Brevet FR2697163A1 — publié le 19940429

PROCEDE DE FABRICATION DE LA TOXINE BOTULIQUE DE TYPE A, CRISTALLINE, EN TANT QUE MEDICAMENT. La présente invention concerne un procédé de fabrication de la toxine botulique de type A, cristalline, en tant que médicament et, plus particulièrement, elle porte sur un procédé de fabrication de la toxine botulique de type A, cristalline, à partir d'une substance naturelle, telle que, par exemple, le Chitoxan (marque de fabrique de produits fabriqués par Dainippon Seiyaku Co) par utilisation d'un agent d'élimination des acides nucléiques. La toxine botulique, en tant qu'exemple typique de neurotoxine provenant de bactéries, est une protéotoxine produite par Clostridium botulinum La toxine botulique est classée en huit sérotypes A, B, Cl, C 2, D, E, F, G en fonction de l'antigénicité Parmi eux, la toxine de type A a été la première à être purifiée et cristallisée (Lamnna, C.O E Mc Elroy et H W Eklund: Science, 103:613-614, 1946). Jusqu'à présent, le procédé de fabrication de la toxine botulique de type A, cristalline, nécessitait des modes opératoires compliqués conduits dans l'ordre suivant: précipitation par un acide ( 1), lavage à l'eau, extraction par le chlorure de calcium et précipitation par un acide ( 2), extraction par un tampon de phosphate, précipitation par l'éthanol et extraction et dépôt dans une solution de sulfate d'ammonium De plus, étant donné que l'opération de fabrication est compliquée, elle nécessite la compétence et le savoir-faire de personnes qualifiées et expérimentées, et elle ne donne qu'un faible taux de récupération de la toxine, et l'on ne peut pas espérer obtenir la quantité requise et l'effet requis de celle-ci De plus, bien qu'un procédé comprenant la combinaison, par exemple, d'un traitement par une protamine, d'une chromatographie d'échange d'ions et d'une filtration sur gel, ait également été adopté, le rendement de cristallisation n'est pas intéressant. L'un des problèmes posés par la cristallisation de la toxine botulique de type A est comment obtenir une toxine en tant que macromolécule facilement cristallisable dans toute la mesure du possible et l'autre problème est comment permettre l'élimination de substances inhibant la cristallisation, comprenant principalement les acides nucléiques contenus dans une solution de culture, sans dénaturer la toxine Le premier problème peut être résolu par le choix d'une souche productrice de la toxine botulique de type A ayant une masse moléculaire de 500 000 à 900 000, et la solution au second problème dépend de la manière dont les acides nucléiques peuvent être éliminés dans des conditions douces. La présente invention a été accomplie pour pallier les inconvénients précités de la technique antérieure, et son but est de proposer un procédé de fabrication de la toxine botulique de type A, cristalline, capable d'améliorer la stabilité et l'efficacité de celle-ci en tant que médicament notamment pour le traitement du strabisme et du blépharospasme, par l'obtention d'une toxine pure. La présente invention a été réalisée sur la base d'un perfectionnement à la technique antérieure telle que décrite ci-dessus, et c'est un objectif de celle-ci que d'améliorer la stabilité et l'efficacité de ladite toxine en tant que médicament notamment pour le traitement du strabisme et du blépharospasme. Pour atteindre l'objectif précité, conformément à la présente invention, la toxine botulique de type A est cristallisée sans perte de toxicité à l'aide d'un agent d'élimination des acides nucléiques comprenant une substance naturelle, telle que le Chitoxan. Tout d'abord, parmi des souches productrices de la toxine botulique de type A, des souches productrices de la toxine L d'une masse moléculaire de 500 000 et de la toxine LL d'une masse moléculaire de 900 000 avec un titre d'hémagglutination élevé et présentant une toxicité élevée, sont choisies Les souches sont cultivées dans un milieu de culture approprié, par exemple, un milieu de culture NZ- amine, un acide est ajouté à un filtrat de culture pour provoquer une précipitation, et une solution tampon de phosphate dont on fait varier la concentration molaire est utilisée à la place du chlorure de calcium pour extraire l'ingrédient toxique de façon efficace du précipité. Ensuite, l'extrait liquide est soumis de façon répétée à un contrôle du p H, un repos pendant toute une nuit, une centrifugation, une dissolution dans une solution tampon d'acétate, une modification de p H et une centrifugation pour obtenir un surnageant limpide Un agent d'élimination des acides nucléiques est ajouté au liquide surnageant dans les conditions les plus efficaces. Jusqu'ici, le calcium et un alcool étaient utilisés de façon habituelle pour éliminer les acides nucléiques. Cependant, aucun résultat remarquable ne peut être obtenu même lorsque des conditions, telles que la concentration et le p H de l'agent d'élimination des acides nucléiques, sont modifiées De plus, la protamine est connue en tant qu'agent d'élimination des acides nucléiques, mais elle provoque la précipitation non seulement des acides nucléiques mais également de protéines nécessaires, bien qu'elle ait un excellent effet en tant qu'agent d'élimination De plus, elle entraîne un problème de différence d'homogénéité entre chacun des lots, ce qui est un défaut propre des produits naturels Ensuite, un mode opératoire d'élimination de la protamine en excès à partir du précipité résultant doit encore être ajouté Par ailleurs, le Chitoxan (marque de fabrique de produits fabriqués par Dainippon Seiyaku Co) est une substance naturelle de masse moléculaire élevée, qui est une substance naturelle obtenue par désacétylation de la chitine (poly-N-acyl-p-D-glucosamine) contenue dans des carapaces externes par exemple de crabes et de crevettes, et les produits C-7 et C-9, obtenus par réduction de sa masse moléculaire, peuvent de façon efficace éliminer les acides nucléiques sans perte de la toxine Lorsqu'un relargage par le sulfate d'ammonium est conduit après élimination des acides nucléiques par le Chitoxan, le Chitoxan en excès ne précipite pas et, après dissolution de la toxine relarguée dans une solution tampon de phosphate, on a ajouté progressivement du sulfate d'ammonium et on a laissé reposer pour faire cristalliser facilement la toxine. Dans le procédé de fabrication utilisant la méthode de Duff, le rendement en toxine botulique de type A, cristalline, était aussi faible que 1,4-3,1 %, en supposant la solution de culture comme représentant 100 % Bien qu'il ait pu être augmenté jusqu'à environ 5 % par l'amélioration du procédé d'extraction, l'activité toxique a pu être conservée jusqu'à 10 % par le procédé d'élimination des acides nucléiques conforme à la présente invention à l'aide du Chitoxan. Compte tenu de ce qui vient d'être exposé, conformément à la présente invention, les acides nucléiques peuvent être éliminés de façon efficace lors de la fabrication de la toxine botulique de type A, cristalline, le taux de conservation de l'activité toxique peut être amélioré et, comme résultat, un effet remarquable peut être atteint en tant que médicament notamment pour le traitement du strabisme et du blépharospasme. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de l'exemple suivant. Exemple (Culture) Clostridium botulinum, souche Hall, milieu de culture NZ-amine, culture immobile à 350 C pendant 4 jours. (Précipitation par un acide-1) Addition d'acide sulfurique: p H ajusté à 3,5 avec H 2504 3 N, mise au repos pendant toute une nuit ( 40 C) Elimination du surnageant (siphon) Centrifugation Précipité: Dissous dans de l'eau distillée, p H ajusté à 5,0 avec Na Cl 0,1 N Centrifugation (Extraction) Précipité: Additionné d'une solution tampon de phosphate 0,2 M (p H 6,0) Centrifugation Surnageant Précipité: Additionné d'une solution tampon de tris-H Cl 0,1 M à laquelle est associé Na Cl 0,5 M (p H 7,5) Centrifugation (Précipitation par un acide-2) Addition d'H Cl: p H ajusté à 3,7 avec H Cl 2 N, mise au repos pendant toute une nuit ( 4 C) Elimination du surnageant (siphon) Centrifugation Précipité: Dissous dans une solution d'acétate 0,05 M (p H 5,0) Centrifugation tampon (Traitement par C-9) Surnageant: Solution de C-9 à 5 % ajoutée jusqu'à 0,1 % en une minute, avec agitation pendant 10 minutes dans un récipient contenant de la glace Centrifugation Surnageant Addition de sulfate d'ammonium: Sulfate d'ammonium solide ajouté pour obtenir une solution saturée à 50 %. Mise au repos pendant toute une nuit à C. Centrifugation Précipité Précipité dissous dans une solution tampon de phosphate 0,03 M à p H 6,8 Dialyse Dialysé avec une solution tampon de phosphate 0,03 M à p H 6,8 (Cristallisation) Addition de sulfate d'ammonium: Sulfate d'ammonium ajouté jusqu'à ce que la solution manifeste une couleur nacrée, à condition que la concentration finale ne dépasse pas une concentration de 0,9 M. Sédimentation de cristaux: Laissé à 40 C (Préparation de la solution de C-9 à 5 %) De l'eau distillée a été ajoutée au produit C-9 (Kurimover, fabriqué par Dainippon Seiyaku, Lot No K 143) dans un rapport 10 à 1 Ensuite, H Cl i N a été ajouté dans un rapport de 2, et on a agité à l'aide d'un agitateur pendant 2 heures Le p H a été ajusté à 4-6 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N La solution a été diluée par de l'eau distillée jusqu'à former une solution à 5 %. Il est manifeste que, dans cette invention, une large gamme de différents modes opératoires peut être établie sur la base de l'invention, sans que l'on s'écarte de l'esprit et du domaine de définition de celle-ci La présente invention n'est pas non plus limitée par ses modes opératoires spécifiques. REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication d'une toxine botulique de type A, cristalline, en tant que médicament caractérisé par le fait que la toxine botulique de type A est cristallisée sans perte de toxicité à l'aide d'un agent d'élimination des acides nucléiques. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent d'élimination des acides nucléiques comprend une substance naturelle obtenue par désacétylation de la chitine. 3 Procédé de fabrication d'une toxine botulique de type A, cristalline, en tant que médicament, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes de: culture d'une souche de bactéries productrice de la toxine botulique de type A; précipitation d'un filtrat de cette culture par un acide; extraction du précipité par une solution tampon de phosphate; ajustement du p H de l'extrait liquide; mise au repos de la solution ajustée pendant toute une nuit; séparation par centrifugation de la solution ajustée dissolution du précipité séparé par une solution tampon d'acétate; modification de la valeur du p H de la solution obtenue; séparation par centrifugation de la solution modifiée; et addition dans le surnageant d'un agent d'élimination des acides nucléiques. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'agent d'élimination des acides nucléiques comprend une substance naturelle obtenue par désacétylation de la chitine.