Brevet FR2686901A1 — publié le 19930806

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides comportant une partie dérivée de la structure du facteur de von Willebrand (vWF) et intrinsèquement capable de se fixer aux plaquettes sanguines et/ou au sous-endothélium. Le vWF est une protéine glycosylée de 2813 acides aminés comprenant une séquence signal de 22 résidus, un région "pro" de 741 résidus et une protéine mature de 2050 acides aminés organisée en plusieurs structures répétées [Titani K. et al., Biochemistry 25 (1986) 31713184; Verweij C.L. et al., EMBO J. 5 (1986) 1839-1847]. Cette glycoprotéine complexe est présente in vivo, soit stockée dans des vésicules spécialisées des cellules endothéliales ou des plaquettes, soit sous forme circulante dans le plasma sanguin après sécrétion et maturation protéolytique lors du processus de sécrétion. Les formes circulantes du vWF sont présentes sous la forme de multimères de haut poids moléculaire (jusqu'à 20 000 kDa) et dont le protomère est un dimère d'environ 450 kDa.Le gène du vWF a été cloné et séquencé par plusieurs équipes et mappé sur le bras court du chromosome 12 [Sadler J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 6394-6398; Verweij C.L. et al., EMBO J. 5 (1986) 1839-1847; Shelton-Inloes B.B. et al., Biochemistry 25 (1986) 3164-3171; Bonthron D. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 7125-7127; Ginsburg D. et al., Science 228 (1985) 14011406]. Le vWF est impliqué dans la génèse des thrombus artériels par une interaction complexe et mal comprise entre certains composants du sous-endothélium d'une part et les plaquettes sanguines d'autre part (et notamment les récepteurs GPlb plaquettaires). Un point important est que le vWF plasmatique circulant ne lie pas spontanément les récepteurs GPlb des plaquettes, et il est vraisemblable que son interaction avec le sous-endothélium soit nécessaire pour démasquer son (ses) site(s) d'interaction avec les plaquettes, par exemple à la suite d'un changement conformationnel du vWF.L'interaction entre le vWF ainsi activé et les GPlb plaquettaires conduit à l'activation des plaquettes sanguines qui acquièrent alors la capacité de s'aggréger et de générer un thrombus fibrino-cellulaire en présence de certaines protéines adhésives (fibrinogène, thrombospondine, vWF etc..). Compte tenu de son rôle précoce dans l'activation plaquettaire, le vWF constitue une cible pharmacologique de choix pour la réalisation d'agents antithrombotiques. Toutefois, de nombreuses difficultés doivent être surmontées pour pouvoir exploiter cette molécule sur le plan pharmacologique: l'incapacité du vWF circulant à lier les plaquettes, la méconnaissance de la contribution respective des différentes fonctions adhésives du vWF (sous-endothélium et plaquettes) dans son activité thrombogénique, la difficulté de produire à des niveaux suffisamment élevés des produits suffisamment purs et homogènes pour pouvoir être utilisés comme agents thérapeutiques, la taille importante du vWF et sa complexité, la dynamique de sa structure tertiaire, etc... Certains fragments du vWF ont été obtenus par digestion protéolytique et étudiés sur le plan pharmacologique. Des fragments recombinants ont également été produits [EP 255 206; Sugimoto M. et al., Biochemistry 30 (1991) 5202-5209; Azuma H. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 12342-12347]. ll ressort de ces études que les molécules obtenues ne sont pas totalement satisfaisantes, et en particulier, ne se comportent pas comme des antagonistes optimaux de l'interaction vWF-plaquettes en l'absence de certains ligands non physiologiques (tels que la ristocétine ou la botrocétine par exemple), ou encore doivent être modifiés chimiquement (réduction et alkylation par exemple), probablement pour démasquer les sites cryptiques de liaison du vWF à la GPlb plaquettaire. La présente invention fournit de nouvelles molécules intrinsèquement capables d'antagoniser au moins partiellement l'activation plaquettaire. Les molécules de l'invention comportent une partie adhésive dérivée de la structure du vWF et une partie permettant sa présentation fonctionnelle et assurant la stabilité et la distribution in vivo de la molécule. La demanderesse a en effet montré qu'il est possible de coupler génétiquement le vWF à une structure de nature protéique, et de produire de telles molécules à des niveaux satisfaisants. Les molécules de l'invention permettent de plus de générer et d'utiliser de petites structures dérivées du vWF et donc très spécifiques d'un effet recherché (par exemple antagonistes de la seule interaction vWF-GPlb). La demanderesse a par ailleurs montré qu'un tel couplage favorisait la présentation de cette structure à son/ses sites de liaison.Les polypeptides de l'invention permettent donc d'exposer, au sein d'une structure stable, des structures dérivées du vWF capables d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes, et de ce fait d'inhiber l'activation plaquettaire. Les polypeptides de l'invention permettent également d'exposer, au sein d'une structure stable, des structures dérivées du vWF capables d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au sous-endothélium. Un objet de la présente invention concerne donc des molécules comportant une partie adhésive dérivée de la structure du vWF capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sous-endothélium, et une partie de nature protéique permettant sa stabilisation et sa présentation in vivo. Plus particulièrement, dans les molécules de l'invention, la partie adhésive est constituée par tout ou partie de la séquence peptidique comprise entre les résidus 445-733 du vWF ou d'un variant de celle-ci. La séquence peptidique du vWF ayant été publiée, la numérotation des résidus de la partie adhésive des molécules de l'invention se réfère à la numérotation de la séquence du vWF publiée par Titani et al. [Biochemistry 25 (1986) 3171-3184]. Il est entendu que cette fonction peut être redondante au sein des molécules de la présente invention. Une partie de cette séquence du vWF (résidus Thr470 à Val713) est indiquée à la Figure 1, dans laquelle elle est couplée en C-terminal de la sérumalbumine humaine. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne toute molécule obtenue par modification de la séquence capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sousendothélium. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification obtenue, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique.De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité de la molécule pour son (ses) site(s) de fixation, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui de réduire sa susceptibilité à des protéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou encore de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques ou biologiques telles que notamment des fonctions adhésives exprimée de façon intrinsèquement non cryptique. Des polypeptides de l'invention particulièrement avantageux sont ceux dans lesquels la partie adhésive présente: (a) la séquence peptidique comprise entre les résidus 445-733 du vWF, ou, (b) une partie de la séquence peptidique (a) capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sousendothélium, ou, (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus) et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, ou, (d) une séquence peptidique non naturelle, par exemple isolée à partir de banques peptidiques et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium. Parmi les structures du type (b), on peut citer plus particulièrement celles ayant conservé la capacité d'antagoniser l'interaction entre le vWF et la GPlb plaquettaire, telles que par exemple les peptides GlO ou D5 décrits par Mori et al. [J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-179041, ou les peptides ayant conservé la capacité de lier le collagène [Pareti F.I. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 15310-15315; Roth G.J. et al. Biochemistry 25 (1986) 8357-8361], et/ou l'héparine [Fujimura Y. et al. J. Biol. Chem. 262 (1987) 1734-1739] et/ou la botrocétine [Sugimoto M. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 18172-18178], et/ou les sulfatides [Christophe O. et al. Blood 78 (1991) 2310-2317] et/ou la ristocétine etc.., ou toute combinaison entre ces différentes fonctions adhésives. Les structures du type (c) comprennent par exemple les molécules dans lesquelles certains sites de N- ou O-glycosylation ont été modifiés ou supprimés, ainsi que les molécules dans lesquelles un, plusieurs, voire tous les résidus cystéine ont été substitués, ou encore des mutants ponctuels et/ou multiples concernant au moins un résidu impliqué dans des pathologies de type IIB associées au vWF comme les résidus Arg543, Arg545, Trp550, Val553 ou Arg578 par exemple.Elles comprennent également des molécules obtenues à partir de (a) ou (b) par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés, et des molécules comportant par rapport à (a) ou (b) des résidus supplémentaires, tels que par exemple une méthionine Nterminale et/ou une séquence signal de sécrétion et/ou un adaptateur polypeptidique permettant la jonction à la structure stabilisatrice. A titre d'exemple on peut citer des polypeptides de l'invention comportant la structure stabilisatrice couplée: - à un peptide de type PI dont la version minimale correspond au peptide G10 compris entre les résidus Cys474 et Pro488 du vWF, ou, - à un peptide de type P2 dont la version minimale correspond au peptide D5 compris entre les résidus Leu694 et Pro708 du vWF ou, - à un peptide de type X ou XA qui correspondent respectivement au fragment du vWF compris entre les résidus Pro488 et Leu694, et ses variants obtenus par délétion, ou, - à un peptide de type X* défini comme tout variant moléculaire des peptides de type X et XA, ou, à toute combinaison de ces peptides, et entre autres:: - les peptides de type PI-P2; - les peptides de type PI-X, P1-Xt, P1-X*; - les peptides de type X-P2, XA-P2, X*-P2; - les peptides de type P1-X-P2; - les peptides de type P1-XA-P2; - les peptides de type P1-X*-P2; - tout peptide adhésif tel que défini plus avant et représenté plus d'une fois au sein de la molécule de l'invention. La partie adhésive des molécules de l'invention peut être couplée, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un peptide de jonction à la structure stabilisatrice protéique. De plus, elle peut constituer l'extrémité N-terminale comme l'extrémité C-terminale de la molécule. Préférentiellement, dans les molécules de l'invention, la partie adhésive constitue la partie C-terminale de la chimère. Préférentiellement, la structure stabilisatrice des polypeptides de l'invention est un polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée. A titre d'exemple, il peut s'agir d'une protéine telle qu'une albumine, une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferine, etc... Il peut également s'agir de peptides dérivés de telles protéines par modifications structurales, ou de peptides synthétisés artificiellement ou semi-artificiellement, et possédant une demie-vie plasmatique élevée. Par ailleurs, la structure stabilisatrice utilisée est plus préférentiellement un polypeptide faiblement ou non-immunogénique pour l'organisme dans lequel le polypeptide de l'invention est utilisé. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine et par exemple la sérum-albumine humaine (SAH). I1 est entendu que les variants de l'albumine désignent toute protéine à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification (mutation, délétion et/ou addition) par les techniques du génie génétique d'un gène codant pour un isomorphe donné de la sérum-albumine humaine, ainsi que toute macromolécule à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification in vitro de la protéine codée par de tels gènes. L'albumine étant très polymorphe, de nombreux variants naturels ont été identifiés et répertoriés [Weitkamp L.R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219].A titre d'exemple, les chimères entre la (les) dite(s) fonction(s) adhésive(s) et la SAH mature possèdent des propriétés pharmacocinétiques et des activités antithrombotiques particulièrement utiles en thérapeutique. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation des molécules chimères décrites ci-avant. Plus précisément, ce procédé consiste à faire exprimer par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide désiré, puis à récolter le polypeptide produit. Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomvces, Kluvveromvces, Pichia, Schwanniomvces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, etc... Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries telles que Escherichia coli, ou appartenant aux genres Corvnebacterium, Bacillus, ou Streptomvces. Les séquences nucléotidiques utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être préparées de différentes manières. Généralement, elles sont obtenues en assemblant en phase de lecture les séquences codant pour chacune des parties fonctionnelles du polypeptide. Celles-ci peuvent être isolées par les techniques de l'homme de l'art, et par exemple directement à partir des ARN messsagers (ARNm) cellulaires, ou par reclonage à partir d'une banque d'ADN complémentaire (ADNc) effectuée à partir de cellules productrices, ou encore il peut s'agir de séquences nucléotidiques totalement synthétiques. Il est entendu de plus que les séquences nucléotidiques peuvent également être ultérieurement modifiées, par exemple par les techniques du génie génétique, pour obtenir des dérivés ou des variants desdites séquences. Plus préférentiellement, dans le procédé de l'invention, la séquence nucléotidique fait partie d'une cassette d'expression comprenant une région d'initiation de la transcription (région promoteur) permettant, dans les cellules hôtes, l'expression de la séquence nucléotidique placée sous son contrôle et codant pour les polypeptides de l'invention. Cette région peut provenir de régions promoteurs de gènes fortement exprimés dans la cellule hôte utilisée, l'expression étant constitutive ou régulable. S'agissant de levures, il peut s'agir du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK), de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD), de la lactase (LAC4), des énolases (ENO), des alcools deshydrogénases (ADH), etc...S'agissant de bactéries, il peut s'agir du promoteur des gènes droit ou gauche du bactériophage lambda (PL, PR), ou encore des promoteurs des gènes des opérons tryptophane (Ptrp) ou lactose (plan). En outre, cette région de contrôle peut être modifiée, par exemple par mutagénèse in vitro, par introduction d'éléments additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels de contrôle. La cassette d'expression peut également comprendre une région de terminaison de la transcription fonctionnelle dans l'hôte envisagé, positionnée immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention. Dans un mode préféré, les polypeptides de l'invention résultent de l'expression dans un hôte eucaryote ou procaryote d'une séquence nucléotidique et de la sécrétion du produit d'expression de ladite séquence dans le milieu de culture. Il est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante des molécules directement dans le milieu de culture. Dans ce cas, la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention est précédée d'une séquence "leader" (ou séquence signal) dirigeant le polypeptide naissant dans les voies de sécrétion de l'hôte utilisé. Cette séquence "leader" peut être la séquence signal naturelle du vWF ou de la structure stabilisatrice dans le cas où celle-ci est une protéine naturellement sécrétée, mais il peut également s'agir de toute autre séquence "leader" fonctionnelle, ou dtune séquence "leader" artificielle.Le choix de l'une ou l'autre de ces séquences est notamment guidé par l'hôte utilisé. Des exemples de séquences signal fonctionnelles incluent celles des gènes des phéromones sexuelles ou des toxines "killer" de levures. En plus de la cassette d'expression, un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombiné peuvent être additionnés, tels que par exemple le gène URA3 de la levure S. cerevisiae ou des gènes conférant la résistance à des antibiotiques comme la généticine (G418) ou à tout autre composé toxique comme certains ions métalliques. L'ensemble constitué par la cassette d'expression et par le marqueur de sélection peut être introduit, soit directement dans les cellules hôtes considérées, soit inséré préalablement dans un vecteur autoréplicatif fonctionnel. Dans le premier cas, des séquences homologues à des régions présentes dans le génôme des cellules hôtes sont préférentiellement additionnées à cet ensemble; lesdites séquences étant alors positionnées de chaque côté de la cassette d'expression et du gène de sélection de façon à augmenter la fréquence d'intégration de l'ensemble dans le génôme de l'hôte en ciblant l'intégration des séquences par recombinaison homologue.Dans le cas où la cassette d'expression est insérée dans un système réplicatif, un système de réplication préféré pour les levures du genre Kluvveromvces est dérivé du plasmide pKDI initialement isolé de K. drosophilarum; un système préféré de réplication pour les levures du genre Saccharomvces est dérivé du plasmide 2 de S. cerevisiae. De plus, ce plasmide d'expression peut contenir tout ou partie desdits systèmes de réplication, ou peut combiner des éléments dérivés du plasmide pKD1 aussi bien que du plasmide 2psi. En outre, les plasmides d'expression peuvent être des vecteurs navettes entre un hôte bactérien tel que Escherichia coli et la cellule hôte choisie. Dans ce cas, une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hôte bactérien sont requises. Il est également possible de positionner des sites de restriction entourant les séquences bactériennes et uniques sur le vecteur d'expression: ceci permet de supprimer ces séquences par coupure et religature in vitro du vecteur tronqué avant transformation des cellules hôtes, ce qui peut résulter en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue des plasmides d'expression dans lesdits hôtes.Par exemple, de tels sites de restriction peuvent correspondre aux séquences telles que 5' GGCCNNNNNGGCC-3' (SfiI) ou 5'-GCGGCCGC-3' (NotI) dans la mesure où ces sites sont extrêmement rares et généralement absents d'un vecteur d'expression. Après construction de tels vecteurs ou cassette d'expression, ceuxci sont introduits dans les cellules hôtes retenues selon les techniques classiques décrites dans la littérature. A cet égard, toute méthode permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule peut être utilisée. Il peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. A titre d'exemple pour les hôtes de type levure, les différentes souches de Kluvveromvces utilisées ont été transformées en traitant les cellules entières en presence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163]. La technique de transformation décrite par Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990) 7] utilisant l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée.Il est aussi possible de transformer les levures par électroporation, selon la méthode décrite par Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 901. Un protocole alternatif est également décrit en détail dans les exemples qui suivent. Après sélection des cellules transformées, les cellules exprimant lesdits polypeptides sont inoculées et la récupération desdits polypeptides peut être faite, soit au cours de la croissance cellulaire pour les procédés "en continu", soit en fin de croissance pour les cultures "en lots" ("batch"). Les polypeptides qui font l'objet de la présente invention sont ensuite purifiés à partir du surnageant de culture en vue de leur caractérisation moléculaire, pharmacocinétique et antithrombotique. Un système d'expression préféré des polypeptides de l'invention consiste en l'utilisation des levures du genre Kluvveromvces comme cellule hôte, transformées par certains vecteurs dérivés du réplicon extrachromosomique pKDI initialement isolé chez K. marxianus var. drosophilarum. Ces levures, et en particulier K. lactis et K. fragilis sont généralement capables de répliquer lesdits vecteurs de façon stable et possèdent en outre l'avantage d'être incluses dans la liste des organismes G.R.A.S. ("Generally Recogmzed As Safe"). Des levures privilégiées sont préférentiellement des souches industrielles du genre Kluyveromyces capables de répliquer de façon stable lesdits plasmides dérivés du plasmide pKD1 et dans lesquels a été inséré un marqueur de sélection ainsi qu'une cassette d'expression permettant la sécrétion à des niveaux élevés des polypeptides de l'invention. La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides chimères décrits ci-avant, ainsi que les cellules recombinantes, eucaryotes ou procaryotes, comprenant de telles séquences. La présente invention concerne aussi l'application à titre de médicament des polypeptides selon la présente invention. Plus particulièrement, l'invention a pour objet toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides tel que décrit ci-avant. Plus particulièrement, ces compositions peuvent être utilisées pour la prévention ou le traitement des thromboses. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LISTE DES FIGURES Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction importants pour la compréhension des donages réalisés ont été indiqués. Figure 1 : Séquence nucléotidique d'un fragment de restriction HindIII codant pour une protéine chimère du type SAH-vWF. Les flèches noires indiquent la fin des régions "pré" et "pro" de la SAH. Le site de restriction MstII est souligné. Un exemple de séquence peptidique incluant un fragment du vWF est en italique. La numérotation des acides aminés corresponds à la protéine chimère mature; le fragment Thr470-Val713 du vWF [Titani K. et al., Biochemistry 25 (1986) 3171-3184] décrit dans cette chimère particulière est numéroté des résidus Thr586 à Va1829. Figure 2 : Schématisation des chimères du type SAH-vWF (A), du type vWF-SAH (B) ou vWF-SAH-vWF (C). Abréviations utilisées: M/LP, résidu méthionine initiateur de la traduction, éventuellement suivi d'une séquence signal de sécrétion; SAH, sérum-albumine humaine mature ou un de ses variants; vWF, fragment(s) du vWF possédant une propriété de fixation aux plaquettes et/ou au sousendothélium, ou un (des) variants obtenus par les techniques du génie génétique. La flèche noire indique l'extrémité N-terminale de la protéine mature. Figure 3 : Carte de restriction du plasmide pYG1OS et stratégie de construction des plasmides d'expression des protéines chimères de la présente invention. Abréviations utilisées: P, promoteur transcriptionnel; T, terminateur transcriptionnel; IR, séquences répétées inversées du plasmide pKD1; LPSAH, région "prépro" de la SAH; Apr et Kmr désignent respectivement les gènes de résistance à l'ampicilline (E. coli) et au G418 (levures). Figure 4 : Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de culture (erlenmeyers) de la souche CBS 293.91 transformée par les plasmides pYG1248 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH P1-X-P2) et pKan707 (plasmide contrôle). Dans cette expérience les résultats des panneaux A, B, et C ont été migrés sur le même gel (SDS PAGE 8,5%) puis traités séparemment. A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste 2); surnageant équivalent à 50 ,ul de la culture transformée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1248 en milieu YPD (piste 3) ou YPL (piste 4). B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de souris dirigés contre le vWF humain: même légende qu'en A à l'exception que des standards biotinilés de poids moléculaire ont été utilisés. C, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de lapin dirigés contre l'albumine humaine: surnageant équivalent à 50 1ll de la culture transformée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1248 en milieu YPD (piste 2) ou YPL (piste 3). Figure 5 : Cinétique de sécrétion d'une chimère du type SAH-P2 par la souche CBS 293.91 transformée par le plasmide pYG1206. A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste 1); surnageant équivalent à 2,5 1 d'une culture "Fed Batch" en milieu YPD après 24h. (piste 2), 40h. (piste 3) ou 46h. (piste 4) de croissance. B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps de souris dirigés contre le vWF humain: même légende qu'en A à l'exception que des standards biotinilés de poids moléculaire ont été utilisés (piste 1). Figure 6 : Caractérisation du matériel sécrété par K. lactis transformé par les plasmides pKan707 (plasmide contrôle, piste 2), pYG1206 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH-P2, piste 3), pYG1214 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH-PI, piste 4) et pYG1223 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH-PI-XA-P2, piste 5); standard de poids moléculaire (piste 1). Les dépôts correspondent à 50 1ll de surnageant d'une culture stationnaire après croissance en milieu YPD, migration dans un gel à 8.5% d'acrylamide et coloration au bleu de coomassie. EXEMPLES TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE. Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & BR Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de 1'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de 1'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de 1'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. La numérotation des acides aminés du vWF est celle de Titani et al. [Biochemistry 25 (1986) 3171-3184]. Les transformations de K. lactis avec l'ADN des plasmides d'expression des protéines de la présente invention sont effectuées par toute technique connue de l'homme de I'art, et dont un exemple est donné dans le texte. Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, gK, strAr), ou E. coli TGI (lac, proA,B, supE, thi, hsdD5 / F'traD36, proA+B+, lacis, lacZ, M15). Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures bourgeonnantes et plus particulièrement aux levures du genre Kluvveromvces. Les souche K. lactis MW98-8C (, uraA, arg, , K+, pKD1") et K. lactis CBS 293.91 ont été particulièrement utilisées; un échantillon de la souche MW98-8C a été déposé le 16 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn (Pays Bas) où il a été enregistré sous le numéro CBS 579.88. Une souche bactérienne (E. coli) transformée avec le plasmide pET8c52K a été déposée le 17 Avril 1990 auprès de l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC 68306. Les souches de levures transformées par les plasmides d'expression codant pour les protéines de la présente invention sont cultivées en erlenmeyers ou en fermenteurs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 280C en milieu riche (YPD: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% glucose; ou YPL: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% lactose) sous agitation constante. EXEMPLE 1: CONSTRUCTION DU PLASMIDE pET-8c52K ET DE SES VARIANTS. Le fragment du cDNA du vWF codant pour les résidus 445 à 733 du vWF humain possède plusieurs déterminants cruciaux de l'interaction entre le vWF et les plaquettes d'une part, et certains éléments de la membrane basale et du tissu sous-endothelial d'autre part. L'amplification de ces déterminants génétiques peut être réalisée, par exemple à partir d'une lignée cellulaire humaine exprimant le vWF, et par exemple d'une lignée de cellules endothéliales de veines de cordon ombilical humain [Verweij C.L. et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 46994717], ou encore à partir d'ARN de plaquettes humaines, par exemple selon le protocole décrit par Ware et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991) 2946-2950]. Les ARN cellulaires sont purifiés en utilisant la technique d'extraction au thiocyanate de guanidium initialement décrite par Cathala et al. [DNA 4 (1983) 329-335] et utilisés comme matrice à la synthèse d'ADN complémentaires (ADNc) incluant la partie du vWF à amplifier.Dans un premier temps, la synthèse du brin non codant se fait en utilisant le kit distribué par Amersham et un oligodéoxynucléotide complémentaire de la séquence nucléotidique de l'ARNm codant pour des résidus contigus localisés en C-terminal de la partie à amplifier. La solution résultante est ensuite soumise à 30 cycles d'amplification enzymatique par la technique PCR, en utilisant comme amorce l'oligodéoxynucléotide précédent et un oligodéoxynucléotide identique à la séquence nucléotidique codant pour des résidus contigus localisés en N-terminal de la partie du vWF à amplifier.Les fragments amplifiés sont ensuite clonés dans des vecteurs du type M13 en vue de leur vérification par séquençage en utilisant soit les amorces universelles situées de part et d'autre du multisite de clonage, soit des oligodéoxynucléotides spécifiques de la région amplifiée du gène du vWF dont la séquence de plusieurs isomorphes est connue [Sadler J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 6394-6398; Verweij C.L. et al., EMBO J. 5 (1986) 1839-1847; Shelton-Inloes B.B. et al., Biochemistry 25 (1986) 31643171; Bonthron D. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1986) 7125-7127]. Le plasmide pET-8c52K est particulièrement utile car il comporte un fragment du cDNA du vWF codant pour les résidus 445 à 733 du vWF humain et inclus notamment les peptides GlO et D5 antagonistes de l'interaction entre vWF et GPlb [Mori H. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-17904]. EXEMPLE 2: CONSTRUCTION D?UN FRAGMENT DE RESTRICTION MSTII/HINDIII INCLUANT UN SITE DE LIAISON DU vWF AUX PLAQUETTES SANGUINES. E.2.1. Résidus Thr470-Val713 du vWF: peptide du type Pl-X-P2. Le plasmide pYG1220 est généré par clonage des fragments résultant de l'amplification PCR du plasmide pET-8c52K avec les oligodéoxynucléotides 5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCTGTGAAG- CCTGC-3' (Sq1969, le site MstII est souligné) et 5'-CCCGGGATCC AAGCTTAGACTTGTGCCATGTCG-3' (Sq2029, le site Hindili est souligné): les fragments amplifiés sont d'abord clonés dans un vecteur de type pUC et leur séquence est vérifiée par séquençage. Les séquences nucléotidiques et polypeptidiques du fragment de restriction MstII HindIII incluant les résidus Thr470 à Val713 du vWF sont indiquées à la Figure I (numérotés de Thr586 à Val829). Cette séquence peptidique est identique à la séquence correspondante décrite par Titani et al. [Biochemistry 25 (1986) 3171-3184] à l'exception du résidu 618 (thréonine à la place de l'alanine). E.2.2. Résidus Thr470-Asp498 du vWF: peptide du type P1. Dans un mode de réalisation particulier, le site de liaison du vWF est un peptide incluant les résidus Thr470 à Asp498 du vWF mature. Cette séquence inclus le peptide G10 (Cys474-Pro488) décrit par Mori et al. [J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-17904] et capable d'antagoniser l'interaction du vWF humain à la GPlb des plaquettes humaines. La séquence incluant le peptide G10 est d'abord générée sous la forme d'un fragment de restriction MstII-HindIII, par exemple au moyen de la technique d'amplification PCR, ou encore directement à l'aide d'oligodéoxynucléotides synthétiques. Par exemple, I'amplification PCR du plasmide pET-8c52K avec les oligodéoxynucléotides Sq1969 et 5'-CC CGGGATCCAAGCTTAGTCCTCCACATACAG-3' (Sq1970, le site HindIII est souligné) génère un fragment de restriction MstII-HindIII incluant le peptide GlO, et dont la séquence est: 5'-CCTTAGGCTTAACCTGTGA AGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGC & CCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACTAAGCTT-3'. E.2.3. Résidus Leu694-Pro708 du vWF: peptide du type P2. Dans un second mode de réalisation, le site de liaison du vWF à la GPîb est directement conçu à l'aide d'oligodéoxynucléotides synthétiques, et par exemple les oligodéoxynucléotides 5'-TTAGGCCTCTGTGACCTTG CCCCTGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCCTAAGCTTA-3' et 5'-GA TCTAAGCTTAGGGGGGCAGAGTAGGAGGAGGGGCTTCAGGGGCAA GGTCACAGAGGCC-3'. Ces oligodéoxynucléotides forment en s'appariant un fragment de restriction MstII-Bglll incluant le fragment MstII-Hindm correspondant au peptide D5 défini par les résidus Leu694 à Pro708 du vWF [Mori H. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17901-17904]. E.2.4. Peptide du type P1-XA-P2. Des variants utiles du plasmide pET-8c52K sont délétés par mutagénèse dirigée entre les peptides G10 et D5, par exemple des sites de fixation au collagène, et/ou à l'héparine, et/ou à la botrocétine , et/ou aux sulfatides et/ou à la ristocétine. Un exemple est le plasmide pMMB9 délétés par mutagénèse dirigée entre les résidus Cys509 et Ile662. L'amplification PCR de ce plasmide avec les oligodéoxynucléotides Sq1969 et Sq2029 génère un fragment de restriction MstII-HindIII incluant les résidus Thr470 à Tyr508 et Arg663 à Val713 et en particulier les peptides GlO et D5 du vWF et délété en particulier de son site de fixation au collagène localisé entre les résidus Glu542 et Met622 [Roth G.J. et al. Biochemistry 25 (1986) 8357-83611. Dans d'autres modes de réalisation, l'utilisation des techniques combinées de mutagénèse dirigée et d'amplification PCR permet de générer à volonté des variants du fragment de restriction MstII-HindE de la Figure I mais délétés d'un ou plusieurs sites de fixation aux sulfatides et/ou à la botrocétine et/ou à l'héparine et/ou au collagène et/ou tout résidu impliqué par mutation naturelle dans l'émergence de pathologies de type IIB associée au vWF. E.2.5. Peptide du type Pl-X*-P2. Dans d'autres variants utiles du plasmide pET-8c52K des mutations sont introduites, par exemple par mutagénèse dirigée, pour remplacer ou supprimer tout ou partie de l'ensemble des cystéines présentes aux positions 471, 474, 509 et 695 du vWF humain. Des exemples particuliers sont les plasmides dans lesquels les cystéines présentes aux positions 471 et 474 d'une part et aux positions 471, 474, 509 et 695 d'autre part ont été respectivement remplacés par des résidus Glycine. L'amplification PCR de ces plasmides avec les oligodéoxynucléotides Sq2149 (5'-CCCGGGA TCCCTTAGGCTTAACCGGTGAAGCCGGC-3', le site MstII est souligné) et Sq2029 permet de générer des fragments de restriction MstII-HindIII incluant les résidus Thr470 à Val713 du vWF naturel à l'exception qu'au moins les résidus Cystéine aux positions 471 et 474 ont été mutés en des résidus Glycine.De tels fragments sont contenus dans les plasmides pYG1271 (Cys471, 474 -- > Gly) et pYG1269 (Cys471, 474, 509, 695 -- > Gly). D'autres mutations particulièrement utiles concernent au moins un résidu impliqué dans des pathologies de type IIB associées au vWF (augmentation de l'affinité intrinsèque du vWF pour la GPlb), comme les résidus Arg543, Arg545, Trp550, Val553 ou Arg578 par exemple. EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESTRICTION MSTII/HINDIII INCLUANT UN SITE DE LIAISON DU vWF AU SOUS ENDOTHELIUM. Dans un mode de réalisation particulier, les sites de liaison du vWF aux composants du tissu sous-endothélial et du collagène en particulier, sont générés par amplication PCR du plasmide pET-8c52K. Par exemple l'utilisation des oligodéoxynucléotides Sq2258 (5'-GG ATCCTTAGGGCTGTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTC-3', le site MstII est souligné) et Sq2259 (5'-GAATTCAAGCTTAACAGAG GTAGCTAA- CGATCTCGTCCC-3', le site HindIII est souligné) permet de générer le plasmide pYG1254 dont le fragment de restriction Mstll-HindllI inclus les résidus Cys509 à Cys695 du vWF naturel (peptide de type X). Des variants moléculaires des types XA (cf. E.2.4.) ou X (cf. E.2.5.) sont également générés selon la même stratégie et comportent toute combinaison souhaitable entre les sites de fixation du vWF aux sulfatides et/ou à la botrocétine et/ou à l'héparine et/ou au collagène. EXEMPLE 4: COUPLAGE EN C-TERMINAL DE LA SAH. Le plasmide pYG404 est décrit dans la demande de brevet EP 361 991. Ce plasmide comporte un fragment de restriction HindIII codant pour le gène de la prépro-SAH précédé des 21 nucléotides naturellement présents immédiatement en amont de l'ATG initiateur de traduction du gène PGK de S. cerevisiae. Ce fragment comporte un fragment de restriction HindIII-MstII correspondant à la totalité du gène codant pour la SAH à l'exception des trois acides aminés les plus C-terminaux (résidus Leucine-Glycine-Leucine).La ligature de ce fragment avec l'un des fragments MstII-Hindm décrits dans les exemples 2 ou 3 permet de générer des protéines chimères dans lesquelles un fragment du vWF (doué de propriétés particulière, et notamment d'adhésivité à un récepteur membranaire du type GPlb et/ou au sous-endothélium et/ou à un inducteur de fixation du vWF aux plaquettes) est positionné par couplage génétique en phase traductionnelle en C-terminal de la molécule de SAH. Par exemple l'utilisation du fragment MstII-HindIII du plasmide pYG1220 (E.2.1) génère le fragment de restriction Hindi de la Figure I, et qui code pour une chimère entre la totalité de la molécule de SAH et un fragment du vWF comprenant les résidus Thr470 à Val713. Dans d'autres modes de réalisation, l'utilisation des fragments MstII HindIII des exemples E.2.2 à E.2.5 génère des fragments de restriction HindIII codant respectivement pour des chimères entre la molécule de SAH et des peptides du type PI, P2, Pî-XA-P2 ou P1-X*-P2. Encore dans un autre mode de réalisation, l'utilisation du fragment MstII-HindIII du plasmide pYG1254 (E.3.) génère le plasmide pYG1277 qui comporte un fragment de restriction HindIII codant pour une chimère entre la totalité de la molécule de SAH et la partie du vWF localisé entre les résidus Cys509 et Cys695. EXEMPLE 5: COUPLAGE EN N-TERMINAL DE LA SAH. Dans un mode réalisation particulier, les techniques combinées de mutagénèse dirigée et d'amplification PCR permettent de construire des gènes hybrides codant pour une protéine chimère résultant du couplage traductionnel entre un peptide signal (et par exemple la région prépro de la SAH), une séquence incluant un fragment du vWF doué de propriétés d'adhésivité et la forme mature de la SAH ou un de ses variants moléculaires. Ces gènes hybrides sont préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du codon de fin de traduction par des sites de restriction HindIII ce qui permet de générer des plasmides d'expression de ces protéines chimères, par exemple selon la stratégie détaillée dans l'exemple suivant. EXEMPLE 6: PLASMIDES D'EXPRESSION. Les protéines chimères des exemples précédents peuvent être exprimées dans les levures à partir de promoteurs fonctionnels, régulables ou constitutifs, tels que, par exemple, ceux présents dans les plasmides pYG105 (promoteur LAC4 de Kluvveromvces lactis), pYG106 (promoteur PGK de Saccharomvces cerevisiae), pYG536 (promoteur PHO5 de S. cerevisiae), ou des promoteur hybrides tels que ceux décrits dans la demande de brevet EP 361 991.Les plasmides pYG105 et pYG106 sont ici particulièrement utiles car ils permettent l'expression des gènes codés par les fragments de restriction HindIII des exemples E.4. et E.5. à partir de promoteurs fonctionnels chez K. lactis régulables (pYG105) ou constitutifs (pYG106). Le plasmide pYGIOS corresponds au plasmide pKan707 décrit dans la demande de brevet EP 361 991 dans lequel le site de restriction HindIII unique et localisé dans le gène de résistance à la généticine (G418) a été détruit par mutagénèse dirigée tout en conservant une protéine inchangée (oligodeoxynucleotide 5'-GAAATGCATAAG CTCTTGCCATTCTCACCG-3').Le fragment SalI-SacI codant pour le gène URA3 du plasmide muté a été ensuite remplacé par un fragment de restriction SalI-SacI comportant une cassette d'expression constituée du promoteur LAC4 de K. lactis (sous la forme d'un fragment SalI-HindE) et du terminateur du gène PGK de S. cerevisiae (sous la forme d'un fragment HindIII-SacI). Le plasmide pYG1OS est mitotiquement très stable chez les levures Kluvveromvces et une carte de restriction en est donnée à la Figure 3. Les plasmides pYG1OS et pYG106 ne diffèrent entre eux que par la nature du promoteur de transcription encodé par le fragment SalI-HindIII.A titre d'exemple, le clonage, "dans l'orientation productive" (définie comme l'orientation qui place la région "prépro" de l'albumine de façon proximale par rapport au promoteur de transcription), des fragments de restriction HindIII codant pour des chimères du type SAH-PI-X-P2, SAH-P1, SAH-P2, SAH-P1-XA-P2 et SAH P1-X*-P2), dans le site HindIII du plasmide pYGIOS, génère respectivement les plasmides d'expression pYG1248, pYG1214, pYG1206, pYG1223 et pYG1279 permettant d'exprimer les protéines chimères correspondantes à partir du promoteur LAC4 de K. lactis. EXEMPLE 7: TRANSFORMATION DES LEVURES. La transformation des levures appartenant au genre Kluyveromvces, et en particulier les souches MW98-8C et CBS 293.91 de K. lactis s'effectue par exemple par la technique de traitement des cellules entières par de l'acétate de lithium [Ito H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163168], adaptée comme suit. La croissance des cellules se fait à 280C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO600) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE (10 mM Tris HCl pH 7,4; 1 mM EDTA), resuspendues dans 3-4 ml d'acétate lithium (0,1 M dans du TE) pour obtenir une densité cellulaire d'environ 2 x 108 cellules/ml, puis incubées à 300C pendant 1 heure sous agitation modérée.Des aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés à 30"C pendant I heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35% de polyéthylène glycol (PEG4000, Sigma). Après un choc thermique de 5 minutes à 42"C, les cellules sont lavées 2 fois, resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile et incubées 16 heures à 280C dans 2 ml de milieu YPD pour permettre l'expression phénotypique du géne de résistance au G418 exprimé sous contrôle du promoteur Pk1 (cf. EP 361 991); 200 ,ul de la suspension cellulaire sont ensuite étalés sur boites YPD sélectives (G418, 200 llg/ml). Les boites sont mises à incuber à 28"C et les transformants apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire. EXEMPLE 8: SECRETION DES CHIMERES ENTRE ALBUMINE ET vWF. Après sélection sur milieu riche supplémenté en G418 les clones recombinants sont testés pour leur capacité à sécréter les protéines chimères entre SAH et vWF. Quelques clones correspondant à la souche CBS 293.91 transformée, par exemple, avec les plasmides pYG1214 (SAH P1), pYG1206 (SAH-P2), pYG1223 (SAH-P1-XA-P2) et pYG1248 (SAH-PI-X P2) ou pKan707 (vecteur témoin) sont mis à incuber en milieu YPD ou YPL à 280 C. Les surnageants cellulaires sont récupérés par centrifugation quand les cellules atteignent la phase stationnaire de croissance, éventuellement concentrés 10 fois par précipitation pendant 50 minutes à -20 C dans une concentration finale de 60% d'éthanol, puis testés après électrophorèse en gel SDS-PAGE à 8.5%, soit directement par coloration du gel par du bleu de coomassie, soit après immunoblot en utilisant comme anticorps primaires des anticorps de souris dirigés contre le vWF ou un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la SAH. Lors des expériences de détection immunologique, le filtre de nitrocellulose est d'abord incubé en présence des anticorps primaires spécifiques, lavé plusieurs fois, incubé en présence d'anticorps de chèvre anti-souris (immunoblot anti-vWF) ou anti-lapin (immunoblot anti-SAH), puis incubé en présence d'un complexe avidine-péroxydase en utilisant le "kit ABC" distribué par Vectastain (Biosys S.A., Compiègne, France). La réaction immunologique est ensuite révélée par addition de diamino-3,3' benzidine tetrachlorydrate (Prolabo) en présence d'eau oxygénée, selon les recommandations du fabricant.Les résultats des Figures 4 à 6 démontrent que la levure K. lactis est capable de sécréter des protéines chimères entre la SAH et un fragment du vWF, et que ces chimères sont correctement reconnues par des anticorps reconnaissant la SAH ou le vWF. EXEMPLE 9: PURIFICATION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE DES PRODUITS SECRETES. Par exemple, le surnageant de culture correspondant à la souche CBS 293.91 transformée par le plasmide pYG1206 est concentré par précipitation et le culot est ensuite resolubilisé dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0; la chimère de type SAH-P2 est alors purifiée par chromatographie d'affinité, par exemple sur Bleu-Trisacryl (IBF). Une purification supplémentaire par chromatographie d'échange d'ions peut être effectuée si nécessaire. Après élution, les fractions contenant la protéine sont réunies, dialysées contre de l'eau et lyophilisées avant caractérisation: le séquençage (Applied Biosystem) de la protéine hybride sécrétée indique la séquence N-terminale attendue de l'albumine (Asp Ala-His...), démontrant une maturation correcte de ladite protéine chimère immédiatement en C-terminal du doublet de résidus Arg-Arg de la région "pro" de la SAH (Figure 1). REVENDICATIONS I. Polypeptide recombinant composé d'une partie adhésive dérivée de la structure du vWF capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF aux plaquettes et/ou au sousendothélium, et d'une partie permettant sa stabilisation et sa présentation in vivo. 2. Polypeptide selon la revendication I caractérisée en ce que la partie adhésive est constituée par tout ou partie de la séquence peptidique comprise entre les résidus 445 et 733 du vWF ou d'un variant de celle-ci. 3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce que la partie adhésive présente une structure choisie parmi: (a) la séquence peptidique comprise entre les résidus 445-733 du vWF, ou, (b) une partie de la séquence peptidique (a) capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sousendothélium, ou, (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus) et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sous-endothélium, ou, (d) une séquence peptidique non naturelle1 par exemple isolée à partir de banques peptidiques aléatoires, et capable d'antagoniser au moins partiellement la liaison du vWF au GPlb et/ou au sousendothélium. 4. Polypeptide selon la revendication 3 caractérisé en ce que la partie adhésive est constituée par une séquence choisie parmi les peptides de type P1, P2, X, X et X* ou par toute combinaison de ces peptides entreeux. 5. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que la combinaison des peptides est choisie parmi les peptides de type P1-P2, P1- X, P1-X, P1-X*, X-P2, XA-P2, X*-P2, P1-X-P2, P1-XA-P2 et PI-X*-P2. 6. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que la partie adhésive est constituée par tout peptide d'un type défini dans les revendications 4 et 5 représenté plus d'une fois. 7. Polypeptide selon l'une des revendications I à 6 caractérisé en ce que la partie adhésive est couplée à l'extrémité N-terminale de la structure stabilisatrice. 8. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la partie adhésive est couplée à l'extrémité C-terminale de la structure stabilisatrice. 9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est un polypeptide possédant une demievie plasmatique élevée. 10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce que le polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée est une protéine telle qu'une albumine7 une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferine. 11. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce que le polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée est dérivé par modification(s) structurale(s) (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus, modification chimique) d'une protéine selon la revendication 10 . 12. Polypeptide selon l'une des revendications 9 à Il caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est un polypeptide faiblement ou nonimmunogénique pour l'organisme dans lequel il est utilisé. 13. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine. 14. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence "leader" permettant la sécrétion du polypeptide exprimé. 16. Cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 14 ou 15 sous le contrôle d'une région d'initiation de la transcription et éventuellement d'une région de terminaison de la transcription. 17. Plasmide autoréplicatif comportant une cassette d'expression selon la revendication 16. 18. Cellule recombinante eucaryote ou procaryote dans laquelle a été inséré une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 14 ou 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16 ou un plasmide selon la revendication 17. 19. Cellule recombinante selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, d'une cellule animale, d'un champignon ou d'une bactérie. 20. Cellule recombinante selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure. 21. Cellule recombinante selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces ou Kluvveromvces. 22. Procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications I à 13 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon l'une des revendications 18 à 21 dans des conditions d'expression, et on récupère le polypeptide produit. 23. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.