Brevet FR2705149A1 — publié le 19941118

La présente invention concerne le domaine de l'élec- trophorèse sur gel sur plaque verticale. En particulier, l'invention concerne les problèmes posés par les gels en plaques extrêmement minces, et l'utilisation de "peignes" pour la formation d'une multitude de cellules pour la disposition des échantillons et la délimitation des voies suivies par chaque échantillon pendant sa migration dans le gel. Parmi les nombreuses considérations de réalisation d'un appareil d'électrophorèse sur gel sur plaque verti- cale, il est nécessaire de charger les échantillons d'une manière fiable et reproductible afin qu'un nombre maximal d'échantillons puissent être séparés simultanément sur un seul gel, chacun ayant une résolution à bandes nettes. Les gels en plaques sont habituellement formés par raccordement de deux lames de verre avec des entretoises aux deux bords verticaux pour l'établissement d'un espace d'épaisseur prédéterminée entre les lames. Celles-ci sont serrées le long des bords verticaux et un joint d'étan- chéité est placé au bord inférieur ouvert. L'espace est alors rempli de la solution de gel, et le gel peut durcir. Dans certains gels sur plaques, un élément rapporté destiné à former des cavités, appelé dans l'industrie "peigne" ou "gabarit", est placé le long du bord supérieur ouvert de la solution de gel avant que le gel ne durcisse, les dents du peigne pénétrant dans l'espace compris entre les lames. Après le durcissement du gel, le peigne est retiré afin qu'il laisse une ligne de cellules formées dans le gel le long de son bord supérieur pour le chargement des échantillons. Dans d'autres gels en plaques, notamment ceux dont l'épaisseur est inférieure à 0,4 mm, on utilise un type différent de peigne qui est placé entre les lames après que le gel a durci et qui est laissé en place au cours de l'électrophorèse. Ce peigne est habituellement appelé "peigne à dents de requin" car ses dents sont pointues. Lorsque le gel a durci, le peigne est introduit entre les lames de manière que les bouts des dents soient au contact du bord supérieur du gel. Les espaces en V inversé sont formés entre les dents du peigne et chacun est utilisé comme cellule pour la disposition d'un échantillon qui doit5 être soumis à la séparation par électrophorèse. Dans les structures dans lesquelles des peignes à dents de requin sont utilisés, les lames qui retiennent le gel ont souvent des hauteurs différentes, une lame étant placée un peu au-dessus de l'autre. Le bord supérieur du gel est placé à une faible distance au-dessous du bord supérieur de la lame la plus courte. Le peigne en dents de requin est introduit entre les lames de manière que les espaces en V retourné formés entre les dents dépassent au- dessus de la lame plus courte mais non de la lame la plus haute qui ferme alors un côté. Des portions d'échantillons liquides sont alors introduites dans les espaces, par les côtés ouverts, et s'écoulent dans la région comprise entre les lames au-dessus du gel et forment des mares indivi- duelles séparées par les dents. Comme les dents sont étroites à leurs extrémités pointues, les échantillons, bien qu'ils soient séparés, sont très proches et forment essentiellement des voies contiguës. Des gels extrêmement minces (ultraminces), c'est-à- dire de 0,13 mm, ne permettent pas l'utilisation des peignes en dents de requin du type décrit dans le dernier paragraphe. Des peignes ayant une épaisseur aussi faible seraient extrêmement délicats à manipuler et risqueraient beaucoup d'être détériorés, et les cellules formées entre les dents seraient si étroites que la disposition des échantillons serait difficile, sinon impossible. La présente invention concerne ces problèmes ainsi que d'autres de nature analogue. La présente invention concerne une combinaison d'une enceinte de gel en forme de plaque et d'un peigne à échan- tillons, le peigne à échantillons contenant des rigoles qui, lorsque le peigne est introduit dans l'enceinte du gel, forme des cellules pour les échantillons avec un profil qui a une dimension qui diminue vers le gel. Les cellules sont ainsi relativement larges à la partie supé- rieure et facilitent l'introduction des échantillons, elles permettent la retenue d'un échantillon de dimension impor-5 tante, et elles sont étroites à la partie inférieure afin que l'échantillon soit dirigé dans le gel ultramince retenu entre les lames. Dans un premier mode de réalisation, les parois de l'enceinte s'écartent vers l'extérieur le long du bord auquel les échantillons sont introduits pour la formation d'un profil en coin, et le peigne à échantillons a un profil complémentaire en coin à son bord denté afin qu'il pénètre dans le coin formé par les parois de l'enceinte du gel. Les dents du peigne ont ainsi un profil en coin (c'est-à-dire dans la section perpendiculaire au plan du peigne). Une gorge ou rigole perpendiculaire au bord du peigne (parallèle aux dents) est placée entre les dents adjacentes de chaque paire, et forme ainsi une cellule en forme de coin pour l'échantillon, ayant une partie supé- rieure dont la profondeur avant-arrière est bien supérieure à la largeur de l'espace du gel dans lequel est logé le gel de la plaque. Grâce à l'utilisation d'un profil en coin à la fois pour l'enceinte du gel et le peigne à échantillons, tous les avantages du peigne à dents de requin sont obte- nus, sans les problèmes posés par les essais d'utilisation d'un peigne à dents de requin ayant la même épaisseur qu'un gel ultramince. Selon des caractéristiques préférées du premier mode de réalisation, une barre d'arrêt en forme de coin a un profil analogue à celui du peigne à échantillons mais n'est ni encochée de manière qu'elle ne forme pas les dents du peigne à échantillons, ni munie de gorges afin qu'elle ne forme pas les rigoles à échantillons. Cette barre d'arrêt se loge dans le coin formé par les parois de l'enceinte de la même manière que le peigne, mais elle est utilisée comme bouchon pendant la coulée du gel afin que le gel possède un bord supérieur rectiligne. Après la coulée du gel, la barre d'arrêt est retirée et remplacée par le peigne à échantil- lons, et les échantillons sont placés dans les cellules individuelles pour l'électrophorèse. Dans un second mode de réalisation, le porte-échan- tillons n'a pas de profil en forme de coin, mais il a au contraire des gorges dont la largeur diminue d'une première extrémité à l'autre. Les parois de l'enceinte de ce mode de réalisation ont des hauteurs qui ne sont pas égales, et le porte-échantillons est en appui sur le bord supérieur de la paroi inférieure, l'extrémité inclinée de chaque gorge étant placée directement au-dessus de l'espace du gel. Une barre d'arrêt de forme- analogue, placée dans les gorges, est incorporée dans les réalisations préférées de ce mode d'exécution. De préférence, les gorges du peigne sont espacées régulièrement à des intervalles inférieurs à 6,35 mm et sont en nombre au moins égal à dix. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux de la description qui va suivre d'exemples de réalisation, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une vue éclatée d'une extrémité d'un mode de réalisation de l'invention, représentant deux lames transparentes, l'une de deux bandes d'entretoise et à la fois la barre d'arrêt et le peigne porte-échantillons; la figure 2 est une coupe en élévation latérale des lames transparentes et d'une bande d'entretoise de la figure 1, suivant la ligne 2-2 de la figure 1; la figure 3 est une vue des éléments représentés sur la figure 1 sous forme assemblée, mais sans la barre d'arrêt mais avec des parties supplémentaires utilisées pendant un essai d'électrophorèse; la figure 4A est une vue en élévation frontale d'un peigne porte-échantillons alors que la figure 4B est une vue détaillée de la partie cerclée de la figure 4A et la figure 4C est une coupe suivant la ligne C-C de la figure 4B; et la figure 5 est une vue éclatée d'un second mode de réalisation de l'invention représentant les deux lames transparentes, une troisième lame formant la chambre tampon supérieure, ainsi que la barre d'arrêt et le peigne porte- échantillons. La demi-vue éclatée de la figure 1 représente la moitié gauche d'une enceinte 11 destinée à contenir un gel et constituée essentiellement de deux lames transparentes 12, 13 et d'une bande 14 d'entretoise. Parmi les deux lames, l'une 12 a un tronçon central 15 à évidement formé le long d'un bord si bien que les deux lames ont des hauteurs différentes dans ce plan de coupe, lorsqu'elles sont placées verticalement avec ce bord à la partie supé- rieure. Ceci facilite la formation d'une chambre supérieure tampon (non représentée) qui comprend une solution tampon d'électrode qui est au contact du bord supérieur du gel, entre les lames. La configuration de cette chambre est évidente d'après la figure 3 et on la décrit en détail dans la suite. Un épaulement 16 qui dépasse au-dessus du bord vertical gauche donne aux deux lames une même hauteur le long de ce bord. Il faut noter que cette représentation est tronquée à droite, les deux lames se poursuivant à droite au-delà de la figure avec un épaulement et une bande d'entretoise au bord 3 (non représentée), comme au bord gauche. De manière classique dans le cas des gels en plaques verticales, la bande d'entretoise 14 et la bande correspon- dante placée au bord 3 déterminent la largeur de l'espace compris entre les deux lames et donc l'épaisseur du gel. Pendant l'utilisation, les deux lames et les deux bandes d'entretoise sont maintenues en coopération par des pinces (non représentées sur les dessins) le long des deux bords verticaux, avec compression des lames contre les bandes d'entretoise. On connaît dans la technique diverses confi- gurations de pinces qui sont utilisées de façon générale, et une pince de type quelconque peut être utilisée dans la structure représentée sur le dessin. Les deux lames 12, 13 ont une surface plate, mis à part la lame 12 ayant le bord évidé puisqu'elle a un bord chanfreins ou incliné 21 le long du tronçon évidé 15. Comme l'indique la figure 2, ce bord fait un angle aigu 22 avec5 un plan horizontal (c'est-à-dire avec l'axe perpendiculaire à la surface de la lame). Sur la figure 2, les deux lames 12, 13 et la bande d'entretoise 14 sont représentées en contact mutuel, le bord chanfreiné 22 de la lame avant et la surface interne plate 23 de la lame arrière 13 formant ensemble une ouverture 24 en forme de coin qui conduit à l'espace 25 du gel délimité par les deux lames et les deux bandes d'entretoise. On se réfère à nouveau à la figure 1; deux éléments rapportés sont représentés au-dessus du bord supérieur de l'enceinte 11 du gel. L'un constitue la barre d'arrêt 31 utilisée pendant la coulée du gel et l'autre le peigne porte-échantillons 32 utilisé au cours de l'électrophorèse. Ils ont tous deux la même forme périphérique, le peigne se distinguant par les gorges et encoches indiquées précédem- ment, comme décrit plus en détail dans la suite. Le profil de chaque élément rapporté, c'est-à-dire le contour de sa section dans un plan parallèle aux bords 33, 34 d'extrémité des éléments rapportés et perpendiculaire aux faces 35, 36, comprend un bord inférieur chanfreiné ou en forme de coin 37, 38. Ces bords forment le même angle que l'ouverture 23 en forme de coin (figure 2) le long du bord supérieur de l'enceinte du gel si bien que chacun des éléments rapportés s'ajuste intimement à la partie supérieure de l'enceinte du gel. Les profils des éléments rapportés comportent chacun une rigole inversée 41, 42 destinée à loger le bord supé- rieur 43 de la lame 13 qui n'est pas évidée. Deux vis commandées manuellement (non représentées sur le dessin) placées aux faces arrière de chaque élément rapporté (c'est-à-dire aux faces opposées aux grandes faces repré- sentées sur la figure) sont utilisées pour la fixation de l'élément rapporté en position et sa stabilisation pendant l'utilisation. La vue de la figure 3 représente les lames transpa- rentes 12, 13, l'entretoise 14 et le peigne 32 assemblés avec deux éléments supplémentaires, une lame conformée 51 destinée à délimiter la chambre tampon supérieure, et un réservoir 52 destiné à former la chambre tampon inférieure. La lame conformée a un bord supérieur 53 qui est incliné vers l'extérieur, un épaulement 54 qui dépasse vers l'intérieur le long du bord inférieur, et un épaulement 55 qui dépasse vers l'intérieur, le long du bord latéral gauche. Un épaulement analogue dépassant vers l'intérieur est placé le long du bord latéral droit, mais comme cette vue est tronquée à droite, cet épaulement n'est pas visible sur le dessin. Ces épaulements 54, 55 délimitent un espace ouvert 56 placé entre la lame conformée 51 et la surface externe de la lame évidée 12. Les surfaces formées le long des épaulements et descendant le long des bords latéraux de la lame conformée 51 qui sont au contact de la surface externe de la lame évidée 12 forment un joint étanche aux liquides grâce à une garniture ou un organe adhésif d'étan- chéité (non représenté). Au cours de l'électrophorèse, cet espace libre 56 est rempli de la solution tampon pour électrode, et est utilisé comme chambre tampon supérieure. La solution qui remplit cet espace est au contact du peigne 32 et du bord supérieur du gel. Le réservoir 52 est un réceptacle en forme de rigole, la vue du dessin étant tronquée à droite, comme sur les autres éléments représentés. Au cours de l'électropho- rèse, le réservoir 52 est rempli d'une seconde solution tampon d'électrode et est utilisé comme chambre tampon inférieure. Les bords inférieurs des lames transparentes 12, 13 formant l'enceinte contenant le gel et en consé- quence le bord inférieur du gel lui-même, qui est exposé, sont immergés dans la solution de ce réservoir. Le procédé de montage des lames et des bandes d'entretoise pour la formation de ce qu'on appelle couram- ment un "sandwich de gel", de serrage d'un dispositif de coulée à la partie inférieure du sandwich de gel, le dispositif ayant un pore central pour l'introduction de la solution de gel, d'introduction de la solution de gel par le pore formé dans l'espace 24 (figure 2), d'introduction de la barre d'arrêt à la partie supérieure du sandwich de gel et le moulage du gel, de remplacement de la barre d'arrêt par le peigne, et de disposition de l'enceinte dans une cellule d'électrophorèse qui contient le réservoir inférieur 52, et les électrodes, l'alimentation, les connexions électriques et les organes de commande et, éventuellement, de programmation qui sont nécessaires sont bien connus dans la technique de façon générale, et ces procédés bien connus peuvent être appliqués pendant l'uti- lisation de cet appareil. La figure 4A représente le peigne porte-échantillons 32 sous forme agrandie. Le bord inférieur de ce peigne (dans la représentation de cette figure), c'est-à-dire le bord placé au contact de la plaque de gel, a des encoches formant les dents 61 dont les pointes constituent les divisions entre les voies des échantillons individuels dans la plaque de gel. Entre les dents adjacentes de chaque paire, des gorges ou rigoles 62 forment des cellules dans lesquelles les échantillons sont disposés. Dans la vue détaillée de la figure 4B, deux dents adjacentes sont représentées avec la même représentation que sur la figure 4A. Cette vue est tournée de 90 sur la figure 4C afin que le profil des dents apparaisse. Comme l'indique la figure 4B, la rigole 62 est centrée entre deux dents adjacentes. La surface avant de chaque dent a une partie 63 de surface qui est parallèle au plan du peigne dans son ensemble, c'està-dire qui est verticale lorsque le peigne est maintenu verticalement, et une partie 64 de surface qui est inclinée vers l'arrière, vers la surface arrière 65 et forme un bord dont la dimension diminue progressivement. L'angle 66 de cette partie inclinée 64 est égal à l'angle 22 du bord chanfreiné 21 de la lame avant 12 de l'enceinte du gel (voir figure 2). Ainsi, lorsque le bord incliné du peigne est introduit dans l'ouverture en forme de peigne 24 formée entre les deux lames (figure 2), la surface inclinée 64 et la surface arrière 65 du peigne sont au contact du bord incliné de la lame avant et de la surface plate interne 23 de la lame arrière respectivement. Une cellule à échantillon est ainsi formée et elle est aussi profonde (c'est-à-dire aussi haute sur la vue des dessins) que la hauteur des tronçons de surface inclinée des dents, et elle est délimitée par l'espace compris entre les tronçons de surface inclinée de deux dents adjacentes et entre le bord chanfreiné 21 de la lame avant et la surface interne plate 23 de la lame arrière. Le bout 67 de chaque dent peut être une pointe aiguë ou une pointe émoussée, mais il est en général suffisamment étroit pour pénétrer dans l'espace 25 du gel (figure 2) entre les deux lames. Dans une variante, si le bout est trop large pour dépasser dans l'espace du gel, il perce encore le gel lorsque le bord correspondant de dimension variant progressivement de la barre d'arrêt 31 (figure 1) est encore plus émoussé. Dans tous les cas, les bouts des dents se terminent plus bas (c'est-à-dire plus profondément dans le gel) que le bord de dimension variant progressi- vement de la barre d'arrêt de manière que les dents percent le gel lorsque le peigne est introduit. Mis à part le degré d'émoussement du bord de dimension variant progressivement, la barre d'arrêt 31 a le même profil en coupe que le peigne porte-échantillons, mais ne contient pas les encoches formant les dents ou les gorges. La barre d'arrêt de ce mode de réalisation contient cependant une série de trous allongés 44 qui donnent de la légèreté et de la souplesse à la barre d'arrêt. Ceci permet à la barre d'arrêt d'être formée d'un matériau relativement rigide, par exemple le polyéthylène. La figure 5 représente un autre mode de réalisation de l'invention. Dans ce cas, comme dans le mode de réalisa- tion des figures précédentes, les deux lames transparentes 81, 82 n'ont pas la même hauteur, la chambre tampon supé- rieure étant formée par une lame conformée 83. Dans ce mode de réalisation cependant, la lame transparente plus courte 81 a un bord supérieur horizontal ou de niveau 84 et non un bord incliné vers l'extérieur. Le porte-échantillons 85 a un profil rectangulaire, indiqué par la configuration de son bord 86 d'extrémité, et non un profil chanfreiné ou en coin. Le bord horizontal inférieur 87 du porte-échantillon est en appui sur le bord horizontal supérieur 84 de la lame relativement courte et forme un joint étanche à l'eau. Les gorges 88 du porte- échantillons débouchent du côté tourné vers la lame la plus haute 82 de l'enceinte du gel et non vers la lame la plus courte, et chaque gorge a un profil de dimension variant progressivement, délimité par une paroi arrière qui forme une fourche et délimite des segments supérieur 89 et inférieur 90. La profondeur de la gorge du bord supérieur 91 du porte-échantillon est ainsi supérieure à celle du bord inférieur 87, et la profondeur au bord inférieur est de façcon générale très proche de l'épaisseur du gel déli- mitée par l'espace séparant les deux lames 81, 82 ou légèrement supérieure ou inférieure. Une barre d'arrêt 92 utilisée dans ce mode de réalisation a de même une section rectangulaire, l'épaisseur étant égale à celle du porte- échantillons. Les bandes d'entretoise, le réservoir de solution tampon inférieur et le dispositif de maintien des parties en coopération de manière étanche aux liquides ne sont pas représentés sur la figure mais sont incorporés à la struc- ture. Ces éléments peuvent être identiques ou analogues à ceux qui sont représentés dans le cas du mode de réalisa- tion des figures précédentes, et ils peuvent être remplacés par des éléments dont la construction apparaît facilement aux hommes du métier. Les dimensions et dispositions des encoches, gorges et autres éléments de surface du peigne peuvent beaucoup varier dans le cadre de l'invention. Lors de l'utilisation de lames de hauteurs différentes comme indiqué sur la figure, l'épaisseur du peigne est de préférence pratiquement égale ou supérieure à l'épaisseur de la lame courte. Les peignes ont en général au moins dix gorges et de préférence au moins trente, et forment ainsi un nombre égal de cellules pour les échantillons. Dans un mode de réalisation actuellement préféré, le peigne et les lames ont la configuration des figures 1 à 4C, le peigne ayant une largeur totale de 14,68 cm, avec trente-quatre dents 61 dont les pointes 67 sont séparées par une distance de 4,32 mm; l'angle 22, 66 du bord chanfreiné et des surfaces inclinées des dents est de 45 , et l'angle 68 des dents adjacentes (figure 4B) est égal à 53 , alors que l'épais- seur du peigne 69 est de 4,75 mm, l'épaisseur 70 de chaque gorge ou rigole est de 3,23 mm, la largeur 71 de l'extré- mité émoussée de chaque dent est de 0,15 mm, et la profon- deur 72 de l'extrémité émoussée de chaque dent est de 0,076 mm. La dimension mesurée au bord émoussé de dimension variant progressivement sur la barre d'arrêt 31 correspon- dant à la profondeur 72 du bord émoussé de chaque dent est de 0,46 mm. Les peignes du type décrit dans le présent mémoire peuvent être utilisés pour des plaques de gel d'épaisseur quelconque, mais ils sont particulièrement utiles pour des plaques de gel dont l'épaisseur est inférieure ou égale à 0,127 mm, surtout des gels dont l'épaisseur est comprise entre 0,0254 et 0,102 mm. Comme indiqué précédemment, l'épaisseur du gel est déterminée par les bandes d'entre- toise utilisées. Les matériaux utilisés pour le peigne et la barre d'arrêt ne sont pas primordiaux et ils peuvent beaucoup varier, et il suffit qu'ils puissent être mis à la configu- ration voulue pour la formation d'un joint pratiquement étanche à l'eau au contact des lames transparentes desti- nées à former les cavités d'échantillons, et qu'ils soient inertes vis-àvis de toutes les matières avec lesquelles le peigne et la barre d'arrêt viennent en contact pendant l'utilisation, tout en permettant la polymérisation de la solution du gel sans empêcher la réaction de polymérisation. Un matériau actuellement préféré est un caoutchouc dur pour le peigne et un polyéthylène pour la barre d'arrêt. Les lames transparentes et les éléments restants de l'appareil sont formés des matériaux5 classiques, la seule considération étant qu'ils sont suffisamment rigides pour garder leur configuration pendant l'utilisation et possèdent des propriétés de non conduction de l'électricité et d'inertie chimique vis-à-vis de toutes les matières avec lesquelles ils viennent en contact pendant l'utilisation. Le verre ou les polymères tels qu'un polycarbonate suffisent en général. La description qui précède n'est qu'un exemple et les hommes du métier peuvent facilement noter que les matériaux, configurations, dispositions, formes et autres paramètres du peigne, de la barre d'arrêt et des lames transparentes ainsi que des autres éléments de l'appareil d'électrophorèse dans lesquels ils sont utilisés peuvent être modifiés ou remplacés de diverses manières dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Ensemble combiné comprenant une enceinte pour plaque de gel et un porte-échantillons pour échantillons liquides destiné à être utilisé pour des séparations par électrophorèse d'échantillons dans des plaques de gel dont l'épaisseur est inférieure à 0,127 mm, l'ensemble étant caractérisé en ce qu'il comprend: une enceinte pour plaque de gel comprenant deux lames (81, 82) ayant chacune des bords qui, lorsque l'enceinte du gel est orientée verticalement, sont délimités par deux bords latéraux, un bord inférieur et un bord supérieur, les bords latéraux correspondants des deux lames étant raccordés par un dispositif d'entretoise destiné à délimiter un espace pour le gel avec une orientation verticale, les bords supérieurs des lames ayant une hauteur non uniforme avec une ouverture intermédiaire permettant l'accès à l'espace du gel, et un porte-échantillons (85) pour échantillons liquides formé d'une barre allongée délimitée par un bord supérieur allongé, un bord inférieur allongé, des bords latéraux et des surfaces avant et arrière allongées, la barre allongée ayant une section rectangulaire et une série de gorges (88) formées à la face avant et ouvertes aux bords supérieur et inférieur, chacune des gorges ayant une profondeur supérieure au bord supérieur à celle du bord inférieur, la profondeur au bord inférieur étant pratiquement égale à l'épaisseur du dispositif d'entretoise. 2. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que la paire de lames comprend une lame relativement courte (81) et une lame relativement longue (82), et l'épaisseur du porte-échantillons, définie comme étant la distance comprise entre les surfaces avant et arrière, est pratiquement égale ou supérieure à l'épaisseur de la lame relativement courte. 3. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque gorge (88) est délimitée par une paroi arrière et deux parois latérales, la paroi arrière ayant une forme fourchue qui constitue des tronçons supérieur et inférieur, le tronçon supérieur (89) étant parallèle à la surface arrière du porte-échantillons et le tronçon inférieur (90) faisant un angle aigu avec cette surface arrière. 4. Ensemble selon la revendication 1, caractérisé en ce que les gorges sont espacées régulièrement à des intervalles inférieurs à 6,35 mm et sont en nombre au moins égal à dix.