Brevet FR2707653A1 — publié le 19950120

Conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule notamment une molécule biologiquement active, à hydrogène mobile, son procédé de préparation et composition pharmaceutique comprenant ce conjugué La présente invention a pour objet un conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule, notamment une molécule biologiquement active, à hydrogène mobile; elle concerne également un procédé de préparation de ce conjugué et une composition pharmaceutique comprenant ce dernier. Dans le domaine médical, utilisation est faite de plus en plus fréquemment en particulier en chirurgie réparatrice et dans les médicaments à effet retard, de polymères et copolymères de l'acide lactique et de l'acide glycolique. Ces polymères et copolymères sont en effet parfaitement tolérés par l'organisme et présentent en outre l'avantage d'être biorésorbables, c'est-à-dire capables de donner des produits de dégradation métabolisés ou excrétés par la voie rénale. De ce fait, ils sont particulièrement adaptés à des applications thérapeutiques temporaires. Par ailleurs, parmi les nouvelles formulations à effet prolongé que l'on voit apparaître, les plus nombreuses sont les microsphères à base d'un polymère de l'acide lactique et d'un principe actif thérapeutique. La méthode la plus couramment utilisée pour la préparation de ces microsphères est celle dite par évaporation de solvant, mais des microparticules peuvent également être obtenues par d'autres techniques telles que: séchage par atomisation, microfluidisation, coacervation, précipitation, etc... La technique dite par évaporation de solvant consiste à émulsionner une phase organique contenant le polymère et le principe actif et une phase aqueuse; elle est facile à mettre en oeuvre, mais présente l'inconvénient de ne pas permettre d'encapsuler des quantités importantes de principe actif lorsque celui-ci est hydrosoluble. D'une manière générale, des microparticules contenant un principe actif hydrophile en forte proportion présentent en outre l'inconvénient d'une libération trop rapide de ce principe actif lorsqu'elles sont placées dans un milieu aqueux, notamment un milieu biologique. Les inventeurs se sont donc attachés à remédier à ces inconvénients en recherchant un moyen permettant d'une part, de modifier le partage du principe actif entre la phase aqueuse et la phase organique et de faciliter ainsi son incorporation dans des microsphères et d'autre part, de diminuer la vitesse de libération du principe actif à partir de ces microsphères. Ils ont ainsi eu l'idée de coupler ledit principe actif à une chaîne hydrophobe et notamment à une chaîne polymère hydrophobe et biodégradable. En conséquence, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule à hydrogène mobile, en particulier une molécule biologiquement active à hydrogène mobile, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: R1O-(P)-CO-X-R2 (I) dans laquelle: - R1 représente un atome d'hydrogène ou une fonction blocante (par exemple benzyle ou triméthylsilyle) d'un groupe hydroxyle, le fragment R1O-(P)-CO- représente le reste d'un polymère d'acide hydroxy carboxylique de formule R1O-(P)-COOH, biocompatible et biodégradable, et le fragment R2-X- représente le reste d'une molécule comportant au moins un atome d'hydrogène mobile, en particulier une molécule biologiquement active à hydrogène mobile, et de formule R-XH o -XH est un groupement nucléophile. On comprendra que grâce à la présence du fragment hydrophobe R1O-(P)-CO-, le conjugué selon l'invention présentera, par rapport à une molécule hydrosoluble notamment une molécule biologiquement active hydrosoluble, un caractère hydrophobe permettant son incorporation à un degré élevé dans des microsphères hydrophobes. En outre, en raison de ce caractère hydrophobe, ledit conjugué présentera une solubilité quasi nulle dans l'eau et ne sera libéré que très lentement dans les milieux aqueux notamment les fluides biologiques aqueux, avec lesquels les microsphères seront mises en présence, à l'intérieur des microsphères ayant absorbé de l'eau ou après passage dans ces fluides de fragments à chaînes hydrophobes suffisamment dégradées pour devenir solubles. Un cas extrême sera un conjugué très hydrophobe entièrement retenu dans la microsphère par son chaînon hydrophobe dégradable, la molécule active ne pouvant être libérée qu'après clivage de la liaison - CO-X choisie pour être plus sensible à l'hydrolyse que les fonctions ester des chaînes polymères du chaînon et de la matrice de la microsphère. Le fragment R1O-(P)-CO du conjugué est avantageusement constitué par le reste d'un polymère d'un acide hydroxy carboxylique choisi parmi l'acide lactique, l'acide glycolique, l'acide malique, l'acide citrique et leurs mélanges, l'extrémité hydroxyle de ce polymère étant ou non protégée par une fonction blocante. Ce polymère peut notamment être un copolymère de deux ou plusieurs de ces acides, tel qu'un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique, ces derniers pouvant être de configuration D, L ou DL. En outre, ce polymère possède avantageusement une masse moléculaire d'au plus 000, et de préférence 3 000, mais il peut s'agir d'oligomères plus petits, le choix étant en partie guidé par l'activité du conjugué désirée. Le groupe -XH de la molécule à hydrogène mobile et dont est issu le reste R2-X- de la formule (I) est avantageusement un groupe -OH, -SH ou -NH2, le fragment R2-X- dans la formule (I) étant alors respectivement R2-O-, R2-S- ou R2NH-. La molécule dont est issu le reste R2-X- peut être quelconque sous réserve qu'elle comprenne au moins un atome d'hydrogène mobile, ce dernier étant symbolisé par H dans la formule R2-XH. Il peut s'agir notamment de toute substance biologiquement active hydrosoluble telle que par exemple le céphradinate de sodium; il peut s'agir encore d'un polymère fonctionnalisé tel le polyéthylène glycol, notamment un PEG monoaminé ou monohydroxylé. Selon un second aspect, la présente invention concerne également un procédé de préparation du conjugué de formule (I) ci-dessus, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la conversion du groupement -COOH d'un polymère d'acide hydroxy carboxylique, protégé ou non au niveau de l'extrémité hydroxyle, de formule R1O-(P)-COOH, en un groupement réactif -COY, puis la condensation sur le polymère résultant d'une molécule comportant au moins un atome d'hydrogène mobile et de formule R2-XH o -XH est un groupement nucléophile. Dans le groupement -COY ci-dessus, Y peut représenter un reste d'ester activé, un groupe alkyle en Cl-C4, un atome d'hydrogène, ou un atome d'halogène, notamment un atome de chlore. Dans ce dernier cas, la conversion du groupement -COOH du polymère de formule R1O-(P)-COOH peut en particulier être réalisée par l'action d'un agent halogénant en excès tel que le chlorure de thionyle sur ledit polymère, cette réaction pouvant être effectuée dans un solvant approprié; on opère de préférence à chaud, notamment à la température de reflux de l'agent halogénant ou du solvant. La réaction de conversion est avantageusement effectuée dans des conditions anhydres (notamment utilisation d'un agent halogénant anhydre et le cas échéant d'un solvant anhydre). Le produit de conversion peut être utilisé tel quel dans l'étape suivante après élimination de l'agent halogénant en excès. L'étape de condensation de la molécule à hydrogène mobile sur le produit de conversion susmentionné est avantageusement réalisée dans un système eau/solvant organique dans lequel le solvant organique est non miscible à l'eau et solvant du produit de conversion. Ce solvant peut être constitué par exemple par un hydrocarbure halogéné (notamment chloré) tel que CH2CI2 ou par le benzène. La température de condensation est avantageusement comprise dans la plage allant de 0-50 C, de préférence de 10 à C. Par ailleurs, on opère avantageusement en présence d'un agent de transfert de phase tel que le bromure de tétrabutylammnonium et à pH basique, notamment à un pH au voisinage de 9. Selon un troisième aspect, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique à activité thérapeutique prolongée, qui se caractérise en ce qu'elle comprend le conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule biologiquement active à hydrogène mobile, décrit ci-dessus, en association avec un véhicule ou support physiologiquement acceptable. Cette composition se présente avantageusement sous la forme de microsphères de polymère biocompatible et biodégradable dans lesquelles est encapsulé ledit conjugué. Une telle composition peut notamment être préparée par la méthode dite par évaporation de solvant. Elle consiste à préparer une phase dispersante, le plus souvent aqueuse, dans laquelle est dissous un agent tensio-actif, par exemple l'alcool polyvinylique. Le polymère d'encapsulation (biocompatible et biodégradable) est dissous dans un solvant organique volatil, non miscible à la phase dispersante, par exemple du dichlorométhane. Le conjugué est soit dissous, soit dispersé dans la solution de polymère. Cette phase, dite phase dispersée, est émulsionnée dans la phase dispersante et agitée jusqu'à évaporation du solvant volatil. Les microsphères obtenues sont alors filtrées sur fritté et séchées dans un dessiccateur. Comme indiqué précédemment, grâce au caractère hydrophobe conféré à la molécule biologiquement activé par greffage sur cette dernière d'un chaînon hydrophobe [RO10-(P)-CO-], l'encapsulation de cette molécule, surtout si elle est hydrophile de nature, est favorisée, ce qui permet d'obtenir des taux d'encapsulation sensiblement supérieurs à ceux obtenus avec la molécule biologiquement active ne comportant pas ce chaînon hydrophobe. En outre, la vitesse de libération de la molécule biologiquement active, en présence d'un milieu aqueux tel qu'un fluide biologique, se trouve considérablement réduite en raison du caractère hydrophobe acquis par suite du greffage dudit chaîne hydrophobe. On ajoutera que le polymère constituant lesdites microsphères et le fragment R10-(P)-CO du conjugué sont de préférence issus du ou des même(s) monomère(s). Ainsi, les microsphères peuvent par exemple être constituées d'un polymère d'acide lactique ou d'acide glycolique, le fragment R1O-(P)-CO- étant alors le reste respectivement d'un polymère d'acide lactique ou d'acide glycolique, protégé ou non au niveau de l'extrémité hydroxyle, ou encore ces microsphères peuvent par exemple être constituées par un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique, protégé ou non au niveau de l'extrémité hydroxyle, le fragment R1O-(P)- CO- étant alors le reste d'un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique, protégé ou non au niveau de l'extrémité hydroxyle. La présente invention est illustrée ci-après par un certain nombre d'exemples non limitatifs. Exemple 1: Préparation du chlorure d'un poly(acide lactique) à 50 % de motifs acide lactique L et 50 % de motifs acide lactique D (en abrégé PLA 50) Dans un tricol muni d'un dispositif d'agitation magnétique, d'un réfrigérant surmonté d'une garde à chlorure de calcium et d'un dispositif de barbotage d'azote, on introduit 5 g d'oligomères (environ 3,1.10-3 moles) d'acide DL-lactique (Mn = 1600) et ml de chlorure de thionyle distillé. Le mélange est chauffé à reflux (80 C) pendant 24 heures. On suit l'avancement de la réaction par spectroscopie infra-rouge, par l'apparition de la bande caractéristique du carbonyle du chlorure d'acide vers 1800 cm-l. Le chlorure de thionyle en excès est évaporé dans un évaporateur rotatif. Le chlorure d'acide obtenu est immédiatement utilisé dans la réaction de couplage, en raison de sa sensibilité à l'hydrolyse. Cc chlorure d'acidc a été caractérisé par spectroscopie infra-rouge IR vu C = O (ester): 1750 cm-' v C = O (chlorure d'acide): 1800 cm-' Exemple 2 Préparation du conjugué entre un poly(acide lactique) et la céphradine et de formule CH-CO-NH NH CH3 GOII i O COOH (P) COOH OH a) Mode opératoire Dans un bécher maintenu à 30 C par un bain-marie, on dissout 10g de céphradinate de sodium (2,7.10-2 moles) dans 250 ml d'eau distillée. Le pH de la solution est amené à 9 par addition de soude 2N. On rajoute 200 ml de dichlorométhane et le mélange est émulsionné par agitation à 13500 trlmin. On rajoute une pointe de spatule de bromure de tétrabutylammonium à titre d'agent de transfert de phase. 5 g du chlorure d'acide de l'exemple 1 (environ 3,1.10-3 moles) dissous dans 50 mil de dichlorométhane sont rajoutés goutte à goutte, le pH étant maintenu aux alentours de 9 par addition simultanée de soude 2N. L'agitation est maintenue 5 minutes après la fin de l'addition du chlorure d'acide, jusqu'à stabilisation du pH (fin de la réaction). Le mélange est alors acidifié par addition d'acide chlorhydrique concentré, jusqu'à pH 2. L'émulsion stable obtenue est "cassée" par addition de 150 nmil d'éthanol absolu. Les deux phases obtenues sont décantées, la phase organique est séchée sur MgSO4 puis évaporée. Le produit visqueux récupéré est lavé à l'éther. On récupère une poudre qui est séchée à l'étuve à température ambiante sous vide. b) Caractérisation de la poudre obtenue (i) Cette poudre est très soluble dans le dichlorométhane, l'acétone et le diméthylformamnide, et soluble dans l'éthanol, contrairement à la céphradine qui n'est pas soluble en milieu organique. Cette même poudre est partiellement soluble dans l'eau distillée (pH 5), la partie soluble correspondant aux fractions de faibles masses moléculaires. Une séparation des espèces constituant la partie soluble dans l'eau distillée a été effectuée en HPLC analytique. Les spectres UV correspondant à chaque pic du chromatogramme sont identiques, et présentent le même maximum d'absorption (261 nm) que celui de la céphradine. Il s'agit d'oligomères couplés de degré de polymérisation croissant. D'autre part, une synthèse directe de céphradine liée à des chaînes ne comportant que un ou quelques motifs d'acide lactique a été réalisée. Le mode opératoire utilisé est le même que celui décrit ci-dessus, le chlorure de poly(acide lactique) étant remplacé par le chlorure d'acide préparé par réaction du chlorure de thionyle avec un mélange constitué par l'acide DL-lactique, le dimère de cet acide et le trimère de cet acide. Le chromatogramme obtenu à partir d'une solution dans l'eau distillée des produits résultant de faibles masses est identique (aux proportions des différentes espèces près), à celui correspondant à la fraction soluble dans l'eau du coniugué obtenu par mise en oeuvre du mode opératoire sous a) ci-dessus. (ii) Les microanalyses de deux lots de conjugués obtenus conformément au mode opératoire sous a) ont conduit à des valeurs proches de celles attendues en théorie, les pourcentages théoriques ayant été calculés en partant de la masse moléculaire des oligomères de départ mesurée par GPC. Théorique Expérimental % C 51,62 50,71 % N 3,93 3,45 % H 5,52 5,64 (iii) L'analyse du spectre infra-rouge du produit obtenu sous a) met en évidence la formation d'une liaison amide: vNH vers 3400 cm', vuC=O à 1663 cm-'. La bande correspondant au vC=O du cycle [-lactame de la céphradine est masquée en raison de la largeur de la bande vC=O caractéristique des groupes ester du chaînon HO-(P)-CO. Le spectre infra-rouge des fractions de faibles masses obtenues par synthèse directe à partir d'acide DL-lactique permet de confirmer l'attribution de la bande à 1663 cm-' au uC=O de la liaison formée; cette bande devient en effet très intense pour les petites masses. D'autre part, une analyse plus fine de la région du spectre comprise entre 1800 et 1650 cm-' permet de mettre en évidence la conservation du cycle [3-lactame lors de la réaction de couplage: la bande caractéristique des liaisons ester reliant les unités lactiques étant moins large dans le cas des petites masses, elle ne masque plus la bande uC=O du cycle j-lactame. (iv) Une analyse par RMN 'H a également permis de confirmer que la réaction de couplage a bien eu lieu. En particulier, si on calcule la valeur de l'intégration d'un hydrogène de la céphradine (par exemple pour le quadruplet du CH2 voisin du soufre vers 3,2 ppm) et celle de l'intégration d'un hydrogène des CH3 des motifs lactiques (pic vers 1,5 ppm), on retrouve approximativement la même valeur, compte tenu de l'approximation de départ sur la masse moléculaire des oligomères. RMN 'H (CDC13) 6 (ppm) ,2 (CH chaîne PLA 50) 4,2 (CH extrémités de PLA 50) 1,4 (CIH3I PLA 50) 1,3 (CH3 extrémités de chaînes) 3,2 (quadruplet du CH2 de la céphradine voisin du soufre) c) Etude de la dégradation du chaînon HO-(P)-CO- La dégradation du chaînon HO-(P)-CO- a été étudiée in vitro selon le protocole suivant: on pèse 50 mg du conjugué obtenu sous a) que l'on introduit dans un flacon contenant 100 ml de tampon phosphate à pH 7,4 et à 37 C. Le flacon est agité par un plateau oscillant dans une étuve à 37 C. Des prélèvements de tampon phosphate sont effectués pendant quinze jours et analysés en HPLC. Au début de l'étude, seule une faible portion du produit correspondant aux conjugués de faibles masses solubles dans le milieu et initialement présent dans l'échantillon considéré est solubilisée dans le tampon phosphate. Au bout de quinze jours, le produit est entièrement solubilisé, le chaînon HO-(P)-CO- s'étant dégradé en donnant des produits de faibles masses solubles dans le tampon phosphate. L'étude par HPLC montre enfin que la dégradation continue une fois le produit en solution dans le tampon phosphate: les chromatogrammes correspondant à des prélèvements effectués au bout d'un jour et au bout de quinze jours mettent en évidence la disparition des espèces de plus hautes masses (celles qui sont le plus retenues sur la colonne), au profit des plus faibles masses dont la concentration augmente dans le milieu de dégradation. Exemple 3: Préparation de microsphères contenant le conjugué de l'exemple 2 Dans un erlenmeyer bouché et muni d'une agitation magnétique, on dissout 1 g de PLA 37,5 GA 25 [copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique comprenant 37,5 % de motifs acide lactique L, 37,5 % de motifs acide lactique D et 25 % de motifs acide glycolique; Mn = 12000, I (indice de polymolécularité) = 3,2] et 1 g de conjugué. La solution organique obtenue est émulsionnée dans un bécher avec une phase aqueuse contenant 250 ml d'eau distillée, 25 g de NaCI et 2 g d'alcool polylvinylique hydrolysé à 88 %. L'émulsion est agitée grâce à une agitation magnétique à 750 tr/minute pendant quatre heures, jusqu'à évaporation complète du dichlorométhane. Les microsphères sont filtrées sur fritté No. 5, lavées à l'eau distillée et séchées dans un dessiccateur. REVENDICATIONS 1. Conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule à hydrogène mobile, caractérisé en ce qu'il répond à la formule RIO -(P)- CO - X - R2 (I) dans laquelle: - RI représente un atome d'hydrogène ou une fonction blocante d'un groupe hydroxyle, - le fragment R10-(P)-CO- représente le reste d'un polymère d'acide hydroxy carboxylique de formule RIO-(P)-COOH, biocompatible et biodégradable, et - le fragment R2-X- représente le reste d'une molécule comportant au moins un atome d'hydrogène mobile et de formule R-XH o -XH est un groupement nucléophile. 2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment R2-X- représente le reste d'une molécule biologiquement active comportant au moins un atome d'hydrogène mobile. 3. Conjugué selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment R1O-(P)-CO- est le reste d'un polymère d'un acide hydroxy carboxylique choisi parmi l'acide lactique, l'acide glycolique, l'acide malique, l'acide citrique et leurs mélanges, l'extrémité hydroxyle de ce polymère étant ou non protégée par une fonction blocante. 4. Conjugué selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le fragment R1O-(P)-CO- est le reste d'un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique. 5. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le polymère d'acide hydroxy carboxylique présente une masse moléculaire d'au plus 30 000. 6. Conjugué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que X représente O, S ou NH. 7. Procédé de préparation du conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend la conversion du groupement - COOH d'un polymère d'acide hydroxy carboxylique, de formule RIO-(P)-COOH, o R. a la même signification que dans la revendication 1, en un groupement réactif -COY o Y représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe alkyle en C1-C4 ou un reste d'ester activé, puis la condensation sur le polymère résultant d'une molécule comportant au moins un atome d'hydrogène mobile et de formule R2-XH o -XH est un groupement nucléophile. 8. Polymère de formule R1O-(P)-COY dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène ou une fonction blocante d'un groupe hydroxyle et Y représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe alkyle en C1-C4 ou un reste d'ester activé et le fragment R10- (P)-CO- représente le reste d'un polymère d'acide hydroxy carboxylique, de formule R1O-(P)-COOH. 9. Polymère selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un chlorure de poly(acide lactique), un chlorure de poly(acide glycolique) et un chlorure d'un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique. 10. Composition pharmaceutique à activité thérapeutique prolongée, caractérisée en ce qu'elle comprend le conjugué entre un polymère biocompatible et biodégradable et une molécule biologiquement active à hydrogène mobile selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, en association avec un véhicule ou support physiologiquement acceptable. 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme de microsphères de polymère biocompatible et biodégradable dans lesquelles est encapsulé ledit conjugué. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que le polymère constituant lesdites microsphères et le fragment R1O-(P)-COdudit conjugué sont issus du ou des même(s) monomère(s).