Brevet FR2700009A1 — publié le 19940701

La présente invention concerne un procédé de mise en évidence, dans un échantillon biologique, d'un déficit de la voie de synthèse de l'aldostérone permettant un diagnostic différentiel des masses surrénaliennes bénignes/malignes. Autrefois évènement exceptionnel en clinique, la mise en évidence de masses surrénaliennes est maintenant un évènement fréquent (2-3 % des scanners et échographies abdominales, quel que soit le motif de la prescription) venant corréler la fréquence des masses surrénaliennes retrouvées, de longue date, à l'autopsie de sujets non sélectionnés (7 à 10 %) et plus fréquente encore dans les populations d'hypertendus. Parmi ces masses souvent bénignes, il faut absolument reconnaître précocément le carcinome surrénalien en raison de son caractère souvent asymptomatique (30 à 40 % des cas), de sa difficulté diagnostique, de son très mauvais pronostic et de son traitement curatif uniquement chirurgical. Or, actuellement, il n'existe aucun marqueur de ce cancer, certes rare mais qu7il faut reconnaître. En effet, il n'existe aucun signe fiable ni radiologique ni biologique et les critères de décision ne sont pas clairs, la taille qui doit alerter le clinicien variant selon les auteurs entre 3 et 6 cm. Ces cancers ne se traduisent qu'exceptionnellement par un hyperaldostéronisme (quelques cas seulement rapportés dans le monde) et l'invention, basée sur les résultats d'études cliniques, montre que c'est l'hypoaldostéronisme qu'il faut rechercher. En outre, la production en quantité non négligeable de stéroïdes rares, non habituellement recherchés dans les pathologies tumorales surrénaliennes, vient fausser le taux de l'aldostérone déterminé par les techniques courantes. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour la mise en évidence in vitro d'un échantillon biologique provenant d'un individu présentant un carcinome surrénalien, caractérisé en ce que l'on mesure dans l'échantillon le rapport des concentrations en aldostérone aux concentrations d'au moins un des précurseurs de l'aldostérone. Par précurseurs de l'aldostérone, on entendra les minéralocorticoïdes suivants : la désoxycorticostérone (DOC), la 18hydroxydésoxycorticostérone (18-OH DOC) (voie de dérivation de la DOC), la corticostérone (B) et la 18-hydroxy-corticostérone (18-OH B). En effet la demanderesse a découvert de manière surprenante que l'hypoaldostéronisme, dans le contexte d'une pathologie tumorale, constitue un marqueur précoce de malignité et qu'il est donc fondamental de s'assurer qu'un hyperaldostéronisme n'est pas un faux positif dû à l'accumulation de stéroïdes non habituellement recherchés par les techniques courantes. L'hyperaldostéronisme, dans le contexte d'une pathologie tumorale, permet de reconnaître une tumeur bénigne (l'adénome de Conn par exemple). Les carcinomes représentent des cancers chimiorésistants et radiorésistants qui se traduisent très fréquemment par un effondrement de la concentration en aldostérone plasmatique, dû à un dysfonctionnement précoce de sa voie de synthèse, qui peut intervenir à différentes étapes de cette biosynthèse mais qui aboutit toujours, dans les résultats selon l'invention, à un "verrouillage" de la dernière étape aboutissant à un hypoaldostéronisme. I1 est donc essentiel de doser l'aldostérone par une méthode présentant une limite de détection très basse et une excellente spécificité dans l'échantillon. L'échantillon biologique est un prélévement sanguin, serum ou plasma. De préférence dans le procédé selon l'invention, dans une première étape, on sépare l'aldostérone de ses différents précurseurs, puis on dose respectivement chacun de ces composés par la même technique ou par des techniques présentant une spécificité et un seuil de sensibilité identique. L'emploi de cette technique fait de l'aldostérone une molécule informationnelle d'alerte qui confirme le diagnostic lorsqu'elle est mise en relation avec les taux des autres molécules de cette voie métabolique. Ce marqueur se révèle également intéressant dans l'orientation vers l'imagerie des hypertensions artérielles à aldostérone normale (dosée en routine) ou basse, dans le diagnostic des métastases surrénaliennes d'un autre cancer (effondrement de l'ensemble de la voie de l'aldostérone), dans un complément des critères histologiques de malignité qui sont très difficiles, dans la recherche précoce de récidive éventuelle, dans la surveillance des masses non encore opérées en complément de l'imagerie, dans le suivi postopératoire en absence de traitement palliatif par l'Op' DDD (orimétène). Il est essentiel pour la mise en oeuvre du procédé, que chaque stéroïde soit dosé séparément, de manière fine, et en particulier l'aldostérone, pour laquelle les techniques de routine classiques ne permettent pas une mesure spécifique. L'aldostérone est, selon l'un des aspects de l'invention, séparée tout d'abord des autres stéroïdes par une chromatographie de partage sur papier. I1 appartiendra à l'homme du métier d'adapter cette technique ou de la remplacer par toute technique permettant la séparation et la récupération des différents minéralocorticoïdes, comme par exemple la C.L.H.P. Le pourcentage de récupération de chaque stéroïde à l'issue de cette étape doit être évalué avec exactitude et on emploie un traceur de perte lors des étapes de séparation et de récupération; on peut notamment ajouter à l'échantillon les différents stéroïdes à doser, marqués, en quantité connue. Après séparation, chaque minéralocortcoïde en cause est dosé par une méthode spécifique, en particulier par immunodosage. Les méthodes ELISA ou par RIA sont connues de l'homme du métier et bien adaptées à la mise en oeuvre du procédé; il importe alors d'employer des anticorps présentant une bonne spécificité, et un faible pourcentage de réactions croisées avec les autres minéralocorticoïdes. La précision est évaluée à l'aide de contrôles contenant des quantités connues du minéralocorticoide à doser. En effet, il est important de pouvoir prendre en compte des variations portant sur de faibles concentrations, et il faut s'assurer que les variations mesurées ne sont pas provoquées par des fluctuations de la méthode de dosage. Le procédé selon l'invention consiste donc à mesurer dans un prélévement biologique, un abaissement de la concentration en aldostérone par rapport à celui de ses précurseurs. Ce rapport sera généralement inférieur ou égal à 10%, dans les prélévements provenant d'un individu présentant un carcinome surrénalien. La demanderesse a ainsi montré que, dans un échantillon provenant d'un tel individu, le rapport aldostérone/(DOC + 18-DOC) est inférieur ou égal à 10%. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Exemple 1 - Méthode de dosage des hormones Les taux plasmatiques de désoxycorticostérone (DOC), 18hydroxydésoxycorticostérone (18-OH DOC), corticostérone (B), 18-hydroxycorticostérone (18-OH B) et aldostérone (aldo) sont déterminés en duplicate par une méthode RIA à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapins préparés au laboratoire, et qui présentent des pourcentages de réactions croisées très bas. Pour chaque dosage, on utilise un 1 ml de plasma, auquel on ajoute une quantité connue du stéroïde tritié que l'on souhaite doser, comme traceur de perte technique. Les échantillons sont traités par 15 ml de dichlorométhane contenant 0,1 % de triéthylamine pour le dosage des composés 18-hydroxylés. Le stéroïde est séparé par une chromatographie de partage sur papier, à l'aide d'un système adapté aux performances de l'anticorps utilisé pour le dosage d'un stéroïde donné, comme indiqué cidessous: Stéroïde dosé Svstème de chromatographie DOC Méthyl cyclo hexane/méthanol eau :10/8-2 B Benzène heptane/méthanol eau : 7-3/8-2 18-OH B Benzène heptane/méthanol eau : 7-3/8-2 î8OHDOC Benzène heptane/méthanol eau : 7-3/8-2 Aldostérone Benzène heptane/méthanol eau : 7-3/8-2 Le papier chromatographique (Whatman 2) est préalablement lavé dans du méthanol en cours de distillation dans un appareil Soxlett. Les pourcentages de récupération après extraction et chromatographie varient de 40 à 60 % (calculés pour chaque extrait à l'aide d'un traceur de perte) et sont pris en compte pour le calcul des résultats. Après élution, la quantité de stéroïde est déterminée par RIA dans un tampon phosphate 0,25 M/1 à pH 7, contenant de l'azide de sodium (2 g/l) et de la gélatine (1 g/l). La précision de la méthode est évaluée pour chaque série de dosage à l'aide de contrôles composés de quantités variables et connues de stéroïde froid en solution dans du plasma dépourvu de stéroïde.Quant les valeurs des contrôles s'écartent de 20 % ou plus des valeurs attendues, les résultats ne sont pas pris en considération. Les coefficients de variation intra et inter-essais sont respectivement de 5 à 12 % et de 10 à 15 %. La concentration la plus basse en aldostérone pouvant être détectée à partir de 1 ml de plasma est de 0,5 ng/100 ml. Exemple 2 33 patients ont été explorés par ce procédé qui se répartissent ainsi - 10 carcinomes surrénaliens asymptomatiques, - 04 carcinomes surrénaliens symptomatiques, - 01 métastase surrénalienne d'un autre cancer, - 01 cancer surrénalien guéri, - 17 tumeurs bénignes. Parmi les patients asymptomatiques, tous étaient de découverte fortuite sauf un et asymptomatique sur le plan de l'endocrinologie. Par "asymptomatique sur le plan de l'endocrinologie" on entend les patients ne présentant qu'une hypertension artérielle dont l'origine ne pouvait être considérée comme endocrinienne en raison de taux plasmatiques de cortisol, d'aldostérone et de méthanéphrine urinaire normaux. Tous les sujets étaient adultes, n'étaient pas traités et avaient un régime normosodé. Dans différents cas de masses surrénaliennes, l'étude des produits finaux des trois voies de la stéroïdogénèse surrénalienne ne sont pas toujours contributifs à la décision chirurgicale. En effet, même en présence de masses surrénaliennes de petite taille, l'aldostéronémie trouvée basse ou effondrée constituait un signe d'alerte qui se confirme si on la compare avec les autres stéroïdes de la voie des minéralcocorticoldes qui sont normaux ou élevés.Ce résultat s'oppose à ceux trouvés pour les masses bénignes. Les résultats qui caractérisent les carcinomes de petite taille sont analogues dans les carcinomes de grande taille. L'hypoaldostéronémie, prise isolément, des carcinomes surrénaliens, quelle que soit la taille de la masse, pouvait faire penser à tort qu'il s'agissait de masse "non sécrétante". Le tableau suivant montre que la mesure des précurseurs de la voie de l'aldostérone révèle que la masse est sécrétante mais qu'elle présente un dysfonctionnement qui se caractérise par une impossibilité de la voie à aboutir à la synthèse du produit final (l'aldostérone). Des masses jugées non sécrétantes sur la base de l'aldostérone par exemple présentent des anomalies qui corrèlent l'histologie: un hypoaldostéronisme associé à des taux normaux ou élevés de précurseurs se retrouve dans tous les cas de carcinome surrénalien. Ce dysfonctionnent de la voie de l'aldostérone constaté pour des masses importantes se retrouve également pour des masses bien inférieures à la taille recommandée pour la décision chirurgicale (6 cm).La reconnaissance de ce signe dans des masses de petites tailles suggère que l'altération de la voie de l'aldostérone, lors du développement tumoral, est précoce puisqu'elle est retrouvée dans des masses de petite taille et a constitué un signe d'alerte suscitant une imagerie de contrôle qui s'est révélée positive pour le patient 9 par exemple. L'interprétation de ce dysfonctionnement de la voie de l'aldostérone est facilitée par un index de dysfonctionnement mettant en rapport le taux d'aldostérone X 100 sur les taux de DOC et de 18-OH DOC qui se révèle inférieur à 10 dans pratiquement tous les cas de carcinomes. Le suivi postopératoire montre la normalisation du fonctionnement de la voie de l'aldostérone rapportée antérieurement dans les cas de guérison en l'absence de traitement par l'Op' DDD (orimétène). VOIE DE l'ALDOSTÉRONE N IMAGERIE DIAGNOSTIC DOC 18-OHDOC B 18-OH B Aldo Aldo X100 HISTOLOGIQUE DOC+18-OHDOC 1 6cm Scan carcinome 905 781 34624 875 48 2.8 2 2cm Scan adénome 531 104 29130 2124 479 75 3 6cm Scan carcinome 2390 40 3087 48 ind. 0,6 4 sup à 15cm carcinome 2389 16 4940 - ind. 0,6 5 sup à 15cm carcinome 377 ind 6837 - ind. 4 6 2cm Scan adénome 360 575 20891 1170 169 18 7 2,5cm Scan adénome 413 331 11620 302 61 8 8 1cm carcinome 212 77 3737 104 ind. 5 9 3cm carcinome 506 103 3237 317 ind. 2.5 10 3cm adénome 21 37 61280 209 22 34 11 2.5cm T.S stable 2 ans 193 505 13492 712 158 23 12 4cm hématome 215 417 8337 504 269 40 13 4cm carcinome 288 259 9297 2020 39 7 14 3cm adénome 55 56 2994 228 65 58 15 2cm adénome 264 85 1624 264 116 33 16 3cm adénome 76 64 4267 159 65 46 17 4cm - 87 49 1873 68 15 11 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la mise en évidence in vitro d'un échantillon biologique provenant d'un individu présentant un carcinome surrénalien, caractérisé en ce que l'on mesure dans l'échantillon le rapport des concentrations en aldostérone aux concentrations d'au moins un des précurseurs de l'aldostérone. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport est inférieur ou égal à 10%. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caracterisé en ce que l'on mesure le rapport aldostérone/(désoxycorticostérone + 18 hydroxydésoxycorticostérone), qui est inférieur ou égal à 10%. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans une première étape, on sépare l'aldostérone de ses différents précurseurs, puis on dose respectivement chacun de ces composés par la même technique ou par des techniques présentant une spécificité et un seuil de sensibilité identique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'aldostérone est séparée par chromatographie de partage sur papier. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caracterisé en ce qu'après séparation et récupération, chaque composé est dosé par immunodosage, de préférence par une technique RIA.