Brevet FR2710074A1 — publié le 19950324

GENE GRB3-3. SES VARIANTS ET LEURS UTILISATIONS La présente invention concerne un nouveau gène, désigné Grb3-3, ses variants, et leurs utilisations, notamment en thérapie génique anticancéreuse. Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceuxì, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogénique. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines a été associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse. Différents facteurs impliqués dans la voie de signalisation ras dépendante ont été identifiés. Parmi ceux-ci figure le gène Grb2, qui code pour une protéine de 23-25 kDa ayant une structure SH3-SH2-SH3 (Lowenstein et al., Cell 70 (1992) 431; Matuoka et al., PNAS 89 (1992) 9015). Le produit du gène Grb2 semble interagir avec les protéines tyrosine phosphorylées, par son domaine SH2, et avec un facteur d'échange du GDP de la classe SOS, par son domaine SH3 (Egan et al., Nature 363 (1993) 45). I1 serait ainsi l'un des composants de l'activité transformante du produit du gène ras. La présente invention découle de la mise en évidence, du clonage et de la caractérisation d'un isoforme du gène Grb2, désigné Grb3-3, possédant une délétion dans le domaine SH2. Ce gène est exprimé dans les tissus adultes : l'ARNm correspondant est présent sous une bande unique de 1,5 kb, et est traduit en une protéine de 19 kDa. En raison de sa délétion dans le domaine SH2, le produit du gène Grb3-3 n'est plus capable d'interagir avec les protéines tyrosine phosphorylées (récepteur EGF phosphorylé), mais il conserve la capacité d'interagir avec les domaines riche en proline des protéines SOS. En raison de sa délétion, le produit du gène Grb3-3 est ainsi capable de s'opposer aux effets cellulaires du produit du gène Grb2. Le transfert de ce gène in vivo, ou de variants de celui-ci, y compris de séquences antisens, permet donc d'interférer avec le processus de transformation ras dépendant, et ainsi d'agir, à titre préventif ou curatif, sur la formation et le développement de cancers. Un premier objet de l'invention concerne donc une séquence nucléotidique comprenant tout ou partie du gène Grb3-3 (séquence SEQ ID n" 1). Un autre objet de l'invention concerne une séquence nucléotidique dérivée de la séquence SEQ ID nO 1 et capable d'inhiber au moins en partie l'expression de la protéine Grb2 ou Grb3-3. En particulier, l'invention concerne les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires des ARNm cellulaires Grb2 ou Grb3-3 et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléiques SEQ ID n" 1, transcrites dans l'orientation inverse. Les séquences nucléiques selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles, par exemple après injection à l'homme ou l'animal, pour induire une protection ou traiter les cancers. En particulier, elles peuvent être injectées sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elles peuvent également être administrées sous forme complexée, par exemple avec du DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), avec des lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), sous forme de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traIter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. De plus, il est possible d'introduire plusieurs séquences d'acide nucléique dans un même vecteur, ce qui augmente également l'efficacité du traitement. Le vecteur utilisé peut être d'origine diverse, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules tumorales humaines. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV), le virus de l'herpès, le cytomégalovirus (CMV), le virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224 ; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241 ; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101(1991)195 ; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988 ; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211 ; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088]. La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant. Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif. Le terme "virus défectif" désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidatîon des particules virales. 1l est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Concernant les adénovirus, il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Par ailleurs, ces virus ne s'intègrent pas dans le génome des cellules qu'ils infectent, et peuvent incorporer des fragments importants d'ADN exogène. Parmi les différents sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions ElAetElB. Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (il), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un virus recombinant ou une séquence nucléotidique tels que définis ci-dessus. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable, éventuellement directement dans la tumeur à traiter. I1 peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acides nucléiques (séquence ou vecteur) utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, de l'acide nucléique à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, concernant les virus recombinants selon l'invention, ceuxci sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. De telles compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées chez l'homme, pour le traitement et/ou la prévention des cancers. En particulier, les produits de l'invention étant capables de moduler l'activité des protéines ras, ils permettent d'intervenir dans le processus de développement des cancers, et notamment, ils peuvent inhiber l'activité des oncogènes dont l'activité transformante passe par une interaction p21-GAP fonctionnelle. De nombreux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques. Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gènes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du pancréas, dont 90 No ont un oncogène Ki-ras muté sur le douzième codon (Almoguera et coll., Cell 2 (1988) 549), les adénocarcinomes du colon et les cancers de la thyroïde (50 %), ou les carcinomes du poumon et les leucémies myéloïdes (30 to, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures Figure 1: Représentation schématique des domaines structuraux de Grb2 et Grb3-3. Figure 2 : Etude de la liaison de Grb3-3 au récepteur à l'EGF (figure 2a) et à des peptides riches en proline (figure 2b). Figure 3 : Effet de Grb3-3 sur la transactivation par ras d'un RRE dérivé de l'enhancer du virus du polyome. Techniques Générales de Biologie Moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 ; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoUchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l1ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. ll (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed hein Rection, Saiki R.K. et al., Science a (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. ffi (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. EXEMPLES 1. Isolement du gène Grb3-3 Le gène Grb3-3 a été isolé par criblage d'une banque d'ADN humain au moyen d'une sonde dérivée de la séquence du gène Grb2. 500 000 phages recombinants Lambda gtll portant des fragments d'ADN issus d'une banque de placenta humaine (Clontech) ont été criblés au moyen d'une sonde dérivée de la séquence du gène Grb2. La sonde utilisée correspond aux 8 premiers acides aminés de la protéine Grb2, et possède la séquence suivante: ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC 10 clones positifs ont ainsi été identifiés. L'insert de ces 10 clones a été isolé sous forme de fragments EcoRI, cloné dans le plasmide M13mpl8 et séquencé. Parmi ces 10 clones, 9 portaient des inserts identiques à la séquence Grb2. Un seul d'entreeux portait un insert d'une taille inférieure au gène Grb2, en raison d'une délétion dans le domaine SH2 (Figure 1). L'analyse de la séquence restante a révélé une identité parfaite avec les régions correspondantes de Grb2, y compris dans les régions 5' et 3' non codantes. La phase de lecture ouverte de ce clone code pour une protéine de 177 acides aminés (SEQ ID nO 1), comprenant 2 domaines SH3 bordant un domaine SH2 incomplet (figure 1). Les acides aminés délétés dans le domaine SH2 (résidus 60 à 100 de la protéine Grb2) correspondent aux résidus impliqués dans la liaison de Grb2 aux peptides contenant des tyrosines phosphorylées. 2. Activité de liaison de la protéine Grb3 3 Comme indiqué plus haut, la protéine Grb2 est le médiateur de l'interaction entre les récepteurs de facteurs de croissance phosphorylés et les facteurs SOS. Cet exemple démontre que la protéine Grb3-3 est incapable d'interagir avec le récepteur à l'EGF phosphorylé, mais qu'elle conserve sa faculté d'interagir avec un peptide riche en proline dérivé de la séquence du facteur SOS1 humain. La capacité de liaison de Grb3-3 a été étudiée en utilisant des protéines de fusion à la Glutathion-S-Transférase (GST), biotinylées. Ce type de fusion permet une purification rapide et efficace des produits recombinants. Pour cela, les séquences de l'invention ont été exprimées dans la souche d'E. coll TG1 sous forme de protéines de fusion avec la GST selon la technique décrite par Smith et Johnson [Gene 67 (1988) 31]. Brièvement, les gènes Grb2 et Grb3-3 ont tout d'abord été modifiés par introduction de part et d'autre des codons start et stop d'un site BamHI. Pour cela, les phases ouvertes de lecture de ces gènes ont été amplifiées par PCR au moyen des oligonucléotides suivants: Oligonucléotide 1(5'): GAATTCGGATCCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC Oligonucléotide II (3'): GAATTCGGATCCTTAGACGTTCCGGTTCACGGGGGTGAC La partie soulignée correspond au site BamHI crée, suivi ou précédé des codons start et stop. Les gènes ainsi amplifiés ont ensuite été clonés sous forme de fragments BamHI dans le vecteur pGEX 2T (Pharmacia) linéarisé par le même enzyme, en 3' et en phase d'un ADNc codant pour la GST. Les vecteurs ainsi obtenus ont ensuite été utilisés pour transformer la souche E.coli TG1. Les cellules ainsi transformées ont été précultivées une nuit à 370C, diluées au 1/10e dans du milieu LB, ajoutées d'IPTG pour induire l'expression (2 heures, 25"C), puis cultivées 21 heures environ à 25"C. Les cellules ont ensuite été lysées, et les protéines de fusions produites purifiées par affinité sur colonne Agarose-GSH. Pour cela, le lysat bactérien est incubé en présence du gel (préparé et équilibré avec le tampon de lyse) pendant 15 minutes à 4"C. Après 3 lavages avec un tampon Tris-HCl pH 7,4, les protéines sont éluées en présence d'un tampon Tris-HCl pH 7,7 contenant un excès de GST. Le surnageant est récolté et centrifugé. Le même protocole a été utilisé pour préparer un mutant de Grb2 dans lequel la glycine 203 est remplacée par une arginine (Grb2G203R) et un mutant de Grb3-3 dans lequel la glycine 162 est remplacée par une arginine (Grb3-3G162R). Le mutant Grb2G203R a été décrit comme n'ayant plus d'activité dans un test de réinitiation de la synthèse d'ADN (Lowenstein et al précitée). Le mutant Grb3-3G162R porte la même mutation sur la même position, et devrait donc également être inactif. Ces mutants ont été préparés par mutagénèse par PCR sur les gènes Grb2 et Grb3-3 en utilisant, en 5', l'oligonucléotîde I décrit ci-dessus, et en 3', l'oligonucléctide III suivant sur lequel le codon muté est souligné: Oligonucléotide Ici (3'): GACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTGCGGGGAAACATGCGGGTC Les fragments ainsi amplifiés ont ensuite été élués, réamplifiés par PCR au moyen des oligonucléotides I et II, puis clonés dans le vecteur pGEX 2T. Les mutants ont ensuite été produits comme décrit ci-dessus. Les protéines de fusion à la GST (GST-Grb2, GST-Grb3-3, GST-Grb33G162R et la GST) ont ensuite été biotinylées par les techniques classiques connues de l'homme du métier (Cf techniques générales de biologie moléculaire ainsi que Mayer et al., PNAS 88 (1991) 627), et utilisées comme sondes pour déterminer la liaison au récepteur à l'EGF phosphorylé immobilisé (2.1.) puis à un peptide dérivé de hSOS1 (2.2.). 2.1. Liaison au récepteur EGF phosphorylé Protocole : Le récepteur à l'EGF utilisé a été purifié à partir de cellules A431 par immobilisation sur WGA-sépharose selon la technique décrite par Duchesne et al. (Science 259 (1993) 525). 2 g de ce récepteur ont d'abord été stimulés par 1 M EGF, 10 min. à 22"C, puis incubés, avec ou sans ATP froid (10 tri), en présence de 2,5 mM MnCl2 dans un tampon HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton, 10 Go Glycérol, pH=7,5) à 4"C pendant 2 min. La phosphorylation du récepteur est ensuite stopée par addition d'un tampon de dégradation. Les échantillons sont ensuite déposés sur un gel SDS-PAGE 4-20 to puis transférés sur des membranes de polyvinylgdène difluorure (PVDF). Les blots ont ensuite été incubés en présence des différentes fusions GST biotinylées (2 pg/ml), puis révélés au moyen de streptavidine couplée à la phosphatase alkaline (Promega). Les récepteurs EGF ont également été soumis à un immunoblot en présence d'anticorps anti-phosphotyrosines (anti--PY) pour vérifier que les récepteurs ont bien été phosphorylés. Résultats : Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2a. Ils montrent, comme attendu, que la protéine Grb2 interagit avec le récepteur EGF sous forme phosphorylée seulement. Ils montrent ensuite que la protéine Grb3-3 ne lie pas le récepteur EGF, quel que soit son degré de phosphorylation. 2.2. Liaison à un peptide dérivé de hSOS1 Protocole: Les deux peptides riches en proline suivants ont été synthétisés: Peptide hSOSî : GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: Ce peptide correspond aux résidus 1143 à 1162 de la protéine hSOS1 (Li et al., Nature 363 (1993) 83), responsable de l'interaction entre Grb2 et hSOS1. Peptide 3BPî : PPPLPPLV : Ce peptide est dérivé de la protéine 3BP1, qui est connue pour lier de manière efficace le domaine SH3 de Abl et Src (Cicchetti et al., Science 257 (1992) 803). Chacun de ces peptides (1 p1, 10 mg/ml) a été immobilisé sur membrane de nitrocellulose. Les membranes ont ensuire été incubées dans un tampon bloquant Cris 20 mM pH=7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween, 3 % albumine bovine). Les membranes ont ensuite été incubées une nuit à 40C en présence des différentes fusions GST biotinylées (4 pg/ml), puis révélées au moyen de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline (Promega) Résultats : Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2b. Ils montrent que Grb3-3, comme Grb2, est capable de lier le peptide hSOS1. Ils montrent de plus que cette interaction est spécifique puisqu'aucune liaison n'est observée avec le peptide 3BP1. Par ailleurs, les résultats montrent également que le mutant Grb3-3G162R n'est plus capable de lier le peptide hSOS1, ce qui confirme l'importance de ce résidu et le role fonctionnel de cette interaction. 3. Activité transformante de la protéine Grb3-3 Cet exemple démontre que, en dépit de sa délétion dans le domaine SH2, la protéine Grb3-3 possède un effet fonctionnel. L'activité de la protéine Grb3-3 a été étudié par détermination de sa capacité à coopérer avec ras pour la transactivation d'un promoteur possédant des éléments de réponse à ras (RRE), et gouvernant l'expression d'un gène reporteur. Le protocole utilisé a été décrit par exemple dans Schweighoffer et al., Science 256 (1992) 825. Brièvement, le promoteur utilisé est un promoteur synthétique composé du promoteur murin du gène de la thymidine kinase et de 4 éléments PEA1 répétés dérivés de l'enhancer du polyôme (Wasylyk et al., EMBO J. 7 (1988) 2475): promoteur Py-TK. Ce promoteur dirige l'expression du gène reporteur, en l'occurrence du gène bactérien de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) vecteur Py-TK-CAT. Les vecteurs d'expression des gènes testés ont été construits par insertion desdits gènes, sous forme de fragments BamHI, au site BglII du plasmide pSV2. Ce site permet de placer les gènes sous controle du promoteur précoce SV40. Des cellules NIH 3T3 à 40 Go de confluence ont été co-transfectées avec 0,5 g du vecteur Py-TK-CAT et 0,5 ou 2 Fg du vecteur d'expression portant, sous contrôle du promoteur précoce de SV40, le gène de: Grb2, 2 g (b), Grb3-3, 2 g (c), ras sauvage (wt ras), 0,5 ,ug (d), wt ras 0,5 g et Grb2 2 g (e), wt ras 0,5 Fg et Grb2G203R 2 g (f), wt ras 0,5 ,ug et Grb3-3 2 g (g), wt ras 0,5 g et Grb33G162R 2 ,ug (h). Dans chaque cas, la quantité totale d'ADN a été ajustée à 5 Fg avec un vecteur d'expression sans insert. La transfection a été effectuée en présence de lipospermine (Transfectam, IBF-Sepracor). Les cellules ont été maintenues 48 heures en culture dans un milieu DMEM supplémenté par 1 to serum de veau fétal. L'activité CAT a ensuite été déterminée comme décrit par Wasylyk et al (PNAS 85 (1988) 7952). A titre de controle, les cellules NIH 3T3 n'ont été transfectées qu'avec le vecteur Py-TK-CAT (a). Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3. Ils montrent clairement que l'expression de la protéine Grb3-3 induit une augmentation de l'activité CAT rasdépendante. Ce résultat indique donc que, in vitro, la protéine Grb3-3 est capable de coopérer avec ras pour la transactivation du promoteur synthétique utilisé. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Gene Grb3-3, ses variants et leurs utilisations. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 933 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 37..567 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Grb3-3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54 Met Glu Ala Ile Ala Lys 1 5 TAT GAC TTC AAA GCT ACT GCA GAC GAC GAC CTG AGC TTC AAA AGG GGG 102 Tyr Asp Phe Lys Ala Thr Ala Asp Asp Asp Leu Ser Phe Lys Arg Gly 10 15 20 GAC ATC CTC AAG GTT TTG AAC GAA GAA TGT GAT CAG AAC TGG TAC AAG 150 Asp Ile Leu Lys Val Leu Asn Glu Glu Cys Asp Gln Asn Trp Tyr Lys 25 30 35 GCA GAG CTT AAT GGA AAA GAC GGC TTC ATT CCC AAG AAC TAC ATA GAA 198 Ala Glu Leu Asn Gly Lys Asp Gly Phe Ile Pro Lys Asn Tyr Ile Glu 40 45 50 ATG AAA CCA CAT CCG TTT GGA AAC GAT GTG CAG CAC TTC AAG GTG CTC 246 Met Lys Pro His Pro Phe Gly Asn Asp Val Gln His Phe Lys Val Leu 55 60 65 70 CGA GAT GGA GCC GGG AAG TAC TTC CTC TGG GTG GTG AAG TTC AAT TCT 294 Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp Val Val Lys Phe Asn Ser 75 80 85 TTG AAT GAG CTG GTG GAT TAT CAC AGA TCT ACA TCT GTC TCC AGA AAC 342 Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser Thr Ser Val Ser Arg Asn 90 95 100 CAG CAG ATA TTC CTG CGG GAC ATA GAA CAG GTG CCA CAG CAG CCG ACA 390 Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln Val Pro Gln Gln Pro Thr 105 110 115 TAC GTC CAG GCC CTC TTT GAC TTT GAT CCC CAG GAG GAT GGA GAG CTG 438 Tyr Val Gln Ala Leu Phe Asp Phe Asp Pro Gln Glu Asp Gly Glu Leu 120 125 130 GGC TTC CGC CGG GGA GAT TTT ATC CAT GTC ATG GAT AAC TCA GAC CCC 486 Gly Phe Arg Arg Gly Asp Phe Ile His Val Met Asp Asn Ser Asp Pro 135 140 145 150 AAC TGG TGG AAA GGA GCT TGC CAC GGG CAG ACC GGC ATG TTT CCC CGC 534 Asn Trp Trp Lys Gly Ala Cys His Gly Gln Thr Gly Met Phe Pro Arg 155 160 165 AAT TAT GTC ACC CCC GTG AAC CGG AAC GTC TAAGAGTCAA GAAGCAATTA 584 Asn Tyr REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n" 1. 2. Séquence nucléotidique dérivée de la séquence SEQ ID n" 1 et capable d'inhiber au moins en partie l'expression de la protéine Grb2 ou Grb3-3. 3. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon les revendications 1 ou 2. 4. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 5. Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine. 6. Vecteur selon les revendications 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication. 7. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 3 à 6. 8. Composition pharmaceutique comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon les revendications 1 ou 2, sous forme complexée à du DEAE; dextran, à des protéines nucléaires ou à des lipides, sous forme brute ou encore incorporée à des liposomes.