Brevet FR2695391A1 — publié le 19940311

GLYCOPEPTIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES L'invention a pour objet des glycopeptides, leur obtention, ainsi que leurs applications biologiques. Elle vise plus particulièrement des glycopeptides présentant notamment des propriétés antibactériennes. On sait que des peptides antibactériens ont été isolés à partir d'insectes. Certaines espèces présentent en effet une résistance efficace contre des bactéries. Des travaux récents ont établi que cette défense est basée, pour une large part, sur la synthèse rapide (2 à 6 h) de plusieurs familles de peptides ou de polypeptides. Cette synthèse peut être induite, notamment, par une blessure septique ou, d'une manière générale, un traumatisme, ou par immunisation, c'est-à-dire par injection d'une faible dose de bactéries. Parmi les peptides ou polypeptides produits, on peut distinguer les quatre groupes suivants i) les cécropines qui sont des peptides cationiques de 4 kDa formant deux hélices a amphipathiques ; (ii) des peptides cationiques riches en proline, de petite taille (2 à 4 kDa), partiellement caractérisés, comme les apidaecines et les abaecines ; (iii) plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaire (PM) de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme les attacines, les sarcotoxines Il, les diptéricines et les coléoptéricines, et (iv) les défensines, peptides non glycosylés, modérément cationiques avec un pI de 8,0 à 8,5, comprenant de 38 à 43 acides aminés et contenant un motif caractéristique de 6 résidus cystéine engagés dans 3 ponts disulfure intramoléculaires. Les peptides antibactériens évoqués ci-dessus ont pu être induits chez des lépidoptères, des diptères, des hyménoptères et des coléoptères. Des travaux réalisés jusqu'à présent sur d'autres espèces n'ont pas permis en revanche de détecter leur présence. On remarquera qu'à ce jour la structure chimique attribuée à ces peptides correspondait à un simple enchaînement d'acides aminés. Sur la base de cet enseignement, l'homme de l'art, cherchant à élaborer par voie de synthèse des peptides présentant de telles propriétés, n était donc amené qu'à construire une séquence peptidique par enchaînement d'acides aminés déterminés selon les techniques classiques. Or, dans le cadre de leurs travaux sur l'étude des bases moléculaires de la réponse immunitaire des insectes, les inventeurs ont constaté que l'activité antibactérienne de certains peptides inductibles chez des espèces particulières d'insectes était liée à la présence de groupes de substitution déterminés sur des acides aminés. L'élimination de ces groupes conduit à une très forte réduction de l'activité antibactérienne, voire à sa disparition complète. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux peptides substitués ayant un haut niveau d'activité vis-àvis d'un grand nombre de bactéries. Elle a de plus pour but de fournir des procédés d'obtention de tels peptides permettant de les obtenir en grande quantité. L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés biologiques conférées par les groupes de substitutions pour l'élaboration d'agents antibactériens utilisables en thérapeutique humaine et vétérinaire et, d'une manière générale, pour la lutte contre les bactéries. Les peptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils possèdent des propriétés antibactériennes conférées par une séquence en acides aminés renfermant au moins un acide aminé substitué par un groupe choisi parmi les oses, les osamines, les poly-oses et/ou-osamines. L'acide aminé substitué est un acide aminé hydroxylé, tel que la thréonine, la sérine ou la tyrosine. La thréonine est particulièrement préférée. Le groupe de substitution du ou des acides aminés sera désigné dans la description qui suit et les revendications par le terme "glycosyle", les peptides de l'invention étant également appelés glycopeptides. Le groupe glycosyle est linéaire ou cyclique, substitué ou non, sous forme a ou p. Il comporte avantageusement 5 ou 6 atomes de carbone. Les substituants éventuellement présents sont avantageusement choisis parmi des radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ou, en particulier dans le cas des osamines, parmi les radicaux acyle, plus spécialement acétyle, ces radicaux substituant plus spécialement la fonction amine. Comme groupes ose appropriés, on citera les pentoses, tels que le ribose, et les hexoses, tels que le galactose et le glucose. Des groupes osamine sont avantageusement constitués par un radical galactosamine ou glucosamine. Les poly-oses et/ou -osamines comprennent un enchaînement des motifs oses et/ou osamines, notamment de 1 à 10 motifs, en particulier de 1 à 5 motifs. Comme le montrent les travaux des inventeurs rapportés dans les exemples, ces groupes de substitution, d'une manière surprenante, apparaissent indispensables pour disposer d'un niveau appréciable d'activité antibactérienne. Les glycopeptides selon l'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils sont du type des glycopeptides tels qu'obtenus chez les arthropodes, et en particulier chez les larves ou les adultes d'insectes, par un procédé comprenant - l'induction de leur synthèse notamment par injection aux insectes de bactéries en doses suffisantes, ou par blessure septique ou autre traumatisme, - l'extraction de manière à recueillir les peptides ayant subi une glycosylation post-traductionnelle et, le cas échéant, - le fractionnement de l'extrait isolé afin de séparer sélectivement les glycopeptides selon le niveau de leur activité antibactérienne. L'invention vise les extraits correspondants, les mélanges de glycopeptides et les fractions. Les glycopeptides de l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils présentent une activité antibactérienne contre les germes à Gram négatif. Selon une disposition de l'invention, les glycopeptides sont du type de ceux élaborés par les diptères. Plus particulièrement, les glycopeptides selon la disposition de l'invention considérée sont caractérisés en ce que leur séquence peptidique responsable de leur activité antibactérienne, qui comprend au moins un acide aminé substitué par un groupe choisi parmi les oses, les osamines, les poly-oses ou -osamines comme défini plus haut, est contenue dans un domaine comportant au moins 30 % environ de groupes proline. Cet enchaînement comporte plus spécialement un motif consensus de O-glycosylation proline-thréonine/sérine Xaal-Xaa2-proline dans lequel les motifs Xaal et Xaa2, identiques ou différents, sont des acides aminés variables. L'enchaînement d'acides aminés de la séquence biologiquement active, c'est-à-dire présentant une activité antibactérienne, comporte, avantageusement, au moins un acide aminé hydrophobe tel que la thréonine, substitué par un groupe glycosyle. Le groupe de substitution est plus particulièrement constitué par un motif N-acétylhexosamine, le cas échéant lui-même substitué par un hexose. Des glycopeptides préférés sont tels qu'inductibles chez les brachycères. Un groupe de ces glycopeptides avantageux au regard de ses propriétés antibactériennes est tel qu'inductible chez le drosophile. L'enchaînement des acides aminés des glycopeptides de ce groupe est notamment compris ou constitué par la séquence (I) suivante MKFTIVFLLLACVFAMAVATPGKPRPYSPRPTSHPRPIRVRREALAIEDHLAQAAIRPP PILPA Plus particulièrement, ledit enchaînement est compris ou constitué par la séquence (II) suivante en acides aminés GKPRPYSPRPXSHPRPIRV Les motifs thréonine soulignés sont les motifs substitués, conformément à l'invention, par un groupe glycosyle. On rappelle que les acides aminés sont représentés de manière conventionnelle par des lettres ou sont désignés par un code à trois lettres, selon la correspondance suivante A = Ala ; R = Arg ; D = Asp ; N = Asn ; C = Cys ; Q = Gln E = Glu ; G = Gly ; H = His ; I = Ile ; L = Leu ; K = Lys ; M = Met ; F = Phe ; P = Pro ; S = Ser ; T = Thr ; W = Trp Y = Tyr ; V = Val. Dans un autre groupe préféré de l'invention, les glycopeptides sont du type de ceux inductibles chez Phormia terranovae. De tels glycopeptides comprennent avantageusement ou sont constitués par un enchaînement d'acides aminés, tel que déterminé selon la dégradation d'Edman, répondant à la séquence (III) suivante DEKPKLILPTPAPPNLPOLVGGGGGNRKDG FGVSVDAHQKVWTSDNGGHSIGVSPGYSQH LPGPYGNSRPDYRIGAGYSYNE D'autres enchaînements comportent comme partie Nterminale, au moins une partie des séquences (IV) et (V) suivantes. D E K P K L V L P (S) X A P P N L P Q L V G G G G G N N K X GXXVSINAAQKV (1V) ou D E K(P) K L I X P X X A (P) X N L X Q L V G G G G G N N K KXXGVXVXXAO (V) Dans cet enchaînement la thréonine en position 10 et/ou celle en position 54 est (sont) substituée(s) par un groupe glycosyle. Le groupe glycosyle est avantageusement un motif osamine lui-même substitué par un ose, un motif approprié pour disposer de glycopeptides antibactériens correspond à un groupe (N-acétylhexosamine)-hexose. Un autre groupe encore comprend des glycopeptides tels qu'inductibles chez les hyménoptères, notamment chez les abeilles. L'invention vise également les fragments ou variantes des glycopeptides définis ci-dessus, dès lors que ces fragments ou ces variantes sont reconnus par des anticorps dirigés contre lesdits peptides et/ou possèdent des caractéristiques de charge et/ou d'hydrophobicité ou dthydrophilie leur conférant une activité antibactérienne contre des germes à Gram négatif, telle qu'observée chez les glycopeptides natifs. Par variantes, on entend des glycopeptides dans lesquels un ou plusieurs acides aminés sont délétés, substitués par un groupe autre qu'un glycosyle, ou remplacés par un autre acide aminé de charge voisine. Les caractéristiques d'hydrophilie et d'hydrophobicité des acides aminés sont données par Kyte et al dans J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982. Les anticorps formés contre les glycopeptides et leurs fragments et variantes entrent également dans le champ de 1' invention. Selon un autre aspect, l'invention vise les séquences de nucléotides comportant l'information génétique correspondant aux acides aminés des glycopeptides définis ci-dessus. Elle vise également les séquences de nucléotides capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec les séquences ci-dessus. Par conditions stringentes, on entend les conditions définies dans l'ouvrage "Molecular Cloning" de Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. L'invention vise en outre les séquences de nucléotides complémentaires de celles définies plus haut, ainsi que les ARN correspondants. Les vecteurs d'expression et/ou de clonage comportant au moins un fragment des séquences de nucléotides définies ci-dessus font également partie de l'invention, ainsi que les hôtes transformés par ces vecteurs. A titre d'exemples, des hôtes appropriés pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent des bactéries, telles que E.coli, des levures ou encore des cellules d'arthropodes, de vertébrés ou de plantes. L'invention concerne également les produits d'expression des vecteurs ci-dessus. La structure chimique des glycopeptides à activité antibactérienne ayant été caractérisée comme indiqué cidessus, l'homme de l'art choisira aisément les techniques les plus appropriées pour leur élaboration. En opérant par voie de synthèse, on a aisément accès aux structures des glycopeptides tels qu'inductibles chez les arthroprodes et à leurs variantes. On procède avantageusement à la substitution d'un ou de plusieurs des acides aminés de la séquence, avec un groupe glycosyle, puis à l'introduction de groupes de blocage des fonctions à protéger et on forme une chaîne peptidique déterminée, avantageusement à l'aide d'un synthétiseur, le ou les acides aminés substitués étant introduits séquentiellement afin d'occuper la position souhaitée dans la séquence. Les groupes de blocage sont éliminés en fin de synthèse. Selon une variante, ces glycopeptides peuvent être obtenus selon les techniques du génie génétique en introduisant dans un vecteur approprié les séquences de nucléotides capables d'exprimer le squelette peptidique du glycopeptide recherché, et en réalisant l'expression dans un hôte capable d'assurer une glycosylation posttraductionnelle. En variante, lorsque l'hôte utilisé ne peut assurer cette fonctionnalisation, on a recours aux voies de synthèse chimiques. Selon encore une autre variante, ces glycopeptides sont obtenus en immunisant des arthropodes renfermant des gènes capables de coder pour le ou les glycopeptide(s) recherché(s), notamment par injection de bactéries, en quantité suffisante pour provoquer leur synthèse, ou par traumatisme, tel qu'une blessure septique. Quelques heures après l'immunisation, ou le traumatisme, les glycopeptides sont extraits puis fractionnés et la ou les fractions correspondant au(x) glycopeptide(s) recherché(s) isolée(s). L'extraction est réalisée dans des conditions permettant d'éviter tout phénomène de dégradation des glycopeptides, tel qu'oxydation ou action de protéases. Pour la purification des produits, on utilise avec avantage des supports très peu rétensifs et possédant un pouvoir séparateur élevé. Des supports appropriés sont choisis parmi les supports utilisés en phase inverse. La mise en oeuvre de ces dispositions permet d'isoler des glycopeptides, sous forme pure, à partir d'animaux aussi petits que des adultes de drosophile. On notera de plus que cette technique d'extraction, telle que décrite dans les exemples, permet d'isoler des glycopeptides dont la fragilité est bien connue. Les propriétés antibactériennes conférées aux peptides de 1 invention par le groupe glycosyle sont mises à profit pour l'élaboration d'agents antibactériens utilisables en thérapeutique humaine ou animale, ou pour traiter un environnement donné. L'invention vise donc l'utilisation, pour élaborer des agents et compositions antibactériens, de peptides renfermant au moins un acide aminé substitué par un groupe choisi parmi les oses, les osamines, les poly-oses et/ou -osamines, possédant une activité antibactérienne conférée par le ou les groupes de substitution glycosyle. Ces compositions sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace des glycopeptides définis ci-dessus, en association avec un véhicule inerte approprié pour l'application envisagée. Il est avantageux d'incorporer des excipients tels qu'inhibiteurs de protéases, antioxydants et inhibiteurs de multiplication des bactéries. Les compositions ou agents destinés à la thérapeutique humaine ou vétérinaire se présenteront avantageusement sous forme de solutions injectables, ou sous une forme pour usage externe, telle que pommades, crèmes, poudres, ou solutions. Ils sont particulièrement indiqués dans le cas de septicémies, ou encore pour le traitement des yeux, des oreilles, des soins buccaux et dentaires et en gynécologie. On a recours avantageusement aux posologies habituelles dans ces domaines. Les compositions de l'invention présentent également un grand intérêt en agrochimie comme agents phytosanitaires. Elles sont avantageusement utilisées sous forme de poudres ou de solutions d'épandage. L'utilisation des compositions et agents antibactériens de l'invention dans l'industrie agroalimentaire permet d'empêcher la contamination par des germes à Gram négatif, pendant la fabrication de produits et leur conservation. L'invention vise également les génomes de plantes tels que modifiés par la présence de gènes codant pour les glycopeptides antibactériens définis ci-dessus. Ces cellules végétales et plantes sont choisies parmi celles capables d'assurer la glycosylation des séquences peptidiques de manière à leur conférer une activité antibactérienne. On dispose ainsi de plantes résistant à des agents pathogènes. A titre illustratif, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de 1' invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 et 2 qui représentent respectivement - la figure 1, la variation de l'absorbance en fonction du temps d'un peptide éb é selon l'invention, et - la figure 2, des séquences de nucléotides capables de coder pour un peptide de l'invention. Exemple : Obtention de glycopeptides antibactériens par extraction à partir de la drosophile. - Méthode d'induction de la synthèse biologique. Les drosophiles sont anesthésiées au gaz carbonique et immunisées par piqûre au niveau thoracique à proximité de l'insertion alaire à l'aide d'une aiguille plongée avant chaque inoculation dans une suspension bactérienne de Microccocus luteus (Gram positif) et d'Escherichia coli 1106 (Gram négatif). Les insectes sont conservés à 250C durant 24 heures et tués par congélation dans l'azote liquide. - Extraction, fractionnement et purification des glycopeptides synthétisés : * extraction Les pattes, les ailes et les têtes d'adultes de drosophiles sont éliminées par tamisage, les thorax et les abdomens sont broyés en présence d'azote liquide durant 30 minutes dans un mortier maintenu au froid. A la poudre ainsi obtenue sont ajoutés 10 volumes d'eau acidifiée EO,l % d'acide trifluoroacétique (TFA 0,1 %)1 contenant de l'aprotinine (total de 2 mg). Après 30 minutes d'extraction sous agitation, l'extrait est centrifugé à 10.000 rpm pendant 30 minutes à 4"C. Le surnageant ainsi obtenu est immédiatement soumis aux différentes étapes de la purification. *Fractionnement de l'extrait sur cartouches Sep-Pak C18 Après dépôt de l'extrait sur un support de phase inverse, tel que commercialisé sous forme de cartouches sous la marque Sep-Pak Cî8B, par Waters Millipore, les molécules à caractère hydrophile sont éliminées par un simple lavage par 5 ml d'eau acidifiée (TFA 0,05 %). L'élution des molécules hydrophobes est réalisée avec des solutions de 10,40 et 80 % d'acétonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05 %). Les fractions recueillies sont dénommées "Elution 10 %", "Elution 40 %" et 11Elution 80 %" et concentrées sous vide. Les fractions sont ensuite reconstituées avec de l'eau Milli Q avant l'analyse en HPLC. *Purification par HPLC des molécules à activité antibactérienne. a- Première étape de purification La fraction "Elution 10 %" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 C18 R avec un gradient linéaire d'acétonitrile de O à 40 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une augmentation de 0,44 % d'acétonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min. La fraction "Elution 40 %" est analysée sur la même colonne que la fraction "Elution 10 %". L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 52 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (progression de 0,55 % d'acétonitrile par minute) à un débit de 1 ml/min. La fraction "Elution 80 *" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore RP 300 C8. L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acétonitrile de 10 à 60 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,55 % d'acétonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min. La collecte des fractions est réalisée suivant la variation de l'absorption à 225 nm, en tenant compte des épaulements. Chaque fraction ainsi récoltée est attribuable à un pic de densité optique. Toutes les fractions sont évaporées à sec sous vide et reconstituées dans de l'eau Milli Q. L'activité antibactérienne de chaque fraction est détectée par la technique du test d'inhibition de croissance en milieu liquide sur des fractions aliquotes de 10 p1 : une telle fraction équivaut à un extrait de 300 adultes de drosophiles. b- Purification finale Deux étapes supplémentaires sont nécessaires à la purification finale des molécules à activité antibactérienne. Les fractions "Elution 10 %" présentant l'activité biologique sont analysées sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 C18 R. L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acétonitrile de O à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,22 % d'acétonitrile par minute) pour un débit de 0,8 ml/min. Les fractions qui présentent une activité antibactérienne, mesurée selon la méthode indiquée ciaprès, sont purifiées sur la colonne précédemment décrite dans un gradient linéaire d'acétonitrile de O à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes pour un débit de 2 ml/min. On rapporte sur la figure 1, la variation de la densité optique DO à 225 nm en fonction du temps lors de l'étape de purification finale du glycopeptide. La ligne en pointillés correspond à l'acétonitrile (en %) ajouté pour la purification. La flèche en trait plein (t) désigne le glycopeptide purifié et celle en pointillés ( La masse molaire mesurée est de 2564,4 daltons. L'analyse de la microséquence est réalisée en procédant à une dégradation d'Edman automatisée du peptide et à la détection des dérivés de phénylthiohydantoïne sur un séquenceur automatique à liquide pulsé (Applied Biosystems) modèle 473 A ou 477 A. L'analyse des acides aminés est effectuée sur un analyseur 420 A (Applied Biosystems) avec analyseur HPLC et microordinateur. Le peptide est hydrolysé à 1200C durant 24 heures avec HCl 6N en phase gazeuse (Pico-Tag, Millipore). On forme des dérivés avec le phényl isothiocyanate, puis on détecte les acides aminés à 254 nm. Le peptide isolé et purifié présente la séquence (Il) en acides aminés donnée plus haut, à savoir NH2 - Gly - Lys - Pro - Arg - Pro - Tyr - Ser - Pro - Arg Pro - Xaa - Ser - His - Pro - Arg - Pro - Ile - Arg - Val COOH La mesure de l'activité biologique a été réalisée par la méthode suivante *Préparation des souches pour le test antibactérien Pour chaque souche, une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 30 ml de milieu PB (milieu LB dépourvu d'extrait de levure) et incubée à 30"C pendant une nuit sous agitation lente. Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont ramenées par dilution dans du milieu PB frais à une concentration de 400.000 UFC(unités formant des colonies)/ml pour E.coli et 40.000 UFC/ml pour M.luteus (soit une D0600=0,001). *Réalisation du test antibactérien L'échantillon à tester (10 pl) est déposé dans des puits de plaques de microtitration dans lesquels sont ajoutés 100 pl d'une culture bactérienne en phase exponentielle de croissance ramenée à D0600 = 0,002. Après 24 heures d'incubation à 25"C, la croissance bactérienne est mesurée à 600 nm. L'inhibition de croissance des bactéries, qui reflète l'activité antibactérienne, est mise en évidence par la différence de D0600 existant entre les fractions testées et une culture témoin dans laquelle les 10 pl d'échantillon sont remplacés par 10 ,ul d'eau stérile. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après et sont exprimés en UFC/ml x 103. Temps d'incubation 1 min 1 h 3 h 5 h 24 h Glycopeptide 1088 1026 688 600 323 antibactérien Expérience de contrôle 1220 1164 1200 1250 1088 Ces résultats mettent bien en évidence l'activité bactéricide des produits de l'invention. A titre de comparaison, on a préparé par voie de synthèse en utilisant un synthétiseur de peptides tel que celui indiqué ci-dessus, un peptide présentant le squelette en acides aminés de l'enchaînement I, mais dans lequel la thréonine en position 11, contrairement au glycopeptide de l'invention, n'est pas glycosylé. La séquence du peptide synthétique a été vérifiée en effectuant une dégradation d'Edman et en déterminant la masse molaire à l'aide d'un spectromètre de masse VG Biotech Bio Q. On constate une élution différente du peptide en HPLC, comme le montre la figure 1. La détermination de la masse molaire donne une valeur de 2199,6 daltons qui diffère de 364,8 daltons de celle du glypeptide de l'exemple 1. De plus, ce peptide synthétique, dépourvu de groupement glycosyle, présente une activité biologique 10000 fois inférieure à celle du glycopeptide de l'exemple 1. Afin de prouver que la différence entre le glycopeptide et ce peptide synthétique provient de la 0glycosylation sur la thréonine en position 11, le glycopeptide purifié de l'exemple 1 a été soumis à l'action de HF anhydre, qui hydrolyse spécifiquement les liaisons 0glycosyle. Ce traitement a conduit principalement à un composé de 2199,6 daltons, donc de même masse que le peptide synthétique non substitué et à un composé de 2403,0 daltons. En revanche, le même traitement appliqué au peptide synthétique n'altère pas ce dernier dont la masse molaire reste inchangée. On notera que le substituant de 365 daltons séparé par le traitement avec HF anhydre peut être décomposé en 2 motifs, l'un de 203 daltons et l'autre de 162 daltons, en le soumettant à son tour à ce même traitement, ce qui correspond à une N-acétyl hexosamine et à un hexose. Deux molécules d'eau sont éliminées respectivement lors de la liaison de la N-acétylhexosamine avec la thréonine et lors de la liaison de l'hexose avec la N-acétylhexosamine. Exemple : Séquences de nucléotides codant pour des glycopeptides antibactériens. Isolement de clones d'ADNc à l'aide d'une sonde dégénérée 5' TAG GGN CGN GGC TTG CC 3' et à partir de 30 000 phages contenant l'insert correspondant, on procède au criblage d'une banque d'ADNc de drosophile (l'élaboration de cette banque est rapportée ci-après). On obtient 30 clones d'hybridation positifs. Séquençage Dix de ces clones sont séquencés. On constate que les inserts contiennent tous un cadre ouvert de lecture de 65 codons commençant avec une méthionine. Les inserts 1 à 9 ne montrent pas de variation de séquence. Le plus long est représenté sur la figure 2. L'insert 10 montre des variations de bases qui sont représentées sur la figure 2. Le signal consensus de polyadénylation AATAAA est indiqué en caractères gras. La première ligne de la séquence de nucléotides correspond à celles des clones 1 à 9, la deuxième ligne mentionne les bases différentes du clone 10, les autres bases étant identiques à celles données sur la première ligne ne sont pas indiquées. La séquence en acides aminés déduite correspond à un précurseur de la séquence peptidique du glycopeptide de l'exemple 1 et présente l'enchaînement I donné ci-dessus. Cet enchaînement I comporte la séquence II de 19 acides aminés et dans la partie N-terminale un signal peptidique potentiel (motifs 1 à 19) et un dipeptide Thr-Pro (en positions 20 et 21). La partie C-terminale comprend un peptide de 22 acides aminés (occupant les positions 43 à 64 dans l'enchaînement I) séparé de l'enchaînement II par un site de clivage dibasique Arg-Arg (en positions 41 et 42). Préparation de la banque d'ADNc On prépare une banque d'ADNc de taille sélectionnée en soumettant à un challenge bactérien des larves de drosophile au troisième stade larvaire. L'ARN enrichi en poly (A) est extrait comme décrit par Reichhart et al dans EMBO J. 11, 1469-1477 (1992). Une banque > gt 22 est construite en utilisant le système Superscript lambda commercialisé par Gibco BRL. Les ADNc sont sous-clonés dans Mt3mpl9. Les deux brins sont séquencés en utilisant la méthode au didéoxy de Sanger avec le kit de séquengage commercialisé sous la marque Séquanase R par USB. Exemple3 : Obtention de glycopeptides antibactériens par expression chez Saccharomices cerevisae. En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, on insère dans un vecteur une séquence de nucléotides d'un clone d'ADNc de l'exemple 2 et on réalise l'expression chez Saccharomices cerevisae. Le glycopeptide produit est récupéré et analysé pour vérifier sa séquence. Exemple : Obtention par voie de synthèse de glycopeptides antibactériens du type de ceux induits chez Phormia. On fait réagir une thréonine avec une Nacétylgalactosamine. On procède au blocage des groupes hydroxyle de la galactosamine à l'aide de groupes protecteurs utilisés habituellement à cet effet. On utilise par exemple du chlorure de benzoyle pour protéger les groupes hydroxyle avec un radical benzoyle. L'enchaînement III d'acides aminés donné plus haut est réalisé à l'aide d'un synthétiseur de peptides, tel qu'utilisé dans l'exemple 1. L'analyse par spectrométrie de masse du produit obtenu et la dégradation d'Edman permettent de vérifier que le glycopeptide recherché a bien été synthétisé. Exemple 5 Formulation utilisable pour traiter des septicémies. Peptide de l'exemple 1 : 10 à 100 mg Excipient : eau physiologique La formulation est administrée par voie injectable 4 fois par jour, pendant une semaine. REVENDICATIONS 1/ Glycopeptides, caractérisés en ce qu'ils possèdent des propriétés antibactériennes conférées par une séquence en acides aminés renfermant au moins un acide aminé substitué par un groupe glycosyle choisi parmi les oses, les osamines, les poly-oses et/ou -osamines. 2/ Glycopeptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'acide aminé substitué est un acide aminé hydroxylé tel que la thréonine, la sérine ou la tyrosine. 3/ Glycopeptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que le groupe glycosyle est linéaire ou cyclique, substitué ou non, sous forme a ou p, ccomportant avantageusement de 5 ou 6 atomes de carbone, les substituants éventuellement présents étant choisis notamment parmi les radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ou, en particulier, pour les osamines, parmi les radicaux acyle, plus spécialement acétyle. 4/ Glycopeptides selon la revendication 3, caractérisés en ce que le groupe glycosyle est choisi parmi les hexoses tels que le galactose ou le glucose, les hexosamines telles que la galactosamine et le glucosamine, ou les hexosamines substituées par des motifs hexoses comme la (N-acétylhexosamine)-hexose. 5/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont du type des peptides tels qu'obtenus chez les arthropodes, et notamment chez les larves ou les adultes d'insectes par un procédé comprenant - l'induction de leur synthèse notamment par injection de bactéries en doses suffisantes ou par blessure septique ou autre traumatisme, - l'extraction de manière à recueillir les peptides ayant subi une glycosylation post-traductionnelle et, le cas échéant, - le fractionnement de l'extrait isolé afin de séparer sélectivement les glycopeptides selon le niveau de leur activité antibactérienne. 6/ Glycopeptides, selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils présentent une activité contre les germes à Gram négatif. 7/ Glycopeptides selon l'une des revendication 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont du type de ceux élaborés par les diptères, en particulier chez les brachycères. 8/ Glycopeptides selon la revendication 7, caractérisés en ce que leur séquence peptidique responsable de leur activité antibactérienne, qui comprend au moins un acide aminé substitué comme défini dans la revendication 1, est contenue dans un domaine comportant au moins 30 % environ de groupes proline. 9/ Glycopeptides selon la revendication 8, caractérisés en ce que ladite séquence comporte au moins un motif de O-glycosylation proline-thréonine/sérine-Xaal- Xaa2-proline dans lequel les motifs Xaal et Xaa2, identiques ou différents, sont des acides aminés variables. 10/ Glycopeptides selon la revendication 8 ou 9, caractérisés en ce que ladite séquence comporte au moins un acide aminé hydrophobe tel que la thréonine, substitué par un groupe glycosyle, en particulier par un groupe N-acétyl hexosamine ou (N-acétylhexosamine)-hexose. 11/ Glycopeptides selon l'une des revendications 7 à 10, tels qu'inductibles chez la drosophile. 12/ Glycopeptides selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par une séquence en acides aminés répondant à l'enchaînement (I) suivant MKFT IVFLLLACVFAMAVATPGKPRPYSPRPlSHPRP IRVRREALAI EDHLAQAAIRPP PILPA plus particulièrement à l'enchaînement (II) GKPRPYSPRPTSHPRPIRV les motifs thréonine soulignés correspondant à ceux substitués par un groupe glycosyle. 13/ Glycopeptides selon l'une des revendications 7 à 10, tels qu'inductibles chez Phormia terranovae. 14/ Glycopeptides selon la revendication 13 caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par une séquence en acides aminés, telle que déterminée selon la dégradation d'Edman, répondant à 1' enchaînement (III) DEKPKLILPTPAPPNLPOLVGGGGGNRKDG FGVSVDAHQKVWTSDNGGHSIGVSPGYSQH LPGPYGNSRPDYRIGAGYSYNE la thréonine en position 10 et/ou celle en position 54, étant substituée(s) par un groupe glycosyle ou que leur partie N-terminale comporte ou est constituée par au moins une partie des enchaînements (IV) et (V) suivants D E K P K L V L P (S) X A P P N L P Q L V G G G G G N N K X GXXVS INAAQKV ou D E K(P) K L I X P X X A (P) X N L X Q L V G G G G G N N K KXXGVXVXXAO 15/ Glycopeptides selon l'une des revendications 7 à 10, tels qu'inductibles chez les hyménoptères, notamment chez les abeilles. 16/ Les fragments, mutants et dérivés fonctionnels des glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 15. 17/ Séquences de nucléotides comportant l'information génétique correspondant aux acides aminés des glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 16, les séquences capables de s'hybrider avec celles-ci dans des conditions stringentes, les séquences complémentaires et les ARN correspondants. 18/ Vecteurs d'expression et/ou de clonage comportant au moins un fragment des séquences de nucléotides selon la revendication 17 et hôtes transformés par ces vecteurs. 19/ Les produits d'expression des vecteurs selon la revendication 18. 20/ Procédé d'obtention de glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'on procède à l'enchaînement des acides aminés par voie de synthèse, l'un au moins des acides aminés utilisés étant substitué comme défini dans la revendication 1 et étant introduit de manière à occuper la position souhaitée dans la séquence. 21/ Agents antibactériens caractérisés en ce qu'ils renferment au moins un glycopeptide selon l'une des revendications 1 à 16. 22/ Compositions antibactériennes, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace de glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 16, en association avec un véhicule inerte. 23/ Compositions selon la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en thérapeutique humaine ou vétérinaire, le véhicule inerte étant approprié pour cette utilisation. 24/ Compositions selon la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en agrochimie, le véhicule inerte étant approprié pour cette utilisation. 25/ Compositions selon la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées dans l'industrie agro-alimentaire. 26/ Cellules végétales et plantes dont le génome est modifié par la présence de genes capables de coder pour les séquences peptidiques des glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 16, ces cellules végétales et plantes étant capables d'assurer la glycosylation des séquences peptidiques de manière à leur conférer une activité antibactérienne.