Brevet FR2695650A1 — publié le 19940318

La présente invention concerne un procédé de détection d'une résistance à la rifampicine ou aux analogues de la rifampicine chez les bactéries du genre Mycobacterium. La rifampicine est l'antibiotique majeur utilisé dans le traitement des infections à Mycobacterium, notamment Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae. Une résistance à la rifampicine ou à l'un de ses analogues peut par conséquent compromettre le traitement d'un patient atteint par une infection à Mycobacterium ; et, du fait de la vitesse de croissance très lente de certains Mycobacterium, il existe un besoin important pour un moyen de détection rapide et efficace d'une résistance éventuelle à la rifampicine ou à ses analogues. Zhang et coll. (Nature, vol. 358 : 591-593) ont rapporté que la résistance à l'isoniazide chez M. tuberculosis était due à une délétion du gène kat G codant à la fois pour la catalase et la peroxydase. Jin et Gross (J. Mol. Biol. (1988), 202, 4558) ont décrit des mutations dans le gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase, de Escherichia coli susceptibles de conférer une résistance à la rifampicine in vitro. Cependant, E. coli est une bactérie d'un genre relativement éloigné de Mycobacterium, et, en outre, la rifampicine est un antibiotique inapte à combattre in vivo une infection par E. coli. Il n'était par conséquent pas évident de transposer aux mycobactéries les résultats obtenus des études de la résistance à la rifampicine obtenus à partir d'E. coli. Les auteurs de la présente invention ont à présent découvert que la résistance des mycobactéries a la rifampicine ou à ses analogues pouvait être détectée de manière rapide et sûre. La présente invention a pour objet un procédé de détection de la résistance des mycobactéries à la rifampicine ou aux analogues de la rifampicine, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur le gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la ARN polymérase desdites mycobactéries. Par analogues de la rifampicine, on entend les dérivés de la 3-formyl-rifamycine, notamment les composés obtenus par remplacement d'un substituant du groupe naphtofuranonyle ou de la chaîne latérale en position 7 du groupe naphtofuranonyle par un autre substituant, ou par introduction ou suppression d'une double liaison sur la chaîne latérale. Avantageusement, on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur les codons 400 à 450 du gène rpo B codant pour la sous-unité p de la RNA polymérase. De préférence, on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur le codon 425 du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase. Les mycobactéries les plus appropriées sont notamment Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium kansaii et Mycobacterium africanum, plus particulièrement Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis. Le diagnostic précoce de la résistance à Mycobacterium tuberculosis est d'autant plus crucial que la tuberculose reste l'une des causes majeures de morbidité et de mortalité dans les pays sous-développés, et son incidence a tendance à croître dans les pays industrialisés, en raison notamment de l'infection par M. tuberculosis de patients séropositifs par le virus VIH (virus de l'immunodéficience humaine). Les procédés utilisés pour la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase sont avantageusement la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde ("oligotyping"), la technique d'analyse des polymorphismes de conformation de simples brins, dite analyse SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphisms), ou encore le séquençage direct des fragments d'ADN du gène rpoB. Pour la technique de l"'oligotyping", la séquence à analyser est divisée en fragments courts de l'ordre de quelques oligonucléotides, qui sont hybridés avec des sondes marquées, par exemple à la biotine, dans des conditions de forte stringence, de sorte que lorsqu'une base est mutée, l'hybridation avec la sonde ne se fait pas. La technique du séquençage direct est bien connue de l'homme du métier. Pour la technique d'analyse des polyphormismes de conformation de simples brins, on se reportera à la publication de Orita et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 2766-2770, Avril 1989). Avantageusement, on réalise d'abord une amplification génique, par exemple par PCR (Polymerase Chain Reaction) dans les conditions classiques de fragments du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase, et l'on détecte la présence de mutations éventuelles sur les produits d'amplification obtenus à l'aide d'une des techniques mentionnées cidessus. Selon un mode de réalisation préféré de 1' invention, - on réalise une amplification de l'ADN à analyser par PCR à partir d'un prélèvement biologique contenant la mycobactérie dont on cherche la résistance éventuelle à la rifampicine ou à ses analogues, par exemple du sang ou un crachat, après en avoir préalablement éliminé les débris cellulaires et lysé les cellules bactériennes à l'aide d'un tampon de lyse approprié, l'amplification par PCR étant réalisée dans les conditions classiques en utilisant un couple d'amorce dont la séquence est complémentaire respectivement de fragments de chacun des brins de l'ADN à amplifier, - on digère les produits d'amplification obtenus comprenant avantageusement de 100 à 300 nucléotides en moyenne à l'aide d'endonucléases de restriction dans les conditions indiquées par le fournisseur, - on soumet les brins d'ADN préalablement extraits du mélange d'amplification à une dénaturation à l'aide d'une solution dénaturante, - on dépose les brins d'ADN monocaténaires sur un gel de polyacrylamide neutre à 5%, et - on fait migrer les brins d'ADN monocaténaires par électrophorèse sur ledit gel, - on transfert les fragments d'ADN ayant migré du gel de polyacrylamide sur une membrane de nylon selon la technique du blotting électrophorétique, et l'on hybride les fragments avec des sondes d'ADN marquées, par exemple au 32p, et - on compare les déplacements des fragments d'ADN à analyser avec des fragments d'ADN témoins correspondants obtenus dans les memes conditions d'amplification, digestion, dénaturation, électrophorèse et transfert sur membrane de nylon que les fragments d'ADN à analyser, provenant d'une souche bactérienne identique mais sensible à la rifampicine. Après transfert sur la membrane de nylon, la différence de mobilité due à la substitution d'un nucléotide du fragment d'ADN simple brin peut être ainsi mise en évidence par comparaison avec l'ADN témoin après détection par hybridation à l'aide de la sonde marquée. Pour la réalisation des amorces utilisées pour la PCR ainsi que pour les sondes utilisées dans l'"oligotyping", ou pour la mise en évidence des fragments d'ADN, on se réfèrera pour M. tuberculosis et M. leprae au gène rpoB de type sauvage, dont des plasmides contenant des clones de type sauvage ont été déposés à la CNCM le 15 Septembre 1992 sous le n" I-1266 pour M. leprae, et le 15 Septembre 1992 sous le n" I-1267 pour M. tuberculosis. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie du genre Mycobacterium à la rifampicine, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpoB codant pour la sous-unité p de la RNA polymérase de ladite bactérie, - des moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification obtenus, - une préparation témoin d'ADN du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase de ladite bactérie sensible à la rifampicine, et - éventuellement une préparation témoin d'ADN du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase de ladite bactérie résistante à la rifampicine. Avantageusement, les moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase comprennent une ADN polymérase, les quatre désoxynucléosides triphosphate, ainsi qu'un couple d'amorces, et les moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification géniques comprennent une solution de digestion de l'ADN amplifié, une solution dénaturante de l'ADN amplifié digéré et une sonde marquée apte à s'hybrider aux brins d'ADN digérés dénaturés. Le kit de diagnostic selon l'invention peut en outre contenir des moyens de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie du genre Mycobacterium à un ou plusieurs autres antibiotiques, notamment à l'isoniazide, consistant par exemple en (A) une sonde comprenant une séquence d'acide nucléique qui est le fragment EcoRV-KpnI de 2,5 kb du plasmide pYZ56, déposé à la CNCM sous le numéro d'accès I-1209, ledit fragment contenant un site de clivage pour Bam HI, et (B) une préparation témoin d'acide nucléique d'une bactérie sensible à l'isoniazide, et (C) éventuellement une préparation témoin d'acide nucléique d'une bactérie résistance à l'isoniazide, et (D) les réactifs permettant d'effectuer une PCR sur 1'ADN de M. tuberculosis. On décrira ci-après à titre d'exemple la mise en évidence selon l'invention de la résistance à la rifampicine chez divers isolats de M. leprae, en se référant aux figures annexées, sur lesquelles - la figure 1 représente un schéma de la stratégie PCR utilisée pour étudier les différents isolats de M. leprae, montrant la séquence codante de rpo B, les régions séquencées étant indiquées par des parties hachurées, la position et la référence des amorces d'amplification utilisées étant indiquées dans la ligne supérieure, tandis que les amorces de séquençage sont indiquées en-dessous - la figure 2 représente (A) la séquence nucléotidique d'une région courte de rpo B portant des mutations conférant une résistance à la rifampicine, sur laquelle les changements de base des allèles correspondants sont indiqués ; et (B) une comparaison entre la séquence d'aminoacide du domaine I de la région Il de la sous-unité ss de la RNA polymérase de E. coli et M. leprae, les numéros des résidus étant indiqués, ainsi que les différences d'aminoacides (*) ; les résidus d'aminoacides mutés associés à la résistance à la rifampicine étant représentés en même temps que la fréquence avec laquelle une mutation déterminée a été isolée. Les résultats pour E. coli ont été obtenus à partir de Jin et Gross (mentionné précédemment). - la figure 3 représente la séquence complète du gène rpoB de M. leprae - la figure 4 représente la séquence partielle du gène rpoB de M. tuberculosis Les propriétés. des isolats de M. leprae utilisés dans le cadre de la présente invention sont résumées dans le Tableau I ci-dessous Tableau I Propriétés des isolats de M. leprae utilisés dans le cadre de la présente invention :: Souche Allèle Rifampicine Origine 82007 rpoB1 R 85054 rpoB2 R Paris (Martinique) 81030 rpoB3 R Paris (Guadeloupe) 82061 rpoB4 R Nouvelle Calédonie 86030 rpoB5 R Guadeloupe 83004 rpoB6 R Martinique 82073 rpoB7 R Paris 83013 rpoB8 R Martinique 87038 rpoB9 R Martinique 88056 rpoB S Guadeloupe 90049 rpoB S Nouvelle Calédonie 92002 rpoB S Martinique 88063 rpoB S Sénégal 89033 rpoB s S Paris R : résistant ; S : sensible La sensibilité à la rifampicine a été déterminée chez la souris, comme décrit par Grosset et Coll. (Int. J. Lepr. 57 : 607-614). Les cellules de M. leprae ont été obtenues à partir de coussinets de pattes de souris par des procédures classiques. Toutes les souches résistances étaient aptes à croître chez des souris recevant des doses journalières de 20 mg/kg de rifampicine, alors que les souches sensibles étaient tuées par des concentrations plus faibles, inférieures à 2 mg/kg. L'ADN a été extrait à partir d'échantillons de suspensions de 200 pl de M. leprae (en moyenne de 104 à 105 bactéries) recouvertes de 100p1 d'huile minérale (Sigma Chemical Co.) par la technique de congélationdécongélation (Woods et Cole, 1989, FEMS Microbiol. Lett. 65 : 305-310). Des portions aliquotes (10 p1) ont été utilisées directement pour la PCR comme décrit par Woods et Cole (ci-dessus mentionné), et deux paires d'amorces ont été utilisées pour amplifier les régions intéressantes du gène rpo B, Brpo 24 et rpo 25 d'une part, et Brpo 22 et rpo 23, d'autre part (dont les séquences sont reportées au Tableau 11, supra), qui ont permis d'obtenir des produits d'amplification de 310 et 710 pb respectivement, comme représenté à la figure 1.Les durées des cycles pour le produit de 310 pb étaient de 1 minute à 92"C, 2 minutes à 59"C, et 2 minutes à 72"C, pour 35 cycles, puis 10 minutes à 72"C. Les cycles nécessaires à l'obtention du produit de 710 pb étaient de 1 minute à 92"C, 2 minutes à 61"C et 2 minutes à 92"C. Les amorces marquées à la biotine, Brpo 24 et Brpo 22, ont été synthétisées sur un appareil Applied Biosystems (modèle 391) à l'aide de phosphoramidite biotinylée (RPN 2012 d'Amersham International), tandis que les autres amorces pour la PCR et le séquençage ont été synthétisées selon des procédures standard. Les séquences des différentes amorces sont mentionnées au Tableau II ci-dessous, et leur localisation est indiquées sur la figure 1. Tableau II Séquences nucléotidiques des amorces utilisées dans la présente invention Amorce Séquence Brpo22 CAGGACGTCGAGGCGATCAC rpo23 AACGACGACGTGGCCAGCGT Brpo24 CAGACGGTGTTTATGGGCGA rpo 25 TCGGAGAAACCGAAACGCTC rpo 32 TCCTCGTCAGCGGTCAAGTA rpo 33 CTTCCCTATGATGACTG rpo 34 GGTGATCTGCTCACTGG rpo 35 GCCGCAGACGCTGATCA rpo 36 TTGACCGCTGACGAGGA rpo37 GCCAGCGTCGATGGCCG Les ADN obtenus ont été séquencés sur la base de la séquence du gène rpoB d'isolats sensibles à la rifampicine. Un plasmide contenant la séquence dudit gène a été déposé à la CNCM le 15 Septembre 1992 sous le numéro I-1266. Les produits de PCR biotinylés ont été concentrés à partir de mélanges réactionnels de PCR de 80 pl à l'aide de billes dynabeads (M-280) recouvertes de 200 pg de streptavidine, préparées suivant les recommandations du fournisseur (Dynal, Norvège). Après 15 minutes à température ambiante, avec des agitations périodiques, les billes ont été concentrées et lavées dans un tampon TE contenant 2M NaCl, à l'aide d'un concentrateur à particules magnétiques (MPC R - E). Les billes ont alors été mises en suspension dans 10 p1 de NaOH (0,1 M) pour séparer les brins des produits d'amplification, et laissées à température ambiante pendant 10 minutes. Le brin biotinylié a alors été récupéré à l'aide d'un concentrateur à particules et remis en suspension dans 15 ul de tampon TE. Le brin complémentaire présent dans le surnageant a été neutralisé par addition de 3 p1 de HCl (0,33 M). Les séquences d'ADN ont été obtenues par la procédure didéoxy modifiée décrite par Biggin et Coll. (1963, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 3863-3965), à l'aide de 1,25 ,ul de matrice par réaction de séquençage, les amorces appropriées représentées au tableau Il et à la figure 1, ainsi que le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Les séquences obtenues ont été comparées avec la séquence du gène rpo B de type sauvage. Les résultats significatifs obtenus avec la séquence du gène sauvage (sensible à la rifampicine) et la séquence correspondant à la sous-unité ss de quatre souches mutantes résistantes à la rifampicine sont représentés à la figure 2. Chez tous les mutants résistants à la rifampicine étudiés, les différences de séquence ont été localisées dans une région courte du gène rpoB, équivalente au domaine I d'E. coli (Jin et Gross, Supra) et sont représentées à la figure 2B. Ces différences vont d'une translation simple C-T affectant le codon 425 dans six cas (allèles rpo B 1, 2, 4, 5, 6 et 7) à une insertion de six bases entre les codons 408 et 409 (rpo B). Deux changements de bases consécutives ont été mises en évidence chez les mutants rpoB3 et rpoB9 (figure 3) affectant le codon de la sérine en position 425. Malgré les différences d'origine géographique des divers isolats (tableau I), les mutations portaient dans 8 cas sur 9 sur le même codon.Aucune des souches étudiées sensibles à la rifampicine ne montraient de déviation par rapport à la séquence du gène rpoB de type sauvage du plasmide I-1266 ci-dessus mentionné, et aucun des mutants ne contenait d'altérations supplémentaires sur les segments étudiés. Les résultats obtenus sont résumés à la figure 3B, où la séquence d'aminoacides du domaine de fixation portatif de la rifampicine a été comparée avec la région correspondante de la sous-unité ss de l'ARN polymérase d'E. coli. Chez les 8 mutants de M. leprae, le résidu Ser425 de domaine I de la région II a été modifié en un aminoacide hydrophobe : la leucine (6 reprises), la méthionine ou la phénylalanine. Chez le 9ème mutant, deux résidus supplémentaires (lysine et phénylalanine) ont été insérés entre Phe408 et Met409. On a également étudié de manière analogue la résistance à la rifampicine de M. tuberculosis. Dans le Tableau III ci-dessous sont représentées des informations sur la séquence de 102 souches provenant de patients infectés par M. tuberculosis. 53 souches étaient sensibles à la rifampicine et 49 étaient des mutants résistants à la rifampicine. Chez 43 mutants sur 49, la mutation se situait dans la région 400-450, et parmi les 43 mutants, 27 portaient la mutation Ser425 en Leu. Tableau III Résultats de mutations observées chez des souches de M. tuberculosis Phénotype Mutation Substitution substitution Pa- Pays (*) de d'aminoacide tients d'origine Position nucléotide du génotype Résistant 533 T-C Leu-Pro 1 USA (1) Résistant 531 C-T Ser-Leu 27 Espagne (16) TC-CA Ser-Gin 1 USA (6) Nouvelle Guinée (3) Turquie (1) inconnu (1) Vietnam (1) Résistant 526 C-T His-Tyr 4 Espagne (5) C-G His-Asp 2 USA (3) C-G His-Gin 2 Turquie (1) C-A His-Asn 1 Résistant 516 A-T Asp-Val 2 Espagne (1) 516/512 A-T/G-C Asp-Val & 1 ex Yougos. 1 Ser-Thr USA (1) Résistant 513 A-T Gin-Leu 1 USA (1) Résistant 511 T-C Leu-Pro 1 Espagne (1) Résistant -- sensible -- 6 Espagne (5) Sensible -- sensible -- 53 Espagne (8) Suisse (15) ex Yougos. 6 Sri Lanka 3 Turquie (3) Italie (2) Vietnam (2) Algérie (1) Zaïre (1) Portugal (1) Thaïlande 1 * Les numéros correspondent à la position des aminoacides de 1'ARN polymérase d'E. coli Symboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cytéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de la résistance des mycobactéries à la rifampicine ou aux analogues de la rifampicine, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur le gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase desdites mycobactéries. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur les codons 400 à 450 du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une ou plusieurs mutations sur le codon 425 du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une mutation chez Mycobacterium tuberculosis. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une mutation chez Mycobacterium leprae. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on met en évidence la présence d'une mutation chez Mycobacterium bovis. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase par la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase par la technique d'analyse des polymorphismes de conformation de simples brins. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on met en évidence la ou les mutations du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase par séquençage direct des fragments d'ADN du gène rpoB. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on - réalise une amplification génique, notamment par PCR, de fragments du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase, et - soumet les produits d'amplification obtenus à l'une des techniques de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations selon les revendications 7 à 9. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par les étapes suivantes - digestion des produits d'amplification obtenus avec des endonucléases de restriction, - dénaturation des brins d'ADN, - dépôt des brins d'ADN monocaténaires sur un gel de polyacrylamide neutre à 5%, - réalisation d'une électrophorèse sur ledit gel, - transfert des fragments d'ADN du gel de polyacrylamide sur une membrane et hybridation à l'aide d'une sonde d'ADN marquée, - comparaison des déplacements des fragments d'ADN avec des fragments témoins correspondants provenant de souches de mycobactéries sensibles à la rifampicine ou à ses analogues. 12. Kit de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie du genre Mycobacterium à la rifampicine ou à ses analogues, caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase de ladite bactérie, - des moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification obtenus, .- une préparation témoin d'ADN du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase d'une souche de ladite bactérie sensible à la rifampicine, et - éventuellement une préparation témoin d'ADN du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase d'une souche de ladite bactérie résistante à la rifampicine. 13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens pour réaliser une amplification génique de l'ADN du gène rpoB codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase comprennent une ADN polymérase, les quatre désoxynucléosides triphosphate, ainsi qu'un couple d'amorces. 14. Kit selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que les moyens de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations sur les produits d'amplification géniques comprennent une solution de digestion de l'ADN amplifié, une solution dénaturante de l'ADN amplifié digéré et une sonde marquée apte à s'hybrider aux brins d'ADN digérés dénaturés. 15. Kit de diagnostic selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie du genre Mycobacterium à un ou plusieurs autres antibiotiques. 16. Kit de diagnostic in vitro selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de diagnostic in vitro de la résistance d'une bactérie du genre Mycobacterium à l'isoniazide. 17. Kit de diagnostic in vitro selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend (A) une sonde comprenant une séquence d'acide nucléique qui est le fragment EcoRV-KpnI de 2,5 kb du plasmide pYZ56, déposé à la CNCM sous le numéro d'accès I-1209, ledit fragment contenant un site de clivage pour Bam HI, (B) une préparation témoin d'acide nucléique d'une bactérie sensible à l'isoniazide, (C) éventuellement une préparation témoin d'acide nucléique d'une bactérie résistance à l'isoniazide, et (D) les réactifs permettant d'effectuer une PCR sur l'ADN de M. tuberculosis. 18. Séquence nucléotidique appartenant au gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase de mycobactéries portant une mutation responsable d'une résistance à la rifampicine ou aux analogues de la rifampicine, obtenue par amplification génique, notamment par PCR. 19. Fragments de séquences nucléotidiques obtenus à partir d'une séquence selon la revendication 18, ayant subi une digestion avec une endonucléase de restriction, portant une mutation responsable d'une résistance à la rifampicine ou aux analogues de la rifampicine. 20. Procédé de sélection de souches de mycobactéries sensibles à la rifampicine, caractérisé en ce que l'on - réalise une amplification génique, notamment par PCR, de fragments du gène rpo B codant pour la sous-unité ss de la RNA polymérase, - soumet les produits d'amplification obtenus à l'une des techniques de mise en évidence d'une ou plusieurs mutations selon les revendications 7 à 9, - et sélectionne les souches ne présentant pas de mutations par rapport au gène rpo B de type sauvage desdites mycobactéries.