Brevet FR2730745A1 — publié le 19960823

La présente invention a pour objet un procédé de détection d'une nouvelle mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer. Elle est en outre relative à des séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'apolipoprotéine E (apo E) est une glycoprotéine plasmatique de 299 acides aminés, synthétisée principalement par le foie et l'intestin, mais aussi dans la plupart des autres tissus, notamment par l'astrocyte du tissu nerveux. La concentration normale en apo E du plasma est de l'ordre de 40 mg/l. Elle y est présente dans les lipoprotéines chylomicrons, VLDL, ILDL (ainsi que dans le liquide céphalo-rachidien). On connaît la séquence de la protéine (RALL et al, 1982 J. Biol. Chem., 257: 4171-4178), celle de l'ADN complémentaire, ainsi que la structure et la séquence du gène APO E (DAS et al, 1985, J. Biol. Chem., 260: 6240-6247; PAIK et al, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci., 82:3445-3449 ). Le quatrième exon du gène code pour le domaine de la protéine apo E, qui participe à la liaison avec le récepteur LDL. Des différences dans la séquence d'ADN de cette région déterminent les trois isoformes communes de l'apo E (E2, E3 et E4). E2 et E4 diffèrent de E3 par des substitutions de bases: dans E4, C se trouve à la place de T en position 3932, et dans E2 se trouve T à la place de C en position 4070. I1 en résulte les changements en acides aminés suivants: Cys (112) au lieu de Arg pour l'isoforme E4, et Arg (158) au lieu de Cys pour l'isoforme E2. Ces trois isoformes de l'apo E sont classiquement distinguées par isofocalisation des protéines du sérum. Il est actuellement plus aisé de les génotyper par amplification en chaîne par polymérase (PCR) sur la base de leur variation de séquence d'ADN (Hixson et Vernier, 1990, J. Lipid Res. 31:545-548), par coupure, après amplification, avec l'enzyme de restriction Hha I. En 1993, Strittmatter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1977-1981) ont montre que la fréquence allélique de APOE-g4 était de 0,50 i 0,06 dans trente familles de patients atteints par la forme tardive de la maladie d'Alzheimer, alors qu'elle n'était que de 0,16 + 0,03 chez les témoins. Les mêmes chercheurs ont retrouvé par la suite (Saunders et al., 1993, Neurology, 43:1467-1472) la nature élevée de l'association entre APO E-E4 et la maladie d'Alzheimer pour 176 cas certains établis par autopsie. La même année, Lucotte et al. (Lancet, 342:1309) ont étendu cette association aux patients atteints par la forme sporadique, qui représente l'essentiel (plus de 95%) des cas d'Alzheimer. Ces résultats ont été confirmés ultérieurement par plus d'une cinquantaine de laboratoires indépendants de par le monde. Il ressort donc de l'état de la technique que l'on connaissait déjà des procédés d'analyse génétique permettant de detecter, au niveau de l'ADN de patients, s'ils étaient porteurs d'une mutation du gène Apo E liée à la maladie d'Alzheimer. Cependant, tous les cas d'Alzheimer ne sont pas liés au variant E4 de l'Apo E, et à l'inverse d'autres Alzheimer peuvent se manifester chez des patients apparemment aussi bien Q3 que s2. La demanderesse a trouvé une nouvelle mutation dans le gène de l'apolipoprotéine E et a montré que cette mutation était associée avec une forte probabilité à la maladie d'Alzheimer. La demanderesse a donc résolu le problème exposé cidessus en fournissant le moyen de distinguer les patients porteurs d'une mutation supplémentaire de l'Apo E qui, conjointement à g4 OU indépendamment d'elle, détermine 1 'Alzheimer. La présente invention a pour objet un procédé de détection, dans une préparation d'ADN, d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans le gène de l'apolipoprotéine E, d'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 ou SEQ ID N'5 suivantes: SEQ ID N'1 : TGC GGC CGC SEQ ID N'3 : TGC GAC CGC SEQ ID N 5: CGC GAC CGC Ces trois séquences correspondent respectivement aux séquences d'acides aminés SEQ ID N'2, SEQ ID N 4 et SEQ ID N'6 suivantes: SEQ ID N'2 : Cys Gly Arg SEQ ID N 4 : Cys Asp Arg SEQ ID N 6 :Arg Asp Arg La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection d'une telle mutation dans une préparation d'ARN, auquel cas on recherche la présence dans 1'ARN correspondant au gène de l'apolipoprotéine E, soit de la séquence SEQ ID N 5, soit des séquences SEQ ID N'7 et SEQ ID N 8 correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N'1 et SEQ ID N 3 dans lesquelles T a été remplacé par U. SEQ ID N'7 : UGC GGC CGC SEQ ID N 8: UGC GAC CGC Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, la présence de la séquence nucléotidique est mise en évidence par séquençage de 1'ADN, ou d'ARN, dans lequel on recherche ces séquences. Des méthodes de séquençage sont bien connues de l'homme du métier et sont en particulier décrites dans MAILLET-BARON "Séquençage des acides nucléiques" Editions Lavoisier, 1992, Paris auquel on peut se référer pour la mise en oeuvre de telles méthodes. Selon un second mode de mise en oeuvre de l'invention, la détermination de la présence d'une des séquences nucléotidiques est effectuée par amplification spécifique de l'ADN, dans lequel on recherche ces séquences, c'est-à-dire celui du gène de l'apolipoprotéine E ou d'une partie de ce gène. Des exemples illustratifs de ces modes de mise en oeuvre sont décrits ci-après. La présente invention est en outre relative à des séquences nucléotidiques comprenant d'environ 20 à environ 30 nucléotides, ou paires de bases, et comprenant l'une des séquences SEQ ID N'3 ou SEQ ID N 5 décrites ci-dessus. De telles séquences ainsi que la séquence SEQ ID N'1 peuvent être avantageusement utilisées comme oligosondes pour l'amplification spécifique de la partie du gène de l'apolipoprotéine E dans laquelle on recherche la présence d'une mutation. On notera néanmoins que l'amplification d'une telle séquence peut être effectuée à l'aide d'amorces ne contenant pas l'une des séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N'3 ou SEQ ID N 5. En effet, le but du procédé selon l'invention est d'amplifier un fragment d'environ 100 à 400 paires de bases, susceptible de contenir la mutation recherchée. Des amorces peuvent donc être choisies de part et d'autre de la région à amplifier. L'amplification spécifique de la séquence susceptible de contenir une mutation est préférentiellement effectuée par la méthode de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), et en particulier sa variante ARMS ( Allele Refractory Mutation System). Les produits de la reaction d'amplification sont identifiés par toute méthode connue de l'homme du métier permettant de différencier deux fragments d'ADN, et en particulier par coloration à l'aide du bromure d'éthidium ou par hybridation avec des oligosondes. Pour la mise en oeuvre de la méthode PCR, l'homme du métier peut consulter de manière avantageuse: LARZUL, " Un procédé de réplication in vitro", Editions Lavoisier, 1993, Paris. On rappelera néanmoins que la variante dite ARMS de la méthode PCR comprend les étapes suivantes: utilisation d'une amorce commune (C) et de deux amorces différentielles; l'une correspondant à l'allèle normal (B), et l'autre à l'allèle muté (A); la réaction est effectuée simultanément d'une part entre amorce commune et amorce normale (AC), et d'autre part entre amorce commune et amorce mutée (BC). La présente invention est illustrée sans être aucunement limitée, par les exemples qui suivent La figure 1 est une représentation de la séquence ADN de la région apo E amplifiée, allant de la séquence nucléotidique n 3869 à la n 3958 ( flèches montantes). Les séquences protéiques correspondantes vont de 90 à 121 (flèches descendantes). Les deux premiers sites HhaI (GCGC) sont soulignés et le troisième, polymorphe s2, 3,4, encadré. Les quatres sites polymorphes de la troisième lettre des codons sont indiqués. Les sites correspondants à la nouvelle mutation sont encadrés (GGC H Gly/GAC Asp).. Les figures 2A à 2C représentent des gels d'agarose issus du procédé de génotypage par PCR ARMS de la mutation. L'amorce commune C est utilisée conjointement, d'une part avec l'amorce mutante A, et d'autre part avec l'amorce normale B. Dans les conditions de température d'hybridation décrites dans le texte, les trois sortes de génotypes: +/+ (une bande BC), +/m (deux bandes d'égale intensité deux fois moindre), et m/m (une bande AC), correspondant respectivement aux figures 2A, 2B et 2C, sont ainsi facilement identifiables. EXEMPLE 1 Mise en évidence de la mutation en position 3936 du gène codant Pour 1'anolipoDroteine E. Par séquençage direct du produit PCR obtenu selon Hixson et Vernier (précédemment cités) de la séquence d'ADN du gène de l'apolipoprotéine E, correspondant aux positions 3869 à 3955 chez 29 individus différents, sains ou atteints de la maladie d'Alzheimer et génotypés par APOE, trois types de variation ont été mis en évidence (figure 1). Chez les E4 on retrouve le remplacement de T par C (3932), aboutissant au niveau protéique à la substitution de Cys par Arg (112). Quatre polymorphismes, correspondant à des remplacements portant sur la troisième base des codons, et neutres du point de vue protéique: G par T (3877), G par A (3886), G par T (3889), et G par T (3946) sont mis en évidence. Enfin et surtout, il a été montré, chez la plupart des malades Alzheimer g4 une substitution G par A en position 3936, devant déterminer au niveau protéique la substitution Gly par Asp en position 113. Cette dernière substitution, déduite de celle détectée au niveau de l'ADN, est susceptible d'avoir d'importantes conséquences sur la structure de l'APOE. Parmi les 29 individus séquencés, la mutation G par A (3936) est présente chez huit individus témoins, non atteints de la maladie d'Alzheimer à un âge avancé: deux homozygotes 33 (Nos 1559 et 145), deux hétérozygotes 2-3 (Nos 1542 et 1597), un hétérozygote 2-4 (N 1149), deux hétérozygotes 3-4 (Nos 1573 et 1542), et même un homozygote 4-4 (N 125). Elle est par contre présente à l'état homozygote chez cinq malades Alzheimer probables 4-4 (Nos 65, 100, 203, 214 et 265) et un malade Alzheimer certain 3-3 (n 81). Elle est aussi présente à l'état homozygote chez un individu à risque primaire 3-3 (n 207), et à l'état hétérozygote chez quatre autres individus à risque primaire 3-3 (Nos 159, 160 , 206 et 209). Elle est également présente à l'état hétérozygote chez deux autres malades Alzheimer probables 3-4 (Nos 233 et 236) et un autre malade Alzheimer probable 3-3 (n 235). Elle est cependant absente chez sept autres malades Alzheimer probables: quatre 3-3 (Nos 215, 226, 231 et 232), un 2-3 (n 229), et deux 3-4 (Nos 213 et 227). Au total, chez vingt et un malades Alzheimer probables, certains, ou à risque primaire (42 allèles), la mutation est présente 21 fois, soit dans 50% des cas. Dix huit fois sur vingt et une ( 86% des cas), elle est associée à au moins un allèle s4. L'association observée est explicable en termes de déséquilibre de liaison entre deux sites mutés correspondant à des codons contigus. Le microséquençage après digestion peptidique de l'apo E chez un malade Alzheimer probable homozygote 4-4 et présentant à l'état homozygote la mutation G par A (3936) montre que le résidu Asp (113) est effectivement présent. Un mode de mise en oeuvre de l'invention utilise la technique de séquençage d'ADN, selon laquelle on réalise un séquençage direct par utilisation de l'enzyme séquenase (kit industriel), sur un appareil séquenceur automatique Applied Biosystems. Le brin non-codant a été séquencé deux fois pour chaque réaction, par utilisation de l'amorce 5' TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' Un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, plus facile à mettre en oeuvre que le précédent, consiste à utiliser la technique PCR pour la détection de la mutation. Deux amorces différentielles: A: 3'-TGGCGGACCACGTCATGGCG-5' (amorce mutante) B: 3' -CGGCGGACCACGTCATGGCG-5' (amorce normale) sont utilisées en technique PCR ARMS (allele refractory mutation system) avec une amorce commune C située à environ 300 pb dans l'intron adjacent. Pour chaque échantillon sont réalisées deux PCR simultanées: AC et BC dans les conditions suivantes: 1 pg d'ADN génomique 1 pmol/ l de chaque amorce, lOymol/yl des dNTP 10% DMSO 0,025 U/;il de Taq polymérase dans un volume de 50 iil de tampon (Tris-HCl, 10 mM, pH=8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2) la réaction est de 30 cycles 95 C 1 minute (dénaturation) 640C 1 minute (hybridation) 70 C 2 minutes (élongation). La température d'hybridation est discriminante entre les réactions AC et BC. La bande d'amplifiat observable en gel d'agarose permet de réaliser le génotype comme illustré à la figure 2. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection, dans une préparation d'ADN, d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans le gène de l'apolipoprotéine E, d'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N'1, SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 suivantes: SEQ ID N'1: TGC GGC CGC SEQ ID N03: TGC GAC CGC SEQ ID N 5: CGC GAC CGC 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence de la séquence nucléotidique est déterminée par séquençage de l'ADN. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence de la séquence nucléotidique est déterminée par amplification spécifique de l'ADN du gène de l'apolipoprotéine E ou d'une partie de ce gène. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). 5. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend l'une des séquences SEQ ID N'3, ou SEQ ID N 5. 6. Oligosondes pour réaction d'amplification en chaîne par polymérase ( PCR) présentant la séquence selon la revendication 5. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la réaction est mise en oeuvre à l'aide d'amorces oligonucléotidiques dans le gène choisies de part et d'autre de la région à amplifier. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'une des amorces est celle selon la revendication 6. 9. Produit issu de l'amplification par un procédé selon l'une des revendications 3, 4, 7 et 8 caractérisé en ce qu'il présente une taille comprise entre environ 100 et 400 paires de bases. 10. Procédé de détection dans une préparation d'ARN d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans l'ARN correspondant au gène de l'apolipoprotéine E, d'une des séquences SEQ ID N 5, SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 8 suivantes: SEQ ID N 7 UGC GGC CGC SEQ ID N 8 UGC GAC CGC SEQ ID N 5 CGC GAC CGC 11. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend l'une des séquences SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 8.