Brevet FR2696093A1 — publié le 19940401

La présente invention concerne l'utilisation thérapeutique du caféate de 3-méthyl-2-butényle et plus particulièrement l'utilisation de ce principe actif comme agent antiviral. Elle concerne à ce titre des compositions pharmaceutiques contenant du caféate de 3-méthyl-2butényle, utiles notamment comme agent antiviral à l'égard de l'Herpès. Actuellement aucune substance d'origine naturelle n'est dans la pratique officielle employée dans le traitement des maladies virales chez l'homme. Il existe toutefois des préparations médicinales traditionnelles, dont certaines peuvent être prescrites empiriquement dans la lutte contre différentes maladies d'origine virale. C'est le cas, par exemple, du baume de propolis, préparé à partir d'un produit de la ruche et utilisé en application externe pour soigner le zona et les atteintes cutanéomuqueuses d'origine herpétique. Par ailleurs une analogie de composition entre la propolis et l'exsudat de bourgeons de peupliers butiné par les abeilles a été évoquée par Greenaway et coll. en 1988. La composition de la propolis déterminée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) s'est effectivement avérée très voisine de celle de l'extrait de peuplier. Cependant des extraits de bourgeons de peuplier noir, Populus nigra, arbre de la famille des Salicacées, ont amené à l'identification de très nombreux flavonoïdes et la demanderesse a ainsi trouvé dans l'extrait à l'éther éthylique: des flavones (chrysine, tectochrysine, apigénine, lutéoline), des flavonols (galangine, kaempférol, quercétine) et des flavonones (pinocembrine). En ce qui concerne les flavonoïdes, il a déjà été fait état de leur activité antivirale (voir Van Hoof, 1984; Van den Berghe, 1986; Kônig, 1985 et Van Hoof, 1989). La demanderesse a alors fait porter son intérêt sur un autre composé de l'extrait à l'éther éthylique des bourgeons de peuplier, Populus nigra, composé qui présentait sous UV à 365 nm une fluorescence bleu clair et qui était ainsi supposé appartenir au deuxième grand groupe des composés présents dans les bourgeons de peuplier, celui des dérivés de l'acide cinnamique ou acide 3-phényl-2-propénoïque. L'ester 1,1-diméthylallylique de l'acide caféique, ou caféate de 3-méthyl-2-butényle, qui avait été isolé en 1987 par E. Wollenweber et coll. de l'exsudat de bourgeons de peuplier (et avait alors été dénommé "LBI") Revoir Z. Naturforsch. 42c, 1030-1034 (1987)1 s'est avéré avoir le même comportement chromatographique que le composé susdit, révélé par sa fluorescence bleu clair sous UV à 365 nm. Hashimoto et coll. ont décrit en 1988 une synthèse de ce même composé. On a maintenant trouvé de manière inattendue que le caféate de 3-méthyl-2-butényle peut constituer à lui seul un principe actif efficace dans la lutte contre l'Herpès, notamment l'Herpès simplex virus, chez les mammifères, y compris l'homme. On a plus particulièrement trouvé que le caféate de 3-méthyl-2-butényle est un principe actif qui exerce à lui seul une activité antiherpétique, tant in vitro que in vivo, notamment chez des patients infectés par le virus HSV1 ou le virus HSV2. La présente invention a donc pour premier objet une composition pharmaceutique, notamment pour utilisation comme médicament pour le traitement de l'Herpès, comportant comme principe actif du caféate de 3-méthyl-2butényle ou un sel ou autre dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. Elle a également pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique contenant du caféate de 3 méthyl-2-butényle, ou un sel ou autre dérivé pharmaceuti quement acceptable de celui-ci, comme principe actif pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement antiviral de l'Herpès. Ces objets, ainsi que d'autres, ressortiront mieux de la suite de la présente description, où les essais et expérimentations relatés sont donnés à titre uniquement indicatif et ne limitent aucunement l'invention. Aux fins d'une étude qui l'a menée à la présente invention, la demanderesse a: - d'une part isolé cette substance fluorescente à partir des bourgeons de peuplier (le composé isolé est appelé N (naturel)]; - d'autre part fait la synthèse de ce composé, comme décrit dans la littérature [le composé obtenu est appelé S (synthétique)J, - en troisième lieu, vérifié la structure des composés N et S; et - enfin étudié et comparé l'activité antiherpétique in vitro et in vivo de l'extrait de peuplier, de la propolis et des composés isolés N et S. Le composé N a été isolé à partir d'un extrait à l'éther éthylique de bourgeons de peuplier, par chromatographies successives sur colonne de silice, puis sur plaques de silice et enfin par HPLC, avec pour cette dernière une colonne en phase inverse semi-préparative. Le composé S a été préparé selon la méthode divulguée par Hashimoto et coll., par réaction de 1-bromo3-méthyl-2-butène sur l'acide caféique, en présence de HMPT (hexaméthyl phosphotriamide) en milieu alcalin (soude). Le produit brut a été chromatographié sur colonne de silice et le composé S ainsi recueilli a été isolé par recristallisation dans un mélange éther/hexane. Les résultats principaux des analyses structurales effectuées pour les composés N et S sont les suivants: Sur les spectres de masse le pic moléculaire a été observé à m/z 248, ce qui correspond à la formule brute C14H16O4. Sur le spectre IR on a observé les bandes d'absorption du groupe carbonyle à 1680 cm- 1 et des groupes hydroxyle à 3478 et 3316 cl~1. En outre les autres signaux étaient superposables à ceux de l'acide caféique. En RMN 1H on a noté les signaux des protons méthyliques à 1,71 et 1,74 ppm, un doublet centré à 4,64 ppm correspondant aux deux protons équivalents du ClO et un multiplet centré à 5,36 ppm correspondant au proton du C11. Les signaux les plus intéressants pour l'identification du produit sont les doublets centrés respectivement à 6,27 (Cg) et 7,53 ppm (C7), la forte valeur de J attestant de leur relation trans (J=16Hz). Sur le spectre de RMN 1H du composé S on a noté la présence de 92% d'isomère E et de 8% d'isomère Z, l'isomère Z étant caractérisé par une constante de couplage de 13Hz environ. L'interprétation des spectres ainsi obtenus montre qu'il s'agit, dans les deux cas, de l'ester 3-méthyl-2buténylique de l'acide 3-(3,4-dihydroxyphényl)-2- propénoïque ou 3-(3,4-dihydroxyphényl)-2-propénoate de 3méthyl-2-butényle, qui peut encore être dénommé caféate de 3-méthyl-2-butényle. Ce composé correspond au composé "LBI" isolé par Wollenweber et au composé synthétisé par Hashimoto. Sa formule développée est la suivante: Masse: M+ m/z 284, C14H16 4 IR: V-C=O 1680 cm-l, V OH 3478 et 3316 cm-l RMN de 1H et 13C: CD3CN, TMS, 300MHz, 75MHz. Activité thérapeutique et résultats pharmacologiques: Les composés ainsi identifiés, obtenus de sources naturelles (extrait de bourgeons de peuplier et propolis) ou synthétisés, ont été testés pour leur activité thérapeutique. On a ainsi trouvé de manière inattendue qu'ils exercent une remarquable activité antivirale, principalement une activité antiherpétique utile, tant in vitro que in vivo sur l'animal et sur l'homme. L'activité antiherpétique des composés susdits N et S, de l'extrait de bourgeons de peuplier et de la propolis, a été d'abord évaluée par la méthode d'inhibition de l'effet cytopathique dû au virus. L'inhibition de l'effet cytopathique a été suivie en fonction de la concentration en composé dans le milieu de culture et en fonction de la dose d'inoculum. L'importance de l'inhibition a été notée par rapport aux Témoins Virus selon un barème de 0 à 100%, comme suit: 0% : pas d'inhibition, toutes les cellules étaient mortes (Témoins Virus). 50% : environ la moitié du tapis cellulaire a été détruite. 100%: aucune destruction par le virus; les cellules étaient protégées. Cette notation a permis de tracer des courbes montrant l'inhibition de l'effet cytopathique en fonction de la concentration. Sur les courbes obtenues on a pu déterminer, pour chaque dose dwinoculum, la concentration réduisant de 50% l'effet cytopathique ou dose efficace 50 (DE50) Pour un inoculum de 103 DI50 par puits, les DE50 étaient respectivement de 15 Rg/ml pour le composé S, de 21 Fg/ml pour le composé N, de 40 Ag/ml pour la propolis et de 195 Rg/ml pour l'extrait de peuplier. Le composé synthétique s'avère donc singificativement plus actif que le produit naturel dans l'utilisation selon l'invention, à savoir sur le virus HSV1 ou HSV2. Tant le composé N que le composé S isolés sont en outre environ 2 fois plus actifs que la propolis et 10 fois plus actifs que l'extrait de bourgeons de peuplier noir. Ces résultats ont été précisés par mesure de la réduction du titre infectieux, sous deux conditions de culture: - Pour 1 cycle de multiplication de HSV1, incubation pendant 18 heures, les cultures étant inoculées à une multiplicité d'infection égale à 1; - Pour 4 cycles de multiplication, incubation pendant 72 heures, les cultures étant inoculées à une multiplicité d'infection faible. Les différents produits testés (N, S et propolis) ont été ajoutés au milieu de culture aux mêmes concentrations de 6,25; 12,5; 25 et 50 Rg/ml. Il convient de noter que l'extrait de bourgeon de peuplier n'a pas été étudié en parallèle, car il est inactif à ces faibles concentrations. La réduction du titre infectieux est exprimée en logarithme décimal (long10) par rapport aux Témoins Virus. Comparaison des réductions de titre infectieux par rapport aux Témoins Virus, provoquées par les composés N et S, la propolis et l'Acyclovir 1 cycle de multiplication Concentration* N S Propolis g/ml) 6,25 1 1,75 2,5 12,5 1,5 2,5 3 25 2,5 2,8 3 50 2,5 2,8 3,2 4 cycles de multiplication Concentration N S Propolis Acyclovir (Rg/ml) 6,25 0,6 0,6 0 2 12,5 1,1 1,25 1 3 25 2 3,25 2 3,25 50 3,1 3,6 3 3 * Les différents produits testés ont été ajoutés au milieu de culture aux mêmes concentrations de 6,25; 12,5; 25 et 50 Rg/ml. Sous les conditions de 1 cycle de multiplication et à la concentration de 25 Fg/ml, la réduction du titre infectieux provoquée par le composé S était légèrement supérieure à celle induite par le composé N et sensiblement équivalente à celle de la propolis. Sous les conditions de 4 cycles de multiplication et à la même concentration de 25 Rg/ml, l'activité du composé S était supérieure à celles du composé naturel et de la propolis. En comparaison de l'acyclovir, qui est l'agent antiviral de référence pour le virus HSV1, l'activité du produit S est significative. Aux concentrations de 25 et 50 Fg/ml, la réduction du titre est égale ou même meilleure pour le produit S, l'acyclovir n'étant plus actif qu'aux faibles concentrations de 6,25 et 12,5 Rg/ml L'ensemble des résultats relatés ci-dessus montrent que le caféate de 3-méthyl-2-butényle est bien l'un des composés responsables de l'activité antiherpétique in vitro des bourgeons de peuplier et de la propolis. L'effet le plus intéressant est celui obtenu dans les conditions de 1 cycle de multiplication. Selon ce protocole expérimental, le caféate de 3-méthyl-2-butényle est ajouté aux cultures cellulaires 1 heure après l'inoculation, ce qui signifie qu'il inhibe ou perturbe une des étapes mêmes du cycle de réplication viral. Sans vouloir se lier à une quelconque théorie, on pense que cette action peut se faire par blocage enzymatique, inhibition de la réplication de l'ADN viral ou inhibition de la synthèse des protéines de structure des virions (protéines de capside). Ces résultats doivent cependant être rapprochés du fait que le caféate de 3-méthyl-2-butényle n'est pas inoffensif à toute dose; la propolis et les bourgeons de peuplier sont en effet connus pour provoquer des dermatites allergiques, principalement chez les professionnels que sont les apiculteurs et les forestiers, et le principal allergène serait précisément le caféate de 3-méthyl-2-butényle (Hausen et coll., 1987). Cependant les patch tests (ou tests épicutanés) réalisés dans le cadre de la présente invention sur des cobayes ont montré que, chez ces animaux, le seuil d'irritation était atteint pour des applications épicutanées de solutions de concentrations comprises entre 3% et 10%. Or les doses inhibitrices révélées par les tests antiviraux relatés plus haut sont environ 100 000 fois inférieures aux concentrations irritantes. D'autre part, les études cliniques ont montré l'efficacité du produit naturel extrait de bourgeons de peuplier, de la propolis de l'abeille et du composé de synthèse S, le caféate de 3-méthyl-2-butényle, en application topique sur les formes d'Herpès cataméniales et génitales, chez l'homme et la femme, classées parmi les maladies sexuellement transmissibles. Le composé de synthèse S a montré une activité constante sur les formes bulleuses de l'Herpès, en assurant de plus une cicatrisation parfaite. Dans la pratique on préconise de préférence une administration de ce principe actif par voie orale sous forme solide ou par voie topique, notamment par application locale d'un baume ou une pulvérisation par atomisation (spray). La forme solide pour administration orale est avantageusement constituée de tablettes à sucer, d'un poids unitaire d'environ 250 mg et comportant environ 100180 mg, de préférence environ 150 mg, de principe actif. Une préparation pharmaceutique en solution ou dispersion sous forme de spray pour pulvérisation par atomisation est de préférence composée d'une solution alcoolique à 20% environ du principe actif. Un baume pour application locale à la zone à traiter, par exemple un baume gingival, comprend de préférence environ 20% du principe actif. La posologie recommandée est, compte tenu des résultats susdits et des indications de toxicité relevées, d'environ 1 à 3 tablettes par jour, ou de 5 à 6 pulvérisations de spray ou applications de baume par jour. Toutefois, les dosages et/ou les formes galéniques retenues peuvent aussi varier selon l'état du malade et le stade de l'atteinte virale à traiter. Leur adaptation au cas spécifique à traiter peut être effectuée aisément par l'homme du métier, sur la base de ses connaissances et si besoin est avec l'aide d'essais de routine préliminaires. Les doses à administrer comprennent en pratique, outre le principe actif selon l'invention ou un sel ou dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, au moins un support ou vecteur pharmaceutique classique et des excipients, des charges, des agents parfumants, édulcorants et/ou colorants, ou autres additifs traditionnels REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour utilisation comme médicament, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif du caféate de 3-méthyl-2-butényle, ou un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable de celui-ci. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le caféate de 3méthyl-2-butényle est préparé par synthèse ou extrait des bourgeons de peuplier, Populus nigra, de la famille dessalicacées, ou de la propolis des abeilles. 3. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est utile dans le traitement de l'Herpès. 4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de tablettes, notamment de tablettes à sucer, d'un spray pour pulvérisation par atomisation ou d'un baume. 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que les comprimés ont un poids unitaire d'environ 250 mg et comportent environ 100-180 mg, de préférence environ 150 mg, de principe actif. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est composée d'une solution ou dispersion, sous forme de spray pour pulvérisation par atomisation, comportant le principe actif de préférence en solution alcoolique à 20% environ. 7. Utilisation d'une composition pharmaceutique contenant du caféate de 3-méthyl-2-butényle, ou un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable de celui-ci, pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement antiviral de l'Herpès. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le caféate de 3-méthyl-2-butényle est préparé par synthèse ou extrait des bourgeons de peuplier, Populus nigra, de la famille des salicacées, ou de la propolis des abeilles. 9. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le caféate de 3-méthyl-2-butényle est présent dans une composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.