Brevet FR2709966A1 — publié le 19950324

1. La présente invention a trait à un vaccin inactive, capable d'empêcher le syndrome de la reproduction et respiratoire du porc, en particulier, contenant le virus responsable de ladite maladie sous une forme inactivée. Historique de l'invention: Cette maladie connue sous le nom de syndrome respiratoire et de la reproduction en porc (PRRS) affecte les truies gravides chez lesquelles il peut provoquer une anorexie, des avortements, des mort-nés, des foetus morts, des cochonnets faibles qui meurent de problèmes respiratoires après la mise bas et des problèmes de reproduction (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Commitee Meeting, October 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA). Quelques cas ont été décrits chez lesquels des truies infectées présentent des tâches bleues sur les oreilles, c'est pour cette raison que la maladie a aussi été connue sous le nom de "avortement bleu" ou "maladie des oreilles bleues du cochon" (veterinary Record, Vol. 130, no.3, January 18, 1992). D'autres noms ont été donnés à cette maladie comme "maladie mystérieuse du cochon" (MPD), "maladie mystérieuse du porc" (MSD), "syndrome mystérieux de la reproduction" (MRS), "syndrome respiratoire et d'infertilité du cochon" (SIARS) ou "syndrome respiratoire et d'avortement épidemique porcin" (PEARS). Les premières manifestations épisodiques de cette maladie apparurent aux Etats-Unis et au Canada en 1987. En Europe, la première manifestation a été détectée en Allemagne en 1990, d'o elle s'est étendue aux Pays-Bas et en Belgique fin 1990 et début 1991. En Espagne les premiers cas de cette maladie ont été détectés en mi-janvier 1991, quand d'importantes altérations respiratoires furent observées chez un lot de 300 cochonnets importés d'Allemagne (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, no.11, 1991). Peu après, chez deux troupeaux d'élevage qui étaient situés à 500 mètres du troupeau o le problème initial fut observe, une maladie a été détectée et caractérisée par un nombre anormalement élevé d'avortements durant la phase terminale de gestation, autant que 70 % de mortalité chez les cochonnets. L'analyse des signes cliniques observes, et considérant que (i) ces troupeaux étaient soumis à un programme de vaccination intensif contre la parvovirose porcine, la maladie d'Aujeszky et l'influenza porcine, et que (ii) les essais en laboratoire ont écarté la présence d'autres maladies abortives, la présence clinique du PRRS fut suspectée. Dans des échantillons provenant de ces exploitations l'agent causal de cette maladie a été isolé tel que décrit ultérieurement en plus amples les détails ci- dessous. Un certain nombre d'agents ont été corrélés avec ce procédé d'infection, parmi lesquels on a: le virus de l'encéphalomyocardite, l'influenza porcine, la fièvre classique du cochon, la fièvre africaine du cochon, la maladie mucosale, la maladie d'Aujeszky, la brucellose, la leptospirose, la fièvre Q, la parvovirose et la maladie chlamydiale, bien que des auteurs l'aient aussi lié à des mycotoxines (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Commitee Meeting, supra; Mengeling, W.L. and Lager, K.M., "Mystery Pig Disease: Evidence and considerations for its etiology", in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, Supra; Dea et al., "Virus isolation from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems", Proceedings of the Mystery Swine disease Committee Meeting, supra; Van Alstine, W."Past diagnostif approches and findings and potential useful diagnostif strategies", in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Loula, T. Agri-Practice, 12(1): 23-33, 1991;Woolen, N. et al., J. Am. Vet. Assoc. 197: 600-601, 1990). La demande de brevet PCT publié sous le numéro de publication WO 92/21375, sous le nom de Stitching Centraal Diergeneeskundig Institut (CDI), décrit l'isolation d'un virus dénommé "l'agent Lelystad" (LA) ou le "virus Lelystad" (LV) qu'ils ont identifié comme l'agent causal de la maladie dénommée jusqu'à maintenant sous le nom de MSD. Le LV isolé quand il est inoculé par voie intranasale chez des truies gravides provoque une perte de l'appétit et même un refus de manger durant 4 à 10- 12 jours après l'inoculation, des désordres de la reproduction et une colorations bleue sur les oreilles chez quelques truies infectées 9 à 10 jours après l'inoculation. Cependant, il a aussi été observé dans 2 cas sur les 8 truies infectées expérimentalement, que la maladie n'a pas été reproduite (voir le tableau 6 de ladite demande PCT), puisque chez une des truies le nombre de cochonnets nés vivants et survivants la première semaine est grand (6 sur 9, truie 1305) et une autre truie a eu deux cochonnets mort-nés alors que les 9 autres survécurent la première semaine (truie 1065). Le virus LV isolé par CDI appartenant au genre des artériviridés a un génome fait de 1 molécule d'ARN polyadénylé de 14,5 à 15,5 kb de long (déterminé en gel d'agarose neutre), qui se réplique par le moyen d'un ensemble d'ARN subgénomique à l'extrémité 3'. La demande PCT précitée montre la séquence nucléotidique du génome du LV, les 8 possibles cadres ouverts de lecture (ORF), la séquence d'acides aminés déduite à partir des ORF identifiés et les sites putatifs de N-glycosilation. Postérieurement, on a isolé d'autres virus causals du PRRS dans des exploitations en Allemagne, en France et en Espagne. Le virus isolé à TUbingen, Allemagne (TV) [Virology, 193, 329-339 (1993)] présente 99,3 % d'homologie avec le LV au niveau nucléotidique contenu dans les ORF 2 à 7 (il y a 24 paires de base différentes sur un total de 3316 paires de base incluses dans cette région). La séquence d'acides aminés TV déduite présente 99,2 % d'homologie avec le LV (il n'y a que 10 acides aminés différents dans la séquence déduite d'acides aminés codée par les ORF 2 à 5 puisqu'il n'y a pas de différence dans les séquences déduites des ORF 6 et 7). D'autre part, l'homologie trouvée entre le LV et le TV contre le virus isolé dans notre laboratoire (Souche espagnole ou SV) est faible. Jusqu'à maintenant, on n'a comparé que les séquences nucléotidiques et d'acides aminés correspondant aux ORF 3 à 7 avec les résultats suivants: 1. Il y a 95,5 % d'homologie au niveau nucléotidique du SV par rapport au LV ou TV (sur un total de 2599 paires de base, il y a eu 144 différentes) et 2. Il y a 94,9 % d'homologie au niveau acides aminés entre le SV et le LV ou TV (sur un total de 955 acides aminés, on a trouvé un total de 47 acides aminés différents). Ces variations d'acides aminés pourraient être liées à la forte pathogénicité d'une souche en comparaison avec les autres, c'est pour cette raison que le virus isolé dans nos laboratoires (la souche espagnole) est plus pathogène que les autres virus PRRS connus. Par exemple, le virus isolé en France (souche française), montré dans l'exemple 8 de cette description, o l'on peut observer que le pourcentage de cochonnets nés vivants d'une truie infectée avec la souche française est de 75 % alors que le pourcentage est de 9,5 % quand les truies sont infectées avec la souche espagnole (Tableau 12 et 14). Le pourcentage est de 61 % quand les truies sont infectées avec le LV (Tableau 6 de la demande de PCT n WO 92/21375) puisque 58 cochonnets sont nés vivants sur un total de 95 cochonnets. La maladie cause de sérieuses pertes dans l'industrie porcine puisqu'elle peut provoquer, dans les premières manifestations aiguës, une mortalité de 70 % des cochonnets dans une portée. Un moyen de résoudre le problème créé serait de conduire un programme de vaccinations approprié qui permettrait la prévention de l'apparition de la maladie. C'est à cette fin que les vaccins capables d'amener à une prévention efficace du PRRS seraient nécessaires. La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 93/06211 sous le nom de Collins, J.E., et Benfield, D. A., se réfère à un vaccin contre MSD contenant un agent infectieux isolé à partir de poumons de cochons infectés avec le MSD. Cependant, ladite demande PCT ne décrit pas la caractérisation ou l'identification de l'agent infectieux, de même que l'agent infectieux n'a pas été déposé dans une institution de dépôts autorisée quelconque. Pour tout ceci, la réalisation des connaissances à partir de cette demande PCT présente de sérieux problèmes de reproductibilité du fait que le produit décrit dans la demande PCT ne peut être vérifié et que les résultats obtenus ne peuvent être comparés avec ceux obtenus par les requérants du PCT. De même, dans cette demande PCT on exprime pas clairement l'antigène ni l'adjuvant utilisé dans la formulation du vaccin qui, comme nous le vérifieront postérieurement, joue un rôle très important, ainsi que les exemples décrits qui démontrent la puissance et l'efficacité desdits vaccins. La demande PCT publiée sous le n WO 93/07898 porte, entre autres choses, sur l'identification de l'agent causal du PRRS et sur les vaccins en dérivant. Le virus isolé a des caractéristiques similaires au LV mais, contrairement au virus isolé dans notre laboratoire, il n'est pas capable de pousser sur des cellules ST (Cellules de testicules de porc) à un niveau détectable. Apparemment, le vaccin a été efficace, mais le niveau de protection n'a été efficace que dans approximativement 52 % des animaux vaccinés seulement, ce qui a été considéré comme un niveau relativement faible de protection, spécialement si nous considérons que le titre viral employé dans la dose vaccinale est élevé. De plus, cette demande PCT n'apporte aucune information sur l'organisation du génome du virus ni sur les protéines codées, pour ces raisons la comparaison entre ce virus et le virus obtenu dans nos laboratoires ne peut être réalisée ou pourrait être réalisée mais en exerçant des efforts de recherche injustifiables. Par conséquent, le besoin de vaccins capables de prévenir le PRRS continue d'exister. Dans le but de résoudre ce problème, cette invention fournit un vaccin capable de protéger efficacement les truies contre cette maladie infectieuse. La phase antigénique de ce vaccin est composé d'un isolat espagnol inactive. L'invention fournit aussi des combinaisons de l'antigène viral PRRS isolé (souche espagnole) conjointement avec différents pathogènes porcins dans le but de fournir des vaccins bi-ou multivalents. Brève description des figures Les figures 1 à 5 montrent les séquences de ADNC correspondants aux ORF 3 à 7, respectivement, du virus PRRS (souche espagnole) ainsi que les séquences déduites des acides aminés codés pour chaque ORF. Les figures 6 à 10 montrent l'homologie et les différences existant entre le LV et le virus isolé dans nos laboratoires, au niveau des séquences en acides aminés déduites à partir des ORF 3 à 7. Les acides aminés sont exprimés en accord avec le code à 1 lettre. La ligne du haut toutes les deux lignes, correspond à la séquence en acides aminés du LV, alors que la ligne du dessous correspond à celle isolée dans nos laboratoires (souche espagnole). Les acides aminés homologues sont représentés par deux traits verticaux, alors que quand il y a des substitutions de quelques acides aminés par d'autres, ils sont représentés par deux points verticaux dans le cas de substitutions conservatives, à savoir, la substitution d'un acide aminé par un autre équivalent fonctionnellement. L'absence de traits et de points verticaux entre les deux acides aminés représente l'existence de substitution non conservatives. Description détaillée de l'invention 1. Echantillons 1.1 Animaux choisis pour isoler le virus On a choisi des foetus, des cochonnets nouveau-nés et des cochonnets vivants mais faibles de 1 à 10 jours d'âge et la progéniture de truies étudiées avec des problèmes cliniques dus au PRRS. 1.2. Préparation des échantillons. On a obtenu des échantillons de poumons, de rate, de foie, de reins, de cerveau et de coeur de cochonnet par autopsie. Dans un cas particulier, les échantillons sont préparés à partir de poumons d'un cochonnet mortné, né d'une truie suspectée d'être infectée par le PRRS. Avec ce poumon, on a préparé un homogénat avec du DMEM (GIBCO), (10 g de poumon dans 90 ml de DMEM) complémentés avec une solution d'antibiotiques (PEG) composée de 1000 IU/ml de pénicilline, 1 mg/ml de streptomycine et 0,5 g/ml de gentamicine. On a laissé la suspension résultante pendant 1 heure à 4 C, on l'a congelée et décongelée deux fois, centrifugée et le surnageant obtenu est conservé à -70 C pour l'infection de macrophages alvéolaires de poumon de cochon. Dans un autre cas, on a préparé des échantillons de poumons à partir de cochonnets nés vivants mais qui sont morts quelques heures après leur naissance, à l'aide un procédé similaire. De plus, le sang est extrait des animaux par ponction de la veine cave pour obtenir (i) du plasma sanguin, qui sera conservé à -70 C et utilisé pour l'isolation de virus, et (ii) du sérum, qui sera utilisé pour effectué la titration des anticorps. 2. Macrophages alvéolaires de poumon de cochon 2.1. Obtention On a utilisé des cochons séronégatifs pour la maladie d'Aujeszky, la parvovI rose porcine, la maladie de la bouche et du pied, la fièvre classique du cochon, l'influenza du cochon (type HlNl et H3N2), et la gastro-entérite transmissible. L'âge des cochons utilisés variant entre 7 à 8 semaines. On a anesthésié les animaux avec du phénobarbital sodique avant l'extraction des poumons, que l'on a réalisée en ligaturant d'abord la trachée, sous l'épiglotte et en sectionnant au dessus de la ligature. Une fois le poumon extrait, on le lave extérieurement avec du sérum physiologique, et on introduit ensuite une solution de PBS et PEG d'antibiotiques à l'aide de lavages successifs. Les cellules obtenues à partir de ces lavages sont soumises à une centrifugation pendant 10 min à 300 g et re mises en suspension dans un milieu DMEM [(Milieu DMEM complété avec des acides aminés essentiels (GIBCO), 1 % de pyruvate de sodium 1 mM et 1 % de glutamine 2 mM)], 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et une solution PEG d'antibiotiques à 1L. Le comptage des cellules est fait dans des chambres Newbauer. 2.2. Contrôle de stérilité On vérifie que les macrophages alvéolaires de poumon de cochon ne sont pas contaminés par des bactéries, des champignons et d'autres virus, à l'aide de tests appropriés. De plus, le bon état général des cellules est vérifié par microscopie optique. L'absence de contamination par des microplasmes est aussi vérifiée par détection cytochimique avec du DAPI (416-diamine-2-phénylindole) qui se fixe sélectivement à l'ADN et formes des complexes d'ADN-DAPI ayant une forte fluorescence et spécificité élevée. 3. Isolation du virus 3.1. Isolation du virus et de croissance virale sur des macrophages alvéolaires de poumon de cochon. Une culture de macrophages alvéolaires de poumon de cochon, précédemment préparée dans du milieu MDEM et FCS à %, était infectée avec un homogénat d'un échantillon suspecté pour contenir l'agent causal du PRRS. L'échantillon est composé, dans un cas, d'un isolat de poumon provenant d'un cochonnet mort-né, né d'une truie qui présentait des signes cliniques de PRRS, alors que dans un autre cas, on a utilisé des isolats de poumon provenant d'un cochonnet né vivant mais qui est mort après quelques heures, progéniture d'une truie avec les symptômes du PRRS, ainsi que d'un isolat provenant de plasma sanguin. L'homogénat était gardé en contact avec la culture de macrophage à 37 C pendant 1 heure. Ensuite, on a retiré l'inoculum et on a ajouté du DMEM frais avec 2 % de FCS et 1 % d'une solution de PEG, on a tamponné la culture avec du C02 et on l'a incubé à 370 pendant plusieurs jours durant lesquels on observe au microscope l'effet cytopathique (CPE) produit par le virus sur les macrophages: à 3-4 jours après l'infection (dpi) l'effet cytopathogène était de 70 à 80 % (des cellules géantes déformées apparaissent). Les cultures étaient congelées à -80 C. Simultanément, on a préparé une culture de macrophage alvéolaire de poumon de cochon exempte de PRRS pour servir de témoin négatif. On a prépare des sous-cultures avec le virus isolé et on observe qu'il y a 100 % de CPE dans le second dpi. Le virus était congelé à - 80 C pour sa caractérisation et identification ultérieure. De façon similaire, on a isolé le virus du plasma sanguin et d'autres échantillons provenant de cochonnets mort-nés ou de cochonnets faibles vivants mais nés de truies infectées expérimentalement. Un des virus isolés, en particulier le virus dénommé PRRS-CY-218-JPD-P56-91, était isolé de poumons de cochonnets mort-nés. Il est capable, dans des conditions expérimentales, de reproduire la maladie, et possède les caractéristiques mentionnées dans la section 4 et il a été déposé dans la collection européenne de culture de cellules animales (ECACC), à Salisbury (Royaume-Uni), le 29 juin 1993 avec le n0 de dépôt V93070108. 3.2. Croissance virale dans un autre système de cellules. Avec le virus isolé (Souche espagnole) on a infecté des macrophages alvéolaires de poumon de cochon et des cellules ST [(lignée cellulaire continue de testicules de cochons) ATCC CRL 1745 ST] en co-culture, comme première étape pour l'adaptation du virus aux cellules ST. Après plusieurs séries de passage (5-6) sur des co-cultures de cellules ST et de macrophages et des cultures de cellules ST seules, les titres d'infection de virus sont de l'ordre de 106 TCID50/ml quand on a infecté par co-culture les macrophages et les cellules ST, et de l'ordre de 104,5 TCID /ml pour le virus' obtenu à partir de cellules ST seules [TCID50, dose de tissu de culture infectieux à 50 %]. De plus, des macrophages alvéolaires de poumons de cochons peuvent aussi être immortalisés par fusion avec des cellules ST à l'aide d'une hybridation. En variante, des macrophages alvéolaires de poumons de cochon peuvent être immortalisés par fusion avec la lignée cellulaire L-14 (cellule B de sang périphérique de porc) ECACC n0 91012317, ou une lignée cellulaire Jag-1 (lignée de cellules de trophoblaste porcine) fournies par le Dr. Jag Ramsoondar []. Les procédés de fusion sont réalisés selon les techniques classiques et utilisées dans cette étude. En variante, les virus peuvent pousser sur des cellules ST ou d'autres lignées cellulaires porcines dans lesquelles on a introduit les gênes codant pour les récepteurs membranaires des macrophages alvéolaires de poumons de cochon pour le virus PRRS. Les virus produits avec ces systèmes cellulaires sont capables d'être utilisés dans l'élaboration de vaccins à la fois vivants ou inactivés. 4. Identification et caractérisation du virus. 4.1 Dénomination et dépôt du virus Le virus isolé à partir de poumons de cochonnets mort-nés dénommé PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, a été déposé à la collection européenne de culture de cellules animales (ECACC), à Salisbury (Royaume-Uni) le 29 juin 1993 avec le n de dépôt v93070108. Dans la présente description, occasionnellement, le virus est décrit sans distinction en tant que virus espagnol (SV) ou souche espagnole. 4.2 Caractérisation du virus isolé. Le virus (PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) présente les caractéristiques suivantes: a) La production de petits CPE sur une lignée continue de cellules ST (ATCC CRL 1746 ST) (testicules foetales de porc) avec un titre moyen de 104,5 TCID50/ml et de macrophages alvéolaires de poumons de cochons avec des titres moyens de 105,5 TCID50/ml,; b) Quand on infecte des co-cultures de cellules ST et de macrophages alvéolaires de poumons de cochon, on obtient des titres moyens de 106,3 TCID50/ml [lesquels titres représentent une unité logarithmique (1 log10) plus élevé que quand des macrophages alvéolaires de poumons de cochons sont infectés seulement]; c) Une réplication cytoplasmique d) Une production de vacuolation cytoplasmique; e) Une enveloppe lipidique; f) Une taille de 40 à 50 nanomêtres; g) On observe pas de hémadsorption o u d'hémagglutination avec le poulet, le cochon de Guinée, le cochon ou hématies de groupe O; h) Une perte de l'infectivité à un pH acide (pH ayant des infections cliniques étudiées (IPMA). m) Le sérum des truies infectées avec ce virus donne une réaction croisée avec le LV; n) L'ARN génomique polyadénilé de approximativement 15000 bp de longueur (gel d'agarose neutre); o) La réplication à l'aide d'ARN subgénomique se réalisant à l'extrémité 3'terminal; p) une séquence nucléotidique ayant 8 ORF; q) Dans une suspension purifiée soumise à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide et transférée postérieurement par immunoblots on détecte, à l'aide de sérum spécifique, préparé à partir des truies provenant de notre laboratoire et qui font une réaction croisée avec le virus PRRS de Lelystad, 4 bandes majoritaires correspondant aux protéines ayant une masse moléculaire apparente de 15000, 23000, 54000 et 66000 Daltons, qui ne sont pas détectables chez les témoins négatifs (les macrophages non infectés); r) Quand les ORF 3 à 7 de ce virus sont comparées avec celles du LV et/ou du TV, on observe 95,5 % d'homologie au niveau nucléotidique (il y a 140 paires différentes de bases sur un total de 2599 paires de base) et 94,9 % d'homologie au niveau des acides aminés (51 acides aminés différents sur un total de 955); et, s) Le virus appartient au genre Arterivirus 4.3 Technique utilisée pour l'identification du virus 4.3.1 Reproduction expérimentale de la maladie chez des truies gravides. On a utilisé des truies croisées race allemande x grosse blanche (Germand Landrace x large White), provenant d'exploitations ayant un contrôle sérologique systématique contre les virus de la maladie d'Aujeszky, de la maladie de la bouche et du pieds, de la parvovirose porcine, de la fièvre classique du porc, de l'inflenza du porc (type HlNl et H3N2) et de la gastro-entérite transmissible. De plus, on a réalisé des essais de titration des anticorps contre le virus causal du PRRS. Entre les jours 77 et 90 de gestation, on a infecté les animaux, avec un isolat obtenu à partir de macrophages alvéolaires de poumons de cochon dans un cas par voie intraveineuse (IV) et intranasale (IN), alors que dans un autre cas seulement par voie intranasale (exemple 2.1). Tout au long de l'expérience, on a suivi le régime alimentaire, la température rectale et l'état clinique des animaux. Dans le but d'exclure tous les agents mentionnés ci-dessus, les échantillons de sang sont prélevés de toutes les truies avant l'infection. Ils s'avèrent être séronégatifs à tous les agents. Alors que, après l'infection expérimentale, toutes les truies sont encore séronégatives à tous lesdits virus et séropositives contre le PRRS (vérifiés avec la référence LV). Les résultats obtenus sont mentionnés dans le tableau 1. Tableau 1 Tests conduits Agent HAI HAI NPLA ELISA SN SN IMPA infec. (1) (2 (3) (4) (5) (6) (7) AD ND ND ND - ND ND ND FMD ND ND ND ND - ND ND PP -N ND ND ND ND ND CSF ND ND - ND ND ND ND SF ND - ND ND ND ND ND TG ND ND ND ND ND - ND PRRS ____ ND ND ND ND ND ND + Légende AD = Maladie d'Aujeszky FMS = Maladie du pied et de la bouche PP = Parvovirose porcine CSF = Fièvre classique du porc SF = Influenza du porc TG = Gastro-entérite transmissible PRRS = Syndrome respiratoire et de la reproduction du porc HAI = Dosage de l'hémaglutination liée à la peroxydase NPLA = Dosage de neutralisation liée à la peroxydase ELISA = Dosage d'immunobsorbtion liée à une enzyme SN = Séroneutralisation IPMA = Dosage monocouche à l'immunoperoxydase (1) = Vannier et al., Rec Méd. Vet. 155 (2), 151-158 (1979) (2) = Charley b., Thesis Doctoral, Alfort (1976) (3) = Trepsta et al., Vet. Microb. 9, 113-120 (1984) (4) = Elliot M., J. Rech.Porc., 20, 141-146. (5) = Lucam F., "Diagnostic sero-immunologique des viroses humains et animais", F. Bricout; L. Joubert; J.M. Huraux (1977). (6) = Jimènez et al., J. Virol., 60, 131-139 (1986). (7) = Wensvoort et al., Vet. QUARTERLY, Vol.13, n93 (Juillet 1991) (-) = Negatif (+) = Positif ND = Pas fait 4.3.2 ReDroduction expérimentale de la maladie chez les cochonnets. Le but de cette expérimentation était de vérifier si le virus causal des altérations de la reproduction chez les truies était capable de produire des symptômes respiratoires chez les cochonnets agés de 2 mois et des liaisons macroscopiques et microscopiques au niveau du poumon. C'est dans ce but que l'on a infecté un certain nombre de cochonnets avec le virus (souche espagnole), par voie intranasale, ceux que l'on a ensuite sacrifiés l'ont été à différents jours après l'infection (exemple 2.2) Les données résultantes les plus pertinentes démontrent que ce virus produit au niveau macroscopique de multiples foyers de consolidation de même que, au niveau microscopique, des pneumonies interstitielles (tableau 4). D'un point de vue de la santé, on n'observe aucun signe clinique pertinent. 4.3.3 - Sensibilité au test du chloroforme. Ce test est réalisé pour déterminer si le virus isolé possède une enveloppe lipidique. Dans ce but on utilise le procédé de FELDMAN, H. et WANG, S., décrit dans "a manuel of basic virological techniques", Prentice-Hall Inc., New Jersey, 146-148 (1978). Les résultats obtenus démontrent que le virus non traité a un titre de 105,6 TCID50/ml, alors qu'après un traitement avec le chloroforme le titre est inférieur à 101, 3 TCID50/ml, base sur laquelle on peut admettre que le virus isolé a une enveloppe lipidique. 4.3.4- Séquençage du génome viral. Cinq phases sont réalisées i) Purification du virus ii) Purification de i'ARN viral iii) Synthèse de l'ADNt iv) Clonage et caractérisation des clones de ADNc v) Séquençage et comparaison des séquences avec celles du LV i) Purification du virus Le virus répliqué des macrophages alvéolaires des poumons de cochons est clarifié, et concentré par filtration en utilisant les filtres MILLIPORE. Ensuite, on centrifuge le virus dans un gradient de métrizamide de 10% à 50% (SIGMA). On complète cette centrifugation, et on obtient une bande qui est concentrée par centrifugation. Avec le virus purifié, on réalise une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et on réalise un immunoblot avec un sérum spécifique, qui montre les protéines dont la masse moléculaire apparente est de 15, 23, 54 et 66 K daltons. ii) Purification de i'ARN viral La technique utilisée pour la sélection et la purification de l'ARN est basée sur le fait que l'ARN contient une séquence poly (A) à son extrémité 3'. C'est dans ce but que l'on utilise la trousse commerciale (Pharmacia) qui permet exclusivement la fixation dela chaîne poly (A) de l'ARN à un oligo (dT) lié à une matrice de cellulose et permet son élution ultérieure. iii) Synthèse de l'ADNc On utilise un trousse commerciale (Boehringer Mannheim), en suivant les instructions du fabricant. Brièvement, l'ARN génomique viral est incubé en présence d'un oligo (dT), dATP, dCTP, dGTP, dTTP et d'une transcriptase inverse. iv) Clonage et caractérisation des clones de i'ADNc L'ADNc est cloné dans un vecteur dérivé du plasmide pUC18 et on obtient une série de clones contenant la séquence complète nucléotidique correspondant aux ORF 3 à 7. v) Séquençage et comparaison des séquences avec celles du LV. v.a) Séquençage. La région correspondant aux ORF3-7 du virus isolé dans nos laboratoires a été complètement séquencée. Les figures 1 à 5 décrivent les séquences de l'ADNc obtenues ainsi que les séquences déduites en acides aminés codées pour chaque ORF. La longueur de la région totale séquencée est approximativement de 2599 nucleotides (nt). Comme on peut le voir, l'ORF 3 a une longueur d'environ 798 nt et code pour une protéine de 266 acides aminés. L'ORF 4 a une longueur approximative de 552 nt et code pour une protéine de 183 résidus acides aminés. Le commencement de cet ORF 4 est situé dans le codon ATG situé à environ 540 bp du codon ATG initial de l'ORF 3. L'ORF 3 et l'ORF 4 partagent une séquence d'environ 246 nt. L'ORF 5 a une longueur d'environ 606 nt et code pour une protéine de 200 résidus acides aminés. le codon initial de cet ORF 5 chevauche pratiquement le codon de fin de i'ORF 4 (il partage les nucleotides T G, le codon ATG, du codon ATG de début de l'ORF 5 et du codon de fin TGA de l'ORF 4). Le codon initial ATG de l'ORF 5 est situé environ au nucléotide 1092 nt du codon ATG initial de l'ORF 3. L'ORF 6 a une longueur d'environ 522 nt et code pour une protéine de 173 résidus d'acides aminés. Le codon initial AGT de cet ORF 6 est situé 8 nt en amont du début du codon de terminaison TAG de l'ORF 5 ( à environ 1682 nt approximativement du codon ATG initial de 1'ORF 3). L'ORF 7 a une longueur de 387 nt et code pour une protéine de 129 résidus d'acides aminés. Le codon initial ATG de cet ORF 7 est localisé 5 nt en amont du début du codon de terminaison TAA de l'ORF 6 (à environ 2193 nt approximativement du codon initial ATG de 1'ORF 3). Les protéines codées par les ORF 3 à 6 sont des protéines membranaires alors que celles codées par l'ORF 7 est une protéine de la nucléocapside. v.b) Comparaison avec le LV En comparant les séquences de l'ADNc des ORF 3 à 7 du LV avec celles du virus isolé dans nos laboratoires on a observé que: i) au niveau des nucléotides, sur les 2599 nucléotides comparés, 114 sont différents, celà représente approximativement 95,5% d'homologie, ii) au niveau des acides aminés, sur les 955 acides aminés comparés, il y a 47 différences, représentant 94,9% d'homologie approximativement, iii) sur les 47 acides aminés différents, il y en a 35 qui sont considérés comme des substitutions non conservatives, parmi lesquelles il y en a: - 12 dans le produit du gène de l'ORF 3 (figure 6); - 9 dans le produit de gène de l'ORF 4 (figure 7); - 10 dans le produit du gène de i'ORF 5 (figure 8), bien qu'il soit important de signaler que le produit du gène de l'ORF 5 de LV contient un acide aminé de plus que le produit du gène de l'ORF 5 du virus espagnol, spécifiquement, c'est l'acide aminé 35 (Asn) produit du gène de l'ORF 5 de LV qui n'est pas présent dans le produit exprimé par le virus espagnol; - 4 dans le produit du gène de l'ORF 6 (figure 9); alors que - Le produit du gène de l'ORF 7 ne contient aucune substitution non conservative (figure 10), iv) l'homologie partielle de chacun des produits exprimés par les différentes ORF du virus espagnol et de LV est de 93,6% pour les produits des ORF 3 et 5, 94,0% pour le produit de l'ORF 4, 96,6% pour le produit de l'ORF 6, et 99,2% pour le produit de l'ORF 7. Comme mentionné ci-dessus, les changements en acides aminés peuvent être reliés à une forte pathogénicité d'une souche en comparaison avec les autres, puisque le virus isolé dans notre laboratoire (la souche espagnole) est plus pathogène que les autres virus PRRS connus comme, par exemple, le Virus isolé en France (exemple 8) et le LV (Tableau 6 de la demande de PCT n WO 92/21375). 5. Les vaccins. L'invention fournit un vaccin capable de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction du porc (PRRS). Le vaccin a montré son efficacité dans la prévention des altérations de la reproduction chez les truies, telles que les cochonnets mort-nés, les cochonnets morts oules cochonnets vivants mais faibles, les problèmes de remise en service et similaires, produits par le virus causal du PRRS. De plus, on a vérifié que le vaccin induisait une immunité cellulaire chez les animaux vaccinés. Le vaccin contient une quantité appropriée d'antigènes viraux du PRRS, souche espagnole, inactivée aussi bien qu'un adjuvant et un conservateur. Les tests réalisés avec ces vaccins ont démontré l'efficacité du vaccin, comme cela est montré par les exemples 7 et 8. De plus, on a démontré l'efficacité du vaccin en évitant les problèmes liés à la remise en service, qui apparaissent chez les truies infectées. Actuellement, les truies vaccinées avec les vaccins résultants de cette invention et infectés avec le virus causal du PRRS furent accouplés et devinrent gravides à la première ovulation post-partum et les cochonnets furent sevrés. 5.1 Les composants 5.1.a) La phase antigénique Comme composant actif, le vaccin contient des antigènes viraux inactivés du PRRS, de la souche espagnole, à une concentration supérieure ou égale à 105,5 TCID50 par dose vaccinale. L'inactivation peut être réalisée par des moyens chimiques qui incluent un traitement avec de la B-propiolactone ou avec d'autres agents classiques inactivants comme l'éthylénimine ou le formaldehyde ou par des moyens physiques. 5.1.b) Les adjuvants Bien qu'il soit possible d'utiliser des adjuvants de type hydroxyde d'aluminium, Quil A ou leurs mélanges ainsi que des adjuvants huileux, pour l'élaboration du vaccin, il est possible de vérifier que les meilleurs résultats sont obtenus quand on utilise un adjuvant huileux (exemple 4). En particulier, on a vérifié qu'un adjuvant huileux constitué par un mélange de Marcol 52, Simulsol 5100 et Montanide 888 apportaient de meilleurs résultats. Marcol 52 est un minéral huileux à faible densité produit par ESSO ESPAGNOLA S.A.; Simulsol 5100 est un poly(éther éthoxy oléate) commercialisé par SEPIC; et Montanide 888 est un éther octadécénoate mannitol anhydre de pureté élevée commercialisé par SEPIC. On a vérifié que l'adjuvant jouait un rôle essentiel dans l'efficacité du vaccin. Ainsi, on a mené des essais de provocation en utilisant des truies vaccinées avec deux vaccins différents, une truie avec l'adjuvant huileux décrit ci-dessus (réf.1) et une autre truie en utilisant l'adjuvant MunokynineR (réf.2). Bien que les deux vaccins produisent une séroconversion, on a montré par un test d'infection expérimental que les truies vaccinées avec le vaccin réf.1 étaient protégées contre l'infection expérimentale avec le virus PRRS, alors que les autres truies, celles vaccinées avec le vaccin réf.2, n'étaient pas protégées en dépit du fait que, lors de la provocation, elles possédaient des anticorps contre le virus. Ceci établit que l'adjuvant approprié peut jouer une part très importante dans la connexion entre la modulation et la stimulation de la réponse immune, principalement au niveau de l'immunité cellulaire. De plus, on a confirmé cet aspect à l'aide de tests de provocation réalisés en utilisant la souche espagnole du virus de PRRS, puisque les truies vaccinées et revaccinées avec le vaccin réf. 1 ne présentent pas de réponse sérologique au moment de l'infection mais, néanmoins, elles sont protégées (exemple 7 table 8). Cependant, il serait aussi possible que le vaccin de la réf.2 (avec la MunokynineR), provoque une immunité cellulaire. A cette fin, il serait nécessaire d'ajouter des substances stimulant la réponse cellulaire (CRP), à savoir, des substances qui stimulent les sous-populations de cellules T-helper (Th, et Th2), comme l'IL-l(interleukine- 1), l'IL-2, l'IL-4, 1'IL-5, 1'IL6, l'IL-12, l'IFNg (interféron gamma), le facteur de nécrose cellulaire et des substances similaires. Évidemment, il serait aussi possible d'ajouter ces substances PRC aux vaccins avec l'adjuvant huileux, auquel cas, leur effet sur l'immunité cellulaire serait stimulé. D'autres types d'adjuvants pourraient aussi être utilisés qui modulent et immunostimulent la réponse cellulaire, comme le MDP (le dipeptide muramyle), l'ISCOM (le complexe immuno stimulant) ou des liposomes. 5.1.c) Les conservateurs Plusieurs conservateurs habituellement utilisés dans l'élaboration de vaccins peuvent être utilisés. Un de ceux- ci est le Thimérosal [sel sodique du (2-carboxy- phénylthio)éthyl-mercure] (ALDRICH). 5.2 Procédé pour la préparation du vaccin Les vaccins résultant de cette invention peuvent être obtenus par le mélange d'une phase antigénique contenant des antigènes viraux inactivés et une autre phase telle que l'adjuvant, qui peut être ou ne pas être huileux, en fonction de l'adjuvant choisi. En option, des substances CRP pourraient être ajoutées à l'ensemble de ces deux phases. Quand l'adjuvant est huileux, une émulsion se forme qui, dans un cas particulier et préférable (quand l'adjuvant est un mélange de Marcol 52, de Simulsol 5100 et de Montanide 888), est une double émulsion eau/huile/eau (w/o/w). 5.3 Test de contrôle du vaccin En addition au test classique, le vaccin doit passer avant son administration, des contrôles (i) de pureté (contre les bactéries, les champignons, les mycoplasmes et les virus étrangers) (ii) d'identification, (iii) de sécurité, (iv) d'efficacité et (v) sur le terrain physico- chimiques, on a réalisé un certain nombre d'essais lors de l'étude en relation avec la sécurité et l'efficacité du vaccin sur un total de 5 exploitations, dans lesquelles 508 truies ont été vaccinées et revaccinées avec un des vaccins résultant de cette invention, alors que le reste des 472 truies n'ont pas été vaccinées et ont été gardées comme truies témoins, rendant ainsi possible l'observation que le vaccin est sûr et en même temps efficace, parce que dans quelques unes des exploitations la maladie PRRS naturelle a été détectée chez des animaux non vaccinés après le procédé de vaccination. 5.4 Posologie et instructions pour l'administration du vaccin Il est possible de vérifier qu'une dose de 2ml de vaccin huileux à la concentration d'antigènes viraux inactivés supérieure ou égale à 105,5 TCID50, administrée par voie intramusculaire est capable de protéger contre le PRRS un très grand pourcentage d'animaux vaccinés. Le programme suivant de vaccinations est conseillé: Première vaccination: vacciner tous les animaux d'élevage (truies et verrats) 'et revacciner 21 jours plus tard. Ensuite, administrer une dose durant toute la lactation (les truies) et tous les 6 mois (les verrats). Vaccinations Dostérieures - Animaux destinés à la reproduction: la première vaccination devra être réalisée à l'âge de 6 mois, et revaccinés 21 jours plus tard. - Les truies: Il est recommandé de les vacciner durant la période de lactation, si possible 15 jours avant l'accouplement. - Les verrats: vaccinés deux fois par an (tous les 6 mois). En variante, s'il n'y a pas de substance CRP dans le vaccin, ces substances peuvent être injectées à des endroits différents du site d'inoculation mais de façon simultanée. 6. Les vaccins polyvalents Pour atteindre un but supplémentaire à partir de cette invention, on fournit des combinaisons de différents pathogènes porcins contenant en plus des antigènes viraux inactivés PRRS (souche espagnole), 1 ou plusieurs des pathogènes cités ci-dessous pour rendre la préparation du vaccin bi- ou multivalent. On peut préparer de cette façon des vaccins bi- ou multivalents contenant des antigènes viraux inactivés PRRS, et un ou plusieurs des pathogènes suivants: Actinobacilus pleuroDneumoniae. HaemoDhilus Darasuis. Parvovirus Porcin. LeDtospira. Escherichia coli. Erysipelothrix rhusiopathiae. Pasteurella multocida. Bordetella bronchiseptica, Coronavirus respiratoire porcin, Rotavirus ou contre les pathogènes causals de la maladie d'Aujeszky, de l'influenza de la truie ou de la gastroentérite transmissible. Exemples Exemple 1. Isolation du virus 1. a) Préparation des échantillons A partir de poumons de cochonnets mort-nés, progéniture d'une truie ayant les symptômes classiques du PRRS [la truie possédait des anticorps contre la maladie d'Aujeszky, la parvovirose porcine, la maladie du pied et de la bouche, la fièvre classique du porc, l'influenza du porc (Types HlN1 et H3N2) et la gastroentérite transmissible], on a réalisé une suspension à 10 % dans un milieu de culture de DMEM, additionnée d'une solution d'antibiotiques (PEG) composée de 1000 U /ml de pénicilline, i mg/ml de streptomycine et 0,5 mg/ml de gentamicine, à un rapport poumon:solution de DMEM de 1:10 (p/v). La suspension réalisée a été homogénéisée et laissée pendant une heure à la température ambiante (20- 22 C). L'homogénat a été congelé et décongelé deux fois, centrifugé et le surnageant obtenu a été conservé à - 70 C, afin d'être utilisé pour l'infection des macrophages alvéolaires de poumon de cochon. Simultanément, on a préparé des échantillons à partir de poumons de cochonnets nés vivants mais qui sont morts après quelques heures. De plus, on a extrait du sang et mélangé avec ou sans anticoagulant afin de l'utiliser d'une part pour l'isolation du virus (à partir de plasma sanguin) et pour obtenir du sérum d'autre part. 1. b) Obtention de macrophages alvéolaires de poumons de cochons. On obtient les macrophages alvéolaires à partir de poumons de cochons séronégatifs pour la maladie d'Aujeszky, la parvovirose porcine, la maladie du pied et de la bouche, la fièvre classique de la truie, l'influenza de la truie (types HlN1 et H3N2) et la gastroentérite transmissible. L'âge des cochons utilisés varie entre 7 à 8 semaines. Avant l'extraction des poumons, les animaux sont anesthésiés avec du phénobarbital de sodium puis ils sont sacrifiés. Immédiatement, on extrait les poumons ainsi que la trachée après sa ligature au dessus de l'épiglotte. On lave le poumon extrait extérieurement avec une solution se sérum physiologique, et on réalise des lavages successifs avec ml de PBS additionné de 2% d'une solution de PEG avec des antibiotiques jusqu'à ce que l'on introduise un total de 500 ml de PBS. Les cellules obtenues à partir de ces lavages sont centrifugées pendant 10 min à 300 g. Cette étape de lavage par centrifugation est répétée deux fois de plus. Les cellules obtenues sont lavées avec des solutions de PBS et de PEG avec des antibiotiques et remises en suspension dans un milieu DMEM [DMEM additionné avec des acides aminés non essentiels (GIBCO), 1 % de pyruvate de sodium lmM et 1 % de glutamine 2 mM], 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et une solution de PEG avec des antibiotiques à 1 %o. On réalise le comptage des cellules dans une chambre Newbauer et pour obtenir une suspension de macrophage à une dilution finale de 1/10 on additionne 0,4 ml de DMEM et 0,5 ml de solution de bleu de trypan au 0,1 ml de la suspension de macrophage. Le nombre de cellules obtenues varie entre 1 et 1,2 x 109. 1. c) Isolation du virus On a injecté un flacon de culture de 25 cm2 de surface contenant une culture de macrophages alvéolaires de poumon de cochon préparée (3 x 106 cellules/ml) dans du milieu DMEM et 10 % de FCS, avec 1 ml de l'homogénat de l'échantillon originaire des poumons de cochonnets mort-nés (exemple 1. a)). L'homogénat est maintenu en contact avec la culture de macrophage pendant une heure à 37 C, tamponné avec du C02 à pH 7,0-7,4, et incubé à 37 C pendant plusieurs jours durant lesquels on a observé le CPE produit par le virus sur les macrophages. A 3-4 dpi, on observe un CPE de 70 à 80 %, c'est pour cette raison que les cultures sont congelées à - 80 C. Simultanément, on prépare une culture de macrophage alvéolaire de poumons de cochons non infectés pour servir de témoin négatif. On a fait des sous-cultures avec le virus isolé dans lesquelles on a observé que le CPE de départ à partir du second dpi était de 100 %. On a congelé le virus à - 80 C pour son identification et sa caractérisation ultérieure. Après le 4ème passage des macrophages on a réalisé les titrations correspondantes dans des microplaques à 96 puits, obtenant un titre moyen de 105,6 TCID50/ml, en accord avec le procédé Reed & Muech [Am. J. Hyg., 27:493-497 (1938)]. Un échantillon de virus isolé (souche espagnole) dénommé PRRS-CY-218JPD-P5-6-91, isolé à partir de poumons de cochonnets mort-nés est capable de reproduire expérimentalement la maladie et a été déposé à 1'ECACC le 29 juin, 1993, sous le n d'accès correspondant V93070108. D'une façon similaire, le virus a été isolé chez des cochonnets vivants et mort-nés, progéniture de truies infectées expérimentalement. Exemple 2: Identification et caractérisation du virus Exemple 2. 1. Reproduction expérimentale de la maladie chez les truies gravides. Douze truies, croisées race allemande x grosse blanche (German Landrace x Large White) sont utilisées provenant d'exploitations ayant un contrôle sérologique systématique contre les virus de la maladie d'Aujeszky, de la maladie du pied et de la bouche, de la parvovirose porcine, de la fièvre classique de la truie, de l'influenza de la truie (types HlN1 et H3N2) et de la gastroentérite transmissible. De plus, on a réalisé les tests d'évaluation des anticorps contre le virus causal du PRRS. On a transporté les truies dans des porcheries de sécurité du centre de recherche, une semaine avant l'infection, et elles ont été placées dans des porcheries séparées. Entre les jours 77 et 90 de gestation, les truies identifiées avec les n 53, 76, 8, 62, 91,93 et 19 ont été infectées avec 5 ml par voie intraveineuse (IV) et avec 5 ml par voie intranasale (IN) de virus PRRS, souche espagnole, isolées à partir des macrophages alvéolaires de poumons de cochons et identifiées sous le numéro PRRS-CY-218-JPD-P5-6- 91, à partir d'un quatrième passage de macrophages filtré à travers un filtre de 200 nm et avec un titre de 105,6 TCID50/ml. Les 5 truies restantes (n" 14, 40, 13, 30 et 85) sont infectées entre les jours 65 et 85 de gestation avec 5 ml par voie IN (seulement) de virus. Durant l'expérience, la perte d'appétit, la température rectale et l'état clinique des animaux ont été suivis chaque jour, ainsi que les altérations de la reproduction (les parturitions prématures, les parturitions au delà du terme, les cochonnets vivants mais faibles, les cochonnets mort-nés, les foetus morts et les cochonnets bien portants). Dans le but de poursuivre avec l'exclusion des pathogènes mentionnés ci-dessus, des échantillons de sang ont été prélevés à partir de truies pré et post-infectées, avec le résultat que les animaux étaient séronégatifs au pathogènes avant et après l'infection et séropositifs contre le PRRS après l'infection (voir le tableau 1, section 4.3.1.). Les résultats de la reproduction sont présentés dans les tableaux 2 et 3. Comme le montre le tableau 2, sur 93 cochonnets mis bas, 15 étaient morts, 35 mort-nés, 22 sont nés vivants mais sont morts le troisième jour et 21 ont survécu 7 jours. Quelques truies ont manifesté une perte d'appétit pendant 2 à 4 jours, les jours 6 et 8 après l'infection, alors que les autres truies ont manifesté une perte d'appétit le deuxième jour après l'infection. On a pas observé d'hyperthermie dans aucun cas. Chez 4 truies (n 8, 62, 92 et 93) la mise bas s'est effectuée 1 à 6 jours avant terme, alors que chez les 3 autres truies, la mise bas avait 1 à 3 jours de retard. Sur les cochonnets nés vivants, i ou 2 par portée ont manifestés un oedème dans les yeux. Les cochonnets faibles ont manifesté une incoordination, une paralysie du train arrière, une perte des poils et une myoclonie. Dans l'autopsie effectuée chez quelques cochonnets mort- nés et faibles, on a observé la présence d'un liquide clair abondant dans la cavité thoracique. Les cochonnets nés bien portants de mères infectées, sacrifiés à 8-12 jours de vie ont manifesté des foyers gris de consolidation. Sous o10 observation microscopique, le changement le plus signifiant était un multifoyer léger de pneumonie interstitielle avec un élargissement de la cavité alvéolaire du fait de l'infiltration de cellules mononucléaires. Ces lésions sont apparues chez tous les animaux analysés lors de cette expérimentation. * Comme le montre le tableau 3, sur un total de 65 cochonnets mis bas, 36 sont mort-nés, 26 sont nés vivants mais faibles, mourant le deuxième jour de vie, et 3 survécurent la première semaine de vie. Une truie mit bas 12 jours prématurément (n 40) alors que les autres mirent bas 1 à 2 jours prématurément. Les signes cliniques des cochonnets nés faibles sont similaires à ceux obtenus par voie IN + IV. Une pneumonie interstitielle a été aussi observée. Les truies infectées n'ont pas manifesté de perte d'appétit ou d'hyperthermie. La différence la plus révélatrice entre les deux systèmes d'infection est que par voie IN + IV on a observé des foetus de cochonnet morts et que 1 à 2 des cochonnets nés vivants dans chaque portée ont manifesté des oedèmes autour des yeux. Au vue des résultats obtenus, on peut conclure en affirmant que le modèle pour l'infection expérimentale des truies, à environ 80 jours de gestation via les deux voies d'infection (IN et IV) avec le virus isolé (souche espagnole) à partir d'animaux infectés naturellement, reproduit la maladie PRRS chez des truies gravides et provoque une forte proportion de foetus morts, de cochonnets mort-nés et de cochonnets vivants mais faibles très semblables à la proportion observée lors d'une infection naturelle aigue. Il est envisageable d'infecter artificiellement par la voie IN du fait que c'est la voie naturelle d'infection sur le terrain et donc le moyen le plus approprié d'évaluer l'efficacité du vaccin. Au moyen de cette expérimentation, il est aussi possible de mettre au point un modèle pour une infection expérimentale de truies gravides qui pourraient aider à la vérification de l'efficacité du vaccin. TABLEAU 2 IN + IV A B C D E F G hl h2 I 53 77 115 9 3 2 0 4 4/4 76 77 116 11 2 4 1 _ 4 NT 8 77 110 12 2 4 1 - 5 5/5 62 80 113 16 - 3 6 4 3 3/3 91 90 109 14 - 1 8 1 4 NT 93 88 110 17 4 2 11 - - NT 19 88 116 14 4 1 8 - 1 NT = =_ =_ _93 15 17 35 5 21 TABLEAU 3 IV A B C D E F G hl h2 I 14 65 111 15 - - 12 - 3 NT 82 102 12 - 12 - - NT 13 80 113 12 - 10 2 - - NT 80 113 15 - 12 3 - - NT 85 112 11 - 4 7 - - NT - 26 36 - 32 A: Truies B: Moment de l'infection (jours de gestation) C: Mise bas (jours de gestation) D: Nombre total de cochonnets E: Foetus de cochonnet morts F: Cochonnets faibles morts après 48h G: Cochonnets mort-nés H: Cochonnets apparemment en bonne santé hl: Morts entre les jours 2 et 7 h2: Vivants après une semaine I: Pneumonie interstitielle NT:Non testé Exemple 2.2 Reproduction expérimentale de la maladie chez le cochonnet Cette expérience a été réalisée dans le but de vérifier que le virus isolé (souche espagnole) qui produit des altérations de la reproduction chez les truies est capable de produire des signes cliniques aussi bien que des lésions macroscopiques et microscopiques dans les poumons de cochonnets âgés de deux mois. Dans ce but, on a infecté 10 cochonnets par voie IN avec 5ml de virus, souche espagnole, avec un titre de 105,6 TCID50/ml et 6 autres cochonnets ont été gardés comme témoins (tous provenant de deux portées) Les animaux ont été sacrifiés les jours 3, 7, 8, 9 et 11 après l'infection. Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau 4. TABLEAU 4 N I/C DPI Anticorps I.P. V.I. 2 I 3 - 2+ NT 12 I 3 - 2+ NT 11 C 3 - NL NT 1 I 7 1:80 4+ + 14 I 7 1:80 2+ + 13 C 7 - NL - I 8 1:160 4+ + I 8 1:160 2+ + 8 C 8 - NL - 17 C 8 - NL - 4 I 9 1:160 4+ + C 9 - NL - I 11 1:160 4+ + 18 I il 1:320 3+ + 9 I 11 1:320 3+ + 6 C 11 - NL N : numéro des cochons I/C: Infecté (I) ou Témoin (C) DPI: Jours après l'infection I.P: Pneumonie interstitielle V.I.: Isolation du virus 2+: Pneumonie interstitielle légère 3+: Pneumonie interstitielle intermédiaire 4+: Pneumonie interstitielle grave NT: Pas testé NL: Pas de lésion Durant les onze jours de l'expérimentation, on a observé aucun signe respiratoire clinique ni d'hyperthermie alors qu'il y avait une perte de poids chez les animaux infectés en comparaison avec les animaux non infectés. D'après les observations microscopiques, l'aspect le plus révélateur était la présence de foyers multiples de consolidation dans les poumons, de nodules lymphoïdes congestionnés dans les mandibules et quelques hémorragies intestinales. Au niveau microscopique, on a observé une pneumonie interstitielle. On a isolé du virus à partir des solutions obtenues des lavages de poumons d'animaux infectés d'une culture de macrophages frais, mais on a pas isolé de virus à partir d'animaux témoins, chez lesquels la séroconversion n'avait pas été observée de lésions pulmonaires ni au niveau macroscopiques ni au niveau microscopiques. Quand le comptage des cellules a été effectué à partir des lavages de poumons d'animaux infectés, 30 % de cellules mortes (macrophages) ont été constatées, ce qui pourrait constituer un facteur d'importance dans les infections secondaires du fait de la destruction des éléments de défense immunologique clef (les macrophages). L'absence de signes respiratoires pourrait être due au fait que les infections expérimentales sont réalisées dans des porcheries continuellement traitées à l'aide de désinfectants et donc la concentration bactérielle serait beaucoup plus faible lorsqu'on la compare à celle existant dans les conditions d'élevage normal. Exemple 2.3. Sensibilité au test du chloroforme On a utilisé la méthode Feldman, H. et Wang S. (section 4.3.3) a été utilisée sachant que le virus isolé possédait une enveloppe lipidique du fait qu'il y avait une chute du titre de 4 logl0 par rapport aux cultures témoins de celles traitées avec du chloroforme. Exemple 2.4. Séquençage du génome viral i) Purification du virus Le virus, répliqué dans des macrophages alvéolaires de poumons de cochons est purifié par filtration et centrifugation dans un gradient de 10 % à 50 % de métrizamide (SIGMA), il en résulte une bande qui est centrifugée à nouveau comme il est mentionné dans la section 4.3.4. Avec le virus purifié, on a réalisé une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et onréalise un immunoblot avec un sérum spécifique, montrant des protéines avec leur poids moléculaire apparent de 15, 23, 54 et 66 KDaltons. ii) Purification de l'ARN viral On purifie i'ARN viral en utilisant une trousse commerciale (PHARMACIA) qui est capable de fixer la queue poly(A) de l'ARN à une matrice oligo (dT) liée à de la cellulose suivie d'une élution. iii) Synthèse de l'ADNc On utilise un kit commercial (BOEHRINGER MANNHEIM) (section 4.3.4 iii) iv) Clonage et caractérisation des clones de 1'ADNc On a cloné de l'ADNc dans un vecteur dérivant du pUC18 et on a obtenu une série de clones contenant la séquence nucléotidique complète correspondant aux ORF 3 à 7. v) Séquençage et comparaison des séquences avec celles du LV. Les résultats du séquençage de l'ADNc du virus isolé dans nos laboratoires (ORF 3 à 7) ainsi que la comparaison entre la séquence et la séquence du LV sont décrites dans la section 4.3.4.v, o l'on peut voir que, au niveau des acides aminés, il y a approximativement 94,9 % de degré d'homologie et un total de 47 acides aminés différents dont 35 correspondent à des substitutions non conservatives. Ces différences au niveau des acides aminés pourraient être responsables des pathogénicités différentes existantes entre les différentes souches de virus PRRS isolées. Exemple 3 Elaboration d'un vaccin Un vaccin, capable de protéger contre le PRRS, est préparé sous forme d'émulsion selon le procédé décrit ci- dessous. Une culture de macrophages alvéolaires de poumons de cochons est infectée avec du MOI (Infection d'ordre multiple) de 0,001 et incubée à 37 C pendant 24 heures, à la fin desquelles le milieu de culture est substitué par du milieu d'infection (DMEM complémenté de 2 % de FCS). La culture est incubée pendant 4 jours à 37 C jusqu'à ce que l'on observe un CPE de 70-80 %. Une fois cette période achevée, on a réalisé un test IPMA dans le but de confirmer l'identification. Le virus est collecté par aspiration sous vide puis congelé à - 80 C. La suspension virale destinée à l'élaboration du vaccin doit avoir un titre minimum de 105,5 TCID50 /ml (avant son inactivation) et ne doit pas être contaminée par des bactéries, des champignons, des mycoplasmes ou d'autres virus. Dans le cas o le titre serait plus faible, il devra être ajusté en concentrant l'antigène. Pour l'inactivation de la suspension virale, on ajoute 2% d'une solution de B13-propiolactone et on la conserve à 4 C pendant une nuit en maintenant le pH à 7,4 par addition de NaOH 0,5 N. Lorsque la période d'inactivation est achevée, la suspension virale est maintenue à 370C pendant une heure. La suite est ainsi préparée: a) Une phase antigénique de l'antigène viral inactivé avec une concentration minimum de 105,5 TCID50 /dose et le conservateur; et b) Une phase huileuse composée de Marcol 52, Simulsol 1500 et Montanide 888. La phase aqueuse, maintenue sous agitation, est ajoutée doucement au réactif contenu dans la phase huileuse aussi maintenue sous agitation. Lorsque la phase aqueuse a été ajoutée complètement, l'agitation est continuée pendant 10 min. Dans un cas particulier et préféré on a préparé des vaccins capables de prévenir le PRRS, comprenant par dose de 2ml: a) 53 % d'une phase antigénique contenant: i) Un antigène viral PRRS dans un milieu de culture DMEM, la souche espagnole inactivée avec du B-propiolactone, à une concentration minimum de.............105,5 TCID50, et ii) thimerosal.......................0,01 %; et b) 47 % d'une phase huileuse, contenant: i) Marcol 52. ........................790,0 mg ii) Simulsol 5100...................70,0 mg iii) Montanide 888........... ......80,0 mg Le rapport phase huileuse/phase aqueuse est un rapport poids/volume (P/V). Ce vaccin a été nommé le MSD Réf.1. Le vaccin obtenu a été soumis au test de contrôle..DTD: correspondant avant l'utilisation. Un autre vaccin a été préparé de façon similaire en utilisant le MunokynineR (Hydroxyde d'aluminium et Quil A, fournis par AMERICAN CYANAMID) comme adjuvant, en conservatn la mêle quantité de virus inactive. Ce vaccin a été nommé le MSD Réf.2. Exemple 4 Evaluation de l'adjuvant Un essais sur le terrain a été réalisé avec un total de 128 truies sur lesquelles 49 ont été vaccinées avec une dose du vaccin nommé MSD Réf.1, 50 truies ont été vaccinées avec une dose du vaccin nommé MSD Réf.2 (MunokynineR) et les 29 restantes n'ont pas été vaccinées et sont gardées comme témoin. Apres 22 jours, les truies sont revaccinées avec une dose du vaccin correspondant. Les paramètres suivants ont été évalués. 1. La réponse sérologique à l'aide de la détermination du IPMA à différents moments To: Vaccination et saignements T22: Revaccination et saignements T51: Saignements 50 jours après la vaccination 2. Les réactions de type général (perte de l'appétit, hyperthermie, etc...). Les résultats obtenus sont décrits dans les tableaux et 6 qui reflètent le pourcentage de truies ayant une réaction sérologique positive (tableau 5) et la moyenne arithmétique des titres sérologiques atteints (tableau 6). TABLEAU 5 % DES ANIMAUX AYANT UNE REACTION SEROLOGIQUE (+) l To T22 T51 MSD Réf.1 - 59 % 100 % MSD Réf.2 - 40 % 87 % Témoins -_ _ _ - TABLEAU 6 MOYENNE ARITHMÉTIQUE DES TITRES SEROLOGIQUES To T22 T51 MSD Réf.1 - 58 200 MSD Réf.2: - 37 133 Témoins _ - - On n'observe aucune réaction de type générale ou locale significative. On peut affirmer, sur la base des résultats obtenus, que la séroconversion positive est produite avec les deux vaccins, bien qu'elle soit plus forte quand on utilise le vaccin MSD Réf.1 (Adjuvant huileux). A la revaccination, on observe un pourcentage de séroconversion élevé et la moyenne arithmétique des titres obtenus est plus élevée chez les animaux vaccinés avec le MSD Réf.1. Exemple 5 Sécurité des truies Exemple 5.a Au niveau du laboratoire Exemple 5.a.1 Les truies primipares Quatre vingts truies primipares croisées ont été choisies (race allemande x grosse blanche: German Landrace x Large White) provenant d'une exploitation de production porcine sont réparties dans deux porcheries à un niveau de 9 truies par porcherie, ainsi les truies vaccinées avec les mêmes vaccins (MSD réf.1 ou MSD réf.2) obtenus dans l'exemple 3 au-dessus ont été logées dans les mêmes porcheries. Neuf truies ont été vaccinées par voie IM profonde avec une dose de 2ml de vaccin MSD réf.1 contenant un titre de virus inactivé de 105,5 TCID50/dose, et elles ont été revaccinées avec une autre dose ayant le môme titre 20 jours plus tard. Les 9 autres truies ont été vaccinées et revaccinées les mêmes jours avec le vaccin MSD réf.2 (2ml de dose à 105,5 TCID50 par dose comme titre de virus inactive). Durant les cinq premiers jours après l'inoculation on a fait les observations suivantes: a) Réaction locale Consistant en l'observation macroscopique du site de l'inoculation et en une palpation, notant le degré d'inflammation en comparaison avec des exemples de taille connus. b) Réaction générale Consistant en l'observation macroscopique des animaux et en une vérification de leur perte d'appétit. Dans les cas négatifs, la température rectale est relevée toutes les douze heures jusqu'à ce que l'hyperthermie ou tous autres signes non favorables aient disparu. Les résultats obtenus montrent qu'il y a une légère réaction inflammatoire chez certaines truies, proéminent au niveau du site d'inoculation, et disparaissant dans tous les cas après quelques jours; on n'observe aucune formation purulente. Une seule des truies refusa de manger sa ration alimentaire en entier les premiers jours suivant l'inoculation, mais sa digestion était normale les jours suivants donc il n'était pas nécessaire de prendre sa température rectale. On a pas détecté de différences importantes dans la réponse aux différents vaccins testés, sur cette base on peut dire que les deux vaccins sont sûrs. 5.A.2 Les truies gravides On a choisi sept truies gravides (Race allemande croisée avec les grosses blanches) provenant d'une exploitation de production de porc ont été choisies au hasard: 6 truies primipares agées d'environ neuf mois et une truie multipare agée de 3 ans et 7 mois. on a utilisé exclusivement le vaccin dénommé MSD réf.1. Les truies ont été vaccinées par la voie IM profonde avec une dose de vaccin de 2 ml contenant un titre de virus inactivé de 105,5 TCID50/ml et quinze jours plus tard, on les a revaccinés avec une dose ayant le même titre. Durant les cinq premiers jours après l'inoculation, les observations suivantes ont été faites: a) Les réactions locales Consistant en des observations macroscopiques sur le site d'inoculation et en des palpations relevant le degré d'inflammation en comparaison avec des exemples dont on connaît la taille. b) La perte d'appétit Consistant en l'observation macroscopique des animaux et un relevé de leur perte d'appétit. c) La température rectale Mesure la température rectale 24 heures après la vaccination et 24 heures après la revaccination. Les résultats obtenus révèlent que il y a une faible réaction locale chez deux des animaux qui ne sont pas graves du fait de leur faible taille et disparaissant en peu de jours. On n'a pas observé de perte d'appétit ou d'hyperthermie dans'tous les cas. C'est sur cette base que l'on peut affirmer que le vaccin est sûr. Exemple 5.B. Sûreté et efficacité des exemples étudiés Ces expériences ont porté sur les 5 exploitations citées ci-dessous. Un nombre variable de truies provenant de chaque exploitation a été vacciné par la voie IM profonde avec une dose de 2ml de vaccin MSD réf.1 contenant un titre de virus inactivé de 105,5 TCIDo50 par dose, et revacciné 21 jours plus tard avec une autre dose ayant le même titre, alors que les autres truies n'ont pas été vaccinées et on été utilisées comme témoin: EXPLOITATION VACCINE TEMOIN TOTAL I 19 11 30 II 46 34 80 III 153 147 300 IV 127 123 250 V 163 157 320 TL 508 472 980 TL = Total I: Exploitation "RAMON DEL QUINTA" (Banyoles) II: Exploitation "CAL SABATER" (Orriols) III: Exploitation "E. CANELA" (Preixana) IV: Exploitation "R. CUNILLERA" (L'Albi) V: Exploitation "INVERSORS PICBER" (Bellpuig) Il a été possible de vérifier que le vaccin est sûr après l'observation des réactions locales et générales. Des réactions locales n'ont été observées que chez 1 % des animaux. En accord avec les paramètres de production observés dans les exploitations mentionnées ci-dessus, on n'observe pas de variation quand on compare avec leur historique clinique; En regardant les réponses sérologiques, quelques exploitations ont obtenu des séroconversions au vaccin alors que, chez d'autres, la réponse est négative. Ceci n'est pas indicatif du faible niveau de protection puisque dans les tests d'infection expérimentaux au laboratoire, les animaux séronégatifs résistent aux infections expérimentales (Exemples 7 et 8). En accord avec la transmission de l'immunité maternelle, d'animaux vaccinés à leur progéniture, il y a une forte chute dans les titres d'anticorps à 1 mois d'âge. Chez les truies vaccinées et revaccinées qui sont positives sérologiquement, il y a une forte chute dans les titres d'anticorps à deux mois après la revaccination. Exemple 6 Vérification de l'immunité cellulaire On a utilisé 5 truies gravides (race allemande croisée avec des grosses blanches) provenant d'une exploitation de production porcine. On a transporté les animaux au centre de recherche dans des porcheries sûres. On a choisi deux truies au hasard et on les a vaccinées avec le vaccin dénommé MSD Réf.1. Une autre truie a été vacciné avec le vaccin dénommé MSD Réf.2. Les deux truies restantes n'ont pas été vaccinées. Les truies ont été vaccinées par la voie IM profonde avec une dose de 2 ml de vaccin MSD Réf. 1 ou de vaccin MSD Réf. 2, contenant des titres de virus inactivés à 105,5 TCID50, et vingt jours plus tard les truies ont été vaccinées avec une autre dose ayant le même titre. Ensuite, entre les jours 77 et 90 de grossesse toutes les truies ont été infectées par la voie IN avec 5 ml de virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 avec une titre de 105,8 TCID50/ml. Lors de l'infection, on a vérifié que toutes les truies vaccinées présentent des anticorps contre le virus causal de PRRS (sérologie positive). Le tableau 7 présente les résultats de reproduction obtenus dans leur ensemble: Tableau 7 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) 2 MSD ref.1 23 20 -- 20 3 1 MSD Réf.2 12 - - 6 -- 6 2 -- 24 -- 7 -- 17 (A) s Nombre de truies (B): Vaccin utilisé (C) s Nombre total de cochonnets (D): Nombre des cochonnets nés vivants en bonne santé (E) z Nombre des cochonnets nés mais faibles (F): NO des cochonnets vivants après la lère semaine (G) z NO des cochonnets mort-nés. Les résultats obtenus démontrent que les truies vaccinées avec le vaccin MSD Réf.1 (adjuvant huileux) résistent mieux à l'infection que les truies vaccinées avec le vaccin MSD Réf. 2 (adjuvant aqueux), ce qui pourrait signifier que l'adjuvant joue un rôle important dans l'établissement de l'immunité cellulaire. Exemple 7: Efficacité chez les truies gravides. On a utilisé 11 truies d'élevage croisées race allemande x grosse blanche provenant d'une exploitation de production de porc. On a porte les animaux au centre de recherche dans des porcheries sQres. On a choisi trois truies au hasard (les truies n 57, 63 et 74) et on les a vacciné avec le vaccin dénommé MSD Réf. 1). Trois truies (NO 15, 18 et 23) ont été vaccinées avec le vaccin dénommé MSD Réf.2, et les cinq truies restantes (N 14, 40, 13, 30, et 85) n'ont pas été vaccinées. Les truies ont été vaccinées par voie profonde IM avec une dose de 2 ml de vaccin dénommé MSD Réf. 1 ou de vaccin MSD Réf. 2, contenant un titre de virus inactivé de -5 TCID50/dose et revacciné avec une autre dose ayant le méme titre 20 jours plus tard. On a observé les réactions locales et générales La réponse sérologique chez les animaux a été vérifiée chez les animaux au moyen du test IPMA en accord avec le programme suivant: Tc: Saignement et vaccination T20: Saignement et re-vaccination T42: Saignement T78: Saignement et infection expérimentale T8: Saignement de l'infection post- expérimentale T25: Saignement de l'infection post-expérimentale T50: Saignement de l'infection post-expérimentale L'infection expérimentale a été menée au centre de recherche dans des porcheries sûres. Tous les animaux étaient infectés à raison de 5 ml du virus virulent PRRS-CY-218-JPD- P5-6-91 ayant un titre de 105-8 TCID50/ml par la voie IN. On a relevé la réponse sérologique ainsi que le nombre de cochonnets nés vivants ou mort-nés pour chaque truie. Les saignements pré et post colostrum ont été faits pour les cochonnets, et on a relevé des échantillons de poumons et de cerveau provenant de cochonnets mort-nés et de cochonnets sacrifiés à différents jours pour l'isolation de virus et des coupes histologiques. Les résultats obtenus sont résumés dans les tableaux 8 et 10 ci-dessous TABLEAU 8 RESULTATS SEROLOGIQUES No To T20 T42 T78 T8 T25 T50 15. __ 1/160 1/160 1/640 1/1280 NT 18. -- 1/80 1/80 1/320 1/640 1/320 23 -- 1/160 1/160 NP NP NP NP 57 -- 1/160 1/160 1/320 1/320 1/1280 1/160 63 -- 1/80 1/80 1/160 1/640 1/1280 1/160 74 -- 1/80 NT 1/160 1/640 1/2560 NT c14. . --. . 1/128 1/2560 NT c40..... _ NT 1/1280 NT c13..... _ NT 1/320 NT c30.. .. __ NT 1/320 NT c85..... _ NT 1/320 NT NT: Non testé NP: Non gravide TABLEAU 9 RESULTAT DES MISES BAS N (A) (B) (C) (D) (E) (F) (S) (H) (I) (J) * 83 112 13........ 18 78 111 -- 11 8 -- 3.. . 2 23a 57 63 108 -- 13 7 6 -- 6 -- 63 79 114 -- 13 8 1 2 2 -- 2 74* 83 112 6 --..... .... c14 65 111 -- 15 __ 3 12. __ c40 82 102 -- 12. __ -- 12. __ c13 80 113 -12 -- 10 -- 2. __ c30 80 113 -- 15 -- 12 -- 3 il c85 85 113 __il 11 4 __ 7 __ 4 a: Non gravide *: Ces truies sont mortes du fait de la température excessivement forte de l'environnement. Une césarienne a été effectuée au 112ème jour de gestation (A): Date de l'infection (jour de gestation) (B); Mise bas (jour de gestation) (C): Nombre total de cochonnets (césarienne) (D); Nombre total de cochonnets (nés) (E): Cochonnets nés en bonne santé (F): Cochonnets nés faibles (G): cochonnets nés en vie metatartus latus (B): Cochonnets mort-nés (morts) (I): Cochonnets mort-nés (foetus morts) (J): Cochonnets morts après la première semaine. TABLEAU 10 SEROLOGIE DES COCHONNETS A. Truies vaccinées 1 2 3 4 5 &) NT NT NT 3 JOURS 10 JOURS 18 1 - NT NT - 2 - NT NT - 7 NT 1/640 1/160 - 8 NT 1/2560 1/320 - 9 NT 1/1280 1/640 - NT 1/1280 1/320 - il NT 1/1280-1/2560 1/640 - 12 NT 1/2560 1/640 - 13 NT -1/2560 1/160 - 14 NT 1/1280 1/160 - NT 1/2560 1/160 - 23 NP NP NP NP 4 JOURS 8 JOURS 57 1 - 1/320 - 1/640 1/320 - 2 - 1/320 - 1/640 1/160 - 1/320 - 3 - 1/640 NT - 4 - 1/320 - 1/640 NT - 5 - 1/640 NT - 1 JOUR 8 JOURS 63 1 NT >1/2560 1/640 - 2 NT >1/2560 1/320 - 3 NT 1/2560 1/320 - 1/640 - 4 NT 1/2560 1/640 - 1/1280 - - 1/1280 1/320 - 6 - 1/2560 1/640 - 7 NT 1/640 - 1/1280 1/320 - 8 NT 1/1280 NT - 74a) B.Truies témoins (non vaccinées) 1 2 3 4 5 12 H. 38 H. 5 jours 9 jours c14 1 NT 1/2560 m1/2560 1/1280 1/640 - 2 - m1/2560 m1/2560 1/1280 1/640 - 3 1/2560 21/2560 1/1280 1/1280 1/1280 - c40 NT 9 jours c13 1 - 1/160 + 2 - 1/160 3 - 1/320 4 - 1/320 c30 - NT NT c85 NT NT NT Légende: a): Ces truies sont mortes du fait de la température environnante excessivement forte. Une césarienne a été réalisée à 112 jours de gestation. 1: Numéro assigné à chaque animal 2: Cochonnet (le numéro assigné à chaque cochonnet correspond à leur ordre de naissance). 3: Sérologie pré-colostrum 4: Sérologie post-colostrum 5: Isolation du virus NT: Non testé -: Négatif +: Positif H: Heures NP: Non gravide Il est évident d'après les résultats obtenus qu'il y a une séroconversion positive contre le virus causal du PRRS. De plus, il y a un comportement satisfaisant contre l'infection expérimentale, en comparaison avec les animaux témoins chez lesquels la majorité des foetus sont morts. En conséquence on peut affirmer que cette vaccination est une mesure efficace pour la prévention du PRRS. Exemple 8 - Efficacité du vaccin contre les infections expérimentales avec un autre agent causal du PRRS (protection croisée). Cette expérience a été réalisée pour vérifier l'efficacité du vaccin identifié sous le nom de MSD 1 dans un test d'infection expérimentale utilisant les 2 souches pathogène du virus causal du PRRS. Les souches pathogènes du PRRS utilisées sont: i) la souche espagnole, PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91; et ii) la souche française, SDRP II 8B, fournie par le docteur E. ALBINA du "Laboratoire Central de Recherches Avicole et Porcine", Ploufragan, France. Le vaccin utilisé est le vaccin nommé MSD Réf. 1, dont la formule est donnée dans l'exemple 5 Trente truies séro-négatives pour les virus causals du PRRS ont été utilisées, à un cycle de reproduction non compris entre les 10 jours précédents jusqu'aux 10 jours suivant l'accouplement, ni entre les 10 jours précédents et les 10 jours suivants la mise bas. Quatre groupes d'animaux ont été formés: A: 10 truies vaccinées et revaccinées via par voie IM et infectées par voie IN avec la s o u c h e espagnole PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 du virus. B: 5 truies non soumises à aucune vaccination et infectées par voie IN avec la souche espagnole PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91. D: 10 truies vaccinées et revaccinées par voie IM et infectées par voie IN avec la souche française SDRP II 8B; D: 5 truies non soumises à aucune vaccination et infectées par voie IN avec la souche française SDRP II 8B. Expérience réalisée. * Vingt truies des groupes A et C mentionnés ci-dessus ont été vaccinées avec une dose de 2 ml de vaccin dénommé MSD Réf. 1 par voie IM profonde et revaccinées 21 jours plus tard avec la même dose de vaccin. Après quoi, entre les jours 70 et 80 de la gestation, toutes les truies ont été infectées expérimentalement avec: roupes A et B: 5 ml de virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 avec un titre de 105,8 TCID50/ml par voie IN; et, Groupes C et D: 5 ml de virus SDRP II 8B avec un titre de 105,8 TCID50/ml par voie IN. Evaluation des paramètres. 1. Réponse sérologique par essai IPMA à: TO: saignement et vaccination T21: saignement et revaccination T41: saignement T1: saignement et infection T1+7: saignement 7 jours après l'infection. 2. Evaluation de la température rectale, des réactions locales et générales, durant le 4ème jour après la vaccination et la revaccination ou jusqu'à ce que la température et les signes cliniques s'il y en a aient disparus. 3. Evaluation de la température rectale, de la perte d'appétit des signes cliniques suivant l'infection expérimentale. 4. Détection des anticorps dans le sérum et isolation de virus dans le sérum et dans les monocytes extraits à partir de prélèvement de sang. 5. Les paramètres de reproduction lors de mise bas, comme le nombre de cochonnets nés vivants, le nombre de mort- nés ou de cochonnets morts dans le ventre de la mère, et le nombre de cochonnets nés en vie, mais faibles et qui sont morts durant la première semaine. 6. Détermination du taux de virus présent dans le sérum par des méthodes de filtration sur des macrophages basés sur le CPE 7. Détermination de virus dans le liquide pleural et les poumons des cochonnets. Les résultats des paramètres de reproduction sont montrés in les tables 11 et 12 (provocation avec du PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) et 13-14 (provocation avec SDRP II 8B). TABLEAU 11 (TRUIES VACCINEES) Provocation avec PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 37a) 14 39 6 6 -- -- _ 5 68 12 8 2 1 1 7 10 7 1 -- 2 6 19 10 9 1 -- -- 8 38 9 8 -- -- 1 8 41 7 5 -- -- 2 5 71 7 5 -- -- 4 6 36 10 6 1 1 2 6 26b) TL 75 55 6 2 12 51 Tl = Total % de cochonnets vivants: 68% (51 survivants/75 nés). On note une protection de 68% quand on compare le nombre de cochonnets nés vivants, avec celui de cochonnets ayant survécus 7 jours. Du fait que l'infection expérimentale est plus puissante que l'infection naturelle dans cette étude, ajoutée aux résultats ci-dessus, il est possible de prévoir que les perspectives pour la protection sont même meilleures. TABLEAU 12 (TRUIES NON VACCINEES) Provocation avec PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 63 9 -- -- 1 8 -- 88 6 -- 3 -- 3 -- 79 8 -- 3 -- 5 -- 22 12 2 -- -- 10 1 28 7 3 -- -- 4 3 TL 42 5 6 1 30 4 TL = Total Pourcentage de cochonnets vivants: 9,5% (4 survivants/42 nés) La souche espagnole utilisée pour l'infection possède un potentiel de pathogénicité extrêmement élevé (90,5%) puisque seulement 4 cochonnets ont survécus après une semaine sur 42 cochonnets nés. TABLEAU 13 (TRUIES VACCINÉES) Provocation avec SDRP II 8B (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 51 13 10 2 -- 1 10 27 14 12 1 -- 1 il 16 9 8 --.. 1 7 17 15 13. . 2 12 1 7. .. .. .. . 7 8 15 13. . 2 13 57 10 9 -- -- 1 8 61 12 8 1 -- 3 8 78 10 10 -- -- -- 10 52c) TL 105 83 4 -- 11 86 TL = Total Pourcentage de cochonnets vivants: 82% (86 survivants/ naissances). On observe une protection approximative de 82%. TABLEAU 14 (TRUIES NON VACCINEES) Provocation avec du SDRP II 8B (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 62 12 7 1 4 -- 9 81 15 13 -- -- 2 13 4 12 12 -- -- --11 94 14 9 1 -- 4 9 1 13 8 1 4 -- 8 TL 66 49 3 8 6 50 TL = Total Pourcentage de cochonnets vivants: 75,7% (50 survivants sur 66 nés). On observe une mortalité approximative de 24,3%. La pathogénicité de la souche française est plus faible (24,3%) quand on la compare avec les résultats obtenus avec les provocations avec la souche espagnole (mortalité de 90,5%). Les résultats utilisés pour l'évaluation de l'efficacité comparant les truies vaccinées et non vaccinées ne sont pas très significatifs dans le cas de la souche française. Cependant dans certains cas la pathogénicité chez les animaux vaccines est réduite de 17,8%. Légende des tableaux 11 à 14. a): Maladie différente (ce n'est pas le PRRS (les cochonnets ne sont pas inclus). b): Malade, mort avant l'infection. c): malade mort pour d'autres raisons (1): Truie de référence (2): Nombre total de cochonnets (3): Nombre de cochonnets nés en bonne santé (4) z Nombre de cochonnets faibles (5): Nombre de cochonnets nés vivants à metatartus latus (6): Nombre de cochonnets mort-nés (7): Nombre de cochonnets vivant après une semaine. REVENDICATIONS 1. Vaccin capable de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction porcine (PRRS), caractérisé en ce qu'il comprend une quantité convenable d'antigènes viraux ou de virus du PRRS, souche espagnole, inactivés, ainsi qu'un adjuvant approprié et, éventuellement, un conservateur. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus PRRS, souche espagnole, est la souche dénommée PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, déposé à ECACC avec le numéro d'accès V93070108. 3. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une quantité de virus inactivé d'au moins 1055 TCID50/dose. 4. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur une culture de macrophage alvéolaire de poumon de porc. 5. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur une co-culture de cellule ST (ATCC CRL 1746 ST) et de macrophage alvéolaire de poumon de porc. 6. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur une culture de cellule ST (ATCC CRL 1746 ST). 7. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur des cellules hybrides provenant de la fusion entre des cellules de macrophages de poumon de porc avec des cellules ST par des moyens d'hybridation. 8. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur des cellules hybrides provenant de la fusion de macrophages alvéolaires de poumon de porc avec des cellules de la lignée L-14 (ECACC n' 91012317) ou des cellules de la lignée Jag-1. 9. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus a poussé sur des cellules ST ou tout autre lignée de cellule de porc dans lesquelles on avait introduit les gènes codant pour le récepteur membranaire de macrophage alvéolaire de poumon de porc pour le virus du PRRS. 10. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit adjuvant est un adjuvant huileux. 11. Vaccin selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit adjuvant huileux est constitué par un mélange de Marcol 52, Simulsol 5100 et Montanide 888. 12. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que qu'il est une émulsion de (i) une phase aqueuse antigénique contenant le virus inactive, et (ii) une phase huileuse contenant l'adjuvant. 13. Vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite émulsion est composée de 53 % en volume de phase aqueuse contenant le virus inactivé et 47 % en poids par une phase huileuse contenant l'adjuvant. 14. Vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que qu'il est capable d'induire une immunité cellulaire chez les animaux vaccinés. 15. Vaccin selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il contient de plus des substances stimulant la réponse cellulaire (CRP) qui stimulent les effets de la réponse cellulaire, telles que l'IL-1, 1'IL-2, 1'IL-4, l'Il- 5, l'Il-6, l'IL-12, l'IFN-g, le facteur de nécrose cellulaire et des substances similaires. 16. Vaccin salon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adjuvant est un adjuvant aqueux. 17. Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il contient de plus des substances stimulant les réponses cellulaires (CRP) qui induisent les effets de la réponse immune, telles que l'IL-2, l'IL-1, 1'IL-4, l'Il-5, l'Il-6, l'IL-12, l'IFN-g, le facteur de nécrose cellulaire et des substances similaires. 18. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adjuvant est un adjuvant qui peut moduler et immunostimuler la réponse cellulaire, comme le MDP, l'ISCOM ou les liposomes. 19. Vaccin capable de prévenir le syndrome respiratoire de la reproduction porcine (PRRS) caractérisé en ce qu'il est une émulsion comprenant: a) 53% d'une phase aqueuse contenant l'antigène viral PRRS dans un milieu de culture DMEM, souche espagnole, inactivée à une concentration minimum de 105'5 TCID50 par dose, et b) 47% d'une phase huileuse contenant un mélange de Marcol 52, Simulsol 5100 et Montanide 888. 20. Vaccin selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit antigène viral est le virus PRRS, souche espagnole, dénommé PRRS-CY-JPD- P5-6-91, déposé à ECACC avec le n d'accès V930707108. 21. Vaccin selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire une immunité cellulaire chez les animaux vaccinés. 22. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il contient de plus des substances stimulant la réponse cellulaire (CRP) qui stimulent l'effet immun cellulaire, telles que l'IL-1, i'IL-2, l'IL-4, 1'IL-5, l'IL-6, l'IL-12, 1'IFN-g, le facteur de nécrose cellulaire et des substances similaires. 23. Vaccin bi- ou multivalent capable de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction porcine et une autre ou d'autres infections porcines, caractérisé en ce qu'il contient une quantité appropriée d'antigènes viraux ou de virus du PRRS, souche espagnole, inactivé plus un ou plusieurs pathogènes de porc. 24. Vaccin selon la revendication 23, caractérisé en ce que ledit antigène viral est le virus du PRRS, souche espagnole, dénommé PRRS-CYJPD-P5-6-91, déposé à ECACC avec le n d'accès V93070108, 25. Vaccin selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il inclut au moins un pathogène porcin sélectionné dans le groupe formé de Actinobacilus pleuropneumoniae, Haemophilus parsuis. Parvovirus Porcin. Leptospira, Escherichia coli, Er sipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Coronavirus respiratoire porcin, Rotavirus ou contre les pathogènes causals de la maladie d'Aujeszky, de l'influenza de la truie ou de la gastroentérite transmissible. 26. Procédé pour la préparation d'un vaccin capable de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction porcine (PRRS), contenant une quantité appropriée de virus PRRS, souche espagnole, inactivée, plus un adjuvant approprié et éventuellement un conservateur caractérisé en ce qu'il comprend: 1) la croissance du virus causal du PRRS, souche espagnole dans un système cellulaire convenable, 2) la récolte du virus à partir dudit système cellulaire quand le titre minimum de 105'5 TCIDs0/ml a été atteint, 3) l'inactivation du virus par des moyens physiques ou des procédés chimiques, et 4) le mélange du virus inactivé avec l'adjuvant et le conservateur. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit virus du PRRS, souche espagnole, est le virus dénommé PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, déposé à 1'ECACC avec le n d'accès V93070108. 28. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit virus pousse sur: i) une culture de macrophages alvéolaires de poumon de porc, ou sur ii) une co-culture de macrophage alvéolaires de poumon de porc et de cellules ST (ARCC CRL 1746 ST), ou sur iii) une culture de cellules ST (ATTC CRL 1746 ST), ou sur iv) des cellules hybrides provenant de la fusion de macrophages alvéolaires de poumon de porc avec des cellules ST, ou sur v) des cellules hybrides provenant de la fusion de macrophages alvéolaires de poumon de porc avec des cellules de la lignée L-14 (ECACC n 91012317) ou avec des cellules de la lignée Jag- l, ou sur vi) des cellules ST ou sur une autre lignée cellulaire porcine dans lesquelles on a introduit les génes codants pour les récepteurs membranaires des macrophages alvéolaires de poumon de porc pour le virus PRRS. 29. Séquence d'ADN du virus causal du PRRS, souche espagnole, comprenant essentiellement les séquences d'ADN présentées dans les figures 1 à 5. 30. Virus causal du PRRS, souche espagnole, dont les caractéristiques essentielles correpondent à celles du virus dénommé PRRS-CY-218-JPD-P5-691, déposé à i'ECACC avec le n d'accès V93070108. 31. Virus selon la revendication 30, inactive, capable d'être utilisé pour l'élaboration de vaccins capables de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction porcine. 32. Virus selon la revendication 30, inactive, capable d'être utilisé pour l'élaboration de vaccins bi- ou multivalents capables de prévenir le syndrome respiratoire et de la reproduction porcine et d'autres infections porcines.