Brevet FR2692435A1 — publié le 19931224

La présente invention a pour objet un lapin transgénique sensible au virus de l'inununo-déffcience humaine (HIV) ainsi que son procédé d'obtention et son usage à titre de modèle-animal. A ce jour, le chimpanzé est le seul modèle animal dont on dispose pour tester des drogues ou des candidats vaccins susceptibles d'être utiles dans la lutte ou la prévention du syndrome d'immuno-déficience acquise (SIDA). Les tests chez le chimpanzé sont excessivement coûteux car il est requis d'entretenir ces animaux qui ne peuvent être tués en raison de leur rareté. D'autre part le chimpanzé ayant reçu le virus HIV (injection par voie intraveineuse) ne développe pas de SIDA. Bien que le virus HIV soit capable de se répliquer chez le chimpanzé, l'infection reste asymptomatique. Puisque le coût des tests chez le chimpanzé grèvent de manière importante les budgets de la recherche contre le SIDA, depuis bien longtemps on cherche à disposer d'un modèle animal dont l'usage serait bien moins contraignant. D'une manière générale, les murins (rat, souris, cobaye) sont assez souvent des animaux de choix. Malheureusement, dans le cas qui nous préoccupe, il se trouve que ces animaux sont réfractaires au HIV. On a maintenant trouvé que des lapins génétiquement modifiés sont utilisables comme modèle-animal HIV. C'est pourquoi, l'invention concerne un lapin transgénique sensible au HIV dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte au moins une séquence d'ADN codant pour le marqueur membranaire CD4 des lymphocytes T humains (hCD4) ou un analogue de celui-ci, placée sous le contrôle d'éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère. Un lapin transgénique selon l'invention peut être soit un transgénique complet (toutes ses cellules possèdent le fragment d'ADN exogène) soit un mosaïque (le fragment d'ADN est présent dans un certain pourcentage de cellules, mais pas dans toutes). Un lapin est dit sensible au HIV lorsque le HIV est capable de se répliquer chez l'animal, après avoir été administré. L'administration du virus peut être avantageusement effectuée par voie intra-veineuse, à raison d'une dose aux alentours de 100 000 cpm activité reverse transcriptase (RTase) / lapin. L'activité RTase d'une préparation virale peut être notamment déterminée selon la méthode de Spire et al, The lancet (1985) i : 188. La réplication du HIV chez le lapin peut être notamment suivie en effectuant des prélèvements de sang à intervalles réguliers pendant 1 à 2 mois après l'administration du virus et en testant les échantillons sanguins pour la présence du virus. Ce test peut être mis en oeuvre de diverses manières ; des kits de diagnostique sont disponibles à cet effet. La sensibilité au HIV est démontrée lorsque le virus reste détectable 1 ou 2 mois après l'administration. La séquence du cADN codant pour le hCD4 est notamment connue par Maddon et al, Celi (1985) 42 : 93. Par "analogue du hCD4", on entend une protéine qui aurait une séquence d'acides aminés légèrement différente de celle spécifiée par Maddon et al, mais qui conserverait l'essentiel des caractéristiques biologiques du hCD4, en particulier son caractère de protéine membranaire et de récepteur du HIV. L'homme du métier connait en effet les règles générales qui permettent de substituer un acide aminé par un autre sans abolir la fonction biologique ou immunologique de la protéine Les éléments indispensables à l'expression du cADN sont : un promoteur fonctionnel dans des cellules de mammifères, et des codons de début et fin de traduction. Lorsque le promoteur contient essentiellement les signaux TATA box et/ou CAAT box (promoteur dit minimal), il devient nécessaire d'y adjoindre un enhancer spécifique d'un gène qui s'exprime dans les lymphocytes. A ce jour, l'enhancer du gène codant pour le marqueur CD2 est le mieux connu, donc le plus employé. Mais il pourrait être remplacé par un autre, notamment par l'enhancer du gène codant pour le marqueur CD4. Le choix du promoteur est très large, mais reste néanmoins à la portée de l'homme du métier. Il peut être aussi avantageux d'ajouter un intron en 5' (entre séquence codante et promoteur) ou en 3' de séquence codante ainsi qu'une région polyA (signal de polyadénylation). L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un lapin transgénique sensible au HIV, qui comprend l'acte (i) d'injecter dans un embryon, un fragment d'ADN exogène comportant au moins une séquence codant pour le hCD4 ou un analogue de celui-ci, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, (ii) de transférer l'embryon ainsi injecté dans une lapine receveuse et (iii) après la naissance, de contrôler la présence du fragment d'ADN exogène dans le génome du lapin nouveau-né. Le fragment d'ADN que l'on injecte doit être dépourvu de séquences procaryotes qui risqueraient d'inhiber l'expression du cADN. Dans l'exemple ci-après un tel fragment d'ADN sera dénommé transgène. De nos jours, les techniques de micro-injection de matériel génétique dans des embryons sont devenues conventionnelles et sont bien évidemment à la portée de l'homme du métier. Il en est de même des techniques de prélèvement et de réimplantation d'embryons. On cite en particulier Hogan et ai, Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Eds (1986). L'essentiel des techniques décrites pour la souris sont applicables au lapin ; sauf celle qui concerne la superovulation. Enfin, l'invention concerne également un procédé pour tester l'efficacité d'une drogue ou d'un candidat-vaccin à l'encontre du HIV dans un but curatif ou préventif, caractérisé en ce que l'on administre la drogue ou le candidat vaccin à un lapin transgénique selon l'invention, et en ce que l'on injecte du HIV au dit lapin, avant ou après administration de la drogue ou du candidatvaccin. L'invention est illustrée ci-après, par référence aux figures 1 à 6. La Figure 1 représente la stratégie générale de la construction du plasmide pTG685. La Figure 2 schématise le plasmide pPolyIII-I. La Figure 3 schématise le plasmide pTG670. La Figure 4 schématise le plasmide pTG685. La Figure 5 shématise le transgène tTG685. La Figure 6 présente l'analyse au FACS des lymphocytes des lapins transgéniques n" 18 (C, D)et 20 (A, B) mis en présence des anticorps Simultest (A, C) et Leu3A (B, D). EXEMPLE: Obtention de la génération Fo de lapins transgéniques sensibles au HIV. A - Construction du transgène tTG685 La construction du vecteur pTG685 est décrite ci-après en se référant à la Figure 1 qui en résume les différentes étapes. Le promoteur du gène codant pour la thymidine kinase (TK) du virus herpes simplex a été purifié par gene-clean (kit de Bio 101 Inc. La Jolla, CA), à partir d'un plasmide pVit-TK-CAT (Klein-HitpaB et al, Cell (1986) 46: 1053) préalablement digéré par BamHI et BglII. Ce promoteur est ainsi récupéré sous forme d'un fragment BamHI - BglI d'environ 160 pb. Ce fragment a été inséré dans le plasmide pPolyIII - I (Lathe et al, Gene (1987) 57 : 193 et tel que montré dans la Figure 2) préalablement digéré par BamHI et traité à la phosphatase alcaline de veau. On génère ainsi le plasmide Pffi-TK. Les signaux d'épissage et de polyadénylation du virus SV40 ont été récupérés sous forme d'un fragment EcoRI" - EcoRI à partir du plasmide pRSVL (deWet et al, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 725) digéré par EcoRI et traité à la polymérase Klenow. Ce fragment EcoRI - EcoRI" a été purifié par la technique du gene-clean. Ce fragment a été inséré dans pIII - TK préalablement digéré par EcoRY et phosphatasé, pour donner le plasmide pTK - SV40 intron/pA. L'enhancer du gène du marqueur CD2 humain a été isolé sous forme d'un fragment BamHI" - XbaI de 5,5 kb à partir du plasmide pIII - hCD2 (Greaves et al, Cell (1989) 56 : 979) digéré par Xbal et BamHI et traité à la polymérase Klenow. Ce fragment de 5,5 kb a été inséré dans le plasmide pTK - SV40 / Intron pA préalablement digéré par Pouh, pour donner le plasmide pTG670, tel que montré dans la Figure 3. Le cADN codant pour le marqueur CD4 humain (récepteur du virus HIV) a été purifié par gradient de saccharose sous forme d'un fragment EcoRI" - EcoRI" de 3kb à partir du plasmide pT4B (Maddon et al, Cell (1986) 47: 333) digéré par EcoRI et traité à la polymérase Klenow. Ce fragment a été inséré dans le pTG670 préalablement digéré par Smal et phosphatasé, pour donner le plasmide pTG685 dans lequel le cADN codant pour le récepteur CD4 est placé sous le contrôle du promoteur TK. pTG685 est tel que montré dans la Figure 4. Le transgène tTG685 tel que représenté à la Figure 5 a été récupéré à partir du plasmide pTG685 sous forme d'un fragment Noti - NotI. Ce fragment a été purifié par gradient de saccharose. B - Génération des lapins transgéniques La superovulation de 16 lapines New Zealand a été induite par injection de 0,25 mg de FSH (folliculine stimuIating hormone) de veau chaque jour pendant 3 jours, puis de 0,625 mg de FSH de porc chaque jour pendant 2 jours et enfin de 0,3 mg de LH (luteising hormone) de porc le 6ième jour au matin. Vers 16h le même jour, les 16 lapines en état de superovulation aussi que 8 autres lapines non-traitées ont été mises en présence de mâles de la même race, pour être fécondées. Le 7ième jour au matin, les femelles ont été séparées des mâles, puis tuées. Les oeufs sont prélevés des ovaires de chaque lapine. Les oeufs, encore agglutinés par un tissu folliculeux sont trempés pendant 20 min. environ dans une solution de hyaluronidase. Puis ils sont lavés deux fois dans la solution de Brinster. Pour les manipuler ensuite sous le microscope, les oeufs ont été déposés dans une goutte de solution Brinster Hépès additionnée de cytochalasine. Cette solution permet à l'oeuf d'avoir une meilleure résistance à I'injection. Par observation au microscope (grossissement x100 et x200) les oeufs ont été sélectionnés. On a séparé ceux qui sont fécondés (ils contiennent deux noyaux) de ceux qui ne le sont pas. Environ 280 oeufs ont été retenus pour micro-injection. Ces embryons ont reçu par micro-injection dans le pronucleus mâle, 2 picolitres contenant environ 500 copies de tTG685 en tampon TE. Environ 260 embryons micro-injectés ont été répartis entre 14 lapines New Zealand en état de pseudo-gestation. Seulement trois lapines receveuses n'ont pas mené leur gestation à terme. 40 lapereaux sont nés parmi lesquels on en a retenu 35 pour analyse. Les lapereaux transgéniques ont été identifiés comme suit: Un échantillon de sang est prélevé à l'oreille des lapereaux. L'ADN a été purifié tel que décrit dans Massoud et al, J. Biotech. (1991) : 193 et le fragment d'ADN codant pour le hCD4 est recherché par PCR. 5 lapins transgéniques sur 35 ont ainsi été détectés. Trois sont morts probablement en raison de conditions d'hygiène non-satisfaisantes. C - Analyse de l'expression du transgène Du sang a été prélevé sur les 2 lapins survivants de sexe mâle, n" 18 et 20, âgés de 7 semaines. Les globules rouges éliminés par traitement hypotonique et chaque préparation lymphocytaire incubée avec un anticorps anti-CD4 humain marqué à la fluorescéine (Leu3A, Becton-Dickinson) et avec un anticorps contrôle marqué ne reconnaissant aucun antigène (Simultest, Becton Dickinson). L'analyse au FACS démontre une forte expression du gène humain dans respectivement 66% et 30% des lymphocytes des lapins n" 18 et 20, tel que montré dans la Figure 6. D - Sensibilité in vitro des lymphocytes au HIV Le sang des lapins n" 18 et 20 âgés de 16 semaines a été prélevé, ainsi que celui d'un lapin non-transgénique pour contrôle. Les lymphocytes ont été purifiés par Ficoll comme suit: 20 ml de sang hépariné et dilué 2 fois en PBS (phosphate buffer saline) sont disposés sur 15 ml de Ficoll (Eurobio MSL 2000) Puis les cellules ont été stimulées pendant 3 jours par 2 g/ml de phosphohémaglutinine (PHA) en milieu RPMI complémenté à 10 % de serum de veau foetal (SVF). Après lavage en RPMI, le culot contenant environ 4 106 cellules a été infecté par 100 sl d'une des préparations virales suivantes telles quelles ou diluées au 1/50: HIV1 Bru 75 000 cpm / 100 1 HIV1 III B 450 000 cpm / 100 z1 HIV1 NDK 700 000 cpm / 100 crl L'infection a été poursuivie 2 hr à 37Ce. Les cellules ont été ensuite lavées 2 fois en PBS et mises en culture en RPMI complémenté à 10 % de SVF et à 10 % d'interleukine-2 humaine (Boerhinger Mannheim), à raison de 1,6 105 cellules / 200 yl dans les godets d'une plaque à 96 godets. La plaque a été placée à 37Ce. Le milieu est renouvelé 2 fois par semaine. Les antigènes viraux ont été détectés à intervalles réguliers en utilisant le kit Pasteur Elavia Agl. On a ainsi montré que les lymphocytes des lapins transgéniques étaient très nettement susceptibles au HIV par rapport aux lymphocytes contrôle. Bien évidemment d'autres lapins transgéniques ont étaient générés par croisement des géniteurs n" 18 et 20 avec des femelles New Zealand nontransgéniques. Revendications 1. Un lapin transgénique sensible au HIV dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte au moins une séquence d'ADN codant pour le marqueur membranaire CD4 des lymphocytes T humains (hCD4) ou un analogue de celui-ci, placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère. 2. Un lapin selon la revendication 1, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte au moins une séquence d'ADN codant pour le hCD4, placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère. 3. Un lapin selon la revendication 1 ou 2, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte au moins une séquence d'ADN codant pour le hCD4, placée sous le contrôle d'un promoteur et d'un enhancer spécifique d'un gène s'exprimant dans les lymphocytes. 4. Un lapin selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enhancer est celui du gène codant pour le marqueur membranaire humain CD2. 5. Un lapin selon l'une des revendications 1 à 4, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte au moins une séquence d'ADN codant pour le hCD4, placée sous le contrôle du promoteur du gène codant pour la thymidine kinase. 6. Un lapin selon l'une des revendications 1 à 5, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte en outre un intron placé en 5' ou en 3' de la séquence codant pour le hCD4. 7. Un lapin selon l'une des revendications 1 à 6, dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN exogène qui comporte en outre un signal de polyadénylation. 8. Un procédé d'obtention d'un lapin transgénique sensible au HIV, qui comprend l'acte (i) d'injecter dans un embryon, un fragment d'ADN exogène comportant au moins une séquence codant pour le hCD4 ou un analogue de celui-ci, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, (ii) de transférer l'embryon ainsi injecté dans une lapine receveuse et (iii) après la naissance, de contrôler la présence du fragment d'ADN exogène dans le génome du lapin nouveau-né. 9. Un procédé pour tester l'efficacité d'une drogue ou d'un candidat-vaccin à l'encontre du HIV dans un but curatif ou préventif, caractérisé en ce que l'on administre la drogue ou le candidat vaccin à un lapin transgénique selon l'une des revendications 1 à 7, et en ce que l'on injecte du HIV au dit lapin, avant ou après administration de la drogue ou du candidat-vaccin.