Brevet FR2720068A1 — publié le 19951124

La présente invention a pour objet des protéines capables d'interagir avec la protéine Nef du virus HW 1 ainsi que les fragments polypeptidiques de celles-ci qui présentent la même activité à l'égard de la protéine Nef. Elle a également pour objet les séquences d'acides nucléiques codant pour lesdites protéines ou leurs fragments polypeptidiques. Elle a également pour objet les vecteurs d'expression contenant lesdites séquences d'acides nucléiques et les microorganismes procaryotes ou les cellules eucaryotes, transformés avec lesdits vecteurs. Elle concerne aussi l'utilisation desdites séquences d'acides nucléiques ou des protéines ou fragments polypeptidiques correspondants pour le criblage d'agents anti-viraux anti-HIV. Enfin, elle a pour objet des procédés de criblage de nouveaux agents antiviraux anti-HIV ayant une activité inhibitrice sur l'interaction entre la protéine Nef et l'une quelconque des protéines selon l'invention. Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) provoquée par le virus HIV est une affection grave puisque le taux de mortalité des malades atteints du SIDA est extrêmement élevé. La recherche d'agents anti-viraux anti-HIV s'est donc intensifiée ces dernières années. Jusqu'à présent, on a principalement recherché des agents anti-viraux capables d'inhiber les protéines virales ayant une activité spécifique, telles que par exemple les protéases et les reverse-transcriptases. Ainsi, pour le traitement du SIDA, on a déjà proposé des agents anti-viraux qui inhibent l'activité de la reverse-transcriptase. Par exemple, on utilise couramment le 3'-azido-3'-déoxy-thymidine, dénommé AZT pour inhiber la reverse-transcriptase du virus HIV. Cependant, ce produit inhibe non seulement la reverse-transcriptase du virus HIV mais également les enzymes endogènes. De plus, le virus MIV développe une résistance à ce produit, de sorte que son utilisation pour le traitement du SIDA présente certains inconvénients. On a également recherché des agents anti-viraux capables d'inhiber les protéines virales qui interviennent au niveau de la maturation des virus, telles que notamment les protéases. A cet effet, on pourra se référer aux travaux de DARLIX (1991) (1). Les travaux, qui ont abouti à la présente invention, ont porté sur une des protéines régulatrices du virus MIV et ses interactions éventuelles avec les protéines cellulaires. En dehors des trois gènes classiques gag, pol, env, qui sont communs à tous les rétrovirus [DARLIX (1991) (1)], le génome du virus MIV 1 responsable du SIDA, code pour plusieurs protéines régulatrices accessoires qui semblent jouer un rôle important mais non caractérisé à ce jour, tant en ce qui concerne le taux de réplication du virus dans les cellules infectées que la pathologie associée à l'infection virale [voir CULLEN (1991) (2)]. La production de particules virales infectieuses par des cellules infectées par le virus HIV 1, à savoir les lymphocytes T, T4 et les macrophages, fait intervenir de nombreuses interactions entre protéines virales et protéines cellulaires, aux différents stades du cycle viral, depuis l'entrée du virus, la reverse transcription, jusqu'à l'intégration, l'encapsidation et le bourgeonnement des vinons. A ce sujet on pourra pour plus de détail se référer aux articles de J.L. DARLIX (1991) (1) et R. WEISS (1993) (3). La plupart de ces interactions restent non identifiées à ce jour, à l'exception de la liaison à la glycoprotéine de surface CD4, caractéristique des lymphocytes T4 également dénommés cellules T4, qui est considérée comme le récepteur du virus. On pense que les protéines virales régulatrices entrent en interaction avec des protéines cellulaires pour exercer leur fonction. L'identification des partenaires cellulaires de protéines virales permettrait donc d'ouvrir tout un champ nouveau au développement d'inhibiteurs de ces interactions, et donc à la conception rationnelle de nouvelles classes de médicaments anti-HIV. La protéine Nef, qui est décrite en détail par HOVANESSIAN (1992) (4), est l'une de ces protéines régulatrices qui constitue une des cibles privilégiées pour la mise en oeuvre d'une nouvelle stratégie anti-virale. En effet, cette protéine est exprimée très tôt au cours du cycle viral et provoque chez l'hôte infecté une forte réponse immunitaire anti-Nef. De plus, une expérience capitale, réalisée par Harry W.KESTLER et al (1991) (5), a récemment montré chez le singe que, si en culture de cellules le gène Nef n'est pas strictement indispensable à la réplication du virus, en revanche chez un hôte infecté l'expression de Nef est essentielle à la multiplication du virus : les virus délétés de Nef ne se répliquent plus, et sont mêmes capables d'induire une protection de type vaccinal. D'autre part, le(s) mécanisme(s) d'action de la protéine Nef ne sont pas entièrement élucidés, mais l'un de ses effets majeurs est qu'elle provoque la diminution de l'expression de la glycoprotéine de surface CD4 ci-après dénommée CD4 à la surface des lymphocytes T infectés comme l'a montré GARCIA et al. (1991) (6). Cet effet de la protéine Nef a été mis en évidence aussi bien dans les cellules T humaines que dans les cellules T murines. Des travaux récents tels que ceux de l.M. BRADY et al. (1993) (7) ont en effet montré que l'expression de la protéine Nef dans des souris transgéniques perturbe le développement des cellules T porteuses de CD4, dénommées ci-après cellules T CD4+, dans le thymus et provoque ainsi la disparition de CD4 à la surface des cellules T CD4+. Ainsi la protéine Nef pourrait intervenir dans le dysfonctionnement du système immunitaire et la suppression des cellules T CD4+ qui sont associés aux infections par le virus HIV. Etant donné que la diminution de l'expression de CD4 à la surface des cellules T n'a pas été observée au niveau de la transcription et que la synthèse globale de CD4 ne semble pas affectée, on pense que la protéine Nef intervient en bloquant l'étape de post-traduction, ce qui favoriserait la séquestration intracellulaire de CD4 dans les cellules exprimant la protéine Nef. Ce mécanisme de séquestration n'est toutefois pas encore connu. Certains chercheurs pensent que la protéine Nef augmente l'endoeytose de CD4 [AIKEN et al. (1994) (8)] alors que d'autres ont observé que CD4 est retenu au niveau de l'appareil de Golgi [J.M. BRADY et al (7)]. Cet état de la technique montre que la protéine Nef joue un rôle régulateur important pour la multiplication du virus MIV in vivo et les inventeurs de la présente demande ont trouvé trois nouvelles protéines qui interagissent spécifiquement avec la protéine Nef du virus MIV 1. Ainsi la présente invention a pour objet les protéines A, B et C de séquences respectives [SEQ ID No.2, No.4, et No.6] représentées sur les figures 1, 2 et 3 ainsi que les variants de celles-ci résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés ou leurs fragments polypeptidiques, lesdits variants ou fragments conservant l'activité d'interaction vis-à-vis de la protéine Nef. L'invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques à savoir les séquences d'ADN génomiques, les séquences d'ADNc ou d'ARNm, qui comprennent, ou sont constituées, par un enchaînement de nucléotides codant pour l'une quelconque des protéines ou fragments polypeptidiques ci-dessus. L'invention concernent notamment les séquences d'ADNc représentées par: a) l'une quelconque des séquences ID No.1, No. 3, ou No. 5 représentées sur les figures 1, 2 et 3 b) les séquences d'ADN hybridant de manière stricte avec l'une quelconque des séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et code pour l'une quelconque des protéines telles que définies ci-dessus; d) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. Les séquences d'ADNc selon l'invention ont été trouvées par criblage d'une banque d'ADNc de cellules Jurkat (lignée lymphocytaire T humaine, ATCC nHB 152) avec la protéine virale Nef du virus HIV 1 à l'aide du système génétique double hybride de levure. Ce système double hybride, basé sur la détection des interactions protéineprotéine par activation d'un gène rapporteur, His3 ou ss-galactosidase sous le contrôle de domaines de l'activateur transcriptionnel Gal4 dans la levure, a été décrit pour la première fois par FIELDS et SONG (1989) (9). Dans ce système, l'interaction entre les deux protéines hybrides testées permet l'expression du gène His 3 et la croissance des levures sans histidine d'une part, ainsi que l'expression du gène ss-galactosidase d'autre part qui donne une coloration bleue en présence de son substrat X-Gal. Ce criblage, qui sera décrit plus en détail dans la partie expérimentale, a permis d'isoler trois clones positifs, ci-après dénommés clone 3, clone 20 et clone 26A, qui ont été caractérisés par séquençage d'ADN sur séquenceur automatique Applied Biosystem avec la technique des terminateurs de chaîne décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK, FRITSCH et MANIATIS (1989) (10). Une recherche dans les banques de séquences d'ADN a montré que les clones 3 et 20 sont des séquences nouvelles pour lesquelles aucune homologie n'a été retrouvée. Les séquences respectivement de ces clones sont les séquences SEQ ID No. 1 et No. 3 et leurs séquences d'acides aminés déduites sont les séquences SEQ ID No.2 et No.4. Un troisième clone positif, clone 26A, est l'homologue d'une séquence codant pour une protéine de rat, la protéine B-COP, non encore clonée ni cartographiée chez l'homme. La séquence du clone 26A est la séquence SEQ ID No. 5 et sa séquence d'acides aminés déduite est la séquence SEQ ID No. 6. La comparaison des séquences protéiques entre le clone 26A et ss-COP de rat est montrée sur la figure 4. En fait le clone 26A code pour un fragment C-terminal de la protéine ss-COP humaine et présente une très forte homologie, entre 95 et 98% avec la protéine de rat [DUDEN el al. (1991) (11)]. La protéine ss-COP de rat entière comprends 900 résidus. On pense que son homologue humain possède une taille similaire si l'on en juge d'une part par l'importante homologie qui a été présentement détectée dans la partie C-terminale, et d'autre part par la taille de l'ARN messager humain qui est très voisine de celle de l'ARN messager de la t3- COP de rat (3,2kb contre 3,4kb). Les résultats de clonage en double-hybride en levure montrent donc que pour l'interaction de ss-COP humaine avec Nef, seuls les 303 résidus au maximum de l'extrémité C-terminale de ss-COP sont nécessaires. La protéine ss-COP est une protéine de l'appareil de Golgi qui a été décrite par exemple par R.DUDEN et al. (1991) (11). Elle n'est pas connue ni suspectée jusqu a présent pour son action avec la protéine Nef du virus HIV 1. On notera d'ailleurs qu'elle n'est pas connue pour l'endocytose. Son interaction avec la protéine Nef du virus HIV 1 est donc tout à fait surprenante. On comprendra aisément que l'interaction mise en évidence ci-dessus ouvre une nouvelle voie pour la recherche de médicaments anti-viraux anti-HIV. Ainsi, selon un autre aspect la présente invention a pour objet l'utilisation des séquences d'acides nucléiques selon l'invention ou des protéines A, B et C pour le criblage d'agents susceptibles d'inhiber l'interaction entre l'une des protéines A, B, C de l'invention et la protéine Nef du virus MIV 1. A titre d'exemple d'inhibiteurs appropriés, on peut citer les fragments peptidiques qui représentent des séquences partielles, soit de la protéine Nef, soit de l'une des protéines A, B ou C. On peut également sélectionner des inhibiteurs soit à partir de banques aléatoires de peptides, à la surface de phages [Scott J. et Smith G. (1990) (27)], soit en utilisant des oligonucléotides de synthèse aléatoires, selon la technique de type SELEX [Tuerk et Gold (1990) (28)]. Cette technique permet d'isoler à partir d'un pool très large d'oligonucléotides, ceux qui vont avoir une grande affinité pour la protéine d'intérêt, dans le cas présent, soit l'une des protéines A, B ou C, soit la protéine Nef. Ils sont dénommés aptamers. Parmi ces aptamers, on pourra sélectionner ceux qui inhibitent l'interaction avec la protéine Nef par le criblage ci-après. Le criblage défini ci-dessus peut par exemple être réalisé en utilisant le système double hybride en levure dans lequel des cellules de levure co-exprimant la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C selon l'invention sont cultivées sur des milieux dépourvus en histidine en présence de la substance à tester. Ce criblage peut aussi être effectué in vitro en utilisant la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C, l'une des protéines étant immobilisée sur un support approprié et l'autre étant marquée par un moyen quelconque utilisé dans les procédés de détection de substances biologiques, ce moyen de marquage pouvant être par exemple un isotope radioactif, un agent luminescent, de la biotine ou un anticorps spécifique. L'une des protéines sera de préférence immobilisée sous la forme d'une protéine de fusion avec la glutathion S-transférase (GST) sur des billes d'agaroseglutathion, la GST servant d'agent de couplage de ladite protéine sur les billes. A cet effet, on peut avantageusement utiliser le test de scintillation à proximité (SPA) décrit par BOSWORTH et al. (1989) (12) et commercialisé par Amersham. Ce test consiste à marquer par un élément radioactif, par exemple le tritium l'une des protéines et à immobiliser l'autre protéine sur des billes magnétiques ou sur des billes d'agarose-glutathion (GSH). L'effet inhibiteur des substances à tester sur l'interaction des deux protéines peut être facilement détectée sans séparation des espèces radio-actives liées ou libres selon les protocoles décrits par BOSWORTH et al. (12). On peut également utiliser la technique "Surface Plasmon Resonances" décrite par KARLSSON et al. (1991) (13) utilisant le Biacore commercialisé par Pharmacia, pour isoler les inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Nef et l'une quelconque des protéines A, B ou C selon l'invention. L'activité inhibitrice des agents ainsi sélectionnés pourra être vérifiée par des tests sur des cellules T CD4+ ou sur des animaux transgéniques infectés par le virus HIV 1. L'invention a aussi pour objet les microorganismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, en plus de la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de replication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des microorganismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme de métier, qui pourra aisément déterminer en fonction du microorganisme à transformer les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Le microorganisme procaryote préféré aux fins de l'invention est E.Coli alors que l'on utilise de préférence, Sacharromvces cerevisiae comme levure. A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention on peut citer notamment les cellules COS, CHO, SF9, Jurkat etc., toutes répertoriées à l'ATCC. L'invention a aussi pour objet les cellules eucaryotes co-transformées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence d'ADN codant pour la protéine Nef d'une part et une séquence codant pour l'une quelconque des protéines A, B ou C d'autre part, lesdits vecteurs d'expression contenant en plus des moyens utiles à leur expression, y compris dans le système double hybride en levure. Enfin, l'invention a pour objet les vecteurs d'expression définis ci-dessus, qui comportent en plus des moyens nécessaires à leur expression une séquence d'ADN choisie parmi les séquences SEQ ID No. 1, No.3 et No. 5. Les protéines A, B, C et leurs fragments peptidiques de même que des fragments peptidiques de la protéine Nef sont des inhibiteurs potentiels de l'interaction entre la protéine Nef et les protéines cellulaires contenant les séquences SEQ ID No.2, No.4 ou No. 6 et peuvent donc de ce fait être utilisés comme agents anti-viraux anti-HIV. La présente invention a donc aussi pour objet, les agents anti-viraux anti-HIV qui sont constitués par les protéines A, B et C ou leurs fragments peptidiques ayant conservé l'activité d'interaction avec la protéine Nef, ou par des fragments peptidiques de la protéine Nef capables d'inhiber la liaison de la protéine Nef avec des protéines cellulaires contenant les protéines A, B ou C. Les protéines et fragments polypeptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de: - culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et - récupération de la protéine ou du fragment polypeptidique produit par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme de métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA technology I, Editors Ales Prokop, Rakesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme de métier. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique et génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme de métier et décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989) (10). Par exemple, la synthèse des séquences d'ADNc selon l'invention peut être effectuée par amplification des ARNm de cellules humaines à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par Goblet et al (1989) (14), en utilisant des oligonucléotides synthétiques comme amorces, définis à partir des séquences d'ADN SEQ ID No.1, No.3 et No.5. Des amorces appropriées pour la synthèse de la protéine C sont constituées par exemple par les oligonucléotides ci-après: amorce 5' CGAATTAACCCTCACTAAAGAAG GATGG CCTCGTG CCGGAAATTATCC amorce 3' ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCTTAAATTATTGCTG. Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut être ensuite cloné selon les techniques décrites dans Ausubel F.M. et al. (1989) (15). L'invention va être maintenant décrite en détail à l'aide de l'exposé expérimental ci-après. Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces sections, bien connues de l'homme de métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) (10) ou dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989) (15). Les autres méthodes utilisées ainsi que les moyens génétiques mis en oeuvre sont décrits dans les références bibliographiques qui sont répertoriées à la fin de la description. L'ensemble des références ainsi répertoriées sont incorporées à la présente description à titre de références. La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 8. - la figure 1 est la séquence de la protéine A [SEQ ID No. 2] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 1] codant pour cette protéine; - la figure 2 est la séquence de la protéine B [SEQ ID No. 4] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 3] codant pour cette protéine; - la figure 3 est la séquence de la protéine C [SEQ ID No. 6] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 5] codant pour cette protéine; - la figure 4 est la comparaison des séquences protéiques du clone 26A (séquence inférieure) et de ss-COP de rat (séquence supérieure); - la figure 5 est la photographie de boîtes de Pétri montrant la croissance de cellules de levure cotransformées par les plasmides contenant SNF1 + SNF4 ; Nef + B-COP-Cter; 5-COP-Cter; Nef, SNF1 + B-COP-Cter ou SNF4 sur milieu en présence d'histidine (His+) et sur milieu en l'absence d'histidine (His-) - la figure 6 est la photographie d'une immunoempreinte (Western blot) montrant l'interaction de la protéine Nef avec t3-COP-Cter in vitro; - la figure 7 est la photographie d'une autoradiographie après séparation sur gel SDS-PAGE montrant l'interaction in vitro entre la protéine C (ss-COP-Cter) marquée à la méthionine S35 et Nef immobilisée sur billes GST; - la figure 8 est la photographie d'immunoempreintes (Western blot) après traitement - en haut avec des anticorps anti B-COP, - en bas avec des anticorps anti-Nef. Les cellules de levure utilisées dans les exemples ci-après sont des cellules de Sacharromvces cerevisiae. EXEMPLE 1: criblage double hybride en levure / mise en évidence des séquences d'ADNc et des protéines de l'invention Pour identifier les protéines cellulaires susceptibles d'interagir spécifiquement avec la protéine Nef de MIV 1, on a utilisé le système de double hybride en levure décrit par FIELDS et SONG (1989) (9). On a procédé à la fusion du cadre de lecture ouvert entier du gène HIV 1 LAI Nef avec le domaine de fixation de l'ADN Gal4 (Gal4 DB), dans le plasmide pGBT10 [CHARDIN et al. (1993) (16)] et on a utilisé ce plasmide d'expression, désigné ci-après Nef hybride, comme cible pour le criblage en double hybride. On a co-transformé la souche de levure HF7, contenant deux gènes rapporteurs réagissant à Gal4, HIS3 et LacZ, à l'aide du plasmide d'expression Nef - hybride et avec une banque d'ADNc de cellules de Jurkat construite dans pGADî3î8 [ HANNON et al. (1993) (17)]; ce vecteur dirige l'expression de protéines hybrides en fusion avec le domaine activateur de la transcription de Gal4 (Gal4AD). La banque d'ADNc a été construite à partir de 5jg d'ARN poly A+ de cellules Jurkat (ATCC TIBI 152) en utilisant le kit Pharmacia (ref. : 27-9274-01) selon les recommandations du fournisseur, avec une amorce oligo dT/Notl et des adaptateurs EcoRI fournis dans le kit. Les ADNc ont été insérés dans le vecteur pGAD1318 entre les sites EcoRI et NotI. Lorsque l'ADNc code pour une protéine qui interagit avec la protéine Nef, la souche rapportrice se développe en l'absence d'histidine et produit de la ss- galactosidase. Sur les quelques 106 doubles transformants criblés, on a sélectionné 148 clones positifs primaires en identifiant les colonies qui s'étaient développées en l'absence d'histidine. On a ensuite dosé l'activité ss-galactosidase de ces colonies et on a constaté que 28 des 148 colonies His+ exprimaient une activité ss- galactosidase. On a récupéré des plasmides de banque de chacun de ces clones et on les a utilisé pour retransformer la souche rapportrice en combinaison avec soit la protéine cible Nef soit une cible étrangère représentée par la protéine de levure SNF4 [FIELDS & SONG 1989(9)]. Seuls trois plasmides de banques, les clones 3, 20 et 26A, ont conféré à HF7 la capacité de croître en l'absence d'histidine et de produire une activité ss-galactosidase en présence de la cible Nef et non avec un hybride formé entre le domaine de liaison de l'ADN Gal4 et SNF4 ou un Gal4 BD sans insert (voir figure 5). Les séquences d'ADNc de ces trois clones, déterminées par séquençage d'ADN sur séquenceur automatique Applied Biosystem, sont représentées sur les figures 1, 2 et 3. Alors que les clones 3 et 20 ne présentent aucune homologie avec les séquences existantes des banques de séquences, le clone 26A, comme représenté à la figure A, fait preuve d'une similarité frappante avec une des séquences figurant dans les bases de données existantes, la protéine ss -COP de rat [Duden et al., (1991) (11)]. En fait, le clone 26A code pour les 303 résidus amino-acides carboxy-terminaux de la protéine ss-COP humaine (protéine C). Le niveau de conservation de séquence entre les deux protéines est extrémement élevé, supérieur à 95% ; sur ces 303 résidus, on ne note que 9 différences. En outre, on a découvert par la technique de Northen que la taille de l'ARNm de la ss-COP humaine (3,2 kb) (donnée non représentée), était très similaire à celle de la RNAm de la ss-COP du rat (3,4kb) [Duden et al., (1991) (11)j. De plus, pour confirmer la spécificité de l'interaction de la protéine Nef avec la protéine C (B-COP), on a utilisé plusieurs produits d'assemblage différents de protéines hybrides fusionnés avec le domaine d'activation transcriptionnel de Gal4 ou de LexA, à savoir des protéines cellulaires telles que rabS, rab6 et des protéines de HIV 1 telles que pS5 Gag pr ou NCp7. Aucune de ces protéines hybrides n'a présentée d'aptitude à interagir avec Nef. De même, en utilisant un produit d'assemblage hybride formé avec le domaine cytoplasmique de CD4 aucune interaction directe entre Nef et CD4, ni entre ss-COP-Cter et CD4 n'a pu être détectée. Dans les exemples ci-après, on a vérifié que l'interaction de l'une des protéines de l'invention, la protéine C (ou protéine ss-COP-Cter) avec la protéine Nef existe in vitro et, ex vivo dans des cellules chroniquement infectées par le virus HIV 1. EXEMPLE 2 : interaction in vitro entre la protéine Nef et la protéine ss-COP-Cter (protéine C) Pour déterminer si l'interaction entre Nef et le fragment C-terminal de ss- COP (B-COP Cter) était directe ou médiée par une protéine de levure non identifiée, on a étudié cette interaction in vitro, en utilisant les deux protéines exprimées par voie bactérienne en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) [Smith et Johnson (1988) (18) et Bougeret et al.(1993) (19)]. Ces protéines de fusion ont été utilisées sous une forme immobilisée sur des billes de glutathion (billes GSH) ou clivés ensuite de la fraction de GST par la thrombine. a) Création de plasmides recombinants pGEX. expression et purification des protéines de fusion GST-Nef et GST-ss-COP-Cter La séquence codante pour Nef (621 bp) a été récupérée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) réalisée sur le génome entier de la souche HIV 1 LaI [Peden et al., (1991) (20)]. Les amorces oligo-nucléotidiques utilisées pour l'amplification de Nef sont les suivantes amorce S'(BamHI) CGGGATCCATGGGTGGCAAGTGTCAAAAAG (LAI8390-84 12), amorce 3' (EcoRI) CCGGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCG (LAI8988-9010). Les produits de la PCR ont été purifiés sur gel, soumis à une double digestion par BamMJ/EcoRI et clonés dans les sites BamHI-EcoRI du vecteur d'expression bactérien pGEX2T (Pharmacia), en phase avec le gène de la Glutathion S-transférase (GST). Pour vérifier l'insertion et pour s'assurer que la PCR n'avait pas introduit d'erreur dans la séquence, on a procédé au séquençage de l'ADN double brin à l'aide d'un kit Séquénase version 2.0 (commercialisé par United States Biochemical) selon le protocole fournit par le fabricant. Après l'avoir isolé par criblage en double hybride, on a sous-cloné le clone 26A représentant les 303 résidus amino-acides C-terminaux de la ss-COP (ss-COP-Cter) humaine en tant que protéine de fusion en phase avec GST en utilisant le vecteur pGEX 4,3 (Pharmacia). ss-COP-Cter on a lavé les billes à trois reprises avec NaCl 1M et à deux reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). On a estimé la quantité de protéine de fusion immobilisée sur les billes après électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie, par comparaison des intensités des bandes avec celles de protéines étalons de concentration connue. On a identifié les protéines de fusion par immunoempreintes (Westem blot) à l'aide d'anticorps anti-Nef (FM11-BF7) [BRADY et al. (1993) (7)] et des anticorps anti-ss-COP (mAD) PEPPERKOK et al. (1993) (26). Pour préparer Nef sous une forme pure, on a traité GST-Nef immobilisée sur des billes GSH par de la thrombine [Smith & Johnson (18) Bougeret et al. (19)] et on a ensuite élué les billes. La pureté de chaque fraction éluée a été vérifiée par SDS-PAGE. b) Etude de la liaison in vitro de Nef à la protéine de fusion GST-ss-COP- Cter immobilisée sur des billes de GSH Pour étudier la liaison de ss-COP-Cter in vitro, la protéine ss-COP-Cter a été produite sous forme de GST-ss-COP-Cter comme décrit plus haut, puis immobilisée sous forme de GST-ss-COP-Cter sur des billes d'agarose-glutathion, et ensuite incubée avec 30,ut de protéine Nef purifiée pendant 30 minutes à 4-C, dans le tampon TENGN. Après lavages, les billes ont été traitées par SDS 1% à 95 pendant 1 minute, puis analysées par Western blot avec des anticorps anti-Nef (FM11-BF7). De manière réciproque, on a pu démontrer que la protéine ss-COP- Cter traduite in vitro et marquée à la méthionine 35S se liait à la protéine Nef exprimée sous forme de GST-Nef et immobilisée sur des billes d'agaroseglutathion. c) Svnthèse in vitro de ss-COP-Cter et liaison à GST-Nef immobilisée sur des billes GSH On a préparé des transcrits T3 de ss-COP-Cter à partir d'un fragment amplifié par PCR sur le plasmide pGal4BD-ss-COP-Cter, selon la technique générale décrite par [GASPAR et al. (1991) (21)]. L'amorce oligonucléotide 5' comporte successivement une séquence promotrice T3 devant un Codon d'initiation ATG en phase avec la phase de lecture de ss-COP-Cter. L'amorce 3' est choisie après le Codon Stop. La séquence des amorces utilisées est la suivante amorce 5': CGAATTAACCCTCACTAAAGAAGGATGGCCTCGTGCCGGAAATTATCC amorce 3': ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCITAAATTATTGCTG . Après PCR, on a préparé le transcrit T3 de B-COP-Cter en utilisant de la T3 ARN polymérase et le kit de transcription de Stratagène (mCapmRNA Cappingkit) selon les instructions du fabricant. On a ensuite utilisé le transcrit T3 de ss-COP- Cter pour traduction in vitro de 5-COP-Cter marquée au 35S à l'aide du kit de traduction in vitro de Stratagène selon les instructions du fabricant. On a utilisé de la ss-COP-Cter marquée au S35 dans les expériences de liaison à GSH-Nef ou GST immobilisées sur des billes GSH dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus à propos de Nef et de GSH-ss-COP-Cter. Les résultats obtenus sont représentés sur les figures 6 et 7. Dans l'expérience représentée à la figure 6, on a d'abord chargé GST-ss-COP Cter ou GST, utilisée comme témoin, sur des billes GSH, puis on a incubé avec de la protéine Nef purifiée, obtenue après clivage de GST-Nef par la thrombine. Après lavage, on a analysé la protéine Nef liée par SDS-PAGE par immunoempreinte avec des anticorps anti-Nef. On constate que la protéine Nef s'est liée spécifiquement à GST-ss-COP Cter (piste 3), mais non à GST (piste 2), ce qui confirme in vitro l'interaction détectée dans la levure à l'aide du système en double hybride. En outre, comme montré à la figure 7, ,B-COP Cter traduite in vitro et marquée par la 35S méthionine, comme indiqué ci-dessus, s'est liée sur la GST Nef immobilisée sur les billes de glutathion (piste 1) mais non sur GST (piste 2), ce qui confirme de nouveau que les deux protéines interagissent directement in vitro. EXEMPLE 3: Co-immunoprécipitation de Nef et ss-COP à partir de lysat de cellules infectées chroniquement par HIV1 m B 15.106 cellules H9 (ATCC n HTB176H9) infectées chroniquement par un isolat de HIV 1 NDK [POPOVIC et al., (1984) (22)] ont été éventuellement traitées à la Bréfeldine A (BFA) à raison de 2g/ml, puis perméabilisées avec 0,8 Hg/ml de Streptolysine O (Murex) selon les conditions décrites par DONALDSON et al. (1991 (23). Des anticorps anti-Nef HIV 1HXB3 [HAMMES et al. (1989) (24) ont ensuite été ajoutés au 1: 250 aux cellules perméabilisées. Les étapes ultérieures de l'immunoprécipitation ont été effectuées selon les enseignements de BENNETF et al. (1992) (25). Les immunoprécipités ont été analysés par immunoempreinte (Western blot) avec soit des anticorps anti--COP (mAD 1 : 1000) [PEPPER KOK et al. (1993) (26)] soit avec des anticorps anti-Nef (AE6 1:100) [BRADY et al. (1993) (7)]. 15.106 cellules non infectées ont été traitées de la même manière à titre de contrôle. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 8 sur laquelle les différentes pistes sont explicitées ci-après Piste 1: Lysat total de cellules H9(1,5.106 cellules) non infectées, contrôle du Western blot avec des anti-ss-COP, pour identifier la bande correspondant à ss- COP. Pistes 2 à 5 : Immunoprécipités: - de cellules H9 non infectées (piste 3) - de cellules H9 non infectées, après addition de Nef recombinant, (rNef), préparé comme détaillé plus haut (piste 2) - de cellules H9 chroniquement infectées par MIV 1 III B (piste 4) - de cellules H9 chroniquement infectées par HIV 1 III B, après traitement à la Bréfeldin A (BFA) (piste 5). Comme on peut le voir sur cette figure, quand les immunoprécipités des cellules infectées, obtenus avec des anticorps anti-Nef, sont analysés en Western blot avec des anticorps anti-ss-COP, une bande de 110 kD qui correspond à t3- COP est détectée, et la protéine Nef est également détectée avec des anticorps anti-Nef (pistes 4 et 5). Dans des cellules non-infectées utilisées comme contrôle, le résultat est négatif. Mais la protéine Nef recombinante, ajoutée à un lysat de cellules non infectées, est également capable de co-précipiter avec ss-COP (piste 2). BIBLIOGRAPHIE (1) J.L. DARLIX (1991) Bull Inst. Pasteur. 89, 211-242 (2) CULLEN B.R. (1991) Ann. Rev. Microbiol., 45, 19-50 (3) WEISS Robin A. (1993) Science, vol. 260 1273-1279 (4) HOVANESSIAN (1992) Inst. Pasteur/Elsevier Res. Virol. 143, 31-81 (5) KESTLER III, J.H., Ringler, D.J., Mori, K., Panicali, D.L., Sehgal, P.K., Daniel, M.D. and Desrosiers, R.C. Cell 65, 651-662 (1991) (6) GARCIA, J.V. and Miller, A.D. Nature 350, 508-510 (1991) (7) BRADY, H.J.M., Pennington, D.J., Miles, C.G. and Dzierzak, E.A. EMBO J. 12, 4923-4932 (1993) (8) AIKEN C., Konner, J., Landau, N.R., Lenburg, M.E. and Trono, D. Cell 76, 853-864, (1994) (9) FIELDS S. and SONG O. Nature 340,245-246 (1989) (10) SAMBROOK, FRlTSCH et MANIAIS "Molecular cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New-York (2ème édition) (11) DUDEN R., Griffiths, G., Frank, R., Argos, P. and Kreis, T.E. Cell 64, 649 665 (1991) (12) BOSWORTH N. et al. Nature 341 167-168 (1989) (13) KARLSSON et al. J. immunol. methods 145, 229-233, (1991) (14) GOBLET ET AL. Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989 (15) AUSUBEL F.M. Brent R., Kingston R.E. Moore D.D., Smith J.A., Seidman J.G. et Struhl K. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, chapître 3, Green Publishing Associates et Wiley-Interscience, New-York (16) CHARDIN et al. Science 260, 1338-1343 (1993) (17) HANNON, G.J., Demetrick, D. and Beach, D. Genes & Dev. 7, 2378-2391 (1993) (18) SMITH, D.B. and Johnson, K.S. Gene 67, 31-40 (1988) (19) BOUGERET et al. Oncogene 8, 1241-1247 (1993) (20) PEDEN, K., et al. (1991) Virology 185, 661-672 (21) GASPAR et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8606-8610 (1991) (22) POPOVIC et al. Science 224, 497-500 (1984) (23) DONALDSON et al. J.Cell Biol. 112, 579-588 (1991) (24) HAMMES et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9549-9553 (1989) (25) BENNE et al. J.Cell Biol. 116, 761-765 (1992) (26) PEPPERKOK et al. Cell, 74, 71-82 (1993) (27) SCOUT J. et Smith G, Science 249, 386-390 (1990) (28) TUERK et Gold 1990 Science 249, 505-510 SEQUENCE LISTING SEQ ID No.1 GGA ATT CGG CAC GAG GGC CTT GGT CAA GGG AGG CAG GCG TAC AAA TCC ATT TGG AGA ATC TGG AGG AAG TAC AAA ATC TTG AAA CTG AAG ATT CTA TTC TTC ATC AGT TAT TTA TGT CCG ATT CCT SEQ ID No.2 gly ile arg his glu gly leu gly gln gly arg gln ala tyr lys ser ile trp arg ile trp arg lys tyr lys ile leu lys leu lys ile leu phe phe ile ser tyr leu cys pro ile pro SEQ ID No.3 GAG GGT CAG GTT CTG TGT ATG TCT CCG CGT CTT CCG CGA GCG GTG TGC AGG GCC TGC AGC ATT GAA CTA GAT GTC GTC CCC GCA GGC CCC AGA AGA TGG GCA GGG CTG TGG CGA CCG CGG CGA TCC CCC TGG GGA CCT CCG SEQ ID No.4 glu gly gln val leu cys met ser pro arg leu pro arg ala val cys arg ala cys ser ile glu leu asp val val pro ala gly pro arg arg trp ala gly leu trp arg pro arg arg ser pro trp gly pro pro SEQ ID No.5 AAA TTA TCC CAA AAG AAA GAA TCT GAA AAG AGG AAT GTG ACA GTA CAG CCT GAT GAC CCC ATT TCC TTC ATG CAA CTA ACT GCT AAG AAT GAA ATG AAC TGC AAG GAA GAT CAG TTT CAG CTG AGT TTA CTG GCA GCA ATG GGT AAC ACA CAG AGG AAA GAG GCA GCA GAT CCC CTA GCA TCT AAA CTT AAC AAG GTC ACC CAA TTG ACA GGT TTC TCA GAT CCT GTA TAT GCA GAA GCT TAC GTT CAT GTC AAC CAA TAT GAT ATT GTC CTG GAT GTA CTT GTT GTG AAC CAA ACC AGT GAT ACT TTG CAG AAT TGC ACA TTA GAA CTA GCT ACA CTA GGG GAT CTG AAA CTT GTG GAA AAG CCG TCT CCT TTG ACT CTT GCT CCT CAT GAC TTC GCA AAT ATT AAA GCT AAC GTC AAA GTA GCA TCA ACA GAA AAT GGA ATA ATT TTT GGT AAT ATA GTT TAT GAT GTC TCT GGA GCA GCA AGT GAC AGA AAT TGT GTG GTC CTC AGT GAT ATT CAC ATC GAA ATC ATG GAC TAT ATC CAG CCT GCA ACT TGC ACT GAT GCA GAA TTC CGT CAG ATG TGG GCC GAA TTG GAA TGG GAA AAC AAA GTG ACA GTT AAC ACC AAC ATG GTT GAT TTA AAT GAC TAC TTA CAG CAC ATA TTA AAG TCA ACC AAT ATG AAA TGC CTG ACT CCA GAA AAG GCC CTT TCT GGT TAC TGT GGC TTT ATG GCA GCC AAC CTT TAT GCT CGC TCC ATA TTT GGT GAA GAT GCA CTT GCA AAT GTC AGC AGT GAG AAG CCA TTA CAC CAG GGA CCA GAT GCT GCT GTT ACC GTC CAT ATA AGA ATT CGT GCA AAG AGC CAG GGA ATG GCC TTA AGT CTT GGA GAT AAA ATC AAC TTG TCA CAG AAG GAA ACT AGT ATA SEQ ID No.6 lys leu ser gln lys lys glu ser glu lys arg asn val thr val gln pro asp asp pro ile ser phe met gln leu thr ala lys asn glu met asn cys lys glu asp gln phe gln leu ser leu leu ala ala met gly asn thr gln arg lys glu ala ala asp pro leu ala ser lys leu asn lys val thr gln leu thr gly phe ser asp pro val tyr ala glu ala tyr val his val asn gln tyr asp ile val leu asp val leu val val asn gln thr ser asp thr leu gln asn cys thr leu glu leu ala thr leu gly asp leu lys leu val glu lys pro ser pro leu thr leu ala pro his asp phe ala asn ile lys ala asn val lys val ala ser thr glu asn gly ile iie phe gly asn ile val tyr asp val ser gly ala ala ser asp arg asn cys val val leu ser asp ile his ile glu ile met asp tyr ile gin pro ala thr cys thr asp ala glu phe arg gln met trp ala glu leu glu trp glu asn lys val thr val asn thr asn met val asp leu asn asp tyr leu gln his ile leu lys ser thr asn met lys cys leu thr pro glu lys ala leu ser gly tyr cys gly phe met ala ala asn leu tyr ala arg ser ile pne gly glu asp ala leu ala asn val ser ser glu lys pro leu his gln gly pro asp ala ala val thr val his ile arg ile arg ala lys ser gln gly met ala leu ser leu gly asp lys ile asn leu ser gln lys glu thr ser ile REVENDICATIONS 1. Protéines capables d'interagir avec la protéine Nef du virus MIV 1, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les protéines A, B et C ayant respectivement les séquences SEQ ID No. 2, SEQ ID No.4 et SEQ ID No.6 ainsi que leurs variants et leurs fragments peptidiques ayant conservé l'activité d'interaction vis-à-vis de la protéine Nef. 2. Séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine A capable d'interagir avec la protéine Nef du virus HIV 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADNc SEQ ID No.1; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci et codant pour ladite protéine A; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour ladite protéine A; d) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. 3. Séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine B capable d'interagir avec la protéine Nef du virus MIV 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADNc SEQ ID No. 3; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci et codant pour ladite protéine B; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour ladite protéine B; d) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. 4. Séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine C capable d'interagir avec la protéine Nef du virus HIV 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADNc SEQ ID No.5; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci et codant pour ladite protéine C; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour ladite protéine C; d) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. 5. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, et les moyens nécessaires à son expression. 6. Utilisation des protéines selon la revendication 1, pour le criblage d'inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Nef du virus HIV 1 et l'une quelconque des protéines A, B ou C. 7. Utilisation des séquences d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, pour le criblage d'inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Nef du virus HIV 1 et l'une quelconque des protéines A, B ou C. 8. Kit pour le criblage par le système double hybride en levure, d'inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Nef et l'une quelconque des protéines A, B ou C selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient des cellules de levure cotransformées à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine Nef et d'un vecteur d'expression selon la revendication 5. 9. Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 5. 10. Microorganismes ou cellules hôtes co-transformés par un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine Nef du virus HIV 1 et un vecteur d'expression selon la revendication 5. 11. Procédé de criblage d'agents anti-viraux anti-HIV mettant en oeuvre le système double hybride en levure, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules de levure co-transformées par un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine Nef du virus HIV 1 et un vecteur d'expression selon la revendication 5 en présence des agents à tester et à isoler les agents qui inhibent l'interaction entre la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C. 12. Procédé de criblage d'agents anti-viraux anti-HIV, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre les agents à tester en présence de la protéine Nef et de l'une quelconque des protéines A, B ou C, l'une des protéines étant immobilisée sur un support et l'autre étant marquée et à isoler les agents qui inhibent l'interaction entre la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C. 13. Agents anti-viraux anti-HIV constitués par les protéines A, B et C ou leurs fragments peptidiques ayant conservé l'activité d'interaction avec la protéine Nef, ou par des fragments peptidiques de la protéine Nef capables d'inhiber la liaison de la protéine Nef avec des protéines cellulaires contenant les protéines A, B ou C selon la revendication 1.