Brevet FR2696476A1 — publié le 19940408

La présente invention concerne un nouveau milieu de culture destiné notamment à la mise en évidence de Escherichia coli. Il existe actuellement pour la mise en évidence de Escherichia coli qui est l'un des microorganismes dont la détection est la plus fréquente, un certain nombre de milieux de culture. La détection de E. coli est très importante notamment dans les industries alimentaires, au niveau du contrôle des eaux mais également en médecine, sachant que dans ce milieu E. coli peut être un agent pathogène mais également un agent mettant en évidence certains types de contamination. Compte tenu de la diversité des applications et des conditions dans lesquelles doit se faire la détection, il est donc nécessaire de pouvoir disposer d'un milieu de détection qui soit simple et rapide d'emploi mais également qui soit fiable. Or, il ressort des essais qui ont été effectués que la plupart des milieux de culture utilisés actuellement, s'ils permettent de détecter un très grand nombre de souches d'Escherichia coli, ne permettent néanmoins pas de détecter d'une manière simple 100 % des contaminations. Or, on sait que généralement on ne peut pas se contenter d'une probabilité de l'ordre de 90 %, car dans la plupart des cas ce type de probabilité est tout à fait insupportable pour des raisons évidentes. Les microorganismes pathogènes qui peuvent être présents dans ces échantillons non contre-sélectionnés pourront avoir tendance à se répandre parce que ne pouvant pas être mis en évidence par les méthodes traditionnelles. C'est pourquoi la présente invention constitue un progrès significatif dans la mesure où elle propose des milieux de culture permettant de mettre en évidence d'une manière simple un nombre beaucoup plus grand de contaminations de E. coli par rapport aux milieux existants. Plus particulièrement, il s'agit d'un milieu de culture destiné à la mise en évidence de E. coli caractérisé en ce qu'il comporte outre un milieu de culture pour E. coli à titre d'agent chromogène une combinaison de - un composé chromogène dérivé d'acide indolyl-glucuronique ou de ses sels substrats de l'enzyme GUS et - un dérivé ou sel d'acide alkyle, alcényle ou aryle glucuronique. Les milieux de culture pour la mise en évidence de Escherichia coli sont connus et ne seront pas redécrits en détail ci-après, mais seront mentionnés uniquement dans les exemples. En ce qui concerne les composés chromogènes, il s'agit d'agents chromogènes utilisés pour certains d'entre eux déjà dans la détection de E. coli et qui mettent en oeuvre des dérivés d'acides indolyl-glucuronique. Ces composés chromo gènes sont des substrats de ltenzyme-bêta-D-glucuronidase ou GUS qui par scission du substrat conduit à un dérivé coloré et/ou fluorescent par exemple. Parmi ces dérivés de l'acide indolyl-glucuronique, il faut plus particulièrement citer les dérivés des acides halogéno-3-indolyl glucuronique et leurs sels correspondants et plus particulièrement encore les composés choisis parmi l'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-Dglucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-bêta-D-glucuronique les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide 6-chloro-3-indolyl-bêta-D-glucuronique, l'acide 5-bromo-3-indolyl bêta-D-glucuronique, l'acide 3-indoly-bêta D-glucoronique, leurs sels de sodium et de cyclohexylammonium. Ces composés sont utilisés selon la présente invention en combinaison avec des dérivés de l'acide glucuronique alkylé, alcénylé et/ou arylé. I1 peut s'agir de dérivés alkylés ou alcénylés en C1 à C3 notamment méthylés ou des dérivés arylés de type phényl ou phényl substitué ainsi que les sels correspondants. Parmi les composés les plus efficaces selon la présente invention, il faut citer tout particulièrement l'acide phénylglucuronique de même que ses sels notamment ses sels alcalins, alcalinoterreux et ses sels dérivés d'ammonium tels que par exemple les sels de type cyclohesxylammonium. Suivant la nature de l'agent chromogène utilisé, les colorations qui mettront en évidence la présence de E. coli pourront varier, l'un des intérêts de ce procédé est qu'il permet avec des concentrations en chromogène relativement peu élevées d'obtenir des détections des contaminations de E. coli voisines de 100 %. Par exemple, on pourra utiliser des concentrations de composés chromogènes inférieures à 40 mg/ml et éventuellement de l'ordre de 30 mg/ml. La présente invention concerne également un procédé de détection de souches de E. coli dans un prélèvement quelqutil soit caractérisé en ce qu'on inocule le milieu de culture tel que décrit précédemment avec ledit prélèvement et/ou un inoculum provenant dudit prélèvement et en ce que l'on met au moins en évidence la coloration ou la fluorescence caractéristique de la présence de E. coli. Ce milieu de culture selon l'invention présente également par rapport aux milieux de la technique antérieure l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre selon l'une quelconque des modalités connues dans ce type de technologie. En particulier, il est possible avec les milieux selon l'invention de prévoir une inoculation dans la masse du milieu. Cet aspect de l'invention est d'autant plus inattendu que les chromo gènes dérivés de l'indolyl ne fonctionnant pas en conditions anaérobies, on aurait pu croire que le procédé d'inoculation dans la masse soit incompatible avec leur utilisation dans le milieu selon l'invention. Enfin, on constate expérimentalement que grâce au milieu de culture selon la présente invention, l'apparition des vrais positifs est accélérée, on élimine des faux négatifs et pratiquement 100 % des contaminations de E. coli sont mises en évidence. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Exemple t : Détection de souches de E. coli Diverses souches de E. coli sont isolées sur le milieu M (en g/I Extrait de viande 1 Extrait de levure 2 ; Peptone 5 ; Chlorure de sodium 5 ; Agar 15 ; Desoxycholate de sodium 1,5 : 5 Bromo-4-Chloro-3-Indolyl glucuronide 0,05). Les boîtes sont incubées à 37"C et la coloration bleue des colonies est observée après 24 heures d'incubation. Une des trois souches, E. coli 297-3, n'est mise en évidence qu'après addition de Phényl glucuronide. souche E. coli coloration coloration milieu M milieu M 100mg/1 Phényl glucuronide 289-3 + + 297-3 ~ + 366-1 + + Exemple 2 : Analyse d'échantillons de steaks hachés Des échantillons de steaks sont examinés par la méthode standard de broyage dilution et étalement. La gélose suivant l'invention est comparée avec un dispositif commercial sur film où les E. coli sont aussi détectés par simple coloration spécifique. Les résultats indiquent que la proportion de colonies E. coli détectées suivant l'invention est plus élevée que la technique utilisant un film donnant une coloration spécifique aux colonies de E. coli. échantillons colonies E. coli colonies E. coli de steak haché détectées sur détectées sur gélose suivant l'invention film commercial pour E. coli 362 0 0 365 0 0 371 120 50 368 102 50 367 0 56 363 2 0 370 40 11 379 , 0 0 380 200 29 382 3 1 383 9 4 384 1 3 386 3 2 3006 0 0 3007 0 0 3008 192 83 REVENDICATIONS 1. Milieu de culture destiné à la mise en évidence de E. coli caractérisé en ce qu'il comporte outre un milieu de culture pour E. coli à titre d'agents chromogènes une combinaison de - un composé chromogène dérivé de l'acide indolylglucuronique substrat de l'enzyme GUS et - un dérivé d'acide alkyle, alcényle ou aryle glucuronique. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé d'acide glucuronique est l'acide phénylglucuronique ou ses sels. 3. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé chromogène est choisi parmi les acides halogéno-3indolyl glucuronique et les sels correspondants. 4. Milieu de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé chromo gène est choisi parmi l'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D-glucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-bêta-D-glucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide 6-chloro-3-indolyl-bêta-D-glucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide 5-bromo-3-indolyl-bêta-D-glucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium, l'acide indolyl-bêta-D-glucuronique, les sels de sodium et de cyclohexylammonium. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient moins de 40 mg/ml du composé chromogène. 6. Procédé de mise en évidence de E. coli dans un prélèvement, caractérisé en ce qu'on inocule le milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5 avec le prélèvement ou en inoculum provenant dudit prélèvement et en ce qu'elle détecte éventuellement la présence de E. coli. 7. Procédé de mise en évidence de E. coli selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'inoculation est effectuée dans la masse du milieu de culture.