Brevet FR2722294A1 — publié le 19960112

Le domaine de l'invention est celui de la détection de produits, de préférence biologiques ("affins"), notamment de haut poids moléculaire, tels que les acides nucléiques, ou bien encore les biopolymères de nature protéique. Plus précisément la présente invention concerne, d'une part, un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, (de préférence biologiques) présentes dans un milieu liquide conducteur (LC), par l'intermédiaire de mesures électriques et, d'autre part, un capteur d'affinité bioélectronique ou biochimique destiné à la mise en oeuvre de ce procédé. Les substances biologiques, plus particulièrement mais non limitativement, visées par l'invention sont les acides nucléiques ARN ou ADN et toute structure génétique en comprenant, ainsi que les composés susceptibles d'entre impliqués dans des réactions; de couplage immunologique antigènes (as)/ anticorps (Ac) ]. Pour détecter, rdentifier ou doser ce genre de molécules, on a exploité leurs propriétés de bioaffinité à savoir leur aptitude singulière à s'apparier spécifiquement avec leurs; complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique ou de couplage immunologique. C'est ainsi que, dans le domaine immunologique, on connaît des méthodes fondées sur le couplage antigène/anticorps et qui font intervenir une étape de révélation des couples formés à l'aide de marqueurs radioactifs, enzymatiques fluorescents, colorés ou analogues. De telles méthodes sont longues et complexes à mettre en oeuvre. De plus, les réactifs utilisés sont peu disponibles et onéreux. Enfin, ces méthodes ne permettent pas des mesures en continu et encore moins in vivo. Ces techniquessont été transposées avec leurs défauts au domaine de la détection de séquences nucléiques. Dans un autre registre, il a été proposé de s'attacher à la détection des signaux physiques de toute nature, susceptibles d'etre induits par les rections biochimiques d'hybridation nucléotidique ou couplage immunologique. Pour ce faire, il convient, tout d'abord, d'isoler un type de signaux particuliers et caractéristiques, puis d'adopter un transducteur apte à convertir lesdits signaux en une grandeur physique mesurable. Ces signaux peuvent être, par exemple, la production d'une espèce chimique, une variation d'épaisseur, d'indice optique, de masse ou bien encore une variation de charge électrique. Les transducteurs peuvent donc être des capteurs électrochimiques, piézoélectriques, optiques ou électriques. Toute la difficulté réside dans la mise en évidence des signaux spécifiques de l'appariement et dans la mise au point d'un transducteur correspondant fiable, sensible et fidèle. L'invention décrite dans la demande de brevet français n 86 OC 315 du 30 avril 1986, s'insère parfaitement dans cet état de la technique fondé sur la détection des signaux électriques, induits par des réactions antigène-anticorps, dans un milieu liquide conducteur de l'électricité. Bien que non limitée aux réactions immunologiques, cette demande de brevet n'exemplifie pourtant que ce type de réaction. Ce procédé antérieur consiste à mettre en contact, dans une cellule de mesure, un milieu liquide avec une plaque porte-réactif comportant un ligand spécifique, fixé directement sur une face d'une couche en matériau mince isolant, dont l'autre face est fixée sur un support capable de conduire l'électricité. Ce procédé est caractérisé en outre, par le fait que l'on mesure les composantes capactives et/ou résistives de l'impédance électrique du système milieu liquide/couche isolante/support, pour une tension donnée, et que l'on compare lesdites composantes à celles d'un système de référence, analogue au pricédent, mais exempt de ligands spécifiques. Une éventuelle diminution de la capacité ou une variation de la résistance par rapport au système de référence est révélatrice de la présence de ladite substance dans le milieu liquide étudié. Les variations de capacité ou de résistance auxquelles on s'intEesse dans ce système de mesure connu sont relativement faibles. I1 en résulte que la sensibilité de la méthode n'est pas excellente. En outre, cette technique est, en pratique, limitée aux couples d'appariement immunologique antigène-anticorps ne s'applique pas à la détection, I'identification ni dosage de séquences nucléotidiques par hybrydation ARN, ADN, ADNc, gène, plasmide, virus Enfin, cette technique connue nécessite la mise en oeuvre d'un dispositif de mesure encombrant et peu commode à utiliser. fl n'est pas susceptible d'être miniaturisé et donc de permettre des mesures in vivo, en mode continu ou discontinu. n est à souligner, également, que cette demande de brevet fait directement référence à un autre état de la technique, dans lequel on exploite les variations de différence depotentiel, provoquées par le couplage antigèneanticorps à l'interface d'une membrane sensible/solution électrolytique. Ces variations ont pour effet de faire varier le champ électrique transversal dans un transistor à effet de champ. Les signaux recueillis sont ceux obtenus par une mesure potentiométrique, des fluctuations du potentiel de grille ou du courant de drain. Une telle technique, divulguée par exemple par J. JANATA et al - ANNALE NEW YORK - Academy of sciences, 286 - 292 (1984), est clairement qualifiée de non -fique pour les auteurs de la demande de brevet n 86-06 315. Dans cet état delconnaissances, I'un des objectifs essentiels de la prsente invention est de fournir un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques qui soit - spécifique, - de haute sensibilité, - commode à mettre en oeuvre, - applicable à une grande variété de substances biologiques et notamment aux substances (poly)nucléotidiques, - d'un coût de revient faible, - et enfin qui soit miniaturisable de façon à permettre des mesures analytiques, in situ et/ou in vivo, de façon continue ou discontinue. Pour satisfaire à tous ces objectifs parmi d'autres, la Demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence, de façon tout à fait surprenante et inattendue, que les appariements spécifiques entre des macromolécules, de préférence, biologiques du type antigène-anticorps, nucléotides-nucléotides complémentaires ou enzymes substrats, entres autres, s'accompagnent d'un effet de charge et donc incidemment d'une variation du potentiel de bande plate Vbp, du semiònducteur dans une structure, de préférence multicouches, semi-condueteur!isolant/membrane sensible (SdIs/Mbs). Ce phénomène d'effet de charge intervient à l'interface d'un milieu liquide conducteur (LC) et d'une mémbrane sensible comprenant au moins un ligand correspondant à une des espèces formant les paires de composés biologiques aptes à s'apparier spécifiquement. Cette membrane est séparée du semiconducteur par une couche isolante. La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, présentes dans un milieu liquide conducteur (LC), à l'aide d'au moins un capteur d'affinité comprenant au moins une structure (SdIslMbs) comportant au moins un matériau seDmi- conducteur (Sc), revêtu sur l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant (lus), elle-même accolée à au moins une membrane sensible (Mbs), en contact avec le milieu conducteur (LC) et comprenant des ligands complémentaires aux substances biologiques visées et aptes à s'apparier spécifiquement avec ces dernières, caractérise en ce qu'il consiste essentiellement: - à appliquer une tension entre le semi-conducteur et le milieu conducteur, - à recueillir les variations des signaux électriques induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lie aux appariements des substances biologiques visées avec leurs ligands complémentaires compris dans la membrane sensible, à l'exclusion des variations résultant d'éventuels effets de charge provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, - et à interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des substances visées. Un tel mode de mesure par transduction électrique répond aux spécifications recherchées de simplicité, sensibilité et spécificité. En particulier, cette méthode s'est révélée être d'une efficacité remarquable dans le cadre de la reconnaissance de séquences (poly)nucléotidique, par hybrydation de brins d'acides nucléiques (ligands) avec des brins d'acides nucléiques complémentaires, immobilisés sur la membrane sensible d'une structure semiconductrice. fl va de soi que le procédé de l'invention n'est pas limité à ce type de substances nucléotidiques, mais concerne, également, des substances biologiques immunologiques (AglAc) entre autres. De plus, il convient de noter que les mesures effectuées par ce procédé sont fiables et précises. Par ailleurs, la technique selon l'invention présente également l'avantage d'être réversible. En effet, on peut aisément réaliser le désappariement des espaces complémentaires ayant réagi spécifiquement au niveau de la membrane sensible de la structure semi-conductnce. La membrane sensible peut être ainsi régénérée après chaque utilisation et ce à de multiples reprises. L'intérêt de ce procédé est de permettre la détection etlou le dosage des substances biologiques, enimettant à profit leur propriété d'affinité spéciSique. Cette technique d'analyse par affinité ne nécessite pas d'interméddures de réactions, ni de marqueurs spécifiques, ni de réactions enzymatiques. De tels résultats avantageux étaient, a priori, difficilement prévisibles, dans la mesure où l'on s'accordait à reconnaître dans le domaine technique considéré, que les réactions de couplage immunologique, de complexation enzymatique ou bien encore d'hybridation nucléique, n'entraînaient pas de phénomènes d'effet de charges significatives et exploitables en analytique. La présente invention renverse totalement ce préjugé technique et permet d'envisager, notamment, la reconnaissance de séquences nucléotidiques, par exemple en vue de la détection de maladies génétiques, de la détection et la caractérisation de virus, de bactéries et de parasites ou de l'établissement de cartes génétiques. Conformément. à l'invention, les appariements spécifiques qui sont exploités, répondent à au moins l'un des mécanismes biochimiques suivants - hybridation nflclêotidique, - couplage immunologique. La structure au coeur de la présente invention est avantageusement une structure multicouches constituée, successivement d'au moins un matériau semisonductcur (sic), - d'au moins une couche de matériau diélectrique bloquant (ils) (par exemple une couche d'oxyde de faible épaisseur, empochant tout phénomène faradique), - et au moins d'une membrane sensible comprenant au moins un ligand d'appariement biospécifique (Mbs), Cette structure étant associée à:un milieu liquide conducteur contenant les substances à doser à détecter ou à identifier (LC). Le retour à l'équilibre thermodynamique intervenant suite à l'imposition d'une tension continue Vpol à cette structure, par rapport à une référence (polarisation), conduit à l'ajustement des niveaux de Fermi du semi-conducteur du milieu liquide conducteur. Cela entraîne une répartition de charges à l'intérieur du semi-conducteur, et plus particulièrement dans sa zone de charge d'espace (effet de charge), de façon à assurer la neutralité électrique. Ce phénomène entraîne l'apparition de la courbure de bande du semiònducteur. Le potentiel de bande plate Vbp est le potentiel qu'il faut appliquer au système (par rapport à une électrode de référence de potentiel plongé dans le milieu liquide) pour que la courbure de bande du semi-conducteur soit nulle. Dans la mesure où la charge électrique varie à la surface du semiconducteur, sous l'effet de l'appariement espèce biologique (ligand)/esp2cc biologique complémentaire, cela entrains une compensation naturelle de cette modification de charge, par réorganisation de la répartition de charge dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur. Cela crée donc un nouveau charnp électrique dans la structure (nouvel effet de charge) et induit une nouvelle courbure de bandes et, par suite, une variation du potentiel de bande Vbp du semi-conducteur. n s'agit là d'une variation de signaux électriques parmi d'autres, que l'on peut recueillir comme transduction de l'appariement biospécifique Ligand / complémentaire à analyser. Conformément à un premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, c'est par la mesure d'impédance électrochimique que l'on va caractériser les structures semi-conducteur I Isolant / Membrane sensible / Liquide conducteur et déterminer, notamment, l'effet de charge induit. Pour cela: - on met en oeuvre une méthode de mesure potentiostatiquc à au moins trois électrodes, à savoir * au moins une électrode de travail constituée par la structure semiconducteur/isolant/membrane sensible, * au moins une électrode de référence formant le système de référence (par exemple du type AglAgCl), * au moins une contre-électrode. - on applique à l'électrode de travail une tension de polarisation V continue par rapport à l'électrode de référence plongée dans le milieu électrolytique, - on surimpose une modulation électrique sinusoïdale à cette tension VpO" - on mesureila tension V électrode de travail / électrode de référence et le courant I traversant l'électrode de travail, - on calcule les impédances en phase Zp et en quadrature Zq, on établit la (ou les) courbe(s) Zp etlou Z,en fonction de V, - et on suit le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallemcnt à l'axe des potentiels, ledit déplacement correspondant aux variations de signaux électriques, induites par l'effet de charges résultant des appariements spécifiques des substances biologiques à analyser avec leurs ligands complémentaires présents dans la membrane sensible, et recueillies selon le protocole défini cidessus. De préférence, le déplacement de la (ou des courbes) Zp et/ou 4 en fonction de Vpoi est suivi au travers du potentiel de bande plate Vbp du semiconducteur, que l'on déduit de ladite (ou desdites) courbe(s). Avantageusement, la tension continue de polarisation V varie dans une fourchette contenant la zone de désertion du semi-conducteur, de préférence dans une fourchette de - 3 à + 3 volts, et plus préférentiellement encore de - 1,5 à + 1,5 volts. Concernant la modulation électrique sinusoïdale surimposée, elle se situe, de préférence, dans une gamme de moyennes fréquences variant de 50 à 500 kHz, de préférence de 100 Hz à 100 kHz. Cette modulation est, par ailleurs, avantageusement de faible amplitude, e. g : comprise entre 1 mV et 100 mV. Pour plus de commodité, on a recours à un convertisseur courantitension, commutable électroniquement et permettant de mesurer alternativement, soit la tension V présente entre les électrodes de référence et de travail, soit le courant I traversant la structure. Avantageusement, ces deux grandeurs sont analysées en phase (partie réelle) ou en quadrature (partie imaginaire) grâce à une détection synchrone calée-sur la fréquence de la modulation sinusoïdale fournie par le générateur. Selon une disposition préférée de l'invention, le pilotage et l'acquisition des mesures se font par l'intermédiaire d'un microordinateur, qui effectue le calcul des impédances selon la loi d'Ohm, de manière connue en soi. Ce mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, par mesure d'impédances, permet de tracer les courbes d'impédance en phase (Z,;) et en quadrature (Z), en fonction de la tension V. Le déplacement des courbes d'impédances parallèlement à l'axe des potentiels provoqués par l'effet de reconnaissance biologique, entre autres, correspond aux variations du potentiel de bandes plates de la structure ScIIsIMbs. Le potentiel de bande plate V,, est déterminé à partir de la courbe, d'impédance en quadrature par application de la relation bien connue de MaIT- SCHOTTKY. Les mesures d'impédances permettent d'évaluer ainsi les signaux électriques induits par les interactions biologiques à la surface de la structure. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on met à profit l'effet de champ induit par les variations de charge de surface, provoquées par l'appariement des substances biologiques complémentaires. Cet effet de champ, localisé dans la zone superficielle du serniconducteur sous-jacent, provoque une modification de la concentration de porteurs de charge libre dans cette zone et, en conséquence, de la transconductance du canal d'un transistor à effet de champ, qui est utilisé conformément à ce deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Le capteur électrochimique utilisé dans ce mode de mise en oeuvre est donc un transistor à effet de champ, dont la grille en contact avec le milieu électrolytique de dosage est constituée par la membrane sensible. Ce transistor est associé à au moins une électrode de référence plongeant également dans le milieu liquide conducteur. Les signaux qui sont induits par la réaction des substances biologiques avec la membrane sensible et qui sont mesurés, sont les variations de courant et/ou de tension. Dans ce mode de mise en oeuvre avec transistor à effet de champ, la tension appliquée entre la structure semiconductrice et le système de référence, peut être produite par toute source appropriée et connue en elle-même. La membrane sensible du transistor à effet de champ, appartenant à un tel capteur comprend au moins un ligand spécifique capable de reconnaitrc, de manière sélective, la substance biologique à détecter. De tels capteurs peuvent etre dénommés "BIOFET". Et dans le cas où les espèces biologiques sont des acides nucléiques ou analogues, on parlera de "GENFET" et d'IMMUNOFET dans le cas d'antigène-anticorps. Les signaux électriques mesurés sur ce "BIOFET" ("GENFET" etlou IMMUNOFET par exemple), peuvent etre obtenus, e. g, par le protocole suivant: - on impose une valeur constante au potentiel V, entre drain et source, - on maintient constant le courant de drain source 1d à une valeur de consigne en ajustant le potentiel entre la référence et la source Vn, - et on mesure les variations de V, en réponse aux interactions membrane sensible/milieu de dosage. Selon ce protocole, le potentiel V,. est assimilé au potentiel Vg, entre la grille et la source du transistor à effet de champ. Conformément à une alternative, il est parfaitement envisageable d'adopter la procédure inverse, c'est-à-dire de maintenir constant le potentiel V,. ou courant Vn et mesurer le courant, et/ou les variations du courant de drain. Suivant une modalité avantageuse de l'invention, on peut éliminer radicalement les réponses non spécifiques, en mettant en oeuvre une mesure différentielle, selon laquelle on prévoit une référence intégrée constituée par au moins une structure semi conducteur (Sc) I isolant (ils) exempte de membrane sensibilisée, et constituant au moins un autre transistor à effet de champ utile comme référence (REFLET) dans un milieu liquide conducteur (LC). En parallle à cette dernière, il est prévu une structure SclIslMbs de mesure (te-1), dans laquelle la membrane sensible comprend des éléments spécifiques réactifs (ligands) en contact avec LC. Le signal de sortie recueilli est formé par la différence des réponses données par la référence et la structure SclIslMbs placée dans les mêmes conditions. Il va de soi que l'invention n'est pas limitée à ces deux modes de mise en oeuvre, mais elle englobe également toutes les méthodes de mesure envisageables et analogues, fondées sur la reconnaissance de la vanation du potentiel de bandes plates d'une structure Sc/IslMbs, possédant une zone sensible apte à réagir spécifiquement avec des substances biologiques dans un milieu LC. La substance biologique: séquence polynucléotidique (ARN, ADN, gène, plasmide ou tout autre matériel génétique), antigène, haptène, anticorps, ou, de manière générale, toute espèce d'un couple formé par une macromoléculaire biologique et son complément spécifique. Comme exemples de couples ou de pares d'appariement spécifique, on peut citer: antigène-anticorps, haptèntanticoxps, ADNc, ADN, ADNc, ARN, poly dT-ARNm, eucaryote, lectine- glycoconjugué, marqueur de cellules (ou de microorganismes) - cellules (ou microorganisme), HcGrécepteur tissulaire et T3 - TGB (thyroxin binding protein). Le procédé selon l'invention passe tout d'abord par l'immobilisation d'au moins un type de ces espèces biologiques réactives pour constituer la membrane sensible. Celleci peut se faire directement sur la couche isolante ou à l'aide d'un matériau intermédiaire (composés d'espacement par exemple), accolé à l'isolant et apte à recevoir par liaison physique (e.g. adsorption-absorption) et/ou chimique (e.g. liaison covalente), les ligands biologiques spécifiques. Selon l'invention, il est parfaitement envisageable de prévoir une membrane sensible hétérospécifique, formée d'espèces biologiques de natures différentes, aptes à réagir avec leurs complémentaires. Pour améliorer la sensibilité de la mesure, il est clair que la membrane sensible d'appariement doit être la plus fine possible, voire monomoleculairc. Le milieu liquide conducteur utilisé peut être toute solution tampon compatible avec les substances biologiques considérées. Ce milieu liquide possède avantageusement une conductivité équivalente à celle d'une solution aqueuse de NaCI ayant une concentration pouvant aller de 0,005M à 3M et préférentiellement de l'ordre de 0,1 M. Le pH du milieu liquide peut être compris entre O et 12, de préférence entre 6 et 8 et avantageusement est de l'ordre de 7, de façon à favoriser les appariements par bioaffinité. Les interactions' non spécifiques, par échange d'ions ou par interactions hydrophobes, peuvent être supprimées en tout ou partie à l'aide de tampon de force ionique appropriée. Avantageusement, la température de mesure peut être comprise entre 0 et 50" C. Elle est de préférence de l'ordre 37"C, de façon à favoriser les réactions biochimiques concernées. La présente invention a également pour objet un capteur élecrochimique pour la mise en oeuvre du procédé décrit supra, ledit capteur comprenant au moins une structure SclIslMbs, dont la Mbs comprend des ligands aptes à s'apparier spécifiquement avec des substances, de préférence biologiques, pour provoquer un phénomène d'effet de charge, à l'origine de variations de signaux électriques mesurables, telles que les variations du potentiel de bande Vbp du semisonductur ou l'effet de champ modifiant la transconductance du canal d'un FET. De préférence, la structure semi-conducteur / isolant / membrane (Sc/Is/Mbs) de té capteur est respectivement formée par du silicium, dc la silice et le (ou les) ligands fixé(s) à la silice, de préférence par l'intermédiaire de composés d'espacement. Les capteurs d'affinité suivant l'invention peuvent être caractérisés par un mode d'appariement spécifique du type hybridation nucléctidique permettant la constitution d'un GENFET et/ou du type couplage immunologique permettant la constitution d'un IMMUNOFET. En pratique, ces capteurs sont avantageusement des hétérostructures formées d'un substrat n ou psilicium présentant au moins un contact ohmique sur au moins une de ses faces et recouvert sur la face opposée à celle présentant ledit contact ohmique, d'au moins un film d'oxyde Si4 d'épaisseur comprise entre 10 et 500 A, de préférence entre 50 et 150 et, plus préférentiellement encore, de l'ordre de 100 A. Le film d'oxyde formant la couche isolante est accolé, par sa face opposée à celle adjacente au semiconducteur, à la membrane sensible. Cette dernière peut être constituée d'au moins une couche de matériau intermédiaire, fixée, de préférence, par liaison covalente sur la couche d'isolant Siq. Cette couche intermédiaire sert de support d'immobilisation pour le ligand d'au moins une espèce biologique dont le complémentaire réactif est à détecter, identifier ou doser. La couche intermédiaire peut, par exemple, être constituée par au moins un silane fonctionnalisé. Le ligand peut, par exemple, être un brin d'ARN,d'ADN ou de toute autre séquence polynucléotidique. Après hybridation nucléotidique ou couplage immunologique, e.g., il est possible de régénérer la membrane sensible du capteur électrochimique selon l'invention, par mise en oeuvre d'une étape de dénaturation. Cette dernière est, de préférence, effectuée par traitement thermique en présence d'un solvant, avantageusement formé par de l'eau déionisée. Conformément à l'invention, le capteur électrochimique adapté pour le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé décrit cidessus, comprend avantageusement au moins un transistor à effet de champ alimentable par au moins une source électrique. Le procédé de capteur selon l'invention permet d'envisager la détection etlou l'identification et/ou le dosage de séquence d'acides nucléiques (ADN ou ARN) ou de toute autre unité génétique formée de ces sous-unités élémentaires que sont les nucléotides. Cela peut etre particulièrement intéressant - pour la détection de maladies génétiques (anomalie du génome), - ou la détection et la caractérisation de virus, de bactéries ou de parasites, - ou bien encore pour l'établissement de cartes génétiques. La technique d'analyse selon l'invention peut également concerner les systèmes antigène-anticorps, pour autant que l'appariement des ligands et de leur complément réactif qui caractérise ces systèmes, génère un effet de champ et une variation du potentiel de bandes plates dans une structure SctElMbs plongée dans un milieu LC contenant les substances à analyser. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et ses vanantes. Les fig. 1 à 10 annexées au présent exposé, constituent des illustrations des exemples - la fig. 1 est une représentation schématique du montage électrique propre au premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, - la fig. 2 représente les courbes d'impédance en phase 4 et en quadrature Zq, en fonction de la tension Vpd, par rapport à l'électrode de référence Ag-AgCl, - la fig. 3 représente des courbes Zq = f(V-) dans différentes conditions expérimentales d'hybridation ex situ, - la fig. 4 représente des courbes f(Vp ) correspondant au suivi de l'hybridation in situ d'un nucléotide avec son complémentaire, - la fig. 5 représente deux courbes 4 = f (Vp,) pour des ligands immobilisés, non appariables, avec des espèces biologiques présentes dans le milieu liquide électrolytique, - la fig. 6 représente, de manibre schématique, un BIOFET (GENFET) selon l'invention, - les fig. 7 à 10 représentent les graphes des réponses AVg, mesurées sur des GENFET du type de celui de la fig.6, dans différentes conditions expérimentales d'hybridation de oligonucléotides. Les fig. 1 à 5 correspondent au premier mode de mise en oeuvre du procédé d'analyse selon 11 invention. Le capteur électrochimique complet représenté sur la flg.1 comprend une cuve de mesure 1 constituée de parois 2 et d'un fond 3 formé de la structure Sc!IslMbs. Ladite cuve 1 contient un milieu liquide conducteur 4, dans lequel plonge une électrode de référence S (AglAgCl saturé) et une contre-électrode 6 en platine. La structure Sc/Is/Mbs ou le fond 3, au fond de la cuve 1, constitue l'électrode de travail et comporte trois couches superposées, désignées par les références 3, à 33 de l'intérieur de la cuve vers l'extérieur. La couche 3, interne est formée par la membrane sensible comprenant le (ou les) ligand(s) Epécifique(s), sws forme immobilisée. La couche 32 intermédiaire, correspondant à l'isolant SiO2, et la couche extérieure 33 est constituée par le semi-conducteur en silicium dopé p. Il est prévu un contact ohmique, disposé sur la face externe de cette couche 33 et relié à un fil conducteur 7. Le circuit de mesure comprend, également, un module d'alimentation en tension 8 (potentiostat rapide) réglable, un générateur de fonction 9 permettant d'imposer une modulation électrique sinusoldale de faible amplitude et de moyenne fréquence, un convertisseur courant/tension 9, un suiveur de tension tens 10. une détection synchrone 11. Le fonctionnement de l'ensemble de ces éléments est géré par un calculateur 12. EXEMPLES EXEMPLE I: MESURE D'IMFEDANCE A L'AIDE DU CAPTEUR DE LA FIG. 1 DONT LA MEMBRANE A ETE SENSIBILISEE AVEC DES LIGANDS DU TYPE OLIGONUCLEOTIDES. 1.1 Fabrication du capteur de Lafig.1. A) SOLUTION CONDUCTRICE La solution conductrice (référence 4 sur fig,l) est préparée en mélangeant 10 mM de Tris HCl(tris[hydroxyméthyl]-aminométhane hydrochloride) à 10 mM de Tns base (Tris[hydroxymethyl]-aminomethane) et 50 mM Nacl. Elle sert de milieu conducteur pour les mesures d'impédances et de solution de rinçage au cours de l'élaboration des structures. B) PRÉPARAllON DU CAPTEUR PROPREMENT DIT: 1- Les hétérostructures, constituant l'électrode de travail 3, sont formées d'un substrat p-Si (couche 33 avec un contact ohmique en face externe) recouveru d'un film d'oxyde SiO2 d'épaisseur 100 (couche 32). Le dégraissage des structures est assuré en les trempant successivement pendant 10 minutes dans un bain bouillant d'acétone, puis d'isopropanol. 2 - L'hydratation de la surface SiO2 se fait par immersion dans de l'acide sulfochromique pendant 5 minutes suivie d'un rinçage soigneux avec de l'eau désionisée puis avec ia solution tampon Tris. 3- La surface hydroxylée de Si/SiO2 est recouverte d'APTS (ammopropyl triéthoxysilane) dilué à 5 % dans de l'eau et laissé à température ambiante pendant 1 heure. On procède ensuite à un rinçage avec la solution Tris. L'APTS forme une partie de la membrane, qui est ensuite sensibilisée par immobilisation du ligand constitué par des simples brins d'ADN. 4 - L'immobilisation de ces simples brins d'ADN [Oligo (dT): Oligonucléotides à bases azotées Thymine = essai n 1] est effectué suivant la méthode utilisant du bromosuccinimide. [cf Keller, Analytical biochem..., 170, 441(1988)] La solution d'ADN est préparée en ajoutant 20 y1 de 0,01 M de N-bromosuccinimide à 1 ml de solution de NaHCO3 (1M) contenant l'ADN en concentration de I mg/ml et en laissant réagir pendant 15 minutes à 0 C. Une goutte de cette solution est déposée sur la couche d'APTS que l'on laisse sécher à température ambiante pendant une nuit. I.2 Mesures: A) MESURES D'IMPÉDANCE AVANT HYBRIDATION (ESSAI 1): Les mesures électriques ont été faites après chaque étape de l'élaboration de l'hétérostructure. L'allure des courbes d'impédances en phase Zp et en quadrature 4. On peut distinguer trois domaines de polarisation correspondant aux différents comportemcnts du semiconducteur sous-jacent - situation d'inversion [V - situation de désertion [- 0,6 V - situation d'accumulation [V > + 0,6 V(AgIAgCl)j, des charges à l'interface. B) SUIVI DE L'HYBRIDATION PAR MESURES D'IMPÉDANCES (VOIR FIG. 3) (ESSAIS 2 À 6): 1 - L'hybridation est réalisée avec une solution comprenant NaHCO3 (1M) et les simples brins complémentaires en concentration de 0,1 mg/ml. 2 - La dénaturation (régénération de la membrane après hybridation) est obtenue en faisant bouillir les échantillons pendant 20 minutes dans de l'eau désionisée. 3 - Une première série de premières mesures très reproductibles d'impédances est faite sur des capteurs dont la structure Se/Is/Mbs comporte une membrane nue (essai 2). Une deuxième série de mesures de Zq est faite après immobilisation d'oligo dT (essai 3) (Sc/Is/Mbs1) Une troisième série de mesures (essai 4) est faite sur les mêmes structures, après hybridation avec des brins complémentaires oligo dA. (Sc/lst Une quatrième série de mesures est faite après dénaturation (essai 5). Et une cinquième série de mesures est faite après réhybridation (essai 6). Ces mesures sont effectuées à une fréquence F de modulation électrique sinusoïdale de 100 KHz. L'hybridation entraîne un déplacement des courbes par rapport à l'axe des potentids de l'ordre de 100 mV (fig. 3). Ce déplacement a été mesuré soit après une hybridation ex-situ, c'est-à-dire que l'étape d'hybridation est réalisée sur l'échantillon en dehors de la cellule de mesure décrite en Fig.l. La translation des courbes Z,q (Vpot), ainsi que celle de Zp (Vpd) le long de l'axe des potentiels, correspond à une variation du potentiel de bande plate V, traduisant luimême la présence de phénomène d'effet de champ à la surface. Ces résultats montrent que le signal biologique (hybridation des brins complémentaires) peut être traduit en une grandeur physique mesurable (variation de V, grâce à un transducteur de type semiconducteur. La réversibilité est également testée puisque, lorsque l'on dénature la structure [séparation des brins complémentaires des brins immobilisés, (essai 5)], les courbes Zq (V",) reviennent à leur position initiale [avant hybridation (essai 3)]. n a pu même être vitrifié que les structures peuvent etre hybridées et dénaturées cinq fois de suite, sans perte de performances. c) SUIVI DE L'HYBRIDATION (IN SITU) PAR MESURES D'IMPÉDANCE Z (essais 7 à 12). 1- Le ligand immobilisé sur la membrane sensible du capteur est un oligonucléotide dT. 2 - L'hybridation est réalisée in situ. Elle a consisté à verser, dans la cuve de mesure 1 contenant le milieu 4, 20 Crl d'oligo dA contenus dans 12 ml de TrisHCl. 3 - Une première série de mesures de Zq a été réalisée avec les oligo dT de la membrane sensible non hybridés (essai 7). Cinq autres séries de mesures de Zq à différents temps après l'ajout de la solution contenant l'espèce complémentaire à détecter à savoir l'oligo dA: - essai 8 = O heures, - essai 9 = 2 heures, - essai 10 = 3 heures, - essai il = 6 heures, - essai 12 = 24 heures. Les mesures de Zq sont effectuées à F = 20 kHz. La fAg. 4 montre l'allure des courbes Zq = f (soi) obtenues. L'hybridation entraîne un déplacement des courbes par rapport à l'axe des potentiels, de l'ordre de 120 mV (#Vbp). D) MESURES D'IMPÉDANCES Zq APRÈS MISE EN PRÉSENCE DE LA MEMBRANE SENSIBLE DU CAPTEUR, AVEC DES BRINS POLYGONUCISOTB)IQUES NON COMPLÉMENTAIRES AUX LIGANDS OL1GONUCLtOlIDIQUES IMMOBILISÉS 1 - Les ligands immobilisés sont des oligo dT. - Fig. 5 2 - Des poly dC ont été rajoutés dans la cuve de mesure du capteur dans les mêmes conditions que pour les essais 7 à 12. 3 - Une première série de mesures a été réalisée avant incorporation des poly dC (essai 13). Une deuxième séne de mesures a été réalisée après incorporation des poly dC (essai 14). La fig. S montre l'allure des courbes obtenues. 4 - Cette fois, les espèces immobilisées sont de poly(dT). - Fig. 6 5 - Des poly(dc) ont été rajoutés dans la cuve de mesure du capteur dans les conditions identiques que les essais 7 à 12. 6- Une série de mesures a été réalisée avant incorporation des poly(dc) (essai 15) 7 - Une deuxième série de mesures a été réalisée après incorporation des poly (dc) - (essai 16) La fig. 6 donne l'allure des courbes obtenues. La spécificité du signal est vérifiée puisqu'aucun déplacement de courbes (V n'est observée au cours des 24 heures suivant l'introduction des poly (dc) dans la cellule, de mesure, ce qui correspond logiquement à l'impossibilité d'appariement entre les oligo dT et les poly dC. Les résultats obtenus et les constats, faits dans le cadre du premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention tel que décrit à l'exemple 1, ont conduit la Demanderesse à imaginer la révélation du phénomène spécifique et sélectif d'appariement, entre ligand immobilisé d'une espèce biologique et son complémentaire, à l'aide d'un transducteur du type transistor à effet de champ (BIOFET e.g. GENFET et ATMMUNOFEI). La fig. 7 annexée correspond à une coupe schématique d'un GENET conforme au deuxième mode de mise en oeuvre de l'invention. Classiquement, ce GENFET comprendl une source 32 un substrat en silicium 33 de type p, un isolant 34, un drain 35 et une source 32 pourvus de contacts métalliqucs, une électrode de référence 36 un milieu liquide conducteur 37 contenu dans une cuve 31, une membrane sensible 38, un encapsulant 312. Dans ce montage expérimental de mesure du signal de sortie, on impose une valeur constante du potentiel entre le drain et la source (Vd,) et un amplificateur maintient constant le courant de drain-source à une valeur de consigne, en ajustant le potentiel V" entre la source et l'électrode de référence. La réponse du capteur, lue directement en millivolts, est donc la mesure de ces variations (au,3. Elle est directement liée à la concentration de l'espèce biologique à détecter dans la solution. EXEMPLE fl: SUIVI D'UNE HYBRIDATION A L'AIDE DU GENET La fig. 8 est la réponse obtenue avec le "GENFEr" dans le cas de l'exemple dont l'élément sensible est le poly(dT), après rajout (flèche F) de 10 ccg d'une solution de poly (dA) [dont la concentration en poly (dA) est de 2 x 104 glml]. Les conditions de cet essai 17 sont les suivantes solution de travail : tampon TRIS température 25 C volume 5ml solution injectée: ADN poly dA (1 mg/ml dans NaHcO3 1M) volume injecté 10 y1. L'amplitude maximale du signal est de 120 mV et celuici se stabilise au bout de 8 heures. Au bout d'une heure, 50 % du signal est obtenu. Cette amplitude correspond au décalage du potentiel de bandes plates mesuré par impédances sur des structures Sc/Is/Mbs en présence de la même concentration de poly(dA). Cette gamme de dosage est donnée à titre indicatif. La limite de détection pouvant être amélioré notamment en optimisant l'immobilisation des éléments de reconnaissance. n n'y a pas de variation de #Vgs lorsque le GENFET est en présence d'une solution contenant la même concentration de brins non complémentaires [poly(dC)]. L'ajout successif de quantité contrôlée de poly(dA) dans la solution entraine une variation de AV". Dans cet exemple, il a pu être observé que la gamme de dosage par cette méthode se situe entre 10-4 et 10-8 g/ml de substance biologique à doser. EXEMPLE III REPONSE IN SITU D'UN GENFET A DIFFERENTS AJOUTS DE L'ESPECE A DETECTER La Fig. 9 est la réponse obtenue sur un GENFET dont l'élément sensible est le poly(dT). Les ajouts successifs de quantités contrôlées de solution de poly (dA) dans NaHCO3, (1 mg/ml), entraînent une variation de A V,. flèches F1 à Fb correspondant respectivement à des ajouts de 2,5 ; 5, 7,5 ; 6; 12,5 et 20 g de la solution de poly dA. La solution de travail est constituée par du NaHCO31M. EXEMPLE IV: REPONSE IN SITU D'UN GENFET A L'INTRODUCTION SUCCESSIVE DE DEUX ESPECES DIFFERENTES : UNE NON SPECIFIQUE A CE CAPTEUR, ET L'AUTRE CORRESPONDANT AUX COMPLEMENTAIRES DES ESPECES IMMOBILISEES SUR LE GENFET La fig. 10 montre la réponse obtenue sur un GENFET dont l'élément sensible est le poly (dT). Les conditions expérimentales sont les suivantes Solutions injectées: 1) poly dC dans NaHCO3 (1 mg/ml). 2) poly dA dans NaHCO3 (1 mg/ml). température: 37" C. solution de travail : tampon TRIS pH 7,1. L'introduction d'espèces biologiques non spécifiques [poly (dC) = flèche F7(5 g)] avec ce GENFET n'entraîne pas de variation de #VGs. L'ajout d'espèces complémentaires poly (dA) [flèche F8 (5 g)] provoque une variation de #VGs. REVENDICATIONS: 1 - Procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, présentes dans un milieu liquide conducteur (LC), à l'aide d'au moins un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-conducteur (Sc), revêtu sur l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant (lus), elle-même accolée à au moins une membrane sensible (Mbs), en contact avec le milieu conducteur (LC) et comprenant des ligands complémentaires aux substances biologiques visées et aptes à s'apparier spécifiquement avec ces dernières, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement: à appliquer une tension entre le semi-conducteur et le milieu conducteur, - à recueillir les variations des signaux électriques induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des substances biologiques avec leurs ligands complémentaires compris dans la membrane sensible, à l'exclusion des variations résultant d'éventuels effets de charge provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, - et à interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des substances visées. 2 - Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les appariements spécifiques qui sont exploités, répondent à au moins l'un des mécanismes biochimiques suivants - hybridation nucléotidique, - couplage immunologique. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que: - l'on met ainsi en oeuvre une méthode de mesure potentiostatique à au moins trois électrodes, à savoir: * au moins une électrode de travail constituée par la structure semi-conducteur/isolant/membrane sensible, * au moins une électrode de référence formant le système de référence, * au moins une contre-électrode. - l'on applique à l'électrode de travail une tension de polarisation V continue par rapport à l'électrode de référence plongée dans le milieu électrolytique, - l'on surimpose une modulation électrique sinusoïdale à cette tension - I'on mesure la tension V électrode de travail / électrode de référence et le courant I traversant l'électrode de travail, - I'on calcule les impédances en phase Zp et en quadrature Zq, l'on établit la (ou les) courbe(s) Zp ettou Zq en fonction de V, - et l'on suit le déplacement de cette (ou ces) courbes parallèlement à l'axe des potentiels, ledit déplacement correspondant aux variations de signaux électriques, induites par l'effet de charges résultant des appariements spécifiques des substances biologiques à analyser avec leurs ligands complémentaires présents dans la membrane sensible, et recueillies selon le protocole défini dans la revendication 1. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le déplacement de la (ou des) courbe(s) 4 et/ou Zq en fonction de Vpd est suivi au travers du potentiel de bande plate Vbp du semiconducteur, que l'on déduit de ladite (ou desdites) courbe(s). 5 - Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce que la tension de polarisation Vpd varie dans une fourchette contenant la zone de désertion du semiconducteur, de préférence dans une fourchette de - 3 à + 3V, et plus préférentiellement encore de - 1,5 à + 1,5V. 6 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé: - en ce que lé capteur d'affinité mis en oeuvre comprend au moins un élément transducteur formé par au moins un transistor à effet de champ dont la grille, en contact avec le milieu conducteur de dosage, est constituée par la membrane sensible, ledit transistor étant associé à au moins une électrode de référence plongeant également dans le milieu liquide conducteur, - et en ce que les signaux qui sont induits par l'appariement spécifique des substances biologiques avec la membrane sensible et qui sont mesurés, sont les variations de courant et/ou de tension. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé - en ce que l'on impose une valeur constante au potentiel Và entre drain et source, - en ce que l'on maintient constant le courant dc drain à une valeur de consigne, en ajustant le potentiel entre la référence et la source V,, - et en ce que l'on mesure les variations de V, en réponse aux appariements spécifiques membrane sensible/milieu conducteur de dosage. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caract9isé en ce que l'on met en oeuvre une mesure différentielle en faisant intervenir, dans le capteur d'affinité, au moins une autre structure Scies exempte de membrane sensible, et dans laquelle l'isolant b et le semiconducteur Sc forment de préférence, un autre transistor à effet de champ utile comme référence (REFLET). 9 - Capteur d'affinité pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une structure SclIslMbs, dont la Mbs comprend des ligands apte à s'appaner spécifiquement avec des substances, de préférence biologiques, présentes dans un milieu liquide conducteur, pour provoquer un phénomène d'effet de charges, ce dernier étant lui-même à l'origine des variations de signaux électriques mesurables. 10 - Capteur d'affinité selon la revendication 9, caractérisé en ce que sa structure Sc/Is/Mbs est respectivement formée par du silicium, de la silice et le (ou les) ligand(s) fixé(s) à la silice, de préférence, par l'intermédiaire de composés d'espacement. il - Capteur d'affinité selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé par un mode d'appariement spécifique du type hybridation nudCotidique permettant la constitution d'un GENFET et/ou du type couplage immunologique permettant la constitution d'un IMMUNOFET.