Brevet FR2709497A1 — publié le 19950310

SOUCHE DE STREPTOMYCES LAVENDOFOLIAE DKRS ET PROCEDE DE PRODUCTION DES ACLACINOMYCINES A, B, Y ET D'AGLYCONE EN UTILISANT CEUX-CI CONTEXTE DE L'INVENTION 1. Domaine de l'invention L'invention se rapporte à une nouvelle souche du genre Streptomyces et à un procédé pour produire les aclacinomycines A, B, Y antitumorales et des aglycones par la culture de cette souche. 2. Description de l'art antérieur L'aclacinomycine est un agent antitumoral du groupe des anthracyclines, contenant du pyrrole et constituée de trois résidus de désoxypyrannose. Elle présente une activité cytotoxique en s'intercalant dans les paires de bases de l'ADN, inhibant ainsi la synthèse de l'acide nucléique. En outre, elle inhibe sélectivement la synthèse de l'ARN, à la différence des autres anthracyclines comme la daunorubicine, la doxorubicine et la carminomycine. En plus, elle est20 active contre la leucémie aiguë et le lymphome malin, tandis que sa toxicité cardiaque est faible. L'aclacinomycine peut être classée en trois groupes: les aclacinomycines A, B et Y. Elles ont essentiellement un résidu d'aglycone, dénommé aklavine.25 Parmi celles-ci, l'aclacinomycine B est très peu employée en clinique en raison de ses effets secondaires et de sa faible activité antitumorale. L'aclacinomycine A est employée dans la pratique du fait de son activité anticancéreuse ou antitumorale30 élevée et de ses faibles effets secondaires et de son fort rendement de production. Par ailleurs, l'aclacinomycine Y devrait être l'agent anticancéreux le plus utile car elle a une activité antitumorale considérablement élevée et de faibles effets secondaires. Toutefois, son rendement de production à partir du bouillon de culture de Streptomyces est faible et il est nécessaire d'améliorer le rendement de la production. Un procédé pour produire des aclacinomycines par fermentation de Streptomyces galilaeus est connu (brevet des Etats-Unis n 3.988.315 de Hamao Umezawa). Ce brevet décrit que Streptomyces galilaeus produit environ 18 analogues, incluant les aclacinomycines A, B, et Y. Toutefois, son rendement de production est très faible: l'aclacinomycine A, produit majeur, a été produite en une quantité de 46 mg/l de bouillon de culture, l'aclacinomycine B a été produite en une quantité de 23 mg/l, et d'autres produits incluant15 l'aclacinomycine Y sont produits en une quantité extrêmement petite. Par conséquent, il est difficile de produire des aclacinomycines à une échelle industrielle en utilisant la souche de Streptomyces ci-dessus, et il est nécessaire de fournir une nouvelle souche qui soit20 capable de produire des aclacinomycines en un rendement élevé. Les présents inventeurs ont fait de vastes recherches pour fournir un procédé de production d'aclacinomycines par fermentation à une échelle25 industrielle et, en conclusion de celles-ci, ont fourni Streptomyces lavendofoliae 12/3A, qui est capable de produire les aclacinomycines A et B. Les présents inventeurs ont poursuivi des recherches avec pour objectif de fournir une souche améliorée qui produise30 une plus grande quantité d'aclacinomycines, et cet objectif peut être satisfait par les Streptomyces lavendofoliae DKRS mutants, dérivés de la souche 12/3A. RESUME DE L'INVENTION Par conséquent, un objectif de l'invention est de fournir une nouvelle souche de Streptomyces lavendofoliae DKRS qui soit capable de produire une grande quantité d'aclacinomycines A, B, Y et d'aglycone. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé pour produire des aclacinomycines en cultivant la souche de Streptomyces lavendofoliae DKRS et en récupérant les aclacinomycines du bouillon et des cellules. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé pour produire sélectivement l'aclacinomycine A ou Y en ajustant le pH d'un bouillon de culture à une15 certaine valeur avec un tampon d'acétate ou de l'acide chlorhydrique après culture de la souche de Streptomyces lavendofoliae DKRS. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Streptomyces lavendofoliae 12/3A, qui est la souche parente de Streptomyces lavendofoliae DKRS selon l'invention, peut produire 60 mg/l d'aclacinomycine A et 10 mg/l d'aclacinomycine B. Streptomyces lavendofoliae DKRS de l'invention peut être obtenu en faisant muter la souche parente, Streptomyces lavendofoliae 12/3A, avec un mutagène chimique, le N-nitrosométhylbiuret (NMB). Le mutant est capable de produire les aclacinomycines A, B, Y et de l'aglycone et, en particulier, produit une grande quantité d'aclacinomycine Y.30 Le mutant de l'invention a été choisi par le procédé suivant: après culture de Streptomyces lavendofoliae 12/3A dans un milieu solide complet à 30 C pendant 6 à 7 jours, les spores ont été recueillies par filtration au travers d'un filtre en laine de verre, lavées trois fois avec un tampon de tris-malate 0,05 M (pH 6, 5) et diluées à un nombre de 106 à 108 spores/ml avec le même tampon. Après ajout de NMB à la suspension de spores à une concentration finale de 500 pg/ml, on a laissé le mélange au repos à C pendant 20 minutes. Après achèvement de la réaction, les spores ont été isolées par centrifugation ou filtration, lavées trois fois avec une solution physiologique saline stérile, puis ensemencées en stries sur le milieu de gélose complet. Après culture à C pendant 7 à 10 jours, des colonies du mutant sont apparues sur la plaque de gélose. Le mutant, Streptomyces lavendofoliae DKRS, de l'invention a été déposé auprès de Korean Collection for Type Cultures à Taejeon, Corée, le 26 août 1993, et a reçu le numéro d'ordre KCTC 8539P. Ce dépôt a été converti en dépôt conforme au traité de Budapest le 26 août 1993 et a reçu le numéro d'ordre KCTC 0092BP. Le milieu complet utilisé dans l'invention a la composition suivante: glucose 10 %, hydrolysat de caséine 0,2 %, extrait de viande 0,1 %, extrait de levure 0,1 % et gélose 1,5 %, pH 7,0 à 7,2. La souche Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) selon l'invention a les propriétés microbiologiques suivantes: 1. Propriétés morphologiques: Au microscope, lorsque la souche est cultivée dans un milieu solide, les mycéliums du substrat ne se fragmentent pas, et les spores sont ellipsoidales et30 forment des chaînes modérément longues. Les spores mesurent environ 2,3 pm x 1,4 pm et forment des oidies, et leur surface est lisse. 2. Propriétés sur divers milieux: La souche de l'invention a les propriétés suivantes lorsqu'elle est incubée à 28 C dans les divers milieux solides suivants: (1) Sur le milieu de Waksman, développement vert; pigment soluble rose-marron. (2) Sur le milieu de Gaus-I, développement rose- blanc; mycélium du substrat rouge-marron; pas de pigment soluble. (3) Sur un milieu au gruau d'avoine, développement gris; mycélium du substrat rouge-marron; pas de pigment soluble. (4) Sur un milieu au maïs, développement marron foncé; mycélium du substrat marron foncé. (5) Sur le milieu de Gaus-II, développement vert- marron; mycélium du substrat marron foncé; pigment soluble marron foncé. (6) Sur un milieu au soja, développement vert clair; mycélium du substrat marron-vert; pigment soluble rouge-marron. (7) Sur le milieu de Riestrick, développement marron; pigment soluble marron foncé. (8) Sur le milieu de Czapek-Dock, développement blanc- rose; mycélium du substrat rouge-marron; pas de pigment soluble. (9) Sur le milieu de Bennet, développement couleur sable clair; pas de pigments solubles. (10) Sur de la gélose à base de viande-peptone, développement couleur sable clair; pigment soluble marron. (11) Sur un milieu à base de glucose-asparagine, développement vert; pas de pigment soluble. 3. Propriétés physiologiques: La souche de l'invention est un aérobie et a un développement optimal à 28 C. Elle présente un développement rouge-orange, une peptonisation, une hydrolyse de l'amidon et une liquéfaction de la gélatine sur un milieu contenant de la farine de maïs. Elle présente un abondant développement avec le maltose et le lactose; un faible développement avec le 5 rhamnose, le xylose, l'arabinose et le galactose; et pas de développement avec le saccharose, le mannitol et le sorbitol. Les différences de morphologie et de propriétés physiologiques entre la souche parente et la souche présente sont présentées au tableau 1. Tableau 1 Streptomyces lavendofoliae DKRS (invention) 12/3A (parent) I. Morphologie Sporangiophores verticaux par rapport au mycélium verticaux par rapport au mycélium basal et sous la forme de basal et sous la forme de spirales simples spirales simples taille: 8,8 à 32,um taille: 10 à 12,um Spore rectangulairement ellipsoidale presque ellipsoidale taille: 2,3 x 1,4grm taille: 0,7 x 1,4,rn Sporulation ++ +++ Nucléoïde rond ou presque ellipsoïdal rond ou presque ellipsoïdal Surface lisse lisse Oïdies développement rapide des oldies non à partir du substrat ou du mycélium aérien, et de taille variable Nucléoïde très large et remplit la cellule entière II. Propriétés physiologiques Peptonisation + + Hydrolyse de l'amidon + + Liquéfaction de la gélatine + + Utilisation de glucidesa Maltose +++ ND Lactose +++ ND 3 5 Rhamnose + + Glucose + +++ Fructose ND +++ Xylose + +++ Arabinose + +++ Galactose + +++ Saccharose - Inositol ND +++ Mannitol - Sorbitol - ND a +++: développement abondant, +:développement positif -: pas de développement, ND: pas de détection Le procédé de production d'aclacinomycines en utilisant la souche de l'invention comprend les étapes de culture de Streptomyces lavendofoliae DKRS dans un milieu contenant des sources de carbone, des sources d'azote et d'autres nutriments, qui sont communément employés dans la fermentation des souches Streptomyces, pour accumuler des aclacinomycines dans le bouillon et dans les cellules, et de récupération de celles-ci à partir du bouillon et des cellules. Les sources de carbone employées dans la culture de l'invention peuvent inclure, de façon non limitative, l'amidon et les farines de soja. Les sources d'azote employées dans le procédé de culture de l'invention peuvent inclure, de façon non limitative, les farines de soja et le sulfate d'ammonium. Les composants inorganiques employés dans la fermentation selon l'invention peuvent inclure, de façon non limitative, le carbonate de calcium, le sulfate de magnésium, le sulfate de zinc et le chlorure de sodium. 20 La fermentation peut être réalisée dans des conditions aérobies à 28-30 C, au pH 7,2 pendant 4 à jours. On peut utiliser des matériaux alcalins, organiques ou inorganiques, de l'ammoniaque et du carbonate de calcium pour ajuster le pH au cours de la25 fermentation. Les aclacinomycines peuvent être séparées du bouillon ou des cellules en utilisant le procédé conventionnel pour isoler les matériaux de poids moléculaire bas, par exemple une extraction avec des30 solvants organiques comme l'acétone ou le chloroforme et une chromatographie sur colonne au moyen d'acide silicique. Un solvant mélangé à base de toluène et d'isopropanol (30:1 à 35:1 en volume) est de préférence employé pour isoler ou purifier les aclacinomycines et l'aglycone. Dans la présente invention, les aclacinomycines accumulées dans les cellules peuvent être extraites en utilisant un mélange de méthanol et de chloroforme (20:1), puis analysées par CLHP (chromatographie liquide haute performance). Pour la CLHP, on peut employer de la silice et un mélange de chloroforme:méthanol:acide acétique:eau:triéthanolamine (68:20:10:2:0,01 (v/v)) comme phases stationnaire et mobile, respectivement. On fait passer l'éluant à travers la colonne à raison de 1,0 ml/min. et on mesure l'absorbance des fractions recueillies à 432 nm. La concentration des aclacinomycines A, B, Y et d'aglycone dans les cellules peut être calculée en comparant le15 temps de séjour absorbant d'échantillons authentiques et de celles-ci dans les cellules. Selon l'invention, l'aclacinomycine A se convertit en Y et vice versa en changeant les conditions des étapes d'isolement et de purification. Cette conversion est probablement due non seulement aux conditions de l'isolement mais aussi à la certaine activité enzymatique des cellules. La plus grande partie de l'aclacinomycine A contenue dans le bouillon de culture et dans les cellules se convertit en Y si le bouillon25 de culture est ajusté au pH 4,4 avec un tampon d'acétate, tandis que l'aclacinomycine Y se convertit en A si le bouillon de culture est ajusté au pH 4,6 avec de l'acide chlorhydrique. Par conséquent, il est possible d'obtenir sélectivement l'aclacinomycine A ou30 Y en ajustant le pH du bouillon de culture dont on récupère le produit. Il est confirmé par les inventeurs que l'aclacinomycine Y isolée purement présente une activité anticancéreuse plus élevée contre le cancer du côlon et une toxicité plus faible, même à une dose plus élevée, que les aclacinomycines A ou B. REALISATIONS PREFEREES DE L'INVENTION La présente invention est illustrée plus en détail au moyen des exemples suivants. Les exemples suivants sont simplement illustratifs et il convient de comprendre que la présente invention ne se limite pas à ces exemples. Exemple 1 Un milieu incliné (note 2) a été inoculé avec une anse en platine de Streptomyces lavendofoliae DKRS. L'incubation a été réalisée à 28 C pendant 5 jours. La culture ainsi obtenue a été inoculée dans 50 ml d'un milieu de culture de germes (note 3) dans une fiole sous agitation Sakaguchi de 500 ml, qui avait auparavant été ajusté au pH 7,8 et stérilisé à 121 C pendant 15 minutes. L'incubation a été réalisée à 250 tr/min. pendant 2 jours sur un vibreur à mouvements alternatifs. Un milieu de production (note 4) a été ajusté au pH 7,5 et inoculé avec la culture de germes ci-dessus à une concentration de 10 %. La fermentation a été réalisée à 28 C pendant 4 jours sous agitation (500 tr/min.) et aération (2,0 vvm). Les milieux employés dans la présente invention ont les compositions suivantes: Note 2: Milieu incliné: amidon 2 %, K2HPO4 0,05 %, MgSO4 0, 05 %, KNO3 0,1 %, sel 0,05 %, Fe2(S04)3 0,001 %, gélose 1,5 à 2 % (pH 7, 2) Note 3: Milieu de culture de germes: glucose 2 %, amidon 1,5 %, farine de soja 1 %, extrait de levure 1 %, CaC03 0,3 %, MgSO4 0,2 %, NaCl 0,3 % (pH 7,8) Note 4: Milieu de production: glucose 3 %, amidon 3,5 %, farine de soja 1 %, CaC03 0,5 %, MgSO4 0,2 %, FeSO4 0,001%, ZnS04 0,001 % (pH 7,5). La souche parente et le mutant de l'invention ont été cultivés en suivant la même procédure, décrite dans ce qui précède, et les quantités d'aclacinomycines produites dans chaque milieu de culture ont été mesurées. Les résultats sont présentés au tableau 2. Tableau 2 Quantité d'aclacinomycines (mg/l) Souches A B Y Souche parente RS 60 10 - Souche de l'invention DKRS 60 70 90 Comme le montre le tableau 2, la souche DKRS de la présente invention produit une grande quantité d'aclacinomycine Y et a une production améliorée d'aclacinomycine B par rapport à la souche RS parente et, par conséquent, on pense qu'elle est un mutant dans lequel une partie du cheminement de la synthèse de l'aclacinomycine comme métabolite secondaire est modifiée. Exemple 2 Dans cet exemple, des aclacinomycines ont été isolées du bouillon de culture de Streptomyces lavendofoliae DKRS. Le bouillon de culture (700 ml) qui a été obtenu dans l'exemple 1 a été ajusté au pH 4,5 avec de l'acide chlorhydrique et filtré pour donner des mycéliums. Du chloroforme a été ajouté aux mycéliums à une concentration de 2 ml/g de mycélium, et le mélange30 a été bien mélangé pendant 1 heure puis filtré. Cette procédure a été répétée deux fois. Le filtrat du chloroforme (120 ml) a été recueilli et concentré par un évaporateur sous vide. Au concentré, on a ajouté 15 ml d'un solvant mélangé, à35 base d'acétate de butyle et d'acétone (4:1), et on l'y a soigneusement dissous. La solution obtenue a été traitée avec un tampon d'acétate (pH 3,4) pour extraire les produits, puis a été extraite à nouveau avec du chloroforme. Après évaporation du chloroforme et concentration de l'extrait, du n-hexane ou de l'éther de pétrole a été ajouté pour précipiter les aclacinomycines A (27 mg), B (35 mg) et Y (41 mg). Exemple 3 Le bouillon de culture (700 ml) obtenu dans l'exemple 1 a été ajusté au pH 4,6 avec de l'acide chlorhydrique et le mélange a été bien mélangé à 28 C pendant 3 heures. Ensuite, la procédure dans l'exemple 2 a été répétée pour donner les aclacinomycines A (50 mg), B (20 mg) et Y (13 mg). Exemple 4 Le bouillon de culture (700 ml) obtenu dans l'exemple 1 a été ajusté au pH 4,4 avec un tampon d'acétate et le mélange a été bien mélangé à 28 C pendant 2 heures. Ensuite, la procédure dans l'exemple 2 a été répétée pour donner les aclacinomycines A (3 mg), B (40 mg) et Y (50 mg). Exemple 5 Un milieu de fermentation (5 1) ayant la composition suivante [Note 5] a été placé dans un fermenteur de 10 1 et ajusté au pH 7,5. Une culture de germes obtenue dans l'exemple 1 a été inoculée à une concentration de 10 % et la fermentation a été réalisée à 28 C pendant 4 jours sous agitation (350 tr/min.) et aération (1,0 vvm). Note 5: Milieu de fermentation: glucose 3 %, amidon ,5 %, farine de soja 1,5 %, CaC03 0,9 %, MgS04 0,25 %, ZnS04 0,002 %, FeSO4 0,002 %. Le bouillon de culture ainsi obtenu (3,5 1) contient les aclacinomycines A (245 mg), B (315 mg) et Y (560 mg). Le bouillon a été ajusté au pH 4,6 avec de l'acide chlorhydrique et centrifugé pour donner des mycéliums. Aux mycéliums, on a ajouté 1,5 1 de chloroforme et on a bien mélangé pendant 1 heure. Cette procédure a été répétée deux fois. Par ailleurs, 600 ml de chloroforme ont été ajoutés au filtrat pour extraire les aclacinomycines. Les extraits de chloroforme ainsi obtenus ont été combinés ensemble et concentrés sous vide. Les précipités ont été dissous dans un solvant mélangé, à base d'acétate de butyle et d'acétone (4:1 en volume). La solution obtenue a été mélangée avec du sulfate de sodium et le mélange a été filtré puis concentré. Finalement, du n-hexane a été ajouté pour donner des précipités, et évaporé pour donner 1,5 g d'aclacinomycines mélangées. Exemple 6 Les aclacinomycines mélangées (1,5 g) obtenues dans l'exemple 5 ont été dissoutes dans une quantité minimale de solvant mélangé à base de toluène et de chloroforme (8:2 en volume), puis soumises à une chromatographie sur une colonne remplie avec de l'acide silicique. Comme éluant, on a employé du toluène. Après élution des fractions contenant de l'aglycone, on a changé l'éluant en un solvant mélangé de toluène et d'isopropanol (35:1 en volume) pour donner des fractions contenant de l'aclacinomycine B. Ensuite, un solvant mélangé à base de toluène et d'isopropanol (30:1 en volume) a été employé comme éluant pour donner des fractions contenant de l'aclacinomycine Y. Aux fractions contenant chacune des produits, on a ajouté du n-hexane ou de l'éther de pétrole pour précipiter les produits et les précipités ont été séchés pour donner de l'aglycone (10 mg), de l'aclacinomycine B (154 mg), Y (182 mg) et A (75 mg), toutes étant sous la forme d'une poudre jaune. REVENDICATIONS 1. Culture isolée purement de Streptomyces lavendofoliae DKRS ayant les caractéristiques d'identification de KCTC 0092BP et capable de produire les aclacinomycines A, B Y et d'aglycone à partir de celle-ci. 2. Culture isolée purement de Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) selon la revendication 1, qui est capable de convertir l'aclacinomycine A en Y lorsque le bouillon de culture de celle-ci est traité avec un tampon d'acétate pour ajuster au pH 4,4, et qui est capable de convertir l'aclacinomycine Y en A lorsque le bouillon de culture de celle-ci est traité avec de l'acide chlorhydrique pour ajuster au pH 4,6. 3. Procédé de production des aclacinomycines A, B, Y et d'aglycone de celles-ci, qui comprend la culture de Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) dans un milieu pour accumuler les aclacinomycines A, B, Y et de l'aglycone de celles-ci dans le bouillon et dans les20 cellules, la récupération de celles-ci à partir du bouillon et des cellules, et leur purification. 4. Procédé de production des aclacinomycines A, B, Y et d'aglycone de celles-ci selon la revendication 3, dans lequel la culture est réalisée à 28-30 C et au pH25 6,8 à 7,5, dans des conditions de culture aérobie. 5. Procédé de production des aclacinomycines A, B, Y et d'aglycone de celles-ci selon la revendication 3, dans lequel les aclacinomycines A, B, Y et les aglycones de celles-ci sont récupérées du bouillon et30 des cellules, puis purifiées en utilisant un solvant mélangé à base de toluène et d'isopropanol (30:1 à 35:1 en volume). 6. Procédé pour la production d'aclacinomycine Y, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) dans un milieu pour accumuler les aclacinomycines A, B, Y et l'aglycone de celles-ci dans le bouillon et dans les cellules, le traitement du bouillon avec un tampon 5 d'acétate pour ajuster le pH à 4,4, et la récupération de l'aclacinomycine Y du bouillon et des cellules. 7. Procédé de production de l'aclacinomycine A, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) dans un10 milieu pour accumuler les aclacinomycines A, B, Y et l'aglycone de celles-ci dans le bouillon et dans les cellules, le traitement du bouillon avec de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 4,6, et la récupération de l'aclacinomycine A du bouillon et des15 cellules.