Brevet FR2699929A1 — publié le 19940701

La présente invention concerne une méthode de diagnostic rapide de bactéries à Gram négatif présentes dans le sang. En dépit des antibiotiques, les septicémies restent une cause majeure de mortalité Ces dernières années, on a proposé de traiter les septicémies et les chocs septiques à Gram négatif par des anticorps monoclo- naux anti-endotoxine Toutefois, ces traitements coûtent cher et il est donc logique de ne les prescrire qu'aux malades qui sont l'objet d'une septicémie à Gram négatif. Faire la preuve de l'existence de bactéries à Gram négatif dans le sang ne passe que par deux voies possi- bles: doser l'endotoxine ou mettre en évidence les bactéries à Gram négatif. Il s'avère toutefois que les méthodes de diagnostic utilisées pour cette dernière voie donnent des réponses beaucoup trop tardives compte tenu de la nécessité qu'il y a à administrer rapidement les anti- corps anti-endotoxine pour qu'ils soient efficaces. Ainsi, les méthodes classiques mettant en oeuvre des cultures ne permettent pas un diagnostic en moins de 12 heures. On a notamment décrit des méthodes de diagnostic utilisant des opérations de lyse et de centrifugation sur des cultures de prélèvement sanguin (voir par exemple G Dorn et al, J Clinical Microbiolo- gy, 1976, 3: 258-263 et N Henry et al, J Clinical Microbiology, 1983, 17: 864-869) Ces méthodes nécessi- tent une longue période d'incubation ( 18 heures au minimum en général). On a également décrit des méthodes comprenant une détection de la croissance bactérienne par radiomé- trie La détection ne peut toutefois être effectuée que dans un minimum de 12 heures. La présente invention vise à fournir une méthode de diagnostic rapide, c'est-à-dire généralement en 5 à 6 heures, des bactéries aérobies à Gram négatif et présentes dans le sang même à des concentrations très faibles ( 0,05 à 5 UFC/ml). La présente invention a ainsi pour objet une méthode de diagnostic de bactéries aérobies à gram négatif présentes dans le sang comprenant successivement: a) une culture d'un échantillon de sang sous agitation, b) une séparation des hématies par centrifugation lente, c) une lyse des globules blancs, d) une centrifugation rapide pour récupérer les bactéries dans le culot de centrifugation, e) la projection par centrifugation du culot ainsi obtenu sur un support, f) la coloration de Gram du frottis ainsi obtenu. L'étape a) de la méthode selon l'invention est une culture d'un échantillon, par exemple de 8-10 ml, de sang sous agitation forte, de préférence sous agitation très forte Cette étape va à l'encontre de tout ce qui était recommandé jusqu'ici En effet, en général l'agita- tion est inexistante, ou faible et de très courte durée afin de permettre le dépôt des hématies Dans la présente invention, la culture sous agitation est effectuée généralement pendant une durée de 2 à 4 heures, cette durée pouvant être d'autant plus courte que la concentra- tion en bactéries est plus élevée. L'étape b) de la méthode est une séparation des hématies par centrifugation lente Cette centrifugation lente peut être effectuée notamment à 200-300 g pendant une durée de l'ordre de 15 minutes. L'étape c) de la méthode est une lyse des globules blancs Cette lyse peut être effectuée comme décrit par N Henry (cité ci-dessus) en utilisant le produit obtenu dans les tubes Isolator ou tout autre produit permettant la lyse, tel que la saponine (concentration finale: 2 %). L'étape d) de la méthode est une centrifugation rapide pour récupérer les bactéries Cette centrifugation peut être effectuée à 4000-5000 g pendant 10 minutes. L'étape e) de la méthode est une projection par centrifugation du culot précédemment obtenu sur un support Cette étape peut être effectuée notamment en utilisant un appareil appelé Cytospin (voir en particul- ier C Shanholtzer et al, J Clinical Microbiology, 16, 6, 1052, 1982) Cet appareil permet de projeter et concentrer les bactéries contenues dans le culot sur une faible surface d'une lame de verre c'est-à-dire sur un cercle d'environ 4 mm de diamètre permettant ainsi d'effectuer la coloration de Gram de cette projection. La méthode selon l'invention a été mise au point en utilisant 3 souches de bactéries aérobie rencontrées dans les infections nosocomiales: Escherichia coli, Pseudo- monas aeruginosa et Acinetobacter bauman i. Ces bactéries ont été cultivées sur gélose pendant 18 heures en aérobiose Des colonies ont été prélevées et diluées dans 2 ml d'eau distillée stérile et l'on a obtenu des concentrations de bactéries de 5 106 à 5 108 UFC/ml Des échantillons de sang de 10 ml ont été inoculés avec 0,1 ml de dilutions 10-5 et 10-6 pour chaque espèce, la densité des bactéries dans les échantillons étant de 0,05 à 5 UFC/ml. Les échantillons de sang ( 10 ml) ont été transférés dans des erlens contenant 20 ml de bouillon de culture (Hemoline performance Biomérieux S A) avec 0,025 % de polyanetholsulfonate de sodium et mis à incuber sous agitation (Rotatest, Bioblock) pendant 4 heures à 370 C. Ensuite chaque culture a été soumise à une centri- fugation à 250 g pendant 15 minutes à 20 C suivie d'une décantation pendant 30 minutes à température ambiante. Le surnageant a été prélevé et pour effectuer la lyse des globules blancs le composé Isolator (Dupont) ou de la saponine à la concentration finale de 2 % a été ajouté. Le mélange a été agité au Vortex pendant 1 minute puis centrifugé à 4500 g pendant 10 minutes Après élimination du surnageant, le culot a été soumis dans sa totalité à une centrifugation à 192 g pendant 10 minutes dans une cytocentrifugeuse (Cytospin 2, Shandon) pour obtenir sur une lame de verre un frottis de 4 mm de diamètre La coloration de Gram a été effectuée sur cet échantillon et examinée au microscope à immersion. On a pu ainsi détecter la présence d'E coli à la concentration de 0,05 UFC/ml dans un échantillon de sang, de P aeruginosa à la concentration de 0,03 UFC/ml et de A baumanii à la concentration de 1,5 UFC/ml. En outre, en l'absence d'antibiotique dans les échantillons de sang, la méthode conduit à mettre en évidence la morphologie des bactéries permettant ainsi une orientation diagnostique quant au type d'espèce. Ainsi, E coli est reconnaissable sous forme de batonnet épais, P aeruginosa sous forme de batonnet fin et allongé, A baumanii sous forme de coccobacilles Ceci est un avantage supplémentaire de la méthode car cela permet au clinicien de choisir de façon plus précise le traitement antibiotique. Enfin, sur le culot d'hématies séparées au stade b) il est possible d'effectuer un antibiogramme le même jour, d'o un gain de temps appréciable. REVENDICATIONS 1 Méthode de diagnostic rapide de bactéries aérobies à Gram négatif présentes dans le sang, compre- nant successivement: a) une culture d'un échantillon de sang sous agitation, b) une séparation des hématies par centrifugation lente, c) une lyse des globules blancs, d) une centrifugation rapide pour récupérer les bactéries dans le culot de centrifugation, e) la projection par centrifugation du culot ainsi obtenu sur un support, f) la coloration de Gram du frottis ainsi obtenu. 2 Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la culture sous agitation est effectuée pendant de 2 à 4 heures. 3 Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la centrifugation lente est effectuée à 200-300 g- 4 Méthode selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, dans laquelle la centrifugation rapide est effectuée à 4000-5000 g.