Brevet FR2721942A1 — publié le 19960105

L'invention concerne l'utilisation d'une glycoprotéine extraite de champignons comestibles de l'espèce Agaricus, comme facteur de croissance à ajouter aux milieux de culture pour cellules eucaryotes. La glycoprotéine appelée CRS 33. 011, ses caractéristiques, ses propriétés et son procédé de préparation sont décrits dans la demande de brevet intitulée " Glycoprotéine extraite de champignons Agaricus, procédé de préparation et applications de ses effets sur la prolifération cellulaire" déposée en même temps que la présente demande. Cette molécule exerce, selon la gamme de concentrations utilisées, un effet stimulateur ou un effet inhibiteur sur la prolifération de différents types cellulaires. Cette substance est de nature glycoprotéique, elle a une masse moléculaire voisine de 30.000 daltons, elle présente un pHi voisin de 8,6. Le procédé de préparation de la substance CRS 33.011 comprend : - l'utilisation comme matériau de départ de champignons comestibles de l'espèce Agaricus ; - le broyage des champignons lavés et la mise en solution du broyat dans l'eau déminéralisée, sous agitation, puis l'élimination des déchets par centrifugation ; - une filtration pour clarifier la solution puis une ultrafiltration pour la concentrer à environ 1 gramme d'extrait par litre ; - deux séparations chromatographiques successives sur résine de type anionique sur laquelle la substance recherchée s'adsorbe ; - l'élution de la substance en présence de NaCl à une concentration de 0,3 M à 0,8 M - une étape de concentration de la solution éluée - une diafiltration et - la lyophilisation de la substance obtenue. La Demanderesse a cherché des applications potentielles de la propriété de stimulation de la prolifération cellulaire de la glycoprotéine obtenue en particulier en utilisant le CRS 33. 011 comme additif pour des milieux de culture pour cellules eucaryotes. Elle a ainsi observé que l'addition de faibles quantités de CRS 33. 011 au serum de veau ou à un concentré de protéines de serum de veau stimulait la prolifération de différents types de cellules mises en culture in vitro. De plus, elle a observé que le CRS 33.011, en mélange avec d'autres protéines et facteurs de croissance définis, pouvait remplacer le sérum de veau foetal ce qui est particulièrement avantageux parce que les milieux définis assurent une meilleure reproductibilité de la multiplication cellulaire que le serum dont chaque lot doit être contrôlé et réévalué par rapport à un standard. La Demanderesse a ainsi mis au point différentes compositions à utiliser comme additif des milieux habituels pour culture in vitro de cellules eucaryotes. Les compositions selon l'invention comprennent, à titre de principe actif, la glycoprotéine extraite d'Agaricus (CRS 33. 011) à une concentration comprise entre 1 et 50 ng/ml et de préférence à une concentration de 20 ng/ml. Les concentrations sont exprimées par ml de composition, étant entendu que celle-ci s'utilise généralement à 10% du volume final dans le milieu de culture des cellules. L'une des compositions selon l'invention comprend, en outre, du serum de veau, de préférence ajusté à une concentration en protéines voisine de 60 mg/ml. Une autre composition selon l'invention comprend, en outre, un concentré de protéines de serum de veau dépourvu d'immunoglobulines, à une concentration voisine de 50 mg/ml. Une autre composition selon l'invention comprend, en outre, un mélange défini de protéines et de facteurs de croissance, constitué d'albumine, de fibronectine, de transferrine, d'insuline, de lipoprotéines et de vitamine C. L'exemple suivant illustre l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 La glycoprotéine extraite du champignon Agaricus campestris ou bisporus est filtrée sur membrane de porosité 0,1 micron puis radiostérilisée à 2,5 mégarads. Les compositions suivantes ont été retenues : Code: SFCRS3 - glycoprotéine CRS 33. 011 20 ng/ml - serum de veau de 130 jours ajusté en PBS à une concentration de 60 mg/ml SFCRS2 - glycoprotéine CRS 33.011 20 ng/ml - concentré de protéines de serum de veau dépourvu d'immunoglobulines en solution en PBS à 50 mg/ml SFCRS1 - glycoprotéine CRS 33. 011 20 ng/ml - albumine bovine (pureté >98%) 42 mg/ml - fibronectine bovine (pureté >98%) 4 mg/ml - transferrine bovine (pureté >98%) 2 mg/ml - insuline porcine 1 mg/ml - lipoprotéines de serum de veau foetal 3 mg/ml - vitamine C l,5mg/ml Ces compositions sont utilisées comme le serum de veau foetal (SVF) qui sert de témoin, c'est-à-dire à 10% en volume final dans le milieu de culture habituel des cellules. Ainsi, pour une boîte de culture de 25 cm2 on utilise 9 ml du milieu additionné de 0, ml de solution de pénicilline-streptomycine, de 0,5 ml de L-glutamine 200 mM, et de 1 ml de SVF ou de "composition". Pour chaque passage on ensemence 1,5 105 cellules/ml par boîte de culture. Les cellules sont détachées par traitement avec une solution de trypsine à 0,05% et EDTA à 0,02%. Les cellules sont comptées à l'aide d'une cellule de NEUBAUER. Les lignées cellulaires suivantes ont été utilisées : VERO (reins de singe), MRC5 (fibroblastes de poumon d'embryon humain), SIRC (fibroblastes de cornée de lapin) et WISH (cellules anniotiques humaines). Pour chaque type de cellule on a effectué 5 passages successifs, en parallèle sur 2 séries de boîtes et les comptages ont été effectués après 48 heures et après 72 heures d'incubation. Cinq lots de serum de veau d'origines différentes ont été utilisés pour donner la moyenne de référence (considérée comme 100% de multiplication cellulaire) . Les résultats présentés dans les tableaux suivants montrent que les compositions SF CRS1,2 et 3 permettent une prolifération cellulaire significativement supérieure à celle obtenue en présence de serum de veau foetal. La reproductibilité des résultats a été vérifiée avec plusieurs lots de "compositions" produits indépendemment . Cellules 48h 72 h VERO 1er 2èrne Sème 4eme 5ème 1er 2ème Sème 4ème 5ème pas pass. I D3SS, ! pass. I D3SS. , D2SS. I D2SS. pass. pass. paSS. nb c,,bi 1 nô clbc n cibi 1 n'o c/b I no o c,,b t1 1 no c/bt i no cb( 1 no cpoi i no c/bi 1 no cibc SVF lot 4088 4,8 4,8 4,9 5,o 5.0 8,0 8,1 8,1 8,3 8,3 lot 4038 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~j~~~~~~~~~~~~~~~)~~~~~~~~~~~~~~~~~~ SVF 4,9 4,9 5,1 5,1 8.1 8,1 8,2 8,3 8,4 lot 2550 8'l 8,2 8,3 SVF 4,8 4.8 4.8 4,9 7.8 7,9 8,0 8,0 8,2 lot X 1 z,8 4.8 ^-.8 z,9 î.8 7,9 8,0 8,0 SVFlot X 2 4,9 4,9 5,0 5,0 5,0 7,9 8. 0 8,0 8,0 8,2 SVF ,8 4,8 4,8 J,0 .9 7,8 7,9 7,8 8,0 8,0 lot X 3 Moyenne 4.S ^-,8 ,9 5.0 5.0 7,9 8,0 8,0 8,1 8,2 % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 SF CRS 1 5'l 5,3 5,3 5,4 5,4 8,7 8,8 8,8 8,9 9,0 %SVF 1C6.2 110,4 108,1 108.0 108.0 108.7 108,6 108.6 107,2 108,4 SFCRS2 5,0 5.2 5,2 5,3 5,3 riz 8, 8,4 8,5 8,6 8,7 % SVF 103.3 107,4 106,2 106.0 106,0 106.0 105,0 106,0 105,9 105.8 SF CRS3 5,8 5,8 5,9 6,0 6.1 9,5 9,7 9,8 9,8 9,9 %SVF 119,8 119.3 120.4 i2o'o 122.0 119.1 121.2 122,2 120.7 120.4 no c/bt : nombre de cellules x 106 par boîte Cellules 48 h 72 h MRC 5 1er 2eme 3eme 4me 5ème 1er 2ème 5ème 4ème Sème ID as pass. pass- pass. Dass. D2SS. pass. pass. pass. pass. no c/bc nb cibt 1 no o clb c nb c,,b( no clbt nô cbc t no cfdi i no c/bt n c/bi nô c/bt SVF 4,5 ,6 4,6 lot 2550 SVF lot X 1 4 4. A4. 4. 4. .,5 d 75 7 4 74 75 ' 7,6 SVF lot ,5 4,6 4,6 4,7 4.3 7,5 7,5 7,5 7,5 /,6 lot X 2~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ SVF lot 4,6 4,5 4,5 4,6 d. 8 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 lot Moyenne -i.5 -.5 4,6 ," ^-,8 7,4 7,5 7,5 7,6 7,8 % 100 100 100 100 100 100 100 100 i00 100 SF CRS 1 4,g 4,9 4,9 5 5,1 8,1 8, 2 8, 2 8,3 8,4 SVF 109,,4- 107.9 107,j 106,8 108.3-/ In-1,6 109,0 109.5 108,8 %a SVF 109,4 107.9 107J 106.3 106,7 108.S7 107.6 109.0 109J 108,8 SF CRS 2 4,7 4,8 4.9 4,9 5,0 7,8 7,8 7,9 8,0 8.0 % SVF 104,9 105.7 107.5 10,7 104,6 10-i, 104,5 105.5 105,54 103.6 SF CRS 3 5,3 5, 5,6 5,6 5.6 8.9 8.9 9,0 9,2 9,2 %SVF 118.3 I 118. 120,6 119.7 1 i i i9 -5 119,0 119,7 122.4 119.2 nb c/bt : nombre de cellules x 106 par boîte Cellules 48 h 72 h S IR C 1er 2ème 3eme 4ème 5ème ier 2ème 3ème 4ème Sème pass. pass. pass. pass. i D2SS. I D2SS. uass. pass. dans. pass. 1 no c/bc nu c,bt nb c/bt I nb c/bt nib c.'b[ ! nib clbt I no clbt I no c/bc 1 no cft)c I nb c/bc SVF 3,5 3,5 3,6 3,6 3,7 4.8 4,8 ,3 4,8 4,9 lot 4068 SVF 3,5 3,5 3.5 3,6 3,-, 4,7 4j 7 4,8 4,3 lot 2550 @ SVF 3,3 3,4 3, il 3,4 3.4 4.2 4,3 4,3 4,4 lot 2 3,5 -',5 3,5 ' 3,5 4,8 4,8 4,7 4,9 4,9 VVF lot 3,20 3,4 3,4 3.4 3. dj ^-,8 4,9 4,9 4,9 Moyenne 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 1,6 -,7 4j ,8 ^-,8 % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 SF CRS 1 3,8 3,8 3.8 3.9 3,9 5,1 5.1 5,2 5,2 5,3 %SVF 111.8 111.3 i C,9, 111. 110.2 109.9 109,0 110.6 109,2 110.7 SF CRS 2 3,7 3,7 3,8 3,8 3.8 5.0 5,0 5.1 5,1 5,1 % SVF 108,8 106.9 109,2 108.6 107.3 107,8 106,8 103.5 107.1 106,7 SF CRS 3 4,4 4,4 z 4,6 4.7 6,i 6,1 6,2 6,2 6,2 % SVF 129,4 il-7,2 129.3 131. 132.3 131-5 130.3 131,8 130.3 129.7 nb c/bt : nombre de cellules x 106 par boîte Cellules 48 h 72 h WISH 1e: terne Sème 1.1.è#:e 5ème 1er 2ème 3ème 4-ème 5ème pass. pas. dans. pas. D2.SS. 'Jass. pass. pass. Dans. pass. no cbt I no c;'ot no cube I no c/b( ! ^c c;bt I r.o o -,lb 1 I no c/bc I no CIDC nc c/bc I nb croc SVF lot A,068 4,8 li,8 4,9 ,9 Li,9 7,6 7,7 7,7 7,7 7,8 lot 4068 SVF 4,9 4.9 4,9 5,0 5.0 7,8 7,8 7,8 7,9 7,8 lot 2550 SVF lot 4,5 4,6 4.7 4.7 4.8 7. 5 7,6 7,7 7,9 7,8 lot X 1 SVFlot x 2 >8 ^,5 ,8 j 4,9 5 7.7 7,8 7,9 8 8 SVF Li,90 4,9 5,0 5,0 bzz 7,8 7,7 8 7,9 8 lot X Moyenne 4,8 z',8 4,9 ^-,9 5,0 7,7 7,8 7,8 7,9 7,9 % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 SF CRS 1 5,2 5,2 5,3 5,4 5,5 8,4 8,4 8,5 8,5 8,5 % SVF 108.8 108.3 109.1 110.2 110.9 109,4 108.3 108.7 107,9 107.7 SF CRS 2 5,0 5,0 5.1 5,1 5.2 8,1 8,1 8,2 8,3 8,3 % SVF 104,6 1 "? 104,9 104,1 104,8 105.3 104,4 104.9 105,3 105.1 SF CRS 3 6,1 6,2 6.2 6,2 6.3 9,8 9,8 9,9 10,0 10,0 % SVF 127,6 129.2 127,2 126.5 127.0 Il:27,6 1 126.3 126.6 126,9 126,6 no c/bt : nombre de cellules x 10 par boîte REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une glycoprotéine extraite de champignons comestibles de l'espèce Agaricus comme facteur de croissance à ajouter aux milieux de culture pour cellules eucaryotes. 2. Composition destinée à l'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de la glycoprotéine extraite d'Agaricus et du serum de veau. 3. Composition destinée à l'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de la glycoprotéine extraite d'Agaricus et un concentré de protéines de serum de veau dépourvu d'immunoglobulines. 4. Composition destinée à l'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de la glycoprotéine extraite d'Agaricus et un mélange défini de protéines et de facteurs de croissance. 5. Composition destinée à l'utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'albumine, de fibronectine, de transferrine, d'insuline, de lipoprotéines et de vitamine C. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que la concentration de la glycoprotéine extraite d'Agaricus est comprise entre 1 et 50 ng/ml. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que la concentration de la glycoprotéine est de 20 ng/ml.