Brevet FR2686221A1 — publié le 19930723

La présente invention est relative à des compositions à base d'antiseptiques, ainsi qu'à leurs applications notamment en hygiène générale et plus particulièrement sous la forme de microcapsules ou de microsphérules, en association notamment avec un dispositif prophylactique en matériau élastomère, comme un préservatif, un doigtier, un gant ou analogue ainsi que dans les soins et protections intimes. De nombreuses compositions antiseptiques ont été décrites dans l'Art antérieur ; elles exercent, de manière générale, plutôt une activité bactériostatique ou bactéricide ; cependant les compositions de l'Art antérieur ne permettent pas l'obtention d'une protection à la fois vis-à-vis des bactéries, des virus et des champignons. Or, pour la mise en place d'un protocole de nettoyage facile à mettre en oeuvre, notamment à l'hôpital, il était important de disposer d'une solution à action polyvalente vis-à-vis de la plupart des organismes pathogènes ; de plus, dans le cadre des soins, le besoin d'une protection de l'équipe soignante, pour éviter les risques de contamination que représentent par exemple la coupure, la piqûre ou la déchirure d'un gant nécessitait la mise au point de compositions actives dans des temps très courts (entre quelques secondes et 5 minutes) aussi bien vis-à-vis des bactéries rencontrées notamment à l'hôpital que vis-à-vis d'affections virales telles que le SIDA, les hépatites ou l'herpès, pouvant être incorporables dans les gants de protection, c'est-àdire compatibles avec les matériaux en élastomères, ce qui n'est pas le cas des compostions de l'Art antérieur, qui aux doses efficaces utilisées, présentent l'inconvénient majeur d'être toxiques pour les matériaux en élastomère. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des compositions antiseptiques qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les compositions précédemment proposées conformément à l'Art antérieur, notamment en ce qu'elles peuvent présenter une activité polyvalente virucide, bactéricide et fongicide, assurant ainsi à l'utilisateur une protection accrue extrêmement rapide aussi bien vis-à-vis des bactéries pathogènes habituellement recontrées chez l'Homme que vis-à-vis des virus, et plus spécifiquement HIV1, HSV et HBV, responsables respectivement du sida, de l'herpès et des hépatites. La présente invention a pour objet des compositions à base d'antiseptiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux antiseptiques (paire d'antiseptiques) à des concentrations efficaces minimales diminuées d'au moins un facteur 5 par rapport aux concentrations efficaces minimales de chacun desdits antiseptiques pris isolément, lesquelles paires d'antiseptiques sont choisies parmi les paires suivantes I - antiseptique cationique-sel hydrosoluble de chlorhexidine, II - antiseptique non ionique-hexamidine, III - antiseptique cationique-antiseptique non ionique, IV - antiseptique non ionique-sel hydrosoluble de chlorhexidine, et exercent une action polyvalente vis-à-vis des organismes pathogènes. De telles compositions ont l'avantage de permettre l'utilisation des antiseptiques la comprenant à des concentrations inférieures à celles auxquelles ils exercent leur action antiseptique lorsqu'ils sont utilisés seuls. Selon un mode de réalisation avantageux desdites compositions, l'antiseptique cationique est choisi parmi les ammoniums quaternaires. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits ammoniums quaternaires sont choisis dans le groupe constitué par les halogénures d'alkylbenzoyldialkylammonium et les halogénures de dialkyldialkylammonium. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'halogénure d'alkylbenzyldialkylammonium est de préférence du chlorure d'alkylbenzyldiméthyl ammonium (chlorure de benzalkonium), encore dénommé Barquat. Selon une autre modalité avantageuse de cette disposition, l'halogénure de dialkyldialkylammonium est de préférence du chlorure de didécyldiméthylammonium, encore dénommé Bardai 228 Des compositions préférées à base d'ammoniums quaternaires comprennent en pourcentage l'ammonium quaternaire à une concentration De manière particulièrement préférée, ladite composition conforme comprend l'ammonium quaternaire et le digluconate de chlorhexidine à des concentrations identiques, de préférence entre 0,00005 et 0,04 %. En effet ces concentrations représentent une fourchette pour laquelle les compositions conformes à l'invention exercent leur action polyvalente contre les différents organismes pathogènes : virus, bactéries, champignons et les spermatozoïdes. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites compositions, l'antiseptique non ionique est choisi parmi les dérivés hydrosolubles de polyoxyéthylène. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit dérivé de polyoxyéthylène est un nonoxynol, de préférence dont le nombre moyen d'unités d'oxyde d'éthylène par molécule est supérieur à 6. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit nonoxynol est du nonylphénoxypolyéthoxyéthanol. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit dérivé de polyoxyéthylène est un octoxynol de préférence dont le nombre moyen d'unités d'oxyde d'éthylène par molécule est supérieur à 6. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit octoxynol est de l'octylphénoxypoly- éthoxyéthanol. Conformément à l'invention, des compositions préférées à base de dérivé de polyoxyéthylène comprennent ledit dérivé de polyoxyéthylène à une concentration comprise entre 0,1 et 10 % et soit de l'hexamidine à des concentrations Des compositions selon l'invention particulièrement préférées sont - chlorure de didécyldiméthylammonium à 0,002 % + digluconate de chlorhexidine à 0,002 %, particulièrement actif sur le virus HIV-1 - chlorure de didécyldiméthylammonium à 0,02 % + digluconate de chlorhexidine à 0,025 %, particulièrement actif sur les virus des hépatites - chlorure de didécyldiméthylammonium à 0,00025 % + digluconate de chlorhexidine à 0,00025 %, particulièrement actif sur les bactéries et les champignons - octoxynol à 0,1 % + hexamidine à 2,5 % - octoxynol à 1 * et digluconate de chlorhexidine à 0,5 %. De manière surprenante, les compositions conformes à l'invention présentent une activité polyvalente rapide, c'est-à-dire à la fois une action bactéricide, virucide très rapide, fongicide, et éventuellement spermicide, à des doses pour lesquelles ses constituants ne présentent pas lesdites activités. De telles composi tions présentent donc une synergie d'action particulièrement intéressante, permettant d'utiliser ses constituants à des doses faiblement toxiques ou non toxiques. Egalement de manière surprenante, les compositions conformes à l'invention, éventuellement incorporables dans un matériau en élastomère, sont également non toxiques vis-à-vis dudit matériau. De telles compositions trouvent application en tant que virucides à action instantanée ou dans des temps très courts, bactéricides, fongicides ou spermicides ; de telles compositions, mises sous forme de microcapsules ou de microsphérules comme précisé dans les Demandes au nom de la Demanderesse EP 0 306 389, EP 0 371 850 ou EP 0 407 257, constituent une protection virucide, bactéricide, fongicide ou spermicide efficace, lorsqu'elles sont incorporées dans un matériau en élastomère à usage de préservatif, de doigtier, de gant ou analogue ou bien dans une bande de tissu ou un pansement. Les compositions conformes à l'invention constituent également une protection virucide, bactéricide, fongicide et/ou spermicide efficace, lorsqu'elles sont associées à des véhicules pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation locale au niveau des muqueuses, (mousses, pour une utilisation vaginale, scrub, crème, suppositoires, ovules). Les compositions conformes à l'invention constituent également un produit d'hygiène ou de désinfection à usage externe avantageux. En fonction des concentrations des différents constituants, on obtient soit une composition à action spécifique (virucide, bactéricide, fongicide ou spermicide), soit une composition à action polyvalente. Dans le cas où lesdites compositions sont utilisées comme spermicide, elles sont avantageusement associées à un diluant choisi dans le groupe constitué par les protéases d'origine végétale (bromélaine) et les enzymes lytiques (trypsine). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Action virucide des compositions conformes à l'invention vis-à-vis des virus HIV (Sida). I - Antisentipue cationipue-sel de chlorhexidine. A) PROTOCOLE OPERATOIRE. 1. Matériel a) Produits utilisés Les concentrations indiquées sur les tableaux correspondent aux concentrations finales en Barquat MS.100R et en Bardac 22.60. b) Milieu utilisé nour la culture cellulaire L'étude de la cytotoxicité étant réalisée sur une lignée T, le milieu de culture correspond à du RPMI 1640 supplémenté par 10 % de sérum de veau foetal (BIO-LAB), 1 % de glutamine (GIBCO), 1 % d'antibiotiques (PSN, GIBCO). Pour l'étude du pouvoir infectieux résiduel après traitement des préparations virales, le milieu de culture des lymphocytes T humains normaux (milieu complet) correspond au milieu ci-dessus auquel sont ajoutés 10 % d'interleukine II, du polybrène (2 Fg/ml) et du sérum anti-interféron humain 1/2500 (M.A. REY et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 1984, 121, 126-133). c) Cellules La cytotoxicité est étudiée sur un clone de cellules CEM, lignée de lymphocytes T prématures. L'infectivité est étudiée sur des lymphocytes T obtenus à partir du sang périphérique d'un donneur humain sain, et séparés sur un gradient de Ficoll. Les lymphocytes sont stimulés pendant 3 jours par de la phytohémagglutinine P (PHA-P), diluée au 1/500 et cultivés dans du milieu complet. Les cellules T blastiques sont infectées par le virus, traité ou non, pour mettre en évidence le pouvoir infectieux résiduel. d) Virus HIV1 : Le virus est obtenu à partir d'un surnageant de culture de la lignée CEM infectée par HIV1. Cette lignée T lymphoblastolde infectée par HIV1 est utilisée pour la production virale. Le titre des surnageants utilisés est évalué après dosage de l'activité transcriptase inverse (ATI) du virus. Dans les essais qui suivent, on a utilisé un surnageant dont 1'ATI est de 1,8.106 cpm/ml. 2. Méthodes a) Etude de la cvtotoxicité des composés cour des cellules T Cellules : suspension cellulaire du clone de CEM à 1.106 cellules/ml. Produits : différentes dilutions dans du milieu RPMI 1640 sont réalisées à partir des composés. Sur une plaque de culture cellulaire à 24 puits, 0,5 ml de chacune des dilutions sont incubés avec 0,5 ml de suspension cellulaire du clone CEM (5.105 cellules) dans un incubateur à 37 C. La croissance cellulaire est évaluée après comptage des suspensions cellulaires au bleu trypan par rapport à un témoin de cellules non traitées. b) Action des produits seuls ou en association. conformément à l'invention. sur le couvoir infectieux du virus HIV1 pour des lymphocytes T humains normaux: - Préparation de la solution virale plusieurs tubes contenant 1 ml de surnageant viral, ATI 1,8.106 cmp/ml sont concentrés par ultracentrifugation. Les culots de virus ainsi obtenus sont repris soit par chacune des dilutions de produit réalisées dans de l'eau bidistillée stérile, soit par de l'eau (virus témoin non traité). - Traitement des préparations virales les préparations virales concentrées sont toutes traitées selon le protocole indiqué ci-dessous échantillons viraux traités les culots de virus concentrés par ultracentrifugation sont resuspendus dans 100 Fl de chacune des concentrations en produits étudiés et incubés pendant 10 minutes échantillon viral témoin témoin virus non traité : le produit est remplacé par 100 Fl d'eau bidistillée stérile. A la suite de ce temps d'incubation de 10 minutes, le virus présent dans chaque échantillon est rincé puis reconcentré par addition de 12 ml de milieu RPMI 1640 et ultracentrifugation. Les culots de virus sont alors repris dans 1 ml de milieu complet et utilisés pour l'infection de lymphocytes T humains normaux. - Mesure de l'infectivité des échantillons 4.106 lymphocytes T humains normaux sont infectés avec chacune des préparations virales traitées ou témoins indiquées ci-dessus. L'infection des cellules T est réalisée selon une méthode précédemment décrite (F. BARRE-SINOUSSI et al., Science, 1983, 220, 868-871) en résumé 4.106 cellules en suspension dans 1 ml de milieu complet sont incubées avec 1 ml de chacune des préparations virales traitées ou témoins pendant 1 heure à 37 C. Après 2 lavages par plusieurs ml de milieu de culture, les suspensions cellulaires sont ajustées à la concentration de 1.106 cellules par ml. Le jour de l'infection est considéré comme jour 0. Cellules témoin 4.106 lymphocytes T sont cultivés et passés tous les 3 ou 4 jours dans les mêmes conditions que tous les autres échantillons. Ce témoin correspond au témoin négatif de la production virale au cours de la manipulation. La production virale au cours du temps est déterminée en mesurant l'activité transcriptase inverse présente dans les surnageants de culture selon le protocole décrit ci-dessous. Mesure de l'activité transcriptase inverse des préparations virales témoins et des échantillons viraux traités par les produits ce dosage permet d'évaluer la présence de virus résiduel non inactivé dans l'échantillon de départ. Il est réalisé à partir de 1 ml de surnageant de culture, prélevé tous les 3 ou 4 jours et ultracentrifugé. Les activités enzymatiques sont mesurées dans 50 Fl d'un mélange réactionnel contenant 50 mM Tris pH 7,8, 20 mM MgC12, 20 mM KC1, 2 mM dithiotréitol, 0,25 OD/ml oligo dT, 0,25 OD/ml poly rA, 0,1 % Triton X 100 et 2,5 FCi 3H DTTP. Après une heure d'incubation à 37 C, la réaction est arrêtée par addition de 10 Fl d'EDTA 0,2 M et les échantillons sont déposés sur membranes DE81. Après plusieurs lavages par Na2HPO4 5 %, puis par l'eau distillée, les membranes sont séchées et la radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation p (PACKARD). B) RESULTATS. Effet d'un traitement des échantillons viraux par les différents produits sur l'infectivité du virus HIV1. TABLEAU I DOSAGE DE L'ATI DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURES INFECTEES (cpm/ml) J3 J6 J10 J13 J17 J20 J23 J27 J30 BardacR (%) 0,01 334 222 1768 1592 190 390 1328 780 1000 0,006 320 326 204 248 364 180 328 588 196 0,004 346 298 160 170 350 218 444 244 264 0,002 464 2472 16066 24902 77754 75554 101394 80560 64692 0,0004 702 18136 117326 74214 50674 22478 13806 7800 4426 Chlorhexidine (%) 0,01 262 274 200 250 230 272 456 420 276 0,005 360 374 580 742 1902 1126 1126 528 720 0,002 252 352 1304 1752 4288 6138 4614 1616 4528 BardacR + Chlorhexidine (%) 0,006 + 0,01 336 202 116 226 280 236 342 510 240 0,006 + 0,005 326 196 210 384 274 166 280 406 304 0,006 + 0,002 286 240 196 282 192 274 376 478 330 0,004 + 0,01 302 326 210 222 240 350 366 278 248 0,004 + 0,005 298 288 206 344 170 346 288 456 282 0,004 + 0,002 228 268 208 232 1200 274 254 422 250 0,002 + 0,01 666 262 222 200 244 394 650 322 280 0,002 + 0,005 364 246 314 308 4386 308 268 446 254 0,002 + 0,002 998 222 666 908 748 1206 1110 370 336 0,0004 + 0,01 2163 234 186 226 204 250 344 352 226 0,0004 + 0,005 438 246 824 1142 2340 2190 2120 1094 1466 0,0004 + 0,002 576 3362 21734 36246 39364 40126 18480 6530 10476 T1 1516 3120 24822 52912 49884 30540 21800 4500 3464 T2 342 4688 61384 64284 69172 15366 12364 3500 3790 T3 1594 45068 75046 56928 12872 8932 5468 1050 1746 T4 232 220 218 202 190 268 394 244 308 T1 : Témoin virus traité par 100 l d'eau bidistillée T2 : Témoin virus traité par 100 Rl d'eau bidistillée T3 : Témoin virus contrôle T4 : Témoin cellules non infectées Ce Tableau montre bien la synergie d'action de l'association Bardac /digluconate de chlorhexidine à faible concentration (concentration 0,002 + 0,002) qui montre l'absence de virus au 30ème jour ; en effet, pour ces mêmes concentrations, les deux produits utilisés seuls ne sont pas virucides. II - antiseDtioue cationicue-antisetticue non ionique. BardacR + nonoxynol L'activité enzymatique représentative de la production virale est déterminée dans 1 ml de surnageant de culture prélevé tous les 3 ou 4 jours (J+ = nombre de jours de culture). TABLEAU Il Echantillons DOSAGE DE L'ATI DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURES INFECTEES (cpm/ml) | J3 57 J11 J14 518 522 526 J29 Virus traité avec 100 l de produit 0,01 % BardacR + nonoxyno 136 364 2942 10764 38388 9954 2164 1634 B4 Témoin positif de la réaction enzy matique 389180 310182 303826 281694 245290 45290 10206 10206 Témoin négatif de la réaction enzy matique 100 210 216 116 302 302 382 382 On obtient avec 0,01 % de chacun des produits une activité virucide. EXEMPLE 2 : Action virucide des compositions conformes à l'invention pour les virus HBV. I - Action sur la dégradation in vitro de l'antigène du virus de l'hépatite B (AaHBs) du virus de l'hépatite B virucide + sérum humain de malade (1/1000ème). A. Mélanges testés BardacR % + CHG* % BardacR seul CHG seul 0,2 - 0,25 0,2 0,25 0,1 - 0,1 0,1 0,1 0,04 - 0,05 0,04 0,05 0,2 - 0,05 0,04 - 0,25 * CHG correspond à une abréviation pour digluconate de chlorhexidine. B. Résultats Virucide testé AgHBs résiduel (ratio) BardacR 0,2 % 1,35 BardacR 0,1 % - CHG 0,1 % 2,18 BardacR 0,2 % - CHG 0,05 % 3,07 BardacR 0,2 % - CHG 0,25 % 3,23 Le mélange Bardac 0,1 % - CHG 0,1 % présente une activité intéressante alors que la dose est diminuée de l'ordre de 50 % par rapport au Bardac 0,2 % seul. II - Essais in vivo chez le canard (voie I,V.). - Bardace 0,02 % (dose 100 fois inférieure à celle qui est efficace in vitro pour le Bardac seul) CHG 0,025 % contre un inoculum à 2.107 vge/canard protège 3/3 canards (figure 2). - BardacR 0,1 % (dose 5 fois plus forte que dans une composition conforme à l'invention pour obtenir une protection équivalente) contre un inoculum à 2.107 vge/canard (vge = viral genoma equivalent) protège 4/4 canards (figure 3). I1 en résulte qu' in vivo, pour des faibles concentrations de mélange comme 0,02 - 0,025 %, il y a déjà protection, ce qui confirme que la suppression de l'activité ADN polymérase est un bon marqueur d'efficacité des virucides testés. La figure 1 correspond à un témoin d'infection : 4/4 canards inoculés avec 2.107 vge développent une virémie dont le pic se situe entre 5 et 10 jours. III - Conclusion générale sur les différents mélanges testés. Seul l'antigène du virus de l'hépatite B résiduel permet de discriminer parmi les mélanges BardacCHG testés. Un mélange à concentrations égales de Bardac et CHG semble optimal et s'avère in vivo protecteur dès la concentration 0,02 - 0,025 contre un inoculum contenant 2.107 vge/canard (soit environ 3 000 DI 50 par canard) Il apparaît que 0,02 % de Bardace en association avec 0,025 de CHG est aussi efficace que le Barda à 0,1 %. Cette diminution d'un facteur 5 est significative et importante, notamment dans l'application d'une composition conforme à l'invention en association avec un matériau en élastomère, le Bardac étant particulièrement toxique pour l'élastomère. EXEMPLE 3 : Action virucide des compositions conformes à l'invention contre les HSV. a) Tests réalisés - La souche virale I1 stagit d'une souche d'Herpès virus Hominis type 1, souche Bey (HSV1), elle est entretenue sur cellules fibroblastiques humaines ou sur cellules KB et a subi un nombre de passages importants, sur l'un ou 1autre type de cellules. On utilise un lot viral congelé à -80'C après obtention d'un effet cytopathique ayant atteint au moins 80 % des cellules, sans une centrifugation préalable, qui aurait débarrassé l'inoculum de la majorité des débris cellulaires ; en effet, il apparaît que l'infectivité du virus disparaît très rapidement lorsqu'il est extracellulaire, et, en conséquence, on est plus près de la réalité de l'infection in vivo lorsqu'on utilise un lot viral dans lequel des virions peuvent encore se trouver dans des débris cellulaires. Ce lot a été titré, après répartition en aliquots de 0,5 ml, conservés à -80'C, sur cellules fibroblastiques humaines par dilution de 10 en 10 et inoculations de 8 tubes de cultures par dilution : 106/ml par inoculation de cultures en boîtes de Pétri (35 mm) et adjonction de sérum anti-HSV1 dans le surnageant pour neutraliser les virions qui pourraient être libérés dans le milieu liquide, permettant ainsi de compter des plages : 100 à 150 unités formant plages par boîte inoculée avec 0,5 ml d'une solution virale diluée à î04. On réalise des contrôles de cytotoxicité des produits pour les cultures cellulaires utilisées dans les tests, c'est-à-dire les cellules fibroblastiques humaines. Les cellules sont cultivées en milieu de Dulbecco enrichi en sérum de veau foetal à 10 % ; au moment de leur utilisation, les cellules sont lavées et on utilise le même milieu de culture, mais dépourvu de sérum de veau. Pour chaque produit testé ou chaque composition, on a utilisé 10 tubes de culture cellulaire et après inoculation du produit, les tubes ont été surveillés pendant trois jours. b) Action observée avec les différents produits seuls Chaque produit a été successivement utilisé pur, et aux dilutions 10-1, 10-2, 10-3 et ajouté aux tubes de culture contenant 1 ml de milieu nutritif, sous le volume de 0,1 ml. Les résultats ont été les suivants . BardacR, solution à 0,04 % : non toxique à la dilution 10-3, . Octoxynol (Triton X 100R), solution à 0,1 % : aucune toxicité, Hexamidine, solution à 2,5 % : non toxique à la dilution 10-3, Digluconate de chlorhexidine, solution à 0,05 % aucune toxicité. c) Action virucide immédiate observée avec des mélanges conformes à l'invention 1. Mesure de l'activité * Protocole on mélange 0,2 ml de suspension virale avec 0,2 ml de suspension virale avec 0,2 ml d'une des solutions à tester (voir Tableau ci-après) ; puis on fait une dilution immédiate de 0,2 ml de mélange à 10-4 ce qui stoppe l'activité du produit. Cette dilution du mélange est déposée, sous un volume de 1 ml sur une couche de cellules Véro cultivées en boîte de Pétri de 6 cm de diamètre. Après une heure d'adsorption, on retire le liquide surnageant et on le remplace par 5 ml de milieu de culture sans sérum d'animal, mais auquel on a ajouté 1 % d'un sérum polyclonal de lapin anti-herpès virus type 1. Ceci ne gêne pas la multiplication du virus intra-cellulaire mais neutralise les particules qui passent dans la phase liquide lors de la destruction des cellules infectées ; au bout de 4 à 5 jours, on observe à l'oeil nu des zones de lyse cellulaire qui s'étendent en tache d'huile et correspondent chacune théoriquement à la multiplication d"'une unité formant plage" (UFP) présente dans la dilution virale qui a été déposée sur la culture. Une unité formant plage peut être grossièrement évaluée comme équivalente à une particule infectante ou encore un virion. TABLEAU III Nombre d'unités formant plage par millilitre de virus dilué à 10-4 (titrage effectué sur 3 boîtes de culture) à J4. BardacR 0,02 % BardacR 0,02 % Tém4Oin virus à 10- 10-5 10- + Digluconate 0,025% 30/125/45 17/26/16 I/223/51 Bardac) 0,02 % BardacR 0,02 % Témoin virus à 10-6 + Digluconate 0,05 26/17/20 9/6/8 | 14/32/30 d) Délais d'apparition de l'activité 1) on mélange 0,2 ml de la suspension virale non diluée avec 0,2 ml de chacun des 2 mélanges suivants - BardacO 0,04 % + CHG (digluconate) 0,05 %, - Bardace 0,02 % + CHG 0, 025 %. Après incubation de une, 5 et 15 minutes, une goutte de mélange TABLEAU IV Virus + Mélange Virus Témoin Effet cytopathique (à J2) 2/5 1 minute 5/5 0/5 5 minutes 5/5 0/5 15 minutes 5/5 EXEMPLE 4 : Action bactéricide des compositions conformes à l'invention. ESSAI 1 I - Matériel. A) Microorganismes testés - souches de référence Pseudoinonas aeruginosa CIP A22 Es Escherichia coli CIP 54127 . Staphylococcus aureus CIP 53154 souche Oxford. - souches hospitalières Pseudoinonas aeruginosa Es Escherichia coli . Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Candida albicans. B)- Membranes millipore : HAE P047S0 (0,45 m) - Gélose Mueller Hinton 2 : 4 3301 (Biomérieux) - Eau distillée stérile et apyrogène (Biosedra). II - Protocole. A) Entretien des souches Chaque souche bactérienne a subi trois repiquages, sur géloses Mueller Hinton, à 24 heures d'intervalle avant son utilisation. B) Précaration des inocula bactériens - suspension bactérienne initiale : A Préparée à partir d'un isolement bactérien, elle doit correspondre à une opacité équivalente au point 1 de McFarland. Elle sera utilisée pour les essais définitifs. - suspension utilisée pour les contrôles et les essais préliminaires : B Elle est préparée par dilutions successives de la suspension A jusqu'à 10 6 C) Dénombrements de contrôle 1 ml de la suspension B est ensemencé "dans la masse" d'une gélose Mueller Hinton. D) Dénombrements témoins de filtration 1 ml de la suspension B est filtrée sur une membrane millipore et lavée par 50 ml d'eau distillée. Numération des colonies après 24 heures à 37 C. E) Essais créliminaires : Pour chacun des 4 mélanges antiseptiques et pour chaque souche bactérienne, l'essai suivant est réalisé - filtration de 1 ml du mélange antiseptique - lavage (2 fois 50 ml d'eau distillée) - filtration de 1 ml de la suspension B - rinçage par 50 ml d'eau distillée - numération des colonies sur la membrane après 24 heures à 37 C. F) Essais définitifs Chaque mélange antiseptique à double concentration est placé pendant, 1, 5 et 10 min au contact de 1 ml de la suspension A puis filtré. Après les lavages définis par l'essai préliminaire, les membranes sont placées à 37 C pour 24 heures. III - Interprétation des résultats. Dans le protocole adopté, un mélange à visée antiseptique est considéré comme bactéricide s'il réduit, après un temps de contact défini, l'inoculum bactérien d'au moins 5 logarithmes. Cet effet est visualisé par le dénombrement, sur les membranes des essais définitifs, d'un nombre de colonies par rapport à celui observé dans l'essai préliminaire correspondant à la même souche et au même mélange. Résultats Efficacité à t = 1 min : E ou N.E. (efficace ou non efficace). Mélange n 1 Mélange n- 2 Mélange n' 3 - TritonR BardacR - BardacR 0,1 g/100 ml 4 % 0,04 g/100 ml - Hexamidine - Digluconate 2,5 g/100 mi 0,05 g/100 mi S. aureus E E E CIP 53154 E. coli E E E CIP 54127 P. aeruginosa E E E CIP A22 S. aureus NE E E E. coli E E E P. aeruginosa E NE E P. vulgaris ME NE NE C. albicans E E E Efficacité à t = 5 min Mélange n 1 Mélange n 2 Mélange n 3 - TritonR BardacR - BardacR 0,1 g/100 ml 4 % 0,04 g/100 ml - Hexamidine - Digluconate 2,5 g/100 ml 0,05 g/100 ml S. aureus E E E CIP 53154 E. coli E E E CIP 54127 P. aeruginosa E E E CIP A22 S. aureus E E E E. coli E E E P. aeruginosa E NE E P. vulgaris E NE NE C. albicans E E E Efficacité à t = 10 min Mélange n 1 Mélange n 2 Mélange n 3 - TritonR BardacR - BardacR 0,1 g/100 ml 4 % 0,04 g/100 ml - Hexamidine - Digluconate 2,5 g/100 ml 0,05 g/100 ml S. aureus E E E CIP 53154 E. coli E E E CIP 54127 P. aeruginosa E E E CIP A22 S. aureus E E E E. coli E E E P. aeruginosa E E E P. vulgaris E E E C. albicans E E E IV - Conclusion. - Après 1 minute de contact aucun mélange n'est efficace sur toutes les souches étudiées. Le mélange n 3 est cependant le plus efficace puisque seule une souche de Proteus vulgaris semble insensible. - Après 5 minutes de contact, seul le mélange n 1 montre une efficacité sur toutes les souches étudiées. Le mélange n 3 pourrait être considéré comme efficace s'il n'y avait la même souche de Proteus vulga- ris qui résiste au produit même après 5 minutes. - Après 10 minutes de contact, les mélanges n 1, 2 et 3 donnent un résultat satisfaisant sur l'ensemble des souches étudiées. ESSAI 2 Un autre essai a été réalisé à partir des solutions suivantes - 100 ml d'une solution à 0,1 % de digluconate de chlorhexidine (pH 6) et - 100 ml d'une solution à 0,1 % de Bardac 22. L'activité de ces solutions, seules ou en combinaison a été plus particulièrement testée vis-à-vis de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 11229 et Candida albicans ATCC 10231. Les tests ont été réalisés conformément au protocole décrit dans le Chapitre 1/2.1 et 2.2 de Richtlinien fur die Prufunq und Bewertung chemischer Desinfektionsverfahren der DGEM, Stand 1.1., 1981). Les Tableaux A, B et C illustrent respectivement l'activité bactéricide et fongicide d'une solution aqueuse à 0,1 % de digluconate de chlorhexidine, d'une solution aqueuse à 0,1 % de Bardac 22 et d'un mélange à part égale des deux composés. Les protocoles dont ces Tableaux illustrent les résultats comprennent une incubation de 72 heures à 37 C et l'utilisation, comme témoins, des substances inactivantes suivantes A : Tweens 80 3 % + lécithine 0,3 % + cystéine 0,1 % B : Tweens 80 3 % + saponine 3 % + cystéine 0,1 % + histidine 0,1 % C : Tweens 80 3 % + lécithine 0,3 % + histidine 0,1 % + thiosulfate de sodium 0,5 %. Dans ces Tableaux, le signe "+" indique une croissance et le signe "-" l'absence de croissance. Le Tableau A suivant, qui illustre l'activité bactéricide et fongicide d'une solution aqueuse à 0,1 % de digluconate de chlorhexidine (1 % de la solution test correspond à 0,001 % de digluconate), montre l'inhibition de la croissance de S. aureus et de E. coli par une dilution à 0,5 % de la solution de digluconate de chlorhexidine précitée, correspondant à une concentration en substance active de 0,0005 % ; C. albicans est inhibé par une dilution à 1 % de ladite solution (0,001 % de digluconate de chlorhexidine). Dans le Tableau B, le, chlorure de didécyldiméthylammonium montre un effet encore plus prononcé d'inhibition des organismes à Gram positif S. aureus et C. albicans avec une dilution à 0,1 % (= 0,0001 % de chlorure de didécyldiméthylammonium) et une inhibition de E. coli (organisme à Gram négatif) avec une dilution à 0,5 % (= 0,0005 % de chlorure de didécyldiméthylammonium) (Tableau B). Le Tableau C montre que l'association de ces deux antiseptiques permet l'inhibition de la croissance des microorganismes précités à des dilutions significativement plus importantes (action vis-à-vis de E. coli et C. albicans à des concentrations de 0,00025 % de digluconate de chlorhexidine et de 0,00025 % de chlorure de didécyldiméthylammonium ; action vis-à-vis de S. aureus pour une concentration de 0,00005 % pour chacun des deux antiseptiques précités). TABLEAU A (digluconate de chlorhexidine seul 1 % de solution # 0,001 % de digluconate). Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 Conc, % (vol/vol) non A B C non A B C non A B C 1,0 - + + + - + + + - + + + 0,5 - + + + - + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + 0,025 + + + + + + + + + + + + 0,0125 + + + + + + + + + + + + 0,00625 + + + + + + + + + + + + TABLEAU B (Bardac 22 seul, 1 % de solution # 0,001 % de BardacR) Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 Conc. % (vol/vol) non A B C non A B C non A B C 1,0 - + + + - + + + - + + + 0,5 - + + + - + + + - + + + 0,1 - + + + + + + + - + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + 0,025 + + + + + + + + + + + + 0,0125 + + + + + + + + + + + + 0,00625 + + + + + + + + + + + + TABLEAU C (Composition conforme à l'invention solution à 2 % # 0,001 % de BardacR et 0,001 % de CHG) Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 Conc. % (vol/vol) non A B C non A B C non A B C 2,0 - + + + - + + + - + + + 1,0 - + + + - + + + - + + + 0,5 - + + + - + + + - + + + 0,1 - + + + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + 0,025 + + + + + + + + + + + + 0,0125 + + + + + + + + + + + + 0,00625 + + + + + + + + + + + + Les tests dont les résultats sont illustrés aux Tableaux D, E et F ont été réalisés à une température de réaction de 22 avec une incubation des sous-cultures 72 heures à 37 C avec comme substances inactivantes TweenR 80 3 % + saponine 3 % + cystéine 0,1 % + histidine 0,1 % ; ces Tableaux illustrent respectivement l'activité bactéricide et fongicide d'une solution aqueuse à 0,1 % de digluconate de chlorhexidine, d'une solution aqueuse à 0,1 % de Bardac 22 et d'un mélange à part égale des deux composés et montrent l'action des antiseptiques précités, en fonction du temps de contact, et font apparaître la même synergie d'action de l'association que ci-dessus, dans la mesure où l'association des deux composés permet de diminuer significativement leur concentration, pour l'obtention d'un même effet. TABLEAU D (CHG seul) Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 organismes/ml : organismes/ml : organismes/ml 8 x 10 2 x 10@ 8 x 10 Temps de désinfection (minutes) Conc. % (vol/vol) 1 3 5 15 30 60 1 3 5 15 30 60 1 3 5 15 30 60 25 + + + + - - + + + - - - + + + - - - 10 + + + + + - + + + - - - + + + + - 5 + + + + + + + + + + - - + + + + - 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + + + + + + + TABLEAU E (Bardac seul) Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 organismes/ml : organismes/ml: organismes/ml 8 x 108 2 x 109 8 x 107 Temps de désinfection (minutes) Cons. % (vol/vol) 13 5 15 30 60 13 5 15 30 60 13 5 15 30 60 25 + 10 + - - - - - + + - - - - - - - - - 5 + + + - - - + + + - - - + + - - - 1 + + + + - - + + + + + + + + + + - 0,5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + + + + + + + TABLEAU F (Composition conforme à l'invention) Essai S. aureus E. coli Candida albicans Souche ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 1031 organismes/ml : organismes/ml : organismes/ml 8 x 10 2 x 109 8 x 10 Temps de désinfection (minutes) Conc. % (vol/vol) 1 3 5 15 30 60 1 3 5 15 30 60 1 3 5 15 30 60 25 + - - - - - - - - - - - + - - - - 10 + + + - - - - - - - - - + - - - - 5 + + + + - - + - - - - - + + + - - 1 + + + + + + + + + + - - + + + + + + 0,5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + + + + + + + + + + EXEMPLE 5 : Action spermicide. 1. PROTOCOLE Les différents échantillons de sperme (une goutte de sperme/échantillon) sont obtenus à partir de volontaires sains. - Mesure de la vitalité Une goutte de sperme est traitée par l'éosinenigrosine. Un frottis est ensuite réalisé et cent spermatozoides sont examinés au microscope. Les cellules mortes sont colorées en rouge, soit totalement, soit partiellement. Les cellules vivantes sont incolores. - Substances étudiées Les substances étudiées ont été d'une part, le Bardac et le digluconate de chlorhexidine, testés seuls et en association conformément à l'invention, d'autre part, le Triton X 100R et l'hexamidine, testés en association, conformément à l'invention. Les différentes étapes du protocole sont indiquées aux Tableaux V à VIII. Le temps de contact maximum des différentes substances et du sperme a été limité à 3 minutes afin de garantir l'efficacité de la méthode dans les conditions d'utilisation. La concentration des solutions actives dans le sperme a été limitée à 10 % afin de diminuer les risques de toxicité des produits pour les muqueuses. TABLEAU V Temps de contact des substances et du sperme 1 Min 3 Min BARDAC Concentration des solutions dans le sperme 10 % 5 % 10 % Témoin Concentration des à TO solutions en substances actives 2.8 # 7.1 0,4 % 10.7 # 7.6 5 + 6.4 0.8 + 1.2 0.8 # 1 1.4 + 5.9 0,6 % 10.5 + 9.7 9.2 + 12.9 2.2 ~ 4.5 0.4 + 0.9 81.4 # 5.9 0,8 % 9.7 # 10.2 1.8 # 2.5 0 0 @9.7 + 5.3 1 % 0 0 0 0 TABLEAU VI Temps de contact des substances et du sperme 1 Min 3 Min DIGLUCONATE DE CHLORHEXIDINE Concentration des solutions dans le sperme 5 % 10 % 5 % 10 % Témoin Concentration des à T0 solutions en substances actives 88 # 6.2 % 0,5 % 77 # 10.8 77.2 # 5.6 78 # 5.7 75.5 # 4.8 TABLEAU VI I Temps de contact des substances et du sperme 1 Min 3 Min BARDAC + DIGLUCONATE DE CHLORHEXIDINE Concentration des solutions dans le sperme 5 % 10 % 5 % 10 % Témoin Concentration des à T0 solutions en substances actives 88.4 # 5.4% B 0.4 % + DC 0.5 % 15.6 # 13.2 5.1 # 8 8.6 # 10.8 2.4 # 4.1 0,8 21.3 # 14 6.7 # 3 18.3 # 13.3 6.3 # 7.8 1 19 # 11.1 10 # 8.7 16 # 9.8 9.3 # 11.9 B 0.6 % + DC 0.5 % 6.3 # 11 4 # 6.9 1.3 # 2.3 1 # 1.7 B 0.8 % + DC 0.5 % 3.7 # 6.3 0 2 # 3.5 0 TABLEAU VII Temps de contact des substances et du sperme I Min . 3 Min TRITON + HEXAMIDINE Concentration des solutions dans le sperme 5 % 10 % 5 % 10 % Témoin Concentration des à T0 solutions en substances actives lA + Sa T 2 % + H 20 % 24.3 # 23.6 | 8.4 # 13.6 | 6 # 8.7 | 6 # 13.4 | | + H 50 % |30 # 20.6 | 3 # 2.5 | 14.2 # 9.5 | 0.3 # 0.6 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven tion. REVENDICATIONS 1) Compositions à base d'antiseptiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux antiseptiques (paire d'antiseptiques) à des concentrations efficaces minimales diminuées d'au moins un facteur 5 par rapport aux concentrations efficaces minimales de chacun desdits antiseptiques pris isolément, lesquelles paires d'antiseptiques sont choisies parmi les paires suivantes I - antiseptique cationique-sel hydrosoluble de chlorhexidine, II - antiseptique non ionique-hexamidine, III - antiseptique cationique-antiseptique non ionique, IV - antiseptique non ionique-sel hydrosoluble de chlorhexidine, et exercent une action polyvalente vis-à-vis des organismes pathogènes. 2) Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'antiseptique cationique est choisi parmi les ammoniums quaternaires. 3) Compositions selon la revendication 2, caractérisées en ce que lesdits ammoniums quaternaires sont choisis dans le groupe constitué par les halogénures d'alkylbenzoyldialkylammonium et les halogénures de dialkyldialkylammonium. 4) Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce que l'halogénure d'alkylbenzyldialkylammonium est de préférence du chlorure d'alkylbenzyldiméthylammonium (chlorure de benzalkonium). 5) Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce que l'halogénure de dialkyldialkylammonium est de préférence du chlorure de didécyldiméthylammonium. 6) Compositions selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent en pourcentage un ammonium quaternaire à une concentration 7) Compositions selon la revendication 6, caractérisées en ce que l'ammonium quaternaire est à une concentration comprise entre 0,00005 et 0,4 % et le digluconate de chlorhexidine est à une concentration comprise entre 0,00005 et 0,5 %. 8) Compositions selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisées en ce qu'elle comprend l'ammonium quaternaire et le digluconate de chlorhexidine à des concentrations identiques, de préférence entre 0,00005 et 0,04 %. 9) Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'antiseptique non ionique est choisi parmi les dérivés hydrosolubles de polyoxyéthylène. 10) Compositions selon la revendication 9, caractérisées en ce que ledit dérivé de polyoxyéthylène est un nonoxynol. 11) Compositions selon la revendication 10, caractérisées en ce que ledit nonoxynol est du nonylphénoxypolyéthoxyéthanol. 12) Compositions selon la revendication 9, caractérisées en ce que ledit dérivé de polyoxyéthylène est un octoxynol. 13) Compositions selon la revendication 12, caractérisées en ce que ledit octoxynol est de l'octylphénoxypolyéthoxyéthanol. 14) Compositions selon la revendication 1 ou l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisées en ce qu'elles comprennent ledit dérivé de polyoxyéthylène à une concentration comprise entre 0,1 et 10 % et de l'hexamidine à des concentrations 15) Compositions selon la revendication 1 ou l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisées en ce qu'elles comprennent ledit dérivé de polyoxyéthylène à une concentration comprise entre 0,1 et 10 % et du digluconate de chlorhexidine à une concentration 16) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'obtention d'un agent virucide. 17) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'obtention d'un médicament bactéricide. 18) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'obtention d'un médicament fongicide. 19) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'obtention d'un médicament à action polyvalente et rapide pour le traitement des infections à germes pathogènes. 20) Application des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à la préparation de microsphérules ou microcapsules pouvant être incluses dans de l'élastomère, une bande de tissu ou un pansement. 21) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'obtention d'un produit d'hygiène et de désinfection destiné à l'usage externe. 22) Utilisation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, éventuellement associées à une quantité suffisante d'un diluant du sperme, pour l'obtention d'un spermicide. 23) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que le diluant du sperme est choisi dans le groupe constitué par les protéases d'origine végétale et les enzymes lytiques.