Brevet FR2719602A1 — publié le 19951110

PROCÉDÉ ET INSTALLATION POUR LA NUMÉRATION DI CILLULIS T MICRO-ORGANISHZS, NOSAKKENT DIS PRODUITS ALIK=XTAIR=S OU DIS FLUIDES BIOLOGIQUZS. La présente invention a pour objet un procédé et une installation pour la numération de cellules et microorganismes, notamment des produits alimentaires ou des fluides biologiques. On connait dans l'état de la technique différents procédés pour déterminer la présence de micro-organismes et cellules, notamment des cellules, des levures, moisissures, parasites ou virus dans un produit alimentaire, et de mesurer la concentration desdits micro-organismes et cellules à des fins de contrôle de qualité par exemple. Un premier procédé consiste à mettre en culture un échantillon du produit à tester, et de procéder après quelques jours d'incubation, a une observation microscopique de la bolte de culture afin de procéder à un comptage des micro-organismes et cellules. Cette méthode de numération nécessite un délai entre la prise d'échantillon et l'obtention du résultat, et n'est donc pas adaptée à un contrôle en temps réel. De plus, ce procédé aboutit à une évaluation plus qu'à une numération précise. On a également proposé dans l'état de la technique de marquer les micro-organismes et cellules au moyen de colorants chimiques afin de les rendre fluorescents, rendant ainsi l'identification et le comptage des micro-organismes et cellules plus facile, et automatisable par l'acquisition d'une image microscopique faisant ensuite l'objet d'un traitement du signal par un ordinateur. Ce traitement du signal a pour effet de reconnaître les micro-organismes et cellules marqués en les discriminant par rapport au fond, et à compter le nombre d'objets reconnus. Afin de rendre la numération plus rapide, on a proposé d'associer ce procédé de marquage et de reconnaissance automatique des objets marqués à un système de filtration augmentant la concentration des micro-organismes et cellules à contrôler. Le brevet français FR8802937 décrit un tel procédé consistant à mettre tout d'abord l'échantillon en contact avec un anticorps ou une sonde fluorescente, et à compter individuellement les micro-organismes et cellules marquées. Le système peut également traiter des cellules comme les polynucléaires du lait, ou le sang et les urines humaines. Dans ce cas, le système se substitue à des moyens connus comme les cytomètres de flux. Ce document de l'art antérieur suggère de procéder au comptage par analyse d'image sous microscope. La demanderesse a développé une installation de comptage automatique de micro-organismes et cellules et de cellules marqués commercialisée sous le nom commercial de "COBRA", permettant de procéder à un comptage des microorganismes et cellules en balayant une pluralité de plans focaux d'une membrane, et en procédant pour chaque plan focal à un traitement de l'image afin de reconnaître et de compter les événements recherchés. Un tel dispositif s'avère très performant pour une analyse en laboratoire et a permis de proposer des tests de routines homologués par les administrations officielles pour le contrôle de produits alimentaires notamment. Les installations de ce type sont toutefois coûteuses car elles mettent en oeuvre des moyens d'acquisition d'image performants et des systèmes de traitement d'image élaborés. Ils sont par ailleurs difficilement compatibles avec une utilisation en dehors d'un laboratoire, sur le terrain et peu accessibles à des petits laboratoires. I1 présente de plus deux inconvénients importants. Premièrement, le comptage selon l'état de la technique s'effectue par échantillonnage de la surface totale de la membrane, chaque image correspondant à un champ d'observation particulier parmi plusieurs centaines ou milliers de champs d'observation possible. Pour que le comptage présente un taux d'erreur acceptable, il convient de multiplier les champs d'observation à l'intérieur desquels on procède à un comptage automatique, le nombre de champ à analyser étant déterminé suivant les lois de la statistiques, et en fonction du temps que l'on peut raisonnablement affecter à une analyser Dans le cas où le nombre de micro-organisme et cellules, et donc la densité d'événements, est très faible, le taux d'erreur devient important. De plus, la répartition des échantillons n'est pas homogène, et il existe notamment des effets de bords. On a dans l'état de la technique tenté de réduire ce taux d'erreurs en procédant à un balayage de la membrane en faisant varier la position du champ d'observation et de la profondeur du champ d'observation. Cela entraîne une multiplication des séquences d'analyse d'image, et donc un temps d'analyse accrue. Un deuxième inconvénient concerne les situations où la densité d'événement est élevée, et entraîne l'agglomération de micro-organisme et cellules. Les algorithmes de comptage automatique peuvent dans ce cas assimiler une agglomération de plusieurs centaines de micro-organismes et cellules à un événement unique, et donc fournir un résultat grossièrement erroné. L'évolution des appareillages automatiques montre que la tendance naturelle de l'homme de métier est de perfectionner continuellement le comptage individuel des événements, en passant du comptage visuel de colonies formées par une culture sur un milieu nutritif dans une boite de PETRI, à l'association de la filtration sur membrane et du comptage automatique par traitement d'image, puis à l'automatisation du déplacement du microscope en position X-Y et en profondeur de champ pour multiplier le nombre de champs analysés. Une autre approche, également sur un principe de comptage individuel d'événements et connue sous le nom de cytométrie de flux, consiste à compter individuellement le passage d'un événement dans un flux porteur. La présente invention va radicalement à l'encontre de cette démarche qui consiste à améliorer les techniques de comptages unitaire des événements, en proposant une évaluation du nombre d'événements par une acquisition globale de la luminescence des micro-organismes et cellules marqués fixés sur un support. Le problème que l'invention vise à résoudre est d'augmenter la fiabilité de la détermination du nombre de cellules ou micro-organismes, notamment dans les cas de très faibles concentrations ou de très fortes concentrations. : L'objet de la présente invention est de proposer un procédé permettant de procéder à une analyse rapide de fluides biologiques à l'aide d'une installation simple et robuste, dont le prix de revient est sensiblement inférieur aux dispositifs de l'état de la technique, et dont le fonctionnement est compatible avec une utilisation sur le terrain. En particulier, la mobilité de l'installation est souhaitable pour procéder au contrôle rapide de lait cru au niveau d'un centre de production, en vue de la recherche individuelle de la source d'infection en cas de présence de cellules somatiques dépassant les normes admises, et pour le contrôle immédiat à des fins de "paiement à la qualité" ou de contrôle sanitaire des animaux producteurs. Afin de répondre à ces objectifs, l'invention concerne plus particulièrement un procédé de numération de cellules et micro-organismes et cellules présents dans un milieu fluide, notamment des produits alimentaires ou des fluides biologiques, consistant à procéder à un marquage avec un marqueur coloré ou fluorescent marquant sélectivement les micro-organismes et cellules à détecter et à procéder au comptage des micro-organismes et cellules ainsi marqués, caractérisé en ce que le marqueur coloré ou fluorescent est un marqueur stoechiométrique, notamment un marqueur du DNA ou un marqueur du RNA, en ce que l'on procède, simultanément ou préalablement au comptage, à une concentration des microorganismes et cellules par une étape de filtration du milieu fluide, le comptage étant réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu concentré et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. Le procédé selon l'invention permet de procéder avec une précision suffisante et une reproductibilité améliorée pour la plupart des contrôles de routine à une détermination de la concentration cellulaire dans un fluide biologique, sans recours à des techniques complexes de traitement d'image, et fournissant un résultat dont la fiabilité n'est pas dégradée en cas de très faible ou de très forte concentration, contrairement aux procédés de comptage individuels de l'état de la technique. En particulier, pour le contrôle de lait, le procédé selon l'invention permet de déterminer des concentrations variant entre 50.000 cellules et 1.000.000 cellules par millilitre de lait, dans un délai de l'ordre de la seconde pour un à 24 échantillons simultanés. Selon une première variante, le marqueur est un colorant marquant sélectivement les micro-organismes et cellules à détecter, et en ce que le comptage est réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu éclaire et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. La mesure s'effectue par mesure globale de la densité optique des événements marqués. Selon une deuxième variante, le marqueur est un marqueur fluorescent marquant sélectivement les microorganismes et cellules à détecter constitué par une sonde fluorescente, et en ce que le comptage est réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu concentré dans la bande de longueur d'onde de réémission de l'un au moins des marqueurs fluorescents et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. La concentration peut étre réalisée de différentes manière, par utilisation de micro-billes magnétiques portant des anticorps spécifiques, par fixation sur une surface microporeuse ou non portant des anticorps greffés, ou de préférence par filtration sur une membrane microporeuse. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé de numération comporte une étape de concentration des micro-organismes et cellules par une étape de filtration mettant en oeuvre une membrane microporeuse transparente dans les longueurs d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents dont la surface est normalisée , le comptage étant réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale de la membrane de filtration de surface normalisée dans la bande de longueur d'onde de réémission, de l'un au moins des marqueurs fluorescents et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. Avantageusement, on procède à la mesure de l'intensité lumineuse par intégration du signal provenant d'un capteur photovoltaïque pendant un interval de temps prédéterminé. Selon une autre variante, on mesure l'intensité lumineuse dans plusieurs bandes de longueur d'onde différente correspondant aux bandes de réémission de marqueurs différents. Cette variante permet de détecter la présence de différents types cellulaires. L'invention concerne également une installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules du type comportant un support de membrane microporeuse, une source de lumière pour l'éclairage de la membrane et des moyens d'analyse des filtrats déposés sur la membrane, les moyens d'analyse étant constitués par au moins un capteur photovoltaïque propre à détecter l'intensité lumineuse globale émise par un élément de surface déterminé de la membrane. Avantageusement, l'invention comporte un tiroir pour le positionnement d'une membrane microporeuse, une source de lumière émettant dans la plage de longueur d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents disposée d'un coté dudit tiroir, et au moins un capteur muni d'un filtre dont la bande passante correspond sensiblement à la bande de réémission du marqueur fluorescent, ledit capteur et ledit filtre étant disposés du coté opposé au tiroir. L'invention peut également fonctionner en mesure de densité par transmission ou réflexion dans le domaine du visible. Selon une première variante de réalisation, l'installation comporte un capteur CCD propre à détecter l'intensité lumineuse d'un élément surfacique de membrane microporeuse. Selon une variante de réalisation préférée, l'installation comporte une pluralité de photodiodes propre à détecter l'intensité lumineuse d'un élément surfacique de membrane microporeuse. Avantageusement, les photodiodes sont logées dans des alésages cylindriques dont la répartition correspond aux zones de filtration de la membrane microporeuse, le tiroir comportant des moyens d'indexation pour le positionnement de la membrane par rapport audits alésages. L'invention sera mieux comprise dans ce qui suit, à la lecture de la description faisant référence aux dessins annexés où - la figure 1 représente une vue en coupe d'un exemple de réalisation d'une installation selon l'invention ; - la figure 2 représente une vue de dessus de la membrane microporeuse placée dans son support semi-rigide - la figure 3 représente un schéma de principe des circuits électroniques mis en oeuvre par l'installation. La figure 1 représente une vue schématique1 en coupe, d'un exemple de réalisation d'une installation de numération de cellules selon l'invention. L'installation comporte un boîtier (l) rigide s'ouvrant par une trappe permettant l'introduction d'une membrane microporeuse (2) dans un support souple indexé portant des filtrats (3 à 5). Cette membrane (2) est placée sur un support métallique formant un tiroir coulissant entre deux rails de guidages (6, 7). Une rampe de sources ultraviolet t8 à 10) est disposée en dessous du tiroir portant la membrane (2). Un filtre passe-bande (11) laissant passer les rayonnements U.V. dans la longueur d'onde d'excitation des marqueurs est intercalé entre la rampe de sources U.V. (8 à l01 et la membrane (2). Un réflecteur métallisé (12) renvoie une partie du rayonnement vers le filtre (11). Du coté opposé à la rampe U.V., l'installation comporte un ensemble de photodétecteurs (13) constitué par un bloc (14) présentant une pluralité d'alésages (15, 16, 17) dirigés en direction de la membrane (2). Dans chacun de ces alésages (15 à 17) de forme cylindrique est logée une photodiode (18 à 20). Ces photodiodes (18 à 20) sont organisés en matrice dont la géométrie correspond à la géométrie de l'installation de filtration assurant le dépôt de filtrats t3 à 5) sur la membrane (2). Un filtre (21) est interposé entre la membrane (2) et le bloc de photodétecteurs (14). Ce filtre est un passebande laissant passer les longueurs d'onde de réémission des marqueurs fluorescents. La figure 2 représente une vue de dessus d'un exemple de membrane microporeuse posée intégrée dans son support souple de type COBRA (Marque déposée par la demanderesse). La membrane (2) présente une matrice de zones de filtration (22) dont la configuration est déterminée par l'appareil de filtration employé, et qui correspond à la disposition des photodiodes. Le fonctionnement de l'installation de numération selon l'invention sera exposé dans ce qui suit, en référence à un exemple d'application concerne le contrôle rapide de lait cru. On prélève un échantillon de lait cru et on procède à un éventuel prétraitement pour digerer les constituants indésirables tels que les globules gras et m'addition d'un colorant fluoréscent. L'échantillon de lait est ensuite filtré sur une membrane en polycarbonate ou en Polyéthylène téréphtalate présentant des pores d'une section de 2 microns sur une installation de filtration telle que le matériel ''COBRA' de la société BIOCOM. L'installation de filtration permet la filtration simultanée de plusieurs échantillons, et le dépôt d'une pluralité de filtrats sur la membrane, en forme de matrice. La sélectivité du marquage n'exige pas de procéder à un rinçage. Le colorant mis en oeuvre pour le marquage est par exemple du bromure d'éthidium. Après séchage à l'air, la membrane est ensuite placée dans l'installation de numération comportant une source d'excitation Uv à 360 nm et des photodiodes associées à un filtre laissant passer les rayonnements dans la bande de longueurs d'onde de l'ordre de 600 manomètres par exemple. La courbe de calibration est obtenue par comparaison du résultat obtenu par l'installation selon l'invention, et le résultat obtenu ultérieurement, par exemple en laboratoire, avec des procédés connus dans l'art antérieur. La figure 3 représente un schéma de principe des circuits électroniques mis en oeuvre par l'installation. Le signal provenant de chacune des photodiodes est numérisé par un circuit de digitalisation (23) relié à un microprocesseur (24) assurant le traitement du signal et le calcul du nombre de cellules en fonction de la courbe de calibration et de l'intensité lumineuse mesurée par la photodiode. Le résultat est affiché sur un afficheur digital (25) et est enregistré dans une mémoire vive (26) . Cette mémoire contient un fichier constitué du numéro de l'enregistrement, de la valeur du signal provenant de la photodiode, et du nombre de cellules détectées. Cette mémoire peut par ailleurs recevoir les résultats de la numération, selon un procédé connu, du même échantillon. Le calculateur (24) recalcule en fonction de ces données une nouvelle courbe de calibration. La numération de cellules ou de micro-organismes selon l'invention s'effectue selon un protocole dont un exemple est indiqué ci-après, pour la numération du nombre de cellules dans le lait - on prélève un échantillon de 30 tjl de lait - on dilue cet échantillon dans 1 ml d'eau distillée - on ajoute 0,5 E de formaldéhyde agissant comme fixateur et 5 Zg de bromure d'éthidium par ml de solution à tampon PH 7 - on chauffe l'échantillon à 60 degrés centigrades pendant 20 minutes - on procède à la filtration de l'échantillon prétraité sur une membrane en polycarbonate présentant une porosité de 2 microns, sous une dépression de 0,5 bars ou une pression de 0,8 bars - on place la membrane sur le dispositif conforme l'invention pour mesurer la luminosité globale, par excitation par une source émettant à 360 nm et observation dans le rouge, à 580 nm. Un exemple de protocole pour la préparation d'échantillons pour la numération des bactéries dans le lait consiste à - prélever 100 Al de lait - procéder à la dilution de cet échantillon dans 800 Al d'un mélange comprenant les produits suivants - trypsine à 1,33 mg/ml - triton à 0,5 % Ce mélange provoque la digestion du lait par éclatement des cellules somatiques et des protéines du lait. Les bactéries, préservées par leur paroi résistante à cette digestion, ne sont pas détruites. - chauffage pendant 10 minutes à 47 OC ; - filtration sur une membrane de porosité 0,6 irn. - Rinçage tampon nitrate PH 3 - coloration à l'acridine 0,025 PH 4 pendant 3 minutes - rinçage avec un tampon CITRATE PH 3 - lecture avec le dispositif selon l'invention, par excitation par une source émettant à 260 nm et observation dans l'orangé, à 580 nm. Un autre exemple de protocole pour la préparation d'échantillons pour le phénotypage des leucémies consiste à - fixer par greffage sur la surface de la membrane des anticorps reconnaissant des lymphocytes déterminés un échantillon de 5 ml de sang - procéder à l'immersion et à 1incubation pendant 20 minutes, avec agitation douce, du récipient pour favoriser l'adhésion des lymphocytes - procéder au rincage de la membrane dans un tampon ; - procéder à la coloration dans du bromure d'éthilium ; - procéder à la lecture des différentes zones de fixations des lymphocytes pour obtenir un profil de la population. Un autre exemple de protocole pour la préparation d'échantillons pour le phénotypage de leucémies consiste à - fixer des anticorps sur des billes magnétiques d'un diamètre de l micron - laisser incuber pendant 15 minutes dans 1 ml de sang ; - introduire un aimant pour retenir le complexe billes/cellules - éliminer les résidus - procéder à la filtration des complexes retenus par l'aimant sur une membrane permettant le passage des billes libres, mais pas des cellules - procéder à une coloration au bromure d'éthidium; - procéder à la numération par mesure globale conformément à l'invention. La présente invention est décrite dans ce qui précède de façon non limitative. Il est bien évident que l'Homme de Métier sera à même de réaliser différentes variantes sans pour autant sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS l - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules présents dans un milieu fluide, notamment des produits alimentaires ou des fluides biologiques, consistant procéder à un marquage avec un marqueur coloré ou fluorescent marquant sélectivement les micro-organismes et cellules à détecter et à procéder au comptage des microorganismes et cellules ainsi marqués, caractérisé en ce que le marqueur coloré ou fluorescent est un marqueur stoechiométrique, notamment un marqueur du DNA ou un marqueur du RNA, en ce que l'on procède, simultanément ou préalablement au comptage, à une concentration des micro-organismes et cellules par une étape de concentration du milieu fluide, le domptage étant réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu concentré et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. 2 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules selon la revendication 1 caractérisé en ce que le marqueur est un colorant marquant sélectivement les micro-organismes et cellules à détecter, et en ce que le comptage est réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu éclairé et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. 3 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules selon la revendication 1 caractérise en ce que le marqueur est un marqueur fluorescent marquant sélectivement les micro-organismes et cellules à détecter constitué par une sonde fluorescente, et en ce que le comptage est réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale du milieu concentré dans la bande de longueur d'onde de réémission de l'un au moins des marqueurs fluorescents et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. 4 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules présents dans un milieu fluide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un marqueur stoechiométrique, notamment un marqueur du DNA ou un marqueur du RNA constitué par une sonde portant une molécule fluorescente, en ce que l'on procède, simultanément ou préalablement au comptage, à une concentration des microorganismes et cellules par une étape de filtration mettant en oeuvre une membrane (2) microporeuse transparente dans les longueurs d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents dont la surface est normalisée, le comptage étant réalisé par la mesure de l'intensité lumineuse globale de la membrane (2) de filtration de surface normalisée dans la bande de longueur d'onde de réémission de l'un au moins des marqueurs fluorescents et par comparaison de ladite intensité lumineuse avec une courbe de calibration. 5 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules selon l'une quelconque des revendications I à 4 caractérisé en ce que l'on procède à la mesure de l'intensité lumineuse par intégration du signal provenant d'un capteur photovoltaïque pendant un intervalle de temps prédéterminé. 6 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 caractérisé en ce que l'on mesure l'intensité lumineuse dans plusieurs bandes de longueurs d'onde différentes correspondant aux bandes de réémission de marqueurs différents. 7 - Procédé de numération de cellules et microorganismes et cellules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la courbe de calibration est recalculée par l'enregistrement des couples de données constituées par la valeur de l'intensité lumineuse et le résultat d'un comptage par analyse d'image d'un même filtrat. 8 - Installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules du type comportant un moyen de support du milieu fluide concentrer à analyser, une source de lumière pour l'éclairage du moyen de support et des moyens d'analyse, caractérisée en ce que les moyens d'analyse sont constitués par au moins un capteur photovoltaïque propre à détecter l'intensité lumineuse globale émise par un élément de surface déterminé du moyen de support. 9 - Installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comporte un support de membrane (2) microporeuse, une source de lumière pour l'éclairage de la membrane (2) et des moyens d'analyse des filtrats (3 à 5) déposés sur la membrane (2), les moyens d'analyse étant constitués par au moins un capteur photovoltaïque propre à détecter l'intensité lumineuse globale émise par un élément de surface déterminé de la membrane (2). 10 - Installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'elle comporte un tiroir pour le positionnement d'une membrane (2) microporeuse, une source de lumière émettant dans la plage de longueur d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents disposée d'une coté dudit tiroir, et au moins un capteur muni d'un filtre (11) dont la bande passante correspond sensiblement à la bande de réémission du marqueur fluorescent, ledit capteur et ledit filtre étant disposés du coté opposé au tiroir. il - Installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10 caractérisée en ce qu'elle comporte une pluralité de photodiodes propre à détecter l'intensité lumineuse d'un élément surfacique de membrane (2) microporeuse. 12 - Installation pour la numération de cellules et micro-organismes et cellules selon la revendication 10 caractérisée en ce que les photodiodes sont logées dans des alésages cylindriques dont la répartition correspond aux zones de filtration de la membrane (2) microporeuse, le tiroir comportant des moyens d'indexation pour le positionnement de la membrane (2)s par rapport audits alésages.