Brevet FR2732978A1 — publié le 19961018

La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale, la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique et plus particulièrement pour le traitement et/ou la prévention de pathologies liées à une hyperglycémie. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Classiquement, cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans 11 organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. La présente invention se rapporte plus particulièrement à la mise au point de nouveaux vecteurs viraux présentant notamment un intérêt particulier pour le traitement des pathologies liées aux hyperglycémies comme le diabète. Le diabète sucré est un syndrome habituellement chronique, dont le symptôme le plus caractéristique est une hyperglycémie provoquant, en l'absence d'élévation du seuil rénal pour le glucose, une glycosurie. Sa cause principale est une carence, absolue ou relative, en insuline entraînant des anomalies non seulement du métabolisme des hydrates de carbone mais aussi de ceux des protéines et des graisses. Le diabète est généralement traité par administration d'insuline, traitement qui s'avère très contraignant pour le patient. La présente invention a précisément pour objet de proposer un vecteur viral original permettant de suppléer à cette désorganisation du métabolisme du glucose dans un organisme via la restauration de manière contrôlée d'une concentration convenable in vivo en insuline. On sait que le glucose est un facteur de régulation de la transcription de gènes dans la majorité des être vivants. Il a notamment été démontré que le glucose est capable de stimuler la transcription de gènes codant pour des enzymes glycolytiques et lipogéniques dans les hépatocytes et adipocytes comme par exemple le gène de la pyruvate kinase de type L, une enzyme glycolytique tissus spécifique qui joue un rôle déterminant dans la régulation de la glycolyse et la gluconéogénèse dans le foie. L'expression de la protéine L-PK, au niveau du foie, est sous contrôle alimentaire et hormonal. Elle est induite par un régime riche en glucose et au contraire inhibée par privation et chez les diabétiques.Il a ainsi été démontré que l'expression de son gène est régulée positivement par le couple glucose/insuline et négativement par le glucagon via son second messager L'AMP cyclique (A. Kahn; J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590). Récemment, la demanderesse a caractérisé différents sites de liaisons (éléments L1 à L4) pour des facteurs de transcription et en particulier un élément de réponse au glucosefmsuline, ou encore "GIRE", dans la région amont du promoteur du gène de cette enzyme L-PK (A. Kahn et al.; J. Mol.Biol. 209, (1989), 205-219). I1 a ainsi été identifié dans le sens 3' à 5' à partir de la boîte TATA, respectivement l'élément L1, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 des hépatocytes (HNF1), l'élément L2, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 (NF1),1'élément L3, un site de liaison pour le facteur nucléaire 4 des hépatocytes (HNF 4) et l'élément M, un site de liaison pour le facteur transcrpitionnel major late (MLFT)/USF (voir figure 1). L'élément spécifique de réponse au glucose/insuline, a précisément été localisé dans le gène codant pour la L-PK, sous la forme d'un palindrome parfait entre les nucléotides -168 à -144 à partir du site cap, soit dans l'élément M (voir figure 2). Ce GIRE s'est avéré capable de conférer une réponse transcriptionnel au glucose à un promoteur minimal de L-PK constitué de la boîte TATA et de l'élément L1. De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de valoriser l'aptitude de cet élément GIRE, à répondre au glucose, dans un contexte viral pour moduler l'expression d'un protéine d'intérêt en thérapie génique. Plus précisément, la présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues. Par analogue du glucose, on entend couvrir tout composé présentant des homologies structurales avec le glucose et étant capable d'induire l'activation du signal d'expression. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente invention on peut notamment citer le fructose, le galactose, le sucrose, le lactose et tous les sucres pouvant être hydrolysés en ces substances. Au sens de la présente invention, un signal d'expression inductible au glucose couvre toute séquence signal d'expression dont l'activation, qui conditionne la transcription subséquente du gène hétérologue associé, est essentiellement induite en présence de glucose ou un de ses analogues. Plus particulièrement il s'agit d'un virus défectif recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène hétérologue est placée sous contrôle d'un signal d'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L, L-PK. Plus précisement, ce signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour L-PK. De préférence, le signal d'expression selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N"1. Selon un mode de réalisation préféré, ce signal d'expression comprend au moins tout ou partie de l'élément M de ce promoteur. L'élément M est de préférence représenté par tout ou partie de la SEQ ID N"2, d'une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, et capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute séquence obtenue par une ou plusieurs modifications et conservant l'une au moins des propriétés biologiques de la séquence d'origine et notamment sa capacité d'interagir avec son ou ses facteur(s) de liaison spécifique(s), dans le cas présent constitué par le facteur MLTF/USF. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier. Dans une variante de l'invention, l'élément M est répété sous la forme de 4 oligomères successifs dans le signal d'expression. Selon un mode préféré de l'invention, le signal d'expression comprend outre l'élément M, tout ou partie de l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L PK. I1 a en effet été monté que cet élément L3 contribue à une meilleure efficacité de l'élément M. (A. Kahn et al; Nucleic Acids Research 20, (1992), N"8 p1871). L'élément L3 est de préférence représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N"3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le signal d'expression comprend l'élément M du promoteur du gène codant pour la L-PK, fusionné en amont de l'élément L3 de ce même promoteur. I1 est alors désigné par M-L3. Plus préférentiellement, le signal d'expression selon l'invention comprend 4 oligomères successifs M-L3. Ce signal d'expression comprend en outre un promoteur dit minimal. Au sens de la présente invention, promoteur minimal désigne toute séquence promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la séquence hétérologue qui lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avère totalement dépendante de l'activation de l'élément répondant au glucose. En fait, ce promoteur minimal a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence hétérologue de manière à former avec elle une séquence nucléotidique continue. I1 est possible d'employer selon l'invention un promoteur minimal dérivant d'un promoteur conventionnel comme par exemple ceux activant la transcription de gène de type thymidine kinase, acétyle transférase chloramphénicol, ssgalactosidase ou luciférase ou notamment dérivant du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L. Ce promoteur minimal peut également dériver du CMV humain. Le cas échéant, un tel promoteur peut être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul la transcription du gène hétérologue. Selon le même principe, le promoteur minimal peut dériver du promoteur naturellement responsable de l'expression du gène hétérologue considéré. A titre de promoteur minimal susceptible d'être utilisé selon l'invention on peut plus particulièrement citer la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK. De manière générale, ce promoteur minimal est placé en amont de la séquence nucléique dont il contrôle l'expression, en substitution ou non de son promoteur naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent mais sous une forme inactivée ou rendue non fonctionnelle par différentes techniques connues de l'homme de l'art et notamment par suppression, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases. Plus préférentiellement, le signal d'expression répond en tout ou partie à la SEQ ID N"4 ou l'un de ses dérivés. En ce qui concerne la séquence d'acides nucléiques hétérologue placée sous contrôle du signal d'expression selon l'invention, elle comporte un ou plusieurs gènes thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché. Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique. I1 peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones comme l'insuline, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), etc. Selon une variante préférée de l'invention, la séquence hétérologue comporte au moins un gène codant pour l'insuline ou un variant de l'insuline. Au sens de l'invention, variant couvre notamment les différentes formes de maturation de l'insuline comme par exemple la proinsuline, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 et Groskreutz et al., J. Biol. Chem.269, (1994), 62416245). Plus préférentiellement, le gène codant pour l'insuline et présent dans un vecteur selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N05. Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus ou des rétrovirus. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour le gène d'intérêt comme par exemple celui de l'insuline. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'enoepsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovints, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBOJ. 3 (1984) 2917). Concernant les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt.Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence d'intérêt, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence d'intérêt est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRJP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150).A titre d'exemple de lignée on peut notamment citer la lignée cellulaire yr-2 qui provient de la lignée NIH-3T3 (lignée fibroblastique de souris) par transfection par pMOV-q,-, un plasmide contenant le génome du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV) dont la séquence d'encapsidation "q," est délétée (Mann et aL, Cell, (1983), 33, 153-159, ). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61, 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Dans le cas particulier de la présente invention, les rétrovirus peuvent être préparés par transfection d'un plasmide rétroviral contenant le signal d'expression selon l'invention couplé au gène codant pour la protéine d'intérêt dans une lignée cellulaire transcomplémentante qui va permettre de produire des particules virales dont le génome code pour le transgène. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif, le rétrovirus étant tout particulièrement avantageux pour exprimer de l'insuline. En plaçant, au sein d'un vecteur selon l'invention, l'expression du gène codant pour l'insuline sous contrôle d'un signal d'expression contrôlé par le glucose et en transfectant des cellules in vivo à l'aide de ce type de vecteur on induit ces cellules à produire de l'insuline sous l'effet de leur teneur physiologique en glucose. Ces cellules deviennent capables d'exprimer le transgène de l'insuline en présence d'une concentration physiologique et suffisante en glucose. Selon un mode préféré de l'invention, les cellules transfectées possèdent un système interne de détection du glucose, encore désigné par machinerie senseur de glucose, susceptible d'induire l'activation du signal d'expression. Certains types cellulaires, comme les hépatocytes et les cellules ss du pancréas en sont naturellement pourvues. I1 s'agit d'un système notamment composé d'enzymes spécifiques comme le transporteur Glut-2-glucose et la glucokinase. Pour ce qui est des cellules démunies de ce type de machinerie senseur, il est tout à fait envisageable d'y suppléer artificiellement.Dans ce cas particulier, les cellules devant être traitées sont, soit préalablement ou simultannément, à l'injection de virus selon l'invention, transfectées à l'aide de constructions génétiques commandant la synthèse du transporteur Glut-2 de l'enzyme glucokinase. L'infection des cellules telles les hépatocytes par des virus recombinants selon l'invention peut être réalisée ex vivo et/ou in vivo rendant les cellules ainsi transfectées capables de secréter de l'insuline. Les sites d'infection privilégiés dans le cadre de la présente invention sont les sites naturels de secrétion de l'insuline, comme la veine porte. La présente invention se rapporte également aux cellules de mammifères, de préférence humaines et plus préférentiellement aux hépatocytes et /ou cellules ss pancréatiques infectées par un ou plusieurs virus revendiqués. Outre leur capacité à induire in vivo l'expression de l'insuline, les vecteurs selon l'invention permettent avantageusement le blocage immédiat de cette secrétion sous l'effet du glucagon du fait de l'AMP classique. On s'affranchit de cette manière du risque d'une hypoglycémie induite par une secrétion excessive en insuline. En conséquence, les vecteurs revendiqués sont particulièrement avantageux pour contrôler in vivo via un phénomène d'induction au glucose, la production d'insuline dans une région précise de l'organisme, de préférence dans un site ou elle est normalement secrétée comme la cirulation porte. Des cellules infectées par un ou plusieurs virus revendiqués pourraient ainsi être inplantées dans le foie, la rate, le pancréas ou l'intestin. La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour le traitement notamment des troubles diabétiques dépendant de l'insuline consistant à induire la synthèse in vivo d'insuline en réponse à une teneur physiologique en glucose. Dans le cas particulier, où les cellules transfectées avec un vecteur selon l'invention ne possèderaient pas cette teneur physiologique en glucose, initiatrice de l'expression d'un gène hétérologue autre que l'insuline par exemple, on peut envisager le protocole suivant: la concentration en glucose ou en un analogue ayant la même influence sur la séquence de réponse au glucose (L4-L3), y serait ajustée de manière à induire l'expression de la protéine d'intérêt via l'activité du signal d'expression selon l'invention. I1 est clair que cette concentration est déterminée en fonction de la quantité en vecteurs injectée, de la nature du site d'infection et de l'expression recherchée en protéine.. Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies liées à une hyperglycémie. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation. Les exemples et figures, présentés ci-après à titre non limitatif de la présente invention, permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. Figure 1 Représentation schématique de l'ordure de succession des éléments L1 à M identifiés dans le promoteur du gène LPK et leurs protéines de liaison respectives. Figure 2 Représentation du palindrome de l'élément M. Figure 3 Représentation partielle du plasmide rétroviral pHSG(L4L3)4PKCAT et des clones F6 et B8. Figure 4 Détermination quantitative de l'activité CAT dans des cellules mhATEF transformées avec le clone B8, en fonction de la quantité de glucose injectée. Figure 5 Détermination quantitative de l'activité CAT dans des cellules mhATmF transformées avec le clone B8 à des temps d"induction différents. Techniques generales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR Lpolymérase-oetalyzed Çhain Eeaction, Saiki R.K. et al., Science aQ (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. chez (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur retroviral. Tous les plasmides sont construits selon des techniques de clonage d'ADN standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG(L4L3)4-PKCAT, (représentée en Fig. 3), contient la partie constructive MMLV de pHSGNeo et la séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pyruvate kinase de type L de rat (bp - 119 to + 11) en amont duquel des fragments L4L3 oligomérisés 4 fois (c.a.d le GIRE et le site de liaison HNF4 contigu) sont ligaturés. Le fragment ML3, correspondant au fragment délimité entre les pb -172 â- 123, en amont du site d'initiation de la transcription L=PK a été obtenu par PCR. La séquence signal polyA utilisée, est celle présente dans le LTR de l'extrémité 3' du MMLV. Le plasmide pHSGNeo (Guild et al. J.Virol. 1988, 62, 37953801), un plasmide rétroviral dérivé du MMLV, la lignée psi-CRIP, une lignée cellulaire complémentaire amphotropique qui apporte en trans les protéines structurales de MMLV, ont été procurés par le Dr. A. Weber (Institut Cochin de Génétique Moléculaire, Paris); le plasmide pRSVNeo, dans lequel le gène aminoglycosidephosphotransférase est sous contrôle du promoteur du LTR du RSV, est utilisé pour la cotransfection. EXEMPLE 2 Culture cellulaire et transfection. La lignée cellulaire mhAllllF, est issue d'une tumeur du foie chez une souris transgénique exprimant les gènes précoces SV40 sous contrôle du promoteur antithrombine ffi spécifique du foie, (ATE-SV40) (Kahn A. et al. Exp; Cell. Res; 200, 175-185). Ces oellules sont cultivées dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT. MIX. (1:1 voVvol) avec du glutamax-1 ou DMEM/HamF12 (1:1 voUvol) (Gibco BRL) avec ou sans D+glucose (Sigma), complémenté avec 1 FM de dexamethasone, 1 M triodothyronine, 20nM d'insuline humaine, 5% (vol/vol) de SVF. Les cellules NIH3T3 et psi-CRIP sont cultivées dans : DMEM (5.5mM de glucose, 1.0mM pyruvate de sodium) complémentée avec 10 % (voVvol) de sérum de veau nouveauné.Tous les milieux sont additionnés d'ampicilline, de streptomycine et de glutamine et les cultures sont incubées à 37"C avec 5 % (vol/vol) C02. Les cellules psi-CRIP sont cotransfectées avec les plasmides pHSG (L3L4)4- PKCAT et pRSV Neo (le rapport molaire des deux plamisdes étant de 10:1) par la méthode liposome cationique (DOTAP, Boeringer Mannheim) et sélectionnées en présence de G418 (800Fg/ml). Les clones résistants à G418 sont séparés pour le test de production des rétrovirus. EXEMPLE 3 Preparation de l'ARN viral et PCR-RT en une etape. Les clones cellulaires résistants à G418 sont ensemencés dans des puits de 90 mm et cultivés jusqu'à 100 % de confluence. Le surnageant de la culture oellulaire est filtré sur une membrane possédant des pores de 0,22 Clam, incubé avec de la DNase I (10RgSml) à 370C pendant 30 min puis centrifugé à 65000 rpm pendant 20 min à 40C. L'ARN rétroviral est extrait et purifié de culots de précipitation par la protéinase K et un mélange phénoUchloroforme puis co-précipité avec de l'ARNt. L'échantillon est dissous dans du pyrocarbonate de diéthyle traité avec de l'eau et contenant 1 mM de dithiothreitol (DTT), 40 U de RNAsin/100 m, puis soumis à une transcriptase réverse et à une PCR en une seule étape. Les deux sondes utilisées pour l'amplification sont: - 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3', correspondant à la région Gag de MMLV (pb 1524 à 1544); - 5' TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3', correspondant à la région codante du gène CAT (pb 35 to 15 en considérant le site d'initiation de la traduction). La transcription inverse à partir de la sonde PCR antisens est catalysée par la transcriptase inverse 8U AMV (Promega) pendant 1 heure à 42 C et la PCR suivante avec l'ADN polymérase Taq25U est réalisée en 35 à 40 cycles. Le fragment amplifié attendu est long de 440 pb et contient une partie du gène gag, 4 motifs répétés L3L4, le promoteur -119 L-PK et les 69 premières pb du gène CAT. Si nécessaire, les fragments RT-PCR sont clonés et séquencés. EXEMPLE 4 Production de retrovinis recombinants. Les vecteurs rétroviraux pHSG(L4L3)4-119PKCAT et pRSVNeo sont utilisés pour co-transfecter des lignées cellulaires psi-CRIP. 70 clones résistants à G418 sont analysés. 8 clones positifs en RT-PCR témoignent d'une capacité à produire des rétrovirus recombinants infectueux, determinée par PCR spécifique du fragment attendu de l'ADN génomique des cellules NIH3T3. ll a été mis en évidence la production de rétrovirus à un titre significatif chez deux clones. - Le clone F6 (5.104) rétrovirus infectueux, produit un rétrovirus avec la région complète de la séquence signal (4 répétitions des fragments L4L3 entier (voir figure 3)) et - le clone B8 (2.105) avec une séquence signal partiellement délété (un seul motif L4L3 entier et une petite partie de la cassette L3 d'un second motif (voir figure 3)). Les titres en rétrovirus ont été estimés par PCR-RT semiquantitative en utilisant différentes délétions en pHSG(LAL3)4199PKCAT comme standards. EXEMPLE 5 Infection par un rétrovirus recombinant. estimation du titre en retrovirus et dosage de la protéine CAT. Les clones positifs sont utilisés pour infecter les cellules NIH3T3 afin d'estimer les capacités infectueuses des rétrovirus produits. 1 ml de surnageant de culture cellulaire à 100 % de confluence est utilisé pour infecter des cellules NIH3T3 en croissance logarithmique avec 8 > g/ml de polybrène. Après 3 heures d'incubation, le polybrène est dilué à 2 > g/ml avec du milieu et la culture est poursuivie 48 heures. L'ADN génomique des cellules NIH3T3 infectées est extrait et utilisé pour une amplification PCR en employant les sondes décrites en exemple 3. La détection du fragment amplifié spécifique prouve l'intégration des séquences rétrovirales dans le génome des cellules infectées. Le titre en est estimé en comparant les intensités des bandes d'ADN amplifiées issu de l'ADN génomique des cellules infectées avec celles issues de différentes dilutions du rétrovirus (102 à 106 molécules). Les clones qui produisent des rétrovirus infectueux sont ccultivés avec des cellules mhATIIIF selon le protocole suivant: On place à l'intérieur d'un puit de 90 mm, un puit de 60 mm dont la base à été retirée et les parois enduites avec de l'huile de silicone, de manière à le diviser en deux parties. On y introduit les cellules mhATIIIF et les cellules produisant le rétrovirus respectivement au centre et en périphérie, et en prenant soin de ne pas mélanger les deux types de cellules. Lorsque les cellules sont bien fixées au puits après 6 heures d'incubation, le petit puit est retiré. Le milieu est changé pour une nouvelle incubation de 16 heures, le polybrène est ensuite ajouté (8 g) et les cellules sont cultivées pendant 48 heures. L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par scintillation. EXEMPLE 6 Induction par le glucose a des doses et temps différents de l'expression de la chimère. La lignée cellulaire mhAllllfi assimilable aux hépatocytes chez le rat, conserve sa capacité à répondre au glucose par activation transcriptionnelle du gène L-PK et est donc appropriée pour tester la réponse du transgène CAT, transféré par le vecteur rétroviral et en conséquence l'activité du L-PK GIRE dans un environnement rétroviral. Pour accroître l'efficacité de la transfection, les cellules mhATEF sont cultivées deux fois avec des cellules produisant les rétrovirus, ce qui conduit à un taux d'infection satisfaisant avec le clone B8. Comme le montrent les figures 4 et 5, l'expression du transgène L-PK/CAT dans les cellules infectées mhATmF est bien induite par le glucose avec la moitié de l'induction maximale obtenue pour 3-4 mM de glucose et l'induction maximale pour 8mM de glucose. Pour des concentrations supérieures en glucose, l'activité CAT demeure relativement stable. Les cellules mhATIIIF sont cultivées dans un milieu contenant 17 mM de glucose, l'induction du gène est observée à partir de la 8ème heure d'incubation, l'induction à moitié avant la 24ème heure et l'induction maximale à la 48ème heure. LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSERM (B) RUE: 101, Rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75654 PARIS Cedex 13 (ii) TITRE DE L' INVENTION : VECTEUR VIRAL RECOMBINANT, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET CELLULES TRANSFORMEES CORRESPONDANTES. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:5 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 194 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: GATCCAGCAGCATCGGCGCACGGGGCACTCCCCTGGTTCCTGGACTCTCGCCCCCAG TGTACAAGGCTTCCGTTGGCAAGAGAGATGCTAGCTGGTTATACTTTAACCAGGACT CATCTCATCTGAGCCAGGCCCCATCCCACTGACAAAGGCGCAGTATAAACCAGACCC ACAGACACAGCAGGTAAGCAACG 3) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GCGCACGGGGCACTCCCGTGGTTC (4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 11 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS:NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CTGGACTCTGGCCCCCAGT (5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:129 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GGCTTCCGTTGGCAAGAGAGATGCTAGCTGGTTATACTTTAACCAGGACTCATCTCA TCTGAGCCAGGCCCATCCCACTGACAAAGGCCCAGTATAAAGCAGACCCACAGACAC AGCAGGTAAGCAACG (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 422 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGG ACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTC TCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAG GACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTG GCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCC CTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCAGCCCCCCACCCGCCGCC TCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGC REVENDICATIONS 1. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues. 2. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L (L-PK). 3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour la GPK. 4. Virus selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend tout ou partie de la séquence représentée en SEQ ID N"1. 5. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend au moins l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK. 6. Virus selon la revendication 5 en ce qu'il s'agit de l'élément L4 représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N"2, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF. 7. Virus selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que l'élément M est répété sous la forme de 4 oligomères consécutifs dans le signal d'expression. 8. Virus selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-PK. 9. Virus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'élément L3 est représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N"3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4. 10. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L PK fusionné en amont de l'élément L3 de ce même promoteur, L4-L3. 11. Virus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend 4 oligomères, successifs L4L3. 12. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression comprend en outre un promoteur minimal. 13. Virus selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il s'agit de préférence de la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK. 14. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression est représenté par la SEQ ID N"4 ou l'un de ses dérivés. 15. Virus selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible. 16. Virus selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus. 17. Virus selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2. 18. Virus selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus. 19. Virus selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus de la famille MoMuLV. 20.Virus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène hétérologue code pour l'insuline ou un de ses variants. 21. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 20 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies liées à une hyperglycémie. 22. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 19. 23. Composition pharmaceutique selon la revendication 22 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable. 24. Composition pharmaceutique selon la revendication 22 ou 23 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs. 25. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 19. 26. Cellule selon la revendication 25 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine. 27. Cellule selon la revendication 26 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un hépatocyte ou d'une cellule (3 pancréatique.