Brevet FR2702841A1 — publié le 19940923

DISPOSITIF ET PROCEDE IMMUNOLOGIQUE PEPTIDE-ANTI-PEPTIDE La presente invention a pour but la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand dans un fluide.Elle est relative à un dispositif et un procédé basé sur la technologie des peptides et des anticorps monoclonaux marqués hautement specifiques de ces peptides, caracterisé,entre autres, par la possibilité de detecter des antigènes ou des anticorps concernant la même affection, avec exactement le même dispositif. Le procédé objet de cette invention consiste en une immunofiltration en une seule etape et sans rinçages,d'une goutte (associant l'echantillon à tester et un (ou des) anticorps marqué(s) specifique de l'antigene recherché dans cet echantillon) à travers un support-ruban fin (qui sera decrit plus loin) ou tout autre support rigide (du type Porex par exemple),sur lequel sont immobilisés des peptides pour pieger les anticorps marqués par leur site immunologique specifique uniquement lorsque ce site est libre de tout antigène,c'est à dire lorsque l'echantillon est dit negatif en antigenes; Et laissant ces anticorps marqués traverser le ruban ou le support pour donner un signal rapide (chromogène ou autre) en quelques secondes sous ce ruban (au contact de moyens de revelation), lorsque l'echantillon est dit positif : les antigenes saturant alors ces anticorps marques. La detection d'anticorps dans l'echantillon est possible avec exactement le même ruban : une grande partie des anticorps recherchés (c'est à dire ayant le même idiotype que les anticorps marqués) contenus dans l'echantillon seropositif,entrent en competition (inegale car infiniment plus nombreux) avec les anticorps marqués au niveau des peptides immobilisés sur le ruban : les sites idiotypiques d'une grande partie des anticorps recherchés dans l'echantillon, saturent rapidement les peptides immobilisées qui ne peuvent plus pieger les anticorps marqués : ces derniers traversent alors le ruban et signalent en quelques secondes la seropositivé de l'echantillon.Ce procédé se differencie des precedents (qui vont être cités plus loin) par le fait que des peptides,specialement preparées et immobilisées sur un ruban ou tout autre support,vont pieger TOUT anticorps (que ce soit humain ou de souris) se presentant à cette membrane ou à ce support,en se fixant aux sites idiotypes (du dit anticorps) qui se presentent libres de tout antigène.Par contre,si cet anticorps est saturé en antigène,ses sites idiotypes ne sont pas libres et les peptides ne le piegeront pas.De la même façon,si des anticorps seriques saturent les peptides, l'anticorps marqué ne sera pas piégé et ira delivrer un signal de seropositivité. Dans ce procédé,à l'inverse des procédés anterieurs,un double selection s'opère au niveau du ruban selectif 1 - saturation du ruban par l'anticorps marqué libre de tout antigène (test antigène negatif) ou non-saturation par l'anticorps marqué deja lié à son antigène (test antigène positif) 2 - saturation du ruban par les anticorps humains recherchés (test anticorps positif) ou par les anticorps marqués en absence d'anticorps seriques (test anticorps negatif). En bref,trois hypotheses surviennent dans le fonctionnement de ce procédé 1 - negatif universel : l'absence d'antigène ou d'anticorps dans l'echantillon,aboutit exactement à la même reaction immunologique : pieger les anticorps marqués 2 - positivité en antigène : saturation DES ANTICORPS MARQUÉS qui ne sont plus reconnus pas les peptides du ruban selectif,peptides restés pourtant libres. 3 - positivité en anticorps : saturation DES PEPTIDES DU RUBAN SELECTIF (par les anticorps seriques) qui n'a plus les moyens de pieger les anticorps marqués pourtant libres de tout antigène Ce procédé se differencie donc bien du brevet français 9012661 (PCT/FR91/00891) publié sous le numero 2667943 et concernant un procédé immunologique different : des immunoglobulines anti-enzyme ou anti-Fab, immobilisées sur un support,piegent des anticorps marqués lorsque leur enzyme n'est pas occulté par un antigène ou lorsque leur site Fab n'est pas saturé par un antigène,mais laissant traverser ces anticorps marqués lorsqu'ils sont saturés en antigènes.Ces immunoglobulines ne fixent que les anticorps uitilisés pour le test et non les anticorps seriques.Par exemple : des immunoglobulines de chèvre,anti Fab de souris,vont pieger uniquement les anticorps de souris marqués utilisés pour le test,et non les anticorps seriques de l'echantillon à tester. La première difference fondamentale est que chaque peptide utilisé est hautement specifique (par definition) de chaque anticorps marqué qui arrive sur la membrane : par exemple un anticorps monoclonal anti-Interleukine 2 arrivant sur la membrane,possède des sites idiotypiques hautement specifiques du peptide d'Interleukine 2 choisi pour être immobilisé;ce sont les sites idiotypiques anti Interleukine 2 que les peptides immobilisées sur la membrane vont pieger s'ils sont libres de toute Interleukine 2.Chaque membrane va donc être preparée pour un diagnostic precis,comme par exemple ici,le dosage de l'interleukine 2. - Par contre,les immunoglobulines anti Fab ou anti-enzymes decrites dans le brevet français 9012661 signalé plus haut,n'ont aucune specifité de diagnostic : quelquesoit l'antigène recherché,l'anticorps marqué non saturé en antigène,est piegé par les immunoglobulines anti-Fab : ces immunoglobulines anti-Fab ou anti enzymes etaient en fait un serum obligatoirement polyclonal puisqu'elles piegent tous les anticorps libres d'antigènes;par exemple : le produit Sigma referencé A4185 est un serum polyclonal de Chèvre reconnaissant tous les Fab de souris;ce serum piegera donc tous les anticorps de souris dont les sites Fab seront libres de tout antigène.L'avantage de ce procédé etait donc le caractère universel du dispositif de detection d'antigène : le même pouvait servir pour tout diagnostic;seul l'anticorps marqué associé à l'echantillon etait specifique du diagnostic recherché. Or, le site Fab d'un anticorps (de souris par exemple)est très vaste et comprend plusieurs sites (dont le site idiotype qui lie l'antigène):le serum (de chèvre par exemple) polyclonal anti-Fab (de souris par exemple) va donc contenir une forte majorité d'immunoglobulines,chacune specifique d'un site different sur la branche Fab des anticorps de souris,site auquel elle se liera qu'il y ait ou non antigène;autrement dit,une faible partie seulement de ces immunoglobulines anti-Fab va reconnaître sur la branche Fab les sites specifiques de l'antigène recherché, alors que le reste de ces immunoglobulines anti-Fab vont se lier à tous leurs sites respectifs sur la branche Fab de souris,qu'il y ait ou non,un antigène fixé au site idiotypique de l'anticorps marqué.D'où un très mauvais rendement : seuls de très rares anticorps de souris,marqués,saturés en antigènes, vont echapper à la membrane supportant les immunoglobulines anti-Fab ; d'où un signal très faible et peu sensible de presence d'antigène recherché.Alors que si la totalité de la membrane est traitée avec des peptides,le moindre anticorps marqué dont le site idiotype sera saturé en antigène,traversera cette membrane pour delivrer un signal,d'où une sensibilité infiniment plus elevée que dans le procédé cité plus haut.Certes,le dispositif n'est plus universel;chacun sera specialement preparé pour un diagnostic precis. Seconde difference fondamentale : le brevet français 90/12661 cité plus haut,ne decrit que des dosages d'antigenes,et non d'anticorps.Ce qui est logique : les immunoglobulines anti-Fab de souris ne piegeront que les anticorps de souris et ne reagiront pas,comme les peptides,à la presence d'anticorps seriques. Troisième diference fondamentale : la specificité du procédé objet de la presente invention est infiniment plus importante : il vient de s'averer qu'un serum polyclonal (de chevre par exemple) anti-Fab de souris reconnaissait un pourcentage non negligeable d' anticorps humains;or,dans un echantillon humain (sang ou plasma ou serum) à tester, il y a de très grandes quantités d'anticorps;et ils vont entrer au niveau de la membrane,en concurrence avec les anticorps marqués de souris destinés à se complexer à l'antigène recherché c'est à dire que les immunoglobulines (de chevre) immobilisées sur la membrane,vont être completement saturées par les branches Fab d'anticorps humains et laisseront filer les anticorps marqués de souris,pourtant libres de tout antigène,ce qui va aboutir à un faux signal positif sous la membrane,alors qu'il n'y a pas d'antigènes dans l'echantillon. Quatrième difference fondamentale : les peptides ne reconnaissent que le site idiotype d'un anticorps qui arrive à leur contact : quelque soit l'origine de cet anticorps : que ce soit un anticorps marqué monoclonal (de souris par exemple) utilisé pour être associé à l'echantillon,ou tous les anticorps polyclonaux (seriques humains par exemple) possedant le même idiotype.Exemple : un peptide de l'antigene p24 HIV,va reconnaître et pieger aussi bien le site idiotype d'un anticorps marqué monoclonal de souris anti-p24 specifique de ce peptide,que le site idiotype d'un anticorps circulant serique humain anti p24 reconnaissant le dit peptide. Or, le même antigène possède plusieurs epitopes differents et provoque donc chez l'hôte,l'apparition d'un anticorps (possedant un site idiotype specifique de cet epitope) contre chaque epitope. : ceci explique pourquoi le procédé objet de la presente invention peut utiliser plusieurs peptides differents (equivalents des epitopes de l'antigene).,immobilisés.-sur le même support. membranaire,et plusieurs anticorps monoclonaux marqués specifiques chacun d'un epitope de l'antigene,pour le même diagnostic. Exemple 1:(Figures 4/Planche III) un dispositif de detection d'anticorps anti-GP120 va utiliser, immobilisés sur le support membranaire,toute une serie de peptides reconnaissant, chacun,un anticorps anti-epitope precis ainsi les très nombreux anticorps seriques anti-GP120 (des microgrammes),bien que possedant chacun un idiotype different, vont tous être piégés par les peptides sur le support membranaire qui va être totalement saturé l'anticorps marqué de souris anti-GPl 20 associé à ltechantillon,ne sera pas piégé par les peptides (totalement saturés) du ruban qu'il traverse pour signaler donc la seropositivité. Exemple 2: l'antigène p24-HIV ne circule chez les patients seropositifs au debut,qu'en quantités infinitesimales (parfois inferieures à 50 picogrammes/ml) indosables par les techniques actuelles,ce qui constitue l'enorme danger des donneurs de sang seropositifs au debut.Cet antigène p24 possède de nombreux epitopes et il existe de nombreux anticorps monoclonaux de souris anti-p24 (chacun etant specifique d'un epitope du p24).En utilisant,non plus un,mais plusieurs anticorps monoclonaux de souris,marqués, anti p-24 (chacun etant dirigé contre un epitope different),il est possible de detecter des quantités infinitesimales de p24 car chaque molecule d'antigène sera cernée par plusieurs anticorps monoclonaux hypermarqués rendant le signal visible.Sur le ruban,seront immobilisés des peptides correspondant chacun à l'idiotype de chacun des anticorps monoclonaux marqués utilisés : en absence de p24,ces derniers seront tous piégés : pas de signal;alors qu'une quantité de 10 picogrammes/ml de p24 dans l'echantillonrmasquera un nombre suffisant de leurs sites idiotype pour leur permettre de traverser le support membranaire et provoquer un signal.Ce qui explique l'extrême sensibilité du procédé. Mais ceci explique egalement l'extrême specificité de cette technique : le signal ne sera visible que si chacun de tous les anticorps monoclonaux marqués antip24 a été saturé par son epitope correspondant de la p24.Ce problème de specifité est la cause de nombreux faux resultats car les techniques habituelles utilisent un seul anticorps monoclonal specifique d'un seul epitope de la p24 par exemple.Or,il arrive que cet epitope existe sur une autre proteine non concernée par le SIDA et le resultat est alors un faux positif. REVUE DE L'ART ANTERIEUR Les precedentes methodes de determination de la presence ou de la concentration de substances antigeniques dans des fluides biologiques,par voie immunologique,sont à present bien connues;elles sont basées sur la formation d'un complexe entre la substance antigenique à determiner et un ou plusieurs anticorps,l'un des composants du complexe pouvant être marqué par un element radioactif(tel que Dans les methodes de determination immunologique par competition,la substance antigenique contenue dans l'echantillon de liquide à analyser,entre en competition avec une quantité connue d'antigène marqué pour une quantité limitée de sites de fixation de l'anticorps : la quantité d'antigène marqué liée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la quantité d'antigène contenue dans l'echantillon. Des tests immunometriques particulièrement adaptés à la detection d'antigènes polyvalents,c'est à dire de substances antigeniques capables de se complexer avec au moins deux anticorps en même temps,consistent à utiliser une quantité d'anticorps non marqué lié à un support solide insoluble dans le liquide à analyser,et une quantité d'anticorps soluble portant un indicateur,tel qu'un isotope radioactif,qui permet la detection ou la determination quantitative du complexe ternaire formé entre l'anticorps en phase solide,l'antigène et l'anticorps marqé.Ces methodes consisitent à mettre tout d'abord en contact l'anticorps lié à la phase solide avec l'echantillon à analyser,pour extraire l'antigène de l'echantillon,par formation d'un complexe binaire entre l'anticorps en phase solide et l'antigène.Après une periode d'incubation,le support solide est lavé pour en eliminer le residu d'echantillon liquide,y compris l'antigène eventuel n'ayant pas reagi,puis mis en contat avec une solution contenant une quantité connue d'anticorps marqué.Après une seconde periode d'incubation pour permettre à l'anticorps marqué de se complexer avec l'antigène lié au support solide par l'intermediaire de l'anticorps non marqué,le support solide est lavé une seconde fois pour enlever l'anticorps marqué n'ayant pas reagi;puis la presence d'anticorps marqué sur le support solide lavé est detectée (par exemple par mesure du rayonnement emis,si l'indicateur est un rayonnement radioactif) et eventuellement soumise à un processus de determination quantitative. Ces methodes sont connues sous le nom de methodes "sandwich" ou "bi-site",du fait que l'antigène porte deux anticorps liés à sa surface en deux sites differents.Elles sont decrites par WIDE dans "Radioimmunoassay Methods" (Kirkham et Hunter,E et S. Livingstone,Ed. Edimbourg, 1970, p 199-206). Des applications specifiques (test de detection de l'antigène de l'hepatite) sont decrites dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 3 867 517 ; des variantes de ces methodes ("simultanées" ou "inverses") sont decrites par JEONG et al.dans "Comparison of RIA with a single incubation two-site immunoradiometric assy (IRMA) as applied to the determination of human thyroïd stimulating hormone (HTSH)",Bio-Rad Laboratories,1979; dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 4 174 384 (marquage de deux anticorps par un chromophore fluorescent (fluoresceïne) et par un chromophore qui absorbe la lumière emise par la fluoresceine); dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 4 098 876.Ces methodes utilisaient initialement des anticorps polyclonaux,dont la sensibilité est insuffisante en raison de l'existence d'une reactivité croisée avec d'autres antigènes.Le Brevet français Hybridtech NO 81 15030 publié sous le NO 2 487 983,a proposé de remplacer dans ces tests immunometriques,les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux,pour augmenter de façon importante la sensibilité de ces methodes. Le Brevet français LIOTTA NO 82 16973,publié sous le NO 2 514 511,decrit un dispositif et un procédé pour determiner la presence d'antigènes dans des fluides biologiques,par la methode ELISA,tout en eliminant les operations de lavage et de dilution qu'elle necessite et en reduisant la durée d'incubation.Le dispositif proposé comprend une matrice formée d'un ruban en papier de nitrocellulose ou de diazobenzyloxymethyle (DBM),en gel poreux tel le polyacrylamide,agarose ou collagène,dans les pores duquel l'antigène peut être piégé ou bien il peut être reticulé avec le gel par l'intermediaire des groupes amines du ligand et des groupes carboxyles portés par la matrice,ou bien d'un ruban de cellulose ou de fibres de matière plastique à l'interieur duquel sont piégées des particules ou des billes qui contiennent le ligand.Conformément à ce brevet LIOTTA,le dispositif comprend - une première zone qui contient des antigènes et des anticorps liés à une enzyme,ces anticorps etant situés dans la dite première zone de telle manière qu'ils soient eliminés de cette première zone quand ils ont reagi avec des antigènes non liés contenus dans l'echantillon à tester, traversant cette première zone,mais qu'ils n'en soient pas eliminés en l'absence de tels antigènes, - et une seconde zone contenant une substance capable de reagir avec les dits anticorps liés à une enzyme,pour produire une reaction colorée revelant la presence des dits anticorps. De façon specifique,le dispositif de dosage immunologique decrit par le brevet Liotta,comprend un stratifié à trois couches de matrice poreuse dont la première est impregnée d'un anticorps specifique lié à une enzyme,la seconde couche poreuse contient un antigène de reference immobilisé (lié), et la troisième couche contient un substrat produisant une couleur,qui reagit avec l'enzyme liée à l'anticorps.L'antigène libre à doser present dans l'echantillon à analyser,mis en contact avec la première couche,diffuse dans la seconde,puis dans la troisième couche.L'antigène libre present dans l'echantillon entre en competition avec l'antigène de reference lié, immobilisé dans la seconde couche,pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme.Si l'anticorps lié à une enzyme se combine à l'antigène libre, il diffuse librement vers la troisième couche et produit une reaction colorée.Par contre,si l'echantillon à analyser ne contient pas d'antigène,tous les anticorps liés à une enzyme possèdent des sites de liaison libres et se combinent avec l'antigène immobilisé present dans la seconde couche;l'anticorps lié à une enzyme,qui se combine à l'antigène immobilisé dans la seconde couche,ne diffuse pas dans la troisième couche et aucune reaction coloré ne se produit.Le bervet français LIOTTA 87 08007,publié sous le NO 2 599 845 decrit une variante de ce dispositif,qui ne comprend que deux couches,dont la couche superieure porte l'antigène avec les deux anticorps reactifs et dont la couche inferieure contient un substrat chromogène,les deux zones (zone de piegeage et zone de substrat) pouvant egalement être juxtaposées. Il existe des differences très importantes entre Liotta et la presente invention 1 - Le procédé Liotta utilise le principe des anticorps pieges par des antigenes entiers immobilisés sur un support membranaire.Or,si on prend comme antigène par exemple la molecule d'HCG (exemple decrit par Liotta),elle pèse 40.000 daltons.Les sites reconnus par les anticorps ne pesent que quelques dizaines de daltons.Ce qui fait que le support membranaire est encombré inefficacement par le reste de la molecule d'HCG immunologiquement neutre,avec un rapport sites actifs/sites neutres de 1/1000.Les anticorps marqués n'ont donc qu'une chance infime d'être piégés en cas d'absence d'antigenes dans l'echantillon testé.C'est la raison pour laquelle Liotta utilise plus de dix membranes superposées pour stopper l'anticorps marqué. Alors que si on traite une seule membrane avec uniquement des peptides hautement specifiques de l'anticorps marqué utilisé,il y aura sur cette membrane infiniment plus de sites actifs et theoriquement pas de site neutre.En simplifiant,on peut dire que le rapport sites actifs/sites neutres est superieur à 1000/1,ce qui fait que la membrane issue de la presente invention est un million de fois plus performante que celles de Liotta. 2 -La notion nouvelle de couple peptide-anti-peptide Liotta pouvait s'apprivisionner en HCG et en anticorps polyclonaux anti-HCG chez tout fabricant.Ici,un etape rigoureuse de preparation des reactifs s'impose : il faut selectionner un anticorps monoclonal après immunisation de la souris par l'HCG par exemple,cet anticorps ne doit croiser avec aucune hormone voisine de l'HCG comme la LH ou la FSH,il doit donc être hautement specifique.Ensuite il faut couper l'antigene HCG en gros peptides,reperer celui qui est reconnu par cet anticorps monoclonal.Puis couper ce gros peptide selectionné en peptides plus petits pour determiner le peptide ultra specifique de l'anticorps monoclonal.La production en grandes quantités de ce peptide sera assurée par genie genetique par des bacteries lorsque l'ARN messager puis l'ADN aura été reconstitué à partir de la sequence en acides aminés de ce peptide.Il est egalement possible de faire appel aux dernières techniques automatiques de production in vitro de peptides si leur longueur n'excède pas un certain nombre d'acides aminés. Le Brevet americain HYBRIDTECH NO 4 632 901 ( et la demande internationale PCT correspondante NO 85/05451) decrit un procédé et un dispositif de realisations d'immunoassays qui ne necessitent pas le recours à des etapes d'incubation de longue durée associées à plusieurs lavages,et permettent par leur simplicité,la mise en oeuvre par un medecin,à sa consultation,et même par le patient chez lui.Ce dispositif comprend un premier element poreux constitué par une membrane ou un filtre auquel est lié un anticorps,monoclonal ou polyclonal,qui reconnait l'antigène que l'on cherche à identifier,et un deuxième element,qui est absorbant et comporte des passages capillaires perpendiculaires à ses surfaces superieure et inferieure;;ce second element est en communication capillaire avec la membrane,ou analogue,poreuse,qui forme le premier element du dispositif,et presente une dimension de pores telle qu'il induise la traversée de liquide à travers le premier element sans application de moyens externes.La membrane filtrante peut être du Nylon portant des groupes NH2 auxquels les anticorps sont liés par covalence ,par couplage à l'aide de glutaraldehyde et l'element absorbant peut être en matière filtrante fibreuse telle que fibres d'acetate de cellulose,de polyester,de polyolefine,etc..Ces deux elements peuvent être separés l'un de l'autre par un autre element poreux en polyethylène par exemple ) qui ne fixe pas d'anticorps de façon non-specifique et empêche que de l'anticorps marqué ne se fixe de façon non-specifique sur la surface superieure de l'element absorbant. De même la demande de Brevet Europeen ABBOTT Laboratories NO 186 100 decrit un dispositif qui vise à determiner la presence ou la quantité d'une substance dans un echantillon à tester,et qui comprend une matrice fibreuse poreuse non-absorbante,telle que de verre,impregnée d'un polymère hydrophobe qui forme un revêtement de surface sur au moins une partie de la matrice et auquel est fixé un reactif,par exemple un anticorps ou un antiène,capable de reagir avec la substance recherchée dans l'echantillon,ce dispositif pouvant être associé à une couche de matière absorbante sous-jacente et/ou à une couche de matière fibreuse telle que fibres de verre ou papier-filtre en cellulose,qui recouvre la matrice fibreuse et peut jouer le rôle de pré-filtre. La demande de Brevet europeen MUREX Corp. NO 206 561 fait egalement connaître un dispositif de diagnostic qui comprend un element filtrant comportant au moins une zone de reaction associée à au moins une zone peripherique,un element absorbant associé à uniquement à la zone peripherique du premier element et un element de maintien du filtre en position appropriée.La "reaction" qui se produit dans la zone de reaction peut aussi bien être une separation par filtration qu'un couplage immunologique et c' est dans la même zone, qu'apparaissent les signaux de lecture de la reaction.L'echantillon liquide parvient sur le filtre par un entonnoir dont l'orifice de decharge est calculé de telle manière que son diamètre soit suffisant,en combinaison avec la pression du liquide dans llentonnoir,pour que le liquide se decharge sur la surface superieure du filtre mais ne traverse pas ce dernier,la pression hydrostatique etant,par la suite,ajustée de telle manière que le liquide penètre dans le filtre par gravité et est diffusé à travers ce dernier par action capillaire,sans le traverser perpendiculairement de part en part. Le Brevet KONICA Corp. No EP-A-328106 est egalement une superposition de trois compartiments qui ont la même fonction que dans le brevet objet de la presente invention mais il s'agit encore ici d'un piegeage des anticorps marqués libres par un antigène correspondant immobilisé dans le compartiment median. Le brevet europeen Boehringer Biochemica Robin (0 303 110) concerne plutôt une filtration horizontale sur des bandelettes avec encore ici des antigenes immobilisés sur la zone selective,pour pieger les anticorps marqués en cas d'absence d'antigenes dans 1' echantillon. Tous ces procédés ont en commun un element filtrant,à travers lequel s'écoule l'echantillon liquide à tester.La filtration est rendue selective par la presence à ce niveau,immobilisé,d'un antigène identique à celui recherché alors que dans le dispositif objet de la presente invention,la filtration est rendue hyperselective par la presence au niveau de l'element filtrant,de peptides d'une part hyperspecifiques de l'anticorps marqué utilisé,et d'autre part en nombre infiniment plus important que les antigenes;de plus,tout cet art anterieur s'adresse exclusivement au dosage d'antigènes et non d' anticorps. Mattiasson,Danielson,Hermansson et Mosbach (FEBS Letters. 85 : p 203,1978) ont mis en evidence les changements qui interviennent dans les structures des proteines (antigenes par exemple) quand ces dernières ne se trouvent plus dans leurs conditions physiologiques,et proposent toute une serie de solutions interessantes. A llinverse,la litterature est abondante sur les hautes qualités de resistance,de conservation et de stabilité des peptides. En ce qui concerne les dispositifs de l'art anterieur utilisant des peptides immobilisés sur des membranes,ils servent exclusivement à pieger les anticorps seriques correspondants qui seront revelés par la suite après plusieurs etapes complexes de lavage et de revelation.Ils ne resolvent pas le problème de la coexistence de complexes antigenes+anticorps et une etape obligatoire de traitement complexe de l'echantillon par des solutions de TRIS-HCl puis de glycine pour separer les antigenes de leur anticorps,est indispensable.Le cas le plus typique etant le depistage du HIV chez les nouveaux nés de mère seropositive : la presence d'antigene p24 associé aux anticorps de la mère,condamne le nourrisson alors que s'il ne possède que les anticorps maternels,il sera epargné. La presente invention s'est en consequence donné pour but de pourvoir à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif,dans un fluide,repondant mieux aux necessités de la pratique que les dispositifs et procédés visant aux mêmes buts proposés dans l'art anterieur. La presente invention a d'abord pour objet un dispositif pour la determination qualitative et quantitative rapides de la presence d'un ligand reactif, dans un fluide,du type comprenant (figure 1/Planche I) deux elements separés - un recipient (A) (poire de prelevement,tube ou tout autre) contenant une solution d'anticorps marqué et destiné à recevoir et diluer,une goutte de l'echantillon à tester (sang total ou plasma ou serum ou salive ou urines ou larmes ou liquide cephalo-rachidien ou tout autre liquide biologique).L'anticorps marqué peut être à l'etat lyophilisé si l'echantillon n'a pas besoin d'être dilué. - Un ruban (B) supporte en certains endroits (voir plus loin,les exemples de montages) de sa face superieure les peptides immobilisés,et à sa face inferieure des moyens de revelation (par exemple chromogènes) signalant que les anticorps marqués provenant de A ont echappé aux peptides de la face superieure et traversé ce ruban. Ce ruban est constitué de tout materiau poreux (papier,nylon,verre,supports Porex,etc..) transparent, de telle sorte qu'il n'est pas necessaire de retourner le ruban pour lire la coloration de B : le depôt de la goutte,puis quelques secondes après,la lecture se font donc à la face superieure du ruban qui peut être simplement collé sur n'importe quel support opaque de preference,ou simplement inséré dans un dossier medical ou epinglé à une fiche. Pour realiser un dosage semiquantitatif(fig.3/Planche II), l'echantillon est d'abord mis en contact avec un premier recipient (Al) contenant des anticorps NON-MARQUÉS cette fois,en quantité uniquement suffisante pour se lier à une certaine quantité seulement d'antigène;;dans une seconde etape,le contenu du recipient Al est transféré au recipient (A2) contenant des anticorps marqués cette fois si il y a excès d'antigène(Fig 3+/Planche II),les antigenes encore libres après l'etape A1,vont se lier en A2 aux anticorps (marqués cette fois ci) et les complexes traverseront la membrane selective B pour delivrer un signal d'excès d'antigenes.S'il n'y a pas d'exces d'antigenes(Fig 3-/Planche II),ces derniers auront tous été liés en Al aux anticorps non marqués de la première etape,ce qui fait que les anticorps marqués de A2 ne seront pas saturés en antigene et seront piégés en B. Selon une autre variante de realisation d'un dosage semiquantitatif,une solution d'anticorps marqué est ajoutée au recipient Al dans un second temps,après incubation de l'echantillon avec le contenu de Al (anticorps marqué);ce qui evite d'utiliser un recipient A2. Conformément à la presente invention,il est possible de realiser des dosages quantitatifs,en associant la membrane de revelation B à un appareillage de quantification connu en lui même,tel que RIA (si le marquage est radioactif),spectrophotomètre,etc. Le contrôle de fonctionnement (fig 2/planche I)) consiste à deposer la première goutte de A (echantillon+conjugué) dans un espace sur le ruban,bien signalé (en imprimant "CTRL" par exemple) et qui se colore de toutes façons (temoignant de la bonne conservation des reactifs) ,et une seconde goutte de A dans un second espace lui aussi bien signalé ("TEST" par exemple) dans lequel le signal n'apparait qu'en cas de test positif. Seul l'espace "test" ayant été preparé avec des peptides. Le dispositif objet de la presente invention se differencie bien des dispositifs suivants retrouvés dans l'art anterieur Ces brevets decrivent tous des superpositions de membranes,chacune jouant un rôle different,mais ne possedent pas l'etape A de contact de l'anticorps marqué avec l'echantillon,avant le depôt de la goutte. Ils ont en commun la lecture du resultat par retournement du dispositif alors que le dispositif objet de la presente invention offre une lecture du resultat vue de dessus par transparence. De plus,ce sont des instruments obligatoirement rigides et opaques,des cartes soudées,etc.;alors qu'ici il s'agit d'un petit ruban.(facilement inséré dans un dossier medical par exemple). Aucun d'eux n'integre le moindre contrôle de fonctionnement. Aucun d'eux ne permet le dosage d'anticorps. Enfin, ils integrent tous,à sec,des anticorps conjugués au niveau de leur membrane superieure afin de proceder directement au dosage par depôt de l'echantillon;alors qu'ici il y a d'abord le passage de l'echantillon par un recipient (A) d'une part pour la dilution obligée des echantillons (qui seraient trop visqueux autrement) et surtout pour mettre en contact (par agitation mecanique intense ou vortex,notemment) l'echantillon avec les anticorps conjugués pendant un temps suffisant pour que lleventuelle reaction antigène-anticorps marqué soit la plus complète possible;ce qui n'est pas le cas lorsque l'on depose intempestivement l'echantillon directement sur les anticorps marqués : les reactions ne se font que très partiellement (si elles se font) Par ailleurs,la declinaison de cette première etape A permet de faire plusieurs tests differents : en utilisant non plus un recipient A mais un recipient AX contenant un anticorps marqué specifique d'un antigène X,un second recipient,AY,contenant un anticorps marqué specifique d'un antigène Y,etc..Le ruban peut être unique : s'il est traité par des peptides de tous les anticorps marqués utilisés.Il possedera alors un espace "TEST X",un espace "TEST Y",etc..et un seul espace "CTRL" Cet exemple peut très bien s'appliquer aux marqueurs tumoraux : la detection d'un cancer digestif debutant est plus efficace si trois ou plusieurs marqueurs differents sont en excès,alors que pris separément,ils sont peu specifiques : exemple : cancer du colon : le CEA (antigène carcino-embryonnaire) n'est augmenté que dans 55% des cas,le CA 19-9 que dans 60% des cas,le CA 15-5 que dans 45% des cas et l'AFP (alpha foeto proteibne) que dans 50% des cas.Par contre,lorsque au moins trois marqueurs sont en excès,ils signent 99% des cancers du colon.Ainsi un dispositif à trois rubans (ACE,CA 19-9,CA 15-5) où seulement un des marqueurs est en excès,ne doit pas inquieter,alors que si les trois tests delivrent un signal d'excès,il y a une très forte probabilité de cancer et des explorations poussées doivent être effectuées,ciblées sur la sphère digestive. Mais il est egalement possible de reduire ces trois recipients à un seul recipient en y associant les trois anticorps marqués specifiques des trois marqueurs : s'il y a signal,c'est qu'au moins un des trois est en excès : à ce moment là, il faut proceder à un test avec les trois recipients differents pour savoir lequel des marqueurs est en excès et surtout si c'est un ou tous les marqueurs qui sont en excès.Cet exmple est aussi valable pour les differents antigenes HIV ou pour toute affection impliquant plusieurs parametres. La presente invention a egalement pour objet un procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif dans un fluide,qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon de fluide à analyser est mis en contact dans un recipient (A),avec un anticorps marqué,en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction entre en contact avec des peptides (specifiques de l'idiotype de l'anticorps marqué de A) immobilisés sur un support B et aptes - soit à pieger très rapidement l'anticorps marqué provenant de A s'il n'est pas saturé en antigènes (dosage d'antigenes negatif) - soit à le laisser traverser B (pour provoquer un signal à la face inferieure de B) s'il est saturé en antigenes (dosage antigenes positif) - soit aptes à être saturés par les anticorps seriques recherchés et donc laisser traverser B pour un signal de seropositivité (dosage anticorps positif). Si le ligand recherché est un antigène,l'anticorps marqué (en A) forme avec lui un complexe qui va traverser la membrane selective B,tandis que l'anticorps marqué est piégé en B en absence d'antigene dans l'echantillon. Si le ligand recherché est un anticorps,il va y avoir competition au niveau de B entre les anticorps seriques (dont l'idiotype est identique à celui de l'anticorps marqué) et les anticorps marqués (de A) qui ont été associés à l'echantillon : les peptides de la membrane selective B sont rapidement submergés et saturés par l'idiotype des anticorps seriques arrivant en quantités enormes (un sang seropositif en HIV par exemple contient des quantités enormes d'anticorps anti-HIV).Les anticorps marqués ne rencontrent plus de peptide encore disponible sur la membrane B et la traversent pour delivrer plus bas,un signal de seropositivité.Ce signal n'est donc pas dû au passage d'un complexe antigene-anticorps marqué à travers B mais plutôt au "non-piegeage" par B,des anticorps marqués; ;ce "non-piegeage" etant dû à la saturation rapide et importante de la membrane selective B par les anticorps seriques. Ce "non-piegeage d'anticorps marqués,pourtant libres" constitue une des originalités de cette invention et la grande difference avec l'art anterieur. EXEMPLES DE DISPOSITIFS EXEMPLE 1 : Figures 7/Planche VI et Figures 8/Pl. VII PREPARATION D'UN DISPOSITIF DE DOSAGE ANTIGENE HBs 1 - Preparation des anticorps monoclonaux marqués : AH1 et AH2 2 - Preparation des peptides : PH1 et PH2 3 - Preparation du support membranaire B 4 - Mode operatoire du dosage 1 - Les anticorps monoclonaux anti-HBs sont obtenus à partir d'immunisation de souris par l'antigene HBs puis selectionnés parmi tous les anticorps obtenus,pour leur haute affinité et specificité pour les peptides correspondants. Marquage retenu : Fe(CN)6 Nombre : 2 numerotés AH1 et AH2 reconnaissant chacun un epitope different de l'antigène HBs. 2 - Les peptides (dirigés contre le site idiotype de AH1 et de AH2) sont obtenues par digestion de l'antigene HBs puis selectionnés sur colonne par leurs anticorps monoclonaux correspondants. 3 - Le support membranaire : Un ruban de nylon (Pall) de 2 cm2,divisé au crayon en deux carrés sur lesquels on imprime à gauche "TEST" et à droite "CTRL" (contrôle).Au centre du carré "test"on depose 10 microlitres d'une solution contenant les peptides PH1 et PH2 à raison de 10 microgrammes de chaque par ml de PBS+BSA (Bovine serum Albumine).Tandis que sur le carré "ctrl" on depose une solution de PBS+BSA uniquement.Au bout de trois heures on rince et seche. Puis on retourne la membrane et on depose sous chaque carré,3 ul d'une solution alcoolique de benzidine à 1mg/ml. Les carrés "CTRL" vont se colorer de toutes façons au contact de l'echantillon contenant les conjugués car ces derniers,avec ou sans antigènes recherchés,ne seront pas retenus à la face superieure de la case "ctrl" et iront colorer le substrat. Les carrés "TEST",supportant les peptides,piegeront à la surface superieure de B,les anticorps marqués non saturés en antigènes,qui ne pourront donc pas entrer en contact avec le substrat de la face inferieure.Par contre si les anticorps marqués sont saturés en antigenes,ils traversent B et entrent au contact du substrat pour produire un signal. 4 - Mode operatoire - on prelève une goutte de sang total ou de plasma ou de serum de 10 microlitres que l'on verse dans le recipient A contenant 90 microlitres d'une soultion d'anticorps conjugués concentrés à 10 microgrammes/ml dans une solution contenant TRIS 0,1 M,BSA 1%,PEG 1%,Antibiotiques (Gentalline et Mycostatine),serum de veau foetal 1%,Antitrypsine,Aprotinine. Vortex 30 secondes au moins. - on prelève de A 50 microlitres que l'on depose en B sur le carré "ctrl" : un spot bleu apparait immediatement par transparence : les reactifs sont bien conserves. - on prelève les 50 microlitres restants que l'on depose sur le carré "test" et on obtient les resultats suivants notés 0 à +++ en fonction de la concentration d'antigène HBs dans le serum (1 UI = 1 nanogramme/ml) Taux HBs en UI/ml : 0 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 Intensité du spot 0 +/- + +/++ ++ +++ EXEMPLE 2 : Figures 7/planche VI et figures 9/Pl.VIII DOSAGE ANTICORPS ANTI-HBs Même montage, même dispositif. Même prelevement. Si on prelève 50 microlitres d'un serum seropositif connu en anticorps anti-HBs,on obtient les intensités de coloration suivantes en fonction des dilutions opérées sur le serum Taux de dilution : 1/100.000 1/10.000 1/1000 1/100 Signal obtenu : +/- + ++ EXEMPLE 3 : ANTICORPS HIV 1 - Les anticorps et les peptides p24-GP40 et GP120 sont aimablement offerts par Innogenics : deux monoclonaux pour chaque proteine,issus d'immunisation de souris par ces peptides. 2 - le marquage choisi est triple,pour amplifier le signal - ferritine pour le fer - haptoglobine pour exalter la ferritine - nitrate d'argent pour amplifier le spot de substrat 3 - Neutralisation des eventuels anticorps seriques Des microbilles à très grand pouvoir de fixation des proteines (Lab.IBF France) sont traitées avec des peptides issus de virus HIV et placées en solution dans un recipient A0 qui va recevoir en premier l'echantillon à tester.Les anticorps seriques parasites vont s'y fixer immediatement.Le surnageant est alors versé dans les differents recipients suivants (voir plus loin) pour être au contact des anticorps marqués. 4 - Les peptides de B sont preparées à partir des anticorps monoclonaux fournis puis fixés sur une membrane de 4 cm de long et de 1 cm de large,divisée donc en quatre carrés : 1er carré imprimé:"p24" - 2ème carré-"GP41" - 3ème carré "GP120" - 4ème carré "CTRL" Après le rinçage et sechage,on retourne la membrane et on depose un spot de 3 ul de benzidine à 1 mg/ml au centre de chaque carré. MODE OPERATOIRE On prepare un recipient marqué au feutre :"A-p24" avec 90 microlitres de la solution contenant cette fois les deux anticorps monoclonaux marqués anti p-24. Puis un second recipient "A-GP41" avec 90 microlitres de la solution d'anticorps marqués anti GP41,puis un troisième recipient "A-GP120" avec aussi ses anticorps marqués anti-GP120. On verse 10 microlitres de serum à tester provenant du premier recipient A0 (donc debarassé d'anticorps parasites) dans chacun des recipients. Agitation au vortex 30 secondes. On preleve 50 microlitres de n'importe quel recipient et que l'on depose sur le carré "contrôle",on attend la coloration avant de proceder aux 3 tests. Puis on depose 50 microlitres de "A-p24" sur le carré noté p-24,50 microlitres de "A-GP41" sur le carré noté GP41 et 50 microlitres du recipient "A-GPl 20" sur le carré noté Gel 20. En fonction de la presence ou de l'absence de ces antigenes,on obtient les resultats schematisés dans la figure 4 - planche III Les limites de sensibilité obtenues sont de 10 picogrammes/ml. EXEMPLE 4: fIGURE ( Figure 5 / Planche IV DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DU D-DIMERE DANS LE PLASMA Le dosage du D-Dimère et d'autres precurseurs du fibrinogène sont d'actualité et très prometteurs pour detecter la formation de caillot avant que l'embolie ne se produise.Il est possible de faire un diagnostic de pré-infarctus ou de pré-embolie pulmonaire ou de pré ACV (accident vasculaire cerebral) ou de pré- phlebite.Il est bien sûr plus interessant d'intervenir sur un patient avant qu'il ne fasse son infarctus : les traitements et les consequences sont bien moins graves. Le D-Dimère circule dans le sang chez tous les etres humains à un taux inferieur à 0,4 microgrammes/ml de plasma.Au delà,le pronostic d'embolie est très elevé mais n'est pas de 100% : toutes les personnes avec un D-Dimère elevé ne font pas d'embolie.Par contre,100% des personnes ayant moins de 0,4 microgrammes de D Dimère ne font pas d'embolie.Il s'agit donc d'un diagnostic d'exclusion,très utile en urgences,en cardiologie,ou en suivi de reanimation après une intervention chirurgicale ou devant toute suspicion d'accident imminent : : il permet de diriger le diagnostic et le traitement et permet surtout d'eviter ce taux élevé d'embolies pulmonaires post-operatoires ou dans les troubles du rythme cardiaque très generateurs d'embolies.Tout comme il evite des contraintes et soins inutiles à des patients chez lesquels il y a certitude qu'il n'y aura pas d'accident embolique. Les anticorps anti-D-Dimère sont le 2F7 et le 9C3 Les peptides dirigées contre eux sont P2F7 ET P9C3 Le D-Dimère est fourni lyophilisé en flacons de 1mg à reconstituer avec 1 ml d'eau distillée sterile.Le poids moleculaire du D-Dimere est identique au PM de ses anticorps.Donc parité de poids. Tous ces produits ont été aimablement offerts par la société Stago-Diagnostica (Asnières-France). Le principe du dosage semi-quantitatif retenu,va consister à neutraliser 0,4 microgrammes/ml de D-Dimere dans un echantillon par des anticorps NON-MARQUÉS.Pour cela on opere de la façon suivante 1 - Dans un recipient Al contenant une solution à 0,4 microgrammes/ml d'anticorps 2F7 NON-MARQUÉ et 0,4 mg/ml d'anticorps 9C3 NON-MARQUÉ (Parité de poids moleculaire),on verse un egal volume de plasma à tester et on vortexe fort pendant 30 secondes. L'equivalent de 0,4 microgrammes/ml de D-Dimère est pris en sandwich entre le 9C3 non marqué et le 2F7 non marqué.Ce complexe va traverser la membrane selective B sans donner la moindre coloration. 2 - Puis on verse le contenu de Al dans un recipient A2 contenant les anticorps 2F7 ET 9C3 MARQUÉS aux sels de mercure (marquage faible) cette fois et on vortex 30 secondes.Si le taux de D-Dimere est superieur à 0,4 ug/ml,des complexes D-dimere et anticorps marqués se forment pour delivrer un signal d'excès à travers B. 3 - On depose 50 microlitres sur le carré de contrôle avant de deposer 50 microlitres sur le carré de test.Resultats D-D(ug/ml): 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,45 1 Signal : 0 0 0 0 +/- ++ EXEMPLE 4: Figure 6 / Planche V DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE L'ANTIGENE SPECIFIQUE PROSTATIQUE (PSA) Cet exemple est interessant car c'est en fait un dosage semi-semi-quantitatif,c'est à dire qu'à l'interieur même du dosage semi-quantitatif,se trouve une limite entre adenome et carcinome. Le PSA n'existe pas chez les sujets jeunes et est produit entre 0 et 4 nanogrammes/ml de serum en cas d'adenome benin.Il depasse beaucoup ce taux dans l'adeno-carcinome de la prostate pour s'elever jusqu'à parfois 100 nanogrammes /ml. 309s des adenomes benins de la prostate peuvent devenir cancereux. Il serait donc très interessant de pratiquer un suivi regulier des hommes atteints d'adenome pour signaler très tôt l'apparition d'un adeno-carcinome qui peut être bien traité par les nouvelles molecules à action hormonale antagoniste,sans avoir recours à une chirurgie lourde et eviter les metastases vertebrales,fatales. Le dispositif sera donc un ruban de 3 cm de long (3 carrés) sur 1 cm de large et va comprendre un carré imprimé "PSA" pour le dosage qualitatif : le PSA existe ou non,un second carré imprimé " > 4ng/ml"pour le dosage semi-quantitatif avec 4 nanogr/ml comme limite : la coloration se produit si le taux est superieur,et enfin le carré de contrôle. Mode operatoire 1 - Dans un recipient A contenant un anticorps MARQUÉ anti-PSA,on verse 50 microlitres de serum à tester selon les modalités des exemples precedents.Vortex. 2 - Dans un autre recipient Al,contenant 4 nanogrammes/ml (parité de poids moleculaire) d'un anticorps NON-MARQUÉ anti-PSA,on verse 50 autres microlitres du même serum à tester et on vortexe. 3 - Dans un recipient A2 contenant un anticorps MARQUÉ cette fois,on verse le contenu de A1.Si le taux de PSA est superieur à 4 ng/ml,des complexes se forment avec l'anticorps marqué pour delivrer le signal d'excès. La membrane B sera preparée avec des peptides dirigés contre les anticorps marqués anti-PSA On depose d'abord 50 microlitres de A sur le carré "CTRL".Si coloration,on poursuit les operations. On depose 50 microlitres de A sur le carré "PSA" pour uniquement detecter la presence ou l'absence de PSA. Puis on depose 50 microlitres de A2 sur le carré " > 4ng/ml" pour detecter l'excès de PSA. Les resultats obtenus sont illustrés figure 6/pl V. REVENDICATIONS 1 - Procédé immunologique peptides-anti-peptides permettant de doser indifferemment des antigènes ou des anticorps avec le même dispositif, basé sur l'extrême amplification de la reaction immunologique entre un anticorps marqué et son peptide correspondant immobilisé sur un support,reaction un million de fois plus volumineuse et rapide qu'avec des molecules d'antigenes entieres immobilisées sur ce support et caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon est mis en contact dans un recipient A avec un ou des anticorps marqué(s) specifique(s) de l'antigène de l'affection recherchée,puis en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction est mis en contact avec un element poreux B supportant, immobilisés,des peptides specifique de (ou des) l'anticorps marqué (s). Si l'echantillon contient l'antigène recherché,ce dernier se lie à l'anticorps marqué qui n'est plus piégé par les peptides de B,et les complexes ainsi formés (antigène + anticorps marqué) traversent B pour entrer à la face inferieure de B en contact avec un moyen de revelation de la presence de ce complexe. Si l'echantillon contient les anticorps recherchés,ces derniers se lient aux peptides de B,ne laissant plus à l'anticorps marqué la place pour s'y fixer alors qu'il n'est pourtant pas lié à son antigène,et le laissant donc traverser B pour reveler la presence d'anticorps dans 1' echantillon. Si l'echantillon ne contient ni antigène ni anticorps,les anticorps marqués provenant de A vont être piégés par les peptides en B,et aucun signal n'apparait à la face inferieure de B. 2 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semi-quantitatifs d'antigène par neutralisation au cours d'une première etape dans un recipient Ai,d'une certaine quantité seulement d'antigènes (considérée comme physiologique) par des anticorps non marqués et surtout n'ayant pas le même idiotype que celui reconnu par les peptides de B,en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction est mis en contact dans un second recipient A2 avec un (ou des) anticorps marqués avant d'être mis en contact avec les peptides en B. Si le taux d'antigene dans l'echantillon est superieur à la normale,des antigènes restés encore libres après l'etape Aî,forment des complexes avec les anticorps marqués (qui ne sont plus piegés en B) qui vont donc reveler un excès d'antigène à la face inferieure de B. Si le taux d'antigène est inferieur ou egal à la normale, il n'y a plus d'antigène libre après l'etape Al et les anticorps marqués vont presenter en B,qui va les pieger,des sites idiotypes libres.Aucun anticorps marqué ne va traverser B et il n'y aura aucun signal 3 - Procédé selon la revendication 1 et 2,caracterisé en ce qu'il est apte à detecter x antigènes differents en même temps à partir du même echantillon,en ce qu'au cours d'une première etape,l'echantillon,divisé en x parties est placé dans x recipipents differents contenant chacun un anticorps marqué specifique de l'un des x antigènes recherchés; et en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction est mis en contact avec x elements poreux identiques supportant à leur face superieure une association de peptides aptes à pieger tous les anticorps marqués utilisés si les sites de ces derniers sont libres de tout antigène,et aptes à les laisser traverser cet element poreux B,si leur site idiotype est saturé par l'antigène correspondant,pour entrer en contact avec des moyens de revelation de la presence de cet antigène. 4 - Procédé selon la revendication 1 et 2,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semi-semiquantitatifs en revelant au cours d'une première etape la presence pathologique ou l'absence d'un antigène,puis en revelant au cours d'une seconde etape si le taux d'antigène,dejà anormalement present (comme dans plusieurs affections chroniques benignes),est superieur au taux limite generalement admis,impliquant une transformation maligne de cette affection benigne.Le procédé consistera donc en un dosage qualitatif simple comme decrit dans le revendication 1,dans un premier temps,puis en un dosage semiquantitatif comme decrit dans la revendication 2,dans un second temps.Les deux dosages utilisant exactement le même element B.Trois hypotheses peuvent alors se presenter *1 - Première et seconde etape : resultat negatif : absence de pathologie *2 - Première etape positive mais la seconde est negative : Presence de la pathologie mais à un niveau benin *3 - Les deux etapes sont positives pathologie maligne 5 - Dispositif de determination indifferente de la presence d'antigène ou d'anticorps dans un echantillon,caracterisé en ce qu'il comprend - un recipient A contenant le ou les anticorps marqués specifiques de l'affection recherchée,destiné à recevoir et eventuellement diluer un echantillon de fluide biologique,pour mettre en contact au cours de cette première etape du procédé,un eventuel ligand contenu dans l'echantillon,avec le ou les anticorps marqués specifique(s) du ligand recherché, - un ruban B poreux du type papier,nylon,fibre de verre,microbilles,polymère quelconque,de preference transparent ou translucide,et supportant - à la surface superieure DE CERTAINES ZONES seulement appelées zones "TEST",des peptides (specifiques du ou des anticorps marqué(s)) aptes à pieger tout anticorps marqué dont l'idiotype est libre de tout antigène(dosages antigène et anticorps negatifs),et aptes à le laisser traverser ce ruban B * si l'anticorps marqué est saturé par des antigènes (dosage antigène positif) * si les anticorps seriques evenetuellement presents dans l'echantillon saturent completement les peptides de B (dosage anticorps positif). Les zones restées vides,sans peptides,appelées zones "CTRL" (contrôle) servent à evaluer la validité de tous les reactifs (avant de proceder au test proprement dit) par coloration du spot de substrat par l'echantillon contenant l'anticorps marqué,et ceci quelle que soit la presence ou l'absence de ligand recherché dans l'echantillon,du fait que dans ces zones "CTRL",il n'y a pas de peptides immobilisés. - et sur TOUTE sa face inferieure des moyens de revelation du passage des anticorps marqués à travers B,ces moyens pouvant être,mais pas uniquement,un spot ou des traits de substrats chromogenes. 6 - Dispositif selon la revendication 5,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semiquantitatifs d'antigènes,et comprenant - un premier recipient Al dans lequel l'echantillon est mis en contact avec des anticorps non-marqués aptes à neutraliser une certaine quantité seulement,considérée comme physiologique,d'antigènes - un second recipient A2 recevant après un certain temps,le contenu de A1 et contenant des anticorps marqués cette fois,destinés à se lier aux eventuels antigènes en excès,qui sont restés libres après l'etape Al - un support poreux B identique à celui precedemment decrit, qui contient à sa face superieure des peptides specifiques des anticorps marqués (mais non specifiques des anticorps non marqués de la première etape Al) et destinés à pieger les anticorps marqués quand le taux d'antigènes est inferieur à la valeur limite normale, soit à laisser passer ces anticorps marqués (complexés aux antigenes en excès) vers la face inferieure de B pour les mettre en contact avec les moyens de revelation. 7 - Dispositif selon la revendication 6,caracterisé en ce qu'il permet de detecter plusieurs antigenes en même temps, et comprenant - x recipients contenant chacun un anticorps marqué specifique d'un des x antigenes,ces recipients etant destinés à recueillir chacun,au cours d'une première etape,une partie de l'echantillon à tester. - un support poreux B presentant (figure 3 planche II) : -- x carrés reactifs (supportant les peptides specifiques de tous les anticorps marqués utilisés),chacun de ces carrés recevant une goutte du recipient correspondant -- 1 carré non reactif (sans peptides) pour le contrôle de fonctionnement -- et les moyens de revelation à la face inferieure