Brevet FR2723748A1 — publié le 19960223

Substances physiologiquement actives de type calédothricine, procédé pour leur production, compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation La présente invention concerne de nouvelles sub- stances physiologiquement actives, à savoir les calédothri- cines A, B, C, D, E, F, G, H et I, et leurs sels. La présente invention concerne également l'utilisa- tion des substances physiologiquement actives calédothri- cines A, B, C, D, E, F, G, H et I ou de leurs sels dans la fabrication de médicaments pour le traitement de mycoses; des compositions pharmaceutiques contenant la calédothri- cine A, B, C, D, E, F, G, H ou I; des micro-organismes capables de produire des calédothricines et un procédé pour la préparation de calédothricines. Les mycoses profondes dues à des champignons opportu- nistes chez des patients immunologiquement affaiblis ont augmenté, en raison de divers facteurs prédisposants tels que le SIDA, le traitement de cancers, les greffes d'or- ganes, l'accroissement de la population âgée et l'utilisa- tion accrue d'antibiotiques. Chez ces patients immunologi- quement affaiblis, un certain nombre de champignons qui ne sont pas pathogènes chez le sujet sain se comportent comme *des pathogènes virulents. En conséquence, le besoin médical en antifongiques bien tolérés augmente rapidement. Toute- fois, des antifongiques n'ont pas encore été parfaitement mis au point. Il n'existe sur le marché qu'un petit nombre25 d'antifongiques pour des mycoses généralisées. En outre, les - 2 - propriétés de ces antifongiques ne satisfont pas pleinement les besoins pratiques. Cet état de chose a incité les auteurs de la présente invention à rechercher de nouveaux antifongiques à large spectre. En conséquence, on a décou- vert que certains micro-organismes déterminés produisent de nouveaux antifongiques à large spectre antifongique, comme décrit ci-après plus en détail. Les propriétés physico-chimiques des substances phy- siologiquement actives calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I, obtenues selon l'invention, sont les suivantes: Calédothricine A: 1) Aspect: solide blanc 2) Pouvoir rotatoire spécifique: [a]D = -50,8 + 6, 40 D (c = 0,10, pyridine) 3) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1401 (M+H), 1423 (M+Na)+ mode à ions négatifs: m/z = 1399 (M-H)-, 1417 (M+H20-H) 4) Formule brute: C65H100N12022 5) Spectroscopie de masse à haute résolution (pour M+H): Trouvé: 1401,7117 Calculé pour C65H101N12022:1401, 7143 6) Spectre UV (méthanol) (voir figure 1): xh = 203 5 (c 4300), 224 5 (c 2900, épaulement), max 275 5 (c 280, épaulement) (dans le méthanol) AM = 203 5 (c 3500), 220 5 (c 2900, épaulement), max 275 5 (c 315, épaulement) (dans HCl 0,1 N- méthanol) x = 204 5 (c 7200), 225 5 (c 2600, épaulement), max 245 5 (c 1600, épaulement), 295 5 (c 200, épaulement) (dans NaOH 0,1 N-méthanol) 7) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 2): les principaux nombres d'onde d'absorption (cm -1) sont les suivants: 3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000 - 3 - 8) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 3 9) Spectre de RMN-13C [100 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 4 ) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 11) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 12) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 dichlorométhane/méthanol/ eau (60:35:5) 0,13 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0, 25 1 E. Merck AG., RFA 13) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: YMC-Pack A303, produit par Yamamura Chemical Laboratories phase mobile: acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) = 45:55 débit: 1 ml/min. t = 16,3 0,5 min r 14) Classification de la substance: substance amphotère ) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine A pendant 24 heures à 120 C dans HC1 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. -4 - Calédothricine B: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SMFAB) mode à ions positifs: m/z = 1223 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1221 (M-H) 3) Formule brute: C59H 90N12016 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 5) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 1130-1060 ) Spectre de RMN- 1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 6 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline- acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 n- butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,49 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 22,4 0,5 min ) Classification de la substance: substance amphotère ) Classification de la substance: substance amphotère - 5 - 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine B pendant 24 heures à 120 C dans HC1 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine C: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1239 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1237 (M-H) 3) Formule brute: C59H 90N12017 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 7) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3368, 2926, 2855, 1740, 1671, 1518, 1204, 1138 ) Spectre de RMN- H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 8 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline- acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 n- butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,46 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. - 6 - phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. tr = 22,2 0,5 min ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine C pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine D: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1355 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1353 (M-H)- 3) Formule brute: C64H98N12020 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 9) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm -1) sont les suivants: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140 5) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 10 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent -7- 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,43 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel- ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 18,2 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine D pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine E: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1371 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1369 (M-H) 3) Formule brute: C64H98N12021 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 11) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm -1) sont les suivants: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 12 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, - 8 - vanillineacide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,39 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1, 2 ml/min. t = 17,6 0,5 min r 10) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine E pendant 24 heures à 120 C dans HC1 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine F: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1517 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1515 (M-H) 3) Formule brute: C70H108N12025 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 13) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm- 1) sont les suivants: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, 1260, 1100-1000 ) Spectre de RMN- 1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 14 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique -9- faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline- acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 n- butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,18 *1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 16,3 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine F pendant 24 heures à 1200C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine G: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1373 (M+H)+ 3) Formule brute: C63H96N12022 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 15) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm-1) sont les suivants: 3350, 2926, 2855, 1739, 1659, 1518, 1265, 1120-1030 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique - 10 - (25:1)]: voir figure 16 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,24 *1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 15,6 0,5 min ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine G pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine H: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM- FAB) mode à ions positifs: m/z = 1343 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1341 (M-H) 3) Formule brute: C62H94N12021 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 17) -35 les principaux nombres d'onde d'absorption (cm1) sont les principaux nombres d' onde d' absorption sont - 11 - les suivants: 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 18 6) Solubilité: soluble dans la-pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,22 *1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 12,3 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine H pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. Calédothricine I: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1327 (M+H)+ - 12 - mode à ions négatifs: m/z = 1325 (M-H) 3) Formule brute: C62H94N12020 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 19) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm-1) sont les suivants: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, ) Spectre de RMN-.H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 20 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,43 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1, 2 ml/min. tr = 12,6 0,5 min 10) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine I pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine. - 13 - Les calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I pré- sentaient des spectres de RMN-1H assez semblables, comme représentés sur les figures 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 et , et des spectres IR assez semblables, comme représentés sur les figures 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 et 19, indiquant respectivement que les calédothricines sont des homologues de depsipeptides. L'analyse des aminoacides des calédothri- cines a révélé qu'ils comportaient les mêmes résidus amino- _ acide, à savoir les résidus thréonine, glycine, glutamine, histidine et tyrosine. La présence de fragments acide gras était indiquée par leur spectres de RMN-1H (un signal à 0,95 ppm pouvant être attribué à un groupe méthyle et des signaux à 1,2-1,4 ppm pouvant être attribués à des groupes méthylène). Selon le procédé fourni par la présente invention, on obtient les calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I par culture d'un micro-organisme appartenant au genre Pseudomonas, dans des conditions aérobies, dans un milieu de culture aqueux, et isolement de celles-ci. Les micro-organismes utilisés dans la présente inven- tion comprennent toutes les souches appartenant au genre Pseudomonas, leurs équivalents fonctionnels, sous-cultures, mutants et variants desdits micro-organismes, qui sont capables de produire les substances physiologiquement actives calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I. Les souches préférées sont Pseudomonas spp. BA 7399 et BA 8429, qui ont été isolées à partir d'un échantillon de sol. Les souches désignées par Pseudomonas spp. BA 7399 et BA 8429 ont été déposées sous les clauses du Traité de Budapest, le 2 août 1994 au National Institute of Bioscience and Human-Technology, Japon, sous les numéros de dépôt: Pseudomonas sp. BA 7399 FERM BP-4766 Pseudomonas sp. BA 8429 FERM BP-4767 Les caractères morphologiques et physiologiques de Pseudomonas spp. BA 7399 et BA 8429 sont les suivants: - 14 - Caractères morphologiques et physiologiques Les souches BA 7399 et BA 8429 étaient Gram néga- tives, non sporulantes, en forme de bâtonnet, aérobies et mobiles avec plusieurs (plus de 6) flagelles polaires. La couleur des colonies était jaune pâle. La production d'oxy- dase et la production de catalase étaient positives. La réponse d'oxydation au test OF de la souche BA 7399 était positive, mais celle de la souche BA 8429 était négative. Des facteurs de croissance n'étaient pas requis. Ces carac- tères indiquaient clairement que les deux souches BA 7399 et BA 8429 appartenaient au genre Pseudomonas Migula. En consé- quence, ces souches ont été identifiées comme Pseudomonas spp. BA 7399 et BA 8429. La culture selon le procédé fourni par la présente invention peut être effectuée dans un milieu de culture con- tenant les nutriments habituels utilisables par le micro- organisme qui est utilisé. Comme sources de carbone, on peut mentionner par exemple le glucose, le lévulose, le galac- tose, le mannose, le sorbose, l'arabinose, le xylose, le saccharose, l'amidon, le glycérol, la mélasse, la dextrine et des mélanges de ceuxci. Les sources d'azote sont par exemple la farine de soja, la farine de coton, la farine de mais, l'extrait de viande, la peptone, la levure déshydra- tée, l'extrait de levure, la liqueur de trempage du mais, le sulfate d'ammonium, le nitrate de sodium et des mélanges de ceux-ci. En outre, on peut ajouter au milieu de culture d'autres substances organiques ou minérales pour favoriser la croissance du micro-organisme et pour augmenter la pro- duction de calédothricines, des exemples de ces substances étant des sels minéraux, par exemple le carbonate de cal- cium, le chlorure de sodium, le thiosulfate de sodium, des phosphates et similaires. La culture est effectuée dans des conditions aéro- bies, dans un milieu aqueux, de préférence par fermentation submergée. La culture est convenablement effectuée à une - 15 - température de 20-35 C, la température optimale étant 27 C. La culture est effectuée de préférence à pH 3-9. La durée de la fermentation dépend des conditions dans lesquelles est effectuée la culture. En général, il suffit d'effectuer la culture pendant 200 heures à 24 C. Pour obtenir les calédothricines recherchées à partir des cultures, on peut-utiliser convenablement les méthodes de séparation qui sont normalement utilisées pour l'isole- ment de métabolites produits par des microbes, à partir de leur culture. Par exemple, la calédothricine A, qui est une substance amphotère extractible par le n-butanol, est conte- nue principalement dans le gâteau de mycélium et recueillie avantageusement par le mode opératoire suivant. A savoir, on soumet le bouillon de culture entier à une filtration et une centrifugation pour recueillir les cellules et on extrait le gâteau de mycélium résultant à l'aide d'un solvant appro- prié, pour recueillir les produits recherchés. Les solvants qui peuvent être utilisés pour l'extraction comprennent des solvants organiques hydrosolubles ou des solutions aqueuses de solvants organiques hydrosolubles, tels que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétone aqueuse et les alcools aqueux. On peut avantageusement éliminer de l'extrait résul- tant les sels, les substances hydrosolubles, etc., par par- tage entre de l'eau et des solvants organiques non miscibles à l'eau, tels que le n-butanol, la méthyléthylcétone, etc. Pour éliminer de l'extrait les substances colorantes, les substances liposolubles et similaires, on peut utiliser du gel de silice (Wako Chemicals Co. Ltd., Japon), des résines de type tamis moléculaire telles que Sephadex (Pharmacia, Suède) et Toyopearl (Toyo Soda Manufacturing Co., Japon), etc. Pour la purification totale des composés, on utilise avantageusement la chromatographie liquide à haute perfor- mance (HPLC). Les supports qui peuvent être utilisés dans - 16 - une telle HPLC comprennent une résine de type à phases inversées, telle que le gel YMC (Yamamura Chemical Laborato- ries, Japon) ou le gel Capcel pak (Shiseido Co. Ltd., Japon). En ce qui concerne la phase mobile, on utilise avan- tageusement un système de solvants constitué d'un mélange d'un tampon aqueux et d'un solvant organique hydrosoluble approprié, tel que le'méthanol, l'acétonitrile, etc. La fraction d'éluat ainsi purifiée et fractionnée ci-dessus peut être soumise à une concentration, à une lyo- philisation et une cristallisation, pour la pulvérisation ou la cristallisation de calédothricines. On peut utiliser des méthodes classiques pour prépa- rer des sels pharmacologiquement acceptables (par exemple le sel de potassium, le sel de calcium et le sel d'acide chlor- hydrique, etc.) à partir des calédothricines sous forme libre. Activité antifongique in vitro Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I contre des cham- pignons pathogènes représentatifs sont données dans le tableau 1. La CMI est définie comme la concentration mini- male du composé d'essai à laquelle aucune croissance visible n'est détectée. Les milieux de culture utilisés pour la mesure des CMI étaient du milieu levure sans glucose (Difco) complété avec 1 % de glucose, 0, 2 % d'agarose à bas point de fusion et 0,25 % de K2HP04 (pH 7,0). L'agarose à bas point de fusion a été omis lorsqu'on a mesuré l'activité anti- fongique contre Candida albicans et Cryptococcus neoformans. On a ensemencé les milieux de culture avec des cellules fon- giques à la concentration finale de 10 000 UFC (unités for- mant colonie) par ml. On a mis les plaques à incuber pendant 1-12 jours à 27 C. Toutes les valeurs de la CMI dans le tableau 1 sont exprimées en gg/ml des composés d'essai. Tableau Activité antifongique des calédothricines A-I Souches CMI e/mz A B C D E F G H I FCZ* Candida albicans 652 0,78 0,78 0,78 1,56 6,25 6,25 0,39 0,78 0,78 >200 ATCC48130 1,56 1,56 0,78 1)56 3,13 6, 25 0,39 3,13 3,13 >200 KB 0,78 0,78 0,78 0,78 1,56 6, 25 0,39 1,56 0,78 >200 AD 0,2 0,2 0,2 0,2 0,39 0> 78 0>2 0,39 0,39 >200 ADytoc u 0,2 0,39 0,2 0,2 0,39 1,56 0,2 0,39 0,39 200 Cryptococcus neoformans MTU13001 0,2 0,2 0,2 0,2 0,39 0, 78 0>2 0,39 0,2 125 422 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, 39 0,2 0,2 0,2 >200 Aspergillus fumigatus MTU0600 0,16 0,31 1,25 125 2,5 0, 63 0,16 1,25 1,25 >200 4370 4 0,16 0,316 1,25 1,25 1,25 0,63 0,16 1,25 1,25 >200 C4370 0,16 0)16 1,25 1:25 1,25 0, 63 0,16 1,,25 1,25 >200 0,31 0,31 2,5 5 2,5 2,5 0,63 2,5 2,5 >200 Absidia corymbifera IFO8084 0,39 0,2 0,2 NT NT NT NT NT 0,2 >200 Trichosporon beigelii ATCC 28592 0,2 0,2 0,1 NT NT NT NT NT 0,2 0,39 Trichophyton mentagrophytes CF1007 0,05 0,025 0,05 NT NT NT NT NT 0,39 >200 *: fluconazole NT: non testée - 18 - On n'a pas constaté de toxicité aigué des calédothri- cines A à I. Pour l'utilisation thérapeutique, on peut mettre les calédothricines sous diverses formes de compositions pharma- ceutiques, selon des techniques connues de formulation. Pour l'utilisation des calédothricines dans le trai- tement de candidoses, par exemple, la calédothricine A peut êtreadministrée par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, sous forme d'une solution dans du sérum physiologique, normalement à une dose de de 0,1 à mg/kg/jour, de préférence de 0,5 à 20 mg/kg/jour. Pour l'administration orale, la calédothricine A est de préfé- rence mise sous forme de gélules ou de comprimés dragéifiés, par des procédés classiques, et administrée à une dose allant normalement de 0, 1 à 100 mg/kg/jour, de préférence de 1 à 50 mg/kg/jour. Les calédothricines obtenues par la présente inven- tion peuvent également être utilisées en tant que désinfec- tants à usage local. Par exemple, on peut utiliser la calé- dothricine A pour la stérilisation et la désinfection de la peau ou des muqueuses de l'homme et d'animaux, en l'appli- quant sous forme d'une composition liquide préparée par dis- solution de calédothricine A, par exemple dans de l'eau dis- tillée, à une concentration allant normalement de 0,1 à 10 % (p/v), de préférence de 0,5 à 5 % (p/v), ou d'une pommade, en utilisant de la vaseline ou de la lanoline en tant qu'ex- cipient, contenant normalement de 0,2 à 100 mg, de préfé- rence de 1 à 20 mg de calédothricine A par g. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Les pourcentages sont donnés en poids/volume. *Exemple 1 On a utilisé la suspension de cellules provenant d'une culture bien développée de Pseudomonas sp. BA 7399 en pan incliné de gélose, pour ensemencer un erlenmeyer de - 19 - 500 ml contenant 100 ml d'un milieu composé de 3 % de dex- trine, 1,5 % d'Ajipron E3 (Ajinomoto), 0,2 % de polypeptone (Wako), 1,5 % de farine de gluten de mais (Shouwasangyou), 0,1 % de Na2S203 et 1 goutte d'antimousse (Nissan) par fla- con. Le flacon a été secoué à 220 tours/minute pendant i jour à 27 C. On a transféré 0,2 ml de la culture résul- tante dans chacun de 50 flacons de 500 ml contenant le même milieu que ci-dessus. La fermentation a été effectuée sur un agitateur rotatif à secousses, à 220 tours/minute, à 270C. Après 2 jours de culture, on a soumis le bouillon de culture à l'opération d'isolement décrite ci-dessous. On a soumis le bouillon de culture (5 1) ainsi obtenu à une centrifugation continue pour l'obtention d'un gâteau de mycélium. On a introduit le gâteau de mycélium dans 1,3 1 d'éthanol et on a agité le mélange. On a filtré le mélange, et l'extrait éthanolique (1,4 1) a été concentré à siccité sous pression réduite. On a dissous le résidu (6,4 g) dans 2 1 d'eau, et on a ajusté le pH de la suspension ainsi obte- nue à 2. On a ajouté 2 1 de n-butanol au mélange et on l'a agité, puis on a éliminé la phase aqueuse. On a ajouté 2 1 d'eau à la phase organique ainsi obtenue et on a ajusté à pH 9 le mélange. On a agité le mélange, puis on a éliminé la phase aqueuse. La phase organique ainsi obtenue a été con- centrée à siccité sous pression réduite, et on a ensuite soumis le résidu (4,5 g) à une chromatographie sur colonne de gel de silice (1 1). La colonne a été éluée d'abord avec un mélange de dichlorométhane et de méthanol (1:1). On a ensuite élué les antibiotiques avec un mélange de dichloro- méthane et de méthanol (1:1)Y et ensuite avec du méthanol. Les fractions contenant les antibiotiques ont été réunies et concentrées à siccité sous pression réduite. On a soumis le résidu (1,4 g) ainsi obtenu à une chromatographie sur colonne de Sephadex LH20 (1,5 1). L'élution a été effectuée avec du méthanol. Les fractions contenant les antibiotiques ont été réunies (205 ml) et ensuite concentrées à siccité - 20 - sous pression réduite. On a soumis les antibiotiques bruts, dissous dans de la pyridine, à une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur une colonne YMCpak C18 (20 mm x 250 mm), en effectuant l'élution avec un système de solvants composé d'acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) (45:55), pour le fractionnement. Les fractions contenant les calédothricines A à I individuelles ont été réunies, puis concentrées. On a ajouté 30 ml de n- butanol au concentré (30 ml), puis on a agité pendant 5 minutes et on a éliminé la phase aqueuse. La phase orga- nique ainsi obtenue a été lavée avec de l'eau (15 ml x 2) puis concentrée à siccité sous pression réduite. On a dis- sous le résidu dans de la pyridine et on l'a à nouveau con- centré à siccité sous pression réduite, pour obtenir les calédothricines A (30 mg), B (7,8 mg), C (3,7 mg), D (2,1 mg), E (1,0 mg), F (1,4 mg), G (1,1 mg), H (1,6 mg) et I (3,0 mg) sous forme de poudres blanches. Exemple 2 En procédant de la même façon que dans l'exemple 1, mais en utilisant Pseudomonas sp. BA 8429 au lieu de Pseudomonas sp. BA 7399, on a obtenu les calédothricines A (12,5 mg), B (2,6 mg), C (traces), D (traces), E (traces), F (0,3 mg), G (5,6 mg), H (traces) et I (3,2 mg) sous forme de poudres blanches. Exemple 3 On a préparé, d'une façon classique connue en soi, des solutions injectables contenant chacune les composants suivants: Calédothricine A 20 mg Hydrogénophosphate disodique, anhydre 7,6 mg Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté 2,0 mg Alcool éthylique 150 mg Eau distillée désionisée stérile 850 mg Total 1 029,6 mg - 21 - REVENDICATIONS 1. Substance physiologiquement active calédothri- cine A, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 24=_5,o+64 2) Pouvoir rotatoire spécifique: [a]24 = 50,8 + 6,40 D (c = 0,10, pyridine) 3) Masse moléculaire (SM- FAB) mode à ions positifs: m/z = 1401 (M+H)+, 1423 (M+Na)+ mode à ions négatifs: m/z = 1399 (M-H), 1417 (M+H20-H) 4) Formule brute: C65H100N12022 ) Spectroscopie de masse à haute résolution (pour M+H): Trouvé: 1401,7117 Calculé pour C65H101N12022: 1401,7143 6) Spectre UV (méthanol) (voir figure 1): A = 203 5 (c 4300), 224 5 (c 2900, épaulement), max 275 5 (c 280, épaulement) (dans le méthanol) à = 203 5 (c 3500), 220 5 (c 2900, épaulement), ax 275 5 (c 315, épaulement) (dans HC1 0,1 N- méthanol) A = 204 5 (c 7200), 225 5 (c 2600, épaulement), 245 5 (c 1600, épaulement), 295 5 (c 200, épaulement) (dans NaOH 0,1 N- méthanol) 7) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 2): les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000 8) Spectre de RMN- 1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 3 9) Spectre de RMN- 13C [100 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 4 - 22 - ) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 11) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline- acide'sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 12) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 dichlorométhane/méthanol/ eau (60:35:5) 0,13 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,25 1 E. Merck AG., RFA 13) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: YMC-Pack A303, produit par Yamamura Chemical Laboratories phase mobile: acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) = 45:55 débit: 1 ml/min. t = 16,3 0,5 min r 14) Classification de la substance: substance amphotère 15) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine A pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 2. Substance physiologiquement active calédothri- cine B, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc - 23 - 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1223 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1221 (M-H) 3) Formule brute: C59H 90N12016 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 5) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 1130-1060 ) Spectre de RMN- H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 6 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,49 *1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 22,4 + 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine B pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle - 24 - on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 3. Substance physiologiquement active calédothri- cine C, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1239 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1237 (M-H) 3) Formule brute: C59H90N12017 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 7) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm -) sont les suivants: 3368, 2926, 2855, 1740, 1671, 1518, 1204, 1138 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 8 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline- acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n- butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,46 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. - 25 - phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. tr = 22,2 0,5 min ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine C pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 4. Substance physiologiquement active calédothri- cine D, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1355 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1353 (M-H) 3) Formule brute: C64H98N12020 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 9) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm-1) sont les suivants: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 10 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent - 26 - 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,43 1E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel-ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 18,2 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine D pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 5. Substance physiologiquement active calédothri- cine E, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1371 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1369 (M-H) 3) Formule brute: C64H98N12021 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 11) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050 5) Spectre de RMN- 1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 12 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol - 27 - 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0, 39 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 17,6 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine E pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 6. Substance physiologiquement active calédothri- cine F, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1517 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1515 (M-H) 3) Formule brute: C70H108N12025 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 13) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm 1) sont les suivants: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, - 28 - 1260, 1100-1000 ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 14 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F2541 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,18 *1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1, 2 ml/min. t = 16,3 0,5 min r 10) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine F pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 7. Substance physiologiquement active calédothri- cine G, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc - 29 - 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1373 (M+H)+ 3) Formule brute: C63H96Nl2o22 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 15) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm -1) sont les suivants: 3350, 2926, 2855, 1739, 1659, 1518, 1265, 1120-1030- ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 16 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,24 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de-sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. t = 15,6 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine G pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- - 30 - mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 8. Substance physiologiquement active calédothri- cine H, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1343 (M+H) + mode à ions négatifs: m/z = 1341 (M-H) 3) Formule brute: C62H94N12021 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 17) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm1) sont les suivants: 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140 5) Spectre de RMN-IH [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 18 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254 1 n- butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,22 1 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon - 31 - hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) débit: 1,2 ml/min. tr = 12,3 0,5 min ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine H pendant 24 heures à 120 C dans HCl 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 9. Substance physiologiquement active calédothri- cine I, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) Aspect: solide blanc 2) Masse moléculaire (SM-FAB) mode à ions positifs: m/z = 1327 (M+H)+ mode à ions négatifs: m/z = 1325 (M-H) 3) Formule brute: C62H94N12020 4) Spectre IR (comprimé de KBr) (voir figure 19) les principaux nombres d'onde d'absorption (cm-1) sont les suivants: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, ) Spectre de RMN-1H [400 MHz, dans un mélange de diméthylsulfoxyde-d6 et d'acide trifluoroacétique (25:1)]: voir figure 20 6) Solubilité: soluble dans la pyridine et l'acide trifluoroacétique faiblement soluble: eau, diméthylsulfoxyde, méthanol 7) Réaction colorée: positive: anisaldéhyde-acide sulfurique, HBr- ninhydrine, vapeurs d'iode, acide molybdophosphorique, vanilline-acide sulfurique, réactif de Rydon-Smith négative: vert de bromocrésol, chlorure ferrique, 2,4- dinitrophénylhydrazine-acide sulfurique, réactif de Sakaguchi, nitrate d'argent - 32 - 8) Chromatographie sur couche mince (CCM): Support Système de solvant mobile Rf gel de silice F254'1 n-butanol/acide acétique/ eau (3:1:1) 0,43 E. Merck AG., RFA 9) Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): support: MCIgel-ODS, produit par Mitsubishi Kasei Co. phase mobile: gradient de solvant acétonitrile/tampon hydrogénophosphate de sodium 10 mM (pH 3,4) -10 débit: 1,2 ml/min. t = 12,6 0,5 min r ) Classification de la substance: substance amphotère 11) Analyse d'aminoacides: on a chauffé la calédothri- cine I pendant 24 heures à 120 C dans HC1 6 N, puis on l'a soumise à une analyse d'aminoacides dans laquelle on a trouvé la tyrosine, la thréonine x 2, la gluta- mine, la glycine, l'histidine, et sel physiologiquement acceptable de celle-ci. 10. Substances physiologiquement actives calédothri- cines A, B, C, D, E, F, G, H et I ou leurs sels, selon les revendications 1 à 9, pour utilisation en tant que médica- ment. il. Utilisation des substances physiologiquement actives calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I ou de leurs sels, selon les revendications 1 à 9, comme composant actif dans la fabrication de médicaments pour le traitement de mycoses. 12. Composition pharmaceutique contenant de la calédothricine A, B, C, D, E, F, G, H ou I ou un de ses sels, selon les revendications 1 à 9, et des adjuvants phar- maceutiques usuels. 13. Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM BP-4766). 14. Pseudomonas sp. BA 8429 (FERM BP-4767). 15. Procédé pour la production des substances actives calédothricines A, B, C, D, E, F, G, H et I, compre- nant la culture d'un micro-organisme appartenant au genre - 33 - Pseudomonas, dans des conditions aérobies, dans un milieu de culture aqueux, et l'isolement de ces substances. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le micro-organisme est Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM BP-4766) ou Pseudomonas sp. BA 8429 (FERM BP-4767).