Brevet FR2701953A1 — publié le 19940902

La présente invention concerne la production d'un neuropeptide VIP (Vasoactif Intestinal Peptide) recombinant, en particulier un VIP dont l'acide aminé en position C-terminale n'est pas amidé. Le VIP est un neuropeptide de 28 acides aminés et de masse molaire 3326, généralement extrait des cellules intestinales, des tissus nerveux et des cellules endocrines. Le VIP est un médiateur connu de la vasodilation des vaisseaux sanguins du cerveau, de la stimulation de la production de prolactine ou encore de la sécrétion endocrine, pancréatique. Le VIP est principalement obtenu par extraction tissulaire ou encore par voie de synthèse chimique. Cempte-tenu de la taille du peptide et des rendements de la synthèse chimique, l'intérêt d'employer les techniques du génie génétique s'est rapidement fait sentir. Le gène précurseur du VIP humain a été isolé et caractérisé, notamment par Bodener et al. (Proc. Nat. Acad Sci., USA, 1985, 82, 3548-3551), ainsi que sa transformation, son intégration dans un plasmide et son expression dans un microorganisme hôte (W.O-A-89/05857). Toutefois, si le VIP a une taille trop importante pour que sa synthèse chimique soit rentable, le fait qu'il ne contienne que 28 acides aminés est également un inconvénient pour sa production par les techniques de génie génétique. Il a été trouvé que l'utilisation de la technique dite des protéines fusionnées permettait d'obtenir le VIP dans de bonnes conditions. La présente invention concerne donc un polypeptide fusionné de formule X-T-(A-VIP-B-C) -A-VIP-B-Y n dans laquelle VIP représente substantiellement la séquence peptidique His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X1et- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Le u-Asn, X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique > Nlet-Hls- -Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser, T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser dans le cas où X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Arg-Gly-Ser dans l'autre cas. A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser, Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre 0 et 31. De préférence, n est compris entre I et 31. La présence d'une protéine marqueur peut présenter un intérêt lors de la purification du polypeptide fusionné selon l'invention. D'une manière préférentielle, X est choisi parmi la glutathion S-transférase (GST). De même, compte tenu du mode de préparation du polypeptide selon l'invention par les techniques de génie génétique, n est de préférence choisi parmi les entiers 0, 1, 3, 7, 15 ou 31. La présente invention concerne également le gène codant pour le polypeptide fusionné ci-dessus. Elle concerne également un plasmide d'expression comprenant le gène selon l'invention, sous la dépendance de séquence d'ADN assurant son expression dans un microorganisme hôte, et le microorganisme transformé comprenant au moins un de ces plasmides. D'une manière avantageuse, ce microorganisme est E. coli JM 105 (ATCC n" 47016). Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation de VIP recombinant comprenant les étapes suivantes - de culture du microorganisme selon l'invention dans des conditions d'expression du polypeptide fusionné, - d'extraction et de purification du polypeptide fusionné, - de clivage, séquentiel ou combiné des sites A-VIP et VIP-B par un agent de clivage approprié, et - de purification du VIP. Le polypeptide fusionné est de préférence extrait par sonication et centrifugation des bactéries soniquées. L'agent de clivage du site A-VIP est de préférence la facteur Xa ou la thrombine, alors que l'on emploie l'hydroxylamine comme agent de clivage du site VIP-B. La présente invention concerne également un neuropeptide VIP recombinant obtenu par le procédé ci-dessus. Compte tenu de son procédé de préparation, la présente invention concerne enfin un polypeptide intermédiaire pour la préparation de VIP recombinant, répondant à la formule (VIP-B-C-A)n ou (B-C-A-VIP) avec A, B, C et n tels que définis précédemment. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple et des figures ci-après. La figure 1 (la et lb) représente le schéma de construction des plasmides. La figure 2 représente une autoradiographie du gel de séquence du plasmide pUCl8 dans lequel a été inséré l'oligonucléotide VIP de séquence (brin anti-sens) 3' CTTGTGAGGC TGCGACAAAA GTGGCTGTTG 30 ATGTGGGCTG ACGCATTTGT CTACCGACAA 60 TTTTTTATGG ACTTGAGGTA GGACTTGCCA 90 CTT 5' La figure 3 représente un gel d'agarose à 2% montrant l'insertion séquentielle des unités VIP dans le plasmide pUC pUC deltaS-FXa. Tous les plasmides ont été digérés par Pvull. a) et h) marqueur de poids moléculaire b) pUC deltaS-FXa c) pUC deltaS-FXa1VIP d) pUC deltaS-FXa2VIP e) pUC deltaS-FXa4VIP f) pUC deltaS-FXa8VIP g) pUC delatS-FXal6VIP La figure 4, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride G1V représente un gel de polyacrylamide SDS 12,5% coloré au bleu de Coomassie montrant a) les protéines totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) la protéine hybride purifiée après passage sur colonne sépharose glutathion. La figure 5, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride G16V, représente un gel de polyacrylamide SDS 12,50j coloré au bleu de Coomassie montrant a) les protéine totales de E. coli avant induction par 1'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par 1'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine après lavage. La figure 6, relative au clivage de la protéine hybride GIV par le facteur Xa, représente un gel de polyacrylamide-SDS 16,500 glycérol coloré au bleu de Coomassie montrant piste a) la protéine hybride purifiée par chromatographie d'affinité, piste b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 1, 2, 3 et 5 heures respectivement, à 25"C, dans un rapport enzyme/substrat de 1/50. piste V), VIP témoin piste M), marqueurs de poids moléculaire La figure 7, relative au clivage de la protéine hybride G16V par le facteur Xa représente un gel dénaturant en gradient de polyacrylamide 12% à 20% coloré au bleu de Coomassie montrant piste a) la protéine hybride soluble pistes b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 15, 30, 45 minutes et 3 heures respectivement à 25"C, dans un rapport enzyme/substrat de 1/50. piste f) monomère VIP (4,4 kDa) purifié sur colonne HPLC (caractéristiques: légende Fig.8). piste h) dimère VIP purifié sur colonne HPLC. La figure 8 représente le diagramme de purification du monomère et du dimère VIP sur colonne analytique HPLC de type Vydac, C18, Sum, 300A end capped 1. monomère VIP (Fig.7 piste f) 2. dimère VIP (Fig.7 piste h) La figure 9 représente le diagramme d'analyse par électrophorèse capillaire de la fraction purifiée du monomère VIP. a) VIP témoin b) monomère VIP rallongé de 10 acides aminés après clivage de la protéine de fusion par le facteur Xa et séparation par HPLC. La figure 10 représente l'analyse par Western blot de la purification de la protéine G16V et sa digestion par le facteur Xa a) les protéines totales de E. coli avant induction par 1'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par 1'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine G16V purifiée f) la protéine G16V clivée par le facteur Xa dans les conditions décrites précédemment g) monomère VIP purifié h) VIP témoin La figure Il représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiodé par la protéine G1V aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) I la) VIP témoin ( # ) protéine G1V () et G1V digéré par le facteur Xa ( ) 3 heures à 25 C dans un rapport enzyme/substrat : 1/50. 11b) Témoin Facteur Xa dans le tampon d'incubation. La figure 12 représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiodé par le VIP monomère (4,4 kDa) purifié (Fig. 7 piste f) aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) : VIP témoin (1) et monomère VIP (2). EXEMPLE : FUSION GSTVIP et GSTpolyVIP I. Généralités A) Synthèse du gène Un oligonucléotide de synthèse codant pour le site de coupure du facteur Xa (séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg) est inséré dans le plasmide pGEX-2T disponible dans le commerce, en 3' et en phase avec le gène de la Glutathion S-transférase dans les sites BamHI et EcoRI. Ile Glu Gly Arg 5' CA TCC ATC GAA GGT CGA CAC CCC CCC G 3' 3' G TAG CTT CCA GCT GTG CCG CCC CTT AA 5' BamHI SalI 5maI EcoRI Entre l'extrémité 3' du gène de la glutathion S-transférase (GST) et l'extrémité 5' du gène de l'oligonucléotide codant pour site de coupure du facteur Xa, se trouve porté par le plasmide pGEX 2T un enchaînement de nucléotides codant pour le site de coupure de la thrombine (séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). Ce site permet d'envisager à l'aide de la thrombine la séparation ultérieure de la GST et d'un VIP ou polyVIP contenant des acides aminés surnuméraires. Le gène VIP (cf séquence, fig. 2) ou polyVIP est inséré dans le site SalI rempli, en 3' de la séquence nucléotidique codant pour le facteur Xa et en phase avec ce dernier. L'insertion séquentielle de gènes VIP peut permettre de mieux maîtriser l'addition d'unités VIP et d'obtenir un concatémère plus grand. B) Caractéristiques de la protéine - Elle est purifiable par chromatographie d'affinité sur colonne CH Sépharose 4B-Glutathion (un seul VIP) ou à partir de corps d'inclusion (polyVIP). - Les différentes unités VIP rajoutées seront séparées par un peptide de 10 acides aminés contenant à l'extrémité N-terminale le site de coupure de l'hydroxylamine et à l'extrémité C-terminale le site de coupure du facteur Xa soit: VIPjGly-Ser-Thr-Pro-Arg-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP NH2OH Facteur 2 - L'action du facteur Xa libère le poly(VIP) sans acide aminé résiduel à l'extrémité N terminale. - A l'extrémité C terminale de chaque VIP, une glycine permet lors de la coupure par l'hydroxylamine l'élimination des acides aminés surnuméraires. II. Construction de la fusion (fig. 1) a) Le plasmide pUC18 est digéré par SalI, rempli par le fragment de Klenow et refermé sur lui-même par la T4 DNA ligase, ce qui permet l'élimination du site SalI. Le plasmide obtenu est dénommé pUC18deltaS. b) L'oligonucléotide de synthèse, codant pour le site de coupure du facteur Xa, est inséré dans les sites BamHI/EcoRI du plasmide pUC 18 deltaS. c) Ce plasmide, appelé pUC18deltaS-FXa, est digéré par SalI et le site est rempli par le fragment de Klenow puis ligaturé avec l'oligonucléotide VIP (cf fig. I). d) Un clone recombinant comportant l'oligonucléotide VIP dans le sens correct (le sens d'insertion est vérifiable par analyse des fragments de restriction) est séquencé afin de vérifier de manière précise les séquences des oligonucléotides codant pour le VIP et le site de clivage par le facteur Xa, le maintien de la phase et des sites de restriction (cf fig. 2). e) A partir de ce plasmide, on peut récupérer le fragment BamHI rempli/EcoRI et le réinsérer dans ce même plasmide ouvert par SmaI/EcoRI (cf fig. 1). On obtient alors 2 unités VIP fusionnées avec maintien de la phase de lecture. Cette opération peut être répétée de façon à réaliser des fusions comportant 2, 4, 8, 16 et 32 gènes VIP. L'insertion de ces derniers peut être visualisée par l'augmentation de la taille du plasmide ou de celle d'un fragment issu de la digestion du plasmide par PvuII. Deux sites PvuII sont présents dans le pUC18 de part et d'autre de la fusion de gènes. En conséquence, le pUC18deltas-FXa digéré par PvuII donne une bande à 2360 bp environ et une bande à 350 bp (fig. 3, piste b). L'insertion d'une unité du gène VIP dans ce plasmide entraîne un accroissement de taille de 87 bp et l'apparition d'une bande vers 440 bp après digestion (piste c) ; la présence de deux unités VIP l'augmente d'environ 200 bp soit 540 bp (piste d) et ainsi de suite jusqu'à 16 VIP (respectivement, piste e, f et g). f) Après insertion d'un nombre donné de gènes VIP, on peut récupérer le concatémère, par digestion EcoRI/BamHI, et le fusionner au gène de la GST dans le plasmide pGEX-2T ouvert par BamHI/EcoRI. III. Synthèse et purification des protéines de fusion Après transformation de bactéries compétentes (souche JM 105 d'E. coli) par le plasmide pGEX-FXaVIP (ne comportant qu'un seul gène VIP) les clones recombinants produisent une protéine de fusion après induction de la synthèse par 1'IPTG en phase exponentielle de croissance (DO555 = 0,65). La figure 4 montre la migration des protéines totales d'E. coli après électrophorèse dans des conditions dénaturantes. On observe bien, après induction, l'apparition d'une bande vers 30 kDa correspondant à la masse théorique de la protéine hybride avec un seul VIP (G1V) (fig. 4, piste b). Les résultats sont confirmés par dosage de l'activité glutathion S-transferase à partir de la culture. Dans ce cas précis, la protéine hybride est soluble et peut être purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne glutathion agarose à partir d'un extrait cytoplasmique bactérien (figure 5, piste c). Cette purification, basée sur l'aptitude de la protéine marqueur (la GST) à se lier de manière réversible au glutathion réduit, donne un rendement en protéine hybride de l'ordre de 90%. Le même protocole a été suivi pour la fusion de la GST avec 8 VIP (G8V) ou 16 VIP (G16V) (fig. 5). Dans ce dernier cas, il y a apparition d'une bande vers 100 kDa qui correspond à la protéine hybride (fig. 5, piste b) (masse moléculaire théorique 96,5 KDa). Cependant des corps d'inclusion se forment, agrégats insolubles composés pour une grande part de la protéine de fusion. Dans ce cas la protéine d'intérêt se retrouve dans le culot de sonication (figure 5, piste d). Sous cette forme agrégée, la protéine marqueur est dénaturée. Elle perd son activité et ne peut plus servir à la purification de la protéine de fusion par chromatographie d'affinité. Ainsi, des lavages successifs ont été réalisés dans des conditions dénaturantes faibles (Triton X100 0,5%, EDTA lmM) afin d'éliminer spécifiquement les débris cellulaires de manière à enrichir le culot en protéine hybride insoluble. Celle-ci est ensuite solubilisée dans de l'urée 10 M, DTT 10 mM, SDS 0,5% et dialysée contre une solution Tris HC1 10 mM pH 8,0, EDTA îmM, puis contre de l'eau en vue de la digestion par le facteur Xa (fig. 5, piste e). Cependant, dans ces conditions, la protéine de fusion redevient parfois insoluble, avec apparition de micro-agrégats, qui n affecteront pas toutefois l'action ultérieure du facteur Xa. IV. Clivage des protéines hybrides a) Clivage de la protéine G1 V La protéine hybride se compose des séquences suivantes GST -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-Pro- rg a b Gly-Ile-His-Arg-Asp GST : séquence de la GST a : site de clivage du facteur Xa VIP: : séquence du VIP b : site de clivage de l'hydroxylamine L'étape suivante consiste donc à cliver cette protéine par le facteur Xa (afin de séparer le VIP de la protéine marqueur). L'action de l'hydroxylamine, libère ultérieurement le VIP des acides aminés surnuméraires, résultant de la constrution choisie. La figure 6 montre l'analyse électrophorétique de la digestion opérée avec le facteur Xa. On remarque une diminution de l'intensité de la bande vers 35 kDa au profit de celle correspondant à la GST (26 kDa) ce qui indique une coupure effective par le facteur Xa au niveau du site attendu. b) Clivage de la protéine G(n+l)V La protéine hybride se compose des séquences suivantes GST-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-(Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg a b S er) n -Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-F)ro-Arg-Gly-Ile-His-Arg-Asp a b avec n = 7, 15 ou 31. La même digestion que précédemment est réalisée et analysée par électrophorèse pour n = 15 (fig. 7). On remarque l'apparition d'une bande qui migre au bas du gel dans la zone correspondant au VIP et dont l'intensité augmente rapidement avec le temps de digestion. Selon les conditions expérimentales, une série de bandes intermédiaires sont obtenues. Elles correspondent à des intermédiaires de la digestion de la protéine de fusion par le facteur Xa, notamment des peptides comprenant 2, 3, 4 ... VIP. Les bandes correspondant au mono mère et dimère de VIP sont purifiées sur colonne HPLC (fig. 8). La fraction monomère est analysée par électrophorèse capillaire afin de confirmer la pureté de l'échantillon (fig. 9). L'analyse de la séquence des 10 premiers acides aminés du côté N-terminal est en tous points conforme à celle du V1P naturel. L'utilisation d'anticorps polyclonaux anti-VIP a révélé que ces intermédiaires cités ci-dessus comportaient bien du VIP (fig. in)). V. Dosage de l'activité du VIP Dans le but de vérifier si le VIP produit sous la forme fusionnée ou libéré après le clivage garde son activité, des tests de déplacement de la liaison du VIP radio iodé à son récepteur sont réalisés (lignée cellulaire HT 29). La protéine G1V ne déplace pas la liaison du VIP radioiodé (figure 9a). Cependant après une incubation de cette protéine pendant 3 heures en présence de facteur Xa, on observe un déplacement mais avec une constante de dissociation (KD) 500 fois plus forte qu'avec du VIP froid. Un témoin réalisé en présence de facteur Xa seul montre que le déplacement est bien dû à la protéine hybride digérée (figure 1 lob) et montre qu'il y a bien libération d'un peptide actif. Une expérience de déplacement de la liaison du VIP radioiodé par le monomère VIP purifié (fig. 12) montre que ce dernier se lie au récepteur des cellules HT 29 avec une constante de dissociation similaire à celle du VIP témoin. REVENDICATIONS 1. Polypeptide fusionné de formule X-T-(A-VIP-B-C) -A-VIP-B-Y pour laquelle VIP représente substantiellement la séquence His-Ser-Asp-Ala-Val-F)he-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Cln-Met- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn, X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Met-His Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser dans le cas ou X représente une protéine maqueur ou la séquence peptidique Arg-Gly-Ser dans l'autre cas. A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser, Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre O et 31. 2. Polypeptide fusionné selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est un entier compris entre 1 et 31. 3. Polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la protéine marqueur est la glutathion S-transférase (GST). 4. Polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que n représente 0, 1, 3, 7, 15 ou 31. 5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que X représente la glutathion S-transférase, T représente Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, A représente Ile-Glu-Gly-Arg, B représente Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente Ser Y représente Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n est égal à 7, 15 ou 31. 6. Gène codant pour un polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Plasmide d'expression comprenant le gène selon la revendication 6, sous la dépendance de séquence d'ADN assurant son expression dans un microorganisme hôte. 8. Microorganisme transformé comprenant au moins un plasmide selon la revendication 7. 9. Microorganisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit de E. coli JM 105. 10. Procécé de préparation de VIP recombinant, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes suivantes de - culture du microorganisme selon l'une des revendications 8 ou 9 dans des conditions d'expression du gène codant pour le polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 à 5, - extraction et purification du polypeptide fusionné. - clivage séquentiel ou combiné des sites A-VIP et VIP-B, par un agent de clivage approprié, et - extraction et purification du VIP. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polypeptide fusionné est extrait par sonication et centrifugation des bactéries soniquées. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou Il, caractérisé en ce que l'agent de clivage approprié du site A-VIP est le facteur Xa ou la thrombine. 13. Procéde selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'agent de clivage du site VIP-B est l'hydroxylamine. 14. Neuropeptide VIP recombinant obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 13. 15. Polypeptide intermédiaire pour la préparation de VIP recombinant, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (B-C-A-VIP)n ou (VIP-B-C-A)n avec VIP, A, B, C et n tels que définis dans l'une des revendications I à 4.