Brevet FR2694766A1 — publié le 19940218

L'Invention est relative au clonage de séquences d'ADN portant un gène codant pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, à la production de ladite aminopeptidase, et à ses utilisations. Les lactocoques utilisés dans l'industrie laitière ont un système protéolytique complexe qui joue un rôle à la fois dans la croissance bactérienne et dans la maturation du fromage. Les acides aminés libres et les petits peptides nécessaires à la croissance bactérienne sont présents dans le lait en quantité relativement faible, et les microorganismes doivent donc hydrolyser les protéines principales du lait, les caséines, afin de pouvoir atteindre une densité cellulaire élevée. En outre, les enzymes protéolytiques contribuent à la maturation du fromage en produisant des acides aminés libres qui sont les précurseurs des arômes du fromage, et en dégradant les peptides amers responsables de défauts du fromage. La protéinase extracellulaire associée à l'enveloppe cellulaire [MONNET et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31:112-118 (1989)], hydrolyse dans un premier temps la caséine en oligopeptides. La dégradation ultérieure de ces oligopeptides par des peptidases, en combinaison avec l'action de systèmes de transport des peptides et des acides aminés, produit les acides aminés utilisés par les bactéries pour leur biosynthèse. Une grande variété de peptidases dotées de spécificités différentes ont été mises en évidence dans différentes souches de Lactococcus lactis ; plusieurs enzymes, par exemple des aminopeptidases, des dipeptidases, des tripeptidases aussi bien que des endopeptidases (pour revue voir J. KOK [FEMS Microbiology Reviews, 87, 15-42 (1990)], ont été purifiées et leurs propriétés biochimiques ont été déterminées. En outre, des études génétiques ont été entreprises dans le but d'obtenir plus d'informations concernant la structure, la localisation et l'expression de ces enzymes, afin d'élucider la contribution de chacune d'entre elles dans le processus de dégradation des caséines. Le clonage desdits gènes a également été entrepris, dans le but, par exemple de pouvoir augmenter l'expression d'une enzyme en insérant plusieurs copies du gène correspondant dans une même bactérie, ou de pouvoir les transférer dans une autre souche bactérienne utilisée dans l'industrie laitière, ou de pouvoir produire les enzymes correspondantes par génie génétique. Le gène pepXP codant pour une X-prolyldipeptidyl-aminopeptidase a été caractérisé le premier [NARDI et al., Appl. Environ. Microbio., 57, 45-50, (1991) ; MAYO et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 3844, (1991)] Plus récemment, le gène pepN qui code pour une métallo-aminopeptidase dénommée PepN (ou également AP II) a été cloné, VAN ALEN-BOERRIGTER et al [Appl. Environ. Microbiol. 57:2555-2561 (1991)]. L'aminopeptidase AP II avait été caractérisée et purifiée auparavant par TAN et KONINGS, [Appl. Environ. Microbiol., 56:526-532 (1990)] Une autre aminopeptidase, dénommée PepC (ou également AP I), et possédant également une large spécificité de substrats, a été purifiée à partir de Lactococcus. lactis subsp cremoris AM2, et son existence chez d'autres lactocoques a été démontréé [NEVIANI et al., Appl. Environ. Microbiol., 55:2308-2314 (1989) Demande PCT WO/91 03738, au nom de 1'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE ; BOQUIEN et al., Appl Environ. Microbiol., 57, 2211-2216, (1991)]. Des études biochimiques et immunochimiques ont montré que 1'aminopeptidase PepC est clairement différente de l'aminopeptidase PepN. L'aminopeptidase PepC hydrolyse des acides aminés substitués par le naphtylamide, aussi bien que des di- et des tripeptides. I1 s'agit d'un hexamère de 300 kDa composé de sous unités identiques, et son activité enzymatique est inhibée par les composés qui bloquent les groupes thiol, mais pas par les inhibiteurs classiques des sérines protéases et des métallo-protéases. Les Inventeurs ont maintenant entrepris de cloner et de séquencer le gène codant pour l'aminopeptidase PepC des lactocoques. Le gène codant pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 a été cloné par complémentation d'un mutant pepN de Escherîchia col i, lequel mutant est dépourvu d'activité aminopeptidase. Une banque d'ADN de la souche AM2 a été construite dans le mutant de E. coli en utilisant le plasmide Bluescript, et été criblée à l'aide d'un essai enzymatique sur boîte en utilisant la Leu--naphtylamide comme substrat. Un clone exprimant l'activité aminopeptidase PepC a été sélectionné par immunoblotting en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre l'enzyme purifiée. Le gène codant pour l'aminopeptidase PepC, dénommé pepC, a été sous-cloné et séquencé. I1 code pour une protéine de 435 acides aminés. I1 apparaît qu'il ne possède pas de séquence signal, ce qui suggère une localisation intracellulaire de l'enzyme.L'analyse de la séquence d'acides aminés déduite de la séquence nucléotidique de pepC montre une homologie importante avec le site actif des protéases à cystéine, et en particulier une conservation des acides aminés impliqués dans le site catalytique. La présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, ou pour un fragment de celle-ci. La séquence d'un fragment d'acide nucléique conforme à l'Invention est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le n SEQ. ID. N 1. La séquence codant pour l'aminopeptidase PepC (cadre de lecture ORF1) correspond aux bases 718 à 2025 de ladite séquence. La séquence polypeptidique de l'aminopeptidase PepC déduite du cadre de lecture ORF1 est également représentée. I1 doit être bien entendu que l'invention englobe également tous les fragments d'ADN dont la séquence est dérivée de la séquence SEQ. ID. N 1, et en particulier des fragments d'acide nucléique de plus de 10 pb s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence, ou avec son complémentaire, ainsi que toutes les séquences qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis ou d'une espèce de lactocoque voisine, ainsi que pour ses isoformes ou variants alléliques, ou pour un fragment de ces protéines. De telles séquences peuvent par exemple, être obtenues à partir de la séquence SEQ. ID. N 1 par mutagenèse dirigée. L'Invention a également pour objet des vecteurs recombinants (plasmides, virus, etc...) caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un segment d'ADN tel que défini ci-dessus, codant pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, ou pour un fragment de celle-ci. Un vecteur recombinant conforme à l'Invention a été déposé en date du 12 août 1992, sous le numéro de dépôt I-1258, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, 25, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant des séquences propres à contrôler l'expression du gène pepC (promoteur, terminateur, etc...). La présente Invention a également pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes transformées (et en particulier des microorganismes), caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus, et en particulier les cellules comprenant au moins un exemplaire du gène codant pour l'aminopeptidase PepC . Ce gène peut être porté par un vecteur recombinant conforme à l'Invention, ou bien intégré dans 1ADN chromosomique de la cellule hôte. L'Invention a également pour objet un polypeptide de 435 acides aminés dont la séquence est celle de 1'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, et plus particulièrement celle de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2, codée par le cadre de lecture de la séquence nucléotidique représentée à la liste des séquences, sous le numéro SEQ. ID. N 1. L'Invention englobe, bien entendu, les polypeptides dont la séquence ne diffère de la séquence mentionnée ci-dessus que par quelques acides aminés, en particulier des polypeptides représentant des variants alléliques ou des isoformes de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis. L'Invention comprend également tout fragment peptidique dont la séquence représente plus de 5 acides aminés consécutifs de celle de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis ; un tel fragment est avantageusement un polypeptide portant un épitope spécifique de ladite aminopeptidase L'Invention comprend également des préparations d'aminopeptidase PepC obtenues par génie génétique, ainsi que de manière plus générale, des préparations de protéines recombinantes comprenant tout ou partie de la séquence de l'aminopeptîdase PepC, éventuellement fusionnée avec une autre séquence peptidique. L'Invention concerne également un procédé de production de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, ou d'une protéine recombinante telle que définie ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on procède à la mise en culture de cellules transformées telles que définies plus haut, comprenant au moins un fragment d'ADN conforme à l'Invention. Les cellules transformées, ainsi que les préparations d'aminopeptidase PepC obtenues par génie génétique conformément à l'Invention, sont utilisables dans l'industrie agro-alimentaire pour la fabrication d'aliments, en particulier de fromages. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère au clonage et à l'expression du gène pepC de Lactococcus lactis, cloné à partir de Lactococcus lactis ssp creinoris AM2. I1 va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : CLONAGE DU GENE DE L'AMINOPEPTIDASE PepC Le gène de 1'aminopeptidase de L. lactis subsp. cremoris AM2 a été cloné par complémentation de la mutation pepN de E. coli 1047. l)Souches bactériennes, plasmides, et milieux de culture L. lactis subsp. cremoris AM2 a été obtenu à partir de la collection de cultures du Centre de Recherches de JOUY-EN-JOSAS. La souche E. coli 1047 (met, supE, supF, hsdS, recA, pepN) est celle décrite par LATIL et al. [Molec. Gen. Genet. 148:43-47 (1976)] ; ce mutant est incapable d'hydrolyser le Leu-ssNA. L. lactis subsp. cremoris a été cultivé, à 30oC, sur milieu M17 [TERZAGHI et al. Appl. Microbiol. Rev. 46:245-268 (1975)], dans lequel le lactose a été remplacé par le glucose . E. coli a été cultivé sur milieu de LURIA-BERTANI [MANIATIS et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, (1982)], à 37 C. L'ampicilline (Ap) a été ajoutée, lorsque nécessaire, à une concentration finale de 50 Rg/ml au milieu de culture. Le plasmide pBluescript a été obtenu auprès de STRATAGENE (La Jolla, Calif.). 2) Clonage moléculaire Une banque d'ADN total de L. lactis subsp. cremoris AM2 a été construite dans la souche mutante de E. coli 1047, en utilisant le plasmide pBluescript. L'ADN de Lactococcus lactis a été préparé selon le protocole décrit par LOUREIRO DOS SANTOS, et A. CHOPIN [FEMS Microbiol. Lett. 42:209-212 (1982)]. Les endonucléases de restriction et la ligase T4 ont été obtenus auprès de BOEHRINGER MANNKEIM BIOCHEMICALS, et utilisées selon les instructions du fabricant. Les protocoles de manipulation de l'ADN, de transformation des cellules E. coli, et de clonage sont ceux décrits par MANIATIS et al. (référence précitée). L'ADN total de la souche AM2 a été digéré partiellement par l'endonucléase Sau3A de manière à obtenir des fragments de taille moyenne 5 kb. Ces fragments ont été ligaturés dans le plasmide pBluescript préalablement digéré par l'endonucléase BamHI et déphosphorylé. Le produit de ligation a été utlisé pour transformer des cellules compétentes E. coli 1047.Les cellules transformées résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnées en procédant à la recherche de l'activité aminopeptidase par essai enzymatique sur plaque, dans les conditions suivantes - La recherche de l'activité aminopeptidase a été faite en utilisant la Leu-Bnaphtylamide (Leu-ssNA) (Sigma) comme substrat. 0,2 ml de solution de L-Leu-ssNA (10 mg/ml dans du méthanol) ont été mélangés avec 5 ml de tampon phosphate (pH 7) et 1 ml de Fast Garnet GBC (SIGMA, St. Louis) (10 mg/ml dans l'eau). Le mélange est versé sur des boîtes de culture portant les bactéries transformées. Après quelques minutes d'incubation à température ambiante, les clones positifs apparaissent colorés en rouge. Le criblage de la banque par cette méthode a permis d'obtenir deux clones positifs à partir de 3000 transformants résistant à l'ampicilline. Les deux clones obtenus ont ensuite été caractérisés par immunoblotting, selon la procédure suivante Un lysat de chacun des 2 clones sélectionnés a été préparé comme suit Les bactéries sont cultivées pendant une nuit dans du milieu LB contenant de l'ampicilline à 50 Fg/ml. Des aliquots d'un ml de culture sont prélevés et centrifugés et le culot bactérien est lavé une fois dans 1 ml de tampon Tri-HCl 200 mM pH 8, et resuspendu dans 25 l de H2O.Le même volume de tampon de dénatiration (Tris 62,5 mM, SDS 2,5%, ss-mercaptoéthanol 5%, glycérol 10%, bleu de bromophénol 0,01%) concentré deux fois a été ajouté et les échantillons sont chauffés à 100 C pendant 5 minutes. 10 1 du mélange sont déposés sur un gel de polyacrylamide et l'on procède à l'électrophorèse en présence de SDS. Après électrophorèse, les protéines sont transférées sur des membranes de nitrocellulose en utilisant une cellule TRANS BLOT (Biorad), pendant 1 heure à 100 volts dans du tampon Tris-HCL 25 mM, 192 mM de glycine pH 8,3 et 20% de méthanol. La saturation de la nitrocellulose et les incubations et lavages ultérieurs sont effectués dans un tampon phosphate 10 mM pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% de poudre de lait écrémé et 0,05% de Tween X100. Des sérums de lapin anti-PepC (1/500), anti-PepN (1/1000), ainsi que des anticorps de chèvre anti-lapin couplés à la peroxydase (dilution 1/1000) (INSTITUT PASTEUR) ont été successivement mis à incuber avec la membrane de nitrocellulose pendant 1 heure à température ambiante. Le 4-chloro-l-naphtol a été utilisé comme substrat pour la peroxydase. Les résultats sont illustrés par la figure 1. Dans la figure 1A la révélation est faite à l'aide d'anticorps anti-PepC, la figure IB correspond à la révélation à l'aide d'anticorps anti-PepN. Dans les deux cas, la piste 1 représente un extrait protéique du mutant pepN de E. coli, la piste 2, le clone positif n 1, la piste 3, le clone positif n 2, la piste 4, un extrait cytoplasmique de L. lactis subsp. cremoris AM2. Les anticorps anti-PepC et anti-PepN reconnaissent respectivement le monomère de 50 kDa de l'aminopeptidase PepC, et l'aminopeptidase PepN dans l'extrait cytoplasmique total de AM2 (piste 4). Aucune bande protéique n'est détectée par l'anticorps anti-PepC dans le lysat du mutant pepN de E. coli (1A piste 1), alors que la bande de 55 kDa qui apparaît lorsque le même lysat est révélé par l'anticorps anti-PepN (figure 1B piste 1) apparaît comme n'étant pas spécifique. Les anticorps dirigés contre PepC reconnaissent une protéine de 50 kDa dans le lysat cellulaire du clone 1 (figure 1A, piste 2) cette bande correspond bien au poids moléculaire du monomère de PepC révélé dans l'extrait cytosolique de AM2 (figure 1A, piste 4). Aucune bande n'est en revanche détectée lorsque le lysat du clone 2 est révélé par l'anticorps anti-PepC (figure 1A, piste 3). En revanche, l'utilisation d'anticorps anti-PepN montre que le clone 2 exprime l'aminopeptidase PepN (figure 1B, piste 3). Le plasmide recombinant obtenu à partir du clone 1 a été dénommé pTIL4. Ce plasmide porte un insert d'ADN de 15 kb. A partir de ce plasmide, un fragment PvuII de 2,7 kb portant le gène de l'aminopeptîdase PepC a été sous cloné. Le plasmide portant ce fragment a été dénommé pTIL24, ce plasmide a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, 25, rue du Docteur ROUX, 75724 PARIS CEDEX 15, en date du 12 août 1992 sous le numéro de dépôt I-1258. La séquence nucléotidique de l'insert d'ADN de 2664 pb du plasmide pTIL24 a été déterminée, par deux techniques différentes : d'une part sur 1'ADN simple brin [NARDI et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 45-50, (1991)], et d'autre part sur ADN double brin, en utilisant le kit de séquençage PROMEGA CYCLE, en suivant le protocole préconisé par le fabricant. Cette séquence est représentée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO 1 : elle contient un premier cadre de lecture (ORF1) de 436 codons, et la partie C-terminale d'un autre cadre ouvert de lecture (ORF2), de même orientation. La longueur de ORF1 correspond à celle d'un cadre de lecture codant pour une protéine de 50 kDa. Un site potentiel de liaison au ribosomes (RBS) complémentaire de l'extrémité 3' du RNA ribosomal 16S de L. lactis subsp. lactis, a été trouvé 4 pb en amont du codon d'initiation AUG. Des régions comportant les séquences consensus des promoteurs -10 et -35 de lactocoque ont été localisées aux positions 581 et 614 de la séquence nucléotidique. Un terminateur potentiel de transcription a été mis en évidence, 14 pb en aval du codon stop de ORF1. Afin de vérifier que ORF1 codait bien pour l'aminopeptidase PepC, la séquence d'acides aminés N-terminale de 1'aminopeptidase PepC purifiée a été déterminée. Cette séquence : Thr-Val-Thr-Ser-Asp-Phe-Thr Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-, concorde avec celle qui est déduite des codons 2 à 16 du cadre de lecture ORF1. Ceci confirme que l'aminopeptidase PepC est codée par ORF1 et démontre que la protéine subit un clivage de la méthionine N-terminale. D'autre part, aucune séquence hydrophobe correspondant à un éventuel peptide signal n'a été localisée. EXEMPLE 2 : SUREXPRESSION DU GENE DE L'AMINOPEPTIDASE PepC CLONE DANS UN VECTEUR MULTICOPIE Le fragment d'ADN cloné de 2,7 kb qui porte le gène pepC et ses propres signaux d'expression a été cloné dans le site XhoI du vecteur multicopie pIL253. Ce vecteur est présent à un nombre de copies de 50 à 60 par bactérie [SIMON et CHOPIN, Biochimie, 70, 559-566 (1988)] Le plasmide recombinant a été introduit par électroporation dans la souche SL5117 de L. lactis subsp. lactis. Cette souche a été obtenue par mutagénèse à la nitrosoguanidine de la souche MQ422 [KIWAKI et al. MOL. MICROBIOL. 3, 359-369, (1989)], qui est elle-même dérivée de la souche NCDO763 après curage de ses plasmides. La souche SL5117 est partiellement dépourvue d'activité aminopeptidase et les expériences d'immunoblotting montrent qu'elle n'exprime plus l'enzyme PepN alors que l'expression de PepC n'est pas affectée. Les clones transformés par le plasmide pIL253 ont été sélectionnés pour leur résistance à l'érythromycine. Les dosages d'activité effectués avec le substrat Met-pNA sur l'un des clones sélectionnés après lyse des bactéries révèlent une activité PepC 25 fois plus élevée dans la souche transformée que dans la souche SL5117 sans plasmide. LISTE DES SEQUENCES : SEQ. ID. N01 CAGCTGAACAACTGGTAATTGATTATTCAGAGAAAAGTGTGATAGTTCAAAAAGAAAAATTAATTGCAAAAAATACTGACGAAAATTTGAAGCTAATTTTTACTGATGGAGTGCAACAAA 120 A E Q L V I D I S E K S V I V Q K E K L I A K N T D N N L K L I F T D G V Q Q ORF# AAGAGATTAACCAGTTTATCAGTAAGAGTCAAGCTTTTGTTGCTGGACTTATGCATGATATTGGTGGGGTTTATCCAAATCATCAGCGAGTAGAAAAAGCAGAATTATTTGGTATAGAAT 240 K E I N Q F I S K S Q A F V A G L N H D I G G V I P N E Q R V E K A L E F G I E TACTGACAGAAGAGCGTGAATTTCCTTTGATTATTCATCAAAAACTTTCTAAATATCTGGCGCGTGAGCATTTTAAAATTACTGACGAAAATATATTGTCAGCGATTGAGTGCCACACAA 480 T L K E N F T E L D L I V F L A D K I S W D G G D N A P F K E G L L T A L S V N TGCAAAGTGCAGCACTTTATTATATAGACTTCATCATCAATGATGGCTTGAAAGTTGCGCACCCGTGGCTTTTAGAAGCAAAGAAAGATTTAGAAAATCAGCTTTCCTAGCTGATTTTTT 600 L Q S A A L Y Y I D F I I N D G L K V A H P W L L E A K K D L E N Q L S * -35 TGATAATTTAGATTATAATAGAAGAATGTAAAAATAATAGAATATCATTAATCAAAATCGATAATGATTATTTTTATCGAAACTTTTGTCAGAAGTTTCGATTTATTGGGAGGTATTATG 720 RES M 1 -10 ORF1# ACAGTAACATCAGATTTCACACAAAAACTCTACGAAAATTTTGCTGAAAACACAAAATTGCGTGCGGTGGAAAATGCCGTGACTAAAAATGGTTTGCTTTCATCACTCGAAGTGCGTGGT 840 T V T S D F T Q E L T E N F A E N T K L R A V E N A V T E N G L L S S L S V R G 41 TCACATGCAGCGAATTTGCCTGAGTTTTCACTTGACTTGACAAAAGACCCTGTAACGAATCAAAAACAATCTGGACGTTGCTGGATGTTTGCTGCTTTGAACACTTTCCGTCATAAATTT 960 S H A A N L P E F S L D L T K D P V T N Q K Q S G R C W M F A A L N T F R H K F 81 ATTAATGAATTTAAAACAGAAGATTTTGAATTTTCACAAGCTTATACTTTCTTCTGGGATAAATATGAAAAATCAAACTGGTTTATGGAACAAATTATAGGAGTAGTTGCGATGGACGAC 1080 I N E T K T E D Z E T S Q A Z T F F W D K Z E K S N W F M E Q I I G D V A M D D 121 CGTCGTTTGAAATTCCTCTTGCAAACTCCACAACAAGATGGTGGTCAATGGGATATGATGGTAGCCATTTTTGACAAATATGGAATTGTTCCAAAAGCTGTTTATCCTGAATCACAAGCT 1200 R R L K F L L Q T P Q Q D G G Q W D M M V A I F D K Z G I V P K A V Z P E S Q A 161 TCAAGTAGCTCACGCGAATTGAATCAATACTTGAACAAATTGCTCCGACAAGATGCTGAAATCTTACGTTATACAATTGAGCAAGACGGTGATGTTCAAGCGGTCAAAGAAGAACTTTTA 1320 S S S S R E L N Q I L N K L L R Q D A E I L R Y T I E Q D G D V Q A V K E E L L 201 CAAGAAGTTTTTAATTTCCTTGCTGTAACTCTAGGTTTGCCACCACAAAATTTTGAATTTGCTTTCCGCAACAAAGATAATGAATACAAAAAATTTGTTGGAACGCCAAAAGAATTCTAC 1440 Q E V F N F L A V T L G L P P Q N F E F A F R N K D N E Y K K F V G T P K E F Y 241 AACGAATATGTTGGGATTGATTTGAACAATTATGTTTCGGTCATTAATGCTCCAACTGCTGATAAACCTATAAACAAAAGCTATACCGTTGAATTTCTTGGTAATGTAGTCGGTGGTAAA 1560 N E Y V G I D L N N Y V S V I N A P T A D K P Y N K S Y T V E F L G N V V G G K 281 GAAGTCAAACACTTGAACGTTGAGATGGACCGTTTCAAAAAATTGGCTATTGCCCAAATGCGGGCGAAACTGTCTGTTTGGGTGACGTTGGTCAAGAATCAAGAATCAAACCGTTCAGCA 1680 E V K H L N V E M D R F K K L A I A Q M Q A G E T V W F G C D V G Q E S N R S A 321 GGACTTTTGACAATGGATTCTTATGATTTTAAATCTTCATTGGATATTGAATTCACACAAAGTAAGGCTGGACGTCTTGACTATGGCGAATCACTGATGACTCATGCCATGGTTTTAGCG 1800 G L L T M D S Z D F K S S L D I E F T Q S K A G R L D Y G E S L N T H A M V L A 361 GGTGTTGATTTAGATGCTGACGGAAATTCAACTAAATGGAAAGTTGAAAATTCTTGGGGTAAAGATGCCGGTCAAAAAGGATATTTCGTTGCTTCTGATGAATGGATGGATGAATATACT 1920 G V D L D A D G N S T K W K V E N S W G K D A G Q K G Y F V A S D E W M D E Y T 401 TATCAAATTGTTGTCCGCAAAGACCTTTAAGCGAAGAAGAATTAGCTGCTTATGAAGCAAAACCTCAAGTTCTGCTTCCAATGGGATCCAATGGGAGCCTTGGCTTAATTTGTAAATTGA 2040 Y Q I V V R K D L L S E E E L A A Y E A K P Q V L L P W D P M G A L A * 436 AACATTTAACTTTTGTTAAATGTTTTTTTATTGACTTAAAGTTCACTTCAAGTGTTAAAATAAAAGAATGAATATAAAAAAGGCCGCCGACTTATCAGGGATAAAAACAGATAATATCAG 2160 ATATTATGAAAGAATTGGGCTAATTCCTAAAATTGCACGGACAGAGTCTGGAATACGAAATTTTTCAGAAGCGAATATTAGAACATTAAAATTCGTCAAACATATGAGAGATGCAGGAGT 2280 GCAAGTAGAACCCTTGACACGTTATATGGTATTGGTAACTGAAGGAAATCCTAATACTAAAGAATAAAGAATTGAAATTCTGAAGAGTCAAGTTGAACAATTGAGAACAGAAATTATTGA 2400 AAAACAATCTGCTTTAGATTATTTAACATTCAAAATTGAAAATTATGATGAAGTCATGCTTCCAAGCGAAATGAATTTGAATCAAAGTTCAACAGAAACAATAAAAATTTGAAGAGGATA 2520 AGGATAAATGGAACTTCGATTATTAAAGTATTTTTGGACAGTTGCCACTGCTGGGACGGTATCCAAAGCTGCTGACAGTTATATATTACACAGCCAACATTATCTAGACAAATTAAAGAA 2640 CTTGAACGAGAATTAGATACTCAGCTTTTTATGCGTATGGGAAAAAGCTTATCTTGACTGAAGATGGTCAATTCTTAAAATCAAAGCTGAAGAGATTTTACAGCTG 2748 LISTE DES SEQUENCES : SEQ. ID. N01 (Suite) REVENDICATIONS 1) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis, ou pour un fragment de celle-ci. 2) Fragment d'acide nucléique selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le n SEQ. ID N 1, ou un fragment de celle-ci. 3) Fragment d'acide nucléique de plus de 10 pb, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement avec une séquence selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2, ou avec son complémentaire. 4) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3. 5) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pTIL24 déposé le 12 août 1992, sous le numéro I-1258, auprès de la C.N.C.M.. 6) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des séquences propres à contrôler l'expression du gène de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis. 7) Cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3. 8) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend 435 acides aminés, et en que sa séquence est celle de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis. 9) Polypeptide selon la Revendication 8, caractérisé en ce que sa séquence est celle de l'aminopeptidase PepC de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2, telle que codée par le cadre de lecture ORF1 de la séquence représentée à la liste des séquences, sous le numéro SEQ. ID. Ne 1. 10) Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il représente plus de 5 acides aminés consécutifs de la séquence de l'aminopeptidase PepC selon l'une quelconque des Revendications 8 ou 9. 11) Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence de l'aminopeptidase PepC selon l'une quelconque des Revendication 8 ou 9, éventuellement fusionnée avec une autre séquence polypeptidique. 12) Procédé de production d'une protéine recombinante selon la Revendication 11, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on procède à la mise en culture de cellules transformées selon la Revendication 7. 13) Utilisation d'une cellule transformée selon la Revendication 7 pour la fabrication d'aliments. 14) Utilisation d'une protéine recombinante selon la Revendication 11 pour la fabrication d'aliments.