Brevet FR2696186A1 — publié le 19940401

SOUCHES DE NYCOPLABMA.FERMENTAN8 CYTOPATHOGENE ET PROCEDES DE DIAGNOSTIC IN VITRO ET D'IMMUNISATION METTANT EN OEUVRE DE TELLES SOUCHES Le SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) est généralement associée à une infection par un virus VIH. Cependant, le rôle possible de certains mycoplasmes comme co-facteurs du SIDA a été récemment envisagé. Plusieurs espèces de mycoplasmes ont été isolées de patients asymptomatiques, infectés par le VIH et aussi atteints de SIDA. Il s'agit de Mycoplasma fermentans, souche incognitus de Lo (3) et souche n"8 déposée à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris, le 22 mai 1990, sous le n"I-949 (4) et aussi de Mycoplasma pirum. La faiblesse de l'immunité humorale dirigée contre les mycoplasmes dans d'autres types d'affections dans lesquels ils ont déjà pu se trouver impliqués rendait difficile le diagnostic in vitro d'infections par des mycoplasmes ou d'affections distinctes susceptibles d'être mise en corrélation avec une infection par des mycoplasmes. Mais l'observation -alors nouvelle pour M.fermentans- que le cycle vital du mycoplasme passe par une forme extrêmement compacte appelée "mycosphère", a déjà été rapportée dans le brevet n"9209626 déposé le 03 août 1992. Ces mycosphères, dont le diamètre moyen est de l'ordre de 140-160 nm, se forment par des étranglements successifs des formes filamenteuses, qui sont les formes de croissance du mycoplasme. Il a été constaté que ces mycosphères, du moins celles de M. fermentans, présentent un certain degré de stabilité même en milieu acide, contrairement à ce qui a pu être observé pour d'autres mycoplasmes non humains ayant déjà donné lieu à 1 l'observation de "mycosphères". En outre les mycoplasmes se présentant sous cette forme sont plus aisément reconnus par des sérums prélevés chez des patients infectés par ces mycoplasmes, d'où le procédé plus particulièrement décrit dans le susdit brevet, pour la détection d'anticorps anti-M. fermentans dans un fluide biologique, notamment un sérum, provenant d'un patient éventuellement porteur de 1'infection, procédé qui, dans l'une de ses formes de mise en oeuvre préférées, comprenait la mise en contact de ce fluide biologique avec des mycoplasmes, notamment de M. anti-fermentans sous forme de mycosphères, et la détection, en cas d'infection effectivement présente, d'une réaction d'agglutination de ces mycosphères par les anticorps anti-mycoplasmes. L'agglutination peut être détectée en coloration négative au microscope électronique. Elle peut aussi plus pratiquement être détectée à l'oeil nu par agglutination de microbilles sur lesquelles auront été fixées les mycosphères. Un procédé de production de mycosphères de M.fermentans décrit dans le brevet sus-mentionné comportait la culture d'une telle souche de mycoplasmes dans le milieu SP4 (13) et le vieillissement de ces mêmes cultures en milieu SP4, jusqu'à transformation de la majeure partie des mycoplasmes présents en mycosphères. Le milieu SP4 est préparé, notamment comme suit à partir d'un "milieu de base" lui-même constitué à partir des composants suivants, commercialisés par la société DIFCO - DIFCO "PPL Broth" : 1 g - DIFCO peptone : 1,6 g - DIFCO tryptone : 3 g Le milieu de base est lui-même obtenu par addition d'eau pyrolisée jusqu'à obtenir un volume de 200 ml, dont le pH est finalement ajusté à 7,8. Le "milieu de base" ainsi obtenu est stérilisé par autoclavage 15' à 120"C. Le milieu complet (SP4) est obtenu en ajoutant aux 200 ml du milieu de base - 2,7 ml d'une solution d'ampicilline dosée à 66 mg/ml - 30 ml d'un extrait de levure "Yeast extract GIBCO" - 15 ml d'un milieu lui-même obtenu à partir de CMRL 1066 (GIBCO) complété avec de la glutamine à raison de 3 mg/l de fluide et sans bicarbonate - 3 ml d'une solution de glucose à 50% - 0,6 ml d'une solution de rouge de phénol (1%) - 50 ml de sérum de veau foetal (GIBCO). Le milieu complet est alors filtré sur membrane (mailles de 0,22 pm). Le filtrat peut être stocké à 4 C pendant 2 semaines. La détection rendue possible grâce à l'invention du brevet n"9209626 déposé le 03 août 1992 de la présence d'anticorps anti-mycoplasmes dans des prélèvements biologiques, notamment sérums, de sujets infectés par des mycoplasmes, apportait la confirmation d'une corrélation qui avait déjà été faite chez un grand nombre de patients, de la coexistence d'infections à la fois par des mycoplasmes et par un VIH. Elle ouvrait une nouvelle voie de dépistage à un stade très précoce d'une éventuelle infection par le VIH chez des sujets à haut risque.En outre, la détection d'une infection par des mycoplasmes, notamment du type M. fermentans, dans les conditions évoquées ci-dessus, précédait la détection d'une séropositivité par les tests classiques mettant en oeuvre la réalisation d'un contact immunologique entre le prélèvement biologique à l'étude et un antigène ou une composition d'antigènes caractéristique du VIH. La présente invention est fondée sur la découverte que certaines souches de mycoplasme possédaient également une cytopathogénicité propre à ces mycoplasmes, susceptible d'infecter spécifiquement des lymphocytes CD4 humains et d'induire chez le patient qui en est porteur un syndrome d'immunodéficience caractéristique du SIDA, et cela même en l'absence de VIH. L'invention concerne plus particulièrement une catégorie de souches de ce type, un procédé pour les cultiver, leurs applications à différentes formes de diagnostic in vitro, notamment de sensibilité des lymphocytes à l'infection, et à la production de compositions immunogènes à base de telles souches. Ces souches présentent naturellement les caractéristiques des mycoplasmes : pour une documentation générale relative aux mycoplasmes, on peut se reporter au chapitre 10 intitulé "The Mycoplasmas" de l'ouvrage intitulé Bergey Manual, ou encore au chapitre intitulé "The molliculites Mycoplasmas and ureaplasmas" de J.G. Tully and S. Razin, dans l'ouvrage intitulé "Practical handbook of Microbiology" édité par William M. O'Leary, 1989, édité par CRC Press, Inc., Boca Raton, Floride, USA. Elles présentent plus particulièrement les caractéristiques d'infecter des lymphocytes CD4, de s'y répliquer et, notamment en l'absence de lymphocytes CD8, d'en produire la lyse complète, notamment en l'espace de 3 jours. Certaines de ces souches sont aptes à former des mycosphères, stables en milieu acidifié, notamment par l'acide lactique, par culture dans un milieu SP4. Parmi ces souches figurent certaines ayant le profil caractéristiques, même en PCR (Polymérase chain Reaction : abreviation anglaise de "Reaction de chaîne par polymerase), de M.fermentans, ces souches étant capables de pénétrer dans le cytoplasme de lymphocytes CD4 humains maintenus dans un milieu RPMI 16-40, et de les infecter, un tel résultat n'étant cependant pas obtenu avec des lymphocytes CD4 de chimpanzés dans les mêmes conditions. Une souche caractéristique de l'invention (M.DEB) a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM sous le n I-1265, le 11 septembre 1992. Une souche d'un tel micro-organisme a été isolée à partir d'un patient présentant des signes cliniques et immunologiques du SIDA, bien que tous les essais sérologiques effectués aux fins de détecter une infection par VIH-1 et VIH-2 se fussent révélés négatifs (essais réalisés par la méthode dite de Western blot) (buvardage Western). Ces essais ont été réalisés sur des lymphocytes purifiés à partir d'échantillons de sang prélevés sous héparine et centrifugés sur un gradient de densité commercialisé sous la marque Ficoll par la firme Pharmacia, à 400 g pendant 30 mn. Aucune activité transcriptase inverse, aucun antigène du type p24/25 n'ont pu être détectés dans les surnageants d'une culture de lymphocytes purifiés à partir du susdit gradient, activés par de la phytohémagglutinine (PHA) et cultivés dans un milieu contenant de l'interleukine 2 et cela même après un mois de culture ou de co-culture. En outre, des essais de détection de séquences d'ADN dans les ADNs préalablement prélevés de ces lymphocytes par PCR mettant en jeu des séquences codant pour env, qaq de HIV-1 et de HIV-2 se sont tous avérés négatifs. En revanche des mycoplasmes ont pu être détectés dans la suspension cellulaire, notamment lorsque l'on a procédé comme suit 1 ml de la suspension cellulaire est marqué par 20 l de uracile tritiée, pendant 18 heures. Le surnageant est sédimenté à l'équilibre de densité dans un gradient de saccharose 70-20 %, 1 h à 45.000 tours/mn dans un rotor SW56 (tampon PBS + 2 % sérum de veau foetal). La radioactivité de chaque fraction est déterminée après précipitation par 5 % d'acide trichloracétique. Les mycoplasmes forment une bande de densité variant de 1,18 à 1,24. Les mycoplasmes récupérés à partir de cette bande de densité ont alors été propagés sur le milieu SP4. Ils ont donné lieu à un développement très rapide. Dans ce milieu qui contient de l'arginine et du glucose, le changement de pH à été indiqué par le virage du rouge au jaune d'un rouge de phénol survenu 24h après l'inoculation de ce milieu avec le surnageant de lymphocytes dans un rapport unique de 1/100. Le titre infectieux exprimé par les unités de changement de couleurs dans le milieu SP4 s'est avéré être de l'ordre de 1012/ml. Dans des essais de PCR mettant en oeuvre des amorces caractéristiques de M. fermentans, pirum et pneumoniae, il a été possible de constater une forte bande d'amplification avec M. fermentans. Cette bande d'amplification avait la capacité de s'hybrider dans un essai de Southern blot, (buvardage Southern) après digestion par l'enzyme EcoR1 avec une sonde d'ADN ribosomique de M.capricolum, laquelle contenait des séquences conservées dans tous les organismes procaryotiques. Ces essais ont été réalisés plus particulièrement dans les conditions suivantes Une bande d'amplification a été observée pour M.fermentans, avec de l'ADN extrait à partir d'un prélèvement de moelle osseuse, selon le procédé suivant : le prélèvement de moelle osseuse a été soumis à un gradient de Ficoll.A l'issue du gradient, ont été prélevés - la bande de cellules lymphoïdes, - le "plasma" - une bande composée de "débris" ayant sédimenté dans la partie supérieure du "plasma". L'ADN a été extrait à partir de chacune de ces fractions, ainsi qu'à partir d'un prélèvement d'urine, et de lymphocytes et de plasma du sang périphérique (cytophorese). La bande d'amplification a été observée avec l'ADN provenant des "débris" obtenus à l'issue de la centrifugation de la moelle osseuse dans le gradient Ficoll. Ceci est probablement dû au fait qu'à cette faible vitesse de sédimentation (2.000rpm), les mycoplasmes intracellulaires sont restés en haut du gradient. Conditions de PCR: La PCR a été effectuée avec l'ÂDN (1 g) de chaque échantillon, dissous dans du 10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgC12, 100 mg/ml gélatine, 0,4 pM de chaque amorce (J. Skov. Jensen et al, 1991) 200 ?M de chaque dNTP et 1,5 unités de Taq DNA polymérase. Le volume final est de 50 pl. Le mélange est recouvert par 50 Al d'huile minérale, les échantillons ont été dénaturés à 95"C pendant 3 mn, puis amplifiés pendant 35 cycles. Chaque cycle est composé de 1) dénaturation à 94 C pendant 1 mn, 2) hybridation à 55"C pendant 1 mn, 3) extension à 72 Cpendant 2 mn et 30 sec. 17A1 du produit réactionnel ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Transfert selon la technique de Southern et hybridation avec une sonde interne. Les amorces et les sondes sont définies dans Wang et al, 1992 (M.fermentans) et Jensen et al, 1991 (M.genitalium). Pour M.pirum (cf FR 9209486). Le profil obtenu en RFLP de N. fermentans (DEB) a été comparé à celui de M. fermentans souche n 8, ainsi qu'à celui d'autres mycoplasmes, après hybridation avec la sonde ribosomique pMCS (Amikam, D., S.Rarin, & BR G.Glaser, 1982, "Ribosomal RNA genes in mycoplasmas Nucleic Acids Res. 10, 4215-4222). La sonde pMC5 provient de 1'ADN de M.capricolum. Le profil de M. fermentans DEB est très proche de celui de M.fermentans souche n 8 L'ADN a été hydrolysé par EcoR1 (Boehringer) pendant 16h à 37 C, soumis à électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, transféré par la technique de Southern et hybridé avec mPC5 (préalablement marqué au 32P par translation de coupure (nick-Translation) (kit Amersham). I1 résulte des essais qui précèdent que la souche selon l'invention présentait des caractéristiques propres à M. fermentans. En outre, après culture dans le milieu SP4, la souche étudiée s'est avérée présentée le cycle de développement caractéristique que l'on avait déjà observé avec d d'autres souches. M. fermentans. Sous des conditions de stress, les formes "plasmodiales" (en tubes) de la souche en cours de croissance se transforment en mycosphères ou en petites unités denses, sensiblement sphériques, ayant des diamètres de l'ordre de 140-160mM. Cette transformation peut être observée en tubes de verre et dans un milieu SP4 appauvri d'abord, puis enrichi en acide lactique. En pratique lorsque 10 unités de changement de couleur (du mycoplasme) sont inoculées dans 1 ml de milieu SP4, on observe la transformation complète des mycoplasmes en sphères individualisées denses environ 3 jours plus tard. Lorsque ces sphères sont ramenées dans du milieu frais elles "germent" en formant des tubes ayant un diamètre de lors de 75 nm conduisant finalement aux formes plasmodiales.Les mêmes sphères -ou mycosphères- sont observées à l'intérieur de lymphocytes T4 lorsqu'ils sont infectés par des mycoplasmes de ce type à l'occasion de leur pénétration dans le cytoplasme. Les mêmes cytoplasmes ont été détectés dans des cellules blanches obtenues par cytophorèse, dans des cellules de moelle prélevées sous héparine et dans de l'urine du patient. Les cellules blanches du sang et les lymphocytes de la moelle ont été séparées sur des gradients de Ficoll, comme cela a déjà été indiqué plus haut. Comme dans le cas précédent, des signaux caractéristiques de M. fermentans ont été trouvés dans des ADN extraits des cellules blanches et des cellules de moelle. Des essais de microscopie électronique ont fait apparaître, après coloration négative dans du molitate d'ammonium, des formes plasmodiales caractéristiques de mycoplasmes dans les lymphocytes dans les cellules de moelle et dans l'urine avoisinantes avec des mycosphères denses. Des mycosphères denses ont également été constatés dans des égratignures provoquées dans la muqueuse de la joue du patient. Ces essais établissent donc à l'évidence une infection de ce patient par M.fermentans. L'hypothèse a également pu être faite de façon très sérieuse que cette souche de M. fermentans pouvait être la cause de l'immunodéficience dont souffrait le patient. En effet cette souche de M.fermentans s'est avérée pouvoir infecter plusieurs cultures de lymphocytes T activées provenant de divers donneurs de sang. Dans certains cas, les sous populations de lymphocytes ont été purifiées par mise en contact avec des surfaces de plastique revêtues d'avec un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement les lymphocytes CD8. Comme cela a déjà été indiqué plus haut, l'effet cytopathique majeur a été observé dans des cultures de cellules T appauvries en cellules T8. L'effet cytopathique affectait surtout les cellules T4. En l'absence des cellules T8, 100 % des cellules ont été lysées en 3 jours, les premiers effet de la lyse ayant été observés dès le deuxième jour de l'infection. Les cellules T8 ont été affectées dans un moindre degré. En revanche une infection de cellules T4 de chimpanzés infectées de façon analogue, en l'absence de cellules T8, n'ont pas été infectées de la même façon, en présence du marqueur uracyl. L'examen au microscope électronique de lymphocytes infectés a conduit à l'observation suivante, chez les lymphocytes T4 humains et les lymphocytes T4 de chimpanzés. Dans le cas des lymphocytes humains, de nombreuses mycosphères ont été observées dans le cytoplasmes des cellules en voie de lyse. Au contraire, dans les préparations de lymphocytes de chimpanzés, la présence de mycoplasmes n'a pu être constatée qu'à l'extérieur des membranes de plasma. Ces essais tendent à établir que l'effet cytopathique de la souche de mycoplasmes de cellules humaines doit être lié à leur capacité de pénétration intracellulaire dans les lymphocytes humains. L'invention concerne aussi les applications de ces mycoplasmes cytopathogènes. En particulier ils peuvent être mis en oeuvre dans un procédé de mesure de la sensibilité in vitro d'un patient à une infection par M. fermentans, ce procédé comportant l'infection des lymphocytes de ce patient par le mycoplasme cytopathogène et l'observation, notamment sous le microscope du délai dans lequel se manifeste cet effet cytopathogène. La mort des cellules est, par exemple, repérée par leur perméabilité au trypan bleu. Dans une variante de cette application, appliqué à des lymphocytes sains, le procédé selon l'invention permet l'évaluation de l'effet protecteur de médicaments, notamment antibiotiques, contre des mycoplasmes. De même, ces mycoplasmes, notamment sous forme de mycosphères, peuvent-ils être utilisés dans des essais de diagnostic de la présence d'anticorps M.fermentans dans un fluide biologique, notamment un sérum, comme cela a été rappelé, plus particulièrement en rapport avec la souche M. fermentans n"8. Dans sa forme la plus générale, le procédé selon l'invention pour le diagnostic in vitro dans un fluide biologique d'une infection antérieure par des mycoplasmes est caractérisé par la mise en contact de ce fluide biologique au sein d'un milieu nutritif approprié avec des mycoplasmes dans des conditions permettant une interaction entre ces mycoplasmes et des anticorps reconnaissant ces mycoplasmes et éventuellement présents dans ce fluide biologique. Dans l'une des formes de mise en oeuvre de ce procédé, le diagnostic in vitro repose sur la mise en évidence d'une action neutralisante de ces anticorps contre lesdits mycoplasmes, lorsque ceux-ci sont amenés au contact du fluide biologique étudié au sein d'un milieu de culture approprié. La visualisation de l'action neutralisante peut être faite par tout moyen approprie. Avantageusement, on peut avoir recours à l'utilisation des manifestations d'un indicateur de réaction susceptible d'être affecté par l'un des produits libérés à l'occasion du développement du mycoplasme, par exemple un indicateur de changement de pH permettant de détecter la production d'acide lactique, lorsque le milieu de culture utilisé contient du glucose et que celui-ci subit une fermentation par le mycoplasme au cours de son développement. Ainsi la présence d'anticorps anti-mycoplasmes dans l'échantillon étudié se manifestera-t'elle par l'inhibition du développement du micro-organisme. Au contraire, on observera un développement des mycoplasmes, par conséquent une acidification du milieu, en l'absence des anticorps dans l'échantillon. Les méthodes de diagnostic in vitro d'une infection par des mycoplasmes sont plus faciles et plus sensibles à mettre en oeuvre lorsque, comme M. fermentans, le mycoplasme étudié peut être isolé et produit à l'état de mycosphères. Celles-ci donnent alors lieu à des réactions d'agglutination plus sensibles, lorsqu'elles sont amenées au contact de prélèvements biologiques, notamment sérums sanguins contenant des anticorps anti-mycoplasmes. L'invention concerne donc également des kits pour le diagnostic d'un infection due à des mycoplasmes, le réactif principal de ces kits consistant alors dans un mycoplasme, notamment sous forme de mycosphères, ou un antigène de mycoplasmes. Dans une forme préférée de kit, du moins lorsque le mycoplasme étudié peut être produit et isolé sous forme de mycosphères, le réactif principal consiste en un conjugué entre ce mycoplasme et des particules supports inertes permettant la réalisation de réaction d'agglutination, ou même d'hémagglutination. Pour la mise en évidence d'une infection par mycoplasmes mettant en jeu les propriétés séroneutralisantes des anticorps éventuellement présents dans les échantillons ou prélèvements biologiques à étudier, les kits du genre en question contiennent à titre de constituants princeps - des mycoplasmes sous forme lyophilisée ou congelée susceptibles d'être remis en culture - les milieux de culture appropriés propres à recevoir à la fois les mycoplasmes et échantillons ou prélèvements biologiques à étudier - l'indicateur ou les indicateurs de l'éventuelle croissance de la culture de mycoplasmes. L'invention concerne encore des kits comportant, outre les réactifs principaux rappelés ci-dessus, des antigènes synthétiques ou naturels susceptibles d'être reconnus par des anticorps caractéristiques du VIH, dès lors que l'échantillon ou prélèvement biologique en contient. L'invention concerne également des compositions de vaccins anti-mycoplasmes essentiellement caractérisées par des formes atténuées ou tuées de mycosphères de mycoplasmes, en particulier de M. fermentans, ou des protéines ou des peptides dérivés de ces mycosphères ainsi que de leurs fragments ceux-ci peuvent être obtenus par hydrolyse enzymatique, par exemple avec la protéine V8, ou par synthèse chimique ou encore par expression de séquences nucléotidiques correspondant aux séquences peptidiques des susdits fragments par des techniques de génie génétique. Les fragments de protéines ou de peptides dérivés des susdites mycosphères sont naturellement caractérisés par leur capacité à être reconnus par les mêmes anticorps que les mycosphères elles-mêmes. L'invention apporte à ce titre un vaccin ayant pour but de prévenir un SIDA dû à des mycoplasmes cytopathogènes. Un tel vaccin peut également être utilisé à titre de vaccin complémentaire permettant de retarder, sinon d'enrayer, le développement du SIDA chez des sujets séropositifs ou à haut risque de le développer. Cette vaccination prend toute sa valeur dès que l'on admet que l'annihilation chez le sujet des mycoplasmes peut également entraîner un ralentissement de l'activité virale du VIH chez le sujet séropositif ou potentiellement séropositif. L'invention concerne enfin des anticorps séroneutralisants susceptibles d'être induits par des mycoplasmes conformes à l'invention et à leur utilisation en immunothérapie, pour enrayer une infection due à de tels mycoplasmes. Les figures 1 et 2 correspondent aux photographies qui sont jointes. Les légendes de ces photos sont les suivantes Photo n-1: Résultat de PCR avec les amorces spécifiques de N. fermentans (Wang et al, 1992) Piste 1 : H20 Piste 2 : témoin "Lyse" Piste 3 : PBME Piste 4 : cellules lymphoïdes de moelle Piste 5 : "débris" de moelle Piste 6 : urine Piste 7 : plasma Piste 8 : lyse (témoin) Piste 9 : M. fermentans (100/g) Photo n-2: RFLP Pour M.fermentans DEB et n S, M. genitalium, M. pirum et M. hominis. L'ADN a été hydrolysé par EcoRI; puis hybridé avec pME5 R ~E VENDICATION8 1. Souche de mycoplasme possédant également une cytopathogénicité propre à ces mycoplasmes, susceptible d'infecter spécifiquement des lymphocytes CD4 humains et d'induire chez le patient qui en est porteur un syndrome d'immunodéficience caractéristique du SIDA, et cela même en l'absence de VIH. 2. Souche de mycoplasme selon la revendication 1, susceptible d'infecter des lymphocytes CD4 et de se répliquer, en l'absence de lymphocytes CD8, et de produire la lyse complète de ces lymphocytes CD4, notamment en l'espace de 3 jours. 3. Souche selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est du type Mycoplasma. fermentans. 4. Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM sous le n I-1265, le 11 septembre 1992. 5. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en qu'elle se présente sous la forme de mycosphères ayant un diamètre moyen de l'ordre de 140-160 nm. 6. Procédé de mesure de la sensibilité in vitro d'un patient à une infection par M. fermentans, ce procédé comportant l'infection des lymphocytes de ce patient par le mycoplasme cytopathogene selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et l'observation, notamment sous le microscope, du délai dans lequel se manifeste cet effet cytopathogène. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en qu'il est appliqué à l'évaluation de l'effet protecteur de médicaments, notamment antibiotiques, contre des mycoplasmes. 8. Procédé de le diagnostic in vitro dans un fluide biologique d'une infection antérieure par des mycoplasmes, caractérisé par la mise en contact de ce fluide biologique au sein d'un milieu nutritif approprié avec des mycoplasmes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans des conditions permettant une interaction entre ces mycoplasmes et des anticorps reconnaissant ces mycoplasmes et éventuellement présents dans ce fluide biologique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le diagnostic in vitro repose sur la mise en évidence d'une action neutralisante de ces anticorps contre lesdits mycoplasmes, lorsque ceux-ci sont amenés au contact du fluide biologique étudié au sein d'un milieu de culture approprié, la visualisation de l'action neutralisante pouvant être faite par tout moyen approprié, notamment l'utilisation des manifestations d'un indicateur de réaction susceptible d'être affecté par l'un des produits libérés à l'occasion du développement du mycoplasme, par exemple un indicateur de changement de pH permettant de détecter la production d'acide lactique, lorsque le milieu de culture utilisé contient du glucose et que celui-ci subit une -fermentation par le mycoplasme au cours de son développement. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les mycoplasmes sont à l'état de mycosphères. 11. Vaccins anti-mycoplasmes essentiellement caractérisées par des formes atténuées ou tuées de mycosphères de mycoplasmes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou des protéines ou peptides dérivés de mycosphères de ces mycoplasmes ou de fragments de ces protéines ou peptides. 12. Anticorps spécifiques des mycoplasmes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.