Brevet FR2717187A1 — publié le 19950915

USAGE COMBINE DE DEUX CASSETTES D'EXPRESSION POUR LA PRODUCTION D'UNE PROTEINE D'INTERET. La présente invention se rapporte au domaine des biotechnologies, notamment à un perfectionnement apporté à la production d'une protéine hétérologue d'intérêt commercial ou thérapeutique dans une cellule eucaryote et, en particulier, une levure du genre Schizosaccharomyces. Elle concerne, en premier lieu, L'usage d'un gène codant pour un produit capable d'activer une région promotrice régulable par la thiamine, cette dernière gouvernant l'expression de la protéine d'intérêt et, en second lieu, une cassette d'expression dans laquelle le fragment d'ADN codant pour la protéine d'intérêt est placé sous le contrôle d'une région promotrice isolée ou dérivée du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe Depuis quelques années déjà, de nombreuses cassettes d'expression pour la production de protéines d'intérêt dans les cellules eucaryotes ont été décrites dans la littérature. Ces cassettes comprennent notamment une région promotrice fonctionnelle dans la cellule considérée. D'une manière générale, une région promotrice est située dans la région 5' flanquante des gènes et comprend l'ensemble des éléments permettant la transcription d'un fragment d'ADN placé sous leur dépendance. Une région promotrice peut également être constituée par l'assemblage d'éléments de diverses origines, fonctionnels dans la cellule hôte, comme notamment: - une région promotrice minimale comprenant la TATA box et le site d'initiation de la transcription. Si elle semble nécessaire à une initiation correcte de la transcription, elle ne peut, à elle seule, assurer une transcription efficace, et - des régions situées en amont de la TATA box qui permettent d'assurer un niveau efficace de transcription soit de manière constitutive (niveau de transcription constant tout au long du cycle cellulaire, quelles que soient les conditions de culture) soit de manière régulable (dites régions de régulation permettant une activation de la transcription en présence d'un activateur et/ou répression de la transcription en présence d'un répresseur), suivant le gène dont elles sont issues. Lorsqu'on cherche à obtenir de grande quantité d'une protéine d'intérêt, on utilise généralement une région promotrice forte et constitutive pour controler l'expression du fragment d'ADN codant pour la protéine d'intérêt, par exemple les régions 5' flanquantes des gènes PGK (3-phosphoglycérate kinase) de Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman et al., 1983, Science, 219, 620-625) et adh (alcool déshydrogénase) de Schizosaccharomyces pombe (Russel et Hall, 1983, J. Biol. Chem., 258, 143-149). Cependant, I'utilisation d'une région promotrice forte et constitutive n'est pas adaptée à la production de protéines d'intérêt présentant une certaine toxicité vis à vis de la cellule hôte . En effet, la production de protéines toxiques affecte la croissance des cellules et risque d'entraîner la sélection de mutations spontanées conduisant à une perte ou une réduction notable du taux de production. Dans les cas extrêmes, la viabilité des cellules peut être affectée. Pour ces raisons, il peut être avantageux de disposer de régions promotrices régulables permettant de faire varier la production de la protéine d'intérêt en fonction des conditions de culture ou de la phase de croissance cellulaire. D'une manière générale, de telles régions promotrices sont isolées ou dérivent de gènes régulables. Au cours de ces dernières années, un certain nombre de gènes régulables ont été mis en évidence dans de nombreux eucaryotes et notamment dans Schizosaccharomyces pombe. Des mécanismes très variés gouvernent la régulation de ces gènes. A titre d'exemples de gènes régulables de Schizosaccharomyces pombe, on peut citer les gènes de "heat shock" dont l'expression augmente avec la température (Gallo et al., 1991, Mol. Cell. Biol., II, 281-288) et le gène codant pour l'enzyme fructose biphosphatase (/bop) pour lequel la transcription est réprimée en présence de glucose et induite en condition de carence en glucose (Hoffman et Winston, 1989, Gene, 8X, 473479). Entrent également dans cette catégorie les gènes régulables par la thiamine, à savoir les gènes pho4 (Yang et Schweingruber, 1990, Curr. Genet., 18, 269-272), nmtl (Maundrell, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10857-10864) et thi2 (Zurlinden and Schweingruber, 1992, Gene, 117, 141 143) dont l'expression est régulée au niveau transcriptionnel par la thiamine, plus précisément réprimée en présence de thiamine et induite ou déréprimée en son absence. On a maintenant caractérisé les régions de régulation de la région promotrice du gène pho4 impliquées dans la réponse à la thiamine et généré des cassettes d'expression régulables pour la production de protéines d'intérêt dans Schizosaccharomyces. Les levures hébergeant une telle cassette d'expression sont cultivées dans un milieu supplémenté en thiamine lorsque la culture vise uniquement à leur propagation. Dès lors qu'une culture est entreprise en vue de produire une protéine d'intérêt, les levures sont transférées dans un milieu dépourvu de thiamine. Ainsi, lorsque ces régions sont placées en amont d'un fragment d'ADN codant pour le variant Lys 47 de l'hirudine, on obtient une expression efficace en l'absence de thiamine, au moins équivalente à celle détectée avec la région promotrice forte du gène adh. De plus, leur mise en oeuvre dans une cassette d'expression de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) a permis sa production par voie recombinante, pourtant toxique dans Schi.osaccharomyces pombe. On a également trouvé un gène de Schizosaccharomyces pombe codant pour un produit activateur agissant sur l'expression des gènes régulables par la thiamine dans des conditions inductrices (en absence de thiamine). L'amplification de ce gène, notamment par introduction dans un vecteur multicopie et transformation d'une souche de Schizosaccharomyces pombe, laquelle comprend également un grand nombre de copies d'un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt, placé sous la dépendance d'une région promotrice régulable par la thiamine, pourrait permettre d'améliorer les niveaux de la production de la protéine d'intérêt en fonction des conditions de culture, en particulier en absence de thiamine. Traditionnellement, la thiamine est ajoutée dans les milieux de culture des levures. Le fait de ne pas en mettre représente un coût moindre et n'affecte pas ou peu leur viabilité. Ces différents critères, qui satisfont aux conditions de production à l'échelle industrielle, illustrent les avantages de la présente invention. Par conséquent, la présente invention a pour objet l'usage combiné en vue de la production d'une protéine d'intérêt, (a) d'une première cassette d'expression comportant un premier fragment d'ADN codant pour ladite protéine d'intérêt, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression , lesdits éléments comprenant notamment une première région promotrice régulable par la thiamine , et (b) d'une deuxième cassette d'expression comportant un deuxième fragment d'ADN codant pour un produit activateur des gènes régulables par la thiamine, placé sous le controle des éléments nécessaires à son expression qui comprennent une deuxième région promotrice, ladite deuxième cassette d'expression étant insérée (i) dans un vecteur multicopie ou (ii) dans le génome cellulaire et dans le cas (ii) caractérisé en ce que ladite deuxième région promotrice est hétérologue audit fragment d'ADN codant pour ledit produit activateur. Comme indiqué précédemment, la présente invention s'applique à la production régulée par la thiamine d'une protéine d'intérêt dans une cellule eucaryote, notamment une souche de Schizosaccharomyces et, tout particulièrement, de l'espéce pombe. Aux fins de la présente invention, le premier fragment d'ADN peut etre issu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus. Il peut être isolé par toute technique en usage dans le domaine de l'art, par exemple par clonage, PCR (Polymerase Chain Reaction) ou synthèse chimique. D'autre part il peut coder pour une protéine d'intérêt (i) intracellulaire (ii) membranaire présente à la surface de la levure hôte ou (iii) sécrétée dans le milieu de culture. Il peut donc comprendre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. Par ailleurs, le premier fragment d'ADN peut coder pour une protéine d'intérêt correspondant à tout ou partie d'une protéine native, telle que trouvée dans la nature. ll peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses, ou d'un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être obtenu par les techniques de biologie moléculaire. Parmi les protéines d'intérêt au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement - les cytokines et notamment les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (CSF) et les facteurs de croissance; - les anticoagulants, de préférence l'hirudine, notamment les variants de l'hirudine décrits dans la demande européenne EP 332 523 et tout particulièrement le variant HV2 Lys 47, - les enzymes telles que la trypsine et les ribonucléases, - les inhibiteurs d'enzymes tels que l'al-antitrypsine, l'antithrombine III et les inhibiteurs de protéases virales, - les protéines impliquées dans les canaux ioniques, telles que la protéine CFTR dont la séquence est décrite dans Riordan et al. (1989, Science, 245, 1066 1073); - les protéines capables d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, telles que les produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple les gènes p53 et Rb, et - les protéines capables d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques de ces virus ou des variants altérés de protéines virales susceptibles de compétition avec les protéines virales natives. Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs. D'une façon générale, on aura recours pour l'expression du premier fragment d'ADN à une région promotrice fonctionnelle dans la cellule considérée et régulable par la thiamine. Cette dernière est isolée de la région 5' flanquante des gènes régulables par la thiamine, tels que ceux mentionnés précédemment. Bien entendu, elle peut être modifiée par mutation, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides(s) par rapport à la région promotrice native, à la condition que ces modifications n'altèrent pas de manière drastique sa capacité de régulation. D'une façon générale, tout ou partie d'une telle région promotrice peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. Ainsi, on peut mettre en oeuvre une région promotrice d'un gène régulable par la thiamine, comprenant une région de régulation capable de conférer la régulation par la thiamine et une TATA box homologue audit gène régulable. Selon un autre mode de réalisation, on peut employer une région de régulation issue cl'un gène régulable par la thiamine placée en amont d'une région promotrice minimale comprenant une TATA box d'une origine quelconque, capable d'assurer une initiation correcte de la transcription d'un premier fragment d'ADN dans la cellule considérée. L'homme du métier connaît de telles régions promotrices minimales. On peut citer à titre d'exemples celles des gènes adh de Schi=osaccharomyces pombe et IEl de CMV (Cytomegalovirus) (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521-530). "Région de régulation" se réfère à une séquence nucléotidique de taille variable, capable de conférer la régulation par la thiamine, c'est à dire d'induire en absence de thiamine une expression du fragment d'ADN placé sous sa dépendance à un niveau notablement plus élevé qu'en présence de thiamine. Une région de régulation comprend notamment un ou des éléments d'activation et/ou de répression responsables de la régulation. Bien qu'une seule région de régulation soit suffisante pour assurer une régulation par la thiamine, on peut également envisager d'employer plusieurs régions de régulation en tandem pour augmenter les niveaux d'expression. Selon un usage selon la présente invention, on peut mettre en oeuvre notamment de 1 à 25 régions de régulation, avantageusement de I à 7 et, de préférence, de 1 à 4. Par ailleurs, la ou les région(s) de régulation peut (peuvent) être insérée(s) en amont d'une région promotrice minimale dans une orientation sens ou inversée par rapport à la TATA box. On préfère tout particulièrement, mettre en oeuvre des régions promotrices issues du gène timtl ou pho4 de Schizosaccharomycespombe. Dans le cadre de la présente invention, on aura, de préférence, recours à une première région promotrice issue du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe. Dans ce contexte, les inventeurs ont caractérisé une région de régulation de 40pb localisée juste en amont de la TATA box. Ainsi, selon un mode avantageux, une région de régulation en usage dans la présente invention comprend au moins 17 nucléotides de la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 et débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucléotide en position +642. La présente invention inclut également toute séquence capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une telle séquence ainsi que son complémentaire. Bien entendu, une région de régulation au sens de l'invention peut etre plus grande et comprendre plus de séquence de la région promotrice du gène phol. A titre d'exemples non limitatifs, on peut envisager d'employer une région de régulation ayant une séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2, - débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +593 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +548 et se terminant au nucléotide en position +642 - débutant au nucléotide en position +496 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +444 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +255 et se terminant au nucléotide en position +642, ou - débutant au nucléotide en position +1 et se terminant au nucléotide en position +642. Une construction particulièrement intéressante est celle qui associe une région de régulation issue du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe et une région promotrice minimale issue du gène adh de Schi=osaccharomyces pombe. Cette dernière correspond à la séquence telle que publiée dans Russel et al. (1983, supra) et comprise entre les nucléotides -119 à -12. Il va de soit qu'elle peut comporter des modifications (mutation, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) par rapport à la séquence publiée du moment que ces modifications ne réduisent pas d'une manière drastique sa capacité à initier la transcription. D'autre part, une première cassette d'expression en usage dans la présente invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression du premier fragment d'ADN, notamment une séquence de terminaison de la transcription telle que celle du gène arg 3 de Schizosaccharomyces pombe (Van Huffel et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205, 3343) ainsi qu'un enhancer de transcription fonctionnel dans la cellule considérée, par exemple, l'enhancer du gène Wl du CMV. Une deuxième cassette d'expression en usage dans la présente invention, code pour un produit activateur capable d'activer l'expression d'un premier fragment d'ADN placé sous le contrôle d'une région promotrice régulable par la thiamine. Le terme "produit activateur" désigne un polypeptide capable d'interagir soit directement avec la région de régulation impliquée dans la régulation par la thiamine soit indirectement par l'intermédiaire de facteurs cellulaires. Il s'agit de préférence d'un produit activateur agissant au niveau transcriptionnel. Différents gènes ou parties de gènes isolés de cellules eucaryotes variées et codant pour un produit activateur de l'expression des gènes régulables par la thiamine peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. De tels gènes activateurs peuvent être obtenus par toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art et, notamment, selon la technique décrite dans l'exemple 2 par complémentation d'une cellule mutante présentant une absence de dérépression de l'expression des gènes normalement induits en absence de thiamine. Mais on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un gène issu de Schi=osaccharomyces pombe codant pour un produit activateur ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 1 débutant à l'acide aminé en position +1 et se terminant à l'acide aminé en position +775 ou un variant fonctionnel dudit produit activateur. Par "variant fonctionnel", on entend un polypeptide capable d'exercer une fonction activatrice de l'expression des gènes régulables par la thiamine. De tels variants fonctionnels peuvent être obtenus par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acide aminé. Ces modifications peuvent être réalisées selon les techniques classiques de biologie moléculaire. La fonctionnalité du variant ainsi obtenu peut être confirmée selon la technique indiquée dans l'exemple 2, par transformation des fragments d'ADN codant pour chacun de ces variants dans des souches mutantes et mesure de la dérépression par restauration d'une activité enzymatique appropnee. Un usage selon la présente invention, comprend le cas où la deuxième cassette d'expression est comprise dans un vecteur à réplication autonome et, dans ce cas, le deuxième fragment d'ADN peut être sous la dépendance soit de sa propre région promotrice, soit d'une deuxième région promotrice hétérologue audit fragment d'ADN. Selon une autre variante, la deuxième cassette d'expression est insérée dans le génome de la cellule hôte, à la condition que le deuxième fragment d'ADN soit placé sous le contrôle d'une deuxième région promotrice hétérologue audit fragment d'ADN. S'agissant d'une deuxième région promotrice hétérologue, elle peut être constitutive ou régulable, d'une origine quelconque du moment qu'elle soit fonctionnelle dans la cellule hôte. Le choix d'une telle région promotrice est à la portée de l'homme du métier. On peut, néanmoins, citer les régions promotrices des gènes adh et Jp de Schi-osaccharomyces pombe et du gène IE 1 du CMV. Cependant, il peut être avantageux d'avoir recours à une deuxième région promotrice régulable par la thiamine du type de la première région promotrice en usage dans la présente invention. Comme précédemment, la deuxième cassette d'expression peut contenir d'autres éléments nécessaires à l'expression du deuxième fragment d'ADN tels que ceux mentionnés cidessus. Selon la variante, par ailleurs préférée, où une ou plusieurs copie(s) de la deuxième cassette d'expression est (sont) insérée(s) dans un vecteur d'expression, on emploie notamment un vecteur d'expression multicopie et, en particulier, un vecteur comprenant une ou plusieurs copie(s) de la première cassette d'expression. L'insertion de la deuxième cassette d'expression en usage dans la présente invention se fait de préférence en dehors de la première cassette d'expression proprement dite. Un tel vecteur peut comporter par ailleurs des éléments assurant sa réplication, c'est à dire une origine de réplication telle que l'origine arsl de Schizosaccharomyces pombe et, de façon optionnelle, ori d'Escherichia coli. En outre, il peut également comprendre des gènes de sélection, tels que le gène URA3 ou LEU2 de Saccharomyces cerevisiae, le gène ura4 ou leul de Schi:osaccharomyces pombe ou un gène de résistance à un antibiotique. On préfère tout particulièrement mettre en usage un vecteur multicopie présent entre 20 et 500 copies dans la cellule hôte, avantageusement entre 25 et 400 copies, et de préférence entre 50 et 300 copies. Dans le cadre de la présente invention, les premières et deuxièmes cassettes d'expression sont présentes dans une cellule hôte selon un rapport en nombre de copies de 200:1, avantageusement de 25:1, de préférence 10:1 et de manière tout à fait préférée de 1:1. La présente invention s'étend également aux cellules hôtes dans lesquelles on met en oeuvre un usage selon la présente invention et, en particulier, aux levures sélectionnées parmi les souches suivantes Schizosaccharomyces pombe, Schi:osaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus et Hasegawaea japoniclrs. Un grand nombre de ces souches sont disponibles commercialement dans des organismes tels que l'AFRC (Agriculture and Food Research Council, Norfolk, UK) ou l'ATCC (Rockville, MA, USA). La présente invention concerne également une troisième cassette d'expression comprenant un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression, lesdits éléments comportant une région promotrice régulable par la thiamine issue du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe Une telle région promotrice est définie précédemment. La présente invention s'étend également à: (i) un vecteur d'expression comprenant une troisième cassette d'expression selon l'invention, et (ii) une cellule hôte comprenant une troisième cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention. On préférée tout particulièrement une cellule de levure avantageusement du genre Schizosaccharomyces et, de préférence, de l'espèce pombe. Enfin, la présente invention vise également un procédé de production d'une protéine d'intérêt par une cellule hôte selon l'invention, notamment une cellule de Schizosaccharomyces pombe, selon lequel - on cultive dans un milieu approprié en absence de thiamine ladite cellule hôte et - on récupère ladite protéine d'intérêt. Dans le cadre de l'invention, la protéine d'intérêt peut être récupérée directement dans le milieu de culture ou après lyse des cellules selon les techniques conventionnelles. Par ailleurs, elle peut être purifiée en appliquant les techniques standards connues de l'homme de l'art, par exemple et à titre indicatif, par chromatographie ou immunopurification. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Ces exemples sont illustrés par référence aux figures suivantes La Figure 1 est une représentation schématique des cassettes pour l'expression du fragment d'ADN codant pour HV2 Lys 47 placé sous la dépendance d'une région promotrice régulable par la thiamine (pTG2734 et pTG2735), constitutive (pTG1757) ou non-fonctionnelle (pTG1758). La Figure 2 est une représentation schématique d'un vecteur d'expression comportant une premiére cassette d'expression du variant Lys 47 de l'hirudine (HV2) sous le contrôle du promoteur pho4 et un gène activateur (ACT) capable d'activer le promoteur pho4, de même qu'un origine de réplication (ars) et des gènes codant pour des marqueurs de sélection (amp et sélection). Les constructions décrites ci-après sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire détaillées dans Maniatis et al. (1989, Laboratory Nianual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). L'ensemble des étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens est effectué par passage dans la souche E. coli 5K. On utilise pour introduire les différents vecteurs dans les souches de Schizosaccharomyces pombe la technique à l'acétate de lithium (Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163-168). Mais toute autre technique standard peut être employée. EXEMPLE 1 - Construction de vecteurs d'expression dans lesquels le gène codant pour le variant HV2 Lys 47 est placé sous le contrôle d'une région promotrice dérivée du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe. A. Vecteur pTG2734 dans lequel le gène HV2 Lys 47 est placé sous le contrôle de la région promotrice isolée du génie pho4 de Schizosaccharomyces pombe. Le plasmide pEVpl 1 (Russell et Nurse, 1986, Cell, 45, 145-153) contient la région promotrice du gène adh de Schizosaccharomyces pombe sous forme d'un fragment SphI-EcoRJ de 700pb, le site Eco%1 étant situé dans la région 5' du gène adh 59pb en amont de l'ATG initiateur. Il est digéré par les enzymes EcoRI et Hindis et on introduit un fragment synthétique résultant de la réassociation des oligonucléotides simple brin OTG2781 et OTG2782 (décrits respectivement dans les SEQ ID NO: 3 et NO: 4) dans le but de compléter la région promotrice adh jusqu'à 11 pb en amont de l'ATG initiateur et de créer des sites de restriction appropriés facilitant les étapes de clonage ultérieures. On génère pTG1702 dans lequel on insère en aval de la région promotrice adh une séquence codant pour le signal de sécrétion de la phosphatase acide majeure de Schizosaccharomyces pombe (phol). Pour ce faire, un fragment d'ADN synthétique issu de la réassociation des oligonucléotides OTG2872 et OTG2873 (SEQ ID NO: 5 et NO: 6) est ligué à pTG1702 préalablement digéré par BamHI et Saci On obtient pTG1716. Ce dernier est modifié par l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour le variant Lys 47 de l'hirudine (HV2 Lys47). pTG1716 est digéré par MluI et HindIll avant d'etre ligué d'une part à un fragment synthétique présentant des extrémités protubérantes MluI et AccI et résultant de la réassociation des oligonucléotides OTG2874 et OTG2875 (décrits respectivement dans les SEQ ID NO: 7 et NO: 8) et d'autre part à un fragment AccI-HirldIII isolé du vecteur pTG2974. Ce dernier porte notamment un fragment d'ADN codant pour HV2 Lys 47. On complète la cassette d'expression par l'introduction en 3' du gène HV2 Lys 47 d'une séquence terminatrice de transcription correspondant à la région 3' du gène arg3 de Schizosaccharomyces pombe. Un fragment HpaI-ClaI de 0,92 kb est isolé de pCVH3 (Van Huffel et al., 1992, Eur J. Biochem., 205, 33-43) puis traité au fragment Klenow de l'ADN polymérase. Ce fragment comporte les derniers codons du gêne arg3 de Schizosaccharomyces pombe suivis de la séquence de terminaison de la transcription. Il est inséré dans pTG1702 digéré par Hindîli et dont les extrémités ont été rendues franches par traitement au fragment Klenow de l'ADN polymérase, pour donner pTG1746. pTG1746 est digéré par XbaI, traité au fragment Klenow de l'ADN polymérase avant d'être digéré par BamHI. Le fragment comportant les séquences de terminaison de la transcription est introduit dans le vecteur pDW230 digéré par EcoRS, soumis à un traitement au fragment Klenow de l'ADN polymérase puis digéré par BamHI. On obtient pTG1751. Le vecteur pDW230 est similaire à pDW232 décrit dans la littérature (Weilguny et al., 1991, Gene, 99, 47-54). Ils dérivent tous deux de pGEM3 dans lequel on a inséré une origine de réplication fonctionnelle dans Schizosaccharomyces pombe (origine arsl) ainsi que le gène ura4 de Schizosaccharomyces pombe en tant que marqueur de sélection , à la différence que l'introduction du fragment portant l'origine arsl au niveau du site NaeI de pGEM3, donnant lieu à pDW230, a entraîné une délétion de ce site jusqu'à la base 2862. Le fragment SphI-SacI comportant la région promotrice adh suivie de la séquence codant pour le signal de sécrétion phol et HV2 Lys 47 est isolé de pTG1722. n est ensuite sous-cloné entre les mêmes sites de pTG1751. n en résulte pTG1757 dans lequel l'expression de HV2 Lys 47 est contrôlée par la région promotrice adh et est donc constitutive (Figure 1). D'autre part, la région promotrice du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe est obtenue par PCR (Polymérase Chain Reaction) à partir du clone pSp4B (Yang and Schweingruber, 1990, Current Genet., 18, 269-272) et à l'aide des amorces OTG3569 comportant un site SphI (SEQ ID NO: 9) et OTG3239 muni d'un site BamHI (SEQ ID NO: 10). Le fragment SphI-BamHI ainsi généré est substitué au fragment SphI-BamHI portant la région promotrice adh de pTG1757 pour donner pTG2734 (Figure 1). B. Constnction de vecteurs d'expression de HV2 Lys 47 comprenant une région promotrice hybride "pho4adh" et caractérisation des régions du gène pho4 impliquées dans la régzzlation par la thiamine. On isole par PCR et à partir du vecteur pTG2734, un fragment de 642 pb comportant les séquences 5' flanquantes du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe situées en amont de la TATA box. On met en oeuvre les amorces OTG3569 (SEQ ID NO: 9) et OTG3210 (SEQ ID NO: 11). Le fragment PCR SphI-NcoI ainsi obtenu, est introduit dans pTG1757 digéré par les mêmes enzymes pour donner pTG2735 (Figure 1). Afin de localiser les régions régulatrices du gène pho4 responsables de la régulation par la thiamine, un certain nombre de fragments PCR ont été générés à partir de pTG2734 et de l'amorce OTG3210 précédemment décrite combiné à l'une des amorces suivantes (voir tableau 1): Tableau 1 Amorces Vecteur d'expression Taille de la région 5' pho4 synthétisée OTG4645 (SEQ ID NO: 12) pTG4734 50 pb OTG4646 (SEQ ID NO: 13) pTG4735 95 pb OTG4647 (SEQ ID NO: 14) pTG4736 148 pb OTG4648 (SEQ ID NO: 15) pTG4737 199 pb OTG4649 (SEQ ID NO: 16) pTG4738 388 pb Chacun des fragments PCR SphI-NcoI généré est sous cloné comme précédemment dans le vecteur pTG1757 traité par les mêmes enzymes. Enfin, on génère le vecteur pTG5701 par introduction dans pTG1757 d'un fragment d'ADN muni d'extrémités SphI et NcoI et provenant de la réassociation des oligonucléotides OTG4924 et OTG4925 (SEQ ID NO: 17 et 18). Ainsi dans pTG5701, l'expression de HV2 Lys 47 est placé sous le contrôle d'une région de régulation de 40 pb du gène pho4 précédant la TATA box du gène adh C. Construction d'un vecteur d'expression de HV2 Lys 47 comprenant une région promotrice hybride "pho4sdh" et dans lamelle la région de régulation pho4 est en orientation anti-sens par rapport à la TA TA box du gène adh Le vecteur pTG4734 est digéré par SphI et NcoI puis traité à l'ADN polymérase T4 puis religué. On vérifie par séquençage selon les méthodes traditionnelles, les clones comportant une copie d'une région de régulation du gène pho4 de 50 pb mais en orientation reverse par rapport au vecteur d'origine pTG4734 et donc à la TATA box du gèneadh. D. Constrtction de vecteurs d'expression de HV2 Lys 47 comprenant une région promotrice hybride "pho4-adh" inclleant plusieurs régions de régulation pho4 de 50 pb en tandem. Un fragment d'ADN correspondant à une région de régulation du gène pho4 de 50 pb muni à ses deux extrémités d'un site de restriction BglI, est généré par réassociation des oligonucléotides OTG5296 et OTG5297 (SEQ ID NO: 19 et 20). L'étape de réhybridation des deux oligonucléotides est suivie d'une étape de ligation puis d'un traitement à l'ADN polymérase de T4. Le mélange réactionnel est ensuite ligué au vecteur pTG1757 (en remplacement du fragment correspondant) préalablement digéré par SphI et NcoI et traité à l'ADN polymérase de T4. On vérifie par séquençage, dans les clones obtenus, le nombre d"'unités" de 50 pb de pho4 ainsi que leur orientation. C'est ainsi que l'on génère pTG8607, pTG8608 et pTG8609 comprenant respectivement 1, 2 et 3 copies de région de régulation de 50 pb en orientation anti-sens par rapport à la TATA box du gène adh. EXEMPLE 2 Construction de vecteurs d'expression du gène HV2 Lys 47 comportant en outre le ozène activateur de Schi.osaccharomvces pombe. A. clonage d1 gène activateur de Schizosaccharomycespombe. Le gène codant pour un produit activateur capable d'activer l'expression des gènes régulables par la thiamine est isolé par complémentation d'une souche mutante de Schizosaccharomyces pombe présentant une absence de dérépression de l'expression du gène pho4 en l'absence de thiamine. On isole des fragments génomiques partiellement digérés par Sau3A d'une souche de Schizosaccharomyces pombe de type sauvage. Ils sont clonés dans le site BamHI du vecteur pURl9 (Barbet et al., 1992, Gene, 11X, 59-66) puis introduits dans la souche mutante thil-23 ura4 D18 pho 1-44 (Schweingruber et al., 1992, Genetics, 130, 445-449). Les transformants sont sélectionnés pour la prototrophie pour l'uracile et le 542 hydroxyethyl)-4-methylthiazole (Zurlinden et Schweingruber, 1992, Gene, 117, 141 143). 14 transformants sont obtenus et leur ADN plasmidique est isolé selon le protocole décrit dans Moreno et al. (1991, Methods in Enzymology, 194, 795-823). L'ADN est ensuite amplifié dans Escherichia coli selon les méthodes standards (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Quatre transformants présentent un insert de 4 kb qui, après transformation dans la souche mutante précédente, est capable de supprimer l'absence de dérépression. Ceci se traduit par la restauration d'une activité phosphatase acide dans un milieu dépourvu de thiamine, mesurée selon la technique décrite dans Schweingruber et al. (1986, J. Biol. Chem., 261, 15877-15882). 11 est donc probable que l'insert de 4 kb comprenne un gène activateur de l'expression des gènes régulables par la thiamine nmtl et pho4. On détermine la séquence de la majorité de l'insert selon les techniques conventionnelles connues de l'homme de l'art. Les données permettent de mettre en évidence un cadre de lecture ouvert de 775 résidus dont la séquence est reportée dans l'identificateur de séquence NO :1 (SEQ ID NO :1). B. Usage combiné du gène activateur de Schizosaccharomyces pombe et d'une cassette d'expression de HV2 Lys 47 sous le contrôle d'une région promotrice issue du gène pho4. Le fragment SphI-EcoRI est isolé du plasmide pUR19 comprenant l'insert de 4 kb et traité par l'ADN polymérase T4 avant d'être introduit dans des vecteurs d'expression réplicatifs multicopies de Schizosaccharomyces comportant une cassette d'expression contrôlée par le promoteur pho4 et des marqueurs de sélection appropriés. Un vecteur de ce type est représenté dans la Figure 2. C. Usage combiné du gène activateur de Schizosaccharomyces pombe et d'une cassette d'expression de HV2 Lys 47 sous le contrôle d'tune région promotrice issue dit gène nmtl. On génère un fragment PCR de 188 pb à partir de l'ADN génomique isolé d'une souche de Schizosaccharomyces pombe par les techniques conventionnelles. On utilise les oligonucléotides OTG5217 et OTG3028 (décrits respectivement dans les SEQ ID NO : 21 et 22). On introduit le fragment SphI et BamHI ainsi généré entre les mêmes sites du vecteur pTG1757. On obtient le vecteur pTG5774. Le fragment d'ADN codant pour le produit activateur est inséré dans un vecteur réplicatif multicopie de Schizosaccharomyces comportant notamment une cassette d'expression contrôlée par le promoteur nmtl. EXEMPLE 3 : Production de HV2 Lvs 47 en fonction du plasmide utilisé. Les vecteurs d'expression des exemples 1 et 2 sont introduits dans une souche de Schizosaccharomyces et on évalue le niveau d'expression du fragment d'ADN codant de l'hirudine selon la méthodologie mentionnée ci-dessous. Une souche de Schizosaccharomyces pombe, par exemple la souche D18 disponiole à l'AFRC sous la référence 2036, est transformée par les vecteurs d'expression précédemment cités. On utilise à titre de contrôle négatif la même souche transformée en parallèle par le vecteur pTG1758 (Figure 1) comportant une région promotrice tronquée réduite à la région promotrice minimale du gène adh. Le controle positif d'expression est constitué par pTG1757 permettant une expression constitutive de HV2 Lys 47, sous le contrôle de la région promotrice du gène adh Les souches transformées sont cultivées dans un milieu Kappeli supplémenté avec 2% de glucose et un mélange de vitamines comprenant notamment de la thiamine à une concentration finale de 0,002g/1 (milieu thi+). Lorsque les cultures atteignent une DO (densité optique) à 600nm comprise entre 1 et 2, elles sont diluées à une DO d'environ 0,05 soit dans du milieu thi+ de composition telle qu'indiquée ci-dessus, soit dans un milieu Kappeli supplémenté avec 2% de glucose et un mélange de vitamines dépourvu en thiamine (milieu thi-) Des aliquotes de culture sont prélevées régulièrement durant la phase exponentielle de croissance ainsi qu'en fin de croissance (DO 600nm comprise entre 7 et 9). On détermine pour chaque échantillon prélevé, la quantité d'hirudine sécrétée dans le milieu de culture. Bien qu'il soit possible de doser l'hirudine par toutes les techniques conventionnelles, on utilise la technique ELISA telle que décrite dans Koch et al., (1993, Analytical Biochemistry, 214, 301-312) en mettant en oeuvre le couple d'anticorps monoclonaux MATG102 et MATS106 et, de l'hirudine titrée comme décrit dans la référence précitée. Par ailleurs, on peut également évaluer le niveau d'expression de l'hirudine par analyse Northern des ARNm isolés des cellules de Schizosaccharomyces pombe. On met en oeuvre une sonde capable de s'hybrider spécifiquement avec les séquences codant pour HV2 Lys 47, par exemple une sonde issue du fragment Acci-Saci de pTG1757. Mais d'autres sondes, telles que des oligonucléotides, peuvent être employées. La tableau 2 résume les niveaux d'hirudine sécrétée par Schizosaccharomyces pombe transformée par chacun des plasmides indiqués et selon que le milieu de culture contient de la thiamine ou non (thi+ ou thi-). Tableau 2 Vecteur Région 5' Orientation TATA box Niveau de HV2 Lys47 pho4 thi+ thi pTGl757 - - ~~ pTG1758 - - adh - - pTG5701 40pb sens adh - ++ à +++ pTG4734 50pb sens adh ttt pTG4735 95pb sens adh ttt pTG4736 148pb sens adh +++ pTG4737 199pb sens adh t+t pTG4738 388pb sens adh 2 +++ pTG273 5 642pb sens adh - +++ pTG2734 642pb sens pho4 - +4+ pTG4770 50pb antisens adh - +4+ Des estimations de la quantité d'ARNm HV2 Lys 47 par Northern blot confirment ces résultats. D'autre part, lorsqu'on analyse par Northern blot les ARNm présents dans les cellules de Schizosaccharomyces pombe transformées par pTG8607, pTG8608 ou pTG8609 et cultivées en présence de thiamine, on ne peut détecter de signal d'hybridation. Par contre lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu dépourvu de thiamine, on observe une forte augmentation de la quantité d'ARNm HV2 Lys 47. L'intensité du signal d'hybridation corrèle le nombre de copies de la séquencepho4 de 50 pb. L'ensemble de ces résultats montre qu'en présence de thiamine, I'expression du gène d'intérêt est réprimée alors qu'en son absence on observe une forte induction, se traduisant par la présence d'une quantité importante d'hirudine sécrétée dans le milieu de culture. D'autre part, ces expériences ont permis d'identifier une région de régulation, que l'on peut qualifier de minimale, comprise dans la région promotrice du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe et responsable de la régulation par la thiamine. Cette région de 40 à 50 pb est située en amont de la TATA box et est suffisante, à elle seule, pour conférer une telle régulation (répression en présence de thiamine et dérépression en absence de thiamine). Le fait que cette région fonctionne quelle que soit son orientation vis à vis de la TATA box est inattendu. Enfin, la présence de plusieurs copies de cette région minimale en amont d'une TATA box a un effet synergique sur le niveau d'expression, effet qui semble corréler le nombre de copies de cette région. EXEMPLE 4 Construction d'une vecteur d'expression de la protéine CFTR sous le controle d'une région promotrice hybride "phoX adh". Le vecteur pTG5960, issu du p poly III-I* (Lathe et al., Gene, 1987, 57, 193-201) et modifié par l'insertion de la séquence codant pour la protéine CFTR humaine dont la séquence en acide aminé est divulguée dans Riordan et al (1989, slrpra), est digéré par les enzymes Aval et ÂhoI. Le fragment Aval-Xhol comprenant la séquence nucléotidique codant pour la protéine CFTR est traité par le grand fragment Klenow de l'ADN polymérase et inséré dans le vecteur d'expression de Schizosaccharomyces pombe pTG2735 digéré par SacI et BamHI et traité par l'ADN polymérase T4. On génère pTG5999. Le fragment AvaI-XhoI-Klenow est introduit en parallèle dans le vecteur pTG1702 digéré par BamHI et traité au grand fragment Klenow de l'ADN polymérase pour donner pTG1753 (expression constitutive du gène CFTR sous le controle de la région promotrice du gène adh de Schizosaccharomyces pombe). Après transformation de Schizosaccharomyces pombe D18 par pTG1753, aucun transformant ne produit de protéine CFTR. L'analyse par cartographie de restriction montre que les plasmides isolés des transformants sont réarrangés, par exemple au niveau de la séquence CFTR. Ces résultats indiquent que l'expression de la protéine CFTR est probablement toxique pour les cellules. Après introduction de pTG5999 dans la souche Schizosaccharomyces pombe D18 selon le protocole indiqué précédemment, les transformants sont cultivés en présence ou en absence de thiamine. Des aliquotes de cellules sont prélevées au cours du temps et la production de la protéine CFTR déterminée par Western blot (Dalemans et al., 1992, Experimental Cell Research, 201, 235-240). Aucun signal n'apparaît dans les cultures placées dans un milieu thi+ (répression de l'expression due à la présence de thiamine), alors qu'on détecte une bande ayant la masse moléculaire attendue dans les cultures réalisées en absence de thiamine. Ces résultats montrent l'utilité de la région promotrice issue du gène pho4 pour la production de protéines toxiques. LISTE DE SEQUENCES 1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NCM: Transgene S.A. (B) RUE: 11 rue de Molsheim (C) VILLE: Strasbourg (D) PROVINCE: France (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 67082 (G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 22 58 07 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Usage combiné de deux cassettes d'expression pour la production d'une protéine d'intérêt (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 22 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 775 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Schizosaccharomyces pombe (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Met Asn Glu Glu Ile Gly Phe Leu Lys Asn Gln Leu Phe Ala Asp Val 1 5 10 15 Lys Asp Leu Glu Arg Lys Lys Lys Arg Arg Val Pro Pro Glu Gln Arg 20 25 30 Arg Arg Val Phe Arg Ala Cys Lys His Cys Arg Gln Lys Lys Ile Lys 35 40 45 Cys Asn Gly Gly Gln Pro Cys Ile Ser Cys Lys Thr Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Cys Val Tyr Ala Gln Lys Ser Gln Asn Lys Thr Leu Ser Arg Glu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Glu Leu Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Glu Tyr Ile Phe Ser 85 90 95 Arg Met Cys Pro Asn Phe Asn Leu Glu Thr Lys Asn Leu Ile Ser Ile 100 105 110 Ser Lys Lys Leu Ser Glu Asn Glu Asn Leu Pro Val Ser Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Val Thr Asn Glu Leu Asp Thr Leu Val Arg Ile Asn Asp Gln Leu 130 135 140 Ser Arg Asn His Ile Ser Gly Thr Thr Glu Glu Met Gln Ser Ser Ser 145 150 155 160 Ser Leu île Ala Gly Glu Val Gln Pro Gly île Ser Phe Arg Asp Gln 165 170 175 Leu Lys Val Gly Lys Leu Glu Asp Thr Leu Tyr Leu Gly Pro Thr Thr 180 185 190 Ser Glu Ala Phe île Glu Arg Leu Gln Asn Glu Leu Glu Leu Glu Ser 195 200 205 Ile Ser Glu Asp Asp Leu Tyr Ser Lys Arg Leu Ser Pro Ser Val Ser 210 215 220 Tyr Ser Glu Phe Asp Glu Gln Leu Leu Leu His Ma Arg Ser Leu Ile 225 230 235 240 Pro Ser Lys Ala Val Val Glu Phe Leu Ile Asn Ser Phe Phe Ile Asn 245 250 255 Val Gln Thr Asn Leu Phe Val Tyr His Pro His Phe Phe Lys Cys Arg 260 265 270 Leu Glu Ile Phe Leu Ala Met Glu Asn Gln Ile Asp Ala Gly Phe Leu 275 280 285 Cys Ile Leu Leu Met Val Leu Ala Phe Gly Asn Gln Tyr Thr Ala Glu 290 295 300 Gln Gln Glu Asp Val Ser Lys Ser Asn Phe His Ala Ser Asn Ile Gly 305 310 315 320 Asn Arg Leu Phe Ser Ala Ala Leu Ser Ile Phe Pro Leu Val Leu Leu 325 330 335 Gln Ser Asp Val Ser Ala Val Gln Ser Ser Leu Leu Ile Gly Leu Tyr 340 345 350 Leu Gln Ser Thr Ile Tyr Glu Lys Ser Ser Phe Ala Tyr Phe Gly Leu 355 360 365 Ala Ile Lys Phe Ala Val Ala Leu Gly Leu His Lys Asn Ser Asp Asp 370 375 380 Pro Ser Leu Thr Gln Asn Ser Lys Glu Leu Arg Asn Arg Leu Leu Trp 385 390 395 400 Ser Val Phe Cys Ile Asp Arg Phe Val Ser Met Thr Thr Gly Arg Arg 405 410 415 Pro Ser Ile Pro Leu Glu Cys Ile Ser Ile Pro Tyr Pro Val Ile Leu 420 425 430 Pro Asp Leu Glu Ile Pro Gly Ser Gln Ser Ile Val Glu Asn Met Arg 435 440 445 Ala Val Ile Asn Leu Ala Lys Leu Thr Asn Glu Ile Cys Asp Ser Leu 450 455 460 Tyr Trp Asn Pro Ser Pro Ser Phe Glu Ser Gln Val Asn Ser Val Arg 4O5 470 475 480 Arg Ile Tyr Ala Arg Leu Glu Leu Trp Lys Ser Asp Leu His Ser Ser 485 490 495 Val Val Phe Asp Glu Ser Ala Val Gln His Pro Leu Phe Arg Ser Asn 500 505 510 Ala His Val Gln Met Ile Tyr Asp Asn Ala Ile Met Leu Thr Thr Arg 515 520 525 Val Ile Met Val Lys Lys Leu Lys Asp Lys Asp Leu Thr Ala Glu Asn 530 535 540 Arg Arg Tyr Ile Gln Leu Cys Val Glu Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn 545 550 555 560 Ile Ala His Leu Leu Leu Thr His Lys Cys Leu Ser Ser Leu Ser Phe 565 570 575 Phe Gly Leu His Val Pro Phe Ala Ser Ala Pro Ile Leu Leu Leu Ser 580 585 590 Leu His Tyr Glu Asn Ser Gln Asp Ile Gln Ala Val Val Thr Lys Leu 595 600 605 Trp Gln Val Leu Glu Phe Leu Ser Ser Arg Cys Glu Phe Ala Arg Glu 610 615 620 Ser Leu Asn Tyr Leu Lys Ser Phe Asn Lys Gln Leu Ser Arg Arg Asn 625 630 635 640 Ala Pro Asp Ile Asn Asn Pro Ile Ala Asp Phe Gln Asn Ser Phe Gln 645 650 655 Asn Trp Gln Ser Trp Val Gly Asp Met Ser His Gly Asp Met Leu Ser 660 665 670 Thr Phe Lys Leu Thr Gly Glu Ser Ser Asn Gly Ser Asn Ser Thr Pro 675 680 685 Asn Glu Ala Phe Gln Pro Phe Asp Gln Thr Ser Ser Leu Tyr Asn Val 690 695 700 Pro Gly Leu Asn Lys Ser Tyr Val Ser Asn Gln Pro Ser Leu Leu Thr 705 710 715 720 Pro Glu Thr Phe Leu Pro Asp Pro Val Leu Asn Leu Glu Val Asp Lys 725 730 735 Gln Trp Thr Ala Pro Thr Phe Leu Ser Trp Thr Glu Leu Leu Gly Pro 740 745 750 Thr Asn Val Ser Glu Gln Ser Ser His Thr Ala Glu Gln Thr Ser Asn 755 760 765 Leu Thr Leu Glu Lys Asn Gly 770 775 2 NORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 642 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: gene pho4 de Schizosaccharomyces pombe (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CTAATAAATT AAATTGTTGG ATCTTACTAA AGACTAAATA TTAATAATAA TTTTCTCCCA 60 AGCTATTTAT ATACATATTA GAAGCAATTT GCAAAGATAG CAGACTAATA CTCTTCAATG 120 CCCAACTTCT TATTAGTGAT ATACATGTAA AAATATCTTT ATTATGCAAT ATTATGTAGC 180 AGCTCGTACA ATGTTTGCAC ATCTTTACAC AATAGTATTC ATTTTGTATT ACATTATCAT 240 TTATAATTCC ATTTCACAGA GAGTAGGCAT TGCTATTATA TAATATAAAT TTATATAAAA 300 CAAAAAGACT GCAAAATCAT TTCCAACTGA AACTTCGTTC TTTAGTTCTA TTAAATTATT 360 AAGTATTGGA ATATCAGATT TTTGTAAGTT CAGTAATAAT AATATCATTA TATTACACCG 420 TTGTATTATT AATCGCATAA TATTACTGTA ACACTTTGTC CGTAATTTGC ATCGTTATTT 480 CAGTTAACAA TTGTGGGTCC AAAATCTTAA AGTCTAATAG CGAACTACAC CAGGTTTGCA 540 ACTTCATTCA TTTTTTTTAA TTCCAATGTA GTCGTGCCGA AATCAGACTT TGGTTTGGTG 600 GTAGCCGGGG TGCTTAGTGT TAGCAGATAT CCGGATTGAT TG 642 (2 > INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 79 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique OTG2781 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AATTCCATTG TCTTGACTAT CACAAACTTT T.EAGTCTTTT CTTTTTTGGA TCCACACCAT 60 C-GAGCTCCZG GGAGATCTA 79 (2) INFCRMATI0N POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 79 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2782) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGCTTAGATC TCCCGGGAGC TCCATGGTGT GGATCCAAAA AAGAAAAGAC TTAAAAGTTT 60 GTGATAGTCA AGACAATGG 79 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 74 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2872) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GATCCAACCA CATAATGTTC TTGCAAAATT TATTCCTTGG CTTTTTGGCC GTCGTTTGTG 60 CCAACGCGTG AGCT 74 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2873) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CACGCGTTGG CACAAACGAC GGCCAAAAAG CCAAGGAATA AATTTTGCAA GAACATTATG 60 TGGTTG 66 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 11 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2874) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CGCGATTACG T 11 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2875) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: ATACGTAAT 9 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (i -) HYPOTHETIQUE: NON iii) .MITI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG3569) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TTTGGGCATG CGTCTTTTGA TGCTAAATAA ATTAAATTGT TGG 43 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG3239) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GAGAAATACC ACTTAACTTC ATGGATCCCG AGAAAAAACA ATG 43 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 36 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG3210) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CCCAAACCAT GGCAATCAAT CCGGATATCT GCTAAC 36 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (oTG4645) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: AAACAAGCAT GCGTTTGGTG GTAGCCGGGG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 40 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4646) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: AAACAAGCAT GCTCATTCAT TTTTTTTAAT TCCAATGTAG 40 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 38 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4647) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: AAACAAGCAT GCGGTCCAAA TCTTAAAGTC TAATAGCG 38 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple 13) CONFIGURATION: linéaire (li) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (lii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4648) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: AAACAAGCAT GCTACTGTAA CACTTTGTCC GTAATTTGC 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1o: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4649) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AAACAAGCAT GCCACAGAGA GTAGGCATTG CTATT 35 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4924) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CAGCCGGGGT GCTTAGTGTT AGCAGATATC CGGATTGATT GC 42 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 50 paires de bases (3) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4925) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: CATGGCAATC AATCCGGATA TCTGCTAACA CTAAGCACCC CGGCTGCATG 50 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 72 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG5296) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: CGGCCCATGG TTTGGTGGTA GCCGGGGTGC TTAGTGTTAG CAGATATCCG GATTGATTGC 60 CATGGGCCTC TC 72 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 72 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG5297) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: AGGCCCATGG CAATCAATCC GGATATCTGC TAACACTAAG CACCCCGGCT ACCACCAAAC 60 CATOOGCCGG AG 72 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21: (i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG5217) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: CCCAAAGCAT GCAAGCTTAA AGGAATCCGA TTGTCATTC 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: OUI (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG3028) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: ATCTTGTTAG TAGCCATGGA TCCGATTTAA CAAAGCG 37 Revendications usage combiné en vue de la production d'une protéine d'intéret, (a) d'une première cassette d'expression comportant un premier fragment d'ADN codant pour ladite protéine d'intérêt, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression , lesdits éléments comprenant notamment une première région promotrice régulable par la thiamine; et (b) d'une deuxième cassette d'expression comportant un deuxième fragment d'ADN codant pour un produit activateur des gènes régulables par la thiamine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression qui comprennent une deuxième région promotrice , ladite deuxième cassette d'expression étant insérée (i) dans un vecteur multicopie ou (ii) dans le génome cellulaire et dans le cas (ii) caractérisé en ce que ladite deuxième région promotrice est hétérologue audit fragment d'ADN codant pour ledit produit activateur. 2 Usage selon la revendication 1, selon lequel ladite première cassette d'expression et ladite deuxième cassette d'expression sont présentes selon un rapport en nombre de copies de 200: 1, avantageusement de 25: 1, de préférence 10:1 et, de manière tout à fait préférée, de 1:1. 3 Usage selon la revendication 1 ou 2, selon lequel le deuxième fragment d'ADN code pour un produit activateur ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: I débutant à l'acide aminé en position +1 et se terminant à l'acide aminé en position +775 ou un variant fonctionnel dudit produit activateur. 4 Usage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ladite deuxième région promotrice est hétérologue audit fragment d'ADN codant pour ledit produit activateur et régulable par la thiamine. 5 Usage selon la revendication 4, selon lequel les première et/ou deuxième régions promotrices régulables par la thiamine sont issues des gènes sélectionnés parmi le groupe constitué par les gènes phol et nmtl de Schizosaccharomyces pombe. 6 Usage selon la revendication 5, selon lequel les première et/ou deuxième régions promotrices régulables par la thiamine sont issues du gène pho4 de Schi=osaccharomyces pombe. 7 Usage selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, selon lequel les première et/ou seconde régions promotrices régulables par la thiamine comprennent au moins une région de régulation conférant la régulation par la thiamine, ladite région de régulation étant placée en amont d'une région promotrice minimale. 8 Usage selon la revendication 7, selon lequel les première et/ou deuxième régions promotrices régulables par la thiamine comprennent de I à 25, avantageusement de 1 à 7, et de préférence, de I à 4 régions de régulation. 9 Usage selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la ou les région(s) de régulation est (sont) dans une orientation sens ou anti-sens par rapport à ladite région promotrice minimale. 10 Usage selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, selon lequel la ou les région(s) de régulation est (sont) issue(s) du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe. 11 Usage selon la revendication 10, selon lequel la région de régulation comprend au moins 17 nucléotides d'une séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 et débutant au nucléotide en position +617 et se terminant au nucléotide en position +642. 12 Usage selon la revendication 11, selon lequel la région de régulation à la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 - débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +593 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +548 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +496 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +444 et se terminant au nucléotide en position +642, - débutant au nucléotide en position +255 et se terminant au nucléotide en position +642, ou - débutant au nucléotide en position + 1 et se terminant au nucléotide en position +642. 13 Usage selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, selon lequel la région promotrice minimale est issue du gène adh de Schizosaccharomyces pombe. 14 Usage selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, selon lequel ladite deuxième cassette d'expression est insérée dans un vecteur d'expression multicopie. 15 Usage selon la revendication 14, selon lequel ladite deuxième cassette d'expression est insérée dans un vecteur d'expression multicopie comprenant notamment ladite première cassette d'expression. 16 Usage selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, selon lequel une ou plusieurs copie(s) de ladite deuxième cassette d'expression sont insérées dans le génome d'une cellule hôte, ladite cellule hôte comprenant notamment une ou plusieurs copies de ladite première cassette d'expression insérée(s) soit dans le génome de la cellule hôte soit dans un vecteur multicopie. 17 Cellule hôte dans laquelle on met en oeuvre un usage selon l'une des revendications I à 16. 18 Cellule hôte selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche de Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus et Hasegawaeajaponicus. 19 Cassette d'expression comprenant un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression, lesdits éiéments comportant une région promotrice régulable par la thiamine et issue du gène pho4 de Schi=osaccharomyces pombe. 20 Cassette d'expression selon la revendication 19, caractérisée en ce que ladite région promotrice est telle que définie selon l'une quelconque des revendications 6 à 13. 21 Vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 19 ou 20. 22 Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression selon la revendication 19 ou 20 ou un vecteur d'expression selon la revendication 21. 23 Procédé de production d'une protéine d'intérêt par une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 17, 18 ou 22, selon lequel - on cultive dans un milieu approprié en absence de thiamine ladite cellule hôte et - on récupère ladite protéine d'intérêt. 24 Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la cellule hôte est une souche de Schizosaccharomyces pombe.