Brevet FR2705676A1 — publié le 19941202

La présente invention concerne des dérivés de la vitamine B12 ayant un caractère hydrophobe accru. Les dérivés de la vitamine B12 sont utiles en tant que composants pour des compositions pharmaceutiques, des produits alimentaires pour les êtres humains, pour les animaux, et similaires. On connaît comme homologues de la vitamine _ B12, la cyanocobalamine, l'hydroxocobalamine, l'adéno- sylcobalamine, la méthylcobalamine et similaires. Toutefois, toutes ces substances sont hydrosolubles et, dans le cas d'une administration orale, ces substances sont absorbées au niveau d'une partie inférieure de l'in- testin grêle, et d'une partie terminale à 50 cm de l'iléon par l'action d'un facteur intrinsèque dans le fluide gastrique (VITAMIN SCIENCE II, activités physiolo- giques de la vitamine B12, page 554, 1980, Tokyo kagaku dojin). La vitamine B12 est absorbée par transport actif, et les maladies de carence en vitamine B12, dans de nom- breux cas, sont causées par un dérèglement de ce méca- nisme d'absorption. Puisque les analogues de la vitamine B12 connus sont hydrosolubles, leur affinité pour les tissus est faible et, dans le cas o le mécanisme d'absorption est déréglé, ils ne peuvent être absorbés par diffusion comme une alternative de mécanisme d'absorption. Par conséquent, on désire développer des dérivés de la vitamine B12 qui peuvent être absorbés par diffusion. D'un autre côté, lorsque la vitamine B12 est ajoutée à une alimentation mélangée, elle peut être aisément dissoute dans l'eau et éliminée. On désire développer des dérivés de la vitamine B12 hydrophobes pouvant présenter les activités biologiques naturelles de la vitamine B12. Par conséquent, un objet de la présente invention est de fournir des dérivés de la vitamine B12 hydrophobes. L'objet est rempli par la fourniture de dérivés de la vitamine B12 hydrophobes ayant un groupe acyle lié à la partie glucidique du ligand inférieur. Les dérivés de la vitamine B12 hydrophobes de la présente invention sont aisément absorbés par diffu- sion thermodynamique sans utilisation d'un mécanisme d'absorption normale par transport actif et, après l'ab- -10 sorption, le groupe acyle est séparé du dérivé de la vitamine B12 pour libérer la vitamine B12, le groupe acyle libéré étant inoffensif vis-à-vis des organismes. Par conséquent, la vitamine B12 hydrophobe de la présente invention permet l'absorption de vitamine B12 dans le cas de maladies de carence en vitamine B12 causée par un dérèglement du mécanisme d'absorption. La Figure 1 représente le rapport de réparti- tion de divers dérivés de la vitamine B12 de la présente invention entre l'eau et un solvant organique. La Figure 2 représente un spectre d'absorp- tion d'un des présents dérivés de la vitamine B12, CN-B12 ( CllC0). - La Figure 3 représente un spectre FAB-MS de l'un des présents dérivés de la vitamine B12, CN-B12(C2CO). La Figure 4 représente une activité des présents dérivés de la vitamine B12 dans E. coli. Les dérivés de la vitamine B12 de la présente invention sont représentés par la formule suivante: H.2NC -O -f NCONON? -10 YCo o P " 0O-C-R on dans laquelle R représente un groupe alkyle ayant de 2 à 17 atomes de carbone, et X représente un groupe cyano, un groupe hydroxy, un groupe alkyle, ou un groupe 5'-désoxyadénosyle. Dans les présents dérivés de la vitamine B12, on préfère utiliser un groupe acyle ayant de 3 à 18 atomes de carbone en tant que groupe substituant RCO du ligand inférieur. Dans la présente demande, le ligand inférieur signifie un des deux ligands de coordination à partir de la direction axiale du cobalt, qui est placé au niveau du cinquième site de coordination (côté de la base, 5,6-diméthyl-benzimidazo- le). Lorsque le nombre d'atomes de carbone du groupe acyle est inférieur à 3, il n'y a pas de caractère hydrophobe suffisant du dérivé de la vitamine B12, alors que si le nombre d'atomes de carbone est supérieur à 20, la vitamine B12 résultante est insoluble dans l'eau. Le groupe alkyle pour X a jusqu'à 25 atomes de carbone et est par exemple un groupe alkyle inférieur tel qu'un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle, etc. -10 Un dérivé de la vitamine B12 de la présente invention peut être produit, par exemple, en faisant réagir de la cyanocobalamine avec un anhydride carboxyli- que ayant un nombre désiré d'atomes de carbone pour obtenir une (5'-0-acyl)cobalamine. Le caractère hydrophobe du présent dérivé de la vitamine B12 peut être exprimé de différentes maniè- res, incluant une valeur de Rf en chromatographie à couche mince (CCM), un rapport de répartition entre 1 'eau et un solvant organique, ou similaires. La relation entre le nombre d'atomes de carbone dans le groupe acyle RCO et les valeurs de Rf en CCM est comme suit. On notera que dans la présente invention, la cyanocobalamine est indiquée par "CN-B12", et la cyano(5'-O-acyl)cobalamine est indiquée par "CN- B12(CnCO)", dans laquelle n est le nombre d'atomes de carbone de R dans le groupe acyle RCO. 2705676 TABLEAU 1 Dérivé de la Solvant vitamine B12 WSB B/P/W CN-B12 0.062 0.22 CN-B12(C2CO) 0.072 0.26 CN-B12(C7CO) 0.167 0.43 CN-B12 (C8CO) 0.174 0.44 CN-B12(CliCO) 0.181 0.45 CN-B12(C17C0O) 0.200 0.46 WSB: 2-butanol saturé avec de l'eau B/P/W: 1-butanol/2-propanol/eau = 10/7/10 Le résultat représenté ci-dessus dans le tableau 1 montre que le caractère hydrophobe des dérivés de la vitamine B12 augmente lorsque le nombre d'atomes de carbone dans R augmente. La Figure 1 montre le rapport de distribution de divers dérivés de la vitamine B12 entre l'eau et un certain solvant organique. On notera que ce résultat a été obtenu en ajoutant les mêmes volumes d'eau et d'un solvant organique à un dérivé de la vitamine B12 devant être testé, en mesurant l'absorbance (546-550 nm) de chaque phase, et en calculant un rapport de ces mesures. EXEMPLES Dans la présente demande, la présente invention est de plus expliquée à l'aide d'exemples, qui ne limitent pas la portée de la présente invention. EXEMPLE 1 Synthèse et purification de CN-B12( ClCO) On a dissout en premier lieu 15 pmoles de cyanocobalamine dans 5 ml de DMSO/DMF sec (1:1). On a ajouté 1,6 mmoles d'anhydride dodécanoï- que à la solution résultante et, après agitation à 42 pendant 23 heures, on a ajouté 10 ml d'éther diéthylique et 10 ml d'eau, afin d'achever la réaction. Ensuite, on a introduit 25 ml du mélange réactionnel dans un entonnoir de séparation, on a en outre ajouté 40 ml d'éther diéthylique et 40 ml d'eau, et le mélange a été agité pour extraire CN- B12(C1lCO). La phase aqueuse a été lavée à trois reprises avec de l'éther diéthylique, et concentrée par un évaporateur. On a fait passer le concentrat résultant dans une colonne de chromatographie sur XAD2, et on a fait ensuite éluer avec de l'eau la cyanocobalamine n'ayant pas réagi, CN-B12(CllC0) a été élué avec un solvant 2-méthyle-2- propanol à 50%. La fraction résultante a été séchée dans un évaporateur jusqu'à obtenir un solide, lequel solide a ensuite été dissout dans 2 ml de méthanol. On a fait passer la solution en chromatographie sur papier (solvant de développement: 1-butanol/2-propanol/eau (10:7:10)), et une partie du papier contenant la bande principale a été découpée, et la bande principale a été éluée avec un solvant 2-mêthyl-2-propanol à 50%. Le produit élué a été purifié par chroma- togrphie liquide à haute performance (phase mobile: méthanol à 62%; colonne: ODS), séché dans un évapora- teur jusqu'à obtenir un solide, lequel solide a été dissout dans de l'éthanol à 30% et la solution résultante a été stockée à -80 C. Le spectre d'absorption (300 à 640 nm) de cette substance est représenté à la Figure 2. D'autres dérivés ont fourni des spectres d'absorption similaires. EXEMPLE 2 De manière similaire à l'Exemple 1, CN-B12(C2CO), CN-B12(CgCO), CNB12(C11CO), et CN-B12(C1vCO) ont été produits. Un spectre FAB-MS de CNB12(C2CO) est représenté par la Figure 3. On n'a pas observé d'ion moléculaire, et un pic de m/e 1386 a été attribué à un ion fragmentaire formé par libération d'un radical cyano. Pour CN-B12, on n'a pas observé d'ion moléculaire et une fragmentation similaire a été observée. EXEMPLE 3 Essai d'activité en utilisant E. coli On a ajouté 10 pl d'une solution de CN-B12(CnCO), dans de l'éthanol aqueux à 70%, à 4,8 ml d'échantillon d'essai, et on a ajouté deux gouttes d'une suspension cellulaire de E. coli 215 sur ce dernier. Le mélange a été incubé à 37 C pendant 16 heures en culture statique. La quantité de la croissance de E. coli 215 a été mesurée par un spectrophotomètre. Le résultat est présenté à la Figure 4. On pense que la meilleure raison pour laquelle CN-B12(CgCO) parmi les dérivés acylés de la vitamine B12 est que sa longueur de la chaîne carbonée de R est optimum. Il est clair que les présents dérivés de la vitamine B12 ont une activité physiologique. REVENDICATION 1. Dérivé de la vitamine B12 représenté par la formule: -10 IH2NC N.N.z --- -- O 'N A/ O-C-R I O dans laquelle R représente un groupe alkyle ayant de 2 à 17 atomes de carbone, et X représente un groupe cyano, un groupe alkyle, un groupe hydroxy, ou un groupe 5'- désoxyadénosyle.