Brevet FR2708855A1 — publié le 19950217

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES IMMUNOADJUVANTES OUIMMUNOSTIMULANTES L'invention a pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques présentant des propriétés immunoadjuvantes ou immunostimulantes. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ces nouvelles compositions. La thymuline largement prescrite en clinique pour stimuler les défenses immunitaires déficientes a été la première hormone à être testée en dilutions infinitésimales sur des modèles pharmacologiques. L'interféron (alpha ,beta )leucocytaire et l'interleukine-2 ont été expérimentés par la suite. On a également montré que la bursine administrée in ovo à 6 et 9 jours d'incubation à une concentration de 10-10 ou 10-13 chez les poulets privés de bourse de Fabricius permettait de compenser les altérations du fonctionnement de l'axe corticotrope. L'immunisation par la thyroglobuline porcine des animaux bursectomisés montre une absence de réponse anticorps spécifique, mais l'administration de faibles doses de bursine permet de normaliser les réponses (Guellati, thèse Montpellier 1990). On a également montré que l'association bursine-thymuline à une concentration de 10-14 sur des poulets immunisés contre la maladie de Gumboro (pathologie virale qui se traduit par une atteinte sélective de la bourse de Fabricius et une altération de la réponse immunitaire humorale chez les animaux infectés), fait apparaître une augmentation plus importante du taux des anticorps anti-Gumboro dans le lot traité (Grandmontagne et al., "Etat actuel de la recherche en homéopathie vétérinaire". Cahiers de biothérapie n[deg] 118, 1992). Rien à ce jour ne permettait de prévoir les propriétés immunostimulantes ou immunoadjuvantes de la bursine, seule ou en association avec un autre composé, soit à des doses infinitésimales, soit à des doses immatérielles, c'est à dire ne contenant plus théoriquement de molécules (ex: au delà de 10- ). La présente invention a pour objet de nouvelles compositions immunoadjuvantes ou immunostimulantes contenant des doses infinitésimales ou immatérielles de substance active, qui peuvent être utilisées chez l'homme ou chez l'animal. La présente invention a pour objet de nouvelles compositions immunoadjuvantes ou immunostimulantes de faible coût. La présente invention a pour objet de nouvelles compositions immunoadjuvantes ou immunostimulantes ne laissant aucun résidu chez les sujets, hommes ou animaux traités. La présente invention a pour objet de nouvelles compositions immunoadjuvantes ou immunostimulantes dont les diverses modalités d'administration (solutés buvables, poudres d'incorporation, nébulisation) sont appropriées à une prophylaxie de groupe. L'invention concerne l'utilisation de l'un au moins des peptides suivants: et notamment de la bursine, et leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, à une concentration égale ou inférieure à environ 10-8, notamment inférieure ou égale à 10-10, pour la préparation d'un immunostimulant ou d'un adjuvant de vaccination, pour l'homme ou pour l'animal. Par "immunostimulant", on désigne une substance capable de stimuler le système immunitaire quelle que soit la situation pathologique dans laquelle l'organisme se trouve, ou quel que soit l'antigène reconnu. Des tests permettant de vérifier cette propriété avec les peptides de l'invention sont, par exemple, ceux décrits par G.H. Werner, Immunomodulateurs et thérapeutique antiinfectieuse; Pocidalo G.G., Coulaud J.P., Vachon F., Vildé; Armette, Paris 1986 (Rapport des journées de l'hôpital Claude Bernard 1986). Par "immunoadjuvant", on désigne une substance capable de stimuler la reconnaissance par l'organisme d'un antigène et d'augmenter la réponse humorale ou cellulaire spécifique de cet antigène. Des tests permettant de vérifier cette propriété avec les peptides de l'invention sont, par exemple, ceux décrits par ASSIM, Immunologie Générale, 2ème éd. 1991; Medsi Mc Graw, Hill, p. 128 et 245. A une concentration supérieure à environ 10-8, on observe pas d'activité. Il est à noter que les concentrations exprimées correspondent aussi bien à des dilutions hanhemaniennes qu'à des dilutions korsako viennes. Comme acides susceptibles de former des sels pharmaceutiquement acceptables avec les peptides de l'invention, on peut citer: l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide perchlorique, l'acide nitrique, l'acide thiocyanique, l'acide sulfurique, l'acide carbonique, et l'acide phosphorique, ainsi que les acides organiques tels que l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide anthranylique, l'acide cinnamique, l'acide naphtalènesulfonique et l'acide sulfanylique. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation de l'un au moins des peptides ci-dessus défmis, et notamment de la bursine, caractérisée en ce que le peptide, notamment la bursine est à une concentration d'environ 10-10 à environ 10-13. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation de l'un au moins des peptides ci-dessus définis, et notamment de la bursine, caractérisée en ce que le peptide, notamment la bursine est à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10-14 à environ 10-22. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation de l'un au moins des peptides ci-dessus définis, et notamment la bursine, caractérisée en ce que le peptide, notamment la bursine est à une concentration égale ou inférieure à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le peptide, notamment la bursine, peut-être utilisé à une concentration inférieure à 10-27, et par exemple à une concentration pouvant atteindre environ 10-60. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent, comme substance active, l'un au moins des peptides ci-dessus définis, et notamment la bursine, à une concentration inférieure à environ 10- , et notamment à une concentration inférieure ou égale à environ 10-14, et notamment à une concentration d'environ 10-14 à environ 10- , ou à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment à une concentration d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. Les animaux que l'on traite en utilisant les peptides selon l'invention sont ceux nécessitant une stimulation du système immunitaire aboutissant à une augmentation de sécrétion d'anticorps spécifiques. Les patients que l'on traite en utilisant les peptides selon l'invention sont ceux nécessitant une stimulation du système immunitaire aboutissant à une augmentation de sécrétion d'anticorps spécifiques. L'invention concerne également un produit contenant: - l'un au moins des peptides ci-dessus définis, notamment de la bursine, à une concentration inférieure à environ 10- , et notamment à une concentration inférieure ou égale à environ 10-14, et notamment à une concentration d'environ 10-14 à environ 10-22, ou à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment à une concentration d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, - et un vaccin, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la vaccination humaine ou animale. Les peptides ci-dessus définis peuvent être associés à des vaccins et jouent alors le rôle d'immunoadjuvant. De façon avantageuse, les peptides de l'invention sont utilisés en même temps ou avant le vaccin. Comme vaccin, on peut citer le vaccin contre l'hépatite B, le vaccin contre la méningite, le vaccin contre le SIDA. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation du mélange de l'un au moins des peptides suivants: Lys-His-Gly (bursine), Lys-Gly-His, Gly-His-Lys, Gly-Lys-His, His-Lys-Gly, His-Gly-Lys avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline, de préférence à une concentration inférieure à environ 10-14, pour la préparation d'un immunostimulant ou d'un adjuvant de vaccination pour l'homme, ou pour l'animal. L'utilisation du mélange de l'un des peptides et de la thymuline permet de stimuler l'ensemble de la réponse immunitaire, aussi bien humorale que cellulaire. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation du mélange de l'un au moins des peptides ci-dessus définis avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline caractérisée en ce que le mélange est à une concentration d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. Dans le cadre de l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, du mélange de l'un au moins des peptides ci-dessus définis avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline, le rapport thymuline/bursine est d'environ 10% à environ 90 % ou d'environ 90 % à environ 10 % respectivement en poids, et avantageusement d'environ 1/1. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent, comme substance active, un mélange de l'un au moins des peptides ci-dessus définis avec la thymuline, et notamment le mélange thymuline-bursine, à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10-23, et notamment d'environ 10-23 à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, le rapport thymuline-bursine étant notamment d'environ 10 % à environ 90 % ou d'environ 90 % à environ 10 % respectivement en poids, avantageusement d'environ 1/1 en poids. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont, à l'état liquide, sous forme notamment de solutés buvables, injectables ou de nébulisats, ou, à l'état solide, sous forme notamment de granules, poudres, comprimés, gélules, ou encore sous forme de crème ou pommade pour l'administration topique. L'invention concerne également un produit contenant un mélange de l'un au moins des peptides ci-dessus définis avec la thymuline, et notamment du mélange thymuline-bursine, à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à 10- , et notamment d'environ 10-23 à environ 10-27, notamment pouvant atteindre environ 10-60, le rapport thymuline-bursine étant notamment de 1/1 en poids, et un vaccin, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la vaccination humaine ou animale. Les animaux que l'on traite en utilisant le mélange bursine-thymuline sont ceux nécessitant une stimulation de la réponse humorale et de la réponse cellulaire augmentant leur défense vis à vis des organismes étrangers. Les patients que l'on traite en utilisant le mélange bursine-thymuline sont ceux nécessitant une stimulation de la réponse humorale et de la réponse cellulaire augmentant leur défense vis à vis des organismes étrangers. L'invention concerne également une méthode de stimulation humorale ou de vaccination chez l'homme ou chez l'animal, caractérisée en ce que l'on utilise, comme immunostimulant ou adjuvant de vaccination, l'un au moins des peptides ci-dessus définis, et notamment de la bursine, à une concentration égale ou inférieure à environ 10-8, notamment d'environ 10-10 à environ 10-13, ou d'environ 10-14 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. L'invention concerne également une méthode de stimulation humorale ou de vaccination chez l'homme ou chez l'animal, caractérisée en ce que l'on utilise comme immunostimulant ou adjuvant de vaccination, le mélange de l'un au moins des peptides ci-dessus définis avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. L'invention concerne également la bursine à une concentration inférieure ou égale à 10-8, notamment d'environ 10-10 à environ 10-13, ou à une concentration inférieure ou égale à 10-14, et notamment d'environ 10-14 à environ 10- , ou inférieure ou égale à 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, pour le nouvel usage d'immunostimulant ou d'adjuvant de vaccination pour l'homme ou pour l'animal. L'invention concerne également le mélange bursine-thymuline à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10-23 à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, pour le nouvel usage d'immunostimulant ou d'adjuvant de vaccination pour l'homme ou pour l'animal. Les peptides de l'invention peuvent être préparés en utilisant la méthode en phase solide décrite par Merrifield dans J. A. C. S. vol 85, p 2149-2154 (1963). Cette technique est bien connue pour la préparation des peptides. Des techniques utiles pour la synthèse des peptides en phase solide sont décrites dans plusieurs ouvrages. Cette méthode de synthèse implique l'addition, étape par étape, d'acides aminés protégés à une chaîne peptidique croissante, qui est liée par des liaisons covalentes à une résine solide. Par ce procédé, ces réactifs et les sous-produits sont éliminés par filtration, évitant ainsi de purifier les intermédiaires. Le concept général de cette méthode dépend de l'attachement du premier amino-acide de la chaîne à un polymère solide par une liaison covalente, suivi par l'addition d'amino-acides protégés successifs, l'un après l'autre, étape par étape, jusqu'à ce que la séquence désirée soit assemblée.Puis, le peptide protégé est éliminé du support de résine solide et les groupes protecteurs sont clivés. Les amino-acides peuvent être attachés à n'importe quel polymère approprié. Le polymère doit être insoluble dans les solvants utilisés, doit avoir une forme physique stable, permettant une filtration immédiate et doit contenir un groupe fonctionnel auquel le premier amino-acide protégé peut être fermement lié par une liaison covalente. Des polymères variés utilisables pour cette fin sont la cellulose, l'alcool polyvinylique, le polyméthylmétacrylate et le polystyrène. Le procédé général de préparation implique l'amidation initiale de la glycine (protégée sur son groupe amino) à la résine dans les solvants.Après que la résine couplée à la glycine a été lavée et séchée, le groupe protecteur sur le groupe amine de la glycine protégée est éliminé. Ce groupe protecteur est de façon appropriée le T-butyloxycarbonyle. L'élimination de ce groupe protecteur doit avoir lieu sans casser la liaison entre la glycine et la résine. A la résine couplée à l'amino-acide résultant, on couple ensuite la L-histidine protégée sur son groupe amino et sur son groupe imidazole. Le couplage a lieu par la formation d'une liaison amide entre le groupe amino libre et l'amino-acide glycine et le groupe carboxylique libre de l'amino-acide L-histidine.Puis le groupe protecteur est éliminé du groupe amino de la L-histidine, sans déranger les liaisons entre les amino-acides ou entre la résine et la glycine, ou entre le groupe protecteur sur le groupe imidazole de l'histidine et un amino-acide Llysine (protégé sur les deux groupes amino) est couplé. Le peptide protégé est clivé de la résine et les groupes protecteurs sont éliminés donnant le peptide désiré. Si l'on désire préparer un sel d'addition de l'un des peptides ci-dessus définis, on peut faire réagir le peptide libre avec la quantité appropriée d'acide. DESCRIPTION DES FIGURES Fig. 1: Titres des anticorps IgM (A) et IgG (B) anti-Tg déterminés 1 jour avant (D20) et 8 jour après (D29) la première immunisation et 8 jours après la deuxième (D38) et la troisième (D47) immunisation. N = poulets entiers opérés (contrôle), BX+S = poulets bursectomisés injectés avec du solvant, BX+B = poulets bursectomisés traités par bursine (Microg =100Microg; pg = lOOpg; fg = lOOfg). Les valeurs sont données comme la moyenne s. e. m. pour A, n = 1 à 8; pour B, n = 3 à 8. * différence statistiquement significative à p ND = non déterminé. Fig. 2: Taux plasmatiques d'ACTH (A) et de corticostérone (B) déterminés 1 jour avant (D20) et 8 jour après (D29) la première immunisation et 8 jours après la deuxième (D38) et la troisième (D47) immunisation. N = poulets entiers opérés (contrôle), BX+S = poulets bursectomisés injectés avec du solvant, BX+B = poulets bursectomisés traités par bursine (Microg =100Microg; pg = lOOpg; fg = lOOfg). Valeurs données comme la moyenne s. e. m.; n = 6 à 7. * différence statistiquement significative à p Fig. 3: Titres des anticorps IgM (A) et IgG (B) anti-Tg déterminés 1 jour avant (D20) et 8 jour après (D29) la première immunisation et 8 jours après la deuxième (D38) et la troisième (D47) immunisation. N = poulets entiers opérés (contrôle), BX+S = poulets bursectomisés injectés avec du solvant, BX+B = poulets bursectomisés traités par bursine (fg = lOOfg; 10-27 = 5 10-27 g). (moyenne s.e. m.; A, n = 3 à 9; B, n = 4 à 9). * différence statistiquement significative à p Fig. 4: Spécificité des anticorps anti-Tg vis-à-vis de divers concentrations de sérum alumine bovine (BSA), d'ovalbumine (OVA), de myosine du muscle de poulet (MYO), d'actine du gésier de poulet (ACT) et de thyroglobuline de porc (Tg) évalué par une technique d'inhibition. Le sérum de poulet BX traité par 5xlO-27 g de bursine (D28) a été dilué au 1/17500 et l'activité résiduelle des IgG anti-Tg a été déterminée part méthode ELISA indirecte. L'absorbance du sérum dilué en absence d'inhibiteur était de 1,288. Tableau 1: Evaluation de la spécificité des IgG anti-Tg a) Antigènes protéiques testés b) Pourcentage d'inhibition des anticorps liés à la Tg sans inhibiteurs. Fig. 5: Taux plasmatiques de corticostérone déterminés 1 jour avant (D20) et 8 jours après (D29) la première immunisation et 8 jours après la deuxième (D38) et la troisième (D47) immunisation. N = poulets entiers opérés (contrôle), BX+S = poulets bursectomisés injectés avec du solvant, BX+B = poulets bursectomisés traités par bursine (fg = lOOfg; 10-27 = 5 10-27 g). Valeurs données comme la moyenne s. e. m.; n = 5 à 9. * Différence statistiquement significative à p EXEMPLE L'induction d'un stress provoque à la fois une stimulation adrénocorticale et une réduction de la réponse immunitaire (i). Cependant, une injection d'antigène augmente le taux de glucocorticoîdes dans le sang conjointement au pic de réponse immunitaire (2). Le système immunitaire est soumis à un contrôle neuro-endocrinien et en retour exerce un effet de réciprocité sur les fonctions neuro endocrines (3). Dans un tel réseau complexe comprenant de nombreuses mécanismes bidirectionnels, il est difficile expérimentalement d'identifier et de localiser l'origine d'un signal spécifique provenant du système immunitaire qui dirige la réponse neuro-endocrinienne.Des relations entre l'activité immunitaire des lymphocytes B et l'axe adrénocorticotrope peuvent être explorés spécifiquement chez les oiseaux parce qu'il existe un organe lymphoïde d'éducation des B distinct, la Bourse de Fabricius, qui constitue le site normal de différenciation des cellules B (4). L'ablation chirurgicale de la Bourse de Fabricius chez des poussins nouvellement éclos altère l'activité adrénocorticale basale ou induite par le stress (5). La Bourse de Fabricius est active très précocement (6). et le tissu bursique est colonisé par les précurseurs des cellules hématopoïétiques entre 8 et 14 jours d'incubation (7). Les poussins bursectomisés au stade de jeunes embryons peuvent produire des IgM, des IgG et des IgA mais sont incapables de fabriquer des anticorps spécifiques en réponse à des stimulations répétées par divers antigènes chez des poulets (8, 9). Nous avons alors examiné la réponse adrénocorticotrope après stimulation antigénique répétée chez des poulets bursectomisés au stade embryonnaire précoce (poulets BX), immunisés avec de la thyroglobuline porcine (Tg). Les titres en anticorps anti Tg ont également été déterminés.On a pu montrer, dans le cadre de l'invention, que la production de deux hormones et des anticorps spécifiques était notablement réduite chez des poussins bursectomisés. On a alors étudié si l'administration in ovo de bursine, un tripeptide (Lys- His-Gly-NH2) extrait de l'épithélium bursique (10) pouvait restaurer les réponses hormonale et immunitaire spécifique. Matériel et Méthodes Oeufs embryonnés: ils ont été obtenus à partir de poules New Hampshire (Couvoir des Cévennes Lédenon France) et incubés (38 + - 10[deg], 80 % d'humidité, obscurité permanente) dans un incubateur CT-60 Adam. Les poussins nouvellement éclos ont été placés sous photopériode (12h lumière 7h00-19h00; 12h obscurité) et la température environnante a été progressivement diminuée à raison de 1[deg] C par jour, de 38[deg] C à 22[deg] C. Bursectomie des embryons: elle est réalisée à 80h d'incubation des embryons selon la technique de Fitzsimmons et coll. (11). Les opérations ont été pratiquées dans des conditions d'asepsie. Après avoir ouvert la coquille, une petite ouverture est pratiquée dans le chorion et dans l'amnios au niveau du bourgeon caudal. A l'aide d'une aiguille fme stérilisée, une boucle est passée autour du bourgeon caudal et tirée en arrière au niveau des ébauches des pattes. La queue est coupée avec des ciseaux de microchirurgie. Les bords de la membrane sont fermés avec des forceps et l'ouverture de la coquille recouverte de para film M et de paraffine. L'éclosion des embryons opérés est de 20 % avec 9 % de survivants au-delà des deux premières semaines de vie.Il est pratiqué pour les embryons opérés témoins une ouverture de la coquille et une incision de la membrane chorio-amniotique avant fermeture de la coquille. Bursine: ce tripeptide a été synthétisé de novo (non.../g nouveau mais synthétisé spécialement) par couplage de fragments peptidiques (12) : BOC-His (BOC) Gly-NH2; BOC-Lys (BOC) His-Gly-NH2; Lys-His-Gly-NH2. Deux expériences ont été réalisées: 1[deg]) traitement in ovo par injection de 250ml, soit de sérum physiologique (BX+S), soit de sérum physiologique renfermant de la boursine (100Microl, lOOpg ou lOOfg) dans la cavité vitelline des embryons bursectomisés (BX+B) aux 6[deg] et 9[deg] jours d'incubation Les témoins opérés ont reçu 250Microl de sérum physiologique (N). 2[deg]) les embryons traités par la bursine (BX+B) ont reçu 100Microl contenant soit lOOfg, soit 5xlO-27 g de bursine par injection .Les témoins opérés (N) et les animaux bursectomisés contrôle (BX+S) ont reçu 100/il de sérum physiologique. Antigène: la thyroglobuline porcine (Tg) (Sigma chemical Co St Louis Mo) a été injectée par voie sous-cutanée. La dose de Tg à injecter a été déterminée par des expériences préliminaires (résultats non donnés). Les poulets ont reçu 3 doses de 125Microg/100g de poids corporel (750 Microg/ml de sérum physiologique). Schéma expérimental: les jeunes poulets ont été immunisés de façon répétée par injection de la Tg aux 21e, 38e et 47e jours de vie. Dosage des hormones: les concentrations plasmatiques de cortistérone (CORT mg/ml) ont été évaluées par un dosage radio-immunologique par compétition. Cette technique a été adaptée auparavant pour les échantillons de plasma de poulets (13). Les coefficients de variation intra et inter essais ont été de 3,1 % et 5,6 % respectivement. La sensibilité de l'essai était de 0,05 mg/ml. La concentration plasmatique en ACTH (pg/ml) a été dosée par un RIA-kit (ACTH k-PR) fourni par le CEA (Paris, France) (14). Les coefficients de variation intra et inter essais ont été de 7,5 % et de 9,0 % respectivement. La sensibilité était de lOpg/ml. Les moyennes SEM ont été comparées par le test t de Student. Dosage des IgM et IgG anti Tg: les anticorps spécifiques ont été déterminés dans les échantillons de sérum ou plasma par technique immuno enzymatique ELISA. Des plaques à micro titration (Immunoplates II, NUNC, Roskilde, Denmark) ont été recouvertes d'une solution de Tg porcine à 10 mg/ml en tampon phosphate (PBS) à pH=7,2, et les plaques ont été incubées une nuit à + 4[deg]C. Les plaques ont été lavées 3 fois avec du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 (vol/vol); puis 100 Microl de plasma ou de sérum de poulet dilués successivement au 1/2 à partir de la dilution 1/20 ont été incubés à 37[deg]C pendant une heure. Les plaques ont été ensuite lavées 3 fois.Pour doser les IgM anti-Tg, 100Microg d'anticorps anti-IgM de poulet marqués à la péroxydase du raifort (Bethyl Laboratoires, Montgoméry, USA) ont été ajoutés et les plaques incubées à 37[deg]C pendant une heure. Après le dernier lavage, le substrat de l'enzyme, 0-phénylène diamine (Sigma) a été ajouté et les plaques incubées pendant 15 min. à la température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 450 mn à l'aide d'un photomètre Multiskan (Laboratoires Flow, Marseille, France). Pour le dosage des IgG anti-Tg, 100Microg d'anticorps anti-IgG de poulet marqués à la phosphatase alcaline (Sigma) ont été ajoutés et les plaques incubées pendant 1 heure à 37[deg]C. Après le dernier lavage du 4- nitrophénylphosphate (Sigma) a été ajouté et les plaques incubées 30 min. à 37[deg]C. L'absorbance a été mesurée à 405 nm.Le titre des IgM ou IgG anti-Tg a été défini comme la dilution de plasma donnant une absorbance égale à 1,0 par méthode ELISA indirecte. Les résultats exprimés en log du titre et ont été comparés par le test t de Student. Evaluation de la spécificité des IgG anti Tg: la spécificité a été évaluée par la technique d'inhibition avec diverses protéines (Sigma Laboratoires): sérum albumine bovine (BSA), ovalbumine (OUA), myosine de muscle de poulet (MYO), a-actinine provenant de gésier de poulet (ACT) et Tg d'origine porcine. Pour résumer, les sérums à tester dilués selon leur titre initial ont été incubés avec 2 mg/ml des différentes protéines pendant une nuit à 4[deg]C. Puis les tests ELISA ont été effectués à nouveau avec de la Tg porcine comme antigène; chaque sérum absorbé a été évalué en comparaison avec le sérum non traité. Contrôles histologiques: les oiseaux ont été sacrifiés à la fin de l'expérimentation. Des coupes sériées colorées par la méthode de Cleveland Wolff ont été examinées afin de s'assurer de l'absence complète de Bourse de Fabricius. Les oiseaux présentant des restes microscopiques de tissu bursique ont été exclus des résultats. Résultats La bursectomie embryonnaire précoce provoque une très forte mortalité pendant les périodes post-chirurgicale, pré-éclosion et post-éclosion. Moins de 10 % des animaux opérés survivent après les deux semaines qui suivent l'éclosion. Aucune différence de poids significative n'a été notée entre les animaux des groupes entiers (N), bursectomisés (BX) et bursectomisés traités (BX+B). 1ère expérience: trente et un poulets bursectomisés chirurgicalement au stade précoce embryonnaire sur 350 ont survécu pendant 48 jours après l'éclosion. A l'autopsie, 3 oiseaux présentant des restes microscopiques de tissu bursique ont été exclus de l'essai. Chez les animaux bursectomisés traités par le sérum physiologique (BX+S), les anticorps anti-Tg sont restés très bas malgré les stimulations antigéniques répétées (fig 1), tandis que les témoins opérés (N) présentaient un taux d'anticorps très élevé. L'administration in ovo de bursine chez les embryons bursectomisés (BX+B) a entraîné la restauration de la production des anticorps mais l'efficacité du traitement a varié de façon inversement proportionnelle à la dose injectée: par exemple, les faibles doses (100 fg et lOOpg) ont induit de meilleures réponses que la plus forte dose (100 mg) et la faible dose (100 fg) a provoqué la production d'anticorps de titre plus élevé que chez les animaux entiers (N). De faibles concentrations d'hormone initiales (20e jour) (fig 2) ont été observées dans tous les groupes (ACTH: 50 - 75pg/ml de plasma; CORT: 3,5 à 4,0 mg/ml). Par comparaison avec les valeurs initiales chez les témoins, les concentrations d'ACTH et de CORT ont légèrement augmenté après la première injection de Tg (29e jour: ACTH : 145pg/ml; CORT: 4 - 6mg/ml). Cependant les taux d'hormone ont été nettement supérieurs une semaine après la 2e immunisation (38e jour: ACTH: 310pg/ml; CORT: 7,5mg/ml) et a diminué jusqu'aux valeurs de base dans les derniers échantillons, après la 3e immunisation. Chez les oiseaux sans aucun traitement par la bursine (BX+S), aucune stimulation de l'axe adrénocorticotrope n'a été détectée entre le 20e et le 47e jour (ACTH: 75 - 120pg/ml; CORT: 3 - 4 mg/ml) et les deux injections de 100Microg de bursine n'ont pas corrigé l'effet suppresseur de la bursectomie embryonnaire (ACTH: 60 - HOpg/ml; CORT: 3 - 5mg/ml). Les traitements opothérapiques par 100 pg ou 100 fg de bursine ont été beaucoup plus efficaces et les oiseaux ainsi traités (BX+Bpg, BX+Bfg, fig 2) ont été capables de répondre presque normalement aux immunisations de Tg (38e jour: ACTH: 250 - 270pg/ml; CORT: 8,0mg/ml). 2e expérience; dix huit poulets bursectomisés sur 240 ont survécu et ont pu être testés. Les taux d'anticorps anti-Tg ont été très bas au 20e jour, avant la première immunisation, chez tous les groupes (fig 3). De valeurs aussi faibles ont été trouvées après les le, 2e et 3e injection de Tg (29e, 38e et 47e jour) chez les animaux bursectomisés traités avec 100Microl de solvent aux 6e et 9e jour d'incubation (BX+S). Les témoins opérés (N) ont répondu fortement aux immunisations répétées et ont présentés des titres très élevés d'IgG au 38e jour. La production d'IgM, quoique significativement augmentée, a été nettement moins forte que celle des IgG. L'administration in ovo de bursine aux embryons BX a rétabli la capacité de réaction immunitaire chez les oiseaux adultes quelle que soit la quantité de bursine injectée (BX+fg; BX+B.10-27 ). La spécificité des IgG anti-Tg a été évaluée. Comme le montre la Fig 4, un sérum (dilué à son titre 17.500) provenant d'un poulet traité par 10-27 g de burcine (38e jour ), a été testé après incubation avec diverses concentrations de OVA, BSA, MYO, ou ACT. Puis, l'activité résiduelle anti Tg a été à nouveau évaluée par méthode ELISA indirecte avec la Tg comme antigène. Aucune inhibition n'a été observée après les incubations avec OVA, BSA, MYO, ou ACT mais seulement après le traitement par la Tg. Puis 4 serums de chaque lot ont été testés en utilisant la même concentration de chaque protéine (2 Microg/ml). Aucune inhibition n'a été observée (tableau 1) dans aucun des sérums testés sauf après incubation avec le Tg.Ces résultats indiquent que la réponse humorale des poulets bursetomisés traités par la bursine était spécifique de la thyroglubine. Discussion Chez les oiseaux, la différenciation des pro-lymphocytes B en lymphocytes B a lieu dans la Bourse de Fabricius (16). Il a été montré que l'incorporation de thymidine tritiée par des splénocytes stimulés par la phytohemagglutinine était inhibée par un facteur provenant des cellules bursiques. Cette substance soluble a été nommée "facteur d'inhibition bursique" (17). Un agent inducteur de faible poids moléculaire, la bursopoïetine, a été extraite de la Bourse de Fabricius de poulets (18). La bursopoïetine aviaire induit sélectivement la transformation des lymphocytes B à partir de leurs précurseurs chez la souris et le poulet (19). La bursine est un tripeptide (Lysyl-histidyl-glycyl-amide) (10).Elle a été localisée par immunochimie dans les cellules des épithéliums réticulaires dendritiques et folliculaires de la Bourse de Fabricius (20), dans la moelle osseuse de bovins et d'ovins et dans les cellules épithéliales des canaux biliaires intrahépatiques du foie de bovins (21). Récemment, un précurseur tétrapeptidique (probursine) a été isolé de la moelle osseuse et du foie de bovins (22). L'ébauche bursique commence son développement dès le Sème jour d'incubation; elle est colonisée par des cellules souches d'origine mésodermique (23) du 8ème au 14ème jour d'incubation (24).Pour cette raison, la bursectomie a été pratiquée au 4ème jour d'incubation pour obtenir des poulets bursoprives complets et permanents ; les injections de bursine ont été faites immédiatement avant et durant la migration des cellules souches au niveau de la Bourse de Fabricius (6ème et 9ème jours d'incubation). Les poulets bursectomisés au stade embryonnaire peuvent produire des immunoglobulines sériques et de surface de classe IgM, IgG et IgA (8) mais sont incapables de produire des anticorps spécifiques, même après immunisation (9, 25). Nous montrons ici qu'aucun anticorps spécifique (IgM ou IgG) n'est produit chez les animaux bursectomisés après immunisation par de la Tg porcine. Nos résultats confirment ceux de Jalkanen et al. (8, 9) qui montraient que des poulets bursectomisés avaient des plasmocytes matures et étaient capables de synthétiser des immunoglobulines de classe IgM, IgG et IgA mais pas d'anticorps spécifiques, même après plusieurs immunisations.L'administration in ovo (6ème et 9ème jours d'incubation) de bursine, avant et durant la migration des cellules souches dans la Bourse de Fabricius, restaure la réponse humorale spécifique des poulets bursectomisés vis-à-vis de la Tg porcine. La production d'anticorps spécifiques anti-Tg est objectivée par l'absence de réaction croisée avec des anticorps de type IgG dirigés contre diverses protéines, incluant des protéines de poulets comme l'OVA, l'ACT et la MYO. Paradoxalement, la plus forte concentration de bursine est inefficace; les meilleures réponses sont obtenues avec les plus faibles doses (100 pg, 100 fg ou 5 10-27 g).Ces résultats confirment le rôle possible de la bursine dans la différenciation sélective phénotypique des précurseurs des lymphocytes B (10) et sa capacité à induire le réarrangement génique des régions V-J des chaînes légères des récepteurs des cellules B, conduisant à la formation du répertoire des anticorps. Il a déjà été noté (10) que la bursine augmente les concentrations intracellulaires d'AMPc et de GMPc des cellules B Daudi, mais pas celles de cellules T CEM pour des titres allant de 0,1 à 1,0 Microg en milieu de culture alors que Gly-His-Lys-NH2 induit des réponses beaucoup plus faibles uniquement pour des doses seuil de 1000 Microg/ml.La bursine (Lys-His-Gly-NH2) et le peptide inverse (Gly-His-Lys-NH2) à des concentrations allant de 10 à 100Microg/ml peuvent tous deux moduler de façon non spécifique la maturation des prolymphocytes B (26) et les tripeptides sériques correspondants, Gly-Lys-His et Gly-His-Lys, ont été décrits comme pouvant stimuler la croissance des hépatocytes (27). Il est important de noter que les résultats in vivo ont été obtenus avec des quantités beaucoup plus faibles de bursine. L'ablation de la Bourse de Fabricius chez des poulets âgés de 2 semaines augmente la réponse adrénergique de l'acide ascorbique à l'ACTH (28) et la réponse de l'axe adrenocorticotrope à des stress divers chez les oiseaux bursectomisés est altérée (29). Les taux sanguins de corticostérone sont augmentés après bursectomie à l'éclosion (5). Toutefois, tous ces résultats étaient obtenus chez des animaux opérés au moment ou après l'éclosion alors que la Bourse de Fabricius est immunologiquement active très précocément (6). Par conséquent, la Bourse embryonnaire fonctionnellement active pouvait exercer très tôt des influences sur le développement avant l'éclosion (30). La bursectomie in ovo à 68 heures d'incubation est responsable d'un accroissement de la taille des glandes surrénales à l'éclosion (30).Nous avons rapporté précédemment (31, 32) que la bursectomie au stade embryonnaire (80 h d'incubation) provoquait diverses perturbations dans le développement de l'axe corticotrope et de la fonction adrénergique: la stimulation hormonale induite par le stress à l'éther pouvait être détectée plus précocément chez les BX que chez les animaux entiers; la période d'absence de réponse au stress chez les poulets juste éclos n'apparaissait pas chez les poulets BX; les jeunes animaux BX manifestaient une réponse plus faible au stress. Le retard de réponse de l'axe adrénocorticotrope après stimulation par Brucella abortus chez les poulets adénohypophysectomiés n'apparaissait pas .quand l'adénohypophysectomie était pratiquée chez des poulets bursectomisés au stade embryonnaire (33).L'administration in ovo de bursine à des embryons BX pouvait minorer les effets d'une bursectomie précoce (32). Ce présent travail montre également qu'un traitement opothérapique d'embyons BX peut être efficace pour restaurer les réponses de l'axe adrénocorticotrope à un niveau presque normal après immunisations répétées par la thyroglobuline. Cependant, des injections de 100 Microg de bursine ne sont pas capables de stimuler l'axe adrénocorticotrope ou d'induire la production d'anticorps anti-Tg spécifiques. En revanche, l'administration beaucoup plus faible de ce tripeptide (en particulier de 100 fg ou 5 10-27 g) restaure pleinement les capacités de réponses normales de l'axe adrénocorticotrope et du système immunitaire chez les animaux BX. Des résultats semblables ont déjà été rapportés : la libération d'anions superoxydes et la phagocytose de polynucléaires neutrophiles peuvent être diminuées de 50 à 80 % par la postine, tétrapeptide actif sur le système immunitaire, à la concentration de 10-14 M et de 20 à 30 % à 10-18 M (34).La thymuline à 10-11 ng (10-20 g) s'est avérée capable de moduler la réponse immunitaire spécifique de souris saines et immunodéprimées mieux que les plus fortes doses (35). Il a été observé que l'interféron leucocytaire pouvait réguler la réponse immunitaire spécifique chez la souris à 10-10 IU (36). On peut constater que la bursine hautement diluée à 5 10-27 g est encore capable de restaurer les capacités hormonale et immunitaire des poulets bursectomisés. L'effet d'agents pharmacologiques hautement dilués comme la silice a été démontré chez la souris alors même que la solution était diluée jusqu'à 10-60 (37). Il a été montré par résonance magnétique nucléaire (RMN)(38) que la structure des hautes dilutions étaient différentes de celle de solvants non dilués. Ces hautes dilutions, au-delà du nombre d'Avogadro, semblent être capables de transmettre une information spécifique à des organismes vivants comme l'indique l'effet de SxlO-27 g de bursine observé chez des poulets bursectomisés. Ainsi, nos données sur la restauration des capacités immunitaires et adrenocorticotropiques normales chez des poulets bursectomisés ayant reçu de très faibles doses ou des hautes dilutions de bursine confirment le fait que le tripeptide bursique contrôle le répertoire anticorps et participe à la maturation fonctionnelle de l'axe adrénocorticotrope. Tableau 1 a = antigènes protéiques testés b = pourcentage d'inhibition des anticorps liés à la Tg sans inhibiteurs. REFERENCES 1- Glick B. The effect of cortisone acetate on the leucocytes of young chickens. Poultry Sci., 37, 1446, 1958. 2- Besedovsky H.O. , Sorkin E., Keller M. & Müller J. Changes in blood hormone levels during the immune response. Proc Soc Exp Biol Med., 150, 466, 1975. 3- Bateman A. , Singh A., Kral T. & Solomon S. The immune hypothalamic-pituitary - adrenal axis. Endocrine Rev., 10, 92, 1989. 4- Lawton A.R., Kincade P.W. & Cooper M.D. Sequential expression of germ-line genes in development of immunoglobulin class diversity. Fed Proc., 34, 33, 1975. 5- Mashaly M.M. Bursectomy and its influence on circulating corticosterone, triiodothyronine and thyroxine in immature male chickens. Poultry Sci., 63, 798, 1984. 6- Owen J.J.T. The origins and developments of lymphocyte populations. In: R. Portes & J. 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Modifications des temps de relaxation RMN à 4 MHz des protons du solvant dans les très hautes dilutions salines de silice/lactose. J.Med.Nucl.Biophys., 16, 135, 1992. REVENDICATIONS 1. Utilisation de l'un au moins des peptides suivants: Lys-His-Gly (bursine), Lys-Gly-His, Gly-His-Lys, Gly-Lys-His, His-Lys-Gly, His-Gly-Lys et notamment de la bursine, à une concentration égale ou inférieure à environ 10-8, notamment inférieure ou égale à 10-10, pour la préparation d'un immunostimulant ou d'un adjuvant de vaccination, pour l'homme ou pour l'animal. 2. Utilisation de l'un au moins des peptides selon la revendication 1, et notamment de la bursine, caractérisée en ce que la bursine est à une concentration d'environ 10-10 à environ 10-13. 3. Utilisation de l'un au moins des peptides selon la revendication 1, et notamment de la bursine, caractérisée en ce que la bursine est à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10-14 à environ 10-22. 4. Utilisation de l'un au moins des peptides selon la revendication 1, et notamment de la bursine, caractérisée en ce que la bursine est à une concentration égale ou inférieure à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. 5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient, comme substance active, l'un au moins des peptides selon la revendication 1, et notamment de la bursine, à une concentration inférieure à environ 10- , et notamment à une concentration inférieure ou égale à environ 10-14, et notamment à une concentration d'environ 10-14 à environ 10- , ou à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment à une concentration d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. 6. Produit contenant: - l'un au moins des peptides selon la revendication 1, notamment de la bursine, à une concentration inférieure à environ 10- , et notamment à une concentration inférieure ou égale à environ 10-14, et notamment à une concentration d'environ 10-14 à environ 10- , ou à une concentration inférieure ou égale à environ 10- , et notamment à une concentration d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60. - et un vaccin, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la vaccination humaine ou animale. 7. Utilisation du mélange de l'un au moins des peptides suivants: Lys-His-Gly (bursine), Lys-Gly-His, Gly-His-Lys, Gly-Lys-His, His-Lys-Gly, His-Gly-Lys avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline, de préférence à une concentration inférieure à environ 10-14, pour la préparation d'un immunostimulant ou d'un adjuvant de vaccination pour l'homme, ou pour l'animal. 8. Utilisation selon la revendication 7, du mélange de l'un au moins des peptides selon la revendication 6 avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline caractérisée en ce que le mélange est à une concentration d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27 et notamment pouvant atteindre environ 10-60. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, du mélange de l'un au moins des peptides selon la revendication 7 avec la thymuline, et notamment du mélange bursine-thymuline, dans laquelle le rapport thymuline/bursine est de 1/1 en poids. 10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient, comme substance active, un mélange de l'un au moins des peptides selon la revendication 7 avec la thymuline, et notamment du mélange thymuline-bursine, à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15) à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, le rapport thymuline-bursine étant notamment de 1/1 en poids. 11. Produit contenant un mélange de l'un au moins des peptides selon la revendication 7 avec la thymuline, et notamment du mélange thymuline-bursine, à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, le rapport thymuline-bursine étant notamment de 1/1 en poids, et un vaccin, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la vaccination humaine ou animale. 12. Bursine à une concentration inférieure ou égale à 10-8, notamment d'environ 10-10 à environ 10-13, ou à une concentration inférieure ou égale à 1014, et notamment d'environ 10-14 à environ 10- , ou inférieure ou égale à 10 , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, pour le nouvel usage d'immunostimulant ou d'adjuvant de vaccination pour l'homme ou pour l'animal. 13. Mélange bursine-thymuline à une concentration inférieure à environ 10-14, et notamment d'environ 10-15 à environ 10- , ou inférieure ou égale à environ 10- , et notamment d'environ 10- à environ 10-27, et notamment pouvant atteindre environ 10-60, pour le nouvel usage d'immunostimulant ou d'adjuvant de vaccination pour l'homme ou pour l'animal.