Brevet FR2721932A1 — publié le 19960105

La présente invention concerne une substance extraite de champignons comestibles de l'espèce Agaricus, de nature glycoprotéique, exerçant, selon la gamme de concentrations utilisées, un effet stimulateur ou un effet inhibiteur sur la prolifération de différents types cellulaires. L'invention concerne également les utilisations potentielles qui résultent de cette propriété de ladite substance, ainsi que son procédé de préparation. La toxicité de divers champignons a encouragé la recherche, à partir de leurs extraits, de substances à activité thérapeutique potentielle. Ainsi, récemment, une glycoprotéine a été isolée à partir du bolet satan, la bolésatine, qui présente des propriétés inhibitrices de la synthèse protéique et de la multiplication cellulaire (Kretz et al. Toxicology letters 64/65, 1992, 763-766). La Demanderesse a poursuivi des recherches du même type sur les champignons comestibles ordinaires, Agaricus campestris et Agaricus bisporus, pour évaluer si ceux-ci pouvaient devenir une source originale et économique de nouvelles substances intéressantes. Différentes fractions extraites empiriquement des champignons ont été évaluées pour leurs éventuels effets stimulateurs ou inhibiteurs sur la prolifération de quelques types de cellules en culture. Les fractions donnant des résultats visibles ont été retenues et mieux purifiées et analysées. Plus particulièrement, une substance présentant la propriété surprenante d'exercer à la fois un effet stimulateur sur la prolifération de divers types de cellules, à des concentrations de quelques nanogrammes par millilitre, et un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules, à des concentrations de quelques microgrammes par millilitre, a été identifiée puis caractérisée de manière plus approfondie. Cette double propriété de la substance a été utilisée comme marqueur pour mettre au point un procédé de préparation applicable à l'échelle industrielle et pour suivre sa purification au cours des étapes de ce procédé. Le procédé de préparation selon l'invention comprend: - l'utilisation comme matériau de départ de champignons comestibles de l'espèce Agaricus; - le broyage des champignons lavés et la mise en solution du broyat dans l'eau déminéralisée, sous agitation, puis l'élimination des déchets par centrifugation; - une filtration pour clarifier la solution puis une ultrafiltration pour la concentrer à environ 1 gramme d'extrait par litre; - deux séparations chromatographiques successives sur résine de type anionique sur laquelle la substance recherchée s'adsorbe; - l'élution de la substance en présence de NaCl à une concentration de 0,3 M à 0,8 M une étape de concentration de la solution éluée - une diafiltration et - la lyophilisation de la substance obtenue. La substance ainsi extraite, appelée CRS 33.011, a été caractérisée comme une glycoprotéine, d'une masse moléculaire d'environ 30. 000 daltons, dont le pH isoélectrique est voisin de 8,6. La séquence en acides aminés de l'extrémité N- terminale est la suivante: Ala-Val-Val-Gly-Gly-Ala-Ala-Thr-Leu..... L'effet stimulateur du CRS 33.011 sur la prolifération de divers type de cellules permet d'envisager son utilisation à titre de principe actif dans des compositions thérapeutiques et cosmétiques pour activer la prolifération ou la régénération cellulaire. De même son utilisation comme constituant de milieux de culture pour cellules peut avantageusement remplacer l'utilisation de certains facteurs de croissance. D'autre part, l'effet inhibiteur du CRS 33.011 sur la prolifération de divers types de cellules permet d'envisager son utilisation à titre de principe actif dans des compositions thérapeutiques pour inhiber la prolifération des cellules, en particulier des cellules cancéreuses. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1. Procédé de production de la molécule CRS 33.011. On utilise comme matière première des champignons de Paris (Agaricus bisporus), cultivés industriellement en champignonnière. La culture s'effectue sur du fumier de cheval composté auquel il est rajouté de l'azote minéral et du sulfate d'ammonium. Ce compost est pasteurisé à une température de 62 C pendant 12 heures, puis suit une phase à C durant 12 heures. Ces opérations durent 5 jours. Le compost ainsi obtenu est ensemencé de 0,8 % de mycélium. Cet ensemble est alors mis en couche et recouvert d'une légère couche de sable, dans une ancienne carrière, à l'abri de la lumière. La température intérieure de la carrière souterraine est en permanence de 18 C. La collecte des champignons peut débuter 30 jours après la mise en couche. La production est de 35 à 40 kg par mètre carré de couche. La cueillette s'échelonne sur une période de 4 à 5 semaines. Extraction des protéines brutes de champignon. Les champignons sont lavés à l'eau et égouttés, puis broyés à l'aide d'un broyeur MANHURIN (broyage 1 tonne/heure). Le broyat est ensuite mis en solution à raison de 1 kg de broyat/10 litres d'eau déminéralisée dans une cuve agitée à l'aide d'une turbine RAYNERI pendant une nuit à une température de 4 C. Ensuite, la solution est centrifugée sur un séparateur WESTPHALIA (à axe horizontal) à un débit de 500 litres/heure. Cette opération est répétée le lendemain afin de récupérer la plus grande quantité de protéines possible. La phase solide est écartée et détruite et la solution de protéines obtenue est clarifiée sur un filtre à plaques creuses. La solution ainsi obtenue est ensuite ultrafiltrée sur un ultra-filtre TECH-SEP avec un seuil de coupure de 10.000 daltons. La concentration en protéines est portée à 1 gramme/litre. La solution de protéines pourra soit être passée sur colonne pour purifier la fraction choisie, soit être conservée congelée pour être traitée ultérieurement ou lyophilisée. Purification de la molécule CRS 33.011 La purification est effectuée par chromatographie sur une résine de la société ROHM AND HAAS: IRA 900. Un prétraitement à l'aide d'une solution de NaOH à pH9 est effectué sur la résine. On utilise 1 litre de gel par litre de la solution de protéines à 1 gramme/litre. Le protocole de chromatographie est le suivant: - injection de la solution de protéines (1 litre/litre de résine) - rinçage de la colonne ayant fixé les protéines à l'aide de la solution de NaOH pH9 pour éliminer les molécules non adsorbées (1,5 litre/litre de résine) - élution de la colonne avec une solution de NaCl 0,3 M (volume d'élution = 1,5 litre/litre de résine) et récupération de l'éluat - élution de la colonne avec une solution de NaCl 1,2 M (1,5 litre/litre de résine) - rinçage de la colonne avec la solution de NaOH à pH9 (2 litres/litre de résine). Le cycle peut alors reprendre. Purification finale de l'éluat de la chromatographie: la solution est concentrée par ultra- filtration avec un seuil de coupure de 10.000 daltons, jusqu'à une concentration de 1 gramme de protéines/litre. Ensuite la solution est soumise à une dia- filtration contre de l'eau déminéralisée (1 litre de solution obtenue contre 30 litres d'eau déminéralisée) puis à un dessalage par ultra-filtration, avec un seuil de coupure de 25.000 daltons. En fin d'échange, la solution dia-filtrée est concentrée à 1 gramme/litre. Cette solution est ensuite chromatographiée sur une colonne d'IRA 900 dans les mêmes conditions que précédemment: - préparation de la colonne avec une solution de NaOH pH9(2 litres/litre de résine) - injection de la solution de protéines dia- filtrée (1 litre/litre de résine) - rinçage de la colonne par une solution de NaOH pH9 (1,5 litre/litre de résine). Élimination des protéines non fixées, - élution avec une solution NaCl 0,5 M (1,5 litre/litre de résine) et récupération de la fraction appelée CRS 33.011, - élution avec solution de NaCl 1,2 M (1,5 litre/litre de résine). Solution écartée, - injection de NaOH pH9 (2 litres/litre de résine). Nettoyage de la colonne. Le cycle de purification peut recommencer. La solution de CRS 33.011 est alors ultra-filtrée jusqu'à une concentration de 1 gramme par litre puis dia- filtrée contre de l'eau déminéralisée (1 litre de solution contre 30 litres d'eau déminéralisée). Cette solution est ensuite filtrée stérilement sur membrane 0,2 micron et lyophilisée. Le rendement du procédé est de 1,3 gramme de CRS 33.011 à partir de 100 kilogrammes de champignons. Exemple 2. Caractérisation de la molécule CRS 33.011. 1. Identification électrophorétique. Les électrophorèses réalisées sur gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes avec coloration au nitrate d'argent, font apparaître la molécule CRS 33.011 à une masse moléculaire voisine de 30.000 daltons. Les électrophorèses réalisées en présence d'un réducteur tel que le béta-mercaptoéthanol révèlent la même entité ce qui indique que le CRS 33.011 est une molécule monocaténaire. 2. pEi. La détermination du pH isoélectrique (pHi) a été effectuée par une technique d'approche c'est-à-dire par variation du pH des tampons d'élution à partir de colonnes échangeuses d'anions. Cette méthode a permis de situer le pHi entre 8,2 et 8,6. Ce pHi a ensuite été contrôlé par électrofocalisation ce qui a confirmé un pHi = 8,6. 3. Composition. 3.1. Par une analyse rapide, et par comparaison à d'autres molécules connues, le CRS 33.011 a été identifié comme une glycoprotéine. Ceci a été confirmé par des tests de compétition avec des sucres connus pour leur capacité de liaison aux membranes cellulaires suivie d'endocytose tels que le glucose, le galactose et le mannose. Ces sucres ont inhibé la cytotoxicité du CRS 33.011, ce qui indique que cette molécule possède au moins un ou plusieurs résidus de ces sucres lui permettant de se fixer aux récepteurs membranaires. 3.2 Composition en acides aminés totaux: Sur la base de la masse molaire d'environ 30.000 daltons, la composition en AA totaux a été établie comme suit: Es9 ACIDES AMINES NOMBRE MOLES % de RESIDUS D'ACIDES AMINES D'ACIDES AMINES par par MOLE de MOLE CRS 33.011 PROTELNE Asx 32 10,60 Gsx 33 10,92 Ser 20 6,62 Gly 26 8,61 1His 5 1,65 Arg 14 4,63 Thr 26 8,62 Ala 34 11,25 Pro 14 4,63 Tyr 8 2,66 Val 21 6,96 Met 5 1,66 Cys 0,66 Ile 14 4,63 Leu 25 8,28 Phe 10 3,31 Lys 12 3,98 Trp 1 0,33 Asx = asparagine + acide aspartique Glx = glutamine + acide glutamique 8 2721932 Il apparaît que le nombre de résidus d'acides aminés hydrophobes (39, 75%) et hydrophiles (36,76%) est pratiquement égal avec un pourcentage de proline (4,63%) relativement élevé. Ceci confère probablement à la molécule une structure globulaire et compacte. Cette organisation structurale assure à la molécule des propriétés de résistance aux protéases et de thermostabilité: - une incubation avec les protéases courantes comme la protéinase K, la trypsine, la chymotrypsine, la pronase, la protéase de staphylococcus aureus (V8), la pepsine ou la thermolysine, n'a aucunement altéré les propriétés biologiques du CRS 33.011. - un chauffage à 70 C pendant 1 heure n'a aucunement altéré les propriétés biologiques du CRS 33.011. 3.3 La séquence de l'extrémité N-Terminale suivante a été déterminée dans un séquenceur automatique: NH2 - Ala - Val - Val - Gly - Gly - Ala - Ala - Thr - Leu..... On constate que tous les acides aminés sont hydrophobes. 4. Spécificité anticénique. D'autres glycoprotéines isolées à partir de champignons ont été identifiées et leurs activités sur le métabolisme cellulaire ont été décrites, en particulier pour la bolésatine isolées à partir du bolet satan. Pour différencier la molécule CRS 33.011 de la bolésatine, des anticorps dirigés contre celle-ci (anticorps polyclonaux de lapins) ont été ajoutés dans les tests d'acitivité biologique du CRS 33.011 (tests d'inhibition ou de stimulation des cellules, comme décrits dans l'exemple 3). A des concentrations d'anticorps comprises entre 10 et 50 gg/ml, on n'observe aucune inhibition de l'activité du CRS 33.011. 9 2721932 emple 3. Propriétés biologiques du CRS 33.011. 1. Contrôle de l'absence de toxicité sur animaux. - Contrôle de la toxicité par voie orale chez le rat Wistar: Un extrait total de protéines d'Agaricus bisporus a été administré per os à un lot de 5 mâles et 5 femelles à la dose unique de 5g/kg. Il n'a été enregistré au cours de ce test aucune mortalité, aucun trouble du comportement des animaux mâles et femelles ni aucune perturbation de l'évolution pondérale au cours des 14 jours d'observation suivant l'administration unique. On peut donc conclure à l'innocuité de l'extrait de protéines totales d'Agaricus bisporus chez le rat par administration orale unique. - Contrôle de la toxicité par voie orale chez la souris Swiss: Le CRS 33.011 a été administré per os à 3 lots de 3 souris aux doses respectives de 3,3 et 300 mg/kg. Les animaux des 3 lots étaient de sexe femelle, et pesaient en moyenne 20 g, en début d'essai. Il n'a été enregistré aucune mortalité, aucun trouble du comportement ni d'anomalie de l'évolution pondérale. 2. Effets du CRS 33.011 sur la prolifération de différents types cellulaires in vitro. On a observé que l'addition, dans le milieu de culture habituel, de faibles concentrations de CRS 33.011 avait un effet mitogène sur divers types de cellules connues comme les cellules VERO (rein de singe), les fibroblastes de souris (primoculture), les fibroblastes humains (primoculture), les cellules MRC5 (lignée cellulaire de poumons de foetus humains), et les SIRC (lignée cellulaire de cornée de lapin). A titre d'exemples, les résultats obtenus après 48 heures d'incubation sur les cellules VERO et les fibroblastes de souris et humains sont présentés dans les tableaux suivants: 1) Fibroblastes de souris: Prolifération des fibroblastes de souris en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %) Nbre de cellules Ecart-type % de Prolifération Témoin 230 000 28 600 2,5 ngIml 243 000 35 200 - 6 ngiml 320 000 33 500 39 ng/ml 256 000 43100 - 11l Incorporation de 3H thymidine dans 1'ADN des fibroblastes de souris en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %) cpm Ecart-type]% de Prolifération Témoin 240 35 I 2,5ng/ml 187 2,5 - 30 ng/ml | 348 67 O1ng/ml 152 20 - 40 2) Fibroblastes humains: Prolifération des fibroblastes humains en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %) Nbre de cellules Ecart-tvpe % de Prolifération Témoin 12 1 000 22 000 2,Sng/ml 242 000 14 000 -100 ng/ml 1 258 000 55 000 113 lOng/ml i 208 000 22 000 + 72 Incorporation de 3H thymidine dans 1l'ADN des fibroblastes humains en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %) 2 cpm Ecart-type /% de Prolifération Témoin 1 130 140. 2,5ng/ml 1 424 30 - 26 ng/ml 1 700 72 +50 0lng/ml 1 427 234 26 3) Cellules VERO: Prolifération des cellules VERO en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %). Nbre de cellules Ecart-rype Pourcentage Témoin 212 583 Il 069 ng/ml s242 000 10279 i -14 ng!ml 276 666 13 697 - 30 lOn2/ml 326 166 10 104 -5 Incorporation 3H de thymidine dans l'ADN des cellules VERO en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 (serum de veau foetal 10 %). ____ _ | cpm Ecart-type Pourcentage Témoin 2 100 150 - 2,5na/ml 2 400 100 14 ng/ml I 2 700 125 9 ng/ml 3250 200 - 52 Dans toutes ces expériences, on constate un effet mitogène du CRS 33.011 manifesté par une prolifération cellulaire et par une incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules atteignant jusqu'à + 55 % après 48 heures d'incubation avec une dose optimale de CRS 33.011 se situant entre 5 et 10 ng/ml. En outre, les cellules ont toujours présenté un aspect et une réactivité biologique comparables à ceux des témoins. 3. Inhibition de la croissance de différents types cellulaires car le CRS 33.011. On a observé que l'addition, dans le milieu de culture habituel, de concentrations importantes de CRS 33.011 avait un effet inhibiteur sur l'incorporation de 3H- thymidine, indiquant un effet cytostatique ou cytotoxique sur différents types de cellules comme les cellules VERO et 2 lignées de cellules tumorales L1210 et P 388. Inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules VERO en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 cpm Ecart-tvpe % d'Inhibition Témoin 3840 260 - 0,04 Lg/ml 3 310 870 13 0,25 gg/ml I 660 T 360 56 0,37 u.g/ml 1190 70 69 0,56 g/ml i 1 670 480 56 0,84 ag/ml 1710 220 55 1 g/ml | I 270 240 67 Inhibition de l'incorportation de 3H-thymidine dans les cellules L1210 en présence de différentes concentrations de CRS 33.011 2 5 i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ | cpm |Ecart-type % d'inhibition Témoin 14 798 1 284 0,25uug/ml 14058 745 5 2.Sug/ml 9 412 587 34,8 , ug/ml 7 325 90 50,5 12,5ug/ml 734' 146 95 25.ug/ml 632 1l0 97 Inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules P388 en présence de différentes concentrations de CRS 33.011. cpm Ecart-rype % d'inhibition Témoin 2 560 413 0,25u.g/ml 2 545 | 435 - 2,5tguml 2380 630 7 Ugml 2 135 538 16 12.5u.g/ml l909 45 25 ig/ml 1 280 90 51 Toutes les déterminations ont été réalisées après 48 heures d'incubation. On observe un effet inhibiteur sur l'incorporation de 3H-thymidine dans les 3 types de cellules pour des concentrations de CRS 33.011 supérieures à 1 g g/ml. REVENDICATIONS 1. Substance extraite de champignons comestibles de l'espèce Agaricus, caractérisée en ce qu'elle est de nature glycoprotéique, qu'elle a une masse moléculaire voisine de 30.000 daltons, qu'elle présente un pHi voisin de 8,6 et qu'elle exerce un effet stimulateur à des concentrations de quelques ng/ml et un effet inhibiteur à des concentrations de quelques gg/ml, sur la prolifération de divers types de cellules. 2. Procédé de préparation de la substance selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: - l'utilisation comme matériau de départ de champignons comestibles de l'espèce Agaricus; - le broyage des champignons lavés et la mise en solution du broyat dans l'eau déminéralisée, sous agitation, puis l'élimination des déchets par centrifugation; - une filtration pour clarifier la solution puis une ultrafiltration pour la concentrer à environ 1 gramme d'extrait par litre; - deux séparations chromatographiques successives sur résine de type anionique sur laquelle la substance recherchée s'adsorbe; - l'élution de la substance en présence de NaCl à une concentration de 0,3 M à 0,8 M une étape de concentration de la solution éluée - une diafiltration et - la lyophilisation de la substance obtenue. 3. Utilisation de la substance selon la revendication 1 à titre de principe actif comme activateur de la prolifération cellulaire pour la préparation de compositions thérapeutiques. 4. Utilisation de la substance selon la revendication 1 à titre de principe actif comme activateur de la prolifération cellulaire pour la préparation de compositions cosmétiques. 5. Utilisation de la substance selon la revendication 1 à titre de principe actif comme inhibiteur de la prolifération cellulaire pour la préparation de compositions thérapeutiques.