Brevet FR2722507A1 — publié le 19960119

La présente invention concerne un adénovirus recombinant comportant un gène codant pour une NO synthase. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques permettant l'administration locale et efficace de ces virus recombinants et plus particulierement leur utilisation pour le traitement de la resténose. Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport, dans le sang et les fluides périphériques, de lipides comme le cholestérol et les triglycérides Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholesterolémie ou l'hypertriglycéridémie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est la cause principale des infarctus du myocarde et est responsable de prés de la moitie du taux de mortalité dans les pays développés. Physiologiquement, elle se traduit principalement par la formation, au niveau de la paroi des grosses arteres, de plaques constituées de cholestérol, lipoprotéines, cellules spumeuses et/ou tissus fibreux V raisemblablement, ces plaques arthérosclérotiques sont la conséquence d'une réponse inflammatoire excessive à une lésion chronique au niveau de l'endothélium des parois arterielles Ce type de plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi. ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par atherome. thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. La technique d'angioplastie est la thérapie la plus couramment mise en oeuvre pour rétablir la circulation sanguine a travers l'artère ainsi obstruée. Toutefois, dans environ 40% des cas, cette technique echoue du fait de resténose, consécutive à la blessure mécanique de la paroi arterielle. Cette seconde pathologie est liée principalement à la migration et la prolifération de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) qui prennent place en l'absence de la protection et/ou du rétrocontrôle exercés par les cellules endothéliales de l'intima. Un traitement propose pour contrer cette prolifération des cellules CMLV, consiste à les supprimer par administration de substances chimiques ou protéiques adéquates. C'est ainsi que des dérives de psolarènes sont incorporés dans les cellules prolifératives de manière à les sensibiliser à l'action de la lumière [March et al, Circulation, 87, 184-191, (1993)] De même, certaines cytotoxines, constituées d'une protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactérienne et un facteur de croissance, ont également été utilisées à ces fins [Pickering et al, J. Clin. Invest., 91, 724-729 (1993) , Biro et al, Circ. Res., 71, 640-645, (1992) , Casscells et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 7159-7163, (1992)]. Toutefois. ces traitements ne donnent pas entière satisfaction en raison notamment de leur faible spécificité, leur efficacité moyenne et un délai d'action important La présente invention a précisément pour objet de proposer une nouvelle méthode, par thérapie génique, particulièrement efficace et sélective pour le traitement de la resténose post-angioplastique L'approche retenue dans le cadre de la présente invention, se distingue totalement de ce qui précède et consiste à intervenir au niveau de l'expression d'un des facteurs impliqués dans la prolifération des CMLV. Préférentiellement, elle vise à augmenter la teneur d'un facteur jouant un rôle d'agent bloquant à l'égard de cette prolifération. Plus précisément, la presente invention vise à accroître la concentration en monoxyde d'azote. NO, au niveau de la paroi vasculaire, soumise à langioplastie, via l'expression de la NO synthase, enzyme catalysant la synthèse de NO à partir d'arginine. On peut admettre que les quantites de NO, produites à l'état physiologique par les cellules endothéliales, correspondent aux concentrations nécessaires à l'intégrité, i.e. au bon fonctionnement de la paroi vasculaire. La destruction mécanique de l'endothélium, consécutive à l'angioplastie, conduit donc à une baisse de la production de NO. Inversement, il est établi que la modulation pharmacologique des taux de NO est capable d'interférer avec la prolifération des CMLV observée lors de la resténose [McNamara et al. Biochem. Biophys. Res. Com., 193(1), 291-296, (1993)] ont notamment montré que l'administration de L-arginine, précurseur de NO, réduit l'hyperplasie intimale dans un modèle de stérose post-angioplastique chez le lapin. L'expression de NO synthase, selon la présente invention, directement au niveau de la paroi endommagée. permet avantageusement de rétablir rapidement des concentrations suffisantes en NO. d'améliorer ainsi le remodelage vasculaire via la vasolidatation EDRF dépendante et de bénéficier en outre des effets associés intéressants comme une inhibition de la prolifération des CMLV et une réduction de l'agrégation plaquettaire. La présente invention se rapporte principalement à un adenovirus recombinant comportant au moins un gène codant, en totalité ou non, pour l'intégralité ou une partie active d'une enzyme catalysant la synthèse de l'oxyde d'azote. Les avantages de la présente invention résident notamment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération. Ceci permet d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes introduits, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. En raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché. Le monoxyde d'azote est connu pour intervenir au niveau de l'activité biologique de EDRF (endothelium-derived relaxing factor). EDRF joue un rôle important au niveau de la régulation notamment du flux sanguin en inhibant les contractions des muscles mous et l'agrégation plaquettaire [Radomski et al., Lancet 2, 1057-1058 (1987)]. Il faut noter que NO est également présent dans le plasma sous la forme de groupements S-nitrosothiols liés à des protéines telles que l'albumine. Les Snitroso-protéines ainsi générées, plus stables que NO, sont responsables, du moins partiellement, de l'activité EDRF. Outre leurs propriétés vasodilatatrices, les Snitroso-protéines sont également de puissants agents antiagrégants plaquettaires [Simon et al. Arteriosclerosis and Thrombosis, 13, 791-799 (1993)]. Dans le cas des maladies cardiovasculaires, une production altérée de EDRF est associée à la pathogénicité de l'arthérosclérose et de l'hypertension pulmonaire et systémique. Le monoxyde d'azote est également reconnu comme fonctionnant, au niveau du système nerveux, à titre de neurotransmetteur et comme participant, au niveau du système immunitaire, à l'activité cytotoxique des macrophages. Plus récemment, le monoxyde d'azote a été décrit comme un agent capable d'agir directement sur la prolifération des CMLV jusqu'in vitro, différents composes, donneurs de NO, inhibent la mitogénêse des CMLV en culture [Garg et al., J Clin.Invest., 83 1774-1777, (1989)] Les enzymes responsables de la production en monoxyde d'azote dans chacun de ces systèmes, désignées ci-apres NO synthases sont classiquement réparties en trois catégories dites isoforme I, isoforme II et isoforme III. - La NO synthase dite isoforme I, est exprimée de manière continue et dépendante du calcium, au niveau des cellules du cerveau. Cette NO synthase neuronale est constitutive. Elle a récemment été clonée chez l'homme [Nakane M., Schmidt H.H, Pollock J.S., Forstmann U., et Murad F Lett. 316(2)175-180(1993)]. L'isoforme II est exprimée dans les macrophages murins et induite par le TNF ou l'rL- 1. La particularité des NOS de type inductible est principalement leur capacité à produire de fortes concentrations de NO en réponse à certaines cytokines. Dans le cadre de la présente invention, on peut parfaitement envisager leur expression sous controle d'un promoteur exogène, viral ou non, ne contenant pas d'élément de réponse aux cytokines. Le controle de la production en monoxyde d'azote est, dans ce cas, assuré par un promoteur present dans l'adénovirus. Deux NO synthases humaines inductibles ont notamment été cionees [Geller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3491-3495 (1993) et Charles et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11419-11423 (1993)] - En ce qui concerne l'isoforme III, elle est exprimée dans les cellules endothéliales et est calcium-calmudoline dépendante. Cette isoforme dite constitutive ou endothéliale, est normalement exprimée dans la paroi vasculaire et associée à l'activité EDRF. La NO synthase endothéliale humaine a été clonée [Janssens et al. J Bio. Chem. 267, 14519-14522 (1992) et Marsden et al. FEBS Lett. 307, 287-293 (1992)]. De part ses propriétés d'EDRF, le monoxyde d'azote produit par cette NO synthase joue un rôle essentiel dans la relaxation des CNwN' Selon la présente invention, tout gène codant pour l'intégralité ou seulement une partie active d'une NO synthase ou un de ses dérivés et préférentiellement codant pour l'une de ces trois isoformes de NO synthases peut être incorporé dans un adenovirus en we de son expression in vivo. Par dérivé de NO synthase, on entend désigner tout polypeptide obtenu par modification et conservant une activité biologique. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Pour la construction des adenovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilisés. Il existe en effet de nombreux sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère cependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, [exemple Mavl, Beard et al.. Virology 75 81. (1990)], ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adênovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple] De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Comme indiqué ci-avant, les adenovirus selon l'invention sont défectifs, c'està-dire qu'ils sont incapables de se repliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles. soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène suicide Préferentiellement, I'adénovirus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gene codant pour une enzyme NO synthase. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, Ll-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de I'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du genie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier [Levrero et al., Gene, 101, 195, (1991), EP 185 573; Graham, EMBO J 3. 2917, (1984)]. En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène codant pour la NO synthase. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59, (1977)] qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 o) Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également eté décrites dans les demandes n" FR 93 05954 et FR 93 08596. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Avantageusement, dans les adenovirus de l'invention, le gène codant pour une enzyme NO synthase est placé sous le controle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées Il peut s'agir du propre promoteur du gène, d'un promoteur hétérologue ou d'un promoteur synthétique. Notamment, il peut s'agir de promoteurs issus de genes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compns du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs EIA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre. ces sequences d'expression peuvent être modifiées par addition de sequences d'activation. de regulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires de préférence en division. de manière à ce que le gène thérapeutique ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule musculaire lisse vasculaire. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un adénovirus recombinant défectif comprenant un gène codant pour une NO synthase sous le contrôle d'un promoteur viral. choisi de préférence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CM', La présente invention vise l'utilisation des adénovirus selon l'invention à des fins thérapeutiques et plus particulierement leur application pour le traitement de la resténose. Leur utilisation est egalement envisageable pour le traitement de pathologies liées au système nerveux central Il a été noté que les proprietes biologiques de NO sont étroitement contrôlées par des réactions d'oxydation. En particulier, la modification de NO- par l'ion superoxyde aboutit a la formation d'ion peroxynitrite ONOO- et par conséquent à la perte de l'activité EDRF. Selon White et al. [Proc.Natl.Acad Sci.USA, 91, 1044-1048, (1994)] ce processus d'oxydation est impliqué dans le développement de l'athérosclérose. Deux mécanismes complémentaires sont en fait mis en jeu: la réduction de l'activité guanylate cyclase des CMLV inhérente à l'inactivation de NO et l'augmentation de l'oxydation des lipoprotéines résultant de l'apparition de peroxynitrite. L'association d'un traitement anti-oxydant à l'augmentation de l'activité NO synthase peut par consequent être souhaitable afin de conserver le bénéfice thérapeutique lié à la production locale de NO. Dans cette perspective, l'administration de Superoxyde dismutase SOD [White et al., Proc.Natl.Acad.SciUSA, 91. 10441048, (1994)] permet de garantir l'environnement vasculaire de la production d'ion peroxynitrite. Un autre objet de la présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif selon l'invention associé le cas échéant à un excipient convenable. L'adénovirus et la composition pharmaceutique, selon la présente invention, constituent des moyens particulièrement avantageux pour le traitement de la resténose post-angioplastique. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considerés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1 Représentation du vecteur pXLCKIV-hum NOS Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique. la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la precipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc . . sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laborator, Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982); Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley & Sons, New N'ork, (1987)]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extremités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nuclease S I La mutagenèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut etre effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 8749-8764, (1985)] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230, 1350-1354 (1985) , Mullis K B. et Faloona F.A., NIeth. Enzym. 155, 335-350, (1987)] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Exemple 1: Construction du vecteur PXLCMV-humNOS portant le gène codant pour la NO synthase sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus (figure 1) Cet exemple décrit la construction d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la NO synthase endothéliale humaine, sous le contrôle d'un promoteur constitué par le promoteur précoce du cstomégalosirus (CMV), ainsi qu'une région de l'adenovirusAd5 nécessaire à la recombinaison homologue. Le fragment EcoRI de l'ADNc de la NO synthase endothéliale humaine, décrit par Janssens et al. [J. Biol. Chem. 267. 14519-14522, (1992)] a été recloné dans pBluescript II SK + (STRATAGENE) dans l'orientation mettant les bases 5' de I'ADNc du côté du site Not I de pBluescript. Un site Sal I est créé par introduction de deux oligonucléotides appariés au niveau du site Not I. Le fragment Cla I-Sal I du plasmide résultant contient I'ADNc de la NO synthase endothéliale humaine. Ce fragment a été inséré, entre les sites Cla I et Sal I, dans le plasmide PXL2375 (PCT/FR94/00422) qui comprend les séquences du promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV) et les régions Ad5 permettant la recombinaison homologue. Le plasmide obtenu a été désigné PXLCMV-humNOS. Exemple 2 : Contrôle de l'activité des vecteurs portant le gène codant pour une NO synthase sur modèles de culture cellulaire in vitro L'activité des vecteurs contenant l'ADNc de NO synthase est contrôlée sur des modèles in "miro Les cellules sont transfectées par les vecteurs contenant les différentes isoformes de NO synthase La determination de l'activité NO synthase des cellules transfectées permet de comparer l'activité des NO synthases ainsi que l'efficacité des promoteurs utilisés (ex. RSV-LTR, CMV). La quantité de NO2-/NO3- produits d'oxydation de NO, est déterminée dans le surnageant de culture par la méthode de Griess ou si nécessaire par des méthodes fluorométriques plus sensibles [Nlisko et al, Analytical Biochemistry 214, 11-16, (1993)]. Par ailleurs I'activité NO synthase intracellulaire peut être quantifiée de manière directe, par mesure de la conversion d'arginine en citrulline [Nakane et al., FEBS Letters, 316, 175-180, (1993)]. L'activité des NO synthases est sensible à l'addition de N-monométhyl-L-arginine. Inversement, I'augmentation du calcium intracellulaire est associée à une stimulation de l'activité de la NO synthase neuronale et endothéliale. Différents modèles cellulaires sont développés. Des clones stables exprimant les NO synthases sont sélectionnés a partir des lignées cellulaires CHO. Des transfections transitoires sont aussi effectuées sur d'autres modèles cellulaires tels que les cellules musculaires lisses vasculaires de rat et de lapin. Par ailleurs, afin de vérifieur la fonctionalité des vecteurs et compléter les donnees initiales de Garg et Hassid [J. Clin Invest., 83, 1774-1777, (1989)], l'effet de l'expression de la NO synthase est également mesurée sur la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires. Exemple 3 : Construction d'un adénovirus recombinant Ad-CMV.NOS contenant une séquence codant pour une NO synthase Le plasmide décrit dans l'exemple I est linéarisé et cotransfecté pour la recombinaison homologue avec le vecteur adénoviral déficient dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (ElA et Elle) d'adénovirus. Plus précisément, I'adénovirus Ad-CMV-humNOS a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre ladénovirus mutant Ad-d11324 [Thimmappaya et al., Cell 31, 543, (1982)] et le plasmide pXL-CMV humNOS, selon le protocole suivant le plasmide pXL-CMV humNOS linéarisé et ladénovirus Ad-dl1324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, I'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52, 456, 1973). L'adénovirus Ad-CMV-humNOS peut être conservé à 80 C dans 20% de glycérol Exemple 4 : Validation in titre de l'adénovirus recombinant Ad-CMV.NOS contenant une séquence contenant pour une NO synthase Les cellules musculaires lisses vasculaires sont préalablement infectées par l'adénovirus [Lee et al., Circulation Research 73, 797-807, (1993)]. La quantité de NO générée est alors mesurée ainsi que l'effet de la production de NO sur la prolifération cellulaire. La prolifération cellulaire est déterminée par mesure d'incorporation de BrdU dans l'ADN (Cell Prolifération Assay RPN210, Amersham). REN'ENDICATIONS 1.Adénovirus recombinant defectif comportant au moins un gène codant, en tout ou partie, pour l'intégralité ou une partie active d'une NO synthase ou l'un de ses dérivés 2. Adénovirus selon la revendication I caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase endothéliale 3. Adénovirus selon la revendication I caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase neuronale 4. Adénovirus selon la rex endication 1 caractérisé en ce que la NO synthase est une NO synthase inductible 5. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées. 6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs viraux. de preférence le promoteur LTR-RSV et CMV. 7. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'adénovirus comprend outre le gene. les ITR et une séquence permettant l'encapsidation 8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que ladénovirus comprend outre le gène, les ITR une sequence permettant l'encapsidation et dans lequel le gène El et au moins l'un des genes E2, E4, Ll-L5 est non fonctionnel. 9. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine, choisi de préférence parmi les sérotypes Ad2 et Ad5 10. Adénovirus selon l'une des revendications I à 9 caractérisé en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale, choisi de préférence parmi les adénovirus canins 11. Utilisation d'un adenovirus selon l'une des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose. 12. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un adénovirus tel que défini dans les revendications de I à 10 associé à un excipient convenable.