Brevet FR2698880A1 — publié le 19940610

La présente invention se rapporte à des récepteurs T solubles et plus particulièrement à des formes sécrétées de récepteurs T solubles (RTs) VaCa/VpCp, VyCy/V6CS ou VaC6/VssCy et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques. Les lymphocytes T sont capables de reconnaître de façon hautement spécifique des myriades d'antigènes (Ag), ce au moyen de structures de surface extrêmement diversifiées appartenant à la superfamille des immunoglobulines (Ig), les récepteurs T (RT). Chez l'homme comme chez la souris, la plupart des lymphocytes T chez l'adulte expriment des RT constitués de 2 sous-unités glycoprotéiques variables dénommées a et p. Tout comme les chaînes lourdes et légères des Ig, ces sous-unités comportent un domaine variable (V) aminoterminal et un domaine constant (C) carboxyterminal et sont en outre très généralement associées entre elles de façon covalente, via un pont disulfure interchaîne. La nature des antigènes reconnus par le récepteur T ap est relativement bien établie : il s'agit de complexes formés par un antigène oligopeptidique (issu de la dégradation intracellulaire de protéines endogènes ou exogènes) étroitement associé aux produits de gènes polymorphes situés dans le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), dits de classe I ou II. L'interaction entre le récepteur T ap et les complexes CMH/Ag est classiquement renforcée par des molécules dites coréceptrices ou accessoires (CD4 et CD8), reconnaissant des portions conservées des molécules CMH de classe II et I respectivement. Plus récemment a été décrit une autre souspopulation de lymphocytes T qui se distingue par la nature des gènes (y et 6) codant pour ces récepteurs T. A la différence des lymphocytes T ap, la spécificité antigénique des cellules T yâ reste encore peu claire. Se basant sur une relative homologie des séquences primaires des chaînes ap et y8 du récepteur T, certains ont prédit une similarité structurale des ligands pour ces récepteurs. En accord avec cette hypothèse, une fraction des lymphocytes T yô s'est avérée être dirigée contre des molécules structuralement proches ou identiques aux produits du CMH classiquement reconnus par les lymphocytes T ap. Cependant, il existe également plusieurs exemples de reconnaissance par cette sous-population T de molécules de structure plus éloignée, telles les protéines de stress ou certaines molécules d'activation comme le CD48. Les présents inventeurs ont cherché à générer des formes "solubles" (sécrétées) de récepteur T y6, qui pourraient être utilisées (à l'instar des Ig) en tant que sondes permettant l'isolement, la localisation et éventuellement la purification de ligands spécifiques. Par ailleurs, de tels récepteurs T solubles présentent également un certain nombre d'applications cliniques. Traunecker et coll. (1989. Immunol. Today 10:29) ont rapporté des tentatives de production de récepteurs T solubles ayant consisté à éliminer la portion transmembranaire (TM) des chaînes a ou des chaînes p par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la région TM qui se sont révélées infructueuses, aucune sécrétion n'ayant pu être décelée. A la suite de ces échecs initiaux, d'autres stratégies ont alors été adoptées. Dans la plupart des cas, le principe consistait à construire des protéines chimériques comprenant les régions V, ou V et C des sousunités a et p, accolées aux régions C d'immunoglobulines ou à des ancres de type glycosyl phosphatidylinositol (GPI). Dans le cas des protéines de fusion RT/Ig, le problème principal s'est avéré être la sécrétion parfois majoritaire de formes monomériques ou homodimériques. En outre, les formes hétérodimériques RTs ap présentait parfois des différences structurales significatives avec les formes membranaires ; en particulier les 2 chaînes a et p étaient très généralement associées de façon non covalente. Ceci pouvait par conséquent avoir des répercussions sur la structure globale et la spécificité antigénique fine de telles molécules chimériques.Dans le cas des récepteurs T "lipiés" (ancrés à la membrane par une séquence GPI), une proportion parfois assez élevée d'hétérodimères ap associés de façon covalente pouvait être obtenue. Cependant, l'inconvénient principal de cette technique était la nécessité d'un traitement enzymatique (par phospholipase C), afin de libérer les récepteurs T dans le milieu, et donc une production coûteuse et de faible rendement. Plus récemment a été proposé un protocole de production de récepteurs T dits monochaîne, consistant à accoler un domaine Va à un domaine Vp via un pont peptidique. Cependant, cette technique s'est révélée délicate d'utilisation.En particulier, elle supposait l'introduction d'un nombre important de mutations dans certaines zones hydrophobes des régions V normalement masquées sur la protéine native, pour rendre ces récepteurs T monochaîne hydrosolubles. Les présents inventeurs ont découvert que l'on pouvait obtenir des récepteurs T solubles de façon aisée et avec un rendement élevé, à l'aide d'un procédé consistant à produire des molécules d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutive du récepteur T délétées de la portion transmembranaire, et à co-transfecter ces ADN dans une cellule-hôte. La présente invention à aussi pour objet un procédé de production de récepteurs T solubles, caractérisé en ce que l'on réalise une co-transfection dans une cellule hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portion transmembranaire du récepteur T. Selon l'invention, on produit des récepteurs T solubles VaCa / VPCP par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sousunités a et p du récepteur Tap délétées de la portion transmembranaire du récepteur Taos. On produit également des récepteurs T solubles VyCy / V6CS par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sousunités y et 6 du récepteur Ty6 délétées de la portion transmembranaire du récepteur Typo. On produit en outre des récepteurs T solubles hétérodimériques VaCy / VssCS et VaC6 / VpCy, dans lesquels les sous-unités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cy et C8 des sous-unités y et 6 du récepteur Ty6 délétées de leur portion transmembranaire, fusionnées respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Va et Vp des sous-unités a et p du récepteur Tap pour obtenir des récepteurs VaCy / VpC6, ou fusionnés respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Vp et Va des sous-unités p et a du récepteur Tap pour obtenir des récepteurs VaC6 / VpCy. On produit également des récepteurs T solubles hybrides VyCy / V&alpha;Cô par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour la sousunité y du récepteur Ty6 délétée de sa portion transmembranaire, avec les séquences d'ADN codant pour le domaine C6 de la sous-unité 6 fusionnées avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Va de la sous-unité a du récepteur Taud. Cette construction est particulièrement avantageuse et est basée sur le fait que certains gènes Va peuvent être utilisés soit par des clones ap, soit par des clones ys. Avantageusement, on utilise pour les constructions des récepteurs T solubles de l'invention pour les parties variables les séquences d'ADN des gènes V62 et Vy9. Il peut toutefois être intéressant de produire des récepteurs VyCy / V8C6 en utilisant une séquence d'ADN Vy9 d'une part, et en remplaçant la séquence d'ADN V62 par d'autres séquences d'ADN VS pour les mêmes raisons que celles évoquées ci-dessus pour la construction du récepteur hybride VyCy / VaC6. Cette construction permet d'obtenir des anticorps anti-a, ou dirigés contre des V6 distincts de V62. Réciproquement, il est également possible de conserver l'ADN V62 et de remplacer la séquence d'ADN Vy9 par d'autres séquences d'ADN Vy, afin d'obtenir des anticorps anti-Vy. L'invention englobe également ces modes de réalisation de récepteurs T solubles VyCy / V6C6. Avantageusement, la délétion de la portion transmembranaire des sous-unités constitutives du récepteur T est réalisée, par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la portion transmembranaire de ces sous-unités, notamment par mutagénèse dirigée par P.C.R. (Polymerase Chain Reaction). Les séquences d'ADN sont des séquences d'ADN génomique ou d'ADNc. De préférence, la co-transfection est réalisée dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules d'ovaires de hamster (CHO). L'invention a également pour objet une protéine de fusion formée entre un récepteur T soluble et une séquence peptidique, la séquence peptidique étant constitutive d'un peptide ou d'une protéine, la protéine de fusion étant obtenue par fusion de la séquence d'ADN codant pour le peptide ou la protéine à l'une des chaînes ou aux deux chaînes d'ADN codant pour les sous-unités d'un récepteur T délétées de leur portion transmembranaire, suivie d'une co-transfection des séquences d'ADN ainsi fusionnées dans une cellule-hôte. Avantageusement dans ce cas, la séquence peptidique est celle de l'interleukine-2 (IL-2). L'invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux humains ou animaux dirigés contre un récepteur T soluble obtenu par le procédé de l'invention ou une protéine de fusion RTs-IL2 telle que définie précédemment. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet, les récepteurs T solubles, éventuellement fusionnés avec l'interleukine-2 ou une autre protéine, peuvent être couplés si nécessaire à un agent immunogène, tel que l'anatoxine tétanique, par un agent de couplage tel une benzidine bis diazotée. La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab' )2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab' )2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Ces fragments, ainsi que des fragments Fc, peuvent être également obtenus par génie génétique. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tels qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives. L'invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la séquence peptidique décrite ci-dessus. Ces hybridomes peuvent être obtenus par les techniques classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre la séquence peptidique de l'invention, et des cellules d'une lignée myélomateuse. L'invention a également pour objet une composition de diagnostic comprenant un récepteur T soluble obtenu par un procédé selon l'invention ou une protéine de fusion RTs-séquence peptidique, notamment RTs-IL2 telle que définie précédemment, ou encore un anticorps monoclonal selon l'invention. La composition de diagnostic selon l'invention peut être utilisée pour le typage de spécificités cellulaires liées au récepteur T. A cet effet, on peut utiliser un récepteur T soluble en tant que tel. Cependant, en raison de l'affinité probablement faible de celui-ci pour son ligand spécifique, il est avantageux de coupler les récepteurs T solubles à un support, afin d'augmenter leur avidité par augmentation de leur valence. Le support peut consister en tout support traditionnellement utilisé, tel des billes organiques ou magnétiques. De tels supports sont par exemple des plaques en matière plastique utilisées pour les tests ELISA sur lesquels on fixe le récepteur T soluble de la même manière que les immunoglobulines, des billes magnétiques tosyl-activées, par exemple celles commercialisées par Dynal, Oslo, Norvège, ou encore des gels activés de type AFFIGEL tels ceux commercialisés par BIORAD. Les techniques de couplage sont celles classiquement utilisées et indiquées par le distributeur pour les supports disponibles dans le commerce. Ces méthodes peuvent consister en un couplage chimique ou au moyen d'anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs T solubles en question, ces derniers étant eux-mêmes couplés au support par couplage chimique. Avantageusement, les compositions de diagnostic comprennent une protéine fusionnée telle que décrite précédemment, constituée d'un récepteur T soluble et d'un déterminant antigénique contre lequel on dispose d'anticorps spécifiques. De telles compositions de diagnostic peuvent être utilisées pour le typage de spécificités cellulaires non détectées par les techniques sérologiques classiques. La composition de diagnostic selon l'invention peut également comprendre des anticorps monoclonaux tels que définis précédemment, et de préférence un panel d'anticorps monoclonaux dirigés contre les portions V et C des chaînes des récepteurs T obtenus par immunisation d'animaux contre les récepteurs T solubles obtenus selon l'invention, préalablement purifiés. Afin d'améliorer l'efficacité des immunisations, il est également possible d'injecter des protéines de fusion RTs-IL2 telles que définies précédemment. Une telle composition de diagnostic peut être utilisée notamment pour la mise en évidence de proliférations mono ou oligoclonales, comme celles rencontrées dans les leucémies T par exemple. Selon l'invention, on met en présence la composition diagnostique avec un prélèvement biologique, par exemple un échantillon de sang contenant des lymphocytes T pathologiques, et on met en évidence le complexe formé avec le ligand spécifique du récepteur T et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion comprenant le récepteur T soluble et un déterminant antigénique ou le complexe formé par les anticorps monoclonaux selon l'invention et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-1L2 contre lesquels ils sont spécifiquement dirigés. Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radio-immunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou une méthode immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA. Pour la mise en oeuvre de ces procédés de détection, on utilise des molécules froides non marquées ou marquées à l'aide d'un marqueur adéquat qui peut être la biotine ou ses dérivés, une enzyme comme la peroxydase, un marqueur fluorescent comme la fluorescéine, un marqueur radioactif, etc... Ces procédés de diagnostic in vitro comprennent par exemple les étapes suivantes - dépôt d'une quantité déterminée d'une composition contenant un récepteur T soluble, un récepteur soluble fusionné avec un déterminant antigénique ou un anticorps monoclonal selon l'invention dirigé contre le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-Interleukine 2 selon l'invention, dans les puits d'une plaque de microtitation ou sur un autre support tel que des billes ou une membrane de nitrocellulose, - dépôt dans les puits du prélèvement biologique à tester, ou incubation de celui-ci avec les billes ou la membrane, en présence d'agents saturants ou après saturation préalable des supports activés, - après incubation et rinçage des micropla ques ou des billes dépôt dans les puits ou incubation avec les billes d'un système de révélation du complexe récepteur T soluble-ligand éventuellement formé. Les kits pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de l'invention comprennent - au moins une composition de diagnostic selon l'invention, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'un complexe entre le ou les ligands éventuellement présents dans un échantillon biologique, - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le complexe formé. L'invention a également pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble obtenu selon le procédé de l'invention ou une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, notamment une RTs-IL2 selon l'invention. Une telle composition thérapeutique est utile notamment dans le traitement des processus pathologiques dans lesquels on observe une prolifération pauciclonale de lymphocytes T, tels les leucémies ou lymphômes T et certaines maladies autoimmunes. Elle est administrée de préférence par voie injectable dans un véhicule approprié. L'administration de cette composition thérapeutique a un double but. Elle permet d'une part l'induction d'une réponse immunitaire anti-idiotypique, conduisant alors à l'élimination active et sélective des cellules porteuses de ces idiotypes, et d'autre part le blocage par compétition de la reconnaissance d'antigènes autologues dans le cas de proliférations autoimmunes. Avantageusement, la composition thérapeutique selon l'invention comprend un récepteur T soluble hêtérodimérique tel que défini précédemment, porté éventuellement par une protéine de fusion. La composition thérapeutique selon l'invention peut également comprendre un anticorps monoclonal selon l'invention, éventuellement couplé à une molécule thérapeutiquement active, par exemple une molécule cytotoxique, ou un fragment ou dérivé d'anticorps monoclonal tels que définis précédemment. Une telle composition permet l'élimination directe de cellules mono- ou oligoclonales rencontrées dans certains types de leucémies T. On décrira ci-après en détail l'obtention de récepteurs T solubles dans le cas de RTyS en se référant aux Figures annexées sur lesquelles - la Figure 1 représente des produits d'assemblage des gènes y et 6. Les séquences des amorces 5' et 3' utilisées pour amplifier les ADNc permettant l'obtention des récepteurs Tyâ solubles (ADNc ys et 6s) sont représentées au-dessus et en-dessous des ADNc y et 6 respectivement. Les positions des codons de terminaison sont représentées en caractères gras. Les parties en gris en 3' des ADNc y et 6 correspondent aux régions transmembranaires (TM) hydrophobes. - La Figure 2 représente les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondantes des chaînes 6 et y solubles du clone utilisé pour la construction du récepteur T soluble décrite ci-dessus. - la Figure 3 représente les résultats des essais de détection de RTsy6 par la technique IRMA en milieu conditionné à partir des cellules CHO transfectées par ys/6s. SN représente le surnageant de culture des cellules CHO, transfectées avec un ADNc non pertinent (C) ou avec les ADNc des sous-unités y et 6 solubles selon l'invention (sy6). Les anticorps monoclonaux donnant un signal radioimmunologique significatifs sont représentés en rectangles gras. - la Figure 4 représente la titration en activité de RT soluble exprimée en ,ug/ml, comme attesté par le test IRMA (sandwich 7B6/TiV62), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vy 7B6 (commercialisé par Immunotech), sur laquelle ont été appliquées environ 500 ml de surnageant de culture de cellules y6sF5-CHO. - la Figure 5 représente l'analyse par SDS PAGE de fractions positives pour l'activité de RT soluble, comme attesté par le test IRMA (sandwich 7B6/TiV62), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vy9B6. Deux préparations indépendantes (&num; 1 et &num; 2) ont été analysées en conditions non réductrices (à gauche) et réductrices (à droite). MW : marqueurs de poids moléculaire. 1. Construction et exPression des ozènes ySs des RTs Le clone de lymphocytes humains y6s G 115 (dont les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondant aux chaînes 6 et y solubles sont représentées à la Fig. 2, respectivement en A et B) exprimant des récepteurs T V9JPCly/V2D3JlCS a été utilisé pour la construction des gènes y8s et l'expression de récepteurs T solubles. Ce clone a été utilisé pour plusieurs raisons dont les principales sont - la grande majorité des récepteurs T y8 des leucocytes humains du sang périphérique comprennent des régions V(D)J similaires de sorte que les résultats structuraux et fonctionnels obtenus avec la forme soluble du RT particulier utilisé peuvent être appliqués facile ment au RT exprimés par une large proportion de cellules &gamma;;ô régions Cy, C6, Vy9 et V62 sont facilement disponibles et peuvent être utilisés pour suivre la production et la purification des molécules RT solubles, - à la différence de la plupart des lymphocytes T humains y6 V61- positifs, les chaînes y et 6 des récepteurs T du clone G 115 sont liées de manière covalente par un pont disulfure qui stabilise fortement la molécule après sa sécrétion dans le milieu, - la spécificité antigénique du clone G 115 est assez bien connue. En particulier, ce clone tue les cellules d'un lymphome de Burkitt (dénommé Dadi) et reconnaît également un antigène présent dans des extraits hydrosolubles de Mycobacterium tuberculosis. Le clone G 115, issu de lymphocytes Ty8 dérivant de leucocytes de sang humain périphérique a été maintenu dans un milieu RPMI 1640 contenant 8% de sérum humain, 2 mM de L-glutamine et 150 unités BRMP (Biological Response Modifier Program) d'IL2 et stimulé une semaine sur deux avec 0,5 ,ug/ml de leucoagglutinine (Pharmacia, France), des leucocytes de sang périphérique irradiés et des lymphoblastes B irradiés et transformés par l'EBV. Après deux lavages dans une solution saline de tampon phosphate, 5.106 cellules ont été lysées sur de la glace dans un tampon Tris-HCl (80 mM, pH 7,5) contenant 100 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA et 0,5% en poids de Triton X100. Après centrifugation, le surnageant a été récolté et mélangé avec un volume égal de phénol à 65"C. L'ARN a été extrait par un traitement au phénol/CHCl3, précipité dans 2,5 volumes d'éthanol et solubilisé dans 40pl de Tris 10 mM/EDTA 1 mM). 5 p1 d'ARN total ont été transcrits de manière inverse pendant 1 heure à 370C à l'aide d'une amorce 3' phosphatée contenant des codons de terminaison de traduction en amont de la région transmembranaire hydrophobe des gènes y et 6, après les codons de la Lys247 et de G1n274, comme représenté à la Fig. 1, à une concentration de 50 pM, des quatre dNTP à une concentration 1 mM chacun et 200 unités de transcriptase réverse du virus de la tumeur mammaire de souris (MMTV) (Boehringer Mannheim, Allemagne), dans un volume final de 25 pl. 75 pl d'un mélange pour PCR (comprenant Tris-HCl 13 mM (pH 8,2), KCl 66 mM, MgCl2 2 mM, 2 U de Taq polymérase (Boehringer) et 50 pM d'amorce 5' phosphatée représentée à la Figure 1 ont été ajoutés au matériau obtenu par transcription réverse et 30 cycles d'amplification (94"C - 1 min, 45"C - 1 min, 72"C - 1 min) ont été effectués. L'ADN amplifié a été purifié après électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion et cloné dans un plasmide Bluescript SK+ (Stratagène, La Jolla, Californie) digéré par Sma I. Le séquençage a été réalisé en utilisant un système de matrice à double brin selon le protocole fourni par le fournisseur du kit USB Sequenase. Les fragments ont été clonés dans un vecteur d'expression pKCR6 (Matrisian et al., Proc.Natl.Acad, Sci. USA. 83 : 9413) digéré par EcoRI. L'ADN plasmidique a alors été introduit dans des cellules d'ovaire de hamster DUKX-B11 DHFR (dihydrofolate réductase)-négatives, cultivées sur un milieu RPMI 1640, additionné de sérum de veau foetal à 8%, de 2 mM de L-glutamine, de thymidine, d'adénosine et de déoxyadénosine à 10 pg/ml chacun, par la technique de précipitation au phosphate de calcium (Wigler et al., 1979 Cell. 16 : 777). Les cellules DHFR- positives ont été sélectionnées par culture des cellules transfectées pendant trois semaines en milieu RPMI, additionné de sérum foetal de veau et de L-glutamine (2 mM) sans nucléosides. Les transfectants stables ont alors été clonés par la technique de dilution limitante. 2. Détection et purification des récepteurs Ty8 solubles a) Détection des récepteurs T solubles Les anticorps monoclonaux utilisés pour la détection des RT solubles ont été marqués à 1'125I par la méthode à l'Iodogène (Fraker et al., 1978 Biochem. Biophys.Res.Commun. 80 : 849). Les récepteurs T ont été détectés par un essai immunoradiométrique (IRMA) en sandwich à l'aide de paires d'anticorps monoclonaux spécifiques des chaînes y et 6. Des plaques de microtitration Immulon-l (Dynatech, Marnes, France) ont été revêtues pendant 90 min. à 37"C avec 50 ul d'anticorps monoclonal Y102 (ou 7B6) à 40 ,ug/ml dans une solution saline de tampon phosphate. Après élimination de l'anticorps, les sites non liés ont été saturés avec une solution saline de tampon phosphate contenant 0,5% de sérum albumine bovine pendant 1 heure à température ambiante. Les échantillons à analyser ont alors été ajoutés à raison de 40 ul en même temps que 10 ul d'anticorps monoclonal TiV62 marqué. Après 90 min. d'incubation à 37"C, les puits ont été rincés à quatre reprises avec 100 pl d'une solution saline de tampon phosphate additionné de sérum albumine bovine. La radioactivité liée a été mesurée dans un compteur y à scintillation. L'ensemble d'anticorps suivant a été utilisé pour mesurer la sécrétion de RTyS soluble par la technique IRMA : anticorps anti-Vy9 (Y102, B37, 7B6), anti-Cy (B121) et anti-V62 (TiV62) (Miossec et al., 1989, J.Exp.Med. 171 : 1171). Un anticorps monoclonal spécifique de l'IL2 a également été utilisé à titre de témoin négatif. Avec les différentes combinaisons d'anticorps, on n'a observé aucun signal avec les surnageants de cellules d'ovaires de hamster (CHO) non transfectées, de cellules transfectées avec un ADNc non pertinent ou des cellules transfectées avec soit un ADNc tronqué ys ou un ADNc tronqué 6s (Fig. 3). Mais les hétérodimères y8 solubles ont été détectés de façon nette par IRMA (essai radioimmunologique) dans les surnageants de cellules CHO cotransfectées avec des produits d'assemblage y solubles et 6 solubles (y8sF5-CHO) lorsqu'on utilisait des paires d'anticorps spécifiques de V62/Cy ou V62/Vy9 (Fig. 3), ce qui suggère que les molécules de RT solubles sécrétées par les cellules y6F5-CHO étaient en majorité des hétérodimères. b) Purification des récepteurs T solubles 10 mg d'anticorps monoclonal Y102 ou 7B6 (anti-Vy9) ont été liés de manière covalente à une matrice de billes d'agarose activé (Affigel, Biorad, Richmond, CA.) selon les indications de fournisseur. Les surnageants de culture ont été appliqués sur une colonne d'affinité à raison de 30 ml/h à 4"C. Après lavage avec une solution saline de tampon phosphate, le matériau lié a été élué avec un tampon glycine 0,2 M (pH 2,5). Les fractions éluées ont été neutralisées en une seule fois par Na2HPO4 1M. Les fractions positives pour l'activité de RT soluble comme attesté par le test IRMA ont été rassemblées, dialysées pendant une nuit contre de l'eau distillée et concentrées par évaporation. Le matériau élué de la colonne anti-Vy9 consistait essentiellement en hétérodimères y6, dans la mesure où il était précipité par des anticorps monoclonaux spécifiques de V82. En outre, une analyse par SDS-PAGE en conditions réductrices et non réductrices a montré que ces hétérodimères étaient liés par une liaison covalente. En effet, en conditions non réductrices, une bande principale diffuse ayant un poids moléculaire apparent de 76 kD était observé, qui se résolvait en conditions réductrices en deux composants majeurs de 50 et 44 kD et un composant minoritaire de 39 kD. Des motifs identiques ont été obtenus avec du matériel précipité par étapes avec des anticorps monoclonaux anti-Vy9 et anti V82. Au moyen d'anticorps monoclonaux générés contre ce récepteur soluble (anticorps monoclonaux 360 et 389, cf. ci-après), il a pu être montré par la technique de Western-Blot que la bande de 50 kD correspondait à une chaîne 6 "surglycosylée", que la bande de 44 kD correspondait aux chaînes 8 et y tronquées normalement glycosylées, et que la bande de 39 kD correspondait à une chaîne y "sousglycosylée". 3. Obtention et propriétés des anticorps monoclonaux diriges contre les récepteurs T solubles de l'invention a) Génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre des formes solubles de RT yô après immunisation de souris contre des RT solubles y8 : Des splénocytes de souris immunisées contre des RT solubles produits par la lignée CHO y8sF5 et purifiés par immunoaffinité, ont été fusionnés avec le myélome SP20 et sélectionnés en milieu HAT selon un protocole standard. Les anticorps sécrétés par les hybridomes ainsi obtenus ont alors été testés par RIA pour leur capacité à reconnaître les RT solubles immunisants.Dans un second temps, les anticorps positifs en RIA ont alors été testés par immunofluorescence pour leur capacité à reconnaitre des formes membranaires de RT. Neuf anticorps monoclonaux reconnaissant tout ou partie des lymphocytes T y8 humains ont été obtenus à partir d'une rate de souris immunisée, 2 anticorps anti-Vy9 (292 et 360), 2 anticorps anti-V82 (1 et 389), 1 anticorps pan yô (510) et 4 anticorps dirigés contre des sous-populations y8 (49, 60, 103 et 515). b) Réactivité des anticorps monoclonaux anti RT solubles vis-à-vis de lignées lymphoïdes humaines mono et polyclonales Les réactivités des 9 anticorps monoclonaux (510, 292, 360, 1, 389, 49, 60, 103 et 515) obtenus après immunisation de souris avec des RT solubles purifiés ont été étudiées par immunofluorescence vis-à-vis de lignées lymphocytaires T humaines. Aucun des anticorps testés ne s'est révélé être réactif vis-à-vis de lymphocytes T ap. Par contre, ces anticorps se sont avérés reconnaître des proportions variables de lymphocytes T y6. La spécificité des anticorps a pu être déduite en comparant les résultats obtenus avec le phénotype des lignées testées (établi au moyen d'anticorps monoclonaux de spécificité connue : pan ap (BMA 031, Boehringer-Mannheim, Allemagne), pan y8 (TCR y61, Becton Dickinson, France), anti Vy9 (7B6, Immunotech, France), anti-V62 (TiV62, Miossec et al. J. Exp. Med. 171:1171 (1989)), et anti-V61 (A13, Miossec et al. ibid). Les résultats des anticorps sont reportés au Tableau ci-dessous. Les anticorps selon l'invention peuvent également être utilisés dans les techniques d'immunoprécipitation et de Western-Blot, soit sur des protéines natives, soit sur des protéines dénaturées. CELLULES TESTEES PHENOTYPE (%) REACTIVITE VIS A VIS AC ANTI- RTs (%) - &alpha;ss &gamma;# &gamma;9 #2 #1 510 292 360 1 389 49 60 103 515 Lignées polyclonales A 0 99 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 3 3 99 100 97 4 100 99 99 96 97 6 87 86 86 C 0 1 99 97 97 2 98 98 98 97 99 4 97 98 92 D 1 7 93 39 28 53 92 41 43 25 25 3 53 75 34 E 2 ND ND 58 98 5 98 57 58 85 96 2 95 97 74 F 2 ND ND 99 29 65 99 98 99 19 15 2 13 83 37 Lignées monoclonales G115 + + - + + + + + + + + + 1939 + + - + + + + + - + + + G12 + + - + + + + + - + + + G93 + + - + + + + + - - - T14 - + - + - - + + - + + + F11 + - ND + + + - - - - - M7 - - + + - - - - - - + M8 - - + + - - - - - + + CONCLUSION pan &gamma;# antiV&gamma;9 antiV#2 sous population &gamma;# REVENDICATIONS 1. Procédé de production de récepteurs T solubles, caractérisé en ce que l'on réalise une co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portion transmembranaire du récepteur T. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles VaCa / VPCP par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous-unités a et p du récepteur Tap délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tap. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles VyCy / V6CS par co-transfection dans une cellule- hôte des séquences d'ADN codant pour les sous-unités y et ô du récepteur Ty8 délétées de la portion transmembranaire du récepteur Ty6. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles hétérodimériques VaCy / VpC8, dans lesquels les sousunités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cellule-hôte des sequences d'ADN codant pour les domaines Cy et C8 des sous-unités y et 6 du récepteur Ty8 délétées de leur portion transmembranaire, fusionnées respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Va et VP des sous-unités a et p du récepteur Taos. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles hétérodimériques VaC8 / VpCy, dans lesquels les sousunités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cy et C8 des sous-unités y et 6 du récepteur Ty8 délétées de leur portion transmembranaire, fusionnées respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines VP et Va des sous-unités p et a du récepteur Taos. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles hybrides VyCy / VaC8 par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour la sousunité y du récepteur Ty8 délétée de sa portion transmembranaire avec les séquences d'ADN codant pour le domaine C8 de la sous-unité 6 fusionnées avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Va de la sousunité a du récepteur Taos. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise la délétion de la portion transmembranaire des sousunités constitutives du récepteur T par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la portion transmembranaire de ces sousunités, notamment par mutagénèse dirigée par P.C.R. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise la co-transfection dans des cellules eucaryotes, notamment dans des cellules d'ovaires de hamster. 9. Protéines de fusion formées d'un récepteur T soluble et d'une séquence peptidique, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion de la séquence d'ADN codant pour ladite séquence peptidique à l'une des chaînes ou aux deux chaînes d'ADN codant pour les sousunités d'un récepteur T délétées de leur portion transmembranaire, suivie d'une co-transfection des séquences d'ADN ainsi fusionnées dans une cellule-hôte. 10. Protéines de fusion selon la revendication 9, caractérisées en ce que la séquence peptidique est celle de l'interleukine-2. 11. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un récepteur T soluble obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une protéine de fusion selon la revendication 9. 12. Fragments Fab, Fab', F(ab')2 ou Fc d'anticorps monoclonaux selon la revendication ll. 13. Dérivés d'anticorps monoclonaux comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 11 ou des fragments d'anticorps monoclonaux selon la revendication 12, auxquels sont liés des marqueurs ou des molécules thérapeutiquement actives. 14. Hybridomes produisant des anticorps monoclonaux selon la revendication 11. 15. Composition de diagnostic comprenant un récepteur T soluble obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une protéine de fusion selon la revendication 9 ou 10, ou un anticorps monoclonal selon la revendication 11, ou un fragment d'anticorps monoclonal selon la revendication 12, ou un dérivé d'anticorps monoclonal selon la revendication 13. 16. Procédé de typage de spécificités cellulaires liées au récepteur T dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce que l'on met en présence le prélèvement biologique avec un récepteur T soluble obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, éventuellement couplé à un support, ou une protéine de fusion selon la revendication 9 ou 10, et on met en évidence le complexe éventuellement formé avec le ligand et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion. 17. Procédé de détection de prolifération mono ou oligoclonales des lymphocytes T pathologiques, caractérisé en ce que l'on met en présence un prélèvement biologique contenant lesdits lymphocytes T pathologiques avec des anticorps monoclonaux selon la revendication 11 dirigés contre les portions V et C des chaînes constitu tives des récepteurs T portés par lesdits lymphocytes T pathologiques et on met en évidence la réaction immunologique éventuelle. 18. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 16 ou la revendication 17, en ce qu'il comprend - au moins une composition de diagnostic selon l'invention, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'un complexe entre le ou les ligands éventuellement présents dans un échantillon biologique, - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le complexe formé. 19. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, une protéine de fusion selon la revendication 9 ou la revendication 10, ou un anticorps selon la revendication 11, ou un fragment d'anticorps monoclonal selon la revendication 12, ou un dérivé d'anticorps monoclonal selon la revendication 13. 20. Composition thérapeutique selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble hétérodimérique ou hybride obtenu selon le procédé de l'une des revendications 4 à 6, ou une protéine de fusion selon la revendication 9, dans laquelle le récepteur T soluble est un récepteur T soluble hétérodimérique ou hybride.