Brevet FR2706906A1 — publié le 19941230

La présente invention a pour objet une alcool- déshydrogénase thermostable ainsi qu'une souche de microorganisme la produisant. Elle est en outre relative à des utilisations de cet enzyme. Les alcool-déshydrogénases (ADH) catalysent la réaction d'oxydation d'un alcool en aldéhyde ainsi que la réduction d'un aldéhyde en alcool. Elles sont également capables de réduire des cétones. En général, elles ne possèdent pas de spécificité stricte et peuvent réagir avec des alcools linéaires, à chaîne aliphatique ramifiée, aromatiques. Cependant, certaines ADH présentent une spécificité pour les alcools primaires ou secondaires. Les ADH nécessitent un cofacteur qui peut être NAD+/NADH, H+ ou NADP+ /NADPH,H+ ou NADP+/NADPH,H+ ainsi que des analogues. L'activité et la structure peuvent dépendre de la présence de Zn2+. Les applications potentielles des ADH dans l'industrie sont nombreuses: synthèse stéréospécifique, synthèse d'arômes aldéhydes ou éthers utilisés dans l'agro-alimentaire, les cosmétiques et synthèse de précurseurs divers. L'utilisation des enzymes mésophiles est limitée par une spécificité relativement étroite, une instabilité thermique et une fragilité vis-à-vis des solvants organiques. Des ADH ont été isolées de différentes sources: plantes, tissus d'animaux, micro-organismes. Deux ADH thermostables, l'ADH de Thermoanaerobium brockii et celle de Sulfolobus solfataricus, ont été étudiées. L'ADH de Thermoanaerobium brockii est NADP dépendante et a été décrite à l'origine par Lamed et Zeikus (1981,Biochem J. 195 (2), 183-190). Les extraits cellulaires de T. brockii contiennent en fait deux activités ADH: l'une dépendante du NAD, peu active et instable à l'oxygène, l'autre dépendante du NADP. Lamed et Zeikus ( 1981-Bîochem J., 195(2),183-190) ainsi que Al-Kassim et Tasi ( 1990-Biochem. Cell. Biol., 68, 907-913) ont purifié et caractérisé cet enzyme. Il est actif sur les alcools primaires linéaires ( activité maximale pour le butanol), les alcools primaires non linéaires, les alcools secondaires cycliques, les aldéhydes et les cétones. Il est plus actif sur les alcools secondaires et agit selon un mécanisme bi-ordonné avec NADP+ comme premier réactant. Il réduit les cétones aliphatiques acycliques asymétriquement, en produisant un composé chiral optiquement pur ( Keinan et al., 1980,J. Am. Chem. Society, 108, 162- 169). Lamed et al ( 1981, Enzyme Microb. Technol., 3, 144- 148) ont étudié les propriétés permettant d'envisager des applications pour cet enzyme: réduction énantiosélective, régénération de NADPH, immobilisation, stabilité en solvant organique. Rella et al. ( 1987 Eur. J. Biochem., 167, 475-479) ont décrit l'ADH de l'Archaebactérie Sulfolobus solfataricus. Cet enzyme a une spécificité de substrat large qui inclut les alcools primaires et ramifiés, les alcools secondaires linéaires et cycliques ainsi que l'anisaldéhyde. Il est spécifique du NAD. Il a été étudié pour la régénération des cofacteurs (Guagliardi et al., 1991, Biotech. Appl. Biochem., 13,25-35) et pour la synthèse d'aldéhydes odorants en réacteurs solide- gaz. Les propriétés des enzymes thermostables permettent de les utiliser dans des conditions industrielles dans lesquelles des enzymes normaux ne pourraient être utilisés. Ainsi l'utilisation de températures importantes permet d'améliorer les transferts de masse par augmentation de la solubilité et de la diffusion, de diminuer la viscosité des milieux et donc de pouvoir travailler en présence de concentrations importantes de substrats, de diminuer les risques de contamination, d'augmenter les rendements de conversion et d'utiliser des réacteurs solide-gaz, ce qui facilite la récupération des produits volatils. Il ressort de l'analyse de l'état de la technique que, à la connaissance du demandeur, il n'existe que deux alcools déshydrogénase thermostables et que ces enzymes possèdent des sélectivités particulières ne les rendant utilisables que dans une gamme d'applications réduite. A la connaissance du demandeur, elles ne possèdent en particulier pas d'énantiosélectivité en ce qui concerne leurs activités oxydatives. Le demandeur s'est donc attaché à la recherche d'un enzyme présentant une stabilité importante à haute température, un large spectre d'action sur différents substrats et une énantiosélectivité. Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un enzyme produit par une souche de microorganismes thermophiles répond à ses. critères. Il a d'autre part montré que cet enzyme pouvait être produit par ce microorganisme. La présente invention a donc pour objet une alcool déshydrogénase thermostable et thermophile caractérisée en ce qu'elle présente une activité oxydative énantiosélective. Un tel enzyme peut présenter un poids isoélectrique d'environ 4,5. Il a avantageusement une activité optimale à pH 8,3. Préférentiellement, un tel enzyme présente une masse de l'ordre de 80 kD. Il peut être activé par NaCl et être inhibé de manière séparée par le benzaldéhyde, CuSO4, le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), ZnC12, et i'EDTA.. Préférentiellement, un tel enzyme utilise du NADP+ comme co-facteur. Avantageusement, cet enzyme est spécifique des alcools primaires non ramifiés. Il peut présenter une activité aldéhyde réductase thermostable. La présente invention a également pour objet un microorganisme produisant un tel enzyme. Ce microorganisme appartient préférentiellement au règne des Archaebactéries. Il peut ainsi être la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le N'I-1319. La souche 1-1319 a été obtenue à partir de fragments de sulfures polymétalliques provenant d'un édifice hydrothermal actif. D'après les observations réalisées en microscopie électronique à balayage, les cellules sont des sphères irrégulières de 0,8 à 1,2 pm de diamètre. Aucun flagelle ou pili n'a été observé; aucune mobilité n'a été visualisée sur des états frais, au microscope optique. Résistant aux antibiotiques tels que la vancomycine, la pénicilline, la kanamycine, la streptomycine, la rifampicine et le chloramphénicol, cette souche fait partie du règne des Archaebactéries. Elle est anaérobie stricte chimio- organohétérotrophe et utilise le soufre élémentaire comme accepteur d'électrons. Aucune croissance n'a été détectée en autotrophie sur H2/C02. 1-1319 se développe peu en absence de soufre. Bien que sa croissance soit plus élevée sur des milieux complexes et un mélange de 20 acides aminés, la souche peut utiliser des substrats simples ( glucose, pyruvate). Quelques caractéristiques physiologiques ont été déterminées. Ainsi, la souche se développe dans une gamme de températures allant de 65'C à 100 'C avec une croissance maximale-& 80*C. Elle est capable de se développer dans une large gamme de pH compris entre 2,5 et 9,5. Le pH optimal pour sa croissance se situe entre 5,5 et 6,5. Cette souche se développe difficilement en l'absence de sels de mer; une croissance optimale est détectée pour une concentration en sels de mer de 30 g/l (l'eau de mer en contient 40 g/l). Elle est donc halophile modérée. Son ADN présente une proportion de bases guanine et cytosine ( % G + C) de 58 % environ. La présente invention a d'autre part pour objet les produits issus de ces microorganismes, tels que les enzymes thermostables et en particulier les enzymes vitaux de la machinerie cellulaire ( polymérases, ligases.....). Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des enzymes ou des microorganismes décrits ci- dessus pour la préparation d'alcools, d'aldéhydes, ou de cétones. L'alcool déshydrogénase objet de la présente invention peut être obtenu par toute méthode de préparation connue par l'homme du métier et en particulier par chromatographie, sur colonne d'échangeuse d'ions, d'extraits bruts des microorganismes la produisant, ce qui permet la purification partielle de cet enzyme. Elle peut aussi être obtenue par des méthodes de génie génétique. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent, dans lesquels: - les figures 1A et lB représentent respectivement l'évolution des activités oxydatives et réductrices de l'enzyme ( en ordonnée) en fonction du pH ( en abscisse) dans différents tampons, à 70'C; - La figure 2 illustre l'évolution des activités oxydatives et réductrices (en ordonnée) en fonction de la température ( en abscisse) à pH 7,5. - Les figures 3A et 3B représentent respectivement la résistance des activités alcool déshydrogénase et aldéhyde réductase de l'enzyme (en ordonnée) et en fonction du temps d'incubation (en abscisse) à différentes températures. - Les figures 4A et 4B représentent l'activité alcool déshydrogénase ( en ordonnée) en fonction de la concentration en NADP+ et en alcool benzylique (en abscisse). - Les figures 5A à 5E illustrent respectivement les effets du NaCi, du ZnC12, du CuSO4, de l'acide éthylène diamine tétracétique EDTA et du Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) (concentrations en abscisse) sur l'activité de l'enzyme ( en ordonnée). - Les figures 6A, 6B et 6C sont des photographies de gels d'électrophorèse respectivement en condition native et en condition dénaturante. Les puits 1 et 2 de la figure 6A correspondent à l'extrait brut, le puits 3 à l'albumine, tandis que les puits 4, 5 et 8 de la figure 6B correspondent à des éluats de la colonne d'échangeuse d'ions et le puits 7 à un extrait brut de la souche 1-1319. Sur la figure 6B, les puits 1 et 2 correspondent à des extraits bruts de la souche 1-1319, le puits 3 à l'éluat de la colonne d'échangeuse d'ions et le puits 4 est un marqueur de poids moléculaire. EXEMPLES: Matériels et Méthodes 1. Préparation pour les mesures d'activités enzymatiaues Les activités enzymatiques ont été mesurées sur des extraits bruts ( protéines intracellulaires) ou des préparations partiellement purifiées. 1.1- Préparation des extraits bruts Les extraits bruts ont été préparés à partir de cultures microbiennes de volumes divers par centrifugation puis cassage du culot cellulaire aux ultrasons en présence de fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF) et de Triton X100. 1.2 Variation des pH avec la température Pour étudier l'évolution de l'activité en fonction de la température, il est nécessaire de connaître la variation des pH des tampons et si possible d'en choisir un qui soit stable. L'ajustement des pH a été fait à température ambiante mais les cinétiques enzymatiques ont été réalisées à température élevée. On a donc estimé les valeurs réelles des pH à cette température. Les pH des tampons citrate-phosphate et phosphate ne varient pas avec la température ( testé entre et 70 C). Par contre, le pH du tampon KCl/acide borique/NaOH 100 mM ajusté à 8,65 à 25'C, perd 0,031 unités tous les 5'C jusqu'à 70'C. Le tampon Tris/HC1 100 mM ajusté à 8,94 à 25'C perd 0,107 unités pH tous les 5 C. 2. Mesure de l'activité alcool-déshydrogénase L'activité alcooldéshydrogénase (ADH) est facilement réversible et peut donc être mesurée selon les deux réactions suivantes: alcool + co-enzyme oxydé - aldéhyde + co-enzyme réduit On a utilisé les co-enzymes NAD+ et NADP+ dont la forme réduite est détectée à 340 nm. A haute température, le co-enzyme réduit se dégrade très rapidement et il est impossible de déterminer le coefficient d'extinction molaire à température élevée. Il a donc été mesuré à température ambiante. 3. Mesure de la thermostabilité La thermostabilité enzymatique a été déterminée par la mesure de l'activité résiduelle après incubation de l'échantillon à haute température. Pour cela, la solution enzymatique a été répartie en petits volumes dans des ampoules à lyophiliser de 1 ou 2 ml qui ont été scellées avant incubation. A chaque prélèvement l'ampoule est sortie du bain, plongée dans la glace afin d'arrêter la dénaturation, puis immédiatement congelée. Lorsque la thermodénaturation est modélisable par une cinétique du premier ordre pendant les premières minutes, le temps de demi-vie ( tl/2) ou temps au bout duquel il reste 50 % de l'activité initiale est déterminé en fonction du modèle suivant: A = Ao ekt et ti/2=(Ln 2)/k o A est l'activité résiduelle au temps t Ao est l'activité initiale k est la constante de vitesse de dénaturation. 4. Purification. Toutes les étapes de purification sont effectuées à 4-C. Le matériel utilisé ( Pharmacia) est un système de chromatographie standard. 4.1 - Filtration sur gel La colonne ( 2,6 x 70 cm) a été remplie par du gel Séphacryl S300 ( Pharmacia). Les protéines étalon proviennent de kits de calibration de Pharmacia et de Touzart et Matignon. 4.2 - Colonne échanceuse d'ions La colonne a été remplie par du gel DEAE Sépharose CL6B de Pharmacia ( 2,6 x 36 cm), équilibrée avec du tampon phosphate 100 mM pH 7,5 et éluée avec ce même tampon contenant des concentrations croissantes de NaCl. Chaque chromatographie a été suivie par détection de l'activité enzymatique dans les fractions collectées lors de 1'élution. Pour cela, chaque puits d'une microplaque a été rempli par 250p1 de substrat et 10 ou 20 p1 de la fraction étudiée. Les microplaques ont été incubées 20 minutes à 70'C puis lues sur un lecteur de plaque. L'activité enzymatique a été exprimée en unités arbitraires (UA). La concentration protéique dans chaque fraction a été évaluée par mesure de l'absorbance à 280 nm dans des cuves en quartz. A chaque étape, le taux de purification et le rendement ont été évalués en dosant la concentration protéique ainsi que l'activité enzymatique sur les fractions récupérées. Des électrophorèses ont permis de visualiser la progression de la purification. 5. Méthodes de dosage des protéines Les dosages de protéines ont été effectués selon deux méthodes différentes en fonction de la gamme de sensibilité désirée: - Méthode de Lowry ( Lowry et al., 1952 J. Biol. Chem.,265-275) pour une gamme de concentrations protéiques comprises entre O,O1 et O,1 g 1-1. - Microdosage de Bradford ( Bradford, 1976,Analytic Biochem., 72,248- 254) pour une gamme de concentrations protéiques comprises entre 1 et 25 mg 1-1. 6. Analyses électrophorétiques Les électrophorèses ont été effectuées en chambre froide (4'C) dans des cuves pour électrophorèses verticales de deux dimensions différentes (Bio-Rad). Les gels après révélation des protéines ont été séchés sous vide à 80'C pendant 1 heure. 6.1- Préparation des gels et échantillons Les compositions des gels et des tampons sont mentionnées en annexe 3. Avant dépôt, l'échantillon a été préparé en ajoutant un demi-volume de tampon d'échantillon à la solution protéique. La migration a été réalisée à 100 V dans le gel d'alignement et 180 V dans le gel de séparation. Des gels précoulés en gradient d'acrylamide 4-20 % ont également été utilisés (Bio-Rad). 6.2 Révélation: coloration des protéines Dès que le front de migration du colorant est parvenu à l'extrémité du gel, la migration a été arrêtée et le gel coloré au bleu de Coomassie pendant une heure puis décoloré. Solution de coloration: Solution de décoloration Bleu de Coomassie O,1 % Méthanol 30% Méthanol 50 % Acide acétique 10 % Acide acétique 10 % Eau 60 % Eau 40 % 6.3- Révélation de l'activité alcool déshydroqénase L'activité ADE a été détectée directement sur le gel par précipitation de colorant formazan insoluble: - préparation d'un mélange alcool ( 50mM)-co-enzyme (lmM) dans 150 ml de tampon - incubation du gel dans ce mélange pendant une heure à "C - élimination du mélange réactionnel avant d'ajouter une solution contenant 0,25 mg m-1 de MTT ( bromure de 3-[4,5- diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium bromure) et 0,05 mg ml-1 de PMS ( phénazine méthosulfate) - incubation à 60'C pendant exactement 15 minutes puis rinçage du gel à l'eau. Les bandes actives apparaissent violettes. 6.4 - ElectroDhorèses dénaturantes Ces électrophorèses ont été effectuées en suivant la méthode de Laemmli ( 1970,Nature, 227,680-685) sur des gels précoulés et commercialisés par Touzart et Matignon à 10 % T. Les échantillons ont été préparés et dénaturés selon la méthode préconisée par SIGMA pour les marqueurs de poids moléculaires MS-SDS-200: ovalbumine (45000), albumine bovine (66000), phosphorylase B (97400), 3-galactosidase ( 116000), myosine ( 205000). Les gels ont été colorés comme les gels natifs au bleu de Coomassie puis décolorés et séchés de la même façon. ANNEXE 1 Composition des milieux de culture Milieu 2216S (2S) ( Belkin et Jannasch, 1985,Arch.Microbiol., 141, 181-186) Extrait de levure 0,5 g Peptone 1 g Sels de mer 30 g Soufre 5 g Acide -2-[N- morpholino]éthane sulfonique il (MES) 3,09 g pour les pH 5, 5 Réazurine Eau distillée qsp 1000 Les pH ont été ajustés à température ambiante. Les milieux en anaérobiose ont été réduits par addition de Na2S stérile & 2,5 % en enceinte anaérobie après tendalisation ( 2 fois 30 minutes à 100 C) s'ils contenaient du soufre élémentaire ou stérilisation (30 minutes à 1200C) dans le cas contraire. ANNEXE 2 Calcul de l'activité alcool-déshvdrogénase L'activité enzymatique exprimée en nombre de pmol de co-enzyme ( ou substrat) réduit ou oxydé par minute et par unité de volume d'enzyme ( U ml-1) a été calculée par la formule suivante: Act = 16 DO x V/( E x Ve) o Act est l'activité exprimée en U ml-1 16 DOI est la valeur absolue de la variation de la densité optique obtenue par minute E est le coefficient d'extinction molaire du co-enzyme réduit V est le volume réactionnel total en ml Ve est le volume de l'enzyme en ml. ANNEXE 3 Préparation des qels et des tampons d'électrophorèse - gel d'alignement ( 6% T): Solution d'acrylamide/bisacrylamide à ,8 % T et 2,6 % C 2 ml Tampon Tris HC1 0,5 M pH 6,8 2,5 ml Eau -1 5,3 ml Persulfate d'ammonium 100 g 1 0,1 ml N,N,N',N'-tétraméthylènediamine (TEMED) dilué au 1/2 0,01 ml - Gel de séparation ( 10 % T) Solution d'acrylamide/bisacrylamide à30,8 % T et 2,6 % C 20 ml Tampon Tris HC1 1,5 M pH 8,8 15 ml Eau 24 ml Persulfate d'ammonium 100 g 1-1 0,6 ml TEMED au 1/2 0,06 ml - Tampon d'échantillon: Tris HCl 0,5 M pH 6,8 2,5 ml Glycérol 2 ml Eau 3 ml Bleu de bromophénol 0, 1% - Tampon de migration: Tris 6 g Glycine 28,8 g Eau 1 1 EXEMPLE 1 - Caractérisation de l'activité enzymatique alcool- déshydroaénase en oxydation et réduction. Les caractéristiques enzymatiques et physico-chimiques de l'alcooldéshydrogénase de la souche 1-1319 ont été déterminées dans l'extrait brut. Celui-ci a été obtenu à partir de 7,5 1 de culture. Il contient 2,404 g/l de protéines, concentration déterminée par le dosage de Lowry. Les deux réactions-oxydation de l'alcool et réduction de l'aldéhyde - ont été étudiées. Sauf exceptions, l'alcool utilisé en tant que substrat est l'alcool benzylique, moins volatil que l'éthanol, à une concentration finale dans le milieu réactionnel de 40 mM; l'aldéhyde utilisé est le benzaldéhyde à 10 mM; les co-enzynmes sont NADP+ à 1 mM et NADPH à 0,6 mM en concentration finale. 1. Effets du PH et de la température sur la vitesse de réaction. Le pH optimal pour la vitesse de réaction à 70*C est de 8,3 dans le tampon KCl/Borate / NaOH 100 mM ( pH ajusté à 8,6 température ambiante). La vitesse d'oxydation est équivalente dans le tampon phosphate et dans le tampon Tris HC1. Elle est plus élevée dans ces tampons que dans le tampon KC1/Borate/NaOH, à des valeurs identiques de pH, à 70'C (figures 1A et lB). La vitesse de réaction a été étudiée en fonction de la température dans le tampon phosphate pH 7,5 afin de se libérer des variations de pH du tampon avec la température. La température maximale étudiée a été de 90'C, le co-enzyme étant très instable à haute température. Les deux activités, alcool-déshydrogénase et aldéhyde-réductase, sont maximales à 75'C ( figure 2). La courbe tracée selon l'équation d'Arrhénius représentant le logarithme de l'activité en fonction de l'inverse de la température absolue a permis de calculer les énergies d'activation à pH 7,5: l'énergie d'activation de l'activité oxydante est de 66,7 KJ mol-1 et celle de l'activité réductrice est de 48,1 KJ mol-1 2. Thermostabilité La résistance de l'enzyme à la dénaturation thermique a été déterminée par incubation dans le tampon phosphate & pH 7,5 ( figures 3A et 3B). L'activité réductase est plus thermostable que l'activité déshydrogénase. Les courbes de dénaturation obtenues sont modélisables par une cinétique de réaction d'ordre i et on a déterminé les temps de demi-vie aux différentes températures testées. Pour l'activité déshydrogénase, les temps de demi-vie sont respectivement de 87 minutes, 56 minutes, 36 minutes et 7 minutes à 52'C, 62'C, 69'C, et 83,5 C. Pour l'activité réductase, à 69'C et 83,5 C, les temps de demi-vie à ces températures sont respectivement de 6 h et minutes. A 52'C et 62'C, cette activité reste stable pendant 1 h 30. 3. Activité en fonction des concentrations des substrats L'étude de la variation de la vitesse de réaction de l'activité déshydrogénase a été effectuée en fonction de différentes concentrations en alcool benzylique et NADP+ à pH 7,5 dans le tampon phosphate à 100 mM ( figures 4A et 4B). Les cinétiques ont été effectuées à 75'C. 4. Effet d'effecteurs sur la vitesse d'oxydation de l'alcool. Des cinétiques enzymatiques en présence de différents additifs (NaCl, CuSO4, SDS, ZnC12, EDTA) ont été effectuées (figures 5A à 5E). Toutes les substances testées inhibent l'activité à l'exception du chlorure de sodium pour lequel la vitesse de réaction est maximale pour une concentration de 0,2 M ( figure A). Cependant, les concentrations en NaCl supérieures à 1 M inhibent l'activité. NaCl n'a pas été ajouté aux échantillons pour que leur force ionique ne soit pas trop élevée et ne gène pas la fixation de l'enzyme sur des colonnes de chromatographie. On a montré de plus que le benzaldéhyde inhibe l'activité alcool-déshydrogénase. EXEMPLE 2: Purification partielle de l'enzyme. Par chromatographie sur colonne d'échange d'ions, DEAE Sepharose CL6B, on a procédé à une purification partielle de l'enzyme à partir d'un extrait brut provenant d'une culture de 27 litres. Lorsque la chromatographie est menée à pH 7,5 (tampon phosphate 100 mM), la protéine est éluée à une concentration de 0,25 M en NaCl. Après cette étape, le taux de purification obtenu est de 2,5 et le rendement de 92 %. C'est donc une étape de purification efficace sans perte d'activité importante. Les fractions actives récupérées ont ensuite été appliquées sur une colonne contenant un gel d'affinité sur lequel est greffé du bleu de Cibacron, substance présentant une analogie de structure avec les co-enzymes NAD+ et NADP+. Pour une raison inconnue la protéine ne s'est pas fixée sur cette colonne. Par contre, d'autres protéines ont été fixées puisque le taux de purification a augmenté: l'activité spécifique dans les fractions récupérées était 81 fois plus élevée que dans l'extrait brut initial. Cette préparation a été utilisée pour les études ultérieures. Elle contient 0,078 g 1-1 de protéines (Bradford) et 1,10 U ml-1. L'activité spécifique de l'alcool-déshydrogénase dans cette préparation est de 14,2 U mg-1 (70'C, pH 7,5 tampon phosphate). A la suite de cette purification, on a effectué des électrophorèses en conditions natives (figure 6A) et dénaturantes ( figure 6B). La révélation au bleu de Coomassie sur deux gels ( une électrophorèse native et une électrophorèse dénaturante) montre que la préparation n'est pas pure et la révélation des bandes actives sur le mélange éthanol-NADP+ montre également la présence de quatre bandes. Caractéristiques phvsico-chimiQues Par chromatofocalisation sur gel PBE94, on a déterminé le point isoélectrique de la protéine; il est de 4,5. Un seul pic de fractions actives a été identifié au cours de l'élution. Une filtration sur gel sur Sephacryl S300 a permis de déterminer que la taille de la protéine était d'environ 80000 daltons. Un seul pic d'activité dans les fractions récupérées lors de l'élution a été observe. EXEMPLE 3: Spécificités de substrats de l'enzyme purifié Les activités oxydatives et réductrices de l'enzyme ont été testées sur différents substrats en présence du co-enzyme NADP+ à lmM ou NADPH à 0,5 mM. Les résultats sont résumés dans les tableaux 1 et 2. Pour des raisons de solubilité, certains alcools ont été préparés à la concentration de 0,8 mM. Lorsque cela était possible, les activités ont été mesurées pour un substrat à 40 mM. L'alcool-déshydrogénase de 1-i319 est plus active sur les alcools primaires que sur les alcools ramifiés. Il est vraisemblable que les activités détectées sur les alcools secondaires, le cyclohexanol, et le butanol tertiaire soient de l'ordre de la sensibilité du dosage et ne soient pas significatives Il convient de noter que l'activité augmente avec la longueur de la chaîne de l'alcool primaire L'activité sur les polyols tels que le glycérol est faible. Enfin, cette alcool-déshydrogénase est énantio- sélective; en effet, elle est plus de dix fois active sur le géraniol que sur le nérol qui sont deux énantiomères. On note également une forte activité sur l'alcool cinnamique. CONCLUSION: L'enzyme selon l'invention présente des propriétés et des caractéristiques qui la distinguent des deux ADH thermostables déjà connues. Le tableau 3 résume ces différences. On notera en particulier que l'enzyme selon la présente invention a une large spécificité de substrats; elle est différente de celles des alcool-déshydrogénases de Sulfolobus solfataricus ( Rella et al., 1987,Eur. J.Biochem. 167,475- 479),et de Thermoanaerobium brockii, deux autres alcool- déshydrogénases thermostables. L'alcool-déshydrogénase selon l'invention est spécifique du co-enzyme NADP+, tandis que celle de T. brockii ( notée TAADH) utilise NADP% ainsi que NAD+, même si elle préfère NADP+ et que celle de S. solfataricus ( notée SSADH) est spécifique du NAD+. Les trois enzymes ont une spécificité de substrats large:ils hydrolysent divers alcools primaires, secondaires, cycliques et divers polyols. TAADH préfère cependant les alcools secondaires tout comme SSADH. L'enzyme selon la présente invention se distingue car elle a une activité préférentielle sur les alcools primaires. Même si la spécificité pour les alcools primaires est très répandue parmi les ADH, l'enzyme selon l'invention présente l'avantage d'être thermostable. Les alcools aromatiques ainsi que les aldéhydes contenant un cycle sont de très bons substrats pour cet enzyme. L'énantiosélectivité de l'enzyme selon l'invention apparaît en comparant l'hydrolyse du géraniol et du nérol. Cette caractéristique est particulièrement intéressante pour la synthèse stéréospécifique ( arômes pour les industries agro- alimentaire et cosmétique, applications en industrie pharmaceutique). En effet, deux énantiomères du même composé peuvent avoir des propriétés différentes et il est toujours difficile de séparer un mélange d'énantiomères. Sa thermostabilité conjuguée à son énantiosélectivité permet son utilisation dans des procédés industriels. TABLEAU. Activité oxvdative de l'enzyme selon l'invention SUBSTRAT CONCENTRATION ACTIVITE RELATIVE Ethanol 40 mM 100 Propanol 1 40 mM 139,1 Isopropanol 40 mM 1,8 Butanol 1 40 mM 152,9 Butanol 2 40 mM 6,2 Butanol tertiaire 40 mM 4,6 Pentanol 1 40 mM 232,6 Hexanol 1 40 mM 240,1 Cyclohexanol 40 mM 5,0 Alcool benzylique 40 mM 180,9 Glycérol 40 mM 4,4 D.sorbitol 40 mM 3,0 Ethylene glycol 40 mM 7,0 Propylène glycol 40 mM 14,2 1,3- propanediol 40 mM 20,4 Ethanol 0,8 mM 100 Alcool cinnamique 0,8 mM 749,0 Alcool furfurylique 0,8 mM 216,0 Géraniol 0,8 mM 780,0 Nérol 0,8 imM 66,7 TABLEAU 2 Activité réductrice de l'enzyme selon l'invention SUBSTRAT CONCENTRATION ACTIVITE RELATIVE Acétaldéhyde 0,8 mM 100,O Benzaldéhyde 0,8 mM 87,9 DL-Glycéraldéhyde 0, 8 mM 15,1 m-Anisaldéhyde 0,8 mM 61,8 p- Anisaldéhyde 0,8 mM 78,2 Laurinaldéhyde 0,8 mm 9,5 2-furaldéhyde 0,8 mM 107,8 Citral 0,8 mM 51,2 TABLEAU 3 Comparaison de 1'ADH selon l'invention et de deux ADH thermostables Enzyme selon T'. brockl t S. solfatarleus l'invention l'invention poids moléc. (D) 150 000 70 000 80 000 sous- unités (D) 40 000 37 000 4o ooo 37 0OO tétramère dimère pli optimal 7,8 8. 5/7,5# 8,6 TC optimale ≥95C 75C PI 5.2 I1,5 thermostabilité 20' 91-C, 20h 60'C, 5h 70C lh 62C ADII tl/2 et. 70' 65C 6h 69Créductase KM mM butanol 2 0,31 éthanol 0,26 acétaldéhyde 0,7 benzol 0,013 spécificité alc. 2nd alc. 2nd alc. lres prérère NADP+ NAD dépendante préfére NADP énantiosélective effecteurs Zn2+ et EDTA EDTA inhibe NaC1 active sans erfet Zn2* active Zn2+ inhibe remarques s'aggrège A forte concentration *: selon le substrat alcool benzylique/anisaldéhyde alc. 2nd = alcools secondaires alc. lrs = alcools primaires nI =point isoelectrique KM = constarts de Michaelis- Menten REVENDICATIONS 1. Alcool déshydrogénase thermostable et thermophile caractérisée en ce qu'elle présente une activité oxydative énantiosélective. 2. Alcool déshydrogénase selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle possède un point isoélectrique d'environ 4,5. 3. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle présente une activité optimale à pH 8,3. 4. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente une masse de l'ordre de 80 kD. 5. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 et 4, caractérisée en ce qu'elle est activée par NaCl. 6. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle est inhibée par le benzaldéhyde, CuSO4, le SDS, ZnC12 et i'EDTA. 7. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle utilise du NADP+ comme co- facteur. 8. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle présente une activité spécifique vis-à-vis des alcools primaires non ramifiés. 9. Alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle présente une activité aldéhyde réductase thermostable. 10. Microorganisme caractérisé en ce qu'il produit une alcool déshydrogénase selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Microorganisme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il appartient au règne des Archaebactéries. 12. Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est une souche déposée auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n'I-1319. 13. Produits issus des microorganismes selon l'une des revendications 10 à 12. 14. Produit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est un enzyme thermostable. 15. Utilisation de l'enzyme selon l'une des revendications 1 à 9 ou du microorganisme selon l'une des revendications 10 à 12 pour la préparation d'alcools, d'aldéhydes ou de cétones.