Brevet FR2686343A1 — publié le 19930723

- La présente invention concerne de nouveaux dérivés pseudopeptidiques à activité antagoniste de la bradykinine, leur procédé de synthèse et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. La demande EP 0370453 décrit des antagonistes de la bradykinine à structure pseudopeptidique ayant pour formule: A-B-C-E-F-K-(D)Tic-G-M-F- I et parmi ceux-ci le décapeptide de formule: H-(D)Arg-Arg-Pro-Hyp-GlyThia-Ser-(D)Tic-Oic-Arg-OH o Arg représente le résidu arginyle, Pro représente le résidu prolyle, Hyp représente le résidu 4- hydroxyprolyle, Gly représente le résidu glycyle, Thia représente le résidu P-( 2-thiényl)alanyle, Ser représente le résidu séryle, Tic représente le résidu tétrahydroisoquinoléine-3-carbonyle, de formule: O Oic le résidu octahydroindole-2-carbonyle de formule: C ONC- le sigle (D) précédant le symbole d'un des acides aminés mentionnés ci- dessus signifiant que cet acide aminé a la configuration (D) En l'absence du sigle (D); les acides aminés sont réputés avoir la configuration (L). La demanderesse a présentement découvert que le nonapeptide de formule: G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)Tic-Oic-Arg-OH o G représente le radical 4-guanidinobenzoyle de formule: HN \ /CNH Q c- H 2 N et Arg représente le résidu arginyle, Pro représente le résidu prolyle, Hyp représente le résidu 4-hydroxyprolyle, Gly représente le résidu glycyle, Thia représente le résidu f-( 2- thiényl)alanyle, Ser représente le résidu séryle, Tic le résidu tétrahydroisoquinoléine-3-carbonyle, Oic représente le résidu octahydroindole-2-carbonyle, le sigle (D) précédant le symbole Tic signifiant que ce résidu a la configuration (D), les autres résidus d'amino acides ayant la configuration (L), était doué de propriétés plus intéressantes que celles du dérivé préféré de la demande EP 0370453. La structure originale nonapeptidique du produit de l'invention lui assure in vivo une plus grande résistance aux enzymes protéolytiques que la structure décapeptidique du composé préféré de la demande EP 0370453; ce qui se traduit par des possibilités d'utilisation en thérapeutique à une posologie plus faible avec des administrations successives plus espacées. Mais en outre, dans les tests in vitro réalisés afin de rechercher l'activité intrinsèque, le dérivé de l'invention s'est révélé significativement meilleur que le produit préféré de la demande EP 0370453. Plus particulièrement l'invention concerne les dérivés de formule (I): GArg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-Tic-Oic-Arg-OH 2 - 3 2686343 o G, Arg, Pro, Hyp, Gly, Thia, Ser, Tic et Oic ont la définition mentionnée ci-dessus, leurs sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable, chaque amino-acide de la séquence peptidique étant optiquement pur et le carbone a de chaque amino-acide ayant la configuration D ou L. Parmi les acides pharmaceutiquement acceptables on peut citer à titre non limitatif les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphonique, acétique, trifluoroacétique, lactique, pyruvique, malonique, succinique, glutarique, fumarique, tartrique, maléïque, citrique, ascorbique, oxalique, méthane sulfonique, camphorique, etc Parmi les bases pharmaceutiquement acceptables on peut citer à titre non limitatif l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, la triéthylamine, la tertbutylamine, etc L'invention s'étend aussi au procédé de préparation des dérivés de formule (I) qui peuvent être obtenus par différentes méthodes telles que la synthèse séquentielle sur phase solide, la synthèse de fragments et leur couplage en solution, la synthèse enzymatique, la synthèse génétique par clonage et expression de gènes dans des bactéries transformées ou par des combinaisons diverses de ces techniques. Les méthodes générales de la synthèse des peptides sur phase solide ont été décrites par B W ERICKSON et R B MERRIFIELD ("The Proteins", Solid- Phase Peptide Synthesis, 3 ème édition, 257-527, 1976). La synthèse sur phase solide peut se réaliser sur un automate qui effectue de façon répétitive et programmable des cycles de déprotection, couplage et lavages nécessaires à l'introduction séquentielle des acides aminés dans la chaîne peptidique L'acide aminé, de préférence C-terminal est fixé sur une résine conventionnellement utilisée pour la préparation de polypeptides, de préférence un polystyrène réticulé à l'aide de 0,5 à 3,0 % de divinylbenzène et muni de restes activés tels que le chlorométhylène ou l'hydroxyméthylène qui permettent la fixation covalente du premier 4 2686343 acide aminé sur la résine Le choix approprié de la résine permet la fixation d'une fonction C-terminale acide carboxylique, amide ou alcool. Les acides aminés sont alors introduits un à un dans l'ordre déterminé par l'opérateur Chaque cycle de synthèse correspondant à l'introduction d'un acide aminé, comporte une déprotection, de préférence N- terminale de la chaîne peptidique, des lavages successifs destinés à éliminer les réactifs ou à gonfler la résine, un couplage avec activation de l'acide aminé et de nouveaux lavages Chacune de ces opérations est suivie d'une filtration réalisée grâce à la présence d'un verre fritté incorporé au réacteur dans lequel s'effectue la synthèse. Les réactifs de couplage utilisés sont des réactifs classiques de la synthèse peptidique comme le dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et l'hydroxybenzotriazole (HOBT) ou le benzotriazol-1-yl-oxytris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) ou encore le diphenylphosphorylazide (DPPA). Des activations par formation d'anhydrides mixtes sont également possibles. Chaque acide aminé est introduit dans le réacteur en quadruple excès environ, par rapport au degré de substitution de la résine et en quantité environ équivalente par rapport aux agents de couplage La réaction de couplage peut être vérifiée à chaque étape de la synthèse par le test de réaction à la ninhydrine décrit par E KAISER et Coll (Analyt Biochem, 34, 595, 1970). Après assemblage de la chaîne peptidique sur la résine, un traitement par un acide fort tel que l'acide trifluoroacétique, ou l'acide fluorhydrique en présence d'anisole, d'éthanedithiol ou de 2- méthylindole sert à séparer le peptide de la résine ainsi qu'à libérer éventuellement le peptide de ses groupes protecteurs Le composé est alors purifié par des techniques classiques de purification, notamment chromatographiques. Les peptides de la présente invention peuvent être également obtenus par couplage en solution de fragments peptidiques sélectivement protégés, qui peuvent être préparés soit sur phase solide, soit en solution L'emploi 2686343 des groupes protecteurs et la mise à profit de leur stabilité différentielle est analogue aux méthodes sur phase solide à l'exception de l'attachement de la chaîne peptidique sur la résine Le groupe carboxylique C-terminal est protégé, par exemple, par un ester méthylique ou une fonction amide Les méthodes d'activation lors des couplages sont également analogues à celles employées dans la synthèse sur phase solide. Les composés de formule (I) possèdent des propriétés pharmacologiques très intéressantes, en particulier antagonistes de la bradykinine. A ce titre, ils peuvent être utilisés avec profit dans un certain nombre d'indications thérapeutiques comme les traumatismes, les écorchures, les brûlures, les éruptions cutanées, eczémas, érythèmes, oedèmes, angines, l'arthrite, l'asthme, les allergies, les rhinites, les chocs anaphylactiques, les inflammations, les hypotensions artérielles, les douleurs, les prurits et les insuffisances de mobilité des spermatozoïdes. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif au moins un composé de formule générale (I) ou un de ses sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable, seul ou en combinaison avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, non toxiques. Parmi les compositions pharmaceutiques selon l'invention, on pourra citer plus particulièrement celles qui conviennent pour l'administration orale, parentérale, nasale, les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, crèmes, pommades, gels dermiques, les aérosols, les ampoules buvables et injectables La posologie varie selon l'âge et le poids du patient, la nature et la sévérité de l'affection ainsi que la voie d'administration. Celle-ci peut être orale, nasale, rectable ou parentérale D'une manière générale, elle s'échelonne entre 5 pg/kg et 5 mg/kg pour un traitement en une ou plusieurs prises par 24 heures. Les exemples suivants illustrent l'invention et ne la limitent en aucune façon. EXEMPLE 1: G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)Tic-Oic-Arg-OH Le composé de l'exemple 1 est synthétisé à partir de 2 g d'une résine substituée par 0,33 mmol/g de Fmoc-Arg-OH et suivant le protocole répétitif suivant: N opération Fonction Solvant/Réactif Répétition/temps lavage déprotection déprotection lavage lavage couplage lavage lavage lavage DMF 2 X 2 min % pipéridine/DMF 1 X 5 min % pipéridine/DMF 1 x 15 min DMF 3 X 2 min dichlorométhane 3 x 2 min acide aminé protégé activé 1 X 90 min DMF 3 X 2 min isopropylique alcool 3 X 2 min dichlorométhane 3 X 2 min Chacune de ces opérations effectuée dans 30 ml de solvant, sous agitation et à température ambiante, est suivie d'une filtration à travers un verre fritté incorporé à la cellule de verre (réacteur) dans laquelle la synthèse progresse Le filtre retient la résine sur laquelle est fixée la chaîne peptidique croissante. Les acides aminés protégés choisis ont été introduits dans l'ordre suivant: Fmoc-Oic-OH, Fmoc-(D)Tic-OH, Fmoc-Ser(t Bu)-OH, Fmoc-Thia-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Hyp(t Bu)-OH, Fmoc-Pro-OH et Fmoc-Arg(Pmc)-OH. L'activation en vue du couplage (opération 6) est obtenue à chaque cycle par dissolution de 4 équivalents ( 2 64 mmoles) de l'acide aminé protégé avec 360 mg d'HO Bt dans 30 ml de DMF, puis après 30 minutes à température ambiante, par addition de 618 mg de DCC Cette solution est alors immédiatement introduite dans la cellule de réaction avec 10 ml de dichlorométhane. 6 - A la fin des huit cycles correspondant à la fixation séquentielle de huit acides aminés, on a ainsi obtenu avec l'arginine C-terminale, un nonapeptide protégé sur ses chaînes latérales et fixé sur la résine Après traitement dans des conditions identiques à celles décrites pour les cycles précédents par l'acide 4- guanidinobenzoique, la résine est alors traitée par un mélange d'acide trifluoroacétique ( 18 ml), dichlorométhane ( 1 ml) et anisol ( 1 ml) pendant 90 minutes à température ambiante Le filtrat et les solvants de lavage de la résine ( 3 X 20 ml dichlorométhane) sont réunis et évaporés à sec Le produit est suspendu dans l'éther, filtré et séché puis purifié par CLHP préparative, sur colonne C 18 (diamètre interne: 47 mm, longueur: 300 mm) et lyophilisé. L'analyse du produit obtenu est réalisé après décomposition de celui-ci en acides aminés par hydrolyse dans de l'acide chlorhydrique 6 N pendant 18 heures à 110 C et dosage quantitatif des acides aminés obtenus par CLHP. Cette analyse est conforme aux normes habituellement exigées. EXEMPLE 2: Etude pharmacologique du dérivé de l'invention: veine jugulaire de lapin: récepteur B 2 La bradykinine engendre une concentration qui est inhibée par le produit de l'exemple 1 Le p A 2 (logarithme négatif de la concentration molaire du dérivé de l'invention qui oblige à doubler la concentration de bradykinine pour obtenir le même effet) est de 9,97 0,21 (n = 5). Dans les mêmes conditions, le p A 2 du dérivé préféré de la demande EP 0370453 est de 9,23 0,45 soit une différence significative en faveur des dérivés de l'invention. EXEMPLE 3: Composition pharmaceutique Pommade à 5 ig/ml du peptide de l'exemple 1 G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)Tic-Oic-Arg-OH 50 mg Polyéthylène glycol Q S P 100 ml Soluté injectable G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)Tic- Oic-Arg-OH 0,5 mg Eau distillée pour préparations injectables Q S P 25 ml 7 - 8 2686343 REVENDICATIONS 1/ Composés de formule générale (I): G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-Tic-OicArg-OH (I) o G représente le radical 4-guanidinobenzoyle de formule: /C-NH C- H 2 N O et Arg représente le résidu arginyle, Pro représente le résidu prolyle, Hyp représente le résidu 4-hydroxyprolyle, Gly représente le résidu glycyle, Thia représente le résidu P-( 2-thiényl)alanyle, Ser représente le résidu séryle, Tic le résidu tétrahydroisoquinoléine-3- carbonyle, Oic représente le résidu octahydroindole-2-carbonyle, leurs sels d'addition à un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable, chaque amino-acide de la séquence peptidique ayant au niveau de son carbone a la configuration D ou L. 2/ Composé selon la revendication 1 qui est le composé de formule: G-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia- Ser-(D)Tic-Oic-Arg-OH o (D)Tic représente le radical tétrahydroisoquinoléine-3-carbonyle, ayant au niveau de son carbone a la configuration D, les autres acides aminés de la séquence peptidique ayant au niveau de leur carbone ala configuration L, ainsi que ses sels d'addition à un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. 3/ Procédé de préparation des dérivés de formule (I) caractérisé en ce qu'ils peuvent être obtenus par synthèse séquentielle sur phase solide d'amino-acides protégés, par synthèse de fragments peptidiques en solution, éventuellement par combinaison de ces deux techniques, dérivés de formule (I) que l'on transforme, si nécessaire, en leurs sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable. 4/ Compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, seul ou en combinaison avec un ou plusieurs excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. 5/ Compositions pharmaceutiques selon la revendication 4 contenant au moins un principe actif selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 utiles dans le traitement des traumatismes d'origine variée, des troubles inflammatoires, des troubles allergiques et l'insuffisance de mobilité des spermatozoïdes. _ 9 _