Brevet FR2702494A1 — publié le 19940916

La présente invention concerne une méthode de traitement d'un cancer secrétant lthCG ou des fragments d'hCG et des moyens pour la mise en oeuvre de cette méthode. L'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG) est une glycoprotéine oligomérique constituée de l'association non covalente de deux sous-unités a(hCG-a) et p(hCG-p). Elle appartient à la famille des hormones gonadothyréotropes comprenant également lthormone folliculotrope (FSH), l hormone lutéotrope (LH) et l'hormone thyréotrope (TSH). LThCG est écrêtée physiologiquement par le trophoblaste dès le début de la grossesse et stimule le corps jaune pour maintenir la synthèse d'hormones stéroïdiennes essentielle à l'implan- tation de ltembryon. Par ailleurs, lThCG et/ou ses sousunités sont également secrétées par une majorité de tumeurs trophoblastiques et certaines tumeurs non trophoblastiques, constituant ainsi des marqueurs biologiques pouvant aider au diagnostic ou au pronostic et à la surveillance de ces tumeurs (Bellet et al. Rev. Prat. 40:1677-1990). La séquence des acides aminés de l?hCG a été décrite par Morgan F. J. et al. The amino acid sequence of Human chorionic gonadotropin, J. Biol. Chem. 250, 5247, 1975. Au sein de la population normale, des taux sériques très faibles d'hCG dimèrique sont retrouvés chez lthomme ( Dans le cas de tumeurs trophoblastiques on a montré que les tumeurs placentaires bénignes (moles hydatiformes) et malignes (choriocarninomes) sont caractérisées par un rapport hCG-p/hCG sérique important : le pourcentage d'hCG-libre qui est de 0,05 à 1* lors de grossesses normales s'élève à 1-5% en cas de môle et dépasse 5% dans les choriocarcinomes. Ce rapport hCG ss/hCG sérique est utilisé comme un témoin d'évolution des tumeurs testiculaires : un pourcentage d'hCG-p devenant inférieur à 5% est souvent caractéristique d'une évolution favorable de la tumeur au cours du traitement. Ce rapport s'relèvera rapidement en cas d'évolution défavorable ou de rechute. Dans le cas de tumeurs non trophoblastiques, Marcillac et al. Cancer Res. 52:3901, 1992 ont montré que lthCG-ss, non détectable chez les individus sains, est retrouvée chez de nombreux patients atteints de certaines tumeurs non trophoblastiques (tumeurs de la vessie, du pancréas, du col de l'utérus, les tumeurs sans primitif retrouvé, les tumeurs de l'endomètre et du poumon). La présente invention a pour objet une méthode de traitement d'un cancer secrétant lThCG ou des fragments dThCG qui consiste à - identifier dans le sang circulant d'un patient à l'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides. - administrer au patient au moins un polypeptide correspondant à l'antigène responsable de l'état d'immunisation. Dans le cadre de la présente invention les polypeptides sont formés par un enchaînement de 15 à 40 aminoacides correspondant à une partie de la séquence primaire de lThCG. On désigne par ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de lthCG un ensemble de polypeptides tels que définis cidessus qui correspondent à des séquences successives de l'hCG ou de ses fragments ou mieux qui correspondent à des séquences qui se chevauchent. On peut par exemple utiliser un ensemble de polypeptides correspondant aux séquences suivantes hCG-a 1-20 15-35 30-50 45-65 60-80 75-92 hCG-ss 1-20 15-35 30-50 45-65 60-80 75-95 90-110 105-125 120-145 De préférence on utilisera au moins un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la hCG-p. Par "polypeptide correspondant à l'antigène responsable de ltétat d'immunisation on désigne un polypeptide qui a la même séquence que l'un des polypeptides responsable de lTétat d'immunisation ou une séquence résultant de la combinaison de séquences au moins partielles des polypeptides responsables de l'état d'immunisation. L'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides peut être identifié par un test de stimulation de la prolifération des lymphocytes T par les polypeptides, ou encore par un test de cytotoxicité des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides. On peut également mettre en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de 1'hCG ou de ses fragments. Ces anticorps peuvent être mis en évidence notamment par une méthode immuno-enzymatique telle qu'une méthode ELISA. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments dThCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de lThCG. La présente invention a également pour objet un vaccin destiné à l'immunothérapie de cancers secrétant lThCG ou des fragments dThCG comprenant au moins un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de lThCG. Pour la thérapie on peut utiliser les polypeptides sous forme libre ou sous une forme plus immunogène, notamment une forme dans laquelle le peptide est couplé à une matrice de polylysine selon la technique du MAP (Posnett et al. J. Biol. Chem. 263, 17, 1988). En outre, pour la thérapie on administre le polypeptide avantageusement avec un agent adjuvant de l'immunité. Comme exemples d'adjuvants de l'immunité on peut citer le muramyldipeptide et le SAF-l (Allison et al., J. Immunol. Methods 45, 157, 1986). On peut également administrer le polypeptide couplé à des nanosphères ou à des nanoparticules telles que celles décrites dans EP 0 240 424. Dans le cas du traitement de certains cancers et notamment dans le cas du cancer de la vessie, on peut également administrer en plus de façon concomitante ou en mélange du vaccin BCG (Bacille de Calmette Guérin) constitué par des souches vivantes atténuées de bacille tuberculeux (voir notamment D. Lamm et al, New England Journal of Medicine 325, 17, 1205, 1991). En pratique l'immunothérapie peut être réalisée avec des doses de polypeptides de 1 à 100 mg administrés au niveau de la tumeur. Par exemple, les polypeptides peuvent être administrés dans le cas d'un cancer de la vessie, comme cela est pratiqué déjà dans le cas d'une immunothérapie par le BCG, c'est-à-dire par instillation intravésicale une semaine après la résection de la tumeur, puis cette administration est répétée chaque semaine pendant 6 semaines et des administrations intravésicales supplémentaires sont effectuées 3, 6, 12, 18 et 24 mois après. Des administrations percutanées sont également possibles. Description des figures. On a représenté sur la Fig. 1 la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence de différents polypeptides. On donnera ci-après le compte-rendu d'essais de diagnostic. 1) Isolement des cellules mononuclées (PBMC) par qradient de ficoll Le sang total hépariné prélevé sur des patients présentant un cancer de la vessie est déposé sur une solution de ficoll-hypaque (1,077 g/l) dans un tube conique. Le tube est centrifugé 30 mn à 900 g, 18-20"C. La couche correspondant aux cellules mononuclées est récupérée à l'aide d'une pipette. Les cellules sont lavées dans du tampon de HANKs. 2) Test de prolifération lymphocytaire Les PBMC sont cultivés (2x105 cellules par puits) dans du RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain AB, 2mM de L-glutamine, 1000 UI/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine, en présence de polypeptide à différentes concentrations. Les cellules sont alors mises à incuber à 37"C avec 5% de CO2 pendant 5 jours. Un uCi de thymidine tritiée est ensuite ajouté dans chaque puit. Les cellules sont collectées 18 heures après et l'incorporation de la radioactivité est analysée par spectrométrie dans un liquide de scintillation utilisant un compteur ss. On a donné sur la Fig. 1 les resultats de prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence - du milieu de culture (M) - de l'hCG et de ses sous-unites a et ss - de différents polypeptides appartenant aux sous-unités a et ss. Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide correspondant à la séquence 95-115 de la sous-unité ss de lThCG ainsi qu'avec le peptide correspondant à la séquence 2559 de la sous-unité a de l'hCG. Les polypeptides 95-115 hCG-ss et 25-59 hCG-a peuvent être utilisés pour une immunothérapie chez le patient testé. 3) Test de cytotoxicité Les PBMC isolés par gradient de Ficoll sont testés pour leur action cytotoxique vis-à-vis de cibles autologues (lymphocytes B du patient immortalisés par llEpstein-Barr virus) marquées au chrome 51 et servant de cellules présentatrices des polypeptides de 1'hCG. La cytotoxicite est évaluée par le comptage de la radioactivite due au relargage de 51cor de la cible lysée. REVENDICATIONS 1. Trousse de diagnostic d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments dThCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de I'hCG. 2. Trousse de diagnostic selon la revendication 1, comprenant un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous unité ss de lthCG. 3. Trousse de diagnostic selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant des polypeptides ayant de 15 à 40 aminoacides. 4. Trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant des polypeptides dont les séquences se chevauchent. 5. Vaccin destiné à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments dThCG comprenant au moins un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG. 6. Vaccin selon la revendication 5, comprenant au moins un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de la sous unité ss de l'hCG. 7. Vaccin selon la revendication 5 ou la revendication 6, dans lequel le ou les polypeptides ont de 15 à 40 aminoacides. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel le polypeptide est couplé à une matrice de polylysine. 9. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, comprenant en outre un agent adjuvant de l'immunité. 10. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant en outre du BCG. 11. Méthode de diagnostic in vitro en vue du traitement d'un cancer secrétant 1'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à identifier dans le sang circulant d'un patient à l'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides. 12. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle l'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de stimulation des lymphocytes T par les polypeptides. 13. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle on met en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments.