Brevet FR2701319A1 — publié le 19940812

PROCEDE DE DETECTION ET/OU DE DOSAGE DE COMPOSES VIRAUX ET SUPPORT PORTANT UNE GLYCOPROTEINE. La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux et un support portant une glycoprotéine. Selon la présente invention, on entend par composé viral aussi bien les composés, en particulier protéiniques, constitutifs d'un virus, que des particules de type viral. Les particules de type viral sont, ou des virions, complets ou incomplets, ou des parties de virion, ou des assemblages contenant des composés constitutifs de virus, qui présentent certaines propriétés des virus ou des composés viraux ; en particulier, ils sont détectés par certains anticorps spécifiques de composés viraux et pourraient donc être apparentés à ces composés viraux. Selon la présente invention, on a trouvé que certains composés viraux se fixaient de façon spécifique sur une glycoprotéine: la glycoprotéine Dt. La glycoprotéine Dt est la glycoprotéine décrite dans la demande de brevet français intitulée "Procédé d'obtention d'une composition aqueuse protéinique, composition correspondante, glycoprotéine contenue et son utilisation" déposée par les mêmes demandeurs le même jour que la présente demande. La glycoprotéine Dt se fixe sur la membrane de particules virales, ainsi que sur certains composés ou surfaces biologiques chargés négativement. Selon la présente invention, on utilise cette propriété pour capter et isoler les composés viraux, ce qui permet de les détecter et/ou de les doser. Dans le procédé selon l'invention, pour faciliter la séparation de l'ensemble (glycoprotéine Dt- composé viral), on fixe sur un support la glycoprotéine Dt avant de la mettre en contact avec le composé viral. La présente invention a donc pour objet un procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux, caractérisé par le fait que l'on fixe la glycoprotéine Dt sur un support, que l'on fixe ensuite sur la glycoprotéine Dt un composé viral, contenu dans un fluide biologique ou extrait d'un tissu biologique de façon à séparer ledit composé viral des composés qui ne sont pas susceptibles de se fixer sur la glycoprotéine Dt, et que l'on détecte et/ou l'on dose le composé viral fixé sur la glycoprotéine Dt par tout procédé de détection et/ou de dosage de ce composé viral. La glycoprotéine Dt est isolée à partir du résidu fixé sur la (les) colonne(s) de chromatographie d'affinité utilisée(s) dans le procédé de purification de l'albumine du plasma sanguin décrit dans la demande de brevet français 92 04941 déposée le 22 Avril 1992. Selon cette demande, on sépare l'albumine des autres protéines par un procédé chromatographique en phase liquide, dans lequel on fait passer la solution aqueuse contenant l'albumine dans au moins une colonne de chromatographie dite "hydrophobe" remplie d'un matériau particulaire apte à retenir une partie des protéines autres que l'albumine; pour compléter la séparation, on propose également de faire passer la solution aqueuse d'albumine dans au moins une colonne de chromatographie d'affinité contenant un support particulaire neutre ou voisin de la neutralité chargé d'un composé polysulfaté.L'effluent obtenu par ce procédé est constitué par une solution d'albumine purifiée, la majeure partie des protéines autres que l'albumine étant fixée, soit sur la (les) colonne(s) de chromatographie hydrophobe, soit sur la (les) colonne(s) de chromatographie d'affinité. En soumettant le support de la (des) colonne(s) de chromatographie d'affinité précitée(s) à une élution, de préférence à une solution par augmentation de la force ionique, on obtient une composition dont le contenu protéinique comporte de 5 à 100 % en poids d'une glycoprotéine dite glycoprotéine Dt. La glycoprotéine Dt a un poids moléculaire de 50 000 + 3 000 daltons et les 20 premiers acides aminés de la région N-terminale de la glycoprotéine Dt sont les suivants: Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thre-Val- Val-Pro-Leu-Lys-Thre. Les composés viraux susceptibles d'être fixés sur la glycoprotéine Dt peuvent plus particulièrement provenir des virus suivants virus de l'hépatite virale B (HBV), virus de l'immunodéficience humaine (HIV1 et HIV2), virus de l'immunodeflcience du singe (SIV) ou virus de l'herpès simplex (HSV) ou peuvent être des particules ou des protéines d'origine virale présentes dans certaines leucémies ou myélomes ou dans le syndrome de Gougerot-Sj ôgren. Selon la présente invention, on fixe d'abord la glycoprotéine Dt sur un support. On utilise, de préférence, un support solide, plus particulièrement constitué par une microplaque de titration, par exemple une microplaque ELISA. La fixation de la glycoprotéine Dt sur le support se fait par réaction de groupes réactifs de la glycoprotéine avec des sites réactifs du support. Cette réaction est, de préférence, effectuée à une température de 0 à 40"C, la glycoprotéine Dt étant, de préférence, mise dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5, de préférence entre 5,5 et 6,5 . On utilise, de préférence, un tampon isotonique ou presque isotonique. Le tampon peut être du type phosphate ou acétate. La solution obtenue a avantageusement une concentration comprise entre 0,01 à 100 g/l de glycoprotéine Dt. Le support est avantageusement maintenu en contact avec le tampon contenant la glycoprotéine Dt à une température de 0 à 40"C et pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 24 heures. Après incubation, on sépare du support le tampon contenant la glycoprotéine Dt n'ayant pas réagi et on effectue un lavage du support, de préférence, avec le même tampon que celui qui contenait la glycoprotéine Dt. I1 peut être nécessaire de saturer les sites actifs du support qui n'ont pas réagi avec la glycoprotéine Dt. Dans ce cas, on fait réagir sur ces sites actifs d'autres groupes actifs. On utilise avantageusement, dans ce but, une solution d'albumine sérique bovine ou de caséine, en particulier une solution à 2 % dans le tampon utilisé pour la glycoprotéine Dt. Après réaction, le support est, également, de préférence, rincé et séché. Le support sur lequel est fixée la glycoprotéine Dt est ensuite mis en contact avec un fluide biologique susceptible de contenir des composés viraux. Ce fluide est préparé soit à partir d'organes ou de liquides biologiques d'un malade atteint d'une pathologie virale, soit, provient de surnageants de cultures virales "in vitro". Le liquide biologique peut être un sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, du liquide synovial, du liquide péritonéal, du liquide pleural, du liquide séminal ou du liquide ascitique. On utilise, de préférence, un plasma sanguin ou sérum. On dilue, de préférence, le fluide biologique à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10, avantageusement 5,6.La réaction est, de préférence, effectuée à une température de 00C à 42"C, avantageusement voisine de 37 C, pendant une période de 30 minutes à 24 heures. On sépare ensuite le fluide biologique et le support portant la glycoprotéine Dt, qui a éventuellement fixé un composé viral. On effectue éventuellement ensuite un lavage avec une solution, tamponnée de préférence. La détection et/ou le dosage du composé viral fixé sur la glycoprotéine Dt peuvent se faire par tout moyen connu, tel l'infectiosfte ou la détection d'acides nucléiques spécifiques par la technique dite "Polymerase Chain Reaction (PCR)". Cette technique est, par exemple, décrite dans l'article de MULLIS K.B. et FALOONA F.A. dans Methods Enzymol. 1987 155 pages 335-350. La détection et/ou le dosage se font, de préférence, à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement des protéines des composés viraux à détecter. De façon connue, cet anticorps peut être conjugué à un marqueur enzymatique, par exemple de la peroxydase. L'excès d'anticorps est éliminé par lavage. On ajoute ensuite, de façon connue, un substrat spécifique de l'enzyme conjuguée à l'anticorps, substrat qui se transforme, dans des conditions fixées, en un produit coloré.La formation dudit composé coloré indique la présence du composé viral recherché et permet un dosage de ce composé viral. Le procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux selon l'invention peut être utilisé pour le diagnostic de pathologies virales, en particulier l'hépatite virale de type B ou le sida, ou être utilisé dans la recherche pour isoler et purifier des composés viraux. La description donnée ci-après, à titre purement illustratif et non limitatif, d'un procédé selon l'invention permettra de mieux comprendre l'invention. A) Fixation de la glycoprotéine Dt sur un support Le support utilisé est une plaque de microtitration de type micro-ELISA à 96 puits et à fond plat, commercialisée par la société "DYNATECH". On prépare une solution de glycoprotéine Dt ayant une concentration de 10 microgrammes/ml (hg/ml) dans un tampon phosphate contenant 0,01 mole/l de phosphates monosodique et disodique et 0,15 mole/l de chlorure de sodium et ayant un pH de 7,00 + 0,05. On dépose 100 ,t41 de cette solution au fond de chaque puits de la microplaque. Celle-ci est ensuite incubée à +4"C pendant 18 heures. Le liquide de chaque puits est ensuite aspiré.On introduit ensuite dans chaque puits 300 à 400 tcl du tampon phosphate décrit cidessus, on laisse en contact avec le support pendant 3 minutes et on aspire le tampon; cette opération de lavage est effectuée 3 fois. Pour saturer les sites de la microplaque éventuellement encore actifs, on dispose dans chaque puits 200 ,ul d'une solution d'albumine bovine à 2 % en poids dans le tampon phosphate décrit cidessus. La microplaque est ensuite incubée à 37"C pendant 90 minutes. La solution contenue dans chaque puits est ensuite aspirée. On effectue ensuite un lavage en introduisant 300 à 400 Cll de tampon phosphate par puits, puis en laissant en contact la solution pendant 3 minutes, et pour finir, en aspirant la solution ; cette opération de lavage est répétée 5 fois. On fait ensuite sécher la plaque. La plaque sur laquelle est fixée la glycoprotéine Dt est ensuite stockée à +4"C ou à -20 C. B) Fixation de composés viraux On a utilisé le sérum sanguin d'un malade atteint du sida et celui d'un malade atteint d'hépatite virale. L'échantillon sérique est dilué 100 à 1000 fois. La dilution est effectuée à l'aide d'un tampon (acide acétique/acétate de sodium) ayant une concentration en acétate de 0,05 mole/l et un pH de 5,6 + 0,05. On dépose 100 ,ul de solution au fond de chaque puits de la plaque préparée et stockée selon A. La plaque est incubée à +37"C pendant une période de 90 minutes. Après cette incubation, on effectue un lavage en introduisant 300 yl de tampon phosphate dans chaque puits, on laisse en contact pendant 2 minutes et on aspire la solution de tampon ; on renouvelle cette opération de lavage 3 fois. On a, par ce procédé, fixé des protéines d'enveloppe de HIV1 et de HBV respectivement. C) Détection de composés viraux On ajoute par puits 100 Cll d'une solution d'anticorps monoclonal spécifique des protéines d'enveloppe de virus : HBsAg pour le HBV ou d'une solution d'anticorps polyclonaux pour le HIV1, les anticorps étant conjugués à la peroxydase. On laisse la plaque incuber à 37"C pendant 90 minutes. A la suite de cette incubation, le contenu des puits de la plaque est aspiré. On introduit 300 Cll de tampon phosphate dans chaque puits et après un temps de contact de 2 minutes, on aspire le tampon: cette opération de lavage est renouvelée 3 fois. On ajoute par puits 100 yl d'une solution d'o-phénylènediamine, 2HC1 dans un tampon de citrate de sodium. On laisse incuber pendant 30 minutes à 37 C, puis on arrête la réaction en rajoutant à chaque puits 50 cul de H2S04,2N. On mesure l'absorbance à 492 nm obtenue en fin de réaction à l'aide d'un robot lecteur de plaque. La présence d'absorbance à 492 nm par rapport à des témoins ne contenant pas de composés viraux, indique la présence de composés viraux du HBV ou du HIV1 et la valeur de cette absorbance permet de doser ces composés. REVENDICATIONS 1- Procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux, caractérisé par le fait qu'on fixe la glycoprotéine Dt sur un support, que l'on fixe ensuite sur la glycoprotéine Dt un composé viral contenu dans un fluide biologique ou extrait d'un tissu biologique de façon à séparer ledit composé viral des composés qui ne sont pas susceptibles de se fixer sur la glycoprotéine Dt et que l'on détecte et/ou dose le composé viral fixé sur la glycoprotéine Dt par tout procédé connu de détection de ce composé viral 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les composés viraux que l'on fixe sur la glycoprotéine Dt proviennent du virus de l'hépatite virale B (HBV), du virus de l'immunodéficience humaine (HIE1 et HIV2), du virus de l'immunodeficience du singe (SIV) ou du virus de l'herpès simplex (HSV) ou sont des particules, ou des protéines d'origine virale présentes dans des leucémies ou myélomes ou dans le syndrome de Gougerot-Sj ôgren. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que le support sur lequel on fixe la glycoprotéine Dt est un support solide. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le support solide est une microplaque ELISA. 5 - Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'avant la réaction de fixation de la glycoprotéine Dt sur le support, la glycoprotéine Dt est mise en solution dans un tampon ayant un pH compris entre 4,5 et 10,5. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le tampon est isotonique. 7 - Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que le tampon est du type phosphate ou acétate. 8 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que la glycoprotéine Dt est à une concentration comprise entre 0,01 et 100 g/l dans le tampon. 9 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé par le fait que l'on réalise la réaction de fixation de la glycoprotéine Dt sur le support en mettant le tampon contenant la glycoprotéine Dt en contact avec le support à une température de 0 à 40"C pendant un temps d'incubation compris entre 30 minutes et 24 heures. 10 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé par le fait que l'on sépare du support la quantité de solution contenant la glycoprotéine Dt, qui n'a pas réagi avec ledit support, et on lave le support. 11- Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'on lave le support avec le même tampon que celui utilisé pour mettre en solution la glycoprotéine Dt. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait qu'après la fixation de la glycoprotéine Dt, on sature les sites actifs du support qui n'ont pas réagi avec la glycoprotéine Dt. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'on sature les sites à l'aide d'une solution d'albumine sérique bovine, ou de caséine. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que le support sur lequel est fixée la glycoprotéine Dt est stocké. 15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que le fluide biologique est un sérum, un plasma, de l'urine, du liquide céphalorachidien, du liquide synovial, du liquide péritonéal, du liquide pleural, du liquide sémianl, du liquide ascitique ou du surnageant de culture virale "in vitro" ou un extrait cellulaire. 16 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé par le fait que le fluide biologique est dilué à l'aide d'un tampon donnant un pH compris entre 4,5 et 10,0. 17 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait que la réaction de fixation virale est effectuée à une température comprise entre 0 et 420C, pendant une période de 30 minutes à 24 heures. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après la fixation virale, on sépare du support le fluide biologique et on lave ledit support. 19 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait qu'on réalise, à l'aide d'un anticorps, la détection et/ou le dosage du composé viral fixé sur le support par l'intermédiaire de la glycoprotéine Dt. 20 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que l'anticorps est conjugué à un marqueur enzymatique. 21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait qu'on ajoute un substrat spécifique de l'enzyme conjuguée à l'anticorps. 22 - Support sur lequel est fixée la glycoprotéine Dt obtenu par le procédé selon la revendication 14.