Brevet FR2708281A1 — publié le 19950203

PROCEDE D'OBTENTION DE BIOCATALYSEURS RENFERMANT DES MICROORGANISMES ET BIOCATALYSEURS OBTENUS L'invention concerne un procédé d'obtention de biocatalyseurs dans lesquels un noyau renfermant des microorganismes est revêtu d'un enrobage de composé gélifiable et/ou réticulable. On sait que des biocatalyseurs de ce type peuvent servir à l'élaboration de boissons fermentées telles que le vin et la bière. On a également proposé leur utilisation pour la fabrication de yaourts et fromages. De nombreux travaux ont ainsi porté sur des biocatalyseurs dans lesquels les microorganismes sont immobilisés dans un gel, le plus généralement dans un alginate, avec ou sans enrobage extérieur. Les techniques le plus généralement proposées conduisent à des taux élevés d'eau d'inclusion qu'il convient d'éliminer pour assurer la conservation du produit. Le séchage de ces biocatalyseurs s'avère toutefois complexe étant donné que l'eau incluse dans le polymère nécessite des températures élevées associées à des temps de séchage importants, ce qui altère l'activité des microorganismes. Des produits dits secs ont également été rapportés, mais leur conservation ne peut être assurée de manière satisfaisante au-delà de 4 C. De plus certains doivent subir une étape de réhydratation et de réacclimatation des microorganismes indispensable pour la mise en oeuvre de ces biocatalyseurs ce qui constitue une contrainte à leur utilisation. Les recherches des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à développer un procédé permettant d'obtenir des biocatalyseurs ayant un taux de matières sèches supérieur à 90 % et même à 96 %, assurant une conservation sur une longue durée à température ambiante, avec maintien de l'activité des microorganismes qu'ils renferment. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de préparation de biocatalyseurs à teneur élevée en matières sèches actives, exploitable à l'échelle industrielle. Elle vise également à fournir des biocatalyseurs sous forme sèche pouvant être conservés sur de longues périodes à température ambiante et utilisables sans réhydratation préalable. Le procédé de fabrication de biocatalyseurs de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l'enrobage de particules dont la teneur en matières sèches est supérieure à 30 % environ, renfermant des microorganismes actifs, et leur séchage de manière à obtenir un taux d'humidité résiduelle n'excédant pas environ 10 %, avantageusement 4 %. On notera que le terme particule tel qu'utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien des granulés, pellets, sphérules, billes, c'est-à- dire tout agglomérat de microorganismes. La teneur élevée en matières sèches des particules mises en oeuvre dans l'étape d'enrobage favorise le séchage ultérieur des particules enrobées et permet d'atteindre aisément des teneurs de l'ordre de 90 à 96 % en matières sèches, tout en maintenant un taux de survie de pratiquement 100 % des microorganismes. Ce taux de survie est contrôlable après libération des microorganismes par comptage sur un milieu adapté en boîte de Pétri ou, pour les levures, par observation microscopique de la décoloration du bleu de méthylène. Ce procédé est plus spécialement caractérisé en ce que les dites particules sont élaborées à partir de préparations de microorganismes dont la teneur en matières sèches est telle que ces préparations sont extrudables. Il s'agit en particulier de préparations obtenues par concentration à partir de culture de ces microorganismes, par exemple par centrifugation et/ou filtration et/ou pressage. Les particules utilisées dans l'étape d'enrobage renferment avantageusement, en plus des microorganismes, des composés capables de participer au maintien de l'intégrité des microorganismes et d'augmenter la teneur en matières sèches du noyau destiné à être enrobé. Compte tenu des applications visées, ces composés sont choisis plus spécialement parmi les produits acceptables dans l'industrie agroalimentaire et en particulier dans les procédés de fermentation. A titre d'exemple, on citera la bentonite, le kaolin, la silice, la cellulose ou encore des extraits cellulaires provenant de membranes et parois cellulaires. D'autres additifs avantageux correspondent à des liants ou lubrifiants. Ces produits sont choisis de manière à favoriser l'intégrité des microorganismes pendant l'extrusion. Parmi les produits acceptables dans l'industrie agro-alimentaire, on citera les carraghénates, la gélatine et l'ovalbumine. La mise en oeuvre dans le procédé de l'invention de particules comportant les additifs mentionnés ci-dessus permet de porter leur taux de matières sèches au moins à 35 à 50 % environ. On notera que, de manière originale, dans ces particules, les microorganismes actifs sont en mélange à faible taux d'humidité, c'est-àdire qu'à la différence de nombreux modes de réalisation de l'art antérieur, ils ne sont pas immobilisés dans un gel ou autre milieu à teneur en eau élevée. Selon une disposition préférée du procédé de l'invention, utilisée le cas échéant avec au moins l'une de celles qui précèdent, on utilise des particules telles qu'obtenues par extrusion. L'étape d'extrusion est réalisée de manière à obtenir des particules ayant une taille donnant une surface d'échange satisfaisante pour les applications envisagées. Des dimensions de pellets appropriées correspondent à des diamètres de 0,5 à 3 mm. En variante, les particules de microorganismes avec le cas échéant les additifs mentionnés plus haut sont obtenus par la technique de rotor granulation. Pour faciliter l'enrobage de ces particules, on a recours de préférence à une étape de sphéronisation au cours de laquelle il est également possible de soumettre les particules à une phase de pré-séchage. On utilise par exemple un sphéronisateur comportant un plateau gaufré tournant, le séchage est réalisé après l'étape de sphéronisation. En variante, l'établissement d'un lit fluidisé dans le sphéronisateur permet de réaliser en même temps le séchage des particules. Pour le séchage, on applique plus spécialement des températures de 40- 50 C afin de conférer une température d'environ 30 C aux particules à la sortie, ce qui permet d'éviter toute altération des cellules. Pour l'enrobage, on a recours à un produit gélifiable et/ou réticulable de faible viscosité, c'est- à-dire pulvérisable par buses de manière à créer une couche régulière autour de la particule renfermant les microorganismes et le cas échéant les additifs mentionnés plus haut. Des viscosités appropriées sont inférieures à x 10-3 Pa.s environ et notamment de l'ordre de 5 à 10 -3 Pa.s. Comme produits de ce type, on citera les alginates, carrhagénates, pectates, agar. L'enrobage des particules est réalisé, de manière préférée, par pulvérisation dudit produit, selon la technique appelée spray-coating, sur les particules avantageusement pré-séchées. Les particules sont mises en suspension dans un courant d'air chaud alors que la solution d'enrobage est vaporisée. Le passage à plusieurs reprises dans le cycle d'enrobage permet de recouvrir uniformément la surface des particules. La température et le débit de l'air, ainsi que le débit et la pression de pulvérisation sont choisis de manière à former une couche homogène et à éviter la formation d'écailles. Si nécessaire, les produits pulvérisés sont soumis à un durcissement ou à une réticulation afin d'assurer l'intégrité mécanique des biocatalyseurs formés et d'éviter le relargage des microorganismes. On procède avantageusement selon les techniques habituelles, le plus généralement par voie physique ou par voie chimique. Par exemple, dans le cas d'enrobage avec un composé réticulable, on plonge les sphérules de biocatalyseur dans un bain contenant l'agent réticulant. Ces particules enrobées sont soumises à une étape de séchage. Cette étape est réalisée en lit fluidisé. Elle permet d'obtenir des biocatalyseurs dont la teneur en matières sèches finales est supérieure à environ 90 % et peut même dépasser 95 %. Dans le cas d'un enrobage avec un composé gélifiable, les particules sont soumises à un séchage préalable jusqu'à l'obtention d'une humidité finale de 6 à 4 % environ. Ces particules sont ensuite enrobées dans un courant d'air froid en lit fluidisé. Le procédé de l'invention convient particu- lièrement pour l'enrobage de microorganismes tels que levures, bactéries, moisissures. Comme levures, on citera le genre Saccharomyces et en particuler Saccharomyces cerevisae. Les bactéries utilisables pour l'élaboration des biocatalyseurs définis ci-dessus comprennent les genres Lactobacillus et Streptococcus et en particulier Lactobacillus casei et Streptococcus lactis. Les moisissures utilisables comprennent le genre Aspergillius et, en particulier, Aspergillus niger. La mise en oeuvre des dispositions de l'invention permet d'obtenir des biocatalyseurs dans lesquels les microorganismes conservent une excellente viabilité au cours du temps, à température ambiante, comme l'attestent les contrôles effectués selon les techniques évoquées plus haut. Ces biocatalyseurs sont utilisables directement sans étape de réhydratation. En tant que nouveaux produits, ils font également partie de l'invention. Ils sont plus spécialement caractérisés en ce qu'ils comprennent un noyau de microorganismes actifs, le cas échéant additionnés de charges et/ou de liants comme indiqué ci-dessus, enrobés d'une couche externe de composé gélifiable et/ou réticulable, et que leur taux de matières sèches est supérieur à environ 90 %. Ces biocatalyseurs se présentent sous forme de billes ou pellets de 0,5 à 3 mm de diamètre environ. Afin d'illustrer l'invention, on rapporte ci- après des exemples de préparation de biocatalyseurs renfermant des levures recouvertes d'alginate. ExempJle 1: Fabrication de biocatalyseur renfermant S.cerevisae enrobée d'un agent réticulant. Le procédé de fabrication mis en oeuvre comporte les étapes suivantes: la production et concentration des micro-organismes, - le mélange avec le liant et les charges de la préparation concentrée obtenue - l'extrusion du mélange pour former des particules, - la sphéronisation des particules, le pré-séchage, - l'enrobage, - la gélification et le lavage des billes, - le séchage en lit fluidisé et le conditionnement. 1) Préparation et concentration de la levure oenologique On opère selon un procédé similaire à la préparation d'une levure de panification. On réalise une culture de levures dans un fermenteur régulé et contrôlé par ordinateur selon le modèle feed batch avec apport contrôlé en azote et en phosphore. Le rendement est compris entre 30 et 40 g de matière sèche par litre, le taux d'azote est compris entre 6,5 et 7,5 % et le taux de phosphore de 2 à 3 %. La levure est récupérée par filtration (filtre rotatif sous vide VELOR modèle FIV 1). La teneur en matières sèches est de 24 à 30 %. 2) Préparation des particules ou billes On mélange la préparation de levure obtenue avec les produits de charges et le liant à très forte concentration, de manière à obtenir un mélange final de à 50 % de matières sèches (formule de base). Le mélange est réalisé dans un mélangeur malaxeur durant 20 à 30 min. L'extrusion est ensuite réalisée à l'aide d'un extrudeur (ALEXANDER WERK S12 M70R) par passage à travers un cylindre couvert d'orifices de 1 mm de diamètre, la vitesse d'extrusion est fixée à 375 tr/min. Les pellets obtenus sont sphéronisés sur un plateau gaufré, par exemple par passage dans un sphéronisateur KALEVAR modèle 15 durant 2 à 20 min à 800 tr/min. 3) Préséchage Les granules obtenus sont pré-séchés sur un lit d'air fluidisé Niro aéromatic MP1R équipé d'un dispositif de pulvérisation. 1 kg de produit granuleux est disposé sur une plaque perforée, un courant d'air chaud traverse ce support de bas en haut avec un débit tel que le produit soit fluidisé. La durée de ce pré-séchage est de 10 à 40 min. Celui-ci est uniforme grâce à la grande surface de contact air/produit et à l'agitation intense. Les températures de l'air à l'entrée les plus adéquates se situent entre 40 et 50 C. Il est important que les levures soient maintenues à une température aussi basse que possible, à savoir de 25 & 33 C. Une teneur en eau résiduelle de 35 à 8 % peut être atteinte dans les granules de micro-organismes après un temps de séjour dans le lit fluidisé allant à 40 min. Le taux de survie après séchage est proche de 100 %. 4) Enrobage On réalise une couche externe par enrobage en lit fluidisé des granules pré-séchés de microorganismes, ce qui permet d'augmenter la résistance mécanique des granules et éviter le relargage de microorganismes pendant l'utilisation des granules. L'enrobage en lit fluidisé est effectué par pulvérisation (spray coating) sur les granules mis en suspension dans un courant d'air chaud ascendant. Une solution d'enrobage est alors vaporisée par une buse. Comme solution de polymère, on utilise par exemple un alginate de faible viscosité de 5 à 15 % de matières sèches. Les particules passent plusieurs fois par minute dans le cycle d'enrobage, ce qui permet selon l'invention une répartition uniforme de la solution d'enrobage à leur surface. Les conditions d'enrobage sont les suivantes: Température de l'air à l'entrée........ 25 à 45 C Température de l'air à la sortie....... 20 à 32 C Débit de pulvérisation................. 8 à 15 g/min Pression de pulvérisation............... 0,5 à 2 x 105SPa Débit de l'air en mm d'eau..............70 à 200 mm d'eau Viscosité........................... .50 - 100 x 10-3 Pa.s Temps d'enrobage..................... 1 à 2 h Les particules enrobées en lit fluidisé sont ensuite trempées dans une solution de CaCl2 à 30 g/l. La réticulation est amorcée immédiatement et après 60 minutes de contact, les particules incluant les cellules de micro-organismes sont rincées à l'eau courante. ) Séchage Les billes lavées sont égouttées, puis séchées dans un lit fluidisé type NIRO aéromatic MP1R jusqu'à 40 à 50 % de matières sèches. Le séchage est effectué à une température d'entrée d'air programmable de 30 à 50 C et à un débit d'air qui correspond à une perte de charge de 150 mm d'eau. L'humidité finale n'excède pas 3 à 8 % après 45 min de séchage. Ces billes sèches actives peuvent être conservées sur de longues périodes de temps, à température ambiante. Le contrôle de la viabilité des t microorganismes montre un maintien de leur activité à pratiquement 100 %. Ces billes sont utilisables telles quelles sans réhydratation et sans nécessité de réacclimater les microorganismes. Eemiple-2: On rapporte dans le tableau qui suit des formules de base de biocatalyseurs élaborés selon le procédé de l'invention. rnagnt Ech Levures Ovalbu Carragh Silice Ceilulose Kaolin Parois Shn alinate %MS mine enane cellules isation enrobage %MS ___ a __g. g g. ó1 g _ mn g 1 700 4 à 45 450 126 4 800 3.3% MS... 2 700 250.. 190 1 7 130 13 75O 3 700 375 250 370 15 850 4 400 500 à 620 980 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la fabrication de biocatalyseurs dans lesquels un noyau renfermant des microorganismes est revêtu d'un enrobage de composé gélifiable et/ou réticulable, caractérisé en ce que l'enrobage est réalisé sur des particules dont la teneur en matières sèches est supérieure à environ 30 %, renfermant des microorganismes actifs, les particules enrobées étant séchées de manière à obtenir un taux d'humidité résiduelle n'excédant pas environ 10 %, avantageusement 4 %, tout en préservant la viabilité des microorganismes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites particules sont élaborées à partir de préparations de microorganismes dont la teneur en matières sèches est telle que ces préparations sont extrudables. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ces préparations de microorganismes sont obtenues par concentration, par exemple par centrifugation et/ou filtration et/ou pressage à partir de culture des microorganismes. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que lesdites particules renferment, en plus des microorganismes, des composés capables de participer au maintien de l'intégrité des microorganismes et d'augmenter la teneur en matières sèches du noyau destiné à être enrobé, en particulier des produits acceptables dans l'industrie agro-alimentaire tel que la bentonite, le kaolin, la cellulose, la silice ou des extraits cellulaires. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les dites particules renferment des liants ou lubrifiants, en particulier de produits acceptables dans l'industrie agro-alimentaire, tels que les carraghénates, la gélatine ou l'ovalbumine, ou des produits à forte viscosité. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites particules sont obtenues par extrusion et présentent une taille d'environ 0,5 à 3 mm de diamètre. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les dites particules sont soumises à un traitement de sphéronisation et de séchage, ce dernier étant réalisé simultanément ou successivement, avantageusement en lit fluidisé. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on réalise l'enrobage des particules à l'aide d'un produit gélifiable et/ou réticulable, de faible viscosité c'est-à-dire pulvérisable par buses de manière à créer une couche régulière autour des particules. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le produit gélifiable et/ou réticulable est choisi parmi les alginates, carrhagénates, pectates, agar. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que l'enrobage est réalisé par pulvérisation, sur les particules de préférence pré- séchées, dudit produit gélifiable et/ou réticulable, ce produit étant ensuite durci ou réticulé si nécessaire. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les particules sont séchées après leur réticulation de manière à éliminer pratiquement totalement l'eau d'inclusion. 12. Procédé selon l'une des revendications 8 à , caractérisé en ce que les particules sont refroidies après leur enrobage par des produits gélifiables. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les microorganismes sont des levures par exemple du genre Saccharomyces comme S. cerevisae, des bactéries comme les bactéries lactiques, comme celles des genres Lactobacillus et Streptococcus, en particulier L.casei et S.lactis, ou des moisissures comme celles du genre Aspergillua, comme A.niger 14. Biocatalyseurs dans lesquels un noyau renfermant des microorganismes est revêtu d'un enrobage de composé gélifiable et/ou réticulable, caractérisé en ce qu'ils comprennent un noyau de microorganismes actifs le cas échéant additionnés de charges et/ou de liants, tel que défini dans l'une des revendications 4 ou 5, enrobé d'une couche externe de composé gélifiable et/ou réticulable et que leur taux de matières sèches est supérieur à 90 % environ.