Brevet FR2688788A1 — publié le 19930924

i Composés hydrosolubles dérivés d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique, et applications desdits composés au support de molécules biologiques La présente invention concerne un composé hydrosoluble d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride ma- léique, un agent d'hydrophilisation d'un tel homopolymère ou copolymère, un procédé pour préparer ledit composé hy- drosoluble et enfin les applications du composé préparé.10 Les homopolymères d'anhydride maléique ou copoly- mères à base d'anhydride maléïque non hydrolysés sont in- solubles dans l'eau à p H neutre Ils deviennent peu à peu solubles par réaction d'hydrolyse en milieu aqueux, du fait de l'ouverture des cycles anhydride maléique par at-15 taque nucléophile des molécules d'eau sur les fonctions anhydride et ouverture subséquente des cycles avec produc- tion de fonctions carboxyliques. Une solubilisation directe en milieu aqueux par hydrolyse des fonctions anhydride présente l'inconvénient d'être un processus long et difficilement contrôlable En effet, on ne sait pas combien de fonctions anhydride sont consommées pour "dissoudre" le polymère. On sait par ailleurs que les homopolymères ou co- polymères d'anhydride maléique sont solubles dans certains solvants organiques. B SOLOMON et Y LEVIN (Biotechnology and Bioengi- neering, vol XVI, pages 1161-1177 ( 1974)) ont décrit un procédé de couplage d'une enzyme à des copolymères éthy- lène-anhydride maléique, selon lequel le copolymère30 d'anhydride maléique dissous dans de l'acétone à une concentration de 10 % (poids/volume) est mélangé à une préparation enzymatique, pour la fixation de cette der- nière sur le copolymère Par effet compétitif entre les molécules d'eau de la préparation enzymatique et les grou-35 pements aminés de l'enzyme, on obtient une hydrolyse du copolymère permettant à la fois sa dissolution et la fixa- tion de la fraction protéique Cependant, comme expliqué dans cette publication, il se forme un précipité partiel du copolymère ethylèneanhydride maléique au cours du mé- lange de la solution organique contenant le copolymère et5 de la solution protéique, ce qui nécessite une étape sup- plémentaire d'agitation pendant au moins une nuit, jusqu'à l'obtention de la dissolution complète du précipité Ce procédé n'est donc pas entièrement satisfaisant car il présente des difficultés techniques de mise en oeuvre d Mes10 à la formation de ce précipité. Une solution pour pallier ce problème pourrait être trouvée dans la publication de Léon GOLDSTEIN et al. (Int J Biochem 2,448,1971, Waterinsoluble derivatives of naringinase) qui consiste à mélanger le copolymère d'anhydride maléique dans une solution contenant environ à 70 % d'un solvant organique tel que l'acétone, le diméthylformamide (DMF) ou le diméthylsulfoxide (DMSO) pour la dissolution complète du copolymère et à ajouter la solution de copolymère d'anhydride maléique ainsi obtenue,20 à une solution aqueuse d'une enzyme pour la fixation de cette dernière sur le copolymère Une phase homogène est effectivement obtenue. Cependant, cette solution est particulièrement désavantageuse quand l'enzyme ou toute autre molécule bio- logique à fixer sur l'homopolymère ou copolymère est sen- sible au solvant organique, risquant d'être partiellement voire totalement dénaturée et, de ce fait, perdre toute activité biologique. La présente invention permet de résoudre les pro- blêmes posés par les solutions actuellement existantes en apportant un composé hydrosoluble dérivé d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique. Selon l'invention, ce composé présente des fonc- tions anhydride disponibles et des fonctions anhydride hy- drolysées, les fonctions anhydride hydrolysées consistant en des fonctions carboxyliques et des fonctions dérivées de fonctions carboxyliques portant un résidu d'un composé répondant à la formule I: Cx Hy Az Ot dans laquelle: A est l'atome d'azote d'une fonction amine pri- maire, secondaire ou tertiaire ou l'atome de soufre d'une fonction thiol, x, y et t indépendamment les uns des autres sont des nombres entiers non nuls, et y est un nombre entier non nul, au moins égal à quand A est un atome d'azote, et au moins égal à 4 quand A est un atome de soufre. Quand A est l'atome d'azote, le composé I est avantageusement choisi parmi le tris(hydroxyméthyl)aminométhane, l'(amino-2-éthylamino)-2- éthanol, l'amino-2-méthyl-2-propanediol-l,3, la diéthano- lamine, les polypeptides et de préférence une polytyrosine ou polyglycine, le N-BOCl,6-diaminohexane et les composés répondant aux formules générales respectivement:20 (II) OH-(CH 2)n-NH 2 (III) HO-(CH 2-CH 2)n-O-(CH 2-CH 2)n-NH 2 (IV) HO-(CH 2-CH 2-O)n-CH 2-CH 2-NH 2 dans lesquelles N est un nombre entier compris entre 1 et 50. De préférence N est compris entre 1 et 10 et le composé II est choisi parmi l'éthanolamine et l'(amino-2- éthoxy)-2-éthanol. Quand A est l'atome de soufre, le composé I est avantageusement le mercaptoéthanol. Les composés hydrosolubles de l'invention dérivés des copolymères de l'anhydride maléique sont choisis parmi les poly (anhydride maléique-éthylène), les poly (anhydride maléique-styrène), les poly (anhydride maléique-propylène), les poly (anhydride maléique-méthyl- vinyléther). De préférence, les copolymères comprennent au moins 5 % de motifs anhydride maléique. Le composé hydrosoluble est utilisé selon l'inven- tion pour immobiliser au moins une molécule biologique, à laquelle il est lié directement ou indirectement Ladite molécule biologique est notamment choisie parmi des pro- téines telles que des anticorps ou des fragments d'anti- corps ou des antigènes; des polypeptides; des enzymes; des petites molécules telles que des haptènes; des fragments10 d'acides nucléiques. Le terme "fragment d'acide nucléique" tel qu'uti- lisé dans la présente invention, signifie un fragment d'ADN ou d'ARN naturel ou un oligonucléotide naturel ou de synthèse ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse non mo-15 difié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la dimé- thylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino- 2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée. Ainsi pour immobiliser des protéines, le composé hydrosoluble de l'invention est ajouté à une solution pro- téique, les groupements aminés des protéines réagissant pour former des liaisons covalentes avec le composé dérivé de l'homopolymère ou copolymère, sur les fonctions anhy-25 dride encore disponibles, c'est-àdire les fonctions anhy- dride non hydrolysées. Selon un mode d'utilisation particulier du composé de l'invention, ce dernier est fonctionnalisé par interac- tion des fonctions anhydride disponibles, avec des fonc-30 tions réactives d'un agent de fonctionnalisation, lesdites fonctions réactives étant notamment choisies parmi les fonctions amine, thiol et hydroxyle. Au sens de la présente invention, une fonctionna- lisation est une modification chimique de l'homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique par un agent de fonc- tionnalisation, en vue de: 1) son immobilisation directe ou indirecte sur un support solide: par immobilisation directe, on entend la fixation par covalence ou adsorption passive de l'homopo- lymère ou copolymère sur ledit support solide préalable-5 ment fonctionnalisé ou non; une immobilisation directe peut être réalisée au moyen d'un ligand, préalablement fixé sur l'homopolymère ou copolymère, puis fixé chimique- ment sur ledit support solide; par immobilisation indi- recte, on entend l'interaction ligand/antiligand entre un10 ligand fixé sur l'homopolymère ou copolymère, et l'antili- gand ou ligand complémentaire fixé sur le support solide. 2) son marquage pour le détecter 3) la fixation indirecte d'une molécule biologique sur ledit homopolymère ou copolymère. L'agent de fonctionnalisation est notamment choisi parmi les haptènes, des agents colorants, luminescents, fluorescents ou phosphorescents et des polymères naturels ou synthétiques notamment polypeptides, polysaccharides et protéines solubles en milieu organique et le N-BOC-1,6-20 diaminohexane. Selon l'invention, il ressort que si la liaison entre le composé de l'invention et la ou les molécules biologiques est indirecte, le composé est lié à un agent de fonctionnalisation pouvant appartenir au groupe des25 agents cités ci-dessus, l'agent de fonctionnalisation étant lui-même lié à la ou les molécules biologiques. En outre, le composé portant la ou les molécules biologiques, fonctionnalisé ou non, peut être lié directe- ment ou indirectement à un support solide Le composé peut30 être directement lié sur un support solide par un ligand notamment choisi par les polypeptides et la polytyrosine et la polyglycine et le N-BOC-1,6-diaminohexane Quand la liaison entre le composé et le support solide est indi- recte, le composé est lié à un agent de fonctionnalisation35 qui est lié à un agent de fonctionnalisation complémen- taire, ce dernier étant lié à un support solide. Selon l'invention, le composé répondant à la for- mule I peut être à la fois, l'agent d'hydrophilisation et l'agent de fonctionnalisation et est de préférence un po- lypeptide choisi par la polytyrosine et la polyglycine ou5 le N-BOC-l,6- diaminohexane. Avantageusement, le support solide est choisi parmi les matériaux naturels, de synthèse modifiés ou non chimiquement et notamment parmi les latex, les polymères du type polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrène,10 polyacrylate et les copolymères du type de ceux à base de styrène. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes ou analogues. 15 La présente invention concerne également un agent d'hydrophilisation d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique, cet agent répondant à la formule I: Cx Hy Az Ot dans laquelle: A est l'atome d'azote d'une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire ou l'atome de soufre d'une fonction thiol, x, y et t indépendamment les uns des autres sont des nombres entiers non nuls, et y est un nombre entier non nul, au moins égal à quand A est un atome d'azote, et au moins égal à 4 quand A est un atome de soufre. L'agent hydrophilisant est un composé soluble à la fois dans l'eau et en milieu organique, capable de se fixer sur l'homopolymère ou copolymère d'anhydride ma- léïque pour lui conférer une totale solubilité en phase majoritairement aqueuse. Un autre objet de l'invention est un procédé pour obtenir un dérivé soluble en phase aqueuse à p H neutre, d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique consistant: à dissoudre l'homopolymère ou copolymère dans un solvant organique anhydre et à faire réagir l'homopolymère ou copolymère en solution, avec l'agent hydrophilisant de l'invention, en phase organique. Pour la mise en oeuvre de ce procédé, et en parti- culier pour l'étape de la dissolution, le solvant employé est de préférence de type aprotique polaire tel que le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxide (DMSO), la10 pyridine, la 1,3-diméthyl -3,4,5,6 tétrahydro-2 ( 1 H)- pyrimidinone, le dioxane, ou analogues. La quantité de solvant à employer dépend de la na- ture chimique de l'homopolymère ou copolymère, de son poids moléculaire et de la nature du solvant organique.15 Aussi pour deux polymères de poids moléculaire identique, le polymère le plus hydrophobe se dissoudra plus facile- ment dans le solvant organique La quantité de solvant est au moins égale à la quantité nécessaire pour dissoudre l'homopolymère ou copolymère à température ambiante, mais20 peut être supérieure sans pour autant nuire au bon dérou- lement du procédé. Enfin, un dernier objet de l'invention est un pro- cédé pour immobiliser une molécule biologique sur un homo- polymère ou copolymère de l'anhydride maléique consis-25 tant: à dissoudre l'homopolymère ou copolymère dans un solvant organique anhydre et à faire réagir l'homopolymère ou copolymère dis- sous avec un agent hydrophilisant selon l'invention, en phase organique et à mettre en contact le composé hydrosoluble ob- tenu avec la molécule biologique, en phase aqueuse. Le procédé d'immobilisation de l'invention peut en outre comprendre, avant la mise en contact du composé hy- drosoluble avec la molécule biologique, une étape de fonc- tionnalisation: de l'homopolymère ou copolymère d'anhydride ma- léique, quand elle est effectuée avant l'étape d'hydrophi- lisation dudit homopolymère ou copolymère ou du composé hydrosoluble, quand elle est ef- fectuée après l'étape d'hydrophilisation de l'homopolymère ou copolymère. L'étape de fonctionnalisation est effectuée en phase organique avec un agent de fonctionnalisation qui est avantageusement choisi parmi les haptènes, des agents10 colorants, luminescents, fluorescents ou phosphorescents et des polymères naturels ou synthétiques notamment poly- peptides, polysaccharides et protéines solubles en milieu organique, et le N-BOC-l,6-diaminohexane. La réaction de fonctionnalisation a lieu à des températures comprises entre + 4 C et 50 C, préférentiel- lement entre + 4 C et 37 C, et plus couramment à tempéra- ture ambiante Le temps de contact entre le ou les agents de fonctionnalisation et l'homopolymère ou copolymère s'échelonne entre 30 mn et 48 heures, préférentiellement20 entre une heure et 24 heures Une agitation du milieu réactionnel n'est pas toujours indispensable. Les différents objets de l'invention ainsi que leurs caractéristiques et avantages sont à présent illus- trés par les exemples 1 à 6 suivants:25 EXEMPLE 1 Préparation de composés hydrosolubles dérivés de copolymères de l'anhydride maléique Le Tableau 1 suivant fait apparaître les condi- tions de préparation d'un composé hydrosoluble dérivé de trois copolymères de l'anhydride maléique respectivement A, B et C:35 Copolymère A commercialisé par la Société POLYSCIENCE sous la référence 3106 Copolymère B commercialisé par la Société JANSSEN sous la référence 17 923 -77 Copolymère C commercialisé par la Société POLYSCIENCE sous la référence 3102. Selon le procédé de l'invention, le copolymère est dissous dans un solvant organique anhydre, le diméthylfor- mamide (DMF) anhydre puis l'agent hydrophilisant, l'étha- nolamine, est additionné en milieu organique La quantité à employer d'agent hydrophilisant en général et d'éthano- lamine en particulier pour cet exemple, dépend de la na- ture chimique du polymère ou copolymère, de la concentra- tion du polymère ou copolymère dans la phase organique et du volume de la phase aqueuse La quantité d'agent hydro- philisant ajoutée dépend essentiellement de l'hydrophilie15 intrinsèque du polymère ou copolymère. Ainsi, le Tableau 1 donne les quantités d'éthano- lamine nécessaire pour que 100 gl de solution de composé hydrosoluble dérivé des copolymères respectivement A, B et C, dilués dans 900 gl de milieu aqueux, fournissent une solution homogène. TABLEAU i 1 Copolymère 50/50 A B C anhydride maléique / P P styrène styrène méthylvinyl- éther Mw (masse moléculaire) 1600 50 000 67 000 quantité de copolymère (mg) 100 50 15 DMF (ml) 1 1 1 éthanolamine (g 1 l) 15 7,5 1 % des fonctions anhydride 50 50 25 consommées par l'éthanolamine EXEMPLE 2 Immobilisation d'allergènes sur un composé hydro- soluble dérivé du copolymère anhydride maléique/styrène, B de l'exemple 1, puis fixation sur des particules de latex fonctionnalisé A i ml d'une solution de B dans du DMF anhydride, on ajoute 7,5 M 1 d'éthanolamine, puis on agite pendant 30 sec Dans un tampon carbonate 100 m M p H 8,2, contenant 0,5 mg/ml d'extrait aqueux de dactyle (Laboratoire des Stallergènes) on additionne successivement 4 p 1 de solu- tion de B diluée au 1/5 dans du DMF et 200 p 1 de suspen- sion de latex aminé à 5 % de taux de solide (Société15 Bio Mérieux) pour obtenir, en final, un volume total de i ml Après agitation douce pendant 18 heures, le latex est centrifugé 5 mn à 8000 tpm dans une centrifugeuse Eppendorf Le culot est repris dans un tampon glycine 0,1 M; Na Cl 0,15 M; p H 8,2; BSA 5 g/1. * Test d'activité des allergènes immobilisés: Dans une plaque filtrante de microtitration, (Société Pall) on dépose dans chaque puits 100 il de sus- pension de latex et 50 pi de sérum Après 3 heures d'incubation à température ambiante, on procède à 2 la- vages en PBS-Tween par filtration sous vide On introduit ensuite 100 pi d'anticorps anti-Ig E marqué à la peroxydase de raifort et on laisse incuber i heure à température am- biante avant de laver deux fois Ensuite, on ajoute 250 p 130 de substrat ortho- phénylènediamine Après 30 mn d'incubation, on bloque la réaction enzymatique par addi- tion de 100 il de H 2504, on filtre dans une plaque de mi- crotitration et la densité optique du filtrat est lue sur un lecteur de plaques, à la longueur d'onde de 492 nm.35 Les résultats (exprimés en unité de D O) sont présentés dans le Tableau 2 suivant: TABLEAU 2 SERUM NEGATIF SERUM POSITIF Témoin LATEX sans 0,056 0,387 copolymère Allergènes immobilisés sur copolymère fixé sur 0,064 1,050 LATEX Le système présente de faibles bruits de fond et le signal spécifique est élevé. EXEMPLE 3 Immobilisation d'allergènes sur un composé dérivé du copolymère anhydride maléiqcrue/styrène, B de l'exemple 1, puis fixation dudit dérivé sur un support solide * Fonctionnalisation par la biotine puis hydrophi- lisation du copolymère B On ajoute 1 ml de solution de B dans du DMF anhy- dride à 1 mg de biotine hydrazide (Pierce) et on laisse agir deux heures à température ambiante Le copolymère est utilisable tel quel sans aucune étape de purification. A la solution de copolymère fonctionnalisé, on ajoute 7,5 pl d'éthanolamine en tant qu'agent hydrophili- sant. * Immobilisation d'allergènes sur la partie non fonctionnalisée du dérivé du copolymère B préparé ci- dessus: Ensuite on dilue le copolymère ainsi obtenu au 1/10 dans le DMF et l'on ajoute 2,5 gl de mélange copoly- mère-biotine à 0,5 ml de solution d'allergènes, extrait de dactyle (Laboratoire des Stallergènes) à 0,5 mg/ml en taux de protéines Après 4 heures d'incubation à température ambiante, on dialyse 18 heures à + 4 C contre un tampon phosphate 20 m M p H 7,4. * Fixation de la partie fonctionnalisée du dérivé du copolymère B sur un support solide portant un anticorps antibiotine: Dans un tube sur lequel est adsorbé un anticorps anti-biotine, on dépose 50 pl de la solution d'allergènes préparée ci-dessus, on incube une heure à température am- biante. * Test d'activité des allergènes immobilisés: Apres deux lavages en PBS Tween, on ajoute 50 Al de sérum et on incube 2 heures à température ambiante. Apres 2 nouveaux lavages, on ajoute 100 gl d'anticorps anti- Ig E marqué à la peroxydase, et on incube une heure à la même température Apres lavage, la réaction enzymatique a lieu pendant 30 min à température ambiante Après blo-20 cage par 1 ml d'acide sulfurique, la lecture est effectuée à 492 nm. Les résultats exprimés en unité de densité optique sont les suivants: SERUM NEGATIF: 0,014 SERUM POSITIF: 1,533 Le système ainsi obtenu présente un très faible bruit de fond et un bon signal spécifique. EXEMPLE 4 Immobilisation d'allergènes sur un copolymère anhydride maléiqcue/styrène fonctionnalisé et hydrophilisé par le même agent, la polytyrosine * Fonctionnalisation du copolymère: mg de copolymère styrène-anhydride maléique de poids moléculaire 360 000 sont dissous dans 1 ml de DMF. On ajoute ensuite 1 ml d'une solution de polytyrosine (Sigma, poids moléculaire 27 000) à 2 mg/ml dans du DMSO. On laisse agir 3 heures à température ambiante Le copoly- mère devient suffisamment hydrophile pour être utilisé tel quel dans les conditions de fixation d'allergènes mises au point. *Immobilisation des allergènes: A 995 pl de solution d'allergènes à 0,5 mg/ml (extrait Armoise du laboratoire des Stallergènes) dans un tampon carbonate 100 m M p H 8,2, on ajoute 5 Ml de solution de copolymère fonctionnalisé, on incube 4 heures à tempé- rature ambiante. * Test d'activité des allergènes immobilisés sur le composé hydrosoluble dérivé de B fixé sur cônes: L'allergène ainsi préparé est testé sur le système VIDAS (Marque déposée Bio Mérieux) après fixation sur les cônes selon un protocole défini par le fabriquant. Les résultats exprimés en unités relatives de fluorescence: RFU sont les suivants: SERUM NEGATIF: 116 SERUM POSITIF: 988 EXEMPLE 5 Immobilisation d'allergènes sur le composé hydro- soluble dérivé d'un copolymère de l'anhydride maléique fonctionnalisé et hydrophilisé par le même acent, le N- BOC-1,6-diaminohexane * Fonctionnalisation et hydrophilisation du copo- lymère: mg de copolymère styrène- anhydride maléique de poids moléculaire 360 000 sont dissous dans 0,7 ml de DMSO On ajoute ensuite 0,3 ml d'une solution à 3 mg/ml d'hydrochlorure de N-BOC-1,6-diaminohexane (Fluka) dans du5 DMSO, contenant 10 pl de triéthylamine (Janssen) par ml de solvant On laisse agir 3 heures à température ambiante. Le polymère devient suffisamment hydrophile pour être uti- lisé tel quel, ou dilué au demi dans du DMF, dans les conditions de fixation d'allergènes mises au point.10 *Immobilisation des allergènes: A 2490 gl de solution d'allergènes à 0,5 mg/ml (extrait Dactyle du laboratoire des Stallergènes) dans un tampon carbonate 100 m M p H 8,2, on ajoute 12,5 gl de solu- tion de copolymère fonctionnalisé dilué au demi dans du DMF, on incube 4 heures à température ambiante. * Test d'activité des allergènes immobilisés: L'allergène ainsi préparé est testé sur le système VIDAS (Bio Mérieux) après fixation sur les cônes selon un protocole défini par le fabriquant. Les résultats exprimés en unités relatives de fluorescence: RFU sont les suivants: SERUM FORTEMENT POSITIF (> 60): 13 827 SERUM POSITIF ( 15): 3 191 SERUM FAIBLEMENT POSITIF ( 1,4): 1 568 SERUM TRES FAIBLEMENT POSITIF ( 0,44): 255 SERUM NEGATIF: 133 Ces méthodes d'immobilisation d'allergènes sur une phase solide selon Exemples 4 et 5 présentent un net avan- tage par rapport à celle décrite dans l'Exemple 3 en ce35 que, étant directes, elles ne nécessitent pas l'emploi d'un anticorps antibiotine Le protocole est aisé à mettre en oeuvre. EXEMPLE 6 Immobilisation d'anticorps monoclonaux anti-alpha- foeto-protéine (anti-AFP) sur le composé hydrosoluble dé- rivé d'un copolymère de l'anhydride maléique B ou C de l'exemple 1 fonctionnalisé par la biotine, puis fixation10 sur support solide portant un anticorps anti-biotine * Fonctionnalisation du copolymère: Le copolymnère B est fonctionnalisé par la biotine et rendu hydrosoluble selon le prototype décrit dans l'Exemple 3. Le copolymère C est fonctionnalisé et rendu hydro- soluble comme suit: A 1 ml de solution C, on ajoute 0,1 ml de solution de biotine hydrazide à 2,5 mg/ml On laisse agir pendant deux heures, après quoi le copolymère fonctionnalisé est traité par l'éthanolamine. * Immobilisation des anticorps sur la partie non fonctionnalisée du dérivé du copolymère B ou C préparé ci- dessus: A une solution d'anticorps à 0,5 mg/ml en final dans un tampon carbonate p H 8,2, 100 m M, on ajoute 5 Ml de solution de composé hydrosoluble fonctionnalisé dérivé du copolymère B ou C On incube 1 heure à 37 C avant de dia-30 lyser 4 heures à température ambiante contre du PBS. * Fixation de la partie fonctionnalisée du composé dérivé du copolymère B ou C sur un support solide portant un anticorps antibiotine:35 Un anticorps antibiotine à raison de 2 Mg d'anticorps par puits est fixé sur une plaque de microti- tration (NUNC, nom commercial) durant 2 heures à 37 C avant saturation en gélatine 0,5 % On dépose dans les5 puits de la plaque ainsi obtenue un volume de solution d'anticorps anti-AFP immobilisés On laisse 1 heure à 370 C. * Test d'activité des anticorps immobilisés: Après 3 lavages en PBS Tween, on introduit une gamme en antigène (AFP) On laisse incuber 1 heure à 37 C, on lave 3 fois en PBS Tween La présence de l'antigène est détectée par un conjugué phosphatase alcaline anticorps15 polyclonal complémentaire On incube 1 heure à 37 C La révélation est effectuée par le substrat paranitrophényl phosphate (p NPP) Après blocage avec Na OH IN, la lecture s'effectue sur un lecteur de plaques, à une longueur d'onde de 405 nm.20 Les résultats obtenus sont montrés dans la figure 1 La courbe intitulée P 3 est celle de l'anticorps seul On voit ainsi que ce dernier n'est pas, ou très peu, adsorbé non spécifiquement par la plaque de microtitration revêtue d'anticorps antibiotine.25 La courbe intitulée AMVE est celle obtenue avec le copolymère C méthylvinyléther-anhydride maléique La courbe désignée SAM est celle obtenue en utilisant le co- polymère B styrène-anhydride maléïque Le copolymère méthylvinyléther anhydride maléique donne des signaux30 plus forts (courbe AMVE) que le copolymère styrène- anhydride maléique (courbe SAM), toute chose étant égale par ailleurs (concentration en anticorps au moment du cou- plage, concentration en biotine sur le polymère). Plus hydrophile que le copolymère styrène- anhydride maléïque, le copolymère méthylvinyléther- anhydride maléique conserve mieux l'intégrité de l'anticorps en ne provoquant qu'une faible dénaturation. EXEMPLE 7 Utilisation d'un composé hydrosoluble dérivé du copolymère anhydride maléiqcrue/méthylvinvléther, fonction- nalisé par la biotine, comme amplificateur chimique Dans divers phénomènes biologiques, et tout parti- culièrement dans le domaine du diagnostic, pour atteindre des niveaux de sensibilité élevés, il peut être nécessaire d'amplifier artificiellement un signal spécifique (par exemple: détection de matériel biologique présent en15 faible quantité tel que des ADN ou fragments d'ADN). Dans ce but, des quantités croissantes de biotine- hydrazide (Pierce) ont été mises en réaction avec le copo- lymère anhydride maléique/méthylvinyléther, C, de l'Exemple 2 pour obtenir des copolymères fonctionnalisés.20 Ces derniers ont été traités par l'éthanolamine pour conduire à des composés fonctionnalisés hydrosolubles que l'on appelle poly-biotine. Dans des puits d'une plaque de microtitration (NUNC), on fixe une quantité constante des diverses poly- biotines, par l'intermédiaire d'un anticorps antibiotine, immobilisé au fond des puits selon la méthode décrite dans l'exemple 5 La présence de la biotine est révélée par un conjugué streptavidine peroxydase qui se fixe en formant un complexe avec la biotine.30 La détection, à l'aide de la streptavidine mar- quée, diluée 1/10 000 en PBS gélatine 0,5 %O, s'effectue de la façon suivante: incubation du conjugué streptavidine-peroxydase pendant une heure à 37 C; 3 lavages en PBS Tween; ajout du substrat orthophénylènediamine (OPD), blocage par H 2504 et lecture à 492 nm. La figure 2 montre le signal obtenu en fonction des quantités de biotine fixée sur le poly(méthylvinyléther anhydride maléique) On observe qu'il y a une amplification du signal par un facteur 6 en- viron quand on passe de 0,05 mg de biotine à 1,5 mg de biotine pour 15 mg de polymère. REVENDICATIONS 1) Composé hydrosoluble dérivé d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique présentant des fonc- tions anhydrides disponibles et des fonctions anhydrides5 hydrolysées, caractérisé en ce qcrue les fonctions anhydride hydrolysées consistent en des fonctions carboxyliques et des fonctions dérivées de fonctions carboxyliques portant un résidu d'un composé répondant à la formule I: Cx Hy Az Ot dans laquelle: A est l'atome d'azote d'une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire ou l'atome de soufre d'une fonction thiol, x, y et t indépendamment les uns des autres sont des nombres entiers non nuls, et y est un nombre entier non nul, au moins égal à quand A est un atome d'azote, et au moins égal à 4 quand A est un atome de soufre. 2) Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que A est l'atome d'azote et le composé I est choisi parmi le tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 1 ' (amino-2- éthylamino)-2-éthanol, 1 'amino-2-méthyl-2-propanediol-1,3, la diéthanolamine, les polypeptides et notamment polytyro- sine ou polyglycine, le N-BOC-1,6-diaminohexane et les25 composés répondant aux formules générales respectivement: (II) OH-(CH 2)n- NH 2 (III) HO-(CH 2-CH 2)n-O-(CH 2-CH 2)n-NH 2 (IV) HO-(CH 2- CH 2-O)n-CH 2-CH 2-NH 2 dans lesquelles N est un nombre entier compris entre 1 et 50. 3) Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que N est compris entre 1 et 10 et le composé II est choisi parmi 1 ' éthanolamine et 1 ' (amino-2-éthoxy)-2- éthanol. 4) Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que A est l'atome de soufre et le composé I est le mercaptoéthanol. 5) Composé selon la revendication 1, caractérisé S en ce que les copolymères de l'anhydride maléique sont choisis parmi les poly (anhydride maléique-éthylène), les poly (anhydride maléique-styrène), les poly (anhydride maléique-propylène), les poly (anhydride maléique- méthyl- vinyléther).10 6) Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le copolymère de l'anhydride maléique comprend au moins 5 % de motifs anhydride maléique. 7) Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est lié directement ou indirectement à au moins une molécule biologique choisie parmi les protéines, les anticorps, fragments d'anticorps ou antigènes, les polypeptides, les enzymes, les haptènes, les fragments d'acides nucléiques. 8) Composé selon la revendication 1 ou 7, caracté- risé en ce qu'il est fonctionnalisé par interaction des fonctions anhydride disponibles, avec des fonctions réac- tives d'un agent de fonctionnalisation, ledit agent de fonctionnalisation étant choisi parmi les haptènes, des agents colorants, luminescents, fluorescents ou phospho-25 rescents et des polymères naturels ou synthétiques notam- ment polypeptides, polysaccharides et protéines solubles en milieu organique, et le N-BOC-1, 6-diaminohexane. 9) Composé selon la revendication 7 ou 8, caracté- risé en ce qu'il est lié à un agent de fonctionnalisation lui-même lié à une molécule biologique. ) Composé selon la revendication 7 ou 8, carac- térisé en ce qu'il est immobilisé directement ou indirec- tement sur un support solide. 11) Composé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est immobilisé sur un support solide par un ligand choisi parmi la polytyrosine, la polyglycine et le N-BOC-1,6-diaminohexane. 12) Composé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est lié à un agent de fonctionnalisation lui- même lié à un agent de fonctionnalisation complémentaire, ce dernier étant lui-même lié à un support solide. 13) Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule I est à la fois l'agent hydrophilisant et l'agent de fonctionnalisa-10 tion. 14) Composé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent hydrophilisant est choisi parmi la poly- tyrosine, la polyglycine et le N-BOC-1,6-diaminohexane. 15) Agent d'hydrophilisation d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique caractérisé en ce qu'il répond à la formule I: Cx Hy Az Ot dans laquelle: A est l'atome d'azote d'une fonction amine pri- maire, secondaire ou tertiaire ou l'atome de soufre d'une fonction thiol, x, y et t indépendamment les uns des autres sont des nombres entiers non nuls, et y est un nombre entier non nul, au moins égal à 5 quand A est un atome d'azote, et au moins égal à 4 quand A est un atome de soufre. 16) Procédé pour obtenir un dérivé soluble en phase aqueuse à p H neutre, d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique caractérisé en ce que:30 on dissout l'homopolymère ou copolymère dans un solvant organique anhydre et on fait réagir l'homopolymère ou copolymère en solution, avec un agent hydrophilisant, selon la revendi- cation 15, en phase organique. 17) Procédé pour immobiliser une molécule biolo- gique sur un homopolymère ou copolymère de l'anhydride ma- léique caractérisé en ce que: on dissout l'homopolymère ou copolymère dans un solvant organique anhydre, et on fait réagir l'homopolymère ou copolymère dis- sous avec un agent hydrophilisant selon la revendication , en phase organique on met en contact le composé hydrosoluble obtenu avec la molécule biologique, en phase aqueuse. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'avant la mise en contact du composé hydrosoluble avec la molécule biologique, on fonctionnalise l'homopo- lymère ou copolymère d'anhydride maléique au moyen d'un15 agent de fonctionnalisation, en phase organique.