Brevet FR2705687A1 — publié le 19941202

IDENTIFICATION CLONAGE ET EXPRESSION DE L'ENZYME MALOLACTIQUE.- En vinification, la fermentation alcoolique par les levures est suivie d'une étape appelée "fermentation malolactique"(FML), réalisée par les bactéries lactiques. Il ne s'agit pas d'une fermentation au sens biochimique du terme mais d'une phase durant laquelle l'acide L- malique du vin est décarboxylé en acide L- lactique. Cette transformation est essentielle car elle participe à l'amélioration des qualités organoleptiques du vin (assouplissement du vin par désacidification) et à sa stabilisation microbiologique dans la mesure o le malate peut être utilisé comme un substrat de croissance d'autres bactéries. En outre, dans de nombreux cas, un vin ne peut pas recevoir la labellisation prévue (AOC etc..) s'il contient encore de l'acide malique. Pour ces principales raisons et d'autres encore évoquées par les producteurs de vin de base pour les eaux de vie ou les mousseux (méthode champenoise) la fermentation malolactique est indispensable. Contrairement aux levures qui se multiplient facilement dans le moût, les bactéries lactiques ont parfois des difficultés de croissance dans le vin; depuis que la fermentation malolactique est connue, le problème de sa maîtrise n'a jamais été résolu. Bien que la FML vienne naturellement après la fermentation alcoolique, son démarrage n'est pas contrôlé et l'oenologue a parfois à attendre plusieurs mois pour que le processus démarre. La constitution du vin, son pH, sa teneur en éthanol et divers autres métabolites de la levure, la température et le taux d'inoculum naturel déterminent le démarrage du processus; seule la température est contrôlée depuis longtemps mais cela est souvent insuffisant. Ce délai constitue une phase o le vin ne peut pas être protégé par sulfitage contre la croissance d'une flore indésirable et l'apparition concomitante de saveurs désagréables ou d'autres maladies du vin (tourne, amertume, vins filants). Il retarde aussi la période d'élevage du vin et la mise en bouteilles.Pour compliquer la chose la FML peut démarrer encore plus tard, par exemple dans la bouteille, ce qui ne peut être empêché sans mettre en oeuvre un procédé très cher de pasteurisation ou de stérilisation par filtration. La seule solution qui existe actuellement sur le marché des produits oenologiques est l'existence de préparations lyophilisées de Leuconostoc oenos (starter malolactique); elle consiste à suppléer la flore lactique naturelle par des bactéries sélectionnées et lyophilisées. Malgré les progrès évidents de ces dernières années, leur efficacité est très moyenne dans la mesure o ces bactéries malolactiques, qui ont poussé dans un milieu synthétique, perdent leur capacité à croître dans le vin. Plusieurs producteurs de champagne utilisent comme inoculum des vins prélevés l'année précédente en cours de FML et stockés au froid. Si ces méthodes donnent des résultats raisonnables, leur coût est prohibitif pour des produits à valeur ajoutée normale. A ce jour, aucun starter malolactique commercial n'est susceptible de résoudre le problème exposé ci-dessus. D'autres solutions ont été proposées, par exemple la transformation de l'acide malique du moût de raisin par Schizosaccharomyces pombe. (Taillandier, 1990) Les levures de cette espèce ont une forte activité à l'égard de l'acide malique et arrivent à dégrader tout l'acide au contraire des levures Saccharomyces qui n'en dégradent qu'un faible pourcentage. Le produit de la réaction est le pyruvate qui entre dans les voies métaboliques de la levure et conduit notamment à l'éthanol. Il s'agit de la transformation malo- alcoolique. En conséquence, la désacidification par disparition de l'acide malique est trop forte car elle n'est pas compensée par l'apparition de l'acide lactique, et le vin s'en trouve déséquilibré. En outre, l'application de ce procédé est difficile à généraliser car ces levures ne peuvent subir les étapes industrielles de préparation sans perdre de leur viabilité et de leur activité. D'autres techniques ont été tentées et notamment la mise en oeuvre de réacteurs à enzyme malolactique. Cependant, les caractéristiques structurales et cinétiques de l'enzyme laissaient entrevoir des problèmes pratiquement insurmontables: nécessité de co-facteur (NAD+), pH optimum d'activité très supérieur au pH du vin, présence de nombreux inhibiteurs et facteurs de dénaturation dans le vin. Aussi, pendant longtemps ces études se sont soldées par des échecs car l'enzyme doit être protégée du milieu du vin. En effet, la protéine est complètement inactivée dans le vin dont le pH est inférieur de 3 à 2,5 unités au pH optimum de l'enzyme et qui contient de nombreux inhibiteurs (tanin, éthanol, etc...). En outre, il est difficile de lui assurer la présence des co-facteurs nécessaires (NAD+ et Mn2+). L'activité n'était maintenue qu'en milieu synthétique. Une équipe a cependant réussi à faire fonctionner un réacteur à membrane; ces résultats ont été décrits dans le brevet FR 2 667 874. L'enzyme est enfermée dans un compartiment interne constitué par des membranes, le NAD+ étant lui immobilisé sur la face interne de la membrane, le malate et le lactate diffusant respectivement de l'extérieur à l'intérieur du compartiment et de l'intérieur vers l'extérieur par les lois de la dialyse. Cependant, ces réacteurs n'ont jamais trouvé un débouché industriel, probablement en raison des raisons exposées ci-dessus et du coût d'exploitation très élevé de ces types de réacteurs. Aussi, l'idée d'introduire le gène codant pour l'enzyme malolactique dans la levure de telle façon que cette dernière pourrait être capable de réaliser à la fois la fermentation alcoolique et la fermentation malolactique est-elle très attractive. A cette fin différentes approches ont été tentées qui toutes ont échoué a) A. Lautenlach et R.E. Subden dans Microbios. 39, 29-39 (1984), ont réalisé des banques de DNA génomiques de L.oenos dans E.coli. Compte tenu des caractéristiques des souches réceptrices et des vecteurs utilisés, la sélection des transformants a été faite sur milieu malate+ tétracycline. Des bactéries ainsi transformées par les plasmides recombinants portant le gène recherché sont supposées résistantes à la tétracycline (TetR) et capables de croître sur malate comme seule source de carbone. Aucune des colonies sélectionnées sur ce milieu et testées ne forment du L-lactate. Les transformants TetR conservent leur résistance mais aucun de ceux qui assimilent le malate ne maintiennent leur activité après plusieurs transferts en milieu sélectif liquide ou solide. En outre, les auteurs n'ont jamais démontré que l'acide L- malique était transformé en acide L-lactique. A aucun moment la preuve n'a pu être apportée que c'est bien le gène de l'enzyme malolactique qui a été clone. b) S.R. Snow et al. dans la demande de brevet européen n 0 103 399 ont procédé à une démarche identique à la précédente en ce sens que le génome de la bactérie lactique L.Delbrueckii a été cloné dans une banque chez E.coli. Les auteurs ont réussi à isoler des clones transformés produisant de l'acide L-lactique à partir d'acide L-malique. Un insert de 5 kilobases a également été cloné chez la levure S. Cerevisiae de laboratoire. Cependant, les auteurs n'ont jamais réussi à transformer correctement le malate en lactate et eux- mêmes soulignent qu'une augmentation de l'expression du gène devrait être nécessaire pour son utilisation en oenologie. En outre, dans les résultats expérimentaux, on n'a jamais pour un même essai les mêmes dosages permettant de voir la transformation stoechiométrique du L- malate en L-lactate. Enfin, les auteurs n'ont fait aucune détermination concernant l'activité malolactique d'extraits acellulaires notamment pour mesurer les caractéristiques cinétiques (KM, pH optimal, co- facteurs), ce qui aurait permis de confirmer la nature de l'enzyme produite. Si l'on ajoute à cela que les auteurs n'ont pas pu déterminer la séquence du gène et qu'ils n'ont pas pu faire exprimer en condition anaérobie le gène, ce qui le rend inutilisable en oenologie, on peut estimer que cette approche s'est soldée par un échec. c) ce même type de travail a été abordé en France (A. Lonvaud et al, résultats non publiés) par une démarche qui est: - 1 ) la purification et le séquencage de l'extrémité N terminale de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis - 2 ) la localisation du gène sur le chromosome en utilisant des sondes d'ADN dégénérées déduites de la séquence protéique et; - 3 ) le clonage et transfert dans la levure. Si l'enzyme malolactique a bien été purifié et séquencé pour vingt acides aminés de l'extrémité N terminale, les essais de clonage ont été là encore un échec. Les résultats obtenus par cette approche ont été décrits par Pierre RENAULT dans H. Heslot, J. Davies, et ai (éditeur 6th International Symposium on Genetics of Industrial Micro-organisms, Société Française de Microbiologie, Paris page 909-916.....). Les tentatives de clonage du gène de l'enzyme malolactique en utilisant une sonde faite à partir des vingt acides aminés N terminaux, par criblage d'une banque génomique de lactococcus lactis dans E. Coli a permis d'isoler deux clones contenant un fragment de 3,7 kilobases. Cependant aucun de ces clones n'est apparu correspondre au gène de structure de l'enzyme malolactique et l'étude a été abandonnée. La présente invention a mis en oeuvre une stratégie totalement différente. Cette stratégie qui sera exposée ci-dessous a permis d'isoler et d'identifier une séquence nucléotidique utilisable dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote pour garantir l'expression d'un polypeptide ayant au moins une partie de la conformation structurelle principale d'une protéine susceptible d'effectuer la transformation enzymatique de l'acide L-malique en acide L-lactique. Ces séquences d'ADN intégrées dans un hôte procaryote ou eucaryote qui n'exprime pas normalement l'enzyme malolactique peuvent être exprimées et la protéine obtenue présente toutes les caractéristiques structurales et bio- chimiques de l'enzyme malolactique. RESUME DE L'INVENTION Le laboratoire de l'Institut d'oenologie avait préalablement purifié l'enzyme malolactique à partir de la souche IL 1441 de Lactococcus lactis ssp lactis; puis les vingt derniers acides aminés de l'extrémité NH2 terminale ont été séquences, laquelle séquence est indiquée dans la figure 1. Afin de pouvoir isoler dans une banque génomique le gène de l'enzyme malolactique, la technique utilisée a été l'obtention d'une sonde d'ADN spécifique de la séquence des vingt acides aminés NH2 terminaux. La stratégie de base a alors été d'utiliser la technique de PCR (polymérase chaine réaction) pour générer un fragment d'ADN spécifique de ces vingt premiers acides aminés de l'EML. Pour se faire, deux mélanges d'amorces dégénérées ont été définis à partir des cinq premiers acides aminés et des cinq derniers acides aminés. Ceci laisse donc au centre une fraction de dix acides aminés ou trente nucléotides qui resteront après amplification spécifiques du gène de l'enzyme malolactique. C'est l'existence de cette sonde spécifique qui permettra par la suite d'isoler par hybridation le fragment d'ADN contenant le gène complet. Cette sonde a été ensuite clonée et séquencée dans un vecteur de E. Coli et la séquence présente une homologie parfaite avec la séquence des vingt acides aminés NH2 terminaux de l'enzyme. Ce fragment qui a été nommé EML 60 et présenté dans la figure 1 constitue donc une sonde spécifique du gène aux erreurs près dûes au couple d'amorces l'ayant généré, la séquence des amorces efficaces n'étant pas forcément identique à celle du gène. Effectivement, après séquencage de ce gène, on a pu noter sept mesappariements répartis uniquement sur les deux amorces. Au sens strict, ce sont donc les trente paires de base centrales amplifiées qui sont parfaitement spécifiques de la séquence du gène, et qui constituent la sonde qui va permettre d'isoler le gène en entier à partir d'une banque génomique. Cette sonde a été ensuite utilisée pour rechercher le gène de l'enzyme malolactique dans une banque génomique de L. lactis par la technique de "marche sur le chromosome", dont le principe de la technique est décrit dans Sambrook, Fritsch et Maniatis, Molecular cloning 1989 vol.1 chapitre 3. Brièvement, l'ADN génomique de la souche IL 1441 a été restreint totalement par les enzymes de restriction EcoR I, EcoR V, Hind III en simple, double ou triple digestion, comme cela est exposé dans le détail, plus bas. Cette digestion a permis d'isoler deux fragments intéressants qui ont ensuite été clones dans des plasmides qui ont été nommées pHE900 et pEML2. Les conditions d'obtention de ces plasmides et leur carte de restriction sont également données dans la description détaillée ultérieure. Ces deux fragments d'ADN recouvrent le gène de l'enzyme malolactique. Le gène de l'enzyme malolactique de L. lactis IL 1441 a donc pu être séquence et integré dans des plasmides permettant de transformer soit des procaryotes (E. coli) soit des eucaryotes (la levure S.cerevisiae). Les exemples ci-dessous montreront que la stratégie de clonage a été bonne puisqu'aussi bien chez E.coli que dans la levure, l'enzyme présente une activité permettant de transformer de façon stoechiométrique le malate en lactate. La validité de la technique a été en outre démontrée par des expériences de micro- vinification dans lesquelles la possibilité pour la levure d'assurer à la fois la fermentation alcoolique et la fermentation malolactique a été démontrée. Enfin la séquence de l'enzyme malolactique objet de la présente invention possède le site de fixation de son co-facteur le NAD+ , et présente une homologie de séquence avec un certain nombre d'enzymes maliques de diverses organismes, homologie d'au moins 35%. L'invention est donc relative à une séquence d'ADN contenant: (1) soit la séquence d'ADN contenue elle-même dans l'acide nucléique représentée dans la figure 5 et s'étendant entre la position 210 et la position 1829. (2) soit une partie de cette séquence, cette séquence étant néanmoins suffisante pour exprimer dans l'hôte approprié, après avoir été incluse au préalable dans un vecteur permettant la transformation de cet hôte, un polypeptide ayant une activité enzymatique malolactique. (3) soit une séquence dérivée de l'une ou l'autre des séquences définies dans (1) ou (2) par substitution de un ou plusieurs de leurs nucléotides, voire même addition ou deletion de certains codons, dès lors que cette séquence continue de coder pour un polypeptide ayant la susdite activité enzymatique. Cette séquence d'ADN est plus particulièrement caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs assemblages de nucléotides codant pour un ou plusieurs sites de fixation du NAD+ lequel est nécessaire à l'expression de l'activité enzymatique, et situés notamment aux positions 651 et 1092. La séquence nucléotidique de la figure 5 est caractérisée en ce qu'elle est issue du génôme de Lactococcus lactis. Fait également partie de l'invention toute séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle inclut de 35% à 100% de la région de codage de protéine indiquée dans la figure 5 et codant pour une enzyme malolactique. 1O 2705687 Plus particulièrement l'invention est également relative aux vecteurs constitués d'un plasmide contenant l'une des séquences de l'invention telle que définie plus haut, sous le contrôle d'éléments promoteurs et de régulation lui permettant de transformer une cellule hôte procaryote ou eucaryote, aux fins de permettre une expression stable dans ladite cellule hôte d'un polypeptide présentant l'activité enzymatique malolactique. Les plasmides de l'invention sont choisis parmi ceux qui sont susceptibles de transformer E.coli, ou en un plasmide susceptible de transformer une levure, ou en une plasmide susceptible de transformer à la fois E.coli et une levure. L'invention se rapporte aux cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes transformées ou transfectées par une séquence nucléotidique d'une façon permettant à la cellule hâte de dégrader l'acide L-malique en acide L- lactique; cette cellule hôte peut être une bactérie gram-positif ou une bactérie gram-négatif, notamment E.coli, ainsi qu'une souche de levures de laboratoire, notamment Saccharomyces cerevisiae, ou une souche de levure oenologique, notamment Schizosaccharomyces ou Saccharomyces, ou encore un champignon filamenteux, notamment des genres Aspergillus ou Trichoderma. Le procédé d'obtention d'une cellule hôte initialement non productrice d'enzyme malolactique ayant intégré de façon stable un matériel génétique hétérologue, et capable d'être exprimé dans ledit hôte sous la forme d'une protéine enzymatique capable de transformer le L-malate en L-lactate, ledit procédé fait également partie de l'invention et comprend une étape d'intégration de l'une des séquences définies ci-dessus, un vecteur susceptible de transformer ladite cellule hôte permettant l'expression stable de ladite protéine enzymatique. Ce procédé est particulièrement caractérisé en ce que la sonde nucléotidique est réalisée par amplification PCR en utilisant comme amorçes nucléotidiques deux amorçes dégénérées correspondant aux extremités de la séquence de acides aminés, de la figure 1, de préférence aux 5 premiers et aux 5 derniers acides aminés. La souche de E.coli contenant le plasmide recombinant pMDML représenté sur la figure 8 et déposée à la CNCM le 19 Mai 1993 sous le n 1-1309, lequel plasmide est susceptible de transformer les bactéries de façon stable, ainsi que la souche de E.coli contenant le plasmide recombinant p MDMALO représenté sur la figure 9 et déposé à la CNCM le 19 Mai 1993 sous le n 1-1310, lequel plasmide est susceptible de transformer les levures de façon stable, font partie de l'invention, ainsi que tout plasmide recombinant ayant intégré l'une des séquences définies ci- dessus, o elle est capable d'exprimer l'activité malolactique. L'invention est également relative à toute protéine susceptible d'effectuer la transformation enzymatique de l'acide L-malique en acide L-lactique, caractérisé par tout ou partie de l'enchaînement d'acides aminés indiqué dans la figure 5, laquelle partie est d'une longueur suffisante pour assurer l'activité enzymatique malolactique. Elle contient, en outre, deux enchaînements d'acides aminés soulignés dans la figure 5 et qui représentent les sites de fixation du NAD+ lequel est nécessaire à l'expression de l'activité enzymatique de la protéine. Son point isoelectrique est compris entre 4 et et son poids moléculaire compris entre 55000 et 65000 daltons. Est également relatif à l'invention, le procédé de désacidification de produits alimentaires, contenant de l'acide L-malique par transformation dudit acide L- malique en acide L-lactique, notamment dans un processus de fermentation de jus de fruit, justifiant d'une telle transformation, comprenant la mise en contact dudit jus avec un hôte cellulaire procaryote ou eucaryote tels que définis plus haut, par exemple E.coli ou S.cerevisiae. Plus particulièrement, ce procédé est caractérisé en ce que l'hâte recombinant est capable d'assurer à la fois la fermentation alcoolique et la transformation malo- lactique dans un processus de vinification. Un autre aspect de l'invention est la mise en oeuvre de ce procédé pour l'obtention de nouveaux produits alimentaires, notamment de boissons par la mise en contact de jus de fruit ou de légume avec un hôte cellulaire recombinant exprimant l'enzyme malolactique, la mise en oeuvre dudit procédé conduisant à la désacidification du milieu constitué par le jus, et l'obtention de nouvelles boissons. Le procédé de production de l'enzyme malolactique consistant en la mise en oeuvre de la culture dans des conditions nutritives appropriées de l'un des hôtes cellulaires recombinants définis ci-dessus de façon à permettre à ladite cellule hôte d'exprimer ladite protéine, puis la purification de cette protéine, fait partie de l'invention. Un autre aspect en est la mise au point d'une méthode de dosage de l'acide L-malique contenu dans un échantillon, caractérisé par la mise en contact dudit échantillon avec l'enzyme malolactique préparé comme ci- dessus et fixée sur un support, et que l'on mesure la quantité d'acide malique contenue dans l'échantillon par mesure de la la quantité de gaz carbonique produit par la transformation enzymatique de 'L-malate en L- lactate, et dans laquelle le support est plus particulièrement une électrode à enzyme. L'électrode à enzyme caractérisée par le fait - qu'elle contient l'enzyme malolactique, - qu'elle est utilisable pour doser une quantité d'acide malique dans un échantillon, - qu'elle permet de mesurer un dégagement de gaz carbonique résultant de la transformation du malate en lactate fait partie de l'invention. Enfin, un dernier aspect de l'invention est relatif à un procédé de dégradation de l'acide L-malique contenu dans un milieu caractérisé par le traitement dudit milieu dans un réacteur contenant l'enzyme malolactique préparée selon la méthode de l'invention et fixée sur un support, et la récupération dudit milieu dépourvu d'acide malique, ainsi que le réacteur caractérisé par le fait que: -il contient l'enzyme malolactique de l'invention, -il est capable de dégrader l'acide malique présent dans un milieu. Afin d'aider à la compréhension du texte qui va suivre, les légendes des figures sont les suivantes: - la figure 1 représente la stratégie d'obtention d'une sonde spécifique, EML 60, du gène de l'enzyme malolactique de L. lactis; - la figure 2 représente l'hybridation en "Southern Blot"' de l'ADN de IL 1441 digéré par EcoRI (puits 1), EcoRV (puits 2), HindIII(puits 3), EcoRI/HindIII (puits 4), EcoRI/EcoRV (puits 5), EcoRV/HindIII(puits 6), EcoRI/EcoRV/HindIII(puits 7), avec la sonde EML60 (figure 2A) et le fragment HindIII/EcoRV de 0,5kpb(figure 2B), M: marqueur de poids moléculaire X/HindIII + îX174/HaeIII; - la figure 3 représente une carte du locus EML (enzyme malolactique) dans laquelle les symboles ont la signification suivante: M sonde EML 60 mm. sonde HIII/EV de 500 paires de base H-f fragments hybridant avec la sonde EML60 F-1 fragments hybridant avec la sonde HIII/EV de 500 paires de bases - la figure 4 représente la stratégie de séquençage du locus EML (enzyme malolactique) dans laquelle les symboles ont la signification suivante: : partie séquencée sur les deux brins (1927pb) > séquençage automatique ---séquençage classique à l'aide des primers SK, KS, universel, reverse -> séquençage classique à l'aide d'oligonucléotides internes à la séquence 1 cm = 120 pb - la figure 5 représente la séquence des 1927 paires de base du locus de l'enzyme malolactique et de la séquence traduite correspondante entre les nucléotides 210 et 1829. Sont soulignes les deux sites de fixation du NAD+, lequel est nécessaire comme co-facteur de l'enzyme. - la figure 6 représente l'hybridation en "Southern Blot" de l'ADN de différentes souches de bactéries lactiques digéré par EcoRI avec la sonde HindIII/EcoRI de 2300 paires de base; les différents puits sont les suivants: IOEB 8417 (1) IOEB Ja2 (2) IOEB 7701 (3) IOEB 7903 (4) IOEB 8607 (5) IOEB 9113 (6) M: marqueur de poids moléculaire X/HindIII + OX174/HaeIII - la figure 7 représente la carte du plasmide pMDML contenant l'insert de 2300 paires de base portant le gène EML (enzyme malolactique). - la figure 8 représente la carte du plasmide pMDMALO contenant l'insert de 1600 paires de base portant le gène EML (enzyme malolactique). La description détaillée ci-dessous indique un mode de réalisation préféré de l'invention mais non limitatif. Les différents couples hôtes-vecteurs utilisables dans ce type de clônage et transformation ou transfection, dont certains sont donnés en exemple dans Sambrook, Fritsch et Maniatis (1989), peuvent notamment être également utilisés. Description de l'invention: La réalisation à l'Institut d'oenologie de Bordeaux de la purification de l'enzyme malolactique de la souche IL1441 de Lactococcus lactis ssp lactis, suivie du séquençage de l'extrémité NH2-terminale de la protéine purifiée, nous a conduit à envisager le clonage du gène correspondant. La stratégie utilisée a pour base l'obtention d'une sonde d'ADN spécifique de la séquence des 20 acides aminés NH2-terminaux. Cette sonde permettant ensuite, par hybridation, d'isoler le fragment d'ADN contenant le gène complet. La purification de la protéine a été réalisée selon le protocole décrit pour l'enzyme malolactique de Leuconostoc mesenteroides (Lonvaud-Funel and Strasser de Saad, 1982) et modifié comme suit. D'une part les acides nucléiques sont éliminés par action de la DNAse et non par précipitation au sulfate de protamine. D'autre part, l'étape d'électrofocalisation est suivie d'une purification supplémentaires par FPLC sur une colonne échangeuse d'anions Mono Q HR 10/10 (Pharmacia). Les tampons utilisés sont: Tris-HCL 50mM pH7,6, EDTA 0,lmM, à 0 et 0,45mM NaCl. La protéine est éluée pour une concentration en NaCl de 0,33M. Le séquençage de l'extrémité N-terminale de l'enzyme a été réalisé avec un séquenceur Applied Biosystem 475H. L'analyse des phényl hydantoines amino-acides est faite par HPLC (Applied Biosystem A) couplé en ligne au séquenceur. Le pilotage et l'interprétation des résultats est assuré par le module d'analyse 900A (Applied Biosystem). Tout le protocole d'utilisation ainsi que les produits chimiques sont fournis par Applied Biosystem. 1-Obtention d'une sonde spécifique du gène de l'enzyme malolactique de L. lactis IL1441: Nous avons utilisé la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) pour générer un fragment d'ADN spécifique des 20 premiers acides aminés de l'enzyme malolactique. Deux mélanges d'amorces dégénérées ont été définis à partir des 5 premiers, OEML1.2, et des 5 derniers acides aminés, OEML2. Dans la synthèse de l'oligonucléotide OEML2 une inosine (I), a remplacé les 4 choix possibles (A, C, G, T) afin de diminuer la dégénérescence de l'amorce. La statégie qui a permis de générer la sonde spécifique est résumée par la figure 1. Le mélange réactionnel de PCR est constitué de: - 5 ng d'ADN génomique de la souche IL1441 (matrice) - 3.x 10-1 moles d'oligonucléotide OEML1. 2 3.x 10-10 moles d'oligonucléotide OEML2 - 200 x 10-10 moles de chaque dNTP (PHARMACIA) - 10 A1 (microlitre) de tampon d'amplification 10 X (BIOPROBE) (100 mM Tris-HCl, pH 8,8; 15 mM MgC12; 500 mM KC1; 1 % Triton X-100) - H20 qsp 100 A1 Après 10 minutes à 96 C, 3 unités de Taq polymérase (BIOPROBE) sont ajoutées et le programme d'amplification est démarré dans l'appareil Triblock (BIOMETRA), soit: - 1 min à 96 C (dénaturation de l'ADN) - 4 min à 50 C (hybridation des amorces) - 3 min à 72 C (synthèse de l'ADN) Ce cycle est répété deux fois. Puis la température d'hybridation des amorcesest diminuée de deux degrès, soit 48 C, deux cycles sont alors réalisés, et ainsi de suite jusqu'à atteindre une température d'hybridation de 34 C pour 40 cycles. Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse horizontale en gel d'agarose 6 % NuSieve GTG (TEBU). 2-Clonaqe et séquençage de la sonde EML60: La méthode décrite ci-dessus nous a permis d'obtenir le fragment d'ADN attendu, c'est à dire une bande de 60 pb sur gel mais dans un mélange de produits réactionnels. Afin de purifier et séquencer ce fragment nous l'avons cloné dans le vecteur pBLUESCRIPT II KS+ (pKS+) (STRATAGENE). Pour celà, l'agarose contenant le fragment d'ADN de 60 pb a été découpé, puis chauffé dans un volume de 10 g1 de TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8) pendant 10 min à 65 C, afin de fondre le gel. Puis l'échantillon est dilué dans du TE pour atteindre une concentration d'agarose inférieure à 0,5 %; après deux extractions phénol-chloroformealcool isoamylique (25:24:1) l'ADN est précipité par du Na-acétate 0,3 M et deux volumes d'alcool absolu. Après séchage sous vide, il est repris dans 5 g1 d'H20. Avant d'être ligué, le fragment d'ADN va subir l'action du fragment de Klenow de la polymérase I d'Escherichia coli. Cette enzyme va réparer les éventuelles extrémités 5' protubérantes dues aux PCR abortives. Le mélange réactionnel est le suivant: - 5 g1 d'ADN - 1 pl de tampon KL 10 X (Tris-HCl 0,1 M pH 7,6; MgC12 0,1 M; ATP 10 mM; DTT 10 mM; chaque dNTP 0,25 mM) - 5 unités de fragment de Klenow - H20 qsp 10 g1 La réaction se déroule 20 min à 19 C, suivie de 10 min à 37 C. Elle est arrêtée par une incubation de 7 min à 65 C. Pour la ligation des fragments d'ADN, 5 ng de vecteur pKS+ digérés par EcoRV, 1 pl de tampon KL 10 X, 1 unité de T4 DNA ligase et H20 qsp 20 pl sont rajoutés, puis incubés pendant 12 heures à 14 C. La souche XL1-Blue de E.coli (recAl, end Al, gyr A96, thi, hsdR17(rk-, mk-), supE44, relA1, >(lac), (F proAB, lacIq, ZDM15, TnlO (tetR)}), (BULLOCK et al, 1987) est transformée par électroporation selon DOWER et al (1988), dans un électroporateur Gene Pulser TM (BIORAD). Les cellules sont cultivées dans du milieu DYT (Bactopeptone 16 g/l; Yeast Extract 10 g/l; NaCl 5 g/l) (MILLER, 1972) jusqu'à une D600m de 0,5. La culture est alors placée à 4 C, les cellules sont lavées 2 fois avec de l'eau désionisée stérile et froide. Elles sont ensuite reprises dans du glycérol % (V/V) au 1/200 du volume de la culture de départ, aliquotées par 40 pl et conservées à -80 C. Les cellules sont décongelées à température ambiante puis placées à 4 C. A 40 A1 de suspension cellulaire sont ajoutés 2 pl d'ADN ( mélange de ligation), après 1 min dans la glace le mélange est transféré dans une cuvette froide de 0, 2 cm et la décharge dont les caractéristiques électriques sont: V=2,5 kV; C=25 MF; R=200 a; T=4,5 ms, est appliquée. Immédiatement après le pulse lml de milieu SOC (Tryptone 20 g/l; Yeast Extract 5 g/l; NaCl 10 mM; KC1 2,5 mM; MgCl2 10 mM; MgSO4 10 mM; Glucose 20 mM) est ajouté et les cellules sont incubées 1 h à 37 C sous agitation. La totalité des cellules a été étalée sur milieu DYT solide (DYT à 20 g/l d'agar) contenant 100 gg/ml d'ampicilline, auquel sont ajoutés par boite de Petri M1 d'IPTG à 20 mg/ml et 40 Al de X-gal à 20 mg/ml. Nous avons ainsi obtenu 10 clones blancs. L'ADN plasmidique de ces clones a été préparé selon une méthode de lyse alcaline dérivée de celle de BIRNBOIM et DOLY (1979), à partir de 5 ml de culture en milieu liquide DYT, et il a été séquencé sur matrice double brin en utilisant un kit SequenaseTM version 2,0 (United States Biochemicals corporation) (TABOR et RICHARDSON, 1987) selon la technique de SANGER et al,(1977) et de RILEY (1989). Le clone 7 contient un fragment d'ADN de 60 pb, dont la séquence code pour les 20 acides aminés NH2- terminaux de l'enzyme malolactique. Ce fragment, nommé EML60 (Figure 1), constitue donc une sonde spécifique du gène, aux erreurs près dues au couple d'amorce l'ayant généré. La séquence des primers efficaces n'étant pas forcément identique à celle du gène; plus tard après séquençage de celui-ci on notera 7 mésappariements répartis sur les deux amorces. Au sens strict ce sont les 30 pb centrales amplifiées qui sont spécifiques de la séquence du gène. 3-Clonage des fragments d'ADN de L.lactis contenant le gène de l'enzyme malolactique par "marche sur le chromosome": Afin d'identifier des fragments d'ADN susceptibles de contenir une partie ou dans son entier le gène EML, 1 gg d'ADN génomique de la souche IL1441 a été restreint totalement par les enzymes de restriction EcoRI, EcoRV, HindIII en simples, doubles et triple digestions, puis les profils de restriction ont été hybridés selon la technique de SOUTHERN (1975) avec la sonde EML60 purifiée par electroelution et marquée par nick-translation à l'(c-32P)dCTP (RIGBY et al, 1977). L'hybridation a lieu à 65 C, dans un tampon 1 M NaCl,;1% SDS; 100 mg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon, pendant 12 h. Le filtre est ensuite rincé 4 fois 15 min dans un tampon 6xSSC(O10xSSC: 1,5 M NaCl; 0,15 M tri-sodium citrate pH 7), 1% SDS, à 65 C. L'hybridation révèle les fragments de restriction suivant (Figure 2): - 1 fragment EcoRI de 8,7 kpb - 1 fragment EcoRV de 4,7 kpb - 1 fragment HindIII de 1,4 kpb - 1 fragment EcoRI/HindIII de 1,4 kpb - 1 fragment EcoRI/EcoRV de 4,7 kpb - 1 fragment EcoRV/HindIII de 0,9 kpb - 1 fragment de la triple digestion de 0,9 kpb Ces résultats nous ont conduit à réaliser 2 minibanques d'ADN de L.lactis, afin d'isoler les fragments EcoRV et HindIII de 4,7 et 1,4 kpb. Pour celà gg d'ADN génomique ont été digérés totalement par EcoRV et par HindIII, soumis à une électrophorèse horizontale en gel d'agarose 0,8%, et les fragments situés au niveau des tailles précitées ont été électroélués contre une membrane à dialyse selon une méthode dérivée de GIRVITZ et al (1980). Ces fragments ont été ligués aux sites correspondants du vecteur pKS+. Nous avons ainsi réalisé dans la souche de E.coli XL1-Blue une minibanque de 250 clones portants des fragments EcoRV et une minibanque de 300 clones renfermants des fragments HindIII. Le criblage de la banque HindIII par hybridation sur colonies avec la sonde EML60, dans les mêmes conditions que celles décrites pour le Southern a permis d'isoler le plasmide recombinant pHll contenant le fragment HindIII de 1,4 kpb. Le pHll digéré simultanément par EcoRV et HindIII puis hybridé en Southern avec la sonde EML60 révèle un fragment HindIII/EcoRV de 0,9 kpb, déjà identifié sur l'ADN génomique de IL1441; ce fragment a été cloné dans le pKS+ donnant ainsi le plasmide pHE900. La somme de ces différentes hybridations nous a permis d'établir une première carte de restriction du locus EML, et ainsi avec l'orientation du gène de définir le ou les fragments d'ADN à isoler pour le cloner en entier (Figure 3). Afin d'orienter le gène sur l'ADN, la borne HindIII du fragment HindIII/EcoRV de 0,9 kpb a été séquencée. Les 250 bases séquencées ne contiennent pas de cadre ouvert de lecture, aussi nous pouvions orienter le gène vers le site EcoRV de ce fragment, comme il est indiqué sur la figure 3. De plus, la sonde EcoRV/HindIII de 0,5 kpb hybridée en Southern sur l'ADN génomique digéré par EcoRV identifie le fragment EcoRV qui permet avec celui du pHll de cloner le gène entier; ce n'est pas le fragment EcoRV de 4,7 kpb identifié en Southern par la sonde EML60, mais le fragment contigu de 4 kpb. La taille des 2 fragments réunis couvre largement la longueur attendue de 1,8 kpb environ du gène. Ce fragment EcoRV de 4 kpb a été cloné en criblant une nouvelle minibanque EcoRV, réalisée comme les précédentes, avec la sonde EcoRV/HindIII de 0,5 kpb. Le plasmide recombinant obtenu est appelé pEML2. La carte de restriction du locus EML est donnée figure 3. 4-Séquençage du gène de l'enzyme malolactique de IL1441 Nous disposons donc de 2 fragments d'ADN à séquencer recouvrant le gène de l'enzyme malolactique, le fragment de 0,9kpb du plasmide pHE900 (fragment HindIII/EcoRV de 900 pb cloné dans le pKS+), et le fragment EcoRV de 4 kpb du plasmide pEML2. Les techniques de séquençage utilisées sont celles décrites au paragraphe 2 et celles utilisant le séquenceur automatique, A.L.F. DNA Sequencer, avec le kit de séquence AutoRead Sequencing Kit( PHARMACIA). Le taitement informatique des séquences a été réalisé avec le logiciel PC GENE (INTELLEGENETICS). La stratégie de séquençage a été la suivante: - séquençage total de l'insert du pHE900 à l'aide des amorces Reverse Primer, Universal, KS Primer, SK Primer, et d'oligonucléotides internes à la séquence. - séquençage de l'insert du pEML2 par génération de clones délétés à la DNase I selon la méthode de LIN et ai (1985), à l'aide des amorces Reverse Primer, Universal Primer, KS Primer et d'oligonucléotides internes à la séquence. - séquençage à l'aide des amorces KS et SK Primers d'un fragment de PCR couvrant la jonction sur l'ADN génomique entre les deux fragments des plasmides pHE900 et pEML2. Ceci pour vérifier que ces deux fragments sont contigus sur l'ADN chromosomique de L.lactis IL1441. Le résumé de la stratégie de séquençage est donné figure 4. Ce travail a abouti à une séquence de 2384 pb dont 1927 pb séquencées sur les deux brins d'ADN. Ce sont ces 1927 pb dont la séquence est donnée figure 5 que nous retenons pour la suite. La détermination de la séquence nucléotidique a permis de localiser les sites de restriction que nous avions trouvés lors de l'établissement de la carte de restriction du locus EML. Le cadre ouvert de lecture que nous attendions a été localisé par les méthodes de SHEPHERD (1981) et FICKETT (1982), il débute par le codon d'initiation ATG en position 210 et se termine par le codon de terminaison TAA en position 1830. Ce cadre ouvert de lecture de 1620 pb code pour une protéine de 540 acides aminés, d'une masse moléculaire théorique de 59517 D et de point isoélectrique égal à 4,46. Ces trois données sont en accord avec celles déduites lors de la purification de la protéine: PM apparant de 60000 D, pHi de 4,3. Classiquement, on détermine le caractère hydrophile-hydrophobe de la séquence protéique (KYTE et DOOLITTLE, 1982). Le profil d'hydropathicité de la protéine EML est globalement hydrophile, ce qui est en accord avec le caractère cytoplasmique, donc soluble de l'enzyme malolactique. La recherche d'homologies entre la protéine EML et d'autres protéines dans la banque de données SWISSPROT a révélé des homologies de séquences avec les enzymes maliques de divers organismes. Les pourcentages d'homologie sont donnés dans le tableau I suivant: Comparaison % d'identité avec la protéine EML entière SFCA-E.coli 42,2 MAOM-ASCU 35 MAOX-FLATR 37,9 MAOX-MAIZE 37,6 MAOX-MOUSE 36 MAOM-HUMAN 35,2 MAOX pour malate oxidoréductase MAOM pour malate oxydoréductase mitochondriale SFCA pour fragment de l'enzyme malique Ce résultat est en accord avec le fait que ces enzymes sont toutes impliquées dans le métabolisme du malate. La recherche de domaines particuliers dans la protéine nous révèle l'existence de deux sites de fixation du NAD+ en position 651 et 1092 (le motif du site étant le suivant: Gly X Gly X X Gly). Ceci est conforme avec la nécessité du NAD+ comme cofacteur de l'enzyme. L'analyse en amont de la séquence codante révèle plusieurs régions promotrices possibles, et on note en particulier la séquence en position 186 (-24 par rapport à l'ATG) comme "boite -10" classique chez les bactéries (VAN DE GUCHTE et al, 1992). En position -12 par rapport à l'ATG (position 198) se trouve la séquence 5'-GGAGGT-3' complémentaire de l'extrémité 3' de l'ARN ribosomique 16S de L.lactis (LUDWIG et al, 1985); cette séquence est le RBS (Ribosome Binding Site) ou séquence de Shine-Dalgarno nécessaire à la traduction. Exemples: 1-Recherche de séquences nucléiques homoloques au gène de l'enzyme malolactique chez d'autres espèces de bactéries lactiques: Dans le but de cloner d'autres gènes codant pour l'enzyme malolactique nous avons recherché par hybridation d'ADN des séquences homologues à celui de L.lactis chez des souches de bactéries lactiques appartenant à d'autres espèces. Pour celà, 1 gg d'ADN génomique des 6 souches suivantes a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI: - Leuconostoc oenos IOEB8417 - Pediococcus damnosus IOEBJa2 - Lactobacillus hilgardii IOEB7701 - Lactobacillus brevis IOEB7903 - Lactobacillus mesenteroides IOEB8607 - Lactobacillus plantarum IOEB9113 Ces ADN ont été hybridés en Southern Blot avec le fragment HindIII/EcoRI du plasmide pMDML de 2,3 kpb contenant le gène complet EML, à 55 C comme température d'hybridation. Ensuite la membrane a été rincée 2 fois min à température ambiante dans du tampon 2xSSC, puis 2 fois 15 min à 55 C dans du tampon 2xSSC, 0,5 % SDS. Dans ces conditions de l'ADN de Saccharomyces cerevisiae et d'E.coli n'hybrident pas avec la sonde. Cette sonde a révélé un à deux fragments de restriction pour chacun des ADN dont les tailles sont données sur la figure 6. Ainsi nous avons mis en évidence la possibilité d'utiliser le fragment d'ADN portant le gène EML comme sonde pour cloner les différents gènes codants pour l'enzyme malolactique chez les bactéries lactiques. 2-Construction du gène EML fonctionnel dans E.coli: 2-1- Construction Afin de reconstituer le gène EML, le fragment EcoRV/EcoRI de 1,4 kpb du pEML2 a été cloné dans le pHE900 digéré par ces mêmes enzymes. La construction obtenue est appelée pMDML, sa carte est donnée figure 7. 2-2-Activité enzymatique Le plasmide pMDML contient le gène EML sous la dépendance du promoteur lacZ inductible par 1'IPTG. Si le gène est fonctionnel un clone de E.coli XLl-Blue transformée par le pMDML devrait avoir une activité de décarboxylation du L-malate en L- lactate, contrairement à XLl-blue transformée par le pKS+ (plasmide du clonage). Pour vérifier le phénotype attendu, nous avons dosé l'activité malolactique chez E.coli. Des cultures aérobies des différents clones de E.coli ont été réalisées en milieu minimum M9 (M9 MINIMAL salts (GIBCO BRL) 10 g/l) supplémenté par du MgSO4 1 mM; CaC12 0,1 mM; NaCl 0,05 % (W/V); glucose 0,2 %; Casamino acid 5 g/l; thiamine 1 mM; ampicilline 50 Mg/ml, (MILLER, 1972). Pour induire le promoteur lacZ 40 Mg/ml d'IPTG sont ajoutés dans le milieu au bout de 2 à 3 h de culture. Après 6 h d'induction les cellules sont récoltées, rincées avec du NaCl 9 g/l, puis reprises dans le tampon phosphate de mesure d'activité malolactique (Na2HPO4 - KH2PO40,2 M; pH 6). Les extraits acellulaires sont réalisés par sonication, et les protéines sont dosées par colorimétrie à l'aide du kit de dosage BCA Protein Assay (PIERCE). Les quatre extraits suivants ont été ainsi préparés pour mesurer l'activité malolactique: - E.coli transformée par le pMDML, non induit, pMDML (NI) - E.coli transformée par le pMDML, induit, pMDML (I) - E.coli transformée par le pKS+, non induit, pKS+ (NI) - E.coli transformée par le pKS+, induit, pKS+ (I) L'activité malolactique est déterminée par la mesure du CO2 produit lors de la décarboxylation de l'acide L-malate en acide L-lactique. L'appareil de mesure est un analyseur de gaz type Eschweiler (KIEL RFA) muni d'une électrode à pH spécifique au CO2 (LONVAUD et RIBEREAU-GAYON, 1973; LONVAUD, 1975). Le mélange réactionnel est le suivant: - L-malate 50 gmoles - NAD+ 1 Mmole - MnCl2 0,1 pmole - extrait brut de protéines 50 à 500 g - tampon phosphate qsp 2,3 ml La mesure d'activité est faite à 37 C. Le résultat est exprimé en Amoles de CO2 dégagées par minutes et par mg de protéines, gmolesCO2/min/mg. Les résultats obtenus avec nos extraits sont résumés dans le tableau 2 suivant: Clones Ecoli Activités spécifiques % d'activité spécifique umoles COmiimg pMDML I) 0,269 100 pMDML (NI) 0,197 73 pKS+ (D 0, 036 13 pKS+ (NI 0,030 Les activités mesurées avec le pMDML induit permettent de calculer les constantes cinétiques apparentes de l'enzyme malolactique codée par le gène EML, vis à vis du L-malate et du NAD+: - Km maate = 20 mMl - Km NAD = 0,43 mM Ces chiffres sont comparables à ceux obtenus par RENAULT (1987) pour des extraits bruts de L.lactis IL1441 en ce qui concerne le malate(Km =12 mM), mais 10 fois supérieur pour le NAD+ (Km= 0.037 mM) Ces résultats montrent que la construction pMDML confère à E.coli le gène fonctionnel de décarboxylation de l'acide malique. Par la suite, toujours sur extraits acellulaires, nous avons dosé par méthode enzymatique à l'aide des kits de dosage BOEHRINGER, le substrat et le produit de la réaction. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 suivant: Clones de temps gmoles de gmoles de gimoles de % Malate E. coli h L-malate résiduel L-lactate app aru D-l actate apparu dégrad 0 48,1 2 1,8 0 3 46,3 2,8 1,6 3,75 pKS+ (I)7 39,5 2,3 1,7 17,90 12 17,2 1,4 2,6 64,20 22 0 0 50,1 2 1,5 0 3 46,3 à 1,5 7,60 pMDML (I) 7 36 6,3 1,3 28,15 12 11,3 7 3,3 77,45 22 0 7,7 4,1 100 Les extraits bruts de E.coli XLl-Blue dégradent entièrement 50 gmoles de L-malate en 22 h, avec une vitesse légèrement supérieure pour le clone pMDML (I), et c'est pour ce clone uniquement qu'apparaissent 7,7 Mmoles de L-lactate, soit 15,4 % du malate dégradé. Un autre essai mené en 18 h présente les mêmes caractéristiques, c'est à dire une dégradation quasi complète (80 % pour pKS+ (I), et 87 % pour le pMDML (I)) du malate et apparition de la même quantité (-7,7 gmoles-) de L- lactate pour le pMDML (I). La dégradation complète du L-malate quel que soit l'extrait de E.coli, est due à l'éequipement enzymatique intrinsèque de E.coli (enzyme malique, et surtout malate déshydrogénase) et en plus pour le clone transformé induit (pMDML(I)) l'enzyme malolactique. De plus sur les mêmes extraits acellulaires, nous avons dosé l'activité L-LDH (réduction du pyruvate en L-lactate), qui normalement doit être réprimée dans ces conditions de culture (FUTAI et al, 1977). Ceci afin de vérifier que l'on ne peut obtenir d'acide L-lactique par couplage d'une activité malique avec une activité L-lactatedéshydrogénase. Le milieu réactionnel est inspiré du kit de dosage BOEHRINGER pour le pyruvate. De cette façon on ne dose aucune activité quel que soit l'extrait. Le dosage du D-lactate montre que E.coli possède une activité D-LDH, et que les quantités produites sont les mêmes pour les deux extraits. Ainsi, nous montrons que le gène porté par le plasmide pMDML code bien pour l'enzyme malolactique. 3-Clonage dans un vecteur navette multicopie chez S.cerevisiae 3-1Construction Dans le but de montrer que le gène de l'enzyme malolactique de L.lactis IL1441 pouvait être exprimé dans la levure S.cerevisiae, nous avons réalisé le clonage du gène dans le vecteur d'expression pTG887 (TRANSGENE S.A.). Ce plasmide est un vecteur navette E.coli/S. cerevisiae de 6847pb, dérivé du pBR322, ayant le marqueur de sélection URA3 de levure et l'origine de réplication du plasmide 2g. De plus, il contient une cassette d'expression utilisant les éléments de régulation de la transcription du gène de la Phospho Glycérate Kinase(PGK) de S.cerevisiae. Le promoteur PGK est un promoteur à fort taux de transcription, actif lors de la glycolyse, première étape de la fermentation alcoolique par la levure. Afin d'intégrer le gène EML en respectant au mieux les distances entre le promoteur PGK et 1'ATG du gène, ainsi qu'entre le codon de terminaison et le terminateur PGK, celui-ci a du être amplifier par PCR. * Effectivement la carte de restriction du locus EML ne permet pas le clonage d'un fragment de restriction respectant ces distances. Pour celà, nous avons choisi le couple d'amorces, OMDML1/OMDML2, tel qu'il est décrit. La séquence de l'oligonucléotide OMDML1, 5'-TTT ATC GAT GTT GTA CG-3', comporte deux mésappariements avec la séquence EML, afin de créer un site ClaI (ATCGAT) pour faciliter les clonages ultérieurs, l'amorce est située de -17 à -1 par rapport à l'ATG du gène EML. L'oligonucléotide OMDML2, 5'-TAA GGA ATT CCC CTT AG-3', est situé sur la fin de la séquence codante du gène EML, le codon stop TAA étant situé en position 14 sur OMDML2, la séquence comporte deux mésappariements pour créer un site EcoRI. Pour amplifier le gène sous la forme d'un fragment de 1,6 kpb, nous avons choisi une ADN polymérase thermophile, la VentRTM DNA polymérase (BIOLABS) qui est 6 fois plus fidèle que les ADN polymérases thermophiles classiques. La réaction de PCR a été la suivante: - 10 ng de pMDML - 10-1 moles d'oligonucléotide OMDML1 - 10-1 moles d'oligonucléotide OMDML2 400 x 10-1 moles de chaque dNTP (PHARMACIA) - 2 unités de VentRTM DNA polymérase - 10 1 de tampon 10x (100 mM KCl; 200 mM Tris-HC1 pH 8,8; 100 mM (NH4)2S04; 20 mM MgSO4; 1% Triton X-100) (BIOLABS). - H20O qsp 100 4l La réaction de PCR est effectuée dans un appareil Triblock (BIOMETRA) selon le programme suivant pendant cycles: - 1 min à 94 C - 1 min à 45 C - 1,5 min à 72 C Après avoir vérifier l'identité du fragment par restriction, l'amplifiat de 1,6 kpb a été réparé par le fragment de Klenow de la polymérase I de E.coli, comme décrit dans le paragraphe 2. Ensuite il a été digéré par EcoRI, créant ainsi un fragment avec une extrémité franche et une extrémité cohésive, puis ligué avec le pTG887 digéré par BgqlII, réparé par le fragment de Klenow et digéré par EcoRI. Ainsi théoriquement, l'insertion du fragment portant le gène EML doit se faire dans un seul sens, celui de la transcription du promoteur PGK. Après transformation de E.coli XLl-Blue selon une méthode au CaCl2 dérivée de MANDEL et HIGA (1970) et sélection des transformants sur DYT plus 50 gg/ml d'ampicilline, nous avons obtenu 400 colonies. Sur 12 minipréparations de plasmides, un clone, le clone 16, présente le profil de restriction HindIII correspondant au pTG887 plus le fragment de 1,6 kpb. Le plasmide recombinant ainsi obtenu est appelé le pMDMALO. 3-2-Activités enzymatiques L'expression dans S.cerevisiae du gène EML porté par le plasmide pMDMALO a été examinée par mesures des activités malolactiques de diverses souches de levures transformées avec les plasmides PTG887 et pMDMALO. Les souches utilisées sont les suivantes: la souche 0514 dérivée de la souche haploïde FL100 (A.T.C.C. 28383), auxotrophe pour l'uracile par la mutation ura3-52, de signe sexuel a. On la notera FL100 (n). - la souche diploïde FL100 (2n) issue du croisement de la souche 0514 avec la souche isogénique 0515 (dérivée de FL200 (A.T.C.C. 32119)) de signe sexuel m. - la souche LG16A dérivée de la souche sauvage haploïde X2180-1A (Yeast Genetic Stock Center), auxotrophe pour l'uracile, de signe sexuel a. On la notera LG16 (n). - la souche diploïde LG16 (2n) issue du croisement de la souche LG16A avec la souche isogénique LG16B (dérivée de la souche sauvage haploïde X2180-1B) de signe sexuel - La méthode de transformation de S.cerevisiae utilisée est la méthode au DMSO. Les cellules d'une culture de 100 ml de levures en milieu complet sont récoltées à une DO600. = 0,6. Elles sont rincées avec 5 ml de solution A (sorbitol 1 M; Tris-HCl 100 mM pH 8,35; éthylène glycol 3 %), puis reprises dans 2 ml de cette solution. Après addition de 110 gl de DMSO désionisé, la suspension est aliquotée par 200 4l et conservée à 80 C. Pour la transformation, 5 gg de plasmide dans 50 Al d'eau stérile sont déposés sur 200 4l de cellules congelées, le mélange est agité et décongelé doucement. Ensuite 1,5 ml de solution B (PEG 4000 40 %; TrisHC1 200 mM pH 8,35) sont ajoutés et la suspension est incubée pendant 1 h à 30 C. Les levures sont alors centrifugées 2 min à 10000 rpm, puis reprises dans 1,5 ml de solution C (NaCl 150 mM; Tris- HC1 10 mM pH 8,35). La suspension est à nouveau centrifugée, puis les cellules sont reprises dans 300 41 d'eau stérile et enfin étalées sur milieu minimum YNB (Yeast Nitrogen Base sans acides aminés & sulfate d'ammonium 1,7 g/l; sulfate d'ammonium 5 g/l; glucose g/l). Parallèlement les différentes souches ont été transformées par le pTG887 et le pMDMALO. Un clone de chaque souche transformée a été testé pour sa capacité à décarboxyler le L-malate. Pour celà des extraits acellulaires ont été réalisés à partir de cultures liquides en YNB10 (Yeast Nitrogen Base w/o acides aminés et sulfate d'ammonium (DIFCO) 1,7 g/l; (NH4)2SO4 5 g/l; glucose 10 g/l) ou YNB80 (même composition que YNB10 mais avec glucose 80 g/l) en aérobiose à 250C. Les cellules de ces cultures sont rincées puis cassées à l'aide de billes de verre de diamètre 0,45 mm dans le tampon phosphate d'activité malolactique décrit au paragraphe 2-2. Les protéines sont dosées avec le kit de dosage BSA Protéin Assay (PIERCE). Les résultats de mesure des activités malolactiques comme décrite au paragraphe 2-2 sont résumés dans le tableau 4 suivant: Clones de S.cerevisiae Activité spécifique % d'activité spécifique p.moles deCO2/min/mg LG16 (n) + pTG887 0 0 LG16 (n) + pMDMALO 0,250 36 LG16 (2n) + pTG887 0 0 LG16 (2n) + pMDMALO 0,050 7 FL100 (n) + pTG887 0 0 FL100 (n) + pMDMALO 0,400 57 FL100 (2n) + pTG887 0 0 FL100 (2n) + pMDMALO0.700 100 Ces résultats montrent que le plasmide pMDMALO confère à différentes souches de levures la propriété de décarboxyler l'acide L-malique, avec des activités spécifiques variables selon les souches. Et ceci de façon comparable quel que soit le milieu de culture, YNB10 ou YNB80. Un extrait acellulaire de FL100 (2n) transformée par le pMDMALO a servi à mesurer les Km apparents pour le malate et le NAD+: - Km maltate = 40 mM - Km NAD = 0,125 mM Ces valeurs de Km sont comparables à celles des extraits bruts de E.coli. Pour ces mêmes extraits nous avons testé l'activité malolactique par la mesure du malate disparu et du L-lactate formé. Les déterminations ont été réalisées avec des prises d'essais correspondant à 200 gg de protéines. Les résultats pour les cultures des levures transformées par pMDMALO en YNB10 sont les suivants et résumés dans le tableau 5: Extraits de heures L-malate en L-lactate en D-lactate en S.cerevisiae gmoles, pmoles pmoles 0 51 3,3 O FL100 (n) 4 29 20 0 24 0 27 0 0 51 5 0 FL100(2n) 4 22 22 O 24 0 35 0 0 51 5 0 LG16(n) 4 26 23 0 24 0 33 0 0 51 2 0 LG16(2n) 4 38 10,5 0 24 0 15 0 En 4 h les mêmes essais avec les levures transformées par le pTG887 ne montrent aucune dégradation de L-malate ni apparition de L et D- lactate; et en 24 h, 40 % à 100 % du L-malate sont dégradés, sans aucune apparition de lactate D ou L. Uniquement S.cerevisiae transformée par le plasmide pMDMALO décarboxyle le L-malate en L-lactate. En 24 h cette conversion porte sur environ 50 % du malate dégradé, le reste du malate est métabolisé par une autre voie que celle de l'enzyme malolactique. 3-3: Dégradation du L-malate en milieu modèle de microvinification Le gène de l'enzyme malolactique de L.lactis IL1441 cloné dans le plasmide pMDMALO est exprimé dans la levure. Il confère donc à S. cerevisiae la possibilité de réaliser la fermentation malolactique in vivo, car le L-malate peut sous sa forme non dissociée pénétrer dans la levure (SALMON, 1987). Pour la démonstration in vivo de l'activité malolactique de la levure transformée par le plasmide pMDMALO, nous avons réalisé des microvinifications en milieu modèle avec la souche qui présentait la meilleure activité spécifique, FL100 (2n). Pour celà, un milieu modèle synthétique (glucose g/l; fructose 100g/l; L-malate 5 g/l; acide tartrique 3 g/l; acide citrique 0,3 g/l; (NH4)2SO4 5 g/l; Yeast Nitrogen Base sans acides aminés et sulfate d'ammonium 1,7 g/l) ajusté à pH 3 avec ou sans L-malate a été ensemencé à environ 106 CFU/ml de FL100 (2n) transformée avec les plasmides pTG887 ou pMDMALO. Les fermentations sont réalisées à 25 C, en semi- anaérobiose dans des bouteilles de 187 ml remplies de ml de milieu. Elles sont suivies par dosages enzymatiques (BOEHRINGER) des sucres, du L-malate, du L-lactate, du D-lactate, et par dénombrements des cellules viables sur milieu nutritif complet YPG (Yeast Extract 10 g/l; bactopeptone 10 g/l; glucose 20 g/l; agar 20 g/l). Les résultats des dosages du L-malate, L-lactate et D-lactate sont résumés dans le tableau 6 suivant: Essais jours L-malate l- lactae D-lactate _ g/l _ 4,5 0,03 0,04 pMDMALO 5 4,2 0,24 0,14 + malate 9 3,8 0,26 0,13 26 38 0,26 0,12 0 4,5 0,06 0,06 pTG887 5 4,3 0,05 0,12 + mrnalate 9 4,2 0,05 0,14 26 4.2 0,04 0.13 0 0 0 0 pMDMALO 6 0,01 0,01 O - rnalate 9 0,04 0,10 0,1 0.04 0,10 0,1 0 0 0 0 pTG887 6 0,01 0,01 0,01 - malate 9 0,04 0,03 0,10 0.04 0.04 0,13 Dans ces conditions, on peut constater que les deux souches forment 0, 13 g/l de D-lactate quand elles sont cultivées en présence de malate. Elles n'en forment pas en son absence. Donc une partie du malate est dégradée par la voie de l'enzyme malique présente chez la levure jusqu'au pyruvate, puis réduit en D- lactate par la D-LDH. Celà correspondrait d'après la conversion stoechiométrique lactate--->malate à 0,2 g/l de malate dégradé. C'est aux erreurs de dosage près la quantité de malate dégradée par FL100 (2n) transformée par le pTG887, 0,3 g/1. D'autre part FL100 (2n) transformée par le plasmide pMDMALO dégrade 2,3 fois plus de L-malate que la souche transformée par le pTG887 (0,7 g/1 au lieu de 0,3 g/l). La différence de 0,4 g/L de malate correspond théoriquement à la production de 0,27 g/1 de lactate. C'est effectivement ce que l'on retrouve sous la forme L-lactate pour FL100 (2n) transformée par le plasmide pMDMALO. En conclusion FL100 (2n) transformée par le plasmide pMDMALO a dégradé davantage de malate que la souche témoin (+ pTG887). La différence du malate dégradé a suivi la voie de l'enzyme malolactique puisque le produit est le L-malate. Références bibliographiques / Birnboim, H.C., & Doly, J., (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res., 7, 1513-1523. Bullock, W.0., Fernandez, J.M. & Short, J.M. (1987). 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Acide nucléique contenant: (1) soit la séquence d'ADN contenue ellemême dans l'acide nucléique représentée dans la figure 5 et s'étendant entre la position 210 et la position 1829. (2) soit une partie de cette séquence, cette séquence étant néanmoins suffisante pour exprimer dans l'hôte approprié, après avoir été incluse au préalable dans un vecteur permettant la transformation de cet hôte, un polypeptide ayant une activité enzymatique malolactique. (3) soit une séquence dérivée de l'une ou l'autre des séquences définies dans (1) ou (2) par substitution de un ou plusieurs de leurs nucléotides, voire même addition ou deletion de certains codons, dès lors que cette séquence continue de coder pour un polypeptide ayant la susdite activité enzymatique. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs assemblages de nucléotides codant pour un ou plusieurs sites de fixation du NAD+ lequel est nécessaire à l'expression de l'activité enzymatique, et situés notamment aux positions 651 et 1092. 3. Acide nucléique selon l'une des rev 1 à 2, caractérisé en ce qu'il est issu du génôme de Lactococcus Lactis. 4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il inclut de 35% à 100% de la région de codage de protéine indiquée dans la figure , ou fragment de cet acide nucléique, dont le produit d'expression est un polypeptide ayant l'activité d'enzyme malolactique. 5. Cellule hôte procaryote ou eucaryote, initialement incapable d'exprimer l'activité enzymatique malolactique, transformée ou transfectée par un vecteur contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, ledit vecteur étant choisi parmi ceux qui permettent une expression stable dans ladite cellule hôte d'un polypeptide ayant une activité enzymatique malolactique. 6. Cellule hôte selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit - soit de bactéries gram-positif ou de bactéries gram- négatif, notamment E.coli; - soit de souches de levures de laboratoire, notamment S.cerevisiae; - soit de souches de levures oenologiques, notamment Schizosaccharomyces ou Saccharomyces. - soit de champignons filamenteux, notamment des genres Aspergillus ou Trichoderma. 7. Cellule hôte selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de se développer et d'exprimer l'enzyme malolactique en condition anaérobie. 8. Cellule hôte selon les revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'une des lignées de E.coli déposées le 19 Mai 1993 à la CNCM sous le n 1-1309 et le n 1-1310, transformées respectivement par les vecteurs pMDML et pMDMALO. 9. Procédé d'obtention d'une cellule hôte selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé par la tranformation d'une cellule hôte procaryote ou eucaryote qui était initialement incapable d'exprimer l'activité enzymatique malolactique par un vecteur choisi parmi ceux qui permettent une expression stable dans ladite cellule hôte d'un polypeptide ayant une activité enzymatique malolactique. 10. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il contient l'une des séquences définies dans les revendications 1 à 4, sous le contrôle d'éléments promoteurs et de régulation lui permettant de transformer une cellule hôte procaryote ou eucaryote, aux fins de permettre une expression stable dans ladite cellule hôte d'un polypeptide présentant l'activité enzymatique malolactique. 11. Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste en un plasmide susceptible de transformer E.coli, ou en un plasmide susceptible de transformer une levure, ou en une plasmide susceptible de transformer à la fois E.coli et une levure. 12. Molécule recombinante contenant une séquence polypeptidique ayant une activité lui permettant d'effectuer la transformation enzymatique malolactique, caractérisée par le fait qu'elle est codée par l'une des séquences d'acide nucléique définies dans les revendications 1 à 4. 13. Procédé de désacidification de produits alimentaires contenant de l'acide L-malique par transformation dudit acide L- malique en acide L-lactique notamment dans un processus de fermentation de jus de fruit ou de légume, justifiant d'une telle transformation, comprenant la mise en contact dudit jus avec une cellule hôte procaryote ou eucaryote selon l'une des revendications 5 à 8. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la cellule hôte est choisie parmi celles qui étaient déjà antérieurement capables d'assurer une fermentation alcoolique dans un processus de vinification. 15. Produits alimentaires, notamment des boissons autres que des vins, initialement chargés en acide L- malique, caractérisés par la présence en leur sein d'une teneur en Llactate contrôlée selon le degré de désacidification recherché. 16. Procédé de production d'une molécule recombinante selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la mise en culture dans des conditions nutritives appropriées de l'un des hôtes cellulaires recombinants définis dans l'une des revendications 5 à 8 de façon à permettre à ladite cellule hôte d'exprimer ladite protéine, puis la purification de cette protéine. 17. Méthode de dosage de l'acide L-malique contenu dans un échantillon, caractérisé par la mise en contact dudit échantillon avec la molécule recombinante de la revendication 12 ou celle préparée par le procédé selon la revendication 16 celle-ci étant de préférence fixée sur un support, notamment une électrode à er me, et par la mesure de la quantité de gaz carbonique produit par la transformation enzymatique de L-malate en L-lactate, la quantité mesurée étant alors mise en corrélation avec la quantité d'acide malique contenue à l'origine dans l'échantillon. 18. Electrode à enzyme caractérisée par le fait: - qu'elle contient l'enzyme malolactique préparé selon la revendication 16, - qu'elle est utilisable pour doser l'acide malique contenu dans un échantillon, qu'elle permet de mesurer un dégagement de gaz carbonique résultant de la transformation du malate en lactate. 19. Procédé de dégradation de l'acide L-malique contenu dans un milieu caractérisé par le traitement dudit milieu dans un réacteur contenant la molécule recombinante de la revendication 12 ou l'enzyme malolactique préparée par le procédé selon la revendication 16, de préférence fixée sur un support, et que l'on récupère ledit milieu contenant en son sein une teneur en L-lactate contrôlée selon le degré de dégradation recherché.