Brevet FR2717823A1 — publié le 19950929

VIRUS RECOMBINANTS. PREPARATION ITT UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale, leur préparation et leur utilisation, notamment pour le traitement etlou la prévention des maladies neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne des virus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD). L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique. Les voies gabaergiques représentent le principal ensemble inhibiteur du système nerveux des vertébrés. L'altération de l'activité des neurones GABAergiques se manifeste immédiatement au niveau de l'organisme tout entier par des dyskinésies ou des convulsions. De plus, le rôle de l'acide gamma-amino-butyrique (GABA) cérébral ne se limite pas à la neurotransmission. Une action neurotrophique durant le développement lui a en effet été attribuée, en particulier dans la neurorétine. Par ailleurs, le GABA est également présent dans les cellules B des ilôts de Langerlaans, où il semble jouer un rôle sur la régulation de la production d'insuline. La possibilité de restaurer ou d'instaurer de novo, une synthèse GABA dans une région précise de l'organisme, présente donc un intérêt thérapeutique important, aussi bien pour des affections directement liées à la dégénérescence de neurones GABAergiques que pour celles qui répondent aux agonistes GABA. La présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse à ce problème. La présente invention décrit en effet la mise au point de vecteurs, d'origine virale, utilisables en thérapie génique, capables d'exprimer in vivo de manière localisée et efficace une activité glutamate décarboxylase. La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour traiter les affections liées à une déficience en GABA, consistant à induire la synthèse in vivo de GABA par libération ciblée d'un enzyme biologiquement actif. L'activité glutamate décarboxylase (GAD) est un enzyme qui catalyse, de manière assez spécifique, la transformation du glutamate en acide gamma-aminobutyrique (GABA) à l'aide d'un cofacteur, le phosphate de pyridoxal (vitamine B6). A l'état natif, cet enzyme se présente sous forme d'un dimère de 120 kilodaltons. Après réduction des ponts disulfures, l'examen par électroimmunoanalyse (Western blot) spécifique révèle deux bandes à 65 et 67 kilodalton. ll a été récemment démontré que ces deux monomeres correspondent à deux protéines différentes codées par des gènes distincts (Erlander et al., Neuron 7 (1991) 91). LRS deux molécules, désormais appelées GAD 67 et GAD 65, se distinguent d'un point de vue enzymatique, la forme courte présentant une affinité plus réduite pour le phosphate de pyridoxal, et par leur localisation subcellulaire, la forme courte étant mieux représentée dans les prolongements neuronaux alors que la forme longue s'accumule au niveau du périkarya. La forme longue, de par sa dépendance plus réduite vis à-vis de la concentration en phosphate de pyridoxal, est donc la plus à même de s'exprimer dans différents types cellulaires. La GAD 65, en revanche, présente la particularité de s'inactiver rapidement en l'absence de phosphate de pyridoxal en se transformant en apoenzyme, dénuée d'activité catalytique. La transformation inverse, d'apoenzyme en holoenzyme active, est relativement lente. En outre, l'expression des GAD 67 et 65 n'est pas restreinte au tissu nerveux. Les deux GAD se rencontrent également dans les cellules (3des îlots de Langerhans du pancréas. Des autoanticorps anti-GAD ont ainsi été détectés chez des patients atteints d'une maladie neurologique très rare, le Stiff-man syndrome, caracterisee par une hypertonie musculaire et accompagnée d'une dégénérescence de certains neurones GABAergiques. Une proportion non négligeable de ces malades (20 to) développe en outre un diabète de type I. De même, la GAD 67 est également relativement abondante dans le manchon du flagelle des spermatozoides où tout laisse à penser qu'elle joue un rôle important dans le catabolisme oxydatif. La présente invention réside dans la découverte qu'il est possible de produire in vivo une activité enzymatique capable à son tour de favoriser ou d'induire la synthèse d'un neurotransmetteur, le GABA. La présente invention réside également dans la mise au point de vecteurs permettant la libération efficace, localisée et durable d'un enzyme actif in vivo sur la synthèse de GABA. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche de thérapie génique particulièrement avantageuse pour le traitement et/ou la prévention des pathologies neurodégénératives. La demanderesse s'est intéressée plus particulièrement à l'utilisation de vecteurs d'origine virale pour le transfert in vivo, notamment dans le système nerveux, d'une activité glutamate décarboxylase. De manière particulièrement avantageuse, la demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de canstnllre des virus recombinants contenant une séquence d'ADN codant pour la GAD, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable, localisée et efficace d'une GAD biologiquement active in vivo, en particulier dans le système nerveux, et sans effet cytopathologique. La présente invention découle plus particulièrement de la mise en évidence de propriétés particulièrement avantageuses de certains virus pour l'expression d'une activité GAD, et de la construction de vecteurs viraux (virus défectifs, délétés de certaines régions virales, contenant certains promoteurs, etc) permettant une expression particulièrement efficace de l'activité GAD, et dans les tissus appropriés. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, particulièrement adaptés et efficaces pour diriger l'expression de la GAD in vivo. Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ettou à la prévention des maladies neurodégénératives. Au sens de l'invention, le terme protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD) désigne toute protéine capable d'induire ou de favoriser la production de GABA à partir de glutamate. Plus particulièrement, la protéine ayant une activité glutamate décarboxylase est choisie parmi tout ou partie des protéines GAD65 et GAD67, ou de dérivés de celles-ci. L'activité glutamate décarboxylase produite dans le cadre de la présente invention peut être une GAD humaine ou une GAD animale. La séquence d'ADN codant pour les GAD65 et 67 a été clonée et séquencée à partir de différentes espèces, et notamment à partir de l'homme (Bu et al., PNAS 89 (1992) 2115) et du rat (Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173). Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagénèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une sequence d'ADN codant pour une GAD humaine. Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de la GAD 65 ou 67, en particulier un dérivé des GAD humaines. Un tel dérivé comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant la capacité d'induire ou de favoriser la production de GABA à partir de glutamate. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ciaprès). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans l'exemple 2. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci. Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo. Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans lesquelles certains sites de N- ou O-glycosylation ont été modifiés ou supprimés, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, ou les molécules dans lesquelles tous les résidus cystéine ont été substitués (mutéines). On peut citer également les dérivés obtenus par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus supplémentaires, tels que par exemple une méthionine N-terminale et/ou un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction. La séquence d'ADN codant pour la GAD utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un Ar > Nc, un ADN génomique, ou une conrtruction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un Ar > Ng. En particulier, l'utilisation d'un ADN génomique permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité GAD. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le virus comprend une séquence d'ADNg codant pour une protéine ayant une activité GAD. Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou de rétrovirus. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour la GAD. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérises. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les 11 R, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ayant une activité GAD. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de 1'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la GAD. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n" FR 93 05954 et FR 93 08596. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. n comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (1TR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une activité GAD. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la GAD bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ciaprès démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité GAD. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. De plus, l'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux cellules voisines. Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ayant une activité GAD est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression de la GAD. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines1 ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraw, Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. n peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187), de la GFAP (Sarkar et al., J. Neurochem. 57 (1991) 675), etc. Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité GAD sous le contrôle du promoteur LTR-RSV. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour une protéine ayant une activité GAD sous le contrôle du promoteur LTR-RSV. La demanderesse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une expression durable et importante de l'activité GAD dans les cellules du système nerveux humain, notamment central. Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité GAD sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux. L'expression est considérée comme majoritaire au sens de l'invention lorsque, même si une expression résiduelle est observée dans d'autres types cellulaires, les niveaux d'expression sont supérieurs dans les cellules nerveuses. Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit cidessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces virus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la sclérose latérale amyotrophique (ALS), de la maladie d'Huntington, de l'épilepsie, de la dégénéréscence cérébrovasculaire, etc. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, souscutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule phannaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est avantageusement réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection. Des injections localisées, telles que notamment des injections intranigrales, dans le lobe temporal, dans les foyers épileptiques ou encore dans l'épithélium intestinal peuvent être particulièrement avantageuses. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation. La libération de GABA obtenue par thérapie génique selon l'invention constitue une approche thérapeutique particulièrement efficace pour contrecarrer les phénomènes excitotoxiques responsables de maladies nerveuses dégénératives comme les scléroses amyélotrophiques. Les vecteurs de l'invention présentent donc des propriétés anticonvulsivantes et neuroprotectrices. Parmi les applications thérapeutiques des vecteurs de l'invention, on peut citer en particulier le traitement de certaines formes d'épilepsies, notamment celles résistantes à tout traitement pharmacologique ou chinugical, telles que les épilepsies rebelles du lobe temporal. Les vecteurs de l'invention peuvent également être utilisés pour le traitement des lésions cérébrales excitotoxiques d'origines diverses, notamment d'origine ischémique, ainsi que pour le traitement des traumatismes médullaires susceptibles d'engendrer des lésions excitotoxiques. Ils présentent également un intérêt thérapeutique important dans le traitement du diabète, notamment de type I, par exemple par l'induction d'une tolérance à la GAD chez des individus prédiabétiques, permettant ainsi d'éviter l'attaque auto-immune responsable des symptômes de cette maladie. A cet égard, une synthèse de GAD, massive mais bien localisée, dans l'intestin par exemple, présente aussi un intérêt thérapeutique certain dans les cas de diabètes déclarés, en déprimant la réponse auto-immunitaire cellulaire. Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces virus. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules gliales, etc. Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures ueees. Cellesci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP228458, Ex289034, EP4oOO47, Ex456640). Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une activité GAD. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. I1 est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules mammifère infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites cidessus, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108. Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules. Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I. Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entrant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PT FE) ou un support d'origine biologique. Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, l'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit thérapeutique dans l'organisme : Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulables, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques. La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des maladies neurodégénératives. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des maladies d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, de l'epilepsie et de l'ALS. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1: Structure du vecteur pLTRIXGAD67 Techniques generales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel KM. et aL (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoUchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du foumisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR oeolymérase-catalyzed Çhain exaction, Saiki RK. et al., Science XQ (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 54635467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Exemples Exemple 1. Construction du vecteur pLTR IX GAD67 portant le gène codant pour la GAD67 sous le contrôle du promoteur du LTR du virus du sarcome de rous (figure 1). Cet exemple décrit la construction d'un vecteur comprenant une séquence d'ADNc codant pour la GAD67, sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV). 1.1. Vecteur de départ (pLTR IX) : Le vecteur pLTR IX contient en particulier la région gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant l'ITR et le site d'encapsidation, le promoteur LTR de RSV, et une région de l'adènovirus Ad5 allant du gène pIX jusqu'au site de restriction EagI, permettant la recombinaison homologue in vivo. Ce vecteur a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. a. Clin. Invest. 90 (1992) 626). 1.2. Construction d'une séquence ADNc codant pour la GAD67. Pour permettre la réalisation de vecteurs selon l'invention, une séquence d'ADNc codant pour la GAD67 de rat a été construite comme suit: - Un clone d'ADNc correspondant à l'ARNm de la glutamate décarboxylase GAD67 a été isolé par criblage immunologique d'une banque d'expression d'ADNc de cerveau de rat construite dans le vecteur lambda GT11 (Julien et al., Neuroci. Letters 73 (1987) 173). La nature et la position exacte de la séquence codant pour la GAD67 dans le clone isolé ont été déterminées par séquençage de l'insert. L'insert contenu dans ce clone a ensuite été isolé par digestion au moyen de l'enzyme EcoRI, puis sous-cloné au site correspondant du vecteur pSPT18 ou Bluescript (Pharmacia). 1.3. Construction du vecteur pLTR IX GAD67 Cet exemple décrit la construction du vecteur pLTR IX GAD67 contenant la séquence codant pour la GAD67 sous contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 permettant la recombinaison in vivo. Le fragment EcoRI-Hindm de 2 kb a été isolé par digestion enzymatique à partir de la construction préparée dans l'exemple 1.2. Ce fragment de 2 kb contient la séquence codante de la GAD67, et s'étend aux 118 pb en amont du codon d'initiation de la traduction, et aux 70 pb situées en aval du codon de terminaison. Ce fragment a été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting Point"), puis traité par l'ADN polymérase de T4 pour obtenir des extrémités franches. Ce fragment a ensuite été inséré au site compatible SalI du vecteur pLTR IX (exemple 1.1.) pour générer le vecteur pLTR IX GAD67 (figure 1). L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert GAD67 a ensuite été vérifiée par séquençage didéoxynucléotides. Exemple 2. Fonctionalité du vecteur pLTR IX GAD67 La capacité du vecteur pLTR IX GAD67 à exprimer sur culture cellulaire une forme biologiquement active de la GAD a été démontrée par transfection transitoire de cellules 293. Pour cela, les cellules (2.106 cellules par boite de 10 cm de diamètre) ont été transfectées (8 ,ug de vecteur) en présence de Transfectam. L'expression de la séquence codant pour la GAD et la production d'une protéine biologiquement active sont mises en évidence par les tests suivants: - Détection et quantification des ARNm GAD par la technique de Northern blot (voir par exemple Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173 pour un protocole détaillé) - Révélation de la protéine GAD par la technique de Western blot en utilisant l'anticorps polyclonal K2 (Chemicon) (voir également Julien et al., Neurosci. Letters 73 (1987) 173 pour un protocole détaillé) - Mise en évidence et quantification de l'activité GAD (synthèse de GABA) à partir du lysat cellulaire. Pour cela, 48 heures après la transfection, les cellules sont lysées et le lysat est clarifié par centrifugation à 100 000 g. Le lysat est alors incubé en présence d'un anticorps anti-GAD, lui-même fixé sur des billes de sépharose. L'anticorps utilisé est en particulier l'anticorps &num;1440, qui présente la propriété de préserver l'activité catalytique de la GAD (Oertel et al., Neurosci. 6 (1981) 2715). n est entendu que d'autres anticorps présentant des propriétés comparables peuvent être utilisés et éventuellement préparés. Le complexe anticorps-GAD active est ensuite séparé du lysat cellulaiore et incubé en présence de [1-14C] Lglutamate. Le 14C02 libéré au cours de la réaction, qui reflète la transformation du glutamate en GABA, est piégé sur un filtre imbibé de hyamine et compté en scintillation liquide. Deux controles négatifs permettent de soustraire le bruit de fond et ainsi de déterminer le signal spécifique: un antisérum pré-immun et un inhibiteur spécifique de la GAD, le y-acétylénique-GABA (voir aussi Julien et al., Neurosci. Letter 73 (1987) 173). Exemple 3. Construction d'un adénovirus recombinant Ad-GAD67 contenant une séquence codant pour la GAD67 Le vecteur pLTR IX GAD67 a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus. Plus précisément, l'adénovirus Ad-GAD67 a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad11324 Cfliimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pLTR IX GAD67, selon le protocole suivant : le plasmide pLTR IX GAD67 et l'adénovrrus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-GAD67 peut être conservé à -800C dans 20 Go de glycérol. Exemple 4. Fonctionalité de l'adênovlrus Ad-GAD67 La capacité de l'adénovirus Ad-GAD67 à infecter des cellules en culture et à exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active de la GAD67 a été démontrée par infection des lignées 293 humaine. La présence de GAD67 actif dans le surnageant de culture a ensuite été déterminée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2. Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forme biologiquement active de la GAD67 en culture cellulaire. Exemple 5 : Transfert in vivo du gène GAD67 par un adénovirus recombinant Cet exemple décrit le transfert du gène GAD67 in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre comment les effets des vecteurs de l'invention sur différents modèles animal peuvent être mis en évidence. L'adénovirus recombinant GAD67 peut être injecté en différents points du sysème nerveux. En particulier, l'injection est réalisée dans les différents points suivants : dans le noyau médian du septum. dans la partie dorsale de l'hippocampe, dans le striatum, dans la substance noire et dans le cortex entorhinal. L'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-GAD67 préparé dans l'exemple 3, utilisé sous forme purifiée (3,5 106 pfu/pl), dans une solution saline phosphate tPBS). Les injections sont réalisées à l'aide d'une canule (diamètre exérieur 280 ,um) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 jilimin, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplémentaires avant d'être remontée. Les volumes d'injection dans l'hippocampe, le septum, le striatum et la substance noire sont respectivement 3, 2, 2x3 et 2 iI. La concentration d'adénovims injectée est de 3,5. 106 pfu/pl. Pour l'injection dans l'hippocampe, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-4; MIn3,5; V3,1 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma. Pour l'injection dans le septum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes : AP=1; Mol=1; V=-6 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma. Dans cette condition, la canule présente un angle de 9 degrés par rapport à la verticale (dans le sens médio-latéral) afin d'éviter le sinus veineux médian. Pour l'injection dans la substance noire, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes : AP=-5,8; ML=+2; V=-7,5 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère). Pour les injections dans le striatum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes : AP=+0,5 et -0,5; ML=3; V=-5,5 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère). Les effets thérapeutiques de l'administration de l'adénovirus selon l'invention sont mis en évidence par trois types d'analyse : une analyse histologique et immunohistochimique, une analyse quantitative et une analyse comportementale, qui témoignent de la capacité des vecteurs de l'invention à produire in vivo une GAD biologiquement active. REVENDICATIONS 1. Virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD). 2. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNc. 3. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg. 4. Virus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour tout ou partie de la protéine GAD67 ou d'un dérivé de celle-ci. 5. Virus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour tout ou partie de la protéine GAD65 ou d'un dérivé de celle-ci. 6. Virus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses. 7. Virus selon la revendication 6 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux. 8. Virus selon la revendication 7 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs ElA, MLP, CMV et LTR-RSV. 9. Virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV. 10. Virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV. 11. Virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité glutamate décarboxylase (GAD) sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules nerveuses. 12. Virus selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible. 13. Virus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus. 14. Virus selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2. 15. Virus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus adéno-associé. 16. Virus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus. 17. Virus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus de l'herpès (HSV). 18. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 17 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives. 19. Utilisation selon la revendication 18 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer, de Huntinggton de l'épilepsie ou de l'ALS. 20. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 17. 21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable. 22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 ou 21 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 101o pfu/ml adénovirus recombinants défectifs. 23. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 17. 24. Cellule selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine. 25. Cellule selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de type fibroblaste, myoblaste, hépatocyte, cellule endothéliale, cellule gliale ou kératynocyte. 26. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 23 à 25 et une matrice extracellulaire. 27. Implant selon la revendication 26 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine et les lectines. 28. Implant selon les revendications 26 ou 27 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées. 29. Implant selon la revendication 28 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polytétrafluoroéthylène.