Brevet FR2720277A1 — publié le 19951201

La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de traitement des cancers par régulation des niveaux cellulaires de la protéine p53. Elle concerne également des vecteurs de thérapie génique permettant de réguler la protéine p53, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant. Depuis une quinzaine d'années, la caractérisation moléculaire des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur a pemis de jeter un regard nouveau sur le processus de la cancérogenèse. Ainsi, la connaissance de plus en plus approfondie de la régulation de ces gènes et de la fonction des protéines correspondantes permet de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques. Plus particulièrement, l'élucidation du catabolisme des protéines oncogéniques et anti-oncogéniques représente un enjeu majeur en terme de lutte anticancéreuse dans la mesure o elle laisse entrevoir, dans le cas des protéines oncogéniques, la possibilité d'accélérer leur dégradation et donc d'anihiler leur action, dans le cas des suppresseurs de tumeur, d'inhiber leur dégradation et donc d'augmenter leur effet anti- prolifératif ou anti-tumoral, dans le cas de protéines mutées, de potentialiser leur présentation antigénique par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité et ainsi de stimuler une réponse immune spécifique des tumeurs, et, dans le cas o la forte expression de l'oncogène ou de l'anti-oncogène est capable d'nduire la mort cellulaire programmée, la possibilité de stabiliser ces protéines pour déclencher le processus apoptotique. Originellement, la protéine p53 a été classée comme un oncogene nucléaire puisqu'elle pouvait, dans des expériences de transfection, allonger la vie de cellules de rongeurs en culture ainsi que coopérer avec des oncogènes activés comme ras pour transformer des cellules en culture primaire. En fait, les gènes utilisés dans ces premières expériences étaient mutés et menaient à l'expression de protéines p53 variantes caractérisées par un gain de fonction. Sans exclure des fonctions qui resteraient à découvrir, on sait maintenant que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement la croissance et la division cellulaire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire rapoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress o l'intégrité de l'ADN cellulaire est menacée, p53 a été suggérée être un "gardien du génome". La présence de p53 mutées dans environ 40 % des tumeurs humaines, tous types confondus, renforce cette hypothèse et souligne le rôle probablement crucial que jouent les mutations de ce gêne dans le développement tumoral (pour revues, voir Montenarh, Oncogene, 7, 16731680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). La protéine p53 sauvage est asujettie à une régulation complexe qui fait intervenir le contrôle de sa synthèse et de son catabolisme ainsi que celui de sa localisation intracellulaire et de ses modifications post-traductionnelles (voir les revues citées plus haut). La protéine p53 sauvage est extrêmement instable avec une demi- vie de quelques minutes. Par contre, certaines protéines mutées qui s'accumulent à haut niveau dans les tumeurs ont une demi-vie significativement allongée. Peu de choses ont clairement été établies concernant la dégradation de p53. En effet, ni les sites intracellulaires de dégradation, ni le nombre et la nature des voies cataboliques empruntées, ni les motifs peptidiques marquant p53 pour sa dégradation ne sont connus. A notre connaissance, la seule information disponible concerne rimplication de l'enzyme El du cycle de l'ubiquitine dans certaines conditions expérimentales (Ciechanover et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 139-143, 1991; Chowdary et al., Molec. Cell. Biol. 14, 1997-2003, 1994). Par ailleurs, il a été montré que certains produits protéolytiques dérivés de p53 peuvent être présentés de manière antigénique. La présente invention résulte en partie de la mise en évidence que les protéines p53 sont des substrats pour des protéases dépendantes du calcium: les calpaines. Elle résulte plus particulièrement de la démonstration que les protéines p53 sont dégradées spécifiquement par la m-calpaine ou la p-calpaine. La présente invention constitue la première mise en évidence d'un mécanisme de régulation des niveaux cellulaires des protéines p53 et offre ainsi une nouvelle approche particulièrement efficace et spécifique pour moduler les niveaux de cette protéine dans des situations pathologiques telles que notamment certains cancers. En particulier, la présente invention décrit une nouvelle approche pour le traitement des cancers, basée sur l'utilisation de composés modulateurs de l'activité des calpaines sur les protéines p53, qui permettent soit d'activer la dégration de protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet tumorigène et/ou pour augmenter la présentation de peptides immunogènes, soit de stabiliser la protéine p53 sauvage, pour contrebalancer l'effet tumorigène des protéines mutées exprimées dans les tumeurs et/ou pour induire l'apoptose des cellules tumorales. Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé capable de moduler l'activité de la calpaine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. Les calpaines sont des enzymes ubiquitaires trouvées dans la plupart des cellules mammifères (pour revue, voir Croall et deMartino, Physiol. Rev., 71, 813-847, 1991). Elles sont essentiellement cytoplasmiques mais elles peuvent pénétrer dans le noyau à la faveur de la destruction de l'enveloppe nucléaire lors de la mitose ou à la suite de certains stimuli. Comme indiqué ci-avant, l'activité protéolytique des calpaines est dépendante de la présence de calcium. Les composés capables de moduler l'activité de la calpaine au sens de la presente invention peuvent être de plusieurs types. Il peut s'agir de composés capables d'inhiber l'activité de la calpaine sur les protéines p53. Ces composés sont particulièrement avantageux puisquils sont utilisables pour inhiber, au moins en partie, la dégradation de la protéine p53 sauvage. Ces composés permettent donc de stabiliser intracellulairement la protéine p53 sauvage et de contrebalancer l'effet des formes mutées. Parmi les composés inhibiteurs utilisables dans le cadre de l'invention on peut citer les inhibiteurs de protéases (leupeptine, aprotinine, PMSF, etc), les chélateurs du calcium (EGTA, EDTA, etc), ou des inhibiteurs plus spécifiques tels la calpastatine ou tout fragment ou dérivé de celle- ci. La calpastatine est un inhibiteur connu des calpaines. Sa séquence a été décrite dans l'art antérieur (SEQ ID n 1). Un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention consiste à transférer dans les tumeurs un vecteur portant tout ou partie de la séquence codant pour la calpastatine. Cette approche est particulièrement adaptée au traitement des cancers présentant toujours un allèle p53 sauvage, tels que les carcinomes coliques ou bronchiques par exemple. Différents fragments ou dérivés de la calpastatine peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. De tels fragments ou dérivés peuvent être toute molécule obtenue à partir de la séquence SEQ ID n 1 par modification(s) de nature génétique et/ou chimique, conservant la capacité d'inhiber au moins en partie l'activité d'une calpaïne. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, délétion, substitution, addition, et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent être effectuées dans différents buts, et notamment celui de préparer des séquences adaptées à l'expression dans un type particulier de vecteur ou d'hôte, celui de réduire la taille de la séquence pour faciliter leur pénétration cellulaire, celui d'augmenter l'activité d'inhibition, ou, de manière particulièrement avantageuse, d'augmenter la sélectivité de l'inhibiteur vis-àvis de l'activité des calpaïnes sur la dégradation de la protéine p53 sauvage. De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénése in vitro, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels. Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité d'inhibiteur de l'activité des calpaines sur les protéines p53 peut être mise en évidence de plusieurs facçons, et en particulier en mettant en présence ledit inhibiteur et les différentes formes de protéines p53, puis en détectant lIs produits de dégradation obtenus (voir exemples 1 à 3). Toute autre technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise comme inhibiteur tout ou partie de la calpastatine, ou un acide nucléique codant pour tout ou partie de la calpastatine. Encore plus particulièrement, on utilise un peptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n 1 ou d'un dérivé de celle-ci. Concernant plus spécifiquement les dérivés, on peut citer à titre d'exemple le composé de séquence SEQ ID n 2, qui correspond à un fragment de la calpastatine. On utilise avantageusement tout dérivé composés de séquence SEQ ID n 1 ou 2 capable d'inhiber spécifiquement ou préférentiellement la dégradation de la protéine p53 sauvage par la calpaine. Les composés capables de moduler l'activité de la calpaine sur les protéines p53 au sens de la présente invention peuvent également être des dérivé de la calpaine capable de dégrader spécifiquement ou préférentiellement les protéines p53 mutées. De tels dérivés sont également très avantageux puisqu'ils permettent d'activer la dégration des protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet tumorigéne et/ou pour augmenter la présentation de peptides immunogènes, sans affecter de manière significative les niveaux cellulaires de protéine p53 sauvage. De tels dérivés peuvent être obtenus à partir de la calpaine, par modification(s) structurales de nature génétique et/ou chimique. La capacité des dérivés ainsi obtenus de dégrader spécifiquement ou préférentiellement les protéines p453 mutées peut ensuite être mise en évidence comme décrit dans les exemples 1 à 3.. Préférentiellement, les modulateurs utilisés dans le cadre de l'invention sont des protéines ou polypeptides, ou des séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides ou protéines. Encore plus préférentiellement, les composés modulateurs sont des protéines ou polypeptides inhibiteurs spécifiques de l'activité de la calpaine sur la protéine p53 sauvage ou des formes de calpaines, modifiées ou non, pour dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées. D'une manière particulièrement avantageuse, l'invention réside dans la possibilité de faire exprimer dans des cellules cancéreuses présentant à la fois un allèle p53 sauvage et un allèle p53 muté des séquences nucléiques codant pour des inhibiteurs de la calpaine, comme la calpastatine ou partie de la calpastatine, ou des formes de calpaïnes, modifiées ou non, pour dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées. La séquence d'acides nucléiques utilisée dans le cadre de la présente invention peut être administrée telle quelle, sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrés sous forme complexée, par exemple avec du DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), avec des lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), sous forme de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Préférentiellement, la séquence utilisée dans le cadre de l'invention fait partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer radministration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. De plus, il est possible d'introduire plusieurs séquences d'acide nucléique dans un même vecteur, ce qui augmente également l'efficacité du traitement. Le vecteur utilisé peut être d'origine diverses, dès lors quil est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules cancéreuses humaines. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV) ou le virus de l'herpès. A cet égard, la présente invention a également pour objet tout virus recombinant comprenant, inséré dans son génome, un acide nucléique codant pour un composé capable de moduler l'activité de la calpaine. Préférentiellement, les virus utilisés dans le cadre de l'invention sont défectifs, c'est-à-dire quils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule infectée. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence codant pour le modulateur des calpaines. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à rencapsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfèere utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de rinvention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour le modulateur des calpaines. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) , EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour le modulateur des calpaines. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de radénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n0 FR 93 05954 et FR 93 08596. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et rexpression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour le modulateur des calpaines bordé de deux régions répétées inversées (TR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gênes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfldield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gênes dans les cellules tumorales. Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour le modulateur des calpaines est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules tumorales. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de rexpression du modulateur. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules tumorales, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule tumorale. Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour un modulateur des calpaines sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR- RSV et le promoteur CMV. Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour un modulateur des calpaines sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules tumorales. L'expression est considérée comme majoritaire au sens de linvention lorsque, même si une expression résiduelle est observée dans d'autres types cellulaires, les niveaux d'expression sont supérieurs dans les cellules tumorales. La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu- tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans la tumeur du patient. n peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon rinvention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation. La présente invention est particulièrement adaptée au traitement des cancers dans lesquels des formes mutées de p53 sont observées. Plus spécifiquement, la présente invention est particulièrement avantageuse pour le traitement des cancers dans lesquels les allèles sauvage et mutés de p53 sont présents. De tels canccers sont notamment les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, etc. La présente invention sera plus complètement décrite à raide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LO.ende des figures Figure 1 Etude de la régulation de la protéine p53 par la calpaine. La réaction est effectuée dans un volume final de 30 pl, dont 1 provenant du mélange de traduction. ligne 1: TO; ligne 2: 30 min en présence de lmM Calcium + 20 pg/ml Calpaîne; ligne 4 30 min en présence de lrmM Calcium + 20 pg/ml Calpaine + 0,5 mg/ml calpastatine; ligne 5: 30 min en présence de lmM Calcium + 20 pg/ml Calpaine + lOmM EGTA; ligne 6: PBS; ligne 7: PBS + calcium; ligne 8: PBS + calpastatine. Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagén.se dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1X (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Eolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 23 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amrnershanm. Exemples Exemple 1 Cet exemple montre que l'addition de m-calpaine au lysat de réticulocytede lapin induit la dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de certaines formes mutées. Cet exemple montre également que des inhibiteurs des calpaines sont capables d'inhiber la dégradation de p53 et donc de moduler l'activité de cette protéine. 1.1. Mise en évidence de la dégradation: Les protéines p53 sauvages de souris et d'homme ainsi que diverses protéines p53 mutées (protéines humaines C273, H273, H175, I247) ont été traduites dans le lysat de réticulocyte de lapin. Les protéines ainsi obtenues sont résistantes à toute dégradation, même en présence de haute concentration de calcium (co-facteur indispensable des calpaines). L'addition de m- calpaine de boeuf (Sigma) au lysat de réticulocyte en présence de calcium a entrainé la disparition rapide des protéines néo-synthétisées et l'apparition de fragments protéolytiques résolvables par électrophorèse. La résistance à la dégradation d'autres protéines comme la dihydrofolate réductase ou la glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase dans les mêmes conditions expérimentales indique la spécificité de substrat de la réaction. 1.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaine pour moduler les niveaux de protéines p53: Dans rexemple 1.1. ci-dessus, il a été montré que l'addition de m-calpaine induisait une dégradation des protéines p53. Dans cet exemple, en plus de m-calpaine, différents composés ont été introduits au milieu pour tester leur capacité d'inhiber l'activité de la calpaine. Les résultats obtenus montrent que l'addition d'un chélateur du calcium (EGTA) ainsi que d'un peptide inhibiteur spécifique des calpaines (dérivé d'un inhibiteur physiologique, la calpastatine; Maki et al., J. Biol. Chem., 254, 18866- 18869, 1989) sont capables d"inhiber de la dégradation des protéines p53 induite par la calpaine exogène. Exmole 2 Dans rexemple précédent, il a été montré que l'addition de calpaine exogène à une solution de protéines p53 entrainait leur dégradation. Cet exemple montre que la dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de certaines formes mutées peut être induite par les calpaines endogènes dans des extraits cytoplasmiques. Cet exemple montre également que des inhibiteurs des calpaines sont capables, en présence de calpaine endogène, d'inhiber la dégradation de p53 et donc de moduler l'activité de cette protéine. 2.1. Dégradation par les calpaines endogènes: Les protéines p53 sauvages de souris et d'homme, ainsi que certaines formes mutées (Cf exemple 1) ont été traduites dans le lysat de réticulocyte puis ont été incubées en présence d'extraits cytoplasmiques de cellules lymphoblastoides humaines Daudi ou Jurkat. Les extraits cytoplasmiques ont été préparés de la manière suivante: Les cellules (accessibles à l'ATCC) ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté de 10%o de sérum de veau fétal. Les cellules ont ensuite été récoltées, lavées dans un tampon PBS, puis incubées 5 min dans un tampon de lyse hypotonique sans détergent (HEPES 20 mM pH 7,5; KOAc 10 mM; MgOAc 1,5 mM; 2ml pour 5.108 cellules). La lyse a été complété en utilisant un homogénéiseur Dounce, puis vérifiée sous microscope. Les noyaux ont ensuite été éliminés par centrifugation à 2000 g pendant 5 min, et les surnageants ont été centrifugés à 10 000g pendant 1 heure (Beckman SW60). Les extraits cytoplasmiques ont ensuite été aliquotes à raison de 5 à 12 mg/ml. Lorsque le lysat de réticulocutes a été incubé en présence d'extraits cytoplasmiques, en l'absence de calcium, aucune dégradation n'a été observée. Par contre, en présence de calcium, une dégradation très rapide des protéines p53 a été observee, avec apparition d'un profil de produits protéolytiques caractéristique proche de celui obtenu dans l'exemple 1. Cet expérience montre bien que les protéines p53:sont dégradées par les calpaïnes endogènes. 2.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaine pour moduler les niveaux de protéines p53: La chélation du calcium par 1EGTA, ainsi que l'utilisation de toute une gamme d'inhibiteurs de protéases (leupeptin, aprotinin, soybean trypsin inhibitor et PMSF) et surtout le peptide calpastatine montrent que la dégradation de ces protéines est sous la dépendance des calpaines de l'extrait cytoplasmique, et que différents composés capables de moduler l'activité des calpaines peuvent être utilisés pour réguler les niveaux de protéine p53. Exmnle 3 Cet exemple démontre que les protéines p53 sauvages de souris et d'homme sont des substrats directs pour les calpaines dans les extraits cytoplasmiques. Les exemples I et 2 montrent que les calpaines peuvent induire la dégradation de p53 dans des mélanges réactionnels complexes. Ces expériences n'excluent cependant pas que dans les conditions utilisées les calpaines activent des protéases secondaires qui sont celles qui agissent véritablement sur p53. Dans cet exemple, rexpérience suivante a été conduite: (1) les protéines p53 sauvages de souris et d'homme néosynthétisées dans le lysat de réticulocyte de lapin ont été incubées pendant 30 minutes en présence d'extrait cytoplasmique de cellules Daudi ainsi qu'en présence de calcium pour activer les calpaïnes comme dans l'exemple 2, (2) de la protéine p53 a alors été rajoutée au mélange réactionnel et la réaction a été poursuivie minutes dans des conditions permissives (mêmes conditions réactionnelles) ou non (addition soit dEGTA pour chélater le calcium, soit de peptide calpastatine) pour les calpaines. En présence de calcium, la protéine p53 nouvellement ajoutée est complètement dégradée indiquant que l'activité protéase est fonctionnelle tout le temps de rexpérience. Quand les calpaïnes sont inhibées par la présence d'EGTA ou, plus significativement, du peptide calpastatin, la protéine p53 nouvellement ajoutée n'est par contre plus dégradée. Cette dernière observation exclut donc la possibilité que dans la première partie de l'expérience les calpaines aient induit une seconde protéase responsable de la dégradation de p53 (figure 1). Exmple 4 Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comportant une séquence d'acides nucléiques codant pour la calpastatine. Cet adénovirus est construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dl1324 et un plasmide portant la séquence SEQ ID n 1 sous controle du promoteur RSV. 4.1. Construction du plasmide SEQ ID n 1 Le plasmide SEQ ID n 1 comporte la séquence codant pour la calpastatine sous le contrôle du promoteur LTR-RSV, ainsi que des régions de l'adénovirus permettant la recombinaison homologue. Il est construit par insertion de la séquence SEQ ID n 1 dans le plasmide pAd.RSV[gal. Le plasmide pAd.RSV[3Gal contient, dans rorientation 5'->3', - le fragment PvuIl correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E1A; - le gène codant pour la [-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSV[3Gal et l'adénovirus d1324. Le plasmide pAd. RSVf3Gal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest (1992) 626). 4.2. Construction de l'adénovirus recombinant Le vecteur décrit en 4.1. est linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et EllB) d'adénovirus. Plus précisément, l'adénovirus recombinant est obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Ihimmappaya et al. , Cell 31 (1982) 543) et le vecteur décrit dans l'exemple 4.1., selon le protocole suivant: le plasmide SEQ ID n 1 et l'adénovirus Ad-d1324, linéarisé par renzyme ClaI, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, oe qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et aL, Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus obtenu peut être conservé à -80 C dans 20 % de glycérol. SEO ID n 1: Séquence d'ADN codant pour la calpastatine humaine 1/1 31/11 ATG AAT CCC ACA GAA ACC AAG GCC ATT CCA GTC AGC CAA CAG ATG GAA GGA CCA CAT CTT M N P T E T K A I P V S Q Q M E G P H L 61/21 91/31 CCT AAC AAG AAAAAA CAC AAAAAA CAG GCT GTA AAA ACA GAA CCT GAG AAG AAG TCA CAG P N K K K H K K Q A V K T E P E K K S Q 121/41 151/51 TCA ACC AAG CTG TCT GTG GTT CAT GAG AAA AAA TCC CAA GAA GGA AAG CCA AAA GAA CAC S T K L S V V H E K K S Q E G K P K E H 181/61 211/71 ACA GAG CCA AA AGC CTA CCC AAG CAG GCA TCA GAT ACA GGA AGT AAC GAT GCT CAC AAT T E P K S L P K Q A S D T G S N D A H N 241/81 271/91 AAA AAA GCA GTT TCC AGA TCA GCT GAA CAG CAG CCA TCA GAG AAA TCA ACA GAA CCA AAG K K A V S R S A E Q Q P S E K S T E P K 301/101 331/111 ACT AAA CCA CAA GAC ATG ATT TCT GCT GGT GGA GAG AGT GTT GCT GGT ATC ACT GCA ATA T K P Q D M I S A G G E S V A G I T A I 361/121 391/131 TCT GGC AAG CCG GGT GAC AAG AAA AAA GAA AAG AAA TCA TTA ACC CCA GCT GTG CCA GTT S G K P G D K K K E K K S L T P A V P V 421/141 451/151 GAA TCT AAA CCG GAT AAA CCA TCG GGA AAG TCA GGC ATG CAT GCT GCT TTG GCAT GAC TTA E S K P D K P S G K S G M D A A L D D L 481/161 511/171 ATA CAT ACT TTA GGA GGA CCT GAA GAA ACT GAA GAA GAA AAT ACA ACG TAT ACT GGA CCA I D T L G G P E E T E E E N T T Y T G P 541/181 571/191 GAA GTT TCA GAT CCA ATG AGT TCC ACC TAC ATA GAG GAA TTG GGT AAA AGA GAA GTC ACA E V S D P M S S T Y I E E L G K R E V T 601/201 631/211 ATT CCT CCA AAA TAT AGG GAA CTA TTG GCT AAA AAG GAA GGG ATC ACA GGG CCT CCT GCA I P P K Y R E L L A K K E G I T G P P A 661/221 691/231 GAC TCT TCA AAA CCC ATA GGG CCGA GAT A GCT ATA GAC GCC TTG TCA TCT GAC TTC ACC D S S K P I G P D D A I D A L S S D F T 721/241 751/251 TGT GGG TCG CCT ACA GCT GCT GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG GAA TCT ACA CGAA GTT TTA C G S P T A A G K K T E K E E S T E V L 781/261 811/271 AAA GCT CAG TCA GCA GCGG ACA GTC AGA AGT GCT GCT CCA CCC CAA GAG AAG AAA ACGA AAG K A Q S A G T V R S A A P P Q E K K R K 841/281 871/291 GTG GAG AAG GAT ACA ATG AGT 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A L D K L S D S L G Q 1741/581 1771/591 AGG CAG CCT GAC CCA GAT GAG AAC AAA CCA ATG GGA GAT AAA GTA AAG GAA AAA GCT AAA R Q P D P D E N K P M G D K V K E K A K 1801/601 1831/611 GCT GAA CAT AGA GAC AAG CTT GGA GAA AGA GAT GAC ACT ATC CCA CCT GAA TAC AGA CAT A E H R D K L G E R D D T I P P E Y R H 1861/621 1891/631 CTC CTG GAT GAT AAT GGA CAG GAC AAA CCA GTG AAG CCA CCT ACA AAG AAA TCA GAG GAT L L D D N G Q D K P V K P P T K K S E D 1921/641 1951/651 TCA AAG AAA CCT GCA GAT GAC CAA GAC CCC ATT GAT GCT CTC TCA GGA GAT CTG GAC AGC S K K P A D D Q D P I D A L S G D L D S 1981/661 2011/671 TGT CCC TCC ACT ACA GAA ACC TCA CAG AAC ACA GCA AAG GAT AAG TGC AAG AAG GCT GCT C P S T T E T S Q N T A K D K C K K A A 2041/681 2071/691 TCC AGC TCC AAA GCA CCT AAG AAT GGA GGT AAA GCG AAG GAT TCA GCA AAG ACA ACA GAG S S S K A P K N G G K A K D S A K T T E 2101/701 GAA ACT TCC AAG CCA AAA GAT GAC TAA E T S K P K D D * SEQ 11) *1 2 Séquc.nc. d'ADN coclanl pour lin dréiv de la calpastatiTo humaine 1/1 31/l1 c GOC AO GCAT OCT OC? ?WG CA? OAC TTA ATA CAT ACT TTA GGA GGA C= AA CA A 8 G W D A A L D D L I D T L G >aP E Z 61/21 91/31 GAA 4AA OA AAAr ACAfc %C AT Ar GOA óc C.A> ur-r VA c;AT CA ATO ACt tc ACC MZC t.P E N T T Y T O P E v a n V N m._ _ ît /41 1 51/s5 ATA Co a TT GCTAAAA OAAO^ CACAc TT OCT CAA A" TA AWG GAA CTA TOCT E L O._X l m __.t K. Y A. t ry I 1,/I61 211 17l AACA CAA oeA iTC ACA G CC;? C.C. GCA GAC TCT T. AAA CCC MA GG CCA GQAt GAT K-2L z s _-1. -1-.._A 2 A I X P T C p D n 245/81 271/91 ocr ATA 4C GCC TT CA W? GAC 'rrc A^CC TT CGG ToCI CCT ACA CICT G C OU A AU ^ P A 1 8 S D P ? C G 8 P T a A o X X 3011101 311/111 AO? CM AA GAGOAA TOCT OAGA C T TrA A&A aCt CAC CA OCA o AC ow AC A AnJ T E X S T 8 V L X A Q 0 A G v a R 361/121 391/1 31 OCT "CT CCA CC AA AAGtAO A AA faA Af oC CAo aAC A A P P 0 1 X X R x V t x REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un composé capable de moduler l'activité de la calpamine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le composé est une protéine ou un polypeptide inhibiteur de l'activité de la calpaine, ou une séquence d'acides nucléiques codant pour un tel polypeptide ou protéine. 3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que le composé est une protéine ou un polypeptide inhibiteur spécifique de l'activité de la calpaine sur la protéine p53 sauvage, ou une séquence d'acides nucléiques codant pour un tel polypeptide ou protéine. 4. Utilisation selon la revendication 2 ou 3 caractérisée en ce que l'acide nucléique fait partie d'un vecteur. 5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que racide nucléique fait partie d'un vecteur viral, choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés. 6. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que racide nucléique fait partie d'un vecteur liposomal, lipidique 7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le composé est un acide nucléique codant pour tout ou partie de la calpastatine. 8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que racide nucléique comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID n 1 ou d'un dérivé de celle-ci. 9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que racide nucléique est choisi parmi les séquences SEQ ID n 1 et 2. 10. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que racide nucléique est choisi parmi les dérivés des séquences SEQ ID n 1 ou 2 codant pour des inhibiteurs spécifiques de la dégradation de la protéine p53 sauvage. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le composé est un dérivé de la calpaïne capable de dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées. 12. Vecteur viral comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide inhibiteur de l'activité de la calpaine. 13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés. 14. Vecteur selon l'une des revendications 12 ou 13 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour tout ou partie de la calpastatine. 15. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour un dérivé de la calpaine capable de dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées. 16. Composition pharmaceutique comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour tout ou partie de la calpastatine ou pour un dérivé de la calpaine capable de dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées. 17. Composition selon la revendication 16 formulée en vue d'une administration inttra-tumorale.