Brevet FR2686883A1 — publié le 19930806

Procédé de fabrication de fibrinogène de très haute pureté, fibri- nogène de très haute pureté obtenu ainsi qu'une composition phar- maceutique le contenant. La présente invention concerne essentiellement un procédé de fabrication de fibrinogène de très haute pureté, du fibrinogène de très haute pureté obtenu, ainsi qu'une composition pharmaceu- tique Le contenant. On sait que Les indications du fibrinogène entrent dans La prévention d'hémorragie chez des ma Lades souffrant de déficits quantitatifs ou qualitatifs en fibrinogène, d'insuffisance hépato- cellulaire, de fibrinolyse et de coagulation intravasculaire dissé- minée (CIVD). On connaît déjà dans l'état antérieur de la technique divers procédés de fabrication du fibrinogène par précipitation à la glycine comme décrit dans EP-A-O 383 234; ou par passage sur colonne d'héparine Sépharose comme décrit dans EP-A-O 359 593; ou encore selon La méthode de COHN et a L (J Am Chem Soc ( 1946), 68, page 459). Ces concentrés de fibrinogène répondent aux normes de La pharmacopée européenne en présentant un taux de pureté d'au moins %, ce qui conduit à un inconvénient lors de la reconstitution en solution du produit lyophilisé en raison d'un temps de reconstitu- tion relativement long, pouvant atteindre 20 min. Par ailleurs, le déposant a décrit dans le document FR-A-2 644 064, un procédé de fabrication de facteur anti- hémophi Lique (facteur VII Ic) ayant une très haute pureté permettant d'obtenir comme constituant secondaire non retenu du fibrinogène pour lequel aucune indication n'est décrite. La présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un procédé de fabrication de fibrinogène ayant une très haute pureté, et ayant une vitesse de reconstitution du produit à l'état lyophilisé rapide, de préférence inférieure à 10 min et encore de préférence voisine de 5 min. La présente invention a encore pour but de résoudre ce problème par un procédé de fabrication simple, permettant une excellente reproductibilité ainsi que de traiter des quantités importantes à l'échelle industrielle tout en étant très peu coûteux De préférence, cette solution doit également permettre une inactivation virale. La présente invention permet de résoudre ces problèmes techniques simultanément, d'une manière simple, peu coûteuse, uti- lisable à l'échelle industrielle en permettant de traiter des grandes quantités sans limitation de volume, tout en étant peu coû- teuse. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé de fabrication de fibrinogène ayant une très haute pureté, caractérisé en ce qu'il comprend, à partir de cryo- précipité de plasma sanguin d'origine animale ou humaine, mis en solution aqueuse, le traitement de cette solution pour l'amener à une force ionique égale à celle d'une solution tampon ayant la com- position suivante: Na CL 120 m M Tris 20 m M p H 8,8 on fait passer cette solution de force ionique réglée sur une colonne d'échange d'anion comprenant un gel d'échange d'anion, par exemple sous forme de billes, à base d'agarose réticulé comprenant des groupements amine quaternaire, notamment au bout d'un petit bras espaceur, par exemple de type alkylène en C 1-C 6 relié aux billes d'agarose, en particulier à environ 6 % d'agarose; et l'on procède à une éLution avec une première solution d'élution de même force ionique: Na Cl 120 m M, Tris 20 m M, p H 8,8; ces condi- tions permettent d' adsorberau moins sélectivement le fibrinogène sur ladite colonne, puis on réalise la désorption sélective du fibrinogène, par un traitement avec une solution tampon d'élution sélective du fibrinogène de force ionique plus élevée, ayant la composition suivante: Na Cl 200 m M Tris 20 m M p H 8,8 et on recueille l'éLuat ainsi obtenu contenant le fibrinogène sous forme hautement purifiée. On observe que cet éluat à forte concentration en fibri- nogène contient au moins 90 % de fibrinogène. Selon une variante de réalisation avantageuse du procédé selon l'invention, on réduit la force ionique de l'éluat purifié contenant le fibrinogène en procédant à une diafiltration de préfé- rence précédée d'une concentration Cette diafiltration peut être avantageusement réalisée contre une solution tampon de conservation permettant une injection intraveineuse Cette solution peut de pré- férence présenter la composition suivante: Na CL 100 m M Tris 20 m M L-arginine 17 m M L-lysine-HCL 20 m M p H 7 L'éluat ainsi diafiltré et concentré peut ensuite être lyophilisé en obtenant ainsi du fibrinogène sous forme lyophilisée de très haute pureté, au moins égale à 90 %, immédiatement utili- sable comme principe actif d'une composition pharmaceutique avan- tageusement pour les indications précédemment indiquées comme la prévention d'hémorragie chez des malades souffrant de déficits quantitatifs ou qualitatifs en fibrinogène, d'insuffisance hépato- cellulaire, de fibrinolyse et de coagulation intravasculaire dissé- minée (CIVD). Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon l'invention, on utilise comme source de fibri- nogène brut un cryoprécipité extrait de plasma sanguin d'origine animale ou humaine, de préférence humaine, que l'on met en solution dans de l'eau additionnée d'héparine. Selon une variante de réalisation, la solution brute ainsi obtenue est débarrassée du facteur VII Ic par utilisation du procédé décrit dans le document antérieur du déposant FR-A-2 644 064 qui est incorporé ici par référence. Selon une variante de réalisation, la solution aqueuse de cryoprécipité a subi une étape d'inactivation virale, par exemple par l'emploi d'un mélange de Tn BP/TWEEN en observant la proportion relative à 0,3 % en Tn BP et 1 % en TWEEN par rapport au volume de la solution à inactiver. Selon une autre variante de réalisation, avant de séparer le facteur VII Ic, on procède à une inactivation virale, pour cela on peut tout d'abord traiter la solution brute avec l'hydroxyde d'aluminium ( 4 % en solution) dans la proportion de 10 à 15 % en volume par rapport au volume total de la solution de départ à traiter On procède ensuite à une centrifugation pour séparer l'hydroxyde d'aluminium qui a piégé les facteurs vitamine K dépen- dants On peut ensuite inactiver la solution avec un mélange d'inactivateurs à base de solvant/détergent comme décrit dans le document EP-A-O 131 740 ou US-A-4 540 573. Selon une autre variante de réalisation avantageuse, avant de passer à l'étape de séparation du facteur VII Ic, de préfé- rence par adsorption sur un gel d'échange d'ions de type anionique sous forme de billes d'agarose réticulé comportant des groupements amine quaternaire, notamment au bout d'un petit bras espaceur, par exemple de type alkylène en C 1-C 6 relié aux billes d'agarose, comme disponible commercialement sous le nom de Q Sépharose Fast Flow R de chez Pharmacia comme décrit dans FR-A-2 644 064, on procède à une diafiltration de la solution brute viralement inactivée à l'aide d'une solution tampon identique à celle servant à fixer le facteur VII Ic qui est décrite particulièrement à la revendica- tion 11 de FR-A-2 644 064. Cette solution tampon d'élution présente la composition suivante Na Cl 250 m M Tris 20 m M Ca Cl 22 H 20 10 mm p H 6,6 Ainsi, l'éluat, contenant la fraction non adsorbée, qui est débarrassé du facteur VII Ic qui a été adsorbé sélectivement sur le gel, contient le fibrinogène qui est ensuite traité par le procédé selon l'invention précédemment décrit. Selon une variante de réalisation avantageuse, le gel utilisé pour l'adsorption sélective du facteur VII Ic ou pour la purification du fibrinogène, est le même, ce qui facilite le pro- cédé industriel de purification du fibrinogène. Selon une autre variante de réalisation, permettant la conservation de la solution de fibrinogène de très haute pureté, on procède à une filtration stérilisante sur filtre stérilisant ayant une dimension de pores de diamètre à 0,22#m, puis la solution sté- rilisée est introduite dans des flacons adéquats, de préférence en vue d'une lyophilisation Avantageusement, on introduit un volume de solution de fibrinogène de très haute pureté de manière à obtenir un produit lyophilisé pesant environ 1,5 à 2 g par flacon. Ce lyophilisat peut ensuite être repris pour l'injection intra- veineuse avec 100 ml d'eau PPI. Selon un deuxième aspect, la présente invention couvre également le fibrinogène de très haute pureté obtenu par le procédé précédent. D'autre part, ce fibrinogène de très haute pureté cons- titue également un produit nouveau qui présente une proportion de fibrinogène au moins égale à 90 % en poids et de préférence com- prise entre 90 et 95 %, de préférence comme déterminé par électro- phorèse ou par des dosages pondéreux. Ce produit présente la propriété avantageuse de pouvoir être dissous à partir d'un lyophilisat en moins de 10 min à tempé- rature ambiante, et en règle générale en environ 5 min alors que les produits antérieurement préparés par les procédés de l'art antérieur donnaient un temps de dissolution de l'ordre de 15 min à min à une température pouvant atteindre un chauffage à 370 C. Le produit selon l'invention est par ailleurs inactivé viralement et naturellement en majeure partie dépourvu d'autres protéines Il est de préférence sous forme lyophilisée qui permet de préparer une préparation injectable extemporanément. Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'ingrédient actif du fibrinogène tel que précé- demment décrit. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven- tion apparaîtront clairement à la lumière de la description expli- cative qui va suivre faite en référence à un exemple de réalisation actuellement préféré donné simplement à titre d'illustration et qui ne saurait donc en aucune facon limiter la portée de l'invention. Dans cet exemple, les pourcentages sont donnés en poids, sauf indi- cation contraire. Exemple de l'invention 9 kg de cryoprécipité issu de 900 1 de plasma sanguin humain sont mis en solution dans 3,2 fois son volume d'eau osmosée à 3 UI d'héparine par millilitre d'eau à température du laboratoire sous agitation pendant 2 h. Après mesure du volume final, on additionne à cette solu- tion de l'hydroxyde d'aluminium à 4 % en solution aqueuse, à raison de 15 % en volume par rapport au volume total de cette solution On laisse sous agitation pendant 5 min, puis on centrifuge à 6 000 G pour séparer l'hydroxyde d'aluminium de la solution. Ensuite, on procède à une diafiltration de la solution brute contenant le facteur VII Ic ainsi que le fibrinogène contre une solution tampon qui sera ensuite utilisée pour-l'équilibration et l'élution du gel de Q Sépharose Fast Flow(B) utilisé pour adsorber sélectivement le facteur VII Ic ayant la composition sui- vante Na Cl 250 m M Tris 20 m M Ca Cl 2 10 mm p H 6,6 La membrane servant à la diafiltration a un seuil de coupure de 100 k D (kilo Daltons). Il est réalisé ensuite une concentration à 30 1 de la solution brute de facteur VII Ic et de fibrinogène On vérifie que cette solution concentrée présente sensiblement la même force ionique que la solution tampon servant à adsorber le facteur VII Ic sur le gel La quantité de gel est, par exemple, de 100 1 Après élution du gel avec la solution tampon, on a ainsi adsorbé sélecti- vement le facteur VII Ic alors que la fraction protéique non retenue contient entre autre le fibrinogène à une concentration de 1,5 à 2 gil ainsi que les inactivateurs et présente un volume de 150 à 1. On sépare sélectivement le fibrinogène par le procédé selon l'invention de la manière suivante: on procède tout d'abord à une concentration de cette solution à 30 1 avec une membrane à seuil de coupure de 100 k D, puis une diafiltration contre une solu- tion tampon caractérisée par: Na Cl 120 m M Tris 20 m M p H 8,8 1 de gel Q Sépharose Fast Flow 3 (PHARMACIA) préala- blement équilibré par cette même solution tampon vont servir à fixer entre autre le fibrinogène, mais ne vont pas retenir l'albu- mine et les inactivateurs Quand la densité optique du filtrat est retombée à la ligne de base, on élue le gel avec le même tampon après avoir augmenté sa force ionique par addition de Na Cl à une concentration finale de 200 m M Ce tampon d'élution sélectif du fibrinogène a donc la composition suivante: Na Cl 200 m M Tris 20 m M p H 8,8 La fraction du fibrinogène recueilli avec un rendement de % par rapport à la nuantité de fibrinogène injecté, est ensuite concentrée et diafiltrée contre un tampon présentant la composition suivante Na Cl 100 m M Tris 20 m M L-arginine 17 m M L-lysine-H Cl 20 m M p H 7 La concentration en fibrinogène est alors de 30 g/L environ; on procède enfin à une filtration stérilisante de la solution de fibrinogène sur une membrane stérilisante de 0,22 pm de diamètre Le produit concentré est réparti en 65 ml dans des flacons, puis lyophilisé. REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication de fibrinogène ayant une très haute pureté, caractérisé en ce qu'il comprend, à partir de cryo- précipité de plasma sanguin d'origine animale ou humaine, mis en solution aqueuse, le traitement de cette solution pour l'amener à une force ionique égale à celle d'une solution tampon ayant la com- position suivante: Na Cl 120 m M Tris 20 m M p H 8,8 on fait passer cette solution de force ionique réglée sur une colonne d'échange d'anion comprenant un gel d'échange d'anion, par exemple sous forme de billes, à base d'agarose réticulé comprenant des groupements amine quaternaire, notamment au bout d'un petit bras espaceur, par exemple de type alkylène en C 1-C 6 relié aux billes d'agarose, en particulier à environ 6 % d'agarose; et l'on procède à une élution avec une première solution d'élution de même force ionique: Na Cl 120 m M, Tris 20 m M, p H 8,8; ces condi- tions permettent d' adsorber au moins sélectivement le fibrinogène sur ladite colonne, puis on réalise la désorption sélective du fibrinogène, par un traitement avec une solution tampon d'élution sélective du fibrinogène de force ionique plus élevée, ayant la composition suivante: Na Cl 200 m M Tris 20 m M p H 8,8 et on recueille l'éluat ainsi obtenu contenant le fibrinogène sous forme hautement purifiée. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réduit la force ionique de l'éluat purifié contenant le fibrinogène en procédant à une diafiltration de préférence précédée d'une concentration; cette diafiltration étant avantageusement réalisée contre une solution tampon de conservation permettant une injection intraveineuse. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution tampon de conservation présente la composition sui- vante: Na CL 100 m M Tris 20 m M L- arginine 17 m M L-lysine-HCL 20 m M p H 7 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que l'éluat diafiltré est concentré et lyophilisé en obtenant ainsi du fibrinogène sous forme lyophilisée de très haute pureté, au moins égale à 90 %, immédiatement utilisable comme prin- cipe actif d'une composition pharmaceutique. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce qu'on utilise comme source de fibrinogène brut un cryoprécipité extrait de plasma sanguin d'origine animale ou humaine, de préférence humaine, que l'on met en solution dans de l'eau additionnée d'héparine. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse de cryoprécipité a subi une étape d'inacti- vation virale, par exemple par l'emploi d'un mélange de Tn BP/TWEEN en observant la proportion relative de 0,3 % en Tn BP et 1 % en TWEEN par rapport au volume de la solution à inactiver. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la solution brute obtenue est débarrassée du facteur VII Ic par adsorption sur un gel d'échange d'anion de type anionique sous forme de billes d'agarose réticulé comportant des groupements amine quaternaire, notamment au bout d'un petit bras espaceur, par exemple de type alkylène en C 1-C 6 relié aux billes d'agarose. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme solution tampon d'élution une solution présen- tant la composition suivante: Na Cl 250 m M Tris 20 m M Ca CL 2,2 H 20 10 m M p H 6,6 9 Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'éluat, contenant la fraction non adsorbée, qui est débar- rassé du facteur VII Ic qui a été adsorbé sélectivement sur le gel, contient un fibrinogène qui est ensuite traité selon l'une quel- conque des revendications précédentes. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gel utilisé pour l'adsorption sélective du facteur VII Ic ou pour la purification du fibrinogène est le même. 11 Fibrinogène de très haute pureté, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, et en ce qu'il présente une proportion de fibrinogène au moins égale à 90 % en poids et de préférence comprise entre 90 et 95 % en poids, de préférence comme déterminé par électrophorèse ou par des dosages pondéraux. 12 Fibrinogène selon la revendication 11, caractérisé en ce que le fibrinogène, à partir d'un lyophilisat, peut être dissous en moins de 10 min à température ambiante et en règle générale en environ 5 min. 13 Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'ingrédient actif du fibrinogène tel que préparé par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou tel que défini à la revendication 11 ou 12.