNr 5S, 16S et 23S est consacrée pour désigner les molécules d'ARN constitutives des ribosomes chez toutes les bactéries. La valeur taxonomique des sous-unités 16S et 23S ribosomiques de diverses espèces bactériennes a été mise en évidence dans des procédés d'hybridation pour quantifier des niveaux d'homologies entre ces espèces. Ainsi, Woese et coll., Microbiological Reviews 47 : 621-669 (1983), et Grayet et colt., Nucleic Acids Research 12 : 5837-5852 (1984) montrent, par des comparaisons de séquences d'ARN 16S, que des régions hautement conservées sont intercalées avec des régions de moyenne et basse homologies, même dans le cas d'espèces proches. A ce jour, seulement six séquences d'ADN correspondant aux ARN ribosomiques 16S (ADNr) de bactéries appartenant à la famille des Rickettsiaceae sont décrites dans la littérature : R. rickettsii, R. prowezekii, R. typhi, Coxiella burnetti, Ehrlichia ristierii et Wolbachia persicae. On a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique de la sous-unité 16S certaines zones qui sont conservées pour diverses espèces appartenant au genre des Rickettsia. Par ailleurs, on a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique 16S des zones variables au sein du genre Rickettsia. Ces résultats ont permis d'établir des sondes de genre permettant de discriminer le genre Rickettsia des genres taxonomiquement proches, ainsi que des sondes spécifiques d'espèces appartenant au genre Rickettsia. Ces résultats ont été vérifiés notamment sur les espèces suivantes : R.tsutsugamushi, R. canada, R. conorli, R. akari, R. mooseri, R. australis, R. rhipicephali, R. montana, R. bellii, R. japonica, R. parkeri, R. helvetica, R. sibirica, R. massiliae, R. slovaca et R. africae. Aussi la présente invention a notamment pour objet un fragment nucléotidique monocaténaire susceptible de s'hybrider dans des conditions prédéterminées à l'ADNr ou à l'ARNr des Rickettsia et non à l'ADNr ou à l'ARNr des non-Rickettsia. En particulier, le fragment nucléotidique monocaténaire ntest pas susceptible de s'hybrider spécifiquement à 1'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantiurn, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti. Avant d'exposer l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après - un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, - un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou 1'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E.Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates, - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels, - par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques, Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires.L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65"C, en particulier entre 35 et 650C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1M. - une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise dans un ARN ribosomique, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, - une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption, - une sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine, - une amorce est une sonde comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc., -l'homologie caractérise le degré de similitude de deux fragments nucléotidiques comparés, - les sondes et amorces selon l'invention sont celles dont les séquences sont identifiées ci-après, ainsi que les analogues de ces sondes ou amorces qui sont celles dont les séquences présentent au moins 70 % d'homologie, et au moins 5 motifs nucléotidiques consécutifs de séquence informationnelle identique avec ces dernières. De telles séquences sont appelées ici "séquences homologues". Les sondes selon l'invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT" (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques SANDWICH (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, 12, 23 (1977)) ; on utilise en particulier la technique SANDWICH, avec une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes. Une autre application de l'invention est une sonde de thérapie pour traiter les infections dûes aux bactéries du genre Rickettsia, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in vivo sur l'ARN ribosomique 16S desdites bactéries et/ou sur l'ADN génomique pour bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou la réplication. La figure annexée représente les séquences d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S de diverses bactéries du genre Rickettsia, dont la liste figure à la suite de la partie expérimentale ci-après. La numérotation de la séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S de R. rickettsii, complètement identifiée par Weisburg et al. (1989, Genbank (M21293)), a été utilisée à titre de référence afin de définir les fragments et pour les aligner. Les fragments nucléotidiques monocaténaires de l'invention présentent une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes commençant au nucléotide N 130 et finissant au nucléotide N 170 commençant au nucléotide N 181 et finissant au nucléotide N 201 commençant au nucléotide N" 241 et finissant au nucléotide N" 272 commençant au nucléotide NO 284 et finissant au nucléotide N" 298 commençant au nucléotide N" 299 et finissant au nucléotide N" 315 commençant au nucléotide N" 334 et finissant au nucléotide N" 357 commençant au nucléotide N" 460 et finissant au nucléotide N" 481 commençant au nucléotide N" 504 et finissant au nucléotide N" 536 commençant au nucléotide N" 550 et finissant au nucléotide N" 570 commençant au nucléotide NO 561 et finissant au nucléotide N" 585 commençant au nucléotide N" 661 et finissant au nucléotide N" 684 commençant au nucléotide N" 710 et finissant au nucléotide N" 739 commençant au nucléotide N" 903 et finissant au nucléotide N" 929 commençant au nucléotide N" 940 et finissant au nucléotide N" 960 commençant au nucléotide N"1035 et finissant au nucléotide N"1055 commençant au nucléotide N"1078 et finissant au nucléotide N"1107 commençant au nucléotide N"1199 et finissant au nucléotide N"1213 commençant au nucléotide N"1330 et finissant au nucléotide N"1350 commençant au nucléotide N"1361 et finissant au nucléotide N"1387 commençant au nucléotide N"1429 et finissant au nucléotide N"1463 commençant au nucléotide N"1501 et finissant au nucléotide N01520 commençant au nucléotide N"1555 et finissant au nucléotide N"1576 et leurs séquences complémentaires. Plus particulièrement, les séquences nucléotidiques des fragments de l'invention sont choisies parmi les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22 décrites en fin de description et leurs séquences complémentaires. La numérotation de la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsii, appliquée aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22 ci-dessus, ne reflète pas toujours le nombre de nucléotides ou monomères constituant ces séquences en raison des variations de taille existant entre les séquences et la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsii. Les variations sont dûes à des insertions ou délétions naturelles dans le matériel génétique. Conformément à la définition ci-dessus les fragments de l'invention sont des fragments d'ADN, mais ils peuvent aussi être des fragments monocaténaires d'ARN, ou leurs fragments complémentaires, ainsi que des fragments monocaténaires d'ADN génomique dont les produits de transcription sont les fragments d'ARN précités, ou leurs fragments complémentaires. Les sondes spécifiques du genre Rickettsia sont notamment celles présentant une séquence choisie parmi les séquences: commençant au nucléotide N" 181 et finissant au nucléotide N" 201 commençant au nucléotide N" 284 et finissant au nucléotide N" 298 commençant au nucléotide N" 561 et finissant au nucléotide N" 585 commençant au nucléotide NO 940 et finissant au nucléotide NO 960 commençant au nucléotide N"1199 et finissant au nucléotide N"1213 commençant au nucléotide N"1429 et finissant au nucléotide N01463 et leurs séquences complémentaires, ou leurs analogues. Les sondes d'espèce R. tsutsugamushi sont notamment celles présentant une séquence choisie parmi les séquences: commençant au nucléotide N0130 et finissant au nucléotide N"170 commençant au nucléotide N0241 et finissant au nucléotide N0272 commençant au nucléotide N"299 et finissant au nucléotide N0 315 commençant au nucléotide N"334 et finissant au nucléotide N"357 commençant au nucléotide N" 460 et finissant au nucléotide N" 481 commençant au nucléotide N" 504 et finissant au nucléotide N" 536 commençant au nucléotide N" 550 et finissant au nucléotide N" 570 commençant au nucléotide N" 661 et finissant au nucléotide N" 684 commençant au nucléotide N" 710 et finissant au nucléotide N" 739 commençant au nucléotide N" 903 et finissant au nucléotide N" 929 commençant au nucléotide N"1035 et finissant au nucléotide N"1055 commençant au nucléotide N"1078 et finissant au nucléotide N"1107 commençant au nucléotide N"1330 et finissant au nucléotide N"1350 commençant au nucléotide N"1361 et finissant au nucléotide N"1387 commençant au nucléotide N"1501 et finissant au nucléotide N"1520 commençant au nucléotide N"1555 et finissant au nucléotide N"1576 et leurs séquences complémentaires, ou leur analogues. Un autre objet de l'invention est une sonde de thérapie pour le traitement des infections dûes aux bactéries du genre Rickettsia et notamment une sonde de thérapie pour le traitement des infections dûes une espèce déterminée de Rickettsia, l'une et l'autre comprenant au moins une séquence nucléotidique appartenant à l'un des fragments précités. Un autre objet de l'invention est une amorce pour la transcription inverse spécifique en une séquence d'ADN complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 16S de Rickettsia appartenant soit à une région conservée seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de l'espèce R. tsutsugamushi ; ou une amorce, notamment pour l'amplification spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de la séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia, appartenant soit à une région conservée seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de l'espèce R. tsutsugamushi. L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique comprenant au moins une sonde de l'invention, et en particulier une sonde de capture et/ou une sonde de détection répondant à la définition d'une sonde donnée ci-dessus. Le réactif peut comprendre un mélange de sondes. Enfin, l'invention apporte un procédé pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique selon lequel on met en contact soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 16S, extrait des rickettsies et éventuellement dénaturé, soit l'ADN génomique, extrait et dénaturé, des bactéries, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN ribosomique 16S, avec au moins une sonde de l'invention, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde, de façon connue en soi. Bien entendu, il convient d'effectuer l'hybridation dans des conditions suffisamment discriminantes (stringence) pour que l'hybridation d'au moins une des sondes soit spécifique. Si désiré, avant d'exposer l'acide nucléique à la sonde de l'invention, on réalise une amplification de cet acide nucléique en présence d'un système enzymatique adapté et d'au moins une amorce d'amplification de l'invention. L'invention concerne en particulier un procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend: a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini ci-dessus, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de s'hybrider à l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et b- la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de Rickettsia dans l'échantillon. Bien entendu, les conditions prédéterminées d'hybridation sont celles qui permettent une hybridation spécifique. Les Exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S de rickettsies. La séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S des 16 souches suivantes a été déterminée: R.tsutsugamushi ATCC Gilliam R. canada Gamaleya Research Institute Collection 2678 R. conorji ATCC VR-141 R. akari ATCC VR-148 R. mooseri ATCC VR-144 R. australis R. rhipicephali R. montana R. belldi R. japonica R. parkeri R. helvetica R. sibirica ATCC VR-151 R. massiliae R. slovaca R. africae Gamaleya Research Institute Collection L'ADN total des souches a été isolé selon la technique décrite par Maniatis et ai. al.(Molecular cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Des produits d'amplification PCR ont été générés à partir de l'ADN génomique isolé de ces souches à l'aide d'amorces d'amplification choisies dans des régions conservées dans les séquences connues de R. rickettsii, R. typhi et R. prowazekii. Les produits d'amplification obtenus ont été purifiés sur billes magnétiques marquées à la streptavidine (Dynabead M-280 ; Dynal Inc., N.Y.) et séquencés en utilisant la technique préconisée dans le kit commercial "Autoread sequencing kit". EXEMPLE 2 Utilisation d'une sonde spécifique dirigée contre l'ARN ribosomique 16S pour l'identification de R. tsutsugamushi. La sonde commençant au nucléotide N"903 et finissant au nucléotide Nu 929 de la SEQ ID NO 13, est spécifique pour les souches de R. tsutsugamushi. Une collection de souches de rickettsies a été testée par hybridation sur l'ARN ribosomique 16S et a permis de constater la spécificité de cette sonde. L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection non-radioactif et semiautomatisé décrit dans le brevet français n" 90 07249 et modifié pour la détection de l'ARN ribosomique par l'addition d'un déstabilisant. Ce déstabilisant (qui est une sonde de capture, commençant au nucléotide N"940 et finissant au nucléotide N0970 de la séquence de R. Tsutsugamuchi (référencée 23 dans la figure annexée)) et un conjugué de détection oligonucléotide-enzyme (l'oligonucléotide correspondant à la sonde définie au début du présent exemple) sont utilisés. La manipulation a été conduite dans une plaque de microtitration selon le protocole suivant. L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries à Gram positif décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de 1 ng/pl de l'oligonuclèotide de capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 370 C puis lavée 3 fois avec 300 pi de PBST (PBS lx, Tween 20 : 0,5 0/00 (Merck 822184)). Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle.La sonde ainsi couplée à un ligand possédant un groupement polaire (amine primaire), et fixée de façon passive sur le support, procure un signal amélioré ; voir la demande FR 91 09057. La cible constituée par 10 ul d'extrait d'ARN totaux est mélangée avec 40 pi de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 pg/ml (Sigma D 9156)). L'ensemble est ajouté dans le puits à 50 pi d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/pl en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMérieux 55842)). La plaque est incubée 1 h à 37 C puis lavée par 3 fois avec 300 p1 de tampon PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100 pi de substrat OPD (orthophénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon 0,055 M acide citrique, 0,1 M monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93) à la concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30 % dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100 pi d'acide sulfurique 1N et la lecture est effectuée sur un appareil Axia Microreader (AXIA : marque enregistrée) (bioMérieux) à 492 nm. Les bactéries-cibles étaient notamment les suivantes - 30 souches appartenant à l'ordre des Rickettsiale - 20 souches appartenant au genre des Rickettsia - 7 souches appartenant à l'espèce de R tsutsugamushi L'adaptation de la combinaison spécifique sur l'automate VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société bioMérieux-VITEK) a été effectuée.La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR (marque de commerce) VITEK (USA). Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône. Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement l'oligonuciéotide de capture comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-réf.400808) à une concentration de 1 ng/pi dans un volume de 315 pi d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37"C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide. La barrette contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire : 200 pi d'une solution à 0,1 ng/pl du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, 2 fois 600 pi de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat. Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 pi de L'ART extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque cidessus. Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible plus sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween. 250 pi de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine sont aspirés dans le cône, puis relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette. Les résultats obtenus avec ce système sont les mêmes que ceux obtenus en microplaque. De façon analogue, on peut vérifier le caractère spécifique de genre ou d'espèces des autres fragments nucléotidiques qui font l'objet de l'invention. Liste et origine des bactéries dont la séquence d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S est représentée à la figure annexée. 1 R.rickettsii Genbank 14 thai (tick typhus rickettsia) 10 R.slovaca (M-91 isolat différent de R siberica) 11 R.japonica 3 R.conorii 18 astrakan fever rickettsia 13 israeli tick typhus rickettsia 7 R.sibirica 15 R.parkeri 16 R.africae 8 R.massiliae 17 Bar29 (GS isolat différent de R massiliae) 6 R.rhipicephali 9 R.montana 12 R.helvetica 4 R.australis 5 R.akari 31 RSDNAX (EBL bacterium) Genbank 2 R.bellii 21 Coccinelle (AB bacterium) Genbank 22 R.canada 19 R.prowazekii Genbank 20 R.typhi Genbank 23 R. tsutsugamushi 26 Cowdria ruminantium (CRDNA) Genbank 25 Ehrlichia chaffeensis (EHRRRNAF) Genbank 27 Anaplasma marginale (APMRR16SA) Genbank 28 Wolbachia pipientis (WP16SCP) Genbank 24 Ehrlichia risticii (EHRRGBSA) Genbank 30 Rochalimea (Bartonella)quintana ROCRR16SA Genbank 29 Coxiella burnatti COXRRSA Genbank LISTE DES SEOUENCES NOMBRE DE SEQUENCES : 22 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 33 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 130-170 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 130-170 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1 CGAATTAATG CTGAGTTTGC TTAGTATTAA TTA 33 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: îviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 181-201 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 181-201 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 2 GTGAGTAACA CGTGGGAATC T 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 27 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 241-272 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 241-272 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 3 TCACGTATGC CCTCTATAAG GAGGAAA 27 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 15 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 284-298 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 284-298 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 4 TATCGCTGAT GGATG 15 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 17 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: IviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 299-315 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 299-315 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 5 AGCCCGCGGC AGATTAG 17 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 24 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 334-357 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 334-357 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 6 GCTCACCAAG CCGACGATCT GTAG 24 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 22 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: IviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 460-481 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 460-481 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 7 CCAGCAATGC CGCGTGAGTG AT 22 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 504-536 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 504-536 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 8 TCTTTTAGTA GGGATGATAA T 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 550-570 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 550-570 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 9 GACAGTACCT ACAGAAAAAG C 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 25 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 561-585 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 561-585 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 10 CAGAAAAAGC CCCGGCTAAC TCCGT 25 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 24 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lvii ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 661-684 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 661-684 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 11 TAATAAGTTA GGAGTGAAAT CCCA 24 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 12 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 30 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 710-739 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 710-739 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 12 AAAACTGTTA GGCTAGAGTA TGGTAGAGGG 30 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 13 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 23 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: IviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 903-929 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 903-929 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 13 GATATTGGGG GATTTTTCTT TCA 23 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 14 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 940-960 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 940-960 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 14 TAACGCATTA AGCACTCCGC C 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 15 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 21 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviî ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1035-1055 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1035-1055 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 15 AATTCGATGA TCCGCGAAAA A 21 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 16 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 30 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: civil ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1078-1107 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1078-1107 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 16 AGTCGCGAAA AATGGAGACA TTTTTCTTCA 30 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 17 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 15 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1199-1213 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1199-1213 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 17 ATTCTTATTT GCCAG 15 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 18 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 20 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1330-1350 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1330-1350 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 18 CTACAGAGTG ATGCGATACG 20 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 19 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 26 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1361-1387 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1361-1387 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 19 AGCTAATCAT TAAAAGGTAT CTCAGT 26 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 20 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 35 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1429-1463 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1429-1463 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 20 CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAAT 35 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 21 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 20 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME :R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviî ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1501-1520 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1501-1520 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 21 TGGGAGTCAG TGGTACCTGA 20 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 22 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR : 22 nucléotides liB TYPE : acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linéaire lii TYPE DE MOLECULE : ADN liii HYPOTHETIQUE liv ANTI-SENS : non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE lviC INDIVIDU/ISOLE: lviD STADE DE DEVELOPPEMENT lviE HAPLOTYPE: lviF TYPE DE TISSU: lviG TYPE DE CELLULE: lviH LIGNEE CELLULAIRE: lviI ORGANELLE: lvii SOURCE IMMEDIATE : bioMérieux S.A. lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: lviii POSITION DANS LE GENOME: lviiiA CHROMOSOME/SEGMENT: lviiiB POSITION PAR RAPPORT A LA NUMEROTATION DE R.rickettsii : 1555-1576 lviiiC UNITES: lix CARACTERISTIQUE: lixA NOM/CLE : ADN lixB EMPLACEMENT : 1555-1576 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 22 CACGGTAGAA CTGGTGACTG GG 22 REVENDICATIONS 1) Fragment nucléotidique monocaténaire capable de s'hybrider dans des conditions prédéterminées à l'ADNr ou l'ARNr d'au moins une bactérie du genre Rickettsia et non à l'ADNr ou l'ARNr des non-Rickettsia. 2) Fragment nucléotidique monocaténaire, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il ne s'hybride pas à l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti. 3) Fragment nucléotidique monocaténaire, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi les fragments d'au moins 5 nucléotides présents dans les séquences nucléotidiques suivantes commençant au nucléotide N" 130 et finissant au nucléotide N" 170 commençant au nucléotide NO 181 et finissant au nucléotide NO 201 commençant au nucléotide N" 241 et finissant au nucléotide N" 272 commençant au nucléotide N" 284 et finissant au nucléotide N" 298 commençant au nucléotide N 299 et finissant au nucléotide N" 315 commençant au nucléotide N 334 et finissant au nucléotide N" 357 commençant au nucléotide N" 460 et finissant au nucléotide N" 481 commençant au nucléotide N" 504 et finissant au nucléotide NO 536 commençant au nucléotide N" 550 et finissant au nucléotide N" 570 commençant au nucléotide NO 561 et finissant au nucléotide N" 585 commençant au nucléotide NO 661 et finissant au nucléotide N" 684 commençant au nucléotide N" 710 et finissant au nucléotide N" 739 commençant au nucléotide N" 903 et finissant au nucléotide NO 929 commençant au nucléotide N" 940 et finissant au nucléotide N" 960 commençant au nucléotide N"1035 et finissant au nucléotide N 1055 commençant au nucléotide N 1078 et finissant au nucléotide N 1107 commençant au nucléotide N 1199 et finissant au nucléotide N 1213 commençant au nucléotide N01330 et finissant au nucléotide N 1350 commençant au nucléotide N 1361 et finissant au nucléotide N 1387 commençant au nucléotide N 1429 et finissant au nucléotide N 1463 commençant au nucléotide N 1501 et finissant au nucléotide N 1520 commençant au nucléotide N 1555 et finissant au nucléotide N 1576 et leurs séquences complémentaires ou les analogues de ces séquences, les numéros des nucléotides correspondant à leur position par rapport à la séquence nucléotidique de l'ADN codant pour l'ARN ribosomique 16S de R. rickettsii, utilisée comme référence. 4) Fragment selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente une séquence informationnelle choisie dans les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N022. 5) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ARN, caractérisé en ce qu'il correspond au produit de transcription d'un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 4, ou son fragment complémentaire. 6) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transcription inverse d'un fragment d'ADN selon le revendication 5, ou son fragment complémentaire. 7) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN génomique caractérisé en ce que son produit de transcription est un fragment d'ARN selon la revendication 5, ou son fragment complémentaire. 8) Sonde pour l'identification de bactéries du genre Rickettsia, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de cinq à cent motifs nucléotidiques, en particulier de cinq à trente cinq motifs, appartenant à la séquence d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou à toute séquence homologue. 9) Sonde pour l'identification de bactéries d'espèce R. tsutsugamushi, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de cinq à cent motifs nucléotidiques, en particulier de cinq à trente cinq motifs, appartenant à la séquence d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou appartenant à toute séquence homologue. 10) Sonde selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de huit à trente cinq motifs nucléotidiques appartenant à la séquence d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 11) Sonde selon la revendication 8 ou selon la revendication 8 et la revendication 10, caractérisée en ce qu elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes: commençant au nucléotide N 181 et finissant au nucléotide N" 201 commençant au nucléotide N" 284 et finissant au nucléotide NO 298 commençant au nucléotide N" 561 et finissant au nucléotide N" 585 commençant au nucléotide N" 940 et finissant au nucléotide N" 960 commençant au nucléotide N"1199 et finissant au nucléotide N01213 commençant au nucléotide N"1429 et finissant au nucléotide N"1463 et leurs séquences complémentaires. 12) Sonde selon la revendication 9 ou selon la revendication 9 et la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes: commençant au nucléotide N"130 et finissant au nucléotide N"170 commençant au nucléotide N"241 et finissant au nucléotide N"272 commençant au nucléotide N"299 et finissant au nucléotide N0 315 commençant au nucléotide N"334 et finissant au nucléotide N"357 commençant au nucléotide N" 460 et finissant au nucléotide N" 481 commençant au nucléotide N" 504 et finissant au nucléotide N" 536 commençant au nucléotide N" 550 et finissant au nucléotide N" 570 commençant au nucléotide N" 661 et finissant au nucléotide N" 684 commençant au nucléotide N" 710 et finissant au nucléotide N" 739 commençant au nucléotide N" 903 et finissant au nucléotide N" 929 commençant au nucléotide N 1035 et finissant au nucléotide N 1055 commençant au nucléotide N 1078 et finissant au nucléotide N 1107 commençant au nucléotide N 1330 et finissant au nucléotide N 1350 commençant au nucléotide N 1361 et finissant au nucléotide N 1387 commençant au nucléotide N 1501 et finissant au nucléotide N 1520 commençant au nucléotide N 1555 et finissant au nucléotide * 13) Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues au genre Rickettsia ou à une espèce déterminée de rickettsies, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique appartenant à la séquence d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 14) Amorce pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 16S des Rickettsia appartenant à une région conservée parmi ce seul genre de rickettsies, en une séquence d'ADN complémentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 7, ou à toute séquence homologue. 15) Amorce pour l'amplification enzymatique spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de la séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 7, ou à toute séquence homologue. 16) Réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 13. 17) Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend comme sonde de capture et/ou de détection au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 13. 18) Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la sonde de capture est fixée sur un support solide. 19) Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la sonde de détection est une sonde marquée. 20) Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon la revendication 14 et/ou au moins une amorce selon la revendication 15. 21) Procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu il comprend: a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de hybrider à l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et b- la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de Rickettsia dans l'échantillon. 22) Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ARN ribosomique 16S, extrait des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, et on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde. 23) Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN génomique extrait et dénaturé des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde. 24) Procédé de détection et/ou d'identification d'une espèce de rickettsie dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN obtenu par transcription inverse de l'ARN ribosomique 16S des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une des revendications 8 à 12, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde. 25) Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'avant d'exposer l'acide nucléique à ladite sonde, on réalise une amplification dudit acide nucléique en présence d'un système d'amplification enzymatique comprenant au moins une amorce selon l'une des revendications 14 et 15.