Brevet FR2692592A1 — publié le 19931224

-1- La présente invention a pour objet des fragments d'ADN de Neisseria meningitidis codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine ainsi qu'un procédé de fabrication de chacune des sous-unités par voie recombinante. D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne Les bactéries principalement responsables sont: N. meningitidis et Haemophilus influenzae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes. On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N meningitidis Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an. L'espèce N meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes: A,B et C. Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à N meningitidis sérogroupes A et C Ces polysaccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et ninduisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse. Par contre, le polysaccharide de N meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher-un vaccin à rencontre des méningites induites par N meningitidis notamment du sérogroupe B autre qu'un vaccin à base de polysaccharide. A cette fin, différentes protéines de la membrane externe de N. meningitidis ont déjà été proposées Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine. -2- D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal En ce qui concerne notamment N meningitidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélevé qu'à partir de protéines humaines de transport du fer telles que la transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'homme (de l'ordre de 10-18 M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne. Ainsi, N meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance. Le récepteur de la transferrine de la souche Y meningitidis B 16 B 6 a été purifié par Schryvers et al (WO 90/12591) à partir d'un extrait membranaire Cette protéine telle que purifiée apparait essentiellement constituée de 2 types de polypeptides: un polypeptide d'un poids moléculaire apparent élevé de 100 k D et un polypeptide d'un poids moléculaire apparent moindre d'environ 70 k D, telles que révélés après électrophorèse sur gel de de polyacrylamide en présence de SDS. Le produit de la purification notamment mise en oeuvre par Schryvers est par définition arbitraire et pour les besoins de la présente demande de brevet, appelé récepteur de la transferrine et les polypeptides le constituant, des sous-unités Dans la suite du texte, les sous-unités de poids moléculaire élevé et de poids moléculaire moindre sont respectivement appelées Tbpl et Tbp 2. Toutefois, le procédé de purification décrit par Schryvers et ai ne peut pas être utilisé pour la production à grande échelle du récepteur de la transferrine La préparation industrielle de ce récepteur sous forme purifiée passe nécessairement par une étape de production à l'aide d'un système d'expression hétérologue. -3- A cette fin, l'invention se propose de fournir les fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de N meningitidis. D'autre part, depuis les travaux pionniers de Schryvers et al, on a découvert qu'il existait en fait au moins 2 types de souches qui diffèrent par la constitution de leurs récepteurs de la transferrine respectifs Ceci a été mis en évidence en étudiant des extraits membranaires de plusieurs dizaines de souches de N meningitidis d'origines variées Ces extraits membranaires ont tout d'abord été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis électrotransférés sur feuilles de nitrocellulose Ces feuilles de nitrocellulose ont été incubées: a) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche N meningitidis B 16 B 6, aussi appelée IM 2394; b) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche N meningitidis IM 2169; ou 2 o c) en présence de la transferrine humaine conjuguée à la peroxydase. En ce qui concerne a) et b), la reconnaissance des sous-unités du récepteur de la transferrine est révélée par addition d'un anticorps anti- immunoglobulines de lapin couplé à la peroxydase, puis par addition du substrat de cette enzyme. Les tableaux I et II ci-dessous indiquent le profil de certaines souches représentatives tel qu'il apparait sur gel de polyacrylamide à 7,5 % après électrophorèse en présence de SDS; les bandes sont caractérisées par leur 3 o poids moléculaires apparents exprimés en kilodaltons (k D): Souches Tableau I 2394 (B; 2 a;P 1 2:L 2,3) 2234 (Y;nd) 2228 (B; nd) 2154 (C; rid) 550 (C; 2 a:) 2170 (B; 2 a:P 1 2:L 3) 2448 (B; nd) 179 (C; 2 a:P 1 2) Détection avec 93 93 99 I'antisérum anti-récepteur 2394 68 69 69 Détection avec I'antisérum 93 93 99 anti-récepteur 2169 Détection avec la transferrine 68 69 69 peroxydase I 4 P. K) (D (n (D K) N.B: Entre parenthèse sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe, le sérotype, le sous-type et l'lmmunotype. Àed Klounuwll la ed Af-snos el'edfqo Js el 'edno J Bo Jgs el e Jp Jo, su Lp S 9 nblpuj luos esgqluejed e Jlu 3: UN esepÀxo Jied 8 998 8 88 6 Le sa 89 8 -8 uu J 8 Jsu EJ Se Le I e A uoogl C 599 S 8 8 88 6 L LB 8 c 98 L_ 69 L; Jnaldeog J-llue ú 6 ti 6 t 6 96 86 86 86 96 96 w Lun J Slues I Oe A U Oll Oelga 6 ú:z Jnaldeog J-llue ú 6 t 6 H 6 96 86 86 86 86 96 w Lun Jg Slluel ae Uol O Oal C 9 (Z' d:qg:g) (pu: 3) (pu:V) ( 9 '-d:6 L:úl) ( 6 'kd:tf:V) ( 91 'd: L:O) (pu:) (pu:g) ( 6 'cd:6:g) Z 98 617 t Z t 96 L 9 L 8 k 00 o L; OL t 09 L 000 L 69 L; II nelqe L seq Dfono u(i ( 1 6 - Les résultats répertoriés dans les 2 premières lignes des tableaux montrent qu'il existe 2 types de souches: Le premier type (Tableau I) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues par l'antisérum anti-récepteur IM 2394 tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antisérum anti-récepteur IM 2169. Le second type (Tableau II) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues par l'antisérum anti-récepteur 1 M 2169 tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antisérum anti-récepteur IM 2394. En conséquence, il existe une diversité antigénique au niveau de la sousunité de moindre poids moléculaire Cette diversité est toutefois restreinte puisqu'elle se résout en 2 grands types, contrairement à ce qui est suggéré par Griffiths et al, FEMS Microbiol Lett ( 1990) 69: 31. En vertu de ces constatations, on pouvait supposer qu'un vaccin efficace à l'encontre de toutes les infections à Nô meningitidis pourrait être constitué de manière suffisante, de la sous-unité de haut poids moléculaire, quelle que soit la souche d'origine du récepteur, puisque cette dernière est reconnue par les 2 types d'antisérums Toutefois, il semble que cela ne puisse être le cas dans la mesure o la sous- unité de haut poids moléculaire ne serait pas capable d'induire la production d'anticorps de type neutralisant Seule la plus petite des 2 sous-unités du récepteur serait capable de remplir cette fonction. Puisque cette sous-unité de moindre poids moléculaire se caractérise par une variation antigénique significative du premier type au deuxième type de souche, un seul type de récepteur de la transferrine ne devrait pas être suffisant pour vacciner contre toutes les infections à N meningitidis Par conséquent, un vaccin devra contenir au moins la sous- unité de moindre poids moléculaire de chacune des souches IM 2394 et IM 2169 ou de leurs équivalents respectifs et, de manière optionnelle, la sous-unité de haut poids moléculaire d'au moins une souche de N meningitidis. -7- C'est pourquoi l'invention fournit un fragment d'ADN isolé codant pour une protéine capable d'être reconnue par un antisérum anti- récepteur de la souche de N meningitidis IM 2394 ou IM 2169. Un tel fragment d'ADN peut notamment comprendre une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés homologue à celle telle que montrée: dans l'identificateur de séquence (SEQ ID NO: 1) n 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 579; dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou 2 o dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. A titre indicatif, on précise qu'un fragment d'ADN selon l'invention peut en outre comprendre une séquence nucléotidique additionnelle codant pour n'importe quelle autre séquence d'acides aminés; les deux séquences nucléotidiques considérées, formant un cadre ouvert de lecture de manière à coder pour une protéine hybride ou un précurseur. De manière avantageuse, un fragment d'ADN selon l'invention peut 3 o être sélectionné parmi: i) Un premier fragment d'ADN isolé, ayant une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés homologue à celle tele que montrée dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 579. -8 - ii) Un deuxième fragment d'ADN isolé ayant une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés à celle telle que montrée dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884. iii) Un troisième fragment d'ADN isolé ayant une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés à celle telle que montrée dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887. iv) Un quatrième fragment d'ADN isolé ayant une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés à celle telle que montrée dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. Par "séquence d'acides aminés homologue", on entend une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 75 %, de manière avantageuse d'au moins 80 %, de manière préférée d'au moins 90 %, de manière tout à fait préférée de 100 %, avec la séquence d'acides aminés que l'on cite en référence On notera que le terme "homologue" tel que défini inclut le cas particulier de l'identité. Le degré d'homologie peut être aisément calculé en alignant les séquences de manière à obtenir le degré maximal d'homologie; pour ce faire, il peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants, comme cela est illustré dans la figure 7 Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions. -9 - Il serait fastidieux de décrire des séquences homologues autrement que de manière générique, en raison du trop grand nombre de combinaisons. L'homme du métier connait toutefois les règles générales qui permettent de remplacer un acide aminé par un autre sans abolir la fonction biologique ou immunologique d'une protéine. Un fragment d'ADN isolé et tout à fait préféré a une séquence nucléotidique codant pour: i) La sous-unité Tbpl de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est telle que montrée dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; ii) La sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 579; iii) La sous-unité Tbpl de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou iv) La sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. Le récepteur de la transferrine étant une protéine membranaire, chacune de ses sous-unités est initialement produite sous forme d'un précurseur constitué d'un peptide signal associé en position N-terminale, à la forme mature. - C'est pourquoi l'invention a aussi pour objet un bloc d'ADN isolé codant pour un peptide signal dont la séquence d'acides aminés présente un degré d'homologie d'au moins 80 %, de manière préférée de 100 %, avec la séquence montrée dans: i) le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu méthionine en position -24 et finissant avec le résidu alanine en position 1; ii) le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu méthionine en position 24 et finissant avec le résidu alanine en position 1; ou iii) le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu méthionine en position et finissant avec le résidu alanine en position 1. Un fragment d'ADN selon l'invention peut être aussi sélectionné parmi un cinquième, sixième, septième et huitième fragments d'ADN codant respectivement pour un précurseur dont la séquence d'acides aminés est homologue à la séquence présentée dans le SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4. Par "fragment ou bloc d'ADN isolé" on entend un fragment ou bloc d'ADN d'origine génomique qui est i) inséré dans un vecteur viral ou plasmidique ou ii) placé sous le contrôle d'un promoteur qui lui est hétérologue. De plus, le bloc d'ADN codant pour le peptide signal selon l'invention est, en outre, considéré comme isolé lorsque ce bloc d'ADN est associé à un fragment d'ADN codant pour une protéine hétérologue au peptide signal; de manière à former un cadre de lecture ouvert codant pour un précurseur hybride. L'invention concerne aussi une cassette d'expression qui comprend au moins un fragment d'ADN selon l'invention, placé sous le contrôle d'éléments capables d'assurer son expression dans une cellule-hôte appropriée. il - Dans la cassette d'expression, le premier, deuxième, troisième ou quatrième fragment d'ADN selon l'invention peut être ou non associé à un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue à la protéine codée par ledit fragment d'ADN, selon que l'on recherche ou non la sécrétion de la protéine De préférence, cette sécrétion sera recherchée. Les éléments indispensables à l'expression d'un fragment d'ADN selon l'invention sont un promoteur de transcription, des codons de début et de fin de traduction et, de manière optionnelle, un terminateur de transcription Le promoteur peut être constitutif ou inductible On indique que le fragment d'ADN codant pour la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2394 semble être toxique pour une cellule hétérologue, notamment pour E coli. Dans ce cas là, il pourrait être préférable d'utiliser un promoteur inductible. Des éléments tels qu'un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue (région signal) ou un promoteur existent déjà en assez grand nombre et sont connus de l'homme du métier Ses compétences générales lui permettront de choisir une région signal ou un promoteur particulier qui seront adaptés à la cellule-hôte dans laquelle il envisage l'expression. Enfin, l'invention fournit un procédé de fabrication d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine capables d'être reconnus par un antisérum anti-récepteur de la souche de N meningitidis IM 2394 ou IM 2169 qui comprend l'acte de cultiver une cellule-hôte comportant une cassette d'expression selon l'invention; ainsi que le peptide, le polypeptide ou la protéine produit par ce procédé et les compositions vaccinales les contenant. Aux fins du procédé selon l'invention, la cellule-hôte peut être une cellule de mammifère, une bactérie ou une levure; ces deux dernières étant préférées Là aussi, le choix d'une lignée particulière est à la portée de l'homme du métier. -12- Afin de déterminer l'objet de la présente invention, on précise que les souches de N meningitidis IM 2394 et IM 2169 sont publiquement disponibles auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris sous les numéros d'enregistrement respectifs LNP N 1511 et LNP N 1520. Un antisérum spécifique du récepteur de la transferrine de la souche de N meningitidis IM 2394 ou IM 2169 peut être obtenu tel que décrit dans les exemples ci-après. 1 o L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après et par référence aux Figures 1 à 8. La Figure 1 représente la structure du phage lambda ZAP II et schématise la méthodologie de clonage y afférent Lambda ZAP II est un vecteur d'insertion équipé de sites de clonage multiples localisés dans la partie plasmidique (p Bluescript SK) Cette partie plasmidique peut être excisée in vivo par co-infection avec un phage-helper et convertie en vecteur plasmidique Si une séquence codante est fusionnée en phase à lac Z ou si un fragment d'ADN cloné comporte un promoteur fonctionnel dans E coli, il peut y avoir production d'une protéine d'intérêt qui pourra être détectée à l'aide d'anticorps spécifiques. La Figure 2 présente la structure du plasmide p TG 1265 p TG 1265 dérive du plasmide p GB 2 (Churchward et al, Gene ( 1984) 31: 165) comme suit: p GB 2 est digéré par Eco RI et Hind III, traité à la polymérase Klenow puis ligué au fragment Ssp I Pvu II de 1 kb issu de p T 7 T 3 184 (Mead et al, Protein Engineering ( 1986) 1: 67; Pharmacia) qui comporte fl-ori, la séquence lac Z, les promoteurs T 3 et 17 ainsi que des sites multiples de 3 o clonage. La Figure 3 présente la carte génonmique de la région d'ADN de la souche IM 2394 comportant les séquences codant pour Tbpl et Tbp 2 ainsi que les différents fragments qui ont été clonés B = Bam Hl; E = Eco RI; H =Hinc I; R = Eco RV; X = Xba I; C = Clal. 13 - La Figure 4 présente la carte génomique de la région d'ADN de la souche IM 2169 comportant les séquences codant pour Tbpl et Tbp 2 ainsi que les différents fragments qui ont été clonés C = Clal; H = Hincl I; M = Mlu I; X = Xba I; ? = position imprécise. La Figure 5 présente la structure du plasmide para 13 para 13 est un plasmide capable de se répliquer dans E coli qui comporte le promoteur de l'opéron arabinose BAD (Para B) de Salmonella typhimurium (modifié au niveau de la TATA box), ainsi que le gène Ara C En aval du promoteur Para B se trouve des sites multiples d'insertion La série des plasmides para est décrite par Cagnon et al, Prot Eng ( 1991) 4: 843. La Figure 6 représente la méthodologie qui a été mise en oeuvre pour construire le vecteur d'expression p TG 3786. La Figure 7 compare les séquences d'acides aminés prédites des sous- unités Tbpl des souches IM 2394 et IM 2169 Le degré d'homologie peut être estimé à environ 76 %. 2 o La Figure 8 compare les séquences d'acides aminés prédites des sous- unités Tbp 2 des souches IM 2394 et IM 2169 Le degré d'homologie peut être estimé à environ 47 %. La Figure 9 représente la méthodologie qui a été mise en oeuvre pour 2 5 contruire le vecteur d'expression p TG 3779. EXEMPLE 1: Clonage des fragments d'ADN codant pour les sous-unités Tbpl et Tbp 2 du récepteur de la transferrine de la souche IM 2394 LA Culture de la souche et purification du récepteur de la transferrine Un lyophilisat de la souche N meningitidis IM 2394 est repris dans environ 1 ml de bouillon Muller-Hinton (BMH, Difco) La suspension bactérienne est ensuite étalée sur le milieu solide Muller-Hinton contenant du sang cuit ( 5 %). Après 24 hr d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 10 % de C 02, la nappe bactérienne est recueillie pour ensemencer 150 m I de Bl MH p H 7 2, répartis en 3 erlens de 250 ml L'incubation est poursuivie pendant 3 hr à 37 C sous agitation Chacune des 3 cultures ainsi réalisées permet d'ensemencer 400 mnl de BMH p H 7,2 supplémenté avec 30 /m de Ethylènediamine Di (O-Hydroxyphenyl acetic acid (EDDA, Sigma), qui est un agent chélatant du fer sous forme libre. Après 16 hr de culture à 37 C sous agitation, les cultures sont contrôlées pour leur pureté par observation au microscope après une coloration de Gram La suspension est centrifugée, le culot contenant les germes est pesé et conservé à -20 C. La purification est mise en oeuvre essentiellement selon la méthode décrite par Schryvers et ai (supra), cornmme suit: Le culot bactérien est décongelé, puis remis en suspension dans 200 ml de tampon Tris H Cl 50 m M, p H 8 0 (tampon A) La suspension est centrifugée pendant 20 ruin à 15 000 xg à 4 C Le culot est récupéré, puis remis en suspension dans du tampon A à la concentration finale de 150 g/l. Des fractions de 150 ml sont traitées pendant 8 min à 800 bars dans un lyseur de cellules travaillant sous haute pression (Rannie, modèle 8 30 H) Le lysat cellulaire ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 rmin à 4 C à 15 000 xg Le 3 5 surnageant est récupéré, puis centrifugé pendant 75 mrin à 4 C à 200 000 xg. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du tampon A et 14- -15 - après dosage de protéines selon Lowry, la concentration de la suspension est ajustée à 5 mg/ml. A 1,4 ml de la suspension de membranes on ajoute 1,75 mg de transferrine humaine biotinylée selon le procédé décrit par Schryvers La concentration finale de la fraction membranaire est de 4 mg/ml Le mélange est incubé 1 heure à 37 C puis centrifugé à 100 000 xg pendant 75 minutes à 4 C Le culot de membranes est repris par le tampon A contenant du Na Cl 0,1 M et incubé pendant 60 minutes à température ambiante. Après solubilisation, on ajoute à cette suspension un certain volume de N-Lauroyl Sarkosine à 30 % (p/v) et d'EDTA 500 m M de façon que les concentrations finales en Sarkosyl et EDTA soient de 0,5 % et 5 m M respectivement Après une incubation de 15 minutes à 37 C sous agitation, on ajoute 1 ml de résine strepavidine-agarose (Pierce) préalablement lavée en tampon A La suspension est incubée 15 minutes à température ambiante puis centrifugée à 1 000 xg pendant 10 minutes La résine est ensuite conditionnée dans une colonne et l'éluat direct est éliminé. 2 o La résine est lavée par 3 volumes de colonne de tampon Tris- H Cl 50 m M p H 8 0 contenant Na CI 1 M, EDTA 10 m M Sarkosyl 0,5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine-H Cl 750 m M Le récepteur de la transferrine est ensuite élué par le tampon B contenant de la guanidine-H Cl 2 M L'éluat est collecté en fractions, dans des tubes contenant un volume identique de Tris HC 1 50 m M, p H 8 0, Na CI 1 M. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'élution sont recueillies, dialysées 3 o contre du tampon phosphate 10 m M, p H 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % et lyophilisées Le lyophilisat est repris dans de 'eau à une concentration 10 fois supérieure La solution est dialysée une seconde fois contre du tampon phosphate 50 m M p H 8,0 contenant du Sarkosyl 0, 05 % (tampon C) puis la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,22,um. Le contenu en protéines est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par -16addition de tampon C, sous conditions aseptiques Cette préparation est conservée à -70 C. l B Préparation d'un antisérum spécifique du récepteur de la transferrine Des lapins néo-zélandais albinos reçoivent par voie sous- cutanée et intramusculaire 100 gg du récepteur IM 2394 en présence d'adjuvant complet de Freund 21 jours et 42 jours après la première injection, les lapins reçoivent à nouveau 100 /g du récepteur purifié mais ces fois-ci en présence d'adjuvant incomplet de Freund 15 jours après la dernière injection, le sérum des animaux est prélevé, puis décomplémenté et filtré sur une membrane de porosité 0,45 /m Le filtrat est par la suite épuisé par contact avec la souche IM 2394 qui pour se faire, a été cultivée au préalable en présence de fer sous forme libre (dans ces conditions, la synthèse du récepteur de la transferrine est réprimée) Les modalités de contact sont comme suit: 10 ml du filtrat sont ajoutés à 1010 cfu (unités formant des colonies) d'une culture de la souche IM 2394 L'adsorption est poursuivie une nuit à 4 C, sous agitation Les bactéries sont ensuite éliminées par centrifugation Le surnageant est récupéré puis soumis à nouveau à 2 2 o opérations d'adsorption successives comme précédemment décrit. 1 C Détermination des séquences peptidiques permettant l'identification des fragments d'ADN. Des fractions aliquotes du matériel obtenu en 1 A sont séchées puis resolubilisées dans le tampon de Laemmli deux fois concentré (Tris 65 rm M, SDS 3 %, glycérol 10 %, 2-mercaptoéthanol 5 %) On ajoute un volume d'eau équivalent. 3 o Après sonication, le matériel est chauffé à 90 C pendant 2 minutes, puis soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide Les sous-unités ainsi séparées sont transférées sur membrane PVDF (Immobilon, Millipore) pendant 16 heures à 400 m A en tampon Tris borate 50 m M, p H 8,3 Les sous-unités électrotransférées sont colorées à l'amido black et les bandes correspondant à Tbpl et Tbp 2 sont récupérées et soumises au microséquençage de l'extrémité N-terminale. 17- Ceci est répété plusieurs fois pour établir les séquences consensus N- terminales suivantes: Tbp 11 IM 2394: EXVQAEQAQEKQLDTIQV Tbp 2 IM 2394: XLXXXXSFDLDSVEXVQXMX (X = acide aminé non-déterminé). Afin de séquencer des régions internes de Tbp 2, la protéine sur membrane PVDF est soumise à digestion par la trypsine en tampon Tris 0,1 M p H 8,2 Après 4 heures de réaction à 37 C, les peptides sont extraits par de l'acide formique 70 % puis par de l'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1 % Ces peptides sont ensuite séparés par HPLC. Pour Tbp 2 IM 2394, les séquences internes qui ont été établies sont les suivantes: 51122: 51125: S" 770: S" 766: 51126: S" 769: S" 771: S" 767: S" 762: 51128: NNIVLFGPDGYLYYK YTIQA DGENAAGPATEXVIDAYR XQIDSFGDVK AAFXXXI XNXXXMFLQGVR TPVSDVAAR XSPAFT NAIEMGGSFXFPGNAPEG(K) XQPESQQDVSENX 1 D Préparation de l'ADN génomique. Le culot bactérien obtenu en 1 A est resuspendu dans environ 25 ml de solution A (Tris H Cl 25 m M, p H 8 contenant 50 m M de glucose et 10 m M d'EDTA) additionnée de 10 mg de protéinase K Le mélange est laissé 10 minutes à température ambiante. f Puis on ajoute 12,5 ml de solution A contenant 10 mg de lysosyme Une nouvelle fois, le mélange est laissé 10 minutes à température ambiante On complète alors par 0,5 ml de sarkosyl 10 % Le mélange est incubé 10 minutes à + 4 C. On ajoute ensuite 2 mg de RN Ase et on laisse l'incubation se poursuivre 90 minutes à 37 C L'ADN est purifié par quatre extractions phénoliques successives L'ADN présent dans la dernière phase aqueuse est précipité par l'6thanol L'ADN de haut poids moléculaire est obtenu par séparation sur gradient de Cs Cl. 1 E Clonage. Une première banque d'ADN a été réalisée dans le vecteur lambda ZAP (Figure 1), comme suit: Une préparation d'ADN génomique a été fragmentée aux ultra- sons Les extrémités des fragments ainsi obtenus ont été rendues franches par traitement à la T 4 polymérase Les fragments ont été méthyles Après méthylation, les fragments ont été liés à des adaptateurs Eco RI, traités par Eco RI puis insérés dans le site Eco RI du phage lambda ZAP II (Stratagène). La souche E coli XL 1-Blue (Stratagène) a été infectée avec la banque d'ADN ainsi préparée Les plages de lyse blanches (présence de phages recombinants) ont été testées à l'aide d'un antisérum spécifique du récepteur de la transferrine de la souche IM 2394 préparé tel que décrit en l B Ceci a permis d'identifier deux clones lambda ZAP II Les plasmides p Bluescript contenus dans ces clones ont été excisés par co- infection avec le phage-"helper" et ont été appelés p BMT 1 et p BMT 2. Les plasmides p BMT 1 et p BMT 2 contiennent chacun un fragment Eco RI Eco Rl respectivement de 3,8 kb et 1,3 kb Ils sont présentés dans la Figure 3. Le séquençage de l'insert Eco RIEco RI de p BMT 1 a été mis en oeuvre selon la méthode de shotgun (Bankier et Barrell, Biochemistry ( 1983) 18BS: 508), comme suit: L'insert Eco RI Eco RI de p BMT 1 a été purifié puis fragmenté aux ultra-sons Les extrémités des fragments ainsi obtenus ont été rendues franches par traitement à la T 4 polymérase Les fragments ainsi traités ont été introduits dans un site du phage M 13 TG 131 (décrit dans Kieny et al, Gene ( 1983) 26: 91) Environ 200 clones issus de cette préparation ont été séquences L'analyse de ces séquences par ordinateur a permis de reconstituer la séquence complète de l'insert Eco RI Eco RI de p BMT 1. 1 o La séquence codant pour l'extrémité N-terminale de Tbpl a été localisée comme le montre la Figure 3 Compte tenu de la masse moléculaire de Tbpl, il était clair que cet insert ne comportait pas le fragment d'ADN complet codant pour Tbpl En amont de l'extrémité 5 ' du gène tbpl, on a mis en évidence un cadre de lecture ouvert mais il n'a pas été possible d'identifier clairement une région codant pour l'extrémité N-terminale du gène tbp 2. Le microséquençage de régions internes de Tbp 2 a donc été entrepnris comme reporté précédemment en 1 C Les séquences internes qui étaient localisées vers l'extrémité C-terminale, correspondaient bien à la partie 3 ' du cadre de lecture ouvert en amont de tbpl. D'autre part, i'ADN génomique de la souche IM 2394, préalablement digéré par Hinc II a été analysé par Southern blot à l'aide d'une sonde d'ADN radioactive correspondant à la zone Hinc I Hinc II de 1,5 kb de l'insert de 3,8 kb de p BMT 1; deux bandes ont été ainsi révélées. Ceci a permis de démontrer que l'insert porté par p BMT 1 résultait d'un assemblage artéfactuel de séquences issues de deux loci distincts La 3 o séquence 5 ' de tbp 2 était donc absente. La banque d'ADN génomique en lambda ZAP précédemment décrite a été criblée de nouveau; cette fois-ci en utilisant l'insert Eco RI - Eco RI de p BMT 2 comme sonde 29 candidats ont été retenus parmi environ 3 5 200 000 plages testées Seul le plasmide dérivé p TG 2749 semblait posséder un insert nouveau par rapport à p BMT 1 et p BMT 2 L'insert de p TG 2749 est 19 - -20 2692592 tel que représenté dans la Figure 3 La région de l'insert en amont du site Eco RV (région Eco RV Eco RI) a été sous-clonée dans M 13 TG 131 et séquencée par la méthode de Sanger et al, PNAS ( 1977) 74: 5463 à l'aide de primers synthétiques La séquence correspondant à l'extrémité N-terminale de Tbp 2 a été ainsi retrouvée. La séquence du fragment d'ADN codant pour Tbp 2 de la souche IM 2394 est présentée dans le SEQ ID NO: 1 ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante. Juste en amont de la séquence codant pour Tbp 2 mature, l'insert de p TG 2749 comporte une région génomique distincte issue d'un autre locus. La aussi, il s'agit d'une artéfact de clonage analogue à celui mis en évidence dans le cas de p BMT 1. Compte tenu des réarrangements observés et de l'absence de séquences 3 ' de tbpl et 5 ' de tbp 2, la banque d'ADN génomique construite en lambda ZAP a été jugée inadaptée pour la poursuite du clonage. Une deuxième banque d'ADN génomique a donc été construite dans un plasmide à faible nombre de copies, comme suit: une préparation d'ADN génomique a été partiellement digérée par Sau 3 A Des fragments d'ADN d'environ 4 à 6 kb ont été purifiés après fractionnement en gradient de sucrose et insérés dans le site Bam HI du plasmide p TG 1265 Cette préparation plasmidique a servi à transformer la souche d'E coli 5 KI On a estimé que cette banque contenait environ 18 000 clones indépendants. Environ 50 000 clones de la deuxième banque ont été testés à l'aide d'une sonde radioactive correspondant à l'insert Eco RI Eco RI de p BMT 2. 3 o Un seul clone a été révélé; soit le plasmnide p TG 2759 qui possède un insert de 1,8 kb La taille de cette insert a été jugée insuffisante pour contenir le gène complet codant pour Tbpl. Une troisième banque d'ADN a été construite selon la méthode décrite au paragraphe précédent à l'exception de la souche d'E coli 5 K qui a été remplacée par la souche d'E coli SURE (Stratagène) On a estimé que -21- cette banque contenait environ 60 000 clones indépendants. Environ 70 000 clones de la troisième banque d'ADN ont été testés à l'aide d'unie sonde radioactive correspondant au fragment Mlu I Hinc II de 2,4 kb issu de l'insert de p TG 2754 décrit dans r Exemple 2 ci-après et représenté dans la Figure 4 Deux clones ont été révélés, soient les plasmides p TG 2780 et p TG 2781, représentés dans la Figure 3. La séquence des inserts de p TG 2780 et p TG 2781 a été établie selon la méthode de Sanger Elle est présentée dans le SEQ ID NO: 2 ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante. Une quatrième banque a été construite Le DNA génomique a été digéré par Sau 3 A et une fraction contenant des fragments d'environ 7 kb a été purifiée sur gradient de sucrose Cette fraction contenait un fragment correspondant au locus tbpl,2 car elle était reconnue par une sonde d'ADN spécifique de tbp 2 Après digestion par Eco R Vet Xba I et ligation à p TG 1265 digéré par Sma I et Xba I, E coli 5 K a été transformée Un criblage des clones à l'aide d'une sonde spécifique de tbp 2 a été réalisé Parmi une série de 2 o clones positifs, le plasmide p TG 3791 a été étudié en particulier et s'est avéré contenir des séquences 5 ' tbp 2 incluant la séquence codant pour le peptide signal putatif de Tbp 2. EXEMPLE 2: Clonage des fragments d'ADN codant pour les sous-unités Tbpl et Tbp 2 du récepteur de la transferrine de la souche IM 2169. 2 A La culture de la souche IM 2169 et la purification du récepteur de la transferrine ont été effectuées dans des conditions identiques à celles décrites dans l'Exemple 1 A 2 B La préparation d'un antisérum anti-récepteur de la souche IM 2169 a été réalisée selon le protocole décrit dans l'Exemple l B. 2 C Les séquences peptidiques permettant l'identification des fragments d'ADN ont été déterminées selon la méthode reportée dans l'Exemple 1 C. Les microséquences qui ont été établies sont les suivantes. Séquence consensus de l'extrémité N-terminale de Tbpl: ENVQAGQAQEKQLXXIQVX Séquences des peptides internes de Tbpl: 51031: XLS(E,W)NAGXVLXPADX 51032: QLDTIQVK 51033: TAGSSGAINEIEYENXX 51034: YVTWENVDXXXXXX Séquence consensus de l'extrémité N-terminale de Tbp 2: SLVXAXSFDLXSV Séquences des peptides internes de Tbp 2: 51037: XXDNLSNAX 51035: XGDDGYIFYXGEKPX 51036: XQGXYGFAMX 51040: XQATGHENFQYVYSGXFYK 2 D La préparation de l'ADN génomique de la souche IM 2169 a été réalisée selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 D. 2 E Clonage Une première banque d'ADN génomique (fragments d'ADN Sau 3 A partiel; p TG 1265; E coli 5 K) a été construite comme précédemment décrit dans l'Exemple 1 On a estimé que cette banque contenait environ 40 000 clones indépendants, dont environ 70 % possédaient un insert de 4-6 kb. 000 clones de cette banque ont été testés à l'aide d'une sonde radioactive correspondant à l'insert Eco RI Eco RI de p BMT 2 42 clones ont été analysés, parmi lesquels 2 ont été retenus: les plasmides p TG 2753 et p TG 2754 qui sont tels que montrés dans la Figure 4 Les analyses en Southern blot ont montré que les cartes de restriction des inserts de p TG 2753 et p TG 2754 correspondaient à la carte de restriction de l'ADN 22 génormique. La détermination des séquences nucléotidiques et la recherche des régions codant pour les extrémités N- terminales et les régions internes ont démontré que: l'insert de 1, 9 kb de p TG 2753 contient la partie 3 ' du gène tbp 2 et la partie 5 ' du gène tbpl; et l'insert de p TG 2754 contient la partie 3 ' du gène tbp 2 et les parties 5 ' et 3 ' du gène tbpl, en rupture de phase. Cette première banque n'a donc pas permis de cloner des fragments d'ADN complets codant pour Tbpl ou Tbp 2. Une deuxième banque génomique a été construite comme précédemment mais à partir d'ADN génomique digéré par Xba I Les fragments d'ADN ont été purifiés après fractionnement en gradient de sucrose Chaque fraction (d'environ 500 gl) a été testée par Southern blot 2 o avec une sonde radioactive correspondant à l'extrémité 3 ' de tbpl (fragment de l'insert de p TG 2754) La fraction présentant une réaction d'hybridation et contenant des fragments d'environ 6 kb a été clonée dans p TG 1265 La souche E coli 5 K a été transformée. Environ 2 400 clones de cette banque ont été testés à l'aide d'une sonde radioactive correspondant au fragment Hinc I Mlu I de 0,6 kb issu de p TG 2754 Cinq clones ont été caractérisés, parmi lesquels 2 ont été retenus: soient p TG 3720 et p TG 3721, tels que montrés dans la Figure 4, qui contiennent tous deux les gènes tbpl et tbp 2. Afin de compléter la séquence nucléotidique codant pour Tbpl, l'insert de p TG 3720 a été séquencé dans la région o se situait la rupture de phase découverte dans l'insert de p TG 2754 Ce séquençage a permis de mettre en évidence que la rupture de phase de l'insert de p TG 2754 était due à une délétion de 22 bp La séquence complète du fragment d'ADN est telle que montrée dans le SEQ ID NO: 3. 23 - -24 - Le séquençage de l'insert de p TG 3720 a été poursuivi pour établir la séquence de tbp 2 Celle-ci a bien été identifiée; mais là aussi une rupture de phase a été constatée. * Finalement la séquence de tbp 2 a été déterminée à partir du plasmnide p TG 3721 Elle est telle que montrée dans le SEQ ID NO: 4. EXEMPLE 3: Expression du fragment d'ADN codant pour la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2394. 3 A Construction du vecteur d'expression p TG 3786. Le site Sph I du plasmide para 13 (Figure 5; Cagnon et al, Prot Eng. ( 1991) 4: 843) a été détruit par traitement à la polymérase Klenow, pour donner le plasmide p TG 3704 p TG 3704 a été linéarisé par coupure Nco I, traité à Ia polymérase Klenow pour rendre les extrémités franches, puis digéré par Hind II. D'autre part, on a synthétisé les oligonucléotides OTG 4015 et 2 o OTG 4016 que l'on a appariés. OTG 4015:5 ' AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGACTGTTATTACT CGCTGCCCAACCAGCGATGGCATGCTTTCCCACGCGTTTTCCCA 3 ' OTG 4016:5 'AGCTTGGGAAAACGCGTGGGAAAGCATGCCATCGCTGGTTGGGCA GCGAGTAATAACAGTCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTATTT 3 ' Le fragment d'ADN double brin OTG 4015/OTG 4016 a été inséré dans para 13 traité comme précédemment décrit, pour donner le plasmide p TG 3717 dans lequel on avait reconstitué la séquence codant pour la partie N-terminale du précurseur de la protéine Pel B d'Erwinia carotovora (Lei et al, J Bact ( 1987) 169: 4379); Soit: ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA CTG Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Sph I TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCA TGCTTT Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Mlu I Hind III CCCACGCGTTTTCCCA AGCTT (en souligné, aparaissent les extrémités de p TG 3704) o O A partir du plasmide p TG 2749, on a généré par PCR à l'aide des amorces OTG 4011 et OTG 4012, un fragment incluant la région codant pour la partie Nterminale de Tbp 2, jusqu'au site Mlu I interne, tel que montré dans la Figure 6. OTG 4011: Bam HI Sph I ' AAAAAGGATCC/GCA TGC CTG GGT GGC GGC GGC AGT TTC 3 ' Cys Leu Gly O TG 4012: Bam HI M 1 u I ' AAAAGGATCCGAATGGTGTAACGCGTAGTTTTTAT 3 ' Le fragment généré par PCR a été digéré par Bam HI, puis inséré dans le site Bam HI du phage M 13 TG 131, pour donner M 13 TG 3724 La séquence de ce fragment a été vérifiée par séquençage. A partir de M 13 TG 3724, on a récupéré la région codant pour la partie N-terminale de Tbp 2 sous forme d'un fragment Sph I Mlu I que l'on insert dans p TG 3717 préalablement digéré par Sph I et Mlu I, pour donner le plasmide p TG 3743. A partir du plasmide p BMT 1, on a récupéré la région codant pour la partie C-terminale de Tbp 2 sous forme d'un fragment Mlu I-Ban I dont l'extrémité cohésive Ban I avait été rendue franche par traitement à la polymérase Klenow On a inséré ce fragment dans p TG 3743 préalablement -26 - digéré par Hind If II, traité à la polymérase Klenow et finalement digéré par Mlu I On obtient ainsi le plasmide p TG 3786. 3 B Production de la sous-unité Tbp 2. E coli MC 1061 (Casadaban & Cohen, J Mol Biol ( 1980) 138: 179) est transformée par p TG 3786 puis mise en culture à 37 C, en milieu LB supplémenté avec 2 g/l de glycérol A la culture est en phase exponentielle, on ajoute 0,2 g/l d'arabinose L'incubation a été poursuivie durant 6 hr supplémentaires L'expression a été observée moins d'une heure après l'addition d'arabinose. L'6 électrophorèse sur gel d'acrylamide d'un échantillon du lysat cellulaire total a mis en évidence la présence d'une protéine d'environ 70 k D qui est capable de fixer la transferrine humaine marquée à la peroxydase. EXEMPLE 4: Expression du fragment d'ADN codant pour la sous-unité tbpl de la souche IM 2169. 2 O 4 A Construction du vecteur d'expression p TG 37796. Un fragment synthétique constitué des oligonucléotides OTG 4038 et OTG 4039 préalablement appariés, a été inséré dans le plasmide p TG 3704 digéré par Nco I et Hind II, générant ainsi le plasmide p TG 3756. OTG 4038: ' CATGGCTGCAGGRACCACGCGTGAATTCCCCGGGTCTAGA 3 ' OTG 4039: 5 ' AGCTTCTAGACCCGGGGAATTCACGCGTGGTACCTGCAGC 3 ' A partir du plasmide p TG 2754, on a généré par PCR à r'aide des amorces OTG 4037 et OTG 4014 un fragment incluant la région codant pour l'extrémité N-terminale du précurseur de Tbpl jusqu'au site Mlu I. -27- 0 TG 4037: ' TTTCCCGGATCCGC ATG CAA CAG CAA CAT TTG TTC CGA TTA 3 Bam HI Sph I Met Gln Gln Gln 0 TG 4014: ' AAAAGGATCCGGGGTCGTAACGCGTCAGGTCGCGG 3 ' Bam HI Mlu I Ce fragment PCR a été digéré par Bam HI et cloné dans le site Bam HI de M 13 TG 131 pour générer M 13 TG 3738 La séquence de ce fragment a été vérifiée. , M 13 TG 3738 a ensuite été linéarisé par Sph I, traité à la T 4 DNA polymérase pour rendre les extrémités franches, puis digéré par Mlu I afin d'isoler le fragment porteur de la région codant pour l'extrémité N-terminale du précurseur de Tbpl. Ce fragment a été inséré dans p TG 3756 digéré par Nco I, traité à la T 4 2 o DNA polymérase puis digéré par Mlu I, pour générer le plasmide p TG 3778. La séquence de la jonction Nco P/Sph Pl a été vérifiée. t Le fragment M Iuf -Xba I de p TG 3720 codant pour la majeure partie de Tbpl ( 3 'tbpl) a été inséré dans le plasmide p TG 3778 Le plasmide final ainsi obtenu est le plasmide p TG 3779. 4 B Production de la sous-unité Tbpl. E coli MC 1061 a été transformé par p TG 3779 puis mise en culture à 3 o 37 C en milieu LB A la culture en phase exponentielle, on a ajouté 0,2 g/1 d'arabinose L'incubation a été poursuivie durant 4 heures. L'électrophorèse sur gel d'acrylamide d'un échantillon du lysat cellulaire total a nmis en évidence la présence d'une protéine d'environ 100 Kd qui est capable de fixer la transferrine humaine marquée à la peroxydase. 28 - SEO ID NO: 1 Séquence de l'ADN génomique de la souche de N meningitidis IM 2394 codant pour la sous unité Tbp 2 et séquence protéique déduite En gras sont indiqués le peptide signal et le site Mlu I ATG Met -20 AAC AAT CCA TTG Asn Asn Pro Leu AAT CAG GCT GCT Asn Gln Ala Ala ATG Met -10 GTG CTG CCT GTG Val Leu Pro Val TTT Phe -5 TTG TTG AGT Leu Leu Ser TGT CTG GGT GGC GGC GGC AGT TTC GAT TTG GAC AGC GTG GAA ACC Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Glu Thr i, 1 5 10 15 GTG CAA GAT ATG Val Gln Asp Met CAG CCT GAA AGC Gln Pro Glu Ser TAT GGC TTT GCA Tyr Gly Phe Ala CCT AAA TAT AAG Pro Lys Tyr Lys AAA AAA CTG CAA Lys Lys Leu Gln CAC His CAA Gln GTA Val GAA Glu AGA Arg TCC AAA CCT AAG Ser Lys Pro Lys CAG GAT GTA TCG Gln Asp Val Ser AAA CTA CCT CGC Lys Leu Pro Arg AAG CAC AAA CCA Lys His Lys Pro GGA GAA CCA AAT Gly Glu Pro Asn TAT Tyr GAA Glu CGG Arg TTG Leu AGT Ser GAG GAT GAA AAA Glu Asp Glu Lys AAC AGC GGC GCG Asn Ser Gly Ala AAT GCA CAT TTT Asn Ala His Phe GGT TCA ATG GAT Gly Ser Met Asp TTT AGT GAG AGG Phe Ser Glu Arg GAA TTG GAA AAA Glu Leu Glu Lys AAA CGG GGT AGT TCT GAA CTT ATT GAA TCA AAA Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys 100 105 TGG GAA GAT GGG CAA AGT CGT GTA GTT GGT TAT ACA AAT TTC ACT Trp Glu Asp Gly Gln Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr 115 120 TAT GTC CGT TCG GGA TAT GTT TAC CTT AAT AAA AAT AAT ATT GAT Tyr Val Arg Ser Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp 130 135 ATT AAG AAT AAT Ile Lys Asn Asn ATA Ile GTT CTT TTT GGA Val Leu Phe Gly CCT Pro GAC GGA TAT CTT Asp Gly Tyr Leu Objet: GTA Val -15 GCT Ala -1 AGC Ser GCT Ala AAT Asn TGG Trp GAT Asp TAC Tyr l 29 - TAT AAA GGG AAA GAA CCT TCC AAG GAG CTG CCA Gly Lys Glu AAA GGT ACT Lys Gly Thr TTT GAA GGA Phe Glu Gly TTG TCT GCA Leu Ser Ala TCA TCC GGT Ser Ser Gly GAT TTT TCT Asp Phe Ser CGT ATT ACT Arg Ile Thr CGT TAC ACC Arg Tyr Thr AAG GCG TTG Lys Ala Leu TTT ATT TCC Phe Ile Ser AAA GGC GAG Lys Gly Glu GTT GCA GCG Val Ala Ala GAA AAC GCG Glu Asn Ala CGT ATT ACC Arg Ile Thr GGA GAT GTG Gly Asp Val CTG CCG TCT Leu Pro Ser Tyr ACT Thr CAA Gln GGG Gly GAG Glu GAG Glu AAC lk- Asr Asn' ACT Thr AAA Lys CAT His GGG Gly AAC Asn GAT Asp GCA Ala AGT Ser TCA Ser Lys TAT Tyr AGG Arg GCG Ala GCA Ala GTT Val AAC Asn ACG Thr GGT Gly CCC Pro CCG Pro AAA Lys GGG Gly TAC Tyr TTT Phe CTG Leu Pro TGG Trp TTG Leu TTA Leu CAT His GAT Asp CAA Gln ATT Ile GCG Ala GAC Asp GAA Glu GTG Val GCA Ala GGC Gly AAA Lys GAG Glu Ser GAT Asp GGT Gly GAA Glu ACC Thr AAA Lys AAT Asn CAA Gln GCA Ala TCC Ser CTT Leu TTT Phe GGG Gly GAG Glu AAG Lys GGC Gly Lys TAT Tyr AGT Ser GAA Glu GAT Asp ACA Thr AAT Asn GCA Ala GAT Asp GAC Asp GCC Ala GGT Gly CCT Pro GAG Glu CTG Leu AAT Asn Glu GTT Val GCA Ala GGG Gly TTT Phe ATA Ile AGT Ser ACT T Hr AAA Lys AGT Ser GGT Gly GCG Ala GCA Ala TTT Phe CTG Leu AAG Lys Leu ACT Thr GCA Ala GTA Val GGT Gly AAG Lys GAA Glu CTT Leu GGT Gly TTG Leu AAA Lys AAG Lys ACG Thr AAG Lys GTT Val GCG Ala Pro GAT Asp GGA Gly TTG Leu ATG Met GGC Gly AAC Asn CAC His GCA Ala GAA Glu TTC Phe CAG Gln GAA Glu AAA Lys GAC Asp GCA Ala TCG Ser GCT Ala GGA Gly CGT Arg ACT Thr ACA Thr AAA Lys GGC Gly ACA Thr GGC Gly TTG Leu AAA Lys ACC Thr GAG Glu GGA Gly TTT Phe GAA Glu ATG Met GAT Asp AAT Asn AGT Ser CTT Leu CAA Gln AAC Asn AAT Asn GGA Gly AGC Ser GAT Asp GTG Val CAA Gln GTG Val CAG Gln AAG ATA Lys Ile GAA AAA Glu Lys AAA TCG Lys Ser CAG GCA Gln Ala GAG TTT Glu Phe TAT CGT Tyr Arg ATA AAA Ile Lys CGT TTC Arg Phe GGA AGT Gly Ser TTT TAC Phe Tyr AAC GAC Asn Asp AAG AAG Lys Lys ATA GAT Ile Asp ATA GAC Ile Asp GAG CTT Glu Leu CAC GAG His Glu - ATT GAG CAA AAC GGC GTG AAG GCA ACG GTG TGT Ile Glu Gln Asn GAT Asp ATG Met AGG Arg ATT Ile GGT Gly ATC Ile ACT Thr AAA Lys AAT Asn TAC Tyr GGA Gly TAC Tyr TTC Phe ACG Thr GCC Ala GGT Gly AGT Ser ATT Ile ACC Thr TCC Ser GGC Gly AAT Asn ATG Met CTG Leu GAG Glu AAC Asn AAT Asn GGC Gly ACT Thr GGT Gly CAC His AAA Lys GCA Ala AGT Ser CAA Gln GCA Ala GGC Gly AGG Arg ACA Thr GCC Ala GAA Glu TAT Tyr AAC Asn CCA Pro Gly TTT Phe GGT Gly AAC Lys ACA Thr GCA Ala CTG Leu ATG Met AAC Asn ACG Thr GCC Ala GAG Glu Val Lys Ala Thr AAG Lys CGC Arg AAA Arg TGG Trp TTT Phe GCA Ala AAG Lys TTT Phe ATT Ile GAG Glu AAA Lys CTG Leu ACT Thr TAT Gly AGC Ser GAC Asp AAA Lys GAC Asp GCG Ala GAA Glu ATG Met CAA Gln TCA Ser CCA Pro CGC Thr GGC Gly GTG Val GAC Asp AAC Asn CTG Leu GCC Ala GGC Gly GAA Glu GGG Gly GTC Val GCC Tyr AGC Ser GAG Glu ACG Thr ATT Ile GGC Gly CAT His ATC Ile GGA Gly GGT GCG AAA CGC Gly Ala Lys Arg CAA Gln CAG CTT GTG CAA Gln Leu Val Gln TAA GCACGGCT Val AAA Lys GTA Val GGT Gly GAA Glu GAT Asp CGT Arg GGT Gly GAT Asp ACT Thr GGA Gly AAA Lys Cys GAA Gku TCC Ser ACT Thr GCC Ala TTT Phe ACG Thr TTT Phe CCG Pro GTA Val TCG Ser GCA Ala TGT TCC Cys Ser AAT AAA Asn Lys GAT GTG Asp Val TGG TAC Trp Tyr TCC AAT Ser Asn TCC ACT Ser Thr TCT CCT Ser Pro TCA GGT Ser Gly CAA AAT Gln Asn TCC GGC Ser Gly TTC TCA Phe Ser TCG GTG Ser Val AAC Asn GAC Asp GCG Ala GGA Gly CAG Gln AAA Lys GCG Ala GTG Val ACC Thr GGT Gly TTT Phe GTA Val TTG Leu GAT Asp GCA Ala TAT Tyr GAA Glu AAA Lys TTT Phe GCG Ala GGA Gly TTC Phe CCG Pro TTC Phe l 31 - SEO ID NO: 2 Séquence de l'ADN génomique de la souche de N meningitidis IM 2394 codant pour le précurseur de la sous-unité Tbp 1 du récepteur de la transferrine et séquence protéique déduite Le peptide signal est indiqué en caractères gras. CTTCCGATG CCGTCTGAAA GCGAAGATTA GGGAAACACT 40 CAT TTG TTC CGA TTA AAT ATT TTA TGC CTG TCT His Leu Phe Arg Leu Asn Ile Leu Cys Leu Ser CCC Pro CAG Gln CGC Arg GAT Asp CGT Arg AGT Ser TTA Leu GCG Ala AAT Asn GGT Gly GTT Val TTG Leu GAT Asp ACG Thr TAT Tyr TCC Set ACG Thr GCA Ala GAA Glu TCG Ser TAT Tyr GAT Asp AAC Asn CTA Leu GAT Asp GGC Gly GTA Val TTG Leu ATC Ile AAT Asn GCA Ala -1 ACC Thr GAA Glu AGT Ser CCG Pro TAT Tyr GAC Asp GGT Gly GAG Glu TCA Set -15 GAA Glu ATA Ile GTA Val AAA Lys GGT Gly TCA Ser GGC Gly GGG Gly TAT Tyr TCA Ser AAT Asn CAG Gin ACC Thr GAA Glu ATT Ile ATA Ile GTT Val ACG Thr GAA Glu GAA Glu GTG Val GTA Val GGG Gly CAG Gln GCC Ala CGC Arg TCG Ser AGG Arg AAC Asn TAC Tyr CAA Gin AAA Lys CTG Leu GTT Val GTG Val GGC Gly CAA Gln ACG Thr GTC Val GGA Gly GCC Ala GCC Ala GGC Gly TTG Leu GTC Val ATG Met ATA Ile GCG Ala AAG Lys AAC Asn -10 GAA Glu AAA Lys AAG Lys AAT Asn GAA Glu GAT Asp CAG Gln GGT Gly GCC Ala GGC Gly GCA TTG GCA GGT TCG GTC Ala Leu Ala Gly Ser Val GCA TTT CAA ACC AAA ACC GCA GCC GAC Ala Phe Gin Thr Lys Thr Ala Ala Asp 155 Objet: ATG Met -24 TTA Leu CAA Gln AAA Lys TTG Leu ATC Ile CAG Gln AAA Lys TCC Ser AGC Ser GTT Val CAA Gln ATG Met GCA Ala CAG Gln GTC Val CGA Arg GGT Gly AAC Asn TAC Tyr AGC Ser GAA Glu CAG Gln ACC Thr CAG Gin AAA Lys AAG Lys GAC Asp CGG Arg CGC Arg ACC Thr GGC Gly ATC Ile CAA Gln GCG Ala GAA Glu ACC Thr TCT Ser CTG Leu GGC Gly GTT Val GCG Ala GCA Ala AGC Ser -20 CTG Leu -5 AAA Lys CGC Arg TCC Ser ACC Thr GCA Ala TCC Ser CAG Gln ATC Ile AAG Lys l 32 - ATT ATC GGA GAG GGA AAA CAG TGG GGC ATT CAG Ile TAT Tyr GGA Gly CGG Arg CAG Gin GGC Gly GGA Gly AAA Lys AAC Asn CTG Leu GCC Ala ACT Thr CTG Leu CTG Leu GGT Gly GGG Gly Ile TCG Ser CGC Arg GGT Gly AGC Ser AGT Ser TAT Tyr GAT Asp CGC Arg TTC Phe GTT Val GTT Val AAA Lys TTT Phe ACC Thr GTC Val Gly GGA Gly AGC Ser CGG Arg TTC Phe CAG Gin GCG Ala GAG Glu TTA Leu CGA Arg CTC Leu CCT Pro GGT Gly GTT Val GGC Gly GAA Glu Glu AAA Lys GGC Gly GAA Glu AAC Asn TAC Tyr GCC Ala CGC Arg CTT Leu CCG Pro GAA Glu GCC Ala CTT Leu CAG Gln GTG Val TAT Tyr Gly GAC. 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CCC Pro ATT Ile GCA Ala GGG Gly CTT Leu CCT Pro ATC Ile AAT Asn GGT Gly GCG Ala GAC GGC AAT AAA Asp Gly Asn Lys TAT GAA GAA AGC Tyr Glu Glu Ser TTT GAT ACG GCC Phe Asp Thr Ala TAC GAC CGC TTT Tyr Asp Arg Phe CAA AAC GCA GTT Gln Asn Ala Val CCG TTT CCC AAC Pro Phe Pro Asn GGC AAG ACC ACG Gly Lys Thr Thr AAC ACC TAT ACA Asn Thr Tyr Thr TAT TAT GCA GCC Tyr Tyr Ala Ala GAT GTC GGA GCA Asp Val Gly Ala CCG Pro CGA Arg AAA Lys TAT TCT TTC TAT Tyr Ser Phe Tyr AAC CTG TTC CAA Asn Leu Phe Gln ATC CGT CAC AAT Ile Arg His Asn AAG TCG Lys Ser CAG Gln GGA Gly GTC Val GAC Asp GTT Val GGC Gly CAA TTG TCC Gln Leu Ser GCA TAT GAT TTG Ala Tyr Asp Leu AGC AAA GAC AAC Ser Lys Asp Asn AAT ACA TCG CCG Asn Thr Ser Pro TGC ACA CCG AGG Cys Thr Pro Arg CAA GAC AAT GTC Gln Asp Asn Val ATA CGT TAC GAT Ile Arg Tyr Asp AGC ACG CAT Ser Thr His TCG Ser GAA GAT AAG AGT GTC TCT ACC GGC ACT Glu Asp Lys Ser Val Ser Thr Gly Thr AAC CTT TCT Asn Leu Ser ATG GAT TTG Met Asp Leu TTT GCC GAA Phe Ala Glu TGG Trp ACT Thr ATG Met AAC GCG GGC GTA Asn Ala Gly Val TAT CGC GCT TCT Tyr Arg Ala Ser TAT GGC TGG AGA Tyr Gly Trp Arg GTC Val ACG Thr GCC Ala CTC AAA CCT TTC Leu Lys Pro Phe GGC TTC CGT CTG Gly Phe Arg Leu GGG GAG TCT TTG Gly Glu Ser Leu TTG GAC Leu Asp GAT AAA Asp Lys AAA TCC Lys Ser GCA GTA Ala Val TTG AGT Leu Ser CAC AGC Hls Ser ATA ACC Ile Thr CCG TAT Pro Tyr ATA TGC Ile Cys AAT ATC Asn Ile CGT TTG Arg Leu TAC CGC Tyr Arg CAC CGC His Arg ACC TGG Thr Trp CCG TCG Pro Ser AAA ACG Lys Thr 34 - GGC GGC AAC GGT TAT TAT Gly AGG Arg ACG Thr CTT Leu GAT Asp GCC Ala GAT Asp TTT Phe GCC Ala AAC Asn CAA Gln TGG Trp CTT Leu GAC Asp TCA Ser Asn TGG Trp CAT His TCT Ser TTG Leu GAA Glu CTG Leu AAA Lys TAT Tyr GGG Gly AAT Asn CAC His GCC Ala AGG Arg CGA Arg Gly GCG Ala TCG Ser TGG Trp ACT Thr ATG Met AAA Lys GGG Gly CGC Arg CAA Gln GCA Ala GGC Gly TAT Tyr ACG Thr TAT Tyr Tyr Tyr GAT GTC Asp Val GAA GAT Glu Asp AAC GCG Asn Ala TAT CGC Tyr Arg TAT GGC Tyr Gly CCG GAA Pro Glu GAC TTC Asp Phe GAC CTG Asp Leu ACT TCG Thr Ser CGG ATA Arg Ile GTA TGG Val Trp AAC CGT Asn Arg TTT GTA Phe Val GTA TTG Val Leu Gly GGC Gly AGC Ser AAC Asn ATG Met TTT Phe 1 TTG Leu GTA Val AAT Asn CAA Gln GCC Ala GAT Asp ACG Thr GCC Ala CCT Pro GCA Ala GGA Gly AAG Lys GGC Gly GCT Ala TGG Trp AAA Lys GGC Gly ATT Ile GCT Ala GCC Ala GGC Gly ATC Ile ACT Thr GGT Gly GCC GTT CAA GAC Val GGC Gly GTC Val GTC Val ACG Thr GCC Ala TTT Phe TTG Leu TTC Phe GGC Gly ATC Ile TTG Leu GTC Val TAT Tyr GGT Gly Gln ATA Ile TCT Ser CTC Leu GGC Gly GGG Gly AAT Asn GAA Glu GGT Gly GAC Asp AAT Asn CCG Pro AAA Lys CTC Leu TAC Tyr Asp CGT Arg ACC Thr AAA Lys TTC Phe GAG Glu AGA Arg GCC Ala TAT Tyr CCC Pro ATT Ile GAC Asp GAT Asp TTT Phe GAC Asp Ala GCA Ala AGT Ser GTA Val TCT Ser AGA Arg TCC Ser AAT Asn GCA Ala TCT Ser GGT Gly GGG Gly AAG Lys TCA Ser TTG Leu ATA TGG GGC Ile Trp Gly ATC Ile AAT ACG ATG TTT Asn Thr Met Phe ACT Thr TAT TCC AAG GCA Tyr Ser Lys Ala AAT Asn TAC Tyr GGC Gly CCT Pro CGT Arg TCT Ser GAG Glu AGC Ser GAA Glu GGA Gly TTG Leu GGG Gly GCC Ala GAT Asp CAT His GTC Val GAT Asp ACT Thr TTC Phe CTG Leu TTG Leu GCA Ala TAT Tyr ACC Thr TAC Tyr GGT Gly TTG Leu GAT Asp GCC Ala CCT Pro CGT Arg TAC Tyr CAC His ACC Thr CCG Pro AAA Lys GGT Gly TTC Phe CGA Arg CGA Arg AAA Lys TAT Tyr ATA Ile GTC Val GAC Asp TTG Leu CGC Arg CGC Arg TGG Trp TCG Ser ACG Thr ATT Ile AAC Asn ACT Thr AAT Asn ATC Ile TCC Ser CGC Arg CAA Gln GGA Gly AAA TCT Lys Ser l - ACA TTT AGC TTG GAA ATG AAG TTT TAA ACGTCCAAAC GCCGCAAATG Thr Phe Ser Leu Glu Met Lys Phe CCGTCTGAAA GGCT _o 36 - SEO ID NO: 3 Séquence de 1 'ADN génomique de la souche de N meningitidis M 2169 codant pour le précurseur de la sous-unité Tbpl et séquence protéique déduite. Le peptide signal est indiqué en caractères gras. CGGCATCGCT CCTI CAA CAG CAA CAT Gin Gln Gln His -20 ATG ACT GCG CTG Met Thr Ala Leu -5 GCA CAG GAA AAA Ala Gln Glu Lys CAG AAA ACC CGC Gln Lys Thr Arg GTC AAA ACC GCC Val Lys Thr Ala CGC GAC CTG ACG Arg Asp Leu Thr GGG CGC GGC GCA Gly-Arg Gly Ala AAC CGC GTT TCC Asn Arg Val Ser TAC ACC GCG CAG Tyr Thr Ala Gin AGC GGC GCA ATC Ser Gly Ala Ile ATCAAGAATA AGGCTTCAGA TCCGATA CCGTCTGAAA GCGAAGATTA GGGAAACATT TTG TTC CGA TTA AAT ATT TTA TGC CTG TCG Leu Phe Arg Leu Asn Ile Leu Cys Leu Ser CCT Pro CAG Gln CGC Arg GAC Asp CGT Arg AGT Ser TTG Leu GCG Ala AAT Asn GCT Ala TTG Leu GAT Asp ACC Thr TAC Tyr TCG Ser ACG Thr GCA Ala GAA Glu TAT Tyr GAT Asp AAC Asn CTC Leu GAC Asp GGC Gly GTG Val TTG Leu ATC Ile GCA Ala -1 ACC Thr GAA Glu AGC Ser CCC Pro TAC Tyr GAC Asp GGC Gly GAG Glu -15 GAA AAT Glu Asn ATA CAG Ile Gln GTA ACC Val Thr AAG GAA Lys Glu GGC ATC Gly Ile TCG ATA Ser Ile GGC TTG Gly Leu GGG ACG Gly Thr TAT GAA Tyr Glu GTG Val GTA Val GGT Gly CAG Gln GCC Ala CGC Arg GCG Ala AGG Arg AAC Asn CAA Gln AAA Lys CTG Leu GTA Val GTG Val GGT Gly CAA Gln ACG Thr GTC Val GCC Ala GCC Ala GGC Gly CTC Leu GTC Val ATG Met ATA Ile GCG Ala AAA Lys -10 GGA Gly AAA Lys AAA Lys GAT Asp GAA Glu GAC Asp CAG Gln GGC Gly GCT Ala GTC GAA ATC AGC AAA GGC TCA AAC TCG GTC GAA CAA GGC AGC GGC Val Glu Ile Lys Gly Ser Asn Ser Val Glu Gln Gly Objet: ATG Met -24 CTG Leu CAA Gln AAA Lys TTG Leu ATC Ile CAG Gln AAA Lys TCC Ser AGC Ser I Ser Ser Gly 37 - GCA TTG GCG GGT TCG GTC GCA TTT CAA ACC AAA Ala GTT Val TAT Tyr GGG Gly CGC Arg CAG Gln GCC Ala ACG Thr CGT Arg CTC Leu CCG Pro CTC Leu CCG Pro GCG Ala TAC Tyr GCG Leu Ala ATC GGG Ile Gly TCC GGC Ser Gly CGC ATC Arg Ile GCG GGG Ala Gly AGC TTT Ser Phe TAT TTC Tyr Phe TGT AAA Cys Lys CAA ACG Gln Thr GCC GAT Ala Asp GGT TTT Gly Phe GAA CAC Glu His GCA TTC Ala Phe GGT TCT Gly Ser GGC GGA Gly Gly GAA TAC Ala Glu Tyr Gly GAA Glu AAA Lys GGC Gly GAA Glu AAC Asn ATC Ile AGC Ser GTT Val CCG Pro CGT Arg ACG Thr CTG Leu TTG Leu CTG Leu GGT Gly Ser Val *GGC' AGG Gly Arg AAC CGG Asn Arg GGT GCG Gly Ala ATC CGC Ile Arg AGG CTG Arg Leu GTT GAA Val Glu AAA CCG Lys Pro TCC ACC Ser Thr CTT TCA Leu Ser TTT GAA Phe Glu CAA CAA Gln Gln ACC AAG Thr Lys CCC GGC Pro Gly TTT ACC Phe Thr Ala CAG Gln GGG Gly GAG Glu GCA Ala GTG Val GAT Asp AAA Lys CGA Arg TAC Tyr AAC Asn ACT Thr GCG Ala AAC Asn AAC Asn Phe TGG Trp CTT Leu GCT Ala CAC His CCG Pro GAA Glu AAA Lys GAC Asp GAA Glu AAA Lys TTC Phe GTT Val GGC Gly GGC Gly Gln GGC Gly ACC Thr TTG Leu GAA Glu GTT Val TGC Cys GAT A Sp TAC Tyr AGC Ser CGG Arg GAC Asp TTT Phe AAA Lys GAA Glu Tyr ATT Ile CAA Gln CTG Leu GAT Asp GAA Glu GAA Glu GTT Val ACG Thr CGA Arg CAC His ACG Thr GAT Asp TAC Tyr AAC Asn Lys CAG Gln TCC Ser ATC Ile GCC Ala GAC Asp GGC Gly GTC Val GGC Gly TCG Set TAC Tyr CGC Arg GCA Ala GCG Ala GGT Gly ACC Thr AGT Ser ATC Ile CAC His GGA Gly AGC Set AAA Lys GGC Gly CCC Pro TGG Trp ATC Ile GAT Asp AAT Asn GGC Gly GCG Ala GCC Ala AAA Lys GCG Ala ACC Thr CGC Arg AGC Set AAT Asn AAA Lys AAC Asn CTG Leu GGC Gly ATG Met TCA Ser AAC Asn CTG Leu GAC Asp ACC Thr CTG Leu GGG Gly GGC Gly GAA Glu TAC Tyr GAC Asp CGC Arg TTC Phe GGC Gly ACG Thr AAA Lys CAC His GTG Val GAT Asp GCC Ala GCG Ala CGG Arg GTT Val TAC Tyr GAA Glu GAA Glu TTC Phe CGC Arg ATA Ile GTT Val CAG Gln AAA Lys GGC Gly ACG GGC GTG TTT TAC GAC GAG ACG CAC ACC AAA Thr Gly Val Phe Tyr Asp Glu Thr His Thr Lys l AGC CGC TAC GGT Arg TGG Trp TTG Leu GAC Asp AAA Lys GCG Ala CTG Leu CAT His AAA Lys CCC Pro ATC Ile AGC Ser CGT Arg TAC Tyr CAC His Tyr Gly GCG GAT Ala Asp GAC AAT Asp Asn AAA TAT Lys Tyr TCC GAC Ser Asp GCA TTC Ala Phe AGC GTG Ser Val CAG GAT Gln Asp ACG CCC Thr Pro TAT TGG Tyr Trp TGC CTC Cys Leu ATC AAC Ile Asn TTG GGC Leu Gly CGC AGC Arg Ser CGC ACC Arg Thr Ser ACT Thr GGT Gly TCG Ser TAC Tyr CAG Gln AAC *h Asn CGC Arg TCG Ser AAA Lys CAA Gln CGC Arg GTC Val GAC Asp ACG Thr GCC GAC TGG Ala Asp Trp TTG GAA Leu Glu TAT GCC Tyr Ala CAT TTT His Phe TGC CGC Cys Arg CGC GTG Arg Val AAA AAA Lys Lys AAT CTC Asn Leu TAT TAT Tyr Tyr CCT AAA Pro Lys GTC AGC Val Ser TTT GGC Phe Gly GGC AAA Gly Lys AGG TGG Arg Trp ACG CAT Thr His CTG TCC Leu Ser TAT GTC TAT ACC AAT Val Tyr CTC TCT Leu Ser CAG ACG Gln Thr AGT GCC Ser Ala TAC GGG Tyr Gly TTC GAT Phe Asp TTT GAC Phe Asp CAA CAT Gln His GCC AAC Ala Asn GGC GGG Gly Gly AAT ACT Asn Thr TAT TAC Tyr Tyr GAT GTC Asp Val GAC GAC Asp Asp AAC GCC Asn Ala Thr TAC Tyr CAC His GAC Asp GAA Glu ACC Thr CGC Arg GCC Ala CCC Pro GGA Gly TAT Tyr GCG Ala GGC Gly GGC Gly GGC Gly Asn GAC Asp TGT Cys AAG Lys AGC Ser GCC Ala TTT Phe AAC Asn AAC Asn AAT Asn ACG Thr GCA Ala GCG Ala AGC Ser ATC Ile Tyr CGC Arg CAG Gln CCG Pro ATT Ile TCC Ser GGG Gly TAT Tyr ACC Thr ATA Ile AAC Asn AGC Ser GCG Ala TCG Ser TGG Trp GCC Ala CGG Arg TCT Ser CCG Pro CAC His AAA Lys GAC Asp CGC Arg GGC Gly GTG Val GAC Asp GTT Val GGG Gly GTT Val GTC Val GAT Asp CAG Gln GCC Ala TTT Phe AGG Arg ATC Ile TCT Ser GCC Ala GAC Asp GTT Val TGC Cys CGG Arg TTG Leu TCC Ser CTC Leu AAA Lys GGC Gly GAC Asp TCC Ser CTC Leu CGC Arg AAT Asn TAT Tyr AAG Lys ACG Thr ACG Thr GAC Asp CGC Arg ACC Thr AAA Lys GAC Asp ATC Ile GGT Gly TAT Tyr TTG Leu CAC His CTC Leu TCG Ser AGC Ser GGG Gly CCG Pro AAT Asn TAC Tyr GGC Gly CCT Pro CTG GAT TTG ACT TAC CGC ACT TCA ACC GGC TTC CGC Leu Asp Leu Thr Tyr Arg Thr Ser Thr Gly Phe Arg l 39 - CTG CCC TCG TTT Leu Pro Ser Phe AGC AAG GCG GTC Ser Lys Ala Val GCC GGC ATC GTG Ala Gly Ile Val TGG TTC AAC AAT Trp Phe Asn Asn GCG CAA ATT AAA Ala Gln Ile Lys TAC CTC AAT GCC Tyr Leu Asn Ala GGC AAA ATC GAT Gly Lys Ile Asp TGG TAT TCT ACA Trp Tyr Ser Thr AAA AAA CGC GCA Lys Lys Arg Ala GCC ATC CAA CCC Ala Ile Gln Pro CCG GAA GGC AAA Pro Glu Gly Lys GCC AAG GAA ATC Ala Lys Glu Ile GGC AAC AGC CGC Gly Asn Ser Arg TGG TAT ATT GTG Trp Tyr Ile Val TTC ACC CTC CGT Phe Thr Leu Arg GTT ACT-TGG GAA Val Thr Trp Glu GCG GAA ATG TAC Ala Glu Met Tyr AAA ATC GAT CCG Lys Ile Asp Pro TTT AAA GGC GAT Phe Lys Gly Asp GCC TAC CGC GAT Ala Tyr Arg Asp AAC GGC AAA GAA Asn Gly Lys Glu CAA AGC GCG CGG Gin Ser Ala Arg TGG AAC GGC GTA Trp Asn Gly Val TTT GCC TAT AAT Phe Ala Tyr Asn GAC CGC ACC GAT Asp Arg Thr Asp TCG CGC TAT GTC Ser Arg Tyr Val TGG GGT GTG AAC Trp Gly Val Asn ACA GAG TTG TTG Thr Glu Leu Leu AAT ACA AAA GCC Asn Thr Lys Ala GAT GTG TCC GGT Asp Val Ser Gly GCG GGC GTG TAC Ala Gly Val Tyr AAT GTG CGG CAA Asn Val Arg Gln GGC Gly GAA Glu TTC Phe TTG Leu GAA Glu ATT Ile TGG Trp CGT Arg ATT Ile GTC Val GGT Gly GGC Gly TGG CGG TCG GGT Trp Arg Ser Gly AAA TCG TTC AAC Lys Ser Phe Asn GGC AAC TTG GAG Gly Asn Leu Glu ATT GTC CGG GGT Ile Val Arg Gly GCC AAA GGC GAC Ala Lys Gly Asp ACC GGC ATC AAT Thr Gly Ile Asn GAT AAA TTG CCC Asp Lys Leu Pro GTC CAT GTC CGC Val His Val Arg CAA TCA CAC CTG Gln Ser His Leu GGC TTG GGC TAT Gly Leu Gly Tyr ATG CTG ACT TAT Met Leu Thr Tyr AGC CGG GCT TTG Ser Arg Ala Leu GTT CAA Val Gln AAA GAA Lys Glu GCA AGT Ala Ser TAT GAA Tyr Glu CCG GCT Pro Ala ATT TTG Ile Leu GAA GGT Glu Gly GAC ATC Asp Ile TTT GAT Phe Asp GAC CAA Asp Gln TCC AAA Ser Lys CTC AAC Leu Asn ACC GCG CGC CGT ACC CGC CCT Thr Ala Arg Arg Thr Arg Pro 810 ' 815 TAT Tyr AAC Asn ACT Thr TAC ACG ATT AAA Tyr Thr Ile Lys CTC CTC AAC TAC Leu Leu Asn Tyr GCC GGC GGC GCA *Ala Gly Gly Ala AAA CAC Lys His CGC TAT Arg Tyr GTC AAC Val Asn - CAA CAC AAA AAT GTC GGC GTT TAC Gln Hls Lys A Sn Val Gly Val Tyr CGA AAC TAC ACA TTT AGC TTG GAA Arg Asn Tyr Thr Phe Ser Leu Glu AAC CGA TAT GCC GCC CCC GGC Asn Arg Tyr Ala Ala Pro Gly 870 875 ATG AAG TTT TAA ACG Met Lys Phe 41 - SEO ID NO: 4 Sequence de l'ADN génomique de la souche de N meningitidis IM 2169 codant pour le précurseur de la sous-unité Tbp 2 et séquence protéique déduite. Le peptide signal est indiqué en caractère gras. ATTTGTTAA AAATAAATAA AATAATAATC CTTATCATTC TTTAATTGAA TTGGGTTTAT ATG AAC AAT CCA Met Asn Asn Pro -20 TTT TTG TTG AGT Phe Leu Leu Ser -5 GAT TCT GTC GAT Asp Ser Val Asp GAT GTT TCT TCC Asp Val Ser Ser TAC GGT TTT GCG Tyr Gly Phe Ala GCA GAA GAA AGC Ala Glu Glu Ser ACG GGA TTG CCG Thr Gly Leu Pro TCG GTT ATT GAA Ser Val Ile Glu TCT TCC CCC TAT Ser Ser Pro Tyr GGC AAC GGT GTA Gly Asn Gly Val AAT TTC CAA TAT Asn Phe Gln Tyr AGT GAA AAA GAT Ser Glu Lys Asp TTG Leu GCC Ala -1 ACC Thr GAA Glu ATG Met GAG Glu ACA Thr AAA Lys CTC Leu AAT Asn GTT Val TTC Phe GTA Val -15 AAT CAG GCT GCT Asn Gin Ala Ala TGT CTG GGC GGC Cys Leu Gly Gly GAA GCC CCG CGT Glu Ala Pro Arg AAA CCG CAA GCC Lys Pro Gln Ala AGG TTG AAA CGG Arg Leu Lys Arg GTT AAA CTG AAC Val Lys Leu Asn AAA CCC AAG GAA Lys Pro Lys Glu GTA GAA ACA GAC Val Glu Thr Asp ACA CCA TCA AAC Thr Pro Ser Asn CAA CCT AAA AAT Gln Pro Lys Asn TAT TCC GGT TGG Tyr Ser Gly Trp AGT AAC AAA AAA Ser Asn Lys Lys GGC Gly CCC Pro CAA Gln AGG Arg GAG Glu CTT Leu GGC Gly CAT His CAG Gln TTT Phe ATT Ile ATG Met -10 GTG CTG CCT GTG Val Leu Pro Val GGC AGT TTC GAT Gly Ser Phe Asp GCG CCA AAG TAT Ala Pro Lys Tyr AAA GAC CAA GGC Lys Asp Gln Gly AAT TGG TAT CCG Asn Trp Tyr Pro AGT GAT TGG GAG Ser Asp Trp Glu CCT AAA CGG CAA Pro Lys Arg Gin GAC AGC GAT ATT Asp Ser Asp Ile CAA AAC GGC AGC Gln Asn Gly Ser GCA ACA GGT CAC Ala Thr Gly His TAT AAA CAT GCA Tyr Lys His Ala AAG TCA GGC GAC Lys Ser Gly Asp Objet: CTT Leu CAA Gln GGA Gly GGG Gly GCG Ala AAA Lys TAT Tyr GCT Ala GAA Glu GCG Ala GAT Asp 42 - GGT TAT ATC TTC TAT CAC Gly GCT Ala GAT Asp AAA Lys GAA Glu GAG Glu AAG Lys AAT Asn GAT Asp ACT Thr GAC Asp GAA Glu GTC Val GCT Ala ACG Thr GAA Glu Tyr TCT Set ACA Thr AAA Lys GAA Glu GGT Gly AAA Lys AAT Asn GCA Ala GAC Asp TCG Ser TTG Leu GGC Gly TCA Ser TCG Ser TTG Leu Ile GGA Gly AAA Lys CAA Gln TAT Tyr TAT Tyr TTG Leu ACT Thr CAA Gin AAA Lys -TCT Set GGT Gly AGC Set GGC Gly TCT Ser ACA Thr Phe AAA Lys AAG Lys GGC Giy TCC Ser GGT Gly ACG Thr AAT Asn ATA Ile AAA Lys TCT Ser TTC Phe GCG Ala AGC Set GAA Glu CTA Leu Tyr His GTT ATC Val Ile GGT CAA Gly Gln GAC AGG Asp Arg AAC AAA Asn Lys TTT ACC Phe Thr GGT AAA Gly Lys AAT GAC Asn Asp ACA GGC Thr Gly GAG AAT Glu Asn TTG AGC Leu Ser CGC TTT Arg Phe AAA ACC Lys Thr ACA GGT Thr Gly AAC AGT Asn Set AAC GAC Asn Asp GGT Gly TAC Tyr GAT Asp TAT Tyr AAC Asn TCG Ser TTA Leu AAA Lys AAC Asn GAA Glu GGC Gly TTG Leu AAA Lys GCG Ala AAG Lys AAG Lys GAA AAA CCT TCC Lys GGT Gly CGT Arg GGA Gly TCC Ser TTA Leu CGC Arg ACC Thr TTC Phe AAA Lys TTT Phe GAC Asp AAA Lys GCA Ala ACC Thr ATC Ile Pro GTG Val GAA Glu TTT Phe ACG Thr GAA Glu AAT Asn ACC Thr AAC Asn CTA Leu TTC Phe GAT Asp CTG Leu TCG Ser ACG Thr AAA Lys Glu AAA Lys TTT Phe AGC Set GAA Glu AAT Asn ATA Ile CAT His CGC Arg ACC Thr GGC Gly AGC Set GAC Asp GCA Ala CTG Leu AAA Lys Set TGG Trp ATT Ile TCT Set CTG Leu GTG Val AAT Asn CAA Gln GGC Gly CAT His GGC Gly CAA Gln GAA Glu GGC Gly GTT Val AAT Asn CGA Arg CAT His ATC Ile GGT Gly AAA Lys GAT Asp GCG Ala TAC Tyr ACG Thr CCC Pro CCG Pro AAA Lys AAT Asn GGT Gly TTG Leu CTC Leu CAA Gln TTT Phe CAG Gln GAT Asp GAT Asp TTC Phe AGC Ser TAC Tyr GCA Ala TTT Phe CAG Gln GTT Val GGC Gly GCG Ala GAT Asp GAC Asp CTT Leu GTA Val CCT Pro GGC Gly GAT Asp GGC Gly CTA Leu AGC Ser ACG Thr GTT Val GGT Gly GCC Ala GCG Ala GCA Ala GCG Ala AAC Asn CCT Pro ACC Thr TCA Ser AGC Ser CAC His AAT Asn AAT Asn CTT Leu GCA Ala TCC Set GAG Glu GTT Val GCG Ala GGC Gly GTT Val TTC Phe 43 - AGC AAT GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp CTG Leu AAA Lys GAA Glu GCG Ala AAA Lys AAA Lys GCA Ala GAA Glu ATT Ile CAT His GAG Glu AAA Lys TTT Phe GCG Ala CCC Pro AAC Asn AGT Ser CAA Gln ACC Thr TAC Tyr GGA Gly CAA Gln CCA Pro ATT Ile GGC Gly ATT Ile ACC Thr AAA Lys AAG GAT Lys Asp GGC GGA Gly Gly GAT AAA Asp Lys ACC GCT Thr Ala TAT GAA Tyr Glu GGA ATG Gly Met GGA AAC Gly Asn AGT ATG Ser Met ACC GAC Thr Asp GCC AAC Ala Asn GGC AAC Gly Asn ACC GGC Thr Gly ATT GAG Ile Glu ACT GCT Thr Ala TCC Ser ACA Thr AAA Lys TCA Set GTC Val TTG Leu AGT Ser TTC Phe CAA Gln GGC Gly AGG Arg AAG Lys GGA Gly GAG Glu GAA Glu GAA Glu GAC Asp AAT Asn GAA Glu ACG Thr AGT Ser CTC Leu AAC Asn ACA Thr GCG Ala TTA Leu ATG Met TCA Ser AGC Ser TTT Phe GCC Ala ACG Thr GTC Val CGC Arg CAA Gln CAA Gln GTC Val AGC Ser GAA Glu ACC Thr ATT Ile GGT Gly GGG Gly ACC Thr CAA Gln GCA Ala TGC Cys AAA Lys GCT Ala GGC Gly GTT Val TGG Trp TTT Phe GCT Ala CAG Gln TTT Phe AAC Asn CGC Arg GCA Ala GGT Gly TGT Cys AAC Asn GAT Asp GAG Glu TAT Tyr AGC Ser ACT Thr GAA Glu GGC Gly GAT Asp ACC CGC ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA GAT GCC AAG GTA AAG GGC Ala Tyr Ile Thr Ala Lys Val Gly ACT Thr AAA Lys GGT Gly GAT Asp TCC Ser AGC Ser GCT Ala CGT Arg CGG Arg GGC Gly GTG Val AAC Asn AAC Asn CTC Leu Ile CAG Gln TTT Phe ACG Thr ACC Thr AAC Asn AAG Lys AAA Lys ACC Thr GGG Gly AAT Asn AAT Asn AGG Arg GGC Gly GAT Asp ATG Met GCA Ala GAA Glu CAG Gln AAT Asn CTC Leu TCC Ser ACG Thr GAT Asp TCT Ser GCT Ala TTT Phe CAG Gln TTT Phe CAA Gln ATT Ile GAT Asp CAC His ACG Thr GC Gly AAT Asn GCG Ala GAA Glu GAA Glu TGG Trp TCT Ser GCC Ala GCG Ala GAA Glu AAA Lys CCG Pro AAA Lys ACG Thr AAT Asn AAA Lys TAT Tyr ATG Met CAA Gln AAA Lys TAC Tyr GAT Asp GAT Asp CAA Gln GGT Gly AAT Asn CTC Leu GGT Gly CCG Pro GGG Gly ACA Thr CTG Leu CAG Gln GTT Val GAG Glu GGG Gly AAA Lys AAA Lys ACC Thr ACG Thr ACC Thr Lys Gly Thr Arg Thr Pro Lys Asp 44 - GGT TTT TAC GGG Gly Phe Tyr Gly TAT CCG GGC GAT Tyr Pro Gly Asp GAT GGA AAT TCA Asp Gly Asn Ser CCT Pro AAA Lys GCA Ala AAA GCC GAA GAG Lys Ala Glu Glu CAA ACG GAA AAG Gln Thr Glu Lys AGC AGC GCG ACC Ser Ser Ala Thr TTG Leu GCA Ala GTG Val GGC GGA TGG TTT Gly Gly Trp Phe ACA GCT ACA TCC Thr Ala Thr Ser GTA TTC GGT GCG Val Phe Gly Ala CGC CAA CAG CCT Arg Gln Gln Pro GTG CAA TAA GCACGGTTGC CGAACAATCA AGAATAAGGC Val Gln TTCAG GCC Ala AGC Ser AAA Lys -45 - Revendications 1 Un fragment d'ADN isolé codant pour un peptide, un polypeptide ou une protéine capables d'être reconnus par un antisérum anti-récepteur de la transferrine de la souche de N meningitidis IM 2394 ou IM 2169. 2 Un fragment d'ADN selon la revendication 1, qui comprend une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés homologue à celle telle que montrée: dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutanmine en position 579; dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. 3 Un fragment d'ADN selon la revendication 2, qui comprend une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés telle que montrée: dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 579; dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; -dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou 46 - dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. 4 Un fragment d'ADN selon la revendication 2, qui a une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés homologue à celle telle que montrée: dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutanine en position 579; dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutam ine en position 691. Un fragment d'ADN selon la revendication 4, qui a une séquence nucléotidique codant pour: i) la sous-unité Tbpl de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; ii) la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 579; iii) la sous-unité Tbpl de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le e -47- résidu acide glutamique en position 1 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou iv) la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu glutamnine en position 691. 6 Un fragment d'ADN selon la revendication 2, qui a une séquence nucléotidique codant pour un précurseur ayant une séquence d'acides aminés homologue à celle telle que montrée: dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu méthionine en position -20 et finissant avec le résidu glutarmine en position 579; dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu méthionine en position -24 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; -dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu méthionine en position -24 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887 ou dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu méthionine en position -20 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. 7 Un fragment d'ADN selon l 'une des revendications 1 et 2, qui a une séquence nucléotidique codant pour: i) Le précurseur de la sous-unité Tbpl de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu méthionine en position -24 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 884; ii) Le précurseur de la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2394 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 1, commençant avec le résidu méthionine en position -20 et finissant 48 - avec le résidu glutamine en position 579 iii) Le précurseur de la sous-unité Tbpl de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu méthionine en position -24 et finissant avec le résidu phénylalanine en position 887; ou iv) Le précurseur de la sous-unité Tbp 2 de la souche IM 2169 dont la séquence en acides aminés est montrée dans le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu méthionine en position - 20 et finissant avec le résidu glutamine en position 691. 8 Une cassette d'expression destinée à la production d'une protéine capable d'être reconnue par un antisérum anti-récepteur de la transferrine de la souche de N meningitidis IM 2394 ou IM 2169, qui comprend un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 7, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. 9 Une cellule-hôte transformée par une cassette d'expression selon la revendication 8. Un procédé de production d'une protéine capable d'être reconnue par un antisérum anti-récepteur de la transferrine de la souche de N. meningitidis IM 2394 ou IM 2169, qui comprend l'acte de cultiver une cellule-hôte selon la revendication 9. 11 Un bloc d'ADN isolé codant pour un peptide signal ayant une séquence d'acides aminés homologue à celle telle que montrée dans: le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu méthionine en position 24 et finissant avec le résidu en position 1. le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu méthionine en position 24 et finissant avec le résidu alanine en position 1; et le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu méthionine en i -49 - position 20 et finissant avec le résidu alanine en position 1. 12 Un bloc d'ADN isolé codant pour un peptide signal ayant une séquence d'acides aminés telle que montrée dans: le SEQ ID NO: 2, commençant avec le résidu méthionine en position 24 et finissant avec le résidu en position 1; le SEQ ID NO: 3, commençant avec le résidu méthionine en position 24 et finissant avec le résidu alanine en position 1; et le SEQ ID NO: 4, commençant avec le résidu méthionine en position 20 et finissant avec le résidu alanine en position 1.