Brevet FR2734567A1 — publié le 19961129

La présente Invention est relative à de nouveaux moyens de détection et d'analyse des interactions entre protéines. Les interactions protéine/protéine sont des mécanismes cellulaires fondamentaux qui interviennent dans la formation de complexes multimériques responsables aussi bien de fonctions comme la transcription, la traduction, que de la transmission des signaux, la réponse à des agents pathogènes, etc... Pour analyser ces interactions, les techniques biochimiques classiques (cross-linking, co-immunoprécipitation, co-fractionnement par chromatographie) ayant pour but d'isoler les protéines interagissant avec une protéine-cible sont généralement difficiles à mettre en oeuvre, surtout quand les protéines en interaction sont en faible quantité. En outre, elles permettent d'identifier les protéines en interaction, mais pas d'obtenir directement les gènes correspondant auxdites protéines. Un procédé dénommé : "méthode double-hybride", permettant de détecter des interactions entre 2 protéines, a été mis au point par FIELDS et SONG [FIELDS and SONG, Nature, 340, 245-246 (1989) et Brevet US 5283173]. Ce procédé est basé sur la co-expression dans une même cellule de levure, des gènes suivants - un gène rapporteur exprimant une protéine détectable, dont le niveau d'expression dépend de l'activation transcriptionnelle par un domaine polypeptidique ; et - deux gènes chimériques, codant pour deux protéines hybrides comprenant respectivement les séquences des deux protéines dont on souhaite détecter l'interaction : lune comprend en outre un domaine d'activation transcriptionnelle régulant l'expression du gène rapporteur, et l'autre comprend en outre un domaine de liaison à l'ADN, qui reconnait un site de liaison situé sur le gène rapporteur dans la cellule-hôte. Lorsque les deux gènes chimériques s'expriment dans la même cellule, si une interaction entre les deux protéines a lieu, elle entraîne la mise en présence du domaine d'activation transcriptionnelle et du gène rapporteur, du fait de la fixation du domaine de liaison à l'ADN à son site situé sur le gène rapporteur. La transcription de ce dernier est activée, et on peut donc observer une augmentation de son produit d'expression. Dans le système décrit dans le brevet US 5283173, FIELDS et SONG ont plus particulièrement exploité les propriétés de GAL4, un activateur de la transcription chez Saccharomyces cerevisiae. GAL4 active la- transcription par l'ARN polymérase II (PolII) de gènes codant pour des enzymes impliqués dans le métabolisme du galactose. Cette protéine comporte 2 domaines fonctionnel 1 ement indépendants, et physiquement séparables : un domaine de liaison à l'ADN, représenté par le domaine N-terminal (acides aminés 1-147) qui se lie à des séquences spécifiques de ltADN (UASG, pour Upstream Activating Sequence pour le Galactose), et un domaine d'activation transcriptionnelle représenté par le domaine C-terminal (acides aminés 768-881), qui active la transcription par la PolII. Deux types de protéines hybrides peuvent ainsi être produits à partir de GAL4 : l'un contient le domaine GAL4(1-147) fusionné à une première protéine-test, l'autre contient le domaine GAL4(768-881) fusionné à une deuxième protéine-test. Si les 2 protéines-tests sont capables d'interagir, elles rapprochent les deux domaines de GAL4, et déclenchent la transcription du gène rapporteur (par exemple le gène lacZ codant pour la 5-galactosidase d'E. coli.). I1 est possible de tester simultanément plusieurs protéines dans le but de rechercher leurs interactions avec une protéine donnée. Par exemple la protéine dont on recherche les partenaires est fusionnée au domaine de liaison GAL4(1-147) et elle est testée contre une banque de protéines fusionnées au domaine activateur GAL4(768-881). De nombreux perfectionnements ont été apportés à la technique initialement utilisée par FIELDS et SONG par exemple un système de clonage dans des phages X convertibles ultérieurement en plasmides par recombinaison de sites lox, a été développé ; un second gène rapporteur, constitué par un marqueur d'auxotrophie, le gène HIS3 (impliqué dans le métabolisme de l'histidine), a été utilisé -en combinaison avec le gène lacZ, afin d'éliminer plus efficacement les faux-positifs [DURFEE et al., Genes & Development, 7, 555-569,(1993)]. Des variantes de cette technique ont également été proposées ainsi, l'aspect non-exclusif de 2 interactions d'une protéine A avec 2 autres protéines B et C peut être démontré par la différence d'activation transcriptionnelle entre un système comprenant uniquement les 2 hybrides B et C respectivement fusionnés à GAL4-(1147) et GAL4-(758-881), et un système comprenant les 2 hybrides B et C ainsi que la protéine A non-fusionnée mais simplement surexprimée, et qui forme un intermédiaire entre B et C [LEGRAIN and CHAPON, SCIENCE, 262, 108-110, (1993)]. Une technique dérivée, dénommée système simple-hybride, permet de détecter des protéines se fixant sur des fragments d'ADN (par exemple des promoteurs ou des fragments impliqués dans la réplication de l'ADN) . Dans ce cas, on utilise uniquement les protéines hybrides codées par une banque d'ADNc fusionnés à GAL4-(768-881). Cette banque est introduite dans des cellules contenant un gène rapporteur [HIS3 ou lacZ) placé en aval du fragment d'ADN étudié [WANG and REED, NATURE, 364, 121-126, (1993) ; LI and HERSKOWITZ, SCIENCE, 262, 1870-1874, (1993)]. Des stratégies apparentées ont également été mises au point pour identifier les séquences d'ADN auxquelles se lie une protéine donnée [WILSON et al., SCIENCE, 252, 1296-1300, (1991)], ou pour sélectionner des mutations fonctionnelles dans des domaines protéiques se liant à l'ADN [WILSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9186-9190, (1993)]. La limitation majeure de ce système tient à ce que la protéine dont on recherche les partenaires ne doit pas présenter d'activité activatrice de la transcription PolII. Cette limite interdit donc l'étude par cette technique des activateurs Polît physiologiques (impliqués dans des mécanismes de régulation de la transcription PolII, pathologiques ou normaux), et, d'une manière générale, des protéines qui, fortuitement possèdent des propriétés d'activation.Or, de telles propriétés ne sont pas rares l'activation de la transcription PolII par des protéines qui ne sont pas des activateurs PolII physiologiques a été signalée; il a également été montré que 1% des fragments génomiques d'E. coli engendrés aléatoirement par digestion par Sau3A, lorsqu'ils sont fusionnés au domaine codant pour GAL4(1-147), codent pour des peptides qui activent la transcription PolII [MA et PTASHNE, Cell., 51, 113-119, (1987)]. Les Inventeurs ont entrepris la mise au point d'un système ne possédant pas cette limitation. Dans ce but, ils ont eu l'idée de rechercher une méthode basée sur l'utilisation du système PolIII. Cependant, pour parvenir à un système doublehybride basé sur l'utilisation de la polymérase III, il fallait d'une part identifier des facteurs de transcription du système PolIII utilisables dans ce but, et d'autre part disposer d'un gène rapporteur approprié. Le système PolIII transcrit des gènes "de ménage", dont les produits (ARNt, ARNr 5S, ARN U6, etc...) sont nécessaires aux fonctions de base (traduction, épissage, etc. .) de toute cellule active. Le fonctionnement du système PolIII nécessite la présence de différents facteurs de transcription, assurant un positionnement correct de la polymérase III. Par exemple, la transcription des gènes des ARNt fait intervenir tout d'abord un facteur dénommé TFIIIC ou T qui se fixe sur des séquences intragéniques dénommées bloc A et bloc B. La fixation de X sur le bloc B fait intervenir la sous-unité 138 et sa fixation sur le bloc A, la sous-unité 95. Une fois fixé, X permet ensuite le recrutement d'un autre facteur, dénommé TFIIIB, à proximité du site d'initiation de la transcription. A son tour, TFIIIB permet le recrutement et le positionnement de la polymérase III sur le gène. Dans le cas du gène de 1'ARN U6 (dénommé SNR6), le promoteur PolIII comprend un bloc A intragénique, un bloc B en aval du signal de terminaison de la transcription du gène, et une boîte TATA en position -30. Une succession d'étapes analogue à celle décrite pour les gènes des ARNt permet d'initier la transcription de SNR6. Ces étapes sont schématisées sur la Figure 1. La sous-unité 138 du facteur X se fixe d'abord sur le bloc B (1), puis la sous-unité T95 sur le bloc A (2). La fixation de T permet de recruter TFIIIB par l'intermédiaire de la sous-unité 131 (3). Le rôle précis des autres sous-unités (250, T60 et 91) na pas encore été établi.TFIIIB, qui est composé des sous-unités de 70 kD (70), 90 kD (90) et de la TBP (TATA-binding protein, protéine se fixant sur la boîte TATA) se positionne en amont de SNR6 (4) et permet ensuite le recrutement de la polymérase PolIII (5). La liaison de 138 sur le bloc B de SNR6 constitue donc une des premières étapes de l'activation transcriptionnelle de ce gène. Une mutation du bloc B (délétion des bases +238 et +239 par rapport au site d'initiation de la transcription de SNR6) qui abolit cette liaison empêche la transcription du gène SNR6 [BROW et GUTHRIE, Gene & Developement 4, 1345-1356 (1990) BURNOL et al., Nature, 362, 475-477, (1993)]. Lors de travaux précédents, les Inventeurs ont démontré qu'il était possible de rétablir la transcription du gène SNR6 en insérant à l'intérieur du bloc B muté de SNR6 des séquences UASG, et en utilisant un facteur de transcription chimérique, GAL4-(1-147)-X138 résultant de la fusion du domaine de liaison GAL4-(1-147) et de 138 [MARSOLIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)]. Ce mécanisme de transcription est schématisé à la Figure 2.Ces expérimentations avaient été effectuées en présence d'un gène SNR6 de type sauvage, afin de produire des transcrits en quantité suffisante pour assurer la viabilité cellulaire Les Inventeurs ont maintenant constaté que la transcription du gène SNR6 muté par l'intermédiaire de la protéine de fusion GAL4-(1-147)-T138 pouvait fournir suffisamment de transcrits pour permettre aux cellules de croître sans la présence du gène SNR6 de type sauvage. En effet, les Inventeurs ont introduit des plasmides comprenant le gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UASG, ainsi que des plasmides comprenant la construction GAL4-(1-147)-X138, dans la souche de levure yMCM616. Dans l'exposé de la présente Invention l'expression "sans bloc B", doit être comprise comme signifiant "sans bloc B fonctionnel". yMCM616 est un dérivé de la souche YPH500a, [SIKORSKI et HIETER, Genetics, 122, 19-27, (1989)], dont le gène SNR6 chromosomal a été muté, et qui survit avec un gène de type sauvage SNR6 porté par un plasmide URA3. Cette souche ne pousse pas en présence d'acide 5-fluoroorotique. De même, les transformants de yMCM616 comprenant la construction GAL4-(1-147)-T138 seule, ou bien la construction GAL4-(1-147)-X138 et des gènes SM26 sans bloc B et sans séquences UASG ne poussent pas en présence d'acide 5-f luoro-orotique (5-FOA), qui est métabolisé en un composé toxique par le produit du gène URA3 [BOEKE et al., Molecular and General Genetics, 197, 345, (1984)]. Or, les Inventeurs ont constaté qu'en revanche, les transformants yMCM616, comprenant la construction GAL4-(1-147)-X138 et le gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UASG, sont capables de pousser en présence d'acide 5-fluoro-orotique, c'est-à-dire de perdre le plasmide URA3 portant le gène SNR6 sauvage, ce qui montre que la présence du gène SNR6 de type sauvage n'est pas nécessaire pour la viabilité cellulaire de ces transformants. Les Inventeurs ont eu l'idée de rechercher si ce processus d'activation de la PolIII par l'intermédiaire de GAL4-(1-147)-X138 pouvait permettre la détection d'interactions protéine/protéine. Dans ce but, deux couples de protéines nucléaires de la levure (facteurs de clivage PRP), dont les interactions ont été préalablement démontrées dans le système double-hybride PolII [LEGRAIN et al., Genes & BR Development, 7, 1390-1399, (1993) et LEGRAIN et CHAPON, Science, 262, 108-110, (1993)], à savoir les couples PRP9/PRP21 et PRP11/PRP21, ont été utilisés. Des plasmides respectivement dénommés GAL4-(1147)-PRP9, et GAL4-(1-147)-PRP11, et comprenant la totalité des séquences codant pour PRP9 ou pour PRP11, fusionnées à la séquence codant pour les 147 aminoacides N-terminaux de GAL4, ont été construits. De même, un plasmide (X138-PRP21) a été construit, qui comprend la totalité de la séquence codante de 138 fusionnée à la région codante de PRP21. Ces différents plasmides ont été introduits dans la souche yMCM616 en même temps qu'un plasmide comprenant le gène SNR6 dépourvu de bloc B, avec ou sans séquence UASG. Les Inventeurs ont ainsi constaté que la présence des trois types de plasmides, SNR6 dépourvus de bloc B sont également dépourvus des séquences UASG. Les Inventeurs ont obtenu des protéines chimériques résultant, l'une de la fusion de GAL4-(1-147) avec une protéine membre d'un couple d'interaction, et l'autre de la fusion de 138 avec l'autre membre dudit couple d'interaction, et ont constaté que l'interaction entre ces deux protéines de fusion reproduisait l'activité du facteur de transcription GAL4-tl-147)-X138. Le système de transcription ainsi obtenu est schématisé à la Figure 3 En outre, l'efficacité de la transcription par ce système permet d'obtenir suffisamment de transcrits pour assurer la viabilité cellulaire, et donc de pratiquer un test de sélection basé sur la viabilité des cellules. La présente Invention a pour objet une protéine chimérique résultant de la fusion d'un polypeptide constituant un activateur de la transcription PolIII, avec un polypeptide constituant un membre d'un couple d'interaction protéine/protéine. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII est une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII ou une sous-unité de la polymérase PolIII elle-même, ou représente au moins une partie de l'une de ces sousunités. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, est choisi dans le groupe constitué par les sous-unités du facteur TFIIIC (7138, 131, etc...), et les polypeptides représentant une partie desdites sous-unités. La présente Invention a également pour objet un gène codant pour une protéine chimérique telle que définie ci-dessus, ainsi qu'un vecteur recombinant portant ledit gène. La présente Invention a également pour objet un couple de protéines chimériques comprenant une première protéine chimérique telle que définie ci-dessus, et une seconde protéine chimérique résultant de la fusion d'un polypeptide capable de se lier à une séquence d'ADN spécifique, avec un polypeptide constituant l'autre membre du couple d'interaction protéine/protéine mentionné ci-dessus. Différents polypeptides capables de se lier à une séquence d'ADN spécifique, sont utilisables pour construire cette seconde protéine chimérique ; à titre d'exemples non-limitatifs, on citera : le domaine 1-147 de GAL4, qui reconnait spécifiquement les séquences UASG ; le domaine de fixation de LexA [BRENT and PTASHNE, Cell, 43, 729-736, (1985)] ou celui du récepteur humain de l'oestrogène [LE DOUARIN et al. Nus lei Acids Research, 23, 876-878, (1995)], etc.. La présente Invention a aussi pour objet un procédé de détection des interactions entre deux protéines, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on introduit, dans une même cellule-hôte, les séquences d'ADN suivantes - une séquence d'ADN (a), dont au moins une partie constitue un gène rapporteur transcrit par la polymérase III ; et au moins une partie constitue un site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à l'ADN ; - une séquence d'ADN (b), dont au moins une partie constitue un premier gène chimérique, comprenant une séquence codant pour un polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, fusionnée avec une séquence codant pour un polypeptide susceptible de constituer un membre d'un couple d'interaction protéine/protéine - une séquence d'ADN (c) , dont au moins une partie constitue un second gène chimérique, comprenant une séquence codant pour le polypeptide qui reconnait le site de liaison porté par la séquence (a), fusionnée avec une séquence codant pour un polypeptide susceptible de constituer le second membre dudit couple d'interaction protéine/protéine en ce que l'on met ladite cellule-hôte en culture, dans des conditions autorisant l'expression du gène rapporteur porté par la séquence (a) et en ce que l'on détecte l'expression dudit gène rapporteur, dans la cellule-hôte ou dans sa descendance, par tous moyens appropriés. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le gène rapporteur transcrit par la polymérase III est le gène SNR6. D'autres gènes PolIII peuvent également être utilisés comme gènes rapporteurs, pour autant que leur expression entraîne l'apparition d'un phénotype observable. Il peut s'agir par exemple des gènes d'ARNt, et en particulier, des gènes suppresseurs de codons de terminaison de traduction. Ce(s) gène(s) rapporteur(s) peu(ven)t se trouver sur des plasmides centromériques ou multicopie, ou être intégré(s) dans les chromosomes de la cellulehôte. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention le site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à 1'ADN est une séquence UASG , et le polypeptide qui reconnait ledit site de liaison est le domaine 1-147 de GAL4. D'autres associations séquence polypeptidiquesite de liaison sont également utilisables, comme par exemple le domaine de fixation de LexA ou celui du récepteur humain de l'oestrogène, cités ci-dessus, ; ces polypeptides sont utilisés en association avec leurs séquences-cibles d'ADN respectives (opérateurs LexA et EREs, éléments de réponse au récepteur de l'oestrogène). Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, est la sous-unité 138 du facteur TFIIIC. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, la cellule-hôte utilisée est de préférence une cellule de levure (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ...). La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. wYoMPLE 1 : Souches et plasmides La souche yMCM616 est identique à la souche FTY115 décrite par MARSOLIER et al. [Genes & Development, 9, 410-422, (1995)], à l'exception du fait qu'elle comprend non pas le plasmide pRS314-U6, mais le plasmide centromérique URA3 pRS316-U6, portant la région du gène SNR6 qui s'étend entre les bases -140 à + 314 par rapport au site de départ de la transcription. Le plasmide pRS316-U6 a été obtenu à partir du plasmide d'origine URA3 pRS316, qui a été décrit par. SIKORSKI et HIETER, [Genetics, 122, 19-27, (1989)]. La région (-140 ; +314) de SNR6 a été clonée entre les sites KpnI et SacI de pR316 pour donner pR316-U6. Cette construction est schématisée à la Figure 4 (CEN séquences centromé-triques de levure ; URA3 gène codant pour 1'orotidine-5'-phosphate décarboxylase qui est impliquée dans la biosynthèse de l'uracile). Le génotype de la souche yMCM616 est : a, ura3-52, lys2-801ambre, ade2-101ochre trpl-h63, his3 A200, leu2-A1. Par ailleurs, le gène chromosomal SNR6 sauvage de la souche initiale a été remplacé par un gène SNR6 mutant dont le bloc B a été inactivé par la délétion des bases 238-239 D'autre part, un gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UASG, similaire à la construction "B block-UASG template" décrite par MARSOLIER et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)] mis à part le fait qu'il est dépourvu de l'insertion de 24 pb à la position +73, a été cloné entre les sites ApaI et SacI du plasmide centromérique LEU2, pRS315 [SIKORSKI et HIETER, Genetics, 122, 19-27, (1989)] Cette construction est schématisée à la Figure 5 (CEN séquences centrométriques de levure ; LEU2 : gène codant pour la ss-isopropylmalate déshydrogénase impliquée dans la synthèse de la leucine). En outre, le gène SMR6 sans bloc B et dépourvu de séquences UASG du plasmide pRS314-U6 décrit par MARSOLIER et al. [Genes & Development, 9, 410-422, (1995)], a été recloné entre les sites ApaI et SacI du plasmide centromérique pRS315. Des plasmides respectivement dénommés GAL4-(1-147)-PRP9, et GAL4-(1-147)-PRP11, et dérivés de pMA424 ont été précédemment décrits [LEGRAIN et al., Genes & Development, 7, 1390-1399, (1993) ; LEGRAIN et CHAPON, Science, 262, 108-110, (1993)]. Ces plasmides contiennent une construction comprenant la totalité de la séquence codant pour PRP9 ou pour PRP11, fusionnée aux 147 aminoacides N-terminaux - de GAL4.Ces constructions sont schématisées à la Figure 6 (ADH1-PRO région promotrice de la transcription du gène de levure ADH1 codant pour une alcool deshydrogénase ; ADH1-TER région terminatrice de la transcription du gène ADH1 2 2R ; séquences de réplication autonome dérivées du plasmide de levure 2 ; HIS3 gène codant pour l'imidazoleglycérolphosphate déshydrogénase impliquée dans la synthèse de l'histidine). D'autre part, la construction T138-PRP21 constituée par la totalité de la séquence de T138 [LEFEBVRE et al. Proceedings of the National Academy of Science USA, 89, 10512-10514, (1992)] fusionnée à la région codante de PRP21, a été obtenue comme suit La séquence de T138 a été clonée à partir du plasmide dénommé pOL101 (fourni par Olivier LEFEBVRE, C.E.A-Saclay, Gif-sur-Yvette). pOL101 a été obtenu comme suit le plasmide pOL45 décrit par LEFEBVRE et al., [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 89, 10512-10516 (1992)] qui contenait la séquence de t138 avait été modifié pour éliminer l'intron du gène (LEFEBVRE et al., 1992, déjà cité).Ce plasmide pOL45 modifié a été ultérieurement mutagénisé par mutagénèse dirigée [KUNKEL et al., Methods in Enzymology, 154, 367382, (1987)] des sites BamHI ont été introduits, l'un, juste devant le codon d'initiation de T138, l'autre, juste devant les codons de terminaison, pour donner pOLlOl. Le fragment BamHI de pOL101 comprenant la totalité de la séquence codante de T138 a ensuite été cloné dans le vecteur pBluescript SK (BSSK, Stratagène) de manière à ce que le site KpnI de BSSK soit localisé à l'extrémité 5' de T138. Le plasmide résultant est dénommé BSSK-T138. La séquence de PRP21 a été clonée à partir du plasmide dénommé pPL247 (ce plasmide a été fourni par Pierre LEGRAIN, Institut Pasteur, Paris). Brièvement, pPL247 a été obtenu comme suit Un fragment d'ADN a été dérivé par PCR à partir du gène PRP21. Ce fragment comprend la séquence codante de PRP21 encadrée en 5' par un site BamHI introduit en -8 par rapport au codon d'initiation, et en 3' par un site EcoRI, suivi d'un site BamHI introduits 26 pb après le codon de terminaison. Ce fragment d'ADN digéré par BamHI a été cloné dans le site BamHI de pMA424 [LEGRAIN et al., Genes & Development, 7, 1390-1399, (1993)]. Le site BamHI en 3' de PRP21 a été ultérieurement éliminé, et le fragment BamHI-PstI du plasmide contenant la séquence de PRP21 a été cloné dans le vecteur pBluescript SK- (BSSK, Stratagene), pour donner pPL247. Le site unique BamHI de pPL247 situé à l'extrémité 5' de PRP21, a été ouvert, pourvu d'extrémités franches, et religué de manière à pouvoir ultérieurement mettre PRP21 en phase avec T138. Le plasmide pPL247 ainsi modifié a été ensuite digéré par SpeI et EcoRV, et le fragment résultant, contenant PRP21, a été inséré entre les sites SpeI et NotI pourvu d'extrémités franches, de BSSK-T138. Un fragment EcoRI comprenant la construction T138-PRP21, a ensuite été introduit dans le site EcoRI du plasmide pYcDE-2. Le plasmide pYcDE-2 a été fourni par B.D. HALL, University of Washington, Seattle, USA. Ce plasmide dérive du plasmide pMAC561 [McKNIGHT et McCONAUGHY Proc.Natl.Acad.Sci USA, 80, 4412-4416 (1983)] par délétion d'un fragment SphI comprenant la partie amont du promoteur du gène ADHl, qui se trouve ainsi réduit à un fragment EcoRI-SphI, ce qui le rend réellement constitutif. La construction résultant de l'insertion du fragment chimérique T138-PRP21, dans le site EcoRI du plasmide pYcDE-2 est schématisée à la Figure 7 (ADH1-PRO : région promotrice de la transcription du gène de levure ADH1 ; CYC1-TER région terminatrice de la transcription du gène de levure CYCi codant pour l'iso-1- cytochrome c ; 24 séquences de réplication autonome dérivées du plasmide de levure 2 ; TRP1 gène codant pour une enzyme impliquée dans la synthèse du tryptophane). IXEMPIZ 2 : ACTIVATION DE LA TRANSCRIPTION PAR UN SYSTèME DOUBLg-HYBRIDE POLIII CONFORME A L'INVENTION Les plasmides contenant les constructions - GAL4-(1-147)-X138 - T138-PRP21, et GAL4-(1-147)-PRP9, ou GAL4 (1-147)-PRP11 ; ont été introduits dans la souche yMCM616 en même temps que les plasmides contenant les gènes SNR6 dépourvus de bloc B, et avec ou sans séquence UASG. Les clones transformants sont sélectionnés sur des milieux minimum dépourvus d'uracile, de leucine, d'histidine ou de tryptophane (selon les gènes marqueurs portés par les plasmides) et sont ensuite étalés sur milieu complet en présence d'acide 5-fluoro-orotique. La présence des trois types de plasmides, GAL4-(1-147)-PRP9 ou 11, et un plasmide portant le gène SNR6 dépourvu de bloc B et comprenant des séquences UASG) est nécessaire pour permettre aux transformants de croître en présence d'acide 5-fluoro-orotique. Aucune croissance cellulaire n'est observée quand l'un des plasmides GAL4-(1-147)-PRP9/11 ou T138-PRP21 manque, ou quand les gènes SNR6 dépourvus de bloc B sont également dépourvus des séquences UASG. Pour l'analyse quantitative des transcrits SNRo produits par le système double-hybride, les transformants contenant les constructions GAL4-(1-147)-PRP9/11 et T138-PRP21 ont été repiqués plusieurs fois sur milieu 5-FOA, et ont de ce fait perdu le plasmide URA3 contenant le gène SNR6 sauvage. Leurs transcrits SNR6 proviennent donc exclusivement de la transcription du gène SNR6 sans bloc B mais avec les séquences UASG par l'intermédiaire des 2 hybrides. Plusieurs clones ont été analysés de la sorte pour chaque combinaison de constructions. La quantité de transcrits SNR6 produits a été quantifiée par transfert d'ARN, comme décrit précédemment [MARSOLIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)], en utilisant le transcrit du gène SNR31 en tant que contrôle interne. Le Tableau I ci-dessous représente le pourcentage de transcrits SNR6 produits par rapport à la souche yMCM616 portant seulement le gène de type sauvage SNR6 sur le plasmide pRS316, qui représente 100%. TABLEAU I CONSTRUCTIONS QUANTITE DE TRANSCRITS (%) GAL4- -T138 90% GAL4-(1-147)-PRP9 + T138- 62% PRP21 GAL4-(1-147)-PRPll + T138- 71% PRP21 Ces résultats montrent que le système doublehybride conforme à l'Invention permet d'obtenir un niveau de transcription élevé, représentant la production de 60 à 70% des transcrits produits par le gène SNR6 sauvage possédant un bloc B intact. EXEMPLE 3 : COMPARAISON DU SYSTèME D'ACTIVATION DOUBLE-HYBRIDE POLI Il CONFORME A L'INVENTION AVEC UN SYSTEME D'ACTIVATION DOUBLE-BYBRIDE POLIT Les taux d'expression obtenus avec les deux systèmes d'activation UASG-lacZ (double-hybride PolII) et UASG-SNR6 (double-hybride PolIII conforme à l'invention) ont été comparés à ceux obtenus avec l'activateur "sauvage" de chacun des deux systèmes. Pour UASG-lacZ, les résultats reproduits dans le Tableau II ci-dessous sont ceux rapportés par MA and PTASHNE, [Cell, 48, 847-853 (1987)] pour l'activateur sauvage et l'activateur chimère PolII, et par LEGRAIN et al. [Nucleic Acids Research, 22, 3241-3242, (1994)] pour le système double-hybride PolII; le taux d'expression est déterminé par la mesure de l'activité B-gal. Pour UASG-SNR6, le taux d'expression est déterminé par la mesure du pourcentage de transcription. Les résultats sont représentés dans le Tableau II ci-dessous TABLEAU II Activité B-gal Transcrits SNR6 (UASG-lacZ) (a) (UASG-SNR6) Activateur GAL4-(1-881) T138 et gène SNR6 sauvage sauvage % d'expression 1860 U 5-gal=190% Transcrits : 110% Activateur GAL4-(1-147)- GAL4-(1-147)-X138 chimère GAL4-(768-881) % d'expression 960 U B-gal = Transcrits : 100% 100% Système double- GAL4-(1-147)- GAL4-(1-147) hybride PRP9/11 + GAL4- PRP9/11 +T138- (768-881)-PRP21 PRP21 % d'expression 40-60 U 13-gal = Transcrits : 69 4-6% 79% Ces résultats montrent que dans le cas des molécules chimère où la partie activatrice des 2 systèmes (respectivement GAL4-(768-881) pour PolII, et #138 pour PolIII) est fusionnée directement au domaine de liaison GAL4-(1-147), et où ces deux domaines sont donc fortement fixés par liaison covalente, on obtient un niveau d'expression (que l'on fixe arbitrairement à 100%), plus ou moins comparable au niveau obtenu avec les activateurs et les gènes sauvages (190% pour PolII avec lacZ et 1108 pour PolIII avec SNR6). En revanche, lorsque la liaison entre la partie activatrice et le domaine de liaison à 1'ADN est constituée par l'interaction entre PRP21, et PRP9 ou PRP11, le comportement des 2 systèmes PolII et PolIII se différencie fondamentalement. En effet, avec le système d'activation PolII (UASG-lacZ), on obtient un taux d'expression mesuré par une activité B-gal de 40-60 U [LEGRAIN et al., 1994)] qui est relativement peu important, (seulement 4-6% de l'activité obtenue avec GAL4-(1-147)-GAL4-(768-881)). Au contraire, on obtient pour le gène UASG-SNR6, et avec la même interaction faible PRP21-PRP9/11, un taux de transcription correspondant à 70-80% de celui obtenu avec GAL4-(1-147)-X138. REVENDICATIONS 1) Protéine chimérique, caractérisée en ce qu'elle résulte de la fusion d'un polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, avec un polypeptide constituant un premier membre d'un couple d'interaction protéine/protéine. 2) Protéine chimérique, selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, est choisi dans le groupe constitué par les sous-unités de facteurs de transcription PolIII, les sous-unités de la polymérase PolIII, et les polypeptides représentant au moins une partie desdites sous-unités. 3) Protéine chimérique, selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymérase PolIII, est choisi dans le groupe constitué par les sous-unités du facteur TFIIIC, et les polypeptides représentant au moins une partie desdites sous-unités. 4) Gène codant pour une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 3. 5) Couple de protéines chimériques caractérisé en ce qu'il comprend une première protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 3, et une seconde protéine chimérique résultant de la fusion d'un polypeptide capable de se lier à une séquence d'ADN spécifique, avec un polypeptide constituant le second membre du couple d'interaction protéine/protéine. 6) Procédé de détection des interactions entre deux protéines, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on introduit, dans une même cellule-hôte, les séquences d'ADN suivantes - une séquence d'ADN (a), dont au moins une partie constitue un gène rapporteur transcrit par la polymérase III ; et au moins une partie constitue un site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à 1'ADN - une séquence d'ADN (b), dont au moins une partie constitue un premier gène, codant pour une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 3 - une séquence d'ADN (c) , dont au moins une partie constitue un second gène chimérique, comprenant une séquence codant pour le polypeptide qui reconnait le site de liaison porté par la séquence (a), fusionnée avec une séquence codant pour un polypeptide susceptible de constituer le second membre dudit couple d'interaction protéine/protéine en ce que l'on met ladite cellule-hôte en culture, dans des conditions autorisant l'expression du gène rapporteur porté par la séquence (a) et en ce que l'on détecte l'expression dudit gène rapporteur, dans la cellule-hôte ou dans sa descendance1 par tous moyens appropriés. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène rapporteur transcrit par la polymérase III est le gène SNR6, le site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à 1'ADN est une séquence UASG , et le polypeptide qui reconnait ledit site de liaison est le domaine 1-147 de GAL4.