Brevet FR2685777A1 — publié le 19930702

La présente invention est relative à un procédé de dépistage prénatal d'anomalies foetales et notamment d'aberrations chromosomiques telles que la trisomie 21, la trisomie 18 ou la trisomie 13 ainsi que d'aberrations géniques telles que la drépanocytose, la thalassémie, la mucoviscidose, etc... La présente invention est également relative à un procédé de dépistage prénatal du sexe. Le problème majeur, pour de tels dépistages, est celui du prélèvement des cellules foetales la plus ancienne des méthodes utilisées consiste à prélever, à travers la paroi abdominale maternelle, quelques millilitres de liquide amniotique ; les cellules foetales sont séparées, notamment par centrifugation et étudiées, directement ou après culture in vitro. En division, lesdites cellules peuvent être mises en milieu hypotonique pour les faire grossir et permettre une observation microscopique plus aisée du caryotype. Cette méthode présente notamment un risque d'avortement et présente en outre l'inconvénient de ne pouvoir être réalisée simplement avant la 15-16ème semaine. le prélèvement du sang foetal par ponction transabdominale directe dans la veine ombilicale, sous échographie ou rarement au cours d'une foetoscopie cette technique, qui nécessite l'hospitalisation de la femme, comporte également un risque élevé de mort foetale et ne peut être réalisée avant la 20ème semaine. . la biopsie des villosités chorionales consiste à prélever, par voie vaginale ou transabdominale, un fragment des villosités du placenta qui contient le même matériel génétique que le foetus ; il est donc possible de réaliser un diagnostic prénatal à partir de ces cellules foetales. Cette technique est simple à mettre en oeuvre ; toutefois, elle entraîne 2 à 3 % de fausses couches. D'autres méthodes, qui ne nécessitent pas le prélèvement de cellules foetales, ont été proposées ; il s'agit notamment de méthodes indirectes, dans lesquelles le dosage de marqueurs sériques convenables est réalisé on peut citer notamment, dans le cas de la recherche des sujets présentant un risque d'apparition de trisomie 21 chez le foetus (femme de plus de 40 ans), le dosage de l'hCG à la 16ème semaine ; en effet, le taux en hCG passe par un pic entre la 12ème et la 13ème semaine ; si un taux élevé subsiste à la 16ème semaine, la femme chez laquelle ce dosage a été effectué peut être considérée comme un sujet à risque, i.e. le foetus peut présenter statistiquement un risque élevé de trisomie 21. Cette méthode, qui ne constitue pas un test de diagnostic, permet uniquement l'évaluation d'un risque et nécessite donc éventuellement, le recours à l'une des techniques précitées, en cas de doute ; de plus, dans la mesure où il n'existe pas de marqueur de ce type pour toutes les anomalies foetales, une telle méthode n'est applicable qu'à la trisomie 21. Dans la mesure où, en France, le dépistage prénatal des anomalies foetales doit être proposé chez la femme enceinte de plus de 38 ans, il était toutefois important de disposer d'un test de dépistage fiable, sans risque et peu coûteux, surtout si l'on considère qu'il existe plus de 20 000 femmes enceintes par an, de plus de 38 ans. Pour ce faire, on a proposé le prélèvement de cellules foetales circulantes, mises en évidence dans la circulation sanguine maternelle. Bien que cette technique présente l'énorme avantage d'être sans danger, par rapport aux techniques précitées aussi bien pour la mère que pour le foetus, le faible nombre de cellules foetales circulantes ne permet pas la réalisation d'un test de dépistage prénatal fiable. C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de fournir un procédé de dépistage d'anomalies foetales qui répond mieux aux besoins de la pratique que les tests actuellement pratiqués. La présente invention a pour objet un procédé non intrusif de dépistage prénatal d'anomalies cellulaires foetales et notamment d'aberrations chromosomiques ou d'aberrations géniques, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte lesdites cellules foetales par tout moyen approprié. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit échantillon est mis en contact avec des anticorps monoclonaux antitrophoblaste humain. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lesdits anticorps sont couplés à un support chromatographique approprié, notamment une colonne d'affinité. Ces cellules foetales sont alors concentrées sur la colonne d'affinité puis éluées, avant de procéder à la détection. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lesdits anticorps sont couplés à des billes magnétiques convenables. Dans ce cas, les complexes cellules foetalesanticorps/billes sont séparés de l'échantillon, avant de procéder à la détection. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies chromosomiques par hybridation in situ des cellules foetales en interphase ou en métaphase, en pré sence d'une collection de sondes convenables complémentaires de la séquence à détecter. On utilisera, en particulier, notamment pour la détection de la trisomie 21, des sondes YAC (Yeast Artificial Chromosome), constituées de plusieurs centaines de kilobases et conjuguées à de la biotine, reconnaissant des séquences présentes sur le chromosome 21; l'hybride formé sera par exemple détecté après addition d'avidine ou de streptavidine couplées à un fluorochrome, pour détecter l'hybridation, par fluorescence. Ce mode de réalisation permet, de manière avantageuse, par la combinaison d'une étape d'extraction et de concentration en cellules foetales et d'une étape d'hybridation in situ, sur un tissu notamment, et sans extraction d'ADN, en dehors de toute mitose (chromatine interphasique) par exemple, de dénombrer les chromosomes. Ce mode de réalisation est également applicable au diagnostic du sexe de l'embryon. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies géniques (mutation ponctuelle, par exemple) par hybridation des cellules foetales en métaphase avec des sondes spécifiques dans des conditions spécifiques de température et de pH ou bien on peut utiliser le procédé décrit dans la Demande de Brevet Européen 412 883, au nom de la Demanderesse. Ce mode de réalisation permet, de manière avantageuse, par la combinaison d'une étape d'extraction et de concentration en cellules foetales et d'une étape d'hybridation, de localiser une mutation unique. La présente invention a également pour objet un procédé non intrus if de dépistage prénatal du sexe, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte les chromosomes sexuels dans lesdites cellules foetales par hybridation in situ desdites cellules foetales en interphase ou en métaphase, en présence d'une collection de sondes convenables, complémentaires des séquences à détecter. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Dépistage de la trisomie 21. 1. Précaration des anticorps monoclonaux antitrophoblastes. On prépare de tels anticorps conformément à la méthode de KOHLER et MILSTEIN, par immunisation de souris avec des cellules de rein embryonnaire humain en culture. La fusion est réalisée avec les cellules du myélome Sp2/0-AG 14, le promoteur de fusion étant le polyéthylène glycol 2. Couslaae de ces anticoros à une colonne d'affinité. - on utilise, comme colonne d'affinité, une colonne dont la matrice doit avoir une adsorption nonspécifique négligeable ; les plus courantes sont à base d'agarose ; on peut citer le Sépharose z 4B de PHARMACIA, par exemple. - le couplage des anticorps est notamment réalisé par la méthode au bromure de cyanogène l'activation est obtenue en ajoutant 100 mg de bromure de cyanogène/g de gel (gépharose), dans un tampon 2 M NaHCO3 - Na2CO3, pH 11 ; le couplage proprement dit est obtenu en mettant en contact 4 mg d'anticorps monoclonal par gramme de gel activé dans un tampon 0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,5 à 4 C pendant 24 à 48 heures. 3. Passaae de l'échantillon de sana maternel sur ladite colonne. - on ajoute sur une colonne contenant 1 ml de gel couplé à l'anticorps monoclonal anti-trophoblaste humain tel qu'obtenu ci-dessus, 20 ml de sang maternel mélangé à 1 ml d'héparine et dilué 10 fois dans un tampon 0,1 M Tris HCl, pH 8. - on lave la colonne par 10 à 20 volumes de colonne avec le même tampon. 4. Elution des cellules foetales retenues. - on élue avec un tampon 4,5 M urée - 0,1 M Tris HCl, pH 7,5. 5. Hvbridation avec des sondes YAC. L'hybridation in situ est utilisée pour repérer une séquence donnée d'ADN, au sein des cellules foetales obtenues au cours de l'étape 4 ci-dessus. L'hybridation est réalisée directement sur les préparations cytogénétiques fixées sur lame, après traitement par la RNase (ARN messager), par la protéinase K (déprotéinisation) et dénaturation de l'ADN chromosomique. L'hybridation se fait avec des sondes complémentaires d'une séquence à détecter sur le chromosome 21 ; les YAC (Yeast Artificial Chromosome) sont des sondes constituées de plusieurs centaines de kilobases et conjuguées à de la biotine, ce qui permet de détecter de longs fragments d'ADN, avec une grande spécificité. 6. Dénombrement du nombre de copies de chromosome 21 par détection de l'intensité du signal d'hybridation, par addition de streptavidine couplée à un fluorochrome. Exemple 2 :Dépistage de la trisomie 21. 1. Précaration des anticorps monoclonaux antitroshoblastes. On procède comme dans l'exemple 1. 2. Couslaae de ces anticorps à des billes magnétiques. Le couplage est réalisé comme à l'exemple 1, avec des billes magnétiques DYNABEADSQ M.450 (DYNAL). Les autres étapes sont réalisées comme dans l'exemple 1, après séparation des complexes cellules foetales-anticorps/billes. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Procédé non intrusif de dépistage prénatal d'anomalies cellulaires foetales et notamment d'aberrations chromosomiques ou d'aberrations géniques, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte lesdites cellules foetales par tout moyen approprié. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est mis en contact avec des anticorps monoclonaux antitrophoblaste humain. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont couplés à un support chromatographique approprié. 4 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit support chromatographique est une colonne d'affinité. 5 ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules foetales, concentrées sur la colonne d'affinité, sont éluées, avant de procéder à l'étape de détection de l'anomalie foetale. 6 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont couplés à des billes magnétiques convenables. 7 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies chromosomiques par hybridation in situ des cellules foetales en interphase ou en métaphase, en présence d'une collection de sondes convenables, complémentaires de la séquence à détecter. 8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies géniques (mutation ponctuelle, par exemple) par hybridation des cellules foetales en métaphase avec des sondes spécifiques dans des conditions spécifiques de température et de pH. 9 ) Procédé non intrusif de dépistage prénatal du sexe, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte les chromosomes sexuels dans lesdites cellules foetales par hybridation in situ desdites cellules foetales en interphase ou en métaphase, en présence d'une collection de sondes convenables, complémentaires de la séquence à détecter.