Brevet FR2709401A1 — publié le 19950310

PERFECTIONNEMENTS AUX TRAITEMENTS DE SURFACE OU DANS LA MASSE DE DENREES ALIMENTAIRES PAR LE SYSTEME LACTOPEROXYDASE. La présente invention concerne des perfectionnements apportés aux traitements de surface ou dans la masse de denrées alimentaires par le système lactoperoxydase. Les propriétés antimicrobiennes de la lactoperoxydase en présence d'un donneur d'oxygène ont été largement décrites dans la littérature (voir, par exemple, "Activité antibactérienne du système lactoperoxydase sur Listéria Monocytogenes", par F. DENIS et J-P. RAMET, dans Microbiologie-Aliments-Nutrition, 1989, vol.7, p.25-30 voir également FR-A-2 600 250, FR-A-2 646 777 et FR-A-2 648 321). On rappelle que la lactoperoxydase est une enzyme présente dans certaines sécrétions des mammifères, telles que le lait, les larmes, la salive et d'autres fluides biologiques, qui, par elle-même, n'a pas d'activité antimicrobienne. En présence d'un composé donneur d'oxygène, tel que l'eau oxygénée ou un peroxyde, et d'un thiocyanate, la lactoperoxydase conduit toutefois, au terme de réactions chimiques relativement complexes, à une composition présentant de puissantes propriétés antimicrobiennes. Cette composition est généralement désignée dans la technique par l'expression "système lactoperoxydase" ou encore "système LP". Ce système lactoperoxydase est donc un système complexe qui met en jeu trois éléments : l'enzyme lactoperoxydase, le thiocyanate (l'ion SON') et un donneur d'oxygène tel que le peroxyde d'hydrogène, le peroxyde de magnésium et/ou le peroxyde de carbamide. Son activité antimicrobienne est due à des produits intermédiaires issus de l'oxydation du thiocyanate par l'eau oxygénée. Ces produits d'oxydation se fixent sur les groupements SHlibres de nombreuses protéines et, en particulier, sur les enzymes vitales de la paroi cellulaire des microorganismes. I1 s'en suit un effet stabilisant ou létal sur certains types de germes présents. L'application d'une telle composition au traitement d'un produit alimentaire non liquide, par exemple de viandes, de poissons, de légumes et, plus particulièrement, de fromages a déjà été décrite dans la technique, en particulier, dans FR-A-2 648 321, déjà cité. On y expose, en particulier, que, pour assurer la décontamination microbienne d'aliments contenant au moins 20 d'eau, notamment vis-à-vis des bactéries du genre Listeria, on applique sur la surface de ces aliments une préparation dite système LP, comprenant un mélange d'enzyme lactoperoxydase, de thiocyanate et d'un donneur d'oxygène. L'application de ce système peut être effectuée par imprégnation au moyen d'une phase aqueuse contenant le système LP ou à l'aide d'un support cristallin tel que le chlorure de sodium contenant le système LP. L'effet de décontamination de ce système LP vis-à-vis de certaines bactéries des genres Listéria, Yersinia et Campylobacter, est décrit dans cette publication et l'on y souligne que les opérations usuelles de salaison des viandes ou des fromages n'ont pas, elles, d'effet sensible sur ces bactéries, alors qu'elles préservent les produits alimentaires de beaucoup d'autres microbes. A l'encontre de cet enseignement, les travaux effectués par la Demanderesse ont montré que l'utilisation conjointe de sel et d'une composition à base de lactoperoxydase pour le traitement de produits alimentaires, dans un certain domaine de pH, a un effet bien supérieur à celui des systèmes LP de la technique antérieure vis-à-vis des bactéries mentionnées ci-dessus. La Demanderesse a également établi que, dans une telle utilisation, il est possible de substituer, partiellement ou totalement, au thiocyanate du système lactoperoxydase, dont certaines réglementations nationales interdisent ou limitent dans de nombreux pays l'application à des denrées alimentaires, de l'iodure de potassium ou de l'iodure de sodium, dont l'emploi dans les industries alimentaires est beaucoup plus souple que celui du thiocyanate. Un premier but de l'invention est donc de proposer l'utilisation du système lactoperoxydase en présence de chlorure de sodium et dans des conditions particulières de pH, pour le traitement de surface ou à coeur de denrées alimentaires, notamment de fromages. Un autre but de l'invention est de proposer, dans une telle utilisation du système lactoperoxydase, la substitution au moins partielle d'iodure de sodium ou d'iodure de potassium au thiocyanate de ce système, en améliorant de façon sensible les propriétés antimicrobiennes de celui-ci. A cet effet, l'invention a pour objet l'utilisation conjointe, pour le traitement de surface ou dans la masse de denrées alimentaires, de chlorure de sodium et d'une composition dite système lactoperoxydase, comprenant l'enzyme lactoperoxydase, un composé donneur d'oxygène et du thiocyanate, caractérisée en ce que le chlorure de sodium est présent en phase aqueuse à la surface ou dans la denrée alimentaire en une quantité représentant entre 1 et 8% en poids de cette phase aqueuse et en ce que le traitement est effectué à un pH supérieur à 4,5 et, de préférence, compris entre 5,5 et 6,5. De préférence, pour 100 parties en poids de chlorure de sodium, on utilisera entre 0,20 et 11,20 parties en poids du composé donneur d'oxygène, entre 0,01 et 0,85 partie en poids de lactoperoxydase et au plus 4,5 parties en poids de thiocyanate. En étudiant les propriétés antimicrobiennes du système LP, la Demanderesse a, en effet, établi que, dans de telles conditions de concentration en sel et de pH, l'activité antimicrobienne de ce système passe par un maximum. Le chlorure de sodium utilisé dans cette application peut être du sel d'origine marine ou du sel d'origine minérale. Le système lactoperoxydase peut être appliqué sous forme d'une solution saline à la surface de la denrée alimentaire à traiter et, dans ce cas, les conditions de pH et de concentration en sel énoncées ci-dessus peuvent être celles de la phase aqueuse du système LP. Ces conditions de pH et de teneur en sel peuvent être aussi celles d'une phase aqueuse présente dans la denrée alimentaire à traiter, par exemple dans le cas de la fabrication de fromage à partir de lait caillé et, dans ce cas, le système lactoperoxydase peut être appliqué sous forme pulvérulente, incorporé au chlorure de sodium, aussi bien que sous forme liquide (solution saline) ou introduit à coeur. L'invention s applique particulièrement bien au traitement de surface de fromages, et notamment de fromages à pâte molle à croûte lavée après salage et en cours d'égouttage, car les conditions de teneur en chlorure de sodium et de pH préconisées ci-dessus sont précisément celles que l'on rencontre dans la phase aqueuse de ces fromages. Dans les fromages à pâte molle lavée du type du Munster, du Livarot, du Pont l'Evêque, du Vacherin etc.., on lave en effet le fromage qui vient d'être mis en forme à l'aide d'une solution saline dont la concentration en sel correspond à celle proposée ci-dessus, alors que le pH du fromage, lors de l'égouttage de lait caillé, entre également dans la gamme de pH caractéristique de l'invention. I1 suffira, par conséquent, d'incorporer le système lactoperoxydase dans la solution de salage, ou de pulvériser une solution ou suspension du système lactoperoxydase à la surface des fromages préalablement salés ou encore de déposer une poudre du système lactoperoxydase à leur surface, pour obtenir un effet bactéricide optimum et durable de ce système sur la croûte du fromage. Ainsi qu'il a été indiqué ci-dessus, pour cette utilisation du système lactoperoxydase pour le traitement de surface ou dans la masse de denrées alimentaires, il est possible de remplacer partiellement ou en totalité par de l'iodure de potassium ou de l'iodure de sodium le thiocyanate qui est habituellement présent dans le système lactoperoxydase, en améliorant, de façon significative, les propriétés antimicrobiennes de celui-ci, ce qui constitue un avantage important, car l'utilisation d'iodure de potassium et/ou d'iodure de sodium est déjà autorisée dans de nombreux pays européens, dans le domaine alimentaire, notamment dans le sel de cuisine, alors que ce n'est pas le cas pour le thiocyanate. L'iodure de sodium ou l'iodure de potassium pourra être présent à raison de 0,1 à 7 parties en poids pour 100 parties en poids de chlorure de sodium. Les études effectuées par la Demanderesse en vue d'obtenir ces résultats vont maintenant être décrites, en référence aux dessins annexés. Sur ces dessins La figure 1 est un diagramme qui illustre l'activité de la lactoperoxydase exprimée en Unités I/mg, cette unité était définie comme la quantité d'oxygène requise pour donner une augmentation de la densité optique de 0,3 en 1 mn, à 250C, dans un tampon citrate-phosphate O,lM, pH 6,2, en présence d'eau oxygénée 0,0132M, en fonction de la concentration en chlorure de sodium de la solution aqueuse d'iodure de sodium, exprimée en g/l La figure 2 est un diagramme illustrant l'activité de la lactoperoxydase, exprimée en Unités I/mg, en fonction du pH de la denrée alimentaire traitée. La figure 3 est un diagramme regroupant des résultats d'essais qui seront décrits ci-après. On se référera d'abord à la figure 1. Dans l'essai dont les résultats sont rassemblés sur cette figure, on a utilisé non pas un système lactoperoxydase, mais de l'enzyme lactoperoxydase seule. L'enzyme utilisée est commercialisée par la Société BIO SERAE. Cette enzyme a été utilisée conjointement avec des quantités variables de chlorure de sodium sur un substrat conventionnel à l'o-dianinisidine et l'activité de l'enzyme ainsi testée a été relevée. Les résultats obtenus apparaissent dans le Tableau I ci-après. TABLEAU I : Teneur en : : : : : : : : : NaCl(g/l) du : 0 : 10 : 20 : 30 : 40 : 50 : 100: 200: : mélange NaCl : : : : : : : lactoperoxydase: : : : : : : : :Activité de : : : : : : : : :la lactoper- : : : : : : : :oxydase (UI/mg) :112 :150 :156 :162 :165 :163 :155 : 133: :Activité de la : : : : . . . :lactoperoxydase : 68 : 91 : 95 : 98 :100 : 99 : 94 : 81 . { e Ce tableau et la courbe correspondante de la figure 1 font clairement ressortir que l'activité de la lactoperoxydase, passe par un maximum marqué pour une teneur en chlorure de sodium du mélange comprise entre 10 et 150 g/l et, plus précisément, pour une teneur de 40 à 60 g/l. La concentration en sel de la phase aqueuse (sérum) des caillés servant à la préparation de fromage est généralement comprise entre ces valeurs de 40 à 60 g/l et l'application d'un système lactoperoxydase à ces caillés en fin d'égouttage s'effectue donc dans des conditions bactériostatiques et/ou bactéricides optimales de ce système, en particulier vis-à-vis de germes indésirables comme les Listeria. Le lavage des fromages à pâte molle avec une solution aqueuse présentant une telle concentration en chlorure de sodium, préalablement à l'application du système LP sur ces fromages, entratne également une majoration extrêmement favorable à l'action bactériostatique et/en bactéricide de ce système LP. On se référera maintenant à la figure 2, qui illustre l'activité de la lactoperoxydase en fonction du pH. Cette activité, exprimée en unités I/mg, a été déterminée de la même façon que précédemment. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau II ci-après. TABLEAU II : pH : 3,0: 3,5: 4,0: 4,5: 5,0: 5,5: 6,0: 6,5: 7,0: 7,5 8,5 :Activité du: :système LP : - : 0,9: - : 6 : 8 : 275 585 360 100: 12 : 5,5: CUl/mg) : : : : : : : : : : :Activité du: : : : : : : : : : :système LP : : : : 1 : 1,4: 47%:100%: 62% 17% 2% :0,74: (%) : : : : : : : : : : Ce tableau et la courbe correspondante de la figure 2 montrent clairement que, dans ces conditions d'utilisation, l'activité de la lactoperoxydase passe par un pic très accusé entre pH 5 et pH 7,5 et, plus particulièrement entre pH 5,5 et pH 6,5. Ces conditions de pH sont précisément celles que l'on rencontre dans la préparation des fromages, en fin d'égouttage d'un caillé mixte. En effet, le pH est alors voisin de 4,5 et il s'élève dès cet égouttage terminé. Le salage de la pâte intervient aussitôt et le pH de la phase aqueuse s 'accroît tout au long du ressuyage pour atteindre des valeurs de 5, puis 6, et les dépasser ensuite, mais seulement à la fin de l'affinage, pour finalement atteindre une valeur supérieure à 7. L'activité de la lactoperoxydase dans de telles conditions de pH est donc optimum. On va maintenant décrire les essais qui ont été effectués, en vue d'établir qu il est possible de substituer au thiocyanate habituellement utilisé dans le système lactoperoxydase, mais dont l'emploi dans des denrées alimentaires est prohibé ou sévèrement limité dans de nombreux pays, de l'iodure de potassium, dont l'emploi dans des compositions de salage à base de chlorure de sodium est parfaitement admis en France et dans les autres pays. L'action bactériostatique et/ou bactéricide du système LP contenant un iodure, ici de l'iodure de sodium, a été mesurée en fonction du temps (jours) sur la croissance de Listeria monocytogenes, dont l'incubation a été conduite à 150C sur des milieux spécifiques de base trypcase-soja différant par leur teneur en NaCl et/ou en NaI. - milieu A : trypcase-soja seul avec 0% de NaCl, considéré comme témoin. - milieu B : trypcase-soja seul, avec 1% NaCl, - milieu C : trypcase-soja + système LP contenant 0,25 mM NaI et O% NaCl, - milieu D : trypcase-soja + système LP contenant 0,25 mM NaI et 1% NaCl. L'halogènure utilisé pour ces essais était l'iodure de sodium (INa) à une concentration de 0,25 mM. Le système glucose-oxydase était la source d'oxygène. La figure 3 est un diagramme illustrant la population bactérienne mesurée en unités CFU/ml (logarithme du nombre de colonies formant unités par ml de milieu), en fonction du temps exprimé en jours. I1 est remarquable de constater, sur les milieux ne contenant pas le système LP avec NaI, une phase de croissance très rapide de la population bactérienne, qui triple en trois jours, alors que sur les milieux contenant le système LP avec NaI, on constate une phase de décroissance de cette population, qui aboutit au septième jour à la destruction de la bactérie, destruction qui perdure encore le quatorzième jour. On note en outre, dans le milieu salé avec 1% de chlorure de sodium, un effet létal plus rapide que dans le milieu non salé. Des résultats similaires et aussi avantageux sont obtenus lorsque l'on substitue de l'iodure de potassium au thiocyanate du système LP conventionnel. On a insisté ci-dessus sur le traitement de surface de fromages, car cette denrée constitue un témoin de choix pour l'étude des propriétés bactéricides du système LP, mais l'invention n'est pas limitée à cette application, et elle englobe également le traitement de surface ou dans la masse de bien d'autres denrées alimentaires. On mentionnera, en particulier, le traitement de surface de denrées carnées (jambon ou viande séchée) en tranches ou en filets, ou de filets de poisson. On mentionnera également le traitement dans la masse de mélanges particulaires (viandes hachées) ou restructurées et de produits dits de la quatrième gamme ou vendus par des traiteurs (par exemple carottes rapées, salades diverses, céleri rémoulade, taboulé, etc...). REVENDICATIONS 1- Utilisation conjointe, pour le traitement de surface ou dans la masse de denrées alimentaires, de chlorure de sodium et d'une composition dite système lactoperoxydase, comprenant l'enzyme lactoperoxydase, un composé donneur d'oxygène et du thiocyanate, caractérisée en ce que le chlorure de sodium est présent en phase aqueuse à la surface ou dans la denrée alimentaire en une quantité représentant entre 1 et 8 % en poids de cette phase aqueuse et en ce que le traitement est effectué à un pH supérieur à 4,5 et de préférence compris entre 5,5 et 6,5. 2- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que, pour 100 parties en poids de chlorure de sodium, on emploie entre 0,20 et 11,20 parties en poids du composé donneur d'oxygène, entre 0,01 et 0,85 partie en poids de lactoperoxydase et au plus 4,5 parties en poids de thiocyanate. 3- Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'une partie au moins et, de préférence, la totalité du thiocyanate normalement présent dans le système lactoperoxydase est remplacée par de l'iodure de potassium ou de l'iodure de sodium. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'iodure de sodium ou l'iodure de potassium représente entre 0,1 et 7 parties en poids pour 100 parties de chlorure de sodium.