Brevet FR2713651A1 — publié le 19950616

NOUVELLE COMPOSITION POUR UN EFFET ANTIVIRAL La présente invention concerne une composition résultant de l'association de variants trans-dominants de deux protéines virales issues du même virus. L'association de ces deux variants permet de conférer une résistance à l'infection ou la propagation du virus en question. La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections à VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine) responsable du SIDA (Syndrome d'Immunodéficience Acquise). Dans le cadre de la recherche et l'élaboration de médicaments inhibiteurs des infections virales, la thérapie génique somatique par immunisation intracellulaire constitue une des approches prometteuses pour l'avenir. Ce concept, défini par Baltimore (1988, Nature, 335, 395-396), consiste à modifier génétiquement des cellules afin de leur faire synthétiser un acide nucléique ou une protéine hétérologue leur conférant une résistance contre l'infection virale. Une des voies possibles pour acquérir cette résistance est de faire synthétiser à la cellule hôte des gènes inhibiteurs d'une étape du cycle viral. Bien que toutes les étapes du cycle viral puissent être ciblées pour mettre en oeuvre une telle thérapie, les gènes intervenant à une étape précoce constituent une cible potentiellement intéressante. Tel est le cas des gènes tat et rev du virus VIH qui jouent un rôle essentiel dans l'initiation de la réplication virale. Le gène tat code pour une protéine TAT trans-activatrice de l'expression de l'ensemble des gènes du VIH (Arya et al., 1985, Science, 229, 69-73). Il semble que TAT intervienne aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, localisée à l'extrémité 5' du génome et des transcrits viraux et désignée séquence TAR (pour Trans-activation Responsive Region) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823). La protéine REV, produit d'expression du gène rev, favorise le transport des ARN messagers (ARNm) de grande taille vers le cytoplasme, pour y être traduits. De son côté, REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive Element) sur les ARNm. Celle-ci est localisée à proximité d'une autre séquence dite CRS (Cis-acting Repression Séquence), impliquée dans la rétention nucléaire des ARNm la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contrebalancer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le cytoplasme. Bien que leurs produits d'expression soient très différents d'un point de vue masse moléculaire, séquence et mécanisme d'action, des gènes régulateurs exerçant une fonction similaire à TAT et/ou REV ont été identifiés dans le génome d'autres virus infectieux, tels que les rétrovirus HTLV I et II (human T-cell leukemia virus) responsables de formes graves de leucémies et les virus de herpès (virus de la varicelle, du zona et d'Epstein Barr). Depuis quelques années, des mutants négatifs et dominants (transZominants) de ces diverses protéines virales ont été décrits dans la littérature. En particulier, plusieurs équipes ont généré des variants trans-dominants des protéines TAT et REV capables de se fixer sur leur séquence cible mais incapables d'exercer la fonction de la protéine native. Si l'on a démontré leur effet inhibiteur vis à vis de l'action de la protéine native, il reste néanmoins à déterminer leur efficacité dans les cellules infectées par le VIH. On a maintenant trouvé que l'expression dans une cellule infectée par le VIH, d'au moins deux gènes codant pour des variants trans-dominants, respectivement des protéines TAT et REV du virus VIH, permet de bloquer la propagation du virus. Les auteurs ont démontré que l'inhibition de l'infection virale résultant de l'expression conjointe des deux gènes est nettement supérieure à celle observée lors de l'expression de l'un quelconque de ces gènes. Cet effet synergique constitue un avantage inattendu. Le but de la présente invention est de mettre à la disposition du public une composition pharmaceutique particulièrement efficace et donc, plus sûre en vue d'un usage humain, qui permette d'inhiber la réplication d'un virus à différents niveaux du cycle viral. C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins: (a) un premier variant trans-dominant d'une protéine virale ; et (b) un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine virale de (a). Dans le cadre de l'invention, un premier et un deuxième variant trans-dominant dérivent, de préférence, de protéines issues des virus HTLV I et II (Human T-Cell Leukemia Virus), HSV-1 (Herpès Simplex Virus) et de manière tout à fait préférée du VIH. On regroupe sous la dénomination "VIH" les différentes souches et isolats viraux du virus agent étiologique de SIDA. Par "mutant trans-dominant", on entend un mutant négatif et dominant c'est à dire un mutant non-fonctionnel (incapable d'exercer la fonction de la protéine native dont il dérive) mais capable d'inhiber de façon compétitive et dominante la fonction de cette dernière. En pratique, un variant trans-dominant peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou d'un fragment fonctionnel de celle-ci. L'homme du métier connaît les techniques qui permettent d'effectuer ces modifications ainsi que les régions qui doivent être modifiées selon les protéines virales considérées. Cependant et selon un mode avantageux, les premier et deuxième variants trans-dominants mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, dérivent de protéines virales intervenant à un stade précoce de l'infection et, notamment, de protéines capables d'interagir de manière spécifique avec une séquence nucléotidique déterminée (dite séquence cible) présente dans le génome et/ou les transcrits du virus dont elle sont issues. Préférentiellement, on met en oeuvre un premier variant trans-dominant dérivé d'une protéine exerçant une fonction trans-activatrice, notamment des protéines VP16 du HSV-1 (Friedman et al., 1988, Nature, 335, 452-454), p40 et p37 codées par la région X du génome des virus HTLV I et II (Wachsman et al., 1987, Science, 235, 67s677) et, de manière tout à fait préférée, TAT du VIH (voir ci-après). A titre de deuxième variant trans-dominant, on emploiera un variant dérivé d'une protéine virale intervenant à une autre étape, de préférence précoce, de la réplication virale, par exemple au niveau du transport des ARNm viraux vers le cytoplasme de la cellule hôte. Une composition préférée selon l'invention résulte de l'association de (a) un premier variant trans-dominant dérivé de la protéine TAT du virus VIH ; et (b) un deuxième variant trans-dominant dérivé de la protéine REV du virus VIH. Le choix d'un variant trans-dominant de la protéine TAT est très large. Il peut s'agir de ceux décrits dans l'art antérieur et notamment dans Green et al. (1989, Cell, 58, 215-233) et Pearson et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5079-5083). Mais il peut s'agir d'autres variants trans-dominants, notamment un variant ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 1, débutant à l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +86, dans laquelle: (1) le résidu phénylalanine en position +38 est remplacé par un résidu acide aspartique; (2) le résidu thréonine en position +40 est remplacé par un résidu alanine (3) le résidu lysine en position +41 est remplacé par un résidu acide glutamique (4) le résidu isoleucine en position +45 est remplacé par un résidu serine et/ou (5) le résidu tyrosine en position +47 est remplacé par un résidu arginine. Bien entendu, un variant trans-dominant TAT peut combiner plusieurs mutations. A titre d'exemples de variants trans-dominants de la protéine REV, on peut citer ceux mentionnés dans Malim et al. (1989, Cell, 58, 205-214) et Venkatesh et Chinnadurai (1990, Virology, 178, 327-330). Mais, il peut être avantageux de mettre en oeuvre d'autres variants trans-dominants, comme un variant ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2, débutant à à l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +116, dans laquelle le résidu glutamine (Gln) en position +74 est remplacé par un résidu glycine (Gly) et le résidu leucine (Leu) en position +75 est remplacé par un résidu sérine (Ser) ci après désigné REV (Gln74, Leu75 - > Gly, Ser). D'autre part, l'emploi de variants modifiés au niveau de trois acides aminés et plus, en particulier au niveau des résidus Leu en position 75, 78 et 81 peut s'avérer avantageux. Il faut également citer le variant trans-dominant de la protéine REV ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 débutant à l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +116 dans laquelle le résidu glutamine en position +74 est remplacé par un résidu glycine, le résidu leucine en position +75 est remplacé par un résidu sérine, le résidu leu en position +78 est remplacé par un résidu phenylalanine, le résidu acide glutamique en position +79 est remplacé par un résidu phenylalanine, et le résidu leucine en position +81 est remplacé par un résidu arginine. La présente invention concerne également une composition selon l'invention, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement ou la prévention des infections dues au virus dont sont issues les protéines virales en cause. L'usage d'une telle composition est plus particulièrement destinée à la thérapie anti-SIDA. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un premier et un deuxième variant trans-dominant peuvent être produits par voie recombinante dans une composition selon l'invention, à partir de vecteurs d'expression appropriés. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux dérivés des rétrovirus, adénovirus ou virus associé à l'adénovirus, dans lesquels on insère au moins une séquence d'ADN codant pour un variant trans-dominant en usage dans la présente invention. Le génome de ces vecteurs viraux est, de préférence, défectif pour la réplication. On indique que, dans le cadre de la présente invention, les vecteurs rétroviraux et notamment ceux dérivés du MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) sont particulièrement préférés. De tels vecteurs ainsi que leur techniques de préparation sont connus de l'homme de l'art. Les séquences d'ADN codant pour un variant trans-dominant d'une protéine virale, peuvent être obtenues selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Une des stratégies possibles consiste, tout d'abord, à isoler la séquence codant pour ladite protéine virale du génome viral, ceci par clonage ou PCR (Polymerase Chain Reaction), puis de la modifier par mutagénèse dirigée, pour générer un variant trans-dominant désiré. Alternativement, on peut produire la séquence d'ADN d'intérêt par synthèse chimique. Evidemment, les séquences d'ADN codant respectivement pour un premier et deuxième variant trans-dominant en usage dans la présente invention, peuvent être insérées dans un même vecteur recombinant ou dans deux vecteurs différents. De plus, ceux-ci peuvent comporter un gène de sélection facilitant l'isolement des clones transfectés par lesdits vecteurs. La présente invention concerne égaiement un vecteur recombinant capable de transférer et exprimer: (a) une première séquence d'ADN codant pour un premier variant trans-dominant d'une protéine virale ; et (b) une deuxième séquence d'ADN codant pour un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine de (a). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite première séquence d'ADN code pour un variant trans-dominant de la protéine TAT du virus VIH, et la deuxième séquence d'ADN codant pour un variant trans-dominant de la protéine REV du virus VIH. Bien entendu, les première et deuxième séquences d'ADN sont placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression. Ces éléments comprennent notamment les éléments de régulation de la transcription d'une séquence d'ADN en ARNm ainsi que les signaux d'initiation et de terminaison de la traduction de 1'ARNm en protéine. Parmi ces éléments, la région promotrice revêt une importance particulière. D'une façon générale, on emploie une région promotrice fonctionnelle dans les cellules eucaryotes que l'on veut traiter et de préférence dans les cellules humaines. Une région promotrice peut être issue de gènes eucaryotes ou viraux, être constitutive ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiques et, en particulier, lymphocyte-spécifiques. A titre d'exemples, on peut envisager d'employer les régions promotrices du virus SV40 (Simian Virus 40), du gène PGK (Phosphoglycérate Kinase), du gène HMG (Hydroxy Methyl-Glutaryl coenzyme A), du gène TK (Thymidine Kinase) du HSV-1, les LTRs (Long Terminal Repeat) du RSV (Rous Sarcoma Virus), du MoMuLV et les promoteurs des gènes ElA, E3 et MLP (Major Late Promoter) de l'adénovirus. On indique que ces exemples ne sont pas limitatifs. La présente invention s'étend aux cellules eucaryotes dans le génome desquelles sont insérées une première et une deuxième séquence mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. Le ou les vecteurs portant lesdites séquences peuvent être introduits soit in vitro dans une cellule prélevée du patient, soit directement in vi vo. De préférence, ladite cellule est une cellule humaine et, de manière tout à fait préférée, une cellule souche de la lignée hématopoïétique ou un lymphocyte. L'invention s'adresse également à l'usage d'une composition, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des infections virales par thérapie génique et notamment des infections dues au VIH. L'invention vise également un composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une composition, un vecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une telle composition pharmaceutique selon l'invention, peut être préparée selon les techniques communément en usage et administrée selon toute voie d'administration connue. Par exemple, on associe l'agent thérapeutique ou prophylactique, en quantité thérapeutiquement efficace, à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. La quantité à administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier de la voie d'administration, de la pathologie concernée, des première et deuxième séquences d'ADN à exprimer ou encore du patient et de la durée de traitement désirée. Par ailleurs, l'invention a trait à un kit renfermant: (a) un premier variant trans-dominant d'une protéine virale, et (b) un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine virale de (a) avec des instructions pour leur administration concomitante ou séquentielle. Enfin, l'invention concerne une méthode de traitement des infections virales et tout particulièrement dues au VIH, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. A titre indicatif, les étapes essentielles pour un traitement anti-viral par thérapie génique, sont les suivantes: - on effectue un prélèvement de moelle osseuse ou sanguin d'un patient ayant besoin d'un tel traitement - on cultive les cellules prélevées (cellules souches ou lymphocytes) selon les techniques de l'art - on transfecte un vecteur selon l'invention, dans lequel sont insérées les séquences codant pour un premier et un deuxième variant trans dominant. Cependant, il est également possible de co-transfecter, ou alternativement transfecter de manière séparée et étalée dans le temps, chacun des vecteurs permettant l'expression de l'un ou l'autre des variants trans-dominants. On effectue éventuellement une étape supplémentaire de culture en milieu sélectif; et - on réinjecte les cellules ainsi modifiées dans le patient. Naturellement, les modalités de ce protocole thérapeutique peuvent être sujettes à de nombreuses variantes déterminées par les cliniciens. L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes. La Figure 1 schématise le vecteur pTG2350 permettant l'expression d'un variant trans-dominant de la protéine TAT du VIH. La Figure 2 illustre le vecteur pTG2428 permettant l'expression d'un variant trans-dominant de la protéine REV du VIH. La Figure 3 montre les effets de l'expression conjointe des variants transdominants TAT et REV (+) sur l'évolution de l'infection dans des cellules infectées par le VIH comparée à l'expression d'un variant trans-dominant TAT (|) ou celle d'un variant trans-dominant REV (o). La Figure 4 schématise le vecteur rétroviral pTG4367 comprenant les séquences codant pour les variants trans-dominants TAT et REV. EXEMPLES Les constructions décrites ci-après sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire détaillées dans Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). L'ensemble des étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens est effectué par passage dans la souche Eçcherichia coli (E. coli) 1106, alors que celles mettant en oeuvre des vecteurs dérivés du phage M13 sont réalisées dans E. coli NM522. En ce qui concerne les mutagénèses dirigées par oligodésoxynucléotides synthétiques, on applique le protocole décrit par Zoller et Smith (1982, Nucleic Acids Res., 10, 6487-6500) ou on met en oeuvre un kit d'origine commerciale selon les recommandations du fabricant. D'autre part, la séquence d'un variant trans-dominant TAT ou REV est alignée sur celle de la protéine TAT ou REV du virus VIH-1, isolat Lai, telle que divulguée par Wain-Hobson et al. (1985, Cell, 40, 9-17). En pratique, la numérotation des acides aminés dans la séquence d'un variant trans-dominant sera calquée sur celle établie pour la protéine native, séquence telle que montrée dans les identificateurs de séquence NO: 1 pour la protéine TAT et NO: 2 pour la protéine REV. Par ailleurs, les lignées cellulaires sont cultivées selon les recommandations du fournisseur. D'une manière générale, les cellules sont transfectées selon la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al., Molecular cloning : a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory), sauf les cellules CEM-A3 pour lesquelles on utilise l'électroporation. Cependant, d'autres protocoles permettant d'introduire un acide nucléique dans une cellule peuvent également être employés. Avant toute transfection, I'ADN est purifié sur gradient de chlorure de césium. EXEMPLE 1 : Etablissement d'une lignée cellulaire co-exprimant les variants trans-dominants TAT et REV. A. Construction du vecteur rétroviral pTG2350 pour l'expression du variant trans-dominant TAT (Ph e38 - > Asp) et caractérisation de son phénotype trans-dominant. Un fragment d'ADN comportant l'ADN-copie (ADNc) correspondant aux 2 exons du gène tat du génome VlH-isolat Lai (Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9-17 ; Sodroski et al., 1985, Science, 229, 74-77) est modifié afin de créer un site BamHI en 5' de l'ATG initiateur. En outre, un site BamHI existe naturellement en 3' du codon stop. Le fragment BamHI de 300pb comportant l'ADNc tat non muté est inséré dans le vecteur M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99). On obtient le vecteur M13TG2306. On génère un variant trans-dominant TAT en remplaçant le résidu phénylalanine (Phe) en position 38 de la protéine TAT native par un acide aspartique (Asp). M13TG2306 est soumis à une mutagénèse dirigée en utilisant un kit commercial (Amersham, RPN 1523) et en mettant en oeuvre l'oligonucléotide décrit dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 3, donnant M13TGTAT.TD. Le fragment BamHI isolé du vecteur précédent, est alors transféré dans le vecteur eucaryote pSGS (Green et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16, 369). On obtient pTG2332, dans lequel l'expression du variant TAT (Phe38 - > Asp) est sous le contrôle du promoteur SV40. On évalue la capacité du variant TAT (Phe38- > Asp) à trans-activer l'expression du gène CAT (Chloramphenicol Acetyl Transferase) placé sous le contrôle du LTR du VIH incluant la séquence TAR (LTR-CAT ; Emerman et al., 1987, EMBO J., 6, 37-55). L'activité trans-activatrice est déterminée par transfection transitoire en cellules HeLa (ATCC CCL2) (4x105 cellules par boîte) de l;g du vecteur d'expression pTG2332 avec 0,5ru du vecteur rapporteur LTR-CAT. On transfecte dans les mêmes conditions l > g de pHMG Tat et 0,5g de LTR-CAT, qui constitue le témoin positif de trans-activation (100%). pHMG-Tat est le vecteur d'expression de la protéine TAT native et résulte du clonage du fragment BamHI de M13TG2306 dans le site BamHI du vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184). 48h après les transfections, on mesure le niveau d'expression du gène CAT sur un aliquote d'extrait cellulaire correspondant à 10 à 20 pg en protéines selon la technique décrite dans (Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051). La concentration en protéines est déterminée à l'aide d'un kit commercial en suivant le protocole indiqué par le fournisseur. Le pourcentage d'activité transactivatrice du variant est calculé par rapport au taux mesuré avec le témoin positif (pHMG-Tat + LTR-CAT), celui-ci représentant 100% d'activité transactivatrice. Puis, la capacité du variant TAT (Phe38 - > Asp) à inhiber la fonction transactivatrice de la protéine TAT native, est déterminée par tranfection transitoire en cellules HeLa du vecteur d'expression pTG2332 (10zig) avec le vecteur rapporteur LTR-CAT (0,5g) et le vecteur pHMG-Tat (1cl). Comme précédemment, on mesure l'expression du gène rapporteur CAT sur un aliquote d'extrait correspondant à 10 à 20pg en protéines. Le pourcentage d'inhibition de la protéine TAT native par le variant TAT (Phe38- > Asp) est calculé par rapport au témoin résultant de la co-transfection de pHMG-Tat et de LTR-CAT qui représente 0% d'activité inhibitrice. Le variant TAT (Phe38 - > Asp) est un mutant trans-dominant efficace puisque son activité trans-activatrice est réduite (expression du gène CAT inférieure à 10% par rapport à celle mesurée avec la protéine TAT native) et puisqu'il inhibe fortement l'activité de la protéine TAT native (au moins 90% d'inhibition). Le fragment BamHI de 300pb isolé de M13TGTAT.TD, est inséré dans le site BamHI du vecteur rétroviral pLXSP, générant pTG2350 (Figure 1). Le vecteur pLXSP dérive du pLXSN (Miller et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène néomycine par un gène conférant une résistance à la puromycine et du LTR3' MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR3' MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus). B. Construction des vecteurs rétroviraux pTG2428 et pTG2430 pour l 'expression du variant trans-dominant REV (yin74, Leu75 - > Gly, Ser) et caractérisation de son phénotype trans-dominant. Un fragment Sail de 830 pb comprenant 1'ADN-copie correspondant aux deux exons codants du gène rev du VIH1-isolat Lai est inséré dans le vecteur M13TG130, générant le vecteur M13TG2309. Celuici est modifié par mutagénèse dirigée (kit Amersham) afin d'introduire deux sites BglII encadrant la séquence codant pour REV, le premier en amont de l'ATG initiateur et le second en aval du codon stop. La présence de ces sites BgiII permet de faciliter les étapes de clonage ultérieures. Mais, tout autre site de restriction adéquate aurait pu être choisi. Le vecteur ainsi obtenu est soumis à une mutagénèse dirigée en mettant en oeuvre ltoligonucléotide OTG4672 reporté dans l'identificateur de séquence NO: 4, dans le but de substituer les résidus Gln et Leu en position 74 et 75 de la protéine REV native par les résidus Gly et Ser. Le vecteur en résultant est digéré par Bgnl et le fragment de 390 pb est inséré dans le vecteur d'expression eucaryotique pSG5 pour donner le plasmide pTG REV.TD, sur lequel on évalue le phénotype trans-dominant du mutant REV (Gln74, Leu75 - > Gly, Ser). Son activité sur le transport des ARNm est déterminée par transfection transitoire dans la lignée cellulaire HeLa, de pTG REV.TD (lg) et du vecteur rapporteur pTG1335 (0,5 Sg). Ce dernier comprend le gène CAT placé sous le contrôle du promoteur SV40 et les éléments RRE/CRS du génome VIHI insérés en aval du gène CAT. Ainsi, en l'absence d'une protéine REV fonctionnelle, l'élément CRS va maintenir les ARNm dans le noyau et on ne détecte pas de produit d'expression du gène CAT. Par contre, en présence d'une protéine REV fonctionnelle, celle-ci va se fixer sur sa séquence cible RRE et induire le transport des ARNm vers le cytoplasme et leur traduction. On détermine l'expression du gène CAT sur un aliquote d'extrait cellulaire dans les mêmes conditions que précédemment. Le pourcentage d'activité du mutant REV (Gln74 Leu75 - > Gly, Ser) est calculé par rapport au taux mesuré avec un témoin positif résultant de la co-transfection du vecteur pHMG-Rev permettant l'expression de la protéine REV native et du vecteur rapporteur pTG1335, représentant 100% d'activité REV. Parallèlement, on évalue sa capacité à inhiber la fonction de la protéine REV native, par transfection transitoire du vecteur d'expression pTG REV.TD (10au) et du vecteur rapporteur pTG1335 (0,5pu) en présence de l,ug du vecteur pHMG-Rev. Le taux d'expression du gène CAT est mesuré par rapport au témoin résultant de la co-transfection de pHMG-Rev et de pTG1335 et qui représente 0% d'inhibition. Le variant REV (Gln74, Leu75 - > Gly, Ser) s'avère être un variant transdominant efficace qui n'a pratiquement plus d'activité dans le transport des ARNm vers le cytoplasme mais qui est capable d'inhiber de façon dominante la fonction REV native. Le fragment BglII de 390 pb portant la séquence codante pour le mutant transdominant REV est sous cloné dans le site BamHI de pTG5 192. Ce dernier dérive de pLXSN, dans lequel le LTR3' issu du MSV est remplacé par le LTR3' du MPSV. On génère le vecteur rétroviral pTG2428 (Figure 2) portant également le marqueur de sélection néomycine qui confère la résistance au G418. D'autre part, ce même fragment BgllI est également inséré dans le vecteur rétroviral pLXSP, pour donner pTG2430 porteur du gène de résistance à la puromycine. C. Etablissement d'une lignée cellulaire CEM-A3 exprimant les mutants trans-dominants TAT (Phe38 - > Asp) et REV (Gln74, Leu75 - > Gty, Ser). On établit une lignée cellulaire stable co-produisant les deux variants transdominants à partir des cellules naturellement infectables par le VIH, par exemple la lignée lymphocytaire humaine CEM-A3 dérivée des CCRF-CEM (ATCC CCL119) et qui exprime fortement le marqueur de surface CD4, récepteur du VIH. On électropore 20,ug d'ADN plasmidique pTG2350 dans 2x107 cellules CEM A3 (Gene pulser Biorad, voltage 210V, capacitance 960pu). Puis les cellules sont remises en culture dans du milieu RPMI (Gibco-BRL) à 37"C en présence de 5% de C02. Deux jours plus tard, on place les cellules en milieu sélectif (puromycine 0,5 g/ml) et on isole les clones résistants (cellules CEM-A3 2350). On peut détecter l'expression du variant trans-dominant dans les différents clones par transfection transitoire A titre de comparaison, on établit également une lignée CEM-A3 productrice du variant trans-dominant REV par transfection du vecteur pTG2430. Les cellules résistantes à la puromycine sont désignées CEM-A3 2430. EXEMPLE 2 : Evaluation de la résistance des cellules CEM-A3 2350+2428 à une infection par le VIII. On centrifuge à basse vitesse, environ 106 cellules CEM-A3 2350+2428. Après lavage, le culot cellulaire est repris dans 200 iLl de milieu RPMI en absence de sérum. Les cellules sont infectées par une préparation de VIH à une TCID50 comprise entre 1 et 1000, et de préférence 50 à 100. La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al. (1938, Am. J. Hyg. 27, 493997), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme par exemple les cellules CEM A3, et correspond à la dose à laquelle 50% des cellules sont infectées et 50% ne le sont pas. Elle est vérifiée pour chaque lot de VIH employé. L'infection est poursuivie I h à 37 C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du RPMI et mises en culture dans 5 ml de ce même milieu, complémenté avec 10% de SVF (sérum de veau foetal). Cette étape constitue le T=0 de l'expérimentation. Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité reverse-transcriptase à intervalles réguliers dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet i, 188-189). On observe que l'activité reverse-transcriptase des surnageants CEM-A3 2350+2428 se situe à un niveau très bas pendant au moins 35 jours de culture. On indique que dans les cellules normales infectées par le VIH, on détecte normalement une activité reverse-transcriptase au bout de 5 à 6 jours, du fait du relargage de nouvelles particules virales dans le milieu, qui va en augmentant rapidement au cours du temps jusqu'à la mort cellulaire. A titre comparatif, on effectue l'expérimentation sur des aliquotes de culture cellulaire CEM-A3 2350 et CEM-A3 2430 dans des conditions strictement identiques. Dans ce cas on observe un retard dans la propagation du virus se traduisant par une activité reverse-transcriptase réduite pendant les 20 premiers jours de culture, mais suivie d'une augmentation lorsque la culture est poursuivie. EXEMPLE 3 : Etablissement de lignées amphotropiques produisant des particules infectieuses de vecteur rétroviral exprimant des variants transdominants TAT et REV. Le vecteur M13TG2309 est soumis à une mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide OTG5254 reporté dans l'identificateur de séquence NO: 5, qui permet de modifier la séquence d'ADN codant pour la protéine REV native en 5 endroits pour créer un variant trans-dominant REV (remplacement des codons codant pour les résidus Gln74 en Gly, Leu75 en Ser, Leu78 en Glu, Glu79 en Phe et Leu81 en Arg). Le vecteur rétroviral pLXSP est digéré par EcoRI-HpaI. On isole un fragment EcoRI-PstI portant le promoteur PGK murin décrit dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74), le site PstI étant rendu franc par traitement à la T4 polymérase. Le vecteur ainsi obtenu est délété du fragment ClaI-BamHI traité au fragment Klenow de l'ADN polymérase et comportant le promoteur SV40 et le gène de résistance à la puromycine. Il est religué sur lui-même afin de générer pTG2673. On introduit le fragment BamHI isolé de M13TGTAT.TD dans le vecteur pTG2673 préalablement digéré par BamHI. Puis, le vecteur obtenu est digéré par EcoRI et traité par le grand fragment Klenow de l'ADN polymérase. En parallèle, M13TG4303 est digéré par BglII, traité par la Klenow puis digéré par PvuII. On isole le fragment porteur de la séquence codant pour le variant transdominant REV 5 fois muté, que l'on insère dans pTG2673 ainsi traité. On obtient pTG4367 (Figure 4) dans lequel la séquence d'ADN codant pour TAT (Phe38 - > Asp) est placée sous le contrôle du promoteur PGK et celle codant pour REV trans-dominant sous le contrôle du LTR 5' du vecteur rétroviral. On établit une lignée amphotropique à partir d'une lignée cellulaire, dite d'encapsidation, dans laquelle est inséré un gène env d'un rétrovirus amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 2895-2902), ou Gp. Env. Am. 12 (Markowitz et al., 1988, Virology 167, 400-406). On transfecte le vecteur pTG4367 et un vecteur de sélection quelconque, comme par exemple un vecteur comportant le gène de résistance à la puromycine sous le contrôle du promoteur SV40. Le jour suivant la transfection, les cellules sont placées en milieu sélectif (puromycine 0,5,ug/ml). On isole les cellules résistantes, productrices de particules virales amphotropes capables d'infecter les cellules humaines. On peut constituer un stock viral qui pourrait être utilisé en thérapie génique pour l'infection des cellules souches hématopoïétiques ou des lymphocytes d'un patient. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: Transgene S.A. (B) RUE: 11 rue de Molsheim (C) VILLE: Strasbourg (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 67082 (G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (ii) TITRE DE L INVENTION: Nouvelles compositions pour un effet antiviral (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 11.0, Version 11.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 86 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Human immunodeficiency virus type 1 (B) SOUCHE: Lai (C) INDIVIDUEL ISOLE: sequence de la proteine TAT de HIV-1 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Protein (B) EMPLACEMENT: 1..86 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gln Val Cys Phe Thr Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gin Thr 50 55 60 His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 85 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 116 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Human immunodeficiency virus type 1 (B) SOUCHE: Lai (C) INDIVIDUEL ISOLE: sequence de la proteine REV du virus HIV-1 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Protein (B) EMPLACEMENT: 1..116 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Lys Ala Val 1 5 10 15 Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Asn Pro Glu 20 25 30 Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg 35 40 45 Gln Arg Gln Ile His Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Tyr Leu 50 55 60 Gly Arg Ser Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Asp Cys Asn Glu Asp Cys Gly Thr Ser Gly Thr Gln Gly 85 90 95 Val Gly Ser Pro Gln Ile Leu Val Glu Ser Pro Thr Val Leu Glu Ser 100 105 110 Gly Thr Lys Glu 115 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de mutagenese (38Phe en Asp) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TAAAGCTTTT GTTGTGTCAC AAACTT 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de mutagenese (Gln, Leu en Gly, Ser) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TCTCTCAAGC GGTGGGGATC CAAGAGGCAC AGG 33 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 41 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de mutagenese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: ATCAAGAGTA TCTCTGAATT CCGGTGGGGA TCCAAGAGGC A 41 Revendications 1. Une composition comprenant au moins (a) un premier variant trans-dominant d'une protéine virale ; et (b) un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine virale de (a). 2. Une composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les protéines virales de (a) et (b) sont issues d'un virus sélectionné parmi les virus VIH, HTLV I, HTLV II et HSV. 3. Une composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un premier variant trans-dominant de la protéine TAT du virus VIH; ; et (b) un deuxième variant trans-dominant de la protéine REV du virus VIH. 4. Une composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le variant trans-dominant de la protéine TAT a la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 1 débutant à l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +86 dans laquelle (1) le résidu phénylalanine en position +38 est remplacé par un résidu acide aspartique (2) le résidu thréonine en position +40 est remplacé par un résidu alanine; (3) le résidu lysine en position +41 est remplacé par un résidu acide glutamique (4) le résidu isoleucine en position +45 est remplacé par un résidu serine; et/ou (5) le résidu tyrosine en position +47 est remplacé par un résidu arginine. 5. Une composition selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le variant trans-dominant de la protéine REV a la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 débutant à l'acide aminé + 1 et se terminant à l'acide aminé +116 dans laquelle le résidu glutamine en position +74 est remplacé par un résidu glycine et le résidu leucine en position +75 est remplacé par un résidu sérine. 6. Une composition selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le variant trans-dominant de la protéine REV a la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 débutant à l'acide aminé + 1 et se terminant à l'acide aminé + 116 dans laquelle le résidu glutamine en position +74 est remplacé par un résidu glycine, le résidu leucine en position +75 est remplacé par un résidu sérine, le résidu leu en position +78 est remplacé par un résidu phenylalanine, le résidu acide glutamique en position +79 est remplacé par un résidu phenylalanine, et le résidu leucine en position +81 est remplacé par un résidu arginine. 7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée au traitement ou à la prévention des infections virales. 8. Une composition selon l'une des revendications 3 à 6, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée au traitement ou à la prévention des infections dues au VIH. 9. Un vecteur recombinant comprenant (a) une première séquence d'ADN codant pour un premier variant trans-dominant d'une protéine virale, ladite première séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; et (b) une deuxième séquence d'ADN codant pour un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine virale de (a), ladite deuxième séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. 10. Un vecteur recombinant selon la revendication 9, comprenant (a) une première séquence d'ADN codant pour un variant trans dominant de la protéine TAT du virus VIH, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; et (b) une deuxième séquence d'ADN codant pour un variant trans dominant de la protéine REV du virus VIH, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. 11. Un vecteur recombinant selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il dérive d'un virus sélectionné parmi les rétrovirus, adénovirus et virus associé à l'adénovirus. 12. Une cellule eucaryote dans le génome de laquelle sont insérées (a) une première séquence d'ADN codant pour un variant trans dominant de la protéine TAT du virus VIH, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; et (b) une deuxième séquence d'ADN codant pour un variant trans dominant de la protéine REV du virus VIH, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. 13. Usage d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 9 à 11 ou d'une cellule selon la revendication 12 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des infections virales et notamment des infections dues au VIH. 14. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6 qui comprend en outre un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique. 15. Une composition pharmaceutique comprenant un vecteur recombinant selon l'une des revendications 9 à 11 ou une cellule selon la revendication 12 en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique. 16. Un kit comprenant (a) un premier variant trans-dominant d'une protéine virale, et (b) un deuxième variant trans-dominant d'une autre protéine virale issue du même virus que la protéine virale de (a) avec des instructions pour leur administration concomitante ou séquentielle.