Brevet FR2696095A1 — publié le 19940401

L'invention a pour objet une colle biologique contenant des protéines plasmatiques humaines coagulables par la thrombine. La colle biologique de l'invention est caractérisée par le fait qu'elle contient des facteurs de croissance d'origine plaquettaire. On sait que des concentrés de protéines coagulables par la thrombine, ou des solutions de fibrinogène, sont utilisés dans la réalisation d'un matériau collant permettant notamment de réunir les tissus vivants tout en exerçant une action hémostatique ; voir par exemple le brevet FR-2.448.900. Ce matériau collant est couramment appelé "colle biologique" et est utilisé en chirurgie. Les colles biologiques permettent de reproduire, dans des conditions physiologiques, la phase finale du processus de la coagulation. Pour cela, on mélange extemporanément, sur le tissu vivant à traiter, une solution contenant du fibrinogène et du facteur XIII avec une solution contenant de la thrombine et des ions calcium. Le fibrinogène, en présence de thrombine et d'ions calcium, est transformé en fibrine. Les monomères de fibrine s'assemblent pour former des polymères de fibrine et ces polymères sont réticulés par l'action du facteur XIII activé. Le facteur XIII, activé sous l'action de la thrombine en présence d'ions calcium, est une transamidase qui établit des liaisons peptidiques entre les chaînes de fibrine avec formation d'un réseau. Dans la présente demande, on appellera "colle biologique" un concentré de protéines coagulables par la thrombine, bien qu'en fait ce soit seulement en présence de thrombine qu'un tel concentré constitue véritablement une colle. La formation du réseau de fibrine est responsable de l'activité hémostatique de la colle biologique. Par ailleurs, la fibrine adhère aux tissus environnants, notamment par l'intermédiaire de la fibronectine et du collagène. En outre, le facteur XIII activé établit des liaisons peptidiques entre la fibrine et la fibronectine, ce qui renforce les propriétés adhésives. On sait que le caillot de fibrine disparaît progressivement, in vivo, sous l'action d'une enzyme protéolytique appelée plasmine, ce qui limite la durée du collage. I1 est toutefois possible de renforcer la durée d'action des colles biologiques en leur ajoutant par exemple de l'alpha 2-antiplasmine ou un inhibiteur des protéases tel que l'aprotinine, ou encore de l'acide epsilon-aminocaprolque. Les applications des colles biologiques sont nombreuses, en particulier en chirurgie pour éviter des saignements, pour remplacer les fils de sutures ou pour renforcer celles-ci. Cependant, les colles biologiques n'ont pas d'activité particulière propre à favoriser la cicatrisation. On sait que la cicatrisation est favorisée notamment par certains facteurs de croissance agissant directement sur des cellules-cibles présentes au niveau d'une plaie. Ces facteurs de croissance induisent la multiplication ou la différenciation, ou encore l'attraction cellulaire (chimiotactisme). Les plaquettes sanguines (ou thrombocytes) sont une des sources principales de facteurs de croissance dans le sang. Lors d'une lésion cellulaire in vivo, les thrombocytes libèrent les facteurs de croissance contenus dans des granules, sous l'action d'activateurs des thrombocytes, dont la thrombine. Les surnageants de plaquettes activées renferment une grande diversité de molécules, comme par exemple le facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou PDGF (Platelet-derived growth factor), le "Transforming growth factor bêta",le "Basic fibroblast growth factor", le "Platelet factor 4", le "Platelet- derived endothelial growth factor", l"'Heparin-binding epidermal growth factor", le "Insulin-like growth factor 1", le "Connective-tissue activating peptide III", la bêta-thromboglobuline, l"'Epidermal growth factor", le plasminogène, le facteur Von Willebrand, le fibrinogène, la sérotonine, l'histamine, l'adénosine di-et triphosphate, la fibronectine, la vitronectine, le facteur XIII plaquettaire, des enzymes protéolytiques ou glycolytiques, les métabolites de l'acide arachidonique etc.... ; voir notamment H.L. Wong & S.M. Wahl, In "Peptide Growth Factors and their Receptors" Sporn & Roberts Eds., Springer-Verlag. Berlin, p.510 R.A. Terkeltaub & M.H. Ginsberg, In "The Molecular and Cellular Biology of Wound repair", Clark & Henson Eds, Plenum Press, New York, p.38. Les extraits plaquettaires renferment une activité mitogène élevée, et leur effet cicatrisant est connu ; voir notamment D.Knighton et al., Ann. Surg., 196, 379-388 (1982) ; D.M. Carter et al., In "Crowth factors and other aspects in Wound Healing", Barbul. Pines, Cadwell Hunt Eds, Alan R.Liss Inc., Nev York 1988, p.303-317 ; brevet US 4,760,131 et demandes de brevet PCT WO 86/03122, WO 88/03409 et WO 89/05656. On a maintenant découvert qu'il est possible d'obtenir une colle biologique améliorée, favorisant notamment la cicatrisation, grâce à un procédé permettant de réunir à la fois les protéines coagulables par la thrombine et des facteurs plaquettaires. Les modes de préparation des concentrés de protéines coagulables par la thrombine sont connus. La matière première est constituée de plasma sanguin, c'est-à-dire de sang dont on a éliminé les cellules sanguines. Autrement dit, il s'agit d'un produit appauvri en plaquettes. Le procédé consiste essentiellement à précipiter le fibrinogène soit par l'éthanol, selon la méthode de Cohn, soit par l'obtention d'un cryoprécipité. On sait que la préparation d'un cryoprécipité consiste à congeler un plasma puis à le décongeler à une température supérieure à O et inférieure à 60C, généralement comprise entre +1 et +40C. La fraction solide qui demeure, et qui contient notamment le fibrinogène et la fibronectine, est appelée cryoprécipité et peut être séparée de la fraction liquide par centrifugation. Le volume du cryoprécipité est généralement compris entre 1/25 et 1/100 du volume du plasma de départ. Les protéines plasmatiques insolubles dans les conditions d'obtention du cryoprécipité sont donc concentrées d'un facteur 25 à 100 au cours de la cryoprécipitation.Mais les préparations ainsi obtenues sont pauvres en facteurs de croissance. En particulier les colles biologiques préparées selon des procédés industriels connus ne renferment pas d'activité mitogène notable. On a maintenant découvert quten utilisant comme produit de départ un plasma enrichi en plaquettes, de nombreux facteurs plaquettaires, bien que normalement solubles dans les conditions d'obtention du cryoprécipité, se trouvent retenus dans ledit cryoprécipité en proportions très importantes, alors qu'on devait normalement s'attendre à une répartition uniforme de ces facteurs entre la fraction liquide et le cryoprécipité obtenus. Le procédé de l'invention permet d'obtenir un produit combinant les propriétés hémostatiques et adhésives des concentrés de protéines coagulables par la thrombine et les activités cicatrisantes des extraits plaquettaires, sans qu'il soit nécessaire de procéder à deux préparations distinctes. C'est ainsi que grâce au procédé de l'invention, le facteur de concentration du PDGF, dans le cryoprécipité, est généralement supérieur à 10. Le rendement en PDGF est généralement supérieur à 20 ng par milliard de plaquettes présentes dans le plasma de départ. L'invention a donc pour objet une colle biologique contenant un concentré de protéines coagulables par la thrombine, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins un facteur de croissance d'origine plaquettaire. Ledit facteur de croissance est notamment le PDGF. La colle biologique de l'invention contient généralement au moins 20 ng/ml, et le plus souvent au moins 50 ng/ml de PDGF. Généralement, elle peut contenir de 20 à 600 ng/ml de PDGF. La colle biologique selon l'invention contient d'autres produits présents normalement dans les extraits plaquettaires, et en particulier la bêta-thromboglobuline. Elle contient par exemple au moins 10 pg/ml, et en particulier de 10 à 300 pg/ml, de beta-thromboglobuline. La colle biologique de l'invention contient par exemple - fibrinogène : 30 - 150 g/l, en particulier de 50-100 g/l, - fibronectine : 8 - 12 g/l, - facteur XIII : 10 à 22 unités de transamidase/ml, - albumine : 10-30 g/l, en particulier 20-30 g/l. L'unité d'activité de transamidase, évaluée dans un test d'incorporation de dansyl cadavérine dans la caséine, est telle que définie par Rodighiero et Barbui, Journal of Clinical Pathology, vol.33, p.434 (1980). La colle biologique de l'invention contient des facteurs plaquettaires en quantité suffisante pour lui conférer des propriétés mitogènes, pouvant etre mise en évidence selon les méthodes classiques. L'activité mitogène de la colle biologique de 1 invention est par exemple telle que diluée au 1/4000e (et même, généralement, au 1/5000e), elle possède une activité mitogène au moins égale à celle d'une solution contenant 0,1 ng/ml de PDGF dans un test de mesure de l'incorporation de thymidine tritiée par des cellules 3T3 stimulées à une phase d'arrêt de croissance. Un tel test est décrit par exemple par HART C.E. et al., Biochemistry vol.29, 166-172 (1990). La cellule 3T3 est une cellule d'embryon de souris Swiss (lignée ATCC CCL 92). Une lignée provenant d'un sous-clonage est également disponible (NIH/3T3 ; ATCC CRL 1658). La colle biologique de l'invention peut être constituée essentiellement d'un cryoprécipité issu d'un plasma enrichi en plaquettes, et l'invention concerne également un procédé de préparation d'une colle biologique dans lequel on prépare et recueille un cryoprécipité à partir d'un plasma congelé, caractérisée par le fait que l'on utilise comme plasma de départ un plasma enrichi en plaquettes. Autrement dit, le procédé de l'invention est caractérisé par le fait qu'avant de préparer le cryoprécipité, on prépare un plasma enrichi en plaquettes. L'opération d'enrichissement du plasma en plaquettes est effectuée selon les méthodes usuelles, notamment par centrifugation du sang prélevé. Le plasma enrichi en plaquettes contient généralement au moins 50 millions de plaquettes par ml, notamment de 100 millions à 1 milliard de plaquettes environ par ml, et par exemple de 100 millions à 500 millions environ par ml. Les conditions d'obtention du cryoprécipité sont les conditions classiques. Par exemple on congèle à une température non supérieure à -15 C, par exemple comprise entre -15 et 600 C. On maintient le produit à cette température pendant au moins un temps suffisant pour permettre un équilibre thermique dans la masse du produit. Ce temps est par exemple de l'ordre de 12 heures à 72 heures. Le plasma est ensuite décongelé à une température supérieure à 0 C mais inférieure à la température à laquelle l'ensemble du produit congelé se liquéfie. On opère généralement entre +1 et +60C, et en particulier vers +4 C. La durée d'incubation à la température de décongélation est suffisante pour permettre de réaliser un équilibre thermique ; cette durée est comprise par exemple entre 12 et 24 heures. On peut ensuite séparer le cryoprécipité de la fraction liquide. Pour cela, on centrifuge le plasma décongelé à une température suffisamment élevée pour ne pas le recongeler, et suffisamment basse pour éviter la liquéfaction du cryoprécipité, puis on élimine le surnageant selon les méthodes connues, et l'on recueille le cryoprécipité qui constitue le culot de centrifugation. Le volume du cryoprécipité représente généralement le 1/25e à 1/100e du volume de plasma initial. Généralement la centrifugation est effectuée à une température comprise entre +1 et +60C. Dans le cas où l'on ne souhaite pas utiliser immédiatement la colle biologique constituée par le cryoprécipité obtenu, on peut la recongeler, par exemple à -200C. Lorsque la colle biologique est destinée à être utilisée immédiatement, il convient de la liquéfier par chauffage à une température suffisante, habituellement comprise entre 32 et 380C. La simplicité du procédé d'obtention de la colle biologique enrichie en facteurs plaquettaires selon l'invention permet d'appliquer ce procédé à la réalisation d'une colle biologique autologue, c'est-à-dire obtenue à partir du plasma provenant d'un seul donneur, en vue de l'utilisation chez ce donneur. L'un des avantages de ce procédé est que toutes les opérations, y compris l'enrichissement du plasma en plaquettes, peuvent être effectuées dans le système de poches utilisé pour le prélèvement du sang d'un donnneur. On peut bien entendu préparer également la colle biologique à partir de plasma provenant de plusieurs donneurs identifiés. Le produit de départ du procédé de l'invention est un plasma enrichi en plaquettes. La préparation d'un tel plasma enrichi en plaquettes est connue en soi. Elle peut être réalisée par exemple selon la méthode suivante. Du sang total, recueilli lors d'un don de sang, dans un système à poche triple (Maco-pharma par exemple), est centrifugé dans une centrifugeuse Jouan K110 à 3000xg pendant 4 minutes. Le plasma surnageant, riche en plaquettes, est transvasé dans la poche de transfert 3 du système de triple poche, à l'aide d'un extracteur de plasma. La poche 3 est séparée du reste du système par soudure de la tubulure. C'est cette poche qui sera utilisée pour la fabrication selon l'invention du concentré de protéines coagulables par la thrombine. L'invention a également pour objet l'utilisation de la colle biologique telle que définie précédemment. Cette utilisation est effectuée selon les méthodes connues en soi. Le principe de cette utilisation consiste à mélanger la colle biologique obtenue telle que décrite précédemment avec une solution aqueuse contenant de la thrombine et des ions calcium afin de déclencher la réaction de coagulation par transformation du fibrinogène en fibrine. On peut utiliser notamment une solution aqueuse contenant de 0,5 à 500 U NIH/ml de thrombine et une concentration en ions calcium (notamment sous le forme de chlorure de calcium) comprise par exemple entre 5 et 100 mM, en particulier entre 20 et 60 mM. Le mélange avec la solution de thrombine est effectué de préférence in situ, sur les tissus à traiter. Généralement, on mélange le cryoprécipité liquéfié et la solution aqueuse de thrombine dans des proportions volumiques de 5:1 à 1:2. Si désiré, on ajoute à la colle finale, ou à l'un de ses constituants avant leur mélange, un inhibiteur de plasmine ou analogue (alpha 2-antiplasmine, aprotinine, acide epsilon-aminocaprolque par exemple). La colle biologique de l'invention peut être utilisée notamment dans le traitement des plaies traumatiques ou chirurgicales, dans la mise en place et le maintien des greffes (notamment greffes de peau, d'os, etc...). Elle peut également être utilisée pour fixer des pièces de prothèse, y compris de prothèses osseuses, de pièces d'ostéosynthèse et de prothèses dentaires, et aussi pour fixer et maintenir assemblés des matériaux de comblement osseux, notamment des matériaux de comblement résorbables à base de carbonate de calcium (par exemple à base de squelette de corail ou de coquille de Pinctada margaritifera), d'hydroxyapatite ou de polymères biodégradables comme le poly(acide lactique). EXEMPLE 1 On a préparé un plasma humain enrichi en plaquettes, comme décrit précédemment. Le plasma enrichi ainsi obtenu contient 154 millions de plaquettes par ml. La poche de transfert renfermant 230 ml dudit plasma enrichi en plaquettes est placée dans une chambre froide à -40 C pendant 72 heures. La poche de plasma est ensuite placée dans un réfrigérateur à une température de 40C pendant 20 heures.La poche de plasma est ensuite centrifugée pendant 20 minutes à 3.000 tours par minute, toujours à la température de +4 C. Après centrifugation, la poche est posée horizontalement, une tubulure de prélèvement est mise en place et le surnageant liquide est soutiré par aspiration. Le résidu solide contenu dans la poche constitue le cryoprécipité qui peut être conservé par recongélation à une température de -200C jusqu'à son utilisation. Lorsqu'on souhaite utiliser immédiatement le cryoprécipité, on place la poche au bain-marie, par exemple à une température de 370C. Après 15 minutes d'incubation la solution résiduelle est prélevée. Son volume est de 3 ml environ. Analyse du produit obtenu : voir tableau 1 ci-après. EXEMPLE 2 On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1. Le volume de plasma traité est de 250 ml. Le plasma renfermait au départ, 256 millions de plaquettes par ml. Le volume de la solution finale récupérée, provenant de la liquéfaction du cryoprécipité, est de 5 ml. Analyse : voir tableau 1. La teneur en PDGF du surnageant obtenu après centrifugation du plasma décongelé n'est que de 5,9 ng/ml. On voit (par comparaison avec le Tableau I) que la quasi-totalité du PDGF se retrouve dans le cryoprécipité. TABLEAU I Exemple 1 Exemple 2 Protéines(1), (mg/ml) 61 89,6 PDGF(2), (ng/ml) 282 310 Beta-Thromboglobuline(3) (g/ml) 127 130 Coagulable par la thrombine(4) OUI OUI Activité mitogène(5) 104 non-mesuré (activité spécifique) (1) Déterminé par la méthode de Bradford (Réactif Biorad référence 500-0006) (2) PDGF : facteur de croissance dérivé de plaquettes (Platelet Derived Growth Factor), mesuré par un test "ELISA" (3) Mesuré par un test "ELISA" (Stago, France, référence 0419) (4) Déterminé en mélangeant un volume de cryoprécipité liquéfié à un volume d'une solution de thrombine à 500 U.N.I.H. et de chlorure de calcium 50 mM.Après 1 minute, on observe la formation d'un caillot. (5) L'activité spécifique est déterminée selon le protocole décrit ci-après. La radioactivité obtenue avec le témoin est de 2.000 cpm. A 4.000 cpm, la concentration en protéines est de 0,0096 mg/ml dans l'exemple 1. A titre indicatif, l'activité spécifique du Tissucol (marque de commerce désignant une colle biologique vendue par IMMUNO) mesurée par la même méthode, est de 0,22. Le protocole de mesure de l'activité mitogène était le suivant: Des cellules de fibroblastes sont isolées à partir du prépuce d'un enfant âgé de 6 mois. Les cellules sont mises en suspension dans du milieu DMEM (Gibco) renfermant 10% de sérum de veau fétal. On ensemence chaque puits d'une plaque de microtitration à 96 puits avec 200 pl de la suspension à 40.000 cellules/ml. Après 3 jours d'incubation à 370C, en athmosphère à 5% de C02, le milieu de culture est remplacé par un milieu DMEM (Gibco) à 8% de sérum de veau nouveau-né. Après 3 jours d'incubation supplémentaires, 50 pl d'une solution de protéines coagulables par la thrombine (échantillon) sont ajoutés. Chaque échantillon est testé à différentes dilutions dans du DMEM, et en triple. 50 pl de DMEM sont inoculés dans des puits témoin. La microplaque est incubée dans les memes conditions pendant 24 heures. Six heures avant la fin de l'incubation, 50 pl d'une solution de thymidine tritiée à 10 pCi/ml sont ajoutés dans chaque puits. Après l'incubation, les puits sont lavés par une solution physiologique. Les cellules sont alors décollées du puits par une solution de trypsine à 0,25%, en présence d'éthylène-diamine-tétra-acétate (solution Gibco). Les cellules sont alors récoltées sur un filtre, grâce à un collecteur de cellules de type "Skatron". Les filtres sont alors séchés et la radioactivité est mesurée en présence d'un liquide scintillant. Détermination de l'activité spécifique On reporte sur un graphe, en abcisse, la concentration en protéines de l'échantillon dans le puits (exprimée en mg/ml) et en ordonnée la radioactivité correspondante. On détermine graphiquement, par interpolation, la concentration en protéines de l'échantillon donnant un taux de radioactivité double de celle des puits témoin. L'inverse de cette concentration est appelée l'activité spécifique de l'échantillon. REVENDICATIONS 1. Colle biologique contenant un concentré de protéines coagulables par la thrombine, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins un facteur de croissance d'origine plaquettaire. 2. Colle biologique selon la revendication 1, caractérisé par le fait quelle contient lesdits facteurs de croissance en quantité suffisante pour conférer à ladite colle, diluée au 1/4000è, et en particulier diluée au 1/5000è, une activité mitogène spécifique au moins égale à celle d'une solution contenant 0,1 ng/ml de PDGF dans un test de mesure de l'incorporation de thymidine tritiée par des cellules 3T3 stimulées à une phase d'arrêt de croissance. 3. Colle biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ledit facteur de croissance est le PDGF. 4. Colle biologique selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins 20 ng/ml de PDGF. 5. Colle biologique selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins 50 ng/ml de PDGF. 6. Colle biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle contient de 20 à 600 ng/ml de PDGF. 7. Colle biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle contient en outre de la bêta-thromboglobuline. 8. Colle biologique selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins 10 pg/ml de bêta-thromboglobuline. 9. Colle biologique selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'elle contient de 10 à 300 pg/ml de bêtathromboglobuline. 10. Colle biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle est constituée essentiellement d'un cryoprécipité obtenu à partir d'un plasma enrichi en plaquettes. 11. Procédé de préparation d'une colle biologique telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on prépare et recueille un cryoprécipité, constituant ladite colle, à partir d'un plasma congelé, caractérisé par le fait que l'on utilise comme plasma de départ un plasma enrichi en plaquettes. 12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit plasma enrichi contient au moins 50 millions de plaquettes par ml. 13. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit plasma de départ contient de 100 millions à 1 milliard, et en particulier de 100 millions à 500 millions de plaquettes par ml. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé par le fait que l'on réchauffe ledit cryoprécipité pour obtenir ladite colle sous forme liquide. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé par le fait qu'au départ de sang prélevé, on prépare d'abord un plasma enrichi en plaquettes. 16. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit plasma provient d'un seul donneur, et que l'on effectue l'ensemble des opérations dudit procédé dans un système de poches servant à prélever le sang. 17. Colle biologique, caractérisée par le fait qu'elle est obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 11 à 16. 18. Utilisation de la colle biologique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 et 17, caractérisée par le fait que l'on mélange ladite colle avec une solution aqueuse contenant de la thrombine et des ions calcium.