Brevet FR2698271A1 — publié le 19940527

Vaccin contre le virus de la leucémie bovine, nouveau peptide immunogène et kit de vaccination. La présente invention a trait à un vaccin contre la leucémie bovine basé sur l'utilisation de fragments peptidiques de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine. Elle concerne aussi un nouveau fragment de la gp51 utile dans l'invention, ainsi qu'un kit de vaccination. Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un oncovirus structurellement et fonctionnellement apparenté aux virus humains HTLV-1 et HTLV-2 (N.R. RICE et al., 1987, in "Enzootic leukosis and bovine leukemia virus", éditions A. Burny et M. Mammerickx, pages 115 à 144, Nijhoff, Boston) et constitue l'agent étiologique de la leucémie et du lymphome des bovins (A. BURNY et al., 1990, in "Retrovirus biology and human diseases", éditions R. Gallo et F. Wong-Staal, pages 9 à 25, Dekker, New-York). Le complexe d'enveloppe (env) de BLV comprend la glycoprotéine membranaire externe gp51 et la glycoprotéine transmembranaire gp30 et est directement impliqué dans le processus infectieux, par exemple dans la reconnaissance du récepteur et la fusion membranaire (V. VONECHE et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3810-3814). Il a été démontré que trois anticorps monoclonaux diriqés contre les sites antiqéniques conformationnels F, G et H de gp51 inhibent la formation de syncytia et neutralisent les pseudotypes VSV (virus de la stomatite vésiculaire) - BLV (C. Bruck et al., 1982, Virology 122, 342-352). L'obtention d'un vaccin efficace sur la base de ces trois épitopes nécessite leur présentation en configuration native. Cela a été récemment réalisé lors de la vaccination de moutons avec un recombinant vaccine incorporant le gène env de BLV (D. PORTETELLE et al., 1991, Vaccine 9, 194-200). Tous les animaux ayant réagi de façon significative à la préparation vaccinale (estimation sur la base du titre en anticorps neutralisants induits) se sont effectivement avérés protégés contre une épreuve virulente (1 500 fois la dose infectieuse chez le mouton). D'une manière générale, un vaccin performant doit inclure des épitopes protecteurs et éviter les parties génomiques nuisibles. Comme il a été récemment rapporté à propos du virus de l'immunodéficience humaine HIV-1 (J.A. BERZOFSKY et al., 1991, FASEB J. 5, 2412-2418), des épitopes indésirables peuvent induire des anticorps facilitants, qui peuvent faciliter ainsi l'introduction du virus dans la cellule par l'intermédiaire des récepteurs Fc ou des récepteurs du complément (A. TAKEDA et al., 1988, Science 242, 4710-4714 et W.E. ROBINSON et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3185-3189). Il a également été décrit des anticorps réagissant de façon croisée avec des antigènes du soi (H. GOLDING et al., 1989, J. Clin. Invest. 83, 1430-1435) ou empêchant la reconnaissance de déterminants "protecteurs" adjacents. On peut également s'attendre à des conséquences néfastes de la stimulation de cellules T suppressives ou, comme ceci est le cas pour des peptides de protéines transmembranaires de rétrovirus, de l'inhibition de plusieurs fonctions immunitaires, telles que la prolifération lymphocytaire (G.J. CIANCOLO et al., 1985, Science 230, 453-455 et C.L. RUEGG et al., 1989, J. Virol. 63, 3250-3256). L'obtention de candidats immunogènes passe donc par le choix de déterminants intéressants et par leur délimitation excluant toute partie indésirable. La demande de brevet européen EP-A-0 284 492 (voir aussi D. PORTETELLE et al., 1989, Virology 169, 34-41) divulgue un certain nombre de peptides et propose d'utiliser à titre de vaccin ceux correspondant aux résidus 39 à 48, 78 à 92 et 144 à 157 de la glycoprotéine gp51. I. CALLEBAUT et al. r 1991 (FEBS Letters, Volume 392, n" 1, 2, pages 148 à 150) ont réalisé une étude antigénique de la glycoprotéine gp51 à l'aide de 27 peptides synthétiques correspondant à des fragments de la glycoprotéine gp51 parmi lesquels on trouve les fragments 64-73 et 98-117. Voir aussi dans ce sens I. CALLEBAUT et al., 1991, Virology 185, pages 48 à 55. Aucun candidat immunogène n'est proposé dans ces articles. La présente invention a pour objectif de proposer un vaccin à base de peptides qui correspondent à des fragments de la glycoprotéine gp51 et qui sont exempts de parties indésirables, notamment facilitantes. L'invention a ainsi pour objet un vaccin contre le virus de la leucémie bovine comportant à titre de principe actif un peptide comprenant essentiellement une séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe constitué des séquences qui correspondent aux résidus 64 à 73, 98 à 117 et 177 à 192 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine, dans un véhicule ou excipient pour vaccin, notamment du type de ceux habituellement utilisés pour la réalisation de vaccins. N. SAGATA et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 677-681) ont déterminé la séquence du variant x-BLV-1. Les fragments définis par les résidus 64 à 73, 98 à 117 et 177 à 192 ont les séquences suivantes (la numérotation est réalisée sans tenir compte du peptide signal) 64 à 73 Arg - Arg - Arg - Phe - Gly - Ala - Arg - Ala - Met - Val 98 à 117 Ser - Gln - Ala - Asp - Gln - Gly - Ser - Phe - Tyr - Val Asn - His - Gln - Ile - Leu - Phe - Leu - His - Leu - Lys 177 à 192 Pro - Asp - Cys - Ala - Ile - Cys - Trp - Glu - Pro - Ser Pro - Pro - Trp - Ala - Pro - Glu. Le vaccin selon l'invention contient donc avantageusement un peptide comprenant essentiellement l'une de ces séquences. L'invention inclut bien entendu les séquences d'autres variants qui pourraient différer sans que soient modifiées les propriétés immunogènes des peptides ainsi que les séquences modifiées par adjonction, suppression ou substitution d'acides aminés et conservant aussi les propriétés propres aux séquences 64-73, 98-117 et 177-192. A titre d'exemples, entrent dans le cadre de l'invention les séquences suivantes - séquences 62-73 ou 63-73 résidu 63 : Gly résidu 62 : Gln (ou Lys dans le cas du variant VdM 7628) - séquence 177-192 allongée de 1 à 8 acides aminés du côté N-terminal ; par exemple séquence 169-192 - séquences 62-73, 63-73 ou 64-73 auxquelles on retirerait un ou plusieurs acides aminés du côté C-terminal - séquence 98-117 dans laquelle le résidu 111 (Ile pour les variants T15-2, LB 285, VdM7628, FLK, lBLV-1 et pBLB-A1) est Thr (variant LB59). Le vaccin selon l'invention peut donc comporter un peptide comprenant la séquence 62-73 ou 63-73 de la glycoprotéine gp51 ou encore la majeure partie de la séquence 169-192 de la gp51, de préférence alors avec la partie 177-192 conservée, allongée d'environ 1 à 8 acides aminés N-terminaux. Bien entendu, le vaccin selon l'invention peut comprendre deux ou trois peptides correspondant aux différentes séquences du groupe, y compris variantes de peptides dans le sens de l'invention. Les peptides selon l'invention peuvent être avantageusement obtenus par synthèse chimique. Selon l'invention, la révélation du pouvoir protecteur du peptide peut être obtenue par différents moyens. Le peptide peut être couplé à une molécule porteuse immunogène usuelle, qui peut être notamment une protéine porteuse1 telle que, en particulier, l'hémocyanine de patelle (Keyhole Limpet Hemocyanin ou KLH). Le couplage du peptide à la protéine porteuse s'effectue de préférence en présence d'un agent couplant tel que notamment le glutaraldéhyde ou l'ester maléimidocaproïque N-succinimide. Dans le cas où le vaccin comprend deux ou trois peptides correspondant aux différentes séquences et/ou variantes de séquences du groupe, ceux-ci se présentent sous la forme d'un conjugué incluant une molécule porteuse immunogène. On comprend que, dans ce cas, chaque peptide peut être conjugué à une molécule porteuse propre ou bien sous la forme d'une entité unique comportant les peptides et le conjugué. L'invention a donc pour objet les vaccins dans lesquels le peptide selon l'invention est ainsi conjugué. En outre, pour faciliter le couplage, un résidu cystéine (Cys) peut être ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide, notamment dans le cas du peptide 64-73, pour faciliter le couplage à la molécule porteuse immunogène. En variante, on peut brancher une pluralité de molécules du peptide "en candélabre" sur une matrice polylysine, par exemple par le procédé décrit par TAM J.P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409-5413, POSNETT D.N. et al, (1988) J. Biol. Chem. 263, 1719-1725. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vaccin peut comprendre un virus vivant recombiné pour exprimer un ou des peptide. Le virus peut être avantageusement un Poxvirus, notamment le virus de la vaccine. Ce type de vaccin peut également être réalisé avec un tel virus vivant recombiné qui est incapable de se répliquer chez le bovin. On peut ainsi avantageusement utiliser un Avipox, notamment fowlpox ou canarypox (D. BAXBY et E. PAOLETTI, Vaccine, volume 10, 1, pages 8 et 9, 1992). De nombreux autres virus sont envisageables, par exemple les adénovirus. Le vaccin selon l'invention peut aussi inclure plusieurs virus recombinés pour exprimer des peptides différents. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vaccin peut comprendre des pseudo-particules virales chimères formées d'une particule virale dépourvue de son matériel génétique et portant le ou des peptides à sa surface. De préférence alors, la pseudo-particule virale peut être avantageusement issue du virus de la langue bleue (P. ROY et al., 1992, Vaccine, volume 10, 1, pages 28 à 32). Le vaccin peut aussi comprendre des combinaisons de pseudo-particules virales portant des peptides différents. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le vaccin peut comprendre des cellules de mammifère vivantes productrices d'un ou de peptides, ou des combinaisons de telles cellules, notamment selon la technique décrite par C. ALTANER et al., dans Vaccine1 volume 9, décembre 1991, pages 889 à 895. Le vaccin peut également comprendre, dans un autre mode de réalisation, une préparation d'ISCOM incorporant un ou des peptides, notamment selon la technique décrite par M.S. MERZA et al., 1989, Vaccine, 7, page 22. Des combinaisons avec des peptides différents sont aussi possibles. Le vaccin selon l'invention peut avantageusement constituer un vaccin de rappel. Dans ces conditions, l'invention a également pour objet un kit de vaccination contre le virus de la leucémie bovine comprenant un vaccin de première administration et un vaccin selon l'invention constituant un vaccin de rappel. De préférence alors, comme vaccin de première administration, le kit peut comprendre avantageusement un virus vivant recombiné pour exprimer à la fois la glycoprotéine gp51 et la glycoprotéine gp30 du virus de la leucémie bovine, comme cela est décrit dans la demande de brevet européen EP-A-0 431 156. Le peptide correspondant au résidu 177-192 de la glycoprotéine gp51 est nouveau. L'invention a donc également pour objet un peptide comprenant essentiellement la séquence d'acides aminés correspondant aux residus 177 à 192 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine, pour la réalisation d'un vaccin ou d'un kit de vaccination selon l'invention. De préférence, le peptide comprend essentiellement la séquence Pro - Asp - Cys - Ala - Ile Cys - Trp - Glu - Pro - Ser - Pro - Pro - Trp - Ala - Pro Glu. La séquence peut être allongée du côté N-terminal, notamment de 1 à 8 acides aminés environ, et le peptide selon l'invention peut donc également comprendre la majeure partie de la séquence 169-192 de la gp51, la partie 177-192 étant de préférence conservée. L'invention a encore pour objet le peptide synthétique constitué de la séquence décrite ci-dessus. DESCRIPTION DETAILLEE PREPARATION DES PEPTIDES SYNTHETIQUES Les peptides sont synthétisés classiquement en phase solide selon la technique décrite par Merrifield, R.B. (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85, 2149-2154). Support solide : résine p-méthylbenzhydrylamine (résine de polystyrène réticulée par 1 % de divinylbenzène). La synthèse est effectuée en "flux continu" (méthode décrite par V. Krchnak et J. Vagner, Pept. Res. (1990) 3, 182-193) en utilisant une stratégie de protection Fmoc (amine a)/t-Bu (chaînes latérales). L'efficacité du couplage est contrôlée par réaction au bleu de bromophénol (V. Krchnak et al., Collet Czech. Chem. Commun. (1988) 53, 2542-2548). Après clivage des groupes protecteurs des chaînes latérales (par traitement à l'acide trifluoracétique) et libération de la résine (par traitement à l'acide fluorhydrique), les peptides sont purifiés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC). Leur composition en acides aminés peut être vérifiée par analyse des acides aminés après hydrolyse acide totale. On a ainsi synthétisé trois peptides ayant les séquences 64-73, 98-117 et 177-192 détaillées ci-dessus. Le peptide de séquence 64-73 comporte en plus un résidu cystéine (Cys) à son extrémité N-terminale. RESULTATS Les résultats se divisent en deux parties reprenant deux voies par lesquelles les peptides peuvent jouer un rôle dans l'acquisition d'une immunité à l'encontre du virus. 1. REPONSE B NEUTRALISANTE (ANTICORPS) 1.1 Préparation des anticorps antipeptides Trois anticorps antipeptides ont été préparés. Les trois peptides ont été couplés à une protéine porteuse, la KLH (pour Keyhole Limpet Hemocyanin ou Hémocyanine de patelle). Les agents couplants sont le glutaraldéhyde pour le peptide 98-117 (1 conjugué), le glutaraldéhyde ou l'ester maléimidocaproïque N-succinimide pour le peptide 177-192 (2 conjugués) et ce même ester pour le peptide 64-73 (1 conjugué). Couplage au glutaraldéhyde : A 5 mg de KLH dans 1 ml de tampon phosphate 0,1 M (0,9 % NaCl, pH 8), on ajoute simultanément 40 iil de glutaraldéhyde à 25 % et 1 mg de peptide. Après 5 heures sous agitation, la solution de conjugué est répartie en aliquotes (aliquotes contenant 1 mg de KLH par ml) et les aliquotes sont conservés à -20 C. Couplage a' l'ester maléimidoeaproïque Nsuccinimide : A 5 mg de KLH dans 1 ml de tampon phosphate 0,1 M (0,1 M NaCl, pH 7), on ajoute 128 ug d'ester maléimidocaproique N-succinimide dissous dans du diméthylformamide. On laisse incuber 1 h à 30"C. Après dialyse sur membrane Millipore (0,025 um) contre le tampon phosphate, on ajoute à la solution activée 2,5 mg de peptide. Après une nuit sous agitation, la solution de conjugué est répartie en aliquotes (aliquotes contenant 1 mg de KLH par ml) et les aliquotes sont conservés à -20 C. Des lapins se sont vus injecter par voie intradermique et à 15 jours d'intervalle chaque fois un aliquote de conjugué (cf. ci-dessus) émulsifié dans de l'adjuvant de Freund complet (2 premières injections) ou incomplet (troisième injection). Du sang a été recueilli avant chaque injection et 8 à 12 jours après la dernière injection. Les échantillons de sérums extraits de ces échantillons de sang ont été stockés à -20 C. C'est sur les derniers échantillons (saignées 8 à 12 jours après la dernière injection), caractérisés par les plus hauts titres en anticorps antipeptides (cf. plus loin), qu'ont été effectués les tests biologiques (pouvoir neutralisant, reconnaissance de la gp51). Tableau 1 Peptides et anticorps antipeptides (GA = glutaraldéhyde, MCS = ester maléimidocaproïque N-succinimide) Peptide Couplage n" lapin 98-117 GA 90 117-192 GA 64 177-192 MCS 66 64-73 MCS 16 1.2. Détermination du titre de l'antisérum Ce titre est déterminé par test ELISA dans lequel le peptide est adsorbé sur la plaque (100 ng par puits). Des dilutions d'antisérum sont ensuite réalisées Le titre d'un antisérum est défini comme étant l'inverse de la dilution pour laquelle la densité optique observée pour la réaction du sérum avec le peptide est encore égale à au moins deux fois la densité optique observée pour la réaction du peptide avec le sérum témoin (sérum avant injection du peptide). Tableau 2 Peptides et anticorps antipeptides : titre ante sérum Peptide n" lapin titre 98-117 90 44 000 177-192 64 1 100 000 177-192 66 3 300 000 64-93 16 180 1.3. Reconnaissance de la gp51 par l'antisérum La capacité que possèdent les anticorps antipeptides à reconnaître la protéine dont sont issues leurs séquences a été déterminée par tests ELISA (reconnaissance du virion BLV dénaturé à l'octylglucoside FELISA BLVJ / reconnaissance de la gp51 présentée par l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E (ELISA E-gpJ) ou par Western Blot FWB]. Les résultats montrent que les différents sérums reconnaissent la gp51, de manière prononcée pour les sérums n" 16, 64 et 66 et faible pour le sérum n" 90. Tableau 3 Peptides et anticorps antipeptides : reconnaissance de la gp51 Peptide nt lapin ELISA BLV ELISA E-gp WB 98-117 90 - ++ 177-192 64 +++ +++ +++ +++ 177-192 66 64-73 16 + +++ 1.4. Pouvoir neutralisant de l'antisérum Définir le pouvoir "neutralisant" d'un antisérum revient à estimer la capacité des anticorps antipeptides à inhiber l'entrée du virus dans une cellule. Cette estimation fait appel aux deux tests décrits ci-dessous. 1" Inhibition de a formation de syncytia Le test en fusion précoce (Early Polykaryocytosis), dénommé également SIA (Syncytia Infectivity Assay), consiste à mettre en coculture des cellules de rein de bovin infectées par le BLV (FLK pour Foetal Lamb Kidney) et des cellules indicatrices de la fusion cellulaire (CC81, cellules de chat transformées par le MSV). De nombreux syncytia apparaissent alors dans les 24 heures dans ces cultures. Afin de diminuer le nombre de syncytia, qui ne peut être déterminé dans ce cas avec précision, des cellules de "remplissage" (OVK) sont ajoutées en meme temps que les FLK et les CC81. Le test d'inhibition a été légèrement modifié par rapport à celui décrit par C. BRUCK et al., 1982 (Virology 122, 342-352). Des cellules productrices de virus BLV (10 000 cellules FLK, Van der Maaten et Miller, 1976, Bibl. Haematol. 43, 360-362) et des cellules non infectées (100 000 cellules OVK) dans 100 p1 de milieu MEM complet (MEM Gibco comprenant des acides aminés non essentiels et de la glutamine, de la kanamycine et 10 % de sérum de veau foetal inactivé) sont ajoutées à des dilutions (de trois en trois à partir de 1/12) d'antisérum (50 ul) préparées dans des microplaques à 96 puits (fonds plats) pour culture cellulaire (Nunc). Les microplaques sont ensuite mises à l'incubation 4 h à 37"C dans une atmosphère à 5 % de CO2. On ajoute ensuite dans chaque puits des cellules de chat CC81 transformées (400 000 cellules) (P.J. Fischinger et al., 1974, J. Virol. 14, 177-179) et on laisse incuber une nuit. On fixe ensuite les cellules avec une solution de méthanol/acide acétique (3 vol./1 vol.), on les lave, puis on les colore, par exemple, au colorant de Giemsa. Les cellules contenant plus de 5 noyaux sont considérées comme syncytia. La formation de syncytia peut être inhibée en présence des différents anticorps antipeptides de l'invention (sérums n" 16, n" 90, n" 64, n" 66). On définit le titre d'inhibition comme étant l'inverse de la dilution de sérum donnant encore 50 % d'inhibition. Tableau 4 Peptides et anticorps antipeptides : titre en inhibition de syncytia (les titres des sérums témoins négatifs sont inférieurs à 12). Peptide n" lapin titre 98-117 90 108 177-192 64 36 177-192 66 36 64-73 16 36 2" Neutralisation de pseudotypes VSV-BLV Des particules de pseudotypes du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) portant à leur surface les protéines d'enveloppe du BLV sont lytiques pour des cellules VERO (cellules indicatrices). On procède comme décrit par J. ZAVADA et al., 1978, (Acta Virol. 22, 91-96). Le pouvoir neutralisant des anticorps est apprécié par l'inhibition de la lyse de ces cellules. Les comptages de plaques de lyse ont été réalisés à une dilution de sérum de 1/30. Seul le sérum n" 64 produit encore 50 % d'inhibition à cette dilution. Les sérums n" 16, n" 90 et n" 66 ne témoignent pas de propriétés manifestes de neutralisation des pseudotypes. 1.5 Conclusion Les antisérums dirigés contre les peptides, reconnaissant tous la gp51, possèdent tous des propriétés inhibitrices de la formation de syncytia. Seul le sérum dirigé contre le peptide 177-192 (lorsque celui-ci est couplé à la KLH au moyen du glutaraldéhyde) neutralise également des pseudotypes VSV-BLV. 2. REPONSE AUXILIAIRE La réponse T auxiliaire se manifeste in vitro par une prolifération des cellules à la suite de la reconnaissance spécifique d'un antigène (ici les peptides). Dans ce cadre, il a été mis au point un système apte à juger de la prolifération in vitro de cellules de bovins infectés mises en présence de différents peptides issus de la séquence de la gp51. Celui-ci implique l'utilisation de sérum autologue (sérum inactivé à la chaleur de l'animal dont on teste les cellules) et l'élimination des cellules B (celles-ci expriment le virus in vitro). Parallèlement, il a été étudié la prolifération, induite par les peptides, de cellules de souris de différents haplotypes qui ont été immunisées avec de la gaps 1. Les résultats concernant les peptides 64-73, 98-117 et 177-192 sont repris dans le tableau ci-dessous en termes d'index de stimulation : rapport des cpm* de la culture avec peptide et de la culture sans peptide (* : les cpm sont directement proportionnels à l'état prolifératif de la culture et donc les index sont fonction du taux de prolifération). Des index supérieurs à 2 sont considérés comme significatifs. Tableau 5 Index de stimulation Peptide Bovin infecté Souris immunisée 68 71 73 79 80 BALB/c C57/BL C3H 98-117 2,5 2,1 - 2,6 - 3,1 - 177-192 - - - - 7,6 64-73 - - 3,8 - - - - N.B. : ces index de stimulation sont les plus hauts que l'on ait observés (tests effectués plusieurs fois). I1 ressort de ces expériences que le peptide 98-117 possède un caractère épi topique vis-à-vis de différentes vaches infectées** et d'un haplotype de souris, tandis que le peptide 177-192 induit de très hauts index de stimulation d'un bovin infecté. Aucun des peptides n'induit d'index de stimulation > 2 avec des cellules de bovins sains ou de souris non immmunes. (** La détermination des haplotypes des différentes vaches ne peut encore être réalisée faute d'outils). TESTS CONCERNANT LE POUVOIR PROTECTEUR DU PEPTIDE 98-117 IN VIVO Le peptide 98-117, seul ou en combinaison avec un virus vaccine recombinant (VP459 portant et exprimant gp51 et gp30 conformément à la demande de brevet européen EP-A-0 431 156), a été injecté à des moutons. Les cellules du mouton n" 175, ayant reçu trois injections du peptide 98-117 (couplé à une protéine porteuse), ont été testées quant à la réponse proliférative induite in vitro en présence du même peptide (cf. figure unique). I1 s'avère que les cellules répondent de manière prononcée à la présence du peptide dans la culture. Le peptide 98-117 apparaît donc inducteur d'une réponse auxiliaire in vivo. Par contre, après surinfection avec des cellules de bovin infecté, on observe une apparition d'anticorps anti-p24, ce qui est un signe d'infection. Un pouvoir protecteur (pas d'apparition d'anticorps anti-p24 après épreuve) est cependant observé pour un mouton (n" 11) auquel on a injecté le peptide et VP459. REMARQUES 1" Le peptide 177-192 a été synthétisé et testé en réponse auxiliaire à la suite de l'observation de très hauts index de stimulation (jusqu'à 12) obtenus avec les cellules du bovin 80 en présence d'un peptide recoupant le peptide 177-192 et comprenant les résidus 169-188 (séquence Leu Asn Gln Thr Ala Arg Ala Phe Pro Asp Cys Ala Ile Cys Trp Glu Ser Pro Pro). Comme les cellules du bovin 80 ne répondent pas face à un autre peptide (résidus 168-180) couvrant la partie N-terminale du peptide 169-188, le site épitopique doit être situé dans la partie C-terminale du peptide 169-188. I1 a donc été synthétisé des peptides reprenant cette partie C-terminale (en l'allongeant toutefois de quelques résidus). Ce sont les peptides 177-192, 179-192 et 181-192. Au vu des résultats repris dans le tableau 6, il ressort que seul le plus long de ces peptides induit une réponse proliférative des cellules du bovin 80. On peut donc conclure que les résidus P (177) et/ou D (178) sont essentiels à l'obtention d'une réponse proliférative, si toutefois les épitopes compris dans les peptides 169-188 et 177-192 sont identiques. Il ressort également du tableau 6 que les peptides 177-192, 179-192 et 181-192 sont à l'origine d'anticorps neutralisants contrairement au peptide 169-188, ce qui montre la nécessité d'un ou de plusieurs des quatre résidus WAPE pour l'obtention d'une réponse B efficace. Tableau 6 : Peptides situés dans la région 168-192 propriétés immunologiques 168-180 169-188 177-192 179-192 181-192 Réponse B (neutralisants) - - + + + Réponse T auxiliaire (bovin 80) - + + - Le peptide 177-192 présente donc un double caractère neutralisant. On peut dire que sa partie Cterminale est essentielle pour l'obtention de la réponse B neutralisante tandis que sa partie N-terminale est essentielle pour la réponse T auxiliaire. Une extension de ce peptide dans sa partie N-terminale peut cependant être réalisée puisque les index de stimulation obtenus avec le peptide 169-188 sont plus hauts que ceux obtenus avec le peptide 177-192 (12 contre 7,6). 2" Les peptides selon l'invention sont situés dans des régions très constantes de la gp51, ce qui constitue un atout considérable pour la conception d'un vaccin. En effet, le peptide 177-192 est complètement invariant sur tous les variants répertoriés jusqu'à présent (Daniel Portetelle, Thèse d'agrégation de l'enseignement supérieur, Gembloux, 1989). Il en est de même pour le peptide 169-188. Pour le peptide 98-117, seul le résidu 111 (Ile pour les variants T15-2, LB285, VdM7628, FLK, lBLV-1, pBLB-A1) est substitué par Thr dans la séquence du variant LB59. 3 Les peptides 64-73, 98-117 et 177-192 sont capables d'induire une réponse B neutralisante et une réponse T auxiliaire. Si dans les conditions expérimentales (notamment concentration, vecteur d'immunogénicité, adjuvant), le peptide 98-117 s'avère être un bon vaccin de rappel après une première administration du vaccin VP459, les peptides selon l'invention présentent les propriétés requises pour constituer le principe actif d'un vaccin. REVENDICATIONS 1. Vaccin contre le virus de la leucémie bovine, comportant à titre de principe actif. un peptide comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe des séquences qui correspondent aux résidus 64 à 73, 98 à 117 et 177 à 192 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine, dans un véhicule ou excipient pour vaccin. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide comprend essentiellement l'une des séquences suivantes 1) Arg - Arg - Arg - Phe - Gly - Ala - Arg - Ala - Met - Val 2) Ser - Gln - Ala - Asp - Gln - Gly - Ser - Phe - Tyr Val - Asn - His - Gln - Ile - Leu - Phe - Leu - His Leu - Lys 3) Pro - Asp - Cys - Ala - Ile - Cys - Trp - Glu - Pro Ser - Pro - Pro - Trp - Ala - Pro - Glu. 3. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide comprend la séquence 62 à 73 ou 63 à 73 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine. 4. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide comprend la majeure partie de la séquence 169-192 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine. 5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend deux ou trois peptides correspondant aux différentes séquences du groupe. 6. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le peptide est couplé à une molécule porteuse immunogène. 8. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce que les peptides du vaccin se présentent sous la forme d'un conjugué incluant une molécule porteuse immunogène. 9. Vaccin selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la molécule porteuse immunogène est une protéine porteuse, telle que notamment l'hémocyanine de patelle. 10. Vaccin selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine porteuse est couplée au peptide en présence de glutaraldéhyde ou d'ester maléimidocaproïque N-succinimide. 11. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend un virus vivant recombiné pour exprimer le peptide. 12. Vaccin selon la revendication 11, caractérisé en ce que le virus est un Poxvirus, notamment la vaccine. 13. Vaccin selon la revendication 11, caractérisé en ce que le virus est incapable de se répliquer chez le bovin. 14. Vaccin selon la revendication 13, caractérisé en ce que le virus est un Avipox, notamment fowlpox ou canarypox. 15. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu il comprend des pseudo-particules virales chimères formées d'une particule virale dépourvue de son matériel génétique et portant le peptide à sa surface. 16. Vaccin selon la revendication 15, caractérisé en ce que la pseudo-particule virale est issue du virus de la langue bleue. 17. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de mammifère vivantes productrices du peptide. 18. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une préparation d'ISCOM incorporant le peptide. 19. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il constitue un vaccin de rappel. 20. Kit de vaccination contre le virus de la leucémie bovine comprenant un vaccin de première administration et un vaccin de rappel selon la revendication 19. 21. Kit de vaccination selon la revendication 20, caractérisé en ce que, comme vaccin de première administration, le kit comprend un virus vivant recombiné pour exprimer à la fois la gp51 et la gp30 du virus de la leucémie bovine. 22. Peptide comprenant essentiellement la séquence d'acides aminés correspondant aux résidus 177 à 192 de la glycoprotéine gp51 du virus de la leucémie bovine, pour la réalisation d'un vaccin ou d'un kit de vaccination selon l'une quelconque des revendications 1 à 21. 23. Peptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la séquence suivante Pro - Asp - Cys - Ala - Ile - Cys - Trp - Glu - Pro - Ser Pro - Pro - Trp - Ala - Pro - Glu. 24. Peptide selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'il comprend la majeure partie de la séquence 169-192 de la glycoprotéine gp51, la partie 177-192 étant conservée. 25. Peptide synthétique constitué de la séquence Pro - Asp - Cys - Ala - Ile - Cys - Trp - Glu - Pro - Ser Pro - Pro - Trp - Ala - Pro - Glu et destiné à la réalisation d'un vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.