Brevet FR2695932A1 — publié le 19940325

La présente invention concerne une nouvelle protéine CBl liant la chitine, possédant à la fois une propriété fongicide et une propriété insecticide, ainsi qu'un procédé pour sa production. Une substance chitineuse est contenue dans la paroi cellulaire de champignons et l'integument d'insectes, d mais, en général, ne se rencontre pas chez les animaux et végétaux supérieurs. L'élaboration de produits chimiques capables d'inhiber la biosynthèse de la chitine et son métabolisme a été tentée, mais il n'a été mentionné jusqu'à présent qu'un inhibiteur de chitine-synthétase nommé polyoxine (The Journal of Antibiotics, Vol. 18, page 131, 1965) et un inhibiteur de chitinase nommé allosamidine (The Journal 0f Antibiotics, Vol. 40, page 296, 1982). Il a été signalé une substance microbicide (dont le nom n'est pas donné) produite par des bactéries du genre Bacillus, ayant une propriété microbicide envers les moisissures (Journal of Pesticide Science, Vol. 15, page 1, 1990). Cependant, cette substance diffère de la protéine CB1 de la présente invention , car elle est à peine extraite par le butanol et reste en grande partie dans la phase aqueuse lors de l'extraction au butanol (Journal of Pesticide Science, Vol. 15, page 7, 1990) et son poids moléculaire est d'environ 52 000 (Proceeding of Annual Meeting of Japan Society for Bioscience, page 308, 1989). Une substance microbicide dérivée de Bacillus subtilis (brevet des E.U.A. NO 5 061 495) a un poids moléculaire supérieur d'environ 10 000 ou plus à celui de la protéine CBî et la composition en acides gras de la première est très différente de celle de la seconde. La bacillomycine est connue comme un lipopeptide fongicide produit par des bactéries du genre Bacillus (The Journal of Antibiotics, Vol. 27, page 1600, 1984). Cependant, cette substance présente un bas poids moléculaire de 10 000 ou moins et diffère également de la protéine CBî de la présente invention par comparaison de leurs compositions respectives en acides gras constitutifs. De nouvelles substances fongicides et insecticides en rapport avec la chitine sont toujours recherchées comme agents chimiques agissant spécifiquement sur les champignons et les insectes sans agir sur les animaux et les végétaux supérieurs. Le but de la présente invention est de fournir une nouvelle protéine cbl liant la chitine, possédant à la fois une propriété fongicide et une propriété insecticide, et un procédé pour sa production. La Demanderesse a conduit des études sérieuses et réitérées pour atteindre ce but, et elle a ainsi découvert qu une substance inhibant la croissance de champignons et d'insectes se trouve dans une culture de cellules d'une souche du genre Bacillus. La substance peut être extraite de la culture par le butanol. Après avoir été isolée et purifiée, la substance s'est révélée être une substance protéique qui est liée à la chitine, mais ne possède pas d'activité chitinase, D'après ses diverses propriétés physico-chimiques et biologiques, elle a été identifiée comme une nouvelle protéine et a été appelée CB1. En conséquence, la présente invention fournit une protéine cBl liant la chitine, ayant les propriétés physico-chimiques mentionnées ci-dessous et possédant à la fois une propriété fongicide et une propriété insecticide, un procédé de production de la protéine CBî par culture de bactéries du genre Bacillus ayant la faculté de produire la protéine CB1 puis séparation de la protéine CBî à partir de la culture des cellules, et un fongicide et un insecticide contenant chacun la protéine CBî comme ingrédient actif. Sur les dessins annexés : la Figure 1 montre un spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la protéine CBî dissoute dans l'eau ; et la Figure 2 montre un spectre d'absorption dans l'infrarouge de la protéine CBî par une pastille de bromure de potassium. La présente invention sera expliquée en détail ci-dessous. Les microorganismes utilisés dans la présente invention ne sont pas spécifiquement définis : ils appartiennent au genre Bacillus et ont la faculté de produire la protéine CB1. A titre d'exemple, on mentionne la souche Bacillus licheniformis CBî qui a été isolée par la Demanderesse. Ses propriétés microbiennes sont les suivantes (1) Caractéristiques Morphologiques On utilise des cellules de la souche cultivée dans un milieu de bouillon nutritif gélosé. La forme des cellules est bacillaire et leurs dimensions sont de 0,5 à 1,0 Fm x 2,0 à 7,0 Fm. Les cellules se tiennent souvent en channe. Elles sont mobiles et leurs flagelles sont disposées sur leur pourtour. Elles forment des spores sphériques ou ovales ayant chacune des dimensions de 0,5 à 1,0 m x 0,5 à 1,0 Fm. Elles sont positives à la coloration de Gram. (2) Conditions de Croissance dans des Milieux Culture sur plaque de bouillon nutritif gélosé La croissance des cellules est bonne et donne des colonies blanches et rugueuses. La surface de chaque colonie n1 est pas brillante et elle est plissée. Aucun colorant diffusif n'est reconnu dans les colonies développées. Culture liquide en bouillon nutritif : Les cellules croissent sur la surface du milieu en formant une pellicule sur celui-ci. Culture en piqûre sur bouillon nutritif à la gélatine : Les cellules croissent sur la surface du milieu en formant des couches liquéfiées. Lait tournesolé : Le milieu devient presque incolore et transparent à cause de la peptonisation et de la réduction du tournesol. (3) Propriétés Physiologiques et Biochimiques Réduction des nitrates : Positif Dénitrogénation : Négatif Test MR : Positif Test VP : Positif Formation d'indole : Négatif Formation d'hydrogène sulfuré : Négatif Hydrolyse de l'amidon : Positif Consommation d'acide citrique Milieu de Koser : Positif Milieu de Christensen : Positif Consommation de sources d'azote minérales Nitrates (nitrate de sodium) : Positif Sels d'ammonium (sulfate d'ammonium) : Positif Formation de colorants : Négatif Uréase : Positif Oxydase : Négatif Catalase : Positif Intervalles de Croissance pH 4 : Pas de croissance pH 5 : Croissance pH 6 : Croissance pH 7 : Croissance pH 8 : Croissance pH 9 : Croissance 150C : Pas de croissance 200C : Croissance 300C : Croissance 400C : Croissance 500C : Croissance 550C : Croissance 600C : Pas de croissance Réaction à l'oxygène : Anaérobie facultatif Test O-F : Fermentescible Formation d'acides à partir de saccharides L-arabinose : Positif D-xylose : Positif D-glucose : Positif D-mannose : Positif D-fructose : Positif D-galactose : Négatif Maltose : Positif Saccharose : Positif Lactose : Négatif Tréhalose : Positif D-sorbitol : Positif D-mannitol : Positif Inositol : Positif Glycérol : Positif Amidon : Positif E n t r a i t a n t ces saccharides, la formation de gaz n'est pas observée. La présente souche est un bacille Gram-positif, comportant des flagelles autour de la cellule. Ses proprié tés sont caractéristiques des bactéries du genre Bacillus, qui croissent en conditions aérobies et forment des endospores. La comparaison des propriétés de Bacillus licheniformis décrites dans "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Vol. 2 avec les propriétés susmentionnées de la présente souche montre que les résultats sont identiques, et il a donc été jugé que la présente souche est susceptible d'appartenir à l'espèce Bacillus licheniformis. La présente souche a été déposée à l'institut de Recherche sur les Fermentations du Japon en tant que Bacillus licheniformis CBî (FERM BP-4008).Dans la présente invention, on peut également utiliser des mutants naturels ou artificiels dérivés de la présente souche, pourvu qu'ils aient la faculté de produire la protéine CB1. Pour la culture des cellules productrices de CB1, on utilise convenablement comme sources de carbone des saccharides tels que le glucose, le maltose et l'amidon. Comme sources d'azote, on utilise des composés organiques d'azote et des composés minéraux d'azote tels que l'extrait de levure, l'extrait de boeuf, l'extrait de malt, la peptone, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium et l'urée, séparément ou en association de deux ou plusieurs d'entre eux. De plus, on peut facultativement ajouter au milieu divers sels de métaux lourds tels que des sels de fer et de manganèse, ainsi que des vitamines telles que la vitamine B et la biotine. Les cellules productrices de CBî sont de préférence cultivées en conditions aérobies, par exemple par culture sous secousses ou culture agitée par l'air. La température de culture est de préférence de 25 à 450C, et le pH du milieu est de préférence de 6 à 9. La durée de culture peut être de 15 à 120 heures, de préférence de 72 à 96 heures. La protéine CBî existe dans le surnageant résultant de la centrifugation de la culture des cellules, mais non sur les surfaces ou à l'intérieur des cellules. Par consé- quent, pour purifier et isoler CBî de la culture, on peut employer convenablement n'importe quelle technique de séparation généralement employée pour purifier une protéine extracellulaire en éliminant les microorganismes. Par exemple, des techniques applicables sont l'élimination des cellules par centrifugation, le relargage avec le sulfate d'ammonium, l'ultrafiltration, la dialyse, la chromatographie avec divers gels échangeurs d'ions ou gels de tamis moléculaires comme milieux, et l'électrophorèse sur gel. Lorsque du n-butanol ou de l'isobutanol est ajouté à la culture et agité, presque toute la protéine CBî de la culture passe dans la phase butanol. La phase butanol est recueillie et un solvant organique tel que l'hexane y est ajouté et agité, si bien que l'eau contenue dans la phase butanol est séparée en redonnant une petite quantité d'une phase aqueuse dans laquelle CBî passe également. Il en résulte que la protéine CBî est ainsi fortement concentrée. Étant donné que la phase aqueuse ne contient presque aucune substance de haut poids moléculaire autre que CB1, cette phase aqueuse est recueillie, puis soumise à une chromatographie, en utilisant comme milieu un gel de tamis moléculaire tel que Sephacryl S-300HR (fabriqué par Pharmacia Co., Suède) en même temps qu'un tampon approprié tel qu'un tampon acétate d'ammonium, pour purifier complètement CB1. Les propriétés de la protéine CBî, telle qu'obtenue dans l'exemple décrit ci-dessous, sont comme suit 1) Aspect Extérieur : Poudre blanche. 2) Point de fusion : Environ 1370C. 3) Éléments constitutifs : C, H, N, O, S. 4) Analyse élémentaire : C 60,90 % H 9,61 % N 12,19 % S 0,29 %. 5) Poids moléculaire : Environ 45 000 (par filtration sur gel). 6) pH au point isoélectrique : Environ 4,3. 7) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet : Amax 196, 275 8) Spectre d'absorption dans l'infrarouge : (cm-1) 3310, 2950, 1730, 1660, 1540, 1470, 1390, 1200, 650. 9) Solubilité Soluble dans l'eau, le méthanol, méthanol et le butanol. Insoluble dans l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'éther, le benzène et l'hexane. 10) Extraction par solvant Presque totalement extraite par le n-butanol et l'isobutanol. Non extraite par l'acétate d'éthyle, le chloro forme, l'éther et le benzène. 11) Réaction colorée Positive dans la réaction à la ninhydrine. Négative dans la réaction au phénol-acide sulfu rique. 12) Capacité de liaison aux polysaccharides Capable de se lier à la chitine et au chitosane, et la liaison n'est pas gênée par le chitotriose, la N-acétylglucosamine et la glucosamine. Incapable de se lier à la cellulose. 13) Ne possède pas d'activité de chitinase ni d'activité de chitosanase. 14) Possède une propriété fongicide. 15) Possède une propriété insecticide. 16) Contient des acides gras dans les proportions suivantes Ci4:0 4% Ci5:0 0% C15:0 (ramification méthyle) li % Cri6:0 21 % C16:0 (ramification méthyle) 0 % Cri7:0 0% Ci7:0 (ramification méthyle) 9 % C18:0 31 % Ci8:i 23 % C18:2 0% Ci8:3 0 %. Parmi les propriétés susmentionnées de CB1, la capacité de liaison aux polysaccharides, la présence ou l'absence d'activité de chitinase et d'activité de chitosanase, la propriété fongicide et la propriété insecticide seront commentées plus en détail ci-dessous. On place séparément de la chitine en poudre, du chitosane en poudre et de la cellulose en poudre dans différents tubes de centrifugeuse de 1,5 ml, chacun en une quantité de 20 mg ; on y ajoute 100 Fl de solution de CBî à 0,1 mg/ml pour que chaque poudre gonfle bien ; la poudre gonflée est ensuite soumise à une centrifugation à 10 000 tr/min pendant 5 minutes ; et le surnageant séparé est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La protéine est détectée en utilisant un nécessaire de coloration par l'argent (fabriqué par Wako Pure Chemicals Co.). Il en résulte que les échantillons traités par la poudre de chitine et la poudre de chitosane ne présentent presque aucune bande attribuable à CB1, tandis que l'échantillon traité par la poudre de cellulose présente des bandes détectables des mêmes densités que celles de l'échantillon non traité. De la N-acétylglucosamine et son trimère, le chitotriose, sont ajoutés séparément à une solution de CBî et l'adsorption du mélange résultant sur la chitine est examinée de la même manière que ci-dessus. Il en résulte que la liaison de CBî à la chitine n'est pas du tout inhibée. Ensuite, la protéine CBî est mélangée séparément avec de la chitine colloïdale (préparée à partir de poudre de chitine), de l'éthylène-glycol-chitine (fabriquée par Seikagaku Co.) et du glycol-chitosane (fabriqué par Wako Pure Chemicals Co.) et amenée à réagir avec ceux-ci dans des conditions de pH 5 (tampon acide acétique), pH 7 (tampon acide phosphorique) ou pH 9 (tampon chlorhydrate de Tris) à 250C pendant 12 heures. Une solution alcaline de ferricyanure de potassium est ajoutée à la solution réactionnelle qui est portée à l'ébullition, après quoi 1 on constate que l'absorption à une longueur d'onde de 400 nm du produit résultant n'est pas très différente de celle du témoin. Autrement dit, étant donné qu'on n'observe la formation d'aucun sucre réducteur, on conclut que la protéine CBî de l'invention ne possède pas d'activité de chitinase ni d'activité de chitosanase. L'activité microbicide de la protéine CBî envers divers microorganismes est montrée dans le Tableau 1 cidessous. Pour ce qui concerne les moisissures, un morceau 3 cubique d'environ 1 mm de mycéliums de la moisissure d'épreuve, découpé à partir d'une culture inclinée de celle-ci, est inoculé dans chacune de plusieurs plaques de milieu MYG (1 % d'extrait de malt, 0,4 % d'extrait de levure, 0,4 % de glucose, pH 6,3)-gélose (1,5 %), contenant la protéine CBî à différentes concentrations, et cultivé à 250C ou à 300C pendant 3 à 7 jours, après quoi la concentration de CBî réduisant de moitié le diamètre de la colonie formée est exprimée en tant que CI50.Pour ce qui concerne les bactéries, on utilise un bouillon liquide comme milieu et pour la levure, on utilise un milieu MYG liquide. Dans les deux cas, la protéine CBî est ajoutée en plusieurs étapes à différentes concentrations au milieu et la bactérie ou la levure d'épreuve est inoculée dans le milieu et y est cultivée à 300C ou 370C pendant 1 à 2 jours. La concentration de CBî réduisant de moitié la turbidité à 590 nm est exprimée en tant que CI50. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Pour examiner la stabilité de l'activité microbicide de la protéine CB1, celle-ci est dissoute dans divers tampons ayant chacun un pH différent et maintenue à 250C pendant 24 heures, puis ajoutée au milieu de la manière mentionnée ci-dessus. Aucune différence n'est observée dans l'activité microbicide envers Corticium rolfsii MAFF 07-12043 dans l'intervalle de pH de 4 à 9. Lorsque le système microbien à pH 7 avec CBî est chauffé dans un autoclave pendant 15 minutes, l'activité microbicide de CBî ne diminue pas jusqu'à une température d'au moins 1200C. TABLEAU 1 Microbes testés C150 (g/m1) Champignons de moisissures Pyricularia oryzae MAFF 01-01002 2 Rhizoctonia solani CFî 5 Corticium rolfsii MAFF 07-12043 5 Tyromyces palustris MAFF 11-20001 5 Botrytis cinerea MAFF 07-12057 10 Coriolus versicolor CF2 20 Fusarium oxysporium NFRI 1011 50 Aspergillus oryzae NFRI 1132 > 100 Bactéries Escherichia coli K-12 > 100 Pseudomonas fluorescens AHU 1719 > 100 Bacillus cereus NFRI 8004 > 100 Staphylococcus aureus AHU 1142 100 Levures Saccharomyces cerevisiae Y02587 > 100 Candida albicans IFO 1385 > 100 Hansenula anomala NFRI 3706 > 100 L'effet de CBî sur la croissance de Sitophilus zeamais est indiqué dans le Tableau 2 ci-dessous. La protéine CBI est ajoutée à de la poudre de riz complet à une concentration de 0 % à 1 %, malaxée avec de l'eau, transformée en comprimés et séchée. Sitophilus zeamais y est appliqué pour la ponte et le développement des oeufs est observé. TABLEAU 2 Nombre Nombre Pourcentage Concentration Temps (jours) insectes d'insectes d'insectes de CBR (%) après éclosion testés morts morts (%) 1 10 30 30 100 0,1 30 60 20 33 0,01 30 60 14 23 30 60 10 17 Comme décrit ci-dessus, la protéine CBî de la présente invention est différente de la substance microbicide produite par des bactéries du genre Bacillus. On connaissait jusqu'à présent un certain nombre de protéines du type lectine liant la chitine chez les végétaux. Cependant, la liaison des lectines à la chitine est inhibée par les monosaccharides ou les oligosaccharides constituant la chitine, tels que la N-acétylglucosamine et le chitotriose. Par conséquent, ces protéines sont différentes de la protéine CBI de la présente invention. Il a été mentionné jusqu'à présent des lectines liant la chitine nommées UDA (Science, Vol. 245, page 1100, 1989) et Hevein (Planta, Vol. 183, page 258, 1991) et des peptides liant la chitine nommés Ac-AMP1 et Ac-AMP2 (Biochemistry, Vol. 31, page 4308, 1992). Cependant, tous ont un poids moléculaire de 10 000 ou moins et sont nettement différents de la protéine CBî de l'invention. Par conséquent, il a été confirmé que la protéine CBî liant la chitine est une substance nouvelle. La présente invention sera maintenant décrite plus en détail au moyen de l'exemple suivant qui n'est cependant pas destiné à limiter le cadre de la présente invention. EXEMPLE 1 Des cellules d'une culture inclinée de Bacillus licheniformis CBî (FRI 4008, FERM BP-4008) sont inoculées dans une fiole d'Erlenmeyer de 100 ml contenant 10 ml d'un milieu liquide (pH 7,2) comprenant 1 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levure et 1 % ae chlorure de sodium, et la fiole est mise à incuber à 370C pendant 24 heures. Ensuite, la culture d'ensemencement est inoculée en un volume d'environ 1 ml dans chacune de 10 fioles de Sakaguchi de 0,5 litre contenant chacune 0,1 litre d'un milieu liquide (pH 7,2) comprenant 1 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levure, 1,5 % de Na2HPO4 12H2O, 0,2 % de KH2PO4 et 1 % de glucose, et les fioles sont mises à incuber sous secousses à 370C pendant 72 heures.L'amplitude d'oscillation pour la culture sous secousses est de 7 cm et la vitesse de rotation est de 140 tr/min. Environ 1 litre de la culture est agité avec 0,2 litre de n-butanol, puis soumis à une centrifugation. On recueille environ 0,15 litre de la phase supérieure de butanol et l'on y ajoute 0,2 litre d'hexane et l'agite. La phase supérieure de butanol/hexane est enlevée après centrifugation et l'on obtient environ 16 ml de la phase aqueuse inférieure. Celle-ci est ensuite soumise à une chromatographie sur colonne de tamis moléculaires avec Sephacryl S-300HR (fabriqué par Pharmacia Co.), pour laquelle on utilise un tampon acétate d'ammonium 50mM (pH 6,5). L'absorption de l'éluat est suivie à 280 nm et l'on recueille la première fraction éluée d'une fraction du plus haut poids moléculaire. La fraction est dialysée contre de l'eau pure et lyophilisée pour donner 48 mg de cristaux. La protéine CBî ainsi obtenue possède les propriétés physico-chimiques et biologiques susmentionnées. Comme expliqué en détail ci-dessus, la protéine CBî liant la chitine de la présente invention peut être produite en un bon rendement par incubation de microorganismes particuliers. La protéine CBî possède à la fois une propriété fongicide et une propriété insecticide et elle est donc utile comme agent chimique pour l'agriculture (fongicide ou insecticide) et comme agent conservateur pour le bois. REVENDICATIONS 1. Nouvelle protéine CBl liant la chitine, caractérisée par les propriétés suivantes 1) Aspect Extérieur : Poudre blanche 2) Point de fusion : Environ 1370C 3) Éléments constitutifs : C, H, N, O, S 4) Analyse élémentaire : C 60,90 % H 9,61 % N 12,19 % S 0,29 % 5) Poids moléculaire : Environ 45 000 (par filtration sur gel) 6) pH au point isoélectrique :Environ 4,3 7) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet : Amax 196, 275 8) Spectre d'absorption dans l'infrarouge : (cm-1) 3310, 2950, 1730, 1660, 1540, 1470, 1390, 1200, 650 9) Solubilité Soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol et le butanol Insoluble dans l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'éther, le benzène et l'hexane 10) Extraction par solvant Presque totalement extraite par le n-butanol et l'isobutanol Non extraite par l'acétate d'éthyle, le chloro forme, l'éther et le benzène 11) Réaction colorée :: Positive dans la réaction à la ninhydrine Négative dans la réaction au phénol-acide sulfurique 12) Capacité de liaison aux polysaccharides Capable de se lier à la chitine et au chitosane, et la liaison n'est pas gênée par le chitotriose, la N-acétylglucosamine et la glucosamine Incapable de se lier à la cellulose 13) Ne possède pas d'activité de chitinase ni d'activité de chitosanase 14) Possède une propriété fongicide 15) Possède une propriété insecticide 16) Contient des acides gras dans les proportions suivantes Ci4:0 4% C15:0 0% Ci5:0 (ramification méthyle) 11 % C16:0 21 % Ci6:0 (ramification méthyle) 0 % Ci7:0 0% Ci7:0 (ramification méthyle) 9 % Ci8::0 31 % Ci8:i 23 % C18:2 0% C18:3 0 %. 2. Procédé de production d'une nouvelle protéine CBl liant la chitine, selon la revendication 1, caractérisé en ce que des bactéries appartenant au genre Bacillus et ayant la faculté de produire une nouvelle protéine cBl liant la chitine, selonla revendication 1 sont mises à incuber et la protéine CBî est recueillie à partir de la culture. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les bactéries sont celles de Bacillus licheniformis CBî (FERM BP-4008). 4. Fongicide caractérisé en ce qu'il contient une protéine CBl liant la chitine, selon la revendication 1 comme ingrédient actif. 5. Insecticide caractérisé en ce qu'il contient une protéine CBl liant la chitine, selon la revendication 1 comme ingrédient actif.