Brevet FR2704001A1 — publié le 19941021

SOUCHE DE MICRO-ORGANISME DU GENRE BACILLUS CEREUS ET SON UTIIISATION La présente invention concerne une nouvelle souche de micro-organisme capable de dégrader des composés organiques et/ou inorganiques, notamment des composés organiques volatils, ci-après dénommés C.O.V. La destruction des principaux polluants industriels, composés directement toxiques pour l'tomme et l'environnement (solvants industriels, hydrocarbures, produits aromatiques) ou polluants impliqués dans les phénomènes géophysiques inquiétants, tels que le réchauffement de la terre (dioxyde de carbone, méthane) ou la formation de trou d'ozone dans la stratosphère (carbures halogénés, méthane, dioxyde de carbone, oxydes de soufre et d'azote), ainsi que des composés malodorants (mercaptans, produits soufrés, ammoniaque, scatols, indoles, etc) fait actuellement l'objet de nombreuses recherches. Les principales méthodes de destruction sont fonction des concentrations à traiter, de la nature des composés polluants présents, de leur état physico- chimique (effluents gazeux contenant des composés organiques volatils, effluents liquides, boueux ou solides). En ce qui concerne les effluents gazeux, la concentration et la nature des polluants (monocomposés, composés multiples) favorisent l'une ou l'autre solution. En ordre croissant de concentration, on emploie habituellement: - le traitement biologique - l'adsorption - l'absorption - l'incinération catalytique - l'incinération thermique - la condensation. Ainsi un procédé très utilisé est celui qui consiste à employer de la boue activée qui, en contact avec les effluents gazeux, favorise l'épuration des composés organiques volatils (C.O.V). On notera par exemple que les demandes de brevets EP-A-074 100, EP-A-186 925, et le brevet US 4,723,968 décrivent des procédés de ce type. n est également possible de mettre en contact des effluents gazeux avec des micro-organismes sélectionnés (on peut citer à ce sujet la demande de brevet européen EP-A-100 024 ou bien le brevet US 4,894,162). On a maintenant trouvé, de manière surprenante, qu'une nouvelle souche de micro-organisme sélectionnée permettait de dégrader de manière efficace de nombreux polluants organiques et inorganiques, seuls ou en combinaisons complexes, contenus dans des effluents gazeux, notamment des effluents gazeux industriels. Ainsi, l'objet de la présente invention concerne une nouvelle souche de micro-organisme du genre Bacillus oereus. ci-après dénommée souche SAA 1, ainsi que les mutants de cette souche, obtenus par culture de la souche SAA 1 en présence d'agents mutagènes tels que, par exemple, les sulfonates, la NTG (N méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), etc., ou sous l'action d'un rayonnement énergétique (rayons UV par exemple). L'invention conceme également les hybrides ou clones issus de la souche SAA 1. La souche SAA 1 a été prélevée dans la nature, dans un environnement spécifique, puis sélectionnée pour son aptitude à la destruction des C.O.V. Elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures des Micro-organismes (CNCM) le 22 avril 1992 sous le numéro I- 1205. Cette souche, extrêmement polymorphe, présente successivement sur un même milieu de culture, tel qu'un milieu comprenant du glucose et de l'extrait de levure ou un milieu nutritif standard PCA (Plate Count Agar), les formes bâtonnets (Gram +), les filaments (Gram -), les spores allongées et formées à l'intérieur des bâtonnets ou des filaments, les spores se développant en paquets de 4 à 6 spores par paquets, ou en chaînes de longueur non-limitée. Le développement de ces formes dépend du milieu, de l'âge et des conditions de culture. Du fait du développement asynchrone de ces formes, une même culture peut se révéler Gram + et Gram - simultanément. Les principales propriétés intrinsèques de cette souche SAA I sont les suivantes: * sa résistance face à de fortes concentrations de composés organiques volatils; * son pouvoir de métabolisation; * sa capacité de s'implanter et de se maintenir en environnement complexe aussi bien très faiblement que fortement pollué; * sa survie dans un milieu fortement contaminé par d'autres microorganismes et ce, dans des environnements extrêmes (absence d'aération, interruption de l'alimentation en effluents gazeux pollués). Ses caractéristiques taxonomiques, déterminées par l'institut Pasteur à Paris (FRANGE) et par l'Université de Delft (HOLLANDE), sont indiquées respectivement dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous: Tableau 1: Caractérisation métabolique de la souche SAA i effectuée par l'institut Pasteur N-acetyl-D-glucosamine x cis-Aconitate x trans-Aconitate Adonitol D-Alanine x L-Alanine 4-Aminobutyrate 5-Aminovalerate L-Arabinose D-Arabitol L-Arabitol L-Aspartate Benzoate Betaine Caprane Caprylate D-Cellobiose x Citrate x m-Coumarate Dulcitol i-Erythritol Esculine (noire) x Ethanolamine D-Fructose x L-Fucose Fumarate D-Galactose D-Galacturonate Gentiobiose Gentisate D-Gluconate x D-Glucosamine D-Glucose x D-Glucuronate L- Glutamate x Tableau 1 (suite) Glutarate DL-Glycerate Glycérol x Histamine L-Histidine (rose) x 3-Hydroxybenzoate 4-Hydroxybenzoate x 3-Hydroxybutyrate x HQ-B-glucuronide Myo-Inositol Itaconate x 2-Ketogluconate 5-Ketogluconate 2-Ketoglutarate x DL-Lactate x Lactose Lactulose D-Lyxose D-Malate L-Malate x Malonate Maltitol Maltose x Maltotriose x D-Mannitol D-Mannose x D-Melezitose D-Melibiose 1-O-Methyl-a-galactoside 1-O-Methyl-B-galactoside 3 -O-Methyl-D-glucose 1 -O-Methyl-B-D-glucoside 1-O -Methyl-B-D-gluoeside Mucate Palatinose Tableau 1 (suite) Phenylacetate 3 -Phenylpropionate L-Proline Propionate x Protocatechuate Putrescine Quinate D-Raffinose L-Rhamnose D-Ribose x D-Saccharate L-Serine x D-Sorbitol L-Sorbose Succinate Sucrose D-Tagatose D-Tartrate L-Tartrate meso-Tartrate D-Trehalose x Tricarballylate Trigonelline Triptamine Tryptophane (orange) x D-Turanose L-Tyrosine x Xylitol D-Xylose Symboles: x, croissance en 3-4 jours; -, pas de croissance Tableau 2: Caractérisation métabolique de la souche SAA1 effectuée par l'Université de Delft Nitrate + Tryptophane Glucose (fermentation) Arginine dihydrolase Uréase Esculine + Gélatine + Para-nitro-phenyl (B) D-galactopyranoside Glucose (consommation) + Arabinose + Mannose + Matinitol N-acétyl-glucosamine + Maltose + Gluconate + Caprate Adipate ± Malate + Citrate Phénylacétate Oxydase Catalase + Gram Galactosidase Lysine décarboxylase Ornithine décarboxylase H2S Tryptophane désaminase Indole Acétoine Inositol Sorbitol Rhamnose Saccharose Tableau 2 (suite) Melibiose Amylase Arabinose Symboles: +, forte réponse en 1 à 2 jours; ±, faible réponse en 1 à 2 jours; -, absence de réponse en 1 à 2 jours. Les caractéristiques génomiques de cette souche ont également été déterminées: des profils de restrictions utiles ont été obtenus avec 1'ADN de cette souche clivé avec les endonucléases BamHI, BglI, Bglll, ClaI, EcoRV, Hindi, MINI, PstI, SmaI, Stol, XbaI et hybridé avec la sonde d'ARN ribosomal 16+23S de Escherichia coli. La figure 1 donne la représentation schématique des profils de restriction de gènes codant pour les ARN ribosomaux de la souche SAA 1, obtenus après clivage avec ces onze endonucléases et hybridation avec l'ARNr 16 + 23 S de Escherichia coli. La figure 2 montre les profils (ribotypes) de 1'ADN de la souche SAA 1 obtenus après clivage avec les endonucléases Hindi, ClaI, StyI et hybridation avec 1'ARN 16 + 23 S de Escherichia coli marqué à l'acétylaminofluorène et détecté par une réaction immuno-enzymatique. La figure 3 montre les profils (ribotypes) de l'ADN de la souche SAA 1 obtenus après clivage avec les endonucléases BamKI, EcoRI, MluI, BglI, PstI, Bglil, XbaI, SmaI et hybridation avec 1'ARN 16 + 23 S de Escherichia coli marqué par du phosphore radioactif 32p La souche SAA 1 selon l'invention permet de dégrader des composés organiques et/ou inorganiques, en particulier des composés organiques volatils, tels que:: - les alcools, notamment I'éthanol et le propanol; - les cétones, notamment la méthyléthylcétone et l'acétone; - les éthers, notamment l'éthoxyde de propanol; - les acétates, notamment l'acétate d'éthyle; On peut aussi utiliser la souche SAA 1 pour dégrader les COV qui sont habituellement utilisés comme solvants, tels que par exemple les solvants aromatiques, les solvants azotés ou les solvants halogénés, ainsi que les aldéhydes, les hydrocarbures, et les résidus de raffinage. La souche selon l'invention peut également être utilisée pour le traitement des gaz malodorants, tels que l'hydrogène sulfureux ou les mercaptans. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée: Exemple 1: dégradation des COV présents dans de l'eau. La souche SAA la été cultivée pendant 24 heures sur un milieu de culture contenant du glucose (30 g/l) et de l'extrait de levure (10 g/l). Aux échelles égales ou inférieures à 1 1, la souche SAA I est cultivée en milieu liquide agité, dans des fioles d'Erlenmeyer Tableau 3), et aux échelles supérieures dans des fermenteurs classiques (Tableau 4). Une courbe de croissance typique, représentée sur la Figure 4, sur laquelle on a porté en abscisse le temps de culture et en ordonnées le nombre de cellules, obtenue en fermenteur de 20 1, illustre l'évolution de la culture. Tableau 3 Milieu liquide et conditions de culture en fioles Erlenmeyer Milieu Glucose 30 gfl d'eau Extrait de levure 10 gll d'eau hloculum 10% Température 30 C Agitation : 50 tpm Aération : Bouchon de coton Durée de culture : 18 à 24 heures DO. 650 nm : 3,2à4 Observation microscopique Absence de c ntamination Tableau 4 Milieu liquide et conditions de culture en fermenteur Milieu :Glucose 30 gn d'eau Inoculum : 10% Température 30'C Agitation 400 tours/minute Aération : 0,3 volume(air)/minute/volume(milieu) 5 10 15 20 25 30 Tableau 4 (suite) Durée de culture : 20 à 24 heures D.O 650 nm : 4 à 12 Observation microscopique : Absence de contamination Comptage sur boîte de Petri PCA : 2 106 oellules/ml La souche SAA I a ensuite été mise en présence de 1,10 ou 100 g/l du milieu d'essai ayant la composition suivante: éthanol (El) 4,0 acétate d'éthyle (AE) 3,5 méthyléthylcétone (MEC) 2,0 isopropanol (IP) 0,3 éthoxyde de propanol (EP) 0,2 Total (T)(1,10 et 100g/l) La souche selon l'invention, cultivée dans les conditons indiquées dans le Tableau 3, et mise en présence du milieu d'essai, présente les caractéristiques suivantes: -effloecité* : 38 % - productivité : 10,2 g/I/h spécificité : dégrade ET, AE, IP, MEC et EP - biomasse produite : 2 g/l milieu à pH = 6 * l'effioecité correspond au pourcentage de dégradation (COV totaux) au cours de l'essai. La dégradation des COV par la souche SAA 1, cultivée dans les conditions indiquées dans le Tableau 4, à partir d'une concentration du milieu d'essai de 10 g" et 100 g" est illustrée respectivement par les Figures 5 et 6, qui représentent l'évolution de la concentration des COV du milieu d'essai en fonction du temps. Exemple 2 : dégradation des COV présents dans des effluents gazeux. La souche SAA 1 a été cultivée pendant 24 heures sur un milieu de culture identique à celui décrit dans le Tableau 4. Ensuite, la souche est ensemencée à raison de 10 % volume d'inoculum/volume de milieu d'essai contenu dans un réacteur liquide alimenté par un effluent gazeux (contenant le mélange de COV du milieu d'essai de l'exemple 1) par simple bullage à travers un tamis.Les performances de la souche SAA 1 sont indiquées dans le Tableau 5 ciaprès: Tableau 5 : performances obtenues avec la souche SAA 1 Concentration entrée Concentration sortie Efficacité (mg/m3) (mg/m3) (%) Total 1127 19,5 > 98 AE 1110 11,6 > 98 MEC 6,5 0,35 > 94 IP 0,3 > 96 EP 67,8 7,6 > 88 La faible quantité de biomasse produite (3,9 exprimée en log cel/ml) pour une efficacité supérieure à 98 to met en évidence les propriétés avantageuses de la souche SAA 1 pour dégrader les COV. n est donc possible d'utiliser la souche SAA 1 selon l'invention dans les industries qui produisent ou mettent en oeuvre des composés organiques volatils, par exemple les imprimeries, mais aussi les stations d'épuration d'eau ou encore les décharges collectives et installations d'hydrocarbures (cuves et réservoir, colonnes de distillation, etc.). REVENDICATIONS 1. Micro-organisme du genre Bacillus oereus. déposé à la CNCM sous le numéro I-1205 et ses mutants capables de dégrader les composés organiques et/ou inorganiques. 2. Utilisation du micro-organisme selon la revendication 1 pour dégrader des composés organiques et/ou inorganiques. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés organiques sont des composés organiques volatils. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que les composés organiques volatils sont choisis parmi l'éthanol, l'acétate d'éthyle, la méthyléthylcétone, l'acétone, l'isopropanol ou l'éthoxyde de propanol.