Brevet FR2700778A1 — publié le 19940729

La présente invention a pour objet un milieu sélectif pour le dénombrement des bactéries propioniques. Elle est également relative à un procédé pour le dénombrement de ces microorganismes. Les bactéries propioniques ont un râle essentiel dans l'obtention des caractéristiques organoleptiques spécifiques des fromages à pâte pressée cuite (Emmental-Gruyere-Conte ). Elles interviennent dans la production de C02 à l'origine de la formation des "yeux", dans la production d'acide acétique et surtout propionique à l'origine de la saveur et dans la dégradation peptidasique des dérivés des protéines laitières à l'origine de la flaveur. Ce genre bactérien a été aussi utilisé dans un passé récent pour la production industrielle de vitamine B12. D'autres emplois sont actuellement proposés : production de propionates en bioréacteur ( brevet français n 90 04 985 publication 2.660.932) lesdits propionates étant utilisés pour leurs propriétés antifongiques en panification et en fromagerie , et production de biomasse pour une utilisation en tant que probiotique ( alimentation de la vache laitière conservation d'ensilage). Que ce soit pour ces utilisations ou pour la détermination précise du rôle joué dans les processus d'affinage des fromages à pâte pressée , le progrès des connaissances sur les bactéries propioniques passe par l'existence d'un moyen de dénombrement spécifique , c'est-àdire d'un milieu de culture sélectif. Un tel milieu sélectif n'existe pas à la connaissance du demandeur. Le milieu de référence, couramment utilisé dans l'industrie fromagère, est le YELA. (Yeast Extract Lactate Agar) décrit par Hettinga et al., 1968 ( J. Dairy Science, 51 1707-1709). Ce milieu permet de dénombrer la flore propionique lorsque celle-ci est majoritaire . Il n'est en aucun cas inhibiteur des bactéries lactiques mésophiles et thermophiles qui constituent la flore dominante des fromages à pâte pressée cuite Deux autres milieux basés sur la limitation des nutriments azotés ( remplacement de l'extrait de levure par du sulfate d'ammonium ou un hydrolysat trypsique de caséine: trypticase) et l'apport corrélatif en quantités notables de vitamines (biotine, pantothénate de calcium, acide para amino benzoïque et thiamine) et de sels minéraux essentiels ( Mg++; Mn++ et Fie++ notamment) ont été décrits par Peberdy et Fryer (NZ J.Dairy Science and Techn., 11, 10-15, 1976). Ces milieux dénommés A.S.L.A. ( Ammonium Sulphate Lactate Agar) et T.L.A. (Trypticase Lactate Agar), s'ils présentent une sélectivité relative, nécessitent au moins 10 jours d'incubation en anaérobiose et de plus doivent être utilisés en parallèle pour dénombrer les bactéries propioniques présentes dans les fromages . Ces limitations d'emploi ont été considérées comme non acceptables par les utilisateurs potentiels et l'emploi des milieux ASLA et TLA n'a connu aucun développement. Plus récemment, Cogan et Drinan ( 1992 , J. Dairy Research, 59, 65-69) ont proposé d'ajouter un antibiotique, la cloxacilline au milieu SLA ( Sodium Lactate Agar). Cet antibiotique inhibe la croissance des ferments lactiques présents dans le fromage mais aux dires mêmes des auteurs, n'inhibe pas la croissance des lactobacilles mésophiles, des entérocoques et des Clostridium, microorganismes fréquemment rencontrés dans les fromages. Enfin, on a proposé l'addition de cadmium ou d'un mélange de sels d'arsenic et d'un antibiotique , la Netilmicine, à un milieu lactate agar ( brevet US 5.026.647) Mais ces milieux ne permettent la croissance que d'un nombre limité de souches appartenant à l'espèce P. jensenii et apparaissent inhibiteurs pour les autres espèces de bactéries proopioniques. De plus, il est évident qu'une utilisation généralisée de ces milieux créerait de sérieux risques de toxicité tant pour les manipulateurs que pour l'environnement du fait du rejet d'arsenic et de cadmium. Le demandeur s'est donc attaché à mettre au point un milieu permettant un dénombrement spécifique et rapide des bactéries propioniques à partir d'un échantillon biologique. Il a ainsi montré de manière surprenante qu'un milieu de culture contenant du lithium et des polyols permet un denombrement spécifique des bactéries propioniques. La présente invention a donc pour objet un milieu pour le dénombrement en anaérobiose des bactéries propioniques caractérisé en ce qu'il comprend un milieu complexe complémenté avec au moins un composé de lithium et au moins un polyol. On entend par milieu complexe un milieu comprenant au moins une source multiple de nutriments telle qu'un extrait de levure, un hydrolysat de caséine ou une autre peptone. Cette ou ces sources contiennent une forte proportion d'acides aminés et de petits peptides , ainsi que des vitamines , des sucres , des bases puriques ou pyrimidiques et d'autres facteurs de croissance des microorganismes Préférentiellement, le milieu complexe servant de base a ce milieu de dénombrement est composé de tryptone et d'extrait de levure, par exemple ceux commercialisés par la Société BIOKAR. Un tel milieu , du fait de la présence d'un composé de lithium, inhibe le développement des bactéries lactiques mésophiles et thermophiles sans inhiber la croissance des bactéries propioniques. Ces bactéries peuvent par contre utiliser et biotransformer en acide propionique les polyols contenus dans le milieu Le composé de lithium est préférentiellement compris dans le milieu entre 0,2 % et 2 % en poids du milieu et le polyol est préférentiellement compris entre 0,01 % et 2 % en poids du milieu. Un tel milieu est avantageusement utilisé sous une forme gélosée. I1 comprend préférentiellement comme composé de lithium du lactate de lithium, de l'hydroxyde de lithium ou du chlorure de lithium. Si le milieu contient du lactate de lithium, la concentration de ce sel peut être comprise entre 2 et 20 g/l préférentiellement entre 5 et 15 g/l et encore plus préférentiellement est d'environ 10 g/l. Le polyol préférentiellement contenu dans ce milieu est du glycérol ou de l'érythritol. Avantageusement le milieu comprend de 0,1 à 20 g/l, préférentiellement de 2 à 10 g/l et encore plus préférentiellement environ 6 g/l de glycérol. La présente invention est en outre relative à un procédé de dénombrement de bactéries dans un échantillon biologique par incubation en anaérobiose dudit échantillon ou de ses dilutions décimales dans le milieu précédemment décrit et comptage desdites bactéries, par toute méthode connue de l'homme du métier La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent EXEMPLE 1: Préparation du milieu de dénombrement A 1000 ml d'eau distillée, on ajoute 10 g de tryptone commercialisée par la Société BIOKAR 10 g d'extrait de levure commercialisé par la Société BIOKAR - 10 g de lactate de lithium commercialisé par la Société MERCK - 0,25 g de P04HK2 ( hydrogénophosphate de potassium), 0,05 g de S04Mn(sulfate de manganèse) commercialisés par la Société Merck et 0,05 g de pourpre de bromocrésol, commercialisé par la Société Sigma. D'autres indicateurs colorés de variation de pH tels le bleu de bromothymol, le vert de bromocrésol ou le rouge de méthyle ou de phénol peuvent également être utilisés en lieu et place du pourpre de bromocrésol. La solution obtenue est additionnée de 6 g de glycérol puis ajustée à pH 7,0 par addition de NaOH et gélosée par ajout de 15 g d'agar type E ( produit commercialisé par la Société Biokar) . Elle est portée à ébullition sous agitation pour dissoudre l'agar, est répartie en flacons et est stérilisée par autoclavage 15 minutes à 1200C. EXEMPLE 2: Dénombrement de bactéries. a) Comparaison du milieu de dénombrement selon l'invention avec le milieu YELA. L'aptitude des bactéries propioniques appartenant aux 4 espèces retrouvées en milieu laitier, à se développer sur le milieu de culture faisant l'objet de la présente invention a été testée en comparaison avec le milieu de référence YELA. Le mode opératoire d'utilisation du milieu selon l'invention est le suivant Le milieu gélosé obtenu dans l'exemple 1 a été refroidi à 46"C. 1 ml des cultures obtenues en 48 heures sur milieu YEL ( milieu YELA sans agar ) , ainsi que des dilutions décimales desdites cultures, ont été transférés dans des botes de Pétri stériles et ont été recouverts de 12 ml de milieu. Après homogénéisation soigneuse et solidification sur une surface froide, les boîtes ont été incubées 5 à 6 jours en anaérobiose à 30'C. Les bactéries propioniques se présentent sous forme de colonies lenticulaires ou rondes de diamètre égal ou supérieur à 0,5 mm entourées d'une zone d'acidification de 1 à 5 mm de coloration jaune sur fond mauve. L'aptitude de 42 souches de bactéries propioniques (tableau 1) appartenant à 4 espèces différentes à se développer sur le milieu de culture faisant l'objet de la présente invention a été testée en comparaison avec le milieu de culture de référence YELA. On constate que le milieu de culture faisant l'objet de la présente invention conduit à des valeurs de dénombrement de cultures de bactéries propioniques tout à fait proches sinon identiques à celles obtenues avec le milieu de référence YELA. b) Dénombrement de bactéries de diverses espèces. La sélectivité du milieu faisant l'objet de la présente invention a été testée vis-à-vis de 18 espèces bactériennes (tableau 2) représentatives des flores lactique et contaminante du lait ou de ses dérivés et vis-à-vis de 6 mélanges commerciaux de levains lactiques mésophiles et thermophiles. 1 ml des cultures de 48 h des différentes espèces à tester et des dilutions décimales des dites cultures sont transférés dans des boîtes de Pétri stériles. Le mode opératoire est ensuite le même que décrit précédemment. c) Dénombrement dans du lait. La sélectivité du milieu de culture faisant l'objet de la présente invention a été testée vis-à-vis du milieu de référence YELA sur du lait ultra-propre ( lait écrémé cru microfiltré sur membrane ayant un diamètre de pores de 1,4 microns) additionné de 500 ml d'une culture de bactéries propioniques à 2,6.109 cellules/ml pour 15.000 1 de lait ( ce qui correspond à un ensemencement d'environ I x 105 cellules de bactéries propioniques par ml de lait). Ledit lait a été également ensemencé avec 1 x 106 bactéries mésophiles et thermophiles par ml.Les dénombrements réalisés avec les deux milieux ont conduit aux résultats suivants - milieu YELA : 1,7 x 106 UFC/ml - milieu selon l'invention : 4,5 x 105 UFC/ml Le milieu selon l'invention conduit à un dénombrement de bactéries propioniques très voisin de celui résultant de l'addition de la culture pure au lait alors que le milieu YELA donne une valeur près de 4 fois supérieure. d) Dénombrement dans des fromages à pâte pressée. La sélectivité du milieu de culture faisant l'objet de la présente invention a également été testée sur différents fromages à pâte pressée . Pour ce faire, 10 g de fromage ont été ajoutés à 90 ml d'eau citratée ( solution de 20g de citrate trisodique dans 1000 ml d'eau distillée ajustée à pH 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium). La suspension a ensuite été broyée 3 minutes au Stomacher puis a servi à l'ensemencement des milieux selon l'invention et YELA comme décrit précédemment. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3 ci-après. De par sa sélectivité et son électivité, le milieu de culture faisant l'objet de la présente invention peut permettre 1) de réaliser l'isolement rapide de nouvelles souches de bactéries propioniques qui peuvent ensuite être caractérisées sur leurs aptitudes technologiques ( production de C02, d'acide propionique, de vitamine B12); 2) de déterminer la flore propionique endogène des laits collectés en vue d'ajuster si besoin est, son niveau; 3) de suivre le développement de la flore propionique en fromagerie de pâte pressée. En conclusion l'utilisation de ce milieu permet d'améliorer la qualité globale des fabrications fromageres à pâte pressée ou d'autres nouvelles variétés de fromages. TABLEAU 1 Dénombrement des bactéries proponiques loq UFC/ml Espéce Souche Milieu Milieu selon Couronne d'acidi YELA l'invention fication # en mm P. freudenreichii CIP 5932 8,23 8,26 NA* CIP 103026 7,88 7,80 2 CIP 103027 8,59 8,65 5 CNRZ 81 9,41 9,43 6 CNRZ 89 8,95 8,90 6 CNRZ 728 7,84 8,00 2 CNRZ 434 8,92 9,00 3 CNRZ 277 9,05 8,95 0,5 NCDO 839 9,44 9,45 5 NCDO 853 9,65 9,27 5 NCDO 1081 9,46 9,42 2 NCIB 9885 9,74 9,65 5 DSM 20270 9,69 9,65 5 NCIB 9416 9,61 9,36 1 ATCC 9617 9,46 9,48 5 P. jensenii CIP 103028 8,00 8,08 5 CIP 6435 8,54 8,49 3 CNRZ 83 9,90 9,88 1 CNRZ 79 9,62 9,66 2 CNRZ 87 9,40 9,29 2 CNRZ 730 9,98 10,02 1,5 CNRZ 288 8,52 8,47 1 CNRZ 851 9,89 8,82 2 NCDO 1077 8,78 8,68 2 NCDO 1074 9,49 9,31 0,5 NCDO 1078 8,97 8,91 2,5 non acidifiant TABLEAU 1 (Suite) Dénombrement des bactéries proponiques loq UFC/ml Espéce Souche Milieu Milieu selon Couronne d'acidi YELA l'invention fication # en mm P. thoenii CIP 103029 6,30 6,30 3 CIP 6434 6,60 6,90 2 CNRZ 85 7,92 7,86 2 CNRZ 732 9,93 9,92 2 CNRZ 84 9,94 9,88 1 NCDO 1080 9,06 9,40 3 NCDO 1082 7,81 7,84 peu AC++ p. acidi propionici NCDO 852 8,32 8,24 2 NCDO 1072 8,54 8,65 NA DSM 4900 8,17 8,22 3 DSM 20273 9,00 9,06 6 CNRZ 86 8,54 8,70 5 CNRZ 80 8,08 8,16 1,5 ENT P01 9,13 9,04 2 ENT 4875 9,19 9,22 NA ATCC 25562 7,81 7,65 2 Souches industrielles LABO STANDA lyophilisées 0,1g - 10 ml eau peptonée 2408 9,95 9,89 1 2410 8,23 8,09 3 2500 9,89 9,91 2 2501 10,02 9,99 2 2502 10,02 9,99 2 2503 8,43 8,5 2,5 ++peu acidifiant TABLEAU 2 Appréciation de la sélectivité du milieu Microorganisme Nb Nb de souches/ Croissance Nb de Taille des Acidification Contesté espèces espèces réductions colonies clusions décimales par rap port au milieu YELA Lactococcus 3 2 - - - Lactobacillus 7 1 à 2 sauf Lb fermentum 0 1,5 + Lb fermentum 0 0,3 mm S. thermophilus 1 2 - - Milieu Leuconostoc 1 1 - sélectif lactis 2 + 0 ou 5 0,2-0,3 Brevibacterium 1 2 - mm linens Micrococcus 2 1 + 0 0,2-0,5 mm Citrobacter 1 1 + 0 3-4 mm - Milieu E. coli 1 1 + 0 1 mm - électif Clost. 1 1 + 0 1 mm sporogenes TABLEAU 2 (suite) Appréciation de la sélectivité du milieu Microorganisme Nb Nb de souches/ Croissance Nb de Taille des Acidification Contesté espéces espéces réductions colonies clusions décimales par rap port au milieu YELA Levains commerciaux EZAL MYC 87 2 essais - - - Milieu EZAL MM 101 2 essais + 3-4,5 0,2 mm - sélectif EZAL MA 019 2 essais + 2-4 0,2 mm Flora Danica 1 essai + 5 0,2 mm - Pas de zones d'acidi fication EZAL TA 040 1 essai + 2,5 0,2 mm EZAL TA 060 1 essai + 1 0,2 mm - tailles colonies TABLEAU 3 Fromages Dénombrement UFC/g Milieu selon Milieu YELA l'invention Emmental âgé de 13 j cave 4,9 x 106 7,6 x 106 froide Emmental grand cru commerce 7,0 x 108 1,3 x 109 Beaufort 18 mois d'affinage 3,0 x 104 1,1 x 108 Fribourg suisse commercial 1,3 x 104 1,4 x 106 Morbier 1,1 x 109 2,5 x 109 REVENDICATIONS 1. Milieu pour le dénombrement en anaérobiose de bactéries propioniques caractérisé en ce qu'il comprend un milieu complexe complémenté avec au moins un composé de lithium et un polyol. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu complexe est composé d'un mélange d'hydrolysat de caséine et d'un extrait de levure 3. Milieu selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est gélosé 4. Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,2 % à 2 % en poids du milieu de composé de lithium et de 0,01 % à 2 % en poids du milieu de polyol. 5. Milieu selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le composé de lithium est le lactate de lithium, l'hydroxyde de lithium ou le chlorure de lithium. 6. Milieu selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend entre 2 et 20 g /1 , préférentiellement de 5 à 15 g/l et encore plus préférentiellement environ lOg/l de lactate de lithium. 7. Milieu selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le polyol est du glycérol ou de l'érythritol 8. Milieu selon la revendication 7 , caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,1 et 20 g/l, préférentiellement entre 2 et 10 et encore plus préférentiellement environ 6 g/l de glycérol. 9. Milieu selon l'une des revendications l à 8, caractérisé en ce qu'il est composé environ de - 10 g de tryptone - 10 g d'extrait de levure - 10 g de lactate de lithium - 0,25 g de PO4HK2 - 0,05 g de S04Mn - 6 g de glycérol - 15 g d'agar - 0,05 g de pourpre de bromocrésol - 1000 ml d'eau le pH du milieu étant ajusté à 7. 10. Procédé de dénombrement de bactéries propioniques dans un échantillon biologique , caractérisé en ce que l'on incube sous anaérobiose ledit échantillon ou ses dilutions décimales dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 9 et en ce qu'on effectue de manière connue le comptage desdites bactéries.