Brevet FR2723204A1 — publié le 19960202

PROCÉDÉ DE DÉTECTION ET/OU DE DOSAGE DE COMPOSÉ(S) INFECTIEUX DANS UN MATÉRIAU BIOLOGIQUE ET SUPPORT UTILISÉ POUR LEDIT PROCÉDÉ La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de dosage de composé(s) infectieux et un support permettant la mise en oeuvre dudit procédé. Dans le cadre de la présente invention, on entend par "composés infectieux" des agents infectieux, exogènes ou endogènes, ou leurs métabolites; parmi les composés infectieux, désignes ci-après par "CInf", on peut citer par exemple les virus, les bactéries, les champignons ou les parasites. On entend par "matériau biologique", un tissu biologique, une préparation ou un extrait issu de tissu biologique, liquide ou solide, dans lequel se trouve à l'état naturel une ou plusieurs formes de ss2-glycoprotéine I, désignée ci-après en abréviation par "B2 Gel". On a constaté que, dans le matériau biologique, certains CInf sont associés à la ss2 GP I naturellement présente pour constituer des complexes (CInf/2 GP I); on appellera donc "complexes" une association, directe ou indirecte, entre au moins une 132 GP I naturelle et au moins un CInf. Dans la demande internationale PCT/FR 94/00142 déposée le 9 Février 1994 et non publiée à ce jour, on a indiqué que certains composés viraux se fixaient de façon spécifique sur une forme de 132 GP I, à savoir la J32'-glycoprotéine I décrite dans la demande de brevet français 93-01399, déposée le 9 Février 1993 et non publiée au jour du dépôt de la présente demande, que cette glycoprotéine soit à l'état pur ou dans une composition protéinique la contenant. On a indiqué que la ss2'-glycoprotéine I se fixe sur certains composés viraux et l'on a, en conséquence, proposé un procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux, caractérisé par le fait que l'on fixe les composés viraux à l'aide de ss2'-glycoprotéine I. Dans un tel procédé, on ajoute donc la ss2'-glycoprotéine I sur des composés viraux contenus dans un matériau biologique, de façon à séparer les composés viraux pour ensuite les détecter. Ce procédé donne des résultats tout à fait satisfaisants lorsque le matériau biologique renferme des composés viraux libres, c'est-à-dire non fixés à la 132 GP I naturellement présente dans le matériau biologique, lesdits composés viraux libres étant par conséquent susceptibles de se fixer à la ss2'-glycoprotéine I que, selon le procédé, on introduit dans le milieu. Dans ce procédé, le signal de réponse croit donc en fonction des composés viraux ayant des sites encore libres ou, éventuellement, libérés des complexes, naturellement présents dans le matériau biologique. En revanche, on peut supposer, dans certains cas, par exemple en début d'infection, que les composés viraux sont présents en quantité faible par rapport à la 132 GP I naturellement présente dans le matériau biologique et que lesdits composés viraux sont donc majoritairement fixés à ladite 132 GP I sous forme de complexes (CInf/132 GP I). Le test proposé dans la demande PCT/FR 94/00142 peut alors être non significatif, puisque les composés viraux ainsi complexés peuvent être masqués. Selon la présente invention, on se propose de détecter et/ou doser des composés viraux ou, plus généralement, des composés infectieux se trouvant dans un matériau biologique, notamment dans le cas où ces composés sont en quantité telle, par rapport à la 132 GP I habituellement présente, qu'ils soient majoritairement complexés à au moins une des formes de 132 GP I ou encore dans le cas où lesdits composés infectieux ne sont pas déplaçables par l'introduction de ss2'-glycoprotéine I extérieure. Il convient de noter que certains de ces complexes peuvent se former durant la préparation du matériau biologique. Selon un mode de réalisation de l'invention, on retient le complexe (CInf-ss2 GP I) par l'intermédiaire de la partie 132 GP I du complexe, en munissant un support d'un composé se liant à ladite partie 132 GP I; ensuite, la partie du complexe correspondant aux composés infectieux est détectée par tout moyen approprié. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on retient le complexe (CInf-ss2 GP I) par l'intermédiaire de la partie CInf dudit complexe en fixant cette dernière à un support muni d'un composé se liant à ladite partie CInf du complexe ; ensuite, on détecte la partie 132 GP I dudit complexe par tout moyen approprié. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut procéder à la visualisation ou détection d'une structure caractéristique de l'agent infectieux notamment à vue, ou en microscopie (notamment optique, électronique, UV) et détecter la 132 GP I associée au(x) CInf sur ces structures, notamment à l'aide d'un anticorps spécifique marqué, par exemple conjugué à une molécule enzymatique ou fluorescente. Ceci peut être réalisé après fixation du matériau biologique notamment par un produit organique (acide, cétonique, alcoolique, paraffinique, ou aldéhydique). On peut aussi utiliser un double marquage spécifique de chaque partie pour détecter le complexe, notamment à l'aide d'anticorps spécifiques de chaque partie, conjugués à 2 traceurs différents, par exemple fluorescents à différentes longueurs d'ondes. Enfin, la détection ou dosage des CInf dans le matériau biologique peut se faire à l'aide d'un appareil d'analyse de signaux tels que nombre, volume, taille, forme de particules ou structures, par exemple en cytométrie, de flux notamment. Etant donné que l'on n'a ajouté aucune ss2'-glycoprotéine I, on évite le phénomène de masquage du procédé antérieur et on obtient un signal de réponse, qui est fonction croissante des quantités de complexe, et donc de composés infectieux, contenues dans le matériau biologique, même pour des quantités très faibles de ces composés infectieux. Le procédé selon la présente invention est donc complémentaire de celui décrit dans la demande internationale PCT précitée et il peut permettre de détecter un état pré-pathologique, alors que le procédé antérieur est plus approprié à l'étude d'un état de pathologie déclarée correspondant, par exemple, à un excès de composés infectieux ou à un défaut de 132 GP I native ou à l'existence naturelle d'une forme de 132 GP I non fonctionnelle pour le lien au(x) CInf. La présente invention a donc pour objet un procédé de détection et/ou de dosage de composé(s) infectieux (CInf) dans un matériau biologique, qui contient naturellement de la ss2-glycoprotéine I (ss2 GP I), caractérisé par le fait que l'on détecte le complexe (CInf/132 GP I) du matériau biologique. Selon l'invention, on peut détecter et/ou doser le(s) CInf du matériau biologique par la reconnaissance, à l'aide d'une substance se liant spécifiquement à la 132 GP I, de la 132 GP I naturellement complexée au(x) CInf. On peut aussi détecter et/ou doser, à l'aide d'une substance se liant spécifiquement à la 132 GP I du complexe, le(s) CInf complexé(s) du matériau biologique physiquement, chimiquement ou biologiquement fixé(s) à un support. Selon un mode préféré de réalisation, on fixe sur un support le complexe (CInf/132 GP I) par l'intermédiaire d'un composé se liant à l'une des parties 132 GP I ou CInf du complexe, on sépare dudit matériau biologique le complexe fixé sur ledit support et l'on détecte et/ou on dose ledit complexe (CInf/132 GP I) par reconnaissance de l'autre partie du complexe. Dans un premier mode de mise en oeuvre du procédé, la fixation du complexe au support s'effectue par l'intermédiaire d'un composé se liant à la partie 132 GP I du complexe dans un second mode de mise en oeuvre du procédé, la fixation du complexe au support s'effectue par l'intermédiaire d'un composé se liant à la partie CInf du complexe. Le composé infectieux du complexe fait notamment partie du groupe formé par HIV1, HIV2, HBV, HSV, des particules ou protéines d'origine virale, de bactéries ou de parasites, notamment Borrelia et Leishmanie, de champignons ou de mycoplasmes. Dans le cas où la fixation du complexe sur un support s'effectue par la partie 132 GP I du complexe, le composé se liant à la 132 GP I peut être un anticorps reconnaisant la 132 GP I ou une autre protéine, par exemple d'origine virale ou cellulaire, procaryote ou eucaryote, ou un composé biologique, par exemple un acide gras ou un lipide, ou un composé chimique, par exemple le dextran sulfate, l'héparine sulfate ou un détergent, tel que celui connu sous le nom commercial "TRITON X 100". Le support est avantageusement un support solide : ce peut être une membrane, par exemple en nitrocellulose, ou une microplaque de titration, par exemple une microplaque ELISA. La fixation sur le support du composé se liant à une des parties du complexe se fait par réaction de groupes réactifs dudit composé sur les sites réactifs du support. Cette réaction est, de préférence, effectuée à une température comprise entre 0 et 400C ; le composé se liant à une des parties du complexe est, avantageusement, mis dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5, de préférence entre 6,5 et 7,5 ; ce tampon peut être du type phosphate ou acétate. Le support est avantageusement maintenu en contact avec le tampon contenant le composé à une température comprise entre 0 et 40"C pendant un temps d'incubation compris entre 30 mn et 24 heures. Après incubation, on sépare du support le tampon, qui n'a pas réagi, et on effectue un lavage du support, de préférence avec un tampon identique au précédent, à cette différence près qu'il ne contient pas le composé se liant avec la 132 GP I. Il peut être nécessaire de saturer les sites actifs du support, qui n'ont pas réagi avec ledit composé ; dans ce cas, on fait réagir sur ces sites actifs d'autres groupes actifs ; on utilise avantageusement dans ce but, une solution d'albumine sérique bovine ou de caséine. Après réaction, le support est, de préférence, rincé et séché. Le support, sur lequel est fixé le composé se liant au complexe, est ensuite mis en contact avec un matériau biologique liquide contenant le composé infectieux recherché. On dissout, avantageusement, ce matériau biologique à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10,5, de préférence entre 5,6 et 7,5. La réaction sur le support est, de préférence, effectuée à une température comprise entre 0 et 400C, avantageusement voisine de 37"C, pendant une période dont la durée est comprise entre 30 minutes et 24 heures. On sépare ensuite du support la solution contenant le composé infectieux, qui n'a pas réagi ; on effectue éventuellement un lavage du support avec une solution saline, de préférence tamponnée. La détection et/ou le dosage du CInf du complexe (CInf/B2 GP I) lié au support peut se faire par tout moyen connu, tel que l'infectiosité, une réaction enzymatique spécifique, un traceur par exemple fluorescent ou radiomarqué, la détection d'acides nucléiques spécifiques par hybridation avec une sonde marquée ou par une réaction en chaîne obtenue avec une polymérase (technique dite "PCR" ou "polymerase chain reaction"). Mais la détection et/ou le dosage se font, de préférence, à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement des protéines des composés infectieux à détecter. De façon connue, cet anticorps peut être conjugué à un marqueur enzymatique, par exemple la peroxydase; l'excès d'anticorps est éliminé par lavage; on ajoute ensuite, de façon connue, un substrat spécifique de l'enzyme conjugué à l'anticorps, substrat qui se transforme, dans des conditions fixées, en un produit coloré ; la formation dudit produit coloré indique la présence du composé infectieux recherché et permet un dosage de ce composé infectieux. On peut également utiliser un anticorps contre le composé infectieux couplé à un marqueur isotopique puis détecté par radio-mesure. Selon la présente invention, on pourra réaliser un test polyspécifique susceptible de détecter différents agents infectieux, par exemple en utilisant simultanément ou successivement une méthode de détection différente pour chacun (notamment un anticorps conjugué à la phosphatase alkaline contre p26HIV2 puis un anticorps conjugué à la peroxydase contre HBsAg). La détection de la partie 132 GP I du complexe fixé par l'intermédiaire d'un composé liant la partie CInf peut se faire par tout moyen approprié, mais avantageusement à l'aide d'anticorps spécifiques de la 132 GP I, conjugués par exemple. L'invention a également pour objet un support utilisable pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini dans lequel la fixation du complexe sur un support s'effectue par la partie 2 GP I dudit complexe, caractérisé par le fait qu'au moins un composé se liant spécifiquement à la 132 GP I s'y trouve fixé. Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, on va en décrire maintenant, à titre d'exemple purement illustratif et non limitatif, un mode de mise en oeuvre décrit ci-après. EXEMPLE 1 - Détection de l'antigène HBs du virus de l'hépatite B Le support utilisé est une plaque de microtitration de type micro-ELISA à 96 puits et à fond plat, commercialisée par la société "DYNATECH". On prépare une solution de protéines recombinantes p2GHIV2 ROD fournies par la société "TRANSGENE" ayant une concentration de 2 yg/ml, dans un tampon phosphate contenant 0,01 molell de phosphates monosodique et disodique et 0,15 mole/l de chlorure de sodium et ayant un pH de 7,00 + 0,05. On dépose 100 il de cette solution au fond de chaque puits de la microplaque. Celle-ci est ensuite incubée à + 4"C pendant 18 heures. Le liquide de chaque puits est ensuite aspiré. On introduit ensuite dans chaque puits 300 à 400 yl de tampon phosphate décrit ci-dessus contenant le détergent vendu sous la dénommination commerciale "TRITON X 100" à 0,05 % en poids. On laisse en contact avec le support pendant 3 minutes et on aspire le tampon ; cette opération de lavage est effectuée trois fois. On a utilisé trois échantillons de sérum de donneurs sains et quatre échantillons de sérum de malades infectés par le virus de l'hépatite B. L'échantillon sérique est dilué dix, cent ou mille fois dans du tampon acétate contenant 0,05 mole/l d'acide acétique et d'acétate de sodium, 0,5 % en poids de TRITON X 100, 0,01 % en poids d'albumine sérique bovine, ayant un pH de 5,6 + 0,05. On dépose 100 Zl de solution au fond de chaque puits de la plaque préparée comme ci-dessus. La plaque est incubée à 37"C pendant une période de 90 minutes. Après cette incubation, on effectue un lavage en introduisant dans chaque puits 300 Zl de tampon phosphate contenant du TRITON X 100 à 0,05 % en poids ; on laisse en contact pendant 2 minutes et on aspire la solution de tampon ; on renouvelle quatre fois cette opération de lavage. On ajoute ensuite, par puits, 100 yl d'une solution d'anticorps monoclonal spécifique contre l'antigène HBs du virus de l'hépatite B conjugué à la peroxydase. On laisse la plaque incuber à 37"C pendant 60 minutes. A la suite de cette incubation, le contenu des puits de la plaque est aspiré. On introduit dans chaque puits 300 yl de tampon phosphate, contenant 0,05 % en poids de TRITON X 100 et, après un temps de contact de 2 minutes, on aspire le tampon ; cette opération de lavage est renouvelée cinq fois. On ajoute, par puits, 100 l d'une solution de d'o-phénylène diamine, 2HCL dans un tampon de citrate de sodium. On laisse incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis on arrête la réaction en rajoutant à chaque puits 50 il de H2SO4, 2N. On mesure l'absorbance à 492 nm obtenue en fin de réaction à l'aide d'un robot lecteur de plaque. La moyenne des absorbances obtenues pour chaque malade ou donneur est donnée dans le tableau 1 (en unités de densité optique multipliées par 1000). Pour les quatre sujets malades et non pour les trois sujets sains, l'AgHBs a été efficacement révélé. TABLEAU 1 Valeurs de densité optique (UDO x 1 000) Dilution du sérum 10 100 1 000 Origine du sérum Donneurs sains 81 72 81 (3 sujets) 89 64 87 82 66 89 Malades hépatite B 2 530 2 493 1 645 (4 sujets) 696 667 250 2 488 2 555 2 298 1 910 1 280 435 EXEMPLE 2 On a utilisé la même procédure que pour l'exemple 1, à cette différence près que, sur le support, est fixé un anticorps dirigé contre la 132 GP I. Des résultats similaires ont été obtenus. Pour ces deux exemples 1 et 2, d'une part, on a montré que de la 132 GP I s'était fixée au support en la révélant par des anticorps spécifiques, d'autre part, on a pu inhiber la fixation d'un complexe (ss2 GP I/AgHBs) présent dans un sérum de malade atteint d'hépatite B en bloquant sa fixation à un support préparé pour fixer la 132 GP I grâce à une pré-incubation du sérum de malade à 37"C pendant 30 minutes avec des anticorps dirigés contre la 132 GP I. Ces résultats indiquent que l'AgHBs du virus de l'hépatite B peut être reconnu par l'intermédiaire de la 132 GP I présente dans le plasma, celle-ci étant, dans ces essais, fixée par la p26-HIV2 ROD ou un anticorps spécifique. EXEMPLE 3 Avec la même procédure que celle utilisée pour l'exemple 1, les résultats ont été positifs pour la détection d'antigènes de surface portés par le parasite LEISHMANIE, extrait d'un tissu infecté. EXEMPLE 4 Avec la même procédure que celle utilisée pour l'exemple 1, les résultats ont été positifs pour la détection d'antigènes de surface portés par la bactérie BORRELIA, notamment la protéine p39-41. REVENDICATIONS 1 - Procédé de détection et/ou de dosage de composé(s) infectieux (CInf) dans un matériau biologique, qui contient naturellement de la ss2-glycoprotéine 1(132 GP I), caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou on dose le complexe (CInf/B2 GP I) du matériau biologique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou on dose le(s) CInf du matériau biologique par la reconnaissance, à l'aide d'une substance se liant spécifiquement à la 132 GP I, de la 132 GP I naturellement complexée au(x)Cinf. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on détecte et/ou on dose, à l'aide d'une substance se liant spécifiquement à la 132 GP I du complexe, le(s) CInf du matériau biologique physiquement, chimiquement ou biochimiquement fixé(s) à un support. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fixe sur un support le complexe (CInf/132 GP I) par l'intermédiaire d'un composé se liant spécifiquement à l'une des parties 132 GP I ou CInf du complexe, que l'on sépare dudit matériau biologique le complexe fixé sur ledit support et que l'on détecte et/ou on dose ledit complexe (CInf/132 GP I) par reconnaissance de l'autre partie du complexe. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on fixe le complexe au support par l'intermédiaire d'un composé se liant à la partie 132 GP I du complexe. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on fixe le complexe au support par l'intermédiaire d'un composé se liant à la partie CInf du complexe. 7 - Procédé selon l'une des revendications 2, 3 ou 5, caractérisé par le fait que le composé se liant à la 132 GP I est choisi dans le groupe formé par un anticorps dirigé contre la 132 GP I, une autre protéine, un composé biologique ou chimique se fixant à la 132 GP I. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la protéine reconnaissant la 132 GP I est la protéine p26-HIV2 ROD. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que le matériau biologique est un liquide biologique ou un extrait liquide de tissu biologique. 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que le CInf du complexe est HBV. ll-Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que le CInf du complexe fait partie du groupe formé par HIV1, HIV2, HSV et des particules ou protéines d'origine virale. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que le CInf du complexe fait partie du groupe formé par les bactéries, les parasites, les mycoplasmes et les champignons. 13 - Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait que le support est un support solide. 14 - Procédé selon les revendications 4 et 13 prises simultanément, caractérisé par le fait que l'on fixe le composé se liant au complexe sur le support à une température comprise entre 0 et 40"C, ledit composé étant en solution dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5, le support étant maintenu en contact avec la solution à une température comprise entre 0 et 40"C pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 24 heures et qu'après incubation, on sépare le support de la solution. 15 - Procédé selon les revendications 4, 9 et 13 prises simultanément, caractérisé par le fait que l'on dilue le matériau biologique liquide dans un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10,5, que l'on porte la solution à une température comprise entre 0 et 40 que l'on met en contact ladite solution avec un support sur lequel est fixé le composé reconnaissant l'une des parties du complexe pendant une période comprise entre 30 minutes et 24 heures et que l'on sépare la solution, qui n'a pas réagi. 16-Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que l'on détecte le CInf du complexe (CInf/B2 GP I), fixé sur le support, par infectiosité, par une réaction enzymatique spécifique, par un traceur fluorescent ou radiomarqué, par la détection d'acides nucléiques par hybridation avec une sonde marquée ou par une réaction de polymérase en chaîne (PCR) ou encore à l'aide d'anticorps spécifique(s) du (ou des) CInf. 17 - Support utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait qu'au moins un composé se liant spécifiquement à la 132 GP I s'y trouve fixé.