Brevet FR2702493A1 — publié le 19940916

La présente invention se rapporte à un procédé d'oxydation enzymatique amélioré pour convertir la Céphalosporine C en acide glutaryl7-aminocéphalosporanique (ci-après désigné glutaryl-7-ACA) comprenant l'utilisation d'un mélange contenant une amino-acide oxydase(ci-après désigné par mélange contenant DAO) Plus particulièrement une activité estérase dans le mélange contenant DAO employé dans le présent procédé est sélectivement réduite. Le glutaryl-7-ACA est un matériau intermédiaire pour la préparation d'acide 7-aminocéphalosporanique (ci-après désigné 7-ACA) à partir de Céphalosporine C La Céphalosporine C réagit avec une D-amino-acide oxydase (ci- après désignée DAO) pour produire un acide a-céto adipoyl-7- aminocéphalosporanique (ci-après désigné a-céto adipoyl-7- ACA) qui est un intermédiaire thermiquement instable et du peroxyde d'hydrogène, ensuite l'a-céto adipoyl-7-ACA produit est oxydé par le peroxyde d'hydrogène pour produire le glutaryl-7-ACA Dans le but d'obtenir un rendement plus élevé en glutaryl-7-ACA, divers procédés enzymatiques pour convertir la Céphalosporine C en glutaryl-7-ACA en utilisant du DAO dérivé de Trigonopsis variabilis (ci- après désigné T. variabilis) ont été développés Par exemple, le brevet U S. No 3 821 209, les Publications des Brevets Japonais Nos 35119/1980 et 15635/1984 décrivent des procédés d'oxydation enzymatiques mis en oeuvre en présence d'inhibiteurs de catalase tels des azotures inorganiques et du perborate et un excès de peroxyde hydrogène, respectivement, pour éviter la décomposition du peroxyde d'hydrogène par catalase Le brevet U S No 3 801 458 décrit une oxydation enzymatique de Céphalosporine C utilisant des cellules activées de T variabilis avec un inhibiteur de catalase d'azoture de sodium pour fournir un bon rendement en glutaryl-7-ACA La Publication du Brevet Européen non examiné No 409 521 décrit un procédé pour inactiver une catalase en présence de DAO par traitement des enzymes avec une solution basique aqueuse d'un p H d'environ 11 à 12 avant l'oxydation enzymatique de la Céphalosporine C en glutaryl-7-ACA. Cependant, ces procédés ont des désavantages dans la réduction du rendement en raison de l'estérase possédé par T. variabilis et dans la détérioration de la qualité en raison des impuretés telles que les inhibiteurs de catalase lorsqu'ils sont appliqués à une pratique économique à une échelle industrielle L'estérase est un enzyme qui convertit la Céphalosporine C, le glutaryl-7-ACA, et l'intermédiaire ccéto adipoyl-7-ACA en leurs formes 3-désacétyle Ces dérivés désacétyle non seulement réduisent le rendement en glutaryl-7-ACA mais également détériorent la qualité du glutaryl-7-ACA comme impuretés Donc, de façon à améliorer le rendement et la qualité du glutaryl-7-ACA, il est très important d'inactiver ou d'inhiber l'activité estérase. La Publication du Brevet Européen non examiné No 409 521 décrit également un procédé d'activation de l'activité estérase par traitement des cellules de T variabilis avec de l'acétone/eau de façon à éviter de produire la désacétyl Céphalosporine C et le désacétyl glutaryl-7-ACA Cependant, le procédé décrit requiert une étape compliquée et difficile pour éliminer l'acétone Ainsi, il y a une forte demande pour un procédé simple et plus efficace d'inactivation de l'estérase, applicable à une pratique industrielle. A cet effet, l'invention fournit un procédé d'oxydation enzymatique pour convertir de la Céphalosporine C en acide glutaryl-7aminocéphalosporanique comprenant l'utilisation d'un mélange contenant une oxydase d'acide D-aminée dont l'activité estérase est 5 % ou moins de l'activité oxydase de l'acide D-aminé. Selon une caractéristique d'un procéde de l'invention, le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu à partir d'un mutant négatif ou déficitaire en catalase capable de produire une D-amino-acide oxydase. Dans ce cas, le mutant est de la souche KC-103 Trigonopsis variabilis ou de la souche EL-17. Selon une autre caractéristique du procédé de l'invention, le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu par mise en contact du mélange avec des composés de Cu. Dans ce cas, le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu par mise en contact du mélange avec un composé de Cu à une concentration de 10 à 2000 ppm. Et le contact est mis en oeuvre avant ou pendant le procédé d'oxydation enzymatique. Selon encore une autre caractéristique de l'invention, le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu à partir d'un mutant montrant 5 % ou moins d'activité estérase sur la base de son activité DAO, qui est obtenu par traitement d'un microorganisme capable de produire du DAO avec une radiation ultraviolette, une radiation de rayons X, ou un mutagène. Dans ce cas, le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est composé de cellules partiellement détruites, ou des cellules perméabilisées, d'extraits exempts de cellules obtenus de celles-ci, ou d'un enzyme immobilisé. Et le mutant est négatif ou déficitaire en catalase. Plus particulièrement, le mutant est la souche EL-17 Trigonopsis variabilis. La présente invention a également pour objet cette souche EL-17 Trigonopsis variabilis. Encore un autre objet de l'invention est un procédé pour inactiver une estérase dans un mélange contenant une D- amino-acide oxydase comprenant la mise en contact dudit mélange, avec un composé du Cu. La présente invention se rapporte à un procédé d'oxydation enzymatique amélioré pour convertir la Céphalosporine C en glutaryl-7- ACA comprenant l'utilisation d'un mélange contenant DAO dont l'activité estérase est environ 5 % ou moins de l'activité de la DAO Dans le procédé de la présente invention, le mélange contenant DAO dont l'activité estérase est abaissée ou inhibée a été obtenu par mise en contact du mélange avec un composé du Cu Dans le procédé de la présente invention, le mélange contenant DAO ci-dessus mentionné est également obtenu à partir d'un mutant montrant 5 % ou moins d'activité estérase sur la base de son activité DAO, qui est obtenu par traitement d'un microorganisme capable de produire de la DAO avec une radiation ultraviolette, une radiation de rayons X, et un mutagène Selon le procédé de la présente invention, l'excellent rendement en glutaryl-7-ACA peut être atteint à une qualité élevée De plus, le procédé de la présente invention comprend des étapes simples et sûres, de sorte qu'il est également applicable à l'échelle industrielle. La présente invention se rapporte à un procédé d'oxydation enzymatique pour convertir la Céphalosporine C en glutaryl-7-ACA comprenant l'utilisation d'un mélange contenant DAO dont l'activité estérase est 5 % ou moins celle de l'activité de la DAO. La Céphalosporine C utilisée dans la présente invention est une solution aqueuse de poudre de Céphalosporine C, ou de bouillons de fermentation de Céphalosporine C dans lesquels les cellules et le solide sont éliminés La Céphalosporine C est produite par culture de cellules d'Achremonium chrysogenum dans le milieu de culture contenant 2 % de sucrose, 3 % d'amidon de maïs, 5 % de mélasses de betteraves, 6 % de graines de soja dégraissées, 3 % de méthyloléate, et 0,5 % de carbonate de calcium, 1,25 % de sulfate de calcium et 0,8 % d'acétate d'ammonium et les analogues ou dans un milieu de fermentation de nutriment. Le mélange contenant DAO utilisé dans la présente invention comprend de la DAO, par exemple, de la DAO partiellement purifiée et de la DAO brute, et montre 5 % ou moins d'activité estérase sur la base de l'activité de la DAO Le mélange contenant DAO peut être utilisé sous toute forme telle que sous forme de cellules intactes, de cellules partiellement détruites, de cellules rendues perméables, d'extraits exempts de cellules, et d'enzyme immobilisé Parmi ceux-ci, les cellules détruites partiellement, les cellules rendues perméables, les extraits exempts de cellules et l'enzyme immobilisé sont préférés Ils sont obtenus par des méthodes connues. On préfère que la DAO soit dérivée de T variabilis dans la présente invention Plus préférablement, un mutant déficient en catalase tel que la souche KC-103 de T. variabilis (déposé auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology sous le No de dépôt FERM-BP-4359, dépôt effectué selon le Traité de Budapest) est utilisé de façon à éviter 1 ' a-céto adipoyl 7-ACA restant. Dans la présente invention, le mélange contenant DAO dont l'activité estérase est 5 % ou moins de l'activité DAO est obtenu par mise en contact du mélange avec un composé de Cu L'activité estérase dans le mélange contenant DAO est sélectivement réduite par mise en contact du mélange avec le composé de Cu à une concentration de 10 à 2000 ppm, sur la base de la quantité totale de solution ou suspension aqueuse du mélange contenant DAO à 5 à 250 C pendant 2 à 24 heures. De façon à inactiver l'estérase sans affecter l'activité de la DAO, on préfère que la concentration du composé Cu soit de à 400 ppm L'activité estérase peut être réduite de moitié ou plus par le traitement Donc, lorsque le mélange contenant DAO est obtenu de la souche KC-103 de T variabilis montrant 9,1 % de rapport d'activité d'estérase/DAO, le rapport d'activité peut être réduit à 4,5 % ou moins. Dans la présente invention, le composé de Cu est mis en contact avec un mélange contenant DAO avant le procédé d'oxydation enzymatique, c'est-à-dire, avant que la Céphalosporine C soit ajoutée Alternativement, le composé de Cu peut être mis en contact avec le mélange contenant DAO pendant le procédé d'oxydation enzymatique, c'est- à-dire, qu'il est ajouté au mélange réactionnel contenant la Céphalosporine C et le mélange contenant DAO Dans ce dernier cas, la concentration du composé Cu est de 10 à 2000 ppm sur la base du mélange réactionnel Un exemple représentatif du composé de Cu utilisé dans la présente invention est Cu SO 4. Dans la présente invention, le mélange contenant DAO dont l'activité estérase est 5 % ou moins de l'activité DAO est également obtenu à partir d'un mutant montrant 5 % ou moins d'activité estérase sur la base de son activité DAO, qui est obtenu par traitement d'un microorganisme capable de produire de la DAO avec une radiation ultraviolette, une radiation de rayons X, ou un mutagène. Un tel mutant est obtenu par ce qui suit Une souche parente capable de produire de la DAO est traitée avec une radiation ultraviolette, une radiation de rayons X, ou un mutagène tel que du N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoganisine (ci- après désignée NTG), puis est cultivée dans un milieu de fermentation La souche montrant une activité estérase réduite est choisie par mesure de l'activité estérase. Dans la présente invention, on préfère que comme souche parente, un mutant négatif ou déficient en catalase soit utilisé pour éviter la formation de produits secondaires Un exemple représentatif du mutant est la souche EL-17 T variabilis (déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology sous le No de dépôt FERM BP-4467, dépôt effectué selon le Traité de Budapest) Il est obtenu par traitement de la souche KC-103 de T variabilis (supra) avec NTG Le mutant a 3,0 % d'activité estérase sur la base de l'activité DAO. L'activité estérase est mesurée par ce qui suit Un échantillon d'enzyme est ajouté à un tampon phosphate 0,2 M (p H 7,5 =) contenant 2 g/l de glutaryl-7-ACA, et ils sont ensuite mis à réagir à 250 C pendant 30 minutes De l'alcool méthylique à la même quantité que le mélange réactionnel est ajouté pour stopper la réaction La solution réactionnelle est soumise à une HPLC pour déterminer la quantité de désacétyl glutaryl-7-ACA produite. Lractivité DAO est mesurée par ce qui suit Un échantillon d'enzyme est ajouté à un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,5) contenant 10 g/l de Céphalosporine C, et ils sont mis à réagir à 250 C pendant 15 minutes De l'alcool méthylique à la même quantité que le mélange réactionnel est ajouté pour stopper la réaction La solution réactionnelle est soumise à une HPLC pour déterminer la quantité de glutaryl-7-ACA et d'OE-céto-adipoyl-7-ACA produite. Lorsqu'un mélange contenant DAO est mis en contact avec un composé du Cu pendant le procédé d'oxydation d'enzyme, la quantité totale de désacétyl Céphalosporine C et de désacétyl glutaryl-7-ACA est mesurée avant et après le procédé oxydation d'enzyme La quantité augmentée des dérivés désacétyle sur la base de la quantité initiale de Céphalosporine C est considérée comme un rapport d'activité d'estérase/DAO. L'oxydation enzymatique est habituellement mise en oeuvre par balayage d'oxygène à travers la solution réactionnelle à 20 à 300 C Le temps de réaction dépend de la concentration en Céphalosporine C, de la quantité de l'activité du mélange contenant DAO, et de la température de réaction Lorsque la quantité de glutaryl-7-ACA produite a atteint un maximum, qui peut être suivie par HPLC ou TLC ou les analogues, la réaction peut être stoppée La réaction est généralement complète en 30 minutes à 4 heures De façon à réduire la quantité d'a-céto-adipoyl-7-ACA restante, du peroxyde d'hydrogène peut être ajouté au mélange réactionnel. Le glutaryl-7-ACA est isolé du mélange réactionnel obtenu par des méthodes connues. La présente invention sera illustrée plus en détail en référence aux exemples non limitatifs suivants. lExemple 1 l Une souche KC-103 de T variabilis a été mise à croître dans un milieu contenant 2 % de glucose, 2 % de liqueur de maïs macéré et 0,2 % de DLméthionine à 250 C pendant 60 heures 0,3 ml de toluène a été ajouté à 60 ml du bouillon de fermentation incluant 6 g de cellules humides, et ils ont été mélangés à 251 C pendant 2 heures pour rendre perméable les cellules. 23,6 mg de Cu SO 4 5 H 20 ont été ajoutés au bouillon de fermentation obtenu des cellules perméabilisées et laissés à reposer à température ambiante pendant deux heures Une quantité appropriée d'échantillon d'enzyme provenant du bouillon de fermentation contenant Cu a été ajoutée à un tampon phosphate de potassium 0,2 M (p H 7,5) contenant 2 g/l de glutaryl-7-ACA La réaction a été mise en oeuvre à 25 WC pendant 30 minutes, et a été stoppée par ajout d'alcool méthylique en la même quantité que le mélange réactionnel, et a ensuite été soumise à une HPLC Le désacétyl glutaryl-7-ACA produit dans la réaction n'a pas été détecté, indiquant que l'estérase dans l'échantillon d'enzyme était suffisamment inactivée. g de poudre de Céphalosporine C ont été dissous dans 1000 ml d'eau, et le p H a été ajusté à 7,5 La solution de Céphalosporine C obtenue a été mélangée avec le bouillon contenant du Cu ci-dessus obtenu, et ils ont été mis à réagir à 201 C pendant 180 minutes avec un balayage d'oxygène à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7- ACA était de 93,2 %. lExemple 2 l Un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche KC-103 de T variabilis dont l'activité estérase était inactivée a été obtenu par la même méthode que décrite à l'Exemple 1. Un bouillon de fermentation de A chrysogenum contenant 8,5 g/l de Céphalosporine C a été ajusté à p H 2,5, puis les cellules ont été éliminées de ce bouillon Le p H du bouillon a été ajusté à p H 7,5 1200 ml du bouillon obtenu ont été mélangés avec 60 ml du bouillon de fermentation de T variabilis ci-dessus obtenu Tandis que de l'oxygène était balayé à travers le mélange réactionnel et que 23, 9 ml de peroxyde d'hydrogène à 3,5 % étaient continuellement ajoutés au mélange réactionnel, la réaction a été menée à 201 C pendant 240 minutes Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 92,8 %. lExemple 3 l Un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche KC-103 de T variabilis a été obtenu par la même méthode que décrite à l'Exemple 1. 10 g de poudre de Céphalosporine C ont été dissous dans 1000 ml d'eau, et le p H a été ajusté à p H 7,5 La solution de Céphalosporine C obtenue a été mélangée avec 60 ml du bouillon de fermentation de T variabilis ci-dessus obtenu. Ensuite, 0,5 g de Cu SO 4 5 H 20 a été ajouté dans le mélange résultant La réaction a été menée à 20 C pendant environ 180 minutes tandis que de l'oxygène était balayé à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 92,2 % La quantité totale augmentée de désacétyl Céphalosporine C et de désacétyl glutaryl-7-ACA était de 1 % ou moins sur la base de la quantité de Céphalosporine C. lExemple 4 l Un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche KC-103 de T variabilis a été obtenu par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 60 ml de bouillon de fermentation de T variabilis et 1200 ml du bouillon de fermentation de A chrysogenum contenant de la Céphalosporine C obtenue par la même méthode que décrite à l'exemple 2 ont été mélangés. 0,5 g de Cu SO 4 5 H 20 a été ajouté au mélange résultant, et ils ont été mis à réagir à 20 C pendant environ 240 minutes pendant que l'oxygène était balayé à travers et que 23,9 ml de peroxyde d'hydrogène à 3,5 % étaient continuellement ajoutés au mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 92,0 % La quantité totale augmentée de désacétyl Céphalosporine C et de désacétyl glutaryl-7-ACA était de 1 % ou moins sur la base de la quantité de Céphalosporine C. lExemple 5 l 400 ml d'un bouillon de fermentation de T variabilis contenant 40 g de cellules humides ont été obtenus par la même méthode que décrite à l'Exemple 1, et ont été traités avec 2,0 ml de toluène par la même méthode que décrite à l'Exemple 1. 157,3 mg de Cu SO 4 5 H 20 ont été ajoutés au bouillon ci- dessus obtenu et le mélange résultant a été laissé à reposer à température ambiante pendant 2 heures L'activité estérase d'un échantillon d'enzyme provenant du bouillon contenant Cu obtenu a été mesurée par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 L'estérase dans l'échantillon d'enzyme était suffisamment inactivée. g de poudre de Céphalosporine C ont été dissous dans 1000 ml d'eau, et le p H a été ajusté à p H 7,5 La solution obtenue a été mélangée avec 400 ml du bouillon de fermentation de T variabilis ci-dessus obtenu La réaction a été menée à 201 C pendant environ 30 minutes avec un balayage d'oxygène à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 99,0 %. lExemple 6 l 400 ml d'un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche KC-103 de T variabilis obtenues par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 et 1000 ml de solution aqueuse de Céphalosporine C obtenue par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 ont été mélangés. 0,66 g de Cu SO 4 5 H 20a été ajouté au mélange réactionnel ci- dessus, et la réaction a été menée à 20 'C pendant 30 minutes pendant que de l'oxygène était balayé à travers le mélange réactionnel. Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 98,1 % La quantité augmentée totale de désacétyl Céphalosporine C et de désacétyl glutaryl-7-ACA était de 1 % ou moins sur la base de la quantité de Céphalosporine C. lExemple 7 l Une souche EL-17 de T variabilis a été mise à croître dans un milieu contenant 2 % de glucose, 2 % de liqueur de maïs macéré et 0,2 % de DLméthionine à 250 C pendant 60 heures 0,2 ml de toluène a été ajouté à 25 ml du bouillon de fermentation ayant 2,5 g de cellules humides, et ils ont été mélangés à 250 C pendant 2 heures pour perméabiliser les cellules. Une quantité appropriée d'échantillon d'enzyme provenant du mélange de fermentation a été ajoutée à un tampon phosphate de potassium 0,2 M (p H 7,5) contenant 2 g/l de glutaryl-7-ACA, et ils ont été mis à réagir à 250 C pendant minutes La réaction a été stoppée par ajout d'alcool méthylique en la même quantité que le mélange réactionnel, et ensuite soumise à une HPLC Le rapport de l'activité estérase à l'activité DAO a été réduit à un tiers de celui de la souche parente, c'est-à-dire 3, O %. g de poudre de Céphalosporine C ont été dissous à 1000 ml d'eau, et le p H a été ajusté à p H 7,5 La solution de Céphalosporine C obtenue a été mélangée avec le bouillon de fermentation ci-dessus obtenu de cellules perméabilisées, et le mélange a été mis à réagir à 200 C pendant environ 180 minutes avec un balayage d'oxygène à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 92,6 %. lExemple 8 l Un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche EL-17 de T variabilis a été obtenu par la même méthode que décrite à l'Exemple 7. Un bouillon de fermentation de A chrysogenum contenant 9 g/i de Céphalosporine C a été ajusté à p H 2,5, et ensuite les cellules ont été éliminées de celui-ci Le p H a été ajusté à p H 7,5 avec Na OH 6 N 6 m 3 du bouillon obtenu ont été mélangés avec 60 i du bouillon de fermentation de T variabilis ci-dessus obtenu Pendant que de l'oxygène était balayé à travers le mélange réactionnel et que 13 i de peroxyde d'hydrogène à 35 % était continuellement ajoutés au mélange réactionnel, la réaction a été menée à 201 C pendant environ 220 minutes Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 92,2 %. il lExemple 9 l ml d'un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche EL17 de T variabilis obtenues par la même méthode que décrite à l'Exemple 7 et 1000 ml de solution aqueuse de Céphalosporine C obtenue par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 ont été mélangés Le mélange a été ensuite mis à réagir à 200 C pendant environ 30 minutes avec un balayage d'oxygène à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 96,2 %. lExemple Comparatifl ml d'un bouillon de fermentation de cellules perméabilisées de souche KC-103 de T variabilis obtenues par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 et 1000 ml de solution aqueuse de Céphalosporine C obtenue par la même méthode que décrite à l'Exemple 1 ont été mélangés Le mélange a ensuite été mis à réagir à 200 C pendant environ 180 minutes avec un balayage d'oxygène à travers le mélange réactionnel Le rendement en glutaryl-7-ACA était de 83,0 %. REVENDICATIONS 1 Procédé d'oxydation enzymatique pour convertir de la Céphalosporine C en acide glutaryl-7-aminocéphalosporanique caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'un mélange contenant une amino-acide oxydase dont l'activité estérase est 5 % ou moins de l'activité du D-amino- acide oxydase. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu à partir d'un mutant négatif ou déficitaire en catalase capable de produire une D-amino-acide oxydase. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mutant est de la souche KC-103 Trigonopsis variabilis ou de la souche EL-17. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu par mise en contact du mélange avec des composés du Cu. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu par mise en contact du mélange avec un composé du Cu à une concentration de 10 à 2000 ppm. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le contact est mis en oeuvre avant ou pendant le procédé d'oxydation enzymatique. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est obtenu à partir d'un mutant montrant 5 % ou moins d'activité estérase sur la base de son activité DAO, qui est obtenu par traitement d'un microorganisme capable de produire de la DAO avec une radiation ultraviolette, une radiation de rayons X, ou un mutagène. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le mélange contenant une D-amino-acide oxydase est composé de cellules partiellement détruites, ou de cellules perméabilisées, d'extraits exempts de cellules obtenus de celles-ci, ou d'un enzyme immobilisé. 14 2702493 9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le mutant est négatif ou déficitaire en catalase. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le mutant est la souche EL-17 Trigonopsis variabilis. 11 Souche EL-17 Trigonopsis variabilis. 12 Procédé pour inactiver une estérase dans un mélange contenant une D-amino-acide oxydase, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact du mélange contenant une D-amino- acide oxydase avec un composé du Cu.