Brevet FR2721029A1 — publié le 19951215

La présente invention a pour objet des composés possédant la propriété de modifier la transmis- sion sérotoninergique ainsi que les applications diagnos- tiques et thérapeutiques de ces composés. Le système sérotoninergique cérébral est un système de neurotransmission cérébral et périphérique, qui met en oeuvre la sérotonine ou 5hydroxytryptamine (5-HT) découverte dans les années 1949-50. Au niveau central, ce système est particu- lier, dans la mesure o il est extrêmement centralisé (tous les corps cellulaires sont localisés dans la région postérieure du cerveau, le raphé) et o il se projette dans pratiquement toutes les régions du cerveau. Il est caractérisé par un nombre extrêmement élevé de varicosi- tés (ou équivalent de terminaisons neuronales) le long des axones; cette disposition multiplie ses points d'interactions avec les autres systèmes neuronaux cérébraux. De plus, une très grande partie de ces varicosités ne présente pas de profil synaptique, c'est- à-dire que la 5-HT libérée par ces "terminaisons" va diffuser et atteindre les cibles (récepteurs) situées à une certaine distance; ce mécanisme nécessite la mise en oeuvre de récepteurs particuliers possédant une affinité élevée pour l'amine. Cette disposition structu- rale est tout à fait favorable à une fonction de contrôle de l'ensemble des cellules neuronales du cerveau, et par là à un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie du système nerveux central. Pour exercer ce contrôle, le système 5-HT met en oeuvre une grande variété de récepteurs spécifiques. Il s'agit en effet de plusieurs familles dont certaines sont bien caractérisées (5-HT, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) et d'autres mises en évidence plus récemment sont encore peu connues (5-HT., 5-HT., 5-HT-). Certaines d'entre elles sont représentées par de nombreux sous-types; c'est le cas en particulier de la famille 5-HT1, caractérisée par une affinité nanomolaire de la 5-HT pour ces sites, et qui comporte les sous-types 5-HTA.8BDe.F Les récepteurs de type 5-HT18 et 5-HT1D sont localisés sur les terminaisons sérotoninergiques et non- sérotoninergiques, o ils modulent la libération du neurotransmetteur contenu dans ces terminaisons, en particulier ils peuvent réguler la libération de la 5-HT elle-même (autorécepteurs) et jouer alors un rôie déterminant dans l'activité de la neurotransmission sérotoninergique. D'un point de vue fondamental, le système sérotoninergique est impliqué dans de très nombreuses fonctions physiologiques et dans de nombreuses patholo- gies, et notamment dans le syndrome dépressif. La dépression est un désordre psychiatrique encore mal connu malgré les très nombreuses études qui lui ont été consacrées. Cependant, il est maintenant assez clair qu'une très grande partie sinon la totalité des dépressions implique le système sérotoninergique et notamment, il est généralement accepté qu'il existe une relation entre un déficit sérotoninergique et le suicide. En outre, les médicaments antidépresseurs interagissent pour un grand nombre d'entre eux avec le système sérotoninergique et les plus récents, qui sont les plus efficaces et qui possèdent le moins d'effets indésirables, sont le plus souvent de type "sérotoniner- gique". Ces substances aboutissent toutes, par des mécanismes divers, à faciliter la transmission sérotoni- nergique (inhibiteurs de monoamine oxydases, inhibiteurs de recapture, agonistes 5-HTA). Mais d'une part, leur efficacité est limitée, et d'autre part, ils possèdent encore pour nombre d'entre eux des effets secondaires importants, et enfin, leur délai d'action est important (> 2 semaines). Les résultats récents de la littérature et des inventeurs indiquent que les récepteurs 5-HTlB/lD pourraient jouer un rôle important dans le syndrome dépressif et dans le mécanisme d'action des antidépres- seurs. Il a en effet été montré que non seulement ils modulent la libération d'acétylcholine, mais ils modulent aussi celle de la 5-HT elle-même, et par là même régulent de façon efficace la transmission sérotoninergique dont on sait l'importance dans le syndrome dépressif. De plus, ils sont la cible des antidépresseurs qui interagissent de façon vraisemblablement non compétitive; autrement dit, les antidépresseurs reconnaitraient un site distinct des récepteurs 5- HTlBiD, mais étroitement interactif avec ces derniers. Les travaux des inventeurs ont permis la mise en évidence d'un composé endogène cérébral reconnaissant un site porté par les récepteurs 5-HT. lB/,lD qui modulent la libération de la 5-HT elle-même. Le composé endogène cérébral mis en évidence est un tétrapeptide de séquence: Leu - Ser - Ala - Leu (séquence LSAL). Les inventeurs ont également testé l'activité de peptides comprenant la séquence LSAL modifiée et montré qu'une modification (par exemple une acétylation) de l'extrémité NH2 terminale aboutissait à un composé n'ayant plus l'activité de ligand sur le récepteur 5-HT, alors que des modifications de l'extrémité COOH permet- taient d'obtenir un peptide qui présentait encore une activité importante. Par exemple, l'adjonction de la séquence Gly- Gly-Gly-Tyr à l'extrémité COOH permet d'obtenir un composé ayant une activité encore importante. Cependant, l'adjonction de la même séquence, mais dont le résidu Tyr était iodé aboutissait à un composé n'ayant plus d'acti- vité de ligand du récepteur 5-HT, probablement en raison de l'encombrement stérique dû à la taille importante des atomes d'iode qui empêcherait la liaison du peptide ainsi modifié sur son récepteur. L'invention a donc pour objet un composé de séquence peptidique suivante: Leu - Ser - Ala - Leu - X dans laquelle X représente OH, NH2, un reste hydrocar- byloxy substitué ou non substitué, ou une séquence peptidique ayant de 1 à 10 aminoacides, ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidi- que est remplacée par une liaison résistante à la dégradation enzymatique des protéases ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique. Ainsi, le groupe de liaison peptidique (-CO- NH-) est avantageusement remplacé par un groupe de liaison -CO-NR'-, CR1R2-CR3R4-, -CO-CR1R2-, R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe alkyle en C1-C6, notamment un groupe méthyle, et R' représentant un groupe alkyle en C1-C6. Parmi les groupes pouvant être intercalés dans le squelette peptidique, on peut citer les groupes suivants -CRR,-, -NR - et -O-, R1 et R2 étant définis comme précédemment. La nature des aminoacides de X est indiffé- rente, la limite étant que lorsqu'il s'agit d'aminoacides modifiés (non codés génétiquement), ceux-ci ne soient pas substitués par un groupe encombrant (ayant une taille D supérieure à celle du rayon de l'atome d'iode. Par reste hydrocarbyloxy, on entend notamment un groupe alkyloxy, alcènyloxy ou alcynyloxy, à chaîne linéaire ou ramifiée, ayant de 1 à 10 atomes de carbone non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi OH, NH2, NO2, Cl, Br, F, CF3, par exemple le groupe OCH3, OC2Hs, OCHOH-OCH3, OCHOH-CH20H, OCH2CH2NH2, OC3H7, etc... Les composés selon l'invention comprennent notamment les peptides de séquence suivante: Leu - Ser - Ala - Leu Leu - Ser - Ala - Leu - OCH3 Leu - Ser - Ala - Leu - NH2 Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly -Gly - Tyr ainsi que les composés analogues dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison telle que définie ci- dessus, ou dont le squelette comprend un groupe intercalé tel que défini ci-dessus. Les composés les plus actifs sont ceux dont les aminoacides constitutifs sont sous la forme L, c'est- à-dire la forme naturelle pour les structures peptidiques définies ci-dessus. Les composés selon l'invention sont préparés par extraction à partir de cerveau lyophilisé comme décrit ci-après ou plus avantageusement par synthèse peptidique classique, par exemple par la méthode en phase solide de MERRIFIELD lorsqu'ils sont de nature exclusive- ment peptidique, ou encore par modification des groupes terminaux des aminoacides et condensation des résidus ainsi obtenus, les fonctions réactives autres que celles engagées dans la liaison entre les résidus successifs ayant été préalablement protégées à l'aide des groupes protecteurs bien connus de l'homme du métier. Selon un exemple de préparation d'un peptide selon l'invention, on fixe sur une résine, par l'intermé- diaire de son groupe carboxylique, le résidu Ser dont la fonction amine est protégée par un groupe terbutyloxycar- bonyle, puis, après avoir déprotégé la fonction amino en lavant la résine avec de l'acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane, on couple dans le diméthylformamide le second résidu d'acide aminé dont la fonction amino est protégée comme précédemment, on fixe ainsi les uns après les autres les résidus aminoacides qui vont constituer la portion du peptide selon l'invention. Après déprotec- tion, la fonction amino du résidu N-terminal peut être acétylée par action d'un excès d'anhydride acétique en présence de diisopropyléthylamine. La chaine latérale de la sérine peut être protégée par exemple par un groupe benzyle. Après avoir éliminé le groupe protecteur,le peptide selon l'invention est libéré du support solide, par exemple avec de l'acide fluorhydrique. Le produit brut est lyophilisé et soumis à une chromatographie en phase liquide à moyenne pression, permettant d'obtenir un produit pratiquement pur; celui-ci est alors caracté- risé par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par l'analyse de sa composition en aminoacides et par spectrométrie de masse. Les peptides caractérisés possèdent la propriété de modifier la transmission sérotoninergique par ses interactions avec les autorécepteurs (et aussi les hétérorécepteurs) et pourraient jouer un rôle clef dans diverses pathologies psychiatriques o le système -HT est notoirement mis en jeu (stress, anxiété, dépression, obsessions compulsives, troubles de l'appé- tit, du sommeil, troubles du comportement, agressivité, etc...). L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant un composé tel que défini ci-dessus, capable de traverser la barrière hématoencéphalique. Pour traverser la barrière hématoencéphali- que, le peptide est de préférence administré sous la forme d'une pro-drogue, notamment de type glycosyl- phospho-triester, dans laquelle le peptide est lié par exemple par la sérine au groupe phosphate, comme décrit dans J. MED. CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39. Une telle pro-drogue, ainsi que de manière générale une molécule précurseur susceptible de libérer in vivo un composé selon l'invention, constitue un autre objet de l'invention. La composition thérapeutique est utilisée avantageusement dans des pathologies dans lesquelles est impliqué le système sérotoninergique, notamment dans les pathologies liées à une déficience de la transmission sérotoninergique. Ainsi, la composition selon l'invention peut être utilisée en particulier dans le traitement de la dépression, mais également dans toutes les indications actuellement couvertes par les antidépresseurs, comme les troubles obsessionnels compulsifs, l'anxiété généralisée, la crise de panique, les troubles de l'appétit, du sommeil, l'impulsivité, les troubles sexuels, l'agressi- vité, et plus généralement celles des composés facilitant la transmission sérotoninergique. La composition selon l'invention peut également être utilisée au niveau périphérique dans des pathologies telles que les troubles de la circulation, la migraine et les troubles de la réponse immunitaire. La composition selon l'invention se présente avantageusement sous forme injectable ou orale, ou sous toute autre forme pharmaceutique connue. La dose thérapeutique efficace est aisément déterminée par l'homme du métier en fonction de la nature et de la gravité de la pathologie à traiter, ainsi que du poids et de l'âge du patient. Les composés selon l'invention ne sont pas toxiques. Ils sont ajoutés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou à un excipient bien connu de l'homme du métier. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence Leu - Ser - Ala - Leu Le dosage est effectué notamment par une méthode immunologique comprenant la mise en présence d'un prélèvement biologique avec un anticorps spécifiquement dirigé contre un peptide selon l'invention et la mise en évidence du complexe antigène-anticorps ainsi formé. Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou sur une méthode immunoenzymatique, par exemple de type ELISA. Le fluide biologique peut être le sang, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien. Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et constituent, ainsi que leurs fragments Fab, Fab', F(ab'),2 et Fc, un autre objet de l'invention. Les anticorps sont obtenus par couplage d'un peptide selon l'invention sur un peptide oui une protéine porteurs immunogènes. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic pour le dosage d'un peptide selon l'invention dans un fluide corporel d'un patient chez lequel on suspecte une pathologie liée à une déficience de la transmission sérotoninergique, notamment une dépression masquée, comprenant au moins un anticorps tel que défini ci-dessus et éventuellement les réactifs pour la mise en oeuvre du dosage. Les peptides de l'invention se sont révélés inactifs sur le site de recapture de la 5-HT. L'existence d'un facteur endogène cérébral non actif sur le site de recapture constitue un standard de référence en terme d'activité et permet ainsi d'envi- sager un procédé de sélection de substances antidépres- sives, consistant à discriminer entre l'effet de recap- ture et l'effet d'interaction sur le site 5-HT1B/5,. Ce procédé s'applique aux antidépresseurs connus et permet également la mise au point de médica- ments nouveaux. En pratique, la discrimination entre l'effet de recapture et l'effet sur le site 5-HT8/.lD peut être effectuée en réalisant des essais d'inhibition de liaison entre d'une part l'activité de quantités croissantes d'antidépresseurs et la capture de la 5-HT dans les synaptosomes, la 5-HT étant radiomarquée et d'autre part en réalisant des essais de même type sur le récepteur 5- HTB/lD en faisant varier la quantité d'antidépresseurs en présence d'un ligand radiomarqué spécifique du site du peptide sur les récepteurs, et en déterminant les Ki respectifs ou de façon plus générale les CI50. Le choix d'antidépresseurs ayant une activité sélective sur le site 5-HTB 1D sera dicté par les substan- ces présentant un Ki élevé ou une CIs. faible dans l'essai de recapture et inversement un Ki faible ou une CId0 élevée dans l'essai de liaison sur le site de reconnaissance du peptide du récepteur 5-HT1B/1D. On peut également et plus aisément utiliser le peptide radiomar- qué (tritium) pour identifier et caractériser le site spécifique de reconnaissance du peptide, et ainsi directement étudier les capacités de diverses substances à déplacer (compétition) ce peptide en mesurant leur Ki et en comparant ce dernier aux valeurs de Ki obtenues pour ces mêmes substances pour inhiber la capture de la 5-HT (ou déplacer un inhibiteur de recapture (3H paroxe- tine par exemple). Un autre objet de l'invention consiste également en un procédé de mise en évidence de ligands du site du récepteur 5-HTlB/lD pour le peptide LSAL, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT B/l Den présence d'un composé selon l'invention dans des conditions permettant l'inter- action entre le récepteur 5-HT18/lD et ladite (lesdites) molécule(s), dans le cas o celle-ci posséderait une affinité pour le récepteur 5- HTlB/1lD; - détecter la quantité dudit composé selon l'invention liée au récepteur; - en déduire la fixation éventuelle de ladite (desdites) molécule(s). Ce procédé peut être utilisé pour la mise en évidence d'agonistes ou d'antagonistes du peptide LSAL. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence de modulateurs du site du récepteur 5-HT.: 1D pour le peptide LSAL caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées, avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HTlB/ID en présence d'un il compose selon l'invention, clans des conditions permettant l'interaction entre le récepteur 5-HTlB/lD et ledit composé selon l'invention; - détecter les molécules capables de moduler l'activité du composé selon l'invention sur ledit récep- teur. Des ligands ou des modulateurs obtenus selon un procédé tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés comme principe actif d'un composition thérapeutique utile dans le traitement de troubles psychiatriques tels que la dépression, circulatoires tels que la migraine, ou immunologiques liés aux récepteurs 5-HTlB,/lD. Les composés selon l'invention sont également utiles comme outils de diagnostic pour marquer les récepteurs 5-HTa1/lD, et plus particulièrement le site de liaison du peptide endogène sur ces récepteurs. A cette fin, on utilise avantageusement une composition de diagnostic comprenant un composé selon l'invention radiomarqué dans une technique d'imagerie mettant en oeuvre un scanner de tomographie par émission de positons. On décrira ci-après l'isolement et la caractérisation du peptide Leu-Ser-Ala-Leu selon l'inven- tion, ainsi que les propriétés de liaison et les activi- tés pharmacologiques sur les récepteurs 5-HTl/,lD du peptide LeuSer-Ala-Leu en se reportant aux figures annexées sur lesquelles: - La Figure 1 représente les interactions de liaison avec le [L25I]cyanopindolol. La liaison du [125I]cyanopindolol a été mesurée comme décrit dans HOYER D. et al., Eur. J. Pharmacol. 118, 1-12 (1985). - La Figure 1A représente les résultats obtenus avec des membranes corticales de cerveau de rat (50 pg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37 C dans un volume total de 100 pl en présence de [125I]cyano- pindolol 0,3 nM. L'incubation a été effectuée dans un tampon tris-HC1 5 mM, pH 7,5, contenant 154 mM NaCl, 1 pM de pargyline, 30 pM d'isoprotérénol et différentes concen- trations du peptide (10-13 à 10-8 M). Chaque point corres- pond à une moyenne plus ou moins l'écart type de cinq déterminations indépendantes. - La Figure lB représente les résultats obtenus avec des membranes de cellules NIH 3T3 tranS- fectées avec le gène du récepteur 5-HT1B (50 pg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37C en présence de ['25I]cyanopindolol 0,3 nM. La liaison a été mesurée comme pour la Figure 1A. - La Figure 1C représente les résultats obtenus des membranes corticales de cerveau de rat (50 pg de protéines) incubées pendant 60 minutes à 37 C dans un volume total de 100 pl en présence de concentrations croissantes de [125JI]cyanopindolol (0,06 à 0,35 nmN) avec (0) ou sans (O) le peptide à 1 nM. Chaque point corres- pond à la moyenne plus ou moins l'écart type de trois déterminations indépendantes. - La Figure 1D représente la courbe de Scatchard des courbes de saturation. - La Figure 2 représente les résultats des effets de LSAL sur l'activité adénylylcyclase stimulée par la forskoline. Des membranes de cellules NIH 3T3 exprimant le gène du récepteur 5-HT.: de souris ont été mises en suspension et homogénéisées avec un homogénisateur Dounce dans un tampon tris-HCl 50 mM pH 7,4 contenant MgCl2 à 3 mM et EGTA à 0,2 mM (tampon TME). Les activités adénylyl cyclase ont été mesurées dans des fractions aliquotes de 50 pl (30-50 pg de protéines) d'homogénats dans un volume final de 100 pl contenant 0,1 mM, [a32P]ATP (lpCi), 1 mM MgCl2, 50 pM GTP, 10 pM forskoline, 100 mM NaCl, 10 mM théophylline, 20 mM phosphocréatinine, 0,2 mg/ml créatine kinase, 1 mM [3H]AMPc (= 15 000 cpm/essai) et les substances à étudier. Les membranes ont été incubées pendant 20 minutes à 30 C. La réaction a été arrêtée par addition de 200 pl d'ATP à 5 mM, 5 mM d'AMPc et du dodécyl sulfate de sodium à 1% dissous dans 50 mM de tampon Tris-HCl. Le [32P]AMPc formé a été isolé par la méthode de chromatographie à deux colonnes décrite par Salomon et al. (Adv. Cyclic Nucleotide Res., 10, 3555 (1979)., modifié par De Vivo et Maayani (J. Pharmacol. Exp. Therap. 238, 248-253 (1986)). - La Figure 2A exprime l'effet de LSAL en fonction de sa concentration sur l'activité enzymatique stimulée par la forskoline en présence de 0,1 pM de 5-HT. - La Figure 2B exprime la courbe dose-réponse de l'effet de 5-HT sur l'activité enzymatique stimulée par la forskoline en l'absence (O ----), ou en présence (O ---- O) de LSAL (10-9 M). - La Figure 3 représente l'effet du peptide sur la libération de sérotonine dans des synaptosomes de l'hippocampe de cerveau de rat. Les résultats sont exprimés en pourcentages de la libération de [3H]5-HT (rapport P2/P:)en l'absence de peptide. Chaque point est la moyenne plus ou moins l'écart type de déterminations en triple obtenue à l'aide de 3-6 homogénats d'hippocampe distincts. La méthode mise en oeuvre est la méthode dé- crite précédemment (BOLANOS-JIMENEZ B. et al., Eur. J. Pharmacol. 242, 1-6 (1993)) avec les modifications suivantes: la [-H]acétylcholine était substituée par 60 nM [3H]5-HT et 0,01% d'acide ascorbique était ajouté au milieu d'incubation. 1. Isolement et purification du peptide Leu- Ser-Ala-Leu En utilisant comme critère de discrimination la capacité d'un facteur potentiel à interagir avec la reconnaissance de la 5-HT par le récepteur 5-HT1B/,lD de membranes de synaptosomes de cerveau de rat, comme décrit dans FR-2 657 784, un composé actif a été purifié à partir d'extraits de cerveaux de rat, de cheval et de bovin. La méthodologie de purification a fait appel à des séparations par perméation sur gel, des phases normales ou inversées ou encore des échanges ioniques. Elle est résumée sur le tableau ci-dessous: Etapes de purification du peptide endogène ETAPES DE LA CONDmONS DE LA FRACTION CHROMATOGRAPHIE CHROMATOGRAPHIE ACTIVE (Temps d'élon __ _ _ _ _ _ _ _ _ou de ré leM 4 EXCLUSION DE TAILLE Elution isocratique avec un tampon (TSK HW 40S, Merck, d'acétate d'ammonium TE = 80 min. 600 x 26 mm) (CH3COONH4) 50mM (pH 5) Vitesse d'écoulement: 2 ml.min-' Gradient d'élution lineaire de A à B pendant 12 minutes PHASE INVERSE A: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5) (C,8, Ultrabase, Shandon, B 50 mM CH3 COONH4 (pH 5)/CH3CN, 88/12 TR = 20 min. 250 x 10 mm) Gradient par étapes pendant 5 min. avec C. C 50 mM CH3 COONH4 (pH 5)/CH3CN, 50/50 Vitesse d'écoulement 4 ml.min-' EXCLUSION DE TAILLE Elution isocratique avec (Sephadex G2, 10 mM CH3 COONH, (pH 5) TE = 240 min. Pharmacia, Vitesse d'écoulement: 0,3 ml.min-' 450 x 16 mm) Gradient d'élution linéaire de A à B pendant 15 minutes PHASE INVERSE A: 50 mM CH3 COONH4 (pH 5)/CH3CN. 85/15 (C", Ultrabase. Shandon, B: 50 mM CH3 COO H4 (pH 5)/CH3CN, 75/25 TR 5.75 rin, 250 x 10 mm) Gradient par taes min. avec C. c: 60 oW eud 5 scH3cN. S5o PHASE 94VERSE G t& RMN, d'analyse d'aminoacides et de séquençage d'aminoa- cides. Le composé purifié consistait en Leu-Ser-Ala-Leu. La même fraction a été obtenue également & partir de cerveau de cheval et de bovin, ce qui signifie que ce peptide est conservé chez les mammifères. 2. Interactions du peptide purifié avec les récepteurs 5- HTlB,/lD Le peptide synthétique LSAL a été testé pour sa capacité à "mimer" les effets de la fraction purifiée obtenue à partir d'extraits de cerveau. LSAL inhibe la liaison de [3H]-5-HT aux récepteurs 5-HT1 avec une CI. proche de 10-11M et un effet inhibiteur maximum de 30 à % se produisant à une concentration de 10-9M. La liaison 5-HTlnonA, qui dans les conditions expérimentales mises en oeuvre, représente principalement les sites 5- HT1B/D, est inhibée jusqu'à une valeur maximale de 75%, comme représenté au tableau 2 ci-dessous avec une CI. identique. Cette dernière observation indique que les récepteurs 5-HT1B/D sont particulièrement sensibles au peptide. C'est pourquoi des essais ont été réalisés sur des homogénats de tissu cérébral de rat dans lesquels les récepteurs 5-HT1B étaient marqués spécifiquement avec du [125I] cyanopindolol avec une CI50 de 10-1lM et un effet maximum de 60%d'inhibition, comme représenté à la Figure lA. En outre, l'activité de ce peptide sur les récepteurs 5-HTlD a été démontrée chez le cobaye et sur le cerveau humain à l'aide de [3H]5- HT. La valeur de la CI50 était à nouveau de 10-1M. Ces résultats suggèrent fortement que in vitro, les récepteurs 5-HT 1B/D consti- tuent la cible du peptide LSAL. L'activité du peptide a également été évaluée sur la liaison aux récepteurs 5-HTlB dans des cellules i7 NIH 3T3 transfectées avec Je gène du récepteur 5-HT1B de la souris. L'effet inhibiteur du peptide était très similaire à celui observé dans les homogénéisats de tissu cérébral (Figure lB). L'effet maximum correspondait à 70% d'inhibi- tion de la liaison spécifique du [125I] cyanopindolol avec une valeur de la CIs0 de 10-1M. Ce résultat démontre clairement que LSAL interagit directement avec les récepteurs 5-HT1,. Pour étudier plus loin le type d'interaction du tétrapeptide avec les récepteurs 5-HT1 B/D, des courbes de saturation du ligand radiomarqué ontété établies en présence du peptide. Les résultats de liaison obtenus suggèrent que l'activité inhibitrice du peptide corres- pond à une interaction non compétitive (Figures 1C, 1D). Ce résultat a été observé avec la [3H]5-HT, aussi bien qu'avec le ['25I]cyanopindolol pour marquer les récepteurs 5-HTB et est en accord avec l'hypothèse précédente de l'existence d'un site spécifique pour le peptide distinct mais étroitement apparenté au site de liaison de 5-HT. La spécificité pharmacologique des fractions partiellement purifiées a été étudiée au cours d'une purification ultérieure en utilisant des homogénéisats de cerveau de rat. Les essais ont été effectués en utilisant le LSAL synthétique pour déterminer si le peptide interagissait ou non avec d'autres récepteurs 5- HT, ou ceux d'autres neuro-transmetteurs. Les récepteurs 5-HTIA n'étaient pas affectés à une concentration du peptide qui antagonisait fortement la liaison au 5-HT:. De manière analogue, la liaison de radio- ligands aux récepteurs 5-HT:,, 5-HT, 5-HT2 et 5-HT3 n'était pas affectée (Tableau 2), ce qui indique que lS parmi les récepteurs sérotoninergiques étudiés, seule la classe 5-HT, était sensible au peptide. La liaison d'autres radio-ligands spécifiques à des récepteurs de neurotransmetteurs variés a été examinée: les récepteurs a et P adrénergiques, dopaminergiques, muscariniques, histaminergiques, aux opiacées et aux benzodiazépines. La liaison à ces récepteurs n'était pas significativement réduite par LSAL à des concentrations qui avaient un effet inhibiteur maximum pour la liaison aux récepteurs 5-HT 1B/D (Tableau 2). Tableau 2 Effet inhibiteur du peptide sur différentes liaisons de radioligands dans des tissus de cerveau de rat Z; +g Z tV u C) uedazaJ2!un4[H.]S3NId3ZVlIGOZN38 0l 0l (Wu z) auoxoIleu(Hc S:3:OV1dO 0 (VAu c) alAulpliDnu!nbo au Se9/zuaq[Hj]s3n'iONluVOSni Oi 0l. Ol (Vu 5) eulue'dawLU(Ht] H S3 nOIDIU3NII/V.LSIH E + H-S Wrf 0l (Vu z) auoJadlds{H] sz S3NflOI9J83NIVdOO W_0I lH-S + Sl 01. (Nu ú) IolouaJd; eoJp/iq!p(H,] ú + S (wu z) au!sozeJd[H] 'D S3=083Nguov Ol 0 ()wu c) b69úb l19iHe] elH-s 8; + Z!Au S) 90C[H0] VZIH-S S -i. 0 iAU 9) auiJasuela>I[Hc)] ZIH-S Sl Ol t- 0 D_- S Au o0 + (nu 0C) _H-S[H)] 3lH-S E + SLZ lVd-HO-9 wNf L'0 + (Vu 0ú) 1H-g[H1] VNON tlH-S -LVd HO-9 V*u '0 + Z O L jouplOjjdOsi tmrl OC + 0 ( ju ú'O) 'lotopudoueA [)I,] LH-S_ O óAu r) lVdG-HO-B[H] 'IH-S S3noi1983NINOOH3OS NIOW31 na % N3 SCNDI-l SM lnqd3D= I: 5 8fNgl8IHNI 13aj Tz Légendes du TaLleau 2: Des membranes cérébrales de cerveau de rat (200 pg) ont été incubées pendant 30 minutes à 25 C avec différents radio-ligands spécifiques (voir Tableau) en présence ou en absence de 1 nM du peptide. Les différentes conditions de liaisons utilisées pour les récepteurs sérotoninergiques sont celles décrites précédemment (PALACIOS J.M. et al. , Methods in Neurosciences 12, 238-262 (1993)). Pour les autres liaisons, le milieu d'incubation consistait en 50 mM Tris-HCl pH 7,4 contenant 120 mM de NaCl et 50 mM de KCl ([3H]spiropéridol, [SH] benzylate de quinuclidinyle, [3H]naloxone, ou 4 mM de CaCl2 et 4 mM de MgCl2 ([3H]flu- nitrazépam), ou 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2 et 1 mM de MgSO4 ([3H]prazosin), ou 90 mM de NaCl ([3H]dihydroalprénolol). Chaque point correspond à une moyenne plus ou moins l'écart type de cinq déterminations indépendantes. Le tétrapeptide identifié n'a pas montré d'autre effet sur la recapture de 5-HT dans les prépara- tions synaptosomales. Il n'a pas non plus montré d'effet sur la recapture d'autres neurotransmetteurs (ou leurs précurseurs), par exemple la choline, le GABA, l'histami- ne, la dopamine et la noradrénaline. ce résultat indique que le peptide est différent des composés endogènes suspectés antérieurement d'interagir avec le transport des amines. * 3) Interaction de LSAL avec l'activité fonctionnelle des récepteurs 5-HT19 (système de transduc- tion) Les récepteurs 5-HT B D sont connus pour être majoritairement couplés à la protéine Gi, en inhibant l'activité de l'adénylyl cyclase. L'interaction de LSAL a été examinée sur l'activité enzymatique corrélée à la stimulation du récepteur 5-HTIB exprimée dans des cellu- les NIH 3T3. Le peptide n'avait pas d'effet sur la production basale d'AMPc. Toutefois, il augmentait significativement l'effet inhibiteur de la 5- HT sur l'activité adénylyl cyclase stimulée par la forskoline (Figure 2). Cet effet était dépendant de la concentration avec une courbe dose-réponse en forme de cloche. L'acti- vité du peptide sur les homogénats de substance noire de rat était pratiquement similaire. Ces résultats indiquent clairement que LSAL interagit avec l'activité du récep- teur 5-HT1B. 4) Effets du peptide sur l'activité fonc- tionnelle cellulaire des récepteurs 5-HT 1s/D L'activité du peptide sur la libération de [3H]5-HT à partir de synaptosomes d'hippocampe, de cerveau de rat préalablement chargées a été examinée. La libération de [3H]5-HT suscitée par K' a diminué de manière dosedépendante en présence de LSAL avec une CI50 apparente proche de 10-11M. L'effet maximum, observé à une concentration de 10-1 M, correspond à une inhibition de 20 à 25% de la libération provoquée et diminue à des concentrations plus élevées (Figure 3). Ces résultats démontrent que LSAL interagit avec la fonction cellulaire corrélée à l'activité des récepteurs 5-HT1 B/D et régule l'activité inhibitrice de la 5-HT. ) Effets in vivo de LSAL Des essais ont été réalisés in vivo chez la souris, pour examiner les effets comportementaux de LSAL. Dans la mesure o des études neuro-pharmaco- logiques antérieures avaient montré l'implication des récepteurs 5-HT dans les désordres liés au stress et à l'anxiété, les effets du peptide ont été examinés dans deux modèles animaux d'anxiété. Test du champ ouvert L'activité de LSAL a été déterminée dans le test du champ ouvert sur des souris C57/Black-6. A des doses de 50 pg ICV par animal, l'activité exploratrice a été significativement diminuée par rapport à des animaux témoins qui recevaient l'excipient dans les mêmes conditions (tableau 3). TABLEAU 3 Effets d'injections intracérébroventriculaires de LSAL chez la souris COMPORTEMENT CHAMP OUVERT Substance Nombre Nombre de Nombre de Temps Injectée d'animaux carrés redressements d'immobilisation (#ec traversés Contrôle 12 115 9 23 3 12 5 (NaCI) LSAL 12 88 - 9 15 t3* 47 8 Pg LABYRINTHE EN CROIX SURELEVE Substance Nombre Bras ouverts Bras ouverts Total Bras Injectée d'animaux ENTREES (%) TEMPS (%) ENTREES Contrôle 18 61 + 9 66 8 10 + 2 (NaCI) LSAL 2 pg 8 68 4 55 4 24 + 4 pg 8 71 +6 58 + 6 15 + 3 Opg 10 28 + 9* 22 + 7** 3 + 1* Légendes du Tableau 3 Champ ouvert: Des souris mâles C57/BL/6 (20-25 g) ont été utilisées. Le champ ouvert consistait en une boite de plastique blanc (35 x 35 x 20 cm) divisée en 25 carrés égaux. Du LSAL dissous dans 5 ml de 0,9% de solution sa- line dans un volume de 5 pl a été injecté icv aux souris, qui ont été placées à un angle de la boite. Apres deux minutes, le nombre de carrés traversés, les demi-tours effectués et le temps d'immobilisation ont été mesurés. Les résultats sont exprimés comme la moyenne plus ou moins l'écart type. Différence avec le témoin: *p Labyrinthe en croix surélevé Des souris mâles BALB/C pesant de 20 à 24 g ont été utilisées. Le labyrinthe en croix surélevé était fait de plexiglas avec bras ouverts et deux bras fermés de la même taille (12,5 x 5 cm) avec des murs de 15 cm de hauteur, ces bras partant d'une plateforme centrale de x 5 cm, placée 40 cm au-dessus du sol. Du LSAL dissous dans 5 ml de solution saline à 0,9% dans un volume de 5 pl a été injecté icv aux souris. Trois heures plus tard, l'animal a été placé sur la plateforme centrale du labyrinthe. Chaque entrée dans un bras ainsi que le temps passé dans chaque bras a été enregistré. La durée du test était de 5 minutes. Le labyrinthe a été nettoyé après chaque essai. Le LSAL a été testé dans des conditions de basse intensité lumineuse (BENJAMIN D. et al., Life Sci. 47, 195-203 (1990)). Les résultats ont été exprimés comme la moyenne plus ou moins l'écart type du pourcentage des entrées dans les bras ouverts (% d'entrées dans les bras ouverts), pourcentage du temps passé dans les bras ouverts (% temps dans le bras ouvert) et nombre total d'entrées dans les bras. Différence avec le témoin: *p La tendance au redressement était significa- tivement diminuée (60 à 65%) et les actes de toilettage étaient abolis. Des résultats similaires ont été observés chez souris BALB/C. Ces résultats indiquent que LSAL est potentiellement anxiogène à forte concentration, car il induit un comportement "d'immobilisation" distinct de l'effet sédatif. Test du 'labyrinthe en croix surélevé" Ce test expérimental est utilisé pour déterminer le degré d'anxiété et consiste en un labyrin- the surélevé à deux bras, l'un protégé par des parois et l'autre non protégé. L'animal est supposé anxieux lorsqu'il évite l'entrée et réduit le temps passé dans les bras ouverts. L'administration du tétrapeptide à des concentrations faibles (2 pg ICV) augmentait le nombre total d'entrées dans les bras de l'appareil, ce qui correspondait à une activité locomotrice augmentée, alors qu'à 10 et 15 pg, il réduisait de façon significative le temps passé par l'animal dans les bras ouverts (Ta- bleau 3). Ce résultat suggère que dans les conditions expérimentales mises en oeuvre, le peptide a des effets sur le comportement. L'augmentation de l'activité locomo- trice observée à 2 pg peut correspondre à un état de désinhibition permettant une exploration plus intense ou à un état de faible anxiété (nervosité ou agitation non productrice). A 10 et 15 pg, la diminution significative du temps passé dans les bras ouverts correspond vraisem- blablement à une effet anxiogène. Ces modifications comportementales observées après administration in vivo de LSAL montrent fortement que les modifications moléculaires et cellulaires induites par le peptide conduisent effectivement à des modifications de la fonction du système nerveux central. En fait, LSAL semble capable de modifier l'état d'anxiété après administration in vivo. LSAL apparaît comme un régulateur endogène, capable de moduler finement le contrôle exercé par la 5-HT sur la neurotransmission au niveau du système nerveux central. Il joue vraisemblable- ment un rôle-clé dans les fonctions physiologiques (sommeil, thermorégulation, apprentissage et mémoire, comportement, douleur,...), ainsi que dans des mécanis- mes physio-pathologiques (stress, anxiété, dépression, agressivité, désordres alimentaires, etc...) connus ou fortement soupçonnés pour impliquer le système sérotoni- nergique. Il devrait également jouer un rôle important dans les pathologies liées à la tension artérielle et la migraine, car des récepteurs de type 5-HT1 (5-HT,-like (probablement des 5-HT,)) ont été localisés dans les vaisseaux de cerveau humain et dans d'autres muscles lisses. Il régule sans doute également la réponse immune dans la mesure o les récepteurs 5-HT1 B/D sont sans doute présents dans des tissus immuno-compétents, et dans la mesure o la transmission de la 5- HT est connue pour interagir avec la réponse immunitaire. 7) Activité relative des peptides selon l'invention L'activité relative de différents aminoacides ou peptides à 1 nM a été déterminée sur des récepteurs -HT1B et 5-HT1B/D à l'aide de 0,3 nM de [1251I] cyanopindo- lol et 30 nM [3H] 5-HT respectivement. Les expériences de liaison ont été réalisées comme décrit précédemment. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'effet de LSAL. Chaque valeur correspond à la moyenne l'écart type de trois essais indépendants réalisés en cinq exemplaires. Tableau PUISSANCE AMINOACIDES RELATIVE | ET PEPTIDES Récepteurs Récepteurs 5-HT. -HT I/D ([ 3I]5-HT) ( ['I]cyanopin- dolol) ALA O 4 1,7 + 1,68 LEU 2 9 O À 2 SER O 5 0 + 1,7 ALA-LEU 50 5 61,5 + 5 P-ALA-LEU O 13 N.D. * D-ALA-LEU O 10 N.D. * P-ALA-DL-LEU 2 13 N.D. * LEU-ALA 1 2 1,7 1,6 LEU-SER 45,7 + 7 53,8 + 8 SER-LEU 4 4 N.D. * ALA-LEU-SER 28 À 10 33,8 10 ALA-LEU-LEU-SER 10 15 23,6 + 10,6 LEU-SER-ALA-LEU 100 À 5 100 10 AC-LEU-SER-ALA-LEU 26,7 + 10 N.D. * LEU-SER-ALA-LEU-NH2 83,3 16 N.D. * LEU-SER-ALA-LEU-GLY- GLY-GLY-TYR 80,9 + 9,5 N.D. * * N.D.: non déterminé REVENDICATIONS 1. Composés de séquence peptidique suivante: Leu - Ser - Ala - Leu - X dans laquelle X représente OH, NH2, un reste hydrocarby- loxy substitué ou non substitué, ou une séquence peptidi- que ayant de 1 à 10 aminoacides, ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résistante à la dégradation enzymatique des protéases ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique. 2. Composés selon la revendication 1, dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par un groupe choisi parmi -CO- NR', -CR1R2- CR3R4-, -CO-CR1R2-, ou dans lesquels le squelette peptidi- que présente un ou plusieurs groupes intercalés choisis parmi les groupes -CR1R2-, -NR1-, -O-, R1, Rz, R3 et R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe alkyle en C1-C6 et R' représentant un groupe alkyle en Cl-C6. 3. Composés selon la revendication 1, comprenant une séquence choisie parmi: Leu - Ser - Ala - Leu Leu - Ser - Ala - Leu - OCH3 Leu - Ser - Ala - Leu - NH2 Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly - Gly - Tyr ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résis- tante à la dégradation enzymatique des protéases, ou dans lesquels le squeiette peî:!ique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résis- tante à la dégradation enzymatique. 4. Composés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont sous la forme L. 5. Composition thérapeutique, caractériséeen ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule précurseur susceptible de libérer in vivo un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 7. Procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence Leu Ser - Ala - Leu 8. Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que le dosage est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique dudit peptide. 9. Anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé spécifiquement contre un peptide tel que défini dans la revendication 7, ainsi que les fragments dudit anticorps, notamment les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ou Fc. 10. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps ou un fragment d'anticorps tels que définis à la revendication 9. 1l. Procédé Je criblage de substances antidé- pressives occupant le ceme site conformationnel que le peptide Leu-SerAla-Leu, caractérisé en ce que l'on réalise une discriminatLon par des essais d'inhibition entre d'une part leur liaison sur le site de recapture de la 5-HT et d'autre part entre leur liaison sur le site - HTlB/lD ' 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on compare la constante d'inhibi- tion Kil des substances à tester par des essais d'inhibi- tion compétitive en présence d'un peptide selon la revendication 1 à la constante d'inhibition Ki2 de ces mêmes substances, pour inhiber la recapture de la 5-HT ou déplacer un inhibiteur de recapture. 13. Composition diagnostique comprenant un composé selon l'invention radiomarqué. 14. Procédé de visualisation des sites peptidiques des récepteurs 5HTlB/lD, caractérisé en ce que l'on utilise une composition selon la revendication 13 et que l'on visualise les récepteurs 5-HT1B/,D à l'aide d'un scanner de tomographie par émission de positons. 15. Procédé de mise en évidence de ligands du site du récepteur 5-HT1B/ID pour le peptide LSAL, caracté- risé en ce que l'on effectue les étapes consistant à: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HTB/îlD en présence d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans des conditions permettant l'interaction entre le récepteur -HT1B/lD et ladite (lesdites) molécule(s), dans le cas o celle-ci posséderait une affinité pour le récepteur 5- HTlB/D; - détecter la quantité dudit composé selon l'invention liée au récepteur; - en déduire la fixation éventuelle de ladite (desdites) molécule(s). 16. Procédé selon la revendication 15 pour la mise en évidence d'agonistes ou d'antagonistes du peptide endogène LSAL. 17. Procédé de mise en évidence de modula- teurs du site du récepteur 5-HTlB/lD pour le peptide LSAL caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à: - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées, avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HTlB/lD en présence d'un composé selon l'une des revendications 1 à 4, dans des conditions permettant l'interaction entre le récepteur -HTlB/lD et ledit composé selon l'une des revendications 1 à 4; - détecter les molécules capables de moduler l'activité du composé selon l'une des revendications 1 à 4 sur ledit récepteur. 18. Ligand ou modulateur du site du récepteur -HT13/1D pour le peptide LSAL, identifié selon le procédé de la revendication 15 ou 17. 19. Composition thérapeutique comprenant comme principe actif un ligand ou modulateur selon la revendication 18.