Brevet FR2696193A1 — publié le 19940401

PROCEDE DE MESURE DE L'ACTIVISTE DES PHOSPHOLIPASES La présente invention a trait au domaine de l'étude des enzymes phospholipases. Elle concerne plus spécialement un procédé de mesure de l'activité de ces phospholipases. Les phospholipases sont des enzymes particulièrement importants d'un point de vue biologique puisqu'ils catalysent l'hydrolyse des phospholipides, constituants principaux des membranes cellulaires, générant à partir des phospholipides, des acides gras et des lysophospholipides. Deux d'entre eux, la phospholipase pancréatique, et la phospholipase intestinale jouent un rôle prépondérant dans les processus nutritionnels. Enfin on trouve certains de ces enzymes dans les venins de serpent. Afin de mesurer l'activité hydrolytique de ces enzymes, diverses méthodes de dosage sont utilisées, consistant soit en la mesure de la disparition du substrat, soit en la mesure de l'apparition des produits de la réaction enzymatique. Parmi les méthodes chimiques, on peut citer la pH-métrie, permettant de déterminer à l'aide d'un pH-stat, les variations de pH, dues à la libération d'acides gras au cours de la réaction d'hydrolyse. La limitation principale de l'utilisation du pH-stat concerne la gamme de pH potentiellement utilisable. En effet, le pH du milieu réactionnel contenant les phospholipides doit être supérieur au pKa apparent de l'acide gras libéré. De plus cette méthode présente l'inconvénient d'être très peu sensible. On connaît également une méthode immunologique, le test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) mettant en oeuvre des anti-corps spécifiques de la phospholipase. Ce test est hautement sensible et spécifique et permet de réaliser une mesure ponctuelle, à un temps donné de l'activité de l'enzyme. Cependant, il n'offre pas la possibilité d'étudier la cinétique de la réaction enzymatique. Enfin, il existe une méthode biophysique, reposant sur la variation d'une tension interfaciale liquide/gaz. On utilise pour cela un milieu aqueux sur lequel repose une couche monomoléculaire de phospholipides, et on mesure la variation de la tension interfaciale à l'interface liquide/gaz, après injection de la phospholipase dans la sous-phase aqueuse. L'inconvénient de cette méthode réside dans le fait, qu'on ne peut mesurer l'activité des phospholipases que sur des phospholipides de synthèse à chaînes acyl courtes et non sur des substrats naturels à chaînes acyl longues, puisque les acides gras naturels ne sont pas solubles dans l'eau. De plus cette méthodologie ne permet pas de reproduire des conditions proches des conditions physiologiques de fonctionnement des enzymes, qui correspondent plutôt à une interface liquide/liquide qu'à une interface liquide/gaz. Au vu du rôle capital des phospholipases en biologie cellulaire, et afin d'étudier leur fonctionnement dans un milieu naturel, la demanderesse s'est proposée de mettre au point une méthode de dosage des phospholipases offrant des conditions de réaction proches des conditions physiologiques de fonctionnement de ces enzymes. L'article de S. NURY, G. PIERONI, C. RIVIERE, Y. GARGOURI, A. BOIS, R. VERGER, dans Chemistry and Physics of Lipids, 45 (1987) p.27-37 intitulé "lipase kinetics at the triacylglycerol-water interface using surface tension measurements" décrit une méthode analytique de mesure de l'activité lipasique, reproduisant les conditions in-vivo de l'interface huile/eau, fondée sur le principe de la variation de la tension interfaciale d'une goutte de substrat immergée dans une solution enzymatique. Cette méthode n'était cependant par applicable aux phospholipides. En effet de par leur hydrophobicité inférieure à celle des lipides, les phospholipides ne sont pas aptes à former une goutte au sein d'une solution aqueuse. Ils ont tendance à former des liposomes ou des phases lamellaires. L'invention a donc pour but de proposer une méthode de mesure de l'activité de phospholipases, de grande sensibilité, facile à mettre en oeuvre et présentant l'avantage de mesurer l'activité de ces enzymes dans des conditions proches des conditions naturelles de leur fonctionnement. Pour atteindre ce but, l'invention propose un procédé de mesure de l'activité hydrolytique des phospholipases sur les phospholipides, du type consistant à mesurer une tension interfaciale d'une goutte d'un corps huileux, immergée dans une phase aqueuse caractérisé en ce que - on réalise une adsorption d'un film de phospholipides à la périphérie de ladite goutte, - on immerge ladite goutte au sein d'une phase aqueuse, - on injecte la phospholipase à doser dans la phase aqueuse - on mesure la variation de la tension interfaciale de ladite goutte, due à l'hydrolyse du film de phospholipides par la phospholipase. D'une façon générale le procédé selon l'invention peut être utilisé avec un nombre varié et non limitatif de phospholipases : on peut par exemple doser la phospholipase Al, A2, D, ou C. Dans la description qui suit, on se réfère plus particulièrement à la phospholipasé A2. Parmi les phospholipides convenant à la mise en oeuvre de l'invention, on peut citer la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine, la phosphatidylethanolamine, le phosphatidylglycérol ou le phosphatidylinositol. Conformément à l'invention, les phospholipides sont adsorbés en une couche monomoléculaire ou multimoléculaire à la surface de ladite goutte. Enfin, à titre de corps huileux apte à former une goutte au sein d'un milieu aqueux on peut choisir ce dernier dans la famille des huiles végétales, notamment l'huile de soja, de tournesol ou l'huile d'olive, ou bien dans famille des huiles d'hydrocarbure, notamment l'huile de parafine, l'huile de silicone ou huile de vaseline. Avantageusement la phase aqueuse est constituée d'une solution tampon de pH compris entre 4 et 9. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description de nombreux essais entrepris par la demanderesse, et en se référant aux dessins et graphiques annexés qui représentent - Figure 1 : la réalisation d'une goutte d'huile au sein d'une émulsion de phospholipides - Figure 2 : la formation par adsorption d'un film monomoléculaire de phospholipides sur la goutte d'huile - Figure 3 : un diagramme illustrant la variation de la tension interfaciale, le temps en abscisse étant exprimé en minutes et la tension interfaciale en millinewton/mètre. Les essais suivants mettent en exergue la variation de tension interfaciale d'une goutte d'huile. Premier essai a) la phospholipase utilisée dans le premier essai était la phospholipase A2, purifiée à partir du venin de Naja Mossambica. On a opéré avec une solution aqueuse de phospholipase de concentration 33 nM. b) la source de phospholipides était la lécithine d'oeuf purifiée se présentant sous la forme d'une émulsion huile/eau, préparée à partir d'une solution mère ayant la composition suivante lecithine d'oeuf purifiée 1,2 g huile de soja purifiée 20 g glycérol 2,25 g eau distillé qsp 100 ml, et ayant été diluée 1.000 fois dans la solution tampon décrite en d) c) la goutte servant de support aux phospholipides était une goutte d'huile de soja purifiée. d) la phase aqueuse est constituée d'une solution tampon de pH 8. e) l'essai proprement dit a consisté, comme on peut le voir sur la Figure 1 à former une goutte d'huile (1) à l'aide d'une seringue (2), reliée à un tube (3), au sein de l'émulsion (4) de lécithine, contenue dans la cuve (5). On a procédé à une préincubation pendant 15 minutes, les molécules de lécithine ont alors migré vers la goutte d'huile et se sont orientées en fonction de leurs pôles hydrophile (6) et lipophile (7), afin de former par adsorption un film monomoléculaire (8), comme on peut le voir sur la Figure 2, sur ladite goutte. On a alors remplacé par périfusion l'émulsion dans ladite cuve par la solution tampon à l'aide de deux pompes péristaltiques synchrones (non représentées sur la Figure), ayant des débits identiques de l'ordre de 0,2 ml/min, l'une aspirant l'émulsion, l'autre apportant la solution tampon. On a alors procédé à une agitation pendant dix minutes avant d'injecter à l'aide d'une deuxième seringue (9) représentée en trait pointillé sur la Figure 1, la solution de phospholipase (10) dans ladite cuve (5). Parallèlement à ceci on a enregistré, après l'étape de périfusion les variations de forme et de dimensions de la goutte à l'aide d'une caméra reliée à une électronique de traitement d'images, permettant de calculer la tension interfaciale d'après l'équation de Laplace. Comme on peut le voir sur la Figure 3, durant les dix premières minutes d'agitation, précédant l'injection de phospholipase, on a noté une valeur constante de la tension interfaciale, indiquant une bonne stabilité du film phospholipidique à l'interface huile-eau. Après l'injection de phospholipase A2 (PLA2), on observe une diminution notable de la tension interfaciale, qui traduit une hydrolyse du film de lécithine présent à l'interface huile-eau. Deuxième essai Selon une variante de réalisation on a procédé à un deuxième essai, en opérant selon le même protocole que dans le premier essai, si ce n'est que l'expérience de périfusion n'a pas eu lieu. On a directement injecté la solution de phospholipase au sein de l'émulsion de lécithine. L'enzyme agit dans ce cas aussi bien sur les phospholipides présents dans l'émulsion que sur les phospholipides constituant la couche adsorbée à la surface de la goutte d'huile. En procèdant parallèlement à la mesure de la tension interfaciale, on a observé après injection de la phospholipase, une chute brutale de ladite tension interfaciale. Ainsi, conformément à l'invention, la mesure de la variation de la tension interfaciale d'une goutte d'huile sur laquelle est fixée le substrat de l'enzyme permet d'étudier la cinétique de la réaction enzymatique. On peut citer de nombreuses applications notamment pharmaceutiques, médicales et industrielles. REVENDICATIONS 1 - Procédé de mesure de l'activité hydrolytique des phospholipases sur les phospholipides, du type consistant à mesurer une tension interfaciale d'une goutte d'un corps huileux, immergée dans une phase aqueuse, caractérisé en ce que - on réalise une adsorption d'un film (8) de phospholipides à la périphérie de ladite goutte (1), - on immerge ladite goutte au sein d'une phase aqueuse, - on injecte la phospholipase à doser dans la phase aqueuse, - on mesure la variation de la tension interfaciale de ladite goutte, due à l'hydrolyse du film (8) de phospholipides par la phospholipase. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adsorption du film de phospholipides est réalisée en formant ladite goutte au sein d'une cuve (5) contenant une émulsion huile/eau de phospholipides. 3 - Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'immersion de ladite goutte au sein de la phase aqueuse est réalisée en aspirant la solution de phospholipides et en injectant de manière synchronisée ladite phase aqueuse. 4 - Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la phase aqueuse est constituée d'une solution tampon de pH compris entre 4 et 9. 5 - Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la phase aqueuse est constituée par l'émulsion huile/eau de phospholipides et que la phospholipase est directement injectée dans l'émulsion de phospholipides. 6 - Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la tension interfaciale est mesurée à l'aide d'une caméra reliée à une électronique de traitement d'images. 7 - Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le corps huileux est choisi parmi le groupe des huiles végétales. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le corps huileux est choisi dans le groupe constitué par l'huile de soja, l'huile de tournesol, l'huile d'olive. 9 - Procédé selon les revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le corps huileux est choisi parmi le groupe des huiles d'hydrocarbure. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'huile d'hydrocarbure est choisi dans le groupe constitué par l'huile de parafine, l'huile de silicone et l'huile de vaseline. 11 - Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le phospholipide est choisi parmi le groupe constitué par la phosphatidylcholine, la phosphatidylserine, la phosphatidylethanolamine le phosphatidylglycérol et le phosphatidylinositol.