Brevet FR2718149A1 — publié le 19951006

La présente invention concerne une souche de microorganismes et de nouveaux peptides manifestant des propriétés inhibitrices de farnésyl transférase. L'activation des oncogènes ras est impliquée dans 10 à 30% des cancers humains. La protéine correspondante Ras est synthétisée in vivo sous la forme d'un précurseur cytosoluble puis modifiée de façon post-traductionnelle de manière à lui conférer son activité biologique et lui permettre de transformer les cellules de mammifères. La première et obligatoire étape de ces modifications posttraductionnelles consiste en une farnésylation du groupe thiol d'un motif cystéine, localisé au niveau du groupement carbonyle terminal de Ras. Ce motif cystéine fait partie de la séquence d'identification de la prénylation, CAAX, où C représente la cystéine, A un résidu aliphatique et X un acide aminé quelconque. C'est la protéine farnésyl transférase qui catalyse le transfert d'un groupement farnésyle du diphosphate farnésyle au peptide CAAX Ras. Cette protéine farnésyl transférase reconnait des tétrapeptides de type CAAX situés à l'extrémité C- terminale de la protéine à la condition expresse que le quatrième motif à partir de l'extrémité C-terminale soit une cystéine. A l'issue de cette prénylation, la protéine Ras possède l'activité biologique requise pour transformer les cellules. La prénylation apparait donc nécessaire à la régulation de l'activité biologique de la protéine Ras. La découverte de composés inhibant sa modification posttraductionnelle est vite apparue comme un des moyens pour la mise au point de nouveaux traitements anti-cancéreux. Ainsi, des études génétiques ont montré que l'inhibition de la farnésylation de Ras empèchait la localisation de la protéine Ras au niveau membranaire et par conséquent bloquait sa faculté à transformer les cellules normales en cellules cancéreuses. La présente invention a pour objet principal de proposer de nouveaux inhibiteurs de farnésyl transférase. Plus précisément, la présente invention résulte de l'isolement d'une souche de microorganisme apparentée au genre Streptomyces et possédant des propriétés particulièrement avantageuses pour la production de peptides manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase. Un aspect de l'invention concerne donc une souche Streptomyces caractérisée en ce qu'il s'agit du microorganisme Streptomyces CBS 154.94, d'un de ses dérivés ou de ses mutants. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé ou mutant, toute souche obtenue à partir de la souche Streptomyces CBS 154.94 et susceptible d'être utilisée pour la production de peptides selon l'invention et plus particulièrement manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase. En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par modifications génétiques t altération au niveau de 1'ADN) ou biochimiques. A cet effet, différents outils de mutagénèse peuvent être utilisés, comme par exemple des outils non spécifiques: -agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet...) ou -agents chimiques (agents alkylants ou biaikylants, agents intercalants...), ou des outils spécifiques tels que les systèmes d'insertions mutationnelles dirigés sur 1'ADN (transposons, rétrotransposons, plasmides intégratifs, etc). La fermentation de cette souche sur un milieu de culture convenable et l'extraction subséquente du moût de fermentation correspondant permet d'isoler des peptides qui, quoique possédant une structure originale comparativement aux inhibiteurs classiques de farnésyl transférase, se révèlent, de manière inattendue, intéressants à ce titre. La présente invention concerne également des peptides susceptibles d'être obtenus par fermentation de la souche Streptomyces CBS 154.94 ou d'un de ses mutants via l'extraction du moût de fermentation correspondant. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de peptides selon lequel on cultive la souche Streptomyces CBS 154.94 ou l'un de ses dérivés ou mutants et l'on récupère au moins un peptide. La fermentation de la souche est réalisée de manière classique à savoir sur un milieu de culture contenant les susbtrats nécessaires au développement dudit microorganisme et dans des conditions de températures et d'aération adéquates. I1 est clair que la mise au point de ces conditions optimales pour le développement du microorganisme font appel à de simples opérations de routine, familières à l'homme du métier. A titre indicatif, le milieu de culture peut comprendre du glucose, un extrait de levure, un extrait de viande, du NaCl, du CaCO3 et de la gélose. La fermentation est réalisée de préférence à une température supérieure à la température ambiante et plus particulièrement comprise entre 250C et 30"C. Le pH est de l'ordre de 7 et le milieu est aéré et agité. A l'issue de la fermentation, on récupère et centrifuge le moût de fermentation. On procède ensuite à l'extraction du surnageant et du culot mycélien correspondants. Leur extraction est effectuée à l'aide d'un solvant organique adéquat. I1 s'agit de préférence d'acétate d'éthyle. Les phases organiques respectives sont réunies, concentrées et chromatographiées de manière à isoler les peptides actifs. L'exemple 1, présenté ci-après, rend compte de manière détaillée de ce processus d'isolement des peptides à partir du moût de fermentation. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des peptides de formule générale I dans laquelle: R1, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en C1 à C4. Plus particulièrement, il s'agit de composés de formule générale I dans laquelle R4 représente un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène. A titre de peptides préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner les peptides 1, 2 et 3 suivants: Dans le cas du peptide N"1, R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène et R4 un groupement méthyle. -Dans le cas du peptide N"2, R2 et R4 représentent un groupement méthyle et R1 et R3 un atome d'hydrogène. -Dans le cas du peptide N"3, R1, R2, et R4 représentent un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène. De manière inattendue, ces peptides présentent une activité significative in vitro dans le test d'inhibition de la farnésyl transférase. Le principe de la technologie SPA ( Scintillation Proximity Assay) est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase. Selon cette méthode, l'activité inhibitrice farnésyl transférase est déterminée par la quantité de (3H1 farnésyle transférée à partir du (3H) farnésyl pyrophosphate ((3HlFPPl sur un substrat accepteur biotinylé. La présente invention se rapporte également à l'utilisation des peptides selon l'invention dans les traitements anticancéreux. Elle concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'invention en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs. 1 MATERIELS ET METHODES Un échantillon de la souche Streptomyces selon l'invention et mise en oeuvre dans l'exemple présenté ci-après, a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmel culturen (CBS) à Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 154.94. Méthode employée pour détecter les métabolites actifs : test d'inhibition de la farnésyl transférase par scintillation proximity assav tSPAi. Le principe de la technologie SPA [ H.E. Hart and E.B. Greenwald, J. Nucl Med, 20, 1062-1065, 1979 et Nelson N., Analytical Biochemistry, 165, 287293,1987.1 est appliquée au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase (Ftase). Cette enzyme a été partiellement purifiée à partir de cellules THP1 humaines (Fromage N., Guitton J.D., Joyeux C., Desanlis F., Boniface O., Soria H.M., Boucher F., Clerc F.F., Crespo A., Duchesne M., Lavayre J., Tocque B;, Van Der Pyl D., Mayaux J.F., Becquart J., 5th European Meetnig of GFBC on bio-chromatography and molecular biology, May 12-14, 1992, Francs.). Le substrat accepteur, biotinylé, est un peptide de 11 acides aminés correspondant à la sequence terminale de la lamine-B (BLB). Le substrat donneur, le farnésyl pyrophosphate est marqué au tritrium (FPP 3H1. L'enzyme transfère le FPP 3H au substrat accepteur biotinylé et une fois la réaction arrêtée, le peptide farnésylé est capturé par des billes encapsulant un scintillant fluorescent et couplées à la streptavidine (kit Amersham, TRKQ70î0). Le peptide radio-marqué, excite les billes qui émettent alors de la lumière que l'on quantifie dans un compteur à scintillation solide-liquide (TopcountS), Packard). La réaction SPA est démarrée en ajoutant 40pl de Ftase (2 g) dans une microplaque contenant 20 p1 de BLB (0,1 pM1, 20 p1 de FPP 3H (0,12 LtM) et 20 p1 de tampon d'essai 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgC12, 5 mM MT, 20 mM KCl, 0.01 % triton X100 (témoin) ou 20 111 d'échantillon dilué dans le tampon d'essai (screening). La plaque est incubée 60 minutes à 37 C et la réaction est stoppée par l'ajout de 150 pi de réactif d'arrêt contenant les billes SPA. La plaque est scellée avec un film adhésif et laissée 30 minutes à température ambiante pour atteindre l'équilibre, puis comptée dans le compteur Topcount. Les résultats sont comptés en désintégration par minute, dpm, et exprimés en % d'inhibition par rapport au témoin enzyme (après soustraction du blanc). Les CI50 des composés sont calculées par régression non linéaire. EXEMPLE 1 Préparation de métabolites actifs selon l'invention à partir de la souche Strer > tomvces CBS 154.94. Un erlenmeyer de 2000 ml rempli avec 250 ml de milieu (peptones 5 g/l, extrait de levure 5 g/l, extrait de viande 5 g/l, glucose 15 g/l, NaCl 5 g/l, CaC03 3 g/l, gélose 1 g/l, pH 7,0) est ensemencé par une culture de Streptomyces CBS 154.94 sous forme de culture liquide congelée. n est agité à 150 trs/min dans un agitateur thermostaté à 280C. Après 72 heures, 64 % de cette culture sont transférés dans un ballon de 6000 ml rempli par 2000 ml du même milieu. Ce ballon, muni de 2 tubulures latérales (une pour l'ensemencement, l'autre pour l'inoculation du fermenteur) est mis en agitation à 28"C sur un tambour magnétique à 1000 tours par minutes environ. Après 72 heures d'incubation, la totalité de eette culture est transférée stérilement dans un fermenteur de production de 100 litres rempli avec 60 litres de milieu préalablement stérilisé (20 minutes à 1200C) lAlburexXN 20 g/l, glycérol 15 g/l, CaC03 2 g/ll. Pendant 91 heures la culture est maintenue à une température de 28"C, une pression de 0,4 bar, agitée à 400 trs/min et aérée à raison de 2 m3/hr. 56,2 kg de moût sont centrifugés à l'aide d'une centrifugeuse Sharples AS16X. Un surnageant aqueux et un culot mycélien sont ainsi obtenus. Le surnageant est extrait par 2 fois avec 1 volume d'acétate d'éthyle. Après décantation la phase organique est concentrée sous pression réduite à 2 litres. Le culot mycélien est repris par 40 litres d'un mélange acétone/eau 80:20 pour délitage pendant 2 heures. Les débris cellulaires sont écartés par filtration sur verre fritté et le filtrat est concentré sous vide pour éliminer l'acétone jusqu'à un volume de 6 litres. Les 6 litres de phase aqueuse pe pH mesuré est de 5,8) sont extraits par 2 fois 15 litres d'acétate d'éthyle. Après décantation, la phase organique est concentrée sous pression réduite à 2 litres. Les extraits acétate d'éthyle, issus du traitement du filtrat et du mycélium, sont réunis et évaporés pour conduire à un extrait huileux de 57 g. Cet extrait est repris par 150 ml de butanol puis précipité par addition de 1350 ml de n-heptane sous forte agitation. Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité formé est séparé par filtration sur verre fritté. Un extrait de 21,7 g présentant une CI50 inférieure à 3 iig/ml est obtenu après séchage une nuit à l'étuve sous vide. EXEMPLE 2 Isolement et caractérisation des métabolites actifs L'extrait, obtenu selon l'exemple précédent, est mis en solution dans 150 ml d'un mélange CH2Cl2/MeOH 95:5 et chromatographié sur silice (colonne de 180 x 200 mm muni d'un fritté et contenant 650 g de silice AmiconX 40-60 lini tassés sous vide). L'élution s'effectue par paliers successifs de CH2C12/MeOH: 90/05v/v 1000 ml pour la fraction 1 90/10v/v 1000 ml pour la fraction 2 80/20v/v 1000 ml pour la fraction 3 70/30v/v 1000 ml pour la fraction 4 60/40v/v 1000 ml pour la fraction 5 50/50v/v 1000 ml pour la fraction 6 Après évaporation sous pression réduite des fractions 4 et 5 on obtient 4,82 g d'extrait actif présentant une CI50 voisine de 1 pg/ml. L'étape suivante de purification consiste en une chromatographie liquide sur colonne de silice greffée C18: l'extrait actif précédent, remis en solution dans un mélange MeOH/H2O 10:90, est percolé à un débit de 10 ml/min dans un réservoir Analytichem International de 300 ml contenant 160 ml de support Econosil prep C18 HL AlltechS 40-63 pin. L'élution s'effectue à l'aide d'un mélange de méthanol dans l'eau de 10 à 100 %. Le gradient est réalisé par paliers incrémentés d'un facteur 10, tous les 500 ml. A ce stade les 10 fractions obtenues peuvent être analysées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice Merck 60 F 254 avec ltéluant AcOEt/EtOH/H20 50:15:10, v:v:v. Dans ce système les métabolites recherchés migrent à un rapport frontal (Rfl compris entre 0,6 et 0,70 sont visibles sous UV à 254nm, et se révèlent de couleur mauve après pulvérisation de vanilline sulfurique. Les fractions obtenues après élution par les mélanges MeOH/H20 70:30 et 80:20 (v:v) contiennent majoritairement les métabolites actifs ; la première fraction de 1948 mg et la seconde fraction de 704 mg présentent une CI50 voisine de 0,7 pg/ml . La purification se poursuit par chromatographie liquide haute pression : les 2 fractions précédentes sont concentrées sous pression réduite et reprises par le minimum de méthanol pour obtenir une concentration finale voisine de 50 mg/ml. Cette solution est injectée à raison de 2 ml pour chaque chromatographie dans un appareil HPLC équipé comme suit: colonne Nucleosil SFCC C18 Spin ,250x25 mm débit de 10 ml/mn élution isocratique A/B, 50:50, v:v A: H2O avec 0,05 % TFA B: CH3 CN/H 20, 95: 5 (v:v), avec 0,05 % TFA détection UV à 230 nm. Les peptides cycliques 1, 2 et 3 sont élués et collectés séparément aux temps de rétention respectifs de 24 min , 30 min , et 45 min. A l'issue de multiples injections et séparations par HPLC dans les conditions citées ci-dessus, nous isolons 3 fractions actives contenant respectivement les métabolites 1,2 et 3 selon l'invention. Après évaporation de l'acétonitrile sous pression réduite, les 3 fractions sont percolées séparément sur une colonne Mega Bond Elut C18 Variant qui est ensuite rincée par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre de l'effluent; l'êlution s'effectue ensuite par environ 10 ml de méthanol. Après évaporation sous pression réduite des éluats méthanoliques, nous obtenons respectivement: 1 2 3 R1 H H CH3 R2 H CH3 CH3 R3 H H H R4 CH3 CH3 CH3 QUANTITé Smg 214mg 243mg TABLEAU I Les structures de chacun des peptides ont été déterminées par Spectrométrie de Masse, Infra-rouge et Résonnance Magnétique Nucléaire (IH et 13C). EXEMPLE 3 Détermination de l'activité inhibitrice de la protéine farnésyl-transférase. Cette activité est appréciée pour chaque métabolite selon la méthode décrite dans le chapitre précédent intitulé materiels et méthodes. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après. | IDENTIFICATION DES METABOLITES ACTIFS i CVFM* 1 2 | 3 CI 50 0,052 M 626nM 538nM 1,3 M TABLEAU II * Peptide ( Cystéine-Valine-Phénylalanine-Méthionine) utilisé à titre de témoin dans les mesures d'activité farnésyl transférase. REVENDICATIONS 1. Souche Streptomyces N" CBS 154.94 et ses mutants ou dérivés. 2. Peptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale I dans laquelle: R1, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement aryle inférieur, linéaire ou ramifié, en C1 à C4. 3. Peptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un peptide de formule générale I dans laquelle R4 représente un groupement méthyle et R3 représente un atome d'hydrogène. 4. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale I dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène et R4 un groupement méthyle. 5. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale I dans laquelle R2 et R4 représentent un groupement méthyle et R1 et R3 un atome d'hydrogène. 6. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale I dans laquelle R1, R2, et R4 représentent un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène. 7. Peptide selon l'une des revendications de 2 à 6 caractérisé en ce qu'il présente une activté inhibitrice de farnésyl transférase. 8. Peptide susceptible d'être obtenu par fermentation de la souche Streptomyces CBS 154.94 ou d'un de ses mutants selon la revendication 1 via l'extraction du moût de fermentation correspondant. 9. Procédé de production de peptides caractérisé en ce que l'on cultive la souche Streptomyces CBS 154.94 selon la revendication 1 et l'on récupère au moins un peptide par extraction du moût de fermentation correspondant. 10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications de 2 à 8 en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs. 11. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications de 2 à 8 dans les traitements anti-cancéreux.