Brevet FR2733913A1 — publié le 19961115

La présente invention concerne le domaine médical. Plus particulièrement, l'invention concerne une séquence d'acide nucléique comme substance thérapeutiquement active. Invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant ladite séquence. L'adhésion des cellules sur les composants de la matrice extracellulaire est un point central dans la biologie du vivant. En pathologie humaine, et spécialement dans le domaine du cancer, ce phénomène tient un rôle crucial dans le développement de la maladie. Il est en effet impliqué dans la migration des cellules cancéreuses, dans le phénomène d'invasion ainsi que dans la colonisation métastatique à distance. Des travaux concernant l'intéraction cellule-matrice extracellulaire ont d'abord permis de mettre en évidence une inhibition de l'activité phosphatasique membranaire des cellules de mélanome malin humain après intéraction de ces cellules avec des séquences spécifiques de la matrice extracellulaire, telle que les séquences RGDS (séquence Arg-Gly-Asp-Ser, présente dans le collagène, la fibronectine, la vitronectine, la thrombospondine, etc...) et YIGSR (séquence Tyr Ile-Gly-Ser-Ar présente dans la laminine) (J. Invest. Dermatol., 1994, 102. N-619, 627 ; J. Ccllul. Biochem., 1994, 18D, QZ 300, 89 ; J. Clin. Experim. Metast., 1994, 12, N95, 37). Des travaux ultérieurs ont montré qcie cette inhi'oition survient dans le cadre d'une opération de signalisation cellulaire impliquant une protéine tyrosine kinase. En utilisant des inhibiteurs de cette famille d'enzymes, il est possible, en effet, de supprimer l'effet inhibiteur de la séquence RGDS ou de la séquence YIGSR vis-àvis de l'activité phosphatasique des cellules de mélanome humain (J. Clin. Experim. Metast., 1994, 12, N-134. 50-51). La phosphatasc impliquée lors de la réaction s'est révélée être de type Sérinefthréonine protéine phosphatase. Son poids moléculaire est de 190 kDa. L'inhibition de cette enzyme résulte d'une phosphorylation au niveau de la tyrosine. Cette protéine est déià connue en tant que substrat du récepteur à l'insuline (dénommé IRS-1). Elle a été, en effet, partiellement repérée et étudiée par certains auteurs travaillant sur le diabète (Quon et al., J. Biol. Chem. (1994), 269 (45), 27920-27924). Ces auteurs ont étudié le rôle de l'IRS-1 sur (i) la translocation du GLUT 4 stimulée par l'insuline et (ii) le transport du glucose, dans des cellules adipeuses de rat. Pour ce faire, ils ont construit un plasmide contenant un oligonucléotide bicatcnairc, obtenu à partir de l'oligonuclcotide sens 5 ' -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3'' et l'ADNc codant pour l'ïRS-1 humain, et ont transfecté dcs cellules adipeuses de rat par ce plasmide. On a maintenant mis en évidence le fait que cette protéine de 190kDa est également présente au niveau des cellules tumorales. De plus, on a trouvé de manière surprenante que l'oligonucléotide ci-dessus . 5' -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3' possède une activité anti-tumorale remarquable. La présente invention concerne donc une séquence d'acide nucléique choisie parmi: (a) 5 -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3' (b) les fragments de (a) qui comportent au moins 21 bases ; et (c) les séquences d'acide nucléique qui hybrident dans des conditions strictes avec (a) ou (b), pour son utilisation comme substance thérapeutiquement active. Avantageusement, tout ou partie des liaisons phosphodiester des séquences (a), (b) ou (c) sont protégées. Cette protection s'effectue généralement par voie chimique, selon des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, on peut protéger les liaisons phosphodiester par une fonction thiol ou amine ou bien encore par un groupe phényle. De façon également avantageuse, les extrémités 5'- et/ou 3'- des séquences cidessus sont protégées, par exemple en utilisant la technique indiquée précédemment pour protéger les liaisons phosphodiester. A titre d'exemples de séquence (b), on peut mentionner les oligonucléotides suivants 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCOTGAG GACGAAACTC TGGCC- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TG- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACT- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAA- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GAC- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGT- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTC- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG A- 3' 5'-ATGTGACGCT ACTGATGAGT CCGTGAGGAC GAAACTCTGG CCTAG- 3' 5'-TGACGCTACT GATGAGTCCG TGAGGACGAA ACTCTGGCCT AG- 3' 5'-CGCTACTGAT GAGTCCGTGA GGACGAAACT CTGGCCTAG- 3' 5'-TACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAACTCTG GCCTAG- 3' 5'-TGATGAGTCC GTGAGGACGA AACTCTGGCC TAG- 3' 5'-TGAGTCCGTG AGGACGAAAC TCTGGCCTAG- 3' 5'-GTCCGTGAGG ACGAAACTCT GGCCTAG- 3' 5'-CGTGAGGACG AAACTCTGGC CTAG- 3' 5'-GAGGACGAAA CTCTGGCCTA G- 3' 5'-TACTGATGAG TCCGTGAGGA C-3' 5'-TGATGAGTCC GTGAGGACGA A-3' Les séquences d'acide nucléique (a), (b) et (c) peuvent être synthétisées selon les techniques conventionnelles bien connues de l'homme du métier, par exemple à l'aide d'un synthétiseur d'ADN commercialisé par la Société Biosearch Inc., USA. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention bloquent la multiplication des cellules, notamment des cellules tumorales in vivo. Bien que leur mécanisme d'action ne soit pas entièrement élucidé, on pense qu'elles inhibent l'adhésion des cellules cancéreuses à la matrice extracellulaire. Dans la mesure où on a mis en évidence que la séquence d'acide nucléique (a) est un oligonucléotide antisens dirigé contre le gène de la protéine de 190 kDa mentionnée ci-dessus, on peut alors émettre l'hypothèse selon laquelle la protéine 190 kDa représente le carrefour où se rejoignent les voies de signalisation dépendantes des intégrines (protéines membranaires responsables de l'adhésion des cellules sur la matrice extracellulaire) et celles impliquant la réponse aux hormones et facteurs de croissance. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention sont donc indiquées comme agent anti-multiplication cellulaire, en particulier comme agent anti-tumoral. Elles sont également indiquées comme agent anti-angiogénèse. On a par ailleurs constaté la repousse des poils chez des souris nude traitées avec les séquences d'acides nucléiques selon l'invention. Celles-ci sont donc également indiquées dans le traitement de la calvitie et de l'alopécie. Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un outil de laboratoire constitué par une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, notamment pour l'étude in vitre des voies de signalisation impliquant la protéine 190 kDa (par exemple sur des cellules, tumorales ou non, transfectées par une des séquences (a), (b) ou (c)), mais également pour l'étude in vivo des voies de signalisation impliquant la protéine 190 kDa dans un grand nombre de phénomènes physiologiques et pathologiques (tcls que la canccrogéncsc), essentiellement à partir du rapport kinase/phosphatase. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention sont notamment des principes actifs de compositions pharmaceutiques, dont la toxicité est compatible avec leur utilisation en tant que médicaments. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant, en tant que principe actif, une séquence d'acide nucléique telle que définie précédemment, mélangée avec tout excipient pharmaceutiquement acceptable. Les compositions ci-dessus sont plus particulièrement réalisées de manière à pouvoir être administrées par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou transdermique. Pour une telle administration, on utilise notamment des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. La dose unitaire usuelle à administrer contient généralement de 0,01 mg à 50 mg de principe actif. L'invention est illustrée par les exemples ci-après, dans lesquels on désigne par "oligonucléotide" ou "oligonucléotide (a)" la séquence d'acide nucléique (a). Exemple 1 : mise en évidence de la protéine 190 kDa dans les cellules tumorales humaines La protéine 190 kDa a été mise en évidence de la manière suivante Des cellules issues de mélanome humain, préparées selon la méthode décrite dans J. Inv. Dermatol., 1991, 96, N02, 238-242, sont mises en suspension dans un tampon phosphate (PBS) contenant 200 g/ml soit de RGDS, soit de YIGSR, à raison de 2 x 107 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est ensuite incubée à température ambiante pendant 30 min. Après cette incubation, les cellules sont récupérées par centrifugation à 1000 g pendant 10 min. et sont mises en suspension dans un tampon de lyse cellulaire contenant de l'orthovanadate de sodium.Cette solution est ensuite clarifiée par centrifugation à 14 000 g pendant 15 min. Le sumageant ainsi obtenu est utilisé pour extraire les protéines phosphorylées au niveau de la tyrosine. Cette extraction est réalisée après une immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-phosphotyrosine (Sigma). Après addition de l'anticorps anti-phosphotyrosine, le surnageant est incubé pendant 2 h à température ambiante puis centrifugé à 14 000 g pendant 15 min.Le précipité obtenu est repris avec une solution d'élcctrophorèse contenant 2 % SDS et 15 mM de dithiothréitol, chauffé à 100 C pendant 5 min. puis déposé en gel de polyacrylamide (gradient de 4 à 15 % cn acrylamidc) dans des conditions dénaturantcs (en présente de 2 % SDS). Après migration et révélation du gel par le nitrate d'argent, on constate la présence d'une protéine de poids moléculaire 190 kDa dans les préparations issues des cellules de mélanome traitées avec le RGDS ou traitées avec le YIGSR; cette protéine est absente de la préparation issue des cellules de mélanome incubées seulement dans du PBS. Exemple 2 : Evaluation de l'activité in vitro de l'oligonucléotide (a) Des cellules de mélanome humain (cf. exemple 1) sont transfectées par l'oligonucléotide. La transfection est réalisée de la façon suivante : les cellules de mélanome humain sont mises en suspension dans une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 100 ,ug d'oligonucléotide/ml de PBS. La suspension est alors incubée à température ambiante pendant 2 heures. Après incubation, les cellules sont récupérées par centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes. On a ensuite testé l'effet de la transfection par l'oligonucléotide des cellules de mélanome humain sur l'adhésion de ces cellules à une matrice extracellulaire : le Matrigel (commercialisé par la Société Bccton Dickinson), dans les conditions suivantes A partir d'une solution de Matrigel (10 mg/ml) dans le PBS, des échantillons ont été placés dans une plaque de microtitration à 96 puits à raison de 50 ,t'l/puits. La plaque est incubée à 37- C pendant 2 h puis lavée trois fois avec un tampon phosphate (PBS) pour éliminer le produit non adsorbé.Les cellules de mélanome (transfectées par l'oligonucléotide pour les tests, ou non transfectées pour les contrôles) qui se trouvent en suspens ion dans du tampon phosphate (PBS) à raison de 106 cellules/ml, ont été distribuées à raison de 50 ,t'l/puits. Après élimination des cellules non adhérentes par trois lavages au tampon phosphate (PBS), la densité optique obtenue pour les puits contenant des cellules transfectées par l'oligonucléotide est comparée avec celle obtenue pour les puits contenant des cellules non transfectées. A la lecture des résultats, il apparaît alors que la transfection des cellules de mélanome humain par l'oligonucléotide inhibe l'adhésion de ces cellules sur le Matrigel. Lorsque l'on tente de cultiver les cellules de mélanome humain après transfection par l'oligonucléotide on observe une inhibition de la multiplication de ces cellules. Exemple 3 : Evaluation de l'activité in viwo de l'oligonucléotide (a) Cinq lots de souris nude ont été utilisés. Il y avait 5 souris par lot. Lot N 1 : Ce lot a servi de témoin. Chaquc souris est inoculée en sous-cutané à JO avec 200,ut d'une suspension de cellules dc mélanome B16 (fournics par l'Institut Gustave Roussy de Villcjuif) dispersées dans du PBS à raison de 106 cellules/ml. Ces souris ne sont pas traitées par la suite. Lot N 2 : Chaque souris est inoculée en sous-cutanée à JO avec 200 Fl d'une suspension de cellules de mélanome B16 dispersées dans le PBS à raison de 106 cellules/ml. A J1, J2 et J3 chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de 200 jtl d'une solution d'oligonucléotide diluée dans le PBS à raison de 500,ug/ml. L'injection d'oligonucléotide est effectuée à proximité du site d'injection des cellules. Lot N 3 : Les cellules de mélanome B16 utilisées pour inoculer les souris de ce lot ont été auparavant transfectées par l'oligonucléotide. Pour que s'opère la transfection, les cellules de mélanome B16 ont été suspendues dans une solution d'oligonucléotide dilué dans le PBS à raison de 500,ug/ml pendant 2 heures à température ambiante. Après cette incubation chaque souris est inoculée à JO avec 200 l de cette suspension de cellules transfectées dans le PBS à raison de 106 cellules/ml. Lot N 4: Les cellules de mélanome B16 utilisées pour inoculer les souris de ce lot ont été, elles aussi, préalablement transfectées par l'oligonucléotide. Pour que s'opère la transfection, les cellules de mélanome B16 ont été suspendues dans une solution d'oligonucléotide dilué dans le PBS à raison de 500 Hg/ml pendant 2 heures à température ambiante. Après cette incubation, chaque souris est inoculée à JO avec 200,ul de cette suspension de cellules transfectées dans le PBS, à raison de 106 cellules/ml.A J1, J2 et J3 chaque souris reçoit une injection de 200 jtl d'une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 500,ug/ml. L'injection est effectuée selon les mêmes modalités que pour le lot N 9. Lot N 5 : Les souris de ce lot ne sont pas inoculées avec les cellules de mélanome B16. Cependant, chacune de ces souris reçoit une injection de 200 ;l d'une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 500,ug/ml; les injections sont faites à J1, J2 et J3. Les résultats sont les suivants Après inoculation, chez les souris du lot N 1, la masse tumorale se développe d'une façon très rapide. En effet, la masse tumorale atteint une taille de 1,6 à 2,5 cm de diamètre après dix jours chez les souris du lot Nv 1 (souris non traitées). L'évolution dc la masse tumorale chez les souris du lot N 2 (souris traitées après inoculation par injections d'oligonucléotide à J1, J2 et J3), comme chez les souris de lot N 3 (souris inocules avec des cellules dc mélanome B16 préalablement transfectées par ltoligonucléotide) montre une moindre augmentation nette du volume de la masse tumorale. La masse tumorale chez les souris des lots 2 et 3 ne dépasse pas 1 cm de diamètre au dixième jour. Au quatorzième jour, la différence entre les souris des lots N 2 et 3 d'une part, et les souris du lot N 1 d'autre part, est remarquable. Chez les souris du lot N' 4, on remarque qu'il n'y a pratiquement pas d'évolution de la masse tumorale jusqu'au quatorzième jour après l'inoculation des souris par les cellules de mélanome B16. Après cette période, chez certaines souris la masse tumorale commence à se développer alors que chez d'autres le développement de la masse tumorale n'est perceptible qu'au 40-42ème jour. Chez les souris du lot N' 5 (souris n'ayant pas reçu de cellules de mélanome B16, niais traitées par injections d'oligonucléotide pendant trois jours) on note un effet général inattendu sur la peau. Il est identique à celui noté chez toutes les souris qui ont été traitées par l'oligonucléotide (lots 2 et 4). La peau prend un aspect vieilli, fripé. On note aussi l'apparition de poils chez toutes les souris traitées. Il existe un parallélisme au cours de l'évolution entre la régression des signes cutanés et la reprise de la croissance tumorale. On constate donc que la séquence d'acide nucléique (a) selon l'invention inhibe la multiplication des cellules de mélanome humain in vitro ; elle possède d'autre part une activité anti-tumorale in vivo remarquable et permet même la repousse des poils chez la souris nude. REVENDICATIONS 1. Séquence d'acide nucléique choisie parmi (a)S'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3' (b) les fragments de (a) qui comportcnt au moins 21 bases ; et (c) les séquences d'acidc nucléique qui hybrident dans des conditions strictes avec (a) ou (b), pour son utilisation comme substance thérapeutiquement active. 2. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle toui ou partie des liaisons phosphodiester sont protégées. 3. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'extrémité 5'- et/ou 3'- est protégée. 4. Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation comme agent anti-multiplication cellulaire. 5. Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation comme agent anti-tumoral. 6. Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation comme agent anti-angiogénèse. 7. Séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation dans le traitement de la calvitie ou de l'alopécie. 8. Composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, une séquence d'acide nucléique telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, mélangée avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 9. Outil de laboratoire constitué par une séquence d'acide nucléique telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.