Brevet FR2715167A1 — publié le 19950721

La présente invention concerne la production d'un enzyme, la L-carnitine déshydratase permettant la conversion énantiosélective de la crotonobétaine en L(-)carnitine. La carnitine (ou ss-hydroxy-triméthylammonium butyrate) existe sous la forme de deux isomères optiques L et D, parmi lesquels seule la L-carnitine ou plus précisément le L(-)- ou R(-)-3-hydroxy-4triméthylaminobutyrate possède un rôle physiologiquement actif. La L(-)-carnitine est un produit naturel que l'on peut retrouver chez les animaux, les végétaux supérieurs et certains procaryotes. Chez les eucaryotes, la L(-)carnitine constitue un facteur essentiel dans le transport des acides gras à longues channes à travers la membrane mitochondriale interne où ils sont oxydés pour fournir de l'énergie. Des rôles de la L(-)-carnitine dans le métabolisme cellulaire découle une série d'applications cliniques et biologiques. Elle est en effet utilisée par exemple pour traiter les patients présentant des syndrômes de déficience en carnitine, les patients hémodialysés ou cardiaques, et plus récemment pour stimuler la production d'anticorps monoclonaux. Certains microorganismes, en particulier de l'espèce Pseudomonas, assimilent la L(-)-carnitine qui peut constituer leur seule source de carbone et d'azote; d'autres par exemple de l'espèce Acinetobacter, dégradent uniquement le squelette carboné de la L-carnitine en formant la triméthylamine. Diverses entérobactéries, telles que Escherichia coli, Salmonella typhimurium, et Proteus vulgaris, sont capables de convertir la carnitine, en passant par la crotonobétaïne, en -butyrobétaïne, en présence de sources de carbone et d'azote et dans des conditions anaérobies. L'activité de la L(-)-carnitine déshydratase a été démontrée chez E. coli au cours d'études qui ont révélé que cet enzyme est inductible en présence de soit L(-)carnitine, soit crotonobétaine, dans le milieu de croissance en anaérobiose. La synthèse stéréosélective de la L-carnitine par voie microbiologique a déjà été réalisée, d'une part en utilisant la L-carnitine déshydratase de Escherichia coli, catalysant la conversion de la crotonobétaine en Lcarnitine, sur des cellules en phase plateau et immobilisées (H. Jung et H.-P. Kleber : L-carnitine synthesis by stereoselective hydration of crotonobetaïne, in : C. Christiansen, L. Munck, J. villadsen (eds), 5th European Congress on Biotechnol, 8-13 July 1990, Nunksgaard Copenhagen, vol I, p. 251), et d'autre part à partir de l'enzyme purifié et complémenté avec le cofacteur de nature inconnue indispensable à son activité, enzyme lui-même immobilisé par exemple sur un support de phénylsépharose (H. Jung, K. Jung et H.-P. Kleber, 1990, DD 281 735 et D 281 919). Les avantages de cette synthèse biotechnologique sont triples : énantiosélectivité, grande spécificité du substrat et déroulement possible de la synthèse à température ambiante. Elle s'accompagne malheureusement d'un certain nombre d'inconvénients et en particulier des suivants: - réactivation de l'enzyme par un cofacteur de nature inconnue - instabilité dans le temps du biocatalyseur employé - utilisation de faibles concentrations de substrat et donc formation de faibles concentrations du produit final. Selon l'invention, la Demanderesse a élaboré un procédé permettant d'amplifier la production de Lcarnitine déshydratase et par conséquent d'augmenter l'utilisation du substrat initial, crotonobétaine, et la concentration du produit final obtenu, L-carnitine. En outre, ce procédé ne requiert pas l'utilisation d'un cofacteur ou d'un biocatalyseur purifié. La présente invention procède des étapes ci-après, effectuées par la Demanderesse: - purification de la L-carnitine déshydratase produite par la souche d'Escherichia coli 044K74, isolée à partir de l'intestin de rat, après un régime riche en D, L-carnitine, et déposée auprès de l'autorité de dépôt, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, dépôt enregistré le 20.12.1993 sous le N DSM8828, conformément au Traité de Budapest, - à partir de l'enzyme purifié, les 19 premiers aminoacides de l'extrémité N-terminale de la L-carnitine déshydratase ont été déterminés, - localisation puis séquençage du gène de l'ADN génomique de Escherichia coli, codant pour la L-carnitine déshydratase, ledit gène dénommé caiB, étant représenté dans la présente description par un fragment d'ADN monocaténaire possédant la séquence nucléotidique SEQ ID N01, décrite plus loin, - clonage du gène caiB dans une souche d'E. coli. Ainsi, les premiers objets de l'invention sont les suivants: - un fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN choisi parmi les fragments dont la séquence nucléotidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N01, identifiée plus loin dans la description, ou sa séquence complémentaire, - un plasmide vecteur d'expression du fragment d'ADN de l'invention, et en particulier le plasmide identifié par la référence pT7-6KE42 dans lequel est insérée la séquence nucléotidique SEQ ID N01 correspondant au gène caiB, codant pour la L-carnitine déshydratase, et sa séquence complémentaire, en aval d'un promoteur du phage T7 (Tabor, S. et Richardson, C.C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol. 82, p.1074-1078). - un polypeptide, dont la séquence peptidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence peptidique SEQ ID N02, ou avec une séquence homologue, - une souche d'Escherichia coli, et en particulier celle identifiée par la référence K38/pT7-6KE42, ses cultures et sous-cultures, obtenue par transformation d'une souche E. coli par un plasmide insérant un fragment nucléotidique de l'invention. Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont à présent définis - selon l'invention, un fragment nucléotidique monocaténaire est un enchainement de nucléotides, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique complémentaire dans des conditions prédéterminées, l'enchainement pouvant contenir des nucléotides de structures chimiques différentes, et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle, et/ou par recombinaison génétique, et/ou par synthèse chimique ; les fragments nucléotidiques selon l'invention peuvent être ou non modifiés chimiquement, - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de nucléotides, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information équivalente à celle des acides nucléiques naturels, - par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires, s'apparient pour former un double brin, - deux fragments nucléotidiques sont homologues lorsqu'ils codent pour deux protéines identiques ou homologues; s'agissant des fragments nucléotidiques de l'invention, deux fragments sont homologues quand ils expriment la L-carnitine déshydratase ou une protéine homologue, - deux séquences peptidiques sont homologues quand les caractéristiques chimiques globales des aminoacides les constituant, telles que polarité, hydrophobicité, et/ou basicité, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes ; ainsi, une leucine est un homologue d'une isoleucine, au sens de la définition précédente. Les séquences polypeptidiques selon l'invention peuvent être telles qu'à l'état natif, ou modifiées chimiquement. Par modification chimique, on entend toute altération chimique d'au moins un groupement fonctionnel d'une séquence peptidique ou nucléotidique, mais préservant substantiellement les propriétés biologiques de ladite séquence. La Demanderesse a découvert au surplus que l'opéron carnitine d'Escherichia coli comprend le gène caiE codant pour une protéine CaiE probablement impliquée dans la synthèse d'un cofacteur qui accroît considérablement l'expression du gène caiB, ledit gène caiE possèdant une séquence SEQ ID N03 et ladite protéine CaiE possèdant une séquence peptidique répondant à la séquence SEQ ID N04. C'est pourquoi, les seconds objets de l'invention sont les suivants: - un fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN choisi parmi les fragments dont la séquence nucléotidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N03, identifiée plus loin dans la description, ou sa séquence complémentaire, - un plasmide vecteur d'expression du fragment d'ADN de l'invention et en particulier le plasmide identifié par la référence pT7-5KE36 dans lequel est insérée la séquence nucléotidique SEQ ID N03 correspondant au gène caiE, codant pour la protéine CaiE et sa séquence complémentaire, - un polypeptide, dont la séquence peptidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence peptidique SEQ ID N04, ou avec une séquence homologue, - une souche d'Escherichia coli, et en particulier celle identifiée par la référence K38/pT7-5KE36, ses cultures et sous-cultures, obtenue par transformation d'une souche E. coli par un plasmide insérant un fragment nucléotidique répondant à la définition ci-dessus. Un fragment nucléotidique particulier de l'invention est obtenu par voie recombinante, à partir de l'opéron carnitine (cai) de l'ADN génomique d'Escherichia coli, comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 et SEQ ID N03. En particulier, ce fragment est inclus dans un fragment de restriction qui a été obtenu par action d'enzymes de restriction sur l'opéron carnitine (cai), ledit fragment de restriction étant choisi parmi les fragments de restriction MluI-1-MluI-2 d'une taille de 1,3 kb et BglII-AspI d'une taille de 0,9 kb, comprenant respectivement le gène caiB, codant pour la L-carnitine déshydratase et le gène caiE codant pour la protéine CaiE. L'invention concerne aussi tout ADN génomique ou isolé, et/ou ARN, et notamment vecteur d'expression ou plasmide dans lequel est inséré au moins un fragment de l'invention, ou un fragment homologue, et en particulier au moins un fragment dont la séquence nucléotidique répond à SEQ ID N01 ou SEQ ID N03. L'invention concerne en outre le polypeptide produit par la transcription et la traduction d'un fragment de l'invention, ou par toute autre voie d'obtention synthétique ou recombinante, comprenant une séquence peptidique identique ou homologue à celle de la L-carnitine déshydratase ou celle de la protéine CaiE. Mettant en application ces objets de l'invention, on apporte une souche d'E. coli, sa culture ou sousculture, dans laquelle on a introduit un plasmide de l'invention, c'est-à-dire insérant un fragment nucléotidique de l'invention, tel que le plasmide pT76KE42 insérant un fragment dont la séquence répond à SEQ ID N01, tel que le plasmide pT7-5KE36 insérant un fragment dont la séquence répond à SEQ ID N03, et tel que le plasmide pT7-5KE49 insérant le fragment de séquence SEQ ID N01 et le fragment de séquence SEQ ID N03, ledits fragments étant susceptibles de s'exprimer notamment dans ladite souche K38 d'E. coli (disponible au laboratoire de Stanley Tabor, Department of Biochemistry, Harvard Medical School, Boston, MA 02115) qui porte le plasmide pGP1-2 résistant à la kanamycine et codant pour 1'ARN polymérase du phage T7 placé sous le contrôle du répresseur thermosensible du phage lambda codé par le même plasmide (Tabor et Richardson, 1985). Enfin, l'invention procure un procédé pour produire par voie microbiologique, la L-carnitine selon lequel, on convertit la crotonobétaïne en L-carnitine, par la L-carnitine déshydratase, à partir d'une culture selon l'invention. Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, celui-ci comprend les étapes suivantes: - mise en culture de la souche d'E. coli K38/pT76KE42 de l'invention, dans un milieu de culture approprié, - inoculation d'une fraction de ladite culture sur un milieu de culture approprié comprenant en outre de la D,L-carnitine, en conditions anaérobies, - exposition des cellules à un choc thermique, - après incubation, addition de crotonobétaine aux cellules éventuellement lysées. La présente invention est à présent détaillée à travers les exemples 1 à 9 suivants et le dessin dans lesquels: Exemple 1 expose la technique de détermination de la séquence nucléotidique du gène caiB codant pour la Lcarnitine déshydratase, et dont la séquence nucléotidique répond à SEQ ID N01, par séquençage d'un fragment de l'opéron carnitine d'E. coli 044K74; Exemple 2 décrit la technique employée pour déterminer la séquence peptidique de la L-carnitine déshydratase répondant à SEQ ID N02, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N01; Exemple 3 illustre une préparation du plasmide pT7-6KE42 par insertion du fragment MluI-1-MluI-2 contenant le gène caiB; Exemple 4 illustre une préparation du plasmide pT7-5KE49 par insertion des fragments MluI-l-MluI-2 et BglII-AspI contenant les gènes caiB et caiE, respectivement; Exemple 5 décrit un procédé de transformation de la souche E. coli K38 par le plasmide pT7-6KE42; Exemples 6 à 9 illustrent un procédé selon l'invention de la synthèse de L-carnitine par action de la L-carnitine déshydratase sur la crotonobétaine, dans lesquels: Exemple 6 et 7 utilisent la souche K38/pT7-6KE42, Exemple 8 utilise la souche K38/pT7-5KE49, Exemple 9 utilise les deux souches K38/pT7-5KE36 et K38/pT7-6KE42 traitées séparément. Enfin, le dessin consiste en la Figure unique représentant la carte de restriction du locus cai (carnitine) d'E. coli 044K74 et les plasmides dérivés de ce locus. La Figure représente la carte de restriction de l'opéron cai de E. coli 044K74, sur laquelle les enzymes de restriction sont codés de la manière suivante A = AspI B = Bam HI Bg = Bgl II E = EcoRV M = MluI P = PstI S = SalI Sm = SmaI et les indices correspondent aux nombres de sites de coupure des enzymes de restriction. Exemple 1 : a) Clonage du gêne de la L-carnitine déshydratase On a choisi de construire une banque de gènes à partir du chromosome de la souche E. coli 044K74 déposée auprès de l'autorité de dépôt DSM (conformément aux références données précédemment). Cette souche a été isolée par Seim et al (Seim, H., Kleber, H.P. et Strack, E., Z. Allg. Mikrobiol., 1979, Vol. 19, p.753-758), à partir de l'intestin de rat, après un régime riche en D,Lcarnitine. Les 19 premiers aminoacides de l'extrémité Nterminale de la L-carnitine déshydratase avaient été déterminés à partir de l'enzyme purifié. La banque a été construite dans la souche d'E. coli Sure à partir d'ADN chromosomique d'E. coli 044K74 digéré partiellement par Sau3A, puis ligué dans le vecteur pUC19, (J. Sambrook et al, Molecular cloning : a Spring Harbor manual (eds), Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Les clones portent un insert dont la taille moyenne est 9kb. La banque constituée d'environ 3000 clones représente plus de 99% du chromosome d'E. coli 044K74. Le criblage de la banque a été effectué avec des sondes oligonucléotidiques déterminées à partir de l'extrémité N-terminale de la L-carnitine déshydratase, répondant aux séquences SEQ ID N05, SEQ ID N06 et SEQ ID N07, testées, avant criblage de la banque, par Southern et Dot Blots de l'ADN, et donnant les plus fortes hybridations. Le système de détection par chimioluminescence DIG (Boehringer Mannheim), employant des sondes froides marquées à la digoxygénine, a été utilisé pour le criblage de la banque. Plusieurs clones positifs ont été obtenus et analysés par Southern après coupures aux enzymes de restriction. Ils portent des fragments chevauchants, dans la région MluI-1-MluI-2 de 1.3 kb contenant le gène caiB (cf Fig). b) Séquençage du gène caiB d'E. coli Différents fragments d' ADN ont été sous-clonés dans les vecteurs pUC18/pUCl9 (Sambrook et al, 1989),en utilisant les enzymes de restriction MluI, EcoRV, HindI I et DraIII dont les sites figurent dans le gène caiB. Puis leur séquence nucléotidique a été déterminée selon la méthode de synthèse enzymatique en présence de didésoxynucléotides de Sanger (Sanger, F., Nicklen, S. et Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, Vol. 74, p.5463-5467). Les réactions de séquençage ont été réalisées à partir des 2 brins complémentaires de l'ADN plasmidique, en utilisant le kit de séquençage T7 fourni par Pharmacia. EXEMPLE 2 Pour confirmer l'identité de la protéine 45kDa exprimée à partir du gène caiB porté par le plasmide pT76KE42, avec la L-carnitine déshydratase, des dosages enzymatiques ont été effectués à partir d'extraits bruts de la souche 044K74 et de la souche K38 abritant différents plasmides pT7 hybrides (ces derniers étant disponibles au laboratoire de Stanley Tabor, Department of Biochemistry, Harvard Medical Schooî, Boston, MA 02115). La souche K38 abritant le plasmide pT7-6KE42 possède, lorsqu'elle est cultivée en présence de 20mM de D,Lcarnitine, une activité L-carnitine déshydratase vingt et une fois supérieure à celle des souches 044K74 et K38 contenant les plasmides pT7 qui ne portent pas le gène caiB. Après culture des mêmes souches en l'absence de carnitine, on observe une augmentation de cinq fois de l'activité L-carnitine déshydratase exprimée à partir de pT7-6KE42, si l'on ajoute une préparation de cofacteur encore non identifié, mais indispensable à l'activité. Un certain nombre d'arguments ont confirmé que le polypeptide CaiB est la L-carnitine déshydratase. La séquence N-terminale dérivée de la L-carnitine déshydratase purifiée et la séquence peptidique SEQ ID N02 obtenue à partir de la séquence nucléotidique sont identiques, exceptée une différence Leu/Arg en position 16 qui peut résulter des limites techniques du séquençage de la protéine. La masse moléculaire de 45 kDa calculée à partir du gène confirme parfaitement la masse moléculaire de la L-carnitine déshydratase purifiée. CaiB présente un degré d' homologie élevé de 61% avec la protéine BaiF (47kKa) d'Eubacterium sp. impliquée dans la déshydratation des acides biliaires dans l'intestin humain (Mallonee, D.H., White, W.B. et Hylemon, P.B., J. Bacteriol., 1990, Vol.172, p.7011-7019). Comme les deux protéines viennent de bactéries intestinales et catalysent des réactions de déshydratation, elles ont probablement une origine commune. EXEMPLE 3 Le fragment MluI-1-MluI-2 de 1,3 kb contenant le gène caiB a été obtenu par coupure de 1'ADN d'un clone dit pKE05 par l'enzyme de restriction MluI, suivie d'une séparation sur gel d'agarose et d'une purification de la bande de 1,3 kb à l'aide d'un kit de purification Geneclean (commercialisé par BiolOl). Parallèlement, le vecteur pSL301 (commercialisé par Invitrogen) a été traité au même enzyme, puis à la phosphatase alcaline et purifié à l'aide de Geneclean. Les deux ADN ont été mélangés en proportion 2/1 (insert de 1,3 kb/vecteur), puis ligués avec 1'ADN ligase du phage T4. Les clones recombinants ont été sélectionnés après transformation de la souche NM522 (commercialisé par Stratagene) selon la technique d'acomplémentation (Sambrook et al., 1989). L'insert de 1,3 kb a ensuite été sous-cloné selon la même technique, dans le sens correct de transcription, dans le vecteur pT7-6 (disponible au laboratoire de Stanley Tabor, Department of Biochemistry, Harvard Medical Schooî, Boston, MA02115), résistant à l'ampicilline en utilisant les sites de restriction EcoRI et HindîlI, pour former le plasmide hybride pT7-6KE42. EXEMPLE 4 Selon la même technique, le fragment SmaI-MluI-3 de 2,3 kb contenant le gène caiE a été cloné à partir du plasmide pKE05 dans le vecteur pSL301 aux sites correspondants. Ce fragment a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pUC19 grâce aux enzymes EcoRI et Hindili, puis réduit au segment BglII-AspI qui correspond approximativement à la taille du gène caiE. Le fragment MluI-1-MluI-2 de 1,3 kb, contenant le gène caiB, a ensuite été introduit dans le même sens de transcription que le gène caiE au site SalI du vecteur hybride précédent, après remplissage des extrémités cohésives par l'enzyme Klenow (Sambrook et al., 1989). L'ADN associant les gènes caiB et caiE a finalement été transféré dans le vecteur pT7-5 résistant à l'ampicilline, en utilisant les sites de restriction EcoRI et HindIII pour former le plasmide hybride pT7-5KE49. EXEMPLE 5 Après une préculture de la nuit en milieu Luria Bertani (en abrégé LB) (Sambrook et al, 1989) supplémenté en kanamycine (20 Ag/ml) à 30"C sous agitation, la souche K38 portant le plasmide pGPl-2 est réensemencée dans 50 ml du même milieu et dans les mêmes conditions. Les cellules sont récoltées à une densité optique à 600 nm, allant de 0,2 à 0,3, par centrifugation à 6000 g et à 4 C, puis resuspendues dans 10 ml de CaC12 50 mM et incubées 30 min dans la glace pour obtenir des cellules dites compétentes, c'est-à-dire prêtes à être transformées. Après une nouvelle centrifugation, les cellules sont resuspendues dans 1 ml de CaC12 50 mM et réparties en tubes Eppendorf à raison de 200 p1 par tube. La totalité du mélange de ligation (obtenu à l'exemple 3) est ajoutée aux cellules compétentes de la souche K38/pGP1-2, puis incubée pendant 15 min à 40C. Le mélange est ensuite transféré à 420C pendant 1 min 30 secondes, puis refroidi 2 min dans la glace. Les cellules sont cultivées pendant lh30 à 300C après addition de 800 1 de LB, puis étalées sur un milieu gélosé sélectif contenant LB, ampicilline (50 g/ml) et kanamycine (20 g/ml). Le procédé de transformation de la souche E. coli K38 par les plasmides pT7-5KE36 et pT7-5KE49 est analogue à celui qui vient d'être décrit. EXEMPLE 6 La culture de la souche d'E. coli K38/pT7-6KE42 a lieu en milieu liquide dans un récipient fermé de 250 ml rempli jusqu'au col par du milieu LB contenant 20 mM de D,L-carnitine. L'inoculation est réalisée avec 5 ml d'une culture aérobie (D0600=1,5) dans le même milieu sans addition de carnitine. Après 8 h d'incubation à 300C, la culture est exposée à un choc thermique pendant 25 min à 420C, puis elle est maintenue à 370C pendant 2h. Les bactéries sont récoltées après 15 min de centrifugation à 6000g à 40C, puis lavées deux fois avec du tampon phosphate (67mM, pH7,5). Les cellules sont resuspendues dans lOml de tampon phosphate (50mM, pH 7,5) et cassées avec la presse de French. Les cellules entières et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation de 20 min à 25000g. La crotonobétaïne est ajoutée à l'extrait brut ainsi obtenu à une concentration de 20 mmol/l et la réaction évolue pendant 3 min à 370C. Les protéines sont précipitées à l'acide trichloracétique et la L-carnitine présente dans le surnageant est déterminée par test enzymatique. L'activité spécifique de la L-carnitine déshydratase atteint 650 mU par mg de protéine. EXEMPLE 7 On procède comme dans l'exemple 6 jusqu'à l'étape du choc thermique. 400 yg/ml de rifampicine sont alors ajoutés et les microorganismes sont incubés 2 h supplémentaires à 370C. Puis les bactéries sont récoltées après 15 min de centrifugation à 6000g et 40C, et lavées deux fois en tampon phosphate (67 mM, pH 7,5). La crotonobétaïne est ajoutée aux cellules entières à une concentration de 20 mmol/l et la réaction évolue pendant 5 min à 37 C. Les cellules sont précipitées à l'acide trichloracétique et la L-carnitine présente dans le surnageant est déterminée par test enzymatique. L'activité spécifique de la L-carnitine déshydratase atteint 2400 mU/mg de poids sec bactérien. EXEMPLE 8 On procède comme indiqué dans l'exemple 6 avec une culture de la souche d'E. coli K38 transformée par le plasmide pT7-5KE49. Dans ce cas, l'activité spécifique de la L-carnitine déshydratase atteint 1600 mU par mg de protéine. EXEMPLE 9 On procède comme indiqué dans l'exemple 6, mais les souches d'E. coli K38/pT7-5KE36 et K38/pT7-6KE42 sont traitées indépendamment à la place de la souche d'E. coli K38/pT7-5KE49. Après mélange des deux extraits dans un rapport 1:1, une activité spécifique de la L-carnitine déshydratase de 1400 mU par mg de protéine est obtenue. Dans les exemples 6 à 9, les procédés décrits comprennent une étape d'exposition des cellules à un choc thermique pour permettre l'expression des gènes portés par le plasmide pT7. Cependant, l'invention n'est pas limitée à ces procédés et plus précisément à ce système de surexpression. En effet, d'autres systèmes de surexpression sont disponibles dans le commerce et peuvent être utilisés pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, tels que le vecteur d'expression pKK223-3 inductible par 1'isopropyl-ss-D-thiogalactoside (IPTG) avec la souche hôte JM 105, ou le vecteur d'expression thermoinductible pPL-lambda avec la souche hôte N4830-1, ces deux systèmes étant commercialisés par Pharmacia, mais aussi les vecteurs pBTacl et pBTac2 à utiliser avec la souche hôte JM 105, systèmes fournis par Boehringer. Les séquences nucléotidiques ou peptidiques, identifiées précédemment selon les références SEQ ID N01 à SEQ ID N07, sont décrites dans les pages ci-après. Concernant la SEQ ID N07 - les nucléotides aux positions 6, 9, 10, 12, 27, 30, 34, 36, 42 et 45 sont des guanosines modifiées représentées dans la séquence par la lettre G, et correspondent à l'inosine, - les nucléotides aux positions 15, 21, 33 et 39 sont soit des guanosines modifiées et dans ce cas l'inosine, soit la cytidine (C), et sont donc représentés par la lettre S, - le nucléotide à la position 24 est soit la thymidine, soit la cytidine, et est donc représenté par la lettre Y. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUES DE LYON (B) RUE: 20 Avenue Albert EINSTEIN (C) VILLE: VILLEURBANNE (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 69100 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE De OBTENTION DE LA L-CARNITINE PAR VOIE MICROBIOLOGIQUE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 7 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (c) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 11.0, Version S1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1215 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Escherichia coli (B) SOUCHE: 044K74 (vii) SOURCE IMMEDIATE: (A) BIBLIOTHEQUE: Bibliothèque du Laboratoire (viii) POSITION DANS LE GENOME: (A) CHROMOSOME/SEGMENT: chromosome E.coli (B) POSITION SUR LA CARTE: imin (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: ATGGATCATC TACCCATGCC GAAATTCGGA CCGCTGGCCG GATTGCGCGT TGTCTTCTCC 60 GGTATCGAAA TCGCCGGACC GTTTGCCGGG CAAATGTTCG CAGAATGGGG TGCGGAAGTT 120 ATCTGGATCG AGAACGTCGC CTGGGCCGAC ACCATTCGCG TTQACCGAA CTACCCGCAG 180 CTCTCCCGCC GCAATTTGCA CGCGCTGTCG TTAAATATTT TCAAAGATGA AGGCCGCGAA 240 GCGTTTCTGA AATTAATGGA AACCACCGAT ATCTTCATCG AAGCCAGTAA AGGTCCGGCC 300 TTTGCCCGTC GTGGCATTAC CGATGAAGTA CTGTGGCAGC ACAACCCGAA ACTGGTTATC 360 GCTCACCTGT CCGGTTTTGG TCAGTACGGC ACCGAGGAGT ACACCAATCT TCCGGCCTAT 420 AACACCATCG CCCAGGCCTT CAGTGGTTAC CTGATTCAGA ACGGTGATGT TGACCAGCCA 480 ATGCCTGCCT TCCCGTATAC CGCCGATTAC TTTTCTGGCC TGACCGCCAC CACGGCGGCG 540 CTGGCAGCAC TGCATAAAGC GCGTGAAACC GGTAAAGGCG AAAGTATCGA CATCGCCATG 600 TATGAAGTGA TGCTGCGTAT GGGCCAGTAC TTCATGATGG ATTACTTCAA CGGCGGCGAA 660 ATGTGCCCGC GCATGAGCAA AGGTAAAGAT CCCTACTACG CCGGCTGCGG TCTGTATAAA 720 TGTGCCGACG GC GCCAAAGTTG AGGAC 1215 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) cARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 405 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Escherichia coli (B) SOUCHE: 044K74 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Asp His Leu Pro Met Pro Lys Phe Gly Pro Leu Ala Gly Leu Arg 1 5 10 15 Val Val Phe Ser Gly Ile Glu Ile Ala Gly Pro Phe Ala Gly Gln Met 20 25 30 Phe Ala Glu Trp Gly Ala Glu Val Ile Trp Ile Glu Asn Val Ala Trp 35 40 45 Ala Asp Thr île Arg Val Gln Pro Asn Tyr Pro Gln Leu Ser Arg Arg 50 55 60 Asn Leu His Ala Leu Ser Leu Asn Ile Phe Lys Asp Glu Gly Arg Glu 65 70 75 80 Ala Phe Leu Lys Leu Met Glu Thr Thr Asp Ile Phe Ile Glu Ala Ser 85 90 95 Lys Gly Pro Ala Phe Ala Arg Arg Gly Ile Thr Asp Glu Val Leu Trp 100 105 110 Gln His Asn Pro Lys Leu Val Ile Ala His Leu Ser Gly Phe Gly Gln 115 120 125 Tyr Gly Thr Glu Glu Tyr Thr Asn Leu Pro Ala Tyr Asn Thr Ile Ala 130 135 140 Gln Ala Phe Ser Gly Tyr Leu Ile Gln Asn Gly Asp Val Asp Gln Pro 145 150 155 160 Met Pro Ala Phe Pro Tyr Thr Ala Asp Tyr Phe Ser Gly Leu Thr Ala 165 170 175 Thr Thr Ala Ala Leu Ala Ala Leu His Lys Ala Arg Glu Thr Gly Lys 180 185 190 Gly Glu Ser Ile Asp Ile Ala Met Tyr Glu Val Met Leu Arg Met Gly 195 200 205 Gln Tyr Phe Met Met Asp Tyr Phe Asn Gly Gly Glu Met Cys Pro Arg 210 215 220 Met Ser Lys Gly Lys Asp Pro Tyr Tyr Ala Gly Cys Gly Leu Tyr Lys 225 230 235 240 Cys Ala Asp Gly Tyr Ile Val Met Glu Leu Val Gly Ile Thr Gln Ile 245 250 255 Glu Glu Cys Phe Lys Asp Ile Gly Leu Ala His Leu Leu Gly Thr Pro 260 265 270 Glu île Pro Glu Gly Thr Gln Leu Ile His Arg Ile Glu Cys Pro Tyr 275 280 285 Gly Pro Leu Val Glu Glu Lys Leu Asp Ala Trp Leu Ala Ala His Thr 290 295 300 Ile Ala Glu Val Lys Glu Arg Phe Ala Glu Leu Asn Ile Ala Cys Ala 305 310 315 320 Lys Val Leu Thr Val Pro Glu Leu Glu Ser Asn Pro Gln Tyr Val Ala 325 330 335 Arg Glu Ser île Thr Gln Trp Gln Thr Met Asp Gly Arg Thr Cys Lys 340 345 350 Gly Pro Asn île Met Pro Lys Phe Lys Asn Asn Pro Gly Gln Ile Trp 355 360 365 Arg Gly Met Pro Ser His Gly Met Asp Thr Ala Ala Ile Leu Lys Asn 370 375 380 Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Asp Ile Gln Glu Leu Val Ser Lys Gly Leu 385 390 395 400 Ala Lys Val Glu Asp 405 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 609 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Escherichia coli (B) SOUCHE: 044K74 (vii) SOURCE IMMEDIATE: (A) BIBLIOTHEQUE: ADN chromosomique;Bibliothèque du Laboratoire (viii) POSITION DANS LE GENOME: (A) CHROMOSOME/SEGMENT: Chromosome E.coli (B) POSITION SUR LA CARTE: îmin (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GTGGAAAGGA CGTTAACAAC CGTGAGCTAT TACGCCTTTG AGGGGTTAAT TCCGGTGGTT 60 CACCCGACGG CGTTTGTCCA TCCCAGTGCA GTCTTGATTG GCGATGTGAT TGTGGGAGCC 120 GGTGTCTACA TTGGCCCACT CGCCTCACTG CGTGGTGACT ACGGGCGGTT GATCGTGCAA 180 ACGGGAGCCA ATATTCAGGA TGGCTGCATT ATGCATGGCT ACTGCGACAC TGACACCATC 240 GTTGGGGAAA ACGGCCATAT CGGGCACGGA GCGATCCTGC ATGGTTGTGT GATTGGTCGC 300 GATGCATTGG TCGGGATGAA CAGCGTGATT ATGGATGGCG CGGTCATTGG CGAAGAGAGC 360 ATTGTTGCCG CCATGAGCTT TGTCAAAGCA GGCTTTCACG GCGAGAAACG CCAGTTGTTG 420 ATGGGTACGC CAGCCCGCGC TGTACGCAGT GTTAGTGACG ACGAGTTACA CTGGAAACAG 480 TTGAATACCA AAGAGTATCA GGATCTTGTC GGGCGCTGTC ATGCATCGTT ACATGAAACG 540 CAGCCACTGA GGCAAATGGA GGAAAATCGC CCCCGTTTGC AGGGGACGAC GGATGTGACG 600 CCTAAACGG 609 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 203 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Escherichia coli (B) SOUCHE: 044K74 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Met Glu Arg Thr Leu Thr Thr Val Ser Tyr Tyr Ala Phe Glu Gly Leu 1 5 10 15 Ile Pro Val Val His Pro Thr Ala Phe Val His Pro Ser Ala Val Leu 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ile Val Gly Ala Gly Val Tyr Ile Gly Pro Leu Ala 35 40 45 Ser Leu Arg Gly Asp Tyr Gly Arg Leu Ile Val Gln Thr Gly Ala Asn 50 55 60 Ile Gln Asp Gly Cye Ile Met His Gly Tyr Cys Asp Thr Asp Thr Ile 65 70 75 80 Val Gly Glu Asn Gly His île Gly His Gly Ala Ile Leu His Gly Cys 85 90 95 Val Ile Gly Arg Asp Ala Leu Val Gly Met Asn Ser Val Ile Met Asp 100 105 110 Gly Ala Val Ile Gly Glu Glu Ser île Val Ala Ala Met Ser Phe Val 115 120 125 Lys Ala Gly Phe His Gly Glu Lys Arg Gln Leu Leu Met Gly Thr Pro 130 135 140 Ala Arg Ala Val Arg Ser Val Ser Asp Asp Glu Leu His Trp Lys Gln 145 150 155 160 Leu Asn Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Val Gly Arg Cys His Ala Ser 165 170 175 Leu His Glu Thr Gln Pro Leu Arg Gln Met Glu Glu Asn Arg Pro Arg 180 185 190 Leu Gln Gly Thr Thr Asp Val Thr Pro Lys Arg 195 200 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQWS DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TACCTRGTRA AYGGHTAC 18 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: TACGGHTTYA ARCCRGGR 18 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 45 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: base modifiée (B) EMPLACEMENT: (6, 9, 10, 12, 15, 21, 24, 27, 30, 33, 34, 36, 39, 42, 45) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TACCTGGTGG AGGGSTACGG STTYAAGCCG GGSGAGCGSC CGGGG 45 REVENDICATION8 1) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments dont la séquence nucléotidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N01, identifiée dans la description, ou sa séquence complémentaire. 2) Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments dont la séquence nucléotidique présente au moins 70% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N03, identifiée dans la description, ou sa séquence complémentaire. 3) Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il est obtenu par voie recombinante, à partir de l'opéron carnitine (cai) de 1'ADN génomique d'Escherichia coli, et en particulier de la souche 044K74, comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 et/ou SEQ ID N03. Fragment nucléotidique d'ADN, selon la revendication 3, caractérisé en ce qu' il est inclus dans les fragments de restriction obtenus par action d' enzymes de restriction, et choisis parmi les fragments de restriction MluI-1-MluI-2 de 1,3 kb et BglII-AspI de 0,9 kb, comprenant respectivement le gène caiB codant pour la L-carnitine déshydratase et le gène caiE codant pour la protéine CaiE. 5) ADN génomique ou isolé, ou ARN, notamment vecteur d'expression ou plasmide, dans lequel est inséré au moins un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il insère un fragment nucléotidique selon la revendication 1, dont la séquence répond à SEQ ID NO1. 7) Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il insère un fragment nucléotidique selon la revendication 2, dont la séquence répond à SEQ ID NO3. 8) Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il insère un fragment nucléotidique selon la revendication 1, dont la séquence répond à SEQ ID NO1, et un fragment selon la revendication 2, dont la séquence répond à SEQ ID NO3. 9) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 70% d'homologie avec la séquence peptidique SEQ ID N02, identifiée dans la description, ou polypeptide homologue. 10) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 70% d'homologie avec la séquence peptidique SEQ ID N04, identifiée dans la description, ou polypeptide homologue. 11) Polypeptide produit par la transcription et la traduction d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou par toute autre voie d'obtention synthétique ou recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence identique ou homologue à celle de la L-carnitine déshydratase et/ou une séquence identique ou homologue à celle de la protéine CaiE. 12) Culture d'Escherichia coli et sous culture de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle est obtenue en partant d'une souche d'Escherichia coli, dans laquelle est introduit un plasmide selon la revendication 5, ladite souche d'Escherichia coli étant choisie ou modifiée génétiquement, de manière à exprimer le fragment nucléotidique selon au moins l'une quelconque des revendications 1 à 4. 13) Culture et sous-culture selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transformation d'une souche E. coli, par le plasmide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8. 14) Culture et sous-culture selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transformation de la souche d'Escherichia coli K38, par le plasmide selon l'une des revendications 6 à 8. 15) Procédé de production par voie microbiologique de la L-carnitine, selon lequel on convertit la crotonobétaine en L-carnitine, par la L-carnitine déshydratase, à partir d'une culture selon l'une quelconque des revendications 12 à 14. 16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - mise en culture d'une souche selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, dans un milieu de culture approprié, - inoculation d'une fraction de ladite culture sur un milieu de culture approprié comprenant en outre de la D,L-carnitine., en conditions anaérobies, - exposition des cellules à un choc thermique, - après incubation, addition de crotonobétaine aux cellules éventuellement lysées.