Brevet FR2723696A1 — publié le 19960223

La maladie de Dupuytren (contracture de Dupuytren) de la main survient principalement, mais non exclusivement, chez l'homme. On la rencontre plus fréquemment chez les personnes d'âge moyen et les personnes âgées, et chez les sujets qui sont affectés de certaines maladies chroniques, par exemple le diabète, l'alcoolisme et la tabagie. Sa cause est inconnue. La maladie est caractérisée par ltépaississement et le raccourcissement de l'aponévrose palmaire (tissu conjonctif), évoluant habituellement en flexions déformantes et atteinte d'un ou plusieurs doigts, qui résultent de la formation de cordes longitudinales de tissu fibreux induré dans la paume. Une affection similaire survient parfois dans le pied. Dans la contracture de Dupuytren, le rapport du collagène de type III au collagène de type I est accru, et l'on observe un plus grand nombre de fibroblastes proliférants. Aucun traitement palliatif efficace n' a été découvert ; les cas sévères sont traités chirurgicalement (aponévrotomie ou aponévrectomie). Selon la présente invention, les conséquences de la maladie de Dupuytren sont atténuées en traitant l'aponévrose atteinte par la collagénase, par application de celle-ci sur les surfaces des zones de fibrose, c'est-à-dire les cordes ou, dans les cas précoces, les nodules précurseurs existant dans l'aponévrose, ou par injection directe de collagénase dans ces zones de fibrose, en prenant soin de ne pas léser le tendon fléchisseur sous-jacent. Le module en traction des cordes est fortement amoindri par traitement à la collagénase, ce qui atténue la tension débilitante qui s'exerce sur les doigts. La collagénase est une enzyme qui possède la faculté spécifique de digérer le collagène. Elle est obtenue industriellement par fermentation avec Clostridium hisolyticum et elle est purifiée par une technique chromatographique. La mesure d'activité de la collagénase est fondée sur la digestion de collagène non dénaturé (extrait de tendon bovin) à pH 7,2 et 370C pendant 20 à 24 heures. Le nombre de liaisons peptidiques clivées est mesurée par réaction avec la ninhydrine. On retranche le nombre de groupes amino libérés par une digestion témoin par la trypsine. Une unité ABC nette de collagénase solubilise une quantité de matière réactive avec la ninhydrine équivalente à 1,09 nanomole de leucine par minute. Une poudre de collagénase lyophilisée stérilisée est disponible qui possède une activité minimale de 50 unités ABC par mg. L'activité mesurée peut varier bien au-dessus de cette valeur d'un lot à un autre, mais on la prend en compte pour déterminer le poids de poudre à utiliser avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, par exemple une solution saline normale, dans la formulation d'une préparation de la concentration désirée pour le traitement. La méthode de traitement et la posologie ressortissent évidemment à l'appréciation du médecin et dépendent, entre autres, du degré de gravité de la maladie et de la nature de l'invalidité. A titre d'indication, on peut utiliser des excipients liquides contenant d'environ 100 unités ABC de collagénase ou moins jusqu'a environ 10 000 unités ABC ou plus par ml. Un intervalle approprié s'est avéré être d'environ 300 à environ 700 unités ABC par ml. La dose peut varier d'environ 100 unités ABC ou moins jusqu'à environ 7500 unités ABC ou plus par corde ou structure équivalente affectée. Cette dose peut être administrée en une seule portion ou, plus efficacement en général, en portions aliquotes distribuées à deux ou plusieurs endroits dans la ou les lésions. Un traitement unique peut être suffisant, ou bien l'on peut effectuer deux ou plusieurs traitements espacés dans le temps, par exemple des traitements mensuels, selon les résultats observés. Bien que des résultats favorables soient observés en quelques jours à quelques semaines, il faut reconnaître clairement qu'un soulagement complet n'est souvent pas réalisable, et quelques rechutes peuvent être attendues. L'homme de l'art est en mesure de choisir des excipients pour la collagénase qui soient pharmaceutiquement acceptables et également inertes envers la collagénase. Des exemples en sont une solution saline normale, une solution aqueuse de dextrane et une solution aqueuse d'hydroxyéthylamidon. Dans certains cas, le médecin peut préférer une formulation à excipient liquide ou solide à libération lente pour injection ou implantation, auxquels cas la dose de collagénase doit être habituellement supérieure à celle utilisée dans une injection aqueuse simple. On peut utiliser comme excipient la colle de fibrine, comprenant de la fibrine ou des précurseurs de fibrine, par exemple du fibrinogène plus de la thrombine ; voir le brevet des E.U.A. NO 5 279 825. La encore, l'homme de l'art est en mesure de choisir l'excipient et les procédés de fabrication des préparations pharmaceutiques. Les dessins annexés sont des microphotographies de coupes de contractures ayant une épaisseur de 3,5 Clam, à un grossissement de 10x10 la Figure 1 est une coupe d'un témoin la Figure 2 est une coupe d'un échantillon traité avec du diluant seul la Figure 3 est une coupe d'un échantillon incubé avec 225 unités ABC de collagénase (U)/ml la Figure 4 est une coupe d'un échantillon incubé avec 450 U/ml ; et la Figure 5 est une coupe d'un échantillon incubé avec 675 U/ml. EXPÉRIENCE I Vingt cordes excisées ont été obtenues en provenance de patients soumis à une aponévrectomie de routine pour la maladie de Dupuytren. Les spécimens ont été congelés dans les 30 minutes qui ont suivi la résection chirurgicale. Dix spécimens choisis au hasard ont été affectés au groupe témoin, et dix autres choisis au hasard ont été affectés au groupe traité. Après que ces derniers eurent reçu une injection de collagénase, les deux groupes ont été mis à incuber à 370C pendant 24 heures. Les spécimens ont été manipulés en utilisant des techniques stériles. La poudre de collagénase lyophilisée fournie par Advance Biofactures Corp., Lynbrook, NY 11563, a été reconstituée avec un diluant consistant en eau, NaCl à 0,9 96 et CaCl2 2mM. La concentration de collagénase était de 3600 unités ABC par 0,5 ml. Cette solution a été injectée en une seule dose de 0,5 ml, de sorte que chaque corde traitée a reçu 3600 unités de collagénase. Une fois préparés, les spécimens ont été testés mécaniquement au moyen d'une machine Chatillon UTSE-2, qui applique une contrainte, c'est-à-dire une traction longitudinale, afin de déterminer les changements du module en traction après l'application de collagénase. L'expérimentateur a tracé deux repères sur les cordes avec un stylo afin d'apprécier les variations réelles de longueur (c'està-dire l'allongement) du tissu examiné. Des agrafes de fixation ont été posées près des extrémités d'une corde, et la corde a ensuite été attachée dans des pinces porteéchantillon, une à chaque extrémité. Les pinces ont été montées sur la machine Chatillon-2 UTSE, qui a ensuite appliqué la contrainte. La distance entre les repères était observée avec un microscope réglé à un grossissement de 12,5X et les observations ont été soumises à une analyse vidéo assistée par ordinateur. Le module en traction moyen pour le groupe traité par la collagénase était réduit d'un facteur 15 : le module en traction moyen dans le groupe témoin était de 33,0169 MPa (écart type de + 22,9386 MPa), tandis qu'il était de 2,1653 MPa (écart type de + 3,2027 MPa) pour le groupe traité (p Un examen histologique du groupe traité a permis de constater une rupture des faisceaux de collagène. Ceci n'a pas été observé dans le groupe témoin. Ainsi, le traitement par la collagénase est très efficace pour disloquer la corde pathologique, et réduire son module en traction, dans la maladie de Dupuytren, avec une réduction consécutive de la tension débilitante exercée sur les doigts. EXPÉRIENCE II Des patients atteints de la maladie de Dupuytren sont venus au service de chirurgie des mains de l'hôpital pour subir une opération. La contracture a été enlevée et placée, enveloppée dans des compresses humides, dans un bocal non marqué. Le bocal a été porté au laboratoire où la contracture a été débarrassé de la graisse, etc., de sorte que seul restait le tissu malade. Ensuite, la contracture a été coupée en quatre morceaux ayant à peu près la même taille. Trois des morceaux ont été placés dans des tubes de centrifugeuse Eppendorf de 1,5 ml. La collagénase est une enzyme qui détruit les liaisons peptidiques du collagène. Le collagène existe également dans la peau, de sorte qu'il est important de porter des gants. Des récipients de collagénase (Nucleolysine lyophilisé qui est une collagénase purifiée par une technique chromatographique, fourni par Advance Biofactures Corp., Lynbrook, NY 11563) au nombre requis ont été retirés du congélateur, où ils étaient conservés, et reconstitués dans un diluant consistant en eau, NaCl (NaCl de Baxter pour injection, 9 mg/ml) et CaCl2 (pulver purum de Merck, anhydre) et contenant 0,9 % de chlorure de sodium et 10 % de chlorure de calcium. Chaque récipient de Nycleolysine contenait 810 unités ABC (U) de collagénase. On a ajouté à chacun d'eux le volume de diluant requis pour obtenir l'une des concentrations suivantes 225 U/ml 450 U/ml 600 U/ml 675 U/ml 900 U/ml Le contenu de NycleolysinqD reconstitué de chaque récipient a été utilisé pour enduire deux des morceaux d'une contracture. Le troisième morceau a été enduit de diluant. Ensuite, les trois bocaux ont été placés dans un incubateur pour une incubation à 370C pendant 48 heures. Le morceau restant a été utilisé comme témoin et n'a pas été mis en incubation. Après l'incubation, les morceaux ont été placés, avec le morceau témoin non traité, dans du formaldéhyde (formaldéhyde à 4 % tamponné neutre à usage technique de Apoteksbolaget), avant fixation pendant une période d'au moins 24 heures. Après la fixation, les morceaux ont été déshydratés selon le programme suivant Programme de Déshydratation Alcool à 70 % une nuit Alcool à 96 % un morceau deux heures Alcool absolu deux morceaux trois heures Xylène 30-45 min Paraffine sur plaque chaude environ 19 heures Ces échantillons inclus dans la paraffine ont été sectionnés au moyen d'un microtome rotatif (Microtome Historange LKB 2218), en tranchant les morceaux en coupes de 3,5 CLm d'épaisseur. Ensuite, les coupes ont été colorées par deux méthodes afin de visualiser toute réduction possible du collagène. La solution de Van Gison, un colorant spécifique pour le tissu conjonctif, a été utilisée dans une méthode de coloration générale. La coloration trichrome de Masson, une méthode spécifique pour le collagène, a été utilisée comme méthode plus spécifique pour mettre directement en évidence le collagène. L'examen des coupes préparées à partir de la matière incubée a révélé que le témoin (Figure 1) et le témoin traité au diluant (Figure 2) contenaient des quantités à peu près aussi grandes de collagène aussi peu dissous. Le collagène se présentait en grands îlots qui se montraient épais et indurés et qui étaient fortement colorés. Le collagène n'était pas dissocié. Dans la coupe ayant été traitée par la collagénase à 225 U/ml, le collagène se montrait intact sous forme de gros morceaux, tout en semblant en même temps être dissocié en certains endroits (Figure 3). L'examen de la coupe ayant été préparée après incubation dans la solution à 450 U/ml de collagénase a révélé que le collagène était nettement aminci, et que le collagène formait un réseau (Figure 4). Dans la coupe préparée après traitement avec 675 U/ml de collagénase, on pouvait voir clairement que le réseau de collagène était très dissocié et que le collagène pouvait alors commencer à s'assouplir (Figure 5). D'après l'examen des coupes, une concentration de 450 U/ml est apparue comme une concentration convenable dans ces conditions d'essai, car elle dissolvait le collagène dans une certaine mesure, mais non pas si fortement qu'il puisse exister un risque quelconque de lésion des tendons fléchisseurs. Bibliographie (1) B.A. Gold, Treatise on collagen, volume 2, 2ème édition, Academic Press, Londres, 1968. (2) G.A. Murell, "An insight into Dupuytren's contracture", Ann. R. Coll. Surg. Engl. 1992, 74, 156-60. (3) L. Bromley, G.A. Murell, M.J. Francis, "The collagen changes of Dupuytren's contracture", J. Hand. Surg. Br. 1991, 16, 263-6. (4) G.A. Murrell, "Scientific comment, Basic science of Dupuytren's disease", Ann. Chir. Main. Memb. Super. 1993, 11, 355-61. (5) R. Fleishmajor, K. Kühn, B.R. Olsen, "Biology, chemistry and pathology of collagen", Annals of the New York Academy of Sciences, volume 460, New York, 1985. (6) J.B. Weiss, M.T.V. Jayson, Collagen in health and disease, 2ème édition, Churchill Livingstone, Londres, 1982. (7) Sobotta, Becher, Atlas der deskriptiven Anatomie des Menschen, Urban & Schwarzenberg, Munich-Berlin, 1964. (8) R.E. Burgeson, R. Mayne, Structure and function of collagen types, 2ème édition, Academic Press, Londres, 1 987. (9) J. Mandl, Collagenase, Gordon and Breach Science Publishers, Londres, 1972. (10) "Structure, molecular biology and pathology of collagen", Annals of the New York Academy of Sciences, volume 580, New York, 1985. (11) M.D. Brown, Intradiscal therapy, Year Book Medical Publishers, Londres, 1983. (12) J.D. Bancroft, A. Stevens, Theory and practice of histological techniques, 3ème édition, Churchill Livingstone, Londres, 1990. (13) B. Ryvedik, T. Ehira, K. Olmaker et coll., "Microvascular response to locally injected collagenase", Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. 1989, 23, 17-21. (14) B. Ryevik, M. Brown, T. Ehira et coll., "Effects of collagenase on nerve tissue", Spine 1985, 10, 562-6. (15) P. Wehling, "Method of enhancing the regeneration of injured nerves and adhesive pharmaceutical formulation therefor", brevet des E.U.A. NO 5 279 825, 1994. REVENDICATIONS 1. Utilisation de collagénase dans la fabrication d'une préparation pharmaceutique pour le traitement de la maladie de Dupuytren. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la quantité de collagénase est comprise entre environ 100 et environ 7500 unités ABC par préparation. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la préparation est fabriquée sous forme d'un excipient pharmaceutiquement acceptable contenant de la collagénase en une concentration d'environ 100 à environ 10 000 unités ABC de collagénase par ml. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la concentration de collagénase est comprise entre environ 300 et environ 700 unités ABC par ml. 5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'excipient est aqueux. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la préparation ainsi fabriquée est destinée à être appliquée à la corde pathologique de Dupuytren. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la préparation est fabriquée sous forme d'un excipient liquide pharmaceutiquement acceptable contenant de la collagénase et est destinée à être injectée dans la corde pathologique de Dupuytren.