Brevet FR2702491A1 — publié le 19940916

CLONAGE DE GENES CODANT POUR DES ANTIGENES D'EXCRETION SECRETION P21 ET P32 DE TOXOPLASME, PREPARATIONS DE TELS ANTIGENES, FRAGMENTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS La présente Invention est relative au clonage de gènes codant pour les antigènes d'excrétion-sécrétion de 21 kDa et de 32 kDa de toxoplasme, à l'obtention de préparations desdits antigènes et de leurs fragments, et à leurs utilisations. La toxoplasmose est une des infections à protozoaires les plus répandues, aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Bien que généralement bénigne, elle peut revêtir des formes graves chez certaines catégories de patients, en particulier les patients immunodéprimés elle est responsable d'environ 25% des décès chez les malades du SIDA. La toxoplasmose peut avoir également des conséquences graves en cas d'infection congénitale, qui est cause d'avortements ou de malformations néo-natales sévères chez l'homme et les animaux domestiques. On sait toutefois que la primo-infection induit une immunité de longue durée. I1 apparaît donc que cette maladie pourrait être prévenue par un vaccin qui permettrait de reproduire la réponse immune engendrant cette immunité. Dans la recherche d'antigènes protecteurs permettant le développement d'un vaccin contre la toxoplasmose, différents antigènes ont été étudiés. L'équipe des Inventeurs s'est en particulier intéressée aux antigènes d'excrétion-sécrétion (AES) des tachyzoltes, qui constituent 90% des antigènes circulants. I1 a en effet été établi, au cours d'expérimentations aussi bien chez l'homme que chez l'animal, que les antigènes AES étaient de puissants immunogènes [DECOSTER et al., Clin. Exp. Immunol. n 73, p. 376-382 (1988) ; DUQUESNE et al., Infect. Immun. n 58, p. 2120-2126, (1990) ; DARCY et al., Gynécol. Int. n 1, p. 48-57 (1992)]. I1 a également été montré que certains des AES possèdent des épitopes communs avec des antigènes des bradyzoïtes. Or, les bradyzoites sont la forme résistante du parasite. Des anticorps monoclonaux dirigés contre plusieurs AES ont été produits. I1 apparaît que tous ces anticorps détectent des molécules stockées dans les granules denses du Toxoplasme et ce , quel que soit le stade, tachyzoite ou bradyzoite. Ces molécules ont également été observées dans la vacuole parasitophore ou le kyste et semblent donc sécrétées par les parasites lors de l'invasion. Cette localisation, au niveau de la surface d'échange entre le Toxoplasme et sa cellule-hôte, suggère une participation fondamentale de ces molécules dans les mécanismes d'échappement et dans le maintien de la relation hôte-parasite. L'utilisation des sondes monoclonales dirigées contre trois de ces antigènes des granules denses (également dénommés protéines GRA), respectivement P23 (GRA1), GP28.5 (GRA2) et P21 (P21) a permis d'observer une localisation commune de ces antigènes dans les granules de sécrétion, et une localisation spécifique pour chacun d'entre eux après sécrétion dans la vacuole parasitophore ou le kyste. P23, qui possède deux structures capables de lier le calcium, est observée dans l'espace vacuolaire. GP28.5 est associée spécifiquement aux microvillosités du réseau membranaire entourant les parasites ; sa structure moléculaire suggère une association possible aux lipides. P21 est très peu abondante dans le réseau membranaire sous-jacent mais au contraire associée spécifiquement à la membrane de la vacuole ou à la paroi du kyste. Deux de ces antigènes ont déjà été isolés, et les gènes correspondants ont été clonés : il s'agit de l'antigène P23 [CESBRON-DELAUW et al. Proc. Natl. Acad. Sci., n 86, p. 7537-7541, (1989)], et de l'antigène GP28.5 [PRINCE et al., Mol. Biochem. Parasitol., n 34, p. 3-14 (1989) ; Demande FR 92 072 06 du 15 Juin 1992 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE et INSERM] ; des épitopes majeurs spécifiques des cellules B ont été localisés sur GP28.5. L'antigène P21 n'avait en revanche pas été isolé jusqu'à présent ; il avait été simplement identifié par sa réaction avec un anticorps monoclonal dénommé TG17-113 [CHARIF et al. Exp. Parasitol., n 71, p. 114124, (1990)] qui avait permis de le localiser dans les granules de secrétion. Les Inventeurs se sont fixé pour but l'isolement et la caractérisation de nouveaux antigènes AES, utilisables pour le traitement de la toxoplasmose. Dans ce but, ils ont entrepris le clonage du gène codant pour P21. Le criblage par l'anticorps monoclonal TG17-113 d'une banque d'expression d'ADNc de tachyzoltes de T gondii effectué dans un premier temps, n'ayant permis la détection d'aucun clone exprimant l'antigène P21, les Inventeurs ont entrepris la purification de cet antigène P21 par RP-HPLC à partir d'un extrait total de protéines de tachyzoites. Ils sont de la sorte parvenus à obtenir une préparation de l'antigène P21 natif, à partir de laquelle ils ont réussi à produire un immunsérum de rat et un immunsérum de souris qui leur ont permis de mettre en évidence dans la banque d'expression d'ADNc de tachyzoites, des clones exprimant l'antigène P21 recombinant. Ils ont en outre constaté que, malgré l'homogénéité des fractions HPLC enrichies en antigène P21, les immunsérums produits contre l'antigène P21 natif reconnaissaient avec la même intensité sur les profils d'immunoélectrophorèse d'extrait total de tachyzoites, la bande correspondant à P21 et deux autres bandes correspondant à des antigènes de 32 et 28kDa. La bande observée à 32 kDa ne correspond à aucun antigène AES connu. Les Inventeurs ont également obtenu à partir de la banque d'ADNc de tachyzoites, les clones exprimant cet antigène de 32 kDa. En comparant la séquence des clones d'ADNc de P21 et P32 avec les séquences de clones obtenus parallèlement à partir d'une banque d'ADN génomique, les Inventeurs ont obtenu les séquences des gènes codant pour les antigènes P21 et P32. La présente Invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, comprenant tout ou partie de la séquence du gène d'un antigène d'excrétion-secrétion de Toxoplasme, lequel fragment est caractérisé en ce que ladite séquence est choisie dans le groupe constitué par a) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P21 de Toxoplasme b) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P32 de Toxoplasme c) une séquence complémentaire de l'une ou l'autre des séquences a) ou b) d) un segment de plus de 10 pb de l'une des séquences a), b) ou c). Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, la séquence a) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 1, qui est celle du gène de l'antigène P21 de Toxoplasma gondii. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, la séquence b) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 2, qui est celle du gène de l'antigène P32 de Toxoplasma gondii. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, la séquence d) est une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide représentant au moins une partie de la protéine P21 ou P32. Ceci englobe les séquences qui, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, codent pour ces mêmes antigènes ou polypeptides. Avantageusement, la séquence d) est une séquence codant pour un fragment peptidique comprenant un épitope de l'antigène P21 et/ou un épitope de l'antigène P32. L'Invention a également pour objet des vecteurs recombinants (plasmides, virus, etc...) caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, codant pour l'antigène P21 de toxoplasme, ou pour l'antigène P32, ou pour un peptide représentant un fragment de ceux-ci. Le plasmide pTG21-22 qui contient un insert d'ADNc (EcoRI-XhOI de 810 pb) codant pour P21, et le plasmide pTG32-43 qui contient un insert d'ADNc (EcoRI XhOI de 159 pb) codant pour P32, ont été déposés à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, France, le 12 Mars 1993, sous les numéros de dépôt respectifs I-1288 et I-1289. Avantageusement, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant des séquences propres à contrôler l'expression du gène de l'antigène P21 (promoteur, terminateur, etc...) La présente Invention a également pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus. Ce fragment d'acide nucléique peut être extra-chromosomique (par exemple porté par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus). I1 peut également être intégré dans le chromosome de la cellulehôte. L'Invention a également pour objet une préparation purifiée d'une protéine constituant un antigène d'excrétion-secrétion de toxoplasme, laquelle préparation est caractérisée en ce que ladite protéine est choisie dans le groupe constitué par - l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme - l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ladite préparation purifiée est une préparation de protéine native. Au sens de la présente Invention, on entend par : "préparation purifiée" une préparation de protéines ne comportant aucun contaminant détectable par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; par "protéine native" la protéine telle qu'exprimée par l'organisme eucaryote dont elle est issue (en l'occurrence T. gondii), en tenant compte des éventuelles modifications post-traductionnelles propres à cet organisme, et par : "protéine recombinante" toute protéine ou fragment peptidique obtenu par génie génétique, chez un hôte eucaryote ou procaryote. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, ladite préparation purifiée est une préparation de protéine recombinante. L'Invention a également pour objet un polypeptide, dont la séquence comprend tout ou partie d'un antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme, lequel polypeptide est caractérisé en ce que ladite séquence d'antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme est choisie dans le groupe constitué par a) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme. b) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme. c) une séquence représentant un segment de plus de 5 acides aminés de l'une des séquences peptidiques a) ou b). Selon un mode de réalisation préféré d'un polypeptide conforme à l'Invention, la séquence peptidique a) est la séquence du polypeptide codé par le gène de l'antigène P21 de T. gondil, laquelle séquence est représentée (en code une lettre) à la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ. ID N 1, en regard de la séquence d'acide nucléique correspondante. Selon un autre mode de réalisation préféré d'un polypeptide conforme à l'Invention, la séquence peptidique b) est la séquence du polypeptide codé par le gène de l'antigène P32 de T. gondii, laquelle séquence est représentée (en code une lettre) à la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ. ID N 2, en regard de la séquence d'acide nucléique correspondante. Avantageusement la séquence peptidique c) comprend un épitope de l'antigène P21, un épitope de l'antigène P32 ou un épitope commun aux deux antigènes. L'Invention englobe, bien entendu, les polypeptides dont la séquence ne diffère de la séquence mentionnée ci-dessus que par quelques acides aminés, en particulier des polypeptides dont la séquence est dérivée de celle de variants alléliques ou d'isoformes de l'antigène P21. Des polypeptides conformes à l'Invention peuvent être obtenus par synthèse, ou par recombinaison génétique ; ils peuvent être des peptides de fusion comprenant la séquence de tout ou partie de l'antigène d'excrétion-sécrétion P21, ou de l'antigène d'excrétionsécrétion P32, avec une autre séquence polypeptidique. L'Invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on procède à la mise en culture de cellules transformées telles que définies plus haut, comprenant au moins un fragment d'ADN conforme à 1 'Invention. Les polypeptides recombinants exprimés chez E. coli conservent des épitopes séquentiels ou des épi topes liés à la structure secondaire des protéines P21 et P32. Pour permettre l'obtention d'autres épitopes tels que des épitopes de nature glucidique, ou des épitopes correspondant à des structures tertiaires et quaternaires, on choisira de produire les recombinants dans des systèmes eucaryotes tels que, par exemple, les levures ou les baculovirus. L'Invention a également pour objet des compositions antigéniques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un antigène pris dans le groupe constitué par - une préparation purifiée de l'antigène P21 ou de l'antigène P32 - un polypeptide comprenant la séquence de l'antigène P21 ou de l'antigène P32, ou d'une partie de ceux-ci. L'Invention englobe également un procédé de préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique conforme à l'invention. Les compositions antigéniques conformes à l'invention permettent également la préparation de réactifs de diagnostic, ou de vaccins anti-toxoplasmes. L'invention englobe également ces réactifs et ces vaccins. Les Inventeurs ont en particulier montré que l'immunisation par P21 confère chez la souris une protection significative vis-à-vis d'une infestation létale par T. gondii, et que P32 recombinant est reconnu par l'ensemble de sérums-tests humains obtenus à partir de patients atteints de toxoplasmose en phase aiguë ou chronique L'antigène P21 est donc plus particulièrement utilisable pour l'obtention de vaccins anti-toxoplasmes, et l'antigène P32 est plus particulièrement utilisable pour le diagnostic de la toxoplasmose. Avantageusement, on peut associer les compositions conformes à l'invention à d'autres antigènes de toxoplasme, en particulier, des antigènes d'excrétionsécrétion, dans un même test de diagnostic, ou une même composition vaccinante. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui décrit le clonage des gènes codant pour les antigènes P21 et P32 de toxoplasme, et la caractérisation de ces antigènes. il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE i : PURIFICATION DE L'ANTIGENE P21 NATIF 1]) Obtention des toxoplasmes. Les tachyzoites de la souche RH sont obtenus à partir du liquide péritonéal de souris Swiss infectées trois jours auparavant. Les parasites sont repris en milieu RPMI-1640 (Gibco-BRL) et les cellules de souris contaminantes sont éliminées par filtration sur membrane de polycarbonate (3 prL, Nucléopore). 2-) Purification de l'antigène P21 natif par RP-HPLC Les protéines de 1 x 1010 tachyzoltes sont extraites une nuit à 4 C en tampon TEN (Tris-HCl pH 7,4 10 mM, EDTA 2mM, NaCl 150 mM) contenant 1% de Nonidet P40, 100 U/ml d'Aprotinine et 40 pM de PMSF. Après centrifugation (20 min. à 3500 g), le surnageant est filtré sur 0,22 pm (MILLIPORE). Les protéines sont alors séparées par RP-HPLC (Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography) sur une colonne VYDAC C18 (300 A, particules de 7 clam, 500 x 9 mm) en 100% de solvant A (0,5% (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau). Après 10 min. d'élution isocratique, les protéines sont éluées par un gradient de 0-10096 de solvant B (25/75/0,45 (v/v/v) d'eau/acétonitrile/TFA) pendant 180 min. à un débit de 2 ml/min. Les protéines sont détectées à 215 nm et chaque fraction est lyophilisée puis reprise dans 100 1 de TEN/PBS pH 8,0 10 mM (v/v). 1 ,U1 de chaque fraction est alors testé en dot-blot avec les anticorps monoclonaux Tg 17-113 et TG17-179 [CHARIF et al., Exp. Parasitol. n 71, p. 114124, (1990)]. Le profil de purification est représenté à la Figure 1 les antigènes de sécrétion GP28,5 ou GP28.5 (pic n 1) et P21 (pic n 2) sont élués successivement. La pureté des fractions contenant l'antigène P21 est analysée sur gel de polyacrylamide 13% (SDS-PAGE) coloré par le nitrate d'argent. Cette coloration révèle deux bandes de poids moléculaires voisins dues à une dégradation de l'antigène P21. En effet, ces bandes réagissent toutes deux avec l'anticorps monoclonal TG17-113. Un premier essai de séquençage par la dégradation d'EDMAN a été effectué sur les fractions HPLC enrichies en antigène P21. Aucun résultat n'a pu être obtenu de cette façon, ce qui suggère un blocage de l'extrémité N-terminale par une modification posttraductionnelle. Une digestion partielle par la trypsine (clivage après les résidus Lysine et Arginine) des fractions contenant l'antigène P21 a donc été réalisée, afin de microséquencer les peptides ainsi obtenus. Ceuxci ont été séparés par chromatographie sur une colonne VYDAC C18. Aucun pic contaminant n'a été observé sur le profil du chromatogramme, ce qui confirme l'homogénéité des fractions HPLC. Les peptides correspondant aux pics majeurs sont alors séquencés par la dégradation d'Edman sur un microséquenceur phase gaz (Applied Biosystem 470A).Les dérivés PTH-acides aminés sont identifiés par HPLC (Applied Biosystem 120A). Six pics majeurs ont été purifiés en quantité suffisante pour être microséquencés. La séquence des peptides correspondants est la suivante 1 : DVGSGGDDSEGAR 2 : EQQQWQHQ?N(E,N) ? R 3 : SLFER 4 : A"A"VTGHPVR 5a : AIQEE (S,M) 5b : AIQEES (K,W) AEST?EE EXEMPLE 2 : OBTENTION DES SERUMS ANTI-P21 Des rats Fisher et des souris OF1 ont reçu à 2 semaines d'intervalle 4 injections sous-cutanées de 15 Rg d'antigène P21 purifié par RP-HPLC, solubilisé dans 100 Cil de PBS pH 7,4 et émulsifié dans 100 l d'adjuvant complet de Freund. L'immunsérum obtenu a été testé par Transfert immuno-électrophorétique et sur un extrait de tachyzoites. Cette analyse a révélé une polyspécificité inattendue, compte tenu de l'homogénéité de la fraction HPLC. Trois bandes majeures sont en effet détectées sur l'extrait de tachyzoites : 21, 28 et 32 kDa. Ces trois bandes sont d'égale intensité, suggérant soit la présence dans les fractions de quantités minimes de contaminants très immunogènes, soit une réactivité croisée entre différents antigènes. La bande reconnue à 28 kDa pourrait être due à la présence de faibles quantités de l'antigène de sécrétion GP28.5 dans les fractions HPLC. En effet, lors de la purification par chromatographie, cet antigène très immunogène est élué dans les fractions qui précèdent celles contenant l'antigène P21. Malgré leur polyspécificité, ces sérums anti fraction HPLC ont été utilisés pour le criblage de la banque d'ADNc de tachyzoites construite dans le vecteur d'expression XZap II (cf exemple 3 ci-dessous). EXEMPLE 3 : CLONAGE ET CARACTERISATION DES GENES CODANT POUR LES ANTIGENES P21 ET P32 A -Techniques générales utilisées Pour plus de précisions sur les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire qui ne sont pas détaillées dans les exemples qui suivent, on peut se reporter à l'ouvrage de MANIATIS et al.[A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1990)]. 1- Banque d'ADNc de tachyzoïtes a- Construction L'ARN de tachyzoites de la souche RH est purifié par extraction au Lithium/urée. La construction de la banque est effectuée à l'aide de kits STRATAGENE. L'ARN poly(A) est séparé par passage sur une colonne oligodT ("Poly(A) QuickTM mRNA Purification Kit"). 511g d'ARN poly(A) sont alors soumis à une transcription inverse ("Uni ZapTM XR Kit") initiée par un primer polyT. Après digestion de la matrice ARN par la RNase H, le second brin de l'ADNc est synthétisé par la DNA polymérase I. Des adaptateurs EcoRI sont alors ligués de manière non sélective aux deux extrémités des ADNc double brin. Une digestion ultérieure par l'enzyme Xhol permet ainsi de libérer en 3' le site Xhol introduit par le primer de la transcription reverse, alors que l'extrémité 5' porte toujours le site EcoRI. Les ADNc sont ensuite séparés selon leur taille sur colonne ULTROGEL AcA34 (IBF BIOTECHNICS). Les plus grands fragments sont alors ligués dans leur orientation 5'-3' dans le vecteur d'expression XZapII digéré par les enzymes EcoRI (5') et Xhol (3'). Les ADNc sont insérés dans le gène Lac Z, en aval d'un cadre de lecture ouvert codant pour la partie N-terminale de la ,8-galactosidase (4kDa). Après "empaquetage" de 1'ADN dans des protéines phagiques ("Gigapack II Gold packaging extract"), le titre de la banque est estimé en étalant différentes dilutions en présence de la souche E. coli PLK-F'. La même souche est utilisée pour l'amplification de la banque. b - Criblage: - Criblage en expression La banque est étalée en présence de la souche E. coli XLl-Blue sur boîtes NZY. Les bactéries sont préalablement rendues compétentes par une incubation d'une heure en MgSO4 10mM. Après 2 h d'incubation à 42 C, un filtre imbibé dIPTG 10IrE et séché est déposé sur le tapis bactérien de façon à induire l'expression des protéines recombinantes, une nuit à 37- C. Les filtres sont saturés en TN1 contenant 5 % de lait en poudre (Gloria) puis incubés 2 h avec le sérum de rat anti-P21 dilué au 1/200e dans le même tampon. Après trois lavages de 15 min., en TN1, les filtres sont incubés 1 h avec des anticorps de chèvre anti-IgG de souris couplés à la Peroxydase (Diagnostic Pasteur), au 1/500e en TN1, puis révélés après lavages. Le criblage différentiel avec l'anticorps monoclonal Tg 17-179, dirigé contre l'antigène de sécrétion GP28,5 est effectué dans les mêmes conditions. - Criblage en hybridation La banque est étalée en présence des bactéries E. coli XLl-Blue compétentes sur boîtes NZY, une nuit à 37 C. Une empreinte des plages de lyse est réalisée sur filtre de nitrocellulose. Ces filtres sont dénaturés par contact pendant 1 min. avec NaOH 0,5M, NaCl 1,5M puis neutralisés 8 à 10 min. par Tris-HCI pH 7,5 1M, NaCl 1,5M. Les filtres sont ensuite rincés 10 mn. en 2 x SSC, séchés puis l'ADN est fixé à 80 C pendant 2 h.Les filtres sont préhybridés en 6 xSSC, 0,25 96 lait en poudre puis hybridés dans le même milieu contenant la sonde marquée au 32P et dénaturée, une nuit à 65 C (T-H). Les lavages sont effectués en 2 x SSC, 0,1 % SDS, 0,25 96 lait en poudre, 2 x 30 min. à température ambiante puis 2 x 30 min., à (T-H-5 à 10 C) en 0,1 x SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont alors séchés puis autoradiographiés une nuit à -80- C (Hyperfilm MP, Amersham). Les clones positifs sont purifiés par un nouvel étalement sur boîte NZY. Les empreintes sont alors hybridées par la même sonde, marquée cette fois par la Digoxigénine ("Non radioactive DNA labeling and detection kit", Boehringer Mannheim). c - Excision : passage à la forme plasmidique des clones #Zap II Les clones phagiques XZap II peuvent être obtenus sous forme plasmidique sans sous-clonage des inserts : cette étape est réalisée in vivo. Les clones XZap II positifs purifiés sont mis en contact avec des XLl-Bîue compétentes, en présence du phage "helper" R408 (Stratagène) pendant 15 min. à 37 C puis l'ensemble est mis en culture en milieu 2TY, 3 h à 37 C sous agitation. Lors de cette étape, une partie de ce phage est répliquée sous forme de "phagemide" pBluescript, c'est-à-dire d'ADN double brin plasmidique. Les cellules sont ensuite lysées pendant 20 min. à 70 C et les débris sont éliminés par centrifugation. Le surnageant est mis en contact avec de nouvelles bactéries compétentes qui sont étalées cette fois sur boîtes LB-Ampicilline (l00g/ml), une nuit à 37 C. Une colonie Amp-résistante bien isolée des colonies satellites est alors réétalée sur une nouvelle boîte afin d'éliminer les éventuelles contaminations par le phage helper. 2- Banque d'ADN génomique a - Purification d'ADN génomique de tachvzoites 1010 tachyzoites de la souche RH [JOHNSON et al., Arst. J. Exp. Biol. Med. Sci., n 64, p. 351-355 (1986)] sont rincés deux fois en PBS. Le culot est resuspendu dans 10 volumes de NaCl 0,1M, EDTA 0,1M, Tris HC1 pH7,5 10mM. Après addition de 1/10 de volume de SDS 10 %, les parasites sont incubés 30 min. à 37 C en présence de 10Rg/ml de RNase, puis 3 h à 50 C avec 100Rg/ml de Protéinase K. Après deux extractions des protéines au phénol/chloroforme, 1'ADN est dialysé une nuit à 4 C contre du TE (Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA 1 mM).La séparation de 1'ADN de tachyzoites et de 1'ADN de souris contaminant, basée sur la différence du % (GC) entre les deux espèces, est effectuée sur gradient de CsCl.200Rg d'ADN sont mélangés à 7,6 ml de Tris-HCl pH 8,0 50mM, EDTA 25mM saturé en CsCl puis 2001g de colorant Hoescht 33258 (Sigma) sont ajoutés. Un volume final de 10,57 ml est obtenu par addition d'eau, déposé dans un tube à ultracentrifugation "Quick Seal" (Beckman). Le volume est complété par de la paraffine et la centrifugation est effectuée 48 h à 45000rpm (rotor Ti90). Trois bandes d'ADN sont alors repérées sous UV, 1'ADN de tachyzoltes correspondant à la plus basse. Cette bande est prélevée à la seringue puis le colorant est extrait au N-Butanol saturé en TE. Un second gradient peut être effectué dans les mêmes conditions, afin d'éliminer 1'ADN de souris résiduel. L'ADN est ensuite dialysé une nuit à 4 C contre du TE puis la concentration est estimée par mesure de la densité optique à 260 nm. b - Banaue aénomiaue Construction L'ADN génomique de tachyzoite est partiellement digéré par l'enzyme de restriction MboII. Les fragments de 15 à 20kb sont alors sélectionnés, et ligués dans le site BamHI du vecteur EMBL 3. Criblage La banque génomique est étalée en présence de la souche E. coli P2.392 rendue compétente par incubation en MgSO4 10mM, une nuit à 37 C sur boîtes NZY. Les empreintes en nitrocellulose sont dénaturées et fixées (voir "criblage de la banque d'ADNc") puis hybridées une nuit à 68 C avec un insert ADNc purifié et marqué par la Digoxigénine. Les clones positifs sont réétalés et criblés dans les mêmes conditions. c - Sous-clonape des fraaments csénomiaues en vecteur plasmidiaue La souche E. coli P2.392 est utilisée pour amplifier en milieu NZY les clones génomiques. Les phages sont purifiés sur gradient de CsCl avant purification de 1'ADN phagique. 2 à 3g d'ADN phagique sont digérés par l'enzyme de restriction appropriée, pendant 3 h à 37 C. Un aliquot est déposé sur gel d'agarose afin de vérifier que la digestion est complète. Le reste est alors ligué en totalité dans le vecteur pUC 18 ou pUC 19, préalablement digéré et déphosphorylé. La souche E. coli JM109 rendue compétente pour la transformation par le TFB (Maniatis, Fritsch et al. 1990) est transformée, pendant 30 min. sur glace. Après 1,5 min. de choc thermique à 42 C, les bactéries sont mises en culture 1 h à 37 C en milieu LB, afin de permettre l'expression de la résistance à l'ampicilline. Les bactéries sont étalées sur boîtes LB-Ampicilline une nuit à 37 C. Les colonies sont alors repiquées en double sur boîtes quadrillées afin de permettre un criblage en hybridation. Une empreinte en nitrocellulose est réalisée sur la moitié de ces boîtes. Ces empreintes sont dénaturées pendant 5 à 10 min. avec NaOH 0,5M, NaCl 1,5M puis neutralisées 15 à 20 min. par Tris-HCl pH 7,5 1M, NaCl 1,5M. Les filtres sont ensuite rincés 10 min. en 2 x SSC, séchés puis 1'ADN est fixé à 80 C pendant 2 h. L'excès de matériel est éliminé par incubation des filtres en 3 x SSC, 0,1 96 SDS, 3 h à 50 C, puis par une digestion par la Protéinase K à 100Fg/ml en 2 x SSC, 0,1 % SDS, 1 h à 56 C. Les filtres sont ensuite préhybridés et hybridés dans les conditions standard avec un insert ADNc marqué par la Digoxigénine. 3 - Préparations de plasmides Après transformation, les colonies sont testées en minipréparation de plasmide par la technique de lyse alcaline. Le matériel est digéré par les enzymes de restriction appropriées en présence de RNase. Les purifications de plasmide à grande échelle sont réalisées par la technique de "boiling" suivi d'un gradient sur CsCl-Bromure d'Ethidium. Après extraction du BrEt au N-Butanol, 1'ADN est dialysé contre du TE et précipité si la concentration est insuffisante. 4 - Sondes nucléiques Purification Le plasmide recombinant purifié sur gradient de CsCl est digéré par des enzymes de restriction pendant 2 à 3 h à 37 C. L'insert ainsi libéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose. Après coloration du gel au Bromure d'Ethidium, la portion de gel contenant l'insert est découpée puis placée dans un tube de 1,5ml préalablement percé et contenant de la laine de verre siliconée tassée (Interchim). Ce tube est emboîté sur un seconde tube et l'insert est élué par centrifugation à 6.000rpm pendant 10 min.Les débris d'agarose sont éliminés par 2 extractions au phénol/chloroforme puis l'insert est précipité une nuit à -20 C par addition de 1/10e de volume d'Acétate de Sodium pH 5,2 3M et de 2 volumes d'Ethanol 100 96. Après 10 min. de centrifugation à 13.000rpm, l'insert est repris en TE Marquage par le 32p 25ng d'insert sont dénaturés 5 min. à 100. C puis transférés rapidement sur glace. Le marquage est effectué par la polymérase Klenow selon la méthode des amorces aléatoires en présence de (a32P)-dCTP (AMERSHAM) Marquage par la Digoxigénine Le marquage est effecctué à l'aide du "Non radioactive DNA labeling and detection kit", (BOEHRINGER MANNHEIM). Hybridation Les Southern blots et Northern blots sont réalisés selon les techniques standard. 5 - Purification d'anticorps sur protéines recombinantes Les clones XZap II sont étalés de façon à obtenir l'expression des protéines de fusion (voir l-b "criblage en expression de la banque ADNc"). Sélection négative (épuisement de sérums) 10 ml de TN1 (Tris-HCl pH 7,5 10 mM, NaCl 0,15M) -lait 5 % contenant le sérum de rat anti-P21 native dilué au 1/200e sont passés successivement sur quatre filtres. Le sérum ainsi épuisé sur les protéines recombinantes est comparé au sérum non épuisé sur un Transfert immunoélectrophorétique d'extrait total de tachyzoites. Sélection positive (élution) Les filtres sont incubés 3 h avec le sérum de souris anti-P21 native au 1/100e en TN2 (pH 8,0) - lait 5%. Après lavages en TN2, les anticorps fixés sur les protéines recombinantes sont élués par 4ml de KSCN 3,5M, 10 min. sous agitation douce. Après addition de 15CL1 de BSA 20 % et de 150CL1 de 10 x TBS (Tris-HCl pH 8,3 0,5M, NaCl 1M), les anticorps sont dialysés une nuit à 4 C contre du 1 x TBS puis analysés sur Transfert immunoélectrophorétique d'extrait total de tachyzoites. 6 - Produits de traduction des clones Le vecteur pBluescript permet de synthétiser 1'ARN sens ou antisens correspondant à l'insert ADNc cloné, grâce à des promoteurs de transcription des phages T3 et T7 clonés de part et d'autre du polylinker. Chaque matrice est purifiée sur gradient de CsCl. lyg est linéarisé en 3' de l'insert ADNc par Xhol ou Kpnl, 1 h à 37 C puis traité par la Protéinase K à 50fg/ml 30 min. à 37 C. Après extraction par le phénol/chloroforme, 1'ADN est précépité à - 20'C et centrifugé. Le culot est repris en TE.La transciption in vitro est réalisée par 25U de T3 ARN polymérase (Boehringer), 30 min à 37 C puis la matrice ADN est éliminée par digestion à la Dnase I, 15 min à 37 C. L'ARN est précipité 1 h à - 20'C après extraction au phénol/chloroforme. Après estimation à 260nm de la quantité d'ARN synthétisé, la traduction in vitro est réalisée sur l,5Rg en présence de 35S- Méthionine (Amersham) et d'acides aminés froids, par un lysat de réticulocytes (Génofit), pendant 90 min. à 30 C. La quantité d'acide aminé radioactif incorporée est estimée par précipitation à l'acide trichloroacétique. Les produits de traduction sont analysés en SDS-PAGE 13 %. Après 30 min. d'incubation en liquide scintillant (Amplify, Amersham), le gel est séché et autoradiographié. La traduction in vitro de 911g d'ARN totaux de tachyzoites est réalisée en parallèle. L'ARNm correspondant aux inserts ADNc est synthétisé in vitro puis traduit en présence de 35S-Met. Les produits de traduction (Pt) sont analysées en SDS PAGE. B - CLONAGE DES GENES CODANT POUR POUR LES ANTIGENES DE 21 ET 32 KDA 1 - Obtention des clones d'ADNc Le criblage de la banque d'ADNc construite dans le vecteur d'expression XZap II à l'aide de sérum de rat anti-P21 (obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 2), a conduit à l'isolement de 17 clones d'ADNc. La polyspécificité du sérum anti-P21 laissant à penser que certains des clones comprenaient des fragments d'ADN qui n'étaient pas dérivés du gène de P21, des criblages supplémentaires ont été effectués pour différencier ces clones. Un premier criblage différentiel avec l'anticorps monoclonal TG17-179 dirigé contre l'antigène GP28.5 a permis l'élimination d'un seul clone. Après passage in vivo à la forme plasmidique pBluescript les 16 clones restants ont classés par hybridations croisées chacun des inserts, purifié et marqué est hybridé en Southern Blot à tous les inserts des autres clones. Quatre familles d'hybridation ont ainsi été identifiées. Elles sont représentées par les inserts 1, 3, 13 et 33.2 et contiennent respectivement 6, 1, 6 et 3 clones d'ADNc. Dans un deuxième temps, les produits de traduction codés par les inserts d'ADNc ont été analysés. Le vecteur pBluescript permet de transcrire in vitro l'ARNm correspondant à l'insert. La traduction in vitro de ces ARNm a été réalisée en présence de 35S-méthionine. L'analyse des produits de traduction en SDS PAGE a permis d'écarter deux familles de clones la première représentée par le clone 33.2, la seconde, représentée par le clone 3. Un autre criblage a été effectué à l'aide d'anticorps purifiés par affinité sur les protéines recombinantes exprimées par les clones sous leur forme phagique (Zap II) (cf protocole décrit ci-dessus). Le sérum de rat anti-P21 (préparé contre la protéine purifiée par RP-HPLC), épuisé sur les protéines recombinantes exprimées par le clone 13 ne reconnait plus la bande de 32 kDa. Les anticorps de rat fixés sur ces protéines recombinantes, trop fragiles, n'ont toutefois pas pu être récupérés par élution. Un sérum de souris dirigé contre l'antigène P21 purifié par HPLC a été préparé selon le protocole décrit à l'exemple 2. En Transfert immunoélectrophorétique, ce sérum reconnaît trois bandes majeures à 21, 28 et 32 kDa ainsi que de nombreuses bandes mineures, dans un extrait total de tachyzoltes. Ce sérum a été épuisé sur les protéines recombinantes exprimées par les clones 1 et 13 ; les anticorps fixés sur les protéines recombinantes ont été élués par le KSCN et leur spécificité a été analysée sur un extrait de tachyzoltes. Les anticorps élués à partir du clone 1 détectent une bande comigrant avec celle reconnue par le monoclonal TG17-113, ainsi qu'une bande plus faible à 32 kDa. Les anticorps élués du clone 13 révèlent une bande à 32 kDa (confirmant le résultat observé avec le sérum de rat) et une bande à 21 kDa, avec une intensité pratiquement identique. Cette observation confirme l'existence d'un antigène de 32 kDa présentant une réactivité croisée avec l'antigène de 21 kDa. La banque d'ADN génomique de tachyzoites a été criblée en hybridation, en utilisant des sondes obtenues à partir des inserts ADNc des clones 1 et 43, ce qui a permis de sélectionner les clones génomiques possédant des inserts codant respectivement pour les antigènes de 21 et 32 kDa. C - DETERMINATION DE LA SEQUENCE DU GENE CODANT POUR L'ANTIGèNE P21 La séquence du gène de la P21 a été établie parallèlement à partir des clones comprenant des inserts génomiques et des clones comprenant des inserts d'ADNc. Cette séquence est représentée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID. NO 1. Ce gène ne contient pas d'intron, et est constitué de 861 pb. Le cadre de lecture ouvert code potentiellement pour 136 acides aminés. Le premier codon ATG rencontré dans ce cadre se trouve dans un contexte favorable d'initiation (A-3 et G+4) et permet la traduction d'une protéine de 133 acides aminés. Cette région codante est encadrée de deux régions non traduites, de 102 pb en 5' et de 319 pb en 3'. Dans la séquence SEQ. ID N 1 représentée sur la liste des séquences en annexe, les codons stop encadrant le cadre de lecture sont doublement soulignés. La flèche verticale indique le site de clivage potentiel du peptide signal. La seconde région hydrophobe est encadrée. La flèche horizontale indique le site majeur d'initiation de la transcription, les deux pointes de flèche montrant l'extrémité 5' des deux principaux inserts ADNc étudiés (1 et 22). Le site de polyadénylation, extrémité 3' de tous les inserts ADNc, est marqué d'une étoile. Les séquences polyT et riches en G et C sont soulignées respectivement dans la région 5' non traduite du messager et dans la région potentiellement promotrice située en amont du départ de la transcription. Les 5 séquences peptidiques soulignées dans la séquence polypeptidique déduite sont celles obtenues par le microséquençage d'une fraction HPLC enrichie en antigène P21. D - DETERMINATION DE LA SEQUENCE DU GENE CODANT POUR L'ANTIGENE P32 La séquence nucléotidique codant pour la P32 a été obtenue par séquencage des inserts ADNc et génomique. Cette séquence qui est représentée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID. NO 2 contient un cadre de lecture ouvert codant potentiellement pour 230 acides aminés. Les codons stop sont soulignés d'un trait double. Les deux codons ATG potentiellement initiateurs sont encadrés. Les têtes de flèches indiquent l'extrémité 5' des deux principaux inserts d'ADNc étudiés (43 et 1-3). Le site de polyadénylation est représenté par une étoile. Les deux régions hydrophobes sont encadrées. Un site potentiel de N-glycosylation est marqué d'une étoile (résidu n 74). Les séquences polyT de la région 5' non traduite du messager et les régions riches en G et C de la région potentiellement promotrice sont soulignées. Le peptide de synthèse 188-201 et le peptide 74-100 sont soulignés dans la séquence polypeptidique déduite. EXEMPLE 4 : STRUCTURE MOLECULAIRE COMPAREE DES DEUX ANTIGENES DE 21 ET 32 KDA Analyse des séquences protéiques L'analyse en séquence primaire est réalisée grâce au programme "PC gene". Les profils en 2 dimensions sont obtenus grâce au programme "HCA plot" [GABORIAUD et al., FEBS Letter, n 224, p. 149-155, (1987) ; LEMESLE-VARLOOT et al., Bioch. n 72, p. 555-574, (1990)]. Les séquences protéiques ont été comparées aux banques de données NBRF / PIR (44900 entrées) et Genbank/EMBL (102947 entrées). A - STRUCTURE PRIMAIRE ET PROFIL D'HYDROPHO BICITE 1 - L'antiaène P21 La présence d'une région N-terminale hydrophobe présentant toutes les caractéristiques d'un peptide signal indique que cette protéine rentre dans le réticulum endoplasmique pour être exportée. Le site de clivage le plus probable se situe entre les acides aminés 25 et 26 ; le peptide mature serait dès lors composé de 108 acides aminés. L'analyse de ce peptide révèle une seconde région hydrophobe au milieu de la molécule dont la taille (18 acides aminés) et l'environnement (5 Arg en position C-terminale) sont compatibles avec une région transmembranaire. La région hydrophile N-terminale de 50 acides aminés est riche en acides aminés acides (34%) et en Glycine (16%). La région C-terminale de 40 acides aminés est riche en acides aminés acides (22%) et en résidus basiques (20%). Une seule Cystéine est présente, dans la région C-terminale (position 124). Le point isoélectrique du peptide mature est de 5,9. L'absence de reconnaissance de P21 recombinant par l'anticorps monoclonal TG17-113 suggère la présence d'épitopes généré par des modifications posttraductionnelles (glycosylation, phosphorylation) de l'antigène natif. La séquence de P21 ne contient pas de sites potentiels de N-glycosylation, mais les résidus Sérine et Thréonine pourraient être O-glycosylés 2 - L'antigène P32 La séquence codant pour l'antigène de 32 kDa possède deux codons ATG distants de 30 acides aminés. Le codon le plus proche de l'extrémité 5' est dans un contexte plus favorable d'initiation, puisqu'il est encadré de G 3 et G+4 . De plus, seul ce premier résidu méthionine est suivi d'une séquence pouvant répondre aux critères de taille d'un peptide signal. Une région hydrophobe de 19 acides aminés et bordée de résidus basiques est située entre les acides aminés 153 et 171, ce qui suggère une région transmembranaire. Le résidu Asparagine 74 est un site potentiel de N-glycosylation. La région C-terminale de 59 acides aminés est riche en Glycine (27%) et en résidus acides (29%). B - REPRESENTATION DES MOLECULES EN 2 DIMENSIONS ("HCA plot") La représentation en 2 dimensions sous forme théorique d'hélice permet l'étude des "clusters" hydrophobes, mais également le rapprochement d'acides aminés éloignés en séquence primaire. Cette représentation des deux antigènes a permis d'observer la présence de 7 motifs semblables ou similaires dans les deux molécules (Figure 2). Ces motifs, constitués de 4 à 6 acides aminés éloignés les uns des autres en séquence primaire (Figure 3), sont situés dans les domaines hydrophiles des molécules et pourraient être à l'origine des réactivités croisées observées. De nombreux doublets d'acides aminés sont observés, en particulier dans la séquence de l'antigène P32 (Figure 3). Figure 2 : Représentation des deux antigènes en deux dimensions et détermination des motifs communs La séquence des antigènes P21 (A) et P32 (B) est représentée sous forme d'hélice a. Les domaines hydrophobes sont indiqués par des doubles flèches audessus de chaque séquence et les acides aminés correspondants sont entourés d'un trait double. Les régions potentiellement a-hélicoldales sont indiquées par des doubles flèches en pointillés. Les motifs d'acides aminés communs aux deux antigènes sont entourés d'un trait épais. Les deux régions hydrophiles entourées d'un trait simple correspondent au fragment exprimé sous forme recombinante (R) et au peptide de synthèse (P) obtenus à partir de P32. Les acides aminés sont représentés selon leur code à une lettre. Les acides aminés particuliers sont indiqués par les symboles suivants Thr O ; Ser m Gly + ; Prou ; Cys Figure 3 : Séquence primaire des deux antigènes Les acides aminés composant les motifs communs aux deux antigènes (A = P21 ; B = P32) sont encadrés Les résidus appartenant à plusieurs motifs sont encadrés et surlignés. Les doublets ou triplets d'acides aminés sont soulignés. L'alignement des séquences en acides aminés des antigènes P32 et P21 ne révèle aucune homologie significative (24%). Par contre, la représentation de ces deux séquences sous forme théorique d'hélice a permet d'observer 7 regroupements d'acides aminés communs pouvant expliquer la réactivité croisée observée entre ces deux antigènes. Ces motifs sont constitués d'acides aminés éloignés les uns des autres en séquence primaire. EXEMPLE 5 : PURIFICATION DES PROTEINES P21 ET P32 RECOMBINANTES Les polypeptides codés par les inserts 1 et 13 ont été produits sous forme recombinante dans E. coli afin d'obtenir des sérums anti-P21 et anti-P32. Les inserts ont été sous-clonés dans le vecteur plasmidique d'expression pGEX 2T [SMITH and JOHNSON, Gene, n 67, p. 31-40, (1988)], de façon à produire une protéine de fusion avec la protéine Sj 26. Cette protéine de 26 kDa, une Glutathion S-transférase de Schistosoma japonicum, possède une très haute affinité pour le glutathion. Le couplage du glutathion à des billes d'agarose permet une purification très rapide des protéines de fusion comprenant la Sj 26. Les inserts ADNc sont ligués dans le vecteur pGEX. La souche E. coli JM109 rendue compétente par le traitement au TFB est transformée par le vecteur chargé. Les colonies sont testées en minipréparation de plasmides par lyse alcaline de façon à vérifier la présence de l'insert et sa bonne orientation. L'expression de la protéine de fusion est recherchée dans un lysat de chacun des clones sélectionnés. Une colonie exprimant la protéine de fusion est cultivée une nuit à 37 C dans 200ml de LBampicilline. Cette culture est diluée dans 2 litres pendant une heure à 37 C puis l'expression est induite pendant 1 h par addition d'IPTG 0,lmM. La culture est centrifugée 10 min. à 4- C, 3000rpm. Chaque culot correspondant à 500 ml de culture est repris dans 10 ml de PBS-TEP froid puis les bactéries sont soniquées 4 x 20 sec.. Le soniquat est centrifugé en tubes Corex à 4- C 10 min. à 10.000rpm puis le surnageant est mis en contact avec 2 ml de billes agarose-Glutathion préalablement équilibrées en PBS, environ 5 min. sur un agitateur rotatif à 4- C.Les billes sont centrifugées 2 min. à 4 C à 2000rpm puis lavées trois fois dans un grand volume de PBS-TEP. L'élution de la protéine de fusion est ensuite réalisée par compétition avec du glutathion libre ajouté à la concentration de 5mM en Tris-HCl pH 8,0 5 ohm. Ce "décrochage" est effectué deux fois de suite par 5 ml de cette solution, quelques minutes à 4 C. La protéine de fusion est conservée à -20- C, un aliquot étant prélevé de façon à effectuer les analyses qualitatives et quantitatives sur minigel de polyacrylamide. La protéine de fusion est dialysée 2 x 1 h à 4 C contre du PBS pH 7,5 EDTA lmM, PMSF 0,5mM, puis concentrée sur AQUACID (CALBIOCHEM). EXEMPLE 6 : PRODUCTION D'ANTICORPS CONTRE LES PROTEINES RECOMBINANTES P21 ET P32 Les protéines recombinantes sont injectées en fusion avec la protéine Sj26. Les souris Swiss OF1 reçoivent à deux semaines d'intervalle quatre injections de 10 à 15reg de chaque construction dans 100R1 de PBS, additionnés de 100,U1 d'adjuvant complet de Freund. L'analyse par Westen blot sur un extrait de tachyzoltes de la réponse anticorps dirigée contre chacune des protéines de fusion a confirmé la réactivité croisée entre les deux antigènes. Le sérum anti-P21 recombinante reconnaît comme prévu l'antigène de 21 kDa. Les deux sérums anti-P21 et anti-P32 recombinantes révèlent en commun une bande à 32 kDa et un doublet à environ 28 kDa. Le sérum anti-P32 recombinante détecte en outre une bande à 24 kDa. Les antigènes de 32 et 21 kDa reconnus par les sérums anti-protéines recombinantes comigrent avec ceux détectés par le sérum de souris dirigé contre la fraction HPLC . Par contre, ce dernier révèle une simple bande à 28 kDa, et non pas un doublet et ne détecte aucune bande à 24 kDa. La réactivité croisée entre les antigènes P21 et P32 semble donc s'étendre à d'autres molécules, en particulier à un doublet migrant à environ 28 kDa et à un antigène de 24 kDa, définissant ainsi une famille de protéines. EXEMPLE 7 : OBTENTION D'ANTISERUMS SPECIFIQUES CONTRE DES FRAGMENTS PEPTIDIQUES DE L'ANTIGèNE DE 32 KDA Afin d'obtenir un anticorps spécifique contre l'antigène de 32 kDa, deux régions hydrophiles ne comportant apparemment pas de motifs communs complets avec l'antigène P21 ont été choisies de part et d'autre de la seconde zone hydrophobe - La région N-terminale 74-100 a été sous clonée dans le vecteur d'expression pGEX 3X (fragment Hindil obtenu à partir de l'insert ADNc 13 Fragment 13HII) et produite sous forme recombinante chez E. coli selon le protocole décrit à l'exemple 5 cidessus; - Un peptide de synthèse a été choisi dans la région C-terminale (188-201). Ce peptide a été couplé à liovalbumine. Les souris Swiss OF1 sont immunisées avec ces deux peptides, selon le protocole décrit à l'exemple 6 ci-dessus. Les sérums de souris dirigés contre ces deux fragments ont été dans un premier temps analysés sur un Transfert immuno-électrophorétique d'extrait de tachyzoites et en immunofluorescence sur parasites fixés. Le sérum anti-13HII révèle sur un Transfert immuno-électrophorétique une simple bande à 32 kDa, alors que le sérum anti-peptide 188-201 ne détecte aucun antigène. En revanche, les deux immunsérums permettent de détecter en immunofluorescence un marquage d'aspect granulaire sur les tachyzoltes fixés ou en coupes. Les bradyzoites présentent le même marquage, et il est également possible d'observer un faible marquage au niveau de la paroi des kystes. La présence dans la séquence en acides aminés de cette molécule de deux régions hydrophobes possédant les caractéristiques d'un peptide signal et d'une région transmembranaire conforte ces résultats. il apparaît donc que l'antigène de 32kDa représente une molécule des granules denses non décrite jusqu'à présent. EXEMPLE 8 : tlNISATION DES SOURIS PAR L'ANTIGENE P21 NATIF ET RECOMBINANT Des souris femelles OF1 âgées de 8 à 10 semaines ont été immunisées de la façon suivante quarante-deux, trente-cinq, vingt-sept et sept jours avant l'infection, l'antigène suivant - 15 g de P21 native purifiée par HPLC a été mis en suspension dans 100 Rl de PBS, émulsifié avec 100 ,ul d'adjuvant incomplet de Freund et administrés par injection sous-cutanée. Des souris témoin ont été traitées selon le même protocole par du PBS additionné de 100 pil d'adjuvant incomplet de FREUND. Le jour de l'infection, les sérums ont été collectés, puis une suspension de 1200 kystes dans 0,3 ml de PBS, pH7,2 a été administrée oralement. Les sérums des souris immunisées avec la P21 purifiée par HPLC ont été testés par transfert immunoélectrophorétique, contre un extrait NP.40 de tachyzoites, afin de déterminer s'ils reconnnaissent l'antigène P21. La figure 4 représente le pourcentage de souris survivantes après l'infection dans le cas d'une expérience d'immunisation par l'antigène P21 natif. Dans une première expérience (figure 4a), alors que seulement 15% des souris témoin immunisées uniquement avec l'adjuvant incomplet de FREUND (+) survivent 15 jours après l'infection, 40% des souris immunisées avec l'antigène P21 purifié par HPLC (Ck) sont encore vivantes. 50 jours après l'infection, le pourcentage de survie n'a pas diminué, alors qu'il est inférieur à 10% chez les animaux témoin. Une deuxième expérience (figure 4b) a abouti à des résultats similaires. Ces résultats montrent que l'immunisation avec l'antigène P21 purifié par HPLC conduit à une protection significative. Dans une autre expérience de protection, il a été constaté que à Jll, l'immunisation de souris par l'antigène P21 natif purifié, et l'antigène P21 recombinant confèraient respectivement 31 %, et 15% de survie, et qu'à J85, les taux de survie sont respectivement de 15 et 8% chez les animaux immunisés par P21 natif et P21 recombinant. Les résultats d'immunisation de cette dernière expérience sont plus faibles que ceux des premières ceci s'explique par une charge parasitaire initiale particulièrement importante. EXEMPLE 9 : REACTIVITE DES SERUMS HUMAINS AVEC L'ANTIGENE P32 RECOMBINANT Les sérums humains ont été obtenus à partir de patients porteurs d'une infection aigue ou chronique par Toxoplasma gondii (TG positif). Des sérums de patients sains ont été utilisés comme témoin (TG négatif). Le test a été réalisé par ELISA, et la révélation faite en utilisant des anticorps anti-IgG humaines biotinylées la fixation de ces anticorps a été décelée en utilisant des complexes streptavidine-biotine marqués à la peroxydase. Le substrat de peroxydase utilisé est l'OPD et la densité optique a été mesurée à 492 nm Les résultats obtenus montrent que l'antigène P32 recombinant est reconnu par tous les sérums de patients infectés par T. gondii .Au contraire, dans les conditions expérimentales utilisées, l'antigène P21 recombinant n'est reconnu par aucun d'entre eux. I1 apparaît donc que, malgré la présence de motifs communs, le ou les épitopes de P32 immunogènes chez l'homme sont soit absents soit non antigéniques dans P21. il semble d'ailleurs en être de même chez la souris, puisque le sérum anti-P32 recombinant ne reconnaît pas P21. SEQ. ID. 1 GGTCGCATG ACTCCCTCAG GTGGTTAGCG GAGAAACCTC AGATCCCTCG GCGCGCGACG CGTGCCAGAG -144 CGCGGGACGG GGTGGCAACG AGACACGTTT GGATAAAGGT CCTGCCAGGT TGTGGAATCA GACGTGTGGG -74 CTGTTCZGCG TCGGTTTGGT TTGTGCAGAG ACGCACTGAC GGTTGACGTC GATCGGCACT CGATCCTACC -4 22 GTCAGTCAAT TTTATTTTGG TTTTTGCAGA TATCATCGCG CGTGTGTTCA CTCTAACTGT GTGTATGGTT 87 +1 CACTGTTTTT TATTGCGATT TTCGTGAAGT AACAAA ATGGCGTCTGTAAAACGCGTCGTTGTGGCGGTAATG 139 M A S V K R V V V A V M 12 ATCGTGAACGTGCTGGCTTTAATTTTTGTGGGCGTTGCCGGTTCAACGCGTGACGTAGGGTCAGGCGGGGATGAC 214 t V N V t A L I F V G V A G S T R D 7 G S G G D 3 37 p TCCGAAGGTGCTAGGGGGCGTGAACAACAACAGGTACAACAACACGAACAAAATGAAGACCGATCGTTATTCGAA 289 S E G A R G R E Q Q Q V Q Q R E Q N E D R S t F E 62 2 3 AGGGGAAGAGCAGCGGTGACTGGACATCCAGTGAGGACTGCAGTGGGACTTGCTGCAGCTGTGGTGGCCGTTGTG 364 R G R A A V T G H P V R T 4 A V G L A A A V V A V V 87 TCACTACTGCGATTGTTGAAAAGGAGGAGAAGACGCGCGATTCAAGAAGAGAGCAAGGAGTCTGCAACCGCGGAA 439 s I K R R R R R A r Q E E S X E S A T X E 112 GAGGAAGAAGTTGCCGAGGAAGATAAGGGGCACTGTGTTGCTCGGCTCTTTGTTGTCTCAGCG TGAGGATTTA 512 E E E V A E E D K G H C V A R L F V V S A 133 GTGCGTGTAG CGCAGCATGT ATCGATCGAT ACAGGCACGG TTGGACGTGT CGTCTGTATC CCTTGTGGCA 582 GACGGCAGAC GCCATTGTCA GAGCGTGTTG CACGTTGGAA GAAAATGTGT TGGTGTAATC CCTCGTCGGA 652 CAGATACCAG GAGGTTGCGT GGTGATGATC GTGTGTGCGT AGAGGTGTGC CTCGTGATAA CATGAAGGGC 722 AAGGACCTTT TTTGTCGAGC ACATACTCAA ACCAGTGATT GTGCGAGGCG GGTTGCXCGC GACTTTGATC 792 CATTACAGTT AAATATGCCG AACGCGTGGC CTGATTCSCA CACAAGGCGC ACAGACGTAC CGTTGATGAG 862 SEQ.ID. 2 GAATACGTCG GACTGGTCTA GGTGAACGTG GTGCGACGAG CTGATCACCA TCGGAGGGCT TTGGCTTTCG 70 TCGCTGAGGA TGCTTCTCAT CTTGTTCCAC CGGCTGCCAC GCGGAGCAGG AACGGCCGAC CTGTACGAAA 140 CACGAGTCTC GCGCGTCTCA TGCAAATGCC CACTGGCTGA CTCTTCCCCA TTAGTAGAAT ATTTGCGTCG 210 TGCAATGCTG ACGGCAAACA AAACGAAGTG CTATCAGCGT GTTTTGCTGT GCATTGCAGG CTGTTTTATT 280 TAGACATTTT GGCCGCAAAA GATTTGTGTT TCCGAGCAGG TGACCTGGGT CGCTTTTTTG AAACAGCAGG 360 AAAACAGCTT CGTGGTGCCA CGTAGCGTGC TTGTTGGCGA CTACCTTTTT TTCTTGGGAG TGTCGGCGAA 420 ATGGCACACGGTGGCATCCATCTGAGGCAGAAGCGTAACTTCTGTCCTGTAACTGTCTCCACAGTTGCTGTGGTC 496 M A H G G I H L R Q K R N F C P V T V S T V A V V 26 TTTGTAGTCTTCATGGGTGTACTCGTCAATTCGTTGGGTGGAGTCCGTGTCGCAGCAGACAGCGGTGGTGTTAAG 570 F V V F M E V L V N S L G G V R V A A A D S G G v K 50 CAGACCCCTTCGGAAACCGGTTCGAGCGGTGGACAGCAAGAAGCAGTGGGGACCACTGAAGACTATGTCAACTCT 645 Q T P S ET G S S GGQQ K A V G T T E O Y Y * TCGGCGATGGGCGGTGGCCAAGGCGACTCGTTAGCTGAAGATGATACAACCTCCGAAGCGGCGGAGGGCGACGTT 720 S A M G G G Q G D S L A E D D T T S Z A A E G D F 100 GACCCTTTTCCCGTGCTGGCGAATGAGGGGAAGTCGGAGGCGCGTGGCCCGTCGCTCGAGGAAAGAATCGAAGAA 795 D P F P V L A N E G K S E A R G P S L E E R I E E 125 CAGGGCACAAGACGACGTTACTCCTCTGTTCAAGAACCACAAGCGAAGGTGCCATGCAAACGAACACAGAAACGC 378 Q G T R R R Y S S V Q E p Q A K V p C K R T Q K R 150 CACAGACTCATTGGTGCTGTGGTGTTGGCAGTATCTGTGGCAATGCTTACCGCTTTCTTTCTTCGAAGGACTGGA 940 K K JL t I G G A 'r v t A V S V A M L T A r A LIR R T G 175 CGACGCTCTCCCCAAGAACCATCTGGGGATGGTGGTGGAAATGATGCAGGCAATAATGCTGGGAACGGTGGGAAT 1020 R R S P Q E P S G D G G G N D A G N N A G N G G N 200 GAAGGCAGAGGTTACGGAGGCAGAGGTGAAGGAGGAGCCGAGGATGACAGGCGCCCGTTGCACCCGGAACGTGTG 1095 E G R G Y G G R G E G G A E D D R R P L H P E R V 226 AATGTGTTTGATTAT TAAAGATGAA AACAGGGGGT CTATGCGCCA CTGGGGCACT CTATGTCTTG 1160 N V F D Y 230 TAGTCGATGC CATGCAACGA CCCGGAGAGC GGCACTGTCC GACGTGGAGA AGAACGTAGG AATCTGTACG 1230 AACTGCGCTC CTTCCAGACT TGGGACGTGG ACAGGTCGAC ATGTGTGGAC GGGTCGCGAT GAATGGTTTG 1300 CGTCTTTTAC ACCTGAGGTA GTGTACGTCG GCGATCGCAG GGCTGTAACG CTCAGGAGAA TCTTCCAAAG 1370 AACGGTGAAG CCGAATCTGT CGAGTTACCA TCTGGCAGTT GTGACGTGGT ACTACCGGAC TGAAATAAAA 1440 AGCAAAGTTT TCGTGAAAGT CTGTGGCAGC GATTCCAGTG AAAAGTCGAA GAGATGAAAC ATAAGTAGGA 1510 ATACGATAAT GCCTCCGACA CCGCCGGCAT CACCTGCAAG CTGTACGTTT CAGTCGTGGA AGATGCTTTA 1580 AGTGTGAAGC GAAAAGAGTC GCACACACGA GAACGAATGA GTGTAAAACA GGGGCCGGAT CATACACCGA 1660 CCCGTCGATG AGGCAGAGCC GCTGCGCCGA AGCTGCCGCG ATTTGTCATA AAGTTTTCAC GTGTTTTGTG 1720 TTTTGCGTCG TGTGTATGCC GTGTCGCGAT TTCGTCTTTC AAAACTCCAC ACAAGCGCGA AAAATTATGG 1790 AAACGTATCA TGCGTGGGCT TAATACGATG TTGAAGAATT GCACGTGCAC ATGCCAGCGA AACTAGCAGG 1800 REVENDICATIONS 1) Fragment d'acide nucléique, comprenant tout ou partie de la séquence du gène d'un antigène d'excrétion-secrétion de Toxoplasme, lequel fragment est caractérisé en ce que ladite séquence est choisie dans le groupe constitué par a) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P21 de Toxoplasme b) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P32 de Toxoplasme c) une séquence complémentaire de l'une ou l'autre des séquences a) ou b) d) un segment de plus de 10 pb de l'une des séquences a), b) ou c). 2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence a) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 1 3) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence b) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 2. 4) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d) est une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide représentant au moins une partie de la protéine P21 ou P32. 5) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d) est une séquence codant pour un fragment peptidique comprenant un épitope de l'antigène P21 et/ou un épitope de l'antigène P32. 6) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7) Cellule eucaryote ou procaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un fragement d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8) Préparation purifiée d'une protéine constituant un antigène d'excrétion-secrétion de toxoplasme, laquelle préparation est caractérisée en ce que ladite protéine est choisie dans le groupe constitué par - l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme - l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme. 9) Préparation purifiée de protéine selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite préparation purifiée est une préparation de protéine native. 10) Préparation purifiée de protéine selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite préparation purifiée est une préparation de protéine recombinante. 11) Polypeptide, dont la séquence comprend tout ou partie d'un antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme, lequel polypeptide est caractérisé en ce que ladite séquence d'antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme est choisie dans le groupe constitué par a) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme. b) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme. c) une séquence représentant un segment de plus de 5 acides aminés de l'une des séquences peptidiques a) ou b). 12) Procédé de production d'un polypeptide selon la revendication 11, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on procède à la mise en culture de cellules transformées, comprenant au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 13) Composition antigénique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène pris dans le groupe constitué par - une préparation purifiée de l'antigène P21 ou de l'antigène P32, selon l'une quelconque des revendications 8 à 10; - un polypeptide selon la revendication 11. 14) Procédé de préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique selon la revendication 13. 15) Utilisation d'une composition antigénique selon la revendication 13 pour l'obtention de réactifs de diagnostic. 16) Utilisation d'une composition antigénique selon la revendication 13 pour l'obtention de vaccins. 17) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce que l'on associe une composition antigénique selon la revendication 13, à une composition antigénique comprenant au moins un autre antigène d'excrétionsécrétion de toxoplasme.