Brevet FR2711143A1 — publié le 19950421

La présente invention concerne un procédé d'identification de l'origine de tissus et extraits dérivés des fruits, et notamment des jus de fruits qui peuvent être sous forme liquide, purs ou dilués, des pulpes, des purées, des vins, des confitures et des yaourts, et d'autres produits des fruits destinés à la consommation humaine, et elle concerne aussi des amorceurs d'acide nucléique et des sondes destinés à etre utilisés dans ce procédé ainsi que des kits de test les contenant. Des fraudes sur des jus de fruits constituent un problème très important, car des producteurs peu scrupuleux utilisent des matières d'altération pour accroître leur profit. Ce genre de fraude rend nécessaire des tests d'authenticité portant sur ces jus et sur les purées et pulpes de fruits utilisées pour la production des produits alimentaires, tels que les vins, les confitures et les yaourts. Il est aussi nécessaire de réaliser des tests lorsqu'on produit de jeunes plants pour la vérification de la constitution génétique des arbres et arbustes. Les problèmes varient d'un Etat à un autre. Par exemple, aux Etats-Unis d'Amérique, les produits de l'espèce citrus "Ambersweet" sont vendus comme produits sous le nom d'"oranges" mais, suivant les règlements européens, cette vente n'est pas autorisée. Les principaux revendeurs de produits à base de jus doivent donc disposer de tests d'authenticité, réalisés soit par soit eux-mêmes, soit par leurs fournisseurs. En outre, différents produits tirés des fruits relèvent de règlements d'importation différents, si bien qu'une identification de l'origine est nécessaire aux autorités douanières. Les chimistes analytiques ont mis au point toute une gamme de techniques de tests, et certaines sont très sophistiquées. Par exemple, on sait caractériser une variété de tissus à l'aide d'une "empreinte génétique", au cours d'une opération dans laquelle des acides nucléiques sont isolés de la matière à analyser et soumis à une détection et une identification. Habituellement, on utilise l'une de deux techniques suivant que des séquences conservees ou des marqueurs sont présents dans la matière soumise aux essais. On utilise en particulier des procédés à base de sondes à iu(s) ifliléi;(s) et des procédés à base de la réaction en chaîne de polymérase (PCR). Toute une gamme de sondes à acide(s) nuclêie(S) du commerce assurant la liaison des séquences conservées a e(s) r 5p(s) ont été mises au point pour la détection des organismes pathogènes bactériens. Des exemples sont les systèmes à sondes colorimétriques ("Genetrak") et à sondes génétiques chimioluminescentes ("Eugenetics") pour Salmonella et Listeria monocytogenes. L'utilisation de telles sondes pour le typage et l'identification humaine est bien documentée dans la technique des sondes génétiques. L'amplification des séquences cibles conservées par la réaction PCR avant détection du produit PCR amplifié est une autre technologie puissante récemment mise au point et qui s'est révélée précieuse dans les sciences cliniques et légales. La portée de la technique PCR est considérable dans d'autres industries, y compris les industries de production alimentaire, agricoles et des eaux. Cette technique permet la création de quantités de séquences cibles de l'ordre du microgramme à partir de quantités de l'ordre du nanogramme en un temps de 3 à 4 h. Dans le cas d'une analyse d'éléments pathogènes microbiens, on obtient des économies considérables de temps par utilisation du procédé PCR à la place des procédés classiques de culture qui nécessitent des jours pour donner le même résultat. Les inventeurs ont maintenant déterminé que les acides nucléiques pouvaient être isolés de toute une gamme de fruits, et en particulier des jus de fruits, c'est-àdire de fluides dérivés des fruits entiers et vendus avec ou sans autres tissus. En outre, ils ont déterminé que l'acide désoxyribonucléique (ADN) pouvait être mis sous forme de sondes ou soumis au procédé PCR de manière que la caractérisation de la source des fruits puisse être effectuée, et ils ont aussi déterminé des séquences spécifiques de sondes et d'amorceurs convenant à cette caractérisation. L',application de ces techniques aux jus de fruits permet une détection rapide de la fraude sans qu'il soit nécessaire de disposer d'un échantillon de tissus de fruits qui en est dérivé. L'invention concerne un procédé d'identification d'un genre, d'une espèce ou d'une variété d'une source de tissus de fruits ou de jus dérivés de tels tissus, comprenant (a) l'amplification de séquences d'ADN dans des acides nucléiques présents dans le tissu ou le jus à l'aide d'une réaction en chaîne de polymérase et/ou l'analyse des acides nucléiques, (b) la com- paraison de 1'ADN obtenu avec celui qui est obtenu d'un tissu ou jus de fruits d'un genre, espèce ou variété connu, et (c) la détermination de la présence des éléments d'ADN dun genre, d'espèce ou variété connu d'après la présence de tissus ou de jus dérivés de ce genre, cette espèce ou cette variété. L'invention repose sur la détermination, par des inventeurs, du fait que, bien que les concentrations d'acide nucléique présentes dans de nombreux jus soient insuffisantes pour permettre l'application directe d'une sonde d'ADN, elles sont suffisantes pour permettre l'application des techniques à base du procédé PCR pour l'obtention d'une quantité suffisante d'ADN. En outre, ils ont constaté que cet acide nucléique était caractéristique du fruit, et que l'ADN souche n'apparaissait pas dans des échantillons de descendants en quantités qui peuvent être détectées. Les inventeurs ont en outre déterminé la séquence de plusieurs amorceurs PCR donnant des profils distincts lors de leur application à l'acide nucléique des fruits ou tissus de fruits. Le profil de l'ADN est obtenu de façon très avantageuse par application de la technique PCR à l'amplification des séquences d'ADN présentes dans l'ADN des fruits, si bien que des produits d'ADN caractéristiques sont obtenus et peuvent être comparés à des produits connus afin qu'ils puissent être identifiés. Par exemple, les inventeurs ont constaté, par comparaison des profils d'ADN des oranges et des pamplemousses, qui sont des fruits de même genre, qu'il existait des différences nettes et que leurs mélanges présentaient un aspect de dessin combinatoire. On a constaté en particulier que l'application de l'amplification statistique d'ADN polymorphe (RAPD) à l'ADN extrait permettait la caractérisation satisfaisante des jus et tissus de fruits avec une différenciation suffisante pour permettre l'identification de l'origine des éléments constituants des mélanges. L'utilisation de la technique préférée permet une distinction facile entre différentes espèces de fruits récoltés et, avec une plus faible fréquence, entre différentes variétés de fruits, par exemple de variétés d'oranges, de pamplemousses et de pommes. Les inventeurs ont déterminé que la souche n'affectait pas le profil de l'ADN du descendant et ainsi que les gènes ne se déplaçaient pas entre les cellules, et ont ainsi démontré la fiabilité de la technique appliquée à de telles plantes à "double génome". Le procédé préféré de l'invention comprend une procédure d'extraction d'ADN de haute qualité d'un fruit intact ou d'un jus de fruits traité. Cette procédure comprend, pour les tissus, la congélation qui donne une matière solide qui est alors transformée mécaniquement en une poudre qui subit une extraction par un solvant capable de prélever 1'ADN. L'étape de congélation comprend une congélation suffisante du tissu dans l'azote liquide et la mise mécanique en poudre est avantageusement réalisée par broyage. L'extraction par un solvant est avantageusement réalisée par les procédés connus au bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) et/ou au phénol-chloroforme. L'utilisation de ces techniques permet l'obtention d'ADN convenant à la formation de profils pour des fruits de variétés très diverses, tels que les oranges Navel Valencia et satsuma, les pommes rouges et Granny Smith, les citrons, les limes, les pamplemousses, les bananes, les fruits du kiwi, les fruits de la passion, les papayes, les pêches, les pamplemousses, le raisin et les prunes. L'utilisation de telles techniques d'extraction donne des rendements variables d'ADN entre différents genres et espèces de fruits (voir tableau 1), mais on constate qu'elles suffisent toutes pour le procédé préféré RAPD. TABLEAU 1 Fruit Pays d'origine Rendement d'ADN ,ug/g Pomme Rouge France 0,14 Granny Smith France 0,98 Citron Afrique du Sud 1,71 Citron Argentine 0,54 Lime E.U.A. 3,92 Pamplemousse Afrique du Sud 1,09 Banane Antilles 0,27 Kiwi Nouvelle-Zélande 5,58 Fruit de la passion Kenya 9,48 Papaye Brésil 4,20 Pêche Italie 2,71 Ananas Costa-Rica 49,92 Prune Angleterre 1,46 Mangue Kenya 5,50 Melon Galia Israël 7,82 Orange Navel N1-625 Afrique du Sud 3,70 N5-J1207 Maroc 3,64 Jus Maroc 0,128/cm3 Jus conc. Maroc 6,16 Jus traité Maroc 0,094/cm3 N6-1207.1 Espagne 3,83 N6-1207.2 Espagne 1,25 L'invention concerne aussi des séquences particulières d'amorceurs qui ont été déterminées comme donnant des profils satisfaisants pour l'identification du genre, de l'espèce ou de la variété de fruits, ainsi que des séquences cibles permettant l'amplification PCR à l'extrémité 5' de séquences correspondant aux séquences d'identification n 1 à 6 suivantes N ident. séqu. 1 : GGTCTAGAGG 2 2 : ACTCCAGTCC 3 3 : TGGAGGGCTC 4 4 : AGACGGCCCT 5 5 : GTCCCAGCAG 6 6 : TGTCGGTCGT Ainsi, les amorceurs repérés par ces séquences peuvent varier des séquences complémentaires aux séquences cibles à l'extrémité 5' de la cible, mais permettent aussi l'hybridation à l'extrémité 3'. De telles séquences d'amorceurs comprennent les séquences ayant les numéros d'identification de séquences 7 à 12 qui suivent et sont de préférence formées de ces séquences. N ident. séqu. 7 : CCTCTAGACC 8 8 : GGACTGGAGT " 9 : GAGCCCTCCA 10 : AGGGCCGTCT 11 : CTGCTGGGAC 12 : ACGACCGACA I1 est possible, avec ces amorceurs, de caractériser et ainsi d'identifier un grand nombre de tissus de fruits et plus précisément de jus de fruits, comme indiqué dans le tableau 2 qui suit. La technique préférée utilisée pour l'obtention des profils RAPD est celle qui est classique pour les techniques d'analyse PCR, c'est-à-dire comme décrit par Mazurier et al (1990), Nucleic Acid Res. 18. 6531-6535 et Mazurier et Werners (1992), Res. Microbiol. 14. 260-262. Dans un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne des kits de test comprenant des oligonucléotides ayant des séquences complémentaires des séquences d'identification n 1 à 6 et comprenant notamment des séquences respectives d'identification n" 7 à 12, comprenant essentiellement ces dernières séquences. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne des kits de test contenant des oligonucléotides tels que décrits précédemment et ayant en outre des motifs comparatifs de fruits connus dérivés d'une ou plusieurs techniques RAPD mettant en oeuvre chacun de ces amorceurs, considérés ensemble ou séparément. Les oligonucléotides décrits précédemment peuvent être utilisés comme amorceurs PCR pour une analyse RAPD des tissus et jus de fruits et peuvent être utilisés pour la formation de sondes d'hybridation d'oligonucléotides qui sont elles-mêmes utiles pour l'analyse et la caractérisation des acides nucléiques des tissus et jus de fruits par hybridation sur papier "Southern". Lors de l'utilisation comme amorceurs PCR, les oligonucléotides peuvent subir une augmentation de longueur permettant l'utilisation de conditions plus sévères d'hybridation et ainsi l'augmentation de la spécificité de la méthode. Par exemple, l'amorceur de la séquence d'identification n" 12 peut être étendu afin qu'il forme des amorceurs direct et inverse capables d'assurer la liaison de l'ADN cible dans des conditions plus sévères par addition d'une ou plusieurs bases à son extrémité 3' comme indiqué par les séquences suivantes séquence directe d'amorceur : (les bases 1 à 10 sont celles de la séquence d'identification n" 12, l'amorceur est agrandi par addition d'un nombre voulu de bases dans l'ordre des bases 11 à 51 de la séquence qui suit) 5'-ACGACCGACA AACGATGAAA ATACTCACGG CTGTGCATAA AGACGCGCAA TATTAGAGAA GGTGGGTTGA TTTGGATTTG GCGT-3' séquence inverse d'amorceur : (les bases 1 à 10 sont celles de la séquence d'identification n" 12, l'amorceur est agrandi par addition d'un nombre voulu de bases dans l'ordre des bases 11 à 51 de la séquence qui suit) 5'-ACGACCGACA CCAAAACCAA AGTCAAGAAC TTCGGCGCAA TAGAGCATAC TTCCAATGAA TTTCACATAT GATCACTA-3' Il est manifeste pour l'homme de métier que des amorceurs constitués par exemple de 5 bases ou plus, avantageusement 10 bases ou plus et de préférence 15 bases ou plus, de ces séquences peuvent être utilisés pour l'amplification de l'ADN des oranges et pour l'obtention d'un fragment d'environ 1 kb (kilobase) caractéristique de l'espèce orange. La spécificité de ces amorceurs est accrue par augmentation de leur longueur correspondant aux séquences spécifiées. La séquence n" 12 est connue (Operon Technologies), mais les oligonucléotides dérivés du reste de la séquence sont nouveaux. Ainsi, ces produits réalisés avec d'autres amorceurs dérivés peuvent être utilisés eux-mêmes comme sondes d'hybridation sur papier "Southern". En particulier, ces sondes comprennent des produits individuels PCR marqués de la réaction PCR des tissus dérivés du fruit à l'aide d'amorceurs PCR de la séquence décrite précédemment. Un ensemble préféré de sondes à polynucléotidesoligonucléotides comprend celles qui sont dérivées par exécution d'une réaction PCR sur l'ADN dérivé du tissu hybride d'orange-pamplemousse "Ambersweet" de Floride, notamment les feuilles, à l'aide de la seule séquence d'amorceur ayant le numéro d'identification n" 12 pour déclencher l'amplification. Le polynucléotide, qui a une longueur d'environ 1 kpb (kilopaire de bases) est propre à l'espèce "Ambersweet". Un autre polynucléotide préféré pour le marquage et l'utilisation comme sonde est un fragment "Aval/Bgl Il" qui peut être obtenu à partir de ce polynucléotide de 1 kilobase, et ayant une longueur d'environ 200 pb. Le produit préféré de 200 pb s'hybride spécifiquement avec l'acide nucléique de génome dérivé d'orange et d'"Ambersweet", mais non avec celui du pamplemousse ou d'une lime. Un second groupe de tels polynucléotides obtenus selon l'invention est rendu disponible par utilisation de la séquence ayant le numéro d'identification 11 pour l'amplification de 1'ADN dérivé de l'un quelconque des cultivars d'oranger indiqués dans le présent mémoire. Le produit a un fragment d'environ 1 kpb à 500 pb et peut être dérivé par utilisation de "EcoRV/Bgl II". Ni ce produit ni le fragment de 500 pb n'ont été trouvés dans l'ADN dérivé du pamplemousse ou d'une lime. D'autres polynucléotides peuvent être dérivés par clivage de ce fragment d'une manière qui est aussi spécifique de l'ADN des oranges. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'un polynucléotide de 200 pb selon l'invention comprenant le clonage d'un produit dérivé par le procédé PCR d'environ 1 kpb, qui peut être obtenu à l'aide de la séquence ayant le numéro d'identification 12 pour l'amplification de l'ADN d'"Ambersweet" et notamment de 1'ADN de feuille d"'Ambersweet", dans un système vectoriel, et par clivage du produit nécessaire d'environ 200 pb à partir du produit obtenu par utilisation des enzymes de restriction "Aval" et "Bgl II", puis par une étape de marquage. Le marquage est réalisé par l'un quelconque des procédés classiques d'incorporation d'un marqueur biologique, chimique ou radioactif, connu dans la technique. Le procédé, les oligonucléotides et les kits selon l'invention sont maintenant décrits à titre purement illustratif en référence aux exemples qui suivent. D'autres modes de réalisation entrant dans le cadre de l'invention sont évidents pour l'homme du métier à la lecture de ces exemples. Exemples Exemple 1 : procédure d'isolement de l'ADN de jus de fruits disponibles dans le commerce. Des tentatives initiales d'isolement de 1'ADN de 100 cm3 de jus de fruits du commerce ont été réalisées, mais les valeurs de la densité optique (à 260 nm) étaient négatives et aucunes bandes de 1'ADN du génome n'ont pu être visualisées après électrophorèse sur gel de gélose. On a alors essayé un isolement à l'aide de 400 cm3 de jus de fruits, et on a obtenu des valeurs positives de la densité optique, mais 1'ADN du génome n'a pas pu être observé après électrophorèse sur gel. Les produits obtenus par la technique PCR ont été tels que, bien que 1'ADN n'ait pas pu être observé sur les gels de gélose, la quantité disponible était suffisante pour l'amplification. Une telle condition de volume dépend évidemment de l'origine et du traitement antérieur du jus. 3 Le pH de 400 cm de jus de fruits du commerce a été ajusté à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium 8,33N, et le jus a été centrifugé à 10 000 g pour l'obtention d'une phase solide et d'une phase qui surnage, et les deux phases ont été séparées. L'ADN a été isolé de la phase qui surnage par addition d'acétate d'ammonium 3M et d'isopropanol destinés à provoquer la précipitation. La centrifugation à 10 000 g a donné un culot d'ADN précipité qui a été traité par une solution d'un détergent cationique (bromure de cétyltriméthylammonium, CTAB) à une concentration de 0,8 % en poids/volume afin que la contamination par les polysaccharides soit réduite et que l'inhibition des enzymes impliquées lors des procédures de clonage soit évitée. On a ajouté du chloroforme à l'ADN traité, et on a centrifugé le mélange qui s'est séparé en deux phases. La phase aqueuse contenant 1'ADN a été retirée et 1'ADN a été précipité par de l'isopropanol. On a obtenu un culot d'ADN par centrifu- gation et ce culot a été remis en suspension dans un milieu TE (Tris-HCl, Na2EDTA). On a utilisé un traitement au phénol et chloroforme pour dénaturer les protéines éventuellement présentes qui ont formé une couche à l'interface des phases organique et aqueuse, et l'opération a été répétée jusqu'à ce qu'il ne reste plus de protéines à l'interface. On a effectué un traitement "Sevag" (chloroforme/alcool isoamylique) par addition d'alcool isoamylique destiné à empêcher le moussage du mélange lors du tourbillonnement ultérieur destiné à faciliter la séparation des deux phases. On a retiré l'acide ribonucléique ARN à l'aide de ARNse, puis on a effectué une extraction au phénol chloroforme et "Sevag", comme précédemment, on a précipité 1'ADN avec de l'isopropanol et de l'acétate d'ammonium 3N, on a fait subir une centrifugation au culot d'ADN, et on a lavé le culot résultant avec de l'éthanol à 70 %. Le culot final a subi un séchage sous vide et une remise en suspension dans de l'eau distillée stérile. Exemple 2 : extraction d'ADN d'un tissu de fruits 30 g de 'tissu de fruits ont été congelés dans l'azote liquide et broyés sous forme d'une poudre pour l'extraction de l'ADN. On a ajouté un tampon d'extraction "TES" (Tris-HCl, Na2EDTA et SDS) à la matière qui s'est décongelée pour provoquer la destruction des cellules, si bien qu'on a obtenu une activité réduite de nucléase. On a ajouté des agents réducteurs PAH (hydrate de phénanthroline) 1M et DTT (dithiotreitol) 1M pour inactiver les protéines, et on a ajouté du phénol pour provoquer leur dénaturation. On a soumis le mélange à une centrifugation et on a traité la phase aqueuse résultante de la même manière que la phase aqueuse "qui surnage',produite après le traitement initial par NaOH de l'exemple 1. Exemple 3 : analyse RAPD de l'ADN dérivé de tissus et jus de fruits La technique RADP a été mise en oeuvre avec six amorceurs de ADN comprenant les séquences de numéros d'identification 7 à 12 respectivement (Operon Technologies) avec des amplifications séparées, les amorceurs agissant aux deux extrémités de l'ADN cible à analyser. Les amplifications ont été réalisées dans un volume 3 total de 25 mm contenant 2,5 mm3 d'un tampon x10 (dépourvu de Mg+) 3 0,1 mm de mélange dNTP (100 mM chacun) 2,0 mm3 de MgCi2 25 mM 3 5,0 mm d'un seul des amorceurs d'oligonucléotides à 10 bases (3 ng/mm ) 3 3 2,5 mm d'ADN de matrice de génome (10 ng 0,2 mm de Taq ADN polymérase (1 unité) 3 12,7 mm d'eau distillée stérile. A l'exception de la matrice de génome, de l'amorceur et de Taq ADN polymérase, toutes les matières précédentes constituent la solution tampon de base préparée en volume et conservée à -20 "C. Toutes les amplifications ont été réalisées avec un appareil de commande de cycle thermique "Perkin-Elmer" avec le programme suivant de température 1 cycle comprenant 3 min à 94 "C 1 min à 36 "C 2 min à 72 "C 44 cycles comprenant 1 min à 94 "C 1 min à 36 "C 2 min à 72 "C 1 cycle final comprenant 10 min à 72 "C 999 min à 18 "C On a analysé les produits d'amplification par électrophorèse sur gel de gélose à 1,4 % à 150 V (tension constante) pendant 2 h et à l'aide de bromure d'éthidiumde coloration pour la visualisation des profils obtenus. On a utilisé une série de tissus et de jus de fruits pour la mise en oeuvre des techniques PCR en présence de chacun des amorceurs d'oligonucléotides séparés décrits précédemment, avec des séquences constituées de celles qui ont les numéros d'identification 7 à 12. Les combinaisons d'amorceurs et d'ADN ont donné soit aucun produit (NP), soit des profils de produits analogues (+) pour tous les ADN testés, soit des profils distincts de produits (-). Les résultats de ces techniques PCR figurent dans le tableau 2 qui suit. Les espaces indiquent que l'amorceur particulier n'a pas été appliqué. Ainsi, les compositions donnant le résultat (-) conviennent pour l'identification de 1'ADN spécifique et ainsi du tissu-jus de fruits particulier dans une application RAPD. TABLEAU 2 N" ident. séq. amorceur 7 8 9 10 FRUIT Pomme rouge NP Granny Smith Citron d'Afrique du Sud NP + Citron d'Argentine NP Lime Pamplemousse NP + Banane Orange Valencia V3-805 - + Navel N5-1207 + + " N5-PJ1207 + + Jus traité Navel N5-J1207 + Jus Navel N5-CJ1207 + + Jus concentré En plus de ces résultats, l'amorceur d'oligonucléotides ayant la séquence de numéro d'identification 10 a été appliqué aux techniques PCR sur des tissus d'un certain nombre de variétés d'oranges Navel Valencia et satsuma. Tous les résultats, sauf pour l'accession N2-625, ont donné le même profil par les accessions suivantes : N1-625, N2-625, N3-805, N3-625, N4-805, N5-1207, N6-1207-1, N6-1207-2, V1-625, V2-805, V3-805, V4-1016, V5-805, V6-1016, V7-1016, VL-1207, S1-1207. On a noté que tous les échantillons de tissus et de jus pouvaient donner un profil par utilisation de l'un ou l'autre des amorceurs utilisés. Certains amorceurs ont donné des profils semblables à des espèces voisines, par exemple les séquences ayant les numéros d'identification 8 et 9. Des différences ont pu être déterminées entre des accessions différentes d'oranges Navel et entre des pommes rouges et Granny Smith, comme indiqué par la séquence ayant le numéro d'identification 7. Les amorceurs ayant les séquences de numéros d'iden- tification 11 et 12 ont été particulièrement utiles pour la distinction de l'espèce orange des autres fruits ou de l'orange "Ambersweet", et d'hybrides de pamplemousse des variétés d'oranges. Exemple 4 : préparation d'une sonde d'oligonucléotides capable de distinguer les oranges Un amorceur de séquence d'ADN de numéro d'identification 12 a été utilisé pour l'amplification d'un fragment d'ADN de feuilles d'"Ambersweet" dérivé d'ADN de génome à l'aide de la technique PCR, ce fragment de produit ayant une longueur d'environ 1 kb . Le produit a subi une nouvelle amplification en 16 cycles et a été analysé sur gel de gélose, et une bande polymorphe de 1 kb a été découpée et purifiée à l'aide du kit "Geneclean Kit" (Bio 101 Inc., E.U.A.). La quantité d'ADN produite a alors été déterminée. Le fragment de 1 kb a été cloné dans un système vectoriel de plasmide pGEM-T ("Promega") et des digestions d'enzymes à simple et double restriction ont été établies pour la localisation relative des sites d'enzymes présents dans le vecteur. Les enzymes choisies "Aval" et "Bgl Il" n'affectaient pas les sites natifs du vecteur. Le produit d'oligonucléotides de fragment "Aval/Bgl Il" d'environ 200kpb a été extrait du reste de la matière, purifié et marqué pour être utilisé comme sonde par les procédés classiques. On a constaté, par utilisation de l'analyse par hybridation/transfert "Southern", que cette sonde permettait l'hybridation de 1'ADN de génome d'orange, mais non de pamplemousse ou de lime. Exemple 5 : utilisation de la technique RAPD pour la distinction entre des raisins Le procédé de l'exemple 3 a été répété à la fois sur des variétés de raisins noirs et blancs à l'aide d'un certain nombre d'amorceurs, y compris ceux des séquences ayant les numéros d'identification 9, 10 et 17. L'utilisation d'un amorceur de numéro d'identification 9 a donné des diagrammes RAPD identiques pour les deux variétés alors qu'un amorceur de numéro d'identification 12 a donné des diagrammes différents pour les raisins noirs et blancs et un amorceur de numéro d'identification 10 a donné des bandes uniquement avec les raisins noirs. Exemple 6 : utilisation de la technique RAPD pour la distinction d'un hybride interspécifique "Sweetie" de pamplemousse L'amorceur ayant le numéro d'identification 8 a été utilisé pour la production de diagrammes d'ADN RAPD à partir d'échantillons d'ADN d'un hybride interspécifique "Sweetie" et de pamplemousse. Plusieurs bandes ont été produites avec 1'ADN de "Sweetie" et n'ont pas apparu avec 1'ADN de pamplemousse sous forme d'une matrice. Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et revendiquée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter toute équivalence dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification d'un genre, d'une espèce ou d'une variété d'une source de tissus de fruits ou de jus dérivés de tels tissus, caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'amplification de séquences d'ADN dans des acides nucléiques présents dans le tissu ou le jus à l'aide d'une réaction en chaîne de polymérase, (b) la comparaison de 1'ADN obtenu avec celui qui est obtenu d'un tissu ou jus de fruits d'un genre, espèce ou variété connu, et (c) la détermination de la présence des éléments d'ADN d'un genre, d'espèce ou variété connu d'après la présence de tissus ou de jus dérivés de ce genre, cette espèce ou cette variété. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont analysés à l'aide d'une sonde nucléique pour hybridation, dans lequel l'apparition de l'hybridation des acides nucléiques de fruits avec une sonde donnée est comparée à celle de l'acide nucléique du genre, espèce ou variété connu, et la comparaison est utilisée pour la détermination de l'identité probable du fruit. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'amplification statistique de 1'ADN polymorphe (RAPD) est appliquée à 1'ADN des tissus ou du jus, et les profils obtenus sont utilisés pour la comparaison de 1'ADN à celui des profils connus. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, avant amplification et analyse, l'acide nucléique est extrait des tissus de fruits par congélation des tissus sous forme solide, la matière solide étant transformée mécaniquement en poudre et la poudre subissant une extraction par un solvant capable de prélever 1'ADN. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape de congélation comprend la congélation du tissu dans l'azote liquide, et l'étape de mise mécanique en poudre comprend une étape de broyage. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, après amplification et analyse, l'acide nucléique est extrait du jus de fruits par précipitation, et subit un traitement par le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) ou par du phénol-chloroforme ou par les deux. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la technique RAPD est mise en oeuvre avec un ou plusieurs amorceurs ciblés pour le déclenchement de l'amplification PCR à l'extrémité 5' de l'une des séquences d'ADN N ident. seq. 1 : GGTCTAGAGG " 2 : ACTCCAGTCC " 3 : TGGAGGGCTC " 4 : AGACGGCCCT 5 5 : GTCCCAGCAG 6 6 : TGTCGGTCGT 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que la technique RAPD est mise en oeuvre avec un ou plusieurs amorceurs comprenant l'une quelconque des séquences ayant les numéros d'identification 7 à 12 : N ident. seq. 7 : CCTCTAGACC " 8 : GGACTGGAGT " 9 : GAGCCCTCCA 10 : AGGGCCGTCT 11 : CTGCTGGGAC 12 : ACGACCGACA 9. Kit de test destiné à être utilisé pour l'identification du genre, de l'espèce ou de la variété de tissus ou de jus de fruits, caractérisé en ce qu'il contient un oligonucléotide comprenant la séquence de l'un des numéros d'identifications 7 à 12. 10. Kit de test selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des diagrammes comparatifs de fruits connus dérivés d'une ou plusieurs opérations RAPD à l'aide respectivement de chacun des oligonucléotides utilisés comme amorceurs, seuls ou en combinaisons. 11. Oligonucléotide comprenant au moins cinq bases de séquence 5'-ACGACCGACA AACGATGAAA ATACTCACGG CTGTGCATAA AGACGCGCAA TATTAGAGAA GGTGGGTTGA TTTGGATTTG GCGT-3'. 12. Oligonucléotide comprenant au moins cinq bases de séquence 5'-ACGACCGACA CCAAAACCAA AGTCAAGAAC TTCGGCGCAA TAGAGCATAC TTCCAATGAA TTTCACATAT GATCACTA-3' 13. Oligonucléotide selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins quinze bases de la séquence donnée. 14. Sonde d'hybridation, par un polynucléotide ou un oligonucléotide, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par amplification PCR d'acide nucléique dérivé de tissus ou de jus de fruits, à l'aide d'un ou plusieurs oligonucléotides ayant les numéros d'identification 7 à 12 comme amorceurs, et par purification ou isolement du produit. 15. Sonde selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de feuilles d'oranger de Floride "Ambersweet", uniquement à l'aide d'un amorceur ayant la séquence de numéro d'identification 12 pour le déclenchement de l'amplification. 16. Sonde selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'elle est obtenue par exposition du polynucléotide de la revendication 14 à des endonucléases de restriction "Aval/Bgl II" et par isolement d'un fragment des produits ayant une longueur d'environ 200 paires de bases (pb). 17. Sonde selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'un cultivar d'oranger, à l'aide uniquement d'un amorceur de séquence ayant le numéro d'identification 11 pour le déclenchement de l'amplification. 18. Sonde selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle peut être obtenue par exposition du polynucléotide de la revendication 17 à des endonucléases de restriction "EcoRV" et "Bgl Il" et par isolement d'un fragment des produits, ayant une longueur d'environ 500 paires de bases (pb).