Brevet FR2720409A1 — publié le 19951201

4q 2720409 METHODE POUR DETECTER DES COMPOSES ANTIMICROBIENS Arrière plan de l'invention Les composés antimicrobiens, tels que les antibiotiques et les médicaments, ont été utilisés dans l'exploitation du bétail à lait pendant plusieurs décennies. Malheureusement, les composés antimicrobiens utilisés dans les traitements peuvent se retrouver dans le lait produit. Une fois présent dans le lait, ils sont difficiles à éliminer et leur présence pose un problème de santé publique. On estime que 5 à 10 % des Américains adultes ont une hypersensibilité aux antibiotiques. Après ingestion, une quantité de pénicilline G aussi faible que 0,003 UI peut être à l'origine d'une réponse allergique. Les résidus d'antibiotiques peuvent aussi créer un milieu favorable à l'émergence de souches bactériennes résistantes. La présence d'antibiotiques dans le lait a aussi créé des problèmes dans l'industrie laitière, avec notamment un caillage du lait inadéquat, un mauvais affinage des fromages et une production d'acide ou d'arôme en diminution. Il a été signalé que 0,2 U/ml de pénicilline inhibait à 50 % les cultures de démarrage de yaourts et de fromages. La FDA considère que le lait contaminé par des antibiotiques est un lait coupé. Par conséquent, le test de recherche de composés antimicrobiens, tels que les antibiotiques, dans le lait est important pour l'industrie laitière. Les sensibilités de plusieurs méthodes actuellement utilisées pour la détection de la pénicilline G dans le lait sont de 0,02 UI/ml pour la méthode de culture en tube avec Sarcinia lutea; 0,01 UI/ml pour le test Penzyme; 0,005 UI/ml pour le test en boîte de Pétri sur Bacillus stearothermophilus; 0,005 UI/mI pour le test de Charm; et 0,005 UI/ml pour le Delvotest. Pour détecter des traces ( d'une méthode plus sensible et de préférence automatique. On a utilisé les variations des propriétés électriques des milieux de culture pour réaliser une estimation rapide du nombre total de mésophiles et psychrotrophes, des coliformes, des salmonelles, du lait anormal et des bactériophages dans la fabrication du fromage Cheddar. Les variations des propriétés électriques ont aussi été utilisées comme indice de croissance des bactéries à acide lactique dans le lait. Okigbo et Richardson ont décrit une méthode d'impédance utilisant un instrument d'impédance, le "Bactometer 123" pour détecter la streptomycine ou la pénicilline G dans du lait stérile ensemencé par 5 % de culture lactique active ou 5 % de culture lactique inactive. Okigbo, O. N. et G. H. Richardson (1985), "Detection of penicillin and streptomycin in milk by impedance microbiology", J. Food Protection, 48: 979. Bien que le test soit plus sensible (0,001 UI/ml) que les tests précédemment rapportés, aucun résultat quantitatif n'a été obtenu. Résumé de l'invention Un aspect de cette invention se rapporte à une méthode de détermination de la présence possible d'un composé antimicrobien dans un échantillon. Par "composé antimicrobien" on entend tout composé (un antibiotique ou un autre composé) capable d'inhiber la croissance d'une bactérie ou d'un champignon. La méthode comprend les étapes de: (i) l'addition de l'échantillon à un milieu de culture; (ii) la croissance d'un micro-organisme, par exemple une bactérie ou un champignon (spores ou cellules), dans le milieu de culture, la croissance du micro-organisme étant susceptible d'être inhibée par le composé; (iii) la mesure d'un paramètre électrique du milieu de culture, par exemple la conductance, l'impédance ou la capacitance, en fonction du temps; (iv) la détermination d'un premier temps au bout duquel se produit une variation, avec augmentation, du paramètre électrique (temps dit temps de détection ou "TD"), la variation résultant de la croissance du micro- organisme; et (v) la comparaison du premier temps à un ensemble de temps pour détermnniner l'éventuelle présence du composé. Chacun des points de l'ensemble des temps est déterminé comme a été déterminé le premier temps mais pour chacun de ces points, le composé est présent dans le milieu de culture à une concentration donnée, et, en outre, il existe pour les points de cet ensemble une relation entre le temps et la concentration correspondante. Dans une mise en oeuvre préférée de la méthode ci-dessus, le premier temps est en outre comparé à un deuxième temps déterminé de la même façon que le premier à la seule exception que l'on a ajouté au milieu de culture un réactif capable d'abolir l'activité antimicrobienne du composé, confirmant ainsi la présence du composé. Par exemple, si le composé à détecter est un antibiotique de la famille des lactames (par exemple, pénicilline G) on peut utiliser de la 3-lactamase pour inactiver l'antibiotique de la famille des lactames présent dans le milieu de culture avant de déterminer le second point. Un autre aspect de cette invention se rapporte à une méthode pour tester la résistance d'un micro-organisme (par exemple une bactérie) vis-à-vis d'un agent antimicrobien, la méthode comprenant les étapes de: (i) la croissance du micro-organisme à tester dans un milieu de culture contenant le composé à une concentration donnée; (ii) la mesure d'un paramètre électrique du milieu de culture, par exemple la conductance, l'impédance ou la capacitance, en fonction du temps; (iii) la détermination d'un premier temps au bout duquel se produit une variation du paramètre électrique lequel augmente (dit temps de détection ou "TD"); et (iv) la comparaison du premier temps à un second temps déterminé comme le premier à la seule exception que le composé est absent du milieu de culture. Le micro-organisme est considéré comme résistant au composé à la concentration utilisée si le premier temps est égal au second temps et est considéré comme non résistant au composé si le premier temps est supérieur au second temps. La méthode de détection d'un composé antimicrobien peut être utilisée pour détecter des antibiotiques de la famille des lactames à une concentration aussi faible que 0,00016 UI/ml; elle est donc environ 30 fois plus sensible que plusieurs méthodes utilisées aujourd'hui. En outre, la mesure du paramètre électrique est totalement automatique, et plusieurs échantillons (par exemple 120 ou 240) peuvent être analysés simultanément. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront manifestes au vu des dessins et de la description des mises en oeuvre préférées qui suivent et aussi au vu des revendications jointes. Brève description des dessins La figure 1 est un graphe présentant les courbes de conductance obtenues en utilisant quatre milieux différents contenant des spores de Bacillus stearothermophilus. La figure 2 est un graphe représentant les courbes de conductance obtenues en utilisant une gélose à indicateur PM contenant trois concentrations d'inoculum de spores de Bacillus stearothermophilus. La figure 3 est un graphe représentant les courbes de conductance d'échantillons de lait sec sans matière grasse reconstitué contenant diverses concentrations de pénicilline G. La figure 4 est un graphe montrant la relation linéaire existant entre le temps de détection ("TD") et la concentration en pénicilline G dans des échantillons de lait déshydraté sans matière grasse. Description des mises en oeuvre préférées La méthode de cette invention pour la détection de composés antimicrobiens est fondée sur l'inhibition par un composé antimicrobien de la croissance d'un micro-organisme. La variation d'un paramètre électrique dans un milieu de culture contenant à la fois l'échantillon et le micro-organisme est enregistrée en continu par un analyseur microbiologique et le temps de détection (c'est à dire le point d'inflexion de la courbe obtenue en portant le paramètre électrique en fonction du temps) est retardé quand il existe dans l'échantillon un composé antimicrobien. Le TD peut être déterminé l0 automatiquement en utilisant un logiciel ou manuellement à partir d'une courbe paramètre électrique-temps. En général, plus la concentration du composé antimicrobien est grande, plus le TD est grand. Dans un certain intervalle, il existe vraiment une relation linéaire entre le TD et la concentration du composé antimicrobien. La méthode ci-dessus est très sensible. Cependant, il est possible de réduire la sensibilité de cette méthode en modifiant les conditions du test (par exemple le milieu, les concentrations en micro-organismes, les températures d'incubation ou même les micro-organismes à tester) pour obtenir une sensibilité plus faible, utile en pratique dans l'industrie laitière. Cette méthode peut aussi être utilisée comme test de criblage rapide si l'on définit un TD correspondant à des échantillons négatifs; des échantillons ayant un TD supérieur à un TD prédéfini seront considérés comme ne contenant pas de composé antimicrobien. Bien sûr, il faut définir pour le TD un intervalle tampon tel qu'un TD seuil pour tenir compte de l'imprécision expérimentale. Une autre méthode de cette invention peut être utilisée pour déterminer si un micro-organisme est résistant à un composé antimicrobien donné en comparant les TD obtenus en faisant pousser le micro-organisme respectivement en présence ou en l'absence du composé antimicrobien. Dans l'exemple qui suit, on a réalisé un test conductimétrique pour détecter la pénicilline G dans le lait en utilisant un analyseur microbiologique Malthus 2000 (Malthus Instruments Limited, Crawley, Angleterre) et en prenant Bacillus stearothermophilus comme organisme à tester. Cependant, la mesure de l'impédance ou de la capacitance, au lieu de la conductance est également faisable. Par exemple, un "Bactometer" fourni par Vitek Systèmes, Hazelwood, MS, Etats-Unis, peut être utilisé pour mesurer la conductance, la capacité et l'impédance. De même, on utilise Bacillus stearothermophilus comme micro- organisme à tester dans l'exemple suivant, mais on peut aussi le remplacer par certains autres micro-organismes. Par exemple, le micro- organisme Sarcinia litea est connu pour être sensible aux antibiotiques de la famille des lactames (par exemple céphaprine, cloxicilline et pénicilline) et peut par conséquent également être utilisé pour détecter la pénicilline G ou ses analogues. Pour plus de sûreté, le test de cette invention est capable de détecter tous les types de composés antimicrobiens dans la mesure o l'on choisit correctement les micro-organismes et les conditions du test. Dans ce contexte, il faut souligner que puisque Bacillus o0 stearothermophilus est sensible aussi aux autres familles de composés antimicrobiens et notamment à la famille des tétracyclines (par exemple tétracycline, chlortétracycline et oxytétracycline), à la famille des érythromycines (par exemple érythromycine, lincomycine et clindamycine) à la famille des aminoglycosides (par exemple streptomycine), à la famille de la novobiocine (par exemple novobiocine), à la famille du chloramphénicol (par exemple, chloramphénicol) et à la famille des sulfonamides (par exemple, sulfaméthazine, sulfaméthoxazole et sulfisoxazole) [cf Charma, S. E. et Chi, R., 1988, "Microbial receptor assay for rapide detection and identification of seven families of antimicrobial drugs in milk: collaborative study", J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 304, joint comme référence], le test de cette invention peut aussi être utilisé pour détecter ces composés dans des échantillons en utilisant Bacillus stearothermnophilus en tant que micro-organisme test. On pense que, sans avoir à procéder à d'autres études, l'homme de l'art peut, en se fondant sur la présente description, utiliser la présente invention dans sa portée la plus large. La mise en oeuvre spécifique décrite dans l'exemple suivant doit, donc, être interprétée comme étant purement illustrative; elle ne limite en aucune façon le reste de la description, de quelque façon que ce soit. Matières La gélose trypticase soja et le bouillon trypticase soja provenaient de BBL (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). Le bouillon SPYE (numéro du catalogue 490-001) était un produit de Malthus Instruments (Crawley, Angleterre). La suspension de spores de Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 (numéro de catalogue 1801-60-6), le milieu témoin positif Bacto-PM (lait déshydraté sans matière grasse contenant 0,12 UI de sel de potassium de la pénicilline; numéro de catalogue 1802-33-9), le milieu témoin négatif Bacto-PM (lait déshydraté sans matière grasse exempt d'inhibiteur; numéro de catalogue 1803-63-1), la gélose à indicateur Bacto-PM (numéro de catalogue 1800-15-3), et la pénicilline G ont été fournis par Difco Laboratories (Détroit, MI). La 3lactamase (EC 3.5.2.6; numéro de catalogue P-0389) était un produit Sigma (St Louis, MO). Optimisation des conditions de mesure de la conductance La réussite d'une méthode conductimétrique dépend de la qualité de la courbe qui est fonction de la combinaison particulière échantillon et milieu. Une courbe de conductance de bonne qualité devrait être constituée d'une ligne de base stable, suivie d'une partie à pente raide dans laquelle la conductance augmente, et la valeur maximale devrait être élevée. Se reporter au document Firstenberg-Eden, R. et G. Eden (1984) Impedance Microbiology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY, joint pour référence. Il est essentiel de bien choisir le milieu, car quelques produits métaboliques terminaux donneront un signal de conductance plus fort. Dans cet exemple, les modifications de conductance, mesurées en microsiemens (PiS), ont été enregistrées automatiquement et représentées graphiquement par le logiciel d'un analyseur microbiologique Malthus 2000 (Malthus Instruments Limited, Crawley, Angleterre). Pour obtenir une courbe de conductance de bonne qualité (c'est à dire une courbe ayant une ligne de base stable, suivie d'une pente raide avec une valeur de conductance élevée), on a utilisé quatre milieux différents (bouillon trypticase soja, gélose trypticase soja, bouillon SPYE et gélose à indicateur Bacto-PM) pour l'ensemencement par spores de Bacillus stearothernnophilus. Les milieux ont été mis en autoclave à 12 C pendant 15 minutes, et ensemencés par les spores de façon à atteindre une concentration de 1 % (On a ajouté un ml de la suspension initiale de spores à 100 ml de milieu stérile; la concentration finale était d'environ 106 spores/ml). Des quantités de 2 ml du milieu contenant les spores ont ensuite été introduites dans des cuves de conductance d'une capacité de 5 ml puis mises à incuber à 55 C dans le bain marie de l'analyseur microbiologique Malthus 2000. La conductance de chaque cuve a été mesurée toutes les 6 minutes pendant 24 heures. Les résultats ont été obtenus numériquement sous la forme de données de conductance ou graphiquement sous la forme de courbes de croissance de la conductance. Le temps de détection ("TD") en heure pour chaque cuve a été déterminé automatiquement par le logiciel de l'instrument quand les valeurs de la conductance ont augmenté de 1 pS ou plus pendant trois lectures successives. Les résultats sont présentés dans la figure 1. Les quatre courbes de la variation de la conductance de la figure 1 (A, B, C et D) ont été obtenues en utilisant comme milieu une gélose à indicateur PM, un bouillon trypticase soja, une gélose tripticase soja, et un bouillon SPYE, respectivement. Les lettres a, b, et c sont les temps de détection des courbes A, B et C; la courbe D n'a pas de temps de détection mesurable. Comme l'illustre la figure 1, la gélose à indicateur PM remplit les critères pour obtenir une courbe de bonne qualité. En outre, l'amplitude de la io conductance créée par la gélose à indicateur PM était au moins le double de celle obtenue par les trois autres milieux. Par conséquent, la gélose à indicateur PM a été retenue comme milieu pour les autres tests. Bien que l'on recommande en général une suspension à 1 % de spores (environ 106 spores/ml) pour le test de Bacillus stearothermophilus en IS boîte de Pétri, cette concentration pouvait ne pas être appropriée à la méthodologie de la conductance. On a utilisé trois pourcentages d'inoculum dans la gélose à indicateur PM pour évaluer l'influence de l'inoculum sur les courbes de conductance et les résultats sont présentés dans la figure 2. Les courbes A, B, et C de la figure 2 représentent les variations de la conductance pour la gélose à indicateur de PM contenant trois concentrations d'inoculum de spores de Bacillus stearothermophilus: A, 1 % (106 spores/ml); B 0,1 % (105 spores/ml) et C 0,01 % (104 spores/ml). Les lettres a, b, et c sont les temps de détection des courbes A, B et C, respectivement. Comme indiqué dans la figure 2, la concentration en spores avait peu d'effet sur la qualité de la courbe à l'exception du fait que le TD était inversement proportionnel aux concentrations de spores utilisées. Les TD étaient de 3,3, 3,9 et 4,2 h pour des concentrations de spores de 1, 0,1, et 0,01 % respectivement. Mais les trois courbes de conductance ont présenté des variations de conductance du même type et ont eu des conductances maximales similaires, quelle que soit la charge initiale en spores. Comme le temps est un facteur important pour le contrôle de qualité du lait, on a choisi une concentration en spores de 1 % dans les expériences suivantes. Relation entre le temps de détection et la concentration en pénicilline G Des expériences ont été réalisées pour déterminer l'effet de la pénicilline G sur les courbes de conductance et la sensibilité de cette méthode conductimétrique. Le milieu témoin positif contenant 0,12 Ut de pénicilline G (Difco) a été dilué par dilutions successives au demi par le milieu témoin négatif (Difco) pour obtenir des échantillons contenant des concentrations décroissantes de l'antibiotique. Après addition de I ml de chaque milieu témoin positif dilué dans la cuve de conductance (six répliques), on a ajouté io 2 ml de gélose à indicateur PM à 50 C contenant une suspension de spores à 1 % dans chaque cuve, on a mélangé soigneusement et on a mis à incuber à C pour enregistrer la variation de la conductance. La sensibilité du test conductimétrique a été définie comme la concentration de la pénicilline G qui avait une valeur de TD supérieure au témoin négatif à un niveau de significativité de 0,01, en utilisant le test de t. Les résultats sont présentés dans la figure 3. Dans la figure 3, les courbes de conductance A, B, C, D, E et F correspondant respectivement à des échantillons contenant 0 UI/ml, 0, 00008 UI/ml, 0,00016 UI/ml, 0,00031 UI/ml, 0,00062 UI/ml, 0,00125 UI/ml, 0,0025 UI/ml, et 0,005 UI/ml de pénicilline G. Les lettres a, b, c, d, e, et f représentent les temps de détection respectifs des courbes A, B, C, D, E et F. Bien évidemment, plus la concentration de la pénicilline G était élevée, plus le TD était long. Le témoin négatif avait un TD de 3, 1 heures. Quand la concentration de l'antibiotique augmentait, le TD augmentait et la pente de la courbe de conductance était plus faible. Quand la concentration en pénicilline G était > 0,0025 UI/ml (figure 3; courbes G et H), l'inhibition de la croissance de Bacillus stearothermophilus était si forte que l'on a alors obtenu comme courbe une ligne de base. Dans ces conditions il n'a pas été possible d'obtenir de TD pendant la période d'incubation de 24 heures. A une concentration en pénicilline G de 0,0012 UI/ml (figure 3, courbe F) la pente de la courbe était si faible qu'il était difficile de donner un TD correct. Il est inévitable que les TD du témoin négatif et positif varient, car il est difficile de maintenir l'état physiologique et la concentration de la suspension de spores à des valeurs constantes selon les lots et les expériences. Cependant, dans de nombreuses expériences différentes, le TD du témoin négatif a toujours été situé entre 2,6 et 3,2 heures. Quand des échantillons positifs dilués par dilution successive ont été testés, il n'a pas été possible, dans le cas d'échantillons contenant plus de 0,005 UI/ml de pénicilline G, de retrouver totalement la valeur du témoin négatif après traitement par de la 0-lactamase (concentration finale de 15 UI/ml) à 37 C pendant 30 minutes. Cela peut être dû au fait que la digestion de la pénicilline G par l'enzyme a été incomplète dans les conditions utilisées. L'inhibition complète pouvait être obtenue en diluant de façon appropriée les échantillons ayant des concentrations en pénicilline G supérieures à 0,005 UI/ml. z0 La sensibilité de l'analyse de la pénicilline G par conductimétrie était de 0,00016 UI/ml; à cette concentration le TD (moyenne de six répliques) était de 3,38 heures, soit significativement plus élevé (c = 0,01) que le témoin négatif (TD 3,11 heures). Comme le montre la figure 4, il existe une droite de régression i5 linéaire (r = 0,99) qui permet de corréler le TD (en heures; six répliques) et la concentration (unités internationales par ml) de pénicilline G; A, 0,00008 UI/ml (TD 3,18 + 0,07 h); B, 0,00015 UI/ml (TD 3,38 + 0,18 h); C, 0,00031 UI/ml (TD 3,98 + 0,38 h) et D, 0,00062 UI/ml (TD 5,33 + 0,44 h). L'intervalle dans lequel il était possible d'analyser quantitativement la pénicilline G allait de 0,00016 UI/ml à 0,00062 UI/ml; une équation a été obtenue pour la droite de régression linéaire: TD = 4000 x (pénicilline G) + 2,8. La précision de la technique conductimétrique (six répliques) était élevée; les coefficients de variance étaient de 2, 2, 5,3, 9,5, et 8,3 % pour des concentrations de pénicilline G de respectivement 0,00008, 0,00016, 0,00031 et 0,00062 UI/ml. L'augmentation des valeurs des coefficients de variance quand la concentration en antibiotiques augmente pourrait être en partie due aux pentes des courbes de conductance beaucoup plus petites (figure 3; courbes D, E et F). Les petites pentes ont rendu la détermination d'un TD précis plus difficile, d'o de plus grandes erreurs et donc de plus grands coefficients de variance. Cependant, pour toutes les concentrations dans la zone quantitative (de 0,00016 à 0,00062 UI/ml), les coefficients de variance étaient inférieurs à 10 % et étaient acceptables pour l'analyse de traces. De toutes façons, du fait de la sensibilité élevée et de l'intervalle relativement petit utile pour l'analyse quantitative par la technique conductimétrique (figure 4), les échantillons de lait ayant des taux en pénicilline G supérieurs à 0, 00062 UI/ml doivent être dilués comme il convient pour obtenir des résultats quantitatifs. Détection de la présence de pénicilline G dans 12 échantillons de lait Après avoir établi les conditions de mesure de la conductance, on a appliqué la technique à l'analyse de 12 produits laitiers commerciaux comprenant six poudres de lait déshydraté et six formules pour nourrissons. On a ajouté 10 g de chaque produit à 90 ml d'eau déminéralisée et la solution a été diluée par dilutions successives au demi par un milieu témoin négatif (Difco). Chaque échantillon dilué a été subdivisé en deux portions: une portion (1 ml) a été chauffée a 82 C pendant 3 minutes, refroidie immédiatement dans un bain de glace et traitée par 0,1 ml de P3-lactamase (165 U/ml) à 37 C pendant 30 minutes. Après addition de 1 ml de chaque échantillon (témoins positifs et négatifs et échantillons traités et non traité par l'enzyme) dans la cuve de conductance, on a ajouté 2 ml de gélose à indicateur PM contenant 1 % de spores de Bacillus stearothermophilus et on a mélangé soigneusement. On a mis les cuves à incuber à 55 C pour mesurer la variation de la conductance. On a aussi dosé la pénicilline G dans les produits laitiers par la méthode au Bacillus stearothermophilus en boîtes de Pétri. Se reporter au document Bishop, J. R., G. F. Senyk, et S. E. Duncan (1992), "Detection of antibiotic/drug residues in milk and dairy products" dans Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 16ème édition R. T. Marshall, ed. Am. Publ. Health Assoc., Washington, DC., joint pour référence. Comme présenté dans le tableau 1, six échantillons (trois laits déshydratés et trois formules pour nourrissons, c'est à dire les poudres de lait A, B, et C et les formules pour nourrissons A, D et E) étaient contaminés par des antibiotiques de la famille des 3-lactames, à des taux allant de 0,01 à à,08 UI/g (activité pondérale équivalente à celle de la pénicilline G); cette contamination a été confirmée par le traitement à la 3-lactamase. Trois autres échantillons (poudres de lait E et F et formule pour nourrissons F) étaient contaminés par des inhibiteurs autres que des antibiotiques de la famille des 13- lactames car les TD n'ont pas pu être restaurés ou raccourcis après traitement par la 0-lactamase. Cependant, à cause de la sensibilité relativement faible de la méthode aux Bacillus stearothermophilus en boîte de Pétri (limite de détection 0,005 UI/ml); c'est à dire 0,05 UI/g de poudre de lait), seulement un échantillon (formule pour nourrissons E) a pu produire des zones d'inhibition par la méthode de dosage en boîte de Pétri. Il est manifeste que la présente 1l méthode de conductimétrie peut détecter de faibles concentrations de pénicilline G dans les produits laitiers et que ces produits auraient été trouvés négatifs par les méthodes utilisées actuellement. TABLEAU 1 Détection de la pénicilline G dans des poudres de lait et des formules pour nourrisson Produit Temps de détection' Antibiotiques de la famille des 3-lactames2 (h) (UI/g) Poudres de lait A > 24 0,057 B > 24 0,045 C > 24 0,064 D 2,6 ND3 E > 24 NI4 F >24 NI Formules pour nourrissons A > 24 0,010 B 2,6 ND C 2,6 ND D > 24 0,023 E5 > 24 0,080 F > 24 NI L'échantillon a été reconstitué à raison de 1:10 (masse/volume) dans de l'eau déminéralisée. 2 Activité pondérale équivalente à la pénicilline G. 3 Inhibiteurs non détectés. 4 Contient des inhibiteurs autres que les 13-lactames et non identifiés. L'échantillon formule pour nourrissons E excepté, les autres échantillons étaient négatifs pour la méthode au Bacillus stearothermophilus en boîte de Pétri. Autres mises en oeuvre A partir de la description ci-dessus, l'homme de l'art peut facilement définir les caractéristiques essentielles de la présente invention et sans s'écarter de la portée et de l'esprit de cette invention, peut apporter divers changements et variantes à l'invention pour l'adapter à divers usages et conditions. Donc, d'autres mises en oeuvre sont aussi comprises dans les revendications. 1'3 2720409 REVENDICATIONS 1. Méthode pour déterminer l'éventuelle présence d'un composé antimicrobien dans un échantillon, laquelle méthode comprend les étapes de: l'addition de l'échantillon à un milieu de culture; la culture d'un micro-organisme dans le milieu de culture, la croissance dudit micro-organisme étant susceptible d'être inhibée par le composé; la mesure d'un paramètre électrique dudit milieu de culture en fonction du temps; la détermination d'un premier temps auquel se produit une variation, avec augmentation dudit paramètre électrique, ladite variation résultant de la croissance dudit micro-organisme; et la comparaison entre ledit premier temps et un ensemble de temps pour déterminer l'éventuelle présence du composé, chacun des points de l'ensemble de temps étant déterminé de la même façon que ledit premier temps à l'exception du fait que le composé est présent dans ledit milieu de culture à une concentration connue, et, en outre, il existe une relation entre lesdits temps de l'ensemble de points et la concentration correspondante. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit micro- organisme est une bactérie. 3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle ladite bactérie est Bacillus stearothermophilus. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit composé appartient à la famille des 13-lactames, à la famille des tétracyclines, à la famille de l'érythromycine, à la famille des aminoglycosides, à la famille de la novobiocine, à la famille du chloramphénicol, ou à la famille des sulfonamides. 5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle ledit composé appartient à la famille des P3-lactames. 6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle ledit composé est la pénicilline G. 7. Méthode selon la revendication 5, comprenant en outre l'étape de comparaison dudit premier temps avec un second temps qui est déterminé de la même façon que ledit premier temps à l'exception du fait que l'on ajoute la 3- lactamase audit milieu de culture, confirmant ainsi la présence d'un antibiotique de la famille des lactames. 14 2720409 8. Méthode selon la revendication 5, ladite méthode ayant une sensibilité de 0,00016 UI/ml. 9. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 10. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 11. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 12. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 13. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 14. Méthode selon la revendication 1, comprenant en outre l'étape de comparaison dudit premier temps avec un second temps qui est déterminé de la même façon que ledit premier temps à l'exception du fait que l'on ajoute audit milieu de culture un réactif capable d'abolir l'activité antimicrobienne du composé, confirmant ainsi la présence du composé. 15. Méthode selon la revendication 14, dans laquelle ledit micro- organisme est une bactérie. 16. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 17. Méthode pour tester la résistance d'un micro-organisme à un composé antimicrobien, ladite méthode comprenant les étapes de: la croissance d'un micro-organisme à tester dans un milieu de culture contenant le composé; la mesure d'un paramètre électrique dudit milieu de culture en fonction du temps; la détermination d'un premier temps auquel se produit une variation avec augmentation dudit paramètre électrique, ladite variation résultant de la croissance dudit micro-organisme; et la comparaison dudit premier temps avec une second temps qui est déterminé de la même façon que ledit premier temps à l'exception du fait que le composé est absent dudit milieu de culture, ledit micro-organisme testé étant considéré comme résistant au composé si ledit premier temps est égal audit second temps et étant considéré comme n'étant pas résistant au composé si ledit premier temps est supérieur audit second temps. 1' 2720409 18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle ledit micro- organisme testé est une bactérie. 19. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance. 20. Méthode selon la revendication 18, dans laquelle ledit paramètre électrique est la conductance.