Brevet FR2703683A1 — publié le 19941014

Dérivés d'aminocoumarines hydrophobes, et Leur utilisation comme substrats d'enzymes protéolytiques ou pour la préparation de teLs substrats. La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés d'aminocoumarines, utilisables comme substrats d'enzymes protéolytiques ou pour la préparation de tels substrats. Les coumarines sont une importante famille de molécules présentant des applications très variées. En effet, en dehors des domaines comme la pharmacologie où elles peuvent jouer le rôle d'anticoagulants, les coumarines sont très utilisées pour leurs propriétés optiques (fluorescence et chimiluminescence), par exemple en tant que - colorants pour Lasers, - produits fluorescents pour l'optique, - produits pour La synthèse de substrats d'enzymes utilisés dans des dosages d'enzymes, en particulier pour le diagnostic médical, et - marqueur de molécules biologiques utiles également dans le domaine du diagnostic médical. De façon plus précise, la présente invention concerne des dérivés d'aminocoumarines utilisables comme substrats d'enzymes protéolytiques ou pour la synthèse de tels substrats Pour la préparation d'un substrat d'enzyme protéolytique, on réalise le plus souvent une combinaison chimique entre a) un colorant ou un produit fluorescent et b) une molécule biochimique telle qu'un acide aminé, un peptide protégé ou non protégé, un acide carboxyLique ou un acide gras. Le substrat ainsi formé doit présenter les propriétés suivantes : 10) les caractéristiques de coloration ou de fluorescence du colorant ou du produit fluorescent a) doivent être annulées ou très fortement déplacées ou diminuées dans le substrat, 20) le substrat doit être capable de réagir avec des enzymes spécifiques pour subir un clivage, 30) le clivage doit régénérer le produit colorant ou fluorescent a) et restaurer ainsi la couLeur ou la fluorescence, 40) cette restauration doit être proportionnelle à La quantité d'enzyme mise en oeuvre pour que les substrats puissent servir au dosage d'enzymes, et 50) le substrat doit être non toxique pour pouvoir éventuellement être utilisé avec des cellules vivantes. Parmi les dérivés d'aminocoumarines connus, on a utilisé jusqu'à présent pour La préparation de substrats d'enzymes protéolytiques, la 7-amino 4-méthyl coumarine, la 7-amino 4-trifluorométhyl coumarine, L'acide 7-amino coumarine 4-méthane sulfonique, la 4(3',6',9'-trioxanonyl) 7-amino coumarine, comme il est décrit dans Chem. Pharm. Bull. Vol. i > 1977, p. 362-363, dans J. Org. Chem., Vol. 45, p. 2283-2287, dans Chem. Pharm. Bull. Vol. 36, 1988, p. 3496-3502, et dans EP-A- 0 516 532. Couplée à la L-alanine, la 7-amino-4-méthyl coumarine peut être utilisée par exemple comme substrat pour la L-alanine amino peptidase. Cette coumarine est très intéressante car elle est très fluorescente avec un maximum d'intensité de fluorescence, environ 14 fois plus élevé que celui des amines utilisées habituellement comme substrat, telles que la ss-naphtylamine. Par ailleurs, il y a une différence d'intensité de fluorescence importante entre l'aminocoumarine et le substrat correspondant amide. Le document EP-A- 0 516 532 décrit en particulier des dérivés de coumarines hydrosolubles qui conviennent pour des dosages effectués en milieu homogène dans des solutions aqueuses où il est important d'avoir une bonne solubilité dans l'eau du substrat d'enzyme ou du colorant (a). En revanche, ces dérivés de coumarines hydrosolubles ne conviennent pas pour détecter des réactions enzymatiques ayant lieu sur des supports solides en contact avec un milieu aqueux, par exemple pour la détection de réactions enzymatiques sur des coupes histologiques, sur des gels, papiers, etc. ... car dans ce cas, le colorant doit être hydrophobe pour ne pas être dissous ou élué mais maintenu précipité sur le site et y être détecté, visualisé ou dosé. En effet, avec Les colorants hydrosolubles connus, ceux-ci diffuseront dans le milieu aqueux au lieu de rester sur le support solide et l'on ne pourra localiser sur le support les sites où se produit la réaction enzymatique par la coloration ou la fluorescence du colorant libéré. Il en est de même, des autres dérivés connus de coumarine qui ont une hydrophilie trop importante : en raison de leur diffusion dans le milieu aqueux, ils ne permettront pas de visualiser ou quantifier les sites intéressants. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux dérivés d'aminocoumarines, utilisables comme substrats d'enzymes protéolytiques ou pour la préparation de tels substrats, qui présentent un caractère hydrophobe les rendant moins aptes à la diffusion dans une phase aqueuse, ce qui permet leur utilisation pour localiser des sites fluorescents sur des supports solides, en milieu hétérogène. Selon l'invention, le dérivé d'aminocoumarine répond à la formule dans laquelle 10) R1 représente un groupe choisi parmi les groupes alkyle, linéaires ou ramifiés, en C1 à C17, les groupes cycloalkyle en C3 à C10 et Les groupes aryle en C6 à C14, Le groupe alkyle, cycloalkyle ou aryle étant non substitué ou substitué par au moins un substituant constitué par - un atome dthalogène, - OH - OR7 - COOR7 - CONHR7 - CONR7R8, - NR7R8, ou - So3R7 avec R7 et R8 identiques ou différents, représen tant un groupe alkyle en C1 à C17, ou un groupe aryle en C6 à C14, ou avec R7 et R8 formant ensemble un cycle hydrocarboné, saturé ou insatu ré, comportant éventuellement un hétéroatome choisi parmi 0, S et N ;; 20)l'un des R2, R3, R4 et R5 représente - NH2 - NHR7 - NH-COOR7 - N(R8)COOR7 - NHR9, ou - NR7R9 avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus et R9 représentant un groupe acyle dérivé d'un composé choisi parmi les acides aminés, les peptides, les acides carboxyliques et les acides gras, le groupement amine des acides aminés ou des peptides étant protégé ou non protégé, salifié ou non salifié ; 30) les autres R2, R3, R4 et R5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent - un atome d'hydrogène, ou - un groupe allyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, OR7, COOR7, CONHR7, -CONR7R8, NR7R8, So3R7 et CF3, avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus, ou R2 et R3, R3 et R4 ou R4 et R5 forment ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou R3, R4 et R5, ou R2, R3 et R4 forment ensemble avec le noyau phényle auquel ils sont Liés un noyau polycyclique à 3 cycles condensés ; et 40) R6 représente - un atome d'hydrogène, ou - un groupe choisi parmi les groupes alkyle en C1 à C17, aryle en C6 à C14 et cycloalkyle en C3 à C10, Le groupe allyle, aryle ou cycloalky- le étant non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, COOR7, OR7, et So3R7 avec R7 ayant la signification donnée ci-dessus, et ses sels d'addition à des acides. Dans le dérivé de coumarine de l'invention, la présence de R1 qui est constitué par un groupe alkyle, un groupe cycloalkyle ou un groupe aryle, éventuellement substitué, confère au dérivé un caractère hydrophobe qui permet de limiter la diffusion de ce dérivé dans un milieu aqueux. On a déjà réalisé des dérivés de coumarine comportant une chaîne hydrophobe comme il est décrit par Legler et al dans Biol. Chem. Hoppe - Seyler, vol. 366, p. 1113-1122, Décembre 1985. Cependant, dans ce cas, il s'agissait d'ombelliférone et non d'aminocoumarine ; de plus, selon ce document, la présence d'une chaine hydrophobe a pour but de rendre le substrat enzymatique (ombelliféryl glucoside) plus spécifique d'une enzyme particulière, la glucosylcéramidase qui a une préférence pour les longues chaînes aliphatiques hydrophobes. En revanche, dans l'invention, la présence d'un groupe R1 ayant un caractère hydrophobe, a pour but d'empêcher la diffusion en phase aqueuse du colorant libéré par le substrat enzymatique sans modifier sa spécificité vis-à-vis de L'enzyme à laquelle il est destiné. Selon l'invention, les groupes alkyle susceptibles d'être utilisés pour R1 sont des groupes linéaires ou ramifiés ayant de 1 à 17 atomes de carbone, des groupes cycloalkyle de 3 à 10 atomes de carbone ou des groupes aryle de 6 à 14 atomes de carbone, ces groupes allyle, cycloalkyle ou aryle pouvant être éventuellement substitués par au moins l'un des substituants mentionnés ci-dessus. De préférence, dans l'invention, R1 représente un groupe alkyle de 3 à 8 atomes de carbone, par exemple le groupe butyle ou pentyle. Dans la formule (I) donnée ci-dessus, les groupes alkyle représentant R7, R8, R2, R3, R4 et/ou R5 peuvent être des groupes linéaires ou ramifiés, ayant généralement de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence 1 à 5 atomes de carbone. Le terme "groupe alcoxy" utilisé pour R2, R3, R4 et/ou R5, représente un groupe linéaire ou ramifié, ayant généralement de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence 1 à 5 atomes de carbone. Les termes "groupes aryle" utilisés pour R1 à R8 désignent des radicaux dérivés d'hydrocarbures aromatiques comme Le benzène et le naphtalène. A titre d'exemple de tels groupes, on peut citer les groupes phényle et naphtyle. Les termes "cycle hydrocarboné, saturé ou insaturé" désignent des hydrocarbures cycliques, saturés ou insaturés, ayant de 3 à 10 atomes de carbone. Lorsqu'ils comportent 1 ou plusieurs hétéroatomes, il peut s' agir par exemple de la pipéridine, de La pyridine, de la pipérazine, du pyrrole, du furanne, du pyranne et de la morpholine. Dans le cas de R9, le groupe acyle peut être dérivé d'un acide aminé appartenant au groupe des acides aminés naturels, en particulier de ceux servant de substrats pour des enzymes. Ce groupe acyle peut être également dérivé d'un peptide formé de plusieurs acides aminés, en particulier d'acides aminés naturels. Les acides aminés et les peptides peuvent se trouver sous la forme libre, sous la forme de sel, par exemple de chLorhydrate, ou sous une forme protégée, c'est-à-dire que le groupe amino terminal du peptide ou de L'acide aminé est protégé par un groupement approprié tel que ceux utilisés habituellement en synthèse peptidique, par exemple le groupe benzyloxycarbonyle (CBZ), le groupe tbutyloxycarbonyle (t-BOC), Le groupe fluorénylméthoxycarbonyle (FmOC) ou le groupe succinyle. Lorsque l'acide aminé ou le peptide formant R9 comportent d'autres groupes amino et/ou carboxyle libres, ceux-ci peuvent être protégés par des groupes appropriés ou être salifiés. A titre d'exemple de peptides utilisables pour former le groupe acyle R9, on peut citer Les peptides suivants : Pro-Arg ou tBOC-Val-Pro-Arg. Le groupe acyle utilisé pour R9 peut encore être dérivé d'un acide carboxylique ou d'un acide gras ayant 4 à 18 atomes de carbone, utilisable comme substrat d'enzyme. A titre d'exemple de tels acides, on peut citer l'acide phénylacétique et l'acide butyrique. Lorsque R2, R3 et R4 ou R3, R4 et R5 forment avec le noyau phényle, un noyau polycyclique comportant éventuellement un ou pLusieurs hétéroatomes, il peut s' agir par exemple du noyau suivant : SeLon un premier mode de réalisation de l'invention, les dérivés de coumarines de formule (I) sont destinés à être utilisés pour la synthèse de substrats d'enzymes. Dans ce cas, l'un des R2, R3, R4 et R5, de préférence R4, représente -NH2, -NHR7 ou -NH-COOR7, car on peut facilement coupler le dérivé de coumarine comportant un tel groupe à un composé approprié (acide aminé ou peptide) pour former un substrat d'enzyme. Les dérivés conformes à ce premier mode de réalisation de l'invention constituent donc des produits intermédiaires très intéressants car, à partir d'un seul dérivé, on peut réaliser toute une gamme de substrats d'enzymes par réaction avec des composés appropriés. Dans ce premier mode de réalisation, lorsque le groupe NH2, NHR7 ou NH-COOR7 se trouve en position R4, R2, R3, R5 et R6 représentent avantageusement un atome d'hydrogène. Selon un second mode de réalisation de l'invention, Les dérivés de coumarine sont destinés à être utilisés comme substrat d'enzyme. Dans ce cas, l'un des R2, R3, R4 et R5 représente -NHR9 et R9 est choisi en fonction de L'enzyme à laquelle est destiné le substrat. Ainsi, R9 peut être un radical dérivé de La L-alanine pour constituer un substrat de la L-alanine aminopeptidase, un radical dérivé de l'argi- nine, par exemple le groupe benzoxycarbonyl arginyle, pour constituer un substrat de la trypsine, le groupe pyroglutamyle pour former un substrat de la pyroglutanyl aminopeptidase ou le groupe 7-glutamyle pour former un substrat de la 7-glutamyltransférase. R9 peut encore être un radical acyle dérivé d'un peptide, par exemple Val-Pro-Arg protégé par le groupe butyloxycarbonyle, afin de servir de substrat pour la thrombine. Dans ce second mode de réalisation, le groupe NHR9 ou NR7R9 est de préférence en position R4. Dans ce cas, R2, R3, R5 et R6 représentent avantageusement un atome d'hydrogène. Dans Les deux modes de réalisation de l'invention, R6 représente de préférence un atome d'hydrogène, mais il peut aussi représenter un substituant permettant d'améliorer encore l'hydrophobie ou la fluorescence du dérivé. Les dérivés de coumarine de L'invention peuvent être préparés par un procédé classique mettant en oeuvre la réaction de Pechman, à partir des esters ss-cétoniques correspondants de formule : R1-CH2-CO-CH(R6)-COOR10 (II) dans laquelle R1 et R6 ont les significations données ci-dessus, et R10 représente un groupe allyle, un groupe aryle ou un groupe cycloalkyle. En effet, en faisant réagir ces esters ss-cetoniques comportant le groupement hydrophobe R1, sur des phénols comportant les substituants R2 à R5, on obtiendra le dérivé de coumarine de l'invention. Les esters ss-cétoniques de formule (II) peuvent être préparés par un procédé classique tel que celui décrit dans EP-A- 0 516 532, à partir des acides de formule R1-CH2-COOH. Le procédé de préparation de ces esters ss-cétoniques comprend, par exemple les étapes suivantes : 10) transformer un acide de formule R1 CH2-COOH dans laquelle R1 a la signification donnée ci-dessus, en l'imidazolide ou le chlorure d'acide correspondant, 20) faire réagir l'imidazolide ou le chlorure d'acide avec un ester de formule : pour former un dérivé acylé, et 3 ) faire réagir le dérivé acylé avec un alcool de formule R100H pour obtenir L'ester ss-cétonique de formule (II). Les acides de départ R1-CH2-COOH ou les chlorures d'acide sont des produits du commerce ou peuvent être préparés par des procédés classiques. L'ester de formule (III) existe dans le commerce (acide de Meldrum) ou peut être préparé par un procédé classique en partant de l'acide de Meldrum ou d'un malonate de diéthyle et en pratiquant deux substitutions successives sur le CH2 malonique. Pour préparer les dérivés de coumarines de formule (I) de l'invention, on fait réagir l'ester ss-cétonique de formule (II) décrit ci-dessus avec un phénol de formule : dans laquelle R2, R3, R4 et R5 ont les significations données ci-dessus, l'un de ces substituants représentant NH2, NHR7, NHCOOR7 ou NR8COOR7. Cette réaction de condensation (réaction de Pechman) peut être effectuée dans l'eau, dans un alcool, dans un mélange mixte eau-alcool, en présence d'un catalyseur acide tel que H2S04, HCl, CF3COOH ou leurs sels, par exemple le chlorure d'aluminium, Le chlorure de zinc ou Le chlorure d'étain. Une fois la condensation effectuée, le dérivé de coumarine sera purifié par les méthodes habituelles si la fonction amine est libre, c'està-dire lorsque R4 représente NH2 ou NHR7. Si la fonction amine est protégée, c'està-dire que R4 représente NHCOOR7 ou NR8COOR7, elle sera déprotégée par hydrolyse en milieu acide ou par hydrogénolyse, puis le produit obtenu sera purifié par les méthodes classiques. Pour préparer un dérivé de coumarine dans lequel l'un des groupes R2, R3, R4 et R5 représente -NHR9 ou -NR7R9, on fait réagir une amino courmarine de formule (I) dans laquelle l'un des R2, R3, R4 et R5 représente -NH2 ou -NHR7, avec l'acide aminé, Le peptide, L'acide carboxylique ou L'acide gras correspondant. Pour cette réaction de couplage, le peptide ou L'acide aminé est généralement protégé sur sa fonction amine NH2 par un groupement approprié tel que le groupe benzyloxycarbonyle ou le groupe tbutyloxycarbonyle. Le couplage peut être effectué par une méthode classique de synthèse peptidique tel Le que celle décrite dans Bodanzki, Principles of Peptidic Synthesis, Springer Verlag, 1984, par exemple après formation d'un anhydride mixte (en utilisant le chloroformiate d'éthyle ou d'isobutyle, ou Le chlorure de diphénylphosphinyle), ou par action d'un agent de condensation tel que le dicyclohexyîcarbodiimide. Une fois le couplage effectué, la fonction amine de L'acide aminé ou du peptide sera déprotégée par hydrogénation catalytique ou par hydrolyse acide. Le produit final étant éventueLlement purifié par chromatographie, puis salifié. Dans le cas de peptides, on peut coupler successivement le dérivé de coumarine comportant une fonction amine libre telle que NH2 ou NHR7 avec les différents acides aminés formant le peptide. Les dérivés de coumarines de formule (I) dans laquelle l'un des R2, R3, R4 et R5 comprend un tel groupe acyle R9 peuvent être utilisés comme substrats d'enzymes dans un procédé de détection d'enzymes sur un support solide. Pour cette détection, on peut utiliser le dérivé tel queL, ou sous la forme de chlorhydrate, bromhydrate, trifluoroacétate. Pour effectuer cette détection, on prépare tout d'abord une solution, par exemple dans le DMSO de concentration choisie d'un dérivé de coumarine de formule (I) dans laquelle R2, R3, R4, ou R5 représente NHR9 ou NR7R9, avec R9 pouvant jouer Le rôle de substrat pour L'enzyme à détecter. On mélange cette solution au support solide (gel ...) ou on fait des dépôts de cette solution sur le support solide , par exemple coupes histologiques, frottis de cellules, papier ... contenant L'enzyme spécifique à détecter ou auquel l'enzyme spécifique à détecter sera ajouté, et on détermine après une durée choisie, par exemple par épifluorescence, la fluorescence ou la coloration du support mettant ainsi en évidence la présence d'enzyme spécifique sur le ou les sites fluorescents et la cinétique de la réaction. Quand l'enzyme spécifique est apporté par des éléments figurés comme c'est le cas dans une coupe de tissu (biopsie), un frottis de cellules, des colonies de bactéries, des cultures de cellules il est ainsi possible de Localiser, dans le tissu ou les colonies de cellules ou de bactéries, les cellules, les bactéries ou les organites de la cellule qui sont le site de l'activité enzymatique ; le colorant (a) hydrophobe n'étant pas dissous ou élué mais maintenu ou précipité sur place, restant ainsi localisé sur le site. Enfin, ce test de détection peut être rendu quantitatif en mesurant la cinétique, l'intensité de la coloration ou de la fluorescence ou en la comparant à celle d'une gamme étalon obtenue dans le même temps, sur le même support solide, avec différentes quantités d'enzymes. D'autres caractéristiques et avantage de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence au dessin annexé. Le dessin annexé est un schéma de préparation des dérivés de coumarine des exemples 1 à 15 avec R2=R3=R5=R6=H. ExempLe 1 : Préparation de la 7-amino 4-propyl coumarine (7a) Pour cette préparation, on condense le butyroyl acétate d'éthyle (5a) avec le 3-carbéthoxyaminophénol (2), en milieu acide, pour obtenir la 7-carbéthoxyamino 4-propyl coumarine (6a). On hydrolyse ensuite ce produit en milieu acéto-sulfurique pour obtenir la 4-propyl 7-amino coumarine (7a). a) Préparation de 3-carbéthoxy aminophénol (2) On met sous agitation 109,139 (1mol) de 3-aminophénol (1) et 839 (1,05mol) de pyridine dans 500ml de dichlorométhane. On introduit en 1h30, sous refroidissement, 109g (1mol) de chloroformiate d'éthyle en maintenant la température entre 100 et 150C. On laisse ensuite 2h sous agitation. La solution obtenue est lavée avec 200ml d'eau, 200ml d'acide chlorhydrique 1N et 200ml d'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec. Le concentrat obtenu (2) (1509 ; Rt = 83%) est pur. Les caractéristiques du produit sont les suivantes : 10) C.C.M. (chromatographie en couche mince) silice fluorescente, dichlorométhane : méthanol (100:3), Révélation : UV longs et courts/iode/permanganate basique - monospot : Rf = 0,3. 20) Spectre I.R. : 3300 cm-1 : vNH ; 3040 cm-1 : uCH aromatique ; 1690 cm-1 : c=0 uréthane ; 1615, 1580, 1505 cm-1 : DC=C aromatique ; 1280 cm-1 : vC N ; 1250 cm-1 : vC-O phénol. b) Préparation de la 7-carbéthoxy-amino 4-propyl coumarine (6a) On introduit sous agitation 0,671 d'acide sulfurique à 70%, 48g (0,3mol) de butyroyl acétate d'éthyle (5a), 50g (0,276mol) de 3-carbéthoxyaminophénol (2), et on laisse sous agitation durant 6h. On coule la suspension formée sur 1kg de glace et on ajoute après 1/2h, 1,51 de dichlorométhane. On filtre le précipité qu'on lave au dichlorométhane et à l'eau. En concentrant à sec le dichlorométhane et en reprenant le résidu dans 200ml d'éthanol, on obtient un 2ième jet de produit (6a). Rendement global = 42,5g (56%). Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes : 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (85:2), révélation : UV courts et longs/iode, Rf = 0,4 20) Spectre RMN (voir tableau 2) c) Préparation de la 7-amino 4-p ropy I coumarine (7a) On met en suspension 279 (0,098mol) de 7-carbéthoxy-amino 4-propyl coumarine (6a) dans un mélange de 100g d'acide acétique et 100g d'acide sulfurique à 95%. On porte au reflux durant 4h. On coule le mélange sur 4009 de glace. En maintenant à 15-200C, par refroidissement énergique, on ramène à pH 7,7 à l'aide de soude 12N (200ml). On filtre et on rince abondamment à l'eau. On recristallise le produit (7a) dans 120ml de butanol. Rendement = 9,6g (48,2%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes : 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane-méthanol (100:3), révélation : UV longs et courts/iode Rf = 0,5 20) Spectre RMN (voir tableau nO 3) 30) Spectre de masse (voir tableau n 3). ExempLe 2 : Préparation de la 7-amino 4-butyl coumarine (7b) Pour cette préparation, on synthétise le valéroyl acétate d'éthyle (5b) par acylation de L'acide de Meldrum (3) suivie de l'éthanolyse de l'intermédiaire obtenu. On condense le valéroyl acétate d'éthyle (5b) avec le 3-carbéthoxyaminophénol (2), en milieu acide, pour obtenir la 7-carbéthoxyamino 4-butyl coumarine (6b). On hydrolyse ce produit en milieu acéto-sulfurique pour obtenir la 7-amino 4-butyl coumarine (7b). a) Préparation du valéroyl acétate d'éthyle (5b) On introduit 189,39 (1,66mol) d'acide de Meldrum (3) dans 600ml de dichlorométhane anhydre. On ajoute en 1h 202,69 de 4-diméthyLamino-pyridine à une température comprise entre 50 et 100C. On coule ensuite lentement, entre 5 et 100C, une solution de 200g (1,66mol) de chlorure de valéroyle (4b) dans 400ml de dichlorométhane anhydre. Après 1h d'agitation à 50C et 1h à 200C, on filtre le précipité formé que l'on élimine après rinçage. Le filtrat est lavé avec 21 d'acide chlorhydrique normal. La phase aqueuse est extraite avec 200ml de dichlorométhane. Les phases organiques sont lavées à l'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées à sec. Le concentrat, repris par un litre d'éthanol est porté à reflux durant 2h. Après évaporation sous vide, le résidu (2189) est distillé sous vide Rendement = 1259 (44%) Eb5mm = 108-1100C. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, heptane-acétate d'éthyle (70/30), révélation à l'iode (Rf = 0,7). 20) Spectre de masse (voir tableau n 1). b) Préparation de la 7-carbéthoxy-amino 4-butyl coumarine (6b) On introduit sous agitation 1,321 d'acide sulfurique à 70%, 102,4g (0,59mol) de valéroyl acétate d'éthyle (5b), 98g (0,54mol) de carbéthoxyaminophénol (2), et on laisse sous agitation durant 8h. On coule la suspension formée sur 1,5kg de glace et on ajoute après une demi-heure, 21 de dichlorométhane. On filtre le précipité qu'on rince au dichlorométhane et à L'eau. On sèche sous vide. Rendement = 106g (68%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane /THF (85:2), révélation : UV courts et Longs, Rf=0,5 20) Spectre RMN : (voir tableau n 2). c) Préparation de la 7-amino 4-butyl coumarine (7b). On met en suspension 100g (0,34mol) de 7-carbéthoxy-amino 4-butyl coumarine (6b) dans un mélange de 400ml d'acide acétique et 400ml d'acide sulfurique. On porte au reflux durant 8h. On coule le mélange sur 1,5kg de glace et 400ml d'eau. En maintenant à 15-200C par refroidissement énergique on ramène à pH8 à L'aide de soude 12N (1,3 t). On filtre et rince abondamment à l'eau. Après séchage, on recristallise le produit (789) dans Il d'éthanol. Rendement = 429 (56%). Les caractéristiques du produit sont Les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane : méthanoL (100:3), révélation : UV courts et longs (Rf=0,8). 20) F = 197-1990C 30) Spectre RMN : (voir tableau n 3) 40) Spectre de masse : (voir tableau n 3). ExempLe 3 : Préparation de la 7-amino 4-hexyl coumarine (7c). Pour cette préparation, on synthétise l'heptanoyî acétate d'éthyle (5c) en utilisant la même technique que dans l'exemple 2. On condense ce céto-ester avec le 3-carbéthoxyaminophénoî (2), en milieu acide, pour obtenir la 7-carbéthoxyamino 4-hexyl coumarine (6c). On hydrolyse ce produit en milieu acéto-sulfurique pour obtenir la 7-amino 4-hexyl coumarine (7c). a) Préparation de l'heptanoyl acétate d'éthyle (5c > . On introduit 285g (2,5mol) d'acide de Meldrum (3) dans 900ml de dichlorométhane anhydre. On ajoute en 1h 305g (2,5mol) de 4-diméthylaminopyridine à une température comprise entre 5 et 10 C. On coule ensuite lentement entre 5 et 100C, une solution de 371g (2,5mol) de chlorure d'heptanoyle (4c) dans 950ml de dichlorométhane anhydre. Après 1h d'agitation à 50C, et 1h à 200C, on filtre le précipité formé que L'on élimine après rinçage. Le filtrat est lavé avec 21 d'acide chlorhydrique normal. La phase aqueuse est extraite avec 500ml de dichlorométhane. Les phases organiques sont lavées à l'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées à sec. Le concentrat, repris par 31 d'éthanol, est porté à reflux durant 2h. On évapore l'éthanol à sec, et on utilise le produit tel quel pour le stade suivant. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation à l'iode (Rf = 0,5) 20) Spectre de masse : (voir tableau n 1). b) Préparation de la 7-carbéthoxy-amino 4-hexyl coumarine (6c). On introduit sous agitation 1l de mélange butanol-eau-acide sulfurique 25:5:70, 929 (0,46mol) d'heptanoyle acétate d'éthyle (5c) brut, 759 (0,414mol) de 3-carbéthoxyaminophénol (2). et on laisse sous agitation durant 24h. On coule lentement sur 6409 de glace pilée, et on laisse 1h sous agitation. On essore et on lave à L'eau le précipité. On sèche sous vide. Rendement = 539 (40%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98/2), révélation : UV longs et courts (Rf=0,5) 20) Spectre R.M.N. (voir tableau n 2). c) Préparation de 7-amino 4-hexyL coumarine (7c). On met en suspension 489 (0,151mol) de 7-carbéthoxy-amino 4-hexyl coumarine (6c) dans un mélange de 192ml d'acide sulfurique et 192ml d'acide acétique. On porte au reflux durant 5h. On coule le mélange sur 1kg de glace et 0,5 l d'eau. En maintenant à 150-200C par refroidissement énergique, on ramène à pH 8 à l'aide de soude 12N. Le précipité formé est essoré et remis 3 fois en suspension dans l'eau pour éliminer tous les sels. Après séchage, le produit brut (279) est recris tallisé dans 1350ml d'éthanol. Rendement = 18,49 (50%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (85/5), révélation : UV longs et courts (Rf=0,75). 20) Spectre RMN : (voir tableau n 3) 30) Spectre de masse : (voir tableau n 3). ExempLe 4 : Préparation de la 7-amino 4-heptyl coumarine (7d) Pour cette préparation, on synthétisera l'octanoyl acétate d'éthyle (5d) en utilisant la même technique que dans l'exemple 2. On condense ce ss-cétoester avec le 3-carbéthoxyaminophénol (2), en milieu acide, pour obtenir la 7-carbéthoxy-amino 4-heptyl coumarine (6d). On hydrolyse ce produit en milieu acétosulfurique pour obtenir la 7-amino 4-heptyl coumarine (7d). a) Préparation de L'octanoyle acétate d'éthyle (5d). On introduit 285,79 (2,5mol) d'acide de Meldrum (3) dans 900ml de dichlorométhane anhydre. On ajoute en 1h 3059 (2,5mol) de 4-diméthylamino pyridine à une température comprise entre 50 et 100C. On coule ensuite lentement, entre 5 et 100C, une solution de 406,6g (2,5mol) de chlorure d'octanoyle (4d) dans 950ml de dichlorométhane anhydre. Après 1h d'agitation à 50C et 1h à 200C, on filtre le précipité formé que l'on élimine après rinçage. Le filtrat est lavé avec 2,5 l d'acide chlorhydrique 0,6N. La phase aqueuse est extraite avec 1l de dichlorométhane. Les solutions organiques, lavées avec 1l d'eau, sont séchées puis mises à sec. Le concentrat, repris par 4 l d'éthanol est porté au reflux durant 2h. Après évaporation sous vide, le résidu pèse 5239 (Rt=97%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation à l'iode (Rf=0,72) 20) Spectre de masse : (voir tableau n 1). b) Préparation de la 7-carbéthox y-amino 4-heptyl coumarine (6d). On introduit sous agitation 245ml de mélange butanol-eau-acide sulfurique (25:5:70), 23,89 (0,1 mol) d'octanoyle acétate d'éthyle (5d) brut, 18,2g (0,1 mol) de 3-carbéthoxy amino phénol (2), et on laisse sous agitation durant 24h. On coule lentement sur 3009 de glace pilée, et 375ml de dichlorométhane. Après extraction de la phase aqueuse avec 125ml de dichlorométhane et lavage des phases organiques réunies par 125ml d'eau, on sèche et on concentre à sec. Le résidu (69g), repris par 69ml d'acétate d'éthyle, laisse cristalliser le produit. Après séchage sous vide, on obtient 19,39 (39%) de cristaux. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation : UV longs et courts (Rf=0,55), 2 ) Spectre RMN : (voir tableau n 2). c) Préparation de La 7-amino 4-heptyl coumarine (7d). On met en suspension 5g de 7-carbéthoxy amino 4-heptyl coumarine (6d) dans un mélange de 20ml d'acide sulfurique et 20ml d'acide acétique. On porte au reflux durant 4 h. On coule le mélange sur 80g de glace. On ramène à pH 8,2 à l'ai de de 95ml de soude 10N. Le précipité formé est remis 2 fois en suspension dans 100ml d'eau pour éliminer les sels. Après sechage, le produit brut (4,269) est recristallisé dans 120ml d'éthanol. Rendement 2,599 (66%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 1 ) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation : UV longs et courts (Rf=0,4) 20) Spectre RMN (voir tableau n 3) 3 ) Spectre de masse (voir tableau n 3). ExempLe 5 : Préparation de La 7-amino 4-nonyl coumarine (7é > . Pour cette préparation, on synthétisera le décanoyl acétate d'éthyle (5e) en utilisant la même technique que dans L'exemple 2. On condense ce ss-céto ester avec le 3-carbéthoxyaminophénol (2) en milieu acide, pour obtenir la 7-carbéthoxy amino 4-nonyl coumarine (6e). On hydrolyse ce produit en milieu acéto-sulfurique pour obtenir la 7-amino 4-nonyl coumarine (7e). a) Préparation du décanoyl acétate d'éthyle (Se). On introduit 102,7g (0,9mol) d'acide de Meldrum (3) dans 350ml de dichlorométhane anhydre. On ajoute en 1/2h, 110g (0,9mol) de 4-diméthylamino pyridine à une température comprise entre 50 et 100C. On coule ensuite, lentement, entre 5 et 10 C, une solution de 190,79 (0,9mol) de chlorure de décanoyle (4e) dans 330ml de dichlorométhane anhydre. Après 1h d'agitation à 50C et 1h à 200C, on filtre le précipité formé que l'on élimine après rinçage. Le filtrat est lavé avec 0,8 l d'acide chlorhydrique normal. La phase aqueuse est extraite avec 2 fois 400ml de dichlorométhane. Les phases organiques sont lavées à l'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées à sec. Le concentrat, repris par 550ml d'éthanol est porté au reflux pendant 2h. On évapore L'éthanoî à sec et on utilise Le produit tel quel pour le stade suivant. Rendement = 2049 (93,7%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation à L'iode (Rf = 0,6) 20) Spectre de masse : (voir tableau n 1). b) Préparation de la 7-carbéthoxy amino 4-nonyL coumarine (6e). On introduit sous agitation 1041ml d'acide sulfurique à 70%, 136,89 (0,424mol) de décanoyl acétate d'éthyle (Se), 77g (0,424mol) de 3-carbéthoxy amino phénol (2) et on laisse sous bonne agitation durant 8h. On coule la suspension formée sur 1,2kg de glace et on ajoute, après 30 min, 1,5 l de dichlorométhane. On sépare la phase organique et on extrait à nouveau la phase aqueuse avec 500ml de dichlorométhane. Après lavage à L'eau et séchage des phases organiques, on concentre à sec et on reprend le résidu (2279) avec 230ml d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, rincé et séché sous vide. Rendement : 139 (8,6%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2), révélation : UV courts et longs (Rf=0,62). 20) Spectre RMN : (voir tableau n 2). c) Préparation de la 7-amino 4-nonyl coumarine (7e). On met en suspension 5,459 (15,2mmol) de 7-carbéthoxyamino 4-nonyl coumarine (6e) dans un mélange de 21,8ml d'acide sulfurique et 21,8 ml d'acide acétique, et on porte au reflux durant 8h. On coule le mélange sur 100g de glace. En maintenant à 15-200C par refroidissement énergique, on ramène à pH 7,7 à L'aide de soude 12N (50ml). On extrait par 500ml puis 200ml de dichlorométhane et on lave les phases organiques jointes avec 200ml d'eau. Après séchage et mise à sec de la solution organique, on a un résidu de 3,69 qu'on recristallise dans 28ml d'acétate d'éthyle. Rendement = 2,99 (66%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) F=141-1420C 20) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (98:2) Rf=0,35. 30) Spectre RMN : (voir tableau nO 3) 40) Spectre de masse : (voir tableau nO 3). ExempLe 6 :Préparation de N-carbobenzyîoxy-alanyl 4-propyL 7-coumarinyLamide (9a). On introduit 4g (19,7mmol) de 7-amino 4-propyl coumarine (7a), 4,4g (19,7mmol) de CBZ L-alanine (8), 3,2g (19,7mmol) d'hydroxybenzotriazoîe et, à 100C, 4,069 (19,7mmol) de dicyclohexylcarbodiimide dans 50ml de diméthylformamide. Après 17h d'agitation à température ambiante, on filtre le précipité formé et on concentre le filtrat à sec. Le concentrat est repris par 40ml de dichlorométhane, qui est lavé avec 40ml de bicarbonate 0,5N, 100ml d'acide chlorhydrique 0,5N, puis séché sur sulfate de magnésium. Après mise à sec, le résidu est recristallisé dans 20ml d'acétate d'éthyle. Rendement : 1,69 (20%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente KC18F, méthanol/eau (80:20) révélation : UV courts et longs (Rf=0,3). Le produit contient encore un peu de 7amino 4-propyl coumarine (7a), il sera utilisé tel quel, la purification se faisant au stade suivant. Exemple 7 : Préparation de N-carbobenzyloxy-alanyl 4-butyl 7-coumarinylamide (9b). On introduit 4,879 (0,0224mol) d'aminobutyl coumarine (7b), 5g (0,0224moI) de CB Z-L-alanine (8) et 4,629 (0,0224mol) de dicyclohexylcarbodiimide dans 37ml de diméthylformamide. Après 30h d'agitation à température ambiante, on filtre le précipité formé et on concentre le filtrat à sec. Le concentrat est repris par 70ml de dichlorométhane et 50ml de bicarbonate 1N. Il se forme un précipité qui est redi ssous par le diméthylformamide. Les phases organiques jointes et séchées sont mises à sec. Le résidu (11g) subit une recristallisation fractionnée dans l'acétate d' éthyle. Rendement des fractions pures = 2,89 (29%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 1 ) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (85:5), révélation : UV courts et longs (Rf=0,5). Le produit contient encore un peu de 7amino 4-butyl coumarine (7b) ; il sera utilisé tel quel, la purification se faisant au stade suivant. ExempLe 8 : Préparation de N-carbobenzyloxy-alanyl 4-hexyl 7-coumarinylamide (9c). On introduit 5g (20,4mmol) d'aminohexyl coumarine (7c), 5,369 (24mmol) de Z-L-alanine (8) et 4,96 de dicyclohexyl carbodiimide, dans 37ml de diméthylformamide. Après 24h d'agitation à température ambiante, on filtre le précipité formé puis on concentre le filtrat à sec. Le concentrat est redissous dans 130ml de dichlorométhane et cette solution Lavée par 100ml de bicarbonate 1N, 100ml d'eau, est séchée et mise à sec. Le concentrat est recristallisé dans 44ml d'acétate d'éthyle. Rendement = 3,89 (41%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (85:5), révélation : UV longs et courts (Rf=0,6). Le produit contient encore un peu de 7amino 4-hexyl coumarine (7c) ; il sera utilisé tel quel, la purification se faisant au stade suivant. Exemple 9 : Préparation de N-carbobenzyloxy-alanyl 4-heptyl 7-coumarinylamide (9d). Après avoir dissous 3,45g (15,4mmol) de carbobenzyîoxy L-alanine (8) dans 225ml de dichlorométhane anhydre, on introduit 3,55g (30,8mmol) d'éthyl morpholine et on refroidit la solution à -150C. On coule ensuite, à -150C, une solution de 3,649 (15,4mmol) de chlorure de diphényl phosphinyle dans 16ml de dichlorométhane. Après 20 minutes d'agitation à -150C, on additionne 4,419 (17mmol) de 7-amino 4-heptyl coumarine (7d) puis on agite 10min à -15 C et 24h à 200 C. La phase organique est lavée avec 250ml d'eau, 2 fois 250ml d'acide chlorhydrique 1N, 2 fois 50ml de bicarbonate îN et 250ml d'eau, séchée puis concentrée à sec. Le résidu (7,739) sera utilisé tel quel pour le stade suivant (hydrogénation) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane : THF (85:5), révélation UV longs et courts (spot principal de Rf=0,3 et spot secondaire de Rf=0,5). ExempLe 10 : Préparation de N-carbobenzyloxy-alanyl 4-nonyl 7-couma ri ny lami de (9e). Après avoir dissous 3,53g (15,8mmol) de carbobenzyloxy L-alanine (8) dans 240ml de dichlorométhane anhydre, on introduit 3,649 (31,6mmol) d'éthyl morpholine et on refroidit la solution à -15 C. On coule ensuite à -150C, une solution de 3,749 (15,8mmol) de chlorure de diphényl phosphinyle dans 16ml de dichlorométhane. Après 20min d'agitation à -15 C, on additionne 59 (17,4mmol) d'aminononyl coumarine (7e) puis on agite 10 min à -15 C et 24h à 200 C. La phase organique est lavée avec 250ml d'eau, 2 fois 250ml d'acide chlorhydrique 1N, 2 fois 50ml de bicarbonate 1N et 250ml d'eau, séchée puis concentrée à sec. Le résidu est chromatographié sur colonne de silice avec comme éluant du dichlorométhane THF (85:5). Les fractions utilisables pour le stade suivant représentent 5g (64%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/THF (85:5), révélation : UV longs et courts (spot principal de Rf = 0,4 et spot secondaire de Rf=0,55). Le produit contient encore un peu de 7amino 4-nonylcoumarine ; il sera utilisé tel quel, la purification se faisant au stade suivant. ExempLe 11 : Préparation de L-alanyl 4-propyl 7coumarinylamide, chlorhydrate (10a). On dissout 1,69 (4mmol) de N-carbobenzyloxy L-alanyl 4-propyl 7-coumarinylamide (9a) dans 50ml de tétrahydrofuranne. Après introduction de 32Omg de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 5h. Après filtration du catalyseur, le filtrat est concentré à sec et le produit chromatographié sur colonne de silice, avec comme éluant du dichlorométhane méthanol (80:20). Les fractions de chromatographie sont concentrées à sec puis dissoutes dans 7ml de tétrahydrofuranne. On salifie avec une solution éthanolique d'acide chlorhydrique. Rendement = 390mg (36%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) Point de fusion : 227-2280C 20) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane : méthanol (80:20), révélation : UV longs et courts/ninhydrine, Rf=0,3 30) Spectre R.M.N. (voir tableau nO 4) 40) Spectre de masse (voir tableau n 4) ExempLe 12 : Préparation de L-alanyl 4-butyl 7-coumarinylamide, chlorhydrate (10b). On dissout 2,59 (0,0059mol) de N-carbobenzyloxy alanine 4-butyl 7-coumarinylamide (9b) dans 75ml de tétrahydrofuranne. Après introduction de 500mg de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 5h. Après filtration du catalyseur, le filtrat est concentré à sec et le produit chromatographié sur colonne de silice avec comme éluant du dichlorométhane-méthanol (85:15). Les fractions pures sont concentrées à sec puis dissoutes dans 17ml de tétrahydrofuranne. On salifie avec une solution éthanolique d'acide chlorhydrique. Le produit est rincé à l'éther. Rendement = 0,89 (42%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/méthanol (85:15), révélation : UV longs et courts/ninhydrine (Rf=0,4) 20) Spectre R.M.N. : (voirtableau n 4) 30) Spectre de masse : (voir tableau n 4). Exemple 13 : Préparation de L-alanyl 4-hexyl 7-coumarinylamide, chlorhydrate (10c). On dissout 3,89 de N-carbobenzyloxy alanine 4-hexyl 7-coumarinylamide (9c) dans 100ml de tétrahydrofuranne. Après introduction de 760mg de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 16h. Après filtration du catalyseur, le filtrat est évaporé à sec et repris dans 50ml de tétrahydrofuranne. On salifie avec une solution éthanolique d'acide chlorhydrique. Après addition de sOmt d'éther et refroidissement, on filtre et rince à l'éther. Rendement = 1,49 (47%). Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente, dichlorométhane/éthanol (80/20), révélation : UV longs et courts/ninhydrine (Rf=0,48) 20) Spectre R.M.N. : (voir tableau n" 4) 30) Spectre de masse : (voir tableau nO 4). ExempLe 14 : Préparation de L-alanyl 4-heptyl 7coumarinylamide, chlorhydrate (10 d) On dissout 7,73g (16,6mmol) de N-carbobenzyloxy L-alanyl 4-heptyl 7-coumarinylamide (9d) dans 231ml de tétrahydrofuranne. Après introduction de 1,549 de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 5 heures 30. Après filtration du catalyseur, le filtrat est concentré à sec et le produit chromatographié sur colonne de silice avec comme éluant du dichlorométhane : méthanol (9:1, puis 7:3). Les fractions de chromatographie sont concentrées à sec (obtention de 0,9g) puis dissoutes dans 15ml de tétrahydrofuranne. On salifie avec une solution éthanolique d'acide chlorhydrique. Rendement : 0,899 (16%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes : 10) C.C.M. silice fluorescente butanol : acide acétique : eau (60:20:20), révélation : UV courts et longs / ninhydrine (Rf=0,7) 20) Spectre RMN (tableau n 4) 3 ) Spectre de masse (tableau n 4). ExempLe 15 : Préparation de L-alanyl 4-nonyl 7-coumarinylamide, chlorhydrate (10 e) On dissout 5g (10,îmmol) de N-carbobenzyloxy L-alanyl 4-nonyl 7-coumarinylamide (9 e) dans 150ml de tétrahydrofuranne. Après introduction de 1 g de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 8 heures. Après filtration du catalyseur, le filt rat est concentré à sec et le produit ch romatographi é sur colonne de silice avec comme éluant les mélanges dichlorométhane : éthanol (9:1, puis 7:3). Les fractions de chromatographie sont concentrées à sec (obtention de 1,769) puis dissoutes dans 28 ml de tétrahydrofuranne. On salifie avec 1,08ml d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique 5,1N, puis ajout de 200ml d'éther. Rendement = 1,69 (39,8%) Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. silice fluorescente butanol : acide acétique : eau (60:20:20), révélation : UV courts et longs / ninhydrine (Rf = 0,75) 20) Spectre RMN (tableau n 4) 30) Spectre de masse (tableau n 4). Exemple 16 : Préparation du N-carbo-t-butyloxy N #-nitro arginyl-4- hexyl coumarinylamide de formule : Après avoir dissous 7,779 (24,3 mmol) de N-carbo-t-butyloxy N- # nitro arginine dans 116ml de diméthylformamide, on introduit 5,619 (48,7 mmol) d'éthyl morpholine et on refroidit la solution à -120C. On coule ensuite, vers -15 C, une solution de 5,769 (24,3 mmol) de chlorure de diphényl phosphinyle dans 24ml de diméthylformamide. Après 20 minutes d'agitation à -150C, on additionne 4,789 (19,5mmol) de 7-amino 4-hexyl coumarine (7 c) puis on agite 10 minutes à -150C et 48 heures à température ambiante. L'insoluble est filtré et rincé au diméthylformamide, et le filtrat est mis à sec sous vide. Le concentrat est repris par 195ml de dichlorométhane / acétate déthyle (1:1). Après élimination d'un insoluble d'amino hexyl coumarine, on lave la solution au bicarbonate 1N, puis à L'eau et on met à sec. Le résidu, repris dans 40ml de dichlorométhane, puis filtré, est chromatographié sur colonne de silice avec le dichlorométhane-éthanol (93:7) comme éluant. Les fractions purifiées représentent 600mg (9%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente dichlorométhane : éthanol (93:7), révélation : UV longs et courts (Rf=0,32) 20) RMN (CDC 13) : 0,88 (t, 3H, CH3-CH2), 1,39 (m, 21 H, t Bu / (CH2)2 arg / (CH2)4 coum) ; 2,70 (t, 2H, CH2-#) ; 3,39 (t, 2H, CH2NH) 4,59 (t, 1H, *CH ) ; 5,88 Cd, 1H, NH-C-OBu) 6,16 (5,1 H, = CH) ; 7,53 (m,4H, Harom/NH) ; 8,65 (m, 1H, NH); 9,66 (5,1H, NH) Exemple 17: Préparation du N-#-nitro argininyl 4-hexyl coumarinylamide, trifluoroacétate de formule Pour cette préparation, on réalise l'acidolyse dans L'acide trifluoracétique du N-carbo t-butyloxy N-#-nitro arginyl coumarinylamide. On met en solution 1,49 (2,56mmol) de N-carbo t-butyloxy N-#-nitro arginyl coumarinylamide dans 22 ml d'acide trifluoracétique. Après 1h de contact sous agitation, on évapore à sec et on reprend le résidu dans 67 ml d'éther Les cristaux obtenus, filtrés, sont bien rincés à l'éther et séchés sous vide. Rt = 1,149 (80%). RMN (CDCL3 - CD30D) : 0,86 (t, 3H, CH3- CH2) ; 1,14 (m, 6H, CH2 x 3) ; 1,64 (m, 6H, CH2 - CH2 - *CH / > '- CH2 - CH2) ; 2,53 (t, 2H, CH2 - Exemple 18: N-carbo t-butyloxy valyl - propyl N-#-nitroarginyl 4-hexyl coumarinylamide de formule: Pour cette synthèse, on prépare un anhydride mixte du N-carbo t-butyloxy valyl proline (t-Boc Va I-Pro (OH)) par action du chlorure de diphényl phosphinyle. Cet anhydride mixte est ensuite couplé au N-# nitroarginyl 4-hexyl coumarinylamide. Après avoir dissous 0,6749 (2,14mmol) de t-Boc-valine-proline dans 15ml de dichlorométhane, on introduit 0,494g (4,29mmol) d'éthyl morpholine et on refroidit la solution à -160C. On coule ensuite à la même température 0,508g (2,14mmol) de chlorure de diphényl phosphinyle dissous dans 1 ml de dichlorométhane. et on laisse en contact 20 minutes à La même température. Pendant ce temps, on désalifie une solution de 1,173g (1,95mmol) de N-#-nitro arginyl 4-hexyl coumarinylamide, 1,24 trifluoroacétate, dissous dans 6,45ml de dichlorométhane, avec 307mg d'éthyl morpholine puis on coule cette solution sur la solution précédente. On laisse 10 minutes à -150C puis 24 heures à température ambiante. Après lavage du milieu réactionnel à l'eau, à l'acide citrique 1N, au bicarbonate IN, puis à l'eau, on sèche et on évapore à sec. Résidu = 1,15 g. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente dichlorométhane : éthanol (93:7), révélation : UV longs et courts / vert de bromocrésol / permanganate basique (Rf = 0,35). 20) RMN (CDC 13 - CD30D) : 0,90 (m, 9H, CH3-CH2/CH3-CH-CH3 ; 1,30 (m, 15H, tBu/(CH2)3) ; 1,90 (m, 11H CH3-CH-CH3 / CH2-CH2-*CH / #-CH2-CH2 N) ; 2,71 (t, 2H, CH2-#) ; 3,21 (t, 2H, CH2N) ; 3,60 (m, 2H, CH2N pro) ; 4,14 (d, 1H, a CHVal) ; 4,51 (m, 2H, C*Hpro + C*Harg) ; 6,15 (s, 1H, CH =) ; 7,48 (m, 3H, Harom) ; 7,68 (m, 2H, 2 x NH) ; 7,90 (d, 1H, NH) ; 10,00 (s,1H, NH). Exemple 19 : N-carbo t-butyloxy valyl-prolyl arginyl 4-hexyl coumarinylamide , acétate de formule Pour cette synthèse, on réalise la déprotection du groupement #-nitro arginyl par hydrogénolyse en milieu hydro-acétique. 1,îg (1,48mmol) de N-carbo t-butyloxy valyl-prolyl arginyl 4-hexylcoumarinylamide sont mis en suspension dans 17ml d'un mélange d'acide acétique-eau (60/40) et hydrogénés en présence de 132mg de palladium sur charbon à 10%. L'hydrogénation dure 14 heures avec deux nouveaux ajouts successifs de 66 et 132mg de palladium. Après filtration du catalyseur et rinçage à L'eau et au méthanol, on évapore le solvant sous vide. Le résidu est repris par le dichlorométhane, la solution filtrée et le filtrat déposé sur une colonne de silice montée sur dichlorométhane. Le produit est chromatographié par élution au dichlorométhane-éthanol-acide acétique (70:15:15). Les fractions de produit purifié sont mises à sec puis reprises dans 50ml d'éther pour la cristallisation. Rendement = 360mg (33%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente butanol : acide acétique : eau 60/20/20, révélation : UV courts et Longs / vert de bromocrésol / ninhydrine (Rf = 0,7, spot mauve). 20) RMN (DMSOD6) : 0,87 (m, 9H, CH-CH2 / CH3-CH-CH) ; 1,30 (m, 15H, tBu / (CH2)3) ; 1,74 Cm, 1 4H, CH3-CH-CH3 / CH2-CH2-*CH / > -CH2-CH2 / ÉN, CH3(COOH); 2,30 - 2,89 (m, 4H, CH2Narg / CH2- ; 3,08 - 4,39 (m, 5H, CH2N pro / 0e CH Val / *CH pro / C*Harg) ; 6,20 (s, 1H, = CH) ; 6,84 - 7,95 (m, 8H, Harom/ NH3+ / NH) ; 8,54 (d, 1H, NH) ; 8,95 (d, 1H, NH) ; 10,8 (s, 1H, NH). ExempLe 20 : Préparation du N-carbo benzyloxy arginyl 4-hexylcoumarinylamide, chLorhydrate de formule : On introduit sous agitation, dans 300ml de diméthylformamide, 15g (61,2mmol) de 7-amino 4-hexyl coumarine, 42,189 (122,4mmol) de carbobenzyloxy arginine chlorhydrate, puis 12,69 (61,2mmol) de dicyclohexyl carbodiimide. Après 22 heures d'agitation, on filtre la dicyclohexylurée formée, on lave avec 25 ml de diméthylformamide et on évapore sous vide. Le résidu (889) est repris par 40ml de méthanol et 400ml d'acétate d'éthyle. L'insoluble est filtré, lavé avec 3 fois 50 ml d'acétate d'éthyle puis séché. Le solide séché est repris par 18ml de diméthylformamide et 60ml de méthanol ; après élimination d'un insoluble, le filtrat est dilué avec 240ml d'acétate d'éthyle. Le précipité formé est lavé à l'acétate d'éthyle, séché puis repris sous agitation, durant 2 heures dans 10 volumes d'eau, filtré, lavé à l'eau et séché. Rendement = 11,5g (33%). Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) F = 1420C. 20) C.C.M. si lice fluorescente butanol / acide acétique / eau (60/20/20), révélation : UV longs et courts / vert de bromocrésol (Rf = 0,7). 30) RMN (DMSOD6) : 0,84 (t,3H, CH3-CH2) ; 1,43 (m, 12H, CH2) ; 2,50 (t, 2H, CH2-C= ) ; 2,72 (t,2H, CH2NH) ; 3,14 (t, 1H, CH) ; 5,04 (s, 2H, O-CH2 O ) ; 6,20 (s, 1H, = CH) ; 7,6 (m, 8H, Harom) ; 7,98 (s, 1H, NH) ; 10,8 (s, 1H, NH). ExempLe 21 : Préparation de l'arginyl 4-hexyl coumarinylamide, chlorhydrate, acétate de formule Ce produit est préparé par hydrogénation catalytique du N-carbobenzyloxy arginyl 4-hexylcoumarinylamide chlorhydrate. On dissout 910mg de N-carbobenzyloxy arginyl 4-hexyl coumarinylamide dans un mélange de 157ml de méthanol, 31,4ml d'eau, et 15,7ml d'acide acétique. Après introduction de 91mg de palladium sur charbon à 10%, on hydrogène sous bonne agitation durant 6 heures. Après filtration du catalyseur, le filtrat est concentré à sec et le résidu repris dans 100ml d'éther. Rendement : 545mg ; produit hygroscopique. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 10) C.C.M. Silice fluorescente butanol : acide acétique : eau (60/20/20), révélation : UV longs et courts / ninhydrine / vert de bromocrésol (Rf = 0,5). 20) RMN (CD30D) : 0,90 (t, 3H, CH3-CH2) ; 1,36 (m, 6H, CH2 x 3) ; 1,67 (m, 6H, CH2 - CH2 *CH / #-CH2; - CH2) ; 1,93 (s, 3H, CH3COOH) ; 2,78 (t, 2H, CH2-#); 3,29 (t, 2H, CH2NH) ; 3,98 (t, 1H, *CH) ; 6,19 (s, 1H, = CH ) ; 7,72 (m, 3H, Ha r). TABLEAU 1 Analyse spectroscopique des alcanoyl acétates d'éthyle Produit Spectre de masse (masse moléculaire) (m/z) ionisation à l'ammoniac Valeroyl acétate 190 (M+ + 17) d'éthyle 173 (M+) C9H16O3 M=172,22 HeptanoyL acétate 218 (M+ + 17) d'éthyle C11H20O3 M = 200,3 201 (M+) OctanoyL acétate 232 (M+ + 17) d'éthyle 215 (M+ C12H2203 M=214,3 Décanoyl acétate 272 CM+ + 17) d'éthyle 243 (M+) C14H2603 M=242,35 TABLEAU 2 Analyse spectroscopique des 7-carbéthoxy-amino 4-alkyl coumarines Produit 1H - RMN (DMSO D6) (masse moléculaire) #, J (HZ) 7-carbéthoxy amino 0,95 (t, 3H, CH3) ; 1,26 (t, 3H, CH3 4-propyl coumarine CH2O) ; 1,61 (q, 2H - CH2-CH3) ; 2,69 (t, 2H, CH2 ; 4,16 (q, 2H, CH2O); C15H17N 4 M = 275,30 6,13 (s, 1H, #H); 7,37 (dd, 1H, Harom) ; 7,53 (d, 1H, Harom) ; 7,69 Cd, 1H, Harom) ; 10,12 (s, 1H, NH) 7-carbéthoxy amino 0,90 (t, 3H, CH3) ; 1,25 (t, 3H, CH3- 4-butyL coumarine CH2O) ; 1,37 (q, 2H CH2-CH3) ; 1,54 (m, 2H, -LH2-CH2-CH3) ; 2,71 (t, 2H C16H19NO4 M = 289,4 CH2 -#) 4,16 (q, 2H, CH2O) ; 6,13 (s, 1H#) ; 7,37 (dd, 1H, Har) ; 7,53 (d, 1H, Harom) ; 7,69 (d, 1H, Harom) 10,12 (s, 1H, NH) 7-carbéthoxy amino 0,85 (t, 3H, CH3) ; 1,25 (t, 3H, CH3 4-hexyl coumarine CH2O) ; 1,56 (t, 2H, CH2-CH2); 2,65 C18H23NO4 M=318, 4 Ct, 2H, CH2-) ; 4,15 (q, 2H, CH2O); 6,12 (s, 1H, #7,37 (dd, 1H, Har) ; 7,53 (d, 1Har) ; 7,69 Cd, 1H Harom) ; 10, 12 (s, 1H, NH) 7-carbéthoxy amino 0,83 (t, 3H, CH3) ; 1,25 (m, 11H, 4-heptyl coumarine CH2 chaine + CH3-CH2O) 1,56; (t, 2H, CH2 CH2-#) ; 2,69 (t, 2H, CH2 -#); C19H25NO4 M=331,41 4,15 (q, 2H, CH2O) ; 6,12 (s, 1H1#); 7,37 (dd, 1H, Har) ; 7,53 (d, 1H, Harom) ; 7,69 (d, 1H, Harom); 10,12 (s, 1H, NH) 7-carbethoxy amino 0,83 Ct, 3H, CH3) ; 1,25 Cm, 15H, CH2 4-nonyl coumarine chaine + CH3-CH2O) 1,56 Ct, ZH, CH2- CH2-#); 2,72 (t, 2H, CH2-#); 4,15 C21 H29N04 M = 359,18 (q 2H, CH2O), 6,12 (s, 1H, #); 7,37 (dd, 1H, arom); 7,53 (d, 1H, Harom) ; 7,69 (d, 1H, Harom) ; 10,14 (s, 1H, NH) TABLEAU 3 Analyse spectroscopiquè des amino alkyl coumarines Produit Spectre de masse H - RMN (DMSO D6) #, J (HZ) (masse moléculaire) (m/z) 7-amino 4-propyl 221 (M+ + 17) 0,94 (t,3H,CH3) ; 1,57 - 1,61 coumarine 204 (M+) (q, 2H, CH2CH2)2,58-2,65 (t, 2H, CH2) ; 5,85 (s, 1H, H7 = CH-C=O) ; C12H13NO2 6,11 (s, 2H, NH2) ; 6,41 (s, 1H, M=203,2 Harom) ; 6,53-6,58 (d, 1H, Harom); 7,41-7,45 (d, 1H, Harom) 7-amino 4-butyl 235 (M+ + 17) 0,86-0,93 (t, 3H, CH3) ; 1,33-1,54 coumarine (m, 4H, CH2) 2,59-2,67 (t, 2H, 218 (M+) #-CH2-CH2) ; 5,84 (s, 1H=CH-CH) ; C13H15NO2 6,11 (s, 2H, NH2), 6,41 (s, 1H M = 217,2 Harom) ; 6,53-6,58 (d, 1H, Harom), 7,40-7,44 (d, 1Harom) 7-amino 4-hexyl 246 (M+) 0,61-0,67 (t, 3H, CH3) ; 1,28 ( coumarine 6H, (CH2)3) 1,55 (t, 2H, -CH2 CH2-#) ; 2,59-2,66 (t, 2H, CH2-#); C15H19NO2 5,85 (s, 1H, = CH-C = O) ; M = 245,2 6,11 (s, 2H, NH2) ; 6,41 (s, 1H, Harom) ; 6,53-6,58 (d, 1H, Harom) 7,40 - 7,44 (d, 1Harom) 7-amino 4-heptyl 260 (M+) 0,83 (3H, CH3) ; 1,24 (8H, CH2)4); coumarine 1,55 (2H, CH2-CH2-#) ; 2,63 (t, 2H CH2#)5,84 (s, 1H = CH-CO) ; 6,11 C16H21NO2 (s, 2H, NH2); 6,41 (s, 1H, Harom); M=259,3 6,59 (d, 1H Harom) ; 7,40-7,44 (d, 1H, Harom) Tableau 3 (suite) Produit Spectre de masse H - RMN (DMSO D6) #, J (HZ) (masse moléculaire) (m/Z) 7-amino 4-nonyl 288 (M+) 0,80-0,83 (3H, CH3) ; 1,21 (14 H, coumarine (CH2)6) 1,56 (2H, CH2 -CH2-#) 2,59 2,66 (t, 2H, CH2-#); 5,84 (s, 1H, = C18H25NO2 CH-CO) ; 6,11 (s, 2H, NH2) ; 6,41 M=287,18 (s, 1H, Harom) ; 6,53 - 6,57 (d, 1H, Harom) ; 7,40-7,44 (d, 1H Harom). TABLEAU 4 Analyse spectroscopique des l-alanine 4-alkyl 7-coumarinylamides, HCl Produit Spectre de masse H - RMN (DMSO D6) #, J (Hz) (masse moléculaire) (m/Z) de la base L-alanine 4-propyl 306 (M+ + 17) (D20) 7-coumarinylamide, 0.88-0,91 (t, 3H, CH3) ; 1,28-1,30 HCl (t, 4H, CH2) ; 1,66-1,70 (d, 3H, CH3) C15H18N2O3, HCl 2,31 (t, 2H, CH2 #); 4,23-4,27 (q M=274,32 1H, CH-CH3); 5,82 (s, 1H, =CH-CO) ; 7,06 7,27 (m, 3H, arom) L-alanine 4-butyl 306 (M+ + 17) (D20) 7-coumarinylamide 289 (M+) 0,85-0,92 (t, 3H, CH3) ; (1,35-1,39 HCl (q, 2H, CH2-CH3); 1,64-1,68 (d, 3H C6H20N2O3, HCl CH3-CH) ; 2,25 (t, 2H, CH2 #) ; M=288,34 4,21-4,24 (q, 1H, CH-CH3) ; 5,76 (s, 1H, =CH-C= ) ; 6,98-7,17 (m, 3H, arom) L-alanine 4-hexyl 663 (2M+1) (DMSO - D6) 7-coumarinylamide 334 (M+ + 17) 0,81-0,84 (t, 3H, CH3) ; 1,26-1,28 HCl 317 (M+) (6H, CH2) ; 1,48-1,52 (d, 3H CH3 C18H24N2O3, HCl CH); 1,88 (2H-CH2-CH2-#) 2,70-2,77 M=316,4 (t, 2H, CH2-#); 4,16-4,20 (q, 1H, CH-CH3) ; 6,20 (s, 1H ; = CH-CO) ; 7,56-7,84 (m, 3H, arom) ; 8,49 (s, 3H, NH3+) ; 11,57 (s, 1H, NH-CO) TABLEAU 4 (suite) Analyse spectroscopique des L-alanine 4-alkyl 7-coumarinylamides, HCl Produit Spectre de masse H - RMN (DMSO D6) #, J (HZ) (masse moléculaire) (m/Z) de la base L-alanine 4-heptyl 348 (M+ + 17) 0,80-0,87 (t, 3H, CH3) ; 1,23-1,30 7-coumarinylamide 331 (M+) (8H, (CH2)4) ; 1,48-1,52 (d, 3H, CH3 HCl CH) ; 1,58 (2H, CH2-CH2-#); 2,70-2,78 C9H26N2O3 M=330,4 (t, 2H CH2-CH2-#); 4,16-4,20 (q, 1H HCl CH-CH3) ; 6,21 (s, 1H, =CH-CO) ; 7,56-7,8 (m, 3H, arom) ; 8,56 (s, 3H, NH3+) L-alanine 4-nonyl 717 (2M + 1) (DMSO-D6) 7-coumarinylamide 376 (M+ + 17) 0,74-0,93 (t, 3H, CH3) ; 1,23 (12H, HCl 359 (M+) (CH2)6) ; 1,52 (d, 3H, CH3-CH) ; 1,80 C21H30N2O3 M=358,3 (2H, CH2-CH2-#) ; 2,75 (t, 2H, CH2 HCl CH2-#); 4,18 (q, 1H, CH-CH3) ; 6,21 (s, 1H, =CH-C=O) ; 7,61-7,80 (m, 3H, arom) ; 8,43 (s, 3H, NH3+) REVENDICATIONS 1. Dérivé d'aminocoumarine répondant àla formule : dans laquelle 10) R1 représente un groupe choisi parmi les groupes alkyle, linéaires ou ramifiés, en C1 à C17, les groupes cycloalkyle en C3 à C10 et les groupes aryle en C6 à C14, le groupe alkyle, cycloalkyle ou aryle étant non substitué ou substitué par au moins un substituant constitué par - un atome d'halogène, - OH - OR7 - COOR7 - CONHR7 - CONR7R8, - NR7R8, ou - So3R7 avec R7 et R8 identiques ou différents, représen tant un groupe alkyle en C1 à C17, ou un groupe aryle en C6 à C14, ou avec R7 et R8 formant ensemble un cycle hydrocarboné, saturé ou insatu ré, comportant éventueLlement un hétéroatome choisi parmi 0, S et N ; 20)l'un des R2, R3, R4 et R5 représente - NH2 - NHR7 - NH-COOR7 - N(R8)COOR7 - NHR9, ou - NR7R9 avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus et R9 représentant un groupe acyle, dérivé d'un composé choisi parmi les acides aminés, les peptides, les acides carboxyliques et les acides gras, le groupe amine de l'acide aminé ou du peptide étant protégé ou non protégé, salifié ou non salifié ;; les autres R2, R3, R4 et R5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent - un atome d'hydrogène, ou - un groupe alkyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi Les atomes d'halogène, OH, OR7, COOR7, CONHR7, CONR7R8, NR7R8, SO3R7 et CF3, avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus, ou R2 et R3, R3 et R4 ou R4 et R5 forment ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou R3, R4 et R5, ou R2, R3 et R4 forment ensemble avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique à 3 cycles condensés ; et R6 représente - un atome d'hydrogène, ou - un groupe choisi parmi les groupes alkyle en C1 à C17, aryle en C6 à C14 et cycloalkyle en C3 à C10, le groupe alkyle, aryle ou cycloalky le étant non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, COOR7, OR7, et S03R7 avec R7 ayant la signification donnée ci-dessus, et ses sels d'addition à des acides. 2. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente un groupe alkyle de 3 à 8 atomes de carbone. 3. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente le groupe butyle ou pentyle. 4. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NH2, NHR7, NHCOOR7, NHR9 ou NR7R9. 5. Dérivé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NH2, NHCOOR7 ou NHR7. 6. Dérivé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NHCOOR7 avec R7 représentant le groupe éthyle. 7. Dérivé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NHR9 ou NR7R9. 8. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NHR9 avec R9 représentant le groupe acyle dérivé de l'alanine protégé par le groupe benzyloxycarbonyle ou salifié par l'acide chlorhydrique. 9. Dérivé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NHR9 avec R9 représentant le groupe acyle dérivé de l'arginine ou de I'arginine protégée par le groupe t-butyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, ou salifié par HCL ou CH3COOH 10. Dérivé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R4 représente NHR9 avec R9 représentant le groupe acyle dérivé du tripeptide -Arg-Pro-Val protégé par le groupe t-butoxycarbonyle. 11. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que R2, R3, R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène. 12. Utilisation d'un dérivé d'aminocoumarine de formule : dans laqueLle 10) R1 et R6 sont tels que définis dans la revendication 1, 20) l'un des R2, R3, R4 et R5 représente -NH2, -NHR7 ou -NHCOOR7 avec R7 ayant la signification donnée dans la revendication 1, et les autres R2, R3, R4 et R5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent - - un atome d'hydrogène, ou - un groupe alkyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, OR7, COOR7, CONHR7, CONR7R8, NR7R8, So3R7 et CF3, avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus, ou R2 et R3, R3 et R4 ou R4 et R5 forment ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou R3, R4 et R5, ou R2 R3 et R4 forment ensemble avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique à 3 cycles condensés, pour la synthèse de substrats d'enzyme. 13. Utilisation d'un dérivé d'aminocoumarine de formule : dans laquelle 10) R1 et R6 sont tels que définis dans la revendication 1, 20) l'un des R2, R3, R4 et R5 représente NHR9 ou NR7R9 avec R7 et R9 ayant les significations données dans la revendication 1, et 30) les autres R2, R3, R4 et R5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent - un atome d'hydrogène, ou - un groupe alkyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, OR7, COOR7, CONHR71 CONR7R8, NR7R8, S03R7 et CF3, avec R7 et R8 ayant les significations données ci-dessus, ou R2 et R3, R3 et R4 ou R4 et R5 forment ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou R3, R4 et R5 ou R2 R3 et R4 forment ensemble avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique à 3 cycles condensés, comme substrat d'enzyme.