Brevet FR2714064A1 — publié le 19950623

La présente invention a essentiellement pour objet l'aspartame, pour son application en tant que substance thérapeutiquement active, et des compositions pharmaceutiques en contenant. L'invention trouve notamment application dans le traitement de certaines maladies provoquées par des contaminations alimentaires, et plus particulièrement dans le traitement et la prophylaxie de l'ochratoxicose humaine et animale. On rappelle que l'aspartame est un dipeptide de synthèse constitué par l'ester méthylique de la L-aspartyl-L-phénylalanine de formule: COOCH3 CO--NH_ C_ H s I H 2N C -- H CH2 CH2 1 2 COOH qui, en raison d'une part de son pouvoir sucrant relativement intense, (de l'ordre de 100 à 200 fois celui du saccharose, sur une base pondérale), et d'autre part de son faible apport en calories, est largement utilisé dans l'industrie alimentaire, pour édulcorer des produits variés. La préparation de l'aspartame est décrite dans le brevet US-A-3,492,131 incorporé ici par référence. En raison de ses applications dans l'industrie alimentaire, les propriétés toxicologiques de l'aspartame ont été étudiées de manière intensive. Cependant, aucune application de ce composé, dans le domaine thérapeutique, n'a été décrite à ce jour. Or, il a été découvert, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que l'aspartame présente des propriétés pharmacologiques particulièrement intéressantes et constitue un excellent moyen pour le traitement et la prophylaxie de l'ochratoxicose humaine et animale. L'ochratoxine A (désignée également ci-après OTA) est une mycotoxine produite par Penicillium verrucosum ainsi que par de nombreuses espèces d'Aspergillus, en particulier Aspergillus ochraceus. La présence de cette mycotoxine a été montrée, parfois dans des proportions élevées dans diverses céréales, comme par exemple le blé, le mais, l'orge, le mil, le riz ainsi que dans d'autres aliments variés comme par exemplc les haricots, le soja, les petits pois, les noix, le cacao et le café, ainsi que dans les produits camés provenant de volailles ou de porcs ayant consommé des aliments contaminés. L'ochratoxine A exerce des effets néphrotoxiques chez toutes les espèces animales par inhibition de la synthèse protéique et par suite de phénomènes oxydatifs. On considère généralement que cette substance est responsable de néphropathies endémiques de certaines régions du monde (par exemple des Balkans) ainsi que de tumeurs du tractus urinaire. Diverses études ont montré que l'ochratoxine A est néphrotoxique chez toutes les espèces animales et, de plus, génotoxiques et cancérigènes chez les rongeurs et probablement chez l'homme.[E.E. Creppy et al., Toxicol. Lett. 28, 29- 35 (1985);NTP (National Texicology Programm) Technical report on Toxicology and carcinogenesis studies of ochratoxin A, G. Boorman, Ed. NIH publication n:89-2813, USA; G. Dirheimer and E E Creppy, Mechanism of action of ochratoxin A in Mycotoxins, Endemic Nephropathy and Urinary Tract Tumours Ed. M. Castegnaro, R. Plestina G. Dirheimer, I.N. Chermozemski & H. Bartsch Lyon, International Agency for Research on Cancer,Scientific Publication n 115 pp.171-185] La structure chimique de l'ochratoxine A et de ses métabolites est connue. Ainsi l'ochratoxine A (ou chloro-dihydro-isocoumarinyl phénylalanine) comporte une partie isocoumarinique chlorée liée à la phénylalanine par une liaison peptidique. Cette substance répond à la formule générale I ci-après dans laquelle R représente un atome d'hydrogène et R' un atome de chlore. ROO O OH O N ICH3Io H H R' 3 2714064 Le dérivé non chloré correspondant (composé de formule I dans laquelle R et R' représentent un atome d'hydrogène) est dénommé ochratoxine B. Cette substance ne semble pas toxique, mais sa génotoxité n'a pas encore été étudiée. L'ester éthylique de l'ochratoxine A (composé de formule I dans laquelle R représente un groupe CH3 et R' représente un atome de chlore) est dénommé ochratoxine C. Cette substance présente des effets comparables à ceux de l'ochratoxine A. De même, le schéma de la métabolisation de l'ochratoxine A ci-dessous fait apparaître les différents métabolites connus de cette substance. OH O OOH HOOC j CH, N NH2 OH Phénylalanine Ci / tH0S Ochratoxine-a THydrolyse HO OH O Phnylalaine HO HO O OH O 0 OhydrOxytase 20.,") _CH: H -. H H ClC Tinde- OTA Ochratoxine A (dû H O OH O HO O OH O Nt XH, O CH2OH 4(S).hydroxy-OTA '1Q-hydroxy-OTA H O OH O O CO Cl H 4-(R)-hydroxy-OTA 4 2714064 En raison du fait qu'il est extrêmement difficile d'empêcher la formation de mycotoxines, notamment durant le stockage ou le transport d'aliments susceptibles d'être contaminés, et plus particulièrement encore en présence de chaleur et d'humidité, il s'est avéré souhaitable de pouvoir disposer de moyens thérapeutiques ou prophylactiques pour lutter contre les effets de ces mycotoxines, et en particulier de l'ochratoxine A. C'est ainsi qu'il a été proposé d'utiliser un bicarbonate de métal alcalin, et plus particulièrement le bicarbonate de sodium, comme principe actif de médicaments destinés à traiter l'ochratoxicose [S. Yong et al. J. Environ. Sci.Health, B22, 455-470 (1987)]. Mais l'efficacité de ce traitement reste faible, même à des doses administrées relativement élevées, par exemple de l'ordre de plusieurs grammes par jour. En outre, ce traitement peut conduire à des effets secondaires indésirables et n'est pas applicable à certains patients, comme par exemple les patients soumis à un régime non sodé. De plus encore, l'administration de bicarbonate de sodium entraîne une acidification de l'urine qui a pour effet d'augmenter le caractère lipophile de l'ochratoxine A ainsi que sa distribution et son éventuelle accumulation tissulaire. Il a également été envisagé d'utiliser des enzymes protéolytiques telles que la carboxypeptidase dans le but d'hydrolyser l'ochratoxine A en ochratoxine act, non toxique, et en L-phénylalanine [L. Delacruz et al. J. Biopharm.Sci.. 1 (3), 277-304 (1990)]. Cependant, il a été montré que l'ochratoxine ct et la L-phénylalanine se lient à nouveau très rapidement, in vivo, pour former l'ochratoxine A, de sorte que cette méthode s'avère inefficace. Par ailleurs, en raison de son analogie structurale avec certains des métabolites de l'ochratoxine A, l'utilisation de la phénylalanine a été envisagée pour réduire la toxicité de cette substance, mais les résultats pharmacologiques obtenus ne sont pas tout à fait satisfaisants, surtout en ce qui concerne les effets chroniques génotoxiques et cancérigènes [E.E. Creppy et al. Food Chem. Toxicol. 22, 883-886 (1984) Dirheimer et Creppy IARC Sc. Publication N 115 (1991)]. Il semble que la tyrosine-OTA, métabolite résultant d'une hydroxylation de l'OTA en para du cycle benzénique par la phénylalanine hydroxylase, soit l'un des 2714064 responsables des effets génotoxiques, et que ces derniers ne peuvent être évités par l'utilisation de la phénylalanine [E.E. Creppy et al. Arch. Toxicol. 64, 279-284 (1990)]. Par conséquent, on retiendra que si la phénylalanine permet de prévenir les effets toxiques aigûs ainsi que l'inhibition de la synthèse des protéines in vivo et in vitro, son action est très insuffisante, voir inexistante, dans les cas d'intoxications chroniques. Les études réalisées par l'inventeur ont permis de montrer que, d'une façon tout à fait surprenante et inattendue, l'administration d'aspartame favorise très sensiblement l'élimination urinaire de l'ochratoxine A présente dans l'organisme et constitue un excellent moyen de traitement prophylactique et thérapeutique, tant chez l'homme que chez l'animal. Il a en outre été observé que l'aspartame permet d'une part, d'empêcher la liaison de l'ochratoxine A aux protéines plasmatiques ainsi que sa distribution et son éventuelle accumulation tissulaire et d'autre part, de ralentir le métabolisme et d'accélérer l'élimination de l'ochratoxine A. Les expérimentations effectuées dans le cadre de la présente invention ont également permis de montrer que l'aspartame présente une action protectrice contre l'ochratoxicose humaine et animale, notamment en agissant au niveau des transporteurs rénaux par compétition avec l'ochratoxine, et en pénétrant préférentiellement dans les cellules rénales, limitant ainsi la pénétration de l'ochratoxine dans ces cellules, ce qui a pour effet de favoriser son élimination. Les résultats des expérimentations réalisées montrent encore que l'aspartame protège le rein contre les atteintes tubulaires et glomérulaires provoquées par l'ochratoxine. Enfin, il a été constaté que l'aspartame s'oppose in-vivo et in-vitro aux effets oxydatifs toxiques de l'ochratoxine A et entraîne la disparition quasi complète des adduits à l'ADN. L'aspartame empêche donc les effets chroniques les plus graves (néphrotoxicité, génotoxicité et cancérogénicité). Cet effet bénéfique peut être étendu aux manifestations liées à l'exposition subchronique à l'ochratoxine A (tératogénicité, immuno suppression, etc.). 6 2714064 Par conséquent, l'aspartame peut donc être utilisé comme médicament, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques variées. Ainsi, la présente invention s'étend aux compositions pharmaceutiques, destinées notamment au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires par des mycotoxines, et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale, contenant à titre de principe actif l'aspartame, en association avec un support, véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques seront généralement préparées selon des procédés classiques et administrées de préférence par voie orale, par exemple sous forme de comprimés simples ou dragéifiés, de gélules, de granulés ou de poudre en sachets. Ces compositions peuvent renfermer les excipients habituellement employés dans les compositions pharmaceutiques, telles que en particulier des agents de conservation, des solvants, des agents de stabilisation, des agents mouillants, des émulsifiants, des colorants, des agents aromatisants, des anti- oxydants ainsi que des agents permettant une libération contrôlée ou prolongée du principe actif. La posologie variera en fonction de l'affection traitée et du sujet en cause. En thérapeutique humaine, la dose journalière utilisable est comprise entre 1 et 2000 mg de principe actif (en une ou plusieurs prises).Compte tenu de l'innocuité de l'aspartame des doses plus élevées peuvent être utilisées. En thérapeutique animale, la dose journalière utilisable est d'environ 1 à mg par kg. Dans ces conditions, les compositions pharmaceutiques selon la présente invention seront présentées de préférence sous forme de doses unitaires, qui peuvent contenir de 1 à 2000 mg d'aspartame. L'aspartame peut être également utilisé comme médicament sous forme de bonbons, pastilles ou gommes contenant jusqu'à 2000 mg de principe actif, pour tenir compte des pertes éventuelles dans la cavité buccale. L'aspartame peut être également utilisé sous sa forme actuelle de pastilles à dissoudre dans les liquides et substances alimentaires en adaptant la concentration afin que les personnes puissent absorber la quantité requise par prise ou par jour. 7 2714064 Selon un troisième aspect, la présente demande vise à couvrir l'utilisation de l'aspartame pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires, et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre des expérimentations qui ont permis d'établir les propriétés pharmacologiques précitées de l'aspartame. L'efficacité de l'aspartame dans la prévention de la néphrotoxicité induite par l'ochratoxine, par comparaison avec des substances connues, a été testée en déterminant les effets des substances testées sur l'excrétion de la créatinine ainsi que des enzymes rénaux et des protéines. La toxine a été administrée dans des conditions comparables à celles des contaminations naturelles (en moyenne 4 ppm par 48h). Répartition des animaux dans les cages Des souris mâles, de souche Swiss, pesant 32 - 2 g sont réparties par groupes de 5 dans des cages. Les animaux sont classés par ordre de poids croissant et distribués de manière aléatoire en 4 lots de 5 souris (répartition homogène par randomisation). Traitement par l'ochratoxine A Les souris reçoivent, par intubation oesophagienne, toutes les 48 h. pendant une semaine, une quantité d'ochratoxine A correspondant à 289 lig/kg de poids corporel; la toxine est mise en solution dans 0,3 ml de NaHCO3 0,1 M; pH 7,4. Témoins Les souris servant de témoins reçoivent, de la même façon 0,3 ml de NaHCO3 0,1 M; pH 7,4. Traitement par l'aspartame 4 lots de 5 souris ont été étudiés. Lot I: souris témoins traitées par NaHCO3 0,1 M; pH 7,4 Lot II: souris traitées par l'ochratoxine A (289 kg/kg) Lot III: souris traitées par l'ochratoxine A (289 [tg/kg) + aspartame (30 mg/kg) Lot IV: souris témoins traitées par l'aspartame seul. L'aspartame est administré dans 0,3 ml de H20, une heure après la dernière administration d'ochratoxine A. 8 2714064 Mise en cages métaboliques Les souris sont ensuite sacrifiées après avoir été placées 15 heures en cage métabolique. Le dosage de la créatinine est effectué sur le sérum et sur les urines de 15 heures. Les résultats des dosages sérique et urinaire montrent qu'il y a simultanément une élévation de la créatininémie et un abaissement de la créatinine urinaire chez les souris traitées par l'ochratoxine A (différence significative par rapport aux témoins à p = 0,005). Le rapport créatinine sérique/créatinine urinaire est deux à trois fois plus élevé chez les souris traitées que chez les témoins, ce qui est la conséquence d'une altération de la filtration glomérulaire. Le traitement par l'aspartame atténue très nettement l'augmentation de la créatinine sérique constatée chez les souris traitées uniquement par l'ochratoxine, et augmente, par contre, le taux de créatinine urinaire, qui se rapproche des valeurs des témoins. Les effets de l'aspartame sur le taux de créatinine sérique et sur le rapport créatinine sérique/créatinine urinaire, soit indirectement sur la filtration glomérulaire, apparaissent, par conséquent, bénéfiques. Les effets de l'aspartame sur l'élimination et la détoxication de l'ochratoxine A sont mesurés en suivant la méthode indiquée ci-après, l'ochratoxine A étant administrée dans des conditions comparables à celles des contaminations naturelles, c'est-à-dire en moyenne 4 ppm/48 h. Répartition des animaux dans les cages Les animaux utilisés dans cette expérience sont des rats mâles de souche Wistar pesant 160 _ 10 g. Les animaux sont classés par ordre de poids croissant, et distribués, de manière aléatoire, en 4 lots de 6 rats (répartition homogène par randomisation). Traitement par l'ochratoxine A Les rats reçoivent, par gavage, toutes les 48 heures, pendant 3 semaines, une quantité d'ochratoxine A correspondant à 289 gg/kg de poids corporel; la toxine est mise en solution dans 0,3 ml d'une solution de NaHCO3 0,1 M; pH 7,4. Témoins 9 2714064 Une partie des rats témoins n'a subi aucun traitement, l'autre partie a reçu 0,3 ml de NaHCO3 0,1 M;pH 7,4. Traitement par l'aspartame L'aspartame est administré par gavage, en même temps que l'ochratoxine A, toutes les 48 heures, pendant 3 semaines. Les lots sont constitués de la façon suivante: Lot I: rats témoins (blancs) Lot II: rats témoins traités par NaHCO3 0,1 M; pH 7,4 Lot III: rats traités par l'ochratoxine A (289 gtg/kg) Lot IV: rats traités par l'ochratoxine A (289 iig/kg) + aspartame (25 mg/kg) Mise en cages métaboliques Les rats témoins et traités sont ensuite sacrifiés après avoir été placés 24 heures en cage métabolique pour le prélèvement des urines. Les résultats des dosages de la créatinine sérique et urinaire chez les rats traités par l'ochratoxine A, d'une part, et par l'association ochratoxine A/aspartame, d'autre part, montrent une diminution significative du taux de créatinine sérique en présence d'aspartame, et parallèlement, une augmentation du taux de créatinine urinaire, qui est comparable au taux des témoins. Les résultats obtenus montrent que l'aspartame protège contre l'atteinte rénale induite par l'ochratoxine A en diminuant la concentration d'ochratoxine au niveau des cellules rénales. D'autre part, on sait que l'activité de certaines enzymes (LAP, PAL, LDH, y GT), normalement faible dans les urines, augmente dans l'urine de rats traités par l'ochratoxine A [A. Kane et al. Toxicologv, 42, 233- 243 (1986)]. Cette augmentation est liée à une destruction des cellules tubulaires. Or, on constate que le traitement par l'aspartame comme indiqué cidessus, atténue notablement l'augmentation des activités enzymatiques provoquées par l'ochratoxine A, les valeurs enregistrées avec les rats traités n'étant pas significativement différentes de celles des témoins. Ceci montre que l'aspartame exerce un effet protecteur contre les atteintes tubulaires induites par l'ochratoxine. Les résultats des expérimentations montrent en outre que le traitement par l'aspartame entraîne une diminution de l'augmentation du taux de protéines dans les urines induite par l'ochratoxine. 2714064 Enfin, les dosages sérique et urinaire de l'ochratoxine montrent que le traitement par l'aspartame augmente de façon significative l'élimination urinaire de l'ochratoxine, ce qui explique en grande partie la prévention de la néphropathie, et confirme l'intérêt de l'aspartame dans cette indication. Sur les mêmes animaux, les organes ont servi à l'extraction de l'ADN qui a été analysé par la technique de post marquage à l'ATP gamma 32P, pour évaluer la génotoxicité par la présence d'adduits aux bases de l'ADN, Dans les organes (foie, rein, rate, etc.), des animaux traités par l'OTA, des adduits sont détectés en grand nombre, alors que les ADN des organes des animaux qui ont été traités par l'aspartame en plus de l'OTA sont comparables à ceux des témoins. L'aspartame s'oppose donc efficacement aux effets génotoxiques de l'OTA et donc à sa carcinogénicité. Ainsi, les résultats des expérimentations effectuées ont montré que l'administration de l'aspartame conformément à l'invention entraîne une suppression non seulement des effets néphrotoxiques, mais aussi des effets génotoxiques. On donnera ci-après, plusieurs exemples non- limitatifs de préparations pharmaceutiques incorporant l'aspartame à titre de principe actif. Exemple 1: Comprimés d'aspartame 1. Aspartame 100 mg 2. Lactose 200 mg 3. Polyvinylpyrrolidone 55 mg 4. Talc 15 mg 5. Stéarate de magnésium 30 mg Les composants 1, 2, 3 sont mélangés à sec dans un mélangeur planétaire. Le mélange est ensuite humecté avec de l'éthanol (à 90'). La masse humide obtenue est granulée à l'aide d'un granulateur type Frewitt muni d'un tamis de 1,5 mm de maille.Le granulé obtenu est séché dans une étuve à 50'C durant 6 heures. Ajouter alors 4 et 5. Mélanger soigneusement.Puis procéder à la compression afin d'obtenir un comprimé dosé à 100 mg d'aspartame et de poids unitaire égal à 400 mg. Exemple 2: Gélule d'aspartame à 200 mg Aspartame 200 mg Lactose 100 mg 11 2714064 Aerosil 10 mg Stérate de magnésium 20 mg Mélanger les différents ingrédients en utilisant de l'aspartame granulé. Le mélange obtenu est ensuite réparti en gélules (Taille n'l)de 330 mg renfermant 200 mg d'aspartame. Exemple 3: Sachet d'aspartame de 500 mg Aspartame 500 mg Roferose G 500 mg Aerosil 20 mg Stéarate de magnésium 20 mg Mélanger dans un mélangeur de type Lodige les composants ci-dessus - durant 2 fois 3 minutes. Le mélange obtenu est homogène et sera réparti en sachets de 1,040 g, par sachet. Le contenu ci-dessus peut être aromatisé de différents arômes tels que orange, café, cacao, etc., afin de rendre la préparation plus agréable. 12 2714064 REVENDICATIONS 1. Aspartame, pour son application en tant que substance thérapeutiquement active. 2. Aspartame, pour son application en tant que principe actif destiné au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires, et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale. 3. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif l'aspartame, en association avec un support, véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 4. Compositions pharmaceutiques destinées au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif l'aspartame, en association avec un support, véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 5. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 3 ou 4, caractérisées en ce qu'elles sont formulées pour l'administration par voie orale. 6. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de doses unitaires contenant 1 à 2000 mg d'aspartame. 7. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale, caractérisé en ce qu'il consiste à incorporer une quantité pharmaceutiquement efficace d'aspartame dans un support, véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 8. Utilisation de l'aspartame pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et à la prophylaxie de maladies résultant de contaminations alimentaires, et en particulier de l'ochratoxicose humaine et animale.