Brevet FR2728587A1 — publié le 19960628

L'invention concerne un milieu de culture non sélectif permettant la numération et l'identification de germes présents dans un échantillon biologique, notamment d'urine. Parmi les germes urinaires les plus fréquemment isolés, on rencontre Escherichia ccli, Proteus et Streptocoques du groupe D. Les procédés classiques d'isolement et de numération des germes responsables d'infections urinaires consistent à ensemencer à l'rose calibrée un milieu gélosé réparti en boîtes de Petri comprenant les éléments nutritifs permettant la croissance des germes potentiellement responsables d'infections urinaires, à incuber ces boîtes pendant une durée de 18 à 24 heures à une température de 37- C et à déterminer ensuite le nombre de germes initialement présents dans l'échantillon d'urine en comparant la densité des colonies présentes sur les boîtes à celles d'étalons obtenus avec des concentrations connues de germes. On considère généralement qu'une numération inférieure à 104 germes/ml correspond le plus souvent à une contamination, ce résultat devant toutefois être interprété en fonction de la leucocyturie et du contexte clinique. Une numération comprise entre 104 et 105 germes/ml a une signification douteuse. II est recommandé dans ce cas de renouveler l'examen sur un nouveau prélèvement. Une numération supérieure à 105 germes/ml correspond généralement à une infection. En outre, il est connu d'ajouter au milieu de culture gélosé des substrats chromogènes qui permettront l'identification des germes responsables de l'infection urinaire le cas échéant en fonction de la couleur des colonies imputable à la présence d'enzymes caractéristiques de l'espèce. On connaît ainsi un milieu gélosé, commercialisé par la Société BIO-MERIEUX sous le nom CPS lD2, ayant la composition suivante en 9/1 d'eau distillée - extrait coeur-cervelle 5 - bio-soyase 5 - L-tryptophane 0,75 - tampon Tris 1 - phosphate monopotassique 1 - mélange chromogène 0,30 - agar 17,5. Ce milieu contient aussi 5 ml de sérum de chevalilitre d'eau distillée et son pH est 7,3. Le mélange chromogène est constitué par deux substrats: - un substrat de la ss-glucosidase qui, après métabolisation, permettra d'obtenir des colonies de couleur bleue, dont le diagnostic sera orienté soit vers les Streptocoques du groupe D soit vers les bactéries du groupe K.E.S. (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) par une coloration de Gram; - un substrat de la ss-glucuronidase qui, métabolisé par Escheridtia coli, permettra son identification par l'obtention des colonies de couleur rose bordeaux.Compte tenu des différentes caractéristiques physico-chimiques et de l'activité enzymatique mises en évidence, ce substrat a été identifié comme étant un sel du Schloro 3-indolyl-ss-D-glucuronide utilisé probablement à une concentration comprise entre 200 et 250 mg/l. Le diagnostic d'Escherichia coli est confirmé par l'addition de diméthylaminocinnamaldéhyde (D.M.C.A.) à 1 % pour la recherche de l'indole (lorsque la souche possède une tryptophanase). La présence de L-tryptophane permet également de rechercher la tryptophane désaminase (TDA) pour l'identification des Proteus. La présence de la tryptophane désaminase est en outre confirmée par l'addition sur les colonies de perchlorure de fer (FeCI3) à 10 % qui conduit à une coloration brun-vert du réactif pour les colonies TDA'. Pour les colonies TDA-, le réactif utilisé ne change pas de couleur et reste de couleur jaune. On connaît également de EP-282 733 un groupe de composés indoxyl-B-D-glucuronides éventuellement substitués sur le noyau indolyle notamment par des atomes d'halogène, qui sont des substrats chromogènes de la P-glucuronidase. pour l'identification d'Escherichia coli dans un échantillon d'eau ou d'eaux d'égoûts. Cependant. ce document ne comporte aucune indication particulière qui permettrait à l'homme du métier de sélectionner en particulier le composé selon l'invention. Selon la présente invention, on a découvert à présent qu'en utilisant comme substrat chromogène de la-D-glucurnnidase, le 5-bromo Schloro 3-indolyl-ss-D-glucuronide, de préférence sous la forme de son sel de cyclohexylammonium, il était possible d'identifier de façon nette les colonies d'Eschenchia coli grâce à la coloration pourpre-violette intense qui était obtenue en n'utilisant que des quantités du substrat chromogène inférieures à celle utilisée pour le milieu connu décrit ci-dessus. En outre, l'utilisation du substrat chromogène de la p- glucuronidase selon l'invention, permet la caractérisation directe d'Escheri- chia coli la confirmation étant apportée par la mise en évidence de l'activité tryptophanase en présence du réactif de Kovacs (dépôt d'une goutte de réactif sur une colonie). La présence d'indole est attestée par la formation d'une coloration rouge instantanée et intense, alors que lorsqu'on utilise le milieu connu de l'état de la technique, il est nécessaire de déposer la colonie (colorée grâce au sel du Schloro-3-indolyl-ss-D-glucuronide) sur un disque de papier et d'ajouter une goutte de diméthylaminocinnamaldéhyde, ce qui constitue une manipulation supplémentaire. L'invention a pour objet un milieu de culture non sélectif pour l'identification directe de germes dans un échantillon biologique, notamment de germes responsables d'infections urinaires, comprenant: - des éléments nutritifs permettant la croissance de tous les germes potentiellement responsables d'infections urinaires; - un substrat chromogène de la ss-D-glucuronidase consistant en le S bromo Schloro 3-indolyl ss-D-glucuronide ou l'un de ses sels; et - un substrat chromogène de la ss-glucosidase. De préférence, le 5-bromo Schloro 3-indolyl ss-D- glucuronide est présent sous la forme du sel de cyclohexylammonium (Magenta-glucuronide), commercialisé par BIOSYNTH AG, BIOCHEMICA AND SYNTHtTICA, Suisse, sous la référence B-735. La concentration de ce substrat varie avantageusement entre 0,05 et 0,20 g/litre de milieu de culture, la concentration préférée étant de 0,05 g/litre à 0,1 g/litre, plus spécialement de 0,1 g/litre. Le substrat chromogène de la P-glucosidase est de manière préférée le 5-bromo 4-chloro 3-indolyl p-D-glucopyranoside (BCI glucopyranoside). Celui-ci est commercialisé par BIOSYNTH AG, BIOCHEMICA AND SYNTHETICA, Suisse, sous la référence B-725. De manière avantageuse, le milieu de culture selon l'invention comprend également du tryptophane. Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation du milieu décrit ci-dessus pour la numération et l'identification dans un échantillon d'urine des bactéries suivantes: Escherichia cdi, les Streptocoques du groupe D et les Proteus, notamment Proteus mirabilis, lorsque le milieu comprend du tryptophane. Par ailleurs, l'utilisation du milieu permet aussi l'identification des Entérobactéries du groupe K.E.S.C. Klebsiella, Enterobacter et Serratia). La numération et l'identification sont réalisées avantageusement par ensemencement du milieu de culture sur des boites de Petri. La numération est réalisée comme décrit précédemment en comparant la densité des colonies obtenues à celles d'étalons correspondant à des concentrations connues des germes. Par identification au sens de la présente invention on entend dans le cas d'Escherichia coli, une identification spécifique par l'expression de ses caractères ss-glucuronidase et tryptophanase positifs. La caractérisation d'Eschenchia coli est réalisée après métabolisation du substrat chromogène selon l'invention par l'obtention de colonies de couleur pourpre-violet d'un diamètre généralement compris entre 1,5 et 2,5 mm après 24 heures d'incubation à 37- C. La réaction de confirmation est réalisée par la mise en évidence de la production d'indole à l'aide du réactif de Kovacs se traduisant par un virage instantané au rose du réactif. Cette identification est avantageusement réalisée en déposant une goutte de réactif de Kovacs sur une colonie présumée d'Escherichia coli, sans qu'il soit nécessaire de repiquer la colonie pour la déposer soit sur un disque de papier préalablement imprégné de réactif de Kovacs, soit sur un disque "sec" de papier en additionnant par la suite une goutte de réactif de Kovacs. Toutefois, selon l'invention, il est aussi possible en cas de mélange polymicrobien, de déposer une colonie sur un disque sec", puis d'additionner une goutte de réactif de Kovacs. Cependant, certaines souches d'Escherichia coline peuvent être identifiées par ces deux caractères; il s'agit des souches ss-glucuroni- dase négative et/ou tryptophanase négative représentant de 3 à 5 % de la population des Escherichia coli. II est alors souhaitable d'identifier ces souches à l'aide des méthodes classiques. D'autres souches pourront également apparaître sous la forme de colonies pourpres ou rosées (C. freundii, S. sonnei, S. xylosus, S. haemolyticus, S. agalactiae). La différenciation se fera alors par le caractère indole négatif de ces souches. Les Streptocoques du groupe D et les Entérobactéries du groupe K.E.S. sont identifiés par l'expression de leur caractère Pglucosi- dase positif. La métabolisation du substrat chromogène fait apparaître les colonies de Streptocoques du groupe D et d'Enterobactéries du groupe K.E.S. en couleur bleue ou bleu-vert dans le cas du BCI-glucopyranosiide, la différenciation entre Streptocoques du groupe D et Entérobactéries étant réalisée par un examen microscopique en fonction de la forme des bactéries : cocci Gram pour les Streptocoques du groupe D et bacilles gram pour les Entérobactéries du groupe K.E.S ou encore par la présence de colonies muqueuses caractéristiques des Entérobactéries, d'une coloration bleu-vert moins intense que les Streptocoques du groupe D et d'une taille allant de 2 à 4 mm de diamètre après une incubation de 24 heures à 37e C (les colonies de Streptocoques du groupe D ayant un diamètre d'environ 1 mm et étant de couleur bleu intense).La différenciation au sein des Entérobactéries du groupe K.E.S. peut être obtenue par une technique classique. Les Proteus sont caractérisés après 24 heures d'incubation à 37- C, par des colonies de couleur brun-orangé (réaction TDA positive) avec ou sans coloration brune de la gélose. La confirmation éventuelle des bactéries du genre Proteus est effectuée par addition de perchlorure de fer et observation du virage du réactif au brun-vert. Le Proteus mirabilis est identifié directement par son activité TDA positive et par son caractère indole négatif par dépôt d'une goutte de réactif de Kovacs sur une colonie TDA+, aucun virage du réactif n'étant observé. On donnera ci-après un exemple de milieu selon l'invention ainsi que les résultats obtenus grâce à ce milieu sur différents germes responsables d'infections urinaires. Exemple On a préparé un milieu ayant la composition suivante pour un litre d'eau osmosée (en g/litre) - tryptone 8 - extrait de levure 5 - extrait de viande 5 - L-tryptophane 1 - Magenta-glucuronide 0,1 - BCI-glucopyranoside 0,05 - agar B 12. Le milieu est préparé de la manière suivante : 0,05 g de BCI-glucopyranoside sont dissous à froid dans 5 ml de diméthyltôrmamide (DMF), dans un erlen propre et sec, en verre. Lors de la dissolution, le DMF est ajouté par petites quantités en agitant manuellement jusqu'à atteindre la dissolution complète du produit. Les autres composants sont pesés, ajoutés à 995 ml d'eau osmosée et dissous par chauffage. Ensuite, les 5 ml de BCI-glucopyranoside dans le DMF sont ajoutés. Le vrac obtenu est alors porté à ébullition en agitant Le PH est mesuré et ajusté à 7,3 + 0,1 par addition d'HCI ou de NaOH, si nécessaire. Le vrac est autoclavé pendant 15 minutes à 121- C puis réparti dans des boites de Petri à raison de 18 ml/boite. Différentes souches sont testées par ensemencement des milieux et incubation. Chaque souche est repiquée la veille du contrôle dans un bouillon T. C. S. et incubée à 37' C. Avant l'ensemencement des boites de Petri, chaque souche est diluée au 1/10ème dans un bouillon tryptone-sel. 10p1 de cette dilution sont ensemencés à l'aide d'une ose calibrée, par la technique d'isolement en stries. Les boites sont incubées à 37' C pendant 24 heures. Les résultats sont rapportés au tableau suivant: Colonies Caractères Souches Diamètre Couleur des bêta- bêta- Indole* T.D.A. glucuronidase glucosidase colonies E. coli K. CIP 54.8 1,5 à 2,5 mm Pourpre + Positif Négatif Positif Négatif E. coli 1,5 à 2,5 Pourpre(+) Positif Négatif Positif Négatif S. sonnel ATCC 25931 Pourpre Positif Négatif Négatif Négatif 2 à 3 mm Bleue Négatif Positif Négatif Négatif E. faecalis ATCC 29212 1 mm Bleue Négatif Positif Négatif Négatif E. faecium CIP 5432 1 mm Bleue Négatif Positif Positif Négatif K. oxytoca 3 mm Orange Négatif Négatif Négatif Positif P. mirabilis ATCC 25933 2 mm Orange Négatif Négatif Positif Positif P. Stuartii 2 mm Blanche Négatif Négatif Négatif Négatif 1 à 2 mm S. aureus ATCC 25933 * : la révélation du caractère indole s'effectue en déposant 1 goutte de réactif de Kovacs sur une colonie isolée : - caractère indole + : virage rapide du réactif au rouge - caractère indole - : pas de virage du réactif. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture gélosé non sélectif pour l'identification directe de germes dans un échantillon biologique, notamment un échantillon d'urine, comprenant: - des éléments nutritifs permettant la croissance de tous les germes potentiellement responsables d'infections urinaires; - un substrat chromogène de la ss-D-glucuronidase consistant en le 5 bromo 6-chloro 3-indolyl ss-D-glucuronide, ou l'un de ses sels; et - un substrat chromogène de la ss-glucosidase. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat chromogène de la ss-D-glucuronidase est le sel de cyclohexylammonium du 5-bromo 6-chloro 3-indolyl-ss-D-glucuronide. 3. Milieu selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat chromogène de la ss-glucosidase est le Sbrnmo 4-chloro 3-indolyl-ss-D-glucopyranoside (BCI-glucopyranoside). 4. Milieu de culture selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend 0,1 g/litre de milieu de sel de cyclohexylammonium du 5-bromo 6-chloro 3-indolyl-ss-D-glucuronide. 5. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre du Ltryptophane. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il a la composition suivante (en g/litre d'eau): - tryptone 8 - extrait de levure 5 - extrait de viande 5 - L-tryptophane 1 - Sel de cyclohexylammonium du 5-bromo 6-chloro 3-indolyl-p- D-glucuronide 0.1 - BCI-glucopyranoside 0,05 - agar B 12 7. Utilisation du milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la numération et l'identification de E coli, des Streptocoques du groupe D, des Entérobactéries du groupe KE.S. et éventuellement de Proteus dans un échantillon biologique. notamment d'urine. 8. Utilisation du milieu de culture selon la revendication 5 pour la numération et l'identification des bactéries du genre Proteus dans un échantillon d'urine. 9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8. caractérisée en ce que le milieu de culture est gélosé et réparti en boites de Petri. 10. Procédé de numération et d'identification d'Escherichia coli dans un échantillon biologique, notamment d'urine, caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en culture de l'échantillon biologique sur un milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5; - I'observation de la formation de colonies pourpre-violet; - la confirmation d'Escherichia coli par addition de réactif de Kovacs sur une colonie et observation du virage au rose du réactif de Kovacs. 11. Procédé de numération et d'identification de bactéries du genre Proteus dans un échantillon biologique, notamment d'urine, caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en culture de l'échantillon biologique sur un milieu selon la revendication 5; - I'observation de la formation de colonies de couleur brun - I'observation de la formation de colonies de couleur brunorangé et éventuellement coloration brune de la gélose; - la confirmation éventuelle des bactéries du genre Proteus par addition de perchlorure de fer et observation du virage du réactif au brun-vert. 12. Procédé selon la revendication 11 pour l'identification spécifique de Proteus mirabilis, comprenant en outre après l'apparition de colonies brun-orangé, I'addition de réactif de Kovacs et l'observation de l'absence de virage du réactif de Kovacs. 13. Procédé de numération et d'identification de Streptoco- ques du groupe D et/ou d'Entérobactéries du groupe K.E.S. dans un échantillon biologique, notamment d'urine, caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en culture de l'échantillon biologique sur un milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5; - I'observation de la formation de colonies de couleur bleue à bleu-vert; - la différenciation entre les Streptocoques du groupe D et les Entérobactéries du groupe K.E.S., par l'observaffon de colonies muqueuses de 2 à 4 mm de diamètre caractéristique des Entérobactéries et d'une coloration bleu-vert moins intense par rapport aux Streptocoques. 14. Utilisation du ibromo Schloro 3-indolyl-ss-D- glucuronide ou l'un de ses sels dans un milieu de culture pour l'idenXon d'Eschenchia coli, notamment dans des échantillons durine.