Brevet FR2693739A1 — publié le 19940121

L'invention concerne un dispositif pour la culture de micro-organismes dans des plaques de microtitrage, les plaques de microtitrage étant fermées par des membranes qui, d'une part, empêchent le liquide de s'écouler et, d'autre part, sont perméables à l'oxygène. L'utilisation de plaques de microtitrage pour la culture de micro- organismes, permettant de tester de multiples cultures, est connue Une série de publications est consacrée à l'analyse qualitative et quantitative de micro-organismes ou de substances qui sont produites par des micro-organismes. FR-A 2 556 741 décrit des plaques de microtitrage qui sont utilisées pour la détection de l'activité de substances déterminées sur des microorganismes ou des mélanges de micro-organismes, les micro- organismes se trouvant dans un milieu lyophile et la substance active étant ajoutée au milieu de culture, puis la plaque de microtitrage étant mise en incubation à une température appropriée. Des plaques de microtitrage pour des essais de sensibilité aux antibiotiques, qui sont conservées à basse température, par exemple à -70 'C, afin de maintenir la stabilité des antibiotiques, sont décrites par P L Kuglin Bailey et N B McGuckin dans Am J Ned. Technol 45 ( 6), pages 517 à 522, 1979. Des plaques de microtitrage, également pour des essais de sensibilité aux antibiotiques, sont décrites dans DE-OS 33 36 738 Les plaques de microtitrage comportent des modules échangeables munis de cavités, les cavites pouvant recevoir des volumes détermines, par exemple de suspensions de bactéries, et présentant des ouvertures pour l'échange de gaz. Le modèle d'utilité allemand G 91 07 670 6 propose des plaques de microtitrage modifiées, ayant une structure en soi connue qui, pour la fixation de matières biologiquement significatives, contenant des groupements amino ou sulfohydrure, présente aà la surface, au moins dans la région de la cavité, un enduit transparent de polymère qui contient un grand nombre de groupements epoxy. Dans US 4 680 269, il est décrit des plaques de microtitrage dont les cavités sont recouvertes d'une couche poreuse qui est impregnée d'un composant acide. Cette couche est en mesure de neutraliser des produits basiques gazeux, comme par exemple l'ammoniac qui est formé au cours de la croissance de cultures de bactéries On evite ainsi des erreurs dans les essais biochimiques sensibles au p E. Dans la culture de micro-organismes, il est souvent nécessaire, dans la phase de selection, d'expérimenter de très nombreuses cultures On s'efforce alors d'obtenir, dans les cultures individuelles, des densités elevees de cellules ou de fortes concentrations de biomasse, en particulier lorsque la formation d'un produit desiré du metabolisme cellulaire, par exemple d'un produit de fermentation, depend de la concentration de biomasse dans la culture Dans le cas par exemple de processus aérobies, la formation de biomasse dépend essentiellement de la quantité de l'oxygène introduit dans la culture Pour y parvenir, on utilise en règle genérale des fioles d'Erlenmeyer munies de chicanes, qui sont mises en incubation dans des appareils agitateurs. Typiquement, les fioles d'agitation présentent un volume total de 100 mi et sont remplies d'environ 20 ml de milieu de culture En comparaison d'une opération miniaturisée, la préparation de multiples cultures dans des fioles d'agitation prend beaucoup de temps et consomme beaucoup de matières. Si l'on utilise des plaques de microtitrage de l'état de la technique, dans le cas notamment de processus aérobies, la biomasse est tout d'abord formée à la surface du milieu de culture dans les cavités, ce qui retarde une diffusion ultérieure d'oxygène à l'intérieur du milieu de culture Cet obstacle à la diffusion peut être surmonté en partie par une agitation, mais avec la technique usuelle d'agitation bidimensionnelle, la permeation des gaz n'est améliorée que de façon insignifiante, en raison des tensions superficielles élevées et de la concentration de la biomasse, spécifiquement plus légere, à la surface du milieu de culture. Le but fixe en conséquence de cela, à savoir améliorer la perméation des gaz en direction des cavités de plaques de microtitrage dans la culture de micro- organismes avec, en même temps, la préparation miniaturisée des cultures, est atteint par le disositif selon l'invention Celui-ci sert à la culture de micro- organismes dans des plaques de microtitrage, les cavités des plaques de microtitrage étant fermées par des membranes flexibles qui présentent une bonne perméabilité à l'oxygène et empêchent en même temps l'écoulement du milieu de culture liquide qui se trouve dans les cavités Avec le dispositif représenté sur la fig 1, les plaques de microtitrage 1, pour la formation de biomasse dans les milieux de culture qui se trouvent dans les cavités 2, sont mises en mouvement à température constante en vue d'un mélange intense et, par suite, d'un enrichissement en oxygène La membrane flexible 4 est faite de préférence d'une matière plastique qui a une permeabilite & l'oxygene, exprimée par le coefficient de permeation des gaz P, de plus de cm 1 O-9 cm t cm s torr) et, avec une préférence particu- lière, d'un polymère compose de motifs siloxane (organopolysiloxane). La plaque de microtitrage 1 selon l'invention est représentée sur la fig 1 Elle se compose d'un nombre A variable de cavités 2 Ordinairement, les cavités 2 et la plaque de base 2 a sont en une matière transparente, de préférence en matiere plastique, les cavités 2 ayant la forme de cylindres ouverts d'un côté Le nombre A des cavités 2 est compris par exemple entre 12 et 96 Après que les cavités 2 ont éte remplies du milieu de culture liquide, par exemple des micro- organismes dans une solution aqueuse de substances nutritives, les côtés ouverts des cavités, de préférence cylindriques, sont recouverts d'une membrane flexible 4 qui doit presenter une bonne perméabilité à l'oxygene La perméabilité a l'oxygène peut étre exprimée par exemple par le coefficient de permâation des gaz P, qui entre dans la loi de transport de Fick: = F t (I) d. dans laquelle N = Quantité passante du gaz P = Coefficient de permeation du gaz F = Surface de passage Ap = Différence de tension de vapeur du gaz t = Temps de passage d = Epaisseur de la membrane 4. De preférence, la membrane flexible 4 est faite d'une matière plastique qui a un coefficient de perméation du cm gaz de plus de 10-9 cm 3 t cm s torr), une préférence particuliere étant donnée aux matières plastiques qui sont résistantes a la corrosion en présence du milieu de culture (cf par exemple & cet égard Vieweg/Braun, Kunststoff-Handbuch, vol 1, pp 936 sqq, Carl Hanser, Munich, 1975). Comme matiere plastique, on utilise par exemple du polystyrène, des poly(méth)acrylates, du polycarbonate, du polyéthylène ayant une masse volumique de moins de 0,94 g/cm 3, du caoutchouc styrene- butadiène et, en particulier, des organopolysiloxanes tels par exemple que le diméthylpolysiloxane. La membrane 4 doit être suffisamment flexible pour que les petits trous qui pauvent être formés par des aiguilles d'injection en cas de réalimentation des cavités 2 individuelles en solution nutritive se referment aussitôt que l'aiguille est retirée et qu'en conséquence, il ne puisse pas s'écouler de milieu de culture. Pour la fixation de la membrane 4, il est posé sur celle-ci une plaque de fixation 3 qui est ordinairement faite de la même matière que la plaque de base 2 a, a des dimensions supérieures d'environ 25 à 50 % à celles de la plaque de microtitrage et comporte des trous 3 a qui permettent d'alimenter les cavités 2 individuelles, au moyen d'une aiguille d'injection, en liquide nutrifif, en cultures ou en d'autres constituants du milieu de culture La plaque de fixation 3 est fixée a la plaque de base au moyen de vis 6, les etriers 5 étant utilisés pour une fixation supplémentaire de la membrane 4 et de la plaque de fixation 3 sur les cavités 2. La plaque de microtitrage 3 ayant une telle structure est mise en mouvement dans un milieu a température constante, de sorte qu'il se produise un mélange intense des milieux de culture liquides dans les cavités 2 De préférence, on utilise, comme milieu à température constante, de l'air qui est chauffé à l'aide d'un thermostat a la température nécessaire, de préférence entre 30 et 60 C, et qui est mis en circulation dans l'étuve d'incubation L'étuve d'incubation est constituée de preférence par une boite transparente qui est faite de préférence de matiere plastique et, avec une preférence particulière, de polymethacrylate de méthyle (Plexiglas ) Les plaques de microtitrage 1 sont placées sur un châssis-support qui est monté sur un arbre entraîné par un moteur Le mélange intense du milieu de culture liquide dans les cavités 2 est obtenu par un mouvement de rotation des plaques de microtitrage 1 autour de l'arbre. Avec le dispositif selon l'invention pour la culture de micro- organismes, des concentrations constamment élevées d'oxygene dans le milieu de culture liquide, qui se trouve dans les cavités 2, sont garanties par le mélange intense du milieu de culture et par le remplacement permanent de l'oxygene consomme à travers la membrane flexible 4 En outre, le mélange intense empêche un dépât de la biomasse à la surface du liquide de culture, ce qui est egalement une cause de retardement du transport d'oxygee et, par suite, de la formation de biomasse Pour les essais de selection, le petit volume des cavités 2 des plaques de microtitrage 1 est avantageux, car la quantité de milieu de culture est nettement réduite de ce fait En outre, la préparation de nombreuses cultures dans des fioles d'agitation prend beaucoup de temps et consomme beaucoup de matieres en comparaison de i'operation miniaturisee selon l'invention. L'exemple qui suit expliquera l'lnvention. Les plaques de microtitrage i utilisées sont faites de polystyrene {Costar , firme Falcon) et comportent de 12 à 96 cavités 2 La membrane 4 est constituée par une feuille mince de polydimethylsiloxane reticule et presente une épaisseur de i mm La plaque de fixation 3 et la plaque de base 2 a sont des plaques de polymethacrylate de methyle de 5 mm d'epaisseur, avec des dimensions, longueur, largeur) supérieures d'environ % à calles de la plaque de microtitrage, le nombre et la disposition des trous 3 a correspondent à ceux des cavités 2 sur la plaque de microtitrage 1. L'arbre sur lequel est fixée la plaque de microtitrage 1 est entraîné par un moteur électrique. L'étuve d'incubation est faite de polyméthacrylate de methyle transparent (Plexiglas ), la température nécessaire dans l'étuve d'incubation, qui doit être comprise entre 30 et 60 OC, de préférence entre 35 et 'C, étant réglée au moyen d'un thermostat avec circulation d'air. REVENDICATIONS 1. Dispositif pour la culture de micro-organismes dans des plaques de microtitrage, caractérise en ce que les cavités des plaques de microtitrage sont fermées par des membranes flexibles qui présentent une bonne permeabilité à l'oxygène et empêchent l'écoulement des milieux de culture liquides. 2. Dispositif pour la culture de micro-organismes selon la revendication 1, caractérise en ce les plaques de microtitrage sont mises en mouvement à température constante pour le melange intense des milieux de culture liquides. 3. Dispositif pour la culture de micro- organismes selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que la membrane flexible est faite d'une matière plastique ayant une permeabilite à l'oxygene, exprimee par le coefficient de permeation des gaz pour l'oxygene P, de cm plus de 10 cm ( cm s torr cm 2 s torr 4. Dispositif pour la culture de micro-organismes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracterise en ce que la matière plastique dont est faite la membrane flexible est un organopolysiloxane.