Brevet FR2692786A1 — publié le 19931231

Anticorps monoclonaux humains anti-Rhésus D et lignées cellulaires les produisant. L ' invention concerne des anticorps monoclonaux humains dirigés contre l'antigène Rhésus D (Rh D) qui est exprimé à la surface des globules rouges humains et une composition pharmaceutique les contenant, destinée à la prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né. Ces anticorps sont produits par des lignées cellulaires hétérohybrides obtenues par fusion de lymphocytes B humains provenant de sujets volontaires Rhésus négatif, immunisés avec des hématies Rhésus positif, avec soit des cellules de myélome murin soit des cellules de myélomes hétérohybrides homme/souris. Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés, de manière prophylactique, pour la protection de femmes Rhésus négatif, avant ou immédiatement après la naissance d'un enfant Rhésus positif, pour prévenir, lors des grossesses ultérieures, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN). Les anticorps selon l'invention peuvent également être utilisés dans des tests de diagnostic. Ainsi 1' invention concerne, d'une manière générale, des anticorps monoclonaux anti D, les cellules hybrides produisant lesdits anticorps, les méthodes de préparation des hétérohybrides producteurs desdits anticorps ainsi que des compositions pharmaceutiques ou des tests diagnostiques comprenant lesdits anticorps. Les antigènes de groupes sanguins sont classés en plusieurs systèmes en fonction de la nature des molécules membranaires exprimées à la surface des hématies. Le système Rhésus (Rh) comprend 5 molécules ou antigènes : D, C, c, E et e (ISSITT, 1988). L'antigène D est la plus importante de ces molécules parce qu'elle est la plus immunogène, c'est-àdire qu'elle peut induire la production d'anticorps anti-D si des globules rouges Rh D positif sont transfusés à des sujets Rh négatif. L'antigène D est normalement exprimé chez 85 % des sujets caucasoïdes, ces personnes sont dites Rh positif 25 % des sujets sont donc Rh négatif c'est-à-dire que leurs hématies ne présentent pas d'antigène D. L'expression des antigènes D présente certaines variantes qui peuvent être liées soit à une faible densité antigénique, on parlera alors d'antigène D faible, soit à une antigénicité différente ou partielle, on parlera alors d'antigènes D partiels. Le caractère D faible est caractérisé par le fait qu'il s'agit d'un antigène normal mais dont le nombre de sites par hématie est diminué de manière plus ou moins importante ; ce caractère est transmissible selon les lois mendéliennes.Les phénotypes D partiels ont été découverts chez des sujets Rh D positif qui possédaient des anticorps anti-D sériques ; ces antigènes D partiels peuvent donc être caractérisés comme ne possédant qu'une partie de la mosaïque. Des études réalisées avec des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont permis de définir 7 catégories d'antigènes D partiels avec la description d'au moins 8 épitopes constitutifs de l'antigène D (LOMAS et al. 1989 ; TIPETT 1988). L'importance des anticoprs anti-Rh D est apparue avec la découverte des mécanismes entraînant la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN). Celle-ci correspond aux différents états pathologiques observés chez certains foetus ou chez certains nouveau-nés lorsqu'il y a une incompatibilité de groupe sanguin foeto-maternelle qui est responsable de la formation d'anticorps maternels anti-Rh D capables de traverser la barrière placentaire. En effet, le passage d'hématies foetales Rh positif chez une mère Rh négatif peut entraîner la formation d'anticorps anti-D. Après immunisation de la mère Rh négatif, les anticorps anti-D de classe IgG sont capables de traverser la barrière placentaire et de se fixer sur les hématies foetales Rh positif. Cette fixation entraîne l'activation de cellules immunocompétentes via leurs récepteurs Fc de surface induisant ainsi une hémolyse des hématies foetales sensibilisées. En fonction de l'intensité de la réaction, plusieurs degrés de gravité de la MHNN peuvent être observés. Un diagnostic de la MHNN peut être réalisé avant et après la naissance. Le diagnostic prénatal est basé sur l'évolution du taux des anticorps anti-D chez la mère en utilisant plusieurs techniques immunohématologiques. Le diagnostic post-partum peut être fait à partir d'un prélèvement dé sang de cordon en analysant les paramètres suivants : détermination des groupes sanguins du foetus, du père ; recherche d'anticorps anti-D ; dosages de l'hémoglobine et de la bilirubine. Une prophylaxie de la MHNN est actuellement systématiquement réalisée chez toutes les femmes de groupe sanguin Rh négatif ayant mis au monde un enfant Rh positif avec des injections d'immunoglobulines humaines anti-D. Les premiers essais réels d'immunoprophylaxie ont débuté en 1964. Pour que la prévention soit efficace, il faut que les immunoglobulines soient injectées avant 1 l'immunisation c'est-à-dire dans les 72 heures qui suivent l'accouchement et que les doses d'anticorps soient suffisantes (100 Ag d'anticorps par voie intraveineuse) . Actuellement des immunoglobulines polyclonales anti-Rh D sont utilisées, elles sont préparées à partir de plasmas de sujets volontaires qui ont été immunisés. Ces immunisations sont nécessaires parce qu'elles constituent les seules sources d'anticorps anti-Rh D disponibles jusqu'à présent.Des volontaires de sexe masculin et de groupe O Rh négatif sont immunisés régulièrement par injection intra-veineuse d'hématies O Rh positif. Le plasma de ces donneurs est récupéré par plasmaphérèse, plusieurs dons sont poolés et servent à la préparation des immunoglobulines anti-D intraveineuses. La préparation de telles immunoglobulines pose des problèmes de deux ordres particuliers - l'immunisation de sujets volontaires est limitée et contrôlée ; aucune nouvelle immunisation ne peut être actuellement réalisée en raison des problèmes éthiques que présentent de tels actes - en France comme en Europe, le nombre de donneurs immunisés est trop faible pour assurer un approvisionnement suffisant en anticorps anti-D.D'autre part, cette pénurie d'immunoglobuline anti-D ne permet pas de réaliser une prophylaxie de la MHNN dans de bonnes conditions en particulier au cours des grossesses, si bien que du plasma hyperimmunisé est importé des Etats-Unis par exemple. Pour la prévention de la MHNN, il a été démontré que les anticorps anti-D doivent être de classe IgG et non IgM pour que le blocage de l'immunisation de la mère soit efficace. Des anticorps polyclonaux sont utilisés depuis longtemps et SHAW et al (1988) ont montré que ces préparations contiennent des IgGl et des IgG3. Plusieurs rapports ont mis en évidence que les anti-D IgG3 sont plus efficaces que les IgG1 pour induire in vitro une phagocytose par les monocytes macrophages de globules rouges sensibilisés avec des anti-D (URBANIAK and GREISS, 1980 WIENER et al. 1987 ; ZUPANSKA et al. 1987 ; ROZSNGAY et al. 1989 ; BROJER et al. 1989 ; HADLEY and KUMPEL 1989). Par contre, il a été prouvé que les anti-D IgGl induisent de meilleurs résultats in vitro dans la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC Antibody Dependent Cell Cytotoxicity) (KUMPEL et al. 1989 b). Plusieurs rapports ont mis en évidence une relation entre la sous-classe des anti-D maternels et la sévérité de la MHNN c'est-à-dire leur puissance à induire une lyse des hématies Rh D positif (EKLUND et al. 1988). La gravité de la maladie a tendance à être corrélée avec la présence d'Ig G1 (PARIMAUD et al. 1985, ZUPANSKA et al. 1989 ; POLLOCK and BOWMAN 1980). Divers travaux ont abouti à la production d'anticorps monoclonaux humains anti-D dans le but de remplacer les anticorps polyclonaux obtenus à partir du fractionnement de plasmas de donneurs volontaires immunisés. Ces anticorps de classe IgG et IgM sont utilisés en diagnostic pour la détermination des groupes sanguins mais aucun d'eux n'a été utilisé jusqu'à présent à des fins thérapeutiques. Les anticorps monoclonaux présentent plusieurs avantages, ils peuvent être obtenus en grande quantité à des prix raisonnables, chaque lot d'anticorps est homogène et la qualité des différents lots est reproductible car ils sont produits par la même lignée cellulaire qui est conservée cryopréservée dans l'azote liquide. La sécurité du produit peut être assurée quant à l'absence de contamination virale. Plusieurs publications décrivent l'obtention de lignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonaux humains anti- Rh D de classe IgG : BOYLSTON et al. 1980 KOSKIMIES 1980.; CRAWFORD et al. 1983 ; BRON et al. 1984 DOYLE et al. 1985 ; MELAMED et al. 1985 ; THOMPSON et al. 1986 ; FOUNG et al. 1987 ; GOOSSENS et al. 1987 ; KUMPEL et al. 1989 a) . La méthode utilisée est généralement une transformation de lymphocytes B avec le virus d'Epstein-Barr avec ou sans fusion consécutive avec des cellules de myélome. Des brevets concernant de tels anticorps monoclonaux et leurs lignées sécrétrices ont été déposés ou délivrés : RODER 1981 ; CRAWFORD 1982 ; KAPLAN et al. 1984 ONO et al. 1983 ; HUGHES-JONES et al. 1986 (a, b) ; DE BURGH BRADLEY et al. (a, b, c) ; SAITO et al.1988. De plus, il a été récemment décrit qu'un anticorps monoclonal anti-D de classe IgG3 était efficace in vivo dans la destruction d'hématies Rh D positif (THOMSON et al. 1990). La prévention de la MHNN à l'aide d'un mélange d'anticorps monoclonaux de haute affinité, de nature et de qualité constantes, garantirait une efficacité prophylactique et représenterait un progrès significatif par rapport aux méthodes utilisées actuellement. C'est pourquoi l'objet de la présente invention est de proposer des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène Rh D, ci-après appelés anti-D, et, plus précisément un mélange de deux anticorps de sous classes différentes, destinés à assurer une prévention fiable de- la MHNN. Ces anticorps ne présentent aucune réaction croisée avec les autres antigènes du système Rhésus : C c E et c. L'un des anticorps anti-D est de sous classe IgG1 avec une chaîne légère de type Kappa et un allotype Glm (3) (GRUBB et al. 1970) et reconnaît les antigènes D partiels à l'exception de la catégorie D VI. L'autre anticorps anti-D est de sous classe IgG3 avec une chaîne légère de type Kappa et reconnaît les antigènes D partiels IIIa, IIIc, IVa, Va et Vc mais non la catégorie D VI. Ces deux anticorps présentent des avantages considérables par rapport aux anticorps polyclonaux anti-D extraits du plasma humain - les cellules sélectionnées produisent de grandes quantités d'anticorps de qualité constante; - les anticorps présentent une forte affinité pour l'antigène D; - la spécificité des anticorps a été contrôlée vis à-vis de plus de 1 500 échantillons de sang; - les anticorps reconnaissent toutes les catégories de D partiels à l'exception du D VI. L'invention concerne également les cellules productrices des anticorps décrits plus haut et le procédé permettant leur sélection. Les anticorps anti-D sont produits par des cellules hétérohybrides obtenues directement par fusion soit avec des cellules de myélome murin, soit avec des cellules d'un hétéromyélome préalablement stabilisé et non pas par immortalisation avec le virus d'Epstein-Barr comme c'est le cas pour la grande majorité des anti-D humains de classe IgG décrits dans l'art antérieur. Cette technique de sélection est particulièrement avantageuse en terme de sécurité car elle permet de réaliser des préparations d'anticorps sans risques potentiels liés à la libération possible du virus d'Epstein-Barr. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention la sélection des cellules productrices d'anticorps est opérée de la manière suivante - des lymphocytes B du sang périphérique de donneurs sains, O Rh D négatifs, immunisés avec des globules rouges D+ sont fusionnés soit avec une lignée cellulaire de myélome murin, soit avec des cellules d'une lignée d'hétéromyélome homme/souris, par la méthode au polyéthylène glycol (Gefter et al. 1977) ;; - les hybridomes obtenus sont sélectionnés en milieu de culture contenant de 1'HAT et criblés pour leur production en anticorps spécifiques à l'aide de globules rouges D+ traités à la papaïne, ce criblage s'effectuant par microagglutination - parmi les clones positifs, seuls les producteurs d'IgG sont sélectionnés (les IgM étant moins efficaces en prophylaxie de MHNN) et sont cultivés en milieu enrichi de 10 % de sérum foetal ; - les clones apparaissent instables aussi bien pour leur multiplication que pour leur taux de production en anticorps et doivent donc être reclonés plusieurs fois successivement, par la méthode de dilution limite (Lefkovits et al. 1979) et en suivant la sécrétion d'IgG par test ELISA ;; - les clones choisis sont ensuite adaptés à la croissance en milieu sans sérum (pour éviter la présence de sérum bovin dans la préparation finale d'anticorps) et reclonés, dans ce milieu, jusqu a ce que des lignées stables et à bonne croissance soient établies - la caractérisation détaillée de l'anticorps produit par chacune de ces lignées est ensuite effectuée pour en définir le sous-type, la spécificité et l'affinité, afin de sélectionner les lignées les plus appropriées en fonction de l'usage thérapeutique ultérieur des anticorps ; - les lignées sélectionnées sont multipliées en cytoculteurs et les anticorps monoclonaux produits sont purifiés par chromatographie d'échange d'ions. Deux lignées particulièrement intéressantes ont été retenues et un échantillon représentatif a été déposé à la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", la première (190/31), produisant un anticorps de type IgG1, sous le nO DSM ACC 2039 et la seconde, (P3 x 229 14G4), produisant un anticorps de type IgG3, sous le NO DSM ACC 2040. L'invention concerne également une composition pharmaceutique qui contient un mélange d'au moins deux anticorps monoclonaux anti-D, de sous-classes IgG1 et IgG3, ce mélange comprend de préférence de 30 à 70 % d'IgG3. La composition pharmaceutique selon l'invention présente une qualité supérieure à certaines préparations d'origine polyclonale qui correspondent à un mélange d'immunoglobulines G de différentes spécificités et qui ne peuvent être administrées pour la plupart que par la voie intramusculaire. A l'inverse la composition selon l'invention est un mélange de deux IgG monospécifiques qui peut être administrée par voie intraveineuse. De plus, lors de tests effectués in vitro, l'efficacité des anti-D monoclonaux est égale voire supérieure à celle observée avec les préparations polyclonales. D'autre part, différents types de traitements ont été réalisés sur les deux produits purifiés pour assurer une totale inocuité virale. De nombreux contrôles ont été réalisés in vitro comme in vivo pour vérifier l'absence de virus ou de particules infectieuses dans les produits purifiés. L'invention concerne également l'utilisation des anticorps monoclonaux tels que décrits plus haut pour la préparation de trousses (kits) de diagnostic sous toute forme acceptable pour la détection des antigènes Rhésus D. Les exemples suivants ilustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1. Sélection des lignées cellulaires productrices d'anticorps anti-D. a) Source des lymphocytes. Des donneurs d'anti-D en plasmaphérèse sont sélectionnés parmi des sujets de groupe sanguin Rh D négatif immunisés avec des hématies O Rh D positif ; ils sont régulièrement stimulés avec des hématies Rh D positif. Après une dernière immunisation 14 jours avant le prélèvement, 450 ml de sang périphérique ont été prélevés et les cellules mononucléées ont été séparées par centrifugation sur un gradient de densité puis lavées. b) Cellules de myélome. Deux types de fusions ont été réalisées selon la nature des cellules de myélome utilisé. - Des cellules de myélome murin (P3 x63 Ag8 653) qui présentent les caractéristiques suivantes : - déficientes en hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT -), - non sécrétrices d'Ig, - temps de doublement de l'ordre de 24 h. Ces cellules de myélome murin sont couramment utilisées pour la production d'anticorps monoclonaux murins. - Des cellules d'hétéromyélome HM22 obtenues par fusion préalable entre des lymphocytes B humains provenant de sujets non immunisés et des cellules du myélome murin SP2O qui est également un myélome utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux murins. Ces cellules HM22 présentent les mêmes caractéristiques que les cellules du myélome P3 x63 Ag8 653. c) Fusions Dans les deux cas les fusions ont été réalisées selon le même protocole. Environ 108 cellules mononucléées provenant d'un donneur immunisé ont été mélangées avec 3 x 107 cellules de myélome murin ou d'hétéromyélome. Sur le culot cellulaire obtenu après centrifugation des cellules, du polyéthylène glycol (PEG) a été ajouté pour induire la fusion cellulaire (GEFTER et al. 1977) . La suspension cellulaire a été ensuite lavée plusieurs fois et déposée dans des plaques de culture à 96 puits dans un milieu sélectif contenant 20 % de sérum de veau foetal et de l'aminoptérine (milieu hypoxanthine-aminoptérine-thimidine ou HAT). Une suspension de cellules péritonéales murines a été préalablement déposée dans les alvéoles de culture pour favoriser le développement des cellules hybrides.Les plaques de culture ont été mises dans des incubateurs à 370 C avec 5 % de CO2. d) Identification des cellules productrices d'anticorps Les surnageants de culture des plaques à 96 puits ont été prélevés après environ 3 semaines de culture pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-D. Un test de microagglutination a été réalisé en plaque à 96 puits avec 100 A1 de surnageant et 100 A1 d'hématies Rh D positif papaïnées. Tous les hétérohybrides présentant une activité anticorps ont été repiqués et clonés. Ainsi - à partir d'une expérience de fusions avec des cellules d'hétéromyélome, on a récupéré 43 hydridomes produisant des IgG et 21 produisant des IgM. Après 12 mois de culture continue, 8 lignées produisaient de hauts niveaux d'anti-D. L'une des lignées produisait la sous-classe IgG3, les autres, la sous-classe IgG1; - à partir d'une expérience de fusions avec des cellules de myélome murin, on a récupéré 25 hybridomes producteurs dont 6 lignées étaient stables après plusieurs semaines. Trois lignées produisaient des IgG1 et trois, des IgG3. e) Clonages Les clonages ont été réalisés par la technique de dilution limite qui consiste à diluer les cellules et à les déposer à des concentrations faibles dans des plaques à 96 puits préalablement conditionnées avec des cellules péritonéales murines ou avec des cellules de thymus de souris SPF BALB/c, à raison de 104 ou de 105 cellules par puits. Le criblage des milieux de culture de chaque puits, pour la présence d'anticorps, est effectué après 2 semaines. Les cellules des puits positifs sont transférées dans des plaques de culture plus grandes et la stabilité de leur taux de croissance et de leur production d'anticorps sont suivies au cours du temps. Plusieurs clonages successifs ont été nécessaires pour obtenir des lignées stables. Les hybridomes sélectionnés ont ensuite été adaptés à la croissance en milieu dépourvu de sérum pour que l'anticorps finalement récolté soit exempt de toute protéine étrangère (comme l'albumine ou les IgG bovines). Cette adaptation a été réalisée par étapes, en diminuant progressivement la concentration en sérum et en mettant de la transferrine comme seul additif protéique dans le milieu. f) Création des banques cellulaires Après l'obtention d'une lignée cellulaire dont la production a été stabilisée par clonage, et multiplication à plus grande échelle, en absence de cellules nourricières, les cellules ont été maintenues en phase exponentielle de croissance jusqu'à leur congélation. Après lavage des cellules par centrifugation, le culot cellulaire a été repris dans un milieu à + 40C contenant du sérum de veau foetal pur avec 10 % de DMSO (diméthylsulfoxyde). Environ 5 x 106 cellules ont été congelées par ampoule à congélation sous un volume de 1 ml. Les ampoules ont d'abord été congelées à - 800C puis stockées dans l'azote liquide. Ces banques cellulaires ont ensuite été validées en effectuant plusieurs contrôles : - un contrôle de stérilité bactérienne, fongique et mycoplasmique ; - une évaluation de la viabilité cellulaire après la décongélation ; - une évaluation de la stabilité de production par clonage en dilution limite. Exemple 2. Production et purification des anticorps Après décongélation d'ampoules des banques cellulaires validées, les cultures des hétérohybrides ont été inoculées successivement dans des flacons de culture, puis dans un système de production sous agitation (Spinner) puis dans des cytoculteurs de 2, 10, 20 et 250 ou 320 litres. Les cytoculteurs sont des cuves en verre ou en inox équipées d'un système de chauffage, d'un système d'agitation par rotation et de systèmes de régulation de la température, du pH et de la consommation d'oxygène (mesure de la pression partielle d'oxygène dissous) . Le fonctionnement de cet appareil répond à des procédures très strictes qui sont scrupuleusement effectuées et enregistrées. En fonction des quantités d'anticorps à produire, les récoltes se font en une seule fois ou en prélevant tous les jours une quantité équivalente à environ 20 % du volume du cytoculteur. Les surnageants de culture sont ensuite poolés, clarifiés et concentrés avec un système automatique de filtrationconcentration. Après une filtration stérilisante sur 0,2 clam, les surnageants concentrés sont congelés et stockés à - 350C. Les anticorps monoclonaux anti-D ont été purifiés avec un système BIOPILOT O (PIARMACIA) qui est un appareil complet de chromatographie liquide basse pression (FPLC) entièrement automatique et biocompatible. Toutes les colonnes du système sont lavables en place et désinfectables suivant des procédures en vigueur. Les différentes étapes utilisées pour la purification des anticorps anti-D sont les suivantes - désinfection de l'automate et des gels de purification. - première chromatographie des anticorps sur une colonne échangeuse de cations (S Sépharose Fast Flow Pharmacia) avec élution des anticorps par un tampon phosphate 50 mM, pH 6,8 et des concentrations en NaCl de 88 mM ou de 150 mM. - concentration des anticorps par filtration tangentielle puis dialyse. - filtration stérilisante sur 0,2 clam. - inactivation virale par mélange avec 13 % en volume d'une solution de Tween 80 (0,3 %) Tn BP (Tri-n-butylphosphate 1 %) pendant 6 h à 240C sous agitation constante. - deuxième chromatographie sur un gel S Sépharose Fast Flow &commat; (Pharmacia) selon la même technique que précédemment. Les éluats sont dilués au 1/3 dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,35. - troisième chromatographie sur une colonne échangeuse d'anions (gel S Sépharose Fast Flow 0 - Pharmacia). Les anticorps sont élués de ces gels par passage d'un tampon phosphate 50 mM pH 7,35 avec du NaCl 1M. - concentration des anticorps par filtration tangentielle puis dialyse des anticorps contre 16 volumes de tampon glycine 0,15 M, pH 7,35 avec 0,45 % de NaCl. - dilution des anticorps ainsi purifiés dans le même tampon glycine. - filtration stérilisante sur filtres de 0,2 Clam. Après ces différentes étapes de purification, les anticorps ont été conditionnés stérilement en flacons de verre borosilicatés de 5 ml de contenance. Les flacons ont été stockés à + 40C à l'obscurité. Exemple 3. Propriétés des anticorps monoclonaux anti-D. En utilisant la technique de sélection décrite dans l'exemple 1 et en tenant compte de l'art antérieur, deux anticorps monoclonaux humains anti-D ont été sélectionnés parmi plus de 20 anticorps anti Rh D sur la base de leur spécificité, de leurs propriétés propres et de leur activité fonctionnelle in vitro - l'anticorps produit par l'hétérohybridome P3 x 229 14 G4, de sous classe IgG3, ci-après désigné P3 x 229; - l'anticorps produit par l'hétérohybridome 190/31 de sous classe IgGl, ci-après désigné 190/31. La lignée 190/31 a été sélectionnée pour sa production de 1.5 tg par 105 cellules par jour. La lignée P3 x 229 a été sélectionnée pour sa production de 2.3 fg par 105 cellules par jour. (La production est une moyenne calculée sur une période de 6 semaines et la mesure est effectuée en ELISA). 3.1 - Spécificité des anticorps La spécificité des deux anticorps sélectionnés a tout d'abord été déterminée en utilisant plusieurs techniques immunohématologiques et sur de nombreux échantillons de sang phénotypés dans les différents systèmes de groupes sanguins. Analyse de la spécificité sur un panel restreint. Différentes réactions d'agglutination ont été réalisées vis-à-vis d'un panel de 8 échantillons de sang de groupe O phénotypés et représentatifs des phénotypes normaux. - Réaction d dthémagglutination directe avec des hématies remises en suspension en milieu salin isotonique après 1 h d'incubation à 370C avec les anti-D et centrifugation. - Réaction d'hémagglutination directe avec des hématies prétraitées à la papaïne (7 minutes à 370C) pendant 35 minutes à 370C avec les anti-D et centrifugation. - Réaction de Coombs indirecte qui consiste à préincuber des hématies en milieu salin à 370C pendant 1 h avec les anti-D puis, après lavage, à ajouter une immunoglobuline anti-IgG humaine et à lire l'agglutination après centrifugation. Analyse de la spécificité sur un panel élargi. La spécificité des anticorps a été confirmée sur un panel informatif de 100 échantillons de sang connus et phénotypés en utilisant des hématies papaïnées et la réaction de Coombs indirecte. D'autre part, un contrôle plus large a été effectué par le laboratoire des Groupes Sanguins du CRTS sur un équipement Groupamatic G 360 en technique enzymatique (broméline) avec au moins 15 000 échantillons de sang prélevés chez des donneurs de sang bénévoles précédemment connus et identifiés. D'autre contrôles ont été effectués avec un panel d'hématies présentant des antigènes D partiels et selon la technique d'agglutination avec des hématies papaïnées et la technique de Coombs indirecte. Le bilan de ces résultats est présenté dans le tableau I. Les deux anticorps ne présentent pas le même profil de réactivité. La combinaison des deux réactifs permet de reconnaître la majorité des D partiels à l'exception des D VI. TABLEAU I Résultats d'agglutination avec les hématies Rh D partiels traitées à la papaïne. CATEGORIES Anticorps D D D IVa D IVb D Va D Vb D Vc D VI D VII IlIa IIIb 190/31 +++ NT - - +++ +++ - - +++ P3 x 229 +++ NT +++ +++ +++ - +++ - +++ NT : non testé +++ : réaction positive - : réaction négative. D'autre part, un contrôle de la réactivité des anticorps a été réalisé sur des coupes de tissus humains prélevés chez des donneurs de reins : peau, cerveau, thyroïde, nerf et artère. Aucune réaction croisée n'a été observée avec ces anticorps alors que d'autres anticorps anti-D se fixent sur certains types de tissus humains. 3.2 - Caractéristiques des anticorps monoclonaux anti-D Classe et sous classe des anticorps La classe et la sous classe des chaînes lourdes et le type de chaînes légères des anticorps ont été déterminés par technique immunoenzymologique Anticorps 190/31 : IgG1 Kappa Anticorps P3 x 229 : IgG3 Kappa Concentration et titre des anticorps Plusieurs techniques ont été utilisées pour déterminer la concentration des anticorps anti-D purifiés. Les résultats obtenus varient en fonction de la technique utilisée ; seules les valeurs d'une même technique peuvent être comparées dans la mesure où les tests ne contrôlent pas les mêmes paramètres. TABLEAU II Concentrations des anti-D selon diverses techniques. METHODES ANTICORPS DO ELISA BCA Pondéral Titre 190/31 0,153 0,174 0,119 0,055 512 P3 x 229 0,142 0,112 0,104 0,047 512 190 + 229 0,134 0,126 0,134 0,067 512 - Les valeurs sont exprimées en g/l (sauf pour les DO et les titres). - 190 + 229 : mélange en quantités égales des 2 anticorps 190/31 et P3 x 229. DO : mesure de la densité optique à 280 mm. ELISA : technique immunoenzymatique avec une anti-Ig humaine marquée à la peroxydase. BCA : dosage des protéines avec l'acide bicinchoninique en présence d'ions Cu++. Pondéral : mesure sur autoanalyseur de l'hémolyse d'hématies non agglutinées par les anti-D. Titre : inverse de la dernière dilution qui donne encore des agglutinations avec des hématies papaïnées. Affinité des anticorps L'affinité des anticorps a été mesurée à l'aide de plusieurs techniques : une méthode radioisotopique utilisant soit une anti-Ig humaine radiomarquée soit les anti-D directement radiomarqués (SCATCHARD 1949) et une méthode par cytométrie en flux. TABLEAU III Valeurs moyennes des constantes d'affinité des anticorps monoclonaux anti-D. ANTICORPS CONSTANTE D'AFFINITE L/MOL 190/31 1,3 1010 P3 x 229 8,0 109 190 + 229 1,8 1010 Polyclonal 2,8 109 3.2 - Activités des anticorps anti-D in vitro Pour pouvoir être utilisés en thérapeutique les anticorps anti-D doivent être capables d d'induire une hémolyse ou plus exactement une élimination des hématies Rh D positif. Les propriétés fonctionnelles de tels anticorps peuvent être contrôlées in vitro en réalisant plusieurs tests : tests d'adhésion et de phagocytose (ZUPANSKA et al. 1987) par les cellules du système macrophagique, tests de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) (SANDAL et al. 1988). Tests d'adhérence et de phagocytose La capacité des anticorps anti-D à induire la formation de rosettes à la surface de monocytes et de macrophages est appréciée après incubation de ces cellules avec des hématies O Rh D positif présensibilisées avec les anticorps anti-D. Les suspensions cellulaires suivantes ont été utilisées - des monocytes séparés par adhérence à 370 C - des macrophages séparés par adhérence à 370 C et incubés 24 heures à 370 C - des cellules de la lignée U 937 d'origine myélomonocytaire. Tests de cytotoxicité dépendante des anticorps Ces tests consistent à mesurer le pourcentage de lyse spécifique par des cellules mononucléées humaines (cellules effectrices) d'hématies -Rh D positif préalablement marquées au 51Cr et présensibilisées avec des anticorps anti-D (cellules cibles). TABLEAU IV Activités relatives des anti-D au cours de tests in vitro Rosettes * ADCC Anticorps Monocytes Macrophaqes U 937 % lyse 190/31 40 40 40 46 P3 x 229 68 70 80 51 190 + 229 70 75 60 66 Polyclonal 50 50 52 64 * Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules ayant fixé au moins 2 hématies (anti-D 4 Wg/ml). ADCC : cytotoxicité dépendante des anticorps ( 4 fg/ml). Des essais d'activité des anti-D ont été réalisés en faisant varier les proportions des deux anticorps dans le mélange avec des concentrations d'Ig G3 de 50 %, 33 % et 10 %. Au cours des tests, l'Ig G3 seule a toujours donné de meilleurs résultats que à l'IgGl testée seule. De plus, le mélange volume à volume des deux anticorps a le plus souvent donné des valeurs supérieures lors des tests d'adhérence et d'ADCC. Les deux sous-classes d'anticorps reconnaissent probablement des épitopes différents de l'antigène D et leur mélange améliore la sensibilité de la détection. Pour ces diverses raisons, un mélange volume à volume des deux anticorps a été retenu pour constituer le produit final, à usage thérapeutique. Références bibliographiques. Boylson, J.M., Gardner, B., Anderson, R.L. and Hughes-Jones, N.C. Production of human IgM anti-D in tissue culture by EB virus-transformed lymphocytes. Scand. J. Immunol. 12 : 355-358 (1980) Brojer, E., Merry, A. H. and Zupansky, B. Rate of Interaction of IgGl and IgG3 sensitized Red Cells with Monocytes in the Phagocytosis Assay. Vox. Sang. 56 : 101-103 (1989) Bron, D. , Feinberg, M. B., Teng, N.N.H. and Kaplan, H. S. Production of Human Monoclonal IgG Antibodies against Rhesus (D) Antigen. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81 : 3214-3217 (1984) Crawford, D. University College London, GB. Human Monoclonal Antibody against Rhesus D Antigen. GB 82 : 26513 (17.09.82) Crawford, D.H., Barlow, M.J., Harrison, J.F., Winger, L. and Huehns, E.R. Production of human monoclonal antibody to rhesus D antigen. Lancet, i : 386-388 (1983) De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. and Kumpelr B.M. (a) Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies PCT/GB88/00755 WO 89/02442 (18.09.87) De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. and Kumpel, B.M. (b) Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies PCT/GB88/00756 WO 89/02600 (18.09.87) De Burgh Bradley, B.A., Doyle, A. and Kumpel, B.M. (c) Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies PCT/GB88/00757 WO 89/024443 (18.09.87) Doyle, A., Jones, T.J., Bidwell, J.L. and Bradley, B. A. In vitro development of human monoclonal antibody secreting plasmacytomas. Hum. Immunol. 13 : 199-209 (1985) Eklund, J., Jouppila, P. and Seppala, I.J.T. IgG subclasses of Anti-Rh (D) and Hemolytic disease of the Newborn. Vox Sang. 55 : 51-52 (1988) Foung, S.K.H., Blunt, J.A., Wu, P.S., Ahearn, P., Winn, L.C. Engelman, E.G. and Grumet, F.C. Human Monoclonal Antibodies to Rho (D). Vox. Sang. 53 : 44-47 (1987) Gefter, M.L., Margulies, D.H. and Scharff, M.D. A simple method for. polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells. Somat. Cell. Genet. 3 : 231-236 (1977) Goossens, D., Champomier, F., Rouger, P., and Salmon, C. Human Monoclonal Antibodies against Blood Group Antigens. Preparation of a series of stable EBV immortalized B clones producing high levels of antibody of different isotypes and specificities. J. Immunol. Methods 101 : 193-200 (1987) Grubb, R. Molecular Biology, Biochemistry and Biophysics. 9 The genetic markers of human immunoglobulin. Springer Verlag, Berlin (1970) Hadley, A,G. and Kumpel; B.M. Phagocytosis by. Human Monocytes of Red Cells Sensitized with Monoclonal IgGl and IgG3 Anti-D. Vox Sang 57 : 150-151 (1989) Hughes-Jones, N.C., Thompson, K.M. and Melamed, M.D. (a) Central Blood Laboratories Authority, Elstree, GB Production of heterohybridomas for manufacture of human monoclonal antibodies to Rhesus D antigen. GB 86-10106 (25.04.86) Hughes-Jones, N.C., Thompson, K.M. and Melamed, M.D. (b) Central Blood Laboratories Authority, Elstreer GB Human Anti-Rhesus D Producing Heterohybridomas. EP 0 251 440 (25.04.86) Issitt, P.D. Genetics of the Rh Blood Group System : Some Current Concepts. Med. Lab. Sci. 45 : 395-404 (1988) Kaplan, H.S., Teng, N.H., and Bron, D.G. Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University, Stanford, CA 94305 Human Monoclonal Antibody against Rh (D) Antigen and its Uses. PCT/US84/01939 WO 85/02413 (26.11.84) Koskimes, S. Human Lymphoblastoid Cell Line Producing Specific Antibody against Rh-Antigen D. Scand. Immunol. 11 : 73-77 (1980) Kumpel, B.M., Poole, G.D. and Bradley, B.A. Human Monoclonal Anti-D Antibodies I. Their Production, Serology, Quantitation and Potential Use as Blood Grouping Reagents. Brit. J. Haemat. 71 : 125-129 (1989a) Kumpel, B.M., Wiener, E :, Urbaniak, S, J and Bradley, B.A. Human Monoclonal Anti-D Antibodies. II. The Realtionship between IgG Subclass, Gm Allotype and Fc mediated Function. Brit. J. Haemat. 71 : 415-420 (1989b) Lomas, C., Tippett, P., Thompson, K.M., Melamed, M.D. and Hughes-Jones, N.C. Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories. Vox Sang. 57 : 261-264 (1989) Melamed, M.D., Gordon, J., Ley, S.J., Edgar, D. and Hughes Jones, N.C. Senescence of a human lymphoblastoid clone producing anti Rhesus (D). Eur. J. Immune. 115 : 742-746 (1985) Ono, I., Uno, M., Yugi, T. and Uchikawa, M. Mitsubishi Chemical Industries Co., LtD., Japan. Preparation of Monoclonal Antibody to Rh (D) positive Antigen. JP 83-248865 (26.12.83) Parinaud, J., Blanc, M., Grandjean, H.,Fournie, A., Bierme, S. and Pontonnier, G. subclassesIgG subclasses and Gm Allotypes of Anti-D Antibodies during Pregnancy : Correlation with the Gravity of the Fetal Disease. Am. J. Obstet. Gynecol. 151 : 1111-1115 (1985) Pollock, J.M. and Bowman, J.M. Anti-Rh (D) IgG subclasses and severity of Rh hemolytic disease of the newborn. Vox Sang 59 : 176-179 (1990) Roder, J.C. Queens University at Kingston, CDN Human Monoclonal Antibodies. CA 82-406033 (29.06.81) Rozsnyay, Z., Sarmay, G., Walker, M., Maslanka, K., Valasek, Z., Jeffries, R. and Gergely, J. Distinctive Role of IgG1 and IgG3 isotypes in FcyR-mediated functions. Immunology 66 : 491-498 (1989) Saito, T. and Kobayashi, M. International Reagents Corp., Japan. Reagents for Determination of Blood Group Substance Rh (D) Factor. JP 88-50710 (03.03.88) Samdal, H.H., Michaelsen, T.E., Heier, H.E. and Nordhagen, R. Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity against Anti-D sensitized Human Erythrocytes. APMIS 96 : 250-256 (1988) Scatchard, G. The attractions of proteins from small molecules and ions. Ann. N.Y. Acad. Sci. 51 : 660 (1949) Shaw, D.R., Conley, M.E., Knox, F.J., Khazaeli, M.B. and Lobuglio, A.F. Direct quantitation of IgG subclasses 1,2 and 3 bound to red cells by Rhl (D) antibodies. Transfusion 28 : 127-131 (1988) Thompson, K.M., Hough, D.W., Maddison, P.J., Melamed, M.D. and Hughes-Jones, N.C. Production of human monoclonal IgG and IgM antibodies with anti-D (rhesus) specificity using heterohybridomas. Immunology 58 : 157-160 (1986) Thomson, A., Contreras, M., Gorick, B., Kumpel, B., Chapman, G.E., Lane, R.S., Teesdale,P. Hughes-Jones, N.C. and Mollison, P.L. Clearance of Rh D-positive red cells with monoclonal anti-D. Lancet 336 : 1147-1150 (1990) Tippett, P. Sub-divisions of the Rh (D) antigen. Med. Lab. Sci 45 : 88-93 (1988) Urbaniak, S.J., and Greiss, M.A. ADCC (K Cell) Lysis of Human Erythrocytes Sensitized with Rhesus Alloantibodies. III. Comparison of IgG Anti-D agglutination and Lytic (ADCC) activity and the Role of IgG Subclass. Brit. J. Haemat. 46 : 447-452 (1980) Wiener, E., Atwal, A., Thompson, K.M., Melamed, M.D., Gorick, B. and Hughes-jones, N.C. Differences between the activities of Human Monoclonal IgG and IgG3 subclasses of Anti-D (Rh) Antibody in their Ability to Mediate Red Cell -Binding to Macrophages. Immunology 62 : 401-404 (1987) Zupanska, B., Brojer, E., Richards, Y., Lenkiewicz, B., Seyfried, H. and Howell, P. Serological and Immunological Characteristics of Maternal Anti-Rh (D) Antibodies in predicting the Severity of Hemolytic Disease of the Newborn. Vox Sang. 56 : 247-253 (1989) Zupanska, B., Thompson, E., Brojer, E. and Merry, A.H. Phagocytosis of Erythrocytes Sensitized with Known Amounts of IgGl and IgG3 anti-Rh antibodies. Vox Sang. 53 : 96-101 (1987). REVENDICATIONS 1.- Composition pharmaceutique destinée plus particulièrement à la prophylaxie de la maladie hémolytique du nouveau-né, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'au moins deux anticorps monoclonaux humains a) qui reconnaissent chacun les antigènes Rhésus D mais pas C, c, E, e; b) dont la combinaison permet la détection de la majorité des antigènes D partiels ; c) dont l'un des deux anticorps est de sous-classe IgG3 d) et dont l'autre anticorps est de sous-classe IgGl. 2.- Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le mélange des deux anticorps comprend de 30 à 70 % d'IgG3. 3.- Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal de sous-classe IgGl est produit à partir de la lignée d'hétérohybridome DSM ACC 2039. 4.- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal de sous-classe IgG3 est produit à partir de la lignée d'hétérohybridome DSM ACC 2040. 5.- Anticorps monoclonal humain produit par la lignée d'hétérohybridome DSM ACC 2039. 6.- Anticorps monoclonal humain produit par la lignée d'hétérohybridome DSM ACC 2040. 7.- Lignée d'hétérohybridome homme/souris telle que déposée à la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" sous le NO DSM ACC 2039. 8.- Lignée d'hétérohybridome homme/souris telle que déposée à la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" sous le NO DSM ACC 2040.