Brevet FR2697028A1 — publié le 19940422

La présente invention se rapporte à un milieu d'isolement permettant l'identification des bactéries de l'espèce Salmonella. L'identification de la bactérie Salmonella pathogène pour l'homme est un problème majeur de la bactériologie médicale et de la surveillance de l'hygiène agro-alimentaire. Ainsi, dans le cas d'épidémies transmises par des élevages de poules, les volailles infestées au niveau du tractus intestinal ne sont pas malades mais constituent un réservoir de Salmonella. Celles-ci peuvent être propagées, notamment par les oeufs, dans l'alimentation à la suite de ces épidémies. D'ailleurs, la Salmonella est une bactérie à déclaration obligatoire. Aujourd'hui, il devient nécessaire de prévoir la mise en oeuvre à grande échelle de la détection des sites infectés et plus particulièrement des fermes infectées par la bactérie Salmonella pour réduire ces épidémies. En fait, les Salmonella sont généralement à reconnaître parmi d'autres microorganismes telles les espèces commensales, Escherichia Coli et Proteus. La détection de Salmonella est habituellement réalisée sur un milieu gélosé d'isolement sélectif pour entérobactéries permettant la différenciation des entérobactéries pathogènes et la détection des colonies suspectes Salmonella. Un milieu d'isolement idéal doit permettre la croissance d'entérobactéries, la différenciation des diverses espèces présentes afin de permettre l'identification ultérieure d'une colonie de chaque type, et la détection des colonies suspectes Salmonella. L'objet de la présente invention est de permettre de réaliser des tests de routine très simplifiés pour Salmonella, par exemple des méthodes de surveillance de la qualité microbiologique de l'eau par des méthodes de trempage, ou la surveillance de la qualité micro-biologique des usines agro-alimentaires par des méthodes de contact, le diagnostique ou encore la recherche de microorganismes pathogènes par les méthodes microbiologiques traditionnelles sur boite de Petri sur milieu solide ou sur milieu sélectif semi-solide, à l'aide de milieux suivant l'invention. L'objet de la présente invention est de permettre la détection et la différenciation de Salmonella par la mise en évidence d'une activité propre à ces bactéries. La bactérie Salmonella possède dans son équipement enzymatique des estérases qui clivent en particulier des dérivés du caprylate tels que le nitrophényl caprylate. On pourrait donc envisager d'utiliser dans un milieu d'isolement un chromo gène lié au caprylate et ses dérivés, substrat des estérases, qui serait libéré dans le milieu sous l'action de ces enzymes, permettant l'identification des colonies de Salmonella. Or des essais sur des chromogènes tels que le 5-bromo-4chloro-3-indolyl-caprylate dans un milieu classique de culture de Salmonella n'ont pas permis de mettre en évidence de colorations particulières des colonies inoculées. Il a été trouvé d'une manière inattendue que l'addition d'un détergent au milieu de culture à une concentration approprié, et compatible avec une bonne croissance de Salmonella, permettait d'obtenir une coloration des colonies de Salmonella. La présente invention concerne donc un milieu de culture destiné à la mise en évidence des bactéries Salmonella, comprenant outre un milieu de culture pour Salmonella, à titre d'agents chromogènes une combinaison de - un composé chromogène lié à un acide gras en C7-C10, et - un détergent approprié favorisant la libération du composé chromogène. D'une manière préférentielle, le composé chromo gène est choisi parmi les esters de l'acide caprylique, avantageusement choisi parmi les dérivés de l'indolyl-caprylate et leurs sels, en particulier le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-caprylate. D'une manière préférentielle, on emploiera le 5-brom-4chloro-3-caprylate à une concentration comprise entre 40 et 200 mg/l. Le détergent approprié sera avantageusement choisi parmi les détergents polycycliques condensés, en particulier les sels de dérivés acide carboxylique-polyols du cholane. D'une manière préférentielle, le détergent approprié sera choisi parmi les sels de métal alcalin de l'acide cholique ou de ses dérivés, en particulier le désoxycholate de sodium. On peut employer le désoxycholate de sodium à une concentration supérieure à I g/l, de préférence compris entre 1,5 et 5 g/l, concentration parfaitement compatible avec une bonne croissance de Salmonella. D'une manière avantageuse, le rapport pondéral composé chromogène/détergent approprié est compris entre 1/10 et 1/100. I1 convient de constater que la présente invention ne consiste pas en une simple addition de détergent à un milieu d'identification, et qu'il est nécessaire de considérer le couple composé chromogène/détergent approprié. Ainsi, pour les dérivés de l'indolyl caprylate, seuls les détergents polycycliques condensés, dérivés du cholane permettent d'obtenir une coloration des colonies de Salmonella, alors que son remplacement par un détergent tel que les détergents anioniques courants (notamment les détergents commercialisés sous la marque TERGITOL par la société UNION CARBIDE Corp.) ne permet pas de mettre en évidence une coloration I1 est également particulièrement intéressant de noter que l'agent chromogène du milieu selon l'invention n'entraîne pas de coloration avec de nombreuses autres entérobactéries, même si on les laisse incuber pendant plusieurs semaines. L'homme du métier saura bien entendu compléter le milieu selon la présente invention de manière à éliminer des bactéries exceptionnelles non-Salmonella, notamment par la mise en évidence d'autres caractères spécifiques de Salmonella, en particulier les caractères de clivage ou de métabolisation des bêta-galactosides et de bêta-glucosides. D'une manière avantageuse, le milieu selon la présente invention contiendra également des bêta-glucosides et/ou des bêtagalactosides. Ainsi, une colonie colorée de Salmonella pourra aisément être repérée sur un dispositif microbiologique même en présence de milliers d'autres colonies, ou sur un milieu semi-solide pour augmenter la spécificité de détection. On obtient généralement une coloration bleue foncée caractéristique de la présence de Salmonella. Toutefois, d'autres colorations peuvent être envisagées, fonction du composé chromo gène employé. Par ailleurs, la détection sera facilitée par le fait qu'elle ne nécessite ni l'emploi d'un révélateur coloré non viable, ni celui d'un éclairage particulier. La présente invention concerne également un procédé de détection de souches de Salmonella dans un prélèvement quelqu'il soit, pour lequel on inocule le milieu de culture tel que décrit précédemment avec ledit prélèvement et en ce que l'on met au moins en évidence la coloration caractéristique de la présence de Salmonella. En fonction de la forme et la présentation du milieu et en fonction du test effectué, on inoculera de préférence le milieu par contact, par trempage, par inoculation en surface ou par inoculation dans la masse. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE : détection de souches de Salmonella Diverses concentrations de désoxycholate de sodium sont ajoutées au milieu S (en g/l : Extrait de viande 1 ; Extrait de levure 2 peptone 5 ; Chlorure de sodium 5 ; Agar 15 ; 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylcaprylate 0,2). Les boîtes sont incubées à 37"C et la coloration bleue des colonies de la bactérie Salmonella AR3001 et de la bactérie contrôlée E. coli AR2901 est observée après 24 heures d'incubation à 37"C. Salmonella n'est mise en évidence qu'avec la combinaison du substrat chromogène et du désoxycholate. Salmonella AR3001 E. coli AR2901 Désoxycholate 0,5 g/l incolore incolore Désoxycholate 1,0 g/l bleu clair incolore Désoxycholate 1,5 g/l bleu incolore Désoxycholate 2,0 g/l bleu assez foncé incolore Désoxycholate 2,5 g/l bleu foncé incolore Désoxycholate 3,0- g/l bleu foncé incolore Diverses souches d'entérobactéries sont isolées sur le milieu T (en g/l: Extrait de viande 1 ; Extrait de levure 2 ; peptone 5 ; Chlorure de sodium 5 ; Agar 15 ; Rouge neutre 0,03 ; Cellobiose 10 ; Dexoxycholate de sodium 2,5 ; 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-caprylate 0,2). Les boîtes sont incubées à 37"C et la coloration des colonies est observée après 24 heures d'incubation. La coloration des colonies permet de distinguer Salmonella des autres entérobactéries. Salmonella AR3001 bleu Salmonella AR3002 bleu Salmonella AR3003 bleu Salmonella AR3004 bleu Citrobacter AR30033 rose Citrobacter AR3437 rose Citrobacter D9316 rose Citrobacter D9352 rose Serratia AR3493 rose Entérobacter AR3494 rose Klebsiella B2497 rose Klebsiella B2593 rose REVENDICATIONS 1. Milieu de culture destiné à la mise en évidence des bactéries Salmonella, caractérisé en ce qu'il comprend, outre un milieu de culture pour Salmonella, à titre d'agents chromogènes une combinaison de - un composé chromogène lié à un acide gras en C7-C10, et - un détergent approprié favorisant la libération du composé chromogène. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé chromo gène est choisi parmi les esters de l'acide caprylique. 3. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé chromogène est choisi parmi les dérivés de l'indolylcaprylate, et leurs sels. 4. Milieu de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé chromogène est le 5-bromo-4-chloro-3indolylcaprylate. 5. Milieu de culture selon la revendication 4, caractérisé en ce que le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-caprylate est employé à une concentration comprise entre 40 et 200 mg/l. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le détergent approprié est choisi parmi les détergents polycycliques condensés, plus particulièrement parmi les sels de dérivés acide carboxylique-polyols du cholane. 7. Milieu de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce que le détergent approprié est choisi parmi les sels de métal alcalin de l'acide cholique ou de ses dérivés. 8. Milieu de culture selon la revendication 7, caractérisé en ce que le détergent approprié est le désoxycholate de sodium. 9. Milieu de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce que le désoxycholate de sodium est employé à une concentration supérieure à 1 g/l, de préférence comprise entre 1,5 g/l et 5 g/l. 10. Milieu de culture selon l'une des revendications I à 9, caractérisé en ce que le rapport pondéral composé chromogène/détergent approprié est compris entre 1/10 et 1/100. Il. Milieu de culture selon l'une des revendications I à 10, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme liquide, semi-liquide ou solide. 12. Procédé de détection de souches de Salmonella dans un prélèvement quelqu'il soit, caractérisé en ce que l'on inocule le milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 11 avec ledit prélèvement, et en ce que l'on met en évidence la coloration caractéristique de la présence de Salmonella. 13. Procédé de détection selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on inocule le milieu de culture par contact, par trempage, par inoculation ou dépôt en surface ou par inoculation dans la masse.