Brevet FR2716263A1 — publié le 19950818

La présente invention concerne une méthode d'alignement de macromolécules telles que des polymères ou des macromolécules à activité biologique, notamment de l'ADN, ou des protéines. Contrôler la conformation de macromolécules représente un enjeu industriel important, par exemple dans la fabrication de capteurs ou d'assemblages moléculaires contrôlés ou encore dans les problèmes de détection et d'analyse. Il peut être intéressant d'avoir une conformation moléculaire allongée. A titre d'exemple, dans le cas o des polymères sont greffés sur un substrat, il a été proposé de les étendre par l'action d'un champ électrique, d'un écoulement ou à l'aide de pinces optiques. En particulier, en biologie, l'alignement de l'ADN - par électrophorèse (Zimmerman et al. Nucl. Acid Res. 22, p 492, 1994), écoulement libre (Parra et Windle, Nature Genetics, 5, p 17, 1993) ou dans un gel (Schwartz et al. Science 262, p 110, 1993) ou à l'aide de pinces optiques (Perkins et al., Science 264 p 819, 1994 et aussi USP 5079169) - ouvre de nombreuses possibilités en cartographie, ou dans la détection de pathogènes. Ces méthodes ne permettent en général qu'un alignement imparfait, ou encore transitoire - c'est-à-dire qu'on a relaxation de la molécule, une fois la contrainte disparue. Dans le cas des pinces optiques, la méthode est lourde, limitée à une seule molécule à la fois, et délicate à mettre en oeuvre par des personnels non qualifiés. Il a été proposé (I. Parra et B. Windle) une technique particulière d'alignement de l'ADN par écoulement après lyse de cellule, puis séchage. L'alignement obtenu est très imparfait et inhomogène et de nombreux amas non alignés sont observés. La présente invention a pour objet une méthode originale et simple pour aligner des macromolécules sur la surface S d'un support caractérisée en ce que l'on fait se déplacer sur ladite surface S la ligne triple S/A/B (ménisque) résultant du contact d'un solvant A avec la surface S et un milieu B, lesdites macromolécules ayant une partie, notamment une extrémité, ancrée sur la surface S, l'autre partie, notamment l'autre extrémité, étant en solution dans le solvant A. 35.../ On a observé selon la présente invention, que le seul passage d'un ménisque sur des molécules dont une partie est ancrée sur un substrat, permet de les aligner uniformément perpendiculairement au ménisque en mouvement les laissant absorbées sur la surface derrière le ménisque. Plus précisément, l'étirement de la partie libre de la molécule se fait par le passage de la ligne triple S/A/B, constituant le ménisque entre la surface S, le solvant A et un milieu B qui peut être un gaz (en général de l'air) ou un autre solvant. Dans un mode de réalisation particulier, le ménisque est un ménisque eauair, c'est-à-dire que le solvant A est une solution aqueuse et le milieu B est de l'air. De plus il est possible d'étendre le ménisque air/eau utilisé ici afin d'étirer la molécule à d'autres systèmes tels que huile/eau ou eau/surfactant/air, notamment. Le déplacement du ménisque peut se faire par tout moyen de déplacement relatif des fluides A et B par rapport à la surface S. En particulier le ménisque peut être déplacé à l'aide d'un moyen mécanique, pneumatique notamment en aspirant ou soufflant un gaz, ou hydraulique notamment en poussant ou en aspirant le solvant A ou le milieu B. Ainsi le déplacement du ménisque peut se faire par évaporation progressive du solvant A. Lorsque le déplacement du ménisque se fait par voie mécanique, il peut se faire soit par translation de l'interface A/B, soit par translation de la surface S. Dans un mode de réalisation particulier, le solvant est placé entre deux supports dont un au moins correspond audit support de surface S et le ménisque est déplacé soit par évaporation, soit en déplacant les deux supports l'un par rapport à l'autre. On entend ici par support, tout substrat dont la cohésion est suffisante pour résister au passage du ménisque. Le support peut être constitué par du verre, de la silice ou un polymère organique ou inorganique ou encore un métal notamment de l'or. Le support est avantageusement sous forme de plaques ou de fibre voire, sous forme de particules. De préférence, le support ne présente que peu ou pas de fluorescence. Des macromolécules, telles que polymères quelconque, ou polymères biologiques tels que ADN, ARN ou Protéines, peuvent être ancrés par des méthodes quelconques sur un support. La macromolécule à aligner peut être choisie parmi les macromolécules biologiques telles que les proteines, notamment les anticorps, antigènes, ligands ou leurs récepteurs, les acides nucléiques, ADN, ARN ou PNA, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés. On a observé selon la présente invention, que la force d'étirement agit localement au voisinage immédiat du ménisque. Elle est indépendante de la longueur de la molécule, du nombre de molécules ancrées, et dans une large gamme, de la vitesse du ménisque. Ces caractéristiques sont particulièrement intéressantes pour aligner les molécules de façon homogène et reproductible. La présente invention permet ainsi la préparation de substrats présentant à leur surface des macromolécules orientées. Une telle construction peut trouver par exemple des applications en électronique ou en optique. On peut contrôler la qualité de l'alignement à l'aide de deux paramètres, à savoir les interactions macromolécule - surface, et l'action locale du ménisque sur la macromolécule. Ainsi, la force d'étirement sera d'autant plus grande que les interactions macromolécule - surface seront d'autant plus faibles. Il peut néanmoins être intéressant de limiter volontairement cette force, pour éviter la brisure de la macromolécule, ou de ses liaisons avec la surface. On peut, selon la présente invention, ajouter des éléments tensio-actifs dans le.solvant A et/ou le milieu B, qui viennent modifier les propriétés des interfaces. Selon la présente invention l'étirement peut en effet être contrôlé par l'addition de tensio-actifs, ou par un traitement de surface adéquat. Ainsi, dans le cas d'un ménisque eau-air étirant de l'ADN sur une surface non-mouillante (verre silanisé), on a mesuré un étirement d'environ 50 96, alors que sur une surface mouillante (recouverte de protéine A et d'anti-Digoxygénine), l'étirement est d'environ 10 %. Une trop grande attraction surface-macromolécule (par exemple un niveau trop élevé d'absorption) peut gêner l'alignement des molécules par le ménisque, celles-ci restant absorbées à la surface dans un état pas nécessairement étiré. De préférence, la surface présente un faible taux d'absorption de ladite macromolécule, de sorte que seules les molécules ancrées seront alignées, les autres étant entraînées par le ménisque. Les molécules, une fois alignées, adhèrent fortement à la surface. Dans le cas de l'ADN, elles ont pu être observées par fluorescence, plusieurs mois après leur alignement. La présente invention est donc très différente de la méthode proposée par Parra et Windle, car selon la présente invention, les molécules sont ancrées à la surface puis uniformément alignées par le passage du ménisque, alors que dans la méthode de Parra et Windle un écoulement hydrodynamique est utilisé pour étirer de façon inhomogène les molécules qui vont s'absorber non-spécifiquement à la surface. D'autres techniques peuvent aussi conduire à l'étirement et l'alignement de molécules. Ainsi une orientation dynamique de molécules en solution ancrées à une extrémité, peut être obtenue par électrophorèse ou par un écoulement hydraulique.Toutefois, les résultats observés montrent que ces techniques, sont beaucoup moins performantes que l'utilisation du ménisque. Par 'ancrage' de la macromolécule sur la surface il faut entendre une fixation aussi bien par un lien covalent ou greffage chimique que par un lien non covalent tel qu'une liaison résultant d'interactions physicochimiques. Cet ancrage de la macromolécule peut se faire directement sur (ou avec) la surface, ou indirectement, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un lien tel qu'une autre molécule, notamment une autre molécule à activité biologique. Lorsque l'ancrage se fait de manière indirecte, la macromolécule peut être greffée chimiquement sur ledit lien, ou interagir de manière physico-chimique avec ledit lien, en particulier lorsque ledit lien intermédiaire est une molécule à activité biologique reconnaissant et interagissant avec ladite macromolécule. Dans un mode de réalisation avantageux, la macromolécule et ledit lien sont toutes deux des molécules à activité biologique qui interagissent telles qu'antigène et anticorps respectivement, acides nucléiques complémentaires ou lipides. Dans ces cas, la fixation non covalente de la macromolécule consiste en une liaison de type antigène- anticorps, ligand-récepteur, hybridation entre fragments d'acides nucléiques complémentaires ou interaction hydrophobe ou hydrophile entre lipides. On met ainsi à profit la très grande spécificité et la très grande sélectivité de certaines réactions biologiques, notamment les réactions antigènes/anticorps, les réactions d'hybridation d'ADN ou d'ARN, les réactions interprotéines ou de type avidine/streptavidine//biotine, de même que les réactions des ligands et de leurs récepteurs. Ainsi, pour réaliser l'ancrage direct ou indirect de la macromolécule sur la surface S on peut utiliser une surface solide présentant certaines spécificités. Il est en particulier possible d'utiliser certaines surfaces prétraitées permettant de fixer certaines protéines ou de l'ADN, qu'il ait été ou non modifié. De telles surfaces sont commercialement disponibles (Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal par exemple) sous différentes 2O formes présentant à leur suface des groupements COOH, NH2 ou OH par exemple. On peut alors fonctionnaliser l'ADN avec un groupement réactif, amine par exemple, et procéder à une réaction avec ces surfaces. Ces méthodes nécessitent cependant une fonctionnalisation particulière de l'ADN à fixer. On a également décrit une technique permettant l'ancrage sans traitement préalable de l'ADN. Ce procédé consiste à faire réagir un phosphate libre de l'extrémité 5' de la molécule d'ADN avec une amine secondaire de la surface (surface NH Covalink). On peut aussi fixer l'ADN à un groupement ou une protéine P0 pour la faire réagir avec une suface recouverte d'un groupement ou une protéine P1, susceptible de réagir spécifiquement avec P0. Le couple P0/P1 peut être un couple de type biotine/streptavidine ou digoxigénine/anticorps dirigé contre la digoxigénine, (anti-DIG) par exemple. La présence d'interactions parasites, même faibles, de type adsorption non-spécifique fait conduire à des adsorptions efficaces pour des molécules longues, capables de contracter avec le solide un grand nombre de points d'interaction faible. Ces surfaces peuvent présenter un fort taux de fluorescence parasite potentiellement gênante lors de la phase de détection de l'alignement. Selon la présente invention, on utilise de préférence un support solide présentant en surface au moins une couche compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant, éventuellement après modification chimique, une affinité pour un type de molécule à activité biologique qui peut être ladite macromolécule ellemême ou une molécule reconnaissant et interagissant avec elle, les autres éléments de la couche ne présentant que peu ou pas d'affinité pour lesdites molécules. Par 'affinité', il faut entendre ici aussi bien une réactivité chimique qu'une absorption d'un type quelconque, ceci dans les conditions éventuelles de fixation des molécules sur le groupement exposé modifié ou non. La surface est compacte, c'est-à-dire qu'elle ne permet pas à la molécule à activité biologique d'avoir accès aux couches inférieures et/ou au support, ceci afin de minimiser les interactions non-spécifiques. Bien entendu, cette non-accessibilité est à prendre en compte dans les conditions éventuelles de fixation de la molécule à activité biologique. Parmi les surfaces les plus intéressantes, on cite celles sur lesquelles le groupement exposé est un groupement comportant une double liaison CH=CH2 qui peut être activée pour donner notamment -CHO, -COOH, NH2 et -OH ou, bien entendu, utilisé tel quel. Parmi les groupements non-réactifs éventuellement exposés, on peut citer ceux appartenant à la classe des hydrocarbures et fluorocarbones, ceux-ci seront présentés plus en détail dans ce qui suit. Comme groupements non-réactifs, on évitera tout particulièrement les groupements organiques comprenant notamment de l'oxygène, du chlore, ceuxci étant connus pour induire des interactions non-spécifiques, par exemple une adsorption parasite. Les supports à surfaces hautement spécifiques selon la présente invention peuvent être obtenues par la mise en oeuvre de divers procédés. On peut citer à titre d'exemple: (A) une couche de polymère carboné, éventuellement branché, d'au moins 10 nm d'épaisseur, remplissant la fonction, de présenter une classe de groupements réactifs tels que défimis ci-après, le reste de la couche étant constitué de groupements hydro- ou fluorocarbonés; (B) des surfaces obtenues par dépôt ou ancrage d'une ou plusieurs couches moléculaires, celles-ci peuvent être obtenues par la formation de couches successives fixées par liaisons non- covalentes, type film de Langmuir-Blodgett, ou par auto-assemblage moléculaire, ceci permettant la formation d'une couche fixée par liaison covalente. Dans le premier cas, la surface peut être obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit groupement exposé, ou bien par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé, ou encore par dépôt de polymère. Dans ce procédé, l'un des monomères est de préférence à double liaison éthylénique, le polymère formé étant une polyoléfmine ou un dérivé polyénique, notamment des surfaces de type caoutchouc synthétique, tel que le polybutadiène, le polyisoprène ou le caoutchouc naturel. Dans le deuxième cas, la surface hautement spécifique comporte: - sur un support, une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins: un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant éventuellement, après une modification chimique suivant la fixation, une affinité pour un type de molécule biologique. Afin d'obtenir une couche compacte, les différents composés organiques sont, de préférence, susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales, on obtient ainsi une couche monomoléculaire compacte grâce à laquelle le support devient totalement inaccessible pour des réactions parasites. De préférence, le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité. Il est bien entendu possible de prévoir des modes de réalisation différents dans lesquels, par exemple, le groupement de fixation serait situé au milieu de la molécule, celui-ci disposant à chacune de ses extrémités d'un groupement exposé. Afin d'éviter les réactions parasites avec le composé organique ailleurs que sur le groupement exposé, on utilise de préférence des composés organiques pour lesquels entre les groupements exposés et le groupement de fixation la ou les chaînes du composé organique sont sensiblement inertes, par exemple il s'agira de chaînes saturées telles que des chaînes paraffiniques. Les surfaces peuvent s'analyser selon a) le support, b) la molécule ayant un groupement exposé et un groupement de fixation sur le support, c) l'interaction entre le support et ladite molécule assurant la fixation. La fixation peut être tout d'abord de type non-covalent, notamment de type hydrophile/hydrophile et hydrophobe/hydrophobe, comme dans les films de Langmuir-Blodgett (K.B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935). Dans ce cas, le groupement exposé ou le groupement de fixation seront, soit hydrophiles, soit hydrophobes, notamment des groupements alkyles ou halogénoalkyles tels que CH3, CF3, CHF3, CH2F, l'autre groupement étant hydrophile. La fixation peut être également de type covalent, le groupement de fixation va alors réagir chimiquement sur le support. Certaines surfaces de structure approchante ont déjà été mentionnées dans le domaine électronique, notamment lorsque les fixations sont covalentes, L Netzer et J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) et US-A-4 539 061. Parmi les groupements de fixation, il faut citer plus particulièrement les groupements de type silane, chlorosilane, silanol, éthoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide, aldéhyde. Tout particulièrement, comme groupement de fixation on préférera utiliser des groupements susceptibles de réagir transversalement avec un groupe équivalent, voisin, pour fournir les liaisons transversales, par exemple il s'agira de dérivés de type silane, notamment dichlorosilane, trichlorosilane, diéthoxysilane et triéthoxysilane. Ces liaisons transversales peuvent aussi être effectuées à un point quelconque dans l'épaisseur de la monocouche. en la polymérisant à l'aide de groupements réactifs éventuellement présents sur la chaîne entre le site de fixation et le groupement exposé. Ainsi, les groupements diacétyléniques sont connus pour permettre une polymérisation uni- ou bidimensionnelle de la monocouche. Le choix du groupement de fixation dépendra évidemment de la nature du support, les groupements de type silane sont bien adaptés pour la fixation covalente sur le verre et la silice. Pour ce qui concerne les groupements exposés, et quelle que soit la surface, ils seront choisis de préférence parmi les groupements éthyléniques, acétyléniques ou des radicaux aromatiques, les amines tertiaires ou secondaires, les esters, les nitriles, les aldéhydes, les halogènes. Mais il pourra s'agir tout particulièrement du groupement éthylénique; en effet, celui-ci peut être modifié chimiquement après fixation pour conduire, par exemple, à un groupement carboxylique ou des dérivés de groupements carboxyliques tels que des groupements alcools, aldéhydes, cétones, acides, amines primaires, secondaires ou tertiaires. De préférence, les chaînes reliant le groupement exposé au groupement de fixation sont des chaînes comportant au moins 1 atome de carbone, de préférence plus de 6 et en général de 3 à 30 atomes de carbone, ainsi même dans le cas de défaut de couverture du solide, des groupements inertes, et non pas le solide, sont exposés; dans ce cas et lorsque l'on a formation d'un couplage latéral à l'intérieur même de la couche, que ce couplage soit ionique, de coordinance ou covalent, on obtient des couches hautement ordonnées obtenues par auto-assemblage, même si la surface initiale ne présente qu'un nombre réduit de sites d'ancrage actifs comparé au nombre de molécules obtenues dans une monocouche compacte. Pour ce qui concerne le support lui-même, il peut être constitué d'une matière quelconque, mais on préfère utiliser de façon générale, du verre, de la silice, un polymère ou de l'or avec ou sans prétraitement de la surface. On peut avantageusement utiliser, dans le cas du verre ou de la silice, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisant des dérivés silanes, par exemple: Si-OH + CI3-Si-R-CH=CH2 donne Si-O-Si-RCH=CH2, R consistant par exemple en (CH 2)4. Une telle réaction est connue dans la littérature, avec utilisation de solvant ultra-purs. La réaction conduit à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur. Dans le cas de l'or, celui-ci étant éventuellement sous la forme d'une couche mince sur un substrat, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisent des dérivés thiols, par exemple: Au + HS-R-CH=CH2 donne Au-S-R-CH=CH2, R consistant par exemple en (CH2)4. Une telle réaction est décrite en milieu liquide et conduit, de même que la réaction précédente trichlorosilane-silice, à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur. Bien entendu la terminologie de "support' englobe aussi bien une surface unique telle qu'une lame, mais également des particules qu'il s'agisse de poudre de silice ou de billes de polymère, et aussi des formes quelconques telles que barre, fibre ou support structuré, lesquelles peuvent d'ailleurs être rendues magnétiques, fluorescentes ou colorées, comme cela est connu dans différentes technologies de dosage. De préférence, le support sera choisi pour être pas ou peu fluorescent lorsque la détection sera effectuée par fluorescence. Les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) ci-dessus présentent une grande spécificité grâce àt: (i) la présence de sites réactifs spécifiques provenant, soit des groupes exposés, soit de la molécule fixée; (ii) un très faible taux d'interactions non-spécifiques, dû à l'absence de liaisons parasites: liaisons covalentes, liaisons faibles de type absorption, liaisons hydrophobes; à titre de comparaison, les surfaces commerciales Nunc, Costar, etc. présentent de nombreux sites d'interactions non-spécifiques, l'ADN y étant ainsi ancré en de nombreux points, alors que sur des surfaces selon la présente invention on peut observer des molécules d'ADN ancrées uniquement par leurs extrémités 5'; (iii) un très faible taux de fluorescence intrinsèque, lorsque cela est requis, un bruit de fond de fluorescence (d'une aire typique de 100 x 100 pm) plus faible que le signal de fluorescence d'une seule molécule à détecter; (iv) la possibilité de détecter des molécules isolées avec un rapport S/N indépendant du nombre de molécules, qui est possible grâce à différentes techniques à grand rapport S/N décrites plus bas et basées sur l'identification de la présence d'un marqueur macroscopique présentant une faible interaction non-spécifique avec la surface. Les surfaces ainsi obtenues sont, de préférence, revêtues d'une macromolécule à activité biologique choisie parmi: - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés. Parmi les protéines, il faut citer les antigènes et les anticorps, les ligands, les récepteurs, mais également des produits de type avidine ou streptavidine ainsi que les dérivés de ces composés. Parmi les ARN et les ADN, il faut également citer les dérivés p ainsi que les dérivés thio et les composés mixtes tels que les PNA. On peut également fixer des composés mixtes tels que les glycopeptides et les lipopolysaccharides par exemple, ou bien d'autres éléments tels que virus, cellules notamment, ou composés chimiques tels que la biotine. La fixation des macromolécules biologiques peut être covalente ou noncovalente, par exemple par absorption, liaisons hydrogènes, interactions hydrophobes, ioniques, par exemple, auquel cas on pourra procéder avantageusement à un pontage ('cross-linking') entre les molécules greffées par les méthodes connues ('Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) et ceci afin de renforcer leur cohésion. Comme cela a été mentionné précédemment, il est possible d'avoir un groupement exposé qui permet la réaction directe avec les molécules à activité biologique, mais il est également possible de prévoir que le groupement exposé est traité, après fixation, pour être transformé, comme cela a été indiqué précédemment, en un radical hydroxy, amine, alcool, aldéhyde, cétone, COOH ou dérivé de ces groupements avant la 20) fixation de la molécule biologique. Lorsque de tels groupements ont été exposés, les techniques de fixation des protéines et/ou de l'ADN, par exemple, sont connues, il s'agit en effet de réactions mises en oeuvre pour des surfaces qui sont déjà utilisées dans le cadre des analyses biologiques, notamment pour les surfaces Costar et les surfaces Nunc ou des microbilles telles qu'Estapor, Bang et Dynal par exemple, sur lesquelles on ancre des molécules d'intérêt biologique, ADN, ARN, PNA, protéines ou anticorps par exemple. Dans le cas o le groupement exposé est un radical -CH=CH2 qui est nommé ci-après 'surface C=C' ou 'surface à liaison éthylénique', il n'existe pas de document mentionnant l'ancrage direct, en particulier de l'ADN ou des protéines. Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que ces surfaces présentent une réactivité pour des acides, non-ionisés tels que COOH,-PO3H2, alors qu'ils ne présentent que pas ou peu d'affinité pour les espèces anioniques correspondantes, cette particularité permet d'ancrer les acides nucléiques ou les protéines en utilisant des zone de pH et souvent avec une vitesse de réaction qui peut être contrôlée par le pH. Ainsi, pour l'ADN à pH 5,5, la réaction d'ancrage est totale en une heure (si pas limitée par la diffusion) et se produit par les extrémités 5'. A pH 8, par contre, l'accrochage est très faible (vitesse de réaction de 5 à 6 ordres de grandeur plus faibles). Cet effet d'accrochage pH dépendant et 5' spécifique) présente une amélioration par rapport aux autres surfaces qui nécessitent une fonctionnalisation de l'ADN (biotine, DIG, NHS, ...) ou des réactifs spécifiques (carbodiimide, diméthyle pimélidate) qui réalisent une liaison peptidique ou phosphorimide entre -NH2 et-COOH ou -POOI-LH Il va de soi que la présente invention implique, dans le même esprit, l'accrochage éventuellement pH dépendant de toutes macromolecules d'intérêt biologique caractérisées en ce qu'elles présentent au moins un site réactif avec un proton mobile. De même ces surfaces C=C peuvent ancrer des protéines directement (protéine A, anti-DIG, anticorps, streptavidine, etc.). Il a été observé que (i) l'activité de la molécule peut être préservée et (ii) que la réactivité de la surface préparée (initialement C=C) est totalement occultée pour faire place à la seule réactivité de la molécule d'intérêt. Il est donc possible, à partir d'une réactivité chimique initiale relativement large, de passer à une surface possédant une réactivité très hautement spécifique, par exemple celle de sites spécifiques sur une protéine. En greffant un anticorps spécifique sur la surface (par exemple anti-DIG), on crée une surface dont la réactivité est limitée à l'antigène (par exemple le groupement DIG). Ceci indique que les groupements chimiques initiaux ont tous été occultés par les anticorps greffés. On peut aussi greffer sur les surfaces réactives (chimiquement ou biochimiquement) d'autres molécules à activité biologique, notamment des virus ou d'autres composants: membranes, récepteurs membranaires, polysaccharides, PNA, notamment. Il est également possible de fixer le produit d'une réaction d'intérêt biologique (par exemple la PCR) sur les surfaces préparées. Le procédé selon la présente invention permet la mise en évidence et/ou laquantification de molécules biologiques, mais également la séparation de certaines molécules biologiques, notamment un prélèvement par mise en oeuvre des techniques de couplage antigène/anticorps et/ou ADN/ARN. En particulier, la présente invention a pour object un procédé de mise en évidence d'une macromolécule consistant en une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, selon la présente invention, caractérisé en ce que: - on met l'échantillon correspondant au solvant A, dans lequel ladite macromolécule est en solution, en contact avec la surface du support dans des conditions de formation d'un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou de formation du produit de réaction protéine/protéine, - l'hybride ou le produit de réaction étant marqué, on l'étire par déplacement du ménisque créé par le contact du solvant avec la surface pour orienter les macromolécules et on effectue la mesure ou l'observation des macromolécules ainsi orientées. Pour la préparation des surfaces hautement spécifiques telles que décrites précédemment pour l'obtention des couches selon (A) et (B) 32 et, en particulier, le procédé consiste en ce que: - on fixe sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins: un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et le groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant éventuellement après une modification chimique suivant la fixation, une affinité pour un type de molécule biologique. Le passage du ménisque, en étirant linéairement les molécules, sous forme de bâtonnets, les rend plus facilement détectables si elles sont marquées. Comme elles présentent un signal corrélé et d'orientation uniforme de par leur étirement, elles sont en effet distinctes du bruit environnant. Il est donc facile d'ignorer les poussières, les inhomogénéités, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particulière. L'alignement est aussi intéressant car en solution, les molécules en pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraîne des variations très importantes de leur signal de fluorescence recueilli de préférence avec une faible profondeur de champs et limite leur observation. La présente invention permet donc l'observation de molécules isolées avec un très grand rapport signal sur bruit. (S/N). Les molécules étirées peuvent être révélées par différentes méthodes enzymologiques ou autres, telles la fluorescence ou l'utilisation de sondes chaudes ou froides. Leur détection peut se faire par mesure d'un signal global (par exemple la fluorescence) ou par observation individuelle des molécules par microscopie optique à fluorescence, microscopie électronique, méthodes à sondes locales (STM, AFM, etc.). Ainsi de façon générale, la présente invention permet la mise en évidence, la séparation et/ou le dosage d'une macromolécule à activité biologique dans un échantillon, par un procédé caractérisé en ce qu'on utilise une surface sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaître la macromolécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence, la séparation ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée ou ladite macromolécule. Parmi les réactifs on distingue les réactifs fluorescents et les réactifs non-fluorescents. Les réactifs fluorescents contiennent des molécules fluorescentes, choisies avec avantage pour être des molécules longues de taille supérieure à 0,1 gm et réagissant de manière spécifique directement ou indirectement avec les surfaces prétraitées. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, une molécule d'ADN double brin teintée à l'aide de sondes fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents, etc.) pouvant s'ancrer directement sur une suface C=C, ou par une modification de la molécule (DIG, biotine, etc.) sur une surface présentant des protéines complémentaires (anti-DIG, streptavidine, etc.). Les réactifs non-fluorescents consistent, notamment, en des billes ancrées par l'intermédiaire d'une molécule fixée de manière spécifique directement ou indirectement à une surface prétraitée. Grâce au traitement des surfaces, ces billes présentent une faible interaction non- spécifique avec la surface. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, on peut citer des billes Dynal recouvertes de sptreptavidine et ancrées par l'intermédiaire d'un ADN biotynilé à une surface selon la présente invention, présentant des sites capables de réagir avec l'autre extrémité de la molécule d'ADN. Selon que la molécule recherchée est détectée directement par fluorescence ou indirectement à l'aide des réactifs ci-dessus, on parlera de 'détection directe' ou 'par drapeau'. Afin de limiter les problèmes associés à des temps de réaction trop lents, on peut avantageusement réduire les temps de diffusion des réactifs vers la surface en utilisant de petits volumes de réaction. Par exemple, mais sans s'y limiter, en conduisant la réaction dans un volume de quelques microlitres déterminé par l'espacement entre deux surfaces dont l'une est traitée pour présenter des sites réactifs selon la présente invention et l'autre est inerte ou traitée pour ne pas présenter de sites réactifs. La détection du nombre de réactions spécifiques s'étant produites peut être réalisée sur un petit nombre de molécules (typiquement 1 à 1 000), par un test physique macroscopique faible bruit ne nécessitant ni microscope électronique ni radioactivité ni nécessairement la PCR. Les procédés d'alignement et de détection selon la présente invention sont susceptibles d'être mis en oeuvre par des personnes n'ayant qu'une expérience de laboratoire réduite. Selon le réactif, deux mises en oeuvre de la présente invention (mode X et mode Y) sont utilisables pour la détection macroscopique faible bruit d'un petit nombre de réactions d'ancrage du réactif. Dans la mise en oeuvre dite de mode X de la présente invention, un test du nombre de réactions spécifiques s'étant produites est obtenu directement par une technique de fluorescence, permettant pour certaines formes de la réalisation de la présente invention d'identifier individuellement le nombre de sites ayant réagi. Dans ce cas, la surface est prise avantageusement pour présenter un taux très faible de fluorescence, notamment le support doit présenter une faible fluorescence. Après ancrage du réactif fluorescent, la détection et le comptage du nombre, éventuellement petit, de réactions d'ancrage peut se faire avantageusement avec l'aide d'un microscope optique à fluorescence utilisant un objectif à grande ouverture numérique, permettant de repérer soit directement à l'oeil, soit après acquisition de signal, le nombre de molécules fluorescentes ancrées ou encore avec un système de photométrie. On peut également avoir recours à un déplacement automatisé de l'échantillon. De même, on peut prévoir des moyens de calcul associés permettant une analyse des données. On peut avantageusement procéder à un balayage du champ d'observation pour explorer une plus grande surface que le seul champ fixe. Dans la mise en oeuvre dite de mode Y de la présente invention, on détecte un réactif macroscopique de type bille (fluorescente, magnétique, colorée, par exemple). Une telle technique est dérivée de Manning et al. en ce sens que la réaction est révélée par la présence ou l'absence de microbilles. La nouveauté du procédé est liée à l'utilisation: (i) de billes à réactivité spécifique, (ii) à l'utilisation, de billes de tailles non pas nanoscopiques mais se situant dans la gamme 0,1 pm-200 Nim, décelables par une technique macroscopique, et (iii) à l'absence de réaction non-spécifique entre billes et surface due à l'utilisation du produit selon la présente invention. Le nombre de ces billes macroscopiques caractérisant chacune une réaction d'ancrage est ensuite déterminé par une méthode physique macroscopique au rang desquelles, mais sans s'y limiter, on peut citer la diffusion de lumière sur les billes, la microscopie optique et la fluorescence des billes. La spécificité de certaines réactions biologiques peut être limitée. Ainsi, dans le cadre de l'hybridation, les hybrides peuvent être imparfaits (réactions avec d'autres sites) tout en présentant un nombre réduit d'appariement et donc une qualité de liaison moindre. La présente invention couvre également l'utilisation possible d'une étape de test de la qualité des liaisons obtenues. Ce test permet de dissocier les produits appariés de façon non-spécifique faible, par absorption, forces hybrophobes, liaisons hydrogènes imparfaites, hybridation imparfaite, notamment. C'est pourquoi, l'invention concerne également dans un procédé de mise en évidence ou de dosage tel que décrit précédemment, un procédé o l'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection. Ce procédé offre, outre la possibilité de détruire les couples mésappariés, la possibilité d'orienter les produits du couplage, ce qui facilite les mesures ou les observations. On peut ainsi appliquer aux surfaces, après fixation des éléments complémentaires, une contrainte qui peut être constituée par l'utilisation simple ou combinée de: - centrifugation, - gradient de champ magnétique appliqué aux réactifs non- fluorescents pris alors pour inclure des microbilles magnétisables ou magnétiques, - agitation, - écoulement liquide, - passage de ménisque, - électrophorèse - variation de température, et/ou gradient de température. On détermine alors par les techniques de détection faible bruit décrites ci-après le nombre de systèmes étant restés intègres ou s'étant détruits. Il convient de remarquer que grâce aux surfaces selon la présente invention, il est possible d'orienter les molécules après leur fixation par passage du ménisque air/eau, notamment sur de l'ADN. Ainsi, on a remarqué que le passage du ménique air/eau sur de l'ADN en solution et ancré à la surface, résultait en une extension régulière des molécules ancrées. Elles se présentent alors à l'air libre sous forme de bâtonnets fluorescents allongés. Ces molécules allongées sont stables à l'air libre et peuvent être observées même après plusieurs semaines, sans présenter de dégradation apparente. Ces observations remarquables et inattendues suggèrent une possibilité de compter le nombre de molécules d'ADN ancrées à la surface: d'une part, les surfaces étant très peu fluorescentes, le rapport signal/bruit (S/N) est bon, d'autre part, recherchant un objet très corrélé (forme de bâtonnets), il est très facile d'augmenter le rapport S/N. C'est-à- dire, ignorer les poussières, les inhomogénéités, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particulière. Il faut noter qu'en solution, les molécules en pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraîne des variations très importantes de leur signal de fluorescence recueilli, en général, avec une faible profondeur de champ et limite leur observation. La présente invention couvre aussi cette technique d'alignement et d'immobilisation qui permet donc l'observation de molécules isolées avec un très grand rapport S/N. nl est remarquable que ce rapport est indépendant du nombre de réactions d'ancrage. Le rapport S/N posé par la détection d'une molécule est le même que pour 10 000. De plus cette technique d'étirement permet de discriminer aisément entre des molécules de longueurs variées. On peut avantageusement procéder aux étapes suivantes pour améliorer encore le rapport S/N: - La molécule étant immobile, on peut intégrer son signal de fluorescence. - L'observation au microscope présente un champ réduit (typiquement 100 im x 100 Fm avec un objectif x 100 à immersion, N.A. = 1. 25). Pour un échantillon de 1 cm2 on peut soit procéder à un balayage, soit envisager l'utilisation d'objectifs d'agrandissements moindres (x 10 ou x 20) mais d'ouverture numérique élevée. - Les bâtonnets étant toujours parallèles, on peut envisager une méthode de filtrage spatial optique pour augmenter encore le rapport S/N. - D'autres méthodes de fluorescence globale sont envisageables telles que celles décrites dans la demande de brevet européen EP # 103426. - La linéarisation des molécules s'observe aussi bien dans le cadre d'un greffage chimique (C=C) que dans le cas de liaisons de type immunologique (DIG/anti-DIG). - Une fois la surface à l'air libre, les molécules d'ADN sont stables (restent intègres, même après plusieurs semaines) et fluorescentes. On peut avantageusement utiliser cette propriété pour différer l'étape d'ancrage de l'étape de repérage/comptage des molécules ancrées, si cette détection se fait par exemple, mais sans s'y limiter, par microscopie à fluorescence. Une telle utilisation est couverte par la présente invention. - Une technique de double (ou multi) fluorescence peut éventuellement servir à améliorer le rapport S/N ou à détecter une double fonctionnalité. 20) Les techniques d'alignement et de détection décrits selon la présente invention peuvent être utilisés pour de nombreuses applications parmi lesquelles, mais sans s'y restreindre: - l'identification d'un ou plusieurs éléments de séquençage d'ADN ou d'ARN que l'on peut utiliser avec avantage pour le diagnostic de pathogènes ou la cartographie génétique; - la mesure de la taille de fragments d'ADN que l'on peut utiliser avec avantage pour la cartographie génétique; - l'amélioration de la sensibilité des techniques d'ELISA avec la possibilité de détecter un faible nombre (éventuellement inférieur à 1 000) de réactions immunologiques. L'identification de séquences d'ADN/ARN peut se faire d'abord par réaction dans le volume de la solution des molécules d'ADN/ARN avec des sondes complémentaires (par exemple par hybridation ou à l'aide de protéines spécifiques du segment recherché). Deux modes d'opération sont alors possibles. En ce qui concerne la détection de réaction, comme seules les molécules ancrées à la surface sont étirées par le ménisque, les autres étant entraînées par celui-ci, cette méthode peut servir pour détecter l'existence d'un ancrage spécifique entre la molécule et la surface, donc d'une réaction biologique, par exemple ELISA. Ainsi on peut utiliser un ADN (ou un autre polumère) fluorescent comme marqueur de réaction (par exemple en le couplant à un élément de reconnaissance d'une réaction immunologique de type ELISA) et estimer le nombre de réactions par un décompte du nombre de molécules étirées à la surface, (le seuil de détection est inférieur à 1000 réactions). On peut aussi utiliser la présente invention pour la détection de la présence d'un pathogène par exemple par hybridation de l'ADN à un oligonucléotide complémentaire capable de s'ancrer spécifiquement à une surface puis dénombrement des ADN ainsi étirés à la surface. En ce qui concerne la cartographie moléculaire, l'étirement de la molécule peut de plus être utilisé pour détecter un motif donné le long de celle-ci, comme par exemple en cartographie génétique. Ainsi, par exemple, un ADN marqueur d'environ 3000 paires de bases et ayant en une de ses extrémités un segment simple brin complémentaire du gène recherché, est teinté avec un fluorofore A. Cet ADN est hybridé avec l'ADN simple brin à cartographier, puis ce dernier est teinté avec un deuxième fluorofore B (après réaction par random priming, pour le transformer en ADN double brin). La molécule est alors ancrée par une de ces extrémités et étirée par l'action du ménisque. La distance entre l'extrémité de la molécule et la position du gène marqué, observable en microscopie par double fluorescence (2 couleurs A et B), permet d'établir la position du gène recherché avec une précision de l'ordre de 1000 paires de bases (0,3 microns). Une autre possibilité est l'utilisation des techniques de FISH et de DIRVISH (Parra et Windle) pour faire de la cartographie sur des molécules déjà étirées. La présente invention a également pour objet une surface avec macromolécule alignée obtenue par le procédé d'alignement selon l'invention en particulier, on peut obtenir une surface ayant des propriétés électriques ou optiques anisotropes. La description qui va suivre, est faite en se référant aux figures annexées sur lesquelles: - la figure 1 schématise la détection d'un pathogène dans une molécule d'ADN fluorescente par hybridation avec une molécule ancre; - la figure 2 schématise la cartographie génétique par extension de l'ADN et l'utilisation d'un ADN marqueur; - la figure 3 schématise la détection d'une réaction immunologique (ELISA) à l'aide d'une molécule 'drapeau': un ADN fluorescent utilisé comme marqueur de réaction; - la figure 4 est une microphotographie de fluorescence montrant l'extension d'ADN de phage. par l'avancée du ménisque, à gauche on aperçoit des molécules d'ADN en solution étirées par l'écoulement d'évaporation parallèle au ménisque, à droite des molécules d'ADN à l'air libre après leur étirement perpendiculairement au ménisque; - les figures 5(a) et 5(b) sont des microphotographies de fluorescence montrant, respectivement, un ADN marqué à la digogixénine (DIG) sur une surface recouverte d'anti-DIG et étiré par le ménisque, et, en contrôle, un ADN non marqué sur une surface anti-DIG, on remarquera la très grande spécificité des surfaces et l'absence d'ancrage non-spécifique; - la figure 6 représente le schéma de l'étalement de l'ADN par passage du ménisque. L'ADN en solution est ancré sur une surface traitée. La solution d'ADN est recouverte d'une lamelle ronde non- traitée; - la figure 7 représente l'histograme des longueurs pour un mélange d'ADN- . et de ses multimères. On identifie les pics correspondant à la position du monomère (16 pm), du dimère (32 mm) et du trimère (48 gim). Les autres pics correspondent à un fractionnement des molécules pendant leur manipulation. Cette figure démontre l'homogénéité de l'étirement. Dans le mode 'diagnostic', les sondes (les 'ancres') possèdent un groupement réactif (DIG, biotine, etc.) capable de s'ancrer de manière spécifique à une surface selon la présente invention (ayant par exemple comme site d'ancrage un anticorps anti-DIG ou la streptatividine). La détection de la réaction d'ancrage peut se faire directement par détection de la fluorescence de la molécule d'ADN teintée par des molécules fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents) (figure 1). Elle peut aussi se faire indirectement par détection d'une "molécule drapeau' : un réactif selon la présente invention capable de se fixer sur la molécule d'ADN/ARN (par exemple par hybridation, interaction protéine-ADN, etc.), mais ne présentant pas d'affinité pour les sites d'ancrage de la sonde. Dans le mode 'cartographie', les sondes complémentaires sont directement couplées à un réactif fluorescent selon la présente invention. Il peut s'agir par exemple d'un simple brin d'ADN complémentaire possédant des bases modifiées pour être fluorescentes ou d'un long double brin d'ADN teinté avec un fluorophore A et se terminant par un segment simple brin complémentaire de la séquence recherchée. Pour des sondes différentes, des fluorophores de différentes couleurs 2) peuvent être utilisés. On peut aussi, avec avantage, teindre la molécule d'ADN sur laquelle les sondes viennent s'hybrider avec un fluorophore d'une autre couleur. L'hybride ADN-sondes est ancré en l'une de ses extrémités et étiré par une des méthodes décrites précédemment. La distance du point d'ancrage aux points d'hybridation,ou entre les points d'hybridations, est déterminée par la détection de la fluorescence de la sonde, suivant les méthodes décrites précédemment (figure 2). Par exemple, sans pour autant s'y limiter, un ADN marqueur, d'environ 3 000 paires de bases et ayant en une de ses extrémités un segment simple brin complémentaire du gène recherché, est teinté avec un fluorophore A (par exemple YOYO1). Cet ADN est hybridé puis ligué avec l'ADN simple brin à cartographier, puis ce dernier est teinté avec un deuxième fluorophore B (POP01) (après réaction par 'random primming', pour le transformer en ADN double brin). La molécule est alors ancrée par une de ses extrémités (par exemple par liaison DIG/anti-DIG) et étirée par l'action du ménisque. La distance entre l'extrémité de la molécule et la postion du gène marqué, observable en microscopie par double fluorescence (2 couleurs A et B) permet d'établir la position du gène recherché avec une précision de l'ordre de 1 000 paires de bases (0,3 gnm). L'identification de séquences d'ADN/ARN peut aussi se faire par réaction entre la séquence recherchée et les sites réactifs d'une surface selon la présente invention (par exemple des oligonucléotides complémentaires ou le site de réaction d'une protéine spécifique du segment recherché). La détection de la réaction d'ancrage peut alors se faire directement ou indirectement (à l'aide d'une 'molécule drapeau") comme décrit précédemment. Il est bien entendu que l'identification de séquences d'ADN/ARN suivant la présente invention peut aussi bien servir à des fins de diagnostic (par exemple la détection de la présence ou l'absence d'un pathogène viral ou chromosomique) qu'à des fins de cartographie génétique. Elle peut être précédée d'une étape d'amplification par une méthode quelconque, notamment la PCR Par ailleurs, comme mentionné par K.R. Allan et al. (US 84 114), La cartographie génétique peut procéder par une mesure de la 2J taille de fragments d'ADN. Or le couplage entre les surfaces selon la présente invention et les techniques originales d'étirement des molécules décrites plus haut (en particulier et avec avantage l'étirement par le ménisque) permet une mesure de la longueur des molécules étirées et cela sur un très petit échantillon (quelques milliers de molécules). On peut, par exemple, mais sans sy restreindre, procéder de la manière suivante: Un échantillon d'ADN est fragmenté (à l'aide d'enzymes de restriction), teinté avec un fluorophore puis ancré sur une surface présentant des groupements réactifs (par exemple les surfaces C=C). Les molécules sont ensuite étirées par le ménisque et la taille des fragments étirés déterminée par microscopie optique à fluorescence avec une résolution et une taille limite de l'ordre de 1 000 bp (0,3 pm) (voir Fig. 7). Les surfaces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre des procédés connus permettant la mise en évidence et/ou la quantification d'un antigène ou d'un anticorps, notamment les méthodes ELISA mettant en oeuvre des systèmes enzymatiques ou des méthodes de type RIA mettant en oeuvre des marqueurs radioactifs. Il s'agit là de technologies qui ne seront pas redécrites en détail. On peut aussi et avantageusement utiliser les surfaces selon la présente invention comme support des réactions immunologiques d'un procédé ELISA possédant une étape d'ancrage d'un réactif selon la présente invention ("drapeau') sur l'un des réactifs de l'ELISA (figure 3). La détection peut naturellement se faire de façon globale par mesure de fluorescence. Il est possible aussi de procéder au comptage du nombre de réactions, ceci peut avantageusement s'effectuer suivant les méthodes de détection décrites dans la présente invention, en particulier l'extension par le ménisque, et ceci grâce au faible taux de fluorescence et d'interaction non-spécifique du produit de la présente inention. Ceci permet la détection d'un petit nombre de réaction, éventuellement inférieur à 1 000) avec un excellent rapport S/N. On peut donc, par une modification mineure des méthodes ELISA en sandwich (anticorps-antigène-anticorps modifié, par exemple biotynilé), venir greffer sur la surface un réactif selon la présente invention, par exemple de l'ADN fluorescent ancré à la streptavidine. Toutes les variantes de la technique ELISA s'appliquent avec une sensibilité bien meilleure. Des techniques de mesure de fluorescence globale sont déjà utilisées pour déterminer la qualité des réactions d'ELISA. Cependant, le procédé selon l'invention permet une détection bien meilleure car sensible au signal de fluorescence d'une seule molécule. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après. Matériels et méthodes L'ADN-X et l'anticorps monoclonal (Anti-DIG) proviennent de Boehringer-Mannheim. Les trichlorosilanes proviennent de Roth- Sochiel. Les sondes nucléiques fluorescentes (YOYO1, YOYO3 et POPO1) proviennent de Molecular Probes. Les lamelles de verre ultrapropres proviennent de Erie Scientific (Lamelles (ESCO). Les particules magnétiques proviennent de Dynal. Le microscope est un microscope inversé Diaphot de NIKKON, équipé d'une lampe Xenon pour l'épi- fluorescence et d'une caméra CCD intensifiée Hamamatsu pour la visualisation. Traitement de surface Des lamelles de verre sont nettoyées pendant une heure par irradiation UV sous atmosphère d'oxygène (par formation d'ozone) . Elles sont ensuite immédiatement déposées dans un dessicateur préalablement purgé de traces d'eau par un courant d'argon. Un volume d'environ 100 à 500 1il du trichlorosilane approprié (H2C=CH-(CH2)N-SiCl3 est introduit dans le dessicateur, d'o les surfaces sont retirées après environ 12 heures (n = 6) ou 1 heure (n = 1). Au sortir les surfaces sont nettes et non- mouillantes. Les groupes fonctionnels de ces surfaces double liaison (H2C=CH-) peuvent être transformés en groupements carboxyles (-COOH) en trempant les lamelles traitées, comme décrit précédemment, pendant une dizaine de minutes dans une solution de 25 mg KMnO4, 750 mg NalO4 dans 1 1 d'eau, puis en les rinçant trois fois dans de l'eau ultrapure. Les lamelles ainsi fonctionnalisées peuvent réagir avec des protéines. Un volume de 300 il d'une solution aqueuse (20 psg/ml) de protéines (protéine A, streptavidine, etc.) est déposé sur une lamelle fonctionnalisée en groupement (H2C=CH-). Cette lamelle est incubée environ deux heures à température ambiante, puis rincée trois fois dans de l'eau ultrapure. Les surfaces ainsi traitées sont nettes et mouillantes. Les surfaces traitées à la protéine A peuvent ensuite réagir avec un anticorps, par exemple anti-DIG, par incubation dans une solution de 20 !g/ml d'anticorps. Ancrage d'ADN natif sur surface double liaison Une goutte de 2 gl d'une solution d'ADN-1 marqué par fluorescence (YOYO1, POPO1 ou YOYO3, mais sans terminaison particulière) de concentration variable et dans différents tampons (nombre total de molécules 106. Cette dépendance peut permettre le contrôle de l'activation/désactivation des surfaces (vis-à-vis de l'ADN) par l'intermédiaire du pH. Alignement et détection de l'ancrage par l'action du ménisque En transférant la préparation précédente dans une atmosphère sèche, la solution en s'évaporant va étirer les molécules d'ADN, ancrées à la surface, perpendiculairement au ménisque. La force capillaire sur la molécule d'ADN (quelques dizaines de picoNewtons) est en effet suffisante pour étirer complètement la molécule (plus grande que les forces d'élasticité entropique), mais trop faible pour briser la liaison covalente entre l'extrémité de la molécule et la surface traitée. L'ADN étant marqué par fluorescence, on observe individuellement et aisément les molécules étirées (longueur totale environ 20 pm). L'ancrage entre la surface et l'ADN étant limité aux extrémités 5'-phosphate, on a pu aussi bien étirer des ADN de phage X, de YAC ou de E coli (longueur totale supérieure à 400 gm). Cette préparation d'ADN étirés, fluorescents et à l'air libre est stable pendant plusieurs jours et peut être observée de façon non destructive, par épifluorescence (microscope inversé Nikkon Diaphot avec objectif x100, O.N.: 1.25). Ancrage et détection spécifiques En traitant les surfaces comme décrit précédemment avec un anticorps monoclonal spécifique, on peut contrôler très précisément leur spécificité. Ainsi, on a testé la spécificité de surfaces traitées anti- DIG vis- à-vis d'ADN-).hybridés avec un oligonucléotide complémentaire d'une des extrémités Cos et possédant un groupement digoxigénine (DIG) et vis-à-vis d'ADN non hybridés. Dans le premier cas, on a observé une extension, par action du ménisque, quasi-générale des molécules ancrées. Dans le second cas, on n'a observé que quelques molécules d'ADN ( Sensibilité de la détection Afin de déterminer la sensibilité de la méthode de détection par extension du ménisque, on a déposé sur des surfaces double liaison des gouttes de 2,5 pI d'une solution d'ADN-. dans 0,05 M MES (pH = 5,5) contenant un total de 105, 104 et 1 000 molécules. L'ancrage s'effectue comme décrit précédemment. Les lamelles sont ensuite observées en microscopie par épifluorescence, pour déterminer la densité de molécules ancrées. Celle-ci correspond bien à celle estimée: environ 46 molécules d'ADN par champ de vision (100 pm x 100 pie) pour un total de 105 molécules d'ADN. Pour la plus faible concentration, on a pu observé une dizaine de molécules étendues par action du ménisque. Ce nombre est essentiellement limité par le grand nombre de champs de vision nécessaires à couvrir tout l'échantillon (environ 25 000), ce qui rend une recherche manuelle difficile, mais peut être avantageusement effectuée automatiquement et avec un objectif plus faible, mais à plus grand champ. En conclusion, la sensibilité de la méthode selon l'invention permet une détection et un comptage individuel de moins de 1 000 molécules d'ADN. Dépoendance de l'étirement sur le traitement de surface L'histogramme des longueurs de l'ADN-X. greffé sur une surface silanisée montre un pic bien défini à 24 mn alors que sur une surface recouverte de protéine A/antiDIG, l'histogramme des longueurs d'ADN-X (marqué en son extrémité par une Digoxigénine), ne fait apparaitre qu'un pic à 16 im. L'étirement dépend donc du traitement de surface. Homogénéité de l'étirement (Figure 7) Afin de déterminer si l'étirement est homogène (indépendant de la longueur de la molécule), une solution de multimers d'ADN-x est préparée à l'aide d'une ligase. Cette solution est greffée sur des surfaces silanisées puis étendue par l'action du ménisque. L'histogramme des longueurs des molécules étirées montre trois pics équidistants correspondant à la longueur des monomères, dimères et trimères. L'étirement par le ménisque est donc bien homogène. REVENDICATIONS 1. Procédé d'alignement de macromolécule(s) sur la surface S d'un support, caractérisé en ce que l'on fait se déplacer sur ladite surface S la ligne triple S/A/B/ (ménisque) résultant du contact d'un solvant A avec la surface S et un milieu B, lesdites macromolécules ayant une partie, notamment une extrémité, ancrée sur la surface S, l'autre partie, notamment l'autre extrémité, étant en solution dans le solvant A. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déplacement du ménisque se fait par évaporation du solvant A. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déplacement du ménisque se fait mécaniquement par déplacement relatif de l'interface A/B par rapport à la surface S. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ménisque est un ménisque eau-air. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'un agent tensio actif est ajouté dans le solvant A, ou le milieu B 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support est constitué par du verre, de la silice, un polymère ou de l'or. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le support est sous forme de plaque ou de fibre, ou sous forme de particules. & Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le solvant A dans lequel les macromolécules à aligner sont en solution est placé entre deux supports, dont un au moins correspond audit support de surface S, et le ménisque est déplacé soit par évaporation, soit en déplaçant les deux supports l'un par rapport à l'autre. ... /... 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le support ne présente que peu ou pas de fluorescence. 10. Procédé de mise en évidence, de séparation et/ou de dosage d'une macromolécule dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise un procédé d'alignement selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel se trouve fixée sur la surface S une molécule à activité biologique capable de reconnaître ladite macromolécule de l'échantillon et en ce que la mise en évidence, la séparation ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée ou ladite macromolécule. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que lesdites macromolécule et molécule à activité biologique sont choisies parmi les protéines, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés. 12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites macromolécule et molécule à activité biologique sont choisies parmi, les anticorps, les antigènes, les ADN et ARN, les ligands ou leurs récepteurs ainsi que leurs dérivés. 13. Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'ADN fixé comporte la séquence complémentaire d'une séquence d'ADN à isoler d'un échantillon. 14. Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la protéine fixée est capable de reconnaître et fixer spécifiquement une protéine à isoler d'un échantillon. 15. Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ladite molécule à activité biologique est choisie parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine, leurs dérivés ou un système antigène- anticorps. 16.l& Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisée en ce que la surface est à faible fluorescence et en ce que le réactif est fluorescent. 17. Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le réactif est constitué par des billes. 1& Procédé selon l'une des revendications 10 à 17, caractérisé en ce que la détection est faite par microscopie. 19. Procédé selon l'une des revendications 10 à 18, caractérisé en ce qu'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la macromolécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection. 20. Procédé de mise en évidence d'une macromolécule consistant en une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, selon la revendication 10, caractérisé en ce que: - on met l'échantillon correspondant au solvant A, dans lequel ladite macromolécule est en solution, en contact avec la surface du support dans des conditions de formation d'un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou de formation du produit de réaction protéine/protéine, - l'hybride ou le produit de réaction étant marqué, on l'étire par déplacement du ménisque créé par le contact du solvant avec la surface pour orienter les macromolécules et on effectue la mesure, l'observation des macromolécules ainsi orientées. 21. Procédé selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisé en ce que l'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont 'colorés' de façon différente et en ce que, après étirement, on mesure la position de la séquence complémentaire par rapport à l'extrémité de l'ADN de l'échantillon. 22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le support est constitué par une lamelle de verre et le ménisque est créé par une goutte d'eau que l'on déplace par évaporation ou par translation d'une deuxième lamelle appliquée par dessus la goutte d'eau. 23. Procédé selon la revendication 21 destiné à la cartographie des gènes. 24. Procédé selon l'une des revendications 12 à 23, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une méthode ELISA ou RIA. 25. Procédé selon l'une des revendications 12 à 23, caractérisé en ce que l'échantillon est le produit d'une amplification d'acide nucléique. 26. Procédé selon l'une des revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'on utilise un support présentant en surface au moins une couche compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant, éventuellement après modification chimique, une affinité pour ladite macromolécule ou une molécule à activité biologique capable de reconnaître ladite macromolécule, les autres éléments de la couche ne présentant que peu ou pas d'affinité pour lesdites macromolécules ou molécules. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que la couche compacte ne permet pas à ladite macromolécule ou molécule à activité biologique d'avoir accès aux couches inférieures et/ou au support. 2& Procédé selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que le support ne présente en surface que des groupements exposés présentant une affminité pour ladite macromolécule ou dite molécule à activité biologique, les autres groupements éventuellement présents étant pratiquement non-réactifs. 29. Procédé selon l'une des revendications 26 à 28, caractérisé en ce que le groupement exposé est un groupement comportant une double liaison. 30. Procédé selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que la surface est obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit groupement expose. 31. Procédé selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que la surface est obtenue par dépôt de polymère sur le support. 32. Procédé selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que la surface est obtenue par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé. 33. Procédé selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisé en ce que le polymère est un polymère à double liaison éthyléniqe. 34. Procédé selon l'une des revendications 30 à 33, caractérisé en ce que le polymère est une polyoléfine ou un dérivé polyénique. 35. Procédé selon l'une des revendications 26 à 34, caractérisé en ce que la surface comporte: - sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins: un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et 25. un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affminité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant éventuellement, après une modification chimique suivant la fixation, une affinité pour ladite macromolécule ou molécule à activité biologique. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la fixation est de type non-covalente. 37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la fixation est effectuée par des interactions hydrophiles ou hydrophobes. 3& Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que la couche sensiblement monomoléculaire et compacte est un film de LangmuirBlodgett. 39. Procédé selon l'une des revendications 35 à 37, caractérisé en ce que le groupement de fixation ou le groupement exposé sont choisis parmi les groupements alkyle et alkyle halogéné pour réaliser des liaisons hydrophobes. 40. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que le groupement de fixation ou le groupement exposé sont choisis parmi: -CH3, CF3,-CH2F, CHF2. 41. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la fixation est de type covalent. 42. Procédé selon l'une des revendications 26 à 41, caractérisé en ce que les composés organiques sont susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales. 43. Procédé selon l'une des revendications 26 à 42, caractérisé en ce que le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité. 44. Procédé selon l'une des revendications 35 à 42, caractérisé en ce que entre les groupements exposés et de fixation la ou les chaînes du composé organique sont sensiblement inertes. 45. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que les chaines du composé organique sensiblement inertes sont des chaînes saturées. 46 Procédé selon l'une des revendicatons 26 à 45, caractérisé en ce que le composé organique est constitué d'une chaîne essentiellement paraffinique comportant un groupement de fixation et un groupement exposé. . /.....CLMF: 47. Procédé selon l'une des revendications 26 à 46, caractérisé en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements de type silane, éthoxysilane, silanol, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide et aldéhyde. 48. Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que le groupement de fixation est susceptible de réagir transversalement avec un groupe équivalent voisin pour créer des liaisons transversales. 49. Procédé selon l'une des revendications 47 et 48, caractérisé en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les silanes, dichlorosilanes, trichlorosilanes, diéthoxysilanes et triéthoxysilanes. 50. Procédé selon l'une des revendications 26 à 49, caractérisé en ce que le groupement exposé est choisi parmi les radicaux éthyléniques, acétyléniques, ou des radicaux aromatiques, les amines primaires, secondaires ou tertiaires, les esters, les nitriles, les aldéhydes, les halogéno, les cétones. 51. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce que le groupement exposé est un radical éthylénique. 52. Procédé selon l'une des revendications 26 à 51, caractérisé en ce que la ou les chaines reliant le groupement exposé et le groupement de fixation sont des chaînes comportant au moins 1 atome de carbone, de préférence de 3 à 30 atomes de carbone. 53. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce que le groupement exposé est traité pour être transformé en groupe -CHO, -COOH, NH2 ou OH ou leurs dérivés réactifs avant la fixation de la molécule à activité biologique 54. Procédé selon l'une des revendications 12 à 25 dans lequel on réalise la fixation d'un acide nucléique ou d'une protéine sur une surface présentant des doubles liaisons, dans une zone de pH de fixation. 55. Procédé selon l'une des revendications 12 à 23 dans lequel on réalise la fixation de l'ADN sur une surface présentant des groupements à double liaison éthylénique, en mettant l'ADN en présence de la surface à un pH inférieur à 8. 56. Procédé selon la revendication 54, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 5 et 6 puis est stoppée à pH 8. 57. Surface avec macromolécule(s) alignée(s) obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 56. 5& Surface selon la revendication 57 ayant des propriétés électriques ou optiques anisotropes.