Brevet FR2686085A1 — publié le 19930716

PEPTIDES REPRESENTANT DES FRAGMENTS DU CMP, ANTICORPS DIRIGES CONTRE LESDITS PEPTIDES, ET LEURS UTILISATIONS L'Invention est relative à un procédé permettant d'évaluer le degré de dénaturation protéolytique du lait et des produits laitiers. Les phénomènes de protéolyse et, en particulier, ceux dus aux protéases bactériennes sont responsables d'une baisse de qualité des produits laitiers. Les bactéries responsables de ces phénomènes sont essentiellement des bactéries Gram négatif, et surtout des Pseudomonas. I1 s'agit de bactéries psychrotrophes capables de se développer à basse température; le stockage du lait à 4 C favorise le développement de ces bactéries, aux dépens d'autres espèces. L'action des protéases des bactéries psychrotrophes a été étudiée essentiellement au niveau de la caséine. I1 semble que la fraction la plus rapidement dégradée soit la caséine K ; la caséine ss est également attaquée de façon significative, et à un degré moindre, la caséine asl est également dégradée. La protéolyse de la caséine K par les protéases des bactéries psychrotrophes libère un peptide d'environ une soixantaine d'acides aminés (par exemple, 64 acides aminés pour le lait de vache), le caséino macropeptide (CMP), également dénommé glycomacropeptide(GMP), et correspondant à l'extrémité C-terminale de la caséine K. L'activité protéasique des bactéries psychrotrophes est thermorésistante, et résiste aux traitements de stérilisation UHT. La persistance de cette activité dans les produits UHT, diminue le temps de conservation de ces produits, et leurs qualités organoleptiques. I1 est donc souhaitable de disposer d'un test permettant d'évaluer la protéolyse (ou le potentiel protéolytique) due aux bactéries psychrotrophes dans le lait et les produits laitiers. Un tel test, pratiqué sur le lait à son arrivée à la laiterie, permettrait de déterminer les traitements et les transformations les mieux adaptés à la qualité du lait reçu. I1 serait ainsi possible d'éviter certains accidents de fabrication (gélification des laits UHT, flaveurs amères, rancissement, baisse des rendements fromagers). D'autre part, un tel test serait également très utile à la fabrication fromagère. En effet, les enzymes protéolytiques des bactéries psychrotrophes jouent un rôle certain dans la maturation des fromages. La détermination de l'activité protéolytique potentielle avant la fabrication permettrait de mieux contrôler la maturation en modulant les conditions d'affinage. Plusieurs techniques ont, en conséquence, été proposées dans le but d'évaluer l'activité protéolytique dans le lait, et en particulier celle due aux bactéries psychrotrophes. Il a par exemple, été proposé d'évaluer directement la flore psychrotrophe, responsable de la protéolyse. Cette méthode qui fait intervenir des techniques de culture et de numération des bactéries présente tous les inconvénients y afférant : il faut disposer d'un équipement spécifique relativement important et d'un personnel spécialisé et, d'autre part, les résultats ne sont obtenus qu'après le délai nécessaire à la croissance des cultures bactériennes. Récemment, des techniques rapides indirectes (bioluminescence,impédancemétrie, etc...), ont été proposées. Toutefois, elles nécessitent un appareilage spécifique, sont plus ou moins adaptées à des cultures hétérogènes comme le lait et les produits laitiers, et sont en pratique peu utilisées dans l'industrie laitière. Il a également été proposé de doser directement ces protéases : ces dosages sont effectués soit sur la base de l'activité enzymatique, soit directement par quantification immunochimique des protéases. Le dosage de l'activité enzymatique s'effectue par exemple en déterminant l'hydrolyse de substrats naturels ou artificiels, libérant des produits marqués (colorés, fluorescents, ou radioactifs). A titre d'exemple, on citera la technique HPA [ CLIFFE et LAW, J. Dairy Sci., 49, 209-219 (1982)], dans laquelle le substrat est du collagène dénaturé par liaison covalente avec un colorant bleu. Cette technique permet de détecter les protéases produites par environ 2.106 psychrotrophes/l. Des méthodes immunochimiques ont été proposées, par exemple, pour la protéinase P1 de Pseudomonas fluorescens [BRIKELAND et al., Appl. Environ. Microbiol., 49, 382-387]. Le dosage de cette protéinase par la technique ELISA permet de détecter l'équivalent d'environ 107 psychrotrophes/l. D'autres techniques font appel à la mesure des acides aminés ou de l'azote non protéique libérés par la protéolyse. Ces méthodes sont toutefois, malaisées à mettre en oeuvre, car elles demandent une séparation préalable des produits de l'hydrolyse. Elles permettent de détecter environ 5 106 psychrotrophes/ml. Enfin, d'autres méthodes sont basées sur la détection des produits de l'hydrolyse des caséines : pour la caséine K, il a été proposé de doser les deux produits de dégradation qui sont la paracaséine K et le caséinomacropeptide (CMP). Actuellement, la paracaséine K n'est décelable que par électrophorèse, ce qui représente une méthode relativement lourde. En ce qui concerne le CMP, qui est un glycopeptide, il a été proposé de le doser par mesure de l'acide sialique, de l'acide N-acétyl-neuraminique, ou par chromatographie sur DEAE cellulose. Il s'agit toutefois de techniques lourdes, et les résultats obtenus sont peu précis Afin de disposer d'une méthode alliant rapidité, simplicité de mise en oeuvre et fiabilité, les Inventeurs ont entrepris la mise au point d'une technique immunologique de dosage du CMP. Ils ont donc cherché à obtenir des anticorps anti-CMP [COLLIN et al Communication au XXème Congrès International de Laiterie, Montréal, 8 - 12 Octobre 1990] Toutefois, ces anticorps ont l'inconvénient de présenter des réactions croisées avec la caséine K non hydrolysée ée ces réactions ne sont pas éliminées même après plusieurs chromatrographies d'affinité, ce qui implique, préalablement au dosage du CMP, de traiter le lait pour éliminer la caséine K non hydrolysée. La présente Invention s'est fixé pour but l'obtention d'anticorps anti-CMP ne présentant pas ou peu de réactions croisées avec la caséine K. Pour parvenir à ce but, les Inventeurs ont d'abord cherché à obtenir des immunogènes induisant des anticorps anti-CMP ne présentant pas de réactions croisées (ou bien uniquement des réactions faciles à éliminer par chromatographie d'affinité) avec la caséine K. Ils ont, de façon surprenante étant donné les réactions croisées observées lorsque le CMP est utilisé comme immunogène, obtenu le résultat souhaité en utilisant comme immunogène des peptides représentant des fragments de la séquence du CMP. La présente Invention a pour objet un peptide antigénique, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comprend au moins un fragment de la séquence du CMP. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par - le peptide de séquence I suivante (I) Lys-Thr-Glu-Ile-Pro-Thr-Ile-Asn-Thr-Ile, - le peptide de séquence II suivante (II) Thr-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro-Thr-Ser-Thr, - le peptide de séquence III suivante (III) Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu-Ala-Val-Glu-Ser, - le peptide de séquence IV suivante (IV) Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser, - le peptide de séquence V suivante (V) Asp-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro, - le peptide de séquence VI suivante (VI) Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val-Gln-Val, - le peptide de séquence VII suivante (VII) Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys-Cys, - le peptide de séquence VIII suivante (VIII) Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Cys, - le peptide de séquence IX suivante (IX) Met-Ala-Ile-Pro-Cys, ainsi que leurs fragments comprenant au moins 2 acides aminés. Ces compositions sont en particulier utilisables comme immunogènes pour l'induction d'anticorps anti-CMP spécifiques, et également comme réactifs pour la détection et le dosage du CMP. L'Invention englobe également des compositions antigéniques, lesquelles compositions sont caractérisées en ce qu'elles comprennent en tant que constituant essentiel au moins un peptide tel que défini ci-dessus. Des compositions antigéniques conformes à l'Invention englobent en particulier, non seulement les peptides représentant des fragments du CMP, mais également les antigènes plus complexes obtenus en couplant lesdits peptides à des protéines porteuses, ainsi que les MAP [multiple antigenic peptides : TAM, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413, (1988)] obtenus à partir desdits peptides. La position des peptides I à IX par rapport à la séquence du CMP est indiquée sur la figure 1, ainsi que celle des peptides utilisés pour la construction de MAP. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti-CMP, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique telle que définie ci-dessus. L'Invention englobe également les anticorps anti-CMP obtenus en utilisant comme immunogène, une composition conforme à l'Invention, en particulier une composition comprenant au moins un peptide répondant à l'une des séquences I à IX ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux. Les Inventeurs ont en outre constaté que l'immunisation d'animaux par les peptides conformes à l'Invention permettait l'obtention de deux types d'anticorps. Les uns reconnaissent le CMP dans le lait et les produits laitiers quelle que soit l'espèce productrice : il s'agit par exemple des anticorps obtenus par immunisation avec le peptide VII.Les autres sont spécifiques d'espèce : par exemple, les anticorps induits par immunisation avec le peptide de séquence VI reconnaissent spécifiquement le CMP de lait de vache ; ces derniers anticorps permettent donc en outre la détection de la présence de lait de vache dans du lait ou des produits laitiers provenant prétendument d'autres espèces (brebis, chèvre, par exemple) La présente Invention a en outre pour objet un procédé d'évaluation de la protéolyse du lait et des produits laitiers, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on met en contact un anticorps spécifique anti-CMP conforme à l'invention avec un échantillon de lait ou de produit laitier à tester, et une étape où l'on procède à la mise en évidence et/ou au dosage par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps formé au cours de l'étape précédente. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'anticorps anti-CMP utilisé est un anticorps produit contre le peptide de séquence VII. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, qui permet en outre la détection de la présence de lait de vache dans les produits laitiers à tester, l'anticorps utilisé est un anticorps produit contre le peptide de séquence VI. La présente Invention a également pour objet des réactifs de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé d'évaluation de la protéolyse du lait et des produits laitiers défini ci-dessus, lesquels réactifs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un peptide ou une composition antigénique ou bien au moins un anticorps spécifique anti-CMP conformes à l'invention. Ledit anticorps ou ledit peptide sont éventuellement couplés à un marqueur approprié permettant la révélation du produit de la réaction. Les réactifs conformes à l'Invention peuvent, par exemple, être utilisés sous forme d'une solution de l'anticorps ou du peptide considéré, ou bien ledit anticorps ou ledit peptide peut être fixé sur un support solide, tel qu'une plaque de microtitration, ou des bandelettes. Ces réactifs peuvent être associés entre eux, ou à d'autres réactifs dans des kits. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre d'une composition antigénique conforme à l'Invention pour l'obtention d'anticorps anti-CMP et à l'utilisation desdits anticorps pour l'évaluation de la protéolyse du lait. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I. - OBTENTION D'ANTICORPS ANTI-CMP Les peptides de séquence VI et VII sont synthétisés par la méthode de MERRIFIELD, en utilisant le protocole décrit dans le fascicule "Synthetic polypeptides as antigens", [VAN REGENMORTEL, BRIAND, MULLER, PLANE, Ed. Elsevier (1988)], puis purifiés par chromatographie. Après purification, le peptide est couplé à une protéine porteuse - soit l'ovalbumine sur l'acide aminé Cystéine par l'agent couplant MBS (M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester, - soit la sérum albumine-bovine sur l'acide aminé tyrosine par l'agent couplant BDB (Bisdiazobenzidine). EXEMPLE 1 - Préparation d'un sérum polyclonal Des lapins sont immunisés contre le peptide de séquence VII, selon le protocole suivant : pour la première injection, 200 Lg du peptide VII sont dissous dans 1 ml d'un mélange à volumes égaux de sérum physiologique et d'adjuvant complet de Freund. Des injections de rappel sont effectuées toutes les 3 semaines, avec 200 Ag de peptide, en émulsion dans de l'adjuvant incomplet de Freund. les prélèvements de sang sont effectués à partir de 10 jours après la 1ère injection, et le sérum est recueilli. Pour éliminer les réactions croisées avec la caséine K, le sérum est adsorbé sur un gel de caséine K, constitué de 10 mg de caséine K, additionnés de 200 mg de sérum albumine bovine et d'un agent couplant : le glutaraldéhyde à 2,5 t. Le gel polymérisé est conserve dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à 4 C. Dans un premier temps, le gel est centrifugé 15 mn à 18600 g, à 4 C. Puis, il est centrifugé 15 mn à 23600 g, à 4 C pour éliminer le tampon phosphate. Le sérum anti-CMP est ajouté sur le gel, à raison de 310 mg de sérum lyophilisé dans 1 ml de tampon phosphate. Ce mélange est agité 2 h à température ambiante, puis une nuit à 4 C. Ensuite, le gel est centrifugé 15 mn à 23600 g, à 4 C. Le surnageant est récupéré et le gel est rincé avec 0,25 ml de tampon phosphate. Puis, il est recentrifugé 15 mn à 23600 g afin de récupérer tout le sérum prisonnier. Le surnageant ainsi obtenu est additionné au premier surnageant. EXEMPLE 2 - Obtention d'anticorps monoclonaux anti-CMP Des souris Balb/c BYJICO sont immunisées par une première injection intra-péritonéale de 100 Rg de peptide VII couplé à l'ovalbumine, émulsifiés dans de l'adjuvant de Freund complet. Au 17ème jour, on procède à une injection intra-péritonéale de 50 Lg de peptide VII couplé à l'ovalbumine, en présence d'adjuvant de Freund incomplet, et à une injection intra-veineuse de 10Ag de peptide couplé à l'ovalbumine, sans adjuvant. Au 20è jour, les souris sont sacrifiées, la rate est prélevée, et les splénocytes sont fusionnés à des cellules myélomateuses selon la méthode de MILSTEIN et KOHLER [Nature, 256, 495-497 (1975)]. Le criblage des hybrides obtenus est effectué sur le peptide ayant servi à l'immunisation couplé à la Sérum albumine Bovine. II. - UTILISATION DES ANTICORPS ANTI-CMP POUR LE DOSAGE DU CMP DANS DES LAITS ET DES PRODUITS LAITIERS Ce dosage est effectué par méthode ELISA d'"inhibition" à l'aide d'un anticorps polyclonal obtenu comme décrit dans l'exemple 1. Une quantité connue d'antigène purifié (100 Rl d'une solution de CMP à 2 Fg/ml) diluée dans un tampon carbonate 0,1 M pH 9,6 est déposée dans chaque cupule d'une plaque de polystyrène. La plaque est ensuite fermée hermétiquement et placée une nuit à + 4 C. D'autres antigènes tels que les peptides ou les MAP dérivés du CMP peuvent être utilisés en remplacement du CMP dans ce dosage ELISA d'"inhibition". Les cupules sont ensuite lavées trois fois avec 350 Wl de PBS-Tween et sont saturées avec 250l de PBS-Tween + gélatine à 1%. La plaque est incubée 1h à 37 C. Dans un tube, on introduit une quantité connue d'anticorps et on ajoute des dilutions successives de la solution antigénique à doser. Ces mélanges sont incubés 2 heures à 37 C puis 100 Rl sont déposés dans les cupules de la plaque qui est ensuite laissée 1 heure 30 à 37 C. Le conjugué est un anticorps anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase. Il est dilué dans du PBS-Tween au 1/2000. Il est toujours mis 100 Fl par cupule. La plaque est incubée 45 mn à 37 C. Entre chaque étape, il est nécessaire de procéder à un lavage pour éliminer les produits en excès non fixés. Ce lavage s'effectue par trois dépôts successifs de 350 Al de PBS-Tween dans chaque cupule. Le substrat utilisé est le 3,3',5,5' tétraméthylbenzidine (TMB), dilué au 1/10 dans du tampon citrate 0,1 M pH 5 + H202. 75 Rl sont déposés dans chaque cupule. La plaque est incubée 15 mn à 37 C. La réaction entre la peroxydase et le TMB provoque une coloration bleue. Cette réaction est stoppée par l'ajout de 25 Rl d'acide chlorhydrique 1 N par cupule. Le substrat prend alors une coloration jaune. Les résultats sont évalués par mesure de la DO à 450 nm. Une gamme étalon est obtenue à partir de dilutions connues de CMP. Le dosage du CMP a été effectué parallèlement à ces observations. EXEMPLE 3 - Dosage du CMP dans le lait Les anticorps utilisés pour ce dosage ont été produits contre le peptide VII. Une étude sur 110 échantillons de lait, provenant de 4 fromageries, a montré que 13 % de ces échantillons renfermant en moyenne 2.105 germes par millilitre à leur arrivée au laboratoire, contenaient plus de 5 Ag de CMP par millilitre. Après deux jours de conservation à +4 C, la moyenne des germes s'élevait à 4.106 germes/ml et 26 % des échantillons possédaient plus de 5 Rg de CMP par millilitre. En outre, 9 échantillons de lait UHT ont été examinés, avant et après centrifugation, et leur déstabilisation a été évaluée. Les échantillons qui restaient stables après centrifugation ont été chauffés, entre 60 et 100-C et leur température de déstabilisation a été notée. On observe que les laits très déstabilisés ont une forte concentration en CMP ( > 80 Rg/ml) alors que les lait stables contiennent 10 Rg de CMP par ml, voire moins. Un lait qui reste stable après centrifugation mais qui se déstabilise lors du chauffage contient 43,4 Lg de CMP par ml. Les résultats font apparaître une relation entre la protéolyse de la caséine K évaluée par dosage du CMP, et la déstabilisation des laits UHT. EXEMPLE 4 - Utilisation d'anticorps conformes à 1'Invention pour le dosage du CMP dans le fromage et démonstration de la spécificité d'espèce d'anticorps dirigés contre le peptide VI Un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le peptide VI et préparé selon le protocole décrit à l'Exemple I est utilisé. Une extraction aqueuse dans 10 ml de tampon phosphate 0,05 M, pH 7,2 est effectuée sur 5 g de fromage par malaxage à l'aide d'un batteur. La présence ou l'absence de CMP de vache est recherchée sur la phase aqueuse obtenue par centrifugation de la solution obtenue après le malaxage en utilisant la méthode ELISA d'inhibition décrite précédemment. Les résultats sont illustrés par la figure 2. En abscisse sont indiquées les dilutions des extraits aqueux : (O) vache (0) brebis ; (s) chèvre ; en ordonnée la DO 450. REVENDICATIONS 1) Peptide antigénique, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comprend au moins un fragment de la séquence du CMP. 2) Peptide selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par - le peptide de séquence I suivante (I) Lys-Thr-Glu-Ile-Pro-Thr-Ile-Asn-Thr-Ile, - le peptide de séquence II suivante (II) Thr-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro-Thr-Ser-Thr, - le peptide de séquence III suivante (III) Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu-Ala-Val-Glu-Ser, - le peptide de séquence VI suivante (IV) Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser, - le peptide de séquence V suivante (V) Asp-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro, -le peptide de séquence VI suivante (VI) Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val-Gln-Val, - le peptide de séquence VII suivante (VII) Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys-Cys, - le peptide de séquence VIII suivante (VIII) Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Cys, - le peptide de séquence IX suivante (IX) Met-Ala-Ile-Pro-Cys, ainsi que leur fragments comprenant au moins deux acides aminés. 3) Compositions antigéniques caractérisées en ce qu'elles comprennent en tant que constituant essentiel au moins un peptide ou un dérivé de peptide choisi dans le groupe constitué par : les peptides selon une quelconque des revendications 1 ou 2, les produits de couplage desdits peptides avec des protéines porteuses, et les MAP dérivés desdits peptides. 4) Procédé de préparation d'anticorps anti CMP, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique, selon la Revendication 3. 5) Anticorps anti-CMP caractérisés en ce qu'ils sont obtenus en utilisant comme immunogène, une composition selon la Revendication 3. 6) Anticorps selon la Revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps monoclonaux. 7) Anticorps selon la Revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps polyclonaux. 8) Procédé permettant l'évaluation de la protéolyse du lait et des produits laitiers, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on met en contact un anticorps anti-CMP selon l'une quelconque des Revendications 5 à 7, avec un échantillon de lait ou de produit laitier à tester, et une étape où l'on procède à la mise en évidence et/ou au dosage par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps formé au cours de l'étape précédente. 9) Procédé selon la Revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise un anticorps dirigé contre le peptide VII. 10) Procédé selon la Revendication 8, permettant en outre la détection de la présence de lait de vache dans le produit à tester, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on utilise un anticorps dirigé contre le peptide VI. 11) Réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon la Revendication 8, lesquels réactifs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un anticorps anti-CMP, selon l'une quelconque des Revendications 5 à 7 ou une composition antigénique, selon la Revendication 3, éventuellement couplé à un marqueur approprié. 12) Utilisation d'une composition selon la Revendication 3 pour la préparation d'anticorps anti-CMP. 13) Utilisation d'une composition selon la Revendication 3 comme réactif pour la détection et le dosage immunologique du CMP.