Brevet FR2705032A1 — publié le 19941118

La présente invention concerne une composition utilisable en thérapeutique humaine et vétérinaire, et plus particulièrement une composition, utilisable notamment comme vaccin, comprenant en combinaison une immunoglobuline et un antigène contre lequel doit s'exercer une réponse immunitaire protectrice. On sait que les individus, déprimés ou déficients, dont le système immunitaire est immature, quelle qu'en soit la cause, sont exposés plus que d'autres aux infections, par exemple respiratoires. Chez un sujet immuno-compétent, les défenses de l'organisme contre ces infections sont assurées, entre autres, par des immunoglobulines à fonction anticorps, sécrétées in situ, tandis que chez un sujet immuno-déficient ou immuno-immature (par exemple un jeune enfant), ces anticorps sont absents, inactifs ou en trop faibles quantités. Ces infections peuvent être traitées de manière classique par la médecine curative, au moyen de médicaments à base de produits chimiques anti-infectieux. On connaît également des traitements préventifs, par immunisation ou vaccination, passive et/ou active. Ainsi, les immunoglobulines polyvalentes extraites du plasma d'adultes cliniquement sains, sont souvent employées par voie parentérale pour lutter contre les déficits immunitaires, mais l'une des principales difficultés réside dans l'efficacité souvent médiocre de ces traitements et de l'instabilité de la réponse, particulièrement à long terme (mémoire immunitaire). Par exemple, la vaccination contre Streptococcus pneumo- niae et Haemophilus influenzae est inefficace lorsqu'il s'agit de protéger des individus immunodéprimés, et en particulier des enfants âgés de moins de deux ans. En effet, les antigènes polysaccharidiques utilisés dans les vaccins classiques ne peuvent pas induire de réponse immunitaire efficace avoir J.M. Borgono et al., "Vaccination and revaccination with polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccines in adult and infants", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 50:14-8- 154(1978)].Aussi on a mis au point des vaccins conjugués anti-HaemoPhilus de type b, associant par liaison covalente des antigènes polysaccharidiques à une molécule protéique, afin de provoquer une réponse immunitaire T-dépendante malgré l'immaturité immunitaire de l'enfant [R. Schneerson et al. "Preparation characterization and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide protein conjugates", J. Exp. Med. 152:361-376 (1980)]. Par contre, il n'existe pas de vaccin conjugué anti Streptococcus pneumoniae, et la prévention contre cet agent infectieux reste un problème crucial, car il constitue la principale cause de pneumonie de l'enfant, nécessitant une hospitalisation, et une pneumonie à S. pneumoniae est le signe d'une infection par le virus HIV dans 48% des cas [M.E. Garcia-Leoni et al. "Pneumococcal pneumoniae in adult hospitalized patients infected with the immunodeficiency virus", Arch. Intern. Med. 152:1808-1812 (1992)]. D'autre part, la demande de brevet WO-A-92/09306 décrit l'utilisation d'immunoglobulines polyvalentes, ou de leurs fragments Fab'2 ou Fab, par voie topique dans le traitement d'infections épithéliales, par exemple des infections bactériennes respiratoires provoquées par des agents bactériens tels que Streptococcus pyoqenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus et Haemophilus influenzae. Les travaux effectués par les inventeurs ont montré de façon inattendue qu'il est possible de protéger passivement des individus, notamment immunodéprimés, en administrant des immunoglobulines spécifiques, en combinaison avec les antigènes de bactéries contre lesquels doit agir la réponse immunitaire protectrice recherchée. On sait que l'administration d'un anticorps (par exemple une immunoglobuline) dirigé contre un antigène d'une bactérie, peut empêcher l'immunisation vaccinale contre cette même bactérie. Or, cet inconvénient n'apparaît pas dans la combinaison de l'invention administrée par voie générale ou par voie locale, associant un anticorps à l'antigène de la bactérie responsable de l'infection que l'on veut traiter, mais au contraire, l'efficacité de la vaccination se trouve renfor- cée. La présente invention a donc pour objet une nouvelle composition utilisable pour le traitement et la prophylaxie d'infections épithéliales provoquées par un agent bactérien ou viral, comprenant en combinaison des immunoglobulines, ou leur fragment Fab ou Fab'2, et l'antigène contre lequel doit s'exercer la réponse immunitaire recherchée. La composition de l'invention peut être administrée par voie générale ou locale, et de préférence par voie locale. L'invention a également pour objet l'utilisation d'immunoglobulines, ou de leur fragment Fab ou Fab'2, dans la préparation d'un médicament pour le traitement et la prophylaxie d'infections épithéliales provoquées par un agent bactérien ou viral, comprenant l'administration conjointe de l'antigène contre lequel doit s'exercer la réponse immunitaire recherchée. Les immunoglobulines utilisées dans la présente invention sont des immunoglobulines polyvalentes monoclonales ou polyclonales, d'origine humaine ou animale, et plus particulièrement des immunoglobulines polyvalentes d'origine humaine, provenant du plasma d'adultes cliniquement sains, ou leurs fragments Fab et Fab'2, quels que soient les modes de préparation et les modifications qui peuvent leur être apportées en cours de préparation. L'anticorps constituant l'immunoglobuline utilisée dans l'invention peut être sous forme purifiée ou non. Les fragments d'anticorps peuvent être obtenus suivant les techniques classiques, par voie chimique ou par digestion enzymatique à partir d'immunoglobulines entières, par voie de synthèse, en particulier à partir de fluides d'animaux, d'hybridomes en culture ou, après introduction dans tout vecteur approprié, par tout virus ou organisme unicellulaire ou pluricellulaire. L'antigène associé aux immunoglobulines peut être issu d'un agent infectieux, par exemple un virus ou une bactérie, d'une toxine (anatoxine), contre lesquels on cherche à protéger l'homme ou l'animal par vaccination ou immunisation, et plus généralement toute préparation chimique ou biochimique obtenue en vue de préparer un vaccin destiné à la prévention en pathologie humaine ou animale. La composition est mise sous forme galénique adaptée au mode d'administration. On peut par exemple préparer une solu tion injectable administrable par voie intraveineuse, mais on utilise de préférence une forme adaptée à l'administration par voie locale, c'est-à-dire une administration non invasive, par exemple par instillation, aérosolisation, pulvérisation, inhalation, ingestion ou encore par voie transdermique, permettant de déposer la composition de l'invention sur les épithéliums tels que les muqueuses respiratoire, oculaire, génitale ou digestive. On utilise de préférence une forme galénique adaptée à l'administration au niveau des voies respiratoires, par exemple par voie nasale. La composition peut encore contenir des excipients et adjuvants usuels, et par exemple des agents tensio-actifs améliorant le contact avec l'épithélium à traiter. Les immunoglobulines, ou leurs fragments Fab ou Fab'2, et les antigènes, constituant la combinaison définie cidessus, sont administrés concurremment, soit au sein d'une composition unique, soit séparément mais à intervalle de temps rapproché, de une à quelques minutes, assurant l'effet recherché d'amélioration de la vaccination. La présente invention procure une protection aussi bien du sujet jeune, et en particulier le jeune enfant, que l'adulte ou le sujet âgé. Le sujet peut être immunocompétent, immunodéficient ou immunodéprimé, quelle que soit la cause du déficit ou de la dépression. Ce déficit peut être iatrogène, consécutif à un traitement, constitutif, pathologique, par exemple lié à une pathologie du système hématopoïétique, d'origine infectieuse, consécutif à une malnutrition, ou être d'origine accidentelle à la suite d'un traumatisme physique ou psychique, d'une intoxication ou d'une irradiation. L'invention s'applique tout particulièrement au traitement et à la prophylaxie d'infections respiratoires provoquées par des agents bactériens tels que Steptococcus pneumoniae et Staphylococcus aureus, en médecine humaine et vétérinaire. Cette protection passive est accompagnée d'une résistance acquise à long terme, analogue à celle obtenue par exemple après vaccination suivant la technique classique. Les expérimentations démontrant l'effet de la composition suivant l'invention ont été réalisées sur un modèle animal utilisant la souris Balb/c, immunodéprimée expérimentalement par injection de cyclophosphamide. On a ainsi démontré que la prolifération bactérienne pulmonaire provoquée par une infection respiratoire due à S. pneumoniae et/ou à S. aureus, est jugulée par l'administration générale ou locale d'immunoglobulines (notamment des immunoglobulines sériques humaines), ou de leurs fragments à fonction anticorps, préalablement titrés avec les agents responsables des infections expérimentales. Des animaux convalescents, appartenant à des lots d'animaux traités et non traités, ont été réinjectés à une dose létale, quelques semaines après le premier essai, à l'aide du même agent infectieux. On a alors constaté que les animaux convalescents d'une infection traitée comme ci-dessus étaient nettement plus résistants que les animaux convalescents d'une infection non traitée. Les animaux traités par voie générale, par exemple par voie intraveineuse (i.v.), ou par voie locale, par exemple par voie intranasale (i.n.), à l'aide d'immunoglobulines, ou de leurs fragments, conformément à l'invention, ont donc acquis une mémoire immunitaire de type vaccinal supérieure à celle obtenue chez des animaux convalescents non traités. Cet accroissement significatif de la protection vaccinale est accompagné d'un accroissement significatif du titre des anticorps spécifiques des agents infectieux utilisés chez les animaux traités. Les titres des anticorps dirigés contre les immunoglobulines d'origine humaine utilisées pour le traitement, ne sont pas significatifs si l'on fait appel à des fragments d'immunoglobulines. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus en détail dans la description suivante relative à des exemples préférentiels de compositions à base d'immunoglobulines et d'antigènes associés. Les exemples sont illustrés par les figures ci-jointes qui représentent Figure 1 : la détection d'anticorps anti-S. aureus et d'anticorps anti-Pn40 dans le sérum de souris immunodéprimées infectées par Pn40 et traitées par une composition suivant 1' invention. Figure 2 : la détection d'anticorps anti-Fc, d'anticorps anti-F(ab')2 et d'anticorps anti-IVIG dans le sérum de souris immunodéprimées infectées par Pn40 et traitées par une composition suivant l'invention. Figure 3 : la mesure de la concentration bactérienne pulmonaire chez la souris, après infection par Pn40. Méthode La souche bactérienne utilisée est une souche de S. pneumoniae appelée Pn40 (sérotype 14 S) fournie par T. Horaud (Institut Pasteur). (Collection IPP 10/53 - Collection CEB 90/10) Les immunoglobulines polyvalentes humaines (IVIG) utilisées proviennent de Biotransfusion. Les fragments F(ab')2 ont été obtenus à partie des IVIG par digestion pepsique et purification par chromatographie d'affinité sur protéine A sépharose. Des souris femelles Balb/c de 4 semaines (CERJ, Le Genest/St/Isles) immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide (CY), infectées par une dose sublétale de Pn40, traitées ou non (témoins) par des IVIG i.n., (lAg/souris) ou i.v. (10 g/souris), ou des F(ab')2 i.n. (1 ssg/souris) sont gardées en observation pendant 3 semaines. A ce moment-là, leur sérum est testé en ELISA. Dans chaque lot de sérum, correspondant à un pool de 20 souris, sont recherchés des anticorps anti-Pn40 et anti-Staphylococcus aureus 184-15 (souche d'origine humaine), mais aussi anti IVIG, anti-fragment Fc et anti-fragments F(abt)2 humains. Puis 1 semaine plus tard, c'est-à-dire 1 mois après la première infection, tous les animaux sont à nouveau immunodéprimés, et ré-infectés par Pn40. Les animaux ne reçoivent alors aucun traitement. L'évolution de la concentration bactérienne est suivie dans chaque groupe quotidiennement. Résultats Des anticorps anti-Pn40 ont été trouvés dans tous les groupes de souris, traités ou non, mais dans des proportions variables, comme le montre la figure 1. Les souris traitées par les F(ab')2 i.n ont développé une réponse anticorps spécifique plus élevée que les souris traitées par les IVIG i.n. Viennent ensuite, par ordre décroissant d'intensité de l'épreuve ELISA anti-Pn40, le lot des souris traitées par voie veineuse, puis les souris témoins, qui développent la réponse la plus faible. L'absence d'anticorps anti-S. aureus 184-15 prouve la spécificité de la réponse immunitaire chez ces souris survivantes d'une primo-infection par le pneumocoque. Seuls les animaux ayant reçu les IvIg entières ont fabriqué des anticorps anti-humains. La présence chez ces mêmes souris d'anticorps anti-Fc prouve que ce domaine de la molécule d'IG humaine est immunogène pour la souris, les fragments F(ab')2 n'induisant qu'une faible réponse. La réponse souris anti-Fc des IG humaines semble plus intense après administration locale que systémique (figure 2). Ceci suggère soit une demi-vie supérieure des IG humaines à la surface de l'épithélium que lors d'une dissémination par voie sanguine, soit une association plus étroite avec les cellules accessoires dégradant et présentant cet antigène. La vérification par ELISA montre qu'aucun résidu d'immunoglobulines humaines n'était décelable dans les différents lots de sérum. Les valeurs des densités optiques lues sont reportées dans le tableau I TABLEAU I Recherche d'IVIG humaines résiduelles dans les pools de sérum 3 semaines après le traitement des souris. La densité optique est lue à 414 nm. Sérum F(abt)2 i.n IvIg i.n. IvIg i.v/ PBS i.n PBS i.v Témoin + négatif 1 ptg 1 L 10 L de plaque 0,005 + 0,0085 + 0,003 + 0,0075 + 0,0035 + 0,0025 + 2,324 + 0,003 0,0025 0,004 0,004 0,0005 0,003 0,109 Aucune trace d'Ig humaine n'est décelable dans les sérums de souris. L'état des souris re-infectées par Pn40 evolue vers la guérison, avec une rapidité proportionnelle à la qualité de la réponse anticorps spécifique détectée avant la réinfection (figure 3). La concentration bactérienne pulmonaire résiduelle 48 heures après l'infection a été mesurée. Les animaux traités par immunothérapie (locale ou systémique) sont presque tous guéris : on retrouve au maximum 5x102 UFC/ml, chez les souris ayant reçu les IVIG par i.v. Les lots "F(ab')2 i.n". et "IVIG i.n." sont très proches de la limite de détection (102 UFC/ml). Seules les souris qui ont survécu sans autre traitement que du tampon phosphate NaCl (PBS) à la première infection, n'ont pas réussi à éliminer lrinoculum de départ qui se maintient à environ 105 UFC/ml. L'importante barre d'erreur (+ 1 log) indique que la qualité de la réponse immunitaire induite lors du premier contact avec Pn40, est variable au sein de ce groupe de souris. L'analyse sérologique, menée sur un pool de sérum a masqué ces différences individuelles. Ces observations sont dues seulement au stock d'anticorps anti-Pn40 constitué par chaque souries, puisqu'aucune trace d'IG humaines résiduelles n'a été décelée dans les sérums. L'inoculum de départ a proliféré à la vitesse de 1 log par 24 heures chez les souris immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, et n'ayant jamais été en contact avec le pneumocoque : ce groupe constitue le témoin positif de manipulation. REVENDICATIONS 1. Composition utilisable pour le traitement et la prophylaxie d'infections épithéliales provoquées par un agent bactérien ou viral, comprenant en combinaison des immunoglobulines, ou leur fragment Fab ou Fab'2, et l'antigène contre lequel doit s'exercer la réponse immunitaire recherchée. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les immunoglobulines sont des immunoglobulines polyvalentes d'origine humaine, ou leurs fragments Fab et Fab '2. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est sous forme galénique adaptée à l'administration par voie locale. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle sous forme administrable par instillation, aérosolisation, pulvérisation, inhalation, ingestion, ou par voie transdermique. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est sous forme galénique adaptée à l'administration par voie générale. 6. L'utilisation d'immunoglobulines, ou de leur fragment Fab ou Fab'2, dans la préparation d'un médicament pour le traitement et la prophylaxie d'infections épithéliales provoquées par un agent bactérien ou viral, comprenant l'administration conjointe par voie locale de l'antigène contre lequel doit s'exercer la réponse immunitaire recherchée. 7. L'utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les immunoglobulines, ou leur fragment, et l'antigène sont administrés concurremment.