Brevet FR2697255A1 — publié le 19940429

La présente demande concerne de nouveaux peptides haptèniques, leur procédé de préparation, leur application à la thérapie ou au diagnostic, les kits et réactifs immunolo- giques les renfermant. La demande de brevet Européen O 173 424 décrit des chélates de Technétium radiomarqué, et leur utilisation dans l'exploration des fonctions rénales. Les demandes de brevet européen N O O 263 046 et 0 419 387 ont décrit des immuno-réactifs destinés à cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo. Ces immuno-réactifs consistent en deux types de produits à savoir: a) un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps reconnaissant un type cellulaire, un tissu particulier ou un constituant d'un organisme animal conjugué à un second anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant un groupement hapténique déterminé et b) une molécule constituée d'au moins deux haptènes identi- ques ou différents reconnus par l'un des anticorps et d'un motif constitué d'un élément de visualisation, ou d'un produit actif ou connu pour pouvoir recevoir un élément de visualisation ou un produit actif destiné à la destruction de la cellule-cible. Dans ce qui suit, on appellera le produit (b) "sonde". Lorsque l'on veut réaliser une bonne visualisa- tion d'une cellule-cible, il est souhaitable de réduire au maximum le bruit de fond De même, étant donné que les produits radiothérapiques ou de radiodiagnostic possèdent habituellement une certaine agressivité, il est souhaitable de les retrouver seulement au niveau de la cellule- cible à détruire, le plus rapidement après leur administration. Les sondes précédemment décrites peuvent être marquées efficacement par différents isotopes radioactifs, particulièrement l'indium 111, l'iode 123 ou l'iode 131 pour la visualisation des cellules cibles et l'iode 131 pour, de plus, leur destruction. Toutefois, l'indium est un métal coûteux L'iode 123, pour sa part est d'un approvisionnement difficile De plus certains de ces produits tels l'Iode 131 sont des isotopes à durée de vie longue. Il serait donc souhaitable, de disposer de sondes très spécifiques, efficaces, capables de fixer des isotopes bon marché, d'approvisionnement aisé, ainsi que d'une durée de vie courte afin de permettre une administration à des doses plus élevées tout en permettant une durée d'exposition plus courte des corps, notamment humains, aux radiations. C'est pourquoi la présente demande a pour objet des sondes comprenant deux haptènes hydrophiles et un groupement potentiellement effecteur caractérisées en ce qu'elles répondent à la formule générale Hi X-S-CH 2-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH (I) I I R 3 H 2 ainsi que leurs sels, dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur utilisable pour protéger une fonction thiol contre l'oxydation, R 1, R 2 et R 3 représen- tent chacun une chaîne latérale d'acide aminé et H 1 et H 2 représentent des haptènes hydrophiles Les haptènes H 1 et H 2 peuvent être identiques ou différents Dans la formule I, le groupement X-S-CH 2-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH= I II R 1 R 2 R 3 représente le groupement potentiellement effecteur. Le groupe protecteur utilisable pour protéger une fonction thiol contre l'oxydation peut être par exemple un radical CH 3-CO-NH-CH 2-, CF 3 CO-, ou HO-CH 2-CO-, et de préfé- rence un radical CH 3 CO ou C 6 H 5 C 0-. Les acides aminés peuvent être choisis de préférence parmi les acides aminés naturels, de séries D ou L, et notamment parmi le groupe constitué de la glycine, de l'acide aspartique, de l'acide glutamique, de 1 'aspargine, de la glutamine et de la lysine Notamment R 1, R 2 et R 3 sont identiques et représentent particulièrement un atome d'hydro- gène. Les sels des dérivés de formule I peuvent être obtenus par réaction avec une base ou un acide de façon à assurer une solubilité suffisante dans l'eau et à ramener le p H de la solution à une valeur comprise entre 5 et 9 Ils doivent être compatibles avec l'activité chélatante du groupement effecteur On préfère utiliser des bases ou des acides connus pour former des sels peu ou pas toxiques On utilise de préférence des chlorhydrates, acétates, citrates, tartrates ou des sels de sodium et ammonium. Par "haptène", l'on entend dans le cadre de la présente invention, une molécule capable de se lier spécifi- quement à un anticorps au niveau d'un de ses sites de fixation C'est une molécule qui n'est pas antigénique par elle-même mais peut le devenir par fixation sur une macromo- lécule Sa masse moléculaire est généralement inférieure à 1500 daltons. Les haptènes préférés selon la présente invention auront une masse moléculaire comprise entre 300 et 1500 daltons et comporteront des groupements chimiques polaires. Ces groupements seront notamment des groupes alcools, amines, acides carboxyliques, sulfoniques et phosphoriques, ainsi que leurs esters et amides. On peut trouver des exemples de haptènes notem- ment dans "Methods in Enzymology Vol 84, J Langone and H Van Vunakis Ed Academic Press, New York 1982. Parmi les dérivés objet de la présente invention, on retient de préférence ceux caractérisés en ce que les haptènes ont une constante de dissociation inférieure ou égale à 10-5 M et notamment inférieure ou égale à 10-6 M avec un anticorps qui leur est spécifique Cette constante est mesurée dans les conditions usuelles de p H, température et concentration en sels. Comme indiqué dans les demandes de brevet précitées, les haptènes peuvent revêtir une grande variété de structures. A titre de haptènes, on retient également les dérivés des acides, amines ou aminoacides polaires liés de façon covalente par des liaisons amides et particulièrement de l'histidine et les dérivés de l'histamine, tout particu- lièrement de l'histamine-succinyl-glycine Ces composés comportent de préférence de 3 à 6 amines, acides ou acides aminés et notamment 3 ou 4 acides aminés, notamment polaires, liés de manière covalente de préférence par des liaisons amide. Par haptènes "hydrophiles", l'on entend que le coefficient de partition entre une phase aqueuse neutre (proche des conditions physiologiques) et un solvant organi- que non totalement miscible à l'eau comme le N-butanol est supérieur à 1 pour le haptène isolé Cette mesure peut être effectuée, notamment après deux heures d'agitation d'une solution d'haptène dans l Om M Hepes, 150 m M Na Cl, p H 7,4 mélangée à une partie égale de butanol. Dans une sonde, les haptènes et le(s) groupe(s) effecteur(s) sont reliés de manière stable par une chaîne de connexion Celle-ci permet la fixation simultanée sur une -25 même molécule sonde d'au moins deux anticorps spécifiques sur le ou les haptènes et ainsi la formation des complexes particuliers recherchés La liaison sera assez courte pour ne pas altérer la solubilité dans l'eau, ni permettre la liaison avec deux sites du même anticorps Elle sera assez longue pour permettre la liaison de deux anticorps différents. Typiquement, la distance entre les haptènes sera de préfé- rence comprise entre 10 et 80 Angstràms. L'on entend par "groupement effecteur", un groupement chimique responsable de l'effet désiré, consécuti- vement à l'utilisation de la sonde, sur sa cible dans l'organisme Le groupement effecteur peut réaliser soit le repérage des sites d'accumulation de la sonde, soit par exemple la destruction de cellules au niveau de sites d'accumulation Dans le cadre de la présente demande, la chaîne X-S-CH 2-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH= R 1 R 2 R 3 est le groupement potentiellement effecteur du dérivé de la formule I. Dans le premier type d'application, le groupement potentiellement effecteur pourra fixer par exemple un atome repérable par des moyens physiques appropriés, comme par exemple des atomes radioactifs émetteurs de rayonnement, notamment gamma, particulièrement le Technetium -99 m. Dans le second type d'application, le groupement potentiellement effecteur pourra fixer un isotope émetteur de rayonnement ionisant, par exemple fl notamment le Rhénium 186 ou 188 en vue d'une radio-thérapie. Des chaînes de connexion préférées sont celles qui permettent une séparation suffisante des haptènes, notamment une chaîne de longueur supérieure à 10 Angstrôms, et sont notamment de nature peptidique; ce sont par exemple des chaînes constituées de 3 à 12 acides aminés et de préfé- rence de 3 à 6 acides aminés. Ces chaînes seront de préférence peu sensibles à l'hydrolyse une fois injectées dans l'organisme On utilise avantageusement à titre de chaînes de connexion des aminoaci- des non naturels, de préférence de série D, en enchaînement peptidique. Pour certaines applications particulières, les chaînes de connexion cidessus décrites comprennent un groupement phénol et on retient tout particulièrement les chaînes de connexion renfermant de la tyrosine ou constituées de tyrosine. Parmi les dérivés objets de la présente inven- tion, l'on retient également ceux dont les haptènes sont des 3-l 2-( 4histidinyl)ethylaminocarbonyllpropionyl-glycyl (Histamine-SuccinylGlycyl), qui sont couplés à une diamine phénolée, notamment couplés à un peptide renfermant de la tyrosine. Parmi les dérivés selon la présente invention, on retient tout particulièrement les dérivés suivants: le Sacétyl-mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-e-(Hista- mine-SuccinylGlycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N-e-(Histamine- Succinyl-Glycine)-Lysinamide et le mercaptoacétyl Glycyl-GlycylGlycyl-N-E-(Histamine- Succinyl-Glycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N-E (Histamine-Succinyl-10 Glycine)-Lysinamide. La présente demande a également pour objet un procédé de préparation des dérivés de formule (I) ci-dessus ainsi que leurs sels, caractérisés en ce que l'on fait réagir un dérivé thiométhylé de formule (II) R-S-CH 2-CO-M (II) dans laquelle M représente un groupement libérable permettant le couplage d'un carbonyle sur une amine, de préférence un ester activé utilisable en synthèse peptidique, plus particu- lièrement un ester de N-hydroxysuccinimide, et R représente un radical R'CO dans lequel R' représente un alkyle renfer- mant 1 à 6 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone ou un radical aryle, notamment phényl, avec un dérivé peptidique de formule (III) I H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH (III) R 1 R 2 R 3 H 2 dans laquelle R 1, R 2, R 3, H 1 et H 2 ont la signification déjà indiquée pour obtenir le produit de formule (I) attendu que l'on isole ou salifie, si désiré.30 Les dérivés ci-dessus décrits possèdent de remarquables propriétés grâce aux deux groupements hapténi- ques hydrophiles et à leur groupement peptidique effecteur. Ils peuvent se lier rapidement, très spécifiquement et solidement à leur cible Leur bruit de fond, c'est à dire leur localisation indésirable est très faible Ils peuvent de plus lier des isotopes à durée de vie courte Leur action in vivo est possible grâce à leur exceptionnelle rapidité de localisation permettant leur mise en oeuvre malgré la brièveté de la demi-vie des isotopes du Technétium et du Rhénium utilisables. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet l'application des dérivés tels que définis ci-dessus au diagnostic et à la thérapeutique. Pour ces applications, on pourra se reporter notamment aux demandes de brevet européen EP-A-0 263 046 ainsi que EP-A-0 419 387 dont les enseignements sont incorpo- rés à la présente demande par référence. En vue de leur utilisation diagnostique, les dérivés selon la présente invention peuvent être par exemple injectés par voie intraveineuse à l'homme ou à l'animal. En même temps ou avant l'injection de la sonde, par exemple quelques minutes jusqu'à quelques heures avant (dans ce cas de préférence de 12 à 96 heures), on aura injecté un conjugué anticorps à double spécificité composé d'un anticorps notamment monoclonal ou fragment d'anticorps également de préférence monoclonal spécifique pour une cellule ou un composant normal ou pathologique d'un être vivant en particulier de l'homme, couplé à un anticorps, notamment monoclonal ou fragment d'anticorps de préférence spécifique pour le haptène considéré, tel que décrit ci- dessus en tant que produit (a), par exemple à la dose de 0,130 mg à 1 g selon la sonde utilisée et de préférence de 1 à 100 mg chez l'homme adulte. Les conjugués anticorps peuvent être préparés par exemple comme décrit par Le Doussal et al dans Cancer Research 50, 3445-3452, June 1, 1990. Le dérivé a) peut être utilisé seul ou en mélange (cocktail), dans ce dernier cas chacun des dérivés du mélange ayant une spécificité particulière pour des cellules ou constituants de l'organisme normaux ou pathologiques diffé- rents et une spécificité pour le même haptène. On procède après l'injection des dérivés selon l'invention à la mesure ou la détection grâce aux appareils biens connus dans l'état de la technique, par exemple pour la scintigraphie. Dans le cas d'un diagnostic isotopique on aura par exemple apporté une activité de 0,1 à 100 m Ci et plus particulièrement de 3 à 3 Om Ci. De même, on peut procéder au traitement radio- immunothérapique localisé d'une affection, par exemple tumorale, en utilisant une sonde selon la présente invention, possédant comme effecteur une isotope du Rhénium approprié. Le taux sera alors limité par la toxicité secondaire du principe actif sur les organes normaux et en particulier sur la moelle osseuse. Pour une application en radio-immunothérapie, une dose préférée sera comprise par exemple entre 50 m Ci et 1 Ci. Compte tenu de l'utilisation particulière des dérivés selon la présente invention, la présente demande a également pour objet les kits diagnostiques ou thérapeuti- ques, caractérisés en ce qu'ils renferment au moins un des dérivés selon la présente invention, tels que définis ci- -25 dessus et un anticorps ou un fragment d'anticorps, notamment monoclonal reconnaissant un type cellulaire ou un tissu particulier, conjugué à un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant un groupement hapténique du dit dérivé. La présente demande a enfin pour objet les réactifs immunologiques et les kits comprenant un conjugué, composé d'un anticorps ou fragment d'anticorps notamment monoclonal ayant une affinité pour un type cellulaire particulier ou un constituant normal ou pathologique de l'organisme particulier, couplé à un anticorps ou fragment d'anticorps notamment monoclonal ayant une affinité pour un haptène donné, et une molécule synthétique, comprenant au moins deux haptènes correspondant au conjugué ci-dessus et au moins un site apte au marquage radioactif, liés de manière covalente, caractérisées en ce que la molécule synthétique5 est un dérivé ci-dessus défini. Les dérivés de formule I peuvent être conservés lyophilisés, seuls ou en présence d'un chélatant intermé- diaire tel que acétate, glycine, citrate, malonate et notamment tartrate, de préférence désoxygéné, et de chlorure10 stanneux, de préférence déshydraté. Lorsque l'on parle de conjugué d'anticorps, on ne préjuge pas d'une méthode de préparation quelconque en ce sens que l'on vise aussi des anticorps bi-spécifiques encore appelés recombinants, quadromes ou polydomes, par exemple.15 Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE i S-acétyl-mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-e- (Histamine-Succinyl-Glycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N (Histamine- SuccinylGlycine)-Lysinamide. Stade A: Préparation du Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-e-(Histamine-Succinyl- Glycine) -Lysyl-D-Tyrosyl-N-e (Histamine-Succinyl-Glycine) - Lysinamide. H-(N FH-CH 2-CO)3-N H-CH-CO-N H-CH -CO-N H-CH-CO-N H 2 l II (CH 2)4 CH 2 (CH 2)4 I I - NH NH I CO CO l I CH 2 OH CH 2 I I = CH 2-CH 2 N H-CH 2 NHO-CH 2 f N NH -CH 2-CO-NH N H _,CH 2-CH 2-N H-CO-CH 2-CH 2-CO Nk N NH Ce peptide a été synthétisé par la technique de synthèse en phase solide. Toutes les étapes décrites ont lieu sous agitation en phase solide. 1 g de résine p-méthyl benzhydrylamine ( 0,63 mmol NH 2) a été traitée par de la di-isopropyl-éthylamine (DIEA) à 5 % dans du dichlorométhane (DCM) 3 fois 2 minutes Puis les acides aminés suivants ont été couplés successivement: N-a-t Boc-N-e-Fmoc-Lysine,N-a-t Boc-O-2,6-dichlorobenzyl-D- tyrosine, N-a-t Boc-N-e-Fmoc-Lysine, N-a-t Boc-Glycine, N-a- t Boc-Glycine, N-a-t Boc-Glycine (t Boc: tert-butyloxycarbo- nyle, Fmoc: fluorénylmethyloxycarbonyle) Les étapes suivantes ont été répétées pour le couplage de chaque acide aminé: Couplage: 1,57 mmol d'acide aminé protégé est ajouté à 1,57 mmol de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et 1,57 mmol de l-hydroxybenzotriazole (HO Bt), en solution dans un mélange de diméthylformamide (DMF)/DCM, 1/1, v/v. Après une heure ( 1/2 heure dans le cas des N-a-t Boc-Glyci- nes), la résine est lavée avec du DMF ( 3 fois) et du DCM ( 3 fois) L'absence de fonctions NH 2 libres sur la résine est vérifiée par le test de Kaiser Si nécessaire le couplage est recommencé dans les mêmes conditions Si après deux couplages successifs le test de Kaiser révèle la présence de fonctions NH 2 libres, la résine est alors acétylée par 2,5 mmol d'anhydride acétique dans du DMF en présence de 2,5 mmol de DIEA. Déprotection de la fonction a-NH 2 La déprotection du groupement a-NH 2 est ensuite effectuée par de l'acide trifluoroacétique dans du DCM ( 50 %), pendant 2 minutes puis minutes, puis après deux lavages au DCM la résine est traitée par de la DIEA ( 5 % dans du DCM, 2 fois 2 minutes, après 3 lavages au DMF le couplage suivant est effectué. Après incorporation de la t Boc-Glycine N-terminale la protection de la fonction a-NH 2 de la glycine est conservée il et les groupements Fmoc protégeant les groupements E-NH 2 des lysines sont clivés en présence d'un mélange de piperidine / DMF, 1/1, v/v, pendant 2 minutes puis 40 minutes Après 3 lavages par le DCM et 3 lavages par le DMF, 3,15 mmol de N-a-Fmoc glycine sont ajoutées en présence de 3,15 mmol de DCC et de 3,15 mmol d'HO Bt, dans un mélange DMF / DCM, 1/1, v/v Après 1/2 heure le couplage est contrôlé par le test de Kaiser, et renouvelé dans les mêmes conditions si nécessaire Puis le groupement Fmoc protégeant la fonction a-NH 2 de la glycine est clivé de la même façon que précédemment. Après lavage ( 3 fois par du DCM et 3 fois par du DMF) de l'anhydride succinique ( 5 mmol) est ajouté en présence de mmol de diisopropyléthylamine (DIEA) après 1 heure la réaction est contrôlée par le test de Kaiser et le couplage renouvelé dans les mêmes conditions si nécessaire Après lavage ( 3 fois par du DCM et 3 fois par du DMF) du di- chlorhydrate d'histamine ( 5 mmol) est ajouté en présence de 25 mmol de DIEA, de 5 mmol d'hexafluorophosphate de benzotriazol-l-yl-oxy-tris(diméthylamino)phosphonium (BOP) et 5 mmol de HO Bt en solution dans un mélange diméthyl- sulfoxyde (DMSO)/DMF, 5/2, v/v. Après deux heures de réaction la résine est lavée au DMSO ( 3 fois) puis au DMF ( 3 fois) et le couplage est répété dans les mêmes conditions Après 12 heures de réaction la résine est lavée comme précédemment, puis séchée sous pression réduite Le peptide est alors clivé de la résine par l'acide fluorhydrique liquide (HF): pour 600 mg de peptidyl résine, 750 1 il de para crésol, 375 gl de diméthyl- sulfure sont ajoutés et 6 ml d'acide fluorhydrique sont distillés dans le réacteur La réaction est maintenue à 4 C 1 heure sous agitation puis le HF est éliminé par distilla- tion La résine est alors lavée à l'éther puis le peptide est élué par de l'acide acétique 0,1 M Le peptide est alors purifié par chromatographie de perméation de gel sur une colonne de TSK HW 40. La pureté est vérifiée par HPLC sur une colonne de phase inverse (C 18) éluée par un gradient de solvants (A: acide trifluoroacétique dans l'eau à 0,56, B: Acétonitrile). L'identité du produit a été vérifiée par spectro- métrie de masse: (M+H)+ observé: 1110,1; calculé: 1109,2. Stade B: Préparation du S-acétyl-mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl- N-E (Histamine-Succinyl-Glycine) -Lysyl-D-Tyrosyl-N-e (Hista- mine-Succinyl-Glycine)-Lysinamide. CH 3-CO-S-CH 2-CO-(NH-CH 2-CO)3-NH-CH-CO-N H-C H-CO-NH-CH-CO-N H I I 2 (CH 2)4 CH 2 (CH 2)4 i i NH C NH CO CO lC O 1 TI CH 2 OH CH 2 II / CH 2-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CO-NH NH N/V NH CH 2-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CO N 1,,NH A 32,5 lmol de produit du stade A en solution dans 12 ml de tampon phosphate (p H 7,4; 50 m M) sont ajoutés -doucement sous agitation à 81 Amol de l'ester de N-hydroxy- succinimide de l'acide S-acétylmercaptoacétique en solution dans 140 gl de DMSO La réaction est laissée sous agitation 3/4 d'heure à température ambiante Le produit obtenu est purifié par HPLC sur une colonne de phase inverse (C 18), et élué par un gradient de solvants (A: acide trifluoroacétique dans l'eau à 0,5 %, B: Acétonitrile). L'identité a été vérifiée par spectrométrie de masse: (M+H)+ observé: 1225,8; calculé: 1225,3. EXEMPLE 2 Mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-e (Hista- mine-Succinyl-Glycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N-e (Histamine- SuccinylGlycine)-Lysinamide. A 0,18 Mmol du dérivé obtenu à l'exemple 1, en solution dans du tampon phosphate (p H 7,4; 50 m M) 1 ml sont ajoutés 0,72 gmol de chlorhydrate d'hydroxylamine en solution dans du tampon phosphate ( 50 m M; ajusté à p H 7,4) 1 ml La réaction est maintenue sous agitation une heure à température ambiante, puis 5 g 1 de mercaptoéthanol sont ajoutés et la10 réaction est maintenue 1 heure à la température ambiante Le peptide est alors purifié par chromatographie haute perfor- mance sur une colonne de phase inverse (C 18), et élué par un gradient de solvants (A: acide trifluoroacétique dans l'eau à 0,5 9, B: acétonitrile) L'identité à été vérifiée par spectrométrie de masse: (M+ H)+ observé: 1183,8; calculé: 1183,3. HS-CH 2-CO-(N H-CH 2-CO)3-N H-CH-CO-N H-CH-CO-N H-CH-CO-N H 2 I I (CH 2)4 CH 2 (CH 2)4 I I NH NH I I CO CO I I CH 2 OH CH 2 I I r_ CH 2-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CO-NH NH N /NH CH 2-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CO N, /NH EXEMPLE 3 Synthèse de 9 Tc mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl- Glycyl-N (Histamine-Succinyl-Glycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N-E-20 (Histamine-Succinyl-Glycine)-Lysinamide. L' éluat d'un générateur de g Tc (Elumatic III, Cis biointernational) est dilué avec du soluté physiologique de façon à avoir 10 m Ci/ml 100 41 (lm Ci) sont mélangés à 0,1 nmol de produit de l'exemple 1 en présence de 2 nmol de tartrate disodique, de 5 nmol de chlorure stanneux et de l Ogmol d'HEPES tamponné à p H 8 Le mélange est agité et chauffé au bain marie à 100 OC pendant 10 mn, puis refroidi sous l'eau froide pour obtenir le produit marqué attendu. Détermination du rendement de marquage: Un échantillon du produit cidessus est dilué dans du tampon phosphate salin p H 7,4 contenant 1 % d'albu- mine bovine de façon à avoir environ 100000 cpm dans 1 ml. 300 p 1 de la dilution sont incubés 1 heure sous agitation à température ambiante dans des tubes recouverts d'anticorps 679 l MC 7 ( 1 gg/l ml) dirigé contre l'haptène glycyl-succinyl- histamine La radioactivité totale présente dans chaque tube est déterminée, puis les tubes sont vidés et lavés et la radioactivité liée est déterminée Le rendement de marquage ( 92 à 97 %) est évalué par le rapport radioactivité liée / radioactivité totale. En conclusion les dérivés de la présente inven- tion présentent de remarquables résultats par rapport aux autres techniques directes et indirectes de visualisation. ETUDE PHARMACOLOGIQUE 1) Marquage in vivo du foie des souris à l'aide d'anticorps 679 1 MC 7 et du dérivé de l'exemple 3 (I marqué à TC). La liaison du dérivé de l'exemple 3 aux cellules hépatiques s'effectue par l'intermédiaire de sa liaison au site Ac de l'anticorps 679 l MC 7, lui même lié par son fragment F(c) à ces cellules Des souris ayant reçu 2 gg d'anticorps 679 l MC 7 24 heures plus tôt sont injectées par voie intraveineuse avec 100 g Ci 15 pmol de dérivés de l'exemple 3 Les images sont réalisées avec une caméra Sopha Medical Gammatome 2 équipée avec un colimateur haute résolu- tion de moyenne énergie, puis les animaux sont sacrifiés et la radioactivité présente dans la rate est déterminée à l'aide d'un compteur gamma Le foie est apparent en scinti- graphie quatre heures après l'injection Les animaux sont alors sacrifiés et le foie est prélevé et sa radioactivité déterminée: 54 + 6 % de la dose injectée est localisée dans le foie. Les sondes selon la présente invention peuvent donc servir au marquage d'un tissu auquel est lié un anti- corps. 2) Marquage avec le produit de l'exemple 3 des lymphocytes de souris BALB/c qui expriment l'antigène Lyb 8 2 pour visuali- ser la rate de ces animaux. 100 g Ci de dérivé de l'exemple 3 sont injectés à une souris ayant reçu quelques minutes plus tôt 1 pg de conjugué anticorps CY 34-679 l MC 7 (anti-lyb 8 2-anti-Histamine- Succinyl-Glycine) Les images sont enregistrées comme indiqué dans l'exemple précédent La rate est apparente en scinti- graphie quatre heures après l'injection Les animaux sont ensuite sacrifiés et la rate est prélevée: 43 + 3 % de la dose injectée est localisée dans la rate. Par l'intermédiaire d'une sonde selon la présente invention à double spécificité tissu-haptène, on peut fixer la sonde sur le tissu, même en cas d' administration quasiment simultanée d'anticorps à double spécificité et de sonde selon l'invention et ainsi procéder à la visualisation du tissu concerné. 3) Ciblage du produit de l'exemple 3 dans des tumeurs colorectales humaines (L 5174) greffées à des souris nudes. Des cellules de tumeurs colorectales humaines (cellules LS L 74, 3 106) sont injectées par voie sous cutanée à des souris nudes Trois semaines plus tard des tumeurs de 0,3 à 1,2 g sont obtenues Les souris reçoivent alors 2 gg de conjugué anticorps F 6-679 l MC 7 (anti CEA-anti-Histamine- Succinyl-Glycine) Vingt quatre heures plus tard les souris reçoivent 6, 7 p Ci (lpmol) de dérivé de l'exemple 3 Six heures plus tard les images sont enregistrées comme indiqué dans l'exemple précédent puis les animaux sacrifiés Les tumeurs sont visibles dès trois heures après l'injection du dérivé de. l'exemple 3, on observe une localisation de la radioactivité de 9,8 + 3, 7 % / g de tumeur et le rapport de marquage *tumeur/plasma est de 2 0 + 0 5. Il est donc possible de détecter des tumeurs humaines grâce à desanticorps à double spécificité corres- pondant à la tumeur et aux haptènes porté par la sonde, et à une sonde selon l'invention. EXEMPLE 4 Tolérance des sondes chez l'animal. Des doses correspondant à 10 nanomol, soit environ 10000 fois plus que la dose qui est nécessaire pour une radio-immunoscintigraphie, du composé 3 ont été adminis- trées à des souris BALB/c Ces souris ont ensuite été observées pendant 16 jours dans des conditions normales d'élevage On n'a constaté aucun signe de toxicité et la prise de poids de ces animaux n'a pas été significativement différente de celle d'un lot d'animaux témoins. REVENDICATIONS 1 Dérivés comprenant deux haptènes hydrophiles et un groupement potentiellement effecteur caractérisés en ce qu' ils répondent à la formule générale Hi 1 X-S-CH 2-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH (I) I I I I Ri R 2 R 3 H 2 ainsi que leurs sels, dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur utilisable pour protéger une fonction thiol contre l'oxydation R 1, R 2 et R 3 représen- tent chacun une chaîne latérale d'un acide aminé et H 1 et H 2 représentent des haptènes hydrophiles. 2 Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce que les haptènes hydrophiles ont un coefficient de partition eau-butanol supérieur à 1. 3 Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les haptènes ont une constante de dissociation inférieure ou égale à 10-5 M avec un anticorps qui leur est spécifique. 4 Dérivés selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisés en ce que les haptènes sont des dérivés d'amines, d'acides ou d'acides aminés polaires liés de façon covalente par des liaisons amide. 5 Dérivés selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisés en ce que les haptènes sont fixés au groupement potentiellement effecteur par l'intermédiaire d'une chaîne de connexion qui est un peptide. 6 Dérivés selon l'une quelconque des revendica- tions 4 ou 5, caractérisés en ce que les haptènes sont des groupements Histamine-Succinyl-Glycine. 7 L'un des dérivés dont les noms suivent: le S-acétyl-mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-e- (Histamine-Succinyl-Glycine)-Lysyl-D-Tyrosyl-N-e-(Histamine- SuccinylGlycine)-Lysinamide, le mercaptoacétyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-N-E (Histamine-. Succinyl-Glycine) -Lysyl-D-Tyrosyl-N-e (Histamine-Succinyl- Glycine)-Lysinamide,ou l'un de leurs sels. 8 Procédé de préparation des dérivés de formule (I) ci-dessus ainsi que leurs sels, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé thiométhylé de formule (II) R-S-CH 2-C 0-M (II) dans laquelle M représente un groupement hydrolysable permettant le couplage d'un carbonyle sur une amine, de préférence un ester activé utilisable en synthèse peptidique, plus particulièrement le N-hydroxysuccinimide, et R repré- sente un radical R'CO dans lequel R' représente un alkyle renfermant 1 à 6 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone ou un radical aryle, notamment phényl, avec un dérivé peptidique de formule (III) g H HI 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH (III) I I I I R 1 R% R 3 H 2 dans laquelle R 1, R 2, R 3, H 1 et H 2 ont la signification déjà indiquée pour obtenir le produit de formule (I) attendu que l'on isole ou salifie, si désiré. 9 Application des dérivés tels que définis à l'une quelconque des revendication 1 à 7 au diagnostic ou à la thérapeutique. 10 Kits diagnostiques ou thérapeutiques, caractérisés en ce qu'ils renferment au moins un des dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et un anticorps ou fragment d'anticorps, notamment monoclonal reconnaissant un type cellulaire ou un tissu particulier, conjugué à un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant un groupement hapténique du dit dérivé. 11 Réactifs immunologiques comprenant un conjugué composé d'un anticorps ou fragment d'anticorps notamment monoclonal ayant une affinité pour un type cellu- laire particulier ou un constituant normal ou pathologique de l'organisme particulier, couplé à un anticorps ou fragment d'anticorps notamment monoclonal ayant une affinité pour un haptène donné, et une molécule synthétique comprenant au moins deux haptènes correspondant au conjugué ci-dessus et au5 moins un site, apte au marquage radioactif ou à fixer un principe actif, liés de manière covalente, caractérisés en ce que la molécule synthétique est un dérivé défini à l'une des revendications 1 à 7.