Brevet FR2692485A1 — publié le 19931224

BOUCHONS DE COMBLEMENT DIAPHYSAIRE OBTENUS PAR COMPRESSION, RESORBABLES ET RADIOSTERILISABLES Lors de l'implantation d'une prothèse cimentée dans le canal médulaire d'un os, le chirurgien doit boucher ce canal afin d'empêcher le ciment de s'écouler et d'endommager la moelle. Dans llétat actuel de la technique, les chirurgiens utilisent des bouchons constitués de collagène et d'hydroxyapatite. Toutefois, l'usage de telles substances présente l'inconvénient de moduler l'expression phénotypique des ostéocytes en contact avec cette matière. En effet, les radiographies des os implantés fraichement d'un bouchon de collagène et d'hydroxyapatite montrent que l'opacité de la diaphyse osseuse est fortement diminuée à la hauteur du bouchon. Cette image traduit la perte de substances minérales. Pour résoudre ce problème, nous avons défini les critères de matériaux constitutifs - biodégradabilité - radiostérilisable - modelable en une structure apte à etre introduite dans la cavité - neutre vis-à-vis des cellules Après avoir étudié le mode d'action du collagène sur les cellules osseuses et sur les fibroblastes, nous avons constaté que ces cellules cherchaient toujours à renouveller la matrice extracellulaire dans laquelle elles se développaient.En effet, si on cultive des fibroblastes humains en présence de collagène bovin de type I (matériaux constitutifs des bouchons actuels), on constate une présence élevée de collagénases dans le milieu extracellulaire. L"os est composé entre autre d'une matrice extracellulaire de collagène I minéralisée par de l'hydroxyapatite. Le collagène I est le collagène que constituent les fibroblastes comme matrice extracellulaire. Experiezicul: L'expérimentation décrite ci-après comporte l'activité stimulante de la synthèse des collagénases du collagène minéralisé. - Cellule : fibroblastes provenant d'explants de peau humaine. - Conditions de culture : les cellules sélectionnées sont cultivées classiquement en milieu DMEM en présence de 5 % de sérum de veau foetal. - Temoin : cellules cultivées en l'absence d'actif testé - Reii1tats : valeur obtenue après mise en culture de 0,5.106 cellules. Nombre de cellules (1) ÀÀmbre à Collagénases (2) heures 48 heures activité'3' ng/ml Témoin 0,490+0,018 0,600+0,015 420+60 19,2,5 10 g/ml 10 g/ml collagène 0,485+0,014 0,490+0,010- 1 200+80 95+7 + wQ-AP'4' 2(1) : en densité optique (2) : méthode de dosage ELISA (immunofluorescence) (3) : une unité de collagénase est définie comme la quantité d'enzymes nécessaires pour dégrader 1 ug de collagène natif par heure à 250 C (4) : HO-AP = hydroxyapatite - obtention des anticorps anticollagènases totaux anticorps anticollagénases totaux sont obtenus par immunisation drun petit mammifère par des collagénases, gélatinase, stromelysine,... - Purification : elle est faite selon la méthode DOT-BLOT libation sur nitrocellulose) - Revelataon : anti-immunoglobupine spécifique fluorescente. Selon une méthode identique, nous avons évalué l'intérêt de nombreuses substances. Chacune de ces substances présentant un intérêt a été radiostérilisée à 25 Kgray (2,5 mégarads), puis la matière stérilisée par rayonnement gamma a été à nouveau testée par les tests précédemment décrits, complétés d'un test M.T.T. Ce test permet d'évaluer globalement les capacités vitales des cellules. En effet, il est tout à fait possible que la diminution de collagénases soit due à une baisse d'activité et non pas à- une modulation phénotypique. Le principe du test M.T.T. repose sur l'utilisation d'une substance : le sel de tétrazolium (jaune) qui sera réduit en un formazan (violet) par les réductases mitochondriales. Cette réduction est objectivée par une modification de la couleur du réactif qui passe du jaune au bleu. Après avoir étudié systématiquement de nombreuses substances naturelles hémisynthétiques et ': synthétiques, nous avons sélectionné le désoxyribonucléate de sodium tamponné à pH 6,5+0,2 par du phosphate monosodique. Exemple 2: - ADN sodique : 96,5 % - NaH2PO4 3,5 % - pH : 6,5 L'acide acide désoxyribonucléique (ADN) peut être obtenu sous différentes formes selon qu'il soit salifié avec du sodium, un alcalin, un métal (salification partielle) ou complexé plus ou moins totalement avec un acide aminé. La plupart de ces substances présentent un intérêt mais les difficultés d'obtention amènent un coût de production plus élevé qui ne se justifie pas toujours par une amélioration des performances. Les complexes ADN-glycine, ADN-Hydroxyproline, ADN-proline doivent être considérés avec attention. ne plus; l'accès industriel de ces substances est mal aise et leurs études toxicologiques ne sont pas aussi complètes que l'ADN de Sodium. Dans le cadre de l'exemple 2, de nombreuses substances peuvent être utilisées en remplacement du phosphate monosodique. On peut citer de manière non limitative tous les sels acides des polyoxacides partiellement neutralisés ainsi que les sels d'acides forts avec les bases faibles, de même les combinaisons de ces sels. L'association de l'ADN-sodique avec un sel dont la solution présente un pH acide est indispensable parce que les solutions aqueuses d'ADN de Sodium développent un pH d'une alcalinité incompatible avec la vie cellulaire. Pour acidifier le milieu, nous pouvons donc envisager d'utiliser les sels suivants NaH2PO4, KH2PO4, NH3H2P04 NaHSO4, KHSO4,NH3HSO4. D'une manière générale : les oxacides d'alcalins, d'alcalino terreux ou de métaux sont susceptibles d'abaisser le pH d'une solution d'ADN, hormis les composés instables (NaHCO3) qui alcalinisent le milieu après dégagement du C02 et les composés toxiques comme les sels d'acide borique. L'utilisation des phosphates calciques peut être envisagée en tant qu'éléments précurseurs de l'hydroxyapatite. Toutefois, l'emploi du CaHPO4 est délicat en raison de sa solubilité. Les polyacides carboxyliques comme par exemple l'acide citrique donnent d'assez bon résultats sous la forme de citrate monosalifié ou partiellement neutralisé par un cation bivalent. Exemple 3 : Nous avons défini ainsi à titre d'exemple 3 non limitatif une composition - ADN Na 96,64 % - NaH2PO4 3,26 % ( ght9 nQudrç! obtenue nar broyage des fibres d'ADN dans l'azote liquide par exemple (pour les rendre plus rigide) est comprimée dans la forme de bouchons. Les bouchons se présentent sous la forme de cônes tronqués dont le volume est défini par la formule suivante v =E .(H/3).(R2+r2+Rr) avec H = hauteur de la pièce R = grand rayon r = petit rayon (ici, la base) La surface décrite par R peut être munie d'un dispositif permettant une meilleure préhension. Toutefois, les volumes les plus divers peuvent être envisagés. Nous pouvons citer, à titre d'exemple non limitatif, quelques volumes "classiques" tels les sphères, les rhomboèdres, les parallélépipèdes, les tétraèdres, les prismes, les pyramides entières ou tronquées, les tonneaux. Des volumes associant un cylindre et un cône tronqué semblent les mieux adaptés mais leur exemple n'est pas exclusif de formes beaucoup plus diversifiées. Le créateur d'une forme de bouchon diaphysaire devra tenir compte de deux phénomènes. Tout d'abord, d'une expansion du bouchon après son formage par compression et ensuite, dl"wre rétraction de sa matière après radiostérilisation. La formulation tient compte d'une expansion de 5,5 % pour la formule précitée et d'une rétraction de 4 à 8 % après radiostérilisation. Il convient de noter que ces coefficients ne sont donnés qu'à titre indicatif, ils dépendent en effet de la force de compression et du débit-dose de la source. Dans notre exemple, une force équivalente à l'application d'un poids de 250 Kg par cm2 a été utilisée pour obtenir des bouchons de bonne tenue. Une adaptation de cette technique permet d'utiliser des forces de compression beaucoup plus faibles. Elle consiste à humecter le bouchon dès qu'il a été formé. Un revêtement vitreux très dur après sèchage constitue une enveloppe rigide et lisse du bouchon. La biodégradabilité du matériau a été testé par des essais chez l'animal. L'implantation de bouchons de 1 gramme dans le péritoine de souris n'a enclenché aucune réaction particulière sur les animaux d'un poids moyen de 50 grammes (n=8). L'observateur a noté que la matière se dégrade rapidement lorsqu'elle servait de support à':la prolifération cellulaire dans un milieu de culture (T=6 heures) et les bouchons de 1 gramme disparaissent avec un T 1/2 = 6 heures lorsqu'ils sont implantés chez l'animal. REVENDICATIONS 1 - Bouchons destinés à obstruer une cavité osseuse, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'ADN. 2 - Bouchons, selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'ADN utilisé est associé à un élément minéral ou organique, choisi préférentiellement parmi le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, le fer, les amines. 3 - Bouchon, selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l1ADN les constituant a un pH stabilisé entre 6 et 7,5 par un tampon classique d'un sel d'un polyacide partiellement neutralisé ou d'un acide fort et d'une base faible. 4 - Bouchon, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est obtenu par compression de l'ADN. 5 - Bouchon, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est radiostérilisable.