Brevet FR2731438A1 — publié le 19960913

HYDROLYSE ENZYMATIQUE DES 4-METHYLTHIOBUTYRONITRILE La présente invention concerne l'utilisation d'une nitrilase comme catalyseur d'hydrolyse d'un groupe nitrile en groupe carboxylique. Elle concerne plus précisement l'utilisation de la nitrilase de Rhodococcus sp. HT 29-7 déposée sous le numéro FERM BP-3857. Cette nitrilase est décrite par exemple dans les brevets européen et américain publiés sous les numéro respectifs EP 610 049 et US 5 296 373, tous deux appartenant à la société NITTO. Dans ces brevets, et particulièrement dans le brevet américain, la nitrilase est utilisée pour produire à partir de nitriles racémiques des acides optiquement actifs. Les nitriles de départ comportent tous un radical aromatique, il s'agit essentiellement de l'hydrolyse du mandélonitrile ou de ses dérivés substitués sur le noyau aromatique. L'exemple 1 du brevet américain sus mentionné décrit l'hydrolyse du mandélonitrile racémique par Rhodococcus sp. HT 29-7, L'acide mandélique R-(-) est obtenu avec un excès énantiomérique de 100 %. L'exemple 2 décrit l'hydrolyse des dérivés substitués du mandélonitrile sur le noyau, l'excès énantiomérique en dérivé de l'acide mandélique est aussi de 100 %, il en est de même lorsque l'hydrolyse est réalisée sur les nitriles du benzaldéhyde. Le brevet européen 610 049 de la société NITTO CHEMICAL décrit l'utilisation de Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-3857), d'Alcaligenes sp.BC35-2 (FERM BP-3318) ou de Brevibacterium acetylicum IAM 1790 pour hydrolyser des a hydroxy nitriles substitués en position Y par un noyau aromatique en acide a hydroxycarboxylique substitué par un groupe phényle optiquement actif. Les activités obtenues avec Rhodococcus sp. HT 29-7 varient entre 5,5 % et 99 % selon le nitrile de départ et selon la présence ou l'absence d'acide phosphorique (pH fixé aux environs de 8,2). II est apparu de façon tout à fait étonnante que ladite enzyme de Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-3318) , lorsqu'elle était utilisée pour hydrolyser le 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile, réalisait cette hydrolyse sans aucune sélectivité du point de vue énantiomérique. Cette enzyme hydrolyse ledit nitrile en produisant un mélange racémique des deux acides sans aucune prépondérance de l'un ou de l'autre des isomères. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'acides 4-méthylthio butyrique a substitués racémiques par hydrolyse des 4-méthylthio butyronitrile a substitués racémiques par la nitrilase de Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-3318). On préfère parmi les 4-méthylthio butyronitriles a substitués utiliser le 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile qui permet de préparer l'hydroxyanalogue de la méthionine racémique. Cette technologie de préparation des dérivés de la méthionine permet d'éviter la formation de produits secondaires minéraux en quantités importantes dont les rejets posent de plus en plus de problèmes à cause des contraintes en ce qui concerne la protection de l'environnement. Cette enzyme qui présentait dans le deuxième brevet précédemment cité des caractéristiques optimales d'activité à certains pH (7 à 10) et à certaines températures (10 à 30"C), présente dans le cadre de la présente invention une activité nitrilase dans une zone de pH comprise entre 5 et 9 et un optimum d'activité à un pH compris entre 5 et 6. Sa température optimale de mise en oeuvre est comprise entre 30 et 50"C, on préfère néanmoins l'utiliser à environ 30"C. On préfère travailler avec une concentration en nitrile dans la solution de départ comprise entre 10 mmoles et 300 mmoles par litre et de préférence entre 50 et 200 mmoles par litre. La concentration en sel d'ammonium de l'acide obtenu a peu d'influence sur l'activité de l'enzyme lorsqu'elle est inférieure à 1,5 mole par litre et de préférence comprise entre 200 et 1000 mmoles par litre. L'invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. EXEMPLE 1 Hydrolyse du 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile par Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857 1) CULTURE Le micro-organisme Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 est cultivé dans le milieu suivant: Glycérol 20 g/l Extraid de levure (DIFCO) 3 g/l KH2PO4 1 g/I Na2HPO4.12H2O 4,4 g/l Na2S 4 2,8 g/ I MgCl2.6H2O 0.85 g/l CaCl2.2H2O 0.05 g/l MnSO4.H2O 0,033 g/I FeSO4.7H2O 0,013 g/I ZnS04.7H2O 0,005 g/l Benzonitrile 0,5 g/ I pH 7,5 La culture est réalisée à 30 C dans des fioles d'Erlenmeyer de 2 litres contenant 600 ml de milieu. Le tout est agité à 150 tours par minute durant 140 heures. Le culot cellulaire est récupéré, lavé avec une solution NaCI à 9 g/l puis congelé. CONDITIONS OPERATOIRES POUR L'HYDROLYSE: Influence du pH Conditions opératoires: 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile 100 mM Densité Optique à 660nm 15 Tampon acétate 100 mM de pH 4 à 5 Tampon phosphate 100 mM de pH 6,0 à 7,0 1 ml Tampon TRIS-HCI 100 mM de pH 8,0 à 9,0 Tampon Borate 100 mM de pH 10,0 à 11,0 Température 30"C Durée 10 heures Rendement en acide pH 4 0% 5 100% 6 100% 7 100% 8 100% 9 100% 10 20% 11 0% EXEMPLE 2: Influence de la concentration en substrat. La stabilité de l'enzyme en fonction de la quantité de substrat a aussi été mesurée dans les conditions suivantes: Conditions opératoires: 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile cf Tableau résultats Densité Optique à 660nm 20 Tampon phosphate 300 mM pH 7,0 5 ml Température 30 C Durée 2 heures Rendement en acide Concentration en nitrile (mM) 50 | 90% 100 44% 200 22% 300 10 O/o 400 0% 500 0% EXEMPLE 3 Stabilité de l'enzyme en fonction de la quantité d'acide formé Conditions opératoires:: 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile100 mM Densité Optique à 660nm 15 Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température 30"C Durée 6 heures rendement en acide Concentration en acide (mM) 0 100% 200 100% 400 100% 600 100% 800 100% 1000 100% EXEMPLE 4 Excès énantiomérique. 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile 140 mM Densité Optique à 660nm 14 Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température 20"C Temps d'incubation Rendement en acide Pureté optique 2h 15% 0 6 h 50% 0 24 h 100% 0 L'étude cinétique d'hydrolyse du 4-méthylthio 2-hydroxy butyronitrile montre une production linéaire d'hydroxy analogue de la méthionine par heure par mg de cellules sèches. L'excès énantiomérique de l'acide formé a été mesuré par chromatographie liquide, il est égal à 0% pour un rendement en acide variant de 15% à 100%. EXEMPLE 5 Influence de la température. Conditions opératoires: 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile100 mM Densité Optique à 660nm 15 Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température voir tableau Durée 6 heures T (0C) rendement en acide 10 70% 20 100% 30 100% 40 100% 50 31% 60 15% RAPPORT DE RECHERCHE PRELIMINAIRE établi sur la base des dernières revendications déposées avant le commencement de la recherche DOCUMENTS CONSIDERES COMME PERTINENTS Revendications Catégorie Citation du document avec indication, en cas de besoin, de la demande des parties pertinentes examinés Y DATABASE WPI 1-6 Section Ch, Week 9213 Derwent Publications Ltd., London, GB; Class B05, AN 92-099665 & JP-A-04 040 898 ( NITTO CHEM IND KK) 12 Février 1992 * abrégé * Y CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 117, no. 13, 1-6 28 Septembre 1992 Columbus, Ohio, US; abstract no. 131511, BHALLA, TEK CHAND ET AL 'Asymmetric hydrolysis of.alpha.-aminonitriles to optically active amino acids by a nitrilase of Rhodococcus rhodochrous PA-34' page 782; * abrégé * & APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL. (1992), 37(2), 184-90 CODEN: AMBIDG;ISSN: 0175-7598, C12P Y EP-A-O 243 967 (NITTO CHEMICAL INDUSTRY 1-6 Cî2N CO., LTD., JAPAN;MITSUBISHI RAYON CO., LTD.) 4 Novembre 1987 * revendications * Y EP-A-O 444 640 (HIDEAKI YAMADA ;;NITTO 1-6 CHEMICAL INDUSTRY CO LTD (JP)) 4 Septembre 1991 * revendications * Date d'archèvement de la recherche 23 Novembre 1995 Delanghe, L CATEGORIE DES DOCUMENTS CITES X : particulièrement pertinent à lui seul Y : particulièrement pertinent en combinaison avec un autre document de la même catégorie A : pertinent à l'encontre d'au moins une revendication en arrière-plan technologique géneral O : divulgation non-écrite P : document intercalaire T : théorie ou principe à la base de l'invention E : document de brevet bénéficiant d'une date antérieure à la date de dépôt et qui m'a été publié qu'à cette date de dépôt ou qu'à une date postérieure. D : cité dans la demande L : cité pour d'autres raisons ................................................................................ & : membre de la même famille, document correspondant EXEMPLE 6 Hydrolyse du 4 méthylthio 2-aminobutyronitrile. Conditions opératoires: 4-méthyl thio 2-hydroxy butyronitrile 23 mM Densité Optique à 660nm 15 Tampon phosphate 100 mM pH 7,0 1 ml Température 30 C Temps rendement en acide excès énantiomérique (heure) de l'acide 0,5 40% n.d. 1 51% % 0,12 2 62% n. d. 5 78% 0,15