Brevet FR2720748A1 — publié le 19951208

La présente invention concerne de nouvelles protéines, leur procédé de préparation et leur utilisation dans le domaine de la biologie, notamment dans le diagnostic de désordres dans le système de réparation de l'ADN. Plus particulièrement, la présente invention concerne deux protéines qui constituent des sous-unités du facteur de transcription humain BTF2 (TFIIH). BTF2/TFIIH est un facteur de transcription de classe II essentiel dont on a démontré qu'il jouait un rôle dans la réparation/excision de nucléotides (NER) (Schaeffer et al., 1993). Ce facteur participe à la formation de complexes, préinitiation, transcription qui comprennent de la TFIIA, TFIID, TFIIB, TFIIE et TFIIF comme facteurs de transcription de base et l'ARN polymérase II (B) sur un promoteur minimal (contenant la boîte TATA et le site cap) (Conaway et Conaway, 1991; Zawel et Reinberg, 1992). Le BTF2, de même que son homologue facteur ô du rat et le facteur b de la levure, sont nécessaires pour la transcription in vitro de la plupart des gènes codant pour une protéine. On connait peut de chose sur le rôle de BTF2 dans la réaction de transcription, à l'exception d'une activité kinase qui est capable de phosphoryler le domaine carboxy-terminal (CTD) de la grande sous-unité de l'ARN polymérase Il et une activité ATPase ADN-dépendante qui a été trouvée en association avec BTF2 et ses homologues chez le rat et la levure (Bunick et al., 1982; Sawadogo et Roeder, 1984; Conaway et Conaway, 1988; Feaver et al., 1991; Dahmus et Dynan, 1992; Lu et al., 1992; Serizawa et al., 1992). Le rôle de BTF2 dans la NER a récemment été suggéré lorsque l'une des sous-unités (le polypeptide de 89 kd; p89) a été identifiée comme le produit du gène ERCC3, une hélicase associée pense-t-on avec la réparation de l'ADN (Weeda et al., 1990; Schaeffer et al., 1993; van Vuuren et al., 1994). Des mutations dans ce gène confèrent une sensibilité au rayonnement solaire (UV) et une prédisposition au cancer de la peau qui se manifeste par un xeroderma pigmentosum de groupe B (XP-B), une forme sévère du syndrome de réparation déficiente, qui présente également les symptômes cliniques d'un autre désordre de la réparation de l'ADN, le syndrome de Cockayne. Des expériences utilisant à la fois des tests de réparation par microinjection in vivo et un système NER in vitro utilisant des extraits acellulaires (Wood et al., 1988), ont confirmé que p89/ERCC3, une sousunité de BTF2, était directement impliqué dans la réaction de réparation/excision (van Vuuren et al., 1994). Des résultats plus récents montrent que ERCC2 (un polypeptide de 80 kD) est également associé au complexe BTF2, bien que, semble-t-il, de façon moins étroite que pour p89. La présente invention concerne plus particulièrement deux nouvelles protéines dénommées p34 et p44 et qui constituent des sous-unités du complexe BTF2. Plus particulièrement, la présente invention concerne des protéines caractérisées en ce qu'elles comportent tout ou partie de la séquence de la protéine p44 ou de la protéine p34 telle que représentée à la figure 1 pour p34 et à la figure 2 pour p44, les variants de ces protéines présentant au moins un épitope reconnu par un anticorps anti-p44 ou anti- p34 selon la figure 1 ou la figure 2. De préférence, les protéines comportent l'ensemble de la séquence de p44 ou p34, il peut alors s'agir de protéines hybrides bien que les protéines en elles-mêmes soient plus particulièrement intéressantes. Parmi les variants délétés, il faut citer notamment les protéines présentant plus de 80 % des séquences de p34 ou p44. La définition précédente concerne, bien évidemment, les protéines hybrides qui comporteraient uniquement l'un des épitopes des protéines p44 ou p34 ou bien des protéines délétées qui ne comporteraient plus qu'un épitope. La présente invention concerne également les séquences d'ADN codant pour lesdites protéines, qu'il s'agisse des protéines en elles- mêmes ou des protéines variantes mentionnées précédemment. Ces séquences d'ADN peuvent être aussi bien des séquences génomiques que des cADN. Enfin, la présente invention concerne les anticorps dirigés contre l'une des protéines mentionnées précédemment, en particulier les anticorps anti-p34 et anti-p44. Comme cela a été mentionné précédemment, et comme cela sera démontré ci-après, ces protéines sont impliquées dans le complexe de réparation de l'ADN, leur absence ou une éventuelle structure incorrecte de ces protéines peut conduire au développement de processus cancéreux, notamment à des mélanomes cutanés mais également à des xérodermes ainsi qu'à des syndromes de Cockayne. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de diagnostic de déficiences dans le processus de réparation de l'ADN chez l'être humain, caractérisé en ce qu'on mesure in vitro dans un prélèvement biologique le taux de p34 et/ou de p44 ou de leurs épitopes correspondants et que l'on détecte notamment un abaissement du taux de p34 ou de p44 ou des épitopes correspondants par rapport au taux normal. Le procédé de diagnostic inclut un dosage de protéine selon des processus au demeurant connus, par exemple par des technologies de type ELISA mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti- p34 ou anti-p44, comme cela sera décrit dans ce qui suit. Un taux anormal de p34 et/ou p44 peut également être un indice d'autres désordres, notamment au niveau de la pigmentation cutanée ou de la sensibilité à certains rayonnements. L'invention concerne également une trousse de diagnostic, notamment pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins: - un anticorps monoclonal ou polyclonal correspondant à une protéine telle que décrite précédemment, et - une protéine telle que décrite précédemment. La présente invention concerne également un procédé de diagnostic de déficience dans le processus de réparation de l'ADN chez l'être humain, caractérisé en ce qu'on détecte l'absence d'une séquence normale d'ADN codant pour p34 et/ou p44 ou bien la présence d'une séquence anormale du même ADN. La mise en évidence d'une séquence d'ADN peut être effectuée par tout processus connu qu'il s'agisse d'un processus utilisant des sondes spécifiques de la séquence normale ou bien d'une séquence spécifique de la présence d'une séquence anormale, ou bien des méthodes utilisant des processus d'amplification, PCR par exemple, mettant en évidence la presence de l'une des deux séquences en utilisant des amorces correspondantes selon des technologies qui sont maintenant bien connues de l'homme du métier. La présente invention concerne également l'utilisation de ces séquences d'ADN, soit seules sous forme d'ADN nu, soit incluses dans un vecteur comportant les éléments assurant l'expression des séquences codantes et susceptible d'exprimer les protéines mentionnées précédemment. Ce vecteur, qui peut être de tout type, plasmidique, autoréplicatif ou intégratif, en particulier de type viral ou non, notamment de type adénovirus, rétrovirus défectif, virus Herpes par exemple, ou des virus synthétiques susceptibles, par injection, d'exprimer les protéines p34 et/ou p44 de structure correcte au sein des cellules, ou bien de se substituer par intégration afin d'apporter l'information protéique correcte. C'est pourquoi ces séquences et vecteurs peuvent être utilisés à titre de médicament. La présente invention concerne également des cellules transformées susceptibles de surexprimer les protéines p34 ou p44 ou leurs variants tels que décrits précédemment, lesquelles cellules peuvent être utilisées pour la production des protéines par culture dans un milieu approprié et récupération de la protéine, et/ou afin d'être réimplantées pour la production desdites protéines in vivo, notamment à titre de médicament. Les protéines en elles-mêmes peuvent être utilisées dans le cadre de thérapie de substitution éventuellement en association avec les autres protéines du complexe BTF2. Bien que les présentes protéines ainsi que leurs séquences d'ADN soient plus particulièrement intéressantes dans la mise en évidence d'états précancéreux ou de risques cancéreux, de même que dans des thérapies possibles anticancéreuses, il faut entendre que ces protéines sont impliquées, de même que les autres protéines du complexe BTF2, dans le processus général de réparation de l'ADN, que leur utilisation peut être bénéfique dans des pathologies très diverses, même dans certains cas associées à des processus dans lesquels les processus vitaux ne sont pas en cause. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après qui sera faite en se référant aux Figures 1 et 2. La Figure 1 schématise la structure en amino-acides de la protéine p34 selon l'invention ainsi que la séquence d'ADN correspondante. La Figure 2 schématise la structure en amino-acides de la protéine p44 selon l'invention ainsi que la séquence d'ADN correspondante. MATERIEIS ET METHODES Isolement et séauencape des clones de cADN Les techniques utilisées pour le microséquençage des polypeptides p34 et p44, le criblage de la banque de cADN provenant de Hela et construite dans des vecteurs kZAP-II (Stratagene) et le séquençage des clones positifs ont été décrits dans Sambrook et al., (1989). Le cADN de 1,2 kb correspondant à p44 a été obtenu par PCR en utilisant les oligonucléotides suivants: 'TGAAACATATGGATGAAGAACCTGTAAAGAACT3' et 'GACCGGATCCIEAAACACCTGAAGGAGCTGGA3'. Les fragments PCR obtenus sont insérés dans le site Ndel- BamHI de pETl la (Novagene). Pour sous-cloner le cadre ouvert de lecture (ORF) de p34 le plasmide pET3d (Novagene) coupé par NcoI-BamHI a été ligué à un adaptateur NcoIBstEII-BamHI. Le fragment de 1038 bp NcoI-BstEII contenant le cadre de lecture ouvert entier de p34 a été cloné dans pET3d modifié mis à digérer avec Ncol-BstEII. Expression des recombinants D44 et D)34 La souche E. coli BL2 i1(DE3) (Novagene) contenant le plasmide pETl la-p44 ou pET3d-p34 est mise en croissance dans un milieu LB additionné d'ampicilline (100 ig/ml) à 37 C. Les cultures sont induites avec l'isopropyl fD-thiogalactopyranoside (0,4 mM) jusqu'à une densité optique à 600 nm de 0,6. Après 2 heures à 37 C les cellules sont récoltées par centrifugation et le culot est remis en suspension dans un milieu 50 mM tris-HCI pH 8; 1 mM EDTA pH 8; 100 mM KCI. Les cellules sont alors congelées, dégelées et lysées par des ultrasons sur la glace. La fraction soluble est séparée de la fraction non soluble par centrifugation. La renaturation des polypeptides recombinants est effectuée comme cela a été décrit (Hager et Burgess, 1980). Production des anticoros Les anticorps monoclonaux contre les protéines recombinantes rp44 (1HS) et rp34 (2B1) sont produits comme cela est décrit (Fischer et al., 1992). Les anticorps contre p44 sont obtenus contre le polypeptide des amino-acides 1 à 17. Pour p34, la protéine entière qui a été surexprimée dans E. coli a été utilisée. Les anticorps dirigés contre la sous- unité p62 sont décrits dans Fischer et al. (1992). Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir du fluide d'ascite par traitement à l'acide caprilique et précipitation par le sulfate d'ammonium. ImmunovréciDitation La fraction héparinique BTF2 a été incubée pendant 2 heures à 4 C avec les anticorps puis 1 heure avec la protéine A-Sepharose F.F. (Pharmacia) dans 50 mM tris-HCI pH 7,9; 10 % glycérol; 0,1 mM EDTA; 150 mM KCI (TGlOEK150); 1 mg/ml de BSA. Les billes sont lavées deux fois avec TGlOEK150 contenant 0,1 % de NP40 et 1 mg/ml de BSA, à nouveau avec TGlOEK150 contenant 0,15 % de NP40, et remises en suspension dans un tampon de chargement SDS/PAGE. Après l'électrophorèse dans le tampon SDS/PAGE et le transfert sur nitrocellulose, les différents polypeptides sont détectés avec les anticorps correspondants. Autres techniques La purification de BTF2 et tous les autres facteurs de transcription nécessaires pour effectuer les tests de transcription ont déjà été décrits (Gérard et al., 1991). Les essais NER in vitro ont été décrits (Weeda et al. 1990). Les mutants 27.1 (ERCC3-) et UV140 (ERCC4-) ont été décrits (Wood et Burki, 1982). EXEMPLE 1 Le facteur de transcription BTF2/TFIIH a été purifié comme cela a été décrit précédemment (Gérard et al., 1991). Une fraction concentrée sur hydroxyapatite a été soumise à une électrophorèse sur gel polyacrylamide SDS (SDS/PAGE) et électrotransférée sur une membrane de PVDF. La protéine de 44 kD (p44) de 34 kD (p34) a été dirigée avec de la trypsine avant d'être résolue par chromatographie en phase inverse. Les séquences d'acides aminés obtenues par digestion tryptique de p34 et p44 ont été utilisées pour synthétiser les oligonucléotides dégénérés destinés au criblage d'une banque de cADN de HeLa dans X-ZAPII. Des clones positifs multiple ont été obtenus et le séquençage révèle que pour chacun d'entre eux un clone contient le cadre de lecture ouverte entier (ORF). Les cADN de p44 et de p34 possèdent un cadre de lecture ouverte de 1185 et 909 paires de base respectivement qui codent pour des protéines de 395 et 303 amino- acides avec des poids moléculaires calculés de 44,451 D et 33,920 D respectivement, ce qui est en bon accord avec les masses moléculaires estimées des protéines purifiées sur gel SDS (43 et 35 kD respectivement; Gérard et al., 1991). D'autre part, lorsqu'on les surexprime dans E coli, les deux polypeptides recombinants (rp44 et rp34) présentent la même mobilité électrophorétique sur SDS/PAGE que les polypeptides p44 et p34 de BTF2 endogène. Dans les deux cas, les peptides microséquencés sont observés avec la séquence d'amino-acides prévue confirmant l'identité des clones (figure 1 et2). EXEMPLE 2 L'exemple ci-après étudie plus particulièrement les propriétés des protéines p34 et 44. La protéine p44 présente une analogie de structure avec la protéine de levure SSL1. SSL1 est une protéine ayant une structure 'zinc- finger' identifiée comme étant le produit d'un gène suppresseur associé avec une initiation de la traduction (Yoon et al., 1992). Au niveau des acides aminés, la p44 et la SSL1 ont une similitude de 58 % et une identité de 40 96. p44 comme SSL1 contiennent des motifs Tyr-X-Cys-X2-Cys-X3-Phe-X8-His-X2- Leu-His (acides aminés 358 à 380) qui sont caractéristiques d'une protéine zinc-finger" similaire à TFIIIA qui a été présentée comme interagissant avec 1'ADN (Jacobs, 1992; Berg, 1993). On remarque également que la p44 comme SSL1 a un motif répété Cys-X2-Cys-X4-Cys/His- X5-Cys-X2-Cys interrompu par Cys-X2-Cys-Xll/X22-Cys-X2-Cys domaine. De façon surprenante le premier type est également présent dans p34. L'alignement des trois séquences dans cette région (figure 1C) met en évidence la conservation des cystéines parmi les trois polypeptides, ce qui suggère que p44 et p34 doivent avoir quelques fonctions communes, par exemple l'interaction avec l'ADN. Des résultats préliminaires ont indiqué que p44 interagit avec l'ADN du promoteur. Il n'a pas été identifié d'autres motifs connus. Il faut remarquer que p34 est riche en leucine et en isoleucine (20 % sur la séquence entière) ce qui lui confère un caractère très hydrophobe. Lors d'une surexpression par E coli, les polypeptides p44 et p34 demeurent sous forme insoluble et peuvent être en partie solubilisés par dénaturation-renaturation avec du chlorhydrate de guanidine. C'est cette petite fraction solubilisée qui a été utilisée dans ce qui va suivre. Les polypeptides recombinants p44 et p34 ne peuvent pas remplacer l'activité totale de BTF2, même lorsqu'ils sont additionnés des deux autres sous-unités de BTF2, a savoir p62 et p89, dans un système de transcription in vitro; bien que cela soit prévisible car la purification montre l'existence d'au moins un polypeptide additionnel dans BTF2. Les protéines p44 et p34 ne présentent aucune activité kinase, ATPase ou hélicase. Des essais complémentaires ont néanmoins démontré qu'à la fois p44 et p34 étaient des sous-unités de BTF2/TFIIH. Tout d'abord, des anticorps monoclonaux anti-p44 (Ab-p44) et anti-p34 (Ab-p34) reconnaissent les polypeptides de 44 kD et de 34 kD qui sont cofractionnés avec l'activité transcriptionnelle de BTF2 et l'activité hélicase par chromatographie HAP. Des essais complémentaires ont démontré que les protéines p44 et p34 sont étroitement associées avec les sous-unités p62 et p89 de BTF2 de même qu'avec toutes les activités enzymatiques présentées par BTF2. Enfin, les anticorps ont été testés pour leur capacité à bloquer l'activité transcriptionnelle de BTF2 dans des essais in vitro. Les essais ont montré que la transcription était réduite en fonction de la concentration des anticorps ajoutés alors que celle-ci n'était pas modifiée lorsqu'on S ajoutait un anticorps contrôle. Des essais comparables ont permis de mettre en évidence l'inhibition in vitro de l'activité NER par des anticorps anti-p44 et anti-p34. Les extraits de cellule HeLa déplétés par des anticorps anti-p34 montrent une claire réduction de leur activité de réparation par comparaison avec les mêmes extraits non déplétés. On a ainsi pu mettre en évidence, de façon non équivoque, que ces deux polypeptides étaient des sous-unités de BTF2. REFERENCES Berg J.M. (1993) Current Opinion in Structural Biology, 3, 11-16 Bunick D., Zandomeni R., Ackermann S. et Weinmann R (1982) Cell, 29, 877- Conaway J.W. et Conaway RC. (1988) J. Biol. Chem., 263, 2962-2968 Conaway RC. et Conaway J.W. (1989) Proc. Natl. Acad.cL Sci. USA, 86, 7356-7360 Conaway J.W. et Conaway RC. (1991) J. Biol. Chem., 266, 17721- 17724 Dahmus M.E et Dynan W.S. in Transcription Regulation, Phosphorylation of RNA (McKnight S.L et Yamamoto K.R, ed. 1992), p. 109 Feaver W.J., Gileadi O. et Kornberg R.D. (1991) Cell, 67, 1223-1230 Fischer L, Gérard M., Chalut C., Lutz Y., Humbert S., Kanno M., Chambon P. et Egly J.M. 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Biol., 4, 488-495 REVENDICATIONS 1) Protéine caractérisée en ce qu'elle comporte tout ou partie de la séquence de la protéine p44 ou de la protéine p34 telle que représentée à la figure 1 pour p34 et à la figure 2 pour p44, les variants de ces protéines présentant au moins un épitope reconnu par un anticorps anti-p44 ou anti- p34 selon la figure 1 ou la figure 2. 2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte l'ensemble de la séquence de la protéine p44 ou de la protéine p34 selon la figure 1 ou 2. 3) Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine p44 ou de la protéine p34. 4) Protéine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 80 % de la séquence de p44 ou p34. 5) Séquence d'ADN codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 6) Séquence d'ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit de la séquence génomique. 7) Séquence d'ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un cADN. 8) Anticorps monoclonal ou polyclonal correspondant à une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 9) Anticorps monoclonal anti-p34 ou anti-p44. ) Procédé de diagnostic de la déficience du processus de réparation de l'ADN chez l'être humain, caractérisé en ce qu'on mesure in vitro dans un prélèvement biologique le taux de p34 et/ou de p44 et que l'on détecte notamment un abaissement du taux de p34 ou p44 par rapport au taux normal. 11) Trousse de diagnostic notamment pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins: - un anticorps selon l'une des revendications 8 et 9, et - une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 12) Procédé de diagnostic de la déficience du processus de réparation de l'ADN chez l'être humain, caractérisé en ce qu'on détecte l'absence d'une séquence normale d'ADN correspondant à p34 et/ou p44. 13 2720748 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on amplifie la séquence d'ADN correspondant à l'ADN codant pour p34 et/ou p44. 14) Vecteur à ADN caractérisé en ce qu'il comporte une séquence codante selon l'une des revendications 5 à 7. ) Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments assurant l'expression des séquences codantes dans une cellule hôte déterminée. 16) Vecteur selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'il est constitué en partie par un virus. 17) Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que le virus est choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus défectif, les virus Herpès. 18) Cellule caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 14 à 17 et exprime une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 19) A titre de médicament, une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. ) A titre de médicament, une séquence d'ADN selon l'une des revendications 6 ou 7 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 à 17. 21) A titre de médicament, une cellule selon la revendication !& 22) Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on cultive une cellule selon la revendication 18 dans un milieu de culture et on récupère la protéine.