Brevet FR2700957A1 — publié le 19940805

COMPOSITION DE VACCIN SOUS UNITAIRE RECOMBINANT VIVANT ET PROCEDE DE PREPARATION. La présente invention concerne de nouvelles compositions vaccinantes associant des vaccins sous unitaires recombinants vivants associés à des émulsions injectables, notamment du type eau dans huile (E/H), huile dans eau (H/E) ou eau dans huile dans eau (E/H/E), pour l'administration en médecine vétérinaire ou humaine. Une application de la présente invention concerne plus particulièrement les vaccins vivants recombinants dans lesquels la protéine recombinante, qui est une protéine recombinante impliquée dans la réponse immunitaire protectrice contre un micro-organisme, en particulier contre un virus enveloppé, est exprimée dans un vecteur viral constitué par un virus non enveloppé tel l'adénovirus, le virus de la vaccine, le Canorypox virus ou les baculovirus. La vaccination par des microorganismes vivants présente de nombreux avantages bien connus comparés à la vaccination par des vaccins non vivants constitués de micro-organismes tues ou de protéines ou peptides isolés. Parmi les vaccins -vivants, les vaccins vivants atténués sont largement utilisés, mais ils ont comme inconvénient de présenter des risques pathogènes ainsi, il existe toujours d'une part une possibilité d'intégration de l'acide nucléique viral dans le génome de l'hôte, et d'autre part de réversion vers une forme virulente. Par ailleurs, les mutations ou délétions conduisant à l'atténuation de la virulence des vaccins vivants atténués entrainent parfois une diminution de la réponse immunitaire, nécessitant l'injection de doses importantes de composition vaccinale. L'utilisation d'adjuvants a été testé afin de combler la diminution de la réponse immunitaire. Ainsi le brevet EP 129923 utilise des adjuvants huileux de type H/E pour améliorer la réponse immunitaire Si l'on constate ainsi une certaine amélioration de la réponse immunitaire, les microorganismes vivants atténués tels des virus vivants atténués, se présentant habituellement sous forme de lyophilisat, nécessite une solubilisation dans un milieu essentiellement aqueux. La quantité d'huile que l'on peut alors introduire dans la phase aqueuse est très limitée. I1 s'ensuit que seules des émulsions du type H/E peuvent être obtenues à partir d'un vaccin vivant atténué. Par ailleurs, certains microorganismes vivants atténués, tels les virus enveloppés vivants atténués, au contact direct d'une huile ou d'une phase huileuse, peuvent être inactivés, notamment sous l'effet d'une perte de l'intégrité de leur membrane biologique. Les progrès du génie génétique permettent d'obtenir des vaccins sous unitaires recombinants, utilisant des antigènes de plus -en plus purifiés, voir totalement synthétiques; La pureté des vaccins sous unitaires recombinants est un atout incontestable sur le plan de la sécurité du vaccin comparativement aux vaccins atténués vivants. Habituellement, les vaccins sous unitaires recombinants consistent en une ou plusieurs protéines purifiées produites par des micro-organismes recombinants et injectées chez l'hôte. La pureté de ces vaccins sous unitaires recombinants non vivants , correspondant à ces vaccins constitués de protéines purifiées produites par des microorganismes recombinants s'accompagne en général d'une diminution de l'efficacité immunologique ; c'est pourquoi, l'emploi de vaccins sous unitaires recombinants nécessite d'utiliser une quantité importante d'antigènes. De plus, les vaccins sous unitaires recombinants non vivants nécessitent plusieurs injections ce qui est difficilement compatible avec des impératifs économiques. Plus récemment, ont été élaborés des vaccins sous unitaires recombinants vivants, consistant en un microorganisme vivant, généralement un virus, en tant que vecteur recombinant et dans lequel est inséré un gène exogène. De tels vaccins ont été décrits dans Journal of General Virology (1990), 71, 2425-2431. Ces vaccins sont directement introduits chez l'hôte, dans lequel la protéine est alors exprimée in vivo pour déclencher la réaction immunitaire. L'utilisation de vaccins sous unitaires recombinants vivants permet de combler partiellement les inconvénients des vaccins sous unitaires recombinants non vivants ; il nécessite cependant d'injecter des micro-organismes recombinants tels des ~ virus recombinants à des- quantités et concentrations très importantes De plus, les réponses immunitaires obtenues restent encore insatisfaisantes. L'invention consiste alors en des vaccins sous unitaires recombinants vivants obviant aux inconvénients mentionnés ci-dessus. De façon surprenante, l'invention permet en outre d'associer directement des huiles en quantité importante à des microorganismes vivants, tels des virus recombinants vivants, exprimant au moins un antigène d'un virus enveloppé. La présente invention concerne de nouvelles compositions de vaccin recombinant caractérisées par le fait qu'elles associent des vaccins sous unitaires recombinants vivants dans au moins une phase aqueuse et une phase huileuse à base d'au moins une huile, sous forme d'émulsions injectables de type E/H ou H/E ou E/H/E, pour l'administration en médecine humaine ou vétérinaire. Plus particulièrement, les vaccins de l'invention sont des vaccins sous-unitaires recombinants vivants caractérisés en ce que le vecteur recombinant est un virus recombinant pouvant être choisi parmi les adénovirus, le virus de la vaccine, le virus Canarypox, les herpes virus, les baculovirus. Les vaccins recombinants de l'invention sont également caractérisés par l'association avec une émulsion injectable à base d'huile et d'eau ,et le cas échéant d'un système émulgateur, d'un vecteur viral non enveloppé vivant dont le génome=contient, insérée de préférence dans une partie non essentielle pour la réplication du virus enveloppé correspondant, une séquence codant pour une sous-unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou microorganisme -pathogène. Les- sous-unités antigéniques peuvent être par exemple, une protéine, une glycoprotéine, un peptide, ou une fraction peptidique immunogène et/ou protectrice contre une infection par un micro-organisme vivant tel un virus enveloppé, une bactérie ou un parasite. L'intéret de l'invention consiste dans la possibilité d'obtenir une composition stable, immunogène, fluide, dans une émulsion huileuse et permettant de diminuer la quantité d'immunogènes par rapport à une composition aquese du même immunogène. Les huiles pouvant être utilisées dans la composition de vaccin selon l'invention sont avantageusement des huiles fluides choisies parmi les huiles minérales naturelles ou synthétiques ou les huiles non minérales d'origines végétales, animales ou synthétiques connues pour leur faible toxicité. Elles doivent être liquides à la température de stockage (+40C) ou, au moins donner des émulsions liquides à cette température. On choisira en particulier des huiles minérales à chaîne linéaire ayant un nombre d'atomes de carbone de préférence supérieur à 16 et exemptes de composés aromatiques. Des exemples connus-sont le MARCOL 52 (produit par ESSO France) et le DRAKEOL 6VR (produit par PENRECO USA). On peut également utiliser des huiles synthétiques telles que les polyisobutènes ou les polyisoproprènes. Parmi les huiles végétales, on choisira des huiles insaturées riche en acide oléique qui sont biodégradables et connues pour leur pouvoir immunogène, par exemple les huiles d'arachide, d'olive, de sésame, de soja, de germe de blé, etc. J Pour les huiles animales, les mêmes critères de tolérance et d'efficacité immunologiques permettentd'utiliser par exemple du squalène, du squalane, de l'huile de spermaceti. Un mélange des huiles citées précédemment est avantageusement utilisé dans le cadre de la présente invention. Habituellement les compositions vaccinales selon l'invention comportent en outre un système émulgateur. I1 doit être adapté pour donner des préparations injectables de type E/H, H/E ,E/H/E fluides et stables. Il se compose d'un ou plusieurs agents tensioactifs ayant en mélange un caractère lipophile ou hydrophile caractérisé par un nombre HLB (Hydrophile - Lipophile Balance) compris entre 1 et 19. Les émulgateurs sont de préférence obtenus par condensation d'un acide gras liquide à 200C sur un sucre (mannitol, glucose, saccharose) ou du glycérol. Les acides gras saturés sont de préférence ceux ayant au moins 16 atomes de carbone et en particulier les acides oléique, linoléique, ricinoléique, cétostéarique. On utilise de préférence les esters de mannitol notamment les oléates obtenus dans des conditions de synthèse particulières, par anhydrisation de la chaîne carbonée polyhydroxylée du mannitol qui se cyclise en 1-4 ou en 2-6. L'hydrophilie des esters obtenus peut être modifiée par greffage de fonctions hydrophiles telles qu'alcool, polyols, oxyde d'éthylène, oxyde de propylène, acide carboxylique, amine, amide. Tous les émulgateurs utilisés doivent être pharmaceutiquement acceptables pour un usage en injectable, notamment être dépourvus de métaux lourds, et présenter des indices d'acide ou de peroxydes très faibles. I1 est également souhaitable qu'ils satisfassent les normes de tests dtinnocuite tels que , par exemple, celui décrit par S.S. BERLIN (Annals of allergy,1962, 20, 473). Les émulgateurs utilisés forment avec l'huile choisie une phase homogène, limpide et stable qui sera émulsionnée avec le milieu aqueux propre à chaque préparation injectable. Le tableau 1 résume la nature minérale ou non minérale, c'est-à-dire métabolisable des huiles, le type d'émulsion vaccinale obtenu et les principales caractéristiques de ces huiles. Les concentrations de vaccins sous unitaires recombinants vivants dans les compositions selon l'invention peuvent etre comprises entre 102 et 1015 micro-organismes ou virus/ml et de préférence entre 105 et 1012 micro-organismes ou virus/ml. Les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être préparées de manière classique, par exemple selon les procédés décrits dans EP 480.981 et EP 480.982. Les proportions volumiques de la phase huileuse contenant huile associée ou non au système émulgateur et de la phase aqueuse contenant les antigènes ou les principes actifs varient respectivement dans l'émulsion de 5 à 95 E de phase huileuse, pour de 95 à 5 E de phase aqueuse, notamment de 25 à 75 % de phase huileuse pour 75 à 25 E de phase aqueuse. Le mélange de la phase huileuse et de la phase aqueuse se fait de manière classique, sous agitation à des températures comprises entre 20 et 40 c. L'ensemble des préparations obtenues doivent être stables, clest-à-dire que la préparation émulsionnée ne doit pas déphaser, ce qui signifie l'absence de libération de la phase antigénique ou de la phase huileuse dans les conditions de stockage normales pour ce type de produits. Les compositions selon l'invention peuvent présenter une stabilité supérieure ou égale à 12 mois à 4"C. De plus, ces préparations vaccinales sont fluides, c'est-àdire que la viscosité mesurée par un appareil à mobile tournant du type BROOKFIELD est avantageusement inférieure à 300 millipascals/seconde à 25 c. Le caractère huileux ou aqueux de la phase continue de l'émulsion est caractérisée par la conductivité mesurée en microsiemens par cm. Pour des valeurs inférieures à 20 microsiemens par cm environ, on obtient une phase continue huileuse à température ambiante. Dans les exemples qui suivent, la composition vaccinale utilisée est un adénovirus défectif exprimant la glycoprotéine gp 50 du virus de la pseudorage (PRV). La construction de l'adénovirus recombinant Ad-gp 50, l'expression de l'antigène gp 50 dans des cultures cellulaires, la réponse immunitaire et la protection conférée par vaccination de souris et de lapins avec Ad-gp 50 sont décrits dans la publication de M. doit et al, Journal of General Virology (1990), 71 : 2425-2431. Brièvement, la lignée cellulaire 293, une lignée embryonnaire humaine transformée par un adénovirus de type 5 (Ad-5) (Graham et al, 1977, Journal of General Virology, 36 : 59-72) a été utilisée pour la transfection, la multiplication et le titrage de 1' adénovirus. La construction de Ad - gp 50 utilise un Ad 5 délété dans la région E3 non essentielle à la croissance du virus. L'Ad - gp 50 exprime de hauts niveaux de gp 50 dans les lignées cellulaires complétant ou-non ElA, et notamment dans les cellules Hela déplétées pour le gène E1A. Les auteurs remarquent que la réponse en anticorps, mesurée par un test ELISA,est significative pour des concentrations élevées en Ad-gp50 tandis que la protection conférée à des souris ou des lapins est faible après épreuve à l'infection par le PRV. L'intérêt de l'invention consiste à émulsionner ce type de vaccin vivant recombinant dans des huiles associées à des émulgateurs décrits plus haut afin d'augmenter leur pouvoir immunogène et protecteur en diminuant les doses de virus vivants injectés. Dans les différents exemples qui suivent le virus Aujeszky est équivalent à PRV. Exemple 1 (comparatif) : Induction d'anticorps et efficacité de la vaccination en absence d'adruvants Le vaccin est constitué d'adénovirus recombinants Ad gp 50 décrits précédemment. Trois concentrations vaccinales ont été utilisées - î09 virus/ml (C1) - 3 108 virus/ml (C2) - 3 107 virus/ml (C3) Le protocole utilisé pour évaluer l'efficacité de la préparation vaccinale est décrit sur la figure 1. Les vaccins aux trois concentrations testées sont inoculés à JO par voie sous cutanée dans des souris OF1 (10 souris par groupe) à raison de 100 jil par souris. Un prélèvement de sérum est effectué deux semaines plus tard pour évaluer la quantité d'anticorps anti gp 50 induite par les préparations vaccinales. Pour évaluer l'efficacité des vaccins, une épreuve "challenge" est effectuée en présence d'une préparation de virus Aujeszky virulente à la- concentration de 20 DL50, définie par une expérimentation préliminaire. Les résultats de cette expérimentation sont représentés à la figure 2 où les concentrations en virus sont en abscisse et la mortalité exprimée en pourcentage en ordonnée. La mortalitéest-observé sur 240 heures ; au - delà de cette période toutes les souris résistent à l'épreuve. Deux paramètres sont validés - le taux de survie exprimé en pourcentage observé à la fin de l'expérimentation - la cinétique de mortalité - Dosage des anticorps anti gp 50 Le prélèvement du sérum est effectué deux semaines après les immunisations. Le dosage des anticorps anti gp 50 est effectué par ELISA, par la technique décrite par Eloit et coll.,Veterinary Record, 1989, 124 : 91-94. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 3, dans laquelle - C1, C2, C3 représentent respectivement les trois concentrations d'Ad-gp 50 : 109, 3.108 et 3.107 virus/ml. - les titres sont indiqués en ordonnées et indiquent la dilution nécessaire à l'obtention d'une D.O. (densité optique) supérieure au bruit de fond; - T indique un témoin absolu : non vacciné ; En absence d'ajuvant, une induction d'anticorps est obtenue uniquement à la concentration de 109 Ad-gps 0/ml ; aux concentration de 3 108 et 3 107 Ad-gp50/ml, on ne détecte pas d'anticorps anti gp 50. - Epreuve avec le virus virulent La résistance à l'épreuve par du virus Aujeszky est évaluée aux trois concentrations vaccinales Ct, C2 et C3. Les taux desurvie après l'épreuve sont présentées sur la figure 4. Le pourcentage de survie est exprimée en ordonnées. Une protection partielle au challenge (50%) est observé en présence de C1 (109 Ad-gp50/ml). Pour C2 (3 108 /ml ) et C3 (3 107 /ml), une absence de protection significative est observée par rapport à un témoin absolu (non vacciné). Le témoin absolu (non vacciné) présente un taux de mortalité de 100%. La figure 5 représente la cinétique de survie à l'épreuve de l'infection par le virus Aujeszky après immunisation sans adjuvant. Le pourcentage de viabilité est exprimé en ordonnée. On note que la mortalité est observée avant 120 heures pour le témoin comme pour les concentrations C2 et C3. On remarque donc qu'en l'absence d'adjuvant, l'adénovirus recombinant est incapable d'induire des anticorps anti gp50 et d'induire une quelconque protection au challenge avec le virus Aujeszky infectieux à une concentration inférieure à 109 Adgp50 /ml et seulement une protection partielle à une concentration de 109 Ad-gp50/ml. - ExemPle 2 : Induction d'une reponse immunitaire et d'une protection à ltépreuve du virus Au,eszky en présence d'adjuvant huileux de type E/H, H/E, E/H/E : Les 6 adjuvants décrits sur le tableau 1 ont été testés quant à leur potentialité à induire des anticorps anti gp 50 et à leur résistance à une épreuve avec des virus Aujeszky infectieux telle que définie dans l'exemple 1. Les préparations vaccinales sont réalisées à la seringue par mélange de l'adjuvant et des virus recombinants aux concentrations C1, C2 et C3 dans les préparations suivantes 1) Préparations vaccinales H/E prétaration n"l 25% adjuvant (huile + système émulgateur)(l) 75% composition immunogène (1)= Montanide ISA 25 préparation n02 25% adjuvant (huile + système émulgateur+ adjuvant de l'immunité cellulaire) (2) 75% composition immunogène (2)= Montanide ISA 25A Préparation n03 20% adjuvant (huile + système émulgateur) (3) 80% composition immunogène (3) Montanide ISA 28 2) Préparations vaccinales E/H/E préparation n04 50% adjuvant (huile + système émulgateur)(4) 50% composition immunogène (4) Montanide ISA 206 3 ) Préparations vaccinales E/H preparation n05 55% adjuvant (huile + système émulgateur)(5) 45% composition immunogène (5) Montanide ISA 50 préparation n06 70% adjuvant (huile + système émulgateur) (6) 30% composition immunogène (6) Montanide ISA 708 Les Montanide ISA sont commercialisés par la société SEPPIC. Ces préparations sont comparées - aux préparations vaccinales sans adjuvant décrites dans l'exemple 1 (T1) - à deux groupes témoins constitués pour l'un des souris non vaccinées (T2) et pour l'autre de souris dans lesquelles on injecte l'adjuvant,Montanide ISA 50, en absence d'Ad-gp50 (T3). Les dosages des anticorps anti gp50, les mesures des pourcentages de taux de survie et les mesure de cinétique de mortalité sont réalisés selon les protocoles décrits dans l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 2 et sur les figures 6,7,8,9,10,11 dans lesquels C1, C2, C3 ont les mêmes significations que dans l'exemple 1. a) Résultats avec des émulsions type H/E - Dosage des anticorps anti gp 50 Le tableau 2 montre que les taux d'anticorps anti gp 50 sont significativement supérieurs à ceux obtenus avec le témoin sans adjuvant et ce respectivement pour les Montanides ISA 25 , Montanide ISA 25 A, qui est le Montanide ISA 25 additionnée d'avridine (voir tableau 1), stimulant de l'immunité cellulaire et le Montanide ISA 28. -Epreuve avec le virus virulent Les figures 6, 7, 8 indiquent le pourcentage de viabilité en fonction du temps pour les trois concentrations vaccinales, comparées au témoin T2, et ce respectivement pour les Montanides ISA 25 (figure 6), Montanide ISA 25 A (figure 7), et le Montanide ISA 28 (figure 8); L'effet adjuvant est à comparer aux résultats obtenus sans adjuvant et représenté sur la figure 5. b) Resultats avec des émulsions de type E/H/E - Dosage des anticorps anti cm 50 Les résultats représentée sur le tableau 2 montrent clairement que le taux d'anticorps anti gp 50 obtenu en présence de Montanide ISA 206 est significativement supérieur à ceux obtenus avec le témoin T2 pour les 3 concentrations de gp50 testés. - Epreuve avec le virus virulent La figure 9 représente les résultats après challenge obtenus avec l'huile minérale Montanide ISA 206. Un taux de survie de 70% et 50% sont obtenus pour les concentrations les plus faibles d'Ad-gp 50 c) Résultats avec des émulsions de type E/H - Dosage des anticorps anti qp 50 Le tableau 2 montre un taux d'anticorps significativement détectables à la- concentration de 3 108 Ad- gp50/ml tandis que pour cette même concentration la détection d'anticorps anti gp 50 est impossible en l'absence d'adjuvant. - Epreuve avec le virus virulent Les résultats obtenus avec le Montanide ISA 50 (huile minérale) et le Montanide ISA 708 (huile minérale) sont représentés respectivement sur la figure 10 et 11. Un taux de survie supérieur à 60% pour le Montanide ISA 50 et à 50% pour le Montanide ISA 708 est obtenu pour toutes les concentrations de Ad- gp50. Le tableau 2 indique donc clairement que le taux d'anticorps anti gp 50 en présence des adjuvants selon l'invention est significativement supérieur à celui obtenu en absence d'adjuvant huileux. Les figures 5 à 11 indiquent que, alors qu'en l'absence d'adjuvant huileux selon l'invention, (figure 5) on observe une protection partielle (50%) au challenge en présence de 109 Ad-gp50/ml et une absence de protection (10%) en présence de 3 108 et 3 107 Ad-gpSO/ml. L'utilisation de Montanide ISA permet d'obtenir des taux de protection jusqu'à 100% pour la concentration la plus élevée (109 Ad-gpSO/ml), 90% (3 108 Ad-gpSo/ml) et 60% (3 107 Ad-gp50/ml). L'ensemble de cet étude permet de montrer l'intéret d'utiliser des adjuvants de type huileux selon l'invention sur des vaccins sous-unitaires recombinants vivants permettant d'augmenter de manière significative le taux d'anticorps spécifiques du gène exprimé et la protection contre l'agent infectieux. Ces résultats significatifs sont obtenus en primovaccination. Parmi les vaccins adjuvés efficaces testés on distingue donc - Les vaccins de type E/H avec les Montanide ISÀ 50 et ISA 708: * ils -induisent d'importants taux d'anticorps aux concentrations de 109 et 3 108 Ad-gp50/ml tandis qu'ils ne sont pas détectables à la concentration de 3 107 Ad-gp50/ml. * ils protègent contre le challenge avec le virus Aujeszky infectieux pour les trois concentrations testées à des taux supérieurs à 50%. I1 semble donc ici qu'il nty a pas ici de stricte corrélation entre le taux de survie et l'induction d'anticorps anti gp 50. Ce phénomène pourrait être lié à - une induction très importante d'une classe d'immunoglobuline non détectable par le dosage ELISA utilisé (IgM, IgA, IgE). -et/ou- l'induction d'une immunité de type cellulaire. - Les vaccins de type E/H/E avec le Montanide ISA 206 * ils induisent des taux d'anticorps très importants pour les trois concentrations d'Ad-gp50 testés (109/ml, 3 108/ml, 3 107/ml) * ils protègent contre le virus Aujeszky infectieux pour les trois concentrations testées à des taux supérieurs à 50%. - Les vaccins de type H/E avec les Montanide ISA 25 et ISA 28 * ils induisent des taux d'anticorps spécifiques anti gp 50 importants aux concentrations de 109 et 3 108 Ad-gpS 0/ml tandis qu'en présence de Montanide ISA 28 on détecte encore la présence d'anticorps anti gp 50 à la concentration d'Ad-gp 50 la plus faible (3 107/ml). * ils protègent contre le virus Aujeszky infectieux avec le Montanide ISA 28 à des taux compris entre 40 et 55%. Ce type de vaccins (H/E) apparait cependant globalement moins efficaces que les vaccins de type E/H ou E/H/E. - Les vaccins de type H/E avec un adjuvant de l'immunité cellulaire. L'adjonction d'un adjuvant de type avridine au Montanide ISA 25 permet d'obtenir des protections à l'épreuve de 100% pour la concentration d'Ad-gp50 la plus élevée (109/ml) sans induire une quantité plus importante d'anticorps anti gp 50. - Observations de réactions locales Une observation macroscopique macroscopique ne révèle ni de réactions locales, ni de granulomes au site d'injection. Il va de soi que les exemples ci dessus sont donnés à titre illustratif. l'invention concerne aussi toute composition contenant une ou des huiles minérales, non minérales ou mixtes (minérale + non minérale) associé à un système émulgateur présentant les caractéristiques physicochimiques (viscosité, conductivité) des Montanide ISA et susceptibles d'être émulsionnée avec une solution aqueuse contenant un vaccin recombinant, dans lequel une protéine ou un peptide immunogène de n'importe quel agent pathogène est exprimé dans un vecteur dont la réplication est compatible avec une émulsion huileuse. Font également parties de l'invention les vaccins recombinants vivants dans lequel la séquence codante dans ledit vaccin code par exemple pour une sous-unité antigénique du virus HIV1 ou HIV2, ou FIV, l'expression de cette sous-unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre ces mêmes virus. TABLEAU 1/2 N ADJUVANT HUILE TYPE DE %Phase àqueuse VISCOSITE CONDUCTIVITE VACCIN /Adjuvant (m Pascal s-1) 25 C (en Vol.) ( S. cm-1) 1 MONTANIDE ISA 25 Minérale H/E 75% 20 5000 2 MONTANIDE ISA 25A Minérale+Aviridine* H/E 75% 20 5000 3 MONTANIDE ISA 28 Minérale+non minéral H/E 80% 25 1000 4 MONTANIDE ISA 206 Minérale E/H/E 50% 50 1000 5 MONTANIDE ISA 50 Minérale H/E 45% 200 1 6 MONTANIDE ISA 708 Non minérale E/H 30% 70 1 *Aviridine=N,N-dioctadecyl-N-bis (2-hydroxyethyl)-propanediamine. TABLEAU 2/2 ADJUVANT Ad gp50 ELISA concentration titre Montanide ISA 25 Cl > 256 Montanide ISA 25 C2 128 Montanide ISA 25 C3 4 Montanide ISA 25A C1 > 256 Montanide ISA 25A C2 90 Montanide ISA 25A C3 90 Montanide ISA 28 Cl > 256 Montanide ISA 28 C2 256 Montanide ISA 28 C3 32 Montanide ISA 206 Cl > 256 Montanide ISA 206 C2 256 Montanide ISA 206 C3 > 256 Montanide ISA 50 Cl > 256 Montanide ISA 50 C2 > 256 Montanide ISA 50 C3 4 Montanide ISA 708 # Cl > 256 Montanide ISA 708 C2 > 256 Montanide ISA 708 C3 4 Néant (Tl) C1 256 Néant C2 4 Néant C3 4 Montanide ISA 50 (T3) 0 4 Néant (T2) # 0 4 C1 = 1 10 9 particules virales/ml C2 = 3 10 8 particules virales/ml C3 = 3 10 7 particules virales/ml REVENDICATIONS 1. Composition de vaccin vivant recombinant caractérisée par le fait qu'elle associe des vaccins sous unitaires recombinants vivants dans au moins une phase aqueuse et une phase huileuse à base d'au moins une huile, sous forme d'émulsions injectables de type E/H ou H/E ou E/H/E, pour l'administration en médecine humaine ou vétérinaire. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le vecteur recombinant est choisi parmi les adénovirus, le virus de la vaccine, le Canarypox virus, les Herpès virus ou les baculovirus. 3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le virus recombinant est un adénovirus. 4. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le virus - recombinant est le Canarypox virus. 5. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le virus recombinant est un baculovirus. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la phase huileuse comporte un système émulgateur. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite émulsion est du type E/H/E ou du type E/H. 8. Composition de vaccin vivant contre un virus enveloppé ou un micro-organisme pathogène caractérisée par l'association avec une émulsion injectable à base d'eau et d'une phase huileuse comportant au moins une huile et le cas échéant un système émulgateur, d'un vecteur viral vivant dont le génome contient, une séquence codant pour une sous unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou microorganisme pathogène. 9. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que le vecteur viral est un virus non-enveloppé. 10. Composition selon l'une des revendications 8 et 9 caractérisée en ce que la dite séquence code pour une sous-unité antigénique induisant un effet protecteur contre les virus HIV1 ou HIV2. 11. Composition selon l'une des revendications 8 et 9 caractérisée en ce que la dite séquence code pour une sous-unité antigénique induisant un effet protecteur contre le virus FIV. 12. Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que la séquence contenue dans le génome du vecteur viral est une séquence codant pour la glycoprotéine gp 50 du virus Aujeszky, et en ce qu'il est protecteur vis à vis d'une infection par le virus Auj eszky. 13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'huile est de type minéral ou non minéral. 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle présente une stabilité supérieure ou égale à 12 mois à 40C et une viscosité inférieure à 300 millipascals /s. à 25 C. 15. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée par le fait que les proportions volumiques de la phase huileuse contenant de l'huile associée ou non au système émulgateur et de la phase aqueuse contenant les antigènes ou les principes actifs varient respectivement de 5 à 95% de phase huileuse, pour de 95 à 5% de phase aqueuse notamment de 25 à 75% de phase huileuse pour 75 à 25% de phase aqueuse. 16. Procédé de préparation d'un vaccin vivant recombinant caractérisé en ce qu'il consiste à émulsionner un vaccin vivant recombinant en solution aqueuse avec une huile minérale ou non minérale ou un mélange d'huile minérale ou non minérale sous la forme d'une émulsion EtH ou H/E ou E/H/E. 17. Procédé selon les revendications 16, caractérisé en ce que l'huile minérale ou non minérale peut être associé à un adjuvant de l'immunité cellulaire.