Brevet FR2707168A1 — publié le 19950113

Vaccin contre la dvsenterie hémorragique du porc et ensemble de vaccination v relatif La présente invention a trait à un vaccin contre la dysenterie hémorragique du porc et à un ensemble de vaccination mettant en oeuvre ce vaccin ainsi qu'à un procédé de traitement des porcs contre cette maladie. L'organisme responsable du syndrome de dysenterie hémorragique est Serpulina hyodysenteriae (anciennement Treponema hyodysenteriae). 9 sérotypes sont aujourd'hui reconnus, identifiés essentiellement aux U.S.A., mais également au Mexique, en Angleterre, au Danemark, en Hollande, en Australie (Classification de Mapother et Joens, J. Clin. Microbiol, 1985, 22, 161-164) et, dernièrement au Canada pour les sérotypes 8 et 9 (Z. Li, J. Clin. Microbiol, 1991,29,2794-2797; 1992, 30 (11), 2941-2947). De nombreux essais de vaccination ont été menés jusqu'à présent. Si la faisabilité d'un vaccin a pu être démontrée à travers divers modèles d'essais, peu de produits ont été exploités sur le terrain par manque d'efficacité et pour des problèmes d'innocuité. Les options vaccinales qui ont fait l'objet des recherches antérieures, ou qui font l'objet de recherches actuelles, couvrent l'ensemble des possibilités en matière de vaccin, à savoir: - vaccins à bactéries totales, inactivées ou vivantes atténuées, dits vaccins classiques, - vaccins à sous-unités bactériennes, classiques ou de recombinaison. Le brevet US-A-4 100 272 a ainsi proposé un vaccin à cellules tuées pour administration parentérale, qui devrait conduire à des immunisations partielles ou totales par voie systémique. Le brevet US-A-4 152 413 a proposé un vaccin oral comprenant des capsules entériques contenant des cellules tuées pour la libération du principe actif dans les intestins ; même approche dans les brevets US-A-4 152 414 et US-A-4 203 968 où S. hyodysenteriae est associé à des cellules tuées de Bacteroides vulgates ou de Furobacterium necrophorium. Le brevet US-A-4 152 415 propose une administration parentérale d'un vaccin à cellules tuées suivie par l'administration orale d'un vaccin en capsules entériques. Le brevet US-A-4 203 968 propose une préparation parentérale contenant des cellules tuées de S. hyodysenteriae et des cellules tuées de Bacteroides vulgatus et propose aussi de la combiner avec une formulation orale. Les brevets US-A-4 469 672 et US-A-4 748 019 proposent de vacciner en administrant des cellules tuées par voie parentérale, puis par voie orale. La demande de brevet EP-A-201 796 décrit un procédé de culture de S. hyodysenteriae dans un milieu nutritif contenant une fraction bovine riche en cholestérol en vue de produire un vaccin inactivé formulé sous forme d'émulsion avec un adjuvant formé d'acide polyacrylique et de polysaccharide sous forme réticulée. Selon ce document, une résistance serait obtenue après deux injections intramusculaires, alors que les vaccins connus demandent plusieurs injections intraveineuses. Enfin, la demande de brevet européen EP-A339 040 propose d'administrer par voie parentérale des cellules vivantes et des cellules tuées en présence d'oxygène. Aucune de ces approches n'a permis la réalisation d'un vaccin efficace. On connaît également la souche de Taylor (1972), atténuée par 80 passages sur gélose au sang de cheval, dont l'efficacité fut explorée par vaccination orale à des doses répétées de l'ordre de 5.109 UFC à 9 semaines d'âge (Hudson, Br. Vet. J. 1974, 130, 37-40 et Res. Vet. Sci. 1976, 21,366-367). Ce vaccin n'a montré qu'une efficacité limitée. A également été utilisée la souche VS 1 dite spontanément atténuée, de Lysons du British Technology Group (souche NCTC 11628), cela à des doses réitérées de 108 UFC, en association à 2 injections d'une formulation inactivée, adjuvée en huile (souche P18A, NCTC 11615, dose de 5.109 UFC). Une solution préconisée actuellement pour réaliser un vaccin vivant atténué est de déléter la bactérie de ses facteurs de virulence, ne laissant au chromosome que ses fonctions de survie de la bactérie (M.B. Koopman, Infect. Immun. 1992, 60, 2920-2925). L'échec de l'approche vaccin classique a été récemment confirmée par J.P. TRONEL (Thèse de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon: "Contribution à la recherche et au développement d'un vaccin contre la dysenterie hémorragique du porc", rendue publique le 17 février 1993). Les vaccins inactivés testés ont présenté les inconvénients des vaccins à bactéries totales inactivées, à savoir notamment faible pouvoir immunogène et lésions inflammatoires au point d'injection. L'auteur conclut que ce type de vaccin n'est pas apte à entraîner une réponse immunitaire suffisamment protectrice, comme cela est le cas aussi de la seule formulation commercialement disponible (vaccin à bactéries totales inactivé et adjuvé) testée en parallèle sur le terrain. Devant l'échec des approches par vaccins dits classiques, les différentes équipes se sont tournées vers les vaccins de sous-unités et l'approche recombinante. On peut citer par exemple les demandes de brevet internationales W090/2565, WO90/15132, européennes EP-A-350 715, EP-A-282 965, EP-A491 859, EP-A-502 100 et le brevet US-A-5 176 910. Cela correspond aussi aux conclusions de J.P. Tronel (supra) qui propose en outre "la combinaison d'une administration systémique des antigènes bactériens protecteurs associée à la mise en contact préalable des muqueuses digestives avec les mêmes antigènes", condition essentielle dans ce contexte. La demanderesse a maintenant découvert de façon très surprenante qu'il était possible de vacciner efficacement les porcs contre la dysenterie hémorragique en utilisant un vaccin de type classique dans des conditions particulières et cela sans problème d'innocuité. L'invention a donc pour objet un vaccin contre la dysenterie hémorragique du porc, comprenant une quantité efficace d'antigène Serpulina hyodysenteriae (souche virulente ou atténuée) inactivé et adjuvé, pour une administration intradermique. On peut aussi avoir recours à des antigènes fractionnés ou à un mélange d'antigènes fractionnés et d'antigènes non fractionnés. De préférence, le volume de dose est faible, notamment compris entre 0,1 et 0,3 mI environ et notamment de l'ordre de 0,2 ml. L'adjuvant peut être avantageusement un adjuvant de type huileux, notamment comprenant un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensio-actifs non ioniques, et le vaccin notamment formulé sous forme d'émulsion eau dans l'huile. On peut également utiliser un adjuvant de type aqueux tel que le gel d'alumine. De préférence, le vaccin selon l'invention comprend un antigène du sérotype 1, référencé 27 164 à l'American Type Culture Collection. Dans le cas où une vaccination contre divers sérotypes serait utile, le vaccin selon l'invention peut comprendre un mélange d'antigènes des différents sérotypes connus rencontrés dans la zone géographique à laquelle le vaccin est destiné. Une protection croisée entre différents sérotypes permet de recourir à un antigène unique ou à un mélange approprié d'antigènes. De préférence, le vaccin comprend de 107 à 109 équivalents UFC environ d'un antigène ou mélange d'antigènes approprié par dose, notamment environ 108 équivalents UFC. L'invention a également pour objet un ensemble de vaccination comprenant un moyen d'administration agencé pour l'administration intradermique de doses individuelles de vaccin et associé à une source d'alimentation contenant un vaccin tel que décrit ci-dessus. De préférence, le moyen d'administration est un appareil d'administration par jet sous pression, celui-ci pouvant produire un jet unique ou simultanément plusieurs jets sous pression. Un appareil approprié est par exemple l'appareil d'administration par jet sous pression décrit dans la demande de brevet européen EP-A-420 744. On peut bien entendu utiliser tout autre moyen approprié, tel que la seringue. L'invention a encore pour objet un procédé de traitement des porcs contre la dysenterie hémorragique dans lequel on administre, dans les conditions décrites ci-dessus, le vaccin selon l'invention aux porcs adultes peu avant la période dite "fin d'engraissement". Cette approche assure une bonne protection contre le syndrome de dysenterie hémorragique en termes de perte de poids et de retard à la mise sur le marché des animaux dans cette période où les traitements antibiotiques de couverture, qui ont dû être arrêtés, ne peuvent plus couvrir l'infection par ce germe. L'invention couvre également une approche vaccinale plus classique dans laquelle les animaux sont vaccinés dans les conditions de l'invention, par exemple à 6 semaines environ, puis rappel à 9 semaines environ. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'un mode de préparation d'un vaccin conforme à l'invention et d'un essai de vaccination, qui sont donnés uniquement à titre d'exemple. 1"/ METHODE DE PREPARATION DE L'ANTIGENE - L'antigène vaccinal est préparé à partir de la souche "Treponema hyodysenteriae, n" 27164, ATCC" cultivé en milieu trypticase soja (TS) enrichi de sérum de porc, dans des conditions d'anaérobiose stricte. A l'optimum de croissance, la culture est arrêtée, puis inactivée par ajout d'une solution de merthiolate (à 1%ov/v final). - La culture inactivée est ensuite lavée et concentrée par centrifugation. L'antigène vaccinal est ainsi une suspension de corps bactérien et de fractions de ceux-ci (paroie bactérienne, membrane, hémolysine, toxine), inactivée, lavée en PBS, concentrée et conservée à 40C. Le calcul du titre de la culture avant traitement nous permet de connaître la concentration finale équivalente en germes (UFC) de l'antigène préparé. - Le vaccin est formulé avec une dilution de l'antigène vaccinal, permettant de délivrer l'équivalent de 109 UFC par dose, émulsionnée avec un adjuvant huileux (huile phase externe), le volume final d'antigène représentant le 1/4 du volume de la dose injectée. 2 ) ESSAI DE VACCINATION - Le vaccin conforme à l'invention est administré par voie intradermique (ID) à des porcelets EOPS, sevrés, à quatre semaines et six semaines d'âge (injection de rappel la veille de l'épreuve). Un groupe de porcs est vacciné avec un vaccin du commerce (vaccin à bactéries totales inactivé et adjuvé) par voie intramusculaire (IM) (voie d'administration indiquée, volume de dose = 5 ml) dans les mêmes conditions calendaires. Les porcs destinés aux groupes témoins ne reçoivent rien. Un autre groupe de porcs est vacciné par voie intramusculaire (IM) avec le vaccin conforme à l'invention. - Les porcs sont éprouvés (sauf un groupe de 5 porcs témoins des conditions d'entretien) par voie intragastrique, deux jours consécutifs, avec des inoculums titrant 109 UFC, deux semaines après la première injection vaccinale; les porcs ont alors six semaines d'âge. - Le suivi clinique des porcs après épreuve est réalisé sur la base du relevé quotidient de scores cliniques individuels, et de pesées espacées de 7 jours (4 pesées après épreuve). Les résultats expérimentaux sont les suivants: Croissance des porcs Groupes J(vacc.) J(Epr.) J7 J14 J21 J28 Témoins 7,5* 11,6 12,6 13,2 14,7 18,9 éprouvés 7,3 11,1 12,1 12,4 11,4 12,8 Vaccin du commerce 7,1 10,6 10,9 12,1 10,8 13,2 Vaccin de l'invention IM 7,3 10,8 11,2 13,2 15,1 18,0 Vaccin de l'invention ID 7,6 11,0 11,6 13,3 13,9 17,0 * = poids moyen du groupe de porcs, effectif de 5, moyenne en kg. (la différence de poids observée entre témoins et vaccinés IM et ID selon l'invention n'est pas significative) Scores cliniques cumulés movens Groupes JO-J7 J8-J14 J15 - J21 J22-J28 Témoins 3 3 3 3 T.Eprouvés 3,36 5,96 7,64 8,68 Vaccin du commerce 3,84 6,64 9,60 9,00 Vaccin de l'invention IM 3,68 5,64 5,96 6,76 Vaccin de l'invention ID 3,08 3,88 4,44 4,76 Le seuil du score clinique du syndrome de dysenterie hémorragique = 5 - Les scores indiqués sont des scores moyens quotidients cumulés sur la période considérée, sur la base des notations suivantes: - Consistance des selles Normale, solide = 1 Molle =2 Très molle, déliée = 3 Diarrhéique, aqueuse =4 - Composition des selles Normale = 1 Trâces de mucus =2 Trâces de sang =3 Hémorragique =4 - Etat général de l'animal Normal = 1 Abattement =2 Amaigrissement marqué = 3 Moribond =4 - Chaque critère est noté quotidiennement, le score individuel étant la somme de trois notes. Une moyenne de ces notes est calculée à partir de l'ensemble des mesures effectuées (35 mesures, 5 porcs sur 7 jours) pour le groupe considéré, sur la période d'observation (ici 7 jours) que l'on appelle "score cumulé moyen". Réponses sérologiques/cinétique Groupes J(vacc.) J(Epr.) J7 J28 Témoins 0,273* 0,420 0,617 0,717 0,070** 0,099 0,081 0,077 éprouvés 0,293 0,448 0,821 1,321 0,067 0,099 0,252 0,237 Vaccin de l'invention ID 0,284 1,508 1,753 1,772 0,064 0,072 0,045 0,059 * = moyenne des DO lues pour le groupe considéré ** = écart standart sur la moyenne (pas de données pour le vaccin du commerce et le vaccin de l'invention administré par voie IM) Ces résultats démontrent l'effet protecteur de l'approche vaccinale selon l'invention dans le modèle expérimental: - Les porcs vaccinés par voie ID et IM avec l'antigène selon l'invention conservent une croissance normale, par rapport au groupe témoins, alors que les animaux vaccinés avec le vaccin du commerce ont un comportement identique à celui des animaux du groupe de témoins éprouvés. - Les scores cliniques montrent que le groupe vacciné par voie ID avec l'antigène conforme à l'invention n'exprime pas de syndrome de dysenterie hémorragique ( score - Les réponses sérologiques montrent une très bonne séroconversion dès 14 jours après l'injection primaire avec le vaccin ID conforme à l'invention. - La vaccination des porcs par la voie intramusculaire se révèle poser des problèmes d'innocuité au point d'injection. Rien de tel n'est observé chez les porcs vaccinés par voie intradermique En conclusion, le vaccin selon l'invention administré par voie intradermique permet d'obtenir une protection contre la maladie et un maintien de la croissance, sans induire de problèmes d'innocuité. REVENDICATIONS 1. Vaccin contre la dysenterie hémorragique du porc, comprenant une quantité efficace d'antigène Serpulina hyodysenteriae inactivé et adjuvé, qui est administré par voie intradermique. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est formulé sous un volume de dose compris entre 0,1 et 0,3 ml environ, notamment de l'ordre de 0,2 ml. 3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'adjuvant est un adjuvant huileux. 4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est sous forme d'émulsion eau dans l'huile. 5. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'adjuvant huileux comprend un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensio-actifs non ioniques. 6. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'adjuvant est du gel d'alumine. 7. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène de sérotype 1 référencé 27 164 à l'American Type Culture Collection. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'antigènes des différents sérotypes connus rencontrés dans la zone géographique à laquelle le vaccin est destiné. 9. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend de 107 à 109 équivalents UFC d'antigène par dose, notamment environ 108 équivalents UFC. 10. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend des antigènes fractionnés ou un mélange d'antigènes fractionnés et non fractionnés. 11. Ensemble de vaccination comprenant un moyen d'administration agencé pour l'administration intradermique de doses individuelles de vaccin et associé à une source d'alimentation contenant un vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Ensemble de vaccination selon la revendication Il, caractérisé en ce que le moyen d'administration est un appareil d'administration par jet sous pression. 13. Ensemble de vaccination selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'appareil est agencé pour produire simultanément plusieurs jets sous pression