Brevet FR2691066A1 — publié le 19931119

L'invention concerne l'utilisation, de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, ainsi que de leurs fractions, fragments et dérivés, pour la préparation des médicaments destinés au traitement des thrombopénies. Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polysaccharides constitués essentiellement par la répétition régulière de la séquence disaccharidique [acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) hexosamine (glucosamine ou galactosamine)]. Ces produits existent sous quatre formes: I'héparine et l'héparane sulfate, les chondroltines sulfate (4-S et 6-S), le dermatane sulfate et l'acide hyaluronique. Les trois premiers sont diversement substitués par des groupes sulfate ; l'acide hyaluronique ne contient pas de groupe sulfate. Les liaisons glycosidiques entre les différents motifs osidiques varient selon les formes et sont de types 1-4 ou 1-3 (Casu B. in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic press zinc. 1985, 43, pp 51-133 ; Ruoslahti & Yamaguchi, Cell, 1991, 64 pp 867-869). Les glycosaminoglycanes sont des composants des cellules et de la matrice extracellulaire. Ils portent des charges négatives importantes leur conférant une capacité à fixer un certain nombre de substances à caractères cationiques. En conséquence, ils possèdent des activités biologiques multiples. On entend par analogues des glycosaminoglycanes, des produits tels que : le dextrane sulfate, le pentosane polysulfate, I'acide alginique sulfaté, I'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate et le sucralfate. Ces produits aussi, possèdent souvent des propriétés pharmacologiques intéressantes. Des fractions, fragments et dérivés des glycosaminoglycanes, et plus particulièrement de l'héparine et de l'héparane sulfate qu'ils aient ou non une activité anticoagulante, sont aussi connus. En effet, les glycosaminoglycanes, leurs analogues, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés, et en particulier l'héparine, I'héparane sulfate et le dermatane sulfate, ont fait l'objet de nombreuses études, qui ont permis de mettre en évidence plusieurs activités biologiques: - activité anticoagulante - faculté de complexer diverses protéines - activité dans le système du complément - activité comme régulateurs et modulateurs du développement de certains types de cellules, vasculaires ou non vasculaires - activité sur l'angiogenèse. (Casu B., in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic press Inc. 1985, 43, pp 51-133 ; Seminar in Thrombosis and Haemostasis, 1991, 17, supl. 1 & 2, pp 1-246. Development of non-heparin glycosaminoglycans as therapeutic agents, J. M. Walenga, J. Fareed, guest editors, Thieme medical Publishers, Inc. New-York ; Ruoslahti E. & BR Yamaguchi Y., Cell, 1991, 64, pp 867-869; Lindahl U., MTP Int. Rev. Sci. Org. Chem. Ser. Two, Carbohydrate, 1976, Z, pp 283-312). La mégacaryocytopofèse concerne l'engagement des cellulessouches hématopofètiques vers la lignée mégacaryocytaire, la prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires et la maturation des mégacaryocytes pour donner naissance aux plaquettes (Mazur EM., Megakaryocytopoiesis and platelet production : A review Exp Hematol., 1987, 15, pp 340-350 Hoffman R., Regulation of megakaryocytopoiesis, Blood, 1989, 74, pp 11961212). Les plaquettes jouent un rôle très important dans certains processus physiologiques notamment la coagulation sanguine (Caen J.P., Cronberg S. et Kubisz P., Platelet physiology and pathology, New-York, Stratton International, 1977). II a été montré que la mégacaryocytopdtèse est directement régulée par un certain nombre de facteurs de croissance hématopdiètique tels le "megakaryocyte colony-stimulating factor" (MK-CSF), I'interleukine-3 (IL3), I'interleukine-6 (IL6), le "granulocyte-macrophage colony-stimulating factor" (GM-CSF) et l'érythropdtétine (Epo). Elle est aussi contrôlée de façon indirecte par l'interleukine-1 et l'interleukine-11 (Mazur EM., Exp. Hematol., 1987, 15, pp 340-350; Hoffman R. , Blood, 1989, 75, pp 1196-1212). Parmi ces facteurs, l'IL31 I'Epo, et le GM-CSF ont été utilisés in vivo chez des sujets normaux et des malades. Leurs effets stimulateurs de la mégacaryocytopoièse sont limités, en particulier dans les anémies aplasiques et dans les insuffisances hématopofètiques secondaires (Peters WP. The myeloid colony-stimulating factors, Introduction and overview, Seminars in Hematology, 1991, 28, pp 1-5 ; Ganser A. et al., Blood, 1990, 76, pp 1287 1292; Ganser A. et al, 76, pp 666-676).Ceci montre l'existence d'un autre mécanisme contrôlant la mégacaryocytopoVèse. Par ailleurs, les facteurs de croissance possèdent des activités multiples, et leur administration excessive pourrait provoquer des effets secondaires inattendus et défavorables (Metcalf D., The consequenses of excess levels of Haematopoietic growth factors. Br. J. Hematol., 1990, 75, pp 1-3). La moelle hématopofétique est un système complexe formé de cellules de natures et de fonctions différentes. Son organisation peut se concevoir en cinq compartiments cellules : les cellules-souches de toute la lignée hématopoïétique, les cellules progénitrices hématopdiétiques, les cellules hématopolétiques matures, le micro-environnement et les cellules accessoires. Les cellules souches par une série de différenciations et de maturations, donnent naissance aux cellules progénitrices dont font partie les progéniteurs mégacaryocytaires, ces derniers donnant naissance à leur tour aux plaquettes comme cela a été indiqué plus haut.On sait seulement qu'il existe des protéoglycanes endogènes qui jouent un rôle sur la granulopolèse par un mécanisme compartimental fermé, ciblé sur le facteur de croissance GM-CSF (Gordon M.Y. et al., "Compartmentalization of a haematopoietic growth factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow micoenvironment", Nature, 1987, 326, pp 403-405; Roberts R. et al., Heparan sulfate bound growth factors, A mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis, Nature, 1988, 332, pp376-378). Aucune information n'existe cependant sur l'action des glycosaminoglycanes exogènes dans le système de la mégacaryocytopoïèse. II a été maintenant mis en évidence, que de façon inattendue, des glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés, s'ils sont administrés chez l'animal ou l'homme, peuvent agir dans un système cellulaire tout à fait différent des systèmes étudiés à ce jour, à savoir le système médullaire hématopolérique, et plus particulièrement, comme inducteurs ou modulateurs spécifiques de la régulation de la mégacaryocytopolèse humaine ou murine, et peuvent être utilisés en thérapeutique pour traiter les thrombopénies. Les thrombopénies sont des états bien connus, notamment au cours des chimiothérapies anticancéreuses. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement efficace et économique pour y remédier. II était donc de tout premier intérêt de trouver un moyen spécifique et économique de lutter contre cette situation pathologique. L'invention concerne donc l'utilisation, en tant qu'inducteurs spécifiques de la mégacaryocytopoïèse de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, ainsi que de leurs fractions, fragments et dérivés, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des thrombopénies. Pour la préparation de ces médicaments on peut utiliser comme héparines non fractionnées, les héparines d'origine porcine ou bovine, extraites des poumons, de la muqueuse intestinale ou de tout autre organe. A titre d'exemple, on peut utiliser comme héparines de faible masse moléculaire, la nadroparine calcique (DCI) et le CY 222 (Laboratoires CHOAY, France ; brevets FR-2 440 376 et EP-0 037 319), le PK 10169 dénommé aussi enoxaparine (DCI) (Laboratoires PHARMUKA, France demande de brevet EP-0 040 144), la tedelparine (DCI) ou le KABI 2165 (KABI VITRUM, Suède ; Thrombosis Res. (1986) 42, p 435-447), le OP 2123 (OPOCRIN, Italie ; demandes de brevet EP-0 121 067 et WO 86/06729), le RD 11885 (HEPAR INDUSTRIES, Ohio USA; demande de brevet et brevets EP-0 244 235, GB-2 002 406 et GB-2 068 011) et le LHN-1 (NOVO INDUSTRIES, Danemark; demandes de brevet EP-0 244 234 et EP-0 244 235).Tous ces produits sont déjà décrits dans la littérature (Haemostasis 1988, 18 sup 3, pp 3-15), et la majorité d'entre eux sont des principes actifs des spécialités déjà mises à la disposition du corps médical. Ainsi par exemple, la nadroparine calcique est le principe actif de la spécialité Fraxiparine&commat;, la tedelparine est le principe actif de la spécialité FragmineQ > , et l'enoxaparine est le principe actif de la spécialité Lovenoxe ou Clexan. Des fragments d'héparines non-anticoagulants et les dérivés d'héparines hypersulfatés, qui peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments selon l'invention, sont décrits respectivement dans les demandes de brevet EP-0 287477 et EP-0 214879. Des dérivés d'héparines O-acylés sont décrits dans la demande de brevet EP-0 356275. D'autres fragments d'héparines (hexasaccharides, octasaccharides etc...) sont décrits dans la demande de brevet EP-0 244298. Les chondroitines sulfate, le dermatane sulfate, l'acide hyaluronique et l'héparane sulfate sont des produits disponibles dans le commerce. Dans un mode particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont, les chondroltines sulfate 4-S et 6-S, le dermatane sulfate ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés. Dans un autre mode particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont l'acide hyaluronique, ses fractions, fragments et dérivés. Dans un autre mode encore particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont l'héparine et l'héparane sulfate, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés. Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont I'héparine, ainsi que ses fractions, fragments et dérivés. Dans un autre mode avantageux de I'invention, sont utilisés des analogues des glycosaminoglycanes, tels que les produits suivants : le dextrane sulfate, le pentosane sulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate et le sucralfate. On utilise de manière préférentielle, le dextrane sulfate et le pentosane polysulfate. De manière tout à fait avantageuse, les glycosaminoglycanes, leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés utilisés pour la préparation des médicaments selon la présente invention, sont ceux dépourvus d'activité anticoagulante. De manière très préférentielle, on utilise comme glycosaminoglycanes exogènes, les héparines de faible masse moléculaire, telles que la nadroparine calcique. Les essais in vitro chez l'homme et chez la souris, et les essais in vivo chez la souris normale et chez des souris rendues aplasiques par traitement chimiothérapique, ont démontré que les glycosaminoglycanes, leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés sont des régulateurs positifs de la mégacaryocytopofèse. Compte-tenu de leurs effets stimulateurs ou modulateurs sur la mégacaryocytopolèsel et de leur mécanisme d'action, ces produits peuvent donc être utilisés pour le traitement thérapeutique de différents types de thrombopénies, comme: - des thrombopénies périphériques de divers mécanismes (les purpuras thrombopéniques idiopathiques et les autres thrombopénies immunitaires). - des thrombopénies centrales acquises, en particulier celles en récupération d'une chimiothérapie (cancers, leucémies, sida...) et d'une greffe de moelle. L'évolution sur la récupération médullaire en particulier mégacaryocytaire et plaquettaire serait importante. II a été montré que chez des patients qui subissent une chimiothérapie ou une greffe de moelle, I'activité MK-CSF plasmatique est très élevée (Mazur EM. et al. Blood, 1990, 76, pp 290-297; Fauser et al., Transplantation, 1988, 46, pp 543-547 ; Hoffman R., Blood, 1989 74, pp 1196-1212). - d'autres types de thrombopénies telles que le syndrome plaquettaire du "Gray platelet syndrome". La posologie utilisée dépend de l'âge du patient, de son poids, de la voie et la fréquence d'administration, de la gravité des thrombopénies et des traitements associés. Elle varie de 40 aLg à 1 mg par kg corporel et par prise, lorsque les glycosaminoglycanes, leurs analogues, leurs fragments, fractions ou dérivés, sont administrés par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. Lors de l'administration par voie orale, des doses de 40 pg à 10 mg par kg de poids corporel et par prise sont nécessaires. Les doses journalières par voie parentérale peuvent varier de 40 I.rg à 2 mg par kg de poids corporel, et par voie orale, de 40 pg à 20 mg par kg de poids corporel. L'invention s'étend aussi aux compositions pharmaceutiques utilisables dans le traitement des thrombopénies, renfermant comme principe actif, un glycosaminoglycane exogène, un de ses analogues, de ses fragments, fractions ou dérivés, en association avec un ou plusieurs excipients inertes et appropriés, ou encore en association avec d'autres composés utilisés pour le traitement des thrombopénies. Diverses formes pharmaceutiques peuvent être envisagées, telles que solutés injectables, comprimés, dragées, gélules, glossettes ou autres préparations galéniques appropriées à une administration sublinguale, nanoparticules, microcapsules et solutions pour pulvérisation endonasale. De manière préférentielle, on utilise, pour l'administration orale, des formulations gastro-résistantes. Les formes pharmaceutiques indiquées ci-dessus sont données à titre d'exemples et ne sont pas limitatives. D'autres formes pharmaceutiques et d'autres voies d'administration peuvent être envisagées. L'invention sera illustrée à l'aide des exemples ci-après, qui contiennent des résultats expérimentaux, obtenus lors des différents essais pharmacologiques. Produits testés Chondroltine sulfate (6-S), dermatane sulfate, héparane sulfate, acide hyaluronique, (Sigma Chemical, USA). Héparine non fractionnée vendue sous le nom de Cuthéparine, fournie par Biosedra, Paris. Fragments d'héparine: * Fraxiparine", fournie par les Laboratoires Choay, Paris; * CY 222: Produit décrit dans le brevet EP-0 037 319 (Exemple 1), fourni par Elf Sanofi; * Produit A : Fragment d'héparine pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante. Pour obtenir ce produit, I'héparine a été soumise à une oxydation ménagée à l'aide de l'acide periodique, puis à une dépolymérisation par addition d'une base forte et enfin, les produits issus de la polymérisation ont été soumis à une réduction selon le procédé décrit dans la demande de brevet EP-0 287 477 (Exemple 1). Le Produit A, a une masse moléculaire moyenne de 6500 Da, et un degré de sulfatation de 2,3. Le Produit A a été fourni par Elf Sanofi, Paris; * Produit B: C'est un hexasaccharide préparé à partir de l'héparine, selon le procédé décrit dans la demande de brevet EP-0 244 298. Ce composé est explicitement décrit dans la même demande, et il a été fourni par Elf Sanofi, Paris. Fragments de dermatane sulfate: Ces produits ont été obtenus par dépolymérisation du dermatane sulfate à l'aide de l'acide periodique (Tollefsen D.M., Nouv. Rev. Fr., Hematol. 1984, 26, pp 233-237). Ils sont composés par un nombre d'unités monosaccharidiques (dérivés d'acide L-iduronique et D-galactosamine) bien déterminé, donné ci-après: * Produit C: constitué de 3 unités monosaccharidiques * Produit D : constitué de 5 unités monosaccharidiques * Produit E : constitué de 7 unités monosaccharidiques * Produit F: constitué de 9 unités monosaccharidiques * Produit G : constitué de 11 unités monosaccharidiques * Produit H : constitué de 13 unités monosaccharidiques Tous ces produits ont été fournis par Elf Sanofi, Paris. - Analogues de glycosaminoglycanes: * Dextrane sulfate fourni par Sigma Chemical, USA * Pentosane polysulfate, fourni par Elf Sanofi, Paris. EXEMPLE 1 Effets sur la stimulation de la mégacaryocytopoïèse in vitro: essais sur un système de culture cellulaires mononuclées murines de moelle de fémurs de la souris Des effets de glycosaminoglycanes, de leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés sur la mégacaryocytopolèse in vitro ont été examinés en utilisant un système de culture de progéniteurs mégacaryocytaires (Han ZC. et al. ; C.R. Acad. Sci., Paris, 1991, t 313, Série lil, pp 553-558). Dans ce système de culture, les cellules mononuclées murines de moelle de fémurs, sont prélevées chez des souris Balb/c (IFFA CREDO). 2.105 cellules mononuclées murines sont ajoutées, au moins en triplicate, dans un volume de 1 ml d'un milieu de base (milieu alpha) contenant: 10 % de plasma bovin citraté, 1% d'albumine de sérum bovin, 10 % de mercaptoéthanol (concentration finale de 104 M), 0,34 mg/ml de chlorure de calcium avec ou sans 10 % de sérum d'aplasie. Les différentes quantités de produits à tester sont diluées dans un volume de 0,2 ml du milieu alpha, et les solutions ainsi obtenues, ayant des concentrations différentes, sont ajoutées sur les caillots plasmatiques formés après coagulation du plasma. Le sérum d'aplasie de porc est utilisé pour ces cultures de moelle murine.Les mégacaryocytes et leurs colonies murines sont identifiés par la coloration d'acétylcholinestérase (Jackson CW., Blood, 1973, 42, pp 413-421). 1- Résultats obtenus avec l'héparine, I'héparane sulfate et la FraxiparineQ} - Effets sur la formation de colonies mégacaryocytaires: Les produits à tester et notamment, une héparine standard non fractionnée, la Fraxiparinee et l'héparane sulfate, ont été utilisés à différentes doses, indiquées dans le Tableau I. Les résultats représentent la moyenne + SEM du nombre de colonies pour 2.105 cellules à partir de 3 expériences séparées, faites en triplicate. La signification statistique (*) a été établie selon le test t de Student pour p TABLEAU I Effets de l'héparine et de l'héparane sulfate sur la formation de colonies mégacaryocytaires (CFU-MK) et granulocyte-macrophagiques (CFU-GM) in vitro SANS SERUM D'APLAISIE AVEC SERUM D'APLAISIE PRODUITS TESTES CFU-MK CFU-GM CFU-MK CFU-GM CONTROLE 6 # 1 12 # 2 42 # 3 160 # 20 FRAXIPARINE # (Ul/ml) 0.1 14 # 2 11 # 2 45 # 4 189 # 18 1 19 # 1 * 13 # 2 62 # 3 * 204 # 15 5 29 # 3 * 12 # 2 85 # 6 * 201 # 21 10 26 # 2 * 15 # 3 83 # 5 * 188 # 15 20 26 # 3 * 10 # 2 63 # 4 * 186 # 18 HEPARINE (Ul/ml) 0.1 8 # 2 9 # 2 43 # 3 203 # 12 1 12 # 2 13 # 2 66 # 4 * 198 # 15 5 21 # 3 * 11 # 2 71 # 6 * 192 # 18 10 19 # 2 * 14 # 3 60 # 5 * 171 # 16 20 20 # 3 * 10 # 2 59 # 4 * 211 # 21 HEPARINE SULFATE ( g/ml) 0.1 7 # 2 8 # 2 52 # 6 189 # 23 1 9 # 2 12 # 3 58 # 5 204 # 17 5 10 # 2 15 # 3 68 # 5 * 189 # 32 10 17 # 3 * 14 # 2 78 # 6 * 201 # 18 20 16 # 2 * 13 # 2 80 # 7 * 189 # 21 Les résultats indiqués dans le Tableau I démontrent que l'héparine standard, la Fraxiparine et l'héparane sulfate sont capables d'augmenter de manière significative la formation de colonies mégacaryocytaires sur le système de culture en caillot plasmatique, en particulier en présence de sérum de porc aplasique, obtenu de porcs irradiés, qui est riche en une activité dite MK-CSF. En revanche, ils ne stimulent pas de façon significative la formation de colonies CFU-GM, que ce soit en la présence ou en l'absence de sérum aplasique. - Effet sur la maturation et la taille des mégacaryocytes et leurs colonies: Plus de 500 colonies et 100 mégacaryocytes individuels ont été analysés. Signification statistique (*) p TABLEAU Il PRODUITS TESTES CELULLES/COLONIE MK DIAMETRE DE MK (î,m) CONTROLE 4.7 # 0.3 27.8 # 1.5 HEPARINE 5 Ul/mi 5.4 # 0.7 * 48,4*1,9* FRAXIPARINE # 5Ul/ml 5.5 # 0.8 * 45.3 # 1.5* HEPARANE SULFATE 50 pg/ml 5.2 # 1.0* 43,4*1,3* L'héparine standard, la Fraxiparine # et l'héparane sulfate, sont capables de promouvoir la maturation et d'augmenter la taille des mégacaryocytes et de leurs colonies. 2- Résultats obtenus avec le Produit A, le Produit B et le CY 222 Le Produit A, héparine dépolymérisée à l'acide périodique et ayant une activité anticoagulante très réduite, le Produit B, hexasaccharide régulier de l'héparine et le CY 222, sont également capables de stimuler de façon significative la formation de colonies mégacaryocytaires sur la système de caillot plasmatique. Lors de ces essais, les cellules ont été cultivées en présence de sérum aplasique de porc. Les résultats rapportés dans le Tableau III, représentent la moyenne + SEM du nombre de colonies pour 2.105 cellules, à partir de 3 expériences séparées faites en triplicate ; signification statistique (*) P TABLEAU III CONCENTRATIONS EN g/ml 0 0.1 1 5 10 50 Produit A 42 # 4 40 # 3 41 # 5 56 # 6 86 # 4* 84 # 3* Produit B 42 # 4 58 # 4 67 # 5 69 # 3 86 # 6* 93 # 5* CY 222 44 # 8 - 104 # 20* - 103 # 24* 124 # 16* 3- Résultats obtenus avec le chondroltine sulfate, I'acide hyaluronique, le dermatane sulfate et ses fragments Les produits ont été testés à des doses variant de 0 à 100 'ig/ml. Les résultats de cette étude sont indiqués dans le Tableau IV. TABLEAU IV CONCENTRATIONS ( G/ML) 0 0.1 1 10 50 100 CHONDROITINE SULFATE 46 # 13 40 # 7 92 # 19* 82 # 12* 75 # 12* 83 # 2* DERMATANE SULFATE 46 # 13 39 # 4 43 # 5 82 # 14* 65 # 11* 64 # 10* ACIDE HYALURONIQUE 46 # 13 - 54 # 5 58 # 4 64 # 4* 46 # 3 PRODUIT H 47 # 5 - 50 # 4 51 # 3 64 # 5* 44 # 6 PRODUIT G 47 # 5 - 58 # 3 86 # 6* 64 # 4* 63 # 4* PRODUIT F 47 # 5 - 95 # 7* 95 # 6* 93 # 8* 90 # 5* PRODUIT E 47 # 5 - 70 # 5* 77 # 8* 96 # 7* 74 # 3* PRODUIT D 47 # 5 - 48 # 3 51 # 5 64 # 5* 42 # 4 PRODUIT C 47 # 5 - 60 # 3 60 # 4 56 # 4 69 # 7* Le chondroltine sulfate, le dermatane sulfate, ses fragments et l'acide hyaluronique, ajoutés aux cultures de moelle murine en présence de sérum aplasique aux concentrations de 10-100 g/ml, sont capables de stimuler de façon significative la formation de colonies mégacaryocytaires. 4- Résultats obtenus avec des analogues de glycosaminoglycanes Les produits examinés sont indiqués dans le Tableau V. TABLEAU V CONCENTRATIONS ( g/ml) PRODUITS TESTES 0 1 10 50 100 PENTOSANE POLYSULFATE 40 # 8 73 # 7* 83 # 4* 86 # 4* 60 # 9* DEXTRANE SULFATE 500000 Da 42 # 7 38 # 3 44 # 6 60 # 2* 59 # 2* 8000 Da 42 # 7 - - 40 # 2 62 # 2* 5000 Da 42 # 7 - - * 53 # 2* 45 # 8 Les résultats du Tableau V démontrent que les produits examinés stimulent de manière dose-dépendante et significative, la formation des colonies mégacaryocytaires dans les cultures contenant du sérum aplasique. EXEMPLE 2 Effets sur la stimulation de la mégacaryocytopoïèse in vifro essais sur un système de culture de cellules mononuclées médullaires humaines Le système de culture de progéniteurs mégacaryocytaires utilisé, est celui décrit par Han ZC. et al, Exp. Hematol, 1989, 17, pp 46-52. Les cellules mononuclées médullaires humaines sont prélevées chez des individus normaux. 2.105 cellules mononuclées médullaires sont ajoutées, au moins en triplicate, dans un volume de 1 ml d'un milieu de base contenant 10 % de plasma bovin citraté, 1 % d'albumine de sérum bovin, 10% de mercaptoéthanol (concentration finale de 104 M), 0,34mg/ml de chlorure de calcium avec ou sans 10 % de sérum d'aplasie. Le sérum d'aplasie humain est utilisé pour les cultures de moelle humaine. L'héparine et l'héparane sont ajoutés dans un volume de 0,2 ml de milieu alpha, sur les caillots plasmatiques formés après coagulation du plasma.Les colonies mégacaryocytaires humaines sont identifiées par la coloration d'immunoperoxidase en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre la glycoprotéine llb/llla plaquettaire (Han ZC. et al., Exp Hemato., 1989, 17, 4652). Les produits testés sont l'héparine non fractionnée et l'héparane sulfate. Les doses utilisées ont été de 1 à 5 Ul/ml pour l'héparine et de 10 à 50 Hg/ml pour l'héparane sulfate. La méthode utilisée pour cette étude, est celle du caillot plasmatique. Les résultats rapportés dans le Tableau VI, représentent la moyenne + SEM du nombre de colonies MK à partir de deux expériences. On constate que l'héparine et l'héparane sulfate stimulent la formation des colonies mégacaryocytaires dans les cultures de moelle normale en présence de sérum aplasique humain. Ces résultats indiquent que l'héparine et l'héparane sulfate, respectivement à des doses de 5 Ul/ml et 50 ug/ml, sont capables d'induire la croissance de mégacaryocytes humains. TABLEAU VI CONTROLE HEPARINE (LN/ml) HEPARINE SULFATE ( g/ml) 1 îl 5 10 50 23+3 36*4 45i5* 37+3 42+4* EXEMPLE 3 Etude de l'interaction de l'héparine standard et de la Fraxiparinw avec les facteurs de croissance agissant sur la mégacaryocytopoïèse Les effets de l'héparine standard et de la FraxiparineQy ont été étudiés en présence de divers facteurs de croissance sur la formation de colonies mégacaryocytaires murines. Les résultats indiqués à la figure 1, représentent la moyenne + SEM du nombre de colonies MK à partir d'au moins 3 expériences séparées.Signification statistique (*) p L'héparine standard et la Fraxiparine, augmentent le potentiel d'activité du sérum aplasique (riche en MK-CSF). Lorsque le sérum d'aplasie est remplacé par un autre facteur de croissance, I'effet de I'héparine sur la mégacaryocyropoïese n'est pas visible. C'est le cas par exemple, lorsqu'on ajoute l'lL3 (Genzyme, USA), l'lL6 (Genzyme, USA), le GM-CSF (Genzyme, USA) ou l'Epo (Amersham, France). Les effets d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'IL3 ou l'IL6 murins sur la formation de colonies mégacaryocytaires (MK) murines induites par l'lL3 ou l'IL6, par le sérum d'aplasie et la Fraxiparine, et par le sérum d'aplasie et l'héparine, ont aussi été étudiés. Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans l'Exemple 1. Les résultats indiqués dans le Tableau VII ciaprès, représentent la moyenne + SEM de deux ou trois expériences. On constate que l'addition d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'IL3 ou l'IL6 murin, neutralise l'action de l'IL3 ou de l'IL6 ajouté, mais ne supprime pas l'activité de la FraxiparineG' et de l'héparine standard. Cela suggère un effet de l'héparine, indépendant de l'IL3 et de l'IL6. TABLEAU VII COLONIES MK/2.105 CELLULES IL-3 IL-6 SERUM APLASIE + HEPARINE SERUM APLAISIE-FRAXIPARINE# 100 20 ng/ml (10%) (5 Ul/ml) (10%) (5 Ul/ml) Ul/ml ANTI-II.3 g/ml 0I 92 # 6 6 117+6 103*6 0.1 43 # 6 - 120 # 7 121 # 8 1 11 # 4 - 110 # 9 102 # 7 5 6 # 2 - 104 # 5 102 # 5 10 5 # 1.5 - 112 # 6 105 # 6 ANTI-IL6 g/ml 0 - 35 # 3 99 # 8 96 # 8 0.1 - 34 # 4 118 # 7 121 # 7 1 - 12 # 2 112 # 8 116 # 9 5 - 3 # 1 119 # 7 122 # 10 10 - 3 # 1 101 # 6 113 # 6 EXEMPLE 4 Essais in vivo chez la souris normale 1- Effets in vivo de la Fraxiparine sur l'hématopoïèse et sur la taille des mégacaryocytes et leurs colonies La Fraxiparine a été injectée par voie sous-cutanée à des souris Balb/c bi-quotidiennement pendant 4 jours à des concentrations de 0, 4, 20, 40, 200 et 1000 Ul/kg. Les souris "témoins" ont seulement reçu du tampon phosphate (PBS Eurobio). Les animaux ont été tués par dislocation cervicale 2 jours après la dernière injection. Le nombre de CFU-MK, de CFU-GM, de mégacaryocytes et les formules sanguines ont été examinés en utilisant les méthodes décrites par Han Z.C. et al; .C.R. Acad. Sci. Paris, 1991, 313, pp 553-558. Les cellules médullaires ont été obtenues à partir des fémurs et le sang a été obtenu par ponction cardiaque. Les cellules médullaires à la concentration de 2.105 cellules mononuclées par ml ont été remises en culture en cinq exemplaires en présence de progéniteurs mégacaryocytaires ou CFU MK et de progéniteurs granulomonocytaires ou CFU-GM. Le nombre des mégacaryocytes (MK) a été évalué sur des cellules médullaires non cultivées mais ensemencées dans des boîtes de culture après l'obtention à partir des fémurs. Le nombre de plaquettes, de globules blancs et le taux d'hémoglobine ont été mesurés en utilisant un compteur hématopofétique automatique. Les résultats indiqués dans les Tableaux VIII et IX, représentent la moyenne # SEM. Chaque groupe contient 5 souris ou plus. Signification statistique (*) p TABLEAU VIII EFFET IN VIVO DE LA FRAXIPARINE# SUR L'HEMATOPOIESE MOELLE SANG MK CFU-MK CFU-GM Leucocyctes Hémoglobine Plaquettes (2 x 105 cellules) 10 / l g/100ml 10 / l FRAXIPARINE# Ul/kg 0 199 # 30 19 # 2 243 # 52 3.2 # 0.5 12.9 # 1.2 784 # 60 4 219 # 29 39 # 2* 214 # 81 2.8 # 0.6 14.7 # 1.4 869 # 92* 20 323 # 30* 52 # 5* 207 # 71 2.8 # 0.9 14.3 # 0.9 861 # 36* 40 284 # 50* 40 # 6* 193 # 47 2.2 # 0.7 13.5 # 0.8 890 # 93* 200 272 # 72* 51 # 6* 198 # 47 3.3 # 0.6 13.9 # 1.1 880 # 63* 1000 244 # 35 56 # 4* 226 # 53 4.0 # 0.8 14.6 # 0.8 876 # 74* TABLEAU IX EFFET DE L'ADMINISTRATION DE LA FRAXIPARINE# SUR LA TAILLE DES MEQACARYOCYTES (MK)) ET LEURS COLONIES FRAXIPARINE CELLULES/COLONIE MK DIAMEURE DE MK Ul/kg Mean t SEM (n) Mean t SEM m (n) 0 4.3 # 0.3 (667) 28 # 0.5 (264) 4 4.6 # 0.4 (748) 35 # 0.7 (130)* 20 4.5 # 0.6 (808) 34 # 0.6 (127)* 40 4,8 + 0,9 (1103)* 38 # 0,6 (126)* 200 4.6 # 0.5 (501)* 36 # 0.6 (245)* 1000 4.8 # 0.4 (550)* 30 # 0.4 (123) On voit que le nombre de CFU-MK médullaires, de mégacaryocytes isolés et de plaquettes, comme aussi la taille de mégacaryocytes et de leurs colonies, augmentent de manière significative 24 heures après la dernière injection de Fraxiparine aux doses de 20 à 200 Ul/kg. Pour autant, le nombre de CFU-GM, de globules blancs et le taux d'hémoglobine n'est pas affecté. 2- Etude de la durée d'action de la Fraxiparine# sur la production de mégacaryocytes et de plaquettes La Fraxiparinee a été injectée à une dose optimale de 40 Ul/kg par voie sous cutanée, à des souris Balb/c bi-quotidiennement pendant 4 jours. Les échantillons de moelle et de sang ont été prélevés aux jours 2, 5, et 8, après la dernière injection, selon le protocole indiqué ci-dessus. Les résultats du Tableau X, représentent la moyenne + SEM. Chaque groupe contient 5 souris ou plus. Signification statistique (*) p TABLEAU X MOELLE SANG CFU-MK Mégacaryocytes Leucocytes Hémoglobine Plaquette Jour/Produits (2x105 cellules) 10 / l g/100 ml 10 / l PBS (Témoin) 39 # 3 152 # 26 3.8 # 0.5 13.4 # 0.8 813 # 62 J2 Fraxiparine# 80 # 6* 195 # 24 2.2 # 0.4 13.9 # 0.4 890 # 76* PBS (Témoin) 46 # 5 164 # 9 2.1 # 0.9 13.3 # 1.2 756 # 84 J5 Fraxiparine# 46 # 5 168 # 7 1.8 # 0.3 13.4 # 0.3 910 # 29* PBS (Témoin) 44 # 5 206 # 16 2.1 # 0.5 12.8 # 0.6 874 # 83 J8 Fraxiparine# 39 # 3 805 # 16 2.0 # 0.4 14.5 # 0.4 863 # 34 Comme on peut le voir, I'effet stimulateur de Fraxiparine sur la production des plaquettes dure au moins 5 jours après la dernière injection. Ces résultats indiquent qu'in vivo, la Fraxiparine# augmente spécifiquement la production de mégacaryocytes et de plaquettes. 3- Résultats obtenus avec d'autres glycosaminoglycanes ou leurs analogues, fragments ou fractions sur l'hémopoïèse Le dermatane sulfate, le dextrane sulfate (5000 Da), I'héparine, le Produit A et le Produit B ont été injectés de la même façon que la Fraxiparine#, à une concentration de 10 uglinjection et par souris. Les échantillons de moelle et de sang ont été prélevés au jour 2, après la dernière injection. Les résultats de cette étude sont donnés dans le Tableau Xl. TABLEAU Xl MOELLE SANG CFU-MK Mégacaryocytes Leucocytes Hémoglobine Plaquettes Produits (2x105 cellules) 10 / l g/100 ml 10 / l PBS (Témoin) 48 # 6 180 # 9 1.9 # 0.2 14.5 # 0.4 803 # 87 Dermatane sulfate 36 # 8 212 # 10* 2.1 # 0.2 14.7 # 0.3 824 # 85 Dextrane sulfate 5000 Da 46 # 3 196 + 11* 2,3 t 0,3 14,9 t 0,2 804 # 90 Produit A 38 # 4 246 # 12* 3.8 # 0.7 14.2 # 0.9 925 # 57* Produit B 49 # 8 198 # 9* 1.8 # 0.3 14.9 # 0.3 830 # 64 On constate, comme pour la Fraxiparine#, que les produits testés sont capables de promouvoir la production des mégacaryocytes et/ou des plaquettes. EXEMPLE 5 Effets de la Fraxiparine#, du dextrane sulfate et du Produit B sur l'insuffisance médullaire entraînée par l'injection de 5-fluorouracyl Des souris Balb/c (5-10 souris par groupe), ont été initialement injectées avec 150 mg/kg de 5-fluorouracyl. Deux jours après, la Fraxiparine# (40 Ul/kg)) ou le Produit B (40 Ul/kg), ont été injectés par voie sous-cutanée (une injection par jour pendant 4 jours). Pour les souris "témoin" on a utilisé du tampon phosphate (PBS-Eurobio). Les animaux ont été tués par dislocation cervicale. Les cellules médullaires ont été obtenues à partir des fémurs et le sang a été obtenu par ponction cardiaque.Les cellules médullaires à la concentration de 5.104 par ml, ont été remises en culture en cinq exemplaires en présence de sérum aplasique de porc pendant une semaine, pour tester le nombre de CFU-MK Le nombre de mégacaryocytes (MK) a été évalué sur les cellules médullaires non cultivées mais ensemencées dans des boîtes de culture après leur obtention à partir des fémurs (Han Z.C. et ai ; CR Acad. Sci. Paris, 1991, 313, pp 553-558). Le nombre de plaquettes, de globules blancs et le taux d'hémoglobine ont été mesurés en utilisant un compteur hématopoïétique automatique. Les résultats indiqués dans le Tableau XII représentent la moyenne + SEM. Signification statistique (*) p TABLEAU XII MOELLE SANG CFU-MK Mégacaryocytes Leucocytes Hémoglobine Plaquettes Jour/Produits (5 x 104 cellules) 10 / l g/100 ml 10 / l PBS* (Exp.I) 8 # 2 221 # 10 1.20 # 0.1 13.0 # 0.5 142 # 26 Fraxiparine# 72 # 4* 221 # 10 1.20 # 0.1 13.0 # 0.5 142 # 26 J2 PBS* (Exp.II) 37 # 9 221 # 10 1.20 # 0.1 13.0 # 0.5 142 # 26 Dextrane sulfate 38 # 4 221 # 10 1.20 # 0.1 13.0 # 0.5 142 # 26 Produit B 37 # 12 221 # 10 1.20 # 0.1 13.0 # 0.5 142 # 26 PBS* 75 # 4 144 # 6 1.40 # 0.3 11.0 # 1.0 806 # 49 J2 Fraxiparine# 99 # 6* 232 # 7* 1.30 # 0.3 11.0 # 1.1 943 # 47* PBS* (Exp.I) 96 # 10 255 # 26 2.40 # 0.2 11.0 # 0.3 1289 # 95 Fraxiparine# 92 # 9 252 # 29 2.00 # 0.3 11.0 # 0.3 1233 # 90 J2 PBS* (Exp.II) 102 # 62 481 # 142 1.41 # 0.2 14.4 # 1.1 1208 # 150 Dextrane sulfate 102 # 31 543 # 135 1.21 # 0.4 13.8 # 1.1 1144 # 75 Produit B 97 # 36 499 # 124 1.41 # 0.2 13.2 # 0.4 1296 # 53 PBS* 80 # 5 246 # 81 2.50 # 0.3 12.1 # 0.6 966 # 63 J2 Fraxiparine# 80 # 3 258 # 38 2.70 # 0.4 12.3 # 0.4 1116 # 117 * PBS = Témoin Les résultats obtenus montrent que l'administration de Fraxiparine# aux souris traitées par le 5-fluorouracyl accélère la récupération mégacaryocytaire. Ainsi aux jours 2 et 3, après l'injection de Fraxiparine, le nombre de CFU-MK et de mégacaryocytes isolés, augmente sensiblement dans la moelle ainsi que le nombre de plaquettes. Le dextrane sulfate (5000 Da) et le Produit B ont été injectés de la même façon que la Fraxiparine#, à une dose de 10 g/injection aux souris traitées par le 5-fluorouracyl. L'administration de ces deux produits accélère également la récupération des plaquettes au jour 2 après la dernière injection. EXEMPLE 6 Expérimentations complémentaires visant à démontrer la spécificité de l'action des glycosaminoglycanes L'effet de la protamine sulfate (Laboratoires Choay, Paris), le principal agent neutralisant de l'héparine a été testé dans les cultures de moelle murine selon le protocole décrit dans l'Exemple 1. La protamine, aux concentrations de 50-100 g/ml, neutralise complètement l'activité de la Fraxiparine#. L'héparinase (Sigma USA) et la chondrnïtinase ABC (Sigma, USA), lorsqu'elles sont ajoutées aux concentrations de 0,1-1 pg/ml, inhibent de manière significative la formation de colonies mégacaryocytaires. Ces résultats montrent bien que les glycosaminoglycanes sont responsables de l'activité constatée sur la mégacaryocytopolèse. Les résultats de ces études sont respectivement regroupés dans les Tableaux Xlil et XIV. Ils représentent la moyenne de 3 expériences + SEM. Signification statistique (*) p TABLEAU XIII Effets de la protamine sulfate sur l'action de la Fraxiparine dans les cultures de moelle murine PROTAMINE Wg/ml) 0 10 50 100 PROTAMINE 58 # 5 52 # 9 46 # 5 26 # 3* PROTAMINE + FRAXIPARINE# (5 Ul/ml) 129 # 11 96 # 10 76 # 9 59 # 8* TABLEAU XIV Effets de l'héparinase et de la chondroltinase ABC sur la formation de colonies MK in vitro (2.105 cellules) CONCENTRATIONS EN (mU/ml) 0 10 100 500 1000 HEPARINASE 68 # 10 39 # 4.5 36 # 3 30 # 4.5# 27 # 10* CHONDROITINASE 68 # 10 66 # 3 51 # 14 32 # 4* 29 # 8* REVENDICATIONS 1- Utilisation de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, de leurs fractions, fragments ou dérivés, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des thrombopénies. 2- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est l'héparine, I'héparane sulfate, leurs analogues, ainsi que leurs fractions fragments et dérivés. 3- Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est une héparine de bas poids moléculaire. 4- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ie glycosaminoglycane exogène est le chondroltine sulfate 4-S, le chondroitine sulfate 6-S, le dermatane sulfate, leurs fractions, fragments ou leurs dérivés. 5- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est l'acide hyaluronique, ses fractions fragments ou ses dérivés. 6- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les analogues des glycosaminoglycanes sont choisis parmi le dextrane sulfate5 le pentosane polysulfate, I'acide alginique sulfaté, I'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfaté ou le sucralfate. 7- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments, ou dérivés sont dépourvus d'action anticoagulante.