Brevet FR2703054A1 — publié le 19940930

PROMOTEUR VEGETAL INDUCTIBLE AU STRESS ET EFfTULES VEGETALES CONTENANT UNE UNITE D'EXPRESSION D'UNE PROTEINE D'INTERET COMPRENANT LEDIT PROMOTEUR La présente invention concerne le domaine de la protection des plantes par génie génétique et plus particulièrement celui de la défense des plantes en état de stress. Au cours des dernières années, les applications de la transformation des végétaux se sont multipliées. De nombreux gènes d'origine procaryote ou eucaryote (animale ou végétale) codant notamment pour des protéines conférant lors de leur expression un caractère agronomique nouveau, ont été isolés puis transférés aux plantes. Dans de très nombreux cas, les gènes qui ont été introduits par génie génétique dans les plantes, sont chimériques, associant des éléments de régulation de différentes origines. C'est ainsi que très souvent le gène codant pour une protéine d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort permettant une expression de ladite protéine dans toute la plante (ou la majeure partie de celle-ci) durant toute sa vie, quel que soit le stade de développement. Le promoteur du transcrit 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur (35S CaMV), le plus utilisé dans les constructions de gènes chimériques, correspond à cette description. Or pour un certain nombre d'applications, il n'est pas nécessaire que le gène codant pour la protéine d'intérêt, support du caractère agronomique, ait une expression continue ou répartie dans toute la plante. De telles caractéristiques peuvent même dans certains cas amoindrir ou annuler les effets bénéfiques du gène transféré. En effet, l'expression continue à un niveau élevé d'une protéine peut détourner une partie du métabolisme vers cette expression, et finalement entraîner une perte de rendement. Très tôt, la recherche d'une expression génique plus spécifique a été engagée ; elle a conduit par exemple à isoler des promoteurs tissus- ou organes-spécifiques. I1 peut être intéressant d'induire l'expression d'un gène donné uniquement dans une situation précise, ou mieux d'assurer un niveau d'expression de base tout au long de la vie de la plante, tout en permettant la surexpression du gène dans une situation donnée. Plusieurs promoteurs inductibles ont déjà été décrits, certains répondant à la fois à l'infection par des microorganismes pathogènes et à des composés chimiques ou des hormones végétales comme l'éthylène (Roby et al, 1990, Plant Cell 2, 999) ou l'auxine. Un promoteur végétal isolé du tabac a été décrit par Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8013-8016. Ces auteurs, dans une autre publication précisent que ce promoteur ne réagit spécifiquement qu'aux auxines et non aux autres hormones ou aux stress (Takahashi et al., The Plant Journal, 1991, 1(3), 327-332). La présente invention a pour objet un promoteur, qui s'exprime à un niveau soutenu dans différents organes et tissus d'une plante et notamment les racines et le méristème et qui est très fortement inductible dans les situations de stress, telles que notamment après un choc thermique, une blessure ou une infection bactérienne, fongique ou virale. L'invention concerne également les cellules végétales ayant intégré une unité d'expression d'une protéine d'intérêt, ladite unité comprenant le promoteur. Elle a également pour objet les plantes ou parties de plantes ainsi que les semences qui comprennent les cellules végétales de l'invention. Enfin, elle concerne aussi l'utilisation des plantes ou parties de plantes ci-dessus pour le screening de produits à activité phytosanitaire qui induisent les réactions de défense naturelles des plantes contre les agressions parasitaires (champignons, bactéries, virus, insectes et nématodes). L'invention a également pour objet une sonde utile pour sélectionner des gènes de végétaux, qui comportent un promoteur qui s' exprime à un niveau soutenu dans les différents organes et tissus d'une plante et qui est très fortement inductible dans des situations de stress. L'invention a aussi pour objet l'utilisation des promoteurs ainsi sélectionnés pour obtenir en situation de stress la surexpression d'une protéine destinée à aider les plantes à surmonter un état de stress. Le promoteur selon l'invention comprend la séquence d'ADN (B) [SEQ ID NO : 4] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (B). Selon une variante, le promoteur selon l'invention comporte, en amont de la séquence (B), une séquence (C) [SEQ ID NO : 5] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (C). Enfin, selon une variante préférée de l'invention, le promoteur de l'invention comporte, en amont de la séquence (B), une séquence (D) [SEQ ID NO : 6] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (D). Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie (rapport entre les nucléotides identiques et le nombre total de nucléotides) d'au moins 70 %, et de préférence d'au moins 80 %, des séquences de nucléotides, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970; J. Mol. Biol., 48, 443453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 87118721 - option GAP. Les éléments nécessaires au fonctionnement de ce promoteur et à l'expression de ses caractéristiques (facteurs transactivateurs, etc) sont présents dans d'autres végétaux, dicotylédones ou monocotylédones. Leur présence permet donc l'utilisation de ce promoteur dans de nombreux végétaux cultivés, tels que notamment le tabac, la pomme de terre, la tomate, le maïs, le tournesol, l'orge, le colza, etc. Les séquences d'ADN codant pour les protéines d'intérêt qui peuvent être placées sous le contrôle du promoteur selon l'invention sont les séquences codant pour des protéines qui permettent d'assurer la protection de la plante contre les infections virales, bactériennes ou fongiques et contre les autres états de stress. A titre d'exemples de telles protéines, on peut citer notamment les B-1,3-glucanases, telles que celle décrite dans WO-A-92/16632 ou les endochitinases de tomate-tabac, telle que celle décrite dans EP-A-493 581 dont les séquences codantes sont respectivement les séquences SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17. Le promoteur selon l'invention a été obtenu par criblage d'une banque génomique de tabac à l'aide d'une sonde d'ADN ayant la séquence (A1) [SEQ ID NO : 3], suivi éventuellement par des délétions successives de la partie 5' du promoteur des gènes sélectionnés par ledit criblage, c'est-à-dire des gènes dont la partie codante, au moins en partie, s'hybride avec ladite séquence (Ai). Cette séquence (A1) a été obtenue par screening différentiel de clones d'ADNc issus d'ARNm poly(A)+, spécifiquement synthétisés au cours de l'infection de feuilles de tabac Nicottana tabacum par la souche de Pseudomonas soZanacearwn GMI 1000. Cette souche bactérienne est bien connue pour provoquer une réaction d'hypersensibilité sur le tabac de la variété Bottom spectral. A cet effet, on peut se référer à l'ouvrage Message et al, 1978, Proc. 4th. Intl. Conf. of plant Pathogenic Bacteria pp. 823-833. Le clone contenant la séquence d'ADN (A1) sera dénommé ci-après "clone 246". Le clone 246 a permis ensuite, par criblage d'une banque génomique de tabac d'isoler un clone, dénommé ci-après clone 246 C, qui contient la séquence d'ADN (D) [SEQ ID NO : 6] et la séquence d'ADN (B) [SEQ ID No : 4]. Par association du clone 246 C avec le gène de la -glucuronidase on a obtenu, selon le mode opératoire décrit à la section 9 ci-après, le vecteur d'expression pSG 123. Le vecteur d'expression pSG 123 a été utilisé pour tester l'expression transitoire dans des protoplastes de tabac, du gène de la glucuronidase, lesdits protoplastes étant mis en situation de stress soit par infection par Pseudomonas solanacearunt soit par traitement à l'aide d'un éliciteur ou d'une hormone. A partir du vecteur d'expression pSG 123 on a préparé, selon le mode opératoire décrit à la section 13, un vecteur d'expression stable dans les cellules végétales, le vecteur binaire pSG 246. Ce vecteur binaire pSG 246 a été transféré dans des cellules d'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacteritm rhizogenes, lesquelles ont été utilisées ensuite pour obtenir des plantes transgéniques de tabac, de colza, de tournesol ou des tissus de monocotylédones (orge et maïs). On a étudié le comportement de ces plantes ou tissus en état de stress. Le promoteur selon l'invention, comprenant les séquences (B) et (D) a aussi été associé au gène codant pour la ss-1,3-glucanasè de soja ou au gène codant pour la chitinase tomate-tabac. Les gènes chimériques résultant ont été utilisés pour transformer des cellules d'Agrobacterium. L'étude des plantes transgéniques obtenues par transformation des plantes à l'aide des cellules d'Agrobacterium obtenues ci-dessus a permis de mettre en évidence l'activité promotrice de base du promoteur selon l'invention ainsi que la surexpression de chitinase ou de ss-1,3 glucanase dans des situations de stress. Les résultats figurant dans la partie illustrative ci-après montrent clairement que le promoteur selon l'invention a une activité promotrice de base qui est fortement augmentée lorsque les plantes transgéniques contenant ce promoteur et un gène codant pour une protéine d'intérêt, sont placées dans des conditions de stress : choc thermique, blessure, infection par des champignons pathogènes. Par différentes délétions du plasmide pSG 123, effectuées dans la région 5' du promoteur à l'aide d'enzymes de restriction et/ou de la nucléase Exo3 on a mis en évidence les vecteurs pSG 251 et pSG 33 dont les séquences sont respectivement la séquence (B) (pSG 33) [SEQ ID NO : 4] ou la séquence (B) comportant en amont la séquence (C)(pSG 251) [SEQ ID NOS : 4 et 5]. La visualisation aisée de l'expression de la glucuronidase (Jefferson et aI., 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387) ou de sa surexpression dans le cas d'une induction du promoteur de l'invention, permet d'utiliser des plantes qui expriment ce gène chimérique pour le screening de molécules inductrices. Les plantes possèdent des mécanismes de défense aux agressions et notamment aux agressions parasitaires (champignons, bactéries, virus ou insectes) ; ces mécanismes dépendant de phénomènes d'induction sont peu connus et se mettent souvent en place trop tardivement pour être efficaces. Leur déclenchement précoce (Roby et al., 1988, Physiol. Molec. Plant. Pathol., 33, 409) notamment par des composés de type éliciteur dans des réactions en cascade permet à la plante de résister aux agressions. Des fongicides de seconde génération, actifs 9ur les défenses de la plante, tout en étant inactifs sur le parasite ont déjà été mis sur le marché. Les plantes exprimant la glucuronidase, sous contrôle du promoteur de l'invention, précocement et spécifiquement induit lors d'une réaction d'hypersensibilité à une infection bactérienne, constituent un outil de choix pour le screening de molécules capables d'induire l'expression ou la surexpression de gène de défense. L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci-après, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceuxci. Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de l'invention, donnés bien sûr à titre purement illustratif. Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook et al. "Molecular Cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New-York (2ème édition). Le matériel biologique (souches, phages, plasmides ou plantes) utilisé dans les sections ci-après est disponible dans le commerce et/ou décrit respectivement dans les documents ci-après - vecteur binaire pBIN 19 : BEVAN et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 ; obtenu auprès de Clontech (Palo Alto Californie USA) - vecteur 101.3 : JEFFERSON, 1987, Plant. Molec. Biol.Reporter 5, 387 - 405 obtenu auprès de Clontech - vecteur pBI 221 : - vecteur pBI 121 - Souche Pseudomonas solanacearum : MESSAGE et al., 1978, Proc. 4th Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria pp 823-833 GMI 1000 - Souche Pseudomonas soZanacearum : n GMI 1178 - Souche Pseudomonas solanacearum: " K 60 n - terminateur NOS : terminateur nopaline synthase - vecteur pTZ 19R : obtenu auprès de Pharmacia - souche E. colt MC1061 : MANIATIS et al., 1982, Molecular cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New-York, obtenue auprès Clontech - souche E. colt HB101 : n - souche Agrobactertum tumefaciens :LBA4404 obtenue auprès de Clontech HOEKEMA et al., 1983, NATURE, 303, 179-180 - souche Agrobacterium rhizogenes : pRIA4 - plante Ntcottana tabacum : Variété Wisconsin Havana 38 : SCHNEIDER M., 1990, Plant Molec. Biol., 14, 935-947 - champignon ChaZara eZegans : RAWLINGS R.E, 1940, Ann. Mo. Bot. Gdn., 27, 561 598 - champignon AZternaria brasstcae : BAINS et TEWARI, 1987, Physiol. Mol. Plant. Pathol. 30 : 259 - plante Nicotiana tabacum : Variété Paraguay 49 obtenue auprès de l'institut du tabac, Bergerac, France. - plante Brassica napus : variétés de printemps Brutor et Westar et lignée d'hiver (lignée de sélection Rustica Semences) - pathogène Rhizoctonia SoZani : ACHARYA et al., 1984, Can. J. Plant. Pathol, 6, 325-328 - plantes de tournesol : genotype 2603B (lignée de sélection, Rustica semences) - maïs : lignée LH 132 - orge : variété GERBEL obtenue auprès de l'institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France Les abréviations suivantes sont utilisées dans les exemples ci-après 32P-dCTP : déoxycytidine 5'-32P-triphosphate commercialisé par AMERSHAM sous la référence 10205 2 SSC :NaCl 0,3M, citrate trisodique 30 mM ; pH 7,0 (décrit par MANIATIS et al., op. cit.) SDS : dodécylsulfate de sodium FPLC : fast protein liquid chromatography PVDF : difluorure de polyvinylidène EDTA : acide éthylènediaminetetraacétique DEPC : diéthylpyrocarbonate. NAD : nicotinamide adénine dinucléotide La description ci-après sera mieux comprise en se rapportant aux figures 1 à 3. La figure 1 représente la cartographie du clone d'ADN génomique 246C, établie à l'aide des enzymes de restriction représentées. La figure 2 représente l'alignement selon la méthode d' alignement optimal de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol., BIol., 48, 443-453 mise en oeuvre par le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin (Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721) option GAP, de la partie 3' de 700 pb du promoteur du gène 246C et du promoteur décrit par Takahashi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8013). La figure 3 représente les différents vecteurs d'expression testés comportant par rapport au plasmide pleine longueur pSG123 une délétion variable de la partie 5' du promoteur. Section 1 : Infection de tabac Ntcottana tabac par deux souches de la bactérie pathogène Pseudomonas solanacearui Les bactéries de la souche de Pseudomonas solanacearurn sont cultivées pendant 72 h sur le milieu BG gélosé (Boucher et al. 1985, J. Gen Microbiol 131, 2449) ; une colonie est prélevée pour ensemencer 40 ml du même milieu. Après de 16 à 24 h d'incubation à 28in, la suspension bactérienne est centrifugée pendant 10 min à 6000 g et 4iC ; le surnageant est éliminé en conservant la couche de polysaccharides présente à la surface du culot. Après un lavage à l'eau stérile, les bactéries sont remises en suspension dans 20 ml d'eau. Leur concentration est alors déterminée par densitométrie. Des jeunes feuilles de plantes de tabac sont détachées de la plante, lavées à l'eau distillée et immergées dans un dessicateur contenant 1,2 1 de suspension bactérienne à la concentration de 3 x 106 bactéries/ml. Le vide est réalisé pendant 10 min à l'aide d'une trompe à vide, puis il est lentement cassé. Chaque feuille infiltrée est alors placée dans un bécher contenant du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 6,0 et transférée dans une chambre de culture. Les feuilles sont prélevées après différents temps d'incubation et conservées à - 70 C. Deux souches bactériennes ont été utilisées : la souche GMI 1000 provoquant une réaction d'hypersensibilité sur le tabac de la variété Bottom Special et la souche GMI 1178 (Message et al, 1978, Proc. 4th. Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria pp. 823-833), mutant issu de la souche précédente et ayant perdu la capacité d'induire la réaction d'hypersensibilité chez le tabac. Section 2 : Extraction et isolement des ARN totaux de Ntcottana tabacui infectés par les souches de Pseudomonas soianacearum 10 g de matériel végétal sont broyés en présence d'azote liquide puis repris dans un mélange de 3 ml de phénol, 3 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24 : 1, V : V) et 6 ml de tampon de lyse de composition Tris-HCl 200 mM pH 7,0, EDTA 200 mM, SDS 1 %. Après agitation au vortex, une centrifugation pendant 10 min à 6000 g à 4 C permet de séparer les phases. La phase aqueuse est prélevée et reextraite à l'aide de 6 ml de mélange de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25 : 24 : 1, V : V), puis à l'aide de 6 ml de phénol. 16 ml d'éthanol absolu et 400 111 d'acétate de sodium 3M pH 5,5 sont ajoutés à la phase aqueuse ; le mélange est précipité pendant 2 h à - 20-C. Le culot obtenu est dissous dans 5 ml d'eau stérile contenant 0,1 % de diethylpyrocarbonate (DEPC) puis les ARN sont précipités pendant 12 h à 4*C après addition de 5 ml de LiCl 4M. Après une centrifugation de 20 min à 6000 g, le culot d'ARN est lavé par de l'éthanol à 75 %, séché et repris dans 800 l d'eau distillée stérile contenant 0,1 % de DEPC.La solution est précipitée pendant 2 h à - 20*C après addition de 0,1 vol d'acétate de sodium 3M pH 5,5 et 2,5 vol d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 15 min à 12 000 g, le culot d'ARN est lavé à l'éthanol à 75 % et dissous dans 200 111 d'eau distillée contenant 0,1 % de DEPC. Les ARN totaux sont alors dosés par spectrophotométrie à 260 nm. Section 3 : Préparation des ARN messagers poly(A)+ 1 g de gel d'oligo-d(T) cellulose (Collaborative Research Inc.) est remis en suspension dans 2 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,4 M, SDS 0,1 %. Ce gel est introduit dans une pipette Pasteur dont l'extrémité est bouchée à l'aide de laine de verre. La solution d'ARN est portée à 65'C pendant 4 min puis laissée refroidir lentement à la température ambiante. Une concentration finale de 0,4 M en NaCl est obtenue par addition d'une solution de NaCl 5M. La solution d'ARN totaux est ensuite déposée sur le gel d'oligo-d(T) cellulose. Celui-ci est ensuite rincé par 12 ml environ de tampon de composition Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, SDS 0,5 %. Les ARN poly(A)+ sont ensuite élués à l'aide de 7 ml de tampon de composition Tris-HCl 10 mM pH 7,4, SDS 0,1 %, puis précipités pendant 1 nuit à -20'C après addition de 2,5 vol d'éthanol à 95 % et 0,1 vol d'acétate de sodium 3,3 M pH 5,5. Le culot d'ARN poly(A)+, obtenu par centrifugation à 35 000 g pendant 1 h est lavé 3 fois par de l'éthanol à 75 %, séché, repris dans 0,5 ml d'eau distillée stérile et soumis à une nouvelle précipitation dans les conditions décrites ci-dessus. Après centrifugation, le culot est alors lavé par de l'éthanol à 75 %, séché et dissous dans de l'eau distillée stérile. Les ARN poly(A)+ sont alors dosés par spectrophotométrie à 260 nm. Section 4 : Synthèse de l'ADN double brin à partir d'ARN messagers poly(A)+ isolés de feuilles de tabac infecté par la souche GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum et clonage dans E. colt. Cette synthèse est réalisée selon la méthode de Gubler et Hoffman (1983, Gene, 25, 263), à l'aide du kit D. Scribe de la société Genofit (Genève, Suisse) et en suivant les instructions du fabricant. Svnthèse du premier brin 2,5 g d'ARN poly(A)+ isolés de feuilles de tabac infectées par la souche GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum et prélevées 6 h après inoculation, sont mis à incuber à 44 C pendant de 30 à 60 min en présence de Tris HCl 40 mM, pH 8,3, NaCl 80 mM, MgC12 6 mM, DTT 5 mM, dATP 0,5 mM, dTTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, 1,5 g d'oligo d (pT) 12-18 et 10 à 15 unités de transcriptase inverse d'AMV (avian myeloblastosis virus) dans un volume total de 25 F1. Synthèse du deuxième brin Le milieu réactionnel issu de la synthèse du premier brin est diluée à 100 l à l'aide du tampon de composition Tris HCl 40 mM pH 7,5, MgC12 10 mM, NaCl 80 mM ; 2 unités de RNase H sont ajoutées et le mélange est incubé à 370C pendant 5 min. Après refroidissement à 12*C, 25 unités de DNA polymérase I, 0,5 unités Weiss de ligase de E. coZi et du NAD en concentration finale de 0,1 mM, sont ajoutés. Après une incubation de 60 min à 12iC puis de 60 min à 18'C, la réaction est arrêtée par l'addition de EDTA et de SDS en concentrations finales de 20 mM et 1 %, respectivement, suivie d'un chauffage de 2 min à 60iC. Purification de l'ADNc Celle-ci est réalisée par chromatographie sur une colonne de Sephadex G100, dans le tampon Tris HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, EDTA 1mM. L'addition d'alpha 32P dCTP lors de l'étape de synthèse permet de repérer plus facilement les fractions issues de la chromatographie renfermant 1'ADN double brin. Celui-ci est précipité par addition d'acétate d'ammonium (concentration finale 0,3 M) et de 2,5 vol d'éthanol absolu. Digestion à l'aide de la mucléase S1 Le précipité obtenu est lavé par de l'éthanol à 75 %, séché et repris par de l'eau stérile. L'ADNc est traité ensuite par la nucléase S1 dans un volume total de 300 F1, à 300C pendant 10 min, en présehce de 20 U d'enzyme dans le tampon de composition acétate de sodium 30 mM pH 4,4, NaCl 0,25 M, ZnCl2 1mM. A la fin de la réaction, le mélange est extrait une fois par un mélange de Phénol-chloroforme-alcool isoamylique (50-48-2, V : V) puis trois fois par ltéther éthylique avant d'être soumis à une précipitation par l'éthanol. Le précipité d'ADN obtenu après centrifugation est ensuite séché et repris dans 20 l d'eau stérile. Addition en 3' d'une terminaison Polv dC (dC Tailing) A la solution d'ADNc sont ajoutés successivement 10 l de tampon de terminal-transférase de composition potassium cacodylate 70 mM pH 7,2, CoC12 0,5 mM, dithiothréitol 0,5 mM, 2 l d'a dCTP 0,25 mM, 5 l d'a 32P dCTP (370 MBq/ml), 12 l d'H20 et 1,2 l de terminal transférase (18 unités). La réaction de tailing est réalisée par incubation à 370C pendant 30 min, puis arrêtée par l'addition de 30 l d'EDTA, 0,25M pH 8.0. Purification aPrès Tailing des ADNc double brin Le mélange issu du dC tailing est précipité par l'éthanol puis centrifugé. Le culot d'ADNc est repris dans 10 > 1 de tampon de composition Tris HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 5 % glycerol, 0,02 % bleu de bromophénol. Cette solution est déposée sur une colonne de Biogel A 0,5 M (1 ml de support). L'élution de la colonne est réalisée par le tampon de composition Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM ; des fractions sont recueillies, leur radioactivité mesurée, et la taille des ADNc qu'elles renferment est analysée en électrophorèse sur gel d'agarose. Les fractions contenant des ADNc de taille supérieure à 500 paires de bases sont réunies et l'ADNc est précipité par l'éthanol. Hybridation avec pHR 322-dG L'ADNc recueilli après précipitation est remis en solution dans 50 III de tampon de circularisation de composition Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA lmM. 4 l de solution de pBR 322-dG (21 ng, Clontech) et 46 l d'eau sont rajoutés. Après incubation pendant 15 min à 65-C puis 2 h à 57-C, l'hybridation est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADNc double brin obtenu est inséré au site PstI du plasmide pBR 322. Après ligation, 1'ADN obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes de la souche E. colt HB101. Des colonies de bactéries recombinantes sont obtenues après étalement et culture sur boîte de Petri des cellules compétentes transformées. Section 5 : Sélection par screening différentiel de clones d'ADNc issus d'ARNm poly(A)+ spécifiquement synthétisés au cours de l'infection bactérienne par la souche de Pseudomanas solanacearum GMI 1000. L'ADN des colonies bactériennes recombinantes obtenues par clonage d'ADNc synthétisé à partir d'ARN messagers poly(A)+ de feuilles de tabac infectées par la souche GMI1000 a été transféré sur une membrane de nylon Biodyne (Pall Corporation, EUA) suivant les indications du fabricant. Ces ADN sont hybridés successivement à l'aide de 2 sondes radioactives obtenues par synthèse d'ADNc, en présence d'alpha-32P dCTP, à partir d'ARN messagers purifiés de plantes infectées par les souches GMI 1000 et GMI 1178 respectivement. Après lavage et exposition autoradiographique des membranes, les colonies bactériennes qui présentent un signal d'hybridation plus fort avec la sonde synthétisée à partir de feuilles inoculées par la souche GMI 1000 sont sélectionnées. L'ADN plasmidique de ces colonies est préparé, les inserts d'ADNc de ces plasmides sont isolés puis marqués à l'alpha 32-dCTP et sont utilisés comme sonde pour révéler selon la technique de dot-blot puis de Northern blot les quantités équivalentes d'ARNm correspondant purifié à partir d'ARN total, de feuilles de tabac inoculées par la souche GMI 1000 ou GMI 1178. Les colonies dont l'insert utilisé comme sonde donne un signal plus intense lors de la révélation des ARN totaux purifiés à partir de feuilles de tabac inoculées par la souche GMI 1000 sont conservées. Section 6 : Caractérisation d'un clone d'ADNc issu d'un ARNr spécifiquement synthétisé au cours de l'infection bactérienne par la souche de Pseudomonas solanacearui GMI 1000. 14 clones bactériens ont été isolés à partir de la banque d'ADNc construite à partir d'ARN messagers de feuilles de tabac infectées par la souche de Pseudomonas solanacearuin GMI 1000. Parmi ceux-ci, un clone appelé 246, présentant une longueur d'insert de 750 paires de bases, permet de révéler en Northern Blot un transcrit de 800 nucléotides environ. L'accumulation de ce transcrit commence 4 à 9 h après l'inoculation, et atteint un maximum entre 12 et 15 h. Dans les feuilles de tabac infectées par la souche GMI 1178, on observe une légère accumulation du transcrit entre 12 et 15 h. L'étude de la séquence de l'ADNc du clone 246 [SEQ ID NO : 1] met en évidence l'existence d'un premier cadre de lecture ouvert incomplet, codant pour un peptide de 59 acides aminés et d'un second cadre potentiel codant pour un peptide de 88 acides aminés. La séquence de ces deux peptides est représentée par [SEQ ID NO : 2]. Entre ces deux cadres de lecture des séquences consensus d'épissage d'un intron (Brown, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 9549) sont présentes. Il y a donc probablement eu clonage d'un ADNc à partir d'un ARN messager immature. La séquence d'ADNc du clone 246 sans l'intron est la séquence Al [SED ID NO : 3] Section 7 : Criblage d' une banque génomique de tabac à I 'aide de 1'ADNc caractérisé. Une banque génomique d'ADN de tabac a été- obtenue par digestion partielle à l'aide de l'enzyme MboI d'ADN isolé de germination de Ntcottana tabacum variété NK 326, et clonage des fragments de restriction dans le phage EMBL-3 (Clontech). 500 000 phages recombinants ont été criblés, après étalement à raison de 10 000 phages par boîte de Petri selon la technique connue de l'homme de l'art et décrite dans Sambrook et al (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). L'ADN phagique est transféré sur membrane de nitrocellulose (BA 85 Schleicher et Schüll), dénaturé pendant 2 min dans une solution NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, puis trempé dans une solution de neutralisation NaCl 1,5 M, Tris HCl 0-,5 M pH 7,4 pendant 5 min. Après rinçage rapide dans du 2 SSC (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 30 mM) les filtres sont séchés 30 min à 37-C et 1'ADN est ensuite fixé par traitement à 80C sous vide pendant lh30. Les membranes sont ensuite préhybridées pendant 4 h à 37iC dans un tampon de composition 5 SSC (NaCl 0,75 M, citrate de sodium 75 mM), 50 % formamide, 0,3 % lait écrémé. L'hybridation est réalisée dans le même tampon, pendant 18 h à 37-C après addition de la sonde marquée à l'alpha 32P-dCTP, constituée de l'insert de 750 paires de bases du clone d'ADNc 246. Les membranes sont ensuite lavées 3 fois pendant 20 min à 37vC dans une solution 5 SSC, SDS 0,1 %, puis 2 fois pendant 30 min à 37'C dans une solution 2 SSC, SDS 0,1 % et enfin 30 min à 42*C dans une solution 2 SSC, SDS 0,1 % elles sont ensuite autoradiographiées. Après révélation des autoradiogrammes, chaque plage de lyse présentant un signal positif est isolée, les phages sont élués dans du milieu SM (NaCl 100 mM, Tris HC1 50 mM, pH 7,5, Mg S04 5mM, gélatine 0,01 %) puis purifiés par un nouveau criblage réalisé dans les mêmes conditions. 12 clones ont ainsi été isolés et purifiés. L'ADN de chaque clone a été produit et purifié, selon la technique bien connue de l'homme de l'art, puis digéré par l'enzyme SalI qui permet d'isoler après électrophorèse sur gel d'agarose l'insert d'ADN génomique. Le transfert sur membrane de nylon suivi d'une hybridation avec la sonde constituée de l'ADNc du clone 246, montre un signal positif, confirmant la présence dans cet ADN génomique d'une séquence complémentaire de l'ADNc 246. Ces clones ont ensuite été cartographiés en utilisant une série d'enzymes de restriction. Un clone a été retenu parmi ceux-ci, qui présente un signal d'hybridation dans la région centrale du fragment inséré dans 1'ADN phagique . Ce clone a été nommé 246C. Section 8 : Séquençage et analyse de la séquence du clone d'ADN génomique 246C Un fragment de l'insert contenu dans ce phage a été isolé par digestion à l'aide de l'enzyme SstI, puis cloné dans le phage pBluescript Il KS +/ (Stratagène) donnant le phagemide pKS246. Sa cartographie a été établie, elle est présentée sur la Figure 1. La séquence de cet insert [SEQ ID NO : 7] a ensuite été déterminée par la méthode de Sanger et al (PNAS-USA, 14, 5463, 1977) après création de délétions progressives à l'aide des enzymes Exo III, mung bean et nucléase S1 selon la technique de Henikoff (Gene, 28, 351, 1984). Ce clone de 3046 paires de bases est constitué d'une région codante de 853 pb débutant par un ATG en position 2146 et terminée par un codon TGA en position 2998 ; cette région est entrecoupée d'un intron commençant en position 2464 et terminant en position 2653. Trois sites potentiels d'initiation de la transcription ont été déterminés par extension d'amorce selon la technique décrite dans Sambrook et al. (opus cité, 1989), le site le plus probable est en position 2068. L'étude de la région promotrice montre la présence dans cette région de plusieurs motifs connus pour être impliqués dans la régulation des gènes. Deux séquences consensus CAAT correspondant à cet élément régulateur de la transcription des gènes eucaryotes ainsi qu'une séquence complémentaire et inverse ATTG sont présentes aux positions 2051, 2101 et 1967. Deux séquences consensus TATAA sont présentes aux positions 2089 et 2111 ainsi qu'une séquence complémentaire AATAT à la position 2020. Ces trois motifs sont tous situés entre 10 et 50 paires de bases en aval des motifs CAAT et 30 à 50 paires de bases en amont des sites de transcription potentiels. Une séquence TGACG a été identifiée à la position 1950 ; cette séquence mise en évidence dans le promoteur 35S du CaMV, semble responsable de l'expression de gènes chimériques dans les racines et dans les feuilles (LAM et al, 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86, 7890). Trois régions présentent une homogénéité importante avec les motifs HSE (Heat Shock Elements) des plantes (GURLEY et KEY, 1991, Biochemistry, 30, 1). Ces régions sont homologues avec la séquence consensus (GAA)XXGAAXXTTCXX(TTC) ou (TTC)XXTTCXXGAAXX(GAA) ; elles sont proches des boîtes TATA et CAAT et dupliquées. Une séquence homologue au motif CCGTCC caractérisé comme étant impliqué dans la réponse à des éliciteurs d'origine fongique (LOIS et al, 1989, EMBO J., 8, 1641) a été localisée à la position 1822. Le promoteur du gène 246 C présente une homologie très élevée ( > à 90 %) sur 700 paires de bases avec le promoteur végétal isolé du tabac ayant la séquence [SEQ ID NO : 8] décrit par TAKAHASHI et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8013-8016. Sur la figure 2, on a représenté l'alignement de la séquence d'ADN de ce promoteur [SEQ ID NO : 9, 10 et 11] (ligne du haut) avec la partie correspondante de la séquence d'ADN du promoteur de l'invention [SEQ ID NO : 12 et 13] (ligne du bas). Section 9 : Construction du vecteur d'expression pSG123 associant le promoteur du gène 246C au gène de la B-glucuronidase. A partir du phagemide pKS 246, la digestion par les enzymes HindIII et BalI permet d'isoler un insert de 2200 paires de bases environ, contenant la partie promotrice du gène 246C, le codon d'initiation de traduction et 11 codons codant pour la partie amino-terminale de la protéine. Le plasmide pBI 101.3 (Clontech) est digéré par les enzymes HindIII et EcoRI ; le fragment de 2100 paires de bases environ, contenant le gène de la -glucuronidase codée par le locus uidA de E. colt, suivi du terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens, est ligué dans le plasmide pUC 19, ouvert aux mêmes sites, donnant un plasmide appelé plasmide pBI 201.3. L'insert HindIII-BalI portant les séquences promotrices du gène 246C est cloné dans le plasmide pBI201.3 ouvert aux sites HindIII et SmaI. Le vecteur obtenu appelé pSG 123 contient donc le gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246c. La séquence nucléotidique du gène chimérique complet est la séquence [SEQ ID NO : 14]. Section 10 : Protocole de 1 'expression transitoire dans des protoplastes de tabac du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C. Prénaration de nrotonlastes de tabac Des feuilles de plantes de tabac (Ntcottana tabac, var Samsun NN), âgées de 4 à 5 semaines sont prélevées, découpées en lanières et incubées dans du milieu T.O (tableau 1,adapté de Chupeau et al., 1974, CR Acad Sci (Paris), 278 D, 1565) contenant 1 g/litre de cellulase R 100 Onozuka, 200 mg/l de macerozyme Onozuka (Yakult Honsha, Nishinoniya, Japon) et 500 mg/l de pectolyase Y23 (Sheishin Pharmaceutical Ind. Japon) pendant 15 h à 22 C. Les protoplastes sont séparés des débris cellulairews par tamisage sur un tamis de nylon de maille 85 m suivi par une centrifugation de 5 min à 50 g sur une solution de saccharose à 19 % (poids/volume). Les protoplastes flottant sur ce milieu sont lavés une fois dans le milieu T.O, comptés et leur nombre ajusté à la densité de 1.5 x 106 protoplastes/ml. Prénaration du vecteur nSG 123 La souche E. colt contenant le vecteur pSG 123 est cultivée sur milieu Luria (Gibco) contenant 50 mg/l d'ampicilline. L'amplification du plasmide est réalisée selon le protocole décrit dans Sambrook et al., 1989 (opus cité). Le plasmide pSG 123 est ensuite purifié par centrifugation sur un gradient de chlorure de césium et par deux précipitations successives par l'éthanol. Le culot plasmidique est ensuite remis en solution dans du Tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,0. Transformation par le polvéthylèneglycol Les suspensions de protoplastes (320 111 par aliquote) sont incubées à 45-C pendant 5 min, puis rapidement refroidis sur la glace. Puis 50 g de plasmide pSG123, 160 l d'une solution de polyéthylèneglycol (40 % polyethyleneglycol, 0,4 M mannitol, 30 mM MgC12, 0,1 % Mes pH 5,8) sont alors ajoutés. Au bout de 10 min, les protoplastes sont collectés par centrifugation et remis en suspension par agitation douce dans 500 yl de tampon TO et incubés à l'obscurité à 28'C. Mesure de l'expression transitoire Au bout de 24 h d'incubation, les protoplastes sont lysés après addition de 50 l de tampon d'extraction lOX de la ss-glucuronidase par une congélation à - 80-C suivie d'une décongélation à 37 C (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387). Le surnageant obtenu après centrifugation à 10 005 g est utilisé pour mesurer l'activité ss-glucoronidase par fluorimétrie -(Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387). Parallèlement, la quantité de protéines présente dans les extraits est mesurée selon la méthode de Bradford à l'aide du kit Bio Rad(Bio Rad. Lab.). Tableau 1 : Composition du milieu TO (pour 1 litre) NH4 N03 825 mg K N03 950 mg CaCl2, 2H20 220 mg Mg S04, 7H20 185 mg KH2 P04 85 mg H3 B03 1 mg Mn S04, 4H20 100 g ZnSO4 7H20 1 mg Kl 100 g AlCl3 30 g NiCl2. 6H2O 30 g CuSO4, 5H2O 30 g Fe S04, 7H20 27,8 mg Na2 EDTA, 2H20 37,2 mg Thiamine . 100 Fg Ac. nicotinique 200 g Pyridoxine 1 mg Biotine 10 g Panthoténate de Ca 1 mg Saccharose 20 g Inositol 100 mg Mannitol 80 g Acide 2-[N-Morpholino] ethanesulfonique (MES) 200 mg pH ajusté à 5,8 avant autoclavage Section 11 : Expression transitoire du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C dans des protoplastes de tabac infectés par Pseudomonas solanacearua. Cette expression transitoire, déterminée selon le protocole de la section 10, est mesurée après incubation pendant 24 h des protoplastes préparés selon le protocole ci-dessus dans le milieu TO (décrit dans la section 10) contenant une suspension de bactéries Pseudomonas solanacearurn (10 bactéries/protoplaste) obtenues comme décrit en section 1. L'activité ss-glucuronidase est exprimée en pmoles de méthylumbelliferone formée/min/mg de protéine. Aucune activité n'est décelée dans les protoplastes de plantes n'ayant pas reçu d'ADN de pSG123. Une activité de 450 pmol/min/mg de protéine est mesurée sur des protoplastes traitées par du vecteur pBI221 (Clontech) contenant le gène de la -glucuronidase sous contrôle du promoteur constitutif 35S CaMV ; cette activité est réduite à 300 pmol/min/mg de protéine après infection par les souches de Pseudomonas soZanacearum GMI-1000 et GMI 1178. Une activité de 600 pmol/min/mg de protéine est mesurée sur des protoplastes traités par du plasmide pSG 123 ; cette activité est peu modifiée après inoculation par la souche GMI 1178, elle augmente jusqu'a une valeur de 1000 pmol/min/mg de protéine après inoculation par la souche GMI 1000. Le promoteur du gène 246C permet donc une expression basale importante du gène de la glucuronidase, expression plus importante que celle commandée par le promoteur 35S du CaMV, qui sert ici de contrôle. Ce promoteur présente de plus une forte inductibilité puisque l'expression de la ss-glucuronidase augmente de 40 % après infection par la souche bactérienne GMI 1000. Section 12 : Expression transitoire du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246 C de protoplastes de tabac traités par un éliciteur ou une hormone. L'expression est mesurée après incubation des protoplastes pendant 24 h comme décrit ci-dessus dans le milieu TO contenant un éliciteur à la concentration de 25 FM ou une hormone, le 2-4-D (acide 2-4 dichlorophenoxyacétique) à la concentration 4 SM. Les éliciteurs utilisés (composés glycosidiques issus de la paroi des champignons pathogènes) sont des heptasaccharides de chitine ayant la propriété d'induire des réactions de défense dans les plantes (Roby et al., 1987, BBRC, 143, 885). Aucune activité n'est détectée dans des protoplastes non traités et qui servent de contrôle. Une activité de l'ordre de 400 pmol de méthylumbelliferone formée/min/mg de protéine est mesurée à partir des protoplastes ayant reçu de l'ADN du vecteur pBI 221, cette activité n'est pas affectée par le traitement (éliciteurs ou hormone). Les protoplastes ayant reçu de 1'ADN du vecteur pSG 123 présentent une activité de 450 pmol/min/mg de protéine ; cette activité est accrue de 50 % si les protoplastes sont traités par l'hormone 2-4-D et de 70 % si les protoplastes sont traités par l'heptasaccharide de chitine. Les caractéristiques de ce promoteur mises- en évidence lors de l'infection de protoplastes par la souche bactérienne GMI 1000 (niveau de base élevé et inductibilité), peuvent être reproduites en utilisant un inducteur issu de la paroi de champignons phytopathogènes. Section 13 : Construction d'un vecteur d'expression stable dans les cellules végétales : le vecteur binaire pSG246 A partir du vecteur pSG 123, une coupure par les endonucléases de restriction HindIII et EcoRI, suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose, permet d'isoler le gène chimérique associant le promoteur 246C à la partie codante de la ss-glucuronidase et le terminateur NOS. Le gène chimérique est introduit et ligué dans le vecteur binaire pBIN 19 (Clontech) préalablement ouvert aux sites HindIII et EcoRI donnant le vecteur pSG246. Ce vecteur binaire possède deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet (Bevan, 1984, Nucl. Ac.Res., 12, 8711) pouvant être transféré aux cellules végétales. Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de la descendance des plantes transformées. Le vecteur obtenu, appelé pSG246, est cloné dans la souche E. colt DH5 a. Section 14 : Transfert dans Agrobacterium du plasmide pSG246 contenant la ss- glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C du tabac a) Transfert dans Agrobacterfum tumefactens Ce transfert est réalisé par transformation selon la méthode de congélation-décongélation décrite dans Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al eds. , Kluwer Academic Publishers, 1988) et résumé ci-après. Des cellules compétentes d'Agrobactertum tumefaefens (souche LBA 4404, Clontech) sont préparées, par refroidissement rapide dans la glace d'une culture en phase exponentielle de croissance. Les bactéries sont alors remises en suspension dans du CaC12 20 mM. Des aliquotes de cette suspension sont distribuées dans des tubes Eppendorf, puis congelées dans l'azote liquide. 1 Fg de plasmide pSG246 est ajouté aux cellules congelées, contenues dans un tube Eppendorf. La suspension est ensuite incubée à 37*C pendant 5 min ; 1 ml de milieu Luria (Gibco) est alors rajouté et le tube est incubé à 28-C pendant 4 h. Des parties aliquotes sont étalées sur des boîtes de Petri contenant un milieu minimum gélosé, décrit dans Plant Molecular Biology Manual (op. cité) en présence de 100 mg de rifampicine et 25 mg/l de kanamycine. Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterfum tumenaefens ayant intégré le plasmide pSG246. Celles-ci contiennent le gène chimérique dans un contexte permettant sa replication. La résistance aux deux antibiotiques des colonies sélectionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de sélection deux fois de suite. La présence du gène chimérique associent le promoteur 246 C à la partie codante de la 5-glucuronidase dans Agrobacterium tumegactens est vérifiée par la méthode de Southern Blot sur une préparation d'ADN total (Lyse des cellules, purification de l'ADN par extraction à l'aide du mélange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de l'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme de l'art). b) Transfert dans Agrobactertum rhtzogenes Ce transfert est réalisé de la même façon que le transfert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Agrobacterium rhizogenes A4 décrite par Guerche et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 206, 382. Section 15 : Obtention de plantes de tabac transformées par Agrobactertun tumefaciens contenant le plasmide pSG246. Le tabac Ntcottana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterfum turne fac tens contenant le plasmide pSG246 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985, Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après. Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac Ntcottana tabacum (variété Bottom Special) sont incubés dans une culture d'A. turne fac tens hébergeant le plasmide pSG246. Les disques égouttés sur papier Whatman sont transférés sur des milieux de culture en boîtes de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals (Murashige et Skoog, 1962, Physiol., Plant., 15, 473), puis produire des bourgeons en présence de céfotaxime (500 Fg/ml) destinée à éliminer Agrobacterium tumefaciens et de kanamycine (100 Fg/ml). Parallèlement, des transformations ont été réalisées avec des souches d'Agrobacterium tumefaefens LBA 4404 contenant les vecteurs - pBI 101 (Clontech), constitué de la partie codante de la glucuronidase précédant le terminateur de la nopaline synthase dans le vecteur binaire pBIN 19. Cette construction est dépourvue de promoteur. - pBI 221 (Clontech), constitué d'un fragment de 800 paires de bases du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux fleur inséré devant la partie codante de la glucuronidase dans le vecteur pBI 101. Les bourgeons résistants à la kanamycine ont été ensuite transférés sur un milieu permettant l'induction des racines en présence de carbenicilline et de kanamycine. Les plantules sont ensuite repiquées en terrines dans un substrat composé de tourbe et de terreau et mises à croître en serre. Toutes les plantes transformées (génération RO) ayant survécu aux étapes de régénération et d'acclimatation en serre se sont révélées morphologiquement normales et fertiles. Elles ont été autofécondées et ont donné des graines (génération R1). Section 16 : Analyse de 1 'ADN génomique des plantes de tabac- transforié'ées par le plasmide pSG246 (génération RO), -selon la technique de Southern Blot. L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été isolé à partir de feuilles matures de plantes transgéniques de la génération RO selon la méthode d'extraction à l'aide de bromure de cétyltriméthylammonium et de purification par précipitation, décrite dans l'ouvrage nPlant Molecular Biology Manual" déjà cité. 10 ijg de cet ADN génomique ont été digérés pendant une nuit à 370C avec 20 unités des enzymes de restriction HindIII et EcoRI. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (1 %). L'ADN a été transféré selon la méthode de Southern Blot sur un filtre de Nylon (Hybond N+ Amersham), et hybridé avec une sonde nucléotidique comprenant une partie de la séquence du gène recombinant, marqué par couplage à la peroxydase (kit ECL, Amersham). Les membranes sont ensuite lavées et révélées selon le protocole recommandé par Amersham. L'analyse des films permet de tirer les conclusions suivantes certaines plantes ne possèdent pas de copies du gène recombinant transféré (absence de signal), la plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de la construction : promoteur 246 - séquence codante de la B-glucuronidase-terminateur NOS, certains profils suggèrent qu'il existe des réarrangements internes dans la construction, mais ces événements sont rares. Section 17 : Etude des caractéristiques d'activation du promoteur 246 C dans les plantes de tabac transgéniques Cette étude a été réalisée sur des plantes de la génération R1 qui ont été préalablement sélectionnées in vitro sur le milieu de Murashige et Skoog gélosé renfermant 500 Fg/ml de kanamycine. 10 plantes par descendance de transformant sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont repiquées sur du terreau puis cultivées pendant 4 à 5 semaines en chambre de culture. a) Activation par la bactérie phytopathogène Pseudomonas solanacearuin Inoculation nar infiltration Des tests d'inoculation sont conduits selon le protocole décrit en section 1 sur quatre feuilles appartenant à 2 plantes différentes. Les mesures d'activité glucuronidase effectuées selon la méthode décrite par Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987) en utilisant le 4methylumbelliferyl 5-D-glucuronide comme substrat. Les résultats montrent que les plantes renfermant la construction pBI 101 ne présentent pas d'activité glucuronidase détectable, les plantes renfermant la construction pBI 121 présentent une activité glucuronidase comprise entre 5000 et 70 000 pmoles de méthylumbelliferone/min/mg de protéine correspondant à une expression constitutive attendue pour cette construction, Une légère activation de ce promoteur en réponse au stress d'infiltration a été constatée pour certains transformants, e les plantes contenant la construction pSG246 présentent une activité glucuronidase faible dans les plantes non inoculées, comprise entre 2000 et 5000 pmol/mg de protéine. Une forte induction est mesurée en réponse à l'infection bactérienne, et ce quelle que soit la souche bactérienne utilisée (GMI 1000 ou K60 (Sequeira et al, Physiol. Plant. Pathol., 10, 43, 1977), souche compatible provoquant des symptômes). Le facteur d'induction (rapport entre l'activité mesurée après inoculation et l'activité mesurée avant inoculation) est de l'ordre de 20 fois et les valeurs d'activité dépassent parfois celles obtenues avec les plantes exprimant la construction pBI 121. Infection bactérienne localisée Une infection bactérienne localisée est réalisée par dépôt d'une goutte de suspension bactérienne de Pseudomonas solanacearuni (3 ILl renfermant 3 x 105 bactéries obtenues comme décrit en section 1) sur une blessure obtenue par perforation d'une feuille à l'aide d'une aiguille de seringue. Le promoteur est activé autour de la lésion créée par l'infection et également dans toutes les parties de la plante infectée (feuille inoculée, feuilles supérieures et feuilles inférieures de la plante et racines). Cette activation systémique se produit dès les premières heures après inoculation. Aucune activation n'a été observée dans des plantes de génération R1 issues de plantes transformées par les constructions pBI 101 et pBI 121. Le même type d'infection localisée, réalisée au niveau de racines de plantes de tabacs cultivées in vitro conduit également à une activation forte du promoteur au site d'inoculation mais également dans l'ensemble de la racine et dans la partie aérienne de la plante. b) Activation par le champignon pathogène ChaZara etegans Etude in vitro 10 à 15 ml de milieu Murashige et Skoog liquide sont versés dans une boîte de Petri contenant une culture de 3 semaines de ChaZara elegans en cours de sporulation (culture sur milieu gélosé Potato dextrose Agar PDA, Difco). Le grattage de la surface de la culture permet de recueillir les spores. Après comptage, une dilution appropriée permet d'obtenir des suspensions de 104 et 105 spores par ml. Des aliquotes de 7 ml sont distribuées dans des boites Magenta (sigma). Une plante de tabac transgénique (âgée de 3 semaines environ et cultivée en milieu stérile) transformée par le gène de ss-glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C est introduite dans chaque boite, leurs racines trempant dans la suspension de spores. Les plantes sont ensuite prélevées, congelées et l'activité glucuronidase déterminée. Au moment de l'infection l'activité spécifique est de 20 000 pmoles de méthylumbelliferone par mg de protéine. Comparativement à des témoins non inoculés placés dans les mêmes conditions, cette activité est multipliée par des facteurs de 8 et 8,5 pour les infections à 104 et 105 spores par ml, respectivement, dès 4 jours après l'inoculation. Etude en serre 10 plantes par descendance de transformant, sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont repiquées en godets de dimension 3 x 3 cm. A l'apparition de la 5ème feuille, les plantes sont inoculées en déposant au niveau du collet une suspension de 5 x 105 endoconidies de ChaZara eZegans. L'activité glucuronidase est mesurée lors de l'apparition des symptômes de la maladie soit 15 jours environ après l'inoculation. Les résultats de l'activité mesurée au niveau de la plante entière montrent que a les plantes renfermant la construction pBI 101 ne présentent pas d'activité glucuronidase détectable, les plantes transformées par la construction pBI 121 présentent une activité de 12 000 à 60 000 pmoles de methylumbelliferone/min/mg de protéine. Cette activité varie peu après inoculation. les plantes transformées à l'aide du vecteur pSG246 présentent une activité glucuronidase faible chez les plantes saines. Cette activité augmente considérablement dans les plantes présentant des symptômes, atteignant des vecteurs de 85 000 pmoles de méthylumbelliferone formée/min/mg de protéine. c) Activation par une blessure Cette activation a été recherchée sur des feuilles de plantes de génération R1 contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ et préalablement sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine. L'excision simple d'une feuille entraîne une activation lente et faible du promoteur, à la fois dans la feuille et dans la plante ; cependant, la lacération d'une feuille entraîne une augmentation très forte (5 fois) et extrêmement rapide (30 min) de l'activité glucuronidase. d) Activation par un choc thermique Des plantes de tabac, de génération R1, contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ et préalablement sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont transférées pendant 2 ou 4 h dans une enceinte à 40'C afin de provoquer un choc thermique. A la fin du traitement, les plantes sont immédiatement congelées dans l'azote liquide et leur activité ss- glucuronidase déterminée sur l'ensemble de la partie aérienne. Le même protocole est appliqué à des plantes transformées par la construction pBI 121 ; l'activité de ces dernières n'est pas modifiée par le choc thermique. Par contre, les plantes contenant la construction pSG246 présentent une forte augmentation d'activité glucuronidase après le choc thermique ; le facteur moyen de stimulation, déterminé sur plusieurs plantes, est voisin de 12. e) Expression au cours du développement et répartition spatiale de l'expression dans la plante L'utilisation du substrat histochimique de révélation de l'activité glucuronidase, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-glucuronide de cyclohexylammonium (X-gluc) selon la méthode décrite par Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987), permet de visualiser la localisation de l'activité dans les tissus de la plante. Germination des draines Au cours de la germination des graines de tabac de génération R1 exprimant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246, l'expression est non détectable dans les cotylédons, élevée dans toute la racine et très forte dans les méristèmes racinaires et caulinaires. Section 18 : Obtention de plantes de colza transftriées par Agrobactertui rhizogenes contenant le plasmide pSG246. La transformation est réalisée selon le protocole de P. Guerche et al. (P. Guerche et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al. (Pelletier et al., 1983, Mol. Gen. Genet., 191, 244). Leur composition sera explicitée par la suite (tableau 2). a) Obtention de racines transformées Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brasstca napus : variétés de printemps Brutor et Westar et variété d'hiver) de 1 m de haut environ. Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A. L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhtzogenes contenant le plasmide pSG 246. Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé (15 g/l) et complémenté par 500 g de céfotaxime/ml. b) Régénération de plantes transformées Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours dans le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons. Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bourgeons sur les milieux F et G. Tableau 2 : Composition des différents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de colza transformées Milieux A B RCC F G D Composition (mg/l) NH4N03 1 650 1 650 1 650 825 200 KNO3 1 900 2 500 1 900 1 900 950 1 250 (NH4)2SO4 134 67 NaH2P04 150 75 KH2P04 170 170 170 85 35 CaC122H20 440 750 440 440 220 525 MgSO47H2O 370 250 370 370 185 250 H3B03 12,4 3 12,4 6,2 6,2 12,4 MnS044H20 33,6 10 33,6 22,3 22,3 33.6 ZnS 47H20 21 2 21 8,6 8,6 21 KI 1,66 0,75 1,66 0,83 0,83 1,66 Na2Mo042H20 0,5 0,25 0,5 0,25 0,25 0,5 CuS045H20 0,05 0,025 0,05 0,25 0,25 0,05 CoC126H20 0,05 0,025 0,05 0,25 0,25 0,05 FeSO47H2O 22,4 27,8 27,8 27,8 22,24 27,8 Na2EDTA 29,84 37,3 37,3 37,3 - 29,84 37,3 Inositol 100 100 100 100 100 100 Acide nicotinique 0,5 1 0,5 1 0,5 1 Pyridoxine HCl 0,5 1 0,5 1 0,5 1 Thiamine 10 10 10 Glycine 2 2 2 Glucose 10 000 20 000 10 000 Saccharose 10 000 10 000 10 000 20 000 D-mannitol 70 000 10 000 N.A.A. 1 1 0,1 0,1 B.A. 1 0,5 0,5 2,4D 0,25 1 Adénine Sulfate 30 I.P.A 30 GA 0,02 Tween 80 10 Agar 8 000 8 000 8 000 8 000 pH 5,8 5,8 5,8 5,8 5.8 5,8 Gentamycine (sulfate) 10 NAA - acide naphtalène acétique BA - 6-benzyl-aminopurine 2,4D - acide dichloro-2,4-phénoxyacétique IPA - N6-(2-iso-pentyl) adénine GA3 - acide gibbérellique EDTA - acide éthylènediaminetétraacétique Section 19 :Caractéristiques de l'expression du gène de glucuronidase sous contrôle du promoteur 246 dans les plantes de colza a) Activation par une blessure Les feuilles de plantes de colza de génération R1, renfermant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246 ont été excisées ou excisées et lacérées. Une activation faible d'activité glucuronidase est observée dans les feuilles excisées ; une activation très forte (6 fois l'activité basale) et extrêmement rapide (30 min environ) est consécutive à la lacération. b) Infection par les champignons phytopathogènes Parasite foliaire (Alternarta brassicae) Des plantes de colza de génération Ri, possédant la construction pSG246 sont cultivées pendant 3 semaines environ en pot sur du terreau. Les plantes sont alors inoculées localement à l'aide d'une suspension de spores (10 > 1, contenant 1000 spores obtenues après culture sur le milieu gélosé PDA) du champignon pathogène Alternarta brasstcae, déposées sur une blessure réalisée à l'aide d'une aiguille. Une nécrose se développe alors autour de cette blessure. On observe alors une forte stimulation de l'activité glucuronidase (détectée par test à l'aide de X-gluc, Section 17e) dans la feuille inoculée, autour de la zone nécrotique ; cette stimulation est également observée de facon systémique dans les feuilles non inoculées de rang inférieur ou supérieur et dans les racines de ces plantes. Parasite racinaire (Rhizoctonia solani) Des graines de colza de génération R1, transformées par la construction pSG246 sont semées sur un substrat constitué d'un mélange de tourbe, vermiculite et sable (10: 10: 5, v : v) contenu dans un pot de 1 litre. Les graines sont recouvertes d'une couche de 1 cm de substrat contenant 10 000 propagules viables de Rhizoctonia sotant par gramme. Ces propagules sont obtenus par culture pendant 15 jours d'une souche de Rhtzoctonta en fiole de Roux sur des grains de riz, suivi d'un broyage à une granulométrie inférieure à 1 Au cours de leur développement, les plantes de colza sont attaquées au niveau racinaire. On observe une forte stimulation de l'activité glucuronidase (détectée par test à l'aide de X-gluc, Section 17e) dans les racines de plantes infectées, comparativement à l'activité mesurée dans les racines de plantes contrôles (même descendance RI de plantes transformées mais non infectées). De plus, une forte stimulation de l'activité glucuronidase est induite de façon systémique dans les parties aériennes. c) Activation par un choc thermique des plantes de colza de génération R1 Des plantes de colza, de génération R1, contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ sont transférées pendant 2 ou 4 h dans une enceinte à 40'C afin de provoquer un choc thermique. A la fin du traitement, les plantes sont immédiatement congelées dans l'azote liquide et leur activité ss-glucuronidase déterminée sur l'ensemble de la partie aérienne. Le même protocole est appliqué à des plantes transformées par la construction pBI 121 ; l'activité de ces dernières plantes n'est pas affectée par le choc thermique. Par contre, les plantes contenant la construction pSG246 présentent une forte augmentation d'activité glucuronidase après le choc thermique ; le facteur moyen de stimulation, déterminé sur plusieurs plantes, est voisin de 12. d) Expression au cours du développement Au cours de la germination de graines de colza de génération R1 renfermant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246, on observe une expression faible de cette protéine dans les cotylédons ; une expression élevée dans toute la racine et très forte dans les méristèmes racinaires et caulinaires. Une très forte expression a également été mesurée dans les racines et cals transformés, au cours des étapes de régénération de plantes transgéniques. Section 20 : Obtention de cals de tournesol transforrP par Agrobactertun rhtzogenes contenant le plasmide pSG246.- La transformation est réalisée selon le protocole de Guerche et al (Mol. Gen. Genet., 206, 382, 1987) initialement mis au point pour la transformation du colza. Les différents milieux de culture sont ceux décrit par Pelletier et al. (Mol. Gen. Genet. 191, 244, 1983) leur composition a été explicitée (tableau 2). Des hypocotyles de tournesol sont obtenus par germination pendant 7 à 10 jours de graines sur de la vermiculite. Ces graines sont placées dans une chambre de culture, les conditions 16 h d'éclairement à 20il/8 h d'obscurité à 17 C. Les hypocotyles sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile et placés dans un tube contenant du milieu Murashige et Skoog, dont la concentration en macroéléments est réduite de moitié. L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhtzogenes contenant le plasmide pSG246. Des racines transformées apparaissent au bout de un mois, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé (15 g/l) et complémenté par 500 yg de céfotaxime/ml pendant 4 semaines avec un repiquage hebdomadaire. Elles sont ensuite cultivées dans le même milieu liquide en agitation (100 tours/min) et repiquées tous les mois. Le passage de ces racines dans le milieu D, permet la formation de cals à partir des racines transformées. L'activité glucuronidase des racines cultivées dans le milieu B liquide et de cals cultivés sur le milieu D, estimée par fluorimétrie, présente des valeurs très importantes, comprises entre 2 et 20 x 105 pmoles de méthylumbelliférone formée/min/mg de protéines. Section 21 : Obtention de plantes de tournesol transforiées par le gène de glucuronidase sous contrôle du promoteur du-gène 246C. Des graines de tournesol immatures sont prélevées sur le capitule de plantes du génotype 2603B (lignée de sélection, Rustica Semences). Ces graines sont stérilisées en surface pendant 30 min dans une solution d'hypochlorite de calcium à 2 %, puis rincées à l'eau distillée stérile. Les embryons immatures sont prélevés sur ces graines et mis en culture sur le milieu I (tableau 3) pendant 14 jours à 25iC et à l'obscurité. Ces embryons sont ensuite cultivés pendant 10 jours sur le milieu Il à 250C sous une photopériode de 16 h jour / 8 h nuit. Les embryons sont alors coupés en deux au niveau de l'axe embryonnaire et mis à tremper pendant 10 min dans une suspension d'Agrobactertum tumenac iens contenant le vecteur binaire pSG246 (cf. section 14). Cette suspension est obtenue par culture de cette bactérie pendant 14 i 16 h dans le milieu Luria liquide. Les embryons sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile, puis remis en culture sur le milieu Il à l'obscurité pendant 3 jours. Les embryons sont alors brièvement rincés par du milieu Murashige et Skoog liquide (Murashige et Skoog, 1962, Physiol. Plant 15 : 473) contenant 500 mg/l de l'antibiotique céfotaxime. Ils sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et mis en culture sur du milieu III contenant 250 mg/l de céfotaxime, 250 mg/l de carbenicilline et 50 mg/l de paromomycine. Cette culture s'effectue à 25-C sous une photopériode de 16 h jour / 8 h nuit ; les tissus végétaux sont repiqués tous les 21 jours sur ce même milieu. Les bourgeons néoformés à partir de ces tissus sont transférés sur le milieu IV, sous les mêmes conditions de température et photopériode. Les plantes enracinées sont ensuite mises à pousser en serre, puis autofécondées. Des plantes ont également été obtenues après transformation par le vecteur binaire pBI 101 et pB1 121, afin de servir de contrôles. Tableau 3 : Composition des différents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de tournesol transformées Milieux I II III IV KNO3 2500 2500 1900 1900 NH NO3 1650 1650 CaCl2, 2H2O 150 150 440 440 MgSO4, 7H2O 250 250 370 370 KH P04 - - 170 170 (NH4)2 SO4 134 134 - NaH2PO4, H2O 150 150 - ZnSO4, 7H2O 2 2 8,6 8,6 H BO 3 3 6,2 6,2 KI 0,75 0,75 0,83 0,83 CuSO4,5H2O 0,025 0,025 0,025 0,025 Na2MoO4,2H2O 0,25 0,25 0,25 0,25 CoCl2 6H O 0,025 0,025 0,025 0,025 Mn S04, 4H 0 10 10 22,3 22,3 Na2 EDTA 37.3 37.3 37,3 37,3 FeSO4,7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8 Ac. nicotinique 1 1 0,5 0,5 Thiamine HCl 10 10 0,1 0,1 Pyridoxine HCl 1 1 0,1 0,5 Myo-inositol 4000 4000 100 100 L-glycine L-alanine 1000 1000 - - L-glutamine 800 800 - L-serine 160 160 - L-tryptophane 50 50 - - L-cystéine 10 10 - - Ca-D-panthoténate - - 0,8 Ac. folique - - 0,1 Chl. de choline - - 0,1 Ac p-Aminobenzoique - - 0,05 Riboflavine - - 0,05 Saccharose 120 000 60 000 30 000 30 000 Ac.Dichloro-2-4-phenoxyacétique 2 - - 6-Benzylaminopurine - 0,4 - Kinétine - - 1 Ac. indoleacetique - - - 0,05 Agar 7000 7000 7000 8000 pH 5.7 5.8 5.7 5.7 Section 22 : Expression de la B-glucuronidase, sous contrôle du promoteur 246C dans des plantes de tournesol transformées Différents organes de plantes transgéniques de tournesol renfermant la construction pBI 101 ne montrent aucune expression de glucuronidase ; les plantes transformées à l'aide de la construction pBI 121 présentent une expression voisine de 2000 pmoles de méthylumbelliferone/min/mg de protéine. Les plantes exprimant la construction pSG246 ont une expression voisine de 8000 pmoles de methylumbelliferone/min/mg de protéine. Cette expression est fortement stimulée lors de la lacération d'une feuille, avec un facteur de 6 obtenu dès 40 min après la blessure. Un choc thermique de 2 ou 4 h à 40il, réalisé sur des feuilles prélevées sur des plantes de tournesol de génération Ro en stade bouton floral entraine une augmentation de l'expression de la glucuronidase par''un facteur voisin de 10. L'inoculation par le pathogène Phomopsts heltantht au niveau du pétiole d'une feuille entraîne une très forte induction de l'activité glucuronidase au niveau de l'ensemble de la plante, avec un facteur de stimulation de l'ordre de 15. Section 23 : Protocole de I 'expression dans les tissus de monocotylédones du gène de la B-glucuronidase, sous contrôle du promoteur 246C Obtention du matériel végétal Des graines du génotype d'orge GERBEL sont mises à germer en serre sur de la vermiculite. Au bout de 7 jours, les feuilles et les racines ont été prélevées et placées sur une boîte de Petri contenant du milieu Murashige et Skoog gélosé pour les expériences d'expression transitoire. Des embryons immatures de Maïs sont prélevés 10 à 14 jours après pollinisation à partir de pieds mères (lignée LH132) cultivés en serre. Les embryons sont placés côté axe embryonnaire en contact avec le milieu d'induction (composition donnée dans le tableau 4 ci-après) puis sur le milieu d'entretien (tableau 5), 3 semaines plus tard. Les cals obtenus sont repiqués toutes les semaines. Les expériences d'expression transitoire sont réalisées quelques heures après le repiquage. Préparation du vecteur t > SG123 Celle-ci est réalisée selon le protocole décrit en Section 10. Transformation du matériel végétal L'introduction de 1'ADN plasmidique (vecteur pSG123) dans les cellules végétales est réalisé par utilisation du canon à particules construit sur le principe décrit par Zumbrunn (Zumbrunn et al. 1989 Techniqué 1 (3) 204-216). L'ADN plasmidique est adsorbé sur des microparticules de tungstène à raison de 4 Fg/mg de tungstène. 2,5 mg du mélange tungstène/ADN sont alors déposés sur un macroprojectile qui est accéléré par l'explosion d'une cartouche. L'écrasement du macroprojectile sur une plaque d'arrêt percée d'un trou permet de projeter les microparticules de tungstène et l'ADN dans les cellules. Mesure de l'expression transitoire L'ADN adsorbé sur les microparticules de tungstène qui ont pénétré dans les cellules végétales est libéré ; le gène chimérique associant le promoteur du gène 246C à la glucuronidase est alors transcrit puis traduit. La glucuronidase obtenue est alors visualisée par le test histochimique décrit par JEFFERSON et al, 1987 Plant Molecular Biology Reporter 5,387, en utilisant le substrat 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ss-glucuronide de cyclohexylammonium (X-gluc). Les cellules exprimant le gène présentent alors une coloration bleue. Le comptage du nombre de cellules bleues obtenues par boîte de Petri au cours d'une expérience d'expression transitoire permet de compter le nombre de cellules transformées et d'estimer l'expression de la construction chimérique testée. TABLEAU 4 : Milieu d'induction de cals de Maïs à partir d'embryons immatures (en mg pour 1 litre) MgS04, 7H20 370 CaCl2, 2H20 440 KNO3 1900 NH4NO3 1650 KH2PO4 170 Na2MoO4, 2H2O 0,25 CuSO4, 5H2O 0,025 MnSO4, H2O 16,75 HqB03 6,2 ZnSO4, 7H2O 8,6 KI 0,83 CoCl2, 6H2O 0,025 FeEDTA 65,1 Saccharose 20 000 Hydrolysat de caséine 100 L-proline 5 800 Glycine 2 Acide nicotinique 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Inositol 100 Thyamine HCl 0,1 Acide abscissique 0,06 Chloramben 4,12 Phytagel 3000 pH = 5,7 Autoclavage 20 min à 120'C TABLEAU S: Milieu d'entretien des cals de Maïs (en mg pour 1 litre) MgSO4, 6H2O 370 CaCl2, 2H2O 440 KNO3 1900 NH4NO 1 650 KH2P04 170 Na2MoOk, 2H20 0,25 CuSO4, 5H2O 0,025 MnSO4. H2O 16,75 H3BO3 6,2 ZnSOk, 7H20 8,6 KI 0,83 CoCl2, 6H2O 0,025 FeEDTA 65,1 Saccharose 20 000 Hydrolysat de caséine 100 L-proline 2 900 Glycine 2 Acide nicotinique 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Inositol 100 Thiamine HCl 0,1 Dicamba (Banvel #) 0,002 Gelrite 3 000 pH = 5,7 Autoclavage 20 min à 120 C Section 24 :Expression transitoire du gène de la -glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C dans les tissus d'orge et les cals de Maïs L'expression transitoire mesurée en utilisant le substrat X-gluc, 48 heures après le bombardement à l'aide du canon à microparticules montre que le gène de ss-glucuronidase s'exprime dans les feuilles et les racines d'orge et également dans les cals de Maïs. L'intensité de l'expression est aussi forte que celle induite par l'utilisation du plasmide pBI 221 (Clontech), dans lequel le gène de glucuronidase est placé sous contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur. Le nombre de cellules transformées, exprimant le gène de glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C est voisin de 200 par boite (valeur moyenne de plusieurs expériences). Le promoteur du gène 246C du tabac est donc capable de diriger l'expression d'un gène dans les monocotylédones. Section 25 : Construction d'un plasmide plaçant le gène de la chitinase tomate-tabac sous le contrôle du promoteur inductible et expression de celui-ci dans le tabac a) Préparation de la séquence promotrice Le plasmide pSG123 décrit précédemment est digéré à l'aide des endonucléases Hind III et Sca I. Après électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III - Sca I de 2088 paires de bases contenant tout le promoteur inductible à l'exception des 57 paires de bases situées immédiatement en amont de 1'ATG est purifié. La ligation de ce fragment purifié, de l'oligonucléotide de synthèse Sca I - Bam HI de 62 paires de bases de séquence suivante [SEQ ID NO : 15] Sca I BamHI ACTACTAATGTT CAATGACTTTTATAAGCACTACATATATATACTCAAACAAAAAGA G TGATGATTACAA GTTACTGAAAATATTCGTGATGTATATATATGAGTTTGTTTTTCTCCTAG et d'un vecteur pTZ 19R (Pharmacia) linéarisé grâce aux endonucléases Hind III et Bam HI a donné naissance au plasmide pPH 111. A partir de ce plasmide pPH 111 par coupure à l'aide des endonucléases Hind III - Bam HI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III - Bam HI de 2150 paires de bases contenant le promoteur inductible dans son entier est isolé. b) Préparation du fragment portant un gène hybride codant pour une protéine à activité endochitinase Le fragment BamHI - EcoRI provenant du plasmide pBR1 décrit dans la demande de brevet EP-493 581, Exemple 1 et contenant un gène chimérique codant pour une protéine à activité endochitinase [SEQ ID NO : 16], qui comprend la séquence codant pour une endochitinase hybride tomate-tabac (en position 4381587) et le terminateur NOS, est purifié. c) Clonage dans le vecteur binaire pBIN 19 On a ligué à l'aide de 1'ADN ligase T4 la séquence promotrice (cf. cidessus) la séquence codant pour la chitinase et la séquence terminatrice, dans le vecteur binaire pBIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721), ouvert à l'aide des endonucléases Hind III et EcoRI. Ce vecteur porte deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet pouvant être transféré aux cellules végétales. Le vecteur obtenu, appelé pBR 20, est cloné dans la souche E. colt HB 101 (Clontech). 2) Transformation d 'Agrobacterium turne fac tens La transformation de la souche d'Agrobacterfum tumefactens LBA 4404 (Clontech) est réalisée selon la méthode de congélation-décongélation décrite dans Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al, op. cité) (résumé en section 14) à partir de 1 mg de plasmide pBR20. 3) Transformation du tabac Du tabac Ntcottana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium turne fac tens contenant le plasmide pBR 20 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985 Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après. Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac Ntcottana tabacum (variété Wisconsin Havana 38) sont incubés dans une culture d'A. turne fac tens hébergeant le plasmide pBR 20. Les disques égouttés sur papier Whatman sont mis en culture sur des milieux de culture en boîtes de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals. Ces cals sont ensuite transférés sur du milieu contenant de la céfotaxime à 500 Ag/ml destinée à décontaminer les tissus végétaux (élimination des Agrobactertum tumefaefens) et de la kanamycine à 100 Fg/ml pour sélectionner le matériel transgénique. Mise en évidence de l'expression de la protéine à activité endochitinase dans les tabacs transgéniques a) Préparation des extraits bruts de protéines de tabac transformé Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de différents tissus de la plante (racine, tige, feuille, etc ...). Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20iC. La poudre a été extraite à 4-C en présence d'un tampon acétate d' ammonium 0,1 M pH 5,2 et soumise à une centrifugation à 10 000 g. La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines en suivant la technique de Bradford (Bradford, M.M., 1976 Anal Biochem., 72, 248-254). b) Mise en évidence de la chitinase hybride par immuno-empreinte (Western Blot) On soumet les extraits bruts de protéines à un Western blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite par H. Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, 4350-4354). L'immunodétection de la protéine d'intérêt se réalise grâce à un immunsérum contenant des anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine hybride à activité chitinase (cf. EP-493 581, section 5). Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d' Amersham ("Blotting detection kit"), utilisé selon les indications du fabricant. L'empreinte obtenue montre, pour les feuilles de plantes de tabac transformées par le plasmide pBR 20, la présence d'une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 26 t 6kDa reconnue par les anticorps polyclonaux et absente des feuilles des plantes de tabac témoins. Cette protéine a le même poids moléculaire apparent que la protéine hybride à activité chitinase décrite dans la demande EP-493 581. c) Mise en évidence de l'activité chitinolytique de la protéine recombinante L'activité chitinolytique des extraits bruts de protéines de feuilles de 5 plantes de tabac transformé par le plasmide pBR 20 ou par le plasmide pBRI (demande EP-493 581) et d'extrait brut de protéines de feuilles de plantes de tabac non transformé (plante W 38) est mesurée selon la méthode suivante L'activité endochitinase de la protéine est mesurée par une méthode radiochimique permettant d'estimer la quantité de monomères ou d'oligomères libérés par l'enzyme à partir d'un substrat (la chitine tritiée). Cette méthode, décrite par Molano et al. (1977, Anal. Biochem., 83, 648-656), est résumée ci-après. A un volume d'extrait protéique de 10 > 1 sont ajoutés 50 p1 d'une suspension de chitine tritiée d'activité spécifique 0,58 MBq/ml. Le volume final est ajusté à 300 F1 avec du tampon d'acétate de sodium 0,2 M de PH 5,0. Après 90 min d'incubation à 30-C, la réaction d'hydrolyse de la chitine est arrêtée par 100 F1 d'acide trichloracétique à 20 %. Les tubes réactionnels sont ensuite centrifugés pendant 10 min à 12 000 g. Une partie aliquote de 100 > 1 du surnageant renfermant les oligomères solubles de chitine est prélevée et la radioactivité correspondante est mesurée par scintillation liquide en présence de 5 ml de mélange scintillant. On exprime l'activité chitinolytique spécifique en dpm/mg de protéine. Pour les 10 plantes transgéniques, on obtient les valeurs suivantes Génotype W38 35S (pBR 1) | Promoteur inductible (pBR 20) à 22*C et à l'obscurité. On évalue la résistance à Chatara eZegans attribuant une note 45 jours après l'inoculation. Les plantes sont notées selon les symptômes d'infection et selon leur niveau de développement végétatif par rapport à un témoin non inoculé (ce témoin est une plante W38 non inoculée pour les plantes issues des 10 plantes transformées choisies et de la plante W38 et une plante P49 non inoculée pour lessplantes issues de la plante P49).Les classes sont définies selon les critères suivants Note O : plante morte ; note 1 : bourgeon terminal encore vert, système racinaire détruit ; note 2 : développement des plantes ne dépassant pas 25 % de celui du témoin, système racinaire entièrement nécrosé ; note 3 développement de plantes atteignant 50 % du développement du témoin, système racinaire présentant ces parties saines ; note 4 : développement des plantes identiques au témoin. Activité 89 147 328 317 351 299 423 397 468 spécifique DPM/mg prox On constate sur le tableau ci-dessus que, dans des conditions de noninduction, les extraits de plantes de tabac transformé par le plasmide pBR 20 ont une activité chitinolytique significativement supérieure à celle d'extraits de plantes de tabac transformé par le plasmide pBR 1 (demande EP 493 581) qui ont elles-mêmes une activité chitinolytique significativement supérieure à celle de l'extrait de plantes de tabac-témoin. Le promoteur inductible a donc une activité promotrice de base, avant induction, plus élevée que celle du promoteur 35S du CaMV. Mesure de la résistance aux chamniznons pathogènes des Plantes transformées (zénération R1) Les plantules de la génération R1 résistantes à la kanamycine issues des 10 plantes transformées choisies (5 transformées avec le plasmide pBR 1, 5 avec pBR 20) d'une plante Nicotiana tabacum var. Wisconsin Havana 38 sensible à ChaZara eZegans , abrégée W38, et d'une plante Nicotiana tabacs var. Paraguay 49, abrégée P49, génétiquement tolérante à ce champignon, ont été transférées en serre pour évaluation de leur résistance à ce champignon. Ce dernier a été choisi car il est représentatif des champignons pathogènes du tabac possédant de la chitine dans leur paroi. Le protocole choisi dans cette étude est décrit ci-àprès Les plantules sont cultivées en godets (3 x 3 cm). A l'apparition de la 5ème feuille, les plantes sont inoculées en déposant au niveau du collet une suspension d'endoconidies 5 x i05 spores/ml). Les endoconidies sont prélevées sur des cultures mycéliennes de ce champignon entretenues sur le milieu "potato dextrose agar" (Difco) L'indice de résistance de la descendance d'une plante transformée représente la moyenne des notes effectuées sur les plantules issues de cette plante. Toutes les descendances des plantes transformées présentent un indice de résistance supérieur à celui de la descendance de la plante témoin W38 (plante non transformée) et parfois proche, voire supérieur à celui de la descendance de la plante témoin p49 génétiquement résistante. De plus, les plantes transformées avec la construction contenant le promoteur inductible (plasmide pBR 20) présentent une résistance à ChaZara e Zegons significativement supérieure à la résistante induite dans les plantes transformées par la constructio contenant le promoteur 35S (plasmide pBR 1). De plus il a été constaté que l'activité chitinase était fortement augmentée à la suite de l'infection dans les plantes transgéniques exprimant le gène du chitinase sous contrôle du promoteur inductible. Cette augmentation d'activité débutant dès les premiers jours après infections atteint une valeur de 15 à 20, 30 à 45 jours après l'inoculation elle permet aux plantes de développer une résistance importante au champignon pathogène ChaZara etegans. Dans les plantes transformées par le plasmide pBR1, une augmentation par un facteur 3 est constatée seulement 45 jours après inoculation. Les résultats exposés ci-dessus montrent que lors d'une attaque par un champignon pathogène, le promoteur inductible a une activité promotrice supérieure à celle du promoteur 35S. Section 26 : Construction d'un plasmide plaçant le gène de la B-1,3-glucanase de soja sous contrôle du promoteur inductible et expression de celui-ci dans le tabac On a utilisé le fragment BamHI-EcoRI provenant du vecteur binaire pBR60 décrit dans la demande de brevet WO-A-92/16632 (section 9) et contenant un gène chimérique codant pour une protéine à activité B-1,3-glucanase. Ce fragment BamHI-EcoRI qui comprend la séquence pour la B-1,3-glucanase de soja (en position 438-1547) et le terminateur NOS [SEQ ID NO : 17] est purifié puis ligué à l'aide de 1'ADN ligase T4, au fragment HindIII-BamHI de 2150 paires de bases du plasmide pPH111 (section 25a ci-dessus) dans le vecteur binaire pBIN19 ouvert aux sites HindIII et EcoRI. Le vecteur obtenu, appelé pBR23 est cloné dans la souche E. coli Ho101 (Clontech). Ce vecteur est introduit dans la souche d'Agrobactertw,i tumefacfens LBA4404 selon le protocole déjà décrit. Du tabac Ntcottana tabacum (Wisconsin Havana 38) a été transformé selon le protocole de Horsch R.B. déjà cité. Des plantes transgéniques ont été obtenues, ces plantes expriment une protéine surnuméraire, la B-1,3-glucanase de soja de taille 37 s 3 kDA environ et mise en évidence par Western Blot (technique décrite dans la demande de brevet WO-A-92/16632, section 13). Cette protéine présente une activité glucanase mesurée selon le protocole de la section 8 de la même demande. L'activité de 8 plantes transgéniques a été mesurée, elle est légèrement supérieure à celles de plantes exprimant le même gène sous contrôle du promoteur 35S du CaMV. Ces plantes, confrontées à une inoculation par le pathogène ChaZara etegans, dans les conditions d'infection décrites ci-dessus (section 25), montrent une surexpression de ss-1,3-glucanase, qui atteint un facteur 8, 45 jours après inoculation. Des plantes transformées par le même gène sous contrôle du promoteur 35S du CaMV ne montrentpas-de surexpression de -1,3-glucanase. La surexpression de p-1,3-glucanase due au promoteur inductible entraîne une forte tolérance des plantes de tabac au champignon ChaZara eZegans : cette tolérance est supérieure à celle observée chez les plantes exprimant le gène de manière constitutive sous le contrôle du promoteur 35S. Section 27 : Localisation des séquences minimales du promoteur 246C responsables des caractéristiques décrites A partir du vecteur pSG123, associant le promoteur du gène 246C au gène de la ss-glucuronidase, différentes délétions ont été effectuées dans la région 5' de ce promoteur. Celles-ci ont été obtenues soit par utilisation d'enzymes de restriction et/ou de la nucléase Exo3. L'extension précise des délétions a été déterminée par séquençage selon la méthode de Sanger. La figure 3 présente les différents vecteurs obtenus à l'aide de ces délétions de la partie 5' du promoteur, comptées à partir du site d'initiation de la transcription en position 2068. Etude de la force du promoteur Ces vecteurs ont été utilisés en expression transitoire sur des protoplastes de tabac qui ne reçoivent aucun effecteur. L'analyse des résultats montre que l'expression maximale est obtenue avec les vecteurs pSG 251 et pSG 33, atteignant 30 000 pmol de méthylumbellifêrone formée/min/mg protéine.Des délétions plus importantes effectuées dans ce promoteur (correspondant aux vecteurs pSG29, pSG23, pSG451, pSG2, pSG24, pSG3, pSGl) ont pour conséquence une réduction de l'expression de la glucuronidase d'autant plus grande que la délétion est importante Les vecteurs pSG 251 et pSG 33 correspondant respectivement aux promoteurs comprenant la séquence (B) [vecteur pSG 33] et la séquence (B) comportant en amont la séquence (C) [vecteur pSG 251] respectivement. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANTS: (A) NOM: ELF SANOFI (B) RUE: 32-34 rue Marbeuf (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75008 (G) TELEPHONE: 40.73.40.73 (A) NOM: SOCIETE NATIONALE ELF AQUITAINE (B) RUE: Tour Elf-002 Place de la Coupole La Defense 6, (C) VILLE: COURBEVOIE (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 92400 (G) TELEPHONE: 47.44.45.46 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR VEGETAL INDUCTIBLE AU STRESS ET CELLULES VEGETALES CONTENANT UNE UNITE D' EXPRESSION D'UNE PROTEINE D'INTERET COMPRENANT LEDIT PROMOTEUR (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 17 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 631 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: 246 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE:CDS (B) EMPLACEMENT: join(1..177, 368..631) (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT: 178.367 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc-signal (B) EMPLACEMENT: 175.182 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquence consensus d'épissage" (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc-signal (B) EMPLACEMENT: 323..333 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquence consensus d' épissage" (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc-signal (B) EMPLACEMENT: 363.368 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquence consensus d'épissage" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: ATG AAC CCT GTT CAC AAA AAG ATC CCT ATT TTG ATT CAC AAT AGT AAA 48 Met Asn Pro Val His Lys Lys Ile Pro Ile Leu Ile His Asn Ser Lys 1 5 10 15 GCC ATT TGT GAG TCT CTA AAC ATT CTT GAG TAC ATT GAT GAA GTC TGG 96 Ala Ile Cys Glu Ser Leu Asn Ile Leu Glu Tyr Ile Asp Glu Val Trp 20 25 30 CAT GAC AAA TGT CCA TTA CTT CCT TCT GAT CCT TAC GAA AGG TCA CAA 144 His Asp Lys Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Glu Arg Ser Gln 35 40 45 GCC AGA TTC TGG GCC GAC TAT ATT GAC AAG AAG GTAATAAACA TCTCACAAAG 197 Ala Arg Phe Trp Ala Asp Tyr Ile Asp Lys Lys 50 55 ACTTAACAGT CAATGTAACA TGACCTTTAC TAAGTTCATC TTGTGTAGTT TCACCGAGCT 257 GTTTAAGGTC GTCGTACATT TGAATATTAG GTGTTTCACA TTTGAATTTT TTTATCCCCT 317 TGTTAGAATT CCTGATTCTG TCAATACTTA TGGACGTTGG TTTAATGCAG ATA TAT 373 Ile Tyr 60 AGC ACA GGA AGA AGA GTG G TGG AGC GGT AAA GGT GAA GAT CAA GAA GAA 421 Ser Thr Gly Arg Arg Val Trp Ser Gly Lys Gly Glu Asp Gln Glu Glu 65 70 75 GCA AAG AAG GAA TTC ATA GAA ATA CTC AAG ACT TTG GAA GGA GAG CTT 469 Ala Lys Lys Glu Phe Ile Glu Ile Leu Lys Thr Leu Glu Gly Glu Leu 80 85 90 GGA AAT AAA ACT TAC TTT GGT GGT GAT AAT CTG GGT TTT GTG GAT GTG 517 Gly Asn Lys Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Asn Leu Gly Phe Val Asp Val 95 100 105 GCT TTG GTT CCC TTT ACT AGT TGG TTT TAT TCT TAT GAG ACT TGT GCA 565 Ala Leu Val Pro Phe Thr Ser Trp Phe Tyr Ser Tyr Glu Thr Cys Ala 110 115 120 125 AAC TTT AGT ATA GAA GCA GAG TGT CCA AAG CTG GTG GTA TGG GCA AAA 613 Asn Phe Ser Ile Glu Ala Glu Cys Pro Lys Leu Val Val Trp Ala Lys 130 135 140 ACA TGT ATG GAG AGC GAG 631 Thr Cys Met Glu Ser Glu 145 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 147 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2: Met Asn Pro Val His Lys Lys Ile Pro Ile Leu Ile His Asn Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ile Cys Glu Ser Leu Asn Ile Leu Glu Tyr Ile Asp Glu Val Trp 20 25 30 His Asp Lys Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Glu Arg Ser Gln 35 40 45 Ala Arg Phe Trp Ala Asp Tyr Ile Asp Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Gly 50 55 60 Arg Arg Val Trp Ser Gly Lys Gly Glu Asp Gln Glu Glu Ala Lys Lys 65 70 75 80 Glu Phe Ile Glu Ile Leu Lys Thr Leu Glu Gly Glu Leu Gly Asn Lys 85 90 95 Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Asn Leu Gly Phe Val Asp Val Ala Leu Val 100 105 110 Pro Phe Thr Ser Trp Phe Tyr Ser Tyr Glu Thr Cys Ala Asn Phe Ser 115 120 125 île Glu Ala Glu Cys Pro Lys Leu Val Val Trp Ala Lys Thr Cys Met 130 135 140 Glu Ser Glu 145 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 441 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: 246 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 3: ATGAACCCTG TTCACAAAAA GATCCCTATT TTGATTCACA ATAGTAAAGC CAITTGTGAG 60 TCTCTAAACA TTCTTGAGTA CATTGATGAA GTCTGGCATG ACAAATGTCC ATTACTTCCT 120 TCTGATCCTT ACGAAAGGTC ACAAGCCAGA TTCTGGGCCG ACTATATTGA CAAGAAGATA 180 TATAGCACAG GAAGAAGAGT GTGGAGCGGT AAAGGTGAAG ATCAAGAAGA AGCAAAGAAG 240 GAATTCATAG AAATACTCAA GACTTTGGAA GGAGAGCTTG GAAATAAAAC TTACTTTGGT 300 GGTGATAATC TGGGTTTTGT GGATGTGGCT TTGGTTCCCT TTACTAGTTG GTTTTATTCT 360 TATGAGACTT GTGCAAACTT TAGTATAGAA GCAGAGTGTC CAAAGCTGGT GGTATGGGCA 420 AAAACATGTA TGGAGAGCGA G 441 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1096 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE:NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TCAAATGAAA TACACATAAG AAGCACATAA ATTTAAATGC CGTATTAAAC TTACAGTATA 60 CTATAGCGGA AGTTGGCTTG ATAAAGGAAC GCTGAGGAGA GTAGCCGATG GTGAAACACT 120 AACATCAAGT GCAAAAGAAA GAAAAACTGA AAACAGAAGA TGAATGTTTG AAGTGGGTAA 180 AAGATTACTT AAAAGATAGG TTTGGTTAAC AAATGATTGT GACTGTTACG AAGCAGTGTG 240 AACCGTTGGG ACTTTTAATA TTCTTC GGCA GAAGAACATT GCTCTTTCCA C GTATGTAGT 300 CTTTGTCTAC TTGTAGTTTT TTTTAATTTA AATTAAATAA GTTAATTAGA GAAATAATAA 360 GAAGGATATT TTAGTAATTC AACTTTTAAC TTTTAGGTTT CCCACTTATA ATATAATATA 420 GATATAGTTT TTTTTAATTT AAATTAAATA AGTTAATTAG AGAAATAATA AGAGGATAT 480 TTTAGTAATT CAACTTTTAA CTTTTAG GGT TTC CACTTAT AATATAATAT AGATATAGAT 540 ATAGATATAG ATATAGATAA AGATATATAG ATATAGATAG ATAATATAGA TGGATGAGTC 600 ATTGGCGATA AAGTGAGGAT TGTTTCATTT TTGTTATTAA AAACTTACTA CTCCTTAAAT 660 ATAAAATATG ATTCCTTTTA AAAAAGAAAT AGAATAAAAA TAAAGATAAA ACACTAAAAA 720 TAAATTAATT GTCTAGACAA AATCTACCGT TCACCTCAAT TAATACACAT CCCCGTCCAC 780 ATCATGAAGT AGCTAGCACA AGCGTACAGA TCAGTTGAAA GAAGAAAAGG GTCCAGTCCT 840 AAATATCCAA ATGTTCATGA AAGGAGGACA ACTTAGTTTT TTCTACTAGA AAGAATATTT 900 TGACGAATTT CGTTCACATT GGCATGCTTT AATTATATTA AGTAGTCTTT CTTGGAAAAG 960 AAGTATTTGC AATATCAAAC CAAATCTTCC CATTACGCAA GCAATGACAT CTAAGCAAAT 1020 ATATATCACT ATAAATAGTA CTACTAATGT TCAATGACTT TTATAAGCAC TACATATATA 1080 TACTCAAACA AAAAGA 1096 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 236 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CCTTTTTCGA TTCTAATCCA ATCAATTCAA CAGTGTAAGG TGAAoeAGTC AATTTAAAGG 60 AAGGCCTTTA AATTCTAAAA TATTGTACTT TTCCTGCGCT TCTAAAAGTG AACGACAAAG 120 AAAAATAGT TATTCTTGAA CTTAATATTG TACAATAGGA TAAATTTTAA CTATCTATAA 180 AAAGAGAACA AAACCTTAAT CTCTTCAAAA TAATATTATA AGAAGTAACA TAATTG 236 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 813 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GAGCTCGGCA AGGCTGACCA AAGTCACAGA AGCGATTGGA ATTCGCAGGA CAGACCATGC 60 ACCTGCGCAC AAAATGTCGT AGGTGCGACA CACCAGAACC AGCACTGGGC AGCAGGTTTC 120 AATTGCTCTG TGGCTCGTTT GAAACTCATC CGAGCCACTC ATGACCTCGT CCGAATATTT 180 CAACAAGTCC ATAAACATAA TACGGACATA CTCGGGGTTT CACTTCACGT CAAACAACAT 240 CAAAATTACA AATCACACCC CGATTCGAAC CTTGAGTTTT AAACTTTTCA ATTTGCAAAT 300 CTCGTGCCAA AACATATTAA ATGAATCCGG AATGACTTCA AATTTATAAA TGACATAACG 360 GAGTTGTTCA AATTTCCAGA ATCAGATTCT GCCTTTGATA TCAAAAAGTC AACCCCGTGA 420 TCAAACTTGG AATTCTTTAG CCTTTAAATT GCTAGTTTTC GTTAAATGGT CATAACTTGA 480 GCTATGGACC TCCAAATTAA ATTTCGGGCA TACGCTCAAA TCCCAATTAC GAATACGGAG 540 CTACCGGACT GTCAAAATAC TGATCCGGGT CCGTTTGCTA AAAACGTTGA CCAAAGTCCA 600 CTAAGTTGAG TTTTAAAACT TTATTTCACA TTTTAATCCA TTTTTTACAT GAAAAC m C 660 CGGAAAATAC GGAGTATGCA CGCAAGTCGA GGAATGATAA ATGGTACGTT TCGAAGTTTT 720 AGAACTCAAA ATTACTTATT AAATTTAAAG ATGACATTTT GGGTCATCAC ATTGATGAAA 780 ATTTTGACAT TAATATCTGA GAACTTTCTT TGA 813 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3046 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: 246C (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 7: GAGCTCGGCA AGGCTGACCA AAGTCACAGA AGCGATTGGA ATTCGCAGGA CAGACCATGC 60 ACCTGCGCAC AAAATGTCGT AGGTGCGACA CACCAGAACC AGCACTGGGC AGCAGGTTTC 120 AATTGCTCTG TGGCTCGTTT GAAACTCATC CGAGCCACTC ATGACCTCGT CCGAATATTT 180 CAACAAGTCC ATAAACATAA TACGGACATA CTCGGGGTTT CACTTCACGT CAAACAACAT 240 CAAAATTACA AATCACACCC CGATTCGAAC CTTGAGTTTT AAACTTTTCA ATTTGCAAAT 300 CTCGTGCCAA AACATATTAA ATGAATCCGG AATGACTTCA AATTTATAAA TGACATAACG 360 GAGTTGTTCA AATTTCCAGA ATCAGATTCT GCCTTTGATA TCAAAAAGTC AACCCCGTGA 420 TCAAACTTGG AATTCTTTAG C CTTTTAAATT GCTAGTTTTC GTTAAATGGT CATAACTTGA 480 GCTATGGACC TCCAAATTAA ATTTCGGGCA TACGCTCAAA TCCCAATTAC GAATACGGAG 540 CTACCGGACT GTCAAAATAC TGATCCGGGT CCGTTTGCTA AAAACGTTGA CCAAAGTCCA 600 CTAAGTTGAG TTTTAAAACT TTATTTCACA TTTTAATCCA TTTTTTACAT GAAAACTTTC 660 CGGAAAATAC GGAGTATGCA CGCAAGTCGA GGAATGATAA ATGGTACGTT TCGAAGTTTT 720 AGAACTCAAA ATTACTTATT AAATTTAAAG ATGACATTTT GGGTCATCAC ATTGATGAAA 780 ATTTTGACAT TAATATCTGA GAACTTTCTT TGACCTTTTT CGATTCTAAT CCAATCAATT 840 CAACAGTGTA AGGTGAAGCA GTCAATTTAA AGGAAGGCCT TTAAATTCTA AAATATTGTA 900 CTTTTC CTG C GCTTCTAAAA GTGAAC GACA AAGAAAAAAT AGTTATTCTT GAACTTAATA 960 TTGTACAATA GGATAAATTT TAACTATCTA TAAAAAGAGA ACAAAACCTT AATCTCTTCA 1020 AAATAATATT ATAAGAAGTA ACATAATTGT CAAATGAAAT ACACATAAGA AGCACATAAA 1080 TTTAAATGC C GTATTAAACT TACAGTATAC TATAGCGGAA GTTGGCTTGA TAAAGGAAC G 1140 CTGAGGAGAG TAGCCGATGG TGAAACACTA ACATCAAGTG CAAAAGAAAG AAAAACTGAA 1200 AACAGAAGAT GAATGTTTGA AGTGGGTAAA AGATTACTTA AAAGATAGGT TTGGTTAACA 1260 AATGATTGTG ACTGTTACGA AGCAGTGTGA ACCGTTGGGA CTTTTAATAT TCTTCGGCAG 1320 AAGAACATTG CTCTTTCCAC GTATGTAGTC TTTGTCTACT TGTAGTTTTT TTTAATT'TAA 1380 ATTAAATAAG TTAATTAGAG AAATAATAAG AAGGATATTT TAGTAATTCA ACTTTTAACT 1440 TTTAGGTTTC CCACTTATAA TATAATATAG ATATAGTTTT TTTTAATTTA AATTAAATAA 1500 GTTAATTAGA GAAATAATAA GAAGGATATT TTAGTAATTC AACTTTTAAC TTTTTAGGGTT 1560 TCCACTTATA ATATAATATA GATATAGATA TAGATATAGA TATAGATAAA GATATATAGA 1620 TATAGATAGA TAATATAGAT GGATGAGTCA TTGGCGATAA AGTGAGGATT GTTTCATTT 1680 TGTTATTAAA AACTTACTAC TCCTTAAATA TAAAATATGA TTCCTTTTAA AAAAGAAATA 1740 GAATAAAAAT AAAGATAAAA CACTAAAAAT AAATTAATTG TCTAGACAAA ATCTAC C GTT 1800 CACCTCAATT AATACACATC CCCGTCCACA TCATGAAGTA GCTAGCACAA GCGTACAGAT 1860 CAGTTGAAAG AAGAAAAGGG TC CAGTCCTA AATATCCAAA TGTTCATGAA AGGAGGACAA 1920 CTTAGTTTTT TCTACTAGAA AGAATATTTT GACGAATTTC GTTCACATTG GCATGCTTTA 1980 ATTATATTAA GTAGTCTTTC TTGGAAAAGA AGTATTTGCA ATATCAAACC AAATCTTCCC 2040 ATTACGCAAG CAATGACATC TAAGCAAATA TATATCACTA TAAATAGTAC TACTAATGTT 2100 CAATGACTTT TATAAGCACT ACATATATAT ACTCAAACAA AAAGAATGGA GAGCAACAAC 2160 GTGGTTCTGC TAGATTTCTG GCCAAGCTCT TTTGGTATGA GGCTAAGAAT TGCATTGGCC 2220 TTAAAGGGAA TCAAATATGA AGCAAAGGAG GAAAACTTAT CTGATAAAAG CCCTTTGCTT 2280 CTGGAGATGA ACCCTGTTCA CAAAAAGATC CCTATTTTGA TTCACAATAG TAAAGCCATT 2340 TGTGAGTCTC TAAACATTCT TGAGTACATT GATGAAGTCT GGCATGACAA ATGTCCATTA 2400 CTTCCTTCTG ATCCTTACGA AAGGTCACAA GCCAGATTCT GGGCCGACTA TATTGACAAG 2460 AAGGTAATAA ACATCTCACA AAGACTTAAC AGTCAATGTA ACATGACCTT TACTAAGTTC 2520 ATCTTGTGTA GTTTCACCGA GCTGTTTAAG GTCGTCGTAC ATTTGAATAT TAGGTGTTTC 2580 ACATTTGAAT TTTTTTATCC CCTTGTTAGA ATTCCTGATT CTGTCAATAC TTATGGACGT 2640 TGGTTTAATG CAGATATATA GCACAGGAAG AAGAGTGTGG AGCGGTAAAG 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TGGTCAATAT GGGTACCAAA ATTTGTTTGA TGCTATGTTG GATTCAGTAC 1200 ATGCAGCCAT TGATAACACT AAGATTGGTT AATGTGAGGT TGTTGTATCC GAGAGTGGGT 1260 GGCCATCAGA TGGAGGATTT GCTGCCACTT ATGACAACGC ACGCGTGTAC TTAGACAATT 1320 TGGTTCGTCG TGCTAATAGA GGAAGCCCAA GAAGGCCTTC GAAGCCCACT GAGACTTATA 1380 TATTTGCCAT GTTCGATGAA AATCAAAAAA ATCCAGAGAT AGAGAAACAT TTTGGGCTCT 1440 TCAATCCCAA CAAACAAAAA AAATACCCAT TTGGGTTTGG AGGAAAGAGG CTAGGGAAAG 1500 TTGTTATTGA CGACTTCAAT GCAACAACTT CCATTAAGAG TGATGTGTAA GGTTGAGCTC 1560 GAATTTCCCC GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC 1620 CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA 1680 CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA 1740 CAITTAATAC GCGATAGAAA ACAAAATATA GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC 1800 GGTGTCATCT ATGTTACTAG ATCGAATTC 1829 REVENDICATIONS 1 Promoteur inductible au stress, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (B) [SEQ ID NO : 4] ci-après TCAAATGAAA TACACATAAG AAGCACATAA ATTTAAATGC CGTATTAAAC TTACAGTATA 60 CTATAGCGGA A AGTTGGCTTG ATAAAGGAAC GCTGAGGAGA GTAGCCGATG GTGAAACACT 120 AACATCAAGT GCAAAAGAAA GAAAAACTGA AAACAGAAGA TGAATGTTTG au AAGTGGGTAA go GL au 180 AAGATTACTT AAAAGATAGG TTTGGTTAAC AAATGATTGT GACTGTTACG AAGCAGTGTG 240 AACCGTTGGG ACTTTTAATA TTCTTCGGCA GAAGAACATT GCTCTTTCCA CGTATGTAGT 300 CTTTGTCTAC TTGTAGTTTT TTTTAATTTA AATTAAATAA GTTAATTAGA GAAATAATAA 360 GAAGGATATT TTAGTAATTC AACTTTTAAC TTTTAGGTTT CCCACTTATA ATATAATATA 420 GATATAGTTT TTTTTAATTT AAATTAAATA AGTTAATTAG AGAAATAATA AGAAGGATAT 480 TTTAGTAATT CAACTTTTAA CTTTTAGGGT TTCCACTTAT AATATAATAT AGATATAGAT 540 ATAGATATAG ATATAGATAA AGATATATAG ATATAGATAG ATAATATAGA TGGATGAGTC 600 ATTGGCGATA au AAGTGAGGAT TGTTTCATTT TTGTTATTAA AAACTTACTA CTCCTTAAAT 660 ATAAAATATG ATTCCTTTTA AAAAAGAAAT AGAATAAAAA TAAAGATAAA ACACTAAAAA 720 TAAATTAATT GTCTAGACAA AATCTACCGT TCACCTCAAT TAATACACAT CCCCGTCCAC 780 ATCATGAAGT AGCTAGCACA AGCGTACAGA TCAGTTGAAA GAAGAAAAGG GTCCAGTCCT 840 AAATATCCAA ATGTTCATGA AAGGAGGACA ACTTAGTTTT TTCTACTAGA AAGAATATTT 900 TGACGAATTT CGTTCACATT GGCATGCTTT AATTATATTA AGTAGTCTTT CTTGGAAAAG 960 AAGTATTTGC AATATCAAAC CAAATCTTCC CATTACGCAA GCAATGACAT CTAAGCAAAT 1020 ATATATCACT ATAAATAGTA CTACTAATGT TCAATGACTT TTATAAGCAC TACATATATA 1080 TACTCAAACA AAAAGA 1096 ou une séquence présentant un degré d'homologie élevée avec la séquence (B). 2. Promoteur selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il comprend en amont de la séquence (B), la séquence (C) [SEQ ID NO : 5] ci-après CCTTTTTCGA TTCTAATCCA ATCAATTCAA CAGTGTAAGG TGAAGCAGTC AATTTAAAGG 60 AAGGCCTTTA AATTCTAAAA TATTGTACTT TTCCTGCGCT TCTAAAAGTG AACGACAAAG 120 AAAAAATAGT TATTCTTGAA CTTAATATTG TACAATAG GA TAAATTTTAA CTATCTATAA 180 AAAGAGAACA AAACCTTAAT CTCTTCAAAA TAATATTATA AGAAGTAACA TAATTG 236 ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (C). 3. Promoteur selon la revendication 1, caractérisée en ce qu il comprend en amont de la séquence (B), la séquence (D) [SEQ ID NO : 6] ci-après GAGCTCGGCA AGGCTGACCA AAGTCACAGA AGCGATTGGA ATTCGCAGGA CAGACCATGC 60 ACCTGCGCAC AAAATGTCGT AGGTGCGACA CACCAGAACC AGCATCGGGC AGCAGGTTTC 120 AATTGCTCTG TGGCTCGTTT GAAACTCATC CGAGCCACTC ATGACCTCGT CCGAATATTT 180 CAACAAGTCC ATAAACATAA TACGGACATA CTCGGGGTTT CACTTCACGT CAAACAACAT 240 CAAAATTACA AATCACACCC CGATTCGAAC CTTGAGTTTT AAACTTTTCA ATTTGCAAAT 300 CTCGTGCCAA AACATATTAA ATGAATCCGG AATGACTTCA AATTTATAAA TGACATAACG 360 GAGTTGTTCA AATTTCCAGA ATCAGATTCT GCCTTTGATA TCAAAAAGTC AACCCCGTGA 420 TCAAACTTGG AATTCTTTAG CCTTAAATT GCTAGTTTTC GTTAAATGGT CATAACTTGA 480 GCTATGGACC TCCAAATTAA ATITCGGGCA TACGCTCAAA TCCCAATTAC GAATACGGAG 540 CTACCGGACT GTCAAAATAC TGATCCGGGT CCGTTTGCTA AAAACGTTGA CCAAAGTCCA 600 CTAAGTTGAG TTTTAAAACT TTATTCACA TTTTAATCCA TTTTTTACAT GAAAACTTTC 660 CGGAAAATAC GGAGTATGCA CGCAAGTCGA GGAATGATAA ATGGTACGTT TCGAAGTTTT 720 AGAACTCAAA ATTACTTATT AAATTTAAAG ATGACATTTT GGGTCATCAC ATTGATGAAA 780 ATTTTGACAT TAATATCTGA GAACTTTCTT TGA 813 ou une séquence présentant un degré d'homologie avec la séquence (D). 4. Sonde d'ADN pour la sélection de promoteur végétaux inductibles au stress, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (A1) ci-après [SEQ ID NO : 3]: ATGAACCCTG TTCACAAAAA GATCCCTATT TTGATTCACA ATAGTAAAGC CATTTGTGAG 60 TCTCTAAACA TTCTTGAGTA CATTGATGAA GTCTGGCATG ACAAATGTCC ATTACTTCCT 120 TCTGATCCTT ACGAAAGGTC ACAAGCCAGA TTCTGGGCCG ACTATATTGA CAAGAAGATA 180 TATAGCACAG GAAGAAGAGT GTGGAGCGGT AAAGGTGAAG ATCAAGAAGA AGCAAAGAAG 240 GAATTCATAG AAATACTCAA GACTTTGGAA GGAGAGCTTG GAAATAAAAC TTACTTTGGT 300 GGTGATAATC TGGGTTTTGT GGATGTGGCT TTGGTTCCCT TTACTAGTTG GTTTTATTCT 360 TATGAGACTT GTGCAAACTT TAGTATAGAA GCAGAGTGTC CAAAGCTGGT GGTATGGGCA 420 AAAACATGTA TGGAGAGCGA G 441 5.Utilisation des promoteurs de gènes végétaux, dont la partie codante est susceptible de s'hybrider avec la sonde (A1) [SEQ ID NO : 3] pour obtenir en situation de stress, la surexpression d'une protéine destinée à aider les plantes à surmonter un état de stress. 6. Utilisation selon la revendications 5, caractérisée en ce que ladite protéine est choisie parmi les chitinases et les ss-1,3-glucanases. 7. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisée en ce que la protéine est la ss-1,3-glucanase de [SEQ ID NO : 16] ou la chitinase hybride tomate-tabac de [SEQ ID NO : 17]. 8. Cellules végétales ayant intégré une unité d'expression d'une protéine destinée à aider la plante à surmonter un état de stress comprenant le promoteur d'un gène du tabac susceptible de s'hybrider avec la séquence (A1) [SEQ ID NO : 3] pour obtenir la surexpression de ladite protéine en situation de stress. 9. Cellules végétales selon la revendication 11, caractérisées en ce que le promoteur d'un gène du tabac susceptible de s'hybrider avec la séquence (A1) [SEQ ID NO : 3] est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10. Plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules végétales selon l'une des revendications 8 ou 9. 11. Semence caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules végétales selon l'une des revendications 8 ou 9. 12. Utilisation d'une plante ou d'une partie de plante selon la revendication 10 pour screener des produits à activité phytosanitaire qui induisent les réactions de défense naturelles des plantes contre les agressions parasitaires (champignons, bactéries, virus, insectes et nématodes).