Brevet FR2699819A1 — publié le 19940701

UTILISATION DE PRODELPHINIDINES POUR L'OBTENTION DE MEDICAMENTS DESTINES AU TRAITEMENT DE L'ARTHROSE La présente invention a pour objet l'utilisation de prodelphinidines, et plus particulièrement celles obtenues à partir de Ribes nigrum, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de l'arthrose. Dans les conditions normales, le cartilage articulaire est soumis à un remodelage lent assuré par un mécanisme de chondrorésorption parfaitement compensé par un processus de chondroréparation (ou chondroformation) qui maintient le cartilage articulaire en équilibre dynamique (Franchimont et al., 1991). La chondrorésorption est assurée par le chondrocyte lui même qui produit des prostaglandines dont la PGE2, des enzymes protéolytiques (collagénase, stromelysine, serine protéases...) et des radicaux libres oxygène qui s'attaquent à la matrice cartilagineuse, la désorganise et la détruit. Parallèlement à cette chondrorésorption, a lieu une chondroformation homéostatique qui répare la matière altérée et/ou résorbée; il y a production des macromolécules qui forment la structure de la substance fondamentale: les collagènes de type II et de type IX, les protéoglycanes, les protéines de jonction, etc... On peut assister à la prolifération clonale de chondrocytes lorsque la chondroformation doit être importante. Cette phase de chondroformation est un processus dépendant de plusieurs facteurs dont la concentration en macromolécules des zones de voisinage du chondrocyte et de l'équilibre hormonal, en particulier de la sécrétion d'hormone de croissance, d'IGF I et II, de calcitonine, d'androgènes... Différents facteurs pathogéniques peuvent survenir qui accélèrent la dégradation du cartilage par accélération du processus de chondrorésorption rompant I'équilibre entre la chondrorésorption et la chondroréparation en faveur du premier. Il s'agit, entre autre, des surcharges fonctionnelles et pondérales articulaires, des dépôts de microcristaux et des troubles de nutrition des structures articulaires. Ces facteurs pathogéniques vont agir en stimulant la production de cytokines (IL1 P, TNF a, IL6...) par les chondrocytes eux-mêmes, par d'autres cellules des structures de voisinage comme les synoviocytes A de la synoviale articulaire. Le déséquilibre sera d'autant plus net qu'il existera des perturbations hormonales (comme c'est le cas après 50 ans, âge du développement de l'arthrose) rendant la chondroréparation moins efficace. Ce déséquilibre biochimique conduit à une fragilisation du cartilage articulaire qui se fissure d'abord en superficie puis en profondeur mettant à nu l'os sous chondral. L'arthrose est l'expression clinique de cette perte de fonction cartilagineuse, elle-même conséquente du déséquilibre biochimique entre la chondrorésorption et la chondroréparation. La thérapeutique médicamenteuse de l'arthrose est pauvre: les anti-inflammatoires non stéroïdiens luttent contre la douleur et améliorent le mouvement; ils n'arrêtent pas l'évolution de la maladie, en particulier la destruction du cartilage, et ne permettent pas la réparation du cartilage. Notamment, l'utilisation de pycnogénols provenant d'extraits de végétaux tels que Ribes nigrum, pour la préparation de médicaments à activité antiinflammatoire, fait l'objet de la demande internationale WO 92/14457 du 14 février 1992. Par ailleurs, l'utilisation de proanthocyanidines pour la prévention ou le traitement de pathologies dues aux effets biologiques des radicaux libres, notamment des inflammations, fait l'objet du brevet US nO 4, 698, 360 déposé le 9 avril 1985. La présente invention a précisément pour but de fournir des médicaments qui, par leurs propriétés de réduction de la chondrorésorption et de stimulation de la chondroréparation, permettent de traiter efficacement l'arthrose ou tout autre pathologie directement ou indirectement liée à une destruction du cartilage et à l'absence de réparation de ce dernier par les mécanismes biologiques de l'organisme. La présente invention a pour objet l'utilisation de prodelphinidines de formule (I) dans laquelle: - R1 et R2 représentent indépendamment H ou OH, - R3 et R4 sont différents et représentent H ou OH, et, - n est un nombre entier de 2 à 40, de préférence de 2 à 10, notamment de 2 à 5, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des pathologies articulaires liées à une destruction du cartilage et à l'absence de réparation efficace de ce dernier, et plus particulièrement de l'arthrose. Par leurs propriétés de stimulation de la production de protéoglycanes et de collagènes (notamment de type II) dans le cartilage, les prodelphinidines selon l'invention sont susceptibles de restaurer le processus de chondroformation. Ces prodelphinidines présentent en outre l'avantage de réduire la chondrorésorption, notamment par leurs effets de réduction de la production des prostaglandines (notamment du type E2) et de réduction de la production de radicaux libres dans l'organisme. Les médicaments selon l'invention sont plus particulièrement destinés à l'administration par voie orale, parentérale ou topique. De préférence, les prodelphinidines contenues dans ces médicaments sont celles issues de plantes, et plus particulièrement de Ribes nigrum. Selon un mode de réalisation de l'invention, les médicaments sus-mentionnés comprennent des extraits de Ribes nigrum, ces extraits comprenant eux-mêmes des prodelphinidines. Ces extraits de Ribes nigrum peuvent avantageusement être obtenus selon les procédés suivants. Dans un premier procédé avantageux pour préparer un extrait de Ribes nigrum, on pulvérise un lot de feuilles que l'on épuise par percolation lente au moyen d'éthanol à 700. Après obtention du dernier percolat, on exprime la poudre et on rassemble toutes les solutions extractives. L'éthanol est éliminé par distillation à l'évaporateur rotatif, sous pression réduite, à une température inférieure à 500C. La solution aqueuse restante est filtrée afin d'éliminer une partie importante de chlorophylle. On pratique ensuite un fractionnement en utilisant successivement des solvants de polarité croissante, tels que: a) l'éther diéthylique afin d'éliminer la chlorophylle restante et diverses substances liposolubles; b) l'acétate d'éthyle; c) le n-butanol. Dans un autre procédé avantageux d'extraction, on épuise un lot de poudre de feuilles sèches de Ribes nigrum par percolation lente, au moyen d'un mélange acétone-eau. Après obtention du dernier percolat, on exprime la poudre à la presse et on rassemble tous les liquides. L'extrait total peut être agité vigoureusement avec du NaCl, ajouté jusqu'à l'obtention de deux phases: une phase supérieure acétonique et une phase inférieure aqueuse. La phase acétonique est évaporée sous pression réduite à 300C et le résidu aqueux est additionné d'un égal volume d'eau, filtré puis ré-extrait: soit par de l'acétate d'éthyle, soit par du butanol. Les extraits sont ensuite évaporés à sec. On obtient ainsi des extraits contenant au moins 2% en poids de prodelphinidines de formule (I). Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les prodelphinidines contenues dans les médicaments susmentionnés, sont isolées et purifiées à partir d'extraits de Ribes nigrum. L'isolement et la purification des prodelphinidines à partir de Ribes nigrum est avantageusement effectuée par différentes techniques de chromatographie sur gel, ou encore des techniques d'ultra-filtration connues de l'homme du métier, à partir des extraits obtenus selon les procédés décrits ci-dessus. Parmi les techniques chromatographiques, on citera notamment l'utilisation de la colonne Fractogel TSK (MERCK, USA) en éluant à l'aide d'eau, puis d'un mélange eau/méthanol à pourcentage croissant en méthanol; la colonne Séphadex LH 20 (PHARMACIA, SUEDE) en éluant à l'aide d'alcool puis d'alcool additionné d'eau; ou encore sur une colonne Lobar Lichroprep RP8 (MERCK, USA), l'élution étant réalisée à l'aide d'un mélange eau/acétone. Ces différentes techniques peuvent être combinées entre elles pour obtenir un plus haut degré de purification. Des médicaments particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce qu'ils contiennent des prodelphinidines choisies parmi l'une au moins des molécules (Ia), (Ib), et (Ic) suivantes: L'invention sera davantage illustrée dans la description détaillée qui suit de l'effet de compositions à base de prodelphinidines selon l'invention, sur la chondroréparation et la chondrorésorption. Le modèle utilisé pour tester les proanthocyanidols à savoir la culture des chondrocytes humains en trois dimensions permet de quantifier la chondroréparation par la production de substances matricielles: collagène de type II, protéoglycanes, et la chondrorésorption par la réduction des taux produits de la prostaglandine E2 et des radicaux libres de type OH0 et 002. I) MATERIELS ET METHODES (Franchimont et al., 1989) 1. Culture tridimensionnelle de chondrocytes humains La technique utilisée a été décrite en détail (Bassleer et al., 1986). Brièvement, des chondrocytes articulaires humains sont cultivés dans le DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium - ICN Gand, Belgique) additionné soit d'Ultroser G 1% (GIBCO, Gand, Belgique) soit de 10% de sérum de veau foetal (ICN - Gand - Belgique), et de 50 ssg d'acide ascorbique/ml. Le cartilage provient de la zone apparemment normale de têtes fémorales humaines atteintes d'arthrose, immédiatement après l'opération réalisée pour la mise en place d'une prothèse totale de hanche; il peut également provenir de tête fémorale saine, mais ayant subi un traumatisme et devant être remplacée.Ce cartilage est ensuite digéré par la collagénase clostridiale 1 mg/ml (Boehringer-Mannheim, Allemagne) dans un tampon, (NaCl 120 mM, CaCl2 lmM, KCL 5 mM, KH2P04 1 mM, NaHC03 25 mM, glucose 2 mM et Hepes 30mM, pH 7.4) durant 24 heures. Après 6 lavages successifs et centrifugations, les chondrocytes, isolés de leur matrice, sont mis en culture dans des flacons (10 6 cellules/2 ml de milieu de culture) placés sur un gyrotor (100 tpm). Les cultures sont maintenues à 37 OC dans une atmosphère air 95%-C02 5% (Bassleer et al., 1986). Cultivés dans ces conditions, après 4 à 5 jours, les chondrocytes forment un agrégat tridimensionnel dans chaque flacon. Ces agrégats, d'abord d'aspect floconneux, tendent ensuite à se condenser au cours de la culture. Après deux semaines, leur diamètre est, en général, de 1 à 2 mm.Le poids frais des agrégats augmente avec la durée de culture, surtout durant les premiers jours. 2. Dosage radioimmunologique des protéoglycanes (PG) cartilagineux Les PG sont mesurés par un dosage radioimmunologique (RIA) spécifique et sensible des PG cartilagineux humains (Gysen et al., 1984). Les PG ont été extraits à partir de cartilage humain, selon les méthodes décrites par Roughley et al. (1981) et par Bayliss et Venn (1980). L'antisérum contre les PG cartilagineux humains a été obtenu chez le lapin selon la technique de Vaitukaitis et al. (1971).Le dosage radio-immunologique est réalisé dans un volume de 0,4 ml consistant en 0,1 ml de la solution traceur (15000 à 20000 cpm 125 I-PG, marqués par la méthode à la chloramine T (Greenwood, 1973), 0,1 ml d'antisérum anti-PG dilué à 1/5000 dans un tampon phosphate salin (PBS - PO4 50 mM, NaCl 150 mM), contenant de la BSA (albumine de sérum bovin-5g/l et de l'azide sodium -6.7 mM) (tampon d'incubation) et 0,2 ml de plusieurs dilutions de milieu de culture ou d'extrait d'agrégat ou encore de l'antigène (0,5 - 500 ng/tube). Après quatre jours à 4"C, les PG* (PG radioactifs) libres sont séparés des complexes PG*-anticorps par double précipitation (Franchimont et al., 1983). La sensibilité du dosage est de 0,6 ng/tube. L'exactitude de la mesure est de l'ordre de 4%. Les coefficients de variation intra- et inter dosages sont de moins de 10 % et de 20 % respectivement. Les anticorps sont dirigés contre les déterminants antigéniques de la protéine centrale du PG. Il existe une réaction croisée complète avec les PG humains de cartilage de côte, de disque vertébral et de trachée, de même avec les PG extraits de veine ou d'artère. Il n'y a pas de réaction croisée avec les glycosaminoglycanes ou avec les PG extraits de tissus foetaux ou les petits PG de l'os. De plus, le dosage est spécifique de l'espèce, puisque les PG extraits de cartilage de chien, de rat, de poulet ou de veau embryonnaires ne réagissent pas dans le dosage. Le collagène de type II, la fibronectine, le sulfate de chondroitine et l'acide hyaluronique n'interfèrent pas dans le dosage. Les PG sont mesurés directement dans les milieux de culture. Les agrégats de chondrocytes, quant à eux, sont lavés 3 fois dans un tampon phosphate salin (PBS PO4 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) contenant des inhibiteurs de protéases (Oegema et al., 1975: acide-6aminohexanoique 100 mM, EDTA 10 mM, chlorhydrate de benzamidine 50 mM, inhibiteur de trypsine 5.10-8 M, azide de sodium 6,7 mM et de la superoxyde dismutase 200 U/ml). Dans ce même tampon, les agrégats sont homogénéisés par dissociation aux ultrasons (10 secondes, à 40 C, puissance: 200 watts/cm2). Cette extraction permet d'obtenir 70 à 80 % des PG extraits par HCL-guanidine. 3. Dosage radioimmunologique du collagène de type II (coll.II) La méthode de dosage radioimmunologique du coll.II a été décrite en détail (Henrotin et al., 1990). Le coll.II est extrait du cartilage articulaire humain selon la technique décrite par Herbage et al.(1977). L'antisérum contre le coll.II a été obtenu chez le lapin selon la technique de Vaitukaitis et al. (1971). Le dosage est réalisé par saturation séquentielle. Dans un premier temps, le dosage radioimmunologique est réalisé dans un volume de 0,3 ml consistant en 0,2 ml de tampon d'incubation (PBS: PO4 50 mM, NaCl 300 mM, BSA 5g/l (P/V), azide de sodium 6,7 mM, pH 7,4) contenant le coll.II de référence (0,5 à 500 ng) ou l'échantillon à doser et 0,1 ml d'antisérum anticoll.II de cobaye dilué à 1/5000 (24 h à 40 C). Dans un deuxième temps, 0,1 ml de traceur 125 I-coll.II marqué selon la technique à l'iodogène (Salacynski et al., 1979 et dilué de manière à obtenir 20.000 cpm/0,1 ml) est ajouté. Après 24 heures à 40 C, les complexes collagène-anticorps sont séparés du coll.II radioactif libre par le système à double anticorps (Franchimont et al. 1983). La saturation séquentielle permet une sensibilité de 3 ng/tube. L'exactitude de la méthode est de 10%.Les coefficients de variation intra- et interdosages sont de 10 et 20% respectivement. Le dosage est spécifique du collagène de type II articulaire humain. Il n'y a pas de réaction croisée avec d'autres constituants du cartilage : PG humains, fibronectine, laminine et acide hyaluronique n'interfèrent pas dans le dosage. Aucune réaction croisée n'est obtenue avec le collagène bovin de type I, III ou IV. Les milieux de culture sont conservés à - 200 C en présence d'inhibiteurs enzymatiques (Oegema et al., 1975). Ces milieux sont dosés par la méthode radioimmunologique sans traitement préalable. Les agrégats de chondrocytes sont lavés et dissociés aux ultrasons selon la méthode décrite pour le dosage des PG. Après centrifugation (1500 tpm, 10 minutes), le résidu est extrait à l'aide d'acide acétique 500 mM sous agitation durant 24 heures à 40 C. Le surnageant de l'homogénat et l'extrait du résidu sont mélangés et dosés après équilibration à pH 7,4 à l'aide de NaOH 4M. La récupération du coll.II est de 88 + 8 (x + 1 d.s.). 4. Dosage radioimmunologique des prostaglandines E2 (PGE2) Le dosage radioimmunologique des PGE2 est réalisé selon la méthode décrite par Serteyn et al., 1988. La PGE2 est obtenue chez Sigma (Aldrich-Chemie, Steinheim, Allemagne) et la 3 H-PGE2 chez NEN (Du Pont de Nemours, Bruxelles, Belgique). Aux 0,1 ml de l'échantillon à doser ou de l'antigène de référence (0-500 pg) sont ajoutés, successivement, 0,1 ml de tampon d'incubation (Tris-HCL 10 mM, NaCl 150 mM, azide de sodium 0,5% (P/V), gélatine 1% (P/V), pH 7,4), 0,1 ml de 3 H-PGE2 (dilué de manière à obtenir 10.000 cpm/0,1 ml) et 0,1 ml d'antisérum (1/4000). Après 48 heures d'incubation à 40C, l'antigène libre est séparé des antigènes liés aux anticorps par une précipitation au charbon - DEXTRAN T70 (0,5 ml par tube).La solution de charbon - Dextran contient 5g/l de charbon neutre, 500 mg de Dextran 70/l. Après centrifugation (20 minutes, 3000 tpm, 40C), la radioactivité présente dans le surnageant est mesurée au compteur bêta (Beckman) par scintillation liquide. La sensibilité du dosage est de 20 pg/ml. L'exactitude de la méthode est de 5%. Les coefficients de variation intra- et interdosages sont de 6 et de 10% respectivement. Il n'y a pas de réaction croisée entre cet antisérum anti PGE2 et d'autres prostanoides (Thromboxane B2, G-keto-PGF1-a, PIF2, PGA2), ni avec des acides gras tels que l'acide arachidonique, l'acide oléique ou encore l'acide linoléique. 5. Analyse de la synthèse de DNA par la mesure de l'incorporation de 3H-thymidine Après différentes durées de culture, les chondrocytes sont cultivés dans le milieu nutritif additionné de 2 uCi/ml (5 Ci/mmole) de méthyl 3Hthymidine (3H-TDN) (Amersham, Bruxelles, Belgique) durant 24 heures. Les agrégats de chondrocytes sont ensuite lavés pendant 20 minutes à l'aide d'un tampon phosphate salin (PBS: PO4 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) contenant les mêmes inhibiteurs de protéases que ceux utilisés pour le dosage des PG. Ils sont ensuite incubés pendant 20 minutes dans du PBS contenant de la thymidine froide (100 pg/ml), puis lavés à nouveau pendant 20 minutes, deux fois. L'agrégat est alors dissocié par les ultrasons (10 sec., 40C, 200 watts/cm2). La radioactivité incorporée dans l'agrégat est ensuite mesurée à l'aide d'un compteur bêta à scintillation. 6. Dosage de l'ADN Le dosage du contenu en ADN des agrégats est réalisé sur les agrégats dissociés par ultrasons, selon la méthode fluorimétrique décrite par Labarca et Paigen (1980). Sur un échantillon d'agrégats homogénéisés aux ultrasons, le réactif fluorochrome de bisbenzimide (FB) (Hoechst nO 33258 - Calbiochem-Behring Cor - La Jolla Californie) est ajouté (4g/tube). La fluorescence des complexes ADN-FB est mesurée aussitôt au fluorimètre (longueur d'onde d'excitation: 256 nm, longueur d'onde d'émission: 458 nm). De l'ADN bovin (0-5 pg) est utilisé comme référence. La fluorescence des complexes est directement proportionnelle à la concentration en ADN. 7. Calculs et analyse statistique Les résultats sont exprimés en quantités de PG, coll.II ou PGE2 mesurées dans le milieu de culture (MC) par ssg d'ADN. Les mesures cumulatives sont obtenues en ajoutant les quantités dosées dans les MC à chaque renouvellement du MC, pour des périodes successives: 0 à 4, 4 à 8, 8 à 12 jours de culture. La production totale de PG est calculée en ajoutant les quantités cumulées mesurées dans les MC à celles mesurées dans les agrégats correspondants. La moyenne et la déviation standard (m +/- d.s) sont calculées. La comparaison des valeurs moyennes est réalisée par le test statistique U de Mann- Whitney. 8. Production de radicaux hydroxyle OH0 Principe de la méthode: Les produits sont dissous dans des flacons de 10 ml à la concentration requise dans du tampon phosphate: 6,6 10-2 M, p H 7.4 en présence d'acide a keto methiolbutyrique (10-3 M: KMB). Après la fermeture hermétique des flacons, les échantillons sont irradiés par rayons y fournis par une source de 137 Cs. Les radicaux OH0 produits par irradiation y réagissent avec le KMB pour produire de l'éthylène détecté par un chromatographe en phase gazeuse. La hauteur du pic d'éthylène est proportionnelle à la quantité de radicaux libres formés dans le milieu (Weis et al., 1978). 9. Activité antilipoperoxydante Principe de la méthode: Semblable à la méthode antiradicalaire précédente mais où le KMB est remplacé par l'acide linoléique (C18: 2), l'irradiation &gamma; libère du pentane qui est dosé. La hauteur du pic de pentane est proportionnelle à la quantité de radicaux libres formés dans le milieu. 10. Production d'anion superoxyde (002) par des cellules polymorphonuclaires (PMNs). Principe de la méthode Celle-ci est mesurée avec un spectrophotomètre à double faisceau qui permet de suivre la réduction du ferricytochrome C par 002. Le milieu d'incubation (2,5 ml) est constitué de tampon PBS contenant du glucose (7,5 mM), du ferricytochrome C (0,056 mM), du CaCl2 (2,3 mM), du MgCl2 (1,1 mM), 7,5.106 de cellules et la substance à tester à une concentration de 0,032 mM. La réaction est enclenchée en ajoutant du phorbol myristate acétate à une concentration finale de 0,012 mM et la réduction du cytochrome C est suivie à 550 nm pendant 10 minutes. La cuvette de référence contient le même matériel que celui décrit ci-dessus avec en plus 48 g de superoxyde dismutase (SOD)/ml de milieu. II RESULTATS CONCERNANT LES PRODUITS DE FORMULE (Ia), (Ib) et (Ic): Ia: GC-(4 a- > 8) EGC Ib: GC-(4 a- > 8) GC Ic:: GC-(4 a- > 8) GC-(4 a- > 8)-GC GC et EGC représentant respectivement la gallocatéchine et l'épigallocatéchine de formules suivantes R3 R4 GC H OH EGC OH H II-1 Incorporation de -3H thymidine dans les chondrocytes, indice de prolifération cellulaire Aucune des substances Ia, Ib et Ic ne modifie l'incorporation de 3H thymidine dans les chondrocytes aux trois doses testées 1, 10 et 100 g/ml par rapport aux valeurs témoins. II-2 Dosage des protéoglycanes du collagène de type II et des protaglandines E2 Les expérimentations ont été réalisées trois fois à plusieurs mois d'intervalle dans deux conditions expérimentales différentes: (1) en l'absence de serum de veau foetal mais en milieu synthétique: 1% ULTROSER G (2) en présence de 5% de serum de veau foetal. A. EN PRESENCE D'ULTROSER 1. Proteoglycanes (PG) Les taux de PG libérés dans les milieux de culture et rapportés au g d'ADN pendant chaque période d'incubation de 4 jours ( g/ g ADN/96 h) sont repris dans les tableaux 1,2,3. Exprimé en taux cumulés absolus et pourcentuels, il apparaît que l'effet des trois substances est assez semblable entre elles (tableau 4). Il faut cependant remarquer que seule, la substance Ic présente un effet significatif à la dose de 1 yg/ml (tableau 3). Les concentrations de PG dans les agrégats sont significativement stimulés et de façon dose dépendante par les trois concentrations étudiées des substances Ia et Ic; pour la substance Ib, aucun effet significatif n'est noté pour la concentration de 1 g/ml (tableaux 5,6,7). 2. Collagène de typell Les taux de collagène de type II libéré dans le milieu de culture par période d'incubation de 4 jours et exprimé par g d'ADN (ng/yg ADN/96 h) sont illustrés dans les tableaux 8 (substance Ia) 9 (substance Ib) et 10 (substance Ic). Seule, la substance Ic exerce un effet significatif à la plus faible dose expérimentée 1 g/ml. La libération cumulée en 12 jours exprimée en valeur absolue et en valeur pourcentuelle est reprise dans le tableau 11. Elles sont pratiquement identiques pour les trois substances Ia, Ib et Ic. Les valeurs de collagène II dans les agrégats de 12 jours exprimées en ng par g d'ADN dans les agrégats de 12 jours sont repris dans le tableau 12. La substance Ic est la seule à être stimulante à la dose de 1 g/ml. 3. Prostaglandine E2 (PGE2) Les prostaglandines ont été dosées dans les milieux de culture correspondant à l'incubation du 4e au 8e jour, période ou l'agrégat est formé. Les trois substances réduisent significativement le taux des PGE2 (tableaul3). B. EN PRESENCE DE S.V.F. Deux expériences (cultures 397 et 403) ont été réalisées pour confirmer les résultats. Elles ont été allégées d'une part en réalisant les cultures pendant 8 jours au lieu de 12 jours et deux doses des produits Ia, Ib et Ic ont été étudiées: 10 et 100 g/ml. 1. Protéoglycanes (PG) Les PG libérés en milieu de culture et exprimés en g/ g d'ADN/96 H sont significativement accrus en présence de 10 et 100 g/ml. Un effet dose-réponse est observé pour les trois substances (tableaux 14 et 15). Les PG dans les agrégats sont également significativement accrus lors de l'incubation des substances Ia, Ib et Ic aux concentrations de 10 et 100 g/ml. Un effet dose-dépendant est observé (tableaux 16 et 17). Ces résultats sont observés pour les deux expériences réalisées : cultures 397 et 403. 2. Collagène de type II Le collagène de type II s'accroît dans les milieux de culture lorsque les chondrocytes sont incubés avec les substances Ia, Ib et Ic aux concentrations de 10 et 100 g/ml. La réponse est dose-dépendante (tableaux 18 et 19). Dans les agrégats, un accident a eu lieu qui n'a permis de doser le collagène II qu'au cours de l'expérience 397. On observe un accroissement de collagène II pour les 3 substances Ia, Ib et Ic aux concentrations de 10 et 100 g/ml. L'effet est dosedépendant (tableau 20). 3. Prostaglandines E2 (PGE2) (tableau 13) Un effet inhibiteur significatif est observé pour les trois substances à 10 et 100 g/ml (sauf pendant la première période d'incubation jour 0-4 pour 10 pg/ml de la substance 1) durant les deux périodes d'incubation de 0 au 4e jour et du 4e au 8e jour (tableau 21). II-3. Production de radicaux hydroxyle OH0 Résultats: L'ajout de substance Ia, Ib et Ic inhibe significativement la production de radicaux libres à partir du KMB (tableau 22) ou à partir de l'acide linoléique (tableau 23). Aux doses de 10-5 M les substances testées ont encore une action sur le modèle au KMB. Par contre, elles sont sans effet sur le modèle utilisant l'acide linoléique comme substrat. II-4. Production d'anion superoxyde (0 2) par des cellules polymorphonuclaires (PMNs). Résultats: En présence de substances Ia et Ib, la réduction du ferricytochrome C est fortement diminuée suggérant ainsi que le produit agit soit en piégeant l'anion superoxyde ou en inhibitant le système enzymatique des PMNs responsable de la production de cette espèce oxygénée activée. Cependant, des expériences témoins indiquent que le produit Ia ainsi que Ib, Ic et l'esculoside sont par eux-mêmes de puissants réducteurs du ferricytochrome C. Cet effet n'étant pas quantifiable, il ne peut être tiré par conséquent aucune conclusion sur un éventuel effet inhibiteur de ces produits sur la production d'anion superoxyde par les PMNs activés. III - Conclusion de l'étude des proanthocyanidols sur le modèle de chondrocytes humains cultivés en trois dimensions Les substances Ia, Ib et Ic agissent sur le modèle étudié en: 1. augmentant significativement la production de protéoglycanes, dosés par méthode radio-immunologique, dans le milieu de culture et dans l'agrégat néoformé; 2. augmentant significativement la production de collagène de type II, dosé par méthode radioimmunologique, dans le milieu de culture et dans l'agrégat néoformé; 3. réduisant significativement la production des prostaglandines E2 dans les milieux de culture pendant les deux première périodes de culture du ler et du 4ème au 8ème jour; 4. réduisant significativement les radicaux libres OH0 produits en présence soit de MKB soit d'acide linoléique. Les résultats ont été reproduits au cours de trois expériences consécutives dans deux conditions de milieu de culture: en présence d'Ultroser 1% et en présence de sérum de veau foetal. Ces substances ont un profil de médicament chondroprotecteur. Les tableaux indiqués ci-dessus sont les suivants: TABLEAU 1 PG LIBRES DANS LE MILIEU DE CULTURE ( g/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ia ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 0 - 4 13,6 + 14,2 + 22,4 + 28,6 + 1,6 1,6 0,2* 2,85* 0 - 8 1,96 + 1,74 + 3,26 + 3,94 + 0,24 0,18 0,12* 0,1* 0 - 12 0,42 + 0,44 + 0,74 + 0,78 + 0,03 0,04 0,18* 0,02* * : p TABLEAU 2 PG LIBERES DANS LE MILIEU DE CULTURE ( g/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ib ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 # 100 0 - 4 13,7 13,0 20,4 28,2 f + f # 1,66 1,22 3,0* 2,92* 0 - 8 3,14 3,45 4,78 5,65 + + + # 0,14 0,56 0,56* 0,24* 0 - 12 0,71 0,72 1,00 1,32 + + + + 0,09 0,08 0,12* 0,01* * :: p (U - test de Mann-Whitney) TABLEAU 3 PG LIBERES DANS LE MILIEU DE CULTURE ( g/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ic ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 - 4 12,4 # 15,9 # 19,1 # 21,1 # 0,96 1,15* 1,2* 1,0* 0 - 8 # 3,0 + 3,7 + # 4,4 + 4,9 # 0,15 0,15* # 0,52* 0,45* 0 - 12 1,04 # 1,32 # 1,53 # 1,75 # 0,07 0,7* 0,15* # 0,05* * : p TABLEAU 4 Substances Concentrations étudiées ( g/ml) n 0 1 10 100 Protéoglycanes libérés durant les 12 jours de culture g/ g/ g/ g/ g ADN/ g ADN/ g ADN/ g ADN/ 12 jours 12 jours 12 jours 12 jour Abs % Abs % Abs % Abs % la 16 1100 16,4 103 26,4 165 33,3 208 Ib 17, 100 17,2 98 26,3 149 35,2 200 6 Ic 16, 100 20,9 127 25 150 27,8 170 4 TABLEAU 5 PG DANS LES AGREGATS (ng/yg ADN) de 12 jours AGE DE LA CULTURE SUBSTANCE Ia ( g/ml) (JOURS) 0 0 1 10 100 0 - 12 581 912 1411 + 2105 + + 98 +83,6* 153* 42* * : p (U - test de Mann-Whitney) TABLEAU 6 PG DANS LES AGREGATS (ng/ g ADN) de 12 jours AGE DE LA SUBSTANCE Ib ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 - 12 724 742 931 1108 + 222 + 62 + 24* + 45* * : p TABLEAU 7 PG DANS LES AGREGATS (ng/ g ADN) de 12 jours AGE DE LA SUBSTANCE Ic ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 - 12 742 + 50 886 + 1046 f 1184 + 114* 74* 33* * : p TABLEAU 8 COLL. II LIBERE DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ia ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 - 4 225 + 233 + 301 + 462 + 22 25 52* 51* 0 - 8 152 + 147 + 259 + 311 + 14 19 22* 41* 0 - 12 97,4 f 102,2 + 147 f 109 f 18 10,96 21* 23* * : p TABLEAU 9 COLL. II LIBERE DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ib ( g/m) CULTURE (JOURS) 0 1 10 . 100 0 - 4 204 # 222 # 322 # 392 # 21 26 33* 46* 0 - 8 102 # 112 # 158 # 190 # 12 19 14* 22* 0 - 12 62,8 + 59,9 f 91,7 + 137,7 f 6,9 0,6 6,1* 13,4* * : p TABLEAU 10 COLL.II LIBERE DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE SUBSTANCE Ic ( g/ml) CULTURE (JOURS) 0 1 10 100 0 - 4 107,8 # 149,4 # 162 # 182 # 10,3 8,7* 11* 5,6* 0 - 8 52,2 + 65,8 + 70,5 + 93,8 + 5,4 7,4* 7,1* 10,5* 0 - 12 32,2 + 41,2 + 50,6 + 61,1 + 3,4 4,6* 4,2* 5,2* * : p TABLEAU 11 Substances Doses étudiées ( g/ml) n 0 1 10 100 Libération cumulée du coll.II en 12 jours g/ g/ g/ g/ g ADN/ g ADN/ g ADN/ g ADN/ 12 jours 12 jours 12 jours 12 jours Abs % Abs % Abs % Abs % Ia 474 100 482 102 787 166 962 202 Ib 369 100 394 107 572 155 728 197 Ic 191 100 265 134 292 153 337 176 Valeur absolue : exprimée en ng/ g ADN/12 jours TABLEAU 12 Concentrations moyennes (m + DS) de collagène de type II dans les agrégats de chondrocytes au terme de 12 jours de culture Doses étudiées Subs. n 0 1 g/ml 10 g/ml 100 g/ml Ia 104 + 105 + 13 165 + 175 + 15,1 21** 19** Ib 90 + 10 98 + 9 121 + 158 # 10** 16** Ic 61 # 7 81 + 6* 94 + 7** 121 i 13** * : p TABLEAU 13 Taux des PGE2 (pg/ g d'ADN) dans les milieux de culture prélevés du 40 au 80 jour Doses étudiées Subs. n 0 1 g/ml 10 g/ml 100 g/ml la 122 # 39 91,5 # 9 44 # 0,6* 25 + 13** lb 146 # 23 129 # 19 76 # 14** 48 + 15** Ic 138 + 19 101 + 7* 81 + 12** 39 + 10** * : p TABLEAU 14 PG DANS LE MILIEU DE CULTURE ( g/ g ADN - 96 H) TEMPS DE Substance Ia Substance Ib Substance Ic CULTURE ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) O 10 100 10 100 10 100 0 - 4 6,5 7,7 9,5 7,6 11,9 7,8 10,4 0,75 0,49* 1,34* 0,41* 2,09* 1,51* 1,19* (100%) (118,5%) (147%) (117%) (183,5%) (120%) (160%) 4 - 8 1,99 f 2,37 + 2,69 + 2,32 + 2,71 + 2,34 + 2,40 + 0,19 0,17* 0,15* 0,21* 0,24* 0,08* 0,35* (100%) (119%) (135%) (117%) (136%) (118%) (121%) * : p Mann-Whitney) TABLEAU 15 PG DANS LE MILIEU DE CULTURE ( g/ g ADN - 96 H) SUBSTANCE ( g/ml) TEMPS DE CULTURE Ia Ib Ic (JOURS) 0 10 100 10 100 10 100 0-4 5,3# 6,9# 8,8# 7,1# 7,9# 7,0# 7,5# 0,38 0,99* 1,49* 0,36* 0,30* 1,19* 0,96* (100%) (131%) (166%) (134%) (149%) (132%) (140%) 4 - 8 1,7 + 2,1 # 2,4 + 2,1 # 2,3 # 2,0 # 2,4 + 0,19 0,21* 0,09* 0,16* 0,13* 0,17* 0,25* (100%) (123%) (138%) (125%) (137%) (117 ) (138%) * : p TABLEAU 16 PG DANS LES AGREGATS (ng/pg DNA) de 8 jours TEMPS DE Substance Ia Substance Ib Substance Ic CULTURE ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) 0 10 100 10 100 10 100 0-8 784# 1004# 1242# 1108# 1142# 915# 1035# 105 56* 208* 166* 110* 75* 121* (100%) (128%) (158%) (141%) (146%) (117%) (132%) * : p TABLEAU 17 PG DANS LES AGREAGATS (ng/ g ADN) de 8 jours TEMPS DE Substance Ia Substance Ib Substance Ic CULTURE ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) 0 10 100 10 100 10 100 0 - 8 576,0 + 688,8 829,4 724,0 + 832,0 718,2 + 799,5 40,55 + + 9,37 72,45* + 62,61* + (100%) 40,65* (144%) (126%) 59,10* (125%) 85,9* (120%) (144%) (139%) * : p TABLEAU 18 COLL. II LIBERE DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE CULTURE O Substance Ia Substance Ib Substance Ic ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) 10 100 10 100 10 100 0 - 4 32,7 + 44,3 + 77,0 f 41,4 f 81,1 + 44,1 + 70,7 + 5,59 2,30* 15,58* 0,51* 20,2* 6,98* 10,3* 4 - 8 25,9 + 34,0 + 47,2 + 33,3 f 55,0 + 33,5 + 41,7 + 5,10 3,11* 5,19* 4,61* 17,21* 3,71* 3,69* * : p TABLEAU 19 COLL. II DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE 0 Substance Ia Substance Ib Substance Ic CULTURE ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) 10 100 10 100 10 100 O - 4 23,0 37,4 44,2 38,2 56,3 37,9 53,2 + + + + + + + 3,91 1,98* 11,6* 2,60* 12,41* 5,47* 4,21* 4 - 8 16,3 25,3 38,2 29,6 46,3 23,3 33,5 + + + + + + + 1,72 2,20* 5,71* 3,44* 2,61* 2,11* 1,73* * : p TABLEAU 20 COLL.IL DANS LES AGREGATS (ng/ g ADN) TEMPS DE 0 Substance Ia Substance Ib Substance Ic CULTURE ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) (JOURS) 10 100 10 100 10 100 4 - 8 62,8 78,8 114,7 81,6 113,2 85,9 109,8 + + + + + + + 4,90 10,5* 10,55* 16,00* 18,25* 14,45* 8,52* * : p TABLEAU 21 PGE2 DANS LE MILIEU DE CULTURE (ng/ g ADN/96 h) TEMPS DE CULTURE 0 Substance Ia Substance Ib Substance Ic ( g/ml) ( g/ml) Ic ( g/ml) (JOURS) 10 . 100 10 . 100 10 100 0 - 4 300 + 312 + 143 + 130 + 121 + 160 + 153 17 15 25* 21* 16* 17* + 15* 4-8 48# 27# 25# 30# 25# 35,5 3,5 2,5* 3,5* 1,7* 1* # 29# 2,1* 3,5* * : p TABLEAU 22 Inhibition (exprimée en % par rapport aux témoins) de la production des radicaux Hydroxyle par les substances Ia, Ib et Ic. Substrat: KMB % D'INHIBITION Produits Ia Ib Ic Concentration 10- M 78 80 74 10-4M 41 46 39 10-5M 22 25 20 TABLEAU 23 Inhibition (exprimée en % par rapport aux témoins) de la production des radicaux Hydroxyle par les substances Ia, Ib et Ic.Substrat: Acide linoléique % D'INHIBITION Produits Ia Ib Ic Concentration 10- M 94 93 91 10-4M 42 45 40 10-5M 0 0 0 REFERENCES Bassleer C., Gysen P., Foidart J.M., Bassleer R., Franchimont P.: Human chondrocytes in tridimensional culture. In vitro, 1986, 22:113-119 Bayliss M.T., Venn M.: Chemistry of human articular cartilage. In : Maroudas A., Holborow E.J., eds. Studies in joint diseases, lst ed. London: Pitman Medical, 1980, 2-58 Franchimont P., Bouffioux Ch., Reuter A. et al. Radioimmunoassay of prostatic acid phosphatase: validation and clinical application. Int. J. Cancer. 1983, 89: 114-124 Franchimont P., Bassleer C., Henrotin Y., Gysen P., Bassleer R.: Effects of human and salmon calcitonin in human articular chondrocytes cultivated in clusters. J. Clin. Endocr. Metab., 1989, 69:259-266 Franchimont P., Bassleer C.: New diagnostic tools and methodological approaches; an outlook to the future. Scand. J. of Rheumatol., 1989, 80:29-31. Franchimont P., Bassleer C.: Effects of hormones and local growth factors on articular chondrocyte metabolism. Scand. J. of Rheumatol., 1991, suppl.27, 18:68:70 Greenwood F.C., Hunter W., Glover J. : The preparation of 131I-labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem J. 1973, 89: 114-24 Gysen P., Franchimont P. : Radioimmunoassay of proteoglycans J. Immunoassay., 1984, 5: 221-243 Henrotin Y., Bassleer C., Collette J., Nusgens B., Franchimont P.: Radioimunoassay for human type II collagen. J. of Immunoassay, 1990, 11(4):555-578 Herbage D., Bouillet J., Bernengo J.C. : Biochemical and physico-chemical characterization of pepsinsolubilized type II collagen from bovine articular cartilage. Biochem.J. 1977, 161: 303-312 Labarca C., Paigen K.: A simple, rapide and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem., 1980, 102:344-352 Oegema T.R., Hascall V.C., Dziewatkowski D.D.: Isolation and characterization of proteoglycans from the swarm rat chondrosarcoma. J. Biol. Chem. 1975, 250: 6151-6159 Roughley P.J., Mc Nicol D., Santer V., Buckwalter J. The presence of a cartilage-like proteoglycan in the adult human meniscus. Biochem. J. 1981. 197: 77-83 Salacynsky P., Hope J., Mc Lean C. et al. : A new simple method which allows theoretical incorporation of radio-iodine into proteins and peptides without damage. J. Endocrinol. 1979, 81: 131 Serteyn D., Deby-Dupont G., Pincemail J., Mottart E., Philippart C., Lamy M.: Equine post-anaesthesic myositis: thromboxane, prostacyclin and prostaglandin E2 production. Vet. Res. Com., 1988, 12:219-226 Vaitukaitis J., Robbins J.B., Nieschlag E., Ross G.T.: A method for producing specific antisera with small doses of immunogen. J Clin. Endocrinol. Metab. 1971, 33: 988-91 Weiss S.S., Rustagi P.K., Lobuglio A.F.: Human generation of hydroxyl radical. J. Exp. Med., 1978, 147: 316-324 REVENDICATIONS 1. Utilisation de prodelphinidines de formule (I) dans laquelle: - R1 et R2 représentent indépendamment H ou OH, - R3 et R4 sont différents et représentent H ou OH, et, - n est un nombre entier de 2 à 40, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des pathologies articulaires liées à une destruction du cartilage, et plus particulièrement de l'arthrose. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les médicaments sont destinés à l'administration par voie orale, parentérale ou topique. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les prodelphinidines sont celles issues de Ribes nigrum. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que les prodelphinidines sont contenues dans des extraits de Ribes nigrum. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que les prodelphinidines sont isolées et purifiées à partir d'extraits de Ribes nigrum. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les prodelphinidines sont choisies parmi l'une au moins des molécules (Ia), (Ib), et (Ic) suivantes: