Brevet FR2701489A1 — publié le 19940819

La présente invention concerne un procédé de production de l'acide Lglutamique par fermentation. L'acide L-glutamique est un acide aminé important dans le domaine de l'industrie alimentaire, de l'industrie pharmaceutique, de l'industrie chimique, etc. Dans le passé, l'acide L-glutamique a été produit industriellement par fermentation au moyen de micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou Corvnebacterium. Dans la production d'acide L-glutamique par fermentation selon l'état de la technique, on sait que la biotine est un facteur essentiel pour la croissance des micro-organismes et que la concentration en biotine ou en une substance présentant l'activité de la biotine du milieu de culture a une grande influence sur la production d'acide L-glutamique. De ce fait, on a développé différents procédés de culture de micro-organismes pour maximiser la production d'acide L-glutamique. La culture peut être réalisée, par exemple, dans un milieu contenant des quantités limitées de biotine ou d'une substance présentant l'activité de la biotine qui est nécessaire pour la croissance des micro-organismes.Ou bien encore, lorsque l'on utiIise comme source de carbone un produit tel que la mélasse de canne ou la mélasse de betterave qui est peu coûteux mais qui contient une trop grande quantité de biotine pour permettre une production d'acide L-glutamique avec des rendements élevés, une pénicilline telle que la pénicilline G, F, K, O, V, X, etc., ou un tensioactif constitué par un acide gras supérieur ou un dérivé d'acide gras supérieur tel que le monoplamitate de saccharose, le monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitan, etc., est ajouté au milieu en tant que substance pour supprimer l'activité de la biotine au niveau de la phase de croissance logarithmique précoce des cellules microbiennes. D'autre part, on a publié des articles concernant la présence d'une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase dans une souche productrice d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium et l'obtention à partir de celle-ci de mutants présentant une faible activité de cette enzyme mais qui, soumis à un examen concernant la production d'acide L-glutamique, se sont révélés présenter la même productivité que la souche parentale (Agric. Biol. Chem.. 44, 1897-1904, 1980 ; Agric. Biol. Chem.. 46, 493-500, 1982). La présente invention a pour but de proposer un procédé amélioré pour la production industrielle de l'acide L-glutamique par fermentation qui soit plus économique et plus efficace. Les auteurs de la présente invention ont fait des recherches intensives pour améliorer le procédé conventionnel de production d'acide L-glutamique par fermentation et ont constaté que lorsqu'un mutant d'un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corvnebacterium qui a une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase plus faible que la souche sauvage dont il est dérivé est cultivé dans un milieu nutritif liquide contenant un excès de biotine, l'acide L-glutamique est produit en grande quantité et avec un rendement élevé sans qu'il soit nécessaire d'ajouter au milieu une substance supprimant l'activité de la biotine telle qutune pénicilline, un tensioactif, etc. Ainsi, la présente invention propose un procédé de production d'acide L-glutamique par fermentation, qui est caractérisé par la culture d'un mutant d'un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corvnebacterium qui a une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase plus faible que la souche sauvage dont est dérivé ledit mutant, dans un milieu nutritif liquide contenant de la biotine en une concentration de 10 à 1000Crgll sans addition au milieu d'une substance supprimant l'activité de la biotine, la production et l'accumulation d'acide L-glutamique dans la solution de culture et la récupération de l'acide L-glutamique à partir de ladite solution de culture. Le mutant à utiliser selon la présente invention peut être tout mutant qui est obtenu à partir d'un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corvnebactexium et qui a une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase plus faible que la souche sauvage dont il est dérivé. Le mutant peut présenter simultanément d'autres caractéristiques, telles qu'une résistance à un composé ayant une activité de vitamine P, une résistance à la décoyinine ou à la tubercidine, une activité de superoxyde dismutase accrue, etcc., dont on sait qu'elles sont efficaces pour augmenter la production d'acide L-glutamique (brevets U.S. n 4334020, 4389483 et 4 529 697).Les souches suivantes sont présentées à titre d'exemples de telles souches: Brevibacterium lactofermentum (Çorvnebactenum glutamicum M 12821 (WiERM BP-4172) Brevibacterium flavum (Corvnebacterium glutamicum) M 12822 (FERM BP-4173) Corvnebacterium glutamicum M 12823 (FERM BP-4174). Ces mutants sont obtenus par un traitement de mutation artificielle de souches productrices d'acide L-glutamique appartenant au genre Brevibacterium ou Corvnebacterium. La nature de la souche parentale n'est pas limitée d'une manière particulière à condition qu'elle appartienne au genre Brevibacterium ou Corvnebacterium et qu'elle soit capable de produire de l'acide L-glutamique, et il est possible d'utiliser les souches sauvages énumérées ci-dessous:: Brevibacterium lactofermentum (Corvnebacterium glutamicum) ATCC 13869 Brevibacterium flavum (Corvnebacterium glutamicum) ATCC 14067 Brevibacterium divaricatum (,Corvnebacterium glutamicum) ATCC 14020 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolvticum ATCC 14066 Corvnebacterium glutamicum ATCC 13032 Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebactenum acetoglutamicum ATCC 15806 Corvnebacterium lilium (Corvnebacterium glutamicum) ATCC 15990 Corvnebacterium melassecola ATCC 17965 Le procédé de mutagénèse qui conduit aux mutants ci-dessus peut être tout procédé conventionnel, par exemple une irradiation ultraviolette, une irradiation par les rayons X, une irradiation radioactive, un traitement avec un agent mutagène, etc., un exemple d'un tel procédé étant le traitement avec 250 fzg/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nltrosoguanidine à 30-C pendant 20 min. La culture peut également être réalisée par la technique d'ADN recombiné. Les procédés d'isolement du mutant selon la présente invention à partir des cellules soumises au traitement de mutagénèse ne sont pas particulièrement limités et comprennent par exemple un procédé d'isolement de souches qui ne peuvent pas pousser sur un milieu contenant de l'acide L-glutamique comme seule source de carbone et d'azote mais qui sont capables de pousser sur un milieu dans lequel l'acide L-glutamique a été remplacé par l'acide succinique et l'ammoniaque dans le milieu évoqué ci-dessus (Agic. EQ1 Bial. Chem,. 46, 493-500, 1982). On va décrire ci-dessous un mode de réalisation d'un procédé d'isolement des mutants. Des cellules de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 ont été soumises à un traitement de mutagénèse conventionneI au moyen de la N-méthyl N'-nitro-N-nitrosoguanidine (250uglml, 30*C, 20 min), après quoi la culture a été réalisée sur un milieu gélosé dont la composition est présentée dans le tableau 1, pour former des colonies. Le procédé des répliques a ensuite été utilisé pour isoler les mutants incapables de pousser sur un milieu contenant de l'acide Lglutamique comme seule source de carbone et d'azote.Pour ce faire, on a prélevé les colonies qui étaient incapables de pousser sur un milieu dont la composition est présentée dans le tableau 2 même après avoir été cultivées à 30C pendant 2 j mais qui poussaient dans les mêmes conditions dans le milieu dans lequel le Lglutamate de sodium indiqué dans le tableau 2 a été remplacé par 10 grl d'acide succinique et par 1 ml/l d'ammoniaque. On a obtenu ainsi de nombreux mutants dont l'activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase était plus faible que celle de la souche sauvage parentale Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. On a choisi Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172) comme souche représentative.Par le même procédé, on a obtenu Brevibacterium flavum M 12822 (FERM BP-4173) et Corvnebacterium glutamicum M 12823 (FERM BP-4174) en utilisant les couches sauvages Brevibacterium flavum ATCC 14067 et Corvnebacterium glutamicum ATCC 13032 comme souches parentales, respectivement. Tableau 1 Ingrédients Concentration Polypeptone 10 gel Extrait de levure 10 g/l NaCl 5 g/l Acide acétique 1 g/l' Agar 20 g/l pH 7,0 Tableau 2 Ingrédients Concentration L-glutamate de sodium 10 g/l KH2P04 10 gel MgSO4,7H2O 0,4 g/l FeSO4,7H2O 0,5 g/l MnSO4,4H2O 8,1mw' Chlorhydrate de thiamine 100 g/l Biotine 300 ssg/l Agar 20 g/l pH 7,0 L'activité d'acide a-acétoglutarique déshydrogénase de chacun des trois mutants décrits ci-dessus et de leurs souches parentales a été mesurée de la manière suivante:: 20 ml d'un milieu dont la composition est présentée dans le tableau 3 ont été versés dans un ballon à secousses de 500 ml et soumis à une stérilisation à 115 C pendant 10 min. Le milieu a été ensemencé avec les cellules de la souche testée et les cellules ont été cultivées à 31,5iC pendant 36 h. Les cellules ont été récoltées à partir de la culture résultante par centrifugation et lavées, après quoi elles ont été mises en suspension dans 20 ml d'une solution tampon 0,1 M TES (acide N-tris(hydrnxyméthyi)méthyl-2-aminoéthanesulfonique)-NaOH contenant 30 % de glycérol. Puis, les cellules ont été traitées par sonication et le surnageant obtenu par centrifugation a été soumis à une filtration sur gel au moyen d'une colonne de Sephadexs G-25.Une solution d'enzyme brute a ainsi été préparée. Puis, L'activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase de la solution d'enzyme brute a été déterminée à l'aide de la solution réactionnelle dont la composition est présentée dans le tableau 4. La réaction a été amorcée par addition de 0,1 ml de solution d'enzyme brute à 1,5 ml de solution réactionnelle, et la variation d'absorbance à 365 nm a été enregistrée à température ambiante. Une solution réactionnelle dépourvue d'acide a-cétoglutarique a été utilisée comme témoin. Tableau 3 Ingrédients Concentration Glucose 50 gel (NH4)2SO4 45 g/l KH2P04 1 gel MgS04,7H20 1 gel FeS04,7H20 10 mgXl MnS04,4H20 10 mg/l Hydrolysat acide de protéines de soja 400 mg/l (en teneur totale en azote) Chlorhydrate de thiamine 200 reg/l Biotine 300 g/l CaC03 50 gel pH 7,0 Tableau 4 Ingrédients Concentration TES-NaOH 100 mM Coenzyme A 0,2 mM Pyrophosphate de thiamine 0,3 mM Acide a-cétoglutarique 1 mM L-cystéine 3 mM MnSO4,7H2O 1 mM MgCl2 5 mM 3-acétylpyridine adénine dinucléotide 1 mM pH 7,7 Les résultats sont présentés dans le tableau. Ce tableau montre clairement que les trois mutants obtenus par le procédé décrit ci-dessus présentaient des activités diacide a-cétoglutarique déshydrogénase considérablement plus faibles que les souches sauvages parentales respectives. Tableau 5 Souches testées Activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase (unités/mg de protéine) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 4,5 AJ 12821 0,06 Brevibacterium flavum ATCC 14067 4,8 Au 12822 0,32 Corvnebacterium glutamique ATCC 13032 3,9 Au 12823 0,24 (Une unité est définie comme étant la quantité d'enzyme nécessaire pour consommer 1,umol de 3-acétylpyridine adénine dinucléotide par min dans le mélange réactionnel). Le degré auquel l'activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase du mutant utilisé dans la présente invention est inférieure à celle de la souche sauvage dont il est dérivé n'est pas limité d'une manière particulière mais il est préférable d'utiliser un mutant dont l'activité représente 1/5 à 1/500, et de préférence encore 1/10 à 1/100, de celle de la souche parentale. Pour la production et l'accumulation d'acide L-glutamique à l'aide du mutant obtenu, la culture est réalisée dans un milieu nutritif liquide dans lequel une substance contenant un excès de biotine telle que la mélasse de canne ou la mélasse de betterave est utilisée comme source de carbone, ou dans un milieu liquide dans lequel de la biotine est ajoutée en excès à une source de carbone telle qu'une solution saccharifiée, L'acide acétique, etc.De manière conventionnelle, dans le cas d'une culture dans un milieu liquide contenant un excès de biotine, il était nécessaire d'ajouter une substance pour supprimer l'activité de la biotine, c'est-à-dire une pénicilline telle que la pénicilline G, F, K, O, V, X, etc., ou bien un tensioactif constitué par un acide gras supérieur ou un dérivé d'acide gras supérieur tel que le monopalmitate de saccharose, le monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitan, etc., pour produire de l'acide L-glutamique avec un rendement élevé.Cependant, lorsque l'on utilise un mutant selon la présente invention qui a une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase plus faible que la souche sauvage dont il est dérivé, il est possible d'obtenir la production et l'accumulation d'acide L-glutamique avec un rendement élevé sans ajouter de substance supprimant l'activité de la biotine, et ceci même dans un milieu nutritif liquide qui contient de la biotine à forte concentration de 10 à 1000 ig/l. Le milieu nutritif liquide contient non seulement une source de carbone mais encore des substances nutritives appropriées telles qu'une source d'azote, des ions minéraux, etc. La source d'azote utilisée peut être constituée par un sel d'ammonium, de l'ammoniaque, de l'ammoniac, de l'urée, etc., substances qui sont utilisées normalement pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, et il est possible aussi d'utiliser si nécessaire un ion minéral approprié tel qu'un phosphate, un sel de magnésium, etc. De plus, des substances nutritives à l'état de traces telles que la thiamine peuvent être ajoutées si nécessaire. La culture est fate de préférence dans des conditions aérobies, la température étant maintenue entre 24 et 42'C et le pH entre 5 et 9. Le pH peut être ajusté à l'aide d'une substance acide ou alcaline minérale ou organique, ou à l'aide de l'urée, du carbonate de calcium, de l'ammoniac, etc. Le procédé de récupération de l'acide L-glutamique à partir de la solution de culture peut être une combinaison appropriée de procédés connus tels qu'un traitement par une résine échangeuse d'ions, une cristallisation, etc. Exemples La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs ci-dessous. Exemple 1 On a préparé un milieu de culture d'ensemencement dont la composition est présentée dans le tableau 6 et on a placé des portions de 20 ml de ce milieu dans des flacons à secousses de 500 ml que l'on a soumis ensuite à une stérilisation. On a ensemencé ce milieu avec chacun des trois mutants et chacune de leurs souches parentales, c'est-à-dire les souches sauvages, et on a réalisé la culture à l'aide d'une secoueuse à va-et-vient pendant 15 h en maintenant la température à 31,5 C. Cette culture est appelée dans la suite culture d'ensemencement. Tableau 6 Ingrédients Concentration Glucose 50 gel Urée 4g/l KH2P04 1 g/l MgS04,7H20 0,4 g/l FeS04,7H20 10 mg/l MnS04,4H20 10 mg/l Chlorhydrate de thiamine 200,ug/1 Biotine 30 Fg/l Hydrolysat acide de protéines de soja 0,9 gXl (en teneur totale en azote) pH 7,0 Puis, on a préparé séparément un milieu de culture présentant la composition montrée dans le tableau 7 et on a versé des portions de 20 ml de ce milieu de culture dans des flacons à secousses de 500 ml que l'on a soumis ensuite à une stérilisation à 115C pendant 10 min. La concentration de la biotine dans ce milieu était de 60 ceg/1. Tableau 7 Ingrédients Concentration Mélasse de canne 60 g/l (en glucose) KH2P04 1 g/l MgSO4,7H2O 1w' Chlorhydrate de thiamine 100,ug/l pH 7,0 On a ensemencé le milieu respectif avec la culture d'ensemencement mentionnée ci-dessus dans des proportions d'environ 10 % en volume et on a réalisé la culture à 31,50C à l'aide d'une secoueuse à va-et-vient. Pendant la culture, on a ajouté des petites quantités d'une solution d'urée d'une concentration de 450 mg/ml pour maintenir le pH de la solution de culture entre 6,0 et 8,5. La fermentation était achevée en 36 h et on a mesuré les quantités d'acide L-glutamique accumulées dans les solutions de culture. Comme le montre le tableau 8, l'accumulation d'acide L-glutamique était très faible dans le cas des souches sauvages du fait de la présence d'un excès de biotine dans le milieu, tandis que les mutants présentant une faible activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase produisaient et accumulaient tous de grandes quantités d'acide L-glutamique. Tableau 8 Souches testées Quantités d'acide L-glutamique accu mulées (g/l) Brevibacteiium lactofermentum ATCC 13869 7,5 AJ 12821 34,0 Brevibacterium flavum ATCC 14067 6,1 M12822 32,1 Corvnebacterium glutamicum ATCC 13032 6,8 M au 12823 30,8 Exemple 2 On a préparé un milieu de culture présentant la composition montrée dans le tableau 9 et on a versé des portions de 300 ml de ce milieu de culture dans des fermenteurs constitués par des récipients de 1 l puis on les a soumises à une stérilisation à 120 C pendant 10 min. La concentration en biotine de ce milieu était de 150 g/l. Tableau 9 Ingrédients Concentration Mélasse de canne 150 g/l (en glucose) KH2PO4 1 g/l MgS04,7H20 1 g/l Chlorhydrate de thiamine 100 g/l Agent antimousse 20 l/l pH 7,0 On a ensemencé le milieu avec la culture d'ensemencement de chacune des souches selon l'exemple 1 dans des proportions de 10 % en volume et on a réalisé la culture à 31,50C sous aération et agitation. On a ajusté à 7,8 le pH de la solution de culture avec de l'ammoniac. La fermentation était achevée au bout de 32 h et on a mesuré les quantités d'acide L-glutamique accumulées dans les solutions de culture. Comme le montre le tableau 10, l'accumulation d'acide L-glutamique était très faible dans le cas des souches sauvages par suite de la présence d'un excès de biotine, tandis que les mutants ayant une faible activité d'acide acétoglutarique déshydrogénase produisaient et accumulaient tous de grandes quantités d'acide L-glutamique. Tableau 10 Souche testée Quantités d'acide L-glutamique accu mulées (g/l) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 18,3 Art 12821 78,3 Brevibacterium flavum ATCC 14067 16,2 M12822 77,1 Corvnebacterium Lutamicum ATCC 13032 14,8 AJ 12823 77,2 Exemple 3 On a préparé des milieux de culture présentant la composition montrée dans le tableau II auxquels on a ajouté de la biotine à des concentrations de 3, 10, 50, 300 et 1000 g/l et on a versé des portions de 300 ml de ces milieux de culture dans des fermenteurs constitués par des récipients de 1 l puis on les a soumises à une stérilisation à 1200C pendant 10 min. Tableau 11 Ingrédients Concentration Glucose 100 g/l KH2P04 1 gel MgSO4,7H2O 1 g/l FeSO4,7H2O 10 mg/l MnSO4,4H2O 10 mg/l Hydrolysat acide de protéines de soja 0,4 g/l (en teneur totale en azote) Chlorhydrate de thiamine 100 g/l Agent antimousse 20 l/l pH 7,0 On a introduit la culture d'ensemencement de chacune des souches selon l'exemple 1 dans le milieu respectif dans des proportions de 10 % en volume et on a réalisé la culture à 31,5 C sous aération et agitation. On a ajusté à 7,8 le pH des solutions de culture avec de l'ammoniac. La fermentation était achevée au bout de 30 h et on a mesuré les quantités d'acide L-glutamique produites et accumulées dans les solutions de culture. Comme le montre le tableau 12, dans les milieux de culture producteurs d'acide L-glutamique dans lesquels la concentration en biotine était limitée à 3,cegll, les quantités d'acide L-glutamique accumulées étaient sensiblement les mêmes pour les souches sauvages parentales et pour les mutants. D'autre part, dans les milieux qui contenaient de la biotine à des concentrations de 10 à 1000 Ctg/l, la production d'acide L-glutamique par les souches sauvages a été soumise à une inhibition tandis que les mutants présentant une plus faible activité d'acide a cétoglutarique déshydrogénase produisaient et accumulaient tous de grandes quantités d'acide L-glutamique. Tableau 12 Souches testées Quantités de biotine Quantités d'acide L ajoutées ( g/l) glutamique accumulées (g/l) Brevibacterium lactofermentum 3 49,2 ATCC 13869 10 25,6 50 15,3 300 5,2 1000 3,1 Brevibacterium lactofermentum 3 51,3 AJ 12821 10 51,5 50 52,4 300 53,3 1000 53,6 Brevibactenum flavum 3 46,8 ATCC 14067 10 23,1 50 13,1 300 4,2 1000 3,8 Brevibacterium flavum 3 47,5 AJ12822 10 48,1 50 49,4 300 50,2 1000 50,6 Corynebactenum glutamicum 3 49,8 ATCC 13032 10 25,7 50 12,5 300 5,1 1000 4,6 Corynebacterium glutamicum 3 48,5 AJ 12823 10 48,6 50 49,5 300 50,8 1000 51,0 REVENDICATION Procédé de production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé par la culture d'un mutant d'un micro-organisme producteur d'acide Lglutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui a une activité d'acide a-cétoglutarique déshydrogénase plus faible que la souche sauvage dont ledit mutant est dérivé, dans un milieu nutritif liquide contenant de la biotine en une concentration de 10 à 1000,ug/1 sans addition au milieu d'une substance supprimant l'activité de la biotine, la production et l'accumulation d'acide Lglutamique dans la solution de culture et la récupération de l'acide L-glutamique à partir de ladite solution de culture.