Brevet FR2686087A1 — publié le 19930716

La présente invention concerne un nouvel antigène lymphocytaire ainsi que des anticorps correspondant à cet antigène et leurs applications. L'activation lymphocytaire induit ou augmente l'expression de plusieurs structures de surface, dont certaines, telles que les récepteurs à l'IL2 et à la transferrine, sont directement impliquées dans la croissance cellulaire. En particulier, I'activation de lymphocytes humains conduit à des modifications phénotypiques apparaissant soit immédiatement soit à des temps variables après la perturbation des structures de reconnaissance de l'antigène.Des changements phénotypiques peuvent être attribués à l'expression à la surface de la cellule de molécules inductibles telles que CD25(1,2) et CD71(3), ou à l'expression accrue d'antigènes de surface tels que CD26(4,5), CD 29(6,7), CD45RO(8,9), ou à une modulation épitopique comme dans le cas de CD2(10,11), ou à des changements de l'affinité comme on l'a rapporté pour les molécules CDlla/CD18(12) et LAM1(13). Il n est pas surprenant que ces molécules inductibles incluent des sous-unités de récepteurs de grande affinité pour diverses cytokines (2). Le plus souvent, elles sont détectées en utilisant un anticorps monoclonal (Acm) reconnaissant un récepteur putatif d'un ligand inconnu.Par exemple, les ligands de CD5(14,15), CD43(16) et CD69(17,18) ont été très récemment identifiés, alors que l'utilisation d'Acm en tant qu'agonistes contre ces structures avait permis d'identifier leur rôle crucial dans l'activation de la cellule T (15, 17, 18, 19). On a montré que ces Acm augmentent la concentration cytoplasmique en calcium libre, si on en fait un "cross linkage" à la surface des cellules T (19). Comme une augmentation du calcium cytosolique et une activation de la Protéine Kinase C (PKC) simultanées sont des événements précoces et essentiels de la prolifération des lymphocytes T, on a mené des investigations sur les effets de ces divers Acm sur l'activation des lymphocytes T humains en présence de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate), qui est un activateur de la PKC(20). En outre, l'utilisation d'Acm a confirmé qu'un grand nombre d'antigènes de surface des leucocytes et en particulier ceux induits pendant l'activation sont communs aux lignées cellulaires B et T(2,3,14). Afin d'identifier de nouvelles structures caractéristiques des lymphocytes activés, on a, selon l'invention, défini des anticorps monoclonaux contre des clones de cellules T humaines fonctionnellement définies. Selon la présente invention, on a tout d'abord isolé un anticorps monoclonal dénommé BB18 reconnaissant, sur la surface cellulaire, un nouvel antigène lymphocytaire composé de sous-unités de 150 *10 kDa, dont l'expression sur les lymphocytes T augmente rapidement après leur activation par divers stimuli notamment des lectines. En revanche, en présence de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), l'expression à la surface de la cellule de cette structure de 150 +10 kDa subit une modulation négative encore plus précoce que les molécules du CD3. Des études biochimiques ainsi qu'une analyse phénotypique ont révélé que cette structure est différente de toutes les molécules identifiées précédemment sur la surface cellulaire des lymphocytes. Un second anticorps monoclonal BD16 obtenu selon l'invention reconnaît la même structure de surface que l'Acm BB18. Ces deux anticorps sont des lgGl qui ont été obtenues après immunisation de souris Balb/c avec un clone thymique humain et fusion avec la lignée cellulaire NSl. Ils immunoprécipitent de la surface de lymphocytes du sang périphérique humain ou de clones T radio-marqués à l'iode, la même structure moléculaire. La modulation de la structure de surface par incubation avec l'un ou l'autre anticorps induit la perte de réactivité en fluorescence avec les deux anticorps.Cependant, ces deux anticorps réagissent avec des épitopes différents de cette structure car il n'y pas d'inhibition de la fixation de l'anticorps BB18 en présence d'un excès de l'anticorps BD16 et vice-versa. La présente invention a donc tout d'abord pour objet une protéine antigénique consistant en une glycoprotéine de poids moléculaire de 150 + 10 kDa déterminé par électrophorèse de type SDS PAGE dans des conditions réductrices, protéine exprimée à la surface des lymphocytes T humains de préférence activés. La présente invention a aussi pour objet une protéine antigénique consistant en la même glycoprotéine mais sous forme d'un dimère à liaison disulfure de poids moléculaire de 300 +20kDa déterminé par électrophorèse de type SDS PAGE dans des conditions non réductrices, protéine exprimée à la surface de lymphocytes T humains de préférence activés, composée de sous-unités de 150 + 1 OkDa telles que définies ci-dessus. L'invention a également pour objet des dérivés de la protéine sous forme monomère ou dimere caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme non glycosylée ou en ce qu elle comporte des glycosilations non naturelles ou un fragment de cette protéine glycosilée ou non comportant les sites antigéniques essentiels de la protéine. La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux reconnaissant un épitope d'une protéine selon l'invention, notamment les anticorps monoclonaux BD16 et BB18, ainsi que des lignées de cellules d'hybridomes produisant ces anticorps, notamment les lignées déposées à l'ECACC sous les numéros 92010801 pour l'anticorps BD16 et 92010802 pour l'anticorps BB18. Les protéines selon l'invention peuvent être obtenues non seulement par purification à partir de cellules productrices par des techniques d'immunopréclpltatlon, notamment avec les anticorps BB18 et BD16 ou d'autres techniques, mais également par des techniques d'ADN recombinant à partir de cellules eukaryotes ou prokaryotes, auquel cas la glycosilation de la protéine recombinante obtenue peut différer de la protéine naturelle comme il est connu de l'homme de l'art. Une protéine ou un anticorps selon l'invention peuvent être marqués par un marqueur détectable en vue de leur dosage in vitro ou leur localisation in vivo ou ex-vivo. L'invention concerne en effet également l'utilisation des protéines et anticorps selon l'invention pour le diagnostic d'états pathologiques ou le suivi du traitement d'affection ou comme voyant d'apparition de ces affections. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation des ces protéines et anticorps pour le diagnostic rapide d'un état d'activation précoce des cellules T lymphocytalres. Enfin, la présente invention concerne l'emploi d'une protéine, anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention à titre de médicament notamment pour le traitement de maladies avec des signes de déficit Immunitaire ou de pathologie inflammatoire ou auto-immunes et dans le traitement in vivo ou ex vivo de proliférations lymphoïdes malignes. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre. Sur les figures annexées, - la Figure 1 représente la cinétique d'expression à la surface cellulaire de la structure reconnue par BB18 après activation des CMSP (cellules mononucléées de sang périphérique) à l'aide de PHA. Les cellules mononuclétaires du sang périphérique ont été marquées avant (DO), 3 jours (D3), ou 9 jours (D9) après la coculture avec le PHA I ug/ml, pour lmmunofluorescence indirecte avec BB18, CD25"BC96" ou un anticorps monoclonal négatif lgGl. Les profils de fluorescence sont figurés comme des histogrammes. - La Figure 2 représente le PMA induisant une décroissance précoce de la réactivité avec BB18. Des cellules T du sang périphérique ont été incubées avec du PMA I ug/ml pendant 6, 10, 24 ou 144 h. Les cellules ont été lavées et traitées pour l'immunofluorescence indirecte avec des anticorps monoclonaux variés. A chaque temps de mesure, un contrôle négatif fait de cellules Incubées dans les mêmes conditions mais sans PMA a été réalisé. Comme on n'a pas observé de modifications des cellules-contrôles, le contrôle testé après 6h de culture est présenté. Les profils de fluorescence sont figures comme des histogrammes. - La Figure 3 représente le profil de SDS-PAGE d'un immunoprécipité BB18 obtenu à partir d'un lysat de cellules T clonées. Le clone immunisant B12 de cellules T de thymus humain a été marqué en surface et lysé dans du NP40 1%. Les immunoprécipités obtenus avec Bol8, CD18"M232" ou un anticorps monoclonal lgGî irrelevant ont été analysés sur un gel de SDS-PAGE à 7,5% dans des conditions non réductrices. Les positions des marqueurs de masse moléculaire ont été indiquées à gauche en kDa. - La Figure 4 représente l'analyse sur gel à deux dimensions (non réducteur/réducteur) d'un immunoprécipité BB18 obtenu à partir de lysats de cellules T clonées. Les immunoprécipités obtenus avec l'anticorps monoclonal BB18 ont été drabord séparés dans des conditions non réductrices (N. Réd.) sur un gel à 7,5 0 à l'aide d'un système PHAST. Ensuite la bande de gel contenant l'immunoprécipité a été coupée et soumise à l'électrophorèse dans la seconde dimension, comme recom mandé par le fabricant, après réduction (Réd.) sur un gel de SDS-PAGE à 7,5%. Les positions des marqueurs de masse moléculaire ont été indiquées à droite en kDa. - La Figure 5 représente la cinétique de la prolifération des CMSP induite par l'anticorps monoclonal BB18. Des cellules mononucléaires du sang périphérique ont été incubées avec le CD3"X3" purifié 5 pg/ml (triangles blancs), l'anticorps monoclonal BB18 purifié 5 çug/ml (carrés vides) ou 10 ugiml (cercles blancs) en présence de PMA 0,2 ng/ml pendant 2 à S jours. L'incorporation de (3H)TdR a été mesurée en "pulsant" la culture pendant les 16 dernières heures. Les résultats sont exprimés comme la moyenne d'échantillons tripliqués et le SEM a toujours été inférieur à 10oxo de la moyenne. Dans ces conditions, le PMA seul n'a induit de prolifération significative a aucun des temps de mesure. Dans une tentative pour définir les glycoprotéines de surface cellulaire spécifiques de l'activation, on a, selon l'invention, utilisé des Acm obtenus par immunisations répétées avec des clones de cellules T humaines hautement fonctionnelles (21). En particulier, on a initialement identifié sur le clone dénommé B12(22) de cellules T de thymus humain un Acm. dénommé BB18, reconnaissant un nouveau dimère à liaison disulfure composé de sous-unités de 150 +l0kDa. Cette structure qui est faiblement exprimée sur des lymphocytes normaux de sang périphérique, se retroue rapidement fortement exprimée pendant l'activation. En revanche, l'incubation de CMSP avec du PMA induit une modulation négative rapide suivie d'une réexpression complète dans les 24 heures. Cette molécule n'est pas spécifique de la cellule T car elle est aussI exprimée dans des lignées cellulaires B EBV-transformées. De plus, les CMSP prolifèrent quand ce dimère a été stimulé en présence de concentrations submitogéniques de P\'A. 1. MATERIEL ET METHODES 1. Anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux utilisés tels que CDl"L404", CD3"OKT3", CD4"0516", CDS"L533", CD8"OKT8", CD18"M232" et CD25"BC96" ont été soit produits localement (23) soit achetés dans le commerce. L'anticorps monoclonal BB18 a été préparé par Immunisation de souris Balb/c avec le clone thymique B12, CD4 CD8 (22) (trois injections intraveineuses avec 20x106 cellules). On a fusionné des cellules de rate de souris immunisées à la lignée cellulaire NUS 1 cinq jours après la dernière injection.Le criblage Initial par lmmunofluorescence indirecte et cytométrie de flux en utilisant un Facstar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a retenu tous les surnageants d'hybridomes réagissants avec les cellules immunisantes mais pas ou faiblement avec les cellules mononucléaires du sang périphérique au repos. La culture contenant l'anticorps monoclonal susmentionné a été clonée deux fois par dilution limitante. On a effectué des passages en série de l'hybridome cloné par injection l.p. dans des souris Balb/c sensibilisées avec du pristane. Le fluide des ascites a été collecté, ultracentrifugé et purifié par affinité, au besoin, sur une colonne de protéine A-Sépharose. 2. Isolation de populations cellulaires. Des CMSP humaines ont été préparées par centrifugation par gradient de densité Ficoll-Isopaque. La population non-fractionnée a été séparée en populations E rosette-moins (E-) et E rosette-plus (Ec) par intéraction avec 5% de globule rouge de mouton (SRBC). Le mélange a été déposé sur du Ficoîl-Isopaque et les cellules E ont été récupérées à partir de l'interface tandis que les cellules E+ ont été obtenues à partir du culot après lyse hypotonique du SRBC. Les monocytes ont été obtenus à partir des cellules E par adhérence au verre pendant une nuit. Les cellules mononucléaires du sang périphérique CD2 + CD3 ont été obtenues par lyse sous dépendance du complément avec un Acm CD3 dans la fractlont cellulaire E+. Des échantillons normaux et leucémiques ont été obtenus à partir de la Banque du Sang de l'Hôpital Saint-Louis et cryopréservés comme décrit précédemment (23). 3. Cultures cellulaires. Des clones de cellules T humaines ont été obtenues comme décrit ailleurs (22) et mises en culture dans du milieu RPMI-1640 (GIBCO, Paisley, Ecosse) contenant 2mmol/lltre de L-glutamine, de la pénicilline (100 U/ml), de la streptomycine (100 ,ug/ml), 10% de sérum humain inactive par la chaleur et de l'interleukine 2 recombinante, gracieusement fournie par Roussel-Uclaf (Romainville, France) (30 U/ml.) Les cellules clonées ont été restimulées tous les 7 jours avec des cellules nourricières en présence de PHA purifé (Wellcome, Beckenham, UK) à 1 ,ug/ml et d'interleukine 2 recombinante.Les cellules nourricières étaient un mélange de LSP allogéniques irradiées provenant de trois donneurs (les mêmes donneurs étant utilisés pendant plusieurs mois). Les cultures de lignées cellulaires humaines leucémiques ou B EBV-transformées et de lignées cellulaires d'hybridome étaient libres de mycoplasme et maintenues en croissance logarithmiques dans du RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal sélectionné inactivé à la chaleur et des antibiotiques. 4. Etudes par immunofluorescence. Des études par Immunofluorescence indirecte ont été pratiqués en utilisant une lg antlsourls conjuguée à de l'isothiocyanate de fluorescéine (CITF) des Laboratoires Meloy (Springfield, VA) comme décrit précédemment (22). La fluorescence a été lue en utilisant un microfluoromètre Facstar (Becton Dickinson, Mountain View, CA). 5. Modulation induite par le PMA de l'expression à la surface de la cellule. Des CMSP ont été incubées avec du PMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) à 1 ugiml dans un milieu de culture contenant 1096 de FCS pendant les temps Indiqués. Après un lavage complet, les cellules ont été marquées en lmmunofluorescence indirecte en utilisant une batterie d'anticorps monoclonaux contre diverses molécules de surface. 6. Marquage et immunoprécipitations de protéines de surface cellulaire. Des cellules clonées ont été marquées en surface avec de la lactopéroxydase et quatre additions de H202 comme décrit précédemment. Les cellules ont alors été lysées dans un tampon de lyse standard 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), contenant 1% (PV) de Nonidet P40, 0,15M de NaCI, 1 mg/ml de BSA et 2 mM de PMSF (Phényl Méthyl Sulfonyl fluoride), 20 mM d'iodoacétamide, et de l'aprotinine à 1 lU/ml comme inhibiteurs des protéases. Les lmmunopréclpltatlons et l'analyse par SDS-PAGE ont été pratiquées comme décrit (22). Des analyses par électrophorèse sur gel bidimensionnelle non réductrlce/réductrice en diagonale ont été pratiquées en utilisant des gels PHAST (Pharmacia) d'acrylamide à 7,5% pour la première et la seconde dimension selon les recomandations du fabricant (Pharmacia, Uppsala, Suède).L'autoradiographie de plaques de gel séchées a été pratiquée à -700C. Les poids moléculaires ont été calculés par référence à la mobilité de protéines standard. 7. Tests de prolifération. 50.000 CMSP ont été mises en culture en triple dans des plaques de 96 puits à fond arrondi (Costar, Cambridge, MA) dans un volume total de 0,2 ml de RPM1 1640, supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Diverses concentrations d'anticorps purifiés ont été ajoutées avec 0,2 ng/ml de PMA. Après diverses périodes de temps, les puits furent radiomarqués individuellement avec 1 ,uCi (1 Ci = 37 Gbq) de (3H)Tdr et récoltés 16 heures plus tard. L'incorporation du (3H)Tdr a été mesuré en utilisant un compteur à scintillations pour liquides (Rac Beta 1211/1212 LKB, Finlande). Il. RESULTATS 1. Les Acm BB18 réagissent fortement avec les cellules T clonées et faiblement avec les cellules T humaines au repos par cytofluorométrie de flux. Afin d'obtenir des anticorps monoclonaux définissant les étapes de l'activation du lymphocyte T, on a immunisé des souris Balb/c âgées de six semaines avec des cellules thymiques clonées humaines (22). Un Acm de l'isotype lgGl, nommé BB18, a été ainsi isolé. Le Tableau I résume la réactivité de l'Acm susmentionné avec de nombreuses cellules humaines normales et hématopoîétiques malignes. La molécule reconnue par cet Acm est faiblement exprimée sur des cellules T au repos mais pas du tout sur des cellules B provenant du sang périphérique ou d'organes lymphoïdes. Parmi les lignées cellulaires lymphoïdes leucémiques testées, toutes les cellules T étaient vivement marquées, tandis que les lignées cellulaires du lymphome de Burkitt n'étaient pas réactives. D'autres lignées cellulaires malignes telles que K 562 (érythroleucémie), U937 (monocytique), HL60 (promeylocytique) ou SKNSH (neuroblastome) n'étalent pas réactives. En revanche, des cellules T activées de longue date (clones de cellules T IL2-dépendants) ou B (lignées cellulaires B EBV-transformées) se sont révélées positives avec cet Acm. De plus, le BB18 marquait fortement la lignée YT de cellules tumorales NK, CD3 négatives activées et son mutant CD 25 négatif, YT2C2.La structure reconnue par BB18 apparaît comme fortement exprimée immédiatement après l'activation cellulaire comme le montre l'expérience cinétique représentative pratiquée avec des cellules mononucléaires du sang périphérique d'un individu normal stimulé avec de la PHA (Figure 1). L'accroissement précoce dans son expression s'est effectué en parallèle à celle du C25 pendant les premiers jours de l'activation de la cellule T, mais elle est restée persistante. Un accroissement similaire de la réactivité au Bu 18 a été ausi observé quand les lymphocytes du sang périphérique (LSP) étaient stimulés soit avec des cellules allogèniques, un Acm CD3, ou 1'IL2 (données non présentées). Par conséquent, l'accroissement de la réactivité avec l'Anticorps BB18 définit clairement l'état d'activation chez les lymphocytes T. TABLEAU 1 Réactivité de l'Anticorps BB18 avec des populations de cellules hémato poïétiques Type de cellules % cellules positives Population de cellules normales : LSP E+ (10) 100 LSP E ( 5) Cellules malignes hématopoïétiques CEMT 100 MOLT4 100 YT2C2 100 Daudi Namalva NALM 6 100 U937 HL60 K562 Cellules malignes non hématopoïétiques: SKNSH (neuroblastome) U373MG (glioblastome) Comme l'expression de plusieurs structures inductibles par activation est régulée positivement par le PMA, on a voulu déterminer Si le PMA était capable d'augmenter rapidement la réactivité avec l'Anticorps BB18. De manière surprenante, après une incubation de 6 heures avec du PMA à 1 ,ug/ml, le marquage avec l'Anticorps BB18 n'était plus détectable. Comme on le montre dans l'expérience représentative présentée à la Figure 2, la réactivité des celulles T au CD3, au CD4 et à l'Anticorps Bu 18 diminue lorsqu'on ajoute du PMA aux cultures. Plus précisément, après 6 heures avec du PMA, la régulation négative de la molécule réagissant avec l'Anticorps BB18 est maximale tandis qu'une fraction importante des cellules avait perdu l'expression du CD4. La modulation de la molécule CD3 atteint son maximum après 24 heures tandis que la modulation du CD4 est achevée dès après 10 heures. En revanche, comme on l'a rapporté précédemment après 24 heures de culture en présence de PMA, le CD25 est induit et l'expression de CD8 n'est pas modifiée par ce traitement. 3. Analyse biochimique de la molécule immunoprécipitée par l'Acm BB18 après marquage de la surface cellulaire. Afin de définir la molécule identifiée par l'Acm BB18, des clones de cellules T humaines ont été marqués avec de l'Iode 125 sur leur face externe, selon la méthode à la lactopéroxydase, et lysés. Les immunoprécipités au BB18 obtenus à partir de ces lysats de cellules marquées ont été ensuite analysés par SDS-PAGE. L'autoradiographie montrée à la Figure 3 indique que l'Acm BB18 Immunopréciplte, à partir d'un clone de cellules T représentatif. Une bande prédominante migrant sous des conditions non-réductrices avec une Masse moléculaire d'approximativement 300 kDa.Des Acm CD18"M232" utilisés comme contrôle lmmunopréclpltent trois bandes de protéines à partir du même lysat caractéristiques des molécules CD18 et de deux différentes molécules CDII, tandis qu'aucune bande de protéine n'est obtenue avec un Acm lnapproprié de type IgGl. De plus, comme on le montre à la Figure 4, l'immunoprécipité obtenu avec l'Anticorps BB18 consiste principalement en homodimères liés par des ponts disulfures d'environ 300 kDa dans la première dimension non-réductrice, qui se résoud dans une seconde dimension réductrice en une bande protéique prédominante d'environ 150 kDa en dessous de la diagonale du gel à deux dimensions. 4. Une stimulation avec des Acm BB18 solubles induit une prolifération des LSP en présence d'une concentration submitogénique de PMA. Il a été montré précédemment que la stimulation de certaines molécules de surface, avec leur anticorps agoniste, en conjonction avec du PMA, induit une prolifération des lymphocytes T (24, 25, 26). Par conséquent, on a testé la possibilité que la prolifération cellulaire puisse être induite par des doses submitogéniques de PMA et des Acm Bu 18 purifiés. Les résultats d'une expérience représentative de cinétique, montrés à la Figure 5, indiquent que des Acm BB18, utilisés soit à 5 soit à 10 ug/ml avec 0,2 ng/ml de PMA, induisent une forte réponse proliférative sur des CMSP fraîchement isolées atteignant un pic au jour 4.Dans des conditions expérimentales similaires, un Acm CD1"L404" d'isotype identique s'est avéré incapable de déclencher une prolifération de lymphocytes, tandis qu'ainsi qu'on l'a rapporté précédemment, un Acm CD3 stimule vigoureusement la prolifération cellulaire. On a donc identifié une nouvelle structure de surface de cellule lymphocytaire humaine avec l'Acm dénommé Bol8. La molécule lmmunoprécipltée en utilisant le BB18, à partir de lysats de lymphocytes T donnés marqués en surface est apparue comme étant un homodimère lié par des ponts disulfures comprenant des sous-unités d'environ 150kDa. Cette structure est faiblement détectable sur des lymphocytes T de sang périphérique au repos, tandis que son expression augmente rapidement après l'activation de la cellule T et se maintient à ce niveau élevé pendant un certain temps après le déclenchement initial. Au surplus, l'Anticorps BB18 réagit vivement toutes les cellules T clonées testées quel que soit leur phénotype CD4/CD8 et leur TcR (données non présentées).La distribution cellulaire indique que l'Acm Bu 18 ne réagit pas avec des cellules B au repos, tandis que des cellules B EBV-transformées de longue date sont faiblement marquées. En revanche, des lignées cellulaires de lymphome de Burkit (maudi et Namalva) manquent clairement de réactivité. Qui plus est, des lignées cellulaires lymphoïdes leucémiques mais pas myélomonocytiques sont réactives au BB18. La distributrion cellulaire, ainsi que l'analyse biochimique de la structure reconnue par BB18, ont établi que cette molécule est différente de toutes les structures de surface de leucocytes précédemment connues. Les fonctions d'autres molécules de surface, telles que LFA-l, CD4 et CD8 ont été démontrées par la faculté de certains Acm spécifiques d'inhiber les activités tueuses naturelles ou cytotoxiques des lymphocytes T. Les tentatives pour inhiber, avec un Acm BB18 purifié, la fonction cytotoxique de lymphocytes allosensibilisées in vitro 6d., de lymphocytes T clonés cytotoxiques ou de cellules NK n'ont pas été couronnées de succès. Les résultats suggèrent que l'épitope reconnu par l'Acm BB18 n'est pas impliqué dans les fonctions cytotoxiques, pas plus que dans l'adhésion de l'effecteur à la cellule cible. Le fait que des cocultures de CMSP avec des concentrations submitogéniques de PMA et de 1'Acm BB18 purifié aient eu pour résultat une réponse proliférative vigoureuse, atteignant un maximum au jour 4 est particulièrement intéressant. Néanmoins, la réponse comitogénique mesurée dans ces conditions expérimentales n'atteint pas la magnitude de la réponse observée avec un déclenchement au CD3. I1 est à noter que les réactivités au CD3 et au BB18 diminuent toutes deux après incubation des LSP avec du PMA. Néanmoins, la cinétique de la diminution de réactivité est différente pour les deux structures. Plusieurs molécules ont été décrites, lesquelles, une fois mises en réaction avec un Acm agoniste dans des conditions appropriées, sont capables de transduction de signaux comitogéniques avec du PMA. La molécule CD28, un homodimère de 44 kDa à ponts disulfure, exprimé de manière préférentielle sur une sous-population de cellule T, a été la première structure décrite induisant des signaux costimulateurs (25, 26). Il a été montré que l'effet s'exerce par régulation de la stabilité de l'ARNm codant pour les lymphokines (27). D'autres exemples de molécules médiatrices de signaux costimulateurs incluent la molécule CD26 (4, 5), identifiant la dipeptidylpeptidase IV, qui est une structure de 120 kDa ; CD69, un hétérodimère d'activation très précoce à ponts disulfure, de 28, 32 kDa (17, 18); la molécule spécifique de la cellule T identifiée par l'Acm lODI, qui est un homodimère à ponts disulfure de 90 kDa (28) ; CD60"UN14D4" reconnaissant une structure hydrocarbonée exprimée sur divers gangliosides (29).Les Acm CD43 sont particulièrement intéressants, identifiant une glycoprotéine fortement sialylée de 95 kDa, laquelle de manière similaire aux Acm CD3 et CD2 peut directement déclencher l'activation des cellules T en présence de monocytes. I1 a été rapporté récemment qu'un anticorps monoclonal réagissant avec CD5, à la différence de l'Acm du CD5 précédemment décrits, était capable d'induire une prolifération de cellules T en présence de monocytes (15). Cela a évoqué la possibilité que seuls certains épitopes de la molécule CD5, comme dans le cas de la CD2, soient impliqués dans l'activation des cellules T.Finalement, cela vaut la peine de mentionner que contrairement à l'épitope reconnu par l'Anticorps Bol8, l'expression de surface de la majorité des structures de transduction du signal n'est pas augmentée durant l'activation de la cellule. Bien que des cellules T humaines puissent être activées par le biais de plusieurs molécules de surface distinctes, ces voies d'activation semblent partager des mécanismes de transduction de signal communs. Il est bien connu que l'activation de la cellule T via CD2 ou CD5, mais non pas via CD43 (16) est dépendante de l'expression de CD3-TcR. Bien qu'aucun lien physique de la molécule BB18 avec le CD3-TcR n'ait été démontré selon l'invention, (I'Acm a marqué les lymphocytes YT2C2 CD3-TcR négatifs), des liens sont possibles avec des composants tels que la chaîne 4 du CD3. DE POT DES ANTICORPS Les lignées de cellules d'hybridomes produisant les anticorps BD16 et BB18 ont été déposées à l'European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, Salisbury, Wiltstrive SP4 03G, England), le 7 janvier 1992 et ont reçu les numéros 92010801 pour l'anticorps BD16 et 92010802 pour l'anticorps Bu 18. REFERENCES 1. Uchiyama, T., S. Broder, and T.A. Waldmann. 1981. A monoclonal antibody (anti-Tac) reactive with activa tex and functionally mature human T cells. J. Immunol. 126: 1393. 2. Smith, K.A. 1988. The Interleukln 2 receptor. Adv. Immunol. 42: 165. 3. Trowbridge, LS. and F. Loupez. 1982. Monoclonal antibody to transferrin receptor blocks transferrin binding and inhibits human tumor cell growth in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1175. 4. Fleisher, B. 1987. A novel pathway of human T cell activation via a 153 kD T cell activation antigen. J. Immunol. 138 : 1346. 5 Higgs, J.B., W. Zeldes. K. Kozarsky, M. Schteingart. L. Kan, P. Bohlke, R. Krieger, W. 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Protéine antigénique sous forme d'un homo-dimère à liaison disulfure de poids moléculaire de 300 + 20kDa déterminé par électrophorèse de type SDS PAGE dans des conditions non réductrices, exprimée à la surface de lymphocytes T de sang humain de préférence activés, composée de sous-unités selon la revendication 1. 3. Dérivé d'une protéine selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine sous forme non glycosilée ou comportant des glycosilations non naturelles ou un fragment de la protéine glycosilé ou non glycosilé comportant les sites antigéniques essentiels. 4. Protéine selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex-vivo. 5. Anticorps dirigé contre la protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Anticorps monoclonal reconnaissant un épitope d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 4. 7. Anticorps selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une immunoglobuline de sous-classe IgG1. 8. Anticorps selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à 1'ECACC sous le numéro 92010801 pour l'anticorps BD16. 9. Anticorps selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à 1'ECACC sous le numéro 92010802 pour l'anticorps BB18. 10. Anticorps selon l'une des revendications 5 à 9 caractérisé en ce qu'il comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex-vivo. 11. Lignée de cellules d'hybridome, caractérisée en ce quelle est capable de produire l'anticorps monoclonal selon l'une des revendications 5 à 10. 12. Utilisation d'un ou des deux anticorps monoclonaux selon les revendications 8 ou 9 pour immunoprécipiter des protéines selon les revendications 1 ou 2. 13. Kit de diagnostic comportant une protéine ou un des anticorps selon l'une des revendications 1 à 10. 14. Utilisation d'une protéine ou d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 10 pour le diagnostic rapide d'un état d'activation précoce des cellules T lymphocytaires. 15. Médicament comportant, à titre de principe actif, une protéine ou un anticorps ou les deux anticorps ou leurs fragments selon l'une des revendications 1 à 10.