Brevet FR2708285A1 — publié le 19950203

La présente invention concerne un procédé de mise en évidence de la présence ou de l'absence d'une souche de microorganisme particulière dans un milieu de culture. La détection de microorganisme est très importante notamment dans l'industrie alimentaire, au niveau du contrôle des eaux ou en médecine, sachant que ces microorganismes peuvent non seulement se révéler être des agents pathogènes, mais également consister en des agents mettant en évidence certains types de contaminations. Différents procédés permettent de mettre en évidence la présence de microorganismes, dans un milieu quelconque, consistant à prélever un échantil- lon du milieu considéré, puis à favoriser le développement des microorganismes présents par culture sur ou dans un milieu approprié. De manière à simplifier la mise en évidence des microorganismes présents, il a été proposé d'utiliser dans le milieu de détection des composés colorés dont la présence est caractéristique d'un microorganisme donné. La coloration est souvent révélatrice d'une activité enzymatique liée au microorganisme considéré, et le résultat de cette activité peut résulter en une modification du pH du milieu, mise en évidence par un indicateur coloré (EP-A-0 395 532), ou encore en la libération d'un composé chromophore ou fluorophore (FR-A-2 684 110). Les chromophores ou fluorophores sont des composés généralement obtenus par hydrolyse enzymatique de composés chromogènes ou fluorogènes correspondants, présents dans le milieu de culture. Les fluorophores émettent un rayonnement caractéristique par fluorescence. Les composés chromophores sont caractérisés par une couleur d'une longueur d'onde dominante. Parmi les composés chromophores connus, on notera notamment les dérivés de l'indoxyle, de l'hydroquinoline ou encore les dérivés naphtoïques, ou les dérivés du naphtyle et du phényle. De manière à différencier deux genres de microorganismes différents dans un milieu de culture, il a même été proposé d'introduire deux agents chromogènes, chacun libérant un composé chromophore d'une couleur caracté- ristique de la présence d'un microorganisme particulier (US-A-5 210 022). Bien que l'ensemble de ces milieux soit performant pour la détection de microorganismes d'un genre spécifique, comme par exemple Salmonella, Candida ou E.coli, et leur distinction parmi d'autres espèces, ils ne permettent toutefois pas la détection d'un grand nombre de microorganismes de genres différents sur un même milieu de culture, ou encore parmi les microorganismes d'un même genre la différenciation des espèces pathogènes des autres. Une telle distinction parait d'autant plus importante pour certaines espèces de levures conmme Candida albicans qui est responsable de plus de 50% des pathologies liées aux levures. Or, il a été trouvé d'une manière inattendue que l'on pouvait remé- dier à ces inconvénients en introduisant dans le milieu de culture au moins un chromogène substrat d'une enzyme de la souche et au moins un composé choisi parmi un hydrate de carbone à concentration élevée, afin d'obtenir une couleur dérivée différente de la couleur de base du chromophore. Par couleur dérivée, on entend toute couleur dont la longueur d'onde dominante diffère de la longueur d'onde dominante des chromophores libérés par les chromogènes présents dans le milieu de culture pris isolément dans un milieu standard. Par milieu standard, on entend tout milieu usuel d'identification dans lequel l'hydrate de carbone a une simple fonction de source de carbone, à des concentrations très faibles, voire nulle, o il est considéré que de telles concen- trations permettent d'éviter tout effet inducteur qui modifierait d'une manière incontrôlée le comportement des microorganismes et induirait des erreurs dans l'identification des microorganismes considérés. La longueur d'onde dominante du chromophore pourra être calculée en référence à la lumière du jour, telle que définie par la CIE (Commission Internationale de l'Energie) comme illuminant D65, à partir de toute méthode standard de mesure de couleur d'objet, en particulier avec un spectrocolorimè- tre. La présente invention concerne donc un procédé de mise en évidence de la présence ou de l'absence d'une souche de microorganisme particulière dans un milieu, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture au moins un chromogène substrat d'une enzyme de la souche et au moins un composé choisi parmi un hydrate de carbone à concentration élevée, afin d'obtenir après hydrolyse du chromogène une couleur différente de la couleur de base du chromophore. Le milieu est avantageusement un milieu à base de peptone. Par hydrate de carbone, on entend selon l'invention, l'ensemble des sucres naturels ou non, en particulier les oses, notamment pentoses ou hexoses, de préférence le glucose. La concentration élevée en hydrate de carbone est de l'ordre de 10 à g/l de milieu. Par ailleurs, il a été également constaté que l'adjonction d'un phosphate à concentration élevée, lorsque l'une des enzymes est la phospha- tase, permettait d'augmenter le nombre de couleurs dérivées susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention. En conséquence, la présente invention concerne un procédé tel que défini précédemment, dans lequel le milieu de culture comprend une concentra- tion élevée en phosphate, de préférence comprise entre 1 et 3g/1. Les chromogènes sont notamment substrats des enzymes suivan- tes: 13-galactosidase, 13-glucuronidase, B-glucosidase, a-glucosidase, agalacto- sidase, phosphatase, N-acétyl-13-gluconidase, N-acétyl-13-galactosidase, a-mannosidase, sulfatase, esterase, lipase et peptidase. Le milieu comprend avantageusement au moins deux chromogènes, en particulier choisis parmi les composés d'une même famille chimique, de préférence parmi ceux qui libèrent par hydrolyse deux chromophores différents qui peuvent subir une réaction de couplage. Par réaction de couplage, on entend toute interaction physico- chimique par laquelle la longueur d'onde dominante résultante est différente de la longueur d'onde dominante du mélange des deux chromophores pris isolé- ment. D'une manière préférentielle, les chromogènes sont de la famille des indoxyles, en particulier des dérivés indoxyle alkylés, halogénés ou dihalogénés. Parmi les chromophores dérivés de l'indoxyle préférés, on trouve les dérivés indoxyle, bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro- bromo-indoxyle, tri-chloro-indoxyle et méthyl-indoxyle, en particulier les dérivés suivants: 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 4,6dichloro- indoxyle, 6,7-dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6chloro- indoxyle ou4,6,7-trichloro-indoxyle. Par microorganisme dont la présence ou l'absence est mise en évidence par le procédé selon l'invention, on entendra les levures, les champi- gnons unicellulaires ou moisissures et les bactéries. Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la mise en évidence de la présence ou l'absence des levures du genre Candida, en particulier Candida albicans et Candida tropicalis. De même, parmi les bactéries dont la présence ou l'absence est susceptible d'être mise en évidence par le procédé selon l'invention, on trouve notamment les bactéries du genre Streptococcus, KLebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Staphylococcus, Listeria, Clostridium ou Proteus. Les exemples ci-après permettent d'illustrer le procédé selon l'invention sans toutefois chercher à en limiter la portée. Tableau I: Exemples de coloration dérivées Milieu en g/l Agar 15 Agar 15 Na C15 Peptone 10 Chromogène Peptone 5 Glucose 20 Extrait de viande 1 Bromo 4Chloro 3lndoxyl Nacetylglucosaminide 0,100 bleuâtre vert clair ** Bromo 6Chloro 3Indoxyl Nacetyl glucosaminide 0,100 rougeâtre beige clair ** 5Bromo 4Chloro 3lndoxyl phosphate 0,100 bleuâtre vert clair ** Bromo 6Chloro 3Indoxyl phosphate 0,100 rougeâtre beige clair ** 6Chloro 3 Indoxyl phosphate 0,200 rosâtre blanchâtre ** ** couleur dérivée Tableau IH: Exemples de coloration selon l'invention pour des espèces variées de levure Milieuxde culture: les milieux suivants ont été préparés pour la mise en oeuvre duprocédé selonl'invention. A (g/l): (comparatif) agar (15), peptone (5), extrait de levure (2), extrait de viande (1), NaCI (5), 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acétyl- glucosaminide (0,1). B (g/l): agar (15), peptone (10), glucose (20), 5-bromo-4-c h 1 o r o -3 - indoxyl-N-acétyl-glucosamine (0,1) C (g/l): agar (15), peptone (5), glucose (20), phosphate (2), 5- bromo-4- chloro-3-indoxyl-N-acétyl-glucosaminide (0,1), 5-bromo-6- chloro-3-indoxyl-phosphate (0,1). A B C Candida albicans bleuâtre vert ** vert-bleu** Candidaglabrata incolore incolore rose-violet** Candidaguilliermondii rose-violetpâle** Candidakrusei rose-violet** Candida lusitaniae rose-violetpâle* * Candidaparapsilosis blanche-grise** Candida tropicalis bleuâtre bleuâtre bleu-métallique* (avec halo) Cryptococcus neoformans blanche- rose** Trichosporon beigelii rose-grise** * tierce couleur, ** couleur dérivée Les résultats ci-dessus montrent que l'adjonction de glucose et de phosphate permet d'élargir la gamme de couleurs disponibles pour un même milieu, permettant ici de distinguer sept espèces différentes, et en particulier de repérer Candida albicans sans ambiguité. REVENDICATIONS 1) Procédé de mise en évidence de la présence ou de l'absence d'une souche de microorganisme particulière dans un milieu, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture au moins un chromogène substrat d'une enzyme de la souche et au moins un composé choisi parmi un hydrate de carbone à concentration élevée, afin d'obtenir après hydrolyse du chromogène une couleur dérivée différente de la couleur de base du chromophore. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu est un milieu à base de peptone. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la concentration en hydrate de carbone est de l'ordre de 10 à 30 g/l. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu comprend une concentration élevée en phosphate. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la concentra- tion en phosphate est compris entre 1 et 3 g/l. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient au moins deux chromogènes. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les chromogènes sont des composés de la même famille chimique. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les deux chromogènes libèrent par hydrolyse deux chromophores différents qui peuvent subir une réaction de couplage. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les chromogènes sont de la famille des indoxyles, en particulier des dérivés indoxyle alkylés, halogénés ou dihalogénés. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le chromophore est choisi parmi les dérivés indoxyle, bromo-indoxyle, chloro- indoxyle,dichloro-indoxyle,chloro-bromo-indoxyle,tri-chloro-indoxyle et méthyl- indoxyle, en particulier les dérivés suivants: 6-chloro-indoxyle, 5bromo- indoxyle, 3-bromo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6,7-dichloro-indoxyle, 5- bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle ou 4,6,7-trichloroindoxyle. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les microorganismes sont des levures. 12) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les levures sont du genre Candida. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les microorganismes sont des bactéries. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les bactéries sont du genre Streptococcus, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Staphylococcus, Listeria, Clostridium ou Proteus.