Brevet FR2712302A1 — publié le 19950519

! Gène et promoteur de la cycline A humaine La présente invention concerne la séquence d'ADN du promoteur et du gène de la cycline A humaine, toute séquence nucléotidique ADN ou ARN humaine correspondant à tout ou partie de cette séquence et aux applications, notamment séquences anti-sens et sens y relatives, aptes à moduler ou à bloquer la traduction ou la transcription du gène de la cycline A. Les cyclines sont des protéines-clef de la régulation du cycle cellulaire. La cycline A humaine et son gène ont été récemment découverts lors d'études portant sur l'intégration de l'ADN du virus HBV dans le génome humain. Du même coup, le séquençage de l'ADNc de cette cycline A a été effectué et publié par J. Wang et al. dans Nature, volume 343, février 1990, pages 555 à 557. La cycline A humaine agit lors des phases S et G2/M du cycle cellulaire et est donc associée à la division cellulaire dont elle constitue un élément indispensable. On sait d'autre part que la cycline A est impliquée dans la prolifération cellulaire. J. Wang et al. (ci-dessus) l'ont montré à propos de l'intégration de l'ADN du virus HBV, laquelle est présente dans les cellules hépatiques à un état précoce du développement tumoral. Dans la demande de brevet internationale WO 91/12324, il est indiqué que l'expression de la cycline A était maximum dans les leucémies aiguës myéloblastiques hyperleucocytaires à temps de doublement rapide et très faible dans le cancer primitif du foie, pour lequel le temps de doublement de la tumeur est lent. Il y est proposé de bloquer la synthèse de cycline A dans les hépatocytes à l'aide d'un ADN cycline A humaine anti-sens, comme cela a d'ailleurs été rapporté par F. Zindy et al. dans Biochem. and Biophys. Research Comm. février 1992, vol. 182, n' 3, pages 1144 à 1154. Conformément à l'invention, le gène complet de la cycline A humaine avec son promoteur a été caractérisé et séquencé et l'on a découvert qu'il était possible de contrôler, moduler ou bloquer la traduction et la transcription de ce gène, ouvrant la voie notamment à de nouveaux traitements préventifs et curatifs de la prolifération cellulaire en général. En effet, la détermination de la séquence du gène avec introns et exons et du promoteur a notamment permis d'identifier des sites sur lesquels il est possible d'intervenir pour moduler ou bloquer l'expression du gène. On a aussi localisé la totalité des sites d'initiation de transcription du gène et en particulier le site majeur. L'invention a donc pour objet les fragments d'ADN ayant une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie de celle représentée à la figure 2, y compris avec des variations mineures, c'est-à-dire à la séquence au sens large du gène de la cycline A humaine, incluant exons et introns, avec son promoteur. Par "variations mineures", il faut entendre notamment, comme cela est d'usage, toute variation de la séquence qui ne modifie pas la signification du code. Les fragments d'ADN selon l'invention peuvent correspondre à une partie de la séquence de la figure 2, y compris les variations mineures, qui comprend au moins une partie d'intron. Les fragments d'ADN selon l'invention peuvent correspondre à tout ou partie du seul promoteur de la cycline A humaine dont la séquence est représentée seule à la figure 8, y compris les variations mineures. L'invention a aussi pour objet les séquences d'ARN correspondant à tout ou partie de la séquence d'ADN représentée à la figure 2 ou d'une séquence n'en différant que par des variations mineures. L'invention a également pour objet de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles de se fixer par complémentarité sur l'ARN prémessager et messager du gène cycline A. De telles séquences sont des ARN ou des oligonucléotides "anti-sens"; elles vont bloquer la O10 traduction de l'ARN en protéine et donc inhiber l'expression de la cycline A. De plus, l'invention fournit la localisation précise des sites d'initiation de transcription du gène cycline A et permet donc d'utiliser des séquences anti-sens spécifiques de l'extrémité 5' des ARNm. L'invention permet également d'utiliser une approche "sens" pour inhiber l'expression de la cycline A: il est possible de trouver des oligonucléotides pouvant se fixer sur certaines séquences d'ADN du promoteur cycline A, formant ainsi une triple hélice et bloquant la transcription du gène cycline A. L'invention permet également de synthétiser des oligonucléotides dont la séquence est spécifiquement reconnue par certains facteurs de transcription et est présente dans la séquence du promoteur cycline A; de telles séquences sont susceptibles de moduler leur activité sur le gène par compétition. L'invention a ainsi pour objet des séquences anti-sens, oligonucléotides (ADN) ou ARN, complémentaires de tout ou partie d'une séquence d'ARN telle que définie plus haut, par exemple une séquence d'ARN correspondant à une jonction entre un intron et un exon. L'invention concerne aussi des séquences nucléotidiques sens complémentaires d'une partie de la séquence représentée à la figure 2 et apte notamment à se fixer sur la double-hélice du gène de la cycline A humaine et/ou de son promoteur pour former une triple hélice. Elle concerne encore des séquences nucléotidiques sens qui sont complémentaires d'une partie, de la séquence de la figure 8, comportant au moins un site spécifique reconnu par un facteur de transcription, et qui sont aptes à s'y fixer et bloquer ou moduler la transcription du gène notamment par compétition avec ces facteurs. D'une manière préférée, ces séquences pourront couvrir plusieurs sites. Les séquences sens et anti-sens peuvent être produites par toute technique connue, par exemple par synthèse chimique pour des séquences de petites dimensions, notamment oligonucléotides. A partir de la séquence du gène et/ou du promoteur et de la fraction choisie de celle- ci, la synthèse est un travail de routine pour le spécialiste. Il peut notamment utiliser la voie bien connue et largement documentée des phosphoramidites, en particulier en mettant à profit les appareils automatiques de synthèse qui travaillent à partir de la séquence oligonucléotidique, déterminée ici à partir de la séquence de la figure 2, et entrée au clavier. La synthèse est suivie de préférence, comme cela est bien connu, par une purification, par exemple par électrophorèse en gel d'acrylamide ou par HPLC (chromatographie liquide à haute performance) sur colonne en phase inverse ou en échange d'ions. En outre, si les fragments choisis sont relativement longs, notamment dépassent les 50 bases, on peut, comme cela est également bien connu, synthétiser des fragments plus petits par les méthodes classiques telles que celle qui vient d'être décrite, puis synthétiser les parties manquantes par voie biologique par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Le spécialiste peut aussi produire selon les techniques usuelles des séquences sens ou anti-sens par réplication de tout ou partie du brin d'ADN anti-sens ou sens du gène et/ou du promoteur de la cycline A humaine. On peut avantageusement insérer l'ADN dans des plasmides qui permettent la synthèse d'ARN, en utilisant les techniques connues. On a indiqué sur la séquence du promoteur représentée à la figure 8 (voir aussi la figure 9) un certain nombre de sites individualisés, ce qui constitue un guide, non limitatif, pour le choix de parties de cette séquence qui pourront donner lieu à un ciblage. Bien entendu, comme cela est bien connu, la spécificité des oligonucléotides dépend de leur longueur et il est donc préférable qu'ils présentent un minimum de 30 paires de bases environ, et notamment recouvrent plusieurs sites. On peut en outre modifier les oligonucléotides dans un dessein de protection contre les nucléases, par exemple par greffage de ligands (alkyphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate), modification du squelette phosphodiester, substitutions (2'-0- alkyl), utilisation d'anomères du sucre (alpha-oligomère). On peut améliorer leur pénétration dans la cellule par greffage de ligands hydrophobes ou polycationiques (cholestérol, poly- lysine, cytokines) ou par leur association avec des liposomes ou des lipoprotéines. Leur affinité vis-à-vis de leur cible peut aussi être accrue par exemple par leur liaison covalente à des agents intercalants, par modification de bases ou du squelette, ou par l'emploi de groupements réactifs, par exemple alkylants. L'invention permet donc la réalisation de séquences sens et anti-sens composées de préférence d'au moins 30 paires de bases, et pouvant atteindre ou dépasser 2000 bases. L'invention permet également une approche originale pour le ciblage de l'expression d'un gène dans des cellules en prolifération: le promoteur du gène cycline A a été cloné et il a été montré qu'un fragment du promoteur, fusionné à un gène hétérologue comme le gène codant pour la luciférase confère à ce gène une expression spécifique de la phase du cycle cellulaire: dans le cas présent une expression apparaissant spécifiquement au moment de la phase tardive de G1 et donc au début de la phase S. Dans ces conditions, l'invention peut être utilisée pour cibler dans une cellule donnée (tumorale ou non) l'expression d'une séquence seulement si la cellule prolifère (et donc passe en phase S). Cette approche est utilisable quelle que soit la séquence d'intérêt: par exemple dans le cadre du traitement de cancers, il est possible de fusionner le promoteur du gène cycline A à une séquence codant pour une cytokine, une molécule HLA, la thymidine kinase du virus Herpès simplex, ou toute séquence anti-sens ou sens. La présente invention a donc aussi pour objet une construction comprenant tout ou partie du promoteur de la cycline A humaine fusionné avec une séquence nucléotidique d'intérêt, de telle manière que cette séquence puisse être exprimée in vivo de façon spécifique en phase tardive de G1 et en phase S du cycle cellulaire. La séquence nucléotidique peut être choisie dans le groupe des séquences sens et anti-sens selon l'invention ou être une séquence hétérologue, notamment choisie parmi le groupe consistant dans les séquences codant pour une cytokine, une molécule HLA ou la thymidine kinase du virus Herpès simplex. L'invention a encore pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant, en tant que principe actif, un anti-sens, une séquence nucléotidique sens ou une construction selon l'invention. Suivant un autre aspect de l'invention, la caractérisation du promoteur, son séquençage et la détermination de sites permet une approche chimique de la modulation ou du blocage de la transcription du gène de la cycline A, en particulier en liaison avec la connaissance des voies de transduction des signaux mitogènes qui induisent l'expression de la cycline A et la prolifération cellulaire. Par exemple, l'AMPc ou AMP cyclique accroit l'expression de la cycline A via une séquence du promoteur appelée CRE (pour "cycline AMP responsive element"). On a pu ainsi démontrer que l'administration in vivo, à des rats hépactomisés, d'un p-bloquant, le propranolol, entraînait une baisse de l'expression de la cycline A. Egalement, la p53 reconnaît une séquence consensus dans la séquence du promoteur et abaisse l'expression de la cycline A, notamment en dehors de la phase G1/S. L'invention a donc aussi pour objet une composition destinée à bloquer ou moduler in vivo l'expression de cycline A humaine et comprenant pour ce faire, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique acceptable, une substance apte à se fixer sur une partie, du promoteur de la cycline A humaine, comportant au moins un site reconnu par un facteur de transcription. Ces susbtances pourront n'être mises à profit in vivo que lorsque la phase du cycle cellulaire concernée par le site visé sera atteinte. L'invention a encore pour objet une méthode permettant de moduler ou de bloquer la prolifération cellulaire induite par la cycline A humaine, par administration d'une séquence sens ou anti-sens selon l'invention, d'une construction selon l'invention ou d'une substance apte à entrer en compétition avec les facteurs de transcription. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par la description de la caractérisation et du séquençage du promoteur de la cycline A humaine, d'expérimentations de transfection et d'expression en fonction du cycle cellulaire et de méthodes de préparation ' de séquences sens et anti- sens, en liaison avec le dessin annexé, dans lequel: La figure 1 présente la carte de restriction du gène de la cycline A humaine. Les boites représentent les exons, les boîtes pleines les séquences codantes. Les abréviations signifient: H: HindIII; S; SacI; Xh: XhoI; N: NheI; Bg: BglII; R: EcoRI, pA indique les sites majeurs de polyadénylation. ATG: site de début de traduction; TAA: site de fin de traduction. La numérotation en bases correspond à la numérotation de la séquence complète. L'extrémité 5' de l'exon 1 correspond au site de début de transcription le plus en 3'. La figure 2 montre la séquence nucléotidique complète du gène de la cycline A, y compris le promoteur. Les exons sont soulignés. Le codon de début de traduction, le codon stop, les signaux de polyadénylation (AATAAA) et les séquences de dégradation d'ARNm (ATTTA) sont soulignés deux fois. L'extrémité 5' de l'exon 1 correspond au site de début de transcription le plus en 3' (voir figure 2). L'extrémité 3' de l'exon 8 représente le site prédominant de polyadénylation. La figure 3 représente des Northern blot d'ARN de Raji sélectionnés à l'aide d'oligo(dT), hybridés avec l'ADNc de 1,6 kb de la cycline A. La figure 4 montre des Northern blot d'ARN de HL60 préparés aux instants qui sont indiqués plus loin d'un traitement à l'actinomycine D et hybridés avec une sonde c- myc et une sonde cycline A. La figure 5 représente la cartographie du site de début de transcription de la cycline A, plus précisément la carte du premier exon sur laquelle sont représentées les deux sondes utilisées lors d'une analyse sous protection contre la nucléase S1. Les abréviations signifient: S: SacI; Xh: XhoI; N: NheI. La figure 6 correspond à la protection par la sonde 1 vis-à-vis de la nucléase S1. Les colonnes indiquent de gauche à droite: colonne "sonde 1": sonde 1 non digérée; colonne "Marqueur": indicateur de poids moléculaire (la taille est donnée par le nombre de paires de bases); colonne "ARNt": ARNt hybridé avec la sonde 1 et digéré par la nucléase Si; colonne "Raji": ARN de la lignée cellulaire du même nom, hybridé avec la sonde 1 et digéré par la nucléase Si. La taille des fragments protégés est indiquée à droite de la figure. La figure 7 correspond à la protection par la sonde 2. Colonne "Marqueur": indicateur de poids moléculaire (taille en paires de bases); colonne "Sonde 2" : sonde 2 non digérée par la nucléase S1; colonne "ARNt": ARNt hybridé avec la sonde 2 et digéré par la nucléase S1; colonne "Raji": ARN Raji hybridé avec la sonde 2 et digéré par la nucléase Si. La taille des fragments protégés est indiquée. La figure 8 donne la séquence de la région du promoteur de la cycline A. Les astérisques indiquent les lieux majeurs de début de transcription (* 2pb). La numérotation correspond à celle de la figure 1; la numérotation entre parenthèses se réfère au site de début le plus en 3' (position 925) qui est le site majeur et a donc été marqué +1. Les sites de liaison pour facteur de transcription consensus ou quasi-consensus sont soulignés. Une partie répétée de 10pb et le site de début de traduction sont également soulignés. Les sites de restriction représentés sont ceux qui ont été utilisés pour les essais in vitro (voir notamment figure 9). La figure 9 se rapporte à un essai in vitro. La ligne supérieure montre l'exon 1 de la cycline A et les séquences en amont. Sont indiquées les positions des motifs consensus de facteur de transcription (voir figure 8) et des sites de restriction utilisés pour la réalisation des fragments A à F montrés ci-après. Leur position relative par rapport à 1'ATG du gène de la cycline A est indiquée. Les fragments A à F ont été clones en amont de l'ADNc de la luciférase et transfectés dans des cellules HeLa (voir Méthodes). Le pourcentage d'activité luciférase obtenue pour chacune de ces constructions est indiqué à droite des 59 promoteurs correspondants. 100 % correspond à l'activité du fragment BamHI-XhoI de 3,6 kilobases. Les valeurs sont des valeurs moyennes arrondies obtenues sur au moins cinq transfections indépendantes. Les abréviations signifient: B: BamHI; Bg: BglII; H: HindIII; S: SacI; A: AatII ;D : DraII; Xh: XhoI; Sm: SmaI. La figure 10 se rapporte à l'activation du promoteur de la cycline A en phase S. Le graphe représente l'activité luciférase dans les cellules PALUC/3T3 (barres pleines) et PGLUC/3T3 (barres hachurées), à des intervalles de 2 h au sortir d'un stade déficient en sérum, par rapport à l'activité luciférase à t = O h. Les barres vides représentent le pourcentage des cellules PALUC/3T3 en phase S; pour les cellules PGLUC/3T3, les valeurs sont très proches. A t = O h, 97 % des cellules étaient en phase G1. Les barres figurent des valeurs moyennes obtenues sur trois essais indépendants (deux pour PGLUC/3T3). METHODES 1) Clonage et séquençage de l'ADN. On a construit une banque génomique humaine (normal) en clonant de l'ADN placentaire partiellement digéré par Sau3a dans le vecteur phagique lambda EMBL3 coupé par BamHI. Un sous-clonage des inserts phagiques a été réalisé à l'aide du vecteur plasmidique pBluescript SK (Stratagene). On a préparé une banque d'ADNc dans le phage lambda gtlO à l'aide d'ARN sélectionné par oligo(dt) à partir d'un tissu tumoral de foie humain en amorçant la synthèse d'ADNc par oligo(dt). Le séquençage de l'ADN a été réalisé sur matrices plasmidiques double-brin dénaturées, par la méthode de terminaison de chaîne aux didésoxynucléotides en présence d'ADN-polymérase T7 modifiée (Séquanase: United States Biochemical) et d'amorces dérivées de séquences de vecteur ou d'insert. 2) Etude de stabilité de l'ARN cycline A. Des cellules en culture asynchrone provenant de la lignée cellulaire HL60 (leucémie promyélocytique) ont été traitées avec 50 Mg/ml de l'inhibiteur de transcription - actinomycine D. Des Northern blot d'ARN total préparés à différents instants après l'ajout de l'actinomycine D sont hybridés avec un ADNc cycline A de 1,6 kb (J. Wang et al. Nature, volume 343, 555-557, 1990), puis avec un fragment ClaI-EcoRI de 1,4 kb du troisième exon du gène humain c- myc. 3) Cartographie de l'extrémité 5' de l'ARN. Les sites de fixation du chapeau de l'ARN cycline A ont été localisés par analyse sous protection vis-à-vis de la nucléase S1 comme cela est décrit par E. Eick, Nucl. Acids. Res., 18, 1199-1205, 1990. On a utilisé deux sondes double-brin (figure 5), un fragment SacI-XhoI de 613 pb (sonde 1) et un fragment SacI-NheI de 827 pb (sonde 2), marqués respectivement au 32p à l'extrémité 5' aux sites XhoI et NheI. On a préparé de l'ARN à partir de lignées cellulaires HL60 (leucémie promyélocytique), Raji (lymphome de Burkitt), EWl (sarcome d'Ewing) et de fibroblastes primaires humains normaux. 40 Mg d'ARN et d'ARNt cellulaires à titre de contrôle ont été hybridés avec chaque sonde et digérés par la nucléase S1 (Boehringer, Mannheim). Les fragments protégés ont été séparés sur gel de séquençage à 6 % de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie. 4) Etude du promoteur in vitro. On a construit le plasmide reporter luciférase pL en insérant une séquence polylinker dans le site unique HindIII de pSVOAL 5' (J.R. De Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737). Des fragments de restriction génomiques de la région amont cycline A ont été clones dans pL, soit directement, soit après réalisation d'extrémités franches, puis ligés dans le site XhoI de pL. 2.105 cellules par disque de 35 mm ont été transfectées suivant la méthode au phosphate de calcium (F.L. Graham et al., 1973, Virology 52, 456-467) pendant 8 heures avec 1,5 pg de plasmide reporter et 1 Mg de plasmide pCH110 (Pharmacia) exprimant la 3-galactosidase. 36 heures après la transfection, les cellules ont été lysées dans 400 pl de tampon contenant 0,6 % de Nonidet P-40, NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 7,9 et 1 mM d'EDTA. L'activité luciférase de pl de lysat clarifié a été mesurée comme cela est décrit par V. Nguyen et al. (Analyt. Biochem. 171, 404-408, 1988) à l'aide du luminomètre Berthold LB 9501 en injectant 50 pl de tampon de lyse contenant 0,45 mM de D-luciférine (Sigma) et 1,2 mM d'ATP. L'activité luciférase a été ramenée à l'efficacité de la transfection déterminée par l'activité p-galactosidase (P. Herbomel et al., 1984, Cell 39, 653-662). L'activité luciférase des extraits cellulaires transfectés par le plasmide pL sans promoteur n'excède pas le niveau de base de la machine qui est de 50 RLU (Relative Light Units). Comme contrôle positif, on a utilisé un plasmide dans lequel le promoteur du cytomégalovirus (CMV) est inséré dans pSVOAL 5'. La plus faible activité de promoteur observée pour un fragment situé en amont de la cycline A (fragment E - figure 8) était de 103 RLU. Pour chaque plasmide reporter, on a réalisé au moins 4 transfections indépendantes. ) Lignées cellulaires: Les transfections ont été réalisées dans: lignées cellulaires humaines HeLa, SAOS-2, Huh7 et HepG2; lignées cellulaires de singe Vero et COS; lignée cellulaire de souris NIH 3T3; lignée cellulaire de hamster CCL39. Toutes ces lignées sont disponibles auprès de l'American Type Culture Collection. Les cellules sont maintenues dans du milieu MEM (milieu essentiel minimum) ou dans du milieu de Eagle modifié selon Dulbecco, supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (SVF), dans une ambiance humide formée de 5 % de CO2 et de 95 % d'air. 6) Transfectants et synchronisation: Dix plaques de 10 cm contenant chacune 106 cellules NIH 3T3 ont été transfectées avec un plasmide PALUC comprenant le fragment A' -7300 à +245 (voir figure ) du promoteur et le gène de la luciférase, et avec un plasmide PGLUC comprenant le fragment G (-79 à +100) et le gène de la luciférase, à partir d'un plasmide conférant une résistance à la puromycine, qui est dérivé du plasmide pBABEPuro selon J.P. Morgenstern et H. Land (Nucleic Acids Res. 18, 3587-3596, 1990). Trois jours après la transfection, on a ajouté de la puromycine (1 Mg/ml) au milieu. Les colonies résistant à la puromycine sont rassemblées et amplifiées. Ces cellules, appelées respectivement PALUC/3T3 et PGLUC/3T3 sont analysées en ce qui concerne leur teneur en luciférase par cellule, laquelle teneur est restée constante pendant la période d'observation de deux semaines. Les deux populations sont ensuite synchronisées en les privant partiellement de SVF (0,5 % de sérum de veau foetal) pendant 60 h, puis sont réalimentées en SVF à 10 %. A des intervalles de 2 h, on détermine l'état du cycle cellulaire et l'activité luciférase. RESULTATS 1) Clonage et séquençage du gène de la cycline A humaine. Un clone d'ADNc de 1,6 kb de la cycline A humaine avait été isolé d'une banque de foie normal à l'aide d'une séquence-sonde adjacente au site d'intégration du virus de l'hépatite B dans un carcinome hépatocellulaire (J. Wang, supra). En se servant de cet ADNc comme d'une sonde, une série de clones phagiques chevauchants ont été isolés à partir d'une banque placentaire, représentant 40 kb d'ADN génomique. Une carte de restriction de cette région a été réalisée et un tronçon central de 12 kb, s'hybridant avec l'ADNc, a été sous-cloné dans de petits clones pBluescript (Stratagene) chevauchants. Ces clones ont été séquences à l'aide d'amorces dérivées de vecteurs commerciaux et d'amorces spécifiques. La carte de restriction et la séquence sont représentés aux figures 1 et 2. 2) Clonage de l'ADNc cycline A. Sur des Northern blot d'ARN sélectionnés par oligo(dt), la sonde d'ADNc cycline A de 1,6 kb détecte une espèce majeure a 2,7 kb, une espèce mineure à 1,8 kb et une espèce très réduite à 2,5 kb (figure 3). Etant donné que l'ADNc ne réagit pas avec des fragments de restriction supplémentaires sur Southern blot génomiques, même dans des conditions non astringentes, les trois ARNm observés sont considérés comme dérivant du locus clone. Pour obtenir des ADNc cycline A en nombre suffisant pour représenter ces ARNm, une tumeur de foie O10 abondant en ARN cycline A a été choisie pour construire une banque d'ADNc. 22 clones ont été isolés à l'aide de 1' ADNc de 1,6 kb servant de sonde. Les 15 d'entre eux contenant une région poly(A) ont été séquences en tout en partie. 9 ADNc sur 15 étaient polyadénylés en position 8266 (par référence aux nucléotides) (figure 2), 18 pb en aval d'un signal consensus de polyadénylation (AATAAA). 6 clones d'ADNc sur 15 correspondaient à des ARNm polyadénylés en position 7341, 17 pb en aval d'un signal de polyadénylation. 1 ADNc représentait un ARN polyadénylé en position 7936, un signal de polyadénylation étant présent 23 pb en amont. Si l'on considère la position des sites de fixation de chapeau de la cycline A dans la région 877-925 (voir plus loin), la taille et la fréquence relative de clonage des trois types d'ADNc ont une concordance avec la taille et la fréquence relative des ARNm cycline A observés sur Northern blot. Une comparaison de l'ADNc et de la séquence génomique montre que le gène de la cycline A est organisé en huit exons présentant des bordures intron/exon et exon/intron canoniques. Les ARNm ne diffèrent que dans le huitième exon, en ce qui concerne la longueur de leur région non codante en 3' (figure 2). Du fait de la présence de trois signaux de dégradation d'ARNm ATTTA (G. Shaw et ai, 1986, Cell 46, 659-667) dans la série majeure à 2,7 kb, un test a été réalisé pour savoir si cette série était moins stable que la série à 1,8 kb. Des cellules HL60 ont été traitées avec l'actinomycine D (inhibiteur de transcription). Un Northern blot d'ARN préparé à différents instants après l'addition de l'actinomycine D a été hybridé avec une sonde cycline A et une sonde spécifique de c-myc servant de contrôle. La figure 4 ne montre toutefois aucune différence apparente de stabilité entre les deux ARNm cycline A majeurs: leurs temps de demi-vie (moyenne sur le cycle cellulaire) sont supérieurs à trois heures. 3) Localisation et caractérisation fonctionnelle du promoteur de la cycline A. Les sites de début de transcription de la cycline A ont été cartographiés à l'aide d'expériences sous protection vis-à-vis de la nucléase S1 en utilisant deux sondes différentes. Il a été localisé 10 points de début de transcription majeurs et quelques points mineurs dans la région de transcription 877-925 avec une précision de * 2 pb (figure 8). Les sites de début de transcription se sont avérés identiques dans tous les types cellulaires étudiés (voir partie Méthodes). Toutefois, pour ce qui est des cellules HL60, plus de 90 % de l'initiation detranscription s'effectue au site de début situé le plus près de l'extrémité 3' (nucléotide 925). Cette position a donc été désignée +1. Si l'on se réfère à la figure 8, on voit qu'il n'y pas de boîte TATA mais une boite CAAT inversée ou site de liaison NF-1/CTF (position - 55) (C. Santoro et al., 1988, Nature 334, 413-419). Il existe 4 sites Spl (centrés sur les positions -193, -170, -138, +118) (J.T. Kadonga et ai., 1986, P.N.A.S. USA 83, 5889-5893), un site ATF (position -80) (K.A.W. Lee et al., 1987, P.N.A.S. USA 83, 8355-8359) et deux sites chevauchants (positions +108 et +112) pour le facteur de transcription spécifique G1/S murin Yi (Q.-P. Dou et al., 1991, P.N.A.S. USA 88, 1156- 1161). Un site AP-1 quasi-consensus (P. Angel et al., 1987, Cell 49, 721-739) se trouve en position -279. Deux motifs inclus (ou emboîtés) TGCCT (+53) pourraient être une cible pour p53 (S.E. Kern et al., 1991 Science 252, 1708- 1711). L'octamère TTTGGCTC (+31) possède une différence avec le site de liaison pour E2F du gène N-myc, tandis que l'octamère TTTGGCCG (+165) diffère d'une base par rapport au site de liaison E2F du promoteur c-myb (M. Mudryj et al., 1990, EMBO J. 9, 2179-2184). A la position -300, on observe un 10-mère qui se répète à partir de la position -310. Pour l'identification fonctionnelle du promoteur de la cycline A et afin de définir les séquences amont nécessaires à la fonction promotrice, il a été cloné différents fragments de restriction de la région en amont de la cycline A, les fragments étant placés devant l'ADNc de la luciférase de luciole servant de gène reporter (voir partie Méthodes). Ces constructions ont été transfectées de manière transitoire dans les lignées cellulaires HeLa, Huh7, HepG2 et SAOS-2 pour les lignées humaines, Vero et COS pour les lignées de singe et NIH 3T3 et CCL39 pour les lignées de rongeurs. a) Les résultats obtenus en transfections sur cellules HeLa sont donnés à la figure 9. Les fragments sont repérés ci-après par référence à l'ATG du gène de la cycline A. La séquence B, un fragment BglII-XhoI de 1,3 kb s'étendant de -1306 à -161 a en gros la même activité promotrice dans des cellules en cycle que le fragment A BamHI-XhoI (-3600 à -161), ce qui suggère que le fragment B contient les éléments régulateurs essentiels. L'activité du fragment B correspond à 0,15 fois l'activité du promoteur de contrôle CMV. Le retrait de la séquence -1303 à -612 du fragment B (on a alors le fragment D) conduit à une augmentation d'un facteur 3,6. La délétion de la séquence -612 à -334 du fragment B (on a alors le fragment C) conduit à l'élimination du site AP-1 et de la série de 3 sites Spl et modifie le site ATF de TGACGTCA en AGACGTCA. L'activité du fragment C correspond à 58 % de celle du fragment A. La délétion du fragment BglII- AatII de C (fragment E) réduit par contre l'activité promotrice de 10 fois (à 6 % de celle du fragment A). Il faut noter que la procédure de clonage du fragment E a modifié le site ATF en CTACGTCA. L'activité du fragment E a été augmentée de 2,5 fois en y ajoutant le reste de la partie non codante de l'exon 1 (fragment F, -334 à -12). La délétion des sites de début de la séquence F supprime complètement l'activité promotrice (fragment XhoI- SmaI, non représenté). Dans les cellules Huh7, les fragments E et F étaient inactifs d'un point de vue transcriptionnel (non représenté). Ces données impliquent que la séquence -1303 à -472 contient des éléments régulateurs positifs (C versus E) et négatifs (B versus D). L'addition de la région -472 à -334 qui présente les trois sites Spl au fragment E conduit à un accroissement de l'activité d'un facteur 60 (D versus E). La partie non codante de l'exon 1 qui contient les sites de liaison putatifs Spl et Yi contribue d'une manière positive à l'initiation de transcription de la cycline A (F versus E). Le clonage et la caractérisation du promoteur permet l'analyse de l'activation de la transcription du i gène de la cycline A. L'absence de boite TATA est cohérente avec l'hétérogénéité de l'initiation de la transcription qui a été observée, étant donné que l'on attribue aux boites TATA le rôle de diriger l'ARNm polymérase II vers un site de début défini. Les expériences menées in vitro sur le promoteur ont démontré la présence, dans le promoteur, d'éléments régulateurs positifs forts et d'éléments régulateurs négatifs forts. La séquence du promoteur contient des sites qui sont des cibles pour des modulateurs de transcription régulés par le cycle cellulaire. La régulation de la cycline A peut être due à la levée de la répression et/ou à l'activation par ces protéines à la transition G1/S. Ainsi, le fragment F, qui comprend la partie non codante de l'exon 1 pour se terminer 30 paires de bases en amont de la région d'initiation de transcription, contient un site de liaison putatif pour p53. On sait que p53 arrête les cellules en G1 lors d'une surexpression (L. Diller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 5772-2781) et peut réprimer divers promoteurs de gènes de contrôle de la croissance (D. Ginsberg et al. 1991, P.N.A.S. USA 88, 9979- 9983), comme le gène PCNA (W.E. Mercer et al., P.N.A.S. USA 88, 1958). Le fait que le fragment F a une activité promotrice dans les cellules HeLa, mais pas dans les cellules Huh7, indique que p53 peut réprimer la transcription due à ce fragment dans les cellules Huh7 o p53 est très abondant, au contraire des cellules HeLa o il n'est pratiquement pas détectable. En outre, le fragment F contient deux sites putatifs pour le facteur de transcription E2F, dont l'activité est réprimée pendant la phase G1 par la formation d'un complexe avec la forme sous- phosphorylée du régulateur de croissance négatif pRB (M. Mudryj supra). Dans les cellules HeLa, E2F ne se trouve pas sous forme de complexe protéique (S. Bagchi et al., 1990, Cell 62, 659- 669). L'activité du fragment F dans les cellules peut donc être due à l'action de l'E2F libre. pRB peut bloquer E2F en le complexant dans les cellules Huh7 lors de la phase G1 et contribuer ainsi à l'inactivité du fragment F. Il a été démontré que le complexe pRB/E2F peut même agir comme silencer (inhibiteur de transcription) sur un site de liaison pour E2F (S.J. Weintraub et al., 1992, Nature 358, 259-261). La découverte que TGFP régule négativement l'ARNm de cycline A est également en conformité avec le rôle de pRB dans la répression du promoteur de la cycline A lors de la phase G1, étant donné que TGFP inhibe la phosphorylation de pRB dans des cellules à croissance stoppée par TGFa (M.M. Hafez et al., 1990, Cell Growth Differ. 1, 617-626; M. Laiho et al., 1990, Cell 62, 175-185). Le fragment de promoteur D atteint la moitié de l'activité du promoteur CMV dans l'essai à la luciférase. Ce fragment contient un groupe de trois sites Spl (J.J. Kadonga supra), connus pour agir d'une manière synergique (G.M. Anderson et al., 1991, Mol. Cell. biol. 11, 1935- 1943). Les regroupements (clusters) de sites Spl semblent typiques des gènes à réponse tardive, comme les gènes pour la thymidine kinase (TK) et le PCNA. Le fragment D contient aussi un site ATF, qui peut lier de multiples facteurs cellulaires et intervenir dans la réponse à des niveaux croissants d'AMPc (W.J. Roesler et al., 1991, J. Biol. Chem. 263, 9063-9066) et à l'adénovirus E1A (K.A.W. Lee et al., 1987, P.N.A.S. USA 84, 8355-8359). La forte activité promotrice du fragment D est contrebalancée par un élément régulateur négatif situé entre -1303 à -472. Cette région ne montre cependant aucune homologie apparente avec des séquences qui sont des cibles pour des répresseurs spécifiques à G1, telles qu'un site de liaison pour p53 ou un élément de contrôle de pRB (RCE). D'autre part, il peut y avoir une régulation positive du promoteur spécifique à G1/S. L'activité du fragment E est pratiquement triplée par l'addition de la partie non codante restante de l'exon 1, qui contient deux sites chevauchants (-148 à -135) pour le facteur de transcription Yi (Q.-P. Dou supra) et un site Spl. Yi est tenu comme responsable de la forte activation du promoteur murin de TK à la transition G1/S. De manière intéressante, on a constaté qu'un 15- mère (-146 à -132) de ce site du promoteur de la cycline A humaine est conservé (avec un changement C en G) dans le fragment de 70 pb du promoteur humain pour TK, qui confère, à un promoteur hétérologue, une régulation en fonction du cycle cellulaire (Y.K. Kim et al., 1991, Moll. Cell. Biol. 11, 1185-1194). Le motif Yi se trouve quatre fois dans cet élément de 70 pb et quatre fois dans une fraction de 100 pb située 30 pb en amont de l'ATG d'initiation du gène de la cycline D humaine (T. Motokura et al., Nature 350, 512- 515). Tandis que Yi se lie à l'ADN au début de la phase S (Q.-P. Dou supra), d'autres facteurs ayant des sites de liaison putatifs dans le promoteur de la cycline A peuvent activer la transcription de la cycline A à la fin de la phase G1 lors de la transition de G1 à G1/S. L'oncogène c- jun, qui se lie aux sites AP-1 et aux sites ATF dans différents complexes (P. Macgregor et al., 1990, Oncogene , 451-458), et le facteur CREB (cAMP-responsive element binding), qui se lie aux sites ATF, sont activés par phosphorylation (Macgregor supra). L'ARNm de c-jun est régulé positivement à la fin de la phase G1 et c-jun forme des complexes de transcription spécifiques de G1/S (R. Carter et al., 1991, Oncogene 6, 229-235). Le fait que p53 et pRB soient in vitro des substrats pour les complexes cycline A/cdc kinase (H.W. St rzbecher et al., 1990, Oncogene 5, 795-801; J.R. Bischoff et al., 1990, P.N.A.S. USA 87, 4766-4770; Y. Taya et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 580-586) et qu'un complexe E2F/p107 s'associe avec cycline A/cdk2 kinase en phase S (S. Shirodkar et al., 1992, Cell 68, 157- 166; S.H. Devoto et al., 1992, Cell 68, 167-176), suggère un mécanisme de contrôle par retour (feedback) de l'expression de la cycline A, par phosphorylation des régulateurs de transcription par une cycline A/cdk kinase, par analogie avec le contrôle en feedback de l'expression du gène CLN par phosphorylation en SWI4/6 par CLN/CDC28 kinase dans S. cerevisiae (L. Dirick et al., 1991, Nature 351, 754-757: K. Nasmyth et al., 1991, Cell 66, 995-1013). En outre, le complexe E2F/p107/cycline A/cdk2 pourrait se lier aux sites E2F du promoteur de la cycline A humaine et phosphoryler des facteurs de transcription voisins. Ainsi, lors de sa liaison à l'ADN, Spl est phosphorylé par une kinase liée à l'ADN (S.P. Jackson et al., 1990, Cell 63, 155-165) et l'ARN polymérase II est un substrat in vitro pour la cdc2 kinase (L.J. Cisek et al., 1989, Nature 339, 679-684). L'adénovirus E1A transactive le promoteur de la cycline A. Des cibles candidates pour cette transactivation sont les sites E2F et le site ATF. b) Les activités luciférase relatives dans les cellules NIH 3T3 (ramenées à l'efficacité de transfection) sont représentées dans le tableau qui suit. On se réfère ici au site majeur noté +1 à la figure 8. Les activités luciférase relatives des fragments A' à G' sont exprimées en pourcentage de l'activité du fragment A'. Les valeurs sont des valeurs moyennes arrondies obtenues sur au moins 4 transfections indépendantes ramenées à l'expression de a-galactosidase - SDs n'excède pas 18 %. Fragment amont cycline A Activité luciférase lié à l'ADNc de la luciférase relative A' -7300 à +245 100 % B' -3400 à +245 100 % C' -945 à +245 92 % D' -516 à +245 94 % E' -215 à +245 247 % F' -79 à +245 16 % G' -79 à +100 6% Les valeurs d'activité sont analogues à celles obtenues dans les autres lignées cellulaires testées. Etant donné que le fragment B' (fragment BamHI/SmaI de 3,6 kb; -3400 à + 245), donne les mêmes résultats que le fragment A' de 7,5 kb, le fragment A' est considéré comme représentant le promoteur dans son entier. Le plus petit fragment du promoteur ayant une activité dans toutes les lignées cellulaires testées est le fragment G': fragment AatII/XhoI; -79 à +100. La délétion des sites de début de transcription du fragment F' (XhoI/SmaI; +95 à +245) abolit totalement l'activité de ce dernier. Ces résultats montrent la présence d'une séquence régulatrice négative (516 à -215, fragment D' versus E') et d'éléments régulateurs positifs situés entre -215 et -79 (E' versus F') et entre +100 et +245 (F' versus G'). La séquence -215 à -79 comporte le groupe de trois sites Spl synergiques. Les caractéristiques principales de la séquence +100 à +245 sont le site E2F et les deux sites Yi. Les données en a) et b) ci-dessus permettent de déterminer les potentialités de régulation du promoteur de la cycline A, par exemple le potentiel de p53, pRB, E1A et de la cycline A à transréguler le promoteur. PREPARATION DES SEQUENCES ANTI-SENS ET SENS. 1) Oligonucléotides. A partir de la séquence représentée à la figure 8, on choisit une ou plusieurs régions couvrant entre 30 et 40 paires de bases. Les séquences anti-sens et sens déterminées à partir des régions sélectionnées sont enregistrées dans un automate de synthèse disponible dans le commerce. Celui-ci se charge ensuite de la synthèse des oligonucléotides. Une purification des oligonucléotides est ensuite effectuée par électrophorèse préparative en gel d'acrylamide. Elle peut aussi être réalisée par HPLC sur colonne en phase inverse ou en échange d'ions. Bien entendu, il est possible, comme cela est bien connu, de modifier les oligonucléotides pour les protéger contre les nucléases, pour améliorer leur pénétration dans les cellules-cibles et leur affinité pour celles-ci. Des techniques disponibles ont été citées plus haut. 2) Longues chaines: On peut produire une séquence anti-sens recouvrant une grande partie ou la totalité de la séquence du promoteur et/ou du gène de la cycline A. Pour ce faire, on peut par exemple insérer l'ADN, ce qui est rendu possible par la caractérisation qui en est faite par les inventeurs, dans un plasmide apte à assurer la synthèse d'ARN en orientation anti-sens. REGULATION SELON LE CYCLE CELLULAIRE DU PROMOTEUR DE LA CYCLINE A. Pour étudier l'initiation de la transcription de la cycline A en fonction de la progression du cycle cellulaire, on a utilisé des cellules NIH 3T3 synchronisées, transfectées d'une manière stable avec les constructions PALUC et PGLUC (voir Méthodes). Lors de la phase exponentielle de croissance, le niveau d'activité luciférase reste constant à 10 RLU (relative light units) par cellule pour PALUC/3T3, contre 0,5 RLU par cellule pour PGLUC/3T3. Cette valeur décroît à 0,2 RLU par cellule, respectivement 0,02 RLU par cellule, après 60 h de privation en sérum, 97 % des cellules étant alors en phase G1. On ajoute ensuite du sérum aux cultures ; à des intervalles de 2 h, les cellules sont analysées en ce qui concerne leur activité luciférase relative par cellule. La figure 10 montre que les cellules PALUC/3T3 entrent en phase S avec un synchronisme remarquable et que l'activation du fragment A' du promoteur cycline A coïncide avec le démarrage de la synthèse d'ADN dans les cellules 3T3. Le déroulement du cycle cellulaire des cellules PGLUC/3T3 après synchronisation ne se distingue pas de celui des cellules PALUC/3T3. La figure 10 montre que l'expression de luciférase dans les cellules PGLUC/3T3 suit le cinétique de l'expression dans les cellules PALUC/3T3, sauf en ce qui concerne l'induction G1/S, qui est moins brusque. Les cibles essentielles pour la répression en G1 du promoteur de la cycline A sont donc situées sur le ' fragment G'. On a donc démontré qu'un fragment du promoteur, fusionné à un gène hétérologue, à savoir le gène codant pour la luciférase, confère à ce gène une expression spécifique de la phase tardive de G1 et du début de la phase S. Cela signifie qu'une expression du gène hétérologue n'est induite dans une cellule donnée que lorsque cette cellule se met à proliférer. Toute séquence codante hétérologue d'intérêt ainsi fusionnée sera exprimée de cette manière, ce qui présente un intérêt tout particulier pour les séquences habituellement utilisées dans le traitement des cancers, telles que les séquences codant pour une cytokine, une molécule HLA, la thymidine kinase du virus Herpès simplex. Le gène sera fusionné selon les techniques usuelles au promoteur du gène de la cycline A ou à une partie de ce promoteur induisant une expression efficace et spécifique de la phase indiquée du cycle cellulaire. De la même manière, on pourra aussi utiliser tout autre gène d'intérêt ou encore toute séquence sens ou anti- sens selon l'invention, qui serait alors exprimée en cas de prolifération et viendrait bloquer en retour la transcription du gène de la cycline A humaine. REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN ayant une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie de celle représentée à la figure 2, y compris avec des variations mineures. 2. Fragment d'ADN ayant une séquence nucléotidique correspondant à une partie de celle représentée à la figure 2, dont au moins une partie d'intron, y compris avec des variations mineures. 3. Fragment d'ADN ayant une séquence !0 nucléotidique correspondant à tout ou partie de celle représentée à la figure 8, qui correspond au promoteur de la cycline A humaine, y compris avec des variations mineures. 4. Séquence d'ARN correspondant à tout ou partie de la séquence d'ADN représentée à la figure 2 ou d'une séquence n'en différant que par des variations mineures. 5. Séquence d'ARN correspondant à une partie de la séquence d'ADN représentée à la figure 2 ou d'une séquence n'en différant que par des variations mineures, cette partie comprenant au moins une région d'intron et une région d'exon adjacentes. 6. Anti-sens, oligonucléotide ou ARN, complémentaire de tout ou partie d'une séquence d'ARN selon la revendication 4 ou 5. 7. Séquence nucléotidique sens complémentaire d'une partie de la séquence représentée à la figure 2 et apte à se fixer sur le double hélice du gène de la cylcine A humaine et/ou de son promoteur pour former une triple hélice. 8. Séquence nucléotidique sens qui est complémentaire d'une partie, de la séquence représentée à la figure 8, comportant au moins un site spécifique reconnu par un facteur de transcription et qui est apte à s'y fixer. 9. Construction comprenant tout ou partie du promoteur de la cycline A humaine fusionné avec une séquence nucléotidique d'intérêt, de telle manière que cette séquence puisse être exprimée in vivo de façon spécifique en phase tardive de G1 et en phase S du cycle cellulaire. 10. Construction selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est choisie dans le groupe des séquences sens et anti-sens selon les revendications 6 à 8. 11. Construction selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est une séquence hétérologue, notamment choisie parmi le groupe consistant dans les séquences codant pour une cytokine, une molécule HLA ou la thymidine kinase du virus Herpès simplex. 12. Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un anti-sens, une séquence nucléotidique sens ou une construction selon les revendications 6 à 11. 13. Composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique acceptable, une substance apte à se fixer sur une partie, du promoteur de 1O la cycline A humaine, comportant au moins un site reconnu par un facteur de transcription.