Brevet FR2705362A1 — publié le 19941125

CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYME MALOLACTIQUE DE LACTOCOCCUS LACTIS. La présente Invention est relative au clonage du gène de structure de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, à sa séquence nucléotidique complète et à la séquence protéique déduite, ainsi qu'à des fragments d'ADN portant la séquence codant pour ce gène. Elle est relative également à 1' expression de ce gène dans différents hôtes procaryotes ou eucaryotes, et en particulier dans SaccharoRyces cerevisiae. La fermentation malolactique, fermentation secondaire qui est observée au cours du processus de vinification en addition de la fermentation alcoolique réalisée par des levures, consiste en la dégradation par certaines bactéries lactiques de l'acide malique présent dans les vins, en acide lactique et C02. Les espèces bactériennes naturellement présentes dans la flore fermentaire et responsables de la fermentation malolactique appartiennent aux genres Lactobacîllus, Leuconostoc et Pediococcus. Cette réaction présente deux avantages principaux - Elle conduit à une désacidification du vin par transformation d'un diacide (L-malate) en un monoacide (L-lactate), dont les conséquences sont avantageuses au niveau organoleptique, pour la majorité des vins rouges et certains vins blancs, - Elle permet la stabilisation microbiologique du vin, et donc une meilleure conservation, par utilisation d'un substrat fermentescible, ce qui empêche des fermentations ultérieures par d'autres souches de microorganismes indésirables. Enfin la fermentation malolactique peut avoir une influence sur la qualité du vin au niveau aromatique. Cette réaction pose toutefois un certain nombre de problèmes, du fait de sa lenteur et de son caractère incontrôlable. La fermentation malolactique ne se produit spontanément qu'à la fin du processus naturel de vinification ; en effet, le pH, la teneur en éthanol et la présence de S02 dans le vin ralentissent considérablement la croissance des bactéries lactiques naturellement présentes dans la masse fermentaire et responsables de la fermentation malolactique. Pour tenter d'accélérer cette fermentation, la technique la plus couramment employée réside en l'adjonction au milieu fermentaire, d'un inoculat de bactéries lactiques. Toutefois, cette technique ne résout pas toujours les problèmes d'implantation des bactéries lactiques, en raison de leur difficulté à s'adapter au milieu vin. D'autre part, l'introduction de bactéries lactiques revient à introduire, outre l'enzyme malolactique dont l'activité est recherchée, de nombreuses autres enzymes, dont l'action sur les nombreux substrats présents dans le vin, peut aboutir à une évolution très difficilement contrôlable des qualités organoleptiques du produit. I1 serait donc souhaitable d'avoir la possibilité de mettre en oeuvre la fermentation malolactique de façon à aboutir rapidement, et en éliminant des variables incontrôlables, à une amélioration du produit obtenu. Dans le but de mieux contrôler la fermentation malolactique, il a été proposé de cloner les gènes des enzymes malolactiques des bactéries lactiques, de les introduire et exprimer dans un microorganisme normalement impliqué dans la fabrication du vin, tel que s. Cerevisiae. WILLIAMS et al. [App. Environ. Microbiol. 47 288-293 (1984)], ainsi que la Demande Européenne 103300 décrivent le clonage d'un fragment d'ADN de 5 kb portant le gène de l'enzyme malolactique de L. delbrueckii chez s. Cerevisiae et chez E. coli. Le gène de l'enzyme malolactique de L. oenos a également été cloné chez E. Coli [LAUTENACH et al., Microbiol., 39 : 29-39 (1984)]. Toutefois, les souches de microorganismes transformés n'expriment le gène qu'à un taux très faible, insuffisant pour permettre son utilisation dans la fabrication du vin. En outre dans les 2 cas, une instabilité de l'ADN cloné chez E. Coli a été observée, allant même jusqu'à entraîner une perte complète du gène. D'autre part une enzyme malolactique, présentant une activité d'un niveau comparable à celle de l'enzyme malolactique des bactéries des genres Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus mentionnés plus haut a récemment été purifiée à partir de Lactococcus lactis. C'est une protéine d'environ 230 kDa, constituée de sous-unités d'environ 56 kDa. Son pHi est d'environ 4,3, et son Km pour l'acide malique est d'environ 10 à 12 mM. Sa séquence N-terminale a également été déterminée [RENAULT, Malolactic fermentation Genetics and Genetic Engineering, GIM90, 6th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Strasbourg (1990)]. A partir d'une préparation purifiée de cette enzyme malolactique, les Inventeurs ont obtenu des préparations d'anticorps polyclonaux spécifiquement dirigés contre cette enzyme. Une banque d'ADN de Lactococcus lactis a ensuite été réalisée dans le vecteur kgtll, dans E. coli. Le criblage de cette banque avec les anticorps obtenus a permis de cloner des fragments d'ADN, qui représentent à eux tous 4.5 kb d'une même région d'ADN génomique de Lactococcus lactis, contenant le gène malolactique, et un fragment du gène de la malate perméase, ces gènes étant organisés en opéron. Les Inventeurs ont identifié un fragment d'ADN de 2684 pb incluant la totalité du gène de l'enzyme malolactique, et ont déterminé la séquence de ce fragment, qui est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID.NO.1. En outre, l'expression du gène malolactique a été obtenue dans différents hôtes, procaryotes et eucaryotes. Ainsi, l'introduction du gène malolactique de Lactococcus lactis dans E. coli, sous contrôle de ses propres éléments de régulation ainsi que l'expression dudit gène dans la levure sous contrôle d'éléments de régulation de levure font été réalisées. La présente Invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis. Par "séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis" on entend en particulier la séquence codante s'étendant des nucléotides 466 à 2085 (inclus) de la séquence SEQ. ID. NO 1 représentée dans la liste des séquences en annexe, ainsi que toute séquence qui, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, code pour le même polypeptide ; cette définition comprend également les séquences portant des modifications mineures destinées à permettre une meilleure expression du gène dans un hôte déterminé. L'Invention englobe également des fragments d'acide nucléique comprenant une séquence homologue ou complémentaire de la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, telle que définie cidessus, ou d'un fragment d'au moins 10-mères, préférentiellement au moins 20-mères, de ladite séquence, et utilisables en particulier comme sondes pour la localisation dudit gène et/ou comme amorces pour son amplification. L'Invention a également pour objet des cassettes d'expression, comprenant la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences propres à réguler l'expression dudit gène. Par "séquences régulant l'expression d'un gène" on entend des séquences de type promoteur et terminateur actives chez l'hôte dans lequel on souhaite obtenir l'expression dudit gêne. Les promoteurs et terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés, associés dans des combinaisons différentes. Parmi les séquences utilisables pour obtenir l'expression dans la levure du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, on citera, à titre d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs, connus en eux-mêmes, des gènes de l'alcooldéshydrogénase I (ADHI), de la phosphoglycérate kinase (PGK), et de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). Les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent être portées par des plasmides, ou intégrées dans l'ADN chromosomique de la levure hôte. L'Invention a également pour objet des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN comportant la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs comprennent des séquences de régulation actives dans la levure. Avantageusement, les vecteurs conformes à l'Invention sont des vecteurs navette, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène de résistance à un antibiotique). Ces vecteurs pourront être sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choisir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou toute autre séquence permettant de contrôler et de réguler l'expression d'un gène dans la levure. Un autre critère du choix des vecteurs réside dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné par le choix de l'origine de réplication. A titre d'exemple, un choix peut être fait entre les vecteurs suivants Vecteur réplicatif (YEp) à haut nombre de copies, possédant comme origine de réplication dans la levure une partie du plasmide 2 endogène. Vecteur réplicatif (YRp) à haut nombre de copies, possédant comme origine de réplication une séquence ARS chromosomique. Vecteur réplicatif (YLp) linéaire à haut nombre de copies possédant des séquences télomériques comme origine de réplication. Vecteur réplicatif (YCp) à bas nombre de copies, possédant une séquence ARS chromosomique et une séquence centromérique. Préférentiellement, les vecteurs conformes à l'Invention comportent également des marqueurs de sélection dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE, etc ...et/ou des marqueurs de résistance à des antibiotiques (G418, hygromycine B, chloramphénicol, phléomycine), à des herbicides (sulfométuron methyl), au cuivre, etc... Des vecteurs conformes à l'Invention, portant le gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis peuvent être introduits dans toutes souches de levure, par différentes techniques de transformation. Parmi les techniques de transformation les plus courantes utilisables on citera la technique des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et l'électroporation. Dans tous les cas, le procédé de cette construction comprend les étapes suivantes - construction d'une cassette d'expression comprenant le gène de l'enzyme malolactique et des éléments régulateurs de force variable - introduction de cette cassette soit en monocopie, soit en multicopie dans la levure. On peut également choisir d'intégrer le gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, muni de ses séquences de contrôle, dans le génome de la levure, auquel cas on choisira par exemple un vecteur intégratif (YIp) ne possédant pas d'origine de réplication dans la levure ; il est également possible d'intégrer ce gène en utilisant d'autres techniques, par exemple la cotransformation. La présente Invention a également pour objet des souches de cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'ADN hétérologue portant au moins une copie d'un gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences régulant l'expression dudit gène dans ladite cellule. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdites cellules sont des cellules de levure. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au genre saccharonvces. I1 est possible de moduler le taux d'expression du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, en jouant notamment sur le nombre de copies du gène introduites dans la levure, et/ou sur la force des éléments de régulation qui y sont associés. Les souches de levure conformes à l'invention trouvent de nombreuses applications dans l'agro-alimentaire et en particulier dans le domaine de l'oenologie pour accomplir la fermentation malolactique. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant le clonage du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis et son expression dans des bactéries et des levures. - Méthodes générales L'enzyme malolactique a été purifiée comme décrit par RENAULT (1990, communication précitée) ; cf. aussi C. ROULLAND, (DEA d'oenologie-ampélologie, Septembre 1988, Université de Bordeaux II) Les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire auquelles il est fait référence dans les exemples qui suivent sont celles décrites par SAMBROOK et al.[ Molécular Cloning A Laboratory Manual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nv. (1989)] EXEMPLE 1 - PURIFICATION DE L'ENZYME NALOLACTIOUE Le protocole d'extraction est brièvement rappelé ciaprès : Souche - conditions de culture Lactococcus lactis (IL 1441) est cultivé dans le milieu suivant Extrait de levure 6 g Tryptone 2g Glucose 15 g Acide DL Malique 15 g K2HPO4 0,5 g KH2PO4 0,5 g MgSO4 0,4 g NaCl 0,02 g FeSO4 0,004 g MnSO4 0,02 g H2O qsp 1 1 Le pH est ajusté à 5%. Le milieu stérile est inoculé avec 10% (v/v) d'une préculture. - Prétaration d'un extrait brut et dosaaes Les cellules sont cultivées dans 3 litres du milieu ci-dessus à 28 C, pendant 24 heures, récoltées par centrifugation à 1000 g pendant 10 mn à 4 C, et lavées 2 fois avec NaCl 0,9%. Le culot est repris dans 30 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 6,0). Les cellules sont broyées aux ultrasons pendant 6 mn à 0 C. Après centrifugation (30 000g, 15 mn, à 4 C) le surnageant constitue l'extrait brut. Les protéines sont dosées par le BCA Protein Assay Reagent (PIERCE). L'activité malolactique est mesurée par la décarboxylation de l'acide malique suivie avec une électrode à C02 (EISCHWEILER). - Purification de l'enzyme Après traitement par la DNAse I (1 mg/ml et 15 mn d'incubation à température ambiante), l'extrait brut est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (35% de saturation, puis 70%). Le surnageant de la précipitation à 70% n'a pas d'activité. Le culot, repris dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 6,0, et qui contient toute l'activité malolactique est déposé sur une colonne de filtration sur gel ACA 34 (ULTROGEL ; domaine de fractionnement de 20 000 à 350 000) de 40 cm de longueur et 2,6 cm de diamètre, préalablement équilibrée par le tampon d'élution : tampon phosphate 0,01 M, pH 6,0, KC1 0,1 M. L'élution est effectuée avec un débit de 18 ml/h. Le volume des fractions collectées est de 2,4 ml. Dans ces conditions les fractions les plus actives correspondent aux fractions 50 à 54. Elles sont rassemblées en vue d'une purification complémentaire par électrofocalisation. L'électrofocalisation est réalisée sur colonne LKB de 110 ml. Le gradient de pH est formé grâce aux ampholines utilisées à 2% et stabilisé par un gradient de densité de glycérol établi lors du remplissage de la colonne. La fraction la plus active qui focalise au pH de 4,3, pHi de la protéine, est récupérée, puis subit une étape supplémentaire de purification par chromatographie dtéchange d'ions (colonne échangeuse d'anions SEPHAROSE Q, PiR1SCIA). L'élution est effectuée par un gradient de 0 à 0,5 M NaCl, dans un tampon Tris-Hcl 50 mM, pH 7,6, EDTA 0,1 mM, ss-mercaptoéthanol 1 mM La fraction renfermant l'activité malolactique est éluée à une concentration en NaCl de 0,33 M. C'est cette fraction qui est utilisée pour l'obtention d'anticorps. EXEMPLE 2 : OBTENTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX DIRIGES CONTRE L'ENZYME MALOLACTIOUE DE LACTOCOCCUS LACTIS Les anticorps ont été obtenus par injection à deux lapins d'une partie de la préparation purifiée de protéine malolactique selon le protocole suivant - Injection sous-cutanée de 2 ml de solution de protéine malolactique (100 g dans tampon NaCl 0,3 M) additionnés de 2 ml d'adjuvant de Freund complet. - Deuxième injection 40 jours après, avec la même quantité de protéine malolactique et 2 ml d'adjuvant de Freund incomplet. Le sang des deux lapins est récupéré 12 jours après la 2ème injection, laissé 24 h à 4 C pour permettre la coagulation, centrifugé à 10 000 g pendant 10 mn à 4, et le sérum récupéré est aliquoté et stocké à -20'C. Les anticorps anti-enzyme malolactique ont ensuite été testés par test ELISA réalisé sur les deux sérums (appelés 120 et 119) obtenus à partir du sérum des lapins selon le protocole décrit par SAMBROOK et al.[(1989)]. Cette analyse a permis de déterminer que la dilution optimale pour l'utilisation des anticorps était de 1/1000ème. La spécificité des anticorps a alors été déterminée par transfert immunoélectrophorétique (Western blot). Les protéines d'un extrait brut de Lactococcus lactis (préparé comme décrit à l'Exemple 1) d'une part, et de la préparation purifiée d'enzyme malolactique d'autre part, ont été séparées par électrophorèse SDS PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose. Les anticorps polyclonaux obtenus sont alors fixés sur la membrane et révélés par des anticorps antilapin couplés à la phosphatase alcaline. Le sérum 120 reconnait sur l'extrait brut et sur la fraction purifiée, une bande majoritaire de poids moléculaire environ 60kD correspondant à l'enzyme malolactique, et plusieurs bandes contaminantes de poids moléculaire inférieur. En revanche, le sérum 119 reconnait sur la fraction purifiée, comme sur l'extrait brut, une seule bande, correspondant à l'enzyme malolactique ; ce sérum très spécifique a donc été utilisé pour les expériences ultérieures. EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION D'UNE BANQW D'EXPRESSION D'ADN GENOMIQUE DE LACTOCOCCUS LACTIS DANS s. COLI a) Extraction de 1'ADN de Lactococcus lactis La banque d'ADN génomique de Lactococcus lactis a été réalisée dans le vecteur Xgtll. L'ADN génomique de Lactococcus lactis IL 1441 a, dans un premier temps, été extrait et purifié. Pour cela, 500 ml d'une culture en phase exponentielle sont centrifugés à 5000g pendant 10 mn. Le culot est repris dans 5 ml de TE (Tris 10 li EDTA 1 mM pH 8) contenant 150 mM de NaCl et 1 mg/ml de lysozyme, et incubé 10 min à 37 C. 1 ml de SDS, 25% dans de l'EDTA, 0,1 M pH 8 sont ajoutés et le mélange est incubé 15 min à 60'C. L'ADN est purifié par deux extractions au phénol-chloroforme, suivies de deux autres au chloroforme-alcool isoamylique (24:1). Une purification finale est réalisée sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium. Le bromure d'éthidium est extrait à l'alcool isoamylique. Après dilution par 2 volumes d'eau, l'ADN est précipité par 6 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à la baguette et dissous dans 1 ml de TE. La concentration de l'ADN en solution a été déterminée (1 ,ug/lll) par mesure de la DO à 260 nm. b) Digestion de l'ADN de Lactococcus lactis 125 g d'ADN de Lactococcus lactis sont digérés partiellement par deux unités d'enzyme AluI et deux unités de HaeIII pendant 35 min. à 37 C de manière à générer des extrémités à bouts francs. La digestion est arrêtée par addition d'EDTA à 0,1 M final. L'ADN digéré est précipité par 1/20 vol d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol. Après centrifugation, l'ADN est repris dans 300 au de TE et les fragments séparés sur gradient de sucrose pendant 15 heures à 25000 rpm. Des fractions de 0,5 ml sont récoltées et analysées sur gel d'agarose 0,8%. La fraction contenant des fragments de 1,5 et 4 Kb est dialysée contre du TE pendant 4 heures. c) Libration de l'ADN diéré au vecteur Batll Le vecteur kgtll (dérivé du bactériophage B) a été choisi pour réaliser la banque d'expression. Le principe de réalisation de la banque consiste à insérer des fragments d'ADN dans la région 3' de la phase codante du gène de la ss-galactosidase, de façon à exprimer des protéines hybrides sous contrôle du promoteur de la ss- galactosidase. Un kit de clonage dans kgtII (AMERSHAM), a été utilisé selon le protocole préconisé par le fournisseur. 1 tjg d'ADN digéré (à bouts francs) et dialysé comme décrit ci-dessus a été inséré dans le vecteur kgtll selon le principe suivant L'ADN est ligué à des adaptateurs déphosphorylés possédant une extrémité à bout franc et une autre extrémité cohésive EcoRI. Après élimination des adaptateurs libres par purification sur colonne d'exclusion, les fragments d'ADN "adaptés" sont phosphorylés et ligués aux bras du vecteur également digérés par EcoR1 et déphosphorylés. L'empaquetage in vitro des particules phagiques est ensuite réalisé. La banque ainsi obtenue a été titrée par infection de la souche bactérienne E. coli 1090 [hSd (r-km+k) lac U169, ProA+, clone. aras139, StrA, SupF, trpC22 : TnlO(pMC9)] par une fraction aliquote de la suspension phagique, et les transformants sélectionnés sur milieu LB (bactotryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 10 g/l) + ampicilline (50 Ag/ml) à 43 C (pour induire la lyse bactérienne). Les plages de lyse sont obtenues après 4h d'incubation. La banque ainsi obtenue représente environ 3 fois le génome de Lactococcus lactis. EXEMPLE 4 : CRIBLAGE DE LA BANOUE D'ADN GENOMIOUE a) Etalement de la banque et oréDaration des filtres 75000 plages de lyse ont été obtenues par étalement de la banque sur milieu LB+ ampicilline + MgC12 et incubation 3h30 à 43 C (conditions de non-expression). Les boîtes sont recouvertes de filtres de nitrocellulose (C extra, AMERSHAM), imprégnés d'IPTG 10 mM et incubées pendant 4 h à 37 C, de manière à induire l'expression. Les filtres sont rincés dans du TNT (Tris-HCl 10 mM pH 8, NaC1 150 mM, Tween 20 0,05%), puis incubés avec légère agitation 30 min à température ambiante dans le même tampon. Afin de limiter la détection de clones "faux positifs" pouvant hybrider de manière non spécifique lors du criblage de la banque, une deuxième série de filtres, constituant des doubles de la première série, ont été déposés sur les boîtes, incubés et traités de la même façon. b) EDuisement du sérum 119 Le criblage immunologique de la banque est réalisé à l'aide du sérum 119 préalablement épuisé contre les protéines de E. coli L'épuisement du sérum est effectué comme suit Une culture de E. coli Y1090 est réalisée dans 100 ml de LB + ampicilline pendant 24h à 37 C. La culture est centrifugée à 5000 g pendant 10 min à 4 C. Le culot est repris dans 3 ml de tampon (Tris 50 mM EDTA 10 mM pH 8), et la suspension congelée à -20'C et décongelée (plusieurs fois). Les cellules sont lysées complètement par sonication à 0 C (six fois 20 secondes), puis centrifugées à 12000 g pendant 10 min à 4 C. Le lysat est récupéré et incubé 4h à température ambiante en présence de 1 ml d'anticorps 119 dilué au 1/10 dans du tampon TNT + 1% gélatine + 3% BSA + 5% lait écrémé en poudre. Le sérum épuisé est stocké à 4 C en présence d'azide de sodium (0,05%). c) Criblage immunoloQicxue de la banaue Les filtres de nitrocellulose sont alors incubés en présence du sérum 119 épuisé comme décrit cidessus, et la révélation des anticorps fixés est réalisée à l'aide d'anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline, comme décrit précédemment. Seuls les clones montrant un signal positif sur les deux filtres ont été pris en considération. 24 clones positifs ont ainsi été sélectionnés. Afin de vérifier la spécificité du signal obtenu, les clones positifs ont été sous-clonés et une deuxième détection à l'aide des anticorps a été réalisée. Autour de chaque plage de lyse positive, une carotte d'agarose est prélevée et incubée dans 500 1ll de tampon SM (NaCl 6 g/l, MgSO4 7H2O 2 g/l, Tris base 6 g/l, gélatine 0,01 % pH 7,5), pendant 2 heures à 4 C afin de permettre la diffusion des particules phagiques. Cette suspension est de nouveau utilisée pour infecter E. coli 1090 et le mélange étalé sur boîte LB + ampicilline + MgCl2 comme précédemment, de façon à obtenir des plages de lyses très isolées. Un deuxième criblage par le sérum 119 réalisé comme précédemment a permis d'éliminer 14 clones sur les 24 testés, qui ne présentaient plus de signaux significatifs. Les 10 autres clones, très nettement positifs ont été sélectionnés. d) Caractérisation des clones recombinants L'ADN phagique des 10 clones positifs a été extrait et analysé. Une plage de lyse positive bien isolée (sous-clone) a été systématiquement utilisée comme matériel de départ. L'ADN est extrait à partir des plages de lyse confluantes sur boîtes LB + ampicilline. Les boîtes sont recouvertes de 5 ml de tampon SM et agitées à 4 C pendant 2 heures. La suspension est récupérée, additionnée de quelques gouttes de chloroforme, et centrifugée à 4000 g pendant 10 min à 4 C pour éliminer les débris bactériens. L'ADN est extrait à partir de la suspension phagique ainsi purifiée. La première analyse a consisté à amplifier par PCR les inserts portés par les phages recombinants pour en déterminer la taille. Deux oligonucléotides [lambda gtll Primer (forward) 24-MER et lambda gtll Primer (reverse) 24-MER, Société BIOLABS] correspondant à des séquences de la ss-galactosidase entourant le site de clonage EcoRI ont été utilisés comme amorces d'amplification des inserts. L'analyse des produits d'amplification sur gel d'agarose (1,6%) a permis de déterminer que les 10 clones Xgtll sélectionnés avaient des inserts de taille comprise entre 2 et 3,5 kb. Afin d'établir la carte de restriction des fragments d'ADN clonés, les inserts des vecteurs kgtll ont été sous-clonés dans le plasmide pUC18 [YANISH-PERRON et al. Gene n 33, p. 103-119, (1985)]. Le sous-clonage de 6 inserts a ainsi pu être obtenu. La carte de restriction des 6 inserts a été réalisée ; 5 des 6 inserts présentent une région commune, suggérant que ces 5 inserts proviennent d'un même fragment génomique. Ceci a été vérifié par hybridation de Southern de fragments de restriction d'ADN génomique de Lactococcus lactis séparés sur gel d'agarose et transférés sur membrane de Nylon, avec les inserts marqués radioactivement au 32P. Les cartes de restriction de 4 de ces 5 inserts sont représentées d'ADN hybrident avec la sonde ; ce qui prouve que l'extrémité 5' du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis est contenue dans les 5 inserts clonés. Par contre, aucune hybridation n'a été détectée sur le 6ème clone. e) Séquence du clone P153A La séquence nucléotidique d'un des 5 clones P153A présentant un insert de 2,7 kb a été déterminée par la méthode de didéoxiterminaison sur un séquenceur Applied Biosystem. La séquence totale de l'insert est représentée en annexe, sous le numéro d'identification SEQ ID NO 1, ainsi que la séquence en acides aminés qui en est déduite. La région codante du gène malolactique est de 1620 nucléotides. Les 20 premiers acides aminés déduits de la séquence nucléotidique obtenue sont identiques à la séquence protéique déterminée à partir de l'enzyme purifiée, à l'exception du 14ème acide aminé (lysine au lieu de cystéine déterminée à partir de l'enzyme purifiée). Cette phase ouverte de lecture est susceptible de coder pour une protéine de 53 kD, ce qui est tout à fait compatible avec la taille de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis estimée par gel filtration et par électrophorèse SDS-PAGE (environ 60kD). La séquence SEQ ID NO 1 comprend en outre 465 nucléotides en amont du codon d'initiation de la traduction. Cette séquence comprend l'intégralité du promoteur du gène de l'enzyme malolactique. Les promoteurs de Lactococcus lactis ont une taille de l'ordre de 150 nucléotides en amont du codon d'initiation. De plus, les signaux caractéristiques d' initiation de transcription des gènes de Lactococcus lactis sont présents. En aval de la phase ouverte de lecture, 596 nucléotides ont été séquencés, et une autre phase ouverte de lecture de 581 nucléotides a été mise en évidence en 3' du gène malolactique dans un autre cadre de lecture. La recherche d'homologies avec les gènes ou protéines connues a été réalisée par comparaison de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1, et des séquences protéiques déduites avec des bases de données. - En ce qui concerne la phase ouverte de lecture de 1620 nucléotides, des conservations très importantes en acides aminés et en nucléotides ont été mises en évidence avec différentes enzymes maliques, responsables de la décarboxylation du malate en pyruvate. D'autre part, une séquence consensus de liaison du NAD a été retrouvée. Ces homologies sont parfaitement en accord avec la fonction de l'enzyme malolactique, qui utilise, comme l'enzyme malique, le malate comme substrat, et exige du NAD pour la transformation du substrat en lactate. - En ce qui concerne le début de phase de lecture identifiée en aval du gène malolactique, des homologies en acides aminés, également importantes (de l'ordre de 409s) ont été identifiées avec des citrate perméases. I1 paraît extrêmement probable que cette phase ouverte de lecture puisse correspondre à la région 5 d'une malate perméase. I1 apparaît donc que sont présents sur le fragment d'ADN séquencé le gène de structure codant pour l'enzyme malolactique, et une partie du gène de la malate perméase, et que ces gènes sont organisés en opéron. EXEMPLE 5 : EXPRESSION DU GENE MALOLACTIOZE CHEZ E. COLI L'expression du gène malolactique a été étudiée chez E. coli, chez différents tranformants de la souche bactérienne DH5a: p153A (clone séquencé), p5A, p191A (voir cartes de restriction, Figure 1). Les transformants ainsi que la souche témoin DH5a transformée par pUC18, ont été ensemencés dans une gamme de milieux de culture à concentration croissante en malate : 3 ml de milieu M9 (Na2HPO4,7H2O 6g/l, KH2P04 3g/l, NaCl 0,5g/l, NH4C1 lg/l, glucose 4g/l), additionné de thiamine lmg/l, acide aspartique 20mg/l et d'ampicilline 20mg/l, et contenant 0 ; 0,3 ; 0,5 ou 1% de malate (p/v). Le milieu est tamponné à pH 6,5 par addition d'acide citrique. Les cultures ont été incubées à 37 C, avec agitation, pendant 48h. A titre de témoin, Lactococcus lactis a été cultivé dans 8 ml de milieu M9 contenant 5g/l de "YEAST EXTRACT" et la même gamme de malate. Les cultures ont été incubées à 28 C, pendant 48 h, en anaérobiose. Les cultures ont alors été centrifugées 10 min à 4000g. Les surnageants ont été récupérés et testés pour la présence de L-lactate. Le dosage du L-lactate a été réalisé à l'aide d'un kit (BOEHRINGER), selon le protocole décrit par le fournisseur. Les résultats, présentés dans le tableau I cidessous (exprimés en g/l), montrent une production très nette de lactate dans le surnageant de culture des transformants p153A et pl91A, alors qu'aucune trace de lactate n'est détectée dans le surnageant de la souche témoin (E. coli DH5 transformée par pUCl8). Un autre transformant, p5A, qui a été testé dans les mêmes conditions, ne produit par contre pas de lactate. Ceci s'explique par le fait que le gène malolactique porté par le vecteur recombinant p5A présente une extrémité 3' tronquée de 200 nucléotides. Cette région semble donc essentielle à l'activité malolactique. En absence de malate, il n'y a pas de production significative de lactate dans le surnageant de culture des transformants p153A et pl91A, ni de la souche témoin transformée par pUC18. Ceci s'explique par le fait que E. coli ne produit pas de L-lactate dans ces conditions de culture. En présence de malate, aucune production de lactate n'est observée pour la souche témoin. Par contre, en ce qui concerne les transformants p153A et pl91A, une production significative de lactate est observée, en présence de 0,1, 0,3, et 1% de malate. Le taux de lactate produit est assez faible si on le compare à celui produit par la souche témoin de L. lactis testée dans les mêmes conditions et à partir des mêmes concentrations en malate. Cependant, il convient de noter que la production de L-lactate dans L. lactis correspond au L-lactate produit par fermentation malolactique, et également à une proportion importante de L-lactate produit par dégradation des sucres, via la L-LDH qui convertit le pyruvate en lactate. D'autre part, il est difficile de déterminer la part de malate qui est réellement disponible pour la fermentation malolactique. En effet, dans les conditions de culture utilisées pour E. coli, une partie non négligeable du malate peut être utilisé via le cycle tricarboxylique. TABLEAU I Souche bactérienne % malate dans le milieu de culture 0 0,3 0,5 1 E. coli DH5a(pUC18) 0,001 0,017 0,008 0,015 E. coli (p153A) 0,015 0,12 0,23 0,31 E. coli (pl91A) 0,017 0,17 0,15 0,2 Lactococcus lactis 2,6 5,09 8,5 EXEMPLE 6 : EXPRESSION DU GENE MALOLACTIOUE DANS LA LEVURE Afin de réaliser l'expression du gène malolactique cloné dans la levure, la région codante a été placée sous contrôle d'éléments régulateurs (promoteurs et terminateurs) de levure, dans des vecteurs navette levure/E. coli. a) Introduction du crène malolacticue sur le plasmide multiconie cVT100-U Le plasmide d'expression pVT100-U a été utilisé. Ce plasmide contient l'origine de réplication de levure 2,u, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH (promoteur et terminateur de l'alcool déshyrogénase I), ainsi que les éléments bactériens (origine de réplication et gène de résistance à l'ampicilline). Ce plasmide a été décrit par VERNET et al [Gene 52 ; 225-233, (1987)] La région codante du gène malolactique a été amplifiée par PCR à partir du plasmide p153A, à l'aide d'amorces constituées d'oligonucléotides dérivés de la séquence du gène malolactique. Afin de faciliter le clonage, l'introduction de sites de restriction XhoI en amont et XbaI en aval de la région codante a été réalisée au cours des amplifications. Les oligonucléotides utilisés comme amorces sont - un oligonucléotide permettant d'isoler la région codante au niveau du codon d'initiation de la traduction ATG (amorce 1) et comportant un site XhoI - Du côté 3', l'oligonucléotide choisi (amorce 3') est localisé à quelques nucléotides en aval du codon de terminaison de la traduction. Les séquences ainsi que les positions exactes des amorces utilisées sont indiquées sur la figure 2. L'amplification a été réalisée de la manière suivante amorce 1 4 l (30pmoles) amorce 3 4,ul(30pmoles) Taq buffer 10X 10 F1 Taq polymérase (5 / l) 0,5l dNTP 2llM 10 1 MgC12 25mM 6111 p153A 4 CL1 (40ng) H20 62 A1 Conditions d'amplification : 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 40 C, 1 min à 72 C pendant 30 cycles. La taille des fragments amplifiés a été vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose. 100ng des fragments amplifiés ont été digérés par XhoI et XbaI et ligués à 50ng de vecteur pVT100-U préalablement digéré par XhoI et XbaI et déphosphorylé. Le vecteur pVT100-U obtenu, dénommé pM1, est représenté à la figure 3. b) Transformation de la levure La souche de levure Saccharomyces cerevisiae SCV5M a été transformée par le vecteur pM1. La souche SCVSM a été déposée le 18 juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le numéro I-1222. I1 s'agit d'une souche de laboratoire haplolde, ura, MATa, dérivée d'une souche oenologique. La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. [J. Bacteriol. n 153, pp. 163-168, (1983)]. c) Obtention de la fermentation malolactipue dans la levure Deux des transformants obtenus, dénommés ScV5M/pMIa et ScV5M/pMIb ont été testés pour leur capacité à réaliser la fermentation malolactique (conversion du malate en lactate) ; ces transformants ont été cultivés dans les conditions suivantes - d'une part, sur milieu synthétique minimum YNB (6,7 g/l "Yeast nitrogen base without aminoacid" (DIFCO), 20 g/l glucose) contenant 0, 0,6 ou 1% de malate, tamponné soit à pH 3, soit à pH 6 avec de l'acide citrique (6,3 g/l). - d'autre part, sur milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisin, [SABLAYROLLES et BARRE, Sciences des Aliments, n 6, p. 373-383 (1986)], tamponné à pH 3,3. Les deux milieux utilisés ne contiennent pas d'uracile, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides. Un transformant de ScV5M par le plasmide pVT100-U ne contenant pas d'insert a été utilisé comme témoin négatif. CONDITIONS DE CULTURE ET DE DOSAGE 8 ml de milieu sont ensemencés par les souches de levures (transformants et témoin). La croissance est réalisée dans des tubes stériles de 10 ml, à 28 C, pendant 60 h, sans agitation. Les cultures sont centrifugées 5 min à 4000 g et le surnageant testé pour la production de L-lactate en utilisant un kit Boehringer, comme indiqué à l'Exemple 5. RESULTATS Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau II. Sur milieu synthétique minimum YNB (Tableau II), en absence comme en présence de malate (0,3 et 1%), aucune trace de L-lactate n'est détectée avec la levure témoin (ScV5M/pVTU). Ceci est tout à fait en accord avec le fait que S. cerevisiae est incapable de réaliser la transformation du malate en lactate, et que, d'autre part, en anaérobiose, elle ne produit que des traces de lactate à partir du glucose, principalement sous forme de D-lactate. Les souches transformées pMla et pMlb, en l'absence de malate, produisent des traces de L-lactate, de l'ordre d'une cinquantaine à une centaine de milligrammes. I1 est probable que cette légère production provient de la conversion par l'enzyme malolactique d'une partie du malate endogène de la levure, métabolisé à partir du glucose. En présence de malate dans le milieu de culture (0,6 et 1%), et dans les milieux YNB tamponnés à pH 3, ou sur moût synthétique (pH 3,3), une production très significative de L-lactate (de 0,5 à 0,7 g/l pour le clone pMîa dans ces conditions expérimentales) est observée. La production la plus importante est observée sur moût synthétique dont la composition est très proche de celle des moûts de raisin (0,7 g/l de L-lactate soit 7,7 llmoles/ml). Dans les mêmes conditions de culture (YNB) mais à pH 6, la production de L-lactate est très faible, du même ordre de grandeur quten l'absence de malate. La différence de production de L-lactate selon le pH du milieu de culture pourrait s'expliquer par un problème de perméation du malate chez S. cerevisiae à pH 6. A pH 3 ou 3,3, une grande partie du malate (pK 3,5) se trouvant sous forme non-dissociée peut entrer à l'intérieur de la cellule par simple diffusion. Par contre à pH 6 le malate, principalement sous forme dissociée entrerait moins facilement à l'intérieur de la cellule. Les souches recombinantes dégradent donc le malate en lactate par fermentation malolactique, et avec une efficacité plus grande à pH acide, donc en conditions proches de celles de l'oenologie. TABLEAU II : DOSAGE DU LACTATE CHEZ S. CEREVISIAE Souches de levure L-lactate produit L-lactate produit (g/l) ( mole/ml) ScVRM/pVT100-U - dans (pH = 3) 0% malate 2,4.10-3 0,02 0,6% malate 7.10-3 0,07 1% malate 9.10-3 0,1 - dans (pH = 6) 0% malate 3.10-3 0,03 0,6% malate 6.10-3 0,06 1% malate 10.10-3 0,11 - Moût synthétique (pH = 3,3) 9.10-3 0,1 ScV5M/gM1a - dans (pH = 3) 0% malate 0,15 1,66 0,6% malate 0,4 4,4 1% malate 0,52 5,7 - dans (pH = 6) 0% malate 0,1 1,1 0,6* malate 0,07 0,77 1% malate 0,05 0,55 - Moût synthétique (pH = 3,3) 0,7 7,7 TABLEAU II (suite) Souches de levure L-lactate produit L-lactate produit (g/l) (llmole/ml) ScV5M/pMlb - dans (pH = 3) 0% malate 0,15 1,66 0,6% malate 0,40 4,4 1% malate 0,48 5,3 - dans (pH = 6) 0% malate 0,11 1,22 0,6% malate 0,08 0,88 1% malate 0,056 0,62 - Moût synthétique (pH = 3,3) 0,51 5,66 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention. LISTE DE SEQUENCES SEQ ID NO: 1: - Longueur: 2684 paires de bases - Type: ADN - Séquence codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis: de 466 à 2085 TTTTGTTGAA AAAATTTCTA ATCAAATTAT TAACCTAAAA GATACATAAA TTTAAAAAAT 60 AAAAGTAGAG TGATTTTACT CTACTTTTTT AGAATACTTT TATATAATAG GAAATATGAA 120 TAAAGCAAAG CGCACAATTT TGGTTTTATT TAAAAAAATG GATACCTTAG ATACACAACC 180 ACCATTGACA AAAAATCTTA ATCCTAAATT GGTTGAAACC CTGATAAATT AGGGATAGTA 240 ATAGGAGGAG GACAGTTTAT CATTTAATAG TTATAAGCTA ATTTTTACTA CCATTTCTTT 300 GATTAATATC ATCTATTTTT ATATAGAGAC TTTTAAATAA ACATTGACAT TATTTATGCG 360 TTATAAATTA AATTTATCAA CACTAAGGAA TTTGACTATA ACGATAAAAG AAGTTTATAG 420 TAATAAAGTA ATAACATTAA TTATAATTTT AATGGAGGTT GTACG ATG CGT GCA 474 Met Arg Ala 1 CAT GAA ATT TTA AAC AAT CCT TTT TTA AAT AAA GGA ACA GCT TTT ACT 522 His Glu Ile Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr Ala Phe Thr 5 10 15 ATG AAA GAC CGT CAA GAA TTG GGG TTG ATT GGT CTT CTT CCA CCA ACT 570 Met Lys Asp Arg Gln Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Pro Pro Thr 20 25 30 35 GTT CAA ACA ATT GAG GAA CAA GCT GAA CAA ACT TAC GAA CAA TAT TTG 618 Val Gln Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gln Thr Tyr Glu Gln Tyr Leu 40 45 50 ACA AAA CCA TCT GAT TTA GAA AAA CGT CAT TTC TTG ATG GAA ATT TTT 666 Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glu Lys Arg His Phe Leu Met Glu Ile Phe 55 60 65 AAT ACA AAC CGT ACT TTG TTT TAC TAC TTA TTC AAC AAA CAT ATT GTA 714 Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys His Ile Val 70 75 80 GAA TTT AAT CCA GTT GTT TAT GAT CCA ACA ATT CCT GAT ACA ATT GAA 762 Glu Phe Asn Pro Val Val Tyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp Thr Ile Glu 85 90 95 AAC TAC AGT CAT TTG TTC GTA GAT CCA CAA TAT GCT GCT TAT CTT GAT 810 Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp 100 105 110 115 ATT AAC CAC CCT GAA AAC ATT ACT GAA ACA TTG AAA AGT GCA GCA GGT 858 Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Gly 120 125 130 GAC AGA GAA ATT CGT CCT ATT GTT GTA ACT GAT CCT GAA GGA ACC CTT 906 Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu Gly Thr Leu 135 140 145 GGT ATT GGA GAC TGG GGA ACT CAA GGT GTT GAT ATC TCA GTT GGT AAA 954 Gly Ile Gly Asp Trp Gly Thr Gln Gly Val Asp Ile Ser Val Gly Lys 150 155 160 TTA ATG ATT TAT ACA GCC GCA GCA GGT ATT GAT CCA GCG TCT GTA CTT 1002 Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala Ser Val Leu 165 170 175 CCA GTT GTT ATT GAT GCA GGG ACA AAT AGG AAA GGA CTT TTA GAA GAT 1050 Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu Leu Glu Asp 180 185 190 195 CAT TTG TAT CTT GGA AAT CAT CAA GAA CGT ATT TAC GGT GAT CAA TAC 1098 His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gln Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gln Tyr 200 205 210 TAC AGT TTC GTC GAT CAA TTT GTA GAA ACT GCA GAA TCA ATT TTC CCT 1146 Tyr Ser Phe Val Asp Gln Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser Ile Phe Pro 215 220 225 AAA TTC TAC CTT CAC TGG GAA GAT TTC GGA CGT TCA AAT CCT GCA ACA 1194 Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn Ala Ala Thr 230 235 240 ATT TTA AAT AAC TAC AAA ACA AAA ATC CCA ACA TTT AAT GAT GAC ATT 1242 Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn Asp Asp Ile 245 250 255 CAA GGA ACT GGT ATT GTT GTT TTA GGT GGT ATT TTC GGA TCA CTT GAC 1290 Gln Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly Ser Leu Asp 260 265 270 275 ATT ACA GGT GAA AAA TTA ACT GAT CAA GTA TAT CTT TGC TAT GGT GGT 1338 Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly 280 285 290 GGT TCA GCC GGT GCA GGG ATT CCT GGT CGT GTT CAT CCT GAA ATC GTT 1386 Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala Glu Met Val 295 300 305 AGT GAA GGT CTT TCT GAA GAA GAA CCT TAC AAA CAT TTC TTC ATG ATT 1434 Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe Phe Met Ile 310 315 320 GAT CAA CAA GGT TTA CTT TTT GAT GAT ATG GAA GAC CTT ACA CCA CCT 1482 Asp Gln Gln Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu Thr Pro Ala 325 330 335 CAA AAA CCA TTT GCT AAA AAA CGT CCT GAT TAT AAA GAT CCT GGA GAT 1530 Gln Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Gly Asp 340 345 350 355 ATG ACT GAC CTT CTT AAC GTT GTT AAG ACA GTA AAA CCA ACT ATT TTA 1578 Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro Thr Ile Leu 360 365 370 GTA GGA ACT TCA ACT AAT CCA GGT GCC TTT ACA AAA GAA GTT GTT GAA 1626 Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu Val Val Glu 375 380 385 GCA ATG TGT CCT AAT ACA GAA CGC CCA GTA ATC TTC CCT ATC TCA AAT 1674 Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pro Ile Ser Asn 390 395 400 CCA ACT AAA AAA ATG GAA ACT ACA CCT GAA CAA GTT ATT GAG TGG TCT 1722 Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gln Val Ile Glu Trp Ser 405 410 415 GAT GGA AAA CCT TTT GTC CCT ACT GGT GTT CCT TCA GGA ACA ATC AGC 1770 Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Ile Ser 420 425 430 435 TAC AAA GGT GTT GAT TAT CAA ATT GGT CAA GCA AAT AAC TCA CTT ATC 1818 Tyr Lys Gly Val Asp Tyr Gln Ile Gly Gln Ala Asn Asn Ser Leu Ile 440 445 450 CAC CCA GGT TTG GGC TTA GGA ATG TTC GCA TCT GAA GCA AAA CTT TTG 1866 His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala Lys Leu Leu 455 460 465 ACA GAT GAA ATG ATC GGT GCA CCT GCA CAT TCA TTG AGC GGT TTA GTA 1914 Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Gly Leu Val 470 475 480 GAT CCA GGT AAA CCA GGT CCT CCT GTT CTT CCT CCA TTT GAA TTT GTT 1962 Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val 485 490 495 CCT GAT GTA TCA ATT AAA GTT GCA GAA GCA GTT GCT AAG AAA CCT CAA 2010 Ala Asp Val Ser Ile Lys Val Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Ala Gln 500 505 510 515 GAA CAA GGT CTT ACT GAA TCT AAA GAA ACT GAT ATG CCT AAA GCA GTT 2058 Glu Gln Gly Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Asp Met Ala Lys Ala Val 520 525 530 CGT GAT CTT AAA TGG TAT CCA GAG TAC TAAGGGGAAT ATCTTAAATG 2105 Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr 535 540 AAAAAACTTA AAGAAACGAA AATATCGGGA ATTAGTCTTC CCTTATATGC CTTTTTCGTA 2165 GCTGTCATCA TAGTTGTAAC ACTATTAGGA AAACTTCCAC TTGATATGGT AGGGTTAACT 2225 CTCCTACTTG TAACATTAGG CCACCTATTA TACTTCATAG GAGAAAAATT CCCTATTATG 2285 AATTCATACT TAGGTGGGGG ATCTGTTTTC ACTTTAATTG GTGCTACTCT ATTATCTTTC 2345 TTCCACATTG TTCCTTCAAA TGTTATTGGA GCAGTTTCCA ATTTTATGGG TGGAAAATTT 2405 GGATTTCTTG ATTTTTATAT AGCTGCACTT ATCTGTGGAT CTATTTTAGG AATGAACAGA 2465 AATCTTTTGG TTAAAGCTTC CAAGAAATTT ATTCCGATTG CTTTAATCAC TATGGTTATT 2525 GGTTTCTTCT CAGTAGGTCT TGTAGGAATG CTTATTGGTA ATGGATTTGC TGATTCTGTA 2585 ATGTATGTTT CTATGCCAAT GATGTCAGGT GGTATGGGAG CCGGAATTAC TCACTCTCTC 2645 AAATCTATGC AGCCGGATTG GCTCATGGAA ACCAAGCAG 2684 REVENDICATIONS 1) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lacis. 2) Cassettes d'expression, caractérisées en ce qu'elles comprennent un fragment d'ADN selon la revendication 1, dans lequel la séquence du gène de l'enzyme malolactique est placé sous contrôle de séquences propres à réguler l'expression dudit gène. 3) Vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN selon la revendication 1. 4) Vecteurs recombinants selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent une cassette d'expression selon la revendication 2. 5) Vecteurs recombinants selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent des séquences de régulation actives dans la levure. 6) Vecteurs recombinants selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont des vecteurs navette, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie. 7) Souche de cellules eucaryote ou procaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragment d'ADN selon la revendication 1, sous contrôle de séquences régulant l'expression dudit gène dans ladite cellule. 8) Souche de levure selon la revendication 7, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules de levure. 9) Souche de levure selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdites levures appartiennent au genre Saccharo ~ ces. 10) Utilisation de souches de levures selon lune quelconque des revendications 8 ou 9 pour accomplir la fermentation malolactique.