Brevet FR2690452A1 — publié le 19931029

COLORANT DE COULEUR ROUGE ORANGE CONSTITUE D'UNE R-PHYCOERYTHRINE DE TYPE 1, UN PROCEDE POUR SON OBTENTION, ET SES UTILISATIONS La présente invention concerne un nouveau type de colorant rouge orangé, un procédé pour son obtention, ainsi que ses utilisations. Depuis quelques années, l'utilisation des colorants est très règlementée, que ce soit dans le domaine des cosmétiques, des produits diététiques ou des compositions pharmaceutiques. En effet, les exigences notamment quant à la non-toxicité de ces colorants, ont été sévèrement accrues. C'est pourquoi il existe une tendance de plus en plus forte à avoir recours à des colorants naturels. C'est ainsi qu'on a déjà proposé d'extraire un colorant de certaines algues rouges. En particulier, on a déjà extrait de ces algues des colorants de la famille des phycoérythrines, pigments photosynthétiques de nature protéique. Toutefois, ces colorants présentent un sérieux inconvénient dû à leur manque de stabilité. En effet, ils perdent vite leur couleur vive et fortement fluorescente. C'est pourquoi on est obligé, le plus souvent, de les conserver à l'abri de la lumière. Le demandeur a constaté qu'il était possible contre toute attente, d'extraire un colorant de la famille des R-phycoérythrines de type 1 qui est stable, c'est-à-dire qui ne perd pas sa couleur même après une longue durée de stockage à la lumière du jour, à partir d'une variété particulière d'algue rouge. Ce colorant rouge orangé, constitué d'une R-phycoérythrine de type 1 est caractérisé par le fait qu'il est extrait de l'algue Dilsea carnosa. Avantageusement, ce colorant présente les paramètres suivants - maxima d'absorption dans le spectre de l'ultra-violet et du visible = 498 - 500, 538 - 540 et 565 - 567 nm - maximum d'émission du spectre d'excitation en fluorescence = 575 - 577 nm - maximum d'excitation du spectre d'émission en fluorescence = 498 - 502 nm. L'invention concerne également un procédé d'obtention du colorant identifié ci-dessus. Ce procédé comprend les étapes qui consistent a: a) faire macérer des thalles de Dilsea carnosa b) filtrer le macérat issu de l'étape a) c) procéder à une centrifugation du filtrat pendant 20 à 40 mn d) récupérer le surnageant issu de la centrifugation et y introduire du sulfate d'ammonium e) centrifuger la solution pendant 20 à 50 mn f) reprendre le culot de centrifugation avec de l'eau et le dialyser pendant 24 à 48 h. Selon d'autres caractéristiques avantageuses du procédé - à l'étampe a), on fait macérer les thalles dans environ deux fois leur poids d'eau - à l'étape a), la macération est poursuivie pendant 4 à 8 semaines - à l'étape d), on rajoute du sulfate d'ammonium à 30-60 % de saturation - à l'issue de l'étape g), on récupère le colorant en solution aqueuse ou on opère une lyophilisation de celle-ci afin d'obtenir un extrait sec. Enfin, l'invention concerne l'utilisation de ce colorant pour la préparation d'une composition cosmétique, diététique, alimentaire ou pharmaceutique et à titre d'agent traceur en immunofluorescence. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront de la description d'un mode de réalisation de l'invention, faite en référence aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 est une représentation du spectre d'absorption dans l'ultra-violet et le visible du colorant de l'invention - la figure 2 est une représentation des spectres d'émission et d'excitation en fluorescence, de ce même colorant. L'algue rouge Dilsea carnosa est une algue de l'embranchement des Rhodophytas qui se rencontre du Groendland jusqu'aux côtes de Vendée puis reparait ensuite sur la côte cantabrique après interruption sur la côte basque. Elle présente un thalle rouge foncé en forme de lames épaisses et charnues pouvant atteindre 50 à 70 cm de longueur et 20 à 30 cm de largeur. Comme évoqué précédemment, on a déjà extrait des colorants des algues rouges. Toutefois, ces colorants ne sont pas stables et il existe un préjugé dans les milieux scientifiques en défaveur de ces colorants. Contrairement à toute attente, il s'est avéré que le colorant rouge orangé extrait de Dilsea carnosa est parfaitement stable, même à la lumière du jour. Nous allons décrire ci-après un mode opératoire préféré pour l'extraction du colorant de l'algue Dilsea carnosa. Les algues récoltées sont lavées soigneusement afin de les débarasser de leurs épiphytes pouvant interférer sur la qualité du colorant. Elles sont ensuite de préférence rincées abondamment à l'eau distillée. Une quantité déterminée d'algue est mise à macérer dans deux fois son poids d'-eau, les thalles devant baigner dans le liquide. On utilise avantageusement de l'eau distillée. Le récipient peut alors être placé dans un milieu à température faible, par exemple un réfrigérateur, en raison de la trop forte prolifération microbienne à température ambiante, pendant une durée de 4 à 8 semaines. Passé cette période, le colorant continue toujours à diffuser mais sa récupération s'avère beaucoup plus difficile, toujours en raison du développement microbien. Le jus de macération est alors de préférence filtré, par exemple sur coton pour éliminer les plus gros débris cellulaires, puis le filtrat est centrifugé à 3000 tours/mn environ pendant 20 à 40 minutes, cette étape permettant d'éliminer les débris cellulaires plus réduits. Le surnageant est alors récupéré puis l'on ajoute à la solution du sulfate d'ammonium (30 à 60 % de saturation) ce qui a pour but de précipiter les protéines constitutives de la R-phycoérythrine de type 1 qui constitue le colorant. On procède ensuite à une centrifugation de la solution pendant 30 à 50 minutes. Ensuite, le surnageant, qui contient la majorité des germes et qui présente une odeur très forte, est éliminé. Le culot est alors rincé légèrement à l'eau distillée puis resolubilisé toujours dans de l'eau distillée. La solution est dialysée pendant 24 à 48 heures afin d'éliminer tous les sels présents et en particulier le sulfate d'ammonium. On utilise pour ce faire un boudin de dialyse trampant dans de l'eau distillée. De préférence, on procède à une filtration stérilisante du dialysat. L'extrait peut alors être utilisé tel quel, en solution aqueuse. On peut également le soumettre à une opération de déshydratation, par exemple par lyophilisation, pour obtenir un produit sec. Le rendement de l'opération d'extraction est au minimum de l'ordre de 1 % d'extrait sec purifié par rapport au poids sec d'algues. Le colorant obtenu présente une couleur rouge orangée très soutenue avec une nette fluorescence orangée. On a soumis le produit obtenu à plusieurs tests afin de pouvoir définir certaines de ses propriétés. Ainsi, on a effectué des tests de solubilité, de stabilité et d'absorption. I - TESTS DE SOLUBILITE - solubilité - dans l'eau = totalement soluble - dans l'éthanol (95 ) = insoluble ; formation d'un précipité - dans la glycérine et le propylène glycol = insoluble - dans les principales huiles végétales et minérales = insoluble. II - TESTS DE STABILITE - aux variations de pH : stabilité de pH 4.5-5 à pH 10 - aux variations de température : stabilité jusqu'à 60 C Ces propriétés rendent possible l'utilisation du colorant dans de nombreuses compositions, notamment cosmétiques et pharmaceutiques. III - TESTS D'ABSORPTION On a procédé à des analyses dans le domaine de l'ultra-violet et de la lumière visible. Des analyses d'émision et d'excitation en fluorescence ont également été effectué sur le colorant. Un spectiophotomètre UV-Visible de la marque HITACHI, modèle U2000 a été utilisé à une température de 20 C. Pour la fluorescence, on a employé un spectrofluorimètre SCM 4800, à une température de 20 C. Les figures 1 et 2 annexées sont des représentations des spectres correspondants. Ainsi, la courbe 1 correspond à la mesure de l'absorption du colorant dans la gamme de l'ultra-violet et de la lumière visible. Les maxima d'absorption se situent dans les fourchettes 498 - 500, 538 - 540 et 565 - 567 nm. Les courbes 2 et 3 correspondent aux spectres d'excitation en fluorescence du colorant, avec une émission à 575 - 577 nm. La courbe 4 représente le spectre d'émission en fluorescence, avec une excitation à 498 - 502 nm. Du fait de ses qualités de stabilité et de solubilité, le produit de l'invention a de nombreuses applications possibles comme colorant. Outre les utilisations déjà citées dans les industries cosmétique et pharmaceutique, il peut également être utilisé comme colorant alimentaire, y compris pour les produits diététiques. De plus, du fait de sa forte fluorescence, on pourrait l'utiliser à titre d'agent traceur en immunofluorescence. REVENDICATIONS 1. Colorant de couleur rouge orangé, constitué d'une R-phycoérythrine de type 1, caractérisé en ce qu'il est extrait de l'algue rouge Dilsea carnosa. 2. Colorant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente les paramètres suivants - maxima d'absorption dans le spectre de l'ultra-violet et du visible = 498 - 500, 538 - 540 et 565 - 567 nm - maximum d'émission du spectre d'excitation en fluorescence = 575 - 577 nm - maximum d'excitation du spectre d'émission en fluorescence = 498 - 502 nm. 3. Procédé d'obtention du colorant conforme à l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à a) faire macérer des thalles de Dilsea carnosa b) filtrer le macérat issu de l'étape a) c) procéder à une centrifugation du filtrat pendant 20 à 40 mn d) récupérer le surnageant issu de la centrifugation et y introduire du sulfate d'ammonium e) centrifuger la solution pendant 20 à 50 mn f) reprendre le culot de centrifugation avec de l'eau et le dialyser pendant 24 à 48 h. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, à l'étape a), on fait macérer les thalles dans environ deux fois leur poids d'eau. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que, à l'étape a), la macération est poursuivie pendant 4 à 8 semaines. 6. Procédé selon l'une des revendicatons 3 à 5, caractérisé en ce que, à l'étape d), on rajoute du sulfate d'ammonium à 30-60 % de saturation. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que, à l'issue de l'étape g), on récupère le colorant en solution aqueuse ou on opère une lyophilisation de celle-ci afin d'obtenir un extrait sec. 8. Utilisation du colorant selon l'une des revendications l et 2 ou obtenu selon un procédé conforme à l'une des revendications 3 à 7 pour la préparation d'une composition cosmétique, diététique, alimentaire ou pharmaceutique. 9. Utilisation du colorant selon l'une des revendications 3 à 7, à titre d'agent traceur en immunofluorescence.