Brevet FR2721405A1 — publié le 19951222

La présente invention concerne une méthode d'analyse améliorée pour déterminer la capacité de fécondation d'échantillons de sperme humain ou animal, ainsi qu'un kit destiné à faciliter l'exécution de cette opération. Dans la reproduction humaine, l'un des problèmes les plus importants du point de vue social et clinique est la stérilité dans le couple et l'étude de la pathologie qui en est à l'origine. Du point de vue clinique, un couple est considéré comme stérile lorsque, après deux ans au moins de vie commune, il ne se produit pas de grossesse, sans qu'aucune précaution bien entendu n'ait été prise pour l'éviter. Normalement, l'étude médicale de la stérilité dans le couple est effectuée à la fois sur les deux conjoints, afin de pouvoir en diagnostiquer correctement la cause. La cause de la stérilité au sein d'un couple peut être d'origine masculine, féminine, ou des deux. On sait que la stérilité d'origine masculine constitue la cause de la stérilité du couple dans 40-50 % des cas. Dans certaines circonstances, il est possible de corriger les motifs de la stérilité avec des traitements médicaux adéquats, cependant, dans d'autres circonstances, il faut avoir recours à des techniques de reproduction assistée (RA.). Ces techniques ont été développées à l'échelle mondiale; il s'agit de l'insémination artificielle (I.A.) et de la fertilisation "in vitro" (F.I.V.), essentiellement. Généralement, on considère qu'un sperme n'est pas normal (normospermique) quand il a moins de 20 millions de spermatozoïdes par ml, quand sa motilité linéaire et progressive est inférieure à 40 % et qu'il a plus de 50 % de formes anormales. Un sperme ayant ces caractéristiques pose des difficultés pour une fécondation naturelle, et cela oblige à avoir recours à l'une des techniques de reproduction assistée citées ci-dessus. En particulier, l'une des techniques préférées serait la F.I.V. On sait que le pourcentage de succès des résultats de ces techniques est relativement bas, de l'ordre de 20-40 % ; la non-fécondation par le spermatozoïde est la première cause d'échec. On définit généralement des paramètres qui permettent de déterminer a priori si le sperme sera capable ou non de féconder in vitro, et on observe dans la pratique que des spermes dont les paramètres sont théoriquement "bons" ne sont pas capables de féconder "in vitro" tandis que d'autres spermes dont les paramètres sont plus "mauvais" parviennent cependant à féconder. Il existe donc une problématique qui n'a pas encore été résolue au sujet de ces paramètres, de sorte que les paramètres dont on dispose actuellement sont insuffisants pour diagnostiquer la capacité de fécondation d'un sperme. Dans ce sens, et afin de pouvoir éviter de façon prospective les échecs, quelquefois répétés, des techniques de fertilisation "in vitro" à cause de la qualité du sperme, la présente invention apporte une méthode d'analyse pour déterminer la capacité de fécondation d'un échantillon de sperme humain, qui permet de savoir a priori si ce sperme sera capable ou non de féconder "in vitro" les ovocytes de sa partenaire. Cela permet d'éviter, d'une part, la désillusion et la démoralisation du couple, et, d'autre part, des frais inutiles car ce genre de techniques est très coûteux. Nous avons exposé jusqu'ici l'importance de la viabilité d'un sperme humain en vue de sa capacité de fécondation. Mais l'importance que peut prendre ce sujet dans le domaine vétérinaire, où la reproduction appropriée du bétail peut avoir de grandes répercussions du point de vue économico-industriel, est évidente. Nous citerons quelques références de bibliographie, ayant un rapport avec l'objet de l'invention: 1.- SINGER R. SAGIV M. ALLALOUF D. ET AL., Lack of Correlation between Acromosal Pathologies of Human Spermatozoa and Hyaluronidase Activity : Int. J. Fertil. 1983, 28 (2): 119-120. 2.- HUSZAR G. WILLETS M. CORRALES M., Hyaluronic acid (Sperm Select) improves retention of sperm motility and velocity in normospermic cno. Fertility Sterility 1990, 54 (6): 1127-34. 3.- GUILLET-ROSO F. FARI A. TAYLOR A. FORMAN R. ET AL., Systematics semen culture and its influence on I.V.F., management., Brit. J. Obst. Gynecol. 1987, 94:543-547. 4.- JEDENDRAU R. ET VAN DER VAN H., Development of an assay to asses the functional integnty of the human sperm membrane and its relati. J. Reprod. Fertil. 1970, 70: 219-228. 5.- MADAHEVA M. TROUNSON A., The Influence of seminal characteristics on the success rate of human in vitro fertilization. Fertil. Steril. 1984,42: 400-405. 6.- TALBERT L. HAMMOND M. HOLME J. ET AL., Semen parameters and fertilization of human cocytes in vitro, a multivariable analysis., Fertil. Steril. 1987, 48:270-277. 7.- ZIEGLER D. CEDARS M. HAMILTON F. MORENO T. MELDRUM Y., Factor influencing maintenance of sperm motility during in vitro processing. Fertil. Steril. 1987, 48:816. De plus, le demandeur, dans sa demande n P-9200700, propose une méthode pour déterminer la capacité de fécondation d'un échantillon de sperme humain, qui a représenté un grand progrès technique étant donné sa simplicité et sa fiabilité. Cependant, le demandeur ayant poursuivi ses études scientifiques en la matière a perfectionné cette méthode, et il a constaté en même temps sa viabilité dans du sperme animal. Il a également conçu un kit destiné à faciliter la réalisation de la méthode citée. La présente invention concerne des améliorations apportées à l'objet du Brevet n0 P-9200700. Ce brevet concemait une méthode d'analyse pour déterminer la capacité de fécondation in vitro d'un échantillon de sperme humain, quelque chose de tout à fait habituel et de normal dans les laboratoires. Cette méthode consiste à mettre en contact, dans des conditions précises, une solution dont la formule comprend des principes actifs, et l'échantillon de sperme ; cela produit une réaction au cours de laquelle une enzyme qui se trouve à l'intérieur de la membrane de la tête du spermatozoïde est libérée, et qui crée des aires de digestion (halo) sur le substrat, autour de la tête du spermatozoïde en question, une fois que l'enzyme a été libérée ; la tête du spermatozoïde doit grossir et conserver intacte sa membrane externe, et produire un diamètre du halo de digestion sur le substrat supérieur à 7,5 Cul ; il existe un rapport entre la taille du halo et la capacité du spermatozoïde à féconder. La composition de cette solution est la suivante: 0,5-15 % en poids d'acide hyaluronique 20-90 % en poids de chlorure calcique 5 mM. 0,1-5 % en poids de Triton X. En particulier, la méthode analytique revendiquée dans le Brevet n 9200700 est caractérisée par les opérations suivantes: a) prendre une goutte de la solution citée et l'étendre sur un porteobjets ; la laisser sécher pendant 1 ou 2 minutes; b) prendre un échantillon de sperme préalablement lavé et préparé et l'étendre sur le porte-objets préalablement imprégné de la solution suivant l'étape (a); le couvrir avec un couvre-objets et laisser en incubation de 30 minutes à 48 heures environ, à 25-40"C environ dans une couveuse avec 1 %-10 % de CO2 environ; c) évaluer le résultat par la lecture du halo formé et de la mesure de son diamètre, au moyen d'un microscope à contraste de phase muni d'un micromètre fixé à l'oculaire avec des grossissements de 10-40. On considère que cette méthode d'analyse est positive, c'est-à-dire que le sperme analysé est capable de féconder, lorsque le diamètre du halo est égal ou supérieur à 7,5 pin et que la morphologie de la tête du spermatozoïde reste intacte (taille et membrane) dans au moins 10 % des spermatozoïdes analysés. On considère que le résultat est négatif pour des valeurs inférieures ou en l'absence de halo. A présent, le demandeur a apporté des améliorations à la technique de détermination afin de: 1) stabiliser la solution réactive employée pour la détermination; et 2) interpréter les résultats pour affiner au maximum la valeur des données obtenues. De plus, le demandeur a conçu un kit destiné à faciliter l'exécution pratique de la méthode d'analyse. Enfin, le demandeur a pu constater, par les études correspondantes, que la méthode peut également être appliquée à des échantillons de sperme animal. La solution réactive employée dans le procédé du Brevet n0 P-9200700 et composée de : 0,5-15 % en poids d'acide hyaluronique 20-90 % en poids de chlorure calcique 5 mM et 0,1-5 % en poids de Triton, est peu stable en vue de son éventuelle commercialisation pour la réalisation des déterminations à l'échelle industrielle. Pour parvenir à augmenter la stabilité de la solution réactive citée pendant de longues périodes, comprises entre six mois et un an, le demandeur a découvert qu'il suffit d'y ajouter du K2P04H/KP04H2 dans des proportions comprises entre 0,1 et 5 % en poids ; il faut en outre régler le pH de cette solution entre 6,5 et 8,0. Par ailleurs, dans le procédé du Brevet n P-9000700, à la dernière étape d'interprétation des résultats, on considérait que le résultat était positif (c'est-à-dire, que le sperme analysé était capable de féconder) lorsque le diamètre du halo était égal ou supérieur à 7,5 pin dans au moins 50 % des spermatozoïdes analysés. Maintenant, le demandeur a pu constater que le résultat est également positif lorsque le diamètre cité du halo est égal ou supérieur à 7,5 pin dans 10-25% seulement des spermatozoïdes analysés, dans la mesure où la membrane de la tête du spermatozoïde reste intacte. En outre, le demandeur a conçu un kit commercial destiné à faciliter l'exécution des tests et des essais de la méthode d'analyse de la présente invention. Ce kit est caractérisé en ce qu'il est constitué de: (1) une seringue munie d'un bouchon ou un flacon compte-gouttes contenant la solution réactive stabilisée; (2) des porte-objets en verre pour le microscope et des couvre-objets, compris dans le kit en quantité suffisante pour permettre d'utiliser tout le volume de réactif, compte tenu du fait que, pour chaque goutte de solution, il faut un porte-objets et un couvre-objets; (3) des pipettes jetables destinées à l'application de la goutte de sperme à analyser. La présente invention est illustrée en outre par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE1 Voici la méthode d'analyse qui a été utilisée: 1) On a pris une goutte de solution qui venait d'être préparée et qui contenait 7 % d'acide hyaluronique, 60 % de chlorure calcique 5 mM, 2,5 % de Triton X et 6 % de K2PO4H/KPO4H2, et dont le pH avait été réglé à 7. Puis, on a étendu la solution sur un porte-objets, et on l'a laissée sécher pendant 5 minutes. 2) On a pris 0,5 Ill d'un échantillon de sperme humain préalablement lavé, et on l'a étendu sur le porte-objets préalablement imprégné de cette solution. On l'a couvert avec un couvre-objets et on l'a laissé en incubation pendant 24 heures à 37"C dans une couveuse de 5 % en CO2. 3) Le résultat a été évalué par la lecture au microscope à contraste de phase muni d'un micromètre fixé à l'oculaire avec un grossissement de 40. 4) On a observé un diamètre du halo formé autour de la tête du spermatozoïde de 8 pin, la membrane de la tête du spermatozoïde étant restée intact dans 20 % d'entre eux. Le résultat a donc été considéré comme positif. Ce résultat a été comparé au résultat obtenu pour le même échantillon de sperme in vivo au moyen de la technique de F.I.V. où les spermatozoides ont fécondé les ovocytes obtenus chez leur partenaire. EXEMPLE 2 La même méthode décrite à l'exemple 1 a été exécutée, mais en employant une solution qui avait été préparée un an auparavant; le résultat obtenu a été le même. EXEMPCE 3 La même méthode décrite à l'exemple 1 a été exécutée, mais en employant un échantillon de taureau étalon. On a constaté que le diamètre du halo formé autour de la tête du spermatozoïde était de 8,2 pin et que la membrane de la tête du spermatozoïde restait intacte pour 22 % d'entre eux. Le résultat a donc été considéré comme positif. EXEMPLE 4 La même méthode décrite à l'exemple 3 a été exécutée, mais en employant une solution qui avait été préparée 14 mois auparavant. Le résultat obtenu a été exactement le même. NOTE : Tous les résultats considérés comme exemples ont été simultanément comparés avec la technique F.I.V. à laquelle les couples ont été soumis ; les résultats obtenus ont été constatés in vivo. REVENDICATIONS 1. Méthode d'analyse pour déterminer la capacité de fécondation d'un échantillon de sperme humain comprenant les opérations suivantes: a) prendre une goutte de solution composée de 0,5-15 % en poids d'acide hyaluronique, 20-90 % en poids de chlorure calcique 5 mM et 0,1-5 % en poids de Triton X et l'étendre sur un porte-objets ; la laisser sécher pendant 1 ou 2 minutes; b) prendre un échantillon de sperme préalablement lavé et préparé et l'étendre sur le porte-objets préalablement imprégné de la solution suivant l'étape (a) ; le couvrir avec un couvre-objets et le laisser en incubation de 30 minutes à 48 heures, à 25-40"C dans une couveuse avec 1 %-10 % de CO2; c) évaluer le résultat par la lecture du halo formé et de la mesure de son diamètre, au moyen d'un microscope à contraste de phase muni d'un micromètre fixé à l'oculaire, caractérisée par le fait qu'elle comprend en outre la stabilisation de la solution décrite dans l'étape (a) en y ajoutant du K2P04H/KP04H2 dans une proportion de 0,1-5 % en poids et en réglant son pH sur une valeur comprise entre 6,5 et 8,0 ; le résultat pouvant être considéré positif lorsque le diamètre cité du halo est égal ou supérieur à 7,5 pin dans 10-25 % des spermatozoïdes analysés, dans la mesure où la membrane de la tête du spermatozoïde reste intacte ; et la méthode d'analyse pouvant également être appliquée au sperme animal, outre le sperme humain. 2. Kit pour exécuter la méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) une seringue munie d'un bouchon ou un flacon compte-gouttes contenant la solution réactive stabilisée; (2) des porte-objets en verre pour le microscope et des couvre-objets, compris dans le kit en quantité suffisante pour permettre d'utiliser tout le volume de réactif, compte tenu du fait que, pour chaque goutte de solution, il faut un porte-objets et un couvre-objets; (3) des pipettes jetables destinées à l'application de la goutte de sperme à analyser.