Brevet FR2714675A1 — publié le 19950707

A 2714675 La présente invention concerne un procédé de mesure du 13CO2 dégagé par une culture biologique, ses applications à l'identification des souches bactériennes, à la détection précoce de pousse bactérienne, et à l'optimisation de la composition des milieux de culture, ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé. On sait qu'un organisme vivant qui consomme des substrats nutritifs les transforme, en fin de chaîne métabolique, en molécules simples et notamment en C02, ce C02 étant ensuite éliminé dans l'air environnant. Différentes méthodes ont déjà été proposées pour mesurer ce dégagement de C02 dans des cultures biologiques et l'appliquer à des analyses microbiologiques. C'est ainsi que Neil M. Dixon et Douglas B. Kell in Jal of Microbiological Methods, 10 (1989) pp. 155-176 passent en revue les principales méthodes utilisées pour mesurer le dégagement de C02 durant les processus de fermentation: méthodes titrimétrique, colorimétrique, gravimétrique, volumétrique, manométrique, mesures des différences de conductivité thermique, mesures en spectroscopie de masse IR, chromatographie, potentiométrie, conductométrie, ampérométrie, fibres optiques, mesures piézoélectriques. D'autres méthodes utilisent l'isotope radioactif 14C. On peut citer J.R. Waters (USP 3.935.073) qui propose une méthode pour traiter les bactéries, K.Brooks et Th. Sodeman in A.J.C.P vol. 61, Juin 1974 pp 859- 866 qui l'utilisent pour la détection rapide de bactérémie, F. Deland et H. N. Wagner Jr in J. Lab. Clin. Med - Mars 1970 - pp. 529-534 qui déterminent la croissance bactérienne dans les cultures de sang et H. Bopp et P.D. Eliner in Jal of Clinical Microbiology - May 1988 pp. 919-922 qui s'en servent pour évaluer des substrats pour la détection radiométrique des bactéries dans les cultures de sang. Toutes ces méthodes présentent de nombreux inconvénients et la mesure absolue de la variation de concentration en C02 dans une atmosphère ne présente pas un caractère de sensibilité suffisante pour l'évaluation de nombreux processus microbiologiques. On sait que, comme toutes les molécules organiques carbonées, le substrat nutritif consommé par les organismes vivants possède une composition isotopique en carbone (CIC), exprimée par son rapport 13C/12C qui constitue une de ses caractéristiques propres. Les molécules de C02 issues de ce substrat, après consommation par un organisme vivant, présenteront donc un rapport 13C/12C qui sera le reflet des -2- caractéristiques isotopiques dudit substrat. Par ailleurs, deux organismes vivants différents (espèces, sous-espèces.. .) qui utilisent pour leurs besoins nutritifs le même substrat carboné, dont la composition isotopique est connue, pourront le transformer en molécules de C02 de compositions isotopiques carbonées différentes, du fait de processus ou de mécanismes différents qui induisent un fractionnement isotopique. On peut traduire ceci par le schéma suivant: 13C0o2 (CIC-1) microorganisme 1 Substrat normalisé / pour sa composition isotopique 13C microorganisme 2 \ -13 C02 (CIC-2) US-A-4 182 656 décrit un procédé de mesure de la variation du rapport 13C0O2/12C02 produit à partir d'un milieu enrichi en carbone 13 et initié par un inocula suspect de contamination bactérienne, mais ce procédé ne permet que de vérifier la présence de bactéries dans l'inocula. Il en est de même pour le procédé décrit dans EP-A-0253927 qui ne vise qu'à détecter la présence de microorganismes produisant l'uréase. Or, les variations d'enrichissement induites par le fractionnement isotopique sont très faibles (variations au niveau de la sixième ou la cinquième décimale du rapport 13C/12C) La mesure de ce rapport 13C/12C consiste à compter dans un échantillon de molécules pures le nombre des atomes de l'isotope 13 et le nombre des atomes de l'isotope 12 du carbone. L'analyse isotopique par spectrométrie de masse isotopique ou IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry) permet de faire ce dénombrement à un très haut niveau de précision. Cette technique consiste à mesurer l'intensité des faisceaux d'ions correspondant aux isotopomères de C02 de masse: 44-45 et 46 à l'aide d'un spectromètre de masse à champ fixe et collecteurs multiples (un par faisceau d'ions). Cette mesure d'intensité des faisceaux d'ions permet de calculer le rapport I 3C/12C (prcsiow n o, 0002 At % 13C). -3- Les inventeurs ont découvert que la mesure de ce rapport avec un très haut niveau de précision, associé à une procédure normalisée, permettait de quantifier le fractionnement isotopique induit par les espèces bactériennes. Ce fractionnement isotopique est spécifique de chaque espèce bactérienne et permet son identification. L'invention concerne donc un procédé de mesure du 13C02 dégagé par une culture biologique, du type consistant à déterminer la variation de la composition isotopique carbonée correspondant à l'évolution de l'enrichissement en molécules de C02 dans l'atmosphère gazeuse environnant la culture, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes, effectuées dans un récipient fermé surmonté d'une atmosphère gazeuse: - Utilisation d'un milieu de culture de composition isotopique standardisée - Mesure par spectrométrie de masse isotopique ou IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry) de la composition isotopique carbonée (CIC) du C02 de l'atmosphère se trouvant au dessus du milieu nutritif avant ensemencement - Ensemencement de ce milieu avec une souche bactérienne - Mesure de la CIC du C02 dégagé après consommation par ladite souche, ceci en référence à un milieu nutritif de composition isotopique connue. Le procédé selon l'invention est de préférence réalisé dans un système compact réunissant un module d'analyse automatique et autonome fonctionnant par spectrométrie de masse isotopique, une étuve comportant les récipients o est réalisé l'ensemencement, associée à des dispositifs d'agitation, une console informatique gérant les séquences et résultats d'analyse. Selon l'invention, ce dispositif d'analyse isotopique par spectrométrie de masse isotopique ou IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry) permet de mesurer les valeurs du rapport 13C/12C du C02 produit par les microorganismes utilisés. Les différentes étapes du procédé selon l'invention, dans son application à l'identification des souches bactériennes, vont maintenant être décrites. La première étape consiste à disposer d'un milieu de culture dont la composition isotopique carbonée est contrôlée. Ceci est obtenu par la détermination de la composition isotopique des différents constituants entrant dans la préparation du milieu et par la même détermination effectuée sur le milieu de culture au terme de sa préparation. Po urces derminations, es mesures soopie sont effectuées par -es 3 5 méthodes classiques d'analyse isotopique, c'est-à-dire par combustion et analyse -4- du 002 purifié à partir du mélange gazeux résultant de la combustion. L'étape suivante consiste à introduire au dessus du milieu de culture un mélange gazeux standardisé dans sa composition et à déterminer l'enrichissement isotopique 1 3C de l'échantillon gazeux contenant du C02 se trouvant au dessus du milieu nutritif; on effectue en une troisième étape l'ensemencement du milieu nutritif, la quatrième étape consistant à mesurer, en fonction du temps, l'enrichissement isotopique 130 de l'échantillon gazeux contenant du 002. L'utilisation cible du procédé se trouve dans l'identification des souches bactériennes. En effet, si l'on ensemence un micro- organisme inconnu dans un milieu nutritif contenant des substrats spécifiques de CIC connue, il est possible, en mesurant la CIC du CO2 produit par ce micro-organisme et en utilisant le principe précédent, d'en définir la nature (espèce, genre...). L'identification se fait donc sur la base de la détermination de la CIC du C02 qu'il produit à partir d'un milieu nutritif de composition définie et contrôlée. Les résultats obtenus par ensemencement de 7 souches bactériennes différentes sur un milieu isotopiquement standardisé sont rassemblés dans le tableau suivant. Ces résultats établissent la corrélation entre les valeurs d'enrichissement isotopiques obtenues au terme de la croissance et l'identification des différentes souches bactériennes. SOUCHE 1 -17,397 0,085 SOUCHE 2 -16,771 + 0,128 SOUCHE 3 -18,758 0,184 SOUCHE 4 -19,018 + 0,040 SOUCHE 5 -25,436 0,330 SOUCHE 6 -17,774 0,232 SOUCHE 7 -26,105 0,060 FLACON TEMOIN - 35,992 0,171 On constate que les mesures d'enrichissement en 13CO2 de l'atmosphère des milieux de culture de ces 7 souches par couplage chromatographie en phase gazeuse -IRMS ont donné des valeurs différentes entre les 7 souches. Ces valeurs sont toutes différentes de celle de l'enrichissement du flacon témoin. La comparaison des enrichissements pour les souches prises deux par deux (test de sdoent) a montré que toutes ces souches étaient signrficafivemerf différentes quant à l'enrichissement en 13C de leur production de CO2. -5- On comprend donc bien qu'il soit possible, une fois établie une banque de données de différentes souches microbiennes, d'identitier facilement une souche inconnue par le procédé selon l'invention. Par ailleurs, le procédé selon l'invention peut être appliqué au diagnostic précoce de pousse bactérienne. Le couplage chromatographie en phase gazeuse-analyse isotopique par spectrométrie de masse isotopique en flux continu permet de mesurer une variation du rapport 13C/1 2C au niveau de la 6ème décimale et à partir de 10 nanomoles de CO2. Il est donc possible d'évaluer très tôt une variation infime de ce rapport dans o I'atmosphère d'une culture de micro-organismes (hémoculture...) La procédure est la suivante: On mesure la CIC du C02 de l'atmosphère avant ensemencement. On effectue l'ensemencement (t = 0). On mesure ensuite la CIC du C02 après l'ensemencement, à différents temps. 1 5 La variation de la CIC du C02 (ou son enrichissement provenant de la consommation d'un substrat donné) peut ainsi être détectée de façon précoce et donc signaler, de façon précoce, la posivité de la pousse du microorganisme. Une autre application consiste à faire varier la CIC de l'un des substrats 1 contenu dans un mélange nutritif, puis à ensemencer ce milieu nutritif avec un microorganisme donné. Il se forme du C02 dont la CIC est corrélée à celle du substrat 1. On peut alors attribuer une spécificité de ce substrat pour le microorganisme en question. Les résultats obtenus permettent d'optimiser, pour une meilleure spécificité, la composition des milieux nutritifs. Les données cinétiques de l'expérimentation à 2 5 partir d'une souche définie permettent de relier les paramètres caractéristiques de la pousse bactérienne à la spécificité des éléments marqués introduits dans les milieux de culture, ce qui permet l'optimisation de ces milieux. Le dessin annexé, donné à titre d'exemple, permettra de mieux comprendre l'invention, les caractéristiques qu'elle présente et les avantages qu'elle est susceptible de procurer, notamment dans le diagnostic précoce de pousse bactérienne. La figure 1 est une vue schématique de l'installation mise en oeuvre pour la réalisation du procédé selon l'invention. Sur la figure 1, I'étuve est désignée par 2, et le dispositif d'analyse 3 5 isotopique par IRMS par 5. 6 - Les figures 2 à 5 représentent les profils isotopiques 13C en spectrométrie de masse isotopique des produits marqués obtenus après ensemencement respectivement avec Staphyloccocus Aureus (fig. 2), Candida Albicans (fig. 3), Escherichia Coli (fig. 4) et Escherichia Coli (sang) (fig. 5). Sur les figures 2 à 5, décrivant des exemples de diagnostic précoce de pousse bactérienne, ainsi que sur les tableaux les accompagnant, le temps est exprimé en heures, et l'enrichissement isotopique en 13 C02 est donné en Delta 13C 0/00 respectivement sur un milieu témoin et sur un milieu ensemencé Le dispositif représenté à la figure 1 se compose essentiellement d'une o10 étuve 2, équipée de plateaux 7 comportant les récipients 3 o est réalisé l'ensemencement. Des dispositifs d'agitation à mouvement orbital (non représentés au dessin) sont prévus pour accélérer la croissance des microorganismes présents. A cette étuve 2, fonctionnant en circuit fermé, est associé un module 4 permettant le transfert des échantillons gazeux dans un dispositif 5 d'analyse isotopique par IRMS. C'est ce dispositif d'analyse 5 associé à un chromatographe en phase gazeuse 6 qui permet de mesurer les valeurs du rapport 13C/12C obtenu pour les microorganismes cultivés dans les récipients 3 disposés sur les plateaux 7 de I'étuve 2. La console informatique 8 assure la gestion des séquences et des résultats d'analyse. Tableau 1 - STAPHYLOCCOCUS AUREUS Enrichissement 13CO2 Temps Flacon témoin Flacon ensemencé Heure Delta 13C 0/00 Delta 13C 0/00 O -43,5 -16,5 1 -43,3 -15,4 2 -43,2 -15,2 3 -43 -14,7 4 -42,7 -14,6 -42,5 -14,5 6 -42,5 -14,2 7 -42,1 -13,9 8 -42 -12,8 9 -42 - 9,5 -7- -38,9 1,2 11 -32,5 61,3 12 -30,4 128 13 -29,5 149 14 -28,8 171 -28,4 263 La courbe de la figure 2 illustre les résultats ci-dessus. Tableau 2 - CANDIDA ALBICANS Enrichissement 13C02 Temps Flacon témoin Flacon ensemencé Heure Delta 13C 0/00 Delta 13C 0/00 0 -43,7 -17,2 1 -43,6 -16,1 2 -43,7 -16 3 -43,7 -15,1 4 -43,4 -13,7 -43,4 -11,6 6 -43,4 -11,1 7 -42,9 - 9,6 8 -42,8 - 5,7 9 -42,6 - 0,5 -41,9 15,3 il -39,8 78,6 12 -36,4 191,5 13 -31,9 288,3 14 -28,2 353,1 -14,9 548,9 La courbe de la figure 3 illustre les résultats ci-dessus. Tableau 3 - ESCHERICHIA COLI Enrichissement 13C02 Temps Flacon témoin Flacon ensemencé Heure Delta 13C 0/00 Delta 13C 0/00 0 -44,5 -18,2 1 -45 -17,6 2 -44,7 -16,9 3 -44,1 -16,7 4 -43,9 -16,9 -8 -43,6 -16,4 6 -43,3 -15 7 -42,9 -12,3 8 -41,7 5,5 9 -35,3 17,1 -26,1 211 11 -21,8 303 12 -19,5 303,1 13 -18,3 389,70 La courbe de la figure 4 illustre les résultats ci-dessus. Tableau 4 - ESCHERICHIA COLI (Sang) Enrichissement 13C02 Temps Flacon témoin Flacon ensemencé Heure Delta 13C 0,'00 Delta 13C 0/00 0 -44,6 -20,9 1 -40,9 -21,7 3 -40,1 -20,2 4 -39,6 -19,8 -39,2 -18,2 6 -39,1 -17,3 7 -37,9 -15 8 -37,9 -14 9 -37,6 -12,4 -37,2 -11 11 -37,2 -10,2 12 -37,2 - 9,4 13 -37,1 - 7,5 14 -36,8 - 5,3 -36,7 - 2,3 27 -18,5 471 32 -18,3 472 La courbe de la figure 5 illustre les résultats ci-dessus. Des courbes similaires, réalisées dans des conditions standards et avec un milieu standard dont on connait l'enrichissement isotopique, sur des souches 3 5 inconnues, permettent de corréler les valeurs d'enrichissement isotopique obtenues au terme de la croissance à la nature des différentes souches bactériennes. De même, les données cinétiques de l'expérimentation à partir d'une souche définie permettent de relier les paramètres caractéristiques de la pousse -9- bactérienne à la spécificité des éléments marqués introduits dans les milieux de culture, ce qui permet l'optimisation de ces milieux. - 10- REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure du 13CO2 dégagé par une culture biologique, du type consistant à déterminer la variation de la composition isotopique carbonée correspondant à l'évolution de l'enrichissement en molécules de C02 dans l'atmosphère gazeuse environnant la culture, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes, effectuées dans un récipient fermé surmonté d'une atmosphère gazeuse: - Utilisation d'un milieu de culture de composition isotopique standardisée - Mesure par spectrométrie de masse isotopique ou IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry) de la composition isotopique carbonée (CIC) du C02 de I'atmosphère se trouvant au dessus du milieu nutritif avant ensemencement - Ensemencement de ce milieu avec une souche bactérienne - Mesure de la CIC du C02 dégagé après consommation par ladite souche, ceci en référence à un milieu nutritif de composition isotopique connue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I'ensemencement est effectué avec une souche bactérienne inconnue dans un milieu nutritif contenant des substrats spécifiques de composition isotopique carbonée du C02 produit par ladite souche. 3. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - Utilisation d'un milieu de culture de composition isotopique standardisée - Introduction au dessus du milieu de culture d'un mélange gazeux standardisé dans sa composition et détermination de l'enrichissement isotopique 13C de l'échantillon gazeux contenant du C02 se trouvant au dessus du milieu nutritif - Ensemencement du milieu nutritif avec une souche bactérienne inconnue - Mesure, en fonction du temps, de l'enrichissement isotopique 13C de l'échantillon gazeux contenant du C02. 4. Application du procédé selon la revendication 2 et la revendication 3 à l'identification des souches bactériennes. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer la composition isotopique carbonée du C02 de l'atmosphère avant ensemencement, à effectuer un ensemencement (t=O), puis à mesurer la ompoon isropqe carbonée do CO2 aprèes t'eem-ncemei à direnbs temps. -11 6. Application du procédé selon la revendication 5 au diagnostic précoce de pousse bactérienne. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire varier la composition isotopique carbonée de l'un des substrats contenu dans un mélange nutritif, à ensemencer ce milieu nutritif avec un micro-organisme donné puis à corréler la composition isotopique carbonée du C02 dégagé à celle dudit substrat. 8. Application du procédé selon la revendication 7 à l'étude et à l'optimisation de la composition des milieux de culture. 9 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte un système compact réunissant une étuve 2 comportant des récipients d'ensemencement 3, des dispositifs d'agitation et un système de transfert des échantillons gazeux 4, ledit système étant associé à un dispositif 5 d'analyse isotopique par spectrométrie de masse isotopique, couplé à un chromatographe en phase gazeuse 6, une console informatique 8 gérant les séquences et résultats d'analyse.