Brevet FR2721617A1 — publié le 19951229

La présente invention est relative à des fragments d'acides nucléiques, dérivés du génome de Mycobacterium xenopi, à leurs applications au typage et à l'identification spécifique de Mycobacterium xenopi et au dépistage des infections à Mycobacterium xenopi ainsi qu'à des plasmides contenant lesdits fragments. En Europe, M. xenopi représente l'une des espèces fréquemment isolée, parmi les mycobactéries pathogènes et constitue avec M. kansasii et M. avium, l'agent principal des infections pulmonaires dues à des mycobactéries opportunistes chez les patients séronégatifs vis-à-vis du virus de l'immunodéficience humaine. Toutefois, les maladies pulmonaires dues à ces différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement. Chez les patients atteints de SIDA, des infections disséminées dues à M. xenopi ont été signalées aussi bien en Europe qu'aux Etats-Unis (V. AUSINA et al., 1988, Ann. Intern. Med., 109, 927-928 ; R.W. SHAFER et al., 1992, AIDS. Clin. Infect. Dis., 15, 161-162) et peuvent être de diagnostic difficile. Des maladies pulmonaires nosocomiales ont également été mises en évidence et sont dues à la présence de M. xenopi dans l'environnement et notamment dans 1' eau du robinet. L'existence de mycobactérioses pulmonaires dues à plusieurs types de mycobactéries et la difficulté de les distinguer par des signes cliniques, nécessite la mise au point de méthodes rapides de détection et d'identification spécifique de chacune de ces mycobactéries, notamment dans la mesure où les traitements applicables sont différents. En outre, dans les différentes infections à mycobactéries, ces dernières sont souvent présentes en faibles quantités, et lorsqu'elles sont en quantités détectables par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage. Plusieurs techniques sont actuellement utilisées en clinique, pour identifier l'espèce impliquée dans une infection mycobactérienne ; on peut citer notamment - la détection directe des microorganismes au microscope ; cette technique est rapide mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité, dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échantillon (supérieur à 104/ml) pour permettre une détection fiable. - les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 % et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée (tests biochimiques) ; néanmoins, il s'agit d'un processus à long terme qui nécessite au moins 4 semaines pour la formation de colonies et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif. - les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faible. - la présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec des sondes, de préférence non-radioactives, qui sont soit des sondes spécifiques des séquences d'ADN des différentes espèces de mycobactéries ; soit des sondes spécifiques d'une portion conservée de l'ARN 16S, qui ont permis de simplifier et de réduire la durée d'identification des mycobactéries. Ces sondes ont montré leur intérêt pour l'identification du bacille de la tuberculose, de M. avium, de M. intracellulare et de M. gordonae (M. GOTO et al., J. Clin. microbiol., 1991, 29, 2473-2476 L. LEBRUN et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30, 247624778), mais ne sont pas utilisables pour M. xenopi. - plusieurs méthodes ont été récemment développées, utilisant la PCR, pour l'amplification d'un fragment sélectionné pour sa séquence hypervariable dans un gène conservé parmi les mycobactéries ; il s'agit, en particulier, de fragments correspondant à 1'ARN 16S ou au gène codant pour la protéine de 65 kDa (PLIKAYTIS B.B. et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 7, 1815-1822). Le séquençage direct du produit amplifié assure un moyen d'identification certain, mais nécessite, pour une application en routine, un séquenceur automatique, qui est un investissement bien trop important pour la plupart des laboratoires. - pour éviter le séquençage du produit amplifié, certains Auteurs ont mis au point une analyse des fragments de digestion obtenus à partir des produits de la PCR (A. TELENTI et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 31, 175-178, PLIKAYTIS B.B. et al., précité). Cependant, de telles méthodes nécessitent plusieurs digestions et plusieurs enzymes pour établir une identification certaine et sont donc également difficiles à mettre en oeuvre en routine. Les différentes méthodes de détection de l'Art antérieur ne permettent donc pas d'identifier et/ou de dépister rapidement une infection à M. xenopi ; or une telle identification d'espèce est cruciale, pour donner aux patients, dans les meilleurs délais, le traitement le plus adapté. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé d'identification et/ou de dépistage spécifique de M. xenopi, permettant une identification d'espèce rapide et/ou une détection de faibles quantités d'ADN extraits des germes, eux-mêmes en nombre restreint, et de révéler la présence desdites mycobactéries, directement dans les échantillons pathologiques. C'est également un but de l'invention de pourvoir à des réactifs d'identification et de dépistage spécifique de M. xenopi. La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi et en ce qu'elle ne s'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie. On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple brin que les produits de transcription desdites séquences. De telles conditions d'hybridation peuvent être notamment définies comme suit : 6xSSC, 5x solution de Denhardt, SDS à 0,5 %, 100 g d'ADN de sperme de saumon dénaturé/ml, sonde d'ADN marqué au 32P (106 cpm/ml), pendant 16 h à 68 C. Selon un mode de réalisation préféré de ladite séquence nucléotidique, elle est contenue dans une séquence PstI-PstI de 1200 paires de bases (pb) de 1'ADN génomique de M. xenopi (SEQ n"l) ou un fragment de celleci. Cette séquence de 1200 pb est, de manière inattendue, commune à toutes les souches de M. xenopi. La présente invention englobe également les fragments de cette séquence de 1200 pb, utiles pour l'identification de l'espèce M. xenopi, et notamment - un fragment de 288 pb, de formule (SEQ n'2) suivante CACACCGATTGTG, - GGAATAGTCAGAGCCCG (XEN1) (SEQ n 4) et - GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2) (SEQ n'5). L'invention vise aussi des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents, ainsi que des fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlèvement ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 % par rapport à la longueur des fragments ci-dessus, et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec la séquence d'ADN de M. xenopi, analogue à celle que présentent les fragments correspondants non modifiés. La présente invention a également pour objet des réactifs d'identification de M. xenopi, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci, tels que définis cidessus, éventuellement associés à un marqueur approprié. Un tel réactif permet, de manière inattendue, l'identification spécifique de M. xenopi, à l'exclusion de toute autre mycobactérie. Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie cidessus. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une paire d'amorces conforme à l'invention est notamment constituée par l'oligonucléotide XEN1, apparié à l'oligonucléotide XEN2. Ces amorces permettent notamment la synthèse de la séquence n-3 définie ci-dessus et/ou de son brin complémentaire. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde de détection est sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence n'l, la séquence n-2 et la séquence nQ3, telles que définies cidessus. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le Brevet français 2 518 755 ou la Demande de Brevet européen 0 158 758. Lesdits réactifs peuvent être utilisés dans un très grand nombre de techniques de diagnostic, basées sur la détection d'acide nucléique par hybridation. La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinants, caractérisés en ce qu ' ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ n'l ou un fragment de celle-ci. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence associée à un vecteur pBS. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ n-2. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC18. La présente invention a également pour objet un procédé d'identification rapide et spécifique de M. xenopi, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces telle que définie ci-dessus, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, préalablement à l'étape (1), les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats, constituant la source d'ADN, et ce, sans nécessiter d'autre purification. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, ladite paire d'amorces correspond à la paire XEN1-XEN2, capable d'hybrider les extrémités 5' et 3' d'un fragment spécifique de M. xenopi. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé d'identification, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces conforme à l'invention et permet l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter. L'étape d'amplification est notamment l'une des techniques d'amplification géniques, telle que la méthode Qss-réplicase (LIZARDI PM. et al., Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite PCR (Polymerase Chain Reaction) décrite dans les Demandes de Brevet européen 0 200 363, 0 201 184 et 0 229 701 déposées par CETUS CO. En variante, l'étape d'amplification du fragment de 1'ADN contenant la séquence spécifique de 288 pb, est réalisée conformément au procédé décrit dans la Demande de Brevet français 92 13562, au nom de BIOMERIEUX. Conformément au mode de mise en oeuvre précité, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié. En variante, l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'un transfert sur membrane (méthode de Southern) et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive telle que définie ci-dessus. Un tel procédé a l'avantage de fournir un test sensible et spécifique, direct et rapide (moins de 24 h), de dépistage spécifique d'une infection à Mycobacterium xenopi, à l'exclusion de toute autre infection mycobactérienne (groupe du bacille de la tuberculose, groupe MAIP (M. avium, M. intracellulare, M. paratuberculosis) ou M. celatum). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde telle que définie ci-dessus. La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et/ou du procédé de dépistage conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés : - des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention, - et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à 1' invention, - et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de l'ADN de l'échantillon à tester. Selon un mode de réalisation avantageux du kit, celui-ci comporte - une paire d'amorces constituée par les séquences SEQ n-4 (XEN1) et SEQ n"5 (XEN2) définies plus haut, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification, - éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence de fragments amplifiés, plus particulièrement une sonde nucléique ayant une longueur d'au moins 20 bases, capable de s'hybrider avec une partie de la séquence n 2 ou n 3, se situant entre les deux fragments de la paire d'amorces susdite. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : séquences nucléotidiques conformes à l'invention. 1) Fragment PstI-PstI de 1200 Db (SEQ n'l) a. Extraction de l'ADN Les mycobactéries sont cultivées sur un milieu Middlebrook 7H9 contenant de la glycine à 1,4 % (p/v), du lysozyme (400 Fg/ml) et de la D-cyclosérine (200 Rg/ml) pendant 24 h à 37C. Les cultures sont ensuite centrifugées à 3 000 rpm pendant 20 min. Les culots sont remis en suspension dans un tampon TEN (pH 8), comprenant du Tris 50 mM, de l'EDTA 50 mM et du NaCl 10 mM, traités avec de la protéinase K à 2,25 mg/ml et du SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) à 0,6 % (p/v) et incubés pendant une nuit à 37 C. On ajoute ensuite du SDS et les tubes sont à nouveau incubés pendant 30 min à 60'C. L'ADN est purifié avec un mélange phénol-chloroforme, précipité avec l'éthanol et dissous dans un tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). b. Digestion par l'enzyme PstI Environ 1 Rg de l'ADN mycobactérien génomique, obtenu en a., est digéré avec l'enzyme de restriction PstI, pendant 16 h à 37 C. Les produits de la digestion sont séparés pendant 1 nuit par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7 % à 1,5 volt/cm. On obtient ainsi notamment un fragment PstI- PstI de 1200 pb, présent dans toutes les souches M. xenopi. 2) Fraqment de 288 Db (SEQ n'2) Ce fragment est obtenu par PCR, réalisée soit à partir du fragment de 1200 pb, soit directement à partir d'un échantillon de M. xenopi, dans les conditions suivantes a. Lyse des mycobactéries Des mycobactéries de l'espèce M. xenopi sont mises en suspension dans de l'eau distillée et soumises à 3 cycles d'ébullition-congélation, comprenant chacun 5 min à 100-C et 5 min à -20'C ; on obtient ainsi un lysat cellulaire, qui est utilisé comme source directe d'ADN, sans nécessiter d'autre purification. b. Amplification de 1'ADN L'amplification est réalisée comme suit 100 pl d'un mélange réactionnel contenant - 1 x d'un tampon Taq polymérase (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gélatine à 0,01 % (p/v)), - 200 RM de chaque désoxynucléoside triphosphate, - 0,3 CLAM d'une seule amorce, dénommée DKU49, de séquence 5'-CCGCCGACCGAG-3' (P.S. PALITTAPONGARNPIM et al., 1993, J. Infect.Dis., 167,975-978), et - 2 unités de Taq polymérase, recouvert d'huile minérale et soumis à 35 cycles comprenant chacun 1 min à 95 C, 1 min à 60'C, 1 min à 72 C, puis à une extension de 10 min à 72 C en utilisant un thermocycleur Techné. De manière inattendue, l'utilisation de cette amorce DKU49 (PALITTAPONGARNPIM P. et al., J. Infect. Dis., 1993, 167, 975-978), préalablement utilisée pour l'amplification de M. tuberculosis, permet effectivement d'amplifier, dans des conditions plus stringentes, c'està-dire en réalisant l'hybridation à 60'C et non à 40'C, un fragment de 288 pb spécifique de M. xenopi. c. Analyse de la séquence amplifiée La figure 1 illustre la spécificité du fragment de 288 pb, vis-à-vis de l'espèce M. xenopi. En effet, toutes les souches de M. xenopi produisent un fragment de 288 pb, lorsque leur ADN est soumis à une PCR qui utilise l'amorce DKU49, aussi bien après électrophorèse sur gel d'agarose des produits amplifiés (figure 1A), qu'après analyse en Southern blot desdits produits amplifiés (figure 1B), alors que les souches d'autres espèces ne produisent pas un tel fragment dans les mêmes conditions : les pistes 1 à 3 et 14 correspondent à des isolats de M. xenopi ; les pistes 4, 8, 11, 12 et 13 correspondent respectivement à M. celatum, M. chelonae, M. simiae et M. scrofulaceum ; les pistes 5 et 6 correspondent à des souches de M. avium; les pistes 7 à 9 correspondent à des souches de M. tuberculosis. La piste 10 correspond à de l'ADN k digéré par l'enzyme de restriction PstI, utilisé comme produit de contrôle. La figure 1A correspond à une électrophorèse en gel d'agarose à 1,5 % de la séquence de 288 pb, qui est ensuite détectée par coloration au bromure d'éthidium. La figure 1B correspond à l'analyse du produit d'amplification (fragment de 288 pb) par une méthode de Southern effectuée dans les conditions suivantes * Dépurination Le gel obtenu est agité 20 min dans une solution d'HCl 0,25 M (13 ml HCl + 500 ml eau distillée), puis rincé 3 fois avec de l'eau distillée. * Dénaturation Le gel est ensuite agité 20 min avec un tampon 1 (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M). * Neutralisation Le gel est ensuite rincé rapidement avec un tampon 2 (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1 M à pH 8), puis incubé avec ce même tampon 2 pendant 30 min. * Transfert Le transfert sur une membrane de nylon Hybond, humidifiée dans une solution lx SSC (NaC1, citrate de sodium), est effectué pendant une nuit. * Hybridation Les séquences obtenues ci-dessus sont soumises aux conditions d'hybridation suivantes - ler protocole la membrane est pré-hybridée pendant 1 h à 42 C et à 6 rpm avec 30 ml, pour un blot de 320 cm2, d'un tampon d'hybridation fourni dans le kit ECL Amersham RPN 3001, et préchauffé à 42 C, pendant 30 min à 1 h) on ajoute une sonde telle que préparée comme précisé en d. ci-dessous, à une concentration de 10 ng/ml, puis la membrane est hybridée à 42 C pendant 1 nuit . 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit 1er lavage la membrane est lavée 10 min, à 55 C, dans un tampon A (1,6 ml de SDS à 10 %, 1 ml de 20x SSC, 37,4 ml d'eau distillée pour 320 cm2, préchauffé à 55C) 2ème lavage : identique au premier lavage 3ème lavage, réalisé sous agitation : la membrane est lavée 5 min à température ambiante dans un tampon B (2x SSC) 4ème lavage : identique au troisième lavage. - 2ème srotocole : La membrane est hybridée avec un tampon comprenant 6xSSC (lxSSC : NaCl 0,15 M, tampon citrate de sodium 0,015 M) 5x de réactif de Denhardt (une solution stock 50x de réactif de Denhardt comprend : 5 g de Ficoll, 5 g de polyvinylpyrrolidone, 5 g de sérum albumine bovine et 500 ml d'H2O), SDS à 0,5 %, 100 g d'ADN de sperme de saumon dénaturé/ml, en présence d'une sonde d'ADN marqué au 32P (106 cpm/ml), pendant 16 h à 68'C. 4 lavages sont ensuite réalisés comme suit ler lavage la membrane est lavée 10 min, à 65 C, dans un tampon 2xSSC. 2ème lavage : identique au premier. 3ème lavage : la membrane est lavée 30 min, à 65 C, dans un tampon comprenant 2xSSC et du SDS à 0,1 %. 4ème lavage la membrane est lavée 10 min, à 65 C, dans un tampon 0,1xSSC. * Détection Les membranes sont ensuite rapidement séchées. La sonde ayant hybridée (ler protocole) est détectée comme suit on incube la membrane, 1 min, dans une solution de détection Amersham (réactif de détection ECL, référence RPN 2105), on sèche rapidement l'excès de solution de détection et on révèle par autoradiographie. d. Mise en évidence de l'hybridation du fragment de 288 pb avec la séquence de 1200 pb - Préparation de la sonde L'ADN amplifié (séquence de 288 pb) est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % ; le fragment ainsi séparé est alors récupéré par électroélution à travers une membrane de dialyse, immergée dans de l'eau stérile. L'ADN ainsi obtenu est ensuite purifié par précipitation au chloroforme et à l'éthanol. La sonde est alors marquée avec de la peroxydase de raifort en utilisant le kit Amersham ECL (direct nucleic acid labelling and detection systems (réf. RPN 3001)). - Echantillons d'ADN On utilise un fragment de 1200 pb tel que préparé en 1) ci-dessus, ou de 1'ADN mycobactérien génomique extrait à partir de souches de M. xenopi et digéré avec l'enzyme de restriction PstI, dans les mêmes conditions que ci-dessus. Les gels obtenus sont transférés sur des membranes de nylon par la méthode de Southern et hybridés avec la sonde marquée conforme à l'invention, comme précisé ci-dessus en c.. Un test d'hybridation comparatif a été réalisé, dans les mêmes conditions que ci-dessus, avec 21 différentes espèces de mycobactéries répertoriées, ciaprès, au Tableau I. TABLEAU I Nombre de souches testées Espèces Identification Analyse en PCR Southern blot M. xenopi 38 28 M. avium 8 3 M. celatum 5 2 M. chelonae 5 NF * M. flavescens 5 2 M. fortuitum 5 2 M. gastri 2 1 M. gordonae 6 2 M. kansasii 6 1 M. malmoense 5 1 M. marinum 5 NF M. non chromogenicum 3 1 M. scrofulaceum 3 1 M. shimoïdei 1 1 M. simiae 5 1 M. smegmatis 1 1 M. szulgaï 1 1 M. terrae 5 1 M. ulcerans 1 1 M. vaccae 1 1 M. tuberculosis 6 2 M. bovis 1 1 M. bovis BCG 1 1 M. africanum 1 1 NF : non fait La figure 3 illustre les résultats obtenus et montre que dans les conditions d'hybridation précisées ci-dessus, le fragment de 288 pb s'hybride exclusivement avec les souches de l'espèce M. xenopi (28 souches testées) et plus particulièrement avec le fragment de digestion PstI d'environ 1200 pb que l'on retrouve dans toutes les souches de M. xenopi, alors que cette sonde ne reconnaît aucun fragment d'autres ADN mycobactériens. La comparaison des figures 1A et 3 montre une parfaite corrélation entre les résultats obtenus par les deux méthodes : PCR et analyse en Southern blot. Dans cette figure 3 (analyse en Southern blot de l'ADN digéré par l'enzyme de restriction PstI de différentes souches mycobactériennes avec la sonde spécifique de M. xenopi de 288 pb), les pistes 1 à 4 et 11 à 16 correspondent à des souches de M. xenopi ; les pistes 5 et 8 correspondent à des souches de M. tuberculosis; les pistes 6 et 7 correspondent à des souches de M. avium, les pistes 9 et 10 correspondent à des souches de M. bovis et de M. celatum respectivement. e. Séquençage Ce fragment de 288 pb, produit par PCR en utilisant l'amorce DKU49 comme précisé ci-dessus en 2) b., a été cloné dans un vecteur pUC18, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction SmaI. Les clones obtenus ont été transformés dans les souches d'E. coli TG1. Les colonies recombinantes ont été sélectionnées sur milieu solide LB complémenté avec de l'isopropyl -D-thiogalactoside, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D- galactopyranoside (X-gal) et de l'ampicilline à 100 Rg/ml. Les plasmides pUC18 qui contiennent les inserts sont purifiés en utilisant des mini-colonnes Qiagene (kit "Midi" Qiagen3, Qiagen Inc, USA). Les séquences des inserts mycobactériens de trois souches différentes de M. xenopi ont ainsi été réalisées par la méthode de SANGER (F. SANGER et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467) en utilisant de la séquénase. Dans les 3 souches étudiées, les deux brins ont été séquencés. La séquence nucléotidique du fragment amplifié est identique dans les 3 souches et la séquence complète du fragment de 288 pb est représentée à la séquence n-2. Cette séquence ne présente pas d'homologie significative avec des séquences décrites précédemment. 3) Fragment de 263 Db (SEQ n'3) Dans les mêmes conditions que celles de 2), lorsque l'on réalise la PCR avec les amorces conformes à l'invention, XEN1 (SEQ n 4) et XEN2 (SEQ n'5), on obtient le fragment de 263 pb, qui constitue une sonde hautement spécifique de détection de M. xenopi. Ces amorces sont significativement plus spécifiques que l'amorce DKU49. En effet, cette dernière bien que permettant la production du fragment de 288 pb décrit ci-dessus et également hautement spécifique de M. xenopi, lorsqu'elle est utilisée pour réaliser des amplifications, entraîne la production d'un fragment additionnel de 800 pb (figure 1A), pour la majorité des souches. Aussi bien le produit de 288 pb que le produit de 263 pb sont hautement spécifiques de M. xenopi et n'hybrident avec aucune des souches d'autres espèces mycobactériennes ; même M. celatum, une nouvelle espèce de mycobactérie récemment isolée et qui présente des similarités phénotypiques avec M. xenopi ne présente pas d'hybridation croisée avec ces sondes spécifiques. Les amorces XEN1 et XEN2 qui permettent l'amplification de ce fragment de 263 pb dans toutes les souches de M. xenopi, même dans celles qui accumulent en outre un fragment de 800 pb lorsque l'on utilise l'amorce DKU49 (figure 4), sont particulièrement intéressantes pour obtenir un profil PCR unique, partagé par toutes les souches de M. xenopi et consistant en une seule bande. EXEMPLE 2 : test d'identification de M. xenopi. 1) Ce test est réalisé selon le protocole exposé à l'Exemple 1, à savoir obtention d'un fragment PstI-PstI, à partir d'ADN génomique, amplification avec les amorces XEN1 et XEN2 et détection des fragments amplifiés. 2) Spécificité et de la sensibilité du test conforme à l'invention La sensibilité des tests PCR a été déterminée par une amplification réalisée avec des dilutions au 10ème en série, à partir de 1'ADN matrice. Les résultats sont illustrés à la figure 2, dans laquelle les pistes 1 à 10 correspondent à des dilutions au 10ème, commençant à environ 10 ng d'ADN. La piste 11 correspond à de 1'ADN X digéré avec l'enzyme de restriction PstI (contrôle) ; les dilutions ont été effectuées dans de l'eau stérile. Le fragment de 288 pb peut être détecté par coloration au bromure d'éthydium jusqu'à 100 pg d'ADN, tandis que l'hybridation avec la sonde augmente la sensibilité de la détection d'un facteur 1000 (figures 2A et 2B). Dans la mesure où 108 cellules correspondent à environ 1 mg, on peut considérer que la limite de détection du produit de la PCR sur gel d'agarose correspond grossièrement à 103 cellules, qui constitue donc un seuil de sensibilité significativement plus faible que ceux nécessaires pour les tests PCR réalisés dans le but d'identification de souches. Pour déterminer la spécificité de ce test PCR, le fragment de 288 pb a été utilisé comme sonde après son marquage avec de la peroxydase de raifort dans les conditions de l'Exemple 1, 2) d.. Les autoradiogrammes montrent l'hybridation spécifique de cette sonde avec le fragment de la PCR de 288 pb et il n'existe aucune autre bande, ni avec le pro duit de 800 pb retrouvé pour certaines souches de M. xenopi, ni avec les souches d'autres espèces (figure 1B et Tableau I ci-dessus). Le test PCR développé pour la détection de cette cible unique présente une sensibilité suffisante pour un test d'identification (figure 2). Le seuil de détection est aussi bas que cellules, ce qui est largement en dessous de minimum requis lorsque l'on considère qu'une colonie contient 108 cellules. EXKMPLE 3 : Test de dépistage de N. xenopi. Ce test peut être réalisé dans les mêmes conditions que celles de l'Exemple 2. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique, spécifique de M. xenopi et en ce qu'elle ne s'hybride, dans des conditions stringentes d'hybridation, avec aucune autre séquence nucléotidique de mycobactérie. 2 ) Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est contenue dans une séquence PstI-PstI de 1200 paires de bases (pb) de 1'ADN génomique de M. xenopi (SEQ n"l) ou un fragment de celleci. 3 ) Fragment d'une séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 288 pb et présente la formule (SEQ n-2) suivante 4 ) Fragment d'une séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 263 pb et présente la formule (SEQ n-3) suivante CACACCGATTGTG. 5 ) Fragment d'une séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et présente la formule (SEQ n 4) suivante : GGAATAGTCAGAGCCCG (XEN1). 6 ) Fragment d'une séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 17 pb et présente la formule (SEQ n'5) suivante : GTGTTAGCCACACCGTC (XEN2). 7 ) Réactifs d'identification de M. xenopi, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, éventuellement associés à un marqueur approprié. 8 ) Réactifs selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 9 ) Réactifs selon la revendication 8, caractérisés en ce que ladite paire d'amorces est constituée par l'oligonucléotide XEN1 selon la revendication 5, apparié à l'oligonucléotide XEN2 selon la revendication 6. 10') Réactifs selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une sonde de détection et/ou d'identification d'un fragment d'ADN ou d'ARN de M. xenopi. 11') Réactifs selon la revendication 10, caractérisés en ce que ladite sonde de détection est sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence n'l, la séquence n-2 et la séquence n 3, selon l'une quelconque des revendications 2 à 4. 12-) Réactifs selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisés en ce que le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base. 13-) Famille de plasmides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 14-) Plasmide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ n'l ou un fragment de celle-ci, selon la revendication 2. 15-) Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ n'l associée à un vecteur pBS. 16-) Plasmide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ n-2 selon la revendication 3. 17-) Plasmide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ n-2 associée à un vecteur pUC18. 18-) Procédé d'identification rapide et spécifique de M. xenopi, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une étape dans laquelle on met en contact l'acide nucléique de la mycobactérie à identifier, avec une paire d'amorces selon la revendication 8 ou la revendication 9, pour amplifier un fragment d'acide nucléique spécifique de M. xenopi et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1). 19') Procédé d'identification selon la revendication 18, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1), les mycobactéries sont lysées et l'étape (1) est réalisée directement sur lesdits lysats. 20') Procédé d'identification selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces correspond à la paire XEN1-XEN2, capable d'hybrider les extrémités 5' et 3' d'un fragment spécifique de M. xenopi. 21-) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié. 22 ) Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive selon la revendication 10. 23 ) Procédé de dépistage d'une infection à M. xenopi, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de dia gnostic selon l'une quelconque des revendications 7 à 12 et (2) une étape dans laquelle on détecte, par tout moyen approprié, le produit obtenu à l'étape (1). 24 ) Procédé de dépistage selon la revendication 23, caractérisé en ce que le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une paire d'amorces selon la revendication 8 ou la revendication 9 et permet l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter. 25 ) Procédé de dépistage selon la revendication 23 ou la revendication 24, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'une détection à l'aide d'un colorant approprié. 26 ) Procédé de dépistage selon la revendication 23 ou la revendication 24, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend une séparation électrophorétique des produits d'amplification obtenus à l'issue de l'étape (1), suivie d'un transfert sur membrane et d'une hybridation avec une sonde non-radioactive selon la revendication 10. 27 ) Procédé de dépistage selon la revendication 23, caractérisé en ce que le réactif de l'étape (1) est une sonde selon la revendication 10. 28 ) Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et/ou du procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 18 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés - des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces la revendication 8 ou la revendication 9, - et/ou des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon la revendication 10, - et/ou des réactifs de visualisation de la réaction d'hybridation de ladite sonde et de 1'ADN de l'échantillon à tester. 29 ) Kit selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comporte - une paire d'amorces constituée par les séquences SEQ n 4 (XEN1) et SEQ n'5 (XEN2) selon la revendication 5 ou la revendication 6, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification, - éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence de fragments amplifiés, plus particulièrement une sonde nucléique ayant une longueur d'au moins 20 bases, capable de s'hybrider avec une partie de la séquence n-2 ou n'3, se situant entre les deux fragments de la paire d'amorces susdite.