Brevet FR2700552A1 — publié le 19940722

i La présente invention concerne des mutants de Phaffia rhodozvma bloqués dans la voie de la carotenogenèse, des procédés d'obtention de 9- carotène, l'utilisation de biomasse de ces mutants et l'utilisation de fi- carotène. Principalement connu comme la plus importante des provitamines A, le I-carotène fait actuellement l'objet d'études épidémiologiques et cliniques approfondies qui semblent lui attribuer des rôles physiologiques autres que ceux liés à la vitamine A. En effet, la conversion du fi-carotène en vitamine A dans la paroi intestinale étant régulée par le taux même de vitamine A dans le sang, une partie du I-carotène alimentaire reste à l'état de provitamine et exerce une fonction antioxydante vraisemblablement responsable de la protection contre certaines formes de cancer, athérosclérose, arthrite rhumatoide, cataracte sénile, parkinsonisme Une dose journalière de 5,2 à 6,0 mg de B-carotène dans les aliments a été préconisée comme facteur important de prévention de ces maladies. Comme le 1-carotène est également un pigment naturel susceptible de remplacer certains colorants de synthèse et qu'il jouit d'une perception très favorable de la part des consommateurs, des efforts considérables se portent actuellement sur l'élaboration de nouveaux produits alimentaires contenant du &-carotène, produits faisant partie de la catégorie des aliments de nouvelle génération, dits aliments "fonctionnels" Par ailleurs, il semblerait que le 1-carotène soit un agent de protection solaire très efficace, d'o certaines applications dans l'industrie des produits cosmétiques. Bien que les caroténoïdes en général et le B-carotène en particulier soient largement répandus dans le monde vivant, seulement les plantes et certains microorganismes possèdent les équipements enzymatiques nécessaires à leur biosynthèse à partir d'acétyl-Co A, via l'acide mévalonique. Parmi les microorganismes, certains champignons et algues synthétisent des carotènes (dont le &-carotène), alors que les bactéries produisent essentiellement des xanthophyles Les procédés de production de l- carotène en fermenteur proposés jusqu'à présent utilisent l'algue Dunaliella (Ben Amotz & Avron, 1980) et les phycomycètes Phycomyces blakesleeanus (Murillo-Araujo et al, 82) et Blakeslea trispora (Ninet et Renaut, 1979). Quant aux levures, à une exception près, ces microorganismes ne font pas l'objet de procédés industriels de production de caroténoides Le torulène, synthétisé par des levures rouges appartenant aux genres Rhodotorula et Rhodosporidium, ne présente qu'un intérêt mineur, alors que les autres caroténoides identifiés chez les levures (dont le i- carotène) sont présents en d'aussi faibles quantités qu'une exploitation industrielle semble peu envisageable. Le seul exemple de caroténoïde produit industriellement par emploi de levures est offert par l'astaxanthine, pigment caractéristique de la levure Phaffia rhodozyma Après optimisation de la production, l'astaxanthine ou la biomasse levurienne sont utilisés comme supplément dans l'alimentation du saumon, de la truite saumonnée, des crustacés, des poules pondeuses, etc (Brevet WO 91/02060). Les caroténoides autres que le R-carotène ne présentent ni le potentiel vitaminique du B-carotène, ni son effet protecteur antioxydant. Cependant, le rendement important du fonctionnement de la voie de biosynthèse de l'astaxanthine chez Phaffia rhodozvma ainsi que l'alimentarité virtuelle de cettte espèce nous ont suggéré de mettre à profit les propriétés de cette levure dans un procédé de production de 1 i- carotène. Une production de f-carotène par levures serait donc intéressante car celles-ci sont, d'une part, plus faciles à cultiver en masse que d'autres microorganismes tels que les champignons et les plantes et, d'autre part, la biomasse de mutants de levures producteurs de f- carotène pourrait être utilisée telle quelle dans les produits notamment alimentaires, diététiques cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. La présente invention fournit des mutants de Phaffia rhodozvma bloqués dans la voie de la caroténogénèse et qui accumulent du k- carotène. La voie de biosynthèse de l'astaxanthine chez Phaffia rhodozvma a été en partie élucidée et est présentée à la Figure 1. Les mutants selon l'invention sont bloqués vraisemblablement dans l'étape de conversion du i-carotène en echinénone, notamment par traitement aux UV Ces mutants sont incapables de produire de l'astaxanthine. La présente invention a en effet pour objet Procédé d'obtention de mutants de Phaffia rhodozvma producteur de fi-carotène selon l'invention, caractérisé en ce que: 1) on traite une souche sauvage de Phaffia rhodozyma en culture par un agent mutagène physique ou chimique, et 2) on sélectionne les clones de couleur jaune obtenus après le traitement de l'étape 1). Comme on l'a mentionné dans un mode de réalisation, à l'étape 1), on traite la souche sauvage de Phaffia rhodozvma par un agent mutagène consistant dans des rayons ultra-violets. La présente invention a aussi pour objet un procédé de production de Rcarotène par fermentation d'une souche mutante de levure de Phaffia rhodozvma selon l'invention. On obtient une augmentation du rendement de production en fi- carotène quand le milieu de culture est enrichi en acide mévalonique. (l'acide mévalonique (AMV) est en effet un précurseur du &-carotène dans la voie de biosynthèse de l'astaxanthine). La présente invention fournit également des préparations brutes de icarotène dépourvue de cellules viables obtenue à partir de la biomasse de mutants de Phaffia rhodozvma selon l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation de B- carotène obtenu par un procédé selon l'invention pour la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de biomasse, éventuellement déshydratée, d'un mutant de levure Phaffia rhodozvma selon l'invention, comme supplément de fs-carotène dans la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. La présente invention fournit en outre un procédé de production de fiionone par chauffage de cellules d'un mutant de levure Phaffia rhodozvma selon l'invention. La présente invention a enfin pour objet l'utilisation de la biomasse d'une levure Phaffia rhodozvma selon l'invention comme source de %- ionone notamment dans la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. La Figure 1 représente la voie de biosynthèse de l'astaxanthine chez Phaffia rhodozvma. La Figure 2 représente le spectre d'absorption de l'extrait de la souche PG 104 (A) et du produit de référence ( 1-carotène pur, Sygma) (B). La Figure 3 représente l'analyse HPLC des extraits de la souche sauvage CBS 6938 de Phaffia rhodozvma (A), du mutant PG 104 (B) et des produits de référence alpha-carotène, (Sygma) et 1-carotène. EXEMPLE 1 Obtention des mutants Les cellules de la souche sauvage CBS 6938 de Phaffia rhodozvma sont cultivées sur un milieu liquide (YPG) contenant 1 % d'extrait de levure, 1 % de bactopeptone et 2 % de glucose, sous agitation ( 150 rpm) à 25 C) Les cultures âgées de 72 heures sont centrifugées 5 mn à 3 000 g et les cellules lavées deux fois à l'eau distillée et traitées aux UV pendant sec à 35 cm d'une lampe germicide, ce qui correspond à une dose de 1.789 j xs-1 x cm 2 Le taux de survie est d'environ 10 % Les cellules traitées sont étalées sur des boîtes de YPG solide et incubées à 25 C pendant 72 heures Sur 5 x 104 colonies examinées, quelques colonies blanches ont été repérées, ainsi que deux colonies de couleur jaune (PG 104 et PG 126) contrastant avec la couleur rouge des colonies sauvages Le mutant PG 104 a fait l'objet des expérimentations ultérieures. EXEMPLE 2 Identification des caroténoïdes du mutant PG 104 ml de milieu SD ( 50, 67 % de bacto-yeast nitrogen base sans acides aminés et 2 % de glucose) sont placés dans des fioles Erlenmayer de 1.000 ml et inoculés avec 106 cellules/ml de la souche PG 104 prélevées d'une préculture en YPG Les cultures sont incubées à 25 C sous agitation ( 150 rpm) et au bout de 72 heures, les cellules sont récoltées par centrifugation et soumises à un traitement lytique: à 200 ml de suspension cellulaire dans du tampon citrate-phosphate 0,1 M, p H 5,6, contenant 107 cpm, on ajoute 6 mg/ml de préparation enzymatique (Novozym 234); après une incubation de 60 mn à 250 C sous agitation faible, l'examen microscopique montre une lyse des parois cellulaires à pratiquement % La préparation de protoplastes est alors traitée à l'acétone et les caroténoides sont extraits à l'éther de pétrole Le spectre UV-VIS de l'extrait (Fig 2) est identique à celui du produit de référence (fi-carotène pur, Sygma). L'analyse par HPLC (Fig 3) sur colonne Microbondapak RP 18 (Waters), avec comme phase mobile du méthanol, montre dans le cas du mutant PG 104 la présence d'un seul pic, correspondant à celui du 9- carotène pur, contrairement à la souche sauvage qui contient de l'astaxanthine comme pic majeur, mais aussi, en faibles quantités, d'autres intermédiaires probables de la voie des caroténoïdes. Une comparaison avec les proportions relatives de différents caroténoïdes chez une souche sauvage (Tableau I) montre clairement que le mutant PG 104 produit pratiquement en exclusivité du g-carotène Il correspond probablement à un blocage mutationnel au niveau de l'étape de conversion du g-carotène en échinénone. TABLEAU i CAROTENOIDES DE PHIAFFIA RHODOZYMA (% DES CAROTENOIDES TOTAUX) * D'après Andrewes et al ( 1976) SAUVAGE * MUTANT (P-104) Neurosporene 0,01 O Lycopene 0,01 ? r-Carotene 0,01 O B-Carotene 2 2,5 92 Echinenone 2 4 O Hydroxyechinenone 3 4 O Phoenicoxanthin 5 7 O Astaxanthin 83 87 O EXEMPLE 3 Production de B-carotène avec le mutant PG 104 Différents milieux et conditions de culture, ainsi que l'effet de certains suppléments sur la biosynthèse de B-carotène par PG 104 ont été testés, afin d'établir les paramètres permettant d'augmenter cette production Les résultats sont présentés dans le tableau II. A la suite de ces tests, les paramètres culturaux suivants ont été choisis pour une production optimum de B-carotène: Milieu de culture: S Gly-HC-AMV Inoculum: 106 cpm Volume: 1/10 du volume de la fiole Température: 250 C Agitation: 150 rpm Dans ces conditions, on obtient au bout de 96 heures jusqu'à 10 mg de 9- carotène par litre de culture. TABLEAU 2 PRODUCTION DE fi-CAROTENE DANS DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE YPG = 1 % E Xtrait de levure, 1 % Bactopeptone, 2 % Glucose YP Gly = 1 % Extrait de levure, 1 % Bactopeptone, 3 % v/v Glycérol SD = 0,67 % Bactoyeast nitrogen base, 2 % Glucose S Gly = 0,67 % Bacto-yeast nitrogen base, 3 % v/v Glycérol PDB = 2,4 % Potato dextrose (Difco) VG = 2 % Extrait de viande, 2 % Glucose V Gly = 2 % Extrait de viande, 3 % (v/v) Glycérol SD-AMV = SD + 500 mg/lacïde révalonique S Gly-HC = S Gly + 5 g/l hydrolysat de caséine S Gly-HC-AMV = S Gly + 5 g/l hydrolysat de caséine + 500 mg/l acide mévaloniaue B-CAROTENE Milieu mg/l mg/g poids sec YPG 0,37 0,07 YP Gly 2,35 0,32 SD 1,80 0,50 S Gly 0,05 0,12 PDB 2,30 0,29 VG 2,70 0,39 V Gly 0,46 0,31 SD-AMV 4,70 1,12 S Gly-HC 7,90 0,87 S Gly-AMV-HC 9,95 1,08 EXEMPLE 4 Préparation brute de fi-carotène à partir de cellules du mutant PG 104 de Phaffia rhodozvma Les cellules de PG 104 cultivées dans les conditions standard sont récoltées par centrifugation et lavées une fois à l'eau distillée A 1 g (poids humide) de cellules, on ajoute 100 ml d'éthanol absolu et la suspension est agitée 1 heure à 150 rpm Les cellules sont récoltées par centrifugation et le culot est réparti en couches de 1-2 mm d'épaisseur sur des boîtes de Petri et séché 24 heures à température ambiante On obtient une poudre qui contient 2 mg de B- carotène par gramme Des aliquots de cette poudre sont étalés sur des boîtes de YPG solide et l'absence de croissance au bout de 2 semaines montre que la préparation ne contient aucune cellule vivante. Cettre préparation peut être utilisée comme supplément de 1-carotène dans des jus de fruits, et tout autre produit alimentaire, ainsi que dans des produits cosmétiques et dans l'alimentation animale. EXEMPLE 5 Préparation riche en &-carotène à partir de cellules de Phaffia rhodozyma PG 104 Les cellules récoltées dans 100 ml de culture sont traitées au Novozym (comme décrit dans l'exemple 2) et extraites 5 fois à l'acétone Les extraits sont réunis et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation Le surnageant acétonique est placé dans une ampoule à décanter; 10 ml d'éther de pétrole et 1 ml de Na Cl saturé sont ajoutés On récupère la phase supérieure (éther de pétrole) fortement coloré; la phase acétonique est extraite une deuxième fois à l'éther de pétrole et les extraits en éther sont réunis, filtrés, séchés sur Na 2 504 anhydre et repris dans 1 ml d'éther de pétrole On confirme l'identité du caroténoïde extrait par spectrophotométrie L'extrait final contient 1 g de fi-carotène par litre. EXEMPLE 6 Production de 9-ionone au cours de l'élaboration de boissons distillées La &-ionone est un arôme cher utilisé dans l'industrie alimentaire Du moût de malt de distillerie (densité initiale 1060), est fermenté avec une souche de distillerie traditionnelle, jusqu'à une densité de 997 Avant la distillation, on ajoute 1 g de cellules de Phaffia rhodozvma PG 104 traitées préalablement au Novozym Dans le low wine obtenu après distillation, on met en évidence par GC-MS la présence de traces de &ionon e, absentes dans le produit témoin. il BIBLIOGRAPHIE Ben-Amotz A, Avron M ( 1983) On factors which determine massive I- carotene accumulation in the halotolerant alga Dunaliella bardawil Plant Physiol 72: 593-597. Muril Io-Araujo F J, Calderon I L, Lopez- Diaz I, Cerda-Olmedo E ( 1978) Carotene superproducing strains of Phycomyces Appl Environ. Microbiol 36: 639-642. Ninet L, Renaut J ( 1979) In "Microbial Technology", H J Peppler & D. Periman eds, 2nd Ed Vol 1, pp 529-544, Academic Press, New York. Igene Biotechnology, Inc ( 1989) Processes for in vivo production of astaxanthin and Phaffia rhodozyma yeast of enhanced astaxanthin content Brevet WO 91/02060. Andrewes A G, Phaff H J, Starr M P ( 1976) Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red-pigmented fermenting yeast Phytochemistry 15: 1003- 1007. REVENDICATIONS 1 Mutants de Phaffia rhodozvma bloqués dans l'étape de conversion du R-carotène dans la voie de bio-synthèse de l'astaxanthine. 2 Procédé d'obtention de mutants de Phaffia rhodozvma producteurs de Rcarotène selon la revendication 1, caractérisé en ce que: 1) on traite une souche sauvage de Phaffia rhodozvma en culture par un agent mutagène physique ou chimique, et 2) on sélectionne les clones de couleur jaune obtenus après le traitement de l'étape 1). 3 Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que, à l'étape 1), on traite la souche sauvage de Phaffia rhodozvma par un agent mutagène consistant dans des ultra-violets. 4 Procédé de production de R-carotène par fermentation d'une souche mutante de levure de Phaffia rhodozyma selon la revendication 1. 5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de culture est enrichi en acide mévalonique. 6 Préparation brute de R-carotène dépourvue de cellules viables obtenue à partir de la biomasse de mutants de Phaffia rhodozvma selon la revendication 1. 7 Utilisation de &-carotène obtenu par un procédé selon la revendication 4 ou 5 pour la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. 8 Utilisation de biomasse, éventuellement déshydratée, d'un mutant de levure Phaffia rhodozvma selon la revendication 1, comme supplément de Rcarotène dans la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques. 9 Procédé de production de &-ionone par chauffage de cellules d'un mutant de levure Phaffia rhodozvma selon la revendication 1. 10 Utilisation de la biomasse d'une levure Phaffia rhodozvma selon la revendication 1 comme source de 9-ionone notamment dans la préparation de produits alimentaires ou diététiques, cosmétiques, parapharmaceutiques ou pharmaceutiques.