Brevet FR2689246A1 — publié le 19931001

PROCEDE IMMUNOCHIMIQUE DE DETECTION DE L'ORIGINE D'UNE SUBSTANCE PRODUITE PAR GENIE GENETIQUE ET REACTIFS POUR SA MISE EN OEUVRE. L'invention est relative à un procédé permet- tant de différencier une préparation contenant une substance obtenue par génie génétique d'une préparation de la substance naturelle correspondante, et à des réactifs pour la mise en oeuvre dudit procédé. Les technologies de l'ADN recombinant permet- tent d'obtenir un grand nombre de substances qui ne pou- vaient être obtenues auparavant que par extraction à par- tir d'animaux ou de végétaux ce qui, selon la substance considérée, peut poser certains problèmes tant au niveau du rendement d'extraction que de la pureté de la prépara- tion obtenue. En règle générale, les substances produites par des microorganismes transformés ont la même structure et les mêmes propriétés que les substances naturelles correspondantes et il est donc très malaisé de les en distinguer. Or, il est parfois souhaitable d'être en mesure de procéder à cette distinction, par exemple dans un but de contrôle de qualité et/ou de détection de fraudes. Un tel problème se pose en particulier dans l'industrie laitière, o il a été proposé d'utiliser, dans la fabrication fromagère, de la chymosine produite par génie génétique et additionnée de pepsine, à la place de présure d'origine naturelle (la présure naturelle, extraite de la caillette de jeunes bovins comprend comme constituants essentiels de la chymosine et de la pepsine). Pour détecter des fraudes éventuelles, il est donc nécessaire de savoir distinguer de la présure naturelle les mélanges contenant la chymosine produite par génie génétique. Or, cette distinction était jusqu'à présent considérée comme impossible, car la chymosine naturelle contenue dans la présure est absolument identique à la chymosine recombinante, par son poids moléculaire, sa séquence en acides aminés et ses propriétés immunologiques. Un tel problème se pose, de manière plus générale, lorsqu'il s'agit de distinguer une protéine produite par génie génétique d'une protéine naturelle. La présente Invention s'est fixé pour but la mise au point d'un procédé permettant cette distinction. Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que les préparations de protéines obtenues par génie génétique contenaient, même après purification, des traces de contaminants provenant du microorganisme hôte ou du milieu de culture Ils ont recherché si ces contaminants présentaient une spécificité antigénique permettant leur identification et étaient présents en quantité suffisante pour être détectés par des méthodes immunologiques. La présente Invention a pour objet un procédé de détection de l'origine d'une substance susceptible d'être produite dans un microorganisme hôte transformé par génie génétique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape o l'on met en contact un échantillon à tester avec un anticorps dirigé contre une préparation antigénique spécifique de la culture de microorganisme hôte (c'est-à-dire, spécifique du micro- organisme hôte et/ou du milieu de culture utilisé). Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, la substance dont on recherche l'origine est la chymosine. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, le microorganisme hôte est choisi dans le groupe constitué par Aspergillus Niger, E Coli K 12, et Kluyverryces lactis. L'Invention a également pour objet un réactif immunochimique pour la mise en oeuvre du procédé ci- dessus, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il com- prend au moins une préparation d'anticorps obtenue en utilisant comme immunogène, une préparation antigénique spécifique de la culture de microorganisme hôte. Selon un mode de réalisation préféré du réac- tif conforme à l'Invention, la préparation antigénique spécifique de la culture de microorganisme hôte est puri- fiée à partir d'un échantillon de la substance dont on souhaite déterminer l'origine, lequel échantillon a été préparé par génie génétique dans ledit microorganisme hôte. Selon un autre mode de réalisation préféré du réactif conforme à l'Invention, la préparation antigé- nique spécifique du microorganisme hôte et est produite à partir d'une culture dudit microorganisme délété du gène de la substance que l'on souhaite tester. La présente Invention a également pour objet des kits de dosage immunochimique pour la détermination de l'origine d'une substance susceptible d'être obtenue par génie génétique, lesquels kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une préparation d'anticorps telle que définie plus haut, éventuellement une préparation antigénique spécifique de la culture de microorganisme hôte telle que définie plus haut, ainsi que des moyens de révélation usuels de la formation d'un complexe antigène-anticorps. Toutes les méthodes de détection et de dosage immunologique peuvent convenir à la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention En particulier, des tests de type ELISA direct, sandwich ou par compétition peuvent être effectués sur des plaques de microtitration permet- tant ainsi des mesures quantitatives. Pour une détermination rapide sur le terrain, on préférera des tests en bandelettes Par exemple, avec l'utilisation d'un conjugué fabriqué avec l'antigène, une méthode ELISA compétitive peut être utilisée en fixant l'anticorps de lapin sur la bandelette et ensuite en ajoutant un mélange de conjugué et de solution inconnue à doser. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation des réactifs conformes à l'Invention. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. DETERMINATION DE L'ORIGINE D'UNE PREPARATION DE CHYMOSINE EXEMPLE 1 PURIFICATION DES ANTIGENES 1 ' A partir de solutions commerciales de chymosine produite par génie génétique 1.1 Ultrafiltration et concentration de la solution commerciale à l'aide d'une membrane de coupure à 10 000 Daltons; 1.2 Dialyse du produit concentré contre un tampon pipérazine 0,05 M p H 5,3, afin d'éliminer la majeure partie de la chymosine par précipitation; 1.3 Chromatographie sur colonne d'hydrophobicité de la fraction non précipitée (Colonne de Phényl-superose de chez PHARMACIA) L'élution est effectuée par un tampon phosphate de potassium 0,1 M, p H 7 et un gradient Na SO 4 1,7 M à O M On élimine les fractions qui coagulent le lait, on récupère les autres, qui sont réunies. 1.4 Lyophilisation des fractions obtenues précédemment; 1.5 Le lyophilisat est chromatographié sur un gel de perméation (Colonne superose 12 de chez PHARMACIA); l'élution est effectuée par tampon pipérazine H Cl 0,05 M, p H 5,3 On élimine les fractions qui coagulent le lait, on recueille les autres. 1.6 Les fractions recueillies sont dialysées contre une solution 0,01 M de carbonate acide d'ainmonium, puis lyophilisées. 2 A partir de cultures de souches microbiennes hôtes délétées Les antigènes sont préparés à partir des pro- téines excrétées dans le milieu de culture, concentrées par ultrafiltration Le concentrat est ensuite lyophylisé. EXEMPLE 2 PROTOCOLE D'OBTENTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN Des lapines de race vulgaire de 2 à 3 mois sont choisies (environ 3 kg). La première injection se fait par voie intradermique avec une des préparations antigéniques obtenue comme décrit à l'Exemple 1 ( 200 Fg de protéines) dissous dans 1 ml de solution contenant, à volumes égaux, de l'eau physiologique et de l'adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se font toutes les trois semaines avec la même quantité de préparation anti- génique en émulsion dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les prélèvements de sang sont réalisés dix jours après l'injection La qualité de l'anticorps est déterminée par une méthode ELISA directe en fixant l'antigène sur la plaque, puis le sérum de lapin et un conjugué commercial anti-Ig de lapin. EXEMPLE 3 PROTOCOLE D'OBTENTION D'ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LA POULE La première injection intramusculaire est réalisée avec 200 Fg de protéines en solution dans 1 ml d'un mélange contenant, à volumes égaux, de l'eau physio- logique et de l'adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se font toutes les trois semaines avec 200 gg de protéines en émulsion dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les oeufs sont retenus dix jours après l'injection Les anticorps sont extraits du jaune d'oeuf par précipitation avec 1,2 % (P/V) de polyéthylène glycol. EXEMPLE 4 DETERMINATION DE L'ORIGINE D'UNE PREPARATION D'ENZYMES DE COAGULATION DU LAIT Méthode ELISA directe sur bandelette a) Dépôt d'une goutte de 2 à 4 Rl d'un échan- tillon non dilué à tester dans un cercle dessiné sur la bandelette et noté A; b) Dépôt d'une goutte de témoin positif (solution commerciale de chymosine obtenue par génie génétique ou préparation d'antigène obtenue comme décrit à l'exemple 1) dans un cercle dessiné sur la bandelette et noté B; c) Attendre 10 min d) Tremper pendant 10 min la bandelette dans la solution de saturation (poudre de lait à 0, 5 %, gélatine 0,5 %, Tween 20 à 0,1 %); e) Laver la bandelette avec un tampon phosphate p H 7,2 contenant du Tween 20 à 0,05 % (solution de lavage);25 f) Tremper la bandelette 10 min dans une solution diluée au 1/200 eme d'anticorps de lapin préparée comme décrit à l'exemple 2; g) Laver la bandelette avec la solution de lavage; h) Tremper 10 min la bandelette dans une solution au 1/200 eme le conjugué anti-immunoglobulines de lapin marqué à la peroxydase; i) Rincer soigneusement la bandelette avec la solution de lavage; j) Tremper la bandelette pendant 5 à 10 min dans la solution de substrat ldiaminobenzidine (DAB)l; k) Lire le résultat en comparant la coloration brune du dépôt A avec celle du dépôt B. Méthode ELISA sandwich sur bandelette a) Utilisation d'une bandelette sensibilisée dans deux cercles notés A et B avec des immunoglobulines de poule; b) Dépôt d'une goutte de solution inconnue (échantillon à analyser) dans le cercle A; c) Dépôt d'une goutte de témoin positif dans le cercle B; d) Attendre 10 min; e) Laver la bandelette avec la solution de lavage; f) Identique à la méthode précédente pour les points f à k. Méthode ELISA directe sur Dplaque a) On ajoute successivement dans chaque puits d'une plaque de microtitration, 100 p 1 d'une solution à tester éventuellement diluée tampon carbonate 0,1 M p H 9 6. b) 100 j 1 d'une solution témoin positif diluée dans le même tampon; Incubation: 2 h à 37 C; 3 lavages tampon phosphate 0,15 M Nacl, Tween 20 à 0,05 % (PBS Tween). c) Saturation des puits avec 100 g 1 sérum albumine bovine 1 % diluée dans tampon PBS Tween; Incubation: 1 h à 37 'C. d) Après 3 lavages dans PBS Tween, on ajoute 100 J 1 sérum lapin dilué dans PBS Tween; Incubation: lh 30 à 37 'C. e) Après 3 lavages dans PBS Tween, on ajoute Jl conjugué anti Ig G lapin, couplé à phosphatase alcaline; Incubation: lh 30 à 37 C. f) Après 3 lavages dans PBS Tween, on ajoute 1 paranitrophényl phosphate à 1 mg/ml; On procède à la lecture à 405 mn après lh environ, en fonction de l'intensité de la coloration. RESULTATS Les figures 1 à 3 illustrent les résultats obtenus par la méthode ELISA directe sur plaque, en utilisant comme antigène à tester, différentes préparations d'enzymes de coagulation, et en utilisant comme antigènes témoin, soit une préparation purifiée à partir d'une solution commerciale de chymosine recombinante, soit une préparation obtenue à partir d'une culture de microorganismes délétés du gène de la chymosine. a) Antigènes testés A) Préparation d'antigène obtenu par élimina- tion de la chymosine d'une préparation de CHYMOGEN . B) Préparation de présure naturelle C) Préparation de chymosine obtenue à partir de chymosine animale, purifiée par échange d'ions (Laboratoires GRANDAY-ROGER, SANOFI BIO-INDUSTRIE) D) Préparation de chymosine CHYMOGEN /CHR HANSENS vendue par la Société BOLL, produite par une souche de Aspergillus Niger. E) Préparation de chymosine CHYMAX (vendue par PFIZER) produite par une souche de E Coli K 12 F) Préparation de chymosine MAXIREN (vendue par GIST-BROCADES) produite par une souche de Kluveromryces lactis. b) Antigènes d'immunisation et anticor Ds La figure 1 représente les résultats obtenus avec l'antisérum CGB 23 ter obtenu en utilisant comme immunogène l'antigène A ci-dessus, lequel antisérum est dilué au 1/100. La figure 2 représente les résultats obtenus avec l'antisérum CGG 13 obtenu en utilisant comme immuno- gène un antigène produit par une souche de Kluveromyces lactis délétée du gène codant pour la chymosine (antigène G), lequel antisérum est dilué au 1/200 La figure 3 représente les résultats obtenus avec l'antisérum CGP 52 obtenu en utilisant comme immunogène un antigène produit par une souche d'E Coli K 12, délétée du gène codant pour la chymosine (antigène H), lequel antisérum est dilué au 1/100. Pour chacune de ces figures, en abscisse sont représentées les solutions antigéniques à tester diluées au 1/10 Les solutions témoin (antigènes d'immunisation) sont à une concentration de 500 ng/ml En ordonnée est indiquée la DO 405 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Procédé de détection de l'origine d'une substance susceptible d'être produite dans un microorga- nisme hôte transformé par génie génétique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape o l'on met en contact un échantillon à tester avec un anticorps dirigé contre une préparation antigénique spécifique du microorganisme hôte et/ou de son milieu de culture. 2) Procédé selon la Revendication 1, caracté- risé en ce que la substance dont on recherche l'origine est la chymosine. 3) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 ou 2, caractérisé en ce que le microorganisme hôte est choisi dans le groupe constitué par Aspergillus Niger, E Coli K 12, et Kluyvernyces lactis. 4) Réactif immunochimique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des Revendica- tions 1 à 3, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps obtenue en utilisant comme immunogène, une préparation antigénique spécifique du microorganisme hôte et/ou de son milieu de culture. 5) Réactif selon la Revendication 4, caracté- risé en ce que la préparation antigénique spécifique du microorganisme hôte est purifiée à partir d'un échantil- lon de la substance produite par génie génétique dans ledit microorganisme hôte. 6) Réactif selon la Revendication 4, caracté- risé en ce que la préparation antigénique spécifique du microorganisme hôte est produite à partir d'une culture dudit microorganisme délété du gène de la substance que l'on souhaite tester. 7) Kits de dosage immunochimique pour la détermination de l'origine d'une substance susceptible d'être obtenue par génie génétique, lesquels kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un réactif5 selon l'une quelconque des Revendications 4 à 6, éventuellement une préparation antigénique spécifique du microorganisme hôte et/ou de son milieu de culture, ainsi que des moyens de révélation usuels de la formation d'un complexe antigène-anticorps.