Brevet FR2686898A1 — publié le 19930806

Domaine de l'invention La présente invention concerne une méthode de production de la Lphénylalanine (désignée ci-après par "Phe") employant un micro-organisme. La L-phénylalanine est amplement utilisée comme matière première pour les médicaments, les édulcorants et les produits chimiques. Art antérieur Les méthodes conventionnelles de production de la L-phénylalanine employant un micro-organisme, qui sont bien connues jusqu'à présent, sont telles qu'un micro-organisme capable de produire la L-phénylalanine est cultivé dans un milieu nutritif liquide ou est incubé par une matière première dans un liquide réactionnel pour produire et accumuler la L-phénylalanine dans la culture ou dans le liquide réactionnel et la L-phénylalanine est moissonnée. La morphologie cristalline de la L-phénylalanine est connue comme incluant des cristaux -alpha (cristaux d'anhydride - désignés ci-après par cristaux -alpha de Phe) et des cristaux -bêta (cristaux de monohydrate - désignés ci-après par cristaux -bêta de Phe).Si l'on considère la forme des cristaux, les cristaux -alpha de Phe sont tabulaires ou lamellaires, tandis que les cristaux -bêta de Phe sont des cristaux analogues à des aiguilles extrêmement fines. Dans la production de la Lphénylalanine employant un micro-organisme, les cristaux à précipiter de la culture en raison de la formation et de l'accumulation de la L-phénylalanine dans cette culture à une concentration supérieure à sa solubilité dans la culture sont des cristaux -bêta de Phe lorsqu'aucun moyen n'y est appliqué. La précipitation des cristaux -bêta de Phe durant la culture provoque l'élévation de la viscosité de la culture et le surmoussage de la culture rendant la poursuite de la culture difficile. Si l'on tente de poursuivre la culture dans ces conditions, on rencontrera un autre problème de dispersion de la culture hors du système du dispositif de culture et, comme résultat, la production de la L-phénylalanine serait substantiellement impossible par la suite. Un micro-organisme qui ne produit pas et n'accumule pas la L-phénylalanine en quantité supérieure à sa solubilité doit donc être employé, ou bien lorsqu'un micro-organisme ayant une capacité de production élevée est cultivé, le contrôle de la quantité de matière première à fournir ou le contrôle de la quantité de culture doit être effectué dans le but de limiter la quantité de Lphénylalanine à accumuler à une valeur inférieure à sa solubilité. Pour ces raisons, la productivité de la L-phénylalanine par les méthodes conventionnelles est faible. Par conséquent, le développement d'une méthode améliorée pour la réduction du coût de production de la L-phénylalanine employant un micro-organisme est fortement désiré. Problème résolu par l'invention L'objet de la présente invention est de fournir une méthode moins coûteuse et plus efficace pour produire la L-phénylalanine employant un microorganisme que les méthodes conventionnelles. Movens pour résoudre le problème Les présents inventeurs ont procédé à des études répétées dans le but de développer une méthode moins coûteuse et plus efficace de production de la Lphénylalanine employant un micro-organisme que les méthodes conventionnelles connues et, comme résultat, ont trouvé que la culture d'un micro-organisme capable de produire la phénylalanine accompagnée de la précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture peut donner une culture douce et successive après l'accumulation de la L-phénylalanine dans la culture en quantité supérieure à sa solubilité de sorte qu'une production efficace de la L-phénylalanine est possible de cette façon. Sur la base de cette découverte, ils ont réalisé la présente invention. Spécifiquement, la présente invention fournit une méthode de production de la L-phénylalanine employant un micro-organisme ayant une capacité de production de la L-phénylalanine selon laquelle la culture du micro-organisme se poursuit avec précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture. Le micro-organisme à utiliser dans la présente invention peut être une souche appartenant au genre Brevibacterium. Corvnebacterium. Bacillus. Escherichia ou analogues et ayant la capacité de produire la L-phénylalanine. Des exemples spécifiques de ces micro-organismes incluent les souches suivantes: Brevibacterium lactofermentum Au12637 (FERM BP-4160 demande de brevet japonais n 3-211052). Bacillus subtilis AJ12097 (FERM BP-609, publication de brevet japonais n0 3-47820). Pour la production de la L-phénylalanine conformément à la méthode de la présente invention utilisant un tel micro-organisme, la culture est effectuée dans un milieu liquide contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques et éventuellement d'autres nutriments mineurs organiques et des substances nutritives nécessaires au micro-organisme à cultiver. Comme sources de carbone, sont utilisables, par exemple les saccharides tels que glucose, saccharose, mélasses et hydrolysats d'amidon; les acides organiques tels qu'acide acétique et acide propionique; et les alcools tels qu'éthanol et propanol. Comme sources d'azote sont utilisables par exemple le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, l'urée et l'ammoniac.Comme nutriments mineurs organiques sont utilisables par exemple les aminoacides, les vitamines, les acides gras, les acides nucléiques, ainsi que les extraits de levure, la peptone, le casaminoacide et les hydrolysats de protéine de soja en contenant. De plus, les précurseurs de L-phénylalanine tels que l'acide phénylpyruvique et l'acide cinnamique sont également utilisables comme matières premières dans le milieu. Les sources de carbone, les sources d'azote et d'autres matières premières constituant le milieu peuvent toutes être ajoutées au milieu initial avant le démarrage de la culture, ou bien elles peuvent être ajoutées continuellement ou par intermittence au milieu durant la culture. La température de la culture peut être de 10 à 50-C, de préférence de 30 à 40il; et la valeur de pH du milieu peut être de 4,0 à 9,0, de préférence de 5,5 à 8,0. Pour ajuster le pH, on peut utiliser des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques ainsi que l'urée, le carbonate de calcium et l'ammoniac gazeux. La technique la plus importante pour mettre en oeuvre la présente invention consiste à précipiter les cristaux -alpha de Phe dans la culture avant la concentration de la L-phénylalanine accumulée dans la culture ait atteint la valeur de sa solubilité. Lorsque les cristaux -alpha de Phe sont beaucoup plus instables que les cristaux -bêta de Phe d'un point de vue d'énergie, ou lorsque la solubilité des cristaux -alpha de Phe est beaucoup plus grande que celle des cristaux -bêta de Phe lorsque la concentration de la L-phénylalanine accumulée dans la culture est supérieure à sa solubilité alors les cristaux -bêta de Phe précipiteraient spontanément hors de la culture à moins que l'on applique un moyen spécifique au système de culture. Par ailleurs, lorsque la stabilité des cristaux -alpha de Phe et celle des cristaux -bêta de Phe varie ou s'inverse au cours de la culture, alors les cristaux -alpha de Phe produits et accumulés dans la culture se dissolveraient ou seraient convertis en cristaux -bêta de Phe par conversion de phases, et la continuation de la culture sera difficile par la suite. Comme moyen de précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture au point où la concentration de la L-phénylalanine accumulée a atteint une valeur proche de sa solubilité, on peut mentionner une méthode d'addition des cristaux de semence de cristaux -alpha de Phe à la culture et une méthode de variation du pH de la culture. Lorsque les cristaux -alpha de Phe précipitent par la méthode d'addition de cristaux de germes de cristaux -alpha de Phe à la culture, le temps d'addition des cristaux de germes est de préférence au point juste avant que la concentration de la L-phénylalanine accumulée dans la culture ait atteint une valeur proche de sa solubilité après le commencement de la culture. Toutefois, même lorsque les cristaux de germes sont ajoutés à la culture dans laquelle la concentration de L-phénylalanine est encore insaturée, les cristaux de germes ajoutés au voisinage de la solubilité saturée de la L-phénylalanine se dissolveraient dans la culture et une addition supplémentaire favoriserait la précipitation des cristaux -alpha de L-phénylalanine dissous dans la culture. D'une manière générale, la présence des cristaux de L-phénylalanine d'environ 0,1 à 1% de la concentration de la L-phénylalanine accumulée dans la culture amène la précipitation des cristaux -alpha de Phe à partir de la L-phénylalanine à produire successivement. La quantité de cristaux -alpha de Phe à ajouter n'est donc pas définie d'une manière spécifique mais peut être choisie librement. Lorsque la concentration de la L-phénylalanine accumulée a atteint la valeur proche de sa solubilité ou a atteint environ 95% de sa solubilité saturée, les cristaux sont ajoutés à la culture généralement en quantité de 1 à 5% de la concentration de la Lphénylalanine dissoute.Pour additionner les cristaux -alpha de Phe de germes, on peut les ajouter à la culture tels quels ou bien ils peuvent être ajoutés à la culture sous la forme d'une bouillie à préparer en les mettant en suspension dans une quantité appropriée d'eau. Lorsque les cristaux -alpha de Phe précipitent par la méthode de variation du pH de la culture, la valeur du pH peut être amenée dans l'intervalle de 7,8 à 8,3 depuis le voisinage de pH 7,0 pour la fermentation générale de la Lphénylalanine au point où la concentration de la L-phénylalanine accumulée a atteint la valeur proche de sa solubilité après le commencement de la culture. Le changement du pH peut être effectué par addition d'une substance alcaline telle que l'ammoniac gazeux ou l'hydroxyde de potassium. La poursuite de la culture après la précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture donne une précipitation supplémentaire de la L-phénylalanine produite par la suite sous la forme de cristaux -alpha sans accroître la viscosité de la culture ou le surmoussage de la culture, et par suite elle peut se faire doucement. Après avoir fini la culture, la culture obtenue est concentrée et cristallisée, et les cristaux sont séparés et soumis à la dissolution et à la cristallisation répétées pour obtenir les cristaux de L-phénylalanine désirés avec une grande pureté avec facilité. Exemples La présente invention sera expliquée en plus amples détails par les exemples qui suivent. Exemple 1 Des cellules de Brevibacterium lactofermentum AJ12637 cultivées sur un milieu de gélose nutritive sont inoculées dans un milieu d'ensemencement stérilisé comprenant 2% de saccharose, 0,1% de phosphate de potassium, 0,04% de sulfate de magnésium, 0,001% de sulfate ferreux, 0,001% de sulfate de manganèse, 0,4% d'acétate d'ammonium, 0,2% (en tant qu'azote total) d'hydrolysats de protéine de soja, 0,04% de L-tyrosine, 100,ugS1 de biotine et 100,ug/1 de vitamine B1, 50 ml de milieu étant dans un ballon secoueur de 500 ml de volume, et cultivés par secouage à 310C pendant 24 h.Dix litres d'un milieu de fermentation comprenant 13% de glucose, 1% de sulfate d'ammonium, 0,15% de phosphate de potassium, 0,04% de sulfate de magnésium, 0,001% de sulfate de manganèse, 0,2% (en tant qu'azote total) d'hydrolysats de protéine de soja, 0,04% de L-tyrosine, 0,04% de DL-méthionine, 1,2% d'acide fumarique, 50 jugal de biotine et 200 g/I de vitamine B1 sont placés dans une jarre de fermentation de 20 1 et stérilisés à la vapeur et la culture d'ensemencement précédente y est ajoutée et cultivée dans les conditions de températures de 31su, de pH contrôlé de 7,0, de débit d'écoulement d'air de 1,3 vvm, une vitesse d'agitation de 400 tr/min et une pression interne de 0,1 kg/cm2 (9,8 kPa).Juste avant que le glucose dans la culture soit complètement consommé, une solution stérilisée contenant 60% de glucose est ajoutée en continu dans la jarre de fermentation et la concentration en glucose dans la culture est contrôlée à 1,0 à 2,5%. 55 h après le commencement de la culture, lorsque la concentration de la L-phénylalanine a atteint une valeur proche de sa solubilité, des cristaux -alpha de Phe en quantité de 1,0% de la concentration de la Lphénylalanine dissoute sont ajoutés pour continuer la culture qui s'accompagne de la précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture. De cette façon, la culture se poursuit pendant 80 h pour obtenir 161 d'une culture contenant 4,8% de L-phénylalanine (n'incluant pas les cristaux -alpha de Phe ajoutés).La culture ainsi obtenue est concentrée et cristallisée pour séparer les cristaux, qui sont ensuite soumis à la dissolution et à la cristallisation répétées à quatre reprises. Comme résultat, 0,47 kg de cristaux de L-phénylalanine ayant une pureté de 99,5% est obtenu. A titre de comparaison, la culture est conduite pendant 80 h dans les mêmes conditions, sauf que les cristaux -alpha de Phe ne sont pas ajoutés durant la culture. Dans le cas de comparaison, 151 d'une culture contenant 4,3% de L-phénylalanine sont obtenus. Elle est purifiée par la même méthode que celle précitée pour obtenir 0,42 kg de cristaux de L-phénylalanine. Les résultats des deux méthodes sont montrés dans le tableau 1 ci-après. Tableau I Cristaux -alpha de Phe Méthode conventionnelle ajoutés Productivité 0,60 g/l.h 0,54 g/l.h Rendement 16% 15% D'après les résultats, il est évident que la poursuite de la culture accompagnée de la précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture par addition des cristaux de germes de cristaux -alpha de Phe améliore la productivité et le rendement de L-phénylalanine. Exemple 2 Des cellules de Bacillus subtilis AJ12097 cultivées sur un milieu de gélose nutritive sont inoculées dans un milieu d'ensemencement stérilisé comprenant 3% du glucose, 0,1% de chlorure d'ammonium, 0,2% de chlorure de potassium, 0,1% de phosphate de potassium, 0,04% de sulfate de magnésium, 0,002% de sulfate ferreux, 0,002% de sulfate de manganèse, 0,2% (en tant qu'azote total) d'hydrolysats de protéine de soja, 0,02% de L-tyrosine et 0,02% de Ltryptophane, 50 ml de milieu étant dans un ballon secoueur de 500 ml de volume et cultivés dans ce ballon par secouage à 30'C pendant 24 h. Dix litres d'un milieu de fermentation comprenant 13% de glucose, 2% de chlorure d'ammonium, 0,2% de chlorure de potassium, 0,15% de phosphate de potassium, 0,04% de sulfate de magnésium, 0,002% de sulfate ferreux, 0,002% de sulfate de manganèse, 0,2% (en tant qu'azote total) d'hydrolysats de protéine de soja, 0,04% de L-tyrosine et 0,04% de L-tryptophane sont placés dans une jarre de fermentation de 201 et stérilisés à la vapeur, et la culture d'ensemencement précédente y est ajoutée et cultivée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Juste avant que le glucose dans la culture soit complètement consommé, une solution stérilisée contenant 60% de glucose est ajoutée en continu dans la jarre de fermentation et ainsi la concentration de glucose dans la culture est contrôlée à 1,0 à 2,5%. Quarante heures après le début de la culture, le pH contrôlé de la culture est déplacé de 7,0 à 7,8 par introduction d'ammoniac gazeux dans la culture. De cette façon, la culture se poursuit avec accompagnement de précipitation de cristaux -alpha de Phe dans la culture dans les conditions déplacées. Comme résultat de la poursuite de la culture pendant 100 h, 161 d'une culture contenant 4,6% de Lphénylalanine sont obtenus. Elle est purifiée de la même manière que dans l'exemple 1 pour obtenir 0,45 kg de cristaux de L-phénylalanine ayant une pureté de 99,5%. A titre de comparaison, la culture est conduite pendant 100 h dans les mêmes conditions, sauf que le pH contrôlé n'est pas déplacé durant la culture, et 151 de culture contenant 4,1% de L-phénylalanine sont obtenus. Elle est purifiée par la même méthode que celle précitée pour obtenir 0,4 kg de cristaux de Lphénylalanine. Les résultats des deux méthodes sont montrés dans le tableau 2 ciaprès. Tableau 2 &verbar; pH déplacé Méthode conventionnelle Productivité 0,46 g/l.h 0,41 g/l.h Rendement 15% 14% D'après les résultats, il est évident que la poursuite de la culture accompagnée de la précipitation des cristaux -alpha de Phe dans la culture par variation du pH de la culture améliore la productivité et le rendement en Lphénylalanine. REVENDICATIONS 1. Méthode de production de L-phénylalanine employant un microorganisme capable de produire de la L-phénylalanine, caractérisée en ce que l'on précipite les cristaux -alpha de Phe au cours de la culture dudit micro-organisme. 2. La méthode de production de la L-phénylalanine selon la revendication 1, selon laquelle la précipitation des cristaux -alpha de L-phénylalanine dans la culture est conduite par addition de cristaux de germes de cristaux -alpha de Lphénylalanine à la culture. 3. La méthode de production de la L-phénylalanine selon la revendication 1, selon laquelle la précipitation des cristaux -alpha de L-phénylalanine dans la culture est conduite par déplacement de pH de la culture dans un intervalle de 7,8 à 8,3.