Brevet FR2710855A1 — publié le 19950414

La présente invention a pour objet le prélèvement de sang et, plus particulièrement, concerne un dispositif en matière plastique pour le prélèvement d'un échantillon de sang.5 Les échantillons de sang sont prélevés de manière usuelle dans des tubes en verre mis sous vide. Une extrémité d'une aiguille à deux pointes est insérée dans une veine d'un patient. L'autre extrémité de l'aiguille perfore ensuite un bouchon fermant l'extrémité ouverte du tube de telle sorte10 que le vide dans le tube provoque l'aspiration de l'échan- tillon de sang à travers l'aiguille et l'introduction de cet échantillon dans le tube. Au moyen de cette technique, il est possible de prélever plusieurs échantillons en utilisant une seule perforation de la peau avec une aiguille. Des tubes en matière plastique ont été également proposés pour le prélèvement de sang. Le plastique présente un certain nombre d'avantages par rapport au verre, tels qu'une plus faible rupture, un faible poids lors du transport et une élimination aisée par incinération. Le sang prélevé dans des tubes mis sous vide doit souvent être coagulé avant un examen clinique. Il est souhaitable de former un caillot dense aussi rapidement et de manière aussi complète que possible pour faciliter la séparation nette du caillot de la phase de sérum par centri- fugation. Pour y parvenir, des tubes de prélèvement de sang en matière plastique et en verre utilisent fréquemment un activateur de coagulation. Dans la pratique, tous les tubes du commerce pour le prélèvement de sang comprennent des activateurs en particules conduisant à la formation de caillots réticulés denses qui se séparent nettement du sérum dans une centrifu- geuse hématologique. Cependant, la formation du caillot est relativement lente, en particulier dans un tube en matière plastique, et un temps d'environ 30 à 60 minutes est requis avant centrifugation. Les activateurs classiques en par- ticules, utilisés commercialement, consistent en une étoffe imprégnée de silice, en particules de silice dans de petites coupelles en matière plastique ou en particules d'un silicate dans de la polyvinylpyrrolidone (PVP) appliquées à la paroi du tube. Lorsque le sang pénètre dans un tube contenant l'association silicate-PVP, la PVP se dissout et les par- ticules de silicate sont libérées. La PVP pénètre à la fois dans le sérum et le caillot et peut interférer avec les analyses chimiques ou hématologiques et peut encrasser les appareils automatisés et/ou appareils optiques. Il existe un besoin dans la pratique d'un activateur de coagulation qui provoque la formation rapide d'un caillot dense qui se sépare nettement du sérum lors de la centrifugation sans contaminer le sérum avec des substan- ces chimiques solubles. La présente invention a pour objet de répondre à ce besoin. Un aspect de la présente invention consiste en un complexe d'un polyélectrolytique insoluble réticulé (CPE) servant d'additif activateur de coagulation pour un disposi- tif de prélèvement de sang. Le CPE est un polymère poly- ionique ayant une charge en surface qui accroît la vitesse de coagulation d'un échantillon de sang. Une première forme de réalisation de l'additif consiste en une bille de gel formée par réticulation d'un polymère possédant des groupes carboxyle et des anions carboxylate engendrant une charge de surface négative. Une deuxième forme de réalisation de l'additif consiste en une structure multicouche possédant un noyau réticulé, une ou plusieurs couches stratifiées sur le noyau, et une charge sur la couche de surface. L'agent de réticulation préféré est un ion métallique divalent ou polyvalent. Un autre aspect de la présente invention consiste en un dispositif de prélèvement de sang qui comprend un tube mis sous vide, obturé hermétiquement par une cloison per- porable et renfermant l'additif conforme à la présente invention. Ainsi, l'additif possède une composition chimique de surface qui active la coagulation d'un échantillon de sang. Etant insoluble dans un milieu aqueux, l'additif, après5 avoir déclenché le mécanisme de coagulation, est centrifugé avec le caillot et est éliminé de la phase de sérum. L'addi- tif peut être produit sous n'importe quelle forme, densité ou composition chimique de surface désirée, de telle sorte que des échantillons de sang de n'importe quel volume puissent10 être traités rapidement avec un effet minimal sur n'importe quels constituants sanguins destinés à l'analyse. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur15 lesquels: la figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif de prélèvement de sang contenant l'activateur de la présente invention consistant en perles de CPE; la figure 2 illustre diverses formes de réalisa- tion des activateurs sous forme de perles de la présente invention; la figure 3 est un graphique du temps de coagula- tion en fonction de la surface pour un activateur de la présente invention sous forme de perle à structure centrale; la figure 4 est une comparaison des temps de coagulation pour diverses formes de réalisation des perles de la présente invention; et la figure 5 compare l'activation de coagulation par une perle de CPE à celle d'un CPE déposé sur un papier- filtre. Bien que la présente invention soit mise en pratique sous de nombreuses formes de réalisation différen- tes, les formes préférées de réalisation de la présente invention sont décrites en détail dans le présent mémoire en ayant à l'esprit que la description de la présente invention doit être considérée comme étant illustrative des principes de la présente invention et n'est pas destinée à limiter l'invention aux formes de réalisation illustrées et décrites. Le cadre de la présente invention sera défini par les5 revendications annexées et leurs équivalents. Le dispositif de prélèvement de sang de la présente invention peut comprendre n'importe quel récipient renfermant l'activateur de la présente invention consistant en un CPE. Des récipients convenables sont, par exemple, des10 bouteilles, des fioles, des flacons, etc., de préférence des tubes. La présente invention sera donc décrite sur la base du tube préféré. Le tube peut être de préférence munie d'une cloison perforable sur l'extrémité ouverte et peut être mis sous vide. Des tubes mis sous vide pour le prélèvement de sang sont classiques dans la pratique, un exemple étant les tubes de marque VACUTAINERTM (Becton, Dickinson and Company). La figure 1 représente le tube de la présente invention. Un tube 10 possède une paroi inférieure 12 définissant une extrémité fermée 14 et une paroi latérale 16 définissant une extrémité ouverte 18. La paroi inférieure 12 et la paroi latérale 16 sont continues et définissent ensemble une surface de paroi intérieure 20. Une multiplicité de perles activatrices 22 (représentées en détail sur la figure 2) est placée dans le tube 10. L'extrémité ouverte 18 du tube 10 est recouverte par une cloison perforable 24. Le tube peut être constitué de verre ou, de préférence, d'une matière plastique. Des matières plastiques convenables sont un polymère de chlorure de vinyle, le polypropylène, un polymère de téréphtalate d'éthylène et, de préférence, le polystyrène (PS). Suivant sa définition la plus générale, l'additif d'activation de coagulation de la présente invention comprend une structure de CPE insoluble réticulée portant une charge en surface. La charge de surface peut être positive ou négative, de préférence négative, et la structure de CPE peut avoir n'importe quelle forme convenable, de préférence une forme pratiquement sphérique. L'additif avantageux consiste en une perle souple et analogue à un gel, mais peut être solide ou semi-solide, comme dans le cas d'une capsule, d'un granule, d'un film ou d'un fil, ou bien il peut être déposé sur une surface solide, telle qu'une particule polymérique, une membrane ou du papier. Dans une première forme de réalisation de l'additif, le CPE comprend un polymère carboxylé réticulé possédant une charge négative de surface, désigné ci-après sous le nom de structure centrale. La structure centrale peut être déposée sous forme d'un film sur une particule polyméri- que, telle qu'une perle de PS, ou sur une membrane telle que le papierfiltre et séchée mais est de préférence utilisée sous forme de la bille de gel préférée. Le polymère carboxylé peut être un sel d'un polysaccharide anionique naturel, tel que l'acide alginique. Des polymères carboxylés dépourvus de groupements acide mannuronique peuvent également être utilisés. Ces polymères comprennent des polypeptides carboxylés, tels qu'un sel de polymère d'acide glutamique, une cellulose carboxylée ou des sels de polymères synthétiques, tels qu'un polymère d'acide lactique et un polymère d'acide méthacrylique. Le polymère carboxylé préféré est un sel d'un dérivé de cellulose carboxylé tel que la carboxyméthylcellulose (CMC). La CMC peut avoir un poids moléculaire d'environ 5000 à 500 000, avantageusement d'environ 20 000 à 100 000 et de préférence d'environ 50 000. Des CMC ayant divers poids moléculaires sont disponibles auprès de Hercules sous le nom commercial AQUALONTM La réticulation peut être effectuée avec un sel d'ion métallique polyvalent tel qu'un chlorure, bromure ou nitrate. Des métaux convenables sont les métaux alcalino- terreux ou les métaux de transition, tels que le scandium, l'or, le baryum, le magnésium ou le calcium. Un sel de réticulation avantageux est le nitrate de plomb. Un additif apprécié consiste en une perle de gel possédant une structure centrale, une pluralité de couches polyélectrolytiques sur la structure centrale et une charge négative de surface. La perle centrale, qui possède elle-même un effet d'activation de coagulation, peut être munie d'une pluralité de couches stratifiées. Ainsi, une perle centrale de CMC réticulée avec un sel métallique et portant des10 groupes carboxylate de surface peut être amenée à réagir avec un polyélectrolyte chargé positivement pour ajouter une couche sur la perle centrale, ayant une charge positive. Ce produit, possédant une seule couche stratifiée, est désigné sous le nom de perle de stade 2 et possède une activité15 d'activation de coagulation. Il peut être soumis en outre à une réaction avec un excès de CMC sodique ou d'un autre polyélectrolyte chargé négativement pour ajouter un second stratifié de sorte que l'additif possède une charge négative de surface. L'homme de l'art appréciera aisément qu'un20 additif comprenant n'importe quel nombre désiré de stratifiés peut être construit par des réactions excessives en utilisant alternativement des polyélectrolytes chargés positivement et des polyélectrolytes chargés négativement. Des polyélectrolytes convenables ayant une charge positive sont des sels d'ammonium, des sels de polypeptides basiques tels que la polylysine et des sels d'aminoglycosides tels que le glycosaminoglycane. Les électrolytes polycationi- ques préférés sont des sels d'ammonium quaternaire tels que, par exemple, l'aminoéthylcellulose, le bromure d'hexa- diméthrine (POLYBRENETM) et le chlorure de polydiallyl- diméthylammonium (poly-DADMAC), disponible auprès de Allied Colloids, Inc., Suffolk, Va. sous le nom commercial ALCOFIXTM 109. La figure 2 représente diverses perles de la présente invention, ayant une activité d'activation de coagulation. Les flèches sur la figure 2 représentent une séquence préférée de réactions de stratification. La figure 2a représente une perle centrale de gel 30 comprenant une multiplicité de molécules de CMC réticulables 32 et une charge négative de surface. La réaction de la perle 30 avec un polyélectrolyte chargé positivement, tel que le polyDADMAC, donne une perle 34 de stade 2, représentée sur la figure 2b, qui comprend une perle centrale 30 et un stratifié de surface 36 constitué de poly-DADMAC. La figure 2c repré-10 sente une perle multicouche de stade 2 comprenant une perle centrale 30, un stratifié de poly DADMAC 36 et un stratifié constitué d'un sel de CMC, ayant une charge négative de surface. La figure 2d représente une perle multicouche 42 de stade 3 comprenant quatre couches stratifiées et ayant une charge négative de surface. La perle 42 comprend une perle centrale 30, un stratifié 36 constitué de poly-DADMAC, un stratifié 40 constitué de CMC sodique, un stratifié 44 constitué de poly-DADMAC et un stratifié 46 constitué de CMC sodique. L'additif le plus avantageux de la présente invention comprend une perle centrale de gel pratiquement sphérique constituée de CMC réticulée avec un sel métallique divalent, un premier stratifié de poly-DADMAC sur la perle centrale et un second stratifié de CMC sodique sur le premier stratifié de telle sorte que l'additif final possède une charge négative de surface. Ce produit est décrit en détail dans l'exemple 2 et sur la figure 2c. L'additif peut avoir un diamètre d'environ 0,01 à 10 mm, avantageusement d'environ 1 à 5 mm, et de préférence d'environ 1,5 à 2,5 mm. La structure centrale représente pratiquement la totalité du diamètre des perles, et les stratifications ne modifient pas notablement le diamètre de la structure centrale. Le diamètre de la perle centrale peut être modifié en faisant varier les dimensions de l'orifice utilisé dans la préparation de la perle et la tension superficielle de la densité du véhicule utilisé pour le polymère carboxylé. De très petites perles centrales peuvent être préparées en dispersant la CMC dans la phase aqueuse d'une émulsion huile-5 dans-eau avant addition à la solution de réticulation. Ces aspects de la présente invention sont classiques et bien connus de l'homme de l'art. Les réactions décrites ci-dessus avec les polyélectrolytes peuvent être effectuées en ajoutant goutte à goutte une solution du polyanion choisi, tel que la CMC sodique, à une solution du polycation choisi, tel que le poly-DADMAC. Il se produit une réaction de double décom- position dans laquelle les groupes carboxyle de la CMC présentent une coordination électrostatique avec les groupes ammonium du poly-DADMAC. Si une charge négative totale est désirée sur le produit, un excès de groupes carboxylate par rapport aux groupes ammonium est utilisé. Si une charge positive totale est désirée, les groupes ammonium sont présents en excès. Une perle, analogue à un gel, de chaînes de polyanions réticulées se forme à l'interface de chaque goutte de solution de polyanion lorsqu'elle entre en contact avec la solution de polycation. La préparation de CPE en mélangeant les polyélectrolytes de charges opposées est bien connue dans la pratique. Le procédé est décrit en détail dans les exemples 1 et 2 et aucun détail supplémentaire n'est requis pour une parfaite compréhension de cet aspect de la présente invention par l'homme de l'art. L'additif consistant en CPE peut être dispersé dans un tube de prélèvement de sang sous n'importe quelle forme. Les perles de gel préférées peuvent être introduites convenablement à la pipette au fond d'un tube de prélèvement de sang. Il est possible d'utiliser n'importe quel nombre de perles ou n'importe quelle surface de perles; cependant, la vitesse de coagulation avoisine un maximum asymptotique de la manière représentée sur la figure 3. EXEMPLE 1 Préparation de la perle centrale ml d'une solution à 0,25 % en poids de CMC sodique ont été ajoutés goutte à goutte, en agitant douce- ment, à 400 ml d'une solution aqueuse 0,1 molaire de nitrate de plomb et le mélange a été agité doucement pendant une nuit à température ambiante. Les perles se sont formées à la surface et ont coulé lentement au fond du bain. On a laissé les perles de déposer, puis on les a lavées avec de l'eau10 désionisée par agitation pendant 30 minutes et décantation. Le lavage a été continué (environ 4 fois) jusqu'à ce que la solution de lavage possède une conductivité finale inférieure à 20 microsiemens. Les perles sont constituées de molécules de CMC réticulées avec du plomb, de groupes carboxylate de plomb et de groupes carboxyle libres. Les perles sont très uniformes et possèdent un diamètre moyen de 2,11 mm. Les résultats d'activation de coagulation de ces perles centrales ont été obtenus par le mode opératoire de l'exemple 5 et sont présentés sur la figure 3. EXEMPLE 2 Préparation de perles multicouches Une solution à 0,05 % en poids de poly-DADMAC a été ajoutée aux perles centrales de l'exemple 1. Le mélange a été agité pendant environ 1 heure et la solution de poly- DADMAC a été décantée. Les perles ont été lavées cinq fois avec de l'eau désionisée, pendant plusieurs heures. Ces perles de stade 2 ont été ensuite traitées avec une solution à 0,025 % en poids de CMC sodique pendant environ 1/2 heure puis ont été lavées cinq fois pour obtenir les perles multicouches préférées de stade 2 de la présente invention. Les perles multicouches de stade 2 ont été ensuite soumises à un traitement supplémentaire successivement avec du poly- DADMAC et de la CMC sadique, ce qui a donné des perles appelées perles de stade 3 et perles multicouches de stade 3. EXEMPLE 3 Comparaison des activations de coagulation par des perles centrales et des perles multicouches Quatre perles centrales de l'exemple 1 et quatre perles multicouches de chaque stade de l'exemple 2 ont été testées en ce qui concerne le temps de coagulation, confor- mément à l'exemple 5. Les résultats de cette expérience sont montrés sur la figure 4. On constate que, bien que les perles multicouches possèdent un temps de coagulation légèrement supérieur à celui des perles centrales, les perles multi- couches sont préférées car elles sont plus stables vis-à-vis d'un choc mécanique, tel que la centrifugation. La figure 4 permet également de constater qu'aucune amélioration supplé- mentaire du temps de coagulation n'est obtenue par addition des couches supplémentaires des perles de stade 3 et des perles multicouches de stade 3. EXEMPLE 4 Préparation d'un CPE activateur de coagulation sur du papier- filtre Un morceau de papier-filtre cellulosique de 2 inches x 1/2 inch a été plongé dans une solution de CMC jusqu'à saturation, puis a été plongé dans un bain de nitrate de plomb. Le papier a été enlevé, lavé, séché à l'air et coupé en disques au moyen d'un poinçon de découpage de papier pour obtenir une surface de 56 mm2 par disque. Des nombres différents de disques ont été introduits dans un tube de PS et l'activation de coagulation a été déterminée par le mode opératoire de l'exemple 5. Les résultats sont présentés sur la figure 5. On constate que la coagulation avec la forme de réalisation de CPE sur du papier-filtre est plus rapide que la coagulation dans le tube dépourvu d'activateur mais pas aussi rapide qu'avec la perle de gel. EXEMPLE 5 Préparation de tubes pour des études de coagulation Du plasma pauvre en plaquettes (PPP) a été préparé en séparant par centrifugation les cellules de sang citraté de porc (Environmental Diagnostics Inc.). Un volume d'approximativement 0,5 ml de PPP a été introduit dans des tubes à essais en PS (Becton Dickinson, 13 mm par 75 mm) contenant un nombre connu ou une surface connue de perles d'activateur d'essai et les tubes ont été équilibrés à10 température ambiante dans un bain d'eau pendant 15 minutes. Après mise à l'équilibre, 200 g1 d'une solution de CaCl2 0,2 M par ml de PPP ont été ajoutés pour déclencher la coagulation. Les contenus des tubes ont été mélangés sur un mélangeur à mouvement d'inversion de laboratoire et le temps15 de coagulation a été noté pour chaque tube. Le PPP coagulé a été différencié du PPP non coagulé par un passage évident d'un état fluide à un état gélatineux ne s'écoulant pas dans le tube lors de la rotation. Le temps de coagulation a été mesuré à ce point. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Additif d'activation de coagulation pour un récipient de prélèvement de sang, comprenant un complexe polyélectrolytique insoluble possédant une charge de surface,5 caractérisé en ce que ledit complexe comprend: a) une structure centrale constituée d'un poly- électrolyte réticulé, ayant une charge de sur- face; b) un premier revêtement de polyélectrolyte sur ladite structure centrale, ledit premier revête- ment ayant une charge de surface opposée à celle de ladite structure centrale; et c) un second revêtement de polyélectrolyte sur ledit premier revêtement, ledit second revête- ment ayant une charge de surface opposée à celle dudit premier revêtement, au moins un des élé- ments consistant en ladite structure centrale, ledit premier revêtement et ledit second revête- ment étant formés d'un polyélectrolyte carboxylé dépourvu de groupes acide mannuronique. 2. Additif d'activation de coagulation pour un récipient de prélèvement de sang, caractérisé en ce qu'il comprend un polyélectrolyte carboxylé réticulé insoluble dépourvu de groupes acide mannuronique. 3. Additif suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que le polyélectrolyte est un dérivé de cel- lulose. 4. Additif suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que le polyélectrolyte est réticulé par un ion métallique divalent ou polyvalent. 5. Additif suivant la revendication 2, carac- térisé en ce qu'il comprend en outre un revêtement d'un polyélectrolyte chargé positivement sur le polyélectrolyte carboxylé. 6. Additif suivant la revendication 5, carac- térisé en ce qu'il comprend en outre un second revêtement d'un second polyélectrolyte carboxylé sur le premier revête- ment. 7. Additif suivant la revendication 5, caracté- risé en ce que le polyélectrolyte chargé positivement comprend un sel d'amine. 8. Additif d'activation de coagulation pour un récipient de prélèvement de sang, comprenant un complexe polyélectrolytique soluble ayant une charge négative sur sa surface, caractérisé en ce que ledit complexe comprend: a) une structure centrale constituée d'un poly- électrolyte carboxylé réticulé avec un ion métallique polyvalent; b) un premier revêtement sur ladite structure centrale, ledit premier revêtement étant consti- tué d'un polyélectrolyte chargé positivement, comprenant un groupement consistant en un sel d'amine; c) un second revêtement sur ledit premier revête- ment, ledit second revêtement étant constitué d'un second polyélectrolyte carboxylé, au moins un desdits premier et second polyélectrolytes carboxylés étant dépourvu de groupes acide mannuronique. 9. Additif suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que les premier et second polyélectrolytes carboxylés sont choisis dans le groupe consistant en la carboxyméthylcellulose, l'acide alginique et un polymère d'acide acrylique. 10. Dispositif de prélèvement de sang, carac- térisé en ce qu'il comprend: a) un récipient de prélèvement de sang ayant une extrémité ouverte; b) une cloison perforable recouvrant ladite extré- mité ouverte; et c) un additif insoluble d'activation de coagulation dans ledit récipient, ledit additif comprenant un complexe polyélectrolytique réticulé in- soluble ayant une charge de surface, ledit additif étant l'additif suivant une des reven- dications 2 et 8.