Brevet FR2698367A1 — publié le 19940527

La présente demande a pour objet des fragments de la protéine p53 Elle est d'autre part relative à leurs utilisations dans la détection et le suivi d'états pathologiques et en particulier d'états cancéreux et pré-cancéreux. Les mutations du gène p53 sont les altérations géniques les plus souvent rencontrées dans les cancers humains. La fréquence des mutations du gène p53 est élevée pour le cancer du colon (1), du sein(2) et du poumon (3) de même que dans les leucémies (4), les ostéosarcomes (5), les cancers de l'ovaire (6), de l'estomac (7), et du cerveau(8). Des mutations héréditaires ont été récemment mises en évidence comme support du syndrome du cancer familial de Li-Fraumeni (9,10). Rapportées aux 10 cancers les plus fréquents dans le monde, les altérations du gène p53 sont retrouvées chez 40 à 45% des cancéreux. Les altérations les plus fréquentes sont des mutations ponctuelles situées dans 4 des 5 régions HCD de la protéine p53( 11,12). Il y a dix ans, Benchimol et al. ont montré par une technique radio-immunologique que la protéine p53 est spécifiquement surexprimée dans les cellules transformées et indécelable dans les cellules normales (13). De nombreuses études ont confirmé depuis ces résultats et montré que l'accumulation de la protéine p53 est due à sa stabilisation. On sait maintenant que cette stabilisation est due dans presque tous les cas à une mutation ponctuelle qui modifie la conformation et la stabilité de la protéine. Ces observations encouragent l'étude systématique par immunohistologie de l'expression de la protéine p53 sur une large gamme de tumeurs car il semble y avoir une bonne corrélation entre la mutation du gène p53 et l'accumulation de la protéine (14, 15). En 1984, Crawford et al. ont détecté des anticorps anti-p53 chez des patients présentant un cancer du sein (16). Caron de Fromentel et al. ont ensuite montré que de tels anticorps étaient présents dans le sérum d'enfants présentant des cancers très divers (17). La fréquence moyenne est de 12% avec une fréquence particulière de 20% dans le lymphome de Burkitt (17). Plus récemment, Davidoff et al.(18) ont montré que la présence d'anticorps anti-p53 est associée avec des mutations spécifiques des exons 5 et 6 du gène. Ces protéines mutées sont connues pour s'associer à la protéine hsp70 et sont encore plus oncogéniques in vitro et in vivo. Le demandeur a montré qu'il existe une corrélation entre le stade clinique du cancer du sein et la présence d'anticorps anti-p53 dans le sérum. Il a d'autre part montré de manière surprenante que seules certaines parties de la protéine p53 sont impliquées dans la réaction entre les anticorps de patients atteints par un cancer et cette protéine La présente invention a pour objet des peptides présentant une réaction spécifique vis-à-vis d'anticorps antip53 présents dans les fluides biologiques de patients précancéreux ou atteints d'un cancer ,préférentiellement d'un cancer du sein , du poumon , du foie , de la prostate, de l'ovaire ou de leucémie Avantageusement , un tel peptide est compris dans la séquence des acides aminés 1 à 112 de la protéine p53. La séquence de la protéine p53 a été décrite par Harlow et al (31). Il comprend avantageusement en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes EPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL DDLMLS PDD I EQWFTEDPGP Préférentiellement , un tel peptide comprend en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes EPPLSQETFSDLWKL QETFSDLWKLLPENN DLWKLLPENNVLSPL DDLMLS PDD I EQWFT SPDDIEQWFTEDPGP La détermination des fragments de la protéine p53 présentant une réaction spécifique vis-à-vis des anticorps de patients atteints d'un cancer peut se faire par les moyens mis à la disposition du l'homme du métier et en particulier par test immunoenzymatique , radio-immunologique, par immunoprécipitation ou par Western-Blot. De tels tests sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits dans des manuels généraux (32, 33). La présente invention est en outre relative à une séquence nucléotidique , ribonucléotidique ( ARN ) ou désoxyribonucléotidique ( ADN), codant pour la synthèse d'un des peptides objet de la présente demande De tels peptides peuvent être utilisés pour la détection ou le suivi d'états pathologiques, et en particulier pour la détection ou le suivi d'états cancéreux et précancéreux. Un autre objet de la présente invention est un procédé pour la détermination de la présence d'anticorps ou pour leur dosage dans un tissu ou un fluide caractérisé en ce que - on met en présence le tissu ou le fluide et l'un des peptides objet de l'invention précédemment décrits , et - on détermine la présence soit de l'anticorps, soit du peptide soit du couple anticorps-peptide et on effectue le dosage correspondant Le dosage des complexes anticorps-peptides peut être effectué soit par dosage de la liaison anticorps peptide, soit par dosage du peptide ou de l'anticorps capté et rentrant dans le complexe anticorps-peptide. Ce dosage peut être effectué par les méthodes connues de l'homme du métier et en particulier par des méthodes physiques ou immunologiques telles que les méthodes immunoenzymologiques, radioimmunologiques ou chimioimmunologiques. Avantageusement, les anticorps dont on détermine la présence ou que l'on dose sont des anticorps représentatifs d'états pathologiques et en particulier d'états cancéreux ou pré-cancéreux. Afin de mettre en oeuvre le procédé, le peptide peut être fixé sur une phase solide. Les complexes formés peuvent être révélés à l'aide d'un anticorps réagissant spécifiquement avec le peptide ou les anticorps à doser ou à détecter . Cet anticorps permettant la révélation des complexes est avantageusement conjugué à un marqueur afin de mettre en évidence le complexe anticorpspeptide Un tel marqueur peut être un enzyme, une molécule chimioluminescente, bioluminescente, fluorescente ou radioactive. Un tel procédé peut être avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un coffret pour le dosage et à la détermination d'anticorps comprenant au moins: - une préparation d'un ou plusieurs des peptides tels que précédemment décrits et - un moyen permettant la révélation de la réaction ou de l'absence de réaction entre l'un de ces peptides et les anticorps à doser Le complexe peptide anticorps formé lors de la réaction est avantageusement révélé à l'aide d'un anticorps conjugué à un marqueur tel que défini ci-dessus. Les peptides objets de la présente invention sont préférentiellement obtenus par synthèse à partir d'acides aminés par tous moyens connus de l'homme du metier Ils peuvent aussi être obtenus par génie génétique ou par découpage enzymatique ou chimique de la protéine p53. Les anticorps permettant la révélation du complexe formé entre le peptide et les anticorps sont avantageusement dirigés contre des déterminants antigéniques spécifiques de l'espèce dont est originaire le fluide ou le tissu . Ainsi, dans le cadre de dosage d'anticorps d'origine humaine, les anticorps permettant la révélation du complexe seront des anticorps anti-humains. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent dans lesquels La figure 1 représente les profils d'intéraction entre les fragments de la protéine p53 et des anticorps présents dans le sérum de différents patients ayant un cancer. Les anticorps utilisés pour les hybridations des figures 1A à 1F sont respectivement un sérum de lapin CMî immunisé avec la protéine p53, un sérum de souris immunisé avec la protéine p53, trois sérums de patients dont il avait été déterminé qu'ils possédaient des anticorps anti-p53 et un témoin (figure 1) constitué un anticorps anti-phosphatase alcaline. Les figures 2 à 7 représentent la réactivité de sept peptides de la partie comprenant les acides aminés 1 à 112 de la protéine p53, vis-à-vis de sérums de six patients numérotés 84 , 37, 109 , 57 , 27 et 29. La réaction est mise en évidence en mesurant la densité optique du produit de réaction de chaque couple peptide-sérum Les abréviations suivantes sont utilisées ER, récepteur oestrogène HCD, Domaine Hautement Conservé (highly conserved domain) de la protéine p53 hsp70, protéine du choc thermique de 70 kilodaltons MAB, anticorps monoclonal PBS, tampon phosphate PBST, PBS avec 0,1 % Tween 20 PBSTM, PBS avec 0,1% Tween 20 et 3% poudre de lait écrémé PCR, réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction). PhoA, Phosphatase alcaline d'E.coli PR, récepteur progestérone SDS, sodium dodécyl sulfate EXEMPLE 1 Mise en évidence et signification des anticorPs anti p53 présents dans le sérum de patients atteints de cancer et localisation des régions de la Protéine p53 reconnues par ces anticorps. 1) MATERIELS ET METHODES SERUMS. Les sérums de 80 malades présentant un carcinome invasif du sein et de 20 malades avec des métastases ont été réunis après diagnostic histopathologique et conservés à 20 C. Analyse de la p53. L'ADNc p53 humaine type sauvage (clone H8) a été donné par le Dr Varda Rotter ( Weizman Institut, Rehovot, Israël). La protéine p53 marquée est obtenue par transcription et translation in vitro de l'ADNc correspondant, tel que décrit par SOUSSI et al.(19). Le Western blot a été réalisé tel que décrit par Towbin et al. (20). Les protéines sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide (10% acrylamide) en tampon Tris-Glycine contenant 0,1 % de SDS, pH 8,3. Les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (2 heures, 40 volts); la membrane est immergée en tampon PBSTM pour saturer les sites de fixation non spécifiques puis lavée 5 fois au PBST. Pour le Western blot du sérum du patient et de l'extrait d'E.coli, plusieurs pré-incubations sont nécessaires pour diminuer les liaisons non spécifiques à la membrane de nitrocellulose et éliminer les anticorps anti-phosphatase présents dans certains sérums.Les sérums sont d'abord incubés avec l'extrait bactérien exprimant la phosphatase alcaline E.coli pendant une heure à +4 C puis sur une membrane de nitrocellulose contenant un extrait bactérien (sans protéine de fusion)12 heures à +4 C. La membrane de nitrocellulose avec les protéines hybrides est incubée avec les sérums préparés et dilués du 1/100 au 1/500 pendant 1 heure en tampon PBSTM à température de la pièce . Après 5 lavages en PBSTM, les membranes sont incubées 1 heure avec un anticorps de lapin anti-souris conjugué peroxydase (dilué au 1/4000 en tampon PBSTM), lavées 5 fois en tampon PBS et révélées par le Luminol (AmershamR). Après lecture et interprétation , les filtres sont contrôlés par hybridation immunologique (Immunoblot) pour la quantité de protéine de fusion effectivement déposée en incubant la membrane avec un anticorps anti-phosphatase alcaline. L'immunoprécipitation et l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS ( SDS-PAGE) ont été réalisés selon la technique décrite par SOUSSI et al.(l9). Construction du Plasmide. Le vecteur pLip4 a été utilisé pour la production des protéines hybrides. Ce plasmide est dérivé de pLipl (21) dans lequel deux sites de restriction Sac I et Sal I sont introduits entre les codons +6 et +7 du gène E.coli PhOA. Après clonage, la protéine de fusion PhoA est exportée dans le périplasme bactérien et peut en être extraite par choc osmotique à froid (21). La protéine p53 a été découplée en 6 fragments bien définis. Les fragments 2 (résidus 108 à 162), 3 (résidus 158 à 219), 4 (résidus 215 à 267) et 5 (résidus 263 à 310) contiennent respectivement les régions HCD II à V et correspondent aux régions HOTSPOT pour les mutations dans les cancers humains (11,22). Les fragments 1 (résidus 1 à 112) et 6 (résidus 306 à 393) correspondent aux régions amino- et carboxy- terminales de la protéine et sont généralement à l'écart des mutations. Les fragments précis d'ADNc ont été amplifiés par PCR utilisant la Vent-DNA polymérase pour réduire les erreurs d'incorporation puis sous clonés dans un vecteur pLIP4. Les clones positifs sont contrôlés pour l'activité phosphatase alcaline et séquencés directement. Les six fragments fusionnés au gène PhoA peuvent être exprimés dans E.coli comme des protéines solubles.Le rendement d'expression de protéine de fusion avec le fragment 6 est plus bas (2 à 5 fois) que pour les autres fragments L'antigénicité de la protéine exprimée est établi par sa réactivité avec différents anticorps monoclonaux . (voir tableau 2). 2 ) RESULTATS. Anticorps anti-p53 et résultats cliniques. Les sérums de 100 patients avec un cancer du sein sont testés pour la présence d'anticorps par immunoprécipitation et Western blot (Tableau 1) . Les anticorps circulant sont détectés chez 14% des patients tous stades cliniques confondus. La fréquence est légèrement plus élevée que celle rapportée par Crawford et al. (10%) (16), en raison sûrement de l'utilisation de protéine purifiée recombinante p53 à la place de lysat cellulaire. Il n'y a pas de corrélation entre la présence d'anticorps et le stade clinique de la maladie. Aucune différence de fréquence en fonction de la taille de la tumeur ou de la dissémination ganglionnaire n'a été montrée. I1 n'y a pas de corrélation avec d'autres paramètres cliniques tels que l'âge , le statut hormonal. Par contre une corrélation a été établie avec le stade histologique de la tumeur (SBR stade 3), un marqueur pronostic indépendant dans les cancers primitifs du sein. Ceci est confirmé par l'association entre la présence d'anticorps et l'absence de récepteurs hormonaux (ER-PR). Analyse des récrions de la protéine p53 impliquées dans la réponse immune. Pour déterminer si la réponse immunitaire est dirigée contre la p53 mutante ou sauvage, tous les sérums positifs et plusieurs sérums négatifs sont contrôlés par immunoprécipitation contre différents mutants p53 (His175, Val 143 et Pro156). La reconnaissance des types sauvages et mutants par les sérums est identique. Pour déterminer les régions de la protéine reconnues par ces anticorps, les fragments de p53 humaine sont exprimés dans le vecteur pLIP4 produisant des protéines de fusion solubles liées à la phosphatase alcaline (21). Dans une expérience de contrôle, toutes les protéines de fusion sont testées avec des anticorps monoclonaux spécifiques d'épitopes connus ( tableau 2). PAbl801 (23) et HT 216 (24) sont spécifiques du fragment 1; l'épitope PAb240 est localisé sur le fragment 3(25). Hlll est sur le fragment 5; HR 231 (24) et PAb122 (26) sont spécifiques de la région carboxy-terminale de la p53 (fragment 6). Tous ces anticorps monoclonaux réagissent en immunoblot et immunoprécipitation avec la protéine de fusion pLIP4 en accord avec la localisation de leur épitope. Dans une seconde série d'expériences , le sérum CM1 (27) a été contrôlé . CMî est un anticorps polyclonal de lapin obtenu par immunisation avec la p53 humaine hautement purifiée et fréquemment utilisée en immunocytochimie (27). Les techniques de Western blot ont montré que le sérum CMî contient des anticorps qui reconnaissent principalement les fragments 1 et 6 et à un moindre degré le fragment 5. Des résultats similaires sont obtenus par immunoprécipitation Une expérience de contrôle avec un anticorps anti-phosphatase alcaline permet d'établir que des quantités identiques des différentes protéines de fusion sont bien présentes sur le gel ( figure 1). Pour élargir des observations nous avons contrôlé le sérum d'une souris immunisé avec de la p53 immunopurifiée. Le profil de reconnaissance est quasiment identique à celui du sérum CM1. Des résultats identiques ont été obtenus avec trois autres souris. L'ensemble de ces résultats permet d'établir que les parties amino et carboxy terminales de la protéine p53 sont très immunogènes chez l'animal immunisé et correspondent à des réponses préférentielles alors que le fragment 5 a une réponse plus faible . Des temps d'exposition radiographique allongés n'ont pas permis de mettre en évidence une reconnaissance des fragments 2 à 4 tant par immunoprécipitation que par immunohybridation (immunoblot). Nous avons ensuite testé le profil de reconnaissance des sérums de malades contenant des anticorps anti-p53 (figure 1 et tableau 3).Les immuno hybridations réalisées ont clairement montré que la réponse immunitaire chez les patients est dirigée principalement contre des épitopes localisés dans les fragments 1 et 6 de la p53. Le sérum de certains patients reconnaît seulement le fragment 1 , mais aucun ne reconnaît uniquement le fragment 6 ce qui laisse supposer que la réponse primaire est dirigée principalement contre le fragment 1. Des résultats semblables sont obtenus par immunoprécipitation. De même que chez l'animal, il existe quelques variations dans la réponse immunitaire et quelques patients ont des anticorps dirigés contre les fragments 4 et 5. Aucun anticorps dirigé contre les fragments 2 et 3 n'a pu être détecté. Ce phénomène n'est pas spécifique au cancer du sein.Des résultats identiques ont été obtenus avec des sérums de patients ayant des carcinomes de l'ovaire ou du poumon (figure 1). Ces résultats établissent clairement que la partie amino terminale de la p53 contient un ou plusieurs épi topes dominants impliqué dans la réponse immunitaire cellule B chez des patients présentant des cancers divers. EXEMPLE 2: Mise en évidence des épitopes reconnus Par les anticorps anti-p53 Présents dans le sérum de malades atteints de divers types de cancer : analyse avec des peptides de synthèse Matériel Les plaques de microtitration utilisées sont des plaques en poly(chlorure de vinyle) à fonds plat, à 96 puits. Ref: M129B, Société Dynatech. La streptavidine en poudre, référence (4762) , Société Sigma. Peptides biotinilés synthétisés par la Société CAT (Angleterre) Une série de peptides chevauchants (longueur de 15 acides aminés (aa) , chevauchement de 5 aa) couvrant l'intégralité de la protéine p53. On dispose actuellement d'une série de 75 peptides biotinylés correspondant à la totalité de la p53. 2 peptides témoins ne correspondant pas à la protéine p53 sont utilisés comme témoin négatif. Les peptides ont été synthétisés par la Société CAT (Angleterre). Trousse de révélation immunoenzymatique Amersham, N933. METHODES DU TEST ELISA PREPARATION DES PLAOUES DE MICROTITRATION. 100 p1 de streptavidine ( concentration 5pg/ml dans l'eau distillée ) sont déposés dans les puits de la plaque. Les plaques sont ensuite incubées à 37 C dans une étuve sèche pendant 48 heures. Après cette étape de déshydratation, elles peuvent être emballées individuellement et stockées pendant plusieurs mois à 4 C. LAVAGE Les plaques déshydratées sont lavées 6 fois avec du PBS ( phosphate buffer saline) contenant 0,5% Tween 20. Ce tampon PBS avec du Tween (PBS-T) sera utilisé tout le long de l'expérience comme solution de lavage. Le premier lavage se fait toujours par immersion de la plaque dans la solution de PBS-T ( 300 ml de solution pour 1 plaque). Les 5 lavages suivant se font de manière usuelle en utilisant 200 p1 de tampon PBS-T par puits. Après le dernier lavage, la plaque est séchée sur un papier absorbant Tous les lavages sont effectués de cette façon. SATURATION 100 p1 de solution de saturation sont ajoutés dans chaque puits. solution de saturation: tampon phosphate PBS 0,2 % Tween 20 10% sérum de chèvre (Réf. J9023, Sigma) Les plaques sont ensuite incubées 1 heure à 37 C avec une légère agitation puis sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. ADDITION DES PEPTIDES BIOTYNILES 50 yl de solution de peptides (125 mg de peptide dilué dans du tampon PBS contenant 0,1 % de Sérum Albumine Bovine et 0,02% d'azide de sodium) sont ajoutés dans chaque puits. Chaque puits reçoit un peptide différent correspondant à une région précise de la p53. Les plaques sont incubées 1 heure à 20 C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment ADDITION DES SERUMS DES PATIENTS Les sérums à tester sont dilués au 1/50 dans une solution de PBS contenant 10% de sérum de chèvre. 50 p1 de sérum ainsi dilué sont ajoutés dans chaque puits de la plaque. Les plaques sont incubées 1 heure à 20 C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. INCUBATION AVEC L'ANTICORPS SECONDAIRE. 100 l d'anticorps monoclonal anti-immunoglobuline humaine sont ajoutés dans chaque puits (provenance: kit Amersham N 933, anticorps dilué au 1/1000 dans du PBS 10% de sérum de chèvre). Les plaques sont incubées 30 minutes à 37 C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. Un septième lavage avec de l'eau distillée est effectué. REVELATION. 100 pl de substrat (ABTS 1 mM, provenance: kit Amersham N 933) sont ajoutés dans chaque puits. Les plaques sont incubées à 20 C avec une légère agitation. Le résultat est lu dans un appareil de lecture ELISA (405 nm) 15 minutes, 30 minutes et 60 minutes après addition du substrat RESULTATS OBTENUS Dans l'exemple 1 deux phénomènes ont été mis en évidence. i) La présence d'anticorps anti-p53 est retrouvée chez les patients ayant une forme agressive de cancer du sein (mauvais pronostic ). ii) Les anticorps anti-p53 reconnaissent principalement une région de 112 acides aminés situés dans la partie amino terminale de la p53. L'étude ne pouvait pas permettre de détailler plus précisément la région reconnue par les anticorps anti-p53. Pour une étude plus détaillée, des peptides de synthèse de 15 résidus ont été utilisés comme substrat pour cartographier les épitopes présents dans ces sérums. Le sérum de 12 patients atteints de divers types de cancers ont été testés par cet ELISA-peptide pour rechercher la nature exacte des séquences de la protéine p53 reconnue par les anticorps anti-p53 présents dans ces sérums. patient 84 cancer : poumon patient 132 cancer: poumon patient 37 cancer: foie patient 109 cancer: sein patient 57 cancer: sein patient 103 cancer: sein patient 15 cancer: sein patient 27 cancer: sein patient 28 cancer: sein patient 29 cancer: sein patient 48 cancer: leucémie patient 51 cancer: prostate Chaque ELISA a été réalisé deux fois excepté pour le sérum 84 où il a été réalisé 5 fois afin de vérifier la reproductibilité des résultats obtenus. Les résultats obtenus pour respectivement les sérums des patients 84, 37, 109, 57, 27 et 29 sont montrés sur les profils des figures 2 à 7. Ils sont résumés pour les 20 premiers peptides de p53 dans le tableau 4. L'ensemble des résultats montre que les anticorps sont dirigés contre des épi topes très localisés sur la molécule p53 et plus particulièrement dans la région amino terminale de la protéine. Les séquences reconnues principalement par les anticorps sont les suivantes peptide 3 EPPLSQETFSDLWKL peptide 4 QETFSDLWKLLPENN peptide 5 DLWKLLPENNVLSPL peptide 9 DDLMLSPDDIEQWFT peptide 10 SPDDIEQWFTEDPGP Tous les sérums testés à l'heure actuelle reconnaissent au moins trois de ces peptides. TABLEAU 1 Corrélation entre le taux d'anticorps anti-p53 dans le sérum et les paramètres cliniques et histologiques de patients atteints d'un cancer du sein Paramètres cliniques N P Patients atteints par des 3/20 métastases ou ayant subi une rechute cancer primaire du sein 17/80 Taille de la tumeur T-T1 2/21 T2 7/33 NS T3 2/19 T4 1/7 Etat des nodules lvmphatigues No 4/32 NS N- 7/43 Catéqorie histoloqique catégories 1 et 2 5/59 Etat des récepteurs hormonaux ER + PR + ER- PR + 2/34 ER- PR- 5/13 NS = non significatif TABLEAU 2 Caractérisation des fragments de p53 clonés dans le plasmide pLIP4 Fragments de p53 1 2 3 4 5 6 Anticorps Ref. (1-112) (108-162) (158-219) (215-267) (263-310) (306-393) monoclonaux PAb1801 23 + - - - - PAb122 26 - - - - - + PAb240 25 - - + - - HR231 24 - - - - - + HT216 24 + - - - - HI11 24 - - - - + - TABLEAU 3 Caractérisation des déterminants antigéniques de la p-53 par les anticorps sériques de patients atteints par un carcinome Patients (1) p53(2) Prot 1 Prot 2 Prot 3 Prot 4 Prot 5 Prot 6 PhoA 26 ++ ++ - - - + + 33 ++ ++ - - - - + 37(3) ++ ++ - - - - - 57 ++ ++ - - + ++ - 60 ++ ++ - - - - - 63 ++ + - - - - - 80(4) ++ ++ - - - - - 84(3) ++ ++ - - - - + 90 ++ ++ - - - - - 94 ++ ++ - - - - ++ 103 ++ + - - - - - 109 ++ ++ + - + - + 134 ++ ++ - - + - - Prot = fragment protéique. (1) Tous les patients sont atteints par un cancer du sein sauf indications contraires (2) p-53 humaine intacte (3) carcinome pulmonaire (4) carcinome des ovaires. TABLEAU 4 Réactivité immunologique des 20 premiers peptides chevauchant de la protéine p53 peptide 84 132 37 109 57 103 15 27 28 29 1 - - - - - - ++ - - 3 ++ + - ++ - + + + + + 4 ++ ++ + + ++ + + + + ++ 5 - ++ - + ++ - - - - ++ 6 - - - + - - - - - 7 - - - - - - + - - 8 - - - - - - + - - + 9 ++ - ++ ++ ++ - + ++ + ++ 10 ++ - + + ++ + + ++ + + 11 - - - - - - - - - + 12 - - - - - - - - - 13 - - - - - - - - - 14 - + - - - - - - - 15 - - - - - + - - - 16 - - - + - - - - - 17 - - - - - - - - - 18 - - - - - - - - - 19 - - - - - - - - - 20 - - - - - - + + + + BIBLIOGRAPHIE 1 Baker S. J., Preisinger A. C., Jessup J. M., Paraskeva C., Markowitz S., Willson J. K. V., Hamilton S.and Vogelstein B. P53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis. Cancer Res., 50: 7717-7722, 1990. 2 Prosser J., Thompson A. L., Cranston G.and Evans H. J. Evidence that p53 behaves as a tumour suppressor gene in sporadic breast tumours. 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Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont ceux de patients atteints d'un cancer du sein, du foie , des poumons, de la prostate, de l'ovaire ou de leucémie 3. Peptide selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il est compris dans la séquence des amino acides 1 à 112 de la protéine p53. 4. Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes EPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL DDLMLSPDDIEQWFTEDPGP 5. Peptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes EPPLSQETFSDLWKL QETFSDLWKLLPENN DLWKLLPENNVLSPL DDLMLSPDD I EQWFT SPDDIEQWFTEDPGP 6. Séquence nucléotidique codant pour la synthèse d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 5 pour la détection ou le suivi d'états pathologiques 8. Utilisation selon la revendication 7 pour la détection ou le suivi de l'évolution d'états cancéreux. 9. Procédé pour la détermination de la présence ou pour le dosage d'anticorps dans un fluide ou tissu caractérisé en ce que: - on met en présence le fluide ou tissu et l'un des peptides selon l'une des revendications 1 à 5, et - on détermine la présence soit de l'anticorps soit du peptide soit du couple anticorps-peptide et on effectue le dosage correspondant 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les anticorps à doser ou dont on détermine la présence sont des anticorps représentatifs d'états pathologiques 11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisé en ce que ledit peptide est fixé sur une phase solide 12.Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que les complexes formés sont révélés à l'aide d'un anticorps réagissant spécifiquement avec les anticorps à doser ou dont on détermine la présence 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'anticorps permettant la révélation des complexes est conjugué à un marqueur 14.Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le marqueur est un enzyme , une molécule chimioluminescente, bioluminescente, fluorescente ou radioactive 15. Coffret pour le dosage et la détermination d'anticorps , caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une préparation d'un ou plusieurs peptides selon l'une des revendications 1 à 5, et - un moyen permettant la révélation de la réaction entre l'un de ces peptides et les anticorps à doser 16. Coffret selon la revendication 15 , caractérisé en ce que le complexe peptide-anticorps formé lors de la réaction est révélé par un anticorps conjugué à un marqueur. 17. Coffret selon la revendication 16, caractérisé en ce que le marqueur est un enzyme, une molécule chimioluminescente, bioluminescente, fluorescente ou radioactive