Brevet FR2693208A1 — publié le 19940107

Procédé d'obtention d'une composition enzymatique d'origine végétale ainsi que composition obtenue par la mise en oeuvre de ce procédé " La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une composition enzymatique d'origine végétale. I1 est connu que les nombreuses réactions chimiques qui sont normalement mises en oeuvre au sein de tout organisme vivant, et qui sont couramment désignées par le terme général d'activité métabolique, entraînent l'apparition d'espèces chimiques particu lières : les radicaux libres qui sont des mole cules présentant la particularité de posséder sur leur périphérie un électron isolé ou célibataire, ce qui les rend très réactifs. Or, ces radicaux libres sont suspectés de participer dans l'organisme à des processus dégénéra- tifs et pathologiques, et, en particulier d'etre responsables au moins en partie du phénomène de vieillissement. Ils doivent donc autant que possible être détruits ou ramenés à un taux physiologique normal. Dans ce but, les spécialistes ont déjà proposé différents agents antiradicalaires qui sont couramment classés en fonction de leur mécanisme d'action qui peut être stoechiométrique ou enzymatique. Parmi les agents antiradicalaires agissant par un mécanisme enzymatique, on peut mentionner la catalase, la peroxydase, la glutathion peroxydase et surtout la superoxyde dismutase qui a, jusqu'à ce jour, été largement utilisée dans le domaine de la cosmétique et dans les hôpitaux pour le traitement de personnes irradiées. Cette enzyme qui a été découverte en 1969 par Fridovich agit en dismutant l'ion superoxyde en oxygène et eau oxygénée conformément à la réaction I1 est toutefois à noter qu'à côté de ses avantages propres, la superoxyde dismutase présente l'inconvénient d'aboutir à la formation d'un composé toxique : l'eau oxygénée.On a pu vérifier, conformément à l'invention, in vitro, en mettant en contact de la superoxyde dismutase et des hématies, qu'il n'était pas possible d'obtenir ainsi une protection de ces dernières, et que leur destruction était meme accélérée compte tenu de la fabrication d'eau oxygénée. Un autre inconvénient de la superoxyde dismutase telle qu'actuellement proposée par les spécialistes est lié au fait qu'elle est toujours d'origine animale, notamment notamment extraite de foie et de globules rouges bovins. Or, compte tenu de cette origine, la superoxyde dismutase vient d'être interdite par la Pharmacie Centrale des Hôpitaux de Paris et son AMM a été bloquée : les Autorités responsables craignent, en effet, l'apparition et la propagation de pathologies très graves liées en particulier à la présence de virus du type prion susceptibles de se développer au niveau du cerveau et des tissus nerveux humains. Compte tenu de cette situation, la présente invention a pour but de proposer, d'une part, un produit de substitution d'origine végétale permettant de remplacer la superoxyde dismutase d'origine animale, et, d'autre part, une composition antiradicalaire elle aussi exclusivement d'origine végétale permettant de remédier aux inconvénients susmentionnés liés à la formation d'eau oxygénée de la superoxyde dismutase. Pour satisfaire à ce dernier impératif, on a eul'idée, conformément à l'invention, d'associer la superoxyde dismutase à d'autres enzymes susceptibles de capter ou de détruire l'eau oxygénée. Parmi les enzymes susceptibles d'être utilisées dans ce sens, on peut noter - la catalase qui est actuellement extraite du foie de boeuf et est capable de détruire l'eau oxygénée en donnant de l'eau et de l'oxygène, - les peroxydases qui sont susceptibles de faire le meme travail mais nécessitent, en outre, la présence d'un substrat réducteur spécifique ; ces enzymes sont actuellement extraites à partir de la moelle épinière (myélo peroxydase), du lait (lacto peroxydase) ou encore des hématies de bovins (glutathion peroxydase). Les substrats réducteurs spécifiques des peroxydases peuvent, à titre d'exemple, être choisis dans la liste suivante : guaïacol, acide urique, pyrogallol, dihydroxyphénylalanine, phénols, polyphénols (acide caféique, acide ferulique, acide chlorogénique), acide ascorbique. Or, il connu que les enzymes susmentionnées sont également toutes présentes, en quantités plus ou moins importantes, dans un certain nombre de céréales, et notamment le germe de blé où une centaine d'enzymes ont été répertoriées à une concentration relativement importante. La présente invention concerne, par suite, un procédé permettant d'extraire une composition antiradicalaire riche en ces enzymes à partir de telles céréales. Ce procédé est caractérisé en ce que lton traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide autorisé par les milieux médicaux et pharmaceutiques, notamment du méthanol ou de l'éthanol de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec de l'eau contenant environ 2 % de chlorure de sodium de façon à extraire les protéines et les enzymes puis on ajoute à l'extrait un alcool liquide, lui aussi accepté par les milieux médicaux et pharmaceutiques, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à précipiter les protéines et les enzymes et on sèche le précipité sous vide pour obtenir une composition lyophilisée. En fin de procédé, on obtient un "cocktail" de protéines et d'enzymes dont l'activité antiradicalaire a pu être prouvée. L'invention concerne également une telle composition. Pour vérifier l'activité de cette composition, on a mis directement en contact avec du sang humain, d'une part, des adjuvants classiques tels que du glycérol, du glucose ou encore de la stéarylamine, et d'autre part, la composition enzymatique conforme à l'invention à différentes concentrations ; on a, à chaque fois, mesuré le point de demi-lyse T50 et le temps de latence tl, c'est-àdire le point à partir duquel commence la lyse des hématies.Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-après TABLEAU Produit(s) Tubes T 50 tl Témoin 1 132 94 Témoin 2 113 78 + Glycérol 10-2M 3 116 86 + Glucose 10-2M 4 133 91 + Stearylamine sans GRL 2,46 mg/ml 5 + Stearylamine 77 o 2,46 mg/ml 6 77 0 + Compositions enzymatiques 7 130 92 1,9 mg/ml + Compositions enzymatiques 8 --- - sans GRL 1,9 mg/ml 8 --- - + Compositions enzymatiques 9 168 132 9,5 mg/ml + Compositions enzymatiques 10 237 202 sans GRL 23,8 mg/ml + Compositions enzymatiques 11 > 340 47,6 mg/ml On a pu constater qu'à partir d'une concentration de 9,5 mg/ml, la composition conforme à 1 invention présente un effet protecteur. Cet effet, contraire à celui obtenu avec la superoxyde dismutase est, selon toute vraisemblance, lié au couplage de cette dernière avec d'autres enzymes de nature à détruire l'eau oxygénée. Cependant, et malgré ses avantages, le protocole susmentionné exige la mise en oeuvre de concentrations très importantes du "cocktail" de protéines et d'enzymes ; il serait donc souhaitable de pouvoir purifier celui-ci 100 à 1 000 fois de façon à pouvoir obtenir des résultats similaires, et ce, avec des concentrations 100 à 1 000~fois inférieures. A cet effet, il est proposé, conformément à 1 invention, un procédé permettant d'obtenir une composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale largement similaire au "cocktail" de protéines et d'enzymes obtenu par le protocole susmentionné, mais, fortement enrichi en superoxyde dismutase. Conformément à l'invention, ce procédé est caractérisé en ce que, après une première étape de délipidation à l'alcool pur similaire à l'étape de délipidation susmentionnée, on récupère le gâteau de filtration et on le traite avec une solution hydroalcoolique à 10 %, notamment une solution de méthanol ou d'éthanol ; cette seconde étape est spécifique à l'extraction de la superoxyde dismutase qui présente la particularité d'être soluble et donc de pouvoir être extraite dans l'alcool à 10 %, ce qui n'est généralement par le cas des protéines et autres enzymes. Conformément à l'invention, cette seconde extraction est suivie d'une étape de chauffage à environ 40 à 50"C de la solution hydro-alcoolique riche en superoxyde dismutase mais contenant également un certain pourcentage de protéines et d'autres enzymes pendant 2 heures : cette opération permet d'obtenir une solution de superoxyde dismutase relativement pure, compte tenu du fait que cette enzyme présente également la particularité d'être stable à la chaleur, ce qui n'est généralement pas le cas des protéines et autres enzymes qui précipitent en grande majorité. La solution de superoxyde dismutase ainsi obtenue peut être lyophilisée et utilisée telle quelle mais, il est particulièrement avantageux de lui faire subir une purification ultérieuré, notamment par chromatographie sur colonne, de façon à obtenir une superoxyde dismutase d'origine végétale essentiellement pure. Selon une autre caractéristique de 1 invention, il est possible, en utilisant une colonne de DEAE cellulose, de retenir les protéines et autres enzymes sur la colonne et de sortir la superoxyde dismutase seule pour une force ionique déterminée. Il ne reste alors plus qu'à effectuer une opération de lyophilisation pour obtenir de la superoxyde dismutase d'origine végétale. Il est, cependant, à noter que la DEAE cellulose est un produit particulièrement onéreux qu'il convient donc de ménager au maximum : il est donc essentiel de traiter au niveau de la chromatographie sur colonne, une solution déjà très pure. A cet effet, et selon une autre caractéristique de l'invention, avant l'étape de séparation par chromatographie sur colonne, on purifie la solution de superoxyde dismutase relativement pure obtenue à l'issue de l'étape de chauffage, par traitement avec du sulfate d'ammonium, de façon à précipiter des cristaux de superoxyde dismutase que l'on reprend avec de l'eau distillée avant de soumettre la solution ainsi obtenue à une dialyse pour éliminer les traces de minéraux, notamment de sulfate d'ammonium, encore présentes. Par ailleurs, il est connu que le germe de blé contient environ 10 % de lipides, 30 % de protéines, 50 % d'amidon, le reste étant constitué par de l'humidité, des minéraux, et en particulier des traces de polyphénols présentes en quantité de l'ordre de 0,1 % ; or, ces polyphénols correspondent à un point "sensible" du procédé conforme à l'invention il est en effet essentiel de s' assurer qu'ils ne puissent pas être entraînés avec la superoxyde dismutase lors de la seconde extraction par la solution hydro-alcoolique à 10 %, compte tenu du fait qu'ils pourraient alors s'oxyder et noircir le produit finalement obtenu. Or, lors de la première extraction à l'alcool pur, une partie des polyphénols est entraînée, mais autre partie reste dans le gâteau de filtration.C'est cette autre partie qu'il faut fixer pour qu'elle ne soit pas entraînée lors de la seconde extraction. A cet effet, et selon une autre caractéristique de l'invention, après la première extraction à l'alcool pur, on ajoute au gâteau de filtration, un agent de fixation des polyphénols, notamment des polyamides ou de la polyvinyle polypyrrolidone. On peut, à titre d'exemple, utiliser le produit commercialisé sous la marque "POLYCLAR" par la société GAF. L'invention se rapporte également à une superoxyde dismutase d'origine végétale obtenue conformément à la mise en oeuvre de ce procédé. I1 est essentiel que selon ce procédé, on utilise que des produits notamment des solvants non toxiques : la superoxyde dismutase d'origine végétale ainsi obtenue pourrait avantageusement remplacer la superoxyde dismutase d'origine bovine dont l'usage vient d'être interdit par la Pharmacie Centrale des Hôpitaux de Paris. Parallèlement à cette obtention de la superoxyde dismutase, il est également souhaitable de purifier le gâteau de filtration délipidé obtenu à l'issue de la première étape d'extraction à l'alcool de façon à pouvoir obtenir un composé enzymatique d'origine végétale riche en catalase et/ou peroxydase notamment susceptible d'être couplé à la superoxyde dismutase pour détruire l'eau oxygénée au fur et à mesure de sa formation. L'invention se rapporte, par suite également, à un procédé pour l'obtention d'un composé enzymatique d'origine végétale riche en peroxydase, ainsi qu'à un procédé d'obtention d'un composé enzymatique d'origine végétale riche en catalase. Conformément à l'invention, pour obtenir la peroxydase, on traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec une solution 100 millimolaire de tampon acétate de sodium de pH 4,5 de façon à extraire essentiellement spécifiquement la peroxydase, on traite la solution ainsi obtenue avec du sulfate d'ammonium, de façon à précipiter la peroxydase que l'on reprend avec de l'eau distillée avant d'effectuer, le cas échéant, une étape de chromatographie sur colonne de façon à obtenir un produit très pur et de lyophiliser le composé obtenu par séchage sous vide. Il est à noter que le gâteau traité au niveau de l'extraction à l'acétate de sodium peut, le cas échéant, correspondre au gâteau de filtration délipidé et largement exempt de superoxyde dismutase obtenu à l'issue de la seconde étape d'extraction par une solution hydro-alcoolique lors du processus de préparation de la superoxyde dismutase d'origine végétale. Il peut, bien entendu, tout aussi bien s'agir là d'un gâteau simplement délipidé n'ayant pas subi une étape d'extraction préalable de la superoxyde dismutase. Conformément à l'invention, on a pu obtenir des résultats particulièrement satisfaisants en traitant 10 g égerme de blé avec 100 millilitres de tampon acétate de sodium et ce, pendant une durée d'environ 30 minutes. L'invention se rapporte bien entendu également à une peroxydase d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé susmentionné. Conformément à l'invention, le procédé d'obtention de la catalase est largement similaire au procédé d'obtention de la peroxydase et ne s'en distingue que par le remplacement de l'étape d'extraction à l'acétate de sodium par un traitement avec une solution 100 millimolaire de tampon dihydrogéno-phosphate de sodium de pH 7,5 ; on s'est, en effet, rendu compte qu'une telle extraction permet d'extraire essentiellement spécifiquement la catalase. Pour cette extraction, on peut, bien entendu, partir de germe de blé simplement délipidé ou du gâteau de filtration obtenu à l'issue de la seconde étape d'extraction par une solution hydro-alcoolique du procédé d'obtention de la superoxyde dismutase d'origine végétale, ou encore du gâteau de filtration récupéré lors de l'étape d'extraction à l'acétate de sodium du procédé d'obtention de la peroxydase d'origine végétale. L'invention se rapporte, bien entendu, également à une catalase d'origine végétale obtenue suite à la mise en oeuvre du procédé susmentionné. Comme il a déjà été indiqué ci-dessus, l'un des principaux avantages de l'invention est lié au fait qu'elle permet d'obtenir une composition enzymatique antiradicalaire, notamment une composition pharmaceutique ou cosmétique, exclusivement d'origine végétale, contenant de la superoxyde dismutase couplée à une autre enzyme dont le rôle est de bloquer la formation d'eau oxygénée. Selon l'invention, cette seconde enzyme peut être la catalase, dont l'usage peut, à titre d'exemple, être envisagé pour des applications pharmaceutiques. Il est toutefois à noter que l'utilisation de la catalase est interdite dans le domaine de la cosmétique ; pour de telles applications, la seconde enzyme peut avantageusement être la peroxydase ; dans ce cas, et comme il a déjà été indiqué, il est nécessaire d'ajouter à la composition un substrat réducteur spécifique de la peroxydase qui peut, à titre d'exemple, être choisi dans la liste susmentionnée. REVENDICATIONS 1") Procédé d'obtention d'une composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale, caractérisé en ce que l'on traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide, notamment du méthanol ou de méthanol de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec de l'eau contenant environ 2 % de chlorure de sodium de façon à extraire les protéines et les enzymes puis on ajoute à l'extrait un alcool liquide, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à précipiter les protéines et les enzymes et on sèche le précipité sous vide pour obtenir une composition lyophilisée. 2") Composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1. 3 ) Procédé d'obtention d'une composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale riche en superoxyde dismutase, caractérisé en ce que l'on traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec un alcool à 10 % de façon à extraire essentiellement spécifiquement la superoxyde dismutase alors que les protéines et autres enzymes restent en grande majorité dans le gâteau de filtration, puis, on chauffe à environ 40 à 50"C la solution hydroalcoolique riche en superoxyde dismutase ainsi obtenue pendant environ 1 à 2 heures pour précipiter la grande majorité des protéines et autres enzymes encore présents et obtenir une solution de superoxyde dismutase relativement pure, on traite, le cas échéant, cette solution par chromatographie sur colonne de façon à séparer la superoxyde dismutase, et on lyophilise la composition obtenue par séchage sous vide. 4 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on fait passer la solution de superoxyde dismutase relativement pure sur une colonne de DEAE cellulose. 5 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que, avant l'étape de séparation par chromatographie sur colonne, on purifie la solution de superoxyde dismutase relativement pure par traitement avec du sulfate d'ammonium, de façon à précipiter des cristaux de superoxyde dismutase que l'on reprend avec de l'eau distillée avant de soumettre la solution ainsi obtenue à une dialyse pour éliminer les traces de minéraux encore présentes. 6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, après la première extraction à l'alcool, on ajoute au gâteau de filtration, un agent de fixation des polyphénols, notamment des polyamides ou de la polyvinyle polypyrrolidone de façon à empêcher que les polyphénols soient partiellement entraînés avec la superoxyde dismutase lors de la seconde extraction par une solution hydro-alcoolique. 7") Superoxyde dismutase d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6. 8 ) Procédé d'obtention d'un composé enzymatique d'origine végétale riche en peroxydase, caractérisé en ce que l'on traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec une solution 100 millimolaire de tampon acétate de sodium de pH 4,5 de façon à extraire essentiellement spécifiquement la peroxydase, on traite la solution ainsi obtenue avec du sulfate d'ammonium, de façon à précipiter la peroxydase que l'on reprend avec de l'eau distillée avant d'effectuer, le cas échéant, une étape de chromatographie sur colonne de façon à obtenir un produit très pur et de lyophiliser le composé obtenu par séchage sous vide. 9 ) Peroxydase d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8. 100) Procédé d'obtention d'un composé enzymatique d'origine végétale, riche en catalase, caractérisé en ce que l'on traite des céréales telles que du germe de blé à l'aide d'un alcool liquide, notamment du méthanol ou de l'éthanol, de façon à extraire tous les lipides alors que les protéines et les enzymes restent dans le gâteau de filtration, on récupère ce gâteau et on le traite avec une solution 100 millimolaire de tampon di-hydrogéno-phosphate de sodium de pH 7,5 de façon à extraire essentiellement spécifiquement la catalase1 on traite la solution ainsi obtenue avec du sulfate d'ammonium, de façon à précipiter la catalase que l'on reprend avec de l'eau distillée avant d'effectuer, le cas échéant, une étape de chromatographie sur colonne de façon à obtenir un produit très pur et de lyophiliser le composé obtenu par séchage sous vide. 11") Catalase d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10. 12 ) Composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle comporte un mélange de superoxyde dismutase d'origine végétale selon la revendication 7 et de catalase d'origine végétale selon la revendication 11. 13 ) Composition enzymatique antiradicalaire d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle comporte un mélange de superoxyde dismutase d'origine végétale selon la revendication 7, de peroxydase d'origine végétale selon la revendication 9 et d'un substrat réducteur-spécifique de la peroxydase.