Brevet FR2688311A1 — publié le 19930910

La présente invention a pour objet un procédé permettant en un seul temps la séparation d'agglutinats érythrocytaires des hématies libres lors d'un test d'agglutination, et la mise en évidence desdits agglutinats. Elle a également pour objet le dispositif permettant la mise en oeuvre de ce procédé. On sait que, en immuno-hématologie érythrocytaire, la réaction antigèneanticorps peut être mise en évidence grâce à la présence d'agglutinats Cette agglutination, spontanée en milieu salin, n'est toutefois pas toujours observable in vitro, notamment dans le cas o les anticorps sont des anticorps dits sensibilisants, les hématies sensibilisées ne donnant pas lieu à une agglutination. Afin de provoquer l'agglutination des hématies sensibilisées, diverses techniques ont été mises au point, parmi lesquelles les plus couramment utilisées consistent à ajouter au milieu réactionnel: soit des macromolécules comme l'albumine, le dextran ou la polyvinylpyrrolidone; soit, après lavage des hématies sensibilisées, une antiglobuline humaine (test de Coombs>; soit une molécule polycationique comme le bromure d'hexadiméthrine, ou "polybrènell, le traitement de l'agglutinat ainsi obtenu par une solution citratée provoquant la remise en suspension des hématies non sensibilisées (technique de Lalezari). Une autre technique consiste à traiter préalablement les hématies par une enzyme protéolytique comme la papaïne, la broméline ou la trypsine. Toutes ces techniques d'agglutination peuvent être mises en oeuvre manuellement ou automatiquement, dans les supports les plus variés: tubes à hémolyse, plaques de verre, rhésuscope, microplaques à 96 puits. Toutefois, elles font souvent appel à une centrifugation et tant les phases de lavage (pour le test de Coombs) que les temps et vitesses de centrifugation ainsi que le type d'agitation pour la remise en suspension finale constituent des paramètres critiques qui rendent la maîtrise de ces réactions délicate. 2 2688311 Dxa-:s: L aÈ les f-i_, Ie S mis en oeuvre dans ces techniques de séoaation et de mise en évidence des agglutinats érythrocytaires sont peu nombreux. Gra hc 2 dm et al a proposé en 1982 un tube capillaire spécifique que I ain remplit d une solution d'albumine et de dextran, de densité Yntlermèdiaire entre sérum et globules, toutefois cette technique ne s'est pas révélée plus sensible que le test de Coombs classique. Une autre technique dite "en phase solide", a été présentée en 1984 au symposium de Munich par une équipe française, MULLER A et al, consistant à centrifuger le mélange sérum-globules à travers un liquide de séparation, après que les puits des microplaques utilisées aient été revêtus d'antiglobuline, la lecture étant faite automatiquement. Le brevet français 2 577 321 décrit une méthode dans laquelle le milieu de séparation est constitué d'un gel à base de dextran, toutefois cette méthode, comme la plupart des méthodes antérieurement proposées, fait appel à une centrifugation, avec l'inconvénient inhérent à la mise en oeuvre de ce type de technique, à savoir de nécessiter un matériel qui ne peut être transporté hors du laboratoire. La présente invention a pour but de remédier à ces divers inconvénients des techniques connues en proposant un procédé et un dispositif qui permettent en un seul temps la séparation et la mise en évidence des agglutinats érythrocytaires, en évitant le recours à une centrifugation. Le procédé selon l'invention se caractérise essentiellement en ce qu'il consiste à soumettre le mélange réactionnel à une percolation sur une phase inerte en forçant le flux de la phase mobile par tout moyen approprié. Conformément à l'invention, le mélange réactionnel, qui peut refermer n'importe quel agent d'agglutination connu (macromolécule, antiglobuline ou molécule polycationique), ou des hématies préalablement traitées par une enzyme protéolytique, est introduit dans au moins un tube capillaire ouvert muni d'un filtre à proximité de son extrémité inférieure, et dans lequel ont été préalablement disposées les microbilles constituant la phase inerte Après incubation pendant un temps et dans des conditions de température qui sont fonction de la technique utilisée, la vitesse d'écoulement de la phase mobile est augmentée par tout moyen approprié, la présence d'agglutinats étant visualisée par la formation d'un anneau de couleur à la partie supérieure de la phase inerte. Conformément à l'invention, les microbilles constituant la phase inerte mise en oeuvre peuvent être n'importe quelles microbilles d'un polymère chimiquement inerte vis à vis du milieu réactionnel, le diamètre de ces billes étant de préférence compris entre 20 et 50 nm. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le tube capillaire mis en oeuvre est un tube capillaire d'environ 60 mm de hauteur et d'un diamètre interne d'environ 2 mm, réalisé en un matériau approprié, tel que le verre ou le polystyrène cristal. Le filtre disposé à proximité de l'extrémité inférieure dudit tube capillaire présente une ouverture moyenne de mailles comprise entre 20 et 50 Wnn, et peut être réalisé en n'importe quel polymère approprié, tel qu'un polyamide Il peut être disposé à l'intérieur du tube, à une distance variable de son extrémité, ou à l'extérieur du tube, auquel cas il peut être maintenu par un manchon semi-rigide tel qu'un manchon en chlorure de polyvinyle, glissé autour du tube. Les réactifs nécessaires au test d'agglutination peuvent être disposés préalablement à la surface des billes ou ajoutées extemporanément avec les hématies ou les sérums à tester Ainsi qu'il a déjà été dit, ces réactifs peuvent être n'importe quel réactif mis en oeuvre à cet effet dans les techniques classiques. Pendant l'incubation du mélange réactionnel, le tube est obturé à son extrémité supérieure afin d'empêcher l'écoulement de la phase mobile. Lorsque la phase d'incubation est achevée, le contenu du tube est soumis à l'action d'un moyen permettant de déplacer la phase mobile. Ledit moyen peut s'exercer à la partie supérieure du tube et consister en une mise sous pression de son contenu, mais il peut aussi s'exercer à la partie inférieure du tube, auquel cas il peut consister soit en un absorbant constitué de matière cellulosique à haut pouvoir de rétention d'eau, disposé dans la partie inférieure du tube ou au contact de son extrémité, soit en un dispositif permettant de créer une dépression dans une chambre mise au contact dudit filtre Ce dernier dispositif est préférentiellement mis en oeuvre lorsque la technique est automatisée. Selon un second mode de réalisation de l'invention, le tube capillaire mis en oeuvre est remplacé par une microplaque 96 puits, munie à sa base d'un filtre tel que décrit ci-dessus, par exemple une membrane de polyamide. Ce second mode de réalisation permet d'effectuer la lecture du résultat à la surface des billes, la faible épaisseur de billes étant suffisante pour séparer les hématies libres des hématies liées Une lecture par le dessus de l'ensemble des puits est ainsi rendue possible tout en conservant une bonne sensibilité. Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être parfaitement autonome, ne nécessitant aucun matériel annexe tel qu'une centrifugeuse, en sorte qu'il peut être aisément mis en oeuvre hors du laboratoire. Il présente également l'avantage d'offrir un champ d'application large, pouvant être utilisé aussi bien en sérologie (hémagglutination) que pour des groupages sanguins ou des recherches d'agglutinines irrégulières. Il peut en outre être utilisé pour la mise en oeuvre de toutes les techniques connues d'agglutination, et il peut être aisément automatisé, notamment dans le cas o il est mis en oeuvre dans des microplaques 96 puits. A ces avantages s'ajoute celui inhérent à la stabilité de l'image produite, les réactions restant visibles plusieurs heures. Le procédé selon l'invention permet d'éviter les phases critiques et longues que constituent les lavages et la centrifugation, tout en conservant une grande sensibilité. D'autre part, le tube mis en oeuvre étant ouvert, le procédé selon l'invention permet de cumuler deux techniques connues en associant les deux réactifs correspondants, introduits successivement on peut ainsi réaliser une 2688311 technique mixte, par exemple en mettant en oeuvre le polybrène et une antiglobuline humaine. Dans le cas o l'on réalise une telle technique mixte, lorsque l'on met en oeuvre un tube capillaire il est nécessaire de préparer dans un autre contenant le mélange réactionnel renfermant le polybrène, puis, après incubation, de transférer ce mélange dans le tube contenant la phase inerte, avant de déposer une quantité suffisante d'antiglobuline et de laver. Par contre si l'on utilise une microplaque, les deux opérations peuvent se faire directement à la surface des billes. Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration de la présente invention, vis-à-vis de laquelle ils ne présentent aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 Des microbilles de FRACTOGEL TSK HW 50 S sont lavées deux fois au sérum physiologique, un mélange volume à volume de billes et de sérum physiologique étant préparé pour couler les billes 50 gl de la suspension ainsi préparée sont coulés dans un tube ouvert de 60 mm de hauteur et 2 mm de diamètre interne, dont l'extrémité inférieure est munie d'un filtre en polyamide de 10 mm de diamètre fixé à un manchon de PVC glissé sur le tube. On introduit dans le tube ainsi préparé le mélange suivant: hématiestests: 10 gl sérum à tester: 10 lil solution à 1 % de polybrène dans du sérum physiologique D 10 il. On laisse incuber 10 minutes à température ambiante, en obturant l'extrémité supérieure du tube de manière à éviter l'écoulement de la phase mobile. On dispose alors un absorbant (ouate de cellulose) au contact du filtre disposé à l'extrémité inférieure du tube et on débouche son extrémité supérieure de manière à provoquer l'écoulement de la phase mobile On lave ensuite avec une solution de citrate hypertonique, et on procède à la lecture. On observe un anneau de couleur rouge à la partie supérieure de la phase inerte, toutes les hématies étant agglutinées. La durée totale de la manipulation est inférieure à 25 minutes. EXEMPLE 2 Cet exemple illustre la cumulation du test au polybrène décrit dans l'exemple 1 avec un test de Coombs à l'antiglobuline. On procède à la préparation du tube de la manière décrite dans l'exemple 1, puis on prépare le mélange réactionnel suivant: hématies-tests à 3 % 1 volume sérum à tester 1 volume polybrène à 1 % 1 volume. On dispose 30 1 il de ce mélange à la surface des billes de FRACTOGEL, puis on laisse incuber 10 minutes à température ambiante Dès que le ménisque du mélange atteint la surface des billes, on dépose 10 1 d'antiglobuline polyvalente, puis il d'une solution de citrate hypertonique additionné de Tween 20 à 1 % (v/v). Après écoulement total de la solution de lavage on procède à la lecture. EXEMPLE 3 Cet exemple reprend le test décrit à l'exemple 2, réalisé avec une microplaque 96 puits. On utilise une microplaque "PALL BIOSUPPORT C" dont on remplace la membrane par une membrane de nylon dont la taille des mailles est de 20 à 50 Nom On dépose cette membrane à la surface des puits, et on recouvre avec une feuille de papier Whatman nh 3 préalablement imbibée de chloroforme On exerce une pression de 2 à 3 minutes sur l'ensemble et on sèche à l'air comprimé Le volume des cupules est de 300 1 il ( 6 mm de diamètre, 12 mm de hauteur). On dépose au fond de chaque cupule 150 il de billes préparées comme dans l'exemple 1, puis, successivement: Hématies tests à 3 % 1 vol ( 50 1) Sérum à tester 1 vol ( 50 I Al) Polybrène à 1 % 1 vol ( 50 il) On laisse incuber dix minutes à température ambiante, en obturant la partie supérieure des puits à l'aide d'un adhésif que l'on enlève dès que l'incubation est terminée. On absorbe ensuite la phase mobile à l'aide d'ouate de cellulose disposée sous la plaque. On obtient un tapis cellulaire uniforme dans tous les puits, sur lesquels on ajoute 10 i l d'antiglobuline polyvalente puis on remplit la totalité des puits avec une solution de lavage (citrate hypertonique> additionnée de TW 20 à 1 % (U/U). Après écoulement total de la solution de lavage, on procède à la lecture, en observant la partie supérieure des billes. Les performances du procédé selon l'invention ont été évaluées dans diverses techniques de recherche d'agglutinines irrégulières, en réalisant des dilutions en sérum AB de raison 2 d'un anti-D polyclonal Les résultats obtenus sont rassemblés ci-après TECHNIQUES TITRES COOMBS MANUEL 128 COOMBS GEL 128 ENZYMATIQUE 65 536 POLYBRENE 32 768 COOMBS POLYBRENE 524 288 On constate que la technique mixte Polybrène-Coombs dont le procédé selon l'invention autorise la mise en oeuvre permet un gain de sensibilité important par rapport aux autres techniques Ce résultat a été confirmé sur d'autres réactifs dilués, notamment des anti-kell. D'autre part un panel d'hématies-tests présentant des agglutinines irrégulières de spécificités très variées a été testé (Rh 1 2 Rh 1 Rh 3 Rh 3 +K 1 Kl Fya Lea). Tous ces tests étaient limites dans la technnique de Coombs Manuel et ont tous donné des résultats nettement positifs en 8 2688311 technique mixte Coombs-Polybrène, illustrant la supériorité du procédé selon l'invention par rapport aux techniques connues. REV 51 OT^T 9 ATIONS 2688311 1) Procédé pour la mise en évidence d'agglutinats érythrocytaires, permettant en un seul temps la séparation des agglutinats des hématies libres et la mise en évidence desdits agglutinats, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre après incubation le mélange réactionnel, disposé dans au moins un tube ouvert, à une percolation sur une phase inerte en forçant le flux de la phase mobile, la lecture du test s'opérant à la partie supérieure de ladite phase inerte. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase inerte consiste en des microbilles d'un polymère chimiquement inerte, de diamètre compris entre 20 et 50 Nm. 3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que chaque tube mis en oeuvre est muni à sa partie inférieure d'un filtre présentant une ouverture moyenne de mailles de 20 à 50 gm. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on obture chaque tube à son extrémité supérieure pendant la phase d'incubation, puis que l'on soumet son contenu à l'action d'un moyen permettant de forcer le flux de la phase mobile. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le moyen pour forcer le flux de la phase mobile consiste en une mise sous pression de la partie supérieure de chaque tube. 6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le moyen pour forcer le flux de la phase mobile consiste en un absorbant à haut pouvoir de rétention d'eau, disposé à la partie inférieure de chaque tube. 7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le moyen pour forcer le flux de la phase mobile consiste en un dispositif permettant de créer une dépression dans une chambre mise au contact de chaque tube à son extrémité inférieure. 8) Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un tube muni à sa partie inférieure d'un filtre dont l'ouverture moyenne des mailles est comprise entre 20 et 50 im. 9) Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que le filtre est réalisé en un polymère chimiquement inerte vis à vis du milieu réactionnel, comme le polyamide. ) Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que le filtre est fixé à un manchon d'une matière semi-rigide glissé autour du tube, et disposé au contact de l'extrémité inférieure du tube. 11) Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste en un tube capillaire dont la hauteur est d'environ mm et le diamètre interne d'environ 2 mm, réalisé en une matière transparente comme le verre ou le polystyrène cristal. 12) Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste en une microplaque à 96 puits munie à sa partie inférieure d'un filtre dont l'ouverture moyenne des mailles est comprise entre 20 et 50 ljm.