Brevet FR2705970A1 — publié le 19941209

IDENTIFICATION DU GENE DE L'ADHESINE DE M. PIRUM La présente invention est relative à l'identification du gène de l'adhésine de Mycoplasma pirum et au rôle de cette adhésine dans l'effet pathogène de ce mycoplasme, ainsi que dans l'effet cytopathogène des rétrovirus, notamment du VIH, sur les monocytes et lymphocytes T4 chez l'homme. M. pirum est un mycoplasme dont l'hôte naturel était jusqu'alors inconnu et n'avait été isolé qu'à partir de cultures cellulaires (Del Giudice (1985)). Sur le plan phylogénique, cette espèce est liée de façon étroite aux mycoplasmes du groupe pneumoniae (Weisburg (1989)). Comme la plupart des membres de ce groupe, M. pirum est caractérisé par une structure externe ou rostre qui a une fonction spécialisée dans l'adhérence cellulaire (Razin et al. (1992)). Les adhésines responsables de l'attachement ont été identifiées pour deux mycoplasmes humains: Mycoplasma pneumoniae et Mycoplasma qenitalium (Inamine et al., 1989). Ces adhésines sont positionnées à la surface de la cellule. Dans M. pneumoniae, l'adhésine principale est un polypeptide de 170 kDa appelé "Pi", et dans M. qgenitalium une protéine similaire appelée "MgPa" a été caractérisée et présente un poids moléculaire de 153 kDa. Les protéines Pi et MgPa sont des immunogènes performants et les anticorps dirigés contre ces adhésines sont susceptibles d'inhiber l'adhésion des mycoplasmes correspondants sur les cellules hâtes. Les gènes de ces deux protéines ont été clones et séquences (Inamine et ai, 1989); en outre, une hybridation croisée a été obtenue entre ces gènes et l'ADN génomique d'un autre mycoplasme de structure semblable, Mycoplasma Gallisepticum (Dallo et al. (1990)), suggérant au moins une homologie partielle entre les différents gènes codant pour les adhésines de mycoplasmes de cette famille. M. pirum a été isolé récemment d'une culture de cellules mononucléées de sang périphérique (PBMCs), purifiées du sang d'un malade infecté avec le virus VIH (Montagnier et col. (1990)). I1 a été démontré que l'effet cytopathique associé au VIH est augmenté en présence de différentes espèces de mycoplasmes, notamment M. fermentans (Lemaître et al. (1992) et Lo (1992)), ainsi que M. pirum (Montagnier et al. (1990)). En outre, la présence de M. pirum a été directement détectée sans culture préalable dans des PBMCs de patients séropositifs par utilisation d'un test PCR (Grau et al. (1993)). Ceci confirme l'idée que M. pirum est un parasite humain et devient ainsi un candidat probable dans l'interaction avec le virus VIH dans l'infection des lymphocytes T. Par ailleurs, il a été montré, notamment dans la demande de brevet EP- 91919407.6 que des anticorps dirigés contre des séquences peptidiques spécifiques des adhésines de M. pneumoniae ou de M. qenitalium étaient capables d'inhiber l'infection des lymphocytes T activés ou de cellules d'une lignée lymphoïde T par la souche prototype du VIH LAVLAI ou par la souche prototype du VIH2RoD. Ces mêmes anticorps reconnaissent aussi, d'une manière plus faible mais spécifique, une protéine de taille similaire dans les extraits de lyse de M. pirum suggérant une homologie entre les adhésines de M. genitalium et M. pirum. Enfin, il a été montré une augmentation de l'infectiosité du virus VIH irradié, par un extrait de M. pirum (Montagnier et al. (1991)); en effet, quand un extrait cellulaire soluble de M. pirum est rajouté en même temps que l'infection cellulaire par le virus VIH irradié, une restauration partielle de l'infectiosité a pu être constatée. Ceci indique qu'un composant de M. pirum, probablement une protéine de ces mycoplasmes, peut augmenter sensiblement l'infectiosité de telles préparations du virus. Un résultat similaire a pu être obtenu avec une cytokine inductrice de l'expression virale, le TNF (Tumor Necrosis Factor). L'ensemble de ces résultats convergeant vers l'idée de l'importance probable du rôle joué par les mycoplasmes dans l'augmentation de l'expression du VIH par un quelconque mécanisme notamment par induction de cytokine. Dans ce contexte, l'étude du gène codant pour l'adhésine à partir du génome de M. pirum est particulièrement importante et ceci pour différentes raisons. a) L'adhésine est une protéine qui joue un rôle essentiel dans la fixation du mycoplasme sur les cellules infectées ou susceptibles d'être infectées et peut-être même dans sa fusion avec la membrane cellulaire. b) M. pirum a été trouvé dans des cellules de carcinome humain, mais ne présente pas d'hôte connu; comme il a été dit plus haut, il a été isolé chez des malades atteints du SIDA. c) Certains mycoplasmes sont connus comme étant inducteurs de synthèse des cytokines augmentant ainsi l'effet cytotoxique des macrophages vis-à- vis des cellules tumorales. Des expériences préliminaires ont montré que M. pirum et M. fermentans semblent participer à ce rôle d'inducteur de synthèse de cytokine (Gougeon M.L. et al. (1992)). d) Avec les séquences nucléotidiques déjà connues des gènes de l'adhésine de M. pneumoniae et de M. genitalium, l'identification du gène de l'adhésine de M. pirum pourra contribuer de façon essentielle à la connaissance du site de cytoadhérence de cette adhésine et par là même avoir un rôle important dans l'infection des cellules par le virus responsable du SIDA. e) L'adhésine de M. pirum pourrait constituer un bon candidat à une préparation vaccinale à la fois contre un effet cytopathique de M. pirum et également contre un effet cytopathique du virus VIH. f) Cet antigène, une fois connu et obtenu en grandes quantités, pourrait être utilisé dans un test sérologique de détection d'anticorps dans un sérum de patient dans un test du type ELISA. La présente invention est relative au clonage et au séquençage d'un acide nucléique codant pour l'adhésine de M. pirum, caractérisé en qu'il est constitué par la séquence nucléotidique représentée dans la figure 1, ou toutes séquences dérivées de celle-ci obtenues par dégénérescence du code génétique. La figure 1 représente la séquence nucléotidique correspondant au gène d'adhésine de M. pirum avec traduction en acides aminés en tenant compte du codon TGA codant pour le tryptophane (trp ou W) chez les mycoplasmes. Tout acide nucléique constitué: - soit d'une séquence dérivée de la séquence de la figure 1 par addition, délétion ou substitution de certains codons, - soit d'un fragment de la séquence représentée dans la figure 1, pourvu que ladite séquence ou ledit fragment code pour une protéine ayant une réactivité immunologique croisée avec la protéine codée par l'acide nucléique représenté sur la figure 1, fait également partie de la présente invention. L'acide nucléique tel que défini ci-dessus code pour l'adhésine de M. pirum et présente entre 40 et 60% d'homologie de séquence avec l'acide nucléique codant pour l'adhésine de M. genitalium et entre 37 et 55% d'homologie avec l'acide nucléique codant pour l'adhésine de M. pneumoniae. L'ARN hybridable avec l'une des séquences ci- dessus définies fait également partie de l'invention. La présente invention est également relative à toute protéine recombinante ayant des propriétés d'adhésion à des récepteurs membranaires de cellules eucaryotes caractérisée en ce qu'elle contient une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences d'acide nucléique définie ci-dessus. Toute protéine recombinante selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle a les propriétés d'une adhésine de M. pirum, et qu'elle présente entre 45% et % de similitude et entre 25% et 50% d'identité avec les adhésines de M. pneumoniae et de M. genitalium. Lorsque l'on compare deux alignements de séquences d'acides aminés de deux protéines que l'on cherche à comparer, le pourcentage d'identité est défini comme le nombre d'acides aminés identiques rapporté au nombre total d'acides aminés de la protéine étudiée; et le pourcentage de similitude (ou d'homologie) est défini comme le nombre d'acides aminés identiques ou appartenant à la même classe rapporté au nombre total d'acides aminés de la protéine étudiée. Ces classes d'acides aminés sont les suivantes: - "polaires-neutres" incluant Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Pro, Met; - "non polairesneutres", incluant Ser, Thr, Tyr, Trp, Asn, Glu, Cys; - "acides" incluant Asp et Glu; - "basiques" incluant Lys, Arg et His. La protéine recombinante de l'invention n'est pas reconnue par des anticorps formés contre le peptide suivant: GVVSTPLVNLINGQ. Font également partie de l'invention tout peptide caractérisé en ce qu'il est inclus dans un fragment hydrophile de la protéine définie ci- dessus, lequel peptide n'est pas reconnu par des anticorps formés contre le peptide GVVSTPLVNLINGQ, et lequel peptide est également susceptible d'induire la formation d'anticorps seul ou associé à une molécule porteuse, lesquels anticorps sont aptes à neutraliser une infection des lymphocytes T ou de monocytes humains par M. pirum et de diminuer l'effet cytopathogène des rétrovirus notamment du VIH sur ces mêmes lymphocytes T ou monocytes humains. En particulier, tout peptide incluant 70 à 100% des séquences suivantes: HIDPKKMVDNYPNQWKSSQ située entre les positions 201 et 219 de la séquence d'acide aminé représentée dans la figure 1, et - IGIPMAKHKKAIKVGFEL située entre les positions 1055 et 1072, ou toute séquence similaire selon la définition ci- dessus, est susceptible d'induire des anticorps aptes à neutraliser une infection des lymphocytes T ou de monocytes humains par M. pirum et de diminuer l'effet cytopathogène des rétrovirus notamment du VIH sur ces mêmes lymphocytes T ou monocytes humains. La présente invention est également relative à tout anticorps monoclonal ou polyclonal contre l'une des séquences protéiques ou peptidiques définies ci- dessus et caractérisé en ce qu'il est susceptible d'inhiber l'infectiosité de monocytes ou de lymphocytes T humains par M. pirum, que ce soit in vitro en culture cellulaire ou in vivo chez l'homme. Cet anticorps monoclonal ou polyclonal est également susceptible d'inhiber l'infection de lymphocytes humains en culture par le virus VIH. L'anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini ci-dessus est utilisable pour la production de compositions pharmaceutiques pour la prévention ou le traitement d'infections des humains par le virus VIH lorsqu'il est en association, dans ladite composition, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ladite composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif l'anticorps selon l'invention est également incluse dans l'invention. Fait également partie de l'invention l'utilisation d'une protéine ou d'un fragment de protéine présentant des propriétés d'adhésion aux membranes de monocytes ou de lymphocytes T humains, pour l'induction in vivo d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection desdits monocytes ou lymphocytes humains par M. pirum, ou une infection de ces mêmes lymphocytes T humains par le virus VIH. Fait également partie de l'invention l'utilisation d'une protéine ou d'un peptide recombinant tel que défini ci-dessus à la détection dans un liquide biologique d'une personne asymptomatique ou malade de la présence d'anticorps contre des peptides originaires de M. pirum. Fait également partie de l'invention toute composition immunogène contre l'infection par M. pirum caractérisée.en ce qu'elle contient une protéine ou un peptide tel que défini ci-dessus et enfin ladite composition immunogène est capable seule ou en association avec d'autres peptides ou protéines immunogènes de constituer un principe actif de vaccin contre le virus VIH. Enfin, le procédé de détection in vitro de la présence d'anticorps contre des peptides originaires de M. pirum dans un milieu biologique susceptible de les contenir, caractérisé par la mise en contact de cet échantillon biologique avec une protéine ou polypeptide et par la détection d'une réaction immunologique ou de la production d'un complexe immunologique contre cette protéine ou polypeptide et des anticorps contenus dans cet échantillon biologique, est partie intégrante de l'invention. Font également partie de l'invention: - un réactif de diagnostic constitué par la protéine ou les peptides selon l'invention pour rechercher la présence éventuelle d'anticorps spécifiques de M. pirum dans un fluid biologique; une sonde pour rechercher la présence éventuelle de M. pirum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'un acide nucléique défini dans l'invention; - une séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour l'une des séquences peptidiques définies dans l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La description détaillée qui suit est donnée à titre d'exemple mais en aucun cas n'est restrictive de la technique expérimentale utilisée dans la mesure o toute méthode permettant le clonage et l'identification du gène codant pour l'adhésine de M. pirum ou des fragments de celle-ci présentant les propriétés données ci-dessus de liaison aux membranes cellulaires humaines ou d'induction d'anticorps susceptibles de bloquer cette fixation font également partie de l'invention. Nous avons envisagé la localisation du gene d'adhésine de M. pirum, souche BER, isolé à partir d'une culture de cellules monoclonales purifiées d'un patient infecté par le virus VIH1. La culture de ce mycoplasme se fait en milieu SP4 dans les conditions expérimentales décrites notamment dans Tully et al. (1977) et l'ADN génomique a été purifié suivant les procédures classiques (Marmur, 1961). Considérant que les gènes codant pour les polypeptides de même fonction chez les organismes d'une espèce présentent souvent des séquences nucléotidiques homologues, une partie de la séquence nucléotidique d'ADN correspondant aux gènes connus de l'adhésine de M. pneumoniae et de M. genitalium a été utilisée dans l'identification du gène d'adhésine de M. pirum. La sonde oligonucléotidique de synthèse 29NTS de 29 nucléotides issue de la région 3' terminale du gène d'adhésine de M. qenitalium (Inamine et al, 1989) a été utilisée et dont la séquence est la suivante: 'TTGACCAAAGCAGTTGGTAGTGTCTTTAA 3'. Elle présente 28/29 nucléotides identiques à ceux de la région 3' terminale du gène d'adhésine de M. pneumoniae (Inamine et al, 1988). Elle a été choisie dans cette région car il y a 72% d'homologie de séquences (Dallo et al, 1989), le plus haut taux d'homologie de séquences trouvé dans la comparaison des séquences nucléotidiques des gènes d'adhésine de M. genitalium et M. pneumoniae. - Clonaqe et séquençage de l'ADN Les techniques de biologie moléculaire utilisées sont décrites dans Sambrook et al, 1989. Sur le profil de restriction EcoRI de M. pirum transféré sur membrane Hybond N.,5 fragments d'ADN de différentes tailles ont été révélés par la sonde 29NTS marquée au 32p à l'extrémité 5' terminale dans des conditions d'hybridation suivantes: l'hybridation a été faite dans un milieu tampon 6xSSC, 5xDenhardt's, 0.1% SDS, mg/ml ssDNA à 42 C pendant 16 à 18 h, la membrane a ensuite été lavée en 6xSSC, 0.1% SDS une fois 30 mn à température ambiante, une fois 1 h à 47 C et une fois mn à température ambiante; la température de lavage déterminante a été augmentée jusqu'à 55 C sans décrocher complètement la sonde 29NTS. Ils ont été clones dans des plasmides vecteurs pBlueScript (Stratagène La Jolla, CA). Les plasmides recombinant ont été obtenus après transformation de cellules compétentes d'Escherischia coli XL1- Blue. Les inserts de DNA des plasmides recombinants ont été séquences en utilisant la méthode dideoxy de Sanger en utilisant la DNA polymérase T7 modifiée (Sequenase US Bayer Chemical Corp. Cleveland, OH). - Analyse du DNA et des séquences polypeptidiques. Toutes les analyses et comparaisons de séquence ont été effectuées en utilisant les logiciels et leurs valeurs par défaut proposés par le GCG (Genetic Computer Group Inc., Madison, Wisconsin) (Devereux et al, 1984). Tenant compte du fait que le codon stop TGA chez les bactéries code pour le tryptophane chez les mycoplasmes (Jacobs, 1991), l'utilisation de ce programme de recherche d'alignements a montré que le fragment d'ADN EcoRI de 7.3 Kb présente une séquence d'acides aminés, déduite à partir de sa séquence nucléotidique, ayant le meilleur score d'homologie de séquences avec celles des gènes d'adhésine de M. genitalium et M. pneumoniae. Toutes les séquences publiées ont été obtenues des banques de données Genbank (Los Alomos, NM) de European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg - Germany). Avec d'autres oligonucléotides de synthèse, une étude de séquences plus approfondie du fragment EcoRI- ll SpeI de 1.5 Kb, un sous-clone du fragment EcoRI de 7.3 Kb, a permis la localisation d'un cadre de lecture ouvert de 973 pb correspondant à une extrémité NH2- terminale. Deux lignées d'E. coli transformées par les plasmides constitués du vecteur p Bluescript SK (Stratagène) et d'un fragment d'ADN hétérologue provenant du génome de M. pirum ont été déposées à la CNCM le 2 Juin 1993: il s'agit de la souche E. coli SKB1HE enregistrée sous le n 1-1314 et contenant le fragment de 5 kbp, lui- même contenant la partie 3'OH du gène codant pour la partie C. terminale de l'adhésine, et de la souche E. coli SKB31ES enregistrée sous le n 1- 1315, et contenant le fragment de 1,5 kbp du gène codant pour la partie N-terminale de l'adhésine. Une région de chevauchement de 87 nucléotides entre ces deux parties du gène est délimitée par les sites EcoRI et HindIII. La taille du cadre de lecture entier est donc de 3435 pb codant pour un polypeptide de 126731 Daltons, de 1145 acides aminés. La figure 2 résume la stratégie générale de clonage telle qu'explicitée ci-dessus et de détermination de la séquence 3435 pb codant pour les 1145 acides aminés du gène de l'adhésine de M. pirum. Ce gène présente 41.4% et 37.2% de similitudes de séquences nucléotidiques, la séquence d'acide aminé correspondante, 46.1% et 46.9% de similitude avec les séquences correspondantes de M. genitalium et M. pneumoniae respectivement. La figure 3 indique les pourcentages d'homologie entre les séquences nucléotidiques de M. pirum avec la séquence nucléotidique de l'adhésine de M. genitalium (figure 3A) avec la séquence nucléotidique de l'adhésine de M. pneumoniae (figure 3B); les figures 3C ET 3D indiquent les pourcentages d'homologie entre la séquence d'acides aminés de M. pirum comparée à la séquence de l'adhésine de M. genitalium (3C) et la séquence d'acides aminés de l'adhésine de M. pneumoniae (3D). Le programme utilisé utilisait l'algorithme de Needleman et Wunsch qui permet de trouver l'alignement des deux séquences complètes qui optimisent le nombre de concordances et minimisent celui des discordances. Des paramètres d'alignement avec le programme GAP préconisé par Devereux et al, (1984) ont ainsi été utilisés. Si l'on compare les séquences d'acides aminés on observe un pourcentage d'identité entre la séquence d'acides aminés ainsi déterminée à partir de la séquence polynucléotidique avec les protéines respectivement MgPa de l'adhésine de M. qenitalium ainsi que la protéine P1 de M. pneumoniae de 26%. Le cadre ouvert de lecture codant pour la protéine Pl supposée être l'adhésine de M. pirum a donc été trouvée être de 3.434 pb (voir figure 1) avec un pourcentage en G+C de seulement 28%, comparé au G+C% de 53.5% pour l'adhésine de M. pneumoniae et de 40% pour l'adhésine de M. qenitalium (Dallo et al, 1989). Ce faible G+C% du gène de M. pirum est en accord avec le G+C% extrêmement bas pour le génome entier de M. pirum (25.5%, Del Giudice et al, 1985). Cette composition en base est également reflétée dans l'usage des codons, notamment pour le tryptophane (Trp) dans la mesure o pour cet acide aminé il y a 18 triplets TGA et aucun triplet TGG codant pour le tryptophane alors que dans M. pneumoniae 17 des 37 résidus Trp sont codés par le TGG et dans M. genitalium 12 des 28 sont codés par le TGG. Le pourcentage des codons avec le A ou le T en troisième position est extrêmement haut: 91% comparé à % pour M. qenitalium et 40% pour M. pneumoniae. - Analyse de la séquence en acides aminés de la protéine Pl-like de l'adhésine de M. pirum. Outre les pourcentages d'homologie et d'identité entre les séquences d'acides aminés de la protéine P1- like de M. pirum avec la protéine P1 de M. pneumoniae et la protéine MgPa de M. qenitalium les observations suivantes peuvent être faites: a) trois résidus cystéine ont été trouvés dans la séquence Pl-like de l'adhésine de M. pirum ce qui potentiellement peut permettre des liaisons SS; aucun résidu cystéine n'a été trouvé dans les séquences de M. pneumoniae et de M. qenitalium. b) les profils d'hydrophilicité et d'hydrophobicité des régions NH2 et COOH terminales des trois gènes d'adhésine ont été comparés et sont présentés dans la figure 4. La figure 4A compare les profits hydrophobicité/hydrophilicité des fragments COOH terminaux des M. genitalium (a) M. pneumoniae (b) et M. pirum (c). La figure 4B compare ces mêmes profits pour les régions NH2 terminales entre les acides aminés 1 à 80 pour ces trois mêmes espèces de mycoplasmes. L'observation de ces figures indique clairement que les profits sont superposables montrant une séquence d'acides aminés terminale chargée positivement suivie par une séquence d'acides aminés hydrophobes. Enfin cette quasi-identité entre les profits d'hydrophilicité suggère la présence d'un peptide signal dans la protéine Pl-like de M. pirum de la même façon que cette séquence existe dans les adhésines de M. pneumoniae et de M. genitalium. c) comme pour la protéine P.1 de M. pneumoniae et MgPa de M. genitalium la protéine Pl-like de l'adhésine de M. pirum a sa partie COOH terminale riche en prolines; en effet 9 des 55 résidus prolines sont groupés dans les 29 derniers acides aminés de la séquence COOH terminale, cette région COOH terminale riche en prolines pouvant contribuer à la rigidité de cette partie de la molécule et pouvant être considérée comme un bon candidat pour induire la synthèse d'anticorps spécifiques. - Immunoréactivité des anticorps anti-peptides vis-à- vis de l'adhésine: Deux peptides synthétiques mimant les régions N- terminales et C-terminales de la molécule Pl-like de M. pirum ont été synthétisés selon la technique en phase solide de Merrifield, puis purifiés par HPLC. Dix mg de chaque peptide ont ensuite été couplés à 6 mg de KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) par la méthode à la glutaraldéhyde comme décrit par Pfaff et al. (1982). Le protocole d'immunisation est le suivant: deux lapins de NouvelleZélande ont été immunisés avec chacun des peptides en mélangeant 200 Mg de peptide couplé au KLH avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund, puis injectés en intradermique le jour 0. Ce procédé a été répété ensuite par injection sous-cutanée avec l'adjuvant incomplet de Freund les jours 30, 60 et 90. Les lapins sont saignés une semaine suivant chacune des injections. L'immunoréactivité des anticorps anti-peptides a été mesurée par un test ELISA: des plaques à 96 trous (Nunc, Rotskild, Denmark) ont été recouvertes pendant 2 h à 37 C avec 100 ng de peptide synthétique dans 50 pl de PBS (Phosphate Buffer Saline), pH 7.4 par puits. Après saturation avec 400,1 de PBS, 5% de lait écrémé, pendant 1 h à 37 C, puis lavage avec du PBS, 0,5% de lait, 0,01% de Tween 20, 50 pl de dilutions en série de sérum ont été ajoutés. Après 2 h, à 37 C, les puits sont rincés et 50 Il d'anticorps anti- lapins marqués à la peroxydase (dilution 1/5000) ont été ajoutés. Après 1 h à 37 C, puis rinçage, 100 Ml d'orthophénylènediamine ont été ajoutés et incubés pendant 30 mn à température ambiante à l'obscurité. La réaction a été arrêtée par addition de 50 p1 d'acide sulfurique 4 N et le rapport de densité optique à 492 et 620 nm a été déterminé. La figure 5 représente la densité optique ainsi mesurée en fonction de la dilution. Les symboles ont la signification suivante: - triangles et carrés vides: 2 lapins immunisés avec le peptide C-terminal; - cercles pleins: lapin immunisé avec le peptide N-terminal; - triangles et carrés pleins: sérums préimmuns des lapins utilisés pour l'immunisation avec le peptide C-terminal. Les résultats indiqués dans la figure 5 indiquent que seuls les lapins immunisés avec le peptide C- terminal produisent des anticorps spécifiques contre le peptide correspondant avec un titre relativement élevé dans la mesure o une dilution de sérum au 5000è donne toujours un résultat positif. Au contraire, aucun anticorps anti-peptide n'a été détecté dans le sérum de lapins inoculés avec le peptide correspondant à la fraction N-terminale. Dans le but de démontrer que le gène recombinant cloné Pl-like ou adhésine de M. pirum code réellement pour une protéine exprimée, nous avons analysé la capacité des anticorps anti-peptides de reconnaître spécifiquement la protéine correspondante dans une expérience de Western blot. - Analyse en Western blot: La technologie utilisée a été la suivante: Un lysat cellulaire de M. pirum dans le SDS a été analysé par gel d'électrophorèse en polyacrylamide-SDS. Après électrotransfert sur membrane de nitrocellulose, la saturation a été obtenue en incubant avec 5% de lait écrémé dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. La membrane a ensuite été incubée pendant 2 h avec le sérum de lapins immunisés, puis lavée dans le PBS. Des anticorps anti-lapins marqués à la peroxydase ont ensuite été ajoutés et incubés pendant 1 h. Finalement, les complexes antigènes- anticorps formés ont été détectés par la diaminobenzidine. La figure 6 représente le profil électrophorétique obtenu par Western blot, après réaction du lysat cellulaire de M. pirum avec des sérums de lapins dans les différentes conditions suivantes: 1. sérum de lapin immunisé avec le peptide C-terminal et dilué au 1/10; 2. sérum de lapin immunisé avec le peptide C-terminal et dilué au 1/100; 3. sérum préimmun de lapin immunisé avec le peptide C- terminal et dilué au 1/10; 4. sérum de lapin immunisé avec le peptide Cterminal et dilué au 1/10, auquel est ajouté le peptide C- terminal immunogène; 5. sérum de lapin immunisé avec le peptide Cterminal et dilué au 1/10, auquel est ajouté le peptide N- terminal immunogène; 6. sérum de lapin immunisé avec le peptide Nterminal est dilué au 1/10; 7. sérum préimmun de lapin immunisé avec le peptide N- terminal est dilué au 1/10. Les résultats de la figure 6 indiquent clairement que les anticorps produits contre le peptide C-terminal reconnaissent une protéine de poids moléculaire relatif de 126 kDa, comme déterminé par sa mobilitéélectrophorétique. Cette reconnaissance semble être spécifique dans la mesure o le sérum de lapin pré-immun n'est pas capable de détecter une réaction positive (figure 6, ligne 3) et également par la capacité du peptide synthétique C-terminal, mais non N-terminal, d'inhiber totalement cette interaction (ligne 4). En outre, en accord avec les résultats des tests ELISA, aucune réaction positive n'a été détectée quand les lapins ont été immunisés avec les résidus N- terminaux (lignes 6 et 7). Ces résultats indiquent bien que la région C terminale de la protéine recombinante est un immunogène susceptible d'induire la formation d'anticorps spécifiques, aptes à interférer avec l'attachement membranaire entre le mycoplasme et la cellule humaine. - Mesure de la capacité des anticorps à inhiber l'attachement de M. pirum à des cellules en culture: Les anticorps polyclonaux ont été faits par exemple par la méthode décrite ci-dessus; les anticorps monoclonaux sont réalisés par la méthode de Kohler and Milstein (1975). Les peptides immunogènes utilisés sont des peptides incluant un ou plusieurs des 6 peptides décrits plus haut ou la protéine entière. Les techniques utilisées pour mesurer l'inhibition de l'attachement du mycoplasme à des cellules en culture par un anticorps sont décrites dans l'article de Chandler et al. (1982). Brièvement, les cellules en culture sont mises en contact avec des mycoplasmes ou des mycosphères de M. pirum et des quantités croissantes de liquide biologique susceptible de contenir des anticorps, ou d'anticorps purifiés, sont mises en contact avec ces cellules. L'inhibition de l'attachement des mycoplasmes aux cellules est mesurée par les techniques décrites dans l'article de Chandler cité ci-dessus. La spécificité de cette inhibition peut être démontrée et précisée par addition d'adhésine purifiée de M. pirum ou de peptides déduits de la séquence de cette adhésine. L'étude de la capacité des liquides biologiques ou des anticorps à inhiber l'attachement des mycoplasmes sur les cellules en culture peut donner une bonne indication du type de cellules qui constitue une cible préférentielle pour M. pirum. En outre, ce test peut donner une indication des anticorps qui seraient les meilleurs candidats pour constituer un principe actif dans la production de compositions pharmaceutiques pour la prévention ou le traitement d'une infection par M. pirum. Enfin, ce test peut orienter le choix des anticorps qui constitueront le principe actif dans la production de compositions pharmaceutiques pour la prévention ou le traitement des infections par le virus VIH. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Blanchard A. (1990). Sequencing of Ureaplasma urealyticum urease genes: use of a UGA tryptophan codon.Molec. Microbiol. 4, 669-676. - Chandler D.K.F., Collier A.M., Barile M.F., Attachement of Mycoplasma pneumoniae to Hamster Tracheal Organ Cultures, Tracheal Outgrowth Monolayers, Human Erythrocytes, and WiDr Human Tissue Culture Cells. Affection and Immunity (1982) vol. 35, n 3, p. 937-942. - Dallo S.F., Chavoya A., Su C-J., Baseman J.B. 1989. 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Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est constitué: - soit d'une séquence dérivée de la séquence de la figure 1 par addition, délétion ou substitution de certains codons, - soit d'un fragment de la séquence représentée dans la figure 1, pourvu que ladite séquence ou ledit fragment code pour une protéine ayant une réaction immunologique croisée avec la protéine codée par l'acide nucléique représenté sur la figure 1. 3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il code pour l'adhésine de M. pirum et en ce qu'il présente au moins 40% d'homologie avec l'acide nucléique codant pour l'adhésine de M. genitalium et au moins 37% d'homologie avec l'acide nucléique codant pour M. pneumoniae. 4. ARN caractérisé en ce qu'il est hybridable avec l'une des séquences définies dans les revendications 1 à 3. 5. Protéine recombinante ayant des propriétés d'adhésion à des récepteurs membranes de cellules eucaryotes, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences d'acides nucléiques définies dans les revendications 1 à 4. 6. Protéine recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est l'adhésine de M. pirum et que sa séquence présente entre 45% et 60% de similitude et entre 25% et 50% d'identité avec les adhésines de M. pneumoniae et de M. genitalium et qu'elle n'est pas reconnue par des anticorps formés contre le peptide: GVVSTPLVNLINGQ 7. Protéine recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient 70 à 100% de l'un ou des deux peptides suivants: HIDPKKMVDNYPNQWKSSQ IGIPMAKHKKAIKVGFEL 8. Peptide dont la séquence en acides aminés est incluse dans la séquence en acides aminés contenue dans la protéine recombinante de la revendication 5, caractérisé en ce: - qu'il n'est pas reconnu par des anticorps formés contre le peptide GVVSTPLVNLINGQ et - que, seul ou associé à une molécule porteuse, il est susceptible d'induire la formation d'anticorps aptes à neutraliser une infection de lymphocytes ou de monocytes humains par M. pirum. 9. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il inclut 70 à 100% de l'une ou des deux séquences suivantes: HIDPKKMVDNYPNQWKSSQ IGIPMAKHKKAIKVGFEL 10. Anticorps monoclonal ou polyclonal contre l'une des séquences protéiques ou peptidiques définies dans l'une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'inhiber l'infection de cellules humaines par M. pirum in vitro et/ou in vivo. 11. Anticorps monoclonal ou polyclonal contre l'une des séquences protéiques ou peptidiques définies dans l'une des revendications 5 à 9, caractérisée en ce qu'il est susceptible d'inhiber l'infection de lymphocytes T humains par le virus VIH. 12. Composition pharmaceutique ayant la capacité d'inhiber l'infection de lymphocytes T humains en culture par le virus VIH contenant l'anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 11, à titre de principe actif. 13. Utilisation de l'anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 10, pour la production de compositions pharmaceutiques pour la prévention ou le traitement de l'infection des humains par le virus VIH. 14. Utilisation d'une protéine selon les revendications 5, 6 ou 7 ou d'un fragment inclus dans ladite protéine, ou un peptide selon les revendications 8 et 9, pour la production de compositions pharmaceutiques pour l'induction in vivo d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection des cellules humaines par M. pirum. 15. Utilisation d'une protéine selon les revendications 5, 6 ou 7 ou d'un fragment inclus dans ladite protéine, ou d'un peptide selon les revendications 8 et 9, pour l'induction in vivo d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes T humains par le virus VIH. 16. Utilisation d'une protéine selon l'une des revendications 5, 6 ou 7, ou d'un peptide selon les revendications 8 et 9, à la détection dans un liquide biologique d'une personne asymptomatique ou malade, de la présence d'anticorps contre des peptides originaires de M. pirum. 17. Procédé de détection in vitro de la présence d'anticorps contre des peptides originaires de M. pirum dans un milieu biologique susceptible de les contenir, caractérisé par la mise en contact de cet échantillon biologique avec une protéine selon l'une des revendications 5, 6 ou 7 ou polypeptide selon les revendications 8 ou 9 et par la détection d'une réaction immunologique ou de la production d'un complexe immunologique contre cette protéine ou polypeptide et des anticorps contenus dans cet échantillon biologique. 18. Composition immunogène contre l'infection contre M. pirum caractérisée en ce qu'elle contient une protéine selon l'une des revendications 5 à 7 ou un fragment de celle-ci, ou un peptide selon les revendications 8 ou 9, ou un mélange de ceux-ci. 19. Composition immunogène selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est capable seule ou en association avec d'autres peptides ou protéines immunogènes, de constituer un principe actif de vaccin contre le virus VIH. 20. Réactif de diagnostic constitué par la protéine ou les peptides selon les revendications 5 à 9 pour rechercher la présence éventuelle d'anticorps spécifiques de M. pirum dans un fluide biologique. 21. Sonde pour rechercher la présence éventuelle de M. pirum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'un acide nucléique défini dans l'une des revendications 1 à 4. 22. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour l'une des séquences peptidiques définies dans l'une des revendications 7 à 9. Figure 1 Frame 1 M K K I K F N Y K Y L L I S L V S ATG AAA AAA ATA AAA TTT AAC TAT AAA TAT TTA TTG ATT TCT TTG GTG AGC 9 18 27 36 45 T T I V S A A A I S L Y S T F N K D Q ACA ACA ATT GTT AGT GCT GCT GCA ATT AGT TTA TAT AGT ACT TTT AAT AAA GAT CAA 69 78 87 96 105 I S N P I I N Q N V K S F S N P S I V ATT TCT AAT CCT ATT ATT AAT CAA AAT GTA AAA AGT TTT TCA AAT CCA AGT ATT GTT 117 126 135 144 153 162 G N K V G K I R H W Q N N N F N G V E GGT AAT AAA GTA GGT AAA ATC CGA CAT TGA CAA AAT AAT AAT TTT AAT GGT GTT GAA 174 183 192 201 210 219 I K N G G F V V L T S T Q S A T R I D ATT AAA AAT GGT GGT TTT GTT GTA TTA ACA AGT ACA CAA AGT GCA ACA AGA ATT GAT 231 240 249 258 267 276 A F G N I L W E F D P E K I A S E D S GCA TTT GGA AAT ATA TTA TGA GAA TTT GAT CCA GAA AAA ATA GCA TCT GAA GAT AGT 288 297 306 315 324 333 Q Y A N L A G K K V V E I T Q D E G D CAA TAT GCA AAT TTA GCA GGC AAA AAA GTT GTT GAA ATA ACT CAA GAT GAG GGT GAT 345 354 363 372 381 390 N S N I L Y L L L I P K N T P D K Q A AAT TCT AAT ATT CTT TAT TTA TTG TTG ATA CCA AAA AAT ACA CCC GAT AAA CAA GCA 402 411 420 429 438 447 S I D P K D L Y A Y N E L T G S S K S TCT ATA GAT CCA AAA GAT CTT TAT GCA TAT AAT GAA TTA ACA GGA AGT TCA AAA AGC 459 468 477 486 495 504 K Q Q A T V V Q I I E N V N L Y Q G S AAA CAA CAA GCA ACT GTT GTT CAA ATA ATT GAA AAT GTT AAT TTA TAC CAA GGA AGC 516 525 534 543 552 561 T W T P S F T I K G L M H I D P K K M ACT TGA ACT CCT TCA TTT ACA ATT AAA GGA TTA ATG CAT ATT GAT CCT AAA AAA ATG 573 582 591 600 609 618 V D N Y P N Q W K S S Q S S S T F F T GTT GAT AAT TAT CCA AAT CAA TGA AAA TCT TCT CAA TCA TCA TCT ACA TTT TTT ACA 630 639 648 657 666 675 K E D H P S W Y V A N N S E K V H N D AAA GAA GAT CAT CCA TCT TGA TAT GTA GCT AAT AAT TCT GAA AAA GTA CAC AAC GAT 687 696 705 714 723 732 A D Q N T N Q Y N G L K S A N M V L P GCT GAT CAA AAT ACT AAT CAA TAC AAT GGT TTA AAA AGT GCT AAT ATG GTT TTG CCG 744 753 762 771 780 789 W K Q Y I T N L G N M F A K N G I V L TGA AAA CAA TAT ATT ACT AAT TTG GGT AAT ATG TTT GCT AAA AAT GGT ATT GTA TTA 801 810 819 828 837 846 I F G G N G S I Y N D P E A L S I G M ATT TTT GGT GGC AAT GGT TCT ATA TAC AAT GAT CCT GAA GCT TTA AGT ATC GGA ATG 858 867 876 885 894 903 W K L D F L K P Y S G N I D N N Q N Y TGA AAA TTA GAT TTT TTA AAA CCA TAT TCT GGA AAT ATT GAT AAT AAC CAA AAT TAT 915 924 933 942 951 960 G G I P Y A Y L L R Y L R Y D P S K P GGC GGA ATT CCT TAT GCT TAT TTA TTA AGA TAT TTA AGA TAT GAT CCA TCA AAA CCA 972 981 990 999 1008 1017 L L G T S A P N R R W N Q S Y A P I G CTT TTG GGA ACT AGT GCA CCA AAC CGA CGT TGA AAT CAA TCA TAT GCT CCT ATT GGA 1029 1038 1047 1056 1065 1074 Q T D N F T Y V P R L A V G G V Q I N CAA ACT GAT AAT TTT ACA TAT GTT CCA AGA TTA GCA GTT GGC GGT GTT CAA ATT AAT 1086 1095 1104 1113 1122 1131 A S T D E A T Y L' Y L A A G I T V G Q GCT TCA ACT GAT GAA GCT ACT TAT TTA TAT TTA GCT GCT GGA ATT ACA GTA GGA CAA 1143 1152 1161 1170 1179 1188 A K E S Q A R E V I S N S N T S T N K GCA AAA GAA TCA CAA GCT CGT GAA GTT ATT AGT AAT AGC AAC ACT TCT ACT AAT AAA 1200 1209 1218 1227 1236 1245 V V T K I Q D K R S L Q L T G A N T I GTT GTT ACT AAA ATT CAA GAT AAA CGT TCA TTG CAG TTA ACA GGT GCC AAT ACT ATT 1257 1266 1275 1284 1293 1302 T N T K D T A A N S I D P A L L F G T ACT AAC ACA AAA GAT ACA GCA GCT AAT TCA ATT GAT CCA GCT TTA TTA TTT GGC ACA 1314 1323 1332 1341 1350 1359 A F N I D S L I N L P T T K L N E N L GCT TTT AAT ATT GAT TCA TTA ATT AAT TTA CCA ACA ACT AAA TTA AAT GAA AAT TTA 1371 1380 1389 1398 1407 1416 Figure 1 (suite 1) T I F Q N V F Q Y E S Y F D V G A T M ACT ATT TTT CAA AAT GTT TTT CAA TAT GAA AGT TAT TTT GAT GTT GGT GCA ACA ATG 1428 1437 1446 1455 1464 1473 S V S S A V G T Y Y Y F D K K N H A S AGT GTG TCT TCT GCA GTT GGT ACT TAT TAT TAT TTT GAT AAG AAA AAT CAT GCA AGT 1485 1494 1503 1512 1521 1530 S S T T D I N T Y T T A S N G W N N L TCA TCG ACA ACA GAT ATA AAT ACA TAT ACA ACA GCC TCA AAT GGT TGA AAT AAT TTA 1542 1551 1560 1569 1578 1587 G R T A F P W S Y K P N N D I G S I F GGT AGA ACT GCT TTT CCA TGA AGT TAT AAA CCA AAC AAT GAT ATA GGA AGT ATA TTT 1599 1608 1617 1626 1635 1644 Q P K T N D N N N A T Y S Y N L S L L CAA CCA AAA ACT AAT GAT AAT AAT AAT GCA ACT TAT TCA TAC AAT TTA AGT TTA TTA 1656 1665 1674 1683 1692 1701 I E N A I N Y Y Y S T L S F G Y S L K ATT GAA AAT GCA ATA AAT TAT TAT TAT TCA ACA TTA TCA TTT GGT TAT TCA CTT AAA 1713 1722 1731 1740 1749 1758 C L G G L T K I E M P S K E N P E N T TGT CTT GGT GGA TTA ACT AAA ATT GAA ATG CCA AGT AAA GAA AAT CCA GAA AAT ACA 1770 1779 1788 1797 1806 1815 I Y G Y A M Q V G K S I V Y L N E P K ATT TAT GGA TAT GCT ATG CAA GTT GGT AAA TCA ATA GTG TAT TTA AAT GAA CCT AAA 1827 1836 1845 1854 1863 1872 S D L R S I A Y H G P S S I S I G E S TCA GAT TTA AGG AGT ATT GCA TAC CAT GGA CCA TCA TCA ATA TCG ATT GGA GAA AGT 1884 1893 1902 1911 1920 1929 N L V G S A K Y G D M D Y P Y V K I N AAT TTA GTT GGA TCC GCA AAA TAT GGA GAT ATG GAT TAT CCA TAT GTA AAA ATA AAT 1941 1950 1959 1968 1977 1986 N S N I G Y V P S D Y S N I T N N I I AAC TCA AAT ATT GGT TAT GTT CCA TCA GAT TAT TCT AAT ATC ACA AAT AAT ATT ATT 1998 2007 2016 2025 2034 2043 N T G V A I Y V T G I K D F N D T I P AAT ACA GGT GTC GCT ATA TAT GTA ACA GGA ATT AAA GAT TTT AAT GAT ACT ATT CCA 2055 2064 2073 2082 2091 2100 T I A S Q F E I G N S P Y E D N S S T ACT ATT GCT TCA CAA TTT GAA ATT GGT AAT AGT CCA TAT GAA GAT AAT AGT TCA ACT 2112 2121 2130 2139 2148 2157 T K T N G T L Q P T I P W N D F V G L ACA AAA ACT AAT GGT ACA TTA CAG CCA ACA ATT CCA TGA AAT GAT TTT GTA GGT TTG 2169 2178 2187 2196 2205 2214 Figure 1 (suite 2) N S T N F N S E I S S L W L N N N Q T AAT TCT ACT AAT TTT AAT TCA GAA ATA TCT AGT TTA TGA TTA AAT AAT AAT CAA ACA 2226 2235 2244 2253 2262 2271 K T N N N E H F I V T K S P E I S E Y AAA ACA AAT AAC AAT GAA CAT TTT ATA GTT ACT AAA TCA CCA GAA ATT AGT GAA TAT 2283 2292 2301 2310 2319 2328 Y G N A I W T E R F Y Y N Y G S S N N TAT GGT AAT GCA ATT TGA ACT GAA AGA TTT TAT TAT AAC TAT GGC TCT TCA AAT AAC 2340 2349 2358 2367 2376 2385 A D W K G S K R A W F E V K D S N S L GCT GAT TGA AAA GGT TCA AAA AGA GCT TGA TTT GAA GTA AAA GAT TCT AAT AGT TTA 2397 2406 2415 2424 2433 2442 S N S S T T V G W Q V G L D S N L T A TCT AAT AGT AGC ACT ACA GTT GGA TGA CAA GTA GGA CTT GAT AGT AAC CTT ACT GCT 2454 2463 2472 2481 2490 2499 D S Y Y V Q K N N E Q P Q G D F D V L GAT TCG TAT TAT GTT CAA AAG AAC AAT GAA CAA CCT CAA GGT GAT TTT GAT GTT TTA 2511 2520 2529 2538 2547 2556 L R T R D D T Q K N N D I F F G Q I N TTA AGA ACT AGA GAT GAC ACG CAA AAA AAT AAT GAT ATT TTC TTT GGT CAA ATA AAT 2568 2577 2586 2595 2604 2613 N T R E P G I S Y C K L K Q N Y G S Y AAT ACA AGA GAA CCC GGA ATT TCA TAT TGT AAA TTA AAG CAA AAC TAT GGT TCA TAT 2625 2634 2643 2652 2661 2670 F Y E T I S E I D R L S L L G N G Q F TTC TAT GAA ACA ATT TCT GAA ATA GAT CGA TTA TCG TTG TTG GGA AAT GGT CAA TTT 2682 2691 2700 2709 2718 2727 V N N L S N Q I L T N N L A N L L V Q GTA AAT AAC TTA TCT AAC CAA ATT TTA ACT AAC AAT TTA GCT AAT TTA TTA GTT CAA 2739 2748 2757 2766 2775 2784 V N L S T V T G N P L D S K S T I R I GTT AAT TTA TCA ACT GTT ACA GGA AAT CCA TTG GAC TCT AAA TCA ACT ATA AGA ATT 2796 2805 2814 2823 2832 2841 V K N Q F L N E V F Q V T K N P I I E GTA AAA AAT CAA TTT TTG AAT GAG GTA TTC CAA GTT ACA AAA AAT CCA ATA ATT GAA 2853 2862 2871 2880 2889 2898 G S T P T Y G P V I I V A S N V D F V GGA TCT ACA CCA ACA TAT GGT CCA GTA ATT ATT GTC GCA TCA AAT GTA GAT TTT GTT 2910 2919 2928 2937 2946 2955 S Q S A T F T A Y S W N S L T K N Y D TCT CAA TCT GCA ACA TTT ACA GCA TAC TCA TGA AAT AGT TTA ACT AAA AAT TAT GAT 2967 2976 2985 2994 3003 3012 Figure 1 (suite 3) 3 o V M P R T N S S K I N V I N N 2705970 A GTA ATG CCA AGA ACG AAT AGT TCT AAA ATT AAT GTT ATA AAT AAT TCT ATT TTT GCT 3024 3033 3042 3051 3060 3069 G F S A M A D W I L P V V I A I P I V GGA TTT AGT GCA ATG GCT GAT TGA ATT CTT CCT GTA GTT ATT GCT ATT CCC ATT GTA 3081 3090 3099 3108 3117 3126 L V A L I I G L G C S I G I P M A K H TTA GTT GCA TTA ATA ATT GGT TTA GGT TGC AGT ATT GGG ATT CCA ATG GCT AAA CAT 3138 3147 3156 3165 3174 3183 K K A I K V G F E L Q H D K V G T L T AAA AAA GCT ATT AAA GTT GGT TTT GAA TTG CAA CAC GAT AAA GTT GGA ACA TTG ACT 3195 3204 3213 3222 3231 3240 S A V G G V F K K I I D N T N S N N V TCA GCT GTT GGT GGT GTT TTC AAA AAA ATT ATT GAC AAT ACA AAT TCT AAT AAT GTG 3252 3261 3270 3279 3288 3297 * K S K P Q M L K A A A K K P N T V P P AAA TCT AAA CCA CAA ATG CTT AAG GCT GCA GCT AAA AAA CCA AAT ACA GTT CCA CCT 3309 3318 3327 3336 3345 3354 A R S Q L T N D S V S R P T P P S S A GCT AGA TCT CAA TTA ACA AAT GAT TCT GTT TCT AGA CCC ACT CCA CCA TCA TCT GCT 3366 3375 3384 3393 3402 3411 P K P P I K CCA AAA CCA CCA ATA AAA TAA 3423 3432 Figure 1 (suite 4) 7.3 Kb Kb Kb I I EcoRI Spel EcoRI v v >1.5 Kb' 2.5 Kb A A A A : A I i i I iIJ I llindIll Xl Iml lict)RV I l ill(ll Spel Hindil I 1 v v RP 6.111.111.211,311,4 12.0 -.->...>...>...> > --.>..- > I j - I ' I.i:i:i:.:::.;-!:::.::::.:..::::i:!,Z.i!:'.i:i,,::; ::!::::!:.'[:i!::::::::::::::::::::::::.:::::. 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TAAAGGCTTTGGTTTAACTGGT'ATGCCCCTACTGATTGGAATGAGATCA 550 9 TAA AAAGATCAATTT-T=AATCCTATTATTAATCAAAATGTAAAAAGT 144 H i lIl I1i I I I il I I Il I AAGGTAAAGTT-.CAGTAGAAGTAGTTCAATCCCCCCATTCCCCCAACCT 599 I1 11 1111 IIIII I HI II I 1400 TTGGTGGTAATGGT.........CATGCTACTAAGATGTTTACCACCAAT 1440 904 ATGTGAAAATTAGATTTTTTAAAACCATATTCTGGAAATATTGATAATAA 953 II1 I I I I1 I I I I 1 I 111 1441 CCCTTAAGTATTGGGGTATTTAGGATTAAATACACTGATAACTTTAGTAA 1490 954 CCAAAATTATGGCGGAATTCCTTATGCTTATTTATTAAGATATTTAAGAT 1003 1 I II I11111 1111 1 11 [III 1491 GTCATCAGTAACAGGTTGACCATATGCAGTGTTATTTGGGGGATTAATTA 1540 1004 ATGATCCATCAAAACCACTTTTGGGAACTAGTGCACCAAACCGACGTTGA 1053 Il I I I I l I I I I I I Il 1541 ATCCCCAAACCAATGGCTTGAAAGATCTTCCCCTTGGTACCAACAGGTGG 1590 1054 AATCAATCATATGCTCCTATTGGACAAACTGATAATTTTACATATGTTCC 1103 i111 I I I I I I I1 I 1591 TTTGAATATGTACCAAGAATGGCAGTTAGTGGGGTGAAATGGGTTGGTAA 1640 104 AAGATTAGCAGTTGGCGGTGTTCAAATTAATGCTTCAACTGATGAAGCTA 1153 I III I l 1 1 11 1 I I1 1111 1 1641 TCAACTAGTGTTAGCAGGAACACTAACAATGGGTGATACAGCTACTGTAC 1690 1154 CTTATTTATATTTAGCTGCTGGAATTACAGTAGGACAAGCAAAAGAATCA 1203 Il lI1 1 I111 1 1 1 1I I I I 1691 CTAGGTTAAAGTATGATCAACTAGAAAAACACTTAAACCTAGTTGCTCAA 1740 1204 CAAGCTCGTGAAGTTATTAGTAATAGCAACACTTCTACTAATAAAGTTGT 1253 I I I I I I I 1 I I 1 I I 1741 GGCCAGGGACTATTGAGAGAAGACTTGCAGATCTTCACTCCCTATGGGTG 1790 Figure 3 A _254 TACTkAATTCAAGATAAACGTTCATTGCAGTTAACAGGTGCCAATACTA 1303 illI 11 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 --91 AGCTAATCGTCCTGATATTCCTGTAGGAGCATGACTCCAAGATGAAATGG 1840 1304 TTACT.A. CACAAAT.ACAGCAGTTTTGATCCAGC 1346 I I! l I I I I II I I i 1841 GCAGTAAATTTGGTCCCCATTkCTTCTTAAATAACCCTGATATCCAGGAC 1890 1347 TTTATTATTT GGCACAGCTTTTAATATTGATTCATTiATTAATTTACCAA 1396 I I IIi I IHH H I II 1!891 AATGTTAATAATGATACGGTTG;AGCATTAATCAGTAGTTACAAAAACAC 1940 729 CAACTAATTAAATGAAAATTTAACTATTTTTCAAAATGTTTTT CAATAT 1446 I I I il i I 1 11 1111I 1 1941 TGATAAGTTAAAACACGTTTATCCTTATCGATACAGTGGTTTGTATGCTT 1990 447 GA.AAGTTATTTGATGTTGGTGCAACAATGAGTGTGTCTTCTGCAGTTGG 1496 Il Illi llll 11 1 Ili I I I I1 I 1 1'991 GACAGTTATTTAACTGGTCTAACAA.ACTAACCAACACTCCCCTATCAGC 2039 497 TACTTATTATTATTTTGATAAGAAAAATCATGCAAGTTCATCGACAACAG 1546 I I I -I I1 I I i i Ii I I 2040 TAACTTTGTTAATGAAAACAGTTATGCACCAAACAGTTTGTTTGCTGCTA 2089 -7 4 ATATAAATACATATACAACAGCCTCAAATGGTTG.AAATAATTTAGGTAGA 1596 III I I lI I I I! I I III I I _^- - T-TTAAATGAAGATCTGTTAACAGGGCTAAGTAGATAAGATTTTCTATGGT 2139 -^7 ACTGCTTTTCCATGAAGTTATAAACCAAACAATGAATATAGGAAGTATATT 1646 [ I I I I I! I I I I I I ^ 40 AAGGAGA.TGAGTTTGCTGAAAATGAAGCAGATAGGTTTAACCAACTTTT 2189 -4 TCAACCAAAAACTAATGATAATAATAATGCAACTTATTCATACAATTTAA 1696 Ilil 11111 11 I 11 I 1I I I I 11 - C AAGTTTAAATCCTAATCCTAACACTAACTGAGCTAGGTATTTAAACGTAG 2239 1697 GTTTATTAATTGAAAATGCAATAAATTATTATTATTCAACATT....... 1739 I Ili I I I I I I II1 I Il 2240 TACAACGTTTTACTACCGGACCTAACCTTGATAGTTCTACCTTCGATCAG 2289 1740 ATCATTTGGTTATTCACTTAAAT...............GTCTTGGTGGAT 1774 Il I I Il I I 111 I I 2290 TTCTTAGACTTTCTCCCCTGAATCGGCAATGGTAAACCCTTTTCCAACTC 2339 1775 TAACTAAAATTGAAATGCCAAGTAAAGAAAATCCAGAAAATACAATTTAT 1824 Il I1 I1 I I I I I 11 I 2340 CCCCTCCCCTTCAACTTCCGCTTCCTCTTCTACCCCCCTCCCCACTTTTT 2389 1825 GGATATGCTATGCAAGTTGGTAAATCAATAGTGTATTTAAATGAACCTAA 1874 I I III I I Illlllli I I I Il I II1 2390 CTAACATCAATG.TTGGGGTTAAATCAATGATCACTCAACATTTAAATAA 2438 Figure 3 A (suite 1) 3 q 2705970 1875.ATCAGATTTAAGGAG. - TATTGCATACCATGGACCATCATCATATCGA 1 921 ! I l I II I I I I II I 2439 AG. AAACACCC2GGTGGGTGTTTATACCTAACmTmTCACCTGACATCTGAA 2488 1922 TTGGAGAAAGTAATT2AGTTGGATCCGCAAAATATGGA...GATATGGAT 1968 IIIII I 11 III I 11 II I I I I I 2489 CAGGAGCAGGGTATCGCGTTCAAAGTGCTAATCAGAAAAACGGCATTCCT 2538 1969 TATCCATATGTAAAATAAAT TAACTCAAATATTGGTTATGTTCC..ATC 2015 II III1 I II 1 11 1 11111 11 2539 TTTGAACAGGTGAAACCTAGCAATAATAGTACCCCCTTTGATCCCAATTC 2588 2016 AGATTATTCTAATATCACAAATAATATTATTAATACAGGTGTCGCTATAT 2065 II1I1 III 11111 I I I I 1 2589 AGATGATAATAAAGTCACACCATCAGGTGGCTCCTCCAAACCCCACACCT 2638 2066 A.TGTAACAGGAATTAAAGATTTTAATGATAC....TATTCCAACTATTGC 2111 IH I 1 11 1i1 I I I II 2639 ATCCTGCTTTACCCAACAGTATCAGTCCCACCAGTGACTGGATCAATGCA 2688 2112 TTC-ACAATTTGAATTGGTAATAGTCCATATGAAGATAATAGTTCAACTA 2161 I!I I I III II I I I II III 2689 TTGACT'TCACTAATAAGAATAACCCGCAGCGCAATCAACTGTTGCTCAG 2738 2162 CAA. AC TAATGGTACATTACAGCCAACAATTCCATGAAATGATMTTTGTA 2211 I I1 111i1 1 1 1 1 i 1 1II i 2739 AAGCTTACTAGGAACTATTCCGGTCTTGATCAATAAGAGTGGGGATAGTA 2788 22 - 2GTTGAATTTMAC2AATTTTAATTCAGAAATATCTAGTTTATGATTAAA 2261 1 IiIl Il I 1I I I l I I 1 2789 ATGATCAATT TAACAAGGATAGTGAGCAGAAATGGGATAAAACTGAGAC 2837 2262 TAAT;.TCAAACAAAAACAAATAACkATGAACATTTATAGTTACTAAAT 2311 III I I I I II I 111 2838 AAATGAGGGTAATTTACCTGGGTTTGGGGAGGTGAATGGGTTGTATAATG 2887 _2, CACCAGAAATTAGTGAATATTATGGTAATGCAATTTGAACTGAAAGATTT 2361 I 11 I I I1 I I I I Ili I I 288 8 iTGCATTA2TCCATACCTATGGTTTTTTTGGCACCAATACCAACTCTACT 2937 2362 TATTTAACTATGGCTCTTCAAATAACGC TGATTGAAAAGGT........ 2 403 Il III 1 1 1 1 1 1 1 1 Hl 2938 GATCCTAAGATAGGTTTTAAAGCTGATAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAC 2987 2404 TCAAAAAGAGCTTGATTTGAAGTAAAAGATTC..........TAATAGTT 2443 I1 i Il il 1l1I I 1 I l 1III I 2988 ACTAGTAGGTAGTGGGTTAAACTGAACTAGTCAGGATGTAGGTAATCTTG 3 0 3 7 2444 TATCTAATAGTAGCACTACAGTTGGATGACAAGTAGGACTT...GATAGT 2490 I I I I 1111 lIl I 111 1 I1 I II I 3038 TTGTAATCAATGACACCAGCTTTGGGTTTCAACTTGGTGGTTGGTTTATT 3087 2491 AACCTTACTG.CTGATTCGTATTATGTTCAAAAGAACAATGAACAACCTC 2539 I I MI i I I i 111[II I II I 1 1IliI 3088 ACCTTCACTGACTTTATCAGACCAAGAACTGGTTATCTAGGGATTACCTT 3137 Figure 3 A (suite 2) 254C AAGGTGATTTTGATGTTTTATTAAGAACTAGAGATGACACGCAAAAAAAT 2589 ij, Hi I I! ' I I I Il I I I _138 AATCAGCCTACAAGATCAAACCATATCT. GAGCAGATCAGCCTTGAACT 3186 259 0 AATGATATTTTCTTTGGTCAAATAAATAAT......ACAAGAGAACCCGG 2633 i I I I I I1 1 1i I 1 1 1 I l 1 3187 AGTTTCAAAGGCAGTTATCTAGACAGTGATGGTACCCCTAAATCACTGTG 3236 2634 AATTTCATATTGTAAATTAAACAAAACTATGGTTCATATTTCTATGAAA 2683 i H Ii1 1 1 1 1 1111111 1 11111 1 3_^- AGATCCAACTGCTTTAAAATCCCTTCCAAATAGTTCAACTACCTATGATA 3286 -2- - CTTTCTGAATGAT-- CGATTATCGTTGTTGGGAAATGGTCAATTTGTA 2733 ! I Il I i I I I I I 1 1 3227 CCAATCCTACCCTCTC-ACCCTCCTTCCAACTCTACCAACCCAACAAGGTG 3336 273- 4 AATAACTTATCTAACCAAATTTTAACTAACAATTTAGCTAATTTATTAGT 2783 HI 1 I I I 11111I11 I i iI 1 3-37 AAGGCTTACCAAACCACTAACACCTACAACAAGTTAATTGAACCAGTTGA 3386 2-84 TCAAGTTAATTTATCAACTGTTACAGGAAATCCATTGGACTCTAAATCAA 2833 I I I 1 11111 1 1 I i1 I 111 232- TCCAACAAGTGCAGCAACTAACAT-ACCAGTTTGTTAAAACTCCTAACAA 3436 2234 CTATAAGAATTGTA..AAAAATCAATTTTTGAATGAGGTATTCCAAGTTA 2881 ii l Il1 1 I1 1 I li 1I iI Il 1 243- TCAAAAACATCAAAGCGTTGGAACAGCTTCTTCGCAGGGA 3486 2:: CAAAAAATCCA........ TAATTGAAGGATCTACACCAACATATGGTC 2923 i I I II I I1II IIII11 1I i 3-; 4.- TA.TCAA-GAGGGGTG-TAG-TAAACGATTAACACCATCACCACTAC 3536 - ^_4 irAGTA. r.ATGTCGCATCAA ATGTAGATTTTGTTTCTCAATCTGCAA 2971 ili Ili i I 11 1 I I 1111 1 111 _. SG; AAATATTAGTGAAGGTCTAAAAGAAGAkACTAGTATTCAAGCAGAAA 3586 29- iATTTACAGCATACTC.TGAAATAGTTTAACTAAAAATTATGATGTAATG 3021 1 1 1 1 1 1 1 1 i l 1 iI l i1 i 1Il i -- C ATTA. AAAAGTTCmTTGATAGTAAACAAAACAATAAGAGTGAAATA 3633 -- _ _ CAA.GAACGAATAGTTCTAAAATTAGATGTTATAAATAATTCTATTTTTGC 3071 tI lilil I i il Ilil I I *-34.GG;TAGGTGATAGTACATTTACCAAGATGGATGGTAAACTAACTGGCGT 3683 7- - TGGATTTAGTGCAATGGCTGATTGAATTCTTCCTGTAGTTATTGCTATTC 3121 I I II li I Ii III 1i I 1 I11 i 364 -GTA-TCTACTCCCCTTGTTAACCTTATCAATGGCCAGGGAGCAACTAGTG 3 7 3 3 _:::_ A-TTGTMTTAGTTGCATAATAATTGGTTTAGGTTGCAGTATTGGGATT 3171 :I I i II l Ii i 111 i I1 2ATGTGATACTGAAAAAATTAGCTTTAAACCTGGTAACCAGATT.GACTT 3782 3 72- CTAATGGCTAAACATAAAAAAGCTTATTAAAGTTGGTTTTGAATTGCAACA 3221 Ili l il 1 li I i l i 11 i1 703 TAATAGCTTATTCArCCTTACCAGTAACTGAACTATTTGATCCTAACACGA 3832 2 r GATAAAGTTGGAACATTGACTTCAGCTGTTGGTGGTGTTTTCAAAAAAA 3271 iI I 1 11 1 1 il il 1 1 1 3'23 TGTTTGTCTATGACCAGTATGTACCACTATTGGTTAACTTACCTAGTGGC 3882 Figure 3 A (suite 3) (v amTns) V C aanB!T Z 80 ' DD> 3L99E9L9L3LLLL9V9DVDDDL99L3DDV'ZLL93 E E O II I 11111I l ú0. V.Y.DL.D.D.D..Y.DDDDJDDY9DY.D.V.DjD V L9DDY DDDDDúL ú86ú II IIlIIl IlII II I gI'vE DDVD DDVDDDDDDjDD. DúDLV D 'fJ. ú9 úú[ ZE 8 6 E VVDD DDDDVDLVVDLVDLDVDú 6E I I1 1 11I II11 11l I 1 ZE E DVDúDDDDVET EE E E 6ú VV DV3YTDVDD V9'DD 9DDDDLV DLLDDV"YLDJNDL EB[ do I I 11I I III 11111 I I1 ETEE VDDVVLD L9DJDL9LL9LVLDJéLVVDVJNDLLVXLJ ELEE 0.690.E A; 'ZZ Ga: Weigh:: 5.000 Averaae Macch: 1.000 =..i.n Weicht: 0.300 Average Mismatch: 0.000 Qualzy: 1054.7 Lenath: 4901 PR. a:io:0.307 Gaps: 32 ^r:en Smi'ari._v: y37.215 Percent Identiny: 37.215 :.....TGAAAAA'ATAAAATTTAACTATAAATATTTATTGATTTCTTTG 45 l! l 1 ll! '! I I l - ^--^AATG-TTGG2TTGAAGGTGAAGAACGCC;AGGCGGACACCGCGAAG 750 4C T7 AGCACAACAATTGTTAGTGCTGCTGCAATTAGTTTATATAGTACTTT 95 ! I I I1 l1 ll! I I tIII I I II! -[ -.A-.^ATGAAAAACTC-AGGG-CGTGAGGCúACTGGTTCTTCAACCACATC 800 7 AAAAAGATCAAATTTCTAATCCTATTALTTAATCAAAATGTAA. AAAG 143 I I I I I I! I I I I I 11i l z_ ?SrAGGCCAATCCúACCCAACGTGGGGGTTCGTCAGGGGACACCAAAG 850 Figure 3 B 144 TTTTTCAAATCCAAGTATTGTTGGTAATAAAGTAGGTAAAATCCGACATT 193 I 1 l Il I I I I I I 1i11 I 851 TCAAGGCTTTAAAAATAGAGGTGAAAAAGAAATCGGACTCGGAGGACAAT 900 194 G.............ACAAAATAATAATTTTAATGGTGTTGAAATTAAAAA 230 i 1 1 I 1[IlH 1 1 1 1111 - GGTCAGCTGCAGTTAGAAAAAAATGATCTCGCCAACGCTCCCATTAAGCG 950 2^, TGGTGGTTTTGTTGTATTAACAAGTACACAAAGTGCAACAAGAATTGATG 280 I [ I I1 I 1 111 I 951 GAGCGAGGAGTCGGGTCAGTCCGTCCAACTCAAGGCGGACGATTTTGGTA 1000 281 CATTTGGAAATATATTATGA.GAATTTGATCCAGAAAAAATAGCATCTGA 329 I I I I I I I I I 1001 CTGCCCTTTCCAGTTCGGGATCAGGCGGCAACTCCAATCCCGGTTCCCCC 1050 330 AGATAGTCAATATGCAAATTTAGCAGGCAAAAAAGTTGTTGAAATAACTC 379 II H I I 111 1 I I I - AC2CCTGAAGGCCGTGGCTTGCGACTGAGCAAATTCACAAGGACCTCCC 1100 380 AAG.TGAGGGTGATAATTCTAATATTCTTTATTTATTGTTGATACCAAAA 429 H!II I, II I I I I II I I _01.CAAATGATCCGCCTCGATCCTGATTCTGTACGATGCGCCTTATGCGCGCA 1150 43,0 AA.ACACCCGATAAACAAGCATCTA.....TAGATCCAAAAGATCTTTAT 474 [11H Il I I I 11111 I I I 1151 ACCGT'ACCGCCATTGACCGCGTTGATCACTTGGATCCCAAGGCCATGACC 1200 GCAATAATGAATTAACAGGAAGTTCAAAAAGCrACAACAAGCAACTGT 524 i I I Il I 1111 I I I II I _ GIG.ACTATCCGCCCAGTTGAAGAACGCCCAAGTGAAACCACCACGGTTT 1250 ^525 TGTTrAAATAATTGAAAATGTTAATTTATACCAAGGAA....GCACTTGA 570 Ii Il I I I I lI I l I I I 1 I I 1251GTGGACTGAAAGGCGCGCGATGTTTTGCTCCAAACCACCGGGTTCTTCA 1300 r71 ACTZTTCATTTACAATTAAAGGATTA'ATGCATATTGATCCTAAAAAAAT 620 ! I I II I II I II I[I l I I I Il 12C..Z.2GCGCCGCCACCCCGAGTGGTTTGATGGCGGGCAGACGGTCGCGGAT 1350 62^ G sTTGATAATTATCCAAATCAATGAAAATCTTCTCAATCATCATCTACAT 670 I I 11 I I I 11 11 Il I i AA- GAAAAGACCGGGTTTGATGTGGATAACTCTGAAAACACCAAGCAGGG 1400 671 TTTTACAAAAGAAGATCATCCATCTTGATATGTAGCTAATAATTCTGAA 720 i!I II I I I I Il I II I 1401 CTTT-CAAAAGGAAGCTGACTCC..... GACAAGTCGGCCCCGATCGCCCT 1445 72 AA.AGTACACAACGATGCTGATCAAAATACTAATCAATACAATGGTTTAAA 770 H I il I Ili Il I I il I I 144'6 C--CGTTGAAGCGTACTTCGCCAACATTGGCAACCTCACCTGGTTCGGGC 1495 Figure 3 B (suite 1) 771 AAGTGCTAATATGGTTTTGCCGTGAAAACAATATATTACTAATTTGGGTA 820 I iI I I Ii lI I I I I! I I II IIII I 1496 AAGCGCT. TTGGTGTTGGTGGCAATGGCCATGTTACCAAGTCGGCCC 1543 821 ATATGTTTGCTAAAAATGGTATTGTATTAATTTTTGGTGGCAATGGTTC 870 I I l IIII I I II I I I 1.111 1 l 1544 ACACCGCGCCTTTGAGTATAGGTGTCTTTAGGGTGCGCTATAATGCAACT 1593 871 ATATACAATGATCCTGAAGCT..................TTAAGTATCGG 902 il I I III I 1l1 I Il 1594 GGTACCAGTGCTACTGTAACTGGTTGACCATATGCCTTACTGTTCTCAGG 1643 903 AATGTGAAAATTAGATTTTTTAAAACCATATTCTGGAAATATTGATAATA 952 Ill Il I I I I I I I 11 1111I 1 644 CATGGTCAACAAACAAACTGACGGGTTAAAGGATCTACCCTTTAACAATA 1693 953 ACCAAAATTATGGCGGAATTCC............TTATGCTTATTTATTA 990 III I Il I II I I I 11 1694 ACCGCTGGTTTGAATATGTACCACGGATGGCAGTTGCTGGCGCTAAGTTC 1743 991 AGATATTTAAGATATGATCCATCAAAACCACTTTTGGGAACTAGTGCACC 1040 I I I I II I I I I I 1744 GTTGGTAGGGAACTCGTTTTAGCGGGTACCATTACCATGGGTGATACCGC 1793 1041 AAACCGACGTTGAAATCAATCATATGCTCCTATTGGACAAACTGATAATT 1090 I I 111 1 1 I III I I I I 1794 TACCGTACCTCGCTTACTGTACGATGAACTTGAAAGCAACCTGAACTTAG 1843 1091 TTACATATGTTCCAAGATTAGCAGTTGGCGGTGTTCAAATTAATGCTTCA 1140 I1 I I I I I I I I 11 1 1 1 1844 TAGCGCAAGGCCAAGGTCTTTTACGCGAAGACTTGCAACTCTTCACACCC 1893 * 1141 ACTGATGAAGCTACTTATTTATATTTAGC.TGCTGGAATTACAGTAGGAC 1189 I I H I I I [1111 I I I I1 11111 I 1894 TACGGATGAGCCAATCGTCCGGATTTACCAATCGGGGCTTGAAGTAGTAG 1943 1190 AAGCA.AAGAATCACAAGCTCGTGAAGTTATTAGTAATAGCAACACTTCT 1239 Il I III I I I II I I III 1944 TAGTAGTAGTAGTCACAACGCACCCTACTACTTCCACAATAACCCCGATT 1993 1240 ACTAATAAAGTTGTTACTAAAmATTCAAGATAAACGTTCATTGCAGTTAAC 1289 Il 1I l 11111 1 1 Il III 1994 GACAAGACCGTCCAATCCAAAATGTGGTTGATGCCTTTATTAAGCCCTGA 2043 1290 AGGTGCCAATACTATTACTAACACAAAAGATACAGCAGCTAATTCAATTG 1339 I I 1 i I 1 1 I I 1 111 i 11 I I 1 Il 2044 GAGGACAAGAACGGTAAGGATGATGCCAAATACATCTACCCTTACCGTTA 2093 1340 ATCCAGCTTTATTATTTGGCACAGCTTTTAATATTGATTCATTAATTAAT 1389 III 111 Ii I1 1 I I II 1 1 1 2094 CAGTGGCATGTGAGCTTG..ACAGGTATACAACTGGTCCAATAAGCTCAC 2141 1390 TTACCAACAACTAAAT..........TAAATGAAAATTTAACTATTTTTC 1429 1 I11111 I1Il1 1 1 M11 IIII 2142 TGACCAACCATTAAGTGCTGACTTTGTCAATGAGAATGCTTACCAACCAA 2191 Figure 3 B (suite 2) 43 A A.AA TG- TT-TAGAGT - TTTGATGTTGGTGCAACAATGAGT 1479 Illi ' ' I I I I lII I 21c2 ASTCTTGTTTG2TGLTATTmT. ATCCGGAA TTGTTAGCAGCTCTTCCC 2241 1480 GTGTCTTCTGCAGTTGGTACTT A.TT ATTA TTTGArTAAGAAAATCATGC 1529 i I I 11 1 1 1 1i I Il I 1 1 2242GACAGGTTAAkTACGGTAAGGAAA.ACGAGTTTGCTGCTAACGAGTACGA 2291 1530 AAGTTCATCGACAACAGATAT1AATACATATACAACAGCCTCAAATGGTT 1579 Ii Ii I III 111 1 I 1 2292 GCG^CTk.A.-CAGAA GTTAACGGTAGCTCCTACC2AAGGAACAAACTGAT 2341 580................GZATATTTAGGTAGAACTGC.TTTTCCATGAAG 1613 I I t I I I I 1 1 I I I -342 C. rACTTCTCCCCCACGCTTTCCCGTTTCTCCACCGGGTTCAACCTTGTG 2391 1614 TTATAAACCrACAATGATATAGGAAGTATATTTCAACCAAAAACTAATG 1663 I I I I i11I I I I I 2392 GGGTCGGTGCTCGACCAGGTGTTGGATTATGTGCCCTGGATTGGGAATGG 2441 1664 ATAArMTAATAATGCAACTTATTCATACAATTTAAGTTTATTAATTGAAAAT 1713 Il I1 1111 I I 1 111 1 2442 GTACAGGTATGGCAATAACCACCGGGGCGTGGATGATATAACCGCGCCTC 2491 1714 GCAATAAATTATTATTATTCAACATTATCATT........TGGTTATTCA 1755 I I I I 11 I III I 11 III 2492 AAACCAGCGCGGGGTCGTCCAGCGGAATTAGTACGAACACAAGTGGTTCG 2541 1756 CTTAAATGTCTTGGTGGATTAACTAAAATTGAAATGCCAAGTAAAGAAAA 1805 I I IIll II I 1I III I III It 2542 CGTTCCTTTCTCCCGACGTTTTCCAACATCGGCGTCGGCCTCAAAGCGAA 2591 1806 TCCAGAAAATACAATTTATGGATAT......GCTATGCAAGTTGGTAAAT 1849 i 11 11 I il 11 II II1 2592 TGTCCAAGCCACCCTCGGGGGCAGTCAGACGATGATTACAGGCGGTTCGC 2641 1850 CAATAGTGTATTTAAATGAACCTAAATCAGATTTAAGGAGTATTGCATAC 1899 I I I I I I I I I I H1 2642 CTCGAAGAACCCTCGACCAAGCCAACCTCCAGCTCTGAACGGGGGCGGGG 2691 1900 CATGGACCATCATCAATATCGATTGGAGAAAGTAATTTAGTTGGATCCGC 1949 1 I I lii 11111I I I1l 2692 TGAAGGAATGATAAGGCTTCAAGTGGACAAAGTGACGAAAACCACACCAA 2741 1950 AAAATATGGAGATATGG...ATTATCCATATGTAAAAATAAATAACTCAA 1996 I 1 11 11 1 II 1 1 111 I 11 111 2742 GTTCACGAGCGCTACGGGGATGGACCAGCAGGGACAATCAGGTACCTCCG 2791 1997 ATATTGGTTATGTTCCATCAGATTATTCTAATATCACAAATAATATTATT 2046 I I IIII I I llll 11 1 I 2792 CGGGGAATCCCGACTCGTTAAAGCAGGATAATATTAGTAAGAGTGGGGAT 2841 2047 AATACA............GGTGTCGCTATATATGTAACAGGAATTAAAGA 2084 II I I 1i 11 II I 11 I I 2842 AGTTTAACCACGCAGGACGGCAATGCGATCGATCAACAAGAGGCCACCAA 2891 2085 TTTTAATGATACTATTCCAACTATTGC........TTCACAATTTGAAAT 2126 I I I I I I I II III 2892 CTACACCAACCTCCCCCCCAACCTCACCCCCACCGCTGATTGACCGAACG 2941 Figure 3 B (suite 3) 169EYL Z79ú II 111111 1 111 11 i II IlIIi III I I II L 88 Z LèLDVV '3Y4LD3LDVLLVD DD3LV993LDvvDJE3vI,:yT 06 OLE I 1I I II llI IIII I I I Il111111 1 1111 1 111 68 L Z L T L LE 1 6 S E E Sú III 111 II II I I 6úLZ DrLYLLLEL9Tw9L9L9YL9L9lyyyDID 06-nZ .v..... IT >S E DDV99 Z6 E6 E IIIlII IlIl I IIII 1 1 1 1 1 1 I lI 11 I 689Z LLY9T9Y9LYL3L9Y3TY9YYLTLLYY09c 6 E 9 E 0O6Z I. I I11 I1 11I I 1 16 EE DDDID Z6Z E 6 ESD3DV DVD -DV,.D'DDúVD.......... D [66[ 6 t, E6 IH I 1 1 II i I I o.. .. 16úEúE 9DDDDDDDDDDDLDDJ.DOYDDvDD D D y LE3LLs L E6E ú..... 11111il11i lIlIl 1 I0II.LIIIIiI IIDIII I 161 E DDDDDDD E IE i> E..... . III11 11 1 1 1 1 1606E 31 -:Dj DEy IIiI 111 1111 1 1 - 1> 1ú99L6904a9YLO33LDv7D 2838 AAGTTGTAAAAATCAATTTTGAATGAGGTATTCCAAGTTACAAAAA 2887 Il1i I I 1l I I ll I 1 3692 CCCrA. TCCACTAACAGTTCCCCCTACCTGCACTTGGTGAAGCCTAAGAAA 3741 2888 ATCCAATAATTGAAGGATCTACACCAACATATGGTCCAGTAATTATTGTC 2937 1111 I I 1 i11 I l I I l1 I 3742 GTTACCCAATCCGACAAGTTAGACGACGATCTTAAAAACCTGTTCGACCC 3791 2 938 GCATCAAArTGTAGATTT'TGTTTCTCAATCTGCAACATTTACAGCATAC.. 2985 III I I 11111 1 1 1 11 1 792 CAACCAGGTTCGCACCAAGCTGCGCCAAAGCTTTGGTACAGACCATTCCA 3841 2986.... TCATGAAATAGTTTAACTAAAAATTATGA.TGTAATGCCAAGAACG 3030 I I I1 Il I i I1il I I III 3842 CCCAGCCCCAGCCCCAATCGCTCAAAACAACGACACCGGTATTTGGGACG 3891 3021 AATAGTTCTAAAATTAATGTTATAAATAATTCTATTTTTGCTGGATTTAG 3080 11111 II1 I I I Il II I 1111111 1 3892 AGrTAGTGGTAACCTCAGTAGTGTGCTTAGTGGTGGGGGTGCTGGAGGGGG 3941 _ ' LTG ATGGCTGATTGAATTCTTCCTGTAGTTATTGCTATTCCCATTGTAT 3130 I I I I I 1 I III il 1 11 1 2-942 TTC...TTCAGGCTCAGGTCAATCTGGCGTGGATCTCTCCCCCGTTGAAA 3988 313 TAGTTGCAT TTAATAATTGGTTTAGGTTGCAGTATTGGGATTCCAATGGC. 3179 1 I I I11 11 I 11111 I I l1 -' '..... ATGAGTGGTGGCTTGTGGGGCAGTTACCAAGCACGAGTGACG 4033 cr.A.. AT 322 3180 TAAACATAAAAAAGCTATTAAAGTTGGTTTTGAATTGCAACACG....AT 3225 1111 Il 1 1 I11i 11 111 Il 434 GC 3 GAAACACCTCCTCCACCAACAACCTCGCGCCTAATACTAATACGGGGAAT 4083 226 AAAGTTGGAACATTGACTTCAGCTGTTGGTGGTGTTTTCAAAAAAATTAT 3275 1iii i I I I I Il I I 11111i 1 4084 GATGTGGTGGGGGTTGGTCGACTTTCTGAAAGCAACGCCGCAAAGATGAA 4133 3276 TGACAATACAAATTCTAATAATGTGAAATCTAAACCACAAATGCTTAAGG 3325 lll 11 Il fI l 1 1 I 11 111 I 4134 TGACGATGTTGATGGTATTGTACGCACCCCACTCGCTGAACTGTTAGATG 4183 3326 CTGCAGCTAAAAAACCAAATACAGTTCCAC.... CTGCTAGATCTCAATT 3371 I 11 111 1 i I 11 1 11111 1 11 11 1 4184 GGGAAGGACAAACAGCTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAAGTTCAAGTCT 4233 3372 AACAAATGATTCTGTTTCTAGACCCACTCCACCATCATCTGCTCCAAAAC 3421 I I I II1 I I I III I I Il I 4234 CCTGACCAAATTGACTTCAACCGCTTGTTTACCCACCCAGTCACCGATCT 4283 3422 CACCAATAAAATAA.................................... 3435 Il III 4284 GTTTGATCCGGTAACTATGTTGGTGTATGACCAGTACATACCGCTGTTTA 4333 Figure 3 B (suite 5) Gaz Weight: 3.000 Average Match: 0.540 Lengt; h Welght: 0.100 Average Mismatch: -0.396 Quality: 472.8 Length: 1506 Ratio: 0.413 Gaps: 46 Percent Sirmlarity: 46-168 Percent Identity: 26.408 1.....MKKTKFNYKYLLISLVSTTIVSAAAISLYSTFNKDQISNPIINQN 45 -: I.::I. I... I.:.::.1:. 11:. I.:.. 1 MHQPK:KRLAKKSWAFLTAALTLGVITGVGGYFLFNQ.NKQRSSVSNFAYQ 49 46 VKSF-S..NPSIVGNKVGKIRHWQNNNFNGVEI..KNGGFVVLTSTQSAT. 90 1:I:. 1::.:..: I.IIII.::.I.I.I..I...I... PKQLSVKHQQAVDETLTP.WTWNNNNFSSLKITGENPGSFGLVRSQNDNL 98 91................................. RIDAFGNILWEFDPEKI 107 1. 1. 1. 1::::.-1: 99 NISSVTKNSSDDNLKYLNAVEKYLDGQQNFAIRRYDNNGRALYDINLAKM 148 108.........................ASEDSQYANLAGKKWEITQDEGDN 132 :....::.:: II.I1:.1.... 149 ENPSTVQRGLNGEPIFDPFKGFGLTGNAPTDWNEIKGKVPVEVVQ.SPHS 197 133 SNILYLLLIPK.................NTPDKQASIDP........... 154 À.1:-::11:11:....1.1::1 198 PNLYFVLLVPKVALEYHNLNNQVVKESLEVKATQSSFNPTQRLQKDSPVK 247 155... KDLYAYNELTGSSKSKQQATWVQI....................... 178 1:..1 1:11I.1.. Il.. 248 DSSKQGEKLSETTASSMSSGMATSTRAKALKVEVERGSQSDSLLKNDFAK 297 179.I.......ENVNLYQGSTWTPSF........................... 194 ::I.I.:..:I..: 298 KPLKHKNSSGEVKLEAEK-EFTEAWKPLLTTDQIAREKGMGATVVSFYDAP 347 195.....TIKGLM.HIDPKKMVDNYPNQWKSSQS................SS 222 - I 11: IIIII1111 II:il.... 348 YSENHTAFGLVDHIDPKKMVENYPPSWKTPKWNHHGIWDYNARNLLLQTT 397 223 TFFTKEDHPSWYVANNSEKVH.......NDADQNTNQYNGLKSANMVLPW 265 11.. 1.1I:......1:..:.:.. I.:.I1: 398 GFFNPRRHPEWFDEGQAKADNTSPGFKVGDTDHKKDGFKKNSSSPIALPF 447 266 KQYITNLGNMFAKNGIVLIFGGNGSIYN..DPEALSIGMWKLDFLKPYSG 313 1I:.I:111 I.1I.I:111111 iI..::11II1I::::.:.:1I 448 EAYFANIGNMVAIGNSVFIFGGNGHATKMFTTNPLSIGVFRIKYTDNFS. 496 314 NIDNNQNYGGIPYAYLLRYLRYDPSKPLLGTSAPNRRWNQSYAPIGQTDN 363 1 III 1: I.....I :....I1 497....KSSVTGWPYAVLFGGLINPQTNGLKDLPLGTNRW............ 530 Figure 3 C 364 -FTYVPRLAVGGVQ. NASTDEAT'YLAAGITVGQAK... ESQ 402 I.I III1:11:1 i..:.. I.!::.. I[I..I,.I 531 Fr'EYVRMAVSG'VKWVGNQLVLAGTLTMGDTATVPRLKYDQLEKHLNLVAQ 580 403 AREVISN..........SNTSTNKVVTKIQDKRSLQLTGANTITNTK.DT 441 :.:::.:.I .. .I...: I-..:.:-.:.I..:. 581 GQGLLREDLQIFTPYGWANRPDIPVGAWLQDEMGSKFGPHYFLNNPDIQD 630 442 AANSIDPALLFGTAFNIDSLIN....................LPTTKLNE 471 I.... I::. I I[.I.: I..I. I.. 631 NV'NNDTVEALTISSYKNTDKLKHVY'PYRYSGLYAWQLFNWSNKLTNTPLSA 680 47-2 NLTIFQNVFQYESYFDVGATMSVSSAVGTYYYFDKKNHASSSTTDINTYT 521 1:::I:.:1.1....:.:.:::..I...... I 681 NF.VNENSYAPNSLFAAILNEDLLTGLSDKIFYGKENEFAENEADRFNQL 729 522 TASNGWNNLGRTAFPWSYKPNNDIGSIFQPKTNDNN..NATYSYNLSLL. 568 I. I.:.:. :. 1I.I.:I..1I:. I.: 1I 730 LSLNPNPNTNWARYL..........NWVQRFTTGPNLDSSTFDQFLDFLP 769 56. -. v..... 569.I-NAINYYYSTLS.FGYSLKCLGGLTKIEMPSKE...... NPENTIYG 609 1:1:: 1.-: I ..1..:..1::. 1. 1.111:. 770 WIGNGKPFSNSPSPSTSASSSTPLPTFSNINVGVKSMITQHLNKENTRWV 819 610 YAMQVGKSIVYLNEPKSDLRSiAYHGPSSISIGESNLVGSAKYGDMDYPY 659 :.:.. I. .:. I.:-..:I.:::..... I: 820 -_PNFSPDIW.... TGAGYRVQSANQKNGIPFEQVKPSNNSTPFDPNSDD 865 660 VKiNNSNIGYVPSDYSNITNNiINTGV...AIYVTG..........IKDF 696 I:.I..: I..1I..:.1.11: 1:.1..::.: 866 NKVTPSGGSSKPTTYPALPNSISPTSDWINALTFTNKNNPQRNQLLLRSL 915 697 NDT:PTIASQFEIGNSPYEDNSS........................... 719 :1I I I.:..:: I..::.:[- 916 LGTIPVLINKSGDSNDQFNKDSEQKWDKTETNEGNLPGFGEVNGLYNAAL 965 20.......TTKTNGTLQPTIPW........................NDFVG 738 1.11:[:1.1.:.::1. 966 LHTYGFFGTNTNST.DPKIGFKADSSSSSSSTLVGSGLNWTSQDVGNLVV 1014 739 LNSTNFNSEISSLWLNNNQTKTNNNEHFIVTKSPEISEYYGNAIWTERFY 788 :I.I.I.:::::::...: .:.:: I I..: I.:.: 1015 INDTSFGFQLGGWFITFTDFIRPRTGYLGITLSSLQDQ...TIIWADQPW 1061 789 YNYGSSNNADWKGSKRAWFEVKDSNSLSNSSTTVGWQVGLDSNL...... 832 À::1 I..I..:.:::....11.1111 1:..i...: 1062 TSFKGS.YLDSDGTPKSLWDPTALKSLPNSSTTYDTNPTLSPSFQLYQPN 1110 833.........TADSYYVQKNNEQPQGDFDVLLR..............TRDD 859 I:....:..:..::. II: I.. 1111 KVKAYQTTNTYNKLIEPVDATSAATNMTSLLKLLTTKNIKAKLGKGTASS 1160 860 TQKNNDIFFGQINNTREPGISYCKLKQNYGSYFYETI.....SEIDRLSL 904 -..11:.:1. Il.........:..:.1. i1: 1.:. I 1161 QGNNNGGGVSQTINTITTTGNISEGLKEETSIQAETLKKFFDSKQNNKSE 1210 Figure 3 C (suite 1) 905 LGNGQFVNNLSNQILTNNLANLLVQ.VNLSTVTGNPLDSKSTIRIVKNQF 953 :I 1:..:. II.:.. il.:I.-I::...I.::... 1211 IGIGDSTFTKMDGKLTGVVSTPLVNLINGQGATSDSDTEKISFKPGNQID 1260 954 LNEVFQVTKNPIIEGST....PTYGPVII.VASNVDFVSQSATFTAYS.. 996 :I:1:...:::..I À I-i:::::1..1.i.....it 1261 FNRLFTLPVTELFDPNTMFVYDQYVPLLVNLPSGFDQASIRLKVISYSVE 1310 997 WNSLTKNYDVMPRTNSSKINVINNS......IFAGFSAMADWILPVVIAI 1040 1...:..... I 1:1.1:1..1.. I1::11:::.: 1311 NQTLGVRLEFKDPQTQQFIPVLNASSTGPQTVFQPFNQWADYVLPLIVTV 1360 1041 PIVLVALIIGLGCSIGIPMAKHKKAIKVGFELQHDKVGTLTSAVGGVFKK 1090 11I1:: 1:.11.11111::111:..11:1:.11:o1.1.I1:tl I. 1361 PIVVIILSVTLGLTIGIPMHRNKKALQAGFDLSNKKVDVLTKAVGSVFKE 1410 1091 IIDNTNSNNVKSKPQMLKAAAKKPNTVPPARSQLTNDSVSRPTPPSSAPK 1140 l il:.I..I. I.. 1l1I.I....l I..: l1 1411 IINRTGISNA.. PKKLKQATPTKPT.................. PKTPPK 1439 1141 PPIK.. 1144 1:1 I 1440 PPVKQ. 1444 Figure 3 C (suite 2) q q 2705970 Gap Weight: 3.000 Average Match: 0.540 Length Weight: 0.100 Average Mismatch: -0.396 Quality: 453.0 Length: 1670 Ratio: 0.396 Gaps: 53 Percent Similarity: 46.915 Percent Identity: 25.771 1...MKKIKFNYKYLLISLVSTTIVSAAA......ISLYSTFNKDQIS... 38 Il:.. ::: I..I.:..:.1 .1:.::1:1 1 MHQTKKTALSKSTWILILTATASLATGLTVVGHFTSTTTTLKRQQFSYTR 50 39........NPIINQNVK.......SFSNPSIVGNKVGK...IRHWQNNNF 70 iII..:. II I..:. I:.. I: 1I....: 51 PDEVALRHTNAINPRLTPWTYRNTSFSSLPLTGENPGAWALVRDNSAKGI 100 71 NGVEIKNGGFVVLTSTQSAT.........RIDAFGNILWEFDPEKIASED 111 :...... I.1:.I I.I I. 1:::1.1:..:. 101 TAGSGSQQTTYDPTRTEAALTASTTFALRRYDLAGRALYDLDFSKLNPQT 150 112 S........................QYANLAGKKVVEITQDEGDNSNILY 137 * - I:.::. I. II:. II.: I.: 151 PTRDQTGQITFNPFGGFGLSGAAPQQWNEVKNKVPVEVAQDPS.NPYRFA 199 138 LLLIPKN.................TPDKQASIDPKDLYAYN......... 161 :11:1:. I.. I.....:::.. 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