Brevet FR2687576A1 — publié le 19930827

La présente invention concerne des ligands capables de se lier à des sidérophores ferriques et notamment des anticorps monoclonaux, dirigés contre ces sidérophores ferriques, pour le traitement et la prévention d'infections bactériennes chez l'homme, les animaux et les plantes. Un certain nombre de bactéries sont la cause d'infections en milieu hospitalier. Ces infections nosocomiales se développent en dépit des traitements antibiotiques modernes et conduisent à un nombre de décès important. Parmi les bactéries provoquant ces infections, on peut citer des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae telles que Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter et des bactéries appartenant à la famille des Pseudomonadaceae telles que Pseudomonas aeruginosa. On a par conséquent cherché d'autres approches thérapeutiques. C'est ainsi que l'on a proposé (WO 85/0i 659) d'utiliser des anticorps monoclonaux dirigés contre des lipopolysaccharides de bactéries gram négatif (endotoxines) et que l'on a effectivement utilisé une composition dénomée Centoxin dans le traitement de septicémies à gram négatif. Le mécanisme exact d'action de ces anticorps n'est pas totalement élucidé. On sait toutefois que ces anticorps ne permettent pas de lutter efficacement contre les septicémies chez des patients présentant une neutropénie (Ziegler et al. N. Engl. J. Med., 1982, 307, 1225). Chez des patients atteints de cancer, des septicémies à gram négatif sont fréquentes et elles se produisent principalement au cours de période ne neutropénie qui suivant l'administration de produits chimiothérapeutiques anti-cancer. Il existe donc un besoin pour une thérapie qui soit indépendante du taux de leucocytes. Il est par ailleurs connu que le fer est un élément essentiel pour le développement des bactéries. Dans les tissus et fluides de l'homme et des animaux, les taux de fer libre sont nettement inférieurs à ceux nécessaires pour la croissance des bactéries. Pour résoudre ce problème, la plupart des microorganismes ont développé des systèmes de transport de fer qui comprennent des agents chélatant le fer de faible masse moléculaire appelés sidérophores. Ces systèmes permettent aux bactéries de prélever le fer de protéines chélatantes de l'hâte telles que transferrine et lactoferrine pendant l'infection et jouent donc de ce fait un rôle déterminant dans la pathogénèse de ces infections bactériennes. C. Bolin et al. (Infect. Immun., 1987, 55, 1239) ont montré que l'immunisation par des anticorps polyclonaux dirigés contre le récepteur membranaire d'un sidérophore ferrique permettait de protéger des dindons contre une infection expérimentale par E. coli. Ils n'ont toutefois pas envisagé d'utiliser un anticorps dirigé contre un sidérophore bactérien. On sait par ailleurs que Erwinia chrysantemie, bactérie productrice de sidérophore, est responsable de symptômes de flétrissement vasculaire chez toute une série de plantes potagères et ornementales (C. Errard et al., J. Bacteriol. 1988, 170 : 2419). La présente invention a pour objet une composition pour le traitement ou la prévention chez l'homme, les animaux et les plantes d'une infection par des bactéries produisant un sidérophore, comprenant une quantité efficace de ligands capables de se lier au sidérophore sous forme ferrique. La présente invention a également pour objet un procédé de traitement ou de prévention chez l'homme, les animaux et les plantes, d'une infection par des bactéries produisant un sidérophore, consistant à administrer une quantité efficace de ligands capables de se lier au sidérophore sous forme ferrique. Les ligands utilisables dans la présente invention peuvent être notamment des anticorps et plus particulièrement des anticorps monoclonaux ou des fragments de ces anticorps, qui sont dirigés contre un déterminant antigénique d'un sidérophore sous forme ferrique. Il peut s'agir également de peptides capables de se lier à un tel sidérophore. Les fragments des anticorps qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont les fragments qui portent les sites de combinaison antigénique. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab' )2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. D'une manière générale, les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par toutes les techniques qui permettent la production de molécules d'anticorps à partir de culture de lignée cellulaire. Ces techniques comprennent les différentes techniques utilisant des hybridomes. La production d'anticorps peut être obtenue chez l'animal par immunisation des animaux par injection des sidérophores ferriques, éventuellement après couplage à un agent immunogène tel que l'anatoxine tétanique, la tyroglobuline ou l'albumine sérique bovine. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux sont des anticorps dirigés contre un déterminant antigénique de l'aérobactine ferrique et la présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre un déterminant antigénique de l'aérobactine ferrique. L'aérobactine est un sidérophore de type hydroxamate. Il a été décrit (F. Gibson et al., Biochim. Biophys. Act 1969, 192, 175) comme ayant la formule suivante Ce sidérophore est produit par de nombreuses souches d'Enterobacteriaceae ainsi que par certaines souches de Pseudomonas (Buyer et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, 2246). Il a été identifié comme jouant un rôle déterminant des la pathogénèse extracellulaire des entérobactéries provoquant une septicémie et des infections urinaires, ainsi que dans la prolifération de pathogènes intracellulaires tels que Shigella. Mais l'invention vise également l'utilisation d'anticorps dirigés contre d'autres sidérophores ferriques. Comme exemples d'autres sidérophores on peut citer : entérobactine, pseudobactines, pyovectines, anguibactine, chrysobactine. Généralement, les ligands peuvent être administrés chez l'homme et les animaux par voie intraveineuse ou intramusculaire dans une solution physiologiquement acceptable. Les compositions peuvent se présenter sous forme de dose unitaire contenant 10 mg à 1 g de ligands. On décrira ci-après de façon plus détaillée la présente invention en se référant aux dessins sur lesquels - la Fig. 1 donne l'absorbance à 492 nm obtenue dans une méthode ELISA compétitive utilisant l'anticorps MAb AERO1 et différentes concentrations d'aérobactine ferrique (courbe a) et de ferrioxamine B (courbe b) - la Fig. 2 donne l'absorbance à 492 nm obtenue dans une méthode ELISA compétitive utilisant l'anticorps MAb AERO1 et différentes dilutions de surnageants contenant de l'aérobactine ferrique (courbe a) ou de l'arthrobactine ferrique (courbe b) - la Fig. 3 donne les concentrations en aérobactine ferrique calculées dans des surnageants de différentes souches d'Enterobacteriaceae produisant de 1 ' aérobactine ferrique - la Fig. 4 donne nombre d'unités formant colonnes de E. coli BN 3040 dans du sérum de veau nouveau-né après addition de l'anticorps MAb AERO1 (courbe a), du sérum physiologique (courbe b) ou un anticorps antianatoxine tétanique (courbe c); - la Fig. 5 représente le pourcentage de survie de souris infectées par voie intra-péritonéale par 3.106 UFC de E. coli V2019, représentant 10 DL50, et traitées préventivement (2 heures avant l'infection) par injection intra-veineuse de 200 pl (1 mg) de MAb AERO1 (courbe a), 200 p1 (1 mg) d'anticorps monoclonal anti-anatoxine tétanique (courbe b) ou 200 pl de NaCl 9"/00 (courbe c). I - Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre 1' aérobactine ferrique. L'aérobactine a été obtenue comme décrit par J.B. Neilands (Structure and Bonding, 1984, 58, 1) à partir de E. coli K 12, souche KH 576 (nal A, rpsl, pColV - K30), cultivée en agitation pendant 24 heures à 37 C dans un milieu à base de Tris (Simon et al., PNAS, 1963, 50, 526) sans FeCl3 mais contenant 0,2 % de glucose et 1 pg/ml de vitamine B1. L'aérobactine ferrique a été préparée et purifiée comme décrit par Konopka et al. (Biochem, 1982, 21, 6503). Sa pureté a été déterminée par chromatographie en couche mince sur gel de silice, spectrométrie de masse par bombardement atomique rapide (m/Z = 565 M+H+, 587 (M + Na) et 603 (M + K) en accord avec la masse moléculaire de 564 daltons de 1'aérobactine) et par analyse par RMN à 250 MHz. L'aérobactine ferrique a été couplée à de la thyroglobuline dans un rapport molaire de 300:1 comme décrit par J.V. Staros et al. (Anal. Biochem., 1986, 156, 220). Le couplage a été confirmé par chromatographie en couche mince comme indiqué ci-dessus et par analyse du spectre d'absorption (visible et ultraviolet). Le conjugué de l'aérobactine ferrique avec la thyroglobuline a été injecté en sous-cutanée à des souris BALB/c à la dose de 50 pg dans du PBS. Des rappels ont été effectués tous les 21 jours en intra-péritonéal. Trois jours après la dernière injection en intra-veineux, les cellules spléniques des deux souris présentant le plus fort titre sérique d'anticorps antiaérobactine ferrique (déterminés par une méthode ELISA utilisant des plaques de microtitration revêtues de 100 p1 par puits de conjugué de l'aérobactine ferrique avec de l'albumine sérique bovine dans du tampon phosphate pH 7,4) ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris (lignée P3-NSI-l-Ag 4-1) comme décrit par D. Bellet et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab., 1983, 58, 530). Trois hybridomes qui secrétaient des anticorps antiaérobactine ferrique ont été identifiés et clonés par dilution. Les isotypes des trois anticorps ont été identifiés comme IgG2 en utilisant des conjugués peroxydase immunoglobuline isotype antisouris de lapin (Nordic Immunological Laboratories, Pays-Bas). L'hybridome produisant les anticorps monoclonaux ayant la plus grande affinité pour l'aérobactine ferrique selon le test ELISA a été amplifié par passage dans le péritoine de souris nude. L'ascite a été recueilli et l'anticorps purifié comme décrit par J.M. Bidart et al. (J. Immunol. 1985, 134, 457). Il a été dénommé MAb AERO1. II - Propriété de l'anticorps monoclonal anti aérobactine ferrique MAb AERO1. On a testé l'affinité de l'anticorps en utilisant une méthode ELISA. A cet effet, on a incubé 100 pl de dilutions en série contenant des sidérophores pendant 1 heure à 37 C avec 100 pl de MAb AERO1 (10-5 mg/ml) dilué dans du pBS Tween 1 % BSA (Albumine sérique bovine) et 200 pM EDDHA et on a déterminé l'activité résiduelle de MAb AERO1 par la méthode ELISA décrite ci-dessus. On a représenté sur la Fig. 1 les résultats obtenus avec l'aérobactine ferrique (courbe a) et avec la ferrioxamine B (courbe b) et sur la Fig. 2 les résultats obtenus avec l'aérobactine ferrique contenue dans le surnageant de culture de E. coli KH 576 pColVK30 (courbe a) et l'arthrobactine ferrique provenant du surnageant de culture de Arthrobacter pascens, souche ATCC 13346. Ces résultats mettent en évidence que MAb AERO1 réagit non seulement avec l'aérobactine ferrique mais également, bien que dans une moindre mesure, avec l'arthrobactine ferrique et la ferrioxamine B. En revanche, l'anticorps MAb AERO1 ne réagit pas avec d'autres sidérophores tels que la pseudobactine ferrique, le coprogène ferrique, l'entêrobactine ferrique provenant de E. coli RW 193 pITS55 et le shizokinen ferrique provenant de Bacillus megaterium. L'absence de réaction avec le shizokinen qui diffère de l'aérobactine par une chaîne (CH2)2 à la place d'une chaîne (CH2)4 permet de penser que l'épitope reconnu par MAb AERO1 est la partie liée au fer du résidu lysyl modifié de l'aérobactine ferrique. On a également testé différentes préparations d'aérobactine ferrique provenant du surnageant de culture de différentes souches appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, isolées chez des patients atteints de cancer et présentant une bactériémie. Les souches ont été cultivées 24 heures à 37 C dans du milieu Tris. Les résultats sont reportés sur la Fig. 3 sur laquelle on a représenté les concentrations en aérobactine qui ont été calculées par comparaison avec des concentrations connues d'aérobactine ferrique. Le trait gras est la moyenne de trois essais et le trait fin indique l'écart type. Ces résultats mettent en évidence que l'anticorps MAb AERO1 reconnaît l'aérobactine produite par un grand nombre de souches distinctes appartenant à six genres différents de la famille des Enterobacteriaceae. III - Activité inhibitrice de l'anticorps MAb AERO1 sur la croissance d'une souche de E. coli pro ductrice d'aérobactine. On a mesuré la croissance de la souche d'E, coli BN 3040 (F-, proC, leuB, trpE, thi, entA, cir) dans un milieu à base de sérum de veau nouveau-né contenant soit 10 % de fluide d'ascite contenant MAb AERO1 (courbe a), soit du soluté physiologique (courbe b) soit un anticorps monoclonal anti-anatoxine tétanique (courbe c). Les cultures ont été incubées à 37 C sous agitation et les bactéries viables ont été comptées à différents moments après dilution sur de l'agar-agar. Les résultats sont la moyenne de trois essais et l'écart-type est indiqué. Il apparaît que l'anticorps MAb AERO1 limite le croissance de E. coli BN 3040, alors que la croissance en présence d'anticorps anti-anatoxine tétanique est similaire à celle obtenue en l'absence d'anticorps. IV - Activité protectrice de l'anticorps monoclonal MAb AERO1 dans un modèle expérimental d'infection à E. coli chez la souris OF1 en traitement préventif On a créé expérimentalement une infection à E. coli V2019 (souche sauvage productrice d'aérobactine et d'entérobactine) chez la souris OF1. Dans ce modèle, les souris sont infectées par 3.108 UFC (10 DL50) de E. coli V2019. Deux heures avant l'infection, les souris ont reçu par voie intraveineuse 7 mg de MAb AERO1, 1 mg d'anticorps monoclonal anti-anatoxine tétanique ou 200 Ul de NaCl 9 /oo. Les résultats présentés sur la Fig. 5 montrent que MAb AERO1 diminue la mortalité murine (45 % de survie) par rapport aux lots témoins ( REVENDICATIONS 1 - Composition pour le traitement ou la prévention chez l'homme, les animaux et les plantes d'une infection par des bactéries produisant un sidérophore comprenant une quantité efficace de ligands capables de se lier au sidérophore sous forme ferrique. 2 - Composition selon la revendication 1, dans laquelle les ligands sont des anticorps dirigés contre un déterminant antigénique d'un sidérophore ferrique. 3 - Composition selon la revendication 2, dans laquelle les anticorps sont des anticorps monoclonaux. 4 - Composition selon la revendication 1, dans laquelle les ligands sont des fragments F(ab' )2, Fab' ou Fab d'anticorps. 5 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le sidérophore ferrique est l'aérobactine ferrique. 6 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant de 10 mg à 1 g d'anticorps monoclonaux. 7 - Anticorps monoclonaux dirigés contre un déterminant antigénique de l'aérobactine ferrique.