Brevet FR2705251A1 — publié le 19941125

La présente invention concerne la détermination qualita- tive et quantitative de substances dans un milieu liquide par filtration tangentielle. Il est connu de détecter des substances telles que des substances biologiques, des micro-organismes ou des substan- ces chimiques présentes dans des milieux liquides à l'aide de réactifs doués d'affinité pour lesdites substances. On peut citer par exemple les procédés fondés sur la réaction antigène - anticorps. Généralement ces procédés nécessitent des temps d'incubation importants qui résultent des lois physico-chimiques des solutés en présence. Pour la détection de substances biologiques, une amélio- ration a été apportée par le procédé dit ELIFA (Enzyme Linked ImmunoFiltration Assay) fondé sur le principe de la mise en contact des différents réactifs nécessaires à l'identifica- tion de la substance biologique par une filtration active à travers une membrane sélective sur laquelle sont immobilisés les différents réactifs nécessaires (Pinon J. M., et al, J. Immunol. Methods 1985, 77, 15-23; H. Dupont, et al, J. Immunol. Methods 1990, 128, 287-291). Ce procédé permet de réduire les temps d'incubation, mais son efficacité est limi- tée par les problèmes de colmatage de la membrane et par le fait que le liquide à analyser ne peut l'être que par petites fractions. On connaît en outre les procédés d'extraction d'une substance contenue dans un liquide par une filtration tangen- tielle. La mise en oeuvre d'une filtration tangentielle nécessite la présence d'une surpression importante au-dessus de la membrane de filtration afin de faire percoler une par- tie du liquide. La présente invention a pour but de permettre la déter- mination qualitative et quantitative d'une ou de plusieurs substances contenues dans un milieu liquide, par un procédé rapide, efficace et économique, qui ne présente pas les inconvénients des procédés de l'art antérieur précités. A cet effet, la présente invention a pour objet un pro- cédé de détermination qualitative et/ou quantitative d'une ou de plusieurs substances susceptibles d'être présentes dans un milieu liquide, ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre dudit procédé. Le procédé de la présente invention est un procédé de filtration dans lequel on met le milieu liquide à analyser en contact avec une membrane, caractérisé en ce que: - l'on utilise une membrane activée ou rendue spécifi- que par immobilisation dans la structure microporeuse de ladite membrane d'au moins un ligand spécifique de chacune des substances recherchées; l'on effectue la mise en contact du milieu liquide avec la membrane de manière répétée en faisant circuler ledit milieu liquide à grande vitesse tangentiellement à la surface de la membrane; - l'on maintient une légère surpression au-dessus de la membrane de filtration, pour favoriser la percolation d'une partie du liquide. Dans le procédé de l'invention, le liquide circule sur la surface de la membrane à grande vitesse, une partie dudit liquide percole à travers la membrane microporeuse, l'autre partie reste au-dessus de la membrane et est remise en circu- lation jusqu'à épuisement. La circulation tangentielle du milieu liquide à la surface de la membrane permet d'assurer un nettoyage de la membrane et d'éviter le colmatage habi- tuellement observé lorsque le principe de l'immunofiltration est appliqué à des milieux complexes contenant des particules solides. En outre, l'utilisation d'une membrane activée ou rendue spécifique exerce un effet moteur pour la percolation du liquide qui doit traverser la membrane. La surpression au- dessus du liquide peut ainsi être maintenue à une valeur fai- ble. Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre pour la détermination qualitative et quantitative de toute substance présente dans un milieu liquide, dès lors qu'il existe un élément qui présente une affinité avec ladite substance et qui peut être immobilisé sur la structure micro- poreuse de la membrane. La substance peut être une substance chimique, une substance biologique telle qu'une protéine, ou un microorganisme tel qu'un virus, une bactérie, une toxine fongique ou marine. Une catégorie particulière de ligands est fournie par les anticorps. Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre pour toutes les déterminations par une méthode immunologique, et notamment pour tous les couples récepteur biologi- que/ligand correspondant (ou agoniste ou antagoniste). Sui- vant les cas, l'un ou l'autre élément du couple pourra être immobilisé dans la membrane microporeuse. A titre d'exemple, on peut citer les couples marqueur de cellules/cellules, mar- queur de microorganisme/microorganisme, HcG/récepteur tissu- laire, anticorps/antigène, haptène/anticorps, ADNc/ADN, poly dT/ARNm eucaryote, enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur d'en- zyme, lectine/glycoconjugué. Un exemple particulièrement intéressant d'application du procédé de l'invention est constitué par l'hybridation de sondes nucléiques entre un oligonucléotide immobilisé sur la membrane et l'acide nucléique portant la séquence complémen- taire. De même que dans le cas de systèmes immunologiques, le signal est obtenu par une deuxième sonde nucléique utilisée dans la phase liquide. Le procédé de l'invention peut également être mis en oeuvre pour traiter des liquides contenant des substances chimiques, dès lors que pour une substance chimique donnée, il existe un ligand qui présente une affinité avec ladite substance et qui peut être immobilisé dans la membrane micro- poreuse. A titre d'exemple, on peut citer les couples cation métallique/ligand chélatant, anticorps anti-haptène/molécule de faible poids moléculaire, enzyme/substrat. La sensibilité du système dépend des dimensions de la cellule de filtration, de la surface spécifique de la mem- brane, de la quantité de ligand immobilisé dans la membrane et des temps de réaction imposés. Le liquide traité peut être toute solution tampon compa- tible avec le couple élément à détecter-élément détecteur utilisé. Les interactions non spécifiques par échange d'ions ou par interactions hydrophobes peuvent être combattues par des tampons de force ionique appropriée contenant éventuelle- ment des détergents ou toute autre substance utilisée classi- quement. Le procédé de l'invention permet de d'identifier au cours d'une même opération, une ou plusieurs substances pré- sentes dans le liquide à traiter. Lorsque l'on veut identi- fier simultanément plusieurs substances présentes dans un liquide, l'on utilise pour la filtration, une membrane com- portant autant de zones que de substances à identifier, cha- que zone portant un ligand spécifique à l'une des substances, et éventuellement un ou plusieurs zones témoins fixant le niveau de bruit de fond et des zones portant des témoins positifs. Dans une mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, après avoir fait circuler jusqu'à épuisement le milieu liquide à analyser sur la membrane microporeuse portant un premier type de ligand spécifique d'une substance à identifier, on fait circuler sur la mem- brane un liquide contenant un second ligand spécifique de ladite substance à identifier, ce second ligand étant porteur d'une activité détectable par un moyen physique, chimique ou biologique. Dans une variante, on utilise le second ligand couplé à une enzyme et l'on effectue ensuite à l'aide d'un substrat précipitant, la mesure de l'activité de l'enzyme retenue par le second ligand. Dans une autre variante, on fixe le second ligand sur de petites particules marquées par une substance détectable par un moyen physique, chimique ou biologique et capables de se maintenir en suspension dans le milieu liquide. La substance détectable est avantageusement constituée par un colorant. Le procédé de la présente invention permet non seulement de détecter et d'identifier une ou plusieurs substances pré- sentes dans le liquide à traiter, mais il permet également une détermination quantitative desdites substances. A cet effet, l'on immobilise une quantité connue de ligand sur la membrane et l'on peut effectuer soit une détermination par capture directe du ligand, soit par compétition entre le ligand en solution et un ligand compétiteur immobilisé sur la membrane au préalable. Lorsque l'on souhaite effectuer une détermination quan- titative d'une substance biologique dont on connaît la pré- sence dans le milieu liquide, il est particulièrement inté- ressant de mélanger ladite substance avec une quantité connue de la même substance fixée sur une protéine enzymatique ou sur de petites particules individuelles marquées par une substance détectable par un moyen physique, chimique ou bio- logique, par exemple par un colorant, avant de mettre ladite substance à doser en présence du ligand immobilisé sur la membrane. La présente invention a également pour objet un disposi- tif pour la mise en oeuvre du procédé. Le dispositif de la présente invention comprend essentiellement une cellule de détection et/ou de mesure et un module hydraulique pour la circulation des liquides à analyser et des moyens pour assurer l'étanchéité de l'ensemble. Il est caractérisé en ce que la cellule de mesure comprend une ou plusieurs enceintes, chaque enceinte comportant un espace interne pour la circulation de l'échantillon liquide et un support perforé pour une membrane microporeuse sur laquelle des ligands sont immobilisés. Le dispositif de l'invention permet de traiter des volumes de liquides très variés, du fait que l'échantillon liquide à traiter est mis en circulation à la surface de la membrane. La présente invention est expliquée plus en détail par référence aux dessins annexés qui sont donnés à titre d'il- lustration. Il est bien entendu que l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation représenté. Dans les dessins annexés: - la figure 1 représente une vue schématique éclatée d'une enceinte de filtration, destinée à illustrer le prin- cipe du procédé de l'invention. - la figure 2 représente une vue éclatée d'une cellule pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. - la figure 3 représente un plan schématique d'une installation complète pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. L'enceinte de filtration représentée sous forme éclatée sur la figure 1 comprend un bloc inférieur 1, un bloc 2 supé- rieur, les deux étant par exemple en Plexiglas , une grille 3, constituée par exemple par du Téflon , ladite grille 3 supportant une membrane 4 sur laquelle sont immobilisés des ligands. Le flux 5 de liquide à analyser circule de manière tangentielle sur la surface de la membrane 4. Une partie 6 du flux liquide percole à travers la membrane 4 sous l'effet d'une surpression exercée sur le liquide constituant le flux et est recueillie dans le bloc inférieur 1. L'essentiel de la partie du flux 5 qui n'a pas percolé est recyclé. La figure 2 représente un mode de réalisation particu- lier d'une cellule de filtration utilisable pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Elle comporte une partie inférieure 7, une membrane 8 et une partie supérieure 9. La partie inférieure 7 sert de support à la membrane 8 et permet de collecter les effluents. La partie supérieure 9 comporte des moyens 11 pour l'introduction du milieu liquide à analy- ser ou de divers réactifs et des moyens 10 (non représentés sur la figure 2) pour leur sortie. La face supérieure de la partie inférieure 7 est munie d'au moins une cavité 13 et la face inférieure de la partie supérieure 10 d'au moins une cavité 14. Chaque face a le même nombre de cavités. Les cavi- tés de l'une des faces ont la même forme que les cavités de l'autre face et elles se trouvent exactement en regard les unes des autres, afin de constituer des compartiments 15 dans lesquels un liquide peut circuler. La figure 3 représente une vue d'ensemble d'une instal- lation pour la mise en oeuvre du procédé de la présente in- vention. Cette installation comprend une cellule de filtra- tion 16 constituée par plusieurs compartiments 15 comportant des moyensd'introduction 11 et des moyens de sortie de liquides 10, un réservoir 17 pour l'introduction manuelle de l'échantillon à analyser, un système 12 pour un éventuel pré- lèvement direct de l'échantillon à analyser et des réservoirs Ri à R7 (ce nombre de réservoirs étant donné à titre d'exem- ple) contenant différents réactifs, une vanne 18 multivoies (huit voies dans le cas présent) et une pompe péristaltique 19 reliant le réservoir à échantillon 17 et les réservoirs à réactifs Ri à R7 à la cellule de filtration 16, un boîtier de décontamination 21, une seconde vanne multivoies 20 reliant la cellule de filtration 16 aux différents réservoirs et au boîtier de décontamination. La cellule comprend en outre des moyens, non représentés, pour extraire de la cellule de fil- tration les fractions de liquide qui ont percolé à travers la membrane dans les différents compartiments, et pour les diri- ger vers le boîtier de décontamination 21. La présente invention est illustrée par l'exemple sui- vant, étant entendu que cet exemple ne limite pas la portée de l'invention. EXEMPLE Une installation conforme à celle de la figure 3 a été utilisée pour mettre en évidence la présence d'une toxine, l'entérotoxine B de Staphylococcus aureus dans un échantillon liquide à l'aide d'une membrane activée au préalable avec un anticorps spécifique. L'échantillon à analyser contenant l'entérotoxine B, placé dans le réservoir 17, a été mis en contact avec la mem- brane activée par circulation tangentielle à un débit de 5 ml/min pendant 5 min. Une très faible fraction de la solu- tion a percolé à travers la membrane et a été dirigée vers le réservoir 21. La membrane ayant retenu sélectivement l'entérotoxine B a ensuite été lavée par circulation pendant 1 min d'une solu- tion de lavage [tampon Tris 20 mM pH 7,2 contenant 0,9% de chlorure de sodium, Tris désignant un tris(hydroxyméthyl) aminométhane] provenant par exemple du réservoir Ri. Une solution d'un second anticorps anti-entérotoxine B couplé à une enzyme, la peroxydase du Raifort, contenue dans l'un des réservoirs R2 à R5, a ensuite été mise en circula- tion tangentielle avec un débit de 5 ml/min pendant 2 min à la surface de la membrane. Puis la membrane a été lavée pen- dant 1 min par circulation sur sa surface de la solution de lavage contenue dans le réservoir Ri. L'activité enzymatique de la peroxydase du Raifort rete- nue sur la membrane par l'intermédiaire de l'entérotoxine B capturée par le premier anticorps anti-entérotoxine B qui a servi à activer la membrane a été révélée en remplissant les compartiments 15 avec une solution de a-chloronaphtol dans un tampon Tris 20 mM pH 7,2 contenant 0, 9% de chlorure de sodium. Après 3 min d'incubation statique de cette solution, la pompe 19 étant à l'arrêt, la présence d'enzyme, et par conséquent d'entérotoxine B, a été quantifiée par l'appari- tion d'une coloration précipitante sur la membrane plus ou moins intense de couleur brune. REVENDICATIONS 1. Procédé de filtration dans lequel on met le milieu liquide à analyser en contact avec une membrane dans une cel- lule de filtration, caractérisé en ce que: - l'on utilise une membrane activée ou rendue spécifi- que par immobilisation dans la structure microporeuse de ladite membrane d'au moins un ligand spécifique de chacune des substances recherchées; - l'on effectue la mise en contact du milieu liquide avec la membrane de manière répétée en faisant circuler ledit milieu liquide à grande vitesse tangentiellement à la surface de la membrane; - l'on maintient une légère surpression au-dessus de la membrane de filtration, pour favoriser la percolation d'une partie du liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane sur laquelle circule le milieu liquide à ana- lyser comporte plusieurs zones, chaque zone étant activée par un ligand spécifique d'une substance donnée. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est activée par un ou plusieurs ligands spé- cifiques de substances chimiques. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est activée par un ou plusieurs ligands spé- cifiques de substances biologiques. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est activée par un ou plusieurs ligands spé- cifiques de microorganismes. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est activée par un ligand du type anticorps. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, après avoir épuisé le milieu liquide à analyser par plu- sieurs passages successifs dans la cellule de filtration tan- gentielle comprenant une membrane portant un ligand spécifi- que d'une substance donnée, on fait passer à travers ladite cellule un liquide contenant un second ligand spécifique de ladite substance donnée, ledit second ligand étant porteur d'une activité détectable, puis on mesure l'activité du second ligand fixé. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le second ligand est couplé à un enzyme et que l'on mesure l'activité de l'enzyme. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, après avoir épuisé le milieu liquide à analyser par plu- sieurs passages successifs dans la cellule de filtration tan- gentielle comprenant une membrane portant un ligand spécifi- que d'une substance donnée, on fait passer à travers ladite cellule un liquide contenant un second ligand spécifique de ladite substance donnée, ledit second ligand ayant été au préalable fixé sur de petites particules marquées par une substance détectable et capables de se maintenir en suspen- sion dans le milieu liquide. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la substance détectable est un colorant. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on immobilise sur la membrane une quantité connue d'un ligand spécifique d'une substance donnée, en vue de la déter- mination quantitative de ladite substance. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on effectue la détermination quantitative de ladite substance par capture directe du ligand. 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on effectue la détermination quantitative par compéti- tion entre un ligand en solution et un ligand immobilisé sur la membrane au préalable. 14. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on mélange, dans le milieu liquide à analyser, la subs- tance à doser à l'état libre avec une quantité connue de la même substance fixée sur une protéine enzymatique ou sur de petites particules individuelles marquées par une substance détectable par un moyen physique, chimique ou biologique, avant d'introduire le-milieu liquide dans la cellule de fil- tration. 15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en immobilisant sur la membrane l'un des deux éléments constituant l'un ou plusieurs des couples choisis dans le groupe suivant: marqueur de cellules /cellules, marqueur de microorganisme/organisme, HcG/ récep- teur tissulaire, anticorps/antigène, haptène/anticorps, ADNc/ADN, poly dT/ARNm eucaryote, enzyme/substrat, enzyme/ inhibiteur d'enzyme, lectine/glycoconjugué. 16. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de la revendication 1, comprenant une cellule de détection et/ou de mesure, un module hydraulique pour la circulation des liquides à analyser et des moyens pour assurer l'étanchéité du dispositif, caractérisé en ce que ladite cellule comprend une ou plusieurs enceintes, chaque enceinte comportant un espace interne pour le passage l'échantillon liquide et un support perforé pour une membrane microporeuse sur laquelle des ligands sont immobilisés.