Brevet FR2728138A1 — publié le 19960621

MATIERE VEGETALE ISSUE D'EPICES A HAUTE TENEUR EN ANTIOXYDANTS La présente invention est relative à des nouveaux plants d'épices, notamment de sauge ou de romarin, présentant simultanément un contenu élevé en antioxydants et en huile essentielle, ainsi qu'au procédé de sélection de ces plants et à leur utilisation comme matière première, à la fois pour l'obtention d'antioxydants à des fins notamment d'additifs l0 alimentaires et également comme source d'huile essentielle pour la parfumerie. La connaissance et l'emploi des épices remontent aux périodes les plus anciennes de notre civilisation; non seulement pour leur utilisation en tant qu'aromates et de condiments ou pour leurs propriétés médicamenteuses, mais aussi dans un rôle fonctionnel important pour la préservation des aliments; cet effet est dû non seulement à un effet de masquage des odeurs résultant de la détérioration de l'aliment, mais surtout à une action protectrice antioxydante et tout particulièrement un effet bactéricide et bactériostatique permettant de retarder la détérioration des aliments par les micro-organismes; cet effet a été décrit par Pruthi (1980) (1) et Shelef (1983) (2). Les numéros entre parenthèse renvoient aux références bibliographiques en fin de description. La mise en évidence des propriétés anti-oxygène de certaines épices remonte à une quarantaine d'années, quand JR Chipault (1952, 1955, 1956) (3,4,5) entreprit l'étude desdites épicés. Les travaux de Chipault ont trouvé un regain d'intérêt il y a une vingtaine d'années, lorsque des doutes, confirmés par la suite, furent émis sur l'innocuité du butylhydroxy-toluène (BHT), antioxydant de synthèse très performant et largement utilisé avec le butyl-hydroxy-anisole (BHA) pour la protection des aliments. L'intérêt pour le rôle antioxydant de certaines épices s'est amplifié depuis peu, avec l'engouement des consommateurs occidentaux pour les produits alimentaires naturels, et plusieurs oléorésines d'épices, notamment de romarin, sont proposés actuellement sur le marché pour prévenir l'oxydation des aliments. Parmi ces épices et herbes aromatiques possédant une activité anti-oxygène, la sauge et le romarin sont parmi les plus prometteuses. Leur pouvoir antioxydant est dû à la présence dans ces plantes de composés tels que l'acide carnosique et l'acide rosmarinique, qui agissent en synergie avec un ensemble de flavonoides suivant des mécanismes complexes qui n'ont pas été complètement élucidés. Au cours des quinze dernières années, plusieurs types lo d'oléorésines, de romarin ont été mis au point, offerts sur le marché et utilisés par l'industrie alimentaire. Leur activité antioxygène dans les matières grasses et les produits alimentaires a été démontrée. Ces oléorésines s'utilisent en général à un dosage voisin de 500 ppm calculé sur la matière grasse des aliments, dosage proche de celui des matières aromatisantes naturelles et employées pour améliorer l'appétence des produits alimentaires. Différents procédés ont été proposés pour extraire l'oléorésine des épices et plus particulièrement, du romarin. L'extraction peut être réalisée en plusieurs étapes en utilisant des solvants polaires ou non, ainsi que leurs mélanges: huile végétale ou graisse animale (6), I'hexane, le benzène, I'éther éthylique, le chloroforme, le dichlorure d'éthylène, le dioxane ou le méthanol (7,8), l'éthanol ou le benzène (9), l'hexane ou l'éthanol (10, 11), le C02 supercritique (12, 13, 14); on peut citer également les brevet EP 307 626 et la demande de brevet EP 507 064. L'ensemble de l'état de la technique décrit dans ces demandes de brevet et dans les articles cités ci-dessus est incorporé ici par référence, en particulier pour ce qui est des procédés d'extraction des antioxydants des plantes, procédés qui peuvent être également appliqués aux plants de l'invention. L'extraction s'accompagne souvent d'une désodorisation et/ou d'une décoloration de l'oléorésine certains traitements permettent de traiter l'oléorésine pour éliminer les insolubles dans les corps gras (brevet US 4.877.635, brevet EP 0.009.661 et références 14, 15, 16). Aeschbach (Brevets Européens 0.307.626 et 0.507.064) a développé des procédés pour obtenir des extraits antioxydants de romarin ou de sauge sous forme de poudre ou de liquide translucide. Ces extraits sont riches en antioxydants, plus particulièrement en acide camosique et carnosol, les deux antioxydants principaux du romarin et de la sauge. L'acide camosique a été isolé et identifié par Aeschbach et Philippossian (Demande de Brevet Européen EP 0.480.077). L'oxydation de l'acide camosique conduit au carnosol qui lui-même est doué de propriétés antioxydantes; la présence d'un groupe isopropyle dans ces deux o10 composés jouent un rôle important dans la stabilisation des radicaux formés en cours d'oxydation. Aeschbach (17) a mis en évidence l'existence de 13 hétérosides dans le romarin, contribuant de façon mineure (synergisme), comme l'acide rosmarinique, à l'effet antioxydant. Plusieurs travaux ont été publiés sur l'effet antioxygène des oléorésines de romarin dans les aliments (8, 14, 15). Dans les trois cas et bien que les oléorésines utilisées soient d'origine différente elles exercent dans les systèmes étudiés un effet protecteur voisin de celui apporté par le BHT seul ou en mélange avec le BHA et le gallate de propyle, ces derniers étant utilisés toutefois à une dose plus faible. La qualité des oléorésines obtenues et plus précisément leur effet antioxygène va dépendre non seulement des paramètres d'extraction (type de solvant, température, durée) mais également de la qualité du végétal mis en oeuvre, de son origine, des conditions climatiques, des conditions de culture et de récolte ainsi que l'indique l'étude de Granger (18) sur l'essence de romarin. Dans ce contexte, les plants de romarin ou de sauge utilisés habituellement ont une application orientée vers l'extraction des huiles essentielles. Aussi les matières végétales obtenues résultant après une 3o distillation aqueuse permettant d'obtenir l'huile essentielle ont une composition en antioxydants éminemment variable les rendant impropres à une utilisation industrielle comme matières premières à l'obtention d'antioxydants ou d'épices utilisables à titre d'additifs alimentaires, et ont toujours été jetées. Résumé de l'invention L'invention résulte de la découverte selon laquelle il était possible d'obtenir, à partir de certaines épices, une matière végétale ayant à la fois des teneurs élevées et stables en antioxydants et en huiles essentielles. L'obtention de plants desdites épices, et de matières végétales issues desdits plants offre un nouvel intérêt économique qui est leur valorisation à la fois dans l'industrie agro-alimentaire et dans la parfumerie. Aucune sélection d'épices au regard de leur teneur en antioxydants n'a jamais été effectuée et les populations naturelles de plantes les contenant présentent une grande variabilité quant à cette teneur et l'activité antioxydante y associée. Dans l'objectif d'obtention des plants présentant la caractéristique d'une haute teneur en antioxydant, il était dans un premier temps important de savoir si une telle caractéristique était liée ou non à leur contenu en huile essentielle. Pour effectuer le criblage de plants de romarin présentant les caractéristiques requises, il fallait préalablement mettre au point une méthodologie. Celle-ci consiste dans un premier temps à sélectionner une collection de plants de romarin présentant des génotypes différents, puis d'effectuer une propagation végétative de chacun des plants collectés et ce, en champs, à raison de cinq réplications de cinq plants par génotypes soit 25 plants par génotypes. Dans le présent texte seront utilisés indifféremment les termes de génotype, ou de clone pour désigner des individus identiques génétiquement et propagés par voie végétative. Le plant est défini comme la plante sélectionnée avant sa mise en place en terre, autrement dit un plant donné correspond nécessairement à un clone donné; en revanche à un clone peuvent correspondre plusieurs plants; cet ensemble de plants génétiquement identiques est défini comme un cultivar. Matière végétale signifie toute matière première issue d'un plant ou d'un cultivar destiné à être transformé pour en extraire une substance dans le cas de la présente invention, il peut s'agir de la plante entière fraîche ou sèche, ou des feuilles fraîches ou séchées. Dans la méthodologie de criblage des clones répondant aux critères choisis, il était nécessaire d'utiliser plusieurs sites d'essais en champs avec la même collection sélectionnée au départ, les analyses des échantillons collectés se faisant par la suite en parallèle et en aveugle. L'autre paramètre essentiel de la méthodologie de criblage est la définition d'un procédé d'extraction et ou de purification commun pour tous les laboratoires travaillant sur le projet et pour les différents sites lo d'essais en champs. Un troisième paramètre essentiel dans la présente méthodologie est la mise au point de procédures analytiques communes et l'évaluation de la déviation standard obtenue à partir de la récolte des 25 plants des clones considérés; la méthodologie implique enfin la mise en évidence d'éventuelles modifications physiologiques en fonction soit du rythme journalier soit du rythme mensuel; il va de soi que le rythme saisonnier conduit à des modifications notamment dans la teneur en huile essentielle, la production étant plus importante pendant les mois d'été (de chaleur) que dans les mois d'hiver. Après avoir calculé la déviation standard des paramètres que sont: le contenu en huile essentielle soit après décantation soit après extraction, le temps d'induction de l'extrait éthanolique mesuré par le test Rancimat (19, 20), le contenu en carnosol, en acide camosique, en verbenone ainsi que leur rendement d'extraction respectif, chaque paramètre est mesuré et les différents cultivars provenant d'une collections de 44 clones de cultures effectuées sur deux sites différents, en France (Francereco) ou en Espagne (Hispareco) ont été criblés au regard de ces différents paramètres et les résultats sont les suivants: a) les variations journalières du contenu en huile essentielle, ainsi que en camosol + acide carnosique (antioxydants) sont insignifiantes quelque soit le lieu de culture. Malgré tout par souci d'homogénéisation toutes les récoltes sont faites en début d'après-midi; b) pour ce qui concerne des variations bimensuelles en huile essentielle et en acide carnosique + carnosol (antioxydants) il a été montré une bonne stabilité entre août et octobre en France et entre juillet et septembre en Espagne. Des exemples et des courbes détaillés sont présentés plus loin et on peut en conclure que la meilleure période de récolte est le mois d'août en Espagne et le mois de septembre ou octobre en France. La figure 1 est un schéma représentant le procédé de distillation à la vapeur d'eau des clones de romarin pour obtenir l'huile essentielle d'une part et les résidus de romarin d'autre part. Les résidus obtenus après distillation acqueuse de la matière lo végétale sont appelés " drêche ", et ils sont traités ensuite pour en extraire les antioxydants, comme schématisé sur la figure 2. L'ensemble du procédé de sélection de cultivars de romarin par la méthodologie décrite plus haut ainsi que les différentes étapes dudit procédé font partie de l'invention, I'objectif du travail rappelé au début étant d'obtenir une matière première valable au plan industriel et permettant d'extraire des antioxydants utilisables notamment en agro- alimentaire; si, en outre, le contenu en huile essentielle y est relativement important, la même matière première pourrait alors par une sorte de " cracking " être utilisée à la fois dans l'industrie de la parfumerie et dans l'industrie agro-alimentaire. Grâce aux différents paramètres calibrés de la façon décrite plus haut, il a été possible de sélectionner des plants d'épices, caractérisés en ce que la matière végétale qui en est issue présente simultanément un contenu élevé en antioxydants et en huile essentielle. Cette matière végétale, objet de l'invention, est en outre caractérisée par son contenu en antioxydants qui est supérieur à 1% en poids du végétal frais ou supérieur à 3,5% en poids de matières séches, et leur contenu en huile essentielle qui est supérieur à 0,3% en poids sur le végétal frais ou supérieur à 1,5% en poids de matières séches. Les plants d'épices possédant ces caractéristiques font partie de l'invention. Le romarin et la sauge sont deux épices particulièrement propices à l'obtention de la matière végétale de l'invention. La description détaillée ci-dessous met en évidence que deux clones de romarin sont particulièrement intéressants de ce point de vue: les clones 28 et 39. Les teneurs en huile essentielle (EO) et en antioxydants (AO) dans la matière végétale permet de calculer la quantité totale d'EO et AO pouvant être obtenue par plant (EOP et AOP) soit le produit: teneur (en pourcentage) x par matière sèche (gramme par plant). Les plantations d'épices et notamment de romarin présentent un rendement à l'hectare éminemment variable notamment pour ce qui concemrne le rendement en poids de feuilles séchées, source aussi bien des antioxydants que de l'huile essentielle. Les plants de romarin de l'invention, sélectionné par la méthodologie de l'invention présentent io l'intérêt d'avoir un rendement à l'hectare supérieur à 7000 Kg/Ha, permettant d'obtenir un rendement à l'hectare d'antioxydants d'au moins 270 kg/Ha et un rendement à l'hectare d'huile essentielle d'au moins 120 Kg/Ha. Les plants de romarin de l'invention, et sélectionnés par la méthodologie décrite plus haut présentent une variation journalière ou bimensuelle de leur teneur en antioxydants et/ou en huiles essentielles inférieure à 20%. Les clones ainsi sélectionnés peuvent être caractérisés sur le plan moléculaire par une empreinte moléculaire (finger print) la technique utilisée étant celle décrite dans (22) et plus loin dans l'exemple sur les empreintes moléculaires. La présente invention est relative également au procédé de sélection de plants permettant l'obtention de drêches à teneur élevée en antioxydants consistant en la mise en oeuvre d'au moins les étapes suivantes: - une calibration des paramètres étudiés sur une population statistiquement valable, - un criblage parmi les plants à disposition de ceux présentant des taux supérieurs à la moyenne de ceux observés dans les plants sauvages, - la multiplication végétative des plants ainsi sélectionnés, lesdits paramètres étant les mesures des teneurs en huile essentielle et en antioxydants. Dans le procédé de l'invention, la matière végétale issue des plants sélectionnés a en outre une teneur en huile essentielle supérieure à 0, 3% en poids de végétal frais ou à 1,5% en poids de matières sèches, et une teneur en antioxydant supérieure à 1% en poids du végétal frais et 3, 5% en poids de matières sèches. Les antioxydants sont constitués au moins de camosol et d'acide camosique. La présente invention est également relative à l'utilisation de la matière végétale issue des plants d'épices sélectionnés par un procédé de sélection tel que décrit plus haut pour l'obtention de drêches à haute teneur en antioxydants et utilisable comme additifs alimentaires ou comme épices; I'utilisation de ces plants de romarin permet en outre, par lo une distillation aqueuse des feuilles séchées l'obtention de l'huile essentielle utilisable en parfumerie de façcon très avantageuse dans la mesure o son taux est égal ou supérieur à celui du taux des plantes sauvages habituellement utilisées en parfumerie. Enfin, I'invention est relative à des compositions utilisables dans un additif alimentaire et contenant des antioxydants caractérisées en ce que lesdits antioxydants sont obtenus à partir de matière végétale sélectionnée par un procédé tel que décrit sommairement ci-dessus et en détail ci-dessous. La méthodologie utilisée a été appliquée de façon systématique sur des plants de romarin et décrite ci-après. La transposition à d'autres types d'épices notamment la sauge, le thym, I'origan ou la girofle est aisément transposable par l'homme du métier, étant connus les différents procédés d'extraction utilisables (6 à 13). Le procédé de sélection des nouveaux plants de romarin selon le critère d'activité antioxydante défini plus haut permet en outre l'obtention de plants présentant une DHS (différence, homogénéité, stabilité) qui permet, par multiplication végétative, d'avoir une matière première constante et donc valable à des fins d'utilisation industrielle. Dans la présente description, la méthodologie employée pour la sélection des clones d'épices présentant les caractéristiques souhaitées et les exemples à l'appui de cette méthodologie sont présentés pour des plants de romarin. Il est clair qu'à partir du moment o l'on recherche des épices qui présentent a la fois les caractéristiques d'être une matière première pour des additifs alimentaires et pour l'obtention d'huiles essentielles utilisables en parfumerie, la méthodologie observée et décrite en détail plus loin peut être transposée à l'obtention de nouveaux clones présentant ces caractéristiques; aussi tout ce qui dans le texte est relatif au romarin, peut s'appliquer également à d'autres types de plantes aromatiques. Description détaillée de l'invention La description détaillée ci-dessous et les figures qui l'accompagnent mettent bien en évidence la méthodologie utilisée dans le lo procédé de sélection de clones ayant à la fois une haute teneur en huile essentielle et en antioxydants, et les caractéristiques mêmes de ces plantes sélectionnées. Dans un premier temps les détails sur les différentes étapes du procédé notamment: la méthodologie de criblage, la réalisation des essais en champs, la méthode de distillation, les procédés analytiques, les résultats de dosages en huile essentielle obtenus dans les clones sélectionnés ainsi que des dosages en antioxydants, enfin les rendements à l'hectare obtenus aussi bien pour l'huile essentielle que pour les antioxydants ont été calculés. Les légendes des figures citées ci-après sont les suivantes: La figure 1 est un exemple de schéma montrant le partir des drêches. RE-S signifie l'extrait sec. La figure 3 représente les variations journalières de la teneur en EO et AO de deux clones puis au hasard: les clones 28 et 30. HE = huiles essentielles (équivalent à EO). AO = antioxydants. La figure 4 représente les variations bimensuelles en EO (HE) et en AO en fonction de la date de récolte; la figure 4a reporte les résultats obtenus en France (Francereco) et la figure 4b ceux obtenus en Espagne (Hispareco). La figure 5 représente le contenu en huile essentielle des 44 clones exprimés en pourcentage de poids (en g pour 100 gr) de matière sèche, obtenus en Espagne et (EOH) et en France (EOF). La figure 6 représente le contenu en antioxydants, en g pour 100 gr de matière sèche, en France (AOF) et en Espagne (AOH) pour les 44 clones analysés. La figure 7 représente l'évaluation du contenu en huile essentielle de 36 clones testés, exprimés soit en pourcentage de matières sèches, soit en gramme par plante. La figure 8 représente l'évaluation du contenu en antioxydants de ces mêmes clones, exprimés soit en pourcentage de matières sèches, soit en gramme par plante. 1) METHODES ET PROCEDES. 1.1 Méthodologie de criblage. Jusqu'à présent les plants de romarins n'ont jamais été considérés quant à leur activité antioxydante. Cela signifie que dans la population naturelle ce critère est éminemment variable aussi la méthodologie utilisée a-t-elle été de: - réaliser une prospection botanique, - de réaliser une propagation végétative de chacun des plants collectés, - de réaliser un criblage de la collection de clones par un essai randomisé sur deux lieux distincts. Préalablement à ces essais, il était nécessaire de définir un procédé de distillation et d'extraction commun pour tous les sites d'expérimentation, puis d'évaluer la déviation au standard des procédés analytiques mis au point, et de mettre s'il existe en évidence un effet possible de la période de récolte soit dans un jour donné soit dans un mois donné, et enfin une évaluation d'un effet possible de la date de récolte pendant la saison de croissance active. Dans l'optique de limiter le nombre d'analyses, il a été récolté un échantillon de chaque clones répliqués au sein d'un cultivar et de les mélanger avant l'analyse. Cela permet de diviser par 5 le nombre d'analyses par clone. Cela permet, d'observer l'année suivante chaque réplication de chaque meilleur clone sélectionné et des 5 parmi les plus mauvais tels que déterminés pendant l'année précédente. 1.2 Essais en champs. Il a été établi une collection d'environ cent plants de romarins; un premier groupe de 44 génotypes a été rassemblé. Chacun de ces génotypes a été ensuite propagé en champs; les essais en champs randomisés incluent 5 réplications de 5 plants par génotype ce qui donne 25 plants par clone, I'ensemble de ces 25 plants représentant un cultivar. io 1.3. Procédés de distillation et d'extraction. Les figures 1 et 2 sont un exemple de procédé utilisé pour l'obtention de l'huile essentielle et des antioxydants. Dans la figure 2 les résidus de romarin sont extraits deux fois à l'hexane (en proportion 1:4) suivi de deux extractions à l'éthanol (1:4). L'extrait à l'hexane est contrelavé avec éthanol 80% (p/p) et la phase éthanolique est ajoutée à l'extrait à l'éthanol. Cet extrait est ensuite décoloré par 3 % de charbon actif, concentré, précipité à l'eau puis filtré et séché. Le procédé utilisé est décrit en détail dans le brevet EP 307 626 et dans la demande de brevet EP 507 064 lorsque l'on souhaite obtenir un extrait liquide d'antioxydant D'autres variantes d'extraction d'antioxydants sont également décrites dans la demande de brevet EP 480 077, et incorporées ici par référence. Les procédés utilisés dans les différents sites d'essais en champs sont les mêmes d'un site à l'autre. Les résidus obtepnus après distillation de la poudre de romarin et réextraite avec du diéthyléne; ultérieurement, cette seconde extraction a été supprimée car inutile: très peu d'huiles essentielles ont été obtenues par distillation au diéthyléne, la classification des clones était semblable que ce soit uniquement par distillation simple ou par les deux distillations successives aussi des considérations simples d'amélioration du rendement conduisent à éliminer cette deuxième distillation. Les huiles essentielles sont obtenues par broyage des parties terminales de tiges séchées puis extraction par hydro-distillation à raison de 15 ml/gr de poudre puis l'huile essentielle est extraite par de l'éther puis filtrée après refroidissement et rincée avec 50 ml d'eau, suivie par deux extractions en phase aqueuse volume à volume avec du diéthylether. 1.4 Procédés analytiques a) Evaluation de l'activité antioxvdante. La concentration des composés impliqués dans l'activité antioxydante est évaluée par des analyses réalisées sur un extrait éthanolique de la poudre brute de romarin. L'activité antioxydante résulte essentiellement de l'acide lo camosique et du camosol; la quantité de chacune des ces deux substances dans l'extrait est évaluée par HPLC (21). L'activité antioxydante de l'extrait est mesurée par la méthode Rancimat (19, 20) sur une graisse de poule. Test Rancimat Le test Rancimat a été utilisé à 100 C selon des méthodes publiées dans Woestenburg (20). Un aliquot d'extrait, correspondant à 500 ppm de matière sèche, a été ajouté à une graisse de poule désodorisée et on a déterminé le temps d'induction de cette graisse " stabilisée ". La graisse de poule désodorisée a été préparée selon une méthode publiée (19); il a été vérifié que l'éthanol introduit dans la graisse pendant la préparation des échantillons n'influence pas les résultats obtenus. Les mesures de Rancimat obtenues sur les 36 clones testés sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous, qui en outre donne les valeurs obtenues pour le contenu en acide carnosique +,carnosol exprimé en pourcentage de matière sèche. Tableau 1 CLONES E.O. DECANTES RANCIMAT ACIDE CARNOSIQUE + mg/100g DM (h) CARNOSOL (Poids %) 253 17.2 0.85 44 356 22.5 1.06 29 536 19.8 2.26 33 770 24.5 2.01 43 781 19.8 1.76 794 22.3 1.85 12 796 20.6 2.09 1027 24.2 1.7 8 1040 31.1 1.75 2 1065 38.3 2.46 32 1142 25.6 1.79 26 1178 32.5 2.57 1186 29.1 2.46 4 1213 39.1 2.75 1265 36.0 2.90 41 1295 25.6 2.89 9 1355 31.6 3.09 21 1363 37.2 2.31 1482 33.5 3.54 1486 38.4 3.65 31 1745 40.9 3.74 13 1758 30.6 3.87 22 1833 30.8 3.2 42 1852 34.3 3.25 28 2002 40.2 4.44 37 2019 34.1 3.29 38 2084 33.2 2.65 19 2085 39.8 3.07 24 2196 53.3 4.86 34 2325 32.1 3.26 23 2335 43.0 4.74 14 2365 38.4, 3.24 17 2383 40.0 3.91 27 2396 34.1 3.76 18 2397 33.4 3.73 39 2641 31.1 3.78 Valeur 1522 32.1 2.82 moyenne SD 651 7.7 0.97 SD/Valeur 43 24 34 moyenne (%) Ce tableau fait clairement apparaître une corrélation entre la quantité d'huile essentielle décantée et la valeur de Rancimat même si des variations existent. SD signifie Evaluation de carnosol et d'acide carnosique par HPLC. Cette technique est bien connue de l'homme du métier; un exemple de réalisation est décrit dans (21), et les résultats obtenus présentés dans le tableau 1 ci-dessus. 1o b) Analyse de déviation standard des différents paramètres. La déviation standard a été évaluée pour les paramètres suivants: - le contenu en matière sèche de la poudre, - le volume et le poids des huiles essentielles extraites par distillation vapeur, - le poids d'huiles essentielles extraites d'un résidu diéthyl-ether, - le test Rancimat, - et la concentration de certains des composés impliqués dans les activités antioxydantes. Le tableau 2 ci-dessous indique les valeurs moyennes obtenues sur les différents paramètres, la déviation standard et le pourcentage de la déviation standard sur la valeur moyenne et ce pour le pourcentage de matières sèches, les huiles essentielles décantées exprimées en ml pour gr de matière sèche, les huiles essentielles décantées exprimées en ml pour 100 gr de matière sèche, les huiles essentielles extraites exprimées en mg pour 100 gr de matière sèche, le test Rancimat réalisé en Espagne, le testRancimat réalisé en France et pour ce qui est des extraits à activité antioxydante sont mesurés le contenu en camosol, le contenu en acide carnosique, la somme des deux, le verbenone et le rendement (également en pourcentage) pour ce qui est de l'activité antioxydante, ES signifie les valeurs obtenues avec les essais en Espagne et (FR) signifie les résultats obtenus à partir des essais en France. Tableau 2 Valeur Moyenne SD. SD/val moyenne (%) Matière Sèche % 91.1 0.27 0.29 DEC EO ml/100g MS 0.39 0.046 11.79 EO DEC EO mg/lOOg MS 374 33 8.82 Rancimat Espagne 13.18 3.30 25.10 Rancimat France 23.20 6.06 26.12 Camrnosol ES (FR) 0.574 (0. 433) 0.046 (0.025) 8.18 (6.10) Acide carnosique ES (FR) 2.3522 (3. 71) 0.133 (0.0624) 5.56(1.66) AO SommeAO: ES (FR) 2.93 (4. 14) 0.123 (0.051) 4.23 (1.23) Verbenone ES (FR) 0.308 (0. 173) 0.082 (0.004) 2.67 (2.15) Rendement (%) ES (FR) 21.15 (14.89) 0.453 (0.754) 2.14 (5.07) Le coefficient de variation le plus important est observé pour l'évaluation du Rancimat pour laquelle il atteint 25%. Au contraire les mesures analytiques obtenues à partir d'un extrait brut, ou sur un composé défini présente toujours un coefficient de variation inférieur à 9% sauf pour le volume d'huile essentielle obtenu pour 100 gr de matière sèche qui est de 11,8%; ce dernier paramètre n'est probablement pas si fiable que les autres du fait des difficultés de mesures sur un petit volume; aussi la mesure du poids/poids plutôt que celle du volume/poids est beaucoup plus fiable et doit être adoptée. Ces résultats indiquent donc que les paramètres mesurés et les procédés mis en oeuvre sont fiables et aptes à être utilisés dans un processus de sélection de clones à haute teneur en EO et en AO. 1.5. Variations climatiques En dehors des variations inhérentes aux procédés analytiques, il était nécessaire d'étudier les variations journalières d'une part et les variations bimensuelles d'autre part a) Evaluation des variations iournalières. Deux clones choisis au hasard (28 et 30) ont été récoltés chaque deux heures entre 6 heures et 18 heures en France et en Espagne; les paramètres analysés ont été le contenu en huile essentielle distillée ou extraites d'une part et en carnosol plus acide carnosique d'autre part; la figure 3 représente les résultats obtenus et indique que les variations journalières ne sont pas significatives et ce pour aucun des paramètres mesurés b) Evaluation de variations bimensuelles Les mêmes clones ont été récoltés chaque deux semaines entre la mijuin et la fin du mois d'octobre (en France) et entre la mi-juillet et la fin du d'octobre en Espagne. Les mêmes paramètres ont été utilisés pour évaluer une éventuelle variation. Les figures 4a et 4b représentent ces lo variations bimensuelles. Il apparaît: - des variations importantes dans le contenu en huile essentielle selon la période de récolte, ce contenu étant relativement stable de la fin août à la fin octobre en France et de la fin juillet à la fin août en Espagne; ceci est parfaitement logique compte tenu des différences climatiques entre la France et l'Espagne. Le contenu en activité antioxydante est stable dans la période utilisée. Ces résultats indiquent que la période de récolte optimale est août en Espagne, septembre ou octobre en France. 2) CRIBLAGE DES CLONES. L'ensemble de ces paramètres étant calibré, le criblage des clones parmi les 44 plants étudiés a pu être réalisé sur tous les génotypes. La figure 5 indique le contenu en huile essentielle des 44 clones exprimés en pourcentage de poids (de matière sèche) obtenu en Espagne et (EOH) et en France (EOF). La figure 6 représente le contenu en antioxydants en g pour 100 gr de matière sèche en France (AOF) et en Espagneq (AOH) pour les 36 clones analysés. La figure 7 représente la teneur en huile essentielle et la quantité d'huile essentielle obtenue par plants (EOP); de façon parallèle la figure 8 représente la teneur en antioxydants (en pourcentage) et le contenu d'antioxydants par plante (AOP). Il apparaît clairement dans ces figures que les deux paramètres ne sont pas corrélés et que certains plants peuvent avoir une forte teneur en antioxydants (figure 8) et par contre présenter un contenu relativement faible (cas des clones n 1, 23 ou 37 par exemple). En revanche, les clones intéressants selon l'invention sont ceux qui ont à la fois une bonne teneur en antioxydants et un contenu par plante élevé ce qui est observé sur les clones 28 et 39. De la même façon on voit qu'il n'y a guère de corrélation entre la teneur en huile essentielle et le contenu par plantes; les clones 11, 19, 27, 28, 34 et 39 sont particulièrement intéressant quand à la valeur. des deux critères réunis. Les conclusions que l'on peut tirer de l'observation des figures 5 à 8 sont les suivantes: Une grande variabilité est observée dans la collection des 36 lo clones dans la mesure o le contenu en huile essentielle varie entre 253 à 2641 mg pour 100 gr de matières sèche pour une récolte en France au mois d'août. Cette variabilité est représentée dans le tableau 3 ci- dessous. Tableau 3: Analyse de la variabilité 36 clones de romarin MOY MIN MAX TAUX DE VARIATION HE(%) 1.48 0.22 1.13 1 >5. 13 AO (%) 2.66 0.85 4.08 1- > 4. 8 HE (g/plante) 4.93 0.19 13.65 1 >72 AO (g/plante) 9.32 0.3 23.71 1 > 79 Il apparaît clairement des figures 7 et 8 ainsi que du tableau 1 ci- dessus que les clones n 28 et 39 présentent le contenu le plus avantageux en EO et en AO. Aussi ces deux clones ont-ils été étudiés de façon beaucoup plus approfondie pour leur contenu en huiles essentielles, en antioxydants et pour le rendement à l'hectare de l'un et de l'autre. 3) CONTENU EN HUILES ESSENTIELLES DES CLONES 28 ET 39. 1660 kg du clone no 28 et 312 kg du clone n 39 ont été distillés en utilisant les techniques d'extraction habituelles. La charge est d'environ 300 kg de végétal frais (50% environ d'humidité) auquel on ajoute 200 I d'eau. Le chauffage est réalisé par vapeur directe (introduction par le fond de l'appareil) et circuit coquille. Il est important, avant toute opération, de vidanger le circuit de vapeur entièrement pour éliminer les particules de fer qui se trouvent dans la canalisation. Le chauffage est de 30 mn environ pour arriver au début de la coulée. La distillation a une durée de 2 h 30 à partir du début de la coulée puis l'eau est vidangée par ouverture de la vanne de fond d'appareil. L'ensemble est ensuite séché par mise sous vide de l'appareil et chauffage au circuit coquillé; la durée de ces opérations de vidange, séchage et chauffage est de 45 mn à 1 h et le processus est arrêté lorsque qu'il ne distille plus d'eau. L'appareil est ensuite déchargé par ouverture de fond basculant. Les branches sont séchées sur aire bétonnée en les étalant sur une hauteur de 10 cm environ et en les retournant fréquemment. Par triage manuel on sépare ensuite les épis de romarin des branches. Les résultats des distillations pour les clones 28 et 39 sont donnés dans les tableaux 4a et 4b ci-dessous. Résultats des distillations: 1) Tableau 4a: clone 28 Rendement % Charge Essence obtenue sur végétal frais sur végétal sec (calculé) 293 Kg 1,020 Kg 0,35 0,65 305 Kg 2,580 Kg 0,43 0,79 299 Kg 304 Kg 2,725 Kg 0,45 0,84 295 Kg 164 Kgq 0,735 Kq 0,45 Kq 0,83 1660 Kg 7,060 Kg 0,425 0,92 2) Tableau 4b: Clone n 39 Rendement % Charge Essence obtenue sur végétal frais sur végétal sec (calculé) 312 Kg 1,830 Kg 0,58 1,15 Les huiles essentielles sont ensuite évaluées quant à leur qualité olfactive d'une part et quant à leur constituant d'autre part. Les huiles essentielles ont été évaluées sur mouillettes 1o fraîchement trempées puis " séchées ", en comparaison avec un échantillon commercial standard d'origine espagnole. Les constituants des huiles essentielles des clones 28 et 39 sont déterminés par chromatographie en phase gazeuse; l'huile essentielle issue du clone 28 possède une composition très voisine de celle de l'huile essentielle expérimentale. Toutefois la teneur en camphre n'y est que de 28% au lieu de 43,4%. Les teneurs en terpène (c et 3 pinène et camphène) y sont en revanche plus élevées (22% environ, entre 6% pour l'échantillon expérimental). L'huile essentielle du clone 39 se caractérise par une teneur élevée en cinéole (22%) quasiment identique à celle de l'échantillon expérimental de Francereco. 3.1. Mesures des antioxydants dans les clones 28 et 39. Après la distillation vapeur qui permet d'obtenir les huiles essentielles comme décrit plus haut, les résidus de la distillation (les dréches) sont extraits dans un réacteur avec 200 I d'éthanol, pendant 4 heures et à 25 . Le résultat de cette extraction, appelé extrait AR (pour " antioxydant romarin ") est ensuite filtré et concentré pour donner un produit brun vert qui va être dosé. Les résultats du contenu en antioxydant sont représentés dans le tableau 5 ci-dessous; il y apparaît que aussi bien le contenu en antioxydant sur la matière première que de l'extrait est au moins deux fois supérieur à celui des extraits courants. Tableau 5: Extrait AR: comparaison entre les extraits bruts et les essais expérimentaux Contenu en Rendement Contenu en Récuperation AO (*) de la de l'extrait (%) AO de l'extrait de l'AO (%) Matière (%) Première Extrait brut 1.5 8;6 7.80 44.7 (moyenne) (min. 6.7 max 10.1) Essais expérimentaux - clone 28 2.3 11.0 15.6 74.6 -clone 39 2.5 12.3 16.2 79.7 (*) Acide carnosique + Carnosol Dans un autre essai, des échantillons différents des feuilles de romarin ont été analysés par HPLC. Il s'agit de deux échantillons classiques: Murcia et Nogales, les clones 28 et 39 et le clone 28 après hydro-distillation. Tableau 6: Teneur en antioxydants Echantillon Teneur en Teneur en Camosol Teneur en * acide carnosique antioxydants Murcia dist. 1.8 0.4 2.2 Nogales dist. 1.7 0.5 2.2 Clone 39 4.5 0.3 4.8 Clone 28 4.9 0.3 5.2 Clone 28 dist. 2.3 1.1 3.4 Teneurs en % poids * Somme d'acide camosique + carnosol Le tableau 6 ci-dessus montre que la teneur en antioxydant mesurée par la somme d'acide carnosique et de camosol est deux à trois fois plus forte que dans les échantillons courants, cette teneur étant lo légèrement diminuée après hydro-distillation mais restant cependant bien supérieure a la normale. L'analyse du contenu en camosol et acide carnosique par HPLC des feuilles montre que l'hydro-distillation avec la vapeur directe est très ménageante en ce qui concerne les antioxydants. Le traitement thermique (3 heures de distillation) suivi de séchage détruit un tiers des antioxydants. La comparaison de clones de romarin sauvage et de romarin sélectionné traités et triés de la même manière montre que les clones sont nettement plus performants au regard de la teneur en AO. Dans une expérience ultérieure la teneur antioxydante de six échantillons différents de romarin ont à nouveau été étudiés par HPLC sur feuilles séchées après extraction Soxtec. Outre la teneur en camosol et acide carnosique, la teneur en acide rosmarinique, antioxydant hydrosoluble du romarin, ont été mesurées. Le tableau 7 ci-dessous donne les résultats obtenus pour les clones 28 et 39. Tableau 7 Code Age des Teneur en antioxydants (% poids) plantes [ans] Acide Camosol Acide Somme rosmarinique (C) camosique C+CA (CA) H 28 3 0.8 0.35 4.65 5.0 AM 28 2 0.25 0.4 5.2 5.6 AM 28.1 2 0.95 0.35 5.45 5.8 CM 28 1 0.2 0.5 5.4 5.9 H 39 3 1.1 0.35 4.9 5.25 AM 39 2 0.5 0.3 5.3 5.6 Les termes H 28 et H 39 signifient que les clones ont été cultivés sur un terrain de Hispareco. Les autres échantillons représentent des clones qui ont été cultivés sur plusieurs hectares sur deux autres sites AM 1o et CM; l'échantillon AM 28.1 provient d'un petit lot qui a été récolté un mois après les clones codés AM28. 3.2 Rendement des cultivars 28 et 39. Les cultivars 28 et 39 de romarin ont 2 à 2,,5 fois plus d'activité antioxydante comparés aux souches sauvages. Cette augmentation du contenu dans ces composés à activité oxydante est accompagnée par une augmentation du contenu en huile essentielle (voir tableau 1) Deux essais en champs en Espagne sur deux fois 2500 m2 avec chacun des clones 28 et 39 ont été réalisés. Les rendements de ces clones est de 5,6 tonnes de feuilles de romarin séchées par hectare * contenant 4% de la matière sèche en composants actifs antioxydants. Le tableau 8 ci-après les résultats obtenus avec les clones 28 et 39, comparés à des clones sauvages (Nogales et Murcia) en termes de rendement obtenu pour les huiles essentielles et pour les A.R. (extraits antioxydants obtenus à partir des drêches). Tableau 8 (1) ESSAI INDUSTRIEL DE ROMARIN Poids Poids Poids récolte Frais Sec Feuille D.L.W. Variété Total Total Sèche T.DW. Matière date (T.F.W) (T.D.W) (D.L.W.) sèche kg kg Kg % Farm 39 24/09/91 791 266 172 64.7 92.0 distillé 1780m2 Farm 28 25/09/91 et 4013 1346 772 57.4 94.0 distillé 26/09/91 5300 m2 Hispareco.28 de19/8/91 2300 898 482 53.6 94.6 distillé à 21/8/91 1700 m2 Nogales 22/07/91 460 290 130 44.8 94.0 Murcia' 30/07/91 2070 931 416 44.6 94.0 Hispareco. 28/08/91 795 332 183 55.1 94.0 non distillé 396m2 Hispareco.39 28/08/91 787 327 223 67.9 94.0 non distillé 320m2 Tableau 8 (2) ESSAI INDUSTRIEL DE ROMARIN récolte Variété Rendem. Feuilles D.L.W/ Huiles E.O/ E.O/ E.O/ A.R/ date approx. sèches T.F.W. Essen. T.F.WT.D.WD.L.WD.L.W kg/Ha Kg/Ha % litres % % % % Farm 39 24/09/91 4500 966 21.74 4.82 0.60 1.8 2.80 3.0 distillé 1780m2 Farm 28 25/09/91 et 7572 1456 19.23 18.43 0.46 1.36 2.38 3.6 distillé 26/09/91 5300 m2 Hispareco.28 de19/8/91 13529 2835 21.00 11.96 0.52 1.33 2. 48 3.4 distillé à 21/8/91 1700 m2 Nogales 22/07/91 ----- ----- 28.26 3.10 0.67 1.06 2.38 2.2. Murcia 30/07/91 ----- ----- 20.11 9.93 0.47 1.06 2.38 2.3 Hispareco. 28/08/91 - 20080 4624 23.00 ---- ---- ---- ----- 5.2 non distillé 396m2 Hispareco.39 28/08/91 24590 6983 28.40 ------ ------ ---- 4.8 non distillé 320m2 4. EMPREINTES MOLECULAIRES Les empreintes moléculaires (ou " Finger Prints " en anglais) ont été réalisées pour chacun des deux clones 28 et 39. La méthode utilisée est la technique RAPD ou technique d'amplification aléatoire d'ADN polymorphe. La technique de PCR est la base d'analyse RAPD. Elle s'effectue dans un thermocycleur programmé (B. Braun, Thermocycler 60/2 à bain d'eau) et nécessite les éléments suivants: - 10pi d'ADN matrice de cacao à la concentration de 3,5 ng/pl. - 5pl d'amorce d'ADN simple brin à 5ng/pI. - 0,4p1 d'enzyme Taq polymérase (5 unités par pi). - 4p1 de chaque dNTP à 0,5 mM. - 5pl du tampon de réaction Stratagène 1 0X - qsp 50pl H20 Ultra-pure autoclavée. On ajoute enfin une goutte d'huile de parafine pour éviter l'évaporation et maintenir la réaction à température voulue. Cette réaction d'amplification est réalisée dans un volume de 50pl, dans des tubes Eppendorf de 0,5 ml. L'ADN matrice est avant tout dénaturé pendant 2 minutes à 94 C. Cette première étape est suivie de 45 cycles d'amplification comme suit: - I min. à 94 C pour la dénaturation de l'ADN. - 1 min. à 37 C permettant l'hybridation de l'amorce. -2 min. à 72 C pour la synthèse de novo de l'ADN. Les amorces oligonucléotidiques utilisées sont des décamères de séquence aléatoire avec un pourcentage de G-C (Guanine et Cytosine) de 60 à %, correspondant aux conditions optimales d'amplification sur le génome en l'absence de toute information moléculaire. Le primer se fixe à différents endroits du génome, encadrant parfois une séquence d'ADN qui sera alors amplifiée si la distance qui.sépare les deux amorces, sur les brins complémentaires, n'excède pas 3 à 4 Kb. La visualisation des fragments amplifiés est réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose 1,4% (p/v) préparé dans du tampon TBE 1X. On utilise ici les deux types d'agarose MP (Boehringer) et NuSieve GTG (TEBU) en proportions égales pour obtenir une meilleure résolution. La migration du gel (20x24 cms) s'effectue pendant 2 heures 1/4 à 100 Volts. Le gel est ensuite coloré au bromure d'éthidium 10 minutes puis rincé à l'eau déminéralisée (10 minutes minimum). Il est ensuite photographié sous lumière UV (film Polaroid 665 positif/négatif). L'échelle de poids moléculaire employée est un mélange de 10plI de phage Lambda digéré par Hind III (500ng) et de 10pl de phage X 174 digéré par Hae III (500ng). Les résultats obtenus sur l'ADN des clones 28 et 39 sont les suivants: REFERENCES (1) PRUTHI J.S. (1980) - " Spices and Condiments Chemistry, Microbiology, Technology ", Academic Press, London. (2) SHELEF L. A. (1983) - J. Food Safety 6, 29. (3) CHIPAULT.J.R. et al (1952) - Food Res. 17, 46. (4) CHIPAULT.J.R. et al (1955) - Food Res. 20, 443. (5) CHIPAULT.J.R. et al (1956) - Food Tech. 10, 209. l0 (6) BERNER D.L. et al (1985) -Brevet EU 3'732'111. (7) CHANG S.S. et al (1973) - Brevet EU 3'950'266. (8) CHANG S.S. et al (1977) - J. Food Sci. 42, 1102. (9) HARTMANN V.E. et al (1980) - Parfums, cosmétiques, arômes No 36, 33. (10) KIMURA Y. et al (1981) - Brevet Européen 0'038'959. (11) CALAME J.P. 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Matière végétale de plants d'épices caractérisée en ce qu'elle présente simultanément un contenu élevé en antioxydants et en huiles essentielles, de telle façon que: - le contenu en antioxydants soit supérieur à 1,5% en poids du végétal frais ou supérieur à 3,5% en poids de matières sèches, et - le contenu en huile essentielle soit supérieur à 0,3% en poids de végétal o10 frais ou supérieur à 1,5% en poids de matières sèches. 2. Matière végétale selon la revendication 1 caractérisée en ce les plants dont elle est issue présentent en outre un rendement à l'hectare en huile essentielle d'au moins 120 Kg/Ha et en antioxydants d'au moins 270Kg/Ha. 3. Matière végétale selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en qu'elle est issue de plants de romarin. 4. Plants d'épices utilisables comme matière première à l'obtention de la matière végétale selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Drêches obtenues après distillation aqueuse de matière végétale selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisées en qu'elles présentent un contenu en antioxydant supérieur à 3,5 % en poids desdites drêches. 6. Procédé de sélection de plants d'épices permettant l'obtention de matière végétale à teneur élevée en antioxydants consistant en la mise en oeuvre d'au moins les étapes suivantes: - une calibration des paramètres étudiés sur une population statistiquement valable, - un criblage parmi les plants de ceux présentant des taux supérieurs à la moyenne de ceux observés dans les plants sauvages, - la multiplication végétative des plants ainsi sélectionnés, lesdits paramètres étant les mesures des teneurs en antioxydants et en huile essentielle. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la matière végétale issue des plants sélectionnés a une teneur en antioxydants supérieure à 1% en poids du végétal frais ou 3,5% en poids de matières sèches. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la matière végétale issue des plants sélectionnés a en outre une teneur en huiles essentielles supérieure à 0;3% en poids de plante fraîche ou à 1,5% en poids de matières sèches. 9. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que les antioxydants contiennent au moins du carnosol et de l'acide carnosique. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé en ce o10 que l'épice est le romarin. 11. Utilisation de matière végétale issue de plants d'épices sélectionnés par un procédé selon l'une des revendications 7 à 10 comme matière première pour l'obtention de drêches ayant une teneur en antioxydants représentant au moins 1% en poids du végétal frais ou 3,5% en poids de matières sèches. 12. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que la matière végétale sélectionnée permet en outre l'obtention d'huiles essentielles utilisables en parfumerie. 13. Antioxydants extraits de matière végétale issue de plants d'épices selon l'une des revendications 1 à 4 et sélectionnés par un procédé selon l'une des revendications 6 à 10. 14. Composition utilisable dans un additif alimentaire et contenant des antioxydants caractérisée en ce que lesdits antioxydants sont obtenus à partir de matière végétale sélectionnée par un procédé selon I'une des revendications 6 à 10.