Brevet FR2712493A1 — publié le 19950524

UTILISATION DE PHOTOSENSIBILISATEURS DERIVES DU NOYAU PHORBINE POUR LA DECONTAMINATION DU SANG INFECTE PAR DES PARASITES ET/OU DES VIRUS La présente invention a pour objet l'utilisation de composés photosensibilisateurs dérivés du noyau phorbine pour la mise en oeuvre de procédés de décontamination de produits sanguins susceptibles d'être infectés par des parasites et/ou des virus. L'invention concerne également l'utilisation de ces photosensibilisateurs pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de pathologies dues à l'infection d'individus par des parasites et/ou des virus. Les photosensibilisateurs de type "photodynamique" sont des molécules qui, lorsqu'elles sont excitées par une lumière de longueur d'onde appropriée, sont susceptibles de transférer une partie de l'énergie lumineuse absorbée à l'oxygène moléculaire (effet photodynamique), générant ainsi de l'oxygène singulet (102), une espèce extrêmement réactive susceptible de réagir avec les principaux constituants cellulaires (lipides, protéines, acides nucléiques), en entraînant la destruction des tissus illuminés (Weishaupt et al., (1976) Cancer Res. 36, 2326; Mazière et al., (1990) J. Photochem. Photobiol. 6, 61). La principale application thérapeutique actuelle des photosensibilisateurs est la photochimiothérapie des tumeurs (Kessel, D. (1984), Photochem. 39, 851; Mazière et al., (1992) Cr. Soc. Chim. Biol. 186, 88), basée sur la rétention préférentielle par les tissus tumoraux de certains photosensibilisateurs dérivés du noyau porphyrinique. Dans ce type d'application, le photosensibilisateur est tout d'abord injecté au patient, et la tumeur secondairement illuminée à l'aide d'une source laser. Le principal photosensibilisateur utilisé actuellement est le Photofrin II (marque déposée) (Lederlé), dérivé complexe de l'hématoporphyrine. Ce type de technique a été également proposé pour le traitement des leucémies (Fibach et al., (1992) Leuk. Res. 16, 453). La photochimiothérapie a aussi été envisagée pour l'élimination de la contamination virale éventuelle au niveau des Centres de Transfusion Sanguine (Matthews et al., (1988) Transfusion 28, 81). Enfin, quelques essais de décontamination du sang infecté par des parasites ont été tentés avec des produits colorants photosensibilisateurs tels que la mérocyanine (Smith et al., (1991), The Journal of Infectious Diseases, 163, 1312-1317), et le violet de gentiane (Docampo et al., (1988), Molecular and Biochemical Parasitology, 27, 241-248). Toutefois, les propriétés spectrales de ces composés présentent certains inconvénients en ce qui concerne l'absorbance propre des érythrocytes. La présente invention a précisément pour but de fournir un nouveau procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus, ce procédé étant fiable et applicable à grande échelle. L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites et/ou virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites et/ou virus. L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguines infectés par des parasites susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites. L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits virus. Avantageusement, les composés photosensibilisateurs susmentionnés pour la décontamination parasitaire sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante dans laquelle: X X représente C=O ou CH-OH, R1 représente -CH=CH2, -COCH3, ou -CH(CH3)-O-(CH2)q-CH3, dans laquelle q est un nombre entier de 0 à 6, notamment 5, R2 représente un groupe aikyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle), R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe allyle de 1 à 6 atomes de carbone, et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n(CH2)p-Z, dans lequel Y représente -O-, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3-, ou PO3--, et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, ou R5 représente -(CH2)r-CO2-R, r étant un nombre entier de 1 à 6, notamment 2, et R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de O. Avantageusement, les composés photosensibilisateurs susmentionnés pour la décontamination virale sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante dans laquelle: X X représente C = O ou CH-OH, R1 représente -CH=CH2 ou -COCH3, R2 représente un groupe allyle de 1 à 6 atomes de carbone, CH2-OH, ou -CHO (formyle), R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, dans lequel Y représente -O-, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3-, ou PO3--, et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, . R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, Par l'expression "dérivés du noyau phorbine", on entend tout composé constitué du noyau suivant (dans lequel les positions ont été numérotées suivant la nomenclature internationale): Des dérivés du noyau phorbine particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention, sont choisis parmi ceux de formule (I) dans laquelle R5 représente le groupe -(CH2)2-CO-NH-(CH2)mî-Zî, dans lequel Z1 représente -OH, un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou -CH3, et ml est un nombre entier de 1 à 8. De préférence, les dérivés du noyau phorbine susmentionnés Sv's vlala parmi ceux répondant à la formule (Ia) suivante dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 12, et plus particulièrement le composé de formule (Ia) dans laquelle m représente 4, à savoir l'éthényl-9éthyl-14-(méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl-4,8,13,18-oxo-20-(hydroxybutyl-4)- N-propanamide-3-phorbine (encore désigné ci-après par l'expression PH40H), et le composé de formule Ia dans laquelle m représente 6, à savoir 1' éthényl-9- éthyl-14-(méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl-4,8,13,18-oxo-20-(hydroxyhéxyl-6)- N-propanamide-3-phorbine (encore désigné ci-après par l'expression PH6OH). Un autre dérivé du noyau phorbine particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention, correspond à l'acétyl-9-éthyl-14-dihydro-13,14- (méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl-4,8,13,18-oxo-20-(hydroxybutyl-4)-N- propanamide-3-phorbine de formule (Ib) suivante Un autre dérivé du noyau phorbine préféré dans le cadre de la présente invention correspond à l'éthényl-9-éthyl-14-tétraméthyl4,8,13,18-oxo-20- (hydroxyhexyl-6)-N-propanamide-3-phorbine de formule (Ic) suivante Parmi les dérivés de formule (I) dans laquelle Z représente -COOH, -CH3 ou -SO3-, on citera plus particulièrement les dérivés de formule (Id) suivante: dans laquelle Z représente -COOH (dérivé ci-après désigné PH2COOH), -CH3 (dérivé ci-après désigné PH2CH3), -SH (dérivé ci-après désigné PH2SH), ou SO3- (dérivé ci-après désigné PH2SO3-). Parmi les agents responsables de maladies parasitaires susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, on citera plus particulièrement: - les agents responsables du paludisme, et plus particulièrement Plasmodiumfalciparum (P. falcipanum), P. vivax, P. ovale et P. malariae, - les agents responsables des trypanosomiases, notamment Trypanosoma bnucei gambiense (T. b. gambiense) responsable de la maladie du sommeil, et T. cruzi responsable de la maladie de Chagas, - les helminthes, notamment les filaires responsables des filarioses lymphatiques, - les leishmanies, notamment Leishmania donovani et L. major, responsables des leishmanioses, - Babesia divergens responsable de babesioses bovines ou humaines (individus splenectomisés). Parmi les agents responsables de maladies virales susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on citera plus particulièrement les virus à enveloppe, notamment, les virus responsables des différentes hépatites, les cytomégalovirus et les virus du type HIV responsables du SIDA. Les produits sanguins susceptibles d'être décontaminés dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, correspondent au sang prélevé sur des mammifères, humains ou animaux, et conservé dans un conditionnement approprié, notamment dans des poches pour perfusion, ou correspondent à des préparations de cellules sanguines, et plus particulièrement d'érythrocytes, débarrassées de tout ou partie des autres constituants du sang. Selon un mode de réalisation préférée du procédé selon l'invention, la concentration en composés photosensibilisateurs dans les produits sanguins à traiter d'environ 0,1 ,umole/l à environ 100 zmole/l, et avantageusement d'environ 0,1 zmole/l à environ 10 zmole/l. De préférence la dose d'énergie lumineuse incidente utilisée dans le cadre du procédé selon l'invention, est d'environ 1 à environ 100 Joules (longueur d'onde d'environ 660 nm à environ 800 nm). A titre d'illustration, 1 minute d'irradiation avec des radiations lumineuses de longueur d'onde 670 i 10 nm, dans des boîtes de 25 cm2 (contenant environ 5 ml de sang), correspond à 11,2 Joules d'énergie lumineuse incidente. L'invention vise également l'utilisation de composés photosensibilisateurs lipophiles, et plus particulièrement des composés photosensibilisateurs selon la formule (I) ci-dessus, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement par voie extracorporelle du sang de mammifères, humains ou animaux, susceptibles d'être porteurs de parasites et/ou de virus, eux-mêmes susceptibles d'être présents dans le sang, ce traitement comprenant une étape d'exposition d'une quantité déterminée du sang de ces mammifères contenant ces composés photosensibilisateurs, à une source de lumière susceptible d'exciter ces composés photosensibilisateurs. L'invention a également pour objet des compositions sanguines comprenant des composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, et plus particulièrement au moins un des composés selon la formule générale (I) cidessus, en mélange avec un produit sanguin correspondant à du sang prélevé chez l'homme ou l'animal, ou à des préparations de cellules sanguines telles que définies cidessus. L'invention concerne également les compositions sanguines telles que décrites cidessus, irradiées à l'aide d'une source lumineuse selon le procédé susmentionné de l'invention. L'invention vise également l'utilisation de compositions sanguines telles que définies cidessus, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extracorporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus. Les états pathologiques dus à l'infection d'individus par des parasites, et susceptibles d'être traités dans le cadre des utilisations susmentionnées, sont notamment les suivants: - le paludisme, - les trypanosomiases, - les filarioses, - les leishmanioses, - les babesioses. Les états pathologiques dus à l'infection d'individus par des virus, et susceptibles d'être traités dans le cadre des utilisations susmentionnées, sont notamment les suivants: - les différentes hépatites, - les pathologies dues à 1' infection par les cytomégalovirus, - le SIDA. Selon un mode de réalisation de la méthode de traitement par voie extracorporelle susmentionnée, une quantité déterminée du composé photosensibilisateur est ajoutée au sang mis en circulation extracorporelle, puis ce sang contenant ce composé photosensibilisateur est exposé à la source de lumière. De préférence, la quantité du composé photosensibilisateur ajoutée au sang mis en circulation extra-corporelle, est telle que la concentration de ce composé dans le sang est d'environ 0,1 ymole/l à environ 100 ymole/l, et avantageusement d'environ 0,1 ymole/l à environ 10 mole/l, et en ce que la dose d'énergie lumineuse est telle que décrite ci-dessus. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de traitement par voie extracorporelle susmentionnée, une quantité déterminée du sang des mammifères, auxquels a été préalablement administrée une quantité appropriée du composé photosensibilisateur, est mise en circulation extra-corporelle et est exposée à la source de lumière. De préférence, la quantité du composé photosensibilisateur administrée au mammifère est d'environ 0,3 mg à environ 3 mg par kg de poids corporel par jour, et en ce que la dose d'énergie lumineuse est telle que décrite cidessus. La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de composés de 1' invention et de leur utilisation dans le cadre de la décontamination de produits sanguins infectés par P falc p arum. I. Descnption des figures. Figure 1: Marquage des globules rouges humains par le PH40H Une aliquote (2 ml) d'une culture in vitro de Plasmodium falciparum (parasitémie de l'ordre de 10%) est incubée à 37"C, dans l'obscurité, pendant 2 heures avec la drogue constituée par PH40H (concentration finale de 10 yM). Après lavage des cellules par centrifugation (600 g, 5 minutes) dans du milieu de culture, le culot de cellules est repris dans ce même milieu. Une goutte de cette suspension est montée entre lame et lamelle, et observée au microscope à fluorescence (objectif à immersion x 100, filtre 420 nm 520 nm). (Figures a, b: formes "anneaux"; c, d, e: formes trophozoites; f: formes schizontes; g: mérozoites). Figure 2: Effet du dérivé PH40H sur la parasitémie dans une culture in vitro de globules rouges humains infectés par Plasmodium falciparum. Les cellules sont incubées avec la drogue pendant 2 heures à 37"C en milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum humain, lavées, puis irradiées à 670 nm durant des temps variables (1 à 15 minutes). La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites après coloration au May-GiemsaGrünwald. Une minute d'irradiation correspond à environ 1 1 Joules. Figure 3: Effet du dérivé PH40H sur la parasitémie d'un sang total infecté par Plasmodium falciparum, en fonction de la concentration de la drogue. Le sang est incubé pendant 2 heures à 37"C avec la drogue. L'irradiation est réalisée à 670 nm pendant 5 minutes. La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites après coloration au May-Giemsa-Grünwald . Figure 4: Effet du PH40H sur la survie des formes épimastigotes de Trypanosoma cruzi en culture (milieu LIT supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal) en fonction de la concentration de la drogue. L'incubation avec la drogue est réalisée pendant 2 heures à 27"C. Après lavage, l'irradiation est réalisée à 670 nm pendant 5 minutes. La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites à la cellule de Malassez. Figure 5: Tests d'activité in vdro du DRS, MACE, PHOH Les drogues, DR5 (Figure A), MACE (Figure B), et PH40H (Figure C) ont été additionnées à des aliquotes de 5 ml de culture in vitro de Plasmodium falciparum en flacons de 25 cm2, parasitémie de 3% pour DR5 et MACE et 1,5% pour le PH40H. Ces flacons sont remis en culture à 37"C, dans l'obscurité pendant 2 heures. Chaque flacon est ensuite irradié pendant différents temps: 0, 1, 5, 10 minutes pour le DR5 et le PH40H (courbes a, b, c, d respectivement). Après irradiation, les boîtes sont remises à incuber à 37"C, dans l'obscurité. Après 2 jours, la parasitémie est déterminée par comptage de 1000 cellules sur frottis sanguins colorés au Diff-Quick. Figure 6: Comparaison m vdro des différents dérivés PH. Chaque dérivé PH (A: PH40H, B: PH2CH3, C: PH2SO3-, D: PH2COOH) est incubé, pendant 30 minutes à 37"C, à l'obscurité, en flacon de 25 cm2 avec 5 ml d'une culture asynchrone (3% de parasitémie) de Plasmodium falciparum. La concentration finale en composé photosensibilisateur est de 0,5yM pour chaque composé. Après incubation les cellules sont ensuite irradiées pendant 5 minutes, lavées dans du milieu RPMI et remises en culture à 37 C dans l'obscurité. Après 2 jours, l'inhibition de la croissance des parasites de chaque flacon par rapport aux témoins avec drogue mais non irradiés, est estimée en calculant la parasitémie sur frottis sanguins colorés au Diff-Quick. Figure 7: Comparaison sur du sang total des dérivés PH (PHaOH. PH2CH3) sur des globules rouges infectés par Plasmodium falciparlun. Des hématies parasitées ont été mélangées à du sang total âgé de 2 semaines (parasitémie finale de 2%). Des aliquotes de 500 y1 de ce mélange auxquels sont rajoutés les composés photosensibilisateurs (PH40H, PH2CH3) ont été placés en boîte 24 puits. Chaque boîte est incubée à 37"C, dans l'obscurité, pendant 2 heures. Elles sont ensuite irradiées pendant 5 minutes, après quoi les cellules sont lavées 2 fois par centrifugation (600 g, 5 minutes) avec du RPMI. Le culot cellulaire est ensuite remis en culture dans 5 ml de milieu en flacons de 25 cm2 et à l'obscurité. Après 3 jours, la parasitémie est estimée sur frottis sanguins colorés au Diff-Qtiick. Parallèlement il est fait des témoins contenant la drogue mais non-irradiés. Figure 8: Exemple reflétant l'activité antivirale du dérivé PHOH Voir section 4.6 des exemples. 11. Exemples de synthese de composes photosensibilisateurs utlllses dans le cadre de la présente invention. EXEMPLE 1 9-ethenyl- 14-ethyl-21 -(methoxvcarbonvl)4 .8.13.1 8-tetraméthvl-20-oxo- N(4-hydroxybutyl)-3 -phorbinepropanamide (PH4OH) 250 samoles de phéophorbide a, sont dissous dans 25 ml de dichlorométhane dans un flacon au fond circulaire, protégés de l'humidité par un flux d'azote et refroidis dans un bain de glace. 260 moles de Nhydroxysuccinimide sont ajoutés à la solution, puis 350 moles de dicyclohexylcarbodiimide. Le mélange est agité pendant 4 heures par un mélangeur magnétique. Le solvant est alors éliminé sur un évaporateur rotatif et le résidu gras dissout dans 30 ml d'acétonitrile. 500 moles de 4-aminobutanol, dissous dans 30 ml d'un mélange 2-propanol : eau, 1:1, sont ajoutés goutte à goutte à la solution mélangée pendant une période de 30 minutes à température ambiante. Le mélange est agité pour une durée supplémentaire de 4 heures et ensuite transféré dans une ampoule à décanter et réparti entre 150 ml de dichlorométhane et 50 ml d'eau. Après lavage avec deux parties de 50 ml d'eau, la phase organique est séchée au sulfate de magnésium, filtrée et évaporée jusqu'au séchage total. Le résidu est dissout dans 10 ml de dichlorométhane et déposé sur une colonne de gel de silice de 2 x 30 cm (E. Merck gel de silice 60 (70-230 mesh) préparée sous dichlorométhane. La colonne est éluée avec 300 ml de dichlorométhane, puis avec 200 ml d'acétonitrile et enfin avec 400 ml de dichlorométhane : méthanol (8:2). Le produit a été obtenu dans l'éluat de dichlorométhane méthanol. Les fractions contenant le produit ont été identifiées par chromatographie en couche mince de gel de silice 60 E. Merck sur plaques de papier aluminium; le solvant de chromatographie est: chloroforme : méthanol : acide sulfurique 0.01 N (80:20:2). Le rendement est de 200 moles (80%). EXEMPLE 2 9-ethényl-14-éthyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetraméthyl-20-oxo-N- (6-hydroxyhexyl-3-phorbineprnpanamide) (PH Le procédé de l'exemple 1 cidessus, est appliqué à l'exception du fait que 500 4moles de 6-aminohexanol ont été substitués au 4-aminobutanol. Le rendement du produit désiré est de 190 moles (75%). EXEMPLE 3 9-éthényl-14-éthyl-4,8,13,18-tetraméthyl-20-oxo-N-(6-hydroxyhexyl)-3- phorbine propanamide (PyPH6OH) 200 moles de pyrophéophorbide a sont convertis en éther activé avec du N-hydroxysuccinimide et du dicyclohexylcarbodiimide comme décrit cidessus pour le phéophorbide a dans l'exemple 1. Cet intermédiaire dissout dans 50 ml d'acétonitrile, est ajouté au goutte à goutte à la solution agitée de 300 moles de 6-aminohexanol dans 50 ml de 2-propanol, contenus dans un flacon de 250 ml muni d'un mélangeur magnétique. Le mélange est agité pendant 4 heures, puis transféré dans une ampoule à décanter de 500 ml, avec 100 ml de dichlorométhane. La solution est extraite avec 4 x 50 ml d'eau. La phase organique est séchée avec du sulfate de magnésium et le solvant évaporé. Le résidu est dissout dans 10 ml de dichlorométhane et déposé sur une colonne de gel de silice de 2 x 40 cm (E. Merck gel de silice 60 (70-230 mesh)) préparée dans du dichlorométhane. La colonne est éluée avec 200 ml de dichlorométhane, puis avec 200 ml de dichlorométhane méthanol (9:1), 200 ml de dichlorométhane : méthanol (4:1) et 400 ml de dichlorométhane (7:3). Les fractions contenues dans le produit, telles que détectées par TLC, sont regroupées. Les plaques de TLC sont du gel de silice 60 E. Merck sur du papier aluminium. Le solvant de chromatographie est le dichlorométhane : méthanol acide sulfurique 0.02 N 85:15:15. Le rendement est de 200 moles (66%). EXEMPLE 4 9-acétvl-14-éthvl-13 . 14-dihvdro-21-(méthoxvcarbonvl)4.8. 13.18- tetraméthyl-20-oxo-N-(4-hydroxybutyl)-3 -phorbinepropanamide (BPHi2OH! 100 moles de bactériophéophorbide a sont dissous dans 5 ml de chloroforme contenu dans un flacon au fond circulaire de 25 ml, et refroidis dans un bain de glace et protégés de l'humidité par atmosphère d'Argon 100 moles d'hydrure de 1-hydroxybenzotriazole sont ajoutés et le mélange est agité pendant 15 minutes. 300 samoles de dicyclohexylcarbodiimide sont ensuite ajoutés et agités de façon continue pendant deux heures. Le chloroforme s'évapore et le résidu est dissout dans 5 ml de 2-propanol. A la solution agitée magnétiquement, est ajoutée une solution de 0.5 mmole de 4-aminobutanol dans 5 ml de 2-propanol. Le mélange est agité pendant 5 heures, puis transféré séparément dans une ampoule à décanter avec 40 ml de dichlorométhane. Le mélange est extrait avec 2 x 40 ml d'eau et la phase organique est séchée par du sulfate de magnésium. Le solvant est évaporé par un évaporateur rotatif, le résidu est repris dans 5 ml de dichlorométhane, et déposé sur une colonne 2x20 cm de gel de silice (E Merck silica gel 60(70-230 mesh)). La colonne a été éluée avec 200 ml de dichlorométhane, ensuite avec 200 ml d'acétonitrile, puis avec 300 ml de dichlorométhane : méthanol (1:1). Les fractions contenant le produit sont identifiées par TLC sur gel de silice E. Merck sur des plaques en papier aluminium. Le rendement est de 55 moles (55%). EXEMPLE 5 Purification de PHI L'instrument employé est le Waters Delta Prep 3000, utilisant une colonne DELTA PAK 15 Cl C18-100 de 10 x 300 mm. Le système de solvant est composé de 75% d'acétonitrile, 25% de tampon phosphate triéthylamine à un pH de 3.2. Le débit est de 20 ml par minute. La détection a été réalisée par absorbance de lumière à 410 mm. Un échantillon de 10 mg, dissout dans 5.0 ml d'acétonitrile est injecté. Le pic du produit majeur (superficie 47.4%) a un temps de rétention de 36.97 minutes. Cette fraction (volume, 72 ml) a été répartie entre 450 ml de dichlorométhane et 400 ml d'eau. La couche de dichlorométhane est séparée, puis lavée avec 5 parties de 400 ml d'eau supplémentaires, séchée par du sulfate de sodium et évaporée pour donner 1.25 mg du produit. Une analyse HPLC montre que ce produit est pur à 99.4%. La spectrométrie de masse montre un ion moléculaire à m/z, 692 daltons (M+), C41H49N5O5 correspond à 692. EXEMPLE 6 Purification de PHdOH Les mêmes instrument et colonne que dans l'exemple 5 sont utilisés. Le solvant est méthanol : eau (88 parties MeOH pour 12 parties H2O, par volume). Le débit est de 20 ml/minute. La détection a été réalisée par absorbance de lumière à 410 mm. Un échantillon de 10.2 mg, dissout dans 10 ml dudit mélange méthanol : eau, et filtré, est injecté. Le pic du produit majeur (superficie 80,8%) a un temps de rétention de 80.8 minutes. La fraction principale du produit (environ 125 ml) est concentrée sur un évaporateur (température du bain inférieure à 40"C). Lorsque la majorité du méthanol est éliminée, un solide vert est séparé. Le solide est dissout dans du dichlorométhane et la couche de dichlorométhane est séparée et évaporée par un flux d'azote sec. Après séchage par du pentoxide de phosphore in vacuo, le produit a un poids de 3.7 mg (récupération, 44.9%). Une analyse HPLC montre que ce produit est pur à 97.3 %. Une spectrométrie de masse montre un ion moléculaire à m/z 664 daltons (M+). C39H45N505 correspond à 664. Les dérivés du noyau phorbine décrits dans le cadre de la présente invention, et plus particulièrement ceux préparés selon les exemples décrits cidessus, peuvent être traités avec un composé métallique, par exemple, un halogénure métallique, dans un solvant approprié, avec chauffage, pour produire des complexes de metalo-phorbine dans lesquels le métal remplace les deux hydrogènes liés aux atomes d'azote dans le noyau phorbine. Les métaux représentatifs de la formation de tels complexes incluent Si, Mn, Fe, Co, Ni, Zn, Ga, In, Sn, Sm, Eu, Gd, Tc et T1. ffi) Matenel et methodes 1. Culture in wtrn de Plasmodium falciparum 1.1. Condltlons de culture La souche de Plasmodium falciparum, FcB1 de Colombie (souche résistante à la chloroquine), est maintenue en culture in vitro sur érythrocytes humains selon la méthode de Trager et Jensen (Trager, W. and Jensen, J.B. Human malaria parasites in continuous culture. Science 193: 673-675, 1976). Le milieu de base est le RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco BRL, Cergy Pontoise) additionné de 25 mM HEPES pH = 7,5, de 27,5 mM de NaHCO3, de 11 mM de glucose, de 100 UI.ml-1 de Pénicilline et de 100 yg.ml~1 de Streptomycine. Ce milieu de base est supplémenté avec 7,5% (V/V) de plasma humain décomplémenté. Plasmodium falciparum est cultivé à 37"C, avec un hématocrite de 2 à 5% de globules rouges humains (recueillis sur citrate dextran, et utilisés dans les 3 semaines consécutives au prélèvement), sous une atmosphère de 3% CO2, 6% 2 et 91% N2. Pour une parasitémie comprise entre 1 et 10%, le milieu est changé quotidiennement par aspiration, alors que pour les fortes parasitémies (supérieures à 10%), il est renouvelé plusieurs fois par jour. Les cultures à parasitémie élevée (15%) sont diluées avec de nouvelles hématies préalablement lavées avec du milieu de culture. La parasitémie est déterminée sur frottis sanguins colorés au May-Grünwald- Giemsa ou au Diff-Quick (Merz + Dade, Düdingen, Suisse) par comptage de 1000 cellules. z Hématies parasitées Calcul du pourcentage de parasitémie (P): P = ---------------------------- X100 z Hématies totales 1.2 Synchromsation sur 4 heures des cultures in vitro Une synchronisation fine sur 4 heures peut être réalisée à partir d'une culture in vitro asynchrone de Plasmodium falciparum, par la mise en oeuvre d'une technique de lyse sélective des hématies infectés contenant des stades âgés de Plasmodium falciparum (trophozoltes, schizontes) par incubation dans le D Sorbitol 5% (P/V) dans l'eau distillée selon la méthode de Lambros et Vanderberg (Lambros, C. and Vanderberg, J.P. Synchronisation of Plasmodium falciparum erythrocytic stage in culture. Journal of Parasitology 65: 418420, 1979), et par une technique de sélection des stades érythrocytaires âgés (trophozoltes agés et schizontes) par flottaison sur gélatine (PLASMAGEL, Laboratoire Roger Bellon, Neuilly) selon Pasvol et al. (Pasvol et al., Separation of viable schizont infected red blood cell of Plasmodium falciparum from human blood. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 72: 87-88, 1979). Une population de formes anneaux obtenue après traitement au sorbitol 5% (P/V) est remise en culture pour croissance. Dès que les parasites les plus âgés ont atteint le stade de schizonte mature, les globules rouges infectés par ces formes âgées sont concentrés par Plasmagel et remis en culture avec des hématies fraîches à 20% de parasitémie. La libération des mérozoites et la formation de nouveaux anneaux sont suivis régulièrement sur frottis sanguins. 4 heures après la libération des premiers mérozoites, un traitement au sorbitol permet d'éliminer les formes âgées et d'obtenir une population de formes anneaux synchronisée sur une fenêtre de 4 heures. 1.3 Estlmatlon de la survie du parasite dans du sang total mamtenu à 4"C Des hématies infectées par des formes anneaux de Plasmodium falciparum provenant de culture in vitro et synchronisées sur 4 heures, ont été mélangées à du sang total (cellules et plasma extraits de poches de transfusion) et laissées à 4"C. La parasitémie initiale est de 1,75%. Afin d'estimer la survie du parasite, des aliquotes de 200Cl1 sont prélevés à différents temps et mis en culture dans des flacons de 25 cm2, avec 5 ml de milieu. La parasitémie est déterminée après plusieurs cycles de multiplication. Ainsi une estimation du nombre de parasites vivants lors de la remise en culture peut être effectuée à partir de la parasitémie déterminée après plusieurs jours de culture in vitro des aliquotes prélevés, et du facteur de multiplication de la souche FcB1/Colombie, qui est en moyenne de 4 par cycle endoérythrocytaire de 48 heures. La formule suivante: 100x(D-8) Kn S = D permet d'estimer le pourcentage de parasites vivants au moment de la remise en culture, où A représente la parasitémie obtenue après plusieurs jours de culture, D la parasitémie initiale (1,75%), n le nombre de cycles effectués, et k le facteur moyen de multiplication de la souche de Plasmodium falciparum concernée. D'autre part, une détermination des parasitémies et un comptage des hématies sur cellules de Malassez, permettent de connaître le nombre de parasites présents dans 1y1 de solution. De ce fait, il est possible de calculer le nombre de parasites survivants dans 1y1 au moment où ils sont remis en culture, et d'extrapoler à la quantité de parasites vivants dans une poche de sang (400 ml) stockée dans les mêmes conditions. 2. Les composés photosensibilisateurs. 2.1 Solutlons stocks. Le MACE correspond au monoaspartylchlorine E6, le DR5 correspond au dérivé de formule suivante: Les solutions mères à 10mM de MACE ou de DR5 sont réalisées dans du DMSO et conservées à 4"C. Les solutions stocks de 2mM des dérivés PH (PH40H, PH2CH3, PH2SO3-, PH2COOH, PH2SH) sont réalisées dans de l'éthanol absolu et conservées à -20 C. Dans tous les cas, ces solutions mères sont stockées à l'obscurité. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission pour le MACE et le DR5 sont de BeXc=4lO nm et bey=666 nm et de 400 et 666 nm pour les dérivés PH. Chaque manipulation doit être effectuée en lumière atténuée afin de préserver l'intégrité des molécules. 2.2 Cmetique d'incorporation des composes photosensibilisateurs par les hématies saines et les hématies parasitées par Plasmodium falcioarum. 2.2.1 "Effet ecran". A partir d'une solution mère de 108 globules rouges sains par ml, différentes concentrations de cellules sont testées. Pour chaque concentration cellulaire, des aliquotes sont prélevées, centrifugées (600 g, 5 minutes), et le culot cellulaire lysé avec une solution de Triton X 100 à 2% (P/V) dans de l'eau bidistillée contenant une concentration fixe de composé photosensibilisateur (= 1.5 nM). Après centrifugation (15000 g, 15 minutes), la fluorescence du surnageant est mesurée sur un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS5 pour une longueur d'onde d'excitation de 410 nm et une longueur d'onde d'émission de 666 nm. 2.2.2. Cmetique d'incorporation des composes photosensibilisateurs. Ces études ont été réalisées comparativement avec des globules rouges sains et des globules rouges infectés par des formes âgées (trophozoltes âgés et schizontes) de Plasmodium falciparum, obtenues après concentration avec la technique du Plasmagel (Lambros, C. and Vanderberg, J.P. Synchronisation of Plasmodium falciparum erythrocytic stage in culture. Journal of Parasitology 65: 418420, 1979) (parasitémie 260%). Les cellules sont comptées sur cellule de Malassez et leur concentration ramenée, avec du milieu de culture, à 107 cellules . mi- 1 Pour chaque temps de la cinétique d'incorporation, les manipulations sont effectuées sur 0,1 ml des cultures, de façon à obtenir 106 cellules, afin que le culot cellulaire soit visible. Au temps to de la cinétique, le composé photosensibilisateur est ajouté à la solution mère de cellules (107 .mis1) de façon à obtenir une concentration finale de composé de 10yM. Ces solutions sont mises à incuber à 37"C, à l'obscurité, sous agitation. A chaque temps de la cinétique, 3 aliquotes de 100y1 (106 cellules) sont prélevées et lavées 2 fois par centrifugation (10 000 g, 1 minute) dans 500 yl de PBS. Chaque culot cellulaire est ensuite lysé avec 1 ml de Triton X 100 à 2% (P/V) dans de l'eau bidistillée. L'échantillon est de nouveau dilué avec la solution de Triton pour avoir l'équivalent de 5.104 cellules par ml, concentration de globules rouges à laquelle la fluorescence du composé n'est pas masquée par l'effet d'écran. Les lysats sont centrifugés 15 minutes, à 15000 g, et la fluorescence mesurée à l'aide d'un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS5 à des longueurs d'ondes Xexc=41O nm et rem=666 nm pour le MACE et le DR5 et de 400 et 666 nm pour le PH et ses dérivés. Chaque point de la cinétique correspond à la moyenne des 3 valeurs plus ou moins l'écart type. Pour chaque mesure, deux séries de témoins sont traitées de façon identique: la première est constituée de cellules sans composé photosensibilisateur et la seconde contient le milieu de culture et le composé photosensibilisateur. 2.3 Locallsatlon des photosensibilisateurs par vldeo microscopie à fluorescence. Les globules rouges sains et les globules infectés par les différents stades de Plasmodium falciparum, souche FcB1, sont incubés pendant 30 minutes, à 37"C, dans un milieu de culture avec de 0,2yM à 100yM de chaque dérivé PH et de 10 à 5001LM de MACE et DR5. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois par centrifugation (600 g, 5 minutes) avec du milieu de culture à 7,5 % sérum. L'observation du marquage a été réalisée à l'aide d'un microscope à épifluorescence Optiphot de Nikon, équipé d'un arc au mercure de 100 Watts (objectif à immersion 100 X). Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission utilisées sont respectivement de 420 nin 520 nm. L'extinction rapide de la fluorescence des composés (de l'ordre de la seconde) est atténuée par l'utilisation d'un filtre limitant la source lumineuse à 1/32iéme. L'enregistrement des images sur vidéo cassettes est obtenu par une caméra LHESA 4036 à bas niveau de lumière (LHESA électronique, Cergy Pontoise) couplée à un magnétoscope Sony "U"-matic V05850-P. Après sélection des images des bandes d'enregistrement, ces dernières sont traitées à l'aide du système Sapphire (Quantel, Ltd Berkshire, GB). Les photographies sont ensuite réalisées sur film PAN F Ilford en utilisant le "Vidéo printer" VIP3 de Polaroïd (Polaroid Corporation, Cambridge, USA). 3. Test d'activlte des composés photosenslblllsateurs. 3.1 Maternel d'irradiation. La table d'irradiation est composée de 2 lampes Tungstène-Iode émettant des longueurs d'ondes de 670 nm et d'un système de circulation d'eau permettant de maintenir les boîtes de cultures à 37"C en évitant une surchauffe de l'échantillon. Le système est conçu pour que l'éclairage du plateau soit uniforme (3mW/cm2). 3.2 Selectlon des composes photosensibilisateurs in vitro. Ces tests ont été effectués à partir de cultures in vitro de Plasmodium falciparum asynchrones avec une parasitémie comprise entre 1 et 3% et à un hématocrite de 5 % . Pour chaque concentration de composé photosensibilisateur, 5 ml de culture ont été incubés, en présence des molécules, de 30 minutes à 2 heures, à 37"C dans des flacons de 25 cm2 puis irradiés pendant différents temps et remis en culture à 37"C, dans l'obscurité. La parasitémie a été déterminée 2 jours et 6 jours après l'irradiation. Parallèlement, deux séries de témoins ont été effectuées: la première est constituée de cultures en l'absence de composé photosensibilisateur mais soumises aux différents temps d'irradiation, la seconde, de cultures en présence des différentes concentrations en composés photosensibilisateurs mais non irradiées. 3.3 Determmatlon de l'effficaclte des composes photosensibilisateurs sur du sang total infecté par Plasmodiumfakiparum. Des hématies parasitées provenant de cultures in vitro ont été mélangées à du sang total pour obtenir une parasitémie finale de 1 à 5%. Ce sang total parasité est aliquoté en plaques de 24 puits (500y1/puits) et le composé photosensibilisateur ajouté dans chaque puits pour obtenir la concentration désirée. Chaque plaque est ensuite incubée à 37"C, dans l'obscurité, pendant 2 heures, puis soumise à différents temps d'irradiation (de 0 à 10 minutes). Après exposition à la lumière, les cellules de chaque puits sont lavées 2 fois avec du RPMI sans rouge de Phénol (GIBCO BRL, Cergy Pontoise), et remises en culture à l'obscurité, en flacon de 25cm2, dans 5 ml de milieu. Puis, 2 jours et 6 jours après l'irradiation, 600y1 de suspension cellulaire sont prélevés dans chaque flacon et centrifugés à 600 g, pendant 5 minutes. Pour chaque flacon, la parasitémie sera déterminée sur le culot cellulaire et la lyse des globules rouges sur le surnageant. Parallèlement, 2 séries de témoins sont réalisées: la première est constituée de sang total parasité sans composé photosensibilisateur soumis aux différents temps d'irradiation, la seconde, de sang total incubé avec les différentes concentrations en composés photosensibilisateurs mais non-irradié. 3.4 Effet hemolytique des composes photosensibilisateurs. L'effet hémolytique des composés photosensibilisateurs est déterminé en mesurant l'absorbance des surnageants de culture à 575 nm, longueur d'onde correspondant à l'absorbance de l'hème de l'hémoglobine libérée dans le milieu lors de la lyse des globules rouges. Cette étude a été réalisée avec du milieu de culture RPMI sans rouge de phénol car celuici absorbe à 575 nm. 400 yl de surnageant de culture sont dilués au demi avec de l'eau distillée et l'absorbance lue au spectrophotomètre UVIKON 930 (KONTRON INSTRUMENT) à 575 nm. La référence de base correspondant à 0% de lyse est déterminée en mesurant l'absorbance du milieu de culture dilué de moitié avec de l'eau distillée. Le 100% de lyse est obtenu en lysant le culot de globules rouges lavés, extrait de 80 yl de sang total, dans 1 ml d'eau distillée et le diluant au demi avec le milieu de culture. La courbe d'absorption à 575 nm en fonction de la lyse cellulaire montre une linéarité entre 0 et 50% de lyse. VI) Résultats et discussion. 1. Reslstance de Plasmodiumfalciparum a une temperature de 4"C. Peu de données précises sont disponibles sur la capacité de survie de Plasmodium falciparum à 4"C dans les poches de sang. Bruce-Chwatt (1974) estimait que Plasmodium malariae et Plasmodiumfalciparum pouvaient survivre à 4"C pendant 10 à 14 jours, préconisant ainsi un stockage des poches de sang d'au moins 2 semaines pour limiter tout risque de contamination lors de transfusion (Bruce-Chwatt, L.J. Transfusion Malaria. Bulletin de l'O.M.S. 50: 337-346, 1974). Au Mexique, il est préconisé d'attendre 10 jours avant de transfuser une poche de sang (Olivares Loupez et al., Infecciones transmitidas por transfusion de sangre. Revista Medica del Instituto Mexicano del Seguro Social 26 (1): 4147, 1988). Pour avoir des données plus précises, a été entreprise une étude de la capacité de survie à 4"C de Plasmodium falciparum, souche chloroquine-résistante FcB1 de Colombie, dans le sang total (voir matériel et méthodes). Pour obtenir une meilleure appréciation de la réalité, l'expérience a été faite avec des formes jeunes du parasite, provenant de cultures in vitro synchrones sur 4 heures. Ces formes anneaux sont en effet, essentiellement les formes récoltées lors d'un don de sang. Chez Plasmodium falciparum, ces formes se retrouvent dans la circulation veineuse alors que les globules rouges infectés par les trophozoites et les schizontes sont séquestrés dans les capillaires profonds. La survie du parasite, à 4"C, dans le sang total a été estimée après différents temps de stockage par le développement du parasite en culture in vitro. Le pourcentage de survie (S) a été calculé à partir de la parasitémie observée in vitro, en tenant compte du facteur de multiplication de la souche FcB1 (X4) et du nombre de cycles effectués (voir "matériel et méthode" pour la formule de calcul). Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1: Survie du parasite à 4"C déterminée à l'aide de la formule: 100x(D-O Kn S = D Temps à 4"C en Pourcentage de Pourcentage de Nombre de Nombre de jours parasites morts parasites vivants parasites parasites vivants/ (S) vivants/poche 0 0 100 101732 4.1010 3 50,6 49,4 50224 2.1010 7 77 33 23490 9,3.109 10 99 1 0 1017 0 4.108 14 99,99 0,01 10 4.106 Ces résultats montrent que plus de la moitié des parasites est incapable de se multiplier après 3 jours de stockage à 4"C. Cependant, après 2 semaines de stockage, 0,01% des parasites, possèdent encore la capacité de se développer à 37"C. Bien que la parasitémie initiale soit faible, (1,75%) un stockage de 2 semaines à 4"C ne suffit donc pas à éliminer tous les parasites, et le risque de contamination par transfusion reste présent. Le nombre de parasites de Plasmodium falciparum nécessaires pour être à l'origine d'une infection n'est pas connu. Cependant, bien que faible, le pourcentage de survie à 14 jours (0,01%) équivaut à 4.106 parasites viables par poche de sang (400 ml). Il est à noter que pour P. vivat seulement 10 parasites suffisent à induire la maladie (Bruce-Chwatt, L.J. Transfusion Malaria. Bulletin de l'O.M.S. 50: 337-346, 1974). Par ailleurs, en utilisant le test QBC (BECTON DICKINSON, Franklin Lakes, USA), test commercial actuellement le plus sensible pour la détection du paludisme, le taux de 10 parasites par y1 est nettement supérieur au seuil minimal de détection de ce test (1 parasite pour 1 y1). Une telle situation est tout à fait compatible avec un risque de contamination transfusionnelle, d'où l'importance des méthodes de décontamination spécifique du sang prélevé dans les régions endémiques du paludisme. 2. Cinétique d'incorporation des photosensibilisateurs. 2.1 Mlse au pomt des conditions expérimentales: effet écran Dans un premier temps, ont été recherchées les concentrations optimales de globules rouges permettant une mesure précise des composés incorporés, sans interférence avec l'absorption des constituants cellulaires, plus particulièrement de l'hémoglobine (effet d'écran). L'effet d'écran se traduit par une diminution de l'intensité de fluorescence relative (IFR). Elle est observée pour une concentration de cellules de l'ordre de 105 cellules.ml-l. Des courbes similaires ont été obtenues avec le MACE et les dérivés PH. Les mesures de cinétique d'incorporation ont été effectuées sur 106 cellules afin d'avoir un culot cellulaire visible lors de la manipulation. Mais, pour limiter l'effet d'écran de l'hémoglobine dû à une telle concentration cellulaire, les échantillons sont dilués lors de la lecture avec le tampon de lyse (Triton X 100 2%) pour avoir l'équivalent de 5.104 cellules. mI- 1 De plus, il s'est avéré indispensable de travailler avec des tubes coniques siliconés car ces composés photosensibilisateurs très hydrophobes se fixent sur le plastique, ce qui induit des artéfacts de mesure. Il est absolument nécessaire d'incuber les cellules en présence de sérum (7,5%) de façon à limiter la précipitation et l'agrégation des molécules photosensibilisatrices utilisées. 2.2 Cinétique d'incorporation des composés photosensibilisateurs. Les globules rouges sains ou infectés par les stades trophozoites et schizontes de Plasmodiumfalciparum, souche FcB1, sont incubés dans le milieu de culture contenant le composé à une concentration finale de 10yM pour le MACE et le DR5, et de 1M pour le PH40H. Les cinétiques d'incorporation dans les hématies saines et parasitées montrent un plateau de saturation dans les 30 minutes pour le PH40H et 1 heure pour le DR5. Une faible incorporation du DR5 est observée dans les globules rouges parasités, par comparaison aux globules rouges sains, malgré la forte parasitémie de la culture (60% de trophozoites et de schizontes). En revanche, pour le PH40H, une incorporation 2 fois plus importante est observée dans les globules rouges parasités par rapport aux globules rouges sains pour une parasitémie de 14,5% de parasites aux stades trophozoïte-schizonte. Aucune différence significative d'incorporation entre les globules rouges parasités et les globules rouges sains n'est observée pour le MACE. Il est à noter que dans la série de témoins sans cellules, une importante précipitation du composé en fonction du temps est observée malgré la présence de sérum dans le milieu d'incubation. Au vu de ces résultats, les tests d'efficacité pour les composés photosensibilisateurs seront effectués avec des temps d'incubation d'au moins 30 minutes pour le PH40H et de 60 minutes pour les dérivés DR5 et MACE. 2.3 Localisation cellulaire des composés photosensibilisateurs. Pour la localisation cellulaire, l'extinction très rapide de la fluorescence émise par les composés photosensibilisateurs testés (de l'ordre de la seconde) a nécessité l'utilisation d'un système de vidéo microscopie avec une caméra à bas niveau de lumière Lhesa LH 4036. Un marquage de globules rouges sains ou parasités n'est observé avec le DR5 qu'à des concentrations supérieures à 0,5 mM. Aucun marquage n'a été constaté avec le MACE, contrairement au PH40H avec lequel les cellules infectées par Plasmodium falciparum sont fortement marquées, à une concentration beaucoup plus faible (jusqu'à 0.2 yM). Il est intéressant de remarquer qu'une fluorescence importante est associée aux parasites intracellulaires, quel que soit leur stade de développement. Il est ainsi possible de différencier les stades anneaux (figure lac), les trophozoites (figure 1 d-e), et les schizontes (figure 1 f), mais aussi les formes infectantes, les mérozoites (figure 1 g). Un marquage des parasites est également observé avec les autres dérivés PH (PH2CH3, PH2SO3-, PH2COOH, PH2SH). De ces observations le PH40H apparaît être plus efficacement incorporé que le DR5 et le MACE par les hématies parasitées, ce qui conforte les résultats précédents sur la cinétique d'incorporation des composés. 3. Tests d'efficacité in vltro des différents composés. 3.1 Test in vitro Les effets des différents composés photosensibilisateurs sur le développement in vitro de Plasmodium falciparum ont été analysés en fonction des différentes concentrations en composés et des différents temps d'irradiation. La figure 5 présente les courbes obtenues avec le DR5 (figure 5A), le MACE (figure 5B), le PH40H (figure 5C). Le tableau 2 présente les concentrations minimales de composé permettant l'élimination totale des parasites des cultures pour différents temps d'irradiation. Tableau 2: Calcul des IC100 (Concentration inhibant 100% du développement parasitaire! sur des cultures in vitro asynchrones de Plasmodium falciparum - souche FcBi. DROGUE IC 100 IC 100 IC 100 1 minute 5 minutes 10 minutes DR5 pas d'effet 100 IlM 50 yM MACE pas d'effet 25 zM 10 M PH40H 0,2 ,uM 0,1 M 0,05 M Il est à remarquer que le PH40H est environ 1000 fois plus actif que le DR5 et 200-250 fois plus actif que le MACE pour 5 minutes et 10 minutes d'irradiation. De plus, aucun effet sur la parasitémie n'a été mis en évidence au cours des manipulations dans les deux cultures témoins (cultures en absence de composé mais irradiées, et cultures avec les différentes concentrations en composés mais non irradiées). L'importante efficacité du PH40H comparée à celle du MACE et du DR5, nous a donc amenés dans un second temps à comparer l'activité in vitro d'une série de dérivés PH. 3.1.1. Selectlon m vltro des dlfferents denves de la serte PH. L'activité des différents dérivés PH est résumée sur la figure 6. Dans nos conditions expérimentales (30 minutes d'incubation, 0,5 zM de composé et 5 minutes d'irradiation), 2 composés entraînent après 2 jours de culture 100% d'inhibition, le PH40H et le PH2CH3. 84% d'inhibition sont obtenus avec le PH2SO3-. Les autres dérivés sont moins efficaces (inhibitions inférieures à 40%). les valeurs d'inhibition observées ont été confirmées après 6 jours de culture. De cette sélection, il ressort que seulement 2 composés, le PH40H et le PH2CH3, présentent un intérêt quant à l'élimination des parasites in vitro. Puis les activités du PH40H et PH2CH3 ont été testées sur des parasites présents dans du sang total. 4. Tests sur du sang "total" parasite. 4.1 Comparaison des denves PH: PHdOH. et PHCB7 sur du "sang total parasité" Sur le sang total parasité, dans de mêmes conditions expérimentales d'incubation et d'irradiation le dérivé PH40H s'est avéré 5 fois plus efficace que le dérivé PH2CH3. En effet les 100% d'inhibition sont obtenus pour 10 yM de PH2CH3 et seulement 2 zM de PH40H avec 5 minutes d'irradiation (figure 7). Ces différences d'IC1oo entre les deux dérivés PH dépendent de leurs caractéristiques physico-chimiques (hydrophobicité...). Pour le PH40H, les valeurs d'activité sur le "sang total" (figure 7) sont 10 fois inférieures à celles observées sur les tests in vitro (figure 6). Cette différence d'activité pourrait s'expliquer par la différence des concentrations sériques entre les tests in vitro et les tests sur sang total. Une étude ultérieure sera nécessaire pour déterminer s'il existe une séquestration du composé dans les différents composants sériques (HDL, LDL, Sérum albumine...) (Jori, G. In vivo transport and pharmacokinetic behaviour of tumour photosensitizers in: Wiley, Chichester (Ed), Photosensitizing compounds: Their Chemistry, Biology and Clinical Use, vol. 146, pp 78-94. Ciba fondation Symposium, 1989; Kongshaug et al., The distribution of porphyrins with different tumours localizing ability among human plasma proteins. Br. J. Cancer, 59: 184-188, 1989). Ce point est important car il est connu que Plasmodium falciparum utilise préférentiellement les lipides de la fraction HDL pour sa maturation (Grellier et al., Induction in vitro de la schizongonie de Plasmodium falciparum par des lipoprotéines humaines de haute densité (HDL). C.R. Académie des Sciences de Paris, 311 (3): 361-367, 1990; Grellier et al., Lipid traffic between high density lipoproteins and Plasmodium falcipanrm-infected red blood cells. Journal of Cell Biology, 112 (2): 267-277, 1991). Au niveau expérimental, il existe aussi une différence d'épaisseur de couches de cellules à irradier (monocouche in vitro et une couche de 1 mm pour du sang total). Sur du sang total, la couche de cellules plus épaisse forme un écran opaque absorbant plus de lumière qu'in vitro. 4.2. Actlvlte de PHdOH sur des globules rouges. Une incubation de 3040 minutes des globules rouges en culture avec la drogue, suivie d'une illumination de 1 à 5 minutes à 670 nm (longueur d'onde à laquelle l'hémoglobine n'absorbe pas), entraîne une destruction totale et sélective des cellules infectées, pour une concentration de l'ordre de 0,2cl (0,lmg/l), ce qui est extrêmement bas et démontre la très grande efficacité du composé, (voir la figure 2). I1 est à noter qu'à de telles concentrations, aucune toxicité éventuellement liée à la présence du composé au niveau des poches de sang devrait être observée. 4.3 Actlvlté de PHnOH sur du sang total. Les mêmes expériences, réalisées sur du sang total (poches de 400 ml obtenues au CNTS), confirment l'intérêt de l'invention, avec une élimination totale des parasites pour une concentration de composé de 2yM (environ lmg/l; temps d'illumination: 5 minutes, voir figure 3). 4.4 Actlvlte de PH40H sur les formes epimastigotes de Trvpanosoma cruzi. Enfin, le composé PH40H s'est avéré également efficace pour la destruction de Trypanosoma cruzi, une éradication pratiquement totale étant obtenue pour une concentration de l'ordre de 2yM, soit lmg/l (figure 4). 4.5 Activlté de PHaOH sur du sang total en fonction de sa durée de conservation. Des résultats obtenus avec PH40H, il ressort que le traitement le plus favorable devra être effectué sur du sang fraîchement prélevé, avec 4 yM de PH40H et 10 minutes d'irradiation, afin de minimaliser l'effet hémolytique de la drogue sur les globules rouges tout en permettant une destruction totale des parasites. 4.6 Actlvlte de PHnOH sur les virus. Le VIII ayant servi à l'infection a été préparé à partir de surnageants de cellules H9V3-beta cultivées en milieu dépourvu de protéines. Trois échantillons de 0.1 ml de suspension virale ont été obtenus par dilution au 1/10 de la solution mère de HIV: l'un constitue le témoin non irradié, les deux autres sont soumis à une irradiation à 670 nm durant 1 ou 4 minutes (soit 1,3 ou 5,2 Joules, respectivement). La concentration finale du photosensibilisateur (PH40H) dans des échantillons viraux est de 10-6M. Après irradiation des suspensions virales, les cellules H9 (lignée T4 dérivée d'un lymphome humain) sont infectées par les divers échantillons viraux (irradiés ou non irradiés comme décrit ci-dessus). L'infection est réalisée par incubation des cellules (4x106) avec une suspension virale possédant une activité transcriptase inverse ("reverse transcriptase: R.T. sur la figure 8) de 12 000 cpm. L'incubation des cellules avec des échantillons viraux est poursuivie pendant 48h, à 37"C, en atmosphère à 5% de CO2. Les cellules sont ensuite lavées de façon à éliminer toute trace de virus dans le milieu, et l'on détermine ensuite à différents temps après l'infection (6, 10, 13 et 15 jours), d'une part le nombre de cellules viables (figure 8, partie A), et d'autre part l'activité R. T. (figure 8, partie B), cette dernière reflétant la multiplication virale. REVENDICATIONS 1. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites et/ou virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites, et/ou virus. 2. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites. 3. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des virus, susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, - et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits virus. 4. Procédé de décontamination parasitaire de produits sanguins selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en que les composés photosensibilisateurs sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante: dans laquelle: X X représente C = O ou CH-OH, R1 représente -CH=CH2, -COCH3, ou -CH(CH3)-O-(CH2)q- CH3 dans laquelle q est un nombre entier de 0 à 6, notamment 5, R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle), R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -Hou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2),-(Y),-(CH2),-Z , dans lequel Y représente -O-, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3-, ou PO3--, et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, ou R5 représente -(CH2)r-CO2-R, r étant un nombre entier de 1 à 6, notamment 2, et R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de 0. 5. Procédé de décontamination virale de produits sanguins selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé en que les composés photosensibilisateurs sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante: dans laquelle: X X représente C = O ou CH-OH, . R1 représente -CH = CH2 ou -COCH3, . R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle), R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, dans lequel Y représente -O-, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3-, ou PO3--, et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de 0. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés du noyau phorbine sont choisis parmi ceux de formule (I) dans laquelle R5 représente le groupe -(CH2)2-CO-NH-(CH2)ml-Zl, dans lequel Z1 représente -OH, un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou -CH3, et mi est un nombre entier de 1 à 8. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés du noyau phorbine sont choisis parmi ceux répondant à la formule (Ia) suivante: dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 12, et plus particulièrement le composé de formule (Ia) dans laquelle m représente 4, à savoir l'éthényl-9- éthyl- 1 4-(méthoxycarbonyl)-2 1 -tétraméthyl-1, 8,13,1 8-oxo-20-(hydroxybutyl4)- N-propanamide-3-phorbine, et le composé de formule Ia dans laquelle m représente 6, à savoir I'éthényl-9éthyl- 14-(méthoxycarbonyl)-2 l-tétraméthyl- 4,8,13,1 18-oxo-20-(hydroxyhexyl-6)-N-propanamide 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en que les dérivés du noyau phorbine correspondent à l'acétyl-9-éthyl-14-dihydro-13,14- (méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl-4,8,13,18-oxo-20-(hydroxybutyl-4)-N- propanamide-3-phorbine de formule (Ib) suivante 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en que les dérivés du noyau phorbine correspondent à l'éthényl-9-éthyl-14-tétraméthyl- 4,8,13,18-oxo-20-(hydroxyhexyl-6)-N-propanamide-3-phorbine de formule (Ic) suivante 10. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 4, 6 à 9, caractérisé en ce que les agents responsables de maladies parasitaires susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, sont: - les agents responsables du paludisme, et plus particulièrement Plasmodium falciparum (P. falciparum), P. vivants, P. ovale et P. malariae - les agents responsables des trypanosomiases, notamment Trypanosoma bnucei gambiense (T.b. gambiense) responsable de la maladie du sommeil, et T. cruzi responsable de la maladie de Chagas, - les helminthes, notamment les filaires responsables des filarioses, - les leishmanies, notamment Leishmania donovani et L. major, responsables des leishmanioses, - Babesia divergens responsable de babesioses bovines ou humaines (individus splenectomisés). 11. Procédé selon l'une des revendications 1, 3, 5 à 9, caractérisé en ce que les agents responsables de maladies virales susceptibles d'être éliminés des produits sanguines, sont les virus à enveloppe, et plus particulièrement, les virus responsables des différentes hépatites, les cytomégalovirus et les virus du type HIV responsables du SIDA. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les produits sanguins à décontaminer correspondent au sang prélevé sur des mammifères, humains ou animaux, et conservé dans un conditionnement approprié, notamment dans des poches pour perfusion, ou correspondent à des préparations de cellules sanguines, notamment d'érythrocytes, débarrassées de tout ou partie des autres constituants du sang. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la concentration en composés photosensibilisateurs dans les produits sanguins à traiter est d'environ 0,1 ,umole/l à environ 100 ymole/l, et de préférence d'environ 1 zmole/l à environ 10 jumole/l. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la dose d'énergie lumineuse utilisée est d'environ 1 à environ 100 Joules. 15. Utilisation de composés photosensibilisateurs lipophiles, en particulier de ceux décrits dans l'une des revendications 2 à 9, susceptibles, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extracorporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus. 16. Utilisation d'une composition sanguine comprenant des composés photosensibilisateurs selon la revendication 15, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extracorporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus.