Brevet FR2686606A1 — publié le 19930730

NOWEAUX PEPTIDES, ADN RECOMBINANTS CODANT CES PEPTIDES ET MICROORGANISMES TRANSFORMES PAR CES ADN RECOMBINANTS La présente invention concerne de nouveaux peptides, et plus particulièrement, des peptides obtenus à partir de l'hormone de croissance de poissons appartenant à la famille des Acipenseridae, du genre Acipenser. Ces peptides présentent des activités physiologiques. La présente invention concerne également un ADN recombinant codant les peptides mentionnés ci-dessus, ainsi qu'un microorganisme transformé avec cet ADN recombinant. Les organismes naturels, tels que les animaux, les plantes, etc., possèdent une grande quantité de substances physiologiquement actives, qui manifestent des activités biologiques dans un être vivant. Un représentant de ces substances est l'hormone de croissance, qui est un peptide secrété par la glande pituitaire chez un vertébré, et dont on sait qu'elle possède une activité physiologique favorisant la croissance du corps, comme fonction principale. Les structures chimiques des peptides constituant les hormones de croissance (appelées ci-après "hormones") extraites des poissons varient en fonction de la famille et du genre du poisson. On sait également que l'activité physiologique de l'hormone est spécifique pour une certaine espèce. Ceci revient à dire que, si l'on administre à un poisson une hormone obtenue à partir d'un poisson appartenant à la même espèce, cette hormone agit plus efficacement, pour ce qui est de son activité de promotion de la croissance, qu'une hormone obtenue à partir d'un poisson appartenant à une autre espèce. En vue de faire des découvertes permettant de mettre au point de nouveaux agents pharmaceutiques, il est très important de découvrir de nouvelles hormones chez des espèces particulières de poisson, d'isoler ces hormones et de déterminer leur structure chimique, ainsi que de trouver un nouveau domaine d'application pour ces hormones. Jusqu'à présent, on a déterminé la structure chimique d'hormones de croissance extraites de vertébrés inférieurs, en particulier de poissons tels que le saumon argenté et l'anguille, et l'on s'attend à ce que ces hormones soient largement utilisées dans le domaine de la pisciculture. D'autre part, on est parvenu à extraire l'hormone de croissance de l'esturgeon, que l'on pêche depuis longtemps en tant que poisson comestible et dont les oeufs, appelés caviar, constituent un mets recherché, et l'on a étudié l'activité de cette hormone (Farmer, S.W., Hayashida, T., Papkoff, H., et Polenov. A. L., Endocrinology 108, pp 377-381, 1981). Cependant, Farmer et coll. ne donne pas la structure chimique du peptide de l'hormone de croissance d'esturgeon, de sorte que l'on n'a pas fait suffisamment de découvertes pour mettre au point de nouveaux agents pharmaceutiques. En outre, comme les esturgeons ne sont capturés que par la pêche traditionnelle, les quantités extraites d'hormone de croissance d'esturgeon ne sont pas suffisantes pour être utilisées en pisciculture. Etant donné ce qui précède, il est souhaitable de déterminer la structure chimique du peptide de l'hormone de croissance d'esturgeon, de trouver le gène codant ce peptide à partir de sa structure chimique, et ultérieurement, de produire l'hormone de croissance à l'échelle industrielle à l'aide de microorganismes transformés avec ce gène, et de mettre au point des agents pharmaceutiques utiles ou de mettre cette hormone à la disposition de l'industrie de pisciculture. La présente invention fournit un nouveau peptide (I) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes 1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS ; 2) un point isoélectrique de 6,0, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10 3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol. Acide aminé Teneur (mole/mole) Cys 4,2 Asp 19,8 Glu 19,2 Ser 18,6 Gly 7,2 His 2,9 Arg 10,0 Thr 9,7 Ala 9,9 Pro 7,0 Tyr 8,2 Val 10,2 Met 4,6 Ile 6,2 Leu 25,7 Phe 12,1 Trp 0,7 Lys 13,3 La présente invention fournit aussi un nouveau peptide (II) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes 1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS ; 2) un point isoélectrique de 6,1, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10 ; 3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol. Acide aminé Teneur (mole/mole) Cys 4,1 Asp 19,9 Glu 19,3 Ser 18,5 Gly 7,2 His 2,8 Arg 9,9 Thr 9,8 Ala 9,3 Pro 7,0 Tyr 8,1 Val 10,7 Met 5,5 Ile 6,3 Leu 25,9 Phe 12,3 Trp 0,8 Lys 12,4 Les nouveaux peptides (I) et (II) mentionnés cidessus contiennent, en tant que composants majeurs, respectivement les peptides (a) et (b), représentés par la séquence d'acides aminés (1) indiquée ci-dessous. Dans cette séquence d'acides aminés (1), les 143ème 151ème Xbb ème soit Lys, Asp et Ala, soit Met, Asn et Val. Dans ce qui suit, le peptide correspondant au premier cas est appelé "peptide (a)", et le peptide correspondant au second cas est appelé "peptide (b)". Séquence d'acides aminés (1) Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 95 40 4 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Als Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Se Pro Leu Gln 80 85 90 Seu Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 12S 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 i55 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 La présente invention fournit également un ADN recombinant codant le peptide (a) ou (b) qui présente la séquence d'acides aminés représentée par la séquence d'acides aminés (1). La présente invention fournit également un ADN chromosomique qui contient un ADN recombinant codant le nouveau peptide (a) ou (b) mentionné plus haut, et un ADNc correspondant à cet ADN recombinant. La présente invention fournit en outre un microorganisme transformé avec un ADN recombinant codant le nouveau peptide (a) ou (b) mentionné plus haut. On va maintenant décrire la présente invention de façon détaillée. De la façon indiquée ci-dessous, on a isolé le nouveau peptide (I) ou (II) de la présente invention et on en a déterminé la structure. Un extrait alcalin de glande pituitaire d'esturgeon est soumis successivement à une filtration sur gel et à une chromatographie en phase liquide haute performance, selon des procédés classiques, ce qui permet d'isoler et de purifier les nouveaux peptides de l'invention. On détermine la séquence d'acides aminés des nouveaux peptides de l'invention selon la méthode d'Edman, après avoir coupé les nouveaux peptides à l'aide de réactifs chimiques et d'enzymes appropriés. Par là, on constate que les nouveaux peptides (I) et (II) de l'invention contiennent respectivement, en tant que composant majeur, c'est-à-dire en tant que fraction active des nouveaux peptides, le peptide (a) ou (b), mentionné plus haut. En outre, quand on administre les nouveaux peptides de l'invention à du frai d'esturgeon et que l'on mesure la croissance de ce frai en longueur et en poids, on constate que les nouveaux peptides (I) et (II) de l'invention présentent une activité remarquable d'accélération de la croissance du frai d'esturgeon, à la fois en longueur et en poids. D'autre part, on peut produire le peptide (I) ou (II) de l'invention par expression de 1'ADN, en utilisant un microorganisme transformé avec 1'ADN recombinant de la présente invention. De plus, en se basant sur la séquence d'acides aminés (1) des peptides de l'invention, on a déterminé que la séquence de nucléotides (1) de 1'ADN recombinant codant les peptides de la présente invention est la suivante. Séquence de nucléotides (1) AATC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG ACZ TCT CTG TTC ACT MC 44 G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG GCA CTT CTG GCT CAG TAC CTG CAT CAG CTG GCT GAC ATC 89 CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GhC CGA CGA CTG TAG TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GM CAG CGT CAT 134 ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179 AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA MG ACG ATG AGA CTT TGA TAG CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224 GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA GAA CTG CrG CM TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269 CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314 GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AAG TGG TTG AGA GAC CAA AAG CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AM CTG AAA GAC CrG GAA GAA 359 GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT GGT ATC GTT GCN' CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404 CCA TAC CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449 AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT MG CTG CAA TTG CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA MC TAC GGT CTA CTG TCT 494 GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTC ATG CCA GAT GAC AGA TGC TTC AAA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539 ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT MC TGC ACT CTG TAGCTCG 565 TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC AGA 592 TCT TCGA On choisit une fraction appropriée de cette séquence de nucléotides, et on synthétise, selon un procédé de synthèse chimique d'ADN, un fragment d'ADN constitué de 10 bases ou plus, et de préférence de 15 bases ou plus. Le fragment d'ADN ainsi obtenu est ensuite phosphorylé et apparié selon un procédé classique, ce qui permet d'obtenir un ADN double brin. L'ADN double brin est coupé avec une enzyme de restriction appropriée, ce qui donne une sonde pour 1'ADN recombinant de la présente invention. Comme méthode de synthèse d'ADN que l'on peut utiliser pour synthétiser ce fragment d'ADN, on peut mentionner la méthode au triester, la méthode au phosphoramidite, etc. On préfère cependant la méthode au phosphoramidite, parce qu'elle donne le fragment d'ADN avec un excellent rendement. Comme le fragment d'ADN obtenu est chimiquement synthétisé, il est nécessaire de transférer un groupe acide phosphorique de l'adénosine triphosphate (appelé ci-après "ATP") à l'extrémité 5'-OH du fragment d'ADN. Par exemple, on peut phosphoryler l'extrémité 5'-OH à l'aide de la polynucléotide kinase de T4. Le fragment d'ADN peut être lié à l'aide d'ADN ligase de T4 et par hybridation de fragments d'ADN. On peut synthétiser l'ADN recombinant de la présente invention selon les protocoles suivants (a) à (c) a) construction d'une bibliothèque d'ADNc à partir d'un ARNm correspondant aux peptides d'hormone de croissance présents dans la glande pituitaire d'esturgeon ; b) sélection, dans cette bibliothèque d'ADNc, d'un clone contenant un ADNc qui peut s'hydrider avec la sonde préparée de la façon indiquée plus haut, selon le procédé classique utilisant comme sonde un fragment d'ADN partiellement synthétisé selon un procédé chimique, d'après la séquence d'acides aminés du peptide (a) ou (b) ; et (c) synthèse du fragment d'ADN de la présente invention à partir de l'ADNc sélectionné. L'ADN de la présente invention ainsi obtenu est inséré (reclonage) dans un plasmide vecteur convenable, connu comme vecteur représentatif. L'ADN plasmidique comportant le fragment inséré est ensuite introduit dans un microorganisme, tel que la souche Escherichia coli JM105, dont on a traité les cellules pour les rendre compétentes, selon le procédé de ' Hanahan (Hanahan, D., Studies on transformation of Excherichia coli with Plasmids, J. Mol. Biol. 166, pp 55, 1983), et l'on obtient ainsi le microorganisme de la présente invention. Par expression de l'ADN recombinant dans ce microorganisme, on peut obtenir une grande quantité du peptide de la présente invention, c'est-à-dire le peptide hormone de croissance d'esturgeon. Le microorganisme de la présente invention, construit de la façon indiquée plus loin dans les exemples de la présente description, a été déposé au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, (Japon), le 17 avril 1992, sous le numéro d'accès FERM P-12923. D'autres buts et avantages de l'invention seront indiqués dans la description annexée, et ils apparaitront à la lecture de cette description ou bien pourront être appris lors de la mise en pratique de l'invention. Les exemples suivants fournissent une description plus détaillée des modes préférés de réalisation de la présente invention. Exemple 1 Production d'un nouveau peptide Sur des esturgeons pesant 11 à 16 kg, on prélève la glande pituitaire, avant la saison du frai, et on lyophilise ces glandes. On homogénéise une suspension de 0,20 g de glandes pituitaires dégraissées, dans du tampon acétate d'ammonium 50 mM (pH 9,0) contenant 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 15 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), et l'on agite cette suspension homogène à 40C pendant 2 heures, pour réaliser ainsi l'extraction des glandes pituitaires. On soumet ensuite la solution agitée à une centrifugation à 10.000 x g pendant 30 minutes, ce qui permet d'obtenir 5 ml d'un surnageant exempt de résidus insolubles. On soumet directement le surnageant obtenu à une filtration sur gel (colonne Sephadexs G-100, 2,46 x 100 cm). Une fois la colonne équilibrée, on réalise l'élution à 200C, à un débit de 16 ml/h, avec du tampon acétate d'ammonium 50 mM (pH 9,0). On surveille cette élution en mesurant l'absorbance de l'éluat à la longueur d'onde de 280 nm, et l'on recueille ainsi 6 fractions principales. On soumet 13,5 mg de la 4ème fraction à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (colonne ODS-120T, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 ym), en utilisant du gel TSK équilibré avec une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique contenant 50 % d'acétonitrile. On réalise l'élution à 400C et avec un débit de 1 ml/min, avec une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique et contenant de l'acétonitrile en un gradient de concentration de 50 à 80 %. On mesure l'absorbance de l'éluat à la longueur d'onde de 220 nm, et on lyophilise les fractions majeures obtenues. Deux fractions ainsi obtenues sont appelées respectivement "GH-I" et "GH-II".Les quantités de GH-I et GH-II obtenues valent respectivement 1,1 mg et 1,0 mg. On a ensuite déterminé les masses moléculaires et les points isoélectriques de GH-I et GH-II, ainsi que leur composition en acides aminés. Expérience 1 (masse moléculaire) On a établi que GH-I et GH-II sont des substances pures par filtration sur gel à l'aide d'une colonne Sephadex G-100, et par chromatographie à polarité de phases inversée sur du gel TSK (colonne ODS-120T, 0,46 x 25 cm). On a déterminé la masse moléculaire des nouveaux peptides de la présente invention par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (appelée ci-après "méthode SDS-PAGE"). Les substances GH-I et GH-II ont toutes deux une masse moléculaire valant environ 22.000 daltons. Expérience 2 (point isoélectrique) On soumet GH-I et GH-II à une électrofocalisation, sur du gel contenant 2 % d'ampholine (pH 3-10), puis on colore le gel obtenu avec une solution mixte contenant 0,04 % de Bleu Brillant de Coomassie G-250 et 3,5 % d'acide perchlorique. Les points isoélectriques ainsi mesurés de GH-I et de GH-II valent respectivement 6,0 et 6,1. Expérience 3 (composition en acides aminés) On soumet le nouveau peptide de l'invention à une hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % de phénol, à 1100C pendant 24 heures, puis l'on fait réagir la solution résultante avec du phénylisothiocyanate, et l'on obtient ainsi les dérivés phénylthiocarbamylés d'acides aminés. En soumettant ces dérivés à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (colonne ODS-80TM, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 Am) sur du gel TSK, on détermine quantitativement les compositions en acides aminés de GH-I et de GH-II, en opérant avec un gradient des proportions d'éluants (solution d'acétate de sodium 0,14 M (pH 5,4) et acétonitrile).La présence de cystéine (Cys) est confirmée par la méthode d'oxydation à l'acide performique. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1. Tableau 1 Teneur Acide aminé (mole/mole) GH-I GH-II Cys 4,2 4,1 Asp 19,8 19,9 Glu 19,2 19,3 Ser 18,6 18,5 Gly 7,2 7,2 His 2,9 2,8 Arg 10,0 9,9 Thr 9,7 9,8 Ala 9,9 9,3 Pro 7,0 7,0 Tyr 8,2 8,1 Val 10,2 10,7 Met 4,6 5,5 Ile 6,2 6,3 Leu 25,7 25,9 Phe 12,1 12,3 Trp 0,7 0,8 Lys 13,3 12,4 Expérience 4 (détermination de la séquence d'acides aminés et identification de l'acide aminé N-terminal) 1) Détermination de la séquence d'acides aminés On fait d'abord digérer le nouveau peptide de l'invention par de la lysylendopeptidase (conditions : E/S = 1/60, bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 8,0, 370C, 4 heures), puis on le fait digérer par 100 mol de bromure de cyanogène (conditions : acide formique 70 %, température ambiante, obscurité, 18 heures), et enfin, on le fait digérer par de la trypsine (conditions : E/S = 1/60, acétate d'ammonium 0,2 M, pH 8,0, 370C, 4 heures).Les fragments de peptide ainsi obtenus sont séparés par chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée sur du gel TSK (colonne : OTS120T, 0,46 x 25 cm, dimension des particules 5 im). On détecte les fragments intéressants à une longueur d'onde de 210 nm, et on les isole. On traite les fragments obtenus dans un appareil automatique d'excision d'acides aminés, appelé "séquenceur de protéines en phase gazeuse" (modèle 470A, fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.), appareil qui découpe un peptide en morceaux.On analyse ensuite les acides aminés par chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée (appareil SP8100, fabriqué et vendu par Spectra Physics Co., Ltd.), en opérant avec un gradient des proportions d'éluants (solution 0,04 M d'acétate de sodium (pH 4,9)/acétonitrile), sur une colonne C8 à polarité de phases inversée (SEQ-4, 0,46 x 30 cm, fabriqué et vendu par Senshu Kagaku Co., Ltd.). L'identification des acides aminés et la détermination des séquences des fragments peptidiques individuels sont effectuées à partir des résultats d'élution et de valeurs d'essais. A partir des résultats concernant les séquences d'acides aminés des fragments peptidiques individuels, on détermine la séquence totale d'acides aminés en suivant la piste des séquences qui se chevauchent mutuellement. 2) Identification de l'acide aminé N-terminal On effectue la détermination qualitative de l'acide aminé N-terminal selon la méthode au DNS. Le résultat en est que, pour les deux peptides GH-I et GH-II, l'acide aminé N-terminal est Tyr. A partir des résultats des étapes (1) et (2) indiquées ci-dessus, on détermine que les peptides GH-I et GH-II de la présente invention sont respectivement les peptides (a) et (b) ayant les séquences d'acides aminés mentionnées plus haut. Toutefois, comme les peptides de la présente invention peuvent contenir non seulement des parties essentielles pour leur activité, mais également des parties ne concernant pas directement leur activité, la présente invention englobe également dans son cadre des peptides contenant les mêmes séquences d'acides aminés que celles des peptides GH-I et GH-II. Quand on administre les peptides GH-I et GH-II à du frai d'esturgeon pour étudier leurs activités physiologiques en ce qui concerne leur rôle dans l'accélération de la croissance, on constate qu'ils possèdent une remarquable activité d'accélération de la croissance du frai d'esturgeon. L'étape suivante concerne la synthèse d'un ADN recombinant codant un nouveau peptide de la présente invention, ainsi que la préparation d'un microorganisme transformé avec cet ADN recombinant pour qu'il synthétise un nouveau peptide de la présente invention. Exemple 2 Construction d'un ADN recombinant 1. Synthèse de fragments d'ADN Pour construire l'ADN recombinant de la présente invention, on synthétise, à l'aide d'un synthétiseur d'ADN 380A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.), selon la méthode au phosphoramidite, des ADN présentant les séquences de nucléotides 2 à 45 indiquées ci-dessous, qui représentent des fragments de la séquence de nucléotides (1). Dans ce qui suit, on appelle respectivement chacun de ces ADN "fragments d'ADN 2, 3, ... 45", et on les appelle collectivement "fragments d'ADN". Séquence de nucléotides (2) AATTCATGTA CCCGATGATC CCGCTG 26 Séquence de nucléotides (3) ATCATCGGGT ACTG 15 Séquence de nucléotides (4) AGCTCTCTGT TCACTAACGC AGTTCT 26 Séquence de nucléotides (5) CGTTAGTGAA CAGAGAGCTC AGCGGG 26 Séquence de nucléotides (6) GCGTGCTCAG TACCTGCATC AGCTGG 26 Séquence de nudéotides (7) ATGCAGGTAC TGAGCACGCA GAACTG 26 Séquence de nucléotides (8) CTGCTGACAT CTACAAAGAC TTCG 24 Séquence de nucléotides (g) TTTGTAGATG TCAGCAGCCA GCTG 24 Séquence de nucléotides (10) AACGTACTTA CATGCCGAAC GAACAG 26 séquence de nucléotides (11) TTCGGCATGT AAGTACGTTC GAAGTC 26 Séquence de nucléotides (12) CGTCATTCTT CTAAAAACTC TCCG 24 Séquence de nucléotides (13) TTTTTAGAAG AATGACGCTG TTCG 24 Séquence de nucléotides (14) TCTGCTTTCT GCTACTCTGA AACTAT 26 Séquence de nucléotides (15) AGAGTAGCAG AAAGCAGACG GAGAG 25 Séquence de nucléotides (16) CCCGGCTCCG ACTGGTAAAG ACG 23 Séquence de nucléotides (17) ACCAGTCGGA GCCGGGATAG TTTC 24 Séquence de nucléotides (18) AAGCTCAGCA GCGTTCTGAC GTTGAAC 27 Séquence de nucléotides (19) GTCAGAACGA TGCTGAGCTT CGTCTTT 27 Séquence de nucléotides (20) TGCTGCAATT CTCTCTGGCT CTGAT 25 Séquence de nucléotides (21) CCAGAGAGAA TTGCAGCAGT TCAAC 25 Séquence de nucléotides (22) CCAGTCTTGG ATCTCTCCGC TGCA 24 séquence de nucléotides (23) GCGGAGAGAT CCAAGACTGG ATCAGAG 27 Séquence de nucléotides (24) GTCTCTGTCT CGTGTTTTCA CCAACTCTC 29 Séquence de nucléotides (25) GGTGAAAACA CGAGACAGAG ACTGCA 26 Séquence de nucléotides (26) TGGTTTTCCT GACTTCTGAC CGTGTATTC 29 Séquence de nucléotides (27) GGTCAGAAGT CAGGAAAACC AGAGAGTT 28 Séquence de nucléotides (2 8) GAGAAACTGA AAGACCTGGA AGAAGGTAT 29 Séquence de nudéotides (29) CTTCCAGGTC TTTCAGTTTC TCGAATACAC 30 Séquence de nucléotides (30) CGTTGCTCTG ATGCGTGACC TGGGTGAAG 29 Séquence de nucléotides (31) CAGGTCACGC ATCAGAGCAA CGATACCTT 29 Séquence de nucléotides (32) GTGGTTTCGG TTCTTCTACT CTGCTGAAAC 30 Séquence de nucléotides (33) CAGAGTAGAA GAACCGAAAC CACCTTCACC 30 Séquence de nucléotides (34) TGACATATGA CAAATTCGAC GTTAACCT séquence de nucléotides (35) GTCGAATTTG TCATATGTCA GTTTCAG 27 Séquence de nucléotides (3 6) GCGTAACGAC GACGCACTGT TCAAAAAACT 29 Séquence de nucléotides (37) GAACAGTGCG TCGTCGTTAC GCAGGTTAAC 30 Séquence de nucléotides (38) ACGGTCTACT GTCTTGCTTC AAAAAAGAC 29 Séquence de nucléotides (39) TTGAAGCAAG ACAGTAGACC CTAGTTTTT 29 Séquence de nucléotides (40) ATGCATAAAG TTGAAACTTA CCTGAAAGT 29 Séquence de nucléotides (41) GTAAGTTTCA ACTTTATGCA TGTCTTTT 28 Séquence de nucléotides (42) TATGAAATGC CGTCGTTTCG TTGAATCT 28 Séquence de nucléotides (43) AACGAAACGA CGGCATTTCA TAACTTTCAG 30 Séquence de nucléotides (44) AACTGCACTC TGTAGCTCGA GA Séquence de nucléotides (45) AGCTTCTCGA GCTACAGAGT GCAGTTAGAT TC 32 Dans l'opération de purification des fragments d'ADN individuels, on chauffe à 550C pendant 5 heures une solution d'ammoniaque qui contient des bases d'ADN protégées par des groupes protecteurs et des oligonucléotides protégés par des groupes 5'-OHprotecteurs, pour éliminer les groupes protecteurs des bases. On soumet la solution résultante à une évaporation sous pression réduite, pour éliminer l'ammoniaque, puis à une chromatographie en phase liquide haute performance à polarité de phases inversée, pour séparer les oligonucléotides protégés par des groupes 5'-OHprotecteurs. On traite la fraction ainsi obtenue avec de l'acide acétique à 80 %, à la température ambiante et pendant 15 à 30 minutes, pour éliminer les groupes protecteurs des groupes 5'-OH.Après évaporation sous pression réduite, on enlève les sels de la solution résultante, à l'aide d'une colonne de filtration sur gel (Sephadex G25), et l'on obtient les fragments individuels. 2. Phosphorylation des fragments dtADN A un mélange contenant 100 mM de tampon Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de dithiothréitol et 1 mM d'ATP, on ajoute 400 pmol de solutions dont chacune contient respectivement l'un des fragments d'ADN 2-45 obtenus selon le protocole 1 cidessus. On y ajoute ensuite 20 unités de polynucléotide kinase de T4 (fabriquée et vendue par Toyobo Co., Ltd.), et on laisse la réaction se dérouler à 370C pendant 1 heure et 30 minutes. Une fois la réaction terminée, on chauffe le mélange réactionnel à 650C pendant 15 minutes pour inactiver l'enzyme. 3. Liaison des fragments d'ADN a) Fragments d'ADN 2-23 On mélange les unes avec les autres des quantités équivalentes à 80 pmol des solutions contenant les fragments d'ADN 2 à 23 phosphorylés, obtenues selon le protocole 2 ci-dessus, puis on chauffe le tout à 900C pendant 3 minutes et on le refroidit lentement pour permettre à ces fragments d'ADN de s'hybrider. Après refroidissement, on ajoute de 1'ATP pour ajuster la concentration d'ATP du mélange réactionnel à 1 mM. On fait réagir le mélange, à 160C pendant 20 heures, avec 700 unités d'ADN ligase de T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd.). Puis on y ajoute 80 unités de l'enzyme de restriction EcoRI et 120 unités de l'enzyme de restriction PstI, et on fait réagir le tout à 370C pendant 2 heures. On soumet la solution résultante à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %. On découpe dans le gel la bande correspondant au fragment d'ADN double brin d'environ 280 pb, qui représente une partie de la séquence de 1'ADN présentant la séquence de nucléotides (1) (fragment appelé ci-après "S1-l"), on trempe cette bande de gel dans une solution contenant 0,5 M d'acétate d'ammonium et 1 mM d'EDTA, et on élue ce fragment d'ADN à 370C pendant 14 heures. On élimine les sels de l'éluat au moyen d'une colonne NAP-5 (fabriquée et vendu par Pharmacia LBK Biotechnology). b) Fragments d'ADN 24 à 45 On reprend pratiquement le même protocole que celui de l'étape (1) ci-dessus, sauf que l'on utilise des quantités équivalentes à 80 pmol des solutions contenant les fragments d'ADN phosphorylés 24 à 45, au lieu des solutions contenant les fragments d'ADN phosphorylés 2 à 23. On obtient, comme résultat des réactions, un fragment d'ADN double brin d'environ 310 pb, représentant une partie de la séquence de 1'ADN représentant la séquence de nucléotides (1) (fragment appelé ci-après "S1-2"). 4. Préparation d'un ADN vecteur On coupe 2 ,ug du plasmide pKK223-3 (fabriqué et vendu par Pharmacia LBK Biotechnology), à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et Hind III, puis on les soumet à une électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion à 0,7 is. Après avoir coloré le gel résultant avec du bromure d'éthidium (EtBr), on obtient l'ADN vecteur souhaité, dont la longueur vaut environ 4,5 kb (appelé ciaprès "pKK223-3-E-H"). 5. Construction d'un plasmide On fait réagir pKK223-3-E-H, S1-1 et S1-2, avec 350 unités d'ADN ligase de T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd.), pour obtenir un plasmide contenant 1'ADN de la présente invention (appelé ci-après "pKK223-3-GH"). On fait ensuite dégeler de la souche Escherichia coli JM105, destinée à être utilisée dans la transduction, qui était congelée et conservée à -700C. On ajoute 10 ng de pKK223-3-GH à 200 iil de la suspension contenant la souche Escherichia coli JM105 dégelée. Après l'avoir refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, on fait subir à la suspension un choc thermique, à 420C pendant 90 secondes, puis on la refroidit sur de la glace pendant 2 minutes. On ajoute ensuite à cette suspension 800 yl de milieu SOC, et on fait incuber le tout à 370C pendant 1 heure.On étale ensuite la suspension sur une plaque de milieu LB gélosé, contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et on fait incuber le tout à 370C jusqu'au lendemain, pour obtenir des transformants contenant le plasmide pKK223-3-GH constitué de pKK223-3-E-H, S1-l et S1-2 (ces transformants sont appelés ci-après "JMl05/pKK223-3-GH1'). A partir de cette souche JM105/pKK223-3-GH, on isole un ADN plasmidique et on le fait digérer par les enzymes de restriction EcORI et Hind III. On soumet les fragments de l'ADN plasmidique digéré à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Par coloration au EtBr, on confirme que l'un des fragments de plasmide possède une longueur de 596 pb. On vérifie la séquence de ce fragment d'ADN au moyen du kit de séquençage Dye Deoxy Terminator Taq (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.) et du système de séquençage d'ADN, modèle 373A (fabriqué et vendu par Applied Biosystems Co., Ltd.). Ceci apporte la confirmation de ce que ce fragment est bien l'ADN présentant la séquence de nucléotides (1). I1 se confirme également que ce fragment possède une séquence complète de nucléotides, contenant un codon d'initiation, 1'ADN codant le peptide (a) ou (b) présentant la séquence d'acides aminés (1), et un codon d'arrêt. Expérience 5 Expression de 1'ADN codant le peptide hormone de croissance d'esturqeon On fait incuber les transformants JM105/pKK223-3-GH dans un milieu de bouillon L, à 370C pendant 8 heures. On récolte les transformants par centrifugation du milieu liquide de culture. Après avoir soumis les microorganismes à une lyse avec une solution tamponnée de SDS, on soumet le lysat à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15 %, pour séparer les protéines. Par électrophorèse, on transfère les protéines séparées sur un papier à la nitrocellulose. On analyse les protéines en utilisant un anti-sérum lapinique contre l'hormone de croissance de rat, qui présente 71,1 % d'homologie avec l'hormone de croissance d'esturgeon (fabriqué et vendu par Chemicon International Co., Ltd.) et une IgG anti-lapin, liée à une phosphatase alcaline, comme sonde. Ceci apporte la confirmation de ce que le peptide obtenu par expression dans les transformants JM105/pKK2233-GH donne une bande située à la même position que celle que donne l'hormone de croissance d'esturgeon, possédant une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons et extraite, isolée et purifiée à partir d'esturgeons naturels. D'autres avantages et variantes de l'invention apparaîtront facilement à l'homme du métier. Par conséquent, l'invention ne se limite pas aux détails particuliers et aux substances représentatives indiqués dans la description donnée ci-dessus. Diverses variantes peuvent donc être réalisées, sans que l'on sorte du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Nouveau peptide (I) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes 1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS ; 2) un point isoélectrique de 6,0, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10 ; 3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol Acide aminé Teneur (mole/mole) Cys 4,2 Asp 19,8 Glu 19,2 Ser 18,6 Gly 7,2 His 2,9 Arg 10,0 Thr 9,7 Ala 9,9 Pro 7,0 Tyr 8,2 Val 10,2 Met 4,6 Ile 6,2 Leu 25,7 Phe 12,1 Trp 0,7 Lys 13,3 2.Nouveau peptide (I) conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient, comme composant majeur, un peptide présentant la séquence suivante d'acides aminés Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyt Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser TRp Ile Ser Pro Ser Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu ha Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 155 Lys Asp Met His Lys val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Het Lys Cys 170 175 180 Arc Arg Phe val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 3. Nouveau peptide (II) qui présente les propriétés physicochimiques suivantes 1) une masse moléculaire d'environ 22.000 daltons, mesurée selon la méthode d'électrophorèse en gel de polyacrylamide au SDS 2) un point isoélectrique de 6,1, mesuré selon la méthode d'électrofocalisation, à l'aide d'un gel contenant 2 % en poids d'ampholyte vecteur à pH 3-10 ;; 3) la composition en acides aminés indiquée cidessous, déterminée après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 6 N contenant 0,6 % en volume de phénol Acide aminé Teneur (mole/mole) Cys 4,1 Asp 19,9 Glu 19,3 Ser 18,5 Gly 7,2 His 2,8 Arg 9,9 Thr 9,8 Ala 9,3 Pro 7,0 Tyr 8,1 Val 10,7 Met 5,5 Ile 6,3 Leu 25,9 Phe 12,3 Trp 0,8 Lys 12,4 4.Nouveau peptide (II) conforme à la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient, comme composant majeur, un peptide présentant la séquence suivante d'acides aminés Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu Pis Gln Leu Ala Ala Asp le Tyr Lys As 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 40 40 Asn Ser Pro Se Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arc Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly île Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg As Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa ha Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 16 Lys As Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Ara Phe val Glu Ser Asn Cys Thr Leu '85 190 5.Nouveau peptide contenant, comme composant majeur, un peptide présentant la séquence suivante d'acides aminés, dans laquelle les 143ème Xaa, 151ème Xbb et 153ème Xcc représentent respectivement soit Lys, Asp et Ala, soit Met, Asn et Val Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gin Arg Fis Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 /0 75 Gln Phe Ser Les Ala Leu le Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Se - 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Le Met Arg Asp Leu Gly Glu '| Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Se Cys Phe Lys 155 160 16 Lys Asp Met Fis Lys val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arc Arg Phe Val Glu Se Asn Cys Thr Leu 185 190 6.ADN recombinant codant un peptide présentant la séquence suivante d'acides aminés, dans laquelle les 143ème Xaa, 151ème Xbb et 153ème Xcc représentent respectivement soit Lys, Asp et Ala, soit Met, Asn et Val Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val ha Thr Asn Se Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arc Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arc Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 i65 Lys As Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 7.ADN recombinant conforme à la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente la séquence suivante de nucléotides AATTC ATG TAC oeG ATG ATC CCG CTG AGC TCT CTG TTC ACT AAC 44 G TAC ATC GCC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTC GCA CTT CTG CGT CGT CAG TAC CTG CAT CAC CTG CGT CGT GAC ATC 89 CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATC GAC GTA GTC GAC CGA CGA CTG TAC TAC MA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCC AAC GM CAG CGT CAT 134 ATC TTT CTG AAC CTT GCA TGA ATG TAC CGC TTC CTT GTC GCA GTA TCT TCT MA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 17 AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA AAG ACC ATG AGA CTT TGA TAG CCC GCT CCG ACT CGT MA GAC GAA CGT CAG CAG CGT TCT CAC GTT 224 GGC CCA GGC TGA CCA m CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA GAA CTG CTG CM TTC TCT CTG GTC CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269 CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAC GTC AGA ACC TAG AGA CCG CTG CAG TCT CTC TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314 GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CM MG TGG TTC AGA GAC CAA AAG CTG ACT TCT GAC CGT GTA rrC GAG MA CTG AAA CAC CTC GAA GAA 359 GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT CGT ATC CTT CGT CTG ATG CGT CAC CTG CGT GAA CGT GGT TTC CGT 404 CCA TAC CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449 AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT AAG CTG CAA TTG CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA AAC TAC GGT CTA CTG TCT 494 GAC CCA TTC CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTC ATG CCA GAT GAC AGA TGC TTC MA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539 ACC AAC TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATC GAC TTT CAA ATG MA TGC CGT CGT TTC CTT GAA TCT AAC TGC ACT CTG TAGCTCG 585 TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTC ACG TGA GAC ATCGAGC AGA 592 TCT TCCA 8. ADN chromosomique, caractérisé en ce qu'il contient 1'ADN recombinant conforme à la revendication 6. 9. ADNc correspondant à 1'ADN recombinant conforme à la revendication 6. 10. Microorganisme transformé avec 1'ADN recombinant conforme à la revendication 6.