Brevet FR2730409A1 — publié le 19960814

La présente invention concerne une nouvelle utilisation des galactolipides, en particulier des galactosylglycérides, tout particulièrement des digalactosyldiglycérides, et des extraits d'origine naturelle contenant ces produits, dans les domaines cosmétique, pharmaceutique et notamment dermatologique. Plus précisément, I'invention concerne une nouvelle utilisation des galactolipides comme agents destinés à intensifier la production de la fibronectine extracellulaire. Cette nouvelle utilisation trouve son application en particulier en cosmétique ou en dermatologie, notamment pour la préparation de compositions destinées au raffermissement de la peau, à accélérer la cicatrisation, à prévenir ou traiter les rides, et, d'une façon générale, à prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané. In vivo, la fibronectine existe sous deux formes : une forme soluble présente dans le plasma et d'autres liquides biologiques, et une forme insoluble matricielle distribuée dans les tissus conjonctifs lâches et diverses membranes basales. Les fibronectines sont des glycoprotéines de haut poids moléculaire (450000) formées de deux sous-unités similaires. Des études de séquençage d'ADNc ont prouvé que fibronectines plasmatique et cellulaire provenaient d'un seul gène par épissage alternatif du premier transcrit. La partie glucidique de la molécule varie selon les fibronectines - les oses constitutifs sont l'acide sialique, des hexoscs, des hexosamines - les chaînes oligossacharidiques sont distribuées asymétriquement sur la molécule avec des domaines hautement glycosylés et d'autres dcpourvus de glucides. Les fibronectines présentent des caractères immunologiques communs vis-à-vis des anticorps polyclonaux.Par ailleurs, elles interagissent avec les collagènes, la fibrine, des protéoglycanes, certains éléments du cytosquelette, des bactéries, les surfaces cellulaires (la fibronectine et son rôle dans les interactions cellulesmatrices. J.LABAT-Robert, comptc rcndu société dc biologie 1986, 180, p. 142- 150). La fibronectine possède une structure moléculaire complcxe consistant en de multiples sites de liaisons spécifiques et il semble que les phénomènes biologiques complexes dans lesqucls sont impliquées "lcs fibronectines" sont liés à leurs structures (fibronectins : multifunctional modular glycoproteins, Richard O hynes and Kenneth M.Yamada - Thc Journal of Ccll Biology 1982, 95 : 369 377) par exemple, la morphologie, I'organisation du cytosquelette, la transformation oncogénique, la phagocytose. Dans la zone centrale de la molécule "fibronectine" se trouve le site de liaison avec les surfaces cellulaires. Dcs recherches intcnsivcs in vitro comme in vivo ont désigné la fibronectinc comme étant le prototype de la protéine responsable de l'adhésion des cellules à leur substrat mais l'expression de la fibronectine et de ses récepteurs régulent plusieurs propriétés cellulaires : la polarité, la capacité à migrer, l'état de différenciation (fibronectin and its receptors E.Ruoslahti, Ann. Rev. Biochem. 1988, 57 : 375-413). On sait que la capacité dc fixation cellulaire pcut être attribuée à un tripeptide : le L-arginyl-glycyl-L-aspartyl (RGD) dont chacun des aminoacides contribue à la liaison (New Perspectives in Ccll Adhcsion RGD and intcgrins, E.Ruoslahti ; M.Pierschbacher, Science 1987, Vol. 238, p. 491-497). Les sous-unités dc la fibroncctine possèdent des sitcs d'interactions avec des récepteurs de la mcmbranc cellulaire, les intégrines qui reconnaissent le peptide RGD. (Integrins in human cclls and tumors, I.Virtanen, M.Korhonen, A.L.Kariniemi, V.E.Gould, L.Laitinen, J.Ylänne, Cell Diffcrcntiation and Development, 1990, 32, 215-228). Toutes les cellules dans les tissus sont cn contact avec une matrice extracellulaire. Cclle-ci est constituée de trois protéines majeures sous forme dc fibres : le collagène, I'élastinc ct les glycoprotéines dc structurcs comme la fibronectine qui sont imbriquées dans un gel hydraté dc glcosaminoglycanes. Toutes ces macromolécules sont sécrétées localement par les cellules. Les macromolécules de la matrice extracellulaire ont des effets remarquables sur le comportement des cellules influençant leur formc, mouvement, métabolisme ct différenciation. Ces interactions ccllulcs-matrice peuvent être modifiées par des altérations dc la structure ct des fonctions dc ces molécules au cours du vieillisse- ment ct de divers états pathologiqucs. Elles pcuxcnt ctrc perturbées par la présence dc fragments possédant une activité protéolytique : c'cst Ic cas de la fibronectine qui est scindée en plusieurs fragments au cours de proccssus inflammatoires.Ces fragmcnts possèdent donc une activité protéolytique propre absente dc la molécule intacte (Potcntial proteolytic activity of fibronectin : fibronectin laminas and its substratc specificity. l.Emod, P.Lafaye. T.Planchenault. S.Lambcrt-Vidman, J.M.Imhoff and V.Keil-Dlouha. Biol. Chcm. Hoppe-Seyler 1990, 371, 129-135). On sait que la composition dc la matricc cxtraccllulaire de tous les tissus et les organes change continuellement en fonction de l'âge. La composition d'un tissu dépend de la vitesse relative de synthèse de ses constituants suivis de leur dégradation. Les interactions cellules-matrice peuvent être d'une grande importance au cours du vieillissement des tissus conjonctifs et les glycoprotéines de structure jouent un rôle clef dans ces phénomènes. Au niveau de la peau, le vieillissement dermique corrcspond à une perte de cohésion entre fibroblastes et collagène. Au cours du vieillissement, les modifications dans l'architecture ne s'accompagnent pas de variations qualitative ct/ou quantitative des collagènes I et III.Par contre, in vitro, la fibroncctine fibrillaire extracellulaire se raréfie avec l'âge. (Vieillissement dermique - Etude en immunofluorescence des collagènes I et III et de la fibronectinc M.TH.Picraggi, M.Julian, H.Bouissou, S.Stocker, J.A.Grimaud - Ann. Pathol. 1984, 4 n3, 185-194). Bien que certains auteurs aient observé une augmentation de la biosynthèse de la fibronectinc avec l'âge (Ladislas Robert, "Le vieillissement. De l'homme à la cellule", 1994, Bclin, Paris, p.126), il ressort clairement de nombreuses autres publications, en particulier dc ccllc de Bcrnard Djian ("Comblement des rides", Manucls dc Pratiques dc Médecine Esthétique, 1992, Ed. Arnette S.A., Paris, p. 40-41), que la fibronectine extracellulaire se raréfie lors du vieillissement cutané.Or cette glycoprotéinc, particulièrement abondante dans le derme, surtout chez les sujets jcuncs, jouc un rôle essentiel dans la cohésion des cellules entre elles et dans l'adhésivité entre les cellules ct le collagène. D'où il ressort que la présence d'un réseau dc fibronectine extracellulaire en bon ctat est bénéfique. Par ailleurs, les galactolipides comptcnt parmi les constituants essentiels des êtres vivants, aussi bien animaux que végétaux. Chez les êtres supérieurs, ils sont présents dans l'ensemble de l'organisme, principalement cn tant que constituants des membrancs cellulaires. Chcz les plantes. ils sont en particulier localisés dans l'enveloppe chloroplastique. Dc très nombrcuscs publications leur sont consacrées, comme par exemple. Ics publieations suivantes - "Comparative study of thc immunological propcrtics of galactosylipid and galactosylceramide includcd within natural mcmbrancs", DUPOUEY P. al., Immunochemistry (1()7( ) 13. p. 289-294 - "Plant galactolipids" DOUCE R. et JOYARD J., dans "The biochemistry of plants", Stumpf P.K. (Editor), Academic Press, Ncw York-USA (1980) volume 4, p. 321-362 - "Localization of galactolipid : galactolipid galactosyltransferase and acyltransferase in outer envelope membrane of spinach chloroplasts", HEEMSKERK J. W.M., et al. Biochimica et biophysica acta, (1986) 877 (2) p. 281-289 - "Lipids : structure and function", Stumpf P.K. (Editor), (1987) vol. 9, ISBN 0-12-675409.8, "The biochemistry of plants" Les galactolipides comprennent en particulier les galactosylglycérides. Ces derniers sont bien connus, et peuvent être extraits de plantes, par exemple de céréales. Ainsi, I'article de J.A. Prieto, A. Ebri et C. Collar, "Optimized Separation of Nonpolar and Polar Lipid Classes from Wheat Flour by Solid-Phase Extraction" (J.Amer. Org. Chem. Soc., (1992) 69, No.4, 387-391), décrit une technique de séparation par chromatographie des différcnts galactosylglycérides contenus dans la farine de blé. Par ailleurs, un autre article des mêmes auteurs "Composition and Distribution of Individual Molecular Species of Major Glycolipids in Wheat Flour" (J. Amer. Org. Chem. Soc., (1992) 69 No. 10, 1019-1022), décrit la composition et la distribution des principaux glycolipides contenus dans la farine de blé. Ces produits, en particulier les digalactosyldiglycérides (DGDG), ont fait l'objet d'utilisations dans des domaines variés. On citcra en particulier: - la demande PCT WO 88.08253 qui décrit l'utilisation des DGDG pour réduire la viscosité du chocolat, - la demande de brevet JP-A2-0503750 qui décrit l'utilisation des mêmes produits pour améliorer la qualité des produits issus de la farine de blé, - la demande de brevet JP-A2-03251506 qui dccrit, quant à elle, une utilisation des mêmes produits comme agent désinfectant, - la demande dc brevet EP-A-0249561 qui décrit des liposomes contenant des agents anti-inflammatoires et des glycolipides, cn particulier des galactolipides dont le digalactosyldiglycéride, - la demande de brevet EP-A-0009842 qui dccrit, quant à elle, des liposomes contenant des digalactosyldiglycérides et des lécithines et leur utilisation pour la libération contrôlé des médicaments. La demanderesse a maintenant découvert que les galactolipides, en particulier les galactosylglycérides et les extraits d'origine naturelle en contenant, notamment les extraits végétaux en contenant, agissent de façon très efficace sur la production extracellulaire de fibronectine par les fibroblastes humains, et amplifient ainsi le réseau extracellulaire de fibronectine. La conséquence de cette découverte a conduit la demanderesse à tester et vérifier l'efficacité des compositions contenant des galactolipides et en particulier du DGDG, pour différentes applications tendant à renforcer les propriétés biomécaniques du derme ou des tissus conjonctifs, par exemple pour prévenir et/ou traiter les effets du vieillissement cutané. Ainsi, I'invention concerne l'utilisation des galactolipides, en particulier des galactosylglycérides, tout particulièrement des digalactosyldiglycérides, et des extraits notamment végétaux contenant ces produits, pour toutes les applications cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, où l'on cherche à obtenir une densification du réseau extracellulaire de fibronectine. Un tel résultat permet, en particulier, de lutter contre les effets du vieillissement du derme et en particulier contre l'apparition des rides ou le relâchement cutané. En effet, il est bien connu que les modifications de l'apparence et surtout des propriétés mécaniques de la peau sont dues essentiellement à des modifications des composants du derme dont fait partie la fibronectine puisqu'elle assure, entre autres, le lien entre la cellule et le collagène. La présente invention a donc pour objet principal de résoudre le problème technique consistant à fournir une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, présentant une exccllente efficacité sur la prévention ou le traitement des effets du vieillissement cutané, en particulier l'apparition des rides et sur le raffermissement cutané. Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un galactolipide ou d'un extrait d'origine naturelle en contenant comme agent cosmétique favorisant la formation de fibronectine extraccllulaire par les fibroblastes, permettant ainsi d'améliorer la cicatrisation cutanée, de renforcer les propriétés biomécaniques du derme ou des tissus conjonctifs, daméliorer l'aspect dc la surface de la peau, et permettant, en pafliculier dc prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané, tels que les rides ou le relâchement des tissus dc soutien cutané. L'invention concerne donc, selon une dc ses caractéristiques essentielles, I'utilisation d'au moins un galactolipidc ou d'un extrait d'origine naturelle en contenant comme agent cosmétique permettant d'améliorer la cicatrisation cutanée, de renforcer les propriétés biomécaniques du derme, d'améliorer l'aspect de la surface de la peau, ou de prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané, tels que les rides ou le relâchement des tissus de soutien cutané. Par amélioration des propriétés biomécaniques du derme, on entend toute amélioration d'origine biologique de la qualité structurelle du derme. En effet, I'intensification du réseau de la fibronectine extracellulaire permet d'améliorer l'adhésion des cellules aux macromolécules intercellulaires, telles que le collagène. Ainsi, I'utilisation selon l'invention permct plus particulièrement d'obtenir un raffermissement cutané, une prévention de l'apparition des rides ou une atténuation de leur profondeur. Suivant une première variante avantageuse, l'extrait d'origine naturelle précité est un extrait végétal, en particulier un extrait de céréale telle que le blé ou l'avoine, ou un extrait de feuilles ou de noix de Ginkgo Biloba. Selon une autre variante avantageuse, on choisira comme galactolipide un produit de la famille des galactosylglycérides. Les galactosylglycérides utiles selon l'invention sont tout particulièrement les monogalactosylmonoglycérides (MGMG), les monogalactosyldiglycérides (MGDG), les digalactosylmonoglycérides (DGMG) et les digalactosyldiglycérides (DGDG). On choisira avantageusement les mono- ou les digalactosyldiglycérides. Selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, le galactolipide sera choisi dans la famille des galactosylglycérides répondant à la formule (I) dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle de préférence bêta-D galaetopyranosyle - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant de 9 à 29 atomes de carbone, - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus, - A représente - une simple liaison, ou - un groupement alpha- ou bcta-D-galactopyranosylc, ou - une chaîne constituée d'un enchaînement dc plusieurs sucres, de préférence de deux ou trois sucres, choisis dans le groupe constitué par l'alpha- et le béta-D- galactopyranosyle, l'alpha-D-glucopyranosyle, I'alpha-D- et l'alpha-L manopyranosyle. Selon une autre variante préférée de l'invention, les galactolipides sont choisis parmi les mono- et les digalactosyldiglycérides (respectivement MGDG et DGDG) de formule (I) précitée, dans laquelle - Gal, R1 et R2 répondent à la définition donnée précédemment, si ce n'est que R2 représente nécessairement un groupement acyle - A représente une simple liaison ou un groupement alpha- ou bêta-D galactopyranosyle. De préférence, le galactosyldiglycéride ci-dessus est choisi parmi les digalactosyldiglycérides (DGDG), c'est-à-dire parmi les produits dans lesquels A représente un groupement alpha- ou bcta-D-galactopyranosyle. De façon avantageuse, on choisira pour chacune des variantes précédentes des galactosylglycérides pour Icsquels - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée linéaire contenant 15 17 ou 19 atomes dc carbone. saturée ou comprenant de 1 à 5 doubles liaisons, en position 7, 10 et/ou 13 pour un groupement acyle de 16 atomes de carbone, en position 9, 12 et/ou 15 pour un groupement acyle de 18 atomes de carbone, et en position 5, 8, 10, 14 et,ou 17 pour un groupement acyle de 20 atomes de carbone. - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus. Selon un autre de ses aspects, I'invention concerne également un procédé de traitement cosmétique dcstiné notamment à renforcer les propriétés biomécaniques du derme par une intensification de la formation de fibronectine extracellulaire par les fibroblastes, à obtenir un raffermissement cutané ou l'amélioration de la surface de la peau ou à prévenir ou à traiter les effets du vieillissement cutané tels que l'apparition des rides, consistant à appliquer localement sur les zones de la peau à traiter une composition contenant au moins un galactolipide ou un extrait végétal en contenant. Pour la mise en oeuvre de ce procédé cosmétique, on choisira avantageusement le galactolipide parmi les galactosylglycérides de formule (I) décrits ci-dessus, les produits préférés constitutant les mêmes sous-classes que celles définies précédemment. On choisira de façon particulièrement préférée les digalactosyldiglycérides. Ces digalactosyldiglycérides ont été décrits dans diverses publications, en particulier dans le brevet US-4,377,567 ou dans la publication de D.V. Myhre dans Canadian Journal of Chemistry (1968) 46, 3071-3077, incorporée ici par référence. Les galactolipides, en particulier les galactosylglycérides, peuvent être obtenus par synthèse, ou bien par extraction à partir de tissus animaux, en particulier ccrx eau, moelle épinière ou à partir de plants, en particulier de céréales, selon des méthodes d'extraction largcmcnt décrites dans la littérature. Pour ccla, on sc rcportcra par exemple à la publication de D.V. Myhre (1968) citée ci-dessus, ainsi qu'à celles dc J.A. Pricto ct al. (J. Amcr. Org. Chem. Soc. (1992) 69 (4) 387-391), dc G.G. Shipley et al. (Biochimica et biophysica acta (1973) 311 531-544), de P. Dupoucy ct al. (Immunochemistry (1976) 13 289 294), ou de Haru Kameyama et al. (J. Amcr. Oil Chcm. Soc. (1979) 56 549-51) ces publications ctant incorporées ici par référence. Par ailleurs, certains galactosylglycérides, notamment du MGDG ou du DGDG sont disponibles dans le commerce, en particulier chez SIGMA. Chem. Co. (Saint-Louis ; Mo, USA). Les extraits d'origine naturelle contenant les galactolipides, utilisables pour la mise en oeuvre de l'invention, peuvent être obtenus par des procédés d'extraction bien connus de l'homme de l'art. Le solvant d'extraction utilisée sera de préférence un solvant polaire, tel qu'un alcool, un éther ou un hydrocarbure halogéné. On choisira par exemple le méthanol, I'éthanol, I'isopropanol, I'éther éthylique ou le chloroforme. Selon un autre aspect dc l'invention, les mêmes produits, galactolipides, en particulier galactosylglccridcs et tout particulièrement les digalactosyldiglycérides, et les extraits naturels en contenant, pourront être utilisés comme agent actif de compositions pharmaceutiques, en particulier dermatologiques, destinées à intensifier la synthèse de la fibronectine extracellulaire. Ainsi selon cet autre aspcct, l'invention concerne l'utilisation, à titre de principe actif, d'au moins un galactolipide ou d'un extrait d'origine naturelle en contenant, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée à prévenir ou traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience en intensité du réseau de fibronectine extracellulaire dans les tissus conjonctifs, en particulier dans le derme, à améliorer les propriétés biomécaniques de la peau, à prévenir ou traiter les effets du vieillissement, en particulier du vieillissement cutané, à favoriser la cicatrisation ou à obtenir un raffermissement cutané. Invention concerne tout particulièrement l'utilisation, à titre de principe actif, d'au moins un galactoslglycéride, tel que décrit précédemment, notamment un digalactosyldiglycéride, pour la préparation de compositions pour les indications précitées. Les galactosylglycérides sont avantageusement choisis pour cette application dans la famille I définie précédemment et les sous-familles de produits préférés sont les mêmes que celles définies précédemment. Selon une autre variante. le principc actif précité est un extrait d'origine naturelle, animale ou végétale, tel que preccdemcnt défini. Avantageusement, il s'agira d'un extrait végétal cn particulier un extrait de céréale, telle que le blé ou l'avoine, ou un extrait de fcuillcs ou de noix dc Gingko Biloba. Les essais réalisés par la demanderesse ont clairement mis en évidence l'effet des galactolipides et tout particulièrement des galactosylglycérides, en particulier du digalactosx Idiglyccridc sur la formation de fibroncctine extracellulaire, dont ces produits permettent d'amplifier le réseau. Cette constatation a conduit la demanderesse à utiliser les compositions selon l'invention pour toutes les applications où l'on cherche à favoriser une augmentation de la densité du réseau de fibronectine extracellulaire dans les tissus conjonctifs, en particulier dans les tissus de soutien cutané. Ainsi, les compositions selon l'invention sont donc tout particulièrement destinées au raffermissement de la peau, à l'accélération ou l'amélioration du processus de cicatrisation, à la prévention de l'apparition des rides ou à leur traitement, et d'une façon générale à la prévention ou au traitement des effets du vieillissement cutané. Les compositions de l'invention peuvent donc, en particulier, être avantageusement utilisées pour atténuer la profondcur des rides, notamment celles du visage et du cou. Elles permettent, également, d'améliorer les propriétés biomécaniques de la peau et ainsi de prévenir ou traiter les effets du vieillissement, en particulier du vieillissement cutané, de favoriser la cicatrisation ou d'obtcnir un raffermissement cutané. Dans chacun des aspects précédemment décrits, on utilisera de préférence les concentrations en galactolipide comprises entre 0,001 et 10 % en poids par rapport au poids total de la composition le contenant. Cette concentration sera de préférence comprise entre 0,01 et 5 % en poids par rapport au poids total de ladite composition. On utilisera de façon particulièrement avantageuse des extraits végétaux contenant au moins un galactosylglycéride, en particulier des extraits de céréales telles que le blé ou l'avoine. De tels produits existent commercialement. A titre d'exemple de produits commcrciaux, on citcra des produits commerciaux contenant du DGDG et du MGDG disponible chez SIGMA Chemical Company (Saint-Louis, Mo, USA). Dans Ic cadrc dc l'invention, selon chacun des aspccts précédents, I'administration des galactolipides. notamment des galactosylglycérides, en particulier des mono- ou digalactosyldiglyccridcs ou des extraits végétaux contenant ces différents produits. est réalisée selon les méthodes classiques, permettant la stimulation dc la production de fibroncctine extracellulaire. Habituellemcnt, la voie la plus simple d'administration est la voie topique, en particulier lorsquc l'on chcrchc à restaurer ou renforcer les propriétés biomécaniques des tissus de soutien cutané pour raffermir la peau, ou à prévenir ou atténuer l'apparition des rides, notamment celles du visage ou du cou. Ainsi, les compositions selon l'invention seront formulées, conformément aux techniques bien connues de l'homme de l'art, de manière appropriée pour l'administration topique, par exemple sous forme de crème, de lait, de lotion, gélifiée ou non, ou de pommade. Selon une variante avantageuse de l'invention, le galactolipide ou l'extrait en contenant, est incorporé dans un excipient, véhicule ou support cosmétiquement ou pharmaceutiquement, notamment dermatologiquement acceptable. De tels supports sont bien connus de l'homme de l'art et résultent également des exemples de compositions cosmétiqucs ou de compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques décrites plus loin qui ont une portée générale. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lecture de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples donnés uniquement à titre d'illustration et qui ne sauraicnt par conséquent en aucun cas limiter la portée de l'invention. Les figures 1 à 4, qui font partie intégrante de l'exemple 1, sont des copies de photographies obtcnues lors dc l'obscrvation au microscope à fluorescence du réseau extraccllulaire dc fibroncctine sécrétée respectivement par: - figure 1: des cellules-témoin prélevées chez un donneur dc 20 ans - figure 2 : les mêmes cellules que pour la figure 1 mais traitées par du DGDG; - figure 3 : des cellules-témoin prélevées chez un donneur de 46 ans - figure 4 : les mêmes cellules que la figure 3 mais traitées par du DGDG. Dans ces exemples les pourcentages sont exprimés en poids, sauf indication contraire. Dans le cas des extraits, les quantités de ceux-ci sont exprimées en poids sec. EXEMPLES Exemple 1: Mise en évidence de l'augmcntation de la formation de fibronectine extracellulaire en présence de DGDG A - Principe de la méthode L'immunolocalisation de la fibronectine repose sur le principe général de la liaison spécifique d'un anticorps à son antigène. La technique est réalisée par immuno-marquage indirect. Dans un premier temps, un anticorps antifibronectine préparé chez le lapin est mis en contact avec la couchc ccllulairc. Dans un deuxième temps, le complexe formé par la liaison de l'anticorps spécifique à son antigène est révélé par l'addition d'une globuline dirigée contre les Ig G de lapin couplé à un fluorochrome, ici, la R phycoérthrine. B - Protocole Les anticorps utilisés sont 1. Anticorps de lapin anti-fibronectine humaine (BTI Ref. BT 551 P) 2. Anticorps de chèvre F(ab')2 anti-immunoglobuline de lapin (G + L) marqués à la phycoérythrine (TAGO Ref. 4920). Culture Les cellules utilisés sont des fibroblastcs issus dc plasties chirurgicales mammaires ou abdominales de donneurs adultes sains. Les cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre, et 24 h après l'ensemencement, le milieu est rcnouvclc cn présence ou non de DG DG. Le milieu de culture initial est du MEM + 10 % dc sérum dc veau foetal (SVF). Pendant la phase de traitement, le milieu est constitué dc milieu MEM + 2,5 % sérum de veau foetal. Le DGDG est mis en solution dans du DMSO ct utilisé sur les cultures à la concentration finale de 750 g/ml. Les opérations de culture se déroulent de la manière suivante Au jour J=0: Ensemencement avec du milieu MEM + 10 % SVF Au jour J+2 : Traitement DGDG (750,ug/ml) avec milieu MEM + 2,5 % SVF Au jour 5+4 : Traitement identique Au jour J+6 : Traitement identique Au jour 5+8 : Fixation des cellules Fixation Après rinçage des lamelles avec le tampon PBS, les cellules sont fixées 20 min au paraformaldéhyde (3,7 So dans PBS) à 4iC. Réaction immunologique Après 2 lavages des lamelles en tampon phosphate PBS puis en tampon PAB (PBS additionné de 0,2 % de sérum albumine bovine (BSA)), I'anticorps antifibronectine (dilué au 1/250ème dans PAB) est mis en contact avec les cellules pendant 60 min à 4-C. Cette opération est suivie d'un passage en solution tampon (PAB) puis de 2 bains de 15 min dans le meme tampon. La deuxième partie de la réaction est réalisée par l'addition du conjugué fluorescent (dilué au 1/500ème dans PAB) pendant 45 min à température ambiante. Les cellules sont alors de nouveau rincées avec du PBS. . Observation Chaque lamelle est cnsuitc séchée et montée sur lame (milieu de montage : glycérol 33 % dans PBS). L'observation est réalisée au microscope à fluorescence (OLYMPUS BH2). Résultats Cette méthode a été appliquée à des fibroblastes de donneurs d'âges différents (17, 20, 46 et 47 ans) et ayant un nombre de rcpiquage croissants (de 3 à 8 passages). L'observation des figures 1, 2, 3 et 4 correspondant au donneur de 20 ans pour les deux premières et à celui de 46 ans pour les deux secondes, montre que l'aspect du réseau extracellulaire de fibronectine change radicalement en présence de DGDG : il s'étoffe en présence de la substance, la distribution des fibres et leur organisation sont différentes. - La détection de la fibronectine extracellulaire par immunofluoreseence dans les cellules témoins (figurcs 1 et 3) révèle la présence d'un ensemble de filaments rassemblés à certains endroits mais orientés dans l'axe longitudinal dzs cellules, parallèles entre eux. L'orientation des fibres est nctte. La condensation des fibres présente au niveau de certaines cellules contraste avec la présence de fines fibres entrecoupées et isolées. - Le traitement par le DGDG (figures 2, 4) fait apparaître une densité de filaments beaucoup plus importante. Les fibres sont associées entre elles, entrelacées. Elles marquent une sorte de tourbillons, le contour des cellules n'est pas discernable Les fibres apparaisscnt imbriquées dans un filet aux maillcs relativement serrées, de type "dcntclle" ou "écheveau". La fibronectine dans les culturcs provenant de sujets jeunes (1720 ans) apparaît sous forme dc fibres plus abondantes que chez les sujets "âgés" (46-47 ans). Il ressort de l'étude que le DGDG provoque une augmentation considérable de la formation de fibroncctine extracellulaire par les fibroblastes et ce, quelque soit l'âge des sujets. Le phénomène paraît être plus important chez les sujets de 46 ans (voir photos) étant donné que le réseau dc basc est moindrc. Si les cellules ont été cultivées très tot en préscncc dc DGDG (avant l'ensemencement sur des lamelles) Ic résultat nc diffère pas, la concentration des filaments paraît être la mêmc qu'après 3 traitements succcssifs. Exemple 2 : Mise en évidence de l'activité du di galactosvldi glïcEride augmentant la capacité d'adhésion des fibroblastes. La présente expérience a pour but de vérifier la stimulation de la capacité d'adhésion de fibroblastes humains normaux traités par du DGDG. Pour cela, on observera la rapidité d'adhésion à un support plastique de ces cellules en culture. On réalise dans un flacon de 75 ml une culture de fibroblastes humains normaux, obtenus comme indiqué précédemment à l'exemple 1. Ces cellules sont cultivées de manière classique dans du milieu MEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal, auquel on ajoute du DGDG (SIGMA) à la concentration de 750,ug/ml. La culture est conduit pendant une semaine, avec deux renouvellements du milieu dc culture dans la semaine, toujours avec la même concentration en DGDG. Ensuite, après rinçagc de la monocouche de cellules par un tampon phosphate PBS, on décolle les cellules en laissant agir pendant 30 minutes une solution 2 mM d'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un milieu de culture classique (MEM additionné de 10 % de sérum de "eau foetal). Pour évaluer la capacité d'adhésion des fibroblastes, on introduit dans les boîtes de culture en matière plastique dc 6() mm de diamètre 3.105 cellules en suspension dans le milieu (environ 3 ml). Après un temps déterminé après cette introduction dans les boîtes, à 15, 20 et 35 minutes, on prélève la totalité du surnageant et on compte les cellules restées en suspension, au moyen d'un compteur de cellules, ZM, COULTRONICS, pour en déduire le nombre de cellules restées attachées aux parois des boîtes formant support. Chaque essai est fait en trois exemplaircs. On compare les résultats ainsi obtenus avec ceux correspondant à des fibroblastes témoins, de même origine, ayant été cultivés dans les mêmes conditions pendant une semaine, Si ce n'est que Ic milieu dc culture nc contenait pas de DGDG. On calcule alors Ic pourcentage des cellules adhérant aux parois par rapport aux essais témoin, en fonction du temps. Les résultats obtenus figurent au tableau I ci-après. TABLEAU I Temps Pourcentage de cellules adhérant au (minutes) support, par rapport au témoin 15 22 + 2 % 20 64 + 6 % 35 64 + 6 % Il ressort très clairement dc ces résultats, que le DGDG joue un rôle positif très important dans le mécanisme d'adhésion des fibroblastes.Ceci constitue une observation qui va dans le même sens que celle de l'exemple 1 sur l'augmentation du réseau extracellulaire de fibronectine, sachant qu'il était connu que la fibronectine intervient dans l'adhésion des cellules du derme entre elles et des cellules avec des protéines telles que le collagène. Exemple 3 : Produit à effet cicatrisant On prépare une dispersion stable contenant 1 % en poids de DGDG et 2 % de collagène. Après homogénéisation, on observe une dispersion de liposomes de dimensions inférieures ou égales à 20 nm. On gélifie la dispersion par addition dc 0,2 % en poids de Carbopol 940 et on ajoute un conservateur. Exemple 4 : Produit à effet antirides On prépare une émulsion stablc contenant .2% en poids de DGDG .18 % en poids d'un triglycéride caprique - capriliquc (Miglxol 812) .80 % eau + conservateurs classiques de la façon suivante Le DGDG est dissous dans l'huile et l'ensemble est amené à 75il. L'eau avec les conservateurs est chauffée séparément à 75-C. Une partie de l'eau est alors incorporée dans la phase grasse, puis l'ensemble est introduit dans la partie restante de phase aqueuse, à 75'C sous agitation magnétique. L'émulsion est amenée à 80*C toujours sous agitation magnétique, puis homogénéisée 5 min à 11 000 tr/min, à l'aide de l'Ultra - Turax. Elle est ensuite plongée dans un bain de glace afin d'obtenir un refroidissement rapide figeant la structure. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un galactolipide ou d'un extrait d'origine naturelle en contenant comme agent cosmétique permettant d'améliorer la cicatrisation cutanée, de renforcer les propriétés biomécaniques du derme, d'améliorer l'aspect de la surface de la peau, ou de prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané, tels que les rides ou le relâchement des tissus de soutien cutané. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent cosmétique est destiné à obtenir un raffermissement cutané, une prévention de l'apparition des rides, ou une atténuation de leur profondcur. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait d'origine naturelle est un extrait végétal, en particulier un extrait de céréale telle que le blé ou l'avoine, ou un extrait dc feuilles ou de noix de Ginkgo Biloba. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'extrait végétal est obtenu par extraction au moyen d'un solvant polaire. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le solvant polaire précité est un alcool, en particulier le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol, un éther, en particulier l'éther éthylique, ou un hydrocarbure halogéné, en particulier le chloroforme. 6. Utilisation selon l'une des rcvcndications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit galactolipide est un galactosylglyccridc. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit galactolipide est un galactosylglycéride répondant à la formule (I) dans laquelle - Gal représente un groupement galactop! ranos! lc, dc préférence bêta-D galactopyranosyle - R1 représente un groupement acyle de formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant de 9 à 29 atomes de carbone, - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus, - A représente - une simple liaison, ou - un groupement alpha- ou bcta-D-galactopyranosylc, ou - une chaîne constituée d'un enchaîncmcnt dc plusieurs sucres, de préférence de deux ou trois sucres, choisis dans le groupe constitué par l'alpha- et le bêta-D galactopyranosyle, l'alpha-D-glucopyranosyle, I'alpha-D- et l'alpha-L manopyranosyle. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit galactosylglycéride est un monogalactosyldiglycéride (MGDG) ou un digalactosyldiglycéride (DGDG) répondant à la formule (I) dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle, de préférence bêta-D galactopyranosyle, - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant de 9 à 29 atomes de carbone, - R2 représente un groupement acyle, identique ou différent dc R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus, - A représente - une simple liaison, ou - un groupement alpha- ou bcta-D-galactop! ranos! lc. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le digalactosylglycéride est un digalactosyldiglycéride (DGDG) répondant à la formule (I): dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle, de préférence bêta-D galactopyranosyle, - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant dc 9 à 29 atomes dc carbone, - R2 représente un groupement acyle, identique ou différent dc R1, dc formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus, - A représente un groupement alpha- ou bcta-D-galactopyranosyle. 10. Utilisation selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que le galactosylglycéride répond à la fomlulc (I) telle que définie à la revendication 7 dans laquelle - R1 représente un groupement acyle dc formulc dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonce linéaire contenant 15, 17 ou 19 atomes de carbone, saturée ou comprenant de 1 à 5 doubles liaisons, en position 7, 10 et/ou 13 pour un groupement acyle de 16 atomes de carbone, en position 9, 12 et/ou 15 pour un groupement acyle de 18 atomes de carbone, et en position 5, 8, 10, 14 ct/ou 17 pour un groupement acyle de 20 atomes de carbone. - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1 de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le galactolipide ou l'extrait d'origine naturelle cn contenant est présent dans une composition à une concentration comprise entre 0,001 ct 1O %, dc préférence entre 0,01 et 5 %, en poids par rapport au poids total de ladite composition 12.Utilisation, à titre de principe actif, d'au moins un galactolipide ou d'un extrait d'origine naturelle en contenant pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée à prévenir ou traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience cn intensité du réseau de fibronectine extracellulaire dans les tissus conjonctifs, en particulier dans le derme, à améliorer les propriétés biomécaniques dc la peau, à prévenir ou traiter les effets du vieillissement, en particulier du vieillissement cutané, à favoriser la cicatrisation ou à obtenir un raffermissement cutané. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit extrait d'origine naturelle est un extrait végétal, en particulier un extrait de céréale telle que le blé ou l'avoine, ou un extrait de feuilles ou de noix de Ginkgo Biloba. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée cn ce que l'extrait végétal est obtenu par extraction au moyen d'un solvant polaire. 15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le solvant polaire précité est un alcool, en particulier le méthanol, l'méthanol ou l'isopropanol, un éther, en particulier l'éther éthylique, ou un hydrocarbure halogéné, en particulier le chloroforme. 16. Utilisation selon l'une des rcvcndicaitons 12 à 15, caractérisée en ce que ledit galactolipide est un galactosylglyecridc. 17. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée ce que ledit galactolipide est un galactosyldiglycéride répondant à la formule (I): dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle, de préférence bêta-D galactopyranosyle, - R1 représente un groupement acyle de formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant de 9 à 29 atomes de carbone, - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dcssus, - A représente - une simple liaison, ou - un groupement alpha- ou bcta-D-galactopyranosyle, ou - une chaîne constituée d'un enchaînement de plusieurs sucres, de préférence de deux ou trois sucres, choisis dans le groupe constitué par l'alpha- et le bêta-D galactopyranosyle, l'alpha-D-glucopyranosyle, I'alpha-D- et l'alpha-L manopyranosyle. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée cn ce que ledit galactosylglycéride est un monogalactosyldiglycéride (MGDG) ou un digalactosyldiglycéride (DGDG) répondant à la formule (I) dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle, dc préférence bêta-D galactopyranosyle, - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonce, saturée ou non, de préférence linéaire. et comprenant de () à 29 atomes de carbone, - R2 représente un groupement acyle identique ou différent dc R1, dc formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus, - A représente : - une simple liaison, ou - un groupement alpha- ou bêta-D-galactopyranosyle. 19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que le digalactosylglycéride est un digalactosyldiglycéride (DGDG) répondant à la formule (I) dans laquelle - Gal représente un groupement galactopyranosyle dc préférence bêta-D galactopyranosyle, - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée, saturée ou non, de préférence linéaire, et comprenant dc 9 à 29 atomes dc carbone, - R2 représente un groupement acyle, identique ou différent dc R1, de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dcssus, - A représente un groupement alpha- ou bêta-D-galactopyranos'le. 20. Utilisation selon l'une des rcvcndications 17 à 19, caractérisée en ce que le galactosylglycéride répond à la formule (I) telle que définie à la revendication 7 dans laquelle - R1 représente un groupement acyle dc formule dans laquelle R représente une chaîne aliphatique hydrocarbonée linéaire contenant 15, 17 ou 19 atomes de carbone, saturée ou comprenant dc 1 à 5 doubles liaisons, en position 7, 10 et/ou 13 pour un groupement acyle dc 16 atomes de carbone, en position 9, 12 et/ou 15 pour un groupement acyle dc 18 atomes de carbone, et en position 5, 8, 10, 14 ct/ou 17 pour un groupement acyle de 20 atomes de carbone. - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement acyle, identique ou différent de R1 de formule dans laquelle R répond à la définition donnée ci-dessus. 21. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 20, caractérisée ce que la concentration en galactolipide dans la composition précitée est comprise entre 0,001 et 10 %, de préférence entre 0,01 et 5 %, en poids par rapport au poids total de ladite composition. 22. Utilisation selon l'une des revendications 11 à 21, caractérisée en ce que ladite composition est formule dc manière appropriée pour une administration topique, en particulier sous forme de crème, de lait, de lotion, gélifiée ou non, ou de pommade, en présence d'un excipient, véhicule ou support cosmétiquement ou pharmaccutiquement acccptable.