Brevet FR2706618A1 — publié le 19941223

La présente invention a pour objet un dispositif pour le dosage d'haptènes ou d'anticorps anti-haptène, et son utilisation. Les haptènes sont de petites molécules non immunogènes, c'est à dire incapables par elles mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par formation d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptèneprotéine. Diverses techniques ont été proposées pour le dosage d'haptènes dans un échantillon, parmi lesquelles les techniques dites de compétition. Par exemple, des auteurs ont décrit une technique de compétition en phase antigène, dans laquelle un haptène identique à l'haptène à doser, fixé sur une phase solide, entre en compétition avec l'haptène de l'échantillon pour sa liaison avec un anticorps spécifique marqué introduit en quantité définie. Cette technique a été décrite par exemple pour le dosage de la thyroxine, du cortisol et de la testostérone (voir notamment les demandes de brevet EP 089806 et WO 83/03306). Toutefois, en raison de leur petite taille, il est impossible dtadsorber directement les haptènes sur une phase solide constituée d'un matériau polymère tout en conservant la disponibilité vis-à-vis du site de liaison d'un anticorps spécifique. Ainsi dans les techniques conventionnelles (voir notamment Clinica Chemica Acta, 162 (1987) 199- 206 Elsevier) l'haptène est greffé sur un ligand protéique ou polypeptidique en vue de son immobilisation sur une phase solide. Cette technique présente cependant un inconvénient important inhérent à la non- immunogénicité des haptènes. En effet, la production d'anticorps anti- haptènes nécessite l'immunisation d'un animal contre des haptènes couplés à des protéines ou des polypeptides, de 2 0 façon à les rendre immunogènes, et les anticorps anti-haptènes produits en réponse peuvent interférer par réactions croisées avec des protéines ou polypeptides auxquels est couplé l'haptène pour sa fixation sur une phase solide. Par ailleurs, l'accès de l'anticorps à l'haptène fixé sur le support peut être gêné par des phénomènes de réorganisation intramoléculaire des protéines ou des polypeptides dans certaines conditions physico-chimiques, ce qui peut introduire des erreurs significatives dans la précision d'un test. Aussi, la présente invention a pour objet un support approprié pour le dosage des haptènes pour pallier les inconvénients sus-mentionnés et qui permet en outre de contrôler le nombre d'haptènes immobilisés sur la phase solide et donc de réaliser un véritable dosage quantitatif. En outre, l'invention fournit un support permettant une meilleure orientation des 3 0 haptènes immobilisés et donc une accessibilité accrue de ceux-ci pour leur liaison avec des anticorps lors des dosages. On a en effet, découvert que de façon surprenante, il est possible de remédier aux inconvénients précités en utilisant comme intermédiaire de fixation un fragment d'acide nucléique. L'invention a donc pour objet un dispositif pour le dosage d'un haptène, comprenant un support solide et un réactif lié de façon covalente à un ligand pour former un conjugué permettant d'immobiliser ledit réactif sur ledit support solide, ledit réactif étant reconnu par des 2 2706618 anticorps capables de reconnaître ledit haptène, caractérisé par le fait que ledit ligand est un fragment d'acide nucléique. On comprend que le réactif peut être soit l'haptène à doser soit un composé ayant une analogie immunologique suffisante avec ledit haptène pour que des anticorps reconnaissant l'un reconnaissent également l'autre. Le terme haptène désigne la molécule à doser ou un analogue capable de réagir avec un anticorps spécifique de la molécule à doser. Par exemple, les haptènes peuvent être des peptides, des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines, ou divers médicaments. L'haptène peut être choisi par exemple parmi: - un peptide glycosylé tel que la séquence N-terminale de la sous-unité bêta de l'hémoglobine humaine; - les hormones thyroïdiennes notamment la thyroxine, la triiodothyronine; les hormones stéroidiennes notamment les oestrogènes tels que l'estriol et l'estradiol, les androgènes tels que la testostérone, les progestatifs tels que la progestérone, les glucocorticoides tels que la 1 1-désoxycorticostérone et le cortisol; les catécholamines telles que l'adrénaline, la noradrénaline, la dopamine; les vitamines A, B comme la B 12, C, D, E et K, l'acide folique, la biotine, la 2 0 thiamine; - les nucléosides et nucléotides comme l'adénosine di- ou triphosphate (ADP et ATP), la flavine mononucléotide (FMN), la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), son dérivé phosphate (NADP), la thymidine, la guanosine et l'adénosine; - des médicaments tels que la digoxine, la digitoxigénine, la digitoxine, la digoxigénine; les antibiotiques notamment les aminoglycosides, la gentamicine, la tobramycine, l'amikacine, la sisomicine, la kanamycine, la netilmicine, la pénicilline, la tétracycline, la terramycine (nom commercial); ou le phénobarbital, la primidone, l'éthosuximide, la carbamazépine, le valproate, la théophylline, la caféine, le propanolol, le procainamide, la quinidine, l'amitriptyline, la désipramine, le disopyramide, etc.; - les toxines comme ralphatoxine, la toxine du choléra, l'entérotoxine B du staphylocoque et analogues. Le produit résultant du couplage covalent ligand-réactif est appelé ciaprès "conjugué". Selon un mode de réalisation de l'invention, le conjugué est immobilisé sur le support solide directement par adsorption passive ou fixation par covalence du fragment d'acide nucléique du conjugué. Selon un autre mode de réalisation, le conjugué est immobilisé sur le support solide par l'intennrmédiaire d'un anti-conjugué, lui-même immobilisé ou immobilisable sur le support solide par covalence ou par adsorption passive, l'anti-conjugué étant un agent permettant 4 0 l'immobilisation du conjugué par interaction avec le fragment d'acide nucléique du conjugué ou 3 2706618 par interaction avec I'haptène et avec un groupement présent à la jonction du fragment d'acide nucléique et de l'haptène. L'anti-conjugué peut être par exemple un second fragment d'acide nucléique capable de s'hybrider avec le fragment d'acide nucléique du conjugué. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anti-conjugué est un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre le fragment d'acide nucléique du conjugué. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anti-conjugué est une protéine susceptible de se lier directement ou indirectement au fragment d'acide nucléique du conjugué dans des conditions prédéterminées. Le fragment d'acide nucléique est choisi notamment dans le groupe consistant en un fragment d'ADN ou d'ARN naturel ou de synthèse, ou un désoxyribonucléotide ou un ribonucléotide, ou un désoxyribonucléoside ou un ribonucléoside. Ce fragment d'acide nucléique peut être simple brin, double brin, ou partiellement double brin. De préférence, on utilise un fragment simple brin. Le fragment d'acide nucléique est un oligodésoxyribonucléotide ou un oligoribonucléotide comprenant par exemple de 2 à 100 nucléotides, en particulier de 10 à 50 nucléotides. Le fragment d'acide nucléique peut en outre présenter une ou plusieurs bases modifiées ou être composé uniquement de bases modifiées naturelles telles que la céto-6-purine, 2 0 la xanthine, la méthyl-5-cytosine, l'amino-2-purine ou non naturelles telles que la thioguanine ou l'oxo-8-guanine. Le fragment d'acide nucléique peut présenter un ou plusieurs ou être composé uniquement de nucléosides modifiés sur la partie osidique tel que des carbonucléosides ou présenter des modifications au niveau du squelette phosphodiester tel que des groupements phosphorothioates. De même il peut présenter une ou plusieurs modifications ou être uniquement composé de nucléosides d'anomérie alpha ou bêta ou d'isomères de la série D ou L; tous ces éléments pouvant être pris indépendamment ou en combinaison. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux polymères sur lesquels peut être immobilisé un fragment d'acide nucléique pour une utilisation dans des tests diagnostiques. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement peuvent être 3 0 utilisés comme support solide, notamment des polysaccharides tels que les matériaux de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que r'acétate de cellulose et la nitrocellulose; des polymères tels que le polychlorure de vinyle, le polyéthylène, les polystyrènes, les polyamides, les polyacrylates, les polyuréthanes, les polycarbonates, les polytétrachloroéthylènes, ou des copolymères tels que les polymères chlorure de vinyle- propylène, chlorure de vinyle- acétate de vinyle, les copolymères à base de styrène ou de dérivés substitués du styrène, et des fibres synthétiques telles que le nylon. Le matériau polymère est notamment un copolymère chlorure de vinyle/acétate de vinyle, chlorure de vinyle/propylène, ou un copolymère de styrène tel qu'un copolymère butadiène-styrène; ou un copolymère butadiène-styrène en mélange avec un ou plusieurs polymères ou copolymères choisi parmi le polystyrène, les copolymères styrène- acrylonitrile ou 4 2706618 styrène-méthylmétacrylate de méthyle, les polypropylènes, les polycarbonates ou analogues. Avantageusement, le support solide de la présente invention est un polystyrène ou un copolymère à base de styrène comprenant entre environ 10 et 90 % en poids de motifs styrène. Le dispositif selon l'invention peut se présenter notamment sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, de particules, de latex ou analogue. Le terme "latex" désigne une dispersion aqueuse colloïdale d'un polymère quelconque insoluble dans l'eau. La présente invention nécessite la préparation de fragments d'acide nucléique conjugués à une ou plusieurs molécules d'haptène par l'intermédiaire d'une liaison covalente. Cette liaison covalente peut être établie en suivant des approches directes ou indirectes. Ces techniques permettent d'obtenir une molécule composite modifiée de façon parfaitement connue quant à la position et au degré de substitution. Par approche directe, on entend le couplage en synthèse automatique de l'haptène additionné comme un nucléotide au cours de la synthèse c'est-à-dire en position 5' et/ou 3' ou en toute autre position dans la chaîne. Ceci nécessite la préparation d'un dérivé utilisable en synthèse automatique, par exemple, un dérivé phosphoramidite, H-phosphonate ou phosphotriester de l'haptène ou d'un nucléotide substitué par l'haptène sur la base ou sur la partie osidique. De même l'haptène peut être introduit au cours de la synthèse sur les phosphores 2 0 internucléotidiques par phosphoramidation oxydative. Deux voies sont envisagées pour les approches indirectes: La première nécessite, de façon connue en soi, l'introduction sur les deux partenaires, c'est à dire sur le fragment d'acide nucléique et sur l'haptène, respectivement, des fonctions réactives l'une par rapport à l'autre. A titre d'exemple une fonction amine primaire portée par l'un 2 5 des partenaires réagira avec l'ester N-hydroxysuccinimique de l'autre partenaire, de même une fonction thiol réagira sur un groupement maléimide, pyridyldisulfure ou halogénoalkyle et un phosphorothioate réagira avec un halogénoalkyle. La deuxième voie implique l'introduction sur le fragment d'acide nucléique et sur l'haptène de fonctions ayant des réactivités spécifiques, mais ces fonctions ne sont pas réactives directement l'une par rapport à rautre. La liaison s'établit par l'intermédiaire d'un agent de couplage. Le terme agent de couplage tel qu'utilisé ici désigne une molécule contenant au moins deux extrémités ou groupements réactifs de même nature ou de nature différente (agent de couplage homobifonctionnel ou hétérobifonctionnel). A titre d'exemple, une fonction amine primaire et une fonction acide carboxylique peuvent former une liaison amide en présence d'un carbodiimide, deux fonctions amines primaires seront couplées en présence de phénylène-l,4-diisothiocyanate ou de disuccinimidylsubérate. Les fonctions réactives introduites sur le fragment d'acide nucléique peuvent être choisies notamment parmi les groupements amine, hydrazinoyle, hydrazonoyle, iminoyle, 2706618 azidoyle, triazenoyle, triazanoyle, amide éventuellement substituée, semicarbazonoyle, aldéhydyle, alkylthiol, arylthiol,carbamoyle, carboxyle, cyanoyle, halogénoalkyle, hydroxyle, N- hydroxysuccinimidyle, maléimide, phosphate, phosphorodithioate, phosphite, phosphonate, phosphorothioate, pyridyldisulfure, sulfamoyle, thiophosphate. Lesdites fonctions réactives introduites (ou éventuellement déjà présentes) sur l'haptène peuvent être choisies à titre d'exemple parmi les groupements amine, hydrazinoyle, hydrazonoyle, iminoyle, azidoyle, triazenoyle, triazanoyle, amide éventuellement substituée, semicarbazonoyle, aldéhydyle, alkylthiol, arylthiol,carbamoyle, carboxyle, cyanoyle, halogénoalkyle, hydroxyle, N-hydroxysuccinimidyle, maléimide, phosphate, phosphorodithioate, 1 0 phosphite, phosphonate, phosphorothioate, pyridyldisulfure, sulfamoyle, thiophosphate. L'introduction de ces fonctions réactives (et par conséquent le greffage ultérieur de l'haptène) sur les fragments d'acide nucléique peut s'effectuer en n'importe quelle position de la chaîne en utilisant par exemple des réactifs synthétisés selon des méthodes connues ou disponibles dans le commerce. A titre d'exemple les modifications peuvent être réalisées en position 5' par emploi d'un réactif type Aminolink II (Applied Biosystems réf. 400808); en position 3' par utilisation d'une phase solide telle que celle vendue par la société Clontech Lab Inc sous la référence 5221, ou celle décrite par Reed et al. (1991) Bioconjugate Chem., 2,217- 225; sur les bases nucléiques (Glen Research réf. 101039); sur la partie osidique par modification de la partie osidique en utilisant par exemple un ribofuranose substitué en position 2 0 2' à la place d'un désoxy-2'-ribofuranose (Yamana et al. (1991) Tetrahedron Lett., 32, 6347- 6350), ou en substituant un nucléoside par un composé alkylamine (Clontech Lab Inc ref 5203) ou encore par substitution d'un phosphate internucléotique selon des protocoles décrits par Froehler et al., (1988) NucI. Acids Res., 16, 11,4831-4839.; Conway et McLaughlin (1991) Bioconjugate Chem., 2, 452-457; Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,6553- 6556. De même, si nécessaire la modification de l'haptène pour l'introduction d'une fonction réactive peut être réalisée en toute position appropriée de la molécule d'haptène. Un exemple de modification est donné dans "Preparation of antigenic steroid-protein conjugate", F. Kohen et al., dans Steroid immunoassay, Proceedings of the fifth tenovus workshop, Cardiff, 3 0 Avril 1974, ed. EHD Cameron, SH. Hillier, K. Griffiths. La fixation du conjugué fragment d'acide nucléique-haptène sur la phase solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du conjugué sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le conjugué et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé anti-conjugué capable d'interagir avec le fragment d'acide nucléique du conjugué de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. 6 2706618 A titre d'exemple, ce composé anti-conjugué peut être: un anticorps antifragment d'acide nucléique tel que décrit par P. CROS et al. (monoclonal antibodies to alpha deoxyribonucleotides, (1993), NAMA conférence, poster 4-37); un fragment d'acide nucléique ayant une séquence au moins partiellement complémentaire du fragment d'acide nucléique du conjugué; une protéine fixant spécifiquement le fragment d'acide nucléique simple brin du conjugué telle que la protéine de liaison simple brin de E.coli ou la protéine codée par le gène 32 du bactériophage T4; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur le fragment d'acide nucléique une molécule telle qu'une vitamine et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotinestreptavidine); une protéine se fixant sur une séquence spécifique couramment appelée promoteur, comme les ARN polymérases et notamment les ARN polymérases phagiques telles que les T7, T3, SP6 ARN polymérases. Le dispositif selon l'invention est utilisable pour effectuer un dosage d'haptènes par compétition dans un échantillon, notamment un fluide biologique, dans lequel le réactif immobilisé entre en compétition avec l'haptène de l'échantillon pour sa liaison à un anticorps spécifique introduit dans des proportions prédéterminées. On révèle la présence de l'anticorps spécifique fixé sur le support solide par les méthodes usuelles. Par exemple l'anticorps spécifique est marqué par tout marqueur approprié, ou bien le complexe immun (haptène immobilisé/anticorps anti-haptène) fixé sur le support solide, susceptible d'être formé, est révélé par l'utilisation d'un anticorps anti-complexe marqué par tout marqueur approprié. De 2 0 préférence, l'anticorps anti-complexe est un anticorps dirigé contre l'anticorps du complexe formé. L'invention a également pour objet un procédé de dosage d'un haptène dans un échantillon liquide caractérisé par le fait: - que l'on ajoute audit échantillon une quantité prédéterminée d'anticorps capables de reconnaître ledit haptène; - que l'on met en contact l'échantillon avec le dispositif tel que précédemment; - que lon évalue la quantité d'anticorps fixé sur le support solide; - et que l'on en déduit, selon les méthodes connues la quantité d'haptènes présente dans l'échantillon. Ce procédé est mis en oeuvre selon des techniques connues en soi. Bien 3 0 entendu, les deux premieres étapes peuvent être réalisées dans un ordre quelconque. On évalue la quantité d'anticorps fixé après un temps d'incubation approprié. On peut par exemple déterminer la quantité d'haptène à l'aide d'une courbe-étalon, obtenue par étalonnage du dispositif à l'aide d'échantillons contenant diverses quantités connues de l'haptène, et permettant d'établir la corrélation entre la quantité d'anticorps fixé et la quantité d'haptènes correspondante. Le dispositif de l'invention peut également servir au dosage d'anticorps anti-haptène dans un échantillon. Pour cela, on peut, selon un mode de réalisation particulier, mettre l'échantillon en contact avec le dispositif, puis révéler, à l'aide d'anticorps marqués, la présence éventuelle d'anticorps anti-haptène fixés. On peut effectuer la révélation par exemple à l'aide 4 0 d'anticorps marqués dirigés contre le fragment Fc des anticorps de l'espèce dont sont issus les 7 2706618 anticorps anti-haptène recherchés. Selon un autre mode de réalisation, on peut opérer par compétition en ajoutant à l'échantillon une quantité connue d'anticorps anti-haptène marqués et en déterminant la quantité d'anticorps marqués fixés. Par comparaison avec une courbe d'étalonnage établie préalablement, on peut en déduire la quantité d'anticorps antihaptène présents à l'origine dans l'échantillon. On va maintenant donner, à titre d'illustration, des exemples de préparation du dispositif selon l'invention ainsi que des exemples d'utilisation dudit support Dans ces exemples, l'expression "speed vac" désigne un concentrateur-lyophilisateur rotatif. EXEMPLE 1: Synthèse d' oligonucleotides pour le couplage sur haptène Les oligonucléotides sont synthétisés sur un appareil automatique 394 de la société APPLIED BIOSYSTEMS en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Pour permettre le couplage de l'oligonucléotide à un haptène sur une position bien déterminée, des fonctions réactives sont introduites sur les oligonucléotides par l'intermédiaire de bras de liaison compatibles avec la synthèse automatique. Les bras utilisés dans la présente invention et donnés ici à titre d'exemple sont décrits dans le tableau 1. Le bras phosphoramidite référencé 1 est additionné à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique. La fonction réactive se trouve à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide. Dans le cas du composé portant la référence 2, la fonction réactive est portée par la base thymine sur la position 5. Ce composé peut être introduit à n'importe quelle position de l'oligonucléotide à l'exception de l'extrémité 3'. Dans le cas du composé portant la référence 3, la synthèse automatique démarre par la silice greffée par le bras selon le protocole standard. La fonction réactive se trouve à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. Après déprotection une nuit à 55'C dans NH4OH 33 %, suivie d'une précipitation dans de l'éthanol à -20'C, les oligonucléotides sont séchés sous vide et repris dans 1 ml d'eau. Dans tous les cas, les oligonucléotides modifiés sont purifiés par chromatographie liquide haute pression (CLHP) en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18 (10 mm - cm). Conditions: Débit 4,6 ml/min, Gradient: i0 % à 35 % de tampon B en 30 min, 35%à 100 % detamponBen 3 min. Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes: Tampon A: 0.1 molaire Triethylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00. Tampon B: 50 % Tampon A + 50 % CH3CN. TABLEAU 1 N * Formule Fournisseur Réf. 1 Applied Biosystems 400808 O OCH3 CF3-CNH(CH2)6-OP \N(IsoPr)2 2 GlenResearch 101039 O O N N s NH(CH2)6-NHCCF3 / O(CH2)2-CN OP O25\ N(IsoPr)2 2 5 3 Clontech Lab Inc 5221-1 1 CPG-LCAA-O-CH-CH2-OD MTr DMTr = diméthoxytrityle Fmoc = fluorenyl-9méthoxycarbonyle CPG = billes de verre à porosité contrôlée LCAA = longue chaine alkyle amine (bras espaceur) Les oligonucléotides modifiés par les bras du tableau 1 et utilisés dans la présente invention sont décrits dans le tableau 2. 9 2706618 TABLEAU 2 Numéro usuel de Nucléotide Tr l'oligonucléotide SEQ ID N (*) (**) 57 1 bêta 19,54 319 2 bêta 18,45 1257 3 bêta 19,85 196 4 alpha 23,21 1 0 1803 5 alpha 20,04 SEQ ID N 1: ACTAAAAACT AGTAATGCAA AG............................ 22 SEQ ID N' 2: ATGTCACGAG CAATrAAGCG............................... 20 SEQID N 3: ACTAAAAACT AGNAATGCAA AG............................ 22 SEQ ID N 4: ACCCCGAGAT TTACGTITATGT.............................. 21 SEQID N 5: I'I'I 'I'T II I l TI' -I'I TIT T. ................................ 20 (*) les nucléotides bêta sont les nucléotides naturels (la liaison glycosidique est sous la forme anomérique bêta). Concernant les nucléotides alpha, la liaison glycosidique est sous la forme anomérique alpha. Les oligonucléotides contenant les nucléotides alpha ont été préparés selon la technique décrite dans la demande de brevet PCT WO 88 / 04 301. (**) Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide dans les conditions suivantes: Colonne Brownlee RP18 (4,6 mm - 25 cm). 3 0 Conditions: débit 1 ml/min, Gradient: 10 % à 35 % de tampon B en 30 mn, % à 100 % de tampon Ben 3 mn. Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes: Tampon A: 0,1 molaire Triéthylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00. Tampon B: 50 % Tampon A + 50 % CH3CN. 2706618 Couplage d'un haptène sur un oligonucléotide: Les haptènes utilisés dans la présente invention et donnés ici à titre d'exemple sont décrits dans le tableau 3. TABLEAU 3 HAPTENE à DOSER HAPTENE ACTIVE UTILISE FOURNISSEUR REFERENCE LE COUPLAGE ESTRADIOL ESTRADIOL-6- BOEHRINGER 05. 21041 CARBOXYMETHOXIME-N- MANNHEIM HYDROXYSUCCINIMIDE ESTER TETRAIODO- N-BOC-THYROXINE-N-HYDROXY- BOEHRINGER 05. 21003 THYRONINE SUCCINIMIDE ESTER MANNHEIM T4 TRIIODOTHYRONINE N-BOC-TRIIODOTHYRONINE-N- BOEHRINGER 05. 21002 T3 HYDROXYSUCCINIMIDE ESTER MANNHEIM TESTOSTERONE TESTOSTERONE-19- BIOMERIEUX / HEMISUCCINATE-N- HYDROXYSUCCINIMIDE ESTER (*) (*) Dérivé de la 19-hydroxy testostérone. L'haptène testostérone, fourni par BIOMERIEUX, est préparé selon la méthode décrite dans J. Steroid Biochem., 23(6a), pages 981-989, 1985 par A. WHITE et collaborateurs. nmoles d'oligonucléotides sont séchées au speed vac et repris dans 20 gl de tampon borate de sodium 0,1 M, pH 9,3. 300 gl d'une solution d'haptène activé (5 mg/ml dans le DMF) sont ajoutés goutte à goutte puis laissés sous agitation 3 heures à 50 C. Après centrifugation, le surnageant séparé, le précipité résultant de la centrifugation repris dans 100 gl d'eau puis additionné au surnageant. Le mélange est traité avec 250 gl d'acétate d'ammonium 3M pH 5,2 puis 5 ml d'éthanol froid (-20'C). Après 30 minutes à -800C et centrifugation, le culot est repris dans 500 gl d'eau. Le conjugué oligonucléotide-haptène est purifié par CLHP dans les conditions suivantes: Colonne BECKMAN ODS (I0 mm - 25 cm). Conditions: débit 4,6 ml/min, Gradient: 20 % à 30 % de tampon B en 10 min, il1 2706618 % à 70 % de tampon Ben 20 min. Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes: Tampon A: 0,1 molaire Triéthylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00. Tampon B: 50 % Tampon A + 50 % CH3N. Le pic correspondant au couplage est séché au speed vac puis repris dans 500 gl d'eau. Les différents conjugués oligonucléotide-haptène préparés dans la présente invention sont résumés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Conjugué Oligonucléotide Haptène Tr oligonucléotide-haptène (*) (**) A 57 ESTRADIOL 16,18 B 57 T3 27,44 C 57 T4 25,79 D 57 TESTOSTERONE 27,96 (a) E 319 ESTRADIOL 14,50 F 1257 T4 22,71 2 0 G 196 ESTRADIOL 15,65 H 1803 ESTRADIOL 15,45 (*) voir le tableau 3 pour la formule exacte de l'haptène utilisé pour le couplage. (**) Tr est le temps de rétention du produit purifié dans les conditions suivantes: Colonne Brownlee RP 300 (4.6 mm x 100 mm). Débit: 1,0 ml/min. Gradient: 20 % à 30 % de tampon B en 10 min, % à 70 % de tampon B en 20 min. (a) pour le conjugué D le gradient est de 10 à 40% de B en 30 min. 3 0 Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes: Tampon A: 0.1 molaire Triéthylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00. Tampon B: 50 % Tampon A + 50 % CH3CN. 12 2706618 EXEMPLE 2: Utilisation d'un conjugué oligonucléotide-estradiol immobilisé par adsorption directe sur un support solide, pour la détermination d'estradiol par technique immunoenzmatique de tvpe compétition. Un anticorps monoclonal anti-estradiol (BIOMERIEUX ref. 10G6E9H4C1D6)obtenu par la technique classique décrite par G. Kôhler et C. Milstein (Nature 256. 495-497 (1975)) purifié à partir de liquides d'ascites par chromatographie de type échangeuse d'ions ABx (Baker-72 69 00), puis conjugué à de la peroxydase (commercialisée par la société FORDRAS) selon la technique décrite en 1974 par Nakané P.K. et Kawoi A. (J. Histochem. Cytochem, 22: 1084) est utilisé à une concentration déterminée non saturante établie à partir d'une courbe de titrage. La courbe de titrage est obtenue comme suit: dans les puits d'une plaque de polystyrène Maxisorb NUNC (commercialisée par la société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454), on immobilise le conjugué A obtenu comme décrit dans l'exemple 1 à raison de 100 gl par cupule et à une concentration de 0,15 gM dans du tampon PBS x 3 (NaCI 0,45 M; phosphate de sodium 0,15 M; pH 7,0). Cette plaque est incubée une nuit à 22 C ou une heure à une température de 37 C. La plaque est lavée trois fois par 300 gI de tampon PBS-Tween 0,05 % (NaCI 0,15 M; phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; Tween 20 à une concentration finale de 0,05 % (Tween: nom commercial)). Les sites dans la plaque non occupés par le conjugué oligonucléotide-haptène A sont saturés par l'addition de 100 gl d'une solution de PBS-lait à 1 % 2 0 en concentration finale (NaCI 0,15 M; phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; lait écrémé Régilait 1 %). La plaque est incubée pendant une heure à 37 C, puis rincée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Dans chaque puits de la plaque sont ajoutés 100 gIl de dilutions successives de l'anticorps anti-estradiol marqué en tampon PBS, et incubés pendant 15 minutes sous agitation à 22 C. La plaque est rincée trois fois avec du tampon PBS-Tween 0,05 %, puis une fois avec de l'eau distillée. 100 gl de substrat OPD (Ortho- Phénylène-Diamine, commercialisé par la société Cambridge Medical Biotechnology sous la référence 456) à la concentration de 4 mg/ml dans un tampon OPD (acide citrique 0,05 M; NaH2PO4 0,1 M; pH 4,93) auquel est ajouté extemporanément H202 à 30 volumes dilué au 1/1000, sont introduits dans les puits de la plaque. La réaction enzymatique est bloquée par addition de 100 gl 3 0 d'H2SO41N après une incubation de 30 minutes à 37 C. La lecture est effectuée à 492 nm sur un lecteur Biowhittaker Microplate Reader 2001. La courbe de titrage obtenue est représentée à la figure 1; chaque point représente la moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique. A partir de cette courbe de titrage, l'anticorps anti-estradiol marqué, qui sera utilisé ultérieurement, est choisi à une dilution déterminée correspondant à une activité enzymatique non saturante, telle que donnant une D.O. de 1,5 à 492 nm. La détermination de la molécule d'estradiol à doser est effectuée selon le même protocole que décrit précédemment, à l'exception de l'étape d'addition de l'anticorps anti- estradiol marqué. A cette étape, 50 gl d'anticorps anti-estradiol à la dilution précédemment déterminée sont préalablement mélangés à 50 pl d'une solution choisie parmi les solutions à concentration croissante d'estradiol. Les résultats sont représentés dans le tableau 5 ci-après. 13 2706618 TABLEAU 5 Concentration d'estradiol D.O.492nm pg/ml (*) (**) 0 1,441 0,1 1,379 1 1,416 1,254 100 0,274 1000 0,019 * Les échantillons contenant les différentes concentrations d'estradiol sont préparés par addition de quantités connues d'estradiol (17 bêta estradiol commercialisée par la société Sigma sous la référence E 1631) dans du tampon PBS. ** Chaque point représente la D.O. moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique (lecture 492 nm). Les résultats de la gamme d'étalonnage présentés dans le tableau 5 montrent une bonne inhibition de la fixation de l'anticorps marqué lorsque la concentration en estradiol 2 0 augmente. EXEMPLE 3: Utilisation d'un conjugué oligonucléotide-testostérone immobilisé par adsorption directe sur un support solide. pour la détermination de testostérone par technique immunoenzvmatique de type compétition. Un sérum polyclonal de lapin anti-testostérone (commercialisé par la société Biospacific sous la référence 052B4089) est utilisé à une concentration déterminée non saturante établie à partir d'une courbe de titrage. La courbe de titrage est obtenue comme suit: Dans les puits d'une plaque de polystyrène Maxisorb NUNC (commercialisée par la 3 0 société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454) est immobilisé le conjugué oligonucléotide-haptène D obtenu comme décrit dans l'exemple 1 à raison de 100 gl par cupule et à une concentration de 0,15 FM dans du tampon PBS x 3 (NaCI 0,45 M; Phosphate de sodium 0,15 M; pH 7,0). Cette plaque est incubée une nuit à 22'C ou une heure à une température de 37 C. La plaque est lavée trois fois par 300 pl de tampon PBS-Tween 0,05 % (NaCl 0,15 M; 3 5 phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; Tween 20 à une concentration finale de 0,05 % (Tween: 14 2706618 nom commercial)). Les sites dans la plaque non occupés par le conjugué oligonucléotide-haptène D sont saturés par l'addition de 100 Il d'une solution de PBS-lait à 1 % en concentration finale (NaCL 0,15 M; phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; lait écrémé Régilait I %). La plaque est incubée pendant une heure à 37 C, puis rincée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Dans chaque puits de la plaque sont ajoutés 100 [l de dilutions successives de sérum de lapin anti-testostérone en tampon PBS, et incubés pendant 15 minutes sous agitation à 22'C. La plaque est rincée trois fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %, puis 100 p1 d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-Fc d'IgG de lapin marqué à la phosphatase alcaline (commercialisé par la société Jackson Immunoresearch Laboratories sous la référence 111-055-046) dilué au 1/1000 en tampon PBS sont incorporés dans les puits de la plaque. Cette dernière est incubée pendant une heure à 37 C, puis est rincée trois fois avec du tampon PBS-Tween 0,05 %, puis une fois avec de l'eau distillée. 100 pl de substrat PNPP (paranitrophényl-phosphate commercialisé par la société Sigma sous la référence 104-O) à la concentration de 2 mg/ml dans du tampon diéthanolamine-HCl (diéthanolamine 1,29 M; MgSO,,56 mM; NaN 0338 mM; HCI 0,012 N; pH 9, 8), sont ajoutés dans les puits de la plaque. La réaction enzymatique est bloquée par addition de 100 pl de NaOH 1 N après une incubation de 30 minutes à 37 C. La lecture est effectuée à 405 nm sur un lecteur Biowhittaker Microplate Reader 2001. La courbe de titrage obtenue est représentée à la figure 2; chaque point représente la moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique. A partir de cette courbe de titrage, l'anticorps anti- 2 0 testostérone qui sera utilisé ultérieurement, est choisi à une dilution déterminée correspondant à une activité enzymatique non saturante, telle qu'une D.O. de 1,5 à 405 nm. La détermination de la molécule de testostérone à doser est effectuée selon le même protocole que décrit précédemment, à l'exception de l'étape d'addition de l'anticorps anti- testostérone. A cette étape, 50 gl d'anticorps anti-testostérone à la dilution précédemment déterminée sont préalablement mélangés à 50 gI d'une solution choisie parmi des solutions à concentration croissante de testostérone. Les résultats sont représentés dans le tableau 6 ci-après. 2706618 TABLEAU 6 Concentration de Testostérone D.O. 405 nm pg/ml (*) (**) 0 2,607 2,392 1,293 1000 0,467 10000 0,203 * Les échantillons contenant les différentes concentrations de Testostérone sont préparés par addition de quantités connues de Testostérone (4-androstène-3-one-17-ol commercialisée par la société Sigma sous la référence T 1500) dans du tampon PBS. * ** Chaque point représente la D.O. moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique (lecture 405 nm). Les résultats de la gamme d'étalonnage présentés dans le tableau 6 montrent une bonne inhibition de la fixation de l'anticorps spécifique lorsque la concentration en testostérone augmente. 2 0 EXEMPLE 4: Utilisation d'un conjugué oligonucléotide-estradiol immobilisé par l'intermédiaire d'un oligonucléotide complémentaire sur un support solide pour la détermination d'estradiol par technique immunoenzvmatique de type compétition. L'anticorps monoclonal anti-estradiol utilisé est identique à celui décrit dans l'exemple 2 (BIOMERIEUX ref. 10G6E9H4ClD6). La courbe de titration est obtenue conformément au protocole décrit dans l'exemple 2, à l'exception de la premiere étape qui se déroule comme suit: Dans les puits d'une plaque de microtitration Maxisorb NUNC, est immobilisé un oligonucléotide d'une séquence complémentaire de la séquence nucléotidique de 3 0 l'oligonucléotide 57 (séquence ID N I) décrit dans l'exemple 1 à raison de 100 [l par cupule et à une concentration finale de 0,75 giM dans un tampon PBS x 3. Les plaques sont incubées une nuit à 22'C ou une heure à une température de 37'C. La plaque est lavée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Les sites de la plaque non occupés par cet oligonucléotide sont saturés par l'addition de 100 gl d'une solution de PBS-lait de concentration finale 1 %. La plaque est incubée 1 heure à 37 C, puis rincée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Dans chaque puits sont ajoutés 100 gI du conjugué oligonucléotide-haptène A obtenu comme décrit 16 2706618 dans l'exemple 1 à une concentration de 0,15 gM, soit dans du tampon PBS 3 X, soit dans du tampon PEG (NaH2 PO4 /Na2 HPO4 0,1 M; NaCi 0,5 M; pH 7, 0, Tween 20: 0,05 %; ADN de sperme de saumon 0,14 mg/ml; PEG 4000 2 %) pendant 1 heure à 37'C. La plaque est lavée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Le reste de l'expérimentation se déroule conformément au protocole décrit dans l'exemple 2. Les courbes de titration obtenues sont respectivement représentées dans les figures 3 (tampon PBS 3X) et 4 (tampon PEG). L'anticorps marqué, qui sera utilisé ultérieurement, est choisi à une dilution déterminée correspondant à une activité enzymatique non saturante, telle que donnant une D.O. de 1,5 lue à 492 nm. La détermination de la molécule d'estradiol à doser est effectuée selon les modalités décrites dans rexemple 2. Les résultats obtenus sont présentés respectivement dans les tableaux 7 (tampon PBS 3X) et 8 (tampon PEG) ci-après. TABLEAU 7 Concentration d'estradiol D.O. 492 nm pg/ml (*) (**) 0 1,875 0,1 1,815 1 1,823 1,428 0,391 1000 0,053 17 2706618 TABLEAU 8 Concentration d'estradiol D.O. 492 nm pg/ml (*) (**) 0 1,859 0,1 1,827 1 1,730 1,512 0,362 1000 0,058 * Les échantillons contenant les différentes concentrations d'estradiol sont préparés par addition de quantités connues d'estradiol (17 bêta estradiol commercialisée par la société Sigma sous la référence E 1631) dans du tampon PBS. ** Chaque point représente la D.O. moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique (lecture 492 nm). Les résultats des gammes d'étalonnage présentés dans les tableaux 7 et 8 montrent une bonne inhibition de la fixation de l'anticorps marqué lorsque la concentration en estradiol augmente. EXEMPLE 5: Utilisation d'un conjiugué oligonucléotide-estradiol immobilisé par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal anti-oligonucléotide sur un support solide, pour la détermination d'estradiol par technique immunoenzvmatique de type compétition. L'anticorps monoclonal anti-estradiol utilisé est identique à celui décrit dans l'exemple 2 (BIOMERIEUX ref. 10G6E9H4ClD6). La courbe de titration est obtenue conformément au protocole décrit dans l'exemple 2, à l'exception de la premiere étape qui se déroule comme suit: Un anticorps monoclonal anti-oligonucléotide (BIOMERIEUX référence 3H11H10) obtenu par 3 0 la technique classique décrite par G. Kôhler et C. Milstein et purifié à partir de liquides d'ascites, par chromatographie de type échange d'ions ABx (Baker - 72 6900), est immobilisé dans une plaque de microtitration Maxisorb NUNC à raison de 100 gl par puits à une concentration de Fg par mi, dans du tampon bicarbonate (NaHCO30,05 M; pH 9,6). La plaque est incubée pendant une nuit à 22'C ou bien 1 heure à 37'C. 18 2706618 La plaque est lavée trois fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 % [NaCI 0,15 M; phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; Tween 20 à une concentration finale de 0,05 % (Tween nom commercial)]. Les sites dans la plaque non occupés par l'anticorps monoclonal anti-oligonucléotide sont saturés par l'addition de 100 pl d'une solution de PBS-lait de concentration finale 1% (NaCl 0,15 M; phosphate de sodium 0,05 M; pH 7,0; lait écrémé Régilait 1 %). La plaque est incubée pendant une heure à 37'C, puis rincée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Dans chaque puits sont additionnés 100 gI du conjugué oligonucléotidehaptène G comme décrit dans l'exemple 1 à une concentration de 0,15 pM dans du tampon PBS, pendant 1 heure à 37'C. La plaque est lavée 3 fois par 300 gl de tampon PBS-Tween 0,05 %. Le reste de l'expérimentation se déroule conformément au protocole décrit dans l'exemple 2. La courbe de titrage obtenue est représentée dans la figure 5 annexée. L'anticorps marqué, qui sera utilisé ultérieurement, est choisi à une dilution déterminée correspondant à une activité enzymatique non saturante, telle que donnant une D.O. de 1,5 à 492 nm. La détermination de la molécule d'estradiol à doser est effectuée selon les modalités décrites dans l'exemple 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 9 ci-après. TABLEAU 9 Concentration d'estradiol D.O. 492 nm pg/ml (*) (**) 0 2,084 0,1 2,028 1 2,061 1,810 0,452 1000 0,056 * Les échantillons contenant les différentes concentrations d'estradiol sont préparés par addition de quantités connues d'estradiol (17 bêta estradiol commercialisée par la société Sigma sous la référence E 1631) dans du tampon PBS. ** Chaque point représente la D.O. moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique (lecture 492 nm). 19 2706618 Les résultats de la gamme d'étalonnage présentés dans le tableau 9 montrent une bonne inhibition de la fixation de l'anticorps marqué lorsque la concentration en estradiol augmente. EXEMPLE 6: Utilisation d'un conjugué oligonucléotide-estradiol immobilisé par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal anti-oligonucléotide sur un support solide. pour la détermination d'estradiol par technique immunoenzvmatique de tvpe compétition. Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites dans l'exemple 5, à l'exception de l'utilisation du conjugué oligonucléotide-haptène H et d'un anticorps dirigé contre l'oligonucléotide 1803 (BIO MERIEUX Réf. 3H11H10). La courbe de titrage obtenue est représentée dans la figure 6 annexée. L'anticorps marqué, qui sera utilisé ultérieurement, est choisi à une dilution déterminée correspondant à une activité enzymatique non saturante, telle que donnant une D.O. de 1,5 à 492 nm. La détermination de la molécule d'estradiol à doser est effectuée selon les modalités décrites dans l'exemple 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 10 ci-après. TABLEAU 10 Concentration d'estradiol D.O. 492 nm pg/ml(*) (**) 0 0,973 1 0,934 10 0,628 0,110 1000 0,017 *Les échantillons contenant les différentes concentrations d'estradiol sont préparés par addition de quantités connues d'estradiol (17bêta-estradiol commercialisée par la société Sigma sous la référence E 1631) dans du tampon PBS. ** Chaque point représente la D.O. moyenne de deux valeurs moins la valeur de la fixation non spécifique (lecture 492 nm). Les résultats de la gamme d'étalonnage présentés dans le tableau 10 montrent une bonne inhibition de la fixation de l'anticorps marqué lorsque la concentration en estradiol augmente. 2706618 LISTE DES SEQUENCES SEQ IDN 1: ACTAAAAACT AGTAATGCAA AG Longueur: 22 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Source: synthèse chimique Caractéristique additionnelle: bras alkylamine (produit référencé 1 dans le tableau 1) à l'extrémité 5' Nom d'usage: 57 SEQID N 2: ATGTCACGAG CAATTAAGCG Longueur: 20 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire 2 0 Source: synthèse chimique Caractéristique additionnelle: bras dérivé d'aminopropanediol (produit référencé 3 dans le tableau 1) à l'extrémité 3'. Nom d'usage: 319 SEQID N 3: ACTAAAAACT AGNAATGCAA AG Longueur: 22 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Source: synthèse chimique Caractéristique additionnelle: N représente un nucléoside thymidine (produit référencé 2 dans le tableau 1) ayant un bras alkylamine en position 5. Nom d'usage: 1257 SEQ ID N 4: ACCCCGAGAT TTACGTTATG T Longueur: 21 Type: acide nucléique 4 0 Nombre de brins:simple 21 2706618 Configuration: linéaire Source: synthèse chimique Caractéristiques additionnelles: est constitué de nucléosides d'anomérie alpha et porte un bras alkylamine (produit référencé 1 dans le tableau 1) à l'extrémité 5'. Nom d'usage: 196 SEQ ID N* 5: Longueur: 20 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Source: synthèse chimique Caractéristique additionnelle: est constitué de nucléosides d'anomérie alpha et porte un bras dérivé d'aminopropanediol (produit référencé 3 dans le tableau 1) à l'extrémité 3'. Nom d'usage: 1803 22 2706618 REVENDICATIONS 1. Dispositif pour le dosage d'un haptène ou d'anticorps anti-haptène, comprenant un support solide et un réactif lié de façon covalente à un ligand pour former un conjugué permettant d'immobiliser ledit réactif sur ledit support solide, ledit réactif étant reconnu par des anticorps capables de reconnaître ledit haptène, caractérisé par le fait que ledit ligand est un fragment d'acide nucléique. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit conjugué est immobilisé par adsorption passive sur le support solide. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit conjugué est immobilisé par couplage covalent sur le support solide. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit conjugué est immobilisé sur le support solide par hybridation avec un second fragment d'acide nucléique capable de s'hybrider avec ledit fragment d'acide nucléique dudit conjugué, ledit second fragment d'acide nucléique étant immobilisé sur le support. 5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit conjugué est immobilisé sur le support par l'intermédiaire d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps dirigé contre ledit fragment d'acide nucléique dudit conjugué, ledit anticorps étant immobilisé sur ledit support solide. 6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit conjugué est fixé sur le support solide par l'intermédiaire d'une protéine immobilisée sur ledit support. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le fragment d'acide nucléique est choisi parmi un fragment d'ADN, un fragment d'ARN, et un fragment d'ADN ou d'ARN modifié. 8. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit fragment d'acide nucléique est un désoxyribonucléotide, un ribonucléotide, du désoxyribonucléoside ou un ribonucléoside. 9. Dispositif selon la revendication 7 ou 8, caractérisé par le fait que le fragment d'acide nucléique est un oligodésoxyribonucléotide ou un oligoribonucléotide de longueur comprise entre 2 et 100 nucléotides et en particulier entre 10 et 50 nucléotides. 10. Procédé de dosage d'un haptène dans un échantillon liquide, caractérisé par le fait: - que l'on ajoute audit échantillon une quantité prédéterminée d'anticorps capables de reconnaître ledit haptène; _ que l'on met en contact l'échantillon avec le dispositif tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes; - que ron évalue la quantité d'anticorps fixé sur le support solide; - et que l'on en déduit, selon les méthodes connues, la quantité d'haptène présente dans l'échantillon.