Brevet FR2705349A1 — publié le 19941125

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CARACTERISTIQUES DES ERWINIA CAROTOVORA RESPONSABLES DE LA JAMBE NOIRE, ET LEURS UTILISATIONS POUR LE DIAGNOSTIC DE CETTE PATHOLOGIE La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues' de bactéries de l'espèce Erwinia carotovora pathogènes chez certaines plantes, et plus particulièrement des Erwinia carotovora responsables de la jambe noire, ces séquences étant utilisables, notamment en tant que sondes et amorces, pour la détection de ces bactéries chez des hôtes susceptibles d'être infectés par ces dernières, ou dans tout milieu o ces bactéries sont susceptibles de survivre. Une étude effectuée en 1988 indiquait que les pertes mondiales dues aux maladies des plantes s'élevaient couramment à 60 milliards de dollars par an. C'est dire l'importance que représente la détection rapide et spécifique des agents phytopathogènes, qui devrait conditionner les pratiques culturales et les choix des produits phytosanitaires, de leur dosage, du moment de leur application, et pour éviter l'agression de l'environnement. Les mesures prophylactiques, nécessitant donc une détection rapide, sensible et fiable, constituent encore de nos jours un des moyens les plus efficaces et les moins coûteux, tant au niveau financier qu'à celui de l'environnement, de lutte contre les maladies, et en particulier contre les bactérioses pour lesquelles peu de moyens de lutte sont disponibles, l'utilisation d'antibiotiques étant prohibée dans la majorité des pays. Ces mesures prophylactiques consistent essentiellement à produire du matériel, en particulier de propagation, sain, et éventuellement à détruire les lots contaminés, en stérilisation ou tout autre procédé de désinfection de l'ensemble des matériaux, locaux et substrats de culture susceptibles d'être en contact avec les plantes et les semences, en choisissant des lieux de production sains. Le dépistage des pathologies d'origine bactérienne chez les plantes n'a cependant pas été satisfaisant jusqu'à présent, et des pertes importantes de plantes mono- et di-cotylédones sont fréquemment observées au champ, en serres ou durant leur stockage. Une des causes principales de ce problème est l'utilisation de semences, au sens large, apparemment saines, mais qui sont en réalité porteuses de bactéries susceptibles d'être à l'origine du développement futur de pathologies chez les plantes obtenues à partir de ces semences. On parlera alors de bactérioses en phase latente d'infection. À -$ 2 2705349 De nombreuses pathologies de plantes sont caractérisées par une phase latente d'infection. Durant cette phase, le niveau d'infection est généralement inférieur à celui qui pourrait être détecté par inspection visuelle (absence de symptômes apparents) ou par les techniques courantes disponibles actuellement (isolement et caractérisation microbiologique, indexage, immunologie...). Une autre source importante de contamination des plantes viendrait également de l'environnement naturel ou artificiel, notamment des sols et de l'eau. Il faut noter également que l'isolement et la caractérisation microbiologique sont en général des techniques longues et laborieuses, susceptibles d'être d'un coût trop élevé pour envisager de les appliquer à grande échelle, tandis que les méthodes immunologiques ne présentent pas toujours la spécificité et la sensibilité désirées. Les bactéries pectinolytiques du genre Erwinia (encore désignées ci- après erwinias) sont responsables d'un grand nombre de pathologies de ce type, dont l'un des symptômes est la macération des tissus chez un grand nombre de plantes et de semences. Ces bactéries sont notamment capables d'infecter la pomme de terre, le maïs, la tomate, la betterave à sucre, le chou, l'endive, etc., ainsi que les plantes de serres, telles que les plantes ornementales qui sont couramment commercialisées entre pays. Parmi ces erwinias, on peut citer principalement d'une part Erwinia carotovora, et plus particulièrement Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp. odorifera (Eco) et Erwinia carotovora subsp. wasabiae, et, d'autre part, Erwinia chrysanthemi (Ech). Ces bactéries produisent plusieurs enzymes extracellulaires capables d'attaquer les composants de la paroi cellulaire; pectinases, cellulases, hémicellulases et protéases (pour une revue détaillée, voir l'article de A. Kotoujansky paru dans Ann. Rev. Phytopathol. 1987, 25: 405-30). Erwinia carotovora a été particulièrement étudiée en raison de son pouvoir pathogène sur plusieurs plantes, et surtout chez la pomme de terre (Pérombelon, 1989). L'espèce Erwinia carotovora (Ec) est actuellement divisée en cinq sous- espèces: atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) et wasabiae (Ecw) précédemment citées, ainsi que la sous-espèce betavascularum (Ecb). Cette classification a été réalisée sur la base de caractéristiques physiologiques et biochimiques, ainsi que sur leur pouvoir pathogène. Eca et Ecb ont une spécificité d'hôtes voisine. Ecb est responsable du pourrissement de la betterave (Thomson et al., 1981). L'action des Eca est 3 2705349 généralement limitée à la pomme de terre dans des climats tempérés frais, à des températures comprises entre environ 18 C et environ 20 C (Pérombelon, 1980). Quelques souches, non isolées à partir de la pomme de terre, ont été décrites comme étant des Eca "atypiques" en raison du fait qu'elles présentent quelques caractéristiques physiologiques particulières, comme par exemple leur capacité de se développer à 37 C (Lopez et al., 1989). Une nouvelle sous- espèce, dénommée odorifera (Eco) a été récemment décrite comme représentant des souches "atypiques" qui sont pathogènes au moins sur l'endive et produisent des métabolites volatiles odorants (Gallois et al. , 1992). D'autres souches d'Eca "atypiques" ont été identifiées comme étant des souches d'Ecc sur la base de caractéristiques phénotypiques et génotypiques. A l'inverse, Ecc est largement répandue dans le monde et présente une large spécificité d'hôtes (Pérombelon et Kelman 1987, Smith et Bartz 1990). Les principales pathologies de la pomme de terre causées par ces bactéries, et plus particulièrement par Eca, sont les suivantes: manque à la levée, fonte de semis, jambe noire, pourriture aérienne de la tige, dessèchement et pourriture des tubercules, et flétrissement aérien (Pérombelon et Kelman 1987). Les pathologies correspondant à la non- levée et à la jambe noire surviennent principalement à partir des tubercules mères et peuvent causer des pertes importantes dans les champs. Eca est considérée comme l'agent typique de la jambe noire en Europe en raison de son pouvoir pathogène à faible température, et de sa capacité à induire la maladie de façon précoce en végétation, ce qui augmente les pertes. La plupart des souches d'Ecc ne peuvent pas produire de symptômes typiques de jambe noire à faible température. Ecc est considérée comme un agent opportuniste plutôt que comme un agent causal primaire de la maladie. Toutefois Ecc présente un pouvoir pathogène accru à des températures d'environ 25 C et est l'agent causal primaire de la jambe noire de la pomme de terre en Arizona et dans le Colorado (Stanghellini et Meneley, 1975). Comme nous l'avons vu précédemment, le contrôle de ces pathologies bactériennes repose essentiellement sur les mesures prophylactiques, et les moyens de détection sont donc particulièrement importants (Lelliott et Stead, 1987). La présente invention a pour but de fournir un procédé fiable de détermination spécifique de la présence d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) chez un hôte (notamment plantes ou semences) susceptible d'être porteur de telles bactéries, ou encore dans le sol et l'eau. 4 2705349 La présente invention a précisément pour but de mettre à la disposition d'utilisateurs potentiels, des méthodes fiables de diagnostic précoce des pathologies causées par Eca, et plus particulièrement de la jambe noire de la pomme de terre, à savoir des méthodes permettant de faire le diagnostic du risque d'apparition de ces pathologies, ou d'identifier les souches bactériennes. L'invention a plus précisément pour but de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques utilisables en tant que sondes ou amorces pour la mise en oeuvre de ces méthodes de diagnostic, notamment par les techniques procédant par hybridation entre acides nucléiques (ARN et/ou ADN), éventuellement suivie par l'amplification du nombre de copies de séquences cibles à détecter, par exemple suivant les techniques d'amplification génique dites PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction) et 3SR (Self- Sustained Sequence Replication). L'invention a également pour but de mettre à la disposition d'utilisateurs potentiels, des kits de diagnostic pour la mise en oeuvre des méthodes de diag- nostic et d'identification susmentionnées. L'invention est illustrée à l'aide des figures 1 à 6 représentant respectivement les séquences nucléotidiques A à F décrites ci-après. L'invention a pour objet toute séquence nucléotidique comprenant la séquence nucléotidique B représentée sur la figure 2, ou à sa séquence complémentaire, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme la séquence B susmentionnée, de s'hybrider avec le génome des souches d'Eca, dans des conditions stringentes. Les conditions d'hybridation susmentionnées sont par exemple les suivantes: hybridation dans 6 SSC, 0,1% SDS et 0,01% de lait écrémé à 65 C pendant une nuit, suivie par deux lavages de 30 minutes à 65 C dans 0,1 SSC, 0,5% de SDS. A titre illustratif, on entend notamment par séquence modifiée dans ce qui précède, et ce qui suit, toute séquence comprenant des nucléotides tels que l'uracile, l'inosine, le 7 deaza 2' desoxyguanosine triphosphate (cdGTP) etc., et correspondant donc soit à un ADN soit à un ARN modifié. De préférence, les séquences modifiées selon l'invention présentent au moins environ 60% d'identité avec tout ou partie de la séquence B susmentionnée. L'invention concerne plus particulièrement les séquences nucléotidiques susmentionnées sous forme marquée, notamment de manière radioactive, X 5 2705349 enzymatique, par un composé fluorescent, par une liaison à une molécule antigé- nique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs (ou encore de rayonnements), cette liaison pouvant éventuellement être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l'intermédiaire d'une séquence nucléotidique constituée d'environ 5 à 100 nucléotides située au moins à l'une des extrémités de ces séquences. A titre d'exemples de molécules directement ou indirectement détectables liées aux séquences nucléotidiques susmentionnées, on peut citer l'acétylaminofluorène, la biotine (détectée à l'aide de l'avidine, la streptavidine) ou encore la digoxigènine. Les séquences nucléotidiques selon l'invention sont avantageusement utilisées en tant que sondes nucléotidiques, le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée ci-dessus, plus particulièrement pour la détection des souches d'Eca responsables de la jambe noire. Tout comme les séquences nucléotidiques susmentionnées, les sondes de l'invention sont susceptibles de s'hybrider avec des séquences nucléotidiques contenues dans le génome des Eca pathogènes (ces dernières séquences étant encore désignées dans ce qui précède et qui suit, par l'expression "séquences nucléotidiques spécifiques" ou "séquences spécifiques"), ces séquences nucléotidiques spécifiques n'étant pas contenues dans le génome des Erwinia carotovora autres que les Eca phatogènes. Avantageusement les sondes de l'invention sont constituées d'enchaînements d'environ 7 à environ 300 nucléotides, choisis à l'intérieur de la séquence nucléotidique B susmentionnée. Des fragments des séquences nucléotidiques susmentionnées de l'invention peuvent avantageusement être utilisés par paires pour former ce que l'on appellera dans la suite de ce texte des couples d'amorces, ces couples d'amorces étant utilisés pour l'amplification du nombre de copies des séquences nucléotidiques susmentionnées, ou des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans le génome des souches d'Eca responsables de la jambe noire. Ces amorces permettent l'amplification (ou encore la multiplication) du nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques des génomes des Eca responsables de la jambe noire, notamment selon la technique PCR qui sera détaillée plus loin, ces amorces étant le cas échéant marquées, notamment de la manière indiquée ci-dessus. Avantageusement, les amorces selon l'invention sont constituées d'environ à environ 100 nucléotides, et de préférence d'environ 15 à environ 30 6 2705349 nucléotides, et sont susceptibles de s'hybrider avec une région d'une séquence nucléotidique selon l'invention, ou d'une séquence nucléotidique selon l'invention, ou d'une séquence nucléotidique spécifique du génome des Eca, cette région étant différente selon les amorces au sein d'un même couple, de manière à permettre l'amplification de tout ou partie des séquences nucléotidiques susmentionnées. Ces amorces sont avantageusement constituées d'environ 7 à 30 nucléotides issus de la séquence B représentée sur la figure 2, et permettent notamment l'amplification de fragments d'environ 100 à environ 300 nucléotides contenus dans des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca responsables de la jambe noire. Les couples d'amorces susmentionnées sont choisies de manière à ce qu'elles s'hybrident du côté 3' de chaun des brins des séquences nucléotidiques susmentionnées, les extrémités 3' de chacune des amorces étant dirigées vers l'intérieur des séquences à amplifier. L'invention concerne également un procédé d'identification et de détection des Eca éventuellement présentes chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, ce procédé comprenant les étapes suivantes: - le traitement d'un échantillon prélevé sur cet hôte de manière à rendre le génome de ces Eca accessible aux sondes et/ou aux amorces définies ci-dessus, et le cas échéant à toute ADN ou ARN polymérase permettant de répliquer les deux brins de l'ADN génomique ou de 'ARN en dérivant, ce traitement étant notamment effectué par ébullition, macération (dans un liquide tel que l'eau), broyage ou sonication, - la mise en contact de l'échantillon ainsi traité avec des sondes telles que décrites ci-dessus, et le cas échéant avec des amorces telles que décrites ci- dessus, notamment dans les conditions d'hybridation défmies ci-dessous dans le cadre de la réalisation du procédé par technique PCR, - le cas échéant, l'amplification à l'aide de couples d'amorces susmentionnés, du nombre de copies des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Eca susceptibles d'être présentes dans cet échantillon biologique, et avec lesquelles sont susceptibles de s'hybrider les sondes ou amorces susmentionnées, et/ou l'amplification du nombre de copies de sondes susmentionnées, - la détection de la présence éventuelle desdites séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Eca, lesdites séquences spécifiques étant hybridées avec les sondes susmentionnées, et donc de la présence d'Eca dans l'échantillon étudié. 7 2705349 Le procédé d'identification et de détection de l'invention peut être réalisé à partir d'un hôte présentant des signes pathologiques, ou avantageusement à partir d'un hôte susceptible d'être un porteur apparemment sain de telles bactéries et se trouvant en phase latente d'infection. Le procédé d'identification et de détection des Eca selon l'invention peut également être réalisé à partir de tout milieu dans lequel ces bactéries sont susceptibles de survivre, notamment dans l'eau ou le sol. De préférence, le procédé d'identification selon l'invention comprend une étape d'amplification du nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Eca responsables de la jambe noire, ou des ARN correspondants. Cette étape d'amplification génique peut être réalisée in vitro ou in vivo par toute méthode utilisant les techniques classiques d'amplification enzymatique de l'ADN ou de I'ARN, telles que la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite notamment dans la revue P.N.A.S., USA, 88, pp. 189-193 (1991), ou la technique "QP Replicase" décrite dans la revue Biotechnology (Vol.6, octobre 1988), ou avantageusement la technique PCR telle que décrite notamment dans les demandes de brevet européen de Cetus (n 200 362, 201 184, 229 701 et 258 017), ou encore la technique 3SR décrite par Fahy et al. PCR Meth Appl 1, 25-33 (1991), ou les techniques dérivées de ces dernières et toute méthode vi- sant à amplifier in vitro les acides nucléiques. Selon un mode de réalisation préféré du procédé décrit ci-dessus selon l'invention, l'amplification par technique PCR du nombre de copies des séquences nucléotidiques contenues dans les génomes des Eca, et/ou l'ampli- fication du nombre de copies des sondes définies ci-dessus, comprend les étapes suivantes: - la prédénaturation de l'ADN double brin en ADN monobrin, de préférence dans un tampon constitué de Tris-HCl 10 mM pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgC12, 0,01% de gélatine, de cofacteurs de l'ADN (ou ARN)- polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP), ou des ARN (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP), et des couples d'amorces tels que définis ci-dessus, par chauffage entre environ 80 C et environ 110 C, avantageusement à 100 C, l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN ou ARN polymérase thermorésistante ou de ligase thermorésistante (dans le cas o ces enzymes n'étaient pas initialement présentes dans le tampon de prédénaturation susmentionné), et 8 2705349 * chauffage (notamment pendant environ 1 minute) à environ 94 C, ce qui correspond à l'étape de dénaturation proprement dite, * puis chauffage (notamment pendant environ 1 minute) entre environ C et environ 76 C, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des couples d'amorces avec les séquences ou sondes susmentionnées, * et enfin chauffage (notamment pendant environ 1 minute) entre environ C et environ 76 C, ce qui correspond à l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de tout ou partie des séquences génomiques des Eca ou des sondes susmentionnées, ces séquences ou sondes étant délimitées par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées, - la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 25 et 35 fois, l'ensemble de la procédure pouvant être répété une ou plusieurs fois à partir de tout ou partie du milieu obtenu à l'étape précédente. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la sensibilité de la détection peut être améliorée en poursuivant le procédé décrit ci- dessus par une amplification du type "nested PCR", décrite dans "PCR A Practical Approach" édité par M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Taylor, (1991) Oxford University Press, en utilisant des amorces internes au fragment précédemment amplifié, ce qui conduit à l'amplification du nombre de copies d'un fragment d'ADN ou d'ARN plus court que celui dont le nombre de copies a été initialement amplifié. il va de soi que tous les intervalles de temps précisés dans les méthodes détaillées ci-dessus, peuvent varier entre autres en fonction de l'appareillage (dit cycleur ou thermocycleur) utilisé. il va également de soi que si l'on utilise d'autres méthodes d'amplification que celle par PCR, et/ou d'autres enzymes, un autre tampon adéquat sera choisi. Dans le cas o le procédé d'identification et de détection de l'invention est réalisé simplement à l'aide de sondes telles que décrites ci-dessus, la détection des séquences nucléotidiques spécifiques, est avantageusement réalisée de la manière suivante: - fixation sur un support solide (tel qu'une membrane ou des puits de plaques de microtitration comme celles couramment utilisées dans la technique dite ELISA, et adaptées ou non aux acides nucléiques) d'une séquence nucléotidique selon l'invention, désignée ci-après "séquence piège", avec laquelle les susdites séquences nucléotidiques spécifiques, ou fragments de ces séquences, sont susceptibles de s'hybrider, notamment dans les conditions 9 2705349 définies ci-dessus, cette fixation étant réalisée selon des techniques usuelles décrites notamment par Maniatis et al., 1982, et par Ausubel et al., 1987, - rinçage du support solide, - saturation des sites réactifs libres du support, - incubation des séquences nucléotidiques pièges, ainsi fixées, avec 1'ADN ou ARN génomique provenant de l'échantillon biologique préalablement traité de la manière indiquée ci-dessus, dans des conditions permettant l'hybridation des séquences nucléotidiques spécifiques avec lesdites séquences pièges, notamment dans les conditions d'hybridation définies plus haut, - rinçage du support solide éventuellement à l'aide de 3 x SSC à 65 C (ou 0,1 x SSC si nécessaire, à 68 C) pendant 15 mn à deux reprises, - incubation des séquences spécifiques hybridées à l'étape précédente avec les séquences pièges, avec une ou plusieurs sondes selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation des séquences spécifiques susmentionnées avec lesdites sondes, notamment dans les conditions d'hybridation défminies plus haut, ces sondes étant choisies de manière à ce qu'elles ne soient pas complémentaires des séquences pièges susmentionnées, - rinçage du support solide, notamment à l'aide de 3 x SSC (ou 0,1 x SSC si nécessaire, à 68 C) à 65 C pendant 15 mn à deux reprises, - détection des éventuelles sondes étant restées fixées sur le support solide après l'étape précédente, témoignant alors de la présence de séquences spécifi- ques, ou fragments de ces séquences dans l'échantillon biologique, cette détection étant réalisée soit directement lorsque les susdites sondes sont marquées de manière radioactive ou fluorescente, soit indirectement par l'intermédiaire de réactifs eux-mêmes susceptibles de reconnaître ces sondes, notamment à l'aide d'anticorps ou autres réactifs décrits précédemment, dans le cas o ces sondes sont marquées par des antigènes ou des molécules susceptibles d'être respectivement reconnus par ces anticorps ou ces réactifs. La détection des séquences nucléotidiques spécifiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon étudié, peut également être réalisée de la manière suivante: - fixation sur un support solide de l'ADN ou ARN génomique provenant de l'échantillon préalablement traité de la manière indiquée ci-dessus, - rinçage du support solide, - saturation des sites réactifs libres du support, - incubation de l'ADN ou ARN ainsi fixé avec une sonde, selon l'invention, cette incubation étant réalisée dans des conditions permettant 2705349 l'hybridation des sondes avec le matériel génomique fixé sur le support solide, notamment dans les conditions d'hybridation défminies plus haut, rinçage du support solide, notamment à l'aide de 3xSSC (ou 0,lxSSC si nécessaire à 68 C) à 65 C pendant 15 mn à deux reprises, - détection des éventuelles sondes étant restées fixées sur le support solide après l'étape précédente, témoignant alors de la présence de séquences spécifi- ques, ou fragments de ces séquences dans l'échantillon biologique, cette détection étant réalisée soit directement lorsque les susdites sondes sont marquées de manière radioactive ou fluorescente, soit indirectement par l'intermédiaire de réactifs eux-mêmes susceptibles de reconnaître ces sondes, notamment à l'aide d'anticorps ou autres réactifs décrits précédemment, dans le cas o ces sondes sont marquées par des antigènes ou des molécules susceptibles d'être respectivement reconnus par ces anticorps ou ces réactifs. Dans le cas o le procédé d'identification et de détection de l'invention comprend une étape d'amplification génique à l'aide des amorces décrites ci- dessus, la détection des séquences nucléotidiques spécifiques ou fragments de ces séquences, peut être réalisée par électrophorèse sur gel de tout ou partie du milieu réactionnel dans lequel l'amplification a été effectuée. La visualisation d'un amas important (plus ou moins individualisé) de séquences en un point spécifique du gel, et correspondant au nombre de copies de tout ou partie des séquences nucléotidiques spécifiques ainsi amplifiées, est corrélable à la présence de ces séquences spécifiques dans l'échantillon étudié. Avantageusement, l'amplification de tout ou partie des séquences spécifiques susmentionnées, est susceptible d'être détectée à l'aide de sondes telles que décrites ci-dessus, notamment selon un des procédés décrits précédemment. D'autres méthodes de détection ou de dosage, en phase solide ou liquide, peuvent bien entendu être envisagées dans le cadre de la présente invention. Ces méthodes sont décrites notamment dans l'article de Bloch, 1991, qui traite de la technique PCR en général et d'une méthode de dosage par co- amplification, ces méthodes pouvant être appliquées à la quantification des erwinias pectinolytiques présentes dans l'échantillon étudié, ou dans l'article de Barany, 1991, traitant de la LCR et de la PCR, ou encore dans l'article de Gilliland et al., 1990, traitant d'une méthode PCR par compétition pour la quantification d'ARNm également applicable dans le cadre de la présente invention. il 2705349 L'invention a plus particulièrement pour objet l'application des procédés d'identification et de détection susmentionnés au diagnostic de l'éventuelle apparition d'une pathologie, notamment de la jambe noire, causée par les Eca. Le résultat de ces méthodes de diagnostic susmentionnées permet d'évaluer le risque que présente un hôte susceptible d'être porteur d'Eca, de développer et le cas échéant, de transmettre, ou non, une pathologie causée par ces bactéries, et plus particulièrement la jambe noire. Par Eca détectées dans le cadre des méthodes de diagnostic et de détection susmentionnées, il faut entendre à la fois les souches naturelles de ces bactéries, ainsi que les souches modifiées, notamment par voie du génie génétique. Les méthodes de diagnostic selon l'invention sont réalisées par détection d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica responsable notamment de la jambenoire en Europe, ou de toute espèce ou sous-espèce dérivée ultérieurement par modification de la taxonomie actuelle. Le polymorphisme des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca pathogènes, ou des fragments de ces séquences, peut être représentatif de différents groupes au sein de ces erwinias, tels que des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes d'Erwinia carotovora, le polymorphisme étant notamment mis en évidence soit par l'action d'enzymes de restriction, par des électrophorèses en gradient de température ou d'agents dénaturants, ou après hybridation avec un fragment d'ARN par action avec la RNase A, ou par toute autre méthode visant à mettre en évidence le polymorphisme des acides nucléiques en phase solide ou liquide. L'invention vise également les kits pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une sonde telle que définie ci-dessus, et, le cas échéant, au moins un couple d'amorces telles que décrites ci-dessus. Avantageusement, les kits selon l'invention comprennent: - une ADN ou ARN polymérase thermorésistante, - un milieu réactionnel avantageusement constitué, dans le cas de l'utilisation de la technique PCR, de Tris-HCl 10 mM pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgC12, 0,01% de gélatine, de cofacteurs de l'ADN ou ARN polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+, et des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) ou des ARN (dCTP, dATP, dGTP, dUTP). Les kits selon l'invention peuvent également comprendre: - une ou plusieurs enzymes de restriction, et, le cas échéant, des fragments de restriction de référence caractéristiques de chacun des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes d'Eca, 12 2705349 - et/ou une ligase et un (ou plusieurs) couple(s) de séquences oligonucléotidiques susceptibles de s'hybrider de part et d'autre d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) situé(s) dans des gènes ou fragment de gènes caractéristique(s) d'une souche d'Eca, et avantageusement une (ou plusieurs) sonde(s) oligonucléotidique(s) spécifique(s) d'une région caractéristique d'une souche déterminée d'Eca, dans l'état actuel de la taxonomie. L'invention concerne également l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection, le cas échéant dans un but de diagnostic, chez un hôte ou dans un milieu tels que définis ci-dessus, de tout micro- organisme ou toute cellule, dans les génomes desquels les séquences nucléotidiques selon l'invention, ont été introduites de façon transitoire ou définitive. Un tel procédé est avantageusement réalisé suivant l'une des méthodes décrites ci-dessus. A ce titre, l'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques défminies ci-dessus, en tant que marqueurs de cellules ou micro- organismes génétiquement modifiés par introduction ou non dans leur génome de ces séquences nucléotidiques, ou d'hôtes cellulaires infectés (ou transformés) par de tels micro-organismes, notamment pour le suivi de l'évolution de ces cellules, micro-organismes et hôtes cellulaires dans un environnement déterminé. L'invention concerne notamment les cellules de plantes (par exemple les protoplastes) transformées par un vecteur choisi parmi ceux dérivés des plasmides Ti et Ri d'Agrobacterium tumefaciens et d'Agrobacterium rhizogenes respectivement, ces plasmides contenant en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication et la transformation des cellules végétales, une séquence nucléotidique selon l'invention. L'invention vise également les plantes régénérées à partir de ces cellules transformées. L'invention concerne également les cellules animales transformées par un vecteur dérivé des rétrovirus et contenant une séquence nucléotidique de l'invention. L'invention concerne également tout procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées. La préparation de ces séquences nucléotidiques peut être effectuée soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés, comme l'amplification par LCR ou PCR ou autre méthode d'amplification génique. Un mode de préparation approprié de ces séquences nucléotidiques (comportant au maximum 200 nucléotides, ou paires de bases lorsqu'il s'agit 13 2705349 d'acides nucléiques bicaténaires) de l'invention par voie chimique comprend les étapes suivantes: - la synthèse d'ADN en utilisant par exemple la méthode automatisée f- cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986, - le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide) et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, généralement après restriction. Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à 200 nucléotides - ou paires de bases (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: l'assemblage, par exemple par aboutage (ou ligation, par action d'une ligase), d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, selon par exemple le principe décrit dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,; 7461- 7465, 1983, le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmides, phages ou cosmides), et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, généralement après restriction. La préparation des acides nucléiques de l'invention peut également être réalisée par voie biologique, notamment après clonage d'hôtes cellulaires dont le génome est susceptible de contenir ces séquences nucléotidiques, le cas échéant, après transformation du génome de ces hôtes à l'aide de vecteurs appropriés contenant ces séquences nucléotidiques. A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique selon l'invention. L'invention a également pour objet tout hôte cellulaire transformé par un vecteur selon l'invention, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucléotidique selon l'invention, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer. L'invention vise plus particulièrement la souche DH5cC d'Escherichia coli transformée par le plasmide pPMV176 lui-même obtenu par insertion de la séquence nucléotidique B représentée sur la figure 2, dans le site BamrHl du plasmide pTZ19R décrit dans l'article de Mead et al., (1985). Ainsi la présente invention vise un procédé d'obtention des sequences nucléotidiques susmentionnées, réalisé par: - mise en culture d'un hôte cellulaire tel que décrit ci-dessus, transformé par un vecteur selon l'invention, 14 2705349 - récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié, - récupération des séquences nucléotidiques de l'invention par traitement des vecteurs susmentionnés à l'aide d'enzymes de restriction appropriés (à l'aide par exemple de BamHll dans le cas du plasmide pPMV176 susmentionné), - purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, suivie d'une élution. Un autre procédé particulièrement avantageux d'obtention des séquences nucléotidiques selon l'invention, comprend les étapes suivantes: - mise en présence de vecteurs contenant les séquences nucléotidiques susmentionnées, avec des couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans des conditions permettant l'amplification du nombre de copies de ces séquences nucléotidiques, notamment dans les conditions décrites ci-dessus, - purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel. L'invention a également plus particulièrement pour objet les séquences E et F représentées respectivement sur les figures 5 et 6, ainsi que leur utilisation pour la mise en oeuvre d'un procédé d'identification spécifique de différentes souches ou pathovars d'Eca, notamment selon les techniques décrites cidessus. La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de la séquence nucléotidique B selon l'invention, et de sa spécificité vis à vis des souches d'Eca responsables de la jambe noire. I - MATERIELS ET METHODES a) Souches bactériennes et plasmides Les souches bactériennes et les plasmides utilisés pour la mise en oeuvre de la méthode de soustraction génomique utilisée pour l'obtention de la séquence B, sont décrits sur le tableau 1. Les micro-organismes testés dans le cadre d'expériences d'hybridation en dot-blot (dépôts en taches) avec les sondes obtenues sont présentés sur le tableau 2. Les souches d'Erwinia et d'Escherichia coli ont été cultivées sur milieu de Luria (Miller 1972) à 30 C et 37 C respectivement. Les antibiotiques ont été utilisés aux concentrations suivantes: ampicilline 50 /g/ml et streptomycine 100 /g/ml. Le X-gal (O-nitrophenylpD- galactopyranoside, Sigma) a été utilisé à la concentration de 40 /g/ml. b) Préparation de l'ADN 2705349 L'ADN génomique total a été extrait et purifié par la méthode de Klotz et Zimm (1972). L'ADN cible à été digéré avec Sau3A1 selon les recommandations du fabricant (Boehringer Mannheim). Après digestion, l'ADN a été extrait une fois par le mélange phénol-chloroforme, précipité, lavé et resuspendu à 0,1 /zg//l dans le tampon EE pH 8,0 [10 mM N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-(3- propanesulfonic acid), 1 mM EDTA]. Deux cents /g d'ADN piège ont été fragmentés par sonication dans 3 ml de tampon EE. La taille moyenne des fragments d'ADN est de 1 000 pb. L'ADN soniqué est concentré avec 7,5 ml de 2-butanol, précipité à l'éthanol absolu (2 volumes), lavé et resuspendu à 1 /g//gl dans l'eau. Les concentrations d'ADN génomique utilisés pour la soustraction sont mesurées très précisément au spectrophotomètre (à 260 nm, 1 DO=50 Ag/ml d'ADN), et par comparaison d'intensité des bandes contre un standard après électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % pendant 1 heure 30 minutes à 75 V dans le tampon TBE (Tris Borate EDTA), et coloration au bromure d'éthidium (Maniatis et al., 1982). L'ADN génomique pour les tests de dot-blot a été extrait de la manière décrite ci-dessus avec des volumes réduits de 10 fois. Chaque ADN a été contrôlé par spectrophotométrie UV et électrophorèse après digestion avec EcoRI (Boehringer Mannheim). Des préparations à grande échelle d'ADN plasmidique ont été réalisées à partir de lysats clairs suivies par deux centrifugations en gradient de densité de chlorure de césium avec du bromure d'éthidium (Maniatis et al., 1982). Des préparations à petite échelle ont été réalisées par la méthode rapide de Holmes et Quigley (1981). c) Marquage de l'ADN avec( a 32 p) dATP L'ADN a été marqué à l'aide du kit de marquage "random primer" d'ADN de Boehringer Mannheim selon les instructions du fabricant, 4 heures à température ambiante. L'élimination des desoxyribonucleotides tri-phosphates non incorporés a été réalisée par chromatographie sur 0,5 ml d'une colonne de Sépharose CL-6B (Pharmacia). 50 ng d'ADN ont été utilisés par sonde, tandis que 1, g a été marqué pour suivre l'ADN génomique total. d) Biotinvlation de l'ADN 16 2705349 La réaction est effectuée sur des plaques de microtitration disposées sur de la glace, dans une chambre noire. 50 1l d'ADN soniqué, à la concentration de 1 /g/Igl sont mélangés à 50 /l d'acétate de photobiotine (Sigma) à la concentration de 2 /g//l par puits. Le mélange est photoactivé par une lampe UV, 10 mn à 360 nm. Après addition de Tris 1M, pH 9 pour une concentration finale de 100 mM, I'ADN biotinylé est extrait quatre fois au 1-butanol (saturé à l'eau), précipité à l'éthanol, lavé et resuspendu à la concentration de 2,5 /g//l dans du tampon 2,5 EE, pH 8. e) Soustraction génomique Les séquences nucléotidiques A à F représentées respectivement sur les figures 1 à 6, sont obtenues par soustraction génomique entre deux souches d'Erwinia carotovora, l'une de ces deux souches étant pathogène, tandis que l'autre n'est pas pathogène (du moins dans les conditions, notamment climatiques, o la souche précédente est pathogène). La souche d'Erwinia carotovora pathogène est une souche d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) responsable de la jambe noire chez certaines plantes (notamment chez la pomme de terre) dans les climats o règne, du moins pendant un certain temps, une température d'environ 15 C à environ 25 C, et la souche d'Erwinia carotovora non pathogène, du moins dans les conditions de température susmentionnées, est une souche d'Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc). La soustraction génomique susmentionnée entre les deux souches d'Erwinia carotovora est réalisée selon la méthode de Straus et Ausubel décrite dans la demande de brevet européen n 372 524 déposée le 6 décembre 1989. Cette méthode de soustraction génomique est de préférence réalisée de la manière suivante: - 1'ADN de la souche d'Eca, ou ADN cible, est coupé en petits fragments, d'environ 100 à environ 1 000 nucléotides, par action d'enzymes de restriction, - I'ADN de la souche d'Ecc, ou ADN piège, est coupé en fragments, d'environ 1 000 à environ 10 000 nucléotides, par sonication, ces fragments étant par la suite marqués, par exemple à la biotine ou autre molécule permettant la détection des acides nucléiques (par exemple par piégeage), - les fragments susmentionnés d'ADN cible et d'ADN piège sont mélangés dans des proportions telles que l'ADN piège soit en excès par rapport à l'ADN cible, notamment dans une gamme de rapports ADN piège/ADN cible d'environ 2 à 100, et avantageusement dans un rapport d'environ 40, À 17 * 17 2705349 - les fragments d'ADN cible et piège ainsi mélangés sont dénaturés par chauffage, notamment à une température d'environ 100 C, ce qui conduit à la formation de fragments d'ADN cible et piège simple brin, - puis les fragments d'ADN simple brin obtenus à l'étape précédente sont placés dans des conditions d'hybridation telles qu'elles permettent la formation de fragments d'ADN double brin constitués de deux brins d'ADN cible (homoduplex cible), ou de deux brins d'ADN piège (homoduplex piège), ou encore d'un brin d'ADN cible et d'un brin d'ADN piège (hétéroduplex), notamment dans des conditions d'hybridation relativement peu stringentes (peu drastiques) à une température d'environ 65 C en présence de NaCl 1M, - les fragments d'ADN double brin obtenus à l'étape d'hybridation précédente, sont ensuite mis en présence d'un réactif ayant une affinité pour le marqueur susmentionné, par exemple l'avidine ou la streptavidine ayant une affinité pour la biotine (constante de dissociation d'environ 10-15M), ce réactif étant immobilisé sur un support solide (tel que des billes), de sorte que les homoduplex pièges et les hétéroduplex marqués, notamment biotinylés, demeurent fixés sur le support solide par liaison entre le marqueur utilisé pour marquer l'ADN piège et le réactif susmentionné, notamment sur les billes couplées à l'avidine ou à la streptavidine, - récupération, notamment par filtration ou sédimentation du support solide, des homoduplex cibles non marqués constituant les séquences nucléotidiques spécifiques de la souche d'Erwinia carotovora pathogène, - avantageusement, répétition des étapes précédentes entre environ 3 et 5 fois, à partir de la solution obtenue à l'étape précédente en tant que solution d'ADN cible, de manière à éliminer les homoduplex piège et hétéroduplex susceptibles d'être présents dans ladite solution, le cas échéant, ligature d'adaptateurs oligonucléotidiques, de séquences connues, de part et d'autre des séquences nucléotidiques spécifiques (homoduplex cibles), cette ligature étant réalisée notamment par l'action d'une enzyme du type ligase, et amplification du nombre de ces séquences nucléotidiques spécifiques par mise en oeuvre d'une méthode d'amplification (ou de multiplication ou de réplication) du nombre de copies desdites séquences nucléotidiques spécifiques, notamment selon les techniques PCR (Polymerase Chain Reaction), 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) ou toute autre technique faisant appel à l'hybridation entre acides nucléiques et permettant de détecter un nombre initialement faible d'acides nucléiques déterminés par multiplication du nombre de copies de ceux-ci. 18 2705349 La méthode d'amplification susmentionnée peut être réalisée suivant les procédures PCR et 3SR décrites ci-après. A titre illustratif, les adaptateurs utilisés peuvent présenter la séquence nucléotidique suivante: ' CACTCTCGAGACATCACCG 3'. Les fragments homoduplex d'ADN cible obtenus et amplifiés par les méthodes précédentes, peuvent être isolés et multipliés sous forme pure, notamment par clonage dans un vecteur approprié. la souche d'Eca est la souche 86.20 déposée à la Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (C.N.C.M.) de l'Institut Pasteur à Paris le 30 mars 1993 sous le numéro 11295, et la souche d'Ecc est la souche CH26 déposée à la C.N.C.M. le 30 mars 1993 sous le numéro I1294. Pour effectuer cette soustraction génomique, 10 /g d'ADN piège biotinylé et 250 ng d'ADN cible digéré ont été utilisés pour le premier cycle de sous- traction génomique selon le protocole de Straus et Ausubel. La procédure n'a pas été changée à l'exception du fait que l'ADN de dépistage et l'ARNt de levure n'ont pas été additionnés dans le mélange réactionnel. La liaison de l'ADN biotinylé a été réalisée avec une solution de streptavidine à 5 % (DynabeadsTM M-280, Dynal A.S., Oslo, Norvège). A chaque cycle d'hybridation successif, 10 /xg d'ADN biotinylé piège ont été additionnés aux échantillons. A la fin du dernier cycle, les échantillons résultants ont été précipités à l'éthanol et resuspendus dans 5 /1 de tampon TE pH 8 (Tris EDTA, Maniatis et al., 1982). * Protocole: Dix /g d'ADN piège biotinylé et 250 ng d'ADN cible digéré sont mélangés avec 3 ml de tampon 10 EE, pH 8,0. L'ensemble est porté à ébullition pendant 1 mn. L'ensemble est ensuite séché par évaporation, et resuspendu dans 4 mi d'eau distillée stérile. Un /1 de solution de NaCI 5 M est ajouté, mélangé et centrifugé par impulsions. L'échantillon est alors recouvert par 20 1l d'huile minérale (Sigma) et placé dans un incubateur thermique à 65 C pendant 17 heures. Le mélange d'hybridation est ensuite repris dans 100,l de tampon EEN, pH 8,0 (NaCl 0,5 M, 10 mM N-(2-hydroxyéthyl)-pipérazine-N'-(3-propane acide sulfonique) (EPPS), 1 mM EDTA) et mélangé vigoureusement (Vortex). L'huile minérale est enlevée délicatement, et 100 il d'une solution à 5% de billes magnétiques recouvertes de streptavidine, lavées et resuspendues dans du tampon EEN (Dynabeads, Dynalabs), sont ajoutés. Le mélange est laissé à incuber 30 mn à température ambiante. 19 2705349 Le mélange est ensuite placé sur un filtre adapté au tube Eppendorf, et filtré par centrifugation 6 000 g, 15 s. Le tube d'hybridation est rincé avec 200 /l de tampon EEN, et le liquide de rinçage est placé sur le filtre et centrifugé dans les mêmes conditions. L'ensemble du filtrat est précipité avec 1 ml d'éthanol absolu, 5 mn à -80 C, centrifugé 30 mn à 10 000 g. Le culot (invisible) est rincé à l'éthanol absolu et séché. Le culot est ensuite resuspendu dans 4 /l d'ADN piège biotinylé (10 gg). La resuspension doit être minutieuse et être effectuée tout le long de la paroi du tube (côté extérieur, force centrifuge). L'ADN resuspendu est porté à ébullition, pendant 1 min, et 1 1l de NaCl 5 M sont ajoutés. Le mélange est placé à 65 C pendant 17 heures pour un nouveau cycle d'hybridation soustractive. Après quatre cycles de soustraction, l'ADN précipité est resuspendu dans ml d'eau distillée stérile. f) Ligature des adaptateurs pour l'amplification par PCR L'amorce oligonucléotidique suivante: 'GACACTCTCGAGACATCACCGTCC3', et l'amorce complémentaire phosphorylée en 5' 'GATCGGACGGTGATGTCTCGAGAGTG3' sont mélangées en proportion égale, 100 ng//ul de chaque, portées à ébulli- tion 1 mn dans un bain-marie. Les amorces sont laissées à hybrider dans le bain- marie jusqu'à ce que celui-ci soit revenu à la température ambiante. Deux /l et demi de l'ADN résultant de la soustraction génomique sont mélangés à 50 ng (2 /l du mélange précédent) de la solution d'adaptateurs, avec 1,i de tampon de ligature, 1 /l de ligase (Stratagène) et 3,5 Al d'eau distillée stérile. Le mélange réactionnel est placé à 16 C pendant 12 heures. Après ligature, le mélange est repris dans 20 AI de tampon TE pH 8,0 (Tris EDTA) et filtré sur minicolonne de sépharose CL-6B par centrifugation 5 mn à 2 000 g. Le filtrat est extrait une fois au phénol- chloroforme et précipité à l'éthanol absolu, le culot séché est resuspendu dans 5 /l de tampon TE. g) Amplification de la banque soustractive par PCR L'ensemble de l'ADN lié aux adaptateurs est mélangé à 5 ml de tampon de PCR (Boehringer Mannheim), 100 pmoles de l'amorce 5'CACTCTCGAGACATCACCG3, 200 mM de chaque dNTP, avec 2,5 unités de Taq polymérase (Boehringer Mannheim) dans un volume complété à 50 /l avec de l'eau distillée stérile. Le mélange est recouvert de 50 A1 d'huile minérale. L'amplification est effectuée dans un thermocycleur (Pharmacia): 1 2705349 mn à 94 C, 1 mn à 65 C et 1 mn 30 à 72 C, pendant 25 cycles. Un aliquot de /l est prélevé, après ces 25 cycles, et amplifié à nouveau 25 fois dans des conditions identiques. Dix /l par échantillon sont analysés par électrophorèse en gel d'acrylamide 6% (Ausubel et al. 1987), 200 V pendant 1 h, et coloration au bromure d'éthidium (2 mg/1). h) Clonage des fragments issus de la PCR Les plasmides utilisés pour le clonage sont ceux décrits sur le tableau 1. La procédure de ligature est la même que celle décrite ci-dessus, avec un rapport 1:1. La souche DH5a de Escherichia coli a été transformée par électroporation (Ausubel et al. 1987). Clonage du mélange des fragments et protocole d'hybridation sur colonies. Un premier clonage sur l'ensemble des fragments, a été réalisé dans le plasmide pUBS-3 portant la résistance à l'ampicilline. Le plasmide est ouvert par restriction avec l'enzyme BamHI, générant des extrémités cohésives compatibles avec les séquences palindromiques du site Sau3Al. Les différents fragments issus de la PCR sont débarrassés de leurs adaptateurs par digestion avec l'enzyme Sau3A1. Ceci permet d'obtenir des extrémités proéminentes Sau3A1. Le plasmide et les fragments sont mélangés en quantité égale (200 ng d'ADN au total) et ligaturés selon le protocole ci-dessus dans 10 /l de volume réactionnel. Le mélange est utilisé pour transformer la souche DH5ax d'Escherichia coli. Cent cinquante,l d'une suspension de cellules compétentes d'Escherichia coli (20 ml de culture en phase exponentielle de croissance en milieu L, à 37 C, sous agitation, soit à la DO 0,5 à 600 nm, sont incubées 15 mn sur la glace, lavées dans l'eau distillée stérile à 4 C, centrifugées à 4 000 g pendant 20 mn et incubées 10 mn sur un lit de glace, deux fois, et le culot fminal est resuspendu dans 0,5 ml d'eau distillée stérile à 4 C) sont mélangés à 2,5,ul du mélange de ligature (50 ng d'ADN), dans une cuve d'électroporation. Aussitôt, la cuve est placée dans l'appareil et la solution soumise à un courant électrique (réglé sur 2,5 KV, 25 mF et 400 W). Un ml de milieu SOC (extrait de levure 0,5%, tryptone 2%, NaCl 2 mM, KC1 2,5 mM, MgC12 10 mM, MgSO4 10 mM, glucose 20 mM) est ajouté immédiatement, le mélange transféré en tube Eppendorf de 1,5 ml et mis à incuber 30 mn à 37 C. Quatre transformations sont ainsi réalisées. 21 2705349 Dix à 100 /l des mélanges de transformation sont étalés sur milieu L gélosé contenant 100 /g/mI d'ampicilline. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant une nuit. Le reste du mélange est conservé à 4 C. Les colonies résistantes à l'antibiotique sont comptées, et des dilutions sont effectuées sur les mélanges pour obtenir une concentration de 300 bactéries pour 100 gl, sachant qu'environ la moitié des bactéries seront mortes pendant leur conservation à 4 C. La totalité des mélanges de transformation est étalée, l1 par boîte de Pétri sur milieu gélosé contenant l'antibiotique et les boîtes incubées à 37 C, 24 à 48 heures (pour obtenir des colonies de 1 mm de diamètre). Des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham), taillées à la mesure des boites, sont appliquées délicatement sur les colonies, et des repères de position membrane/boîte sont marqués. Les membranes sont alors retirées avec précaution et placées sur papier buvard imprégné de solution de lyse (Tris HC1 50 mM pH 8,0, saccharose 25%, EDTA 10 mM, lysozyme 1,5 gg/ml), 5 mn, côté en contact avec les bactéries vers le haut. Les membranes sont ensuite transférées sur un papier buvard imprégné de solution dénaturante (NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M, Triton X100 0, 2%), 5 mn, puis sur solution neutralisante, deux fois 5 mn (Tris HC1 0,5 M pH 8,0, NaCl 2,5 M). Les membranes sont ensuite séchées et cuites 1 heure au four à 80 C sous vide, pour fixer l'ADN. Les boîtes contenant les bactéries sont conservées à 4 C. Les membranes sont préhybridées et hybridées, en utilisant comme sonde marquée au ct32P l'ensemble des fragments issus de PCR. Les protocoles de marquage radioactif et d'hybridation sont décrits ci-dessous. Après autoradiographie des membranes, les colonies présentant un signal d'hybridation, sont repérées grâce à l'orientation des membranes, des autoradiographies et des boîtes de culture. Ces colonies sont prélevées avec un cure-dent, inoculées à 10 ml de milieu L, avec ampicilline et incubées à 37 C sous agitation une nuit. Les cultures sont centrifugées 10 mn à 6 000 g. Le culot est repris dans ml de tampon Tris 50 mM pH 8,0, contenant 25% de sucrose. Un volume de 400 ml de MSTET (saccharose 5%, Triton X100 5%, EDTA 50 mM, Tris HCI mM pH 8,0), additionnés de 7,l de lysozyme à 40 mg/ml sont ajoutés et l'ensemble est porté à ébullition 45 s et plongé dans la glace. Le mélange est centrifugé à 4 C, 30 mn à 10 000 g. Le surnageant est ensuite prélevé délicatement, l'ADN extrait une fois avec le mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique, précipité et resuspendu dans 20 gl de tampon TE pH 8,0. 22 2705349 Cinq /l de chaque préparation sont digérés en présence de 1 /g de RNAse A bouillie, les restrictions sont analysées par électrophorèse en gel d'acrylamide. Les clones contenant un insert sont repérés par comparaison des profils électrophorétiques avec le plasmide de départ. Clonage des fragments prépurifiés par électroélution et sélection des clones sur milieu X-gal. Les fragments issus de PCR, débarrassés de leurs adaptateurs (100 ng dechaque fragment), sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide. Chaque bande est délicatement découpée au scalpel et récupérée (certaines bandes proches ne peuvent être séparées et sont prélevées ensemble). Chaque bande d'acrylamide est placée dans un boudin de dialyse (Spectrapore) dans de l'eau distillée. Les boudins sont placés dans une cuve d'électrophorèse horizontale contenant du tampon TBE dilué au demi. Les bandes d'acrylamide sont orientées dans le sens de la longueur du boudin, côté anode. Deux cents volts sont appliqués pendant 1 heure. Le courant est alors inversé 10 s, pour décoller l'ADN de la membrane de dialyse. On vérifie sous lampe UV que l'ADN est bien sorti de l'acrylamide. La solution est alors homogénéisée, récupérée et l'ADN extrait une fois au phénol-chloroforme-alcool isoamylique, précipité et resuspendu dans 5 /l d'eau distillée. Les ADN purifiés par électroélution sont mélangés à une quantité égale de vecteur (50 ng de chaque). Dans ce cas, il s'agit du plasmide pTZ19R, portant la résistance à l'ampicilline et le fragment ca du gène de la P3galactosidase (lacZ). Le plasmide est ouvert par restriction avec l'enzyme BamHI, dont le site est situé dans lacZ. La ligature et la transformation sont effectuées comme ci- dessus. Les bactéries sont étalées ensuite sur milieu contenant de l'ampicilline (100 /g/ml), de I'IPTG (Isopropylthiogalactoside; inducteur) et le substrat de l'enzyme, l'X-gal (O-nitrophenyl-13D- galactopyranoside, 100,g/ml). Les colonies contenant un plasmide sont sélectionnées par l'ampicilline, les colonies contenant un plasmide avec insert sont identifiées par l'absence d'activité P3- galactosidase: les colonies blanches sont mutées par insertion dans lacZ, les colonies bleues possèdent un système P3-galactosidase fonctionnel. Les colonies blanches sont sélectionnées et analysées comme ci-dessus. i) Hybridations Marquage des sondes au a32P par hybridation d'amorces au hasard ou "Random priming". Cinquante ng d'insert purifié à partir du plasmide de clonage par digestion, électrophorèse en gel d'acrylamide et électroélution sont utilisés 23 2705349 comme sonde. Le marquage est effectué avec le "Random primed DNA labeling kit" (Boehringer Mannheim). Cinquante ng d'ADN sont mélangés à 2 /1 de tampon contenant des amorces hexanucléotidiques, 1 /1 de chaque dNTP (excepté le dATP). Le volume est complété à 14 /1 avec de l'eau distillée stérile, porté à ébullition 3 mn, et le tube plongé dans la glace. Un gl de polymérase (fragment de Klenow) et 5 gl de (a32P) dATP (50 y Ci) sont ajoutés. Le mélange est laissé incuber 4 heures à température ambiante. La sonde marquée est ensuite purifiée (débarrassée des nucléotides marqués non incorporés et de courts oligonucléotides non spécifiques) par filtration sur Sépharose CL-6B, dans un tube Eppendorf de 0, 5 ml percé, placé dans un tube de 1,5 ml, en centrifugeant 5 mn à 2 000 g. L'efficacité du marquage est vérifiée au détecteur de rayons p3. La sonde est dénaturée juste avant l'hybridation par ébullition 3 mn, et le tube plongé dans la glace. Hybridation des ADN en "dot-blot" ou dépôt en taches: Les ADN de différents micro-organismes (tableau 2) ont été dénaturés et fixés par la méthode alcaline proposée pour les membranes Hybond N+ (Amersham). L'ADN génomique pour la méthode de Southern a été traité à l'aide de plusieurs endonucléases selon les instructions du fabricant (Boehringer, Mannheim). Les mélanges réactionnels ont été passés sur gel d'agarose 0,8 % en utilisant 1 /g de marqueur de taille (1 kb de ladder BRL). La méthode de Southern à été réalisée sur des membranes Hybond N+ selon les instructions du fabricant. Préparation des membranes. - membranes pour hybridation en "dot blot" Deux,g d'ADN par échantillons, dans un volume de 1,5 /l sont mélangés à un volume égal d'une solution de soude (NaOH 0,4 M, EDTA 1 mM) et déposés sur membrane de nylon (Hybond N+, Amersham). Lorsque tous les échantillons sont déposés, la membrane est placée, côté ADN vers le haut, 5 mn sur un papier buvard imprégné d'une solution de dénaturation (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M), puis 1 mn sur une solution de neutralisation (Tris HC1 0, 5 M pH 7,2, NaCl 1,5 M, EDTA 1 mM), 20 mn sur une solution de fixation (NaOH 0,4 M) et rincée 1 mn en 2X SSC (Citrate de sodium 0,03 M, NaCl 3 M). La membrane est ensuite séchée et peut être conservée à température ambiante. - membrane pour hybridation de Southern. Deux à trois,g d'ADN par échantillon sont digérés par des enzymes de restriction et séparés par électrophorèse sur grand gel d'agarose à 0,8% (300 ml). Après lecture, le gel est traité pour transférer l'ADN sur membrane de nylon. Le gel est traité deux fois 15 mn en HC1 0,25 M, rincé à l'eau 24 2705349 distillée, incubé deux fois 15 mn en solution dénaturante (NaOH 1 M, NaCI 1,5 M), rincé à l'eau distillée et 30 mn en solution neutralisante (Tris HC1 0,5 M, NaCi 1,5 M pH 7,5). Le montage suivant est ensuite réalisé: 6 feuilles de papier Whatmann 3M découpées à la taille exacte du gel et imbibées de 20X SSC (Citrate de sodium 0,3 M, NaCl 3 M) sont déposées au fond d'un bac. Le gel d'électrophorèse est ensuite superposé à ces feuilles, recouvert ensuite de la membrane découpée à la taille du gel. Une feuille de papier Whatmann et une pile de "linges" secs (15 à cm d'épaisseur), à la taille du gel également sont placés par dessus. Enfm une plaque de verre et un poids n'excédant pas un kg sont ajoutés. Le transfert de l'ADN s'effectue par capillarité pendant au minimum 6 heures. La membrane est ensuite récupérée, séchée et cuite au four à 80 C sous vide. - Hybridation et lavages. Les membranes sont préhybridées, à 65 C, sous agitation, au minimum une heure dans une solution de 6X SSC, SDS 0,5%, lait écrémé 0,05%. L'hybridation est réalisée dans un volume de 10 ml, en sachet plastique soudé, dans une solution de 6X SSC, SDS 0,1 %, lait écrémé 0,1 % contenant la sonde dénaturée, 17 heures à 65 C. Après hybridation, la membrane est lavée une fois en 3X SSC, SDS 0,1 %, à 65 C, deux fois en 0,3X SSC, SDS 0,1% à 65 C, et pour des conditions stringentes deux fois en 0,1X SSC, SDS 0,1% à 68 C. La membrane est alors légèrement essuyée puis placée sous film plastique. La membrane en fonction du nombre de coups/mn observés au compteur de rayons P est placée plus ou moins longtemps en présence d'un film d'autora- diographie dans une cassette à -80 C. L'autoradiographie est ensuite développée. j) Séquençage direct sur plasmide Le séquençage est réalisé directement sur plasmide double brin avec deux amorces choisies dans la séquence du gène lacZ à 150 nucléotides de distance du site de clonage. La réaction de séquence est réalisée par la méthode "dideoxychain termination" de Sanger et al. (1977), en utilisant le kit SequenaseTM (United States Biochemical Corporation). Pour chaque échantillon, l'amorce directe et l'amorce reverse sont utilisées séparément. Pour chaque échantillon, une première étape d'élongation à partir de l'amorce est réalisée par l'ADN polymérase (sequenase) en présence d'une quantité limitante de dNTP et de (ao32P) dATP pendant 5 mn à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite réparti, pour chaque échantillon, en quatre puits * 25 2705349 contenant des dNTP en quantité non limitante et pour chacun de ces puits un des didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Cette réaction s'effectue pendant 5 mn à 37 C et est ensuite stoppée par ajout d'EDTA. Les échantillons peuvent être conservés à -20 C et seront portés à ébullition 2 mn juste avant d'être déposés sur gel, leur dépôt étant toujours effectué dans l'ordre ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP. La séparation des différents fragments est réalisée par électrophorèse en gel d'acrylamide (6%, urée 460 g/l en tampon TBE), de 80 cm de long, à une puissance constante de 100 W (durée 3-6h). Le gel est ensuite démoulé et fixé dans un mélange méthanol 10%, acide acétique 10%, transféré sur papier Whatmann 3M, recouvert d'un film plastique, et l'ensemble est séché par chaleur et sous vide dans un sécheur de gel. Le gel est ensuite placé avec un film d'autoradiographie dans une cassette, pendant une durée variable, selon le nombre de coups/mn au compteur à rayons P. Les séquences sont ensuite lues et saisies sur ordinateur pour être analysées. Les programmes utilisés sont ceux du GCG (University of Wisconsin, Genetics computer Group, Devereux et al. 1984). Les recherches d'homologie de séquences sont réalisées dans les banques de données internationales Genbank et EMBL. il) Rsultats a) Détermination des conditions de soustraction Les conditions de biotinylation de l'ADN et de liaisons à la streptavidine ont été testées en même temps: 1 /g d'ADN de la souche 3937 d'Erwinia chrysanthemi coupé marqué au a32P ont été mélangés avec 49 /g d'ADN de la souche 3937 coupé. Le mélange a été biotinylé de la manière décrite précédemment dans le chapitre des matériels et des méthodes. Dix,g d'ADN biotinylés ont été incubés avec différentes concentrations de billes enduites de streptavidine (0,5%, 1%, 2,5% et 5%). Pour les solutions de 0,5, 1 et 2,5 %, une certaine radioactivité reste dans la fraction libre. La solution à 5% a été déterminée comme représentant la condition de liaison la plus efficace. Le nombre de cycles de soustraction a été déterminé à l'aide des deux critères suivants: liaison de séquences homologues et enrichissement en séquences non homologues. Deux bibliothèques ont été obtenues avec les paires suivantes: (i) 100 ng de fragment Q digéré par Sau3Al et marqués avec du a32P, 2 kb du fragment d'ADN Smr/Spcr (Prentki et Krisch 1984), ont été 26 2705349 mélangés avec 150 ng de l'ADN génomique de la souche 3937 digéré par Sau3Al, et soustrait avec l'ADN biotinylé de la souche 3937, (ii) 250 ng d'ADN de la souche 3937 digéré par Sau3A1 et marqué avec du a32P a été soustrait avec l'ADN biotinylé de 3937. La récupération à chaque cycle de séquences non homologues (fragment Q du contrôle (i)) dans la fraction libre et la liaison de séquences homologues (ADN de 3937 de contrôle (ii)) ont été estimées par comptage de la répartition de la radioactivité dans les fractions libres et liées. Après quatre cycles de soustraction, le facteur d'enrichissement (rapport entre les séquences hétérologues isolées et les pertes en séquences homologues) est de 14 et la fixation de séquences homologues de 99 %. Toutefois quelques pertes ont eu lieu à chaque cycle pour les séquences hétérologues (approximativement 40 %), et après 4 cycles les pertes sont de 80 %. Pour cette raison, 4 cycles ont été estimés comme étant suffisants pour permettre l'enrichissement en séquences hétérologues et pour éviter des pertes trop importantes. b) Soustraction g6nomique Quatre cycles d'hybridation de soustraction ont été réalisés pour chacune des paires (ADN cible/ADN piège) suivantes: (i) contrôle positif souche PMV 4071/souche 3937 (fragment d'insertion oméga (Qf) du mutant 4071 dans la souche Ech 3937 en tant qu'ADN cible et la souche 3937 en tant qu'ADN piège), (ii) la bibliothèque soustraite entre 8620 et CH126 (souche 8620 d'Eca en tant que source de sondes et CH26 d'Ecc en tant qu'ADN piège) et (ii) un contrôle négatif CH126-CH126. Les résultats de la soustraction sont présentés sur la figure 1. Le contrôle positif présente deux fragments amplifiés de 230 et 300 pb approximativement. Le traitement par l'enzyme de restriction est Sau3A1 du fragment Q a généré huit fragments principaux de 460, 300, 230, 190, 150, , 80 et 60 pb. Parmi tous ces fragments, seule une partie (33 % du fragment) a été réisolée par soustraction génomique. La bibliothèque différentielle entre Eca et Ecc présente 6 fragments d'ADN principaux (190, 200, 250, 300, 400 et 410 pb) et une bande double d'environ 450 pb moins claire que les autres. Aucun fragment amplifié n'est présent ni dans le contrôle négatif de soustraction, ni dans le contrôle négatif de contamination PCR. Dans tous les échantillons de soustraction génomique, de l'ADN coupé à été observé sur gels d'électrophorèse. A 27 2705349 c) Clonage des sondes à partir de la bibliothèque soustraite Les échantillons provenant de la PCR ont été traités par Sau3Al avant clonage afin de retirer les adaptateurs et de posséder des extrémités BamHI compatibles. Premièrement, la bibliothèque entière à été utilisée pour un clonage global avec pUBS-3 traité par BamHI en tant que vecteur. L'hybridation des colonies (Maniatis et al., 1982) après clonage de la bibliothèque entière, a permis d'isoler deux inserts contenant des clones en utilisant toute la bibliothèque en tant que sonde. Une seconde approche a consisté en le clonage, après séparation de la bibliothèque en quatre fractions sur gel de polyacrylamide à 6% et purification par électroélution (Maniatis et al., 1982). Le vecteur de clonage utilisé dans ce cas a été pTZ-19R traité par BamHI, les colonies blanches de E. coli DH5a transformées ont été sélectionnées sur milieu Xgal. Cette seconde stratégie a conduit a l'obtention de 4 clones contenant des inserts. Les six clones ont été dénommés respectivement A, B, C, D, E et F dans l'ordre de taille décroissante (voir figure 2, et tableau 1). d) expériences d'hybridation Les hybridations ont été réalisées avec les six sondes. Pour la plupart des souches, les hybridations ont été réalisées au moins deux fois sur des membranes séparées. Le tableau 2 illustre les résultats. Les sondes E et F donnent un signal seulement pour un nombre restreint de souches d'Eca. La sonde A donne un signal positif pour la plupart des souches testées dont les sou- ches d'Ecc, et est absente dans certaines souches et dans celle de l'ADN piège. Les résultats obtenus avec la sonde B sont représentés sur la figure 3. Dans des conditions de lavage stringentes, seules les souches d'Eca typiques sont hybridées, et dans des conditions de lavages moins stringentes quelques hybridations croisées ont été observées avec des souches d'Ecb. Pour la sonde C, toutes les souches typiques d'Eca présentent un signal positif et quelques souches d'Ecc également. Concernant la sonde D, toutes les souches d'Eca ("atypiques et typiques") et quelques souches d'Ecc ont été hybridées. L'ADN de la souche 86.20 d'Eca a été digéré par plusieurs endonucléases (BamHll, Clal et Sau3Al) et transféré après électrophorèse sur des membranes (technique dite de Southern). Les résultats d'hybridation avec les six sondes sont présentés sur la figure 4. Différents fragments d'ADN obtenus avec différentes endonucléases ont été hybridés avec les 6 sondes, indiquant ainsi que les sondes ne sont pas regroupées dans l'ADN génomique (cluster) de la souche 86.20 d'Eca. De plus, l'absence de signal d'hybridation avec l'ADN d'Ecc CH26 et la 28 2705349 présence de ce signal avec l'ADN d'Eca 86.20 indique que les sondes correspondent à la bibliothèque de soustraction. e) Séquençage de l'ADN Les séquences des sondes A, B, C, D, E et F ont été obtenues. Les résultats sont représentés sur la figure 5. Pour chaque sonde, des homologies ont été recherchées sur les bases de données Genbank et EMBL. Aucune homologie significative n'a été observée pour les séquences à l'exception de la sonde A, qui présente une homologie importante avec la séquence du gène putP de Salmonella typhimurium et E. coli. Ce gène code respectivement pour une proline perméase (73,8 % d'homologie) et un transporteur de proline (73,2 % d'homologie). TABLEAU 1: Souches bactériennes et plasmides caractéristiques source ou référence E. coli DH5ca endA1 hsdR17(rK- mK+) supE44 Bethesda Research thi-1 X7 recAl gyrA {80dlacZAM15 Laboratories A(lacZYA-argF) U169 Eca 86.20 souche isolée à partir de pomme de B. Jouan (Station de terre (France, 1986) Pathologie Végétale, INRA, Le Rheu, France) Ecc C1126 souche isolée à partir de pomme de O. Cazelles terre (Suisse, 1985) (Changins, Suisse) Ech 3937 souche isolée à partir de Saintpaulia Kotoujansky et al. ionantha (1982) PMV 3937 pelE-, fragment Q Smr-Spcr M. Boccara 4071 de R100.1 dans le site de restriction (Laboratoire de Bglll Pathologie Végétale, INRA INA P-G, Paris, France) 29 2705349 TABLEAU 1 (suite): Souches bactériennes et plasmides caractéristiques source ou référence plasmides pUBS-3 dérivé pUC contenant G. Murphy (IPS, pBLUESCRIPT Norwich, UK) pIP450 dérivé pUC contenant un fragment Prentki and Krisch Smr-Spcr de R100.1 (1984) pTZ19R dérivé pUC avec un promoteur de Mead et al. (1985) 1'ARN polymérase T7 pPMV174 dérivé pUBS-3 contenant la sonde A Collection du dans le site BamHll (Apr) laboratoire INRA (Pathologie Végétale, Paris) pPMV176 dérivé pTZ19R contenant la sonde B dans le site BamH1l (Apr) pPMV177 dérivé pTZ19R contenant la sonde C dans le site BamH1 (Apr) pPMV175 dérivé pUBS-3 contenant la sonde D dans le site BamHl (Apr) pPMV178 dérivé pTZ19R contenant la sonde E dans le site BamHil (Apr) pPMV179 dérivé pTZ19R contenant la sonde F dans le site BamHl (Apr) 2705349 TABLEAU 2. Résultats de l'hybridation Souches hôtes pays résultats de l'hybridation année avec les sondes A B C D E F Eca 88.33 pomme France, + + + + + - de terre 19881 88.45 " France, + + + + + - 88.1 " France, + + + + - - 88.22a " France, + + + + + + 88.24 " France, + + + + - - 88.30a " France, + + + + + - 87.7 " France, + + + + - - 87.13 " France, + + + + + + 87.16a " France, + + + + + - 87.16b " France, + + + + + - 86.14.11 " France, + + + + - + 86.20 " France, + + + + + + 511 " France, + + + + + - SF1. l, Allemagne3 + + + + + - 161 " Hollande4 + + + + + + Cip114 " Perou, + + + + + + Cipl25 " Perou, + + + + - - Cipl31 " Perou, + + + + - - CipO26 " Perou, + + + ++ + SH164.4 " La Réunion, + + + + + + CH3 " Suisse, + + ++ - - 31 2705349 TABLEAU 2 (suite 1) CH5 " Suisse, + + + + - - CH6 " Suisse, + + + + + - SF18.296 " Suisse, + + + + + + 1329 " UK, 19672 + + + + - + 1330 " UK, 19672 + + + + - - SCRI1043 " UK, 19857 + + + + + + 1526 " UK, 19572 + + + + - + 1527 " USA, 19732 + + + + + + 1525 " USA, 19692 + + + + + + 1453 tomate France, + + + + - - 1546 " France, + + + + - - 89.19* pomme Argentine, + - - + - - de 19891 terre 1H* eau Espagne, + - - + - - H1* Espagne, + - - + - - Ecb 2121 betterave USA, 19722 + - - - - - 2122 " USA, 19722 + - - - - - 1520 tournesol Mexico2 - Ecc SH230.134 banane Cuba3 +. CM1 choux Malawi, +. 798 carotte USA2 - (ATCC 495) CH15 celeri Suisse, - - - + - 1489 chrys- France, - anthème 19712 1458 " USA, 19712 + - + - - - SH230.115 mais Cuba3 + -. 1350 con- Italie2 + - + - combre 1285 cycla- Grèce2 + - mène SE99.1 chicorée France, 32 2705349 TABLEAU 2 (suite 2) 1488 iris France, - - SB89.7 poireau France, - - 2046T pomme Danemark + - de 19522 terre 88.22c " France, - - 88.29al " France, + - 88.44 " France, - - 87.25 " France, - 86.14.51 " France, - S99 " France, - - - + - S101 " France, - - - 76.26 " France, - - - PM2 " Malawi, + - - + 194 " Maroc, - - Cip360 " Perou, + - + - Cip361 " Perou, + - + - CipOO9 " Perou, - - + - CH24 " Suisse, - - CH26 " Suisse, - - SCRI193 " USA7 + - - - 1336 " UK, 19672 - - Si82.1 " Vietnam, + - SG162.6 tournesol France, - - 33 2705349 TABLEAU 2 (suite 3) 1403 Yougo- - - - - - - slavie, 797 tabac USA, 19512 + - + SG39.1 ? La Réunion, + - - - La Réunion, SG39.3 ? 19873 + - + - - - Eco 1893 celeri France, CHll " Suisse, + - - 2155 endive France, + - - 2154 " France, + - - 1892 " France, + - - 1959 " France, + - - 1878 " France, - 1879 " France, + 1880 " France, - 1646.2 poireau France, + 1654 " France, + - - - - + CH4 laitue Suisse, - Ech 3716 kalen- France, + choe 19789 1596 maïs France, + EP22 philoMartinique + dendron 198710 1271 mais Egypte SH1230-C94 tabac Cuba3 3665 diffenba- France + chia 19749 TABLEAU 2 (suite 4) 3937 saint- France + paulia 19779 1499 mais France 1888 pomme France + de terre 19782 CH29 pomme Suisse de terre 19886 2267 pomme Australie de terre 19782 1871 banane Côte + d'Ivoire CH36 pomme Suisse - de terre 19876 1275 oeillet USA + 3805 philo- France + dendron 19769 2015 pomme France + de terre 19752 1236 parth- USA + - - - - - enium 19452 B374 pelar- Comores + - - - - - gonium 19602 *2013 dalhia France + - - - - - 2051 diffenba- USA + - - - - - chia 19572 Erwinia aubépine France 1. amylovora [11 Erwinia non Francel 1 + herbicola [1] patho- gène Erwinia rhubarbe Suisse6 + rhapontici[1] Pseudomonasjfluore ail 19763 pv. lomagnae [1] Pseudomonas pomme de USA, 19703 marginalis [1] terre Pseudomonas pomme de Costa Rica3 solanacearum [1] terre 2705349 TABLEAU 2 (suite 5) Pseudomonas France 11 syringae pv. phaseoli- cola[1] Pseudomonas Pays-Bas4 + sp. [2] Pseudomonas chicorée Suisse6 viridiflava [1] Rhizobium France meliloti [21 Azorhizobium Sesbania Senegal10 caulinodens rostrata [1] Klebsiella France10 pneumoniae [1] Agrobacterium France i tumefaciens ['i Xanthomonas France campestris [2] Clavibacter pomme USA, michiganensis de terre 19763 [1] Brucella Francel melitensis [1] Yarrovia France i lipolytica [11 Yersinia salmo France, ruckeri [1] 1982"1 Yersinia patho- ATCC- + - pseudo- gène 23207 tuberculosis humain -29833 [11 bactéries pomme Espagne8 saprophytes de terre [8] Escherichia + - coli [1] Bacillus pomme France, polymixa de terre 19793 [11 36 2705349 (.) Non effectué. (*) Souche Eca atypique, récemment identifiée en tant que souche Ecc par leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques. (T) Souche type de l'espèce. [n] Nombre de souches testées. (1) Bernard Jouan, Institut National de la Recherche Agronomique, Rennes, France, collection per- sonnelle. (2) CFBP, Collection Française de Bactéries Phytopathogènes, INRA, Angers, France. (3) Régine Samson, Institut National de la Recherche Agronomique, Angers, France. (4) IPO, Research Institute for Plant Protection, Wageningen, Pays Bas. (5) CIP, International Potato Center, Lima, Pérou. (6) Olivier Cazelles, Station Fédérale de Recherches Agronomiques, Changins, Suisse, collection personnelle. (7) SCRI, Scottish Crop Research Institut, UK. (8) Maria Lopez, Instituto Valenciano De Investigaciones Agrarias, Espagne, collection personnelle. (9) Monique Lemattre, Institut National de la Recherche Agronomique, Versailles, France, collection personnelle. (10) Claudine Elmerich, Institut Pasteur, Paris, France, collection personnelle. (11) CFISM, Collection Française Informatisée de Souches Microbiennes, Institut National de la Recherche Agronomique, France. BIBLIOGRAPHIE Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. 1987. Current protocols in molecular biology. Greene/Wiley, New York. Barany, 1991, Biochemistry, vol. 30, n 11, 2735. Bloch, 1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, 189-193. Devereux, J., Haeberli, P., and Smithies, O. 1984. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Research. 12: 387- 395. Gallois, A., and Samson, R. 1992. Erwinia carotovora subsp. odorifera subsp. nov., associated with odorous soft rot of chicory, Cichorium intybus L. International Journal of Systematic Bacteriology. 42: 582-588. Gilliland et al., 1990, PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. Edited by Innis, Gelfand, Sninsky, White. Academic Press Inc. 37 2705349 Holmes, D. S., and Quigley, M. 1981. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Analytical biochemistry. 114: 193-197. Klotz, L., and Zimm, B.H. 1972. Size of DNA determined by viscoelastic measurments: Results on bacteriophages, Bacillus subtilis and Escherichia coli. J. Mol. Biol. 72: 779-800. Kotoujansky, A., Lemattre, M., and Boistard, P. 1982. Utilization of a thermosensitive episome bearing transposon Tn 10 to isolate Hfr donor strains of Erwinia carotovora subsp. chrysanthemi. J. Bacteriol. 150: 122-131. Lelliott, R.A., and Dickey, R.S. 1984. Genus VII: Erwinia. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, MD. 469473. Lelliott, R.A., and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. British Society for Plant, Blackwell Scientific publications. Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp. Marti, R., Lopez, M.M., Morente, C., and Alarçon, B. 1989. Incidence of erwinia-causing soft rots in irrigation water in Valencia (Spain). In Pro. 7th Int. conf. Plant Path. Bact., Budapest, Hungary, Eds: Z. Klement. 755-760. Miller, J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 466 pp. Pérombelon, M.C.M. 1989. Ecology and pathogenicity of soft rot erwinias: an overview. in. Proc. 7th Int. Conf. Plant Path. Bact., Budapest, Hungary, Eds: Z. Klement. 745-751. Pérombelon, M.C.M., and Kelmnan, A. 1987. Blackleg and other potatoes diseases caused by soft rot erwinias: proposal for revision of terminology. Plant diseases. 71: 283-285. 38 2705349 Pérombelon, M.C.M. 1980. Ecology of the soft rot erwinias. Ann. Rev. Phytopathol. 18: 361-387. Prentki, P., and Krisch, H.M. 1984. In Vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA fragment. Gene. 29: 303-309. Smith, C., and Bartz, J.A. 1990. Variation in the Pathogenicity and agressivness of strains of Erwinia carotovora subsp. carotovora isolated from different host. Plant disease. 74: 505-509. Stanghellini, M.E. 1982, and Meneley, J.C. 1975. Identification of soft rot Erwinia associated with blackleg of potato in Arizona. Phytopathology. 65: 86- 87. Thomson, S.V., Hildebrand, D.C., and Schroth, M.N. 1981. Identification and nutritional differentiation of the erwinia sugar beet pathogen from members of Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi. Phytopathology. 71: 1037- 1042. 39 2705349 REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique B représentée sur la figure 2, ou à sa séquence complémentaire, ou à des fragments de ces séquences, ou à toutes séquences susmentionnées modifiées par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides, lesdits fragments ou séquences modifiées étant capables, tout comme la séquence B susmentionnée, de s'hybrider dans des conditions stringentes avec le génome des souches d'Erwinia carotovora, subsp. atroseptica (Eca) pathogènes, notamment dans les conditions suivantes: hybridation dans 6 SSC, 0,1% SDS et 0,01% de lait écrémé à 65 C pendant une nuit, suivie par deux lavages de 30 minutes à 65 C dans 0,1 SSC, 0, 5% de SDS. 2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est marquée, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par une liaison à une molécule antigénique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs, cette liaison pouvant éventuellement être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l'intermédiaire d'une séquence nucléotidique constituée d'environ 5 à 100 nucléotides située au moins à l'une des extrémités de ces séquences. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 à la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en tant que sonde nucléotidique pour la détection des souches d'Eca responsables de la jambe noire. 4. Couples d'amorces utilisés pour l'amplification du nombre de copies des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3, ou des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans le génome des souches d'Eca responsables de la jambe noire, avec lesquelles lesdites séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3, sont susceptibles de s'hybrider, notamment dans les conditions définies dans la revendication 1, ces amorces étant avantageusement constituées d'environ 7 à environ nucléotides issus des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3. 2705349 5. Procédé de détection et d'identification des Eca éventuellement présentes dans le sol ou l'eau, ou encore chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, susceptible d'être un porteur apparemment sain de telles bactéries et se trouvant en phase latente d'infection, ce procédé comprenant les étapes suivantes: - le traitement d'un échantillon prélevé dans le sol ou l'eau ou sur cet hôte de manière à rendre le génome de ces Eca accessible aux sondes et/ou aux amorces défminies dans les revendications 3 et 4, et le cas échéant à toute ADN ou ARN polymérase permettant de répliquer les deux brins de l'ADN génomique ou 'ARN en dérivant, ce traitement étant notamment effectué par ébullition, macération (dans un liquide tel que l'eau), broyage, ou sonication, - la mise en contact de l'échantillon ainsi traité avec des sondes selon la revendication 3, et le cas échéant avec des amorces selon la revendication 4, notamment dans les conditions d'hybridation défmines dans la revendication 6, - le cas échéant, l'amplification à l'aide de couples d'amorces selon la revendication 4, du nombre de copies des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca pathogènes, responsables notamment de la jambe noire, et contenues dans les génomes de ces bactéries susceptibles d'être présentes dans cet échan- tillon biologique, et avec lesquelles sont susceptibles de s'hybrider les sondes ou amorces susmentionnées, et/ou l'amplification du nombre de copies de sondes selon la revendication 3, - la détection de la présence éventuelle desdites séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Eca, lesdites séquences étant hybridées avec les sondes susmentionnées, et donc de la présence d'Eca responsable de cette pathologie dans l'échantillon étudié. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplification du nombre de copies des séquences nucléotidiques spécifiques contenues dans les génomes des Eca, et/ou l'amplification du nombre de copies des sondes selon la revendication 3, comprend les étapes suivantes: - la prédénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin, de préférence, dans le cas de la technique PCR, dans un tampon constitué de Tris- HCI 10 mM pH 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgC12, 0,01% de gélatine, de cofacteurs de l'ADN (ou ARN)-polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP), ou des ARN (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP), et des couples d'amorces tels que définis dans la revendication 4, par chauffage entre environ 80 C et environ C, avantageusement à 100 C, 41 2705349 - l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN polymérase, ou d'ARN polymérase, ou de ligase thermorésistante, et * chauffage à environ 94 C, ce qui correspond à l'étape de dénaturation proprement dite, * puis chauffage entre environ 35 C et environ 76 C, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des couples d'amorces avec les séquences ou sondes susmentionnées, * et enfin chauffage entre environ 50 C et environ 76 C, ce qui correspond à l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de tout ou partie des séquences génomiques des Eca ou des sondes susmentionnées, ces séquences ou sondes étant délimitées par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées, - la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 25 et 35 fois, l'ensemble de la procédure pouvant être répété une ou plusieurs fois à partir de tout ou partie du milieu obtenu à l'étape précédente. 7. Procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est réalisé à l'aide de tout ou partie de la sonde constituée de la séquence nucléotidique B représentée sur la figure 2, le cas échéant marquée, notamment de la manière indiquée dans la revendication 2. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il est appliqué au diagnostic de l'éventuelle apparition d'une pathologie, notamment de la jambe noire, causée par les Eca, chez un hôte tel que défini dans la revendication 5. 9. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon la revendication 3, et, le cas échéant, au moins un couple d'amorces telles que décrites dans la revendication 4. 10. Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend: - une ADN ou ARN polymérase thermorésistante, - un milieu réactionnel avantageusement constitué, dans le cas de la technique PCR, de Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgC12, 42 2705349 0,01% de gélatine, de cofacteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions Mg2+ et K+, et des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) ou des ARN (dCTP, dATP, dGTP, dUTP). 11. Kit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend également: - une ou plusieurs enzymes de restriction, et, le cas échéant, des fragments de restriction de référence caractéristiques de chacun des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes d'Eca, - et/ou une ligase et un (ou plusieurs) couple(s) de séquences oligonucléotidiques susceptibles de s'hybrider de part et d'autre d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) situé(s) dans des séquences nucléotidiques ou fragment de séquences caractéristique(s) d'une souche d'Eca, et avantageusement une (ou plusieurs) sonde(s) oligonucléotidique(s) spécifique(s) d'une région caractéristique par exemple d'une souche déterminée d'Eca, dans l'état actuel de la taxonomie. 12. Vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2. 13. Hôte cellulaire transformé par un vecteur selon la revendication 12, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer. 14. Procédé d'obtention d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, comprenant les étapes suivantes: - mise en culture d'un hôte cellulaire selon la revendication 13, transformé par un vecteur selon la revendication 12, - récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié, - récupération de la séquence nucléotidique susmentionnée par traitement des vecteurs récupérés à l'étape précédente, à l'aide d'enzymes de restriction appropriés, - purification de la séquence nucléotidique ainsi obtenue, notamment par électrophorèse sur gel. 4*3 2705349 15. Procédé d'obtention d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, comprenant les étapes suivantes: - mise en présence de vecteurs selon la revendication 12, avec des couples d'amorces selon la revendication 4, dans des conditions permettant l'amplification du nombre de copies de cette séquence nucléotidique, notamment dans les conditions décrites dans la revendication 6, - purification de la séquence nucléotidique ainsi obtenue, notamment par électrophorèse sur gel.