Brevet FR2696189A1 — publié le 19940401

POLYPEPTIDES IMPLIOUES DANS LA BIOSYNTHESE DES STREPTOGRAMINES. SEOUENCES NUCLEOTIDIOUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET LEUR UTILISATION. La présente invention concerne de nouveaux polypeptides impliqués dans la biosynthèse des Streptogramines et comprend également Isolement et l'identification de gènes de biosynthèse des composants A et B des Streptogramines, l'expression de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et leur utilisation pour la construction de mutants bloqués pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de Streptogramines Les Streptogramines forment un groupe homogène d'antibiotiques constitués d'une association de deux types de molécules chimiquement différentes; d'une part des macrolactones polyinsaturées (composants du groupe A, dont deux exemples de structures sont présentées figure 1) et d'autre part, des depsipeptides (composants du groupe B, dont trois exemples de structure sont présentés sur la figure 2).Ce groupe comprend de nombreux antibiotiques (cf. tableau 1) connus sous différents noms en fonction de leur origine dont les Pristinamycines, les Mikamycines, les Virginiamycines (pour une revue, voir Cocito 1979, 1983). Les composants A et B ont une activité antibactérienne synergique qui peut atteindre 100 fois celle des composants séparés et qui, contrairement à celle de chaque composant, est bactéricide (Cocito 1979). Cette activité est plus particulièrement efficace conte les bactéries Gram-positives, comme les Staphyloeoques et Streptocoques (Cocito 1979, Videau 1982). Les composants A et B inhibent la synthèse protéique en se fixant à la sous-unité 50S du ribosome (Cocito 1979 ; pour une revue, voir Di Giambattista et al. 1989). Les Streptogramines sont essentiellement produites par des Actinomycètes dont de nombreux Streptomycètes, présentés dans le tableau 1. En outre, les Streptogramines sont aussi synthétisées par des eucaryotes tel que Micromonospora qui synthétise les Vernamycines. Les Actinomycètes constituent un groupe de microorganismes très intéressant du fait de la quantité importante de métabolites secondaires qu'ils produisent, parmis lesquels de nombreux antibiotiques (Betalactames, Tétracyclines, Macrolides, Aminoglycosides, Polyacétates, etc), des herbicides, des anti-cancéreux, des antifongiques, des immunomodulateurs, des inhibiteurs d'enzymes. De nombreuses voies de biosynthèse, concernant des antibiotiques appartenant à des classes variées ainsi que d'autres métabolites secondaires tels que des pigments (pour une revue, Chater 1990), ont à ce jour déjà été étudiées chez les Actinomycètes.Un aspect important de ce groupe de bactéries, est que les gènes impliqués dans une même voie de biosynthèse, gènes de structure, mais également, gène(s) de résistance et gène(s) de régulation, sont groupés physiquement sur le chromosome, constituant des clusters, pouvant atteindre plus de 100 Kb (Hopwood et al.l986a, Hopwood et al. 1986b, Hallam et al. 1988, Anzai et al. 1987, Onuki et al. 1985b). A ce jour aucun exemple n'est venu contredire cette constatation. Une telle organisation structurale présente un intérêt important dans le développement des stratégies de clonage des gènes de biosynthèse.En effet, il est possible, à partir d'un seul gène préalablement cloné par des techniques diverses, gène de biosynthèse, de résistance ou de régulation, de marcher le long du chromosome et d'isoler ainsi l'ensemble des gènes du cluster de biosynthèse. La connaissance des voies de biosynthèse de chacun des composants des Streptogramines n'est que très partielle à ce jour, mais l'origine des différentes parties de chaque molécule a été identifiée par marquage radioactif (Kingston et L1. 1983). Ainsi, les composants de type A sont formés de deux régions provenant de la condensation d'acétates et de plusieurs acides aminés tels que la sérine, la glycine, par exemple. En ce qui concerne les composants de type B, des études ont montré que tous les acides aminés présents dans la chaîne peptidique dérivent des acides aminés naturels (Hook et Vining 1973). Toutefois, aucun polypeptide impliqué dans ces voies n'a été purifié en quantité suffisante à ce jour pour permettre sa caractérisation moléculaire, et aucun gène de biosynthèse n'a été décrit. La présente invention résulte de la purification de polypeptides intervenant dans la biosynthèse des Streptogramines ainsi que du clonage de gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des Streptogramines. La présente invention permet ainsi d'augmenter les taux de production de ces métabolites grâce aux techniques d'ADN recombinant. Un autre intérêt de la présente invention réside dans la possibilité, par construction de mutants bloqués dans les différentes étapes de cette biosynthèse, de produire des intermédiaires de synthèse de chacun des deux composants. Ces intermédiaires peuvent servir de substrats à de nouvelles modifications, par voie chimique, biochimique, enzymatique ou microbiologique.De même l'isolement des gènes de biosynthèse permet, par transfert des gènes entre souches productrices, de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et al. 1985a, Hopwood et al. 1985b, Hutchinson et al. 1989). Un autre intérêt de la présente invention réside dans le fait qu'elle apporte une meilleure connaissance des voies de biosynthèse des métabolites classés comme des Streptogramines. En effet, l'invention permet de construire des souches bactériennes ou fongiques dans lesquelles on exprime, sous le contrôle de signaux d'expression appropriés, une ou plusieurs protéines intervenant dans la biosynthèse des Streptogramines. De telles souches peuvent alors être utilisées pour réaliser des bioconversions.Ces bioconversions peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Ces bioconversions peuvent permettre de transformer une Streptogramine en une forme dérivée, avec une enzyme d'une voie de biosynthèse. Par exemple, la Pristinamycine IIB peut être, de cette manière, transformée en Pristinamycine IIA. Le même raisonnement peut être appliqué à tout intermédiaire de biosynthèse. Un premier objet de l'invention concerne donc une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines. Plus particulièrement, plusieurs gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des Streptogramines ont été isolés à partir de Streptomyces pristinaespiralis. Les Streptogramines produites par cette souche étant plus communément désignées par le terme Pristinamycines (Cf tableau 1), dans ce qui suit, référence sera faite dans certains cas aux gènes de biosynthèse des Pristinamycines. Mais il est clair que les résultats obtenus s'appliquent à l'ensemble des Streptogranines. Les Pristinamycines I et II correspondent respectivement aux composants B et A des Streptogramines. Les molécules de la famille des Pristinamycines II et de la famille des Pristinamycines I, désignent donc dans ce qui suit les composants A et B des Streptogramines respectivement. La présente invention décrit en particulier l'isolement et la caractérisation des gènes snaA, snaB. snaC, snbA et snbR. Ces gènes ont été isolés à partir d'une banque d'ADN génomique de S. pristinaespiralis. Cette banque a été obtenue par digestion partielle de l'ADN génomique de S. pristinaespiralis, par l'enzyme de restriction Sauva De larges fragments d'ADN, de 40 à 50 Kb en moyenne, ont été clonés dans le cosmide pHC79 (Hohn, B., and Collins, J. F., 1980). Après encapsidation in vitro, les souches d'E.coli HB101 (Boyer et Roulland-Dussoix, 1969) et DHî (Low, 1968) ont été transfectées. La banque d'ADN de S.peistinaespiralis se trouve ainsi dans deux souches différentes d'E.coli. Les gènes snaA. snaB et snaC sont présents sur le cosmide pIBV1 (figure 4). Le produit des gènes snaA et snaB. correspondant aux polypeptides SnaA et SnaB, intervient dans la dernière étape de biosynthèse du composant II des Pristinamycines (conversion de la Pristinamycine IIB en Pristinamycine IIA) correspondant à l'oxydation de la liaison 2,3 de la D-proline. Ces deux polypeptides constituent les deux sous-unités de Pristinamycine "A synthase dont la purification est décrite dans la présente invention Le produit du gène snaC interviendrait dans la synthèse de la SAM (donneur de groupements méthyls) à partir d'ATP et de méthionine.Le composant A de la plupart des Streptogramines est en effet méthylé en C-4 (figure 1), et il a été décrit (Kingston et al., 1983) que ce méthyl dérive du méthyl de la méthionine, très probablement via une réaction de méthylation avec la SAM. Le gène snaC coderait donc pour une SAM synthase (EC. 2.5.1.6) spécifique de la voie de biosynthèse des Pristinamycines. Les gènes snbA et snbR sont présents sur le cosmide pIBV2 (figure 5). Le gène snbA correspond, d'aprés les études biochimiques présentées dans l'exemple 5, à la première étape de la synthèse des Pristinamycines I. Il s'agit de l'activation du premier acide de la chaine, l'acide 3-hydroxypicolinique, par adénylation. Le gène snbR pourrait intervenir dans le transport des molécules de la famille des Pristinamycines I (voire des Pristinamycines 11) hors de la cellule, aprés synthèse, conférant ainsi, à la souche productrice une résistance à ce composant. Ces différents gènes ont été sous-clonés à partir de leur cosmide d'origine et leurs séquences nucléiques ont été déterminées. Les gènes snaA, snaB et snaC, ont été sous-clonés sur un fragment BamHI-BamHI de 6 kb, dont une partie a été séquencée (SEQ ID n 1). Le gène snbA a été sous cloné sur un fragment EcoRI-BgIII de de 5.5 kb, dont une partie a été séquencée (SEQ ID n 8). Le gène snbR a été sous cloné sur un fragment bu II-BglII de 4.6 kb, dont une partie a été séquencée (SEQ ID n 10). La proximité des gènes snaA, snaB et snaC ainsi que des gènes snbA et snbR. confirme la localisation en clusters des gènes de biosynthèse des composants A et B des Streptogramines. Il est donc évident que les régions qui entourent les gènes identifiés dans la présente invention (snaA. snaB et snaC, snbA et snbR), contiennent les autres gènes du cluster de biosynthèse des Pristinamycines, et que ces gènes peuvent être utilisés pour localiser les autres gènes de biosynthèse des Streptogramines. Préférentiellement, l'invention a pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi: (a) les gènes snaA (SEQ ID n 2), .snaB (SEQ ID n 4), 3naC (SEQ ID n 6), snbA (SEQ ID n 8) et snbR (SEQ ID n 10), (b) les séquences adjacentes aux gènes (a) constituant les clusters de biosynthèse et codant pour les polypeptides impliqués dans la biosynthèse des Streptogramines, (c) les séquences hybridant avec tout ou partie des gènes (a) ou (b) et codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines, et, (d) les séquences dérivées des séquences (a), (b) et (c) en raison de la dégénérescence du code génétique. Encore plus préférentiellement, Invention a pour objet les séquences nucléotidiques représentées par les gènes snaA (SEQ ID nO 2), snaB (SEQ ID n" 4), snaC (SEQ ID n" 6), snbA (SEQ ID n" 8) et snbR (SEQ ID n" 10). Un autre objet de l'invention concerne tout ADN recombinant comprenant un gène de biosynthèse des Streptogramines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un ADN recombinant comprenant tout ou partie des cosmides pIBV1 ou pIBV2 tels que représentés sur les figures 4 et 5 ou tout ou partie de séquences hybridant avec les cosmides pIBV1 ou pIBV2 ou avec des fragments de ceux-ci. Dans un mode préféré de l'invention, les séquences nucléotidiques définies ci-dessus font partie d'un vecteur d'expression, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Comme indiqué plus haut, bien que Invention soit plus particulièrement illustrée avec les gènes de biosynthèse de la Pristinamycine, il est clair que les résultats obtenus s'appliquent à l'ensemble des Streptogramines. Plus particulièrement, les techniques développées dans la présente invention pour purifier des protéines ou cloner des gènes de biosynthèse des Streptogramines à partir de S.pristinaespiralis peuvent être appliquées aux autres microorganismes productéurs de Streptogramines (Cf tableau 1). Ainsi, la purification d'une activité enzymatique à partir de S. pristinaespiralis rend possible la purification de la même activité à partir d'une autre souche productrice de Streptogramine. La présente invention peut donc être appliquée au clonage de gènes de biosynthèse de Streptogramine à partir de tout microorganisme producteur par purification d'une protéine intervenant dans la biosynthèse puis, à l'aide de la séquence NH2-terminale de celle, synthèse d'une sonde oligonucléotique qui permet de cloner le gène correspondant. Ensuite une marche sur le chromosome permet d'identifier le cluster de biosynthèse en entier. De plus, à partir des gènes identifiés dans la présente demande, il est possible, par hybridation, de cloner directement les gènes de biosynthèse des Streptogramines à partir de RADON d'un autre microorganisme producteur. En effet, les gènes de biosynthèse des Pristinamycines hybrident fortement à ceux des autres Streptogramines. li est ainsi possible de cloner par hybridation les gènes de biosynthèse des Streptogramines en utilisant comme sonde les gènes sna ou snb, ou des fragments de ceuxci, ou les fragments adjacents à ceux-ci contenant, comme il est montré dans la présente invention, d'autres gènes sna et sk. Ceci résulte du fait que (1) les Streptogramines produites par les différents microorganismes ont des structures identiques ou similaires (voir figure 3), (2) les gènes de biosynthèse des Streptogramines sont organisés en clusters, et (3) les systèmes enzymatiques responsables de cette biosynthèse n'ont pas une spécificité absolue pour leurs substrats. Par ailleurs, le clonage de gènes impliqués dans la biosynthèse des Streptogramines peut aussi se faire en utilisant des oligonucléotides dégénérés, préparés à partir des séquences des gènes sna ou snb cités plus haut, ou des fragments de ces gènes, ou des fragments contigus à ces gènes. 1l est ainsi possible d'aller piocher les gènes de biosynthèse des composants A et B des différentes souches productrices de Streptogamines. Ces souches peuvent faire partie du genre Streptomyces, mais aussi d'autres genres (Cf tableau 1). En outre, si RADON génomique des souches de départ utilisées a une composition en G+C différente de celle observée chez les Streptomyces les sondes utilisées peuvent être synthétisées avec un biais de codon spécifique du genre ou de l'espèce à partir duquel on veut isoler l'ADN. Un autre objet de la présente invention concerne les polypeptides résultant de l'expression des séquences nucléotidiques définies ci-dessus. Plus particulièrement, la présente invention concerne les polypeptides comprenant tout ou partie des polypeptides SnaA (SEQ ID n" 3), SnaB (SEQ ID n" 5), SnaC (SEQ ID n" 7), SnbA (SEQ ID n0 9) et SnbR (SEQ ID n" 11) ou de dérivés de ceux-ci. Au sens de la présente invention, Ie terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) substrat(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter etlou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues aux polypeptides décrits dans la présente invention, issus d'autres sources cellulaires et notamment de souches productrices de Streptogramines. L'invention a également pour objet toute cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique ou un vecteur tel que défini ci-avant. Les cellules recombinantes selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromvces, Pichia. Schwanniomvces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Micromonospora, Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes Actinomycètes, E.coli, Bacilles. et notamment Streptomyces. Préférentiellement, les cellules recombinantes de l'invention sont choisies parmi les cellules productrices de Streptogramines (Cf tableau 1). Les cellules recombinantes de l'invention peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'introduire une séquence nucléotidique étrangère dans une cellule. 1l peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. L'invention a encore pour objet un procédé de production d'un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines selon lequel on cultive une cellule recombinante telle que définie ci-avant et on récupère le polypeptide produit. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule recombinante telle que définie ci-avant exprimant un polypeptide au moins impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines, dans une réaction de bioconversion. En particulier, ces cellules peuvent permettre de transformer une Streptogramine en une forme dérivée. Par exemple, la Pristinamycine IIB peut être, de cette manière, transformée en Pristinamycine IIA. Le même raisonnement peut être appliqué à tout intermédiaire de biosynthèse. Ces cellules peuvent également permettre de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et 1985a, Hopwood et al. 1985b, Hutchinson et al. 1989).Ces bioconversions peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant pour amplifier la production de Streptogramine. L'invention concerne également un procédé de production de Streptogramines selon lequel on introduit et/ou on amplifie dans une cellule productrice de Streptogramines ou potentiellement productrice de Streptogramines une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'invention, on cultive ladite cellule dans des conditions de production des Streptogramines, et on récupère les Streptogramines produites. La surexpression de certains gènes impliqués dans la biosynthèse peut permettre l'augmentation de la production des Streptogramines A et/ou B des souches productrices. Cette surproduction peut se faire dans plusieurs souches : soit des souches qui ne produisent que des molécules de la famille des Streptogramines A, soit des souches qui ne produisent que des molécules de la famille des Streptogramines B, soit des souches qui produisent les deux composants A et B. Ces surexpressions peuvent résulter de l'augmentation du taux de synthèse, donc de la productivité, des composants A et/ou B soit en erlenmeyer, soit en petits fermenteurs, soit en gros fermenteurs industriels.Par ailleurs, la surexpression spécifique d'un gène impliqué dans la biosynthèse d'un composant A ou B permet également de faire varier le to de composants A et B produits par la souche, et ainsi d'obtenir une meilleure synergie entre ces molécules. En outre, les gènes de biosynthèse isolés à partir d'un microorganisme producteur de Streptogramines peuvent être utilisés pour amplifier la production dans un autre microorganisme producteur. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation de cellules bloquées dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines selon lequel on effectue, sur une cellule productrice de Streptogramines, une mutagénèse au niveau d'un gène au moins de la voie de biosynthèse. Préférentiellement, la mutagénèse est effectuée in vitro ou situ. par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré, ou par disruption génique. Un autre aspect de la présente invention réside en effet dans la construction de mutants bloqués dans certaines étapes de biosynthèse des Streptogramines. L'intérêt réside d'une part dans l'étude de la fonctionnalité des protéines mutées et d'autre part dans la réalisation de souches produisant des intermédiaires de biosynthèse. Ces intermédiaires peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants particuliers dans les milieux de production, soit par introduction dans les souches ainsi mutées d'autres gènes susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant de substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.Dans ce cadre, le mutant SP92::pVRC505 de la souche S.stinaespiralis SP92 a été construit S.pristinaespiralis SP92::pVRC505 a été isolée par intégration homologue dans le gène snaA d'un plasmide suicide pVRC505, construit à partir du vecteur pDH5 et d'un fragment interne au gène snaA. L'invention concerne donc également un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse des Streptogramines selon lequel: - on prépare une cellule bloquée dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines telle que décrite ci-avant, - on cultive ladite cellule, et - on récupère rintermédiare accumulé. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une molécule dérivée des Streptogramines selon lequel: - on prépare une cellule bloquée dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines telle que décrite ci-avant, - on cultive ladite cellule, et, - on modifie rintermédiare accumulé par cette cellule, éventuellement après séparation du milieu de culture. La présente invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LISTE DES FIGURES Figure 1 : Exemple de structure des composants A des Streptogramines. Figure 2: Exemple de structure des composants B des Streptogramines. Figure 3 : Autres exemples de structures de Streptogramines. Figure 4 : Représentation du cosmide pIBV1. Figure 5 : Représentation du cosmide pIBV2. Figure 6 : Réaction catalysée par la Pristinamycine IIA-synthase. Figure 7: Réaction catalysée par l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase. Figure 8 : Représentation des plasmides pVRC402 (A) et pVRC501 (B). Figure 9: Représentation du plasmide pXL2045. Figure 10 : Représentation du plasmide pVRC505. Figure 11 : Représentation du plasmide pVRC507. Matériels: Bio-Sil SEC 125 et 250 (Bio-Rad) Centricon 10 (Amicon) Centriprep 10 (Amicon) FMN agarose (Sigma) MonoQ HR 5/5 et 10/10 (Pharmacia) PD-10 (Pharmacia) Phenyl Sepharose (Pharmacia) Phenyl Superose HR 10/10 (Pharmacia) Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) Sephadex G25 Fine (Pharmacia) Superose 12 prep grade (Pharmacia) Vydac C4 et C18 (The Separations Group) EXEMPLE 1 : Isolement de l'ADN total de la souche Streptomvees pristinaespiralis SP92. Cet exemple illustre comment FADN de S pristinaespiralis SP92 peut être purifié. La souche Streptomyces pristinaespiralis SP92 dérive de la souche Streptomyces pristinaespiralis DS5647 (ATCC25486). 50 ml de milieu YEME (34% de sucrose, 5 mM MgC12, glycine 0.25% (D. Hopwood et al. 1985)) sont inoculés avec 108 spores de S pristinaespiralis SP92 et la culture est incubée 40 heures à 300C, sous agitation de 280 tours/mn. Le mycélium est récolté et lavé avec 15 ml de saccharose 10.3 %. Environ 1 g du culot de mycélium est repris par 5 ml de TE complémenté par 34 % de sucrose, auxquels sont ajoutés, 1 ml de lysozyme à 50 mg/ml dans une solution de Tris-HCl 0.01 M pH8 et 1 ml d'EDTA 0.25 M pH8. Après incubation à 30 C pendant une durée de 30 à 60 mn, le mélange est éclairci par 0.8 ml de sarkosyl 10 %. Puis sont ajoutés, 2 ml d'EDTA 0.25 M pH8, 10 ml de TE, 18 g de CsCl et 1.2 ml de BET 10 mg/ml. La préparation est ultracentrifugée pendant une nuit à 55 000 tours/mn, à 20 C. L'ADN chromosomique présent dans le gradient de CsCl sous forme d'une bande, est récupéré à l'aide d'une pipette Pasteur. Le BET est éliminé par plusieurs lavages avec une solution d'isopropanol saturée par du tampon TE, 5 M NaCl. L'ADN est précipité par ajout de 3 volumes de TE et 4 volumes d'isopropanol. Après lavage à Méthanol 70 %, l'ADN est repris dans un volume approprié de TE. La quantité d'ADN total obtenu varie entre 250 et 500 C19 par g de mycélium. EXEMPLE 2: Isolement d'ADN plasmidique d'E.coli: Cet exemple illustre comment l'ADN plasmidique d'E.coli est préparé à partir des souches d'E.coli recombinantes 2.1. Préparation d'ADN plasmidique d'E.coli en grosses quantités: Cet exemple illustre comment les maxipréparations d'ADN plasmidique sont réalisées chez E.coli. Cette préparation est effectuée à partir d'une culture de 500 ml en milieu LB contenant 150 pg/ml d'ampicilline. Le protocole d'extraction est dérivé des méthodes décrites par Birnboim et Doly (1979) et Ish-Horowicz et Burke (1981) et est décrit dans Maniatis et al (1989). Après cette extraction, l'ADN plasmidique est purifié par gradient de CsCl, comme décrit dans Maniatis et al. (1989). L'ADN plasmidique est ensuite précipité par ajout de 3 volumes de TE et 4 volumes d'isopropanol. Après centrifugation, le culot est repris dans 0.5 à 1 ml de TE. 2.2. Prénaration d'ADN plasmidique d'E.coli. en petites quantités: Cet exemple illustre comment les minipréparations d'ADN plasmidique sont réalisées chez E.coli. Cette préparation est réalisée à partir de 1.5 ml de culture en milieu LB contenant 150 Mglml d'ampicilline. La procédure est celle décrite par Birnboim et Doly (1979). EXEMPLE 3 : Construction de la banque d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92 chez E.coli. Cet exemple illustre comment une banque d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92 est réalisée chez E.coli. 3.1. Préparation des fragments d'ADN génomique: Cet exemple illustre comment des fragments d'ADN génomique de haut poids moléculaire peuvent être préparés. L'ADN total de la souche SP92, préparé comme décrit dans l'exemple 1, est digéré partiellement par Sau3A (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 USA) dans le tampon préconisé par le fournisseur: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgC12, 100 g/ml BSA. La quantité d'enzyme utilisée pour obtenir des fragments d'ADN de haut poids moléculaire, a été déterminée empiriquement. Environ 0.025 unités d'enzyme sont utilisées pour digérer 1 ,ug d'ADN total pendant 20 mn à 37 C. La réaction est ensuite arrêtée par une incubation de 15 mn à 65 C et l'enzyme éliminée par l'addition d'un volume égal de phénol-chloroforme. Après centrifugation, le surnageant contenant l'ADN total partiellement digéré est précipité par ajout d'acétate de sodium 0.3 M final et 2.5 volumes d'éthanol. Environ 100 ,ug d'ADN total sont ainsi digérés, puis les fragments d'ADN de taille comprise entre 30 et 50 kb sont isolés par gradient de sucrose 10-40 %. Leur taille est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,4 %. 3.2. Préparation du cosmide pHC79: Cet exemple illustre comment le cosmide pHC79 est préparé à partir d'E. coli. Le cosmide pHC79 (Hohn, B. and Collins, 1980) comprend une partie de pBR322 (Bolivar, F. et al, 1977), la région cro-cII de # et la région contenant la séquence coe de Charon 4A (Blattner, F.R. et al. 1977). - L'extraction du cosmide a été réalisée comme décrit dans l'exemple 2.1., à partir d'une souche d'E.coli TG1 (K12, #(lac-pro) supE thi hsd DS F' traD36 proA+B+ lacIqLacZ #M15, Gibson, 1984). 500 ng de cosmide pHC79 ont été digérés par BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 USA) dans 20 1 de tampon 150 mM NaCl, 6 mM Tris HCl (pH7.9), 6 mM MgC12, 6 mM 2-mercaptoéthanol, 100 g/ml BSA. 3.3. Ligation des fragments d'ADN et du cosmide: Cet exemple illustre comment les fragments du génome de S.pristinaespiralis SP92, issus d'une digestion Sau3A, peuvent être ligaturés avec le vecteur pHC79 linéarisé par BamHI. Environ 150 ng de cosmide linéarisé comme décrit plus haut ont été précipités à l'éthanol avec 350 ng de fragments d'ADN total de S.pristinaespiralis SP92 préparés comme décrit à l'exemple 3.2. Le culot a été repris dans 10 l de tampon de ligation: 50 mM Tris-HCl pH7.8, 10 mM MgC12, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 50 g/ml de BSA et 0.5 ,ul de T4 DNA Ligase à 400 000 unités par ml (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 USA) ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée durant une nuit à 15 C. 3.4. Réalisation de l'encapsidation in vitro: Cet exemple illustre comment les cosmides construits en 3.3 sont encapsidés in vitro. L'encapsidation des cosmides hybrides après ligation a été réalisée à partir du kit Gigapack II Gold, développé par Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA). 2x4 ,ul de mélange de ligation, soit 2X70 ng de cosmides hybrides ont été encapsidés in vitro selon la procédure décrite par le fournisseur. 3.5. Transfection des souches d'E.coli DHî et HB101; Cet exemple illustre comment les cosmides sont introduits chez E.coli. Deux transfections en parallèle ont été réalisées avec les souches d' E.coli DHî (F. gyrA96 recA1 relA1 end A1 thi-1 hadR17 supE44L, Low 1968) et HB101 (Fsup E44 hsdS20(rB-mB-) rec A13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1, Boyer et Roulland-Dussoix 1969). Les cellules ont été préparées selon le protocole suivant: une préculture de 100 ml est réalisée en milieu LB complémenté par 0.2 to Maltose et 10 mM MgSO4, pendant 4 à 5 heures jusqu'à ce que la DO600 atteigne la valeur de 0.8. La culture est alors centrifugée et le culot repris dans 40 ml de MgSO4 10 mM et dilué jusqu'à D0600=0.5, dans la même solution. 200 sul de la suspension cellulaire ainsi préparée sont mélangés à 100 Cll de mélange d'encapsidation.Après 20 mn de contact à 37"C, 1 ml de LB est ajouté et l'ensemble est incubé 1 hr à 37"C. Les transfectants sont ensuite sélectionnés sur milieu LB solide contenant 150 pglml d'ampicilline. Le nombre de transfectants obtenus est d'environ 104 par pg de cosmide recombinant. 36 Stockage des banques d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92: Cet exemple illustre comment les banques d'ADN génomique de S.pristinaespîralis SP92 sont conservées. Après vérification de la taille moyenne des fragments insérés dans le cosmide pHC79, environ 1500 colonies issues de chacune des transfections réalisées avec les souches HB101 et DHî sont repiquées dans des plaques de micro-titration à 96 puits contenant 200 Cll de milieu Hogness (milieu LB complémenté avec 8.8 to glycérol, 3 mM sodium acétate, 55 mM K2HPO4, 26 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 15 mM (NH4)2S04, ampicilline 150 Mg/ml). Ces plaques sont incubées une nuit à 370C puis stockées à -800C. EXEMPLE 4 : Préparation des membranes d'hybridation à partir des banques génomiques de S. pristinaespiralis SP92: Cet exemple illustre comment 1'ADN des colonies constituant les banques génomiques de S. pristinaespiralis SP92 est transféré sur une membrane d'hybridation. Ces membranes d'hybridation ont été réalisées en double pour chacune des 2 banques, selon le protocole suivant: Les 15 plaques de micro-titration de chaque banque sont répliquées à l'aide d'une brosse à clous sur milieu LB agar contenant 150 g d'ampicilline par ml. Après une nuit de croissance à 37"C, le transfert des colonies est effectué sur membrane Biohylon Z+ (Bioprope System) selon le protocole suivant: la membrane découpée à la taille adéquate est laissée au contact des colonies pendant 1 mn. Puis une dénaturation est effectuée par imbibation de la membrane avec une solution de NaOH 0.5 M, NaCl 1.5 M pendant 5 mn, suivie d'une neutralisation par imbibation de la membrane dans une solution d'acétate de sodium 3 M pendant 5 mn. L'ADN est fixé sur la membrane par exposition sous une lampe UV pendant 5 mn. EXEMPLE 5: Isolement de cosmides portant les gènes codant pour des protéines purifiées impliquées dans la biosynthèse des Streptogramines: Cet exemple décrit comment, à partir d'une protéine purifiée intervenant dans la biosynthèse des Pristinamycines, dont la séquence NH2-terminale, ou une séquence interne ont été établies, il est possible d'isoler à partir des banques génomiques précédemment réalisées, un cosmide portant le gène de structure de cette même protéine. 5.1. Isolement du cosmide pIBV1 portant les gènes de structure des deux sousunités de la Pristinamvcine IIA svnthase. 5.1.1. Identification et purification d'une des protéines impliquées dans l'étape finaIe de la synthèse des Pristinamycines II: la Pristinamycine IIA synthase. Comme il a été indiqué dans l'introduction, la dernière étape de synthèse de la Pristinamycine IIA correspond à une oxydation de la liaison 2-3 de la D-proline en déhydroproline. La protéine responsable de cette activité a été purifiée jusqu'à homogénéité comme l'illustre cet exemple. 5.1.1.A. Dosage de l'activité Pristinamycine IIA synthase Cet exemple illustre le dosage d'une activité de la voie de biosynthèse de la Pristinamycine IIA qui n'a encore jamais été décrite et qui possède la propriété remarquable de n'être exprimée que pendant la période de production des Pristinamycines. li s'agit de la Pristinamycine IIA synthase qui catalyse la conversion de la Prïstinanamycine IIB en Pristinamycine IIA par oxydation du résidu D-proline de la Pristinamycine IIB en résidu 2-3 déhydroproline (figure 6) en présence d'oxygène moléculaire et de FMNH2. Les fractions enzymatiques à doser (0,002 à 0,005 unités) sont incubées 1h à 27 C dans un volume total de 500 ml de tampon bis-tris-propane 50 mM pH 6,8 contenant NADH (500 pM), FMN (5 M), Pristinamycine IIB (20 pM) et 0,02 unités de FMN réductase (Boehringer Mannheim). La Pristinamycine IIA formée est dosée par CLIIP aprés l'arrêt de l'incubation par ajout de 500 Cll d'acide chlorhydrique 0,1 N et 500 p1 d'acétonitrile, et une centrifugation de l'échantillon pendant 5 minutes à 5 000 g. 150 ,ul du surnageant de centrifugation sont injectés sur une colonne Nucléosil 5-C8 de 15 cm éluée par un mélange de 34 to CH3CN et 66 % tampon phosphate 0,1 M pH 2,9. Les Pristinamycines ItA et IIB sont détectées grâce à leur absorbance UV à 206 nm. L'unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour synthétiser 1 Fiole de Pristinamycine IIA par heure dans les conditions décrites. 5.1.1.B. Purification de la Pristinamycine IIA synthase de S pristinaespiralis SP92. Cette expérience illustre comment une enzyme de S pristinaespiralis SP92 intervenant dans la voie de biosynthèse de la Pristinamycine IIA peut être purifiée. En utilisant le dosage décrit précédemment à l'exemple 5.1.1.A la purification de la Pristinamycine IIA synthase est réalisée comme décrit cidessous en prenant soin de congeler et conserver les fractions actives à -300C entre chaque étape si nécessaire. 150 g d'un culot de centrifugation, lavé par un tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à 10 % v/v de glycérol, d'une culture de S pristinaespiralis SP92 récoltée en début de phase de production des Pristinamycines sont repris par 450 ml de tampon bis-tris-propane 50 mM pH 6,8 contenant 5 mM de DTT et 0,2 mgtml de lysozyme. La suspension ainsi obtenue est incubée pendant 45 minutes à 27"C puis centrifugée à 50 000 g durant 1 heure. L'extrait brut ainsi recueilli est fractionné par précipitation au sulfate d'ammonium. La fraction protéique précipitant entre 40 et 55 % de saturation est déssalée sur une colonne de Sephadex G25 Fine puis injectée (100 mg par injection) dans le tampon pH 6,8 bis-tris-propane 50 mM, DTT 1 mM sur une colonne MonoQ HR 10/10. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KCl (0 à 0,5M). Les fractions contenant l'activité enzymatique (mises en évidence grâce au test. décrit à l'exemple 5.1.1.A) sont regroupées et concentrées à 20 ml sur Centriprep 10.Après dilution par un volume de tampon pH 6,8 bis-tris-propane 50 mM, DTT 1 mM contenant 2 M de sulfate d'ammonium, les protéines sont chromatographiées (22,5 mg par injection) sur une colonne Phenyl Superose HR 10/10 avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonium (1,0 M à O M). Les meilleures fractions contenant l'activité recherchée sont rassemblées, reconcentrées à 1 ml sur Centriprep 10, puis appliquées (200 ,ul par injection) sur une colonne Bio-Sil SEC 250. Le pic d'activité est détecté dans cette technique à un poids moléculaire centré à 77 000. La fraction contenant l'activité est injectée sur une colonne MonoQ HR 5/5 dans le tampon pH 6,8 bis-tris-propane 50 mM, DTT 1 mM éluée avec un gradient linéaire de KCl (0 à 0,5M). Aprés cette étape, l'enzyme est pure et en éléctrophorèse PAGE-SDS, deux sous unités de poids moléculaire estimé à 35 000 et 50 000 sont mises en évidence. Elles sont séparées sur colonne Vydac C4 de 25 cm éluée avec un gradient linéaire de 30 à 50 % de CH3CN dans l'eau à 0,07 % d'acide trifluoroacétique. Tableau: Purification de la Pristinamycine IIA synthase tapes de vol. Protéines Act. Spé. Rendement Facteur de Purification (ml) (mg) ,umoleAl/mg purification Extrait brut 490 1690 0,14 100 1 40-55% sulf. 60 1050 0,19 85 1,4 MonoQ 10/10 95 45 3,0 58 21 Phenylsuperose 8 2,8 12 14 86 BioSil SEC 5 1,3 18 14 130 MonoQ5/5 10 0,7 23 10 160 Le facteur de purification est calculé d'après l'augmentation de l'activité spécifique des fractions au cours de la purification. 5.1.2. Réalisation d'oligonucléotides à partir des séquences protéiques: Cet exemple décrit comment à partir des séquences NH2-terminales des deux sous-unités de la Pristinamycine IIA-synthase purifiée comme décrit dans l'exemple 5.1.1B, il est possible de synthétiser des oligonucléotides. Les deux sous-unités de la Pristinamycine IIA synthase sont appelées SnaA et SnaB et correspondent aux polypeptides de poids moléculaire de 50000 et 35000 respectivement tel que cela est décrit à l'exemple 5.1.1.B Les séquences NH2-terminales des proteines SnaA et SnaB, correspondant aux sous unitées de la Pristinamycine IIA-synthase, ont été réalisées par microséquençage.Ceci est fait par la technique de dégradation d'Edman, en utilisant un séquenceur automatisé (Applied Biosystems modèle 407A) couplé à un appareil CLHP pour l'identification des dérivés phénylthiohydantoines. Une trentaine de résidus ont été déterminés pour chacune d'entre elles. Protéine SnaA: (Cf résidus 2 à 29 sur SEQ ID n" 3) TAP(R)(R,W)RITLAGIID GP G GHVAA(W)RHP (A) T Protéine SnaB: (Cf résidus 2 à 31 sur SEQ ID n 5) TAPILVATLDTRGPAATLGTIT(R)AV(R)AAEA Par ailleurs des séquences internes à ces deux polypeptides ont été déterminées après digestions trypsiques de SnaA et SnaB et purification des fragments obtenus sur colonne Vydac C18.Les séquences internes suivantes ont été trouvées: Protéine SnaA: (Cf résidus 365 à 384 sur SEQ ID n" 3) GADGFNIDFPYLPGSADDFV Protéine SnaB: (Cf résidus 122 à 136 sur SEQ ID n" 5) GL(-)DSFDDDAFVHDR A partir des régions soulignées dans chacune des séquences des fragments internes aux protéines SnaA et SnaB et, en fonction de la dégénérescence du code génétique spécifique des Streptomyces (cf. Exemple 8), les mélanges d'oligonucléotides suivants ont été synthétisés par un synthétiseur automatisé Biosearch 8600. Ils ont ensuite été purifiés par la technique déjà décrite (Sawadogo M. et Von Dyke M. W., 1991). Les gènes snaA et snaB désignent les gènes de structure des protéines SnaA et SnB respectivement. Mélange correspondant à la partie soulignée de la séquence interne de SnA: ATC GAC TTC CCC TAC CTC CCC GG T T G T G G A T Mélange correspondant à la partie soulignée de la séquence interne de SnaB: TTC GAC GAT GAT GCA TTC GTC CAT GAC C C T G C C G 5.1.3. Marquage des mélanges d'oligonucléotides synthétiques et hybridation avec les banques d'ADN génomique de la souche SP92: Cet exemple décrit comment des oligonucléotides spécifiques d'un gène de biosynthèse des Pristinamycines peuvent être marqués radio activement puis hybridés avec des membranes sur lesquelles l'ADN des banques génomiques de S.pristinaespiralis SP92 a été transféré. Le marquage des oligonucléotides est réalisé par transfert en position 5' terminale, d'un groupe phosphate marqué au y32P par la T4 polynucléotide kinase. Ce marquage est réalisé comme indiqué dans Maniatis et al. (1989). Après le marquage, les oligonucléotides sont utilisés sans purification. Environ 2 x 500 ng de chaque mélange d'oligonucléotides ont été ainsi marqués au 732p et ont été utilisés pour hybrider chacune des deux banques. L'hybridation des membranes de chaque banque est réalisée selon un protocole dérivé de ceux développés par Meinkoth, J. and Wahl, G. (1984) et Hames, B.D. and Higgins, SJ. (1985): les 15 membranes sont préhybridées pendant 3 hrs à 50"C dans 40 ml d'une solution contenant: DenhardtX5 (DenhardtxlOO: 2 % (p/v) Ficoll, 2 % (p/v) polyvinyl-pyrrolidone, 2 % (p/v) BSA), SSCx5 (SSCx20 : NaCl 3 M, citrate de sodium 0.3 M), NaP04 pH6.5 50 mM, SDS 0.1 %, ADN de sperme de saumon 250 Ilgîmi. L'hybridation est ensuite réalisée pendant une nuit à 500C, dans 20 ml de la même solution auxquels sont ajoutés les 500 ng d' oligonucléotides marqués. Les filtres sont ensuite lavés dans une solution de SSCx6 et SDS 0.5 %, 2 fois 30 mn à température ambiante puis de façon empirique à des températures graduellement plus élévées (50 à 65 "C). La température de ces derniers lavages est progressivement augmentée après des expositions autoradiographiques successives afin de déterminer la spécificité des clones hybridants avec les mélanges d'oligonucléotides. 5.1.4. Isolement du cosmide pIBV1 et détermination des régions contenant les gènes snaA et snaB:: Cet exemple illustre comment il est possible d'obtenir un cosmide, tel que construit à l'exemple 3, contenant des gènes de biosynthèse des Pristinamycines. Le cosmide pIBV1 a été isolé d'un clone de la banque réalisée dans la souche HB101, ayant hybridé simultanément avec les deux mélanges d'oligonucléotides préparés dans l'exemple 5.1.2. Ce cosmide a été purifié comme décrit dans l'exemple 2. II contient un insert d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92 dont la taille a été estimée à 36 kb. Une cartographie (figure 4) a été établie à partir de digestions avec différentes enzymes de restriction, selon les protocoles du fournisseur (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 USA). Des hybridations en Southern de RADON de pIBV1 digéré par différentes enzymes, avec les mélanges d'oligonucléotides, ont permis d'identifier la région de ce cosmide contenant les gènes snaA et snaB. Les Southerns ont été réalisés comme décrit dans Maniatis et M. (1989). Après séparation des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose 0.8 %, RADON est transféré sur membrane Biohylon Z+ (Bioprope System). L'hybridation de RADON ainsi transféré sur les membranes avec les mélanges d'oligonucléotides a été réalisée comme décrit dans l'exemple 5.1.3. Ces Southerns ont permis de montrer que le cosmide pIBV1 possédait un fragment BamHI de 6 kb contenant les séquences homologues aux sondes synthétisées dans l'exemple 5.1.2. 5.2. Isolement du cosmide pIBV2 contenant le gène de structure de l'acide 3hydroxypicolinique-AMP ligase (snbA). Cet exemple illustre comment il est possible d'obtenir un cosmide, tel que construit à l'exemple 3, contenant au moins un gène de biosynthèse des Pristinamycines L 5.2.1. Identification et purification de la protéine impliquée dans l'activation de l'acide 3 -hydroxypicolinique. Cet exemple illustre comment la protéine responsable de l'activation de l'acide 3-hydroxypicolinique peut-être purifiée jusqu'à homogénéité, à partir de S.pristinaespiralis SP92. 5.2.1.A. Dosage de l'activité acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase Cet exemple illustre le dosage d'une activité de la voie de biosynthèse de la Pristinamycine IA qui n'a encore jamais été décrite et qui possède la propriété remarquable de n'être exprimée que pendant la période de production des Pristinamycines. li s'agit de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase qui catalyse la formation de l'adenylate de l'acide 3-hydroxypicolinique (figure 7) à partir de cet acide libre et de l'ATP en présence de MgC12. Les fractions enzymatiques à doser (0,002 à 0.020 unités) sont incubées pendant 15 min à 27 C dans un volume total de 250 p1 de tampon pH 6,8 bis-tris-propane 50 mM, DTT 1 mM, 10 % v/v de glycérol, en présence d'acide 3-hydroxypicolinique (lmM), ATP (2mM), MgC12 (5mM) et tetrasodium pyrophosphate marqué avec l'isotope 32 radioactif de l'atome de phosphore (200 ). La réaction est arrêtée par ajout de 1 ml d'une suspension de charbon activé à 10 g/l dans un mélange de 75 % de tetrasodium pyrophosphate 0,1 M et 25 % d'acide perchlorique à 14 %. Après agitation le charbon est recueilli et lavé par deux fois 1 ml du mélange pyrophosphate-acide perchlorique. Les molécules organiques radioactives sont alors éluées par trois fois 1 ml d'un mélange de 50 % de méthanol et 50 % d'ammoniaque N, dans une fiole de comptage contenant 12 ml d'eau. La radioactivité est mesurée par effet Cerenkov avec un compteur à scintillation (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD). L'unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour incorporer 1 simple de pyrophosphate dans l'ATP en 1heure dans les conditions décrites ci-dessus. 5.2.1.B. Purification de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase de S pristinaespiralis SP92. Cette expérience illustre comment une enzyme de S pristinaespiralis SP92 intervenant dans la voie de biosynthèse de la Pristinamycine IA peut être purifiée. En utilisant le dosage décrit précédemment à l'exemple 5.2.1.A, la purification de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase est réalisée comme décrit cidessous en prenant soin de congeler à -70 C les fractions actives et de les conserver à -30 C entre chaque étape si nécessaire. 234 g d'un culot de centrifugation, lavé par un tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à 10 % v/v de glycérol, d'une culture de S pristinaespiralis SP92 récoltée en début de phase de production des Pristinamycines sont repris par 234 ml de tampon pH 8 tris-HCl 100 mM contenant 4 mM DTE, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 % v/v glycérol et 0,6 mg/ml de lysozyme. La suspension ainsi obtenue est incubée pendant 30 minutes à 27"C puis centrifugée à 50 000 g durant 1 heure. L'extrait brut ainsi recueilli est injecté dans le tampon pH 8 tris-HCl 100 mM, DTE 4 mM, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 to v/v glycérol sur une colonne (80 ml) de Q-Sepharose Fast Flow. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KCl (O à 0,4 M). Les fractions contenant l'activité enzymatique (mises en évidence grâce au test décrit à l'exemple 5.2.1.A) sont regroupées et diluées par un volume de tampon pH 8 tris-HCl 100 mM, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 % v/v glycérol contenant 2 M de sulfate d'ammonium. Les protéines sont alors chromatographiées sur une colonne (50 ml) de Phenyl Sepharose avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonium (1,0 M à O M) dans le tampon pH 8 tris-HCl 100 mM, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 % v/v glycérol. Aprés ajout de 4 mM DTE, les fractions actives sont rassemblées, reconcentrées à 5 ml sur Centriprep 10, puis appliquées sur une colonne (100 ml) de Superose 12 prep grade.Les fractions contenant l'activité recherchée sont regroupées et injectées dans le tampon pH 8 tris-HCl 100 mM, DTE 4mM, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 % v/v glycérol (environ 6 mg par injection) sur une colonne de MonoQ HR 5/5 éluée avec un gradient linéaire de KCl (O à 0,4 M). Les fractions actives sont regroupées, concentrées à 1 ml sur Centricon 10, diluées par 3 volumes de tampon pH 6,8 bis-tris-propane 50 mM, DTE 4 mM, 1 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 15 % v/v glycérol, puis injectées (2 mg par injection) dans ce dernier tampon sur une colonne de MonoQ HR 5/5 éluée avec un gradient linéaire de KCl (O à 0,3 M).Les meilleures fractions contenant la ligase recherchée sont regroupées, puis appliquées dans le tampon pH 6,8 phosphate de sodium 20 mM, sulfate de sodium 50 mM sur une colonne Bio-Sil SEC 250. Le pic d'activité est détecté dans cette technique à un poids moléculaire centré à 60 000. La protéine possédant l'activité d'activation de l'acide 3-hydroxypicolinique est désignée par la suite SnbA. Après cette étape, l'enzyme est pure et en éléctrophorèse PAGE-SDS son poids moléculaire est estimé à environ 67000. Tableau: Purification de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase Etapes de vol. Protéines Act. Spé. Rendement Facteur de Purification (ml) (mg) pmoleA/mga purification Extrait brut 246 2050 (0,06) Q-Sepharose 40 188 0,47 100 1 Phenylsepha. 70 35 2,21 88 4,7 Superose 12 16 17 ~ 2,03 39 4,3 MonoQ pH 8 4,5 9,0 2,09 21 4,5 MonoQ pH 6,8 1 2,0 2,9 6,6 6,2 Bio-Sil 250 2,5 0,23 12,4 3,2 26 a L'activité dans l'extrait brut ne peut pas être mesurée précisément à cause d'échanges entre le pyrophosphate et l'ATP non spécifiques de l'acide 3 -hydroxypicolinique. Le facteur de purification est calculé d'après l'augmentation de l'activité spécifique des fractions au cours de la purification. 5.2.2. Réalisation d'oligonucléotides à partir de la séquence protéique: Cet exemple décrit comment à partir des séquences NH2-terminale et interne de la protéine 3-hydroxypicolinique-AMP ligase, il est possible de synthétiser des oligonucléotides. La séquence NH2-terminale de la protéine SnbA a été réalisée par microséquençage comme décrit dans l'exemple 5.1.2. Une vingtaine de résidus ont été ainsi identifiés. Une séquence interne à la protéine SnbA, d'environ 20 acides aminés, a également été identifiée, après hydrolyse trypsique et purification des fragments obtenus sur colonne Vydac C18. Séquence NH.-terminale de la protéine 3-hydroxypicolinique-AMP ligase (Cf résidus 1 à 21 sur SEQ ID n 9) MLDGSVPWPEDVAAKYRAAGY Séquence interne de la protéine 3-hydroxypicolinique-AMP ligase: (Cf.résidus 448 à 467 sur SEQ ID n 9) VSA(-) EVEGHLGAHPDVOOAA A partir des régions soulignées dans chacune des séquences et en fonction de la dégénérescence du code génétique spécifique des Streptomyces (cf.Exemple 8), les mélanges d'oligonucléotides suivants ont été synthétisés: Mélange correspondant à la partie soulignée de la séquence NH2-terminale de la protéine 3-hydroxypicolinique-AMP ligase: 5' 3' GTC CCC TGG CCC GAG GAC GTC GCC GCC AAG TAC G G G G G G Mélange correspondant à la partie soulignée de la séquence interne de la protéine 3-hvdroxvpicolinique-AMP ligase: 5' 3 GAG GTC GAG GGC CAC CTC GGC GCC CAC CCC GAC GTC CAG CAG GC G G G G G G G 5.23. Marquage des mélanges d'oligonucléotides synthétiques et hybridation des banques d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92: Cet exemple décrit comment des oligonucléotides spécifiques d'un gène de biosynthèse des Pristinamycines peuvent être marqués radio activement puis hybridés avec des membranes sur lesquelles l'ADN des banques génomiques de S.pristinaespiralis a été transféré. Le marquage des oligonucléotides est réalisé par transfert en position 5' terminale, d'un groupe phosphate marqué au y32P par la T4 polynucléotide kinase, comme indiqué dans l'exemple 5.1.3. Environ 2x500 ng de chaque mélange d'oligonucléotides ont été ainsi marqués au 832p et ont été utilisés pour hybrider chacune des deux banques. L'hybridation des membranes de chaque banque a été réalisée comme indiqué dans l'exemple 5.1.3. 5.2.4. Isolement du cosmide pIBV2 et détermination de la région contenant le gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase: Cet exemple illustre comment il est possible d'obtenir un cosmide, tel que construit à l'exemple 3, contenant au moins le gène de structure de l'acide 3hydroxypicolinique-AMP ligase. Le cosmide pIBV2 a été isolé d'un clone de la banque réalisée dans la souche d'E.coli DH1, ayant hybridé avec les deux mélanges d'oligonucléotides simultanément. Ce cosmide a été purifié comme décrit dans l'exemple 2. 1l contient un insert d'ADN génomique de S.pristinaespiralis SP92 dont la taille à été estimée à 47 kb. Une cartographie (figure 5) a été établie à partir de digestions avec différentes enzymes de restriction, comme indiqué dans l'exemple 5.1.4. Des hybridations en Southern de l'ADN de pIBV2 digéré par différentes enzymes, avec les mélanges d'oligonucléotides, ont permis d'identifier la région contenant le gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase. Les Southerns et les hybridations ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 5.1.4. Les résultats d'hybridation ont permis de montrer que le cosmide pIBV2 possédait un fragment EcoRI-DglII de 5.5 kb, contenant la séquence homologue aux sondes synthétisées dans rexemple 5.2.2. EXEMPLE 6 : Sous clonage des fragments d'ADN clonés dans des cosmides tels que préparés dans l'exemple 3 et contenant les gènes d'intérêt. Cet exemple illustre comment à partir des cosmides construits comme décrit à l'exemple 3 et contenant des gènes de biosynthèse des Pristinamycines II ou des Pristinamycines I, il est possible de sous cloner des fragments d'ADN contenant ces gènes. Ces sous clonages ont été effectués afin de pouvoir réaliser ultérieurement la séquence nucléique des gènes identifiés ainsi que les différentes constructions présentées dans les exemples suivants. 6. 1. Isolement du fragment EcoRI-BglII de 5.5 kb contenant le gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase. Cet exemple décrit comment à partir du cosmide pIBV2, contenant le gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase, il est possible de sous cloner un fragment d'ADN de taille inférieure, contenant ce gène. Environ 10 jg du cosmide pIBV2 ont été coupés successivement par les enzymes de restriction Bglll et Eco}tI (New England Biolabs) dans les conditions préconisées par le fournisseur. Les fragments de restrictions ainsi obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 % et le fragment BglII-EcoRI de 5.5 kb a été isolé par électroélution comme décrit dans Maniatis et al. (1989). Environ 100 ng de pUC19 (Viera et Messing 1982) coupés par BamHI et EcoRI ont été ligaturés avec 200 ng du fragment BglIt-EcoRI de 5,5 kb, dans les conditions décrites dans l'exemple 3.3. Après transformation de la souche TG1 et sélection des tansformants sur milieu LB solide contenant 150 g/ml d'ampicilline et 20 g/ml de X-gal, selon la technique décrite par Maniatis et al. (1989), un clone portant le fragment souhaité a été isolé. Le plasmide recombinant a été nommé pVRC402. Sa carte de restriction est présentée dans la figure 8(A). II a été montré par hybridation, dans l'exemple 5.2, que le fragment EcoRI-BglII de 5.5 kb, contient le gène de structure de l'acide 3hydroxypicolinique-AMP ligase de S. pristinaespiralis SP92. Le plasmide pVRC402 contient donc le gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase de S. pristinaespiralis SP92. 6. 2. Isolement d'un fragment Bglll-Bglll de 4.6 kb à partir du cosmide pIBV2. Cet exemple décrit comment à partir du cosmide pIBV2, il est possible de sous cloner un fragment d'ADN de taille inférieure, dans le but d'identifier dans les régions adjacentes au gène de structure de l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase, la présence d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des Pristinamycines L Les différentes étapes de clonage ont été réalisées comme décrit plus haut. Environ 10 ,ug du cosmide pIBV2 ont été coupés par bu II. Les fragments de restrictions ainsi obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 to et le fragment BgiII-Bglll de 4.6 kb a été isolé par électroélution. Environ 100 ng de pUC19 coupés par BamHI ont été ligaturés avec 200 ng du fragment Bglll-Bglll. Un clone portant le fragment souhaité a été isolé après transformation de la souche TG1 comme décrit dans l'exemple 6.1. Le plasmide recombinant a été nommé pVRC501. Sa carte de restriction est présentée dans la figure 8(B). 6.3. Isolement du fragment BamHI-BamHI de 6 kb contenant les gènes de structure des deux sous-unités de la Pristinamvcine ITA-svnthase. Cet exemple décrit comment à partir du cosmide pIBV1, il est possible de sous cloner un fragment d'ADN de taille inférieure, contenant les gènes de structure des deux sous-unités de la Pristinamycine I1A-synthase. Les différentes étapes de clonage ont été réalisées comme décrit plus haut. Environ 10 jg du cosmide pIBV1 ont été coupés par BamHI. Les fragments de restrictions ainsi obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 to et le fragment BamHI de 6 kb a été isolé par électroélution. Environ 100 ng de pBKS- (Stratagene Cloning Systems, La Jolla Californie) coupés par BamHI, ont été ligaturés avec 200 ng du fragment BamHI de 6 kb. Un clone portant le fragment souhaité a été isolé après transformation de la souche TG1. Le plasmide recombinant a été nommé pXL2045. Sa carte de restriction est présentée dans la figure 9. ll a été montré par hybridation, dans l'exemple 5.1, que le fragment BamHI de 6 kb, contient les gènes snaA et snaB, codant pour les deux sous unités de la Pristinamycine IIA-synthase de S. pristinaespiralis SP92. Le plasmide pXL2045 contient donc les gènes snaA et snaB, codant pour les deux sous unités de la Pristinamycine IIA-synthase de S. pristinaespiralis SP92. EXEMPLE 7: Séquence des fragments d'ADN isolés contenant les gènes de biosynthèse des Pristinamycines de S. pristinaespiralis SP92 Cet exemple illustre le séquençage de fragments d'ADN portant d'une part des gènes impliqués dans la biosynthèse des Pristinamycines de la famille des Pristinamycines I et d'autre part des gènes impliqués dans la biosynthèse des Pristinamycines de la famille des Pristinamycines II de la souche S. pristinaespiralis. 7.1. Séquençage d'un fragment BamHI-XhoI de 5 kb Cet exemple illustre comment la séquence nucléotidique d'un fragment contenant les gènes snaA et snaB de S. pristinaespiralis SP92 peut être obtenue. Le fragment BamHI-XhoI fait partie du fragment BamHI-BamHI de 6 kb qui a été cloné dans le phasmide pBKS- pour donner le plasmide pXL2045 décrit dans l'exemple 6. Des sous-fragments de cet insert BamHI-XhoI de 5 kb ont ensuite été obtenus par digestion enzymatique puis sous-clonés dans les phages M13mpl8 ou M13mpl9 (Messing et al, 1981) dans les deux orientations. Les sites de sous-clonage utilisés sont les suivants: EcoRI, PstI, PstI, NruI, EcoRI, NotI, SalI, SstI, XhoI, SalI et XhoI et sont représentés sur la figure 9. Ces différents inserts ont été séquencés par la méthode de réaction de terminaison de chaîne en utilisant comme amorce de synthèse le primer universel (Maniatis et al, 1989) ou des oligonucléotides synthétisés (comme il est décrit dans l'exemple 5), et complémentaires d'une séquence de 20 nucléotides de l'insert à séquencer. Le recouvrement entre ces différents inserts a permis d'établir la séquence nucléotidique totale sur les deux brins du fragment BamHI-XhoI qui comprend 5392 pb (SEQ ID n 1). 7. 2. Séquençage d'une région de 1870 bp du fragment EcoRI-BglII de 5.5 kb Cet exemple illustre comment la séquence nucléotidique d'un fragment contenant le gène snbA de S. pristinaespiralis SP92 peut être obtenue. La région de 1870 pb séquencée fait partie du fragment EcoRI-3g in de 5.5 kb qui a été cloné dans le plasmide pUC19 pour donner le plasmide pVRC402 décrit dans l'exemple 6 (figure 8(A)). Des sous-fragments de l'insert EcoRI-BglII de 5.5 kb ont été obtenus par coupure enzymatique puis sous-clonés dans des phages M13mpl8 ou M13mpl9 dans les deux orientations. Les sites de sous-clonage sont Hindi, PstI et Hindi et sont représentés sur la figure 8(A). Le recouvrement entre ces fragments a permis d'établir la séquence totale de la région Sau3A-Sau3A qui comprend 1870 pb (SEQ ID n 8). 7.3 Séquence d'une région de 1830 ph dans le fragment BamHI-EcoRI de 3.1 kb Cet exemple illustre comment la séquence nucléotidique d'un fragment adjacent à celui qui contient le gène snbA de S. pristinaespiralis SP92 peut être obtenue. Cette séquence a été realisée par sous-clonage des fragments BamHI-PstI de 1 kb et PstI-EcoRI de 2,1 kb (figure 8(B)) à partir du pVRC501 (Exemple 6) dans les vecteurs M13mpl8 et M13mpl9. Le site PstI a été traversé par sous-clonage d'un fragment Sau3A-Sau3A de 423 pb chevauchant ce site, puis séquençage. La séquence de 1830 pb ainsi obtenue est représentée sur la (SEQ ID n 10). EXEMPLE 8: Analyse des séquences nucléotidiques par détermination des phases ouvertes Cet exemple illustre comment il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture présentes dans les séquences nucléotidiques définies à l'exemple 7, et d'identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse des Pristinamycines I et des Pristinamycines II de S. pristinaespiralis SP92 ainsi que les polypeptides codés par ces gènes. 8.1. Fragment BamHI-XhoI de 5 kb (pXL2045). Cet exemple illustre comment il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture présentes au sein du fragment BamHI-XhoI de 5 kb précédemment isolé et séquencé comme il est décrit dans les exemples 6 et 7. Nous avons recherché la présence de phases ouvertes de lecture au sein du fragment BamHI-XhoI de 5 kb en utilisant le fait que RADON des Streptomyces présente un haut pourcentage en bases G et C ainsi qu'un fort biais dans l'usage des codons qui composent les phases codantes (Bibb et al. 1984). La méthode de Staden et McLachlan (1982) permet de calculer la probabilité des phases codantes en fonction de l'usage des codons de gènes de Streptomyces déjà séquencés et rassemblés dans un fichier contenant 19673 codons obtenu à partir du serveur informatique BISANCE (Dessen et al. 1990). Cette méthode a permis de caractériser au sein du fragment BamHI-XhoI de 5 kb, quatre phases ouvertes de lecture fortement probables qui sont représentées dans le tableau suivant. Elles sont nommées phases 1 à 4 d'après leur position à partir du site BamHI. Pour chacune, on a indiqué leur longueur en bases, leur position au sein du fragment (le site BamHI étant situé à la position 1) ainsi que le poids moléculaire en kDa de la protéine corespondante. Les phases 1, 3 et 4 sont codées par le même brin et la phase 2 par le brin complémentaire (figure 9). Numéro de la Position nombre de nombre PM en kDa de phase et nom nucléotides d'acides la protéine du gène | aminés codée 1 (snaA) 48-1313 1266 422 46.5 2 2530-1328 1203 401 (inv) 3 (snaB) 2692-3522 831 277 29 4 (snaC) 3558-4763 1206 402 43 - Les phases 1 et 3 correspondent respectivement aux protéines SnaA (SEQ ID nO 2 et 3) et SnaB (SEQ ID n" 4 et 5) précédemment isolées comme il est décrit dans l'exemple 5 et dont le clonage des gènes est détaillé dans l'exemple 6.En effet les séquences NH2-terminales des produits des ORFs 1 et 3 sont identiques aux séquences NH2-terminales trouvées pour les protéines SnaA et SnaB respectivement, à l'exemple 5.1.2, sauf pour la méthionine amino-terminale qui a été excisée. Par ailleurs, les masses moléculaires calculées d'après les séquences sont comparables aux masses moléculaires apparentes des protéines SnaA et SnaB, estimées respectivement en PAGE-SDS comme il est décrit dans l'exemple 5. - La - comparaison du produit de la phase ouverte n04 avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaitre une homologie avec différentes S-adenosylmethionine (ou SAM) synthases codées par d'autres organismes. Les pourcentages d'homologie calculés sur la totalité de la séquence à l'aide de l'algorithme de Kanehisa (1984) varient de 51,8 à 55.4 Go. Ces comparaisons de séquence permettent donc de mettre en évidence que le produit de la phase ouverte n 4 est une SAM synthase, impliquée dans la biosynthèse des Pristinamycines II (et peut-être Pristinamycines I). Ce gène a été désigné snaC (SEQID n 6 et 7). La mise en évidence de l'implication d'une SAM synthase dans la biosynthèse des Streptogramines est confirmée par les données biochimiques décrites pour la Virginiamicine M1 (une Streptogramine appartenant au même groupe A que les Pristinamycines II) qui indiquent que le groupement méthyl C-33 provient vraisemblablement d'une aixylation d'un groupement methylène situé en position C-4 du cycle macrolactone avec une molécule de SAM (Kingston et al. 1983). - La comparaison de la séquence du produit de la phase ouverte n 2 avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro, fait apparaitre qu'une partie interne de cette protéine est homologue à 36% avec une partie interne de la première phase ouverte de la séquence d'insertion (IS891) d'Anabaens (Bancroft et Folk, 1989). Ce résultat suggère que la phase ouverte n 2, désignée orf 401, appartient à une séquence d'insertion, et donc qu'il existe une séquence d'insertion située entre les gènes snaA et snaB. 8. 2. Fragment Sau3A-Sau3A de 1870 pb (pVRC402) Cet exemple illustre comment il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture présentes au sein du fragment Sau3A-Sau3A de 1870 pb précédemment isolé et séquencé comme il est décrit dans les exemples 6 et 7. La recherche de phases ouvertes pour le fragment Sau3A-Sau3A a été effectuée comme précédemment. Une seule phase ouverte de lecture complète a pu ainsi être mise en évidence. Ses caractéristiques sont les suivantes: cette phase s'étend de la position 109 à la position 1858 du fragment Sau3A-Sau3A, ce qui correspond à une phase de 1749 bases codant pour une protéine de 582 acides aminés ayant une masse moléculaire de 61.4 kDa. Cette protéine correspond à la protéine SnbA précédemment purifiée comme il est décrit dans l'exemple 5 et dont le clonage du gène est détaillé dans l'exemple 6. En effet la séquence NH2-terminale du produit de l'ORF présente sur le fragment Sau3A-Sau3A est identique a la séquence NH2terminale trouvée pour la protéine SnbA, à l'exemple 5.2. La masse moléculaire de 61.4 kDa calculée d'après la séquence est comparable à la masse moléculaire apparente de la protéine SnbA, estimée à 67 kDa en PAGE-SDS et à 600 kDa par perméation sur gel comme il est décrit dans l'exemple 5.2.1B. Le gène snbA code donc pour l'enzyme qui catalyse la formation de l'acyladenylate 3-hydroxypicolinyl-AMP à partir d'une molécule d'acide 3hydroxypicolinique et d'une molécule d'ATP : l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase (SEQ ID n" 8 et 9). 8.3. Fragment BamHI-EcoRI de 3.1 kb (pVRC501). Cet exemple illustre comment il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture présentes au sein du fragment BamHl-RQRI de 3,1 kb précédemment isolé et séquencé comme il est décrit dans les exemples 6 et 7. La recherche de phases ouvertes pour le fragment BamHI-EcoRI de 3,1 kb a été effectuée comme précédemment. Une seule phase ouverte de lecture complète a pu ainsi être mise en évidence. Ses caractéristiques sont les suivantes: le démarrage probable de cette phase se situe à la position 103 et la fin à la position 1686 de la région de 1830 pb séquencée à partir du fragment BamHI-SQRI, ce qui correspond à une protéine de 528 acides aminés ayant un poids moléculaire approximatif de 54 kDa. La comparaison de la séquence de cette protéine avec les séquences contenues dans la banque Genepro fait apparaitre qu'elle est homologue à des protéines ayant une fonction de transport pour différents métabolites, notamment pour la tétracycline chez différents microorganismes (Khan et Novick, 1983; Hoshino et al. 1985), l'actinorhodine (Fernandez-Moreno et al, 1991) et la méthylénomycine (Neal et Chater, 1987b) chez S. coelicolor. Ces données indiquent que le produit de la phase ouverte contenue dans le fragment BamHI-EcoRI de 3,1 kb est une protéine de transport permettant d'exporter les Pristinamycines I (et éventuellement Pristinamycines II) à l'extérieur de la cellule. Cette protéine a été désignée SnbR et le gène correspondant snbR (SEQ ID n" 10 et 11). L'analyse du profil d'hydrophobicité de la protéine SnbR par la méthode de Kyte et Doolittle (1982) corrobore sa localisation membranaire et donc sa fonction de transport. L'étude des fragments d'ADN de la souche S. pristinaespiralis SP92, portés par les cosmides pIBV1 et pIBV2, a mis en évidence la présence de plusieurs gènes impliqués dans la biosynthèse des Pristinamycines II et des Pristinamycines L Les gènes snaA, snaB et snaC codent pour des enzymes intervenant dans la biosynthèse des Pristinamycines II, la Pristinamycine IlA-synthase et une probable SAM synthase et sont groupés physiquement sur un large fragment d'ADN cloné dans le cosmide pIBV1. De même les gènes snbA et snbR qui codent pour des protéines intervenant dans la biosynthèse des Pristinamycines I, l'acide 3-hydroxypicolinique-AMP ligase et une protéine probablement responsable du transport des Pristinamycines I, sont groupés sur un large fragment d'ADN cloné dans le cosmide pIBV2.Ces résultats confirment l'hypothèse du groupement des gènes de biosynthèse des Pristinamycines II et également des gènes de biosynthèse des Pristinamycines I et offrent la possibilité de cloner les autres gènes impliqués dans ces biosynthèses, par marche sur le chromosome, en amont et en aval des régions étudiées. De plus, il est possible par hybridation de l'ADN total des différentes souches productrices de Streptogramines (cf tableau 1) avec les gènes snaA, snaB, snaC, snbA, snbR, ou avec les gènes identifiés par marche sur le chromosome, ou avec des fragments de ceux-ci, d'isoler les gènes correspondants aux mêmes fonctions dans les autres microorganismes producteurs de Streptogramines. Ceci permet par la même démarche que celle envisagée pour les Pristinamycines, d'isoler l'ensemble des gènes impliqués dans la biosynthèse des différentes Streptogramines. EXEMPLE 9 : Etude génétique de fragments d'ADN par disruption de gènes. Cet exemple illustre comment il est possible de mettre en évidence l'implication de gènes dans la biosynthèse des Streptogramines en construisant des souches dérivées d'une souche productrice, mutées au niveau de ces gènes par disruption et en analysant le phénotype de tels mutants. Cet exemple montre de plus comment obtenir des souches ne produisant plus que l'un ou l'autre des composants A et B des Streptogramines. 9.1 Construction d'un mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène snaA. Cet exemple illustre comment il est possible par disruption du gène snaA, de construire une souche de S.pristinaespiralis SP92 qui ne produit plus de Pristinamycine ItA et qui produit par contre de la Pristinamycine IIB. Ce mutant a été construit dans le but de confirmer la fonctionnalité de la proteine SnaA et de fournir un intermédiaire de production de la Pristinamycine II, pouvant par la suite être modifié. Sa construction a été réalisée à l'aide d'un vecteur suicide, capable de se répliquer chez E.coli seulement, mais portant un marqueur de résistance s'exprimant chez Streptomyces. Ce vecteur, pDH5, a été développé par Hillemann et a1. (1991). 9.1.1 Construction du plasmide pVRC505: Cet exemple illustre comment il est possible de construire un plasmide ne se répliquant pas chez S.pristinaespiralis SP92 et qui peut être utilisé pour disrupter par simple recombinaison homologue le gène snaA. Le plasmide pVRC505 a été construit pour réaliser le mutant chromosomique SP92 disrupté dans le gène snaA à partir du plasmide pXL2045 décrit dans l'exemple 6.3. Le fragment BamHI de 6 kb, cloné dans le pXL2045 (figure 9), a été coupé par les enzymes de restriction EcoRI et PstL Après séparation des fragments ainsi générés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, un fragment de 0.7 kb, contenant l'extrémité 5' du gène snaA. a été isolé et purifié par Geneclean (BiolOl, La Jolla, Californie). 100 ng de vecteur pDH5 linéarisé par une double digestion SURI, I, ont été ligués avec 100 ng du fragment de 0.7 kb, comme décrit dans l'exemple 3.3. Un clone portant le fragment souhaité a été isolé après transformation de la souche TG1. Le plasmide recombinant a été nommé pVRC505. Le plasmide pVRC505 a été préparé comme décrit dans l'exemple 2.1. Sa carte de restriction est présentée dans la figure 10. 9.1.2. Isolement du mutant SP92 disrupté dans le gène snaA par recombinaison homologue. Cet exemple illustre comment le mutant de S pristinaespiralis SP92, disrupté dans le gène nsÀ, a été construit. Ce mutant a été isolé par transformation de la souche SP92 avec le plasmide suicide pVRC505. La préparation des protoplastes et leur transformation ont été réalisées comme décrit dans D. Hopwood et al. (1985). La souche SP92 a été cultivée en milieu YEME, 34% de sucrose, 5 mM MgC12, glycine 0.25 % pendant 40 hrs à 30 C. Le mycélium a été protoplastisé en présence de lysozyme et 5X1 ijg de pVRC505 ont été utilisés pour la transformation (par la méthode utilisant le PEG) des protoplastes. Après une nuit de régénération des protoplastes sur milieu R2YE (D. Hopwood et a1. 1985), les recombinants ont été sélectionnés par étalement de 3 ml de milieu SNA (D. Hopwood et aL 1985) contenant 2.6 mg/ml de thiostrepton. Sur les 5 transformations réalisées, 3 clones résistants au thiostrepton ont été isolés. Ceci donne un taux de recombinants inférieur à 1 par mg d'ADN. Ces recombinants résultent de l'intégration par simple recombinaison homologue entre le gène snaA porté par le chromosome de la souche SP92 et le fragment de 0.7 kb du plasmide suicide pVRC505. La faible taille du fragment inséré dans pVRC505, 0.7 kb, explique le faible taux de recombinaison. Les spores des recombinants ont été isolées par étalement et croissance sur milieu R2YE supplémenté par 400 llglml de thiostrepton, et réétalées sur le même milieu pour obtenir des colonies isolées. Afin de vérifier la position de l'intégration du plasmide pVRC505, différents Southerns de RADON total de plusieurs clones recombinants digéré par les enzymes de restriction appropriées, ont été réalisés et hybridés avec le vecteur pDH5 et le fragment de 0.7 kb, utilisés successivement comme sondes après marquage par random priming (Random Primed DNA labeling kit, Boehringer Mannheim, France) avec du dCTP aP32, comme décrit dans Maniatis et al. (1989). Les résultats d'hybridation montrent l'apparition, dans le génome des clones recombinants, d'une bande EcoRI-PstI supplémentaire, de la taille du vecteur pDH5 et hybridant avec celui-ci ainsi que d'une bande supplémentaire EcoRI-SQRI, hybridant à la fois avec les 2 sondes.Un de ces mutants a été nommé SP92::pVRC505. Ce mutant correspond bien à l'intégration par simple recombinaison homologue du plasmide pVRC505 dans le gène snaA. 9.1.3 Production de Pristinamycines par le mutant SP92::pVRC505. Cet exemple illustre comment il est déterminé que le mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène snaA par l'intégration du plasmide pVRC505, ne produit plus de Pristinamycine IIA, tout en continuant à produire de la Pristinamycine IIB. Le mutant SP92::pVRC505, ainsi que la souche SP92, en tant que souche témoin, ont été cultivés en milieu de production liquide. La fermentation a été réalisée comme suit: 0.5 ml d'une suspension de spores des souches citées sont ajoutés en conditions stériles à 40 ml de milieu inoculum dans un erlen de 300 ml. Le milieu inoculum est constitué par 10 g/l de Corn Steep, 15 gil de saccharose, 10 g/l de (NH4)2S04, 1 g/l de K2HP04, 3 gn de NaCl, 0.2 g/l de MgS04-7H20 et 1.25 g/l de CaC03. Le pH est ajusté à 6.9 par de la soude avant l'introduction du carbonate de calcium.Les erlens sont agités pendant 44 hrs à 27"C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 tr/mn. 2.5 ml de la culture précédente âgée de 44 hrs sont ajoutés stérilement à 30 ml de milieu de production dans un erlen de 300 ml. Le milieu de production est constitué par 25 g/I de farine de soja, 7.5 g/l d'amidon, 22.5 g/l de glucose, 3.5 g/l de levure fourragère, 0.5 g/l de sulfate de zinc et 6 g/l de carbonate de calcium. Le pH est ajusté à 6 par de l'acide chlorhydrique avant l'introduction du carbonate de calcium.Les erlens sont agités pendant 24, 28 et 32 hrs à 27"C. A chaque temps, 10 g de moût sont pesés dans un erlen lisse, auxquels sont ajoutés 20 ml de phase mobile composée par 62.5 % d'acétonitrile et 37.5 % d'une solution de 0.1 M de KH2P04 (ajusté à pH3 par H3P04). Après agitation sur un agitateur (325 rpm) pendant 20 mn à température ambiante, le tout est filtré sur filtre de papier et les Pristinamycines sont dosées par CLHP comme décrit à l'exempte 5.1.1A. Les résultats ont montré que, dans les conditions de fermentation réalisées, le mutant SP92::pVRC505 a produit une quantité de Pristinamycine I équivalente à celle du témoin SP92, ceci pour les 3 temps testés. En revanche, alors que le témoin a produit à 24, 28 et 32 hrs de fermentation, environ 70 % de Pristinamycine IIA et 30 % de Pristinamycine IIB, le mutant SP92;; pVRC505 a produit pour ces mêmes temps, 100 % de Pristinamycine "B, en quantité équivalente à la somme des Pristinamycine IIA + Pristinamycine IIB produites par la souche SP92. Le mutant est donc bien bloqué dans une étape de biosynthèse de la Pristinamycine II qui correspond à l'oxydation de la liaison 2-3 de la D-proline de l'intermédiaire Pristinamycine IIB. Ce mutant accumule donc la Pristinamycine IIB.Ceci montre bien l'implication fonctionnelle de SnaA dans la conversion Pristinamycine IIB en Pristinamycine IIA. Cet exemple montre qu'il est possible, à partir des gènes de biosynthèse clonés, de construire des souches mutées dans les étapes de biosynthèse des Pristinamycines. Ceci a été montré pour les Pristinamycines II mais les mêmes résultats peuvent être obtenus pour les Pristinamycines I et par extension, pour les différents composants des Streptogramines. Des souches produisant différents intermédiaires peuvent être ainsi obtenues. Ces souches peuvent être utilisées pour produire des molécules nouvelles, par modification(s) chimique, biochimique, enzymatique, etc desdits intermédiaires. Un blocage dans une étape précoce de la voie de biosynthèse de l'un ou l'autre des composants des Streptogramines peut également conduire à des souches mutées ne produisant plus que l'un ou l'autre des composants. EXEMPLE 10 : Complémentation d'un mutant non producteur de la souche SP92. Cet exemple montre comment il est possible d'exprimer des gènes de biosynthèse des Pristinamycines. Cette expression a été plus particulièrement réalisée pour les gènes snaA et snaB portés par le cosmide pIBV1, dans une souche mutante dérivée de SP92 : SP120. Ce mutant ne produit pas de Pristinamycine IIA. ll accumule le dernier intermédiaire de la voie de biosynthèse de la Pristinamycine II: Pristinamycine IIB. 10.1 Clonage des gènes snaA et snaB dans le vecteur navette pU903. Cet exemple illustre comment un sous-fragment du cosmide pIBV1, contenant les gènes snaA et snaB, a été cloné dans un vecteur capable de se répliquer à la fois chez E coli et chez Streptomyces. Le vecteur pU903 (Lydiate D. J. et al, 1985) est un vecteur navette à faible nombre de copies (1 à 3 par cellule), capable de se répliquer à la fois chez E.coli grâce à son origine de réplication de pBR322 et chez Streptomyces grâce à son origine de réplication de SCP2*. Le gène de résistance à l'ampicilline permet la sélection dans E.Coli et le gène de résistance au thiostrepton permet la sélection dans Streptomyces. Le cosmide pIBV1 a été digéré par l'enzyme de restriction SATI. Un large fragment d'ADN de 7.6 kb portant les gènes snaA et snaB a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 % et électroélué. 500 ng de ce fragment ont été ligaturés avec 100 ng du vecteur pUC1813 (Kay et McPherson, 1987) linéarisé par SATI. Après transformation de la souche E.coli DH5a (supE44) #lacU169 (f80lacZ#M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1; Hanahan, 1893) et sélection des transformants sur LB solide contenant 150 g/ml d'ampicilline et 20 pg/ml de X-gal, un clone portant le fragment de 7.6 kb a été isolé. Le plasmide a été nommé pVRC506. Une préparation de ce plasmide recombinant a été réalisée comme décrit dans l'exemple 2.1. Le clonage dans le vecteur pU903 a été réalisé au site Hindi. Le plasmide pVRC506 a été coupé par Hinnm et le fragment de 7.6 kb portant les gènes snaA et snaB a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 % et électroélué. 500 ng de ce fragment ont été ligaturés avec 500 ng du vecteur pU903 linéarisé par Hindi. Après transformation de la souche E.coli DH5a et sélection des tsnsformants sur LB solide contenant 150 Uglml d'ampicilline, un clone portant le fragment de 7.6 kb a été isolé. Le plasmide a été nommé pVRC507. Une préparation de ce plasmide recombinant a été réalisé comme décrit dans l'exemple 2.1. Sa cartographie est présentée figure 11. 10.2 : Expression des gène snaA et snaB dans le mutant SP120 Cet exemple illustre comment il est possible d'exprimer les protéines SnaA et SnaB chez S.pristinaespiralis SP92, par introduction dans cette souche, d'un plasmide portant les gènes de structure correspondants. L'expression des gènes snaA et snaB a été réalisée après transformation de la souche mutante SP120 avec 500 ng de plasmide pVRC507. La transformation des protoplastes de SP120 et la sélection des transformants au thiostrepton a été réalisée comme décrit dans l'exemple 9.1.2. De nombreux transformants ont été ainsi obtenus et 3 d'entre eux ont été choisis pour les tests de production en milieu liquide. La souche SP120 portant le plasmide plu903 a été choisie comme témoin. Les fermentations ainsi que l'extraction des produits de biosynthèse ont été réalisés comme décrit en l'exemple 9.1.3. Les résultats ont montré que dans les conditions de fermentation réalisées, alors que le témoin (SP120 portant le plasmide plu903) a produit à 24, 28 et 32 hrs de fermentation, 100 % de Pristinamycine IIB et 0 to de Pristinamycine IIA, les 3 clones de la souche SP120 transformés par le plasmide pVRC507, ont produit pour ces mêmes temps, environ 85 à 80 % de Pristinamycine IIB et 15 à 20 % de Pristinamycine IIA, dont la somme est équivalente en quantité à la production de Pristinamycine IIB de la souche témoin (SP120 portant le plasmide pIJ903). Les clones portant pVRC507 ont bien été complémentés pour l'étape de biosynthèse des Pristinamycines II correspondant à l'oxydation de la liaison 2-3 de la D-proline de l'intermédiaire Pristinamycine IIB.Ceci a été confirmé par dosage enzymatique de l'activité Pristinamycine IlA-synthase, comme décrit dans l'exemple 5.1.1.A., pour les souches SP120 portant pVRC507 et SP120 portant plu903. Alors que la souche témoin SP120 portant plu903, ne présente aucune activité Pristinamycine IIAsynthase, la souche SP120 portant pVRC507, présente une activité Pristinamycine IIA-synthase. Cet exemple montre qu'il est possible d'exprimer des gènes de biosynthèse des Streptogramines. Cette expression a été étudiée plus particulièrement pour les gènes codant pour la Pristinamycine IIA-synthase mais les autres gènes de biosynthèse des Pristinamycines II et des Pristinamycines I et ainsi que ceux impliqués dans la biosynthèse des composants des différentes Streptogramines peuvent être ainsi exprimés. Cette expression peut être réalisée dans des souches mutantes comme c'est le cas dans l'exemple 10, mais également dans des souches productrices afin d'augmenter les niveaux de production des Streptogramines.L'expression peut être modifiée par clonage des gènes dans un vecteur à nombre de copies différent (faible ou élévé) ou dans un vecteur intégratif, par dérégulation de ces gènes, par clonage de ces gènes sous un promoteur homologue ou hétérologue (promoteur fort ou régulé spécifiquement). L'expression des différents gènes de biosynthèse des Streptogramines peut également être réalisée dans des souches hétérologues à partir de vecteurs d'expression adaptés, afin de produire des antibiotiques hybrides. TABLEAU 1 MICRO ORGANISMES ANTIBIOTIQUES CHAMPIGNONS Micromonospora sp. Vernamycines STREPTOMYCES S. alborectus Virginiamycines S. conganensis (ATCC13528) F1370 A, B Plauracines, Streptogramines SI graminofasciens Streptogramines S, griseus (NRRL2426) Viridogriséine (Etamycine) S. griseoviridus Griseoviridine S. griseoviridus (FERMP3562) Néoviridogriséines S. lavendulae Etamycines S. loidensis (ATCC11415) Vernamycines S. mitakaensis (ATCC15297) Mikamycines S. olivaceus (ATCC12019) Synergistines (PA114 A, B) S. ostréogriseus (ATCC27455) Ostréogrycines S. pristinaespiralis (ATCC25486) Pristinamycines S. virginiae (ATCC13161) Virginiamycines (Staphylomycines) ACTINOMYCETES A. auranticolor(ATCC31011) Plauracines A. azureus (ATCC31157) Plauracines A. daghestanicus Etamycine A. philippinensis A-2315 A, B, C Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104 Actinoplanes sp. A17002 A, B, C, F Actinomadura flava Madumycines Abreviations utilisées: ADN: acide déoxyribonucléique VAMP. adénosine 5'-monophosphate ATP: adénosine 5'-triphosphate BET: bromure d'éthidium BSA: bovine serum albumine CLHP: chromatographie liquide haute performance DO: Densité optique DTE: dithioerythritol DTT: dithiothréitol EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique FMN: flavine mononucleotide FMNH2: flavine mononucleotide reduite kDa: kilodalton kb: kilobase LB: Luria broth (milieu de croissance riche pour E. coli) NAD: nicotinamide dinucleotide NADH: nicotinamide dinucleotide reduit PAGE: electrophorese sur gel polyacrylamide pb: paire de base PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride PPi: pyrophosphate SAM: S-adénosylméthionine SDS: sodium dodecyl sulfate TE: tris-EDTA Tris: amino-2-hydroxylméthyl-2 propanediol-1,3 U.V.: rayons ultra-violets Xgal: 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside YEME: yeast extract-malt extract medium (milieu de croissance riche pour Streptomyces) Bibliographie: - Anzai H., Murakami T., Imai A., Satoh A., Nagaoka K. et Thompson C. 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Antim. Chemother., 24: 485-507. - Fernandez-Moreno M. A., Caballero J. L., Hopwood D. A. et Malpartida F. (1991) Cell,66: 769-780 - Gibson T. J. (1984) Ph.D. thesis, Cambridge University, England. - Hallam S. E., Malpartida F. et Hopwood D. A. (1988) Gene, 74: 305-320. - Hames B. D. et Higgins S. J. (1985) IRL Press Ltd., Oxford, U. K, - Hanahan D. (1983) J. Mol. Biol. , 166 :557 - Hillemann D., Pühler A. et Wohlleben W. (1991) Nucl. Acids Res., 19 :727-731. - Hohn B. et Collins J. F. (1980) Gene, 11: 291-298. - HookJ. D. et Vining L. C. (1973) J.C.S. Chem. Comm., 185-186. - Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Kieser T., Bruton C. J., Kieser H. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. et Scrempf H. (1985) A laboratory manuaL, The John lunes Fondation, Norwich, England. - Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Janssen G. R., Malpartida F. et Smith C. (1986b) In Regulation ofgene expression - 25years on (ed. I; A. Booth C; F. Higgins), 251-276. - Hopwood D. 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LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES STREPTOGRAMINES, SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATIONS. (iii) NOMBRE DE SEOUENCES: 11 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5392 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1: GGATCCTGGC GTCCGCCGTC AAGAACTGAA CCGAGGAGAC ACCCACCATG ACCGCACCCC 60 GCCGGCGCAT CACCCTCGCC GGCATCATCG ACGGCCCCGG CGGCCATGTG GCCGCCTGGC 120 GCCACCCGGC GACCAAGGCG GACGCCCAGC TCGACTTCGA ATTCCACCGC GACAACGCCC 180 GCACCCTCGA ACGCGGCCTG TTCGACGCCG TGTTCATCGC GGACATCGTC GCCGTGTGGG 240 GCACCCGCCT GGACTCCCTG TGCCGCACCT CGCGCACCGA GCACTTCGAA CCGCTCACCC 300 TGCTCGCCGC CTACGCCGCG GTCACCGAGC ACATCGGCCT GTGCGCCACC GCCACCACCA 360 CGTACAACGA ACCGGCGCAC ATCGCCGCCC GCTTCGCCTC CCTCGACCAC CTCAGCGGCG 420 GCCGGGCCGG CTGGAACGTC GTCACCTCCG CCGCACCGTG GGAGTCCGCC AACTTCGGCT 480 TCCCCGAGCA CCTGGAGCAC GGCAAACGCT ACGAGCGGGC CGAGGAGTTC ATCGACGTCG 540 TCAAAAAACT GTGGGACAGC GACGGCCGCC CCGTCGACCA CCGCGGCACC CACTTCGAGG 600 CCCCCGGCCC GCTCGGGATC GCCCGCCCCC CGCAGGGCCG CCCCGTCATC ATCCAGGCCG 660 GCTCCTCGCC GGTGGGACGC GAGTTCGCCG CCCGGCACGC CGAGGTCATC TTCACCCGGC 720 ACAACCGGCT CTCCGACGCC CAGGACTTCT ACGGCGACCT CAAGGCACGC GTCGCCCGGC 780 ACGGCCGCGA CCCCGAGAAG GTCCTCGTGT GGCCGACCCT CGCGCCGATC GTCGCCGCCA 840 CCGACACCGA GGCGAAGCAG CGCCTGCAGG AACTGCAGGA CCTCACCCAC GACCATGTCG 900 CCCTGCGCAC CCTTCAGGAC CACCTCGGCG ACGTCGACCT GAGCGCGTAC CCGATCGACG 960 GGCCCGTCCC CGACATCCCG TACACCAACC AGTCCCAGTC GACGACCGAG CGGCTGATCG 1020 GCCTGGCCAG GCGCGAGAAC CTCAGCATCC GCGAGCTGGC CCTGCGGCTG ATGGGCGACA 1080 TCGTCGTCGG CACACCGGAG CAGCTCGCCG ACCACATGGA GAGCTGGTTC ACCGGCCGCG 1140 GCGCCGACGG CTTCAACATC GACTTCCCGT ACCTGCCGGG CTCCGCCGAC GACTTCGTCG 1200 ACCACGTGGT GCCCGAACTG CAGCGCCGCG GCCTGTACCG CTCGGGCTAC GAGGGCACCA 1260 CCCTGCGGGC CAACCTCGGC ATCGACGCCC CCCGGAAGGC AGGTGCAGCG GCTTGACTTC 1320 CGTCCTAAAG GCGGGGGATT CCAGCGGTCG CCCGCTGGGG TTCCTGCTTC ACCGACGACC 1380 GCCCCGTCCG GGAGGACTCC CGTTGAGGTC TTATACCGTC TCCACAGGCC GACGCCGCCA 1440 GCCCGGCGGC CAGGATGTTG CGTGCCGCAT TCACGTCGCG GTCATGCACA GCGCCGCAGT 1500 CGCACGTCCA CTCCCGGACG TTCAGCGGCA GCTTCCCGCG GACCGTGCCG CAGGTTCCGC 1560 ACAGCTTGGA GCTGGGGAAC CAGCGGTCGA TCACGACGAG TTCGCGCCCA TACCAGGCGC 1620 ACTTGTACTC CAGCATGGAG CGCAGTTCCG TCCAGGCCGC GTCGGAGATG GCGCGCGCGA 1680 GCTTGCCGTT CTTCAGCAGG TTGCGGACGG TGAGGTCCTC GATCACGACC GTTTGGTTCT 1740 CACGGACGAG TCGAGTCGAC AGCTTGTGGA GGAAGTCGCA GCGCCGGTCG GTGATCCGGG 1800 CGTGGACGCG GGCGACCTTG CGGCGGCCTT TCTTCCGGTT CGCCGACCCC TTCGCCTTGC 1860 GCGACACGTC CCGCTGAGCC TTCGCGAGGC GGGCGCGGTC ACGGCGCTCG TGCTTGGGGT 1920 TGGTGATCTT CTCCCCGGTG GACAGGGTCA CCAGGGAGGT GATCCCGGCG TCGATGCCGA 1980 CGGCCGCCGT GGTGGCGGGC GCGGGGGTGA TGGTGTCCTC GCACAGCAGG GACACGAACC 2040 AGCGGCCCGC ACGGTCGCGG GACACGGTCA CCGTCGTCGG CTCCGCCCCT TCGGGAAGGG 2100 GACGGGACCA GCGGATGTCC AGGGGCTCCG CGGTCTTCGC CAGCGTGAGC TGTCCGTTAC 2160 GCCACGTGAA GGCGCTGCGG GTGTACTCGG CCGACGCCCT GGACTTTTTC CGCGACTTGT 2220 ACCGCGGGTA CTTCGACCGC TTGGCGAAGA AGTTGGCGAA CGCCGTCTGC AAGTGCCGCA 2280 GCGCCTGCTG GAGCGGGACG GAGGACACCT CCGAGAGGAA GGCGAGTTCT TCGGTCTTCT 2340 TCCACTCCGT CAGCGCGGCG GACGACTGCA CGTAGGAGAC CCGGCGCTGC TCGCCGTACC 2400 AGGCTCGCGT GCGCCCCTCA AGCGCCTTGT TGTACACGAG GCGGACACAG CCGAACGTGC 2460 GGGACAGCTC AGCCGCCTGC TCGTCCGTGG GATAAAAGCG GTACTTGAAA GCCCGCTTGA 2520 CCTGCTGCAT CACGCCTCAC ACGCTATCAG TTCCCGTGTG AGCGGCGGGT GTCTGCCGGT 2580 GGTTGCAGAC GCCGAACCGC CCTGGCGGCG ATTCGCCCAT CCCTGCCCTG CTCCGCAAGA 2640 GCTTCGTCTC CTCCCCGGTC TGAAGGCCGG GGTATCCACG AAGGAATTCT GATGACCGCG 2700 CCCATCCTCG TCGCCACCCT CGACACCCGC GGCCCCGCCG CCACCCTCGG CACGATCACC 2760 CGCGCCGTGC GGGCCGCGGA GGCCGCCGGA TTCGACGCCG TCCTGATCGA CGACCGGGCC 2820 GCCGCCGGCG TCCAGGGCCG GTTCGAGACG ACGACGCTGA CCGCCGCGCT GGCCGCCGTC 2880 ACCGAGCACA TCGGCCTGAT CACCGCCCCG CTCCCGGCCG ACCAGGCCCC CTACCACGTG 2940 TCCCGGATCA CCGCCTCGCT CGACCACCTC GCCCACGGCC GCACCGGCTG GCTCGCGAGC 3000 ACGGACACCA CCGACCCCGA GGGCCGCACC GGCGAACTCA TCGACGTCGT CCGCGGCCTG 3060 TGGGACAGCT TCGACGACGA CGCCTTCGTC CACGACCGCG CCGACGGCCT GTACTGGCGG 3120 CTGCCCGCCG TCCACCAACT CGACCACCAG GGCAGGCACT TCGACGTGGC CGGCCCCCTC 3180 AACGTCGCCC GCCCGCCGCA GGGCCACCCC GTCGTCGCCG TCACCGGCCC CGCCCTCGCC 3240 GCGGCCGCCG ACCTCGTCCT GCTCGACGAG GCGGCCGACG CCGCCTCGGT GAAGCAGCAG 3300 GCACCGCACG CCAAGATCCT CCTGCCGCTG CCCGGCCCGG CCGCCGAACT GCCCGCCGAC 3360 AGCCCCGCGG ACGGCTTCAC GGTGGCGCTC ACCGGCTCCG ACGACCCGGT CCTGGCCGCG 3420 CTCGCCGCCC GGCCCGGCCG CCCGGACCGC ACCGCGGCCA CCACCCTGCG CGAACGCCTG 3480 GGCCTGGCCC GCCCCGAGAG CCGCCACGCC CTCACCACCG CCTGACGACC CGTCCGCCCG 3540 CTGCTTCCTG GAGAGTCATG TCCCGTCGCC TGTTCACCTC GGAGTCCGTG ACCGAGGGCC 3600 ACCCCGACAA GATCGCCGAC CAGATCAGTG ACACCGTCCT CGACGCCCTG CTGCGCGAGG 3660 ACCCCGCCTC ACGCGTCGCG GTCGAGACCC TGATCACCAC CGGCCAGGTC CACATCGCCG 3720 GCGAGGTCAC CACCAAGGCG TACGCGCCCA TCGCCCAACT GGTCCGCGAC ACGATCCTGG 3780 CCATCGGCTA CGACTCGTCC GCCAAGGGCT TCGACGGCGC CTCCTGCGGC GTCTCCGTCT 3840 CCATCGGCGC GCAGTCCCCG GACATCGCCC AGGGCGTCGA CAGCGCCTAC GAGACCCGCG 3900 TCGAGGGCGA GGACGACGAG CTCGACCAGC AGGGCGCCGG CGACCAGGGC CTGATGTTCG 3960 GCTACGCCAC CGACGAGACC CCCTCGCTGA TGCCGCTGCC CATCGAGCTC GCCCACCGCC 4020 TCTCGCGCCG GCTCACCGAG GTCCGCAAGG ACGGCACCGT CCCCTACCTG CGCCCCGACG 4080 GCAAGACCCA GGTCACCATC GAGTACCAGG GCAGCCGCCC GGTGCGCCTG GACACCGTCG 4140 TCGTCTCCTC CCAGCACGCC GCCGACATCG ACCTCGGCTC CCTGCTCACC CCCGACATCC 4200 GCGAGCACGT CGTCGAGCAC GTCCTCGCCG CACTCGCCGA GGACGGCATC AAGCTCGAGA 4260 CGGACAACTA CCGCCTGCTG GTCAACCCGA CCGGCCGTTT CGAGATCGGC GGCCCGATGG 4320 GCGACGCCGG CCTGACCGGC CGCAAGATCA TCATCGACAC GTACGGCGGC ATGGCCCGCC 4380 ACGGCGGTGG CGCGTTCTCC GGCAAGGACC CGTCCAAGGT CGACCGTTCC GCCGCGTACG 4440 CGATGCGCTG GGTCGCCAAG AACGTCGTCG CCGCGGGCCT CGCCTCCCGC TGCGAGGTCC 4500 AGGTCGCCTA CGCCATCGGC AAGGCCGAGC CGGTCGGCCT GTTCGTCGAG ACGTTCGGCA 4560 CCGGCACCGT CGCCCAGGAG CGCATCGAGA AGGCCATCAC CGAGGTCTTC GACCTGCGCC 4620 CCGCGGCCAT CATCCGCGAC CTCGACCTGC TGCGGCCCAT CTACGCCGCC ACCGCCGCCT 4680 ACGGCCACTT CGGCCGCGAA CTGCCCGACT TCACCTGGGA GCGGACCGAC CGCGCCCACC 4740 GGCTCAAGGC CGCGGCCGGT CTCTGAGCCG GCCGGACCTG TGAGGAGACC TGACGTGCGC 4800 ATCGCTGTCA CCGGTTCCAT CGCCACCGAC CATCTGATGG TCTTCCCCGG CCGGTTCGCG 4860 GATCAGCTGA TCCCCGACCA GCTCGCTCAT GTCTCGCTCT CCTTCCTGGT CGACGCACTC 4920 GAGGTGCGCC GGGGCGGAGT GGCGGACAAC GTCGCCTTCG GCCTCGGCGG CCTCGGCCTC 4980 ACCCCCCAGC TGGTCGGCGC CGTGGGCAGC GACTTCGCCG AGTACGAGGT CTGGCTCAAG 5040 GAACACGGCG TCGACACCGG CCCCGTCCTG GTCTCCACCG AGCGGCAGAC CGCCCGGTTC 5100 ATGTGCATCA CCGACCAGGA CTCCAACCAG ATCGCCTCCT TCTACGCGGG CGCCATGCAA 5160 GAGGCCCGCG ACATCGACCT GTGGCACCTG ACCACCGGCA GCGTCCGCCC CGACCTCGTC 5220 CTGGTCTGCC CGAACGACCC GGCGGCGATG CTGCGCCACA CGGGGAGTGC CGCGAAACTG 5280 GGCCTGCCGT TCGCCGCCGA CCCCTCCCAG CAGCTCGCCC GCCTGGAGGG AGGGAGGTAC 5340 GCGAACTCGG TCGACGGGGC CCGTTGGTTT TTCACCAACG AAGTACGAGG CC 5392 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1269 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1269 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATG ACC GCA CCC CGC CGG CGC ATC ACC CTC GCC GGC ATC ATC GAC GGC 48 Met Thr Ala Pro Arg Arg Arg Ile Thr Leu Ala Gly Ile Ile Asp Gly 1 5 10 15 CCC GGC GGC CAT GTG GCC GCC TGG CGC CAC CCG GCG ACC AAG GCG GAC 96 Pro Gly Gly His Val Ala Ala Trp Arg His Pro Ala Thr Lys Ala Asp 20 25 30 GCC CAG CTC GAC TTC GAA TTC CAC CGC GAC AAC GCC CGC ACC CTC GAA 144 Ala Gln Leu Asp Phe Glu Phe His Arg Asp Asn Ala Arg Thr Leu Glu 35 40 45 CGC GGC CTG TTC GAC GCC GTG TTC ATC GCG GAC ATC GTC GCC GTG TGG 192 Arg Gly Leu Phe Asp Ala Val Phe Ile Ala Asp Ile Val Ala 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Gly Arg Pro Val 165 170 175 GAC CAC CGC GGC ACC CAC TTC GAG GCC CCC GGC CCG CTC GGG ATC GCC 576 Asp His Arg Gly Thr His Phe Glu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala 180 185 190 CGC CCC CCG CAG GGC CGC CCC-GTC ATC ATC CAG GCC GGC TCC TCG CCG 624 Arg Pro Pro Gln Gly Arg Pro Val Ile Ile Gln Ala Gly Ser Ser Pro 195 200 205 GTG GGA CGC GAG TTC GCC GCC CGG CAC GCC GAG GTC ATC TTC ACC CGG 672 Val Gly Arg Glu Phe Ala Ala Arg His Ala Glu Val Ile Phe Thr Arg 210 215 220 CAC AAC CGG CTC TCC GAC GCC CAG GAC TTC TAC GGC GAC CTC AAG GCA 720 His Asn Arg Leu Ser Asp Ala Gln Asp Phe Tyr Gly Asp Leu Lys Ala 225 230 235 240 CGC GTC GCC CGG CAC GGC CGC GAC CCC GAG AAG GTC CTC GTG TGG CCG 768 Arg Val Ala Arg His Gly Arg Asp Pro Glu Lys Val Leu Val Trp Pro 245 250 255 ACC CTC GCG CCG ATC GTC GCC GCC ACC GAC ACC GAG GCG AAG CAG CGC 816 Thr Leu Ala Pro Ile Val Ala Ala Thr Asp Thr Glu Ala Lys Gln Arg 260 265 270 CTG CAG GAA CTG CAG GAC CTC ACC CAC GAC CAT GTC GCC CTG CGC ACC 864 Leu Gln Glu Leu Gln Asp Leu Thr His Asp His Val Ala Leu Arg Thr 275 280 285 CTT CAG GAC CAC CTC GGC -GAC GTC GAC CTG AGC GCG TAC CCG ATC GAC 912 Leu Gln Asp His Leu Gly Asp Val Asp Leu Ser Ala Tyr Pro Ile Asp 290 295 300 GGG CCC GTC CCC GAC ATC CCG TAC ACC AAC CAG TCC CAG TCG ACG ACC 960 Gly Pro Val Pro Asp Ile Pro Tyr Thr Asn Gln Ser Gln Ser Thr Thr 305 310 315 320 GAG CGG CTG ATC GGC CTG GCC AGG CGC GAG AAC CTC AGC ATC CGC GAG 1008 Glu Arg Leu Ile Gly Leu Ala Arg Arg Glu Asn Leu Ser Ile Arg Glu 325 330 335 CTG GCC CTG CGG CTG ATG GGC GAC ATC GTC GTC GGC ACA CCG GAG CAG 1056 Leu Ala Leu Arg Leu Met Gly Asp Ile Val Val Gly Thr Pro Glu Gln 340 345 350 CTC GCC GAC CAC ATG GAG AGC TGG TTC ACC GGC CGC GGC GCC GAC GGC 1104 Leu Ala Asp His Met Glu Ser Trp Phe Thr Gly Arg Gly Ala Asp Gly 355 360 365 TTC AAC ATC GAC TTC CCG TAC CTG CCG GGC TCC GCC GAC GAC TTC GTC 1152 Phe Asn Ile Asp Phe Pro Tyr Leu Pro Gly Ser Ala Asp Asp Phe Val 370 375 380 GAC CAC GTG GTG CCC GAA CTG CAG CGC CGC GGC CTG TAC CGC TCG GGC 1200 Asp His Val Val 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INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1209 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1209 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6: ATG TCC CGT CGC CTG TTC ACC TCG GAG TCC GTG ACC GAG GGC CAC CCC 48 Met Ser Arg Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Gly His Pro 1 5 10 15 GAC AAG ATC GCC GAC CAG ATC AGT GAC ACC GTC CTC GAC GCC CTG CTG 96 Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Thr Val Leu Asp Ala Leu Leu 20 25 30 CGC GAG GAC CCC GCC TCA CGC GTC GCG GTC GAG ACC CTG ATC ACC ACC 144 Arg Glu Asp Pro Ala Ser Arg Val Ala Val Glu Thr Leu Ile Thr Thr 35 40 45 GGC CAG GTC CAC ATC GCC GGC GAG GTC ACC ACC AAG GCG TAC GCG CCC 192 Gly Gln Val His Ile Ala Gly Glu Val Thr Thr Lys Ala Tyr Ala Pro 50 55 60 ATC GCC CAA CTG GTC CGC GAC ACG ATC CTG GCC ATC GGC TAC GAC TCG 240 Ile Ala Gln Leu Val Arg Asp Thr Ile Leu Ala Ile Gly Tyr Asp Ser 65 70 75 80 TCC GCC AAG GGC TTC GAC GGC GCC TCC TGC GGC GTC TCC GTC TCC ATC 288 Ser Ala Lys Gly Phe Asp Gly Ala Ser Cys Gly Val Ser Val Ser Ile 85 90 95 GGC GCG CAG TCC CCG GAC ATC GCC CAG GGC GTC GAC AGC GCC TAC GAG 336 Gly Ala Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val Asp Ser Ala Tyr Glu 100 105 110 ACC CGC GTC GAG GGC GAG GAC GAC GAG CTC GAC CAG CAG GGC GCC GGC 384 Thr Arg Val Glu Gly Glu Asp Asp Glu Leu Asp Gln Gln Gly Ala Gly 115 120 125 GAC CAG GGC CTG ATG TTC GGC TAC GCC ACC GAC GAG ACC CCC TCG CTG 432 Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Ser Leu 130 135 140 ATG CCG CTG CCC ATC GAG CTC GCC CAC CGC CTC TCG CGC CGG CTC ACC 480 Met Pro Leu Pro Ile Glu Leu Ala His Arg Leu Ser Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 GAG GTC CGC AAG GAC GGC ACC GTC CCC TAC CTG CGC CCC GAC GGC AAG 528 Glu Val Arg Lys Asp Gly Thr Val Pro Tyr Leu Arg Pro Asp 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Asp Pro Ser Lys Val 275 280 285 GAC CGT TCC GCC GCG TAC GCG ATG CGC TGG GTC GCC AAG AAC GTC GTC 912 Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn Val Val 290 295 300 GCC GCG GGC CTC GCC TCC CGC TGC GAG GTC CAG GTC GCC TAC GCC ATC 960 Ala Ala Gly Leu Ala Ser Arg Cys Glu Val Gln Val Ala Tyr Ala Ile 305 310 315 320 GGC AAG GCC GAG CCG GTC GGC CTG TTC GTC GAG ACG TTC GGC ACC GGC 1008 Gly Lys Ala Glu Pro Val Gly Leu Phe Val Glu Thr Phe Gly Thr Gly 325 330 335 ACC GTC GCC CAG GAG CGC ATC GAG AAG GCC ATC ACC GAG GTC TTC GAC 1056 Thr Val Ala Gln Glu Arg Ile Glu Lys Ala Ile Thr Glu Val Phe Asp 340 345 350 CTG CGC CCC GCG GCC ATC ATC CGC GAC CTC GAC CTG CTG CGG CCC ATC 1104 Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Asp Leu Asp Leu Leu Arg Pro Ile 355 360 365 TAC GCC GCC ACC GCC GCC TAC GGC CAC TTC GGC CGC GAA CTG CCC GAC ' 1152 Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu Leu Pro Asp 370 375 380 TTC ACC TGG GAG CGG ACC GAC CGC GCC CAC CGG CTC AAG GCC GCG GCC 1200 Phe Thr Trp Glu Arg Thr Asp Arg Ala His Arg Leu Lys Ala Ala Ala 385 390 395 400 GGT CTC TG 1209 Gly Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 402 acides amin,s (B) TYPE: acide amin, (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: prot,ine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 7: Met Ser Arg Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Gly His Pro 1 5 10 15 Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Thr Val Leu Asp Ala Leu Leu 20 25 30 Arg Glu Asp Pro Ala Ser Arg Val Ala Val Glu Thr Leu Ile Thr Thr 35 40 45 Gly Gln Val His Ile Ala Gly Glu Val Thr Thr Lys Ala Tyr Ala Pro 50 55 60 Ile Ala Gln Leu Val Arg Asp Thr Ile Leu Ala Ile Gly Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Ser Ala Lys Gly Phe Asp Gly Ala Ser Cys Gly Val Ser Val Ser Ile 85 90 95 Gly Ala Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val Asp Ser Ala Tyr Glu 100 105 110 Thr Arg Val Glu Gly Glu Asp Asp Glu Leu Asp Gln Gln Gly Ala Gly 115 120 125 Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Ser Leu 130 135 140 Met Pro Leu Pro 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Ala Ile Ile Arg Asp Leu Asp Leu Leu Arg Pro Ile 355 360 365 Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu Leu Pro Asp 370 375 380 Phe Thr Trp Glu Arg Thr Asp Arg Ala His Arg Leu Lys Ala Ala Ala 385 390 395 400 Gly Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1879 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 110..1858 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8: GATCGGCTCC TGACGGAGCG GCGGCGCGCG GGCGCGGCGC ATCAGCGGCG TGTCAACGGC 60 GCTGCCGACA CTGGGCGCGA CGCGAGGACG AAGCCGGAAA GGACCAACG ATG CTG 115 Met Leu 1 GAC GGA TGC GTT CCC TGG CCC GAG GAT GTG GCC GCG AAG TAC CGG GCG 163 Asp Gly Cys Val Pro Trp Pro Glu Asp Val Ala Ala Lys Tyr Arg Ala 5 10 15 GCC GGC TAC TGG CGG GGC GAG CCG CTG GGC ATG CTG CTG GGC CGC TGG 211 Ala Gly Tyr Trp Arg Gly Glu Pro Leu Gly Met Leu Leu Gly Arg Trp 20 25 30 GCG GAG CAG TAC GGC GAG CGG GAG GCG CTG GTC GGC GCG GAC GGG TGC 259 Ala Glu Gln Tyr Gly Glu Arg Glu Ala Leu Val Gly Ala Asp Gly Cys 35 40 45 50 TCC CGT GTC ACC TAC CGT GCC CTG GAC CGC TGG TGC GAC CGG CTG GCG 307 Ser Arg Val Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Arg Trp Cys Asp Arg Leu Ala 55 60 65 GCG GGG TTC GCG GCG CGC GGG ATC GGC GCC GGC GAG CGG GTG CTG GTG 355 Ala Gly Phe Ala Ala Arg Gly Ile Gly Ala Gly Glu Arg Val Leu Val 70 75 80 CAG CTG CCG AAC ACG CCC GAG TTC GTC GCG GTG TGC TTC GCG CTG TTC 403 Gln Leu Pro Asn Thr Pro Glu Phe Val Ala Val Cys Phe Ala Leu Phe 85 90 95 CGT CTG GGC GCG CTG CCG GTG TTC GCG CTG CCC GCG CAC CGT GCC GCC 451 Arg Leu Gly Ala Leu Pro Val Phe Ala Leu Pro Ala His Arg Ala Ala 100 105 110 GAG GTG GGG CAC CTG CTC GAG CTG TCC GGC GCC GTC GCC CAC ATC CTG 499 Glu Val Gly His Leu Leu Glu Leu Ser Gly Ala Val Ala His Ile Leu 115 120 125 130 CCG GGC ACC GGC ACC GGC TAC GAC CAT GTC GCG GCG GCC GTG GAG GCC 547 Pro Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Asp His Val Ala Ala Ala Val Glu Ala 135 140 145 CGT GCC CGC CGT GCC CGC CCG GTG CAG GTG TTC GTG GCG GGC GAG GCG 595 Arg Ala Arg Arg Ala Arg Pro Val Gln Val Phe Val Ala Gly Glu Ala 150 155 160 CCC GCG GTG CTG CCC GAG GGC TTC ACC GCG CTG GCC GAC GTG GAC GGC 643 Pro Ala Val Leu Pro Glu Gly Phe Thr Ala Leu Ala Asp Val Asp Gly 165 170 175 GAC CCG GTG GCG CCG GCG GAC GTG GAC GCC TTC CGA CGT GGC GTC TTC 691 Asp Pro Val Ala Pro Ala Asp Val Asp Ala Phe Arg Arg Gly Val Phe 180 185 190 CTG CTG TCC GGG GGG ACG ACC GCG CTG CCG AAG CTG ATC CCG CGC ACC 739 Leu Leu Ser Gly Gly Thr Thr Ala Leu Pro Lys Leu Ile Pro Arg Thr 195 200 205 210 CAC GAC GAC TAC GCC TAC CAG TGC CGG GTC ACG GCC GGT ATC TGC GGC 787 His Asp Asp Tyr Ala Tyr Gln Cys Arg Val Thr Ala Gly Ile Cys Gly 215 220 225 CTG GAC GCG GAC AGT GTC TAT CTG GCG GTG CTG CCG GCC GAG TTC AAC 835 Leu Asp Ala Asp Ser Val Tyr Leu Ala Val Leu Pro Ala Glu Phe Asn 230 235 240 TTC CCC TTC GGC TGC CCG GGC ATC CTG GGC ACC CTG CAC GCC GGC GGG 883 Phe Pro Phe Gly Cys Pro Gly Ile Leu Gly Thr Leu His Ala Gly Gly 245 250 255 CGG GTG GTG TTC GCG CTG TCA CCG CAG CCC GAG GAG TGC TTC GCG CTG 931 Arg Val Val Phe Ala Leu Ser Pro Gln Pro Glu Glu Cys Phe Ala Leu 260 . 265 270 ATC GAA CGC GAA CAC GTC ACC TTC ACC TCC GTC ATC CCC ACG ATC GTG 979 Ile Glu Arg Glu His Val Thr Phe Thr Ser Val Ile Pro Thr Ile Val 275 280 285 290 CAC CTG TGG CTG GCG GCC GCC GCA CAA GGC CAC GGC CCC GAC CTG GGC 1027 His Leu Trp Leu Ala Ala Ala Ala Gln Gly His Gly Arg Asp Leu Gly 295 300 305 AGC CTT CAG CTG CTG CAG GTC GGC AGC GCC AAA CTC CAC GAG GAG CTC 1075 Ser Leu Gln Leu Leu Gln Val Gly Ser Ala Lys Leu His Glu Glu Leu 310 315 320 GCC GCC CGC ATC GGC CCC GAA CTG CCC GTG CGC CTG CAG CAG GTG TTC 1123 Ala Ala Arg Ile Gly Pro Glu Leu Gly Val Arg Leu Gln Gln Val Phe 325 330 335 GGC ATG GCC GAG GGA CTG CTG ACC TTC ACC CGC GAC GAC GAC CCG GCG 1171 Gly Met Ala Glu Gly Leu Leu Thr Phe Thr Arg Asp Asp Asp Pro Ala 340 345 350 GAC GTG GTG CTG CGC ACC CAG GGC CGG CCG GTG TCC GAG GCC GAC GAG 1219 Asp Val Val Leu Arg Thr Gln Gly Arg Pro Val Ser Glu Ala Asp Glu 355 360 365 370 ATA CGC GTC GCC GAC CCC GAC GGC CGG CCC GTG CCC CGC GGT GAG ACC 1267 Ile Arg Val Ala Asp Pro Asp Gly Arg Pro Val Pro Arg Gly Glu Thr 375 380 385 GGT GAA CTG CTC ACC CGC GGC CCC TAC ACG CTG CGC GGC TAC TAC CGG 1315 Gly Glu Leu Leu Thr Arg Gly Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Arg 390 395 400 GCC CCC GAG CAC AAC GCC CGC GCG TTC ACC GAG GAC GGC TTC TAC CGC 1363 Ala Pro Glu His Asn Ala Arg Ala Phe Thr Glu Asp Gly Phe Tyr Arg 405 410 415 AGC GGC GAT CTG GTG CGG CTC ACC GCC GAC GGG CAG TTG GTG GTG GAG 1411 Ser Gly Asp Leu Val Arg Leu Thr Ala Asp Gly Gln Leu Val Val Glu 420 425 430 GGC AGG ATC AAG GAC GTC GTC ATC CGC GGC GGC GAC AAG GTC TCC GCG 1459 Gly Arg Ile Lys Asp Val Val Ile Arg Gly Gly Asp Lys Val Ser Ala 435 440 445 450 ACC GAG GTC GAG GGC CAC CTG GGC GCC CAC CCC GAC GTC CAG CAG GCC 1507 Thr Glu Val Glu Gly His Leu Gly Ala His Pro Asp Val Gln Gln Ala 455 460 465 GCC GTC GTC GCC ATG CCC GAC CCG GTG TGG GGC GAG AAG GTC TGC GCC 1555 Ala Val Val Ala Met Pro Asp Pro Val Trp Gly Glu Lys Val Cys Ala 470 475 480 TAC ATC GTG CCC GCA CCC GGC CGT CCC GCA CCG CCG ATG GCG GCG CTG 1603 Tyr Ile Val Pro Ala Pro Gly Arg Pro Ala Pro Pro Met Ala Ala Leu 485 490 495 CGC CGG CTG CTG CGC GCG CGG GGA CTG GCC GAC TAC AAG CTT CCC GAC 1651 Arg Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Leu Ala Asp Tyr Lys Leu Pro Asp 500 505 510 CGG GTG GAG GTC GTC GAC GCG TTC CCG CTG ACC GGC CTC AAC AAG GTC 1699 Arg Val Glu Val Val Asp Ala Phe Pro Leu Thr Gly Leu Asn Lys Val 515 520 525 530 GAC AAG AAG GCC CTG GCG GCC GAC ATC GCC GCC AAG ACC GCC CCC ACC 1747 Asp Lys Lys Ala Leu Ala Ala Asp Ile Ala Ala Lys Thr Ala Pro Thr 535 540 545 CGC CCC ACC ACC GCC GGC CAC GGC CCG ACC ACG GAC GGC GAT ACG GCC 1795 Arg Pro Thr Thr Ala Gly His Gly Pro Thr Thr Asp Gly Asp Thr Ala 550 555 560 GGT GGG GGT GGG TCC GCG GGC GGG GTG ACG GCC GCC GGT GGC GGG CGG 1843 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Gly Gly Gly Arg 565 570 575 GAG GAG GCG GCG TGAGCGGGCC CGGGCCCGAG GGCG 1879 Glu Glu Ala Ala 580 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 582 acides amin,s (B) TYPE: acide amin, (D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: prot,ine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 9: Met Leu Asp Gly Cys Val Pro Trp Pro Glu Asp Val Ala Ala Lys Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Ala Gly Tyr Trp Arg Gly Glu Pro Leu Gly Met Leu Leu Gly 20 25 30 Arg Trp Ala Glu Gln Tyr Gly Glu Arg Glu Ala Leu Val Gly Ala Asp 35 40 45 Gly Cys Ser Arg Val Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Arg Trp Cys Asp Arg 50 55 60 Leu Ala Ala Gly Phe Ala Ala Arg Gly Ile Gly Ala Gly Glu Arg Val 65 70 75 80 Leu Val Gln Leu Pro Asn Thr Pro Glu Phe Val Ala Val Cys Phe Ala 85 90 95 Leu Phe Arg Leu Gly Ala Leu Pro Val Phe Ala Leu Pro Ala His Arg 100 105 110 Ala Ala Glu Val Gly His Leu Leu Glu Leu Ser Gly Ala Val Ala His 115 120 125 Ile Leu Pro Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Asp His Val Ala Ala Ala Val 130 135 140 Glu Ala Arg Ala Arg Arg Ala Arg Pro Val Gln Val Phe Val Ala Gly 145 150 155 160 Glu Ala Pro Ala Val Leu Pro Glu Gly Phe Thr Ala Leu Ala Asp Val 165 170 175 Asp Gly Asp Pro Val Ala Pro Ala Asp Val Asp Ala Phe Arg Arg Gly 180 185 190 Val Phe Leu Leu Ser Gly Gly Thr Thr Ala Leu Pro Lys Leu Ile Pro 195 200 205 Arg Thr His Asp Asp Tyr Ala Tyr Gln Cys Arg Val Thr Ala Gly Ile 210 215 220 Cys Gly Leu Asp Ala Asp Ser Val Tyr Leu Ala Val Leu Pro Ala Glu 225 230 235 240 Phe Asn Phe Pro Phe Gly Cys Pro Gly Ile Leu Gly Thr Leu His Ala 245 250 255 Gly Gly Arg Val Val Phe Ala Leu Ser Pro Gln Pro Glu Glu Cys Phe 260 265 270 Ala Leu Ile Glu Arg Glu His Val Thr Phe Thr Ser Val Ile Pro Thr 275 280 285 Ile Val His Leu Trp Leu Ala Ala Ala Ala Gln Gly His Gly Arg Asp 290 295 300 Leu Gly Ser Leu Gln Leu Leu Gln Val Gly Ser Ala Lys Leu His Glu 305 310 315 320 Glu Leu Ala Ala Arg Ile Gly Pro Glu Leu Gly Val Arg Leu Gln Gln 325 330 335 Val Phe Gly Met Ala Glu Gly Leu Leu Thr Phe Thr Arg Asp Asp Asp 340 345 350 Pro Ala Asp Val Val Leu Arg Thr Gln Gly Arg Pro Val Ser Glu Ala 355 360 365 Asp Glu Ile Arg Val Ala Asp Pro Asp Gly Arg Pro Val Pro Arg Gly 370 375 380 Glu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Arg Gly Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr 385 390 395 400 Tyr Arg Ala Pro Glu His Asn Ala Arg Ala Phe Thr Glu Asp Gly Phe 405 410 415 Tyr Arg Ser Gly Asp Leu Val Arg Leu Thr Ala Asp Gly Gln Leu Val 420 425 430 Val Glu Gly Arg Ile Lys Asp Val Val Ile Arg Gly Gly Asp Lys Val 435 440 445 Ser Ala Thr Glu Val Glu Gly His Leu Gly Ala His Pro Asp Val Gln 450 455 460 Gln Ala Ala Val Val Ala Met Pro Asp Pro Val Trp Gly Glu Lys Val 465 470 475 480 Cys Ala Tyr Ile Val Pro Ala Pro Gly Arg Pro Ala Pro Pro Met Ala 485 490 495 Ala Leu Arg Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Leu Ala Asp Tyr Lys Leu 500 505 510 Pro Asp Arg Val Glu Val Val Asp Ala Phe Pro Leu Thr Gly Leu Asn 515 520 525 Lys Val Asp Lys Lys Ala Leu Ala Ala Asp Ile Ala Ala Lys Thr Ala 530 535 540 Pro Thr Arg Pro Thr Thr Ala Gly His Gly Pro Thr Thr Asp Gly Asp 545 550 555 560 Thr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Gly Gly 565 570 575 Gly Arg Glu Glu Ala Ala 580 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1833 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE:CDS (B) EMPLACEMENT: 103..1689 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GGATCCCCTC GCCCAGGGCC CTGGCGGGCC CGCCGGGCCG TGGGGGAGGT GCGGGGGCCG 60 CGGGCCCCGG CACCGCACGAACAGAACAAC CGCTCCGGGC CC ATG CGG ACT TCA 114 Met Arg Thr Ser 1 CGG TCC CAC GAC CAG CGG GCC CCT ACC CCC TGG AGA CAT CCC TTG CAC 162 Arg Ser His Asp Gln Arg Ala Pro Thr Pro Trp Arg His Pro Leu His 5 10 15 20 AGC ACC CGG CCC GCG CCC GCG GCC GAC CGT GAC CCC AGG CGC TGG GTC 210 Ser Thr Arg Pro Ala Pro Ala Ala Asp Arg Asp Pro Arg Arg Trp Val 25 30 35 ATC CTC GGC GTG ATC TGC CTG GCC CAA CTC GTC GTC CTG CTC GAC AAC 258 Ile Leu Gly Val Ile Cys Leu Ala GlnLeu Val Val Leu Leu Asp Asn 40 45 50 ACC GTC CTC AAC GTC GCC ATC CCG GTG CTC ACC ACC GAC CTG GGC GCC 306 Thr Val Leu Asn Val Ala Ile Pro Val Leu Thr Thr Asp Leu Gly Ala 55 60 65 AGC ACC GCC GAC ATC CAG TGG ATG ATC AAC GCC TAC GCG CTC GTG CAG 354 Ser Thr Ala Asp Ile Gln Trp Met Ile Asn Ala Tyr Ala Leu Val Gln 70 75 80 TCC GGG CTG CTG CTC ACC GCG GGC AGC CTC GCG GAC CGC TAC GGC CGC 402 Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ser Leu Ala Asp Arg Tyr Gly Arg 85 90 95 100 AAA CGG CTG CTG ATG CTC GGA CTG GTG CTC TTC GGC GCC GGG TCC GCC 450 Lys Arg Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ala 105 110 115 TGG GCG GCC TTC GCC CAG GAC TCC GCC CAA CTC ATC GCC GCC CGG GCC 498 Trp Ala Ala Phe Ala Gln Asp Ser Ala Gln Leu Ile Ala Ala Arg Ala 120 125 130 GGC ATG GGC GTG GGC GGG GCG CTG CTG GCG ACC ACC ACC CTC GCC GTC 546 Gly Met Gly Val Gly Gly Ala Leu Leu Ala Thr Thr Thr Leu Ala Val 135 140 145 ATC ATG CAG GTC TTC GAC GAC GAC GAA CGC CCC CGC GCG ATC GGC CTG 594 Ile Met Gln Val Phe Asp Asp Asp Glu Arg Pro Arg Ala Ile Gly Leu 150 155 160 TGG GGA GCG GCC AGC TCA CTG GGC TTC GCG GCC GGC CCG CTG CTC GGC 642 Trp Gly Ala Ala Ser Ser Leu Gly Phe Ala Ala Gly Pro Leu Leu Gly 165 170 175 180 GGC GCC CTC CTC GAC CAC TTC TGG TGG GGC TCC ATC TTC CTG ATC AAC 690 Gly Ala Leu Leu Asp His Phe Trp Trp Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn 185 190 195 CTC CCC GTC GCG CTC CTG GGC CTG CTC GCC GTC GCC CCC CTC CTC CCC 738 Leu Pro Val Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro 200 205 210 GAG ACG AAG AAC CCC GAA GGC CGC CGC CCC GAC CTG CTC GGC GCC GTG 786 Glu Thr Lys Asn Pro Glu Gly Arg Arg Pro Asp Leu Leu Gly Ala Val 215 220 225 CTC TCC ACC CTC GGC ATC GTC GGC GTC GTC TAC GCC ATC ATC TCC GGC 834 Leu Ser Thr Leu Gly Met Val Gly Val Val Tyr Ala Ile Ile Ser Gly 230 235 240 CCC GAA CAC GGC TGG ACG GCC CCG CAG GTC CTC CTG CCG GCC GCC GTC 882 Pro Glu His Gly Trp Thr Ala Pro Gln Val Leu Leu Pro Ala Ala Val 245 250 255 260 CCC GCC GCC GCG CTC ACC CCC TTC GTC CCC TCC GAA CTC CAC ACC CCC 930 Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe Val Arg Trp Glu Leu His Thr Pro 265 270 275 CAC CCC ATC CTC GAC ATG CCC TTC TTC ACC GAC CGG CGC TTC AAC CGC 978 His Pro Met Leu Asp Met Gly Phe Phe Thr Asp Arg Arg Phe Asn Gly 280 285 290 CCG TCG CCG CCC GAG TGC TCG TCC TTC GGC ATG GCC GGC TCG CTC TTC 1026 Pro Ser Pro Ala Glu Cys Ser Ser Phe Gly Met Ala Gly Ser Leu Phe 295 300 305 CTG CTC ACC CAG CAC CTC CAA CTC GTC CTC GGC TAC GAC GCC CTC CAG 1074 Leu Leu Thr Gln His Leu Gln Leu Val Leu Gly Tyr Asp Ala Leu Gln 310 315 320 GCC GGC CTG CCC ACC GCG CCA CTG GCT TTG ACG ATC GTC GCC CTC AAC 1122 Ala Gly Leu Arg Thr Ala Pro Leu Ala Leu Thr Ile Val Ala Leu Asn 325 330 335 340 CTG GCC GGC CTC GGC CCC AAA CTC CTC GCC CCC CTC CCC ACC GCC CGC 1170 Leu Ala Gly Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ala Ala Leu Gly Thr Ala Arg 345 350 355 AGC ATC GCC CTG GGC ATC ACA CTG CTG GCC GCC GGC CTC AGC GCG GTG 1218 Ser Ile Ala Leu Gly Met Thr Leu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ala Val 360 365 370 GCC GTC CCC GGA TCC GGC CCC GAC GCC GGC TAC GGC GGC ATC CTC GCC 1266 Ala Val Gly Gly Ser Gly Pro Asp Ala Gly Tyr Gly Gly Met Leu Ala 375 380 385 GGC CTG CTC CTC ATG CCC GCG GGC ATC GCA CTG GCC ATG CCC GCC ATC 1314 Gly Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Ile Ala Leu Ala Met Pro Ala Met 390 395 400 GCC ACC GCC GTG ATG TCC TCC ATC CCG CCC GCC AAC GCC GGG GCC GGA 1362 Ala Thr Ala Val Met Ser Ser Ile Pro Pro Ala Lys Ala Gly Ala Gly 405 410 415 420 GCG GGC GTG CAG GGC ACC CTG ACC GAG TTC GGC GGC GGA CTG GGA GTG 1410 Ala Gly Val Gln Gly Thr Leu Thr Glu Phe Gly Gly Gly Leu Gly Val 425 430 435 CCC ATC CTC CCC GCC GTC CTC GGC TCC CGC TTC GCC TCC CAA CTG CCC 1458 Ala Ile Leu Gly Ala Val Leu Gly Ser Arg Phe Ala Ser Gln Leu Pro 440 445 450 GCC GCC ATC ACC GGC ACC GGC TCC CTC GAC GAG GCA CTG CGC GAC GCC 1506 Ala Ala Ile Thr Gly Thr Gly Ser Leu Asp Glu Ala Leu Arg Asp Ala 455 460 465 ACA CCC CAA CAG GCC CGC CAG GTC CAC GAC CCC TTC GCC GAC CCC GTG 1554 Thr Pro Gln Gln Ala Gly Gln Val His Asp Ala Phe Ala Asp Ala Val 470 475 480 AAC ACC AGC CAA CTC ATC GGC GCC GCC GCC GTG TTC ACC GGC GGC CTG 1602 Asn Thr Ser Gln Leu Ile Gly Ala Ala Ala Val Phe Thr Gly Gly Leu 485 490 495 500 CTC GCC CCC CTG CTG CTG CAC CGC GCC GAC CCC AAG GCC GCC CCC CAG 1650 Leu Ala Ala Leu Leu Leu His Arg Ala Asp Arg Lys Ala Ala Pro Gln 505 510 515 CCC ACC GCC CCC ACC CCC GAA CCC ACC ACC ACC GCC TGACCCCCGG 1696 Pro Thr Ala Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Thr Ala 520 525 CCCGCCGGGC ACCACACAAC CCACGGCCCC ACCCCTGCGG CTCCCCACCG GGACCCACAG 1756 GGGCGGGGCC GTGCCGCTGC CCTGCCCACA CACACAGCCC CCACACACAC AGCCCCCGCA 1816 CGGCCGACAG CGCCGGG 1833 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 528 acides amin,s (B) TYPE: acide amin, (D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: prot,ine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: Met Arg Thr Ser Arg Ser His Asp Gln Arg Ala Pro Thr Pro Trp Arg 1 5 10 15 His Pro Leu His Ser Thr Arg Pro Ala Pro Ala Ala Asp Arg Asp Pro 20 25 30 Arg Arg Trp Val Ile Leu Gly Val Ile Cys Leu Ala Gln Leu Val Val 35 40 45 Leu Leu Asp Asn Thr Val Leu Asn Val Ala Ile Pro Val Leu Thr Thr 50 55 60 Asp Leu Gly Ala Ser Thr Ala Asp Ile Gln Trp Met Ile Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Ala Leu Val Gln Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ser Leu Ala Asp 85 90 95 Arg Tyr Gly Arg Lys Arg Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Leu Phe Gly 100 105 110 Ala Gly Ser Ala Trp Ala Ala Phe Ala Gln Asp Ser Ala Gln Leu Ile 115 120 125 Ala Ala Arg Ala Gly Met Gly Val Gly Gly Ala Leu Leu Ala Thr Thr 130 135 140 Thr Leu Ala Val Ile Met Gln Val Phe Asp Asp Asp Glu Arg Pro Arg 145 150 155 160 Ala Ile Gly Leu Trp Gly Ala Ala Ser Ser Leu Gly Phe Ala Ala Gly 165 170 175 Pro Leu Leu Gly Gly Ala Leu Leu Asp His Phe Trp Trp Gly Ser Ile 180 185 190 Phe Leu Ile Asn Leu Pro Val Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala 195 200 205 Arg Leu Val Pro Glu Thr Lys Asn Pro Glu Gly Arg Arg Pro Asp Leu 210 215 220 Leu Gly Ala Val Leu Ser Thr Leu Gly Met Val Gly Val Val Tyr Ala 225 230 235 240 Ile Ile Ser Gly Pro Glu His Gly Trp Thr Ala Pro Gln Val Leu Leu 245 250 255 Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe Val Arg Trp Glu 260 265 270 Leu His Thr Pro His Pro Met Leu Asp Met Gly Phe Phe Thr Asp Arg 275 280 285 Arg Phe Asn Gly Pro Ser Pro Ala Glu Cys Ser Ser Phe Gly Met Ala 290 295 300 Gly Ser Leu Phe Leu Leu Thr Gln His Leu Gln Leu Val Leu Gly Tyr 305 310 315 320 Asp Ala Leu Gln Ala Gly Leu Arg Thr Ala Pro Leu Ala Leu Thr Ile 325 330 335 Val Ala Leu Asn Leu Ala Gly Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ala Ala Leu 340 345 350 Gly Thr Ala Arg Ser Ile Ala Leu Gly Met Thr Leu Leu Ala Ala Gly 355 360 365 Leu Ser Ala Val Ala Val Gly Gly Ser Gly Pro Asp Ala Gly Tyr Gly 370 375 380 Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Ile Ala Leu Ala 385 390 395 400 Met Pro Ala Met Ala Thr Ala Val Met Ser Ser Ile Pro Pro Ala Lys 405 410 415 Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Gln Gly Thr Leu Thr Glu Phe Gly Gly 420 425 430 Gly Leu Gly Val Ala Ile Leu Gly Ala Val Leu Gly Ser Arg Phe Ala 435 440 445 Ser Gln Leu Pro Ala Ala Ile Thr Gly Thr Gly Ser Leu Asp Glu Ala 450 455 460 Leu Arg Asp Ala Thr Pro Gln Gln Ala Gly Gln Val His Asp Ala Phe 465 470 475 480 Ala Asp Ala Val Asn Thr Ser Gln Leu Ile Gly Ala Ala Ala Val Phe 485 490 495 Thr Gly Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu His Arg Ala Asp Arg Lys 500 505 510 Ala Ala Pro Gln Pro Thr Ala Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Thr Ala 515 520 525 REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines. 2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: (a) tout ou partie des gènes snaA (SEQ ID nO 2), snaB (SEQ ID n" 4), snaC (SEQ ID n" 6), snbA (SEQ ID n" 8) et snbR (SEQ ID n" 10), (b) les séquences adjacentes aux gènes (a) constituant les clusters de biosynthèse et codant pour les polypeptides impliqués dans la biosynthèse des Streptogramines, (c) les séquences hybridant avec tout ou partie des gènes (a) ou (b) et codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines, et, (d) les séquences dérivées des séquences (a), (b) et (c) en raison de la dégénérescence du code génétique. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les gènes snaA, snaB, snaC, snbA et snbR. 4. ADN recombinant comprenant un gène de biosynthèse des Streptogramines. 5. ADN recombinant selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie des cosmides plBV1 ou pIBV2 tels que représentés sur les figures 4 et 5 ou tout ou partie de séquences hybridant avec les cosmides plBV1 ou pIBV2 ou avec des fragments de ceux-ci. '6. Vecteur d'expression à réplication autonome et/ou intégratif caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 3 ou un ADN recombinant selon l'une des revendications 4 et 5. 7. Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le cosmide plBV1 (figure 4), le cosmide pIBV2 (figure 5), le plasmide pVRC402 (figure 8(A)), le plasmide pVRC501 (figure 8(B)), le plasmide pXL2045 (figure 9), le plasmide pVRC505 (figure 10) et le plasmide pVRC507 (figure 11). 8. Cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique et/ou un ADN recombinant et/ou un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Procédé de production d'un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon la revendication 8 et on récupère le polypeptide produit. 10. Utilisation d'une cellule recombinante selon la revendication 8 exprimant un polypeptide au moins impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines, dans une réaction de bioconversion. 11. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 5 pour amplifier la production de Streptogramines. 12. Procédé de production de Streptogramines caractérisé en ce que: - on introduit et/ou on amplifie dans une cellule productrice de Streptogramines ou potentiellement productrice de Streptogramines une ou plusieurs séquences et/ou vecteurs selon l'une des revendications 1 à 7, - on cultive ladite cellule dans des conditions de production des Streptogramines, et, - on récupère les Streptogramines produites. 13. Procédé selon la revendication 12 pour la production de Pristinamycines, Mikamycines ou Virginiamycines. 14. Procédé de préparation de cellules bloquées dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines caractérisé en ce que ron effectue, sur une cellule productrice de Streptogramine, une mutagénèse sur au moins un gène de la voie de biosynthèse. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré, ou par disruption génique. 16. Mutant d'un microorganisme producteur de Streptogramines caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique au moins dans un gène impliqué dans la biosynthèse des Streptogramines. 17. Procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse des Streptogramines caractérisé en ce que: - on prépare une cellule bloquée dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines selon la revendication 14, - on cultive ladite cellule, et - on récupère l'intermédiare accumulé. 18. Procédé de préparation d'une molécule dérivée des Streptogramines caractérisé en ce que: - on prépare une cellule bloquée dans une étape de la voie de biosynthèse des Streptogramines selon la revendication 14, - on cultive ladite cellule, et, - on modifie rintermédiare accumulé par cette cellule, éventuellement après séparation du milieu de culture. 19. Utilisation d'une séquence et/ou d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'antibiotiques hybrides. 20. Polypeptide résultant de l'expression d'une séquence selon rune des revendications 1 à 5. 21. Polypeptide comprenant tout ou partie des polypeptides SnaA (SEQ ID no 3), SnaB (SEQ ID n 5), SnaC (SEQ ID n 7), SnbA (SEQ ID n 9) et SnbR (SEQ ID n 11) ou de dérivés de ceux-ci.