Brevet FR2711375A1 — publié le 19950428

PROCEDE DE DETERMINATION DIFFERENTIELLE DES ACTIVITES DES ISOENZYMES DE L'a-AMYLASE La présente invention concerne un procédé de détermination différentielle des activités des isoenzymes de l'a- amylase. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la détermination différentielle des activités des isoenzymes de l'o-amylase dans un échantillon selon une opération facile et précise par la méthode de l'inhibiteur, avec un nouvel inhibiteur. On sait que, de façon générale, une î-amylase humaine comprend deux isoenzymes dont l'une provient du pancréas (que l'on appelle ci-après aamylase de type P) et l'autre provient des glandes salivaires (que l'on appelle ci-après c-amylase de type S). On soupçonne un stade précoce de pancréatite aiguë ou une pancréatite chronique grave lorsqu'on observe un taux élevé d'activité a-amylasique totale dans le sérum, ce taux étant principalement dû à une élévation de l'activité de l'î-amylase de type P. Cependant, on observe également un accroissement intense de l'activité oe-amylasique totale dans des affections des glandes salivaires ou de la glande parotide, dans des périodes postchirurgicales, ainsi que dans certaines affections hépatiques, principalement par suite d'un accroissement de l'activité de l'c-amylase de type S, ce qui peut souvent conduire à un diagnostic erroné. On recherche donc, ces dernières années, un procédé simple et précis pour la détermination différentielle de ces isoenzymes. On connaît à ce jour comme méthodes de détermination différentielle des activités des isoenzymes de l'o-amylase humaine, par exemple (1) l'électrophorèse, (2) la filtration sur gel, (3) l'essai immunoenzymatique (EIA) ou (4) la méthode de l'inhibiteur qui utilise un inhibiteur tel que l'inhibiteur de germe de blé. Parmi ces méthodes, les méthodes (1) à (3) ont pour défaut que l'opération de mesure est compliquée et longue. Par ailleurs, la méthode de l'inhibiteur (4) utilisant l'inhibiteur de germe de blé comme inhibiteur détermine les activités des t-amylases de type P et de type S en utilisant le fait que ledit inhibiteur de germe de blé inhibe plus fortement les c-amylases de type S que les c-amylases de type P, en d'autres termes, que cette inhibition a des constantes d'inhibition différentes contre ces amylases. Cette méthode, relativement simple & mettre en pratique, a été de plus en plus utilisée ces dernières années. Cependant, l'inhibiteur de germe de blé est une proteine et sa stabilité est donc médiocre. Il est donc difficile de conserver pendant une période longue un coffret de réactifs pour la mesure de l'activité des isoenzymes de l'o-amylase. De plus, l'inhibiteur de germe de blé a également pour défaut que sa constante d'inhibition doit être mesurée pour chaque coffret, car les inhibiteurs de germe de blé des isoenzymes de l'o-amylase ont des constantes d'inhibition différentes selon leur degré de purification. L'invention vise & supprimer les défauts de la méthode classique de l'inhibiteur et de fournir un procédé pour mesurer efficacement les activités des isoenzymes de l'î-amylase selon une opération simple et très précise. Les présents inventeurs ont effectué diverses recherches pour atteindre le but précité. Ils ont ainsi découvert qu'il existe une très grande différence entre les constantes d'inhibition du 63- désoxymaltotriose vis-à-vis des a-amylases de type P et de type S et que la détermination différentielle des isoenzymes de l'c-amylase selon la méthode de l'inhibiteur peut être effectuée avec succès lorsqu'on utilise la matière précitée comme inhibiteur. L'invention repose sur ces découvertes. L'invention fournit un procédé de détermination quantitative différentielle des activités des isoenzymes de l'î-amylase, qui utilise une valeur mesurée de l'activité d'=-amylase obtenue par réaction d'un substrat de mesure de l'activité d'o-amylase avec un échantillon et une valeur mesurée d'une activité d'oe-amylase obtenue par réaction du même substrat et du même échantillon que ci-dessus en présence d'un inhibiteur qui a des constantes d'inhibition différentes vis-à-vis des deux types des isoenzymes de l'o-amylase, l'inhibiteur utilisé dans ce procédé étant le 63-désoxymaltotriose [0-6-désoxy-X-D-glucopyrannosyl-(1-*4)-O-=-D-glucopyrannosyl-(1-4)- D-glucose] représenté par la formule CH3 OH OH O)O O OHa H, f, OH (1I) OH O H O H OH OH OH L'invention est expliquée de façon plus détaillée ci-après. Tout d'abord, le substrat pour la mesure des activités de l'o-amylase utilisée dans l'invention peut être l'un quelconque des substrats permettant de mesurer les activités de l'î-amylase et comprend par exemple un dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale F RlH OH OH -> OH " H ïe OR (II) R2 OI OH OH n OH dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe chromogène aromatique ou un groupe saccharide autre que le glucose, Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy, azido, acyloxy, alkyloxy, aryloxy, alkylsulfonyle, arylsulfonyle, alkylmercapto, arylmercapto, N-alkylcarbamoyloxy, N-arylcarbamoyloxy, alkyloxyméthoxy ou aryloxyméthoxy, ou R1 et R2 peuvent former ensemble un groupe méthylènedioxy substitué ou non substitué et n est un entier de 1 à 6. Parmi eux, un substrat présentant un rapport des vitesses de réaction des a-amylases de type P et de type S vis-à-vis du substrat d'au moins 0,6, en particulier d'environ 1, est avantageux eu égard à la simplicité, à la facilité et à l'exactitude. Egalement, le 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I), que l'on utilise comme inhibiteur, n'est pratiquement pas hydrolysé par l'aamylase ou même par une enzyme couplée qui peut exister, si besoin est, lors de la mesure des activités de l'c-amylase et spécifiquement inhibe particulièrement l'a-amylase de type P. Donc, la différence des constantes d'inhibition des C-amylases de type P et de type S est très élevée. De plus, cette matière diffère des autres protéines, telles que l'inhibiteur de germe de blé, en ce qu'elle est très stable, si bien qu'on peut la conserver pendant une période prolongée et l'utiliser efficacement lorsqu'on l'incorpore à un coffret de réactifs pour la mesure des activités des isoenzymes de l'C-amylase. Le procédé de détermination différentielle des activités des isoenzymes de l'o-amylase dans un échantillon va être expliqué en détail ci-après. Les constantes de vitesse de réaction (kp, ks) pour un substrat de mesure des activités de l'o-amylase utilisé sont tout d'abord obtenues de façon ordinaire respectivement avec des préparations d'a-amylases de type P et de type S ayant une activité connue (voir les exemples suivants). Egalement, on ajoute le 63-désoxymaltotriose, utilisé comme inhibiteur, à diverses concentrations au même substrat de mesure des activités de l'c-amylase que celui utilisé ci-dessus, pour déterminer la concentration du 63-désoxymaltotriose pour laquelle la différence des constantes d'inhibition pour les préparations d'a-amylases de type P et de type S décrites ci-dessus est maximale, et on détermine les constantes d'inhibition (a, b) relatives aux c-amylases de type P et de type S pour cette concentration selon la méthode ordinaire (voir les exemples ci-après). Ensuite, on ajoute le substrat précité de mesure des activités de l'=amylase à un échantillon dont on mesure les activités d'a-amylase. On fait réagir de façon ordinaire le mélange en présence ou en l'absence d'une enzyme couplée et on mesure les absorbances variables (T). On mesure ensuite l'absorbance variable (W) de la même façon que mentionné ci-dessus, si ce n'est que l'on ajoute le 63-désoxymaltotriose & la concentration déterminée ci-dessus. A cet égard, il existe la relation suivante entre l'activité (P) de l'o-amylase de type P et l'activité (S) de l'o-amylase de type S: kpP + ksS = T (1) (1 - a) kpP + (1 - b) kS = W (2). On obtient les équations suivantes à partir de ces relations: P = [(1 - b) T - W]/[kp (a - b)] (3) S = (T - kpP)/ks (4). Donc, lorsqu'on mesure préalablement kP, ks, a et b, on peut facilement effectuer la détermination différentielle des activités des deux isoenzymes dans un échantillon par utilisation d'un substrat de mesure des activités d'o-amylase, et du même substrat et de 63- désoxymaltotriose, et en utilisant comme T et W dans les formules (3) et (4) les absorbances variables (T, W) mesurées lors de la réaction de l'enzyme. Le 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I), que l'on utilise dans le procédé de l'invention, peut être l'anomère o ou l'anomère 3. Egalement, le dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule (II), que l'on utilise comme substrat pour la mesure des activités de l'a-amylase, peut être l'anomère î ou l'anomère 13. De plus, comme fragment de maltooligosaccharide, on peut utiliser tous ceux allant du maltotriose au maltooctaose, en particulier le maltopentaose, le maltohexaose et le maltoheptaose. Le symbole R dans la formule générale (II) représente un atome d'hydrogène, un groupe chromogène aromatique ou un fragment d'un monosaccharide autre que le glucose, et on préfère particulièrement un groupe chromogène aromatique. Comme groupe chromogène aromatique, on peut utiliser tout groupe détectable par spectroscopie, y compris par exemple les suivants: R3 R4 R5 Rl 6 o R3 & R7, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène ou un groupe nitro, alkyle, aryle, allyle, amino, acide sulfonique ou carboxy, ou R3 et R ou R4 et R5 peuvent être réunis pour former un cycle aromatique condensé, m? R 4 15 R16 17 o R10 à R17, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène ou un groupe nitro, alkyle, aryle, allyle, amino, acide sulfonique ou carboxy, ou R10 et R11 ou R12 et R13 peuvent être réunis pour former un cycle aromatique condensé, ou R11 et R12 et/ou R15 et R16 peuvent représenter un atome d'oxygène commun pour former un cycle éther condensé, et Z représente un atome d'azote ou un groupe N-O. De plus, le monosaccharide autre que le glucose peut être un monosaccharide au sens large ou un dérivé de monosaccharide, et comprend par exemple le fructose, l'inositol, le glucitol, le sorbitol et le glucose-6-phosphate. Des exemples typiques du composé représenté par la formule générale (II) comprennent le maltopentaose, le maltoheptaose, le 3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 45,65-di-O- (N-éthyl)carbamoyl-0-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le ,65-di-O-méthoxyméthyl-O-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitro- phényle, le 65-azido-65-désoxy-e-D-maltopentaoside de 2-chloro-4- nitrophényle, le 67-chloro-67-désoxy-3-D-maltoheptaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, l't-D-maltotrioside de 2-chloro-4-nitro- phényle, le 65-O-benzyl---D-maltopentaoside de 4-nitrophényle, le ,65-Obenzylidène-3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 65-O-toluènesulfonyl-O-D-maltopentaoside de phénolindo-3'-chloro- phényle, le 65-chloro-65-désoxy-D-maltopentaose, le 1-(46-O,66-O- diméthanesulfonyl-=-maltohexaosyl)-=-D-glucitol et similaires. Dans ce contexte, les symboles 65, 6?, 6m et 4m signifient ici que les groupes 6- ou 4-hydroxy dans la 5èe, 7ème ou mème positions & partir de l'extrémité réductrice d'un motif de glucose constituant un dérivé de maltooligosaccharide sont substitués. De plus, le 63-désoxymaltotriose de formule (I) est une matière connue (voir Carbohydrate Res., 51, 73-84 (1976)), que l'on peut préparer selon des procédés quelconques. Par exemple, on peut préparer le 63-désoxymaltotriose désiré par monotosylation de la 3-cyclodextrine selon le procédé décrit dans Carbohydr. Res., 238, 193-213 (1993), réaction du dérivé tosylé avec le borohydrure de sodium pour former la mono-6-désoxy-0-cyclodextrine, que l'on fait réagir avec une enzyme saccharifiante de type exo, telle que la glucoamylase ou l'a-glucosidase, pendant ou après la réaction avec la cyclodextrinase (voir la publication préliminaire de brevet japonais n 3-15384), une a-amylase dérivée du genre Aspergillus ou similaires et, de plus, traitement du produit selon un procédé ordinaire de purification. De plus, ledit 63- désoxymaltotriose peut être produit par combinaison de divers procédés de synthèse (voir J. Biochem. 84, 835-842 (1978)). De plus, comme dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II), on peut utiliser un produit du commerce, tel quel, directement, ou un produit obtenu selon une combinaison appropriée des procédés généraux de préparation [voir par exemple les publications préliminaires de brevets japonais n 5-1091, 6-56869, -78994 et 4-346994 et Carbohydrate Research, 238, 109-133 (1993)]. Dans le procédé de la présente invention, on mesure les activités de l'=amylase avec le dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II) en tant que substrat de mesure de l'activité d'a-amylase, en présence ou en l'absence du 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I) en tant qu'inhibiteur de l'=-amylase, pour la détermination quantitative des activités des isoenzymes de l'a-amylase. Dans ce cas, on fait généralement réagir l'=-amylase et le substrat en présence d'une enzyme couplée. La relation entre le substrat et l'enzyme couplée n'est pas particulièrement limitée et peut être ordinaire. Pour certains substrats, des enzymes couplées sont inutiles, comme précisé ci-après. Par exemple, on peut mentionner comme combinaison du dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II) en tant que substrat et de l'enzyme couplée, les suivantes: (1) lorsque n est 1 et OR représente un anomère oe, aucune enzyme couplée n'est nécessaire; (2) lorsque dans le composé n vaut 2 ou plus et R représente un atome d'hydrogène (anomère c et/ou anomère 53), on utilise l'e- glucosidase et/ou la glucoamylase; (3) lorsque dans le composé R représente un groupe chromogène aromatique ou un fragment d'un monosaccharide autre que le glucose, (i) dans le cas d'un anomère o seul, on utilise l'oc-glucosidase et/ou la glucoamylase; et (ii) dans le cas d'un anomère 03 seul ou d'un mélange d'un anomère o et d'un anomère 3, on utilise la 0-glucosidase en plus de l'o-glucosidase et/ou de la glucoamylase. A cet égard, lorsqu'on utilise comme substrat le dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II), dans laquelle l'extrémité non réductrice est un composé ayant des groupes hydroxyles pour R1 et R2, on n'utilise pas, comme d'habitude, la glucoamylase comme enzyme couplée. L'=-glucosidase utilisée ici peut provenir d'animaux, de plantes ou de microorganismes et on utilise de préférence celle provenant de levures. Egalement, la glucoamylase peut provenir d'une source quelconque et on préfère par exemple celle provenant de Rhizopus sp. De plus, on peut également utiliser une 3-glucosidase provenant de sources quelconques et on utilise par exemple celle obtenue à partir d'amandes. Ensuite, comme systèmes avantageux pour la détermination quantitative des activités des isoenzymes de l'e-amylase, on peut mentionner les systèmes comprenant le dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II), en tant que substrat, en une quantité de 0,1 à 10 mM, un tampon en une quantité de 2 & 300 mM et, lorsqu'une enzyme couplée est nécessaire, de l'=-glucosidase et/ou de la glucoamylase en une quantité de 5 à 1 000 unités/ml respectivement, et de la 3- glucosidase en une quantité de 0,5 & unités/ml et ayant un pH de 4 à 10, eu égard à la combinaison dudit substrat et de l'enzyme couplée. Egalement, comme concentration du 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I) et incorporé en tant qu'inhibiteur au système de mesure des activités de l'=-amylase, on utilise une concentration à laquelle la différence entre les constantes d'inhibition de l'-amylase de type P et de l'o-amylase de type S est maximale, et une telle concentration est généralement de 0,01 à 10 mM, de préférence de 0,05 à 5 mM. Comme tampon utilisé, on peut mentionner par exemple un phosphate, un acétate, un carbonate, le tampon de Good, un borate, un citrate ou un diméthylglutarate. Si besoin est, on peut ajouter une grande diversité d'additifs classiques, en plus des composants précités, à de tels systèmes, dans une gamme ne nuisant pas à invention. Par exemple, on peut ajouter du glycérol, de la sérum-albumine bovine, des a- ou 3-cyclodextrines ou du Triton X-100 comme adjuvant de dissolution et comme agent stabilisant, et on peut ajouter des ions, tels que Cl-, Ca2+ ou Mg2 sous forme de NaCl, MgCl2, MgSO4, CaCl2 ou CaCl2-H2O comme agents d'activation de l'=- amylase humaine. Ces additifs peuvent être ajoutés isolément ou en combinaison de deux ou davantage. Ces composants peuvent être ajoutés en une étape appropriée lors de la préparation du système. Lorsqu'on utilise comme substrat un maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un fragment d'un monosaccharide, la détermination quantitative du glucose, du maltose ou des autres monosaccharides formés par une réaction enzymatique, selon la méthode spectroscopique, peut être effectuée par addition des enzymes généralement utilisées dans le système de mesure impliqué dans la réaction d'oxydoréduction de NAD(P) - NAD(P)H ou NAD(P)H - NAD(P), telles que la glucose-6-phosphate déshydrogénase (par exemple celle provenant de Leuconostoc mesenteroides), la maltose phosphorylase (par exemple celle provenant de Lactobacillus brevis), l'hexokinase (par exemple celle provenant de levure), la 3-phosphomutase (par exemple celle provenant de muscle de lapin), la sorbitol déshydrogénase (par exemple celle provenant de foie de mouton), le NAD(P) [ou le NAD(P)H] et l'ATP. On préfère utiliser comme substrat le maltooligosaccharide de formule (II) dans laquelle R est un groupe chromogène aromatique, car l'utilisation desdites enzymes est inutile et on peut utiliser le procédé par mesure de l'absorbance. Sur les dessins annexés: la figure 1 est un graphique illustrant la relation entre les diverses concentrations de 63- désoxymaltotriose (DOG3), en tant qu'inhibiteur, et les activités relatives des o-amylases de type P et de type S dans les exemples des procédés selon l'invention, la figure 2 est un graphique illustrant la corrélation entre les mesures des activités d'o-amylase de type P selon le présent procédé et celles selon le procédé de l'inhibiteur de germe de blé, la figure 3 est un graphique illustrant la corrélation entre les mesures des activités d'o-amylase de type P selon la méthode au -azido-65-désoxy-0-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle (N3G5-CNP) dans le présent procédé et celles selon la méthode au 3-D- maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle (G5-CNP) et la figure 4 est un graphique illustrant la corrélation entre les mesures de l'activité de l'e-amylase de type P selon la méthode à deux canaux et selon la méthode cinétique double dans le présent procédé. Le procédé de l'invention va être expliqué relativement aux modes de réalisation préférés. Tout d'abord, on détermine les constantes de vitesse de réaction (kp, ks) en utilisant un dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule (II) comme substrat et des préparations d'c-amylases de type P et de type S, ayant une activité connue, selon la méthode classique. On utilise également des préparations d'e-amylases de type P et de type S ayant une activité connue, on ajoute le 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I) & diverses concentrations au même substrat pour déterminer la concentration à laquelle la différence des constantes d'inhibition entre les inhibiteurs pour les o-amylases de type P et de type S décrites ci-dessus est maximale et on obtient les constantes d'inhibition (a, b) pour les a-amylases de type P et de type S & cette concentration selon la méthode habituelle. La méthode de détermination différentielle comprend la méthode à deux canaux (méthode de mesure double) et la méthode cinétique double (méthode de mesure simple, analyse simultanée de deux éléments), et la première méthode va maintenant être expliquée. A un échantillon ayant une activité d'î-amylase, on ajoute, si besoin est, de l'o-glucosidase et/ou de la glucoamylase en tant qu'enzyme couplée, en une quantité de 5 & 1 000 unités/ml, de préférence de 10 à 500 unités/ml. Si le substrat contient l'anomère 3, on lui ajoute de plus de la 13-glucosidase en une quantité de 0,5 à 30 unités/ml, de préférence de 1 à 15 unités/ml. Simultanément ou ensuite, on ajoute le substrat à raison de 0,1 à mM, de préférence de 0,3 à 5 mM, avec un tampon, et on fait réagir le mélange dans des conditions telles que la température soit de 25 à 45 C, de préférence de 35 à 40 C, et le pH de 4 à 10, de préférence de 6, 5 à 7,5, pendant au moins 1 minute, de préférence 2 à minutes. On mesure en continu, de façon intermittente, à une longueur d'onde appropriée, la variation de l'absorbance (T) du composé chromogène aromatique ainsi obtenu, directement ou après ajustement du pH. Egalement, on mesure les absorbances variables (W) de la même façon que ci-dessus, si ce n'est que l'on ajoute l'inhibiteur au même substrat que ci-dessus à une concentration à laquelle la différence des constantes d'inhibition des amylases de type P et de type S dans le système de mesure est maximale. En ce qui concerne cette dernière méthode, on mesure les absorbances variables (T') de la même façon que ci-dessus et on ajoute ledit inhibiteur au système de mesure, à une concentration à laquelle la différence des constantes d'inhibition est maximale, pour mesurer les absorbances variables (W). Dans ce cas, T est représenté par l'équation suivante: T = T' x (T' de la quantité totale de liquide lors de la mesure/W de la quantité totale de liquide lors de la mesure) A cet égard, on peut ajouter l'inhibiteur directement à la solution de substrat ou au système de mesure ou on peut également l'utiliser en l'ajoutant à une enzyme couplée utilisée. Dans le cas du composé représenté par la formule générale (II) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un fragment d'un monosaccharide, on peut suivre des modes opératoires semblables à ceux du cas o R est un groupe chromogène aromatique, après addition de l'enzyme correspondant au système d'absorbance et des autres composants nécessaires. Les valeurs ainsi obtenues peuvent être utilisées comme kp, ks, a, b, T et W dans les équations (3) et (4) et on peut donc obtenir l'activité P d'o-amylase de type P et l'activité S d'o-amylase de type S dans un échantillon. Le 63-désoxymaltotriose représenté par la formule (I), que l'on utilise comme inhibiteur dans la présente invention, présente une différence extrêmement importante entre les constantes d'inhibition des deux isoenzymes de l'o-amylase et a donc comme avantage que l'on peut réaliser efficacement, selon une opération simple et avec une précision améliorée par rapport aux méthodes classiques, la détermination différentielle des activités d'isoenzyme de l'=-amylase humaine. Donc, le procédé de la présente invention convient comme méthode de détermination pour le diagnostic de maladies dans lesquelles l'a-amylase de type P et l'c-amylase de type S doivent être déterminées quantitativement séparément. On peut également utiliser la méthode cinétique double (méthode de mesure simple, avec analyse simultanée de deux éléments) comme méthode de détermination différentielle de l'invention. Cette méthode est préférée en ce que la mesure peut être réalisée comme décrit dans les exemples ci-dessus avec un échantillon, un substrat et une enzyme couplée, en une quantité moitié moindre, rapidement, par rapport à la méthode à deux canaux (méthode de mesure double). L'invention est illustrée de façon plus détaillée par des exemples. Dans les exemples N3G5-CNP signifie 65-azido-65-désoxy-3- D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, DOG3 signifie 63désoxymaltotriose et G5-CNP signifie 3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle. Egalement, la longueur d'onde de l'absorbance maximale est mesurée dans le méthanol et la rotation spécifique est mesurée avec la raie D & 25 C, sauf indication contraire. Exemple informatif 1: Préparation de N3G5-CNP (1) Préparation de 6-Otosyl-0-cyclodextrine On dissout 50,0 g (44,1 mmol) de O-cyclodextrine du commerce (Waco Pure Chemical Industries Ltd.) dans 500 ml de pyridine et on ajoute 33,3 g (175 mmol) de chorure de tosyle. On fait réagir le mélange avec agitation & la température ordinaire pendant 4 heures. On ajoute ensuite au mélange réactionnel 250 ml d'eau et 1 1 de nbutanol. On concentre le mélange & la moitié de son volume, sous pression réduite, et on verse avec agitation dans 500 ml d'acétone pour précipiter un produit solide que l'on sépare par filtration avec un filtre de verre et lave deux fois avec 200 ml d'acétone. On purifie le produit séparé par filtration par chromatographie sur une colonne de phase à l'ODS et on concentre et recristallise dans l'eau la fraction désirée, éluée avec un mélange d'éthanol-eau (rapport en volume 1/9), pour obtenir 25,3 g de 6-O-tosyl-3-cyclodextrine (19,6 mmol; rendement: 44,4 %). Point de fusion ( C): 172,0-174,0 (décomposition). Spectre IR (cm 1): 3 400, 2 930, 1 642, 1 632, 1 600, 1 424, 1 360, 1 300, i 178, i 156, 1 078, 1 028. Spectre de RMN (200 MHz) ppm (DMSO-d6): 2,44 (3H, s), 3,15-4,45 (m), 4, 76 (2H, s large), 4,85 (5H, s large), 7,44 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,8 Hz). (2) Préparation de 6-azido-6-désoxy-%-cyclodextrine On dissout 16,9 g (13,1 mmol) de 6-O-tosyl-3-cyclodextrine obtenue dans la section (1) cidessus dans un mélange de 500 ml d'eau et de 250 ml de 1,4-dioxanne, on ajoute 34,1 g (525 mmol) d'azide de sodium et on fait réagir le mélange à 85 C pendant 4 heures. On concentre ensuite le mélange réactionnel sous pression réduite à la moitié de son volume et on purifie par chromatographie sur une colonne de phase à l'ODS. On concentre et recristallise dans l'eau la fraction désirée, éluée avec un mélange d'éthanol-eau (raport en volume 1/9), pour obtenir 14,3 g (12, 3 mmol; rendement: 93,9 %) de 6-azido-6-désoxy-3-cyclodextrine. Point de fusion ( C): 215,0-218,0 (décomposition). Spectre IR (cm 1): 3 390, 2 920, 2 120, i 642, 1 414, 1 370, 1 340, 1 304, 1 156, i 080, 1 030. Chromatographie liquide à haute performance [colonne de TSK gel Amide-80 (4,6 mm de diamètre intérieur x 250 mm) fabriquée par Tosoh Corporation, détecteur réfractométrique; éluant: acétonitrile/eau = 3/2 (v/v); débit: 1,0 ml/min]: tR = 6,6 min. Rotation spécifique [(]: (c = 0,510; 1,4-dioxanne/H2O = 1/1 (v/v)) +145 . Analyse élémentaire pour C42H69N3034 C H N Théorique (%) 43,49 6,00 3,62 Trouvée (%) 43, 28 6,11 3,53 (3) Préparation de 65-azido-65-désoxy-D-maltopentaose On verse avec agitation 25 g (21,6 mmol) de 6-azido-6- désoxy-0-cyclodextrine, obtenue selon le même mode opératoire qu'en (2), dans 1,0 1 de tampon phosphate 10 mM (pH 7,8) que l'on a chauffé à 40 C et on dissout complètement. On ajoute 490 unités de cyclodextrinase, obtenue dans le procédé décrit ci-après, et on fait réagir le mélange avec agitation à 40 C pendant 2 heures. Après achèvement de la réaction, on chauffe le mélange réactionnel avec agitation à 80 C pendant 10 minutes. On refroidit ensuite le mélange réactionnel à la température ordinaire, on filtre avec du RADIOLITE (#100) et une membrane filtrante (0,45 pm), puis on concentre sous pression réduite à 115 ml. On purifie le concentré obtenu par chromatographie sur une colonne de phase à l'ODS, on élue avec un mélange d'éthanol-eau [gradient de 0 % (v/v) - 35 % (v/v)] et on concentre pour obtenir 11,6 g d'un 6m-azido- maltoheptaose (m est un entier de 1 à 7) (9,86 mmol; rendement: 45,6 %). On dissout ensuite le produit dans 250 ml de tampon acétate mM (pH 4,5) avec agitation et on ajoute de plus à la solution 8 mg de glucoamylase [250 unités; Seikagaku Corporation]. On fait réagir le mélange avec agitation à 40 C pendant 4 heures. Après achèvement de la réaction, on chauffe le mélange réactionnel avec agitation à C pendant 20 minutes. On refroidit ensuite à la température ordinaire, on filtre sur une membrane filtrante (0,45 pm) et on concentre sous pression réduite à un volume de 55 ml. On purifie le concentré obtenu par chromatographie sur une colonne de charbon actif en éluant avec un mélange d'éthanol-eau (gradient de 5 % - 45 %) et on lyophilise la fraction éluée avec de l'éthanol à environ 30 % pour obtenir 1,79 g de 65-azido-65-désoxy-D- maltopentaose (2,10 mmol; rendement: 21,3 %). Point de fusion ( C): 176,0-179,0. Spectre IR (cm1): 3 400, 2 920, 2 110, 1 628, 1 406, 1 360, 1 278, i 240, 1 144, 1 076, 1 022. Spectre de RMN (200 MHz) ppm (D20): 2,80-4,00 (m), 4,64 (0,SH, d, J = 8,0 Hz), 5,23 (0,5H, d, J = 3,5 Hz), 5,35 (4H, d, J = 3,5 Hz). Chromatographie liquide à haute performance [colonne TSK gel Amide-80 (4, 6 mm de diamètre intérieur x 250 mm) fabriquée par Tosoh Corporation; détecteur réfractométrique; éluant: acétonitrile/eau = 3/2 (v/v); débit: 1,0 ml/min]: tR = 6,9 min. Rotation spécifique [î]: (c = 0,544; H20) +169 . Analyse élémentaire: pour C30H51N3025 C H N Théorique (%) 42,21 6,02 4,92 Trouvée (%) 42,03 6,13 4,69 (4) Préparation de N3G5-CNP On dissout 5,0 g (5,86 mmol) de 65-azido-65-désoxymalto- pentaose, obtenu de la même façon qu'en (3) ci-dessus, dans 100 ml de pyridine, on ajoute 50 ml (529 mmol) d'anhydride acétique et on fait réagir le mélange à la température ordinaire pendant 2 jours. Ensuite, on évapore la pyridine, l'anhydride acétique et l'acide acétique du mélange réactionnel et on dissout le résidu, sans purification, dans 30 ml de dichlorométhane, on ajoute 556 g1 (5,86 mmol) de tribromure de phosphore et 211 bl (11,7 mmol) d'eau à la solution et on fait réagir le mélange avec agitation à la température ordinaire pendant 20 heures. On ajoute au mélange réactionnel 18,6 g (135 mmol) de carbonate de potassium anhydre et on fait réagir le mélange avec agitation à la température ordinaire pendant 15 minutes. On sépare les matières insolubles avec un filtre de verre et on lave trois fois avec 200 ml de dichlorométhane. On combine le filtrat et les liquides de lavage et on chasse le dichlorométhane par évaporation. On dissout le résidu sans purification dans 100 ml d'acétonitrile, on ajoute & la solution ,09 g (29,3 mmol) de 2-chloro-4-nitrophénol, puis 6, 80 g (29,3 mmol) d'oxyde d'argent (Ag2O) et on fait réagir le mélange avec agitation à C pendant 17 heures. On fait passer le mélange réactionnel à travers un filtre de verre et on lave le solide trois fois avec 50 ml de dichlorométhane. On combine le filtrat et les liquides de lavage et on concentre sous pression réduite pour chasser l'acétonitrile et le dichlorométhane contenus dans le filtrat. Après addition de 300 ml de dichlorométhane au résidu et filtration du mélange sur un tampon de coton, on lave les matières insolubles avec 200 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,5 N et trois fois avec 200 ml de solution salée saturée. On combine le filtrat et les liquides de lavage et on sèche sur 10 g de sulfate de sodium anhydre, on filtre & travers un tampon de coton et on concentre sous pression réduite pour chasser le dichlorométhane. On met le résidu directement en suspension dans un mélange de 60 ml de méthanol, 30 ml d'ammoniaque & 28 % p et 15 ml d'eau et on fait réagir la suspension avec agitation & 35 C pendant 20 heures. On concentre ensuite le mélange réactionnel sous pression réduite pour chasser l'eau et le méthanol contenus dans le mélange réactionnel. On purifie le résidu ainsi obtenu par chromatographie sur une colonne de gel & l'ODS et on élue la fraction désirée avec un mélange d'éthanol-eau (rapport en volume: 1/4), on concentre et on recristallise dans l'eau pour obtenir 2,47 g du N3G5-CNP désiré (2,45 mmol; rendement: 41,8 %). Point de fusion ( C): 130,0-135,0 (décomposition). Spectre UV-visible: longueur d'onde d'absorption maximale [(Xmax] (nm) = 290 (log E = 3,98), 227 (log E = 3,99), 209 (log E = 4,20). Spectre IR (cm 1): 3 410, 2 930, 2 110, 1 584, 1 520, 1 484, 1 274, 1 150, 1 078, 1 024. Spectre de RMN (200 MHz) ppm (DMSO-d6): 3,05-3,90 (m), 4,20-4,55 (m), 4, 74 (1H, d large, J = 4,8 Hz), 4,96 (1H, d large, J = ,4 Hz), 5,05 (2H, d, J = 3,7 Hz), 5,10 (2H, d, J = 3,7 Hz), 5,25 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,25-5, 60 (m), 7,47 (1H, d, J = 9,3 Hz), 8,19 (1H, dd, J= 9,3 Hz, 2,7 Hz), 8,29 (1H, d, J = 2,7 Hz). Chromatographie liquide à haute performance [colonne TSK gel Amide-80 (4, 6 mm de diamètre intérieur x 250 mm) fabriquée par Tosoh Corporation; détecteur réfractométrique; éluant: acétonitrile/eau = 3/1 (v/v); débit: 1,0 ml/min]: tR = 6,7 min. Rotation spécifique [o]: (c = 0,516; H20) +92,4 . Analyse élémentaire: pour C36H53C1N4027 C H N Théorique (%) 42,84 5,29 5,55 Trouvée (%) 42,88 5,31 5,59 Exemple informatif 2: Préparation de DOG3 (1) Préparation de 6-désoxy-3cyclodextrine On dissout 1,27 g (0,985 mmol) de 6-O-tosyl-3- cyclodextrine obtenue au paragraphe (1) de l'exemple informatif 1 dans 20 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO), on ajoute 384 mg (10,2 mmol) de borohydrure de sodium (NaBH4) et on fait réagir le mélange à 50 C pendant 12 heures. On ajoute ensuite au mélange réactionnel 1 000 ml d'eau et on soumet le mélange à une chromatographie sur une colonne de phase à l'ODS pour éliminer le DMSO. On élue la fraction désirée avec un mélange d'éthanol-eau (rapport en volume: 1/9), on concentre et on recristallise dans le méthanol pour obtenir 839,6 mg de 6-désoxy-0- cyclodextrine (0,750 mmol; rendement: 76,1%). Point de fusion ( C): 280,0-281,0 (décomposition). Spectre IR (cm 1): 3 370, 2 920, 1 152, 1 080, 1 020. Spectre de RMN (200 MHz) ppm (DMSO-d6): 1,20 (3H, d, J = 6,1 Hz), 2,80-4,05 (m), 4,84 (7H, s large). Analyse élémentaire: pour C42H70034 C H Théorique (%) 45,08 6,31 Trouvée (%) 44,99 6,45 (2) Préparation de DOG3 On ajoute avec agitation 15 g de 6-désoxy- 3-cyclodextrine, obtenue de la même façon que décrit en (1), dans 1,0 1 de tampon phosphate 100 mM (pH 7,0) et on dissout complètement. On ajoute à cette solution 24 unités de cyclodextrinase obtenue selon le procédé décrit ci-après et on fait réagir le mélange avec agitation à 40 C pendant 48 heures. Après achèvement de la réaction, on ajoute de l'acide chlorhydrique au mélange réactionnel pour ajuster le pH à environ 2,0 et arrêter la réaction. On neutralise le mélange par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium et on fait passer à travers une colonne de phase à l'ODS pour y adsorber la 6-désoxy-p- cyclodextrine n'ayant pas réagi et obtenir une fraction éluée. On répète cette opération pour traiter 63 g au total de 6-désoxy-0-cyclodextrine. On mélange la fraction éluée avec 1/10 en volume de tampon acétate 100 mM (pH 7,5) et on ajuste le pH à 4,5 avec de l'acide acétique 100 mM. Ensuite, on ajoute 2 500 unités de glucoamylase pour effectuer une réaction enzymatique & 40 C pendant 8 heures, on ajoute de l'acide chlorhydrique au mélange, pour ajuster le pH & environ 2,0 et arrêter la réaction, et on ajoute une solution d'hydroxyde de sodium pour neutraliser le mélange réactionnel. On fait passer le mélange réactionnel & travers une colonne de charbon actif en éluant le 6désoxymaltooligosaccharide avec des gradients d'éthanol de 0 à 35 %, puis on lyophilise la fraction éluée avec de l'éthanol à environ 21 % pour obtenir environ 1,0 g de 63-désoxy-D- maltotriose ayant une pureté d'environ 98 %. Spectre IR (cm 1): 3 400, 2 950, 1 690, 1 146, 1 042. Spectre de RMN (200 MHz) ppm (D20): 1,28 (3H, d, J = 6,1 Hz), 3,17 (1H, t, J = 8,9 Hz), 3,29 (1H, t, J = 8,9 Hz), 3,50-4,05 (m), 4,65 (environ 0, 5H, d, J = 7,8 Hz), 5,25 (environ 0,5H, d, J = 3,7 Hz), ,27 (1H, d, J = 3,0 Hz), 5,36 (1H, d, J = 3,9 Hz). Chromatographie liquide à haute performance [colonne TSK gel Amide-80 (4,6 mm de diamètre intérieur x 250 mm) fabriquée par Tosoh Corporation; détecteur réfractométrique; éluant: acétonitrile/eau = 3/2 (v/v); débit: 1,0 ml/min]: tR = 5,9 min. Analyse élémentaire: pour C18H32015 C H Théorique (%) 44,26 6,60 Trouvée (%) 44,28 6,58 Exemple informatif 3: Préparation de cyclodextrinase On introduit une portion de 100 ml d'un milieu de culture liquide (on utilise comme eau de l'eau du robinet, à pH 7,0) comprenant 1 % (p/v) de 3-cyclodextrine, 1 % (p/v) de peptone, 0,5 % (p/v) de NaCl et 0,1 % (p/v) d'extrait de levure dans une fiole de Sakaguchi de 500 ml et on pasteurise à 120 C pendant 20 minutes. On ensemence le milieu avec une anse de platine d'une culture inclinée d'une souche de Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458) et on cultive avec agitation à 30 C pendant 1 jour. On ensemence, avec une portion de 50 ml du milieu de culture, un récipient de 3 000 ml contenant 2 000 ml d'un milieu de culture ayant la même composition et préparé selon la même pasteurisation que ci-dessus et on effectue une fermentation avec aération-agitation à 30 C, 1 v/v.min et 350 tr/min pendant 2 jours. Après achèvement de la fermentation, on sépare les cellules bactériennes de la culture par centrifugation à 8 000 tr/min pendant 20 minutes, on met en suspension dans 500 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,0) contenant 2 % (p/v) de Triton X-100 et on agite la suspension à 25 C pendant 1 jour. On élimine les cellules bactériennes résiduelles de la suspension par centrifugation à 12 000 tr/min pendant 20 minutes, on dialyse le surnageant contre du tampon phosphate 10 mM (pH 7,0) et on centrifuge le produit dialysé à 12 000 tr/min pendant 20 minutes pour éliminer les matières insolubles. On utilise le surnageant comme solution d'enzyme brute (1).- On applique ensuite environ 500 ml de la solution d'enzyme brute (1) (activité totale: 200 unités; quantité de protéines: 2 083 mg; activité spécifique: 0,1; pH 7,0) à une colonne chargée de DEAE Sepharose équilibrée avec du tampon phosphate 10 mM (pH 7,0) (diamètre: 34 x 170 mm), on y adsorbe l'enzyme et on élue avec un gradient de NaCl de 0 & 0,5 M. On combine les fractions actives ainsi éluées pour obtenir 105 ml d'une solution d'enzyme brute (2) (activité totale: 145 unités; activité spécifique: 0,58; rendement: 72,5 %). Ensuite, on applique une portion de 20 ml de la solution d'enzyme brute (2) (activité totale: 31 unités; quantité de protéines: 29 mg) à une colonne chargée d'Ether 5PW équilibrée avec du tampon phosphate 100 mM (pH 7,0) contenant du sulfate de sodium 1 M (diamètre: 21,5 x 150 mm) et on adsorbe l'enzyme, puis on élue avec un gradient de sulfate de sodium de 1 M à 0 M. On combine les fractions actives recueillies pour obtenir 500 ml d'une solution d'enzyme brute (3) (activité totale: 72 unités; activité spécifique: 2,93; rendement: 36 %) (voir la publication préliminaire de brevet japonais n 3-15384). Exemple 1 (1) Mesure de la valeur Km d'un substrat N3G5-CNP pour la mesure de l'activité de l'a-amylase (a) Préparation d'une solution de N3G5-CNP Dans du tampon phosphate 50 mK (pH 7,0) contenant du NaCl mM et du MgCl2 2 mM, on dissout le N3G5-CNP obtenu dans l'exemple informatif 1 pour préparer des solutions de substrat pour la mesure de l'activité de l'c-amylase, & des concentrations de 0,16, 0,32, 0,48, 0,64, 0,80 et 0,96 mM. (b) Préparation d'une solution d'enzyme couplée On mélange et dissout une glucoamylase du commerce provenant de Rhizopus sp. et une P- glucosidase provenant d'amandes, dans du tampon phosphate 50 mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgC12 2 mM, pour obtenir des concentrations respectives de la glucoamylase et de la 3-glucosidase de 163 unités/ml et de 16,3 unités/ml. La glucoamylase et la 3-glucosidase du commerce utilisées sont fabriquées par Toyobo Co. Ltd. (c) Préparation d'une solution d'o-amylase On dissout de l'o-amylase humaine de type P et de l'a-amylase humaine de type S du commerce, chacune dans de l'eau distillée, pour établir une concentration de chaque amylase d'environ 150 UI/1. Les a-amylases humaines du commerce sont le CARIBZYME AMY fabriqué par International Reagents Corp., Japon. On attribue la valeur 16 100 au coefficient d'extinction moléculaire (E) du 2-chloro-4-nitrophénol et, par définition, une unité internationale (UI) d'activité d'o-amylase est la quantité d'enzyme qui décompose une pmol de G5-CNP & 37 C en une minute (il en est de même ci-après). (d) Mesure de Km Pour la solution d'a-amylase humaine de type P et la solution d'o-amylase humaine de type S, on ajoute 1,0 ml d'une solution d'enzyme couplée et on agite avec 250 p1 de la solution d'C-amylase, on chauffe & 37 C pendant 1 minute et on ajoute 2,0 ml de chaque concentration de la solution de N3G5-CNP et on agite et chauffe à 37 C pendant 2,5 minutes pour mesurer les absorbances variables & 400 nm pendant 2 minutes. Simultanément, on réalise un essai & blanc avec 250 p1 d'eau distillée au lieu de la solution d'c-amylase. On trace un graphique des mesures selon la méthode Lineweaver-Burk pour calculer la valeur Km selon la méthode des moindres carrés. Les résultats indiquent que les valeurs Km du N3GS-CNP pour les c-amylases humaines de type P et de type S sont respectivement de 0,17 mM et de 0,27 mM. (2) Mesure des constantes de vitesse de réaction kp et ks du substrat N3G5-CNP pour la mesure de l'activité de l'a-amylase, et essai de confirmation de la linéarité (a) Préparation d'une solution d'O-amylase On dissout les a-amylases humaines de type P et de type S du commerce, décrites ci-dessus, dans de l'eau distillée pour préparer des solutions d'=-amylase ayant respectivement une concentration de 541 UI/l et de 510 UI/l. On utilise ces solutions comme solutions- mères et on les dilue avec de l'eau distillée pour préparer six solutions d'X-amylase ayant une concentration de 100 %, de 80 %, de %, de 30 %, de 20 % et de 10 % (v/v). (b) Préparation de la solution d'enzyme couplée On la prépare de la même façon qu'en (b) de (1) décrit ci-dessus. (c) Préparation de la solution de N3G5-CNP On dissout le N3G5-CNP décrit ci-dessus dans du tampon phosphate 50 mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgCl2 2 mM pour que la concentration dans le tampon du N3G5-CNP soit de 3,25 mM [concentration finale (concentration dans le système de mesure, il en est de même ci-après): 2,0 mM]. La concentration correspond à 11,8 et 7, 4 fois la valeur Km pour les =-amylases humaines de type P et de type S et donc cette concentration suffit pour l'obtention de la vitesse de réaction maximale. (d) Confirmation de la linéarité et mesure des valeurs kp et ks A six solutions de chacune de l'e-amylase humaine de type P et de l'- amylase humaine de type S, on ajoute 1,0 ml de la solution d'enzyme couplée et on agite avec 250 i1 de la solution d'c-amylase et on chauffe à 37 C pendant 10 minutes. On ajoute 2,0 ml de solution de N3G5-CNP, on agite et on chauffe le mélange à 370C pendant 2,5 minutes pour mesurer les absorbances variables à 400 nm pendant 2 minutes. On réalise un essai à blanc avec 250 1l d'eau distillée au lieu de la solution d'=- amylase. On confirme ainsi la linéarité jusqu'à la concentration de 541 UI/1 pour l'c-amylase humaine de type P (r = 0,999) et jusqu'à la concentration de 510 UI/1 pour l'c-amylase humaine de type S (r = 0, 998). On obtient également les équations suivantes à partir de la pente de la courbe obtenue selon la méthode des moindres carrés kp = 1,1 x 10- 3 ks = 1,1 x 10-3. (3) Essai de mesure de la constante d'inhibition relative à l'a-amylase humaine de type P et à l'a-amylase humaine de type S du DOG3 (a) Préparation d'une solution mixte du substrat (N3G5-CNP) et de l'inhibiteur DOG3 On dissout le N3G5-CNP et le DOG3 obtenus dans l'exemple informatif 2, dans du tampon phosphate 50 mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgC12 2 mM, pour que le N3G5-CNP ait une concentration de 3,25 mM (concentration finale de 2,0 mM) et le DOG3 ait sept concentrations de 0,05, 0,11, 0,54, 1,09, 2,16, 3,25 et 5,41 mM (concentrations finales respectivement de 0,03, 0,07, 0,33, 0,67, 1,33, 2,00 et 3,33 mM). (b) Préparation d'une solution d'a-amylase On dissout de l'a-amylase humaine de type P et de l'o-amylase humaine de type S du commerce dans de l'eau distillée pour qu'elles aient une concentration d'environ 150 UI/l. (c) Préparation d'une solution d'enzyme couplée On la prépare de la même façon que décrit en (b) dans la section (1). (d) Mesure de la constante d'inhibition On mélange 250 1 de la solution d'o-amylase avec 1,0 ml de la solution d'enzyme couplée et on chauffe à 37 C pendant 1 minute, puis on ajoute 2,0 ml de chacun des mélanges (ayant 7 concentrations) du substrat (N3G5-CNP) et de l'inhibiteur DOG3, on agite et on chauffe à 37 C pendant 2,5 minutes, puis on mesure l'absorbance variable de chaque échantillon à 400 nm pendant 2 minutes. On attribue la valeur 100 % aux activités de l'o-amylase humaine de type P et de l'C-amylase humaine de type S contenant 0 mM de DOG3 (sans DOG3) et on obtient les activités relatives de l'=-amylase humaine de type P et de l'-amylase humaine de type S dans différentes concentrations de DOG3 à partir de chaque valeur déterminée, comme mentionné ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la figure 1. Sur cette figure, un cercle clair correspond à l'c-amylase humaine de type P et un cercle plein correspond à l'c-amylase humaine de type S. Ensuite, on obtient les activités relatives des =-amylases humaines de type P et de type S (respectivement 13,1 % et 67,9 %) & la concentration du DOG3 (0, 33 mM) à laquelle la différence des activités relatives est maximale (0, 548) et les constantes d'inhibition (a, b) à partir de ces valeurs. a = 1 - 0,131 = 0,869 b = 1 - 0,679 = 0,321. On obtient donc les valeurs de kp, ks, a et b et on obtient les activités des o-amylases humaines de type P et de type S (P, S) en utilisant les absorbances variables mesurées, comme T et W dans les équations (3) et (4). * (4) Essai de détermination différentielle On mélange des c-amylases humaines de type P et de type S ayant une activité connue, dans diverses proportions, et on observe la compatibilité de la valeur théorique obtenue à partir du rapport de mélange et de la valeur calculée obtenue à partir des équations (3) et (4), par utilisation du N3G5-CNP comme substrat et du DOG3 comme inhibiteur. (a) Préparation de la solution de substrat (N3G5-CNP) On dissout le substrat (N3G5-CNP) dans du tampon phosphate 50 mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgCl2 2 mM pour que le substrat ait une concentration de 3,25 mM (concentration finale: 2,0 mM). (b) Préparation de la solution mélangée du substrat (N3G5-CNP) et de l'inhibiteur (DOG3) On dissout du N3G5-CNP et du DOG3 dans du tampon phosphate mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgCl2 2 mM pour que le substrat et l'inhibiteur aient respectivement une concentration de 3,25 mM (concentration finale: 2,0 mM) et de 0,54 mM (concentration finale: 0,33 mM). (c) Préparation de la solution d'enzyme couplée On la prépare de la même façon que décrit en (b) dans la section (1). (d) Préparation de la solution d'essai des isoenzymes des o-amylases On dissout des a-amylases humaines de type P et de type S du commerce dans de l'eau distillée pour préparer des solutions d'a-amylase ayant une valeur théorique correspondant à (P/S) = (10/0) et (0/10). Les activités se situent dans l'intervalle o la linéarité étudiée dans la section (2) précitée est conservée. On utilise ces solutions comme solutions-mères et on mélange les solutions mélangées des x-amylases de type P et de type S dans les proportions de mélange en volume suivantes pour préparer 11 solutions d'essai des isoenzymes de l'OE-amylase: (P/S) = (10/0), (P/S) = (9/1), (P/S) = (8/2), (P/S) = (7/3), (P/S) = (6/4), (P/S) = (5/5), (P/S) = (4/6), (P/S) = (3/7, (P/S) = (2/8), (P/S) = (1/9) et (P/S) = (0/10). (e) Essai de détermination différentielle On mélange 1,0 ml de la solution d'enzyme couplée avec 250 l de chacune des solutions d'essai des isoenzymes de l'=-amylase et on chauffe le mélange à 37 C pendant 1 minute, on ajoute 2,0 ml de la solution de N3G5-CNP ou de la solution mélangée de N3G5-CNP et de DOG3 et on chauffe à 37 C pendant 2,5 minutes pour mesurer les absorbances variables (àDO) à 400 rnm. On réalise l'essai à blanc avec 250 1l d'eau distillée au lieu des solutions d'essai des isoenzymes de l'o-amylase pour obtenir les valeurs de T et de W. On utilise comme activités théoriques les valeurs d'activité obtenues à partir de l'activité avant le mélange et du rapport de mélange et on utilise comme activités calculées (valeurs trouvées) les valeurs obtenues par calcul en reportant dans les équations (3) et (4) les valeurs de kp, ks, a, b, T et W. Les résultats de l'essai figurent dans le tableau 1. L'unité d'activité est UI/l. Tableau 1 c-amvlase de type P *-amvlase de tvype S Théoriqcrue Calculée Théorique Calculée /0 183 183 0 0 9/1 165 168 16 14 8/2 147 151 32 33 7/3 128 133 47 47 6/4 110 106 63 66 /5 92 90 79 79 4/6 73 70 95 93 3/7 55 55 111 106 2/8 37 32 126 127 1/9 18 18 142 141 0/10 0 0 158 158 Le tableau 1 montre que les valeurs calculées (trouvées) et les valeurs théoriques présentent une forte corrélation. Exemple 2 On réalise une détermination quantitative différentielle de l'activité de l'o-amylase sur un sérum humain ayant des activités d'a-amylase. (1) Détermination différentielle selon le présent procédé (méthode à deux canaux) On réalise (a) la préparation du substrat (N3G5-CNP), (b) la préparation du mélange du substrat (N3G5-CNP) et de l'inhibiteur (DOG3) et (c) la préparation d'une solution d'enzyme couplée, de la même façon qu'en (a) à (c) de (4) de l'exemple 1. (d) Solution d'essai de l'a-amylase Sérums humains (50 échantillons) ayant des activités d'o-amylase. (e) Détermination quantitative différentielle On reprend les modes opératoires de (e) de (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 250 1l de sérum humain au lieu de la solution d'essai des isoenzymes de l'a-amylase. On utilise les valeurs de kp, ks, a, b et T et W obtenues dans les équations (3) et (4) pour obtenir les valeurs de P et de S (UI/1). (2) Méthode utilisant l'inhibiteur de germe de blé La préparation de la solution de substrat (N3G5-CNP) (a) et la préparation de la solution d'essai d't-amylase (b) sont les mêmes qu'en (a) et (d) en (1) ci-dessus. (c) Préparation du mélange d'une enzyme couplée et d'un inhibiteur de germe de blé On dissout le contenu d'un flacon d'inhibiteur de germe de blé [fabriqué par Seikagaku Corporation, 8 UIA (1 UIA est la quantité suffisante pour inhiber 50 % d'une amylase humaine de type S (2 unités/litre)) (méthode & l'amidon bleui)] dans 50 ml d'une solution d'enzyme couplée préparée de la même façon qu'en (b) de (1) dans l'exemple 1. (d) Détermination quantitative différentielle On mélange une portion de 1,0 ml de la solution mélangée préparée en (c) avec 250 1l de sérum humain et on chauffe à 37 C pendant 1 minute. On mélange, dans ledit mélange, 2,0 ml de la solution de N3G5-CNP et on chauffe & 37 C pendant 2 minutes, puis on mesure les absorbances variables (ADO) à 400 nm pendant 2 minutes. On réalise un essai à blanc avec 250 1 d'eau distillée au lieu de la solution d'essai d'c-amylase pour obtenir la valeur de W avec cette méthode. Par ailleurs, on opère de la même façon que décrit ci-dessus, si ce n'est que l'on utilise 1,0 ml de la solution d'enzyme couplée seule au lieu de la solution mélangée de (c) pour obtenir la valeur de T selon cette méthode. Les mesures indiquent que les valeurs de kp, ks, a et b dans la méthode de l'inhibiteur de germe de blé sont de 1,1 x 10'3, 1,1 x -3, 0,262 et 0, 726. On reporte dans les équations (3) et (4) ces valeurs ainsi que celles de T et de W obtenues selon cette méthode, pour obtenir les valeurs de P et de S (UI/1). (3) Le graphique des valeurs de P obtenues selon le présent procédé de détermination différentielle et les valeurs de P obtenues selon la méthode de l'inhibiteur de germe de blé est illustré par la figure 2. Les résultats montrent que les deux valeurs de P ont une corrélation r = 0,989, avec Y = 0,962 X - 1,469 et que ces deux méthodes concordent bien entre elles. (4) Comparaison des erreurs de mesure dans le présent procédé de détermination différentielle utilisant une autre solution d'essai de l'=amylase et dans la méthode de l'inhibiteur de germe de blé On mesure l'activité d'a-amylase de type P de la même façon que dans la méthode de détermination différentielle de (1) et de (2) décrites ci- dessus, si ce n'est que l'on utilise l'Enzyme Reference [nom commercial d'une a-amylase humaine (î-amylase de type P/ a-amylase de type S = 1/1), fabriquée par Wako Pure Industries Ltd.] au lieu de sérum humain, pour comparer les erreurs de mesure dans ces méthodes. Les résultats figurent dans le tableau 2. Tableau 2 Présent Méthode de l'inhibiteur procédé de germe de blé Nombre de mesures 30 30 Moyenne (UI/1) 141,2 143,9 Ecart type 2,0 3,0 Coefficient de variation (%) 1,44 2,09 Comme le montrent les coefficients de variation du tableau 2, les activités des isoenzymes de l'=-amylase peuvent faire l'objet d'une détermination différentielle avec une erreur de mesure moindre et une plus grande précision selon le présent procédé par rapport & la méthode de l'inhibiteur de germe de blé. Exemple 3 (1) Mesure de la valeur Km, des constantes de vitesse de réaction kp et ks de G5-CNP et des constantes d'inhibition a et b de DOG3 On mesure la valeur Km et les constantes de vitesse de réaction (kp et ks) de G5-CNP et les constantes d'inhibition a et b de DOG3, de la même façon que dans l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise un G5-CNP du commerce [fabriqué par Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd.] au lieu du N3G5-CNP en tant quesubstrat pour la mesure de l'a-amylase et que l'on utilise 406 unités/litre d'c-glucosidase [fabriquée par Toyobo Co. Ltd.] au lieu de glucoamylase comme enzyme couplée. Les résultats indiquent que les valeurs de Km, k et ks du G5-CNP sont respectivement de 0,45 mM, 1,2 x 10'3 et 1,2 x 10'3 et que les valeurs de a et de b du DOG3 à la concentration de 0,50 mM sont respectivement de 0,617 et de 0,141. (2) Détermination quantitative différentielle (a) Préparation de la solution de substrat G5-CNP On la prépare de la même façon qu'en (a) de (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 3,25 mM du G5-CNP précité (concentration finale: 2,0 mM) au lieu de N3G5-CNP. (b) Préparation d'une solution mélangée du substrat (G5-CNP) et de l'inhibiteur (DOG3) On la prépare de la même façon qu'en (b) de (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 0,325 mM (concentration finale: 2,0 mM) du G5-CNP précité au lieu de N3G5-CNP et que l'on utilise le DOG3 à la concentration de 0,81 mM (concentration finale: 0,50 mm). (c) Préparation de la solution d'enzyme couplée On la prépare de la même façon qu'en (c) de (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 406 unités/ml d'c-glucosidase [fabriquée par Toyobo Co. Ltd.] au lieu de glucoamylase. (d) Solution d'essai d'=-amylase Sérums humains ayant des activités d'C-amylase (50 échantillons). (e) Essai de détermination quantitative différentielle On réalise la détermination différentielle de la même façon qu'en (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise les solutions (a) à (d) indiquées ci-dessus au lieu des solutions (a) à (d) de (4) de l'exemple 1. (3) Détermination différentielle utilisant le N3G5-CNP comme solution de substrat On effectue une détermination différentielle de la même façon qu'en (4) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise la solution d'essai d'=-amylase de (d) ci-dessus au lieu de la solution d'essai d'isoenzyme d'a-amylase de (d) de (4) de l'exemple 1. (4) Un graphique des valeurs P obtenues selon la méthode de détermination différentielle des modes opératoires (2) et (3) précités est illustré par la figure 3. On voit que les valeurs P ont une corrélation r = 0,986 pour Y = 0,974 X + 1,155 et que ces deux méthodes concordent bien. De plus, la méthode au G5-CNP et la méthode au N3G5-CNP illustrées par la figure 3 sont les méthodes de détermination différentielle décrites respectivement en (2) et en (3). Exemple 4 (1) Méthode de mesure de T et de W selon la méthode cinétique double (méthode de mesure unique) (a) Solution d'essai d'c-amylase Sérums humains ayant des activités d'=-amylase (70 échantillons). (b) Préparation de la solution de substrat (N3G5-CNP) On dissout du N3G5CNP dans du tampon phosphate 50 mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgC12 2 mM pour que la concentration du substrat soit de 3,25 mM (concentration finale 2,0 mM). (c) Préparation de la solution d'enzyme couplée On la prépare selon le même mode opératoire qu'en (b) de (1) de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise la glucoamylase et la 3-glucosidase, respectivement & la concentration de 181 unités/ml et de 18,1 unités/ml. (d) Préparation de la solution de DOG3 On dissout le DOG3 décrit cidessus dans du tampon phosphate mM (pH 7,0) contenant du NaCl 40 mM et du MgCl2 2 mM pour que la concentration soit de 10,73 mM (concentration finale: 0,33 mM). (e) Détermination quantitative différentielle On agite le mélange de 0,9 ml de la solution d'enzyme couplée et de 250 g1 de chaque sérum humain et on chauffe & 37 C pendant 1,0 minute, puis on ajoute 2,0 ml de la solution de N3G5-CNP. On chauffe le mélange obtenu & 37 C pendant 1,0 minute et on mesure les absorbances variables (ADO) & 400 nm pendant 2 minutes. Après 30 secondes, on ajoute 0,10 ml de la solution de DOG3 & la solution constituant le système de mesure. On chauffe le mélange obtenu & 370C pendant 1,5 minute et on mesure les absorbances variables (ADO) & 400 nm pendant 2 minutes. On réalise l'essai & blanc avec 250 1 d'eau distillée au lieu de la solution d'essai d'î-amylase pour mesurer T' et W. Dans ce cas, T = T' x 3,15/3,25. Ensuite, on calcule les valeurs de P et de S (UI/1) en reportant, dans les équations (3) et (4) précitées, les valeurs de kp, ks, a et b obtenues dans l'exemple 1, ainsi que les valeurs de T et de W obtenues selon ce mode opératoire. (f) Le graphique des valeurs de P ainsi obtenues et de celles obtenues de la même façon qu'en (1) dans l'exemple 2 (méthode & deux canaux) est illustré par la figure 4. Les résultats montrent que les valeurs P ont une corrélation de r = 0,9995 pour Y = 0,994 X - 0,415 et que ces deux procédés sont bien concordants. En d'autres termes, le présent procédé est un procédé permettant d'effectuer la détermination différentielle des isoenzymes de l'-amylase avec une bonne précision en une seule mesure, le substrat et l'enzyme couplée peuvent être mesurés avec utilisation d'une quantité moitié moindre dans la méthode & deux canaux et le procédé est également excellent du point de vue économique. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détermination différentielle des activités des isoenzymes de l'X-amylase, par utilisation d'une valeur mesurée d'une activité d'a-amylase, obtenue par réaction d'un substrat pour la mesure de l'activité d'a-amylase avec un échantillon, et d'une valeur mesurée d'une activité de l'a-amylase, obtenue par réaction du même substrat et du même échantillon que ci-dessus en présence d'un inhibiteur qui a des constantes d'inhibition différentes vis-à-vis de deux types d'isoenzymes de l'a-amylase, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation comme inhibiteur du 63-désoxymaltotriose [0-6-désoxy-X-D-glucopyrannosyl-(1-4)-O-X-D-glucopyrannosyl-(1-4)- D-glucose] représenté par la formule CH3 H OH s ^ s -o)O O O OH O O OH OH OH 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite a-amylase est une a-amylase humaine et les deux isoenzymes de l'a-amylase sont une aamylase provenant du suc pancréatique et une a-amylase provenant des glandes salivaires. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le 63- désoxymaltotriose représenté par la formule (I) a une concentration de 0, 01 à 10 mM dans un système de mesure de l'activité d'=-amylase. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit procédé de détermination différentielle est le procédé cinétique double ou le procédé & deux canaux. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit substrat de mesure des activités de l'u-amylase est un dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale Rl OH OH HR i \ \ H X H OR (II) R2 O OH OH n OH dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe chromogène aromatique ou un groupe saccharide sauf le glucose, R et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'halogène ou un groupe hydroxy, azido, acyloxy, alkyloxy, aryloxy, alkylsulfonyle, arylsulfonyle, alkylmercapto, arylmercapto, N-alkylcarbamoyloxy, N-arylcarbamoyloxy, alkyloxyméthoxy ou aryloxyméthoxy, ou R1 et R2 forment ensemble un groupe méthylènedioxy substitué ou non substitué et n est un entier de 1 & 6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II) est le maltopentaose, le maltoheptaose, le 0-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 45,65-di-0-(N-éthyl)carbamoyl-%-D- maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 45,65-di-O-méthoxy- méthyl-3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 65-azido- -désoxy-3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 67-chloro-67désoxy-O-D-maltoheptaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, l'x-D-maltotrioside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 65-O-benzyl-X-D- maltopentaoside de 4-nitrophényle, le 45,65-O-benzylidène-0-D- maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle, le 65-O-toluènesulfonyl- 3-D-maltopentaoside de phénolindo-3'-chlorophényle, le 65-chloro- -désoxy-D-maltopentaose ou le 1-(46O,66-O-diméthanesulfonyl- a-maltohexaosyl)-=-D-glucitol. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit dérivé de maltooligosaccharide représenté par la formule générale (II) est le 65azido-65-désoxy-3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle ou le 3-D-maltopentaoside de 2-chloro-4-nitrophényle. 8. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le rapport des vitesses de réaction entre l'o-amylase provenant du suc pancréatique humain et l'a-amylase provenant des glandes salivaires humaines, relativement audit substrat, est de 0,6 ou plus.