Brevet FR2722209A1 — publié le 19960112

RECEPTEUR OPIOIDE KAPPA HUMAIN. ACIDES NUCLEIOUES ET UTILISATIONS La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et le matériel génétique permettant leur expression. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur opioïde kappa humain. Les récepteurs opimes sont des récepteurs membranaires du système nerveux qui médient les propriétés analgésiques et psychotropes des drogues alkaloïdes de type morphinique (Brownstein, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 90, 5391). Les études pharmacologiques ont démontré l'existence de trois sous-types de récepteurs, nommés mu, delta et kappa, qui différent par leur capacité à lier les différents ligands opioides (Goldstein et al, 1989, Mol. Pharmacol., vol 36, 265-272.) et par leur distribution dans l'organisme (Mansour et al, 1987, J. Neurosci., vol 7, 2445). Récemment, trois récepteurs opioïdes ont été clonés chez les rongeurs. Le profil pharmacologique de ces trois récepteurs clonés exprimés transitoirement en cellules Cos indiquent qu'il s'agit d'un récepteur delta, d'un récepteur mu et d'un récepteur kappa. L'analyse de leur structure primaire confirme qu'ils font partie de la famille des récepteurs couplés aux protéines G, qui possèdent une topologie putative à sept domaines transmembranaires (Bockaert, 1991, Curr. Op. Neurobiol., vol 1, 32). La présente invention réside dans la mise en évidence, l'isolement et la caractérisation moléculaire du récepteur opioïde kappa humain. Elle réside notamment dans l'isolement et le séquençage du gène codant pour ce récepteur, dans la construction de souches recombinées permettant l'expression de récepteurs fonctionnels, et dans la mise au point de tests permettant l'isolement de composés actifs sur ces récepteurs et possédant des propriétés thérapeutiques avantageuses. Les séquences d'ADN de l'invention permettent également la réalisation de sondes, capables de détecter dans des échantillons biologiques toute irrégularité dans l'expression d'un récepteur opioïde kappa (non-expression, mutation, polymorphisme, etc). Ces sondes sont également utilisables pour le clonage par hybridation de tout autre ADNc codant pour un récepteur opioïde, à partir de tissus d'origines diverses et notamment d'origine humaine. Un premier objet de l'invention réside donc dans une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur opioide kappa humain. Plus préférentiellement, la séquence nucléotidique selon 11 invention est choisie parmi (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n"l ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde kappa humain, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. Un mode de réalisation tout particulier de l'invention est représenté par une séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n"l ou de son brin complémentaire. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n"l. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des phosphoramidites, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour la production des polypeptides opioïdes kappa. Le terme polypeptide opioide kappa désigne tout polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde kappa, et tout fragment ou dérivé d'un tel polypeptide. Pour la production de polypeptides opioides kappa, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides opioides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces. Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes permettant la détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de récepteurs opioïdes dans des échantillons biologiques et la mise en évidence d'anomalies génétiques (polymorphisme, mutations) ou d'expressions aberrantes. L'inhibition de l'expression de certains gènes par des séquences antisens s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les séquences antes en sont des séquences dont le produit de transcription est complémentaire du brin codant d'un gène donné, et est de ce fait capable d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine (EP140 308). L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides opioides kappa tels que définis précédemment. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides de l'invention. De telles séquences peuvent être obtenues à partir de la séquence SEQ ID n"l, par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique. Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides opioides de l'invention, ou avec les ARNm correspondants. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression d'un récepteur opioïde kappa, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Compte tenu des activités multiples des ligands endogènes des récepteurs opioides, les sondes de l'invention peuvent ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique. Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides opioïdes tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent comporter jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n"l ou de son brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples. L'invention a également pour objet tout polypeptide résultant de l'expression d'une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Préférentiellement, il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n" 1 ou d'un dérivé de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ ID n" 1 et conservant une activité de récepteur opioide kappa. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont des polypeptides possédant la capacité de lier la dynorphine et les dérivés du gène de la prodynorphine. Encore plus préférentiellement, ils possédent la capacité de lier les agonistes de la dynorphine tels que le U-50,488, l'éthylcétoeyclasoncine et la brémozacine, et les antagonistes de la dynorphine tel que la norbinaltorphimine. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont susceptibles d'être reconnus par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique SEQ ID n" 1 complète. De tels anticorps peuvent être générés par toute technique connue de l'homme du métier, en utilisant comme antigènes les polypeptides décrits dans la présente demande. Comme indiqué dans les exemples, ces polypeptides peuvent être exprimés dans différents types cellulaires pour former des récepteurs opioides fonctionnels. Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite cidessus, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n" 1 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées capables d'exprimer à leur surface un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde kappa humain. Ces cellules peuvent être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, puis culture desdites cellules dans des conditions d'expression de ladite séquence. Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, K:luverom.ces, Pichia, Sch;anniomSIces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomjces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour mesurer la capacité de différentes molécules à se comporter comme ligand ou comme modulateur de l'activité des récepteurs opioïdes. Plus particulièrement, elles peuvent ainsi être utilisées dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de modulateur de l'activité des récepteurs opioides, et, plus préférentiellement, d'agonistes et d'antagonistes. Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des récepteurs opioïdes, selon lequel on réalise les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide. Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la dynorphine ou autres ligands des récepteurs kappa pour les récepteurs opioïdes kappa. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des récepteurs opioïdes, selon lequel on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde, en présence du ligand endogène dudit récepteur, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et son ligand, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du ligand sur ledit polypeptide. Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs de l'activité de la dynorphine ou autres ligands des récepteurs kappa sur les récepteurs opioïdes kappa. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections liées aux récepteurs opioïdes. En particulier, les récepteurs opioïdes kappa étant les médiateurs d'un effet analgésique, les agonistes de ces récepteurs peuvent être utilisés pour diminuer les sensations de douleur. L'invention concerne également tout médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un récepteur de l'invention. Préférentiellement la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé décrit précédemment. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1 : Organization partielle du gène du récepteur opiolde kappa humain (hKOR). Les exons sont indiqués par des boïtes et les introns par des lignes. La position des domaines transmembranaires putatifs du récepteur kappa sont indiqués par des chiffres romains. Les extrémités connues des exons sont numérotées en chiffres arabes, par rapport à leur position dans l'ADNc (fig. 2). L'exon en 3' a été séquencé jusqu'au codon terminateur TGA. Figure 2 : Stratégie de clonage de l'ADNc codant pour le récepteur opiolde kappa humain. Techniques générales de clonage Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coil selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. Ji (1985) 8749-8764]. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 1 (1985) 1350-1354 ; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]. Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence sont basées sur Maniatis T. et al., précitée. 1. Clonage génomique et organization partielle du gène Une banque génomique humaine a été criblée à l'aide d'une sonde provenant d'un ADNc codant pour un récepteur delta de souris (Kieffer et al., PNAS 1992, vol 89, 12048). La sonde est un fragment Pst I-Not I (976bp) de l'ADNc qui correspond à la majorité de la portion codante de l'ADNc. La banque a été étalée et transférée sur filtres de nitrocellulose. Ceux-ci ont été hybridés à la sonde marquée au 32P, dans des conditions relativement stringentes (5XSSC, SXDenhardt's, SDS O.1 o, Formamide 40%, NaPPi 0.05% et ADN de sperme de saumon 100 llg/ml). Les lavages ont été réalisés en 0.1% SSC jusqu'à 50"C et les filtres exposés à un film Rayons-X pendant la nuit. Deux clones génomiques hybridant faiblement avec la sonde ont été isolés. L'analyse des inserts par séquençage partiel indique qu'ils contiennent des régions très homologues au récepteur kappa de souris. Un exon a été identifié sur chacun des clones: l'un code pour une région correspondant topologiquement au début de la première boucle intracellulaire jusqu'à la fin du quatrième domaine transmembranaire et l'autre code pour le reste de l'extrémité C-terminale du récepteur. La topologie de cette portion du gène est représentée à la figure 1 et la position exacte des jonctions intron-exon y est indiquée. 2. Clonage d'un ADNc complet codant pour le récepteur kappa humain La plupart des méthodes utilisées ("standard"), sauf précisé dans le texte, dérivent de Sambrook, J.et al., 1989 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), 2nd Ed. Le placenta humain exprime le récepteur kappa (Meunier et al., 1988 Life Sci., vol 43, 559). Nous avons préparé de l'ARN total de placenta humain (Chomczynski, P. et al., 1987, Anal. Biochem., vol 162, 156) et avons synthétisé de l'ADNc à partie de cet ARN, à l'aide d'une amorce nucléotidique au hasard ("random hexamer", Pharmacia) et de Moloney Murine Leukemia Virus réverse transcriptase (BRL), dans des conditions standard. Nous avons ensuite amplifié l'ADNc codant pour le récepteur kappa humain par PCR (Polymerase Chain reaction) en utilisant des portions de la séquence humaine obtenue à partir de l'analyse des clones génomiques pour la conception d'amorces spécifiques. L'extrémité 5' de la partie codante du gène nous manquant, nous avons utilisé un oligonucléotide dérivé à partir d'une séquence kappa de souris pour l'amplification à partir de l'extrémité 5'. L'utilisation de deux amorces situées aux extrémités 5' (souris) et 3' (humain) de la région codante s'étant avérée peu efficace pour la production d'un ADNc complet, nous avons procédé en trois étapes et la stratégie utilisée est présentée sur la figure 2 (les chiffres indiquent la position précise des nucléotides dans la séquence complète de l'ADNc représentée sur la séquence SEQ ID n" 1). La séquence des oligonucléotides utilisés est la suivante: RP69: 5' GAGAGCTCGCGGCCGCGAGCTGCAGCGCTCACCATG (SEQ ID 2) RH84: 5' CACGGGGTGGCACACGGCAA (SEQ ID n" 3) RN6: 5' GTCTACTFGATGAATTCCTGG (SEQ ID n" 4) RP70: 5' AGACCCAAGClTGCCCGGGTCCACGACTAGTCATACTGG (SEQ ID n" 5) Les séquences hybridant à l'ADNc sont indiquées en gras, les autres nucléotides étant présent pour faciliter l'étape ultérieure de clonage des fragments produits par la réaction de PCR. Les oligonucléotides RP70, RH84 et RN6 sont dérivés de la séquence kappa humaine. L'oligonucléotide RP69 correspond à une séquence 5' non codant de souris (incluant l'ATG initiateur à l'extrémité 3') afin de ne pas introduire de séquence murine dans l'ADNc humain. La position précise des régions de l1ADNc qui hybrident aux 4 amorçes est indiquée à la fig. 2. Les différentes réactions d'amplification ont été réalisées dans les conditions suivantes Réaction 1: Amorces RN6 et RP70. La réaction est réalisée en présence de Taq Polymérase (Cetus) dans des conditions de PCR standard, excepté l'addition de DMSO 5% dans le milieu d'incubation. L'amplification se fait durant 40 cycles (lmin à 94"C, 1 min à 550C, 1 min à 720C). La dernière étape d'élongation se réalise pendant 10 min à 72"C. On obtient un fragment d'ADN de la taille attendue (760 bp)= fragment 1. Réaction 2: Les conditions d'amplification sont les mêmes que pour la réaction 1. Deux amplifications successives ont été nécessaires: la première utilise les amorces RP69 et RP70 et aboutit à l'obtention d'un mélange de fragments d'ADN de taille comprise entre 1 et 1.3 kb, contenant l'ADNc complet. Ce mélange est purifié après électrophorèse à partir d'un gel d'agarose 1% par le procédé GeneClean et réamplifié à l'aide des oligonucléotides RP69 et RH84. On obtient alors un fragment d'ADN de la taille attendue (508 bp)=fragment 2. Clonage de l'ADNc complet: Les fragments PCR sont réparés et clonés dans les extrémités franches du vecteur pBluescript (Stratagene) linéarisé par EcoR V. Les inserts sont séquencés dans les deux sens sur un séquenceur d'ADN automatique (373A DNA, Applied Bioystems Inc.) .Puis les deux inserts sont excisés du plasmide en présence de EcoR I (coupe côté 3' du fragment 2 et côté 5 du fragment 1) et d'un enzyme de restriction du polylinker. Les fragments sont purifiés à partir d'un gel d'agarose 1% par le procédé gene Clean et co- ligués dans le vecteur pcDNA/Amp (Invitrogen) pour l'expression transitoire du récepteur en cellules Cos. Les deux réactions d'amplification ont produit les fragments 1 et 2 attendus. Dans le cas du fragment 2, l'utilisation d'un oligonucléotide dérivé d'une séquence de souris à l'extrémité 5' a permis l'amplification de l'ADNc humain. Les deux fragments se recouvrent sur 140 bp. La séquence de recouvrement est identique dans les deux fragments. Les séquences des deux fragments sont comparées à la séquence déterminée à partir de l'ADN génomique (position 257 à position 1143) et trouvée parfaitement identique. Concernant la portion de séquence 1 à 256, dont la séquence génomique nous est inconnue, nous avons vérifié que l'amplification par PCR n'a pas introduit d'erreurs: nous avons comparé la séquence du fragment 2 obtenu à partir de trois réactions d'amplification différentes et l'avons trouvée identique dans les 3 cas. La séquence de l'ADNc codant pour le récepteur kappa humain selon l'invention, ainsi que la séquence protéique déduite, sont présentées sur la séquence SEQ ID n" 1. 3. Conclusion: structure primaire du récepteur kappa humain Nous avons utilisé une sonde codant pour un récepteur opioïde delta de souris afin de cribler une banque génomique humaine à moyenne stringence et d'isoler des fragments d'ADN génomique homologues. Nous avons identifié deux exons, qui au vu d'une comparaison de séquence, codent vraisemblablement pour le récepteur opioïde kappa humain. Nous avons isolé un ADNc dérivé de ce gène (partie codant) à partir d'un tissu humain (placenta) et avons analysé sa structure primaire (SEQ ID n" 1). L'ADNc a une taille de 1101 paires de bases et code pour une protéine de 380 acides aminés . La séquence nucléotidique est homologue à 86,7% à l'ADNc de souris codant pour un récepteur opioïde kappa. Les zones de divergence les plus importantes sont situées dans les régions N- et C-terminales. Ces mêmes zones sont également les régions les moins conservées entre les trois sous-types mu, delta et kappa. 4. Etude pharmacologique du récepteur K56 Le vecteur pcDNA/Amp contenant le cDNA codant pour le récepteur opioïde selon l'invention isolé dans l'exemple 2 est utilisé pour transfecter des cellules Cos- 1. Les membranes des cellules transfectées obtenues ont ensuite été préparées et testées pour leur capacité à lier certains ligands opioldes marqués. Le plasmide vecteur pcDNA/Amp purifié sur chlorure de césium est utilisé pour transfecter les cellules Cos- 1 en utilisant la technique au DEAE-dextran. 72 heures après la transfection, les cellules recombinantes sont récoltées et les membranes sont préparées de la manière suivante : les culots cellulaires sont repris, à 4"C, dans 60 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4; EDTA 10 mM, homogénéisés et centrifugés à 1100 g pendant 10 minutes. Le culot est ensuite repris une seconde fois dans 30 ml du même tampon, homogénéisé et centrifugé. Les 2 surnageants sont réunis et centrifugés à 110 000 g pendant 15 minutes. Le culot membranaire est alors repris dans 5ml du même tampon, aliquoté et conservé à - 80 "C. Des expériences de liaison à saturation et de compétition sont ensuite réalisées sur ces membranes en présence de différents ligands. Pour cela, les échantillons de membrane (15-30 Mg de protéines) sont incubés 2 heures à 25"C en présence de 3Hdiprénorphine ou 3H-U-69,593, avec ou sans compétiteur, dans un volume final de 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4); EDTA 10 mM. La réaction est ensuite stopée par filtration sous vide sur filtr LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: Universite Louis Pasteur (B) RUE: 11 rue Humann (C) VILLE: STRASBOURG (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 67085 (ii) TITRE DE L' INVENTION: RECEPTEUR OPIOIDE KAPPA HUMAIN, ACIDES NUCLEIQUES ET UTILISATIONS (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1143 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITI0NELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1143 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: ATG GAC TCC CCG ATC CAG ATC TTC CGC GGG GAG CCG GGC CCT ACC TGC 48 Met Asp Ser Pro Ile Gln Ile Phe Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Cys 1 , 5 10 15 GCC CCG AGC GCC TGC CTG CCC CCC AAC AGC AGC GCC TGG TTT CCC GGC 96 Ala Pro Ser Ala Cys Leu Pro Pro Asn Ser Ser Ala Trp Phe Pro Gly 20 25 30 TGG GCC GAG CCC GAC AGC AAC GGC AGC GCC GGC TCG GAG GAC GCG CAG 144 Trp Ala Glu Pro Asp Ser Asn G1 Ser Ala Gly Ser Glu Asp Ala Gln 35 40 45 CTG GAG CCC GCG CAC ATC TCC CCC GCC ATC CCG GTC ATC ATC ACG CCC 192 Leu Glu Pro Ala His Ile Ser Pro Ala Ile Pro Val Ile Ile Thr Ala 50 55 60 GTC TAC TCC GTA GTG TTC GTC GTG GGC TTG GTG GGC AAC TCG CTG GTC 240 Val Tyr Ser Val Val Phe Val Val Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val 65 70 75 80 ATG TTC GTG ATC ATC CGA TAC CA AAG ATG AAG ACA GCA ACC AAC ATT 288 Met Phe Val Ile Ile Arg Tyr Thr rs Met Lys Thr Ala Thr Asn Ile 85 90 95 TAC ATA TTT AAC CTG GCT TTG GCA GAT GCT TTA GTT ACT ACA ACC ATG 336 Tyr Ile Phe Asn Leu Ala Leu Ala Asp Ala Leu Val Thr Thr Thr Met 100 105 110 CCC TTT CAG AGT ACG GTC TAC TTG ATG AAT TCC TGG CCT TTT GGG GAT 384 Pro Phe Gln Ser Thr Val Tyr Leu Met Asn Ser Trp Pro Phe Gly Asp 115 120 125 GTG CTG TGC AAG ATA GTA ATT TCC ATT GAT TAC TAC AAC ATG TTC ACC 432 Val Leu Cys Lys Ile Val Ile Ser Ile Asp Tyr Tyr Asn Met Phe Thr 130 135 140 AGC ATC TTC ACC TTG ACC ATG ATG AGC GTG GAC CGC TAC ATT GCC GTG 480 Ser Ile Phe Thr Leu Thr Met Met Ser Val Asp Arg Tyr Ile Ala Val 145 150 155 160 TGC CAC CCC GTG AAG GCT TTG GAC TTC CGC ACA CCC TTG AAG GCA AAG 528 Cys His Pro Val Lys Ala Leu Asp Phe Arg Thr Pro Leu Lys Ala Lys 165 170 175 ATC ATC AAT ATC TGC ATC TGG CTG CTG TCG TCA TCT GTT GGC ATC TCT 576 Ile Ile Asn Ile Cys Ile Trp Leu Leu Ser Ser Ser Val Gly Ile Ser 180 185 190 GCA ATA GTC CTT GGA GGC ACC AAA GTC AGG GAA GAC GTC GAT GTC ATT 624 Ala Ile Val Leu Gly Gly Thr Lys Val Arg Glu Asp Val Asp Val Ile 195 200 205 GAG TGC TCC TTG CAG TTC CCA GAT GAT GAC TAC TCC TGG TGG GAC CTC 672 Glu Cys Ser Leu Gln Phe Pro Asp Asp Asp Tyr Ser Trp Trp Asp Leu 210 215 220 TTC ATG AAG ATC TGC GTC TTC ATC TTT GCC TTC GTG ATC CCT GTC CTC 720 Phe Met Lys Ile Cys Val Phe Ile Phe Ala Phe Val Ile Pro Val Leu 225 230 235 240 ATC ATC ATC GTC TGC TAC ACC CTG ATG ATC CTG CGT CTC AAG AGC GTC 768 Ile Ile Ile Val Cys Tyr Thr Leu Met Ile Leu Arg Leu Lys Ser Val 245 250 255 CGG CTC CTT TCT GGC TCC CGA GAG AAA GAT CGC AAC CTG CGT AGG ATC 816 Arg Leu Leu Ser Gly Ser Arg Glu Lys Asp Arg Asn Leu Arg Arg Ile 260 265 270 ACC AGA CTG GTC CTG GTG GTG GTG GCA GTC TTC GTC GTC TGC TGG ACT 864 Thr Arg Leu Val Leu Val Val Val Ala Val Phe Val Val Cys Trp Thr 275 280 285 CCC ATT CAC ATA TTC ATC CTG GTG GAG GCT CTG GGG AGC ACC TCC CAC 912 Pro Ile His Ile Phe Ile Leu Val Glu Ala Leu Gly Ser Thr Ser His 290 295 300 AGC ACA GCT GCT CTC TCC AGC TAT TAC TTC TGC ATC GCC TTA GGC TAT 960 Ser Thr Ala Ala Leu Ser Ser Tyr Tyr Phe Cys Ile Ala Leu Gly Tyr 305 310 315 320 ACC AAC AGT AGC CTG AAT CCC ATT CTC TAC GCC TTT CTT GAT GAA AAC 1008 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Glu Asn 325 330 335 TTC AAG CGG TGT TTC CGG GAC TTC TGC TTT CCA CTG AAG ATG AGG ATG 1056 Phe Lys Arg Cys Phe Arg Asp Phe Cys Phe Pro Leu Lys Met Arg Met 340 345 350 GAG CGG CAG AGC ACT AGC AGA GTC CGA AAT ACA GTT CAG GAT CCT GCT 1104 Glu Arg Gln Ser Thr Ser Arg Val Arg Asn Thr Val Gln Asp Pro Ala 355 360 365 TAC CTG AGG GAC ATC GAT GGG ATG AAT AAA CCA GTA TG 1143 Tyr Leu Arg Asp Ile Asp Gly Met Asn Lys Pro Val 370 375 380 REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde kappa humain. 2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde kappa, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. 3. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire. 4. Séquence nucléotidique selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques. 5. Séquence selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. 6. Polypeptide résultant de l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications précédentes. 7. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n" 1 ou d'un dérivé de celle-ci. 8. Sequence antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production d'un polypeptide selon l'une des revendications 6 ou 7. 9. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 2 ou avec l'ARNm correspondant. 10. Utilisation d'une sonde selon la revendications 9 pour la détection de l'expression d'un récepteur opioïde; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs opioïdes; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides opioides. 11. Polypeptide selon les revendication 6 ou 7 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur opioïde kappa. 12. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un polypeptide selon l'une des revendications 6, 7 ou 11. 13. Cellule selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes. 14. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des récepteurs opioïdes, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 12 exprimant à sa surface un polypeptide opioide, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celleci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide. 15. Procédé selon la revendication 14 pour la mise en évidence et/ou l'isolement de ligands des récepteurs opioïdes kappa. 16. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des récepteurs opioïdes, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 12 exprimant à sa surface un polypeptide ayant une activité de récepteur opioïde, en présence d'un ligand dudit récepteur, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le ligand, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du ligand sur ledit polypeptide. 17. Ligand ou modulateur d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 6, 7 et 11, susceptible d'être obtenu selon les procédés des revendications 14 à 16. 18. Utilisation d'un ligand ou modulateur identifié et/ou obtenu selon les procédé des revendications 14 à 16 comme médicament. 19. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon la revendication 11. 20. Médicament selon la revendication 19 caractérisé en ce que la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 14 à 16.