Brevet FR2701954A1 — publié le 19940902

La présente invention concerne une composi- tion stabilisée de troponine pouvant servir d'échantillon de référence dans les immunoessais visant à doser la troponine dans le sérum ou le plasma sanguin. On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I, T, qui permet la régulation de la contraction du muscle par le Ca 2 +, contraction qui résulte de l'interaction de la myosine et de l'actine des fibrilles musculaires. Lorsque le muscle est endommagé, que ce soit le muscle cardiaque, lors d'un infarctus du myocarde, ou le muscle squelettique, lors d'efforts physiques pro- longés, les protéines contractiles alors libérées apparaissent plus ou moins rapidement dans la circulation sanguine. Ainsi on a récemment préconisé le dosage des troponines pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation 83 902-912 ( 1991) ou de la troponine I dans Am Heart J 110 1333-44 ( 1987) et Molecular Immunology 29 ( 2) 271-278 ( 1992). Tout immunoessai enzymatique ou tout ra- dioimmuoessai pratiqué dans les laboratoires d'analyses biologiques implique, en général, la fourniture par le fabriquant à côté des réactifs nécessaires au dosage, c'est-à-dire des anticorps marqués ou non, des agents de révélation et des solutions de dilution, d'un étalon du composé à déterminer qui, mis en oeuvre dans des condi- tions analogues à celles de l'échantillon à étudier, servira de référence pour le calcul des résultats et/ou de témoin positif. On sait que les protéines sont peu stables en solution, et les réactifs qui en contiennent sont fréquemment commercialisés sous forme lyophilisée, accompagnés d'un solvant, de composition convenable, dans lequel ils devront être dissous par l'utilisateur avant l'emploi; le maintient à 40 C des solutions obtenues permet de les utiliser pendant plusieurs jours, même si l'étalonnage journalier montre une certaine évolution des concentrations du réactif; en général, et c'est ce qui est préconisé pour la troponine T, les solutions de référence préparées à partir du lyophilisat sont conge- lées, en dose unitaire. Les solutions aqueuses tamponnées de tropo- nine, notamment celles de troponine I et T, peuvent être conservées plusieurs mois à -800 C, mais on a constaté qu'elles n'étaient pas stables plus de quelques heures à + 40 C, même si des inhibiteurs de protéases ou des agents antibactériens, y étaient ajoutés, ce qui oblige les laboratoires d'analyses biologiques à préparer fré- quemment, quelquefois deux fois par jour, leurs solutions d'étalonnage. La présente invention permet la conservation durant plusieurs jours à + 40 C, des solutions étalons plus ou moins diluées de troponine I ou de troponine T qui servent de référence dans des immunoessais spécifi- ques. La composition stabilisée de l'invention comprend en milieu aqueux l'une des deux troponines I ou T selon le dosage à effectuer et de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C et de préférence de 2 à 5 équivalents, ainsi qu'une grande quanité de chlorure de calcium La quantité de Ca Cl 2 peut être de 100 à 10000 fois en poids celle de la troponine I ou de la troponine T. La troponine C peut être d'origine humaine ou animale. La concentration de troponine I ou T dans les solutions selon l'invention correspond à celles générale- ment utilisées dans les immunoessais, c'est-à-dire qu'elle peut être comprise entre 0,01 ng/ml et 1 pg/ml et de préférence entre 0,2 ng/ml et 25 ng/ml, tandis que la concentration de Ca C 12 qui n'est pas critique pourra être comprise entre 20 pm et 10 m M; de façon classique, cette concentration sera voisine de 2 m M. La solution peut être tamponnée, de façon classique, à un p H compris entre 4 et 10, de préférence ,5 et 7,5, et le solvant peut être constitué partiel- lement ou dans sa totalité de plasma humain normal, ce qui permet d'avoir un échantillon de référence de composition équivalente à celle de l'échantillon à étu- dier qui contient le plasma ou le sérum du malade. L'invention a également pour objet une composition de troponine I ou T en poudre, de préférence sous forme lyophilisée, comprenant éventuellement du Ca C 12 et de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C bien que dans ce cas la présence de troponine C ne sera utile pour assurer la stabilité des autres troponines qu'à partir du moment o la composition aura été mise en solution aqueuse par l'utilisateur. La composition lyophilisée peut ne pas contenir de Ca C 12, qui sera alors ajouté lors de la mise en solution. L'invention a également pour objet un procédé de stabilisation d'une solution de troponine I ou T pour immunoessais, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et du Ca Cl 2. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de réalisation de l'invention et les résultats des essais f de conservation correspondants. La troponine I (Tn I) humaine a été isolée d'un coeur par la méthode décrite dans FEBS Lett 40 253- 257 ( 1974) La solution obtenue peut être conservée plusieurs mois à -80 C, à une concentration supérieure à 10 pg/ml dans un tampon phosphate salin contenant 0,5 % de caséine. La troponine T (Tn T) peut être obtenue comme décrit dans J Biochem 72, 723-735 ( 1972) ou dans J. Biol Chem 249 4742-4748 ( 1974). La troponine C (Tn C) peut être isolée par la méthode décrite dans Acta Chem Scand B 42; 211-215 ( 1988) à partir du complexe des 3 troponines (T, C, I), d'origine bovine, qui est commercialisé. Les concentrations des solutions préparées sont déterminées à l'aide du réactif de Bradford, décrit dans Ann Biochem 72, 248 ( 1976) et commercialisé; le produit de référence est un mélange de troponine I, C et T, connu, commercialisé par la société Sigma sous forme lyophilisée avec la réf T 4895. Préparation de la composition selon l'invention Composition contenant 5 molécules de troponine C par molécule de troponine I. On introduit dans 940 pl de tampon KH 2 PO 4 ( 0,1 M; p H 6,8) contenant 10 % de plasma humain normal, 276 pg de Ca Cl 2, 2 H 20, 10 pl de solution de troponine I à 10 pg/ml et 50 pl de solution troponine C à 10 pg/ml. Il est préférable d'effectuer ces opérations en milieu stérile en utilisant des solutions de troponine I et de troponine C stérilisées, par exemple en leur faisant traverser un filtre de diamètre de pores 0,22 pm. La solution obtenue de concentration en Tn I voisine de 100 ng/ml et Tn C de 500 ng/ml est utilisée ensuite pour préparer une gamme de dilutions de 1 ng/ml à 10 ng/ml en troponine I. On prépare de la même façon des solutions contenant 1 ou 2 ou 10 équivalents molaires de troponine C par rapport à la troponine I. La composition en poudre pourra être obtenue par lyophilisation d'une composition aqueuse préparée comme précédemment en l'absence de plasma humain. On prépare de façon analogue des solutions contenant de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par rapport à la troponine T, en remplaçant la troponine I par la troponine T. Réalisation des essais Les solutions conservées à 4 C sont dosées aux jours choisis, pendant 6 semaines, en utilisant comme référence une gamme étalon, préparée extemporanément, à partir de la solution de troponine I conservée à -80 C. Le dosage est effectué avec deux anticorps monoclonaux dirigés contre la troponine I myocardique; le premier anticorps est adsorbé sur les parois de tubes pour immunoessais commercialisés par NUNC (USA) sous la référence Maxisorp, Startube; le second anticorps est marqué à la peroxydase; la méthode est dite méthode sandwich. L'obtention de ces anticorps est décrite dans Molecular Immunology 29 ( 2) 271-278 ( 1992) On a constaté qu'il n'y a pas d'interférence dans ce dosage avec les autres isoformes de troponine I, la troponine C ou les autres protéines myocardiques. En l'absence de Tn C, dès le premier jour de conservation, on observe une diminution sensible de la concentration en Tn I pour les différentes dilutions; si la Tn C est remplacée par de l'actomyosine ou par de la tropomyosine, à raison de 5 équivalents molaires par rapport à la Tn I, la concentration de Tn I mesurée au bout de 12 jours n'est plus que les 2/3 de celle du départ à ng/ml alors que les solutions stabilisées par la Tn C et Ca Cl 2 n'ont pas évolué. Au bout de 40 jours, les solutions de Tn I, stabilisées par différentes concentrations de Tn C et Ca C 12 n'ont pas évolué, tandis que les solutions non stabilisées ont une concentration apparente qui peut chuter jusqu'à 80 %. REVENDICATIONS 1 Composition stabilisée de troponine I ou T pour immunoessais, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une solution aqueuse contenant de la troponine I ou de la troponine T, 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et du Ca Cl 2. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité de Ca Cl 2 égale à 100 à 10000 fois, en poids celle de la troponine I ou de la troponine T. 3 Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle comprend de la troponine I et 2 à 5 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I. 4 Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est en solution aqueuse tamponnée à p H compris entre 4 et 10. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le milieu de dilution est constitué jusqu'à 100 % de plasma humain. 6 Composition selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que la concentration en troponine I est comprise entre 0,01 ng/ml et 1 pg/ml et ce que la concentration de Ca C 12 est comprise entre 20 p M et 10 m M. 7 Composition en poudre pour la préparation d'une composition stabilisée selon l'une des revendica- tions précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient de la troponine I ou de la troponine T, 1 à 10 équiva- lents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T et éventuellement du Ca Cl 2. 8 Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme lyophilisée et exempte de Ca Cl 2. 9 Procédé de stabilisation d'une composition aqueuse de troponine I ou T pour immunoessais, caracté- risé en ce qu'il consiste à ajouter de 1 à 10 équivalents molaires de troponine C par équivalent molaire de troponine I ou T, et du Ca Cl 2. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter une quantité de Ca C 12, de préférence égale à 100 à 10000 fois en poids celle de la troponine I ou de la troponine T.