Brevet FR2698694A1 — publié le 19940603

MOYENS POUR LA DETECTION II VITRO D'IVE DIRIGEES CONTRE UN NOUVEL ALLERGENE D' INSECTES LEPIDOPTEREB : LA THAUWETOPOEINE La présente demande a pour objet des moyens pour la détection in vitro dans un fluide biologique, d'anticorps de type IgE, dirigés contre la thaumétopoéine, un nouvel allergène d'insectes lépidoptères. Certains insectes ou certaines larves d'insectes ont la propriété de déclencher chez l'homme ou l'animal, des réactions cutanées de type urticaire. De telles réactions urticantes ont par exemple été constatées après un contact avec des chenilles d'insectes, notamment de lépidoptères. Ces réactions peuvent également apparaître en l'absence de tout contact avec l'insecte responsable; elles résultent alors de contact avec des substances libérées dans l'air par ces insectes. Ainsi on a mis en évidence que la chenille processionnaire du pin (Thaumetopoea pityocampa Schiff.) et la chenille processionnaire du chêne (Thaumetopoea processionea L.) libèrent, par l'intermédiaire de poils urticants se détachant de la cuticule de la chenille dans laquelle ils sont fichés, une substance responsable de dermatites. Cette substance a été identifiée comme étant une protéine, appelée thaumétopoéine, spécifique des poils urticants de la chenille. En d'autres termes, la thaumétopoéine est absente de la cuticule de la chenille. La thaumétopoéine de la chenille processionnaire du pin a été isolée et caractérisée comme étant une protéine de poids moléculaire d'environ 28000 Da, après électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS (Lamy N. et al, C.R. Acad. Sci., Paris, 301, 173 (1985) et Lamy M. J. Appl. Ent. 110 (1990) 425 - 437). La thaumétopoéine de la chenille processionnaire du chêne est très apparentée structuralement à celle de la chenille du pin (Novak F; et al- Comp. Bio-chem. Physiol. (1987) Vol 88 A, No 1, pp 141 - 146). Les recherches effectuées jusqu'a présent sur les substances toxiques libérées par ces chenilles ont permis d'établir le lien entre un contact avec la thaumétopoéine et des manifestations d'urticaire au niveau de la peau, voire d'autres réactions plus ou moins localisées. Ces manifestations, attribuées à l'agression mécanique (pénétration dans la peau des poils urticants) et/ou chimique (libération par les poils urticants de la thaumétopoéine) peuvent être plus ou moins graves. Jusqu'à présent, même si l'idée selon laquelle la thaumétopoéine pourrait être chez certains individus ou animaux, responsable d'allergie, a pu être émise, aucun résultat n'a pu être obtenu en vue de démontrer que la thaumétopoéine peut effectivement se comporter comme un allergène chez certains individus. Au contraire, certains auteurs (David B. "L'hérédité et les allergies" - La recherche -1990- 223-902) ont affirmé que les réactions d'urticaire d'origines diverses et par exemple résultant de piqûres d'insectes "proviennent le plus souvent de l'action de substances toxiques, sans la sensibilisation préalable caractéristique de l'allergie". L'allergie est une manière pour l'organisme de réagir envers une substance d'origine étrangère (naturelle ou non) et de façon différée. Lors d'un premier contact avec une substance étrange, le système de défense immunitaire du futur allergique l'identifie et la garde en mémoire. Le deuxième contact avec cette substance étrangère (allergène) aboutira à une réponse exagérée, une hypersensibilité. D'une façon générale, tous les individus réagissent aux substances étrangères en développant des défenses appropriées sous forme de production d'anticorps. Les anticorps produits par les individus allergiques sont spécifiques : ce sont des immunoglobulines de type E (IgE) qu'une recherche sanguine permet de détecter et de doser. Le taux des immunoblobulines constitue la preuve de la maladie allergique. Les IgE circulent en très faible quantité dans le sang (0,01 % des immunoglobulines totales). Comme toutes les immunoglobulines, les IgE sont fabriquées par les lymphocytes. Elles se fixent sur les cellules du sang (basophiles) ou des tissus (les mastocytes).Lors d'un deuxième contact, l'allergène réalise un pontage entre deux molécules d'IgE fixées sur les mastocytes et les basophiles produisant l'activation de ces derniers et la libération de médiateurs tels que l'histamine, les leucotriènes, les prostaglandines,... Leur libération est à l'origine des manifestations allergiques. Les symptômes sont différents selon les organes atteints. Si c'est l'appareil respiratoire, il peut y avoir rhinite, crise d'asthme. Si ce sont les yeux, il peut y avoir blépharite, conjonctivite, kératite, rétinite, uvéïte. Si c'est la peau, un eczéma peut se déclarer. Il peut également se produire une urticaire c'est à dire une éruption cutanée localisée ou généralisée (urticaire géante). Lorsque cette manifestation se situe plus profondément dans le tissu sous-cutané, c'est une urticaire profonde connue sous le nom d'oedème de Quincke avec parfois asphyxie. Enfin dans les cas les plus graves, on peut assister à une allergie généralisée induisant un choc anaphylactique de pronostic parfois mortel. Les inventeurs ont maintenant démontré que contrairement à ce qui a pu être reconnu dans l'art antérieur, la thaumétopoéine n'est pas seulement une protéine urticante mais de plus peut être responsable d'allergie associée à la production chez l'homme d'anticorps de type IgE. L'invention a donc pour objet un procédé pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, de la présence d'IgE spécifiquement dirigées contre la thaumétopoéine. L'invention vise également un kit pour la détection de ces IgE. Elle concerne par ailleurs des moyens propres à la réalisation chez des individus ou des animaux allergiques, d'une désensibilisation vis à vis de la thaumétopoéine, et dans certains cas d'un traitement de cette allergie, par exemple par homéopathie. L'invention vise par conséquent un procédé pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, de la présence d'anticorps de type IgE dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine ou contre une protéine immunologiquement apparentée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de - mise en contact de l'échantillon testé avec la thaumétopoéine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe de type antigene-anticorps entre la thaumétopoéine et les anticorps spécifiques s'ils sont présents; - détection de la présence de complexes de type antigène-anticorps. Parmi les échantillons biologiques, on cite à titre d'exemple, le sang ou le sérum. L'expression "anticorps de type IgE dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine" signifie que les IgE détectées mises en contact avec différents allergènes autres que la thaumétopoéine en particulier avec les pneumallergènes courants, ne produisent pas de complexe immunologique. En particulier ces IgE ne réagissent pas avec les allergènes d'hymènopteres, de poils d'animaux, dans les conditions expérimentales classiques de recherche d'allergie. En outre la spécificité de la thaumétopoéine est telle que les anticorps de type IgE produits par un sujet en contact avec d'autres allergènes comme ceux des hymenoptères, de poils d'animaux, de graminées, de poussières de maison, ne réagissent pas avec la thaumétopoéine. Par nprotéine immunologiquement apparentéen on entend toute protéine reconnue par des anticorps dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine. Plusieurs techniques peuvent naturellement être envisagées pour la réalisation du procédé décrit cidessus. On aura par exemple recours à la technique immuno-enzymatique ELISA décrite dans les exemples, à la technique de dosage radio-immunologique. Dans le cas du dosage des IgE, on aura avantageusement recours à un test de "radioallergosorbant" (RAST). Dans ce test qui reprend les étapes des tests RIA, l'antigène en l'occurence la thaumétopoéine est fixé de façon covalente à un support tel qu'un disque de cellulose. On pourra également avoir recours à un test de type "radio-immunoabsorbant" (RIST), correspondant à un dosage radio-immunologigue par compétition, des IgE sériques. Une première étape consiste à sensibiliser la plaque avec des anti-IgE et des quantités croissantes d'IgE marquées sont ajoutées pour déterminer la quantité maximale d'IgE que peut fixer la plaque. Dans un second dosage l'échantillon susceptible de contenir les IgE recherchées, est mélangé avec une quantité d'IgE, correspondant à la quantité d'IgE marquées qui se sont fixées sur la plaque lors du premier dosage. les IgE recherchées, lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon, entrent en compétition avec les IgE marquées, pour se fixer aux anti-IgE. La quantité d'IgE recherchées de l'échantillon sera déterminée par rapport à la quantité d'IgE marquées non fixées dans le second dosage. Pour la réalisation de ce procédé de détection d'IgE, la thaumétopoéine mise en oeuvre peut être celle isolée chez la chenille processionnaire du pin, ou la thaumétopoéine de la chenille processionnaire du chêne. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention le procédé de détection est caractérisé en ce que la thaumétopoéine est fixée sur un support et en ce que la détection du complexe thaumétopoéine-IgE, est réalisée à l'aide d'un anticorps anti-IgE spécifique d'espèce, marqué par exemple par une enzyme. Tous les supports habituellement utilisés pour fixer les protéines peuvent être utilisés. L'anticorps spécifique d'espèce, utilisé pour révéler la présence du complexe thaumétopoéine-IgE est marqué par exemple avec une substance radioactive, un marqueur fluorescent ou chemoluminescent ou avantageusement par une enzyme susceptible d'être ensuite révélée par mise en contact avec son substrat, de préférence grâce à une réaction colorée. Selon une variante de l'invention, le procédé de détection est caractérisé en ce que la détection du complexe thaumétopoéine-IgE, est réalisée à l'aide d'un ligand capable de se fixer sur les IgE, ce ligand étant marqué, par exemple par une enzyme. Un procédé avantageux de détection in vitro, entrant dans le cadre de la définition générale donnée ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de l'échantillon testé le cas échéant dilué, avec la thaumétopoéine préalablement fixée sur un support, par exemple fixée dans les puits d'une plaque, - le lavage pour éliminer les protéines libres contenues dans l'échantillon testé, - l'addition d'anticorps anti-IgE spécifiques d'espèce, marqués par exemple par une enzyme, dans des conditions permettant la réaction de ces anticorps avec les IgE réagi avec la thaumétopoéine, - le lavage pour éliminer les anticorps anti-IgE libres, - l'addition d'un substrat spécifique de l'enzyme, pour révéler par exemple par coloration, la présence d'anticorps anti-IgE ayant réagi avec les IgE de 1 'échantillon testé, - le cas échéant, le dosage de la quantité d'IgE de l'échantillon testé, ayant réagi avec la thaumétopoéine, par exemple par la mesure de la densité optique. La détection des IgE dirigées contre la thaumétopoéine est qualitative, voire quantitative après avoir établi des courbes d'étalonnage. Pour la réalisation du test de détection, la thaumétopoéine et l'échantillon sont préparés selon des concentrations relatives permettant la réaction. Ces concentrations ont été décrites dans les exemples pour la réalisation d'un test ELISA et l'homme du métier est en mesure d'adapter ces données à d'autres types de tests décrits. L'invention a également pour objet un kit pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, de la présence d'anticorps de type IgE, dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine ou une protéine immunologiquement apparentée, caractérisé en ce qu'il comprend - la thaumétopoéine ou une protéine immunologiquement apparentée, fixée sur un support, - un anticorps anti-IgE spécifique d'espèce, - un marqueur capable de se fixer à l'anticorps anti-IgE, - le cas échéant un révélateur du marqueur, - le cas échéant un témoin négatif et/ou un témoin positif. Selon un mode de réalisation préféré de ce kit, le marqueur est une enzyme et le révélateur est son substrat. L'invention a également pour objet des fractions de la thaumétopoéine, capables de déclencher une réaction d'allergie chez l'homme ou chez l'animal, réaction se manifestant par la production d'IgE reconnaissant la thaumétopoéine et en particulier la fraction testée. De telles fractions que l'on peut qualifier d'"actives" peuvent être obtenues par clivage avec des enzymes ou par traitement avec un détergent conduisant à la dissociation des sous-unités, par exemple avec du SDS. Les moyens décrits précédemment, pour la détection in vitro d'IgE anti-thaumétopoéine, peuvent être mis en oeuvre dans le cadre d'un protocole de diagnostic d'une allergie à des insectes urticants, par exemple des lépidoptères, en particulier à des chenilles ou papillons urticants, par exemple la chenille processionnaire du pin ou la chenille processionnaire du chêne. D'autres tests tels que les tests cutanés habituellement effectués pour détecter les allergies, peuvent être réalisés pour compléter le diagnostic. Des tests cutanés ont par exemple été décrits par les Laboratoires des Stallergènes (7 Allée des Platanes, 94264 Fresnes) sous la référence "Stallerpointe". En outre, la caractérisation de la capacité de la thaumétopoéine à se comporter comme un allergène permet de définir des moyens en vue de la prévention d'allergies due à la thaumétopoéine, et d'envisager des opérations de désensibilisation, voire de traitement. Pour ce faire, on aura recours à l'administration de thaumétopoéine voire d'extraits de poils urticants, selon des concentrations déterminées, en un temps déterminé, selon les techniques habituelles pratiquées par exemple lors de désensibilisation aux venins d'hymenoptères. L'invention concerne à cet égard des extraits de thaumétopoéine sous forme lyophilisée. De préférence, dans le cadre d'une utilisation en vue d'une désensibilisation voire d'un traitement contre la thaumétopoéine. Ainsi l'invention a pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un extrait de thaumétopoéine, de préférence lyophilisée. Une telle composition peut être mise en oeuvre pour réaliser une désensibilisation ou un traitement visant à atténuer voire neutraliser, au moins pendant une durée limitée, les effets de l'allergène ; dans ce cas, des doses croissantes de l'extrait d'allergène sont administrées, au cours d'une période déterminée. S'agissant de la mise en oeuvre de la désensibilisation, on pourra avoir recours au protocole "rush" de désensibilisation (désensibilisation accélérée). A cet égard, on se reportera à la technique décrite par exemple par Freeman J. (Lancet, i, 1930, 744-747) ou Bousquet J. et al (J. Allergy Clin. Immunol. 1983, 69, 133). Dans le cadre d'un traitement homéopathique de l'allergie, l'extrait de thaumétopoéine est utilisé à de hautes dilutions dites homéopathiques. Une solution à haute dilution est obtenue à partir de thaumétopoéine purifiée (substance active), diluée à plusieurs reprises dans une solution de dilution, pour que la substance active soit inférieure à environ 10-10 moles/l. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent. Figure 1. Pipette de prélèvement des poils urticants. Figure 2. Courbe de dilution entre l'extrait total de poils urticants et le sérum de lapin. Figure 3. Courbe de dilution entre la protéine urticante et le sérum de lapin. Figure 4. Histogramme représentant les densités optiques (DO) de sérums trouvés positifs (présence d'immunoglobulines totales dirigées contre de l'extrait total de poils urticants) pour différentes dilutions. Figure 5. Histogramme représentant les densités optiques (DO) de sérums trouvés positifs H1, H8, H10, H5 (présence d'IgE dirigées contre de l'extrait total de poils urticants), suspect (H9) et négatif (H4). Figure 6. Histogramme représentant les densités optiques (DO) de sérums trouvés positifs H1, H8, H10, (présence d'IgE dirigées contre la thaumétopoéine), suspect (H5) et négatif (H9 et H4). MATERIEL ET METHODE 1 - 4 Immunologie et allergie Si en raison des observations cliniques, l'idée que les poils urticants peuvent être responsables de manifestations allergiques, est admise, il n'a jamais été montré qu'ils peuvent induire la production d'IgE, preuve de la maladie allergique. La recherche des IgE éventuellement produites lors d'un contact avec des poils urticants a été effectuée selon la méthode expérimentale suivante - Fabrication d'extraits totaux de poils urticants, - Extraction de la thaumétopéine, - Tests immunologiques, sur sérums de lapin immunisé et d'humain sensible. I - MATERIEL ET METHODES OBTENTION DES EXTRAITS TOTAUX DE POILS URTICANTS ET DE LA THAUNETOPEINE 1) Prélèvement de chenilles Des chenilles processionnaires du pin au stade larvaire L5 ont été prélevées dans la forêt landaise dans les nids ou au moment des processions de nymphose. Dans les deux cas un maximum de protection a été envisagé en raison des risques d'incidents. Plus de 3000 chenilles ont été ainsi stockées dans des bocaux par lots d'environ 100 chenilles. Ramenées au laboratoire, elles ont été placées à 4"C pour être rapidement épilées. 2) Prélèvement des poils urticants Toutes les chenilles ont été épilées miroir par miroir à l'aide d'une pipette pasteur reliée à une trompe à vide "Figure 1". Les chenilles anesthésiées ont été manipulées sous une hotte aspirante. Les poils urticants de 50 chenilles sont aspirés et stockés dans la pipette. Cette dernière est fermée hermétiquement aux deux extrémités et conservée à 4iC. De cette façon, on a obtenu environ 60 mg de poils. Ce même protocole peut être appliqué à d'autres lépidoptères. 3) Préparation des extraits de poils urticants Les méthodes utilisées par PASTUREAUD M.H., Thèse Université Bordeaux I, 1983, et NOVAK F., Thèse Université Bordeaux I, 1987, ont été appliquées. 400 mg de poils urticants ont été broyés dans de l'azote liquide à l'aide d'un pilon de verre selon PAPILLON et CASSIER (Expérientia 38, 1982,1476) avec 5,5 ml de tampon LAEMMLI (Nature 1970, 227, 680). Dans ces conditions, les poils sont rendus plus cassants. Cette solution a été placée sous agitation lente et permanente à 4"C pendant 48 H. Apres centrifugation, (5000 tr/mn pendant 30 mn) on a recueilli le surnageant.Il a été filtré sur millipore (millex 0,22m). Afin d'éliminer les sels qui auraient pu interférer avec les protéines dans les électrophorégrammes, on a dialysé la solution sur une membrane (6000 daltons) contre de l'eau distillée pendant 24 heures. Dans une deuxième préparation des inhibiteurs de protéases (Sérine protéase, Phénylméthanesulphonyl fluorure dit PMSF) ont été ajoutés. En effet, les protéases auraient pu agir sur les protéines en modifiant leur structure. Les deux solutions ont été dosées par la méthode de BRADFORD (Annls Bioch 72, p. 248-254, 1976) : elles contenaient 0,8 mg/ml de protéines. Ces extraits de poils urticants ont été fractionnés puis stockés au congélateur. Certaines de ces fractions ont été utilisées telles quelles pour les analyses immunologiques, d'autres pour la purification de la protéine urticante par électrophorèse. 4) Purification de la protéine urticante * Electrophorèse L'électrophorèse en gel d'acrylamide (concentration 12 %) séparant les protéines par leur charge a été choisie. Cette méthode s'est révélée la plus efficace et a permis d'identifier la thaumétopoéine. la manipulation a été réalisée en conditions natives afin de ne pas dénaturer les protéines. On a coulé entre deux plaques verticales un gel d'étanchéité, puis le gel de séparation à 12 %. Dans la partie supérieure un stacking gel a été déposé, pour permettre la concentration des protéines avant leur séparation lors du passage du courant. Une cuve LKB couplée à un système de refroidissement a été utilisée. L'extrait total de poils urticants a été dilué au 2/3 dans un tampon d'échantillon (sample buffer). Une préélectrophorèse a été réalisée avant le dépot de 50A1 de la solution urticante par puits. L'électrophorèse se fait dans un tampon de migration pendant 4 h sous un courant continu de 60 mA assuré par un générateur de type LKB Bromma 230 Multidrive XL. Les gels sont colorés et fixés durant une heure dans une solution contenant 10 % d'acide acétique, 50 % de méthanol et 0,5 % de bleu de Coomassie R250. Afin de visualiser les protéines, les gels ont été décolorés dans un mélange de 30 % de méthanol, 7,5 % d'acide acétique. plusieurs bains ont été nécessaires pour y parvenir. Les gels ont été ocnservés sous plastique avec un peu de décolorant à 40C. * Electroélution Cette technique permet de récupérer les protéines contenues dans le gel en les remettant en solution dans un tampon. Les bandes visualisées par la coloration au bleu de Coomassie ont été découpées et identifiées comme étant la thaumétopéine par immunoempreinte. De la même façon, des bandes voisines ont été isolées. Le dispositif est constitué de deux chambres réunies par un pont et posées sur deux cuves. C'est du coté de la cathode (A) qu'ont été placés les morceaux de gel d'acrylamide en présence de 200 Al de tampon ammoniumhydrogénocarbonate 0,4 N. Du coté anodique, on a réalisé la concentration des protéines extraites du gel. On a rempli les deux chambres de tampon ammoniumhydrogénocarbonate 0,05 N. A la base des deux chambres, une membrane de dialyse de 6000 daltons assure l'étanchéité. Cet ensemble a été déposé sur deux cuves remplies de tampon ammoniumhydrogénocarbonate 0,05 M. Les deux cuves étaient reliées aux bornes d'un générateur assurant le passage au travers de deux chambres. On a pu suivre la migration des protéines en observant la coloration, liée au bleu de Coomassie, au niveau de la membrane de dialyse du côté anodique. Après 24 h les protéines ont été récupérées puis conservées au congélateur. * Toxicité de thaumétopoéine Deux tests biologiques ont été utilisés. Ils reconnaissent la propriété toxique de l'extrait total de poils urticants et de la thaumétopoéine purifiée, en mettant en évidence le pouvoir histamino-libérateur. - Test in vitro sur de mastocytes de souris Les mastocytes de souris ont été prélevés dans la cavité péritonéale à l'aide d'une pipette pasteur. Ils ont été lavés et récupérés dans un milieu de culture cellulaire. 50 yl de cette préparation ont été incubés avec 10 Al de solution urticante ou non, à 37-C, dans une atmosphère contenant 5 % de CO2, pendant 20 minutes. On a ajouté alors 10 yl de bleu de toluidine à 0,3 %. Une observation directe au microscope a permis de différencier les mastocytes intacts et dégranulés et de conclure sur le pouvoir urticant ou non de la solution testée. L'extrait total de poils urticants, différentes bandes électroluées et le tampon d'électroélution ont ainsi été testés. - Test in vitro sur les R.B.L (Rat Basophile Leucocytes) Il s'agit de cellules leucémiques de rat de la lignée des basophiles. Ces cellules sont peu différenciées et possèdent de ce fait de nombreuses potentialités comme celle en particulier de pouvoir dégranuler en présence d'une substance urticante. Mises en culture, les RBL ont permis de mettre en oeuvre un test analogue à celui des mastocytes de souris. 50 ?l de RBL ont été déposés sur une lame microscopique et ont été mis à incuber à 37-C en atmosphere humide dans une étuve à CO2 pendant 1 h 30. On a observé alors l'état des cellules au microscope en s'assurant qu'elles avaient bien adhéré au verre.On a ajouté 10 l de solution urticante ou non et l'on a replacé l'ensemble, dans les mêmes conditions, à l'étuve pendant 30 mn. On a coloré avec 10 g1 de bleu de toluidine à 0,3 %, puis on a recouvert la lame avec une lamelle. Une observation microscopique a permis de visualiser la dégranulation ou l'absence de dégranulation des RBL. OBTENTION DES SERONS DE LAPIN ET DE SERUNS HUMAINS 1) Sérums de lapin Un immunsérum de lapin obtenu par NOVAK dirigé contre les protéines spécifiques du poil urticant dont la thaumétopoéine a été utilisé. I1 a été réalisé par la technique du double épuisement contre de l'extrait cuticulaire à partir d'un immunsérum polyvalent antiprotéines de poils urticants de la chenille processionnaire du pin. Ce sérum monospécifique (antithaumétopoéine) a servi de base quant à l'élaboration des différents tests immunologiques. 2) Sérums humains Afin de rechercher l'éventuelle présence d'anticorps dirigés contre la thaumétopoéine et notamment les IgE, dans des sérums humains, 21 sujets ayant manifesté des réactions assez importantes liées aux chenilles processionnaires du pin, ont fait réaliser un prélèvement de sang dans un laboratoire d'analyse. Les 21 échantillons ont ensuite été testés pour la recherche des immunoglobulines humaines. METHODES IMMUNOLOGIQUES 1) Techniques immunoenzvmatigue : Méthode ELISA (Enzymo Linked Immunosorbent Assay) 1-1 Principe Ce test très sensible est très utilisé pour mettre en évidence les liaisons antigene-anticorps. Il comprend les étapes suivantes 1. la fixation de l'antigène contre lequel on cherche à détecter la formation d'anticorps dans les puits d'une plaque (coating); 2. la mise en présence d'anticorps d'une espèce donnée avec l'antigène fixé, en l'occurence la mise en contact de l'échantillon testé susceptible de contenir des anticorps dirigés contre les antigenes de 1), avec l'antigène fixé; 3. l'addition d'anticorps anti-anticorps de l'espèce, couplés avec une enzyme; 4. l'apport d'un substrat réagissant avec l'enzyme en donnant une réaction colorée dont l'intensité, proportionnelle aux liaisons entre l'antigène et le premier anticorps, est quantifiée par un spectrophotometre. 1-2 Protocoles * Avec l'immunsérum anti-thaumétopoéine de lapin Un ELISA a été réalisé en "coatant" les plaques avec de l'extrait total de poils urticants ou la protéine urticante puis en ajoutant le sérum de lapin. La mise au point préalable de ce test est indispensable avant d'utiliser les sérums humains. - Coating On a dilué l'extrait total de poils urticants ou la protéine purifiée dans du tampon Carbonate Bicarbonate (CBC) (0,05M Ph 9,6) pour obtenir 1 yg de protéine par ml. On a utilisé des plaques comportant 96 puits. On a déposé 100 Zl par puits de solution. La plaque a été placée à 4 C pendant une nuit. - Post-coating La plaque a été lavée 3 fois avec du tampon PBS contenant du Tween 20 (0,5 ml/l). Afin de saturer les sites libres qui pourraient interférer dans le déroulement de la manipulation, on a ajouté 100 l par puits de Bovine Sérum Albumine (BSA) à 1 % diluée dans du PBS. LA plaque a été placée dans une étuve à 370C pendant 1 h 30. - Immunsérums de lapin On a lavé à nouveau trois fois la plaque avec le PBS Tween. On a préparé une gamme de dilution de l'immunsérum de lapin allant du 1/50 au 1/64000. On a ajouté 100 l de chaque dilution par puits. pour une même dilution, plusieurs puits ont été réalisés. La plaque a été déposée dans l'étuve à 370C pendant 1 h 30. - Conjugué Après trois lavages au PBS Tween, on a ajouté l'anticorps secondaire. Il s'agissait d'un sérum de chevre contenant des anticorps anti-anticorps de lapin conjugués à la peroxydase. On a dilué ce conjugué au 1/5000 dans du PBS. On a ajouté 100 l de cette solution par puits. La plaque a été placée à 37 C pendant une heure. - Substrat. On a effectué 4 lavages avec du PBS Tween afin d'éliminer totalement le conjugué qui n'aurait pas été fixé. Au cours de ces lavages, on a préparé le substrat à l'abri de la lumiere. Il s'agissait de 15 mg d'Ortho Phénylène Diamine (OPD) dissous dans 30 ml de tampon citrate 0,1M auquel on a ajouté 90 l d'eau oxygénée à 30 %. Ce substrat réagit avec la peroxydase en donnant une réaction colorée. Toujours à l'abri de la lumière, on a déposé dans chaque puits 100 l de substrat. Après 15 mn, on a bloqué la réaction avec 50 l d'acide sulfurique (H2SO4) 4N. La lecture a été réalisée avec un spectrophotomètre à 492 nm. Certaines bandes obtenues apres électrophorèse et électroélution de l'extrait total de poils urticants ont également été "coatées". * Avec les sérums humains Avant de rechercher des IgE dirigées spécifiquement contre la protéine urticante, on a recherché dans un premier temps la présence d'anticorps totaux (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) éventuellement produits lors d'un contact avec les poils urticants. Pour cela la plaque a été "coatée" avec l'extrait total de poils urticants, puis les sérums humains ont été déposés dans les puits, puis la présence d'anticorps a été recherchée en utilisant un conjugué anti-immunoglobulines humaines totales. Les plaques ont été coatées avec 0,1 ig de protéines par puits. Les sérums ont été utilisés à différentes concentrations (1/8 au 1/128). Le deuxième anticorps est un conjugué de chèvre anti-immunoglobulines totales couplé à la peroxydase. Il est utilisé au 1/5000. La révélation se fait avec l'O.P.D et la lecture à 492 nm. Comme pour le sérum de lapin, pour une même dilution de sérum, plusieurs puits ont été réalisés. Dans un deuxième temps, le conjugué antiimmunoglobulines totales a été remplacé par un conjugué dirigé contre les immunoglobulines de type E. Il est utilisé au 1/1800. En raison du faible pourcentage d'IgE par rapport aux immunoglobulines totales (0,01 %), les sérums ont été utilisés au 1/4. Enfin, dans un troisième temps, la protéine purifiée a été "coatée" dans les puits. Les sérums humains sont dilués au 1/4. Le conjugué de chevre anti-immunoglobulines de type E est utilisé au 1/1800. Comme pour le sérum de lapin, certaines bandes obtenues après électrophorèse et électroélution de l'extrait total de poils urticants ont été "coatées". De la même façon, des puits ont été réalisés en coatant avec des allergènes classiques (phléole, dactyle). Par la suite, les sérums humains ont été ajoutés. Parallèlement à ce travail, une dizaine de sérums d'allergiques déjà connus pour leur important taux en IgE ont été utilisés. Il s'agit d'allergiques aux graminées (dactyle, phléole), aux poussieres de maison (acariens : Dermatophagoïdes farinae et pteronysimus), aux hyménoptères (abeille, guêpe), aux poils de chien et aux poils de chat. Ces sérums dilués au 1/4 ont été testés sur la protéine purifiée, afin de vérifier que les IgE ne se fixent pas sur la thaumétopoéine. Enfin les sérums d'allergiques aux graminées ont été testés en tant que témoins positifs sur des allergènes dactyle et phléole. 2 RéSULTATS Immunologie a) PURIFICATION DE LA PROTEINE URTICANTE * Electrophorèse La comparaison des électrophorégrammes obtenus avec l'extrait total de poils urticants et le même extrait, auquel on a ajouté des inhibiteurs de protéases, ne révèle aucune différence. On retrouve exactement le même nombre de bandes à la même position. L'hypothèse concernant la présence de protéase dans la préparation et risquant de modifier les protéines de l'extrait total de poils urticants, est donc écartée. A partir du gel obtenu avec le premier extrait, la bande nommée B4 a été découpée selon la technique de F. NOVAK. Selon ces travaux, elle est constituée en de deux bandes de poids moléculaires voisins, 15000 daltons et 13000 daltons. Ces deux protéines sont toutes deux réactives avec l'immunsérum monospécifique dirigé contre la protéine urticante avec une immunoréactivité plus importante pour la protéine de 15000 daltons. D'autres bandes B3, B2, B1 situées, dans le gel, au dessus de B4 ont également été découpées. * Identification de la thaumétopoéine Après électroélution de B3 et de B4, les deux tests biologiques de dégranulation ont été utilisés. 1) Déqranulation des mastocytes de souris Selon le protocole décrit, l'extrait total de poils urticants ainsi que la bande B4 révélaient une dégranulation quasi totale de tous les mastocytes de souris. Parallèlement, le tampon Laemmli, la bande B3 et le tampon d'électroélution, ne provoquaient aucune dégranulation. La thaumétopoéine est donc présente dans la bande B4. 2) Déqranulation des RBL Les résultats sont identiques à ceux obtenus avec les mastocytes de souris. On obtient 100 % de dégranulation avec l'extrait total de poils urticants et avec la bande B4. Les témoins ne provoquent pas de dégranulation. Ces résultats permettent de confirmer la présence de la thaumétopoéine dans la bande B4. La mise au point de ce nouveau protocole est intéressante. L'observation microscopique de la dégranulation des RBL est plus évidente que pour les mastocytes et ce test ne nécessite pas le sacrifice d'une souris. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide de l'électroélution, et enfin des tests de dégranulation, ont permis de séparer et d'identifier la thaumétopoéine. Nous pouvons désormais l'utiliser dans nos différents tests immunologiques. b) RESULTATS IMMUNOENZYMATIQUES METHODE ELISA * Sérums de lapin Mise au point du test L'expérience a été réalisée avec l'extrait total de poils urticants et l'immunsérum de lapin. On a constaté que les liaisons antigène-anticorps primaire s'effectuaient, car la révélation par le deuxième anticorps avec le substrat a donné une forte coloration. Pour une même dilution de sérum de lapin, on a réalisé des puits coatés avec l'extrait total de poils urticants et des puits non coatés. La comparaison des valeurs obtenues entre ces deux types de puits a permis d'évaluer la validité des résultats. Pour écarter toute mauvaise interprétation, on a considéré qu'il y avait une différence significative entre les deux types de puits chaque fois que la valeur trouvée (moyenne de 5 valeurs) avec la présence de l'antigène était deux fois supérieure à celle trouvée sans antigène.Dans ce cas, le sérum a été considéré comme positif, c'est à dire qu'il contenait des anticorps dirigés contre l'antigène coaté. Ce principe est valable pour tous les autres tests réalisés par la suite. Pour le sérum de lapin, une courbe de dilution a été réalisée. les valeurs des densités optiques (DO) obtenues à 492nm sont représentées en fonction des dilutions de sérums "Figure 2". Le sérum de lapin a donc bien réagi avec l'extrait total de poils urticants. On a observé avec la dilution du sérum une diminution de la densité optique en relation avec la concentration des anticorps. Par rapport aux puits dans lequels l'extrait total de poils urticants n'a pas été coaté, on a constaté que la DO (bruit de fond) était toujours inférieure à plus de deux fois celle obtenue avec l'antigène (jusqu'au 1/32000). Parallèlement, des sérums de lapins normaux (non immunisés) dilués au 1/4 ont été testés sur l'extrait total. Dans tous les cas la DO était proche des bruits de fond montrant que des anticorps non spécifiques ne se fixent pas sur l'antigène. Cette expérience constituait la premiere étape montrant que le test est réalisable. Cependant le sérum de lapin était mis en présence de l'extrait total de poils urticants, donc d'une multitude de protéines (mises en évidence dans les électrophorégrammes). La deuxieme étape a donc consisté à coater comme précédemment la protéine urticante électroéluée dans les puits. Les réactions antigène-anticorps ont été recherchées. Avec la protéine urticante purifiée Selon le même protocole que pour l'extrait total de poils urticants, la protéine urticante a été coatée ou non (bruits de fond). Les bandes B3, B2, B1 électroéluées ainsi que le tampon de migration d'électroélution ont été aussi coatées. Seule la protéine urticante (B4) a réagi avec le sérum de lapin. La courbe de dilution comme pour l'extrait total de poils urticants a été tracée (fig 3). Les autres bandes testées, ainsi que le tampon d'électroélution, n'étaient pas immunoréactifs. Cette expérience a montré que le sérum est dirigé spécifiquement contre la protéine urticante. Elle était donc bien présente dans la bande B4. * Sérums humains Recherche des Immunoqlobulines totales à partir de l'extrait de poils urticants. Au cours de ce test, il s'agissait d'étudier les 21 sérums humains à partir de 1 'extrait total de poils urticants en recherchant la présence des immunoglobulines totales. Si certains sujets réagissaient avec l'extrait total, on mettait en évidence le pouvoir immunogène des protéines constitutives de l'extrait total. Dès lors des recherches plus précises, tout d'abord d'IgE dirigées contre l'extrait, puis contre la protéine urticante, pouvaient être entreprises. Sur les 21 sérums humains numérotés de H1 à H21, 5 ont réagi de façon significative (DO > 2 fois la DO du blanc) avec l'extrait total de poils urticants. Il s'agit de H1, H5, H9, H10, H18. Les autres sérums ne réagissaient pas de façon significative avec l'extrait total "Figure 4n. Ces résultats démontraient pour la première fois que certains individus produisent des anticorps dirigés contre de l'extrait total de poils urticants. On a donc recherché si parmi les immunoglobulines détectées par l'anticorps secondaire anti-immunoglobulines totales on notait la présence d'immunoglobulines de type E. Recherche des Immunoglobulines de type E à partir de l'extrait total de poils urticants Les 21 sérums ont été repris, avec une attention particulière pour les sérums détectés précédemment. Le conjugué anti-immunoglobulines totales a été remplacé par un conjugué anti-immunoglobulines de type E. le coating a été réalisé avec l'extrait total de poils urticants. La densité optique des sérums intéressants dilués au 1/4 a été représentée sous forme d'histogramme "Figure 5n. Les sérums H1, H18, H10 et H5 ont été trouvés positifs. Ils ont donc permis d'affiner les résultats obtenus avec le conjugué anti-immunoglobulines totales en démontrant la présence d'IgE. H9 semblait contenir également des IgE, mais la DO obtenue n'était pas deux fois supérieure à celle obtenue avec le blanc. Ce sérum à donc été considéré comme suspect. Les 16 autres sérums étaient négatifs. Les densités optiques étaient toujours proches de celles des blancs. Seul l'exemple (H4) a été représenté. L'étape suivante a consisté & démontrer que les IgE produites par les individus étaient dirigées contre la protéine urticante et non contre d'autres protéines constitutives de l'extrait total de poils urticants. Recherche des Immunoglobulines de Type E dirigées contre la protéine urticante L'expérience menée ici était identique à la précédente. Seul le coating était différent. La protéine urticante a été déposée dans les puits, à la place de l'extrait total de poils urticants. Parmi les 21 sérums testés, 3 étaient significativement positifs (H1, H18 et H10) "Figure 6". Nous avons "perdu" définitivement dans cette expérience le sérum H9. Les immunoglobulines détectées dans les expériences précédentes dans ce sérum n'étaient pas dirigées contre la protéine urticante mais contre d'autres protéines constitutives de l'extrait total de poils urticants. De la même façon le sérum H5 était suspect. Cet individu a dû produire des IgE dirigées contre la protéine urticante mais aussi contre d'autres protéines des poils urticants. Ce phénomène explique la diminution de la densité optique entre les dernières expériences. Les 16 autres sérums étaient négatifs. Seul le sérum H4 a été représenté sur la figure. * Spécificité de la thaumétopoéine Des protéines électroéluées autres que B4 ont été coatées. Parmi les sérums positifs en IgE sur l'extrait total de poils, aucune ne réagissait avec les protéines coatées. En testant toutes les bandes de l'électrophorèse comme LEHRER et HORNER (Aerobiologia, 6, p. 181-186, 1990), VIJAY et coll (Aerobiologia 6, p. 159-164, 1990 ; Grana 30, p. 161-165, 1991 ; Grana 30, p. 167-170, 1991) sur les protéines de spores. On aurait mis en évidence les protéine(s) constitutive(s) de l'extrait total de poils urticants sur lesquelles le sérum H 9 voire le sérum H 5 réagissaient. Les sérums contenant des IgE dirigées contre la protéine urticante ont été testés sur des allergènes classiques de graminées. Ils étaient négatifs. Parallèlement à ce travail, une dizaine de sérums d'allergiques aux graminées, aux poussières de maison, aux hyménoptères et aux poils de chien ou de chats ont été expérimentés sur la protéine urticante. Ils étaient tous négatifs. Les IgE de ces sérums ne se fixaient donc pas sur la protéine urticante. Enfin en tant que témoins positifs de l'expérience, les IgE d'allergiques aux graminées se fixaient bien sur les allergènes correspondants (phléoles et dactyles) en donnant une réaction positive. Dans le cadre de ces expérimentations, on a montré par ces réactions croisées que les IgE dirigées contre la protéine urticante sont spécifiques. Elles ne se fixent pas sur d'autres allergènes. De la même façon les IgE d'allergiques à des graminées ne se fixent pas sur la protéine urticante. Conclusions Pour la première fois des immunoglobulines humaines de type E dirigées contre la protéine urticante ont été mises en évidence. Pour arriver à ce résultat, de nombreuses étapes ont dû être franchies. I1 a fallu travailler avec un sérum de lapin immunisé et un extrait total de poils urticants pour s'assurer de la réalisation du test. Le test a ensuite été affiné en purifiant la protéine urticante. Puis il a fallu vérifier que le test était toujours applicable. A partir de ce moment, les sérums humains ont pu être utilisés en recherchant des immunoglobulines totales, puis des IgE, dirigées contre l'extrait de poils urticants. Enfin une recherche d'IgE spécifiques à la protéine urticante a pu être réalisée. Si le nombre de sérums possédant de telles IgE est faible (3/21), il était important de démontrer la présence de telles immunoglobulines responsables d'allergie. La protéine urticante doit être classée parmi les substances allergéniques et même pneumallergéniques car la thauméotopéine est présente dans l'atmosphère via les poils urticants. L'invention offre donc des moyens pour aider au diagnostic, faire de la prévention, voire de la désensibilisation (BOUSQUET et coll., La Presse Médicale, 8 décembre 1984, 13 n- 44, 2679-2683). En ce qui concerne ce dernier aspect on peut administrer un broyat de chenilles processionnaires du pin ou la protéine urticante chez des sujets sensibles aux chenilles mais aussi chez des individus allergiques à d'autres substances. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, de la présence d'anticorps de type IgE dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine ou contre une protéine immunologiquement apparentée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de - mise en contact de l'échantillon testé avec la thauméotopéine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe de type antigène-anticorps entre la thaumétopoéine et les anticorps spécifiques s'ils sont présents; - détection de la présence de complexes de type antigène-anticorps. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que la thaumétopoéine est celle de la chenille processionnaire du pin. 3. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que la thaumétopoéine est celle de la chenille processionnaire du chêne. 4. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la thaumétopoéine est fixée sur un support et en ce que la détection du complexe thaumétopoéine-IgE, est réalisée à l'aide d'un anticorps anti-IgE spécifique d'espèce, marqué, par exemple par une enzyme. 5. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la détection du complexe thaumétopoéine-IgE, est réalisée à l'aide d'un ligand capable de se fixer sur les IgE, ce ligand étant marqué, par exemple par une enzyme. 6. Procédé de détection in vitro de la présence d'anticorps de type IgE dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de l'échantillon testé le cas échéant dilué, avec la thaumétopoéine préalablement fixée sur un support, par exemple fixée dans les puits d'une plaque, - le lavage pour éliminer les protéines libres contenues dans l'échantillon testé, - l'addition d'anticorps anti-IgE spécifiques d'espèce, marqués par exemple par une enzyme, dans des conditions permettant la réaction de ces anticorps avec les IgE ayant réagi avec la thaumétopoéine, - le lavage pour éliminer les anticorps anti-IgE libres, - l'addition d'un substrat spécifique de l'enzyme, pour révéler par exemple par coloration, la présence d'anticorps anti-IgE ayant réagi avec les IgE de 1 'échantillon testé, - le cas échéant, le dosage de la quantité d'IgE de l'échantillon testé, ayant réagi avec la thaumétopoéine, par exemple par la mesure de la densité optique. 7. Kit pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, de la présence d'anticorps de type IgE, dirigés de façon spécifique contre la thaumétopoéine ou une protéine immunologiquement apparentée, caractérisé en ce qu'il comprend - la thaumétopoéine ou une protéine immunologiquement apparentée, fixée sur un support, - un anticorps anti-IgE spécifique d'espèce, - un marqueur capable de se fixer à l'anticorps anti-IgE, - le cas échéant un révélateur du marqueur, - le cas échéant un témoin négatif et/ou un témoin positif. 8. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que le marqueur est une enzyme et le révélateur du marqueur est le substrat de cette enzyme. 9. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 6 ou du kit selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 en vue du diagnostic d'une allergie à des insectes urticants, par exemple des lépidoptères, en particulier à des chenilles ou papillons urticants, par exemple la chenille processionnaire du pin ou la chenille processionnaire du chêne.