Brevet FR2700235A1 — publié le 19940713

La présente invention a pour objet des plantes transgéniques résistantes aux virus végétaux et un procédé d'obtention des plantes. Elle est également relative à des fragments d'ADN, d'ARN et à des protéines procurant une protection aux plantes à ltencontre de ces virus. Les virus sont parmi les pathogènes majeurs des plantes cultivées . Du fait de la dépendance des virus vis-à-vis de leurs cellules hôtes, il est difficile de les détruire sans courir le risque d'endommager les organismes qu'ils parasitent. Les moyens de lutte sont donc essentiellement préventifs : sélection sanitaire des semences, utilisation de variétés résistantes, assainissement des plantes infectées par thermothérapie ou culture de méristèmes. Certains génotypes possèdent des gènes de résistances pour certains virus , mais ces caractères sont extrêmement longs à être introduits dans d'autres lignées par les voies classiques de la génétique. Le nombre des espèces végétales accessibles à la transformation génétique s'accroît régulièrement . Des stratégies d'introduction de gènes de résistance par cette voie sont donc hautement désirables . Aucun gène naturel de résistance n'a encore été isolé, aussi les méthodes actuelles font appel à la construction de gènes artificiels. Les potyvirus forment par leur nombre et leur importance agronomique le groupe le plus important des virus végétaux . La particule virale filamenteuse de 600 à 900 nm de long contient une molécule unique d'ARN de polarité positive d'environ 10 kb. Chaque molécule d'ARN porte une protéine liée de manière covalente à son extrémité 5' (VPg) et est polyadénylée à son extrémité 3'. Dans la cellule végétale, ces virus induisent la formation d'inclusions cytoplasmiques cylindriques et parfois nucléaires de forme caractéristique. Ils sont transmis naturellement par les aphides sur le mode non-persistant. La plupart ont un spectre d'hôte relativement étroit. Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est le membre type de ce groupe. On distingue trois souches principales (O, N et C) caractérisées par les différences de symptômes qu'elles induisent. Le PVY est pathogène pour de nombreuses solanacées d'intérêt agronomique, comme le tabac, la tomate, le poivron et diverses variétés de pomme de terre . Chez cette dernière espèce les rendements peuvent être diminués de lO à 80% selon la souche du virus, le cultivar et le moment de l'infection. Une infection précoce du tabac peut induire une perte de rendement d'environ 30%; la maladie des nécroses des nervures, causée par la souche N sur certaines variétés de tabac, peut entraîner une perte totale de la récolte de cette plante. L'ARN des potyvirus , comme celui des autres virus de plantes de type picorna associés (népovirus et comovirus) est traduit en un polypeptide, qui est ensuite maturé par clivage protéolytique pour donner les protéines virales . La revue de Riechmann et al. (J. Gen.Virol.(1992), 73, 1-16) résume les résultats obtenus récemment. On a montré qu'il existe une grande similarité dans l'organisation génomique des protéines du complexe réplicatif des potyvirus, des comovirus et népovirus. L'analyse des séquences nucléotidiques des potyvirus a confirmé l'existence d'une seule longue phase de lecture ouverte, entre un codon AUG initiateur et un codon d'arrêt de traduction; l'ARN viral code pour une polyprotéine, qui est ultérieurement clivée par protéolyse enzymatique . Une carte génétique partielle de ces virus a été établie et est représentée pour le virus PVY sur la figure 1. Il a été montré que l'une des inclusions nucléaires (NIa) est une protéase (Carrington et Dougherty 1987, J. Virol. 61, 2540-2547), et des homologies de séquence mises en évidence avec les protéines codées par les picornavirus suggèrent que l'autre inclusion nucléaire (NIb) pourrait être impliquée dans la réplication (Domier et al. 1987 Virology 158, 20-27). Les autres protéines connues sont celles du facteur assistant ( "helper component") nécessaire à la transmission par les aphides, de l'inclusion cylindrique, du VPg lié en 5' de l'ARN viral, et enfin de la capside. S'y ajoutent deux protéines encadrant le facteur assistant. L'une d'une masse de 31 kD , appelée P1, pourrait être impliquée dans le transport de cellule à cellule ( Domier, (1987) , Virology, 158, 20-27) tandis que l'autre d'une masse de 38 kD appelée P3 serait impliquée dans la réplication (Gamble - Klein et al, Abstracts of the third international congress of plant molecular biology, Tuckson, Arizona, 6-11 Octobre 1991). En 1985 , Sanford et Johnston (J. Theor. Biol. 113, 395-405) ont émis le concept de résistance dérivée du pathogène, en vertu duquel des séquences nucléotidiques issues d'un pathogène peuvent être utilisées pour modifier génétiquement l'hôte afin qu'il devienne résistant à ce pathogène. Selon ce principe , une résistance vis-à-vis de virus végétaux a été déjà obtenue par transformation des plantes à l'aide de fragments d'ADN portant des gènes codant pour les protéines de la capside Une revue bibliographique a recensé les résultats obtenus sur différents virus végétaux ( Beachy et al. Annual Review of Phytopathol,l990, 28: 451-74) Cette technique a été plus précisément développée dans le cas des potyvirus et a abouti au dépôt de la demande PCT FR-89 00 260 ( publiée sous le n" WO-89 121 00) . Dans cette demande , on décrit la construction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus dans des conditions telles que sa fonction n'est pas altérée. Des plantes transgéniques pour ce gène et résistantes aux potyvirus peuvent être obtenues. Une autre publication mentionne l'obtention de plantes résistantes aux virus de la mosaïque du tabac par l'introduction d'un gène supposé coder pour une protéine non structurale qui pourrait être un composant du complexe de réplication de ce virus (Golemboski et al., Proc. National Acad. Sci. USA, Vol.87, pp.6311-6315, 1990 ) . Les auteurs montrent que les plantes transformées à l'aide d'un vecteur portant la séquence de ce gène présentent une résistance vis s à-vis du virus. Bien que les techniques précédemment décrites permettent l'obtention dans certains cas de plantes présentant une résistance aux virus végétaux , elles ne sont néanmoins pas applicables à toutes les espèces de plantes et pour tous les virus végétaux. En effet, dans le cas de certains potyvirus , les résultats n'ont pu conduire qu'à de faibles résistances. D'autre part , des mutations pourraient intervenir dans les virus, rendant inefficace la résistance induite chez les plantes transformées par les protéines de capside. Il serait donc souhaitable de générer d'autres types de gènes de résistance afin de pouvoir combiner plusieurs résistances dans des plantes transgéniques, et de cumuler les effets de résistances faibles. En conséquence,le demandeur s'est attaché à développer un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux potyvirus transformées par des séquences de gène non capsidiques, ne présentant pas les inconvénients précités. Selon l'invention, on a montré de manière surprenante que l'introduction dans des plantes d'un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à au moins une partie d'une protéine d'un potyvirus autre qu'une protéine de capside, conférait à ces plantes une résistance efficace à l'encontre de ces virus. Les inventeurs ont en outre montré de manière tout aussi surprenante que l'on pouvait sélectionner en quantités suffisantes des plantes résistantes à des virus végétaux par introduction directe d'une banque d'ADN dans des cellules ou des tissus de ces plantes. La présente invention a pour objet une plante résistante aux potyvirus, caractérisée en ce qu'elle porte dans son génome un ou plusieurs fragments d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou à une partie d'une protéine d'un virus donneur , à l'exception d'une protéine de capside , ladite plante étant susceptible d'être obtenue par introduction à l'aide de techniques connues de l'homme du métier, telles que l'électroporation, de vecteurs issus d'une banque d'ADN du virus donneur , et sélection selon des critères de résistance aux potyvirus On entend par virus donneur, un virus dont le génome va être à l'origine des fragments d'ADN à insérer dans le génome de la plante. Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite plante est caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou partie de protéine intervenant dans la formation du complexe réplicatif d'un potyvirus. Un tel fragment d'ADN peut contenir une partie de la séquence codant pour la protéine P3, en particulier une partie de la séquence comprise entre les nucléotides 2853 et 3492 de l'ADN complémentaire (ADNc) du potyvirus PVY Un tel fragment d'ADN peut aussi contenir une partie de la séquence codant pour la partie centrale de la protéase NIa, en particulier une partie de la séquence comprise entre les nucléotides 5999 et 6660 de la séquence de l1ADN complémentaire du potyvirus PVY Un troisième type de fragment d'ADN peut contenir une partie de la séquence codant pour l'extrémité C-terminale de la protéase NIa et l'extrémité N-terminale de la polymérase NIb, auquel cas le fragment d'ADN est préférentiellement compris entre les nucléotides 6652 et 7080 de la séquence de 1'ADN complémentaire du potyvirus PVY. Les séquences d'ADN complémentaire correspondant à la séquence du potyvirus Y ainsi que les acides aminés composant la polyprotéine correspondante ont été décrits dans la demande WO-89 12 100 précitée. Il est donc fait référence à ce document en ce qui concerne la numérotation des nucléotides et acides aminés de cette polyprotéine. Néanmoins, cette demande ne mentionne pas les séquences particulières objets de la présente invention. Selon un second mode de mise en oeuvre , ladite plante peut porter un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine intervenant dans le transport d'un potyvirus d'une cellule à une autre . Dans ce cas, le fragment d'ADN peut coder pour une partie de la protéine P1, et en particulier être compris entre les nucléotides 428 et 1044 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus PVY. Selon un troisième mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite plante peut aussi être définie en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine présentant une similarité avec les sites de clivage des protéines virales d'un potyvirus Préférentiellement , le potyvirus à l'encontre duquel les plantes sont résistantes est le virus Y de la pomme de terre Ladite plante peut être toute plante sensible à des virus végétaux et notamment aux potyvirus La présente invention peut d'autre part s'appliquer à la résistance de plantes à d'autres virus végétaux tels que les népovirus et les comovirus.Les fragments d'ADN portés par les plantes sont alors préférentiellement des fragments exprimant des transcripts correspondant à des protéines ou parties de protéine ayant des similarités avec la partie centrale de la protéase NIa ou la partie de la polyprotéine correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéase NIa et l'extrémité N-terminale de la polymérase NIb. Cette plante dans le cas du PVY appartient avantageusement à la famille des Solanacées incluant notamment le tabac , la tomate , le poivron et la pomme de terre La présente invention est en outre relative à un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus et procurant une protection aux plantes à l'encontre de virus végétaux , et en particulier des potyvirus La présente invention a de plus pour objet des ARN susceptibles d'être transcrits à partir d'un de ces fragments d'ADN Un autre objet de la présente invention est un fragment de protéine ou une protéine telle que définie ci-dessus et procurant aux plantes une résistance aux potyvirus De manière plus générale , la présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention de plantes résistantes à un virus végétal dans lequel - on introduit dans des cellules ou des fragments de tissu desdites plantes des vecteurs issus d'une banque d'ADN complémentaire d'un virus donneur - on régénère des plantes à partir desdites cellules ou desdits fragments de tissu , et - on sélectionne les plantes présentant une résistance à l'encontre du virus végétal. Avantageusement , un tel procédé peut être appliqué à la sélection de plantes résistantes à l'encontre d'un potyvirus , d'un népovirus ou d'un comovirus , mais le procédé peut être appliqué à l'obtention de plantes résistantes à tout virus végétal. Les vecteurs issus de la banque d'ADN complémentaire peuvent être introduits par électroporation ou par toute méthode connue de l'homme du métier permettant d'introduire un ADN dans une cellule végétale. Préférentiellement, le virus donneur tel que défini cides sus , est un virus appartenant à la même famille que celui pour lequel on cherche à obtenir des plantes résistantes Ainsi, on utilisera préférentiellement une banque d'ADN d'un potyvirus pour obtenir des plantes résistantes à un potyvirus. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent La figure 1 représente de manière schématique la structure connue de la polyprotéine du virus Y de la pomme de terre( 1A) et les peptides traduits à partir de ce virus (1B). Les flèches courbes indiquent les clivages protéolytiques. La figure 2 représente le schéma général d'obtention de plantes résistantes aux virus à partir d'ADN complémentaire de virus PVY. La figure 3 représente de manière plus précise le procédé de clonage des fragments d'ADN complémentaires viraux ayant abouti à la fabrication d'une banque d'ADN complémentaire Les figures 4 à 7 illustrent les résistances respectivement des descendants des clones FCD3E1, FCD3B6, FCD4A2 et FCD3I1. Le pourcentage de plantes infectées est exprimé en ordonnée tandis que le nombre de jours suivant l'inoculation du virus à la plante est indiqué en abscisse Les figures 8 et 9 illustrent respectivement les résistances des plantes de première et seconde générations homozygotes pour le gène introduit issues de croisements à partir du clone T3A5. Les figures 10 à 13 représentent la séquence nucléotidique de l'ADN exprimé dans les clones T3A5, FCD3I1 FCD4A2 et FCD3B6 et leurs séquences peptidiques correspondantes dans les trois cadres de lecture possibles notés a, b, et c La figure 14 est une carte génétique schématique du virus PVY, sur laquelle les flèches noires indiquent les positions des fragments de virus correspondant aux fragments d'ADN intégrés dans les lignes T3A5, FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6. EXEMPLE 1: Construction du vecteur d'expression de la banaue d'ADN complémentaires Le procédé de construction de ce vecteur est schématisé sur les figures 2 et 3 Sur la figure 2 de l'ADN complémentaire (ADNc) du génome viral (ARN PVY) est synthétisé par amorce au hasard dans l'étape (1). L'ADNc obtenu en (2) est cloné dans un site Sma I du plasmide pRT103NPT II(-) représenté schématiquement en (3) et donne naissance à une banque d'ADNc représentée schématiquement en (4). La banque d'ADNc(4) est alors introduite par électroporation dans une préparation de protoplastes de tabac (5) puis les clones sont sélectionnés et régénérés (6) et soumis à des tests de résistance au PVY(7). La figure 3 résume de manière plus précise la fabrication de la banque. Un fragment de 800 paires de base issu de la digestion par Hind-III du plasmide pABD1 ( Paskowski et al., 1984, EMB0,3,2717-2722) a été purifié et rempli par la polymérase de Klenow. Ce fragment correspond à la partie codante du gène conférant la résistance à la kanamycine. Il est ensuite cloné au site BamH1 du plasmide pRtlO3 rempli par la polymérase de Klenow ( Topfer et al. , 1987, N.A.R., Vol.15, n014). Le plasmide ainsi obtenu , dénommé pRtlO3NPTII(-), est composé par le promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ( CaMV) suivi d'un codon d'initiation de la traduction qui n'est pas en phase avec la région codante du gène conférant la résistance à la kanamycine issu du transposon bactérien Tn5, codant pour la protéine néomycine phosphotransférase II (NPTII). Ce plasmide comprend en outre le terminateur de transcription du virus de la mosaïque du chou-fleur. De l'ADN complémentaire de l'ARN viral d'une souche N du virus Y de la pomme de terre obtenu par amorçage au hasard (Sambrook et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory press) a été cloné dans le plasmide pRtlO3NPTII(-) au site SmaI. Le gène NPTII n'étant pas placé en phase avec le codon d'initiation de la traduction, l'insertion d'un fragment d'ADN complémentaire codant pour une fraction de la polyprotéine virale peut restaurer la continuité de la phase de lecture entre le codon d'initiation et la région codante du gène NPTII. Un tel événement conduit à l'assemblage d'une unité transcriptionnelle pouvant résulter en la synthèse d'une protéine de fusion comportant une extrémité N-terminale issue de la polyprotéine virale et une extrémité C-terminale correspondant à la néomycine phosphotransférase II ( NPTII). Il est à noter que la protéine NPTII est connue pour supporter des extensions N-terminales n'affectant pas son activité EXEMPLE 2: Obtention de plantes transsénisues La banque d'ADN complémentaire obtenue à l'exemple 1 a été introduite par électroporation ( Guerche et al., 1987 Biochimie, 69:621) dans des protoplastes de Nicotiana tabacum (variété Xanthi , clone diploïde D8). Des cals résistants à la kanamycine ont été sélectionnés , et des plantes ont été régénérées à partir de ces cals par les techniques connues de l'homme du métier. La descendance issue d'une autofécondation des plantes ainsi obtenues , a été récoltée et semée in vitro sur un milieu sélectif . La ségrégation pour la résistance à la kanamycine est du type Mendélien monogénique dominant chez les descendants des clones obtenus EXEMPLE 3 Résistance des plantes transqeniques au virus. Les descendants de plantes transgéniques ont été obtenus par autofécondation à partir de ces transformants primaires . Le comportement de ces plantes vis-à-vis d'une infection virale a été alors évalué. Vingt plantes de la descendance ont été inoculées mécaniquement par une dilution au 1/2000 d'un extrait de plantes infectées par le virus Yn, ainsi que vingt plantes témoins non transgéniques Cinq clones dont la descendance présente un phénotype de résistance au virus PVYn ont été obtenus ( sur 53 clones testés). Les résultats obtenus sont présentés sur les courbes des figures 4 à 7 ( respectivement descendants des clones FCD3E1, FCD3B6, FCD4A2 et FCD3I1) et 8 ( descendants du clone T3A5). Pour ces cinq clones les résultats obtenus ont mis en évidence de manière claire une résistance accrue à l'infection par des potyvirus par comparaison à une plante témoin. La résistance des plantes a été confirmée par un test ELISA ( SANOFI, Phyto Diagnostic ) qui permet de doser la protéine capsidiale du virus représentant ainsi le niveau d'infection des plantes EXEMPLE 4 Résistance des plantes de première génération et de seconde vénération issues du clone T3A5. Une autofécondation de la plante issue du clone T3A5 a été effectuée La résistance des plantes obtenues, dite de première génération a été testée . Les résultats figurent sur la courbe de la figure 8, comme indiqué précédemment Parmi ces plantes, on a recherché celles qui étaient homozygotes pour le marqueur de résistance à la kanamycine associé au fragment d'ADNc viral. La descendance d'une autofécondation d'une plante homozygote a été étudiée. Les résultats sont représentés sur la figure 9 Ces résultats montrent clairement que la résistance au virus Y est transmise de manière séxuée et est conservée à un niveau équivalent d'une génération à l'autre. EXEMPLE 5: Détermination des séquences exprimées dans les plantes transsniaues . Des ADN complémentaires correspondant aux transcripts des gènes chimériques exprimant un morceau de protéine virale, des plantes résistantes , ont été obtenus par la technique de rétrotranscription PCR (Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) Les deux oligonucléotides synthétisés qui ont permis d'amplifier les ADN complémentaires ont les séquences suivantes: ** l'amorce 1 couvre la séquence du vecteur d'expression pRtlO3NPTII(-) allant du nucléotide + 1 de la transcription jusqu'au codon ATG (Odell et al, 1985 Nature 313, 810) 5'ACCTCGAGTGGCCACCATG 3' ** l'amorce 2 couvre la séquence complémentaire du gène NPTII de pABD1 allant du nucléotide 1489 au nucléotide 1508:: 5' GGCCGGAGAACCTGCGTG 3' Un seul produit d'amplification est obtenu pour chaque plante étudiée Les fragments d'ADN amplifiés ont été purifiés et séquencés ( Applied Biosystem, Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) à l'aide de ces oligonucléotides afin de déterminer la partie du génome viral qui est exprimé dans ces plantes La séquence exprimée par le clone T3A5 est la suivante: de la base 428 jusqu'à la base 1044 du génome viral. Elle est représentée sur la figure 10 avec les séquences peptidiques correspondantes. Ce gène code pour la partie C terminale de la première protéine (P1) de la polyprotéine virale. Les plantes descendantes du clone T3A5 sont donc résistantes au virus Y et possèdent un fragment du gène codant pour la protéine P1 intégrée dans leur génome. Les séquences exprimées par les clones FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6 s'étendent respectivement de 2853 à 3492, de 5999 à 6660 et de 6552 à 7080. ( figures 11, 12 et 13). La séquence exprimée par le clone FCD3I1 peut coder pour une partie de la protéine P3 impliquée dans la réplication. La séquence exprimée par le clone FCD4A2 peut coder pour une partie de la protéine NIa comprenant le site de clivage protéolytique entre la partie VPg et la partie protéase de cette protéine ( Dougherty et Parks (1991) Virology 183 449-456). La séquence exprimée par le clone FCDB6 peut coder pour une protéine comprenant l'extrémité C-terminale de la protéase Nia et l'extrémité N-terminale de la polymérase NIb et comprend le site de clivage protéolytique séparant ces deux protéines. Un schéma représentant les différentes séquences exprimées dans les clones T3A5, FCD3I1, FCD4A2 et FCD3B6 est donné figure 14. REVENDICATIONS 1. Plante résistante aux potyvirus , caractérisée en ce qu'elle porte dans son génome un ou plusieurs fragments d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou à une partie d'une protéine d'un virus donneur , à l'exception d'une protéine de capside, ladite plante étant susceptible d'être obtenue par introduction de vecteurs issus d'une banque d'ADN du virus donneur , et sélection selon des critères de résistance au potyvirus. 2. Plante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine intervenant dans la formation du complexe réplicatif d'un potyvirus 3. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour la protéine P3. 4. Plante selon la revendication 3 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 2853 et 3492 de 1'ADN complémentaire du potyvirus Y 5. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour la partie centrale de la protéase NIa 6. Plante selon la revendication 5 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 5999 et 6660 de la séquence de l'ADN complémentaire du potyvirus Y. 7. Plante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN contient une partie de la séquence codant pour l'extrémité C-terminale de la protéase NIa et l'extrémité N-terminale de la polymérase NIb. 8. Plante selon la revendication 7, caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 6652 et 7080 de la séquence de 1'ADN complémentaire du potyvirus Y. 9. Plante selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou un fragment d'une protéine intervenant dans le transport d'un potyvirus entre les cellules. 10. Plante selon la revendication 9 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN code au moins pour une partie de la protéine P1. 11. Plante selon la revendication 10 , caractérisée en ce que le fragment d'ADN est compris entre les nucléotides 428 et 1044 de la séquence de 1'ADN complémentaire du potyvirus Y. 12. Plante selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle porte un fragment d'ADN exprimant des transcripts correspondant à une protéine ou une partie de protéine présentant une similarité avec les sites de clivage des protéines virales d'un potyvirus 13. Plante selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'elle est résistante au virus de la pomme de terre 14. Plante selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle appartient à la famille des Solanacées . 15. ADN ou fragment d'ADN tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 et procurant aux plantes une résistance à un potyvirus 16. ARN susceptible d'être transcrit à partir d'un fragment d'ADN selon la revendication 15. 17. Fragment de protéine ou protéine tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 et procurant aux plantes une résistance à un potyvirus 18. Procédé d'obtention de plantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans lequel - on introduit dans des cellules ou des fragments de tissu desdites plantes des vecteurs issus d'une banque d'ADN complémentaire d'un virus donneur - on régénère des plantes à partir desdites cellules ou desdits fragments de tissu et - on sélectionne les plantes présentant une résistance à l'encontre des potyvirus 19. Procédé selon la revendication 18 , caractérisé en ce que les vecteurs issus de la banque d'ADN complémentaire sont introduits par électroporation.