Brevet FR2704002A1 — publié le 19941021

La présente invention concerne une méthode de détection de la résistance à la streptomycine chez les mycobactéries du "complexe tuberculosis" Mycobacterium tuberculosis. L'année 1945 a vu une grande percée dans la lutte contre la tuberculose avec l'introduction de la streptomycine, médicament puissant de la famille des aminoglycosides. Initialement utilisée en monothérapie, la streptomycine fut, en 1955, incorporée en une polychimiothérapie (PCT) avec l'isoniazide et l'acide para-aminosalicylique, car le taux de mutants résistants devenait trop important. La PCT antituberculeuse a eu un effet drastique sur la maladie, et avec l'amélioration des conditions de vie dans les pays industrialisés, la tuberculose ne constituait plus un problème majeur de santé publique (Bloom, B.R., and Murray, C.J.L. (1992) Science 257, 1055-1064). Plusieurs améliorations à la PCT ont depuis été effectuées et, de nos jours, elle consiste en l'association de l'isoniazide, de la rifampicine, de la pyrazinamide et de l'éthambutol(Snider Jr., D.E., and Roper, W.L. (1992), The New England Journal of Medicine 326, 703-705). La streptomycine a été quelque peu abandonnée pour deux raisons, un taux non-négligeable d'effets secondaires chez certains malades, comme la surdité, et son application par injection intramusculaire. Néanmoins, malgré ces problèmes, la streptomycine demeure une arme létale contre Mycobacterium tuberculosis. Dans les années 80, quand le SIDA a commencé ses ravages, la tuberculose a de nouveau émergé en occident. Aux Etats-Unis, le réveil de la maladie s'est déclaré sous forme de plusieurs petites épidémies dans certaines institutions comme des prisons, des cliniques visitées par des personnes atteintes du HIV et des hôpitaux. Malheureusement, la "nouvelle tuberculose" se manifeste sous une forme inquiétante, car beaucoup des souches de M. tuberculosis qui en sont responsables résistent à un, ou plusieurs, des agents antituberculeux couramment utilisés. I1 est généralement admis que, d'une part, de nouveaux médicaments sont nécessaires pour combattre cette menace, et que d'autre part, la détection rapide de souches polyrésistantes est prioritaire. Par exemple, si lon savait à temps qu'un malade hébergeait une souche de M. tuberculosis résistante à la rifampicine et à l'isoniaside, une modification de sa chimiothérapie serait envisageable. Ainsi, la streptomycine pourrait encore trouver un rôle dans le traitement de la tuberculose. La streptomycine a des effets inhibiteurs forts au niveau traductionnel chez beaucoup de bactéries, et des mutations entraînant une résistance sont associées à certains gènes dont les produits sont des composants du ribosome (Liu, X.-Q., Gilham, N.W., and Boynton, J.E. (1989), J. Biol. Chem. 264, 16100-16108). Des mutations faux-sens du gène rpsL, codant pour la protéine ribosomale S12, ont été trouvées dans les codons 41-47 et 90-92 chez Escherichia coli et d'autres bactéries, voire chez les chloroplastes de quelques plantes. Un autre site de mutation, associé à la résistance à la streptomycine, se trouve dans le gène rrs dont le produit est l'ARNr 16S. Plusieurs substitutions nucléotidiques, touchant des boucles invariables, ont été décrites (Mélançon, P. Lemieux, C., et Brahier-Gingras, L. (1988), "Nucleic Acid. Res." 20, 9631-9639). La séquence nucléotidique du gène rpsL de M. leprae a été établie (Mol. Microbiologie 7, 207-214 (1993)). Les auteurs de la présente invention se sont servi du gène rpsL de M. leprae pour construire deux amorces qui ont permis de mettre en évidence le site de mutation responsable de la résistance à la streptomycine chez M. tuberculosis. Les auteurs de la présente invention ont donc découvert que la résistance des mycobactéries à la streptomycine pouvait être détectée de manière rapide et sûre. I1 est à noter que M. leprae est une bactérie qui n' a pas le même type de pathogénicité que M. tuberculosis, et la streptomycine est un antibiotique inapte à combattre in vivo une infection induite par M. leprae. Il n'était par conséquent pas évident de trouver un site de mutation du gène rpsL chez M. tuberculosis à partir de la séquence de M. leprae. La présente invention a pour objet une méthode de détection de la résistance des mycobactéries Mycobacterium tuberculosis à la streptomycine, caractérisée en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou de plusieurs mutations sur le gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome. De préférence, on met en évidence la présence d'une mutation sur le codon 43 du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome. Les procédés utilisés pour la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome, sont avantageusement la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde ("oligotyping"), la technique d'analyse des polymorphismes de conformation de simples brins, dite analyse SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphisms), ou encore le séquençage direct des fragments d'ADN du gène rpsL. Pour la technique de l"'oligotyping", la séquence à analyser est divisée en fragments courts de l'ordre de quelques oligonucléotides, qui sont hybridés avec des sondes marquées, par exemple à la biotine, dans des conditions de forte stringence, de sorte que lorsqu'une base est mutée, l'hybridation avec la sonde ne se fait pas. La technique du séquençage direct est bien connue de l'homme du métier. Pour la technique d'analyse des polymorphismes de conformation de simples brins, on se reportera à la publication de Orita et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 2766-2770, Avril 1989). Avantageusement, on réalise d'sabord une amplification génique, par exemple par PCR (Polymerase Chain Reaction) dans les conditions classiques du fragment du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome, et l'on détecte la présence de mutations éventuelles sur les produits d'amplification obtenus à l'aide d'une des techniques mentionnées ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention - on réalise une amplification de 1'ADN à analyser par PCR à partir d'un prélèvement biologique contenant la mycobactérie dont on cherche la résistance éventuelle à la streptomycine, par exemple du sang ou un crachat, après en avoir prealablement éliminé les débris cellulaires et lysé les cellules bactériennes à l'aide d'un tampon de lyse approprié, l'amplification par PCR étant réalisée dans les conditions classiques en utilisant un couple d'amorces convenable, - on soumet les brins d'ADN préalablement extraits du mélange d'amplification à une dénaturation à l'aide d'une solution dénaturante, - on dépose les brins d'ADN monocaténaires sur un gel de polyacrylamide neutre à 5%, et - on fait migrer les brins d'ADN monocaténaires par électrophorèse sur ledit gel, - la PCR peut être effectuée à l'aide d'un nucléotide marqué au 32P OU d'un autre marqueur facilement détectable et on les détecte par autoradiographie ou un autre système de révélation, - on compare les déplacements des fragments d'ADN à analyser avec des fragments d'ADN témoins correspondants obtenus dans les mêmes conditions d'amplification, digestion, dénaturation, électrophorèse et transfert sur membrane de nylon que les fragments d'ADN à analyser, provenant d'une souche bactérienne identique mais sensible à la streptomycine. Après transfert sur la membrane de nylon, la différence de mobilité due à la substitution d'un nucléotide du fragment d'ADN simple brin peut être ainsi mise en évidence par comparaison avec l'ADN témoin après détection par hybridation à l'aide de la sonde marquée. Pour la réalisation des amorces utilisées pour la PCR ainsi que pour les sondes utilisées dans l'"oligotyping", ou pour la mise en évidence des fragments d'ADN, on se refermera pour M. tuberculosis à la souche déposée à l'INSTITUT PASTEUR. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie Mycobacterium tuberculosis à la streptomycine, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens pour réaliser une amplification génique de 1'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome de ladite bactérie, - des moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification obtenus, - une préparation témoin d'une séquence d'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome de ladite bactérie sensible à la streptomycine, et - éventuellement une préparation témoin d'une séquence d'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome de ladite bactérie résistante à la streptomycine. Avantageusement, les moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome comprennent une ADN polymérase, les quatre désoxynucléosides triphosphate, ainsi qu'un couple d'amorces, et les moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification géniques comprennent une solution dénaturante, l'ADN amplifié digéré, une sonde marquée et un système de détection adéquat, par exemple une sonde marquée apte à s'hybrider aux brins d'ADN digérés dénaturés. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique d'un fragment du gène rnsL de Mycobacterium tuberculosis codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome, ainsi que la séquence nucléotidique du fragment du gène rDsL muté responsable de la résistance à la streptomycine. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique du gène rpsL de Mycobacterium tuberculosis codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome, ainsi que la séquence nucléotidique du rpsL muté responsable de la résistance à la streptomycine. L'homme du métier pourra, à partir de l'amplification de la séquence nucléotidique du fragment du gène rpsL, obtenir la séquence nucléotidique du gène rpsL dans son entier ainsi que son produit d'expression. L'invention a aussi pour objet les produits d'expression des séquences nucléotidiques sauvages ou mutées du fragment du gène et du gène rpsL. On décrira ci-après à titre d'exemple la mise en évidence selon l'invention de la résistance à la streptomycine chez divers isolats de M. tuberculosis, en se référant aux figures annexées, sur lesquelles - la Figure 1 représente la séquence d'une partie du rpsL de M. tuberculosis. La séquence du gène rpsL de M. leprae est indiquée, ainsi que celle de son produit, la protéine S12, dont le début est marqué par 1. Les positions des amorces ML51-et ML52 sont montrées et la séquence d'une partie de rpsL de M. tuberculosis est donnée sous celle de M. leprae. Seulement les positions qui diffèrent, et les changements d'acides aminés qu'ils entraînent, sont indiqués. - la Figure 2 représente la séquence ADN sauvage du fragment du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome responsable de la résistance à la streptomycine, et la séquence en acides aminés de la protéine S12 correspondante. La culture des souches M. tuberculosis et leur test de sensibilité à la streptomycine ont été effectués par la méthode des proportions sur milieu de Lôwenstein-Ierca (Méthode de laboratoire pour mycobactériologie clinique - Hugo David, Véronique Lévy Frébault, M.F. Thorel - Ed. Institut Pasteur). La séquence nucléotidique du gène rDsL du M. leprae a permis, par analogie de séquence, la construction de deux amorces, ML51 (CCCACC*TTCAGCAGCTGGT) et ML52 (GTCGAGCGAACCGCGAATGA), encadrant la région des sites putatifs de mutation responsable de la résistance à la streptomycine, convenant à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L'ADN de M. tuberculosis utilisé comme matrice permet ainsi d'obtenir un fragment de rpsL de 306 pb. La séquence nucléotidique du fragment confirme une certaine identité et montre 28 différences avec celle de M. leprae. Les codons étant numérotés à partir du premier codon, dans la protéine S12, ceci engendre un décalage de 1 vers la droite de la séquence des acides aminés par rapport à celle des codons dont le produit n'est vraisemblablement pas présent. Pour déterminer si des mutations faux-sens étaient responsables de la résistance à la streptomycine, le gène rpsL de 43 souches de M. tuberculosis, dont 28 résistants, a été amplifié par PCR et les produits analysés par la technique de SSCP. L'ADN a été extrait à partir d'échantillons de suspensions de 200 pl de M. tuberculosis (en moyenne de 104 à 105 bactéries) recouvertes de 100 pl d'huile minérale (Sigma Chemical Co.) par la technique de congélation-décongélation (Woods et Cole, 1989, FEMS Microbiol. Lett. 65:305-310). Des portions aliquotes (10 pl) ont été utilisées directement pour la PCR comme décrit par Woods et Cole (ci-dessus mentionné), et les deux amorces (ML51 et ML52) ont été utilisées pour amplifier la région intéressante du gène rpsL, qui ont permis d'obtenir des produits d'amplification de 306 pb. Les cycles nécessaires à l'obtention du produit de 306 pb étaient de 1 minute à 92"C, 2 minutes à 61"C et 2 minutes à 72"C, et le set final 10 minutes à 72" C. Les amorces ML51 et ML52, ont été synthétisées sur un appareil Applied Biosystems (modèle 391) selon des procédures standard. Deux profils de mobilité des brins d'ADN ont été observés après électrophorèse : sauvage (rpsL+) ou muté. Chez 16 des mutants résistants à la streptomycine, le profil muté a été observé. Ceci suggère que les autres souches résistantes ont des mutations ailleurs, peut-être dans d'autres gènes ribosomaux. Pour établir la nature de la mutation chez les 16 souches identifiées par SSCP, les fragments du gène rpsL étaient amplifiés par PCR à l'aide de ML51 et ML52 et leur séquences nucléotidiques ont été déterminées. Les ADN obtenus ont été séquencés sur la base de la séquence du gène rpsL d'isolats sensibles à la streptomycine. Les séquences d'ADN ont été obtenues par la procédure didéoxy modifiée décrite par Biggin et Coll. (1963, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3863-3965), à l'aide des amorces appropriées représentées à la Figure 1. Les séquences obtenues ont été comparées avec la séquence du gène rpsL de type sauvage. Les résultats significatifs obtenus avec la séquence du gène sauvage (sensible à la streptomycine) et la séquence correspondant à la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome résistante à la streptomycine sont représentés à la Figure 2. Une seule différence avec la séquence sauvage a été trouvée, le codon 43, AAG, a été muté en AGG et, par conséquent, l'aminoacide Lys-42 a été remplacé par Arg. Bien entendu, cette invention permet l'identification d'éventuelles autres mutations responsables de la résistance à la streptomycine sur le fragment du gène rpsL ou sur le gène rpsL dans son entier par utilisation du fragment identifié dans la présente invention par hybridation en condition de forte stringence. Symboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn aspargine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1. Méthode de détection de la résistance à la streptomycine chez Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur le gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on met en évidence la présence d'une mutation sur le codon 43 du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome par la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome par la technique d'analyse des polymorphismes de conformation de simples brins. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome par le séquençage direct des fragments d'ADN du gène rpsL. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'on réalise préalablement une amplification génique du fragment du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sousunité du ribosome. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise les amorces ML51 (CCCACCATTCAG CAGCTGGT) et ML52 (GTCGAGCGAACCGCGAATGA) pour la réalisation de l'amplification du gène rpsL par PCR. 8. Méthode selon la revendication 6, caractérisé par les étapes suivantes - amplification génique du fragment, - dénaturation des brins d'ADN, - dépôt des brins d'ADN monocaténaires sur un gel de polyacrylamide neutre à 5%, - réalisation d'une électrophorèse sur ledit gel, - révélation par une technique de détection utilisant des nucléotides marqués, - comparaison des déplacements des fragments d'ADN avec des fragments témoins correspondants provenant de souches de Mycobacterium tuberculosis sensible à la streptomycine. 9. Séquence nucléotidique appartenant au gène rosL de Mycobacterium tuberculosis constitué par ou comprenant la séquence nucléotidique (I) suivante CGCAAGGGTC GTCGGGACAA GATCAGTAAG GTCAAGACCG CGGCTCTGAA GGGCAGCCCG CAGCGTCGTG GTGTATGCAC CCGCGTGTAC ACCACCACTC CGAAGAAGCC GAACTCGGCG CTTCGGAAGG TTGCCCGCGT GAAGTTGACG AGTCAGGTCG AGGTCACGGC GTACATTCCC GGCGAGGCGC ACAACCTGCA GGAGCACTCG ATGGTGCTGG TGCGCGGCGG CCGGGTGAAG GACCTGCCTG GTGTGCGCTAC CAAG. 10. Séquence nucléotidique du gène rpsL de Mycobacterium tuberculosis hybridant en condition de forte stringence avec la séquence I selon la revendication 9. 11. Séquence d'ADN selon la revendication 9 ou 10, caractérisée par une mutation du codon 43 AAG en AGG. 12. Produit d'expression de la séquence d'ADN selon la revendication 10 codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome de Mycobacterium tuberculosis. 13. Produit d'expression de la séquence d'ADN selon la revendication 11 codant pour une protéine mutée S12 de la petite sous-unité du ribosome de Mycobacterium tuberculosis responsable de la résistance à la streptomycine. 14. Kit de diagnostic in vitro de la résistance de Mycobacterium tuberculosis à la streptomycine, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome, - des moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification obtenus, - une préparation témoin d'une séquence d'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome d'une souche de Mycobacterium tuberculosis sensible à la streptomycine, et - éventuellement une préparation témoin d'une séquence d'ADN du gène rpsL codant pour la protéine S12 de la petite sous-unité du ribosome d'une souche de Mycobacterium tuberculosis résistante à la streptomycine. 15. Kit selon la revendication 14, caractérisé en ce que les moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpsL codant pour la protéine 512 de la petite sous-unité du ribosome comprennent une ADN polymérase, les quatre disoxynucléosides triphosphates, ainsi qu'un couple d'amorces, de préférence les amorces ML51 et ML52. 16. Kit selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que les moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification génique comprennent une solution dénaturante de l'ADN amplifié digéré et une sonde marquée apte à s'hybrider aux brins d'ADN digérés dénaturés.