Brevet FR2687158A1 — publié le 19930813

POLYSACCHARIDES SULFATES. PROCEDE DE PREPARATION. COMPOSITION PHARMACEUTIOUE ET UTILISATION La présente invention concerne le domaine des polysaccharides de faible masse moléculaire. Plus particulièrement, elIe concerne des compositions oligosaccharidiques présentant d'excellentes propriétés pharmacologiques et antithrombotiques. D'une manière générale, les traitements antithrombotiques font appel à deux grandes catégories d'agents, à savoir les agents anticoagulants et les agents antiplaquettaires. Parmi les agents anticoagulants, les composés anti-vitamine K constituent une famille très importante. Ces composés étant actifs par voie orale, ils sont utilisés dans de nombreuses indications. Cependant, leur emploi est encore limité par certains inconvénients et notamment les risques d'hémorragies qu'ils occasionnent et la difficulté d'adapter la posologie à un traitement de longue durée. Les héparines constituent la seconde catégorie d'agents anticoagulants. Ce sont des substances biologiques d'extraction de la famille des glycosaminoglycans composées d'oligosaccharides ayant des longueurs de chaînes et des degrés de sulfatation variables. Plus précisément, les masses moléculaires des chaînes constituant l'héparine non fractionnée se répartissent généralement entre 2000 et 40000 daltons. Les héparines sont utilisées dans différents types de thromboses, notamment dans le traitement ou la prévention des thromboses veineuses, éventuellement associées à d'autres thérapeutiques. L'inconvénient des héparines réside dans leur activité anticoagulante élevée qui peut engendrer des hémorragies, et dans leur sensibilité à certains facteurs inhibiteurs du sang tels que le facteur 4 plaquettaire, qui impose l'utilisation de doses relativement importantes. Par ailleurs, les héparines sont des produits très hétérogènes. I1 est donc difficile d'évaluer leur mécanisme d'action, d'apprécier la contribution de chacune des composantes dans l'activité globale de l'héparine, et, de ce fait, d'augmenter l'activité antithrombotique sans augmenter les effets secondaires. L'évolution des connaissances scientifiques dans ce domaine a révélé que les propriétés biologiques, c'est-à-dire les effets sur la coagulation sanguine, de même que les propriétés pharmacologiques, c'est à dire les activités antithrombotiques in vivo, de ces oligosaccharides varient en fonction de leur masse moléculaire. Une première solution aux inconvénients mentionnés plus haut a été apportée par les héparines de faible masse moléculaire. Ces héparines sont des mélanges d'oligosaccharides sulfatés dont les masses moléculaires se répartissent généralement entre 2000 et 10000 daltons. Ces héparines sont obtenues par fractionnement des chaînes oligosaccharidiques de l'héparine (par exemple par gelperméation selon Barrowcliffe et al., Thrombosis research 12 (1977) 27-36), ou par fragmentation (dépolymérisation) des chaînes oligosaccharidiques de l'héparine au moyen d'agents chimiques ou enzymatiques. En particulier, la dépolymérisation a été décrite par traitement d'un ester d'héparine en présence d'une base forte (EP 40144). Elle peut également être réalisée par traitement d'héparine en présence d'acide nitreux, ou par action d'une héparinase (EP 64452).Ces différents procédés conduisent à des mélanges d'oligosaccharides ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, mais ayant un poids moléculaire moyen en poids inférieur. Ces modifications se traduisent généralement par une meilleure biodisponibilité et un effet moindre sur le saignement par rapport à l'héparine non fractionnée. Plus particulièrement, les recherches se sont essentiellement orientées vers des mélanges dérivés de l'héparine ayant des chaines oligosaccharidiques très courtes. Ainsi, le brevet EP 27089 indique que des mélanges d'oligosaccharides dérivés de l'héparine ne renfermant pas plus de 8 motifs saccharidiques possèdent une activité spécifique antithrombotique supérieure à l'héparine. De la même manière, des hexasaccharides ont été préparés et leurs propriétés antithrombotiques étudiées (EP 64452). On peut encore citer les brevets plus récents EP 84 999 et EP 301 618 sur des polysaccharides tels que des hexa-, des penta- et des tétrasaccharides dérivés de l'héparine. Cependant, les produits décrits jusqu'à aujourd'hui n'ont pas permis de résoudre de manière totalement satisfaisante les problèmes rencontrés avec les héparines. En particulier, les héparines de faible masse moléculaire ont pour la plupart une action inhibitrice vis-à-vis de la thrombine (activité anti IIa) plus de 6 fois inférieure à celle de l'héparine. Expérimentalement, sur un modèle de thrombose classique tel celui de Wessler chez le lapin, les doses antithrombotiques sont très supérieures à celles de l'héparine. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible d'obtenir, à partir d'héparines natives ou dépolymérisées, des mélanges d'oligosaccharides ayant d'excellentes propriétés biologique et pharmacologique, et par conséquent, de meilleures potentialités thérapeutiques. De manière inattendue, la demanderesse a en effet trouvé que lorsque l'on réalise un mélange d'oligosaccharides dont la répartition moléculaire est caractérisée par une proportion égale ou supérieure à 70 to d'oligosaccharides sulfatés de masse moléculaire comprise entre 5400 et 7800 daltons et 5 % au moins d'oligosaccharides sulfatés de masse moléculaire supérieure à 6900 daltons3 possédant une activité anti IIa supérieure à 60 UI/mg et, de préférence, égale ou supérieure à 70 UI/mg, cette préparation conserve les avantages de bonne biodisponibilité et d'effets négligeables sur le saignement des héparines de faible masse moléculaire, mais présente en outre l'avantage d'un pouvoir inhibiteur accru vis-à-vis de la thrombine, et d'une activité antithrombotique supérieure avec une durée d'action au moins égale. Un objet de l'invention réside donc dans un mélange d'oligosaccharides sulfatés présentant la structure générale des oligosaccharides constitutifs de l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 70 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5400 et 7800 daltons3 au moins 5 Go d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire supérieure à 6900 daltons, et en ce qu'il possède une activité anti IIa supérieure à 60 UI/mg et, de préférence, égale ou supérieure à 70 UI/mg. Un tel mélange réunit pour la première fois les avantages de l'héparine non fractionnée et ceux des héparines de faible masse moléculaire. Par rapport à l'héparine native, les mélanges de l'invention présentent en outre une sensibilité moins forte aux facteurs inhibiteurs du sang tels que le facteur 4 plaquettaire, ce qui augmente leur potentialité thérapeutique. D'autres avantages des mélanges de l'invention résident notamment dans la réduction de certains effets secondaires indésirables, tels que l'effet thrombocytopénique. L'un des inconvénients des mélanges connus dérivés de l'héparine provient de la chute du nombre de plaquettes qu'ils peuvent occasionner. Cet effet indésirable est fortement diminué lorsque les mélanges de l'invention sont employés. Les propriétés énoncées ci-dessus permettent une utilisation pharmacologique particulièrement performante, notamment dans la prophylaxie et le traitement des thromboses veineuses ou artérielles. En outre, elles devraient rendre possible l'utilisation de doses plus importantes in vivo sans accroître les risques hémorragiques. Plus préférentiellement, les mélanges de l'invention comprennent au moins 10 Go d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire supérieure à 6900 daltons. Par ailleurs3 des mélanges préférés selon l'invention comprennent 70 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5700 et 7500 daltons. Encore plus préférentiellement, les mélanges de l'invention comprennent au moins 60 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5700 et 6900 daltons, Par ailleurs, l'activité anti IIa des mélanges de l'invention est de préférence inférieure à leur activité anti Xa. Dans un mode préféré, les mélanges de l'invention sont plus particulièrement des fractions d'héparine dépolymérisée. Comme indiqué précédemment, l'héparine dépolymérisée peut être obtenue par toute technique chimique, enzymatique ou autre, connue de l'homme de l'art permettant de fragmenter les chaînes oligosaccharidiques de l'héparine. En particulier, les procédés décrits dans les brevets EP 40144, EP 64452, EP 37319 ou EP 337327 conviennent pour l'invention. Encore plus préférentiellement, les mélanges de l'invention sont constitués d'oligosaccharides ayant un acide 2-Q-sulfo 4 enopyranosuronique à l'une de leurs extrêmités. Un mélange particulièrement avantageux est constitué par une fraction d'héparine dépolymérisée par action d'une base sur un ester d'héparine. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un mélange tel que défini ci-avant caractérisé en ce que l'on fractionne une héparine ou une héparine dépolymérisée par gel-filtration. Le procédé de l'invention fait intervenir plusieurs paramètres, dont le contrôle permet de calibrer la masse et la répartition moléculaires du mélange final. Ces paramètres sont notamment la force ionique de l'éluant et la nature du support utilisé. Plus préférentiellement, le fractionnement est caractérisé en ce que l'on réalise successivement les étapes consistant à (i) mettre l'héparine ou l'héparine dépolymérisée de départ en solution dans l'éluant, (ii) faire passer la solution ainsi obtenue à travers une colonne au moins contenant le support solide pour la gel-filtration préalablement équilibrée avec le même éluant, et (iii) récupérer les fractions de poids moléculaire désiré. Dans un mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, on utilise comme héparine de départ une héparine dépolymérisée. Une telle héparine peut être obtenue selon les procédés décrits dans les brevets EP 40144, EP 64452, EP 37319 ou EP 337327. Encore plus préférentiellement, on utilise une héparine dépolymérisée par action d'une base sur un ester d'héparine, comme par exemple selon la technique décrite dans le brevet EP 40 144. En particulier, la dépolymérisation peut être réalisée en milieu aqueux ou au sein d'un solvant organique inerte, sous l'action d'une base organique ou minérale telle que par exemple d'hydroxyde de sodium ou de potassium, d'un carbonate alcalin ou d'une amine tertiaire (triéthylamine, triéthylène-diamine, etc). L'action de la base sur l'ester permet de réaliser une dépolymérisation partielle et contrôlée de l'héparine sans altérer sa structure générale. Comme éluant utilisable dans le procédé de l'invention, on peut citer différents types de solutions salines, telles que des solutions de chlorure de sodium. Cependant, la demanderesse a montré que, pour obtenir des fractions ayant les meilleures propriétés, il est particulièrement avantageux de réaliser le fractionnement en utilisant un éluant choisi parmi les tampons phosphate, tels que notamment phosphate de potassium, phosphate de sodium ou NH4H2PO4. I1 est encore possible d'utiliser des solutions de Na104 ou de NH4NO3 qui permettent d'obtenir des mélanges ayant d'excellentes caractéristiques. La concentration de l'éluant et donc sa force ionique sont adaptées au mélange final recherché. Notamment, la concentration de l'éluant est avantageusement inférieure à 1M, et, encore plus préférentiellement, comprise entre 0,1 et 0,5 M. Lorsque l'on utilise un tampon phosphate, il est particulièrement avantageux d'opérer à des concentrations proches de 0,2 M. Dans la seconde étape du procédé de l'invention, le support utilisé est généralement choisi en fonction de la masse moléculaire moyenne du mélange de départ (héparine native, dépolymérisée ..), du produit final recherché, et du comportement du mélange de départ dans l'éluant utilisé. Avantageusement, on utilise comme support un gel de type polyacrylamide-agarose. A titre d'exemple on peut citer les gels AcA 54, AcA 202, séphadex G25 ou G50, ou encore Biogel P30 qui donnent de bons résultats. Dans un premier mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre du procédé de l'invention, lors de la seconde étape du fractionnement, le support solide est réparti en plusieurs colonnes disposées en série. Cette variante de l'invention permet d'employer des quantités finales de support pour la gel-filtration importantes, sans les inconvénients de l'art antérieur, à savoir essentiellement les phénomènes de tassement. De cette manière, la séparation est beaucoup plus nette, y compris dans les hauts poids moléculaires, en une seule opération de fractionnement, et les supports sont plus facilement régénérables. Le nombre de colonnes utilisées est adapté par l'homme de l'art en fonction du volume et de la nature du gel employé, de manière à obtenir le meilleur équilibre entre l'efficacité de la séparation et l'effet néfaste dû au tassement du gel. Pour des raisons pratiques de mise en oeuvre, on préfère généralement utiliser dans la seconde étape du procédé un nombre de colonnes inférieur à 20. A titre illustratif, 40 litres de gel AcA 202 peuvent être répartis en 10 colonnes de 4 litres. Dans un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on utilise lors de la seconde étape du fractionnement successivement 2 types de supports au moins, ayant des caractéristiques de séparation différentes. Cette variante de l'invention permet d'obtenir un fractionnement final de meilleure qualité. A titre d'exemple, le fractionnement peut être réalisé sur la séquence suivante de gels : AcA 202 - AcA 54 - AcA 202. Pour une meilleure mise en oeuvre de l'invention, il est important d'employer des quantités élevées de gel, de manière à réaliser une séparation plus nette et à obtenir une plus grande homogénéité. Compte tenu toutefois des débits assez lents utilisés pour ce genre de gel-filtration, le volume de gel doit être adapté à la quantité de produit à séparer, de manière à obtenir le meilleur équilibre entre la séparation et l'effet de diffusion longitudinale. Avantageusement, dans le procédé de l'invention, le rapport héparine de départ (g)/ volume de gel (1) est inférieur à 2, et encore plus préférentiellement compris entre 0,5 et 1,5. Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique ayant comme principe actif un mélange tel que défini ci-avant. Une telle composition peut être utilisée de manière particulièrement avantageuse dans la prophylaxie ou le traitement ou la prévention des accidents thrombotiques. Plus précisément, elle peut être utilisée: - dans la prévention des thromboses veineuses dans les situations à risques, - dans la prévention des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde, - en régime post-opératoire, dans la prévention de thromboses veineuses chez les malades chirurgicaux, ou encore, - dans la prévention des thromboses dans le matériel chirurgical. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Dans ces exemples, les caractéristiques physicochimiques, biologiques et pharmacologiques des mélanges ont été déterminées selon les techniques suivantes: Masse moléculaire et répartition moléculaire Les masses moléculaires et les répartitions moléculaires des produits sont déterminées par chromatographie liquide haute pression avec deux colonnes en série, par exemple celles commercialisées sous la désignation TSK G3000 XL et TSK G2000 XL couplées avec un détecteur réfractométrique. L'éluant utilisé est du nitrate de lithium 0,5M et le débit est de 0,6 ml/minute. Le système est calibré avec des étalons monodisperses obtenus par fractionnement de l'enoxaparine (Pharmuka) par chromatographie d'exclusion sur agarose-polyacrylamide (IBF) selon la technique décrite par Barrowcliffe et coll., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ou D.A. Lane et coll., Thromb. Res. & , 257271 (1977-78). Les résultats sont calculés à l'aide du logiciel GPC6 (Perkin Elmer). Activité anti Xa La technique utilisée est celle décrite par Teien A.N. et Lie M. dans Thrombosis research 10 (1977) 399-410, avec comme étalon le premier étalon international des héparines de bas poids moléculaire (WHO LMWH1). Activité anti IIa La technique utilisée est celle décrite par Anderson L.O. et al., dans Thrombosis research 15 (1979) 531-541, avec comme étalon le premier étalon international des héparines de bas poids moléculaire (WHO LMWH1). AHT La technique utilisée est la technique "Actimat" (Bio Mérieux) telle que décrite par Bell W.N. et Alton H.G. dans Nature 174 (1954) 880-881. Thrombose veineuse chez le lapin La technique utilisée est celle décrite par Wessler S. dans Journal of Clinical investigation 34 (1955) 647-651. Temps de saignement chez le rat La technique utilisée est celle décrite par Palm M. et al., dans Thrombosis and haemostasis 64(1) (1990) 127-132. Légende des figures: Figure 1 : Activité AP,l'T in vitro sur plasma humain des mélanges de l'invention comparée à d'autres héparines. Figure 2: Cinétique de l'activité anti Xa des mélanges de l'invention chez le lapin: comparaison avec une autre héparine de faible masse moléculaire. Figure 3 : Cinétique de l'activité anti IIa des mélanges de l'invention chez le lapin: comparaison avec une autre héparine de faible masse moléculaire. Exemple 1 : Préparation d'une héparine dépolymérisée. A une solution de 10 g d'héparinate de sodium dans 100 ml d'eau on ajoute une solution de 25 g de chlorure de benzéthonium dans 125 ml d'eau. Le produit obtenu à température ambiante est filtré, lavé à l'eau puis séché. 15 g d'héparinate de benzéthonium ainsi obtenu sont mis en solution dans 75 ml de chlorure de méthylène, auxquels on ajoute 15 ml de chlorure de benzyle. La solution est chauffée à une température comprise entre 25 et 35"C pendant 25 heures.On ajoute alors 90 ml d'une solution à 10 Go d'acétate de sodium dans le méthanol, filtre, lave au méthanol et sèche. 10 g d'ester benzylique de l'héparine obtenu dans les conditions décrites ci-dessus sous forme de sel de sodium sont dissous dans 250 ml d'eau. A cette solution chauffée à 60"C environ on ajoute 0,9 g de soude. La température est maintenue lh30 à 60"C environ, et le mélange réactionnel est ensuite refroidi vers 200C et neutralisé par addition d'acide chlorhydrique dilué. On ajuste alors la concentration du milieu à 10% en chlorure de sodium, et le produit est précipité dans 750 ml de méthanol, filtré et séché. Exemple 2: Préparation du mélange M1 10 colonnes de verre de diamètre 100 mm et de hauteur 50 cm contenant chacune 4 litres de gel AcA 202 (gel sous forme de billes de polyacrylamide-agarose, de diamètre compris entre 60 et 140 Cun) sont utilisées en série pour le fractionnement: Une solution contenant 30 g d'héparine dépolymérisée dans les conditions décrites dans l'exemple 1 est placée en tête de la première colonne et éluée par une phase mobile constituée d'une solution 0,2M de KH2PO4, à un débit de 300 mllheure. Les fractions sont récoltées en fin de la dixième colonne. Ce traitement permet de séparer efficacement les chaînes oligosaccharidiques en fonction de leur masse moléculaire, et de les rassembler ensuite pour obtenir des mélanges ayant des caractéristiques désirées. Le mélange M1 a ainsi été obtenu, dont les caractéristiques physicochimiques et biologiques in vitro sont données dans le tableau 1. Exemple 3 : Préparation du mélange M2. Le mélange M2 a été obtenu en suivant le même protocole de fractionnement que celui décrit dans l'exemple 2, en utilisant 50 g d'héparine dépolymérisée. Les caractéristiques physicochimiques et biologiques in vitro du mélange M2 sont données dans le tableau 1. Exemple 4: Exemple comparatif : Préparation du mélange M3 et du mélange M4. Le mélange M3 a été obtenu en suivant le même protocole de fractionnement que celui décrit dans l'exemple 2. Pour le mélange M4, après fractionnement selon le protocole de l'exemple 2, il a été obtenu par mélange d'une fraction sortant à 5530 daltons (63%) et d'une fraction sortant à 7770 daltons (376ru). Les caractéristiques physicochimiques et biologiques in vitro des mélanges M3 et M4 sont données dans le tableau 1. Tableau 1 Produit M1 M2 Exemple 1 M3 M4 Masse moléculaire 6410 6340 4280 5550 6360 movenne Répartition moléculaire (% MM) - > 7500 1 5,5 9 0 22 -7200+300 12,5 15 3,5 0 10,5 -6600+300 47 30,5 5 9 10 - 6000+300 35 32,5 6,5 30 19,5 -5400#300 4,5 13,5 7,5 40,5 25 - 5100 0 3 68,5 20,5 13 Activité in vitro - anti Xa 109 127 94,25 116,6 130 -anti IIa 75 80 27,75 41,8 78 Exemple 5 : Etude de l'activité APTT in vitro sur plasma humain des mélanges de l'invention. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 1. Ils montrent clairement que les mélanges de l'invention font varier in vitro, sur plasma humain, 1'APTT de manière beaucoup plus importante que l'héparine non fractionnée. Exemple 6: Etude cinétique des activités anti Xa et anti IIa chez le lapin Cette étude a été réalisée selon le protocole suivant: - lapins : néo-zélandais (3,5 kg) - volume injecté : voie sous-cutanée: 0,5 ml/kg (région abdominale) - prises de sang: 3 ml de sang sont prélevés sur solution de citrate de sodium 3,1% (1/10) au niveau de l'artère médiane de l'oreille aux temps 0 min, 45 min, 90 min, 3h, 4h, 6h, 8h. Après injection sous-cutanée au lapin du mélange M1 ou d'héparine dépolymérisée selon l'exemple 1 à doses anti Xa égales, on obtient des activités anti Xa et anti IIa dans le plasma qui sont: - parallèles et comparables pour l'anti Xa (figure 2), - très supérieures avec le mélange de l'invention pour l'activité anti IIa (figure 3). La même comparaison faite par rapport au mélange M4 décrit dans l'exemple 4 montre que les activités anti Xa du plasma demeurent parallèles mais que la différence est très importante pour l'activité anti IIa (figures 2 et 3). Exemple 7 : Etude de l'activité in vivo des mélanges de l'invention, sur la thrombose veineuse chez le lapin après injection intra-veineuse. Le tableau 2 rassemble les résultats obtenus. Ce tableau montre que le mélange M3 (exemple 4), dont la répartition moléculaire est différente de celle revendiquée, et l'héparine dépolymérisée (exemple 1) sont moins actifs que le mélange M1 de l'invention. En particulier, celui-ci donne une activité anti lla nettement supérieure. Exemple 8 : Etude de l'activité in vivo des mélanges de l'invention, sur la thrombose veineuse chez le lapin après injection sous-cutanée. Le tableau 3 rassemble les résultats obtenus. Ce tableau montre que le mélange M1 est plus actif qu'une héparine dépolymérisée de l'art antérieur (exemple 1), et qu'il présente une durée d'action au moins équivalente. Tableau 2 EXAMPLE 1 MELANGE M1 MELANGE M3 Anti Xa=94.25 IU/mg 109 IU/mg Anti Xa=116.6 /mg Contrôle Anti IIa=27.75 IU/mg 75 IU/mg Anti IIa=41.8 /mg g/kg 318.00 265.00 212.00 183.50 257.3 214.4 171.5 107 0 Doses Anti Xa /kg 30.00 25.00 20.00 20.00 30 25 20 12.5 0 Anti IIa /kg 8.80 7.30 5.90 13.80 10.75 8.96 7.1 4.5 0 n 5 5 8 8 5 8 8 5 8 Poids du Trombus 2.24#2.24 14.2#8.4 53.2#25 6.44#3.44 27.74#17.96 27.5#12.66 50.5#15 75.3#25 120.7-34.1 Nombre de lapins sans 4/5 2/5 3/8 5/8 2/5 2/8 1/8 0/5 0/8 thrombus Plasma Anti Xa /ml 0.370#0.026 0.356#0.039 0.193#0.015 0.268#0.02 0.363#0.023 0.296#0.008 0.241# 0.125#0.011 0.022 (n=4) Plasma Anti IIa /ml 0.100#0.004 0.069#0.011 0.062#0.004 0.196#0.09 0.100#0.008 0.130#0.006 0.093# 0.054#0.005 0.008 (n=4) Tableau 3 EXAMPLE 1 MELANGE M1 Contrôle Anti Xa = 94.25 IU/mg 109 IU/mg Anti IIa = 27.75 IU/mg 75 IU/mg Temps 90 minutes 240 minutes 360 minutes 90 minutes 240 minutes 360 minutes Anti Xa IU/kg 300.00 300.00 300.00 200.00 200.00 200.00 Doses Anti IIa IU/kg 88.33 88.33 88.33 137.98 137.98 137.98 mg/kg 3.18 3.18 3.18 1.83 1.83 1.83 n 8 5 5 5 5 5 5 73.10 0.00 0.00 91.00 0.00 0.00 111.50 62.70 13.60 47.20 19.50 44.80 19.00 12.20 41.00 4.10 0.00 2.90 18.50 0.00 60.40 Poids du Thrombus 68.00 0.00 22.00 0.00 3.20 23.40 7.10 114.00 10.40 3.60 15.20 0.00 0.00 0.00 100.60 339.70 166.90 Moyenne#SEM 120#34 5.62#2.75 14.56#9.12 25.72#16.72 13.30#8.60 8.48#5.24 38.24#21.20 Student test p p NS p p NS Nombre de lapins sans 0/8 2/5 2/5 1/5 2/5 3/5 1/5 thrombus Plasma Anti Xa /ml 0.89#0.10 0.89#0.125 0.47#0.005 0.61#0.06 0.61#0.06 0.40#0.04 (N=4) Plasma Anti IIa /ml 0.16#0.02 0.16#0.023 0.12#0.013 0.55#0.04 0.55#0.04 0.32#0.02 (n=4) Exemple 9: Etude de l'activité in vivo sur le temps de saignement chez le rat. Les résultats présentés dans le tableau 4 suivant montrent clairement que les mélanges de l'invention (illustrés par le mélange M1) font moins saigner que les autres héparines de faible masse moléculaire. Les résultats donnés correspondent à l'augmentation du temps de saignement en minutes par rapport à des valeurs contrôle. Tableau 4 Dose#Produit Mélange M1 Exemple 1 Mélange M4 4mg/kg 107+0,4 4#1,1 8,6+3.6 8 mg/kg 3,0+0,7 7,9~2,1 33,7+8 REVENDICATIONS 1. Mélange d'oligosaccharides sulfatés présentant la structure générale des oligosaccharides constitutifs de l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 70 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5400 et 7800 daltons, au moins 5 to d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire supérieure à 6900 daltons, et en ce qu'il possède une activité anti IIa supérieure à 60 UI/mg. 2. Mélange selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins 70 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5700 et 7500 daltons. 3. Mélange selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend au moins 60 % d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire comprise entre 5700 et 6900 daltons. 4. Mélange selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 to d'oligosaccharides ayant une masse moléculaire supérieure à 6900 daltons. 5. Mélange selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il possède une activité anti IIa égale ou supérieure à 70 UVmg. 6. Mélange selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une fraction d'héparine. 7. Mélange selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une fraction d'héparine dépolymérisée. 8. Mélange selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est constitué d'oligosaccharides ayant un acide 2-g-sulfo 4 énopyranosuronique à l'une de leurs extrêmités. 9. Mélange selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une fraction d'héparine dépolymérisée par action d'une base sur un ester d'héparine. 10. Procédé de préparation d'un mélange selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l'on fractionne une héparine ou une héparine dépolymérisée par gel-filtration. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le fractionnement comprend successivement les étapes consistant à (i) mettre l'héparine ou l'héparine dépolymérisée de départ en solution dans l'éluant, (ii) faire passer la solution ainsi obtenue à travers une colonne au moins contenant le support solide pour la gel-filtration, préalablement équilibrée avec le même éluant, et (iii) récupérer les fractions de poids moléculaire désiré. 12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'on utilise une héparine dépolymérisée. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'on utilise une héparine dépolymérisée par action d'une base sur un ester d'héparine. 14. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que, lors de la seconde étape du fractionnement, le support est réparti en plusieurs colonnes disposées en série. 15. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la seconde étape est réalisée en utilisant successivement 2 types de supports au moins, ayant des caractéristiques de séparation différentes. 16. Composition pharmaceutique ayant comme principe actif un mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 destinée au traitement et à la prévention des thromboses veineuses et artérielles. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 destinée à la prévention des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 destinée à une utilisation en régime post-opératoire, dans la prévention de thromboses veineuses chez les malades chirurgicaux. 20. Utilisation d'un mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans la prévention des thromboses dans le matériel chirurgical.