Brevet FR2690921A1 — publié le 19931112

Polypeptides de synthèse appartenant au virus de l'hépatite C (VHC) et utilisables notamment pour détecter ce dernier La présente invention concerne de manière générale des polypeptides de synthèse, c'est-a-dire obtenus par des voies préparatives telles que synthèse chimique, composés d'acides aminés consécutifs, identiques ensemble à tout fragment, séquence, ou région du virus humain de l'hépa- tite C (VHC) Ces polypeptides peuvent être utilisés comme antigènes de synthèse, dans différentes applications dé- coulant de leur pouvoir immunogène, et précisées ci-après; au premier rang de ces applications figure la détection du VHC, dans différents milieux coroporels, par exemple un échantillon ou prélèvement sanguin. Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié et complètement séquence, tant en ce qui concerne son génome ARN monocaténaire que les protéines de son enveloppe; on se référera en particulier aux publications suivantes: Choo Q-L, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M, Isolation of a c DNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome, Science 1989; 244: 359-62. Choo Q-L, Weiner AJ, Overby LR, Kuo G, Houghton M, Bradley DW, Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-A, non-B hepatitis, Br Med Bull 1990; 46: 423-41 non-A, non-B hepatitis Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9524-8. Overby LR Non-A, non-B hepatitis Success and failure in an era of molecular biology In: Shikata T, Purcell RH, Uchida T, eds Proceedings of the International Meeting on Non-A, Non-B Hepatitis Amsterdam: Elsevier. 1991; 3-5. Choo Q-L, Richman KH, Han JH, et al Genetic organiza- tion and diversity of the hepatitis C virus Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 2451-5. Le virus VHC est un virus non A-non B de l'hépatite, se transmettant par la voie parentérale. Il est une source importante d'hépatites post- transfusionnelles Et rien qu'à ce titre, le besoin existe d'un réactif immunologique sensible et fiable, couvrant la quasi-totalité des différents isolats du VHC ou sérotypes de l'hépatite C A cet égard, trois groupes de virus de l'hépatite C ont été isolés et coexistent souvent à l'intérieur d'une zone géographique et à la même fréquence; cf: Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo Q-L, Molecular biology of the hepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease Hepatology 1991; 14: 381-8. Il a été établi que la protéine de la nucléo-capside, dite protéine CORE, du VHC, se composant comme établi par les figures 1 et 2 de 191 acides aminés, est celle qui présente l'homologie la plus importante, d'une part entre les séquences d'un même groupe, et d'autre part entre les différents groupes Par ailleurs, cette protéine CORE est codée par une partie structurale du génome du VHC, et constitue donc une protéine structurale La grande conservation de la structure de cette protéine en fait un candidat, particulièrement adapté à la détection immunologique du VHC, et a permis de déterminer une séquence dite "consensus", cf par exemple: Hosein B, Fang CT, Popovsky MA, Ye J, Zhang M, Wang CY, Improved serodiagnosis of hepatitis C virus infection with synthetic peptide antigen from capsid protein Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 3647-51.30 De fait, différents tests ou réactifs immuno- logiques, de deuxième génération, ont été récemment intro- duits sur le marché, pour la détection des anticorps anti- VHC; parmi ces tests, on peut citer: là test ELISA HCV commercialisé par la Société ORTHO et le test RIBA HCV commercialisé par la Société CHIRON. Tous ces tests comprennent une protéine recombi- nante de fusion dont une partie C terminale, relativement courte par rapport à la longueur totale de la protéine de fusion, correspond à la protéine CORE proprement dite En pratique, ces tests se sont révélés supérieurs en spéci- ficité et sensibilité aux tests dits de première géné- ration, c'est-à-dire comprenant d'autres protéines du virus VHC. Comme discuté concrètement, à la fin de la présente description, c'est-à-dire après avoir exposé le protocole expérimental complet soutenant la présente invention, ces protéines de fusion présentent néanmoins en pratique différents inconvénients: 1) elles sont exprimées, soit dans E coli, soit dans un système baculovirus, soit dans des cellules de mammi- fères, ce qui implique toute la complexité liée aux processus de manipulation génétique et biotechnolo- giques; 2) la majeure partie de la protéine de recombinaison ne sert à rien, vis-à-vis du processus de détection immu- nologique, et peut être une source de perturbation de ce processus, par exemple en étant susceptible dlimmuno-réagir avec d'autres anticorps. Conformément à une publication déjà citée, à savoir: Hosein B, Fang CT, et al, Improved serodiagnosis of hepatitis C virus infection with synthetic peptide antigen from capside protein Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 3647-51, différents peptides synthétiques correspon- dant à certaines séquences de la protéine CORE peuvent être utilisés en tant qu'antigène dans des tests de détection en phase solide, par exemple sur des supports immunoabsorbants. Il résulte du protocole expérimental exposé ci- après que les peptides retenus jusqu'à présent n'ont pas apporté un réactif immunologique à large spectre vis-à-vis de tous les différents isolats du VHC. La présente invention a donc pour objet un ou plu- sieurs peptides, ou leurs fragments, représentant chacun une séquence de la protéine CORE, et présentant seuls ou en mélange une réactivité avec la majorité, ou la quasi- totalité des sérums d'individus ou échantillons infectés par le VHC. La présente invention a pour origine les conclu- sions totalement inattendues suivantes, résultant du pro- tocole expérimental exposé ci-après 1) dans la protéine CORE du VHC, il existe une région immunodominante représentée par environ les 45 premiers acides aminés; 2) cette région immunodominante suffit à elle seule pour obtenir la même sensibilité qu'avec la protéine CORE totale, en ce qui concerne la détection des anticorps anti-VHC; 3) cette région immunodominante doit être continue, si on veut réagir avec la quasi-totalité des sérums d'indivi- dus ou échantillons sanguins infectés par le VHC; 4) cette région immunodominante comporte manifestement des épitopes de type conformationnel et des épitopes de type linéaire. En conséquence, la protéine utilisée conformément à l'invention est constituée uniquement par un polypeptide isolé, et comprenant environ 45 acides aminés N-terminaux de la protéine CORE du virus VHC Ou alternativement, la protéine selon l'invention est constituée uniquement par tout polypeptide homologue, comprenant environ 45 acides aminés, et présentant une réactivité immunologique croisée avec ledit polypeptide isolé, et ceci vis-à-vis du VHC. La présente invention découle de ces observations expérimentales, comme défini ci-après. L'invention apporte tout d'abord l'un quelconque des composés ou compositions polypeptidiques suivants: a) uniquement une séquence peptidique isolée, se composant de 45 acides aminés N-terminaux de la protéine CORE (ou capside) du virus humain de l'hépatite C (VHC), telle que représentée aux Figures 1 et 2, cette séquence étant éventuellement amputée dans sa partie N-terminale et/ou sa partie C-terminale de 1 à 10 acides aminés; b) uniquement une séquence immunogène équivalente à la séquence peptidique (a), présentant une réactivité immunologique croisée avec cette dernière, vis-à-vis du VHC; c) uniquement une séquence homologue à la séquence pepti- dique (a), dont chaque acide aminé constitutif présente des propriétés chimiques identiques ou analogues à celles de l'acide aminé homologue dans la séquence pep- tidique (a); d) une combinaison polypeptidique, comprenant ou associant une pluralité de fragments polypeptidiques isolés, ré- pondant à la définition suivante: chaque fragment polypeptidique se compose d'acides aminés pris consécutivement dans les 45 acides aminés Nterminaux de la protéine CORE (ou capside) du VHC, correspondant à la séquence peptidique (a), ou dans toute séquence (b), ou dans toute séquence (c); l'un des fragments N-terminal/C-terminal desdits fragments peptidiques est homologue, sans tenir compte des acides aminés éventuellement en commun entre deux fragments consécutifs, à la séquence pep- tidique (a), à la séquence (b), ou la séquence (c); Préférentiellement, cette combinaison comprend au moins deux fragments polypeptidiques isolés, et/ou chaque fragment polypeptidique isolé comprend entre 12 et 2430 acides aminés; avantageusement, cette combinaison comprend trois fragments polypeptidiques isolés. e) tout mélange approprié des composés ou compositions polypeptidiques selon (a) à (d). Par "séquence polypeptidique isolée", on entend tout polypeptide non fusionné avec une autre protéine ou un autre peptide, quelle que soit sa voie d'obtention, par exemple par synthèse chimique, lyse de la protéine CORE, ou par des techniques de recombinaison génétique Ce poly- peptide peut par conséquent être un peptide de synthèse, ou une protéine. Selon la présente invention, un acide aminé est dit homologue d'un autre acide aminé, lorsque leurs caractéristiques chimiques, telles que polarité, hydro- phobicité, et/ou basicité, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes Ainsi, une leucine est homologue d'une isoleucine, au sens de la définition précédente. Les séquences polypeptidiques selon l'invention peuvent être telles qu'à l'état natif, ou modifiées chimi- quement Par modification chimique, on entend toute alté- ration chimique d'au moins un groupement fonctionnel de la séquence peptidique, préservant substantiellement voire développant les propriétés biologiques de ladite séquence. Font notamment partie des modifications chimiques considé- rées précédemment, le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amine, une carboxyméthylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques, une modification des liaisons peptidiques telles que des liaisons carba, retro-inverso, réduites et méthylène- oxy. A partir des composés ou compositions peptidiques définis précédemment, l'invention propose un réactif de détection du virus humain de l'hépatite C (VHC), compre- nant à titre de substance réactive l'un quelconque des composés ou compositions précités, et éventuellement tout additif immuno-compatible avec la détection du VHC Ainsi, la détection peut être effectuée à l'aide d'un polypeptide identique ou analogue à ceux de la présente invention ou d'un anticorps anti-immunoglobuline humaine, marqués par tout marqueur conventionnel, tel que marqueur radioactif, fluorescent, enzymatique ou analogue Un tel réactif peut être utilisé, aussi bien en phase homogène, par exemple dans des essais d'immuno-précipitation, qu'en phase hétérogène, par exemple dans des essais d'immuno- adsorption. Avec le réactif précité, on peut obtenir tout moyen approprié de détection du VHC, qu'il s'agisse d'un kit de détection ou de tout autre système ou ensemble équivalent A titre d'exemple, le réactif précité est sup- porté sur un support solide, immuno-compatible avec le ré- actif dans son ensemble; en particulier le support solide est sans limitation sous la forme d'une plaque de micro-titration, d'une feuille, d'un cône, d'un puits, d'une bille, ou tout autre substrat microparticulaire approprié. Le terme support solide tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peuvent être immobilisés les polypeptides selon l'invention Ce peut être des matériaux de synthèse modifiés ou non chimiquement, notamment des polysaccharides, tels que les matériaux de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que la nitracellulose et l'acétate de cellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrène, polyacrylate, ou copolymères tels que polymère de chlorure de vinyle et de propylène, polymère de chlorure de vinyle et d'acétate de vinyle; copolymères à base de styrène; des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que le nylon De préférence, le support solide est un polymère de polystyrène, un copolymére butadiène-styrène ou un copolymère butadiène-styrène en mélange avec un ou plusieurs polymères ou copolymères choisis parmi le polystyrène, les copolymères styrène-acrylonitrile ou styrène-méthylméthacrylate de méthyle, les polypropylènes, les polycarbonates ou analogues. A partir des réactifs ou moyens de détection immunologique selon l'invention, on peut détecter des anticorps anti-VHC, dans toute partie ou milieu corporel, tel qu'un échantillon du sang d'un individu suspecté d'être infecté par le VHC Il suffit pour cela de mettre en contact cette partie corporelle et le réactif précité, dans des conditions prédéterminées, par exemple de température, permettant une éventuelle réaction immunologique, et de détecter ensuite la présence d'un complexe immun avec ce réactif. Par "partie corporelle", on entend tout fluide, tissu ou organe d'un individu, comprenant ou susceptible de comprendre des anticorps anti-VHC Ces parties corpo- relles peuvent être un échantillon de sang, de plasma, de sérum, des sécrétions diverses, etc Le procédé décrit précédemment peut être mis en oeuvre dans tout dispositif ou appareil de détection, com- prenant un récipient de mise en contact de la partie cor- porelle analysée, avec un réactif tel que défini précédem- ment, et ce avec des moyens créant des conditions, telles que température, propices à une éventuelle réaction immunologique Et ce dispositif comprend des moyens de détection, notamment optiques, du complexe immun obtenu avec le réactif. Une autre manière de détecter le virus VHC à par- tir des polypeptides selon la présente invention est d'ob- tenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, par toute technique connue en elle-même, comprenant une réaction immunologique entre un organisme humain ou animal et un agent immunogène constitué par une combinaison ou composi- tion polypeptidique telle que définie précédemment Les anticorps ainsi obtenus, par exemple convenablement mar- qués, peuvent être utilisés pour détecter le VHC, ou pour suivre la progression du virus chez un malade atteint de l'hépatite C. Bien entendu, chacune des compositions poly- peptidiques selon l'invention, peut constituer le principe actif d'une composition immunothérapeutique active, éventuellement en étant conjuguée sur un support immuno- logiquement adapté Un excipient pharmaceutiquement accep- table peut compléter ladite composition Une telle compo- sition est par exemple une préparation vaccinale. Le caractère immuno-dominant de la séquence pepti- dique selon la présente invention, a été mis en évidence conformément au protocole expérimental suivant. La protéine nucléocapside (CORE) du virus HCV com- prend 191 acides aminés (cf figures 1 et 2). La stratégie choisie consiste à synthétiser des longs fragments peptidiques, d'environ 40 acides aminés. On a donc défini trois peptides, en commençant la synthèse à l'acide aminé N 02 (Serine). Conformément à la figure 1, trois peptides ont été synthétisés, à savoir: peptide dit 542 G, s'étendant de la sérine 2 jusqu'à la glycine 45 peptide dit P 42 Y, s'étendant de la proline 39 jusqu'à la tyrosine 82 peptide dit R 40 R, s'étendant de l'arginine 75 jusqu'à l'arginine 116. Il apparaît que ces peptides présentent quelques acides aminés en commun, ce qui permet de mettre en évi- dence un éventuel déterminant antigénique localisé à l'intersection de deux peptides. Les peptides ont été synthétisés chimiquement par synthèse en phase solide, selon la technique de Merrifield (Barany G, and Merrifield R B, 1980, In the Peptides, 2, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds Academic Press, New York) Les modalités pratiques sont celles décrites ci-après. Synthèse des peptides Les peptides sont synthétisés sur une résine phénylacétamidomethyle (PAM)/polystyrène/divinylbenzène (Applied Biosystems, Inc Foster City, CA), en utilisant un synthétiseur automatique "Applied Biosystens 430 A" Les acides aminés sont couplés sous forme d'esters d'hydroxy- benzotriazole (HOBT) Les acides aminés utilisés provien- nent de chez Novabiochem (La flerlfingen, Suisse) ou de chez BACHEM (Bubendorf, Suisse). La synthèse chimique des peptides a été réalisée en utlisant un protocole de double couplage avec la N-méthyl-pyrrolidone (NMP) comme solvant Les peptides ont été coupés de leur résine ainsi que les protections laté- rales, de manière simultanée, à l'aide d'acide fluor- hydrique (HF) dans un appareillage approprié, (appareil de coupure de type I, Peptide Institute, Osaka, Japon). Pour lg de peptidylrésine, 10 ml de HF, 1 ml d'anisole et 1 ml de diméthylsulfure (DMS) sont utilisés, et le mélange est agité durant 45 minutes à -2 C Le HF est alors évaporé sous vide Apres des lavages intensifs à l'éther, le peptide est élué de la résine par de l'acide acétique 10 %, puis le peptide est lyophilisé. Les peptides sont purifiés par chromotographie li- quide haute performance préparative sur une colonne VYDAC de type C 18 ( 250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) L'élution est réalisée par un gradient d'acéto- nitrile à un débit de 22 ml/mn Les fractions collectées sont contrôlées par une élution en condition isocratique sur une colonne VYDAC C 18 analytique ( 250 x 4,6 mm), à un débit de lml/mn Les fractions qui présentent le même temps de rétention sont réunies et lyophilisées La frac- tion majoritaire est ensuite analysée par chromatographie liquide haute performance analytique, avec le système dé- crit précédemment Le peptide qui est considéré comme de35 pureté acceptable se traduit par un pic unique représen- tant 95 % minimum du chromatogramme. il Les peptides purifiés sont analysés dans le but de contrôler leur composition en acides aminés, à l'aide d'un analyseur d'acides aminés automatique Applied Biosystems 420 H La mesure de la masse moléculaire chimique (moyenne) des peptides est obtenue en utilisant la spectrométrie de masse L S I M S en mode d'ion positif sur un instrument à double focalisation VG ZAB ZSEQ, relié à un système d'acquisition DEC-VAX 2000 (VG analyti- cal Ltd, Manchester, Angleterre). La réactivité de ces trois peptides vis-à-vis de sérums d'individus infectés par le virus de l'hépatite C dits (VHC) positifs, a été évaluée dans un test ELISA se- lon le protocole décrit ci-après. Détection des anticorps anti-HCV par ELISA Les puits d'une plaque de microtitration de marque "NUNC maxisorb" sont saturés par 100 gl d'une solution contenant le peptide ou un mélange de peptides ( 10 gg/ml) durant 2 heures à 370 C La plaque est ensuite vidée puis lavée à l'aide d'un tampon de lavage contenant 0,05 % de Tween 20 Les puits sont saturés par 100 gl de tampon de lavage additionné de 10 % de sérum de chèvre (v/v), puis incubés pendant 30 minutes à 37 WC, puis lavés à nouveau comme précédemment Les sérums à analyser sont dilués à la dilution appropriée avec le tampon de saturation L'incu- bation des sérums est de 1 heure à 370 C Les puits sont à nouveau lavés La solution de conjugué (Ig G de chèvre anti Ig G humain marquées par la peroxydase) à une dilution de 1/1000 dans le tampon de saturation est alors ajoutée et l'incubation dure 90 minutes à 370 C Après lavages, la so- lution de substrat orthophénylène-diamine est ajoutée. Après 10 minutes, la réaction est stoppée par 50 Ml d'H 2504 et la densité optique est lue à 492 nm Il est à noter que tous les tests ont été réalisés en double. Comme on peut le voir sur le tableau 1, les pep- tides réagissent de manière différente avec les sérums. 969 191 OZI 61 NS 089 L 91 6 úT Z 8 6 ZZ úZ 1 61 T Zúú 8 TZ 81 NS q L It 1 f 7 lZZ Ir OIL 6 L 9 T 01 991 6 ZI Li NS ïIL TOLI OZ a 69 I L 99 Lú 59 68 SOI Zll 9 lI ú 99 155 91 NS 19 901 50 T 61 a 8 8 ú 1 Vt 001 O 9 LUT 6 úúZ E 0 I 99 I LOT TTN i ZS 091 951 ú 01 Il NS |ZZI úZZ 991 81 a 7 SI SOZ Z 61 ZIZ 9 ZL 591 LEZ SOZ 01 NS LIZ 66 L + LT a ZI 55 T ' ff 96L 991 út T ZZZ 91 U 8 ú 6 Zt LI 9 9 i a Oú Zl E 95 ú 1 Z ú ú 1 ú 51 9 a 50 úZ S OS a 511 69 Z 098 OLZ 619 ú OSI 8 "Z 998 'I 9 08 Z Z 9 ú az9 c a 66 609 Z TT 911 80 T 90 T 01 9 'i L 1 t'úT ú 91 S úT 1 ti 9 T 1 ú 91 a 4 9 ú 1 55 E ++w Zl 9 IZII zi++d++ Z z 81 68 L 6 t 81 L 1 UT t 91 ú 18 6 T 1 11 a 1611 T T 11 a SI 86 s ZZ 99 ú 91 Z O o Z úTL - 801 ZZZ 099 OT 9 81 Z t 6 T 691 01 a 6 ZZ 516 ç 851 TúZ ú 91 úZ L 56 6 a 651 8 úZ 981 6 a l Z OZ 9 lr 1 81 Zú ú 06 ' ILZ 11 T 9 L 951 8 9 Zs 8 Z ú 86 8 a L 9 'i68 " 1 8 L 689 úZ 8 Vî 199 t 1 g L 968 96 ZZ L i a 591 16 L 811 001 581 O ú 1 ZLI 018 IL 91 9 a Z 8 R 8 9 T 1 9 18 Z 6691 80 SZ 9 T 1 úI l 09 ú 699 S S 6 úZI 9 úZ 9 a 9 f 7 úL 55ST++ LOú 501 Z ++ g O 'i8891 a g 60 ú t TúZ c i a I 9 ú O 09 9891 1 Z 89 ú 9 Z 96 T l úZ 9 ú 991 ú a ZZ 9 899 9 1 Z ú a 599 ú 991 8 t ZZ 16 ú 9 O o 99 ú 61 l I ZOúZ Z a 66 ú 6 T 11 % Z a C ú 9 t 118, * O Vî O Zl 80 RT ZLI 698 *** I g 91 ú 10 o I a TZ 6069 Z I fnl% aqv' Réactivité des peptides 542 G, P 42 Y, et R 40 R mesu- rée en ELISA, vis-à-vis de sérums VHC positifs (P 1 à P 20 et B 1 à B 16) et de sérums normaux (SN 10, 11, 16, 17, 18, 19) Les différents peptides sont adsorbés sur les microplaques à une concentration de 10 gg/ml et les sérums sont utilisés à la dilution 1/100 Les valeurs obtenues correspondent à la densité optique (DO) multipliée par 103, à 492 nm Pour chaque sérum, l'expérience a été réalisée en double Les **** sont des valeurs hors échelle supérieure. Il apparaît clairement que le peptide le plus ré- actif est le peptide 542 G qui détecte 31 sérums sur 36. Aucun de ces peptides ne détecte les sérums nor- maux, ce qui atteste leur spécificité. Enfin, aucun sérum négatif avec le peptide 542 G n'est positif avec les peptides P 42 Y ou R 40 R, ce qui montre qu'à lui seul le peptide 542 G détecte les sérums sans l'aide des deux autres peptides. L'étude a alors été poursuivie, afin de connaître de manière plus précise le ou les déterminants anti- géniques localisés sur le peptide 542 G. Dans ce but, deux peptides ont été préparés dans les mêmes conditions que précédemment. Ces deux peptides sont, conformément à la figure 1 1) un peptide de 20 acides aminés, dit 518 D, couvrant la séquence 2 à 21 de la protéine CORE 2) un peptide de 24 acides aminés, dit V 22 G, couvrant la séquence 22 à 45 de la protéine CORE. La réactivité de ces deux peptides (séparés et ad- ditionnés) a été évaluée en la comparant à celle du pep- tide 542 G, dans un test ELISA tel que décrit précédemment. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. TABLEAU 2 SERUM I Pl 1/100 2 P 2 1100 o 3 P 3 1100 oo 4 P 4 11100 Ps 1/100 6 1 o 1000 o 7 1110000 8 P 6 1 U 100 9 P 7 1110 oo 111000 I l 1/10000 12 P 8 1/1 oo 13 1 ooo 1000 14 1/10000 P 9 1/100 16 P 1 O 11 oo 17 Pll 1/100 18 P 12 1/100 19 111000 1110000 oo 21 P 13 110 oo 22 P 14 1/100 23 P 15 1/100 24 P 16 1/100 P 17 1100 oo 26 P 18 11100 27 111000 28 1/1 ooo 0000 29 PI 9 1/loo P 20 1/100 31 P 21 1/100 32 P 22 1/100 33 1/1000 34 1/1000 oooo P 23 1/100 36 P 24 11100 37 P 25 11100 38 111000 39 1110000 *P 26 1/100 41 111000 42 1110000 43 P 27 1/100 44 P 28 1/100 P 29 1 0100 46 P 30 11100 47 P 31 1/100 48 1/1000 49 1110000 P 32 1/100 oo 54 P 33 1/100 52 P 34 1/o 100 53 P 35 11100 54 P 36 11100 P 37 11100 56 111000 57 1110000 58 P 38 11100 59 1/1000 1/10000 61 P 39 11100 542 G 2.500 2.500 2.500 2.500 2.500 2.500 2.093 0.000 2.500 2.500 1.916 2.500 2.500 1.565 0.090 0.172 2.500 2.500 2.500 2.500 0.000 2.so 500 2. 500 2,500 2.500 2.500 2.500 1.006 0.000 2.500 2.500 2.500 2.500 0.894 0. 000 2.500 2.500 2.500 1.550 2,500 2.500 2.500 2.500 2.500 0.331 2.500 2. 500 2.500 2.071 2.500 2.500 2.500 2.500 2.500 2.500 2.500 1.088 2.500 2. 500 1.477 2.500 5180 +V 22 G 0.438 0.310 0.665 2.500 2.500 2.500 0.977 0.007 2.500 2.500 0.402 2.500 2.500 0.730 0.027 0.054 2.500 2.500 2.500 0.560 0.025 2.500 2.500 2.500 2,129 2.500 0.895 0.167 0.021 2.500 2.383 2.500 1.844 0.234 0.030 0.594 2.500 2.500 0.418 2.500 2.500 1.156 2.500 2.500 0.005 2.500 2.500 2.500 1.030 2.500 2.500 2.500 2.500 1.341 2.500 1,388 0.230 2.500 2.335 0.156 2.500 0.012 0.020 0.162 0.982 2.500 2.317 0,399 0.007 2.500 0.854 0.165 2.500 2.500 0.681 0.019 0.028 0.383 2.500 2.500 0.454 0.012 0.907 2.500 0.225 0.297 2.500 0.297 0,095 0.011 1.433 0.111 2.500 1.142 0.146 0.015 0.015 2.500 2.199 0.329 2.500 2.500 0.957 1.425 0.115 0.000 0.483 2.500 1.975 0.183 1.046 1.307 2.500 2.500 0.115 2.500 0.523 0.102 2.500 0.753 0.099 V 22 G 0.426 0.290 0.503 1 739 * 2.500 2.293 0.578 0.000 2.500 1.590 0.237 2.241 0.476 0.049 0,008 0,026 2.500 2.500 2.500 0.106 0.013 1.* 778 1.810 2.500 1.832 2.500 0.598 0.072 0.010 2.249 2.272 2.500 0.702 0.088 0.015 0.579 2.252 0.695 0.089 2.500 1.541 0.199 1.600 2.500 0.005 2.500 2.500 2.500 0.847 1.639 1.987 1.618 1.504 1.226 2.500 0.865 0.128 2.500 1.582 0,057 I R 83 EM 542 G 5180 +V 22 G 2.500 2 500 2.500 2500 0.034 0000 2.500 2 500 2.500 2 500 2.500 O 338 2.500 2 500 2.500 2 500 1.336 0 602 2.500 2 500 2.500 2 500 2.500 1,573 2.500 2 500 2.500 2 464 1.021 0 315 2,500 2 500 2.500 2 500 2.500 2 500 2.500 1 720 2.500 2 500 0.721 0 324 2.084 2 500 2.500 2 392 1.809 0 674 0.698 0 258 2.500 1 044 2.500 2 500 V 22 G 2.500 2.218 0.000 2.500 1.155 0.043 2.500 1.605 0.255 1.225 0.756 0.329 2.500 1.214 0.144 0.863 0.749 2.102 0.358 2.082 0.225 0.616 1.017 0.304 0.186 0.954 2.500 Réactivité des peptides 542 G, 518 D, V 22 G, 518 D + V 22 G, mesurée en ELISA, vis-a-vis de sérums VHC positifs. Les différents peptides sont adsorbés sur les microplaques à une concentration de 10 gg/ml, et les sérums sont utili- sés à la dilution mentionnée Les valeurs obtenues corres- pondent à la densité optique à 492 nm Toutes les expé- riences ont été réalisées en double. P 40 11100 P 41 11100 P 42 11100 CTS iiioo M 000 BARIN 11100 81 11100 82 11100 83 11100 84 Illoo 111000 as 11100 56 11100 B 7 iii oo 88 11100 89 11100 Sio 11100 ail 11100 ( 312 11100 813 11100 B 14 ilioo 815 illoo 816 lri 00 SIBO 2,500 1.579 0.000 2.500 2.500 0.295 2.500 2.500 0.347 1.859 1.781 1.244 2.500 1.250 0.171 2.032 2.500 2.500 1.362 0.808 0.099 2.324 1.375 0.37 o 0.072 0.090 2.500 Chaque sérum a été dans un premier temps testé à la dilution 1/100 Dans le cas o la réponse s'avérait sa- turante pour l'ensemble des peptides (exemple: sérum P 5), on a procédé à une dilution au 1/1000, et si besoin était à une dilution au 1/10000. Il apparaît que pour tous les sérums VHC positifs, la réactivité du peptide 542 G est nettement supérieure à la réactivité des peptides 518 D et V 22 G, et à celle de 518 D + V 22 G. Les sérums P 6, P 9, P 10, P 13, P 19, P 23, P 24 sont des sérums qui ne présentent pas d'anticorps vis-à-vis de la protéine CORE du VHC. Bien que l'ensemble de ces résultats soit non am- bigu, la fixation des différents peptides sur les puits des plaques de microtitraton, peut modifier les épitopes ou déterminants du peptide testé Les plaques utilisées (NUNC Maxisorb) sont des plaques de polystyrène irradiées aux rayons gamma, qui fixent de façon non covalente les peptides, grâce à des liaisons de types électrostatiques mais également des liaisons hydrophobes Il se peut que des peptides, en fonction de leur séquence, s'adsorbent de manière sélective, privilégiant ainsi une partie bien pré- cise, et empêchant par là même la réactivité immunogénique vis-à-vis d'une autre partie qui serait devenue moins ac- cessible. Pour évaluer cette hypothèse, on a procédé à des tests d'inhibition, dont l'intérêt est de permettre la formation du complexe antigène-anticorps en milieu li- quide, en s'affranchissant ainsi des éventuels artefacts liés à l'adsorption des peptides sur un support solide. La méthodologie est celle décrite ci-après. Test d'inhibition Les expériences d'inhibition ont été réalisées par réaction en phase liquide des sérums VHC avec les pep- tides, suivie de la réaction des anticorps restants avec le peptide adsorbé sur les microplaques Les peptides in- hibiteurs sont incubés à une concentration de 0,1 mg/ml, avec les sérums de la dilution appropriée La suite de la manipulation est identique à celle décrite pour le test ELISA. Le peptide 518 D, ou V 22 G, ou le mélange des deux est pré-incubé une nuit, en présence du sérum à tester. Les anticorps peuvent se fixer sur les sites correspon- dants Le mélange (peptide + sérum) est ensuite incubé avec le peptide 542 G adsorbé sur les plaques de micro- titration Si tous les anticorps ont réagi lors de l'incu- bation avec les peptides 518 D, V 22 G, ou avec le mélange, aucune réactivité ne sera observée, ce qui conduira à une inhibition de 100 % Par opposition, si des anticorps propres au peptide 542 G demeurent, ils pourront alors réagir. Un contrôle est réalisé, en pré-incubant chaque sérum avec le peptide 542 G, ce qui permet de calculer le pourcentage d'inhibition. Comme il est montré sur le tableau 3, aucun pep- tide n'inhibe de façon complète la réactivité des sérums envers le peptide 542 G. TABLEAU 3 valeurs inhibition 542 g 03/92 serum inhibition 542 G inhibition 51 i 80 inhibition V 22 G inhibition pool SP+ V 22 G 1 P 5 100 % 3,5 % 83 O % 77 0 % 2 P 7 100 % 8,4 % 81 0 % 86,0 % 3 P 8 100 % 1 4 % 77,4 % 53,0 % 4 P 18 100 % 10,6 % 48,0 % 52 O % P 22 100 % 5,6 % 65,5 % 5 V O % 306 P 25 100 % 14,1 % 71,8 % 70 O % 7 P 31 100 % 2 0 % 39,9 % 27 O % 8 P 37 100 % 43,6 % 88 7 % 73,0 % 9 P 38 -100 % 8 9 % 70 3 % 650 % 84 100 % 16,8 % 83,6 % 720 % Inhibition de la fixation des anticorps anti-VHC (dilution 1/10000) sur le peptide 542 G, par préincubation de sérums VHC avec le peptide 542 G, le peptide 518 D, le peptide 522 G et le mélange des peptides 518 D + 522 G. Autrement dit, cette expérience prouve qu'il existe des anticorps spécifiques pour le peptide 542 G, qui ne réagissent ni avec le peptide 518 D, ni avec le peptide V 22 G, la somme des deux représentant la séquence totale du peptide 542 G. Une dernière hypothèse à évaluer consiste à véri- fier que les anticorps spécifiques du peptide 542 G n'étaient pas dirigés contre la partie centrale du pep- tide 542 G, c'est-à-dire à la jonction des peptides 518 D et V 22 G. On a donc préparé (cf figure 1) un peptide dont la séquence comprend la partie C-terminale ( 6 acides aminés) du peptide 518 D et la partie Nterminale ( 6 acides aminés) du peptide V 22 G. Bien que ce peptide présente une réactivité avec des sérums VHC positifs, en aucun cas le niveau obtenu n'est comparable avec celui obtenu avec le peptide 542 G. L'ensemble des résultats présentés précédemment permet de tirer les conclusions suivantes. Dans les 115 acides aminés N-terminaux de la pro- téine CORE, les 45 premiers acides aminés sont les plus réactifs vis-à-vis de sérums VHC positifs. Les 21 premiers acides aminés (peptide 518 D) ré- agissent, ce qui montre la présence d'un ou plusieurs dé- terminants antigéniques sur ce peptide. Les acides aminés 22 à 45 (peptide V 22 G) portent également un ou plusieurs épitopes. La jonction de ces deux séquences est également réactive. Par conséquent, la séquence 1-45 de la protéine CORE est pluriépitopique. De plus, il existe un ou des déterminants anti- géniques qui ne sont réactifs que dans la mesure o l'on possède la séquence 1-45 en entier, et non pas de façon discontinue (peptides 518 D + V 22 G) Ces épitopes propres au peptide 542 G sont sans aucun doute des épitopes de type conformationnel qui ne peuvent exister que dans la mesure o cette séquence de 44 acides aminés (peptide 542 G) pré- sente une structure adéquate, structure qui n'est pas ob- tenue avec des peptides de taille plus réduite. En conséquence, le peptide 542 G permet potentiel- lement la détection d'anticorps dirigés contre la protéine CORE du VHC. Pour terminer, on a substitué la protéine CORE en- tière ( 191 acides aminés) par le peptide 542 G ( 44 acides aminés), pour détecter les anticorps anti VHC. Pour ce faire, on a choisi de comparer la sensibi- lité du peptide 542 G à celle du test ORTHO HCV ELISA 2 è génération; il s'agit d'un test commercialisé par la Société ORTHO comprenant une protéine de fusion incorpo- rant la protéine CORE du VHC, nommée C 22-3; cf Vanderpoel, C L, HTM Cuypers, H W Reesink et al, 1991, Confirmation of hépatites C virus infection by new four antigen recombinant immunoblot assay, Lancet 337; 317-319. La comparaison a porté sur 173 échantillons posi- tifs avec le test ORTHO HCV ELISA 2 è génération. Sur 173 échantillons, le peptide 542 G en a détecté 151, ce qui donne une sensibilité de 87,28 % Les 22 sérums discordants ont alors été analysés à l'aide d'un autre test de 2 è génération, à savoir CHIRON RIBA HCV Il s'agit d'un "immunoblot" destiné à la détection des anti- corps dirigés contre les antigènes du virus de l'hépatite C dans le sérum ou le plasma humain Ce test comprend cinq antigènes (protéines) recombinants L'un d'entre eux est la protéine CORE recombinante C 22-3, obtenue sous forme de protéine de fusion avec la superoxyde dismutase humaine, et exprimée par une levure. Il s'avère à l'issue de ce test de confirmation, qu'aucun des 22 sérums ne présente de réactivité vis-à-vis de la bande C 22-3 (CORE). En conséquence, la sensibilité du peptide 542 G est de 100 % par rapport à la protéine CORE (C 22-3) du test CHIRON RIBA HCV de 2 è génération. En conclusion, on peut remplacer la protéine CORE par le peptide 542 G, pour la détection sérologique du VHC. A ce stade de l'exposé de l'invention, il convient de comparer les résultats et constatations expérimentales selon l'invention, avec ceux de la publication mentionnée dans le préambule de la description, à savoir: Nasoff MS, Zebedee SL, Inchauspe G, Prince AM, Identifica- tion of an immunodominant epitope within the capsid protein of hepatis C virus, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 4641-5 Cette publication est relative à l'obtention de fragments protéiques recombinants de la protéine CORE exprimée dans E coli, et rapporte des résultats à la fois proches et divergents de ceux rapportés précédemment. En effet, les auteurs ont exprimé une protéine re- combinante comprenant les 74 premiers acides aminés de la protéine CORE La stratégie de clonage utilisée conduit à la production de protéines de fusion Autrement dit, les 74 acides aminés N-terminaux de la protéine CORE du VHC dits CAP-A, sont précédés par 308 acides aminés, dont les 221 premiers correspondent à la glutathione S-transférase. La réactivité de cette protéine de 382 acides aminés, dont seulement 20 % représentent la protéine CORE, vis-à-vis de sérums VHC positifs n'est bonne qu'en apparence, compte tenu du nombre très faible de sérums testés ( 5 sérums humains). Par contre, une protéine comprenant la séquence 69-120 de la protéine CORE, dite CAP-B, ne présente aucune réactivité vis-à-vis de ces mêmes sérums Ce dernier résultat est en contradiction relative avec ceux de la présente invention, puisque le peptide R 4 OR qui comprend la séquence 75-116 de cette même protéine réagit tout de même avec quelques sérums (environ 10 %, cf tableau 1). Ces mêmes auteurs ont poursuivi leur travail, en produisant d'autres protéines recombinantes de fusion, avec respectivement comme séquence de la protéine CORE, les acides aminés 1-20, 21-40, 41-60, dits respectivement CAP-1, CAP-2 et CAP-3. Leurs résultats toujours obtenus sur un nombre de sérums humains très faibles ( 9 sérums), montrent que la séquence 21-40 réagit mieux que la séquence 1-20 La sé- quence 41-60 ne présente quant à elle aucune réactivité. Ce dernier résultat est également en contradiction rela- tive avec ceux présentés selon l'invention, puisque le peptide P 42 Y (acides aminés 39-82) présente (cf tableau 1), une réactivité élevée bien qu'inférieure au peptide 542 G. De plus, une autre publicaton à savoir Okamoto H, Munekata E, Tsuda F, Takahashi K, Yotsumoto C, et al, 1990, Jpn, J Exp Med 60, 223-233, a montré qu'un peptide de 36 acides aminés comprenant la séquence 39-74 de la protéine CORE réagit avec au moins 70 % des sérums VHC positifs. Concernant la réactivité de la séquence 21-40, ces auteurs affirment que dans plusieurs cas la réactivité de ce fragment de protéine CORE recombinant est supérieure à celui comprenant la séquence 1-74. Les résultats obtenus selon l'invention sont en désaccord avec les résultats de ces auteurs, puisqu'on a démontré que dans tous les cas de sérums VHC étudiés (cf tableau 2), la réactivité du peptide 542 G (séquence 2-45) est nettement supérieure à celle des pep- tides 518 D (séquence 2-21) et V 22 G (séquence 22-45). L'explication proposée pour expliquer ces résul- tats divergents concerne l'obtention des différents frag- ments de la protéine CORE dans les deux cas. Selon l'invention, les peptides obtenus par syn- thèse chimique comprennent uniquement la séquence mention- née pour chacun d'entre eux, et comme il a été explicité plus haut, ceci est un des avantages liés à ces peptides synthétiques. En ce qui concerne les protéines recombinantes ob- tenues par NASOFF et al, il s'agit de protéines de fusion dans lesquelles se trouvent en position N-terminale 308 acides aminés qui sont totalement étrangers de la protéine CORE. Les protéines recombinantes qui comprennent les séquences 1-20 et 21-40 de la protéine CORE sont donc à plus de 90 % composées d'une séquence étrangère. Bien que les auteurs stipulent que pour des tests de détection, la partie glutathione -S-transférase de la protéine de fusion ne gène pas la réaction, puisqu'aucun des sérums testés ne réagit avec la glutathione S-transférase isolée (donc pas de faux positif), il appa- raît difficile d'admettre que ces 90 % de protéine de fu- sion n'interfèrent en aucune manière dans la réactivité avec les anticorps anti-VHC. En effet, le fait que la partie N-terminale des séquences 1-20 ou 21-40 de la protéine CORE soit liée à la partie C-terminale de la protéine de fusion contribue à restreindre l'accessibilité de cette région N-terminale. Par contre, la partie C-terminale est quant à elle mise en évidence C'est très vraisemblablement ces contraintes structurales, imposées par l'obtention d'une protéine re- combinante de fusion dans laquelle la partie immunogène (la partie CORE) représente la partie mineure de la pro- téine de fusion (moins de 10 % dans ce cas), qui condui- sent à des résultats inverses à ceux présentés. Les acides aminés sont représentés selon les Figures 1 et 2, selon la convention du tableau ci-après: TABLEAU 4 ACIDE AMINE ______________ ALANINE CYSTEINE AC ASPARTIQUE AC GLUTAMIQUE PHENYLALANINE GLYCINE HISTIDINE ISOLEUCINE LYSINE LEUCINE METHIONINE ASPARAGINE PROLINE GLUTAMINE ARGININE SERINE THREONINE VALINE - TRYPTOPHANE TYROSINE CODE 3 LETTRES Ala Cys Asp Gl U Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Set Thr Val Trp Tyr CODE 1 LETTRE *_____________ A C D E F G H I K L M N P Q R s T V W Y POIDS MOLECULAIRE _________________ Selon l'invention le protocole expérimental com- plet, exposé précédemment, démontre clairement par des types de réaction antigène-anticorps réalisés soit en phase solide (ELISA direct, cf Tableau 2), soit en inhibi- tion (cf Tableau 3), que la séquence 2-45 de la protéine CORE du virus VHC obtenu par synthèse chimique en phase solide, non seulement s'avère nettement supérieure à des séquences plus petites ( 518 D ou V 22 G), mais également qu'elle présente une sensibilité équivalente à la protéine CORE elle-même (protéine C 22-3 du test CHIRON RIBA HCV de 2 ème génération), et qu'en conséquence on peut utiliser dans des tests diagnostiques sérologiques le peptide syn- thétique 542 G, en lieu et place de la protéine CORE. REVENDICATIONS 1 Polypeptide comprenant une séquence peptidique appartenant à la protéine CORE (ou capside), du virus humain de l'hépatite C (VHC), telle que représentée aux Figures 1 et 2, caractérisé en ce que ledit polypeptide est constitué uniquement, ou par une séquence peptidique isolée, se composant des 45 acides aminés N-terminaux de ladite protéine, amputée éventuellement dans sa partie N-terminale et/ou sa partie C- terminale de 1 à 10 acides aminés, ou par une séquence immunogène équivalente à ladite séquence peptidique, et présentant une réactivité immunologique croisée avec ladite séquence peptidique,vis- à-vis du VHC. 2 Polypeptide comprenant un séquence peptidique appartenant à la protéine CORE (ou capside), du virus humain de l'hépatite C (VHC), telle que représentée aux Figures 1 et 2, caractérisé en ce que ledit polypeptide est constitué uniquement, ou par une séquence peptidique isolée, se composant des 45 acides aminés N-terminaux de ladite protéine, amputée éventuellement dans sa partie N- terminale et/ou sa partie C-terminale de 1 à 10 acides aminés, ou par une séquence homologue à ladite séquence peptidique, et dont chaque acide aminé constitutif présente des propriétés chimiques identiques ou analogues à celles de l'acide aminé homologue dans ladite séquence peptidique. 3 Combinaison polypeptidique comprenant une plu- ralité de fragments polypeptidiques isolés, caractérisée en ce que chaque fragment polypeptidique se compose30 d'acides aminés pris consécutivement dans les 45 acides aminés N-terminaux de la protéine CORE (ou capside) du virus humain de l'hépatite C (VHC), telle que représentée aux Figures 1 et 2, ou dans toute séquence peptidique immunogène équivalente, ou dans toute séquence peptidique homologue, et en ce que l'un des alignements N terminal/C terminal desdits fragments peptidiques est homologue, sans tenir compte des acides aminés en commun entre deux fragments consécutifs, aux 45 acides aminés N- terminaux de la protéine CORE, ou à toute séquence pepti- dique immunogène équivalente, ou à toute séquence pepti-5 dique homologue desdits 45 acides aminés N-terminaux. 4 Combinaison selon la revendication 3, caracté- risée en ce qu'elle comprend au moins deux fragments poly- peptidiques isolés, notamment trois dits fragments. 5 Combinaison selon la revendication 3, caracté- risée en ce que chaque fragment polypeptidique isolé com- prend entre 12 et 24 acides aminés. 6 Composition polypeptidique, caractérisée en ce qu'elle comprend en mélange au moins deux polypeptides, chacun selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,15 et/ou au moins une combinaison polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5. 7 Réactif de détection du virus humain de l'hépa- tite C (VHC), caractérisé en ce qu'il comprend à titre de substance réactive, un polypeptide selon l'une quelconque20 des revendications 1 et 2, ou une combinaison polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, ou une combinaison polypeptidique selon la revendication 6. 8 Moyen de détection du virus humain de l'hépa- tite C (VHC), caractérisé en ce qu'un réactif selon la revendication 7, est supporté par un support solide, immunologiquement compatible avec ledit réactif. 9 Procédé de détection d'anticorps anti-VHC dans une partie corporelle, telle qu'un échantillon du sang d'un individu suspecté d'être infecté par le VHC, caracté- risé en ce qu'on met en contact ladite partie corporelle et un réactif selon la revendication 7, dans des condi- tions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec35 ledit réactif. Dispositif ou appareil de détection d'anti- corps anti-VHC dans une partie corporelle, telle qu'un échantillon du sang d'un individu suspecté d'être infecté par le VHC, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient de mise en contact de ladite partie corporelle avec un réactif selon la revendication 7, avec des moyens créant des conditions, telles que température, propices à une éventuelle réaction immunologique, et des moyens de détec- tion, notamment optiques, d'un complexe immun avec ledit réactif. 11 Composition immunothérapeutique active, notam- ment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou une combi-15 naison polypeptidique selon l'une quelconque des revendi- cations 3 à 5, ou une combinaison polypeptidique selon la revendication 6, le principe actif étant éventuellement conjugué avec un support immunoligique adapté, et éven- tuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. 12 Composition selon la revendication 11, en tant qu'agent de traitement contre le virus humain de l'hépatite C. 13 Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre le virus humain de l'hépatite C, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un orga- nisme humain ou animal à un agent immunogène constitué par un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou une combinaison polypeptidique selon l'une quel- conque des revendications 3 à 5, ou une combinaison poly-30 peptidique selon la revendication 6. 14 Réactif de détection du virus humain de l'hépatite C (VHC), caractérisé en ce qu'il comprend à titre de substance réactive un anticorps selon la revendication 13.