Brevet FR2721175A1 — publié le 19951222

La présente invention concerne un nouvel agent nématophage destiné à lutter contre les nématodes du genre Meloidogyne, et un procédé de lutte contre la prolifération de ces nématodes en mettant en oeuvre des nouvelles souches du champignon Arthrobotrys conoides Drechsler. Il est connu depuis longtemps que les nématodes phytophages occasionnent des pertes considérables aux cultures, estimées à 3 milliards de francs chaque année. Les espèces les plus répandues et causant les dégâts les plus importants dans le monde appartiennent au genre Meloidogyne. Ce genre plus connu chez les agriculteurs sous le nom de "nématodes à galles" induit en effet la formation de galles sur le système racinaire des plantes attaquées. Ces nématodes extrêmement polyphages, attaquent pratiquement toutes les cultures et sont de ce fait responsables de baisses de rendements catastrophiques de l'ordre de 50 à 70%. Dans de nombreuses régions, Heterodera carotae est un dangereux ravageur spécifique des cultures de carottes pour lesquelles ses piqûres déclenchent une production anormale de radicelles latérales et qui rend les carottes non commercialisables. Un autre nématode, Ditylenchus myceliophagus, peut causer des dégâts importants sur les cultures de l'agaric dans les champignonnières. Pour lutter contre ces ravageurs, les agriculteurs disposent de plusieurs moyens qui, en culture intensive, se résument à faire appel: - soit à une désinfection préventive du sol avant la mise en culture à l'aide de fumigants (Bromure de Méthyle, Chloropicrine, Dichloropropène.. .). Ces produits, à spectre d'action très large, stérilisent le sol et détruisent ainsi l'équilibre écologique du milieu. De plus en sol léger, leurs résidus peuvent passer dans la nappe phréatique, et en sol lourd leur efficacité est réduite par leur mauvaise diffusion - soit à des traitements curatifs sur certaines cultures en place au moyen de produits systémiques, véhiculés par la sève (carbamates ou organophosphorés), ceci pour des productions non consommées telles les cultures florales ou les pépinières. Ces produits sont dangereux aussi bien pour les animaux que pour l'homme, car ils passent dans la plante en y laissant des résidus toxiques. Ces deux techniques n'agissent que sur les trente premiers centimètres de sol. Les nématodes qui peuvent se trouver à une plus grande profondeur vont de nouveau envahir la zone traitée au cours de la culture suivante. Ceci implique une répétition continuelle des désinfections. En outre, du fait de leur toxicité pour l'homme, plusieurs nématicides chimiques tendent à être interdits dans de nombreux pays, comme c'est le cas aux Pays-Bas, en Suisse, en Allemagne. C'est pourquoi, le but de l'invention est d'utiliser un agent naturel pour lutter contre les nématodes, qui ne soit pas dangereux pour l'homme et son environnement. L'objet principal de l'invention est donc un nouvel agent nématophage destiné à lutter contre les nématodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus, choisi parmi six souches du champignon Arthrobotrys conoides Drechsler. Un autre objet de l'invention est un procédé de lutte contre les nématodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus consistant à incorporer le champignon Arthrobotrys conoides Drechsler dans le sol o sont effectuées les cultures au moyen de graines ensemencées au préalable par l'inoculum du champignon. Les buts, objets et caractéristiques de la présente invention font l'objet de la description suivante pour laquelle les dessins joints illustrent certains aspects de l'invention. La figure 1 représente schématiquement un conidiophore et ses conidies des souches d'Arthrobotrys conoides selon l'invention. La figure 2 est une représentation schématique des pièges formés par les souches d'Arthrobotrys conoides selon l'invention pour capturer les nématodes. La figure 3 représente une table donnant le résultat obtenu avec un gel d'électrophorèse utilisé pour différencier les différentes souches d'Arthrobotrys conoides. Les six souches d'Arthrobotrys conoides Drechsler qui font l'objet de l'invention proviennent d'endroits différents. Le critère principal pour vérifier que les différentes souches appartiennent à la même espèce est la mesure des conidies (organes de reproduction de ces champignons). Comme illustré sur la figure 1, les conidies sont groupées par 20 ou 30 sur le conidophore. Les conidiophores peuvent continuer à se développer au delà d'une première tête de conidies et après une certaine longueur de croissance former un second groupe de conidies et ainsi de suite jusqu'au développement de 5 à 6 groupes additionnels. La souche 42A est originaire de Fada N'Gourma au Burkina Faso, elle est constituée par un mycélium composé d'hyphes cloisonnés hyalins. Les conidiophores se terminent par une tête d'environ conidies serrées; sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et peuvent produire successivement 5 à 10 groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 27 pm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur, o elle a été enregistrée sous le n' 1-1425. La souche 42A' est originaire de Leguéma au Burkina Faso. Les conidiophores se terminent par une tête formée de 3 à 20 conidies serrées; sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et peuvent produire successivement 3 à 5 groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 30 nm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), o elle a été enregistrée sous le ne 1-1426. La souche 42B provient de la mycothèque de Baarn aux Pays-Bas. Sur les cultures jeunes (moins d'un mois), les conidiophores sont rares et se terminent par une tête formée de 3 à 20 conidies serrées; la formation de groupements additionnels de conidies est rare. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 28 pm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), o elle a été enregistrée sous le ne 1-1427. La souche 42Br provient du Brésil. Les conidiophores se terminent par une tête formée de à 20 conidies serrées. Ils continuent à se développer et produisent successivement 5 à 10 groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 23 pnm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), o elle a été enregistrée sous le n* 1-1428. La souche 42T a été récoltée à Tours Indre-et-Loire (France). Les conidiophores se terminent par une tête formée de à 20 conidies serrées. Sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et produisent successivement 3 à groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 28 pmn. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), o elle a été enregistrée sous le ne 1-1429. La souche 42Vl a été prélevée à Villeneuve Loubet Alpes-Maritimes (France). Les conidiophores se terminent par une tête formée de 10 à 20 conidies serrées. Sur les cultures âgées, ils continuent à se développer et produisent successivement 20 à 30 groupes additionnels de conidies. Les conidies s'atténuent d'une manière prononcée vers leur base, elles ont une forme presque conique et sont constituées de deux cellules de tailles différentes, la longueur totale de la conidie est en moyenne de 23 pm. Cette souche a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM (Institut Pasteur), o elle a été enregistrée sous le n' 1-1430. Le mycélium des champignons nématophages a la capacité de produire des organes de capture qui piègent les nématodes. Les pièges du mycélium des six souches d'Arthrobotrys conoides selon l'invention sont en forme d'anses hyphales qui deviennent par anastomose des réseaux plus ou moins compliqués comme illustré sur la figure 2. Des six souches étudiées, seule la souche 42A forme spontanément des pièges. Les 5 autres forment des pièges induits par la présence des nématodes dans le milieu de culture. Qu'ils soient spontanés ou induits, les pièges sont constitués par des anses hyphales qui deviennent par anastomose des réseaux plus ou moins compliqués. L'étude du génome des six souches par la technique des RAPD permet de différencier sans ambiguité les six souches grâce à un oligonucléotide. L'emploi d'un gel d'électrophorèse a permis de révéler les résultats de la figure 3 o les bandes ont été schématisées, et o le témoin sert à déterminer la taille des fragments d'ADN. Les différentes souches d'Arthrobotrys conoides peuvent être utilisées de façon industrielle pour lutter contre les nématodes en utilisant les procédés décrits ci- après. L'utilisation d'un milieu de culture à base de grains permet une bonne conservation du champignon. Ce dernier se réfugie à l'intérieur de la graine et devient donc moins sensible aux agressions du milieu extérieur. De plus, chaque grain épandu sur le sol est le point de départ d'une nouvelle colonie mycénienne. Les graines sont mises à tremper 24 heures dans l'eau en excès avant d'être stérilisées. Puis les graines sont ensemencées avec l'inoculum de champignon. Les meilleures espèces à utiliser comme support sont celles qui permettent d'atteindre le maximum de croissance en un minimum de temps. Un deuxième critère est le nombre de propagules par gramme de milieu support atteint au moment du maximum de croissance, la propagule correspondant à un fragment minimum de mycélium ou même à une seule conidle. Les espèces qui peuvent être utilisées sont parmi les graminées, les légumineuses, ou les oléagineux. Ainsi, on peut utiliser le chanvre, le tournesol et le riz pour lesquels le temps pour atteindre le maximum de croissance est de 14 jours. On peut encore utiliser l'avoine, le sorgho, l'orge, le blé, la lentille, le maïs, l'alpiste, le soja, le haricot, le lupin, le pois chiche, la fèverole. Parmi les espèces ci-dessus, celles qui permettent d'obtenir un nombre de propagules maximum, soit environ 3.107/g, sont le lupin, la lentille, le maïs, le haricot, l'alpiste, le pois chiche et le riz. Pour une meilleure répartition du champignon, il est préférable d'épandre, à poids égal, des petites graines. Pour cette raison et d'autres, les graines à utiliser de préférence sont celles d'alpiste, lentille et maïs. Dans le cas du maïs, l'incorporation dans le sol est satisfaisante à raison de 2 g par litre de sol. En raison de la durée nécessaire pour obtenir le maximum de croissance, le champignon sur son support est de préférence incorporé dans le sol environ 15 jours avant la plantation. L'efficacité des différentes souches d'Arthrobotrys conoides vis à vis de Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus a d'abord été testée lors d'essais in-vitro effectués en boîte de Petri. Pour réaliser ces essais in-vitro, les différentes souches de l'Arthrobotrys conoides ont été cultivées sur milieu gélosé (Corn meal agar: 1, Agar-agar: 1) en boites de Petri. Quand le champignon a envahi toute la gélose, 200 nématodes sont déposés aseptiquement dans chaque boîte de champignons y compris des boîtes témoins contenant seulement du milieu gélosé. Après un laps de temps de lh, 2h, 8h, et 24 heures, la gélose contenue dans les boîtes est renversée sur un tamis de mailles de 100 pm dont le fond affleure l'eau d'une boîte de Petri sous-jacente. Ce montage permet aux nématodes non piégés par le champignon, de traverser activement la toile de tamis pour atteindre l'eau. Les nématodes non piégés sont ensuite comptés sous la loupe. Dans le cas de Meloidogyne et Ditylenchus myceliophagus, les six souches se séparent en 2 groupes: les souches A, A' et B piègent entre 60% et 100% de nématodes en 24 heures, les trois autres souches se trouvant en dessous de ce seuil. Dans le cas d'Heterodera carotae, les six souches piègent entre 50% et 75% des nématodes en 24 heures. Il a par ailleurs été observé que le développement du champignon était rapide (en moyenne 1,5 cm par 24 heures). Il peut donc être utilisé de façon satisfaisante dans la pratique en tant qu'agent nématophage dans les cultures maraîchères et florales ainsi que dans les plants de pépinières. Dans le cadre d'essais relatifs à l'écologie des nouvelles souches de champignon prédateur de nématodes, il a été observé que celles-ci se développent bien dans les sols dont la salinité ne dépasse pas 3 g/l. Il a été également noté par ailleurs que le champignon prédateur envahit beaucoup plus intensement le milieu quand il est introduit à forte dose, mais ceci ne l'empêche pas de coloniser les substrats de manière appréciable même à la dose de 10% du volume de terre. L'activité prédatrice des différentes souches d'Arthrobotrys conoides 42 a par ailleurs été confirmée par un certain nombre d'essais d'applications pratiques dont quelques résultats sont rappelés ci-après à titre indicatif. I. Essai en tubes sous serre contre Meloidogyne Les souches étudiées se divisent en 2 catégories dont la capacité de piégeage est différente: A, A' et B piègent en moyenne 80% des nématodes en 24 heures; Br, T et Vl ne piègent que 30% de Meloidogyne en 24 heures. Pour réaliser cet essai, nous avons pris les 2 souches les plus représentatives dans chaque catégorie soit A et Vl. Cet essai a été fait dans des tubes de 50 ml contenant 30 ml de sol. Les souches de champignons cultivées sur un milieu à base de maïs concassé cuit et stérilisé, ont été incorporées au sol à la dose de 100 g/m2. Les tubes ont été traités comme suit: Témoin Sol ne contenant pas de champignon prédateur A1 Sol contenant la souche A, I'inoculation des nématodes s'effectue le même jour que l'incorporation du champignon dans le sol. Vl 1 Sol contenant la souche Vi, I'inoculation des nématodes s'effectue le même jour que l'incorporation du champignon dans le sol. A15 Sol contenant la souche A, I'inoculation des nématodes s'effectue jours après l'incorporation du champignon dans le sol. V1 15 Sol contenant la souche Vl, I'inoculation des nématodes s'effectue jours après l'incorporation du champignon dans le sol. A1 + Vl 15 La souche Vi est incorporée au sol (en demi dose: 50 g/m2) 15 jours avant l'inoculation des nématodes, et la souche A est ajoutée en demi dose le même jour que les nématodes. Le jour J, 30 larves de Meloidogyne sont déposées dans chaque tube. Au bout de 24 heures, les tubes de chaque série sont sortis et leur contenu est analysé afin de connaître le nombre de nématodes piégés. Cette manipulation est renouvelée tous les jours jusqu'au piégeage complet de tous les nématodes. Les résultats obtenus présentés dans le tableau qui suit montrent que, quelle que soit la souche d'Arthrobotrys conoides, si le champignon est incorporé 15 jours avant la mise en culture (donc avant l'activation des nématodes par sa plante hôte), le piégeage varie de manière significative durant les premiers jours, mais cette différence s'atténue rapidement. % moyen de % moyen de % moyen de nématodes piégés à nématodes piégés à nématodes piégés à J+1 J+2 J+3 A1 46,14 66,67 90,28 V11 32,09 59,44 87,22 A15 63,12 80,28 94,44 Vl 15 61,8 86,11 93,06 A1 + Vi 15 44, 92 88,89 95,06 II. Essai sous serre sur culture de tomates Cet essai a été réalisé sous serre, en milieu agricole avec de l'Arthrobotrys conoides 42A. Il est destiné à évaluer la dose de champignon prédateur à épandre sur le sol. Pour ce test, le champignon est cultivé sur un milieu à base de maïs concassé. La teneur de ce milieu est de 107 propagules/g. La parcelle mise à notre disposition est de 120 m2. Elle a été découpée en trois zones de 40 m2 chacune, qui sont séparées entre elles par des planches afin de bien les isoler. La première parcelle constitue la zone témoin, elle est suivie d'une zone traitée avec 50 g de préparation de 42A par m2, puis d'une parcelle contenant 100 g de préparation par m2. Avant de mettre en place cet essai, une première analyse a été faite sur du sol prélevé entre la culture en place (salade). Elle a été réalisée en mettant des jeunes plants de tomates sensibles (variété St Pierre) dans ce sol afin de révéler la présence de nématodes. Un mois après la plantation, une coloration des racines au Lactophénol Bleu- Coton (de GUIRAN, 1966) est réalisée. Cette coloration met en évidence les juvéniles de Meloidogyne ayant pénétré dans les racines de la tomate. Nous avons trouvé 620 larves de Meloidogyne/10 g de racines, ce qui correspond à une infestation moyenne. Ce taux moyen d'infestation est idéal pour tester le champignon nématophage. En effet, comme tout moyen de lutte biologique, il agit lentement et ne peut arriver à réguler une très forte pullulation de nématodes sur une seule campagne de culture. L'Arthrobotrys conoides 42A a été épandu 15 jours avant la plantation des pieds de tomates. Ce laps de temps de 15 jours permet au champignon prédateur de commencer à coloniser le sol et donc d'être opérationnel au moment de la mise en place de la culture. En effet, les plants de tomates émettent dans le sol des exsudats racinaires, qui activent l'éclosion des oeufs de Meloidogyne et permettent aux jeunes larves de se diriger jusqu'aux racines. Les plants de tomates sont répartis sur quatre rangs, dans les deux rangs du milieu (afin d'éviter les effets de bordure), 10 pieds de tomates sensibles (variété St Pierre) ont été répartis, ce sont ces plants qui seront arrachés pour analyse. Les derniers prélèvements ont été faits en fin de culture. Les plants sensibles ont été arrachés et les racines analysées. Pour cela, le système racinaire une fois lavé est broyé dans une solution à 1% d'Hypochlorite de calcium à 12' chlorométrique. Ce broyât est passé sur une série de tamis afin d'éliminer les fragments de tissus végétal. Les oeufs de Meloidogyne issus de la racine sont recueillis sur un tamis de 5 pm et comptés à la loupe binoculaire. Ils vont constituer le potentiel infestant pour la culture suivante. Parcelle témoin Parcelle à 509m2 Parcelle à 100 g/m2 Nombre d'oeufs pour 10 g de 44 581 25 838 17 725 racine Il est bon de préciser certains points: - une femelle de Meloidogyne peut donner, suivant les conditions climatiques, de 300 à 3000 oeufs, - une infestation est considérée comme moyenne lorsque le nombre de larves pour 10 g de racine est compris entre 100 et 1000. On remarque une diminution sensible du potentiel infestant (plus de la moitié) entre la parcelle témoin et la parcelle traitée avec 100 m2 d'Arthrobotrys conoides 42A. Pour les plantes livrables en mottes, godets ou conteneurs, on incorpore directement le champignon nématophage au sein de la motte, du godet ou du conteneur. L'ensemencement par le champignon prédateur s'effectue dès le départ dans les mottes pressées qui sont utilisées pour la fabrication des plants maraîchers. En opérant de la sorte, il est apparu que dans les 20 à 30 jours o les plants nouvellement repiqués dans les mottes restent en serre au chaud et à l'humidité, le champignon prédateur à le temps de croître et d'envahir la totalité de la motte qui se comporte alors comme un inoculum lorsqu'elle est mise en place en culture. Cette variante du procédé selon l'invention, applicable aux plants livrables en mottes, godets, conteneurs ou analogues, s'est avéré présenter les avantages décicifs suivants: Le sol habituellement utilisé pour la confection des mottes est un mélange riche en humus, à pH neutre, il est donc particulièrement favorable au développement de l'Arthrobotrys conoides 42. On a par ailleurs constaté que le système radiculaire de la plante se trouve littéralement enveloppé dans le feutrage mycénien qui ne perturbe cependant absolument pas sa croissance. Le système radiculaire est donc protégé des attaques des nématodes, même si la motte est plantée dans un sol particulièrement contaminé. Il apparait donc ainsi que la jeune plante est bien protégée dès le départ de la végétation, or, c'est généralement lorsqu'une plante est jeune qu'elle craint le plus les attaques des nématodes. Les différentes expériences conduites ont démontré que la motte constitue un inoculum important, à partir duquel le champignon gagne très facilement le sol environnant. La préparation de tels mottes, godets, conteneur ou équivalent ne soulève pas le moindre problème technique d'emploi ni de fabrication de plants. Il suffit en effet d'amener le granulé dans le mélange par exemple à l'aide d'une trémis. La plantation des végétaux ainsi préparée s'effectue par ailleurs de façon tout à fait habituelle. En résumé, le procédé de l'invention peut être appliqué à toutes les cultures maraîchères, florales, ou plants de pépinières, bien que certains de ces plants ne souffrent pas trop de nématodes Meloidogyne. Il peut aussi être employé sur cultures de carottes qui sont sensibles à Heterodera carotae, ou contre Ditylenchus myceliophagus dans le cas du champignon de couche Agaricus bisporus. Dans ce dernier cas, le champignon nématophage peut être ajouté au compost après pasteurisation. REVENDICATIONS 1. Agent nématophage destiné à lutter contre les nématodes du genre Meloidogyne caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe de six souches de Arthrobotrys conoides Drechsler consistant en souches 42A, 42A', 42B, 42Br, 42T et 42V1. 2. Agent nématophage selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit groupe de six souches comprend les souches déposées à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (Institut Pasteur) respectivement sous les numéros: 1- 1425, 1-1426, 1-1427, 1-1428, 1-1429 et 1-1430. 3. Procédé de lutte contre les nématodes du genre Meloidogyne, Heterodera et Ditylenchus myceliophagus dans les cultures, consistant à incorporer dans le sol o sont effectuées les cultures, l'agent nématophage selon la revendication 1 ou 2. 4. procédé selon la revendication 3, dans lequel l'agent nématophage est incorporé dans le sol au moyen de graines ensemencées au préalable par l'inoculum dudit agent nématophage. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel lesdites graines sont choisies dans le groupe consistant en alpistes, lentille et maïs. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'agent nématophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé contenant au moins 107 propagules dudit agent par gramme. 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel l'agent nématophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé, cuit et stérilisé, ledit milieu ensemencé étant ensuite incorporé dans le sol à la dose de 100g/m2. 8. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel l'agent nématophage est préalablement ensemencé sur un milieu à base de maïs concassé, cuit et stérilisé, ledit milieu ensemencé étant ensuite incorporé dans le sol à la dose de 2 g par litre de sol. 9. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'agent nématophage est incorporé directement dans la motte, le godet ou conteneur qui est utilisé pour livrer des plants de pépinières ou de culture maraîchère. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, dans lequel ledit agent nématophage est incorporé dans le sol environ 15 jours avant la plantation.