Brevet FR2719056A1 — publié le 19951027

Herpèsvirus transformés pour exprimer gD in vitro La présente invention a trait à de nouveaux herpèsvirus recombinés obtenus à partir d'herpèsvirus naturellement déficients en gD, notamment herpèsvirus aviaires et alphaherpèsvirus, en particulier alphaherpèsvirus aviaires et plus particulièrement MDV sérotypes 1, 2 et 3, ainsi que notamment VZV. Elle a également trait entre autres à leur utilisation comme vaccins et à leur procédé de préparation. Le virus responsable de la maladie de Marek (Marek's disease virus ou MDV) chez le poulet est un alphaherpèsvirus. Trois sérotypes du virus MDV sont décrits (BUlow V.V. et Biggs P.M., Avian Pathology, 1975, 4, 133- 146). Seuls les virus du sérotype 1 oncogènes sont pathogènes chez le poulet. Leur réplication chez l'hôte provoque la formation de lymphomes des cellules T et une l! démyélination des nerfs périphériques moteurs se traduisant en général par des signes de parésie ou de paralysie chez les animaux atteints (Calnek et Witter, Marek's Disease in Diseases of Poultry 9th edition, pp 342-390, Calnek B.W. et al. Ed. 1991, Iowa State Univ. Press). Cette maladie, aux conséquences économiques très importantes pour l'élevage aviaire, est prévenue par une vaccination des poussins d'un jour avec soit l'herpèsvirus du dindon (Herpesvirus of turkey ou HVT ou encore MDV de sérotype 3), virus antigéniquement proche du virus MDV mais non pathogène chez le poulet, soit des souches vivantes MDV non oncogènes et non pathogènes chez le poulet, appartenant aux sérotypes 1 ou 2. Pour les besoins de la production de vaccins, ces trois sérotypes sont principalement cultivés sur cellules primaires d'embryons de poulets (CEPs). Les cellules primaires d'embryons de canards peuvent également être utilisées pour multiplier les virus MDV de sérotype 2. Lors de la culture in vitro, ces virus sont fortement associés aux cellules. Ce phénomène est connu depuis longtemps (Churchill A.E. et Biggs P.M. Nature, 1967, 215, 528-530), et il a été également constaté que les virions produits après culture sur CEPs étaient non infectieux par voie orale ou nasale pour les poulets. La vaccination avec ces virus nécessite donc leur administration par voie parentérale, en général par transfixion de la membrane alaire ou par injection intramusculaire, ce qui augmente de façon non négligeable le coût de la vaccination contre la maladie de Marek. Il existe par contre chez le poulet une production de virus MDV infectieux, c'est-à-dire transmissible par voie aérienne ou par simple contact, au cours de l'infection par les souches pathogènes du virus MDV. Cette production de virus infectieux se fait au niveau des follicules plumeux, et le virus est disséminé dans l'environnement par l'intermédiaire des plumes de mue, des squames et des poussières (Calnek B.W. et ai., Avian Diseases, 1970, 14, 219-233). C'est par ce mécanisme que s'effectue la diffusion naturelle de la maladie dans les élevages. Les différences observées entre la culture in vitro et la réplication in vivo du virus MDV n'ont jamais été expliquées jusqu'à ce jour. L'étude de la culture in vitro des virus HVT ou MDV sur CEPs a montré que ces virus étaient étroitement associés aux membranes cellulaires. Cela a pour conséquence la quasi absence de virions libres et infectieux dans les surnageants de cultures. Il vient d'être montré récemment qu'un gène codant pour une glycoprotéine homologue de HSV-1 gD est présent sur les génomes respectifs des virus HVT et MDV (Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 1991, 72, 949-954; Zelnik V. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 2151-2162). Les produits d'expression de ces gènes chez HVT et MDV ont été étudiés et recherchés dans les lysats de CEPs infectées par ces virus. Ces expériences n'ont toutefois pas permis de démontrer l'expression de la glycoprotéine gD chez ces deux virus. En effet, des antigènes MDV gD exprimés sous forme de protéines de fusion avec la protéine TrpE chez E. coli ont été utilisés pour induire la production d'anticorps chez des lapins et, curieusement, les sérums ainsi préparés n'ont pas reconnu de protéine spécifique dans les lysats de CEPs infectées avec HVT ou MDV, alors que les anticorps préparés à partir de protéines de fusion exprimant des antigènes MDV gI ou MDV gE reconnaissent les glycoprotéines correspondantes exprimées par les virus MDV ou HVT au cours de la culture in vitro (Brunovskis P. et al, Proceedings l9th World's Poultry Congress, pp118-122. Amsterdam, 19-24 Septembre 1992). Cela indique soit une absence d'expression, soit un très faible niveau d'expression de gD au cours de la culture in vitro de HVT et MDV. A l'inverse, des sérums de poulets infectés par les souches pathogènes de MDV reconnaissent les antigènes HVT gD ou MDV gD exprimés sous forme de protéines de fusion avec la glutathion-transférase (Zelnik V. et al., Proceedings 19th World's Poultry Congress, pp 114-117. Amsterdam, 19-24 Septembre 1992). Ces résultats montrent que les gènes HVT gD et MDV gD sont bien exprimés au cours de la réplication in vivo chez le poulet et que les glycoprotéines respectives sont non seulement immunogènes, mais partagent aussi certains déterminants antigéniques. Il est à noter que chez la plupart des alphaherpèsvirus étudiés à ce jour, la glycoprotéine gD est un immunogène majeur qui contribue de façon significative à l'induction de l'immunité protectrice antivirale chez l'animal infecté ou immunisé. La présente invention est basée sur la découverte que la mise en oeuvre d'une expression constitutive de la glycoprotéine gD par le virus MDV, y compris HVT, permet de manière surprenante d'obtenir, comme lors de l'infection chez le poulet, des virions libres non associés aux cellules. Cette particularité offre la possibilité très avantageuse d'administrer ce virus par voie aérienne à des fins vaccinales et permet par ailleurs d'obtenir du virus libre dans le surnageant des cultures in vitro, ce qui facilite l'obtention et la fabrication du vaccin contre la maladie de Marek. De manière surprenante, la présente invention permet, par remplacement du promoteur naturel du gène gD chez les virus HVT et MDV par un autre promoteur, l'expression in vitro des glycoprotéines HVT gD et MDV gD. L'expression de gD, obtenue notamment en plaçant ce gène sous le contrôle d'un promoteur non régulé par le virus, permet la maturation complète des virions qui peuvent alors "sortir" librement des cellules infectées. Cette expression de gD in vitro est réalisée en remplaçant le promoteur naturel du gène gD par un autre promoteur qui peut être choisi parmi les promoteurs eucaryotes forts classiquement connus (exemple promoteurs HCMV IE, SV40, ou promoteurs précoces endogènes des virus HVT ou MDV...). Cette expression nouvelle peut être obtenue en utilisant les moyens offerts par les techniques de recombinaison génétique, en remplaçant par exemple la région située en amont de 1'ATG du gène gD par un promoteur exogène de type HCMV IE ou SV40, ou en transposant le gène gD dans la région unique longue du virus et en le plaçant sous le contrôle d'un promoteur endogène ou exogène. De nombreuses possibilités sont ainsi réalisables pour l'expression du gène gD en combinant différents promoteurs et différents sites d'insertion potentiels (tels que les sites RR2, TK, gD, gI, US3, US2, US10O...). Cette expression a des conséquences nouvelles et inattendues sur les propriétés biologiques du virus recombinant. L'expression de la glycoprotéine gD au cours de la réplication in vitro des virus recombinants HVT et MDV ainsi construits se traduit en effet par l'incorporation de la glycoprotéine gD dans l'enveloppe virale et par l'obtention de virions infectieux à un titre élevé dans les surnageants de culture. Par ailleurs, les virus recombinants ainsi obtenus, tout en gardant les caractères d'atténuation des virus parentaux, sont plus infectieux pour les lymphocytes in vivo et se répliquent plus rapidement dans ces cellules. Cela a pour conséquence directe une plus grande et une plus rapide diffusion de ces virus au sein de l'organisme du poulet. La protection contre la maladie de Marek est donc meilleure, quelle que soit la voie d'administration (oronasale ou parentérale). Du fait de ces modifications biologiques dans la réplication du virus, la protection contre la maladie de Marek peut être obtenue plus précocement et avec des doses vaccinales beaucoup plus réduites qu'avec les vaccins classiquement utilisés. On a en outre découvert qu'il était possible d'étendre cet enseignement aux autres herpèsvirus dont la structure génomique et les propriétés biologiques in vitro et in vivo sont équivalentes à celles des herpèsvirus aviaires mentionnés ci-dessus. Par exemple, la présente invention permet l'obtention d'un virus VZV recombiné exprimant le gène gD d'un autre virus tel que HSV-1 ou HSV- 2, avec pour conséquence très avantageuse la production de virus VZV libre par culture in vitro sur cellules. Ce virus recombiné peut constituer un vaccin contre VZV et contre le virus dont est issu le gène gD, par exemple HSV-1 ou HSV-2. Il existe en fait deux grands types de virus concernés par l'invention, qui correspondent à la 1Q définition de virus déficient en gD, à savoir ceux qui n'expriment pas gD in vitro en cultures cellulaires, ce qui est le cas des virus MDV, y compris HVT, et ceux qui sont dépourvus d'un gène homologue du gène gD, ce qui est le cas du virus VZV (varicella-zoster virus). L'invention concerne donc tous les herpèsvirus équivalents, dans le sens qui vient d'être défini, aux virus-types MDV et VZV. La présente invention a donc pour objet un herpèsvirus naturellement déficient en gD (dans le sens de 2Q l'invention défini ci-dessus), transformé pour exprimer une glycoprotéine gD au cours de sa réplication in vitro. De préférence, il s'agit d'un herpèsvirus aviaire, notamment virus MDV des sérotypes 1, 2 et 3 ou bien du virus de la varicelle VZV. Selon un premier mode de réalisation préféré de l'invention, qui concerne les herpèsvirus ayant un gène gD non exprimé in vitro, l'herpèsvirus a son gène gD placé sous le contrôle d'un promoteur autre que le promoteur naturel de ce gène. Le promoteur naturel du gène gD est remplacé par un promoteur endogène (c'est-à-dire un promoteur de ce virus ou des autres sérotypes de ce virus, notamment un promoteur précoce) ou exogène, permettant l'expression du gène gD in vitro. Dans un deuxième mode de réalisation préféré de l'invention, l'herpèsvirus comprend une cassette d'expression comportant le gène gD placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression lors de la réplication du virus in vitro. Dans le cas d'un herpèsvirus ne présentant pas naturellement de gène gD, la cassette comprend le gène gD d'un autre virus, par exemple de HSV ou même d'un virus tel que MDV, y compris HVT, et un promoteur approprié qui peut être le promoteur naturel du gène inséré ou être un autre promoteur, ce qui sera le cas lorsque le gène gD proviendra d'un virus du type MDV, la condition étant d'obtenir une expression du gène gD in vitro. Dans le cas d'un herpèsvirus seulement déficient dans l'expression de gD in vitro, la cassette peut aussi comprendre aussi bien le gène gD endogène qu'un autre gène gD, et un promoteur approprié comme défini ci-dessus. La cassette d'expression est insérée dans un site non essentiel pour la réplication du virus et pour l'efficacité du virus à titre de vaccin. Pour les virus MDV des sérotypes 1, 2 et 3, un site d'insertion est avantageusement choisi parmi le groupe consistant en: US2, US3, US10, gI, gD, TK, RR2, UL13. On comprend bien entendu que cette énumération n'est pas limitative et que tout site d'insertion potentiel peut être utilisé. Pour le virus VZV, on peut choisir un site d'insertion parmi le groupe consistant en: TK, US3, gI, gE, gC, région intergénique US3-gI. On comprend que le gène gD, au sein d'une cassette telle que définie ci-dessus et quelle que soit son origine, peut être inséré dans MDV, ou autre virus du même type, à la place du gène gD lui-même ou dans un autre site d'insertion. La présente invention a de préférence pour objet un herpèsvirus choisi parmi le groupe consistant en: MDV des sérotypes 1, 2 et 3 et VZV, exprimant une glycoprotéine gD au cours de sa réplication in vitro. La présente invention a pour objet la production in vitro de virus, notamment HVT et MDV, infectieux, sous forme de virions libres présents dans le surnageant de culture de cellules. Les techniques de culture sont notamment celles habituellement utilisées dans la pratique pour un virus donné. Celles-ci sont bien connues de l'homme du métier et n'ont donc pas à être décrites plus en détail ici. L'utilisation des virus transformés conformément à ll l'invention dans la production de virus facilite la fabrication de vaccins, notammunent ceux contre la maladie de Marek, et de virus recombinants, notamment HVT et MDV, en permettant d'obtenir un effet cytopathique généralisé plus rapide (2 à 3 jours selon la richesse de l'inoculum) et une meilleure résistance du virus aux opérations de conservation par congélation ou par lyophilisation. On obtient avantageusement des titres élevés en virus libres dans le surnageant de culture en comparaison de ce qui est obtenu en l'absence d'expression de gD. Il s'agit là d'un résultat remarquable. L'invention a donc pour objet un procédé de culture d'herpèsvirus naturellement déficient en gD, dans lequel on cultive sur cellules le virus qui a été transformé par recombinaison génétique pour exprimer la glycoprotéine gD, puis l'on recueille les virions produits dans le surnageant de culture. Les techniques de culture des virus sont notamment celles habituellement utilisées dans la pratique. L'homme du métier est parfaitement au fait des techniques appropriées à chaque virus et celle-ci n'ont donc pas à être décrites plus en détail ici. L'invention a également pour objet les cultures d'herpèsvirus susceptibles d'être obtenues par ce procédé. La présente invention a aussi pour objet la production in vitro de virus, notamment HVT ou MDV, infectieux qui peuvent être utilisés comme vecteurs d'expression pour des gènes étrangers, en particulier pour des gènes ou des fractions de gènes codant pour des antigènes induisant une protection contre des maladies, en particulier une protection des oiseaux d'élevage contre des virus, bactéries ou parasites pathogènes responsables de maladies aviaires, et plus particulièrement des poulets. L'invention a donc également pour objet les herpèsvirus tels que définis plus haut, qui comprennent en outre au moins un gène hétérologue inséré dans leur génome O10 de manière que ce gène puisse s'exprimer in vivo. Pour cela, le virus recombiné peut comprendre soit une double cassette incluant le gène gD, le promoteur de celui-ci et le gène codant pour l'antigène avec un promoteur approprié, la cassette pouvant être insérée dans le site gD pour un virus tel que MDV, ou dans un autre site, soit une cassette pour chaque gène, celle comprenant le gène gD pouvant être insérée par exemple dans un site autre que le site gD naturel dans le cas d'un virus tel que MDV et l'autre cassette pouvant être insérée par exemple dans le site gD naturel, ou dans tout autre site approprié, soit encore seul le promoteur naturel du gène gD est remplacé et la cassette comprenant le gène hétérologue est insérée dans un autre site approprié. Il est remarquable de noter que lorsque le virus tel que MDV a été transformé pour exprimer un gène endogène ou d'un autre sérotype sous le contrôle d'un promoteur efficace selon l'invention, ce gène inséré est exprimé in vivo au cours de la virémie et pas seulement dans les follicules plumeux (cas du gD naturel), ce qui se traduit notamment par une réponse immunitaire, en particulier cellulaire, plus forte et plus précoce. La présente invention a encore pour objet la production de vaccins avantageusement utilisables par les voies aérienne (nasale, oculaire), orale ou parentérale, notamment pour immuniser les poulets contre la maladie de Marek et les autres maladies correspondant aux antigènes spécifiques exprimés par les virus HVT ou MDV recombinants. Les vaccins selon l'invention se caractérisent par le fait qu'ils comprennent un virus vivant tel que défini plus haut et qu'ils peuvent se présenter notamment sous la forme lyophilisée ou congelée. Le procédé de production d'un vaccin vivant selon l'invention se caractérise par le fait que l'on cultive sur cellules un herpèsvirus naturellement déficient en gD, qui a été transformé pour exprimer gD lors de sa réplication in vitro et éventuellement transformé pour exprimer in vivo au moins un gène hétérologue codant pour un antigène ou immunogène vaccinal. La présente invention a également pour objet la production de vaccins administrables in ovo pour vacciner les poulets contre la maladie de Marek et les vaccins obtenus. La présente invention a de manière spécifique pour objet l'utilisation du gène gD comme locus d'insertion pour construire des herpèsvirus aviaires recombinants, notamment HVT ou MDV, exprimant en sus des gènes étrangers d'intérêt vaccinal. La présente invention a aussi pour objet l'obtention de virus aviaires, notamment HVT ou MDV, infectieux pouvant servir de vecteurs pour l'expression d'antigènes étrangers et permettant la vaccination in ovo. La présente invention a aussi pour objet une méthode de vaccination notamment des oiseaux d'élevage, utilisant les virus transformés conformément à l'invention et prévoyant notamment leur administration par voie aérienne, bien que les autres voies ne soient pas exclues. Enfin, la révélation du principe à la base de l'invention permet à l'homme du métier de rechercher aussi chez les virus du type MDV des mutants naturels exprimant gD in vitro. Ces mutants entrent alors dans le cadre de l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de réalisation se référant au dessin, dans lequel on voit: - à la figure 1: par digestion du plasmide pRD001 comprenant un fragment de 29 kpb de l'ADN de HVT, construction des plasmides pRD006 et pRD007 qui comprennent respectivement un fragment de 2,8 kb incluant la partie de gD en 5' de PstI et un fragment de 5,7 kb incluant la partie de gD en 3' de PstI; - à la figure 2: construction du plasmide pRD015 comprenant la partie flanquante en 5' de gD, à partir du plasmide pRD001; - à la figure 3: plasmide pRD022 obtenu à partir du vecteur pBS-SK+ et comprenant le gène gD dépourvu de sa partie en ' du site SacI; - à la figure 4: plasmide pRD030 comprenant l'entièreté du gène gD et des sites de restriction l'encadrant; - à la figure 5: à partir du pCMVp, construction du plasmide pRD031 contenant le gène gD sous le contrôle du promoteur HCMV IE, par remplacement du gène LacZ par gD; - à la figure 6: plasmide pRD040 comprenant une cassette incluant le gène gD et le promoteur HCMV IE, dans le vecteur pBS-SK+; - à la figure 7: construction du plasmide pRD041 obtenu par addition, au plasmide pRD040, de la séquence 5' flanquante contenue dans le plasmide pRD015; - à la figure 8: construction du plasmide pRD043 comprenant le gène gD, le promoteur HCMV, et l'ensemble promoteur SV40 et gène LacZ apporté par pSVa dans pRD041 entre le promoteur HCMV et la séquence 5' flanquante; - à la figure 9: construction du plasmide pRD046 à partir du plasmide pBamB contenant un fragment HVT BamHI B incluant le gène TK; - à la figure 10: construction du plasmide pRD051 par introduction d'un site de restriction multiple dans le site unique DraIII du plasmide pRD049; - à la figure 11: construction du plasmide pRD053 comprenant la cassette promoteur HCMV et gène HVT-gD insérée dans le gène TK de HVT. EXEMPLES Toutes les techniques utilisées pour les constructions des plasmides donneurs sont les techniques standards de biologie moléculaire décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Le contenu de cette publication est considéré comme étant incorporé par référence dans cette description. Exemple 1: Construction du plasmide pRD043 La souche FC126 du virus HVT a été isolée en 1968 par le Dr Witter du Regional Poultry Research Laboratory (U.S.D.A., East Lansing, Michigan, U.S.A.), dans un troupeau de dindes de 23 semaines (R.L. Witter et al., Am. J. Vet. Res. 31, 525-538, 1970). Elle a été ensuite passée fois sur des fibroblastes de canard, puis a subi 9 passages supplémentaires sur des fibroblastes d'embryons de poulets EOPS. L'ADN utilisé provient de virus ayant fait l'objet au total de 23 à 24 passages à partir de l'isolat d'origine. On pourrait aussi utiliser par exemple la souche HVT enregistrée à l'ATCC sous la référence VR584C. L'ADN génomique du virus HVT a été extrait selon la technique décrite par N. Ross (Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 1989, 70, 1789-1804). Cet ADN a été digéré par BamHI, puis le fragment A de 29 kpb (Igarashi T. et al., Virology 1987, 157, 351-358), comprenant la région Us de HVT, a été cloné dans le vecteur pBR322 préalablement digéré par BamHI pour donner le plasmide pRD001. pRD001 a été digéré par PstI et les fragments PstI-PstI 2,8 kpb et ,7 kpb ont été clones dans le plasmide pBR322 digéré par PstI pour donner respectivement les plasmides pRD006 et pRD007 (Figure 1). pRD001 a été digéré par XhoI et le fragment XhoI- XhoI 3,5 kpb a été cloné dans le vecteur pBluescript KS+ pour donner le plasmide pRD015 (Figure 2). Le plasmide pRD006 a été digéré par SacI et PstI pour isoler le fragment SacI-PstI de 340 pb (fragment A). Une PCR a été réalisée avec lee oligonucléotides RD045 (SEQ ID No. 1:5' TGCTGGTACCGTCGACAAGCTTGGATCCGTGCAGATAACACGTACTGGC 3') et pBR Pst- (SEQ ID No. 2: 5' CATGTAACTCGCCTTGATC 3') et la matrice pRD007 pour amplifier la région 3' du gène gD (positions 6491 à 6980 sur la séquence HVT Us (Zelnik V. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 2151-2162). Le fragment PCR de 560 pb a été ensuite digéré par PstI et KpnI pour isoler un fragment B PstI-KpnI de 520 pb. Les fragments A et B ont été clones dans le vecteur pBS-SK+ préalablement digéré par SacI et KpnI pour donner le plasmide pRD022 (Figure 3), comprenant le gène gD dépourvu d'une partie 5'. Le plasmide pRD022 a été digéré par BamHI et SacI pour isoler le fragment BamHI-SacI de 850 pb (fragment C). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides RD050 (SEQ ID No. 3: 5' TGCTGAATTCGCGGCCGCATGATTATTGTCACCACTTC GAAGATGGC 3') et HVT40M1 (SEQ ID No. 4: 5' GTCCCCGTTGACAACTACTA 3') et la matrice pRD006 pour amplifier la région 5' du gène gD (positions 5747 à 6286 sur la séquence HVT Us (Zelnik V. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 2151-2162). Le fragment PCR de 560 pb a été digéré par EcoRI et SacI pour isoler un fragment D EcoRI-SacI de 420 pb. Les fragments C et D ont été clones dans un vecteur pBS-SK+ modifié, ne comportant plus les sites XbaI et SpeI (pBS-SK+ digéré par XbaI et SpeI, puis ligaturé), digéré par EcoRI et BamHI pour donner le plasmide pRD030 (Figure 4), comprenant le gène gD. Le plasmide pRD030 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1250 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pCMVI (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) digéré par NotI pour l'insertion du gène gD à la place de LacZ, ce qui donne le plasmide pRD031 (4944 pb) contenant le gène HVT-gD sous le contrôle du promoteur HCMV IE (Figure 5). Le plasmide pRD031 a été digéré d'une part par EcoRI et BstBI et d'autre part par BstBI et BamHI pour isoler respectivement le fragment EcoRIBstBI de 800 pb et le fragment BstBI-BamHI de 1250 pb. Ces deux fragments ont été clones dans le vecteur pBS-SK+ digéré par EcoRI et BamHI pour donner le plasmide pRD040 (Figure 6) comprenant le promoteur HCMV et gD dans le vecteur SK+. Le plasmide pRD015 a été digéré par KpnI et BstBI pour isoler un fragment KpnI-BstBI de 2100 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-KS+ digéré par KpnI et ClaI pour donner le plasmide pRD033 (5024 pb). Le plasmide pRD040 a été digéré par EcoRI et SpeI pour isoler le fragment EcoRI-SpeI de 2000 pb. Ce fragment a été cloné dans le plasmide pRD033 digéré par EcoRI et XbaI pour donner le plasmide pRD041 (Figure 7) comprenant gD, le promoteur HCMV et la région 5' flanquante. Le plasmide pSVP (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) a été digéré par EcoRI et HindIII pour isoler le fragment EcoRI-HindIII de 4300 pb. Ce fragment a été cloné dans le plasmide pRD041 digéré par EcoRI et HindIII pour donner le plasmide pRD043 (11306 pb) (Figure 8) comprenant en plus par rapport au pRD041, le gène LacZ et son promoteur SV40. Le plasmide pRD053 permet à la fois de remplacer le promoteur naturel de gD par le promoteur HCMV IE et d'introduire, par recombinaison homologue en utilisant le bras 5' correspondant au fragment allant des bases 2152 à 4245 (Zelnik 1993 - supra) (fragment correspondant à la plus grande partie du gène sORF-3, au gène US2 et au début du gène US3) et le bras 3' allant des positions 5747 (A de l'ATG du gène gD) à 6980 (ce qui correspond au gène gD et au polyA). On comprend que, au lieu d'apporter le gène LacZ, on pourrait tout à fait aussi facilement apporter un gène codant pour un antigène d'intérêt. Exemple 2: Construction du plasmide pRD053 (cassette CMV-gD dans TK) Le fragment HVT BamHI B (Igarashi T. et al., Virology. 1987, 157, 351-358) contenant le gène TK a été cloné dans le vecteur pBR322 pour donner le plasmide pBamB. Le plasmide pBamB a été digéré par HindIII pour isoler le fragment HindIII-HindIII de 3200 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBSSK+ digéré par HindIII pour donner le plasmide pRD046 (Figure 9). Le plasmide pRD046 a été digéré par SalI, réparé avec la polymérase Klenow puis digéré par SacI pour isoler le fragment SalI(K)-SacI de 3200 pb. Ce fragment a ensuite été ligaturé avec le vecteur pUC18 préalablement digéré par HindII et SacI pour donner le plasmide pRD049 (5943 pb). Le plasmide pRD049 a alors été digéré par DraIII (site unique sur pRD049), déphosphorylé par l'action de la phosphatase alcaline, et ligaturé avec un oligonucléotide synthétique double brin obtenu par hybridation des deux oligonucléotides suivants: RD053 SEQ ID No 5: 5' GTGGTACCATAGTCGACACCCT 3' RD054 SEQ ID No 6: 5' GTGTCGACTATGGTACCACAGG 3' Le plasmide ainsi obtenu a été appelé pRD051 (Figure 9). Ce plasmide a été digéré par KpnI et SalI pour isoler le fragment KpnI-SalI de 5960 pb (fragment A). Le plasmide pRD040 (voir exemple 1) a été digéré par KpnI et BstBI pour isoler le fragment KpnI- HCMV IE- ATG-BstBI de 800 pb (fragment B). Le plasmide pRD031 a été digéré par BstBI et SalI pour isoler le fragment BstBI-HVT gD-SalI de 1450 pb (fragment C). Les fragments A, B et C ont ensuite été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pRD053 (Figure 11) comprenant la cassette de gD insérée dans TK. Ce plasmide permet l'introduction de cette cassette gD dans le gène TK par recombinaison homologue en utilisant des bras flanquants 5' et 3' respectivement homologues des régions en amont du site DraIII du gène TK (fragment HindIII-DraIII de 520 pb) et en aval du site DraIII du gène TK (fragment DraIII-HindIII de 2650 pb). Cette insertion conduit à l'inactivation de TK. Ce plasmide est linéarisé par ScaI avant la cotransfection avec l'ADN viral d'HVT. Exemple 3: Isolement et purification du virus recombinant vHVT004 L'ADN viral utilisé pour les expériences de transfection a été préparé selon la technique décrite par Robin Morgan (Morgan R. W. et al., Avian Diseases, 1990, 34, 345-351). Le plasmide pRD043 a été digéré par KpnI pour linéarisation, puis extrait avec un mélange phénol/chloroforme (19:1), précipité avec de l'éthanol absolu, et repris dans de l'eau stérile. Des cellules CEPs primaires de 24 heures ont été transfectées avec le mélange suivant: 5 Mg d'ADN viral+ lg du plasmide pRD043 linéarisé dans 300 il de milieu OptiMEM (Gibco) et 100 mg de Lipofectamine (Gibco BRL Ref. 18324- O10 012) dans 300 Ml de milieu (volume final du mélange = 600 Il). Ces 600.l ont été ensuite dilués dans 3 ml (volume final) de milieu et étalés sur 3.106 CEPs. Le mélange est laissé 5 heures en contact avec les cellules, puis éliminé et remplacé par 5 ml de milieu de culture. Les cellules sont alors laissées en culture 3 jours à 37o C, puis elles sont pronasées, mélangées à des CEPs secondaires fraîches (mélange 3:1), et réétalées sur boites de Petri jusqu'à apparition d'un effet cytopathique (ECP). Le tapis cellulaire est alors pronasé et sert d'inoculum (à raison de 1 plage par boîte) pour des boîtes de 60 mm (contenant 2.106 CEPs secondaires). Trois jours après l'inoculation, une couche d'agar est coulée sur le tapis cellulaire. 24 heures plus tard, une surcouche d'agar contenant de l'X-Gal (500 ig par ml final) est coulée. Trois heures après, une coloration bleue intense se développe au niveau des plages contenant les virus recombinants. Chaque plage bleue est alors repiquée individuellement pour amplification dans une cupule d'une plaque 96 puits. A l'apparition d'un ECP, la cupule est pronasée et sert d'inoculum pour une nouvelle boite 60 mm. La sélection des plages recombinantes et l'estimation du pourcentage de purification de ces plaques se fait comme précédemment par coloration X-Gal des plages sous agar. En général, 4 cycles d'isolements successifs suffisent pour obtenir des virus recombinants dont la totalité de la progénie présente la coloration bleue. Chaque plage individuelle purifiée à 100 % est alors caractérisée au niveau moléculaire par les techniques PCR et de Southern blot en utilisant les oligonucléotides et les sondes d'ADN appropriés. Un clone pur à 100% et présentant les caractères du recombinant attendu a été isolé et désigné vHVT004. Ce virus contient une cassette SV40-LacZ insérée entre les gènes US2 et gD ainsi que le promoteur HCMVIE placé directement en amont du gène gD et contrôlant ainsi ce gène dans son site d'origine. Ce virus est donc délété de US3, qui est le site d'insertion. Exemple 4: Isolement et purification du virus recombinant vHVT005 (TK-) L'ADN génomique du virus HVT utilisé pour les expériences de transfection a été préparé comme précédemment (Morgan R. et al. , Avian Diseases, 1990, 34, 345-351). Les transfections ont été réalisées avec le plasmide pRDO53 linéarisé par ScaI comme décrit dans l'exemple 3. Après 3 jours de culture, les cellules sont pronasées, mélangées à des CEPs secondaires fraîches et réétalées sur boîtes de Petri. A l'apparition d'un ECP, le tapis cellulaire est pronasé, et sert d'inoculum pour des boîtes de Petri de 60 mm. La culture est alors effectuée avec un milieu de culture contenant de la 1-j-D- arabinofuranosyl-thymine (ara T) (Sigma) à la concentration finale de 100 pg/ml de milieu de culture. L'ara T inhibe la réplication des virus HVT TK+ et seuls les mutants naturels TK- ou les recombinants TK- peuvent se répliquer en présence d'ara T. Trois jours après l'infection, une couche d'agar est coulée sur le tapis cellulaire. 24 heures après, les plages virales présentes sur le tapis cellulaire sont repiquées individuellement dans des cupules d'une plaque 96 puits. La culture de ces plages se fait en présence d'araT dans le milieu de culture. A l'apparition d'un ECP, les cupules sont pronasées, des dilutions des cupules infectées sont étalées sur des boîtes de Petri, et un nouveau cycle de culture sous agar est effectué comme précédemment. Après deux cycles de culture en présence d'araT, la culture peut être effectuée en milieu normal. Quatre cycles d'isolement/purification sont suffisants pour obtenir des clones recombinants purs à 100 % pour le caractère TK-. Ces clones sont alors caractérisés au niveau moléculaire avec les techniques habituelles de la biologie moléculaire (PCR, Southern blot, etc...). Un clone pur à 100% et présentant les caractères du recombinant attendu a été isolé et désigné vHVT005.Ce virus contient le gène gD sous le contrôle du promoteur HCMV IE dans le gène TK, lequel est donc inactive. REVENDICATIONS 1- Herpèsvirus naturellement déficient en gD, transformé pour exprimer une glycoprotéine gD au cours de sa réplication in vitro. 2- Herpèsvirus selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un herpèsvirus comprenant naturellement un gène gD qui n'est pas exprimé in vitro, tel que le virus MDV, sérotypes 1, 2 et 3. 3- Herpèsvirus selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un herpèsvirus ne comportant pas naturellement de gène gD, tel que le virus VZV. 4- Herpèsvirus selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène gD du virus est placé sous le contrôle d'un promoteur autre que le promoteur naturel de ce gène et apte à induire l'expression du gène gD in vitro. - Herpèsvirus selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le virus comprend une cassette d'expression comportant un gène gD placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression lors de la réplication du virus in vitro. 6- Herpèsvirus selon la revendication 5, caractérisé en ce que le promoteur inclus dans la cassette est différent du promoteur naturel du gène gD qui est inséré ou est ce promoteur naturel dans la mesure o ce gène gD inséré est issu d'un virus l'exprimant naturellement. 7Herpèsvirus selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la cassette d'expression est insérée dans un site non essentiel pour la réplication du virus et pour l'efficacité du virus à titre du vaccin. 8- Herpèsvirus selon la revendication 7, caractérisé en ce que, pour MDV sérotypes 1, 2 et 3, le site d'insertion est choisi parmi le groupe consistant en: US2, US3, US10, gI, gD, TK, UL13. 9- Herpèsvirus selon la revendication 7, caractérisé en ce que, pour VZV, le site d'insertion est choisi parmi le groupe consistant en: TK, US3, gI, gE, gC et région intergénique US3-gI. 10- Herpèsvirus selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que le promoteur intégré pour assurer l'expression in vitro d'un gène gD est un promoteur fort, tel que le promoteur HCMV IE ou le promoteur SV40. 11- Herpèsvirus choisi parmi le groupe consistant en MDV sérotypes 1, 2 et 3 et VZV, exprimant une glycoprotéine gD au cours de sa réplication in vitro. 12- Herpèsvirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un gène hétérologue codant pour un antigène d'intérêt, inséré dans son génome de manière que ce gène puisse s'exprimer in vivo. 13- Herpèsvirus selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant un gène gD et le gène hétérologue, chacun avec leur promoteur propre, insérée dans un site non essentiel. 14- Vaccin comprenant un virus vivant selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. - Vaccin selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est utilisable par les voies parentérale, orale ou aerienne. 16- Vaccin selon les revendications 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il est sous forme lyophilisée ou congelée. 17Procédé de culture d'herpèsvirus naturellement déficient en gD, dans lequel on cultive sur cellules le virus qui a été transformé pour exprimer la glycoprotéine gD, puis l'on recueille les virions produits dans le surnageant de culture. 18- Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'on cultive un herpèsvirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 19- Culture d'herpesvirus, notamment aviaire, tel que MDV sérotypes 1, 2 et 3, susceptible d'être obtenue par le procédé selon les revendications 17 ou 18. 20- Procédé de production d'un vaccin vivant, caractérisé en ce que l'on cultive sur cellules un herpèsvirus naturellement déficient en gD, qui a été transformé pour exprimer gD lors de sa réplication in vitro et éventuellement transformé pour exprimer in vivo au moins un autre gène hétérologue codant pour un immunogène vaccinal. 21- Procédé selon l'une quelconque des revendications 17, 18 et 20, caractérisée en ce que l'on cultive un virus MDV du sérotype 1, 2 ou 3 ou le virus VZV.