Brevet FR2685956A1 — publié le 19930709

Procédé et dispositif de test par agglutination de particules La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour détecter un agent à reconnaître par analyse (ci-après dénommé simplement "agent") dans un échantillon, sur la base d'une réaction de forma- tion d'un complexe au sein de la matrice d'un milieu fibreux La présence ou l'absence d'un agent spéci- fique est déterminée par la présence ou l'absence d'une réaction de type agglutination d'un réactif attaché à des particules, qui est spécifique à l'agent à détecter. On a déjà proposé des procédés de dosage d'agent basés sur des réactions de formation de complexes, par exemple de formation d'un complexe anticorps/ antigène et l'immobilisation de ces complexes dans un milieu support Par exemple, un dispositif de test analytique est décrit dans la demande de brevet internationale WO-A-88/08534, o un réactif marqué devient lié à un support poreux dans une certaine zone de celui-ci lorsque l'agent recherché est pré- sent. L'un des critères importants, lorsque l'on déve- loppe de tels procédés et de tels dispositifs, est la taille des pores et diverses autres propriétés du milieu poreux à utiliser en liaison avec le type de fluide ou d'échantillon fluide à étudier Une taille de pore plus fine du milieu poreux conviendrait à la détection d'antigènes ou d'anticorps dans des flui- des fins tels que l'urine, tandis que des échantil- lons visqueux tels qu'un sérum ou des échantillons alimentaires nécessiteraient un milieu présentant une taille de pore plus importante. Il serait intéressant de pouvoir développer des procédés de test qui soient moins dépendants de l'aptitude du fluide échantillon à traverser le milieu Il serait également intéressant de pouvoir disposer d'un procédé et d'un dispositif plus uni- versels, capables de détecter différents types d'agents, par exemple des bactéries, des virus, des antigènes, des haptènes ou un matériel génétique. L'un des buts de la présente invention est de pro- poser un procédé simple et rapide pour détecter un agent dans un échantillon Un autre but de la pré- sente invention est de proposer un dispositif plus universel permettant de détecter des agents dans une gamme variée d'échantillons, en particulier vis- queux, qui soit fiable et peu coûteux à fabriquer. La présente invention propose un procédé et un dispositif pour détecter un agent dans un échantil- lon Le procédé comprend les étapes consistant à appliquer un échantillon à tester à une zone d'échantillon d'un milieu poreux et à faire migrer des particules auxquelles est attaché un réactif spécifique à l'agent à détecter au travers du milieu Lors de la migration, les particules traver- sent la zone d'échantillon et, si l'agent recherché est présent, il va se produire une réaction de for- mation d'un complexe entre le réactif et l'agent Le complexe, s'il s'en forme un, est immobilisé dans la zone d'échantillon Une surface contenant les parti- cules immobilisées est alors observée dans la zone d'échantillon Si l'agent recherché n'est pas pré- sent, les particules vont continuer à migrer au tra- vers de la zone d'échantillon et il ne se formera aucune surface que l'on puisse distinguer Il est possible de rendre la surface distinguable par le fait que les complexes rendent eux-mêmes la surface optiquement observable, ou bien qu'ils la rendent optiquement observable par une réaction ultérieure. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, on donne aux particules une couleur, de sorte que les complexes piégés comprenant les particules rendent la surface observable. L'un des avantages du procédé tient au fait que le fluide échantillon, en tant que tel, n'a pas besoin de présenter une très grande aptitude à la diffusion au travers du milieu poreux; il est simplement nécessaire que l'échantillon puisse passer à travers la petite surface de la zone d'échantillon De ce fait, on peut étudier de très nombreux types de fluides échantillon. La migration des particules est de préférence opé- rée en appliquant tout d'abord les particules à une seconde zone du milieu poreux, géométriquement dis- tincte de la zone d'échantillon On applique ensuite une solution de lavage au milieu, qui entraîne les particules hors de cette seconde zone sur toute l'étendue du milieu poreux Lorsqu'elles passent à l'endroit de la zone d'échantillon, les particules sont immobilisées en raison de l'agglutination ou de la réaction de formation d'un complexe, ou bien continuent à migrer au travers de la zone d'échan- tillon avec la solution de lavage lorsqu'aucun agent n'est présent. Dans l'une des formes de mise en oeuvre, les par- ticules sont appliquées au milieu poreux dans la zone d'échantillon avant d'appliquer l'échantillon lui-même La solution de lavage traverse alors la zone d'échantillon et élimine par lavage les parti- cules lorsque l'agent n'est pas présent, ou sinon les piège après agglutination. Le présent procédé présente les avantages d'être rapide et simple L'utilisateur peut se contenter d'observer s'il se développe ou non une surface dis- cernable Par exemple, lorsque l'on utilise des par- ticules colorées, une surface colorée se forme dans la zone o l'échantillon a été appliqué. Le dispositif de la présente invention comprend un boîtier contenant un milieu poreux Le boîtier est de préférence en un matériau résistant à l'humidité ou non absorbant, tel qu'une matière plastique Le boîtier comporte en outre au moins une ouverture qui expose à l'extérieur une zone du milieu poreux pour l'application d'un échantillon Le milieu poreux contient également des particules revêtues d'un réactif spécifique à l'agent à détecter Les parti- cules sont capables de migration au travers du milieu Dans un mode de réalisation préféré, les particules sont contenues dans une zone de particu- les géométriquement distincte de la zone d'échantil- lon, quoique les particules puissent l'être dans la zone d'échantillon proprement dite Très avantageu- sement, les particules ont une couleur qui contraste avec la couleur du milieu poreux. Le boîtier du dispositif de l'invention comprend en outre des moyens d'alimentation en communication avec une partie de la membrane poreuse, pour l'ap- plication d'une solution de lavage Ces moyens d'a- limentation comprennent, dans l'une des formes de réalisation, une seconde ouverture formée dans le boîtier, qui expose à lrextérieur la partie du milieu à laquelle on peut appliquer la solution de lavage De préférence, les moyens d'alimentation comprennent une chambre susceptible d'écrasement, formée d'une seule pièce avec le boîtier et qui con- tient la solution de lavage Lorsque l'on écrase une paroi interne de cette chambre, la partie d'alimen- tation du milieu poreux communique avec la solution de lavage. Le dispositif peut être conditionné et entreposé au laboratoire de façon simple Pour l'utilisation il peut être tenu à la main, l'échantillon à tester pouvant être appliqué par l'ouverture de la zone d'échantillon par exemple avec une pipette. Dans un autre mode de réalisation, le dispositif comporte une pluralité de bandes de milieu poreux, chaque bande possédant des particules revêtues d'un réactif différent spécifique d'un anticorps diffé- rent De cette manière, on peut tester pour le même échantillon la présence d'agents différents, par exemple différentes bactéries ou autres microorga- nismes. D'autres détails de l'invention apparaîtront à la lecture de la description ci-dessous, faite en réfé- rence aux dessins annexés. La figure 1 est un dessin schématique illustrant le principe de base d'un procédé selon la présente invention. La figure 2 montre une forme de réalisation du dispositif de la présente invention. La figure 3 montre un autre mode de réalisation du dispositif, comprenant une pluralité de bandes po- reuses. L'invention est, de façon très large, applicable à la détection de bactéries, d'antigènes, d'anticorps, de virus ou d'autres microorganismes Le réactif spécifique à l'agent particulier sera normalement un anticorps ou un antigène On trouve dans le commerce des antigènes ou anticorps monoclonaux et/ou poly- clonaux utilisables avec la présente invention. Le procédé de la présente invention peut être ex- pliqué à l'aide de l'illustration de la figure 1 Un échantillon 1, par exemple un échantillon bactérien à tester, est appliqué à une zone d'échantillon 2 d'un milieu poreux 10 Selon la viscosité de l'échantillon fluide, celui-ci pénètre plus ou moins profondément dans le milieu 10 Une pénétration com- plète n'est pas nécessaire; il est seulement impor- tant qu'au moins une partie de la matrice du milieu dans la zone d'échantillon contienne l'échantillon. Des particules 3 revêtues d'un réactif spécifique migrent alors au travers du milieu 10 Dans l'exem- ple de la figure 1, les particules migreraient dans une direction allant d'une première extrémité 5 à une seconde extrémité 6 du milieu 10. Lorsqu'elles traversent la zone d'échantillon 2, les particules 3, avec le réactif qui leur est rat- taché, vont réagir avec l'agent de l'échantillon 1 lorsque cet agent est présent Cette réaction de formation d'un complexe produit des complexes incluant les particules, qui sont alors piégées dans le milieu poreux 10 ou au voisinage de la zone d'échantillon 2 Une surface se développe alors à cet endroit, que l'on peut distinguer du reste du milieu poreux Les complexes constituent eux-mêmes la surface optiquement observable, par exemple en prévoyant des particules avec une matière qui est optiquement active, ou bien ils peuvent être rendus optiquement actifs, par exemple par des réactions de fluorescence ou de chimioluminescence Dans une forme de mise en oeuvre préférée, on utilise des particules qui possèdent par elles-mêmes une couleur autre que celle du milieu poreux Il est également possible de rendre la surface optiquement observable par réaction ultérieure des complexes formés avec une substance additionnelle, par exemple une matière fluorescente ou chimioluminescente ou une enzyme qui engendre ensuite une fluorescence ou une chimiolumi- nescence. Dans la forme de mise en oeuvre illustrée figu- re 1, on applique des particules colorées à une se- conde zone 4 du milieu poreux géométriquement dis- tincte de la zone d'échantillon 2 La migration des particules est réalisée en appliquant une solution de lavage au milieu poreux, par exemple à la pre- mière extrémité 5 du milieu poreux ou directement à la seconde zone 4 Les particules colorées sont alors emportées avec la solution de lavage lorsque celle-ci, par effet de mèche, se déplace le long du milieu en direction de la zone d'échantillon 2 Les particules colorées sont de préférence appliquées au milieu poreux avant application de l'échantillon à tester. Dans une autre forme de mise en oeuvre, il est également possible d'appliquer tout d'abord les par- ticules colorées dans la zone d'échantillon 2, puis d'appliquer ensuite l'échantillon à tester sur cette même zone La solution de lavage ou tampon de lavage est alors appliquée de manière à laver complètement la zone d'échantillon 2 Comme précédemment, si l'agent est présent il se forme des complexes agglu- tinés qui vont être retenus dans la zone d'échantil- lon et produire une surface colorée visible Si l'agent n'est pas présent, la zone d'échantillon est entièrement lavée par la solution tampon, ne lais- sant aucune couleur se développer et indiquant ainsi un résultat négatif. On peut également appliquer à la seconde zone 4 des particules colorées de deux couleurs différen- tes Dans cette forme de mise en oeuvre, on peut appliquer un réactif spécifique d'un premier agent à des billes d'une première couleur et un second réac- tif spécifique d'un second agent à des billes d'une seconde couleur Lors du lavage de la zone d'échan- tillon, plusieurs situations peuvent se produire Si l'un seulement des agents est présent dans l'échan- tillon, seules les billes possédant la couleur asso- ciée à cet agent seront piégées et produiront une surface colorée observable Il est également possi- ble que les deux agents soient présents, auquel cas les deux couleurs de billes seront piégées dans la zone d'échantillon On a également représenté sur la figure 1 des moyens d'absorption 7 placés de manière à communiquer avec le milieu poreux 10 à l'extrémité 6 Dans cette forme de mise en oeuvre, les moyens d'absorption renforcent l'effet de mèche de la solu- tion de lavage au travers de la zone d'échantillon 2 En général, les moyens d'absorption, qui sont de préférence constitués d'un tampon absorbant, sont situés à l'opposé de la zone d'échantillon 2 par rapport à la seconde zone 4 contenant les particules colorées De cette manière, lorsque l'on applique la solution de lavage, par exemple dans la seconde zone 4 ou au voisinage de celle-ci, un écoulement direc- tionnel de la solution de lavage s'établit en direc- tion des moyens d'absorption 7 et de ce fait au tra- vers de la zone d'échantillon 2. La solution de lavage ou tampon de lavage peut être une solution saline tamponnée par des phospha- tes, un soluté physiologique salin ou tout autre tampon physiologique approprié On utilise de préfé- rence une solution saline tamponnée par des phospha- tes On a également constaté que l'on pouvait in- clure de façon appropriée des détergents tels que le Triton (marque déposée) X 705 à 0,2 %, le Tween 20 à 0,3 % et le Triton X 100 à 0,1 %. Parmi les particules qui conviennent à la présente invention, on trouve les billes de latex, également désignées "microsphères" ou "microbilles" On a uti- lisé des billes d'un diamètre de 0,2 à 3 pm, bien que l'on ait constaté que des billes d'un diamètre d'environ 0,5 à environ 0,8 gm se soient révélées particulièrement appropriées Ces particules sont disponibles en diverses couleurs. Les particules ou billes peuvent être revêtues par le réactif de toute manière appropriée Le matériau réactif, formé de protéines ou de molécules, peut être soit adsorbé sur la bille de latex ou lié de façon covalente par couplage chimique Le procédé de couplage covalent est utilisé de façon préférentiel- le Les billes sont tout d'abord lavées par mise en suspension dans une solution saline tamponnée aux phosphates (PBS: Phosphate-Buffered Saline) et cen- trifugées Les billes lavées sont alors remises en suspension dans le PBS et une solution de glutaral- déhyde contenant l'anticorps, que l'on incube en- suite. Le milieu poreux 10 de la présente invention pré- sentera la propriété que les particules peuvent migrer librement au travers des pores du matériau lors de l'application de la solution de lavage. D'autre part, si l'agent à détecter, par exemple une bactérie, est présent dans l'échantillon, les com- plexes agglutinés vont être piégés dans la matrice. Le milieu poreux est de préférence un matériau hydrophile fibreux d'une fibre polymère Dans une forme de réalisation préférée, le matériau est une polyoléfine, de préférence le polyéthylène, le poly- propylène ou un copolymère éthylène-oléfine inféri- eure Un LLDPE (Linear Low Density Poly Ethylene: polyéthylène linéaire à faible densité) est préféré entre tous Parmi les polymères qui, de façon géné- rale, conviennent, on trouve ceux des oléfines com- prenant de 2 à 10 atomes de carbone Très préféren- tiellement, il s'agit d'un copolymère d'éthylène et de 0,5 à 8 % en poids, de préférence de 1 à 7 % en poids, d'un comonomère Les comonomères préféren- tiels sont des oléfines avec 4 à 10 atomes de car- bone, très préférentiellement 4 à 8 atomes de car- bone Le copolymère préféré entre tous est un copo- lymère d'éthylène et de 1-octène. Lorsque l'on utilise le polyéthylène, on le rend mouillable à l'eau ou hydrophile par addition d'une quantité appropriée d'un produit mouillant ou ten- sioactif Les produits mouillants peuvent compren- dre: a) un alkyl-phénol alkoxylé, avec un monoglycé- ride, diglycéride et/ou triglycéride en mé- lange, ou b) un ester d'acide gras de polyoxyalkylène, ou c) une combinaison de (b) et d'une fraction quel- conque de (a). De tels produits mouillants sont décrits dans le US-A-4 578 414 L'alkyl-phénol alkoxylé est de pré- férence un de ceux dont le groupe alkyle possède de 1 à 20 atomes de carbone, très préférentiellement environ 6 à environ 12 atomes de carbone Une chaîne polyéthoxy constitue la chaîne polyalkoxy préférée. Le glycéride mélangé est de préférence un glycéride d'un acide gras L'acide gras peut être saturé ou insaturé et il s'agit de préférence d'un mélange d'acides gras présentant une longueur de chaîne car- il bonée comprise dans la plage allant d'environ 12 à environ 18 atomes de carbone Parmi les produits mouillants particulièrement préférés, on trouve le Atmer 645, qui est un glycéride mélangé complexe avec adduction d'un acide gras à longue chaîne, dis- ponible auprès de ICI America, Inc Un autre produit mouillant est un monoester d'acide Z-9-octadécénoï- que et de 1,2,3-propanetriol, disponible auprès de Dow Chemical sous la référence XU 61518 10. Les substances décrites ci-dessus peuvent être traitées de toute manière appropriée pour former le milieu poreux de la présente invention Le matériau hydrophile fibreux préférentiel peut être réalisé par exemple à partir de fibres, de préférence à par- tir de fibres filées, en particulier de fibres filées fondues La forme préférée entre toutes du matériau de la présente invention est celui produit par soufflage-fusion du copolymère d'éthylène préfé- rentiel mentionné plus haut avec un produit mouil- lant. Le matériau fibreux ainsi formé peut se présenter sous la forme d'un tissu ou d'un tampon et peut être calandré On a cependant constaté qu'un matériau non calandré était plus efficace, et c'est donc ce der- nier matériau que l'on utilisera de préférence. Le matériau hydrophile fibreux préférentiel selon la présente invention possède une ou plusieurs des propriétés suivantes prises en combinaison, avec les plages larges et préférentielles mentionnées ci-des- sous. Propriété Plage large Plage préférentielle Teneur en produit mouillant dans la composition de polyéthylène (% en poids) Diamètre de fibre (pm) 0,5 à 5,0 1,0 à 15 0,6 à 3,0, en part env 1,0 2 à 11 CWST des fibres soufflées fondues (x 10-5 N/cm) Taille des pores du matériau de la fibre, selon ASTM F 316-80 (pm) Volume d'eau retenue/ volume de matériau 0,6 à 0,95 0,7 à 0,9, en part env 0,85 Poids spécifique du matériau (g/m 2) lg/pied carrél Traitement (calandré ou non) de préférence non calandré Épaisseur (cm) 0,01 à 0,07 0,02 à 0,06, en part env 0,03 Les particules revêtues de réactif peuvent être appliquées au milieu poreux de toute manière appro- priée Lorsque le milieu doit être conservé avant utilisation, les particules peuvent être appliquées à 120 à 120 3 à 300 à 20 à 90 l 2 à 8 l à 40 l 3 à 4 l dans une solution de sucrose On va donner ci-des- sous un exemple d'application des particules. On applique au milieu une solution de sucrose à à 300 mg/ml au moyen d'un applicateur chromato- graphique à couche mince Camag, ou à la main au moyen d'une pipette Dans cet exemple, on a appliqué sous forme d'une bande au milieu poreux environ 2 à Jl/cm d'une solution de sucrose à 200 mg/ml Le milieu a été ensuite étuvé à 400 C pendant 1 heure. Les billes sont appliquées à la bande dans une solution de sucrose à 20 à 100 mg/ml Dans l'exemple o l'on utilisait une pipette, on a appliqué à la bande de sucrose les billes de latex dans du sucrose à 50 mg/ml On a utilisé approximativement 5 à 10 gl de billes de latex/cm Le milieu a été alors laissé à sécher à l'air à la température ambiante. Comme on peut le voir d'après cet exemple, les particules peuvent être appliquées en surface du milieu poreux ou, comme illustré figure 1, sur toute la profondeur du milieu Lorsque la solution de lavage est appliquée au voisinage des billes fixes, elle migre aisément hors de la zone de fixation et le long du milieu poreux. Sur la figure 2, on a illustré un mode de réalisa- tion d'un dispositif selon la présente invention Le dispositif comprend un boîtier 20, de préférence en un matériau résistant à l'humidité ou non absorbant. Le boîtier contient le milieu poreux 10 et possède au moins une ouverture 21 qui expose à l'extérieur une zone 2 du milieu poreux pour application de l'é- chantillon à analyser Le milieu poreux possède une zone 4 contenant des particules revêtues d'un réac- tif spécifique à l'agent à détecter Comme indiqué plus haut, la zone contenant les particules 4 peut, si on le désire, coïncider avec la zone d'échantil- ion 2. * Comme on l'a mentionné précédemment, les particu- les peuvent porter un matériau additionnel qui leur est fixé et qui rend, lorsqu'il est formé, le com- plexe optiquement discernable ou observable, soit directement soit à la suite d'une réaction subsé- quente Les particules peuvent posséder par elles- mêmes une couleur distincte de la couleur du milieu poreux, ce qui permet d'observer visuellement les complexes piégés Ces particules colorées consti- tuent la forme préférentielle. Il est également possible de prévoir pour les par- ticules au moins deux couleurs différentes, l'une des couleurs de bille possédant un réactif spécifi- que de l'un des agents et l'autre couleur de bille possédant un réactif spécifique d'un second agent. De cette manière, on peut tester simultanément dans un échantillon la présence ou l'absence de deux agents différents. Le boîtier comporte en outre des moyens d'alimen- tation en communication avec une partie du milieu poreux, permettant d'appliquer une solution de lavage Comme illustré sur le mode de réalisation de la figure 2, ces moyens d'alimentation comprennent une seconde ouverture 22 formée dans le logement, qui expose à l'extérieur une partie d'extrémité 5 du milieu poreux En variante, les moyens d'alimenta- tion peuvent comprendre un tampon absorbant tel qu'un tampon d'alimentation (non illustré sur la figure 2) Le tampon d'alimentation contenant une solution tampon peut être situé dans le boîtier et placé en contact direct avec l'extrémité 5 de la bande 10. Dans un autre mode de réalisation (non repré- senté), les moyens d'alimentation peuvent comprendre une chambre susceptible d'écrasement contenant la solution de lavage, formée d'une seule pièce avec le boîtier 20 La chambre est configurée par exemple de manière à entourer la première extrémité 5 du milieu poreux Sous l'effet de l'application externe d'une pression, une paroi interne de la chambre s'écrase, permettant à la solution de lavage de venir en con- tact avec la partie d'extrémité 5 du milieu poreux. Dans ce mode de réalisation, le dispositif ne com- porte qu'une ouverture vers l'extérieur. Le milieu poreux du dispositif de la figure 2 a été illustré sous forme d'une bande allongée de matériau Il est également possible de prévoir pour ce dispositif une pièce circulaire en forme de dis- que du milieu poreux enfermée dans un boîtier circu- laire (non représentée) Dans un tel mode de réali- sation, l'ouverture 22 d'application de la solution de lavage se trouverait au centre du boîtier circu- laire, de manière à exposer une partie centrale du milieu fibreux La zone 4 contenant les billes est alors configurée circonférentiellement autour de l'ouverture centrale 22 et comprend une région annu- laire La zone d'échantillon 2 est alors présentée radialement encore plus à l'extérieur, en direction radiale, par rapport à la zone des billes 4 La périphérie externe du milieu poreux circulaire est alors placée en contact avec une partie de matériau absorbant en forme d'anneau 7 afin de jouer le rôle de promoteur de la migration des billes radialement vers l'extérieur, au travers de la zone d'échantil- lon 2. Comme illustré sur la figure 2, le milieu poreux se présente sous forme d'une bande allongée avec une première extrémité 5 et une seconde extrémité 6 On peut utiliser toute dimension appropriée pour la bande, par exemple 1 cm sur 6 cm L'épaisseur est typiquement comprise entre 0,02 et 0,06 cm. La zone 4 des particules est située adjacente à la première extrémité 5, tandis que la zone d'échantil- lon est située en une position intermédiaire entre la zone des particules 4 et une seconde extrémité 6. Comme on peut également le voir sur la figure 2, des moyens d'absorption, en particulier un tampon absor- bant 7, sont placés dans le boîtier en contact avec la seconde extrémité 6 de la bande La suction du tampon absorbant aide au flux directionnel des billes au travers du milieu poreux dans la direction longitudinale vers la seconde extrémité 6 Le milieu poreux 10 est situé, ici encore, de façon préféren- tielle sur une partie de base non absorbante 23 du boîtier 20. Dans certaines situations, il peut être avantageux de pourvoir le dispositif d'une zone de contrôle positif x située au voisinage de la seconde extré- mité 6 de la bande allongée 10, ou à l'endroit de cette extrémité (voir figure 1) La zone témoin per- met de vérifier que les billes 3 ont effectivement traversé par migration la zone d'échantillon 3 La zone témoin x peut contenir l'agent bactérien recherché, qui va produire la réaction de formation d'un complexe avec les billes et indiquer donc un résultat positif dans la zone x En variante, on peut placer du glutaraldéhyde dans la zone x, qui viendrait alors se lier au moins à une partie des billes de latex lorsque celles-ci traversent par migration cette zone. Le dispositif de la présente invention peut être également réalisé sous forme d'un dispositif pour tests multiples Une telle forme de réalisation est illustrée figure 3 Le milieu poreux se présente sous forme d'une pluralité de bandes allongées enfermées dans un boîtier 201 Les bandes sont pla- cées à l'intérieur du boîtier de manière à éviter tout contact de fluide entre les bandes Une ouver- ture ou puits commun 221 expose une première extré- mité 51 de chacune des bandes allongées pour l'ap- plication de la solution de lavage Les zones de particules 41 des bandes contiennent des particules colorées, les particules de chaque bande étant revê- tues d'un réactif spécifique d'un agent différent. Comme dans le mode de réalisation précédent, cha- cune des diverses bandes est disposée de manière à se trouver en communication avec un tampon absorbant 71 Le boîtier est également pourvu d'une ouverture 212 pour exposer la zone d'échantillon du milieu poreux de chaque bande Comme illustré sur la figure 3, le dispositif de tests multiples comporte cinq bandes allongées distinctes du milieu poreux Le même échantillon peut ainsi être testé simultanément afin de détecter cinq types d'agent différents, par exemple cinq bactéries différentes On peut égale- ment tester la présence d'un même agent particulier, par exemple Listeria, dans cinq échantillons diffé- rents. Le mode de réalisation à tests multiples de la présente invention peut être également configuré sous forme circulaire (non représenté) Le milieu poreux se présente sous forme d'une couche circu- laire enfermée dans un boîtier, avec une ouverture au centre pour l'application de la solution de lavage Une pluralité de zones de particules conte- nant des particules colorées sont disposées dans la couche circulaire en une pluralité de positions angulaires, à une première distance radiale du cen- tre La solution de lavage migre ensuite radialement vers l'extérieur depuis le centre, en traversant les zones de particules Une zone d'échantillon est dis- posée radialement, à l'extérieur de chaque zone de particules, à une seconde distance radiale du centre qui est supérieure à la première distance radiale. Des ouvertures sont formées dans le boîtier afin d'exposer chacune des zones d'échantillon Les mo- yens d'absorption de cette forme de réalisation cir- culaire du dispositif comprennent un matériau d'ab- sorption en contact avec la périphérie externe de la couche circulaire du milieu poreux. L'exemple ci-dessous va permettre d'illustrer la mise en oeuvre de la présente invention. Exemple Cet exemple illustre la détection d'une bactérie dans un échantillon, le réactif étant un anticorps spécifique de la bactérie L'échantillon bactérien contenait une souche HB 101 d'Escherichia Coli Pour un essai témoin, on a utilisé la bactérie Micrococ- cus Sp On a utilisé des anticorps anti-E Coli de lapin, disponibles auprès de Dako Ltd, Buckinghams- hire, Royaume-Uni. L'anticorps a été lié à des billes de latex de 0,55 pm de diamètre, qui ont été colorées en bleu. Les billes ont été obtenues auprès de Polysciences Ltd, Northhampton, Royaume-Uni Un volume de 1 ml de billes de latex ( 2,5 % en poids) à 2, 5 % en volume a été transféré dans un tube de centrifugation Eppen- dorf Le tube a été rempli d'un soluté salin tam- ponné aux phosphates (PBS) présentant un p H de 7,2 et contenant 150 m M de Na Cl, 50 m M de Na 2 HPO 4 et 8 m M de Na H 2 PO 4 La suspension de billes a été centrifugée et le surnageant a été jeté Les billes ont été en- suite lavées deux fois en les remettant en suspen- sion dans du PBS et en les centrifugeant à nouveau. Le granule de billes de latex a été remis en sus- pension dans 1 ml de glutaraldéhyde à 8 % (en volu- me) de qualité "microscopie électronique" dans du PBS Les billes de latex remises à nouveau en sus- pension ont été ensuite laissées incuber une nuit à la température de la salle, avec agitation modérée. Après incubation, les billes ont été lavées par sus- pension à nouveau dans du PBS et centrifugation à nouveau Les billes de latex lavées ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS et 400 Fg de solution d'anticorps La suspension a été mise à incuber pen- dant 4 heures à la température de la salle, avec agitation modérée. Après incubation des billes de latex avec la solu- tion d'anticorps, les billes ont été centrifugées et le surnageant a été jeté Le granule de billes de latex a été alors remis en suspension dans 1 ml de sérumalbumine bovine et incubé pendant 10 mn à la température de la salle Les billes de latex ont été ensuite centrifugées et le granule de billes a été remis en suspension dans 1 ml de soluté PBS Le gra- nule de billes de latex a été remis en suspension dans 1 ml de solution contenant 10 mg/ml de sérumal- bumine bovine, 0,1 % de Na N 3 et 5 % (en volume) de glycérol. On a préparé le milieu poreux sous forme d'une bande de 1,5 cm sur 5 cm de matériau de membrane "h HDC" disponible auprès de Pall Corporation sous la référence P/N HHDC 4 G 5 Le matériau est un milieu hydrophile fibreux à base de copolymère d'éthylène, comme décrit dans le US-A-4 578 414 On a dilué une culture d'une nuit de souche HB 101 d'Escherichia Coli dans du PBS afin de donner une concentration cellu- laire approximative de 106 bactéries/ml On a appli- qué directement 10 ml de cette suspension bacté- rienne (approximativement 104 bactéries) à une zone d'échantillon de la bande h HDC Un certain nombre de bandes ont été préparées de cette manière, qui représentaient les bandes de test Des bandes témoin ont été préparées en utilisant du PBS ne contenant pas de bactérie, ou contenant Micrococcus. Après avoir ainsi chargé les bandes h HDC, on a appliqué 10 Al de la suspension de billes de latex, contenant des billes couplées à l'anticorps, à 1 cm de l'extrémité de chaque bande opposée à celle o l'échantillon avait été appliqué On a placé des tampons absorbants en contact avec les bandes immé- diatement derrière l'extrémité à laquelle l'échan- tillon a été chargé On a appliqué 200 ml de soluté PBS en tant que solution de lavage à chaque bande au voisinage du point o la suspension des billes avait été chargée Le PBS s'est alors déplacé par effet de mèche le long des bandes en direction de la zone d'échantillon On a enregistré la présence ou l'ab- sence d'une surface colorée se développant après la migration des billes. Les bandes d'essais chargées par E Coli ont réagi avec les billes bleues de 0,55 gm revêtues de l'anti- corps anti-E Coli, produisant ainsi une zone d'ag- glutination observable de façon distincte Une sur- face colorée en bleu, résultant de l'immobilisation des complexes comprenant les billes bleues, était visible dans la zone o l'échantillon de E Coli avait été appliqué, ainsi qu'autour de cette zone. Lorsque l'on a testé des bandes témoin chargées de PBS ou par Micrococcus, aucune réaction d'agglutina- tion n'a été observée, c'est-à-dire qu'aucune sur- face bleue ne s'est développée Pour l'essai selon les enseignements de l'invention, une surface colo- rée en bleu, observable de façon distincte, s'est développée en 1 à 3 mn Pour les essais témoin, les billes avaient complètement migré au travers de la zone d'échantillon et jusqu'au tampon absorbant sans formation d'un complexe en 1 à 3 mn. De nombreux essais selon les enseignements de l'invention ont été effectués pour détecter E Coli, avec des essais témoin et d'autres bactéries, sans donner aucun faux positif ni faux négatif Tous les résultats positifs ou négatifs ont pu être claire- ment distingués comme étant des positifs ou des négatifs La procédure de test illustre bien que ce procédé est rapide et simple, et qu'il est capable de détecter de façon fiable des quantités relative- ment faibles de bactéries (environ 104 E Coli). REVENDICATIONS 1 Un procédé pour détecter un agent par analyse, ce procédé étant caractérisé par les étapes consis- tant à: a) appliquer sur une zone d'échantillon ( 2) d'un milieu poreux ( 10) un échantillon ( 1) dont on veut tester la présence de l'agent, b) faire migrer au travers de ce milieu des parti- cules ( 3) auxquelles est attaché un réactif spécifique de l'agent, une réaction de forma- tion d'un complexe du réactif avec l'agent se produisant dans la zone d'échantillon si l'agent est présent, de manière à immobiliser lesdites particules, et c) observer une surface contenant les complexes formés dans la zone d'échantillon, les com- plexes rendant la surface optiquement observa- ble soit par eux-mêmes soit sous l'effet d'une réaction ultérieure. 2 Le procédé de la revendication 1, dans lequel l'étape (b) consistant à faire migrer des particules comprend: l'application de ces particules à une seconde zone ( 4) du milieu poreux, géométriquement dis- tincte de la zone d'échantillon, et l'application d'une solution de lavage au milieu poreux, afin de transporter les particu- les au travers du milieu poreux depuis la seconde zone, les particules étant immobilisées dans la zone d'échantillon lorsque l'agent est présent ou bien traversant la zone d'échantil- lon lorsque l'agent n'est pas présent. 3 Le procédé de la revendication 2, dans lequel les particules sont appliquées au milieu poreux avant application de l'échantillon à tester. 4 Le procédé de la revendication 1, dans lequel l'étape (b) consistant à faire migrer les particules comprend: l'application de ces particules à la zone d'échantillon du milieu poreux avant applica- tion de l'échantillon proprement dit, et l'application d'une solution de lavage au milieu poreux afin qu'elle puisse traverser la zone d'échantillon, les particules étant immo- bilisées dans la zone d'échantillon lorsque l'agent est présent ou bien étant emportées par lavage complet de la zone d'échantillon lorsque l'agent n'est pas présent. 5 Le procédé de l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la surface contenant les complexes de l'étape (c) est rendue optiquement observable par une couleur donnée aux particules. 6 Le procédé de la revendication 5, dans lequel les particules sont présentes en deux couleurs, le réactif lié aux premières particules colorées étant spécifique d'un premier agent et le réactif lié aux secondes particules colorées étant spécifique d'un second agent. 7 Le procédé de l'une des revendications précé- dentes, dans lequel l'étape consistant à appliquer les particules au milieu poreux comporte: l'application d'une solution de sucrose au milieu poreux, puis le séchage du milieu, et l'application des particules revêtues de réactif dans une solution de sucrose au milieu poreux, puis le séchage à nouveau du milieu. 8 Le procédé de l'une des revendications 2 à 7, dans lequel le milieu poreux ( 10) se présente sous forme d'une bande allongée et la solution de lavage est appliquée de manière à assurer la migration des particules suivant la direction longitudinale vers l'une des extrémités ( 6) de la bande. 9 Le procédé de la revendication 8, dans lequel l'étape consistant à faire migrer les particules comporte en outre la mise en communication de moyens absorbants ( 7) avec la bande de milieu poreux, ces moyens d'absorption étant situés à ladite extrémité ( 6) de la bande et au voisinage de la zone d'échan- tillon afin d'agir comme promoteur de l'écoulement de la solution de lavage au travers de la zone d'échantillon. Le procédé de l'une des revendications précé- dentes, dans lequel ledit agent est une bactérie, un antigène, un anticorps ou un haptène, tout particu- lièrement une bactérie. 11 Le procédé de l'une des revendications précé- dentes, prise en dépendance de l'une des revendica- tions 2 ou 4, dans lequel la solution de lavage est choisie dans le groupe comprenant les solutés salins tamponnés aux phosphates, les solutés physiologiques salins et l'eau désionisée. 12 La procédé de l'une des revendications précé- dentes, dans lequel les particules sont des billes de plastique ayant un diamètre compris entre environ 0,2 à environ 3,0 pm, en particulier environ 0,5 à environ 0,8 gm. 13 Le procédé de l'une des revendications précé- dentes, dans lequel le milieu poreux comprend un matériau hydrophile fibreux ayant une dimension moyenne de pore d'environ 5 à environ 20 gm. 14 Un dispositif pour détecter un agent par ana- lyse, caractérisé en ce qu'il comprend un boîtier ( 20) contenant un milieu poreux ( 10) et comportant au moins une ouverture ( 21) qui expose à l'extérieur une zone d'échantillon ( 2) du milieu poreux pour application d'un échantillon de l'agent ( 1), le milieu poreux contenant des particules auxquelles est attaché un réactif spécifique de l'agent à dé- tecter, ces particules étant susceptibles de migra- tion au travers du milieu poreux. Le dispositif de la revendication 14, dans lequel les particules sont contenues dans une zone de particules ( 4) géométriquement distincte de la zone d'échantillon, ou dans lequel les particules sont contenues dans la zone d'échantillon. 16 Le dispositif de l'une des revendications 14 ou 15, dans lequel les particules possèdent une cou- leur différente de la couleur du milieu poreux. 17 Le dispositif de l'une des revendications 14 à 16, dans lequel le boîtier comporte en outre des moyens d'alimentation en communication avec une par- tie du milieu poreux, pour l'application d'une solu- tion de lavage. 18 Le dispositif de la revendication 17, dans lequel les moyens d'alimentation ( 20) comprennent une seconde ouverture ( 22)dans le boîtier, qui expose à l'extérieur ladite partie. 19 Le dispositif de la revendication 17, dans lequel les moyens d'alimentation comprennent une chambre susceptible d'écrasement contenant la solu- tion de lavage, ladite partie du milieu poreux com- muniquant avec cette chambre lorsque cette dernière est écrasée. 20 Le dispositif de l'une des revendications 14 à 19, dans lequel le milieu poreux se présente sous forme d'au moins une bande allongée et la partie pour l'application de la solution de lavage est située à une première extrémité ( 5) de la bande. 21 Le dispositif de la revendication 20, dans lequel la zone des particules ( 4) et la zone d'échantillon ( 2) sont disposées entre la première extrémité ( 5) et une seconde extrémité ( 6) de la ou des bandes de milieu poreux, la zone la plus proche de ladite première extrémité étant la zone des par- ticules. 22 Le dispositif de la revendication 21, dans lequel des moyens d'absorption ( 7), en particulier un tampon d'absorption, sont disposés dans le boî- tier en contact avec la seconde extrémité ( 6) de la bande ou des bandes. 23 Le dispositif de l'une des revendications 20 à 22, dans lequel le milieu poreux comprend une plura- lité de bandes allongées ( 101), le boîtier ( 201) étant conformé de manière à empêcher un contact de fluide entre les bandes, les zones des particules ( 41) des bandes respectives comprenant des particu- les auxquelles sont attachés des réactifs spécifi- ques des différents agents respectifs à détecter. 24 Le dispositif des revendications 14 à 19, dans lequel le milieu poreux se présente sous forme d'une couche circulaire, la partie destinée à l'applica- tion de la solution de lavage étant située au centre de cette couche. 25 Le dispositif de la revendication 23, dans lequel une pluralité de zones de particules conte- nant des particules possédant des réactifs spécifi- ques à des agents différents sont disposées dans la couche circulaire en une pluralité de positions an- gulaires à une première distance radiale du centre. 26 Le dispositif de la revendication 25, dans lequel une zone d'échantillon est associée à chacune desdites zones de particules, chaque zone d'échan- tillon étant disposée à une seconde distance radiale du centre, cette seconde distance radiale étant supérieure à ladite première distance radiale. 27 Le dispositif de la revendication 26, dans lequel il est prévu des moyens d'absorption dans le boîtier, les moyens d'absorption étant en contact avec la périphérie extérieure de la couche circu- laire. 28 Le dispositif de l'une des revendications 14 à 27, dans lequel les particules sont des billes de plastique ayant un diamètre compris dans la plage allant d'environ 0,2 à environ 3,0 gm, en particulier environ 0,5 à environ 0,8 gm. 29 Le dispositif de l'une des revendications 14 à 28, dans lequel le milieu poreux comprend un maté- riau hydrophile fibreux ayant une dimension moyenne de pore d'environ 5 à 20 gm et un rapport entre volume d'eau retenu et volume de matériau d'environ 0,7 à environ 0,9. Le dispositif de la revendication 29, dans lequel le matériau hydrophile fibreux comprend une fibre de polyéthylène contenant un produit mouillant, ce produit mouillant étant en particulier choisi dans le groupe comprenant: a) un alkyl-phénol alkoxylé, avec un monoglycé- ride, diglycéride et/ou triglycéride en mé- lange, ou b) un ester d'acide gras de polyoxyalkylène, ou c) une combinaison de (b) et d'une fraction quel- conque de (a).