Brevet FR2714621A1 — publié le 19950707

La présente invention concerne un procédé de préparation de liposomes sans utilisation de solvant organique. Les liposomes comprennent habituellement un tensioactif lipidique ainsi que du cholestérol et/ou un/des produit(s) actif(s) encapsulé(s) . Le cholestérol (plus généralement un stérol) se lie avec le phospholipide pour améliorer les propriétés élastiques et d'imperméabilité de la membrane lipidique. Si le cholestérol ou le produit actif à encapsuler sont mélangés directement avec le lipide et le solvant aqueux, le mélange reste inhomogène. Par exemple, on peut observer que le cholestérol reste après plusieurs jours sous forme de petits cristaux qui ne se dissolvent pas dans la préparation même par adjonction d'un grand excès d'eau. Afin de pallier à ce problème on passe par un procédé dit "d'atomisation" (voir EP-A-87 993) qui comprend le mélange des différents constituants dans un solvant organique (généralement chloré tel que le chloroforme ou le dichlorométhane, le méthanol est aussi utilisé) avant leur utilisation en milieu aqueux. L'évaporation de ce solvant produit une poudre qui est ensuite utilisée directement dans le procédé de préparation des liposomes (voir par exemple EP-A-O 107 559). L'inconvénient de ce procédé est que le passage par l'atomisation peut laisser des traces (petites mais impossible à faire disparaître) de solvant dans la préparation finale. Compte tenu des effets nuisibles sur la santé de telles traces il est indispensable d'arriver à préparer des liposomes sans utiliser de solvant organique. Des procédés semblables sont utilisés pour incorporer dans des liposomes des protéines membranaires, c'est-à-dire des protéines solubles dans les membranes mais difficilement solubles dans liteau. La présente invention vise à fournir un procédé de préparation de liposomes permettant de se dispenser de l'étape d'atomisation. L'originalité du procédé repose sur l'utilisation d'un co-tensioactif bien choisi qui permet de solubiliser le cholestérol ou le produit actif à encapsuler sans utiliser un solvant organique. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de préparation de liposomes comprenant 1) le mélange d'un solvant aqueux, d'un tensioactif comprenant une tête hydrophile et une chaîne hydrocarbonée en C2 à C16, d'un stérol et/ou une protéine membranaire et/ou d'un produit à encapsuler de façon à obtenir une dissolution du stérol et/ou du produit à encapsuler; 2) le mélange de la composition ainsi obtenue avec un tensioactif lipidique de façon à former une phase cristal liquide lamellaire homogène ou une suspension de phase cristal liquide dans de l'eau, et 3) la transformation de la phase cristal liquide ou de la suspens ion de phase cristal liquide en liposomes. Il est à noter que dans certains cas la transformation de la phase cristal liquide en liposomes se produit spontanément. La taille des liposomes spontanés est typiquement de 100 à 500 nm plus généralement de 50 à 5000 On décrira maintenant de façon plus détaillée la présente invention. Le tensioactif utilisé au premier stade comprend une chaîne carbonée en C2 à C16 ramifiée ou non et de préférence en C6 à C14. La tête hydrophile est généralement un alcool ou un alcool éthoxylé mais peut être aussi un acide carboxylique ou un sel d'acide gras, un ammonium quaternaire, un sulfonate ou un sulfate ou tout autre groupement ionique ou non ionique polaire. Dans le premier stade, le solvant aqueux, le tensioactif et le cholestérol et/ou une protéine membranaire et/ou le produit à encapsuler sont mélangés en proportions adéquates. Généralement, le tensioactif est utilisé en une proportion de 1 à 50 % en poids, de préférence de 5 à 25 % et le cholestérol en une proportion de O % à 25 % en poids. Après agitation, généralement le mélange est laissé 1 à 2 heures au repos. On peut dans certains cas solubiliser le cholestérol dans ce mélange avec ou sans chauffage (40 à 100" Celsius) et agitation. Cette solubilisation peut durer de quelques heures à quelques jours. il est possible de solubiliser aussi dans certains cas d'abord le cholestérol dans le tensioactif lorsqu'il est liquide (alcool, alcool éthoxylé, etc...) puis d'ajouter le solvant aqueux. Dans le deuxième stade, le tensioactif lipidique est ajouté à la composition obtenue au premier stade en proportion nécessaire pour la formation d'une phase cristal liquide ou d'une suspension de phase cristal liquide dans l'eau. Typiquement on ajoute de 1 à 50 %, de préférence de 5 à 25 % en poids de tensioactif lipidique. Le tensioactif lipidique est choisi parmi ceux classiquement utilisés pour la fabrication des liposomes et est généralement un phospholipide. Généralement le mélange est agité doucement pendant 5 à 48 heures. Si nécessaire on peut le porter à une température plus élevée de l'ordre de 60-80 Celsius afin d'accélérer le processus de dissolution. Puis le mélange est ramené à température ambiante. Dans certains cas, on peut ajouter le produit à encapsuler à ce moment, juste avant d'ajouter le tensioactif lipidique. On obtient ainsi une phase cristal liquide lamellaire homogène ou une suspens ion de phase cristal liquide dans un excès d'eau. L'ensemble du cholestérol et/ou du produit actif à encapsuler ont été solubilisés. On peut alors utiliser cette pâte pour préparer des liposomes selon une méthode classique (ultrasonication, extrusion) ou selon le procédé décrit dans FR-A 2 689 418. Comme indiqué précédemment, dans certains cas, on obtient la formation de sphérulites spontanées sans le besoin d'étapes supplémentaires. Ces sphérulites peuvent être facilement caractérisées par microscopie optique à contraste de phase ou ordinaire lorsque leur taille est suffisamment importante et/ou par cryofracture et microscopie électronique. Lorsque le dosage conduit à la formation de sphérulites spontanées, la crème obtenue après le second stade peut être diluée directement dans une solution aqueuse et les liposomes initialement empilés de façon compacte se séparent et restent en suspension diluée. Lorsqu'un produit actif a été incorporé lors de la première étape, celui-ci se retrouve à l'intérieur des liposomes. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 1,5 g de pentaoxyethylene lauryl éther (C12E5) de la société NIKKOL est dissous dans 7g d'eau. On ajoute 0,14 g de cholestérol (MERCK). On mélange et l'on peut clairement voir avec les yeux et sous microscope optique les cristaux de cholestérol non dissous. On porte le mélange à 80 pendant 12 heures afin d'obtenir une complète dissolution du cholestérol dans le mélange eau/C12E5. On peut éventuellement agiter de temps en temps le mélange ou de façon permanente, le temps de dissolution du cholestérol est alors réduit. Le mélange homogène obtenu est ramené à température ambiante. On ajoute alors 1,35 g de lécithine de soja (SIGMA) puis on mélange et après 12 h d'attente on obtient une phase cristal liquide lamellaire homogène. On peut vérifier soit par microscopie optique après dilution soit par cryofracture et microscopie électronique sur la crème pure que le mélange est constitué de liposomes concentrés de rayon d'environ 200 à 500 nm. On peut afin d'améliorer l'homogénéité en taille, traiter directement le mélange obtenu (avant dilution) selon le procédé décrit dans FR-A-2 689 418. EXEMPLE 2 On opère comme à l'exemple précédent en suivant le même ordre mais avec les proportions suivantes: 2,5 g de C12E5 2,1 g de lécithine 0,4 g de cholestérol 5 g d'eau. On obtient spontanément des liposomes à l'issue du deuxième stade. EXEMPLE 3 On opère comme à l'exemple 1 mais avec les proportions suivantes 0,5 g de C12E5 2,5 g de lécithine de soja 0,25 g de cholestérol 6,75 g d'eau. Il est cependant nécessaire d'attendre au moins 24 h à 60 pour obtenir un mélange homogène d'eau, de C12E5 et de cholestérol. On obtient spontanément des liposomes à l'issue du deuxième stade. EXEMPLE 4 On opère comme à l'exemple 1, mais on remplace le C12E5 de la société NIKKOL par du LAUROPAL de la société WITCO (constitué principalement de C12E5) et en utilisant les proportions suivantes 1,1 g de LAUROPAL 0205 1,9 g de lécithine de soja 0,2 g de cholestérol 6,8 g d'eau ou 0,4 g de LAUROPAL 0205 2,6 g de lécithine de soja 0,25 g de cholestérol 6,8 g d'eau. EXEMPLE 5 On opère comme à l'exemple 1 mais en utilisant un autre tensioactif non-ionique : LAUROPAL 4 de la société WITCO (constitué principalement de C12E4) et les proportions suivantes 1,5 g de LAUROPAL 4 2,5 g de lécithine de soja 0,25 g de cholestérol 6 g d'eau ou 0,7 g de LAUROPAL 4 3,3 g de lécithine de soja 0,33 g de cholestérol 6 g d'eau. EXEMPLE 6 On opère comme à l'exemple 1 en utilisant un autre tensioactif non-ionique : REMCOPAL 121 de la société CECA (constitué principalement de C12E3) et les proportions suivantes 0,7 g de REMCOPAL 121 3 g de lécithine de soja 0,33 g de cholestérol 6 g d'eau ou 0,5 g de REMCOPAL 121 3 g de lécithine de soja 0,35 g de cholestérol 6 g d'eau. EXEMPLE 7 On opère comme à l'exemple 1 en utilisant 1 g d'oléate de potassium (Aldrich) 3 g de lécithine de soja 0,3 g de cholestérol 6 g d'eau ou 0,5 g d'oléate de potassium 3,5 g de lécithine de soja 0,35 g de cholestérol 6 g d'eau. EXEMPLE 8 On incorpore dans l'eau de préparation de l'exemple 4 (deuxième composition) une concentration de 10-3 molaire de calcéine. On peut après préparation vérifier que la sonde fluorescente (calcéine) a bien été incorporée en mesurant la cinétique de déclin de fluorescence par extinction avec du cobalt. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de liposomes comprenant 1) le mélange d'un solvant aqueux, d'un tensioactif comprenant une tête hydrophile et une chaîne hydrocarbonée en C2 à C16, d'un stérol et/ou une protéine membranaire et/ou d'un produit à encapsuler de façon à obtenir une dissolution du stérol et/ou du produit à encapsuler; 2) le mélange de la composition ainsi obtenue avec un tensioactif lipidique de façon à former une phase cristal liquide lamellaire homogène ou une suspension de phase cristal liquide dans de l'eau, et 3) la transformation de la phase cristal liquide ou de la suspension de phase cristal liquide en liposomes. 2. Procédé de préparation de liposomes selon la revendication, caractérisé en ce que le tensioactif utilisé au premier stade a une chaîne hydrocarbonée en C6 à C14. 3. Procédé de préparation de liposomes selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au premier stade on utilise un mélange comprenant 1 à 50 % en poids de tensioactif et O à 25 % en poids de cholestérol. 4. Procédé de préparation de liposomes selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'au premier stade on utilise un mélange comprenant 5 à 25 % en poids de tensioactif. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au deuxième stade on ajoute 1 à 50 % en poids de tensioactif lipidique. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'au deuxième stade on ajoute 5 à 25 % en poids de tensioactif lipidique.