Brevet FR2710523A1 — publié le 19950407

Extrait de lipides de blé et son procédé de préparation Il est déjà connu d'utiliser en cosmétologie des glycocéramides d'origine animale. On préfère que ces glycocéramides se présentent sous forme de liposomes. Il est connu également que des glycocéramides figurent dans les lipides du blé (FUJINO Y. OHNISHI M., 1982 Structural characterization of sphingolipids in wheat grain Proc. Japan Acad. , 58, Ser. B., 32-35). Il serait donc souhaitable de pouvoir utiliser ces glycocéramides provenant du blé en cosmétologie. Malheureusement, la teneur en glycocéramides du blé est si petite qu'une simple extraction éthanolique telle que décrite dans un article de Clements de 1977 paru dans "American Association of Cereal Chemist 54(6) p1198 à 1206" donne un extrait pauvre en glycocéramides. De ce fait il n'est pas apte à former des liposomes. L'invention pallie cet inconvénient par un extrait de lipides de blé, qui comprend en poids de 10 à 80 % de glycocéramides du blé, de 90 à 20 % de glycosides de sitostérol, et qui est apte à former des liposomes. En général, plus de 50 % en poids des glycocéramides sont des glucocéramides. L'extrait de lipides de blé suivant l'invention peut comporter éventuellement au maximum 10 % et notamment 5 % au plus d'impuretés, tels que des acides gras libres, des stérols libres. L'invention vise également un procédé de préparation d'un extrait suivant l'invention, qui consiste à mettre de la farine, du gluten ou un complexe lipidoprotéique du blé en contact avec un premier solvant organique apte à solubiliser les lipides polaires du blé dont les glycocéramides du blé pendant une durée suffisante pour obtenir une suspension dont la partie liquide contient des glycocéramides, à séparer cette partie liquide du reste de la suspension pour obtenir un extrait lipidique, à saponifié cet extrait lipidique en un extrait lipidique saponifié, à faire percoler l'extrait lipidique saponifier sur une résine échangeuse de cations fortement acide et protonée pour obtenir un extrait acide, à faire percoler cet extrait acide sur une résine échangeuse d'anions, pour obtenir un extrait désacidifié, à évaporer le solvant de l'extrait désacidifié jusqu'à précipitation, à séparer le précipité pour conserver une huile, à lui ajouter une base dans un second solvant organique apte à dissoudre la base et les glycocéramides du blé jusqu'à obtention d'une solution et d'un précipité et à séparer de la solution ce précipité qui constitue l'extrait de lipides de blé visé. Il s'avère en effet qu'il est impossible de séparer les glycocéramides du blé de l'extrait lipidique par simple précipitation fractionnée. La présence d'une grande quantité de lipides fige le milieu et empêche la précipitation sélective des glycocéramides. En éliminant les glycérides, on obtient une huile plus apte à permettre aux glycocéramides de se séparer. A cet effet, on transforme les glycérides en acides gras libres par saponification et on élimine ces acides gras par passage sur la résine échangeuse de cations sous forme H pour obtenir un extrait acide. En faisant passer cet extrait acide sur une résine échangeuse d'anions, on retient les acides sur cette résine et on récupère un extrait désacidifié apte à la précipitation des glycocéramides. Il s'est avéré que cette précipitation est rendue plus complète et plus facile en présence d'une base. On peut obtenir ainsi un extrait ayant une concentration en glycocéramides de 10 à 80 % et notamment supérieure à 70 % en poids, le seuil de 10 % correspondant sensiblement à la possibilité de former des liposomes. Le premier stade du procédé suivant l'invention consiste à mettre de la farine, du gluten ou un complexe lipidoprotéïque du blé en contact avec un premier solvant organique apte à dissoudre les glycocéramides du blé pendant une durée suffisante pour obtenir une suspension dont la partie liquide contient des glycocéramides. Comme complexe lipidoprotéïque, on peut utiliser notamment celui décrit à la demande de brevet européen No 92402215.5 déposée le 3 août 1992. Comme solvant organique, on peut utiliser un étheroxyde tel que le tétrahydrofurane, le dioxane, l'éther diméthylique de l'éthylèneglycol ou du diéthylèneglycol, un hydrocarbure halogéné tel que le chloroforme, le dichlorométhane, le dichloroéthane, un ester tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate de butyle, un alcane tel que le pentane, l'hexane, l'heptane, l'optane, un composé aromatique tel que le toluène et le xylène, un alcool tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le butanol, l'octanol, le décanol, le dodécanol, le tétradécanol, des polyols. On peut utiliser des mélanges de ces solvants. On préfère de beaucoup l'isopropanol, l'hexane et le dichlorométhane et tout particulièrement l'éthanol. On utilise habituellement le premier solvant à raison de 2 à 5 litres par kilo de farine, de gluten ou de complexe lipidoprotéique du blé. On effectue la mise en contact pendant une durée comprise entre 10 minutes et plusieurs heures et, de préférence, pendant au moins une heure pour obtenir de meilleurs rendements. Pour accélérer l'extraction, on peut chauffer en-dessous du point d'ébullition du solvant, mais, en général, il suffit d'opérer à la température ambiante. Le deuxième stade du procédé consiste à séparer la partie liquide du reste de la suspension pour obtenir un extrait lipidique. Cette séparation peut se faire de manière classique par décantation, par filtration ou par centrifugation. Le troisième stade du procédé consiste à saponifier cet extrait en un extrait lipidique saponifié. On utilise à cet effet un hydroxyde métallique, notamment de la soude ou de la potasse, à raison de 0,2 à 0,5 mole par litre de l'extrait lipidique. De préférence, on effectue la saponification entre 10 et 250C pendant 6 à 15 heures et, de préférence, pendant 12 heures environ. Le stade suivant du procédé suivant l'invention consiste à faire percoler l'extrait lipidique saponifié sur une résine échangeuse de cations fortement acide et protonée pour obtenir un extrait acide. Le rapport de l'extrait lipidique saponifié à traiter au volume de résine dépend de la charge en acides gras et se calcule simplement en sachant que les résines fixent de 1 à 1,5 équivalent par litre de résine. En général, on fait percoler de 4 à 10 m3 de la solution qu'est l'extrait lipidique saponifié sur 1 m3 de résine. Le stade suivant du procédé suivant l'invention consiste à faire percoler cet extrait acide sur une résine échangeuse d'anions pour obtenir un extrait désacidifié. Là encore, on fait en général passer de 4 à 10 m3 de l'extrait acide par m3 de résine. L'extrait désacidifié obtenu contient environ 3 % de glycocéramides en matière sèche. Le stade suivant du procédé consiste à évaporer le solvant de l'extrait désacidifié. Pendant cette opération, le sitostérol et son dérivé glycosylé précipitent. On sépare alors le solide par filtration et on continue à évaporer pour expurger de tout précipité. On obtient ainsi une huile de couleur rougeâtre enrichie en glycocéramides. Le stade suivant de précipitation des glycocéramides consiste à préparer un base telle que de la potasse ou de la soude dans du solvant frais, puis à l'ajouter à l'huile de couleur rougeâtre pour faire précipiter les glycocéramides. La quantité de base ajoutée est telle que sa molarité sera comprise entre 0,2 et 0,5 M, de préférence 0,4 M, après évaporation de tout le solvant. Comme solvant, on peut utiliser le solvant dans lequel on a effectué précédemment la saponification. On peut utiliser tout solvant susceptible à la fois de dissoudre la base utilisée et d'être miscible à l'huile de couleur rougeâtre. On préfere un alcanol inférieur, notamment 1'éthanol. On remet à évaporer pour amplifier la précipitation des glycocéramides, puis on les recueille par filtration et on les lave éventuellement, par exemple à l'acétone. Afin de faciliter la précipitation, on peut abandonner au froid (40C) après évaporation. La préparation obtenue a une teneur en glycocéramides de 70 à 80 % en poids. On prépare des liposomes de la manière suivante - Prévoir : 20 mg de glycocéramides par ml de solution de liposomes, un ballon de capacité 15 à 20 fois supérieur au volume de solution, - Dissoudre les glycocéramides dans un minimum de chloroforme, (1/2 à 2 fois le volume final de solution) - Evaporer le chloroforme à l'évaporateur rotatif (400C, 100tr/min), - Laisser sécher le film environ 10 minutes, - Reprendre le film avec la phase hydrophile et des billes de verre, (1/20e du volume en billes) - Sitôt le film entièrement repris, centrifuger la solution sans les billes, (5mn, 5000 tr/min) - Prélever le surnageant. Il est opaque et exempt de cristaux. On a effectué cette préparation de liposomes avec deux extraits de lipides de blé suivant l'invention, l'un à 70 % et l'autre à 20 % de teneur en glycocéramides. On obtient des liposomes dans les deux cas, diverses catégories de liposomes pouvant être obtenues (unilamellaires, multilamellaires et de grande et de petite tailles) en fonction de la méthode de fabrication. L'examen au microscope montre que les glycocéramides composent les bicouches des liposomes. Les impuretés des glycocéramides n'entrent pas dans la composition des bicouches. Elles sont pour la majeure partie insolubles dans les solvants utilisés. Elles peuvent cependant être encapsulées dans la cavité des liposomes. Les solutions de liposomes obtenues avec les extraits de lipides de blé suivant l'invention comportent donc des insolubles qu'il est souhaitable d'éliminer pour obtenir des solutions pures de liposomes. Ces insolubles sont plus nombreux pour la qualité à 20 %. Une simple centrifugation permet d'obtenir cette élimination à condition de la faire aussitôt après avoir formé les liposomes. En effet ces derniers s'adsorbent vite sur les insolubles (cristaux). Plus il y a d'insolubles, plus les liposomes s'adsorbent rapidement. Beaucoup de liposomes restent prisonniers des insolubles dans les culots de centrifugation quand on utilise l'extrait de lipides de blé à 20 %. En revanche, quand on utilise un extrait de lipides de blé provenant d'une simple extraction éthanolique et contenant environ 3 % en poids de céramides, on n'arrive pas à former des liposomes. Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1 Extraction On met en contact en vase clos 1 kg de gluten vital de blé (à 75 % de protéines N x 6,25) avec 4 litres d'éthanol à 96 % et on maintient une agitation vigoureuse pendant 4 heures à 250C à l'aide d'une turbine. La préparation est ensuite filtrée sur fritté de porosité 4; le gâteau est rincé sur son fritté avec 0,5 1 d'éthanol frais. On récupère 4 litres d'extrait (filtrat) contenant 150 g de matière sèche. Saponification : On ajoute 89,6 g de potasse en pastilles à l'extrait éthanolique (4 litres) (normalité = 0,4 N; rapport base/extrait sec = 0,6) et on laisse, sous légère agitation, à 200C, pendant 12 heures. Purification par échange d'ions On prépare un chaînage de déminéralisation par échange d'ions de la façon suivante : en amont, une colonne contenant un lit fixe d'un litre de résine échangeuse de cations fortement acide type A200 (polystyrène/DVB, macroporeuse) (Rohm and Haas) chargée en protons; en aval (placée en série), une colonne contenant un lit fixe de deux litres de résine échangeuse d'anions type MP64 (BAYER) chargée en ions hydroxyde (polystyrène/DVB, macroporeuse, 15 % anions forts + 85 % anions faibles). On fait percoler, à 2 1/heure, sur ce chaînage, les 4 litres d'extrait saponifié et on rince les colonnes avec 1 litre d'éthanol frais. On fixe ainsi, sur la première colonne (cations), le potassium, les autres cations et la matière azotée et sur la deuxième colonne (anions) les acides gras et les autres anions. On récupère l'extrait purifié (5 litres). Précipitation fractionnée On concentre l'extrait purifié par évaporation de l'éthanol sous vide partiel. Pendant l'évaporation, se forment des cristaux de sitostérol et deux glycosides de sitostérol; lorsque le volume d'extrait atteint 500 ml, on filtre sur fritté 4 et on poursuit la concentration du filtrat. Cette opération est répétée plusieurs fois pendant la suite de l'évaporation-concentration. L'évaporation est poursuivie jusqu'à atteindre un volume d'extrait purifié concentré de 50 ml. Cet extrait concentré a l'apparence d'une huile de couleur rouge. On prépare de la potasse éthanolique de la façon suivante : on dissout 1 g de potasse en pastilles dans 50 ml d'éthanol frais. Cette préparation est ajoutée à l'huile de couleur rougeâtre et on met l'ensemble à nouveau à évaporer jusqu'à atteindre 50 ml. Les effets conjugués de la base et de l'évaporation font précipiter les glycocéramides. Ceux-ci sont récupérés par filtration (Fritté 4) et lavés avec un peu d'acétone. La préparation ainsi obtenue contient 75 % en glycocéramides (HPLC) par rapport à la matière sèche totale. On effectue le dosage des glycocéramides et des glycosides de sitostérol par chromatographie liquide à haute performance de la manière suivante Colonne : Fournisseur INTERCHIM Type : silice sphérique Appellation : Sphérisorb 3 microns Dimensions : 100 mm x 4,6 mm. . Température en cours d'analyse : 200C . Elution On pratique un gradient à l'aide des 3 solvants suivants - Premier solvant : Hexane à 1% v/v de THF - Deuxième solvant : Isopropanol / Chloroforme 80/20 (v/v) - Troisième solvant : Isopropanol / Eau : 50/50 (v/v) . Détecteur A diffusion de lumière (Evaporative light-scattering Detector) Pression d'azote 2 bar Température du tube de sortie : 700C Un étalonnage est effectué à l'aide des composés suivants, en quantités variables . Glucocérébrasides SIGMA Référence G 9884 Bêta-sitostérol SIGMA Référence S 9889 ; . Glucoside de sitostérol préparé par recristallisation dans l'eau ; Les temps de rétention de ces composés dans le système d'analyse chromatographique décrit ci-dessus, sont les suivants Glucocérébrasides : 14,47 minutes ; . Bêta-sitostérol : 8,47 minutes ; . Glucoside de sitostérol : 14,06 minutes ; Pour analyser les préparations de glucocéramides, on compare, à temps de rétention égal, l'aire du pic obtenu avec l'aire du composé étalon correspondant ; la courbe d'étalonnage permet de déterminer la concentration du composé corresponant dans la préparation. Exemple 2 On reprend l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise comme résine échangeuse de cations une résine fortement acide de type IR120 (polystyrène/DVB, gel) (Rohm and Haas) chargée en protons, et comme résine échangeuse d'anions une résine de type IRA900 (polystyrène/DVBmacroporeuse-100 % d'anions forts) (Rohm and Haas) chargée en ions hydroxydes. Exemple 3 On reprend l'exemple 1, si ce n'est que l'on effectue la précipitation fractionnée en plaçant le mélange à 40C pendant 12 heures. On récupère le précipité formé par filtration et on concentre le filtrat par évaporation jusqu'à 50 ml afin de former un nouveau précipité qui est récupéré. Cette façon de procéder plus longue permet cependant de multiplier les rendements par 1,5. La qualité obtenue est identique (75 % de glycocéramides). Exemple 4 Cet exemple illustre l'utilisation d'un solvant autre que l'éthanol (hexane lors de l'extraction). On met en contact, en vase clos, 2,5 kg de gluten vital de blé avec 10 litres d'hexane et on maintient une agitation vigoureuse pendant 2 heures à 200C à l'aide d'une turbine. La préparation est ensuite filtrée sur Fritté 4 et le gâteau rincé avec 1 litre d'hexane. Le filtrat est récupéré et on évapore tout l'hexane. On obtient alors 147,5 g de résidu huileux que l'on reprend avec 4 litres d'éthanol. On continue suivant l'exemple 1. Exemple 5 : Utilisation d'une autre matière première que le gluten (farine) Extraction On met en contact, en vase clos, 1 kg de farine de blé (71 % d'amidon, 13 % de protéines, 1,2 % de lipides et 0,4 % de cendres) avec 4 litres d'éthanol à 96 % et on maintient une agitation vigoureuse pendant 5 heures à 350C à l'aide d'une turbine. La préparation est ensuite filtrée sur Fritté N04 et le gâteau lavé avec 0,5 1 d'éthanol frais. On récupère 4 litres d'extrait (filtrat) contenant 22 g de matière sèche et on concentre 7 fois pour obtenir une préparation à 38 g de MS par litre et on procède ensuite comme pour les exemples 1, 2, 3. Exemple 6 (comparatif) On met en contact, sous agitation à 350C pendant 5 heures, 1 kg de farine de blé (de même nature que celle utilisée dans l'exemple 5) avec 4 litres d'éthanol à 96 OC. La préparation est ensuite filtrée et on récupère le filtrat qui contient 5,5 g de matière sèche (MS) par litre. Celui-ci est placé plusieurs jours, soit à +4"C, soit à -180C. Nous n'avons pas observé de formation de cristaux ou de dépôts. Le même filtrat est alors concentré par évaporation 7 fois (38 g MS/l), 12 fois (66 g MS/l) et 20 fois (110 g MS/l) et placé également plusieurs jours à +4"C et à -180C. La préparation concentrée 7 fois ne subit aucune modification à +40C, mais se fige à -180C. Les préparation concentrées 12 fois et 20 fois se fignet à +40C et à -180C. La prise en masse observée est contrairement due à la présence des glycérides et, dans ce cas, il n'a pas été possible d'effectuer de purification des glycocéramides par précipitations sélective. Cet exemple illustre bien la nécessité d'extraire la charge glycéridique avant toute tentative de purification par cristallisation. REVENDICATIONS 1. Extrait de lipides de blé, caractérisé en ce qu'il comprend en poids de 10 à 80 % de glycocéramides du blé et de 90 à 20 % de glycosides de sitostérol et il est apte à former des liposomes. 2. Extrait suivant la revendication 1, caractérisé en ce que plus de 50 % en poids des glycocéramides sont des glucocéramides. 3. Procédé de préparation d'un extrait suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre de la farine, du gluten ou un complexe lipidoprotéïque du blé en contact avec un premier solvant organique apte à dissoudre les glycocéramides du blé pendant une durée suffisante pour obtenir une suspension dont la partie liquide contient des glycocéramides, à séparer cette partie liquide du reste de la suspension pour obtenir un extrait lipidique, à saponifier cet extrait lipidique en un extrait lipidique saponifié, à faire percoler l'extrait lipidique saponifié sur une résine échangeuse de cations fortement acide et protonée pour obtenir un extrait acide, à faire percoler cet extrait acide sur une résine échangeuse d'anions pour obtenir un extrait désacidifié, à évaporer le solvant de l'extrait désacidifié jusqu'à précipitation, à séparer le précipité pour conserver une huile, à lui ajouter une base dans un second solvant organique apte à dissoudre la base et les glycocéramides du blé jusqu'à obtention d'une solution et d'un précipité et à séparer de la solution ce précipité qui constitue l'extrait de lipides de blé. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le premier solvant est un étheroxyde, un hydrocarbure halogéné, un ester, un alcane, un composé aromatique ou un alcool. 5. Procédé suivant la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser pour 1 kg de farine, de gluten ou de complexe lipidoprotéïque du blé, de 2 à 5 litres du premier solvant. 6. Procédé suivant l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à saponifier par 0,2 à 0,5 mole d'un hydroxyde métallique par litre de l'extrait lipidique. 7. Procédé suivant l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser au moins 0,1 mole de base par litre d'huile.