Brevet FR2733666A1 — publié le 19961108

La présente invention concerne un procédé de sélection d'une cellule végétale résistante à une infection par le champignon Mvcosphaerella ou le champignon Fusarium. un procédé de production d'un végétal résistant à une infection par le champignon Mvcosphaerella ou le champignon Fusarium une cellule végétale résistante au champignon Mycosphaerella ou au champignon Fusarium et un végétal régénéré à partir d'une telle cellule végétale. Les bananiers et les plantains (genre musa) sont dans le monde entier parmi les cultures les plus importantes d'aliments de base. L'incidence de diverses maladies et insectes nuisibles sur la culture des bananiers et des plantains entraîne des pertes économiquement significatives pour ce qui concerne les aliments et les revenus. Parmi les maladies fongiques principales ayant une importance économique, qui infectent le genre musa. la maladie dite de Black Sigatoka provoquée par M. fijiensis (Morelet (1969) (2e note) Annales de la Société des Sciences Naturelles et d'Archéologie de Toulon et du Var 21:104-108) et la fusariose provoquée par Fusarium oxvsporum f. sp. cubense constituent un pro blème pour la culture en continu des bananiers.En général, la maladie de Black Sigatoka reste la maladie la plus importante et la plus destructrice des bananiers et des plantains en Afrique tropicale, dans les îles du pacifique et en Amérique Centrale et la maladie constitue une menace pour la production des bananiers et des plantains du point de vue du commerce et de la subsistance. Dans les conditions naturelles, M. fij iensis présente un cycle asexué et un cycle sexué. I1 produit des ascospores et des conidies qui sont dispersées par le vent, l'eau et les feuilles infectées. On pense qu'une dissémination à longue distance est due au mouvement des insectes suceurs de bananes infectées ou des feuilles malades (ascospores et conidies). Le champignon induit des stries foliaires avec une chlorose subséquente et une réduction du taux d'assimilation net limité par la lumière. Cela entraîne habituellement une capacité diminuée de photosynthèse et éventuellement dans certains cas une maturation prématurée des fruits sur le tronc. Dans les cultivars très sensibles, cela peut entraîner de plus un affaissement du végétal.Des pertes de rendement de 30 à 50 % ou davantage ont été indiquées dans des petites exploitations (Stover, R. et Simmonds, N. (1987) dans : Bananas. Longmans Science and Technical, Harlow, p. 468). Historiquement, le procédé le plus efficace de lutte contre la maladie Black Sigatoka a consisté à utiliser des fongicides systémiques qui appartiennent aux groupes chimiques du benzimidazole (Benlate), du tridemorph (Calixin) et du triazolepropiconazole (Tilt). Les préoccupations environnementales et économiques concernant l'utilisation des pesticides et les résidus ont toutefois favorisé récemment la mise au point de formes biologiques de lutte contre la maladie. Parmi les formes biologiques de lutte contre la maladie, la sélection de génotypes végétaux résistant à des agents pathogènes a constitué une priorité pour ce qui concerne les études d'amélioration des récoltes. La pression de sélection peut être exercée pour les agents pathogènes fongiques sur les végétaux par le biais du mycélium, des conidies, des spores ou des ascospores. L'utilisation de l'agent pathogène lui-même sur la surface en tant qu'agent de sélection dans des études in vitro semble être l'approche la plus directe. Toutefois, cette approche n'est pas classiquement utilisée. Le criblage précoce de plantules in vitre résistant à toute maladie a été rendu possible par l'utilisation de toxines purifiées ou de filtrats de culture provenant d'agents pathogènes.Un avantage majeur de la sélection par des toxines in vitre sur la sélection par des agents pathogènes consiste en ce que de nombreuses toxines ont un rôle au niveau cellulaire, de sorte que la sélection peut être effectuée sur une plus large gamme d'unités sélectives. Il a été décrit dans la littérature que les symptômes de la maladie de Black Sigatoka sur les bananiers et les plantains pouvaient être induits par des filtrats bruts, ce qui suggère la présence d'une ou plusieurs phytotoxines pour le développement des symptômes. Strobel et al. ((1993) The phytotoxins of Mycosphaerella fijiensis dans: Biotechnology application for banana and plantain improvement INIBAP, France, p. 251) ont isolé 6 composés actifs à partir de l'agent pathogène Mvcosphaerella fijiensis. Les composés sont la 2,4,8trihydroxytétralone, la juglone, l'acide 2-carboxy-3-hydroxycinnamique, le 2carboxy-3-méthoxycinnamate de diméthyle, l'acide isochracinique et la 4hydroxycystalone. Ces substances appartiennent à différentes classes chimiques. La juglone et la 2,4,8-trihydroxytétralone sont des dérivés des composés polycétoniques. Les toxines peuvent être de plus séparées en deux groupes en tenant compte de la sélectivité vis-à-vis de l'hôte. Le premier groupe, à savoir les composés sélectifs vis-à-vis de l'hôte, n'est constitué que d'un composé, à savoir la 2,4,8-trihydroxytétralone. Tous les autres composés, y compris la juglone, appartiennent au deuxième groupe constitué des toxines qui ne sont pas sélectives visà-vis de l'hôte. Tous les isolats fongiques de Mvcosphaerella fijiensis produisent les toxines mentionnées ci-dessus. La concentration des différents composés varie entre les différents isolats provenant d'endroits différents. La fusariose ou maladie de Panama provoquée par Fusarium oxysporum f. sp. cubense constitue la deuxième maladie principale affectant les bananiers et les plantains. On connaît quatre sortes de ce champignon (Moore et al. (1995) Disease Fact Sheet n 5, INIBAP, Montpellier, France, p. 4). Les symptômes externes de la maladie comprennent le jaunissement des bords de feuilles pour les feuilles les plus vieilles. Les feuilles s'affaissent progressivement au niveau du pétiole ou, plus communément, vers la base de la mi-nervure et elles penchent pour former une jupe de feuilles mortes autour de la pseudotige. Les symptômes internes sont caractérisés par une décoloration vasculaire commençant avec le jaunissement du tissu vasculaire dans les racines. Un végétal de type bananier ou plantain sensible, infecté par la maladie, survit rarement. Il a été indiqué que Fusarium oxvsporum produisait la toxine fongique acide fusarique in vitre (Matsumoto et al. (1995) Euphytica 84:67-71). Ce composé se trouve parmi les toxines responsables des symptômes de la fusariose chez les végétaux (Davis (1969) Phytopathology 59:1391-1395). De même que la maladie de Black Sigatoka, la fusariose est combattue au moyen de fongicides systémiques. Des filtrats de culture partiellement purifiés ou bruts, qui contiennent une toxine fongique, ont été utilisés antérieurement dans des techniques de sélection pour produire des espèces végétales résistantes, comme par exemple la pomme de terre, le maïs et le tabac (Daub (1986) Annu. Rev. Phytopathol. 24, 159-186). Les techniques de sélection dans la plupart des végétaux ont été réalisées en utilisant des cultures de cals. Dans une approche plus récente, des microcoupes ont été introduites en tant que nouvelle source de produit végétal de façon prédominante pour des études physiologiques. Les microcoupes sont des couches ou tranches cellulaires minces (de 5 à 8 cellules d'épaisseur) coupées à l'aide d'un microtome ou manuellement à partir de pousses méristématiques d'un végétal (Hicks, G. (1980) Botanical Review 46:1-23). Ces couches cellulaires minces sont capables de régénérer des bourgeons sur un milieu de culture tissulaire approprié. Les microcoupes isolées à partir de méristèmes, par comparaison à des tissus vivants entiers en milieu artificiel, offrent l'avantage qu'elles sont physiologiquement homogènes. Elles sont de plus capables de réaliser un transport des toxines fongiques de meilleure façon que les tissus vivants entiers en milieu artificiel.De plus, elles sont relativement exemptes d'effets de corrélation entre tissus et elles présentent un faible entraînement des substances régulatrices endogènes compliquées. Les résultats utilisant des couches cellulaires minces sont de plus très reproductibles par rapport aux résultats avec les tissus vivants entiers en milieu artificiel. Ainsi, selon selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de sélection d'une cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvoosphaerella et et de Fusarium. lequel procédé comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium et (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon. Selon un deuxième aspect, l'invention propose un procédé de production d'un végétal résistant à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. lequel procédé comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon et (3) régénérer le végétal à partir de la cellule végétale résistante. Selon un troisième aspect, l'invention propose une cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mycosphaerella et de Fusarium. produite par le premier procédé décrit ci-dessus. Selon un quatrième aspect, l'invention propose un végétal régénéré à partir d'une cellule végétale telle que décrite ci-dessus. Selon un cinquième aspect, l'invention propose l'utilisation d'une toxine provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium dans un procédé de sélection d'une cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. comme décrit ci-dessus, ou son utilisation dans un procédé de production d'un végétal résistant à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et et de Fusarium, comme décrit ci-dessus. Le végétal appartient de préférence à la classe des monocotylédones; mieux, c'est un élément de la famille des musacées, comme le bananier et le plantain, et encore mieux un membre du sous-groupe cavendish. Le champignon Mvcosphaerella est de préférence Mvcosphaerella fi)iensis. Mycosphaerella fiiiensis est de préférence un isolat d'barrique occidentale ou d'Afrique centrale, mieux il est choisi parmi les cultivars de plantain et de bananier Agbaba, Bobby Tanap ou de bananier de type cavendish. Le champignon Fusarium est de préférence Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Fusarium oxvsr > orum f. sp. cubense est de préférence un isolat d'Afnque du sud, mieux il est choisi parmi les bananiers de type cavendish. On peut mettre en oeuvre l'étape (1) en cultivant la microcoupe sur un milieu contenant la toxine fongique. Le milieu est de préférence un milieu de Murashige et Skoog, adapté à une régénération de végétaux, et de préférence il a une concentration en toxine de 6,ug/ml pour une toxine non sélective ou de 14,ag/ml pour une toxine sélective. On produit de préférence la microcoupe en utilisant un microtome. On peut également produire la microcoupe en réalisant une coupe manuelle. La toxine peut être toute toxine adaptée provenant d'un champignon Mycosphaerella ou d'un champignon Fusarium. La toxine peut être une toxine non sélective vis-à-vis de l'hôte, de préférence la toxine juglone ou acide fusarique, ou une toxine sélective vis-à-vis de l'hôte, de préférence la toxine 2,4,8-trihydroxytétralone, ou bien la toxine peut être une association d'une toxine non sélective vis-à-vis de l'hôte, de préférence la toxine juglone ou acide fusarique, et d'une toxine sélective vis-à-vis de l'hôte, de préférence la toxine 2,4,8trihydroxytétralone. On peut mettre en oeuvre l'étape (2) du procédé de l'invention en choisissant un bourgeon qui se développe à partir de la microcoupe traitée ou qui se développe à partir d'un cal provenant de la microsection transversale traitée. Dans l'étape (3) du deuxième procédé de l'invention, un végétal est régénéré à partir de la cellule végétale résistante, par exemple du bourgeon, par des techniques classiques. Le végétal régénéré à partir de la cellule végétale résistante, par exemple du bourgeon, présentera une résistance accrue à une infection par un champignon hycosphaerella ou un champignon Fusarium. Les techniques qu'on peut utiliser pour atteindre les divers aspects de l'invention vont être décrites ci-dessous. Prét > aration des microcoupes On a obtenu des microcoupes, qui sont des couches ou tranches cellulaires minces (de 5 à 8 cellules d'épaisseur) de tissu méristématique, avec un microtome à partir des pousses méristématiques du bananier du sous-groupe cavendish, variété Williams. On a ajusté le microtome pour couper des couches cellulaires minces comprises entre 100 et 200,ut. On a placé ces couches cellulaires minces sur un bain stérile contenant du milieu liquide de Murashige et Skoog (MS).Ces couches cellulaires minces étaient capables de régénérer des bourgeons sur du milieu de multiplication MS contenant de la 6benzylaminopurine (BAP, 10/zM), de l'acide indolacétique (IRA, 10ssM) et un mélange de vitamines, comme indiqué par Okole, B. (1995) (Thèse, Berlin, Allemagne). On peut encore obtenir des microcoupes à l'aide d'un scalpel en utilisant une échelle millimétrée sous une boîte de Petri pour permettre un dimensionnement précis. Isolement de la toxine et purification On a cultivé un isolat fongique de Mvcosphaerella fijiensis dans un flacon de Duran (1 I) contenant 150ml d'un milieu liquide MID modifié (Pinkerton, F. et Strobel, G. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73:4007-4011). On a incubé la culture fongique pendant 32 j dans une secoueuse rotative à 140 trimin. On a ajusté la température entre 26 et 28-C avec un régime lumière/obscurité de 16/8 h dans une enceinte de croissance. On a réalisé l'extraction de la toxine selon la technique décrite par Strobel et al. (1993) (The phytotoxins of Mycosphaerella fijiensis dans : Biotechnology application for banana and plantain improvement. INIBAP, France, p. 251) en utilisant du méthanol et de l'acétate d'éthyle pour l'extraction. On a tout d'abord partiellement purifié par chromatographie sur couche mince l'extrait à l'acétate d'éthyle concentré, puis on l'a purifié par chromatographie liquide haute pression (CLHP). On a finalement identifié différents composés de la toxine par résonance magnétique nucléaire (RMN). Deux toxines intéressantes utilisées dans cette étude étaient la 2,4,8-trihydroxytétralone, qui est une toxine sélective vis-à-vis de l'hôte, et la juglone qui est une toxine non sélective vis-à-vis de l'hôte. On a cultivé Fusanum oxysporum f. sp. cubense dans un Erlenmeyer de 250 ml contenant 150 ml d'un milieu liquide de Czapex Doz. On a incubé la culture pendant un maximum de 21 j entre 26 et 280C avec un régime lumière/obscurité de 16/8 h dans une enceinte de croissance. On a réalisé l'extraction de l'acide fusarique en suivant le procédé indiqué par Davis (Davis (1969) Phytopathology 59:1391-1395). Sélection des lignés cellulaires résistantes On a utilisé un système de sélection unique pour sélectionner les lignées cellulaires résistantes de bananier. On a placé les microcoupes (200,ut), à partir desquelles les bourgeons ont pu être régénérés, dans un milieu contenant la toxine 2,4,8-trihydroxytétralone (12-14ssg/ml) et/ou la juglone (6g/ml) ou l'acide fusarique (1 fzg/ml). On a ensuite placé les coupes sous la lumière pendant 2 j. Après traitement par une toxine, on a transféré les coupes sur un milieu exempt de toxines. Les bourgeons, qui se sont développés à partir de certains tissus bruns traités par la toxine, se sont régénérés en plantules sur le milieu MS exempt de toxines. On a mis en oeuvre un deuxième procédé de sélection d'une lignée cellulaire résistante en utilisant des microcoupes de bananier qu'on a fait passer par une phase de cal pour accroître les cas de mutation. Pour ce faire, on a transféré les microcoupes, qui ont d'abord été traitées par les toxines comme décrit ci-dessus, sur un milieu induisant le cal qui contenait les phytohormones dicamba (10 ftM) et acide indolacétique (10 fi). Les plantules se sont régénérées à partir de méristémoides blancs résistant aux toxines, qui sont de petits groupes organisés de cellules méristématiques qui se développent habituellement à partir des microcoupes. Criblage in vivo des végétaux résistants On a réalisé le criblage des bananiers, qui se sont régénérés à partir des zones résitantes des microcoupes, en prenant en compte la résistance fongique avec une suspension d'ascospores et de conidies de Mycosphaerella fijiensis ou Fusarium oxvsporum. On a préparé la suspension d'ascospores et de conidies de 4 x 104 spores/ml et 4,6 x t04 spores/ml à partir de boîtes fraîchement cultivées de Mycosphaerella fXiensis et de Fusarium oxvsr > orum. respectivement. Pour la préparation, on a séparé par lavage les conidies et les ascospores à partir d'une boîte contenant du milieu PDA (dextrose de pomme de terre-gélose) en utilisant une brosse à poils de chameau et on les a mélangées avec un homogénéisateur Janke et Kunkel Ultra-Turrax T25. Pour Mvcosphaerella on a d'abord nettoyé la cire des feuilles à inoculer avec la brosse à poils de chameau. On a mis en oeuvre l'inoculation des bananiers en frottant la suspension de spores sur les côtés inférieur et supérieur des feuilles de bananiers. On a ensuite maintenu les végétaux pendant 2 j dans une enceinte de croissance présentant une humidité relative élevée de 95 %. On a ensuite réduit l'humidité entre 60 et 70 %, et on a maintenu une température comprise entre 26 et 280C avec un régime lumière/obscurité de 16/8 h. On a pu observer des symptômes, tels que chlorose des végétaux, lésions foncées sur les feuilles et verticiliose du végétal, qui résultent de l'infection fongique, environ 40 à 60 j après inoculation dans des végétaux témoins non sélectionnés. Pour Fusarium, on a légèrement écorché avec un scalpel les racines des végétaux sélectionnés pour ce qui concerne la toxine pour permettre la pénétration du champignon. On a réalisé l'inoculation des végétaux dans un milieu de croissance MS liquide pour végétaux se développant dans un système in vitro. lequel contenait les spores fongiques. On a enregistré des symptômes pathologiques des végétaux infectés artificiellement 8 semaines après inoculation. Les symptômes observés comprennent le jaunissement et la verticiliose des feuilles et la décoloration vasculaire. Chez les végétaux qui ont été sélectionnés pour la résistance aux toxines de Mycosphaerella ou Fusanum. on n'a pas pu observer de symptômes significatifs liés à la maladie après traitement par des spores fongiques. REVENDICATIONS 1. Procédé de sélection d'une cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mycosphaerella et de Fusarium, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium et (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape (1), la toxine fongique est choisie dans le groupe constitué de la juglone provenant d'un champignon Mycosphaerella. de la 2,4,8-trihydroxytétralone pro- venant d'un champignon MvcosDhaerelL. d'un mélange de juglone et de 2,4,8trihydroxytétralone provenant d'un champignon Mycosphaerella et de l'acide fusarique provenant d'un champignon Fusanum. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, dans l'étape (2), on choisit un bourgeon qui se développe à partir de la microcoupe traitée ou qui se développe à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cellule végétale provient d'un végétal qui est un membre de la famille des musacées. 5. Procédé de production d'un végétal résistant à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et et de Fusarium caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon et (3) régénérer le végétal à partir de la cellule végétale résistante. 6. Procédé selon la revendicationS, caractérisé en ce que, dans l'étape (1), la toxine fongique est choisie dans le groupe constitué de la juglone provenant d'un champignon Mvcosphaerella. de la 2,4,8-trihydroxytétralone pro venant d'un champignon Mvcosphaerella! d'un mélange de juglone et de 2,4,8trihydroxytétralone provenant d'un champignon Mvcosphaerella et de l'acide fusarique provenant d'un champignon Fusarium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que, dans l'étape (2), on choisit un bourgeon qui se développe à partir de la microcoupe traitée ou qui se développe à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le végétal est un membre de la famille des musacées. 9. Cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium caractérisée en ce qu elle est produite par un procédé qui comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de wMycosphaerella et de Fusanum et (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon. 10. Végétal régénéré à partir d'une cellule végétale résistante à une infection par un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium caractérisé en ce qu'il est produit par un procédé qui comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon et (3) régénérer le végétal à partir de la cellule végétale résistante. 11. Utilisation d'une toxine provenant d'un champignon dans un procédé de sélection d'une cellule végétale résistante à une infection par un champignon, caractérisée en ce que le champignon est choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fyswanum et en ce que le procédé comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium et (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon. 12. Utilisation d'une toxine provenant d'un champignon dans un procédé de production d'un végétal résistant à une infection par un champignon, caractérisée en ce que le champignon est choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium et en ce que le procédé comprend les étapes consistant à (1) traiter une microcoupe provenant d'une partie quelconque d'un végétal dans le cas des dicotylédones ou d'un méristème dans le cas des monocotylédones par une toxine fongique provenant d'un champignon choisi dans le groupe constitué de Mvcosphaerella et de Fusarium. (2) choisir à partir de la microcoupe traitée ou à partir d'un cal provenant de la microcoupe traitée une cellule végétale qui est résistante au champignon et (3) régénérer le végétal à partir de la cellule végétale résistante.