Brevet FR2728588A1 — publié le 19960628

PROCEDE DE SELECTION DE SOUCHES BACTERIENNES PRODUCTRICES DE DIACETYLE La présente Invention est relative à un procédé de sélection de souches bactériennes déficientes en CL- acétolactate décarboxylase, en vue de favoriser la production de diacétyle. Le diacétyle est un arôme recherché dans certains produits alimentaires tels que le beurre, la crème fraîche, les fromages frais et certains laits fermentés. Dans ces produits, la concentration en diacétyle est le plus souvent inférieure à 5 mg/l. Dans les produits laitiers, le diacétyle est principalement synthétisé à partir de l'acide citrique, présent naturellement dans le lait à une concentration voisine de 1,7 g/l. Les ferments aromatisants utilisés dans les procédés de fabrication contiennent généralement des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis ou de Leuconostoc spp., capables d'utiliser l'acide citrique. L'acide citrique donne lieu à la formation d'a-acétolactate, qui est le précurseur du diacetyle. L'a-acétolactate est un composé instable, qui se décarboxyle spontanément en diacétyle, ou en acétoine. Le diacétyle est formé dans des conditions oxydatives, par exemple en présence d'oxygène. En conditions nonoxydatives, se forme de l'acétoïne qui ne possède pas les propriétés aromatiques du diacétyle. L'a-acétolactate décarboxylase est une enzyme qui décarboxyle l'a-acétolactate en acétoïne, au détriment du diacétyle. Plusieurs procédés de production d'arômes font intervenir la synthèse d'a-acétolactate par des microorganismes. L'a-acétolactate produit peut ensuite être transformé en diacétyle, par exemple par une distillation en présence d'oxygène (JÔNSSON H. et al., Milchwissenschaft, 1980, 31, 8, 658-662). Dans le cas de la fabrication de beurre selon le procédé "NIZO" (développé par le Netherland Institute for Dairy Research) la production d'a-acétolactate par le ferment est due à la présence dans ledit ferment d'une souche de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis naturellement déficiente en a-acétolactate décarboxylase. En culture dans du lait, cette souche produit des quantités élevées d'a-acétolactate, contrairement aux souches possédant une a-acétolactate décarboxylase (Hugenholtz J. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992 38, 17-22). I1 a également été proposé d'utiliser l'a- acétolactate synthase, qui est l'enzyme responsable de la formation d'a-acétolactate à partir du pyruvate, dans une souche déficiente en a-acétolactate décarboxylase, pour augmenter encore la production d'a-acétolactate (Demande de Brevet Européen nO 500 188, aux noms d'Unilever N.V. et Unilever PLC). I1 serait intéressant de pouvoir disposer d'autres mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase, en particulier de mutants réalisée à partir de souches ayant des caractéristiques technologiques intéressantes pour les procédés de fabrication concernés (produits laitiers) (résistance aux phages, activité acidifiante, activité protéolytique ...). L'acide nucléique codant pour l'a-acétolactate décarboxylase de Lactococcus lactis subsp. lactis a été cloné et séquencé (Demande de Brevet Français 2 696 191 au nom de i'INRA). Cette Demande de Brevet Français 2 696 191 décrit également des procédés de préparation de bactéries lactiques du type Lactococcus lactis subsp. lactis chez lesquelles i'a-acétoiactate décarboxylase a été inactivée par génie génétique. Cependant, les techniques de génie génétique sont relativement lourdes à mettre en oeuvre ; la sélection des microorganismes obtenus nécessite l'utilisation d'un gène marqueur en outre, l'utilisation de microorganismes recombinants fait l'objet de réglementations contraignantes. Une autre méthode pour l'obtention de mutants déficients en La présente Invention a pour but de permettre la détection de bactéries lactiques déficientes en La présente Invention a pour objet un procédé de détection de la production de diacétyle par une bactérie, caractérisé en ce que l'on met ladite bactérie en présence d'hydroxylamine, et en ce que l'on détecte le diméthylglyoxime formé par réaction du diacétyle éventuellement produit et de lwhydroxylamine. Le diméthylglyoxime formé peut ensuite être détecté, par exemple, par formation d'un complexe de coloration rouge, en présence de sulfate de fer et d'ammoniaque. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, il s'agit d'un procédé de criblage ou de sélection, sur milieu gélosé, des colonies bactériennes produisant du diacétyle. I1 peut toutefois être appliqué au criblage des cultures en milieu non gélosé, par exemple à la sélection de clones sur plaques de microtitration. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, on procède à la détection de la production de diacétyle après avoir soumis ladite bactérie à un traitement mutagène. Ce traitement mutagène peut être effectué par tout moyen connu en lui même ; il peut s'agir de mutagénèse chimique, de mutagénèse par irradiation, ou de mutagénèse par insertion ou délétion de séquences d'acide nucléique. I1 peut s'agir d'un traitement de mutagénèse aléatoire, mais il peut s'agir également de mutagénèse dirigée. Par exemple, pour utiliser le procédé conforme à l'invention pour la détection de bactéries lactiques déficientes en a-acétolactate décarboxylase ; on opère comme suit Les cellules ayant subi une mutagénèse sont inoculées sur des boîtes de Pétri, de manière à former des colonies. Le milieu de culture utilisé permet la production d'a-acétolactate par les mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase. L'a-acétolactate est en partie transformé par décarboxylation chimique oxydative en diacétyle en raison de l'incubation des boîtes de Pétri en conditions aérobies. Les souches possédant l'a- acétolactate décarboxylase produisent peu de diacétyle dans ces conditions et n'induisent pas de coloration autour des colonies.Les souches produisant de l'a- acétolactate sont donc aisément mises en évidence dans ce criblage. Le diacétyle réagit avec de l'hydroxylamine pour former du diméthylglyoxime. Le diméthylglyoxime forme ensuite un complexe fortement coloré en rouge en présence de sulfate de fer et d'ammoniaque. Comme cette série de réactions chimiques est létale pour les microorganismes, on effectue préalablement au criblage, des répliques des boîtes de Pétri. Les colonies révélées par le criblage sont ensuite récupérées sur ces répliques. Le procédé de détection conforme à l'invention peut également être utilisé pour le criblage et l'obtention de souches dans lesquelles l'a-acétolactate décarboxylase a été suffisamment atténuée, sans avoir été totalement inactivée, dès lors que la production d'a-acétolactate par ces souches est plus élevée que chez les souches parentales. Parmi les souches mutantes sélectionnées, on peut citer de manière préférée, la souche F2X2 déposée en date du 20 décembre sous le nO I - 1510 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. De manière générale, le procédé conforme à l'Invention peut être utilisé dans toute procédure de criblage de la production d'a-acétolactate par des microorganismes, dès lors que ce criblage est basé sur une détection spécifique du diacétyle. L'Invention concerne également l'utilisation du procédé de détection de la production d'a-acétolactate pour des microorganismes autres que Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, par exemple pour les bactéries lactiques des genres Leuconostoc ou Lactobacillus. Les souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis ne sont pas les seules souches capables de produire du diacétyle. La stimulation de la production d'a-acétolactate et de diacétyle par une inactivation de l'a-acétolactate décarboxylase est envisageable pour d'autres espèces bactériennes. De manière avantageuse, ledit procédé de détection permet de sélectionner des bactéries lactiques déficientes en a-acétolactate décarboxylase, aptes à être utilisées comme ferment aromatisant. De tels ferments aromatisants sélectionnés conformément à la présente invention sont de préférence utilisés dans la préparation de fromages frais, de laits fermentés, de crème maturée et de beurre. De manière avantageuse, lesdits ferments comprennent soit des leuconostocs, soit des lactocoques, sélectionnés conformément à l'invention, seuls ou en mélange. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE : OBTENTION DE SOUCHES DE LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS BIOVAR. DIACETYLACTIS PRODUISANT DE L'&alpha;-ACETOLACTATE. 1. MUTAGENESE Une souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis est cultivée à 300C dans 5 ml de bouillon MRS (DE XAN J.C. et al. J. Appl. Bacteriol., 1960, 23, 130-135). La culture est arrêtée en fin de phase exponentielle, puis les cellules sont récupérées par centrifugation, lavées avec du tampon phosphate 100 mM (pH 7), et récupérées avec 0,5 ml de ce même tampon. Un volume de 0,5 ml d'une solution de N-méthyl-N'-nitro N-nitrosoguanidine (NTG) est ajouté à la suspension cellulaire ; le mélange est alors incubé 1 h à 300C (la concentration de la solution de NTG est ajustée de manière à obtenir 10% de survie au traitement mutagène). Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation, lavées avec 5 ml de tampon et reprises dans 5 ml de bouillon MURS. La suspension cellulaire est ensuite incubée 1 h à 300C, puis elle est diluée dans une solution de chlorure de sodium à 0,9%. Cette suspension est destinée à ensemencer les boîtes de Pétri pour le criblage. 2. INOCULATION DES BOITES DE PETRI 200 boîtes de Pétri sont utilisées. Leur préparation est décrite ci-dessous. Les composants suivants sont mélangés dans 950 ml d'eau distillée : 5 g d'extrait de levure, 10 g de polypeptone, 2 g de K2HPO4, 200 mg de MgSO4,7H2O, 50 mg de MnS04,4H20, 15 g de citrate trisodique,2H20 et 15 g d'agar. Le pH est ajusté à 6,5 et la gélose est autoclavée 15 min à 1210C. Avant de couler les botes de Pétri, on ajoute, pour 950 ml de milieu maintenu à 500C, 50 ml d'une solution autoclavée de glucose à 400 g/l. On verse approximativement 12 ml de gélose par boîte de Pétri. Les 200 boîtes de Pétri sont inoculées avec la suspension cellulaire provenant de la mutagénèse. L'inoculation est réalisée, de manière à obtenir environ 60 colonies par boîte de Pétri. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées 60 h à 300C, afin de permettre le développement des colonies. 3. CRIBLAGE Des répliques sur velours des boîtes de Pétri sont effectuées. Ces répliques permettent le récupération des colonies détectées par le criblage. Les boîtes de Pétri sont ensuite recouvertes de 6 ml d'une sur-couche contenant de l'agar et de l'hydroxylamine, maintenue en surfusion à 600C (210 g/l NH2,HC1/50 g/l agar ; 1/1, vol/vol ; les deux solutions sont mélangées extemporanément). Après la prise en masse de la surcouche d'agar, les boîtes de Pétri sont incubées 30 min à 750C pour permettre la formation du diméthyglyoxime à partir du diacétyle et de l'hydroxylamine. Les bonites de Pétri sont ensuite retirées de l'étuve et l'on verse 8 ml d'une solution d'acétonephosphate (200 ml d'acétone et 150 g de K2HPO4 par litre de solution) dans chaque boîte de Pétri encore chaude. Cette opération est destinée à fixer l'excès d'hydroxylamine et à permettre un meilleur développement ultérieur de la coloration. Après 15 min environ, l'acétone-phosphate est éliminé et on ajoute à chaque boîte de Pétri 9 ml d'un mélange extemporané de deux solutions : (500 g/l sodiumpotassium tartrate /NH40H ; 3/1, vol/vol) / (50 g/l FeSO4,H2O dans 1% H2S04 ; 8/1, vol/vol). L'ajout de cette solution a pour effet de former un complexe coloré rouge à partir du diméthylglyoxime. La couleur rouge atteint son maximum environ 10 min après l'ajout du réactif et elle persiste environ 1 h. Pour faciliter le criblage, les réactifs utilisés sont répartis dans les boîtes de Pétri à 1 l'aide d'un distributeur automatique. De plus, après l'incubation à 750C, toutes les opérations sont réalisées sous une hotte chimique. Les boîtes de Pétri sont examinées sur une table lumineuse.Les colonies entourées d'un halo rouge sont repérées. Ces colonies sont récupérées à partir des répliques des boîtes de Pétri effectuées avant le criblage. Les Tableaux I et II et les Figures 1 et 2 illustrent des expériences de mutagénèse et de caractérisation des mutants obtenus à partir de trois souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. - Le tableau I illustre les résultats des mutagénèses obtenus avec trois souches de Lactococcus lactis lactis - Le tableau II illustre les mesures de l'activité a-acétolactate décarboxylase des mutants et des souches parentales, ainsi que la production d'a-acétolactate dans du lait. - Les figures 1 et 2 représentent une cinétique de production d'a-acétolactate et de (diacétyle plus acétoïne) dans du lait d'une souche de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis ( figure 1), ainsi que d'un mutant obtenu à partir de cette souche (figure 2). Tableau I : Criblage de la production d'aacétolactate par des colonies issues de la mutagénèse de 3 souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Lactococcus Concentration Nombre Nombre de lactis subsp. en NTG de colonies colonies lactis biovar testées positives diacetylactis (CLg/ml) CD 300 5000 1 F2 200 14000 3 F5 20 12000 2 Les souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis utilisées dans les mutagénèses décrites dans le tableau I (CD, F2 et F5) proviennent du Centre de Recherche International André Gaillard Yoplait (Ivry-sur-Seine, France). Les souches CD, F2 et F5 sont aptes à utiliser le lactose et le citrate ; seules les souches CD et F2 présentnent en outre des caractéristiques de protéolyse. La mutagénèse est réalisée, conformément au point 1. ci-dessus. Les concentrations en NTG sont ajustées, de manière à obtenir 10 % de survie à la mutagénèse ; ce Tableau I montre que la souche F5 est beaucoup plus sensible au NTG que les souches CD et F2. Tableau II : Caractéristiques des souches parentales (CD, F2 et F5) et des souches sélectionnées après mutagénèse (CDM1, F2M1, F2x2, F2X3, F5M1, F5M2). Lactococcus Activité Production lactis subsp. a-acétolactate maximale lactis biovar. décarboxylase d'a-acétolactate diacetylactis (U/mg) (mM) CD 0,561 CDM1 2,38 F2 0,628 F2M1 2,28 F2x2 2,20 F2X3 2,30 F5 1,610 F5M1 2,46 F5M2 2,12 La fréquence d'apparition de colonies positives après une mutagénèse telle que décrite précédemment est de l'ordre de 1 pour 5000. Les colonies sélectionnées ont été caractérisées au niveau enzymatique, par la mesure de l'activité a-acétolactate décarboxylase, à partir d'extraits acellulaires, avec une concentration de 50mM de D-a-acétolactate et en présence de 40mM de leucine et pour leur capacité à produire de l'a-acétolactate ; les 6 clones révélés par le criblage ne possèdent plus d'activité a-acétolactate décarboxylase (tableau II). Lorsqu'ils sont inoculés dans du lait (à 107 ufc/ml, culture à 230C), ils produisent de l' La cinétique d'une culture de la souche parentale Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis F2 dans du lait (figure 1) montre les caractéristiques suivantes - La souche acidifie le lait à un pH inférieur à 4,5 en raison de la formation d'acide lactique à partir du lactose. - L'acide citrique du lait est consommé par la souche F2. - Aucune production a-acétolactate n'est détectée. - On observe une production des composés issus de la décarboxylation de l'a-acétolactate (diacétyle plus acétoïne, non dissociables dans le dosage utilisé), jusqu'à l'épuisement de l'acide citrique. Une étude plus détaillée montrerait que la concentration de l'acétoïne est beaucoup plus élevée que celle du diacétyle, en raison de la présence de l'a-acétolactate décarboxylase, qui transforme l'a-acétolactate en acétoïne uniquement. La cinétique d'une culture du mutant F2X2 (figure 2), isolé à partir de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis F2 et sélectionné en mettant en oeuvre le procédé de l'Invention, montre les caractéristiques suivantes - La souche F2M2 acidifie le lait et consomme l'acide citrique de façon similaire à la souche parentale. - On observe une production importante d'aacétolactate jusqu'à épuisement de l'acide citrique. La production de cet intermédiaire métabolique est due à l'absence de l'activité a-acétolactate décarboxylase chez la souche F2X2. - L'a-acétolactate se dégrade ensuite lentement par une décarboxylation chimique, ne faisant pas intervenir l'a-acétolactate décarboxylase, en acétoïne et/ou en diacétyle, de sorte que la somme diacétyle plus acétoïne plus a-acétolactate reste quasiment constante. En présence d'oxygène, la formation de diacétyle à partir de l'a-acétolactate est favorisée. Dans le cas contraire, l'a-acétolactate se transforme surtout en acétone. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de détection de la production de diacétyle par une bactérie, caractérisé en ce que l'on met ladite bactérie en présence d'hydroxylamine, et en ce que l'on détecte le diméthylglyoxime éventuellement formé. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour la sélection de bactéries produisant du diacétyle. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur une culture bactérienne en milieu gélosé, pour le criblage des colonies bactériennes produisant du diacétyle. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on procède à la détection de la production de diacétyle après traitement mutagène de ladite bactérie. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit traitement mutagène est un traitement de mutagénèse aléatoire. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite bactérie est une bactérie lactique. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite bactérie lactique est choisie dans le groupe constitué par Lactococcus, Leuconostoc ou Lactobacillus. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que ladite bactérie est du type Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. 9 - Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis obtenu selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, déposé en date du 20 décembre 1994 sous le nO I - 1510 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. 10 - Utilisation d'un procédé de détection de la production de diacétyle selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la sélection de bactéries lactiques déficientes en a-acétolactate décarboxylase. 11 - Utilisation d'un procédé de détection de la production de diacétyle selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la production d'un ferment aromatisant. 12 - Utilisation d'un procédé de détection de la production de diacétyle selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la sélection de bactéries aptes à être utilisées dans l'industrie alimentaire.