Brevet FR2719117A1 — publié le 19951027

L'invention concerne la collecte du sang, et plus particulièrement un ensemble de collecte et de séparation d'échantillons de sang et un procédé pour son utilisation. Des échantillons de sang sont prélevés habituel- lement dans des tubes vidés d'air. Une extrémité d'une aiguille ouverte aux deux extrémités est insérée dans une veine d'un patient. L'autre extrémité de l'aiguille perce ensuite un bouchon fermant l'extrémité ouverte du tube afin que le vide présent dans le tube aspire l'échantillon de sang à travers l'aiguille jusque dans le tube. En utilisant cette technique, on peut prélever plusieurs échantillons au moyen d'une seule piqûre d'aiguille à travers la peau. Avant un examen clinique, le sang collecté dans des tubes vidés d'air doit souvent être séparé en une fraction liquide constituée de plasma ou de sérum et une fraction solide constituée de cellules concentrées ou coagulées. Il est classique dans la technique d'effectuer cette séparation par centrifugation. Un problème qui apparaît souvent est que les phases solide et liquide se remélangent, après la centrifugation, lorsque le tube est manipulé, en particulier lorsqu'une séparation physique des deux phases est tentée. Il est également classique, par conséquent, dans la technique de prévoir certains moyens pour maintenir la séparation des phases solide et liquide après l'achèvement de la centrifugation. Pratiquement tous les dispositifs modernes de collecte du sang et de séparation du sérum utilisent un gel thixotrope en tant que séparateur de phases. Ces disposi- tifs reposent sur la densité du gel pour positionner celui-ci à l'interface solide-liquide. Le gel est placé initialement dans le fond du tube de façon qu'il s'élève pour atteindre l'interface. L'utilisation d'un gel thixotrope en tant que séparateur de phases est décrite dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4 050 451. Des problèmes posés par les gels thixotropes sont liés à des spécifications étroites de formulation demandées pour maintenir un comportement thixotrope et une densité corrects qui compliquent notablement la fabrication en grande quantité. De lentes variations de la formulation du gel avec le vieillissement posent des problèmes de comportement du produit et limitent sa durée de stockage. De plus, des constituants du gel sous la forme de particules de gel peuvent contaminer notablement le sérum ou le plasma et affecter l'analyse chimique effectuée ensuite ou les instru- ments d'analyse chimique. L'invention vise à éliminer ces inconvénients. Un ensemble collecteur de sang comprend un récipient, avantageusement un tube de verre ou de matière plastique, ayant une paroi de fond continue avec une paroi latérale. La paroi latérale définit une extrémité ouverte et la paroi de fond définit une extrémité fermée. Les parois de fond et latérale définissent ensemble une surface de paroi intérieure. L'extrémité ouverte peut être recouverte par un bouchon qui peut être percé, et le tube peut être vidé d'air. L'ensemble comprend un élément rapporté mécanique destiné à séparer les phases du sang dans le volume intérieur du tube. L'élément rapporté est immobilisé de façon à ne pas descendre contre la partie supérieure de la surface inté- rieure de la paroi du tube et présente un passage qui est aligné coaxialement avec une saillie s'élevant du fond du tube. Le tube peut contenir un additif utile dans la sépara- tion ou l'analyse du sang, tel qu'un anticoagulant ou un agent de coagulation, ou bien l'ensemble peut présenter une surface ayant été traitée pour favoriser la coagulation. Un autre aspect de l'invention réside dans un procédé pour prendre un échantillon de sang en utilisant l'ensemble de l'invention. Un échantillon de sang est amené au fond du tube par perforation du bouchon. Le tube est centrifugé pour séparer l'échantillon en une phase liquide constituée de sérum ou de plasma et une phase solide consti- tuée de cellules concentrées ou d'un caillot. On fait ensuite descendre l'élément rapporté à travers la phase liquide, laquelle s'élève par le passage, et l'élément se pose de façon fixe sur la saillie à l'interface entre les couches liquide et solide. L'invention procure donc un ensemble collecteur de sang comportant un séparateur mécanique, sans gel, des phases liquide et solide du sang. Le séparateur vient se bloquer fixement entre les phases et ne se déplace pas dans le cas o le tube est déplacé ou agité. Une séparation nette des phases, indépendante du niveau d'adresse du technicien, est obtenue. L'invention sera décrit plus en détail en regard des dessins annexés à titre d'exemples nullement limitatifs et sur lesquels: la figure 1 est une vue en perspective d'un ensemble collecteur de sang selon l'invention; les figures 2 à 4 sont des vues en perspective de formes de réalisation de l'élément rapporté de séparation de phases de l'invention; la figure 5 est une coupe axiale montrant la position de l'élément rapporté pendant la prise d'un échan- tillon de sang; et la figure 6 est une coupe axiale montrant l'ensemble de l'invention après la centrifugation d'un échantillon de sang. L'ensemble collecteur de sang selon l'invention peut comprendre tous récipients ayant une extrémité fermée et une extrémité ouverte. Des récipients appropriés sont, par exemple, des bocaux, des flacons, des fioles et analogues, avantageusement des tubes. L'invention sera donc décrite en termes de tube.5 En se référant à présent aux dessins, les figures 1 à 4 illustrent une forme avantageuse de réalisation d'un ensemble collecteur de sang 10 de l'invention. Sur la figure 1, l'ensemble 10 comprend un tube 12 et un bouchon 14 pouvant être perforé. Le tube 12 comporte une paroi de fond 16 et une paroi latérale 18 définissant une extrémité ouverte 20, dans laquelle le bouchon 14 peut être placé. La paroi latérale 18 présente une surface intérieure 19. La paroi de fond 16, la paroi latérale 18 et le bouchon 14 renferment un volume intérieur 22 du tube qui est avantageusement vidé d'air. L'ensemble comprend une pointe effilée 24 qui s'élève verticalement de la paroi de fond 16 à laquelle elle est reliée. La pointe préférée est pleine et réalisée d'une seule pièce avec le corps du tube, et formée pendant le moulage du tube.20 L'ensemble de l'invention comprend un élément rapporté 30 immobilisé de façon à ne pas pouvoir descendre dans le volume intérieur 22. La figure 2 illustre une forme avantageuse de l'élément rapporté 30 sous la forme d'une capsule annulaire. La capsule 30 comporte une paroi supé- rieure concave 32, une paroi inférieure convexe 34 et une paroi latérale sensiblement verticale 36. Un passage 38 ayant une paroi latérale 39 s'étend à travers la capsule, de la paroi supérieure 32 à la paroi inférieure 34, et est posi- tionné coaxialement avec la pointe effilée 24 du tube qu'il engage lorsque l'élément rapporté 30 descend pendant une centrifugation, comme décrit ci-dessous. Le degré de concavité de la paroi supérieure 32 n'est pas critique. Ainsi, bien que la figure 2 illustre l'élément rapporté avantageux ayant la forme d'une capsule peu profonde, on n'entend pas limiter l'élément rapporté à cette forme. La figure 3 montre l'élément rapporté sous la forme d'un disque 30a ayant une paroi supérieure sensiblement plate 32a, une paroi inférieure 34a, une paroi latérale 36a et une passage 38a (sur les figures 2 à 6, les éléments identiques ou sensiblement identiques aux éléments décrits précédemment portent les mêmes références numériques suivies d'une lettre). Un élément rapporté 40 ayant la forme d'un entonnoir est montré sur la figure 4 et comprend un bord supérieur sensiblement annulaire 42 définissant une extrémité ouverte 44. Un paroi latérale comporte une section sensible- ment verticale 45 et une section conique 46 aboutissant à un bord inférieur sensiblement annulaire 48 définissant une extrémité de fond ouverte 50 qui engage la pointe 24 pendant une centrifugation.15 L'élément rapporté mécanique de séparation du sang de l'invention peut être immobilisé de façon à ne pas descendre dans le tube par tous moyens appropriés. L'élément rapporté et le tube peuvent être dimensionnés pour réaliser un ajustement serré entre la surface intérieure 19 de la paroi latérale 18 du tube et les parties de paroi latérale verticales 36, 36a et 45 des formes de réalisation de l'élément rapporté des figures 2 à 4. L'ajustement serré est avantageusement suffisamment étroit pour immobiliser l'élé- ment rapporté dans la partie supérieure du tube, comme montré sur la figure 1, jusqu'à ce qu'un échantillon de sang se trouvant dans le tube ait été séparé en phases solide et liquide. L'élément rapporté peut avantageusement être immobilisé à l'aide d'une couche de gel thixotrope. Un gel avantageux est formé d'un surfactant en copolymères polydimé- thylsiloxane-polyéthylèneoxyde (PDMS-PEO) contenant environ 0,1 à 1,5 % en poids d'un agent gélifiant du type dibenzyli- dènesorbitol (DBS) et contenant optionnellement jusqu'à 50 % en poids d'eau ou d'alcool. Des agents gélifiants du type DBS sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 186 972, et les surfactants sont disponibles auprès de - 6 Union Carbide Corporation sous le nom commercial de surfac- tant "SILWETTM". Des surfactants préférés sont les "SILWETTM- L720, L722 et L7500. Une préparation des gels est décrite dans l'Exemple 1.5 L'immobilisation de l'élément rapporté peut être réalisée l'aide d'une couche de gel d'environ 1 à 5 mm d'épaisseur entre l'élément rapporté et la paroi intérieure du tube. Des gels du type PDMS- PEO-DBS coulent sous la force de cisaillement d'une centrifugation de façon à libérer l'élément rapporté immobilisé. Les figures 5 et 6 illustrent l'utilisation de l'ensemble durant la collecte d'un échantillon de sang et après une centrifugation, respectivement. Une extrémité (non représentée) d'une aiguille ouverte aux deux extrémités est insérée dans une veine d'un patient et l'autre extrémité 60 perfore le bouchon 14b. Du sang est aspiré de l'aiguille dans le tube sous l'effet de la différence de pression entre le tube vidé d'air et la veine. L'échantillon de sang 62 peut être amené au fond du tube par l'intermédiaire du passage 38b. L'échantillon peut ensuite être centrifugé pour que l'on obtienne une phase liquide formée de plasma et une phase solide formée de cellules concentrées. Lorsque l'ensem- ble est destiné à être utilisé pour séparer les cellules du plasma, un anticoagulant est avantageusement présent dans le tube. Tout anticoagulant classique, tel que de l'oxalate, de 1'EDTA, du citrate ou de l'héparine, peut être utilisé. En variante, le sang peut être amené à coaguler afin que, lors de la centrifugation, la phase fluide soit du sérum et la phase solide soit un caillot. La coagulation peut être provoquée par tous moyens appropriés, comme décrit ci- dessous, et elle est avantageusement sensiblement complète avant la centrifugation. La centrifugation peut être effectuée classique- ment à partir du repos et peut atteindre 1000 à 5000, avantageusement environ 2000 G de force centrifuge radiale, G étant la force de la gravité et i G étant égal à 9,8 m/sec2, de manière que la phase solide se sépare de la phase liquide et se concentre dans le fond du tube. Lorsque la centrifugeuse accélère, la force de cisaillement de la5 centrifugation amène le gel à couler, libérant l'élément rapporté immobilisé. L'élément rapporté descend lentement, la phase liquide séparée 64 s'écoulant par le passage jusque dans la partie du tube située au-dessus de l'élément rappor- té, et l'élément rapporté vient s'engager et s'appliquer sur la pointe. Dans la forme avantageuse de réalisation de l'invention, l'élément rapporté s'accouple avec la pointe à l'interface 66 entre la phase liquide 64 et la phase solide 68 et sépare efficacement la phase liquide située au-dessus de l'élément rapporté de la phase solide située au- dessous de l'élément rapporté. La position dans le tube, dans laquelle l'élément rapporté descendant vient s'arrêter sur la pointe, est déterminée par le diamètre du passage et le diamètre de la pointe. Pour déterminer les dimensions du passage et de la pointe qui établissent la position de l'élément rapporté à l'interface entre les phases liquide et solide, on peut utiliser des valeurs moyennes pour l'hématocrite. L'hématocrite est le rapport du volume occupé par les constituants cellulaires d'un échantillon de sang centrifugé au volume total. Pour les hommes, la moyenne de l'hématocrite est de 0,46, et elle est de 0,40 pour les femmes. Par conséquent, une prise classique d'échantillon de sang de 6 ml contient, après une centrifugation classique, environ 2,4 à 2,76 ml de cellules concentrées. L'invention englobe donc toute combinaison de diamètres du passage et de la pointe au point de contact, qui établit un volume compris dans cette plage au-dessous du point de contact pour les cellules concentrées. Plus avantageusement, on choisit un point de contact qui permet, pour une prise de 6 ml, environ 2,8 à 3, 0 ml de cellules concentrées, car une faible quantité de sérum ou de plasma au-dessous de l'élément rapporté est préférée à la présence de cellules au-dessus de l'élément rapporté, lesquelles cellules se seraient élevées à force dans le passage du fait d'un point de contact ne laissant pas un volume suffisant pour les cellules.5 Un tube collecteur de sang classique, vidé d'air, conçu pour une prise de sang de 6 ml, a une longueur de mm et un diamètre de 13 mm. Pour un tel tube, le point de contact, qui laisse 2,8 ml au-dessous de l'élément rapporté, se trouve à environ 25 mm au-dessus du fond du tube. Il est cependant évident que la position du point de contact et donc que les diamètres du passage et de la pointe dépendent de facteurs tels que les dimensions du tube et le volume de l'échantillon. Il apparait en outre que diverses combinaisons de diamètres du passage et de la pointe établissent un point de contact à la hauteur appropriée au-dessus du fond du tube. On n'entend donc pas limiter l'invention à une combinaison particulière quelconque de quantité de sang prélevée, de dimension du tube et de diamètres du passage et de la pointe, et l'homme de l'art est capable de déterminer des dimensions satisfaisantes pour ces éléments. Dans une variante de réalisation de l'invention, le tube peut être moulé de façon à comporter une saillie annulaire s'étendant depuis la surface intérieure de la paroi du tube dans le volume intérieur, saillie sur laquelle l'élément rapporté descendant peut venir reposer. La saillie peut être placée dans la position qui laisse, au-dessous de l'élément rapporté immobilisé, un volume pour les cellules concentrées, comme décrit ci-dessus. Le tube et la pointe peuvent être en verre ou avantageusement en matière plastique. Des matières plastiques convenables sont le polypropylène (PP), le téréphtalate de polyéthylène (PET) et le polystyrène (PS). Bien que le tube puisse être d'une dimension quelconque, l'invention est particulièrement bien adaptée à des tubes de collecte de sang vidés d'air. Ces tubes sont d'une forme généralement cylin- drique, de 50 à 150 umm de longueur et d'environ 10 à 20 umm de diamètre. Le bouchon peut être formé d'un élastomère quelcon- que, comme cela est bien connu dans la technique des tubes de collecte du sang, vidés d'air. De la même manière, l'élément rapporté peut être en matière plastique, avantageusement en5 PET ou plus avantageusement en PS, et il est généralement fabriqué par moulage par injection. Pour la forme de réalisation de l'invention dans laquelle l'échantillon de sang doit être séparé en sérum et en coagulum, il est avantageux, mais non essentiel, que l'ensemble de l'invention comprenne un moyen activant la coagulation. Tout additif, toute structure ou tout procédé pour activer le mécanisme de coagulation, comme cela est connu dans la technique, peut être utilisé. Des activateurs habituels qui peuvent être présents dans le tube sont de la terre de diatomées, des particules de silicates inorganiques, ou des substances biochimiques telles que l'acide ellagique et la thromboplastine. L'activateur peut être placé dans le fond du tube ou peut être fixé à la paroi du tube. L'activation de la coagulation est avantageuse- ment réalisée par traitement d'une surface qui est en contact avec l'échantillon de sang avec un plasma généré à partir d'un gaz de traitement approprié. Ainsi, la totalité ou une partie de la paroi intérieure du tube ou de la pointe peut être modifiée à l'aide d'un plasma pour activer la coagula- tion. Une liste représentative, mais non limitative, de gaz de traitement appropriés comprend l'azote, l'ammoniac, l'anhydride carbonique, l'anhydride sulfureux, l'air et l'oxygène, l'air et l'oxygène étant préférés. La surface à traiter peut être placée entre les électrodes d'un générateur classique de plasma équipé d'un manomètre, d'une purge de gaz et d'un raccordement au vide. Des électrodes appropriées peuvent être réalisées en toute matière conductrice, bien que 1 'acier inoxydable et 1 'aluminium soient préférés. La largeur et la forme des électrodes ne sont pas critiques. Tout plasma ionisant approprié peut être utilisé, par exemple un plasma généré par une décharge par effet corona ou avantageusement une décharge luminescente. Une large gamme de réglages de puissance, de radiofréquences et de durée d'exposition de la surface de la matière plastique au plasma peut être utilisée. Des gammes pour ces paramètres qui procurent des résultats avantageux sont des niveaux de puissance en courant continu ou en courant alternatif atteignant 200 watts, environ 0,1 à environ 50 mégahertz et environ 0,1 à 30 minutes. Des gammes préférées sont de 10- 50 watts, 10-20 mégahertz et 2-10 minutes, respectivement. On peut utiliser toute pression gazeuse; cependant, les pressions gazeuses sont avantageuse- ment maintenues à 5 mm de Hg ou moins afin de bénéficier des demandes de tension réduites. La température ambiante est avantageuse pour la génération du plasma. Les autres détails ne sont pas indispensables à l'homme de l'art pour comprendre complètement cet aspect de l'invention. Le traitement au plasma a pour résultat d'intro- duire des groupes fonctionnels polaires dans la surface de la matière plastique. Le groupe fonctionnel dépend du gaz de traitement utilisé pour générer le plasma. Par exemple, après le traitement au plasma, la surface peut contenir des atomes d'oxygène, d'azote ou de soufre. Ces groupes amènent la surface traitée au plasma à avoir une propriété activant la coagulation, similaire ou même quelque peu supérieure à celle du verre. L'ensemble peut contenir, suivant l'utilisation prévue, l'un quelconque de divers additifs connus comme étant utiles dans la séparation ou l'analyse du sang. EXEMPLE I Préparation d'un gel Un mélange d'un surfactant PDMS-PEO soluble dans l'eau (SILWETTM L-720"), de densité 1,04, de DBS (0,25, 0,50, et 1,0 pour cent en poids) et d'eau (0, 10, 25 et 50 pour cent en poids) dans un tube d'essai en verre, a été chauffé dans un bain de sable à 175-2000C pendant environ 1/2 heure. En refroidissant pendant environ 1 à 48 heures, les mélanges se sont gélifiés. Les gels n'ont pas coulé. D'une manière similaire, des surfactants solubles dans l'alcool, des types SILWETTM L-722 et L-7500 ont été transformés en gels avec du DBS, soit pur, soit avec jusqu'à5 50% d'isopropanol. EXEMPLE II Immobilisation et libération de l'élément rapporté dans le tube Un élément rapporté en verre, conforme à la figure 4, a été réalisé par sectionnement de l'extrémité d'une pipette de verre afin que le diamètre extérieur du sommet de l'entonnoir soit légèrement inférieur au diamètre intérieur d'un tube de verre de 13 x 100 mm. Le gel de l'Exemple I a été chauffé jusqu'à ce qu'il soit liquide et appliqué sur le bord extérieur de l'élément rapporté en verre. L'élément rapporté revêtu du gel a été monté dans le tube de verre à 23 umm au-dessous de l'extrémité supérieure du tube. L'ensemble a été refroidi à la température ambiante et le gel s'est reformé et a servi de colle pour maintenir l'élément rapporté contre la paroi intérieure du tube. Du sang entier citraté de porc a été additionné au tube et recalcifié par addition de 200 gl de CaCl2 à 0,2 M. On a laissé coaguler le sang pendant 15 minutes tandis que le tube était tourné en continu sur un mélangeur à inversion classique pour hématologie, après quoi le tube a été centrifugé pendant 10 minutes dans une centrifugeuse pour hématologie à rotor fixe. Un examen a révélé que l'entonnoir s'était libéré et était descendu à l'interface cellules- sérum. Le gel a été trouvé au fond du tube. EXEMPLE III On a prélevé un échantillon de 6 ml de sang dans un ensemble vidé d'air selon l'invention comprenant un tube en PS de 13 x 100 mm, traité avec un plasma d'oxygène et l'élément rapporté de la figure 2, immobilisé à l'aide du gel de l'Exemple I. Les diamètres du passage et de la pointe étaient tels que l'élément rapporté s'appliquait sur la pointe en un point situé à environ 25 mm au-dessus du fond du tube, et le plasma a été généré au moyen d'un système classique de diode planar, à environ 50 mtorrs et sous une puissance de 50 watts, à une radiofréquence de 13,56 MHz.5 Le tube a été mis de côté pendant un temps suffisant pour permettre à l'échantillon de coaguler, puis a été centrifugé avec une force centrifuge radiale allant de O à 1100 G. L'élément rapporté est descendu jusqu'à ce qu'il s'applique sur la pointe. Une couche claire de sérum était présente au-dessus de l'élément rapporté et était nettement décantée d'un coagulum de cellules concentrées au-dessous de l'élément rapporté. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées à l'ensemble décrit et représenté sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Ensemble collecteur de sang, caractérisé en ce qu'il comporte un récipient (12) ayant une paroi de fond (16), une paroi latérale (18) définissant une extrémité ouverte (20) et un bouchon (14) pouvant être perforé dans ladite extrémité ouverte, la paroi de fond, la paroi latérale et le bouchon renfermant un volume intérieur (22); un moyen mécanique (30) dans ledit volume intérieur, immobilisé, de façon à ne pas descendre, contre la paroi latérale pour séparer des phases liquide et solide du sang; et un moyen (24) d'engagement dans le récipient pour arrêter la descente du moyen mécanique entre lesdites phases liquide et solide. 2. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen mécanique est fixé, de façon à ne pas descendre, à ladite paroi latérale par un ajustement serré. 3. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen mécanique est fixé, de façon à ne pas descendre, à ladite paroi latérale par un gel. 4. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens pour activer la coagulation du sang dans le récipient. 5. Ensemble collecteur de sang, caractérisé en ce qu'il comporte un tube (12) ayant une paroi de fond (16), une paroi latérale (18) définissant une extrémité ouverte (20), et un bouchon (14) pouvant être perforé dans ladite extrémité ouverte, la paroi de fond, la paroi latérale et le bouchon renfermant un volume intérieur (22) vidé d'air; un élément rapporté (30) dans le tube, immobilisé de façon à ne pas descendre, contre une surface intérieure de la paroi latérale et traversé par un passage (38); et une pointe effilée (14) s'élevant de la paroi de fond et alignée axialement avec le passage pour engager une paroi(39) de ce passage. 6. Ensemble selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un anticoagulant dans le tube. 7. Ensemble selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens situés dans le tube pour activer la coagulation du sang dans le tube. 8. Ensemble selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdits moyens comprennent une surface traitée au plasma. 9. Procédé de préparation d'un échantillon de sang pour une analyse, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire un échantillon de sang dans le volume intérieur de l'ensemble de la revendication 5, à centrifuger l'échantillon pour obtenir une phase liquide et une phase solide, à faire descendre l'élément rapporté et engager une paroi (39) du passage à une interface entre les phases solide et liquide, et à séparer la phase liquide, située au-dessus de l'élément rapporté, de la phase solide située au-dessous de l'élément rapporté. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la coagulation de l'échantillon avant la centrifugation.