Brevet FR2694022A1 — publié le 19940128

Procédé d'amplification des agents infectieux en diagnostic "in vitro" sur cultures cellulaires La présente invention concerne un procédé d'amplification des agents infectieux en diagnostic "in vitro" sur cultures cellulaires mycoplasmisées. La culture cellulaire est encore la technique de référence pour le diagnostic de nombreuses maladies infectieuses. La spécificité cellulaire souvent associée avec un effet cytopathogène caractéristique, est généralement confirmée par une détection immunologique révélant une structure antigènique spécifique de l'agent infectieux recherché. La culture cellulaire fournit alors une phase d'amplification de cet agent. Par exemple, le HSV (Herpès Simplex Virus) est ainsi recherché sur cellules Véro, le Chlamydiae sur cellules Mac Coy, le RSV (Virus Respiratoire Syncitial) sur les cellules Hep-2, etc. Certaines infections étant rares et de développement difficile sur cultures cellulaires, d'une part (exemple Chlamydiae), et le germe recherché pouvant être peu abondamment représenté dans le prélèvement, d'autre part, il importe d'optimiser au maximum le système de diagnostic in vitro des agents infectieux correspondants, notamment par un procédé d'amplification préalable du nombre d'agents infectieux. C'est le but de la présente invention, qui a en outre l'intérêt de mettre en évidence le rôle de ce type de cofacteur en pathologie humaine et de compléter un modèle in vitro dans le sens des écosystèmes plus proche de la réalité in vivo. Longtemps considérés comme opportunistes ou associés à certaines infections, les mycoplasmes ont aussi été suspectés d'être eux-mêmes responsabLes de pathologies. Le travail ayant conduit à la présente invention a consisté à étudier in vitro L'impact des mycoplasmes sur d'autres infections, notamment celles où les mycoplasmes étaient considérés comme fréquemment associés (pathologies de la sphère uro-génitale et puLmonaire). SeLon le procédé de L'invention, on infecte volontairement des cellules cultivées "in vitro" avec des mycoplasmes. Cette inoculation permet d'induire une réponse cellulaire potentialisée par la présence du ou des mycoplasmes utilisés. Selon une application particulièrement intéressante, l'invention concerne la "mycoplasmisation" de cellules, utilisées, entre autre, pour la détection de certains agents infectieux, par des mycoplasmes potentialisant de façon importante l'infectiosité de ces agents, et l'utilisation biotechnologique qui en découle, notamment en terme d'amplification de signal Le néologisme "mycoplasmisation" désignera le fait d'infecter volontairement des cellules avec des mycoplasmes, dans un but précis. Ces cellules seront dites "mycoplasmisées", par opposition à l'appellation "celluLes mycoplasmées" qui sous-entend que ces dernières ont été contaminées par hasard. Dans L'application avantageuse susmentionnée, l'invention concerne la mise en évidence et l'utilisation biotechnologique du pouvoir amplificateur du mycoplasme dans la recherche d'agents infectieux inoculés "in vitro" à des cultures de cellules ; cellules et mycoplasmes étant, dans ce cas, choisis en fonction de La sphère où le prélèvement est effectué, et de l'agent recherché. Font partie de l'invention : - tout système cellulaire, mycoplasmisé expérimentalement, et dans le but d'induire une réponse cellulaire potentialisée par la présence du ou des mycoplasmes utilisés ; - tout système cellulaire mycoplasmé, utilisé dans le but d'induire une réponse cellulaire potentialisée par la présence du ou des mycoplasmes. Plus généralement, le procédé selon l'invention consiste en l'utilisation in vitro d'écosystème amplifiant la technique conventionnelle de culture cellulaire de virus (par exemple: HSV, RSV, etc) ou de bactéries (par exemple Chlamydiae, Legionella, Hyteria, etc ). L'Ecosystème considéré consistant en : tout système cellulaire constitué de cellules sensibles aux agents infectieux susceptibles de se trouver dans une sphère pathologique où est effectué le prélèvement (le système pouvant être constitué d'un ou plusieurs types de cellules selon les besoins) + mycoplasmes comme agent potentialisateur de La multiplication virale en culture cellulaire. Les travaux et expérimentations ayant abouti à la présente invention ont essentiellement porté sur deux sphères pathologiques - uro-génitale avec Le HSV (cellules Véra) et Chlamydiae Trachomatis (celLules Mac Coy) ; - pulmonaire avec le RSV (ceLlules Hep-2) et Chlamydiae Twar (cellules Hela) et sur divers mycoplasmes - ceux ayant un tropisme particulier pour la sphère uro-génitale (Uu : Uréaplasma uréalyticum, Mh : MycopLasma hominis) et pulmonaire (MP : Mycoplasma pneumoniae) - ceux qui sont les pLus répandus (MF : M. Fermentans, MS : M. Salivarium, MG : M. Genitalium, MO : M. Orale, MHy : M. Hyorinis, MA : M. Arginini, MPi : M. Pirum, MN : M. Nou (souche MPi), etc. Pour cette raison, dans la description de l'exemple de mise en oeuvre du procédé de L'invention qui est faite ci-après, l'application des cellules mycoplasmisées porte essentiellement sur la prévention et la détection des MST (Maladies Sexuellement TransmissibLes), des cancers du col, et de toutes maladies dont l'agent infectieux est potentialisé par un mycoplasme. Il ne s'agit cependant pas d'une application limitative. I - Mycoplasmisation des cellules Les cellules sont cultivées dans des boites ; elles sont mycoplasmisées à confluence. Les mycoplasmes utilisés pour infecter ces cellules sont préalablement amenés en phase de croissance dans leur milieu (milieu de culture pour mycoplasmes additionné d'un indicateur coloré). Les cultures de cellules sont infectées dans un milieu compatible avec la double viabilité : cellule et mycoplasme. a croissance est déterminée par une modification de la couleur du milieu. Les boites sont vidées de leur surnageant, puis infectées sous un inoculum du milieu contenant les mycoplasmes, additionné par du milieu de culture cellulaire. Les boites sont incubées environ une heure sous agitation Lente, entre 36"C et 390 C, puis le milieu est complété par du milieu de culture cellulaire. Les boites complémentées au milieu de culture sont contrôlées au microscope, puis sont trypsinées 2 à 3 jours après l'infection, et cultivées dans leur milieu habituel. Les signes de contamination sont fréquemment visibles en microscopie optique (pourtour cellulaire et morphologie générale), mais les cellules sont généralement viables et peuvent être cultivées. II - Détection des mycoplasmes Différents systèmes peuvent être utilisés - Sonde nucléique chaude ou froide spécifique des mycoplasmes permettant La détection du DNA des mycoplasmes par hybridation moléculaire ; - Anticorps monoclonaux permettant la détection d'un antigène spécifique de mycoplasme par révélation immunoenzymatique sur membrane en utilisant un monoclonal dirigé contre cet antigène et un anti-souris conjugué à la péroxydase ; - Culture en milieu solide ou liquide permettant la détection directe ou indirecte des mycoplasmes. III - Mise en évidence de la potentialité du mycoplasme comme cofacteur augmentant la sensibilité de test de diagnostic "in vitro". L'augmentation de signal du à la présence de mycoplasmes dans des cultures cellulaires est mise en évidence par comparaison entre les niveaux d'infection obtenus avec cellules mycoplasmisées et cellules homologues normales (non infectées par des mycoplasmes). Les infections ont lieu simultanément avec un inoculum homogène, sur des cellules à même état de confluence. Les exemples donnés ci-dessous portent sur Les virus HSV et RSV, ainsi que sur le Chlamydiae. - 1/ Infection Les infections sont réalisées selon un protocole standard. Les cellules (mycoplamisées et non mycoplasmisées témoin) sont vidées de leur surnageant et inoculées sous lente agitation pendant 1 heure à 370C par l'agent infectieux sous faible volume (dilution dans du milieu de culture cellulaire sans sérum, appelé supplément). Du supplément est ensuite ajouté, puis Les cellules sont incubées à 37"C pendant 3 Jours. - 2/ Révélation de L'infection Elle est faite par marquage immunologique sur membrane d'un antigène spécifique de l'agent infectieux, détecté par un anticorps monoclonal dirigé contre cet antigène, et marqué à une enzyme, elle-même révélée par un substrat chromogène. L'intensité de la coloration, exprimée en + sur une échelle allant de O à 4+ (+/- représentant la valeur maximum assimilable à du bruit de fond) est proportionnelle à la quantité d'antigènes présents, et permet d'évaluer l'intensité de L'infection. La sensibilité de cette technique immunologique a été confirmée par La cLassique détermination du titre infectieux par titrage en dilution Limité sur microplaque. Abréviations utilisées dans les exemples donnés dans les tableaux suivants : DI = détection immunologique, avec contrôle négatif sans agent infectieux, afin de voir si la cellule mycop lasmi sée ne cross-réagit pas avec le monoclonal. DM = détection de mycoplasme. Tableau I - HSV Cellule DI/HSV+ DI/HSV- DM Véro Témoin + +/- Véro-MP 2+ +/- + Véro-MH 4+ +/- + Véro-MF 2+ +/- + Véro-UU 4+ +/- + Véro-MS 3+ +/- + TabLeau II - Chlamydiae, à différentes dilutions de Chlamydiae sur cellules Mac Coy avec et sans MP : étude de sensibilité. Cellule DI/Chlamyd+ DI/Chlamyd- DM Dilution Témoin M. Coy 1,5+ +/- - Pur M. Coy-MP 3+ +/- + M.Coy 1,5+ +/- - 1/2 M.Coy-MP 2+ +/- + M.Coy + +/- - 1/5 M.Coy-MP 2+ +/- + M.Coy + +/- - 1/10 M.Coy-MP 1,5+ +/- + Ce dernier tableau est particulièrement significatif dans le cas du Chlamydiae. Il montre qu'un résultat douteux, proche de +/-, peut devenir beaucoup plus net et franchement positif. Tableau III- RSV Cellule DI/RSV+ DI/RSV- DM Hep-2 + +/ Hep-2-MP 2,5+ +/- + Après l'exposé qui précède, on comprend que selon la présente invention, l'activité des mycoplasmes comme cofacteur d'infection virale ou bactérienne peut être exploitée en biotechnologie pour amplifier la réponse cellulaire, dans des kits de diagnostic utilisant des cultures cellulaires mycopLasmisées. D'autre part, le choix du mycoplasme pour La sphère pathologique concernée, est particulièrement important. IL donne toute sa valeur clinique au terme "cofacteur". L'exemple exposé à propos du HSV montre, en effet, que pour potentialiser au maximum la culture, on aura tout intérêt à utiliser des cellules Véro mycoplasmisées avec Uu ou Mh, qui sont justement et également des germes de la sphère uro-génitale, fréquemment associés voire incriminés dans de nombreuses pathologies de cette région. REVENDICATIONS 1* Procédé d'amplification des agents infectieux en diagnostic "in vitro" sur cultures cellulaires, caractérisé par l'utilisation d'écosystème représentatif de la sphère pathologique concernée, reconstitué in vitro avec des cellules permissives pour Lesdits agents, additionnées de mycoptasmes comme élément de potentiatisateur de ta multiplication virale ou bactérienne en culture cellulaire de virus (par exempte: HSV, RSV) et de bactéries (par exemple : Chtamydiae, egioneLla, HystEria > . 2* Procédé d'amplification des agents infectieux en diagnostic "in vitro" sur cultures cetlutaires, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on infecte Lesdites cultures cellulaires "in vitro" avec des mycoplasmes permettant d'induire une réponse cellulaire potentialisée par La présence du ou des mycoplasmes utitisés. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise pour la recherche et l'amplification des agents Infectieux, des cellules et des mycoplasmes choisis en fonction de La sphère ou te prélèvement est effectué, et des agents Infectieux recherches 4. Procédé suivant l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que les cultures de cellules sont infectées, dans un milieu compatible avec La double viabilité cellule et mycoplasme, avec des mycoplasmes préalablement amenés en phase de croissance dans leur milieu de culture. 5. Procédé selon ta revendication 4, suivant tequel les cellules sont cultivées dans des botes de culture, carac ternis en ce que teur infection ou mycoplasmisation est opérée de la manière suivante : les bottes sont vidées de leur surnageant, puits infectées en milieu constitué de mi- lieu contenant Les mycoplasmes et du milieu de culture cel- tubaire et ensuite incubées environ une heure sous agitation lente, entre 36 degrés C et 39 degrés C ; tes bottes complémentées au milieu de culture sont contralées au microscope ; elles sont trypsinées 2 à 3 jours après l'infection, et cultivées dans leur milieu habituel. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'augmentation de signal dû à la présence de mycoplasmes dans des cultures cellulaires, est mise en évidence par comparaison entre les niveaux d'infection obtenus avec cellules mycoplasmisées et cellules homologues normales ; les infections ayant lieu simultanément avec un inoculum homogène, sur des cellules à même etat de confluence. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la révélation de l'infection est obtenue par marquage immunologique sur membrane d'un antigène spécifique de l'agent infectieux, détecté par un anticorps monoclonal dirigé contre cet antigène, et marqué à une enzyme, elle-même revélée par un substrat chromogène ; l'intensité de la coloration, exprimée en + sur une échelle allant de O à 4+ (+/- représentant la valeur maximum assimilable à du bruit de fond), est proportionnelle à la quantité d'antigènes présents et permet d'évaluer l'intensité de l'infection ; le niveau de détection étant confirmé par titrage classique du pouvoir infectieux par dilution limité sur microplaque. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, appliqué à la révélation d'une infection virale ou bactérienne, caractérisé en ce que l'infection de la culture cellulaire, préalable à ladite révélation, est réalisée selon un protocole standard ; les cellules (mycoplasmisées et non mycoplasmisées témoin) sont vidées de leur surnageant, et inoculées sous lente agitation pendant une heure à 37"C par l'agent infectieux sous faible volume (dilution dans du milieu de culture cellulaire sans sérum, appelé supplément), du supplément est ensuite ajouté, puis les cellules sont incubées à 370C pendant 3 jours.