Brevet FR2722797A1 — publié le 19960126

La présente invention concerne un milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines. On connait tous les problèmes que l'on rencontre quant on désire remédier aux insuffisances fonctionnelles organiques, innées ou acquises, des glandes endocrines. On a propocé plusieurs solutions qui se sont avérées insuffisantes pour de multiples raisons - dans certains cas, du fait de leur instabilité, ou de l'impossibilité de les produire, la ou les hormones manquantes ne peuvent être délivrées sous forme de médicament - quand cette ou ces hormones existent sous forme de médicament, la chronologie de leur administration est délicate il est nécessaire de l'adapter aux variations physiologiques des métabolismes régulés - la greffe d'organes allogènes est impossible ou tout au moins hautement improbable du fait de leur très haute Immunogénicité - les cellules endocrines normales, prises isolément en dehors de toute contamination par d'autres cellules du tissu concerné sont non immunogènes. La solution idéale consisterait donc à remplacer les seules cellules concernées. Pour isoler ces cellules endocrines, il faut dissocier le tissu concerné puis préparer, par filtration ou centrifugation adaptée, une suspension cellulaire la plus enrichie possible en cellules endocrines. C'est la culture cellulaire de cette suspension qui constitue la deuxième étape indispensable de cette purification Cette culture doit être sélective, pour ne conserver définitivement que les seules cellules endocrines , elle doit être adaptée pour permettre la conservation des caractères fonctionnels de ces cellules ainsi que leur multiplication in vitro. A l'heure actuelle, aucun milieu de culture ne remplit ces conditions. La présente invention s'est donnée pour objet de résoudre ce problème en proposant un nouveau milieu de culture constitué de l'association d'éléments nutritionnels et stimulants capables de répondre à la double exigence définie cidessous Pour définir ce mélange, les Inventeurs ont choisi de considérer les cellules selon différentes approches jusqu'ici toujours dissociées - les cellules ont été considérées selon leur origine exodermique, ce qui leur confère des exigences de cellules épithéliales - elles ont été considérées selon leur appartenance au système A.P.U.D (Amine Precursor Uptake Decarboxylation ou cellules capables d'incorporer et de décarboxyler les précurseurs des amines biogènes). Ces cellules, comme les celules de la glande mammaire, sont alors capables d'utiliser un substrat d'acide aminé de forme racémique D (tel que la D Valine) capacité que ne possèdent pas les cellules les plus indésirables fibroblastes, macrophages - elles ont été considérées selon leur nature endocrine, ce qui conduit à un enrichissement du mélange nutritionnel en plusieurs facteurs stimulants connus pour leur influence sur l'expression des fonctionnalités des cellules différenciées. Au cours de leurs recherches, les inventeurs ont pu déterminer qu'il était essentiel que ce milieu de culture ne renferme aucune trace de L Valine ; ils ont donc, d'une part remplacé dans la solution de base la L Valine par la D Valine et d'autre part employé, pour la complémentation, du sérum de veau foetal dialysé, additionné de facteurs de croissance et d'hormones. Le milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines selon l'invention est donc essentiellement constitué de l'association d'un mélange nutritionnel de base dans lequel l'acide aminé Valine est apporté sous la forme racémique D et d'un complément en sérum de veau foetal dialysé, de facteurs de croissance et d'hormones Ce milieu de culture présente ainsi les trois propriétés désirées - sélectivité - réponse aux besoins en facteurs différenciants - réponse aux besoins en facteurs stimulants Ce milieu est donc tout spécialement adapté à la culture cellulaire de certaines cellules endocrines. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le milieu de culture présente la composition suivante - solution de base MEM (milieu essentiel minimum) D Valine (sel de Earle + D Valine) - complémentation: - Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,02 à 0,20 ml/ml - Facteur de croissance épidermique 1 à 50 ng/ml - Insuline 0,001 à 20 s g/ml - Hydrocortisone 0,004 à 5 Cig/ml - Transferrine 0,5 à 100 Icg/ml - Toxine cholérique 10-8à 10.12 M - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -7 à 2.10-11 M - Extrait pituitaire bovin 0,05 à 100 ug/ml Ce milieu sera dénommé par la suite APUDCM Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture présente la composition suivante - solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - complémentation: - Sérum de veau dialysé ( 1 8h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,12 ml/ml - Facteur de croissance épidermique 10 ng/ml - Insuline 5 Eng/ml - Hydrocortisone 400 ng/ml - Transferrine 5 sg/ml - Toxine cholérique 10-10 M - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -9 M - Extrait pituitaire bovin 5 stg/ml Ce milieu de culture sera dénommé par la suite PTCM. Ce milieu a été utilisé plus particulièrement pour la culture des cellules parathyroidiennes obtenues à partir de glandes de sujets adultes hyperplasiques, adénomateuses ou normales, par digestion enzymatique, filtration ou centrifugation en gradient de Percoll discontinu. La présente invention sera bien comprise à l'aide de la description suivante qui l'illustre sans nullement la limiter ainsi que du dessin schématique annexé représentant certains des résultats obtenus. Dans le dessin schématique Figure 1 représente les courbes de numération cellulaire Figure 2 est un graphique-barre illustrant le dosage en chimiluminescence pour une culture primaire de la parathormone (PTH) dans les surnageants de culture Figure 3 est un graphique-barre similaire au graphique-barre 2 après premier passage Figure 4 représente des courbes de modifications de la sécrétion de PTH Induite par la variation du taux de calcium extra cellulaire. Obtention de la préparation cellulaire Des échantillons glandulaires ont été obtenus, après consentement des malades concernés. Après vérification anatomo-pathologique de la pièce chirurgicale en extemporané. le fragment tissulaire est placé dans un flacon stérile contenant du sérum physiologique puis transporté au laboratoire de cultures cellulaires. II est alors immédiatement traité ou cryopréservé en vue d'une mise en culture ultérieure. Après un découpage fin de l'échantillon, les fragments obtenus sont rincés pour éliminer le sang résiduel puis pesés. Un de ces échantillons est passé aux ultra-sons afin de déterminer son contenu en parathormone. La digestion tissulaire est obtenue par incubation 45 à 60 minutes à 37"C, avec agitation mécanique, par pipettage toutes les 15 minutes dans le tampon suivant - 20 mM HEPES,136 mM NaCI. 4.7 mM KCI. 0,65 mM MgSO4, 1,2 mM CaC12 - 1,5 mg/ml collagénase - 40 stg/ml DNAse - pH 7,45 La suspension cellulaire obtenue est filtrée à 25 t.m puis incubée 3 minutes dans le tampon EGTA suivant -1 mM EGTA - 20 mM HEPES, 142 mM NaCI, 07 mM KCI - pH 7,4 On réalise ainsi la dissociation des agrégats cellulaires. La purification des cellules parathyroldiennes est effectuée par centrifugation de la suspension cellulaire sur gradient discontinu de Percoll. La dilution d'une solution stock isotonique de Percoll (d = 1,123) avec une solution saline de Hanks (d = 1.006) permet d'obtenir 3 solutions de densité 1,035, 1,058 et 1,090. La centrifugation est réalisée à 2000 tours /mn pendant 20 mn avec une accélération et une décélération minimale. Les cellules sont récupérées délicatement à chaque interface, lavées de toute trace de Percoll puis comptées. La viabilité cellulaire est déterminée par exclusion au Bleu Trypan. Un aliquote de chaque suspension est conservé pour permettre une mesure de son contenu cellulaire en PTH. Culture cellulaire Les cellules sont ensemencées à la densité de 105 cellules/cm2 dans des plaques 24 puits et incubées 18 heures à 37"C dans un milieu de base supplémenté à 12 ?o de sérum de veau foetal. Après cette période, le milieu est remplacé par le milieu PCTM. Tous les trois jours, le milieu de culture est prélevé, filtré, conservé à -20 C en vue du dosage de PTH et remplacé par du milieu frais. A confluence, les cellules sont détachées par l'action d'une solution de trypsine-EDTA. La culture cellulaire est alors poursuivie sous deux formes - ensemencement en plaques 24 puits à raison de 1,5.105 celluleslpuit dans le but d'estimer la croissance cellulaire on effectue la numération 245 heures après l'ensemencement puis tous les 3 jours en triplicate. - ensemencement en boîtes de Pétri. à la densité de 105 cellules/cm2 afin de poursuivre la culture Caractérisation cellulaire Les différents examens de caractérisation cellulaire ont été effectués selon les techniques suivantes - Microscopie optique une coloration cellulaire par le réactif May Grunwald Giemsa permet de caractériser les différents types de cellules parenchymateuses - Microscopie électronique on a observé des sections cellulaires ultrafines, réalisées en culture secondaire - Immunomarquages: Antikératine caractérisation de la nature épithéliale des cellules (anticorps monoclonal de souris) Anti Facteur VIII Indication de la présence ou de l'absence de cellules endothéliales dans la monocouche cellulaire (anticorps monoclonal de souris) Anti PTH intacte mise en évidence du caractère endocrine parathyroïdien des cellules en culture par un marquage intra-cytoplasmique (anticorps polyclonal de lapin) Fonctionnalité des cellules en culture. Elle a été étudiée comme suit - Les dosages de la PTH intacte ont été réalisés en chimiluminescence à l'aide de la trousse de dosage "Magic Lite Intact PTH" commercialisée par Ciba Corning, tant sur le tissu initial que sur les cellules purifiées et dans les surnageants de culture - Pour la détermination de la sensibilité au calcium, les cellules, durant la culture primaire et lors du premier repiquage, ont été exposées pendant 2 heures à des variations de la concentration en calcium extracellulaire ' passage de 0,62 mM (taux de base dans le milieu PTCM) à 1,8 mM. Au terme de cette incubation, les surnageants ont été prélevés et l'on a effectué le dosage de la parathormone Immunoqénicité - L'expression des anticorps HLA DR a été étudié par immunomarquage en fluorescence à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris. Ce marquage a été réalisé durant toutes les étapes de la préparation cellulaire, de la culture primaire, lors du premier repiquage et après incubation durant 48 heures des monocouches cellulaires avec 200 U/ml d'interféron y. - Cultures mixtes cultures réalisées avec des cellules parathyroïdiennes irradiées à 2500 rad. selon le protocole de Saxe (Surgery 1990 108 :56-62 : "In vitro assessment of parathyroid Immunogenicity") RESULTATS. Purification et culture cellulaire La centrifugation sur gradient de Percoll a permis la purification de cellules parathyroldiennes endocrines. Des aliquotes de suspension cellulaire, obtenus après centrifugation en gradient de Percoll, ont été cytocentrifugés et fixés. Une coloration en réactif May Grunwald Giemsa a permis la caractérisation des types cellulaires isolés pour chaque densité (x 100): La microscopie optique en contraste de phase met en évidence les types cellulaires classiquement décrits dans le tissu parathyroïdien. - 1035 g/ml - essentiellement cellules graisseuses et débris cellulaires -1,058 g/ml - petites cellules principales avec quelques cellules oxyphiles -1,090 g/ml - cellules principales. La viabilité du tissu frais est de l'ordre de 80 à 90 %; elle décroît légèrement pour le tissu cryopréservé. 30 à 40 C.c du matériel glandulaire initial est récupéré après la centrifugation sur Percoil 52,82 ng à 120,68 ng de PTH/g de tissu initial pour 12,76 ng à 49,92 ng de PTH/g de cellules après Percoll. L'adhésion cellulaire est obtenue 24 heures après l'ensemencement dans le milieu PTCM avec une capacité d'adhésion de l'ordre de 70 %. Des clones typiques des cellules épithéliales apparaissent dès le deuxième jour et une monocouche cellulaire est obtenue sous 6 à 8 jours. Les quelques cellules de type fibroblastique visibles les premiers jours ( Les courbes de numération cellulaire représentées à la figure 1 du dessin schématique annexé, (la durée, en jours, étant portée en abscisses et le nombre de cellules ensemencées en ordonnées) mettent en évidence que le nombre de cellules ensemencées en culture primaire est restauré sous 8 à 10 jours. Sur la courbe A, la numération cellulaire a été réalisée en culture primaire et sur la courbe B en culture secondaire au premier repiquage. Les résultats représentent la moyenne réalisée pour des essais en triplicate pour 3 souches cellulaires indépendantes. Sur la courbe A, on constate qu'au jour J + 1 de la culture primaire, 60 à 80 % des cellules ensemencées ont adhéré. Leur nombre initial est restauré sous 8 à 10 jours Sur la courbe B, on constate que l'adhésion des cellules est diminuée lors du passage en culture secondaire , au jour J + 1, 30 à 50 % des cellules adhèrent , cependant, à J + 10, on atteint 80 ,/O du nombre initial de cellules. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le passage se fait à subconfluence il a été possible alors d'effectuer 3 à 5 passages avant l'apparition de la sénescence cellulaire Caractérisation cellulaire L'examen en microscopie électronique a démontré la nature endocrine des cellules en culture L'ultra structure correspond à celle de cellules principales actives contenant des grains de sécrétion, un appareil de Golgi et un réticulum endoplasmique actif, cellules décrites dans le tissu parathyroïdien normal ou adénomateux. (Weymouth R.J et Sheridans M.N. - 1966 - Acta Endocrinol. 53 529-546 et Thiele J Damer J. and Fischer R - 1988 : - J. Submicros. Cytol. Pathol. 20 (3) 491-500) Les immunomarquages. réalisés sur des cultures primaires et lors du premier passage ont donné les résultats suivants - Dans le cas de l lmmunomarquage antikératine humaine, on relève un marquage positif des filaments Intermédiaires dans toute la population cellulaire le contrôle réalisé avec un sérum non-immun de souris à la place du premier anticorps est négatif, ce qui révèle la nature exclusivement épithéliale des cellules (Miettinen M. et al. 1985 - Arch. Pathol. Lab. Med. 109 :986-989). - Dans le cas de l'immunomarquage anti-facteur VIII humain, on constate l'absence de cellules endothéliales au cours de la phase de culture cellulaire. La spécificité du marquage est confirmée par la présence de cellules marquées positivement après la digestion enzymatique. - Dans le cas de l'lmmunomarquage anti-PTH intacte humaine, I'anticorps anti-PTH marque positivement toutes les cellules fixées tant en culture primaire que lors du premier passage les contrôles réalisés avec un sérum de lapin à la place du premier anticorps ne révèlent aucune fluorescence. On met ainsi en évidence la nature endocrine des cellules : chaque cellule contient de la PTH, que ce soit en culture primaire ou à la fin du premier repiquage, ce qui exprime le maintien de la différenciation cellulaire. Fonctionnalité - Les dosages de PTH intacte sont représentés sur les graphiques-barre des figures 2 et 3 (la durée, en jours, est portée en abscisses et et la sécrétion de PTH en ordonnées). Sur les deux figures, A, B et C sont 3 souches cellulaires représentatives les résultats expriment la moyenne des essais réalisés en triplicate pour chaque glande.Le dosage de la PTH dans les surnageants de culture a été réalisé en chimiluminescence Pour la figure 2, correspondant à la mesure de l'activité de sécrétion pendant 3 jours d'une culture primaire, on obtient un taux de base moyen de 34,66 pg/105 cellules/h pour une concentration de calcium extraceliulaire de 0,62 mM. Pour la figure 3, après un premier passage, on relève un taux de sécrétion moyen de 34,39 pg/105 cellules/h L'étude de la modification de la sécrétion de PTH induite par la variation du taux de calcium extracellulaire est représentée sur les courbes de la figure 4 (la durée, en heures, est portée en abscisses et la sécrétion de PTH en ordonnées). Sur ces courbes les résultats représentent une moyenne de 3 essais indépendants, réalisés en triplicate. Les cellules à confluence lors du premier passage ont été Incubées 2 h dans le milieu PCTM à des taux de calcium de 0,62 mM (taux de base) et de 1,8 mM. On voit qu'une augmentation du taux de calcium de 0,62 mM à 1,8 mM induit une diminution de la sécrétion de PTH intacte d'environ 40 % du taux de base, cette modification correspond à la régulation normale des cellules parathyroldiennes dans les conditions physiologiques in vivo. (Brown et al. Am. J. Med. 66 923-931). Immunoqénéicité - Quelques cellules ont été marquées positivement lors de l'immunomarquage anti HLA DR réalisé aux différentes étapes de la purification cellulaire. Ce marquage positif n'est plus détecté au sein de la monocouche cellulaire tout le long de la culture même après une stimulation de l'expression de ces molécules de classe Il par l'lnterféron y. Les résultats présentés dans la table suivante montrent la capacité des lymphocytes T à réagir à une stimulation par la Concanavaline A ainsi que leur absence de réaction aux cellules parathyroldiennes purifiées, ce qui confirme la non immunogénicité de ces dernières Co-culture cellules sarathvroïdiennes (PT)-lvmphocvtes (Lvm) Suspension cellulaire Cellules par puits Incorporation thymidine tritiée Lym PT (impulsions/min) Moyenne SEM PT irradiées 105 342 38 Lym/PT irradiées 105 105 444 175 Lym 105 148 94 Lym +Concanavalin A) i 105 1 1992 582 (0,25 mg/puit) La description qui précède montre bien l'originalité de la formulation du milieu de culture proposé, qui associe des constituants connus pour leur capacité à maintenir les propriétés des cellules endocrines et à permettre la prolifération des cellules épithéliales, avec un acide aminé particulier, la D Valine qui assure, par l'élimination des cellules parasites fibroblastes, macrophages, la sélection des seules cellules endocrines. Cette formulation originale autorise la survie et la multiplication cellulaire de cellules endocrines parathyroidiennes purifiées, fonctionnelles et non imunnocompétentes. La similitude d'équipement enzymatique qui permet aux cellules parathyroldiennes et aux cellules de la glande mammaire de convertir l'acide aminé D Valine et L Valine, ainsi que des résultats préliminaires avec les cellules t des îlots de Langerhaus permet de penser que cet équipement enzymatique peut être commun à de nombreuses cellules endocrines. Les cellules obtenues par culture sur le milieu selon l'invention sont susceptibles d'application par greffage comme substitut d'organe. REVENDICATIONS 1 - Milieu de culture favorisant la croissance cellulaire de cellules endocrines caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de l'association d'un mélange nutritionnel de base dans lequel l'acide aminé Valine est apporté sous la forme racémique D et d'un complément en sérum de veau foetal dialysé, de facteurs de croissance et d'hormones. 2 - Milieu de culture selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante - solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - complémentation: - Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,02 à 0,20 ml/ml - Facteur de croissance épidermique 1 à 50 ng/ml - Insuline 0,001 à 20 g/ml - Hydrocortisone 0,004 à 5 tzg/ml - Transferrine 0,5 à 100 ig/ml - Toxine cholérique 10-8 à 10-12 M - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 ~7 à 2.10-11 M - Extrait pituitaire bovin 0,05 à 100 ug/ml 3 - Milieu de culture selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante - solution de base MEM D Valine (sel de Earle + D Valine) - complémentation: - Sérum de veau dialysé (18h contre une membrane de cellulose régénérée, porosité 1000 da) 0,12 ml/ml - Facteur de croissance épidermique 10 ng/ml - Insuline 5 stg/ml - Hydrocortisone 400 ng/ml - Transferrine 5 ltg/ml - Toxine cholérique 10-1 M - 3,3'-5 Triiodo L Thyronine 2.10 -9 M - Extrait pituitaire bovin 5 tzg/ml 4 - Application du milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à la culture cellulaire de certaines cellules endocrines capables d'incorporer et de décarboxyler les précurseurs des amines biogènes 5. Cellules obtenues par culture suF le milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la préparation de substituts d'organes.