Brevet FR2695557A1 — publié le 19940318

COMPOSITION BIOLOGIQUE CONTENANT DES EGF DESTINEE A REGULER LA CROISSANCE CELLULAIRE La présente invention a trait au domaine des produits dits facteurs de croissance et concerne plus spécialement de nouvelles applications de ces produits. Les facteurs de croissance sont définis en biologie cellulaire comme des substances capables de stimuler la prolifération des cellules. Un nombre important de facteurs de croissance d'origines diverses du type tissus ou organes animaux, sécrétions cellulaires, ont été identifiés, isolés et caractérisés. On se référera plus spécialement ic au facteur de croissance épidermique dénommé EGF ("Epidermal Growth Factor, selon la terminologie anglo-saxonne). Isolé depuis une trentaine d'années, 1'EGF est un polypeptide dont l'activité mitogène a été décrite dans de nombreux articles. Sa capacité à stimuler la prolifération des cellules de peau en culture a été mise en évidence dans le brevet FRA-2 472 385 et le certificat d'addition FRA-2 533 438, ainsi que son utilisation en cosmétologie à des doses de 0,001% à 0,1%. L'utilisation d'un tel facteur de croissance dans le cas d'organismes, présentant des risques de prolifération de cellules malignes s'avère potentiellement dangereuse du fait de la division anarchique des cellules dont le développement est favorisé par l'EGF. Il a maintenant été trouvé, de manière surprenante que des doses extrêmement faibles de facteurs de croissance présentaient l'avantage de stimuler la multiplication des cellules saines tout en inhibant la prolifération des cellules malignes. Ainsi la présente invention a pour objet, une composition biologique permettant de réguler l'activité mitotique et métabolique par la stimulation des cellules normales en culture et l'inhibition des cellules malignes en culture, caractérisée en ce qu'elle renferme comme principe actif un facteur de croissance épidermique (EGF) en des quantités infinitésimales. En pratique, on utilise 1'EGF sous forme de dilutions successives réalisées à partir d'un solvant approprie. A cet effet, on peut mettre en oeuvre tout solvant convenable. Dans la description qui suit, on décrit comme solvant particulièrement avantageux un mélange d'alcool et de glycérine. L'invention sera mieux comprise par la description résumée de nombreuses séries d'essais entrepris par la Demanderesse et permettant d'établir l'efficacité des dilutions très élevées d'EGF dans la régulation de la croissance cellulaire. Exemples de réalisation Les exemples qui suivent concernent tout d'abord l'action inhibitrice de dilutions d'EGF sur la croissance de keratinocytes malins, puis l'effet stimulant de ces mêmes dilutions sur la croissance de fibroblastes sains. Premier groupe d'essais a) L'EGF utilisé dans le premier groupe d'essais provenait des glandes sous-maxillaires de la souris. En effet, de par sa structure similaire à l'EGF humain, l'EGF murin peut être utilisé chez l'homme. Il s'agit d'un polypeptide de 56 Acides aminés comprenant trois ponts disulfure, de poids moléculaire 6,045KD. b) Pour la réalisation des essais, on a procédé à des dilutions centésimales sériées d'EGF en utilisant comme solvant de l'éthanol à 20 degrés alcoolimétrique additionné de 25 % (en poids) de glycérine pure et en partant d'une solution mère contenant 0,01 mole.1-1 d'EGF. La gamme étalon a été obtenue comme suit : on a dilué, dans 3,5 ml de solvant, 35 pl (microlitres) de solution mère en agitant pendant cinq minutes, ceci donnant un échantillon de concentration 104M. Puis 35p1 de cet échantillon ont été agités pendant cinq minutes avec 3,5 ml de solvant pour donner une nouvelle dilution de concentration 10-6M. On a ensuite opéré de la même façon pour obtenir les dilutions successives au 1/100 ème, de concentration 10-8M, l0-10M ... 10-50M. Chacune des dilutions a été conservée à +40C et des séries de gammes témoins ont été réalisées, selon les mêmes dilutions, en utilisant uniquement le solvant précité. Bien entendu, on a réalisé selon le même principe de dilution, des solutions de concentration : l05N, 10-7M ... 10-53M à partir d'un échantillon de concentration 10-3M, ainsi que les dilutions intermédiaires. c) Les cellules mises en oeuvre dans le premier groupe d'essais étaient des keratinocytes de lignée provenant d'un carcinome squameux murin. Les kératinocytes ont été cultivés dans un milieu de culture approprié. Afin d'optimiser les conditions expérimentales, les expériences ont été réalisées sur un milieu de culture carencé en sérum de veau foetal (SVF), c'est à dire ayant une teneur en SVF de 2% au lieu du taux d'environ 10% généralement nécessaire. d) Les essais proprement dits ont été faits en comparant le taux de croissance cellulaire de keratinocytes mis en présence de dilutions successives d'EGF au taux de croissance cellulaire d'échantillons témoins constitués d'une part par les keratinocytes seuls et d'autre part par les kératinocytes mis en présence du solvant, dilué sur lui-même dans les mêmes conditions. Pour cela, on a travaillé selon un protocole opératoire bien déterminé, les kératinocytes ayant été répartis en trois groupes Le premier ayant reçu la dilution à tester, le second ayant reçu le solvant, le troisième constitué par les kératinocytes seuls. Après le deuxième jour de mise en contact, on a procédé au dénombrement des kératinocytes, en utilisant la technique au bleu de méthylène (culture sur plaques à six puits). Ces mesures ont été répétées au troisième jour après inoculation et elles ont permis de calculer le taux de croissance cellulaire pour les échantillons à tester et les deux échantillons témoins. En comparant les taux de croissance pour le groupe à tester et les deux groupes témoins on a pu constater une différence très significative entre les deux séries de valeurs. e) Dans la première série d'essais on a mis en oeuvre des dilutions infinitésimales d'EGF de l09M, 1015M, 1019M, l025M, l035M, 10-45M, et 1055M. Les résultats des essais sont illustrés par les graphiques annexés qui représentent - Figure 1 : Un diagramme de taux de croissance cellulaire dans lequel chaque pic représente le taux de croissance cellulaire de kératinocytes traités au deuxième jour après inoculation. Les pics TC et TS correspondant respectivement aux témoins constitués par les cellules seules et les cellules mises au contact du solvant. En abcisse, sont portées les concentrations des dilutions infinitésimales d'EGF exprimées en concentration molaire (M) et en ordonnée, le taux de croissance cellulaire mesuré sous forme de densité optique, suite à la coloration au bleu de méthylène. - Figure 2 : Un diagramme de taux de croissance cellulaire au troisième jour après inoculation. Il ressort clairement des figures 1 et 2, que 1'EGF exerce un puissant effet inhibiteur sur la prolifération des cellules malignes. f) D'autres séries d'essais ont été réalisées avec des dilutions infinitésimales d'EGF de 10-20M et 1040M. Ces essais ont conduit aux mêmes effet, c'est à dire une inhibition significative de la croissance de kératinocytes de lignée à toutes les dilutions testées. Deuxième groupe d'essais a) L'EGF utilisé dans le deuxième groupe d'essais était l'EGF humain recombinant à 98% de pureté (Sigma E 3264). b) Pour la réalisation des essais, on a procédé de la même manière que dans le premier groupe d'essais, à des dilutions centésimales sériées d'EGF. c) Les cellules mises en oeuvre dans le deuxième groupe d'essais étaient des fibroblastes humains de premier explant, cultivés selon la technique décrite dans le premier groupe d'essais. d) Le protocole opératoire des essais a différé de celui du premier groupe dans la mesure où le dénombrement des fibroblastes a été effectué en utilisant la technique au bleu de méthylène (culture sur plaques renfermant 96 puits). Le dénombrement a été répété au quatrième, cinquième et sixième jour après inoculation. e) Dans la première série d'essais, on a mis en oeuvre des dilutions infinitésimales d'EGF 10-7M, 10-9M, 10-15M, 10-19M, 10-25M, l035M, 1045M et 10-55M. Les résultats des essais sont illustrés par le graphique annexé qui représente. - Figure 3 : Un diagramme de taux de croissance cellulaire, dans lequel chaque pic représente comme dans les figures précédentes le taux de croissance cellulaire de fibroblastes traités au sixième jour après inoculation. Il ressort clairement de la Figure 3, que l'EGF exerce un effet stimulateur sur la croissance des fibroblastes normaux. f) D'autres séries d'essais ont été réalisées avec des dilutions infinitésimals d'EGF de 1020M, 10-30M ... 10-50M. Ces essais ont conduit aux mêmes effets, c'est à dire une stimulation de la division des cellules à toutes les dilutions testées. La composition biologique selon l'invention pouvant être destinée à un usage pharmaceutique ou cosmétique, contient bien entendu, outre le principe actif susvisé, les excipients et adjuvants habituels tels que épaississants, diluants, solvants, émulsifiants, lubrifiants, aromatisants, liants etc...., formulés en fonction de leur mode d'administration. Les compositions selon l'invention pourront prendre les formes les plus variées, convenant à l'application topique, notamment : pommades, lotions, émulsions, onguents ou autres. A titre d'exemple, on peut citer les compositions suivantes. Exemple 1 Emulsion régénératrice : % (en poids) Propylèneglycol 5,0 Carbopol 934... 0,6 Alcool cétylique ... 1,0 Dérivés de lanoline ... 10,00 . Huiles végétales 7,0 Myristate d'Isopropyle 10,00 Triethanolamine... 0,6 &alpha;-Tocophérol... 0,05 EGF - (Solution 10-10M)... 10,00 Conservateurs 0,15 Parfum 0,2 Eau démineralisée et stérilisée q.s pour 100 Exemple 2 Lotion : ' % (en poids) Extrait hydroglycolique végétal (*) ... 5-10 Glycérine... 2-5 EDTA (sel disodique)... 0,05 Acide lactique ... 0,50 Urée - 0,25 Lactate de Na (Sol. 70%) ... 0,50 Pyrrolidone carboxylate de sodium (sol. 50%). 0,75 Conservateurs 0,25 EGF - (Solution.10-19M) 10,00 Parfum 0,20 Eau déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 (*) Camomille, Gentella Asiatica, Orchidée, Lotus, Ginseng. Exemple 3 Masque Stimulant : % (en poids) Kaolin 5,0 Lait en poudre .... 2,0 Talc 12,0 Stearalkonium Bentonite... 8,0 . Glycérine 10,0 Propylène Glycol ... 10,0 Alcool Polyvinylique ... 0,5 . Dioctyl Succinate de Sodium 0,5 Conservateurs 0,150 EGF (Solution.10-11M)... 10,0 Parfum 0,35 Eau déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 Exemple 4 Pommade Labiale régénérante :: 8 (en poids) Ceresine 5-7 Cire de Carnauba ... 5-7 Ozokérite 3-5 Alcools de Lanoline ... 20-23 PPG 45 Dodecyl glycol Copolymer... 18-22 Lactate de Myristyle ... 18-22 Complexe Cire d'abeille PEG 20 - Sorbitol ... 5-7 Huiles Végétales ... 3-5 Bentone 0,4-0,6 .Glycérine 3-5 Conservateurs 0,25-0,30 EGF (Solution 10-9M)... 10,00 Eau déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 Exemple 5 Fond de Teint traitant Propylèneglycol 5-8 Poudre de Soie naturelle ... 1-2 Carboxy Méthyl Cellulose de Na... 0,2-0,3 Talc 1,0-2,0 , Oxydes de Ti, Fe (rouge, jaune, brun, noir) . q.s pour teinte , Mono, di-Stéarate de 1, 2 propanediol 1,5-2,0 , Mélanges d'acides stéarique et palmitique ... 1,5-2,5 . Lanolate d'Isopropyle... 1,0-2,0 . Dérivés de Lanoline... 0,5-1,0 . Huiles végétales... 3-5 Lécithine de Soja ... 0,5-1,0 &alpha;-Tocopherol... 0,05 . EGF (Solution 10-17M) 5-10 .Conservateurs... 0,35 . parfum... 0,35 , Eau déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 Exemple 6 Emulsion dermatologique apaisante % (en poids) (brûlures, erythèmes) . Stearate de Propylèneglycol... 5,0-7,0 . Cire de Paraffine... 1,0-2,0 . Huile de Paraffine... 3,0-5,0 . Stearine... 3,0-5,0 . Glycérine... 3,0-5,0 . Huiles végétales... 3,0-5,0 . Allantoine... 0,2-0,5 . Extrait hydroglycolique de camomille 2,0-4,0 . 6-Bisabolol... 0,1-0,3 . Triethanolamine... 0,5-0,75 . EGF (Solution 10-9M)... 5-10 . Conservateurs... 0,25-0,40 . Parfum... 0,25-0,50 , Eau Déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 Exemple 7 Lotion Après Rasage . Acide lactique... 0,3-0,5 Lactate de Na ... 0,2-0,4 . Glycérine.... 1,05-3,0 . Allantoine... 0,15-0,35 , EDTA (Solution disodique) 0,05 . Carboxymethyl Cellulose... 0,05-0,15 . EGF (Solution 10-15M)... 5-10 . Conservateurs 0,20-0,35 . Parfum... 0,20-0,35 , Colorant q.s pour teinte Eau déminéralisée et stérilisée q.s pour 100 REVENDICATIONS 1 - Composition biologique permettant de réguler l'activité mitotique et métabolique des cellules par la stimulation des cellules normales sans stimulation de croissance ou même inhibition de croissance des cellules malignes, caractérisée en ce qu'elle renferme comme principe actif un facteur de croissance épidermique (EGF) sous forme de dilutions infinitésimales. 2 - Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le facteur de croissance épidermique est extrait des glandes sous-maxillaires de la souris. 3 - Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le facteur de croissance épidermique est un EGF humain recombinant. 4 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration en EGF dans les dilutions infinitésimales est inférieure à 10-7 moles . l-S. 5 - Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la concentration en EGF dans les dilutions infinitésimales est comprise entre 10-7 et 10-53 moles .1-1. 6 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les dilutions sont réalisées à l'aide d'un solvant constitué par de l'éthanol à 20 degrés alcoolimétriques additionné de 25 % (en poids) de glycérine pure. 7 - Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend outre ledit principe actif des ingrédients et/ou excipients pharmaceutiquement et physiologiquement acceptables. 8 - Utilisation de la composition selon la revendication 7 pour la fabrication de formulations cosmétiques. 9 - Utilisation de la composition selon la revendication 7 pour la fabrication de formulations pharmaceutiques.