Brevet FR2693475A1 — publié le 19940114

PROCEDE D'IDENTIFICATION ET/OU DE CLONAGE DE PROMOTEURS TRANSCRIPTIONNELS. ET UTILISATION DE CES PROMOTEURS POUR L'EXPRESSION DE GENES La présente invention concerne le domaine du génie génétique. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour l'identification et le clonage de promoteurs transcriptionnels. Les progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier des microorganismes pour leur faire produire des protéines hétérologues. En particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur la bactérie E. coli et sur la levure Saccharomyces. Toutefois, l'application industrielle de ces nouveaux modes de production est encore limitée, en particulier par les problèmes d'efficacité d'expression des gènes dans ces microorganismes recombinés. Aussi, dans le but d'augmenter les performances de ces systèmes de production, il est nécessaire de pouvoir disposer de promoteurs forts, permettant d'obtenir des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues. Il peut également être souhaitable de disposer d'un grand nombre de promoteurs variés, actifs dans différentes conditions physiologiques. Chez Ecoli, certains promoteurs forts ont été décrits (promoteurs des opérons tryptophane et lactose). De même, chez la levure S. cereuisiae, des études ont porté sur des promoteurs dérivés de gènes impliqués dans la glycolyse. On peut citer notamment les travaux sur le promoteur du gène de la 3-phosphoglycérate kinase PGK (Dobson et al., Nucleic Acid Res. iQ, 1982, 2625; Hitzeman et al., Nucleic Acid Research 1982, 7791), sur celui du gène de la glyceraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase GAPDH (Holland et al., J.Biol.Chem. 254, 1979, 9839; Musti et al., Gene X, 1983, 133), sur celui du gène de l'alcool deshydrogénase 1 ADH1 (Bennentzen et al., J.Biol.Chem. 257 1982, 3018; Denis et al., J.Biol.Chem. X, 1983, 1165), sur celui du gène de l'enolase 1 ENVOI (Uemura et al., Gene 45 1986, 65), sur celui du gène GAL1/GAL10 Uohnston et Davis, Mol. Cell. Biol. 4 (1984) 1440) ou sur celui du gène CYC1 (Guarente et Ptashne, PNAS 78 (1981) 2199). Toutefois, il est clair que le génome de ces cellules n'a pu être étudié complètement, et qu'il renferme potentiellement d'autres promoteurs forts non encore identifiés. De même, de plus en plus, des procédés recombinants visent aujourd'hui à utiliser de nouveaux types de cellules hôtes (cellules animales, végétales, levures, champignons ou bactéries). Ainsi, des outils génétiques ont été développés afin de se servir de la levure Kluyveromyces comme cellule hôte pour la production de protéines recombinantes (EP 361 991). Des études ont également été entreprises avec Bacillus subtilis (Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 2917), avec levure de brasserie (EP 201 239), ou encore avec les levures Pichia pastoris (EP 344 459), Schizosaccharomyces pombe (EP 385 391) ou Schwanniomyces (EP 394 538). Cependant, les promoteurs utilisés dans ces nouveaux systèmes ne sont pas encore optimisés. En particulier, il s'agit souvent de promoteurs hétérologues, c'est-à-dire provenant d'autres microorganismes, ce qui peut engendrer différents inconvénients, et notamment limiter l'activité du promoteur à cause de l'absence de certains éléments de la machinerie transcriptionnelle (par exemple de trans-activateurs), présenter une certaine toxicité pour la cellule hôte due à une absence de régulation, ou affecter la stabilité du vecteur. Dans ces conditions, l'exploitation de de ces systèmes de production impose de posséder des promoteurs adaptés, préférentiellement homologues, régulables et forts. Il est donc important de pouvoir disposer d'un moyen efficace, simple et fiable permettant de rechercher et d'isoler des promoteurs à partir de tout hôte cellulaire. La demanderesse a maintenant mis au point, et ceci constitue un objet de la présente invention, un procédé particulièrement avantageux permettant d'identifier et de clone des promoteurs transcriptionnels. Plus précisément, Invention concerne un procédé d'identification et/ou de clonage de promoteurs transcriptionnels fonctionnels dans un hôte donné, selon lequel on effectue les étapes suivantes:: - on prépare une banque d'ADN d'une cellule de départ déterminée, - on réalise une mutagénèse insertionnelle par transposition sur cette banque permettant d'insérer dans l'ADN de la cellule de départ un transposon portant un gène reporteur dont l'expression dans l'hôte donné peut être mise en évidence, - on sélectionne le(s) clones exprimant, dans des conditions de culture déterminées, ledit gène reporteur dans l'hôte donné, et, - on isole le fragment d'ADN comprenant la région promotrice du (des) clones ainsi sélectionné(s). Le procédé de clonage selon l'invention est particulièrement avantageux puisqu'il peut être appliqué à toute cellule de départ, et qu'il n'est pas nécessaire de connaitre la fonction et/ou la structure du gène naturellement exprimé par ce promoteur. Ce procédé permet ainsi de cloner des promoteurs parfaitement inconnus. Par ailleurs, un autre avantage du procédé de l'invention est qu'il permet de cloner des promoteurs actifs dans des conditions de culture déterminées, et de ce fait d'orienter la sélection des promoteurs en fonction par exemple d'un type de régulation souhaité.Le procédé de l'invention est également avantageux puisqu'il peut permettre l'identification rapide du gène placé sous le controle du promoteur isolé par détermination d'un court fragment de séquence au niveau de la jonction entre le transposon et le fragment d'ADN de la souche de départ au moyen d'un oligonucléotide spécifique du transposon. En ce qui concerne la première étape du procédé de l'invention, elle est applicable à tout type de cellule, et notamment aux cellules eucaryotes et procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes, on peut citer les cellules végétales, animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, etc. Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on peut utiliser les bactéries telles que Escherichia coli, ou celles appartenant aux genres Corynebacterium, Bacillus, ou Streptomyces. Le choix de la cellule de départ peut être dicté par différents critères (facilité de manipulation, fort niveau d'expression de protéines, analyse d'une cellule peu étudiée, etc). La banque d'ADN de la cellule de départ peut être une banque génomique ou une banque d'ADNc. Celles-ci peuvent être préparées par toute technique connue de l'homme du métier. Notamment, s'agissant d'une banque génomique, elle peut être préparée par rupture des cellules, digestion de l'ADN au moyen d'enzymes de restriction et insertion de l'ADN ainsi digéré dans un vecteur. Généralement, on utilise des conditions de digestion (enzymes, temps de réaction, etc) permettant d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 4 à 8 kb. S'agissant d'une banque d'ADNc, elle peut être préparée à partir des ARN, par transcription inverse. Pour des raisons de commodité, la banque est généralement préparée chez E. coli, dans des vecteurs de type pBR322. Par ailleurs, pour permettre le tranfert de la banque depuis la souche initiale (E.coli) vers l'hôte dans lequel l'expression est recherchée, il est possible d'utiliser soit des vecteurs navettes capables de réplication dans les 2 types d'hôtes, soit de construire des transposons possédant les éléments nécessaires à la réplication et la sélection dans l'hôte dans lequel l'expression est recherchée. Cette deuxième alternative présente l'avantage de ne pas utiliser des vecteurs de taille trop grande pour réaliser la banque. En ce qui concerne la deuxième étape du procédé de l'invention, le gène reporteur est un gène dont l'expression peut être mise en évidence dans l'hôte donné. Il peut s'agir d'un gène induisant une coloration des souches (gène lacZ notamment) ou leur conférant un caractère luminescent (gène luxA notamment), ou encore d'un gène conférant une résistance à la souche [gène conférant la résistance au G418 (gène g) ou au cuivre (gène COUP1) notammentj. Il peut également s'agir d'un gène indispensable à la croissance de la souche dans certaines conditions de culture, etc. A titre d'exemple de gène reporteur particulièrement avantageux pour les levures Kiactis lac4, le gène lacZ d'E. coli codant pour 13-galadosidase permet une sélection sur milieu lactose (Chen et al., J. Basic Microbiol. 28 (1988) 211). Le gène reporteur doit être présent dans le transposon dans une forme ne permettant son expression que par fusion traductionnelle avec un gène de l'hote donné. Notamment, il ne doit pas être précédé de codon stop ou d'autres signaux qui pourraient empêcher son expression. A titre d'exemples de transposons utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement le transposon MiniMu et les transposons Tn (Tn3, Tn5, Tn7, TnlO, Tnbla, etc). La troisième étape du procédé de l'invention consiste à sélectionner le(s) clone(s) exprimant le gène reporteur dans l'hôte donné, dans des conditions de culture déterminées. Dans le cas où la banque est réalisée dans une cellule différente de l'hôte donné dans lequel l'expression est recherchée, la banque doit dans un premier temps être transférée dans l'hôte donné, avant de procéder à la sélection des clones exprimant le gène reporteur. Dans ce cas, une première sélection est effectuée pour isoler les transformants ayant reçu 1'ADN de la banque. Cette sélection peut être effectuée en utilisant tout marqueur d'auxotrophie ou de résistance. Le transfert de l'ADN de la banque peut être réalisé par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par transformation, électroporation, ou conjugaison.S'agissant de la transformation chez la levure, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, elle peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. g. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la technique de Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7). Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet EP 361 991.Il est aussi possible de transformer les levures par électroporation, selon la méthode décrite par Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 901. La sélection des clones exprimant le gène reporteur dans l'hôte donné est réalisée après transformation, dans différentes conditions de culture selon les caractéristiques du promoteur recherché (promoteur régulable, promoteur fort, etc). Par ailleurs, selon le gène reporteur utilisé, les clones possédant une région promotrice active dans les conditions de la sélection sont ceux générant une certaine coloration ou une luminescence, ceux présentant une résistance à un composé donné (gène de résistance) ou encore ceux capables de pousser dans certains milieux (gènes complémentant une auxotrophie tels que les gènes i, URA3 ou LEU2, notamment), etc. Dans un mode avantageux de l'invention, il est en outre possible d'effectuer simultanément la sélection des transformants et la sélection des clones exprimant le gène reporteur. Lors de la quatrième étape du procédé de l'invention, l'isolement du fragment d'ADN comprenant la région promotrice est généralement réalisée par excision au moyen d'enzymes de restriction, suivie éventuellement d'une digestion par des nucléases ou d'une synthèse chimique pour reconstituer une partie manquante. Préférentiellement, l'excision est précédée d'une étape de délimitation de la région promotrice portée par le fragment d'ADN. Celleci est généralement réalisée en plusieurs temps: - détermination d'une carte de restriction de l'insert porté par le clone. Cette étape est néanmoins facultative, - localisation de l'extrémité 3' de la région promotrice: Cette étape consiste à identifier le codon ATG. Elle est généralement réalisée par séquençage de la jonction entre le transposon et le fragment d'ADN de la souche de départ.Ce bout de séquence peut ensuite permettre, par recherche d'homologies avec des séquences connues, de localiser l'ATG. Si la recherche d'homologie ne donne pas de résultat, I'ATG peut être identifié par séquençage complet du fragment d'ADN de la souche de départ portant la région promotrice. - localisation de l'extrémité 5' de la région promotrice: Celle-ci peut être mise en évidence par des délétions séquentielles sur le fragment d'ADN de la souche de départ portant la région promotrice et sousclonage dans des vecteurs d'expression. Les promoteurs obtenus par le procédé de l'invention peuvent être utilisés pour l'expression de tout gène soit dans la cellule de départ, soit dans l'hôte donné, soit encore dans tout autre cellule dans lesquels ils sont fonctionnels. Ils peuvent notamment être utilisés pour l'expression de gènes codant pour des protéines recombinantes telles que par exemple des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire, ou également pour l'expression de gènes de biosynthèse de métabolites, tels que par exemple des gènes de biosynthèse d'acides aminés, de vitamines, d'antibiotiques, etc. Par ailleurs, ces fragments d'ADN peuvent également être modifiés préalablement à leur utilisation, par exemple pour préparer des promoteurs portables, pour les adapter à l'expression dans un type particulier de vecteur ou d'hôte, pour réduire leur taille, pour augmenter leur activité de promoteur de la transciption, pour générer des promoteurs inductibles, améliorer leur niveau de régulation, ou encore changer la nature de leur régulation. De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse in vitre, par introduction d'éléments additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels de contrôle. L'invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine recombinante par expression d'une séquence d'ADN codant pour ladite protéine dans un hôte cellulaire, selon lequel l'expression de la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur obtenu par le procédé décrit ci-avant. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Préparation du transposon Mini Mu MudIIZK1. Figure 2: Carte de restriction du transposon Mini Mu MudIIZK1. Figure 3: Séquence de la jonction entre le promoteur du gène PGK de Kadis et le gène lacZ de E. coli (mini mu MudIIZK1) sur le clone 4B3. Figure 4: Séquence de la jonction entre le promoteur du gène ADHII de K. tactis et le gène lacZ deEcoli (mini mu MudIIZK1) sur le clone 10B1. Figure 5: Carte de restriction de l'insert du clone 1D12. Figure 6 : Séquence de la jonction entre Ie promoteur du gène PDC1 de K. lactis et le gène lacZ de E. coli (mini mu MudIIZK1) sur le clone lu12. TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE. Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophoeèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Eschwichia coli etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs) ou Pharmacia et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les Iigatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Boehringer) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de I'ADN Polymérase I d'E. coli (Boehringer) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par Ia technique dite de PCR Eolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]. Les transformations de K tacts sont effectuées par toute technique connue de l'homme de l'art, et dont un exemple est donné dans le texte. Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont Ecoli DH1 (Hanahan D., J. Mol. Biol. /166 (1983) 557) ou Ecoli JM109::(Mucts) (Daignan-fornier et Bolotin-Fukuhara, Gene 62 (1988) 45). Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures bourgeonnantes et plus particulièrement aux levures du genre Kluyveromyces. Les souche K lactis 2359/152 et K lactis SD6 ont été particulièrement utilisées. Les souches de levures transformées par les plasmides sont cultivées en erlenmeyers ou en fermenteurs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28"C en milieu riche (YPD: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% glucose; ou YPL: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% lactose) sous agitation constante. EXEMPLES EXEMPLE DE CLONAGE DE PROMOTEURS DE KLuYvERoMYcEs EN UTILISANT COMME GENE REPORTEUR LE GENE LACZ DE ECOLI ET COMME SYSTEME DE MUTAGENESE LA TRANSPOSrrION. 1. Préparation du transposon Mini Mu MudIIZK1 (figures 1 et 2) Le Mini Mu MudIIZK1 a été construit à partir du Mini Mu MudIIZZ1 décrit par Daignan-Fornier et Bolotin-Fukuhara (Gene 62 (1988) 45). Il a été obtenu en substituant l'origine de réplication du mini transposon MudIIZZ1 par une origine de réplication fonctionnelle dans Kluyveromyces : l'origine de réplication du plasmide pKD1 (EP231 435). 1.1. Construction d'une cassette portant l'origine de réplication du plasmide pKD1 (fragment S11). Afin de faciliter les manipulations ultérieures, le fragment S11 (portant l'origine de réplication du plasmide pKD1) a été mis sous forme d'une cassette NotI. Pour cela, un dérivé du plasmide pUC18 a été construit, dans lequel les sites externes du multisite de clonage (sites HindIII et EcoRI) ont été changés en sites NotI. Cela a été fait par digestion avec l'enzyme correspondante, action de l'enzyme de Klenow et ligature avec un oligonucléotide synthétique correspondant à un site NotI [oligo d(AGCGGCCGCT); Biolabsl. Le plasmide obtenu est désigné pGM67. Le fragment S11 de 960 pb obtenu par digestion par l'enzyme Sau3A du plasmide KEp6 (Chen et al, Nucl. Acids Res. 114 (1986) 4471) a ensuite été inséré au site compatible BamHI du plasmide pGM67.Le plasmide ainsi obtenu, désigné pGM68, contient sous forme d'une cassette NotI le fragment S11. 1.2. Suppression de l'origine de réplication 2p du transposon MudIIZZ1. Le plasmide pGM15 portant le mini Mu MudIIZZ1 (Daignan-Fornier et Bolotin-Fukuhara précitée) a été délété des régions 2p par digestion au moyen de l'enzyme SalI. Le site SalI unique ainsi obtenu a ensuite été transformé en site NotI par ligature d'un oligonucléotide synthétique correspondant à un site NotI après action de l'enzyme de Klenow. Le plasmide résultant est appelé pGM59. 1.3. Insertion du fragment S11 La cassette NotI portant l'origine de réplication du plasmide pKD1 (fragment S11), provenant du plasmide pUC18 modifié a ensuite été introduite au site NotI unique du plasmide pGM59. Le plasmide obtenu, désigné pGM83, porte un mini Mu, appelé MudIIZK1, qui est adapté à la levure Kluyveromyces lactis, ainsi qu'une copie fonctionnelle du gène LEU2 de S.cerevisiae capable de complémenter une mutation leu2 chez Kiactis (vamper et al, Curr. Genet. 19 (1991) 109) (figure 2). 2. Introduction du Mini Mu MudIIZK1 dans la souche E. coli portant le Mu helper JM109::(Mucts) : Obtention de la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1). La souche JM109::(Mucts) a été transformée par le plasmide pGM83 contenant le mini mu MudIIZK1 en présence de chlorure de calcium. Après transformation, la transposition a été induite par choc thermique selon la technique décrite par Castilho et al. (J. Bacteriol. 158 (1984) 488). Le lysat phagique obtenu après induction est ensuite utilisé pour surinfecter la souche JM109::(Mucts). La souche JM109::(Mucts) étant recA, l'ADN linéaire encapsidé par le phage ne peut se refermer pour donner un plasmide réplicatff. Les intégrants [souche JMlO9::(Mucts)::(MudIIZK1)j sont donc sélectionnés comme clones chloramphénicol résistants (CmR), ampicilline sensibles (AmpS). 3. Préparation de la banque génomique de Klactis dans E.coU DH1 L'ADN de haut poids moléculaire a été préparé à partir de la souche Kiactis 2359/152, et digéré partiellement par l'enzyme Sau3A. Les fragments d'une taille de 4 à 8 kb ont été récupérés sur gel d'agarose LMP ("Low Melting Point", SEAKEM) et clonés dans le plasmide pBR322 linéarisé par BamHI et déphosphorylé par action de la phosphatase intestinaIe de veau (Biolabs). 35 pools de 1000 colonies ampicilline résistantes (AmpR) et tétracycline sensibles (TetS) dans E. coli DH1 ont ainsi été réalisés. 4. Préparation de la banque de fusion 4.1. Introduction de la banque génomique de ltlactis dans la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) . L'ADN plasmidique de chaque pool réalisé dans DH1 est extrait (Maniatis). Cet ADN est ensuite utilisé pour transformer la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) en présence de chlorure de calcium. Pour être représentatif des 1000 colonies contenues dans chaque pool de la banque génomique, plus de 3000 clones par pool ont été récupérés dans la souche JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) permettant la transduction. 4.2. Transposition du Mini Mu MudIIZK1 La banque de fusion est réalisée par transposition extensive du Mini Mu MudIIZK1 sur les plasmides formant la banque d'ADN génomique de Kiactis. Les mini-muductions ont été faites selon le protocole décrit par Castilho et al. g. Bacteriol. 158 (1984) 488) et les transductants ont été sélectionnés sur milieu sélectif LBAC (milieu LB (Gibco, BRL) supplémenté avec 50 mg/l d'ampicilline et 30 mg/l de chloramphénicol), le marqueur AmpR étant apporté par le plasmide, et le marqueur CmR par le mini-mu. Pour chaque pool, des transpositions sont faites en série, et entre 10 000 et 20 000 transductants sont récupérés par pool. L'ADN des transductants est ensuite extrait d'une préparation de 100 ml, purifié par précipitation au polyéthylène glycol (Maniatis et al, 1989) et resuspendu dans 1OOpl d'eau. Cet ADN a ensuite été utilisé pour transformer Kiactis et pour cloner des promoteurs. 5. Recherche de promoteurs chez Klactis L'ADN de fusion préparé ci-dessus a été utilisé pour transformer, par électroporation, une souche réceptrice de K.lacfis. Cette souche réceptrice, désignée SD6, porte les mutations leu2 (correspondant au marqueur de sélection du mini-mu MudIIZK1) et lacS8. Cette dernière mutation empêche la souche de pousser sur un milieu contenant du lactose comme seule source de carbone, mais elle peut être complémentée par la surexpression du gène lacZ d'E. coli codant pour la ss-galactosidase (Chen et al., J. Basic Microbiol. 28 (1988) 211). De ce fait, l'expression d'une protéine fusionnée à la ss- galactosidase doit permettre la croissance de la souche SD6 sur lactose après transformation.Ce crible positif a été utilisé pour sélectionner rapidement des clones portant des promoteurs forts. 5.1. Construction de la souche réceptrice K.lacfis SD6. Cette souche doit porter les marqueurs suivants: - marqueur d'auxotrophie complémenté par le marqueur du mini mu (LEU2) - marqueur Ade+ pour éviter des problèmes de lecture sur milieu Xgal dus à la coloration rouge de l'allèle Ade-, - marqueur lac4 (muté pour la ss-galactosidase). L'utilisation de ce marqueur doit permettre, dans le cas d'un promoteur fort et donc d'une protéine de fusion fortement exprimée, de complémenter le phénotype lacde la souche. La souche SD6 (Chen et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 97) a été obtenue par croisement de la souche CXJ1-7A (a, lac4-8, uraA, adel-1, K1, K2, pKD1) (Chen et Fukuhara, Gene 69 (1988) 18187) avec la souche AWJ-137 (leu2, trpl, homothallique) (vamper et al, Curr. Genet. 19 (1991) 109), et sélection des spores ayant le génotype ADE+, uraA, leu2, lacS8. Comme les spores obtenues n'étaient pas capables de régénérer après tranformation par protoplastes, un croisement retour a été fait avec la souche CXJ1-7A.Après sporulation en masse, les spores du génotype choisi ont été testées par transformation au chlorure de lithium avec le plasmide KEp6 selon une technique dérivée de celle décrite par Ito et al. U. Bacteriol. 153 (1983) 163) (la concentration en LiCl est de 20 mM, soit 10 fois moins que celle utilisée par Ito pour S.cerevisiae). La souche CXJ1-7A a servi de témoin de transformation. La souche SD6, selectionnée sur ces critères, se transforme correctement: 1 à 3. 104 transformants par pg d'ADN; et les transformants ont une stabilité satisfaisante: 30 à 40% des colonies gardent le phénotype [Ura+i après 6 générations en milieu non sélectif. 5.2. Isolement de promoteurs forts La souche SD6 a été transformée par électroporation selon Becker et Guarante (in Methods in Enzymology vol194 (1991) 182) (appareil Jouan; 2500 V/cm; 80-100 ng d'ADN/transformation) avec l'ADN de i1 pools de transductants obtenus en 4. (correspondant à une banque de 11000 clones dans E. coli). Après 5 heures de régénération en milieu YPD (extrait de levure : 10g/l; peptone: 10g/l; glucose 20g/l), les cellules ont été étalées sur milieu minimum lactose. Les transformants capables de pousser sur lactose ont été restriés et, pour chaque clone, le plasmide a été extrait, amplifié dans E. coli, et, après vérification rapide de la carte de restriction du vecteur et du minimu, utilisé pour retransformer la levure SD6.Après retransformation, différents clones de Kiactis capables de pousser sur lactose ont été mis en évidence. Chacun de ces clones porte une région promotrice capable d'exprimer un gène hétérologue dans la levure Kiactis. Parmi les clones ainsi identifiés, plusieurs ont été analysés par restriction et par séquençage des jonctions entre la protéine de Ktactis et la R-galactosidase. En effet, la séquence des jonctions à partir de l'extrémité lacZ du mini-mu (séquence double brin) peut être déterminée par séquençage au moyen d'un oligonucléotide complémentaire des extrémités du mini-mu.Il est notamment possible d'utiliser les oligonucléotides ayant la séquence suivante: (i) oligonucléotide amont: 5'CTGTTTCATTTGAAGCGCG-3' (il) oligonucléotide aval : 5'-CCCACCAAATCTAATCCC-3' Dans cet exemple, la séquence a été réalisée au moyen de I'oligonucléotide (i) situé à -59 nucléotides de la jonction. Cette étape de séquençage permet de vérifier l'insertion du mini-mu en phase dans une phase de lecture ouverte (on attend une ORF dans le cadre -1) et, lorsque c'est le cas, d'analyser la séquence protéique déduite de la séquence nucléotidique par comparaison avec les séquences de banques de protéines d'autres levures ou eucaryotes (Genbank, MIPS, EMBL, etc). L'analyse de la séquence des jonctions a permis de montrer que le clone 4B3 portait le promoteur du gène de la phospho-glycérate kinase de Kiactîs (figure 3), que le clone lOBI portait le promoteur du gène de l'alcool déshydrogénase II de Kiactis (figure 4), et que le clone 1D12 portait le promoteur du gène de la pyruvate décarboxylase de K. lactîs (figures 5 et 6). REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification et/ou de clonage de promoteurs transcriptionnels fonctionnels dans un hôte donné, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes suivantes: - on prépare une banque d'ADN d'une cellule de départ déterminée, - on réalise une mutagénèse insertionnelle par transposition sur cette banque permettant d'insérer dans l'ADN de la cellule de départ un transposon portant un gène reporteur dont l'expression dans l'hôte donné peut être mise en évidence, - on sélectionne le(s) clone(s) exprimant, dans des conditions de culture déterminées, ledit gène reporteur dans l'hôte donné, et, - on isole le fragment d'ADN comprenant la région promotrice du (des) clone(s) ainsi sélectionné(s). 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la cellule de départ est une cellule eucaryote ou procaryote. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la banque de la cellule de départ est une banque génomique préparée par rupture des cellules, digestion de l'ADN au moyen d'enzymes de restriction et insertion de l'ADN ainsi digéré dans un vecteur. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'on utilise des conditions de digestion permettant d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 4 à 8 kb. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la banque de la cellule de départ est une banque d'ADNc préparée à partir des ARN par transcription inverse. 6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène reporteur est un gène dont l'expression induit une coloration de l'hôte donné, ou lui confère un caractère luminescent, ou lui confère une résistance, ou est un gène indispensable à la croissance de l'hôte donné dans certaines conditions de culture. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le gène reporteur est choisi parmi le gène LacZ, LuxA, CUP1 et aph. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce que le gène reporteur est présent dans le transposon dans une forme ne permettant son expression que par fusion traductionnelle avec un gène de l'hôte donné. 9. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le transposon est choisi parmi le transposon mini mu et les transposons Tn.. 10. Utilisation d'un promoteur obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour l'expression de gènes. 11. Utilisation selon la revendication 10 pour l'expression de gènes codant pour des protéines recombinantes telles que par exemple des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire, ou également pour l'expression de gènes de biosynthèse de métabolites, tels que par exemple des gènes de biosynthèse d'acides aminés, de vitamines, ou d'antibiotiques. 12. Procédé de production d'une protéine recombinante par expression d'une séquence d'ADN codant pour ladite protéine dans un hôte cellulaire caractérisé en ce que l'expression de la séquence d'ADN est sous le contrôle d'un promoteur obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 13. Banque d'ADN dite banque de fusion, consistant en une banque d'ADN de Kluyveromyces sur laquelle a été réalisée une mutagénèse insertionnelle au moyen d'un transposon MiniMu comprenant un gène reporteur.