Brevet FR2701955A1 — publié le 19940902

La présente invention a pour objet un facteur de croissance de la famille de l'HARP. Elle est également relative à un procédé d'obtention de ce facteur en mettant en oeuvre des techniques d'ingénierie génétique. Un exemple d'expression dans des cellules de mammifères est présenté. Elle concerne aussi les applications d'un tel facteur en thérapeutique. Des facteurs de croissance appelés HBBM ont été mis en évidence lors de la purification d'autres facteurs de croissance , du groupe des FGFS (Fibroblast Growth Factor). Les HBBM ont fait notamment l'objet d'une demande de brevet européen 89 101 187 ( N de publication EP-326.075) dans laquelle on décrit leur isolement à partir d'un extrait de cerveau , par un procédé de purification incluant une extraction à pH acide et des étapes de chromatographie. Ce procédé a permis d'isoler trois peptides de 18 kD, 16 kD et 15 kD ayant la même extrémité terminale avec la séquence NH2-GLY LYS-LYS-GLU-LYS-PR0-GLU-LYS-LYS-VAL-LYS-LYS-SER-ASP-CYS-GLY- GLU-TRP-GLN-TRP-SER-VAL-CYS-VAL-PRO. La demande EP-326.075 décrit une activité mitogène des HBBM sur des cellules endothéliales à des doses de l'ordre de 20 à 50 ng/ml , pour l'induction d'un effet de stimulation de 50% de la stimulation maximale de la prolifération, et un effet minimum à partir de 3 ng/ml . Dans ce dosage, l'effet mitogêne des HBBM est comparable à celui de la forme acide du FGF (aFGF) . Cette demande mentionne aussi pour les trois formes HBBM une activité de promotion de l'angiogenèse et des activités d'entretien de l'intégrité et de cicatrisation tissulaire pour les tissus cutanés, osseux et nerveux notamment , sans que des résultats expérimentaux soient rapportés . Dans un article ultérieur ( Growth Factors, 4: 97-107, 1991), les inventeurs reviennent sur les résultats décrits dans le brevet EP-326.075 et démontrent que leurs nouvelles préparations d'HBBM également obtenues à partir de cerveau de boeuf, sont en réalité dépourvues d'activité mitogène, notamment pour des cellules endothéliales et fibroblastiques, même à des doses de 1 à 10 Hg/ml. Seule est confirmée une activité neurotrophique donnant une croissance neuritique sur des neurones d'embryons de rat à des doses comprises entre 80 et 640 ng/ml. Les auteurs de cet article décident donc de changer le nom de ce facteur pour le désigner par le nouveau sigle HBNF pour "Heparin Binding Neurotrophic Factor " .La raison de ces différences entre les premiers travaux décrits dans la demande de brevet et ceux décrits ultérieurement n'est pas clairement comprise mais l'hypothèse avancée est celle d'une contamination par le facteur de croissance bFGF lors des premières préparations. En effet, le facteur bFGF est déjà bien connu pour ses activités angiogénique et mitogène et s'isole par une procédure similaire à partir du cerveau. Afin de confirmer leurs résultats sur l'absence d'activités mitogêne et angiogénique du HBNF , les mêmes auteurs purifient le HBNF à partir du produit d'expression du gêne de cette protéine dans des bactéries ( Growth Factors 5: 99-114, 1991). La protéine obtenue contient 168 acides aminés et est purifiée après maturation sous la forme d'une protéine de 136 acides aminés, dont la séquence est identique à celle décrite précédemment, commençant donc du côté Nterminal par les acides aminés NH2-GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO- GLU-LYS-LYS-VAL. Cette protéine est dépourvue d'activités mitogène et angiogénique . Seule l'activité neurotrophique, comparable à celle de la protéine HBNF purifiée à partir du cerveau, est confirmée . Par une approche comparable, une autre équipe de chercheurs démontre que la même protéine obtenue par expression du même gène , appelé par ces auteurs HB-GAM et inséré sur un vecteur baculovirus dans des cellules d'insectes, est également dépourvue d'activité mitogène (Raulo et al., J. Biol. Chem., 267, 1-9, 1992). La protéine ainsi purifiée a une séquence N-terminale GLY-LYS-LYS-GLU-LYS identique à celle que ces auteurs ont obtenue à partir d'une extraction de cerveau de rat . Cette protéine recombinante a une activité neurotrophique comparable à la protéine native Les auteurs concluent que seule l'activité neurotrophique de HB-GAM existe. Elle est optimale à 200 ng/ml dans le test utilisé sur des cellules neuronales cultivées sur un support recouvert de la protéine HB-GAM. Des résultats analogues, montrant l'absence d'activité mitogène de cette protéine, extraite de cerveaux de boeuf, sont également rapportés par d'autres chercheurs travaillant indépendamment , voir Molecular Biology of the Cell, 3: 85-93, 1992 et J. Biol. Chem., 265: 18749-18752, 1990 . L'activité neurotrophique est également décrite . La séquence peptidique est identique à HB-GAM ou HBNF avec du côté N-terminal les acides aminés GLY-LYS -LYS-GLU-LYS. Parallèlement , à partir d'utérus de bovin, a été extraite la même protéine ( séquence N-terminale GLY-LYS-LYS GLU-LYS) , dénommée HBGF-8 par les auteurs , puis Pléiotrophine (PTN), ayant une activité mitogène sur fibroblastes (Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1096-1103, 1989). Une année plus tard, les mêmes auteurs ( Li et al, Science, 250: 1690, 1990) publient les résultats d'une expérimentation de transfection de cellules eucaryotes COS-7 et une expression transitoire du gène PTN. Ces auteurs montrent que le lysat cellulaire des cellules COS-7 transfectées par le gêne PTN est capable d'induire la multiplication cellulaire .Cependant la caractérisation moléculaire de la protéine PTN n'a pas été réalisée D'autres scientifiques , encore , ont montré que des cellules tumorales d'origine mammaire sécrètent un facteur de croissance capable d'être retenu sur une chromatographie d'héparine-Sépharose. Ce facteur a été purifié et sa séquence peptidique N-terminale est identique à celle de l'HARP à l'exception toutefois du premier acide aminé qui n'est pas déterminé (WELLSTEIN et al. J. Biol. Chem. 267: 2582, 1992). Il ressort donc de l'état de la technique analysé cidessus qu'il existe une grande incertitude quant à la structure de la ou des molécules responsables des activités mitogènes , angiogéniques et. neurotrophiques décrites par les différents auteurs. L'homme du métier pouvait néanmoins supposer , au vu de ces résultats , que la ou les molécules isolées par les diverses équipes possédai(en)t une extrémité N-terminale commune ayant la séquence suivante NH2 -GLY-LYS -LYS-GLU-LYS-PRO- La demanderesse s'est donc attachée à trouver une molécule de structure bien déterminée, possédant les activités précitées à des valeurs permettant l'utilisation thérapeutique. Elle s'est également attachée à mettre au point un procédé d'obtention de cette molécule sous une forme substantiellement libre de contaminant. Elle a trouvé de manière surprenante que cette molécule présentait une séquence en partie similaire à celles déjà décrites, mais allongée par des acides aminés à son extrémité N-terminale , et des activités biologiques supérieures à celles décrites dans l'état de la technique. Elle a d'autre part montré que l'on pouvait obtenir cette molécule dans des quantités suffisantes , et sous une forme quasiment pure , par insertion et expression d'un ADN complémentaire de cette molécule dans des cellules eucaryotes. La présente invention a donc pour objet un peptide présentant une similarité de séquence avec le peptide HARP et ayant une masse de 18 KD caractérisé en ce que la séquence (I) de son extrémité N-terminale est la suivante NH2 -ALA-GLU-ALA-GLY-LYS -LYS -GLU-LYS-PRO-GLU-LYS -LYS (I) Ce peptide présente avantageusement la séquence (II) suivante ALA-GLU-ALA-GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO-GLU-LYS-LYS-VAL-LYS-LYS SER-ASP-CYS-GLY-GLU-TRP-GLN-TRP-SER-VAL-CYS-VAL-PRO-THR-SER- GLY-ASP-CYS-GLY-LEU-GLY-THR-ARG-GLU-GLY-THR-ARG-THR-GLY-ALA GLU-CYS -LYS -GLN-THR-MET-LYS-THR-GLN-ARG-CYS -LYS- ILE-PRO-CYS ASN-TRP-LYS-LYS-GLN-PHE-GLY-ALA-GLU-CYS-LYS-TYR-GLN-PHE-GLN ALA-TRP-GLY-GLU-CYS-ASP-LEU-ASN-THR-ALA-LEU-LYS-THR-ARG-THR GLY-SER-LEU-LYS-ARG-ALA-LEU-HIS-ASN-ALA-GLU-CYS-GLN-LYS-THR- VAL-THR-ILE-SER-LYS-PRO-CYS-GLY-LYS-LEU-THR-LYS-PRO-LYS-PRO- GLN-ALA-GLU-SER-LYS-LYS-LYS-LYS-LYS-GLU-GLY-LYS-LYS-GLN-GLU LYS-MET-LEU-ASP. La présente invention est aussi relative à des fragments du peptide tel que défini ci-dessus comprenant au minimum à son extrémité terminale la séquence (I) Des peptides biologiquement actifs présentant une telle séquence N-terminale sont d'autant plus surprenants qu'il était difficile pour l'homme du métier , ayant connaissance de l'état de la technique analysé ci-dessus, de prédire qu'une adjonction d'acides aminés au peptide connu avec séquence Nterminale , améliorerait considérablement son activité biologique. En effet, les prédictions quant à l'influence de l'adjonction, de l'élimination ou de la modification d'un acide aminé dans une structure donnée sont impossibles dans l'état actuel des connaissances de la structure des protéines, même à l'aide des méthodes de modélisation les plus avancées. La présente invention a encore pour objet l'obtention du peptide ou de ses fragments tel que défini précédemment,par la technique générale d'ingénierie génétique , selon laquelle des vecteurs portant au moins une partie d'un ADN complémentaire de la forme allongée du peptide HARP, sont exprimés et le peptide est ensuite extrait Le procédé d'obtention du peptide tel que défini précédemment comprend une étape de sécrétion dudit peptide ou de ses fragments dans les milieux de culture ou d'extraction, avantageusement à partir de cellules de mammifères transfectées par un vecteur portant au moins une partie d'un ADN complémentaire du peptide HARP, et une étape de purification dudit peptide. Avantageusement , ledit vecteur porte la séquence , ou une partie de la séquence (III) d'ADN représentée à la figure 1. La présente invention est en outre relative à l'utilisation du peptide ou d'un de ses fragments, tels que précédemment définis , comme agent mitogène , neurotrophique ou comme agent stimulant l'activité tyrosine hydroxylase Un tel peptide peut être ainsi utilisé pour la cicatrisation de la peau, la régénération osseuse ainsi que le maintien de l'homéostasie de ces tissus , en particulier pour lutter contre des déséquilibres, tels que l'ostéoporose ainsi que comme agent angiogénique , en particulier pour favoriser la vascularisation des structures cérébrales ou du système nerveux La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant les peptides et fragments précédemment définis en association avec un ou plusieurs diluants ou véhicules compatibles et pharmaceutiquement acceptables . De telles compositions sont avantageusement formulées en vue de l'administration entérale ou parentérale par les méthodes usuelles de la galénique. L'invention sera illustrée, sans être aucunement limitée, par la description qui suit , en référence aux dessins annexés sur lesquels: La figure 1 représente la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire obtenu à partir d'une banque d'ADN complémentaire de cerveaux humains, ainsi que la séquence peptidique correspondante . Sur cette figure , la flèche pleine indique le site de maturation de la protéine recombinante selon l'invention La figure 2 est un schéma du plasmide appelé pJKl2 utilisé pour transfecter des cellules de mammifères La figure 3 représente un gel SDS-PAGE de surnageants respectivement d'un clone cellulaire témoin ( colonne 1) d'un clone transfecté par le plasmide pJK12 ( colonne 2 ) et de la protéine HARP extraite de cerveaux de bovins. La figure 4 illustre des effets sur la croissance de neurites de la lignée PC12 respectivement d'un milieu conditionné par des cellules témoins (4a) et d'un milieu conditionné par des cellules transfectées par le plasmide pJK12 (4b). La figure 5 représente l'activité mitogène de fractions obtenues par chromatographie sur héparine-Sépharose du milieu conditionné par les cellules transfectées par le plasmide pJK12. L'activité mitogène est évaluée par la thymidine tritiée incorporée ( en ordonnée ) tandis que l'absorbance des fractions est mesurée à 280 nm (A 280) . NRHS correspond à la fraction non retenue sur le gel de chromatographie. La figure 6 illustre l'évolution de l'activité mitogène des fractions obtenues par chromatographie sur Mono S, de la fraction biologiquement active obtenue préalablement sur chromatographie d'héparine-Sépharose. NaCl représente l'evolu- tion de la concentration en NaCl dans le gradient d'élution La figure 7 représente la prolifération mesurée par la synthèse d'ADN ( en ordonnée ) en fonction de la concentration en protéine recombinante en ng/ml ( en abscisse ). EXEMPLE : PRODUCTION DE LA PROTEINE SELON L'INVENTION PAR CLONAGE ET EXPRESSION DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES I . Matériels et méthodes 1. Matériel Les produits radiomarqués tels que la thymidine tritiée (3H Tdr) sont commercialisés par Dositek (France) et la Cytosine triphosphate marquée au phosphore 32 est commercialisée par Amersham France. Les produits de culture de cellules proviennent de la Société Gibco (France), comme le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), la Généticine (G418), la Pénicilline, la Streptomycine et la Fungizone. Les sérums de veau nouveau-né et de foetus bovin proviennent de la Société Eurobio (France). Les lignées cellulaires utilisées sont la lignée PC12 (dérivée de Phéochomocytome) et la lignée de cellules endothéliales capillaires de cerveau bovin (BBC), ainsi que les cellules NIH 3T3. Les produits permettant d'effectuer les chromatographies proviennent de la Société Pharmacia (Suède) (S-Sépharose, Mono S, heparin-Sépharose). Le plasmide pAG60 est dû à la générosité du Dr. A. Garapin de l'institut Pasteur, Paris ( Colbère et al. J. Mol. Biol., 1981, 150, 1-14). 2. Méthodes a - Construction du vecteur d'expression eucaryote codant pour la protéine selon l'invention. L'isolement du gène cDNA complémentaire a été effectué à partir d'une banque de cDNA de cerveau humain établie dans le système lambda gtII et d'une sonde d'oligonucléotides codant pour un morceau de la séquence de HARP (Asp-Cys-Gly Glu-Trp-Gln). Le gène ainsi isolé de ce clone présente la séquence donnée dans la figure 1. Ce gène a été inséré dans le vecteur d'expression contenant le promoteur SV40 et l'amplificateur du cytomégalovirus humain. Le plasmide ainsi obtenu , de 5,1 Kb , est représenté sur la figure 2. Ce plasmide est appelé pJK12. b - Transfections des cellules de mammiferes. Les cellules NIH 3T3 sont cultivées dans du milieu DMEM en présence de 10 % de sérum de veau nouveau-né, de Pénicilline (100 unités par ml) et de Streptomycine (100 Hg par ml). Ces cellules sont transfectées en présence de phosphate de calcium comme décrit par Chen et Okayama (Mol. Cell Biol., 1987, 7: 2745-2752). On réalise les transfections suivantes : 10 Hg de pAG60 (plasmide de résistance à la néomycine) ou le mélange contenant 10 pg pJK12 et 1 pg pAG60 dans les cellules NIH 3T3. Après 48 heures, les cellules sont sous-cultivées après dilutions de 1/5e dans un milieu de sélection en présence de l'antibiotique G418 à 400 pg/ml . Ce milieu a été renouvelé tous les 3 jours et après 15 jours, on détecte des colonies de cellules résistant au G418 poussant dans le milieu de culture. Chaque clone sélectionné est cultivé indépendamment et est étudié. Après 2 sous-cultures, les cellules sont cultivées dans le milieu normal de culture (sans l'antibiotique G418). c- Sélection de clone cellulaire sécrétant la protéine selon l'invention après transfection. Afin de sélectionner un clone exprimant la protéine recombinante, les expériences suivantes sont effectuées On récolte le milieu de culture obtenu après 72 heures de culture des cellules du clone transfecté étudié. Ce milieu de culture est complété par du tampon Tris HCl 10 mM, pH 7,5 et est incubé pendant 2 heures à 4 C avec 150 ml d'une solution d'héparine-Sépharose (10 % poids/volume dans un tampon TE 10 mM Tris HC1, pH 7,5, lmM EDTA). Le gel d'héparine Sépharose a ensuite été lavé 4 fois avec un tampon de 0,6 M NaCl et 2 fois avec le tampon seul. Les protéines retenues sur l'heparine-Sepharose sont éluées avec 40 p1 du tampon d'échantillon d'électrophorèse décrit par Laemmli ( Nature , 1970, 227: 680-685) L'analyse des protéines sur gel d'électrophorèse en présence de sodium dodécyl sulfate est également effectuée selon le même protocole de Laemmli. Après électrophorèse, les gels sont colorés à l'aide d'argent selon le protocole décrit par Wray et coll,( Anal. Biochem., 1981, 118: 197-203). d - Purification de la protéine recombinante selon 1' invention. La purification de la protéine humaine recombinante a été effectuée comme décrit précédemment (Courty et coîl, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 151: 1312-1318). En résumé, à partir d'une récolte de 1,2 litres de milieu conditionné , obtenu après plus de soixante douze heures de culture des cellules du clone étudié exprimant la protéine, on ajuste le pH à 6,00 avec 100 mM de phosphate de sodium (tampon A). On centrifuge à 10 000 g pendant 15 minutes pour éliminer les débris cellulaires et les cellules qui flottent dans le milieu et le surnageant est déposé sur une colonne "fast flow" S Sépharose. Cette résine est lavée avec le tampon A contenant 0,15 M NaCl et les protéines éluées à 0,6 M NaCl dans le même tampon. Cet éluat est ensuite déposé sur une colonne de 1 ml d'héparine-Sépharose à l'aide d'une pompe dont le débit est de 0,5 ml par minute. La colonne d'héparine-Sépharose est préalablement équilibrée en tampon Tris-Hcl 10 mM, pH 7,5 et 0,5 M NaCl. Le matériel non absorbé sur la colonne d'héparine Sépharose est éliminé ; la colonne est lavée dans le tampon d'équilibration d'une manière exhaustive jusqu'à l'obtention d'une ligne de base d'absorption à 280 nm. L'élution des protéines absorbées sur la colonne d'héparine-Sépharose est alors réalisée par une augmentation de la concentration en NaCl dans le tampon de lavage. Cette augmentation est faite par paliers successifs jusqu'à la concentration de 2 M NaCl. Chaque fraction ainsi obtenue est analysée pour son activité mitogene selon le protocole décrit ci-dessous. Les fractions voisines ayant une activité mitogène sont regroupées, dialysées contre le tampon 100 mM phosphate de sodium, pH 6,00 et contenant 0,15 M NaCl. Cette fraction est ensuite déposée sur une colonne de chromatographie Mono S à température ambiante. La séparation des fractions est obtenue par un gradient linéaire de NaCl entre 0,15 et 1 M dans le même tampon. Chaque fraction de 1 ml est étudiée pour son activité mitogène sur des cellules BBC. e - Mesures des activités mitosène et neurotrophique. La mesure des activités mitogènes présentes dans les différentes fractions de chromatographie est effectuée par mesure de l'augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée sur des cellules BBC en culture selon le protocole décrit par Courty et coll,( Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 151: 1312-1318) La mesure de l'activité neurotrophique sur les cellules PC12 est effectuée après ensemencement de ces cellules à dix mille cellules par boîte de culture de 35 mm de diamètre. Ces cellules sont mises en présence de 3 ml de milieu de culture contenant pour moitié le milieu conditionné obtenu après 72 heures de culture des cellules de clone résistant au milieu de sélection contenant l'antibiotique G418. Après 3 jours, la croissance neuritique est estimée par comparaison avec celle des cellules contrôle. f - Microséguencape des protéines Le microséquençage de la protéine recombinante selon l'invention est réalisé selon les techniques classiques décrites dans de nombreux ouvrages. Environ 75 mmoles (1,3 pg) de la fraction active repérée par Mono S est déssalée par chromatographie HPLC et injectée dans un microséquenceur en phase gazeuse (Applied Biosystem 470 A). Les dérivés phénylthiohydantoine des acides aminés sont identifiés par chromatographie HPLC (modèle 120 A, Applied Biosystem). II. Résultats 1. Séquence du cDNA de la protéine selon l'invention. La séquence du cDNA de la protéine selon l'invention montrée à la figure 1 présente des caractéristiques communes à celles publiées par Kretschmer et al, (Growth Factors, 1991, 5: 99-144) , mais , du côté de la région 5' non traduite, la séquence complémentaire à celle décrite entre les bases 130 et 136, soit : GGGAGGG et trois bases additionnelles non décrites en position 137, 138 et 139, soit GAG. 2. Mise en évidence de la protéine recombinante selon 1 'invention. Le milieu, conditionné pendant 72 heures, de deux clones résistant au G418 a été analysé par électrophorèse en SDS. La figure 3 montre l'existence d'un polypeptide de 18 kD présent spécifiquement dans le milieu de culture des cellules transfectées par pJK12 (colonne n 2) alors que le milieu conditionné par les cellules témoins (transfectées par le vecteur dont est issu pJK12 mais ne portant pas l'ADNc, colonne n I ) ne contient pas cette protéine. La colonne n03 correspond à la migration de protéine HARP isolée de cerveau de bovin. 3. Mise en évidence de l'activité neurotrophipue selon 1 'invention. L'activité neurotrophique sur les cellules PC 12 n'est détectée que dans le milieu conditionné par les cellules transfectées par la protéine selon l'invention comme l'illustre la figure 4. On remarque ainsi une croissance de neurites importante dans la figure 4b par rapport à la figure 4a. 4. Purification de la protéine selon l'invention et caractérisation de son activité mitocrène. La purification de la protéine à partir du milieu conditionné des cellules transfectées par le plasmide pJK12 est effectuée selon le protocole décrit ci-dessus. Le profil de l'activité biologique de la protéine obtenue après élution de la chromatographie d'affinité sur héparine-Sépharose est présenté dans la figure 5. La fraction éluée à 2 M NaCl stimule l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules BBC. La chromatographie Mono S permet de mieux fractionner cette activité mitogène comme l'illustre la figure 6. A la concentration de 0,8 M NaCl, une activité mitogène est obtenue et l'étude de cette activité en fonction de la dose est illustrée dans la figure 7 . La dose de protéine nécessaire à ajouter aux cellules BBC en culture dans les conditions opératoires décrites dans la publication de Courty et coll,( Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 151: 13121318) est de 55 pM (1 ng/ml) pour obtenir un effet moitié de l'effet maximal d'incorporation de thymidine tritiée et est de 220 pM (4 ng/ml) pour obtenir le maximum (figure 7). 5. Etude de la structure N-terminale de la protéine recombinante selon l'invention. La fraction biologiquement active éluée à 0,8 M NaCl de la chromatographie Mono S, présente uniquement dans le milieu conditionné des cellules transfectées par le plasmide pJK12 a été injectée après déssalage par chromatographie HPLC C4 dans un microséquenceur. La séquence obtenue est la suivante NH2-ALA-GLU-ALA-GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO-GLU-LYS-LYS (I) Aucune séquence GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO-GLU-LYS-LYS n'a été détectée. Conclusion L'activité biologique de la protéine recombinante selon l'invention obtenue par secrétion de cellules de mammifères transfectées par un vecteur portant un ADNc humain est attribuée à un polypeptide dont la séquence peptidique présente la caractéristique originale de comporter trois acides aminés supplémentaires du côté N-terminal qui sont ALA GLU-ALA. La présence de ces trois acides aminés supplémentaires permet d'obtenir une forme biologiquement active par rapport à la protéine HARP telle que décrite précédemment Les activités sont obtenues à des doses très faibles (environ 1 ng/ml soit 55 pM) de protéine , par comparaison aux doses mentionnées dans l'état de la technique. REVENDICATIONS 1. Peptide présentant une similarité de séquence avec le peptide HARP et ayant une masse de 18 kD, caractérisé en ce que la séquence (I) de son extrémité N-terminale est la suivante: NH2-ALA-GLU-ALA-GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO-GLU-LYS-LYS (I) 2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence (II) est la suivante ALA-GLU-ALA-GLY-LYS-LYS-GLU-LYS-PRO-GLU-LYS-LYS-VAL-LYS-LYS- SER-ASP-CYS-GLY-GLU-TRP-GLN-TRP-SER-VAL-CYS-VAL-PRO-THR-SER- GLY-ASP-CYS-GLY-LEU-GLY-THR-ARG-GLU-GLY-THR-ARG-THR-GLY-ALA GLU-CYS -LYS -GLN-THR-MET-LYS -THR-GLN-ARG-CYS -LYS - ILE-PRO-CYS ASN-TRP-LYS-LYS-GLN-PHE-GLY-ALA-GLU-CYS-LYS-TYR-GLN-PHE-GLN ALA-TRP-GLY-GLU-CYS-ASP-LEU-ASN-THR-ALA-LEU-LYS-THR-ARG-THR GLY-SER-LEU-LYS-ARG-ALA-LEU-HIS-ASN-ALA-GLU-CYS-GLN-LYS-THR VAL-THR-ILE-SER-LYS-PRO-CYS-GLY-LYS-LEU-THR-LYS-PRO-LYS-PRO- GLN-ALA-GLU-SER-LYS-LYS -LYS -LYS -LYS -GLU-GLY-LYS -LYS-GLN-GLU LYS-MET-LEU-ASP. 3. Fragment du peptide selon l'une des revendications 1 et 2 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins son extrémité N-terminale 4. Procédé d'obtention du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou de ses fragments, par la technique générale d r d'ingénierie génétique, selon lequel des vecteurs portant au moins une partie d'un ADN complémentaire de la forme allongée du peptide HARP sont exprimés et ensuite extraits 5. Procédé selon la revendication 4 comprenant les étapes de sécrètion dudit peptide ou de ses fragments dans les milieux de culture ou d'extraction à partir de ces milieux, à partir de cellules de mammifères transfectées par un vecteur portant au moins une partie d'un ADN complémentaire du peptide HARP, et de purification dudit peptide 6.Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que l'ADN complémentaire possède la séquence (III) représentée à la figure 1. 7. Utilisation du peptide ou fragment selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 6, comme agent mitogène, angiogénique, neurotrophique ou comme agent stimulant l'activité tyrosine hydroxylase. 8. Utilisation du peptide ou fragment selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 6, pour la fabrication d'un médicament pour la cicatrisation de la peau , la régénération osseuse ainsi que le maintien de l'homéostatie de ces tissus , en particulier pour lutter contre des déséquilibres tels que l'ostéoporose , ou comme agent angiogénique, en particulier pour favoriser la vascularisation des structures cérébrales ou du système nerveux. 9. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un peptide ou fragment selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 6 , en association avec un ou plusieurs diluants ou véhicules compatibles et pharmaceutiquement acceptables 10. Composition selon la revendication 9 , caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour l'angiogénèse, en particulier pour favoriser la vascularisation des structures cérébrales ou du système nerveux. 11. Composition selon la revendication 9 , caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour induire la croissance des cellules nerveuses ou pour stimuler l'activité tyrosine hydroxylase. 12. Composition selon la revendication 9 , caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour induire le développement de cellules 13. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour favoriser la cicatrisation de la peau ou pour maintenir l'homéostatie de ce tissu 14. Composition selon la revendication 9 , caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée pour favoriser la régénération osseuse ainsi que le maintien de l'homéostatie de ce tissu, en particulier pour lutter contre des déséquilibres, tels que l'ostéoporose. 15. Composition selon l'une des revendications 9 à 14 présentée en vue de l'administration entérale ou parentérale.