Brevet FR2694895A1 — publié le 19940225

Procédé de fabrication de microparticules en émulsion par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification La présente invention concerne essentiellement un procédé de fabrication de microparticules en émulsion par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification. Avantageusement, cette fabrication de microparticules est obtenue par réaction chimique ou physicochimique au sein de la phase dispersée d'une émulsion d'une substance ou d'un mélange de substances, par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification par incorporation d'un agent chimique essentiellement insoluble dans le liquide dispersant, pour provoquer ladite réaction. il est connu de former des microparticules par réaction chimique, par exemple, par les documents FR-A-2 444497 Mars, FR-A-2 527438 CNRS, ou encore 8901221 BIOETICA qui décrivent la préparation de microcapsules par réticulation interfaciale d'une solution aqueuse de protéine ou d'un mélange de protéine et de polysaccharide au sein d'une phase hydrophobe à l'aide d'un agent bifonctionnel tel que les dichlorures d'acides. ll est également connu de fabriquer des microparticules par modifications physicochimiques à partir de solutions de polymères mais il s'agit de procédés de coacervation dits de coacervation simple ou de coacervation complexe (document EP 0 273 823 Al MERO ROUSSELOT SATIA, par exemple), selon que l'on fait intervenir respectivement un ou deux types de polymères. La présente invention permet de fabriquer des microparticules par une méthode différente des méthodes classiques de réticulation interfaciale ou de coacervation simple et complexe. La présente invention a pour but de réaliser la fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules, par un procédé de fabrication extrêmement simple, peu coûteux, présentant une bonne reproductibilité, donc une bonne fiabilité, permettant de régler la dimension des particules obtenues dans un large domaine de valeurs et surtout donnant la possibilité d'éviter l'utilisation d'agents réticulants bifonctionnels dont la présence résiduelle ou les produits de réaction sont susceptibles de compromettre la biocompatibilité des microparticules ou microcapsules ainsi formées, en le rendant ainsi très compétitif à l'échelle industrielle et de préférence adapté pour un usage cosmétique ou pharmaceutique ou encore alimentaire. La présente invention permet de résoudre simultanément ces exigences. Ainsi, la présente invention fournit un procédé de fabrication de microparticules, caractérisé en ce que l'on prépare tout d'abord une solution essentielle homogène d'une substance ou d'un mélange de substances, que l'on réalise une émulsion de la solution dans un liquide dispersant dans lequel ladite substance ou ledit mélange sont essentiellement insolubles, puis on déclenche une réaction chimique ou physicochimique par modification de la composition chimique in situ de ladite substance ou dudit mélange provoquant une modification de l'état physicochimique traduite par une insolubilisation de la substance ou du mélange de substances et en obtenant ainsi l'individualisation de particules qui sont ensuite récupérées. L'objet de la présente invention repose essentiellement sur la possibilité parfaitement nouvelle pour l'homme de l'art d'être capable de modifier la composition chimique de la phase dispersée d'une émulsion après que la dispersion ait été réalisée et ceci par l'intermédiaire d'agents non solubles ou non miscibles dans ouà la phase continue. Le moyen d'effectuer cette modification est d'ajouter à l'émulsion une solution de l'agent que l'on souhaite incorporer à la phase dispersée dissout dans un solvant miscible au liquide de la phase dispersée et présentant une certaine affinité pour la phase continue, cette dernière étant moindre que l'affinité vis-à-vis de la phase dispersée. Selon une application particulière, cette opération permet, de façon tout à fait inattendue, de faire diffuser l'agent permettant le déclenchement de la réaction à travers une phase hydrophobe jusque dans les gouttelettes d'une solution aqueuse dispersée, alors qu'une solution aqueuse du même agent est parfaitement inefficace. Comme substance ou mélange de substances utilisées pour la réalisation de la solution, on choisit de préférence des protéines, des polysaccharides ou des acides nucléiques, des mélanges de protéines, des mélanges de polysaccharides ou des mélanges de protéines et de polysaccharides, éventuellement avec des acides nucléiques. Comme protéines, on peut citer les protéines purifiées suivantes alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline, caséines, ovalbumine, albumines animalles, globulines sanguines, hémoglobine, fibrinogène, collagène, atélocollagène, gélatine, kératine, albumines végétales, globulines végétales, gluténines, gliadine; les extraits protéiques issus du lait, de la soie, des céréales, des légumineuses, des algues, du poisson. Comme polysaccharides, on peut citer l'agar, l'agarose, l'agaropectine, les carraghénanes, les alginates, les pectines, l'amylose, l'amylopectine, l'amidon, les amidons modifiés, les galactomannanes (guar, caroube), le glucomannane, le konjac, les celluloses modifiées, l'inuline, le xanthane, le dextrane, le curdlane, la gellane, le chitosan, les chondroitines sulfates, l'acide hyaluronique, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, l'héparine, le kératane sulfate. Comme acides nucléiques, on envisage l'acide ribonucléique et l'acide désoxyribonucléique. Comme réaction chimique, on envisage la formation de liaisons covalentes en particulier des estérifications et des amidations ou la formation de liaisons ioniques entre les groupements ionisables d'une substance ou d'un mélange de substances. Comme réaction physicochimique, on entend essentiellement des réactions telles que des réactions de coacervation, de précipitation ou de désolvatation. Comme insolubilisation, on entend essentiellement une séparation de phase au sein d'une solution initialement homogène ou une gélification de ladite solution ou une perte de solubilité par condensation ou polymérisation. Comme modification de la composition chimique, on envisage l'addi- tion d'un non-solvant, la modification du pH, l'addition d'électrolytes, l'addition de molécules susceptibles de réagir avec la ou les substances dissoutes dans la phase dispersée de l'émulsion. Selon un premier mode de réalisation avantageux, la modification de composition chimique induite in situ est une modification de pH; on réalise tout d'abord une émulsion d'une solution aqueuse d'une substance ou d'un mélange de substances susceptibles de subir par réaction chimique ou physicochimique une variation d'état physicochimique traduite par une insolubilisation provoquée par une modification de pH, à un pH auquel l'état physicochimique de ladite substance ou dudit mélange de substances est celui d'une solution de viscosité appropriée à la réalisation d'une émulsion.Puis, on fait varier le pH, en ajoutant une substance modifiant le pH dissoute dans un solvant organique miscible à la phase aqueuse, pour déclencher la réaction chimique ou physicochimique et amener la substance ou le mélange de substances dans un état physicochimique correspondant à une insolubilisation de la substance ou du mélange et qui conduit à la formation de microparticules physiquement individualisées. Comme substance modifiant le pH, on utilise en général un acide, une base, ou un tampon en fonction de la valeur de pH souhaitée. Selon une caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, la substance utilisée si l'on souhaite alcaliniser la phase dispersée de l'émulsion est une solution de soude ou de potasse dans un alcool tel que le méthanol ou méthanol, utilisés purs ou renfermant 5 à 10 % (p/v) d'eau, ou encore un polyol, tel que le glycérol ou un polyéthylèneglycol. Selon une caractéristique préférée, la solution contient entre 0,5 et 10 % de soude dans méthanol 95 % (p/v). Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, la substance utilisée si l'on souhaite acidifier la phase dispersée de l'émulsion est une solution d'un acide monocarboxylique ou polycarboxylique, porteur ou non de fonctions alcool, comme l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide malique, ou d'un acide minéral comme l'acide chlorhydrique, dans un alcool tel que le méthanol ou méthanol, purs ou renfermant 5 à 10 % d'eau, ou encore dans un polyol, tel que le glycérol ou un polyéthylèneglycol. Selon une caractéristique préférée, la solution acide est constituée d'éthanol à 95 % contenant entre 1 et 10 % (v/v) d'acide acétique. Selon un premier aspect, la réaction provoquée in situ par le changement de pH dans les gouttelettes de la phase dispersée est une réaction physicochimique de coacervation. Dans ce cas, le procédé de fabrication des microparticules est avantageusement le suivant: a) on prépare une solution aqueuse d'une substance choisie parmi les acides nucléiques, un polysaccharide ou une protéine ou les divers mélanges de ces substances, le pH étant choisi de façon que la substance ou le mélange de substances forme une solution essentiellement homogène, de viscosité compatible avec la réalisation d'une émulsion; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel la substance ou les substances précitées sont essentiellement insolubles; c) on mélange le liquide hydrophobe et la phase aqueuse pour former une émulsion;; d) on ajoute à l'émulsion soit une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse si l'on souhaite alcaliniser la phase aqueuse ou une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse si l'on souhaite acidifier la phase aqueuse; e) après une période de temps prédéterminée nécessaire pour réaliser la coacervation de la ou des substances initialement solubilisées, on recueille les microparticules formées par centrifugation ou par filtration; f) dans la majorité des cas, il est préféré de renforcer la cohésion des microparticules par une réticulation. Parmi les agents -classiques pour l'homme de l'art- de réticulation des composés polyaminés, polycarboxylés ou polyhydroxylés ou présentant un mélange de ces types de groupements, on citera à titre d'exemple un certain nombre de réactifs qui peuvent être regroupés en deux types. Le premier type est constitué des agents bifonctionnels qui forment un pontage entre les groupements réactifs de la ou des substances constitutives des microparticules et subsistent dans le produit de réaction. Le glutaraldéhyde, le formaldéhyde et les di-aldéhydes en général, les dichlorures d'acides, les dianhydrides d'acides, les isocyanates, les succinimides font partie de ce type de réactifs. Le second type de réactifs concerne les agents qui ne forment pas de pontage mais qui activent les groupements carboxyliques en particulier, de façon qu'ils puissent former des liaisons amides avec les groupements aminés ou des liaisons esters avec les fonctions alcools de la substance ou du mélange de substances mis en oeuvre pour la fabrication des microparticules. Les méthodes aux azides telles que décrites dans les documents 87 103 17 BIOETICA et 8904846 BIOETICA ou utilisant des carbodiimides, par exemple, sont représentatives de ce type de méthodes. Dans le cas où l'on souhaite préparer des microparticules de parfaite biocompatibilité, ce qui est absolument indispensable pour une utilisation pharma ceutique, on préférera particulièrment l'utilisation des méthodes du second type qui, permettant la formation de liaisons amides ou esters directement entre les groupements carboxyliques d'une part et aminés ou alcools d'autre part de la ou des substances constitutives des microparticules, conduisent à l'obtention tout à fait remarquable de microparticules constituées uniquement de la ou des substances mises en oeuvre pour la réalisation de l'émulsion, à l'exclusion de tout agent de réticulation. Selon une variante particulière, la protéine utilisée est du collagène, en effet cette protéine est essentiellement soluble à pH inférieur à 4 et précipite à des pH supérieurs à cette valeur. On fabrique donc une solution de collagène à un pH voisin de 3,5. On réalise une émulsion par dispersion de la solution de collagène dans un liquide hydrophobe. On alcalinise les gouttelettes de la solution de collagène par addition à l'émulsion d'une solution alcoolique alcaline ce qui provoque une précipitation du collagène et ainsi une individualisation de microparticules de collagène que l'on peut récupérer par centrifugation ou par filtration et auquel on peut ensuite faire subir une réticulation selon les méthodes précitées. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la concentration de la solution de collagène est comprise entre 0,1 et 2 %, de préférence voisine de 0,5 % (p/v). Selon une seconde variante particulière la protéine utilisée est de l'atélocollagène. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la concentration de la solution d'atélocollagène est comprise entre 0,3 et 4 % (p/v). Selon une troisième variante particulière, le polysaccharide utilisé est le chitosan. Le chitosan est un polymère polyionique qui n'est soluble en phase aqueuse qu a des pH inférieurs à 5. Lorsque le pH d'une solution de chitosan est amené à un pH proche de la neutralité, le polymère précipite en formant des fibrilles parfaitement insolubles dans l'eau. On peut tirer profit de cette propriété pour la réalisation de microcapsules selon l'invention. On prépare une solution de chitosan à pH acide, on réalise une émulsion dans un liquide hydrophobe, on modifie le pH de la phase dispersée par ajout, à l'émulsion, d'une base en solution alcoolique. La précipitation in situ permet la formation de microparticules facilement récupérables que l'on peut réticuler ultérieurement de façon chimique si nécessaire. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, on préfère un chitosan hautement désacétylé et de très haut poids moléculaire, de préférence supérieur à 300 000 daltons. Par "hautement désacétylé" on entend de préférence un taux d'acétylation résiduel inférieur à environ 5 %, mieux 3,5%. De tels chitosans hautement désacétylés sont disponibles dans le commerce. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la concentration de la solution de chitosan est comprise entre 0,2 et 10 %, de préférence voisine de 1%(p/v). Selon un second aspect de formation de sphères par variation du pH de la phase dispersée d'une émulsion, la formation de microcapsules est réalisée par déclenchement, une fois que l'émulsion est réalisée, d'une réaction chimique entre les groupements réactionnels d'une substance ou de substances mélangées. La réaction chimique peut être, par exemple, une réaction de transacylation qui se produit à pH alcalin entre un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, et soit une substance polyaminée comme par exemple une protéine, soit une substance polyhydroxylée comme par exemple un polysaccharide porteur de groupements hydroxyles. Dans ce cas, le procédé de fabrication des microparticules est avantageusement le suivant: a) on prépare une solution aqueuse neutre donc non réactive renfermant d'une part un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, et d'autre part soit une substance polyaminée comme par exemple une protéine, soit une substance polyhydroxylée comme par exemple un polysaccharide porteur de groupements hydroxyles; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel le polysaccharide estérifié et la substance polyaminée ou polyhydroxylée sont essentiellement insolubles; c) on mélange le liquide hydrophobe et la solution aqueuse pour former une émulsion;; d) on ajoute à l'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, ce qui permet l'obtention de conditions physicochimiques favorables au déroulement de la réaction entre la substance polyaminée ou la substance polyhydroxylée et le polysaccharide porteur des groupements carboxyliques estérifiés; e) après une période de temps prédéterminée nécessaire pour réaliser une réaction de transacylation, en formant ainsi des microparticules, en particulier des microcapsules, on réalise une neutralisation de l'émulsion, de préférence en ajoutant à l'émulsion une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse; ce qui neutralise et stabilise les microparticules, en particulier les microcapsules formées. Selon une variante de réalisation, on forme une émulsion de la solution aqueuse comme phase dispersée dans le liquide hydrophobe formant la phase continue. Selon un second mode de mise à profit de l'invention, la modification de composition chimique induite in situ après réalisation de l'émulsion, est une modification de la concentration en certains électrolytes. Un certain nombre de polysaccharides s'associent spécifiquement avec des ions ou des polyions pour former des gels. En particulier un certain nombre de polysaccharides polyanioniques s associent spécifiquement avec des cations ou des polycations, plus particulièrement avec des cations monovalents comme le potassium et le sodium ou bivalents comme le calcium, le magnésium, le strontium ou le baryum. Cette association se traduit par la formation de gels plus ou moins cassants en fonction de la nature du polysaccharide, du cation et des concentrations mises en oeuvre. Selon une variante particulière, on réalisera un mélange de polysaccharides de façon à pouvoir moduler la cohésion du gel formé. Comme polysaccharide préférentiellement utilisé, on chosit les carraghénanes kappa et iota, les pectines faiblement méthylées, les alginates et la gomme gellane. Selon une variante de réalisation, le polysaccharide est de la gomme gellane, qui est un polysaccharide polyanionique de très haut poids moléculaire (au moins 500 000 daltons) fabriqué par des microorganismes. Solubilisé dans l'eau, le gellane donne une solution de viscosité faible avec laquelle il est possible de réaliser une émulsion par dispersion dans une phase hydrophobe. Lorsqu'une telle émulsion est chauffée à une température supérieure à 750C et que des cations sont ajoutés par un procédé selon l'invention, les gouttelettes de la phase dispersée subissent une gélification. Après retour à la température ambiante, il est possible de récupérer les sphères ainsi formées et de les réticuler ultérieurement de façon chimique Si nécessaire. Selon une caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, la concentration de la solution de gellane est comprise entre 0,1 et 5 % et encore mieux voisine de 0,6 % (p/v). Selon une autre caractéristique du procédé de fabrication, on réalise une solution éthanolique contenant des ions calcium ou magnésium ou sodium ou potassium de façon à amener la solution à une concentration en ions comprise entre 1 et 400 mM, de préférence plutôt comprise entre 5 et 10 mM, pour les ions calcium et magnésium et de préférence comprise entre 150 et 250 mM pour les ions sodium et potassium. Selon une autre variante de réalisation, le polysaccharide utilisé est un carraghénane kappa ou un carraghénane iota qui gélifie respectivement en présence d'ions potassium ou calcium. Selon une caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, on dissout le carraghénane à froid, à pH neutre ou alcalin dans des concentrations comprises entre 0,1 et 5 % (p/v), de préférence voisines de 1,5 %. On élève la température autour de 80in, puis on réalise une émulsion par dispersion dans un liquide hydrophobe. On provoque alors la gélification des gouttelettes par addition d'une solution alcoolique contenant des ions potassium ou calcium selon que la solution aqueuse contient du carraghénane kappa ou iota. Selon une troisième variante de réalisation, le polysaccharide utilisé est une pectine faiblement méthylée qui forme des solutions gélifiables en présence d'ions calcium. Selon une caractéristique avantageuse, on réalise une solution de pectine de concentration comprise entre 0,1 et 10 %, de préférence de l'ordre de 1 à 2 % (p/v), à froid, à pH neutre. On réalise une émulsion par dispersion dans un liquide hydrophobe. Puis on rajoute, selon l'invention, des ions calcium sous forme d'une solution alcoolique de chlorure de calcium. Selon une dernière variante de réalisation, on réalise le même type de procédé à partir d'une solution contenant de 1 à 2 % (p/v) d'alginate de sodium. Enfin, selon un deuxième aspect, la présente invention concerne encore une composition telle qu'une composition cosmétique ou une composition pharmaceutique, ou une composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend des microparticules, en particulier des microcapsules, obtenues par le procédé précité. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre, faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire. Exemple 1 de l'invention Fabrication de microparticules d'atélocollagène a) Préparation de la phase aqueuse On prépare une solution d'atélocollagène bovin à 2 % (p/v) dont le pH est ajusté à 4. b) Emulsification On émulsionne 40 ml de cette phase aqueuse dans 250 ml de cocoate d'éthyle-2-hexyle contenant 2 % v/v de Span 85(8) comme phase dispersante, par agitation mécanique pendant quelques minutes. c) Alcalinisation On ajoute deux fois 10 ml de soude à 2 % (p/v) dans de l'éthanol à 95 % à 10 min d'intervalle. On laisse la réaction se dérouler pendant 10 min après chaque ajout. d) Lavages Les microparticules sous forme de sphères sont recueillies par centrifugation, puis lavées dans plusieurs bains d'éthanol à 95 %. e) Réticulation Les sphères sont réticulées par incubation pendant 24 h à 40C dans un bain de diméthylformamide contenant 0,5 % (v/v) de diphénylphosphorylazide, puis pendant 4h à température ambiante dans du tampon borate pH 8,9 (tétraborate de sodium 0,04 M, acide borique (0,04 M). Après lavages à l'eau, les microparticules ainsi obtenues peuvent être lyophilisées. Exemple 2 de l'invention Fabrication de microparticules de chitosan a) Préparation de la phase aqueuse On prépare une solution à 1 % (p/v) de chitosan HPM hautement désacétylé (Aber Technologies) dans de l'acide acétique à 1,25 %, pH 4. b) Emulsification On réalise une émulsion par dispersion de 50 ml de cette solution dans 250 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % (v/v) de Span 858. L'émulsion est maintenue sous agitation mécanique pendant 10 min. c) Alcalinisation On ajoute 16 ml de soude à 2 % p/v dans méthanol à 95 % et on poursuit l'agitation pendant 15 min. d) Lavages Les microparticules sont récupérées par centrifugation et lavées dans plusieurs bains d'éthanol, puis d'eau. e) Réticulation Les microparticules peuvent être réticulées selon l'exemple 1. Exemple 3 selon l'invention Fabrication de microparticules de diamètre moyen 150m à partir de sérumalbumine humaine (HSA) et d'alginate de propylèneglycol (PGA). a) Préparation de la phase aqueuse On prépare, par agitation magnétique de 10 min à température ambiante, une solution dans l'eau distillée renfermant 20 % d'HSA (Centre de Transfusion Sanguine, Strasbourg) et 1 % d'un PGA présentant un taux d'estérification compris entre 80 et 85 % (Kelcoloïd S(g), KELCO International). b) Emulsification On émulsionne 6 ml de cette phase aqueuse utilisée comme phase dispersée dans 40 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % v/v de Span 85(8 comme phase dispersante, par agitation mécanique de 5 min à 2000 tr/min. c) Alcalinisation On ajoute à l'émulsion en agitation 2 ml d'une solution de soude à 2 % p/v dans méthanol à 95 % et on laisse la réaction de transacylation se développer pendant 15 min, ce qui produit des microparticules. d) Acidification On ajoute au milieu réactionnel en agitation 2 mol d'une solution à 7,6 % v/v d'acide acétique dans méthanol à 95 %. L'agitation est encore maintenue pendant 15 min de manière à permettre la neutralisation des microparticules formées. e) Lavages Les microparticules sont séparées par centrifugation, puis lavées par remises en suspension dans de l'éthanol à 95 % renfermant 2 % de Tween 20), puis dans méthanol à 95 %, puis dans l'eau distillée. Les microparticules peuvent être ensuite congelées et lyophilisées. On obtient des sphères transparentes de taille moyenne 150 jan. Après lyophilisation, la réhydratation de la poudre obtenue montre que les microparticules sont intactes et reprennent leur forme sphérique. Essais de stabilité dans divers milieux contenant ou non des protéases Dans des tubes à essais, des prises d'essai de 25 mg de microparticules lyophilisées sont réhydratées par addition de 1 ml d'eau distillée, puis additionnées de 7,5 ml de différents milieux: - de l'eau distillée - une solution de pH acide (1,2) additionnée ou non de pepsine (milieu gastrique artificiel, USP XXI) - une solution de pH légèrement alcalin (7,5), additionnée ou non de trypsine (0,25 % p/v). Les tubes sont incubés à 37ex. La stabilité des microparticules est étudiée par examen microscopique. Le temps de lyse est le temps au bout duquel toutes les microparticules ont disparu du milieu. Résultats Les microparticules préparées selon cet exemple sont stables plus de 3 j dans l'eau distillée comme dans les solutions de pH 1,2 ou de pH 7,5. Elles sont dégradées par les protéases : en 15 min par la pepsine, en 25 min par la trypsine. Exemple 4 de l'invention Fabrication de microparticules à partir de gélatine et de PGA. Préparation de la phase aqueuse On prépare, à la température de 40in, 8 ml d'une solution aqueuse de gélatine type B, bloom 150, à la concentration de 10 %, et de PGA à la concentration de 1 %. Emulsification Dans un récipient thermostaté à 40*C, 6 ml de cette phase aqueuse sont émulsionnés dans 40 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % de Span 85 et préchauffés à la température de 400C (vitesse d'agitation : 2000 tr/min). L'alcalinisation La neutralisation et les lavages sont ensuite effectués comme décrit dans l'exemple 3. Les microparticules apparaissent comme des sphères de diamètre moyen 1 mm. Après lyophilisation, elles donnent une poudre blanche qui se réhydrate facilement. Exemple 5 de l'invention Fabrication de microparticules à partir d'atélocollagène et chondroitine sulfate et de PGA. Préparation de la phase aqueuse Une solution à 1,6 % d'atélocollagène et 0,6 % de chondroitine sulfate dans un tampon phosphate pH 7,4 est additionnée de PGA à la concentration de 0,7 %. Le protocole décrit à l'exemple 3 est ensuite appliqué à cette solution aqueuse. On obtient des microparticules de diamètre moyen 600 m. Exemple 6 de l'invention Fabrication de microparticules à partir d'un concentré de protéines du lactosérum et dePGA. Préparation de la phase aqueuse Dans 16 ml d'eau distillée, on dissout 160 mg de PGA, et 3,2 g de concentré de protéines du lactosérum (Prosobel S65E8, Bel Industries). Le protocole décrit à l'exemple 3 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 12 ml de la solution précédente et en doublant tous les volumes des différents réactifs. On obtient des microparticules sphériques à contenu granuleux, de diamètre moyen 500 um, qui sont intactes après lyophilisation. Exemple 7 de l'invention Fabrication de microparticules à partir d'ovalbumine et de pectine. Préparation de la phase aqueuse Dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 240 mg de pectine de pomme (FLUKA, estérification : 70 à 75 %), et 800 mg d'ovalbumine. Puis le protocole décrit dans l'exemple 3 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente, en remplaçant le myristate d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide, et en doublant les volumes des solutions alcaline et acide. On obtient des microparticules de taille moyenne 200 mi, à contenu granuleux. Exemple 8 de l'invention Fabrication de microparticules à partir de carboxyméthylcellulose (CMC) et de PGA. Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 80 mg de CMC (CMC 7 LF, degré de substitution : 0,7, Hercules) et 320 mg de PGA, par agitation magnétique de 15 min à 40*C. Puis le protocole décrit dans l'exemple 3 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente. On obtient des microparticules granuleuses de taille moyenne 1,8 mm. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules, caractérisé en ce que l'on prépare tout d'abord une solution essentiellement homogène d'une substance ou d'un mélange de substance, que l'on réalise une émulsion de la solution dans un liquide dispersant dans lequel ladite substance ou ledit mélange sont essentiellement insolubles, puis on déclenche une réaction chimique ou physicochimique par modification de la composition chimique in situ de ladite substance ou dudit mélange provoquant une modification de l'état physicochimique traduite par une insolubilisation de la substance ou du mélange de substance et en obtenant ainsi l'individualisation de particules qui sont ensuite récupérées. 2. Procédé selon la revendication 1, en ce qu'on modifie la composition chimique de la phase dispersée par l'intermédiaire d'un agent non soluble ou non miscible dans/ou à la phase continue. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent non soluble ou non miscible dans/ou à la phase continue est présent dans une solution que l'on souhaite incorporer la phase dispersée à l'état dissous dans un solvant mis cible au liquide de la phase dispersée et présentant une certaine affinité pour la phase continue, cette dernière étant moindre que l'affinité vis-à-vis de la phase dispersée. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme substance ou mélange de substances précitées une substance choisie parmi des acides nucléiques, une protéine, ou un polysaccharide, ou les divers mélanges de ces substances. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que comme réaction chimique, on réalise la formation de liaisons covalentes en particulier des estérifications et des amidations ou la formation de liaisons ioniques entre les groupements ionisables d'une substance ou d'un mélange de substances. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que comme réaction physicochimique, on réalise une réaction choisie parmi une réaction de coacervation, de précipitation ou de désolvatation. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que comme insolubilisation précitée, on réalise une séparation de phase au sein d'une solution initialement homogène ou une gélification de ladite solution ou une perte de solubilité par condensation ou polymérisation. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 ou 7, caractérisé en ce que, comme modification de la composition chimique, on réalise l'addition d'un non-solvant, la modification du pH, l'addition d'électrolytes, l'addition de molécules susceptibles de réagir avec la ou les substances dissoutes dans la phase dispersée de l'émulsion. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 ou 8, caractérisé en ce qu'on réalise une modification de pH pour produire la modification de composition chimique induite in situ ; on réalise tout d'abord une émulsion d'une solution aqueuse d'une substance ou d'un mélange de substances susceptibles de subir par réaction chimique ou physicochimique une variation d'état physicochimique traduite par une insolubilisation provoquée par une modification de pH, à un pH auquel l'état physicochimique de ladite substance ou dudit mélange de substances est celui d'une solution de viscosité appropriée à la réalisation d'une émulsion puis on fait varier le pH, en ajoutant une substance modifiant le pH dissoute dans un solvant organique miscible à la phase aqueuse, pour déclencher la réaction chimique ou physicochimique et amener la substance ou le mélange de substances dans un état physicochimique correspondant à une insolubilisation de la substance ou du mélange et qui conduit à la formation de microparticules physiquement individualisées. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on utilise comme substance modifiant le pH un acide, une base ou un tampon en fonction de la valeur de pH souhaitée. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes: a) on prépare une solution aqueuse d'une substance choisie parmi les acides nucléiques, un polysaccharide ou une protéine ou les divers mélanges de ces substances, le pH étant choisi de façon que la substance ou le mélange de substances forme une solution essentiellement homogène de viscosité compatible avec la réalisation d'une émulsion; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel la substance ou les substances précitées sont essentiellement insolubles; c) on mélange le liquide hydrophobe et la phase aqueuse pour former une émulsion;; d) on ajoute à l'émulsion soit une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse si l'on souhaite alcaliniser la phase aqueuse ou une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse si l'on souhaite acidifier la phase aqueuse; e) après une période de temps prédéterminée nécessaire pour réaliser la coacervation de la ou des substances initialement solubilisées, on recueille les microparticules formées par centrifugation ou par filtration; f) dans la majorité des cas, il est préféré de renforcer la cohésion des microparticules par une réticulation. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent de réticulation des composés polyaminés, polycarboxylés ou polyhydroxylés précités ou de leur mélange, un agent bifonctionnel tel que le glutaraldéhyde, le formaldéhyde et les di-aldéhydes comme les dichlorures d'acides, les di-anhydrides d'acides, les isocyanates, les succinimides ; ou un agent d'activation de groupements carboxyliques pour former des liaisons amides avec les groupements aminés ou des liaisons esters avec les fonctions alcools de la substance ou du mélange de substances, tel qu'un carbodiimide ou un azide. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise une protéine de préférence choisie parmi le collagène ou l'atélocollagène ; ou un polysaccharide de préférence le chitosan. 14. Procédé selon l'une des revendications 1à 6, caractérisé en ce qu'on réalise une réaction chimique de transacylation qui se produit à pH alcalin entre un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et soit une substance polyaminée comme par exemple une protéine, soit une substance polyhydroxylée comme par exemple un polysaccharide porteur de groupements hydroxyles. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend: a) on prépare une solution aqueuse neutre donc non réactive renfermant d'une part un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, et d'autre part soit une substance polyaminée comme par exemple une protéine, soit une substance polyhydroxylée comme par exemple un polysaccharide porteur de groupements hydroxyles; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel le polysaccharide estérifié et la substance polyaminée ou polyhydroxylée sont essentiellement insolubles; c) on mélange le liquide hydrophobe et la solution aqueuse pour former une émulsion;; d) on ajoute à l'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, ce qui permet l'obtention de conditions physico-chimiques favorables au déroulement de la réaction entre la substance polyaminée ou la substance polyhydroxylée et le polysaccharide porteur des groupements carboxyliques estérifiés; e) après une période de temps prédéterminée nécessaire pour réaliser une réaction de transacylation, en formant ainsi des microparticules, en particulier des microcapsules, on réalise une neutralisation de l'émulsion, de préférence en ajoutant à l'émulsion une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; ce qui neutralise et stabilise les microparticules, en particulier les microcapsules formées. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on forme une émulsion de la solution aqueuse comme phase dispersée dans le liquide hydrophobe formant la phase continue. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'on utilise comme substance un polysaccharide capable de s' associer spécifiquement avec un ion ou un polyion pour former un gel, de préférence choisi parmi le carraghénane kappa et iota, une pectine faiblement méthylée, un alginate et la gomme gellane ayant de préférence un haut poids moléculaire d'au moins 500 000 daltons. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on utilise du gellane à une concentration en solution aqueuse comprise entre 0,1 et 5 % et encore mieux voisine de 0,6 % (p/v). 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'on réalise une solution éthanolique contenant des ions calcium ou magnésium ou sodium ou potassium de façon à amener la solution à une concentration en ions comprise entre 1 et 400 mM. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on utilise du carraghénane kappa ou iota qui se gélifie respectivement en présence d'ions potassium ou calcium; on dissout le carraghénane à froid, à pH neutre ou alcalin dans des concentrations comprises entre 0,1 et 5 % (p/v), on élève la température autour de 800C et on réalise une émulsion par dispersion dans un liquide hydrophobe; on provoque ensuite la gélification des gouttelettes par addition d'une solution alcoolique contenant des ions potassium ou calcium selon que la solution aqueuse contienne du carraghénane kappa ou iota. 21. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on utilise comme polysaccharide une pectine faiblement méthylée qui forme des solutions gélifiables en présence d'ions calcium; la solution de pectine étant réalisée à une concentration comprise entre 0,1 et 10 % (p/v) à froid, à pH neutre, puis on réalise une émulsion par dispersion dans un liquide hydrophobe, puis on rajoute enfin des ions calcium sous forme d'une solution alcoolique de chlorure de calcium. 22. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on utilise comme polysaccharide une solution d'alginate de sodium à 1 à 2 % (p/v). 23. Composition telle qu'une composition cosmétique ou une composition pharmaceutique ou une composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend des microparticules, en particulier des microcapsules, telles qu'obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 précitées.