Brevet FR2689905A1 — publié le 19931015

La présente invention concerne un procédé de clonage d'un gène de NADPH Cytochrome P450 Réductase de plante ou d'un autre organisme par un crible basé sur une complémentation fonctionnelle dans une souche de levure où la NADPH cytochrome P450 Réductase endogène est soit déficiente, soit rendue de niveau modulable. La présente invention concerne plus particulièrement l'application de ce procédé au clonage de gènes de NADPH Cytochrome P450 Réductases de plantes. La présente invention concerne en outre l'utilisation de l'ADNc d'une NADPH Cytochrome P450 Réductase de plante obtenu par ledit procédé, pour cloner des gènes de NADPH Cytochrome P450 Réductases d'une autre plante par hybridation sous condition de stringence réduite. La présente invention concerne également des séquences d'ADN codant pour une NADPH Cytochrome P450 Réductase de plante obtenues par les procédés de clonage selon l'invention. Domaine technique de l'invention Les NADPH Cytochrome P450 Réductases (ci-après abrégées "P450Réd") sont indispensables à l'activité enzymatique des Cytochromes P450 (ci-après abrégés "P450") (1). Dans le complexe membranaire fonctionnel P450-P450 Réd, elles apportent au P450 des électrons à un potentiel életrochimique suffisamment négatif pour leur permettre d'effectuer les réactions de type monooxygénasique. Ces réactions sont caractérisées le plus souvent par l'introduction d'un atome d'oxygène dans des liaisons carbone-carbone ou carbone-hydrogène ou alors par l'oxydation d'un hétéroatome (2). Jusqu'à présent, les P450 Réd étaient considérées comme uniques dans une espèce donnée où elles interagissaient avec l'ensemble des P450 présents.La présente invention démontre le caractère erroné de ce concept et que différentes classes de Réductase peuvent contrôler l'activité de différentes familles de P450. Bien que l'état des connaissances concernant l'intervention de P450 de plantes dans les différentes voies de biosynthèse ou de détoxification ne soit pas aussi avancé que dans le domaine des P450 de mammifères, l'implication de P450 dans de nombreuses réactions du métabolisme secondaire de différentes plantes, est décrite aujourd'hui dans la littérature (3). I1 est également connu par la littérature que les P450 de plantes inverviennent dans la métabolisation de certains pesticides tels que le diclofop ou le chlortoluron (4, 5). L'activité des P450 Réd comme donneur électronique indispensable à la fonction des P450 est susceptible d'être utilisée dans une grande gamme de domaines d'applications.On peut citer à titre d'exemples non-limitatifs - la bioconversion dtarômes ou de pigments naturels à partir de précurseurs endogènes à la plante. En effet, il a été démontré qu'un certain nombre de molécules de natures chimiques très variées comme les phényl propanoîdes, les terpenoîdes, les acides gras et les stérols sont substrats de P450 de Plante (3). Ces molécules sont également des intermédiaires de la biosynthèse de molécules d'intérêt industriel tels que les arômes, pigments ou des phytoalexines (substances de défense synthétisées par la plante contre des infections pathogènes).Dans ce but, l'isolement des gènes de P450 de plantes et de P450 Réductases associées, leur clonage et leur surexpressions coordonnées dans un microorganisme adapté afin d'y reconstruire une portion de voie de biosynthèse est d'un intérêt certain. On peut citer comme applications - Le remplacement des étapes d'hydroxylation stéréospécifique lors de la synthèse chimique de molécules d'intérêt industriel par voie biotechnologique. L'introduction de groupements hydroxyle à des positions bien précises par la voie de la chimie de synthèse est souvent fastidieuse et coûteuse. Cette étape peut être avantageusement remplacée par l'utilisation d'un complexe P450/P450 Réd capable de faire des réactions d'hydroxylation à la position voulue. A titre d'exemple, on peut citer la conversion de la digitoxine en digoxine par une hydroxylation en position 12 beta (6).L'enzyme qui effectue cette réaction dans des cellules en culture de Digitalis lanata est une hydroxylase à cytochrome P450 - La modulation in vivo de voies de biosynthèse de plantes. La découverte de l'existence d'au moins deux P450 Réductases à fonction non-interchangeable est une forte indication qu'au moins les deux P450 Réductases isolées pourraient intervenir différentiellement dans les voies de biosynthèse chez la Plante. La modulation dans des plantes transgéniques de l'activité relative des P450 Réductases pourrait être un moyen puissant de contrôle global de fonction telle que la floraison, la croissance, la symbiose, la résistance au parasite, la fructification, la conservation et le mûrissement des fruits, etc...; - Un diagnostic in vitro de pollution de l'environnement.Un certain nombre de polluants industriels sont soit des inhibiteurs ou des activateurs de P450 de plantes - L'oxydation de Xénobiotiques. I1 a été démontré que certains P450 constituent des facteurs de résistance et de sélectivité vis-à-vis des pesticides. I1 est clairement intéressant de transférer ces gènes vers des plantes d'intérêt agronomique de façon à les rendre résistantes à un herbicide, fongicide, insecticide, etc... La disponibilité des Réductases correspondantes dans la même localisation que les P450 impiiqués est un facteur critique pour cette utilisation. Etat de la technique Bien que les P450 et les P450 Réductases aient été mis en évidence chez les plantes au début des années 1970 (7), des clones génomiques ou d'ADNc de P450 Réductases membranaires proviennent d'eucaryotes supérieurs (homme, lapin, porc, rat ou truite), ou de levures, à l'exclusion du règne végétal. La faible teneur en P450 Réductase des tissus végétaux, ainsi que le mauvais rendement des procédés de purification décrits, s'est soldé par un sérieux retard dans le développement d'outils de clonage chez les plantes. La recherche de l'activité enzymatique des P450 Réductases nécessite la reconstitution d'un complexe multienzymatique membranaire, un procédé très mal maîtrisé jusqu'à présent dans le cas des enzymes de plantes. Récemment, la purification à homogénéité d'une protéine P450 Réd de la patate douce (8) et du topinambour (9) a été décrite. Leur identité a été démontrée par la reconstitution d'un très faible niveau d'activité P450 à partir de préparations partiellement purifiées de P450 de plante. Un anticorps polyclonal dirigé contre la P450 Réd de Topinambour inhibe complètement l'hydroxylation du cinnamate par la cinnamate 4-hydroxylase (P450) dans les microsomes de topinambour (9). Cette réaction est commune dans le règne végétal puisque l'acide cinnamique est le tronc commun de différentes voies de biosynthèse conduisant à la lignine, à de nombreux pigments végétaux, à des composés de défense et à des arômes. Le même anticorps anti-P450 Réd inhibe des réactions P450 dépendantes dans un grand nombre d'espèces végétales, par contre il ne montre pas de cross-réactivité avec les P450 Réd de levure, d'insectes, de poissons ou de mammifères (10). Inversement des anticorps contre les P450 Réd de levure ou de mammifères n'inhibent pas les P450 Réd végétales. Des études plus poussées ont montré que la P450 Réd de topinambour (et de plusieurs autres espèces) ne semble pas une forme unique sur la base d'expériences d'immunoblotting et de chromatographie d'affinité (présence de trois bandes de poids moléculaire de 80, 82 et 84 kDa) (11). Néanmoins ces travaux ne permettaient pas de conclure en l'existence de plusieurs gènes dans la mesure où il avait été démontré dans au moins un des cas qu'une des bandes correspondait à une glycoprotéine. De ce fait, il n'était pas connu si les différentes bandes correspondaient à différents états de modification post-traductionnels d'une même protéine ou à des protéines de séquences distinctes. Des fragments de digestion de la forme de 80 kDa ont été microséquencés, et les séquences peptidiques obtenues ont pu être alignées avec les séquences connues de truite, lapin, rat, porc, et levure.Sur une distance allant de 10 à 15 aminoacides, l'homologie trouvée dans le meilleur des cas est de l'ordre de 60%. Très récemment, un anticorps monoclonal fabriqué à partir d'un mélange des trois formes de P450 Réd de Topinambour, dans l'espoir qu'il sera capable de reconnaître un motif structural commun entre les trois isoformes, s'est avéré reconnaître uniquement une structure dite "dinucléotide fold", un motif banal présent dans un très grand nombre d'enzymes NAD(P)H dépendantes (12). Les approches classiques pour cloner un gène de Réductase de plantes soit par criblage de banques avec un anticorps spécifique, soit par hybridation avec des sondes hétérologues ou déduites des séquences en acides aminés obtenues par microséquençage de Réductases de plantes, se sont révélées inefficaces pour les raisons suivantes - le niveau d'expression de la P450 Réd au niveau ARNm de plantes est très faible, comparé aux taux d'expression mesuré chez les mammifères. L'induction chez la plante par une blessure ou autres moyens, est modeste et de surcroît un phénomène transitoire. Même dans des conditioins optimales d'induction, la P450 Réd reste donc une protéine mineure dans les tissus végétaux (12). Le criblage d'un ADNc peu abondant dans une banque d'ARNm total de plante est une procédure fastidieuse et lente. I1 faut ajouter aussi que, d'une manière générale, il est plus difficile d'obtenir une banque d'ARNm de bonne qualité chez les plantes qu'à partir de tissus de mammifère. - Aucune séquence d'acide nucléique de P450 Réd végétale n'était connue, le criblage par hybridation devait.-être effectué soit avec une sonde de mammifère ou de levure, soit avec des oligonucléotides dérivés des microséquences d'acides aminés de la P450 Réd de topinambour. Dans les deux cas, l'utilisation de conditions de stringence faible était requise, ce qui augmentait de façon considérable la possibilité d'obtenir des faux positifs. S'il existe dans la littérature un certain nombre d'exemples qui ont décrit l'application avec succès d'anticorps spécifiques pour le criblage de banques d'expression, la réussite de cette procédure, qui dépend entièrement de la spécificité de l'anticorps, est quelque peu aléatoire. Résumé de l'invention La présente invention fournit un procédé de clonage de gènes de toutes NADPH-Cytochrome P450 Réductases indépendamment de leurs provenances, procédé qui consiste à se servir d'un crible permettant de déceler l'activité même d'un Cytochrome P450. Par rapport aux méthodes classiques de clonage citées ci-dessus, qui se basent sur des critères indépendants de la fonction, comme le degré d'homologie ou la reconnaissance de motifs structuraux, le procédé de clonage selon la présente invention comporte un degré considérablement supérieur de fiabilité puisque basé sur la fonction. L'absence d'activité NADPH-cytochrome P450 Réductase endogène n'est pas léthale chez la levure si l'activité cytochrome P450 est exprimee. En particulier, chez la levure, et plus particulièrement Saccharomyces cerevisiae, un P450, la nanostérol 14-déméthylase (C14DM), constitue une étape essentielle de la biosynthèse de l'ergostérol, un constituant majeur de la membrane cellulaire. L'absence de l'activité Cl4DM résulte en l'accumulation d'intermédiaires méthylés en 14 de la biosynthèse de l'ergostérol dans la membrane et en un défaut en ergostérol, ce qui est léthale pour la cellule (14). La délétion de la P450 Réd, par contre, n'est curieusement pas léthale alors que celle de la C14DM l'est.En effet, une Réductase inconnue microsomale NADH dépendante (sur la base de son activité à reconstituer une activité Ethoxyrésorufine O-deéthylase en présence de cytochrome P450 lAI de souris et de NADH), peut alternativement fournir des équivalents réducteurs à la C14DM de façon à assurer le taux de synthèse d'ergostérol requis pour que la cellule puisse survivre. Soumise à de fortes doses d'inhibiteurs de cytochrome P450, la levure ne survit pas. Toutefois, une souche de levure qui n'exprime plus l'activité P450 Réductase ne survit pas à des doses d'inhibiteur de P450 tel que le kétoconazole, normalement insuffisantes pour être léthales, c'est-à-dire insuffisantes pour être léthales lorsque l'activité P450 Réd est exprimée (13). Le procédé selon l'invention se base sur la découverte que ce phénotype d'hypersensibilité à un inhibiteur de P450, notamment à l'antifongique kétoconazole d'une souche de levure déficiente en activité P450 Réductase endogène est supprimé par l'expression d'une P450 Réductase exogène (quel que soit le donneur d'électrons). La présente invention a en effet pour objet un procédé de clonage d'une séquence d'ADN codant pour une NADPH Cytochrome P450 Réductase, notamment de plantes, ou d'un autre organisme, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes 1- On soumet une souche de levure transformée avec des plasmides d'une banque d'ADNc total dudit organisme, notamment de ladite plante, et ayant un phénotype de déficience en activité NADPH-Cytochrome P450 Réductase endogène, à un traitement avec un inhibiteur de cytochrome P450 à une dose qui rend léthale l'absence d'activité NADPH Cytochrome P450 Réductase endogène, puis 2- On récupère les clones survivants et on en extrait les plasmides permettant l'expression d'une activité NADPH Cytochrome P450 Réductase qui correspond à la NADPH Cytochrome P450 dudit organisme, notamment de ladite plante. On entend donc par l'expression "dose qui rend léthale" une dose qui -normalement, c'est-à-dire lorsque l'activité P450 Réd endogène est exprimée n est pas léthale pour la levure et ne le devient qu'en l'absence d'activité P450 Réd endogène. La dose d'inhibiteur de P450 ne doit donc pas dépasser la dose léthale, même en présence de P450 Réductase endogène. La transformation de l'Etape 1 se fait selon des techniques bien connues de l'homme de l'art ; par exemple, à partir d'une souche de levure URA- et des plasmides portant le gène URA 3 comme marqueur de sélection, ce qui permet d'excercer une pression de sélection avec de l'uracyle. Dans la présente invention, on peut se servir de levures totalement ou partiellement déficientes en P450 Réductase endogène pour tester une activité P450 Réd. L'obtention et la description des souches de S. cerevisiae, dans lesquelles le gène de la NADPH-Cytochrome P450 Réductase endogène a été soit délété, soit mis sous le controle d'un promoteur inductible permettant de l'activer, sont décrits dans la demande de brevet n" 91 08884 (souches PES1-3D et PES1-3U). Dans la souche PES1-3U, le gène endogène de la NADPH-Cytochrome P450 Réductase a été mis sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1, ce qui confère à la souche un phénotype sauvage en milieu galactose. Dans la souche PES1-3D, la région codante de la NADPH-Cytochrome P450 Réductase a été remplacée par le gène du marqueur TRP1, ce qui lui confère un phénotype déficient permanent en NADPH-Cytochrome P450 Réductase. On entend par "inhibiteur de Cytochrome P450" un composé qui interagit avec ledit Cytochrome P450 notamment par complexation, de sorte que ledit Cytochrome P450 se trouve inactivé. Un grand nombre de composés azole, et plus particulièrement le kétoconazole, ont été développés comme fongicides puissants dans le domaine médical et agricole et peuvent être utilisés selon l'invention (15). La dose léthale est variable selon les agents et selon la souche, en général une dose de 5 à 100 ug/ml, de préférence de 10 à 50 ug/ml, peut être suffisante dans le procédé selon l'invention. Les agents antifongiques du type kétoconazole inhibent en particulier la déméthylation du lanostérol au niveau de la C14DM en formant un complexe 1:1 avec cette P450. Du fait de l'affinité très élevée du kétoconazole, le lanostérol en tant que substrat physiologique ne peut pas déplacer l'inhibiteur, ce qui entraîne la mort de la cellule. Une souche sauvage de levure est résistante jusqu'à une concentration de 50 vmoire 80 ug/ml de kétoconazole. L'observation selon la présente invention qu'une souche déficiente en P450 Réd est plus sensible au kétoconazole jusqu'à 10 fois, et peut-être léthale à 5,ug/ml (à cause du mauvais couplage entre la Réd non-spécifique et la C14DM), a été utilisée pour développer un mode de sélection de l'activité NADPH P450- Réd.En effet, après transformation d'une souche de levure déficiente en NADPH P450 Réd avec une banque d'ADN exogène, ne pourront pousser en présence de 50 ug/ml de kétoconazole que des cellules transformées dans lesquelles l'ADN exogène reçu a introduit une activité P450 Réd suffisante. Le point essentiel de cette méthode de criblage par complémentation fonctionnelle est son universalité, puisqu'on peut tenir compte des différences d'efficacité de couplage entre la C14DM de levure et la P450 Réd exogène en variant la concentration d'inhibiteur. Dans un mode de réalisation, on a appliqué le procédé selon la présente invention au clonage des P450 Réd végétales, en particulier de l'espèce Arabidopsis thaliana. En l'absence de connaissances quant aux conditions maximales d'induction de l'expression de la P450 Réd chez Arabidopsis et des tissus où la P450 Réd est exprimée, l'ARNm total extrait à partir de jeunes plantules entières en phase de croissance nécessite une intense activité de synthèse, on peut donc supposer que tous les facteurs nécessaires à la croissance de la plantule soient exprimés à ce stade-là. L'utilisation de plantules entières dilue la population d'ARNm exprimés de façon tissue-spécifique dans la population totale d'ARNm, mais présente l'énorme avantage de ne pas tenir compte de conditions particulières d'induction de la P450 Réd, et de faciliter la préparation du matériel de départ. Une banque d'expression chez S. cerevisiae peut être construite de façon connue par insertion d'un ADNc double brin dans un vecteur entre un promoteur et un terminateur de transcription de levure. On peut utiliser le promoteur bien connu de type PGK (16), étant bien entendu que la nature du promoteur n'est pas critique pour la méthode selon l'invention. De préférence, toutefois, on utilisera un promoteur fort dans la levure. La nature multicopie du vecteur utilisé, bien que souhaitable, n'est pas non plus critique. La banque ainsi obtenue est fractionnée avant transformation dans la levure selon la taille des ADNc synthétisés. Comme la taille de la séquence codante de P 450 Réd d'eucaryote décrites dans la littérature est de l'ordre de 2 kbp hormis les séquences 5' et 3' flanquantes, l'ARNm codant pour une P450 Réd chez une plante et en particulier chez Arabidopsis doit raisonnablement être présent dans la fraction ayant un poids moléculaire plus grand que 2 kbp. Selon l'invention, à l'Etape 1, la banque d'ADNc est e préférence enrichie en gène d'intérêt (gène de NADPH-Cytochrome P450 Réductase de ladite plante ou autre organisme) par fractionnement selon la taille, en ne conservant que les fragments de taille supérieure à 2 kbp. Un tel fractionnement conduit en effet à un enrichissement de la banque pour le gène d'intérêt. Avantageusement selon l'invention, on utilise une méthode de transformation dite "en vol" d'une souche de levure portant un gène rendu artificiellement conditionnel pour la P450 Réductase endogène. En effet, la déficience en P450 Réductase induit une perte de transformabilité importante qui rendrait difficile, voire impossible dans certains cas, la constitution de banque représentative dans une souche délétée pour la P450 Réductase de manière non conditionnelle, c'est-à-dire permanente. De préférence donc, on utilise une souche de levure dans laquelle le gène de NADPH Cytochrome P450 Réductase est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible telle que la souche PES1-3U. Dans ce cas, à l'Etape 1, on induit une déficience en P450 Réductase en inactivant ledit promoteur dans la souche déjà transformée. La présente invention a donc également pour objet un procédé caractérisé en ce que le gène de la NADPH Cytochrome P450 Réductase endogène de levure est mis sous le contrôle d'un promoteur inductible et à l'étape 1, on réalise successivement les sous-étapes suivantes 1-a) On transforme une souche de levure avec des plasmides d'une banque d'ADNc total dudit organisme, notamment de ladite plante, puis l-b) On induit la déficience en activité NADPH-Cytochrome P450 Réductase endogène en inactivant ledit promoteur, et l-c) On soumet ladite souche à un traitement avec ladite dose d'inhibiteur de cytochrome P450. Dans un mode de réalisation, la souche PESl-3U est, dans un premier temps, transformée par une banque d'ADNc dudit organisme, notamment de la plante et les transformants sélectionnés uniquement sur la base du marqueur de sélection URA3 du plasmide. Dans un second temps, les transformants sont soumis à l'inhibiteur de P450, notamment au kétoconazole, pour rendre léthale l'absence d'activité NADPH Cytochrome P450 Réductase. Les clones survivants contiennent alors un plasmide permettant l'expression d'une activité P450 Réductase exogène (0,1% environ dans le cas d'Arabidopsis). La présence d'artefacts de clonage est possible par la sélection d'un facteur de régulation du promoteur inductible tel que GAL 10-CYC1 en milieu glucosé. C'est pourquoi une série d'étapes de contrôle annexes permet de s'assurer, notamment après extraction du plasmide et retransformation d'une souche de levure totalement déficiente en P450 Réductase, que la complémentation est bien due à l'expression d'une NADPH Cytochrome P450 Réductase exogène. Pour ce faire, on utilise une souche de levure dans laquelle le gène de P450 Réductase endogène est entièrement délété, tel que PES 1-3D. L'origine végétale de cette réductase peut être alors contrôlée par hydridation du clone avec 1'ADN génomique de la plante d'origine. La nature biochimique du gène cloné est alors vérifié par séquence. La présente invention a donc également pour objet un procédé caractérisé en ce qu'après la transformation "en vol" et à l'aide des plasmides récupérés à l'étape 2), on transforme une souche de levure dans laquelle le gène de la NADPH cytochrome P450 Réductase endogène à été délété et on réitère un traitement avec un inhibiteur de cytochrome P450 à une dose qui rend léthale l'absence d'activité NADPH cytochrome P450 endogène, puis on récupère les clones survivants et on en extrait les plasmides permettant l'expression d'une activité NADPH-cytochrome P450 qui correspond à la NADPH cytochrome, notamment de ladite plante. La présente invention apporte en outre la démonstration de l'existence, dans certains organismes, de plusieurs gènes indépendants de NADPH cytochrome P450 Réductase codant pour des protéines de caratères physicochimiques prévisibles bien distincts susceptibles d'interagir avec des classes différentes de cytochromes, P450. Le procédé selon l'invention a permis de cloner deux séquences d'ADN codant pour des NADPH Cytochrome P450 Réductase d'Arabidopsis ara-B et ara-C telles que représentées aux Figures 9 et 10 respectivement. La présente invention a donc également pour objet des séquences d'ADNc codant pour des NADPH Cytochrome P450 Réductase d'Arabidopsis ara-B ou ara-C, ou de topinambour heliantus tuberosus, telles que représentées aux Figures 9 à 1 1 respectivement. En effet, selon la présente invention, une séquence codante entière d'arabidopsis (ara-C), y compris les séquences 5' et 3' flanquantes, a ensuite été utilisée comme sonde pour cribler une banque d'ADNc totale de topinambour heliantus tuberosus sous conditions de stringence réduite. Cette banque a été obtenue à partir de nodules de topinambour qui ont été induits pour la synthèse de la P450 Réd par blessure, mais n'a pas été enrichie par fractionnement selon la taille des ADNc. L'usage d'un anticorps monospécifique dirigé contre un mélange des trois isoformes présentes chez le topinambour ne s'est pas avéré fructueux, ni le criblage à l'aide de sonde hétérologue (Réductase de levure et humaine), ou dérivées de la séquence protéique, n'avaient permis le clonage. Le criblage de la même banque avec une sonde d'ADNc du clone ara-C a mis immédiatement en évidence des positifs ayant un insert de plus de 2 kbp avec une fréquence de 1 pour 10.000 après trois tours de criblage. Ainsi, par le procédé de la présente invention, on a pour la première fois isolé et identifié trois ADNc de source végétale codant pour des NADPH Cytochrome P450 Réductases dans deux espèces différentes (Arabidopsis et topinambour heliantus tuberosus). Les microsomes préparés à partir de ces souches transformées par les vecteurs d'expression de levure sont capables de réduire un substrat non-physiologique des P450 Réd, le Cytochrome c. L'alignement des séquences en acides aminés avec les séquences connues de P450 Réd provenant d'autres sources eukaryotes permet de les identifier comme étant des P450 Réd d'Arabidopsis sur la base d'une très forte conservation au niveau des domaines fonctionnels des P450 Réd décrits dans la littérature.Une comparaison directe au niveau acides aminés entre les deux P450 Réd d'Arabidopsis montre des longs blocs dthomologie quasi parfaite pour les mêmes domaines tandis que, en dehors de ces domaines notamment, la distribution des acides aminés chargés varie significativement. En southern génomique avec de l'ADN d'Arabidopsis digéré par différents enzymes de restriction, les deux clones d'ADNc s'hybrident à des loci génomiques différents indiquant clairement la présence de deux gènes. Une analyse plus fine des séquences montre que (Figure I) - la divergence en acide-aminés entre les deux Réductases d'Arabidopsis (ara-B et ara-C) est de 36%, alors que celle entre les gènes de la Réductase ara-B et topi-A est de 31% et celle entre ara-C et topi-A est de 27%.Ceci est une forte indication que les deux gènes chez Arabidopsis ont évolué indépendamment durant un temps au moins comparable à celui de la divergence entre ces espèces végétales lointaines. Par ailleurs, l'analyse de la conservation en nucléotides sur la troisième base des codons (Figure 1) après alignement entre les séquences en aminoacides des Réductases, démontre un très faible résidu de conservation évolutive confirmant les données précédentes. Cette très faible conservation au niveau nucléotidique, sur les bases non contraintes comparées à l'homologie relativement élevée des Réductases de plantes entre elles au niveau amino-acides, démontre l'existence d'une forte contrainte évolutive sur la fonction des deux gènes d'Arabidopsis. Ceci indique que l'activité de ces deux gènes est évolutivement critique pour la plante et suggère que ces deux gènes ne sont pas interchangeables. Ils semblent donc jouer des rôles individuels dans la vie de la plante probable du fait de leurs association à des voies de biosynthèse spécifiques. Outre des séquences d'ADNc codant pour une NADPH P450 Réductase de plante obtenue par les procédés de clonage selon l'invention, la présente invention a également pour objet des séquences d'ADN s'hybridant dans des conditions faiblement stringentes à 50"C et/ou présentant au moins 60% d'homologie avec l'une des séquences d'arabidopsis ou de topinambour heliantus tuberosus représentées aux Figures 9 à 11, ou tout autre séquence de NADPH Cytochrome P450 Réductase, notamment de plantes, obtenue par les procédés de clonage selon l'invention. Bien évidemment, la présente invention a également pour objet toutes séquences d'ADN équivalentes, c'est-à-dire qui diffère des séquences d'ADNc ci-dessus mentionnées, seulement par une ou plusieurs mutation(s) neutre(s), c'est-à-dire dont le changement ou la substitution des nucléotides en cause, n'affectent pas la séquence primaire de la protéine résultante. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée du mode de réalisation suivant. La Figure 1 est une représentation schématique des éléments constitutifs du vecteur pFL 61, des sites uniques de restriction et leur localisation physique ainsi que la cassette de clonage insérée dans le site N" 1. La Figure 2 représente la séquence nucléotidique de la région d'insertion de la cassette de clonage dans le site Not I du vecteur pFL 61 avec les sites de restriction. Les deux sites Not I en bordure de la cassette et les deux sites BstX I portés par la cassete sont indiqués pas les flèches. La Figure 3 est une représentation schématique du principe de clonage utilisant des adaptateur synthétiques aux bouts non compatibles. La Figure 4 représente le schéma d'obtention d'une souche mutante de levure où le promoteur endogène du la P450 Réd est remplacé par le promoteur modulable pGK après recombinaison homologue avec un fragment linéaire Eco RI du vecteur pGPlPC. La Figure 5 représente le schéma d'obtention d'une souche mutante de levure où le gène du marqueur TRP1 a été introduit au locus endogène de la P450 Réd pour donner la souche PES 1-3D. La Figure 6 représente la classification des clones pouvant conférer un phénotype kétoconazole R à la souche PES 1-3U après transformatioin selon leur profil de restriction et la fréquence d'apparition. La Figure 7 représente la Mesure de l'activité NADPH CYT P450 Réductase dans des microsomes isolés de la souche mutante PES 1-3D après transformation avec de l'ADN plasmidique provenant des classes A, B, C, E. Comme contrôles ont été inclus la souche PES 1-3D non-transformée (absence d'activité de P450 Réd) et la souche sauvage W303.1B (activité endogène de P450 Réd). La Figure 8 représente l'homologie entre NADPH-P450 Réductase végétale et comparaison à des P450 Réductases connues, humaines et de levure. La colonne 1 montre le calcul du taux global de conservation au niveau acides aminés entre les deux P450 Réd d'Arabidopsis, les colonnes 2 à 4 montrent le taux de conservation entre des séquences d'acides aminés des deux P450 Réd d'Arabidopsis avec la P450 Réd humaine (HRed) et la P450 Réd de levure (YRed) connues de la littérature. La colonne 5 montre la distance évolutive entre la P450 Réd de levure et la P450 Réd humaine. Les colonnes 6 et 7 montrent le taux de conservation entre les deux P450 Réd d'Arabidopsis et un eP450 Réd d'une autre espèce végétale, isolé par cross-hybridation avec AraB comme sonde. Les Figures 9 à Il représentent les Séquences nucléotidiques et les séquences déduites des acides aminés des deux ADNc de P450 Réd d'Arabidopsis (Ara B -Figure 9- et Ara C -Figure 10-) isolées par complémentation fonctionnelle et de la P450 Réd de topinambour (Figure 11) isolée par crosshybridation (TopA). Les domaines fonctionnels de ces réductrases ont été définis par alignement avec les P450 Réd connues et son indiqués par des crochets. La Figure 12 représente l'alignement des séquences en acides aminés déduites des ADNc des trois P450 Réd végétales. Les positions de conservation stricte entre les réductases végétales sont indiquées par des astérisques en ligne 4. La cystéine conservée parmi toutes les P450 réductases végétales et animales connues et qui est importante pour la fixation du NADPH est surlignée par un astérisque. Les séquences nécessaires à la fixation du FMN sont indiquées par les blocs At et A2. Les séquences nécessaires à la fixation du FAD sont représentées par les blocs B1 et B2. Les séquences nécessaires pour la fixation du NADPH sont représentées par le bloc C et la cystéine conservée surlignée par un astérisque. La souche de Saccharomyces cerevisiae PES1-3U a été déposée auprès de la Collection Nationale des Cultures et de Microorganismes le 17 mars 1992, sous le numéro de dépôt I-1187. 1) Construction du vecteur d'expression chez S. cerevisiae Le vecteur pFL61, utilisé ici pour le clonage d'une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana, a été obtenu à partir du vecteur pFL60, décrit dans la littérature (17). I1 est caractérisé par les modifications suivantes : A la place du polylinker ClaI-BglII présent dans pFL60, a été créé un site unique Note. Dans ce site unique a été introduit ensuite une cassette contenant à l'intérieur deux sites uniques BstXI et bordée de bouts 5' sortants compatibles NotI. La digestion avec BstXI génère un vecteur linéarisé avec deux bouts incompatibles (18). La recirculation du vecteur ne sera possible qu'en présence d'un fragment d'ADN possédant des bouts compatibles avec ceux créés sur le vecteur par la digestion BstXI. La cassette d'insertion est placée entre le promoteur inductible PGK et le terminateur PGK, ce qui permettra l'expression des séquences d'ADN hétérologue insérées. De plus, ce vecteur contient le gène marqueur d'auxotrophie URA3 de S. cer., une petite partie du plasmide 2u comprenant l'origine de replication de S. cer. et des séquences provenant du vecteur d'E. coli pUCl9 qui sont inchangés par rapport au vecteur d'origine pFL 60. 2) Préparation d'une banque totale d'ADNc d'Arabidopsis thaliana triée selon le poids moléculaire des ADNc De jeunes plantules entières, comprenant feuilles, tiges et racines, sont collectées au stade deux feuilles, congelées dans de l'azote liquide puis broyées dans un mortier contenant du milieu d'homogénéisation congelé (10 mM Tris-Hcl pH8,0, I mM EDTA pH8, 0,5% sodium Dodecyl Sulfate). La poudre ainsi obtenue est ensuite décongelée et extraite deux fois avec un volume égal d'un mélange 1:1 Phénol/chloroforme. Après addition de 1/10 volume d'une solution 4M NaCI, la solution aqueuse est de nouveau extraite deux fois avec un mélange 1:1 phénol/chloroforme, et les acides nucléiques sont précipités par l'addition de deux volumes d'éthanol. Les acides nucléiques totaux obtenus sont immédiatement enrichis en ARN poly(A+) par chromatographie sur oligo dT sépharose (19). Après élution et précipitation, les ARN poly(A+) sont resuspendus dans de l'eau, leur quantité est déterminée par absorption à 260 nm, puis ils sont congelés immédiatement jusqu'à utilisation. Une banque d'ADNc totale est synthétisée à partir d'un aliquot de 5ug ARN poly(A+), en utilisant le "cDNA Synthesis System Plus" fourni par Amersham. Les ANDc sont ensuite rendus bout francs avant ligation avec des adaptateurs possédant des bouts 5' sortants CACA qui sont compatibles avec les bouts GTGT produits sur le vecteur de clonage par la digestion avec BstX I (voir Figure 2).Les ADNc sont ensuite préparés selon leur taille par électrophorèse sur gel d'agarose "low gelling temperature" (Sigma, Cat. NO. A 9539), ce qui enlève aussi l'excès d'adaptateurs gênants lors de la ligation. Lors de l'élution du gel d'agarose, les ADNc sont répartis en deux classes selon leur taille : une allant de 0,2 à environ 2 kb, et une représentant les ADNc plus grands que 2 kb. Après quantification, la ligation a été effectuée en présence de quantités stolchiométriques de vecteur pFL61 digéré par Bst XI (après avoir enlevé le petit fragment Bst XI interne) et d'ADNc de taille supérieure à 2kb. Après transformation par électroporation dans E. coli (Souche MR 32), 5 2,0 x 10 clones ont été obtenus.L'ensemble des clones a été réuni pour une préparation d'ADN plasmidique sur gradient cholorure de Césium, après avoir enlevé un aliquot en vue d'amplifications futures. 3) Description des souches mutantes de levure utilisées et conditions de culture. Les souches décrites ci-dessous ont été décrites dans la demandes de brevet en France n" 91 08884. Elles ont été construites à partir d'une souche qui porte le nom W303.1B. Cette souche est haploîde (mating type alpha) et porte comme mutations connues Ura3, Ade 2, His 1, Trp 1, Leu 2 ; elle respire normalement et est capable d'utiliser le galactose comme source de carbone. On reprend ici la construction des souches PES 1-3U et PES 1-3D. Souche PES 1-3U Cette souche haploïde (mating type alpha) est totalement isogénique à la souche W303.1B, sauf la région promotrice précédant la phase codante de la P450 Réd endogène, qui est modifiée par recombinaison homologue de façon à remplacer le promoteur naturel de la P450 Réd par le promoteur inductible GALlO-CYCI. La procédure utilisée pour obtenir cette souche recombinante est schématisée dans la Figure 3. a) La souche W303.1B est transformée (en utilisant la méthode standard au chlorure de lithium) avec un mélange de quatre fragments linéaires d'ADN obtenus après digestion exhaustive du vecteur pGPl-PC par Eco RI. Le seul fragment susceptible d'entrer en recombinaison avec les séquences naturellement présentes dans la souche, porte outre les bornes de recombinaison -la région 5' non codante de la P450 Réd et la région 5' codant de la P450 Réd- le gène marqueur Ura3 lié au promoteur GAL10-CYC1. Dans un premier temps ont été sélectionnés les marquants Ura +, pour tester l'intégration du marqueur dans le génome de la levure. b) Le deuxième crible consiste en la sélection des transformants Ura obtenus selon leur vitesse de croissance lente par rapport à W303 l.B en milieu complet glucosé et une croissance identique à W303 1.B en milieu complet galactosé. En effet, un niveau très faible de P450 Réd -qui est sous contrôle du promoteur GAL10-CYC1 après recombinaisonconduit à l'accumulation d'intermédiaires de synthèse de l'ergostérol dans la membrane cellulaire, ce qui a pour conséquence un abaissement considérable de la vitesse de croissance de la cellule. A l'inverse, une expression à haut niveau de la P450 Réd en milieu complet galactosé assurera une biosynthèse correcte de l'ergostérol, et devra présenter les mêmes caractéristiques de croissance que la souche sauvage. Un des clones répondant à ces critères a été choisi et stocké sous le nom de PES 1-3. c) Un révertant spontané du phénotype Ura + en Ura 3 a été sélectionné par une réplique faite sur un milieu contenant de l'uracile et de l'acide 5-fluoro-orotique. Un mutant stable URA- (taux de réversion inférieur à 10-7), indistinguable par tout autre critère de PES 1-3, est stocké sous le nom de PES 1-3U. d) Les caractéristiques relatives au phénotype recombinant du locus de la P450 Réd sont ensuite testés i) vérification du phénotype Ura 3 de la souche PES1-3U ii) amplification par PCR d'une bande de 2,2 kb en utilisant un premier primer situé à l'extrémité 3' du promoteur GAL10-CYC1 et un second primer situé à l'extrémité 5' du brin non-codant de la phase codante. iii) test du phétotype kétoconazole R en milieu complet galactosé, lié à la surexpression de la P450 Réd, par rapport au phétotype kétoconazole S en milieu complet glucosé. La souche PES 1-3D Cette souche est totalement isogénique à la souche PES1-2, à l'exception du locus sexuel qui a été changé en mating type a par la technique du plasmide HO selon la méthode publiée (Methods in Enzymology, vol 194, pp 132-146, et du locus de la P450 Réd. L'ensemble de la phase codante ainsi qu'une partie des séquences 5' et 3' flanquantes sont éliminés et le gène du marqueur TRP1 est introduit au niveau de la délétion. Une représentation schématique du locus recombine de la P450 Réd endogène est donnée en Figure 4. Conditions de Culture Les différentes souches sont cultivées à 28"C sous une agitation modérée (agitateur rotatif à 100rpm) dans un milieu semisynthétique, composé comme suit - milieu SWA6 : D-glucose 20 g/l (w/v), Yeast nitrogen base (Difco) 0,7% (w/v), Hydrolysat acide de caséine 0,1% (w/v), adénine 40 mg/l, tryptophane 20 mg/l. - milieu SWAPS: D-Galactose 20 g/l (w/v), yeast nitrogen base (Difco) 0,7% (w/v), Hydrolysat acide de caséine 0,1% (w/v), adénine 40 mg/l, tryptophane 20 mg/l. 4) Transformation "en vol" de la souche recombinante PES 1-3U Une condition nécessaire lors de la conception du clonage par complémentation fonctionnelle est l'obtention d'un nombre suffisamment grand de transformants dans la levure de façon à y trouver statistiquement un représentant d'ADNc rares de la banque préalablement enrichie selon la taille des ADNc. or, le taux de P450 Réd endogène présent dans la levure sauvage semble être strictement lié à la bonne transformabilité de cette levure. La surexpression de la P450 Réd endogène (culture de PES 1-3U en milieu galactose) ainsi que des niveaux très faibles ou l'absence de P450 Réd (culture PES 1-3U en milieu glucose ou PES 1-3D en milieu glocose/galactose) baissent de façon considérable la transformabilité de ces souches mutantes.On décrit ici un protocole qui résoud les problèmes de transformation liés à la concentration en P450 Réd : Après une culture de nuit (2 x 107 cellules/ml de la souche PES 1-3U) en milieu galactose permettant la surexpression de la P450 Réd, les cellules sont collectées par centrifugation, lavées et 106 cellules/ml sont replacées en milieu glocose où l'expression du gène de la P450 Réd endogène sous contrôle du promoteur gal 10-cycl est réprimée. La culture est ensuite continuée pendant 5 h (environ 107 cellules/ml), le temps nécessaire pour que le taux initial en P450 Réd retombe à un niveau résiduel correspondant à celui de la souche sauvage. A ce moment, les cellules sont collectées par centrifigation, lavées et utilisées pour la transformation selon la méthode standard chlorure de Lithium, décrite dans la littérature. Après transformation, les cellules sont maintenues en milieu glucosé, ce qui fait tomber à zéro le taux de P450 Réductase endogène présent dans les cellules au moment de la transformation. Ensuite, on procède à la complémentation fonctionnelle ci-après décrite. 5) Complémentation fonctionnelle dans les souches PES l-3U et PES 1-3D Après transformation de la souche PES l-3U avec 10 ug de la banque d'ADNc dans le vecteur pFL61 selon la procédure décrite ci-dessus, les cellules sont étalées sur 20 boîtes Ura , pour sélectionner dans un premier temps pour la présence d'ADN plasmidique dans les levures transformées, le gène Ura3 présent sur le vecteur de clonage permettant de complémenter le phénotype Ura de la cellule récipiente.Environ 2 x transformants initiaux sont ainsi obtenus, répartis en deux pools et ensuite étalés en deux séries indépendantes en double sélection sur des boîtes uraet comprenant 0, 5, 10, 20 ou 50 ug/ml de kétoconazole pour tester la présence d'une activité P450 Réd dans les transformants initiaux. 52 clones de transformants indépendants secondaires, pouvant complémenter le phénotype Ura et pouvant pousser en présence de 10 ou 20 ug/ml de kétoconazole ont été isolés et resélectionnés sur milieu SWA-6/kétoconazole 10 ug/ml. 24 clones ont été choisis au hasard pour des minipréparations d'ADN plasmidique selon des méthodes standard, qui sont ensuite utilisées pour transformer une souche d'E. coli (DH5-1).Les clones résistants à l'ampicilline (gène bla porté par le vecteur pFL61) ont été sélectionnés et leur ADN plasmidique analysé par double digestion Bam HI/Hind III après amplification. Selon leur profil de restriction (représentation schématique en Figure 5), les 24 clones ont été répartis en 5 classes différentes. La taille des inserts a été estimée être comprise entre 2 et 3kb, ce qui correspond à la taille attendue après le pré-fractionnement. Afin d'étudier le caractère héréditaire du phénotype conféré par 1'ADN végétal transformé, 4 membres de chaque classe établie sur la base du profil de restriction ont été choisis au hasard pour la transformation de la souche PESl-3D, dans laquelle le gène de la P450 Réd a été disrupté. Après transformation de 10 ug d'ADN plasmidique provenant des quatre membres différents des classes A, B, C, D et E dans la souche PES1-3D, les cellules sont étalées sur une série de 4 boîtes SWA6/agarose contenant 0, 20, 40 ou 80 ug/ml de kétoconazole. Les transformants issus des classes A, B, C et E ont montré une résistance au kétoconazole jusqu'à 40 ug/ml, un niveau comparable àm celui de la souche PES1-3 cultivée en milieu SW A5 (réductase endogène exprimée).Les transformants issus de la classe D ont été incapables de pousser en présence de kétoconazole et ont été abandonnés. 6) Dosage enzymatique de l'activité P450 Réd dans la fraction microso male provenant des 4 classes de transformants de PES 1-3D résistants au kétoconazole Les cultures (250 ml) de PS1-3U, transformées par les classes A, B, C et E sont arrêtées lorsqueola densité cellulaire est de é,5 x 107 cellules/ml. Après centrifugation 5 min à 2500 g, le culot cellulaire est suspendu dans 35 ml de tampon 50 mM Tris-HCl pH 7,4,5 mM EDTA, 100 mM KC1, 20 mM bêta-mercaptoéthanol, incubé à 20"C pendant 10 min, puis recentrifugé à 10000 g pendant 3 min.Après lavage dans 35 ml de tampon de casse (50 mM Tris-CHl ph7,4,1 m EDTA, 0,6 M Sorbitol), le culot est resuspendu dans un volume de tampon de casse égal à celui du culot, puis sont ajoutées des billes de verre (Braun, diamètre 0,45-0,5 mm) en une quantité juste suffisante pour affleurer la surface de la suspension cellulaire. Les tubes sont fermés hermétiquement et secoués violemment sur agitateur horizontal à une vitesse de 3 coups par seconde durant le temps nécessaire pour que plus de 70% des cellules soient cassées. 3 ml de tampon de casse sont alors ajoutés au mélange, les tubes sont vortexes brièvement puis le liquide présent entre les billes est transféré dans un autre tube. L'extraction est répétée deux fois avec 3 ml de tampon de casse, et les surnageants sont transférés dans le même tube. L'ensemble des extraits est centrifugé 15 min à 10000 g. Le surnageant est transféré dans un autre tube et le volume est ajusté à 10 ml avec du tampon de casse. Trois cents microlitres d'une solution de NaCI 4M sont ajoutés, puis 3,5 ml d'une solution à 40% (w/v) polyéthylène glycol-4000. Après incubation de 15 min à 0 C et centrifugation à 10 min à 10000 g, le surnageant est soigneusement écarté sans perturber le culot (qui contient les microsomes), puis on rince tube et culot avec un faible volume de tampon de reprise (50 mMTris-HCl pH 7,4 1 mM EDTA, 20% glycérol) afin d'éliminer les traces de polyéthylène glycol. Le culot ainsi obtenu est resuspendu et homogénéisé dans 1 ml de tampon de reprise, puis la suspension est aliquotée par 200 ul pour conservation à -80 C. L'activité de la P450 Réd contenue dans la fraction microsomale est mesurée par une cinétique de réduction d'un sustrat non-physiologique, le cytochrome c de coeur de cheval (Sigma type vr). Le mélange réactionnel contient dans 1 ml de volume final : 2 à 10 ul d'une solution diluée 30 fois de microsomes, 10 pM cytochrome c, 100 ug/ml NADPH dissous dans 50 mM Tris-HCl pH7,4, lmM EDTA. L'activité est calculée en utilisant un coefficient différentiel de 21 mM 1 à 550 nm. Une unité d'activité P450 Réd est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire à la réduction de 1 nmole de cytochrome c/min à 200C. L'activité est rapportée à la quantité totale de protéines microsomales présents dans la réaction qui a été préalablement déterminée par le test BCA de PIERCE. Les activités obtenues sont montrées dans la Figure 6 : tous les clones obtenus par complémentation fonctionnelle expriment une activité de type P450 Réd au moins 3 fois supérieure au bruit de fond mesuré dans la souche déficiente en P450 Réd, transformée avec un vecteur vide. Le clone B ayant montré le même phénotype de résistance au kétoconazole que les clones A, C et E, il faut en conclure qu'environ un tiers de l'activité P450 Réd mesuré dans la souche sauvage est suffisant pour établir ce phétotype dans la souche déficiente après transformation. 7) Détermination de la séquence nucléotidique des inserts d'ADNc dans le vecteur pFL61 isolés à partir des 4 classes de transformants de PES 1-3D résistants au kétoconazole. Un clone de chaque classe (A, B, C, E), qui auparavant était résistant au kétoconazole et montrait aussi une activité significative de P450 Réd, a été choisi au hasard et I'ADN plasmidique a été préparé à partir d'une miniculture par des méthodes standard. Les fragments correspondant aux ADNc végétaux insérés ont été purifiés par élution de gel d'agarose après digestion du vecteur avec Not I. Les fragments ainsi obtenus sont ensuite sous-clonés dans le vecteur pUC19/NotI, linéarisé par Note. Ce vecteur est dérivé du vecteur standard pUCl9 et caractérisé par les modifications suivantes: Un site NotI unique est créé par la ligation de linkers NotI au vecteur pUCl9 linéarisé en Hindi dans le polylinker, suivi de la recirculation.Le vecteur ainsi obtenu est ensuite linéarisé en EcoRI, les bouts 5' sortants sont rendus francs pr la Klenow polymérase, puis ensuite religés, ce qui rétablit la phase ouverte dans le gène LacZ. Ainsi ce vecteur permet un double criblage après transformation dans une cellule hôte les colonies blanches poussant sur un milieu complémenté Ampicilline X-Gal et IPTG contiennent le vecteur (le gène de la résistance à l'ampicilline est porté par le plasmide) dont la phase ouverte du gène LacZ a été détruite par l'insertion d'un fragment d'ADN au niveau du polylinker (p. ex. site NotI). Après transformation, les transformants obtenus pour chaque classe sont testés sur la présence d'ADNc inséré par restriction enzymatique, puis sont ensuite utilisés pour le séquençage. La séquence nucléotidique de l'insert entier d'un représentant de chaque classe (A, B, C, E) a été déterminé par séquençage sur ADN double-brin selon une méthode de Sanger modifiée en utilisant la T7 polymérase fournie pr BRL, exactement dans les conditions décrites par le fournisseur. Partant des primers universels situés en 5' et 3' du site d'insertion sur les deux brins du vecteur, la séquence complète a été obtenue par progression graduelle en utilisant des oligonucléotides séquence-spécifiques, dérivés de la partie 5' des séquences nouvellement lues sur les deux brins. La région codante des clones A, C et E étant identique, le séquençage de l'insert complet a été poursuivi avec les clones B et C.La séquence nucléotidique comprenant les régions 5' et 3' flanquantes et la région codante entière à partir du premier ATG suivi de la phase de lecture ouverte pour les clones B et C est donnée dans les Figures 9 et 10. La numérotation des acides nucléiques est donnée dans la colonne de droite, la numérotation des acides aminés est indiquée en dessous des acides aminés Concernant les séquences décrites dans les Figures 9 et 10, plusieurs remarques peuvent être faites a) Malgré une homologie relativement faible de l'ordre de 36% avec des séquences de P450 Réd connues de levure (21) ou de l'homme (22) au niveau acides aminés déduits, l'identification des séquences d'ADNc isolées sur des critères de fonctionnalité comme étant P450 Réd a été aidée par l'existence de blocs de forte conservation dans tous les domaines fonctionnels auparavant décrits pour les eukaryotes supérieurs à l'exception des plantes. Ces domaines ont été identifiés sur la base de comparaison des séquences de P450 Réd connues avec celles d'autres flavoprotéines ainsi que sur la base de modifications chimiques des P450 Réd. (24) Haniu, M., Iyanagi, T., Legesse, K., et Shively, J.E. 1984 J. Biol. Chem. 259,pp 13703-13711 (25) Porter, T.D., et Kasper, C.B. 1986 Biochemistry 25, pp 1682-1687 (26) Porter, C.D. et Kasper, C.B. 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, pp 973-977 (27) Katagiri, M., Murakami, H., Yabusaki, Y., Sugiyama, T., Okamoto, M., Yanano, T. et Ohkawa, H. 1986, J. Biochemistry 100, pp 945-954 (28) Vogel, F. et Lumper, L. 1986, Biochem. J. 236, pp 871-878 Les localisations des sites de fixation du FMN (A1/A2) du FAD (B1/B2) et du NADPH (C) pour les P450 Réd végétales sont obtenus par comparaison à l'alignement selon Yabusaki et al, 1988 (21) et sont indiqués par crochets dans la Figure 12. b) Les séquences en acides aminés déduits des clones AraB et AraC ne montrent que 64% de conservation stricte entre elles-mêmes bien qu'ayant été criblées sur une fonction identique et provenant du même organisme. De plus, les deux ADNc clones montrent un pattern d'hybridation différent dans un southern génomique, suggérant qu'elles sont des produits de transcription de deux gènes bien distincts, présents en copie simple à des endroits différents dans le génôme d'Arabidopsis. Ceci est une indication très forte que les deux ADNc proviennent de gènes indépendants, et qu'il existe une pression sélective pour le maintien de deux protéines à fonction identique. Cette observation est renforcée par la différence de la troisième base du codon sur les acides aminés identiques (Figure 8): le choix de la troisième base est très proche de la distribution au hasard et largement inférieur au cas de gènes qui ont divergé il y a 300 millions d'années (Figure 8, colonnes 8 et 9). c) Du côté N-terminal, le clone B contient une extension significative de 25 acides aminés (soit 75 nucléotides), comprenant notamment un bloc de 7 sérines qui suit immédiatement le premier ATG. d) En utilisant l'algorithme de Kyte et Doolittle pour le calcul de l'index d'hydropathie, on peut déceler dans les deux séquences ARaB et AraC, un segment très hydrophobe dans la région NH2- terminale des deux protéines, composé d'une suite d'au moins vingt acides aminés hydrophobes. Ceci est un signal typique d'une protéines localisée dans le réticulum endoplasmique et a également été -décrit dans tous les P450 connus à ce jour. e) En utilisant le programme ISOELECTRIC fourni par Wisconsin GCG Software Package, la charge nete calculée des protéines putatives AraB et AraC déduits des séquences nucléotidiques, montre une différence très nette à pH physiologique (7,5): AraB est très proche de la P450 Réd humaine en termes de charge nette, AraC étant beaucoup plus acide. Ceci est une forte indication pour une interaction des deux P450 Réd d'Arabidopsis avec des classes de P450 distinctes et/ou une localisation subcellulaire différente, qui explique bien la pression sélective sur la maintenance des deux P450 Réd chez Arabidopsis. 8) Utilisation des ADNc de P450 Réd d'Arabidopsis pour le clonage d'autres P450 Réd végétales par cross-hybridation inter-espèces. Tenant compte du faible degré de conservation entre les P450 Réd eucaryotes connues (levure, rat, lapin, porc, truite, homme), il est aisément compréhensible que toutes les tentatives d'utiliser des sondes de P450 Réd connues pour isoler une P450 Réd par crosshybridation étaient vouées à l'échec. Les premières ADNc de P450 Réd végétale ont été utilisées pour le criblage d'une banque d'ADNc de topinambour sous conditions de stringence réduite pour tenir compte des variations inter-espèces. Des morceaux de nodules de topinambour qui ont été maintenus dans de l'eau à 4"C pendant 24h pour induire la synthèse d'ARNm de P450 Réd (12), ont servi comme matériel végétal pour préparer de l'ARNm total de topinambour selon des procédures standard. Une banque d'ADNc total de topinambour dans le phage lambda gt 10 a été obtenue selon la méthode d'OKAYAMA et BERK (13).Environ 20 000 pfu sont ensemencés par boîte petri contenant du milieu LB solide et ensuite transférés sur filtre nitrocellulose (Schleicher and Schuell, BA85). 400 000 pfu de la banque d'ADNc de topinambour sont criblés avec 500 ng d'ADNc purifié AraB, marqué à haute spécificité par random priming, selon les méthodes standard, mais à 50"C au lieu de 65"C pour tenir compte des divergences dans la séquence pour une protéine identique dans différentes espèces végétales. Les filtres sont/ ensuite lavés dans les conditions de stringence croissante jusqu'à disparition du signal d'hybridation nonspécifique. Plus précisément, les conditions d'hybridation permettant de détecter des séquences d'ADNc codant pour une protéine identique dans différentes espèces végétales sont les suivantes : Un lot de 10 filtres nitrocellulose est préhybridé à 50"C dans un four à hybridation dans une boîte tupperware fermée hermétiquement contenant 100 ml de solution de préhybridation sur un agitateur rotatif. La solution de préhybridation qui a été préalablement maintenue à 50"C contient par 100 ml : 10 ml 50x Denhardt's, 25 ml 20x SSPE, 5 ml 10% Sarcosyl, 0,5 ml ADN de sperme de saumon à 10 mg/ml dénaturé, 59,5 ml eau. La composition des ingrédients est tout à fait standard et décrite dans des livres de référence (24).La durée de préhybridation est de 2 heures minimum. La solution de préhybridation est ensuite éliminée et remplacée par le même volume de solution d'hybridation également préchauffée à 50"C. Cette solution est identique à la solution de préhybridation à l'exception de 1'ADN de sperme de saumon qui a été remplacée par 2,5 ug de sonde spécifique marquée radio activement par random priming, puis dénaturée par chauffage juste avant de l'ajouter à la solution d'hybridation. La durée d'hybridation est de 16 heures à 50"C sous agitation, puis on procède aux lavages : Le tampon d'hybridation est éliminé et remplacé par 200 ml d'une solution de lavage contenant lxSSPE, 0,1% SDS, 0,2% pyrophosphate et on laisse agiter à température ambiante pendant 20 minutes.On élimine cette solution, on la remplace par 200 ml de la même solution préchauffée à 50"C et on laisse agiter à 50"C pendant 20 minutes. Cette dernière étape est répétée au moins une fois, puis on égoutte les filtres, on enlève le liquide restant sur des feuilles de papier Whatman puis on scelle les filtres humides mais pas sèches dans un sac en plastique pour exposition. Les colonies qui avaient hybridé spécifiquement avec la sonde AraB, ont été mis en évidence par exposition en présence d'un écran "Chronex Lightening Plus" (Dupont), puis sont soumis à 2 tours supplémentaires d'hybridation. Les clones positifs après 3 tours d'hybridation ont été utilisés pour des minipréparations d'ADN et identifiés par analyse du profil de restriction. Des fragments de restriction choisis ont été purifiés par électrophorèse agarose LMT (low melting temperature), puis ligés dans le bactériophage M13mpl8.L'ADN phagique simple brin a été isole à partir de cultures de bactéries infectées, par précipitation au polyéhylène glycol, digestion à la protéinase K, extraction phénolique puis précipitation à l'éthanol. La séquence nucléotidique de 1'ADN simple brin a été déterminée par la méthode de Sanger (20) en utilisant la T7 polymérase fournie par BRL dans les conditions indiquées par le fournisseur. Partant du primer universel, la séquence complète a été obtenue par progression graduelle en utilisant des oligonucléotides séquence-spécifiques, dérivés de la partie 5' des séquences nouvellement lues sur les deux brins. La séquence d'un clone choisi au hasard qui a été positif après 3 tours d'hybridation avec une sonde de P450 Réd d'Arabidopsis dans les conditioins décrites ci-dessus, est montrée en Figure 11. Plusieurs commentaires peuvent être faits a) Bien que le clone séquencé ne soit pas complet dans l'extrémité NH2 terminale de la protéine, l'ADNc de topinambour isolé par cross-hybridation avec un ADNc de P450 Réd d'Arabidopsis est irrévocablement identifié comme étant celui d'une P450 Réd de- topinambour, puisqu'il présente 69 respectivement i3% d'homologie au niveau des acides aminés avec les 2 P450 Réd végétales identifiées auparavant (Figures 6 et 10). b) Un alignement de la séquence des acides aminés de I P450 putative de topinambour avec les P450 Réd d'Arabidopsis montre une conservation particulière dans les domaines fonctionnels auparavant décrits pour les eukaryotes supérieurs à l'exception des plantes (Yabusaki et al, 1988). c) L'ADNc de la P450 Réd de Topinambour montre une homologie significatiement supérieure avec la forme d'AraC (73%) qu'avec la forme AraB (69%), ce qui laisse supposer l'existence de plusieurs gènes indépendants chez le topinambour, contrairement à ce qui a été rapporté dans la littérature pour les P450 Réd de mammifères. d) Compte tenu de la faible homologie de la P450 Réd de topinambour avec les P450 Réd connues de la littérature, il n'est pas possible d'isoler cet ADNc à l'aide de séquences d'ADNc de P450 Réd déjà connues de la littérature. LISTE BIBLIOGRAPHIQUE 1) Ortiz de Montellano, P.R. (ed.) 1986 Cytochrome P450 : Strcture, Mechanism and Biochemistry, Plenum Press, New York 2) Guengerich, F.P. et Macdonald, T.L. (1990) FASEB J. 4 : 2453-2459 3) Durst, F. 1991 Frontiers in Biotransformation (Ruckpaul, K and Rein, H., eds), Volume 4, 191-232, Akademie Verlag, Berlin 4) Zimmerlin, A. et Durst, F. 1990 Phytochemistry, 29, 1729-1732 5) Fonné-Pfister, R. et Kreuz, Kg 1990 Phytochemistry, 29, 2793-2797 6) Petersen, M. et Seitz, H.U. 1985 FEBS Lett., 188, 11-14 7) Ernster, L., Lind, C., Nordenbrand, K., Thor, H., et Orrenius, S. dans Oxygen Metabolism and Oxygen Metabolism (Nozaki, M., Yamamoto, S., Ishimura, Y., Coon, M. Ernster, L., and Eastabrook, R., eds) pp 357-369, Academic Press, Orlando) 8) Fujita, M. et Ashai, T. 1985 Plant Cell.Physiol. 26, pp 397-405 9) Benveniste, I., Gabriac, B. et Durst, F. 1986 Biochem. J. 235, pp 365-373 10) Benveniste, I. 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Procédé de clonage d'une séquence d'ADN codant pour une NADPH Cytochrome P450 Réductase d'un organisme, notamment de plantes, caractérisé en ce que 1- On soumet une souche de levure transformée avec des plasmides d'une banque d'ADNc total dudit organisme, notamment de ladite plante, et ayant un phénotype de déficience en activité NADPH-Cytochrome P450 Réductase endogène, à un traitement avec un inhibiteur de cytochrome P450 à une dose qui rend léthale l'absence d'activité NADPH Cytochrome P450 Réductase endogène, puis 2- On récupère les clones survivants et on en extrait les plasmides permettant l'expression d'une activité NADPHCytochrome P450 Réductase qui correspond à la NADPHCytochrome P450 Réductase dudit organisme, notamment de ladite plante. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène de la NADPH Cytochrome P450 Réductase endogène de levure est mis sous le contrôle d'un promoteur inductible et à l'étape 1, on réalise successivement les sous-étapes suivantes l-a) On transforme une souche de levure avec des plasmides d'une banque d'ADNc total dudit organisme, notamment de ladite plante, puis l-b) On induit la déficience en activité NADPH-Cytochrome P450 Réductase endogène en inactivant ledit promoteur, et l-c) On soumet ladite souche à un traitement avec ladite dose d'inhibiteur de cytochrome P450. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que, à l'aide des plasmides récupérés à l'étape 2, on transforme une souche de levure dans laquelle le gène de la NADPH cytochrome P450 Réductase endogène a été délété et on réitère un traitement avec in inhibiteur de cytochrome P450 à une dose qui rend léthale l'absence d'activité NADPH cytochrome P450 endogène, puis on récupère les clones survivants et on en extrait les plasmides permettant l'expression d'une activité NADPH cytochrome P450 qui correspond à la NADPH cytochrome P450 Réductase dudit organisme, notamment de ladite plante. 4. Procédé selon la revendication 1 à 3 caractérisé en ce que la souche est une souche de saccharomyces cerevisiae. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'inhibiteur d'activité P450 est un inhibiteur de lanostérol 14-déméthylase tel qu'un composé azole antifongique, en particulier le kétoconazole. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'inhibiteur d'activité P450 tel que le kétoconazole est utilisé à une dose comprise entre 5 et 100 ,ug/ml de milieu de culture, de préférence entre 10 et 50 ug/ml. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'à l'étape 1 ; la banque d'ADNc est enrichie en NADPH-Cytochrome P450 Réductase d'intérêt, par fractionnement selon la taille, en ne conservant que les fragments de taille supérieure à 2 kpb. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'on clone la séquence d'ADNc codant pour une NADPH Cytochrome P450 Réductase d'Arabidopsis à partir d'une banque d'ANDc totale ou enrichie de ladite plante. 9. Procédé de clonage d'un gène de NADPH Cytochrome P450 Réductase de plante par hybridation sous condition de faible stringence avec un ADNc d'une NADPH Cytochrome P450 d'une autre plante obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8 à partir d'une banque d'ADNc total ou ou enrichie en fragments supérieurs à 2 kbp de ladite plante. 10. Séquences d'ADNc codant pour une NADPH Cytochrome P450 Réductase de plante obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Séquences d'ADNc codant pour des NADPH Cytochrome P450 Réductase d'arabidopsis ara-B ou ara-C, ou de topinambour heliantus tuberosus, telles que représentées aux Figures 9 à 11 respectivement. 12. Séquences d'ADN codant pour des NADPH Cytochrome P450 Réductase de plantes s'hybridant dans des conditions faiblement stringentes à 50"C et/ou présentant au moins 60% d'homologie avec l'une des séquences selon les revendications 10 ou 11.