Brevet FR2692280A1 — publié le 19931217

La présente invention est relative à des levures de Saccharomyces zinco- résistantes, à un procédé pour leur préparation, ainsi qu'à leur utilisation pour préparer par fermentation du glutathion. Le glutathion est un tripeptide de structure gam- ma-glutamyl-L-cystéinyl-glycine, qui possède un râle impor- tant en tant que co-facteur de divers enzymes et comme pro- tection des cellules contre un endommagement par oxydation par des composés toxiques, des dérivés oxygénés réactifs et le rayonnement et, généralement, dans l'inactivation des substances endommageant la cellule Il représente le thiol le plus fréquent des cellules. Le glutathion a une importance économique aussi bien comme thérapeutique, par exemple dans le traitement préventif des lésions hépathiques et comme protection d'une néphro-toxicité induite par médicament, que comme additif dans l'industrie alimentaire, par exemple comme additif de cui S son. La synthèse intra-cellulaire a lieu par voie en- zymatique à partir des acides aminés que sont l'acide L- glutamique, la L-cystéine et la glycine Pour stimuler la production de glutathion, on peut alors ajouter aux cellu- les, comme substances précurseurs actives, des composés du soufre comme l'acide aminé qu'est la L-cystéine. Etant donné que l'obtention de glutathion a lieu usuellement sur des cellules de levure, il est d'une impor- tance particulière d'améliorer le procédé pour la prépara- tion bio-technologique de glutathion Un aspect particu- lièrement important est dans ce cas le développement des souches de production de levure d'une productivité élevée en glutathion. Une augmentation de la teneur en glutathion peut être atteinte par une modification des souches de produc- tion par technique génétique, en particulier par clonage de gènes de synthèse de glutathion Un tel procédé de la tech- nique génétique est par exemple décrit dans EP-A-0 300 168. Selon JP 89/141 591, on peut également obtenir des teneurs élevées en glutathion en cultivant la levure de des teneurs élevées en glutathion en cultivant la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae dans un milieu synthé- tique renfermant des ions métalliques et des vitamines. On connaît également des procédés selon lesquels la synthèse du glutathion est améliorée par l'utilisation de levures modifiées par voie mutagène C'est ainsi que l'on peut, selon JP 86/031 081, muter des levures de la Fa- mille Candida et, selon JP 85/248 199 et EP-A-O 079 241, muter également des souches de Saccharomyces cerevisiae. Avec les mutants alors obtenus, on augmente notablement la production de glutathion. Dans ce cas, l'utilisation de levures de Candida ne conduit toutefois pas à un produit pouvant être utilisé dans des aliments sans autres purifications Lorsque l'on utilise des levures de Saccharomyces, spécialement de Sac- charomices cerevisiae, l'utilisation d'un produit brut com- me un type d'extrait de levure dans des aliments est égale- ment inoffensive Toutefois, les procédés décrits jusu'à présent n'indiquent pas de possibilité simple de sélection pour des souches de surproduction de glutathion, et les mu- tants obtenus possèdent par exemple selon JP 73/092 579 une productivité élevée de glutathion seulement dans un milieu de culture renfermant des teneurs élevées en soufre et avec addition d'acides aminés. Le problème se pose donc d'obtenir avec un rende- ment élevé du glutathion d'une pureté améliorée à partir de souches présentant après sélection une teneur en glutathion nettement accrue et qui fournissent également cette teneur accrue même lorsqu'on cultive dans un milieu standard sans addition de fractions élevées de soufre ou de mélanges d'a- cides aminés. Ce problème est résolu, conformément à l'inven- tion, par le fait que l'on utilise, lors de la préparation de glutathion par fermentation, une levure zinco-résistante de Saccharomyces. Des levures de Saccharomyces qui conviennent sont par exemple les souches zinco-résistantes de Saccharomyces cerevisiae et de Saccharomyces bayanus De ce fait, on peut aussi bien utiliser les levures de boulangerie proprement dites qui sont aussi utilisées comme levures de bière, qu'employer également d'autres levures de bière, de vin et de vin mousseux De préférence, on utilise des levures de Saccharomyces cerevisiae, la souche de levure Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 étant tout particulièrement préférée. Indépendamment des levures zinco-résistantes de Saccharomyces, la fermentation n'exige pas de mesures par- ticulières La fermentation peut donc être effectuée dans les conditions usuelles. Les levures zinco-résistantes de Saccharomyces sont obtenues par mutation et sélection de souches sauvages de Saccharomyces Dans ce cas, on produit d'abord des mu- tants par irradiation ultra-violette ou par des mutagènes chimiques, comme par exemple l'acide méthyl et l'acide éthyl-méthane- sulfonique, ou la nitroso-méthyl-guanidine, puis isole A partir de ces mutants, on sélectionne les mu- tants qui, par rapport à la souche sauvage, présentent une résistance accrue vis-à-vis du zinc La sélection a lieu dans ce cas à l'aide de solutions de sel de zinc d'une con- centration en sel qui est, de préférence, de 2 à 40 m moles par litre Des sels de zinc appropriés sont, par exemple, les sulfates, les phosphates ou le nitrate, le chlorure ou l'acétate Le chlorure de zinc est utilisé de préférence. Les mutants survivant à cette sélection se carac- térisent par le fait que, lors de la culture selon des pro- cédés connus, ils atteignent, sans addition d'agents par- ticuliers, une teneur nettement accrue en glutathion La teneur en glutathion est, en général, au moins sextuplée. Dans le cas de Saccharomyces cerevisiae DSM 7092, on obser- ve une augmentation octuple à décuple vis-à-vis de la sou- che sauvage Un autre augmentation de la teneur en gluta- thion peut être obtenue lors de la dernière phase de la culture en fournissant de la L-cystéine comme nourriture complémentaire. On obtient le glutathion en extrayant les cellu- les de levure Ensuite, on peut purifier selon des méthodes connues le produit qui a été extrait Selon le procédé in- diqué dans JP 86/031 081, le glutathion peut par exemple être précipité à l'état de sel de cuivre et être ensuite mis en liberté à l'aide d'hydrogène sulfuré. La présente invention possède les avantages sui- vants: La méthode de sélection décrite permet un enrichissement rapide et indubitable des mutants surproduisant du gluta- thion. La culture peut avoir lieu dans des milieux standard qui ont fait leurs preuves à l'échelle industrielle pour la culture de levures de boulangerie. Le procédé permet la préparation de glutathion dans la levure, dans des concentrations qui jusqu'à présent ne pouvaient être obtenues qu'en utilisant des milieux de mélasse standard. Les levures ne nécessitent pas d'autre zinc et, vis-à-vis d'une fermentation normale de levure de cuisson, pas de quantités accrues de soufre pour produire du glutathion en quantités élevées. Les exemples suivants doivent illustrer l'inven- tion. EXEMPLE 1 Préparation de saccharomyces cerevisiae DSM 7092 Avec 0,1 ml d'une solution 9,4-molaire d'acide éthyl-méthane-sulfonique et avec 4 ml d'un phosphate-tampon décimolaire, on secoue pendant 60 minutes, à 280 C, 20 mg de la souche haploïde A 4 du type Saccharomyces cerevisiae On obtient un taux de décès de 90 %. Les cellules survivantes sont plaquées sur le mi- lieu de sélection Dans ce cas, on utilise, par litre de milieu de sélection, comme agent de sélection, 1 ml d'une solution de Zn C 12 renfermant 600 m moles par litre de Zn C 12 * On isole les souches Zn C 12 résistantes ("mutant") et examine leur teneur en glutathion Un Saccharomyces ce- revisiae DSM 7092 isolé présente, vis-à-vis de la souche sauvage, une teneur en glutathion renforcée de 8 à dix fois. EXEMPLE 2 Culture de Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 dans un milieu total standard Dans un milieu total utilisé de façon standard pour la culture de levure et renfermant 2 % de glucose et 0,5 % d'extrait de levure, on agite pendant 48 heures à C, avec une fréquence d'agitation de 120 secousses par minute, la souche de Saccharomyces cerevisiae DSM 7092. Le glutathion est extrait des cellules par disso- lution, par extraction avec une solution chaude à 5 % d'a- cide phosphorique et décelé quantitativement par un test enzymatique. La teneur en glutathion est de 4,1 %, relative- ment à la substance sèche. EXEMPLE 3 Culture de Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 dans un milieu de mélasse standard La souche de Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 est extraite, dans les conditions indiquées dans l'exemple 2, dans un milieu de mélasse utilisé à l'échelle indus- trielle ( 10 % de mélasse, 25 g/l de saccharose, 0,55 g/l de (NH 4)H 2 P 04, 5,8 g/l de NH 4 Cl, 0,5 g/l de Mg C 12, 75 mg/l d'inositol, 5)ug/l de biotine, 800,yg/l de thiamine). L'extraction du glutathion et la détermination ont lieu comme décrit dans l'exemple 2. La teneur en glutathion est de 5,0 %, relative- ment à la substance sèche. EXEMPLE 4 Culture dans un milieu de mélasse standard avec addition de L-cystéine La souche de Streptomyces cerevisiae DSM 7092 est extraite comme décrit dans l'exemple 3 Seize heures avant la récolte, on ajoute à 100 ml de la solution de culture mg de chlorhydrate de L-cystéine. L'extraction du glutathion et la détermination ont lieu comme décrit dans l'exemple 2. La teneur en glutathion est de 6,6 %, relative- ment à la substance sèche. R E V E N D I C A T I O N S I L'utilisation de levures zinco-résistantes de Saccharomyces pour la préparation de glutathion par fermen- tation. 2 L'utilisation de levures selon la revendica- tion 1, caractérisée par le fait que l'on utilise des levures de Saccharomyces cerevisiae. 3 L'utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'on utilise la souche de Saccha- romyces cerevisiae DSM 7092. 4 Procédé de préparation de levures zinco-résis- tantes de Saccharomyces selon la revendication 1, à partir de levures, par mutation et sélection, caractérisé par le fait que l'on effectue la sélection en utilisant des sels de zinc. 5 La souche de levure, zinco-résistante, Saccha- romyces cerevisiae DSM 7092.