Brevet FR2723104A1 — publié le 19960202

La présente invention concerne une nouvelle topoisomérase IV, les séquences nucléotiques codant pour cette enzyme, leurs vecteurs correspondants et l'utilisation de cette enzyme pour cribler des produits biologiquement actifs. Les topoisomérases sont des enzymes capables de modifier la configuration topologique des anneaux de l'ADN, d'y faire des noeuds ou d'enlacer des anneaux séparés. Elles sont ainsi impliquées dans la réplication, la transcription et la recombinaison de toutes les informations génétiques (Wang et al., 1990). Le mécanisme de toutes ces conversions topologiques est le même: l'anneau est ouvert pour qu'un segment d'ADN passe à travers la brèche avant que les extrémités ne se rejoignent. Deux types de topoisomérases sont impliquées dans ces conversions: les topoisomérases de type I qui coupent un seul brin d'ADN et les topoisomérases de type II qui coupent simultanément les deux brins. A ce jour, deux topoisomérases bactériennes de type II, ont été plus particulièrement identifiées et étudiées, la gyrase d'Escherichia coli (Gellert et al., 1976), et plus récemment, I'ADN topoisomérase IVde E. coli (Kato et al., 1990). La gyrase est un tétramère ct232 dont les sous-unités at ou GyrA et D ou GyrB sont codées respectivement par les gènes gyrA et gyr-. Les gyrases bactériennes sont les seules topoisomérases connues, capables de surenrouler, en présence d'ATP, des anneaux d'ADN relachés. En ce qui concerne plus particulièrement, I'ADN topoisomérase IV de E. coli, elle relâche l'ADN plasmidique surenroulé, dénoue l'ADN du phage T4 et désenlace (ou décatène) l'ADN de kinétoplaste (Kato et al., 1992; Peng et al., 1993). La séquence de ses gènes correspondants, parC et parE de Ecoli a permis de mettre en évidence des régions d'identité élevée entre les sous-unités de la gyrase et celles de cette topoisomérase IV, respectivement ParC avec GyrA (35,6 % sur toute la séquence) et ParE avec GyrB (40,1 % sur toute la séquence) (Kato et al., 1990). La gyrase d'E. coli a également été identifiée comme étant une cible primaire des fluoroquinolones (Hooper et al., 1993). Il a ainsi été démontré que des souches d'E. coli, mutées au niveau du résidu Ser83 dans la sous-unité GyrA, présentent une résistance élevée à l'égard des fluoroquinolones (Maxwell, 1992). Les fluoroquinolones se lient moins aux complexes ADN-gyrase mutée qu'aux complexes ADN- gyrase sauvage. En fait, d'autres mutations ponctuelles, cartographiées dans la région comprise entre les résidus 67 et 106 de GyrA, conduisent à des souches résistantes aux fluoroquinolones. Cette région est appelée QRDR (Yoshida et al, 1990 ; Cullen et al., 1989). Des résultats comparables ont été publiés avec des souches de Staphylococcus aureus résistantes aux fluoroquinolones (Goswitz et al., 1992; Sreedharan et al. , 1990). La gyrase est donc reconnue aujourd'hui comme étant la cible primaire des quinolones. Toutefois, une souche clinique de Staphylococcus aureus. ne comportant aucune mutation dans la région QRDR de GyrA, a également été décrite comme résistante aux fluoroquinolones (Sreedharan et al, 1991). Aujourd'hui, on se heurte de plus en plus, sur un plan thérapeutique, à ce phénomène de résistance développé par les bactéries Staphylococcus aureus à l'égard des antibiotiques et plus particulièrement vis à vis des fluoroquinolones. Il serait particulièrement important de pouvoir lever cette résistance et ceci passe par une caractérisation de l'ensemble des paramètres qui lui sont associés. La présente invention a précisément pour principal objectif l'identification, le séquencage et la caractérisation de séquences nucléiques codant pour des sous-unités d'une nouvelle topoisomérase, la topoisomérase IV de Staphylococcus aureus, composée de deux sous-unités la GrlA et la GrlB. De manière inattendue, la demanderesse a trouvé que la cible primaire des fluoroquinolones chez S. aureus est une topoisomérase IV et non la gyrase. Elle a ainsi mis en évidence que des souches cliniques de S. aureus, dont la région QRDR de la sous-unité GyrA de la gyrase est identique à la séquence sauvage, développent néanmoins une résistance à l'égard des fluoroquinolones en raison d'une mutation qu'elles possédent dans la région de la sous-unité GrlA de la topoisomérase IV, homologue à la région QRDR. La présente invention a pour premier objet une séquence nucléotidique codant pour au moins une sous-unité de la topoisomérase IV de Staphylococcus aureus. La présente invention décrit en particulier l'isolement et la caractérisation des gènes grA et grB. Ces gènes ont été clonés, séquencés et exprimés chez E. coli, et leur activité enzymatique a été caractérisée. Ils ont été isolés à partir d'une banque d'ADN génomique de Staphylococcus aureus. A partir de la séquence nucléique grlAB (SEQ ID N I1), il a été identifié deux phases ouvertes, correspondants respectivement aux gènes glffi et grIA. Les gènes grlA et griB ont été respectivement séquences en SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3. Préférentiellement, la présente invention a pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi: (a) tout ou partie des gènes gIA (SEQ ID n 2) ou grlB (SEQ ID n 3), (b) les séquences hybridant avec tout ou partie des gènes (a) et codant pour une sous-unité d'une topoisomérase IV, et (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. I est clair qu'a partir des gènes identifiés dans la présente demande, il est possible, par hybridation, de cloner directement d'autres gènes codant pour une sous- unité de la topoisomérase IV de bactéries proches de S. aureus comme par exemple des Streptocoques et Entérocoques. I est ainsi possible de cloner ce type de gène en utilisant comme sonde les gènes grlA, grIlB ou des fragments de ceux-ci. De même, le clonage de ces gènes peut être réalisé en utilisant des oligonucléotides dégénérés, dérivant des séquences des gènes grIA ou grffi ou de fragments de ceuxci. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute séquence obtenue par une ou plusieurs modifications et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques de la protéine d'origine. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier. Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion(s) de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native un ou plusieurs résidus supplémentaires. Encore plus préférentiellement, l'invention a pour objet les séquences nucléotidiques représentées par les gènes grIA(SEQ ID N 2) et griB( SEQ ID N 3). Elle se rapporte également à tout gène grlA possédant une mutation conduisant à une résistance vis-à-vis de molécules de la famille des quinolones et plus particulièrement des fluoroquinolones. A titre représentatif de ces gènes mutés, on peut plus particulièrement citer le gène grIA possédant une mutation ponctuelle en position Ser-80. Un autre objet de la présente invention concerne un ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une sous- unité de la topoisomérase IV de Staphylococcus aureus. Plus préférentiellement, il s'agit d'un ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique telle que définie précédemment en (a), (b) et (c) et plus particulièrement le gène grA(SEQ ID N 2) et/ou le gène grIB (SEQ ID N 3). Selon un mode préféré de l'invention, les séquences nucléotidiques, définies ci- 1 5 dessus, font partie d'un vecteur d'expression qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Un autre objet de l'invention concerne les polypeptides résultant de l'expression des séquences nucléotidiques telles que définies précédemment. Plus particulièrement, la présente invention concerne les polypeptides comprenant tout ou partie des polypeptides GrlA (SEQ ID N 2)ou GrlB (SEQ ID N 3) ou de leurs dérivés. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) substrat(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues aux polypeptides décrits dans la présente invention, issus d'autres sources cellulaires. Préférentiellement; il s'agit des polypeptides GrIA (SEQ ID N 2) et GrB (SEQ ID N 3). L'invention a également pour objet toute cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique, un ADN recombinant et/ou un vecteur tels que définis ci- avant. Les cellules recombinantes selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces. Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, les oeufs de Xenope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Micromonospora, Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. De préférence, il s'agit de cellules procaryotes. A ce titre on peut plus particulièrement utiliser les bactéries suivantes Actinomycètes, Bacillus, et plus préférentiellement E.coli et Staphylococcus. Les cellules recombinantes de l'invention peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'introduire une séquence nucléotidique étrangère dans une cellule. Il peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de polypeptides tels que revendiqués à partir de la culture d'une de ces cellules recombinantes. Le ou les polypeptides ainsi obtenus, sont récupérés selon des méthodes classiques à l'issue de la culture. L'invention se rapporte également à une topoisomérase IV isolée, susceptible d'être obtenue à partir de l'expression de tout ou partie du gène gr!A (SEQ ID N 2) et de tout ou partie du gène grffi (SEQ ID N 3) ou de leurs dérivés respectifs. Par dérivé, on entend désigner les séquences hybridant avec tout ou partie du gène grlIA ou grlB et codant pour une sous-unité d'une topoisoméraseIV ainsi que l'ensemble des séquences dérivant d'une dégénérescence du code génétique de ces séquences hybrides ou des séquences correspondant à tout ou partie du gène grIA ou rlIB. Plus préférentiellement, il s'agit d'une topoisomérase IV isolée, issue de l'expression de tout ou partie du gène grlA (SEQ ID N 2) et de tout ou partie du gène grIB (SEQ ID N 3). La présente invention concerne plus particulièrement toute topoisomérase IV possédant un comportement de cible primaire à l'égard des fluoroquinolones. Selon un mode particulier de l'invention, il s'agit de la topoisomérase IV de Staphylococcus aureus. La topoisomérase IV revendiquée selon l'invention, est tout particulièrement utile pour cribler des produits biologiquement actifs comme par exemple des antibiotiques potentiels et notamment des molécules de la famille des fluoroquinolones. Avantageusement, elle peut être également utilisée pour doser et/ou identifier des produits inhibiteurs de la réaction de relaxation ATP dépendante de l'ADN et/ou des produits inhibiteurs de la réaction de décaténation des caténanes d'ADN. La demanderesse a ainsi mis au point un dosage d'activité enzymatique spécifique de la topoisomérase IV de S. aureus et a montré que cette activité est inhibée par des molécules antibiotiques telles que les fluoroquinolones. La présente invention propose une nouvelle cible pour rechercher de nouveaux antibiotiques; ainsi qu'un crible spécifique de cette cible, ce crible est décrit dans l'exemple 5. Ce crible permet de mettre en évidence des produits inhibiteurs de l'ADN topoisomérase IV de S. aureus. Dans ce test, pourront être testés: des produits de synthèse purs ou en mélange, des extraits naturels de plantes, des culture de bactéries, de champignons, de levures ou d'algues, purs ou en mélange. Le test décrit dans la présente invention permet de mettre en évidence à la fois des produits qui stabilisent le complexe clivable, intermédiaire réactionnel de la réaction catalysée par l'enzyme mais aussi des inibiteurs agissant par d'autres mécanismes. Les exemples et figures, présentés ci-après a titre illustratif et non limitatif, mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Carte de restriction du fragment de 4565 pb contenant les gènes grlB et grlA de S. aureus. Figure 2: Construction des plasmides d'expression de griA et grlB. Les constructions réalisées avec griA sont schématisées en A et celles de griB sont en B. L'ADN de S. aureus cloné est représenté par les rectangles hachurés, les vecteurs dérivés de M13 sont en ligne noire épaisse et les vecteurs d'expression sont en ligne noire fine, le site de restriction SstI est entre paranthèses car c'est un site de clonage. Figure 3: Gel d'electrophorèse PAGE-SDS coloré au bleu de Coomasie. Sont déposés des extraits cellulaires totaux, pistes: 1 et 2, XLl-blue, pXL2340; 3 et 4, XLl-blue, pRSETB; 5 et 6, XLl-blue, pXL2320. Les marqueurs de poids moléculaires (en centaines) sont indiqués à droite de la figure. La flèche montre la protéine surproduite. Les signes + ou - représentent 1' induction avec ou sans IPTG. Figure 4. Activité de relaxation ATP-dépendante de la protéine GrlAB. Les expériences contrôles avec l'ADN topoisomérase IV de E. coli purifiée (Peng and Marians, 1993) et de l'ADN gyrase de E. coli purifiée (Hallett et al., 1990) sont aussi décrites. Figure 5. Activité de décatenation de la protéine GrIlAB. kDNA, ADN de kinétoplaste; monomères, monomères d'ADN relaches et décaténés. TopoIV: ADN topoisomérase IV de E. coli purifiée (50 ng); Gyrase: ADN gyrase de E. coli purifiée (50 ng); GrlA: extrait protéique de GrIA (2 g.g); GrlB: extrait protéique de GrIlB (2 tg); GrlAB: extrait protéique de GrlA (2 gg) mélangé avec l'extrait protéique de GrlB (2 pg). Exemple 1- Amplification par PCR de fragments d'ADN de Staphvlococcus aureus internes aux gènes ú!l et OIB. Cet exemple décrit l'obtention de fragments d'ADN de Staphylococcus aureus internes aux gènes grIA et gr!B. Ces fragments ont été obtenus après amplification par PCR réalisée à 50 C avec l'ADN génomique de la souche de Staphylococcus aureus RN4220 (Novick, 1990) et des oligonucléotides dégénérés correspondant aux acides aminés conservés dans les régions N-terminales des sous-unités GyrA de E. coli et B. subfilis et ParC de E. coli ou des sous-unités GyrB de E. coli et B. subtilis et ParE de E. coli. Plus spécifiquement les oligonucléotides sens 2137 et antisens 2135 ont permis d'amplifier des fragments de 255 pb pouvant coder pour 85 acides aminés qui correspondraient aux positions 39 à 124 sur la séquence GyrA de E. coli; la séquence de l'oligonucléotide sens 2137 est 5'-GCGCGAATTCGATGG (A,T)(TXC,T)T(A,T)AAACC(A,T)GT(A,T)CA-3' et celle de l'antisens 2135 est 5'- CGCGAAGCTTTTC(T,A)GTATA(A,T)C(T,G)CAT (A,T)GC(A,T)GC-3'. Les oligonucléotides 2144 et 2138 ont conduit à l'amplification de fragments de 1 kb pouvant coder pour 333 acides aminés qui correspondraient aux positions 98 à 430 sur la séquence de GyrB de E. coli; la séquence de l'oligonucléotide sens 2144 est 5'- GCGCGAATTCT (T,A)CATGC(A,T)GG(T,A)GG(T,A)AAATT-3', et celle de l'antisens 2138 est 5'- CGCGAAGCTT(T,A)CC(T,A)CC(T,A)GC(T,A)GAATC(T,A)CCTTC-3'. Les fragments ont été clones et un total de 40 clones ont été analysés par séquençage de leur insert. La séquence des oligonucléotides utilisés pour la PCR a été retrouvée pour 31 clones sur 40; parmi les 31 clones, 20 possèdent une séquence interne du gène gyrA ou MUB de S. aureus; les 11 autres clones contiennent soit un fragment A de 255 bp ou un fragment B de 1 kb. La séquence en acides aminés que coderait le fragment A a 59% d'identité avec la sous-unité GyrA de S. aureus entre les positions 44 à 125, le fragment A serait donc une partie d' un gène de S. aureus grIA ainsi nouvellement identifié. De même, la séquence en acides aminés que coderait le fragment B a 51% d'identité avec la sous- unité GyrB de S. aureus entre les positions 105 à 277, le fragment B serait donc une partie d'un gène de S. aureus grlB ainsi nouvellement identifié. Exemple 2- Clonage et séquencage des gènes gA et er!B de Staphvlococcus aureus. Cet exemple décrit les expériences de biologie moléculaire qui ont permis de S cloner puis séquencer les gènes grlA et grlB de Staphylococcus aureus. Les fragments A et B décrits dans l'exemple 1 ont été utilisés comme sonde radioactive pour identifier par hybridation les gênes gIA et gIlB dans une banque d'ADN génomique de S. aureus FDA 574 (CE ent+) construite dans lgtll 1 par Clontech Laboratories (catalogue XL1501b, lot 0721). Sur un total de 250 000 phages recombinants, douze phages hybrident avec le fragment A ou le fragment B mais n'hybrident pas avec des oligonucléotides spécifiques des gènes gyrA ou gBt. La taille des inserts EcoRI contenus dans ces phages varie entre 0,7 et 3,5 kb et deux phages 16 et 111 dont l'insert est de plus grande taille, ont été étudiés. L' insert EcoRI de 3,5 kb du phage 16 a été élué puis digéré par XbaI et les deux fragments de 1,5 et 2 kb ont été clonés dans M13mpl9 et M13mpl8 pour générer pXL2321 et pXL2322. De même l'insert EcoRI de 3,6 kb du phage 111 a été élué puis digéré par PstI et le fragment de 2 kb a été cloné dans M13mpl9 pour générer pXL2324. Les inserts contenus sur les phages recombinants pXL2321, pXL2322 et pXL2324 ont été séquences sur les deux brins à l'aide du primer universel ou d'oligonucléotides internes en utilisant la méthode de Sanger. La séquence nucléique grlAB ( SEQ ID N 1) de 4565 pb, a été analysée par le programme de Staden et al., 1982 pour identifier les séquences codantes à l'aide d'un tableau d'usage des codons chez S. aureus. Deux phases ouvertes uniquement ORF1 (positions 41 à 2029) et ORF2 (positions 2032 à 4431) ont ainsi été déterminées. Sur la SEQ ID N 1, le brin codant est le brin supérieur 5' -> 3', la phase ouverte ORF1 débute arbitrairement à l'ATG position 41 mais elle peut aussi débuter au TTG position 17 ou 35 ce codon étant déjà décrit comme codon d'initiation chez S. aureus; le codon de terminaison de l'ORF1 se chevauche avec le codon d'initiation GTG de l'ORF2 ce qui est caractéristique d'un couplage traductionnel (Normark et al., 1983); un tel couplage a par exemple été décrit pour les gènes gyrA er gyrBfi dHaloferax sp. (Holmes et al., 1991). Ces phases ouvertes ont un pourcentage en GC de 34,5 % qui est une valeur en accord avec les valeurs décrites pour l'ADN de S. aureus dans la littérature (Novick, 1990). D'autre part le fragment B est identique à la séquence décrite sur la SEQ ID N I1 de la position 333 à la position 1348 dans ORF1 et le fragment A est identique à la séquence de la SEQ ID N 1 de la position 2137 à la position 2394 dans ORF2. A partir de la séquence nucléotidique, une carte de restriction est réalisée avec des enzymes qui coupent le moins fréquemment, voir figure 1. Cette analyse de séquence montre que ORFI est le gène grlB et ORF2 le gène gMA. Exemple 3- Structure primaire, expression et fonction des protéines GrlA et GrlB codées par les gènes r!A et 2rB de Staphvlococcus aureus. Cet exemple décrit la structure primaire, l'expression chez E. coU et la fonction des protéines GrlA et GrlB de Staphylococcus aureus. Cette fonction, qui correspond à une ADN topoisomérase IV, repose dans cet exemple sur des données d'homologies de séquence et de complémentation génétique. Exemple 3.1- Structure primaire et analyse de séquence des protéines GrIA et GrlB. Cet exemple décrit l'analyse informatique de la séquence des gènes grlA et g'i. de Staphylococcus aureus, réalisée à partir des données de séquence présentées dans l'exemple 2. Le gène grflB code pour une protéine GrlB de 663 acides aminés (poids moléculaire 74 318); et le gène grlIA code pour une protéine GrlA de 800 acides aminés (poids moléculaire 91 040). Les parties codantes des gènes glIB et grlA, les séquences des protéines GrlB et GrlA sont présentés respectivement en SEQ ID N 3 et SEQ ID N 2 et les propriétés de chacune de ces protéines (composition en acides aminés, point isoélectrique, index de polartité) fgurent dans les tableaux I et 2 ci-après. Proteine: GrlA: Premier résidu = 1 et dernier résidu = 800 Masse moléculaire (monoisotopique) = 91040.8438 Masse moléculaire (moyenne) = 91097.2578 Index de polarité (%) = 52.00 Point isoelectrique = 6.77 DO 260 (lmg/ml) = 0.298 DO 280 (lmg/ml) = 0.487 NOMBRE % NOMB POIDS % POIDS I Phe F 22 2.75 3235.51 3.55 2 Leu L 74 9.25 8368.22 9.19 3 Ile I 77 9.63 8707.47 9.56 4 Met M 19 2.38 2489.77 2.73 Val V 59 7.38 5845.04 6.42 6 Ser S 51 6.38 4438. 63 4.88 7 Pro P 22 2.75 2135.16 2.35 8 Thr T 43 5.38 4345.05 4.77 9 Ala A 37 4.63 2628.37 2.89 Tyr Y 28 3.50 4565.77 5.02 12 His H 20 2.50 2741.18 3.01 13 Gin Q 26 3. 25 3329.52 3.66 14 sn N 45 5.63 5131.93 5.64 Lys K 66 8.25 8454.27 9.29 16 Asp D 54 6.75 6211.45 6.82 17 Glu E 67 8.38 8645.85 9.50 18 Cys C 0 0.00 0.00 0.00 19 Trp W 2 0.25 372.16 0.41 Arg R 44 5.50 6868.45 7.54 21 Gly G 44 5.50 2508.94 2.76 TABLEAU I Proteine GrlB: Premier résidu= I et dernier résidu = 663 Masse moléculaire (monoisotopique) = 74318.3516 Masse moléculaire (moyenne) = 74363.9219 Index de polarité (%) = 53.70 Point isoelectrique = 7.21 DO 260 (lmg/ml) = 0.404 DO 280 (lmg/ml) = 0.603 NOMBRE % NOMB POIDS % POIDS I Phe F 26 3.92 3823.78 5.15 2 Leu L 55 8.30 6219.62 8.37 3 Dle I 36 5.43 4071.03 5.48 4 Met M 10 1.51 1310.40 1.76 Val V 50 7.54 4953.42 6.67 6 Ser S 41 6.18 3568.31 4.80 7 Pro P 15 2.26 1455.79 1.96 8 Thr T 41 6.18 4142.95 5.57 9 Ala A 33 4.98 2344. 22 3.15 Tyr Y 19 2.87 3098.20 4.17 12 His H 14 2.11 1918.82 2. 58 13 Gin Q 26 3.92 3329.52 4.48 14 Asn N 36 5.43 4105.55 5.52 Lys K 63 9.50 8069.98 10.86 16 Asp D 40 6.03 4601.08 6.19 17 Glu E 61 9.20 7871.60 10.59 18 Cys C 0 0.00 0.00 0.00 19 Trp W 4 0.60 744.32 1.00 Arg R 34 5.13 5307.44 7.14 21 Gly G 59 8.90 3364.27 4.53 TABLEAU 2 Le programme de Kanehisa, décrit en 1984, a été utilisé pour aligner les protéines GrIB et GrlA avec les DNA topoisomérases bactériennes de type II suivantes les gyrases de E. coli, B. subtilis ou S. aureus ou la topoisomérase IV de E. coli. Les identités, voir tableau 3, sont élevées et comprises entre 32 et 55%. Plus spécifiquement, GrlB présente plus d'identité avec les sous-unités GyrB de E. coli (49%) et de S. aureus (52%) qu'avec ParE de E. coli (38%); alors que GrIA présente des identités comparables avec les sous-unités GyrA de E. coli (32%) et de S. aureus (39%) qu'avec ParE de E. coli (33%). Les sous-unités GyrB de Staphylococcus aureus (Margerrison et al., 1992), Bacillus subtilis (Moriya et al., 1985), et Escherichia coli (Adachi et al., 1987) sont nommées SAGYRB, BSGYRB et ECGYRB respectivement, GrlB est nommé SAGRLB et ECPARE correspond à ParE de E.coli (Kato et al., 1990). Une nomenclature comparable est employée pour les sous-unités GyrA GrlA et ParC. Les chiffres sous le nom des protéines sont les nombres d'acides aminés de celles ci. Sous-unités SAGYRB SAGRLB BSGYRB ECGYRB B ou B-like 644 663 638 804 SAGRLB 52 % BSGYRB 68 % 55 % ECGYRB 55% 49% 57 % ECPARE 40 % 38 % 40 % 40 % Sous-unités SAGYRA SAGRLA BSGYRA ECGYRA A ou A-like 887 800 821 875 SAGRLA 39 % BSGYRA 65 % 40 % ECGYRA 39% 32 % 41 % ECPARC 38 % 33 % 36 % 32 % TABLEAU 3 Des alignements multiples entre les topoisomérases bactériennes de type II, réalisés avec le programme CLUSTAL de Higgins et al., 1988, mettent en évidence de nombreuses régions conservées entre les séquences des diverses sous-unités B, GrlB et ParE et dans la partie N-terminale de la séquence des sous-unités A, GrlA et ParC. Les résidus conservés dans la région N-terminale des sous-unités B de ces protéines sont en fait les résidus impliqués dans la fixation de l'ATP et identifiés d'après les données de cristallisation aux rayons X avec la GyrB de E. coli (Wigley et al., 1991). Les résidus conservés dans la région N-terminale des sous-unités A de ces protéines sont soit les résidus AAMRYTE proches du site actif de la gyrase Tyr-122, identifiée sur la GyrA de E. coli (Horowitz et al., 1987); ou soit les résidus YHPHGDS modifiés dans les souches résistantes aux fluoroquinolones (Hooper et al. , 1993). Exemple 3.2- Expression des gènes arlA et grlB chez E. coli. Cet exemple décrit les constructions réalisées pour exprimer, chez E. col, les gènes grA ou gLI sous le contrôle du promoteur pT7 (Studier et al., 1990). Le plasmide d'expression pXL2320, voir figure 2, contenant le gène grB dans le vecteur pRSETB (Invitrogen) a été construit en clonant 1) l'insert EcoRI-XbaI de I kb du pXL2321 dans le pXL2322 aux sites XbaI et EcoRI pour générer pXL2323; 2) l'insert KpnI-EcoRI de 1,9 kb du pXL2323 aux sites KpnI et EcoRI du vecteur pRSETB pour générer pXL2319; l'insert NdeI-KpnI de 0,5 kb du pXL2325 aux sites NdeI et KpnI du pXL2319 pour obtenir pXL2320. (Le pXL2325 contient les 500 premières bases du gène o une séquence CAT a été introduite par mutagénèse, juste en amont du codon d'initiation ATG pour créer un site NdeI). La cassette d'expression du gène grlB contenue dans pXL2320 a été clonée aux sites Bg!II et EcoRI du pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) pour obtenir pXL2439. Le plasmide d'expression pXL2340, voir figure 2, contenant le gène gMLA dans le vecteur pRSETB a été construit en clonant 1) l'insert NdeI-EcoRI de 1,7 kb du pXL2324 aux sites NdeI et EcoRI du vecteur pRSETB pour générer pXL2338; l'insert NdeI de 0,75 kb du pXL2337 aux sites NdeI du pXL2338 pour obtenir pXL2340. (Le pXL2337 contient les 750 premières bases du gène o une séquence CATATG a été introduite par mutagénèse, à la place du codon d'initiation GTG pour créer un site NdeI). Les plasmides pXL2320, ou pXL2340 ont été introduits dans la souche de E_. coli XL1-Blue et l'expression des gènes a été induite lorsque l'ARN polymérase du phage T7 était produite après induction du gène, codant pour l'ARN polymérase du phage T7, cloné sur le phage helper M13/T7 (Studier et al., 1990, Invitrogen). Les extraits cellulaires ont été analysés par électrophorèse sur gel PAGE-SDS coloré au bleu de Coomasie comme cela a déjà été décrit (Denèfle et al., 1987). Sur la figure 3 est représentée la production d'une protéine de i) 79 000 de poids moléculaire, lorsque le gène grlB est induit dans la souche E. coli XL1- Blue, pXL2320; et ii) 90 000 de poids moléculaire, lorsque le gène grIA est induit dans la souche E. coli XL1-Blue, pXL2340. Les poids moléculaires mesurés sont en accord avec les poids moléculaires déduits de la séquence. Exemple 3.3- Complémentation des mutants narCts et parEts de Salmonella typDhimurium par les gènes grIA et grlB de StaDhvlococcus aureus. Cet exemple décrit la complémentation hétérologue des mutants de S. typhimurium parCts et parEts par les gènes de S. aureus gmA et grB. Les plasmides pXL2320, pXL2340, pXL2439 ou le vecteur pRSETB ont été introduits dans les souches de S. typhimurium SE7784 (parC281(Ts) zge2393::TnlO leu485) ou SE8041 (parE206(Ts) zge-2393::TnlO leu485) (Luttinger et al., 1991). Aucun plasmide complémente le phénotype thermosensible, par contre lorsque les plasmides pXL2340 et pXL2439 sont introduits simultanément dans la souche SE7784 ou dans la souche SE8041 le phénotype thermosensible des deux souches est complémenté. Par conséquent la coexpression des gènes grMA et grIB de S. aureus permet la complémentation du phénotype ParC Ts ou ParE Ts des mutants de S. typhimurium. Exemple 4- L'ADN topoisomérase IV de S. aureus est la cible primaire des fluoroquinolones. Cet exemple décrit la présence d'une mutation ponctuelle Ser-80 dans la sous- unité GrlA avec toutes les souches cliniques analysées de S. aureus résistantes aux fluoroquinolones alors qu'une mutation dans la région QRDR (équivalente à la région Ser-80 de GrIA) dans la sous-unité GyrA n'existe pas avec les souches cliniques de S. aureus faiblement résistantes aux fluoroquinolones. De ce fait la sous-unité GrlA est montrée être la cible primaire des fluoroquinolones chez S. aureus. L'ADN génomique de huit souches cliniques de S. aureus et d'une souche de laboratoire a été préparé et utilisé pour amplifier à 42 C par PCR: i) les 500 premières paires de bases de gyrA en utilisant les oligonucléotides sens 5'- GGCGGATCCCATATGGCTGAATTACCTCA-3' et antisens 5'-GGCGGAAT TCGACGGCTCTCTTTCATTAC-3', ii) et les 800 premières paires de bases de grIA en utilisant les oligonucléotides sens 5'- GGCCGGATCCCATATGAG TGAAATAATTCAAGATT-3' et antisens -5'- GGCCGAATTCTAATAATTAA CTGTTTACGTCC-3'. Chaque fragment amplifié a été cloné dans le phage M13mpl8 et la séquence des 300 premières paires de bases de chacun des gènes a été lue sur 2 clones. La séquence gyrA est identique à celle publiée par Magerrison et celle de grlA à celle décrite en SEQ ID N 1, à l'exception des mutations présentées sur le tableau 4. Les mutations dans gyrA existent avec les souches fortement résistantes aux fluoroquinolones (SA4, SAS, SA6, SA35, SA42R et SA47; CMI pour la ciprofloxacine > 16 mg/l); ces mutations sont un changement de base qui conduit aux changements des acides aminés Ser-84 ou Ser-85 ou Glu-88. Une mutation dans griA existe avec toutes les souches résistantes aux fluoroquinolones et correspond au changement du résidu Ser-80 en Phe ou Tyr. Souche CMI mg/I Mutation dans gyrA Mutation dans grlA Ciprofloxacine Base Codon Base Codon SA42* 0.5 non non non non SA3** 4 non non 2270 80Ser->Phe C->T SA2* 16 non non 2270 80Ser->Tyr C->A SA47* 16 2533 84Ser->Leu 2270 80Ser-> Tyr C->T* C->A SA4** 32 2544 88Glu->Lys 2270 80Ser-> Phe G->A C->T SA42R* >128 2533 84Ser->Leu 2270 80Ser-> Tyr C->T* C->A * déjà publié par Sreedharan et al. (1990) ** Souche procurées auprès dlopitaux Publics Français. Exemple 5- Activité ADN topoisomérase IV de la protéine GrIAB de S. aureus. Cet exemple illustre comment un extrait acellulaire contenant la protéine GrIAB peut être préparé et comment l'activité enzymatique de la protéine GrlAB présente dans cet extrait peut être détectée et mesurée. Un extrait acellulaire de la souche E. coli XLl-blue pXL2340 exprimant la protéine GrlA est préparé par exemple de la façon suivante: la souche E. coli XLl-blue pXL2340 est cultivée comme suit: 250 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline a 50 mg/l sont inoculés au 1/lOOième avec une culture de E. coli XLI-blue pXL2340, et incubés à 30 C; lorsque la densité optique à 600 nm est de 0.3, sont ajoutés 1 mM IPTG; après 30 min d'incubation à 37 C, la souche est infectée par le phage helper M13/T7 avec une multiplicité d'infection de 5 pfu par cellule pendant 4 heures. Après centrifugation (5000 x g; 20 min), les cellules obtenues à partir de 1,5 litre de culture sont resuspendues dans 20 ml de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 contenant 10 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1 mM DTT, 0. 12% Brij 58 et 0.75 mg/ml de lysozyme. Après 30 min à 4 C, le mélange est centrifugé durant lh à 50 000 x g et le surnageant contenant la protéine GrlA est récupéré. Un échange de tampon est effectué sur cet échantillon en chromatographiant l'extrait à travers une colonne remplie de Sephadex G625 (Pharmacia) équilibrée et éluée avec du tampon Tris/IHCl 50 mM pH 7.5 contenant 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 100 mM NaCI et 10% de sacharose. Un extrait acellulaire contenant la protéine GrlB est préparé de façon similaire à partir de la souche E. coli XLI-blue pXL2320. Les différentes activités enzymatiques de la protéine GrlAB sont ensuite détectées en incubant dans le même mélange réactionnel des quantités égales des deux types d'extraits préparés à l'aide du procédé décrit ci dessus ou de tout autre procédé permettant de récupérer les protéines enzymatiques intracellulaires du microorganisme tout en préservant leur activité, comme par exemple les procédés mettant en oeuvre l'utilisation de presses (telles que la French Press, la X-Press), ou l'utilisation des ultra- sons. On peut détecter l'activité de relaxation (ou relâchement) ATP- dépendante de l'ADN surenroulé en procédant par exemple de la façon suivante: un mélange d'un extrait de la souche E. coli XLI-blue pXL2320 (1 pg de protéines) et d'un extrait de la souche E. coli XLl-blue pXL2340 (lIg de protéines) est incubé durant lh à 37 C dans 30gl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.7 contenant 4 mM ATP, 6 mM MgCI2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 20 mM KCI, 50 gg/ml d'albumine de sérum de boeuf et 500 ng de plasmide pBR322 surenroulé. La réaction est arrêtée par l'ajout de 7gl d'un mélange SDS à 5% et protéinase K à 2,5 mg/ml et les échantillons sont incubés pendant une seconde période de 30 min à 37 C puis analysés par électrophorèse en gel d'agarose à 1% dans du tampon Tris/borate 0.1M pH 8.3 contenant 2 mM EDTA à 6V/cm pendant 3h. La séparation des ADN relâchés et nickés (ou open circular) est effectuée en procédant à une migration électrophorétique supplémentaire de 2h après ajout de bromure d'éthidium (1 gg/ml) au tampon de migration. L'ADN est ensuite quantifié en scannant les négatifs de photos des gels (film Polaroid type 665) à l'aide d'un appareil Bioimage 50S (Millipore). La Figure 4 montre que les extraits acellulaires des souches E. coli XLlblue pXL2320 et E. coli XLl-blue pXL2340 présentent en mélange, une intense activité de relâchement de l'ADN alors que chacun des extraits est inactif lorsqu'il est incubé seul. La réaction est dépendante de l'ATP. De plus, ces deux extraits, seuls ou en mélange ne présentent pas d'activité de surenroulement de l'ADN, activité typique de la gyrase. On peut détecter l'activité de décaténation ATP-dépendante de molécules d'ADN circulaires entrelacées (caténanes) en procédant par exemple de la façon suivante: un mélange d'un extrait de la souche E. coli XLl-blue pXL2320 (2.5lig de protéines) et d'un extrait de la souche E. coli XLIblue pXL2340 (2.5 gg de protéines) est incubé durant lh à 37 C dans 401il de tampon Tris/HCI 50 mM pH 7.7 contenant 1 mM ATP, 6 mM MgC12, 200mM de glutamate, 10 mM DTT, 10 mM NaCI, 50 gg/ml d'albumine de sérum de boeuf et 800 ng d'ADN de kinetoplaste [constitué d'un réseau de molécules d'ADN enlacées (caténanes) obtenu à partir de Crithidia fasciculata; TopoGene]. La réaction est arrêtée par l'ajout de 7.l d'une solution 250 mM EDTA (incubation 5 min à 37 C), 5 jil d'un mélange SDS à 5% et protéinase K à 2,5 mg/ml (incubation 30 min à 37 C). Le mélange est ensuite analysé par électrophorèse en gel d'agarose à 1% dans du tampon Tris/borate 0.1 IM pH 8.3 contenant 2 mM EDTA à 6V/cm pendant 2h 30 min. Après coloration de l'ADN au bromure d'éthidium (lpg/ml), I'ADN est quantifié en scannant les négatifs de photos des gels (film Polaroid type 665) à l'aide d'un appareil Bioimage 50S (Millipore). En se plaçant par exemple dans les conditions décrites ci dessus, les extraits des deux souches E. coli XLl-blue pXL2320 et E. coli XLl-blue pXL2340 présentent en mélange une activité de décaténation complète de l'ADN de kinétoplaste de départ. Cette activité est mise en évidence par l'apparition d'une bande d'ADN d'une taille de 2,5 kb environ et par la disparition de la bande d'ADN caténé de très grosse taille qui pénètre très peu dans le gel au cours de la migration électrophorétique (Figure 5). La gyrase de E. coli introduite en contrôle dans cet essai ne présente pas d'activité de décaténation contrairement à l'ADN topoisomérase IV de E. coli qui décatène complètement l'ADN de kinétoplaste (Figure 5). Exemple 6- Inhibition par les fluoroquinolones de l'activité ADN topoisomérase IV de la protéine GrlAB de S. aureus. Les deux méthodes décrites dans l'exemple 4 peuvent être utilisées pour mettre en évidence des molécules agissant comme des inhibiteurs de la protéine GrlAB. Dans le test de relaxation de l'ADN surenroulé par exemple, la disparition ou la diminution de la bande d'ADN relaché lors de l'analyse du mélange réactionnel après incubation de la protéine GrlAB en présence d'une molécule ou d'un mélange de plusieurs molécules, indique que cette molécule (ou ces molécules) est inhibitrice de l'activité de relaxation de GrlAB. Toutefois, puisque les études réalisées à ce jour ont démontré que la protéine GrlAB est une topoisomérase IV, et puisqu'il est aujourd'hui établi que la fonction majeure des topoisomérases IV est la décaténation des chromosomes fils enlacés lors des étapes finale de la réplication, il parait plus judicieux de rechercher les inhibiteurs de la protéine GrlAB en utilisant un test de décaténation de l'ADN en mettant en oeuvre par exemple, le test décrit à l'exemple 5. Dans ce test, s'il est observé la disparition ou la diminution de l'intensité de la bande d'ADN décaténé lors de l'analyse du mélange réactionnel après incubation de la protéine GrlAB en présence d'une molécule ou d'un mélange de plusieurs molécules, ceci indique que cette molécule (ou ces molécules) est inhibitrice de l'activité de décaténation de la protéine GrlAB. Puisqu'il a été démontré dans la présente invention que la protéine GrlAB est la cible primaire pour les molécules de la famille des fluoroquinolones, il apparait que les fluoroquinolones doivent agir comme des inhibiteurs dans le test de décaténation décrit à l'exemple 5. En effet, lorsque la protéine GrlAB est incubée en présence de quantités croissantes d'une fluoroquinolone, par exemple la ciprofloxacine, il apparait qu'à partir d'une concentration de 5 pg/ml, la cipofloxacine inhibe totalement l'activité de décaténation de l'ADN de kinetoplaste. ABREVIATIONS ADN: acide déoxyribonucléique ARN: acide ribonucléique CMI: concentration minimale inhibitrice IPTG isopropylthio-13-D-galactoside LB: milieu Luria-Bertani PAGE gel d'électrophorèse contenant de l'acrylamide et du N, N'-methylenebisacrylamide PCR: réaction de polymérisation de chaine pfu: particule conduisant à la formation d'une plage QRDR: région de la sous-unité GyrA o sont cartographiées les mutations ponctuelles conduisant à la résistance aux fluoroquinolones SDS sodium dodecyl sulfate Tris: tris(hydroxymethyl)aminométhane REFERENCES Adachi, T., Mizuuchi, M., Robinson, E.A, Apella, E., ODea, M.H., Gellert, M., and Mizuuchi K. (1987) DNA sequence ofthe E. coli gyrB gene: application of a new sequencing strategy. NuclAcidRes 15: 771- 784. Bagdasarian, M., Lurz, R., Ruckert, B., Franklin, F.C., Bagdasarian, M.M., Frey, J., and Timmis, K. (1981) Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. 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(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4565 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Staphylococcus aureus (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: 20 30 40 50 60 GAATTCCGAC GTACGTTTGC AGGAGGCGAA ATCATTGGCA ATGAATAAAC AAAATAATTA CTTAAGGCTG CATGCAAACG TCCTCCGCTT TAGTAACCGT TACTTATTTG TTTTATTAAT 80 90 100 110 120 TTCAGATGAT TCAATACAGG TTTTAGAGGG GTTAGAAGCA GTTCGTAAAA GACCTGGTAT AAGTCTACTA AGTTATGTCC AAAATCTCCC CAATCTTCGT CAAGCATTTT CTGGACCATA 140 150 160 170 180 GTATATTGGA TCAACTGATA AACGGGGATT ACATCATCTA GTATATGAAA TTGTCGATAA CATATAACCT AGTTGACTAT TTGCCCCTAA TGTAGTAGAT CATATACTTT AACAGCTATT 200 210 220 230 240 CTCCGTCGAT GAAGTATTGA ATGGTTACGG TAACGAAATA GATGTAACAA TTAATAAAGA GAGGCAGCTA CTTCATAACT TACCAATGCC ATTGCTTTAT CTACATTGTT AATTATTTCT 250 260 270 280 290 300 TGGTAGTATT TCTATAGAAG ATAATGGACG TGGTATGCCA ACAGGTATAC ATAAATCAGG ACCATCATAA AGATATCTTC TATTACCTGC ACCATACGGT TGTCCATATG TATTTAGTCC 310 320 330 340 350 360 TAAACCGACA GTCGAAGTTA TCTTTACTGT TTTACATGCA GGAGGTAAAT TTGGACAAGG ATTTGGCTGT CAGCTTCAAT AGAAATGACA AAATGTACGT CCTCCATTTA AACCTGTTCC 370 380 390 400 410 420 TGGCTATAAA ACTTCAGGTG GTCTTCACGG CGTTGGTGCT TCAGTGGTAA ATGCATTGAG ACCGATATTT TGAAGTCCAC CAGAAGTGCC GCAACCACGA AGTCACCATT TACGTAACTC 430 440 450 460 470 480 TGAATGGCTT GAAGTTGAAA TCCATCGAGA TGGTAATATA TATCATCAAA GTTTTAAAAA ACTTACCGAA CTTCAACTTT AGGTAGCTCT ACCATTATAT ATAGTAGTTT CAAAATTTTT 490 500 510 520 530 540 CGGTGGTTCG CCATCTTCAG GTTTAGTGAA AAAAGGTAAA ACTAAGAAAA CAGGTACCAA GCCACCAAGC GGTAGAAGTC CAAATCACTT TTTTCCATTT TGATTCTTTT GTCCATGGTT 550 560 570 580 590 600 AGTAACATTT AAACCTGATG ACACAATTTT TAAAGCATCT ACATCATTTA ATTTTGATGT TCATTGTAAA TTTGGACTAC TGTGTTAAAA ATTTCGTAGA TGTAGTAAAT TAAAACTACA 610 620 630 640 650 660 TTTAAGTGAA CGACTACAAG AGTCTGCGTT CTTATTGAAA AATTTAAAAA TAACGCTTAA AAATTCACTT GCTGATGTTC TCAGACGCAA GAATAACTTT TTAAATTTTT ATTGCGAATT 670 680 690 700 710 720 TGATTTACGC AGTGGTAAAG AGCGTCAAGA GCATTACCAT TATGAAGAAG GAATCAAAGA ACTAAATGCG TCACCATTTC TCGCAGTTCT CGTAATGGTA ATACTTCTTC CTTAGTTTCT 730 740 750 760 770 780 GTTTGTTAGT TATGTCAATG AAGGAAAAGA AGTTTTGCAT GACGTGGCTA CATTTTCAGG CAAACAATCA ATACAGTTAC TTCCTTTTCT TCAAAACGTA CTGCACCGAT GTAAAAGTCC 790 800 810 820 830 840 TGAAGCAAAT GGTATAGAGG TAGACGTAGC TTTCCAATAT AATGATCAAT ATTCAGAAAG ACTTCGTTTA CCATATCTCC ATCTGCATCG AAAGGTTATA TTACTAGTTA TAAGTCTTTC 850 860 870 880 890 900 TATTTTAAGT TTTGTAAATA ATGTACGTAC TAAAGATGGT GGTACACATG AAGTTGGTTT ATAAAATTCA AAACATTTAT TACATGCATG ATTTCTACCA CCATGTGTAC TTCAACCAAA 910 920 930 940 950 960 TAAAACAGCA ATGACACGCG TATTTAATGA TTATGCACGT CGTATTAATG AACTTAAAAC ATTTTGTCGT TACTGTGCGC ATAAATTACT AATACGTGCA GCATAATTAC TTGAATTTTG 970 980 990 1000 1010 1020 AAAAGATAAA AACTTAGATG GTAATGATAT TCGTGAAGGT TTAACAGCTG TTGTGTCTGT TTTTCTATTT TTGAATCTAC CATTACTATA AGCACTTCCA AATTGTCGAC AACACAGACA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 TCGTATTCCA GAAGAATTAT TGCAATTTGA AGGACAAACG AAATCTAAAT TGGGTACTTC AGCATAAGGT CTTCTTAATA ACGTTAAACT TCCTGTTTGC TTTAGATTTA ACCCATGAAG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TGAAGCTAGA AGTGCTGTTG ATTCAGTTGT TGCAGACAAA TTGCCATTCT ATTTAGAAGA ACTTCGATCT TCACGACAAC TAAGTCAACA ACGTCTGTTT AACGGTAAGA TAAATCTTCT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 AAAAGGACAA TTGTCTAAAT CACTTGTGAA AAAAGCGATT AAAGCACAAC AAGCAAGGGA TTTTCCTGTT AACAGATTTA GTGAACACTT TTTTCGCTAA TTTCGTGTTG TTCGTTCCCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AGCTGCACGT AAAGCTCGTG AAGATGCTCG TTCAGGTAAG AAAAACAAGC GTAAAGACAC TCGACGTGCA TTTCGAGCAC TTCTACGAGC AAGTCCATTC TTTTTGTTCG CATTTCTGTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320 TTTGCTATCT GGTAAATTAA CACCTGCACA AAGTAAAAAC ACTGAAAAAA ATGAATTGTA AAACGATAGA CCATTTAATT GTGGACGTGT TTCATTTTTG TGACTTTTTT TACTTAACAT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 TTTAGTCGAA GGTGATTCTG CGGGAGGTTC AGCAAAACTT GGACGAGACC GCAAATTCCA AAATCAGCTT CCACTAAGAC GCCCTCCAAG TCGTTTTGAA CCTGCTCTGG CGTTTAAGGT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 AGCGATATTA CCATTACGTG GTAAGGTAAT TAATACAGAG AAAGCACGTC TAGAAGATAT TCGCTATAAT GGTAATGCAC CATTCCATTA ATTATGTCTC TTTCGTGCAG ATCTTCTATA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 TTTTAAAAAT GAAGAAATTA ATACAATTAT CCACACAATC GGGGCAGGCG TTGGTACTGA AAAATTTTTA CTTCTTTAAT TATGTTAATA GGTGTGTTAG CCCCGTCCGC AACCATGACT 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CTTTAAAATT GAAGATAGTA ATTATAATCG TGTAATTATT ATGACTGATG CTGATACTGA GAAATTTTAA CTTCTATCAT TAATATTAGC ACATTAATAA TACTGACTAC GACTATGACT 1570 1580 1590 1600 1610 1620 TGGTGCGCAT ATTCAAGTGC TATTGTTAAC ATTCTTCTTC AAATATATGA AACCGCTTGT ACCACGCGTA TAAGTTCACG ATAACAATTG TAAGAAGAAG TTTATATACT TTGGCGAACA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 TCAAGCAGGT CGTGTATTTA TTGCTTTACC TCCACTTTAT AAATTGGAAA AAGGTAAAGG AGTTCGTCCA GCACATAAAT AACGAAATGG AGGTGAAATA TTTAACCTTT TTCCATTTCC 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CAAAACAAAG CGAGTTGAAT ACGCTTGGAC AGACGAAGAG CTTAATAAAT TGCAAAAAGA GTTTTGTTTC GCTCAACTTA TGCGAACCTG TCTGCTTCTC GAATTATTTA ACGTTTTTCT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ACTTGGTAAA GGCTTCACGT TACAACGTTA CAAAGGTTTG GGTGAAATGA ACCCTGAACA TGAACCATTT CCGAAGTGCA ATGTTGCAAT GTTTCCAAAC CCACTTTACT TGGGACTTGT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ATTATGGGAA ACGACGATGA ACCCAGAAAC ACGAACTTTA ATTCGTGTAC AAGTTGAAGA TAATACCCTT TGCTGCTACT TGGGTCTTTG TGCTTGAAAT TAAGCACATG TTCAACTTCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TGAAGTGCGT TCATCTAAAC GTGTAACAAC ATTAATGGGT GACAAAGTAC AACCTAGACG ACTTCACGCA AGTAGATTTG CACATTGTTG TAATTACCCA CTGTTTCATG TTGGATCTGC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 TGAATGGATT GAAAAGCATG TTGAGTTTGG TATGCAAGAG GACCAAAGTA TTTTAGATAA ACTTACCTAA CTTTTCGTAC AACTCAAACC ATACGTTCTC CTGGTTTCAT AAAATCTATT 1990 2000 2010 2020 2030 2040 TTCTGAAGTA CAAGTGCTTG AAAATGATCA ATTTGATGAG GAGGAAATCT AGTGAGTGAA AAGACTTCAT GTTCACGAAC TTTTACTAGT TAAACTACTC CTCCTTTAGA TCACTCACTT 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ATAATTCAAG ATTTATCACT TGAAGATGTT TTAGGTGATC GCTTTGGAAG ATATAGTAAA TATTAAGTTC TAAATAGTGA ACTTCTACAA AATCCACTAG CGAAACCTTC TATATCATTT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 TATATTATTC AAGAGCGTGC ATTGCCAGAT GTTCGTGATG GTTTAAAACC AGTACAACGT ATATAATAAG TTCTCGCACG TAACGGTCTA CAAGCACTAC CAAATTTTGG TCATGTTGCA 2170 2180 2190 2200 2210 2220 CGTATTTTAT ACGCAATGTA TTCAAGTGGT AATACACACG ATAAAAATTT CCGTAAAAGT GCATAAAATA TGCGTTACAT AAGTTCACCA TTATGTGTGC TATTTTTAAA GGCATTTTCA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 GCGAAAACAG TCGGTGATGT TATTGGTCAA TATCATCCAC ATGGAGACTC CTCAGTGTAC CGCTTTTGTC AGCCACTACA ATAACCAGTT ATAGTAGGTG TACCTCTGAG GAGTCACATG 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GAAGCAATGG TCCGTTTAAG TCAAGACTGG AAGTTACGAC ATGTCTTAAT AGAAATGCAT CTTCGTTACC AGGCAAATTC AGTTCTGACC TTCAATGCTG TACAGAATTA TCTTTACGTA 2350 2360 2370 2380 2390 2400 GGTAATAATG GTAGTATCGA TAATGATCCG CCAGCGGCAA TGCGTTACAC TGAAGCTAAG CCATTATTAC CATCATAGCT ATTACTAGGC GGTCGCCGTT ACGCAATGTG ACTTCGATTC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TTAAGCTTAC TAGCTGAAGA GTTATTACGT GATATTAATA AAGAGACAGT TTCTTTCATT AATTCGAATG ATCGACTTCT CAATAATGCA CTATAATTAT TTCTCTGTCA AAGAAAGTAA 2470 2480 2490 2500 2510 2520 CCAAACTATG ATGATACGAC ACTCGAACCA ATGGTATTGC CATCAAGATT TCCTAACTTA GGTTTGATAC TACTATGCTG TGAGCTTGGT TACCATAACG GTAGTTCTAA AGGATTGAAT 2530 2540 2550 2560 2570 2580 CTAGTGAATG GTTCTACAGG TATATCTGCA GGTTACGCGA CAGATATACC ACCACATAAT GATCACTTAC CAAGATGTCC ATATAGACGT CCAATGCGCT GTCTATATGG TGGTGTATTA 2590 2600 2610 2620 2630 2640 TTAGCTGAAG TGATTCAAGC AACACTTAAA TATATTGATA ATCCGGATAT TACAGTCAAT AATCGACTTC ACTAAGTTCG TTGTGAATTT ATATAACTAT TAGGCCTATA ATGTCAGTTA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 CAATTAATGA AATATATTAA AGGTCCTGAT TTTCCAACTG GTGGTATTAT TCAAGGTATT GTTAATTACT TTATATAATT TCCAGGACTA AAAGGTTGAC CACCATAATA AGTTCCATAA 2710 2720 2730 2740 2750 2760 GATGGTATTA AAAAAGCTTA TGAATCAGGT AAAGGTAGAA TTATAGTTCG TTCTAAAGTT CTACCATAAT TTTTTCGAAT ACTTAGTCCA TTTCCATCTT AATATCAAGC AAGATTTCAA 2770 2780 2790 2800 2810 2820 GAAGAAGAAA 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nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Staphylococcus aureus (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: M S E I I Q DL S LE DV L G DR F G R Y S K Y I GTGAGTGAAATAATTCAAGATTTATCACTTGAAGATGTTTTAGGTGATCGCTTTGGAAGATATAGTAAATATAT T 2032 2042 2052 2062 2072 2082 2092 2102 I Q E R A L P DV RD GL K P V Q R R IL Y A M Y ATTCAAGAGCGTGCATTGCCAGATGTTCGTGATGGTTTAAAACCAGTACAACGTCGTATTTTATACGCAATGTA T 2107 2117 2127 2137 214 2157 2167 2177 S S G N T H D K N F R K S A K T V G D V I G Q Y H TCAAGTGGTAATACACACGATAAAAATTTCCGTAAAAGTGCGAAAACAGTCGGTGATGTTATTGGTCAATATCA T 2182 2192 2202 2212 2222 2232 2242 2252 P H G D S S V Y E A M V R L S Q D W K L R H V L I CCACATGGAGACTCCTCAGTGTACGAAGCAATGGTCCGTTTAAGTCAAGACTGGAAGTTACGACATGTCTTAAT A 2257 2267 2277 2287 2297 2307 2317 2327 E M H G N N G S I D N D P P A A M R Y T E A K L S GAAATGCATGGTAATAATGGTAGTATCGATAATGATCCGCCAGCGGCAATGCGTTACACTGAAGCTAAGTTAAG C 2332 2342 2352 2362 2372 2382 2392 2402 L LA E EL L R D I N K E T V S F I P N Y D D T T TTACTAGCTGAAGAGTTATTACGTGATATTAATAAAGAGACAGTTTCTTTCATTCCAAACTATGATGATACGAC A 2407 2417 2427 2437 2447 2457 2467 2477 L E P M V L P S R F P N L L V N G S T G I S A G Y CTCGAACCAATGGTATTGCCATCAAGATTTCCTAACTTACTAGTGAATGGTTCTACAGGTATATCTGCAGGTTA C 2482 2492 2502 2512 2522 2532 2542 2552 A T D I P P H N L A E V I Q A T L K Y I D N P D I GCGACAGATATACCACACATAATTTAGCTGAAGTGATTCAAGCAACACTTAAATATATTGATAATCCGGATATT 2557 2567 2577 2587 2597 2607 2617 2627 T V N Q L M K Y I K G P D F P T G G I I Q G I D G ACAGTCAATCAATTAATGAAATATATTAAAGGTCCTGATTTTCCAACTGGTGGTATTATTCAAGGTATTGATGG T 2632 2642 2652 2662 2672 2682 2692 2702 I K K A Y ES G K G R I I V R S K V E E E T L R N ATTAAAAAAGCTTATGAATCAGGTAAAGGTAGAATTATAGTTCGTTCTAAAGTTGAAGAAGAAACTTTACGCAA T 2707 2717 2727 2737 2747 2757 2767 2777 G R K Q L I I T E I P Y E V N K G S LV K R ID E GGACGTAAACAGTTAATTATTACTGAAATTCCATATGrAAGTGAACAAAGGTAGCTTAGTAAAACGTATCGATG AA 7Ovç Z6I zsi. o7 L 1 1 v Z: L1 G: LZGVLt A V A I À 3 S1I E A> 7 S ' E4 OLI >43' 1(1 N VDDJ.D &ú 3J.V'dDVVD LDVVDVdLWLVf L9DWLV D LDJ,údV'VJVD&DDO'DVD DDDSV &&V&VDJ.VC 1 S0 7 6 6 ú g86ú D L a S 3 3 S L N A L 73S W D A N L I A L I 3 È C] LL6ú L96E Lq6L L /65 LL6C L6 L16ú L06f > 3 3 EdN A S I C OON 3 > A > L I I '1 3 > N 3 Ed Z06ú Z68ú Z88ú ZLSE Z98ú ZS89 ZV8ú Zú8f C]DVVDVVLLLVdLDJDDC].]DVJ.C]VVVVWJ..V]IDC]E,9 J.VVVDI3JVCDC]J.J.JC].V1J. J.VDD9LVCLDV L L > 3 ' d A L S > > I N 9 N O L V 3 A A 3 Va L G LE8ú L18ú LO8E L6L- L8Lú LLLC L9LC LSLú N 3 > 3 N A A N I A A 3 3 3 I d AI SA H os L5 ZbvLú ZúLú 3ZZLú Z'ILE ZOLú Z69ú Z89ú 9] 3 3 > M E I1aE3>4 N A d I33 A R4 E] 9 N L. 3 A LL9ú L99ú L L9 Lv9ú Lú98 LZ9ú L19ú L09ú S, ZO3J.CDDVJ.ú VCDVJVV.]VCVD.3VVJ.'2.DVJ.úC]ViDZiVZDú D'C]VV.J. Jq]CúúZDD&ZC]VZD'kIk.C] 3 A 1 a Ja N A 3 a H 3 5 0 SCI Da>43D I a 3 A Z09ú Z65ú Z85ú ZLSú Z9SE ZSSú ZbSú Zú59 9] SV N 3 S I S LJ >1 I A H L W S 3 I A 33 3J >4>MI3N 33>I A N 3 V ONH N aI H E 0o LLúú L9úE Lgúú LbEú LúúE LEúú LIúE LOúE 3 O > I 3 V 3 3 3 > H 3 ú 3 ' VAI a L N 1 3 E>4 A ZCúú Z6.E Z8ZE ZLZ.8 Z5E bú ZZú SZ VJ.J.VDVYLú9LVL úVD D9 JDC]úVZDVVDCYYV L9VVDDV&LVLúD'C&VDD'"LLJ VCWD'q&D3dV 0 'I WA I V 3 V 0 3 3 L 3 3 A A 3 I 3 N 3 4 V O LJTC L[Zú LOSC L61 /81 LLI L919 LSIE 4 >ÀN > S S E4 I ' 3 I A > a 3 T S 3 fVi I 'I 9 3 A Zq15 gvlú Zú1E ZZIE.11ú ZGIE Z60E Z80E T H N E4 >4 3 VN a 3 3 3 >4 L. EN V A A 3 T O H N 3 IHNdM3'dNGq'33-NúEN'AA31ÈHNqI si LLOF L90ú LqOú LVOS LCOú LOCú LIOú LOO0 R S a I I EI DW I > d E Sv S I Y Av4 N 3 N ZOOú.662 Z86. ZL6Z.96Z gS6Z Zbv6Z ZE6Z S I O 3 O s N >4 A 3 A N >4 I S 3 S N A a >4 > -3 3 I LZ6Z L162 L06. L6BJ L88Z LL8Z L98G LS8Z V I E 3 9. LEO J 3 C E4 A 3 A I 9 O A > > V ZS8Z Zv8Z ZE8Z ZZ8Z.18Z Z083 Z6LZ Z8LZ 15 Z/Z Z R A Q R G I T L L K E L K K N P H R I V A A H V V AGAGCACAACGTGGAATAACTTTATTAAAAGAATTAAAGAAAAATCCACATCGTATAGTAGCTGCACATGTAGT G 4207 4217 4227 4237 4247 4257 4267 4277 T G E H SQ Y T L Y S K S N E E H G L I N D 1 H K ACAGGTGAACATAGTCAATATACATTATATTCAAAATCAAACGAAGAACATGGTTTAATTAATGATATTCATAA A 4282 4292 4302 4312 4322 4332 4342 4352 S E Q Y T N G S F I V D T D D F G E VI D M Y I S TCTGAACAATATACAAATGGCTCATTCATTGTAGATACAGATGATTTTGGTGAAGTAATAGACATGTATATTAG C 4357 4367 4377 4387 4397 4407 441? 4427 TAA 4432' (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1991 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Staphylococcus aureus (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: M N K Q N NY S D D S I Q V LE G LE AV R K R P ATGAATAAACAAAATAATTATTCAGATGATTCAA. TACAGGTTTTAGAGGGGTTAGAAGCAGTTCGTAAAAGACCT 41 51 61 71 81 91 101 111 G M Y I G S T D K R G L H H LV Y E r IV D N S V D GGTATGTATATTGGATCAACTGATAAACGGGGATTACATCATCTAGTATATGAAATTGTCGATAACTCCGTCGA T 116 126 136 146 156 166 176 186 EV L N G Y G N E I D V T I N K DG S I S I E D N GAAGTATTGAATGGTTACGGTAACGAAATAGATGTAACAATTAATAAAGATGGTAGTATTTCTATAGAAGATAA T 191 201 211 221 231 241 251 261 G R G M PT GI H K S G K PT V E VI F T V L H A GGACGTGGTATGCCAACAGGTATACATAAATCAGGTAAACCGACAGTCGAAGTTATCTTTACTGTTTTACATGC A 266 276 286 296 306 316 326 336 G G K F G Q G G Y K T S G G L H G V G A S V V N A GGAGGTAAATTTGGACAAGGTGGCTATAAAACTTCAGGTGGTCTTCACGGCGTTGGTGCTTCAGTGGTAAATGC A 341 351 361 371 381 391 401 411 L S E W L E V E I H R D G N I Y H Q S F K N G G S TTGAGTGAATGGCTTGAAGTTGAAATCCATCGAGATGGTAATATATATCATCAAAGTTTTAAAAACGGTGGTTC G 416 426 436 446 456 466 476 486 P S S G L V K K G K T K K T G T K V T E K P D D T CCATCTTCAGGTTTAGTTGAAAAAGGT AAATAAGAAAACAGGTACCAAAGTAACATTTAAAcCTGATGACACA 491 501 511 521 531 541 551 561 I F K A S T S F N F DV L SE R L Q E S A F L L K 34 2723104 ATTTTTAAAGCATCTACATCATTTAATTTTGATGTTTTAA'TGAACGACTACAAGAGTCTGCGTTCTTATTGAA A 566 576 586 596 606 616 626 636 N L K I T L N DL R S K E R Q E H Y H Y E E G I AATTTAAAAATAACGCTTAATGATTTACGCAGTGGTAXRAGACGTCAAGAGCATTACCATTATGAAGAAGGAAT C 641 651 661 671 681 691 701 711 K E F V S Y V N E G K E ' L H D V' A T F S G E A N AAAGAGTTTGTTAGTTATGTCAATGAAGGAAAAGAAGTTTTGCATGACGTGGCTACATTTTCAGGTGAAGCAAA T 716 726 736 746 756 766 776 786 G I E V D V A F Q Y N D Q Y S E S I L S F V N N V GGTATAGAGGTAGACGTAGCTTTCCAATATAATGATCAATATTCAGAAAGTATTTTAAGTTTTGTAAATAATGT A 791 801 811 821 831 841 851 861 R T K D G G T H E V G F K T A M T R V F N D Y A R CGTACTAAAGATGGTGGTACACATGAAGTTGGTTTTAAACAACTGACACGCGTATTTAATGATTATGCACGT 866 876 886 896 9C6 916 926 936 R I N E L K T K D K N L C G N C I R E G L T A V V CGTATTAATGAACTTAAAACAAAAGATAAAARCTTAAT,3TAATGATATTrGTGAAGGTTTAACAGCTGTTGTG 941 951 961 971 781 391 10--1 1011 S V RIPE E L L Q F E Q T K SK L G T S E AR TCTGTTCGTATTCCAGAAGAATTATTGCAATTTGA'.GACAJAC. RAAATCTAAATTGGGTACTTCTGAAGCTAGA 1016 1026 1036 1C46 1256 1066 1076 1086 S A V D S V V A D K L -t F Y L E E K G Q L S K S L AGTGCTGTTGATTCAGTTGTTGCAGAC.AA.T3 TTCCATTCTATTTAGAAGAAAAAGGACAATTGTCTAAATCACTT o1091 1101 1111 1121 1131 1141 1151 1161 V K K A I K A Q Q A R E A A R K A R E D A R S G K GTGAAAAAAGCGATTAAAGACAACAAGCAAGGGAAGCTGCACGTAAAGCTCGTGAAGATGCTCGTTCAGGTAAG 1166 1176 1186 1196 1-06 1216 1226 1236 K N K R K D T L L S G K LT P A Q SK N T E K N E AAAAACAAGCGTAAAGACACTTTGCTATCTGGTAAATTAACACCTGCACAAAGTAAAAACACTGAAAAAAATGA A 1241 1251 1261 1271 1281 1291 1301 1311 L Y L V E G D S A G G S A K L G R D R K F Q A I L TTGTATTTAGTCGAAGGTGATTCTGCGGGAGGTTCAGCAkIACTTGGACGAGACCGCAAATTCCAAGCGATATT A 1316 1326 1336 1346 1356 1366 1376 1386 P L R G K VI N TE K A R L E D I F K N E E I N T CCATTACGTGGTAAGGTAATTAATACAGAGAAAGCACGTCTAGAAGATATTTTTAAAAATGAAGAAATTAATAC A 1391 1401 1411 1421 1431 1441 1451 1461 I I H T I G A G V G T D F K I E D S NY N R V I I ATTATCCACACAATCGGGGCAGGCGTTGGTACTGACTTTAAAATTGAAGATAGTAATTATAATCGTGTAATTAT T 1466 1476 1486 1496 1506 1516 1526 1536 M T D A D T D G A H I Q V L L L T F F F K Y M K P ATGACTGATGCTGATACTGATGGTGCGCATATTCAAGTGCTATTGTTAACATTCTTCTTCAAATATATGAAACC G 1541 1551 1561 1571 1581 1591 1601 1611 LV Q A G R V FI A L P P L Y K LE K G K G K T K CTTGTTCAAGCAGGTCGTGTATTTATTGCTTTACCTCCACTTTATAAATTGGAAAAAGGTAAAGGCAAAACAAA G 1616 1626 1636 1646 1656 1666 1676 1686 R V E Y A W T D E E L N K L Q K E L G K G F T L Q CGAGTTGAATACGCTTGGrACAGACGAAGACTTAATAAATTGCAAAAAGAACTTGGTAAAGGCTTCACGTTACA A 1691 1701 1711 1721 1731 1741 1751 1761 R Y K G L G E M N P E Q L W E T T M N P E T R T L CGTTACAAAGGTTTGGGTGAAATGAACCCTCGCAACAATTATGGGAAACGACGATGAACCCAGAAACACGAACT TTA 1766 1776 1786 1796 1806 1816 1826 1836 I R V Q V E D E V R S S K R V T T L M G D K V Q P ATTCGTGTACAAGTTGAAGATGAAGTGCGTTCATCTAARCGTGTAACAACATTAATGGGTGACAAAGTACAACC T 1841 1851 1861 1871 1981 1891 1901 1911 R R E W I E K H V E F G M Q E D Q S I L D N S E V AGACGTGAATGGATTGAAAAGCATGTTGAGTTTGGTATGCAAGAGGACCAAAGTATTTTAGATAATTCTGAAGT A 1916 1926 1936 1946 1956 1966 1976 1986 s r, oa N N N oa[ +L 4 H LI hi o O L'i O --4 w El CD REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique codant pour une sous-unité de la topoisomérase IV de Staphylococcus aureus. 2. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: (a) tout ou partie des gènes grIA (SEQ ID N 2) ou gfib (SEQ ID N 3), (b) les séquences hybridant avec tout ou partie des gènes (a) et codant pour une sous-unité d'une topoisomérase IV et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du gène giA (SEQ ID N 2). 4. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du gène griB (SEQ ID N 3). 5. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il s'agit du gène grlA possédant une mutation conduisant à une résistance à l'égard de molécules de la famille des quinolones. 6. Séquence nucléotidique selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'il s'agit du gène grlA possédant une mutation ponctuelle en position Ser-80. 7. ADN recombinant comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Vecteur d'expression à réplication autonome et/ou intégratif caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 6. 9. Cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 6, un ADN recombinant selon la revendication 7 et/ou un vecteur d'expression selon la revendication 8. 10. Cellule selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit de préférence d'une bactérie. 11. Polypeptide résultant de l'expression d'au moins une séquence selon l'une des revendications 1 à 6. 12. Polypeptide comprenant tout ou partie du polypeptide GrlA (SEQ ID N 2), du polypeptide GrlB (SEQ ID N 3) ou d'un dérivé de ceuxci. 13. Polypeptide selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce qu'il s'agit du polypeptide GrlA (SEQ ID N 2). 14. Polypeptide selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce qu'il s'agit du polypeptide GrlB (SEQ ID N 3). 15. Procédé de production d'un polypeptide selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon la revendication 9 ou 10 et l'on récupère le polypeptide produit. 16. Topoisomérase IV isolée caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir de l'expression de tout ou partie du gène grlA (SEQ ID n 2) et de tout ou partie du gène grlB (SEQ ID n 3), ou de leurs dérivés respectifs tels que définis en b) et c) de la revendication 2. 17. Topoisomérase IV isolée selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle est issue de l'expression de tout ou partie du gène grlA (SEQ ID n 2) et de tout ou partie du gène grlB (SEQ ID n 3). 18. Topoisomérase IV isolée caractérisée en ce qu'elle possède un comportement de cible primaire à l'égard des fluoroquinolones. 19. Topoisomérase IV isolée selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il s'agit de la topoismérase IV de Staphylococcus aureus. 20.Utilisation d'une topoisomérase IV selon l'une des revendications 16 à 19 pour cribler des produits biologiquement actifs. 21. Utilisation d'une topoisomérase IV selon l'une des revendications 16 à 19 pour rechercher des produits inhibiteurs de la réaction de relaxation ATP dépendante de l'ADN. 22. Utilisation d'une topoisomérase IV selon l'une des revendications 16 à 19 pour identifier des produits inhibiteurs de la réaction de décatanation des caténanes d'ADN.