Brevet FR2703363A1 — publié le 19941007

La présente invention se rapporte à des anticorps purifiés qui reconnaissent la DOPA-décarboxylase avec une grande spécificité, ainsi qu'à des kits permettant la mise en évidence ou le dosage de cette enzyme. Elle se rapporte également à une protéine de fusion entre la ss- galactosidase et la DOPA-décarboxylase. Elle concerne enfin des procédés de préparation d'anticorps anti-DOPA-décarboxylase et de ladite protéine de fusion. La DOPA-décarboxylase est une enzyme (EC.4.1.1.28) qui décarboxyle les L acides aminés aromatiques et qui intervient dans les voies de biosynthèse des catécholamines et des indolamines. En particulier, elle transforme la dihydroxyphénylalanine (DOPA) en dopamine et le 5hydroxytryptophane en sérotonine. Elle est présente chez les mammifères dans le système nerveux central, l'épiphyse et la surrénale, mais également dans des organes périphériques comme le foie, le rein et le pancréas. Les taux de DOPA-décarboxylase peuvent se trouver perturbés dans différentes situations pathologiques : hypertension artérielle, cancer à petites cellules du poumon, neuroblastome. Par ailleurs, le dosage de la DOPA-circulante s'avère souhaitable lors du traitement de la maladie de Parkinson par administration de L DOPA, afin d'adapter la posologie. La quantité de DOPA circulante peut être dosée par production de dopamine par la DOPA-décarboxylase. Le contrôle de la quantité de DOPA ou de DOPA-décarboxylase permettrait en outre de limiter le traitement complémentaire par les inhibiteurs de la DOPAdécarboxylase, qui est souvent nécessaire chez les patients parkinsoniens et qui peut entraîner des effets secondaires. L'activité de la DOPA-décarboxylase peut être dosée soit en estimant le 14C02 dégagé à partir de la DOPA marquée au 14C sur le carboxyle, soit en dosant par HPLC la dopamine formée. Ces deux méthodes sont à l'heure actuelle les plus utilisées. Elles se prêtent peu au traitement en série et nécessitent un appareillage spécialisé coûteux (compteur de radioactivité, HPLC). La caractérisation de la DOPA-décarboxylase par des méthodes immunologiques représenteraient une amélioration certaine. Cependant, la préparation d'antisérum nécessite de pouvoir disposer de la protéine en quantité et avec un degré de pureté suffisant ; la purification de cette protéine se heurte à un certain nombre de difficultés techniques. La structure primaire de la DOPA-décarboxylase est largement conservée chez les différentes espèces de vertébrés et de mammifères, et également chez la drosophile. Ce degré élevé de parenté dans les séquences d'amino- acides rend difficile l'obtention d'une réponse immunitaire par administration de cette protéine à un animal. En outre, la purification de la DOPA-décarboxylase à partir d'organes nécessite de nombreuses étapes et la protéine est obtenue avec un très faible rendement. Cependant, plusieurs antisérums dirigés contre la DOPAdécarboxylase ont été préparés à partir de DOPA-décarboxylase extraite de tissus animaux L'équipe de Joh (Albert et al) a préparé un antisérum de lapin dirigé contre la protéine extraite de médullosurrénale de boeuf. Des antisérums de lapin et de rat, dirigés contre la protéine de foie de rat (Tanaka et al) et un antisérum dirigé contre la protéine extraite de phéochromocytome de rat (Krieger et al) ont également été obtenus. Toutefois, ces antisérums sont coûteux car la protéine est difficile à purifier. Les titres en anticorps ne sont pas satisfaisants et conviennent mal à la préparation de tests de diagnostic. I1 serait donc souhaitable de pouvoir disposer d'une protéine susceptible d'entraîner la production d'anticorps spécifiques dirigés contre la DOPA-décarboxylase, selon un procédé rapide. De tels anticorps pourraient alors être utilisés dans un test du type ELISA, facilement utilisable en série. C'est pourquoi la présente invention se rapporte à une protéine recombinante purifiée, caractérisée en ce qu'elle est composée d'au moins moins une partie de DOPA-décarboxylase fusionnée à tout ou partie de la - galactosidase. Par partie de la B-galactosidase, on entend désigner une partie possédant les principaux épitopes antigéniques de la protéine et suffisante pour entraîner la production d'anticorps anti-DOPAdécarboxylase ; de préférence cette partie a un poids moléculaire supérieur à 80 000 daltons. Le poids moléculaire d'une protéine de fusion qui convient particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention, évaluée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, est d'environ 166 000 daltons. Une telle protéine peut être produite en grande quantité par génie génétique. Après incorporation de la séquence d'ADNc correspondante dans un vecteur d'expression approprié et transformation d'une cellule hôte, la protéine produite peut être purifiée aisément. Ceci constitue un avantage par rapport à la DOPA décarboxylase extraite des tissus animaux, où il y a souvent contamination par des protéines de poids moléculaire équivalent normalement présentes dans ces tissus ; le nombre d'étapes de purification peut donc être réduit sans risque de copurifier d'autres protéines indésirables. La séquence complète de la DOPA décarboxylase de rat a été déterminée par Tanaka et al. et par Krieger et al. Etant donné que la structure est très conservée chez les mammifères, cette protéine isolée est en général faiblement immunogène. En revanche, une protéine de fusion avec la ss-galactosidase entraîne, de manière inattendue, une réponse immunogène de très bonne qualité. Les anticorps produits sont dirigés contre la p-galactosidase et contre la DOPA-décarboxylase. La ss-galactosidase est normalement absente chez les mammifères. On peut facilement éliminer les anticorps dirigés contre la ss-galactosidase en épuisant le sérum contre cette protéine. L'antisérum obtenu reconnaît de manière croisée la DOPA décarboxylase de nombreuses espèces de vertébrés, en particulier de l'homme. Par exemple, le sérum obtenu par hyperimmunisation d'un lapin est capable de reconnaître la DOPA-décarboxylase jusqu'à des dilutions de 1/5000 en Western blot et de 1/2000 sur des coupes tissulaires. Plus particulièrement on utilise une protéine de fusion caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence de 467 acides aminés de la DOPA-décarboxylase de rat, codée par la séquence comprise entre les nucléotides +12 et +1965 de l'ADNc correspondant de rat La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une protéine recombinante composée de DOPAdécarboxylase fusionnée à la B-galactosidase, caractérisée en ce que a) on lie la séquence d'ADNc comprise entre les nucléotides +12 et +1965 de l'ADNc de la DOPA-décarboxylase de rat, à l'ADN codant pour la Bgalactosidase, dans le même cadre de lecture ouvert d'un vecteur d'expression, b) on transforme des cellules hôtes par le vecteur, c) on sélectionne les clones produisant la protéine de fusion p- galactosidase-DOPA-décarboxylase, d) on récupère la protéine de fusion produite. Plus particulièrement, la cellule hôte est une bactérie, de préférence E. coli. On peut notamment utiliser comme vecteur le plasmide pEx2. La protéine peut alors être préparée à partir des corps d'inclusion de E coli, où il n'existe pas de protéine de ce poids moléculaire. Elle peut par exemple être repérée en électrophorèse préparative puis purifiée par électroélution. Cette protéine injectée au lapin ou à la souris génère des anticorps et permet l'obtention de sérum polyclonal ou monoclonal respectivement. L'un des objets de l'invention est donc un anticorps purifié, caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement la DOPAdécarboxylase et qu'il peut être obtenu après immunisation d'un animal par une protéine de fusion B-galactosidase-DOPA-décarboxylase . Pour cela, après avoir immunisé l'animal par injection de la protéine de fusion, on recueille l'antisérum dont on élimine les anticorps dirigés spécifiquement contre la p-galactosidase. Cet anticorps peut être marqué par un moyen radioactif ou enzymatique. L'une des applications possibles est l'obtention d'anticorps monoclonaux, n'inhibant pas l'activité de la DOPA-décarboxylase, et qui permettraient de fixer l'enzyme dans un test ELISA destiné à doser la DOPA circulante par mesure de la dopamine formée. L'invention comprend également un procédé de préparation d'anticorps dirigés contre la DOPA-décarboxylase, caractérisé en ce que a) on prépare une protéine de fusion ss-galactosidase-DOPA- décarboxylase, b) on injecte la protéine de fusion purifiée à un animal, selon un protocole entraînant une hyperimmunisation, c) on recueille le sérum hypenmmun de l'animal, d) on épuise le sérum contre la p-galactosidase afin d'éliminer les anticorps spécifiques de cette protéine, e) on récupère le sérum contenant les anticorps spécifiques de la DOPA-décarboxylase. Les anticorps subissent ensuite éventuellement une ou plusieurs purifications. Après immunisation de l'animal par la protéine de fusion, on peut selon un autre aspect de l'invention, préparer des anticorps monoclonaux selon des technologies connues de l'homme de métier. Les anticorps peuvent être utilisés pour la purification de la DOPAdécarboxylase. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic contenant des anticorps anti-DOPA-décarboxylase tels qu'ils ont été définis ci-dessus, et préparés à partir de la protéine de fusion recombinante selon l'invention. Un tel kit peut être appliqué à la mise en évidence ou au dosage de la L-DOPA ou de la DOPA-décarboxylase. Ce kit consiste de manière préférée en un test ELISA. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer certains avantages et caractéristiques de l'invention, sans aucunement en limiter la portée. Exemple I : Préparation de protéine de fusion Le vecteur pUC18, contenant l'ADNc de rat codant pour la décarboxylase des acides L aminés aromatiques (AADC) ou DOPAdécarboxylase est digéré aux sites Eco R1, et le fragment est lié dans le vecteur pEX2 (Boehringher Mannheim) aux mêmes sites de restriction. La construction obtenue contient l'ADNc de la DOPA-décarboxylase de rat (nucléotide +12 à nucléotide +1965) dans le même cadre de lecture que l'ADN de la ss-galactosidase (B-gal). La protéine de fusion ,8-gal-AADC est constituée par la protéine ,B-gal liée à un fragment de 476 acides aminés de la protéine AADC ; seuls les quatre premiers acides aminés de la séquence polypeptidique totale manquent. La souche d'Escherichia coli pop 2036 (fournie par le Dr Raibaud, Institut Pasteur Paris), est transformée et sélectionnée pour sa capacité à produire la B-galactosidase ou B-gal AADC en augmentant la température de 30 C à 40 C, ce qui inactive le répresseur thermosensible cI857.Les clones sélectionnés, après induction à 40 C, sont ensuite cultivés à cette température pendant 90 minutes. Les cellules sont centrifugées et mises en suspension dans un tampon d'extraction ( Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM) en présence de 0,5 mg/ml de lysozyme, pendant 30 minutes à 0 C. La suspension est congelée-décongelée, et l'ADN est cassé par sonication. Les corps d'inclusion contenant la protéine de fusion sont sédimentés par centrifugation à 12 000 g pendant 10 minutes, lavés une fois à l'eau distillée et solubilisés dans un échantillon de tampon (Schoner et al, Biotechnol. 3, 1985, 151-154). La protéine de fusion est caractérisée par SDS PAGE 6%, après marquage au bleu de Coomassie, comme la plus grande protéine, en comparant les profils protéiques provenant de cellules exprimant de manière différentielle ss-gal ou ,6-gal-AADC. La protéine de fusion (de poids moléculaire 166 000 daltons) est purifiée à partir d'une SDS PAGE préparative à 6%, par électroélution dans du tampon Tris-acétate 10 mM, contenant 0,001% de SDS et dialysée contre une solution saline de phosphate tamponné: PBS (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,5 mM). Exemple 2 : Préparation d'anticorps 200 Fg de protéine du fusion sont émulsionnés dans de l'adjuvant de Freund complet et injectés par voie souscutanée à un lapin. Après deux semaines, on injecte 270 ccg de protéine de fusion par voie intramusculaire. Sept jours plus tard, le lapin est saigné. Tous les deux mois, une injection intraveineuse suivie d'une prise de sang est effectuée. L' activité anti AADC du sérum final provenant de ce lapin hyperimmunisé est ensuite testée en comparant les taux antigéniques respectifs en AADC dans différents organes du rat. Plusieurs extraits d'organes de rat: phéochromocytome, épiphyse, médulosurrénale, rein, foie, tissu cérébral, et testicule, sont préparés par broyage des tissus dans un appareil de Potter avec trois volumes de tampon phosphate de potassium 0,020 M, pH 7,2, et centrifugés pendant 10 minutes à 12 000 g. Le surnageant brut est soumis à une électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel SDS. Le contenu du gel est transféré sur une membrane de nitrocellulose et la membrane est incubée avec le sérum anti AADC. La présence de sérum anti AADC est détectée par une réaction sandwich en utilisant des IgG dirigées contre le lapin marquées à la phosphatase alcaline.La bande correspondant à 1'AADC est la seule détectée dans tous les organes, sa migration indique une masse moléculaire de 50 000 daltons. Quelques variations sont observées dans les quantités d'AADC présents dans les différents organes, l'épiphyse étant la plus riche et le testicule étant le plus pauvre. La spécificité du sérum anti-AADC est vérifiée par western blot d'un extrait de cerveau dans des expériences d'adsorption. L'antisérum dilué au 1/2000 est incubé pendant une nuit en présence de fragments de membrane de nitrocellulose saturée soit par de la B-galactosidase, soit par la protéine de fusion ss-gal-AADC (40 zg de chaque protéine/cm2). L'incubation du sérum avec la membrane saturée en ss-gal-AADC annule complètement le signal AADC, alors que l'incubation avec la membrane saturée en B-gal ne modifie pas la réponse antigénique. La spécificité est également vérifiée en immunochimie. Pour cela, le cerveau de rats Wistar est préparé par perfusion de la tête avec une solution de paraformaldéhyde à 4% dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,1 et congelé. Des sections libres flottantes (40 llm) sont faites dans le plan frontal. L'AADC est détecté par application de l'antisérum, suivie par un marquage par la méthode peroxidase-antiperoxidase. Les sections sont incubées trois jours à 4" C dans le sérum dilué au 1/2000 dans du PBS contenant 0,3% de Triton X100 et 0,1% de sérum albumine bovine. Le sérum anti AADC est marqué avec un sérum de mouton contenant des y globulines anti-lapin, et un complexe lapin/PAP selon le procédé décrit par Tillet et al. (Neurosci. 20, 1987, 1011-1022). L'activité péroxidase est détectée par un mélange de diaminobenzidine (0,02%), de sulfate d'ammonium nickel (0,5%), eau oxygénée (0,003 %) dans du tampon Tris-HCl 0,05 M, pH 7,9. Dans les coupes de cerveau de rat, des neurones contenant de l'AADC (corps cellulaires et fibres) sont marqués intensément à l'intérieur de la substantia nigra, une zone bien connue pour la présence de neurones dopaminergiques et dans le nucleus raphe dorsalis connu pour la présence de neurones sérotoninergiques. Le marquage par l'anti g-gal AADC est conservé après adsorption sur p-gal mais disparaît après adsorption sur ,8- gal-AADC. La morphologie et la localisation topographique des neurones immunoréactifs à l'AADC révélées par l'antisérum à une dilution de 1/2000 sont similaires à celles obtenues en utilisant un sérum polyclonal anti phéochromocytome de rat AADC produit dans notre Laboratoire. La production de la protéine de fusion p-gal-AADC permet un accès facile à l'antigène, l'enzyme AADC, qui est sinon difficile à purifier. RéVéRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Tanaka T., Horio Y., Taketoshi M., Imamura I., Ando-Yamamoto M., Kangawa K., Matsuo H., Kuroda M. and Wada H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 8142-8146. Molecular cloning and sequencing of a cDNA of rat dopa decarboxylase: Partial amino acid homologies with other enzymes synthesizing catecholamines. Krieger M., Cogé F., Gros F. and Thibault J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88, 2161-2165. Different mRNAs code for dopa decarboxylase in tissues of neuronal and nonneuronal origin. Albert, V.R, Allen J.M, & Joh T.H. J. Bill. Chem., 1987, 262, 9404-9411 REVENDICATIONS 1. Protéine recombinante purifiée, caractérisée en ce qu'elle est composée d'au moins une partie de la DOPA-décarboxylase, fusionnée à tout ou partie de la ss-galactosidase. 2. Protéine recombinante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence de 467 acides aminés de la DOPAdécarboxylase de rat, codée par la séquence comprise entre les nucléotides +12 et +1965 de l'ADNc correspondant de rat 3. Protéine recombinante selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 166 kDa. 4. Procédé de préparation d'une protéine recombinante selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que a) on lie la séquence d'ADNc comprise entre les nucléotides +12 et +1965 de l'ADNc de la DOPA-décarboxylase de rat, à 1'ADN codant pour la 13-galactosidase, dans le même cadre de lecture d'un vecteur, b) on transforme des cellules hôtes par le vecteur, c) on sélectionne les clones produisant la protéine de fusion - galactosidase-DOPA-décarboxylase, d) on récupère la protéine de fusion produite. 5. Procédé de préparation d'une protéine recombinante selon la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule hôte est une bactérie, de préférence E. coli. 6. Procédé de préparation d'une protéine recombinante selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que la protéine est extraite des corps d'inclusion d'E. coli. 7. Anticorps purifié, caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement la DOPA-décarboxylase et qu'il peut être obtenu après au moins une immunisation d'un animal par une protéine de fusion - galactosidase-DOPA-décarboxylase selon l'une des revendications 1 à 3. 8. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'après avoir immunisé l'animal par injection de la protéine de fusion, on recueille l'antisérum dont on élimine les anticorps dirigés spécifiquement contre la p-galactosidase. 9. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps polyclonal. 10. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est marqué par un moyen radioactif ou enzymatique. 11. Anticorps selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il est marqué par un moyen radioactif ou enzymatique. 12. Procédé de préparation d'anticorps dirigés contre la DOPAdécarboxylase, caractérisé en ce que a) on prépare une protéine de fusion ss-galactosidase-DOPA- décarboxylase, selon l'une des revendications 1 à 3, b) on injecte la protéine de fusion purifiée à un animal, selon un protocole entraînant une hyperimmunisation, c) on recueille le sérum hyperimmun de l'animal, d) on épuise le sérum contre la ss-galactosidase afin d'éliminer les anticorps spécifiques de cette protéine, e) on récupère le sérum contenant les anticorps spécifiques de la DOPA-décarboxylase. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on effectue ensuite des étapes de purification des anticorps. 14. Kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il contient des anticorps selon l'une des revendications 7 à 11, et pouvant être préparés par le procédé selon l'une des revendications 12 et 13. 15. Kit de diagnostic selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un test FUSA.