Brevet FR2686350A1 — publié le 19930723

METHODE D'EVALUATION DE L'INNOCUITE DE PRODUITS AU MOYEN DE MESURES DE BIOLUMINESCENCE La présente invention a trait au domaine de l'étude de produits et compositions. On entendra, d'une façon générale, par le terme "produits", dans la présente description, tout ingrédient, substance, isolé ou en composition, pouvant relever des domaines : pharmaceutique, cosmétique, alimentaire, agricole ou autres. Elle concerne plus spécialement un procédé permettant de mesurer l'innocuité et/ou l'efficacité de tels produits. La mise sur le marché d'un grand nombre de produits nécessite de mettre en évidence leur innocuité. Depuis de nombreuses années, on a tenté de résoudre ce problème en recourant à des expérimentations in vivo sur l'animal, le plus souvent : lapin, cobaye, souris et rat. Etant donné la propagation des mouvements de défense et protection des animaux, le recours à de telles méthodes est parfois compromis. On connaît également des méthodes alternatives, consistant par exemple en des tests de cytotoxicité réalisés sur des cultures cellulaires de kératinocytes ou de fibroblastes. Ces tests, qui impliquent une méthode de dénombrement, faisant appel à des colorations, donnent lieu à des difficultés expérimentales et sont encore souvent imparfaitement maîtrisés. Selon d'autres procédés, gui évitent l'expérimentation sur l'animal, on étudie la toxicité in vitro, sur des produits de synthèse de constitution sensiblement identique à celle de l'organe habituellement utilisé dans les tests sur animaux. Les résultats obtenus ne sont pas toujours fiables. L'invention a pour but de proposer une méthode de substitution permettant d'évaluer l'innocuité de produits, ladite méthode faisant appel à une mesure physique simple et actuellement maîtrisée, sans grandes difficultés expérimentales, et qui présente l'avantage d'être rapide et de grande précision. Pour atteindre ce but, l'invention propose un procédé pour détecter la présence de substances toxiques dans des produits ou compositions et/ou pour évaluer l'efficacité de ces derniers, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer des mesures comparatives d'émissions de photons issues de corps végétaux bioluminescents, seuls puis mélangés auxdits produits à étudier. Les phénomènes de bioluminescence sont connus de l'homme de l'art comme des phénomènes de chimiluminescence se produisant chez des organismes vivants. Les exemple les plus connus sont les lampyres ou vers luisants, les lucioles et certaines espèces de végétaux. On sait que ces phénomènes correspondent~ à la particularité de certains corps d'émettre spontanément, en permanence, un très faible courant de biophotons, et après exposition à un bref éclairement de lumière blanche, d'émettre un courant de biophotons beaucoup plus important dont l'intensité diminuera, jusqu'à atteindre celle du courant spontané. L'intensité du courant de biophotons est facilement mesurable à l'aide d'un ensemble instrumental approprié incluant un photomultiplicateur. D'une façon générale, la méthode selon l'invention peut être utilisée avec un nombre varié et non limitatif de végétaux. Par exemple, on peut choisir ces derniers parmi les familles des : chlorophycées, graminées, papilionacées, cucurbitacées, et de nombreux autres groupes. Dans la description qui suit, on se réfère essentiellement à un individu de la famille des chlorophycées, à savoir l'Acetabularia acetabulum, qui constitue un support préféré mais il est bien entendu qu'il s'agit d'un simple exemple illustratif. La mise en oeuvre de l'invention sera donc maintenant décrite par l'utilisation, à titre de corps végétal, de l'algue verte unicellulaire dénommée Acetabularia acetabulum (Aa), et en se référant aux dessins et graphiques annexés qui représentent : - Figure 1 : une courbe illustrant la bioluminescence de l'algue en cause (Aa), sur laquelle la bioluminescence est exprimée en 103 nombre de biophotons émis par 500 millisecondes. NB correspondant à la valeur de la bioluminescence retard; DA correspondant à la valeur de la bioluminescence spontanée. - Figure 2 : des diagrammes de bioluminescence, dans lesquels chaque pic représente la bioluminescence d'une Aa adulte. Les Aa sont numérotées de t--~à 30. NB est exprimée en 103 nombre de biophotons émis par 500 millisecondes, alors que DA est exprimée en nombre de biophotons émis par 500 millisecondes. Plus particulièrement - Les figures 2a et 2b, donnent respectivement les valeurs de NB et de DA des Aa non traitées. - Les figures 2c et 2d, illustrent respectivement les valeurs de NB et de DA des Aa traitées après trois jours de traitement. Les Aa portant les numéros impairs étant traitées par un extrait naturel alors que les Aa portant les numéros pairs ont été traitées par un extrait synthétique. - Figure 3 : des diagrammes illustrant les pourcentages d'augmentation de bioluminescences des Aa jeunes, après trois jours de traitement par un extrait naturel (N), un extrait synthétique (S) et un extrait de Ginseng (GE), chaque extrait N S et GE étant ajouté en des quantités de 0,2ml, 0,lml et 0,05ml; les figures 3a et 3b illustrant respectivement les valeurs de NB et DA. Acetabularia acetabulum (Aa) présente donc la particularité d'émettre spontanément un très faible courant de biophotons, ou bioluminescence spontanée dénommée DA. Après exposition à un très bref éclairement de lumière blanche, elle émet au moment de l'interruption de la source lumineuse, un courant de biophotons plus important ou bioluminescence retard dénommée NB, qui diminue ensuite jusqu'au niveau d'émission spontanée (voir Fig. 1). Soumise à une variation de son environnement, Aa modifie l'intensité de son émission de biophotons. Un environnement défavorable, correspondant par exemple à un milieu de culture carencé, et de.ce fait à une diminution de l'apport d'énergie à ladite Aa, se traduit par une diminution de l'émission de biophotons. En revanche, un apport d'énergie à ladite Aa, induit une augmentation des valeurs de bioluminescence DA et NB. Les essais suivants, au travers de l'étude de l'émission de biophotons d'Aa, mettent en exergue la sensibilité de l'algue à détecter une variation de son environnement. Plus précisément, ces essais mettent en oeuvre à titre purement indicatif et, ici, dans le domaine des cosmétiques, deux extraits de composition analytique très voisine, puisqu'il s'agit d'un extrait naturel et de l'extrait synthétique correspondant. Le composé naturel utilisé est ici un extrait hydrovégétal Lotus et Orchidée dénommé "N" préparé en mélangeant 50% d'un extrait hydrophile de fleurs d'orchidée (Dendrobium nobile) à 50t d'un extrait hydrophile de graines de Lotus (Nelumbo nucifera). L'extrait synthétique hydrovégétal dénommé "S" est préparé en mélangeant 50% d'extrait synthétique de fleurs d'Orchidée à 50% d'extrait synthétique de graines de Lotus. On s'est assuré par analyse chimique des extraits hydrophiles de fleurs d'Orchidée et de graines de Lotus de leurs compositions exactes afin de préparer des extraits synthétiques correspondants. Le premier essai met en exergue la capacité d'Aa à réagir de manière significative en termes de bioluminescence en présence de l'extrait naturel N et de l'extrait synthétique S. On procède de la manière suivante : on utilise 30 Aa à l'état adulte qui sont cultivées dans 10ml d'eau salée et les boites de Pétri sont numérotées de 1 à 30, chaque boite contenant une algue. On soumet chaque Aa à un éclairement de lumière blanche, et, à l'interruption de cet éclairement, on mesure la bioluminescence retard NB (Fig. 2a),~-~ainsi que la bioluminescence spontanée DA (Fig. 2b). Les Aa sont ensuite traitées soit par l'extrait N soit par l'extrait S. Les boîtes de Pétri portant les numéros impairs (1, 3, 5..29) reçoivent 0,2ml de l'extrait N, alors que les boîtes de Pétri portant les numéros pairs (2, 4, 6..30) reçoivent l'extrait S. Au terme d'une période de trois jours, on procède à nouveau à la mesure des bioluminescences NB et DA de chacune des trente Aa, et l'on compare les valeurs des bioluminescences avant et après traitement. La différence entre les valeurs des biolumines cences des Aa portant les numéros impairs, avant et après traitement n'est pas significative. En revanche, la différence entre les valeurs des bioluminescences des Aa portant les numéros pairs, avant et après traitement est hautement significative, aussi bien pour les valeurs de NB que de DA. Le traitement d'Aa pour l'extrait S aboutit à une diminution significative des valeurs de bioluminescence. L'émission de biophotons d'Aa a diminué, l'addition de l'extrait S dans le milieu de culture correspondant à une diminution de l'apport d'énergie à ladite Aa. Aa est apte à réagir de manière significative à la présence de substances à l'origine d'un environnement défavorable. Une deuxième série d'essais met en exergue la capacité d'Aa jeune à réagir de manière significative en termes de bioluminescence en présence de l'extrait N et de l'extrait S. La sensibilité d'Aa à réagir aux substances ajoutées dans leur milieu de culture est accentuée lorsque Aa est soumise à des conditions de stress, c'est-à-dire placée dans un milieu de culture carencé. On procède de la manière suivante : on utilise des Aa à ltétat jeune qui sont cultivées dans des boites de Pétri contenant 10ml d'eau salée, ayant une~~teneur en vitamines réduite de 90%, chaque boite contenant une algue. Comme dans le premier essai on procède à la mesure de NB et DA pour chaque Aa. L'émission de biophotons des Aa est soumise à deux influences opposées : d'une part la croissance des algues provoque une augmentation de l'émission de biophotons, d'autre part le milieu de culture carencé a une influence négative sur l'émission de biophotons. Les Aa sont ensuite traitées soit par l'extrait N, soit par l'extrait S ou par un extrait commercial de Ginseng GE. 0,2ml d'extraits N, S ou GE sont ajoutés au milieu de culture. On répète l'opération en utilisant 0,1 et 0,05ml des différents extraits. Au terme d'une période de trois jours, on procède à nouveau à la mesure des bioluminescences NB et DA pour chacune des Aa traitées, et on compare les valeurs de bioluminescences avant et après traitement. Le traitement d'Aa par les trois extraits aboutit à une augmentation significative des valeurs de bioluminescence. Cependant, l'augmentation des valeurs de NB et DA des Aa traitées par l'extrait N ou GE est plus importante que l'augmentation des valeurs de bioluminescence des Aa traitées par l'extrait S (voir Fig. 3a et 3b). La différence entre les pourcentages d'augmentation est d'autant plus significative que les extraits sont ajoutés en de fortes concentrations. L'extrait N est plus efficace que l'extrait S, de par son aptitude à contrebalancer l'influence du milieu de culture carencé. La mesure de la bioluminescence d'Aa constitue donc un précieux indicateur de l'efficacité des différents extraits introduits dans le milieu de culture. Dans une troisième série d'essais on a utilisé Aa à l'état adulte. L'émission de biophotons a été dans ce cas uniquement soumise à l'influence négative du milieu de culture carencé. Après addition des trois extraits N, S et GE, on a observé après une période de trois jours, une dépression des valeurs de bioluminescence plus importante pour les individus en contact de S. La mesure de la bioluminescence a permis de sélectionner l'extrait N, plus efficace, pour lutter contre une situation de stress. Il est important de noter que la méthode sus-décrite dans la présente invention a un caractère de généralité et ne se limite pas à l'utilisation d'Acetabularia acetabulum. C'est ainsi que l'on peut mettre en oeuvre d'autres corps végétaux comme par exemple : de la graine de concombre, des graines d'orge, de blé ou de maïs, des lentilles ou encore des graines de haricot. Ainsi, grace à l'invention, le praticien peut disposer d'une méthode substitutive, par mesure physique simple et précise de bioluminescence, permettant de détecter tout constituant toxique et d'évaluer l'efficacité de produits entrant dans la composition de formulations des domaines les plus variés, notamment pharmaceutique, cosmétique, alimentaire, agricole ou autres. REVENDICATIONS 1. Procédé pour détecter la présence de substances toxiques dans des produits ou compositions cosmétiques, pharmaceutiques, alimentaires, agricoles ou autres et/ou pour évaluer l'efficacité de ces derniers, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer des mesures comparatives d'émissions de photons issues de corps végétaux bioluminescents, seuls puis mélangés au(x) produit(s) à étudier. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les corps végétaux sont choisis dans le groupe constitué par : chlorophycées, graminées, papilionacées, cucurbitacées. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la chlorophycée est constituée par l'algue verte unicellulaire dénommée Acetabularia acetabulum. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'Acetabularia acetabulum est utilisé à l'état jeune et à l'état adulte en présence d'extrait naturel puis d'extrait synthétique d'un même produit, la capacité de l'Aa de différencier ces deux extraits étant mesurée par les diminutions ou augmentations d'émissions de photons. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit produit est constitué par un extrait de fleurs d'orchidée et un extrait de graines de lotus.