Brevet FR2697845A1 — publié le 19940513

La présente invention se rapporte à des séquences peptidiques de la partie intracellulaire carboxy-terminale du récepteur du virus d'Epstein-Barr (EBV) et du récepteur C3d (gap140, EBV/C3d R, CD 21 ou CR2) ainsi que les applications de ces séquences et des anticorps dirigés contre des peptides présentant ces séquences. Le récepteur CR2 est une glycoprotéine membranaire de 140 kDa impliquée dans l'activation des lymphocytes B humains (Frade, R. 1986 Mol. Immunol. 23:1249 ; Frade, R. 1990, Transmembrane Signalling in Lymphocytes, Vol. 2). Les travaux des auteurs de la présente invention ont permis de démontrer que le récepteur CR2 porte sur son domaine extracellulaire deux sites de fixation distincts pour EBV et C3d (Barel, M., J. Immunol. 141:1590. En outre, les auteurs ont montré que le récepteur CR2, exprimé dans les cellules du lymphome B humain Raji, interagit de manière spécifique avec une seule protéine intracellulaire identifiée comme l'antioncoprotéine p53, phosphoprotéine codée par un antioncogène (Barel, M. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10054). Cette P53 nVest pas exprimée dans les lymphocytes B normaux. Les auteurs ont ensuite démontré que dans les lymphocytes B normaux, CR2 interagit directement avec p68, une protéine intracellulaire de liaison du calcium appartenant à la famille des annexines VI. P68 est un composant intracellulaire distinct de 1 'anti-oncoprotéine p53 et n'est pas exprimée dans les cellules transformées. De plus, des travaux récents réalisés dans ce même laboratoire, mettent en évidence que l'infection de lymphocytes B humains normaux par l'EBV, induit un certain nombre de réactions qui aboutissent à des mutations de la protéine p53 et a une inhibition totale de l'expression de la protéine p68, (inhibition de 90% en 24 heures et de 100% en 8 jours). L'analyse de la séquence d'aminoacides déduite de la séquence de l'ADNc du récepteur CR2 (Weiss, J.J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.84:9194 ; Fujisaku, A. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:2118) montre que ce récepteur est caractérisé par un domaine extracellulaire de 15 à 16 séquences consensus répétitives de 60 à 70 aminoacides, un domaine hydrophobe transmembranaire de 25 aminoacides et un domaine cytoplasmique C-terminal de 34 aminoacides. Les présents inventeurs ont réalisé des travaux qui ont permis de montrer qu'un peptide synthétique de 34 aminoacides (ci-après désigné par pep34), correspondant à l'extrémité intracellulaire C-terminale du récepteur CR2, possède des propriétés inattendues - il porte deux sites de fixation spécifiques et distincts pour les protéines de régulation p53 et p68 - par immunisation de lapins, il permet la génération de deux populations d'anticorps polyclonaux, différentes d'un lapin immunisé à un autre, présentant soit des spécificités anti-p53, soit des spécificités anti-p68 (anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2), mais en aucun cas une expression conjointe des spécificités anti-pep68 et anti-pep53, qui sont différentes, dans le même lapin. Ils ont également synthétisé un peptide synthétique de 17 aminoacides (ci-après désigné par pepl7) dérivé du peptide pep34, et montré que celui-ci permettait 1' induction d' anticorps reconnaissant spécifi- quement la protéine p53 de 53 kDa obtenue à partir des cellules de la lignée Raji. Ces résultats montrent que le peptide pepl7 représente le domaine du récepteur CR2 qui interagit avec la protéine de régulation p53. La présente invention a ainsi pour objet un peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante Lys His Arg Glu Arg Asn Tyr Tyr Thr Asp Thr Ser Gln Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser (SEQ ID N 1) ainsi qu'une séquence peptidique qui en diffère par addition, délétion ou modification d'un ou plusieurs aminoacides, et qui présente les mêmes propriétés que la séquence ci-dessus. L'invention a également pour objet un peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser (SEQ ID N" 2) ainsi que les séquences peptidiques qui en diffèrent par addition, délétion ou modification d'un ou plusieurs aminoacides, et qui présentent les mêmes propriétés que la séquence ci-dessus. Les peptides de l'invention peuvent être utilisés comme facteurs de régulation de la croissance des cellules lymphocytaires, in vitro et in vivo. L'invention a donc également pour objet une composition thérapeutique comprenant un peptide ayant une séquence de 34 aminoacides ou 17 aminoacides, telle que définie ci-dessus. La composition selon l'invention est, selon un premier aspect, utilisée dans le but de modifier la prolifération des lymphocytes normaux, notamment dans les cas de déficit immunitaire. Selon un deuxième aspect, elle est utilisée pour modifier la croissance des lymphocytes transformés par l'EBV, par exemple dans les cas de leucémies ou lymphomes. Elle est administrée de préférence sous forme injectable, le peptide ou les peptides qu'elle contient à titre d'ingrédient actif étant avantageusement fixés sur un support (billes de polymère par exemple) ou sur des liposomes. Les peptides selon l'invention permettent de générer des anticorps hautement spécifiques de p53 et de ses formes mutées, ou de p68 dans le cas d'un peptide présentant la séquence SEQ ID N" 1 ou une séquence équivalente, ou de p53 et de ses formes mutées dans le cas d'un peptide présentant la séquence SEQ. ID N" 2 ou une séquence équivalente. L'invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux idiotypiques et anti-idiotypiques obtenus par immunisation d'un hôte au moyen du peptide ayant une séquence d'aminoacides telle que définie ci-dessus, des fragments de ces anticorps, notamment fragments Fab, Fab', F(ab' )2, ou Fv ainsi qu'un hybridome produisant des anticorps monoclonaux. De tels anticorps, en particulier des anticorps monoclonaux, pourront être utilisés dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Dans le domaine du diagnostic, les anticorps monoclonaux générés contre les peptides de l'invention peuvent être utilisés pour cibler des marqueurs spécifiques de l'évolution d'une cellule lymphocytaire transformée. Ainsi, des anticorps dirigés contre le peptide de 34 aminoacides ou le peptide de 17 aminoacides selon l'invention peuvent être utilisés comme marqueurs de certaines formes mutées de p53 pour suivre l'évolution de certaines pathologies, telle une leucémie ou un lymphome. Par ailleurs, des anticorps dirigés contre le peptide de 34 aminoacides peuvent etre utilisés avantageusement pour suivre la disparition de p68 dans les cellules transformées par l'EBV ou pour détecter l'ex- pression de p68 chez des patients présentant une pathologie dans laquelle le récepteur CR2 est susceptible de jouer un rôle, par exemple dans le cas de lymphocytes T où il est probable que le récepteur CR2 a des liens avec d'autres infections, par exemple celle avec le VIH. Dans ce cas, les anticorps dirigés spécifiquement contre p68 peuvent être utilisés pour suivre de manière indirecte l'évolution d'un lymphocyte T infecté par le VIH. Dans le cas de maladies auto-immunes dans lesquelles l'EBV joue un rôle, par exemple la polyarthrite rhumatoïde, il a été récemment mis en évidence des auto-anticorps anti-idiotypes anti-p68. Des anticorps dirigés contre pep34 peuvent être utilisés comme marqueurs de l'évolution de la maladie. L'invention a donc également pour objet une composition de diagnostic comprenant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux dirigés contre un peptide selon l'invention. Les anticorps monoclonaux specifiques générés contre les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés pour obtenir des formes tres pures de p53 (au cas où l'on utilise un peptide de séquence SEQ. ID N 1 ou SEQ. ID N 2 ou leurs équivalents) ou de p68 (au cas où l'on utilise un peptide de séquence SEQ. ID N 1 ou ses analogues). L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre un peptide selon l'invention pour la purification de la protéine de régulation p68 ou la protéine de régulation p53. La purification est réalisée par toute technique classique, notamment par chromatographie d'affinité (les anticorps monoclonaux étant fixés sur une colonne de gel). L'invention a en outre pour objet une composition thérapeutique comprenant des anticorps dirigés contre un peptide selon l'invention. De tels anticorps sont susceptibles d'induire la formation d'anticorps anti-idiotypiques mimant les sites de liaison du récepteur CR2 pour p53 ou p68. Les anticorps selon 1' invention sont dirigés contre un domaine spécifique de p53 ou p68 reconnaissant le peptide p34. Suivant le type de pathologie, on administre des anticorps reconnaissant spécifiquement p53 ou des anticorps reconnaissant spécifiquement p68, qui agiront comme modulateurs de populations cellulaires différentes. Ainsi, les compositions thérapeutiques selon l'invention, comprenant des anticorps reconnaissant la protéine p53 sont utiles dans les pathologies où il est important d'inhiber la protéine p53, notamment les pathologies tumorales où existe une expression de p53, notamment les lymphomes tel le lymphome de Burkitt, par l'action sur la protéine de régulation p53. Les compositions thérapeutiques selon l'invention comprenant des anticorps reconnaissant la protéine p68 sont utiles dans les pathologies où il est intéressant de suivre l'expression de p68, par exemple les maladies auto-immunes où est impliqué l'EBV, telle la polyarthrite rhumatoïde. Les compositions thérapeutiques selon l'invention peuvent également être utilisées pour manipuler le réseau idiotypique. On décrira ci-après les propriétés des peptides de l'invention en se référant aux figures annexées, sur lesquelles - la Fig. 1 représentes les résultats de la liaison des protéines p53 et p68 marquées sur le peptide 34 - la Fig. 2 représente les résultats de l'inhibition de la liaison sur le peptide pep34 des protéines p53 et p68 marquées par des protéines p53 et p68 non marquées - la Fig. 3 représente les résultats de la liaison spécifique d'anticorps anti-pep34 sur pep34 - la Fig. 4 représente les résultats de la réactivité des anticorps anti-pep34 vis-à-vis de la forme soluble du récepteur CR2 - la Fig. 5 représente les résultats des spécificités anti-pep34 - la Fig. 6 représente les résultats des réactivités des populations d'anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2 vis-å-vis de CR2, p53 et p68 unifiés ;; - la Fig. 7 représente les résultats de la recherche d'anticorps anti-idiotypiques parmi les anticorps anti-pep34/1 et les anticorps anti-pep34/2 - la Fig. 8 représente les spécificités des anticorps anti-pep 17. I - DESCRIPTION DES TECHNIQUES GENERALES UTILISEES : Cellules humaines Les cellules Raji, une lignée cellulaire de lymphome de Burkitt CR2-positive ont été cultivées sur un milieu RPMI additionné de 10% de sérum foetal de veau, de pénicilline et de streptomycine, à 37"C dans un incubateur à 5% de CO2. Synthèses des peptides Les peptides pep34 et pep 17, dont les séquences ont été décrites précédemment (SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 respectivement), ont été synthétisés par des méthodes classiques de synthèse des peptides par Appligène (Illkirch, France). Leur purification a été étudiée par chromatographie en phase liquide à haute performance sur une colonne C18 nucléosil Su et a été estimée supérieure à 90%. Les séquences d'aminoacides ont été confirmées par dégradation d'Edman. Les peptides pep34 et pep 17 ont été utilisés soit sous forme soluble, soit sous forme liée de façon covalente à des billes Af figel 10 (Biorad). Deux autres peptides synthétiques ont été utilisés comme témoins négatifs dans les essais a) pep 16 (Lyamani F. et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 175:823), un peptide de 16 aminoacides dérivé de la chaîne a du C3 humaine et contenant la séquence Leu Tyr Asn Val Glu Ala, responsable de la liaison de C3d sur le récepteur CR2 ; b) pep 39, un peptide de 39 aminoacides dérivé de l'hormone adrénocorticotropique humaine (Sigma, Saint-Louis, Mo). Préparation des anticorps polyclonaux Les anticorps polyclonaux anti-C3, anti-CR2 et anti-idiotypes-anti-CR2 (Ab2) ont été préparés comme décrit respectivement dans (Frade, R. et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14:542 ; Barel, M. et al., 1991, J. Immunol. 149: in press). Les anticorps polyclonaux anti-pep34 ont été préparés par immunisation de lapins avec 1 mg de pep34 couplé de façon covalente à 50 pl de billes Af figel 10, toutes les deux semaines pendant 2 mois. La première immunisation a été réalisée en présence d'adjuvant de Freund complet. Des fragments F(ab')2 anti-pep34 ont été préparés comme décrit dans Fraude, R. et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14:542. Les anticorps anti-pep 17 ont été préparés de la même manière. Préparation d'extraits membranaires Des cellules humaines (2 x 109) ont été lysées à 4"C par addition de tampon phosphate à pH 7,4 contenant 30 mM de Nacl. Après élimination des noyaux par centrifugation à 300 x g pendant 15 minutes à 4"C, les membranes totales ont été rassemblées par centrifugation à 100 000 x g pendant 30 minutes à 4"C. Les composants membranaires ont été solubilisés pendant 45 minutes à 4"C dans 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4 contenant 1% (vol/vol) de Nonidet p40, 2% de glycérol, et 5 x 10-4 M de PMSF. Les substances insolubles ont été éliminées par centrifugation à 100 000 x g pendant 30 minutes à 4"C. La teneur en protéines des composants solubilisés a été déterminée par le test de Bradford (Bradford, M., 1976, Analyt. Biocheni, 72:248) et elles ont été utilisées à raison de 4 mg/ml. Purification des protéines Le C3 a été purifié comme décrit dans Tack B. et al., 1976, Biochemistry 15:4513. Le récepteur CR2 et la protéine p53 ont été solubilisés à partir de membranes de cellules Raji au moyen de NP-40 à 1%. Le récepteur CR2 a été purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose B sur laquelle étaient couplés C3bi/C3d de façon covalente. La protéine p53 a été purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose 4B sur laquelle étaient fixés des anticorps Ab2 ou des anticorps monoclonaux anti-p53 Pab 1801 (Barel, M. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10054. La protéine p68 a été obtenue à l'état soluble à partir de membranes de lymphocytes B normaux à l'aide d'EGTA 5mM, ajusté à 30 mM de CaCl2, absorbée sur des colonnes de phénothiazine, éluée par des agents chélateurs d'ions calcium puis purifiée sur une colonne de Sépharose 4B, sur laquelle étaient fixés des anticorps Ab2 ou des anticorps polyclonaux anti-p68 MC2 (Barel, M. et al., 1991, J. Immunol. 147:1286). Techniques de radiomarquaqe Le C3, le récepteur CR2 et la protéine p53 purifiée à partir de membranes de cellules Raji, la protéine 68 purifiée à partir de membranes de lymphocytes B, la protéine A ou les cellules Raji (108 cell./ml) ont été marqués avec de l'iode 125 à l'aide d'iodogène immobilisé (Pearce Chemical Co., Rockville, IL), selon les recommandations du fabricant, avec une activité spécifique allant de 2 à 4 x 106 cpm/pg pour chaque composant. Techniques dtimmunoélectrotransfert Les protéines membranaires solubilisées (400 pg) ont été déposées sur un SDS-PAGE (0,1% dodécylsulfate de sodium, 7,5% de gel de polyacrylamide contenant 0,8% de bisacrylamide), puis transférées sur des feuilles de nitrate de cellulose (Schleicher & Schnell, Keene, NH) à l'aide d'un système de transfert Bio-Rad (Richmond, CA). Le transfert, avec les fractions IgG des différents sérums, a été effectuée en présence de NaCl 150 mM, comme décrit précédemment (Barel, M. et al., 1991, J. Immunol. 147:1286 ; Barel, M. et al., 1991, J. Immunol. 147:1286). Immunoprécipitation Les CR2, p68 et p53 marqués à 1'125I ont été incubés pendant 1 heure à 4"C avec 3 mg d'Ig de sérum de lapin non immunisé liées de façon covalente à 250 mg de Sépharose 4B (Barel, M. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10054 ; Barel, M. et al., 1991, J. Immunol. 147:1286). Les effluents ont été incubés pendant 2 heures à 4"C avec 1 mg d'IgG de différents sérums (Abl, Ab2 ou anticorps-anti-pep34) couplés à 100 mg de Sépharose 4B. Les immuno-billes ont alors été lavées intensivement. Les protéines ont été éluées dans un tampon contenant du SDS par chauffage pendant 2 minutes à 100 C et analysées sur SDS-PAGE, et par autoradiographie à l'aide de films Trimax-XD (3M, Paris, France) en présence d'écrans intensifiants. La radioactivité a été mesurée quantitativement par densitométrie laser à l'aide d'un densitomètre UltraScan (LKB) et d'un intégrateur. Les marqueurs de poids moléculaire de référence étaient le facteur H (150 kDa), purifié comme décrit dans Frade, R. et al, 1984, Eur. J. Immunol. 14:542, la phosphorylase B (92 kDa) (Sigma, Saint-Louis, Mo), l'albumine de sérum bovin (66 kDa) (Sigma, Saint Louis, Mo) et la carboxypeptidase B (35 kDa) (Sigma, Saint-Louis, Mo). Liaison de l25I-p68 et de125I sur le peptide pep34 1 ug de pep34 solubilisé dans 100 ul a été immobilisé pendant 16 heures à 4"C sur des plaques de microtitration à 96 puits (Falcon). Après lavage des puits avec du PBS, on a ajouté 150 p1 de BSA à 1% dans du PBS, et on a laissé reposer pendant 90 minutes à 20 C. Les protéines non marquées ont été ajoutées et laissées pendant 90 minutes à 20"C. Ensuite, on a ajouté 125I-p53 ou 125I-p68 dans 100 ul, et laissé pendant 90 minutes à 20 C. Après lavage, les puits ont été découpés et la radioactivité liée sur trois exemplaires a été mesurée dans un compteur gamma (LKB). Liaison des anticorps polyclonaux sur les cellules Raji 2 x 106 cellules Raji ont été incubées pendant 90 minutes à 4"C avec 50 pl de fractions d'IgG dans différents anticorps polyclonaux (dilués à 1/50), dans des plaques de microtitration à 96 puits, sous agitation constante. Les cellules ont été lavées dans du PBS, puis on y a ajouté 2 x 105 cpm de protéine A marquée à 1'125I dans 50 pl, et laissé pendant 90 minutes à 20"C. Après lavage des puits, de la protéine A marquée à 1'125I (2 x 105 cpm) a été ajoutée et laissée pendant 90 minutes à 20"C. Les puits ont été lavés, découpés, et la radioactivité liée a été mesurée dans un compteur gamma (LKB). II - PROPRIETES DE Pep34 ET PEP 17 A/ Propriétés de liaison de pep34 La liaison des 125I-p68 et 125I-p53 hautement purifiées sur le peptide pep34 a été déterminée comme décrit précédemment. Les résultats sont représentés à la Fig. 1. A titre de contrôle (témoin), on a mesuré la liaison de 125I-p53 ou 125I-p68 sur 1 pg de pepl6 ou pep39, dans les mêmes conditions que pour pep34. Chaque point représente la moyenne de 3 déterminations réalisées à partir de 5 essais distincts. 125I-p53 et 125I-p68 se lient à pep34 en une courbe saturable, tandis que 125I-C3bi/C3d, qui réagit avec le domaine externe de CR2, ne s'est pas liée au peptide pep34. Dans les essais témoins, 125I-p53 et 1251 p68 ne se sont pas liées au peptide pepl6, le peptide de 16 aminoacides dérivé de la chaîne a du C3 humain et contenant la séquence Leu Tyr Asn Val Glu Ala responsable de la liaison de C3d sur CR2 ou sur le pep39, un peptide de 39 aminoacides dérivé de l'hormone adrénocorticotropique humaine. La spécificité de la liaison de 125I-p53 et 125I-p68 sur pep34 a été analysée en présence d'un excès large de composants non marqués, comme représenté à la Fig. 2, qui illustre l'inhibition de la fixation de 125I- p53 et 125I-p68 sur pep34 par p53 ou p68 non marquées, respectivement comme décrit précédemment. La liaison non spécifique de 125I-p53 ou 1251-p68 ayant été mesurée sur le peptide pepl6, mentionné précédemment, comprenant la séquence Leu Tyr Asn Val Glu Ala du C3d et été déduite à partir de chaque point. Chaque point sur la figure représente la moyenne de 3 déterminations réalisées à partir de 5 essais distincts. La Fig. 2 montre que la liaison de 1251-p53 et 125I-p68 est inhibée par p53 et p68 non marquées, respectivement. Au contraire, la liaison de 125I-p53 ou 1251-p68 sur pep34 n'est pas inhibée par p68 ou p53, non marquées, respectivement. La BSA et C3bi/C3d, un ligand externe du récepteur CR2, utilisé à titre de témoin, n'ont pas modifié cette liaison. En outre, lorsque 1251-p53 et 125I-p68 sont ajoutées dans le même essai, elles se lient ensemble sur le peptide pep34 suivant une réaction d'addition. Ces résultats montrent que p53 et p68 se lient de manière spécifique sur deux sites de fixation distincts du peptide pep34. B/ Spécificités d'anticorps qénérés par peP34 et pepl7 1) Spécificités générées par pep34 Les propriétés antigéniques de pep34 ont été analysées par immunisation de lapins avec pep34 lié de façon covalente à des billes Af figel par l'intermédiaire de son résidu lysine NH2-terminal, comme décrit précédemment. Quatre lapins ont été immunisés et divisés en deux groupes, en fonction des spécificités des anticorps, les anticorps ayant été désignés par anti-pep34/1 et anti-pep34/2. Les spécificités des anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2 ont été analysées sur des plaques de microtitration recouvertes de pep34, sur des molécules CR2 exprimées à la surface des cellules, sur la molécule gp140 entière obtenue sous forme soluble à partir de cellules Raji, et sur des antigènes cellulaires obtenus sous forme soluble à partir de cellules Raji et de lymphocytes B normaux. L'incubation de pep34 adsorbé sur des plaques de microtitration avec un excès de 50 pg d'IgG de chacun des anticorps anti-pep34 montre que les deux populations d'anticorps anti-pep34 se lient à pep34, comme représenté sur la Fig. 3A. La liaison des anticorps anti-pep34/1 à pep34 est 7 fois supérieure à celle des anticorps anti-pep34/2, cette dernière étant du même ordre de grandeur que pour les anticorps polyclonaux anti-CR2 (Abl) préparés contre la molécule gp140 hautement purifiée. L'essai témoin montre que les anticorps polyclonaux anti-C3 ne se lient pas à pep34. Lorsque les cellules Raji sont incubées avec les fractions IgG de chaque population d'anticorps antipep34, on ne peut mesurer aucune liaison spécifique de ces anticorps, comme c'est la cas pour la liaison spécifique des anticorps polyclonaux anti -CR2 sur la surface des cellules Raji ou de la liaison non spécifique des fractions IgG des anticorps polyclonaux anti-C3, utilisés à titre de témoin négatif (voir Fig. 3B). Cependant, lorsque la surface des cellules Raji est marquée à 1'125I au moyen de la technique à l'iodogène, et lorsque des CR2 marqués sont obtenus sous forme soluble grâce au NP40 à 1%, les anticorps anti pep34/1 et anti-pep34/2 immunoprécipitent 125I-CR2, comme cela apparaît à la Fig. 4. La quantité d'125I-CR2 immunoprécipitée par les anticorps anti-pep34/1 et les anticorps anti-pep34/2 représentent 25% et 15%, respectivement, de la quantité immunoprécipitée par les anticorps polyclonaux antigp140. L'ensemble de ces résultats montre que les anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2 portent des spécificités qui reconnaissent pep34, et également le domaine intracellulaire carboxy-terminal du CR2 solubilisé, tandis qu'ils ne réagissent pas avec le domaine extracellulaire de CR2. Les spécificités portées par chaque population d'anticorps anti-pep34 ont également été analysées par des techniques d'immuno-transfert, comme décrit précédemment, à partir des composants totaux obtenus sous forme soluble, soit à partir de cellules Raji à l'aide de NP40 à 1%, soit à partir de'lymphocytes B normaux à l'aide d'agents chélateurs d'ions calcium. Les résultats sont reportés sur la Fig. 5, qui montre que les anticorps anti-pep34/1 (partie C) et anti-pep34/2 (partie D) détectent à la fois le CR2 soluble obtenu à partir des cellules Raji ou des lymphocytes B et immobilisés sur des feuilles de nitrocellulose, avec un degré moindre que les anticorps polyclonaux anti-gpl40 (partie B). En outre, les anticorps anti-pep34/1 possèdent des spécificités qui reconnaissent la protéine p53 présente parmi les composants solubilisés obtenus à partir des membranes des cellules Raji (partie C1, Fig. 5) et absente dans les composants solubilisés obtenus à partir des membranes des lymphocytes B (partie C2, Fig. 5). Ces spécificités ne réagissent avec aucun autre composant cellulaire présent dans les lymphocytes B normaux en dehors de CR2 (partie C2, Fig. 5). A l'inverse, les anticorps anti-pep34/2 possèdent des spécificités qui reconnaissent la protéine p68 présente parmi les composants solubilisés obtenus à partir de lymphocytes B normaux (partie D2, Fig. 5) et absente dans les composants solubilisés à partir des membranes des cellules Raji (partie D1, Fig. 5). Ces spécificités ne réagissent avec aucun autre composant cellulaire présent dans les cellules Raji en dehors de CR2 (partie D1, Fig. 5). Dans l'essai témoin, les anticorps Ab2 reconnaissaient l'anti-oncoprotéine p53 présente dans les cellules Raji et la protéine de liaison au calcium p68 présente dans les lymphocytes B normaux (Fig. 5, partie A). Les protéines p53 et p68 reconnues par les spécificités présentes chez les anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2, respectivement ont été identifiées comme étant respectivement l'anti-oncoprotéine p53 et la protéine de liaison au calcium p68 interagissant avec CR2. Cela est confirmé par le fait que 125I-p53, obtenue sous forme soluble à partir des membranes des cellules Raji et purifiée sur une colonne de Sépharose Ab2, ou de Sépharose-Pab 1801, un anticorps monoclonal, mentionné précédemment (Fig. 6, piste 1), est immunoprécipité par les anticorps anti-pep34/1 (Fig. 6, piste 3), mais non par les anticorps anti-pep34/2 (Fig. 6, piste 4). A l'inverse, 125I-p68, purifiée sur des colonnes de phénothiazine, éluée par des agents chélateurs dotions calcium et purifiés sur Sépharose-Ab2 ou MC2, un anticorps polyclonal anti-p68 (Fig. 6, piste 2) est immunoprécipité par les anticorps anti-pep34/2 (Fig. 6, piste 6), mais non par les anticorps anti-pep34/1 (Fig. 6, piste 5). Par conséquent, en plus des spécificités réagissant avec le domaine C-terminal de CR2, les anticorps anti-pep34 possèdent également des spécificités qui reconnaissent soit l'anti-oncoprotéine p53, soit la protéine de liaison au calcium p68 interagissant avec CR2. 2) Recherche d'anticorps anti-idiotype (anti Id) parmi les anticorps anti-pep34 La présence d'anticorps anti-idiotype parmi les populations d'anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2 a été recherchée par des essais dtimmunotransfert. La fraction IgG de chaque anticorps antipep34 réagissait avec les fragments F(ab' )2 du même sérum (Fig. 7, pistes 1 et 3), mais non avec les fragments F(ab' )2 de l'autre sérum. Cette réactivité disparaissait totalement lorsque les anticorps anti-pep34/1 ou anti-pep34/2 étaient d'abord absorbés, soit sur des anticorps antipep34/1 ou des anticorps anti-pep34/2 fixés sur des particules, respectivement, ou après absorption sur pep34 fixé sur des particules (Fig. 7, pistes 2 et 4). Dans un deuxième temps, les spécificités anti-CR2 ou anti-p53 présentes sur les anticorps antipep34/1 et anti-CR2 ou anti-p68 présentes sur les anticorps anti-pep34/2 ont été analysées sur des protéines purifiées. Des protéines gp140, p53 et p68 marquées à 1'125I hautement purifiées ont été incubées dans des conditions ne permettant pas d'interaction de CR2 avec soit p53, soit p68, c'est-à-dire en présence de NaCl 150 mM et absence de Ca2+, respectivement. Dans ces conditions, l'incubation simultanée de ces trois antigènes purifiés, suivie par immuno-précipitation, a montré que seuls CR2 et p53 étaient isolés avec des anticorps anti-pep34/1 (Fig. 6, piste 7), tandis que seuls CR2 et p53 étaient isolés avec des anticorps anti-pep34/2 (Fig.6, piste 8). A titre de témoin, des anticorps polyclonaux anti-CR2 n'ont immuno-précipité que la glycoprotéine gpl40 (Fig. 6, piste 9). En outre, afin de distinguer entre les spécificités anti-CR2 et anti-p53 d'une part, et anti-CR2 et anti-p68 d'autre part dans les sérums anti-pep34/1 et anti-pep34/2 respectivement, on a pré-incubé des anticorps anti-pep34 avec des molécules de CR2 hautement purifiées et non marquées, de manière à saturer toutes les spécificités anti-CR2. Dans ces conditions, les anticorps anti-pep34/1 et anti-pep34/2 n'ont pas immunoprécipité 125I-CR2, tandis que l'immuno-précipitation de 125I-p53 (piste 10) ou 125I-p68 (piste 11) n'a pas été modifiée. En outre, les spécificités anti-p53 ou antip68 présentes chez les anticorps anti-pep34/1 et antipep34/2, respectivement, et isolées par chromatographie d'affinité sur des antigènes p53 ou p68 fixés sur des particules, n'ont pas immuno-précipité 1251-CR2. De plus, les anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-CR2 n'ont pas réagi avec p53 ou p68 purifiés, tout comme les anticorps polyclonaux n'ont pas réagi avec CR2 ou avec le pep34, son domaine C-terminal intracytoplasmique. La comparaison sur bases de données (NBRF et GENBANK, CITI.2, Paris VI) des séquences d'aminoacides du domaine intracytoplasmique de CR2 avec p53 ou p68 a montré l'absence d'homologies de séquences entre ces trois protéines. Par conséquent, la présence de spécificités anti-p53 ou anti-p68 chez les anticorps anti-pep34 n'est pas due à d'éventuels déterminants antigéniques possédant des similitudes de structure ou de conformation, entre CR2 et p53 ou p68, mais est due à une induction in vivo par le peptide pep34 lié à des particules d'anticorps anti-CR2 et d'anticorps anti-Id anti-CR2, mimant les sites de liaison de p53, p68 sur CR2. C) Spécificités d'anticorps générés par le peptide pepl7 Les propriétés antigéniques du peptide pepî7 ont été analysées par immunisation de lapins avec le peptide pepl7 fixé de façon covalente sur des billes Af figel par l'intermédiaire de leur résidu de histidine N-terminal, comme décrit précédemment. Les spécificités portées par les anticorps anti-pepl7 ainsi obtenus ont été analysées à l'aide de techniques d' immuno-transfert, comme décrit précédemment, sur des composants totaux obtenus sous forme soluble, soit à partir de cellules Raji avec NP40 à 1%, ou de lymphocytes B normaux avec des agents chélateurs des ions calcium. Les résultats sont représentés à la Fig. 8, qui montre que les anticorps anti-pepl7 (pistes 1 et 2) reconnaissent un composant de 53 kDa obtenu sous forme soluble à partir de cellules Raji et non obtenu à partir de lymphocytes B normaux. Des essais complémentaires ont démontré que le composant cellulaire p53 reconnu par les anticorps anti-pepl7 était l'anti-oncoprotéine p53. LISTE DES SEQUENCES I - INFORMATION GENERALE (1) DEMANDEUR : INSERM (2) TITRE DE L'INVENTION Séquences peptidiques du récepteur EBV/C3d, applications diagnostiques et thérapeutiques. (3) NOMBRE DE SEQUENCES : 2 Il - INFORMATION POUR SEQ ID N 1 CARACTERISATION DES SEQUENCES TYPE : peptide LONGUEUR : 34 aminoacides CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE ORIGINE ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : cellules lymphocytaires CARACTERISTIQUE Lys His Arg Glu Arg Asn Tyr Tyr Thr Asp Thr Ser Gln Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser III - INFORMATION POUR SEQ ID N 2 CARACTERISATION DES SEQUENCES TYPE : peptide LONGUEUR : 17 aminoacides ORIGINE ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : cellules lymphocytaires CARACTERISTIQUE His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser REVENDICATIONS 1. Peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante Lys His Arg Glu Arg Asn Tyr Tyr Thr Asp Thr Ser Gln Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser ou une séquence peptidique qui en diffère par addition, délétion ou modification d'un ou plusieurs aminoacides, et qui présente les mêmes propriétés que la séquence cidessus. 2. Peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser ou une séquence peptidique qui en diffère par addition, délétion ou modification d'un ou plusieurs aminoacides, et qui présentent les mêmes propriétés que la séquence ci-dessus. 3. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux idiotypiques et anti-idiotypiques obtenus par immunisation d'un hôte au moyen du peptide ayant une séquence d'aminoacides selon la revendication 1, fragments de ces anticorps, notamment fragments Fab, Fab', F(ab' )2, ou Fv. 4. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus par immunisation d'un hôte au moyen du peptide ayant une séquence d'aminoacides selon la revendication 2, fragments de ces anticorps notamment fragments Fab, Fab', F(ab')2 ou Fv. 5. Hybridome produisant des anticorps monoclonaux selon la revendication 3 ou la revendication 4. 6. Composition thérapeutique comprenant à titre d'ingrédient actif un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2. 7. Composition thérapeutique selon la revendication 6 pour la modification de la croissance de populations de lymphocytes normaux. 8. Composition thérapeutique selon la revendication 6 pour la modification de la croissance de populations de lymphocytes transformés par l'EBV. 9. Utilisation d'anticorps selon la revendication 3 pour la purification de la protéine p68 ou de la protéine p53. 10. Utilisation d'anticorps selon la revendication 4 pour la purification de la protéine p53. 11. Composition de diagnostic comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 3 ou la revendication 4. 12. Composition thérapeutique comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 3 ou la revendication 4. 13. Composition thérapeutique comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 3 ou la revendication 4 pour la manipulation du réseau idiotypique.