Brevet FR2716805A1 — publié le 19950908

La présente invention se rapporte à une nouvelle composition immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un extrait végétal pouvant être obtenu par extraction à partir des feuilles d'une plante de la famille des Buxacées, et notamment du genre Buxus. L'invention concerne également un médicament contenant cette composition, utile en particulier comme immunomodulateur et pour le traitement des affections provoquées par le virus de l'immunodéflcience humaine (VIH). Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) se développe à la suite de l'infection d'un individu par le VIH; le VIII reconnait le récepteur CD4 exprimé à la surface des lymphocytes T4. Une période asymptomatique pouvant durer plusieurs années peut suivre la contamination initiale. Le déclenchement du SIDA est entrainé par l'activation des cellules et la multiplication du virus qui se propage à d'autres lymphocytes. La phase clinique de la maladie se traduit par la survenue d'affections opportunistes et la modification de paramètres sanguins, comme la chute du taux de CD4 ou l'augmentation de l'antigénémie p24. L'extrême variabilité du VIH rend très difficile la mise au point d'un traitement efficace. La demande de brevet FR 2 678 835 a proposé l'utilisation d'un extrait préparé à partir du bois, de la racine et de l'écorce de la racine de Buxus sempervirens, essentiellement constitué d'alcaloïdes stéroïdiques, pour le traitement du SIDA. De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé qu'un extrait végétal obtenu à partir de plantes de la famille des Buxacées, dont les alcaloïdes ont été pratiquement éliminés, possède une activité immunomodulatrice. C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un extrait végétal, caractérisée en ce que l'extrait végétal peut être obtenu par la mise en oeuvre des opérations successives suivantes: a) les feuilles d'une plante de la famille des Buxacées sont soumises à une étape d'extraction par un mélange eau/solvant organique, puis les solvants sont éliminés pour obtenir un extrait brut solide, b) l'extrait brut est remis en suspension dans un mélange hydroalcoolique puis introduit dans une colonne de résine non ionique macroporeuse, qui est éluée par un mélange hydroalcoolique, de façon à récupérer un extrait essentiellement dépourvu de sucres, c) les solvants de l'extrait obtenu à l'issu de l'étape b) sont éliminés et le résidu est remis en solution dans de l'eau, d) la solution aqueuse obtenue à l'issue de l'étape c) est introduite dans une colonne de résine échangeuse de cations faiblement acide, qui est éluée par de l'eau, e) les solvants sont éliminés de l'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) et le résidu solide est remis en solution aqueuse à pH acide, f) la solution aqueuse est introduite dans une colonne de résine échangeuse de cations fortement acide, qui est éluée par de l'eau, de façon à récupérer un extrait végétal essentiellement dépourvu d'alcaloïdes. La préparation s'effectue de préférence sur des feuilles sèches, broyées, débarassées de toute trace de bois ou de racine, les feuilles sont éventuellement réduites en poudre avant d'etre soumises à l'extraction. L'extraction à l'étape a) peut avantageusement être effectuée par un mélange hydroalcoolique, par exemple par un mélange éthanol/eau, dans des rapports compris entre 99/1 et 65/35, de manière préférée entre 90/10 et 75/25. Un mélange éthanol/eau dans un rapport de 80/20 est particulièrement approprié. Selon l'un des modes de mise en oeuvre de l'invention, l'extraction de l'étape a) peut être effectuée à température ambiante, c'est-à-dire comprise entre environ 18 C et 30 C, de l'ordre de 20 à 26 C. L'étape d'extraction comprend de préférence plusieurs extractions répétées, chaque période d'extraction pouvant durer plusieurs semaines. Après chaque période d'extraction, le mélange est filtré pour séparer le solide de la solution. Le solide est ensuite réextrait dans les conditions décrites précédemment. Les solutions provenant des extractions successives sont ensuite réunies, filtrées pour éliminer toute particule solide puis évaporées soit sous pression réduite à une température ne dépassant pas 400 C, soit lyophilisée. Par exemple, 4 kg de feuilles sont mis en suspension avec 5 litres d'un mélange d'éthanol absolu (4 litres) et d'eau (1 litre) dans un récipient fermé et soumis à une agitation mécanique pendant trois semaines. L'extraction s'effectue à température ambiante. Le mélange est filtré. La solution éthanolique est conservée. Le résidu solide est mélangé à 5 litres du même mélange éthanol-eau 80/20 (volume/volume). L'opération précédente est ainsi renouvelée deux fois. Les solutions éthanoliques sont réunies et traitées pour obtenir l'extrait brut solide. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, l'extraction de l'étape a) est effectuée à chaud. Elle est effectuée de préférence plusieurs fois, pendant plusieurs heures, au moyen d'un solvant organique et d'eau au reflux Par exemple, l'extraction est effectuée en plaçant les feuilles broyées (100 g) en suspension dans le mélange éthanol (400 ml) et eau (100 ml), dans un ballon surmonté d'un réfrigérant. La suspension est chauffée jusqu'à l'ébullition qui est maintenue pendant 9 heures. La suspension est ensuite refroidie, filtrée et le résidu solide est repris dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. L'opération est renouvelée en tout trois fois. Les solutions provenant des extractions successives sont ensuite réunies et traitées comme pour l'extraction effectuée à froid, afin d'obtenir un extrait brut solide. L'extrait brut solide est remis en suspension pour subir plusieurs étapes de fractionnement par chromatographie d'adsorption et de partition. Le mélange hydroalcoolique servant à préparer cette sus pension est de préférence constitué par un mélange éthanol/eau, dans les proportions indiquées pour le mélange utilisé à l'étape a). Le passage sur la colonne de résine macroporeuse de l'étape b) permet d'éliminer essentiellement les sels et les sucres présents dans l'extrait brut solide de départ. Par exemple, une colonne de 3 cm de diamètre et de 50 cm de hauteur est remplie par une suspension de DUOLITE S 861 (Rohm & Haas) dans un mélange d'éthanol et d'eau 80/20 (volume/volume). 5g d'extrait en solution dans 10 cm3 d'eau distillée sont déposés au sommet de la colonne. On fait passer à travers la colonne, pour l'élution, 1 litre du même mélange éthanol-eau. La solution recueillie est évaporée sous pression réduite ou lyophilisée. L'extrait dépourvu de sucre ainsi obtenu, est de préférence trituré dans de l'eau distillée, pour séparer une fraction insoluble. L'extrait obtenu à l'issue de l'étape b, débarassé de la fraction insoluble et remis en solution aqueuse, est séparé par passage sur une colonne de résine échangeuse d'ions, faiblement acide, ce qui constitue l'étape d) ci-dessus. Par exemple, dans une colonne, de mêmes dimensions que celle décrite à l'étape précédente, on place en suspension dans de l'eau distillée une résine échangeuse de cations faiblement acide, par exemple une résine Amberlite IRC 50 (Rohm & Haas). L'extrait, débarrassé de la fraction insoluble, est mis en solution dans de l'eau distillée (10 cm3) et déposé sur la colonne. L'élution est effectuée au moyen d'un litre d'eau distillée. La nouvelle solution obtenue est évaporée sous pression réduite à une température ne dépassant pas 40 C, ou lyophilisée. On obtient un résidu solide qui est remis en solution aqueuse à pH acide puis fractionné par passage sur une colonne de résine échangeuse cationique fortement acide, possédant de préférence des groupes fonctionnels sulfonate (étape f) ). Par exemple, une résine Amberlite IR 120 (RohM et Haas) sous forme ionique Na+ est placée en suspension dans l'eau distillée dans une colonne de mêmes dimensions qu'à l'étape précédente. L'extrait est solubilisé dans 10 cm3 d'eau distillée et le pH de cette solution est ajusté à pH = 2. Cette solution est déposée sur la colonne et l'élution s'effectue par un litre d'eau distillée. La nouvelle solution obtenue est évaporée sous pression réduite à une température ne dépassant pas 40 C, ou lyophilisée. On obtient un extrait qui, à l'issue des étapes e) et f) est essentiellement débarrassé des alcaloïdes présents dans le produit de départ. L'extrait végétal selon l'invention peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes du procédé défini ci-dessus, à partir de plantes de la famille des Buxacées appartenant au genre Buxus, et en particulier à partir de Buxus sempervirens. En chromatographie basse pression sur colonne Zorbax ODS SB (250 x 4,6 mm) éluée par un mélange eau + 1% d'acide trifluoroacétique, avec un débit de 1 ml/min, la composition présente, à 255 nm, le spectre représenté sur la figure 1, comportant 6 pics majeurs. Ces pics sortent aux temps suivants: - 0,07 min - entre 3,72 et 4,87 min - 8,75 min - 11,17 min -14,29min - 28,70 min La composition selon l'invention, en chromatographie sur appareil Waters 990, sur colonne Hypersil BDS C18 (100 mm x 4,6 mm), éluée par de l'acétate d'ammonium, pH 5,9 (10 min) puis par un gradient jusqu'à acétonitrile-eau 70% (20 min), elle présente, à 254 nm, le spectre représenté sur la figure 2. La figure 3 représente le spectre à 254 nm de la phase aqueuse obtenue après une extraction chloroforme/eau de la composition selon l'invention, et filtration sur Millex GV13, par chromatographie sur une colonne Hypersil BDS C18, dans des conditions identiques à celles de la composition totale. La figure 4 représente le spectre chromatographique de la phase chloroformique obtenue après une extraction chloroforme/eau de la composition selon l'invention et filtration sur Millex GV13, sur une colonne Hypersil BDS C18 dans des conditions identiques à celles suivies pour la composition totale. La figure 5 représente le spectre UV des trois principaux produits trouvés dans la phase chloroformique. La composition selon l'invention présente une activité immunomodulatrice sur les cellules immunocompétentes humaines. La composition selon l'invention stimule la production basale d'IL1 ss, de TNFa et de GM-CSF par les cellules mononuclées du sang périphérique, de manière dose-dépendante. Cependant, l'activation de la production induite par d'autres activateurs est inhibée par les compositions selon l'invention, jusqu'à 90% pour le GM-CSF et à environ 30% pour le TNFa. L'extrait selon l'invention est sans action sur la production d'IL-6. La composition est également sans action sur la production basale d'IL-2. Lorsque la production d'IL-2 est stimulée par des activateurs comme la phyto-hémaglutinine, ou le PMA, l'addition d'une composition selon l'invention entraine une inhibition de cette production. Les compositions selon l'invention renforcent l'effet inhibiteur de la ciclosporine sur la production d'lL-2. Les compositions selon l'invention ont une action antagoniste de l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par la ciclosporine. C'est pourquoi la présente invention a également pour objet un médicament, caractérisé en ce qu'il contient une composition contenant les principes actifs de l'extrait végétal pouvant être obtenu par les étapes a) à f) décrites ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'une telle composition pour la préparation d'un médicament utile comme immunomodulateur. De manière générale les compositions selon l'invention ont une activité immunostimulante sur les cellules quiescentes (IL-1S,TM;a, GM CSF), immunosuppressive sur les cellules activées (IL-2, GM-CSF), agoniste de la ciclosporine A dans l'inhibition de la synthèse d'IL-2, antagoniste de la ciclosporine A dans l'inhibition de la prolifération. Les médicaments selon l'invention pourront donc être avantageusement utilisés lors de transplantation d'organes, dans le traitement des maladies autoimmunes ainsi que dans le traitement de l'infection à VIH. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement des infections virales, en particulier provoquées par les rétrovirus comme le VIII. L'administration de telles compositions selon l'invention à des sujets infectés par le VIH est bien tolérée et entraine une remontée du taux deCD4. L'invention concerne également un procédé de stimulation in vitro des lymphocytes, caractérisé en ce qu'on introduit dans une culture lymphocytaire une composition selon l'invention. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Exemple 1: Préparation d'un extrait végétal selon l'invention (SPV 30) A partir de 4 kg de feuilles de Buxus sempervirens, traités durant 3 fois 3 semaines par 3 fois un mélange éthanoVeau (80:20), on récupère 350 g d'extrait brut. Le fractionnement est effectué sur 6g d'extrait brut à l'aide d'une colonne de 3 cm de diamètre et de 50 cm de hauteur. Première colonne: Elimination des sels et des sucres par une résine DUOL1TE S 861 qui est introduite dans la colonne en suspension dans un mélange EtOH/HzO (80:20), jusqu'à une hauteur de 45 cm. 6 g d'extrait brut, solubilisés dans 4 5 cm3 d'EtOH/H2O (80:20), sont déposés. On élue par un litre de solution EtOH/H2O (80:20) et on évapore les solvants. La fraction ainsi obtenue est solubilisée dans 4-5 cm3 d'eau (une partie reste non soluble, elle est éliminée du milieu) et acidifiée par HCl 1N jusqu'à pH = 4. Deuxième colonne: La résine utilisée ici est l'Amberlite CG 50, échangeuse d'ions, faiblement acide. Elle est introduite dans la même colonne que précédemment en suspension dans l'eau jusqu'à une hauteur de 45 cm. La fraction acidifiée résultant de la première colonne est déposée et on élue par un litre d'eau. On évapore ensuite le solvant. Cette dernière fraction est alors déposée sur une troisième colonne. Troisième colonne Echangeuse d'ions fortement acide, cette Amberlite IR 120 (plus) forme Na+ est introduite comme précédemment en suspension dans l'eau jusqu'à une hauteur de 45 cm. La fraction résultant de la deuxième colonne est déposée dans 45cc d'eau et on élue par il d'eau. La fraction SPV -30 récupérée est évaporée et on isole 3,5 g. La régénération des différentes colonnes s'effectue de la façon suivante DUOLITE: 51 de NaOH à 4% Rinçage jusqu'à ph=7 AMBERUTE CG 50: 2,51 de HCl 1N. Rinçage jusqu'à ph=7 AMBERLITE IR 120: 2,51 de NaCl saturée. Rinçage. Exemple 2 : Etude de la cytotoxicité du SPV30 L'effet toxique de la fraction SPV30 sur les cellules CEM-SS non infectées est apprécié par la réaction colorimétrique (MTT). Cette réaction est basée sur la capacité des cellules vivantes à réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl-tétrazolium bromide en formazan après 5 jours d'incubation en présence de différentes concentrations de la fraction SPV30. La cytotoxicité de SPV30 (SPV30.1) a également été mesurée par comptage en microscopie optique, en comparant l'exclusion du bleu trypan par les cellules incubées en absence et en présence des concentrations croissantes (de 50 ,wg/ml à 10 mg/ml) de la fraction, pendant 24, 48 et 120 heures. L'absence de cytotoxicité de SPV30 a été démontrée dans plusieurs expériences, en comparant la mortalité des cellules incubées en absence et en présence des concentrations croissantes, 50 ,Wg/ml à 10 mg/ml, de la fraction. L'exclusion du bleu trypan a été estimée à 24, à 48 et 120 heures d'incubation, par comptage en microscopie optique. Jusqu'à 5 mg/ml la viabilité des cellules incubées en présence de SPV30 était la même que celle des cellules contrôles. Après 48 h d'incubation en présence de 10 mg/ml de SPV30, 70% de cellules sont restées vivantes par rapport aux cellules contrôles. Exemple 3 : Evaluation de l'activité anti-VIH-l de la fraction SPV30 1). Activité anti-rétrovirale de SPV30 La multiplication du VIH-1 (souche LAI) dans les cellules CEM-SS est évaluée, après 5 jours de culture, par dosage de la réverse transcriptase (RT). L'activité de la RT traduit la présence de virus, relargué dans le surnageant de culture. La fraction SPV30 est ajoutée après l'adsorption du virus dans le milieu de culture. Activité anti-VIH-l de la fraction S. P.V. 3Q sur les autres lignées cellulaires Activité anti-VIH mesurée 1- par inhibition de ECP (Effet cytopathogène) estimation de la viabilité cellulaire (transformation du MTT en formazepan) 2- par inhibition de la Reverse. Transcriptase à J5 infectés par le VIH (souche Lav-i-bru) ou non infectés pour déterminer la cytotoxicité du produit. Efficacité testée sur différentes lignées : le SPV 30 est actif sur les lignées Mr4 à une concentration de 10-3 mg/ml CEM-SS à une concentration de 10-3 mg/ml PBMC à une concentration de 103 mg/ml Absence de cytotoxicité jusqu'à des concentrations > lmg/ml, ce qui permet de penser que l'index de sélectivité est important. 2) Activité antirétrovirale sur des cellules fibroblastiques de souris (rétrovirus murin de Friend SMuLV) Après 4 jours de culture de cellules fibroblastiques : recherche de protéine d'enveloppe virale (gp70) à différentes concentrations de SPV 30 (mise en évidence des foyers de cellules infectées) et calcul du 96 inhibition de la réplication virale/cellules non traitées mais infectées: 1,6 pg/l 39% inhibition 22 foyers 1000 ccg/l 78% inhibition 8 foyers 5000 ccg/l 100% inhibition 0 foyers 3) Evaluation de l'activité anti-VIH-l des composés sur les cellules CEM-SS Principe La multiplication du VIH-t (souche LAI) dans les cellules CEM-SS (infectées avec 20 TCID50) est évaluée, après 5 jours de culture, par dosage de la réverse transcriptase (RT) dont l'activité traduit la présence de virus relargué dans le surnageant de culture. Les composés testés sont ajoutés après l'adsorption du virus dans le milieu de culture. On compare l'activité de l'AZT et de l'extrait SPV30 selon l'invention. L'effet toxique des composés sur les cellules CEM-SS non infectées est apprécié par la réaction colorimétrique (NUIT basée sur la capacité des cellules vivantes à réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényltétrazolium bromide en formazan après 5 jours d'incubation en présence de différentes concentrations en composé. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Les courbes font apparaitre - d'une part les résultats du test NUIT exprimés en DO - et d'autre par les valeurs (en cpm) de l'activité enzymatique en présence du composé testé aux différentes concentrations indiquées. 4) Evaluation de l'activité anti VIH-1 de différents composés sur les cellules MT4 Principe La multiplication du VIH-1 (souche HTLV IIIB) dans les cellules MT4 (cellules T4 transformées par le HTLV-1) est suivie par l'effet cytopathogène induit parle virus. Les cellules sont infectées avec une dose de VIH-1 produisant, après 5 jours de culture, une diminution de 90% de nombre de cellules vivantes. Les composés testés sont ajoutés après l'adsorption du virus dans le milieu de culture à différentes concentrations. La viabilité des cellules est mesurée par la réaction colorimétrique (Ml r) basée sur la capacité des cellules vivantes à réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl ) -2,5 diphényl-tétrazolium bromide en formazan, propriété due aux déshydrogénases mitochondriales. La quantité de formazan produite (DO à 540 nm) est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le pourcentage de protection () des cellules infectées par le traitement avec les composés est calculé en appliquant la formule proposée par Pauwels et col. D0540 des cellules infectées traitées (T) - DOS40 des cellules infectées To (S2) DOs40 des cellules non infectées (S1) - DO540 des cellules infectées Témoin (S2) L'effet toxique des composés sur les cellules MT4 non infectées est mesuré par la même réaction colorimétrique. La concentration cytotoxique 50% (CC 50) est la concentration de composé provoquant une diminution de moitié de la DO540 par rapport à celle des cellules témoins. S'il y a lieu, la concentration du composé conférant une protection de 50% (IC = 50 = concentration inhibant la réplication virale de 50 %) est calculée. Résultats La feuille de résultat représente, pour chaque produit, - d'une part le plan de la plaque de culture (96 puits) avec les résultats du test MTT (exprimés en DO) des cellules infectées et non infectées, en présence et en absence du composé, - et d'autre part, exprimées sur le graphique, la protection (A) et la toxicité (I) du composé en fonction de sa concentration. Exemple 4 : Effets immunomodulateurs in vitro du SPV 30 MATERIEL ET MéTHODES Réactifs La solution stock de la fraction SPV30 a été préparée par dissolution de la fraction désséchée dans un milieu aqueux (milieu de culture, PBS ou NaCl 0,9%) à la concentration de 100 mg/ml, filtrée sur membrane 0,45 ym puis sur membrane 0,2 Fm et conservée à 4" C dans un tube stérile. Dans ces conditions, elle maintient ses propriétés biologiques pendant au moins deux mois. Le(s) principe(s) actif(s) de SPV30 est (sont) dialysable(s) (membrane de dialyse avec cut off de poids moléculaire égal à 10 KDa). Un deuxième lot de la fraction préparé par le LCBO, désigné SPV30.1, a également été testé ; utilisés dans les mêmes conditions, SPV30 et SPV30. ont manifesté les mêmes propriétés biologiques. Les autres réactifs ont été préparés et stockés comme suit : PMA, solution dans EtOH absolu 1 mg/ml, -20" C ; ciclosporine A, solution dans EtOH absolu 1 mg/ml, -20" C; PHA, solution dans PBS 1 mg/ml, -20" C ; anticorps monoclonal CD3, solution dans PBS 1 mg/ml, -20" C; LPS, solution dans PBS 10 mg/ml, 4" C. Le milieu de culture RPMI 1640 a été supplémenté avec 10% (mesure de la prolifération cellulaire) ou 5% (mesures de la synthèse des cytokines) du sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur (30 min à 56" C), le glutamate de sodium 2 mM, la pénicilline 100 UI/ml et la streptomycine 100 UI/ml. Cellules et conditions de culture Les cellules mononucléées du sang périphérique de donneurs sains ont été obtenues par centrifugation sur milieu de séparation des lymphocytes (soit le sang total mélangé à du NaCl 0,9% (2:1), soit les poches de "buffy coat" mélangées à du NaCl 0,9%, resuspendues dans le milieu de culture complet à la densité de 106 cellules/ml, ensemencées dans des plaques de culture de 24 ou 48 puits (mesures de la synthèse des cytokines, 106 cellules/puits) ou 96 puits (mesures de la prolifération cellulaire et de la cytotoxicité, 105 cellules/puits) et laissées à 37 C (humidité 5%) en absence de tout effecteur pendant 14 à 18 heures. Les cellules ont ensuite été incubées avec le SPV30 (SPV30.1) à différentes concentrations testées en absence, ou en présence, des concentrations optimales ou suboptimales d'activateurs. Les cellules des lignées humaines T (Jurkat) et monocytaire (THP-1) ont été maintenues en culture continue dans le même milieu (5% SVF) et utilisées à la même densité et dans les mêmes conditions. Mesure de la synthèse des cytokines : IL-le, TNFa, IL-6, GM-CSF, IL-2. Les effets sur la production des cytokines ont été testés pour des concentrations de SPV30 de 2 ng/ml à 4 mg/ml. Au terme de l'incubation, les plaques de culture contenant les différentes conditions expérimentales ont été rapidement congelées et décongelées. Les quantités de cytokines produites par les cellules mononucléées ont été déterminées en utilisant des immunodosages spécifiques et quantitatifs (ELISA) ; les performances de ces tests ainsi que les détails techniques précis de mesure ont été publiés. Il a été vérifié que la présence de SPV30 n'interférait pas avec la quantification des cytokines par ELISA. Détermination de la prolifération cellulaire Les effets sur la prolifération cellulaire ont été testés pour des concentrations de SPV30 de 2 ng/ml à 4 mg/ml. La prolifération lymphocytaire, basale et induite par des mitogènes, a été quantifiée en mesurant l'incorporation de la thymidine tritiée par les cellules en culture, selon les techniques déjà décrites. RESULTATS Production de l'IL-i p La fraction SPV30 en absence de tout autre effecteur stimule de manière dose-dépendante la production de l'IL-l ss par les cellules mononuclées du sang périphérique. L'augmentation de la production de l'lL-lss par rapport à la production basale est détectable à partir de 50-100 llg/ml de SPV30, après 24 heures d'incubation. L'IL-lss stimulée par le SPV30 à 2 mg/ml atteint les concentrations 2 à 3 fois supérieures (15-20 ng/ml) à celles induites, dans la même expérience, par les concentrations optimales (1-10 ng/ml) de LPS ; cependant, le plateau de production de l'IL-l n'est pas observé dans ces conditions. La production de l'IL-I p par les cellules stimulées par les LPS (1 ng/ml) ou par le PMA (10 ng/ml) plus le CD3 (1 ,ug/ml) n'est pas modifiée de manière significative par la présence de SPV3o. Production de l'lL-6 La présence de la fraction SPV30 dans le milieu de culture des cellules mononucléées du sang périphérique n'exerce aucun effet sur la production de l'IL-6, basale ou stimulée. Production du TNFa En absence d'autres effecteurs, la fraction SPV30 stimule la production de TNFcx par les cellules mononucléées du sang périphérique de manière dose dépendante (détectable à partir de 50-100 rg/ml de SPV30) et modeste (de l'ordre de 0,4 ng/ml pour la concentration de SPV30 de 2 mg/ml). La production de TNFa induite par les concentrations optimales de PMA (10 ng/ml) plus CD3 (1 rg/ml), de l'ordre de 5-10 ng/ml à 24 h et de 50 ng/ml à 48 h, est légèrement inhibée par le SPV30 (inhibition maximale de 20 à 30% par la présence de SPV30 à 4 mg/ml, demieffet à 750 rg/ml de SPV30 . Production du GM-CSF La fraction SPV30 en absence de tout autre effecteur induit de manière dose-dépendante, détectable à partir de 50-100 rg/ml de SPV30, la production de GM-CSF par les cellules mononucléées du sang périphérique. A 24 h, en présence de 2 mg/ml de SPV30, le taux de GM-CSF atteint 0,2 ng/ml (quatre fois la production basale), comparable à celui induit par les LPS. Le SPV30 inhibe de manière significative la production de GM-CSF induite par l'incubation avec PMA (10 ng/ml) plus CD3 (1 Fg/ml) ainsi qu'avec PMA (10 ng/ml) plus PHA (6 rg/ml). La production de GM-CSF induite par ces activateurs est de l'ordre de 10 ng/ml à 48 heures. L'inhibition maximale atteint 90% en présence de SPV3 Production d'IL-2 Mis en présence des cellules mononucléées du sang périphérique, le SPV30 n'exerce aucun effet sur la production basale d'IL-2. La synthèse d'IL-2 induite par différents activateurs, tels la PHA (1 rg/ml), le PMA (10 ng/ml) plus le CD3 (1 crg/ml), le PMA (10 ng/ml) plus la PHA (1 rg/ml), est inhibée de manière spectaculaire, dose dépendante, par le SPV30. L'effet inhibiteur de la synthèse d'IL-2 est détectable à 200-300 rg/ml de SPV30, le demi-effet est observé à 750-1000 ,ug/ml, et l'inhibition maximale de 8090% est atteinte à 4 mg/ml. La fraction dialysable de SPV30 rend compte de ces propriétés. Pour observer l'effet inhibiteur optimal, le SPV30 doit être ajouté dans le milieu de culture simultanément avec l'activateur ou peu après, une à deux heures ; l'inhibition de la production d'IL-2 est observable, mais suboptimale, quand les cellules ont été préincubées 2 heures avec le SPV30 seul ou 4 heures avec l'activateur seul. L'effet du SPV30 est détectable dès le début de la production d'IL-2 elle-Même ; puis l'effet suppresseur augmente régulièrement pour atteindre 50% et 75% d'inhibition (SPV30 à 1 mg/ml et à 2 mg/ml, respectivement) après 24 h d'incubation et 65% et 85% d'inhibition après 48 h. Action agoniste du SPV30 et de la ciclosporine A sur la production d'IL-2 En accord avec les données publiées, l'effet inhibiteur de la ciclosporine A sur la synthèse d'IL-2 a été détectable à 10-20 nM, le demieffet a été observé à 50 nM et l'inhibition de 80% a été atteinte à 100 nM. La présence de la fraction SPV30 a déplacé la courbe dose-réponse de l'inhibition de production d'IL-2 par la CsA vers la bas et légèrement à gauche, indiquant leur action au moins additive : ainsi à 300 ,ig/ml de SPV30, l'inhibition de la production d'IL-2 a été observable à 5-10 nM de CsA ; en présence de 1250 pg/ml de SPV30, l'inhibition a été de 60% pour 1 nM de CsA, de 80% pour 50 nM de CsA et de 92% pour 100 nM de CsA. n existe un probable effet de potentialisation de l'action suppressive de la ciclosporine A par la fraction SPV30 ; en présence de 50 nM de CsA, la courbe doseréponse de l'inhibition de la production d'-2 par le SPV30 est plate, montrant 85% d'inhibition pour toutes les concentrations testées (0,01 à 2,5 mg/ml) de SPV3o. Prolifération cellulaire La prolifération de cellules mononucléées du sang périphérique induite par la PHA (1 rg/ml) est inhibée de manière dose-dépendante par le SPV30 pour des concentrations de 0,7 à 2 mg/ml; à 1 mg/ml de SPV30, concentration demi-inhibitrice de la synthèse d'IL-2, la prolifération a été inhibée de 30% et à 2 mg/ml l'inhibition de la prolifération a été de 75t Cependant, une amplification par le SPV30 de la prolifération cellulaire induite par la PHA a été observée pour des concentrations qui n'exercent pas d'effet détectable sur la production d'IL-2 ; 30% d'augmentation d'incorporation de thymidine tritiée à 50 rg/ml de SPV30, 15% d'augmentation à 200 crg/ml. n faut souligner que l'influence de SPV30 sur la prolifération cellulaire a été observée uniquement à 48 heures de culture; la mesure de l'incorporation de thymidine tritiée à des temps plus tardifs (72 h ou 96 h) n'a montré aucun effet de SPV30 sur la prolifération, basale ou induite par la PHA. Action antagoniste du SPV30 et de la ciclosporine A sur la prolifération cellulaire En accord avec les données publiées, l'effet suppresseur sur la prolifération lymphocytaire induite par les mitogènes a été observé pour les mêmes concentrations de ciclosporine A, que son effet inhibiteur de la production d'lL-2. La fraction SPV30 exerce un effet antagoniste de l'action de la CsA sur la prolifération. La présence de SPV30 à 0,3 mg/ml a induit une amplification de la prolifération stimulée par la PHA en présence des doses non inhibitrices de la CsA (6096 d'augmentation à 1 nM de CsA, 30% à 10 nM de Csa) ; à 100 nm de CsA en présence de 0,3 mg/ml de SPV30 à la prolifération reste à son niveau maximal stimulé par la PHA. Le même effet est observé en présence de SPV30 à 1,2 mg/ml qui a provoqué une translation analogue de la courbe dose-réponse de l'inhibition de la prolifération par la CsA vers le haut. L'effet antagoniste de l'action suppressive de la prolifération par la CsA n'a pas été observé en présence de SPV30 à 2,5 mg/ml. Exemple 5 : Essai clinique : SPV vs PIACEBO Essai pilote phase VII randomisée en double aveugle - But: Efficacité et de la tolérance du S.P.V. patients V.I.H asymptomatiques - Avis favorable du C.C.P.P.RB: avril 92 - Critères inclusion: CD4 entre 250 et 500 / mm3. patient V.l/ll asymptomatique (stade II CDC) - Critères d'exclusion: prise d'antiviraux (AZT-DDI) - Critères principal de jugement: évolution du nombre de CD4 - Critères secondaires Evaluation de la tolérance du S.P.V-Progression dans la maladie Autres marqueurs prédictifs de l'infection V. l.H (Agp24, B2microglobulinémie, néoptérine, IgA) Les résultats sont présentés sur la figure 7. On observe une augmentation significative du taux de CD4 dans le groupe traité par SPV30. Il n'existe pas de différence significative des effets secondaires entre les deux groupes. REVENDICATIONS 1. Composition immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un extrait végétal, caractérisée en ce que l'extrait végétal peut être obtenu par la mise en oeuvre des opérations successives suivantes: a) les feuilles d'une plante de la famille des Buxacées sont soumises à une étape d'extraction par un mélange eau/solvant organique, puis les solvants sont éliminés pour obtenir un extrait brut solide, b) l'extrait brut est remis en suspension dans un mélange hydroalcoolique puis introduit dans une colonne de résine non ionique macroporeuse, qui est éluée par un mélange hydroalcoolique, de façon à récupérer un extrait essentiellement dépourvu de sucres, c) les solvants de l'extrait obtenu à l'issu de l'étape b) sont éliminés et le résidu est remis en solution dans de l'eau, d) la solution aqueuse obtenue à l'issue de l'étape c) est introduite dans une colonne de résine échangeuse de cations faiblement acide, qui est éluée par de l'eau, e) les solvants sont éliminés de l'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) et le résidu solide est remis en solution aqueuse à pH acide, f) la solution aqueuse est introduite dans une colonne de résine échangeuse de cations fortement acide, qui est éluée par de l'eau, de façon à récupérer un extrait végétal essentiellement dépourvu d'alcaloïdes. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la plante de la famille des Buxacées appartient au genre Buxus, et est de préférence Buxus sempervirens. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'en chromatographie basse pression sur colonne Zorbax ODS SB (250 x 4,6 mm) éluée par un mélange eau + 1% d'acide trifluoroacétique, avec un débit de 1 ml/min, elle présente, à 255 nm, le spectre représenté sur la figure 1, comportant 6 pics majeurs. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'en chromatographie sur colonne Hypersil BDS C18 (100 mm x 4,6 mm), éluée par de l'acétate d'ammonium, pH 5,9 (10 min) puis par un gradient jusqu'à acétonitrile-eau 70% (20 min), elle présente, à 254 nm, le spectre représenté sur la figure 2. 5. Médicament, caractérisé en ce qu'il contient une composition selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 4, pour la préparation d'un médicament utile comme immunomodulateur. 7. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement des infections virales, en particulier provoquées par le VIH. 8. Procédé de stimulation in vitro des lymphocytes, caractérisé en ce qu'on introduit dans une culture lymphocytaire une composition selon l'une des revendications 1 à 4.