Brevet FR2726913A3 — publié le 19960515

FR 2726913 A3 19960515 FR 9413875 A 19941115 La présente invention concerne un dispositif d'analyse qualitative et/ou quantitative par immunochromatographie. Ce principe est décrit dans plusieurs documents, et notamment dans les demandes de brevet publiées sous les numéros EP-A-0 149 168, WO-A-86/04683 et EP-A-0 186 799. Les définitions données ci-après des termes utilisés dans la description et les revendications faciliteront la compréhension de l'invention et de l'art antérieur - ANALYTE : le composé, corps, ou composition dont la présence est à déterminer quantitativement ou qualitativement, et qui peut être un ligand mono- ou polyépitopique, antigénique ou haptique, une molécule ou une pluralité de molécules possédant toutes au moins un site épitopique ou site récepteur en commun - AGENT DE LIAISON SPECIFIQUE : une molécule dont la structure tri-dimensionnelle présente une ou plusieurs zones ou cavités qui se lient à un endroit spatial ou polaire spécifique d'une autre molécule. L'agent de liaison est aussi connu sous le nom "ligand", et la molécule avec laquelle il se lie spécifiquement est dénommé "récepteur' ou encore "anti-ligand".On citera, à titre d'exemple, les anticorps, les "anti" anticorps, les antigènes, et les fragments d'anticorps ou d'antigènes - LIGAND : tout composé pour lequel existe un récepteur naturel ou pour lequel un récepteur peut être préparé ; - RECEPTEUR (ANTI-LIGAND) : tout composé ou toute composition susceptible de reconnaître une organisation spatiale ou polaire spécifique d'une molécule - MARQUEUR : système, comprenant un ou plusieurs composants, dont au moins un est conjugué ou associé à un agent de liaison spécifique. Le marqueur fournit un signal pouvant être détecté par des moyens externes, généralement par détermination du rayonnement électromagnétique, de préférence par examen visuel.De tels systèmes comprennent souvent des chromophores, tels que des colorants, et des enzymes ou encore des particules colorées, telles que de l'or colloïdal - IMMUNOCHROMATOGRAPHIE : 1'immunochromatographie comporte au moins un agent de liaison adsorbé ou immobilisé dans une ou plusieurs zones dans un support poreux. Ce dernier permet le déplacement de liquide dans un sens de sorption, ainsi que le transport d'un analyte à travers lesdites zones. Les agents de liaison peuvent être libres de se déplacer dans le sens de sorption chromatographique, ou encore immobilisés de façon permanente, par exemple par liaisons covalentes. Le document EP-A-O 149 168 décrit, par exemple, un dispositif imunochromatographique de type "sandwich", comprenant un corps creux (tube capillaire) dans lequel se trouvent un ou plusieurs supports poreux reliés entre eux et disposés selon l'axe longitudinal du corps creux, c'est-à-dire en série ; ces supports poreux contiennent au moins un agent de liaison, spécifique pour un analyte, marqué avec une enzyme, dans une première zone en amont, par rapport au sens de la sorption chromatographique, d'au moins une deuxième zone ; cette deuxième zone comporte au moins un agent de liaison, spécifique pour le même analyte, non marqué, et immobilisé dans le support poreux. L'agent de liaison marqué peut se déplacer librement par chromatographie à l'état humide, mais l'agent de liaison non marqué immobilisé dans la deuxième zone ne peut pas se déplacer. Lorsque le tube est mis au contact avec un échantillon susceptible de contenir l'analyte recherché, le support poreux imbibe l'échantillon. Ce dernier diffuse le long du support poreux, dissolvant et emportant l'agent de liaison marqué. Si l'analyte spécifique est présent dans l'échantillon, un complexe immun se forme et migre vers la deuxième zone dans laquelle se trouve l'agent de liaison non marqué. Lors de l'arrivée du complexe dans cette zone, celui-ci est immobilisé par la capture "sandwich" de l'agent de liaison non marqué, et/ou de l'analyte. Une coloration visible est ensuite développée par ajout de substrat pour l'enzyme ou en incorporant un ou plusieurs agents chromogènes et/ou substrats également dans la deuxième zone. Des marqueurs autres qu'enzymatiques, peuvent être utilisés, notamment des marqueurs ne nécessitant pas d'opération complémentaire, et/ou visibles à l'oeil nu sous forme concentrée, par exemple de l'or colloïdal. L'inconvénient de ce type de dispositif réside dans le fait que les analyses sont effectuées, en pratique, avec un seul et même support poreux. Ceci est problématique lorsqu'on souhaite utiliser plusieurs échantillons liquides différents d'un même individu ou patient, tel que la salive et le sang, car leurs analytes respectifs peuvent interférer, obscurcissant ou même faussant le véritable résultat. Le même problème se pose lorsqu'on souhaite détecter deux ou plusieurs analytes différents présents dans un seul et même échantillon. Ainsi pour pallier ces inconvénients, l'objet de la présente invention concerne un dispositif d'analyse, ainsi que son utilisation, soit avec deux ou plusieurs échantillons liquides différents pour la détection d'un même analyte, soit avec un même échantillon liquide pour la détection de deux ou plusieurs analytes différents, tout en gardant une fiabilité de résultat. En effet l'invention concerne un dispositif comme précédemment décrit, la modalité pratique suivante ayant été retenue - le dispositif comporte au moins deux supports poreux en bande, distincts l'un de l'autre, contenus dans le même boitier, et disposés en parallèle - les agents de liaison marqués et non marqués, respectivement des deux supports poreux sont les mêmes ou différents. L'invention sera mieux comprise en se référant au dessin annexé dans lequel - la Figure 1 représente une vue en perspective par dessus d'un dispositif d'analyse qualitative et/ou quantitative par immunochromatographie selon l'invention - la Figure 2 représente une vue en perspective éclatée du dispositif de la Figure 1. Conformément aux Figures 1 et 2, qui représentent un mode d'exécution préféré selon la présente invention, le dispositif, indiqué de manière générale par le numéro de référence (1), comprend un boîtier creux (2), en matière étanche, par exemple en PVC, polypropylène ou polyéthylène, se composant d'une partie supérieure (3) et d'une partie inférieure (4). Ces deux parties (3, 4) peuvent être formées par tout procédé convenable, mais de préférence par moulage par injection. La partie supérieure (3) constitue en effet le couvercle du boîtier (2) et est munie de moyens (5) de fixation complémentaires avec la partie inférieure (4), par exemple des tenons. La partie inférieure (4) comporte des moyens de logement (6) complémentaires aux moyens de fixation (5) de la partie supérieure (3), par exemple des évidements ou des trous, ainsi que des moyens de maintien (6a) des supports poreux (10, loua), qui seront décrits plus loin. Les moyens de maintien (6) sont bien connus par l'homme du métier et consistent par exemple en des rebords parallèles longitudinaux formés lors du moulage du boîtier (2). Les deux parties (3, 4) ainsi formées peuvent être solidarisées l'une à l'autre par clipsage, collage ou soudure, avantageusement par soudure à ultrasons. La partie supérieure (3), ou couvercle, comporte des moyens de communication (7, 8) reliant l'intérieur du bottier (2) avec son environnement extérieur, à une de ses extrémités. Ces moyens peuvent être un trou prévu dans la partie supérieure (3), ou encore une membrane, perméable au passage d'un échantillon liquide, incorporé dans ou prévu sur ladite partie supérieure. Dans un mode particulièrement préféré de l'invention, ces moyens consistent en deux puits prévus côte à côte sur le bottier (2) et débouchant sur l'intérieur de celui-ci. La partie supérieure comporte également des moyens (9) permettant l'observation du résultat de l'analyse effectuée, disposés entre les moyens de communication (7, 8) et l'autre extrémité du dispositif. Ces moyens peuvent consister, par exemple, en au moins une fenêtre allongée dans le sens longitudinal du boîtier (2), ou bien, s'il s'agit d'un boîtier (2) en matière plastique, les moyens (9) peuvent être en matière transparente, de manière à former au moins une fenêtre dans la partie supérieure (3). Avantageusement, et comme illustré aux figures, ces moyens consistent en deux fenêtres (13, 13a), éventuellement côte à côte et de forme essentiellement elliptique ou ovale. Les moyens (9) d'observation ouvrent sur une partie de l'intérieur du boîtier (2) appelée zone de lecture (18). Cette zone comprend au moins un support poreux (10, 10a) à l'état sec, sous forme de bande. Selon un mode particulièrement avantageux de l'invention, le dispositif comporte deux supports distincts l'un de l'autre et disposés en parallèle et les moyens de communication (7, 8) débouchent chacun sur un support poreux (10, l0a). Ce dernier peut être tout support permettant un transport chromatographique, c'est à dire dans un sens de sorption d'un liquide appliqué à celui-ci, et notamment est choisi parmi la cellulose, naturelle ou synthétique, et ses dérivés. Dans un mode d'exécution préféré du dispositif selon l'invention, les supports poreux (10, loua) sont constitués de nitrocellulose. Avantageusement les supports poreux (10, 10a) sont recouverts, sur leurs faces inférieures, d'une couche (17, 17a) de matériau étanche, par exemple une matière plastique telle que le polyéthylène ou polypropylène. Les supports poreux (10, l0a) ainsi décrits comportent, dans une première zone, en amont dans le sens de sorption chromatographique, au moins un agent de liaison spécifique marqué (16, 16a) tel que défini précédemment, déposé sur ou dans les supports poreux (10, 10a), et mobile dans ou sur celui-ci à l'état humide. Par "mobile", on entend que l'agent de liaison marqué (16, 16a) peut se déplacer avec l'échantillon liquide par chromatographie ou sorption. Pendant ce transport, l'agent marqué (16, 16a) peut former un complexe immun avec un analyte éventuellement présent dans l'échantillon.Le marqueur associé ou conjugué à cet agent spécifique de liaison (16, 16a) est un marqueur choisi de préférence pour être visible à l'oeil nu sous forme concentrée, essentiellement insoluble dans l'eau, et éventuellement choisi dans le groupe consistant en l'or colloïdal, les sols de colorant, et un latex coloré. Comme représenté aux figures, cette première zone peut être recouverte en tout ou en partie par une couche de matière absorbante (14, 14a), par exemple une nappe de fibres non tissées, qui sert à stocker l'échantillon liquide appliqué à travers les moyens de communication (7, 8). Une couche (15, 15a) plus absorbante que celle de stockage (14, 14a) et les supports poreux (10, l0a), peut éventuellement être prévue à l'extrémité distale du dispositif, recouvrant en partie les supports poreux (10, lOa). Cette couche distale (15, 15a) sert à évacuer l'excès d'échantillon éventuellement appliqué aux supports poreux (10, l0a), tout en accélérant le transport chromatographique, ce qui a pour conséquence de réduire la durée de temps nécessaire pour obtenir un résultat. En aval de la première zone se trouve la zone de lecture (18), dans laquelle est disposé au moins un agent de liaison non marqué (11, pila), immobilisé de façon permanente sur ou dans les supports poreux (10, 10a). Cet agent de liaison non marqué (11, lla) est conforme à la définition donnée préalablement dans la description. Par "immobilisé", on entend que cet agent de liaison non marqué (11, lla) ne peut pas se déplacer librement par chromatographie, lorsqu'un échantillon liquide est appliqué aux supports poreux (10, l0a). Les techniques d'immobilisation de tels agents sont en soi bien connues à l'homme du métier et ne nécessitent pas une description détaillée. Dans un mode d'exécution préféré les agents de liaison marqués (16, 16a) et non marqués (11, lla) respectivement des deux supports poreux (10, lOa) sont les mêmes, de façon à pouvoir analyser un seul et même analyte. Dans ce cas, un échantillon liquide différent contenant le même analyte est appliqué à chaque support poreux (10, l0a) différent. Ces échantillons liquides peuvent être d'origines très diverses, notamment d'origine naturelle ou synthétique, et de préférence d'origine humaine, animale, ou végétale. A titre d'exemple, on citera notamment les échantillons d'eau pris dans l'environnement, ou dans des sorties d'eaux usées, à des fins de dépistage de polluants ou autres molécules, ou encore des extraits liquides de plantes ou de fermentation, tels que des hydrolysats, ou des isolats. S'agissant d'échantillons liquides d'origine humaine, ceux-ci sont de préférence choisis dans le groupe consistant en l'urine, le sang, la salive, les mucus, le liquide cérébrospinal, le liquide synovial, le liquide lacrymal, et la transpiration. Selon une autre variante de l'invention, les agents de liaison marqués (16, 16a) et non marqués (11, lla) respectivement des deux supports poreux (10, 10a) sont différents. Dans ce cas l'analyte à détecter avec chaque support poreux (10, l0a) est différent. Optionellement, et comme représenté aux figures 1 et 2, les supports poreux (10, 10a) comportent également au moins un autre agent de liaison (12, 12a), tel que défini préalablement, spécifique pour l'agent de liaison marqué, et immobilisé de façon permanente dans la zone de lecture (18) du support poreux (10, 10a), en aval de l'agent de liaison non marqué (11, lia) par rapport au sens de sorption chromatographique. Cet agent sert uniquement à des fins de contrôle pour indiquer à l'utilisateur que le dispositif a bien fonctionné. REVENDICATIONs 1. Dispositif (1) d'analyse qualitative et/ou quantitative par immunochromatographie, comprenant un bottier creux (2) en matière étanche, au moins un support poreux (10, 10a) sous forme de bande à l'état sec contenu dans ledit bottier, et des moyens de communication (7, 8) avec l'extérieur du bottier (2), de telle sorte qu'un ou plusieurs échantillons liquides puissent venir au contact avec ledit support (10, 10a), au moins un agent de liaison marqué (16), spécifique pour un analyte, déposé sur ou dans le support poreux (10, 10a), ledit agent de liaison marqué (16) étant mobile dans ou sur ledit support poreux (10, 10a) à l'état humide, dans un sens de sorption chromatographique, et au moins un agent de liaison nonmarqué (11, pila) spécifique pour le même analyte, immobilisé de façon permanente dans une zone de lecture (18) dans ledit support poreux (10, l0a), et qui, de ce fait, n'est pas mobile à l'état humide, le positionnement relatif de l'agent de liaison marqué (16, 16a) et la zone de lecture (18) étant tel qu'un échantillon liquide mis au contact avec ledit support poreux (10, 10a) du dispositif (1), en amont de l'agent de liaison marqué (16) selon le sens de sorption, puisse emporter ce dernier et migrer vers la zone de lecture (18), et des moyens (9) permettant l'observation et éventuellement la quantification d'immobilisation du complexe agent de liaison marqué (16, 16a)/analyte dans la zone de lecture (18), caractérisé en ce que le dispositif (1) comporte au moins deux supports (10, 10a) poreux en bande distincts l'un de l'autre, contenus dans le même boîtier, et disposés en parallèle, et en ce que les agents de liaison marqués (16, 16a) et non marqués (11, lla), respectivement des deux supports poreux (10, 10a) sont les mêmes ou différents. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux moyens (7, 8) de communication distincts sont affectés aux deux supports poreux (10, 10a) respectivement, et consistent respectivement en deux puits prévus sur le bottier (2), éventuellement côte à côte, débouchant sur les deux supports poreux (10, 10a) respectivement 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux fenêtres (13, 13a) prévues sur le bottier (2), éventuellement côte à côte, ouvrent sur les deux zones de lecture (18) respectivement. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un autre agent de liaison (12), spécifique pour l'agent de liaison marqué, est immobilisé de façon permanente dans la zone de lecture (18) de chaque support poreux (10, 10a), en aval de l'agent de liaison non marqué (11, lla) par rapport au sens de sorption chromatographique. 5. Dispositif (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les agents de liaison marqués (16, 16a) et non marqués (11, lla) respectivement des deux supports poreux (10, 10a) sont les mêmes, de façon à pouvoir analyser un seul et même analyte. 6. Utilisation d'un dispositif (1) selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'un échantillon liquide différent contenant le même analyte est appliqué à chaque support poreux (10, 10a) différent. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les échantillons liquides différents appliqués sont d'origine naturelle ou synthétique, et de préférence d'origine humaine, animale, ou végétale. 8. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que les échantillons liquides différents appliqués sont d'origine humaine et sont choisis dans le groupe consistant en l'urine, le sang, la salive, les mucus, le liquide synovial, le liquide lacrymal, et la transpiration. 9. Dispositif (1) selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caractérisé en ce que les agents de liaison marqués (16, 16a) et non marqués (11, lia) respectivement des deux supports poreux (10, 10a) sont différents. 10. Utilisation d'un dispositif (1) selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'analyte à détecter avec chaque support poreux (10, l0a) est différent. 11. Dispositif (1) selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur est un marqueur visible à l'oeil nu sous forme concentrée, essentiellement insoluble dans l'eau, éventuellement choisi dans le groupe consistant en l'or colloïdal, les sols de colorant, et un latex coloré.