Brevet FR2695406A1 — publié le 19940311

Les analyses pour la détermination du taux sérique de vitamine B 12 se sont révélées être extrêmement difficiles à élaborer Cela est dû principalement à la grande sensibilité requise, de l'ordre des picogrammes, ainsi qu'au fait que le sérum normal contient des agents endogènes fixant la vitamine B 12 Ces agents fixants doivent être traités pour libérer la vitamine B 12 avant analyse; un tel traitement est très difficile et nécessite généralement une étape distincte pour sa mise en oeuvre Le traitement fait intervenir l'utilisation d'un chauffage à des températures élevées ( 1000 C), les analyses étant couramment désignées sous le nom d'analyses "par ébullition", ou bien l'utilisation d'agents chimiques forts, les analyses étant désignées sous le nom d'analyses "sans ébullition" Un exemple d'une analyse sans ébullition est présenté dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 300 907 au nom de Mansbach et collaborateurs. En raison de ces impératifs, jusqu'à une date récente, pratiquement toutes les analyses disponibles dans le commerce pour la vitamine B 12 consistaient en analyses radio- isotopiques utilisant pour la détection une protéine de liaison marquée avec un isotope radioactif Diverses autres formes ont été décrites dans la littérature, comprenant l'utilisation d'un agent chimioluminescent (Clin Chem, Vol. , N O 6, page 1194, résumé no 609 ( 1989)), d'un agent fluorescent (Clin Chem, Vol 37, N O 6, page 978, résumé N O 326 ( 1991)), et de vitamine B 12 marquée avec un colorant (disponible auprès de Ciba Corning) comme détecteurs Ces analyses utilisent pour la détection des microbilles revêtues d'une protéine fixant la vitamine B 12 et, en tant que telles, peuvent ne pas être compatibles avec de nombreux procédés de détection automatisés. En outre, des analyses par liaison à un enzyme, utilisant la phosphatase alcaline (par exemple Clin Chem, Vol 38, N O 6, page 1089, résumé no 0662 ( 1992), Clin Chem, Vol 38, N O 6, page 1095, résumé N O 0691 ( 1992), Clin Chem, Vol 37, N' 6, page 978, résumé N O 320 ( 1991)) et la /3- galactosidase (Clin Chem, Vol 33, No 6, page 963, résumé n O 403 ( 1987)) ont été décrites; cependant, ces deux enzymes sont très volumineux Puisque le temps requis pour les5 analyses immunologiques compétitives dépend fortement de la vitesse de diffusion, et puisque la vitesse de diffusion est approximativement inversement proportionnelle à la racine cubique du poids moléculaire, l'utilité de ces formes de réalisation dans de telles analyses est limitée.10 La présente invention propose une analyse compétitive non isotopique de la vitamine B 12 En résumé, l'analyse utilise le facteur intrinsèque (IF) marqué avec la peroxydase de raifort (PR) La PR peut être conjuguée au IF par oxydation des glucides de surface sur la PR. Il a été trouvé que ce procédé permet la forma- tion du conjugué IF/PR sans effet néfaste sur les sites de liaison à la vitamine B 12 présents sur le IF Ainsi, les conjugués peuvent être utilisés dans des analyses de vitamine B 12 En outre, le IF étant marqué avec la PR, les analyses peuvent être effectuées sur un appareil automatisé adapté à l'utilisation du signal engendré par la réaction PR/substrat. En outre, le procédé permettant la conjugaison de quantités relativement importantes de PR au IF (par exemple un rapport PR/IF élevé), le signal engendré est également puissant, ce qui augmente la sensibilité de l'analyse. Les analyses de la présente invention utilisent l'affinité de liaison bien connue du facteur intrinsèque (IF) pour la vitamine B 12 En résumé, dans une forme d'analyse compétitive appréciée, l'échantillon (liquide) (qui peut contenir de la vitamine B 12) est mélangé au IF conjugué à la peroxydase de raifort (PR) et est laissé en réaction Une portion aliquote de ce mélange est ensuite placée en contact avec une phase solide contenant de la vitamine B 12 liée Puis la phase liquide est séparée de la phase solide, en abandon- nant n'importe quelle quantité de IF/PR liée à la vitamine B 12 de la phase solide; toute quantité de IF/PR liée à la vitamine B 12 de l'échantillon reste dans le liquide La quantité de conjugué IF/PR dans l'échantillon peut ensuite être mesurée par addition de substrat de PR et mesure du produit de réaction Cette valeur est directement en rapport avec la quantité de vitamine B 12 dans l'échantillon En variante, l'activité du conjugué IF/PR lié est déterminée pour évaluer indirectement la quantité de vitamine B 12 dans l'échantillon.10 Le substrat utilisé est n'importe quel substrat sensible à l'action de la PR; les substrats appréciés comprennent: la tétraméthylbenzidine, la 0-phénylènediamine, le luminol/iodophénol et la tyramine. Le couplage de la PR au IF est une condition déterminante de cette analyse Puisque de nombreux procédés de couplage nécessitent un traitement avec des agents chimiques qui peuvent avoir un effet néfaste sur le IF et/ou la PR, le traitement doit être suffisamment doux pour permettre à ces deux constituants de rester inaltérés, tout en étant suffisamment puissant pour permettre la formation d'un conjugué qui ne se dissocie pas dans les conditions d'entreposage et/ou d'analyse. Un tel procédé utilise la réaction au periodate décrite par Wilson et Nakane dans Immunofluorescence and Related Staininq Techniques, Krapp et Collaborateurs (éd), North Holland Biomedical Press, Amsterdam, pages 215-224 ( 1978), citée à titre de référence dans le présent mémoire. En résumé, la surface glucidique de la PR est oxydée en un aldéhyde par addition de Na IO 4, dans une chambre réaction- nelle obscure à température ambiante La PR est en solution aqueuse, à une concentration de 1 à 50 g par litre, avanta- geusement de 5 à 25 g par litre, de préférence de 10 à 15 g par litre; le Na IO 4 est également en solution aqueuse à une concentration de 10 à 50 m M, avantageusement de 15 à 40 m M, de préférence de 20 à 30 m M Les corps réactionnels sont mélangés en un rapport de 10 à 20, de préférence 12-16, moles de Na IO 4/mole de PR. Puis la réaction est terminée par addition d'un excès d'un glycol, de préférence l'éthylèneglycol, et la PR oxydée est dialysée contre un tampon faiblement acide (p H 3- 6, de préférence 4-5) Une quantité d'environ 0,1 à 3 mg, de préférence 0,6 à 2,4 mg, de la PR oxydée purifiée est ensuite amenée à réagir avec environ 5 à 20 Mg, de préférence 10 à 15 Mg, de IF, en solution aqueuse à un p H basique ( 8-10, de préférence 8,5-9,5) Les conjugués résultants sont ensuite réduits par une solution aqueuse d'un hydrure métallique ou non métallique, de préférence le borohydrure de sodium ou l'hydrure de lithium-aluminium Puis le produit final est15 soumis à un échange dans une solution d'un sel neutre et du glycérol est ajouté pour faciliter le stockage. Les conjugués précités peuvent être utilisés dans l'analyse compétitive de vitamine B 12 décrite ci-dessus Les modes opératoires précités conviennent particulièrement pour la préparation de conjugués PR-IF car ils réduisent au minimum l'utilisation d'un IF coûteux, par utilisation d'un excès de PR pour garantir la réaction de la totalité du IF, en plus du fait de laisser la PR et le IF relativement intacts et fonctionnellement non modifiés.25 En outre, le mode opératoire d'analyse précité, utilisant des conjugués PR-IF, convient particulièrement pour l'utilisation dans des appareils d'analyse automatisés, tels que l'analyseur AFFINITYO produit et commercialisé par Bectonr Dickinson and Company, en raison du fait que l'acti- vité de PR est mesurée. Puisque de nombreuses analyses peuvent être formatées pour utiliser la PR comme marqueur ou détecteur, la polyvalence d'une telle analyse et, ainsi, d'un tel appareil est accrue. EXEMPLES Les exemples suivants démontrent certaines formes appréciées de réalisation de la présente invention, mais ne sont pas destinés à être illustratifs de toutes les formes de réalisation. Exemple 1 Préparation d'un conjugué PR-IF par réaction avec un periodate. Une quantité de 12 mg de PR a été dissoute dans 1,0 ml d'eau et mise à l'abri de la lumière Un volume total de 164 gl de solution aqueuse de Na IO 4 25 m M a été ajouté et le mélange réactionnel a été laissé en réaction pendant minutes à 250 C (bain d'eau à température ambiante). Immédiatement après, la réaction a été terminée par addition de 200 il d'une solution aqueuse à 1 % (en volume/volume) d'éthylèneglycol et le mélange réactionnel a été laissé au repos pendant 20 minutes à 250 C La solution résultante a été soumise à un échange dans un tampon consis- tant en une solution aqueuse d'acétate de sodium 1 m M (p H = 4,4) au moyen d'un dispositif d'ultrafiltration Centricon 30 jusqu'à obtention d'un tampon à une concentration supérieure ou égale à 99,5 % de carbonate. Puis la concentration de PR a été déterminée par absorbance à 403 nm et s'est révélée être égale à 9,2 mg/ml. Une quantité totale de 600 Mg de PR ( 66 Ml) a été ensuite mélangée à 85 pl d'un tampon consistant en une solution aqueuse de carbonate de sodium 0,5 M (p H 9,0) et 50 gg de IF, et le mélange a été mis en incubation à 250 C pendant 4 heures, à l'abri de la lumière. Immédiatement après, le tube a été placé dans un bain de glace et 50 gl d'une solution aqueuse de Na BH 4 ( 4 mg/ml) ont été ajoutés pour interrompre la réaction La solution a été mise en incubation à 40 C pendant 40 minutes, puis soumise à un échange de tampon dans une solution de phosphate de potassium 10 m M dans du sérum physiologique normal (p H 7,6) au moyen d'un dispositif Centricon 30 jusqu'à obtention d'un tampon à une concentration supérieure ou égale à 99,5 % de phosphate Le conjugué a été stocké dans un mélange de sérum physiologique tamponné avec un phosphate et de glycérol dans le rapport 50/50 (en volume/volume). Le conjugué a été utilisé dans une analyse compétitive de vitamine B 12 dans l'unité AFFINITY@ dans laquelle la vitamine B 12 liée (dans un tube revêtu) entre en compétition avec la vitamine B 12 libre pour le conjugué IF- PR La totalité du conjugué IF-PR réagissant avec la vitamine B 12 de l'échantillon (libre) est évacuée du tube, et la concentration de vitamine B 12 est déterminée par contrôle de l'activité de PR restant dans le tube revêtu. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de conjugués facteur intrinsèque-peroxydase de raifort, caractérisé en ce qu'il comprend (i) la réaction de la peroxydase de raifort avec Na IO 4 pour oxyder les glucides de surface afin de former une peroxydase de raifort oxydée; (ii) l'arrêt de ladite réaction et la concen- tration de ladite peroxydase de raifort oxydée; (iii) la réaction de ladite peroxydase de raifort oxydée concentrée avec le facteur in- trinsèque à un p H basique pour former un conju- gué oxydé; et (iv) la réduction et la concentration ulté- rieures dudit conjugué oxydé. 2 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que le rapport Na IO 4/peroxydase de raifort (mole/mole) est compris dans l'intervalle de 10/1 à 20/1. 3 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que le rapport de la peroxydase de raifort oxydée concentrée au facteur intrinsèque est compris dans l'inter- valle de 100-3000/5-20 (en poids/poids). 4 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que les conjugués oxydés sont réduits par addition d'un hydrure métallique ou non métallique. Conjugué facteur intrinsèque/peroxydase de raifort, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé comprenant: (i) la réaction de la peroxydase de raifort avec Na IO 4 pour oxyder les glucides de surface afin de former une peroxydase de raifort oxydée; (ii) l'arrêt de ladite réaction et la concen- tration de ladite peroxydase de raifort oxydée; (iii) la réaction de ladite peroxydase de raifort oxydée concentrée avec le facteur in- trinsèque à un p H basique pour former un conju- gué oxydé; et (iv) la réduction et la concentration ulté- rieures dudit conjugué oxydé. 6 Conjugué suivant la revendication 5, caracté- risé en ce que le rapport Na IO 4/peroxydase de raifort (en mole/mole) est compris dans l'intervalle de 10/1 à 20/1. 7 Conjugué suivant la revendication 5, caracté- risé en ce que le rapport de la peroxydase de raifort oxydée concentrée au facteur intrinsèque est compris dans l'inter- valle de 100-3000/5-20 (en poids/poids). 8 Conjugué suivant la revendication 5, caracté- risé en ce que le conjugué oxydé est réduit par addition d'un hydrure métallique ou non métallique. 9 Kit pour l'analyse compétitive de la vitamine B 12 au moyen d'un marqueur consistant en facteur intrinsèque marqué avec la peroxydase de raifort, caractérisé en ce que le perfectionnement comprend l'utilisation, comme marqueur, du conjugué facteur intrinsèque/peroxydase de raifort suivant la revendication 5.