Brevet FR2722692A1 — publié le 19960126

MEDICAMENT A BASE DE PHOSPHOLIPASE A2 DE VENIN D'ABETst-2 La présente invention concerne un médicament à base de phospholipase A2 de venin d'abeille destiné au traitement préventif et/ou curatif des affections à rétrovirus, et plus particulièrement du SIDA (syndrome d'immuno-déficience acquise) et de syndromes associés [ARC (AIDS related complex)]. Par prophylaxie nous sous-entendons le traitement des sujets qui Ont été exposés aux virus HIVs (human immunodeficiency virus), en particulier les séropositifs asymptomatiques, qui présentent le risque de développer la maladie dans les mois et les années à venir après la primo-infection. Les propriétés anti-inflammatoires et anti-rhumatismales du venin d'abeille sont connues. Le venin d'abeille comprend de noSbreut constituants dans des teneurs variables, parmi lesquels de. substances peptidiques comme par exemple l'apamine, la melittine, le peptide MCD... et des phospholipases parmi lesquelles la phospholipase A2, qui est présente à raison d'environ 12 %. L'apamine et la melittine ne possèdent pas d'activité antivirale. I1 a été montré que la phospholipase A2 de venin d'abeille possède une activité particulièrement intéressante sur rétrovirus et notamment sur virus HIV. L'activité de la phospholipase A2 de venin d'abeille a été mise en évidence de la manière suivante Activité vis- -vis de l'effet cytopathoqène et de la Droduction Jdu virus HIV dans les lymphocytes Cellules : Le test est réalisé sur la lignée CEM 4, un sousclone enrichi en récepteurs CD4 obtenu à partir d'une lignée cellulaire lymphoblastoïde. Les cellules sont exemptes de mycoplasmes. Elles sont cultivées à 370C sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique, dans un milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal, 100 UI/ml de pénicilline, 100 pg/ml de streptomycine et 2 pg/ml de polybrene. Virus On utilise la souche LAI de virus HIV-1. Les virus sont obtenus partir de surnageants de cellules CEM clone 11 filtrés sur filtre de 0,45 pm. Les titres des préparations de HIV-1 sont de l'ordre de 104 CCID50 (50 % de doses de cultures cellulaires infectées par nl). Essai Les produits sont testés pour leur cytotoxicité et leur aptitude i inhiber l'effet cytopathogène induit par l'infection à HIV-1. las essais sont mis en oeuvre dans une microplaque de 96 puits contenant des cultures tissulaires. On dépose en triple exemplaire : 25 pl/puits de chaque dilution de produit à tester dans du tanpon phosphate isotonique (TPI) ou de TPI seul dans le cas des contrôles. On ajoute alors 125 ul de la suspension de cellules CEM 4 (105 cellules par ml) et les microplaques sont incubées une heure å 370C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique. Les cellules sont infectées avec 100 ul de suspension virale (100-200 CCID50 > et cultivées pendant au moins 6 jours. Au bout de 6 jours d'incubation, 100 ul de surnageant sont prélevés pour la quantification de l'antigène viral p24 et 100 ul de cellules sont prélevés pour mesurer la viabilité cellulaire [déterminée selon une modification de la technique décrite par R. Pauwels et coll., J. Virol. Meth., çQ, 309-321 (1988)]. On ajoute à ce prélèvement 10 ul d'une solution contenant 7 mg de MTT [bromure de 3-(4,5-diméthyl 2 thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium] par ml de tampon phosphate isotonique. Après 3 heures d'incubation à 370C le surnageant est enlevé. Le MTT est converti en un sel de formazan (bleu) uniquement å l'intérieur des cellules vivantes. On ajoute alors 100 îil d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlorhydrique dans du propanol-2) et les microplaques sont agitées jusqu'à la solubilisation du bleu de formazan. L'absorbance à 540 nia est lue avec un lecteur automatique de réactions Biotek EL-311 en microplaques. Cette absorbance est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes. On étudie en parallèle la cytotoxicité des produits. Le taux de protection (en %) d'un produit donné est déterminé partir des densités optiques (DO) par la formule DO(cell. traitées et inf.)-DO(cell. non traitées et inf ) DO(cell. traitées et non inf.)-DO(cell. non traitées et inf.) La concentration inhibitrice 50 % est déterminée. La quantification de l'antigène viral p24 se fait à l'aide d'un kit (NEK - 060B, Dupont, Wilmington USA) selon les instructions du fabricant. Résultats 2 dosages sont réalisés après 6 et 12 jours de traitement - détermination de la concentration inhibant 50 * de l'effet cytopathogène du virus (EC50) et toxicité des produits (CC50); - concentration inhibant 50 % de la production virale (EC50 Ag). Toxicité effet production virale cytopathogène J + 6 J + 6 J + 12 CC50 EC50 (g/ml) EC50 Ag (g/ml) EC50 Ag (g/nl) 15 0,25 0,25 2,5 Les résultats démontrent que l'on obtient une diminution significative de l'effet cytopathogène et de la production virale d des concentrations non cytotoxiques. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant la phospholipase A2 de venin d'abeille éventuellement sous forme d'une association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables, ou avec un autre agent anti-rétrovirus, un agent antiviral, immunomodulateur ou antimicrobien. Les compositions selon l'invention est capable de protéger de l'infection par le virus HIV, de réduire la progression vers le SIDA ou de diminuer sa gravité chez les sujets déjà infectés en réduisant la mortalité des cellules infectées. Les compositions peuvent être utilisées par voie parentérale ou rectale. Les compositions peuvent être utilisées à titre curatif ou à titre préventif chez des sujets présentant une immunodéficience et/ou infectés par un virus HIV. Bien entendu, la constitution de ces cono- sitions sera adaptée au cas particulier du tractus digestif des imsu- nodéprimés. Les compositions pour administration parentérale, peuvent être de. solutions stériles ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les compositions par administration rectale sont les suppositoires ou les capsules rectales, qui contiennent outre le principe actif, des excipients tels que le beurre de cacao, des glycérides semisynthétiques ou des polyéthylèneglycols. En thérapeutique humaine, le médecin déterminera la posologie qu'il estime la plus appropriée en fonction d'un traitement préventif ou curatif, en fonction de l'âge, du poids, du degré de l'infection et des autre facteurs propres au sujet à traiter. Généralement, les doses sont comprises entre 0,5 et 10 mg/kg par voie intra-veineuse ou sous-cutanée pour un adulte. La présente invention concerne également les associations constituées de la phospholipase A2 de venin d'abeille, et d'un autre principe actif connu pour son activité anti-rétrovirus, éventuellement en présence d'excipients pharmaceut iquement acceptables. Les agents anti-rétrovirus pouvant être associés sont choisis parni des agents compatibles et inertes vis-à-vis du dérivé du lupane de formule générale (I). A titre non limitatif ces agents sont choisis parmi des inhibiteurs de la reverse transcriptase [zidovudine (AZT), didanosine (DDI), didéoxycytidine (DDC), TIBO, névirapine, PHEA, HEPT... ], parmi des inhibiteurs de la protéase [comme par exemple le RO 31-8959]. L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention. Exemple On prépare des ampoules contenant une solution dosée à 25 zig de phospholipase A2 de venin d'abeille en ajoutant 20 ml de soluté physiologique à 250 mg de phospholipase A2 de venin d'abeille. La solution est divisée et répartie aseptiquement dans des ampoules de 2 ml. Chaque ampoule contient 25 mg de produit actif. REVENDICATIONS 1 - Médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif des affections à rétrovirus caractérisé en ce qu'il comprend la phospholipase A2 de venin d'abeille. 2 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend la phospholipase A2 de venin d'abeille éventuellement en association avec tout diluant ou adjuvant compatible et pharmaceutiquement acceptable. 3 - Association utile pour le traitement d'affections à rétrovirus comprenant la phospholipase A2 de venin d'abeille, et un agent antirétrovirus, un agent antiviral, immunomodulateur ou antimicrobien, éventuellement en combinaison avec des excipients compatibles et pharmaceutiquement acceptables.