Brevet FR2704227A1 — publié le 19941028

L'invention conceme des immunoparticules constituées de nanoparticules de méthylidène malonate polymérisé revêtues d'anticorps anti-CD4 et leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, ou en tant que réactifs biologiques. De nombreuses études ont rapporté l'importance de l'antigène CD4 dans l'infection des lymphocytes par le virus de l'immunodéficience humaine (virus Han3, et suggère son rôle en tant que récepteur cellulaire du virus HIV (D.Ktatzmann et aI, Nature, 1984, 312 20-27). La capacité d'anticorps monoclonaux anti-CD4 à inhiber la formation de syncytia (cellules géantes formées par l'accolement de lymphocytes T sains et de lymphocytes T infectés) a été rapportée dans F. Rey et al, Virology, 1991, 181. 165-171. Des conjugués nanoparticules-anticorps monoclonaux dans lesquels la nanoparticule est constituée d'un polymère d'hexylcyano-acrylate et l'anticorps monoclonal est un anticorps anti-alpha foetoprotéine (en vue de I'application au dosage de l'alpha foetoprotéine) d'une part, ou un anticorps anti-sarcome (en vue d'une application anti-tumorale) ont été décrits respectivement dans C. Kubiak et al, Int. J. Pharmaceutics, 1988, 42. 181-187 et L. Pilum et al, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 1984, 230. 733-736. Néanmoins, ces conjugués à base de polymère cyano-acrylique présentent une toxicité vis à vis des lymphocytes T4. Des liposomes revêtus d'anticorps anti CD4 LEU3-A ont été décrits dans N. Phillips et al, Cancer Detect Prev., 1990, 14 383-390. Néanmoins, ces liposomes ont présenté le désavantage de susciter l'apparition d'anticorps antiliposomes chez les souris (N. Philipps, Second European Symposium on Controlled Drug Delivery, 1992, Noorduijk aan Zee, Pays-Bas, Abstract book, p. 172-175). On a maintenant trouvé qu'il était possible d'utiliser des immunonanoparticules porteuses d'anticorps monoclonaux anti-CD4 dans la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, en particulier le SIDA. Ces immunonanoparticules présentent les avantages de conférer auxdits anticorps une meilleure stabilité, une plus grande activité et une meilleure immunoréactivité. Elles sont également totalement biodégradables et présentent une très faible toxicité, leurs produits de dégradation étant eux-mêmes nontoxiques. De plus, elles peuvent avantageusement être stérilisées et lyophilisées. L'invention concerne donc des immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (0: dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1-Cs et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-CD4. La préparation des composés de formule (I) est décrite dans le brevet EP 0 283 364. Les composés de formule (1) se polymérisent sous forme d'un réseau polymérique pour former les nanoparticules ayant un diamètre compris entre 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm. Le poids moléculaire moyen (Mp) des polymères de méthylidène malonate de formule (I) est de l'ordre de 600 exprimé en équivalents polystyrènes. De préférence, le composé méthylidène malonate de formule (0 est le 1-éthoxycarbonyl- 1 - éthoxycarbonylméthylèneoxycarbonyléthène (composé de formule (I) dans laquelle R1 = R2 = éthyle et n = 1). Les immunonanoparticules selon l'invention peuvent avantageusement contenir au sein de leur réseau polymérique une substance biologiquement active, de préférence un agent antiviral. A titre d'exemples d'agents antiviraux, on peut citer de manière non Iimitative la didanosine, la ribavirine, la zidovudine, l'aciclovir, la vidarabine et la zalcitabine. Dans un aspect avantageux, l'anticorps monoclonal anti CD4 dont est revêtue la nanoparticule pour constituer l'immunonanoparticule est choisi parmi les anticorps LEU3-A, OKT4, OKT4-A, BIA et l'anticorps IOT4a issu de l'hybridome 13 B8-2, l'anticorps IOT4a étant préféré. On utilisera notamment les anticorps monoclonaux sous forme d'une solution contenant de la sérumalbumine bovine telle que fournie commercialement. Les anticorps anti-CD4 sont fixés sur les nanoparticules pour constituer les immunonanoparticules par des techniques connues en soi, de préférence par adsorption passive, notamment dans un tampon phosphate. Les anticorps monoclonaux anti-CD4 peuvent également être fixés sur les nanoparticules par adsorption spécifique notamment via la protéine A de Staphylococcus aureus ou une liaison biotine-avidine. Différents procédés de fixation des anticorps sont décrits notamment dans la publication L. lllum et al, Meth. Enzymol., 1985 112. 67-84. Dans un aspect ultérieur, l'invention concerne l'utilisation des immunonanoparticules selon l'invention pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV. En effet, les immunonanoparticules décrites ci-dessus possèdent des propriétés d'inhibition de la formation de syncytia dans le modèle expérimental de F. Rey et al, Virology 1991, 181. 165-171. Dans un autre aspect, l'invention concerne également I'utilisation des nnmunanoparticules revêtues d'anticorps anti-CD4 décrites ci-dessus en tant que réactifs biologiques, notamment en tant que contrôles pour l'évaluation de l'activité de composés dans un modèle d'inhibition de la formation de syncytia, ou encore dans des techniques d'immunoséparation, d'immunoprécipitation, d'immunomarquage ou d'immunopurification. L'invention est illustrée par les exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 : Préparation d'une immunonanoparticule de 1-éthoxycarbonyl-1- éthoxycarbonylméthylèneoxycarbonyléthène revêtue d'anticorps anti-CD4 IOT4a. 1) Préparation des nanoparticules: Les nanoparticules sont préparées dans des conditions stériles à 25iC par émulsion-polymérisation du monomère comme décrit dans F. Lescure et al, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 1991, 18, 325-326, Controlled Release Society hic. Brièvement, 100 ,ul de monomère d'éthoxyvarbonyl-1-méthylèneoxyvarbonyl- 1-éthène (UPSA laboratoires/CARBIPEM, France) sont appauvris en S02 sous vide pendant 3 h à 10-2 torr, puis ajoutés goutte à goutte sous agitation à un milieu de polymérisation (10 ml) thermostaté à 25iC constitué d'un tampon KH2P04/NaH2P04, 0,066 M, pH 5,5 contenant 1% de dextran (Mr = 70 000, FLUKA CHEMIE, Suisse). L'ensemble est laissé sous agitation pendant 18 h puis les nanoparticules sont récupérées par filtration sur papier filtre 8,um (Whatman, Grande-Bretagne), puis réparties en fractions aliquotes, lyophilisées et conservées à température ambiante. Au moment de l'utilisation, les nanoparticules sont remises en suspension dans de l'eau pour préparation injectable. La taille moyenne des nanoparticules est mesurée avant et après lyophilisation à l'aide d'un appareil à analyser les particules submicrométriques (Coulter Electronics, USA). Le diamètre moyen des particules est de l'ordre de 320 mn. Les masses moléculaires des polymères constitutifs des nanoparticules sont déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) (Polymer laboratories, Grande-Bretagne). Pour l'analyse, la suspension nanoparticulaire est ultracentrifugée à 200.000 g durant 5 minutes, puis le culot repris par du THF auquel on ajoute 0,5% de toluène, est injecté. La détection se fait par réfractométrie. 2) Fixation des anticorps sur les nanoparticules: Les nanoparticules sont diluées dans un tampon phosphate pH 7,4 à 2,7 mg/ml. On ajoute 100 Ul d'anticorps monoclonaux IOT4a marqués ou non à l'isothioeyanate de fluoresceine (clone 13B8-2, solution à 100,zeg/ml contenant 0,2% de serum albumine bovine, IMMUNOTECH, France) à une suspension de 450 ul de nanoparticules. Le mélange est incubé à 20iC pendant 2h sous agitation. EXEMPLE 2: Etude de la stabilité des immunonanoparticules de l'exemple 1. Les immunonanoparticules sont ajoutées à une concentration en polymère de 50,clg/ml à un milieu RPMI 1640 exempt de rouge de phénol (GIBCO, USA) contenant 1% de glutamine, 1% de pénicilline, 1% de streptomycine, 1% de néomycine, et 10% de sérum de veau foetal. Les nanoparticules revêtues d'anticorps sont séparées des anticorps libres par ultracentrifugation à 40 000 g pendant 5 mn, immédiatement et 2h après le début de l'incubation à 37 C. A titre de témoin, on a également préparé des nanoparticules d'isohexylcyano acrylate (PIHCA) préparées comme décrit dans les brevets EP 0007895 et U.S 4,329,332. Dans ce cas, les nanoparticules revêtues d'anticorps sont séparées des anticorps libres par centrifugation à 80 000 g pendant 5 mn. Pour déterminer la quantité d'anticorps IOT4a fixés, on mesure la fluorescence du surnageant (#excitation = 485 nm, rémission = 535 nm) à l'aide d'un spectrofluorimètre L530 (Perkin Elmer Ltd, Grande-Bretagne). La concentration en anticorps libre est calculée par référence à une courbe d'étalonnage, et le pourcentage d'anticorps fixé est déduit par différence. Les résultats sont donnés dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous: - le tableau 1 rapporte les résultats obtenus avec les immunonanoparticules de l'exemple 1; -le tableau 2 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus avec des nanoparticules de PIHCA revêtues des mêmes anticorps que les immunonanoparticules de l'exemple 1. Tableau 1 Concentration en Pourcentage de fixation anticorps ( g/ml) Initial Après 2h d'incubation 0,1 241,52 231 0,05 490 481,15 0,025 634,9 619,16 Tableau 2 (exemple comparatif) Concentration en Pourcelltage de fixation anticorps (;;ug/ml) Initial | Après 2h d'incubation 0,4 31~0,64 0,76,55 0,2 561,9 6,7+1,2 0,1 850 30s3,6 Les résultats montrent que le pourcentage d'anticorps fixés ne varie pas significativement au bout de 2h pour les immunonanoparticules selon l'invention, alors qu'il décroît fortement dans le cas des nanoparticules de PIHCA. EXEMPLE 3 : Etude de l'activité inhibitrice de la formation de syncytia dans un modèle in vitro par les immunonanoparticules de l'exemple 1. 1) Culture des lymphocytes et infection par le virus 11W-i: Les cultures cellulaires et l'infection par le virus 11W-i sont réaIisées selon le protocole décrit dans F. Rey et al., Virology, 1991, i, 165-171. On utilise les lignées cellulaires CEM et MT4. L'infection par le virus HIV-1 BRU (F. Barré-Sinoussi et al., Science, 1983, 220. 868-871) est effectuée en utilisant une suspension cellulaire à 2.106 cellules/ml incubée à 37 C pendant 1h à l'aide d'un volume égal de dilution de stock du virus. Après infection, les cellules sont lavées par centriguation à 4 reprises avec du tampon PBS pour éliminer les particules virales non liées. Les cellules sont ensuite cultivées à une concentration de 5 x 105 cellules/ml dans un milieu RPMI 1640 (GIBCO, USA) contenant du rouge de phénol supplémenté à 10 % de sérum de veau foetal, 1% d'antibiotiques et 1% de glutamine. Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont diluées 3 fois (cellules MT4) ou 4 fois (cellules CEM) et remises en culture dans un nouveau milieu de culture. L'infection des lymphocytes est mise en évidence en utilisant le test de la réverse-transcriptase. 2) Inhibition de la formation de svncvtia Comme indiqué dans la publication F. Rey et al. citée ci-dessus, les syncytia sont généralement observées à 1 ou 2 jours d'incubation après avoir mélangé un volume de cellules CEM infectées de façon chronique avec 2 volumes de cellules Mr4 à 2.105 cellules/ml. La capacité des anticorps monoclonaux anti-CD4 et des immunonanoparticules porteuses d'anticorps anti-CD4 à inhiber la formation des syncytia est évaluée en incubant les cellules MT4 avec les différentes préparations pendant 2h puis en ajoutant les cellules CEM infectées. La formation des syncytia, indiquée par le signe +, est évaluée au microscope après 2jours d'incubation à 37 C. Les résultats sont rapportés dans les tableaux 3,4 et 5 ci-dessous: - le tableau 3 concerne les résultats obtenus avec les immunonanoparticules selon l'invention porteuses d'anticorps IOT4a; - le tableau 4 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus avec des nanoparticules de PIHCA revêtues d'anticorps IOT4a; - le tableau 5 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus en utilisant l'anticorps IOT4a non fixé. Tableau 3 Inhibition de la formation de syncytia par les immunonanoparticules selon l'invention Polymère Anticorps total Anticorps fixé Formation de ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) syncytia 25 0,05 0,012 25 0,025 0,012 -1+ 25 0,012 0,0069 + 25 0,006 0,004 + 25 0 0 + O 0 0 + Tableau 4 Inhibition de la formation de svncitia par des nanoparticules de PIHCA porteuses d'anticorps IOT4a (exemple comparatif Polymère Anticorps total Anticorps fixé Formation de ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) Syncytia 5 0,045 0,012 + 5 0,02 0,011 + 5 0,01 0,008 + 5 0,005 0,005 + + : présence de syncytia - : absence de syncytia Tableau 5 Inhibition de la formation de svncvtia par l'anticorps IOT4a non fixé (exemple comparatif Concentration (ug/ml) Formation de syncytia 10 5 i + 0,5 + o,l + Les résultats montrent qu'en utilisant les immunonanoparticules selon l'invention, on obtient une inhibition de la formation de syncytia à une concentration en anticorps 100 fois inférieure à celle de l'anticorps libre. Une inhibition complète de la formation des syncytia est en effet obtenue avec 0,05 jczg/ml d'anticorps lorsque ceux-ci se trouvent sous la forme d'immunonanoparticules selon l'invention, alors qu'une concentration de 5 ug/ml est nécessaire pour obtenir le même résultat avec l'anticorps libre. De plus, ces résultats avantageux ne sont pas retrouvés en utilisant une nanoparticule constituée d'un polymère différent de celui des immunonanoparticules selon l'invention. REVENDICATIONS 1. Immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (1): dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1-Cg et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-CD4 2. kimunonanoparticules selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé méthylidène malonate est un composé de formule (1) dans laquelle R1 = R2 = éthyle et n = 1. 3. hmnunonanoparticules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que les anticorps monoclonaux anti-CD4 sont choisis parmi les anticorps LEU3-A, OKT4, OKT4-A, BM et IOT4a. 4. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'anticorps monoclonal anti-CD4 est l'anticorps IOT4a. 5. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les anticorps monoclonaux anti-CD4 sont fixés sur la nanoparticule par adsorption passive. 6. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que Ia nanoparticule a un diamètre compris entre 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm. 7. Iinsunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que le polymère de composé méthylidène malonate de formule (I) a un poids moléculaire moyen de l'ordre de 600 exprimé en équivalents polystyrènes. 8. ltnmunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que les nanoparticules contiennent une substance biologiquement active, de préférence un agent antiviral. 9. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV. 10. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en tant que réactifs biologiques.