Brevet FR2723749A1 — publié le 19960223

La présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'acétylcholine et à la protéine correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou desdits vecteurs à des fins thérapeutiques. L'acétylcholine, ACh, est un neurotransmetteur synthétisé par l'enzyme choline acétyltransférase, ChAT. Au niveau des extrémités des neurones cholinergiques, la majorité de l'ACh produite, est transportée du cytoplasme à l'intérieur des vésicules synaptiques. L'accumulation de l'ACh, au niveau de ces vésicules, passe par l'activité d'une ATPase qui pompe des ions H+ ce qui génère un gradient électrochimique (Anderson D. C.et al., (1982) Biochemistry 21, 3037-3043). Ce gradient est utilisé par un transporteur pour la capture de l'ACh via un échange de protons (Parsons S.M. et al., (1993), Int. Rev. neurobiol. 35, 279-390). Ce type de mécanisme est comparable à celui impliqué dans le transport des amines biogènes au sein des vésicules synaptiques. La compréhension des différents mécanismes de régulation, intervenant au niveau de l'expression de l'ACh, serait particulièrement précieuse sur un plan thérapeutique. Récemment, ont été clonés et séquences des ADNc codant pour des transporteurs vésiculaires de l'ACh chez Caenohabditis elegans et Torpedo (Alfonso A et al., (1993) Science 261, 617-619; Varoqui H et al., FEBS Letters 342, 97-102). L'étude des séquences des protéines correspondantes a révélé rexistence de similitudes structurales entre ces deux protéines de même que vis- à-vis de deux transporteurs vésiculaires d'amines biogènes de mammifères, les VMAT1 et VMAT2 (Liu et al., (1992) Cell 70, 539-551). Ces caractéristiques structurales communes sont notamment (i) 12 domaines transmembranaires (TM), (ii) la présence, dans ces domaines transmembranaires, de résidus d'acides aminés chargés qui interviennent vraisemblablement dans le transport de substrat, (iii) une boucle glycosylée localisée entre TM1 et TM2, et (iv) des extrémités C et N terminales cytoplasmiques qui présentent moins de similitudes que le reste de la protéine. La présente invention a plus particulièrement pour objet l'isolement, le séquençage et la caractérisation d'une région du gène codant pour la ChAT, capable d'exprimer un transporteur vésiculaire d'ACh ainsi que l'identification de séquences promotrices impliquées dans l'expression de ce transporteur. Elle décrit aussi des cassettes d'expression de ce gêne, des vecteurs le contenant et leur utilisation pour diriger l'expression de ce transporteur. Plus précisément, la présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'ACh caractérisée en ce qu'elle est localisée au sein du premier intron du gêne codant pour la ChAT, dans la même orientation transcriptionnelle. A partir de la région 5' du gène codant pour la ChAT de rat et plus précisément d'une carte de restriction de cette région, les inventeurs ont isolé un fragment HindiI- BamHI portant le premier intron de ce gêne et en partie les séquences des deux premiers exons R et N correspondants respectivement aux extrémités 5' et 3' de ce fragment. De manière inattendue, le clonage et le séquencage de ce fragment ont révélé la présence d'une phase ouverte de lecture de 1590 pb, codant pour une protéine de l'ordre de 530 acides aminés soit d'une masse de l'ordre de 56,5kDa et présentant des similitudes, au niveau de sa séquence avec des protéines du type transporteur. Cette protéine a été identifiée comme un transporteur vésiculaire d'ACh de rat et est désignée ci-après par rVAT. Cette séquence d'ADN est plus précisément localisée au sein du premier intron du gène codant pour la ChAT, en aval du promoteur de type R du gêne de la ChAT et dans la même orientation transcriptionnelle que le gène ChAT. Elle n'est interrompue par aucun intron. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour un transporteur vésiculaire d'ACh caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la SEQ ID N 1 ou l'un de ses dérivés. Préférentiellement, il s'agit de tout ou partie de la séquence SEQ ID N 2 ou l'un de ses dérivés. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du polypeptide correspondant pour son(ses) ligand(s), oelui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées. La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée, transcrite dans l'orientation inverse. Plus préférentiellement, il s'agit de la séquence nucléique codant pour le transporteur vésiculaire d'ACh de rat, la rVAT. Compte-tenu de la localisation du gène selon l'invention à savoir dans le premier intron du gène codant pour la ChAT, en aval du promoteur ChAT de type R et dans la même orientation transcriptionnelle, les inventeurs ont cherché à savoir si les ARNms ChAT et VAT pouvaient être exprimés à partir du même promoteur par épissage alternatif. Cette hypothèse a été vérifiée expérimentalement Deux formes d'ARNm codant pour le transporteur VAT ont été identifiées. Elles contiennent la séquence de l'exon R de type R1 ou R2 (de l'ARNm ChAT) (Kengaku et al. Mol. brain Res.18: 71- 76 (1993)) (figure 1) immédiatement suivie de la séquence d'un second exon débutant à 308pb en amont du codon d'initiation de la traduction (de VAT). Outre ces deux ARNm, il existe vraisemblablement au moins une troisième forme d'ARNm VAT apparemment, plus abondante que les deux formes précitées, codant pour le polypeptide objet de l'invention. La présente invention a également pour objet des régions promotrices impliquées dans l'expression de VAT et localisées dans le gêne codant pour la ChAT. Il s'agit plus particulièrement de la région promotrice comprenant tout ou partie de la SEQ ID n 3 ou un de ses dérivés. Il peut également s'agir d'une région promotrice localisée dans la SEQ ID n l. Au sens de la présente invention, région promotrice, désigne le ou les séquences responsables de l'expression de VAT. Il s'agit en particulier de séquences promotrices, d'activation, de régulation, et/ou de séquences permettant une expression tissu-spécifique. La SEQ ID N 3, est déjà connue pour contrôler l'expression du gène ChAT (Bejanin et al. J. Neurochem.58: 1580-1583 (1992)). De manière inattendue, cette région s'est révélée être également responsable de rexpression du gène codant pour le VAT et plus précisément d'au moins deux types d'ARNm VAT. Il a ainsi été mis en évidence que des ARNm VAT et ChAT peuvent être produits à partir du même promoteur ChAT de type R, par épissage alternatif. La présente invention a également pour objet rutilisation de ces régions promotrices pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes. Ces régions promotrices sont également avantageuses pour cibler rexpression d'une proteine dans les neurones cholinergiques. Bien entendu, ces régions promotrices sont particulièrement utiles pour diriger l'expression du gène codant pour le VAT, expression couplée le cas échéant avec celle d'un autre gène. L'invention concerne en outre un polypeptide impliqué dans le transport vésiculaire de l'ACh susceptible d'être exprimé par une séquence nucléique telle que décrite précédemment Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n 2 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques. La comparaison de cette protéine avec des protéines déjà connues à titre de transporteur d'ACh, comme celles de Torpedo ou Caenorhabditis elegans a permis de mettre en évidence certaines similitudes. C'est ainsi que la protéine selon l'invention possède environ 77%o d'homologie avec la protéine Torpedo et 56%o d'homologie avec la protéine Caenorhabditis elegans, sur 352 acides aminés. Dans le cas des homologies significatives précitées, on note en particulier que les 12 domaines transmembranaires, (TM), représentatifs des transporteurs déjà connus, existent dans la protéine selon l'invention. En particulier, sont présents les résidus d'acide aspartique des domaines transmembranaires 1, 6, 10 et 11 et le résidu lysine du domaine transmembranaire 2, qui, vraisemblablement, interviennent dans la liaison avec le substrat. La divergence importante, entre la protéine selon rinvention et les autres transporteurs connus, existe au niveau de la boucle hautement hydrophile, située entre les deux premiers domaines transmembranaires et les extrémités N- et C- terminales. Dans le cas de la présente invention, la boucle intègre deux sites potentiels de N-glycosylation. L'ensemble de ces observations démontre l'appartenance de la protéine revendiquée à la famille des transporteurs vésiculaires de neurotransmetteurs à 12 domaines transmembranaires. Plus précisément, il s'agit d'une protéine qui comprend tout ou partie de la SEQ ID N 1 ou N 2 ou l'un de leurs dérivés. Pour la définition du terme dérivé on se réferera à la définition soumise précédemment. Plus préférentiellement, il s'agit du transporteur vésiculaire de l'ACh de rat, désigné ci-après par rVAT. Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV), le virus de l'herpès, le cytomégalovirus (CMV), le virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088]. La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant. Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif. Le terme "virus défectif" désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. Il est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de linvention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Concernant les adénovirus, il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Par ailleurs, ces virus ne s'intègrent pas dans le génome des cellules qu'ils infectent, et peuvent incorporer des fragments importants d'ADN exogène. Parmi les différents sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions E1AetE1B. Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucléotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention. Elle se rapporte également à toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiqués pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux. Les exemples et figures présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. Figure. 1: Réprésentation schématique de la région 5' du gène ChAT de rat et des différents ARNm ChAT Les boites blanches et noires indiquent respectivement, les exons codants et non codants. R, N et M sont les 3 exons ChAT non codants. La phase ouverte de lecture de 1590pb, identifiée à partir du séquençage d'un fragment de gène HindII(H)- BamHI(B) de 3940 pb, est également représentée. Le codon d'initiation potentiel de la traduction, ATG (position + 1) est bordé par une cytosine (position -1) et deux résidus de guanosine (positions -3 et +4) qui concordent avec la séquence consensus de Kozak (Kozak M. J., Cell. Biol. 115, 887-903 1991). l est précédé d'un codon stop en phase situé 726pb en amont. La phase ouverte de lecture, est suivie par des séquences consensus de polyadénylation. La plus probable, désignée par PA (AATAAA), est située 389pb en aval du codon de terminaison. Eiggr. 2: Analyse par la technique de Northern de la distribution des ARNm-rVAT dans différents tissus de rat avec une sonde spécifique de la phase ouverte de lecture (position 31-1724 telle que définie en Fig. 1) Ligne 1: ARN poly (A)+ de moelle épinière (1 g); Lignes 2-11: 10 pg de: 2,3: ARN de moelle épinière (2 préparations différentes); 4: ARN de tronc cérébral; : ARN poly (A)+de glande surrénale; 6: ARN du bulbe olfactif 7: ARN de cervelet; 8: ARN de foie; 9: ARN de moelle épinière; : ARN poly(A)+ de la région septale; 11: ARN poly(A)+ de striatum. Les blots d'ARN sont préparés en présence de marqueurs de poids moléculaires d'ARN (Gibco BRL). Les lignes 1 à 8 et 9 à 11 représentent les résultats des deux expériences indépendantes. Les autoradiographies sont exposées pendant 3 jours à une température de -70 C avec un écran intensifiant Fgigure. 3: Diversité des ARNm-rVAT dans la moelle épinière de rat Y sont représentés les résultats d'analyse par Southern blot des produits d'amplification d'ADNc (lignes 1,2) et des produits SLIC (lignes 3,4). Les boîtes blanches et noires indiquent respectivement les exons non codants et codants. Les oligonucléotides utilisés pour la synthèse de l'ADNc (P), pour l'amplification (deux amorces sens 1,2 en amont et une amorce antisens commune L) et pour l'hybridation des Southern (H), sont schématisés par des flèches. L'ARN poly(A)+ est soumis à une synthèse de premier brin d'ADNc avec/ou comme contrôle sans transcriptase réverse. Les amplifications de l'ADNc (+) ou des contrôles (-) avec la paire d'oligonucléotides L et 1 ou 2 sont représentées respectivement, en lignes 1 et 2. Les amplifications avec des oligonucléotides L et A5'1 de l'ADNc (+) ou des contrôles (-), ligaturés ou non, sont présentées respectivement en lignes 3 et 4. Les barres verticales dans les exons R et rVAT représentent les sites d'épissage déduits des séquences des deux fragments d'ADN obtenus en ligne 1. Le site d'épissage en 5' dans l'exon R correspond à celui représenté en figure 1. La séquence consensus du site d'épissage en 3' est soulignée. La position du nucléotide situé le plus en 5' pour les produits SLIC séquences est indiquée par un astérisque. EXEMPLE 1 Synthèse du premier brin d'ADNc (extension d'amorce) et ligation d'un oligonucléotide à l'ADNc simple brin (SLIC). L'ARN est extrait de moelle épinière de rat en utilisant la méthode RNAzol (System Bioprobe). L'ARN poly(A)+ est purifié à raide du kit Dynabeads ) (Dynal). Le premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 1 Fg d'ARN poly(A)+ dans un tampon de transcription réverse en présence de 100 xg/ml BSA, 15 unités de RNasin (Promega), 14 mM de [3-mercaptoéthanol, lmM de dNTPs, 4 mM de pyrophosphate, 7,5 pM d'oligonucléotide amorce P (Fig. 3) et 40 unités de transcriptase réverse (RTase, Promega). Le mélange réactionnel est incubé 45 minutes à 42 C. Un contrôle est effectué en l'absence de RTAse. ADNc et contrôles sont chauffés 5 minutes à 95 C afin de dénaturer les hétéroduplex ADN-ARN, puis purifiés avec le Kit Prep-A- Gène (Biorad). Dans les expériences de SLIC, un oligonucléotide 50 mer (A5'NV) est ligaturé à l'extrémité 3' du premier brin d'ADNc purifié en utilisant l'ARN ligase de T4 (Boehringer) comme décrit dans la littérature (Dumas et ai., Nucleic Acids Res. 19 5227-5232, 1991). Un contrôle est effectué en absence de l'enzyme. Les produits de ligation et les contrôles sont ensuite purifiés en utilisant le Kit Prep-A-Gène. EXEMPLE 2. Expériences d'amplification Les ADNc et les produits de SLIC sont amplifiés dans un Techne Thermal Cycler (30 ou 40 cycles d'amplification respectivement). Chaque cycle consiste en: 45s à 94 C, 45s à 65 C et SOs à 72OC. Les amorces sens utilisées sont les suivantes: oligonucléotides 1 ou 2 pour les ADNc et l'oligonucléotide A5'1 (complémentaire d'une partie de A5'NV) pour les ADNc ligaturés en 3'. Une amorce antisens et commune L, est utilisée. Les produits d'amplification sont séparés sur gel d'agarose à 2% et analysés par la technique de Southern blotting en utilisant roligonucléotide H comme sonde. Les parties du gel contenant les bandes observées sont isolées et l'ADN qu'elles contiennent est purifié, sous cloné dans le plasmide pUC19 (Appligéne) et séquencé sur les deux brins au moyen du kit Sequenase (USB, Amersham). Les séquences et les positions (cf. figure 1) des oligonucléotides utilisés sont: 1 (-1486,5'-CTGTCGCTGCAAGCCAGGACTCT-3') 2 (-410, 5'-TGGAGGAAGAGGCAAGAGCGGA-3') H (+24, 5'-ACCGGTrGGCGCGGTGGGTrCCAT-3') L (+62, 5'-CACCGCTr CCGACAGTITTGGTG-3') P (+187, 5'-TGGGCGATATAGTCGG GAACAATG-3') A5'NV (5'-CTGCATCTATCTAATGCTCCTCTCGCTACCTGCTCACTCTGCGTGA CATC-3') A5'1 (5'-GATGTCACGCAGAGTGAGCAGGTAG-3') EXEMPLE. 3. Analyse de l'ARN Les ARN ou ARN poly(A)+ sont préparés à partir des tissus de rat comme décrit ci- dessus, fractionnés sur gel d'agarose (1 %)/formaldéhyde et transférés sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham) comme décrit dans la littérature (Faucon Biguet et al., EMBO J., 5 287-291 1986). Les filtres sont hybridés à 42 C, dans un tampon contenant 50 % (vol/vol) de formamide, à un fragment d'ADN SmaI- EcoRI (position 31-1724), marqué par amorçage aléatoire (19) avec (a- 32P) dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham) et ayant une activité spécifique de 1. 2 x 109 cpm/f4g. Les derniers lavages des filtres sont effectués à 65 C dans la solution 0.1 x SSC/0.1 % SDS. Abréviations utilisées: ChAT: choline acétyltransférase ACh: acétylcholine VMAT: transporteur vésiculaire des monoamines TM: domaine transmembranaire rVAT: transporteur vésiculaire de l'acétylcholine de rat SLIC: ligation du cDNA simple brin 1l LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM:CNRS (B) RUE: 15,Anatole-France (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75007 (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveau transporteur véiculaie d acétyldcholine. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:3926 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: rat (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AAGCTTCCAAGCCACTTGTGAGCCCACTCAGGGTTTGGAGGCGGACGGGGTGGGGGT GGGGTGGGGAAATGCAGAAAAGTGGGCGGAGGCTCTCAAGAGCCTAGGGAGGATAAG GTCTGGAAAGAAGAGGACCTGGGAGGAGTTAGATTGAGGAGTGGGAGAGTAGAAGGG GAGGGAAATAGGCGGGGCTGGAGGCCGGGGAGACCCGCGCACCGAAAAGCCCAAAGG GAGAGTCCAGGCAGGGGGAGGTCAAAAAGGGTTAGCGTTGACATCCAGGACCCTGGG TGCAGAGAAAGACTCCTCCTCTCAGTCCTCATACCCTCATAGTTCAGAATTAGCTGC CAAGACTTTCTGCCTAAGGGCGGTGGGTCGGAACCAGAGCCTGAAGGCTCTGTACCT 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GGGGCATGGAACCCACCGCGCCAACCGGTCAGGCCCGGGCGGCGGCCACCAAACTGT CGGAAGCGGTGGGAGCCGCGCTACAAGAGCCCCAGAGGCAGCGGCGCCTGGTGCTGG TCATCGTGTGCGTTGCACTGTTACTGGACAACATGTTGTACATGGTCATCGTGCCCA TTGTTCCCGACTATATCGCCCACATGCGCGGGGGCAGCGAGGGCCCGACCCTGGTCT CTGAGGTGTGGGAACCCACTCTGCCGCCGCCCACTCTGGCTAATGCCAGTGCCTACT TGGCCAACACGTCGGCGTCCCCGACGGCTGCCGGGTCGGCTCGGTCAATCCTGCGAC CTCGCTACCCCACAGAAAGCGAAGATGTGAAGATAGGTGTGCTGTTTGCCTCCAAGG CTATCCTGCAGCTTCTGGTGAACCCCTTAAGCGGGCCTTTCATTGATCGCATGAGCT ACGACGTGCCGCTGCTTATAGGCCTGGGCGTCATGTTCGCCTCCACAGTCATGTTTG CCTTTGCAGAAGACTATGCCACGCTCTTCGCTGCGCGCAGTCTACAAGGCCTGGGCT CGGCCTTCGCGGACACGTCTGGCATTGCCATGATCGCCGACAAGTATCCCGAGGAGC CTGAGCGCAGTCGTGCCCTGGGCGTGGCGCTAGCCTTTATTAGCTTTGGAAGCCTAG TGGCGCCACCGTTTGGGGGCATCCTCTACGAGTTCGCGGGCAAGCGTGTACCCTTTC TAGTGCTCGCCGCTGTGTCCCTTTTCGACGCGCTCCTGCTCCTGGCGGTGGCTAAGC CCTTCTCGGCTGCGGCTCGGGCGCGAGCCAACCTGCCGGTGGGCACACCTATCCATC GCCTCATGCTAGACCCTTACATCGCTGTGGTAGCCGGCGCGCTCACCACTTGTAACA TTCCCCTTGCGTTCCTCGAGCCCACCATAGCCACGTGGATGAAGCACACAATGGCCG CATCCGAGTGGGAGATGGGCATGGTTTGGCTGCCGGCTTTCGTGCCACACGTGTTAG GCGTCTACCTCACCGTGCGCCTGGCGGCGCGTTATCCACACCTGCAGTGGCTGTACG GCGCTCTCGGGCTAGCGGTAATTGGAGTGAGCTCTTGCGTCGTACCTGCCTGTCGCT CATTCGCGCCGTTAGTGGTCTCGCTCTGCGGACTCTGCTTCGGCATCGCGTTAGTGG ACACAGCGCTCCTACCCACGCTCGCCTTTCTGGTGGACGTGCGCCACGTATCCGTCT ATGGCAGTGTCTATGCCATAGCTGACATCTCCTATTCTGTGGCCTACGCGCTCGGGC CCATAGTGGCAGGCCACATCGTTCACTCTCTTGGCTTTGAGCAGCTCAGCCTGGGCA TGGGCCTGGCCAACCTGCTCTACGCACCAGTCCTTCTTCTTTTGCGCAATGTAGGCC TCCTTACACGCTCGCGTTCGGAGCGCGATGTGTTGCTTGATGAACCGCCGCAGGGTC TGTACGACGCGGTGCGCCTGCGTGAGGTGCAGGGCAAGGATGGCGGCGAACCTTGTA GCCCACCTGGCCCTTTTGACGGGTGCGAGGACGACTACAACTATTACTCCCGCAGCT AGCAGACCCGCTTCTCCTCCAGGCCACCTACCCGCCCCATTTAGGTCAAGATGGTCA TTCTGCAAGAGCACTGTCCAACTTTGGCTTGGGGCCCACCTCCTCTAATGAATACCC TAGCCCCTCGCCCGTCCTGAATTCCTTTGCTGGAATCCCTTCTCCATGACCCCTCCC AGTCTAGGCCCCTCCCAAACACACTCGTATTCATTGGGGAAATGGAGCAGGGAGGCA GAAGAAGCTGTTGGGCTCTTGGCAGAGGTGAAGAGGTGTGCGGGTGATCGCCAATCA CCTACTGAGAGCCCCCAAATAGAGTCATGCATCTGTTTGTCCTTCCTGCGGATCTTT CCAGTGCCAAACTTGGTCTCTGCACTCCGGTGCCTCCGGCCTGAATTAATAAACCAT ATCTATCTGAGGAGGCCGAGTCTCTTTACTGATGAGGGGTGGGTGGTGTGACACAAG ACCTAAGCACAGAGAAGGCTGCCTGGGTTTCACAGGTTCAGTCCAGACCTGAGGAGG AGGGGAAGCCTGAAGCGTCTTTGCTGCCTGGTAAAAGAACCCAAAGGAGGGCTCTCC CCCATGGATATTCAGAACACACACACACACACACACACTCACACACACACACACACA CACACACACACACACGAACGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGT CTCTCCCTTCCAAGTCCAGTGTAGCACCTGGAGGTTCCACCCGAGGGAGCCTGAGGA TCTGCCTGGCCTTGGAGGATAGCTGGCACCAGGAATTTTGGGTGCCAGGACTGGGCT TTCCTACACAGTGGGAACTCGCTTCATGTTGTCAAGAAAGGGAGCTGTTTTCTGCAG AGAAGAGGAGGTAGTCCCGTCTTTTAGGGTCCTGGCCTGGGGACAGTGTTCATTAAG GATTCAGGCTCTTTCTGTGAAGACTGAGAGGACACTTACCTGTGGATCC (3) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:1593 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: rat (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATGGAACCCACCGCGCCAACCGGTCAGGCCCGGGCGGCGGCCACCAAACTGTCGGAA GCGGTGGGAGCCGCGCTACAAGAGCCCCAGAGGCAGCGGCGCCTGGTGCTGGTCATC GTGTGCGTTGCACTGTTACTGGACAACATGTTGTACATGGTCATCGTGCCCATTGTT CCCGACTATATCGCCCACATGCGCGGGGGCAGCGAGGGCCCGACCCTGGTCTCTGAG GTGTGGGAACCCACTCTGCCGCCGCCCACTCTGGCTAATGCCAGTGCCTACTTGGCC AACACGTCGGCGTCCCCGACGGCTGCCGGGTCGGCTCGGTCAATCCTGCGACCTCGC TACCCCACAGAAAGCGAAGATGTGAAGATAGGTGTGCTGTTTGCCTCCAAGGCTATC CTGCAGCTTCTGGTGAACCCCTTAAGCGGGCCTTTCATTGATCGCATGAGCTACGAC GTGCCGCTGCTTATAGGCCTGGGCGTCATGTTCGCCTCCACAGTCATG'ITGCC T= GCAGAAGACTATGCCACGCTCTTCGCTGCGCGCAGTCTACAAGGCCTGGGCTCGGCC TTCGCGGACACGTCTGGCATTGCCATGATCGCCGACAAGTATCCCGAGGAGCCTGAG CGCAGTCGTGCCCTGGGCGTGGCGCTAGCCTTTATTAGCTTTGGAAGCCTAGTGGCG CCACCGTTTGGGGGCATCCTCTACGAGTTCGCGGGCAAGCGTGTACCCTTTCTAGTG CTCGCCGCTGTGTCCCTTTTCGACGCGCTCCTGCTCCTGGCGGTGGCTAAGCCCTTC TCGGCTGCGGCTCGGGCGCGAGCCAACCTGCCGGTGGGCACACCTATCCATCGCCTC ATGCTAGACCCTTACATCGCTGTGGTAGCCGGCGCGCTCACCACTTGTAACATTCCC CTTGCGTTCCTCGAGCCCACCATAGCCACGTGGATGAAGCACACAATGGCCGCATCC GAGTGGGAGATGGGCATGGTTTGGCTGCCGGCTTTCGTGCCACACGTGTTAGGCGTC TACCTCACCGTGCGCCTGGCGGCGCGTTATCCACACCTGCAGTGGCTGTACGGCGCT CTCGGGCTAGCGGTAATTGGAGTGAGCTCTTGCGTCGTACCTGCCTGTCGCTCATTC GCGCCGTTAGTGGTCTCGCTCTGCGGACTCTGCTTCGGCATCGCGTTAGTGGACACA GCGCTCCTACCCACGCTCGCCTTTCTGGTGGACGTGCGCCACGTATCCGTCTATGGC AGTGTCTATGCCATAGCTGACATCTCCTATTCTGTGGCCTACGCGCTCGGGCCCATA GTGGCAGGCCACATCGTTCACTCTCTTGGCTTTGAGCAGCTCAGCCTGGGCATGGGC CTGGCCAACCTGCTCTACGCACCAGTCCTTCTTCTTTTGCGCAATGTAGGCCTCCTT ACACGCTCGCGTTCGGAGCGCGATGTGTTGCTTGATGAACCGCCGCAGGGTCTGTAC GACGCGGTGCGCCTGCGTGAGGTGCAGGGCAAGGATGGCGGCGAACCTTGTAGCCCA CCTGGCCCTTTTGACGGGTGCGAGGACGACTACAACTATTACTCCCGCAGCTAG (4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:1902 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: rat (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AAGCTTTTTGCTGAAGGCGATCCTTCCCTGACTGTGGCCCCATATCCTTCCGATGTA AAGTCTCTGCCTTCTTATTTGGAAGCTAAAGAATGTCATTTAGGGACCTGGAAGGAG CCAAACCCATGCCTCCCTCACTCCGATTTTATTTGCCTAGGTGTGTGTGCCACACTG CACATGGAGTGACACAGGCGTAATGAAACACAAGGGAAAGGGAGGTGGCACGAAGAC CTCAAAGCAGGTCCCAACAGCCTGGAAACTCAACAAGTGACCATCTCCCTTCTCCAT GCCTAGTTTCCTATGGGGGTGTGTGATGGGGGTGGGGTGGATAGCATCTACATTGTA CCAAGATTGAGGAAGGACGGAGTGAGCTCACCCATGGCCCTGGCACGAAACCAGTGG GTCTGCACCTTATCAGAGAGGAACGGAGGAGCAGAGAGTTGGGTGCGAGTCCCAGAA TGAATTGGCTTCATTCTCAGGAAGCCATGGATTATTATGTGGGCTGGAGGGCTGAGA GACAAGGTCTGCCTCTTGCTAGCACTGGGAAGTTTCTTTCCTGAAAGATTCTACTGT * CCACTAACCACCAGAAAGAAAACTGCTGCCTGCGGTGTTGTCCTGCACCCTGATTTT ATTCAGTCAGAGCGGCAATATATGAATAAGTAATCACGACCATGTAGGGCAGGAAAT ACCTCTTTAAAAACCACCAGTGGGATTTTCATAGAAAAGTCAGAGGAACCCAGAGCG TTCTTAAACTCCAGTGTCTGGAGAGCCAAGCAGGTGACAGACAGAGTTCATGAAGCA AGCTGAGGGAAAACCCCATCGCTGGAGTGTGTGCTATGAACAAAGGCACCAGGATAA TATTTAAAGTTGTTTCACCGCACTTTCTGCAAGGTGGATCTTGGTAATCTCTTGATG AACAGAGGCCAAGTGGGCCAGGGTTAGTGGGGAATGTGGCTTGCCCAATGCTTTCCA TAGCCATGGCTGTCCCCATAGTTAGGCTTCCTCCCTCATTTTGAGGGCAGCTGGGCC ACTGCAGGGTATGTGATGGGCAGCTCTCTACTCAGATGAGTCTGTTCCTTTCAGGAG TACCTGTGTACAGGTTGGGAGGTTGGGCACTAGACCACTTGATTGCTGCCTCTCTCC CTGACTCTGTTCTCCATCACCTCCTCTTGCAACTGGCTTAAGAACAGAAGCCAGCCA ATTTTCCAGCTCCTTCTGTATCTTCCACCATCCCAGACAGAGTCCAGGCTCACAATG CCTACCCAACTGAGGAAGAAATCAGAGAGTCAGGATGCTCCCGGTGTCTGACTGCCC TTCACAAGACCCTCATGAACACAAGGCAGCAAGCACATGCTATAACAACAACGGCAA ATGCTAATGATTCACACCACGCGTGTGCCACACCCTAGTTGTACGTACTCCTATTCC AT'IITTTACAGATAAATAAAGGGGCGGTGGGGGCAGAGGGAGGAAACAACGGCTCCCTT GGCACTGTTATCTAGTAAGTGGCAGCACTGGGAGCCATCCTATCTGTCTGCATCTGG AGCTCAAATCGTGATGCCTCCTTCGGTGGAGGAAGGCTAGCTTGGGATATGGAGGCT ACTGTGACTCCGGAAGACAGAGAAAAGTCCAATCTCAACAACGTCACCACTATCCCC AATCTCAGCTGACTGGCATCCTCTCTCCTGCCAGTCTGTGGACGGGAACGCGGGCCT CACGTGCCATCTAGGGTCAAAACTCGTCTGAGGACACACACTGGGCCCAACGCAGAG GCTGATCTGTTCAGCCTGTCGGCTGCAAGCCAGGACTCTCAGCTTGTGCAGCACCCC CGGAAGGAAGGTGAGCCTTCCTAAGCCTCTACTGACAGCAAAGCTGCAGAGGCCCTG CCGCGTGAGACCCAGAAGCTT REVENDICATIONS 1. Séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vesiculaire de l'acétylcholine (ACh) caractérisée en ce qu'elle est localisée dans le premier intron du gêne codant pour la choline acétyltransférase (ChAT) et dans la même orientation transcriptionnelle. 2. Séquence nucléique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est localisée en aval du promoteur de type R du gène de la ChAT. 3. Séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'ACh caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la SEQ ID N 1 ou l'un de ses dérivés. 4. Séquence nucléique selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la SEQ ID N 2 ou l'un de ses dérivés. 5. Séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle code pour la protéine rVAT. 6. Polypeptide impliqué dans le transport vésiculaire de l'ACh susceptible d'être exprimé à partir d'une séquence selon l'une des revendications de 1 à 5. 7. Polypeptide selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la SEQ ID N 1 ou N 2 ou l'un de leurs dérivés. 8. Polypeptide selon la revendication de 6 ou 7 caractérisé en ce qu'il s'agit de la rVAT. 9. Région promotrice susceptible d'exprimer une séquence codante selon l'une des revendications 1 à 5 et localisée dans le gêne codant pour la ChAT. 10. Région promotrice susceptible d'exprimer une séquence codante selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N 3. 11. Utilisation d'une région promotrice selon la revendication 9 ou 10 pour contrôler l'expression d'au moins une séquence codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'ACh et/ou pour cibler l'expression d'une proteine dans les neurones cholinergiques. 12. Vecteur comprenant une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 5. 13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine. 15. Vecteur selon les revendications 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication. 16. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 12 à 14. 17. Composition pharmaceutique comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 5 ou un polypeptide selon la revendication 7ou 8. 18. Utilisation d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 5 ou d'un vecteur contenant ladite séquence pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de pathologies affectant le système nerveux.