Brevet FR2707011A1 — publié le 19941230

La présente invention concerne un procédé d'immunodiagnostic de maladies autoimmunes systémiques et d'états cancéreux qui repose sur la recherche dans le sérum des malades d'anticorps dirigés contre la poly(ADP- ribose) polymérase. On sait que cette enzyme catalyse l'ADP- ribosylation de protéines du noyau cellulaire, réaction associée à un certain nombre de fonctions régulatrices telles que la réparation de l'ADN, l'expression des gènes et la différenciation cellulaire. Sa séquence d'aminoa- cides a été décrite dans Biochem. Biophys. Res. Commun. 148 617-622(1987); la formation de poly(ADP-ribose) est augmentée notamment en cas de dommage dans l'ADN, de choc thermique et d'inflammation et la présence d'anticorps dirigés contre le poly(ADPribose) dans le sérum de malades atteints de lupus érythémateux disséminé a été décrite dès 1977 puis ultérieurement chez certains patients ayant un syndrome de Gougerot-Sjôgren, une polyarthrite rhumatoïde, une sclérodermie ou encore chez d'autres patients souffrant d'une maladie infectieuse comme la tuberculose, la lèpre ou bien étant infectés par E. Coli ou Klebsiella. Plus récemment, la présence d'autoanticorps dirigés contre la poly(ADPribose) polymérase a été recherchée dans le sérum de diverses personnes atteintes de maladies autoimmunes mais les résultats mentionnés par Yamanaka et col. dans J. Clin. Invest. 80 900-904 (1987) et 83 180-186 (1989) puis par Negri et col. dans Autoim- munity 6 203-209 (1990) sont contradictoires, le premier ne trouvant des anticorps que dans une faible proportion de maladies rhumatismales, tandis que le second les trouve dans plusieurs types de maladies autoimmunes, mais probablement à cause d'un artefact expérimental. On a maintenant trouvé qu'il était possible de diagnostiquer un lupus érythémateux disséminé ou un syndrome de Gougerot-Sj6gren en recherchant dans le sérum des malades la présence d'anticorps dirigés contre une région particulière de l'enzyme poly(ADP-ribose)polymé- rase. On sait néanmoins que la concentration sérique de ces anticorps varie avec les phases de ces maladies, et d'autres moyens seront nécessaires dans certains cas pour les diagnostiquer; la recherche d'anticorps dirigés contre le polymère lui-même, le poly(ADP-ribose), est l'un des moyens déjà utilisé, mais il n'est pas très spécifique et révèle aussi d'autres maladies autoimmunes. La présente invention concerne un procédé immunologique de détection et de dosage d'anticorps dirigés contre la poly(ADP-ribose) polymérase dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'antigène mis en oeuvre est le peptide formant les doigts de zinc Fl ou F2 de ladite poly(ADP-ribose) polymérase, des fragments de ceux-ci ou des peptides homologues. Les peptides sont représentés à la Fig. annexée, F1 étant SEQ ID N 1 et F2 étant SEQ ID No 2, et comprennent respectivement les séquences d'amino- acides situées entre les positions 21 à 56 et 125 à 162 de l'enzyme. Par peptides homologues, on entend des peptides dans lesquels certains amino-acides ont été remplacés par des amino-acides équivalents, et qui présentent une réactivité immunologique sensiblement identique à celle des peptides constituant les doigts F1 ou F2 ou des fragments de ceux-ci. Comme aminoacides équivalents, on peut citer lysine et arginine, glycine et alanine, acide aspartique et acide glutamique, asparagine et glutamine. Ces peptides peuvent être obtenus par clonage ou par synthèse chimique, par exemple par la méthode en phase solide de Merriefield. Les autoanticorps dirigés contre la poly(ADP- ribose) polymérase sont généralement présents dans le sérum des malades atteints de maladies autoimmunes systémiques telles que le lupus érythémateux disséminé ou les syndromes de Gougerot-Sjôgren primaire ou secon- daire, mais on pense les trouver aussi dans les états précancéreux et cancéreux puisqu'il existe une corréla- tion entre l'inhibition de l'enzyme et la transformation maligne des cellules, comme cela a été décrit par T. Boulikas dans Anticancer Research 12: 885-898 (1992). La présente invention concerne donc aussi les procédés d'immunodiagnostic du lupus érythémateux disséminé, du syndrome de Gougerot-Sjôgren ou de certains états précancéreux ou cancéreux qui consistent à effec- tuer la recherche d'anticorps dans le sérum des patients à l'aide d'un peptide choisi parmi les doigts F1 ou F2 de la poly(ADP-ribose) polymérase, leurs fragments et leurs homologues à l'aide d'un immuno-essai. Par immuno-essai ou procédé de détection immunologique, on entend tous les procédés bien connus de l'homme du métier, qui consistent à mettre en présence un échantillon du liquide biologique, en général du sérum, dans lequel on veut rechercher les anticorps avec une certaine quantité de l'antigène caractéristique choisi, à séparer l'antigène n'ayant pas réagi et à révéler le complexe immunologique éventuellement formé. L'antigène peut être immobilisé sur une phase solide, telle que les cupules d'une microplaque de titration ou des microbilles de polymère, par adsorption ou par couplage chimique; l'anticorps fixé peut alors être révélé par la formation d'un complexe avec un anti- anticorps, qui a été préalablement marqué de façon classique dans ce domaine par une enzyme, dont la présence sur la phase solide se traduira par la conver- sion de son substrat, lors de son introduction dans le milieu, en un produit coloré, fluorescent ou luminescent; l'anti-anticorps peut aussi être radiomarqué. D'autres méthodes plus ou moins complexes sont connues et décrites notamment dans l'ouvrage "Laboratory Technics in Biochemistry and Molecular Biolo- gy", vol. 19, edited by R.H. Burdon and P.H. van Knippen- berg - Elsevier (1988), auquel l'homme du métier pourra se référer. La présente invention a également pour objet un kit de détection d'anticorps dirigés contre la poly(ADP-ribose) polymérase, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide antigénique choisi parmi les doigts F1 et F2 de ladite polymérase, un peptide homologue ou l'un de leurs fragments présentant une réactivité immunologique sensiblement identique, éventuellement immobilisé sur un support solide, et éventuellement un anticorps marqué apte à se fixer au complexe anticorps- antigène formé, et des moyens de mise en évidence de la fixation dudit anticorps audit complexe. - Dans ce qui suit, on décrit les résultats de l'étude des sérums de 235 sujets connus présentant diverses maladies autoimmunes et de 42 volontaires sains, par le procédé de l'invention avec une méthode immunoen- zymatique sur phase solide dite ELISA. 97 malades avaient un lupus érythémateux disséminé en phase active ou non (LED), 67 avaient un syndrome de Gougerot-Sjôgren primaire (pSS) et 16 un syndrome secondaire associé à un lupus (sSS) tandis que 38 avaient une polyarthrite juvénile (JCA) et 17 une connectivité mixte (MCTD). On a immobilisé dans les puits d'une plaque de microtitration le peptide F2 (Fig.) synthétisé par la méthode de Merriefield ou à titre comparatif l'enzyme poly(ADP-ribose) polymérase recombinante humaine décrite dans Gene 114 279-283 (1992) ainsi que l'enzyme de veau de structure analogue, par adsorption de façon classique à 370 C à partir de leurs solutions dans un tampon carbonate (0,05 M, pH 9,6), à raison de 100 ng/ml pour les enzymes et 1 pM pour le peptide. Du poly(ADP-ribose) de 90 + 10 unités avec une densité de ramification de 2 + 0,5 %, préparé comme décrit dans Biochem. Cell. Biol. 65 668-673 (1987) a aussi été immobilisé à partir d'une solution dans un tampon phosphate salin Tween de 50 ng/ml, par la méthode citée dans Clin. Exp. Immunol. 86 124-133 (1991). Les sérums testés ont été dilués au 1/1000 et la révélation a été effectuée par addition d'anti-IgG humaine conjugué à de la peroxydase de radis noir, en utilisant comme substrat la tétraméthylbenzidine en présence de H202. Les sérums ont été déclarés positifs lorsque la densité optique mesurée était supérieure à une valeur définie à l'aide de sérums normaux, étant entendu que la densité optique de moins de 2,5 % de ces sérums normaux pouvait être supérieure à cette valeur. Les résultats obtenus figurent dans le tableau ci-dessous. L'enzyme entière recombinante ne donne pas de réaction décelable dans les conditions classiques choisies; par contre le poly(ADP-ribose) donne des résultats intéressants, comme l'avaient souligné d'autres auteurs. Le peptide F2 donne un résultat inattendu, lorsque l'on se réfère à celui obtenu avec l'enzyme entière, recombinante humaine ou naturelle de veau, d'autant plus que très peu de sérums ont été trouvés positifs avec l'enzyme et négatifs avec le peptide. TABLEAU Sujets positifs avec avec avec Maladie Nb sujets Poly(ADP-ribose) Enzym entière Peptide F2 LED n=--97 41 (42,3%) 5 (5,2%) 34 (35,1%) pSS n=67 14 (20,9%) 6 (9,0%) 28 (41, 8%) sSS n=16 7 (43,8%) 2 (12,5%) 9 (56,3%) JCA n=38 1 (2,6%) I (2,6%) 0 (0%) MCTD n=17 2 (11,8%) 1 (5,9%) 1 (5,9%) normal n=42 1 (2,4%) 0 (0%) I (2,4%) REVENDICATIONS 1. Procédé immunologique de détection et de dosage d'anticorps dirigés contre la poly (ADP-ribose) polymérase dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'antigène mis en oeuvre est le peptide consti- tuant le doigt F1 ou le doigt F2 du zinc de ladite polymérase ou un peptide homologue ou l'un de leurs fragments, présentant une réactivité immunologique sensiblement identique. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'antigène est le doigt F2 du zinc de ladite polymérase. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à étudier est mis en contact avec l'antigène immobilisé et que le complexe immunologique est révélé avec un anti- corps marqué par une enzyme. 4. Procédé de diagnostic d'une maladie autoimmune choisie parmi le lupus érythémateux disséminé et le syndrome de Gougerot-Sjôgren, caractérisé en ce qu'on effectue la recherche d'anticorps sériques dirigés contre la poly(ADP-ribose) polymérase par un procédé selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Procédé de diagnostic d'un état précancé- reux ou cancéreux, caractérisé en ce qu'on effectue le recherche d'anticorps sériques dirigés contre la poly- (ADP-ribose) polymérase par un procédé selon l'une des revendications 1 & 3. 6. Kit de détection d'anticorps dirigés contre la poly(ADP-ribose) polymérase, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide antigénique choisi parmi les doigts F1 et F2 de ladite polymérase ou un peptide homologue ou l'un de leurs fragments, présentant une réactivité immunologique sensiblement identique, éven- tuellement immobilisé sur un support solide, et éventuel- lement un anticorps marqué apté à se fixer au complexe anticorps- antigène formé, et des moyens de mise en évidence de la fixation dudit anticorps audit complexe.