Brevet FR2710655A1 — publié le 19950407

La présente invention concerne un procédé pour effectuer un test biologique destiné à identifier et à doser des gènes, des protéines et autres molécules. De nombreux tests pratiqués en biologie clinique ou en biologie moléculaire (recherche et industrie) font intervenir la phosphatase et ses substrats pour identifier et doser des substances ayant un intérêt biologique comme des métabolites, des hormones. La phosphatase est aussi largement utilisée pour détecter des gènes ou des protéines d'organismes pathogènes pour l'homme ou, autre exemple, pour détecter les anomalies génétiques constitutionnelles ou acquises notamment par des techniques de séquençage non radioactif. Les substrats de la phosphatase sont soit colorigéniques (comme le bromo-chloro-indoyl-phosphate en présence de nitrobleu de tétrazolium) soit chimioluminescents comme par exemple les dérivés du dioxétane (AMPPDTM: soit 3-(2'-spiroadamantane)-4méthoxy-4(3"-phophoryloxy)phényl-1,2-dioxetane, Tropix) dont l'hydrolyse enzymatique produit des photons détectés par noircissement d'un film autoradiographique ou comptés par un luminomètre. Les substrats chimioluminescents permettent un seuil de détection inférieur aux substrats colorigéniques mais présentent l'inconvénient d'un bruit de fond important diminuant d'autant leurs performances. Le but de la présente invention est d'améliorer la précision de ces tests. L'invention vise ainsi un procédé pour effectuer un test biologique dans lequel on utilise des sondes moléculaires chimioluminescentes et une solution de détection renfermant un composé à base de phosphatase pour identifier et doser des gènes, des protéines ou autres molécules. Suivant l'invention, ce procédé est caractérisé en ce qu'on ajoute à la solution de détection une cyclodextrine. Il a été constaté que l'ajout d'une cyclodextrine à la solution de détection permet d'améliorer la détection des gènes, protéines et autres molécules, notamment d'améliorer de façon sensible le rapport signal/bruit de la réaction chimioluminescente mise en oeuvre dans le test. Selon une version préférée de l'invention, ladite cyclodextrine est la 13-cyclodextrine. Selon une version avantageuse de l'invention, le composé hydrolysé par la phosphatase est un dérivé du dioxétane, tel que le 3-(2'-spiroadamantane)-4-méthoxy4(3"-phophoryloxy)phényl-1,2-dioxétane. Dans le cas de la détection d'un fragment d'ADN cible, le procédé comprend les étapes suivantes: - séparation de 1'ADN; - transfert et fixation de 1'ADN sur une membrane; - hybridation de 1'ADN au moyen d'une sonde marquée par la phosphatase; - lavage de la membrane; - incubation de la membrane dans une solution de détection renfermant un réactif chimioluminescent hydrolysé par les phosphatases et de la 13-cyclodextrine; - application de la membrane contre un film radiographique; - révélation du film radiographique; - mesures denstométriques sur le film. On donne ci-après, un exemple non limitatif, illustrant le procédé conforme à l'invention. Description d'une application de type "Southern": détection d'un fragment d'ADN du gène ras de 208 paires de bases. 1. Expérimentation L'ADN est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 2,5%. Les concentrations d'ADN sont de 800, 400, 80, 40, 8, 4, 0,8pg d'ADN. Après électrophorèse, 1'ADN est transféré sur une membrane de polyamide (type Nytran 13TM, Schleicher & Schuell) sous vide par transfert alcalin NaOH 0,25 mol/l) mais tout autre transfert est aussi efficace notamment le transfert neutre. La membrane est ensuite fixée par irradiation UV à raison de 1,2 mJoule/cm2. L'étape de préhybridation est réalisée en immergeant la membrane dans la solution suivante N-lauroylsarcosine 0,1% [p/v], sodium dodécylsulfate 0,02% [p/v] et réactif bloquant de la membrane à raison de 1% [p/v], réactif qui peut être semblable au réactif bloquant du kit DigTM de Boehringer Mannheim. La sonde permettant de détecter l'ADN correspond à de l'ADN homologue de 208 pb marqué par l'enzyme de Kleenow à l'aide de la digoxigénine-ll-dUTPTM (ou digoxigenin-3-Ométhylcarbonyl-e-aminocaproyl-[5-(3-aminoallyl)-2'déoxyuridine-5'-triphosphate], Boehringer Mannheim), mais tout autre processus de marquage peut être utilisé (marquage terminal, marquage par "nick translation" ou marquage par les dérivés de la biotine-dUTP, ou tout autre dNTP, ddNTP modifiés reconnus par un anticorps marqué à la phosphatase). Après 4 heures de préhybridation, 30 ng de sonde marquée sont ajoutés à la solution de préhybridation et l'ensemble est agité à 690C pendant 18 heures dans une étuve à hybridation. Après cette étape, la membrane est lavée deux fois 5 minutes dans une solution contenant NaCl 0,3 mol/l, citrate trisodique 30 mmol/l, sodium dodécylsulfate 0,1% [p/v], pH = 7,0 à température ambiante avant d'être immergée deux fois 15 minutes dans une solution de NaCl 15 mmol/l, citrate trisodique 1,5 mmol/l, sodium dodécylsulfate 0,1% [p/v], pH = 7,0 à 650C. La détection des fragments d'ADN cible (fragment de 208 pb) est réalisée de la manière suivante: - lavage de la membrane dans le tampon NaCl 150 mMol/l, Tris.HCl 100 mMol/l, pH = 7,5; - incubation de la membrane dans ce même tampon contenant 0;5% [p/v] d'agent bloquant (semblable au réactif bloquant du kit DigTM de Boehringer Mannheim), pendant 30 minutes; - lavage de la membrane pendant 2 minutes dans le tampon Tris.HCl 100 mMol/l, pH = 7,5. - incubation dans ce même tampon pendant 30 minutes en présence d'un anticorps anti-digoxigénine dilué au 1/5000e (Boehringer Mannheim); - double lavage de 5 minutes dans le tampon suivant: diéthanolamine 100 mMol/l, MgC12 2 mMol/l, azide de sodium 3 mMol/l, pH = 10. Puis la membrane est incubée 5 minutes dans la solution de détection: diéthanolamine 100 mMol/l, MgC12 2 mMol/l, azide de sodium 3 mMol/l, AMPPDTM 1,3 HMol/l (3 (2'-spiroadamantane)-4-méthoxy-4(3"-phophoryloxy)-phényl1,2-dioxetane, Tropix) voire n'importe quel autre réactif chimioluminescent hydrolysé par les phosphatases, ss- cyclodextrine substituée ou non à raison de 400 HMol/l pH = 10 et à 37 OC. Cependant des concentrations de 10 à 500 HMol/l s'avèrent efficaces. Puis la membrane est égouttée, placée dans un film plastique transparent (type Saran), placée contre un film autoradiographique (type XAR KodackTM) durant des périodes variables (de 5 minutes à 5 heures). Après la révélation, les autoradiographies sont évaluées à l'aide d'un densitomètre laser à transmission type Schimadzu CS 9000 avec un faisceau de 5 mm de large et 0,5 mm d'épaisseur de 550 nm de longueur d'onde de manière à obtenir des électrophorégrammes pour chaque profil de migration. Ceci permet l'intégration des valeurs d'absorbance à 550 nm en fonction de la distance de migration (70 cm en moyenne). Quatre paramètres principaux sont analysés: 1. le niveau moyen de l'absorbance sur toute la distance de migration: il correspond à la ligne de base; 2. la surface moyenne représentée par la distance (en millimètres) multipliée par la valeur de l'absorbance: cette surface moyenne représente un reflet du bruit de fond, c'est-à-dire du noircissement du film en présence et en l'absence de cyclodextrine; 3. la surface du pic spécifique qui correspond au fragment d'ADN recherché; 4. la surface totale des pics non spécifiques correspondant aux taches additionnelles détectées sur les pistes d'électrophorèse. Ces quatre paramètres, variables en fonction de l'absence ou de la présence de cyclodextrines, sont des indicateurs du bruit de fond et permettent de quantifier le rapport signal/bruit. Trois expériences indépendantes ont été réalisées. 2. Résultats La figure 1 montre un exemple de transfert en méthode de Southern en l'absence (en bas) et en présence (en haut) de 13-cyclodextrine: le bruit de fond est nettement moins important en présence de 13-cyclodextrine, de même sur d'autres électrophorégrammes, il a été noté que les taches parasites de noircissement de film sont significativement moins nombreuses en présence de cyclodextrine. Sur la figure 1, les dilutions d'ADN sont croissantes de gauche à droite et indiquées dans le paragraphe "Expérimentation" ci-dessus. Afin de quantifier le nombre et l'intensité des taches parasites ainsi que le niveau de la ligne de base, les courbes d'absorbances en fonction de la distance ont été établies avec un spectrophotomètre laser (Shimadzu CS 9000). Un électrophorégramme type est montré à la figure 2. L'électrophorégramme représenté à gauche a été obtenu en présence de ss-cyclodextrine tandis que celui représenté à droite a été obtenu en l'absence de 13-cyclodextrine. Dans une même expérience, la valeur de l'absorbance à 550 nm (en ordonnée) est représentée en présence de ss-cyclodextrine (partie de l'électro- phorégramme comprise entre 10 et 86 mm, en abscisse) et en l'absence de ss-cyclodextrine (partie de l'électrophorégramme comprise entre 94 et 170 mm, en abscisse): les flèches représentent le pic d'ADN spécifique. Trois électrophorégrammes ont été réalisés et les paramètres mesurés par l'intégrateur ont été reportés dans le tableau I ci-dessous. Les trois expériences sont notées R2E2, R3E3, R3E2 et les valeurs respectives de la ligne de base, de la surface sous la ligne de base, de la valeur du pic spécifique et de la valeur des pics non spécifiques sont représentées pour chaque expérience. TABLEAU I: Valeurs des principaux paramètres analysés par l'intégrateur BASE SURFACE PIC SPEC PIC NON SPEC R2E2 0,375 27,13 118705,8 28,2 SANS CD R3E3 1,120 78.40 75911,5 13,8 R3E2 1.200 83,80 141709,3 R2E2 0,194 14,34 172112,1 21,5 AVEC CD R3E3 0,060 4,40 155768,9 4,8 R3E2 0,078 5,73 323246,1 4,1 E01 1,93 1,89 0,69 1,31 COMPARAISONS (-/+) E02 18,67 17,82 0,49 2,88 E03 15,38 14,62 0,44 4,05 E11 0,52 0,53 1,45 0,76 COMPARAISONS (+/-) E12 0,05 0,06 2,05 0,35 E13 0,07 0,07 2,28 0,25 Trois expériences indépendantes sont à l'origine des électrophorégrammes R2E2, R3E3 et R3E2 en l'absence (SANS CD") et en présence (AVEC CD") de cyclodextrine. "BASE" représente la valeur moyenne de la ligne de base (en unité d'asborbance à 550 nm), "SURFACE" la valeur moyenne de la surface sous la ligne de base, "PIC SPEC" la valeur de la surface sous le pic recherché. Ces deux valeurs sont exprimées en unité arbitraire. "PIC NON SPEC" correspond au rapport de la valeur de la surface sommée des pics non spécifiques (ou parasites de l'électrophorégramme) à la surface totale. Cette dernière valeur est exprimée en pourcentage. "COMPARAISONS (-/+)" représente pour chaque expérience, le rapport des valeurs de la variable considérée et "COMPARAISONS (-/+)" représente le rapport inverse. La figure 3 représente l'action de la ss-cyclodextrine sur la valeur moyenne de la ligne de base. L'expression "LIGNE DE BASE" représente la valeur moyenne de la ligne de base de l'électrophorégramme exprimée en unité d'absorbance à 550 nm. Le paramètre étudié ici correspond à la valeur moyenne de la ligne de base dans les 3 expériences indépendantes notées R2E2, R3E3 et R3E2. Les valeurs exactes de ce paramètre apparaissent dans le tableau I sous la colonne "BASE" au niveau des lignes "SANS CD" (soit en l'absence de cyclodextrine) ou "AVEC CD" (en présence de cyclodextrine). Les comparaisons deux à deux de ces valeurs apparaissent dans la ligne "COMPARAISONS (-/+)" quand le rapport des valeurs "SANS CD1'/"AVEC CD" est réalisé et "COMPARAISONS (+/-)" quand il s'agit du rapport inverse. On note une augmentation importante, dans les trois expériences, de la valeur moyenne de la ligne de base en l'absence de 13-cyclodextrine: cette augmentation varie de 1,93 à 18,67 fois (valeurs E01 et E02 du tableau I). La figure 4 représente l'action de la ss- cyclodextrine sur la surface située sous la ligne de base. L'expression "SURFACE" représente la surface moyenne située sous la ligne de base. Ce paramètre évolue de manière parallèle au précédent. La surface sous la ligne de base (donnée en mm*absorbance) est le reflet du noircissement moyen du film (ou bruit de fond moyen) en présence et en l'absence de 13-cyclodextrine. Le noircissement moyen est de 1,89 fois (valeur E01, tableau I) à 17,82 fois (valeur E02, tableau I) plus important en l'absence de ss- cyclodextrine. La figure 5 représente l'action de la ss-cyclodextrine sur la surface totale des pics non spécifiques. L'expression "PIC NON SPEC" représente le rapport de la surface sommée de tous les pics parasites de l'électrophorégramme à la surface totale (exprimé en %). Les pics situés à des temps de rétention différents des pics spécifiques ont été comptés et leur surface sommée. Leur valeur apparait dans le tableau I sous la colonne "PIC NON SPEC". En comparant les valeurs trouvées pour les trois expériences, on remarque une diminution des surfaces cumulées correspondant à des pics non spécifiques d'un facteur de 1,31 (E01) à 4,05 (E02). Ces pics non spécifiques correspondent en fait à des taches de noircissement de film, taches qui se réalisent de manière spontanée en l'absence de cyclodextrine. La figure 6 représente l'action de la ss-cyclodextrine sur la surface du pic spécifique. L'expression PIC SPEC" représente la surface du pic d'ADN cible exprimée en unité arbitraire. Cette figure montre l'évolution de la surface du pic recherché en l'absence et en présence de cyclodextrine. Les valeurs correspondantes sont indiquées dans la colonne "PIC SPEC" du tableau I. En présence de cyclodextrine (AVEC CD"), la surface du pic recherché est augmentée d'une manière significative de 1,45 (E11) à 2,28 (E13) fois. Les gains totaux des rapports signal/bruit sont de 1,90 à 9,12 fois plus importants en présence de cyclodextrine. Ces gains sont mesurés pour chaque valeur par les rapports des valeurs Eîî, E12 et E13 "PIC SPEC"/"PIC NON SPEC" (tableau I). 3. Conclusions L'ajout de cyclodextrines au milieu réactionnel des détections non radioactives basées sur la chimioluminescence et utilisant les phosphatases afin de mettre en évidence ou de doser des acides nucléiques, des protéines ou toute autre molécule, permet une diminution sensible du bruit de fond et une amélioration subséquente du rapport signal/bruit. Ces effets se manifestent par un noircissement moindre des films, une diminution du nombre des taches parasites et finalement un gain de 1,90 à 9,12 fois du rapport signal sur bruit. De tels effets sont également constatés quand les dosages sont réalisés en phase liquide et les photons comptés au luminomètre. Cette amélioration est importante lors de la mise en oeuvre de techniques basées sur une détection non radioactive et notamment pour les tests biologiques basés sur la chimioluminescence. Cette technique permet l'amélioration de la fiabilité des tests biologiques basés sur la chimioluminescence, l'extraction de l'information des "biokitst et finalement la détection de résultats faiblement positifs. REVENDICATIONS 1. Procédé pour effectuer un test biologique dans lequel on utilise des sondes moléculaires chimioluminescentes et une solution de détection renfermant un composé à base de phosphatase pour identifier et doser des gènes, des protéines ou autres molécules, caractérisé en ce qu'on ajoute à la solution de détection une cyclodextrine. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que ladite cyclodextrine est la 13-cyclodextrine. 3. Procédé conforme à l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé hydrolysé par la phosphatase est un dérivé du dioxétane. 4. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que le dérivé du dioxétane est du 3-(2'-spiroadamantane)-4-méthoxy-4(3"-phophoryloxy)phényl-1,2-dioxetane. 5. Procédé conforme à l'une des revendications 1 à 4, appliqué à la détection d'un fragment d'ADN cible, caractérisé par les étapes suivantes: - séparation de l'ADN; - transfert et fixation de l'ADN sur une membrane; - hybridation de l'ADN au moyen d'une sonde marquée; - lavage de la membrane; - incubation de la membrane dans une solution de détection renfermant un réactif chimioluminescent hydrolysé par les phosphatases et de la 13-cyclodextrine; - application de la membrane contre un film radiographique; - révélation du film radiographique; - mesures densitométriques sur le film. 6. Procédé conforme à l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de détection renferme entre 10 et 500 Mol/1 de ss-cyclodextrine.