Brevet FR2686884A1 — publié le 19930806

La présente invention est relative à des fragments de la jacaline et à leur utilisation comme médicament notamment dans le traitement des maladies liées aux virus HIV. Elle a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant ces fragments La jacaline est une protéine composante majoritaire des graines du jaque ( Artocarpus heterophyllus). Cette protéine présente une structure quaternaire combinant des chaînes a ayant un poids moléculaire apparent d'environ 11-12 kD et des chaînes p composées de 20 à 21 acides aminés . ( Young et al, Arch. Biochem.Biophys, 270; 596-603, 1989). Le séquençage de ces deux chaînes a été effectuée et leurs séquences ont été publiées ( Young et al. 1989 précédemment cité; Young et al., FEBS Lett., 282, 382-384, 1991). La jacaline a été testée dans un but de diagnostic sur des cellules de patients atteints à différents stades par le virus HIV ( Pineau et al. Aids, 1989, 3 : 659-663). I1 a été montré in vitro que la jacaline active de manière spécifique des cellules lymphocytaires CD4+. Les réponses à ces activations sont très différentes en fonction du stade de la maladie des patients étudiés , ce qui laisse supposer selon les auteurs la possibilité de corréler dans un but de diagnostic l'activation des CD4+ avec l'évolution ultérieure du SIDA. Cette étude a été suivie par un article de PINEAU et ai. ( Clin. Exp. Immunol., 1990, 80: 420-425) qui précise l'activation in vitro de différents types cellulaires des cellules du sang par la jacaline. Ces publications , si elles indiquent une utilisation potentielle de la jacaline dans un but de diagnostic , ne mentionnent en aucune façon la possibilité d'utiliser la jacaline dans un but thérapeutique. La demande de brevet FR 91 07 041 déposée le 10 Juin 1991 est relative quant à elle à l'utilisation de la jacaline, de ses fragments ou de ses dérivés dans le traitement des maladies liées aux virus HIV. I1 est indiqué dans cette demande que la jacaline inhibe de manière spécifique l'infection des lymphocytes par le virus HIV1 . Néanmoins , il n'est fait mention d'aucun fragment peptidique particulier de la jacaline pouvant être utilisé dans le traitement des maladies liées aux virus HIV L'utilisation thérapeutique de protéines de la taille de la jacaline peut présenter des inconvénients . En effet, l'organisme humain peut ne pas accepter parfaitement de telles molécules, ou il peut les dégrader, entraînant de ce fait une diminution importante d'activité. Ainsi , le demandeur s'est attaché à trouver des fragments de la jacaline possédant des activités à l'encontre des maladies liées aux virus HIV et ne présentant pas d'inconvénients en thérapeutique humaine Le demandeur a montré de manière surprenante que des fragments peptidiques de la jacaline inhibent de manière spécifique l'infection des lymphocytes par les virus HIV. La présente invention a donc pour premier objet un peptide présentant une activité biologique équivalente à celle de la jacaline. Ce peptide comprend préférentiellement un fragment de la région de la jacaline interagissant avec le récepteur CD4. De manière avantageuse , ledit peptide comprend la séquence (I) suivante V V V R S L T F K T N K K T (I) La présente invention a également pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (II) suivante X V V V R S L T F K T N K K T (Il) dans laquelle X représente un acide aminé hydrophile non chargé , en particulier l'aspargine , la glutamine , la thréonine , la sérine ou un de leurs dérivés Un tel peptide portant des acides aminés hydrophiles non chargés à son extrémité NH2 présente l'avantage notable d'avoir une meilleure solubilité dans des milieux aqueux Les peptides objets de la présente invention possèdent de plus la propriété de ne pas agglutiner les cellules , à la différence de la jacaline. La présente invention inclue aussi dans son objet, les peptides correspondant aux formules précédemment mentionnées et dans lesquelles un faible pourcentage, d'au maximum environ 15% , d'acides aminés non essentiels à l'activité biologique du peptide a été substitué. Elle inclue aussi les dérivés et fragments des peptides précédemment décrits. La présente invention a pour autre objet l'utilisation d'un ou plusieurs peptides précédemment décrits ou d'un ou plusieurs de leurs fragments ou d'un ou plusieurs de leurs dérivés pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies liées aux virus HIV On peut aussi utiliser à cette fin les sous-unités de la jacaline ou leurs dérivés ou leurs fragments biologiquement actifs. Ces sous-unités ont été décrites par Young et al. (1991 et 1989, précédemment cités). La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un ou plusieurs des peptides précédemment décrits , ou d'un ou plusieurs de leurs fragments ou d'un ou plusieurs de leurs dérivés en association avec un ou plusieurs adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables . Une telle composition peut aussi comprendre ou être constituée des sousunités de la jacaline, de leurs fragments ou de leurs dérivés biologiquement actifs. Elle est notamment destinée au traitement des maladies liées aux virus HIV La présente invention est en outre relative à un médicament contenant un ou plusieurs des peptides précédemment décrits ou un ou plusieurs de leurs dérivés ou fragments,et/ ou des sous-unités a ou ss de la jacaline, leurs fragments ou leurs dérivés biologiquement actifs. Les peptides objets de la présente invention peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier, et préférentiellement par synthèse chimique à partir d'acides aminés . Néanmoins , de tels peptides peuvent aussi être obtenus par des méthodes de synthèse utilisant des cellules eucaryotes ou des fractions de ces cellules L'homme du métier trouvera avantageusement la description de telles méthodes dans Molecular Cloning, a Laboratory manual ( Sambrok et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) Le traitement thérapeutique des patients atteints de maladies liées aux virus HIV est effectué par administration d'un ou plusieurs des peptides précédemment décrits, en particulier par administration orale , parentérale ou intraveineuse La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent dans lesquels La figure 1 représente l'influence sur l'activité transcriptase inverse ( en ordonnées ) exprimée en cpm/ml de différentes substances dont des peptides selon l'invention, en fonction du nombre de jours après l'infection de cellules ( en abscisses ). La figure 2 est un diagrame illustrant l'effet du peptide de séquence II selon l'invention sur la réponse de cellules mononucléaires du sang à un agent mitogène (OKT3) mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée ( en ordonnée). La figure 3A est une photographie d'un gel SDS-PAGE de la jacaline (a) et des sous unités purifiées ( b et c). La figure 3B est un diagrame illustrant l'effet des sous-unités de la jacaline sur l'infection de cellules par le virus HIV1 ( activité transcriptase inverse en ordonnée). La figure 3C est un gel illustrant le résultat de l'amplification PCR d'ADN de cellules infectées par le virus HIV1 et traitées en particulier par les sous-unités de la jacaline. EXEMPLE 1 Effet du peptide de séquence (II! ( X = Asn) sur l'infection de cellules CEM Par le virus HIV. 5 105 cellules CEM ( lignée cellulaire T leucémique) sont incubées 30 min. à 4 C avec différentes molécules dans un volume de 100 p1 dans une plaque de 96 micropuits , puis mises en contact 30 min à 4 C avec 100 p1 d'une solution diluée au 1/1000 d'une suspension de VIHI-BRU correspondant à 100 TCID50. Les cellules sont ensuite lavées cinq fois avec 200 pl de milieu de culture puis recultivées à la concentration de 5 5.105 cellules par ml en plaque de 24 puits dans un volume de I ml en présence des différentes substances testées La production virale est évaluée deux fois par semaine par mesure de l'activité transcriptase inverse dans le surnageant de culture Les différentes substances testées sont - un anticorps anti-CD4 , 1'OKT4A ( 2 pg/ml) - un fragment de la cholecystokinine (CCK) (séquence 26 à 33 : DYMGWMDF-NH2) , à une concentration de 500 pg/ml, - le peptide de séquence II dans laquelle X est l'asparagine, à une concentration de 10 pg/ml , 100 Hg et 500 pg/ml. La figure I montre que le peptide II inhibe de façon dose dépendante l'infection induite par HIV-1 . A 100 pg/ml l'infection est retardée alors qu'à 500 Hg/ml l'infection est totalement inhibée. Le peptide de référence ( fragment CCK) est totalement inactif. OKT4A utilisé comme contrôle positif montre une inhibition totale à 2 pg/ml. EXEMPLE 2: Effet du peptide de séquence II ( X = Asn) sur la réponse mitosène de cellules du sang induites par 1'OKT3. Des cellules mononucléaires du sang périphérique ont été isolées et cultivées comme décrit par FAVERO et al.( Cell. Immunol. , 122, 307-318 , 1989), en présence ou en absence d'OKT3 ( Orthodiagnostic System ) à une concentration de 60 pg/ml, en l'absence (A) ou en présence de 100 pg/ml ( B) ou 500mg/ml du peptide de séquence II selon l'invention. Après 72 heures de culture , la réponse mitogène est évaluée par l'incorporation de thymidine tritiée. Le diagrame de la figure 2 illustre les résultats de ces expériences. Ces résultats montrent que le peptide de séquence II selon l'invention, n'affecte pas la réponse des cellules mononucléaires du sang périphérique vis-à-vis des mitogenes. EXEMPLE 3: Effet des sous-unités de la iacaline sur l'infection par le virus HIV. Les deux types de sous-unités ont été isolés par des gels préparatifs SDS-page selon AUCOUTURIER et al. (Molec. Immunol. 24 , 503-511 , 1987 ) suivie par une électroélution. Le SDS est éliminé par chromatographie sur une colonne de gel Extracti D ( Pierce) équilibré avec 0,05 M de tampon Tris (pH 9). Les fractions contenant les sous-unités sont concentrées par lyophilisation et conservées à -80'C. La figure 3A représente le gel SDS - PAGE. Les pistes a, b et c, correspondent respectivement à la jacaline native , à la sous-unité de haut poids moléculaire purifié et à la sous-unité de faible poids moléculaire purifiée L'effet des sous-unités de la jacaline a été testé sur l'infection par le virus HIV de cellules CEM. Ces cellules sont incubées avec l'OKT4 (2 pg/ml) , la jacaline ou ses sousunités ( 10 ug/ml) puis infectées , lavées abondamment et cultivées sans autre additif. L'activité transcriptase inverse est mesurée dans le surnageant après six jours. Le diagrame de la figure 3 B , illustre les résultats obtenus . Cette figure montre que les deux sousunités ont des actions inhibitrices vis-à-vis de l'infection par le virus HIV, comparables à celle de la jacaline. L'analyse PCR de 1'ADN du HIV1 dans les cellules infectées en présence de sous-unités de la jacaline a été effectuée La production de DNA HIVI a été évaluée de la manière suivante . Les cellules sont lavées 4 fois dans 5 ml de tampon PBS . Après centrifugation , les culots sont suspendus dans 50 p1 d'eau et chauffés à 93 C en présence de 0,005 % de Tween 20 , 0,05 % de NP40, 0,001 % de gélatine , 20 Hg de chacune des amorces Vpr( TGAAACTTATGGGGATACTT-GGG-3',et CTAGGATCTACTGGCTCCATTTC-5'), et deux unités de polymérase Taq. Le mélange est soumis à une première dénaturation durant 5 minutes à 92 C puis à une hybridation par les amorces durant 3 minutes à 55 C et à une polymérisation durant 3 minutes à 72 C. 30 cycles additionnels ont été réalisés dans les conditions suivantes dénaturation durant 7 secondes à 92 C, hybridation durant 30 secondes à 55 C, polymérisation durant 3 minutes à 72 C (15 minutes pour le dernier cycle ). Le produit amplifié ( 160 paires de bases ) est analysé par électrophorèse sur un gel à 1% d'agarose , fixé durant deux heures sur une feuille de nylon selon Cuny et al.(Anal. Biochem., 193, 45-48, 1991) et hybridé avec une sonde HIV1 env marquée au 32 P Les produits d'hybridation ont été visualisés par autoradiographie La figure 3C représente le cliché final obtenu. La piste 3 correspond aux cellules CEM non traitées la piste 4 correspond aux cellules traitées avec des concentrations saturantes en anticorps anti-CD4(OKT4 A) , les pistes 5, 6 et 7 correspondent à des cellules infectées par le virus HIV1 et traitées par respectivement de la jacaline (piste 5), la sous-unité de haut poids moléculaire ( piste 6 ou la sous-unité de bas poids moléculaire ( piste 7 ) à des concentrations de 10 pg/ml Des cellules non infectées ( piste 1 )et des cellules infectées de manière chronique par le virus HIV1 BRU ( piste 2) ont été utilisées comme témoins REVENDICATIONS 1. Peptide présentant une activité biologique équivalente à celle de la jacaline , caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (I) suivante V V V R S L T F K T N K K T (I) ou la séquence (II) suivante X V V V R S L T F K T N K K T (II) dans laquelle X représente un acide aminé hydrophile non chargé 2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de la région de la jacaline interagissant avec le récepteur CD4. 3. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit acide aminé hydrophile est l'asparagine, la glutamine, la thréonine, la sérine ou un de leurs dérivés. 4. Dérivé ou fragment des peptides selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou d'une des sous-unités a ou ss de la jacaline pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies liées aux virus HIV. 6. Médicament contenant un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou une des sous-unités a ou ss de la jacaline. 7. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou d'une des sous-unités a ou ss de la jacaline, en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement des maladies liées aux virus HIV.