Brevet FR2719773A1 — publié le 19951117

La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'une glycoprotéine humaine immunostimulante. Dans FR-A-2 650 183, on a décrit deux glycoprotéines ayant des masses moléculaires d'environ 92 kD et 43 kD, qui présentent une activité immunostimulante et qui peuvent être obtenues à partir d'urine humaine. La protéine de masse 43 kD est obtenue à partir de la protéine 92 kD par traitement par la pronase. Dans ce qui suit, on appellera HGP92 la protéine de 92 kD et HGP43 celle de 43 kD. Comme décrit dans FR-A-2 650 183, la protéine HGP92 peut être obtenue à partir d'urines congelées. Après décongélation, les urines sont centrifugées et le surnageant est concentré par ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de passage de 10.000 kD. Le concentrat est déposé sur une colonne de chromatographie par échange d'anions chargée de DEAE puis élué avec une solution de NaCl 0,2 M. On a maintenant découvert que la protéine HGP92 est un inducteur de cytokines. Elle trouve de ce fait une application importante en thérapeutique humaine. La présente invention a donc pour objet l'utilisation de la protéine HGP92 comme inducteur de cytokine. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la protéine HGP92 pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la production de cytokines. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la protéine HGP92 in vitro pour l'induction de la production de cytokines. Les médicaments contenant la protéine HGP92 peuvent être administrés à l'homme ou aux animaux par voie topique, orale ou parentérale. Ces médicaments peuvent être sous la forme de préparations solides, semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les comprimés, les gélules, les suppositoires, les solutions ou suspensions injectables, les pommades, les collyres huileux ou aqueux, les collutoires, les solutions nasales et otologiques, ainsi que les formes retard. Dans ces médicaments, le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les médicaments administrables par voie topique peuvent contenir notamment de 0,1 à 5 % en poids du principe actif. Les médicaments administrables par voie orale ou parentérale peuvent contenir notamment de 1 % à 60 % en poids de principe actif. La quantité de principe actif administré dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Cependant, pour l'adminitration par la voie parentérale, on peut administrer le principe actif à la dose de 50 à 500 microgrammes/kg. Pour la voie orale on peut administrer environ de 0,5 à 5 mg/kg de principe actif. On donnera ci-après une description détaillée de l'obtention et des nouvelles propriétés de la protéine HGP92. 1) Obtention de la protéine HGP92 Des urines de 24 heures provenant de personnes des deux sexes sont congelées et gardées à -20" C. Après décongélation, elles sont centrifugées à 6900 g à 4 C et le surnageant obtenu est concentré 50 fois par ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de passage de 104. Le concentrat est ensuite déposé sur une colonne de chromatographie par échange d'anions rempli de DEAE Affigel équilibrée avec du tampon phosphate de sodium 0,07M (pH 6,8). La colonne est d'abord lavée avec ce tampon puis les protéines sont éluées avec une solution aqueuse de NaCl 0,2M (Fig. 1). On suit l'absorption de l'éluat à 280 nm et on recueille des fractions de 1 ml. On teste l'activité de chaque fraction par injection de 20 pg à des souris, 24 heures avant infection par une dose létale de Listeria monocytogenes. L'activité biologique (zone hachurée sur la Fig. 1) est exprimée en pourcentage de souris survivantes, 4 jours après l'infection. On rassemble les fractions actives, on les concentre par ultrafiltration sur une membrane Amicon XM 100 et on dépose le concentrat sur une colonne de gel de perméation Ultragel AcA44 équilibrée avec un tampon phosphate de sodium 0,1M (pH 7,2) contenant 0,15M NaCl et calibrée avec des échantillons de masse moléculaire connue. L'absorption à 280 nm des différentes fractions est donnée sur la Fig. 2. Le produit obtenu a été soumis à une électrophorèse dans des conditions réductrices dans un gel de polyacrylamide SDS à 10 % (PAGE). Sur la Fig. 3 on a représenté les résultats obtenus avec 20 pg d'urine concentrée (bande 1), 20 pg de fractions actives séparées sur DEAE (bande 2), 5 ug de HGP92 purifiée (bande 3). Des étalons de masse moléculaire sont indiqués sur la gauche de la Fig. 3. Le produit obtenu réagit avec la concanavaline A, ce qui confirme la glycosylation. Une réaction avec l'anthrone permet d'estimer que la partie carbohydrate représente 15 % de la masse totale de la protéine HGP92. La protéine HGP92 a été soit hydrolysée par du bromure de cyanogène dans de l'acide formique à 70 %, soit isolée à partir de sels de polyacrylamide colorés au bleu de Coomasie puis hydrolysée in situ par de la trypsine. Les peptides ont été séparés par HPLC en phase inverse. Cinq des peptides séparés ont été soumis à une analyse de la séquence d'aminoacides. On a ainsi pu identifier les séquences suivantes Thr Leu Asp Glu Tyr Trp Arg Gly Trp Tyr Arg Met Ala Glu Thr Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Asn Val Ser Leu Gly Lys Ser Leu Gly Phe Asp Lys En outre, après déglycosylation de HGP92 par la N-glycanase on a pu identifier la séquence NH2 terminale suivante Asp Thr Ser Glu. 2 - Induction de la production de cytokines par des monocytes humains ou de souris Des cellules THP1, lignée de cellules premonocytiques humaines (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26, 171, 1980) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur. Les cellules THP1 sont préparées par addition de phorbol 12-myristate, 13-acétate (10 ng/ml), puis disposées dans des plaques à 24 puits (2,5.105 cellules par puits) pendant 24 heures. les monocouches de cellules ont été lavées avec du RPMI et laissées 24 heures avant l'addition de la protéine HGP92. Des quantités croissantes de protéine HGP92 ont été ajoutées et on a déterminé la quantité de IL-1S et de TNF produits à l'aide de tests ELISA du commerce. Pour une dose de 5 ug/ml de HGP92 on a également déterminé la quantité de IL-îp et de TNF produits en fonction de différents temps d'incubation. On a reporté sur les Fig. 4A et 4B les résultats sur la production de IL-1S (respectivement pour des doses croissantes de HGP92 et pour une dose de 5 pg/ml de HGP92) et sur les Fig. 5A et 5B les résultats sur la production de TNFa (respectivement pour des doses croissantes de HGP92 et pour une dose de 5 pg/ml de HGP92). On constate un effet qui est dépendant de la concentration avec un maximum à une dose de 5 pg/ml de HGP92. Cet effet est également dépendant du temps d'incubation. On a procédé de même en utilisant des cellules J774, une lignée de macrophages inflammatoires de souris. On a ajouté des quantités croissantes de protéine HGP92 et on a déterminé la quantité d'IL-6 de souris produite. A cet effet on a utilisé des plaques de microtitration à 96 puits préalablement revêtues de 50 p1 d'anticorps anti IL-6 monoclonal de souris (2 pg/ml dans 0,1M de NaHCO3, pH 8,2) puis lavées le lendemain avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Tween 20. Les puits ont été bloqués avec du sérum de veau foetal à 10 % de PBS (200 wul/puits) pendant 2 heures à température ambiante et lavés avec PBS-Tween. Les échantillons ont été ajoutés à raison de 100 Wul/puits et laissés incuber à 4 C. Les plaques ont été lavées 4 fois et 100 p1 d'anticorps anti IL-6 monoclonaux de souris biotinylés (1 pg/ml dans PBS contenant 0,05 % de Tween) ont été ajoutés pendant 45 minutes à température ambiante. Les plaques sont lavées 6 fois puis de l'avidine-peroxydase est ajoutée pendant 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont lavées 8 fois avec du PBS contenant 0,05 % de Tween et le substrat chromogène est ajouté. Les plaques sont lues à 490 mm dans un appareil de lecture pour ELISA. Les résultats sont reportés sur les Fig. 6A et 6B (respectivement pour des doses croissantes de HGP92 et pour une dose de 5 pg/ml de HGP92 avec différents temps d'incubation). On constate une production d'IL-6 qui dépend de la dose et du temps d'incubation. 3 - Induction de la production de IFNa/ss dans des macrophages inflammatoires Des cellules L929 ont été disposées en monocouches dans des plaques à 96 puits. On a ajouté à 1.106 macrophages inflammatoires 10 ,ug/ml de protéine HGP92 et laissé incuber 24 heures. Les milieux ont été retirés et du milieu frais contenant 50-75 PFU de virus de stomatitis vesiculaire a été ajouté. Au bout d'une heure le virus a été remplacé par un recouvrement de 0,5 % de méthylcellulose dans DMEM additionné de 2 % FBS et les cellules ont été incubées jusqu'à la formation de plaque. Les monocouches ont été colorées avec du crystal violet et les plaques ont été comptées. La concentration en IFN a été calculée comme étant la dilution réciproque induisant une réduction de 50 % dans le nombre de plaques par rapport au témoin. On a détecté la présence de 12 unités/ml d'IFNa/B. REVENDICATIONS 1 - Utilisation de la protéine HGP92 pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la production de cytokines. 2 - Utilisation de la protéine HGP92 pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la production de IL-1S, TNFa, IL-6 et IFNa/ss. 3 - Utilisation de la protéine HGP92 in vitro pour l'induction de la production de cytokines.