Brevet FR2697088A1 — publié le 19940422

Il DESCRIPTION La présente invention est relative à une méthode de fabrication et d'utilisation de 9 anticorps monoclonaux et de leurs spécificités antigéniques pour diagnostiquer différentiellement les métastases de cancers épithéliaux humains dans les épanchements séreux. Leur utilisation conjointe permet: 1: De confirmer la nature métastatique de carcinome d'un épanchement séreux. 2: De préciser s'il s'agit d'un adénocarcinome ou d'un carcinome épidermoïde indépendamment de la localisation tissulaire. 3: De préciser l'origine de ces carcinomes indépendamment de leur type histologique pour: -les cancers digestifs -les cancers pulmonaires ou oto-rhino-laryngologiques -les cancers ovariens -les cancers rénaux A. BASES ET OBJECTIFS Les carcinomes humains représentent les cancers qui ont pour origine les cellules épithéliales. Les deux grandes subdivisions des épithéliums donnent ainsi naissance à des cancers de types histologiques distincts: -les épithéliums de revêtement dits malpighiens seront à l'origine des carcinomes épidermoïdes ou épithéliomas malpighiens -les épithéliums glandulaires donnent la famille des adénocarcinomes. Les thérapeutiques sont strictement adaptées à chacun des types de carcinomes. Le diagnostic précis d'un carcinome primitif ne pose pas de problème puisque la localisation de la tumeur rend compte du tissu qui a subi une évolution néoplasique. En revanche, au niveau des localisations secondaires ou métastases, il est parfois difficile d'en préciser l'histogénèse. En effet, les cellules cancéreuses ayant acquis leur caractère essentiel, I'instabilité génétypique, subissent au niveau des sites d'invasion, des variations pouvant altérer leur morphologie. II est alors difficile de diagnostiquer précisément la tumeur primitive ce qui compromet l'efficacité thérapeutique. Un des moyens de repérer les divers types de cancers est de cartographier les molécules situées à la surface des cellules grâce aux protéines de reconnaissance que sont les anticorps Les anticorps se combinent aux molécules cellulaires reconnues: ces molécules sont dites antigéniques et peuvent être spécifiques de tel ou tel type cellulaire. Ce sont des immunoglobulines de structures moléculaires bien connues. II deviennent alors des marqueurs par lesquels les cellules peuvent être identifiées. Parmi les divers anticorps, les anticorps monoclonaux représentent des molécules d'anticorps homogènes qui se lient à un seul site antigénique dit épitope ou déterminant. Depuis 1975, KOHLER et MILSTEIN ont développé une technique de production d'anticorps monoclonaux par fusion cellulaire permettant de produire des lignées de cellules hybrides ou hybridomes secrétant des quantités illimitées d'anticorps de spécificité précise et reproductible. Bien qu'il existe d'autres méthodes de fabrication d'anticorps monoclonaux, nous ne retiendrons que celle mise au point par Kôhler et Milstein ( Nature, 256:495-497, 1975 ) Les marqueurs antigéniques cellulaires peuvent être utilisés pour suivre les processus de différenciation cellulaire et pour localiser les anomalies liées à des pathologies d'un système cellulaire donné. C'est par ce moyen que l'on a essayé de repérer des antigènes liés à la maladie cancéreuse en général, puis ceux spécifiques des différentes localisations. En fait les diverses tentatives effectuées pour aboutir à la détection d'antigènes spécifiques des cellules cancéreuses n'ont permis de retrouver que des antigènes de différenciation du lignage cellulaire impliqué ou des antigènes oncofoetaux dont l'expression étaient inhibée dans les tissus adultes. Ces essais ont, en outre, montré que les cellules cancéreuses pouvaient, au cours de la progression maligne, aboutir à une perte quasi totale de tout marqueur. Cette aberration est en accord avec le fait que la tumeur échappe aux défenses immunitaires. Le diagnostic précis des différents carcinomes nécessite pour chaque type la mise en place de marqueurs. Aucun de ceux-ci n'a de spécificité stricte, mais l'utilisation conjointe de plusieurs d'entre eux va permettre le ciblage sélectif de certains types de cellules carcinomateuses. La présente invention a pour objet l'obtention d'un panel d'anticorps monoclonaux (ou ACMC ), tous dirigés contre des antigènes cellulaires. Elle a pour but de montrer comment l'arrangement judicieux des réactivités de ces ACMC permet de cibler différents types de carcinomes. Elle a de ce fait une utilisation pour la précision diagnostique des métastases de cancers d'origine inconnue dans les épanchements séreux. Son objet essentiel est la constitution d'un kit d'immunodiagnostic d'une grande utilité pour les cytologistes. En effet, pour de nombreux patients, la maladie cancéreuse ne devient évidente que par l'apparition de métastases d'emblée, sans qu'aucune tumeur primitive n'ait pu être détectée auparavant. Ces métastases se situent au niveau des séreuses donnant des liquides pleuraux, ascitiques, péricardiques, dans lesquels les cellules cancéreuses évoluent hors de toutes structures tissulaires, en suspension et au milieu d'un ensemble de cellules normales et réactives. Il est parfois difficile de préciser la nature métastatique de ces cellules et leur tissu d'origine. En effet, le revêtement mésothélial des séreuses est constitué par des cellules pluripotentes qui s'activent, se multiplient, à des fins défensives contre toute attaque infectieuse ou néoplasique. Tous les cytologistes connaissent les difficultés d'affirmer un cancer métastatique d'emblée et surtout d'en préciser l'origine. Pour pallier à ces difficultés, ils utilisent un ensemble d'ACMC reconnaissant des antigènes de différenciation cellulaire et des antigènes oncofoetaux. Les antigènes les plus couramment utilisés sont: - les différentes cytokératines, - I'antigène épithélial de membrane (EMA) qui est une protéine du lait humain, - les filaments intermédiaires comme par exemple la vimentine , retrouvée essentiellement dans les cellules des tissus conjonctifs, la desmine et l'actine dans les tissus musculaires, les neurofilaments retrouvés dans les cellules d'origine neuroectodermique, - les antigènes oncofoetaux: l'alpha foetoprotéine et l'antigène carcinoembryonnaire. - les antigènes pan leucocytaires. Avec des anticorps dirigés contre les différents antigènes, les cytologistes effectuent des tests immunologiques avec des marquages à la péroxydase ou à la fluorescéine pour préciser le diagnostic dans les épanchements séreux métastatiques. Malheureusement, un écueil compromet leurs résultats: le manque de spécificité des antigènes utilisés. Par exemple: -les cytokératines se retrouvent au niveau des cellules mésothéliales, des carcinomes et de certains cancers des tissus conjonctifs. -1'EMA est aussi situé sur les cellules mésothéliales et peut être absent de certains carcinomes. -1'ACE n'est pas retrouvé sur tous les adénocarcinomes. C'est pour pallier à cette absence de spécificité que de nombreux chercheurs continuent dans cette voie. L'obtention de nombreux ACMC dirigés contre des antigènes cellulaires est un moyen de repérage de ces antigènes. Pour cibler une population cellulaire cancéreuse il faut deux éléments essentiels: - de nombreux modèles cellulaires représentatifs de cette population: ce sont des lignées de cellules. - la maîtrise de la technique de fabrication des ACMC par la technique d'hybridation cellulaire de Kôhler et Milstein. La présente invention a pour objet la fabrication d'un ensemble de nouveaux ACMC spécifiques de différents antigènes retrouvés sur divers types de cellules présentes dans les épanchements séreux métastatiques des carcinomes d'origines variées. L'expression "divers types de cellules" comprend: les cellules mésothéliales réactionnelles, les cellules macrophagiques, les leucocytes et les cellules tumorales représentatives des différents carcinomes à diagnostiquer. La présente invention concerne les antigènes attachés à ce dernier type de cellules. Ces antigènes peuvent être purifiés à partir de cellules par une méthode de chromatographie d'affinité sur colonnes de Sepharose auxquelles sont rattachés les anticorps spécifiques. Depuis 1981 les inventeurs ont obtenu et caractérisé différentes lignées cellulaires représentatives des carcinomes humains à partir de tumeurs de patients. Cette invention met en jeu le choix approprié de certains de ces modèles les plus représentatifs des divers types de carcinomes en ce qui concerne leur antigénicité. La présente invention concerne l'obtention des différents ACMC reconnaissant les antigènes les plus représentatifs de ces modèles. Elle consiste aussi en la constitution d'une trousse de diagnostic de métastases de carcinomes utilisant 100 jil de surnageant de chacun des hybridomes par test unitaire ainsi que des immunoglobulines conjuguées à la fluorescéine ou à d'autres chromophores. B. PROCEDE D'OBTENTION DES ACMC CONSTITUANT L'INVENTION. 1. Choix et culture des cellules ayant servi d'agents immunogènes. Parmi les lignées entretenues dans leur laboratoire, les inventeurs ont porté leur choix sur les suivantes: -CAL 44 épithélioma malpighien du col utérin; -CAL 18 A adénocarcinome du sein. -CAL 27 EOA malpighien de la base de langue. -CAL 53 glioblastome -CAL 58 glioblastome -CAL 56 astrocytes normaux -CAL 1 Mélanome -CAL 32 Mélanome -CAL 52 Mélanome -647 V cancer de la vessie (lignée fournie gracieusement par l'UCLA Los Angeles, USA) Les lignées prénommées CAL sont des lignées originales appartenant au Centre Antoine Lacassagne NI CE, France. Certaines ont été décrites dans des articles publiés dans des revues spécialisées: il s'agit des mélanomes, de CAL 18 A, de CAL 27. Elles sont maintenues au laboratoire dans des milieux de culture classiques: DMEM (milieu essentiel minimum avec sels de Earle modifié par Dulbecco) auquel on ajoute 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de L.Glutamine, 400 unités/ml de pénicilline et 200 lig de streptomycine.Elles sont utilisées ensemble ou séparément comme agent immunogène pour l'obtention des ACMC dirigés contre des protéines de leur membranes. 2. Immunisation. Les cellules sont injectées à des souris Balb/c par voie intra péritonéale sous forme de 3 injections de 5.106 cellules à 15 jours d'intervalle, rappel tous les mois et hyperimmunisation par une injection IP de 2.106 cellules durant les 3 jours précédant le sacrifice de l'animal. 3. Fusion cellulaire. Les rates des souris immunisées sont prélevées stérilement et lavées dans du milieu de culture. Les lymphocytes sont récupérés et mis en contact avec des cellules d'une lignée de myélome de souris Balb/c appelée NS1 ( lignée par l'ATCC:American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive. Rockville, Maryland 20852 ) dans une proportion de 5 pour 1. La fusion est réalisée par action de Polyéthylène glycol pendant 2 minutes à 37". Le mélange est ensuite lavé, centrifugé et repris dans du milieu sélectif de HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine ) et réparti dans des plaques de microtitration de 96 puits à raison de 100Ll de suspension par puits. Ces plaques ont été ensemencées 48 heures auparavant à l'aide d'une suspension de macrophages de souris irradiés à 20 Grays. Le milieu de HAT provoquera la mort des cellules NSI non hybridées. Les plaques sont incubées à 37 en atmosphère d'environ 7% de C02 durant 2 à 3 semaines. Des clones d'hybridomes vont alors croitre . Lorsqu'ils auront atteint une taille correcte, un test de sélection ou "scrnening" sera utilisé: il permettra de repérer les puits contenant les sécrétions d'anticorps recherchés. 4. Screening par test radio immunologique. II permet de mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre des cellules cibles choisies dans les surnageants de cultures d'hybridomes croissant dans les puits. Des cellules cibles (en général celles ayant servies d'agent immunogène) sont cultivées 48 heures dans des puits de plastique découpable. Puis, 50R1 de surnageant de chaque puits de la fusion sont déposés sur ces cellules durant 30 minutes à température ambiante. Après lavages, un anticorps dirigé contre les immunoglobulines de souris et marqué à l'lode 125 est distribué dans tous les puits. II va donner, avec le complexe antigène cellulaire - anticorps de souris, une structure radioactive qui peut être décelée par un compteur à' scintillation détecteur de rayonnements gamma. 5 Résultats Seuls seront conservés les hybridomes sécrétant de manière stable et définitive des anticorps révélés positivement par le compteur à scintillation. Pour chaque immunisation, on obtient une centaine de puits positifs. L'étude des réactivités des surnageants contenant les anticorps monoclonaux sur toutes sortes de cellules a permis de choisir les 9 hybridomes faisant l'objet de l'invention. Ils sont appelés : GC12, Calam 27, 3D7, SM27, MEZ45, SM13, SM92, SM43 et CM256. Pour chacun, les sous-classes d'immunoglobuline ont été déterminées en utilisant un kit ELISA permettant l'identification des sous-types (Calbiochem). Tous les caractères des 9 anticorps choisis sont résumés dans le tableau 1. 6 . Test d'immunofluorescence II permet d'étudier les réactivités de ces anticorps sur des cellules et des tissus humains et entre de manière non limitative dans la constitution du kit de diagnostic. Les 9 anticorps de la présente invention peuvent être utilisés comme sonde dans la détection de cellules possédant les antigènes reconnus spécifiquement par chacun. Les cellules à étudier sont déposées sur une lame de verre par cytocentrifugation, puis séchées à l'air et non fixées. Ensuite, on fait agir sur ces cellules le surnageant de l'hybridome contenant l'anticorps durant 30 minutes à température ambiante. Après rinçages, un conjugué marqué à la fluorescéine est déposé et va se combiner aux cellules ayant les antigènes fixant l'anticorps utilisé. Au microscope à fluorescence, ces cellules apparaissent entourées d'une fluorescence verte . Cette méthodologie entre dans le kit de détection faisant en partie l'objet de l'invention. Cependant cette méthode n'est pas limitative, les conjugués utilisés pouvant être autre que le fluorochrome. 7. Multiplication de hybridomes et production des anticorps monoclonaux La mutliplication de chaque hybridome peut être effectuée de deux manières - soit "in vitro" dans des flacons de cultures ou des bioréacteurs - soit "in vivo" en ascites de souris Balb C, dans lesquelles on a préalablement injecté du pristane par voie péritonéale La concentration en anticorps monoclonaux obtenue dans les surnageants de culture est de l'ordre 'de 10 ,ug/ml dans les flacons de culture, de 1 mg/ml dans les bioréacteurs et de 10 mg/ml dans les liquides d'ascite. Le kit de diagnostic faisant l'objet de la présente invention utilise pour un test 100 pI de surnageant dosé à 10 ,ug/ml d'anticorps monoclonal. 8 . Antigènes cellulaires reconnus par chacun des 9 anticorps monoclonaux (aussi revendiqués) Les antigènes cellulaires reconnus par chacun des 9 anticorps monoclonaux de la présente invention entrent aussi dans ce même cadre. La caractérisation des protéines cellulaires reconnues, dont les différentes combinaisons s'avèrent spécifiques de divers types de carcinomes, entre aussi dans le cadre de celle-ci. Tout procédé d'isolement de ces protéines membranaires, autre que celui mettant en jeu des anticorps monoclonaux, relève aussi de la présente invention. Outre ce qui précède, l'invention comprend des dispositions concernant l'utilisation des 9 anticorps monoclonaux qui ressortiront de la description qui va suivre. Ce complément de description se réfère à des exemples de réalisation des objets de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Il s'agit essentiellement de procédés de détection de souspopulations cellulaires spécifiques au niveau des épanchements séreux métastatiques des carcinomes. Ces détections spécifiques font intervenir différentes combinaisons de réactivités des 9 anticorps monoclonaux de la présente invention, ainsi que les conjugués fluorescents ou marqués à d'autres chromophores. La méthodologie d'immunisation entre aussi dans la description de ce procédé. Il est donné à titre d'exemples 6 tableaux de réactivités types des 9 anticorps monoclonaux pour: - la détection d'une sous population épithéliale dans les épanchements séreux (tableau 2) Et toujours dans les épanchements séreux - la détection de cellules métastatiques d'épithélioma malpighien indépendamment de toute localisation tissulaire .C.t.l.e.a.u..)... - la détection de populations cellulaires d'origine digestive (tableau 4) - la détection de population cellulaires d'origine ovarienne (tableau 5). - la détection de populations cellulaires d'origine pulmonaire ou de la cavité buccale (tableau 6). - la détection de populations cellulaires d'origine rénale (tablçau 7.). Ce procédé de détection de sous-populations cellulaires spécifiques peut s'étendre à des liquides corporels autres que les épanchements séreux, par exemple le liquide céphalo-rachidien, ainsi qu'à des organes ne comprenant aucun compartiment cellulaire épithélial hors des conditions de dissémination métastatique de carcinomes (cerveau, morelle osseuse, ganglions lymphatiques). La visualisation de cellules réactives avec les différents anticorps monoclonaux, objet de l'invention, peut être faite à l'examen microscopique ou par des techniques informatisées d'analyseur d'images. La présente invention n'exclue pas la détection sérologique d'antigènes reconnus par chacun des 9 anticorps monoclonaux et circulant dans le sérum de patients atteints de carcinomes par toute méthode appropriée. Le principe de cette méthodologie consiste à recouvrir les puits de plaques de microtitration avec chacun des anticorps monoclonaux, puis à incuber 100 ,ul de sérum de patients ou de surnageant de culture de cellules réactives et à visualiser la fixation antigène-anticorps par un conjugué approprié marqué à la peroxydase. TABLEAU 1 ANTICORPS MONOCLONAUX GC12 CALAM 27 3D7 SM 27 MEZ 27 MEWZ 45 SM 13 SM 02 SM 45 CM2-56 Lignéses cellulaires CAL 53 CAL 27 647 V CAL 18A 647 V CAL 18A CAL 18A CAL 18 A OAL 1 immunonènes CAL 58 647 V 647V 647 V 647 V CAL 32 CAL 58 CAL 44 CAL 44 CAL 44 CAL 44 CAL 52 ISOTYPE Ig G 2b Ig G 2a Ig M Ig M Ig M Ig M Ig M Ig G1 Ig G1 TABLEAU 2 Effusions métas- # Effusions Diagnostic Effusions séreuses tatiques métastatiques autres cytologique ou P2 carcinomateuses: que carcinomes :P4 histologique P4 Cancers autres que Carcinomes carcinomes Nombre d'échantillons 57 312 # 71 GC12 4 +à++++ 0 à +++ j 0 à++++ CALAM 27 0 0 à ++++ 0 3D7 0 j 0 à++++ 2 SM27 o ~ * o MEZ 45 o variable SM 13 o variable o SM 92 o variable 0 SM 0 variable O to ++++ CM2-56 o variable 0 to ++++ Identification de Identification de Identification de cellules d'origine Conclusion cellules cellules mésenchymateuses mésothéliales épithéliales et/ou d'origine neuro-ectodermique corrélation 47 /57 311 /312 70/ 71 + 25% de cellules positives ++ 50% de cellules positives 75% de cellules positives ++++ 100% de cellules positives * Au moins un de ces trois anticorps doit être bien positif P2 terminologie utilisée par les cytologistes pour caractériser les épanchements non métastatiques P4 terminologie utilisée par les cytologistes pour caractériser les épanchements contenant de façon certaine des cellules tumorales. TABLEAU 3 Diagnostic cytologique ou Adénocarcinomes Eplthéliomas histologique malplghiens Nombre d'échantillons 259 53 GC12 0 0 CALAM 27 0 à ++++ 0 à ++++ 3D7 0 à ++++ 0 à ++++ SM 27 0 à ++++ 0 à ++++ * MEZ 45 0 + à ++++ SM 13 variable variable SM 92 variable variable SM 43 variable variable CM2-56 variable variable Identification de cellules Identification de Conclusion épithéliales non cellules épithéliales réactives avec réactives avec MEZ45 MEZ 45 corrélation 253/259 48 / 53 TABLEAU 4 Diagnostoc Epithélioma cytologique ou Adenocarcinomes malpighien de histoloaique digestifs lwsesophaae Nombre d'échantillons 46 I GC12 0 0 CALAM 27 0 à++++ ++ 3 D 7 0 à++++ ++ SM 27 0 à++++ * +++ MEZ 45 0 ++ SM 13 0 0 SM 92 + à ++++ ++ SM 43 variable O CM2-56 0 0 Présence de cellules Présence de cellules Conclusion adénocarcinomateuses d'épithélioma réactives avec SM92 malplghien réactives avec SM92 corrélation 41 / 46 1 / 1 TABLEAU 5 Diagnostic cancers germinaux cytologique et Cystadénocarcinomes ovariens et histologique testiculaires Nombre d'échantillons 39 7 GC12 + à ++++ ++ à ++++ CALAM 27 0 à ++++ 0 3 D 7 0 à ++++ 0 SM 27 0 à ++++ * 0 MEZ 45 0 0 SM 13 O O SM 92 O O SM 43 ++ à ++++ ++ à ++++ CM2-56 0 0 Identification de Identification de Conclusion cellules réactives cellules réactives avec SM43, GC12 et avec SM43 et GC12 les ACMC seulement. Perte de antiépithéliaux ACMC antiépithélia corrélation 32 / 39 7 I 7 TABLEAU 6 Diagnostic adenocarcinomes Epithéliomas cytologique ou pulmonaires ou malpighiens histologique O.R.L pulmonaires ou O.R.L. Nombre d'échantillons 15 38 GC12 0 0 CALAM 27 0 à ++++ 0 à ++++ 3D7 0 à ++++ 0 à ++++ SM 27 0 à ++++ 0 à ++++ * SM 27 MEZ45 o + à SM 13 + à ++++ + à ++++ SM 92 variable variable SM 43 variable variable CM2-56 variable variable Présence de cellules Présence de cellules Conclusion adénocarcinomateuses malpighien pulmonaire pulmonaires ou O.R.L ou ORL réactives réactives avec SM13. avec SM13 corrélation 13 /15 29 I 38 TABLEAU 7 Diagnostic cytologique ou Adénocarcinomes histologique rénaux Nombre d'échantillons 12 GC12 + à ++++ CALAM 27 0 à ++++ 3D7 0 à ++++ SM 27 0 à ++++ * MEZ 45 0 SM 13 0 SM 92 0 SM 43 + à ++++ (f) CM2-56 + à ++++ (f) Identification de cellules faiblement réactives avec Conclusion SM43 et CM256, réactives avec GC12 et les ACMC antiépithéllaux corrélation 9 / 12 f : légère réaction d'immunofluorescence I I/REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic des métastases de carcinomes d'origine inconnue dans les épanchements séreux caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des anticorps monoclonaux reconnaissant des antigènes cellulaires humains dénommés GC12, Calam 27, 3D7, SM27, Mez45, SM 13, SM92, SM43 et CM256. 2. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome GCl2 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgG2b. 3. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome 3D7 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgM. 4. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome SM27 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgM. 5. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome Mez45 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgM. 6. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication l, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome Su 13 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgM. 7. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome SM92 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgM. 8. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome SM43 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline lgGl 9. Anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome CM256 et qu'il appartient à la classe d'immunoglobuline IgGl. 10. Conjugués de ces anticorps suivant la revendication l en ce qu'ils sont associés à un marqueur capable de produire un signal détectable de préférence par une substance fluorescente ou un chromophore. 11. Procédé de récupération d'une protéine antigénique reconnue par un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que l'on dénature les cellules et en ce que l'on récupère la dite protéine. 12. Application des anticorps monoclonaux selon l'une des revendications 2 à 9 et de l'anticorps monoclonal Calam 27, en combinaison entre eux sur des cellules humaines ou animales pour la détection spécifique de sous-populations cellulaires normales et pathologiques, tous tissus confondus. 13. Procédé de détection de sous-populations cellulaires normales et pathologiques dans les épanchements séreux, les liquides corporels > le cerveau, la morelle osseuse, les ganglions lymphatiques, caractérisé en ce que l'on combine les réactivités d'un ou de plusieurs anticorps monoclonaux selon les revendications 2 à 9 ainsi que du Calam 27. 14. Toute constitution de trousse de détection de sous-populations cellulaires au moyen d'un ou de plusieurs anticorps monoclonaux, selon les revendications 2 à 9 ainsi que du Calam 27, caractérisé en ce qu'un test unitaire comprend 100 ,ul de surnageant de culture de l'hybridome correspondant. 15. Procédé de production de ces 9 anticorps monoclonaux selon les revendications 2 à 9 ainsi que du Calam 27, caractérisé en ce qu'on multiplie les hybridomes correspondant soit "in vitro" en surnageant de culture ou de bioréacteurs, soit "in vivo" en ascites. 16. Tout procédé de détection de cellules malignes dans un échantillon suspect de contenir les dites cellules en ce qu'il consiste a) à mettre en contact l'échantillon avec les anticorps monoclonaux selon les revendications 2 à 9 et le Calam 27 par les procédés selon les revendications 12 et 13, de façon à permettre les liaisons des anticorps aux sites spécifiques. b) à examiner ou à passer à l'analyseur d'image les liaisons des dits anticorps mononclonaux indiquant la présence ou l'absence de cellules malignes dans les échantillons. 17. Tout procédé de détection sérologique des 9 antigènes reconnus spécifiquement par les anticorps monoclonaux sel-on les revendications 2 à 9.