Brevet FR2695139A1 — publié le 19940304

La présente invention a pour objet un nouvel additif de biodégradation et son application pour le traitement de milieux souillés par des hydrocarbures, par accélération de la biodégradation naturelle. I1 existe de nombreux procédés mettant en oeuvre des cultures de micro-organismes, qui sont développées en conditions contrôlées (dans des réacteurs par exemple) et ensuite appliquées sur le milieu à traiter. Mais ces procédés ne sont pas efficaces dès qu'il s'agit de travailler en milieu ouvert. On observe en effet des problèmes liés à la dilution des micro-organismes dans le milieu naturel, et des problèmes de compétition avec les micro-organismes indigènes bien mieux adaptés au milieu considéré. C'est pourquoi on s'est orienté vers la solution dans laquelle on stimule les micro-organismes indigènes en leur apportant des éléments nutritifs nécessaires à leur développement et qui sont limitants dans le milieu naturel. Aussi, a-t-on proposé des additifs nutritionnels qui sont additionnés au milieu à traiter. Ces additifs peuvent être des fertilisants du type de ceux utilisés en agriculture, ou des produits protéiques de synthèse, ou encore des lyophilisats bactériens avec le nutriment. Ces produits satisfont aux besoins en carbone, azote, phosphore des bactéries. Les besoins particuliers des micro-organismes en azote et phosphore correspondent à un rapport molaire N/P variable dans une large mesure, sans altération sensible de l'effi- cacité. Outre l'azote et le phosphore, ces additifs comportent du carbone assimilable. Ce carbone assimilable est contenu dans des molécules hydrocarbonées dont la chaîne est similaire à une chaîne aliphatique que l'on rencontre dans les hydrocarbures.Par ailleurs, ces produits servent de "starter", c'est-à-dire qu'ils favorisent la réaction dans les premiers instants. La disponibilité des nutriments est aussi un problème important, puisque celle-ci conditionne la cinétique de dégradation des hydrocarbures. Afin d'accélérer cette cinétique, on a proposé diverses solutions, qui consistent à mélanger les nutriments avec des additifs divers et à former des suspensions, et surtout des émulsions. FR-A-2 490 672 décrit des microémulsions dans lesquelles les substances nutritives sont dans une solution aqueuse qui est microémulsionnée dans un liquide lipomiscible. Cependant, cette technique implique l'étape de formation de la microémulsion et nécessite la présence d'additifs tels que des tensio-actifs et autres, qui sont coûteux.FR-A-2 512 057 décrit une amélioration de la solution proposée dans le brevet précédemment cité qui consiste à apporter la source d'azote sous la forme d'un système dual comportant deux sortes chimiquement différentes de composés azotés. Un système préféré est un système consistant en urée et acides aminés. Par ailleurs, ce brevet enseigne que les acides aminés seuls ne sont pas aussi efficaces que le système dual. Ce système dual étant aussi une microémulsion, il souffre des mêmes inconvénients que toute (micro)émulsion. Cependant, ces additifs de synthèse présentent des problèmes de toxicité, du fait de la présence de dérivés, tel par exemple du butoxyéthanol, et autres produits similaires. Aussi recherche-t-on des produits naturels en tant qu'additifs; mais le problème est que ces produits ne contiennent pas de carbone sous une forme proche d'un groupe aliphatique du type de ceux présents dans les hydrocarbures et, par là, ne sont pas susceptibles de conduire à un effet starter. Par ailleurs, on recherche des additifs qui puissent s'utiliser sans nécessiter une (micro)émulsion ou l'emploi d'additifs coûteux. On connaît par ailleurs l'emploi de farines animales en tant que nutrient pour des microorganismes, ceux-ci étant en solution ou suspension aqueuse. Biosis Previews Databank. Philadelphia, Biosis Number: 83042449, G.A. Kochkina et al.: "Development of a Nutrient Medium for Cultivating Ntomophthora-Thaxteriana" & Biotekhnologiya, vol. 4, 1986, pages 46-51, décrit l'utilisation de farine de poisson comme nutrient pour la culture d'un microorganisme, par exemple Entomophthora-Thaxteriana fungi. Biosis Previews Databank, Philadelphia, Biosis Number: 70050436, M. Rusan et al.: "Influence of Animal Proteins on the Fermentation of Antibiotics" & Bol Soc Broteriana 52, vol. 0, 1978, (Recd. 1979), pages 29-36, décrit l'utilisation de farines de viandes ou de sang comme source d'azote pour la production d'antibiotiques à partir de microorganismes de type fungi. Biosis Previews Databank, Philadelphia, Biosis Number: 70043472, O. Yagi et al.: "Degradation of Poly Chlorinated Bi Phenyls by Microorganisms" & J. Water Pollut Control Fed 52, vol. 5, 1980, pages 1035-1043, décrit l'utilisation de microorganismes pour la lutte contre la pollution, de l'extrait de viande étant additionné au milieu de culture. Cependant, il n'y a aucune indication que ces mêmes farines puissent aussi être utilisées dans un milieu souillé par un hydrocarbure, c'est-à-dire aussi différent qu'un milieu aqueux simple. De façon surprenante, la demanderesse a trouvé que l'additif selon la présente invention répond à toutes les exigences énoncées ci-avant. Ainsi, la présente invention a pour objet un additif de biodégradation caractérisé en ce qu'il consiste en au moins une farine animale, ladite farine comprenant au moins une source d'azote assimilable consistant en au moins un acide aminé. Par biodégradation, on entend la dégradation par un micro-organisme, présent in situ ou rapporté. Cette application peut donc être réalisée en milieu ouvert en présence d'une flore bactérienne indigène, ou sur sols en présence d'une flore bactérienne spécifique rajoutée, si celle en présence est jugée insuffisante. Le micro-organisme utilisé peut être une levure, un champignon, une bactérie; en fait tout micro-organisme susceptible de dégrader un hydrocarbure est approprié. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer Pseudomonas, Acitenobacter, Flavobacterium, Artrobacter, Corynebacterium. Par azote assimilable, on entend l'azote effectivement métabolisé par le micro-organisme lors de la dégradation. Les acides aminés qui peuvent être utilisés dans la cadre de la présente invention peuvent être tout acide aminé, naturel ou les acides de synthèse proches tels que 1 'orni- tine, et autre. Ces acides aminés peuvent être non-substitués ou substitués. Lorsqu'ils sont substitués, le substituant est un groupe alkyle, alkoxy inférieur, hydroxy et autre. De préférence, l'acide aminé est choisi dans le groupe consistant en: lysine, méthionine, cystine, thréonine, tryptophane, hydroxylysine, hydroxyproline, et leurs mélanges. De préférence, la source d'azote assimilable représente au moins 5% en poids du poids total dudit additif de biodégradation. Selon un mode réalisation de la présente invention, la source d'azote assimilable se trouve dans des protéines représentant au moins 50% en poids du poids total dudit additif. Selon une variante, la farine est une farine de poisson. Selon une autre variante, la farine est une farine de viande. Les farines de poisson ou de viande sont obtenues par tout procédé classique de fabrication. A titre d'exemple, on peut citer le procédé suivant pour la farine de viande: dépecage des cadavres, broyage de ceux-ci, calibrage, préchauffage, égouttage, séchage, presse et broyage final. A titre d'exemple pour la farine de poisson, on peut citer le procédé suivant: déchiquetage, cuisson, presse, mélange avec un concentré de jus de presse, séchage, tamisage, et broyage final. La composition de ces farines peut varier dans une large mesure; à titre d'exemple représentatif mais non-limitatif on donne ci-après des compositions pour diverses farines. Farines de poisson: protéines: 60 à 85% dont acides aminés principaux: lysine, méthionine, thréonine. matières grasses: 3 à 25%. matières minérales (phosphore, calcium, chlorures): 5 à 24%, Farines de viande: protéines: 60 à 85% dont acides aminés principaux: lysine, thréonine, hydroxyproline. matières grasses: 2 à 7. matières minérales (phosphore, calcium, chlorures): 7 à 28%, L'utilisation des additifs selon la présente invention, telles que farines de viande ou poisson, est donc utile pour la biodégradation des hydrocarbures sur sols, sédiments et à la surface de l'eau. Les sédiments souillés par hydrocarbures peuvent provenir de déversements accidentels d'hydrocarbures ou non, tels que nettoyage de bassins, chaussée, sols, ... Cette utilisation est tout aussi adaptée et profitable, dans le cas de traitement en milieux fermés, tels que réacteurs, bourbier, stockage d'hydrocarbures et autres. La proportion d'additif par rapport à l'hydrocarbure est variable. Le rapport massique radditif]/hydrocarbures] est généralement comprise entre 3 et 30. De préférence, le rapport massique est égal à environ 10. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation des présents additifs pour la biodégradation d'hydrocarbures. Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail, sans toutefois la limiter. EXEMPLES COMPOSITION DES ADDITIFS La composition des additifs de biodégradation est donnée dans le tableau ci-après. Produits % Azote % Phosphore N/P % Carbone (N) (P) (C) . farine de poisson ... 12,1 0,6 20,2 50,1 (Solatlante G) . farine de viande 60 % ... 9,8 3,95 2,5 35,4 (d'extraction Viandor) . farine de viande 70% ... 12,0 3,1 3,9 40,8 (Creton d'extraction Viandor) . farine de viande 80% ... 12,9 1,4 9,2 40,5 (Creton d'extraction Viandor) Ces farines présentent les caractéristiques analytiques moyennes suivantes. POISSON VIANDE60% VIANDE70; VIANDE80% PROTEINES 70-73 60 70 80 Lysine 5,20 3,25 4,20 4,80 Méthionine 2,05 o,85 1,00 1,20 Cystine 0,55 0,85 0,42 0,48 Thréonine 2,65 2,00 2,40 2,75 Tryptophane 0,70 0,45 0,70 1,10 Hydroxylysine - 0,45 0,42 0,48 Hydroxyproline - 3,42 3,85 4,40 HUMIDITE 3-5 4-9 3-7 3-7 MATIERES GRASSES 20-23 2-6 2-4 2-4 MATIERES MINERALES 5-7 25-28 17-20 7-10 Phosphore 0,40-0,80 3,5-4,2 2,9-3,3 1,2-1,6 Calcium 0,15-0,50 7-9 5,5-7,0 2,4-3,7 Chlorures (NaCl) 2-3 1,4-1,6 1,1-1,5 0,8-1,0 EXEMPLE 1 Accélération de la biodégradation des hydrocarbures en milieu contrôlé en laboratoire Les cultures bactériennes sont réalisées dans des réacteurs fermés, qui sont des erlenmeyers de 250 ml, continuellement agités grâce à des agitateurs magnétiques (200 tr/min). Ces erlenmeyers, préalablement stérilisés, étaient bouchés par des bouchons adaptés. La flore bactérienne utilisée est une flore marine complexe (1,4.104 bact/ml) prélevée à Biarritz. Les différents milieux utilisés sont les suivants: réacteur n" 1 .. témoin sans additif de biodégradation réacteur n' 2 .. farine de poisson réacteur n' 3 .. farine de viande à 70% de protéines réacteur n' 4 .. farine de viande à 60% de protéines réacteur n' 5 .. farine de viande à 80% de protéines . réacteur n 6 .. témoin stérile (100 mg/l HgCl2) Tous les milieux nutrififs, mis à part les témoins, sont composés de:: . 0,5 g/l de brut * . 0,05 g/l d'additifs de biodégradation (soit 10%/brut) . 160 ml d'eau de mer ** (eau de dilution et inoculum) * Brut: Arabian Light étêté à 1500C: BAL 150 ** Eau de mer: 2,2 mg N-NO3/l, pH 7,8. Le témoin stérile permet de quantifier l'élimination due à l'évaporation. Le témoin sans additif de biodégradation permet d'estimer les potentialités de la flore marine complexe à dégrader naturellement les hydrocarbures. Le suivi de la biodégradation est obtenu par analyse de la flore bactérienne marine et de la disparition des hydrocarbures aliphatiques. Le dénombrement des bactéries hétérotrophes totales est réalisé sur gélose (MARINE AGAR DIFCO) après incubation pendant 7 jours à 27"C. Le suivi des modifications de la composition des hydrocarbures est obtenu par l'analyse de la fraction aliphatique des hydrocarbures; la biodégradation est suivie par l'estimation des ratios C17/pristane et C18/phytane. Le pristane et le phytane étant plus difficiles à biodegrader que les alcanes en C17 et C18, l'évolution des ratios peut permettre de quantifier la biodégradation de la fraction aliphatique des hydrocarbures. (L'estimation de la quantité de brut résiduelle est effectuée par: - extraction de tout l'échantillon au chloroforme (100 ml), évaporation du chloroforme à l'évaporateur rotatif, i.e. au rotavapor, - analyse des hydrocarbures repris dans de l'hexane en chromatographie phase gazeuse. Cette dernière étape permet l'estimation de la biodégradation par le calcul des rapports C17/pristane et C18/phytane.) Les différents milieux, mis dans les réacteurs, sont agités pendant 18 jours, à 20 C, à l'obscurité. Au bout de 18 jours, un dénombrement bactérien est effectué avant de stopper la réaction par ajout de chloroforme pour analyse du brut résiduel. Le développement bactérien est représenté dans le tableau I. Les réacteurs dans lesquels a été ajouté un additif de biodégradation ont un développement bactérien supérieur au témoin après 18 jours d'incubation. TABLEAU I Valeur des dénombrements bactériens réalisés après 18 jours de culture Additifs Bactéries totales/ml Jour O Jour 18 . témoin... 1,4.104 3,5.104 . farine de poisson... 1,4.104 5,3.105 . farine de viande 60%... 1,4.104 1.105 . farine de viande 70% .. 1,4.10 4,7.105 . farine de viande 80% .. 1,4.10 4,6.105 témoin stérile ... O 0 La quantité de brut éliminée par biodégradation est représentée dans le tableau II. TABLEAU II Elimination de la fraction aliphatique des hydrocarbures par biodégradation Additifs Elimination par biodégradation . témoin... 0% . farine de poisson... 38,7% . farine de viande 60% .. 49,8% . farine de viande 70% .. 44,7% . farine de viande 80%... 46,2% . témoin stérile... 0% Tant le développement bactérien que la biodégradation du BAL 150 sont accélérés. EXEMPLES 2 à 3 Accélération de la biodégradation des hydrocarbures d'un sol pollué par ajout d'additifs de biodégradation (farines animales), avec ou sans aération Afin de tester l'utilisation des farines animales dans des conditions de traitement in situ, deux séries de tests sont effectués en traitement de sols pollués par l'hydrocarbures: le premier est le traitement d'un sol par ajout d'additifs de biodégradation, le second est le même traitement auquel on a rajouté un traitement mécanique d'aération. Premier test Le traitement de sols souillés par hydrocarbures consiste en l'apport de farine animale sur le sol pollué. Cette farine animale permet le développement des bactéries déjà présentes sur le site et facilite la biodégradation des hydrocarbures. Dans cet essai, une farine de viande (60% de protéine: voir composition exemple 1) est testée comme additif de biodégradation pour le traitement de parcelles de terre (1 m2) souillées par hydrocarbures. Une parcelle traitée et une parcelle témoin (sans ajout de farine) sont suivies pendant 2 mois. Le taux d'humidité de la terre est contrôlé et maintenu à 15-20* pendant les deux mois. L'épandage du brut (Arabian Light étêté à 150 C: BAL 150) est réalisé, à raison de 3 kg/m2, deux mois avant application du traitement. La quantité de farine appliquée est de 225 g/m2 (7,5% par rapport aux hydrocarbures). Les échantillons ont été prélevés par carottage sur 20 cm, à 0, 7, 15, 30 et 60 jours. Le suivi de la biodégradation est réalisé par analyse de la flore bactérienne du sol et de la disparition des hydrocarbures par biodégradation. Le dénombrement des bactéries totales hétérotrophes aérobies est réalisé sur gélose (milieu glucose) après incubation pendant 7 jours à 27"C. Le dénombrement de la flore spécifique hydrocarbure est réalisé sur milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (incubation à 27"C pendant 21 jours). L'estimation de la quantité de brut résiduelle est effectuée comme décrit dans l'exemple 1, à savoir par l'analyse des rapports C17/pristane et C18/phytane. Les résultats obtenus pour l'analyse de la flore bactérienne sont présentés dans le tableau III. TABLEAU III Evolution temporelle des flores bactériennes totales aérobies et spécifiques hydrocarbures Jours Témoin Parcelle traitée avec farine Bactéries totales hétérotrophes aérobies/g sédiment sec 0 6,4.104 5,6.104 7 1,1.105 6,9.105 15 4,2.104 2,2.105 30 8,5.105 5,3.106 60 1,6.105 2,6.105 Jours Témoin Parcelle traitée avec farine Bactéries spécifiques hydrocarbures/g sédiment sec 0 2,5.103 5,6.104 7 2,8.104 6,9.1ou 15 1,1.104 2,2.105 30 2,3.105 5,3.106 60 4,8.104 2,6.105 L'évolution temporelle des bactéries, totales et spécifiques hydrocarbures, dans la parcelle traitée à la farine animale montre un développement plus important que dans la parcelle témoin.Ceci montre que l'activité bactérienne dans la parcelle traitée est supérieure, elle est stimulée par la présence de la farine animale. Les résultats en biodégradation des hydrocarbures aliphatiques sont présentés dans le tableau IV. TABLEAU IV Taux de biodégradation (t) des hydrocarbures aliphatiques Jours Témoin Parcelle traitée avec farine taux de biodégradation des hydrocarbures aliphatiques g O O O 7 7,5 0 15 17,0 29,0 30 21,0 53,0 60 28,0 53,0 Les résultats indiquent une nette différence entre la biodégradation observée dans la parcelle témoin et dans la parcelle traitée avec farine. La farine de viande stimule donc bien la biodégradation des hydrocarbures sur sol pollué, sans apport de bactéries. Second test Il s'agit d'un test similaire avec ajout cette fois d'un traitement d'aération mécanique. Au cours de cet essai, nous avons utilisé une boue huileuse contenant 23% d'hydrocarbures. Les farines sont apportées à raison de 5% en poids d'hydrocarbures au moment de l'épandage et un nouvel apport a lieu six semaines après. Trois types de farines animales sont testés; viande 70% et 80% et poisson (composition: voir exemple 1). Les parcelles traitées sont comparées à une parcelle témoin. La durée de l'expérimentation est de deux mois. Pour chaque parcelle, un échantillon moyen est constitué à partir de six prélèvements sur une profondeur de 10 cm. Les prélèvements sont effectués toutes les semaines pendant 8 semaines puis les semaines 10, 14, 18 à compter du début de l'expérience. Une aération est pratiquée la quatrième semaine. L'évaluation de la population bactérienne aérobie totale et spécifique est faite par comptage de colonies isolées sur boîte de Pétri (milieu glucose et milieu 90% essence; 10% gaz-oil). La fraction volatile du milieu est évaluée par distillation des échantillons prélevés sur la parcelle boues seules. Le dosage des hydrocarbures résiduels s'effectue par gravimétrie sur l'extrait sec de chaque prélèvement. Le taux de biodégradation des hydrocarbures est déterminé après passage en chromatographie en phase gazeuse de la fraction alcane. Les résultats de l'évolution de la flore bactérienne totale hétérotrophe aérobie et spécifique hydrocarbures sont reportés dans le tableau V. TABLEAU V Evolution de la flore bactérienne totale aérobie et spécifique hydrocarbures sur sol souillé par hydrocarbures après traitement avec différentes farines animales ou non traité, et avec aération mécanique du sol Un second ajout de farine est effectué à la semaine 6. Semaine Témoin Viande 70% Viande 80% Poisson Bactéries totales aérobies/g de sédiment sec 0 2,00E+05 1,50E+06 2,80E+05 3,30E+05 1 8,60E+04 1,50E+07 1,10E+08 4,80E+07 2 2,40E+05 1,40E+08 2,10E+08 7,20E+07 3 7,30E+05 1,70E+08 1,80E+08 1,80E+08 4 5,20E+05 6,40E+07 8,30E+07 3,70E+07 5 3,10E+05 5,60E+07 4,20E+07 5,30E+07 6 1,40E+05 1,50E+07 9,90E+07 3,20E+07 7 4,40E+05 2,60E+08 2,40E+08 5,30E+08 8 7,00E+05 3,50E+08 5,30E+08 4,80E+08 10 6,40E+04 9,20E+07 1,20E+08 1,80E+08 14 4,90E+04 7,90E+07 1,30E+08 1,30E+08 18 1,20E+05 8,30E+07 1,40E+08 4,90E+07 Bactéries spécifiques/g de sédiment sec 0 2,40E+03 5,10E+04 9,90E+03 9,40E+03 1 9,60E+03 4,00E+06 2,40E+07 6,00E+06 2 3,40E+03 7,20E+07 7,20E+07 2,90E+07 3 9,30E+03 1,60E+Ç)7 4,80E+07 3,60E+07 4 5,00E+03 6,20E+06 1,30E+07 7,80E+06 5 4,60E+03 3,80E+06 6,70E+06 1,90E+07 6 1,40E+03 3,10E+06 1,10E+07 1,20E+07 7 2,90E+03 6,50E+07 1,90E+08 3,70E+08 8 5,10E+04 1,00E+08 1,10E+08 1,10E+08 10 1,40E+03 1,40E+07 6,50E+06 3,30E+07 14 4,10E+03 1,70E+07 8,40E+06 2,90E+07 18 6,20E+03 6,20E+06 5,80E+06 6,90E+07 On observe une croissance rapide les deux premières semaines, puis la flore décroît. L'aération et la seconde addition de farine provoquent une nouvelle croissance. Les développements bactériens observés en présence de farines animales sont nettement supérieurs à ceux observés dans la parcelle témoin (boues). Cela indique que les farines animales stimulent les flores bactériennes. Les résultats obtenus pour l'évaluation de la biodégradation sont présentés dans le tableau VI. TABLEAU VI Taux de biodégradation (%) des hydrocarbures aliphatiques dans un sol pollué par hydrocarbures, traité et non traité Semaine Témoin Viande 70% Viande 80% Poisson Taux de biodégradation des hydrocarbures aliphatiques % O 0 O O O 1 - - 12,6 30 2 6,1 17,1 3 - 25,9 - 42,2 4 12,4 - 43,7 5 - - 52,4 60,3 6 35,2 80,3 70,9 7 - - 78,6 84,4 8 65,2 93,3 77,7 84,8 L'étude des chromatogrammes permet d'observer la disparition des hydrocarbures aliphatiques révélatrice de la biodégradation. L'évolution du taux de biodégradation en fonction du temps montre que les farines de viande et de poisson ont un effet accélérateur sur la biodégradation. En effet, après quatre semaines d'épandage, le taux de biodégradation pour les farines de viande et de poisson est de l'ordre de 40% alors qu'il est seulement de 10% pour le témoin boues seules. L'application de farines animales sur sols souillés par hydrocarbures accélère donc la biodégradation des hydrocarbures. EXEMPLE 4 Accélération de la biodégradation des hydrocarbures de sédiments sableux souillés en zone supratidale L'étude de la biodégradation des hydrocarbures sur sable a été réalisée en milieu ouvert dans des bassins de 600 litres dans lesquels une plage de sable a été reconstituée. Les bassins sont alimentés à raison d'un renouvellement journalier avec de l'eau de mer issue d'un pompage situé à proximité. Après avoir laissé le système se stabiliser pendant 1 mois, le sable est souillé par 2 litres d'hydrocarbure BAL 150 (Arabian Light etêté à 1500C) par m2 de sable et laissé reposer pendant une semaine avant traitement. Un bassin a été traité avec de la farine animale (10% poids d'hydrocarbure; farine de viande à 60% de protéines, voir composition exemple 1), un autre a servi de témoin. Un suivi bactériologique (bactéries totales hétérotrophes aérobies et bactéries spécifiques hydrocarbures) est réalisé sur le sédiment. Le nombre de bactéries est ramené au poids de sédiment sec. Les bactéries marines hétérotrophes aérobies sont dénombrées sur milieu gélosé Zobell-2216E. Les bactéries marines spécifiques hydrocarbures sont dénombrées en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable et consultation des tables de MC CRADY. Le taux d'humidité du sable est de 17,0% +0,5%. Un suivi des hydrocarbures est également réalisé dans le sédiment. L'estimation de la quantité de brut résiduelle est effectuée comme décrit dans l'exemple 1, à savoir par l'analyse des rapports C17/pristane et C18/phytane. Les sédiments sont échantillonnés aux temps: 0, 7, 15, 30, 45 et 60 jours. La température moyenne extérieure peuvent atteindre 30"C pendant la journée. La température de l'eau moyenne est de 25"C, sa salinité de 40 /00 et son pH de 8. L'expérimentation est menée sans marée, ce qui signifie que la biodégradation est étudiée dans une zone supratidale. Différents carottages permettent d'observer que le brut pénètre dans les 5 premiers centimètres de sédiment. I1 reste donc dans la zone supratidale où les conditions d'oxygénation sont correctes. Les résultats obtenus pour l'analyse de la flore bactérienne sont présentés dans le tableau VII. TABLEAU VII Evolution temporelle des flores bactériennes totales aérobies et spécifiques hydrocarbures dans la zone supratidale d'un sédiment sableux Jours Témoin Parcelle traitée avec farine Bactéries totales aérobies/g de sédiment humide 0 2,0.107 2,3.107 7 2,4.107 7,6.107 9 15 1,9.107 2,8.109 30 5,7.107 4,8.108 45 1,0.108 8,9.108 60 4,7.107 6,8.108 Bactéries spécifiques hydrocarbures/g de sédiment humide 0 1,1.104 1,1.104 7 4,6.105 1,1.106 15 4,6.105 1,1.106 30 2,1.105 3,9.106 45 1,5.106 8,9.106 60 2,1.106 L'évolution temporelle des bactéries, totales et spécifiques hydrocarbures, dans la parcelle traitée à la farine animale montre un développement plus important que dans la parcelle témoin. Ceci montre que dans la zone supratidale d'un sédiment sableux, l'activité bactérienne dans la parcelle traitée est supérieure à celle non traitée. Elle est stimulée par la présence de farine animale. Les résultats en biodégradation des hydrocarbures aliphatiques sont présentés dans le tableau VIII. TABLEAU VIII Taux de biodégradation (e) des hydrocarbures aliphatiques dans la zone supratidale d'un sédiment sableux, à 60 jours Jours Témoin Parcelle traitée avec farine taux de biodégradation des hydrocarbures aliphatiques % O O O 60 25,0 38,0 EXEMPLE 5 Accélération de la biodégradation des hydrocarbures de sédiments sableux souillés en zone intertidale L'expérimentation a été réalisée dans les memes conditions opératoires que dans l'exemple 4, mis à part les conditions climatiques qui sont différentes (conditions hivernales) et le temps de l'expérimentation qui a duré plus longtemps. Les sédiments sont échantillonnés aux temps: 0, 7, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 jours. La température moyenne extérieure peut atteindre 30"C pendant la journée. La température de l'eau moyenne étant de 20"C, sa salinité de 400/oc et son pH de 8. L'expérimentation a été menée avec une simulation de marée, ce qui signifie que la biodégradation est étudiée dans une zone supratidale et intertidale. Les résultats obtenus pour l'analyse de la flore bactérienne sont présentés dans le tableau IX. TABLEAU IX Evolution temporelle des flores bactériennes hétérotrophes aérobies et spécifiques hydrocarbures dans les zones supratidales, intertidales et immergées d'un sédiment sableux. Jours Témoin Parcelle traitée avec farine Zone Zone supra- inter- immer- supra- inter- immer tidale tidale gée tidale tidale gée Bactéries totales aérobies/g sédiment humide 0 1,6.107 1,3.107 2,2.106 1,6.107 1,3.107 2,2.106 7 3,2.107 1,0.107 2,7.106 7,4.107 4,9.107 4,6.106 15 4,1.107 1,9.10.6 1,3.108 4,4.107 4,8.106 30 2,1.107 2,0.107 1,0.106 2,3.108 2,3.107 7,2.105 37 1,5.107 3,0.106 5,1.105 2,4.108 6,0.107 1,0.106 45 2,7.107 1,9.107 3,4.106 7,8.108 6,2.107 5,9.106 7 7 6 8 8 6 58 5,4.107 3,2.10' 2,2.106 3,3.108 2,1.108 9,3.106 89 4,1.107 4,8.1o6 1,6.106 8,9.107 1,1.108 9,5.106 Bactéries spécifiques hydrocarbures/g sédiment humide 0 - - 4,6.104 - - 4,6.104 7 1,1.107 4,6.106 2,4.104 4,6.107 1,1.108 15 2,4.107 4,6.107 4,6.104 9,3.107 2,3.107 1,1.105 30 9,3.106 - 4,3.104 2,4.108 2,4.107 9,3.104 6 6 3 8 7 5 37 4,3.106 2,3.106 9,3.103 2,4.108 2,4.107 2,4.105 45 9,3.106 - 4,3.104 1,1.108 3,0.107 2,4.105 58 4,3.106 4,5.105 1,5.103 2,0.107 4,6.107 1,1.106 6 5 6 7 7 6 89 9,3.106 2,3.105 4,6.104 4,3.107 4,6.1o7 2,4.106 L'évolution temporelle des bactéries hétérotrophes aérobies et spécifiques hydrocarbures, dans la parcelle traitée à la farine animale montre un développement plus important que dans la parcelle témoin, ceci pour toutes les zones: supratidale, intertidale et immergée, alors que la zone immergée n'a pas été polluée par hydrocarbures et n'a pas été traitée. Les résultats en biodégradation des hydrocarbures aliphatiques sont présentés dans le tableau X. TABLEAU X Taux de biodégradation ( ) des hydrocarbures aliphatiques dans les zones supratidale et intertidale d'un sédiment sableux traité et non traité Jours Témoin Parcelle traitée avec farine Zone Zone supratidale intertidale supratidale intertidale O O O O O 7 7 - 17 1 15 0 19 25 24 30 13 18 - 22 45 18 - 32 60 23 27 27 60 75 36 22 40 50 Les résultats obtenus montrent que les farines animales stimulent la biodégradation des hydrocarbures en zone supratidale et intertidale d'un sédiment sableux souillé par hydrocarbures. REVENDICATIONS 1.- Additif de biodégradation caractérisé en ce qu'il consiste en au moins une farine animale, ladite farine comprenant au moins une source d'azote assimilable consistant en au moins un acide aminé. 2.- Additif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en une farine de poisson. 3.- Additif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en une farine de viande. 4.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide aminé est choisi dans le groupe consistant en: lysine, méthionine, cystine, thréonine, tryptophane, hydroxylysine, hydroxyproline, et leurs mélanges. 5.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la source d'azote assimilable se trouve dans des protéines représentant au moins 50% en poids du poids total dudit additif. 6.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit additif est présent selon un rapport massique [additif]/[hydrocarbures] compris entre 3 et 30, et de préférence égal à environ 10. 7.- Utilisation d'un additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la biodégradation d'hydrocarbures.