Brevet FR2719308A1 — publié le 19951103

La présente invention porte sur de nouveaux dérivés de la purpurogalline, plus particulièrement sur l'acide 8-0-méthylpurpuro-gallincarboxylique de formule (I): OH O H3C OOH (I) O 0C2H et sur les esters et les sels de celui-ci. La présente invention porte aussi sur une composition pharmaceutique contenant l'acide 8-Ométhylpurpuro-gallincarboxylique de formule (I) ou un ester ou un sel de celui-ci utile pour inhiber la catécholamine-0-méthyltransférase (ciaprès désignée COMT), et sur un procédé de production d'acide 8-0méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I) ou d'un ester ou d'un sel de celui-ci. La COMT est une enzyme qui catalyse le transfert d'un groupe méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine sur le groupe m-hydroxy des catécholamines, de leurs métabolites et de la L-dopa, ce qui inactive ces derniers. Elle est largement distribuée dans différents tissus cérébraux et périphériques chez toutes les espèces mammaliennes. Dans la cellule, la présence d'au moins deux isomères distincts de la COMT a été démontrée, dont l'un est soluble et l'autre est lié à la membrane. Bien que ces deux formes de la COMT catalysent l'O-méthylation des catécholamines, leur abondance relative diffère selon les tissus et les espèces. On s'attend à ce que les inhibiteurs sélectifs de la COMT associés à la L-dopa et un inhibiteur de la dopa décarboxylase périphérique améliorent la disponibilité et l'efficacité de la L- dopa, en prévenant sa conversion en 3-O-méthyldopa, dans le traitement de la maladie de Parkinson par la L-dopa. Certains inhibiteurs de la COMT ont déjà été décrits, mais tous étaient inefficaces, toxiques ou peu sélectifs vis-à-vis de la COMT. Récemment, plusieurs nouveaux inhibiteurs de la COMT puissants et sélectifs ont été développés, et sont actuellement en cours d'essai clinique dans le traitement de la maladie de Parkinson. La situation actuelle a amené les inventeurs à rechercher de nouveaux inhibiteurs de la COMT. Dans le but de trouver ces nouveaux composés, les présents inventeurs ont isolé un grand nombre de micro- organismes vivant dans le sol et les matières vivantes, etc., dont le composé qu'ils produisent a été purifié à fin d'étude. En conséquence, les présents inventeurs ont découvert que certains micro- organismes spécifiques produisent un nouveau composé ayant une activité inhibitrice puissante et sélective à l'encontre de la COMT, qui accomplit la présente invention. Les propriétés physico-chimiques de l'acide 8-O- méthylpurpuro-gallincarboxylique de formule (I) obtenu en suivant la procédure décrite dans l'exemple 1 ci-dessous, sont les suivantes: Aspect Poudre brune Point de fusion 276-284 C (dec.) Formule brute C13HI007 HERI-MS (m/z) M+ calc. 278,0426 trouvé 278,0430 UV lambdaxl.(,> dans le MeOH 2 1 6 ( 1 7 2 0 0), 285 ( 2 4 2 0 0, SH), 299(24900), 398(7400) dans le MeOH + HCl 2 1 9 ( 1 6 9 0 0, 2 8 7 (2 3 2 0, 299( 2 3 6 00, SH), 400(5700) dans le MeOH + NaOH 2 3 0 ( 1 4 6 0 0, 326(36600), 404(4900) IR Nuxl*m(KB,>;cm 3360, 1720, 1695, 1605, 1480, 1405, 1380, 1255, 1010 Solubilité Soluble dans le DMSO, MeOH Légèrement soluble dans HO RMN 'H (400 MHz, DMSO-d6, 3.87 (3H, s), 7.05 TMS utilisé comme standard (IH, s), 7.51 (1H, d, interne)6 J=1,5 MHz), 8.11 (!H,d, J=1,5 MHz), 9.75 (iH, br), 11,0 (1H, br), 15.23 (1H, s) RMN '13C (100 MHz, DMSO-d6, 59.7, 113.1, 113.5, TMS utilisé comme standard interne)6 115. 2, 126.4, 134.1, 136.9, 137.3, 154.1, 156.0, 158.8, 167.5, 183.2 Selon le procédé de la présente invention l'acide 8- O-méthyl-purpurogallincarboxylique de formule (I), ou un ester ou un sel de celui-ci, peut être produit par mise en culture d'un micro- organisme appartenant au genre Absidia capable de produire l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I) dans des conditions aérobies dans un milieu de culture, et en isolant ledit acide 8-Ométhylpurpurogallincarboxylique de formule (I) à partir dudit milieu de culture et, si nécessaire, en convertissant le composé ainsi obtenu en un ester ou un sel de celui-ci. Les micro-organismes de la présente invention peuvent appartenir à n'importe quelle souche (y compris les variants) du genre Absidia capable de produire l'acide 8- O-méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I). La souche Absidia sp. NR7184 est particulièrement préférée, ainsi que les variants de celle-ci. Absidia sp. NR7184 a été isolée à partir d'un échantillon de sol collecté à Mariposa, Californie, USA, et identifié comme étant d'une souche appartenant au genre Absidia. La souche désignée Absidia sp. NR7184 a été déposée à l'Institut National des Biosciences et des Technologies Humaines, Agence des Sciences et des Techniques Appliquées, au Japon, dans le cadre du Traité de Budapest du 10 mars 1994, sous la désignation suivante: Absidia sp. NR7184 (FERM BP-4599) Les caractéristiques de culture, les caractéristiques taxonomiques et les caractéristiques morphologiques d'Absidia sp. NR7184 (FERM BP-4599) sont les suivantes: Caractéristiques taxonomicues Les recherches taxonomiques ont été menées en se fondant sur les publications de Zycha et coll., "Mucorales, eine Beschreibung aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe". Verlag von J. Cramer, Lehre, p. 355 (1969), O'Donnel, "Zygomycetes in culture", University of Georgian, Athens, pp. 257 (1979), et Gams et coll. "Compendium of Soil Fungi", Vol. 1, Academic Press, London, pp. 7-15 (1980). Les colonies étaient de couleur blanche et croissaient rapidement sur un milieu gélosé à l'extrait de malt, en prenant un aspect floconneux. Les stolons étaient portés par les rhizoïdes. Les sporangiophores étaient répartis le long des stolons, mais jamais au niveau de leur insertion sur les rhizoïdes. Le sporange piriforme portant de nombreuses sporangiospores était supporté par une apophyse en forme d'entonnoir entouré d'une columelle, et les parois du sporange persistaient sous forme de collerettes courtes après la maturité. Les sporangiospores étaient minuscules, à paroi lisse et de forme subsphérique à ovale. Les sporanges étaient piriformes avec une apophyse distincte, et étaient supportés à l'extrémité de sporangiophores se ramifiant sur les stolons. Sur la base de ces caractéristiques distinctives, la souche fongique a été aisément incluse dans le genre Absidia, famille des Mucoraceae, Zygomycotina. C'est pourquoi la souche a été identifiée comme étant Absidia sp. NR7184. Selon le procédé de la présente invention, la mise en culture peut être faite dans un milieu de culture qui contient les nutriments habituels utilisables par le micro-organisme cultivé. En tant que sources de carbone, on peut citer, par exemple, le glucose, le saccharose, l'amidon, le glycérol, les mélasses, la dextrine et les mélanges de ceux- ci. Les sources d'azote sont, par exemple, la farine de soya, la farine de graine de coton, l'extrait de viande, la peptone, la levure séchée, l'extrait de levure, la liqueur de mais, le sulfate d'ammonium, le nitrate de sodium et les mélanges de ceux- ci. De plus, il est possible d'ajouter au milieu de culture d'autres substances organiques ou inorganiques dans le but de favoriser la prolifération du micro- organisme et d'augmenter la production d'acide 8-O- méthylpurpuro-gallincarboxylique, des exemples de telles substances étant les sels inorganiques tels que, par exemple, le carbonate de calcium, le chlorure de sodium, les phosphates et les sels similaires. La culture est conduite dans des conditions aérobies dans un milieu liquide, de préférence par fermentation immergée. La culture est conduite de préférence à une température comprise entre 20 C et 35 C, la température optimale étant de 27 C. La culture est de préférence conduite à un pH de 3 à 9. La durée de la mise en culture dépend des conditions dans lesquelles la culture est conduite. En général, il est suffisant de réaliser une culture de 50 à 200 heures. La séparation de l 'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique du bouillon de fermentation peut être réalisée selon les procédés connus en soi. Par exemple, le mycélium peut être séparé du bouillon de fermentation par centrifugation ou filtration, et l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique peut être extrait du filtrat au moyen d'un solvant organique immiscible à l'eau tel qu'un alcanol, par exemple le butanol, ou des esters tels que, par exemple, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, etc. D'un autre côté, l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique contenu dans le mycélium séparé peut être récupéré, par exemple, par extraction du mycélium dans un solvant tel qu'une solution aqueuse d'acétone ou de méthanol, élimination du solvant et extraction répétée du résidu dans un solvant organique immiscible à l'eau. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur un agent déshydratant tel que le sulfate de sodium, etc., puis concentrée sous pression réduite. L'acide 8-O-méthylpurpurogallincarboxylique brut ainsi obtenu peut être purifié selon des procédés d'extraction, des procédés de partage, des procédés de précipitation, des procédés de chromatographie sur colonne (en utilisant du gel de silice, du gel de silice en phase inverse, de l'oxyde d'aluminium, le Diaion H?-21, etc., en tant qu'adsorbant) ou par des procédés de tamisage moléculaire. Le principe actif individuel peut être obtenu selon des procédés de CLHP préparative. L'acide 8-O-méthylpurpurogallincarboxylique est isolé sous la forme de l'acide libre, mais l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique libre peut être, si nécessaire, converti en différents sels acceptables au plan pharmaceutique tels que le sel de sodium, le sel de potassium et le sel de calcium selon des procédés conventionnels. L'acide 8-O-méthylpurpuro- gallincarboxylique peut aussi, si nécessaire, être converti en esters tels que les esters d'alcoyles inférieurs, par exemple l'ester d'éthyle ou de méthyle, selon des procédés conventionnels. L'activité inhibitrice de l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I) sur la COMT a été mesurée comme suit. Le mélange d'essai (120 pil), placé dans une mini- ampoule à scintillation, comprenait 68 mM de tampon K-PO4 (pH 8,0), 10 mN de MgCl1, 2,2 mm4 de dithiothréitol, 7,8 U/ml d'adénosine désaminase, 5 mM d'EGTA, 100 pM de 1,2- dihydroxybenzène, 183 pM de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] méthionine (73 Ci/mol, Amersham) et des enzymes hépatiques d'origine humaine. Dans le test standard, 5 pl d'inhibiteur ont été ajoutés au mélange d'incubation et la réaction a été démarrée par l'addition d'enzyme brute (8,3 pg de protéine) préparée à partir de foie humain. Après incubation à 37 C pendant 30 min., la réaction a été stoppée par immersion des ampoules dans de l'eau glacée. pl de guaïacol 1 M - HCl ont été ajoutés aux échantillons et ceux-ci ont été extraits dans 2 ml d'un mélange d'hexane et de toluène (4/1) pour la scintillation. La radioactivité des produits O-3H- méthylés a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation en phase liquide (LSC1100, Aloka). Les activités inhibitrices de l'acide 8-O- méthylpurpuro-gallincarboxylique et des composés de référence sont présentées dans le tableau suivant. Tableau Composé CI50 (PM) Acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique 2,23 Tropolone 963 Gallate de propyle 0,455 L'acide 8-O-méthylpurpurogallincarboxylique n'a donné lieu à aucune toxicité aiguë. Le nouvel acide 8-O-méthylpurpurogallincarboxylique et ses sels et esters fournis par la présente invention peuvent trouver leur utilité en tant que médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques en doses unitaires qui les contiennent en mélange avec un véhicule inerte organique ou inorganique approprié à l'application entérale, tel que la gélatine, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, les polyalcoylènes glycols. Les préparations pharmaceutiques en doses unitaires peuvent se présenter sous forme solide, oar exemple sous forme de comprimés, de comprimés dragéifiés, de dragées ou de gélules de gélatine dure ou de gélatine molle, ou sous forme liquide, par exemple sous forme de solutions, de sirops, ou de suspensions. Une dose unitaire peut contenir 10 à 200 mg d'ingrédient actif. La posologie journalière pour un adulte peut se situer dans la gamme de 10 à 400 mg et peut être modifiée selon les besoins individuels, qui pourront être déterminés par le spécialiste de la technique. L'exemple suivant illustre la présente invention de manière plus détaillée. Exemple 1 Une partie d'une culture mère (100 pl) d'Absidia sp. NR7184 (FERM BP-4599) conservée à -80 C a été introduite dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu consistant en 2% de glucose, 2% d'amidon de pomme de terre, 2% de soya grillé, 0,5% d'extrait de levure, 0,25% de NaCl, 0,005% de ZnSO,.7HO, 0,0005% de CuSO4.5HO, 0,0005% de MnSO4.4HO, 0,32% de CaCO3 et 0,03% de disfoam CA-115 de Nissan. Le pH du milieu était ajusté à 7,0 avant l'addition du bicarbonate de calcium. Cette culture d'ensemencement a été soumise à l'agitation dans un agitateur rotatif à 220 tours/min., à la température de 27 C, pendant 3 jours. Ensuite, des aliquotes de 2 ml ont été transférées dans cinquante flacons de 500 ml contenant le même milieu et incubées dans les mêmes conditions pendant 6 jours de plus. Le bouillon de culture (10 litres) a été séparé en filtrat et en mycélium par centrifugation. Le filtrat de culture (6,1 litres) a été extrait dans le butanol (6,1 litres) à pH 2. Le gâteau de mycélium a été extrait dans 2,5 litres d'éthanol. Après élimination du gâteau de mycélium, l'extrait dans 'éthanol a été concentré à sec sous pression réduite et dissous dans de l'eau (2 litres). La solution aqueuse a été extraite dans le butanol (2 litres) à pH 2. Les deux extraits dans le butanol ont été combinés et concentrés sous pression réduite. Le concentré (32,0 g) a été dissous dans l'eau (1 litre) et soumis à une chromatographie sur colonne de Diaion HP-21 (10 ml) (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) en utilisant l'eau et l'acétone en tant qu'éluants. Les fractions actives ont été combinées et concentrées sous pression réduite. Le concentré a été soumis à une chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 (1 litre) (Pharmacia) en utilisant le méthanol en tant qu'éluant. Les fractions actives ont été combinées et concentrées sous pression réduite. Le concentré a été dissous dans l'eau (30 ml) et soumis à une chromatographie sur colonne de Bond Elute CH (Varian Sample Preparation Products) en utilisant l'eau et le méthanol en tant qu'éluants. Les fractions actives ont été combinées et concentrées sous pression réduite. L'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique a été purifié par CLHP préparative dans les conditions suivants, puis extrait à l'acétate d'éthyle à pH 2; colonne: Capcellpak Cs (20 x 250 mm); solvant: méthanol- NaHPO aq. 0,1 M = 1,1 (pH 2,2); débit: 10 ml/minute; détection: UV 260 nm. L'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique ainsi obtenu (14 mg) se présentait sous la forme d'une poudre brune et amorphe. L'exemple suivant illustre une préparation pharmaceutique contenant 1 ' acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique de la présente invention. Exemple 2 Des comprimés contenant chacun les ingrédients suivants ont été fabriqués selon un procédé conventionnel per se: Acide 8-Ométhylpurpurogallincarboxylique 100 mg Amidon 26 mg Carboxyméthylcellulose calcique 15 mg Cellulose cristalline 20 mg Stéarate de magnésium 4 mg mg 1! Revendications 1. Acide 8-O-méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I), OH O COH OH HO (I) CO2H ou un ester ou un sel de celui-ci. 2. Composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace au plan thérapeutique de l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I), OH O H3CO OH HO CO2H ou d'un ester ou d'un sel de celui-ci et un véhicule inerte au plan thérapeutique. 3. Procédé de production de l'acide 8-0- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I), OH O OHO OH HaCO (I) HO 0 CO2H comprenant la mise en culture d'un micro-organisme appartenant au genre Absidia capable de produire l'acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I) dans des conditions aérobies dans un milieu de culture et la séparation dudit acide 8-O- méthylpurpurogallincarboxylique dudit milieu de culture et, si nécessaire, la conversion du composé résultant en un ester ou en un sel de celui-ci. 4. Procédé de production de l'acide 8-0- méthylpurpurogallincarboxylique de formule (I), selon la revendication 3, dans lequel le micro-organisme est Absidia sp. NR7184 (FERM BP-4599). 5. Absidia sp. NR 7184 (FERM BP-4599).