Brevet FR2714676A1 — publié le 19950707

La présente invention concerne un procédé d'élimination d'erreurs dans les analyses biologiques successives, lorsque l'on effectue un dosage enzymatique mettant en jeu la détermination de l'ion ammonium et son application au dosage enzymatique de la créatinine dans le sang ou les urines. L'un des procédés de dosage enzymatique connu, décrit notamment dans Clinical Chemistry 28 (7) 1461-1464 (1982) consiste à hydrolyser la créatinine en présence de créatinine iminohydrolase, puis à faire réagir 1 'ion ammonium libéré sur de 1 'alpha-cétoglutarate en présence de glutamate deshydrogénase et de NADPH, ce qui conduit à la formation de NADP ; la quantité de NADP apparue est déterminée par une lecture spectrophotométrique en ultraviolet à 340 nm. Il est indiqué dans cet article qu'au-delà de certaines concentrations, des médicaments ou des molécules biologiques peuvent fausser les résultats, ainsi qu'évidemment l'ion ammonium, qui serait initialement présent dans l'échantillon ou les diluants, et celui-ci est en général éliminé lors d'une première étape par réaction enzymatique avec l'alphacétoglutarate. L'ensemble du procédé correspond au schéma réactionnel suivant GLDH 1) NH4 + a-cétoglutarate gt L-glutamate + H20 NADPH NADP GLDH = Glutamate deshydrogénase CIH 2) créatinine + H,O N-méthylhyàantoïne + NH4+ CIH = créatinine iminohydrolase GLDH 3) NH4+ + a-cétoglutarate * L-glutamate + H20 NADPH NADP+ Cette méthode est maintenant utilisée de façon courante par des laboratoires d'analyse biologique, qui opèrent éventuellement dans des appareils automatiques d'analyse équipés d'un photomètre ultraviolet, tel que celui commercialisé par Hitachi, sous les références 704, 717, 747 ou 911 ; par Olympus, sous les références AU 5000 ou AU 510 ; par Technicon, sous la référence RA1000-TX ; par Beckman ou Shimadzu. Malgré l'utilisation d'enzymes de grande pureté, dépourvue d'uréase, d'argininase et créatininase, on observe parfois des résultats par excès, y compris lors de l'étalonnage de l'appareil avec une solution de créatinine connue. La présente invention est un perfectionnement du procédé précédemment cité qui évite l'obtention de résultats par excès, notamment en cas de contamination par l'uréase, que ce soit parce que la créatinine iminohydrolase n'est pas pure ou parce que le matériel a été souillé lors de dosages précédents ; il est, en effet, très fréquent dans les laboratoires d'analyses biologiques d'effectuer successivement plusieurs types de dosage, tel que celui de l'urée, de l'acide urique, de protéines, du cholestérol, des triglycérides, des phospholipides, des enzymes hépatiques, du calcium, du phosphore avec celui de la créatinine, et de faibles traces d'uréase suffisent pour qu'une quantité de NH4+ non négligeable se forme dans l'appareil à partir de l'urée de sérum sanguin ou de l'urine, quantité qui viendra s'ajouter à celle provenant de la créatinine, lors de son dosage. La présente invention consiste à effectuer les réactions enzymatiques précédemment décrites en présence d'un acide hydroxamique ou de l'un de ses sels, de telle sorte que l'action de l'uréase soit bloquée. On a constaté que dans ces conditions, on n'observait plus de résultat par excès et sans vouloir être limite à cette explication, on pense que ceci résulte, au moins en partie, de l'activité inhibitrice des acides hydroxamiques sur cette enzyme. Toutefois, la thiourée et l'hydroxylamine, qui sont aussi des inhibiteurs, ne conviennent pas. L'ensemble de réactifs selon l'invention, pour le dosage de la créatinine, comprend - les enzymes glutamate deshydrogénase et créatinine iminohydrolase - le substrat : a-cétoglutarate - le NADPH - une solution diluante, éventuellement tamponnée à un pH compris entre 7,5 et 8,5 - un acide hydroxamique, éventuellement salifié. Les quantités relatives des produits et les concentrations sont celles généralement utilisées en l'absence d'un acide hydroxamique ; on peut avoir en outre des activateurs des enzymes tel que l'adénosine diphosphate pour la glutamate déshydrogénase. La solution tampon peut être choisie parmi celles habituelles de ce domaine technique telle qu'une solution aqueuse de trishydroxymêthylaminométhane (TRIS) et de l'un de ses sels, de préférence organique, par exemple d'acide tartrique ou succinique. Les acides hydroxamiques pourront être introduits dans la solution tels quels ou sous forme de sel soluble, de préférence de sel de sodium. De nombreux acides hydroxamiques conviennent, du moment qu'ils sont solubles dans la solution tampon à la concentration utile. Parmi les acides hydroxamiques préférés, se trouvent les acides (Cl-C4)alkylhydroxamiques et mieux 1 'acide acétohydroxamique. Ceux-ci seront à une concentration comprise entre 0,1 mM et 10 mM par litre dans le milieu réactionnel, et de préférence pour l'acide acétohydroxamique à une concentration comprise entre 500 mg/litre et 25 mg/litre, avantageusement entre 300 mg/litre et 100 mg/litre. I1 est clair que toute autre méthode de dosage de la créatinine dans laquelle est effectuée directement ou non une détermination de la quantité d'ion ammonium libérée est comprise dans l'invention, et tout procédé de dosage enzymatique de la créatinine qui consiste à déterminer la quantité d ion ammonium libérée en présence d'un acide hydroxamique est un autre objet de l'invention. On pourra aussi, lors du dosage enzymatique de l'ammoniac dans le sérum, généralement présent à une concentration comprise entre 20 et 80 pu/100 ml, introduire de l'acide hydroxamique. Dans ce qui suit, on décrit un exemple de mise en oeuvre de l'invention et les résultats obtenus avec l'appareil Hitachi réf. 717 lors de déterminations dans des échantillons de sérum ou d'urine ; l'urine est diluée 50 fois avec de l'eau distillée. La lecture de la densité optique est effectuée à 340 nm. EXEMPLE 1 On prépare un réactif I sous forme lyophilisée contenant de l'alpha-cétoglutarate de sodium 9 mM, du NADPH 0,2 mM, de la glutamate déshydrogénase, (2 40 kU/litre) et de l'adénosine diphosphate 0,5 mM, par addition d'une solution tamponnée à pH 8,5 constituée d'un mélange de TRIS et d'acide succinique et contenant 200 mg/l d'acide acétohydroxamique. Dans 5 ml du réactif I, on introduit la quantité suffisante de créatinine iminohydrolase lyophilisée pour obtenir le réactif II à une concentration d'au moins 40 kU/litre. On introduit dans 1,8 ml du réactif I tel que préparé précédemment 0,2 ml de l'échantillon à étudier, on agite, puis, après 5 minutes à 37"C, on ajoute au mélange 0,2 ml du réactif II. La lecture est effectuée après une minute d'agitation puis 3 minutes après. La différence de densité optique dans l'intervalle de lecture est exprimée en concentration de créatinine dans l'échantillon. Plus de 1000 dosages successifs d'urée puis de créatinine ont été effectués dans l'appareil, sans aucun résultat erroné avec les réactifs selon l'invention, alors que sur 100 déterminations effectuées sur un appareil d'analyse automatique après un dosage d'urée, plus de 90% des résultats étaient faux. Dans un laboratoire faisant des analyses en routine, on estime que 1 à 2% des résultats sont erronés et peuvent être évités avec le procédé de l'invention. En outre, on a constaté que les réactifs selon l'invention donnaient des résultats corrects en présence de 0,1 à 0,5 U/ml d'uréase, contrairement aux réactifs antérieurs. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage enzymatique de la créatinine qui consiste à déterminer la quantité d'ion ammonium libérée par la créatinine, caractérisé en ce que le dosage est effectué en présence d'un acide hydroxamique ou l'un de ses sels. 2. Procédé enzymatique de dosage de la créatinine qui consiste à hydrolyser la créatinine en présence de créatinine iminohydrolase et à déterminer la quantité d'ion ammonium formé en mesurant la quantité de NADP libérée à partir de NADPH, lors de la réaction de l'ion ammonium sur un alpha-cétoglutarate en présence de glutamate deshydrogénase, caractérisé en ce que les réactions sont effectuées dans une solution aqueuse qui contient entre 0,1 mM et 10 mM d'un acide hydroxamique ou de l'un de ses sels. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide hydroxamique est un acide (C1 C4 ) alkylhydroxamique. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide hydroxamique est l'acide acétohydroxamique. 5. Ensemble de réactifs pour le dosage enzymatique de la créatinine, qui comprend - de la glutamate deshydrogénase - de la créatinine iminohydrolase - du NADPH - un sel d'acide alpha-cétoglutarique - une solution de dilution - et un acide hydroxamique ou l'un de ses sels. 6. Ensemble de réactifs selon la revendication 4, caractérisé en ce que la solution de dilution est tamponnée à un pH compris entre 7,5 et 8,5. 7. Ensemble de réactifs selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'acide hydroxamique est un acide (C1-C4)alkylhydroxamique. 8. Ensemble de réactifs selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'acide hydroxamique est l'acide acétohydroxamique. 9. Procédé d'élimination d'erreurs dans le dosage enzymatique de l'ion ammonium, caractérisé en ce que l'on introduit dans le milieu réactionnel, avec l'échantillon, un acide hydroxamique ou l'un de ses sels.