Brevet FR2704237A1 — publié le 19941028

PROCEDE D'ADRESSAGE DANS LES LEVURES La présente invention concerne notamment un procédé destiné à permettre une accumulation chez les levures de peptides ou de protéines instables ou bien qui sont toxiques sous forme cytoplasmique ou sécrétée. Un grand nombre de protéines homologues et hétérologues ont été exprimées dans les levures notamment Saccharomyces cerevisae, soit sous forme cytoplasmique, soit sous forme sécrétée dans le milieu de culture. Un des facteurs limitant l'accumulation de peptide ou polypeptide ou protéine dans la levure est leur stabilité. Ceci est paticulièrement vrai pour les peptides ou polypeptides de petite taille c'est à dire de 10 à 200 acides aminés qui ont tendance à être dégradés très vite chez les levures. Cet inconvénient n'est pas limité aux levures mais est également présent chez les bactéries. Afin d'éviter cet inconvénient, plusieurs solutions ont été proposées essentiellement la polymérisation, la fusion avec des protéines stabilisante ou la co-expression avec une protéine formant des aggrégats. Des méthodes mettant en oeuvre la polymérisation ont été décrites par CAREY (1980) pour la stabilisation d'un poly-phénylalanine chez Escherichia coll ; SHEN (1982) pour la stabilisation de la proinsuline humaine chez les bactéries ; FERRARI (1986) dans le cas de polymères de protéines pour la levure et Bacillus subtils. Des techniques mettant en oeuvre la fusion avec des protéines stabilisantes ont été décrites par COUSENS (1987) pour l'expression de la proinsuline utilisant la superoxidismutase humaine comme protéine de fusion ; BARR (1991) pour l'expression de protéines humaines utilisant l'ubiquitine comme protéine de fusion. La co-expression avec une protéine formant des aggrégats a été décrite par HENRY (1982) chez E. Coli. Dans ce micro-organisme l'accumulation de protéines sous forme d'aggrégats insolubles dit corps réfractiles a été largement décrite, toutefois cette technologie n'est pas développée pour l'instant chez les levures. On a également proposé pour permettre l'accumulation de protéines chez les levures d'utiliser les mécanismes de compartimentation. Ainsi on a essayé d'accumuler les protéines sous forme de protéine retenue dans les différents compartiments de la voie secrétoire (KURODA, 1992 ; CORAGGIO, 1988). Les désavantages des compartiments sécrétoires (réticulum endoplasmique ou appareil de golgi) sont: - la présence de protéases spécifiques; - la modification possible de la protéine en particulier la glycosylation et, - si l'accumulation intracellulaire est désirée, celle-ci peut être difficile à réaliser dans un système de sécrétion. Différents documents ont également décrits l'accumulation dans les vacuole ou les mitochondries. La présente invention repose sur la mise en évidence du fait qu'il est posssible d'accumuler et de stabiliser des protéines instables ou toxiques en les adressant dans les péroxysomes des levures. il s'agit en particulier d'un procédé de stabilisation d'un peptide ou d'une protéine non péroxysomale instable chez une levure ou toxique pour la dite levure et obtenue par expression dans la dite levure d'une séquence d'ADN hétérologue caractérisée en ce que ledit peptide ou la dite protéine est exprimée avec une séquence d'adressage dans les péroxysomes de façon à stabiliser ou détoxifier le peptide ou la protéine dans les péroxysomes de la dite levure. Les péroxysomes sont des organites de forme sphérique constituées d'une membrane simple et qui contiennent de nombreuses enzymes qui permettent l'utilisation de l'acétate, des acides gras ou qui participent au cycle du glyoxylate. On a constaté selon la présente invention qu'il était possible d'accumuler des protéines ou peptides instables dans la levure dans les péroxysomes en augmentant leur stabilité. De même, si ces peptides ou protéines sont toxiques notamment au-delà d'une certaine concentration, il est néanmoins possible de les accumuler dans les péroxysomes sans endomager la levure. Les protéines ou peptides sont essentiellement des produits d'expression d'une séquence d'ADN obtenus par des techniques d'ADN recombinants. Parmi les protéines peptides ou polypeptides qui pourront être préparés dans le cadre de la présente invention, il faut citer bien entendu plus particulièrement les produits qui sont instables soit à cause de leur taille soit à cause de leur structure particulière, ainsi que les peptides ou protéines qui sont toxiques lorsqu'elles sont dirigées ailleurs que dans les péroxysomes. Ce procédé concerne plus particulièrement la préparation de protéines, polypeptides ou peptides non péroxysomales c'est à dire des molécules qui naturellement ne doivent pas se trouver dirigées ou se trouver à l'intérieur des péroxysomes de la souche en cause. il peut s'agir de produits homologues ou hétérologues c'est à dire de protéines polypeptides ou peptides qui sont produites naturellement par la souche hôte en cause ou bien au contraire qui sont d'origines différentes mais qui proviennent de l'expression d'une séquence introduite par des techniques recombinantes. ll doit être compris que par séquences d'ADN hétérologues on entend désigner des séquences d'ADN ne figurant pas tel quel dans l'équipement chromosomique de la levure aux origines, même s'il s'agit d'une séquence d'ADN qui présente la même fonction mais qui provient d'une souche différente ou en tout état de cause une séquence d'ADN introduite par des techniques recombinantes. La technologie d'expression des séquences d'ADN chez les levures par la technique des ADN recombinants est connue ; elle utilise essentiellement soit des vecteurs à replication autonome de type plasmidique, soit des vecteurs d'intégration. Toutes ces techniques sont connues tant pour les levures Saccharomyces que pour d'autres types de levure tels que kluyvéromyces. Les séquences protéiques permettant l'adressage dans les péroxysomes nécessitent la présence de ces séquences soit à l'extrêmité Nterminale soit à l'extrêmité C- terminale de la protéine d'intérêt. Il est également possible de prévoir dans certains cas des séquences d'adressage figurant dans la partie interne de la protéine. Ces séquences d'adressage sont appelées PTS (Péroxysomales Targeting Seqences). On en distingue essentiellement trois types. Les séquences d'adressage du type I c'est à dire qui sont situées en position C terminale sont du type Ser-Lys-Leu et il est possible d'admettre des variations de ce motif notamment (Ser/Ala/Cys-Lys/Arg/His-Leu). Cette séquence a été mise en évidence pour la première fois en extrêmité C terminale de la Luciférase (Gould 1987). I1 est également possible d'utiliser des séquences de type II, séquences fixées en extrêmité N- terminale. Celles-ci ne présentent pas de consensus, elles existent et dépendent du type de protéine dirigée. Elles ont été mises en évidence pour la thiolase chez Saccharomyces cerevisae. I1 est également possible d'utiliser des séquences introduites à l'intérieure de la protéine qui permettent également cet adressage. La présence à l'extrêmité C- ou N- d'une séquence d'adressage correspond évidement à la présence d'une séquence d'ADN correspondant à I'extrêmité 3' respectivement 5' de l'ADN codant pour le peptide ou la protéine. lu doit être entendu qu'il n'est pas absolument nécessaire que la séquence d'adressage soit contigüe de la séquence de la protéine, dans certains cas on peut prévoir des séquences intermédiaires qui pourront faciliter la récupération par exemple. Dans les procédés selon la présente invention, il est possible par exemple de prévoir entre les séquences d'adressage et la protéine d'intérêt, des sites de clivage qui permettront de libérer la protéine mature. Dans certains cas en particulier lorsqu'on utilise des séquences de type II, celles-ci peuvent être clivées dans les péroxysomes. Lorsque ceci n'est pas le cas on prévoiera des sites de clivage correspondant à des enzymes spécifiques, par exemple les sites Lys-Arg ou bien correspondant à des clivages chimiques au bromure de cyanogène lorsque la protéine d'intérêt est dépourvue de méthionine, en plaçant cet acide aminé en tête de la protéine. Le procédé selon la présente invention permet donc d'obtenir des souches de levure dans lesquelles les péroxysomes comportent des quantités importantes d'une protéine obtenue par la technique des ADN recombinants. La levure ainsi obtenue peut être traitée afin d'en extraire les péroxysomes riches en protéines dont on extraira ensuite la protéine ellemême, suivant une technologie du type de celle qui a été développée pour la préparation des protéines dans E Coli en utilisant la technologie des corps réfractiles. Toutefois comme cela sera démontré dans les exemples suivant, il est possible, par le biais du procédé selon la présente invention, d'enrichir la levure elle-même au niveau des péroxysomes avec une protéine polypeptide ou peptide riche en certains amino-acides essentiels comme par exemple les acides aminés soufrés méthionine ou cystéine et d'utiliser directement la souche de la levure obtenue comme additif alimentaire ou comme aliment. Ainsi il est intéressant d'exprimer la protéine 2S de la protéine de stockage de la noix du Brésil qui est riche en amino-acides soufrés. Dans ce cas la séquence d'ADN hétérologue est la séquence codant pour la protéine de 12kDa intermédiaire de maturation de la protéine 2S. On peut aussi prévoir l'expression de gène synthétique codant pour des peptides ou protéines ayant un équilibre particulier en amino-acide, c'est le cas par exemple de: * la protéine E et de ses polymères et, * la protéine R F et de ses polymères, qui sont décrits à la figure 2. Dans ce cadre, il peut être particulièrement intéressant d'utiliser comme cellule hôte des levures riches en lysine, c'est le cas particulièrement de la souche Saccharomyces ELY M8, ainsi que ses descendances obtenues par croisement qui sont riches en lysine, notamment les souches obtenues par croisement avec des levures de boulangerie tel que ELY S3. Par transformation à l'aide du procédé selon la présente invention, ces souches conduisent à des additifs alimentaires également riches en acides aminés soufrés. Les souches en cause présentent les caractéristiques suivantes * ELY M8 Souche de levure prototrophe, productrice de lysine dont le contenu en lysine totale peut atteindre jusqu'à 8 - 9%; * ELY S3 Souche de levure prototrophe, productrice de lysine dont le contenu en lysine totale est supérieur à 10%. Cette souche a été isolée après croisement de la souche ELY M8 avec une souche de boulangerie de telle manière à combiner les capacités de production de lysine et les capacités à pousser en milieu industriel avec un taux de croissance et un rendement sucre/blomasse élévé. De ce fait la souche ELY S3 est une souche utilisable au niveau industriel. Ces souches ont été déposé le 19 Avril 1993 à la Collection Nationale de Culture de Micro-organisme au 28 rue du Docteut Roux, 75015 PARIS sous le numéro: S. cerevisae ELY M8 = I - 1299 S. cerevisae ELY S3 = 1-1300 Ces souches sont disponibles par l'intermédiaire d'un expert. La présente invention concerne donc également les souches obtenues ainsi que leur application, notamment à titre d'additif alimentaire ainsi que les procédés mettant en oeuvre les souches ainsi obtenues pour en extraire les péroxysomes puis les protéines peptides ou polypeptides correspondants. D'autre caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples ci-après dont certains seront décrits décrit en se référant aux figures ci-annexées comme suit: Fig.1 Séquence protéique correspondant au gène synthétique codant pour le précurseur de 12kDa de la noix du Brésil et séquence des oligonucléotides utilisés pour la construction du gène synthétique. Fig. 2: Séquence protéique des peptides E et ELE. La séquence des oligonucléotides utilisés pour la construction des gènes synthétiques est indiquée en dessous (El ligne 2, E2 ligne3 pour le peptide E). Les différents oligonucléotides utilisés sont symbolisés par des fléchez ( et ). Fig. 3 : Structure des vecteurs d'expression pYEL1 et pYEL45 pour la levure S. cerevisiae. Le plasmide pYEL1 dérive du plasmide yMC45 (Francingues-Gaillard, Thèse, 1990) où un fragment de 1786 pb contenant le promoteur et le terminateur de la PGK a été inséré. Le fragment EcoRI-HinDIII dérive du plasmide pBR322 et contient le gène de la Rlactamase et une origine de réplication pour E coli (boite noire). Le fragment BamHI-EcoRI contient le marqueur URA3 et un sousfragment du plasmide 2p. Le fragment Hindlll-Sall correspond au promoteur et terminateur PGK. Le fragment Sall-BamHI correspond au gène ntpII placé entre le promoteur et le terminateur de la Rglucosidase. Fig.4 : Profil de radioactivité (Methionine 35S) incorporée dans les protéines des levures. Contrôle: levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYEL1; BZN: levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYEL44; BZN-PTS: levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYEL75. Fig. 5 : Stabilité des protéines BZN et BZN-lTS Fig. 6: Stabilité des peptides ELE et ELE-PTS EXEMPLE 1 Construction d'un gène synthétique correspondant à la protéine de 12ka, intermédiaire de maturation de la protéine 2S, riche en méthionine, de la protéine de stockage de la noix du Brésil. La protéine de stokage de la noix du Brésil (Bertholletia excelsia) présente une composition en méthionine et cystéine élevée (1896 et 13% respectivement). Elle est composée de deux sous unitées (9 et 3kDa) provenant de la maturation d'un précurseur unique. Cette maturation complexe fait intervenir plusieurs étapes; après la synthèse d'un précurseur de 18kDa, le clivage de la séquence signal au cours de la translocation dans le Réticulum Endoplasmique (ER) est effectuée (intermédiaire de 15kDa). La maturation se poursuit par le clivage de l'ATPF et du CTPF (intermédiaire de 12kDa). Ce polypeptide subit une dernière étape de maturation pour donner les deux sous-unités qui sont accumulées dans les "Proteines bodies" dans la graine de la plante. Un gène synthétique correspondant à l'intermédiaire de 12kDa a été construit. Ce gène synthétique présente; en 5' un site XhoI, une séquence en amont de l'ATG initiateur répondant au consensus des gènes fortements exprimés, l'ATG initiateur, un codon sérine pour répondre à la loi du 2ème acide aminé et en 3' un site BglII pour des facilités de clonage et l'addition de signaux d'adressage. La séquence protéique désirée est présentée en Fig.l. La construction du gène synthétique a été réalisée à l'aide de dix oligonucléotides BZN1 à BZN10, d'une taille allant de 62 à 71 bases, dont la séquence a été choisie en utilisant le biais de codon de S. cerevisiae des protéines fortements exprimées. Les oligonucléotides ont été phosphorylés à l'exception de BZN1 et BZN6. Les oligonucléotides, purifiés sur gel de polyacrylamide ont été resuspendus en TE (Tris EDTA) à une concentration de 0.5 pg/ml. Des mélanges d'hybridation contenant 10 ,ul de chaque oligonucléotide complémentaire ont été chauffés 5 min. à 85"C, puis refroidis à 37"C et stockés à -20 C avant utilisation. Ses mélanges correspondent à I (BZN1 + BZNî0), Il (BZN2 + BZN9), III (BZN3 + BZN8), w (BZN4 + BZN7), V (BZN5 + BZN6) (Fig. 1). Les mélanges d'hybridation (0.5 ul) ont été ligués, une heure à température ambiante, successivement selon le protocole suivant: 1") Ligation I avec II (0.5 pi de I, 0.5 pi de II dans un volume final de 25 p1). 2") Ligation IV avec V (0.5 pi de IV, 0.5 pi de V dans un volume final de 25 p'). 3 ) Ligation (I/tI) + (III) + (W/V) lîpi de la ligation (1/Il), lîpi de la ligation (IV/V), 0.5 pi de III dans un volume final de 47 l. Le mélange de ligation (I/II) + (III) + (IV/V) est ensuite cloné dans un vecteur KS+ 10 (plasmide dérivant du vecteur bluescript KS+, STRATAGENE, où un adaptateur Bglll de séquence GGAAGATCTTCC a été introduit au site Hindis) ouvert par les enzymes XhoI et BglII pour donner le plasmide KS+17. Des transformants de la souche DH5 N ont été obtenus par éléctroporation et sélection sur milieu LB ampiciline (100pg/ml). Les clones contenant la construction désirée ont été identifiés par PCR en utilisant le couple d'oligonucléotides BZN1/ BZN6 qui permettent l'amplification d'une bande de 339bp.Les produit d'amplification ont été analysé sur gel de polyacrylamide. Le vecteur final KS+17 contenant le gène synthétique a été séquencé par la méthode de Sanger sur les deux brins en utilisant comme amorce les oligonucleotides T3 et T7 du bluescript. EXEMPLE 2 Construction d'un gène synthétique codant pour un peptide riche en méthionine. Un gène synthétique codant pour un peptide de 58 acides aminés, riche en acides aminés essentiels et principalement en méthionine a été construit. Ce gène synthétique présente; en 5' un site XhoI, une séquence en amont de 1'ATG initiateur répondant au consensus des gènes fortements xprimés, 1'ATG initiateur, un codon sérine pour répondre à la loi du 2éme aide aminé et en 3' un site BglIS pour des facilités de clonage et l'addition designaux d'adressage. La séquence protéique est présentée en Fig.2. La construction du gène synthétique a été réalisée en deux étapes à l'aide d'oligonucléotides dont la séquence a été choisie en utilisant le biais de codon de S. cerevisiae des protéines fortement exprimées. La première étape a permis la construction du peptide E, à l'aide des oligonucléotides El et E2, 81 bases.Puis les deux oligonucléotides El et E2 ont été purifiés sur gel de polyacrylamide et resuspendus en TE (Tris EDTA) à une concentration de 0.5 pg/pl, puis hybridés. Pour cela, les oligonucléotides ont été chauffés 5 min. à 85"C, puis refroidis à 37OC et stockés à -20 C avant utilisation. Les oligonucléotides ainsi hybridés (0.5 pl) ont été clonés dans le vecteur KS+10 ouvert par les enzymes XhoI et BglII pour donner le plasmide pE Ce vecteur a été séquencé par la méthode de Sanger sur les deux brins en utilisant comme amorce les oligonucleotides T3 et T7 du bluescript. à ELE a été éluée puis clonée dans le vecteur KS+10 ouvert par les enzymes Mol et BglII pour donner le plasmide pELE. Des transformants de la souche DH5 ont été obtenus par éléctroporation et sélection sur milieu LB ampiciline (1 00pg/ml). Les clones blancs sur LB ampiciline Xgal on été analysés par restriction avec les enzymes XhoI et BglII . Les clones présentant la bande de 177pb attendue ont été controlés par séquence. EXEMPLE 3 Construction des vecteurs d'expression. A) Vecteurs de base. Les vecteurs de base pYEL1, pYEL45 et pYEL107 sont des vecteurs navette E coi - S. cerevisiae, réplicatifs, de type deux micron (Fig.3). Le vecteur pYELl contient; A- La région ColE1 permettant la réplication et le gène bla permettant la séléction avec l'ampiciline dans E coli B- La région ORI et STB du plasmide 2 micron permettant la réplication chez la levure S. cerevisiaa C- une région de 2Kb contenant le gène URA3 permettant la séléction des transformants par complémentation de l'auxotrophie ura-. ) La région correspondant au promoteur et terminateur PGK avec les sites uniques XhoI et BglII pour le clonage des régions codantes que l'on veut exprimer. Le vecteur pYEL1 résulte de l'insertion d'un fragment de 1786pb contenant les caractéristiques (D) dans le vecteur yMC45 (Francinguesgaillard, thèse 1990) contenant les caractéristiques (A, B, C). Un site XhoI a été créé en amont de l'ATG du gène PGK, un site BgllI a été créé en amont du stop TAA de telle manière à permettre une fusion optimale des séquences à exprimer avec les séquences promotrice et terminatrice du gène PGK. Le vecteur pYEL45 contient en plus: S Une région de 1.8 kb qui contient le gène nptII placé sous le contrôle du promoteur et terminateur de la R-glucosidase de K. fragilis conferant la résistante au G418 à la levure transformée (A. Raynal et coll., 1987). Cette cassette de résistance a été réalisée selon les étapes suivantes: Un fragment HinDIII-AsulI de 1250bp contenant le gène nptll (castilho et coll., 1984) est introduit dans le vecteur KS+10 ouvert par les enzymes HinDIII et Clal. Le vecteur résultant pYEL3 5 a été utilisé pour réaliser une mutagénèse par PCR.Un site BamHI a été introduit devant l'ATG initiateur grâce à ltoligonucleotide mutagène (GATGGATCCGCATGATTGAACAAGATGGA). Le fragment modifié a été cloné au site Hindll du vecteur KS+10 pour donner le vecteur pYEL38. Le fragment BamHI-Bglll du plasmide pYEL38 contenant le gène nptII a été ensuite inséré au site BamHI du plasmid yBG47 (Francingues-gaillard, thèse 1990) entre le promoteur et terminateur du gène de la B-glucosidase. Cette cassette d'expression ( fragment SalI-SphI traité à la Klenow) a été ensuite introduit au site BamHI (traité à la Klenow) du plasmide pYEL1. Le vecteur pYEL107 dérive du vecteur pYEL45 où les sites BglII situés dans le promoteur du gène de la ss-glucosidase ont été modifiés par PCR pour conserver un site unique Bglll dans le vecteur. B) Vecteurs d'expression du gène synthétique BZN. Le vecteur pYEL44 contient le gène synthétique BZN isolé du plasmide KS+17 (fragment XhoI-BglII) inséré aux sites correspondant du vecteur pYELl. Le vecteur pYEL93 a été construit par échange du fragment XhoI-SalI du plasmide pYEL45 avec le fragment XhoI-SalI du plasmide pYEL44 contenant le gène synthétique BZN et le terminateur PGK. B) Vecteurs d'expression du gène Et Le vecteur pYEL34 contient le gène synthétique ELE isolé du plasmide pELE (fragment XhoI-BglII) inséré aux sites correspondant du vecteur pYEL1. Le vecteur pYEL127 a été construit par échange du fragment BglI-BgllI du plasmide pYEL34 avec le fragment BglI-BgllI du plasmide pYEL107. EXEMPLE 4 Adressage de peptides/protéines dans les péroxysomes, vecteurs d'expression et d'adressage. Pour diriger les peptides/protéines dans les péroxysomes, nous avons utilisé la séquence PTS de la protéine luciférase (Gould et coll., 1988, J. Cell. Biol. 107:897-905). Pour cela nous avons utilisé un adapteur composé de deux oligonucléotides PTScl et PTSc2 de séquence; PTSc 1 GATCAAGGCTAAGAAGGGTGGTAAGTCTAAGTTGTAAT PTSc 2 GATCATTACAACTTAGACTTACCACCCTTCTTAGCCTT qui code pour la séquence protéique KAKKGGKSKL constituant la séquence PTS, séquence minimale connue pour diriger des protéines dans les péroxysomes. Cet adapteur a été introduit au site BglII dans les vecteurs d'expression pYEL44 et pYEL127. A. Plasmides d'adressage de la protéine BZN L'adapteur, realisé par hybridation des oligonucléotides PTScl et PTSc2 a été introduit dans le vecteur pYEL44 ouvert par l'enzyme Bglll. La ligation a été effectuée en présence de l'enzyme BglII afin d'enrichir en vecteur ayant incorporé l'adapteur. Les transformants d' R coli ont été testés par PCR en utilisant les couples PTScl/PGKter et PTSc2/PGKter afin de déterminer ltorientation (PGKter est un oligonucleotide correspondant à la région 3' du gène PGK en aval du TAA). Le vecteur présentant l'orientation désirée, appelé pYEL75, qui contient le gène codant pour la protéine BZN-TS, a été vérifié par séquencage. Le vecteur pYEL108 contient la région codant pour la protéine BZN-PTS isolé du plasmide pYEL75 (fragment Xhol-Sall) inséré aux sites correspondants du vecteur pYEL45. B. Plasmides d'adressage du peptide WL L'insertion de l'adapteur a été réalisée, comme précédemment, dans le vecteur pYEL127. Le vecteur présentant l'orientation désirée a été vérifié par séquencage et appelé pYEL129. Ce vecteur code pour le peptide ELETS. EXEMPLE 5 Expression et stabilisation de la protéine BZN. La souche de levure ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Schüller et Entian,1988, Gene, 67:247-257) a été transformée par la méthode de Dohmen et coîl. (Dohmen et coll., 1991, Yeast, 7:691-692) avec les plasmides pYEL1 (vecteur de contrôle), pYEL44 (portant le gène BZN) et pYEL75 (portant le gène BZN-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la complémentation de l'auxotrophie Ura-. Pour étudier l'expression et la stabilité des peptides produits, des cultures en phase exponentielle en milieu minimum YNBG (Yeast Nitrogene Base 6.7g/l; Glucose 20g/l) supplémenté en histidine et en leucine ont été centrifugées et resuspendues à une concentration cellulaire de 5 unités (DO600). Les cellules ont été marquées 5 minutes en présence de 50 pcu/ml de [S35] Méthionine suivie d'une chasse par de la méthionine froide, des prélévements de 200 sont réalisés aux temps suivants (T=0, T=20, T=40, T=80 et T=120 min.). Après centrifugation les cellules sont resuspendues dans 20pl de tampon de charge.Aprés incubation lOmn à 95"c, les protéines de levure sont séparées par éléctrophorése sur gel de polyacrylamide en tampon Tricine-SDS-PAGE Les profils protéiques sont ensuite analysés après coloration au bleue de coomassie et après autoradiographie. Nous observons sur gel acrylamide aprés coloration au bleue de coomassie la présence d'une protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL44 et pYEL75 dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine BZN (pYEL44) et pour la protéine BZN-PTS (pYEL75). Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYELl. Le niveau d'expression a été estimé selon le protocole suivant: après un marquage de 5 min. en présence de 50 pcu/ml de [S35] Méthionine, analyse des protéines sur gel et séchage du gel d'acrylamide, la radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur Beckman LS6000IC pendant 1 ou 2 minutes. Les profils de radioactivité presentés en Fig. 4 montrent qu'une faible radioactivité est observable dans la région du marqueur de poids moléculaire de 14.3 kDa (bandes 30 à 35) pour le vecteur contrôle par contre une forte radioactivité est observable pour la souche contenant le plasmide pYEL44 et la souche contenant le plasmide pYEL75 (Fig.4). La radioactivité dans la bande correspondant à la BZN et à la BZN-PTS représente environ 15% de la radioactivité totale. Ceci indique que la protéine BZN et la protéine BZN-PTS représente 1.5% des protéines synthétisées. Cette estimation est basée sur un peptide contenant 20% de méthionine et les protéines de levure 1.4% de méthionine. La stabilité des protéine BZN et BZN-PTS a été estimée par mesure de densité de l'autoradiogramme en utilisant le densitometre GS300 (HOEFIER). Pour chaque temps de chasse (T=0, 20, 40, 80, 120mn) la surface des pics correspondant à la protéine BZN et à la protéine BZN-PTS a été déterminée et définie les unités arbitraires correspondant à la quantité de ces protéines marquées. Les résultats présentés dans la Fig.5 montre que la protéine BZN présente une demie-vie de 20 min. alors qu'une demie-vie de 140 min. est obtenue pour la protéine BZN-PTS. EXEMPLE 6 Expression et stabilisation du peptide ELE. La souche de levure ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Schüller et Entian,1988, Gene, 67:247-257) a été transformée avec les plasmides pYELl (vecteur de contrôle), pYEL127 (portant le gène ELE) et pYEL129 (portant le gène ELE-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la complémentation de l'auxotrophie Ura-. Nous observons sur gel acrylamide aprés coloration au bleue de coomassie la présence dtune protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL127 et pYEL129 dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine ELE (pYEL127) et pour la protéine ELE-PTS (pYEL129). Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYEL1. le niveau d'expression a été estimé comme pour l'exemple 5. La radioactivité dans les bandes correspondant au peptide ELE et au peptide ELE-PTS représente environ 15% de la radioactivité totale incorporée dans les protéine de levure. Ceci indique que ces peptides représentent 1.5% des protéines synthétisées. La stabilité des peptides ELE et ELE (Fig.6) a été estimée par mesure de la radioactivité incorporée dans les peptides aux temps t=0, 5, 10, 20, 40mn et représentée en pourcentage par rapport à la méthionine incorporée dans les peptides au temps T=0 mn. Le peptide lIE présente une demie vie de 1 min. alors qu'une demie vie de 90 min. est observée pour le peptide g WPTS. EXEMPLE 7 Enrichissement en méthionine de la levure ELYM8 La souche de levure ELYM8 ( souche de levure prototrophe, surproductrice de lysine) a été transformée par la méthode de Dohmen et coll. (Dohmen et coll., 1991, Yeast, 7:691-692) avec les plasmides pYEL45 (vecteur de contrôle), pYEL93 (portant le gène BZN) et pYEL108 (portant le gène BZN-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la résistance au G418 sur milieu riche YPD (extrait de levure, 10g/l; bactopeptone, 10g/l; glucose 20g/l) additionné de 200 pg/ml de G418. Les niveaux d'expression ont été estimés selon le protocole décrit précédemment. Les levures transformées ont été cultivée en milieu riche YPD additionné de G41 8 (1 50pg/ml ) jusqu'à une concentration cellulaire comprise entre 4 et 5 unités (DO600). Ces précultures ont été utilisées pour ensemencer des cultures en YPD à une concentration cellulaire de 0.5 unité DO 600. Après 3 heures d'incubation les cellules ont été collectées par centrifugation, lavées deux fois en milieu minimum YNB, puis marquées en milieu YNB pendant 5 minutes en présence de 50 pcu/ml de [S35] Méthionine. Les protéines de levure sont analysées sur gel d'acrylamide aprés coloration au bleue de coomassie.Après séchage du gel d'acrylamide, la radioactivité incorporée dans les protéines totales et dans la noix du Brésil est mesurée. La radioactivité dans les fragments correspondants à la BZN et à la BZN-PTS représente environ 30 et 40% de la radioactivité totale respectivement. Ceci indique que la protéine BZN et la protéine BZN-PTS représente respectivement 4 et 5% des protéines synthétisées. Pour mesurer le niveau d'accumulation des protéines BZN et BZN-PTS en milieu riche et l'enrichissement en méthionine de la levure, des précultures des transformants ont été realisées en milieu riche YPD additionné de G418 (150pg/ml ) jusqu'à une concentration cellulaire comprise entre 1 et 3 unités (Do600). Ces précultures ont été utilisées pour ensemencer des cultures en YPD à une concentration cellulaire initiale de 0.15 unité DO600. Des prélévements ont été realisés aux temps T=0, T=16, T=24 et T=40 heures après inoculation.L'accumulation des protéines au cours de la croissance est analysée par gel d'éléctrophorèse TRICINESDS-PAGE suivie d'une coloration au bleue de coomassie Nous observons sur gel acrylamide aprés coloration au bleue de coomassie la présence d'une protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL93 et pYEL108 dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine BZN (pYEL93) et pour la protéine BZN-PTS (pYEL108) aussi bien en phase exponentielle (16heures) qu'en phase stationnaire. Cependant le niveau d'accumulation de la protéine BZN-PTS est nettement supérieure en phase stationnaire que le niveau d'accumulation observé pour la protéine BZN au même temps. Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYEL45. L'analyse du contenu en acides aminés libres et totaux de la levure est realisée à l'aide de l'analyseur d'acides aminés Beckman System 6300. La composition totale en acides aminés des levures transformées a été déterminé aprés hydrolyse acide. Préalablement, la méthionine a été transformée en méthionine sulfone par oxydation à l'acide performique. La composition en acides aminés libres des levures transformées a été déterminée aprés incubation à 100"c pendant lOmn d'une suspension cellulaire correspondante. Les valeurs obtenues aux temps T= 40 heures sont présentées dans la Table 1. Une augmentation significative de 30% en méthionine total est obtenue pour la souche contenant le plasmide pYEL108 codant pour la protéine BZN-PTS. Cette augmentation en méthionine total n'affecte par l'accumulation de lysine, 6.9 et 6.8 % respectivement. Table 1 : Enrichissement en Méthionine. Plasmides Protéines Méthionine Lysine Pourcentage Totale Libre Total d'augmentation pYEL45 - 0.70 0.02 7 pYEL93 BZN 0.78 0.05 6.9 10% pYEL108 BZN-PTS 0.94 0.08 6.8 35% EXEMPLE 8 Localisation de la protéine BZN-PTS dans les péroxysomes. La souche de levure ELYM8 contenant le plasmide pYEL 108 (portant le gène codant pour la protéine BZN-TS) a été cultivée en milieu YPD en présence de G418 150 pg/ml. L'équivalent d'environ 2000 unités de cellules (2000 unité DO600) ont été collectées par centrifugation à 3200 RPM pendant 5 minutes, puis lavée deux fois avec 25 ml de tampon SP (Tampon de sphéroplatisation; 50mM tampon phosphate de potassium, pH 7.5; 1M sorbitol). Aux cellules resuspendues dans 10 ml de tampon SP, est ajouté 10 pi de ss- Mercapto-ethanol et 20 pi de ZYMOLIASE 100 (200 mg/ml). Après 25 minutes d'incubation à 30"C, les sphéroplastes sont collectés par centrifugation à 4000 RPM pendant 8 minutes. Les sphéroplastes, fraction appelé (SPHERO) sont resuspendus dans 4 ml de tampon MES (en présence d'inhibiteur de protéase ; Aprotinine, PMSF et PEFABLOCK). Après cassage des cellules au poter, les gros débrits et les cellules non cassées sont éliminés par centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes. Les fractions subcellulaires sont alors séparées par centrifugation à 20 000 g. Nous avons analysé le profil protéique des différentes fractions cellulaires obtenues aprés ultracentrifugation, sur gel acrylamide utilisé précedemment dans l'exemple 5. Les fractions cellulaires suivantes ont été étudiées: le surnageant noté (20kg-SN) correspondant au cytoplasme et le culot qui contient les mitochondries et les péroxysomes repris dans du tampon MES (noté 20 kg-P). La protéine BZN-PTS est observée uniquement dans la fraction 20 kg-P. La protéine BZN-PTS n'est pas accumulée dans le cytoplasme sous forme soluble (absence de bande de 14 kDa dans la fraction cytoplasmique, 20 kg-SN). L'étude de la localisation de la protéine BZN-PTS a été poursuivie. Pour cela, la fraction 20Kg-P contenant la protéine BZN-PTS a été analysée sur gradient discontinu de NYCODENZ réalisé par addition de solution de Nycodenz en tampon MES; - 1 ml d'une solution à 50 % - 1,4 ml 35 % -5ml 25% - 2,2 ml 17% Puis 400 pi de la fraction 20 Kg-P est déposé sur le gradient et centrifugé à 135 Kg pendant 1 heure à 4"C. Après centrifugation le gradient est récupéré en 31 fractions d'environ 250 pi. La concentration protéique de chaque fraction est déterminée par la méthode de Bradford et les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE (15 %) puis visualisées par coloration au bleu coomassive. La protéine BZN-PTS est majoritairement localisée dans les fractions 3 à 1 1 correspondant aux péroxysomes. Une fraction de la protéine BZN-PTS est observable dans la fraction 1 correspondant probablement à une faible portion de la protéine BZN-PTS localisée dans le cytoplasme sous forme d'agrégats. REVENDICATIONS 1. Procédé de stabilisation d'un peptide ou d'une protéine non péroxysomale instable chez une levure ou toxique pour la dite levure et obtenue par expression dans la dite levure d'une séquence d'ADN hétérologue caractérisée en ce que ledit peptide ou la dite protéine est exprimée avec une séquence d'adressage dans les péroxysomes de façon à stabiliser ou détoxifier le peptide ou la protéine dans les péroxysomes de la dite levure. 2. Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que l'ADN hétérologue codant pour le peptide ou la protéine est d'origine synthétique ou ne provient pas d'une levure. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est choisie parmi les séquences d'adressage de type I. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est choisie parmi: Ser-Lys-Leu Ser/Ala Cys-Lys/Arg/His-Leu. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est de type II. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est celle de la thiolase chez S. Cerevisae. 7. Procédé selon l'une des revendications I à 6 caractérisé en ce que la protéine en cause est la protéine 2S de la protéine de stockage de la noix du Brésil. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue et la séquence codable pour la protéine de 12KDa intermédiaire de maturation de la protéine 2S. 9.Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la protéine en cause est choisie parmi: * la protéine E et ses polymères et, * la protéine ELE et ses polymères. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé en ce que la souche de levure est une souche de Saccharomyces. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la souche de levure est une souche de Saccharomyces cerevisae. 12. Procédé selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que la souche est choisie parmi ELY M8 et les souches obtenues par croisement. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que la souche est ELY S3 ou une souche obtenue par croisement entre ELY M8 et une souche de boulangerie. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'on sépare les péroxysomes de la souche de levure et on purifie les peptides ou les protéines accumulés dans les péroxysomes. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'on prévoit un site de clivage de protéine entre le peptide ou la protéine et la séquence d'adressage. 16. Souche de levure obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 15. 17. Peptide ou protéine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 15. 18. Souche de Saccharomyces cerevisae ELY S3 et les souches obtenues par croisement notamment ELY M 8. 19. Additif alimentaire contenant une souche selon l'une des revendications 16 et 18.