Brevet FR2701028A1 — publié le 19940805

La présente invention se rapporte à une séquence nucléique spécifique de Campylobacter jejuni, ainsi qu'aux applications de cette séquence en tant que sonde nucléotidique spécifique pour la détection de séquences de Campylobacter jejuni ou de fragments de cette séquence comme amorces nucléotidiques pour l'amplification d'ADN ou d'ARN de Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique. Les infections à Campylobacter sont très répandues dans le monde entier, affectant aussi bien l'homme que les animaux sauvages ou domestiques. Bien que découvertes au début du vingtième siècle, les bactéries appelées actuellement Campylobacter furent longtemps méconnues, car leurs particularités rendaient leur identification et leur culture difficiles. D'abord isolés chez les ovidés et les bovidés et appelés Vibrio fetus puis, plus tard, Campylobacter fetus, ce n'est qu'à partir de 1946 que les premiers cas de campylobactérioses humaines ont été décrits, mais ce n'est qu'à partir de 1972, lorsque des milieux sélectifs pour Campylobacter ont commencé à être mis au point, que l'importance des infections à Campylobacter a pu être prouvée et reconnue. Depuis la désignation de l'espèce type Campylobacter fetus, une douzaine d'autres espèces et sous-espèces ont été découvertes, le nombre exact variant selon les auteurs et les méthodes taxonomiques, qui proposent souvent de nouveaux critères de classification. Parmi ces espèces, les plus rencontrées en pathologie humaine et/ou animale sont Campylobacter jejuni, Campylobacter coli et Campylobacter fetus. Actuellement, Campylobacter jejuni est considérée comme l'une des causes les plus fréquentes de diarrhée infectieuse chez l'homme. Le "réseau de surveillance nationale des infections à Campylobacter", mis en place en France en 1986, publie chaque année un bilan faisant ressortir les principales données épidémiologiques et cliniques des cas rapportés. Pour les années 1988, 1989 et 1990 par exemple, il apparaît que l'espèce la plus impliquée dans ces infections (de 60 à 75% des cas analysés) était C. jejuni. Dans l'espèce humaine, le symptôme majeur de l'infection intestinale à C. jejuni est la diarrhée qui, dans les cas les plus graves peut entraîner de fortes pertes hydriques, ce qui peut être particulièrement dangereux pour les enfants et les nourrissons, très sensibles à la déshydratation. Cependant, l'entérite à C. jejuni reste souvent sans complications et les diarrhées peuvent même cesser spontanément au bout d'une semaine. Toutefois, les coprocultures peuvent rester positives jusqu'à quelques semaines ou même mois, et, dans 5 à 10% des cas, des rechutes peuvent survenir. Un traitement et un suivi rigoureux s'imposent donc, surtout pour les sujets immunodéprimés ou ayant des maladies graves (SIDA, cirrhose du foie, cancer, leucémie, etc.), chez lesquels les Campylobacter peuvent se comporter comme des bactéries opportunistes. D'autres conséquences des infections à C. jejuni ont également été décrites, bien que plus rares ou exceptionnelles : adénite mésentérique, cholécystite, infections urinaires, méningites, septicémies, érythème noueux ou syndrome de Guillain-Barré, etc. Chez les animaux, les Campylobacter vivent habituellement en commensaux dans le tube digestif de nombreuses espèces : bovins, ovins, porcs, volailles, oiseaux sauvages, chiens et chats. Ces animaux, malades ou porteurs sains, constituent un large réservoir de germes, et donc un risque important de contamination. Dans le cas d'infections évidentes, chez les bovins et ovins, C. jejuni est connu, depuis la première description en 1931, comme étant la cause de la "dysenterie du bétail", qui peut avoir pour conséquence, outre l'effet sur le bétail, la transmission à l'homme à travers la dissémination des germes dans l'environnement des animaux (terre, eaux). Même pour des animaux asymptomatiques, "porteurs sains", la transmission à l'homme peut se faire : soit par contact direct avec ces animaux ou leurs déjections, soit par consommation d'aliments ou d'eaux souillés (viandes contaminées pendant leur préparation et mal cuites, lait non pasteurisé, eau polluée, etc.). Dans une optique de prévention, il est important donc, tant chez l'homme que chez l'animal, de pouvoir identifier le pathogène C. jejuni le plus tôt possible, afin d'empêcher, par des mesures adéquates, toute contamination. Ceci est particulièrement le cas dans l'industrie agro-alimentaire, où des conditions de stérilité doivent être respectées. C'est également important en pathologie humaine, pour effectuer un suivi correct des malades traités à la suite d'une infection à C. jejuni, afin d'éviter toute nouvelle rechute. Enfin, dans le cas d'infections déclarées, il est très important de bien identifier le germe responsable, et ceci rapidement après le déclenchement de la maladie, afin de pouvoir appliquer un traitement correct et efficace qui empêcherait l'évolution de l'infection, voire la propagation d'épidémies. Or, l'identification des Campylobacter et la détermination de l'espèce incriminée n'est pas aisée. En effet, leur isolement nécessite des milieux spéciaux et leur détection classique ne se fait actuellement qu'après un enrichissement par culture d'au moins 48 heures. Ceci est très long lorsqu'un diagnostic rapide est nécessaire.D'autre part, étant donné que le diagnostic microbiologique se fait actuellement par des techniques bactériologiques et/ou biochimiques qui exploitent des différences phénotypiques existant entre les différentes espèces, des erreurs de diagnostic peuvent se produire, surtout lorsque des mutants apparaissent pour un caractère donné. Dans le cas précis de C. jejuni et C. coli, l'unique critère de différenciation est l'hydrolyse de l'hippurate (C. jejuni peut l'hydrolyser alors que C. coli ne le peut pas), et il arrive parfois que cette distinction ne puisse pas se faire, car il existe des souches C. jejuni hippuratenégatives (Hébert et al., J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 138-140, Totten et al., J. Clin. Microbiol., 1987 25, 1747-1752). Des approches utilisant l'hybridation moléculaire pour identifier l'espèce C. jejuni ont été proposées. Cependant, ces méthodes ne permettent l'identification qu'après culture, elles ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter cette bactérie dans les prélèvements biologiques. Ainsi, des méthodes d'identification et de classification des Campylobacter ont été proposées, utilisant soit des sondes radioactives (Ng et al., Mol. Cell. Probes, 1987, 1 233-243), soit des sondes non radioactives (Chevrier et al., J. Clin. Microbiol., 1989, 27 321-326), mais ces méthodes utilisent des sondes génomiques totales et nécessitent un enrichissement par culture du pathogène à détecter, car le seuil de détection est assez élevé, environ 105 bactéries (Chevrier et al., ci-dessus). Des recherches de sondes nucléiques spécifiques de C. jejuni, dans un but de diagnostic d'espèce, ont été faites par Picken et al. (Mol. Cell. Probes, 1987 1, 245-259), Korolik et al. (J. Gen. Microbiol., 1988, 134, 521-529) et Zhou et Wang (Zbl. Bakt., 1989, 272, 186-190), mais il subsiste des problèmes de spéci ficité et les séquences de ces sondes potentielles n'ont pas été déterminées. De même, une autre sonde "spécifique" de C. jejuni, constituée d'un oligomère couplé à la phosphatase alcaline et dont la séquence n'a pas été publiée, a été décrite (Jablonski et al., N.A.R., 1986, 14, n" 15), mais sa spécificité n'a été testée que vis-àvis d'un fragment de C. jejuni et non pas contre le génome entier de C. jejuni et des autres espèces du genre Campylobacter. Récemment, une approche pour identifier C. jejuni par PCR a été décrite, utilisant des oligonucléotides choisis dans le gène fla A de C. coli VC167 (Oyofo et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, n" 10, 2613-2619) ; cependant, cette méthode ne permet pas de distinguer C. jejuni de C. coli. Les inventeurs ont à présent isolé une séquence nucléique utilisable pour la détection spécifique de l'espèce Campylobacter jejuni. La présente invention a ainsi pour objet une séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique génomique de Campylobacter jejuni, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n 1, la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique comportant tout ou partie de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n" 2, et la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. L'invention a également pour objet les produits d'amplification d'une séquence telle que définie ci-dessus. L'invention a également pour objet un vecteur de clonage contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. Les séquences nucléotidiques définies cidessus peuvent être des séquences d'ADN ou des séquences d'ARN. La taille exacte du fragment de séquence SEQ ID n 1 est de 147 pb. Cette séquence est spécifique de l'espèce C. jejuni et n'hybride pas avec 8 autres espèces représentatives du genre Campylobacter. Le fragment de séquence SEQ ID n 2 a une longueur de 1189 pb. et hybride très légèrement avec Campylobacter coli, mais non avec les 7 autres espèces de Campylobacter testées. Une interrogation des banques de données "Genebank" et "EMBL" n'a fait ressortir aucune homologie entre d'une part les séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2 et d'autre part les séquences d'ADN connues. Les séquences SEQ ID n" 1 et SEQ ID n" 2, des parties ou des variants fonctionnellement équivalentes de celles-ci, peuvent être utilisés dans des techniques d'hybridation moléculaire pour la détection et l'identification de Campylobacter jejuni. Les variants fonctionnellement équivalents comprennent des séquences dans lesquelles des paires de bases ont été mutées, délétées, insérées ou substituées, sans que les propriétés essentielles à la spécificité de ces fragments soient affectées. Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont des applications diagnostiques et épidémiologiques en médecine humaine ou vétérinaire, notamment comme sondes nucléiques spécifiques de Campylobacter jejuni ou comme amorces oligonucléotidiques pour l'ampli- fication d'une séquence spécifique de Campylobacter jejuni. Les sondes selon l'invention comprennent avantageusement au moins 20 nucléotides consécutifs parmi les séquences ou les fragments de séquences mentionnés ci-dessus. Les sondes sont des sondes d'ADN ou des sondes d'ARN. Les séquences nucléotidiques décrites dans cette invention peuvent ainsi être utilisées comme sondes pour détecter spécifiquement et de manière directe des souches de Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique. Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (32p, 35S, I 3H, 125I) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromodésoxyuridine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications. Dans ce dernier cas, on pourra utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut etre réalisée de manières diverses (Matthews, J.A. et Kricka, L.J., Anal. Biochem. 1988, 169, 1-25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser 1' acide nucléique extrait des cellules de Campylobacter jejuni sur un support (nitrocellulose, nylon, polystyrène,...) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde...). Dans une autre application, les sondes d'acide nucléique décrites ici peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce procédé, la sonde est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible extrait de C. jejuni. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde de détection marquée par un élément facilement détectable. Lorsqu'une quantité suffisante d'acide nucléique de Campylobacter jejuni peut être extraite à partir des prélèvement à analyser, les séquences décrites dans le brevet sont utilisables pour détecter et identifier les souches appartenant à Campylobacter jejuni directement dans ces prélèvements. Dans le cas contraire, une culture rapide en milieu liquide peut être réalisée avant l'extraction de l'acide nucléique de Campylobacter jejuni, ou bien la petite quantité d'acide nucléique de Campylobacter jejuni extrait du prélèvement peut être soumise à une technique d'amplification comme par exemple la technique PCR. Les séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2 ou les fragments obtenus à partir de ces séquences peuvent également être utilisés pour sélectionner des amorces oligonucléotidiques, notamment pour la technique PCR. Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié (brevet U.S. n 4 683 202). Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont avantageusement une longueur comprise entre 18 et 30 et de préférence 18 et 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaire du brin (+) de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-). Il est important que ces amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre.D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes en particulier avec les acides nucléiques des Campylobacter n'appartenant pas à l'espèce jejuni et avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer le prélèvement. Les amplimères sélectionnés comme amorces spécifiques pour l'amplification de séquences nucléiques de souches appartenant à Campylobacter jejuni sont choisis par exemple en suivant la méthode décrite par Griffais et Coll. (Nucleic Acids Res. 1991, 19, 38873891). A partir de la séquence SEQ ID n" 2, les inventeurs ont choisi des oligonucléotides pour réaliser un test PCR. Grâce à ces oligonucléotides, ils ont obtenu une amplification spécifique de Campylobacter jejuni, aucune amplification n'était visible avec un acide nucléique d'autres Campylobacter. Un couple d'amorces tout particulièrement préféré est représenté par les oligonucléotides VS15 et VS16 issus de la séquence SEQ ID n 2, de séquences Oligo VS15 : 5 GAA TGA AAT TTT AGA ATG GGG 3 Oligo VS16 :: s GAT ATG TAT GAT TTT ATC CTGC 3 Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une électrophorèse capillaire, ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou sur échangeur d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les séquences nucléotidiques SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 2, des fragments de celles-ci, des plasmides contenant ces séquences ou des fragments de celles-ci, des oligonucléotides complémentaires de ces séquences ou fragments de séquences ou des produits d'amplification. Ces sondes peuvent être marquées ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. La présente invention a également pour objet une méthode de détection de la présence des souches de Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes i) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple de fragments oligonucléotidiques dits amorces, tels que définis précédemment, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique des souches appartenant à Campylobacter jejuni ii) amplification de l'acide nucléique des souches de Campylobacter jejuni iii) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces iv) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié, par exemple par hybridation de sonde spécifique, par séquençage ou par analyse de site de restriction. La présente invention a en outre pour objet un kit ou coffret pour la détection de la présence de souches appartenant à Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments suivants - un couple de fragments oligonucléotidiques tels que définis précédemment - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'acide nucléique de souches appartenant à Campylobacter jejuni - éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde nucléique telle que définie précédemment. Ce kit contient plus avantageusement la ou les sondes marquées ou non. Celles-ci peuvent être en solution ou immobilisées sur un support. Le kit peut également contenir les réactifs nécessaires pour la lyse des bactéries et l'extraction des acides nucléiques cibles, ainsi que les solutions d'hybridation et de lavage correspondant à la méthode choisie. L'invention a également pour objet l'utilisaiton d'une sonde nucléique telle que définie ci-dessus comme outil épidémiologique, en épidémiologie moléculaire. En effet, si le fragment spécifique est présent plusieurs fois sur le génome de C. jejuni, sa répétitivité peut servir d'outil pour repérer et classer des souches identiques et, évidemment, pour établir des liens quant à la source et à la propagation de l'infection. L'invention est illustrée plus en détail dans les exemples qui suivent et à la figure annexée, représentant la stratégie de séquençage de la séquence SEQ ID n" 2 (fragment VS 1) EXEMPLE 1 : Construction de la banque génomique de C. jejuni. Criblage de la banque et détermination de la séquence du fragment spécifique L'ADN génomique de C. jejuni CIP (Collection de l'Institut Pasteur) 70.2 est digéré partiellement par l'endonucléase de restriction Hind III en faisant agir 0,06U d'enzyme par pg d'ADN dans le tampon recommandé par le fournisseur pendant 1 heure à 37"C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,5%.Les fragments dont la longueur est comprise entre 30 et 40 kb sont électroélués et précipités en éthanol après extractions au phénol/chloroforme (1/1). Le vecteur est le cosmide réf. pHC79 (fourni par Boehringer). Il est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation. La ligation s'effectue en mélangeant 700 ng de vecteur et 1,5 pg de fragments d'ADN de 30/40 kb, le mélange est laissé à 14"C pendant 18 heures après que l'on ait ajouté 1 unité d'ADN ligase de T4 dans un tampon approprié. Les cosmides recombinants sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries (E. coli HB 101). Les bactéries transformées sont incubées pendant 1 heure à 37"C en milieu LB, puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 25 pg/ml d'ampillicine. Les colonies résistantes à l'ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la tétracycline (le fragment d'ADN de 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tétracycline (Tet) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp)). Il est effectué une mini préparation d'ADN des 60 premières colonies transformantes résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tétracycline (tels) selon la technique de la lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonucléase de restriction Hind III, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%, puis transféré sur des filtres de nylon. L'ADN est fixé de façon irréversible par 3 minutes d'exposition aux UV à 254 nm. Ces différents filtres sont incubés pendant 16-18 heures à 65"C dans un tampon 6X SSC (lX SSC correspond à 0,15M NaCl et 0,015M citrate de Na) contenant 10% de sulfate de dextrane, une solution de Denhardt 5X concentrée (une solution de Denhardt 1X correspond à 0,02% de Ficoll, 0,02% de polyvinylpyrrolidone et 0,02% d'albumine sérique bovine), lOmM EDTA, 0,5% de SDS, 100 pg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon et l'ADN génomique, radiomarqué au 32P par "multipriming" (amor çage multiple), de l'une des trois espèces suivantes C. jejuni CIP 70.2, C. coli CIP 70.80 et C. fetus subsp. fetus CIP 5396. Après hybridation, les filtres sont lavés par exemple pendant 2 fois 10 minutes en 2X SSC à 65"C, 1 fois pendant 30 minutes en 2X SSC + 0,1% SDS à 65"C, et enfin 1 fois pendant 10 minutes en 0,lX SSC à 65"C. Les filtres encore humides sont mis en autoradiographie à 80"C avec écran intensifiant de 15 minutes à 3 jours. Les résultats de ces hybridations ont permis d'isoler un clone cosmidique contenant un fragment d'environ 1,2 kb nommé VS1. Ce fragment a été cloné dans un vecteur pUC18 (commercialisé par Boehringer) et préparé en grande quantité. Le plasmide résultant a été dénommé pVS20. La spécificité du fragment a été vérifiée comme décrit dans l'exemple n" 2. Le fragment VS1 a été cloné dans le phage M13mpl8 et séquencé selon la méthode de Sanger en utilisant le kit de séquençage "Séquénase 2.0" (United States Biochemia Corporation). Certaines parties du fragment VS1 ont été séquencées directement sur le plasmide pVS20, après dénaturation alcaline des deux brins d'ADN. Toutes les réactions de séquençage ont été réalisées avec du dATP marqué au 35S. Le schéma de la figure annexée représente les stratégies suivies pour le séquençage du fragment VS1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 16, 17, 18 représentant les différentes amorces utilisées pour le séquençage, FP et RP étant des amorces universelles complémentaires de l'ADN de pUC18 et de M13mpl8. La séquence entière du fragment est la séquence SEQ ID n 2. La comparaison entre les banques de données "Genebank" et "EMBL" et les 1189 nucléotides du fragment VS1 ainsi déterminés, ne fait ressortir aucune homologie significative avec les séquences connues aujourd'hui. EXEMPLE 2 : Analyse d'ADN par la technique de Southern, en utilisant comme sondes les séquences d'acide nucléique de l'invention La liste et les références des bactéries utilisées dans cette étude sont les suivantes Campylobacter : C. jejuni CIP 70.2 C. coli CIP 70.80 C. lari CIP 102722 C. fetus subsp. fetus CIP 5395 C. fetus subsp. venerealis CIP 6829 C. hyointestinalis C120 C. curvus (Hôpital des Enfants, Bordeaux) C. sputorum subsp. sputorum CCUG 9728 C. sputorum subsp. bubulus CIP 53103 C. concisus 18688 C. fecalis CIP 12014 Non-Campvlobacter : Escherichia coli HB101 Helicobacter pylori CIP 101260 Salmonella typhimurium CJ 53 A. cryaerophilus CCUG 17801. ADN de bactéries n'appartenant pas au qenre Campylobacter : L'ADN de ces bactéries et de C. jejuni utilisé comme contrôle positif a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Hind III, puis les fragments ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur une membrane de nylon Hybond-N. Ces différents fragments d'ADN sont analysés par hybridation moléculaire, en utilisant comme sonde le fragment VS1 marqué au 32P selon la technique du kit "Random primed DNA Labelling" (Boehringer). L'autoradiographie montre que la seule espèce détectée est C. jejuni. Aucune hybridation n'est détectable sur les ADN des espèces noncampylobactériennes, même après 72 heures d'exposition. ADN de bactéries appartenant au genre Campylobacter, autres que C. jejuni Après culture sur milieu approprié (gélose au sang de mouton à 5%, Biomérieux), les Campylobacter sont traités de la manière suivante Les bactéries de chaque boîte de Petri sont récoltées avec 2 ml de tampon TE-glucose (Tris-HCl pH 8 25 mM, EDTA 10 mM, glucose 50 mM), centrifugées pendant 5 minutes à 5000 g, le culot est redispersé et lavé en TE-glucose puis recentrifugé, les bactéries sont resuspendues dans 100 p1 de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) et l'ADN est extrait selon la technique de Pitcher et al. (Lett. Appl. Microbiol., 1989, 8 151156). Les ADN ainsi extraits subissent une digestion totale par l'enzyme Hind III.Les fragments obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% en TAE avant d'être transférés sur membrane de nylon selon la technique de Southern. Les fragments transférés sont analysés par hybridation moléculaire. Dans cet exemple, les sondes utilisées étaient, séparément, le fragment VS2 (de séquence SEQ ID n" 1) et le fragment VS3, obtenus après hydrolyse du fragment VS1 par l'enzyme Bgl II. Ces deux sondes ont été marquées par du 32p. La sonde VS2 détecte spécifiquement l'ADN de C. jejuni et n'hybride pas sur les ADN génomiques d'autres Campylobacter. La sonde VS3 détecte également l'ADN de C. jejuni, mais hybride aussi très légèrement avec un fragment d'ADN situé sur le génome de C. coli. Cette hybridation croisée n'est détectable qu'après 16 heures d'exposition, alors que l'ADN de C. jejuni est détectable après seulement 15 minutes d'exposition. L'ensemble de ces résultats amène à la conclusion que la sonde VS1 (SEQ ID n 2) détecte spécifiquement l'ADN de C. jejuni parmi des ADN de bactéries d'autres genres, et que le fragment VS2 (SEQ ID n 1) reconnaît spécifiquement C. jejuni dans le cas d'une identification précise à l'intérieur du genre Campylobacter. EXEMPLE 3 Amplification enzymatique in vitro de 1'ADN de C. jejuni avec les amorces définies à partir de la séquence d'acide nucléique faisant l'objet de l'invention. Choix des amorces Il a été démontré que c'est essentiellement l'extrémité 3' des amorces oligonucléotidiques qui détermine la spécificité de la PCR (PCR Protocols, M. Innis et col., Academic Press Inc.). Il est donc important que cette région 3' soit parfaitement spécifique de la cible à amplifier. Etant donné que le génome de Campylobacter présente un très faible pourcentage de guanine et cytosine (entre 28 et 38% de G+C), il a été estimé que des amorces dont l'extrémité 3' était riche en G+C pouvaient présenter un important degré de spécificité. Les inventeurs ont recherché, à l'intérieur de la séquence VS1, des zones riches en G+C et qui sont présentes une seule fois sur VS1. C'est à partir de ces régions que la séquence des amorces a été orientée et complétée de façon à obtenir une longueur d'environ 20 nucléotides. Synthèse des amorces oliqonucléotidipues Les amorces dérivées de la séquence VSl, appelées oligoVS15 et oligoVS16, dont les séquences sont indiquées ci-dessus et ayant une longueur de 21 et 22 nucléotides respectivement, ont été synthétisées sur un appareil automatisé "Cyclone Plus" (Millipore) basé sur la chimie des phosphoramidites. Après la synthèse, la solution d'oligonucléotide est transférée dans un tube et incubée avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré pendant 16 heures à 55"C. L'oligonucléotide est précipité à l'éthanol, puis le culot est lavé avec de l'éthanol à 70% et séché. Finalement, le culot est repris dans 1 ml d'eau distillée stérile. La concentration de chaque amorce est déterminée au spectrophotomètre. Amplification : La technique d'amplification, par exemple l'amplification enzymatique in vitro (PCR), est réalisée selon le protocole décrit par Saiki et al. (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 1 pM des oligonucléotides oligoVS15 et oligoVS16 et 30-100 ng d'ADN de différentes souches de Campylobacter avec 0,5 unité de Taq polymérase dans un tampon contenant 25 mM de KCl, 20mM de Tris-HCl pH 8,5, 1,5 mM de MgCl2, 200 pM de désoxyribonucléotides triphosphates et 100 pg/ml d'albumine sérique bovine, le volume final de la réaction étant de 50 pl.Les paramètres des étapes de la PCR ont été choisis de la façon suivante : 5 minutes à 94"C, 1 minute à 60"C, 1 minute à 72"C, puis (1 minute à 94"C, 1 minute à 60 C, 1 minute à 72"C) 28 fois et un dernier cycle 1 minute à 94"C, 1 minute à 60"C, 5 minutes à 72"C. Trente cycles sont ainsi réalisés en utilisant un appareil automatique. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 4"C jusqu'à l'analyse. Analyse électrophorétique sur un gel d'aaa- rose des échantillons amplifiés : Dix ul des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2% dans un tampon TBE (0,04 M Tris-borate, 0,0OlM EDTA) contenant 1 pg/ml de bromure d'éthidium. Les fragments amplifiés sont visualisés sous W et les gels sont photographiés en utilisant un film Polaroid 667. On a comparé les résultats obtenus avec, d'une part, différents ADN de Campylobacter, d'autre part différents ADN de bactéries n'appartenant pas au genre Campylobacter, et les amorces oligoVS15 et oligoVS16. La longueur théorique attendue du fragment amplifié avec ce couple d'amorces est de 358 paires de bases. Seul l'ADN extrait de C. jejuni permet d'obtenir un tel fragment. Aucun fragment amplifié de la taille attendue n'est visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes : C. coli, C. lari, C. fetus subsp. fetus, C. fetus subsp. venerealis, C. hyointestinalis, A. cryaerophilus, C. sputorum subsp. sputorum, C. sputorum subsp. bubulus, C. concisus, C. fecalis, E. coli, H. pylori, S. typhimurium, C. curvus, ou de cellules humaines. Dans le cas de C. fetus subsp. fetus, un fragment de haut poids moléculaire a été amplifié, mais de façon non-spécifique, car après transfert sur membrane de nylon, ce fragment n'hybride pas avec la sonde VS1 marquée au 32p. D'autre part, la technique d'identification de C. jejuni par PCR décrite ci-dessus a été utilisée pour tester 15 souches de C. jejuni isolées sur des pintades. L'amplification a été réalisée après subculture des souches et extraction de l'ADN. Toutes les souches ont été identifiées comme étant des C. jejuni, ce qui est en accord avec les tests biochimiques effectués au préalable. Détermination de la sensibilité du test PCR Afin de déterminer le seuil de détection absolu de 1'ADN de C. jejuni par PCR avec le couple d'oligonucléotides décrit ici, plusieurs quantités d'ADN de C. jejuni (de 1 pg jusqu'à 0,012 fg) ont été amplifiées in vitro dans les conditions décrites ci-dessus. Un volume correspondant à un cinquième du volume total d'amplification a été soumis à une électrophorèse en gel d'agarose, puis les fragments séparés ont été transférés sur une membrane de nylon et hybridés avec la sonde VS1 marquée au 32P. L'autoradiographie a révélé que le seuil de détection est de 1,86 fg, ce qui correspond à l'équivalent d'un génome bactérien, donc à une bactérie. En conclusion, il est important de noter que ce couple d'amorces permet de détecter spécifiquement l'espèce C. jejuni, ce qui laisse penser que des isolats de malades et des échantillons biologiques infectés par C. jejuni peuvent être identifiés, rendant ainsi la méthode utilisable dans le domaine de la bactériologie clinique et en médecine vétérinaire. LISTE DES SEQUENCES I-INFORMATIONS GENERALES (1) DEMANDEUR : Institut Pasteur (2) TITRE DE L'INVENTION Séquences nucléotidiques hybridant spécifi quement avec une séquence nucléique génomique de Campylobacter jejuni, applications comme sondes nucléiques et amorces oligonucléotidi ques, et dans le diagnostic d'une infection à Campylobacter jejuni. (3) NOMBRE DE SEQUENCES : 4 II - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N" 1 CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE TYPE : Nucléotide LONGUEUR : 147 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADN ORGANISME : Campylobacter jejuni NOM : VS2 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE 10 20 30 40 50 AAGCTTGTGA TACTTTTAAG TGCTATAGAA AGTGAAAATG AAATTTCTTT 60 70 80 90 100 AGCAGGCATA TATAGAGCGT ATTGTTCCAA ATTTGATTTA AAGAATGAAA 110 120 130 140 TTTTAGAATG GGGTCTTAAA ATATTTAAAA ACAATAATGC CTTAAAA III - INFORMATIONS POUR SEQ.ID N 2 2 CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE TYPE : Nucléotide LONGUEUR : 1189 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADN ORGANISME : Campylobacter jejuni NOM : VS1 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE 10 20 30 40 50 AAGCTTGTGA TACTTTAAG TGCTATAGAA AGTGAAAATG ARATTTCTTT 60 70 80 90 100 AGCAGGCATA TATAGAGCGT ATTGTTCCAA ATTTGATTTA AAGAATGAAA ******** 110 120 130 140 150 TTTTAGAATG GGGTCTTAAA ATATTTAAAA ACAATAATGC CTTAAAAGAT ************** 160 170 180 190 200 CTTGTAGAAA AAGAAGATAT ATACAATCCT ATTGTTGTAA GTAGTTTGGT 210 220 230 240 250 TTCTAAGCTA GAAAATTTAG AAAATTTAGA GCTTTTATAT ACTTTAACTT 260 270 280 290 300 GGCTAAAGGC TAAGGCTTTA AATTATAATG CTTTTTATTT TAGAGTTCTT 310 320 330 340 350 GATAAACTTT TAGAAAATGC AAAACAAGGT TTTGAAGATG AAAATCTACT 360 370 380 390 400 TGAAGAAAGT GCAAGAAGGG TAAAAAAAGA ATTAACACTT AAAAGAAGTA 410 420 430 440 450 AGATTTTTTT AGAGCAAGAT GAAATTTTGC AGGATAAAAT CATACATATC 460 470 480 490 500 AAATCAAATC TTTTTATTAT AAAAAATACT TTTGAAGATA TTGTTATGAT 510 520 530 540 550 TTCTAAATTA GCCAAAGAAA ATGATTTTAA ATTTTGGTTT AGTAATGAAA 560 570 580 590 600 CAAATCTTAG TTTGCAAATT GTTGCACCAC TTCATTTTAA TATTGCCATT 610 620 630 640 650 ATTTTAAGTT CTTTAACAAA TTTAAATCTT ATTTTTATGA ATTTTTTTGA 660 670 680 690 700 ACTTTTTGAT GATAAAATTT ATTTAAGGTT TGAATATGAT AATATTATCA 710 720 730 740 750 GTGATGAGCA AAAACTAAAA CTTTGTGAGC TTTTAAATTC AAATCTTTCT 760 770 780 790 800 GGTTTTAATT TGAAAAAAAT TAAAAAGCCA ATCATTAAAA AAGAGGAGTT 810 820 830 840 850 AAAATTAGAC TTAAACTATT CTAAAATGTA TGCCAAATTA GGTCTTAATA 860 870 880 890 900 CTAAAGATCA GCAAGGTTTA ATGGCGTATT TGATGAATGT TTTTAATGAA 910 920 930 940 950 CTTGAACTTG TTTTATGTGC AGCAAAAATT CAAACCATAA GACAAAGGAC 960 970 980 990 1000 GCGTAATATT TTTATTTTTC AAAAGAATGA AAAATTAGAA CATAGCGAGC 1010 1020 1030 1040 -1050 AAAAGTTAGT TAATTTATTA ATAAGTGAGT AAAAAAATGT GTGGAATCGT 1060 1070 1080 1090 1100 AGGCTATATA GGAAATAATG AAAAAAAACA AATTATACTA AATGGACTTA 1110 1120 1130 1140 1150 AAGAATTAGA ATATCGTGGC TATGATAGTG CGGGTATGGC AGTGATGCAA 1160 1170 1180 GAAGGCGAAC TTAGTTTTTT TAAAGCTGTA GGALAGCTT IV - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 3 3 CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE TYPE : Nucléotide LONGUEUR : 21 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADN ORGANISME : Campylobacter jejuni NOM : OligoVSî5 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE 5 GAA TGA AAT TTT AGA ATG GGG 3 V - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 4 4 CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE TYPE : Nucléotide LONGUEUR : 22 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADN ORGANISME : Campylobacter jejuni NOM : OligoVS16 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE 5 GAT ATG TAT GAT TTT ATC CTGC 3 REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique génomique de Campylobacter jejuni, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n 1, la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases 2. Séquence nucléotidique comportant tout ou partie de la séquence nucléotidique selon la revendication 1. 3. Séquence nucléotidique comportant une séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n 2, la séquence complémentaire de celle-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. 4. Produits d'amplification de l'une des séquences selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il contient une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 3. 6. Sonde nucléique spécifique des acides nucléiques de Campylobacter jejuni, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 20 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 4. 7. Sonde nucléique spécifique des acides nucléiques de Campylobacter jejuni selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1, la séquence nucléotidique SEQ ID n 2, les séquences complémentaires de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. 8. Sonde nucléique selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support et utilisée comme sonde de capture. 9. Couples d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Campylobacter jejuni, caractérisés en ce qu'ils comprennent des paires d'oligonucléotides ayant de 18 à 30 nucléotides, de préférence 18 à 22 nucléotides choisis parmi les séquences selon l'une des revendications 1 à 4. 10. Couple d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Campylobacter jejuni selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est constitué par les paires oligonucléotidiques de séquences 5 GAA TGA AAT TTT AGA ATG GGG 3 5 GAT ATG TAT GAT TTT ATC CTGC 3 11.Méthode de détection de la présence de Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon la revendication 9 ou 10, l'acide nucléique de Campylobacter jejuni contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, été rendu préalablement accessible à une hybridation, et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique appartenant à Campylobacter jejuni b) amplification de l'acide nucléique appartenant à Campylobacter jejuni c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique de Campylobacter jejuni correspondant au fragment encadré par les amorces d) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié, par exemple par hybridation de sonde spécifique, par séquençage ou par analyse de site de restriction. 12. Kit de détection de la présence de Campylobacter jejuni dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants - un couple d'amorces selon la revendication 9 ou 10 - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'un acide nucléique de Campylobacter jejuni - éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde nucléique selon l'une des revendications 6 à 8. 13. Utilisation d'une sonde nucléique selon l'une des revendications 6 à 8 comme outil épidémiologique pour repérer et classer des souches de Campylobacter jejuni à des souches particulières de Campylobacter jejuni.