Brevet FR2700777A1 — publié le 19940729

POLYPEAVNDES A ACTIVITÉ AMIDASE, OUTILS GETIQUES ET MICRO-ORGANISMES HÔTES PERMETTANT LEUR OBTENTION, PROCÉDÉ D'HYDROLYSE METTANT EN OEUVRE LESDITS POLYPEPTIDES Le domaine de l'invention est celui de la production enzymatique de dérivés carboxyliques (carboxylates) à partir de composés contenant des groupements amides. La présente invention concerne de nouveaux polypeptides présentant une activité amidase, le matériel génétique impliqué dans leur production, ainsi que les micro-organismes contenant ce matériel génétique et présentant cette activité. L'invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides en carboxylates dans lequel on met en oeuvre ces nouveaux polypeptides ou des micro-organismes les synthétisant, dont, notamment, les susdits microorganismes hôtes. Sans que cela ne soit limitatif, les amides, auxquels on s'intéresse plus particulièrement dans le cadre de l'invention, sont : le cyano-5 valéramide, l'adipamide ou l'adipamate d'un cation quelconque, de préférence choisi parmi la liste de composés suivants: alcalins, alcalino-terreux, amines, ammonium, ce dernier composé étant particulièrement préféré. Le but visé est la transformation enzymatique des fonctions amides en fonctions carboxylates, de manière à obtenir in fine l'acide 5-cyanovalérique, I'acide adipique ou des sels de ceux-ci, e. g. : 5cyanovalérate d'ammonium, adipate de diammonium. Tout l'intérêt industriel des adipates, et en particulier, de l'adipate d'ammonium, réside dans le fait qu'il constitue l'une des bases fondamentales pour la fabrication du nylon-6,6. S'agissant des 5-cyanovalérates, ils sont susceptibles de constituer des produits de départ de choix, pour la préparation de caprolactame, donnant lui-même accès au nylon-6. L'action de ces amidases s'intègre dans un schéma connu de synthèse enzymatique d'adipate de diammonium, à partir d'un dinitrile, à savoir l'adiponitrile. Ce schéma est le suivant: NH = nitrile hydratase, Ni= nitrilase, A= amidase, R = (CH2)n, n étant un nombre entier égal à 4 dans le cas de composés adipiques. Un tel schéma est resté pendant longtemps uniquement d'intérêt thérorique, car on ne connaissait que l'amidase à activité générale de Brevibacterium R 312, décrite notamment dans les articles suivants: - ARNAUD et al., "Etude de l'activité amidasique de quelques bactéries", FOLLI MICROBIOLOGICA, 1976, 21, pages 178-185, - MAESRACCAT et al., "Utilisation d'une amidase à activité générale pour la bioconversion des amides en acides organiques", Microbiologie - aliments nutrition, 1986, vol. 4, pages 19-24. Selon ces auteurs, une telle amidase est apte à hydrolyser l'adipamide en acide adipique (ou adipate d'ammonium). En fait, il a été démontré, par la suite, notamment par la Demanderesse, que l'activité, vis-à-vis de 1'adipamide, de cette amidase à activité générale est extrêmement faible, voire nulle et ce, que l'on utilise l'enzyme issue de Brevibacteflum R 312 ou celle issue d'un micro-organisme recombinant comprenant le gène d'expression de cette enzyme. Cette absence d'activité enzymatique de l'amidase à activité générale se vérifie, également, pour les substrats amides se présentant sous forme de sels solubles dans l'eau. La faisabilité industrielle de la synthèse enzymatique d'adipates, en particulier de diammonium, ou d'acide adipique à l'aide d'amidases n'a pu être envisagée qu'à partir du moment où la Demanderesse a pu mettre en évidence des polypeptides exprimés par Brevibacterium R 312 et Rhodococcus et caractérisés, notamment, par une activité amidase, dite énantiosélective, c'est-à-dire qu'ils sont capables d'hydrolyser énantiosélectivement des racémiques d'amides en un acide, soit de forme S, soit de forme R. Cela concerne particulièrement les aryl-2 propionamides et les aryloxy-2 propionamides racémiques. En isolant, purifiant et caractérisant ces amidases "énantiosélectives", il a été possible de proposer un procédé de synthèse enzymatique d'adipate d'ammonium présentant des rendements améliorés. C'est ce que décrit la demande de brevet FR 90-14 853. Outre ces nouvelles amidases, cette demande de brevet décrit également les outils de génie génétique pour les produire: séquences d'ADN, recombinées ou non, cassettes d'expression portant cette séquence et micro-organismes naturels ou recombinés contenant ces cassettes d'expression. Bien que constituant un progrès technique notable, ces amidases "énantiosélectives" souffrent, néanmoins, d'un handicap, déjà signalé pour les amidases à activité générale,- qui est d'avoir une capacité d'hydrolyse des amides se présentant sous forme de sels solubles dans l'eau, e. g. adipamate d'ammonium inférieure à celle qu'elles ont vis-à-vis des amides insolubles dans l'eau, tels que 1' adipamide. Or, il est bien connu qu'une telle propriété de solubilité des substrats est tout à fait souhaitable, au regard de l'amélioration de la faisabilité et de la rentabilité d'une synthèse enzymatique industrielle. Ainsi, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de proposer de nouvelles enzymes à activité amidasique, un matériel génétique permettant leur production et des micro-organismes contenant ce matériel génétique et permettant cette production, lesdits enzymes et micro-organismes se caractérisant, à la fois, par des rendements satisfaisants de production de carboxylates à partir de substrats de type amide de natures diverses (mono ou diamides) et par une activité amidasique, vis-à-vis des sels solubles d'amides, importante et industriellement intéressante. Après de nombreux essais et recherches, la Demanderesse est parvenue à atteindre, entre autres, cet objectif en isolant, purifiant et caractérisant de nouvelles enzymes aptes à hydrolyser les amides en carboxylates avec de fortes activités et en transformant, préférentiellement, des sels solubles d'amides, lesdites enzymes étant utilisées, soit telles quelles, soit, et de préférence, sous la forme de microorganismes recombinés les générant. La présente invention a donc pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité amidase, capables d'hydrolyser les amides en carboxylates et possédant une activité enzymatique vis-à-vis de l'adipamate d'ammonium supérieure à celle qu'ils ont vis-à-vis de l'adipamide. L'un de ces nouveaux polypeptides a été isolé à partir d'une souche de Comamonas testosteroni NI 1. Plus précisément, ce polypeptide est préparé par extraction et purification à partir de cultures de micro-organismes naturels ou recombinants, la purification étant réalisée par une succession d'étapes consistant à préparer un extrait enzymatique à partir de la culture cellulaire, à précipiter cet extrait avec du sulfate d'ammonium et à le purifier par différentes étapes de chromatographie et filtration sur gel. Ces étapes, qui font appel à des techniques bien connues de l'homme du métier, sont décrites en détail dans les exemples illustratifs ci-après. Par activité amidase, on désigne, dans le présent exposé, l'hydrolyse enzymatique d'un amide, tel que le cyano-5 valéramide, l'adipamide et l'adipamate d'un cation Z, en un carboxyle, à savoir, respectivement, le cyano-5 valérate de Z, l'adipamate de Z et l'adipate de Z. Le cation Z peut être quelconque, mais on le choisit, de préférence, parmi les composés suivants : alcalins, alcalino-terreux, amines, ammonium, ce dernier composé étant particulièrement préféré. Il est du mérite de la Demanderesse d'avoir pu isoler ces nouveaux polypeptides et d'avoir pu mettre en évidence leur utilisation préférentielle de substrats sous forme de sels solubles dans l'eau, tels que l'adipamate, par exemple d'ammonium, plutôt que de substrats non ioniques, insolubles ou faiblement solubles dans l'eau, tels que l'adipamide. Cette caractéristique se vérifie aussi bien pour les enzymes sous forme pure que pour les germes naturels ou recombinés exprimant ces enzymes. Parmi les polypeptides à activité amidase conformes à l'invention figure un polypeptide se caractérisant par la séquence peptidique, telle que représentée à la fig. 1. Un autre objet de l'invention est relatif à une séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une activité amidase, capable d'hydrolyser les amides en carboxylates, et choisie parmi la liste de séquences suivante: - la séquence d'ADN, telle que représentée à la fig. 2, et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase, - un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, - une séquence d'ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou un fragment de celles-ci et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase, Les polypeptides résultant de l'expression de l'une des séquences d'ADN ci-dessus sont compris dans le champ de l'invention. Le micro-organisme sauvage Comamonas testosteroni NI 1, isolé par la Demanderesse, contient l'une des séquences ci-dessus dans son génome. Conformément à l'invention, il a été possible d'accéder à l'identification de ces séquences d'ADNpar la méthode bien connue du clonage du fragment d'ADN génomique codant pour le polypeptide dont la séquence peptidique est représentée à la fig. 1, à l'aide de sondes nucléotidiques élaborées à partir du polypeptide purifié. L'invention concerne, également, les cassettes d'expression qui portent, avec les signaux assurant son expression, l'une des séquences d'ADN définie précédemment. Ces cassettes d'expression peuvent être, soit naturellement présentes, soit intégrées dans le génome de l'hôte ou localisées sur un vecteur d'expression, tel qu'un plasmide contenant, de préférence, un moyen de sélection. Ces cassettes d'expression comportent, notamment, des régions d'initiation de la transcription et de la traduction, qui contiennent une séquence promotrice et un site de fixation des ribosomes. Ces régions peuvent être homologues ou hétérologues du micro-organisme produisant naturellement le polypeptide. Le choix de ces régions dépend, notamment, de l'hôte utilisé. En particulier, lorsqu'il s'agit de micro-organismes hôtes procaryotes, le promoteur hétérologue peut être choisi parmi les promoteurs bactériens forts, tels que le promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp de Eschenchia coli, le promoteur de l'opéron lactose Plac de E. coli, le promoteur droit du phage lambda PR, le promoteur gauche du phage lambda PL, les promoteurs forts de Pseudomonas et Comamonas, les promoteurs forts de Corynébactéries. Plus particulièrement, dans le cas du promoteur droit du phage lambda, la forme thermosensible PRCIts est préférée. Dans le cas des micro-organismes eucaryotes, tels les levures, les promoteurs peuvent être ceux des gènes glycolytiques de levure, tels les gènes codant pour la phospho-glycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD), ou bien encore des gènes codant pour la lactase (LAC4), l'énolase (ENO). Concernant les sites de fixation des ribosomes, celui dérivé du gène CII de lambda, ainsi que ceux dérivés de gènes de Comamonas ou Pseudomonas ou ceux dérivés de gènes de Corynébactéries sont utilisés préférentiellement lorsque le microorganisme hôte est procaryote. Une région, permettant une terminaison de la traduction et de la transcription fonctionnelle de l'hôte envisagé, peut être positionnée en 3' de la séquence codante. Avantageusement, la cassette d'expression peut comprendre, également, un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombinant. Les marqueurs préférés sont des marqueurs dominants, c'est-à-dire conférant une résistance à des antibiotiques comme l'ampicilline, la tétracycline ou la streptomycine ou à d'autres produits toxiques pour les bactéries. il est à noter que l'amidase selon l'invention constitue déjà, en ellemême, un marqueur de sélection pour l'hôte qui les contient. L'invention a également pour objet les micro-organismes contenant la séquence d'ADN selon l'invention, ainsi que ceux aptes à produire au moins un polypeptide selon l'invention. Ces micro-organismes comportent ou non au moins une cassette d'expression, du type de celle décrite ci-dessus. Parmi ces micro-organismes, on trouve les hôtes utilisables pour l'accueil d'un vecteur d'expression conforme à l'invention, on peut citer, notamment, les entérobactéries telles que E. coli les bactéries appartenant aux genres Comamonas ou Pseudomonas les bactéries corynéformes, telles que celles appartenant aux genres Corynebacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Streptomyces ou Bacillus. Un micro-organisme recombiné, contenant ladite séquence d'ADN sur une structure plasmidique, a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C. N. C. M.) (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, PARIS) sous le n" I 1279 le 11 janvier 1993. Ce micro-organisme est la souche E. Coli qui contient le plasmide pXL 2216 (décrit ci-après). Ce micro-organisme est également identifié par la Demanderesse par la référence G 4315. li va de soi que les polypeptides produits par les micro-organismes cidessus sont, également, compris dans l'invention. Cette dernière concerne aussi le procédé de transformation des amides en carboxylates à l'aide d'un polypeptide selon l'invention ou d'un micro-organisme recombiné le générant. Ce procédé consiste à mettre en présence l'amide à transformer avec un polypeptide ou un micro-organisme recombiné, tel que défini précédemment. On opère, généralement, à la température ambiante. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polypeptide ou le micro-organisme recombiné sont immobilisés sur ou dans un support solide, selon une technique classique, comme celle décrite, par exemple, dans le brevet américain US N" 4732 851. Le procédé de l'invention convient pour la transformation des amides, en carboxylates et, plus particulièrement, pour la transformation en carboxylates des mono et diamides de formules: NC -R - CON"2, H2NOC-R-CONH2 etH2NOC -R - COO-Z+ dans lesquelles R est un groupe aikylène ou alcénylène linéaire ou ramifié, contenant 1 à 18 atomes de carbone, R étant, de préférence, égal à - (Cll4 - et Z est choisi parmi la liste de composés suivants: alcalins, alcalino-terreux, amines, ammonium, ce dernier composé étant particulièrement préféré. Le procédé de l'invention est particulièrement approprié pour la synthèse enzymatique, d'une part, d'un adipate, tel que l'adipate d'ammonium à partir d'adipamide et surtout à partir d'un adipamate, tel que l'adipamate d'ammonium et, d'autre part, de cyano-5 valérate à partir de cyano-5 valéramide. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques et les avantages de la présente invention sans, toutefois, en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES La fig. 1 représente la séquence peptidique d'un polypeptide conforme à l'invention. La fig. 2 représente une séquence d'ADN selon l'invention. La fig. 3 représente l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS des fractions obtenues aux différentes étapes de purification de l'exemple 2. La fig. 4 représente une courbe de l'activité spécifique de l'amidase selon l'invention (micromoles d'adipate x h-1 x mgl de protéine) en fonction de la température en C. La fig. 5 représente une courbe de l'activité spécifique de l'amidase selon l'invention (micromoles d'adipate x h-l x mg-l de protéine) en fonction du pH. La fig. 6 représente une variation de l'activité spécifique (micromoles d'adipate x h-l x mg-1 de protéine) de l'amidase selon l'invention vis-à-vis de l'adipamate, en fonction de la concentration en adipamate (millimoles x 1-'). La fig. 7 représente une courbe donnant le rapport de la concentration en adipamate sur l'activité spécifique (litres d'adipate x h-' x g-1 de protéine) en fonction de la concentration en adipamate (millimoles x l-l). La fig. 8 représente la carte de restriction du plasmide pXL2104 contenant le gène de l'amidase selon l'invention. La fig. 9 représente la séquence d'un fragment de 1491 pb contenant le gène codant pour l'amidase de Comamonas testosteroni NI 1. La fig. 10 représente la carte de restriction du plasmide pXL 2216 contenant le gène de l'amidase selon l'invention. La fig. 11 représente la carte de restriction du plasmide pXL2144 contenant le fragment SpeI-ClaI dérivé du plasmide pXL2104 entre les sites XbaI et ClaI du vecteur pMIL22. La fig. 12 représente l'électrophorèse sur Gel SDS-PAGE montrant l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention dans la souche E-Coli TG 1. La signification des abréviations utilisées dans la suite de la description est donnée ci-après. - SSC: tampon couramment utilisé pour les hybridations, il contient du citrate de sodium et du NaCl (20XSSC = NaCl 3M-citrate de sodium pH 7, 0,3 M), - SDS : dodécylsulfate de sodium, - FPLC: chromatographie liquide dénommée en langue anglaise "fast protein liquid chromatography", - SDS-PAGE: gel d'électrophorèse à base de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, - IPTO: isopropyl ss-D thio galactopyranoside, - CLHP: chromatographie liquide haute performance, - PS : poids sec, - X-gal. : 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indoyl - P 6 galactopyranoside. EXEMPLES EXEMPLE 1: HYDROLYSE DE L'ADIPAMATE ET DE L'ADIPAMIDE PAR Comamonas testosteroni NI 1. La souche Comamonas testosteroni NI 1 est une souche isolée à partir d'un échantillon de terre par criblage microbiologique. Ses performances sont évaluées sur adipamate et adipamide. 1.1. Préparation des cellules: La souche Comamonas testosteroni NI 1 est cultivée, en fiole agitée, à 28 C, pendant 19 h, dans le milieu A dont la composition est la suivante: -Glycérol................................... 10,0 x 10 mgxl-1 -Cyano-5-valérate de sodium................. 1,5 x 10 mgxl-1 -K2HPO4..................................... 0,5 x 10 mgxl-1 -MgSO4, 7H2O................................ 0,5 x 10 mgxl-1 -MnSO4, H2O................................. 20,0 mgxl-1 -FeSO4, 7H2O................................ 20,0 mgxl-1 -NaCl....................................... 10,0 mgxl-1 -Extrait de levure.......................... 0,5 x 10 mgxl-1 -Extrait de boeuf........................... 0,5 x 10 mgxl-1 - HC1 3N QSP pH 5 Cette préculture sert à ensemencer une fiole de 2 litres remplie au dixième par le milieu A.Après 22 h, 3,5 gxl-1 de cellules exprimées en poids humide sont récoltés. Cela correspond à une DO66onm de 1,4 et un poids sec de 0,9 gxl-1. 1.2. Détermination de l'activité enzymatique sur adipamide et adipamate: Un culot cellulaire contenant 31 mg de cellules sèches est mis en suspension dans 5,5 ml d'une solution 20 mM en adipamate ou adipamide dans le tampon phosphate de potassium pH 7,50 mM. La réaction est conduite à 25 C sous agitation et la cinétique est suivie par prélèvement. Sur chaque prélèvement, sont dosés par CLHP l'adipamide, l'adipamate et l'adipate. Les vitesses de formation de l'adipate, à partir de l'adipamide et de l'adipamate, sont, respectivement, de 8,3 et 33 Uxgl de cellules sèches (1 U est égale à 1 micromole de produit formé par minute) (cellules entières). Par comparaison, on obtient les activités données dans le TABLEAU I ci-dessous et mesurées dans les mêmes conditions, avec Brevibacterium R 312 et Rhodococcus sp. TABLEAU I: ACTIVITÉS EN MICROMOLES DE SOUCHES SUBATRATS PRODUIT FORMÉ PAR MINUTE ET PAR GRAMME DE CELLULES SÈCHS Comamonas testosteroni Adipamate 33,0 NI i Adipamide 8,3 Brevibacterium R 312 Adipamate 0,0 Adipamide 2,3 Rhodococcus sp Adipamate 0,0 Adipamide 35,0 EXEMPLE 2 : PURIFICATION DE L'AMIDASE DE Comamonas testosteroni NI 1. 2.1. Culture des cellules: La souche Comamonas NI 1 est cultivée en fermenteur de 15 1 sur le milieu B dont la composition est: - Glucose . . . . 5,0 x 10 mgxl-1 - Cyano-5-valérate de sodium . 5,7 x 10 mgxl-1 - Adiponitrile . . . 1,0 x 103 mgxl-1 - Na2HPO4, 2H2O . . 3,4 x 103 mgxl-1 - KH2PO4 . . . 2,7 x 103 mgxl-1 -MgSO4, 7H2O................................ 0,5 x 10 mgxl-1 -MnSO4, H2O................................. 20,0 mgxl-1 -FeSO4, 7H2O................................ 20,0 mgxl-1 -NaCl....................................... 10,0 mgxl-1 - Vitamines Biotine . .. 8 x 10-5 mgxl-1 Acide nicotinique . . . ... 8 x 10-3 mgxl~ Thiamine, HCl . . .. 4 x 10-3 mgxl-1 Le pH, la température, le débit d'air et la vitesse d'agitation sont régulés, respectivement, à 6,6, 28 C, 300 t/h et 350 tpm. Après 4 h de fermentation, 15 g d'adiponitrile sont ajoutés. Après 19 h 30 de culture, 188 g de cellules humides, soit 40 g de cellules sèches sont récoltées. Cela correspond, en fin de culture, à 2,5 g/l de cellules poids sec et à une DO660mm de 7. 2.2 Purification: Toutes les étapes de la purification sont réalisées dans le tampon B (Tris-HCl 100 mM pH 7,5, glycérol 10 %). A chacune des étapes, l'activité amidase des fractions est déterminée à pH 7,5 et à 25 C dans le tampon B dilué 10 fois en présence d'adipamate 10 mM. La concentration en protéine des pools est déterminée par la méthode au bleu de Coomassie (kit PIERCE Protein assay). L'unité d'activité U correspond à 1 ,umole d'adipate produite par minute dans les conditions du test. Le pannel de protéines est analysé par gel de polyacrylamide-SDS (Phastsystem PHARMACIA). Les données de chacune des étapes de la purification sont regroupées dans le tableau II ci-après et la fig. 3 annexée. Les procédures de chacune des étapes sont commentées ci-après. - Etape O : extrait brut: 66 g de cellules humides sont reprises dans 100 ml de tampon B et soniquées pendant 28 min en temps effectif (sonicateur VIBRACELL de BIOBLOCK : sonde 13 mm, puissance 7, 30 % du cycle actif. La DO660mm passe ainsi de 220 à 63. Après centrifugation à 30 000 gmax pendant 60 min, les 125 ml du surnageant sont récupérés. - Etape 1 : fractionnement au sulfate d'ammonium: Les 125 ml sont additionnés de 26 g de sulfate d'ammonium pour atteindre 35 % de la saturation. Après une heure, la suspension est centrifugée 30 min à 30 000 gmax. Le surnageant est récupéré et additionné de 18 g de sulfate d'ammonium pour atteindre 60 % de la saturation. Après 1 h, la suspension est centrifugée à 48 000 gmax. Le précipité est récupéré puis dialysé contre le tampon B pendant 66 heures environ. Après dialyse, 43 ml sont récupérés puis analysés (protéine totale 1 200 mg, Iprot] = 28 gxl-1, activité totale = 1 200 U, act. spéc. = 1 Uxmg-1, rdt prot. = 46 %, rdt act. = 60 %). - Etape 2 : colonne échangeuse d'ions (Q sepharose fast flow): La fraction dialysée (43 ml) est chargée à un débit de 130 mlxh4 sur une colonne (26 x 380 mm) de "Q sepharose flast flow" équilibrée avec le tampon B à un débit de 200 mlxh1. La colonne est percolée à un débit de 200 mlxh-1 successivement par les solutions suivantes tampon B, QSP pour retour à la ligne de base, 500 ml d'un gradient de KCl 0 à 0,4 M dans le tampon B, 200 ml de tampon B contenant 0,4 M de KCl, 250 ml de tampon B additionné de 1 M de KCl. L'activité amidase est éluée dans un volume de 170 ml, à une force ionique comprise entre 0,05 et 250 mM en KCl. Cette solution est analysée (prot. 580 mg, [prot.J = 3,4 gxl-1, act. tot. = 1 200 U, act. spéc. = 2,1 Uxmg1 de prot., rdt en prot = 47 %, rdt en act. = 100 %). - Etape 3 : colonne d'interactions hydrophobes (Phenyl Sepharose) Les 168 ml sont concentrés par précipitation au sulfate d'ammonium à 65 % de la saturation. Pour cela, 72 g de sulfate d'ammonium sont additionnés. Après une heure d'agitation à 40 C, la suspension est centrifugée à 30 000 gmax pendant une heure. Le culot est remis en suspension dans le tampon B et dialysé contre 2 1 de tampon B pendant une nuit. 25 ml sont recueillis, additionnés de 4,4 g de sulfate d'ammonium pour atteindre 30 % de la saturation puis chargés à 50 mlxh-1 pendant 35 min sur une colonne de "Phenyl Sepharose" (26 x 300 mm), équilibrée avec du tampon B contenant le sulfate d'ammonium à 30 % de la saturation. La colonne est lavée avec le même tampon à un débit de 100 mlxh-1 pendant 1 h. Le débit est réduit à 40 mlxh-1 et la colonne est percolée avec du tampon B seul. L'activité est éluée après 2,8 h dans un volume de 30 ml (prot. + 110 mg, Iprot.] = 1,4 gxl-l, act. tot. = 910 U, act. spéc. 8,1 Uxmgl de prot., rdt en prot. = 20 %, rdt en act. = 74 %). Les étapes suivantes sont réalisées sur le système FPLC Pharmacia. - Etape 4 : gel filtration (FPLC Superdex 200): Les 80 ml sont concentrés par ultrafiltration sur membrane Amicon PM10 puis sur centriprep 10. Ces 2,8 ml sont chargés sur la colonne de gel filtration (16 x 600 mm) équilibrée avec le tampon B additionné de 0,1 M de KC1 à un débit de 0,8 mlxmiir1. L'activité est éluée avec le tampon ci dessus à un débit de 1 mlxmin-1 et dans un volume de 9 ml (26 mg de protéine, 470 U, act. spéc. = 18 Uxmg-1 de prot., rdt en act. = 51 %, rdt en prot. = 26 %). - Etape 5: gel filtration (FPLC Superdex 200): Cette deuxième gel filtration est effectuée dans des conditions identiques à la précédente, mais en deux fois. Les dosages ne sont effectués que sur le premier passage, réalisé à partir d'une fraction de 3 ml des 9 ml de la précédente étape. - Etape 6: colonne échangeuse d'anions (mono Q HR 5/5 Pharmacia) Sur cette colonne, équilibrée avec le tampon B, les protéines ne sont pas retenues et sont éluées directement dans le volume mort. Les fractions actives, 16,5 ml, sont analysées (prot. = 17,1 mg, Lprnt.] = 1 gxl-l, act. tot. = 262 U, act. spéc. = 15 Uxmg' de prot., rdts cumulés pour les étapes 5 et 6 = 65 % pour les prot. et 55 % pour l'activité). - Etape 7: colonne échangeuse d'anions (mono Q "R 5/5 Pharmacia) Cette étape est réalisée en deux fois, en utilisant la moitié de la fraction précédente à chaque fois et avec le tampon B/5. Le tampon est modifié par dialyse sur membrane Amicon PM10 et substitution par du tampon B/5. Les 6 ml de rétentat sont chargés sur la colonne équilibrée avec le tampon B/5, à un débit de 1 mlxmin-1. Après lavage de la colonne pendant 14 min, un gradient de 0 à 0,15 M en KC1 est appliqué en 25 min. La colonne est ensuite alimentée avec une solution de KC1 1 M dans le tampon B/5.En deux fois, 3,75 ml sont recueillis et analysés (prot. = 1,5 mg, Lprot.] = 0,4 gxl-1, act. tot. = 121 U, act. spéc. = 81 Uxmg4 de prot., rdt en prot. = 11 %, rdt en act. = 46 %. - Etape 8 : colonne échangeuse d'anions (mono Q "R 5/5 Pharmacia) Les 3,7 ml de l'étape précédente sont dilués à 6 ml avec le tampon B/5, déposés sur la colonne. Les protéines sont éluées dans les conditions de l'étape 7. Les fractions actives sont réunies et analysées (vol. = 3 ml, protéines = 1 mg, (prot.J 0,34 gxl-1, act. tot. = 93 U, act. spéc. = 92 Uxmgl de prot., rdt en prot. = 67 %, rdt en act. = 77 %). - Etape 9 : colonne d'interactions hydrophobes (octyl superose "R 5/5): Les 3 ml du pool de l'étape précédente sont amenés à 38 % de la saturation par addition d'une solution concentrée en sulfate d'ammonium. Les 6 ml résultants sont chargés sur la colonne, équilibrée avec le tampon B additionné de 1,7 M de sulfate d'ammonium. Les protéines sont éluées par un gradient décroissant de sulfate d'ammonium de 1,7 M à 0 M dans le tampon B en 1 h à un débit de 0,5 mlxmin-1. Les fractions actives sont réunies pour analyse (vol. = 1,5 ml, prot. = 0,75 mg, [prot.] = 0,5 g/l, act. tot. = 53 U, act. spéc. = 70 Uxmg4 de prot., rdt en prot. = 75 %, rdt en act. = 56 %. - Etape 10: dessalage (colonne de Fast desalting "R 10/10 Pharmacia): Les 1,5 ml sont tout d'abord concentrés à l'aide du centricon PM10 jusqu'à un volume de 0,5 ml. Cette fraction est déposée sur la colonne, équilibrée avec le tampon phosphate 10 mM pH 6,8. La protéine est éluée à un débit de 4 mlxmin-1. La protéine sort dans un volume de 2 ml environ (prot. tot. = 360 g, [prot.] = 180 mgxl-1, act. tot. = 19 U, act. spéc. = 53 Uxmgl de prot., rdt en prot. = 48 %, rdt en act. 36 %). TABLEAU II: PURIFICATION DE L'AMIDASE DE Comamonas NI 1 Vol Prot. ACTIVITE RENDEMENT ETAPE PF DE PURIFICATION ML MG Totale Spécif. Prot. Activ. U U/MG % % 0-Extrait brut 125 2700 2100 . 0,78 100 . 100 1 1-(NH4)2SO4 35-60% 43 1200 1200 . 2,1 22 59 1,3 2 - Q sepharose 170 580 1 200 . 2,1 22 59 2,7 3-Phenylsepharose 80 110 910 8,1 4,2 44 10 4 - Gel filtration 12 26 470 . 18 0,9 . 23 23 5 - Ge1 filtration 6 - Mono Q HR 515 16 17 262 . 15 0,6 . 13 19 7 - Mono Q HR 5/5 3,7 1,5 121 81 0,051 5,8 100 8-Mono Q HR5/5 3 1 93 92 0,03 4,5 120 9 - Octyl superose HR 5/5 1,5 0,75 53 . 70 0,03 2,5 90 lO-Dessalage 2 0,4 19 . 53 0,01 0,9 67 ABREVIATIONS - PF = coefficient de purification, - U = 1 mole/min. La fig. 3 annexée montre les résultats d'une analyse en gel de polyacrylamide SDS des fractions obtenues aux différentes étapes de la purification. Les puits sont numérotés de 1 à 12, de gauche à droite, les poids moléculaires du marqueur ont été portés sur la droite de la figure (kilo Daltons). Les puits 1 et 12 contiennent des protéines standard de poids moléculaire connus, le puits 2 l'extrait brut et les puits 3 à 10 correspondent aux extraits purifiés des étapes 1 à 8 et le puits 11 à l'extrait purifié de l'étape 10. La bande correspondant à l'amidase selon l'invention est celle d'environ 40 kDa. 2.3 Caractérisations: Cette amidase analysée par gel SDS-PAGE présente une bande principale de 43 000 Da dont la séquence N-terminale est: Met-Ile-Glu-Asn-Ile-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-Asn-Ile-Leu-Glu-Ser-Asn-Thr-Asn-... Par gel filtration, le poids moléculaire est de 80 000 +/- 2 000 Da. L'amidase est donc une enzyme homodimérique. 2.4 Activité de l'amidase en fonction de la température: Un pool de fractions contenant l'amidase a été utilisé pour cette étude. Dans les conditions de la purification, ce pool contient 0,3 gxl-l de protéine et possède une activité spécifique de 26 Ux m g-l de protéine. L'activité de ce pool a été déterminée entre 10 et 60 C. Les conditions de cette étude sont les suivantes : [adipamate] = 10 mM, tampon tris-HCl 10 mM, pH 7,5. Volume réactionnel 2 ml, temps de réaction 15 min, [protéine] = 7,5 mgxt. Les résultats sont regroupés dans la fig. 4. L'activité augmente en fonction de la température jusqu'à 50 C environ. Au-delà, une dénaturation est observée. Entre 10 et 40 C, la loi d'Arrhénius est observée et permet de calculer un G de réaction de 83 kJxmole-1. 2.5 Activité en fonction du pll: A partir de la même préparation enzymatique que celle utilisée précédemment, l'activité est mesurée à différents pH. Les conditions de cette étude sont les suivantes: [adipamate] = 10 mM, tampon carbonate 10 mM, pH 10, tris-HCl 10 mM, pH 9, 8.5, 7.5, phosphate 10 mM, pH 6.5, acétate 10 mM, pH 3.5, 4.5, 5.5, T = 25 C, volume réactionnel 2 ml, temps de réaction 15 min, [protéine] = 7,5 m gxl-l. Les résultats sont regroupés dans la fig. 5. Le pH optimum se situe entre 8,5 et 10, ce qui correspond bien au comportement généralement rencontré pour les amidases. 2.6 Détermination du Km de l'amidase: Le substrat utilisé est l'adipamate. Sa vitesse d'hydrolyse en adipate est déterminée à différentes concentrations en adipamate (0,2, 1, 2, 5 et 10 mM). Les conditions de cette étude sont les suivantes: T = 25 C, tampon Tris-HC1 10 mM, pH 7,5, extrait enzymatique 100 F1 (cf. paragraphe 2.5), volume réactionnel 4 ml, sauf 10 ml pour 0,2 et 1 mM en adipamate, temps de réaction cinétique sur 2 h. Comme montré à la fig. 6, la courbe obtenue en traçant la vitesse en fonction de la concentration en substrat est conforme à une cinétique de Michaelis Menten. En conséquence, la transformation de Hanes S/V = f(S), représentée à la fig. 7 donne une constante de Michaelis de 0,25 mM. EXEMPLE 3: CLONAGE DU GÈNE CODANT POUR L'AMIDASE DE Comamonas testosteroni NI 1. A partir de la séquence N-terminale présentée dans l'exemple 2.3, une sonde nucléotidique a été synthétisée. n s'agit d'un 20 mer 256 fois dégénéré: MIE NI I A 5 ' ATG ATT GAA AAT ATT ATT GC 3' C G C C C A A A La stratégie suivie a consisté, tout d'abord, à vérifier la spécificité de cette sonde nucléotidique et à déterminer la nature des fragments d'ADN génomique à cloner. Brièvement, 1'ADN génomique de Comamonas testosteroni NI 1 a été digéré par plusieurs enzymes de restriction correspondant à des sites utilisables pour le clonage. Après électrophorèse sur gel d'agarose et transfert sur membrane de nylon, les diverses digestions ont été hybridées à la sonde. La sonde a une spécificité suffisante dans les conditions d'hybridation utilisées (5x SSC, 5x Denhardt, 0,1 % SDS, 50 mM NaPO4 pH 6,5, 250 ,ugxmll ssDNA, température d'hybridation 50"C. Conditions de lavage 1 h, 6x SSC, température ambiante et 5 min en 2 x SSC, 0,1 % SDS à 50"C). Dans ces conditions, la sonde nous a permis d'obtenir des signaux importants et sans ambiguité. En particulier, dans le cas des digestions par SstI, PstI et Bgm. Les empreintes d'hybridation montrent, en particulier, l'existence d'un fragment unique SstI d'environ 5,5 kb. Afin de cloner ce fragment, les fragments de 5 à 6 kb d'une digestion SstI de I'ADN génomique ont été purifiés par électrophorèse préparative sur agarose et électroélution, puis ligaturés au plasmide pUC 19, lui-même digéré par SstI. Après transformation dans la souche DHSa, 500 clones blancs sur LB ampicilline X-gal ont été repiqués individuellement, transférés sur membrane de nylon, puis analysés par hybridation avec la sonde ayant servi pour hybrider le Southern blot et ce dans les mêmes conditions de stringence.Deux clones ont ainsi été repérés comme hybridant très fortement avec la sonde. Ces deux clones se sont avérés contenir un plasmide ayant inséré le même fragment d'environ 5,5 kb dans la même orientation. L'un de ces deux plasmides (pXL2104) a été analysé plus en détail (cartographie de restriction, séquençage partiel en utilisant la sonde comme amorce et Southern blot). n a ainsi pu être montré que la partie 5' du gène, qui hybride avec la sonde, est localisée sur un fragment de PstI/SpeI de 420 pb environ et que le gène est orienté dans le sens SpeI vers PstI. La fig. 8 présente une carte de restriction de ce plasmide. EXEMPLE 4 : SÉQUENCE D'UN FRAGMENT DE 1491 pb CONTENANT LE GENE CODANT POUR L'AMIDASE DE Comamonas Testosteroni b La localisation du fragment de 1491 pb séquencé, contenant le gène codant pour 1'amidase de Comamonas testosteroni NI 1, est indiquée sous l'insert cloné sur la fig. 9. La stratégie de séquençage de ce fragment, réalisé selon des méthodes classiques connues par l'homme de métier, est représentée sur la même figure. Les diverses séquences ont toutes été obtenues par la méthode de terminaison de chaînes (kit sequenase en présence de 7-déaza dGTP ; (35S)dATP) soit sur des matrices simple brin de M13 (mp18 ou mp19 cf YANISH et al., Gene 33 (1985) 103) recombinant portant des sous fragments, soit directement sur le plasmide pXL2104. Plusieurs amorces spécifiques ont également été synthétisées dans ce but. La séquence est présentée sur la fig. 2. Le GC % moyen de la séquence obtenue est de 33,6 %, ce qui est inférieur au GC % de 61,5 % décrit chez d'autres souches de Comamonas (TÂMOEA et al., Int. J. Syst. Bacteriol, 1987 37, 52-59). Une analyse de la séquence obtenue a permis de caractériser une phase ouverte de 1254 pb codant pour un polypeptide de 418 résidus correspondant à un poids moléculaire de 46 148 Da. Ce polypeptide comprend la séquence NH2 terminale utilisée pour synthétiser la sonde. Ainsi cette phase ouverte représente le gène structural de l'amidase recherchée. Ce gène sera dénommé amdA dans la suite du présent exposé. A partir du plasmide pXL 2104, le plasmide pXL 2216 a été préparé par insertion du fragment SpeI-ClaI contenant le gène amdA entre les sites XbaI et ClaI du vecteur pMIL 23 (CHAMBERS et Al., Gene, 68 (1988) 139-149). Ce plasmide, dont la carte de restriction est présentée sur la figure 9 bis a été utilisée pour transformer la souche de E. coli TG 1. La souche résultante appelée G 4315 a été déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes à Paris (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux) sous le n" I 1279. EXEMPLE 5: EXPRESSION DE L'AMIDASE DE Comamonas Testosteroni NI 1 DANS E. coli. Afin de confirmer l'identité entre le gène amdA et le gène codant pour l'amidase de Comamonas testosteroni NI 1, un plasmide a été construit dans lequel le gène amdA, précédé de son propre site de fixation des ribosomes, est placé sous le contrôle du promoteur de l'opéron lactose de E. coli. Ainsi, le plasmide pXL2144, décrit sur la fig. 11, a été obtenu par insertion du fragment SpeI-ClaI dérivé du plasmide pXL2104 entre les sites XbaI et ClaI du vecteur pMTL 22 (CHAMBERS et al., Gene, 68 (1988) 139-149). Ce plasmide contient donc le promoteur de l'opéron lactose Plac, suivi du site de fixation des ribosomes et du gène structural de l'amidase, ainsi qu'un gène conférant la résistance à l'ampicilline. Le plasmide pXL2144 a été utilisé pour transformer la souche de E. coli TG 1. La sélection des micro-organismes se fait sur ampicilline. L'expression de l'amidase de Comamonas testosteroni NI 1 a été visualisée, après sonication des cellules, par gel SDS-PAGE, dans la fraction brute ou, après centrifugation, dans le culot et dans le surnageant. Chaque piste correspond à une quantité de protéine équivalente à 60 ,ul de culture à une DO de 3 à 610 nm. La fig. 12 présente les résultats obtenus. Les poids moléculaires des marqueurs sont indiqués en kilodaltons par les flèches à droite du gel sur cette figure. Le contenu des différentes pistes est indiqué sur le tableau suivant. TG1 + TG1 + TG1 + TG1 + pXL2144 pXL3144 pMTL22 pMTL22 + IPTG + IPTG Surnageant A D G J Culot B E H K Fraction brute C F I L I1 ressort de la fig. 12 que les extraits de cellules comprenant le plasmide pXL 2144 expriment l'amidase selon l'invention, essentiellement sous forme soluble : bande à environ 45 kDa A.C.D.F., alors que celle-ci n'apparait pas pour les extraits G à L. De plus, la comparaison de la bande à 45 kDa environ des extraits A.C et des extraits D.F montre que les premiers cultivés en présence d'ITPG ont un niveau d'expression plus élevé. EXEMPLE 6: ACTIVITE DE L'AMIDASE CHEZ Escherichia coli. L'activité de la souche E. coli (pXL2144), induite ou non, est mesurée sur adipamide et adipamate et comparée à celle de la souche témoin E. coli (pMTL 22). 6.1 Préparation des cellules: Les cultures sont réalisées dans les conditions décrites dans le TABLEAU III ci dessous. Au cours de la phase exponentielle de croissance, une des deux cultures de la souche recombinante est induite par 1'IPTG 1 mM, après encore 2 h à 37 C cette culture est traitée. TABLEAU III: CULTURE DES SOUCHES Ps. MICRO-ORGANISMES MILIEU DO 660 nm g/l E. coli (PMTL22) B 2,2 0,84 E. coli (pXL2144) B 1,8 0,75 E. coli (pXL2144) C 2,3 1,10 ABRÉVIATIONS : - B = milieu LB + Amp 100 gxml4, - C = milieu B + ajout de IPTG 1 mM à 0,8 de DO660nm. CONDITIONS COMMUNES: Ensemencement au 1/100ème à partir d'une préculture âgée de 17 h, temps de culture 5,5 h, T = 37 C. 6.2 Mesures des activités spécifiques: Les conditions de mesure des activités spécifiques et les résultats sont répertoriés dans le TABLEAU IV ci dessous. Les conditions communes de ces mesures sont les suivantes : T = 25 C, tampon phosphate 50 mM pH 7, cinétique sur 90 min. TABLEAU IV: MESURES DES ACTIVITES AMIDASIQUES DES SOUCHES RECOMBINATIONS QUI EXPERIMENT L'AMIDASE DE Comamonas NI 1. SUBSTRAT ACTIVITE GOUCHES SPECIFIQUE Nature [cel.] Induit Etat Nature [S] mole/min/g g/l +/- mM de PS E. coli (pXL 2144) 6,2 + . E Adiapamide 15 14 6,1 + . ST Adipamide 12 15 6,1 + SC Adiapamide 12 0 6,1 + SS Adiapamide 12 14 6,2 - E Adiapamide 11 0 0,3 + # E # Adipamate 50 700 0,25 + ST Adiapamide 50 2000 2,50 + # SC # Adipamate 50 97 0,25 + SS Adiapamate 50 1900 Adipamate 50 130 1,4 - ST Adiapamate 50 500 2,8 - SC Adiapamate 50 46 1,4 - SS Adiapamate 50 433 E. coli (PMTL22) 10 . , E Adipamate 25 25 0 14 E Adiapamide 13 0 ABREVIATIONS - E = cellules entières, - ST = broyat cellulaire, - SC = fraction insoluble du broyat cellulaire, - SS = fraction soluble du broyat cellulaire. EXEMPLE 7: COMPARATIF DES ACTIVITES SPECIFIQUES SUR ADIPAMIDE ET ADIPAMATE DE SOUCHES EXPRIMANT UNE AMIDASE SELON L'ART ANTERIEUR (FR 90-14 853) ET SOUCHES EXPRIMANT UNE AMIDASE SELON L'INVENTION. Les conditions des mesures et les résultats sont donnés dans le TABLEAU V cidessous. TABLEAU V: SOUCHES SUBSTRAT ACTIVITE SPECIFIQUE Nature [Cel.] Induit Nature Etat Nature [S] ( mole) (g/l) +/- (màl) min/g Brevibracterium (R 312) 0,06 + E Adiapamide 20 2,3 . 0,3 . + # ST Adiapamide 20 10 0,3 + ST Adiapamide 20 4,2 ANT E. coli (pXL1751) 0,3 + E Adiapamide 20 75 ANTERIEUR 0,3 + E Adiapamate 20 16 0,3 + ST 20 16 Rhodococcus sp . 0,76 + f E Adipamide # 20 35 . 0,76. + . ST Adipamide. # 20 62 0,32 + ST Adiapamate 20 55 C. testoteroni sp 5,6 + E Adiapamide 20 8,3 5,6 + E Adiapamate 20 33 INEVENTION E. coli (pXL2144) 6,2 + E Adiapamide 15 14 6 1 + ST Adipamid 12 15 + E Adiapamate 50 700 + ST Adipamate 50 2000 CONDITIONS COMMUNES: - T=25 C - Tampon phosphate 50 mM pH 7. ABREVIATIONS - E = cellules entières, - ST = broyat cellulaire. Le plasmide pXL1751 de la souche recombinée E. Coli est décrit en détail dans la demande de brevet FR 90-14 853. Le TABLEAU V met clairement en évidence la plus grande spécificité de l'amidase suivant l'invention vis-à-vis de l'adipamate que vis-à-vis de l'adipamide, à l'inverse de ce que l'on observe pour les amidases connues. Cette observation vaut aussi bien pour une expression amidasique par les germes naturels que par les germes recombinés. REVENDICATIONS: 1 - Polypeptides ayant une activité amidase, capables d'hydrolyser les amides en carboxylates, caractérisés en ce qu'il possèdent une activité enzymatique vis-à-vis de l'adipamate d'ammonium supérieure à celle qu'ils ont vis-à-vis de l'adipamide. 2 - Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par la séquence peptidique telle que représentée à la fig. 1. 3 - Séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une activité amidase, capable d'hydrolyser les amides en carboxylates, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la liste des séquences suivantes - la séquence d'ADN, telle que représentée à la fig. 2 et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase, - un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, - une séquence d'ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou un fragment de celles-ci et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase. 4 - Polypeptides résultant de l'expression d'une séquence d'ADN selon la revendication 3 et ayant une activité amidase. 5 - Micro-organisme constitué par la souche E. coli contenant le plasmide pXL 2216, souche référencée G 4315 et déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n" I 1279 le 11 janvier 1993. 6 - Micro-organisme apte à produire au moins un polypeptide selon la revendication 4. 7 - Micro-organisme selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient au moins une cassette d'expression comprenant la séquence d'ADN selon la revendication 3 et, en amont de celle-ci, une séquence promotrice et un site de fixation des ribosomes. 8 - Micro-organisme selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il appartient à la famille des procaryotes et en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs suivants : promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp de E. coli, promoteur de l'opéron lactose Plac de E. coli, promoteur droit du phage lambda PR, promoteur gauche du phage lambda PL, promoteurs forts de Pseudomonas, Comamonas ou de corynébactéries. 9 - Micro-organisme selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il appartient à la famille des procaryotes et en ce que le site de fixation des ribosomes est choisi parmi celui dérivé du gène CII de lambda, ceux dérivés de gènes de Comamonas ou Pseudomonas, ou ceux dérivés de gènes de corynébactéries. 10 - Micro-organisme selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il appartient à la famille des eucaryotes, tels que les levures et en ce que les promoteurs sont choisis parmi ceux des gènes glycolytiques de levure, tels les gènes codant pour la phospho-glycérate kinase, le glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, ou ceux de la lactase ou l'énolase. 11- Micro-organisme selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que la cassette d'expression est portée par un plasmide. 12 - Micro-organisme selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi la liste suivante de souches E. coli, Comamonas, Pseudomonas, Coiynebacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Bacillus. 13 - Polypeptides, caractérisés en ce qu'il sont produits par les microorganismes selon l'une quelconque des revendications 6 à 12. 14 - Procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides en carboxylates, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre les mono ou di-amides répondant à l'une des formules générales suivantes H,NOC -R - CONH,, H,NOC - R - COO-Z+ NC -R - CONH, dans lesquelles R est un groupe alkylène ou alcénylène, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 18 atomes de carbone et Z est choisi parmi la liste de composés suivants alcalins, alcalino-terreux, amines, ammonium, ce dernier composé étant particulièrement préféré, en présence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2, 4 et 13 ou en présence d'un micro-organisme selon l'une quelconque des revendications 6 à 12. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que R=-(CH2)4-.