Brevet FR2727316A1 — publié le 19960531

La présente invention est relative à une nouvelle utilisation thérapeutique des superoxyde dismutases (SOD). La SOD a été caractérisée. en 1968, par Mc CORD et FRIDOVICH il s'agit d'une enzyme qui favorise l'elimination du radical superoxyde ( O2 ), constitue a priori un mécanisme de protection contre les effets délétères de ce radical, susceptible de se former in vivo á partir de l'oxygène atmosphérique, et joue donc un rôle capital dans la prévention des effets toxique qui pourraient résulter ae l'exposition à une atmosphère oxygénée Les radicaux libres dérivés de l'oxygène appa raissant impliqués tans te ombreuses affections, l'utilisation de la SOD en thérapeutique a donc été préconisée dans les arthropathies inflamatoires (R. NORDMANN et al., Ca;- Nutr. Diet., 1991, 26, 6, 398402) ; dans les maladies pulmonaires et plus particuliéremuent, la dysplasie croncho-pulmonaire ou dans d'autres conditions toxiques, liées à la présence d'oxygène en quantité importante (système nerveux central, ischémie, désordres gastro-intestinaux non vasculaires, désordres oculaires (en local dans la chambre antérieure de l'oeil) ou lutte contre les effets indésirables des traitements anti-cancéreux), la SOD a également été proposée avec plus ou moins de succés (GRENNWALD R.A., Free Radical Biol. Med., 1990, 8, 201-209). La SOD, sous sa forme Cu/Zn bovine liposomiale, s'est révélée particulièrement efficace sur les radiofibroses en clinique Baillet F. et al., Treatment of radiofibrosis with liposomal superoxide dismutase. Preliminary results of 50 cases, Free Rad. Res. Commun., 1, 387-394, Harwood Academic Publishers Gmbb, 1986) et ensuite, expérimentalement, chez le porc (Lefaix JL et al., La fibrose cutanéo-musculaire radio-induite : efficacité thérapeutique majeure de la SOD Cu/Zn liposomiale, Bull. Cancer, 1993, 80, 799-80@, résultats d'autant plus intéressants qu'il n'y a pas de produit ayant une action équivalente. Parmi Les SOD testées ce sont ceiles qui présentent une demi-vie prolongée et une faible incidence des accidents de nature immunologique qui ont la préférence ; on peut citer en particulier la Cu,Zn-SOD d'origine bovine (homodimère qui catalyse la dismutation du radical superoxyde) , la Mn-SOD, la Fe-SOD, les SOD liposomales, les SOD conjuguées au polyéthylène glycol, les polymères ou copolymères de SOD, la Cu,Zn-SOD et la Mn SOD humaines recombinantes. Les Demanderesses ont trouvé une nouvelle utilisation des préparations à base de SOT à durée d'action prolongée, pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir es perturbations des performances cérébrales, de préférence es performances cognitives cérébrales, proviquées par une agression cérébrale spécifique ou par une agression non spécifique. On entend, au sens de La présence invention, par agression non spécifique, par exemple une stimulation électrique (choc plantaire), et par agression cérébrale spécifique, par exemple une irradiation crânienne globale prolongée. De manieré inattendue, ladite préparation de SOD à durée d'action prolongée protège les mammifères des perturbations des performances cérébrales aussi bien à titre préventif, qu'a titre curatif. De manieré préférée, la préparation de SOD à durée d'action prolongée est notamment sélectionnée parmi les SOD liposomiales, les conjugués SOD-polyéthylène glycol et es polymères ou colpolymères de SOT. Te manière avantageuse, la superoxyde dismutase (SOD) est notamment de la Cu/Zn-SOD, de la Mn-SOD, de la Fe-SOD de mammifère (murin, bovine, humain) ou une SOD recombinante. Ces préparations peuvent être administrées, soit par vote parentérale, te préférence en sous-cutané, soit par voie orale. Les préparations à base de SOD telles que définies ci-dessus peuvent être utilisées, chez les mammifères, et notamment l'homme, pour le traitement curatif ou préventif des perturbations des performances cognitives cérébrales provoquées par une agression cérébrale spécifique (irradiation par exenple) ou par une agression non spécifique (stimulation électrique, par exemple). es doses de SOT sont efficaces sur les complications des radiothérapies avec un grand éventail de posologies, dont les extrêmes vont de 2,3 mg/kg, chez le porc à 0,03 mg/kg, chez l'homme. Chez l'homme, on prescrira, de préférence, pour la voie sous-cutanée. une dose journalière comprise entre 0,03 m/kg et 0,08 mg/kg. Outre es dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description oui va suivre, oui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invetion, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Effet préventif d'un traitement à la SOD, sur une agression non spécifique (stimulation électrique). - Agression stimulation électrique. L'intensité du choc plantaire au-dessus d'un certain seuil (1,1 à 1,2 mA), , inhibe fortement l'apparation de la réponse conditionnelle (évitement). Dans l'étude qui suit, des chocs plantaires de 1,5 mA ont été appliqués, alors que es conditions habituelles sont de 0,8 mA. * Méthodes et matériels - Animaux 12 rates mâles de souche Wistar âgés de 5 mois répartis au hasard sont divisés en 2 groupes de six : I) groupe témoin et 2) groupe SOD Cu/Zn liposomiale. - Traitement 2 heures avant chaque séance d'apprentissage, 0,5 mg/kg de SOD Cu,Zn liposomiale, à raison de 0,05 ml/100 g de poids de rat est administré par voie sous-cutanée au groupe SOD Cu/Zn liposomiale. Le groupe témoin a reçu un volume équivalent de NaCl à 0,9%. - Test comportemental Evitement actif bilatéral (Two-way avoidance). Les animaux doivent passer d'un compartiment A à un autre 3, afin d'eviter Le cnoc électrique (1,5 mA pendant 15 secondes) appliqué alternativement, soit au plancher de La cage A, soit au plancher ae a cage 3. Un stimulus conditionnel sonore (300 Hz) leur permet d'éviter ce choc, à condition qu'ils réagissent dans un laps de temps d'une durée de s secondes (durée du stimulus conditionnel et de l'intervalle). L'apprentissage se déroule en trois jours consécutifs à raison d'une séance par jour. Chaque séance est composée de 15 essais. L'intervalle entre les essais est de 50 secondes. Le nombre d'évitements, d'échecs d'échappement, et le temps d'exposition au choc plantaire sont enregistrés. - Statistiques A partir des données individuelles brutes, les valeurs moyennes, les erreurs standard affectées aux moyennes (sem), les effectifs, et les valeurs de t de Student, ont été calculés. Les comparaisons sont effectuées entre les deux groupes sur l'ensenble des résultats obtenus. * Résultats - Pourcentage d'évitement La comparaison entre groupe témoin et groupe SOD Cu/Zn liposomiale (Tableau I) montre une différence significative dès le premier jour d'apprentissage en faveur du groupe traité 12,22 % vs 0 %, p=0,02). Cette différence persiste dans un moindre degré le deuxième jour (14,44 % vs 1,11 %, p=0,15) et le troisième (23,33 % vs 4,45 %, p=0,09). - Pourcentage d'échec d'échappement On constate Tableau II) que e traitement par la SOD Cu/Zn liposomiale diminue significativement les échecs d'échappement au premier jour (13,33 % vs 58,88 %, p=0,02) et cette diminution se maintient à un certain niveau au deuxième jour d'apprentissage (0 % vs 14,45 %, p=0,11). - Durée d'exposition au choc plantaire par seance L'administration te SOD Cu/Zn liposomiale (Tableau III, figure 1 permet aux rats de mieux maîtriser l'agression due au stimuls inconditionnel (choc de 1,5 mA) , puisqu'ils diminuent Leurs temps d'exposition au choc de façon significative le premier our (88,93 sec vs 165,62 sec, p=0,04), le troisiéme jour (13,61 sec vs 45,64, p=0,03 et dans une certaine mesure le deuxième jour d'apprentissage 37,52 sec vs 82,50 sec, p=0,15) Cela laisse supposer due pentant le déroulement des i5 esssais qui composent la séance, la SOD Cu/Zn liposomiale agit efficacement non seulement au moment du choc mais aussi pendant la parlote te repos (50 sec), séparant deux essais consécutifs. * Conclusion Sur les trois paramètres étudiés au cours de l'acquisition d'un évitement actif bilatéral, l'effet protecteur de la SOD Cu/Zn liposomiale est manifeste. De manière inattendue, l'administration de SOD Cu/Zn liposomiale attaque donc les effets néfastes d'une agression non spécifique (stimulation électrique), qui perturbe l'acquisition d'un apprentissage. En effet, des injections sous-cutanees préalables de SOD permettent la conservation de la capacité d'apprentissage. TABLEAU I TWO-WAY AVOIDANCE : pourcentage d'évitement ESSAIS PRELIMINAIRES : EFFET DE LA LIPSOD SUR LE RAT WISTAR MALEAGE DE 5 MOIS LORS D'UN TEST A RENFORCEMENT NEGATIF GROUPE rat No 25.07.1994 26.07.1994 27.07.1994 7 13 33 0.00 20 00 LIPSOD 8 13 33 53.33 53 33 0.5 MG/KG 10 0 00 0 00 0 00 2H AVANT 16 0.00 0 00 6 67 S.C. 17 20 00 13 33 6 67 18 26 67 20 00 53.33 MOYENNE 12.222 14 438 23 333 SEM 4 361 8 501 9 850 N 6 6 6 t-Student 2.803 1.554 1.818 p 0.018 0.151 0.099 11 0 00 0.00 0 00 TEMOINS 12 0 00 0 00 0 00 13 0 00 0 00 6.67 15 0 00 6.67 20.00 19 0 00 0 00 0.00 20 0 00 0.00 0 00 MOYENNE 0.000 1 112 4.445 SEM 0.000 1 112 3.296 N 4 6 6 TABLEAU II TWO-WAY AVOIDANCE : pourcentage d'échec d'échappement ESSAIS PRELIMINAIRES : EFFET DE LA LIPSOD SUR LE RAT WISTAR MALE AGE DE 5 MOIS LORS D'UN TEST A RENFORCEMENT NEGATIF GROUPE rat No 25.07.1994 26.07.1994 27.07.1994 7 13 33 0 00 0 00 LIPSOD 8 0.00 0 00 0 00 0.5 MG/KG 10 26 67 0 00 0 00 2H AVANT 16 26 67 0 00 0 00 S.C. 17 6 67 0 00 0 00 18 6.67 0 00 0 00 MOYENNE 13 335 0 000 0 000 SEM 4.555 0 000 0 000 N 6 6 6 t-Student 2.654 1.734 1.225 p 0.024 0.114 0.249 11 100 00 46 67 0 00 TEMOINS 12 46 66 6 67 0 00 13 80.00 0 00 6 67 15 6.67 0 00 0 00 19 20.00 0.00 0.00 20 100.00 33.33 33 33 MOYENNE 58 888 14.445 6.667 SEM 16.548 8 329 5 442 N 6 6 6 TABLEAU III TWO-WAY AVOIDANCE :: durée d'exposition au choc plantaire par séance (en secondes) ESSAIS PRELIMINAIRES :EFFET DE LA LIPSOD SUR LE RAT WISTAR MALE AGE DE 5 MOIS LORS D'UN TEST A RENFORCEMENT NEGATIF GROUPE rat No 25.07.1994 26.07.1994 27.07.1994 7 65 00 27 42 11.67 LIPSOD 8 37.49 14 01 7 63 0.5 MG/KG 10 127 16 34 14 18 80 2H AVANT 16 168.53 106.87 22 73 S.C. 17 72 45 26 70 13 00 18 62.94 15 97 7 84 MOYENNE 88.928 37 518 13 612 SEM 19 970 14 209 2 472 N 6 6 6 t-Student 2.365 1.536 2.434 p 0.040 0.155 0.035 11 225 00 180.86 39 18 TEMOINS 12 151 71 77 62 30 34 13 204.58 47.93 61.47 15 78.16 37 31 18 51 19 109.28 18.04 22 19 20 225.00 133.25 102.22 MOYENNE 165.622 82 502 45.652 SEM 25.552 25.604 12.928 N 6 6 6 EXEMPLE 2 :Dysfonctionnement cognitif induit par l'irradiation crânienne : effet curatif de la superoxyde dismutase Cu/Zn liposomiale chez le rat irradié à l'âge de 4 mois. * Méthodes et matériels - Animaux 15 rats mâles de souche Wistar irradiés à l'âge de 4 mois sont divisés en 2 groupes : 1) groupe témoin, n=7 et 2) groupe traité 9 moins aprés irradiation par la SOD Cu/Zn liposomiale, n=8. - Traitement Une fois par jour et pendant cinq jours consécutifs, 0,5 mg/kg de SOD Cu/Zn liposomiale, à raison de 0,05 ml/100 g ae pots ta rat, est administré par voie sous-cutanée sur les animaux du groupe 2 tandis que le groupe 1 a reçu un volume équivalent de NaCl à 0,9 %. Trois jours plus tard et deux heures avant le test comportemental, une sixième injection de SOD CU/Zn liposomiale ou de NaCl à 0,9 % a été practiquée. - Irradiation (9 mois avant traitement) Les rats ont été anesthésiés par 250 mg/kg d'hydrate de chloral (voie @.p.), à raison de 0,5 ml.100 g de leur poids. L'encéphale du rat a été traité par deux faisceaux opposés également pondérés de télécobalt. Les deux faisceaux ont été traités le même jour. Une dose de 30 Gy a été délivrée en 10 fractions sur 12 jours sur l'isodose 95 % de la dose à l'isocentre aprés dosimétrie par ordinateur. La cavité buccale, le museau, les yeux et la moelle épinière cervicale ont été protégés par un cache personnalisé de plomb de 5 cm d'épaisseur, placé à proximité de la portée d'entrée cutanée. La distance entre la source de cobalt 60 et l'axe est de 80 cm.Aprés irradiation, les rats ont été logés dans leurs cages @ origine (4 à 5 animaux chacune) - Test comportemental Evitement actif bilatéral (Two-way avoidance). Les animaux doivent passer d'un compartiment A à un autre 3 afin d'éviter Le cnoc électrique (0,8 mA pendant 15 secondes appliqué a alternativement, soit au plancher de la cage A, soit au plancher de la cage B. Un stimulus conditionnel sonore 300 Hz) leur permet d'éviter ce choc, à condition qu'ils réagissent dans un laps de temps d'une durée de 6 secondes (durée du stimu lus conditionnel et de l'intervalle). L'apprentissage se déroule en cinq ours consécutifs à raison d'une séance par jour. Chaque séance est composée de 15 essais. L'intervalle entre es essais est de 50 secondes. Le test est introduit un mois aprés irradiation. Quatre séances de rappel sont proposées 2 1,2, 4 1/2, 5, et 9 mois aprés irradiation. Le nombre d'évitements est enregistré. - Statistiques A partir des données individuelles brutes, les valeurs moyennes, es écarts-types, es erreurs standard affectées aux moyennes sem), , les effectifs et les valuers de t de Student pour séries appariées, sont calculés. * Resultats - Pourcentage d'évitement La comparaison intra-groupes (Tableau IV) montre une différence significative quant à l'évolution du pourcentage d'évitement au sein tu groupe irradié traité (30,83 % vs 49,170 %, p=0,05, degré de liberté (ddl)=7) entre le troisième rappel du test (J257) et celui (quatrième) appliqué après 6 injections de la SOD Cu/Zn liposomiale (J283) Evolution non observée chez le groupe irradié témoin (36,19 % vs 34,29 %, p=0,83), pour la même période. TABLEAU IV LIPSOD TEMOINS @cs rats J257 J283 J257-J283 @cs rats J257 J283 J257-J283 1 6.67 6.67 0.00 2 40.00 40.00 0.00 5 6.67 40.00 33.33 6 6.67 0.00 -6.67 8 33.33 53.33 20.00 7 53.33 33.33 -20.00 9 33.33 20.00 -13.33 10 26.67 33.33 6.67 12 40.00 46.67 6.67 11 26.67 66.67 40.00 13 20.00 66.67 46.67 14 40.00 40.00 0.00 16 93.33 @00.00 6.67 19* 60.00 26.67 -33.33 18* 13.33 60.00 46.67 moyenne 30.832 49.168 18.355 moyenne 36.191 34.286 -1.906 ecart-type 28.269 28.715 22.182 ecart-type 17.992 19.788 23.001 sem 9.99 10.152 @.843 sem 6.801 7.479 8.69 n 8 8 8 n 7 7 7 t-Student 2.338 0.219 p= 0.052 0.834 * 3.5 Gy/jour * Conclusion Sur le paramètre étudié au cours du quatrième rappel J283) d'un évitement actif bilatéral, l'effet curatif post-irradiation de la SOD Cu/Zn liposomiale s'avère significativement important.L'amélioration de l'expression d'une réponse déficitaire induite par l'irradiation serait à rapprocher de l'effet protecteur constaté précédemment exemple 1 De manière inattendue, le trattement par la SOD améliore les performances des rats devenus chroniquement déficitaires sous l'effet de l'irradiation. En effet, une irradiation de 30 Gy en 1@ séances en 12 jours altere de façon importante et chronique les performances cognitives cérébrales des rats âgés, sans entraîner d'anomalies morphologiques cérébrales en microscopie optique, alors que des injections souscutanées de SOD 9 mois aprés l'irradiation améliorent les performances des rats de façon importante, les rapprochant de celles des rats témoins non irradiés. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matiére, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Utilisation d'une préparation à base de SOD à durée d'action prolongée, pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir les perturbations des performances cérébrales, provoquées par une agression cérébrale spécifique " pas une agressIon non spécifique. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite préparation est destinée à être administrée par voie parentérale, de préférence en sous-cutané. 3 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite préparation est destinée à etre administrée à une ose journalière comprise entre 0,03 mg/kg et 0,08 mg/kg. 4 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite préparation est destinée à être administrée par voie orale 5 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans La prévention des perturbations des performances cognitives cérébrales, provoquées par une agression non spécifique. 6 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans le traitement des perturbations des performances cognitives cérébrales, provoquées pas une agression non spécifique. 7 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans la prévention des perturbations des performances cognitives cérébrales, provoquées par une agression cérébrale spécifique. 8 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à ', tans le traitement des perturbations des performances cognitives cérébrales, provoquées par une agression cérébrale spécifique.