Brevet FR2714053A1 — publié le 19950623

La présente invention concerne un procédé d'extraction et d'isolement de la 10-désacétylbaccatine III, composé utile comme intermédiaire dans l'hémisynthèse du taxol ou de ses dérivés présentant un intérêt oncologique. Les taxanes dont le taxol sont des agents anticancéreux aux propriétés particulièrement intéressantes. Toutefois, les taxanes naturels anticancéreux, sont principalement présents en faible concentration dans les écorces d'If, végétaux connus pour la finesse de leur écorce et leur croissance très lente. Afin d'assurer une exploitation rentables des taxanes anticancéreux sans porter préjudice à la source végétale de matières premières, il a été rapidement envisagé d'obtenir ces produits par hémisynthèse à partir de la 10désacétylbaccatine 111(1) ou tétraol. En effet, ce dernier se trouve en quantité plus importante dans les feuilles d'if, comme l'ont montré Sénilh & al. en 1981 (C. R. Acad. Sc. Paris, 1981, 293 (2), 501-503), assurant une source renouvelable de matière première dans la préparation du médicament. Le tétraol (I) a été décrit la première fois comme le produit résultant de la méthanolyse alcaline du taxol par M.C. WANI en 1971 lors de la mise en évidence du taxol. L'obtention de ce produit avec un rendement élevé devient donc un des aspects essentiels du problème de l'exploitation rentable des taxanes d'intérêt oncologique comme le taxol et le taxotère. Or, si le principe général d'extraction des taxanes à partir des feuilles d'if est connu, un seul procédé concerne spécifiquement le tétraol. En effet, le but de la quasi-totalité des procédés est d'obtenir le taxol, produit à haute valeur ajoutée, alors que le tétraol est toujours pris en considération comme sous-produit d'extraction. Il s'agit en général d'extraire le végétal par un alcool, puis d'adopter les conditions de purification spécifiques à l'obtention du taxol. Cependant, les demandes de brevet EP-A 253 738 et EP-A-253 739 mentionnent un procédé d'extraction du tétraol qui consiste à reprendre un extrait éthanolique des feuilles d'if par de l'eau, le filtrer sur Célite et à extraire le filtrat par le chlorure de méthylène avant de l'extraire par l'eau puis de séparer les différentes fractions. Le tétraol est obtenu sous forme purifiée après deux chromatographies successives sur colonne de silice. Ce procédé utilisé dans les deux demandes de brevet citées ci-dessus est très long et complexe. Les feuilles non séchées sont extraites par de l'éthanol à 95" (cinq macérations de dix heures chacune). Les extraits alcooliques sont réunis et concentrés afin d'éliminer l'éthanol résiduel. La suspension aqueuse est reprise par du chlorure de méthylène (neuf extractions). L'extrait dichlorométhylénique est concentré puis chromatographié sur colonne de silice. La fraction riche en tétraol est à nouveau soumise à une chromatographie sur colonne de silice. Le rendement d'extraction n'est pas mentionné et le titre du produit final est supposé à 100%. La demande de brevet WO-A-92/07842 décrit un procédé où intervient une préparation par chromatographie en phase inverse. L'extrait brut d'écorces ou de feuilles de Taxus est traité par chromatographie en phase inverse ce qui permet d'adsorber les taxanes qui seront élués sélectivement. Les phases inverses citées sont la silice Cg, la silice CN et la silice Cula. La demande de brevet WO-A-92/18492 décrit un procédé général d'extraction et de purification des taxanes notamment par adsorption/élution et par extraction liquide/liquide. La plante est extraite par un solvant organique (éthanol, acétone, acétate d'éthyle). La phase organique est reprise par le dichlorométhane ou acétate d'éthyle et les fractions hydrophiles sont extraites par de l'eau. La phase organique est reprise par un mélange acétate d'éthyle/méthanol (3/1) pour adsorber l'extrait sur Célite. La Célite éluée par du dichlorométhane conduit à un extrait de taxanes. Une variante consiste à remplacer la purification par la Célite par une extraction liquide/liquide par l'hexane et un mélange méthanol/eau (9/1). Ces méthodes dans tous les cas ne conduisent qu'à un mélange brut de taxanes, qui seront ensuite purifiés par des techniques chromatographiques traditionnelles. Enfin, dans la demande EP-A-521 675 une préparation par CO2 supercritique de la 10-désacétylbaccatine III est revendiquée. Cependant le procédé décrit plus spécialement l'extraction du taxol. La présente invention concerne donc un procédé amélioré d'extraction et d'isolement du tétraol à partir des feuilles d'if. Les végétaux utiles pour le procédé selon l'invention sont de préférence les espèces du genre Taxus (if). Certains botanistes différencient le genre Taxus en plusieurs espèces : T. baccata, T. brevifolia, T. wallichiana, T. chinensis, T. cusnidata, T. canadensis, T. floridana, T. elobosa, T. mendia T hunnewelliana ... alors que d'autres auteurs considèrent toutes ces espèces comme des sous-espèces d'une espèce collective : T. baccata. Le procédé s'applique donc sur l'espèce collective T. baccata au sens large ainsi que sur les cultivars correspondants. Le procédé selon l'invention étant spécifique à l'extraction et l'isolement du tétraol, c'est bien par rapport à ce produit que seront déterminées les conditions spécifiques de sa mise en oeuvre. De ce fait, bien que spécifié pour l'extraction et la purification du tétraol à partir des feuilles d'if, le procédé selon l'invention pourra très bien s'adapter à tout milieu riche en taxanes et plus particulièrement en taxanes de polarité voisine du tétraol, quelle que soit son origine, naturelle ou non, végétale ou non, comme des cultures cellulaires d'écorce ou de feuilles d'if, des cultures de champignons ou leurs cultures cellulaires, ou encore des mélanges de taxanes, résidus d'extraction du taxol. Les manipulations décrites en exemples ont été réalisées sur des feuilles séchées dont la teneur en tétraol était voisine de 500 mg/kg. Bien entendu, l'invention s'applique à des Taxus pauvres en tétraol (300 mg/kg) et a fortiori à des Taxus riches (1000 mg/kg et au-delà). Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - première étape d'extraction des feuilles d'if par un solvant polaire protique approprié pour obtenir une phase aqueuse contenant le tétraol, ladite phase aqueuse étant un extrait inital résultant directement de la pre mière étape d'extraction ou étant obtenue après un traitement additionnel dudit extrait initial, - deuxième étape d'extraction de ladite phase aqueuse par un solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau, de manière à obtenir une phase organique riche en tétraol, puis - dernière étape d'isolement du tétraol de ladite phase organique. L'extrait initial comprend généralement le tétraol en mélange avec des taxanes de polarité voisine, extraits par un même solvant polaire protique. Le but de la deuxième et de la dernière étape consiste alors, par un solvant organique approprié, à extraire et isoler le tétraol de ce mélange. D'une manière avantageuse, les feuilles d'if sont séchées et/ou broyées. La première étape d'extraction est de préférence effectuée par macération dans le solvant polaire protique pour une durée comprise entre 15 minutes et 6 heures, de préférence 1 heure. L'extrait initial contenant le tétraol est ensuite récupéré, notamment par filtration. L'homme du métier saura adapter le temps de macération en fonction du nombre choisi d'opérations d'extraction des feuilles. Ainsi, il pourra effectuer plusieurs macérations de 15 minutes avec de faibles quantités de solvant, ou au contraire effectuer une opération équivalente en une seule étape, additionnant les temps de macération et les volumes de solvant employés dans l'extraction multiple. Le nombre de macérations sera bien entendu choisi avec pour objectif d'épuiser les feuilles d'if de leur teneur en tétraol présent. Dans le cas de plusieurs macérations, les extraits de chaque macération sont alors regroupés pour donner l'extrait initial contenant le tétraol. La première étape d'extraction pourra également être conduite d'une manière avantageuse par macération dans le solvant polaire protique sous irradiation de micro-ondes ou d'ultra-sons pour une durée comprise entre 2 et 15 minutes. La température d'extraction est comprise entre 10 C et la température d'ébullition du solvant. Dans le cas d'un mélange de solvants, on choisira comme limite supérieure la température d'ébullition la plus basse des différents solvants, ou en présence d'un eutectique, la température d'ébullition de ce dernier. La température préférée sera la température ambiante, que l'on définit dans la présente demande de brevet comme la température du laboratoire, comprise entre environ 15"C et environ 25"C. Bien entendu, il est compris qu'en fonction des variations saisonnières de température, cette température ambiante pourra être inférieure ou supérieure à la fourchette proposée. En fait, on définit plus simplement la température ambiante par la température de l'environnement dans lequel sera conduit le procédé, sans qu'il ne soit indispensable de fournir une énergie additionnelle au milieu d'extractions pour obtenir des rendements satisfaisants. Le solvant polaire protique est avantageusement choisi parmi l'eau, les alcools aliphatiques linéaires ou ramifiés en C1-C3, et les mélanges de ces solvants en toutes proportions. Selon le choix de ce premier solvant, l'homme du métier déterminera la nécessité d'effectuer l'étape facultative de traitement de l'extrait initial. Il pourra s'agir d'une simple évaporation de l'alcool aliphatique ou du mélange hydroalcoolique éventuellement additionné d'eau, de manière à obtenir un extrait en phase aqueuse. Il pourra également s'agir d'une étape plus complexe où l'on cherchera à éliminer certaines impuretés présentes dans l'extrait initial contenant le tétraol par une extraction liquide/liquide avec un solvant hydrophobe. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est l'eau. Dans ce cas, la phase aqueuse contenant le tétraol est l'extrait initial résultant directement de la première étape. Cette phase aqueuse est alors traitée directement par le solvant organique approprié de manière à obtenir la phase organique riche en tétraol. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est un mélange hydroalcoolique ou un alcool précité. Dans le cas d'un mélange hydroalcoolique essentiellement aqueux, on pourra considérer l'extrait initial comme étant la phase aqueuse résultant directement de la première étape. Toutefois et d'une manière générale, la phase aqueuse est avantageusement obtenue après un traitement de l'extrait initial consistant à évaporer l'alcool, et le cas échéant, à ajouter une quantité appropriée d'eau, avant et/ou après l'évaporation de l'alcool. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est le méthanol, avec une étape intermédiaire de traitement de l'extrait initial, comprenant les étapes suivantes consistant à: - éventuellement concentrer l'extrait initial par évaporation du méthanol, - ajouter de l'eau à l'extrait contenant le tétraol dans un rapport en volume 1/1, - extraire au moins une fois le mélange hydroalcoolique obtenu par un volume égal d'un mélange acétate d'éthyle/hexane dans un rapport en volume 1/1, - récupérer la phase hydroalcoolique, et - concentrer la phase hydroalcoolique en éliminant le méthanol, de manière à obtenir ladite phase aqueuse contenant le tétraol, utile pour la deuxième étape. Bien entendu, l'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention, en choisissant ou non d'effectuer le traitement additionnel de l'extrait initial en fonction de données telles que la teneur en alcool du solvant d'extraction des feuilles d'if. Quelque soit ce solvant de départ employé, le résultat de la première étape d'extraction avec éventuellement le traitement additionnel consiste bien à obtenir une même phase aqueuse contenant le tétraol, laquelle sera extraite dans tous les cas de figure par un solvant organique essentiellement non miscible à l'eau, dans la deuxième étape du procédé. Ce solvant organique essentiellement non miscible à l'eau est avantageusement un hydrocarbure halogéné. I1 sera de préférence choisi parmi le chlorure de méthylène, le chloroforme et leurs mélanges. La deuxième étape pourra bien entendu être répétée plusieurs fois jusqu'à épuisement de la phase aqueuse en tétraol, les différentes fractions organiques étant alors réunies pour obtenir la phase organique riche en tétraol, utile pour la dernière étape. Pour isoler le tétraol, la dernière étape commune à toutes les variantes consiste de préférence à évaporer le solvant organique, puis à reprendre le résidu sec par un solvant de cristallisation dans lequel il précipite sélectivement. Ce solvant de cristallisation est de préférence l'acétonitrile. La solution de tétraol dans l'acétonitrile est laissée à reposer à une température comprise entre 0 C et la température ambiante, pour laisser précipiter le tétraol en laissant les impuretés dans le surnageant. Le solide précipité sera alors récupéré par les techniques usuelles de l'homme du métier, notamment par filtration et séchage. Une purification supplémentaire, qui n'affecte pas le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans la plante consiste à faire recristalliser le tétraol. Les solvants de recristallisation sont de préférence choisi parmi les mélanges (en volume) de solvants suivants: - chlorure de méthylène/hexane: 1/1 à 1/3 - chlorure de méthylène/acétonitrile: 1/1 à 1/5 - chlorure de méthylène/hexane/méthanol: 1/1/0,1 - acétone/hexane 1/1 à 1/4 Après cette reprécipitation, la pureté du tétraol isolé est généralement très supérieure à 90% et le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présent dans le végétal est supérieur à 70% en masse. Les exemples ci-après permettent d'illustrer différentes conditions de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Nous entendons par feuilles "séchées finement broyées" les sommités feuillées séchées à température ambiante ou à température ne dépassant pas 70"C, d'une granulométire comprise entre 2 mm et 0,5 mm pour les fragments ligneux (moins de 15% masse/masse totale) et 2 mm à 100 Am pour les fragments de feuilles. Le dosage des feuilles est effectué de la manière suivante : la poudre de feuilles (prise d'essai de 50 g prélevée selon les techniques classiques d'échantillonnage) est extraite à deux reprises par 500 ml de méthanol à température ambiante. L'extrait obtenu est dosé en tétraol par CLHP par rapport à une gamme d'étalonnage réalisée avec un échantillon authentique. Le dosage est exprimé en mg de tétraol par kg de feuilles séchées. Les exemples présentés ont été réalisés sur une matière première dont la teneur en tétraol (en masse) exprimée par rapport à la feuille séchée est d'environ 500 mg/kg. L'analyse CLHP est réalisée sur du matériel WATERS-MILLIPORE (référence Millenium) en condition isocratique (H20/CH3CN: 75/25, 1 ml/mn) sur colonne Lichrospher 100 MERCK (5 Am). La quantité injectée est de 20 Al, l'intégration est réalisée à 230 nm. Les conditions d'analyses CLHP sont identiques pour le dosage des feuilles et pour l'évaluation de la pureté du tétraol isolé lors des manipulations. L'échantillon de référence ainsi que le tétraol extrait au cours des différentes manipulations présentées ont montré les mêmes caractéristiques spectrales que celles mentionnées dans la littérature 1H RMN, 1 3C RMN, UV, IR, point de fusion ...). EXEMPLE 1 : Extraction initiale des feuilles pour obtenir un extrait aqueux Différents modes d'extraction du tétraol par l'eau, le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol, ont été mis en oeuvre sous diverses conditions opératoires. 1.a Extraction par l'eau à temPérature ambiante 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" (porosité 10 à 20 ,um, FILTROX, Saint Gall, Suisse) et rinçage du marc par 0,7 litre d'eau, on obtient 2,2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol. 1.b Extraction par l'eau à 600C 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par deux fois 1 litre d'eau pendant 30 minutes à 60"C sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,4 litre d'eau, on obtient 2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol. 1.c Extraction nar l'eau avec activation micro-ondes 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau sous activation micro-ondes (4 fois 30 secondes entrecoupées par 1 minute de repos) dans un four micro-ondes domestique (puissance absorbée = 1000 W). Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'eau, on obtient 2,2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol. 1.d Extraction par l'eau avec activation par ultra-sons 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau pendant 2 minutes, avec une activation ultra-sons de 10 minutes (bac à ultra-sons FRITCH, référence 17.002, Germany). Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,4 litre d'eau, on obtient 2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol. 1.e Extraction par le méthanol 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre de méthanol, on obtient 2,2 litres d'une phase méthanolique enrichie en tétraol. A cet extrait méthanolique sont ajoutés 300 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. 1.f Extraction Par l'éthanol 200 mg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'éthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'éthanol, on obtient 2,2 litres d'une phase éthanolique enrichie en tétraol. A cet extrait éthanolique sont ajoutés 300 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. l.g Extraction par un mélange méthanolleau (70/30) 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange méthanol/eau (70/30) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange méthanol/eau (70/30), on obtient 2,2 litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse d'extrait aqueux, puis filtré. 1.h Extraction par un mélange éthanolleau (70/30) 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange éthanol/eau (70/30) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange éthanoVeau (70/30), on obtient 2.2. litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. l.i Extraction par un mélange eauiisonronanol (111) 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 510 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange eau/isopropanol (1/1) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange eau/isopropanol (1/1), on obtient 2,2 litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. 1 j Extraction parle méthanol à deux renrises 200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Le marc est séparé de l'extrait méthanolique. Le marc récupéré est extrait à nouveau par 1,5 litres de méthanol pendant une heure à température ambiante, puis rincé par 0,7 litre de méthanol. Les extraits méthanoliques réunis représentent 3,7 litres. A cet extrait méthanolique enrichi en tétraol sont ajoutés 350 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. EXEMPLE 2. Extraction de la phase aqueuse et isolement/purification du tétraol 2.a Extraction par le chlorure de méthylène 2,2 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol, obtenue en 1.a, sont extraits par quatre fois 1,5 litres de chlorure de méthylène. Les phases organiques sont réunies, (séchées sur Na2SO4) puis le solvant est évaporé sous pression réduite (25 mm Hg) à 40"C. On obtient 1,5 g d'un résidu solide, pulvérulent, de couleur brun clair. Ce résidu est dissous par 5 ml d'acétonitrile, puis abandonné 15 heures à température ambiante pendant lesquelles le tétraol précipite. On récupère (après filtration sur fritté n" 4, rinçage par 2 ml CH3CN) 92,5 mg de poudre blanche titrant 90% en 10-désacétylbaccatine III (dosage CLHP décrit plus haut). Il est éventuellement possible d'améliorer la pureté du produit obtenu en opérant une ultime purification. Le produit est solubilisé dans le mélange CH2Cl2/hexane (1/1) et mis à précipiter de manière analogue à l'étape précédente. Le tétraol ainsi purifié (84,1 mg) atteint alors une pureté de plus de 99%, 85% de la quantité de tétraol initialement présent dans la poudre de feuilles étant ainsi obtenu. Cette dernière étape de purification effectuée avec un mélange acétone/hexane (1/1) ou CH2Cl2/acétonitrile/ (Ü5) donne la même quantité de tétraol (84,15 mg) de pureté voisine de 100%. 2.b extraction Par le chloroforme 2,2 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol, obtenue en suivant le mode opératoire décrit en 1.a, sont extraits par quatre fois 1,5 litres de chloroforme. Les phases organiques sont réunies et portées à sec sous pression réduite (25 mm Hg) à 40"C. On obtient 1,6 g d'un résidu solide, pulvérulent, de couleur brun clair. Ce résidu est dissous par 5 ml d'acétonitrile, puis abandonné 15 heures à température ambiante pendant lesquelles le tétraol précipite. On récupère (après filtration sur fritté n" 4, rinçage par 2 ml CH3CN) 95,7 mg de poudre blanche titrant 85% en 10-désacétylbaccatine III (dosage CLHP décrit plus haut). Il est éventuellement possible d'améliorer la pureté du produit obtenu en opérant une ultime purification. Le produit est solubilisé dans le mélange CH2Cl/hexane (1/1) et mis à précipiter de manière analogue à l'étape précédente. Le titre du tétraol ainsi purifié (82,1 mg) atteint alors plus de 99%. La quantité de tétraol ainsi extraite représente 83% en masse de la quantité de tétraol initalement présent dans la poudre de feuilles. Cette dernière étape de purification effectuée avec un mélange acétone/hexane (1/1) ou acétonitrile/CH2Cl2 (5/1) donne la même quantité de tétraol (81,4 mg) de pureté voisine de 100%. 2.c extraction par le chlorure de méthylène Le mode opératoire décrit en 2a est repris pour la phase aqueuse obtenue en 1.c. On obtient 90,4 mg de tétraol titrant 86suc (avant l'ultime purification) et correspondant à 77% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. 2.d Extraction Par le chlorure de méthylène Le mode opératoire décrit en 2.a est repris pour la phase aqueuse obtenue en 1.e. On obtient 97,7 mg de tétraol titrant 86% (avant l'ultime purification) et correspondant à 84% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. 2.e Extraction par le chlorure de méthylène Le mode opératoire décrit en 2.a est repris pour la phase aqueuse obtenue en 1.f. On obtient 95,7 mg de tétraol titrant 85% (avant l'ultime purification) et correspondant à 83% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. 2.f Extraction par le chlorure de méthylène Le mode opératoire décrit en 2.a est repris pour la phase aqueuse obtenue en 1.g. On obtient 98,8 mg de tétraol titrant 82% (avant l'ultime purification) et correspondant à 81% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. EXEMPLE 3: Extraction liquide/liquide intermédiaire par mélange quaternaire de solvants sur un extrait initial méthanoli que concentré avant l'extraction classique par un solvant chloré 200 g de feuilles de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées puis extraites une seule fois par 2 litres de MeOH à température ambiante pendant 1 heure. Ces 2 litres sont concentrés à 400 ml. Sont ajoutés à cette phase méthanolique 400 ml d'H2O, 400 ml d'hexane et 400 ml d'acétate d'éthyle afin de réaliser une première extraction liquide/liquide. La phase hydroalcoolique récupérée est soumise à une deuxième extraction volume à volume par la phase organique du mélange quaternaire suivant, méthanoVH aO/hexane/acé- tate d'éthyle (1/1/1/1). La phase hydroalcoolique récupérée est concentrée jusqu'à élimination complète du méthanol. La phase aqueuse est épuisée quatre fois (v/v) par du CH2Cl2. Ce dernier est alors concentré à 100 ml puis lavé par 50 ml d'une solution aqueuse de Na2CO3 (5%). La phase CH2C12 est séchée sur Na2SO4, auxquels sont ajoutés 30 ml de CH3CN. Après précipitation/cristallisation, on récupère 82,3 mg de tétraol titrant 85% (avant l'ultime purification) et correspondant à 70% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. EXEMPLE 4. Extraction et isolement du tétraol à l'échelle industrielle 4.a extraction par l'eau 30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 495 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres d'eau dans un réacteur inox de 600 litres pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après essorage sur essoreuse ROBATEL SLP munie d'une toile nylon de 20 Fm et rinçage du marc par 105 litres d'eau, on obtient 330 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol. Cette phase aqueuse est extraite par quatre fois 225 litres de dichlorométhane. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4 puis évaporées sous vide jusqu'à siccité. On obtient 225 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair. Ce résidu est dissous dans 1 litre d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite (13,8 g). Après recristallisation de ce précipité, on obtient 12,17 g de tétraol sous forme de poudre blanche titrant 100% de 10-désacétylbaccatine III. Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 82% en masse. 4.b extraction par le méthanol 30 kg d Cette phase aqueuse ajustée à 42 litres par addition d'eau, filtrée sur AF 15 est extraite par quatre fois 27 litres de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies après concentration. Le solvant organique est évaporé. On obtient 220 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair. Ce résidu est dissous dans 0,80 litre d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite. Après recristallisation de ce précipité dans le mélange CH2Cl2/CH3CN (1/5), on obtient 12,37 g tétraol sous forme de poudre blanche titrant 95% en 10-désacétylbaccatine III. Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 80% en masse. 4.c Extraction par le méthanol et extractions liquide/liquide par mélange quaternaire 30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante. Après filtration et rinçage du marc par deux fois 30 litres de méthanol, on obtient 320 litres d'une phase méthanolique enrichie en taxanes. La phase méthanolique est concentrée et ajustée à 60 litres. On ajoute alors à la phase méthanolique 60 litres d'eau, 60 litres d'hexane et 60 litres d'acétate d'éthyle, on effectue une première extraction liquide/liquide et l'on récupère la phase hydroalcoolique (125 litres environ). La phase hydroalcoolique est à nouveau extraite par 100 litres de la phase organique du mélange quaternaire eau/méthanol/hexane/acétate d'éthyle (1/1/1/1) préparée séparément. La phase hydroalcoolique est récupérée et concentrée jusqu'à élimination du méthanol. On obtient 52 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol. La phase aqueuse est extraite par quatre fois 53 litres de chloroforme. Les phases organiques enrichies en tétraol sont réunies, et le solvant organique est évaporé. On obtient 285 g d'un résidu solide pulvérulent. Le résidu est repris par deux litres d'acétonitrile puis après précipitations, on obtient 12,47 g de poudre blanchâtre, titrant 85% en tétraol. Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 70% en masse. La pureté est améliorée par une reprécipitation par le système CH2Cl/hexane (1/1) pour atteindre 98% sans altérer le rendement d'extraction (709). On obtient alors 10,82 g de tétraol titrant 98%. 4.d Extraction par Méthanol 30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres d'éthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après essorage sur essoreuse ROBATEL SLP munie d'une toile nylon de 20 Am et rinçage du marc par 105 litres d'éthanol, on obtient après addition de 50 litres d'eau et concentration par évaporation jusqu'à un volume de 30 litres environ une phase aqueuse enrichie en tétraol. Cette phase aqueuse ajustée par addition d'eau à 42 litres est extraite par quatre fois 27 litres de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies après concentration. Le solvant organique est évaporé. On obtient 225 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair. Ce résidu est dssous dans 1,2 litres d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite. Après recristallisation de ce précipité par le mélange dichlorométhane/hexane (1/1), on obtient 10,9 g de tétraol sous forme de poudre blanche titrant 95% en 10-désacétylbaccatine III. Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 69% en masse. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction et d'isolement de la 10-désacétylbaccatine III (tétraol) à partir de feuilles d'if, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - première étape d'extraction des feuilles d'ifpar un solvant polaire protique approprié pour obtenir une phase aqueuse contenant le tétraol, ladite phase aqueuse étant un extrait initial résultant directement de la première étape d'extraction ou étant obtenue après un traitement additionnel dudit extrait initial, - deuxième étape d'extraction de ladite phase aqueuse par un solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau, de manière à obtenir une phase organique riche en tétraol, puis - dernière étape d'isolement du tétraol de ladite phase organique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les feuilles d'if sont séchées et/ou broyées. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que les feuilles d'if sont extraites par macération, dans le solvant polaire protique pour une durée comprise entre 15 minutes et 6 heures, de préférence 1 heure. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la première étape d'extraction des feuilles d'if est effectuée par macération dans le solvant polaire protique sous irradiation de micro-ondes ou d'ultra-sons, pour une durée comprise entre 2 et 15 minutes. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les feuilles d'if sont extraites à une température comprise entre 10 C et la température d'ébullition du solvant polaire protique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est choisi parmi l'eau, les alcools aliphatiques linéaires ou ramifiés en C 1-C3, et les mélanges de ces solvants en toutes proportions. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est l'eau. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la phase aqueuse contenant le tétraol est l'extrait initial résultant directement de la première étape. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est un mélange hydroalcoolique ou un alcool. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la phase aqueuse est obtenue après un traitement de l'extrait initial consistant à évaporer l'alcool, et le cas échéant, à ajouter une quantité appropriée d'eau, avant et/ou après l'évaporation de l'alcool. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est le méthanol et la phase aqueuse est obtenue après un traitement de l'extrait initial, comprenant les étapes suivantes consistant à: - éventuellement concentrer l'extrait initial par évaporation du méthanol, - ajouter de l'eau à l'extrait contenant le tétraol dans un rapport en volume 1/1, - extraire au moins une fois le mélange hydroalcoolique obtenu par un volume égal d'un mélange acétate d'éthyle/hexane dans un rapport en volume 1/1, - récupérer la phase hydroalcoolique, et - concentrer la phase hydroalcoolique en évaporant le méthanol. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau est un hydrocarbure halogéné, préférentiellement choisi parmi le chlorure de méthylène, le chloroforme et leurs mélanges. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le tétraol est isolé par évaporation du solvant organique approprié, puis par reprise du résidu par un solvant de cristallisation dans lequel il précipite. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le solvant de cristallisation est l'acétonitrile. 15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'une purification supplémentaire du produit de cristallisation par l'acétonitrile est opérée par recristallisation dans l'un des mélanges (volume/volume) de solvants suivants - chlorure de méthylène/hexane: 1/1 à 1/3 - chlorure de méthylène/acétonitrile: 1/1 à 1/5 - chlorure de méthylène/hexane/méthanol: 1/1/0,1 - acétone/hexane 1/1 à 1/4