Brevet FR2688515A1 — publié le 19930917

La présente invention concerne un plasmide utilisable pour la modification génétique des bactéries à coloration gram positive, en particulier des bactéries lactiques. Elle concerne également des bactéries contenant un tel plasmide. Elle concerne enfin des procédés de modifications génétiques mettant en oeuvre un tel plasmide, soit pour inactiver un gène normalement présent dans le chromosome bactérien, soit pour introduire et exprimer un gène dtintérêt. La biotechnologie cherche à faciliter l'usage industriel de microorganismes ; les bactéries lactiques sont utilisées en agroalimentaire majoritairement pour la fabrication des produits laitiers fermentés mais aussi en dehors de la filière lait pour la fabrication de vin, cidre, charcuterie et ensilage. L'addition, la perte ou la modification de gènes peuvent transformer le rôle d'un organisme dans un processus industriel tel que la fermentation. Il est donc particulièrement souhaitable de disposer de moyens efficaces d'introduire ou de modifier spécifiquement et définitivement certains gènes dans ces organismes. Actuellement, la modification du chromosome chez les bactéries lactiques est effectuée par l'intermédiaire d'un système par transformation d'un plasmide non réplicatif. Dans une seule étape, il est nécessaire d'avoir deux évènements de basse fréquence, la transformation par un plasmide, et une recombinaison dans le chromosome. La probabilité d'obtenir ces deux évènements dans une seule étape est le produit des probabilités de chacun ; donc une chance très faible d'obtenir la modification. Le plasmide pWVO1 est un plasmide cryptique initialement isolé chez Lactococcus lactis subsp. cremoris ; il s'agit d'un plasmide à large spécificité d'hôte, réplicatif à la fois dans des bactéries gram positif et gram négatif, notament chez E. coli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Streptococcus et Lactobacillus. Il a été caractérisé et sa séquence nucléotidique a été publiée par Leenhouts et al (1991). Dans la demande WO 85/03495, de larges fragments de ce plasmide sont utilisés pour construire un plasmide recombinant pGK12, marqué par le gène de résistance à l'érythromycine, et/ou le gène de résistance au chloramphénicol (la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT)). Ce plasmide pGK12 n'est pas utilisable pour faire des intégrations dans le chromosome bactérien. Les plasmides non réplicatifs utilisés jusqu'à présent permettent de pallier ce problème, mais ce système requiert des taux de transformation élevés pour permettre la détection d'évènements de basse fréquence tels que la transposition ou la recombinaison dans le chromosome or la plupart des bactéries lactiques sont faiblement transformables. L'ensemble de ces difficultés pourrait être surmonté grâce à l'obtention d'un réplicon thermosensible, utilisable comme vecteur de livraison dans les bactéries, lactiques ou autres. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un plasmide vecteur bactérien du type comportant une origine de réplication efficace dans les bactéries gram+, en particulier les bactéries lactiques, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - un gène marqueur qui s'exprime dans une souche hôte bactérienne, - un système de réplication efficace qui est thermosensible (Ts) à partir d'une température compatible avec la viabilité de la souche hôte. Le plasmide selon l'invention porte au moins un gène codant pour un marqueur de sélection, ainsi que les éléments nécessaires à son expression tels que promoteur, site de fixation des ribosomes, terminateur, etc. Des gènes de sélection sont par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques (Erythromycine, chloramphénicol), ou permettant la croissance sur un milieu dépourvu de certains éléments, etc. Le gène marqueur est intégré dans le chromosome en cas de recombinaison. Par système de réplication, on entend un système comprenant une origine de réplication ainsi que la protéine induisant son fonction ment; ladite protéine est inactivée au-dessus d'une température inhibant le système de réplication. Un tel plasmide se réplique normalement à 28 C, chez un grand nombre de bactéries. A une température supérieure à environ 35 C, la réplication de ce plasmide est inhibée ; cette température inhibitrice de la réplication du plasmide est relativement basse et permet la multiplication et la croissance normale de la plupart des bactéries, en particulier des bactéries lactiques. La température recommandée pour l'inactivation efficace de ce plasmide est de 37 C. Selon l'un de ses aspects, la présente invention a pour objet un plasmide vecteur, caractérisé en ce qu'il contient le plus grand fragment Cla 1 du plasmide pWV0l, présentant au moins une mutation dans la région Thal-Rsal. Plus particulièrement, un plasmide vecteur à réplication thermosensible selon l'invention présente au moins une mutation dans la région correspondant à RepA du plasmide pWVO1. La protéine RepA est codée par l'un des 4 cadres ouverts de lecture (ORF) identifiés sur pWV0l, l'ORF A, et est nécessaire pour la réplication. Des mutations préférées de ce plasmide se trouvent dans les positions 972, 977, 980 et 987 de la séquence nucléotidique de pWVO1. La protéine RepA codée par le plasmide selon l'invention présente, par rapport au type sauvage, les modifications représentées à la figure 3, à savoir le remplacement de - Ser par Asn, - Asp par Asn, - Val par Ile, - Arg par Gln. Un tel plasmide constitue un vecteur suicide à large spécificité d'hôte, dtun type unique jusqu'à nos jours dans le domaine des bactéries lactiques. En effet, il permet de dissocier en deux étapes, l'intégration dans le chromosome. Dans la première étape de transformation, le plasmide est établi dans la cellule. Dans la deuxième étape, l'évènement d'intégration dans le chromosome est sélectionné par élévation de la température. On peut ainsi modifier génétiquement des bactéries reputées peu transformables. Les outils génétiques ainsi développés permettent d'introduire et de stabiliser des gènes dans le chromosome bactérien. On choisit par exemple d'appliquer un procédé par recombinaison homologue. Pour cela, on utilise un réplicon thermosensible selon l'invention, qui comporte en outre au moins un fragment d'ADN homologue à 1'ADN chromosomique de la bactérie que l'on veut modifier. Selon l'un de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé d'inactivation d'un gène présent dans le chromosome d'une bactérie, caractérisé en ce que a) on introduit dans la bactérie, par transformation, le plasmide selon l'invention, b) on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d) on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multiplication, à température d'inhibition de la réplication plasmi dique. L'étape d) permet de sélectionner les bactéries portant le marqueur plasmidique. Le fragment chromosomique cloné dans le plasmide peut correspondre à un gène précis, qui est spécifiquement inactivé par intégration du plasmide au niveau de la copie chromosomique du gène. Dans la population bactérienne, seul ce site d'intégration sera trouvé. Dans un autre mode de réalisation, ltADN bactérien présent dans le plasmide pourra être choisi dans une banque de fragments chromosomiques pour le clonage, et il y aura intégration au hasard ; le site d'intégration du plasmide est différent d'une bactérie à l'autre et on réalise ainsi de la mutagénèse. Le procédé peut également s'appliquer à un réplicon thermosensible porteur d'un transposon. On dispose de différents transposons pour mutagéniser le chromosome. Le plasmide Ts est employé comme porteur d'un de ces transposons éventuellement modifié pour être actif chez L. lactis. Chaque transposon porte un gène marqueur (ex: gène de résistance). En appliquant le protocole précédemment décrit (a à c), on obtient, des cellules ayant intégrées le transposon dans leurs chromosomes. On sélectionne ces cellules au moyen du marqueur du transposon. Dans le cas de la transposition, le plasmide n'est pas intégré dans le chromosome. En variante, le plasmide vecteur selon l'invention comporte également un locus de mobilisation permettant la conjugaison. De préférence, ce locus de mobilisation est le locus ori T, extrait d'un plasmide de bactérie à gram positif, préférentiellement pouvant être extrait d'un plasmide de Streptococcus. Le plasmide vecteur portant ce locus peut être mobilisé et transféré par conjugaison chez des espèces bactériennes non transformables. Le procédé d'inactivation d'un gène dans une bactérie fait alors intervenir les étapes suivantes a) on introduit dans la bactérie, par conjugaison, un plasmide selon l'invention, portant un locus de mobilisation et un fragment homologue au chromosome et/ou un transposon, b) on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d) on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multiplication, à température d'inhibition de la réplication plasmi dique. Les bactéries obtenues à l'issue de l'étape d) ont subi un évènement de recombinaison ou de transposition et portent le marqueur du transposon ou du plasmide. En variante, le plasmide vecteur selon l'invention, comporte également un réplicon actif chez E. coli. Le plasmide vecteur portant ce locus, et ces dérivés, peut être propagé chez E. Coli. Les constructions préparées et propagées chez E. coli à 37 C (grâce au deuxième réplicon) peuvent être ensuite transférées dans les bactéries lactiques dans lesquelles seul le réplicon Ts sera actif. Dans les procédés décrits ci-dessus, après introduction du plasmide vecteur dans la bactérie par transformation ou conjugaison à l'étape a), on laisse le plasmide s'établir dans la population bactérienne, par réplication, à 28-30" C. Le caractère de sélection est exprimé dans l'ensemble des bactéries. Quand la température s'élève au-dessus de 35 C, le plasmide sous forme libre devient incapable de se répliquer et se trouve donc perdu lors des divisions cellulaires. Seules les bactéries pour lesquelles ce plasmide s'est intégré par recombinaison dans le chromosome ou pour lesquelles le transposon s'est intégré dans le chromosome, conservent et transmettent l'information génétique portée par le plasmide ou le transposon et leur permettant de pousser sur milieu sélectif. On sélectionne ainsi les évènements d'intégration, de basse fréquence, en récupérant les bactéries se multipliant à 35-37 C sur milieu sélectif. Le schéma suivi pour l'intégration du plasmide par recombinaison homologue est illustré à la figure 6. La souche L. lactis VE 6002, contenant le plasmide pVE6002 selon l'invention a été déposée à la collection nationale de l'institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, Paris, sous le numéro I-1179. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé permettant l'introduction d'un gène hétérologue dans une bactérie. Pour sa mise en oeuvre, on utilise un plasmide vecteur thermosensible tel qu'il a pu être défini précédemment, et comportant en outre un gène codant pour une protéine d'intérêt, sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression, et qui sont connus de l'homme du métier. Le cas échéant, ce gène pourra être porté par le transposon. On suit alors les étapes indiquées ci-après. a) on introduit dans la bactérie, par transformation ou conjugaison un plasmide selon l'invention, b) on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d) on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multiplication, à température d'inhibition de la réplication plasmi dique. L'étape d) permet de sélectionner les bactéries portant le marqueur du plasmide ou du transposon. L'invention a également pour objet des bactéries contenant un plasmide selon l'invention, sous forme libre ou intégrée dans le chromosome. De telles bactéries trouveront notamment des applications dans le domaine de l'industrie agroalimentaire, en particulier laitière, ou fromagère. Dans certains des cas décrits précédemment, on souhaite pouvoir éliminer tout ou partie du matériel génétique introduit dans le chromosome bactérien par le procédé selon l'invention. Le procédé de recombinaison homologue permet deux étapes la première consiste à sélectionner l'évènement d'intégration du plasmide, la seconde étape - qui est facultative - consiste à exciser du chromosome le réplicon et les marqueurs qui ne correspondent pas aux normes alimentaires. Excision du réplicon l'intégration par recombinaison homologue crée des duplications de chaque côté du plasmide Ts (Fig. 7a). I1 a été montré qu'un plasmide, réplicatif intégré dans le chromosome stimule fortement la recombinaison homologue entre les séquences avoisinantes. Lorsque le fragment chromosomique porté par le plasmide Ts contient un marqueur, les duplications créées par l'intégration permettent d'exciser le réplicon en laissant un gène chromosomique inactif (Fig. 7a). Expérimentalement, il s'agit de cultiver à 28 C la souche contenant le plasmide intégré (préalablement sélectionée à 37 C). A température permissive, la réplication reprend et stimule la recombinaison entre les séquences répétées aboutissant à la délétion du réplicon (Fig. 7a). La présente invention a également pour objet un plasmide vecteur à réplication thermosensible présentant une ou plusieurs des caractéristiques déjà exposées, et dans lequel une région interne est dupliquée. Les deux séquences identiques sont placées de manière à encadrer la région que l'on souhaite éliminer. Un tel plasmide est alors utilisé dans un procédé d'inactivation d'un gène ou d'introduction d'un gène hétérologue par recombinaison dans le chromosome bactérien, tels que décrits ci-dessus. A l'issue de l'étape d), les bactéries survivantes sont à nouveau mises en culture à une température inférieure à la température d'inhibition, par exemple à 28-30 C, sur milieu non sélectif. En effet, un plasmide réplicatif stimule fortement la recombinaison homologue entre les séquences avoisinantes. La souche contenant le plasmide intégré préalablement sélectionnée à 35-37 C est cultivée à température permissive : la réplication plasmidique reprend, stimulant la recombinaison entre les séquences répétées. Le réplicon et les marqueurs incompatibles avec, par exemple, une utilisation agroalimentaire de ce système sont excisés, avec rétention éventuelle du gène modifié. La sélection des bactéries ayant excisé les marqueurs indésirables se fait après étalement à température non-permissive. Ce mécanisme est illustré sur la figure 7b. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. On se réfèrera aux figures suivantes FIGURE 1 : cinétique de perte et analyse du nombre de copies de pVE6002 selon l'invention et de pVE6001 non Ts. L. lactis subsp. lactis IL 1403 portant le plasmide pGKl2, pVE6001 ou pVE6002 sont cultivés à 280 C ou 37,5 C. Après différents temps de culture, des échantillons sont prélevés pour être cultivés à 28 C sur des milieux sélectifs et non-sélectifs. 100 colonies sont repiquées à partir du milieu non-sélectif sur le milieu sélectif (Em 5 pg/ml) pour évaluer la proportion de cellules contenant un plasmide dans la population. Les extractions d'ADN total sont faites sur les cultures à 28 C ou 37,5 C, sans sélection, pendant 5h 30. FIGURE 2 : Plasmide hybride de pGK12 et pVE6002. pVE6043 est constitué du fragment Sacl-Thal, de 994 pb, de pGK12, lié au fragment Thal-Sacl de 3384 pb de pVE6002. pVE6044 contient la paire réciproque, le fragment Sacl-Thal de 994 pb de pVE6002, lié au fragment Thal-Sacl de 3384 pb de pGK12. Les traits fins correspondent à l'ADN de pGK12 ; les traits épais pointillés, à l'ADN de pVE6002. FIGURE 3 : Localisation de la mutation Ts dans le gène RepA de pVE6002. Le fragment Thal-Rsal de pVE6002, contenant le gène RepA a été séquencé sur les deux brins. La séquence montre quatre mutations aux positions 972, 977, 980, 987 alors que le reste de la séquence ne diffère pas de la séquence publiée pour le réplicon parental pWV0l. FIGURE 4 : Description des dérivés thermosensibles. pVE6006 est construit par insertion du fragment PvuII de 445 pb de pBluescript SK+ dans le site Clal de pVE6002. pVE6007 provient d'une délétion Sacl de pVE6006, condui sant à la perte du gène de résistance à l'érythromycine. pVE6004 est construit par insertion du fragment PvuII de 445 pb de pBluescript SK+ dans le fragment Clal-HpaII de pVE6002 dépourvu de gène de résistance au chloramphénicol. FIGURE 5 : Comparaison des protéines analogues à Rep de PE.194. FIGURE 6 : Schéma du procédé d'inactivation d'un gène. FIGURE 7a : Schéma d'un exemple d'excision du réplicon Ts en deux étapes. 7b : Schéma de l'excision du réplicon au moyen de duplications plasmidiques. MATERIELS ET METHODES Les travaux ont été réalisés au Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut de Biotechnologie, INRA, 78352 Jouy-en-Josas cedex France. Souches bactériennes, plasmides et les conditions de culture. Les plasmides et les souches bactériennes utilisées sont indiqués dans le tableau 1. Les constructions de pVE6043 et pVE6044 sont décrites dans la figure 2 ; les plasmides pVE6004, pEV6006 et pVE007 sont présentés à la figure 4. E. coli et Bacillus subtilis ont été cultivés en milieu LB. L. lactis subsp. lactis (L. lactis) est cultivé sur milieu M17, dans lequel on a remplacé le lactose par du glucose. On a utilisé respectivement du chloramphénicol (Cm) à 5 llg/ml pour L. lactis et B. subtilis et de l'érythromycine (Em) à 5 pg/ml et 0,5 pg/ml respectivement. Le Cm, l'azaerythromycine et l'érythromycine ont été utilisés à des concentrations finales respectives de 15 ug/ml, 100 ugîml et 150 pg/ml pour E. coli. Clonage moléculaire, compétence et procédure de transformation. Des enzymes du commerce ont été utilisées comme indiqué par les fournisseurs. Des mini-lysats de cellules entières et du DNA plasmidique ont été préparés ainsi qu'il est décrit dans la littérature. L'induction de compétence et la transformation d'E. coli et de B. subtilis ont été effectuées par des procédures standards (Hanahan, 1985, ou Niaudet et al, 1979). Les souches de L. lactis ont été électrotransformées comme décrit par Langella et Chopin, 1989a et modifié selon la procédure de Holo et Nes, 1989. TABLEAU 1 : LISTE DES SOUCHES ET DES PLASMIDES Souches ou plasmide Marqueurs génétiques ou description Origines ou référence L. lactis: IL 1403 Dépourvu de plasmide, R- M-, Chopin et al, 1984 2 prophages b128.5 et b1286 MG1363 Dépourvu de plasmide Gasson, M.J. 1983 B. subtilis : SB202 trpC2, tyrA1, aross2, hisH2, thyA Laboratoire INRA E. coli : DH5 F- endAl recAl hsdR17 (rk1 mk+) Hanahan, D. 1985 supE44 thil gyrA96 relAl TABLEAU 1 : SUITE PLASMIDES pBluescript Apr M13-ori pBR322-ori Stratagene pGK 12 Emr Cmr Kok et al, 1984 pVE6004 fragt de 445bp de pBluescript et Frgt de 3340 bp Clal-HpaII de pVE6002 Présente invention Emr pVE6006 frgt de 445bp de pBluescript inséré dans le site ClaI de pVE6002 Fig. 4 Emr Cmr pVE6007 délétion Scal de 1175bp de pVE6006 Présente invention Cmr pVE6043 frgt Ssti-Thal (ori +) de pGK12 " frgt Thal-Ssti (ORF A) de pVE6002 Emr Cmr pVE6044 frgt Sstl-Thal(ori +) de pVE6002 Fig. 2 frgt Thal-Ssti (ORF A) de pGK12 Emr Cmr Mutagénèse des plasmides. La mutagénèse par hydroxylamine a été effectuée sur l'ADN du plasmide pGK12 dans les conditions décrites par Thomas, 1987. Après 110 et 120 minutes de traitement à 70" C, l'hydroxylamine est éliminé par précipitation du DNA à l'isopropanol. Séquençage du DNA. Pour le séquençage du DNA, on a cloné le fragment Thal (756pb)-Rsal (1620 pb) de pVE6002, dans le plasmide pBluescript. On génère une série de clones se recouvrant, par utilisation d'exonucléase III et de nucléase de haricots mung (Stratagène). Le fragment Thal (756pb)-Ndel (1140pb) de la préparation du plasmide pGK12 utilisé pour la mutagénèse est également séquencé par la même procédure. On réalise le séquençage du DNA par la méthode de terminaison de chaînes didéoxy sur des ADN doubles brins avec le Kit de séquençage Taq Dye Primer Cycle (Applied Biosystem) en utilisant un appareil PCR Perkin Elmer. Les réactions de séquençage sont initiées avec des oligonucléotides fluorescents (Applied Biosystem) et sont analysées sur un séquenceur automatique (séquenceur 370 A DNA, Applied Biosystem). Les séquences obtenues ont été déterminées sur les deux brins. RESULTATS Isolement du mutant. Le plasmide utilisé dans ces expériences, pGK12, est un dérivé de QWVO 1 contenant deux marqueurs de résistance aux antibiotiques (KoK et al, 1984). 10 llg d'ADN plasmidique sont mutagénisés in vitro par de l'hydroxylamine et introduits par électroporation dans la souche de lactococcus IL1403, après élimination de l'agent mutagène. L'efficacité de la mutagénèse est évaluée par la diminution de viabilité du plasmide et par l'apparition de mutants sensibles à l'érythromycine ou au chloramphénicol. Après 110 à 120 minutes de traitement, la viabilité du plasmide chute à moins de 0,1 % et environ 10 % des transformants contiennent des plasmides sensibles à l'un des antibiotiques. Ces conditions de mutagénèse sont choisies pour rechercher des plasmides thermosensibles, identifiés par réplique des transformants obtenus à 28 C sur un milieu contenant de l'érythromycine incubés à 37,5 C. Deux candidats thermosensibles, dénommés pVE6001 et pVE6002, sont obtenus par criblage d'environ 5000 clones. Leurs nombres de copies plasmidiques sont comparés, et la perte à 37,5 C est déterminée. Caractérisation du mutant : pVE6001 est un mutant non Ts. Le plasmide pVE6001 est plus instable que pGK12 à 28 C, et cette déficience devient plus prononcée à 37,5 C. Cependant, 7 % des bactéries contiennent encore le plasmide après 8 heures de croissance non sélective à 37,5 C, ce qui suggère qu'une réplication a lieu dans les conditions restrictives (figure 1A, gauche). Par rapport à pGKl2, le nombre de copies de pVE6001 apparaît diminué à 28 C et 37,5 C, avec ou sans sélection (figure lA), ce qui pourrait expliquer sa stabilité inférieure. I1 est possible que la perte du plasmide à des températures élevées, soit due à des changements physiologiques chez l'hôte à des températures supérieures, et non à la thermosensibilité du plasmide. Caractérisation du mutant : pVE6002 est un mutant thermosensible au dessus de 35 C. Les mesures de la stabilité du plasmide pendant la croissance sans antibiotique, révèlent que pVE6002 est aussi stable que pGK12 à 28 C, mais est perdu de façon drastique à 37,5 C (figure 1B). La perte rapide de pVE6002 à 37,5 C suggère que la réplication est bloquée immédiatement après le changement de température. Après 8 heures de croissance, il ne reste qu'environ 0,1 % de cellules résistantes à l'érythromycine.Les nombres de copies de pGK12 et de pVE6002 sont similaires à 28 C, avec et sans sélection ; cependant, après 5 heures à 37,5 C, pVE6002 est indétectable alors que le nombre de copies de pGK12 est à peu pres te même (figure 1B). On peut conclure de ces expériences que la mutation sur pVE6002 constitue réellement une déficience thermosensible de réplication. La température minimum permettant la perte de pVE6002 a été déterminée. La souche IL1403 contenant pVE6002 a été testée pour la perte plasmidique pendant 8 heures de croissance non sélective à 28 C, 30 C, 33 C, 35 C et 37,5 C (tableau 2). TABLEAU 2: Pourcentage de cellules Emr dans la population Temps (Heures) Température de croissance 28 C 30 C 33 C 35 C 37,5 C 0 100 100 100 100 100 2 100 100 99 97 98 4 100 100 48 47 38 6 100 100 9 3 4 8 100 99 5 1 1 Une culture d'une nuit en M17 avec Em, de IL1403 portant pVE6002 est diluée dans du milieu sélectif neuf et mise à pousser 3 heures à 28 C. La culture est alors diluée 10.000 fois dans un milieu non-sélectif et incubée à différentes températures. A des intervalles de temps variés, des échantillons sont prélevés et placés sur M17 à 28 C. Pour chaque point de température et de temps, la perte du plasmide est évaluée en repiquant une centaine de colonies sur des boîtes de milieu sélectif (Em) à 28 C. On a trouvé que la perte plasmidique est équivalente à 37,5 C et 35 C. Une perte partielle du plasmide est déjà observée à 33 C, alors que le plasmide était stable à 28 C et 300 C. Ainsi, les cellules contenant pVE6002 peuvent perdre ce plasmide par élévation de la température à 35 C ou plus. On a aussi introduit pVE6002 dans une autre souche de Lactococcus, MG1363 (Gasson, 1983), qui est distincte de IL1403 par comparaison des profils d'électrophorèse en champ pulsé. L'analyse des séquences indique que MG1363 est probablement une souche L. lactis subsp. cremoris (Godon et al, 1992). pVE6002 montre la même thermosensibilité dans cet environnement, démontrant que le phénotype du mutant plasmidique n'est pas lié à la souche. Large spécificité d'hôte et phénotype Ts de pVE6002. Un plasmide Ts peut être un véhicule de clonage utile dans d'autres organismes. Ainsi le comportement thermosensible de pVE6002 a été examiné chez B. subtilis et E. coli. Ces souches ont été choisies comme représentatives du large spectre d'hôte du réplicon original pWV0l. L'ADN plasmidique a été introduit dans les deux espèces par transformation et sélection à 28 C. Etant donné que B. subtilis et E. coli ont des températures de croissance maximales supérieures à celles de L. lactis subsp., la réplication de pVE6002 a été testée à 28 C, 37 C et 420 C. Les résultats montrent que pVE6002 est thermosensible chez les deux hôtes. Il est probable que pVE6002 conserve ses propriétés de thermosensibilité chez le large spectre d'hôtes chez lequel il peut être établi. Cartographie de la mutation Ts. La séquence d'ADN de pWV0l montre la présence d'une origine-plus et de quatre ORF. Leenhouts déduit de sa similarité avec des ADN plasmidiques mieux caractérisés, que 1'ORF A code pour la protéine de réplication (RepA) responsable de la coupure d'un brin d'ADN à l'origine-plus. Des homologies supplémentaires suggèrent que l'O RF C pourrait réguler 11 expression de RepA. Des fonctions n'ont pas encore été clairement attribuées à ORF B et ORF D, bien que l'on sache que cette dernière n'est pas nécessaire à la réplication. Afin de localiser la mutation qui confère la thermosensibilité à pVE6002, on a construit des plasmides hybrides associant des parties du réplicon thermosensible et des parties non mutées. pVE6043 est constitué d'un fragment de pGK12 contenant ltorigine-plus, ORF B et ORF C, et d'un fragment pVE6002 (Ts) contenant l'O RF A (RepA) dépourvu de son promoteur, l'O RF D et les marqueurs de résistance à Em et Cm (on utilise les sites de restriction Sacl et Thal, figure 2). Cet hybride est perdu à 37,5 C, au même taux que pVE6002, alors que l'hybride réciproque (pVE6044) est maintenu avec la même stabilité que pGK12 (figure 2). Ainsi, la mutation conférant la thermosensibilité à pVE6002 se trouve dans le fragment d'ADN codant pour RepA, ORF D et les marqueurs aux antibiotiques.Etant donné que l'ORF D n'est pas indispensable et que les marqueurs aux antibiotiques ne sont pas candidats, on peut conclure que la fonction thermosensible est la protéine RepA. Données de séquençage. Afin de localiser la mutation Ts, on a séquencé le fragment de 864 pb codant pour la protéine RepA de pVE6002. On a identifié quatre mutations, aux positions 972, 977, 980 et 987 (figure 3). On a confirmé que la région correspondante du plasmide parental pGK12 qui a été utilisé pour la mutagénèse est identique à la séquence publiée pour pWV0l (Leenhouts et al, 1991). Les quatre mutations sont des transitions de G à A, correspondant à l'effet mutagène connu de l'hydroxylamine. Chaque changement de base a pour résultat une altération d'un acide aminé (figure 3) dont l'une, Val en Ile est conservative. La contribution d'une ou plusieurs de ces altérations peut être impliquée dans le phénotype Ts. Dérivés du plasmide Ts. Dans un but de clonage, des dérivés du plasmide Ts initial pVE6002 ont été développés (figure 4). Ces dérivés sont modifiés pour contenir soit les deux résistances aux antibiotiques (Em et Cm) soit seulement l'une (Em ou Cm) et tous ont une séquence multisite dérivée du plasmide pBluescript SK+. Excision du réplicon Des évènements de double échange réciproque ont pu être obtenus à partir d'un plasmide dérivé de pVE6002 portant une région d'homologie avec le chromosome bactérien interrompue par un gène de résistance à un antibiotique (Abr) comme illustré sur la figure 7a. Après introduction du plasmide dans la bactérie à 28 C, une première étape consiste à sélectionner les intégrants dans le chromosome par culture à 37 C sur milieu contenant l'antibiotique. La région d'homologie est dupliquée à la suite de l'intégration (Figure 7a). Lors d'une seconde étape, on obtient l'excision du réplicon par incubation à 28 C pour permettre à la réplication plasmidique de reprendre et stimuler un second évènement de recombinaison.Les évènements d'excision sont sélectionnés par culture à 37 C ; le gène chromosomique est inactivé par le gène Abr. REFERENCES Chopin, A., MC. Chopin, A. Moillo-Batt, and P. Langella. 1984. Plasmid 11: 260-263. Gasson, M.J. 1983. J. Bacteriol. 154: 1-9. Godon, J-J., C., Delorme, P., Renault and S. D. Ehrlich. 1992. Appl. Env. Microbiol. submitted. Hanahan, D. 1985. In DNA cloning: A practical approach Vol 1: 109-135. IRL Press Ed Glover. Holo, H, and Nes, I, F. 1989. Appl. Env. Microbiol. 55: 3119-3123. Kok, J., J.M.B. van der Vossen and G. Venema. 1984. Appl. Env. Microbiol. 48: 726-731. Langella, P., and Chopin, A. 1989. FEMS Microbiol. Lett. 89: 301-306. Leenhouts, K., J., B., Tolner, S., Bron, J., Kok, G., Venema and J., F.M.L. Seegers. 1991. Plasmid. 26: 55-66. Niaudet, B; Ehrlich, S, D. 1979. Plasmid. 2: 48-58. Petit, MA., Mesas, M., J., Noirot, P., and Ehrlich, S., D. 1992. Inducible Amplification in the Bacterial Chromosome. submitted. Thomas C.M. 1987. In Plasmids. A practical approach. IRL Press EDS Hardy. REVENDICATIONS 1. Plasmide vecteur bactérien du type comportant une origine de réplication efficace dans les bactéries gram positives, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - un gène marqueur qui s'exprime dans une souche hôte bactérienne, - un système de réplication efficace qui est thermosensible à partir d'une température compatible avec la viabilité de la souche hôte. 2. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède un système de réplication efficace dans les bactéries lactiques. 3. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une séquence d'ADN homologue avec une séquence d'ADN chromosomique, afin de permettre une recombinaison. 4. Plasmide vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène marqueur est situé de façon à être intégré dans le chromosome en cas de recombinaison. 5. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le gène marqueur assure une résistance à un composé chimique ou est un gène permettant la complémentation d'une auxotrophie. 6. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le système de réplication thermosensible est inhibé au dessus d'environ 35 C. 7. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le plasmide comporte un locus de mobilisation permettant la conjugaison. 8. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte deux séquences identiques répétées, encadrant une séquence du plasmide. 9. Plasmide vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le système de réplication est celui porté par le plus grand fragment Clal du plasmide pWV0l, présentant au moins une mutation dans la région Thal-Rsal. 10. Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation dans la région correspondant à Rep A du plasmide pWVO1. 11. Plasmide selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que, par rapport à la séquence de pWV0l, il présente au moins une mutation dans l'une des positions suivantes : 972, 977, 980, 987. 12. Plasmide selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le fragment correspondant au système de réplication code pour une protéine présentant les mutations représentées sur la figure 3. 13. Plasmide selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il est réplicatif à 28 C, et non-réplicatif à une température supérieure à environ 35 C. 14. Plasmide selon l'une des revendications 7 à 13, caractérisé en ce que le locus de mobilisation est le locus ori T, extrait d'un plasmide de bactérie à gram positif. 15. Plasmide selon l'une des revendications 7 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un réplicon actif chez E. coli, qui en fait un plasmide navette gram-négatif, gram-positif. 16. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il porte un transposon. 17. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène codant pour une protéine d'intérêt, sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. 18. Bactérie caractérisée en ce qu'elle contient un plasmide selon l'une des revendications 1 à 17, sous forme libre ou intégré dans son chromosome. 19. Procédé d'inactivation d'un gène présent dans le chromosome d'une bactérie, caractérisé en ce que a)on introduit dans la bactérie, par transformation, le plasmide selon l'une des revendications 1 à 6, 8 à 13, 15, 16 ou 17, b)on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d)on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multipli cation. 20. Procédé d'inactivation d'un gène dans une bactérie, caractérisé en ce que a)on introduit dans la bactérie, par conjugaison, un plasmide selon l'une des revendications 7 à 17, b)on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d)on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multipli cation. 21. Procédé d'introduction d'un gène hétérologue dans une bactérie, caractérisé en ce que a)on introduit dans la bactérie, par transformation ou conjugaison un plasmide selon la revendication 17, b)on cultive la bactérie sur milieu sélectif à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication. c) on élève la température de culture à une température supérieure à ladite température d'inhibition, d)on récupère les bactéries survivantes après plusieurs cycles de multipli cation. 22. Procédé selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que les bactéries survivantes obtenues à l'issue de l'étape d), sont à nouveau mises en culture à une température inférieure à la température d'inhibition de l'origine de réplication, sur milieu non sélectif. 23. Procédé selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée à une température d'environ 28"C.