Brevet FR2708282A1 — publié le 19950203

MUTANT AYANT UN POUVOIR DE GERMINATION DE LA GLACE, ET UN PROCEDE AMELIORE DE FABRICATION DE NEIGE ET DE GLACE UTELISANT CE MUTANT. - La présente invention concerne un nouveau mutant ayant un pouvoir de germination de la glace, et un procédé amélioré de fabrication de neige et de glace utilisant ce mutant. Plus particulièrement, la présente invention concerne un nouveau mutant, le Pseudomonas syringae, dont le pouvoir de germination de la glace est stable à température ambiante, ainsi qu'un procédé amélioré de fabrication de neige et de glace utilisant ce mutant. Description des techniques antérieures Dans le brevet US n 4 200 228, il est décrit un procédé de fabrication de neige en mettant en suspension puis en pulvérisant des micro- organismes dans l'air. Les micro-organismes employés dans cette. invention sont d'un type qui est connu pour stimuler la germination de la glace, et l'utilisation de tels micro-organismes rend possible la fabrication de neige à des températures largement supérieures à ce qui est possible d'ordinaire. De plus, il est également présenté un procédé d'obtention, sous une forme sèche, de micro- organismes qui ont un pouvoir de germination de la glace, à partir un milieu contenant des micro-organismes cultivés selon une technique conventionnelle. Dans le brevet US n 4 706 463, il est décrit un procédé d'obtention de micro-organismes ayant des pouvoirs de germination de la glace. Dans cette méthode, la température du milieu de fermentation qui contient le Pseudomonas syringae est portée à une température d'environ C ou moins, un concentré du dit microorganisme est formé, et le concentré est refroidi pour former des pastilles gelées, qui sont ensuite lyophilisées à une température inférieure à 25 C. Dans le brevet US n 4 796 805, il est décrit un procédé de fabrication de glace utilisant des micro- organismes germinateurs de la glace. Le procédé comprend les étapes consistant à préparer une suspension aqueuse de micro-organismes germinateurs de la glace, à introduire la suspension dans la source d'eau à une température inférieure à 13 C et à distribuer et geler la source d'eau contenant des germes de glace. On a cependant constaté que si on laissait reposer ladite suspension à une température de 21 C pendant environ 24 heures, elle perdait complètement son activité de germination de la glace. Toutes ces techniques antèrieuresvisent à empêcher que les microorganismes employés pour la germination de la glace perdent leur faculté à température ambiante. Les micro-organismes germinateurs de la glace qui ont été employés dans les inventions ci-dessus sont par exemple les pseudomonades, en particulier le P. syringae. Le micro- organisme préféré est le P. syringae ATCC 53543 déposé le 23 septembre 1986 auprès de l'American Type Culture Collection. D'rautres exemples de micro-organismes appropriés ayant un pouvoir de germination de la glace sont le P. syringae KCTC 1832, déposé auprès de la collection coréenne des types de cultures, et le P. syringae IFO 3310, déposé auprès de l'institut de fermentation d'Osaka, Japon. Ce sont d'abord L. R. Maki et ses collaborateurs qui ont découvert en 1974 un micro-organisme germinateur de la glace (L.R. Maki et al., Applied Microbiology, Vol. 28, p. 456, 1974), et de nombreux micro- organismes germinateurs de la glace ont ensuite été extraits des feuilles de diverses plantes. Des exemples de micro-organismes ayant une activité de germination de la glace sont le Pseudomonas syringae, le Pseudomonas fluorescents, le Pseudomonas pici, le Pseudomonas coronafaciens, le Pseudomonas viridiflava, l'Erwinia herbicola, l'Erwinia uredovara, l'Erwinia ananas et le Xanthomonas campestris. Le Pseudomonas syringae, entre autres, a une activité de germination de la glace plus importante et a été largement utilisé dans l'industrie. Cependant, ces micro-organismes ne sont malheureusement pas stables et perdent facilement leurs activités de germination de la glace à température ambiante. En conséquence, pour conserver leurs pouvoirs de germination de la glace, ces micro- organismes ne doivent être cultivés, extraits et séchés qu'à basse température. De plus, la suspension de ces micro-organismes nécessite également d'être stockée à basse température. Par ailleurs, dans la cas o ces micro-organismes germinateurs de la glace sont utilisés pour la fabrication de glace à l'échelle industrielle, une grande quantité de cellules de micro-organismes est nécessaire et ces micro- organismes doivent être maintenus à basse température pendant les processus de culture, d'extraction et de séchage et pendant le transport et le stockage. Ces restrictions augmentent les coûts et rendent les processus plus complexes. En conséquence, il est nécessaire de proposer une nouvelle lignée ayant une activité de germination de la glace à haute température, par exemple à température ambiante. Les auteurs de la présente invention ont conduit des recherches destinées à fournir une nouvelle lignée ayant une activité de germination de la glace même à température ambiante, leurs résultats leur permettant ici de proposer le Pseudomonas syringae S0754, qui conserve son pouvoir de germination de la glace de manière stable à température ambiante. Le Pseudomonas syringae S0754 de la présente invention conserve une forte activité pendant les phases de fermentation, d'extraction et de séchage et au cours du transport et du stockage. Résumé de l'invention Un objectif de la présente invention est donc de fournir une nouvelle lignée ayant un pouvoir de germination de la glace à une température d'environ 25 C. Et un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé amélioré de fabrication de la glace à température ambiante utilisant ladite lignée. Description détaillée de l'invention Les micro-organismes germinateurs de la glace peuvent être extraits de feuilles de plante gelée. ces micro- organismes sont soumis à des mutations pour choisir un mutant ayant encore un pouvoir de germination de la glace à température ambiante. Les procédures de mutation et de sélection sont les suivantes. Isolement des micro-organismes germinateurs de la glace Les feuilles de plante gelée ont été lavées avec une solution physiologique et la solution ainsi obtenue a été cultivée dans un milieu nutritionnel d'agar- agar contenant 0,3 t d'extrait de viande, 0,5 t de peptone, 2,5 Z de glycérol et 1,5 t d'agar-agar, pendant 2 jours à une température d'environ 30 C. Pour le premier isolement, le fermentateur a ensuite été placé dans le générateur de glace à -4 C et y a été maintenu pendant environ 10 minutes. Puis les colonies de lignées présentant une germination de glace ont été isolées. Chacune des 5 colonies isolées a été cultivée à une température de 30 C. Les lignées présentant la plus forte activité de germination de la glace ont alors été isolées de nouveau. Le deuxième isolement a été réalisé en comparant les pouvoirs de germination de la glace de toutes les colonies. Le pouvoir de germination de la glace a été déterminé de la manière suivante: les lignées isolées ont été cultivées dans un milieu nutritionnel liquide qui contient 0,3 t d'extrait de viande, 0,5 X de peptone et, 2,5 X de glycérol, pendant 2 jours à une température d'environ 30 C. Les lignées cultivées ont été extraites puis mises en suspension dans une solution tamponnée à 50 mM de phosphate (pH 7). Dans ces conditions, le pouvoir de germination de la glace a pu être déterminé en mesurant la température à laquelle la germination de la glace était observée. Le pouvoir de germination de la glace a été déterminé à l'aide d'un spectromètre de germes à congélation (Mitsuwa K-1, Japon), par la méthode de M. Vali (Vali, G.: J. Atmos. Sci., 28, pp. 402-409, 1971). Sur 7 colonies, une colonie, qui avait la plus forte activité de germination de la glace, a été isolée et utilisée comme lignée mère pour obtenir la lignée mutante améliorée. Identification de la lignée parente (lignée mère) L'identification de la lignée parente a été réalisée en suivant la méthode de M. Krieg (Krieg, N. R.: Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1, 1984) et les caractéristiques morphologiques, physiologiques et de fermentation sont rassemblées dans les tableaux 1 et 2. D'après les résultats des tableaux 1 et 2, la lignée parente a été déterminée comme étant le Pseudomonas syringae, et désignée par Pseudomonas syringae S07. Tableau 1 Caractéristiques morphologiques et de fermentation de la lignée parente S07 Morphologie baguettes courtes Taille 0,7-1,0 x 1,2-1,6 pm Coloration par le Gram négatif Mobilité positif Couleur de la colonie jaune clair - blanc Besoin en oxygène aérobie Température de croissance 28 C optimale Pigment fluorescent positif Croissance à 41 C négatif Production de lévane positif Dégradation à l'arginine négatif Réaction d'oxy-Meige négatif Dénitrification négatif Liquéfaction de gélatine positif Hydrolyse de l'amidon négatif Tableau 2 Caractéristiques physiologiques de la lignée parente S07 Source de Disponibilité Source de. Disponibilité carbone carbone Glucose + L-alanine + D-ribose + D-alanine - L-arabinose + L-leucine - D-mannose + L-histidine - D-fructose + L-tyrosine - Raffinose + L-tryptophane - Fumarate + Putrescine + Sucrose + Sarcosine + Saccharate - Linolénate - Valérate + Ascorbate + Pyruvate + Lécithine - Sorbitol + Asparagine - Préparation du mutant La lignée parente S07 isolée comme décrit précédemment présentait un pouvoir de germination de la glace à 30 C extrêmement élevé. Mais son activité n'était malheureusement pas stable vis-à-vis de la chaleur. Afin de préparer de nouveaux micro-organismes de germination de la glace ayant une meilleure stabilité à la chaleur, la lignée parente S07 a donc été mutée et traitée à la chaleur. Le mutant dont le pouvoir de germination de la glace était très stable à la chaleur a ensuite été évalué en mesurant son pouvoir de germination de la glace. La mutation a été effectuée selon une technique conventionnelle utilisant des rayons ultraviolets comme mutagène. Le Pseudomonas syringae S07 a été cultivé dans un liquide nutritionnel au glycérol à 30 C jusqu'à la phase de croissance exponentielle. Les lignées extraites ont été mises en suspension dans une solution physiologique, épandues sur un agar-agar nutritionnel au glycérol, puis irradiées avec des rayons ultraviolets jusqu'à ce que le taux d'extinction des germes atteigne 95%. Le fermentateur a été placé immédiatement après dans une chambre noire à C, dans laquelle la culture a été effectuée pendant 24 heures. Les colonies de lignées vivantes ont été multipliées à l'aide d'un velouté stérilisé et cultivées pendant 24 heures à 30 C. Le réplique a été placée dans le bain de refroidissement à -4 C. Parmi elles, quelques colonies qui présentaient une germination de la glace plus précoce que les autres ont été isolées. Le pouvoir de germination de la glace des colonies isolées a été mesuré à l'aide d'un spectromètre de germes à congélation. Parmi celles-ci, on a choisi les lignées dont le pouvoir de germination de la glace était élevé et se maintenait à température ambiante. Ces lignées ont été cultivées dans un milieu nutritionnel au glycérol pendant 48 heures à 30 C, puis centrifugées. Les blocs de lignées obtenues ont été lavés avec une solution physiologique, puis lyophilisés. Les blocs de lignées lyophilisés ont été mis en suspension dans une solution tamponnée à 50 mM de phosphate (pH 7,0) et maintenus dans des bains à température constante, chacun d'entre eux présentant respectivement une température de 40 C, 35 C, 30 C, 25 C, C, 10 C et 4 C. Leurs activités ont été mesurées au bout de 24 heures à l'aide d'un spectromètre de germes à congélation. De cette manière, un mutant dont l'activité était le plus forte et la plus stable à température ambiante a pu être identifié et a été désigné par Pseudomonas syringae S0754. Le Pseudomonas syringae S0754 a été déposé le 19 juillet 1993, conformément au Traité de Budapest, auprès de la collection coréenne de culture de micro-organismes de Séoul, Corée, sous le numéro d'entrée KCCM-10039. Le mutant de la présente invention présente les mêmes caractéristiques microbiologiques que celles de la lignées parente S07, sauf que la première lignée conserve sa forte activité de germination de la glace à haute température et peut être cultivée dans un milieu de fermentation utilisé communément pour la culture du Pseudomonas syringae, et contient une source de carbone et d'azote appropriée et des sels inorganiques au pH contrôlé. Ces compositions du milieu de fermentation et des conditions de culture peuvent être optimisées sans difficulté par quelqu'un rompu à ces techniques. Bien que la plus grande quantité de micro-organismes germinateurs de la glace nécessaire dans les techniques anciennes puisse être collectée à 28-30 C, ces micro- organismes perdent leur activité dans cette plage de température. Ils doivent donc être cultivés à une température plus faible, inférieure à environ 21 C. Cependant, le mutant de la présente invention présente une bonne activité de germination de la glace à une température inférieure à 60 C, en particulier à une température inférieure à 40 C. Modes de réalisation préférés de la présente invention La présente invention va être décrite plus en détails à l'aide des exemple suivants. Les exemples suivants ne valent qu'à titre d'illustration et il va sans dire que la présente invention ne se limite pas à ces exemples. Exemple 1 Cinq échantillons (A, B, C, D et E) de Pseudomonas syringae S0754 (KCCM-10039) ont été cultivés pendant 24 heures dans un récipient de fermentation de 3 litres contenant un milieu nutritionnel au glycérol (0,3 % d'extrait de viande, 0,5 r de peptone et 0,5 % de glycérol) avec une aération de 1,0 VVM et à un pH d'environ 6,0. Les températures de culture étaient respectivement de 15 C (échantillon A), 21 C (échantillon B), 25 C (échantillon C), 28 C (échantillon D) et 30 C (échantillon E). Une fois la culture terminée, les bouillons de culture ont été centrifugés et des blocs ont été obtenus. Les blocs obtenus ont été mis en suspension dans une solution tamponnée à 50 mM de phosphate (pH 7), et l'activité de germination de la glace a pu être déterminé en mesurant la température (T50%) à laquelle 50 - de la quantité totale de l'échantillon était gelée. L'activité (T50%) était de -2,6 C pour l'échantillon A, de -2,5 C pour l'échantillon B, de -2,8 C pour l'échantillon C, de -2,8 C pour l'échantillon D, et de - 3,0 C pour l'échantillon E. Exemple comparatif 1 Dans cet exemple, la procédure de l'exemple 1 a été répétée, hormis le fait qu'on a utilisé du Pseudomonas syringae ATCC 53,543. L'activité (T50%) était de -2,7 C pour l'échantillon A, de -2,8 C pour l'échantillon B, de -3,5 C pour l'échantillon C, de -4,2 C pour l'échantillon D, et de - 4,9 C pour l'échantillon E. Les résultats de l'exemple 1 et de l'exemple comparatif 1 sont réunis dans la tableau 3. Tableau 3 Activité de germination de Echantillon Température la glace (T50%) de culture Exemple 1 Exemple comparatif 1 A 15 C -2,6 C -2,7 C B 21 C -2,5 C -2,8 C C 25 C -2,8 C -3,5 C D 28 C -2,8 C -4,2 C E 30 C -3,0 C -4,9 C Exemple 1 Quatre échantillons (F, G, H et I) de Pseudomonas syringae S0754 (KCCM-10039) ont été cultivés à 28 C selon la procédure de l'exemple 1, puis ont été séchés par pulvérisation jusqu'à ce que la température finale de l'échantillon séché atteigne respectivement 60 C (échantillon F), 50 C (échantillon G), 40 C (échantillon H) et 30 C (échantillon I). L'activité (T50%) des échantillons séchés était de -5,2 C pour l'échantillon F, de -4,1 C pour l'échantillon G, de -3,6 C pour l'échantillon H, et de -3,1 C pour l'échantillon I. Exemple comparatif 2 Dans cet exemple, la procédure de l'exemple 2 a été répétée, hormis le fait qu'on a utilisé du Pseudomonas syringae ATCC 53,543. L'activité (T50%) des échantillons séchés était de -8,3 C pour l'échantillon F, de -6,7 C pour l'échantillon G, de -5,7 C pour l'échantillon H, et de -3,8 C pour l'échantillon I. Les résultats de l'exemple 2 et de l'exemple comparatif 2 sont réunis dans la tableau 4. Tableau 4 Température Activité de germination de Echantillon finale de la glace (T50%) l'échantillon Exemple 2 Exemple séché comparatif 2 F 60 C -5,20C -8,3 C G 50 C -4,1 C -6,7 C H 40 C -3,6 C -5,7 C I 30 C -3,1 C -3,8 C Exemple 3 La lignée séchée de l'échantillon H (température finale C) obtenue dans l'exemple 2 a été mise en suspension dans l'eau distillée. Plusieurs échantillons (désignés par a, b, c, d, e, f et g) de cette suspension ont été placés pendant 12 heures dans un bain à une température constante de 4 C, 10 C, 20 C, 25 C, 30 C 35 C et 40 C respectivement. L'activité de germination de la glace est exprimée par le pourcentage d'activité résiduelle par rapport à celle de l'exemple 2 et les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous. Exemple comparatif 3 Dans cet exemple, on a répété la procédure de l'exemple 3, hormis le fait qu'on a utilisé la lignée séchée de l'échantillon H (température finale de 40 C) de l'exemple comparatif 2. L'activité de germination de la glace de chaque échantillon est exprimée par le pourcentage d'activité résiduelle par rapport à celle de l'exemple comparatif 2 et les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous. Tableau 5 Température Activité de germination de Echantillon de la glace (T50%) l'échantillon Exemple 3 Exemple comparatif 3 a 4 C 99,8%+5,4 92,3%+2,5 b 10 C 91,2%+3,1 89,6%+3,1 c 20 C 97,6%+2,3 81,5%+3,4 d 25 C 95,4%+2,9 75,3%+5,2 e 300C 89,7%+3,4 54,3%+6,7 f 35C 82,3%+3,3 25,9%+7,3 g 40 C 75,1t+5,1 11,1%+6,4 Comme le montre les tableaux 3-5, le nouveau mutant S0754 (KCCM-10039) de la présente invention présente une activité plus élevée que le ATCC 53,543 sur un large domaine de températures et, plus particulièrement, il présente une activité de germination de la glace bien plus élevée dans une gamme de températures de 25-40 C. L'invention a été décrite en détail en s'appuyant particulièrement sur ses modes de réalisation préférés, mais il va sans dire que l'on peut procéder à des variations et modifications sans sortir de l'esprit et du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1.- Culture biologiquement pure de Pseudomonas syringae SO754, qui a les mêmes caractéristiques microbiologiques que celles de la lignée KCCM10039 ayant une activité de germination de la glace à température ambiante. 2.- Procédé de fabrication de glace utilisant un micro- organisme de germination de la glace et comprenant les étapes consistant à: (a) préparer une suspension aqueuse d'un micro- organisme de germination de la glace, le Pseudomonas syringae S0754 (KCCM-10039); et (b) introduire ladite suspension dans une source d'eau dont la température est maintenue au-dessous d'environ C.