Brevet FR2734825A1 — publié le 19961206

La présente invention a pour objet un procédé pour séparer la totalité de la mélanine présente dans des cellules. Ce procédé permet notamment d'étudier directement l'effet des modulateurs de la mélanogénèse. L'invention a également pour objet un procédé pour sélectionner des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse. Chez l'homme, la mélanine est synthétisée dans la peau par des cellules spécialisées, les mélanocytes, et transférée ensuite dans les kératinocytes voisines. Sa principale fonction biologique est la photoprotection via une absorption optique et une diffusion des rayons U.V.. On comprend ainsi l'intérêt de ce produit dans les domaines cosmétique ou dermatologique. La mélanine est un biopolymére granulaire insoluble dont sa structure chimique est encore mal définie. De nombreuses méthodes ont été décrites pour isoler, purifier et/ou quantifier la mélanine. Mais, du fait de la complexité structurelle de la mélanine et de son insobilité partielle, ces méthodes présentent le risque de ne pas avoir récupéré la totalité de la mélanine et/ou de l'avoir altérée structurellement de manière irréversible. La présente invention a donc notamment pour but de résoudre ces problèmes. De plus, du fait de l'implication de la mélanine dans le phénomène de coloration de la peau et des fibres kératiniques (cheveux ou poils), il serait intéressant de trouver une méthode permettant de sélectionner de manière simple et efficace des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse, et donc de modifier la coloration de la peau et/ou des fibres kératiniques. Ainsi, ces but et d'autres sont atteints par la présente invention qui a pour objet un procédé pour séparer la mélanine présente dans des cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) on lyse des cellules contenant de la mélanine avec une solution comprenant au moins une enzyme dégradant les protéines, (ii) on passe l'extrait obtenu à l'étape (i) sur un filtre échangeur d'anions dont le diamètre des pores est inférieur ou égale à 1 Fm, de préférence est inférieur ou égal à 0,60 lim. L'utilisation de ce filtre spécifique présente l'avantage de séparer toute la mélanine présente. La technique utilisée selon l'invention présente également l'avantage de ne pas devoir être à des conditions opératoires, telles que le pH et la température, extrêmes dénaturant structurellement et irréversiblement la mélanine. Ainsi, sans vouloir se lier à une quelconque théorie de l'invention, il semble que le type de filtre utilisé permet de fixer toute la mélanine et ceci de deux manières chimiquement pour la mélanine présente sous forme soluble et physiquement pour la mélanine présente sous forme granulaire. Les cellules utilisées sont d'origine humaine ou animale, on utilise préférentiellement les mélanocytes. Les cellules utilisées peuvent être seules (monoculture) ou en mélange avec d'autres types de cellules, telles que les kératinocytes et les cellules de Langerhans. On peut plus particulièrement utiliser un mélange de cellules comprenant des mélanocytes et des kératinocytes. Elles peuvent également être sous forme de peau naturelle (obtenue notamment par biopsie) ou de peaux reconstruites (telles que notamment décrites dans Skin Pharmacology, vol. 3, n" 2, 1990, pp. 40-85, Régnier M. et al.). Selon un mode particulier et préféré de réalisation du procédé selon l'invention, les cellules à lyser ont été préalablement mises dans un milieu de culture. Ce milieu de culture est un milieu nutritif au moins constitué des éléments nécessaires au maintien en survie de ces cellules. Bien entendu, il peut contenir tout autre élément nécessaire par exemple à la multiplication et à la croissance de ces cellules. II comprend avantageusement au moins un précurseur de la mélanine. On peut citer à titre d'exemple de milieu de culture bien connu de l'homme du métier, le milieu MEM modifié Dulbecco (DMEM), le milieu Williams E, le milieu F12, le milieu de HAM, ou encore le RPM11640, vendus par les sociétés Gibco-BRL, Biomed, Boehringer ou encore Sigma. La lyse des cellules est réalisée dans une solution comprenant au moins une enzyme dégradant les protéines. L'enzyme dégradant les protéines est de préférence un mélange non spécifique d'enzymes dégradant les protéines, tel que la protéinase k vendu par Boehringer. Une fois les cellules lysées, on passe le lysat sur un filtre échangeur d'an ions dont le diamètre des pores est inférieur ou égale à 1 clam, de préférence est inférieur ou égal à 0,60 pm. Préalablement à la filtration, et si nécessaire, la solution comprenant le lysat est avantageusement ajustée à un pH pour lequel la capacité d'échangeur d'an ions du filtre utilisé subsiste, ce pH dépendant bien entendu de la nature de la résine constituant l'échangeur d'anions. Parmi les échangeurs d'anions, on peut citer les résines comportant des bases, tels que des bases à groupements aminés, de préférence des bases correspondant à des amines tertiaires ou quaternaires. Avantageusement, on utilise des résines comportant des groupements diéthylaminoéthyle (DEAE). La résine comportant des bases peut être tout type de résine habituellement utilisée dans les échangeurs d'ions, tel que la cellulose. Ainsi, lorsque l'échangeur d'anion du filtre correspond à des résines comportant des groupements diéthylaminoéthyle (DEAE), le pH de la solution comprenant le lysat est avantageusement ajustée à un pH compris entre 7,5 et 8. Bien entendu, ce pH peut être ajusté, si nécessaire, lors de l'étape (i) dans laquelle la solution comprenant au moins un enzyme dégradant les protéines est alors tamponnée à un pH pour lequel la capacité d'échangeur d'anions du filtre utilisé subsiste. Selon une variante de l'invention, le procédé peut permettre de sélectionner des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse. Dans ce cas, le procédé comprend la mise en culture des cellules avant l'étape (i) en présence d'au moins un composé susceptible de moduler la mélanogénèse et une étape (iii) supplémentaire au cours de laquelle on évalue la quantité de mélanine fixée par ledit filtre. Selon ce mode particulier du procédé pour sélectionner des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse, le milieu de culture est tel que décrit ci-dessus, il comprend avantageusement au moins un précurseur de la mélanine. La mise en culture des cellules est avantageusement réalisée en présence de précurseurs marqués de la mélanine. Ainsi, la quantification peut se faire sur la mélanine marquée et donc sur la mélanine nouvellement synthétisée par les cellules mises en culture. Ce mode s'avère particulièrement intéressant lorsque l'on veut sélectionner et/ou étudier des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse. Parmi les précurseurs de la mélanine, on utilise plus particulièrement la tyrosine, la cystéïne, la thiouracile, la 3,4 dihydroxyphénylalanine (DOPA). De préférence, on utilise la thiouracile ou la DOPA. Plus particuliérement, on utilise la thiouracile, et ce surtout dans le cas où l'on réalise une culture de cellules comprenant à la fois des mélanocytes et des kératinocytes. Ces précurseurs peuvent être marqués radioactivement. La mesure de la quantité de mélanine fixée par ledit filtre peut être réalisée par toute méthode connue en soi. On peut notamment citer les méthodes de dosage par spectrocolorimétrie (appareil Microflash 200D vendu par la société Data Color International), par pesée ou encore par radioactivité. Lorsque l'on veut doser la mélanine nouvellement synthétisée ayant incorporé des précurseurs radiomarqués, on préfère utiliser le dosage radioactif. Dans le cadre du procédé pour sélectionner des composés susceptibles de moduler la mélanogénèse, I'étape (iii) d'évaluation consiste bien entendu en une comparaison de la quantité de mélanine fixée lors d'une culture de cellules en présence d'au moins un composé susceptible de moduler la mélanogénèse avec la quantité de mélanine fixée lors d'une culture de cellules sans composé susceptible de moduler la mélanogénèse. Dans tout ce qui suit ou ce qui précède les pourcentages sont exprimés en poids sauf mention contraire. L'invention est illustrée plus en détail dans les exemples suivants. EXEMPLE 1 Des mélanocytes normaux humains d'origine caucasienne ou noire sont cultivées dans un milieu dépourvu de sérum contenant 0,2mM de L-tyrosine sans ester de phorbol et sans extrait pituitaire, tel que décrit dans Lancet (1992) 340, 981 par Olsson, M.J. et al.. 4 Les cellules sont ensuite ensemencées dans 24 puits de culture (4.10 cellules par puit). et maintenues 3 jours dans le milieu décrit ci-dessus. Pour évaluer le taux de synthèse de mélanine, les cellules sont ensuite mises en culture pendant 3 jours dans un milieu constitué par: DMEM/F12 (1/1) de la société Gibco, 10 lg/ml de I3FGF (facteur de croissance des fibroblastes), 10 ng/ml d'EGF (epidermal growth factor) et 1 pCi/ml de C thiouracile et contenant soit : 0,2mM, 0,4mM, 0,6mM, 0,8mM ou 1mM de L-tyrosine, soit 1mM d'acide kojique avec 0,4mM de L-tyrosine. Le milieu (1ml/puit) est changé tous les jours. 18 heures avant le dosage, de la 3H leucine (1 CICi/ml) est ajoutée dans le milieu de culture pour évaluer la synthèse de protéine. L'excédant radioactif est retiré du milieu en lavant les cellules d'abord une fois avec Iml/puit de tampon phosphaté salin et ensuite deux fois avec îml d'acide trichloroacétique (5% en poids par volume). Les cellules sont ensuite incubées à 37"C pendant une nuit dans ImI de solution tamponnée à pH 7,8 à base de Tris-HCI (100mM) contenant 0,1% en poids de triton X-100, 10mM d'acide tétraacétique éthylènediamine (EDTA) et 100Clg de protéinase K (de la société Boehringer). Les filtres à membrane cellulosique DEAE qui ont été imbibés dans une solution tamponnée à pH 7,8 à base de Tris-HCI (100mM) sont placés sur une rampe de filtration. Ces filtres (vendus par la société Schleicher et Schuell) ont les caractéristiques suivantes : diamètre 2,5cm, taille des pores 0,45 clam, capacité d'ions échangeables 0,5 mmol/g, épaisseur 80-100Lm. Avant filtration du lysat obtenu ci-dessus, 50 jli sont retirés pour évaluer la quantité de protéine synthétisée basée sur l'incorporation de la 3H leucine. Après filtration du lysat, les filtres sont rincés deux fois avec 4m1 de solution tamponnée à pH 7,8 à base de Tris HCI (100mM). La radioactivité des filtres est ensuite comptée dans un compteur à scintillation liquide. Résultats La synthèse de la mélanine augmente avec l'augmentation en concentration de tyrosine (précurseur de la mélanine) dans le milieu de culture. Sa synthèse est par contre diminuée de 65% par rapport à sa synthèse dans un milieu contenant 0,4 mM de Ltyrosine et 1mM d'acide kojique, connu comme un inhibiteur de la mélanogénèse. De plus, la synthèse de mélanine est trois fois plus importante dans le cas des mélanocytes humains d'origine noire que dans le cas des mélanocytes humains d'origine caucasien ne. EXEMPLE 2 Des mélanocytes normaux humains d'origine caucasienne ou noire sont cocultivées avec des kératinocytes normaux humains d'origine caucasienne ou noire dans un rapport cellulaire 1/10. Le milieu de culture est celui décrit dans Cell, 6:33, 343, 1975 par Rheinwald J.-G. et Green H.. On applique ensuite exactement le même mode opératoire que dans l'exemple 1. Les résultats sont comparables à ceux de l'exemple 1. EXEMPLE 3 On utilise dans cet exemple un modèle de peau reconstruite tel que décrit dans le Journal of Investigative Dermatology, Vol. 102, 1994 par Régnier M. et Schmidt R.. Ce modèle présente l'avantage d'être plus proche des conditions in vivo. Notamment, I'épiderme reconstruit est couvert d'une couche cornée et permet l'application topique de produits formulés (tels que des produits comprenant des écrans solaires). On applique exactement le même mode opératoire que dans l'exemple 1, en détachant l'épiderme avant la lyse des cellules avec la protéinase K. Les résultats montrent une modulation de la mélanogénèse comme dans les exemples précédents. REVENDICATIONS 1- Procédé pour séparer la mélanine présente dans des cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) on lyse des cellules contenant de la mélanine avec une solution comprenant au moins une enzyme dégradant les protéines, (ii) on passe l'extrait obtenu à l'étape (i) sur un filtre échangeur d'anions dont le diamètre des pores est inférieur ou égale à 1 m. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le diamètre des pores est inférieur ou égal à 0,60 lm. 3- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules sont des mélanocytes. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme dégradant les protéines est un mélange non spécifique d'enzymes dégradant les protéines. 5- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions est une résine comportant des bases à groupements aminés. 6- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions est une résine comportant des groupements diéthylaminoéthyle. 7- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, avant l'étape (i), les cellules sont mises dans un milieu de culture. 8- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend des précurseurs de la mélanine. 9- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les précurseurs de la mélanine sont marqués radioactivement. 10- Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le précurseur de la mélanine est choisi parmi la tyrosine, la cystéïne, la thiouracile et la 3,4 dihydroxyphénylalanine. 11- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le précurseur de la mélanine est la thiouracile ou la 3,4 dihydroxyphénylalanine. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la mise en culture des cellules est réalisée en présence de composés susceptibles de moduler la mélanogénèse. 13- Procédé pour sélectionner des composés modulant la mélanogénèse, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre le procédé selon la revendication 12, puis on évalue la quantité de mélanine fixée par ledit filtre. 14- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend des précurseurs radiomarqués de la mélanine et que l'évaluation de la quantité de mélanine fixée par ledit filtre se fait sur la mélanine radiomarquée.