Brevet FR2691974A1 — publié le 19931210

PROCEDE DE SEPARATION DE LA FRACTION INSAPONIFIABLE LIBRE OU ESTERIFIEE D'UNE HUILE, D'UN CORPS GRAS OU D'UN EXTRAIT LIPIDIQUE D'ORIGINE VEGETALE, PRODUIT ISOLE AINSI OBTENU ET COMPOSITIONS LE CONTENANT. La présente invention concerne un procédé de séparation sans saponification des constituants mineurs non glycéridiques qui ne réagissent pas avec une base pour donner un savon et restent solubles dans les solvants, appelée "fraction insaponifiable", contenue dans une huile, un corps gras ou un extrait lipidique d'origine végétale, notamment une huile végétale; elle concerne également le produit isolé ainsi obtenu et les compositions contenant ledit produit. On sait que les huiles et les corps gras naturels sont principalement constitués par des tri-esters d'acides gras et de glycérol mais contiennent également, en quantité moindre, des constituants tels que des hydrocarbures et des composés hydroxylés autres que le glycérol, ces composés étant en partie sous forme estérifiée par des acides gras et en partie sous forme libre. L'ensemble des composés autres que les triglycérides simples, partiels ou complexes contenus dans les huiles ou corps gras est généralement désigné par le nom d' "insaponifiable" ou de "fraction insaponifiable". Cet insaponifiable représente généralement jusqu'à 1,5 % en poids de l'huile ou corps gras naturel mais peut atteindre des teneurs plus élevées, par exemple 7 %, dans certaines huiles ou corps gras tels que les huiles d'avocat, le beurre de karité et les huiles d'oeufs. Les composés hydroxylés contenus dans l'insaponifiable sont des stérols, des alcools terpéniques, des tocophérols et des alcools alphatiques. La composition de l'insaponifiable est caractéristique d'une huile ou d'un corps gras déterminé. Cette composition est caractéristique dans son ensemble, c'est-à-dire que la nature, le nombre, les proportions relatives des constituants présents dans chacune des catégories de constituants (hydrocarbures, stérols, alcools terpéniques, tocophérols et alcools alphatiques) sont caractéristiques. Pour une même catégorie de composés hydroxylés, par exemple les stérols, le nombre et la nature des composés présents ainsi que leurs proportions relatives sont également caractéristiques de chaque huile ou corps gras. Les huiles et corps gras sont très largement utilisés en cosmétique et en pharmacie humaine ou vétérinaire, et on a souvent émis l'hypothèse que leur action bénéfique était, en grande partie, due à la présence des composés hydroxylés autres que le glycérol, sous forme estérifiée et/ou sous forme libre, et que l'action particulièrement favorable de certaines huiles ou corps gras était due à la composition particulière de leur insaponifiable. On a, en conséquence, cherché à isoler l'insaponifiable pour bénéficier au mieux de ses effets favorables. Malheureusement les procédés connus de séparation de insaponifiable ne permettent pas de recueillir les composés hydroxylés correspondants sous leur forme estérifiée. Selon un premier procédé, on effectue une saponification en chauffant les huiles ou corps gras avec une base, telle que la potasse, et en extrayant d'une part, à l'aide d'une solution hydroalcoolique, le glycérol et les acides gras saponifiés obtenus, et, d'autre part, l'insaponifiable à l'aide d'un solvant, tel que l'hexane ou l'éther. L'insaponifiable ainsi obtenu est constitué de composés hydroxylés sous forme libre, c'est-à-dire que le(s) groupement(s) fonctionnel(s) OH de ces constituants n'est (ne sont) pas estérifié(s) puisque par action de la base en cours de saponification, les esters des composés hydroxylés ont été scindés pour donner naissance aux composés hydroxylés eux-mêmes.Selon un autre procédé d'extraction de l'insaponifiable, on traite l'huile ou corps gras par entrainement à la vapeur et on sépare par décantation les composés entraînées de l'insaponifiable. Ce procédé est classiquement mis en oeuvre au cours du raffinage et plus spécialement de la désodorisation des huiles ou corps gras ; mais cet entrainement à la vapeur ne permet que de recueillir les composés hydroxylés présents sous forme libre et non pas ceux présents sous forme d'esters d'acide gras. Jusqu'à une époque récente, on avait donc utilisé, dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques, des fractions insaponifiables, dans lesquelles les composés hydroxylés étaient sous forme libre.Ces composés ont une action bénéfique mais qui n'a généralement pas la nature et l'amplitude que l'on pourraît espérer au vu de l'action des huiles et corps gras naturels dont cet insaponifiable est extrait. Dans la demande de brevet français 89-07437, on a proposé de réestérifier les composés hydroxylés de l'insaponifiable extraits sous forme libre et l'on a constaté que cette réestérification entraînait une amélioration de l'efficacité par rapport à l'utilisation des composés hydroxylés sous forme libre de la fraction insaponifiable. Ces composés hydroxylés réestérifiés n'ont cependant pas exactement la même composition que dans l'insaponifiable naturel étant donné que l'estérification n'est pas réalisée avec les acides gras utilisés dans l'exacte proportion de leur présence dans l'huile ou corps gras naturel. Dans les brevets japonais 55-139119 et 52-041215, on a également décrit des compositions renfermant le produit de réestérification d'une fraction insaponifiable extraite d'une huile ; dans le premier de ces documents on propose la réestérification d'un distillat de désodorisation de l'huile de soja et la fraction estérifiée contient 40 à 50 % de stérols végétaux, 18 à 22 % de tocophérol et environ 30 % d'un acide gras insaturé ; dans le deuxième de ces documents, on propose une composition contenant un ester d'acide gras supérieur tel que l'acide palmitique, et d'un stérol d'origine animale ou végétale. Néanmoins, dans l'état de la technique, les produits de réestérification des fractions ins aponifiables extraites sont toujours chimiquement différentes de l'insaponifiable naturel, tant par l'association des acides gras et des composés hydroxylés que par la répartition pondérale des différents esters dans le produit de réestérification . La présente invention a pour but de décrire un procédé, qui permet d'isoler la fraction insaponifiable d'une huile ou corps gras naturel en la conservant dans sa forme naturelle tant dans la nature des esters qu'elle contient que dans leurs proportions pondérales entre eux et vis-à-vis des composés hydroxylés à l'état libre de la fraction insaponifiable. La séparation d'un tel produit permet, lorsqu'on l'utilise dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques destinées à l'homme ou à l'animal, de bénéficier de l'ensemble des effets favorables de ces fractions insaponifiables sans aucune distorsion due à des modifications consécutives au procédé d'extraction. La présente invention, a en conséquence, pour objet un procédé de séparation des constituants mineurs non glycéridiques composant l'insaponifiable d'une huile, d'un corps gras, ou d'un extrait lipidique végétal constitué, en majeure partie, de triglycérides et, pour une faible partie, dudit insaponifiable, caractérisé par le fait que l'on soumet l'huile, le corps gras ou l'extrait lipidique à une hydrolyse enzymatique au moyen d'au moins une lipase spécifique des triglycérides, ladite hydrolyse étant effectuée par addition dans l'huile, le corps gras ou l'extrait lipidique d'une suspension aqueuse d'enzyme(s), le mélange obtenu étant maintenu sous agitation pendant un temps suffisant pour obtenir le rendement désiré; que l'on ajoute ensuite un solvant organique ; que l'on sépare, d'une part, une phase aqueuse contenant le ou les enzyme(s) et du glycérol et, d'autre part, une phase solvant organique contenant un mélange hydrolysé constitué par les acides gras issus des triglycérides et la fraction insaponifiable non transformée; et que l'on extrait dudit mélange hydrolysé les acides gras par passage sur une résine échangeuse d'ions qui les retient, la fraction insaponifiable naturelle se retrouvant dans la phase organique éluée. On préfère utiliser, comme enzyme, la lipase L-1734 type VII de Candida cylindracea ; l'hydrolyse enzymatique est avantageusement effectuée à l'abri de l'oxygène, car on a constaté que le rendement de l'hydrolyse était affecté lorsque l'huile ou le corps gras contient des peroxydes ou des produits d'auto-oxydation : on propose donc de réaliser l'hydrolyse enzymatique sous un balayage de gaz neutre, par exemple sous balayage d'argon.Il convient que l'hydrolyse soit aussi poussée que possible pour que la fraction insaponifiable extraite contienne le moins possible de triglycérides résiduels ; pour ce faire, on peut avantageusement utiliser un rapport volumique (suspension aqueuse/huile) compris entre 1 et 1,5 ; on peut également prévoir que le rapport pondéral (enzyme(s)/huile) soit compris entre 0,02 et 0,1 ; de la sorte, l'hydrolyse peut être menée jusqu'à un rendement en moles d'au moins 85 %, et de préférence d'au moins 95 % avec un temps d'hydrolyse compris entre 2 et 4 jours, à une température comprise entre 20 et 300 C. Dans les rapports donnés cidessus le terme "huile" a été utilisé seul pour faciliter la description, mais il doit être entendu que le terme "huile" recouvre également les corps gras et extraits lipidiques d'origine végétale. Après l'hydrolyse, on ajoute au mélange d'hydrolyse au moins un solvant organique dans un rapport volumique (solvant(s)/mélange d'hydrolyse) compris entre 2,5 et 4 ; le solvant organique peut avantageusement être choisi dans le groupe formé par l'oxyde d'éthyle et l'hexane. Après addition d'un solvant organique, le ou les enzyme(s) et le glycérol issus de l'hydrolyse passent dans la phase aqueuse alors que les acides gras issus de l'hydrolyse et la fraction insaponifiable passent dans la phase solvant ; on réalise de préférence la séparation des deux phases par décantation(s) avec d'éventuel(s) lavage(s) à l'eau et au(x) solvant(s) pour que l'ensemble de la fraction insaponifiable se retrouve dans la phase solvant ; le solvant est ensuite éliminé, par exemple par évaporation sous pression réduite, pour obtenir le mélange hydrolysé. La séparation des acides gras à partir du mélange hydrolysé obtenu s'effectue par passage sur une résine anionique, notamment celle connue sous la dénomination commerciale "DOWEX 1 x 8 (FLUKA)" ; le passage sur cette résine échangeuse d'ions s'effectue dans une colonne avec un solvant d'solution tel que le méthyl-t. butyl-éther. La fraction insaponifiable naturelle est ensuite séparée du solvant d'élution par évaporation du solvant sous pression réduite. Le procédé de séparation selon l'invention donne des résultats particulièrement intéressants lorsqu'il est appliqué à des huiles d'origine végétale telle que l'huile de maïs, de tournesol, de colza, d'avocat, de noisette ou similaire. L'invention a également pour objet la fraction insaponifiable naturelle d'une huile, d'un corps gras ou d'un extrait lipidique d'origine végétale isolée par le procédé tel que ci-dessus défini. L'invention a enfin pour objet une composition à usage humain ou vétérinaire, caractérisée par le fait qu'elle contient, dans un support approprié, en une quantité efficace, une fraction insaponifiable naturelle isolée selon le procédé tel que ci-dessus défini. Dans une telle composition, la quantité efficace de fraction insaponifiable est généralement comprise entre 0,1 et 5 5G en poids. Une telle composition peut avantageusement être utilisée, en cosmétique ou en pharmacie humaine ou vétérinaire, par application topique. Pour mieux faire comprendre l'invention, on va en décrire maintenant, à titre d'exemple, purement illustratif et non limitatif, un mode de mise en oeuvre. EXEMPLE On place successivement 3,5 g d'huile de maïs, 3,5 g d'huile de tournesol ou 3,5 g d'huile de colza à l'intérieur d'un ballon bi-col de 50 ml et l'on y ajoute une suspension homogène de 80,3 mg d'enzyme et de 4,8 ml d'eau. L'enzyme est la lipase L-1734 type VII de Candida cylindracea (SIGMA). Les réactifs sont mélangés doucement par agitation magnétique, le ballon étant relié à un courant d'argon. La température est maintenue à 250 C. On arrête la réaction d'hydrolyse au bout de 72 heures en ajoutant 30 ml d'oxyde d'éthyle, l'agitation étant maintenue pendant quelques minutes. L'ensemble est versé dans une ampoule à décanter de 100 ml. Après décantation, on élimine la phase aqueuse, qui contient l'enzyme et du glycérol. On refait deux extractions de cette phase aqueuse en utiIisant à chaque fois 20 ml d'oxyde d'éthyle de façon à en extraire pratiquement tout le mélange hydrolysé constitué par les acides gras et la fraction insaponifiable. Les phases éthérées sont rassemblées et lavées deux fois avec 5 ml d'eau. On effectue un séchage sur Na2SO4. On filtre la phase organique sur papier filtre puis on la soumet à une évaporation sous pression réduite. On obtient ainsi le mélange hydrolysé. On a mesuré le taux d'hydrolyse en dosant les acides gras par une méthode titrimétrique. Pour ce faire, on introduit, dans un erlenmeyer de 100 ml, 150 mg de mélange hydrolysé dissous dans 10 ml d'éthanol. On ajoute quelques gouttes de phénolphtaléine puis on ajoute une solution de potasse 0,1N au goutte à goutte jusqu'au virage de la coloration. Lorsque l'hydrolyse est menée comme indiquée cidessus, on constate que, pour l'huile de maïs, le taux d'hydrolyse est de 96,4 %, pour l'huile de tournesol de 97,5 % et pour l'huile de colza de 98,2%. Dans une étape ultérieure, on sépare les acides gras du mélange hydrolysé. Pour ce faire, on utilise une colonne de 25 mm de diamètre et de 50 cm de haut que l'on remplit avec 100 g d'une résine anionique vendue sous la dénomination commerciale "DOWEX I x 8 (FLUKA)". Les particules de résine ont une granulométrie correspondant à la rétention entre deux tamis ayant respectivement 20 et 50 mailles pour 2,54 cm. Cette résine possède, par gramme de résine sèche, 3,3 milliéquivalents (groupements -(R)3N+Cl-). Avant d'être introduits dans la colonne, les 100 g de résine sont placés dans un erlenmeyer de 2 litres dans lequel on ajoute 750 ml de solution aqueuse de potasse 2N. L'ensemble est agité magnétiquement pendant 15 heures puis est versé dans la colonne. La colonne est alors lavée à neutralité par de l'eau ; puis l'eau est déplacée par un lavage au méthyl-t.butyl-éther (MTBE). On pèse 1,5 g de mélange hydrolysé que l'on dilue dans 3 ml de MTBE. La solution est versée en haut de la colonne et éluée avec 300 ml de MTBE. La solution récupérée est lavée au carbonate acide de sodium pour éliminer toute trace d'acide puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après un séchage sur Na2SO4, on filtre l'élut sur papier filtre et on évapore sous pression réduite le MTBE. On obtient ainsi la fraction insaponifiable naturelle. Pour extraire, si on le désire, les acides gras retenus sur la résine, on verse en tête de colonne comme éluant 300 ml de méthanol chlorhydrique; l'écoulement est très lent pour permettre une bonne action de l'éluant. Les phases alcooliques récupérées sont portées à ébullition pendant 30 minutes. Après une dilution avec une solution de NaCl saturée (2 volumes pour 1 volume d'alcool), la phase aqueuse est extraite 3 fois avec 200 ml d'hexane. Les phases organiques sont rassemblées, lavées à l'eau puis au carbonate de sodium neutre. Il n'y a pas d'émulsion, les acides gras étant tous méthylés. Après un lavage à neutralité, la phase hexanique est séchée sur du sulfate de sodium neutre, filtrée sur papier filtre et évaporée sous pression réduite. On régénère la résine en effectuant une élution à l'eau pour éliminer toute trace d'acide. Après quoi on élue avec 300 ml de potasse 2N puis on lave à l'eau jusqu'à neutralité et la colonne est de nouveau prête à être utilisée comme précédemment indiqué. REVENDICATIONS 1 - Procédé de séparation d'une huile, d'un corps gras ou d'un extrait lipidique végétal constitué, en majeure partie, de triglycérides et, pour une faible partie, dudit insaponifiable, caractérisé par le fait que l'on soumet l'huile, le corps gras ou l'extrait lipidique à une hydrolyse enzymatique au moyen d'au moins une lipase spécifique des triglycérides, ladite hydrolyse étant effectuée par addition dans l'huile, le corps gras ou l'extrait lipidique d'une suspension aqueuse d'enzyme(s), le mélange obtenu étant maintenu, sous agitation, pendant un temps suffisant pour obtenir le rendement désiré ; que l'on ajoute ensuite un solvant organique ; que l'on sépare, d'une part, une phase aqueuse contenant le (ou les) enzyme(s) et du glycérol et, d'autre part, une phase solvant organique contenant un mélange hydrolysé constitué par les acides gras issus des triglycérides et la fraction insaponifiable non transformée; et que l'on extrait dudit mélange hydrolysé les acides gras par passage sur une résine échangeuse d'ions qui les retient, la fraction insaponifiable naturelle se retrouvant dans la phase organique éluée. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme enzyme, la lipase L-1734 type VII de Candida cylindraceae. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on effectue l'hydrolyse enzymatique à l'abri de l'oxygène. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on effectue l'hydrolyse enzymatique sous un balayage de gaz neutre. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on choisit un rapport volumique (suspension aqueuse/huile) au cours de l'hydrolyse enzymatique compris entre 1 et 1,5. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on choisit un rapport pondéral (enzyme(s)/huile) compris entre 0,02 et 0,1. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on mène l'hydrolyse jusqu'à un rendement en moles d'au moins 85 % et, de préférence, d'au moins 95 %. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on maintient l'hydrolyse pendant un temps compris entre 2 et 4 jours, à une température comprise entre 20 et 30" C. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'après l'hydrolyse, on ajoute au moins un solvant organique dans un rapport volumique (solvant(s)/mélange d'hydrolyse) compris entre 2,5 et 4. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on choisit le solvant organique dans le groupe formé par l'oxyde d'éthyle, l'hexane, et le chloroforme. 11 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation (phase aqueuse/phase solvant organique) par décantation(s) avec éventuel(s) lavage(s) à l'eau et au(x) solvant(s), le solvant étant ensuite éliminé pour obtenir le mélange hydrolysé. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que l'on extrait les acides gras lors du mélange hydrolysé par passage sur une résine anionique. 13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que l'on effectue le passage sur une résine échangeuse d'ions dans une colonne avec un solvant d'élution. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la fraction insaponifiable naturelle est séparée du solvant d'élution par évaporation sous pression réduite. 15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que l'huile est une huile d'origine végétaIe. 16- Fraction insaponifiable naturelle d'une huile, d'un corps gras ou d'un extrait lipidique d'origine végétale isolée par le procédé selon l'une des revendications 1 à 15. 17- Composition à usage humain ou vétérinaire, caractérisée par le fait qu'elle contient, dans un support approprié, en une quantité efficace, au moins une fraction selon la revendication 16. 18 - Composition selon la revendication 17, caractérisée par le fait que la quantité efficace est comprise entre 0,1 et 5 % en poids. 19 - Composition selon l'une des revendications 17 ou 18, pour utilisation en cosmétique ou en pharmacie humaine ou vétérinaire.