Brevet FR2721033A1 — publié le 19951215

La présente invention concerne une nouvelle protéine dénommée placentine, ses analogues, leurs procédés de préparation ainsi que leurs applications. L'insuline, l'IGF-l, l'IGF-2 et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques avant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire. L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-1 sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale. La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Son rôle fonctionnel dans le cerveau o une expression très importante a été obtenue reste à élucider. On a adjoint, récemment, à cette famille les Ley I-L qui sont actuellement clonés sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire. L'insuline qui est le prototype de cette famille comprend deux chaines peptidiques A et B reliées par des ponts disulfure. Elle est codée par un ARNm qui est traduit en pre-pro insuline. Le peptide signal, de même que le peptide de conjonction C, sont excisés par modification post- traductionnelle; ceci est également valable pour la relaxine alors que les IGFs sont maturés différemment sans élimination du peptide C et demeurent sous forme de chaine unique. On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et l'IGF. Ils appartiennent à la super-famille des 2 2721033 récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c-erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF). La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-kinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaine d'évènements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et l'IGF), PI3K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP) kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription. Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives. La présente invention concerne plus particulièrement une nouvelle molécule de cette famille de l'insuline qui est dénommée ci-après placentine et dont la séquence d'acides aminés et celle de l'ADN qui code pour cette protéine sont représentées dans la figure 1. La placentine a été isolée à partir d'une banque d'ADNc de cellules cytotrophoblastiques préparées à partir de placenta prélevé lors du premier trimestre de la grossesse. L'analyse par Northern blot (effectuée sur un très grand échantillonnage de tissus normaux) a révélé des niveaux d'ARN détectables seulement dans le tissu placentaire. La séquence d'acides aminés qui a été obtenue montre, pour la placentine, un arrangement de résidus cystéine caractéristique de la famille de l'insuline. Le traitement de cellules cibles avec des milieux conditionnés à partir de cellules cultivées exprimant la protéine recombinante induit un schéma de phosphorylation de la tyrosine similaire à celui observé après traitement avec l'insuline. Enfin, de même que l'insuline, la placentine induit la synthèse d'ADN, comme cela peut être mesuré par l'incorporation de thymidine dans les cellules cibles traitées. C'est pourquoi la présente invention concerne plus particulièrement une protéine dénommée placentine, protéine de formule correspondant à la figure 1, et ses analogues, présentant une activité de type placentine et obtenue par délétion et/ou substitution. Sur la figure 1, la structure de la placentine correspond à la structure en acides aminés suivant la méthionine en position 36 jusqu'à l'acide aminé en position 174. Les références aux séquences d'ADN de la placentine correspondent à cette séquence. Les séquences nucléiques présentes avant le premier ATG présumé (souligné) et après le codon stop sont en minuscule. Les analogues de la placentine sont les protéines ou peptides qui présentent une forte homologie, en particulier plus de 60 % d'homologie, de préférence 80 %, en acides aminés avec le composé de la figure 1 et qui ont pu être obtenus par délétion ou par substitution tout en conservant les caractéristiques essentielles de la placentine. Ces analogues seront parfois nommés "composés de type placentine". En particulier, la présente invention concerne des fragments qui présentent certains des épitopes caractéristiques de l'activité de la placentine, notamment les protéines de type placentine qui présentent au moins les 20 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale de la figure 1. La présente invention concerne bien entendu la placentine ou ses analogues sous forme glycosylée ou non glycosylée et les protéines présentant ou non les ponts disulfures de la protéine d'origine. En effet, cette protéine peut être préparée par extraction à partir d'échantillons biologiques mais sera de préférence obtenue par des techniques mettant en oeuvre le génie génétique et dont les structures secondaires pourront varier en fonction de l'organisme hôte. L'invention concerne également une molécule choisie parmi (a) la séquence d'ADN de la figure 1, (b) les séquences d'ADN susceptibles de s'hybrider à la séquence précédente et qui codent pour un polypeptide de type placentine, et (c) les séquences d'ADN qui compte tenu du code génétique correspondent aux séquences (a) ou (b) et qui codent pour un polypeptide de type placentine. En particulier, l'invention concerne la séquence d'ADN correspondant à la figure 1. Bien entendu, les séquences d'ADN mentionnées précédemment peuvent être des séquences génomiques ou de type génomique, c'est-à-dire que certains des éléments peuvent être séparés par des introns qui seront excisés pour conduire à l'expression de la placentine mature. Les séquences d'ADN précédentes pourront être incorporées dans des vecteurs de clonage ou d'expression de la placentine ou de ses analogues, de préférence sous le contrôle d'éléments assurant leur expression dans une cellule hôte définie. Les systèmes d'expression dans les cellules procaryotes ou eucaryotes sont bien connus de l'homme de métier, il pourra s'agir notamment de systèmes de type plasmidique ou de type viral comportant des promoteurs assurant l'expression dans la cellule hôte et munis également des éléments terminateurs nécessaires. Mais il pourra également s'agir de vecteurs d'intégration qui pourront comporter leur propre système d'expression ou bien être conçus pour s'intégrer dans les chromosomes à des endroits o ils se trouveront sous la promotion d'un promoteur chromosomique, notamment dans le cas des cellules procaryotes, en utilisant la technique des recombinaisons homologues. La présente invention concerne également des cellules hôtes caractérisées en ce qu'elles comportent un vecteur autoréplicatif exprimant la placentine ou un analogue de placentine selon l'invention ou une séquence d'ADN selon l'invention incorporé dans un chromosome et exprimant la placentine ou un analogue de la placentine. Comme cela a été indiqué précédemment, il pourra s'agir de cellules eucaryotes, en particulier de cellules de mammifères type cellule CHO, ou de cellules en culture d'autres types plus appropriées à la préparation de la placentine sous sa forme mature; mais il est également possible d'envisager l'utilisation de cellules bactériennes par exemple: dans ce cas il pourra être utile de faire subir des remaniements complémentaires à la protéine ainsi obtenue. Il s'agit là encore de techniques qui sont connues de l'homme de métier et qui ne seront pas décrites plus complètement, sauf dans le cadre de certains des exemples ci-après. Les cellules ainsi transformées par un vecteur autoréplicatif exprimant la protéine ou ayant intégré la séquence exprimant la protéine dans ses chromosomes pourront être utilisées par culture dans un procédé permettant de préparer la placentine ou ses analogues. Il s'agira notamment d'un procédé de préparation de la placentine ou ses analogues caractérisé par la mise en culture de cellules dont on extraira directement ou à partir du milieu de culture la placentine ou ses analogues. La placentine pourra notamment être extraite par immuno- purification. La présente invention concerne également les produits de recombinaison obtenus par le procédé mis en oeuvre précédemment. Dans certains cas, la protéine pourra être préparée sous forme fusionnée, en particulier lorsqu'il s'agira d'un analogue de la placentine de type peptidique, ou bien lorsque la fusion avec cette protéine permettra d'atteindre plus facilement le site d'action de la placentine ou de ses analogues, ou lorsque, dans certains cas, cette protéine permettra de leurrer certains systèmes naturels en assurant une plus longue durée de vie de la protéine en cause. La présente invention concerne enfin des compositions pharmaceutiques utilisant la placentine ou ses analogues à titre de principe actif. Comme cela a été indiqué, la placentine présente un grand nombre d'activités, en particulier elle peut présenter comme d'autres facteurs humains de croissance de type 1 une activité au niveau cardiaque, notamment dans le traitement et la prévention de certains troubles cardiaques tels que les insuffisances cardiaques aigues. Cette protéine ou certains de ses analogues peuvent présenter une activité de type facteur de croissance et promoteur de la lactation. Egalement, les produits peuvent être utilisés dans le processus de régénération de tissus nerv-eux, musculaire, cutané ou osseux, notamment en cas de pathologies dégénératives ou endocriniennes, de lésions traumatiques ou d'affections virales. Enfin, la placentine ou ses analogues peuvent présenter une action au niveau du contrôle de l'ensemble des phénomènes de la conception chez l'homme ou chez les animaux. La présente invention concerne également des anticorps et plus spécialement des anticorps monoclonaux spécifiques de la placentine ou de ses analogues ainsi qu'une méthode de diagnostic in vitro permettant, à l'aide de la placentine ou de ses analogues et/ou des anticorps correspondants, de détecter des taux anormaux de placentine dans les échantillons physiologiques ou non. Des fragments d'ADN correspondant aux séquences mentionnées précédemment pourront être intégrés dans une stratégie thérapeutique "sens" ou "anti-sens"; quant à la placentine ou ses analogues, ils pourront également être intégrés dans une stratégie de ciblage de certaines molécules pharmaceutiquement actives vers les récepteurs de la placentine ou ses analogues. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples ci-après qui sera effectuée en se référant à la figure 1 sur laquelle est représentée la séquence de la placentine et du gène humain codant pour cette protéine. EXEMPLES La mise en évidence de la placentine est le fruit d'une recherche spécifique tendant à mettre en évidence les molécules impliquées dans la croissance cellulaire et/ou dans les processus néoplasiques. Bien que le placenta soit un tissu normal, les cellules constituantes présentent de nombreuses propriétés communes avec les cellules néoplasiques, notamment les cytotrophoblastes invasifs et hautement mitotiques qui peuvent pénétrer le tissu maternel. Ces trophoblastes sont une source inépuisable de facteurs de croissance, d'hormones et de récepteurs de facteurs de croissance notamment. Les études actuelles montrent que les gènes préférentiellement exprimes dans les cellules trophoblastiques peuvent aussi être exprimés préférentiellement dans les cellules néoplasiques. Mais tenant compte du fait que le placenta, et notamment les trophoblastes, demeurent sous un contrôle complet durant la grossesse normale, les molécules trophoblastiques correspondant à ce contrôle sont des candidats très intéressants à titre d'agent anticancéreux ou susceptibles de contrôler le processus de cancérisation. C'est pourquoi la méthode d'isolement qui a été utilisée est une méthode de soustraction de ADNc mettant en oeuvre la technologie PCR sur des trophoblastes jeunes. Ceci a permis de mettre en évidence des gènes qui sont surexprimés dans ces cellules mais qui sont également surexprimés dans des cellules néoplasiques. MATERIEL ET METHODES Tissus Des placentas de 5 à 12 semaines et des placentas à terme, de même que des échantillons chirurgicaux de tissus normaux et tumoraux, ont été réfrigérés immédiatement (dans les 10 minutes suivant l'intervention chirurgicale) et conservés dans l'azote liquide jusqu'à la préparation des ARN. Ces collections de tissus ont été obtenues et utilisées en accord avec les protocoles approuvés par les Comités des différents hôpitaux. Cellules Les lignées de cellules humaines utilisées pendant cette étude et leurs origines histologiques sont les suivantes: choriocarcinome gestationnel (JAr et JEG-3); carcinome hépatocellulaire (PLC/PRF/5 et Hep G2); adénocarcinome du colon (LS180); carcinome de l'ovaire (OV1/p, OVIVCR), la lignée de cellules OV1/VCR est dérivée de OV1/p et est résistante à la vincristine; carcinome épidermoide (A431); carcinome du poumon (A427); carcinome épithéloide du cervix (HeLa); carcinome mammaire (McF7, MDA-MB-361, SK-BR-3, BT-20 et BT-474); cellules mammaires transformées par SV-40 (HBL-100); lignée cellulaire de neuroblastome (SHSY-5Y); lignée cellulaire de fibroblaste normal (CCL-137). toutes ces lignées cellulaires étant disponibles à l'ATCC à l'exception de l'IGR/OV1 (OV1/p) et d'OV1/VCR. Ces lignées cellulaires sont mises en croissance dans un milieu DMEM ou RPMI-1460 (Gibco-BRL Laboratoires, Gaithersburg, MA) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur, !,M d'acides aminés non essentiels, 4 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 ig/ml de streptomycine à 37 C avec 5 % de C02. Isolement des cvtotroDhoblastes Les cytotrophoblastes sont purifés comme cela est décrit par Kliman et al. Endocrinology, 118:1567-1582, 1986. En bref, les tissus villeux du placenta du premier trimestre sont dispersés avec de la trypsine et de la déoxyribonucléase I. Les cellules dispersées sont alors purifiées sur un gradient Percoll 5-70 % (Pharmacia). La bande à 1 040-1 060 g/ml de densité est collectée. L'examen microscopique révèle qu'elle comprend des cellules cytotrophoblastiques avec moins de 5 % de contamination par des cellules non trophoblastiques telles que les macrophages, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Préparation de l'ARN L'ARN total est préparé à partir de cultures de cellules préconfluentes ou de tissus réfrigérés en utilisant de l'isothiocyanate de guanidinine et par ultracentrifugation sur un gradient de chlorure de cesium en adaptant le protocole de Chirgwin et al. Les ARN des polysomes associés aux membranes du reticulum endoplasmique (MB-ARN) sont purifiés comme cela a été décrit précédemment. Après trypsination et purification sur gradient de Percoll, les cellules cytotrophoblastiques sont homogénéisées, puis les MNIB-ARN sont isolés sur gradient de sucrose en incluant un complexe ribonucléoside vanadyl comme inhibiteur de ribonucléase. Synthèse des ADNc et amplification par PCR 0,1 ig de MIB-ARN est dissous dans 5 tl d'eau traitée DEPC et dénaturé avec O,1 NIM MleHgOH et f-mercaptoéthanol. Le premier brin d'ADNc est synthétisé avec la transcriptase réverse du virus de la myoblastose aviaire (trousse Invitrogen, San Diego) en utilisant le primer-dT modifié indiqué ci-après (Frohman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002, 1988). Les hétéroduplex ARN-ADNc de taille comprise entre 0,5 et 2 kb sont électroélués après migration dans un gel d'agarose à 2 %. Une queue d'oligo dG est ajoutée à l'extrémité 3' du premier brin d'ADNc avec la transférase déoxynucléotide terminale et l'ARN est éliminé par hydrolyse alcaline. Les ADNc sont amplifiés avec des amorces non spécifiques incluant les sites de restriction pour les enzymes NotI et SalI. La séquence de l'amorce T utilisée pour la transcription réverse et la PCR est la suivante: '- GACTCGAGTCGACATCGATI T 1lTII f lTI T 11 -3' L'amorce C est identique à celle décrite dans Loh et al., (Science, 243: 217-220, 1989): '-GCATCGGCGCGGCCGCGGAGGCCCCCCCCCCCCC-3' Le mélange réactionnel comporte 1,25 mM de chacun des 4 désoxyribonucléotides triphosphates, 0,5 iM de chaque amorce et 2,5 unités de Taq polymérase dans 50 mMI KCI - 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) - 3,5 mM MgC12 - 0,01 % gélatine. L'amplification est effectuée dans un thermocycleur pour cycles de 20 secondes à 94 C, 30 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Les produits sont chargés sur un gel d'agarose à 1 % à fusion basse. Puis la région 0,5-2 kb est excisée et réamplifiée dans les mêmes conditions. Les produits sont précipités, digérés totalement avec NotI et SalI, les tailles sont sélectionnées comme précédemment et électroéluées à partir d'agarose, précipitées et quantifiées. L'ADNc total de placenta à terme et de lymphocytes T activés par de la phytohémaglutinine et cultivés pendant plusieurs jours en présence d'IL2 a été préparé en utilisant un système de synthèse d'ADNc double brin. Construction de la banque soustraite d'ADNc L'hybridation soustractive est effectuée comme cela est décrit par Klickstein (Klickstein et al. Current protocols in molecular biology, pp 5.8.9.-5.8.15 Wiley Interscience, 1989). 0,2 Ig d'ADNc de cellules cytotrophoblastiques amplifiés par PCR sont mis à digérer avec NotI et SalI, mélangés avec 8 tg d'ADNc de lymphocytes T activés et 8 Hg d'ADNc de placenta à terme digérés avec AluI et RsaI, dissous dans 40 nl de tampon d'hybridation (50 % de formamide déionisé; 10 mM de tampon phosphate sodium, pH 7; 5 X SSC; 0,1 % SDS; 10 mNI EDTA), dénaturés 5 minutes à 98 C et incubés 24 heures à 37'C. Les séquences communes entre cible et compétiteur sont reprises pour former des duplex entre les fragments courts (Alu/Rsa, compétiteur) et long (Not/Sal de la cible), en inhibant la formation d'extrémités cohésives. Les brins d'ADNc complémentaires exprimés spécifiquement dans les cytotrophoblastes jeunes permettent la régénération des extrémités cohésives NotI et SalI pour un clonage unidirectionnel dans les sites pBSKII + phagemid de vecteur (Stratagene). Cribla2e de la banque La banque d'ADNc soustraite est étalée sur milieude culture gélosé et les colonies recombinantes sont prélevées et mises en culture dans le milieu LB puis amplifiées par PCR. Les ADN plasmidiques préparés par la méthode des minipréparations bouillies (Del Sal G. et al. Nucleic Acids Res., 16: 9878, 1988) et digérés avec NotI et SalI ou les produits des inserts amplifiés par PCR a l'aide des amorces originales sont analysés par Southern blot sur des gels à 1,2 % d'agarose. La taille moyenne des inserts est entre 500 et 1 000 nucléotides. Les gels sont transférés en double sur membranes de nylon (Hybond N, Amersham) dans un tampon alcalin. Les sondes utilisées pour l'hybridation sont des ADNc totaux synthétisés à partir des placentas jeunes, des placentas à terme et des lymphocytes T activés marqués au 32p (Amersham) par multi-amorcage aléatoire. L'hybridation se déroule pendant 18 heures à 42 C suivie par un lavage stringent dans 0,1 X SSC à 50 C et la mise en autoradiographie. Analyse sur Northern blot ,tg d'ARN total provenant de différents tissus et de lignées cellulaires sont analysés sur un gel à 1 % d'agarose contenant 2,2 M de formaldéhyde. Quand l'électrophorèse est terminée, le gel est rincé avec de l'eau bi-distillée et traité avec 10 x SSC pendant 30 minutes. L'ARN est alors transféré sur membrane de nitrocellulose renforcée (Schleicher et Schuell, Dassel) dans le tampon de transfert 20 X SSC pendant 18 heures. Les ARN transférés sont fixés sur les membranes par irradiation aux UV avant hybridation. Les sondes utilisées pour hybrider les membranes sont des inserts excisés marqués au 32p par multi-amorçage aléatoire, ou des sondes monobrins générées par PCR en utilisant une amorce antisens universelle. L'hybridation est effectuée une nuit à 42 C suivie par des conditions de lavage stringentes dans 0,1 X SSC à 50WC et la mise en autoradiographie. Séquencage de l'ADN et analyse Les ADN plasmidiques sont préparés par la méthode des minipréparations bouillies. Le séquençage de l'ADN est réalisé avec le kit Sequenase, version 2.0 (U.S. Biochemical). Les amorces sont soit des amorces universelles M13, T3,T7 ou des amorces spécifiques internes. Les produits de réaction sont analysés sur des gels contenant 6 % d'acrylamide et 50 % d'urée. Les séquences obtenues sont comparées aux séquences des différentes banques de données. Analyse Les clones qui ne donnent pas de signal d'hybridation avec les sondes normalisées sont analysés par séquençage partiel et comparaison dans ces banques de données. L'un des clones correspondant à la placentine correspond à la séquence en acides aminés représentée à la figure 1. Les échantillons d'ARN totaux et polyA préparés à partir de lignées cellulaires transformées ou normales et des tissus correspondants sont analysés par Northern blot à l'aide de sondes ADNc de placentine antisens monobrin marquées. Les signaux d'hybridation sont détectés seulement dans les placentas, en particulier en début de grossesse, et sont pratiquement inexistants dans les autres tissus comme cela ressort du tableau ci-après (tableau I) 12 2721033 TABLEAU I PLACENTA JEUNE l PLACENTA A TERME ++ FOIE NORMAL - FOIE TUMORAL VESSIE NORMALE - VESSIE TUMORALE - EPIPLOON NORMAL EPIPLOON TUMORAL OESOPHAGE NORMAL - OESOPHAGE TUMORAL - COLON NORMAL - COLON TUMORAL - ESTOMAC NORMAL COL DE L'UTERUS TUMORAL - ENDOMETRE NORMAL - OVAIRE NORMAL - SEIN TUMORAL GANGLION TUMORAL - RATE NORMALE - RECTUM NORMAL - RECTUM TUMORAL TROMPE DE FALLOPE NORMALE - PEAU NORMALE - MYOMETRE NORMAL GLANDE SURRENALE NORMALE - THYROIDE NORMALE - THYROIDE TUMORALE 13;2721033 Des etudes effectuées sur des produits d'origine murine et simienne montrent des analogies indiquant des similitudes fonctionnelles significatives entre les espèces. Expression de la placentine Pour l'expression eucaryotique de la placentine, l'ADNc a été inséré dans le vecteur d'expression pBK-CMV dans l'orientation sens et antisens. Deux types cellulaires ont été utilisés de façon à étudier les effets possibles des modifications post-traductionnelles inhérentes aux types cellulaires. Des cellules de rein de singe COS-7 ont été transfectées par DEAE pour l'expression transitoire tandis que des cellules trophoblastiques humaines transformées par SV4O (3AsubE) ont été transfectées par CaPO4 pour l'expression transitoire et stable. Les cellules COS-7 et 3AsubE n'expriment pas de niveaux détectables d'ARNm de placentine. Les cellules transfectées sont conditionnées avec un milieu de culture exempt de sérum. Les milieux conditionnés obtenus à partir des cellules transfectées sens ou antisens sont analysés pour tester la présence de protéines recombinantes. L'activité biologique de la protéine recombinante est analysée sur différentes cellules cibles, considérant que les récepteurs spécifiques peuvent exister ou que la protéine peut se fixer sur d'autres récepteurs pour des molécules de structure proche, comme cela a été observé pour l'insuline et l'IGF. L'accroissement de la tyrosine phosphorylation des protéines cellulaires a été détecté par immunoblot des lysats avec un anticorps anti- phosphotyrosine a partir des cellules cibles COS et 3AsubE traitées avec les milieux conditionnés par les cellules transfectées par l'ADN sens de la placentine. Les milieux conditionnés à partir de 3AsubE non transfectées présentent des effets équivalents aux milieux obtenus à partir de 3AsubE transfectées par les antisens. Un grand nombre des protéines qui présentent une augmentation de la tyrosine phosphorvlation correspondent en taille à différents éléments identifiés de la cascade de phosphorylation; le substrat du récepteur commun à l'insuline et à l'IGF-1 ou IRS-1 (170 kDa), l'unité 1 autophosphorylée du récepteur de l'insuline (IR, 95 kDa), l'unité régulatrice de P13K (85 kDa), Shc (66 et 52 kDa), la MAP kinase (42 kDa). Dans 3AsubE, la différence dans la bande de phosphoprotéine aux alentours de 95 kDa (IR-I) après traitement avec le milieu conditionné et l'insuline suggère différents récepteurs pour l'insuline et la placentine. Comme la régulation autocrine est l'une des caractéristiques des trophoblastes, la présence de récepteurs spécifiques pouvait être prévisible. Dans les cellules COS, le schéma est pratiquement identique avec une réactivité croisée de la placentine sur l'IR seul pour servir comme récepteur, connu pour s'exprimer à différents niveaux dans la plupart des cellules. La présence de séquences homologues à la placentine dans l'ADN génomique du singe, toutefois, permet de considérer qu'il existe peut- être un récepteur similaire d'une taille semblable à celle de l'IR. Les milieux conditionnés à partir de l'expression des cellules COS transitoires semblent être plus puissants pour induire la phosphorylation, probablement correspondant à des concentrations plus élevées. Les modifications post-traductionnelles, dont on pensait qu'elles pourraient être plus appropriées dans les cellules 3AsubE dérivées de trophoblastes qui normalement produisent l'ARNm de la placentine naturelle, sont apparemment également compatibles avec la production d'un produit biologiquement actif dans les cellules COS. Savoir si les produits des deux cellules sont identiques et comparables au peptide putatif obtenu naturellement demande à être vérifié. Finalement, l'activité mitogénique a été évaluée en mesurant la stimulation del'incorporation de la 3H-thymidine dans des cellules 3AsubE quiescentes après traitement avec un milieu conditionné à partir de cellules transfectées. Les effets mitogéniques de la placentine semblent être égaux à ceux de l'insuline dans la mesure o la concentration dans le milieu conditionné est apparemment suffisante pour induire des niveaux similaires de phosphorylation. /2721033 REVENDICATIONS 1) Placentine, protéine de formule correspondant à la figure 1, et ses analogues présentant une activité de type placentine, obtenus par délétion et/ou substitution. 2) Placentine selon la revendication 1, correspondant à la structure protéique de la figure 1. 3) Protéine de type placentine, caractérisée en ce qu'elle présente au moins les 20 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale de la figure 1. 4) Analogue de la placentine, caractérisé en ce qu'il présente au moins 60 % d'homologie avec la structure de la figure 1. ) Placentine ou analogues de placentine, caractérisés en ce que la protéine est glycosylée. 6) Une molécule d'ADN choisie parmi: (a) la séquence d'ADN de la figure 1, (b) les séquences d'ADN susceptibles de s'hybrider à la séquence précédente et qui codent pour un polypeptide de type placentine, et (c) les séquences d'ADN qui compte tenu du code génétique correspondent aux séquences (a) et (b) et qui codent pour un polypeptide de type placentine. 7) Une molécule d'ADN correspondant à la séquence de la figure 1. 8) Vecteur d'expression de la placentine ou de protéines de type placentine, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN sous le contrôle d'éléments pousant assurer son expression dans une cellule hôte. 9) Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle comporte un vecteur autoréplicatif exprimant la placentine ou un analogue de placentine selon l'une des revendications 1 à 5, ou une séquence d'ADN selon l'une des revendications 6 et 7 incorporée dans son chromosome et exprimant la placentine ou un analogue de placentine. ) Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote. 1 1) Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie. 12) Procédé de préparation de placentine ou d'une protéine de type placentine, caractérisé par la mise en culture de cellules dont on extraira directement ou à partir du milieu de culture la placentine ou ses analogues. 13) Placentine ou analogue de placentine obtenus par le procédé selon la revendication 12. 14) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une placentine ou un analogue de placentine. ) Anticorps monoclonaux dirigés contre la placentine ou un analogue de placentine selon l'une des revendications 1 à 5. 16) Méthode de diagnostic mettant en oeuvre la placentine ou un analogue de la placentine selon l'une des revendications 1 à 5 ou un anticorps monoclonal selon la revendication 15.