Brevet FR2715940A1 — publié le 19950811

Procédé de préparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de gènes d'anticorps, banque et systèmes d'expression d'anticorps "col iclonaux" obtenus. Les molécules d'anticorps sont constituées par l'association de deux chaînes lourdes (H) et de deux chaînes légères (L) par l'intermédiaire de ponts disulfure. Les deux chaînes lourdes sont associées entre elles selon une structure en forme de Y et les deux chaînes légères s'associent respectivement aux deux branches de cette structure, de façon telle que les domaines variables des chaînes légères (VL) et lourdes (VH) soient situés à proximité l'un de l'autre. La liaison à l'antigène résulte des propriétés des parties variables des chaînes légères et lourdes. Un système complexe de réarrangement et de sélection permet alors d'induire rapidement une quantité importante d'anticorps spécifiques contre un antigène. La technique c 1 a s s i que des hybridomes permet la sélection de clones de cellules hybrides exprimant des gènes codants pour les chaînes légère et lourde d'une molécule d'anticorps. Cette technique demande la fusion de cellules d'origine lymphocytaire, contenant les gènes présidant à la formation des anticorps et de cellules susceptibles de conduire à des hybridomes formant des lignées immortalisées. Les cellules portant les gènes en question sont en général obtenues par création au hasard de banques de cellules circulantes, avec ou sans immunisation préalable par l'antigène spécifique, et le criblage des hybridomes s'effectue par une réaction antigène-anticorps après multiplications et cultures des clones hybrldomes. Cette technique est lourde, d'un rendement limité et le criblage n'est pas facile. Une autre méthode, utilisant des bactériophages recombinants a été récemment mise en oeuvre. Les principes et diverses réalisations de ce procédé sont par exemple décrits par D. R. Burton, Tiptech - mai 1991, vol. 9, 169-175 ; D. J. Chiswell et al., Tiptech - mars 1992, vol. 10, 80-84 ; H. R. Hoogenboom et al., Rev. Fr. Transfus. Hémobiol., 1993, 36, 19-47 (voir également les demandes de brevets PCT WO 92/01047 et 92/20791). Cette technique consiste à insérer, dans un vecteur, un répertoire de gènes de régions variables d'anticorps en association avec un gène de bactériophage dans des conditions permettant l'expression du gène sous la forme d'une protéine de fusion se présentant à la surface du phage, exposant les régions variables des chaines variables légère et lourde associées par leurs ponts disulfure à la façon d'un fragment Fab d'anticorps, et à sélectionner directement les phages par une méthode rapide de séparation utilisant l'antigène spécifique immobilisé, par exemple par chromatographie d' immuno-affinité. Les phages sélectionnés, après élut ion, peuvent infecter une bactérie et être utilisés pour une production directe ou pour répéter des cycles de sélection. Cette méthode est particulièrement puissante car elle permet la création, en théorie, de banques très importantes et un criblage extrêmement fin, efficace et rapide de la banque. Un phage qui se prête particulièrement bien à ce procédé est le phage filamenteux fd, dans lequel on peut fusionner le fragment codant pour l'une des chaînes lourde et légère de l'anticorps avec le gène de la protéine mineure de surface et insérer le fragment codant pour l'autre chaîne, de sorte que, après infection de bactéries par le phage, on obtient une population de phages portant à leur surface une protéine de fusion présentant les chaînes lourde et légère dans une configuration capable de reconnaître l'antigène, et donc criblable. Outre sa simplicité, cette technique présente de grands avantages. En association avec l'amplification préalable de la banque de gènes d'anticorps, on peut arriver à sélectionner un phage présentant un fragment d'anticorps spécifique dans une très grande population de phages, de l'ordre de 107, ce qui peut permettre de rechercher les gènes d'anticorps humains sans avoir forcément à procéder à l'immunisation préalable du donneur. Par clivage suivi de religation, ou à partir de deux banques séparées de gènes de chaînes légères et de chaînes lourdes on peut obtenir des phages associant une chaîne légère et une chaîne lourde au hasard. Le nombre de clones différents que l'on peut obtenir est cependant limité par le rendement de la sélection et par le degré d'efficacité de la transformation bactérienne. Un moyen d'accroître le nombre d'associations réussies associant les chaînes légères d'une première banque aux chaînes lourdes d'une deuxième banque été décrit par P. WATERHOUSE et al., Nucleic acids Research, 1993, Vol. 21, No. 9, 2265-2266, permettant d'obtenir jusqu'à 10 clones, en utilisant un système de recombinaison spécifique de sites loxP sensible à l'action d'une recombinase Cre. Cependant l'association reste réversible. De plus il n'existe aucun contrôle de l'action de la recombinase et les vecteurs recombinés n'ont aucun avantage sélectif par rapport aux autres vecteurs. Or, compte-tenu du rendement de l'étape de sélection des phages recombinés, qui, en réalité, ne retient qu'une fraction des phages intéressants, il est souhaitable d'obtenir les plus hauts rendements possibles de vecteurs recombinés avec le moins possible de vecteurs non-recombinés. Un objectif de l'invention est donc de fournir un procédé de production de banques multicombinatoires, et notamment sous forme de phages ou phagemides, à partir de deux répertoires de gènes, l'un de chaînes légères et l'autre de chaines lourdes, permettant d'obtenir un nombre de clones très élevé. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé dans lequel le nombre de vecteurs non-recombinés présents à la fin du procédé soit réduit. Un autre objectif de l'invention est de produire de tels recombinants ayant une stabilité accrue. L'invention a pour objet un procédé de production de banques multicombinatoires dans lequel, partant d'un premier répertoire de gènes codant pour une population d'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, de manière covalente ou non, notamment de régions variables de l'un des types chaine légère et chaine lourde d'anticorps, et d'au moins d'un gène codant pour l'autre type de polypeptide, notamment une région variable de l'autre type, de chaîne d'anticorps ou de préférence d'un second répertoire de gènes codants pour une population dudit autre type, on introduit les gènes dudit premier répertoire dans un premier vecteur pour former une population de vecteurs portant les différents gènes dudit premier répertoire, et on introduit ledit gène dudit autre type ou les gènes dudit second répertoire dans un second vecteur, l'un au moins desdits vecteurs, dit receveur, étant agencé pour recevoir, par recombinaison avec l'autre vecteur, tout ou partie dudit autre vecteur, avec son gène, dans des conditions permettant audit vecteur receveur de contenir, après recombinaison, un gène de l'un des deux types et un gène de l'autre type et d'exprimer les deux gènes sous forme de polypeptides associés susceptibles d'apparaître à la surface extérieure du produit dudit vecteur en y restant maintenus et en étant associés entre eux de façon multimérique ou simulant un multimère, caractérisé en ce que lesdits vecteurs présentent des moyens permettant à la recombinaison des chaînes de deux types d'être effectué de façon irréversible. Par la suite l'invention sera décrite dans l'application dans laquelle les deux types de polypeptides sont des régions, au moins en partie variables, de chaines légères et de chaines lourdes d'anticorps. Cependant on comprend qu'elle s'applique à d'autres types de polypeptides susceptibles de s'associer, et notamment les chaînes de récepteurs hétérodimériques, tels que les chaines a et ss ou i et S des récepteurs des cellules T. De façon particulièrement avantageuse les vecteurs, de préférence circularisés, contiennent respectivement les sites de recombinaison spécifiques attB de E. coli et attP du phage 1 agencés de façon à permettre la recombinaison sous l'effet de la recombinase ou intégrase associée en formant, dans un vecteur unique résultant de la recombinaison, des séquences de jonction stables telles que attL et attR. Bien entendu on pourrait également remplacer ces sites par des sites de recombinaison spécifiques d'autres systèmes de recombinaison, bacterie-phage ou autres. De façon à permettre l'élimination des vecteurs ne comportant qu'une chaine unique et obtenir en conséquence un accroîssement supplémentaire de la teneur relative en vecteurs recombinés, ledit vecteur peut être agencé pour présenter un marqueur de sélection initialement non fonctionnel et rendu fonctionnel par la recombinaison. De préférence le marqueur de sélection comporte un gène permettant la sélection, lorsqu'fil est exprimé, et un promoteur propre au gène, le promoteur étant inséré dans l'un des vecteurs et le gène marqueur dans l'autre, de façon à se retrouver associés dans le vecteur de recombinaison obtenu. Parmi les marqueurs préférés figurent les gênes de résistance, avec leur promoteur, au chloramphenicol, aux tétracyclines et à la gentanycine. Bien entendu les deux vecteurs peuvent également comporter des marqueurs propres utilisables dans la construction spécifique de chacun des vecteurs, de façon à permettre ou améliorer la sélection de chacun des vecteurs pendant son processus de construction. A titre d'exemple ces marqueurs peuvent être les gènes de résistance à des antibiotiques tels que la kanamycine et l'ampicilline. De façon préférée on utilise, pour contrôler l'étape de recombinaison entre le premier et le second vecteur, une recombinase thermo-inductible, par exemple par le choix d'un hôte approprié tel que la souche E. coli D1210 HP figurant au catalogue de la société américaine Stratagène. L'invention a également pour objet les vecteurs obtenus par le procédé selon l'invention, et notamment les vecteurs de type plasmide ou phagemide, et qui se caractérisent par la présence d'une séquence codant pour une partie variable de chalne légère d'anticorps, et une séquence codant pour une partie variable de chaîne lourde d'anticorps, lesdites séquences étant accompagnées, dans des cadres convenables, des éléments permettant leur expression dans un hôte, lesdites séquences de chaîne légère et de chaîne lourde, avec lesdits moyens qui leur sont associés, étant respectivement séparées par des sites uniques d'intégration irreversibles tels que, notamment, attP ou attB. Enfin l'invention a pour objet les banques multicombinatoires, formées par les vecteurs selon l'invention et associant, de façon aléatoire, une séquence codant pour l'un des types de polypeptides, tel qu'une partie variable de chaine légère et une séquence codant pour l'autre type de polypeptide tel qu'une partie variable de chaine lourde. On va maintenant décrire un exemple de construction d'un vecteur recombiné selon l'invention combinant les parties variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde d'un même clone anti-gpl60 de HIV, vecteur qui s'avère capable d'exprimer les gènes desdites parties variables légères et lourde et de présenter leurs produits d'expression à sa surface ou, en variante, de les relarguer sous forme d'une association chaîne lourde-chaine légère reconnaissant l'antigène gp160. La même technique pourra être utilisée pour réaliser les constructions multicombinatoires associant les gènes d'un répertoire de parties variables de chaîne légère à un gène de partie variable de chaine lourde, ou un répertoire de parties variables de chaîne lourde à un gène de partie variable de chaîne légère, ou deux répertoires de parties variables lourdes et légères. La figure 1 représente schématiquement les étapes de constructions partant de pM822 pour aboutir à pM825. La figure 2 représente schématiquement les étapes de construction partant de pM829 pour aboutir à pM833. La figure 3 représente schématiquement l'étape de recombinaison de pM827 et pM834. La figure 4 représente une vue schématique du vecteur multicombinatoire pM835 obtenu. La figure 5 représente les amorces d'amplification du pACYC177. La figure 6 représente la séquence du linker 30 pb. La figure 7 représente l'oligonucléotide incorporant la séquence de recombinaison AttB. La figure 8 représente la séquence du linker 70 pb. La figure 9 représente les amorces d'amplification du promoteur lac. La figure 10 représente la séquence du linker 98 pb. La figure 11 représente les amorces d'amplification de la chaîne VL anti-gp 160. La figure 12 représente les amorces d'amplification de pM825. La figure 13 représente les amorces d'amplification du gène de résistance au chloramphénicol. La figure 14 représente la séquence du linker 68 pb. La figure 15 représente la séquence du linker 115 pb. La figure 16 représente les amorces d'amplification du gène III. La figure 17 représente les amorces d'amplification de la chaîne VH anti-gp 160. La figure 18 représente les amorces d'amplification de la séquence de recombinaison AttP. La figure 19 représente les amorces d'amplification de la chaîne lourde introduisant la mutation Ambre. La figure 20 représente les amorces d'amplification du promoteur du gène de résistance au chloramphénicol. I - Création d'un plasmide possédant une origine de réplication p15A, un gène de résistance à la kanamycine et une séquence de recombinaison AttB pour l'insertion du gène ou de banque de gênes régions variables de chaîne légère. 1) On procède à l'amplification par PCR (réaction en chaîne de polymérase) d'un fragment de 2 050 pb couvrant les bases 759 à 2 810 du plasmide pACYC177. Ce plasmide (ATCC 37031), diffusé par la firme Biolabs, est répertorié, et sa séquence décrite, dans les banques de données (GenBank Accession n0 X06402). Ce fragment amplifié comprend le gène de résistance à la kanamycine, y compris son promoteur, l'origine de réplication plSA et un site EcoRI à chaque extrémité. Le fragment amplifié par PCR est ensuite recircularisé pour former un plasmide appelé pM822, de 2 056 pb. Les amorces utilisées pour l'amplification du fragment sont décrites sur la figure 5 et dans les identificateurs SEQ ID No. 1 et 2. 2) Dans le site EcoRI unique du vecteur pM822 on insère un adap teur (linker) synthétique de 30 pb comprenant les sites de restriction SacI, KpnI, XbaI et SphI, le vecteur obtenu, de 2 086 pb étant appelé pM823. Les séquences d'amorce adapteur (linker) synthétique apparaissent sur la figure 6 et dans les identificateurs SEQ ID No. 3 et 4. 3) On insère dans le vecteur pM823 la séquence de recombinaison AttB de 23 pb sous forme d'oligonucléotide synthétique entre les sites SacI et KpnI, en contrôlant l'orientation 5'-3' par destruction du site SacI par modification de sa dernière base. On obtient ainsi un plasmide pM824 de 2 107 pb. Les séquences oligonucléotidiques synthétiques correspondant au site de recombinaison AttB sont décrites sur la figure 7 et les identificateurs SEQ ID No. 5 et 6. 4) Insertion de la cassette permettant le clonage des parties variables des chaines légères VL. - pour construire un phagemide appelé pM452 on procède à la digestion du phagemide pBLuescript IISK+ (commercialisé par Stratagène) de 2 961 pb par les enzymes AflîlI et KpnI et à l'élimination d'un fragment de 501 pb comprenant le promoteur lactose et différents sites de clonage. On synthétise un adapteur de 70 pb représenté sur la figure 8, dont les séquences d'amorces sont décrites dans les identificateurs SEQ ID No. 7 et 8 comprenant les sites de restriction BglII, NheI, EcoRI, SacI, XbaI et NotI, et on insère le linker entre AflIII et KpnI pour aboutir & un phagemide pM836 de 2 530 pb. - On insère entre les sites NheI et EcoRI un fragment de 171 pb amplifié par PCR à partir du pBluescript (bases 802 à 973) en utilisant les amorces correspondant aux identificateurs de séquence SEQ ID No. 9 et 10 (figure 9), ce fragment contenant le promoteur lac pour obtenir le phagemide pM837. - On insère entre EcoRI et SacI de pu837, un adapteur synthétique de 98 pb contenant la séquence signal PelB (figure 10 et identificateurs SEQ ID No. 11 et 12) pour obtenir finalement un phagemide pM838 de 2 795 pb. - On insère ensuite la séquence codant pour la région VL de chaîne légère d'un clone anti-gp 160 de HIV de 642 pb amplifiée par PCR (banque d'ADNc) entre les sites SacI et XbaI, ce qui permet la conservation de la phase de lecture entre PelB et la chaine légère. Les amorces (figure 11) sont définies dans les identificateurs de séquence SEQ ID No. 13 et 14. On obtient le phagemide pM452 (3 427 pb) contenant la cassette VL (promoteur lac, séquence signal PelB et la séquence (642 pb) codant pour la chaine légère du clone anti-gp 160. - Le phagemide pM452 est digéré par NheI et XbaI pour libérer un fragment de 960 pb correspondant à la cassette VL, fragment que l'on purifie. - Ce fragment est ensuite inséré dans le vecteur pM824 au niveau des sites KpnI et XbaI avec destruction du site KpnI pour contrôler l'orientation, donnant le plasmide pM825 de 3 056 pb. 5) Un site AscI unique est créé en position 3' de la séquence AttB par amplification par PCR du plasmide pM825 entier à l'aide de deux amorces (figure 12) possédant un site AscI à leur extrémité et ayant les séquences figurant sur les identificateurs SEQ ID No. 15 et 16. Le plasmide ainsi modifié est nommé plasmide pM826 (3 050 pb). Le gène de résistance au chloramphénicol (770 pb), dépourvu de son promoteur, est amplifié par PCR à partir du plasmide pBR328 (Boehrlnger, Accession Genbank VB0004). L'amplification est faite avec les amorces (figure 13) dont les séquences sont indiquées sur les Identificateurs de séquences SEQ ID No. 17 et 18. On clone ensuite le gène de résistance au chloramphénicol dans le plasmide pM826 au niveau du site AscI en déterminant l'orientation correcte pour son expression après l'étape de recombinaison, par séquençage. On obtient ainsi un plasmide dénommé pM827 de 3 816 pb. II - Création d'un vecteur de type phagemide portant deux origines de réplication ColEl et f1, un gène de résistance à l'ampicilline et une séquence de recombinaison AttP pour l'insertion d'une banque de régions variables de chaînes lourdes. 1) Modification du vecteur pBluescript SKII+ (Stratagène, Accession Genbank X52328) pour obtenir un phagemide capable de présenter un Fab fusionné au niveau du gène III (protéine de surface) à sa surface - Après digestion du pBluescript par SacI et destruction du site SacI par action de la mung bean nucléase puis digestion par KpnI pour éliminer le site de clonage multiple (polylinker) (107 pb) on insère un adapteur synthétique de 68 pb (figure 14) contenant les sites SacII, XhoI, SpeI, NheI et NotI (séquences SEQ ID n- 19 et 20), obtenant le phagemide pM828 de 2 922 pb. - On crée un adapteur synthétique 115 pb (SEQ ID No. 21 et 22) contenant la séquence signal PelB. Ce linker (figure 15) est inséré entre les sites SacII et XhoI pour donner le phagemide pM829 de 3 034 pb. - On procède à l'insertion, entre les sites Spel et NheI de pM828 d'un adapteur flexible de 15 pb (fig 16 et identificateurs SEQ ID No. 23 et 24) et du gène III du phage M13 (663 pb) après amplification par PCR sur le phage M13 mu 18 des bases 2 223 à 2 885 (Biolabs, Accession Genbank X02513), obtenant le phagemide pM830 de 3 709 pb. - On amplifie par PCR la chaîne lourde d'un clone (ADNc) anti-gp 160 de HIV de 684 pb à l'aide des amorces SEQ ID No. 25, 26 (figure 17). Cette chaîne lourde est ensuite insérée entre les sites XhoI et SpeI du phagemide pM830 pour aboutir au phagemide pM831 de 4 384 pb, avec conservation de la phase de lecture entre PelB et la chaîne lourde et entre celle-ci et le gène III. 2) Insertion de la séquence de recombinaison AttP de 250 pb au niveau du site NheI après amplification par PCR sur le phage X des bases 27 571 à 27 820 (Biolabs, Accession Genbank V00636). Les amorces utilisées (figure 18) possèdent les séquences SEQ ID No. 27 et 28. La séquence de recombinaison AttP amplifiée peut être insérée avec deux orientations possibles mais seule une orientation est retenue.On aboutit ainsi au phagemide pM832 de 4 641 pb comprenant la structure représentée sur la figure 3. 3) Modification du vecteur pour la production de Fab solubles. Pour produire facilement des Fab solubles, une mutation Ambre (identifiée comme un codon stop dans les souches bactériennes non suppressives) est donc introduite entre la chaîne lourde et le gène III en conservant la phase. La chaîne lourde est amplifiée par PCR avec une amorce en 5' possédant le site XhoI (SEQ ID No. 25) et une autre en 3' (SEQ ID No. 29 ; voir figure 19) contenant le site SpeI suivi du codon Ambre TAG puis du site XbaI compatible avec SpeI. Elle est ensuite clonie entre les sites SpeI et XhoI du vecteur pM832, aboutissant au phagemide pM833 de 4 650 pb. 4) Insertion du promoteur du gène de résistance au chloramphénicol au niveau du site unique KpnI situé en 3' de la séquence de recombinaison AttP. Une seule orientation confère une nouvelle résistance au vecteur recombiné. Le promoteur (177 pb) est amplifié préalablement par PCR a partir des bases 3270 à 3440 du vecteur pBR328 (commercialisé par Biolabs) à l'aide des amorces (figure 20) dont les séquences sont indiquées dans les identificateurs de séquence SEQ ID No. 30 et 31. On obtient ainsi le phagemide pM834 de 4 827 pb. III Recombinaison entre les deux vecteurs pM827 et pM834. Les deux plasmides précités serviront de point de départ pour obtenir des banques d'anticorps multicombinatoires. Dans l'exemple représenté la recombinaison s'effectuera entre les chaînes VL et VH du clones anti-gp 160 de HIV utilisé. Cependant si les deux vecteurs sont construits à partir de banques de gènes de chaînes lourdes et/ou de gènes de chaînes légères d'anticorps ils permettront d'obtenir une banque multicombinatoire d'anticorps que l'on pourra ensuite cribler. Transformés dans une souche adéquate (D1210HP), les deux vecteurs pourront s'associer grâce aux séquences AttP et AttB, cibles d'un facteur de recombinaison int inductible. Les mécanismes de recombinaison sont décrits dans le chapitre 9 du livre "The recombination of genetic material" (Miller H. V., Viral and cellular control of site-specific recombination, 1988, p 360-384, edited by Brooks Low K., Academic Press). Le vecteur multicombinatoire (8 643 pb) ainsi créé possèdera trois origines de réplication différentes, trois résistances aux antibiotiques et les deux cassettes permettant l'expression des chaînes VL et VH. 1) On procède à la transformation par électroporation de la souche de E. coli D1210HP (diffusée par Stratagène), et qui contient la recombinase inductible int, avec l'épisome F' sous forme d'ADN provenant de la souche bactérienne XLl-Blue (diffusée par Stratagène). Les bactéries sont ainsi infectables par un phage filamenteux. L'épisome F' est maintenu dans la souche grâce à sa résistance à la tétracycline. La souche D1210rlP-F' ainsi transformée possède le génotype suivant : Dl210HP-F' HB101, lacIq, lacY+, #xis- kil- cI857 [F', proAB, lacIqZ#M15, Tn10(TetR)]. 2) Etapes de la recombinaison. - On procède à la transformation de cette souche par le plasmide pM 827 (contenant les chaines VL et résistant à la kanamycine), et en parallèle on transforme une souche compatible, par exemple, XL-1 Blue par le phagemide pM834 (résistant à l'ampicilline et portant les chaînes VH). A partir de la souche transformée par le phagemide pM 834 on prépare celui-ci sous forme de phage puis on infecte la culture de D1210 HP-F' contenant le plasmide pn 827, à 30-C (DO = 0,6). Après 30 mn d'infection à 30-C, on soumet la culture à un choc thermique à 42'C pendant une heure pour déclencher la recombinaison sous l'effet de la recombinase Inductible. Après avoir remis la culture à 30-C et ajouté du chloramphénicol (50 à 100 g/ml final) on étale les clones sur milieu gélosé contenant du chloramphénicol. On ajoute une heure après le phage helper VCSM13 (KanR) de Stratagène à raison de 1012 pfu/100 ml de culture. Puis on ajoute, deux heures après, la kananycine à 70 pg/ml final et la culture est laissée quelques heures à 30-C. L'analyse des clones après recombinaison des vecteurs pM827 et pM834 montre que l'association s'est bien déroulée. On obtient un phagemide recombiné pM835 de 8 643 pb stable, exprimant un Fab et toujours capable d'infecter la souche D1210HP-F. Les points de jonction AttL et AttR ont été vérifiés par séquençage. IV - Préparation d'une banque multicombinatoire à partir d'une banque de chaînes légères et d'une banque de chaînes lourdes. L'étape d'insertion I.4 de la région variable de la chaîne légère du clone anti-gp 160 de HIV amplifié par PCR est remplacé par une insertion similaire des régions variables des chaînes légères d'une banque de chaînes légères d'anticorps amplifiée par PCR à l'aide d'un système d'amorces connu convenable propre au type de chaîne légère recherchée, ou d'une pluralité de systèmes d'amorces si l'on souhaite effectuer la multicombinaison à partir de populations de différents types de chaînes légères. Les systèmes d'amorce permettant l'amplification des chaines légères sont bien connus et décrits par W.D. Huse et al., Science, Vol 246 (1989), 1275-1281. De la même façon, pour le clonage des chaînes lourdes, on remplace l'étape d'insertion II.1 de la chaîne lourde d'un clone anti-gp 160 HIV par l'insertion d'une banque de régions variables de chaînes lourdes amplifiée par PCR à l'aide des systèmes d'amorce convenables décrits par M.J. Campbell et al., Molecular Immunology, Vol. 29, No. 2 (1992), 193-203 ou par W.D. Huse et al. ci-dessus. Après les étapes de recombinaison les clones résistant au chloramphénicol sont sélectionnés et on procède ensuite au criblage destiné à sélectionner les clones exprimant des associations de chaine légère et chaîne lourde d'anticorps ayant les affinités recherchées contre les antigènes déterminés, conformément aux techniques décrites dans par exemple par S.F. Parmley et al., Gene 73 (1988), 305-318. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins (B) RUE: 58 avenue Leclerc (C) VILLE: LYON (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 69007 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé de préparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de gènes d'anticorps, banque et systèmes d'expression d'anticorps "coliclonaux" obtenus. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 31 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 11.0, Version 11.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce pACYC+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGGAATTCCC CTTAATAAGA TGATCT 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (t) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amo (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGGAATTCCA TTCAACAAAG CCGCCGTC 28 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pAC Link+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AATTCGAGCT CGGTACCTCT AGAGCATGCG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pAC Link (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AATTCGCATG CTCTAGAGGT ACCGAGCTCG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse séquence de recombinalson AttB Sac-Kpn+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GCCTGCTTTT TTATACTAAC TTGGTAC 27 (2 > INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse séquence de recombinaison AttS Sac-Kpn (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CAAGTTAGTA TAAAAAAGCA GGCAGCT 27 (2 > INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 79 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVL Link+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CATGTGCAGA TCTTAGCTAG CATGAATTCC AGAGCTCGTC AGTTCTAGAG TTAAGCGGCC 60 GCAATCGAGG GGGCGGTAC 79 (t) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 71 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVL Llnk- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CGCCCCCTCG ATTGCGGCCG CTTAACTCTA GAACTGACAG ACTCTGGAAT TCATGCTAGC 60 TAAGATCTGC A 71 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Pro Lac+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: CTAGCTAGCT AACACGACAG GTTTCCCGAC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Pro Lac (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CGGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCT 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 108 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVL PelB+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: AATTCTAAAC TAGCTAGTCG CCAAGGAGAC AGTCATAATG AAATACCTAT TGCCTACGGC 60 AGCCGCTGGA TTGTTATTAC TCGCTGCCCA ACCAGCCATG GCCGAGCT 108 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12s (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 100 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C > NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Ollqonucléotide de synthèse amorce linker pVL PelB (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA GGCAATAGGT 60 ATTTCATTAT GACTGTCTCC TTGGCGACTA GCTAGTTTAG 100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Olfqonucléotide de synthèse amorce VL5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24 (2 > INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oliqonucléotide de synthèse amorce CL2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: CGCCGTCTAG AACTATGAAC ATTCTGTAGG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide de synthèse amorce pAC Asc+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: TTGGCGCGCC TAGTAACACG ACAGG 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce pAC Asc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: TTGGCGCGCC GGTACCAAGT TAGTA 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide de synthèse amorce Gene Cm Asc+ (xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TTGGCGCGCC GAGTTATCGA GATTTT 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Gene Cm Asc- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: TTGGCGCGCC ATTCATCCGC TTAT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 73 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVH Llnk+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TGGCCACCGC GGTGCTCGAG GATACTAGTC AGCTAGCTAG AGAGTTAAGC GGCCGCAATC 60 GAGGGGGCGG TAC. 73 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 69 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVH Link (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CGCCCCCTCG ATTGCGGCCG CTTAACTCTC TAGCTAGCTG ACTAGTATCC TCGAGCACCG 60 CGGTGGCCA 69 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 117 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVH PelB+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: GGTGGCGGCC GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATAA TGAAATACCT ATTGCCTACG 60 GCAGCCGCTG GATTGTTATT ACTCGCTGCC CAACCAGCCA TGGCCCAGGT GAACTGC 117 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 123 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE :Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVH PelB (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: TCGAGCAGTT CACCTGGGCC ATGGCTGGTT GGGCAGCGAG TAATAACAAT CCAGCGGCTG 60 CCGTAGGCAA TAGGTATTTC ATTATGACTG TCTCCTTGAA ATAGAATTTG CGGCCGCCAC 120 CGG 123 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVR GIII+ (xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: GGACTAGTGG TGGCGGTGGC TCTCCATTCG TTTGTGAAT 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker pVH GIlI- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: CTAGCTAGCA TAATAACGGA ATACCCAAAA G 31 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oliqonucléotide de synthèse amorce linker VH4f (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce linker CG1z (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: GCATGTACTA GTTTTGTCAC AAGATTTGGG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce AttP Nhe+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: CTAGCTAGCC GCGCTAATGC TCTGTTACAG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE :Oligonucléotide de synthèse amorce AttP Nhe (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: CTAGCTAGCA TCAAATAATG ATTTTATTT 29 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 29 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Amb PCR (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29: GCTCTAGACT AACTAGTTTT GTCACAAGAT TTG 33 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 30: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Pro Cm Kpn+ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: GGGGTACCGA ATAAATACCT GTGA 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse amorce Pro Cm Kpn (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31: GGGGTACCAA AAAATACGCC CGGTA 25 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de banques multicombinatoires dans lequel, partant d'un premier répertoire de gènes codant pour une population d'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment de régions variables de l'un des types chaine légère et chaîne lourde d'anticorps, et d'au moins d'un gène codant pour l'autre type de polypeptide, notamment une région variable de l'autre type de chaîne d'anticorps, ou de préférence d'un second répertoire de gènes codants pour une population dudit autre type, on introduit les gènes dudit premier répertoire dans un premier vecteur pour former une population de vecteurs portant les différents gènes dudit premier répertoire, et on introduit ledit gène dudit autre type ou les gènes dudit second répertoire dans un second vecteur, l'un au moins desdits vecteurs, dit receveur, étant agencé pour recevoir, par recombinaison avec l'autre vecteur, tout ou partie dudit autre vecteur, avec son gène, dans des conditions permettant audit vecteur receveur de contenir, après recombinaison, un gène de l'un des deux types et un gène de l'autre type et d'exprimer les deux gènes sous forme de polypeptides associés susceptibles d'apparaître à la surface extérieure du produit dudit vecteur en y restant maintenus et en étant associés entre eux de façon multimérique ou simulant un multimère, caractérisé en ce que lesdits vecteurs présentent des moyens permettant à la recombinaison des chaînes de deux types d'être effectué de façon irréversible. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits premier et second vecteurs contiennent respectivement l'un des sites de recombinaison spécifique d'un système de recombinaison spécifique, notamment les sites attB de E. coli et attP du phage X, agencé de façon & permettre la recombinaison sous l'effet d'une recombinase ou intégras associée en formant, dans un vecteur unique résultant de la recombinaison, des séquences de jonction stables telles que attL et attR. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le vecteur recombinant obtenu à partir desdits premier et second vecteurs est agencé pour présenter un marqueur de sélection initialement non fonctionnel et rendu fonctionnel par la recombinaison. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le marqueur de sélection comporte un gène permettant la sélection, lorsqu'il est exprimé, et un promoteur propre au gène, le promoteur étant inséré dans l'un desdits premier et second vecteurs et le gène marqueur dans l'autre. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le marqueur est le gène de résistance à un antibiotique, notamment un gène du groupe formé par les gènes de résistance aux tétracyclines, à la gentamycine et au chloramphénicol, avec son promoteur. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on utilise, pour contrôler l'étape de recombinaison entre le premier et le second vecteur, une recombinase thermo- i nduct i bl e. 7. Vecteurs obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, et notamment les vecteurs de type plasmide ou phagemide, et qui se caractérisent par la présence d'une séquence codant pour l'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment une partie variable de chaîne légère d'anticorps, et une séquence codant pour l'autre desdits deux types, notamment une partie variable de chaîne lourde d'anticorps, lesdites séquences étant accompagnées, dans des cadres convenables, des éléments permettant leur expression dans un hôte, lesdites séquences de chaîne légère et de chaîne lourde, avec lesdits moyens qui leur sont associés, étant respectivement séparées par des séquences relatives à des sites uniques d'intégration tels que, notamment, attP ou attB. 8. Banques multicombinatoires de vecteurs, formées par les vecteurs selon la revendication 7 et associant, de façon aléatoire, une séquence codant pour l'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment une partie variable de chaîne légère d'anticorps et une séquence codant pour l'autre desdits deux types, notamment une partie variable de chaîne lourde d'anticorps