Brevet FR2687681A1 — publié le 19930827

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué polyéthylèneglycol(ou dérivés)-peptide, ci-après PEG-peptide, et en particulier d'un conjugué polyéthylèneglycol(ou dérivés)-hirudine (PEGhirudine). Les composés tels que le polyéthylèneglycol et ses dérivés, ci-après PEG, ou le Dextran sont connus pour ne pas être immunogènes chez l'homme et leur utilisation en association avec des protéines à usage pharmacologique a déjà été proposé pour prolonger la demi-vie de ces protéines in vivo. Ainsi, un peptide tel que l'hirudine dont la source principale se trouve dans les glandes salivaires des sangsues médicinales sous forme d'un mélange de peptides de 65 et 66 acides aminés, connue pour ses propriétés inhibitrices très spécifiques et très efficaces de la thrombine, est éliminé très rapidement de la circulation sanguine Son temps de demi-vie est d'environ lh Il est donc très intéressant de prolonger la demi-vie in vivo de l'hirudine en particulier pour son utilisation dans la prophylaxie des thromboses. Pour augmenter la demi- vie de l'hirudine in vivo, un conjugué Dextran-hirudine a été produit par P Crause (EP-A-0 345 616) Bien que la demi-vie du Dextran- hirudine soit augmentée in vivo chez le rat par rapport à la demi-vie de l'hirudine libre, le rendement du procédé de couplage de l'hirudine au Dextran est très faible puisqu'on observe une perte de plus 70 % de l'activité de l'hirudine conjuguée. Le couplage PEG-peptide est également connu et est généralement obtenu par une liaison covalente. Le procédé de couplage du PEG à un peptide comprend les deux étapes principales d'activation du PEG, et de couplage du PEG activé au peptide. La première étape d'activation est généralement limitante pour le rendement final en conjugué obtenu. En effet, la technique antérieure propose des procédés d'activation du PEG qui nécessitent une étape de purification et de récupération du PEG activé, réalisée avec des rendements faibles. Ainsi Beauchamp et a I (Analytical Biochemistry 1983, 131, 25-33) décrivent un procédé d'activation du PEG par réaction avec du carbonyldi- imidazole dans le dioxane, qui comprend une étape de purification du PEG activé par dialyse extensive contre l'eau et lyophilisation. Cette dialyse étant extensive pose des problèmes pour son application à l'échelle industrielle Par ailleurs, le PEG activé se désactive en milieu aqueux, ce qui entraine une baisse du rendement de la réaction d'activation due à l'étape de dialyse. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'un conjugué PEG-peptide d'utilisation simple et rapide, applicable à l'échelle industrielle La présente invention concerne avantageusement un procédé de préparation d'un conjugué PEG-hirudine, dont au moins 8096 de l'hirudine est couplé au PEG et les conjugués obtenus ont une activité voisine de % par rapport à l'hirudine de départ. Le procédé selon la présente invention comprend les étapes connues d'activation du PEG dans un solvant anhydre approprié, de récupération du PEG et sa réaction avec un peptide. Par PEG, ou polyéthylèneglycol et ses dérivés, on entend principa- lement le polyéthylèneglycol et les monoéthers aliphatiques inférieurs en C 1-C 6 du polyéthylèneglycol, également les monoéthers aromatiques ou monoesters du polyéthylèneglycol, ainsi que les dérivés polyglycolés comprenant au moins 90 % de motifs éthylèneglycol par rapport au nombre total de motifs monomères. Il a été trouvé d'une manière inattendue que le PEG activé pouvait être simplement purifié par précipitation à partir du mélange d'activation à l'aide d'un solvant organique hydrophobe et rester actif pour l'étape ultérieure de condensation sur un peptide. Le solvant organique hydrophobe est choisi parmi les solvants aprotiques apolaires ou peu polaires, parmi lesquels on trouve les éthers alphatiques et les hydrocarbures. D'une manière avantageuse, ce solvant organique hydrophobe est sélectionné parmi l'éther éthylique, le pentane, l'hexane ou l'heptane, de préférence l'éther éthylique. Le PEG activé est alors récupéré par filtration puis lyophilisé. La réaction d'activation du PEG est effectuée dans un solvant anhydre approprié, préférentiellement dans un solvant aprotique polaire. Ce solvant anhydre approprié est généralement choisi parmi le dioxane, le diméthylformamide, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde ou le tétrahydrofurane. Le PEG est activé à l'aide d'un agent d'activation choisi parmi le carbonyldiimidazole, le N-hydroxysuccinimide et le 2,3,5trichloroformiate. Le rapport molaire entre l'agent d'activation et le PEG, lors de l'activation de ce dernier est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 20 Avantageusement, on emploie le carboxydiimide comme agent d'activation. Le PEG employé dans le procédé selon la présente invention a un poids moléculaire compris entre 2 000 et 100 000, avantageusement compris entre 2 000 et 50 000, et est choisi parmi le polyéthylèneglycol et les monoesters aliphatiques en C 1-C 6 du polyéthylèneglycol. Le PEG activé obtenu par réaction avec le carboxydiimide peut alors être représenté par la formule générale I, suivante N R- (O(CH 2)2)n-O-C-N (O) R pouvant être notamment, d'une manière indifférente, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C 1-C 6 ou un groupement carboxy- imidazole, N étant compris entre environ 45 et environ 2400. Le-couplage avec le peptide est effectué à p H légèrement alcalin en substituant le noyau imidazole par une fonction amine libre du peptide. Le conjugué obtenu peut alors représenté par la formule générale Il, suivante R-(O(CH 2)2)n-O-C-NH-Peptide (II) R et N tant dfinis prc odemment. R et N étant définis précédemment. D'une manière particulièrement avantageuse, le procédé selon la présente invention est employé pour la préparation d'un conjugué PEG-hirudine. Par hirudine, on entend l'hirudine naturelle extraite des glandes salivaires des sangsues médicinales, ses variants naturels dont certains ont été désignés par HVI, HV 2 et HV 3, ainsi que les variants et analogues produits par génie génétique et conservant leur activité antithrombotique. La préparation de ces peptides par génie génétique a été décrite en particulier dans les demandes de brevets EP-A-0 158 564, EP-A-0 200 655, EP-A-0 273 800 et EP-A-0 332 529. L'hirudine comprend plusieurs groupements Lysine dans sa séquence peptidique Le PEG activé peut donc se fixer de façon aléatoire sur la fonction N-terminale du peptide ou l'une quelconque des fonctions amine des différents groupements Lysine. Or, de manière inattendue, le PEG activé ne se fixe pas sur l'amine Nterminale de l'hirudine, ce qui permet d'obtenir un conjugué avec une activité anti-thrombotique voisine de celle du peptide seul. En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de préparation d'un conjugué PEG-hirudine qui comprend: a) l'activation du PEG par réaction avec le carboxydiimidazole dans un solvant anhydre approprié, b) la récupération du PEG activé par précipitation à l'aide d'un solvant hydrophobe, c) la condensation du PEG activé sur l'hirudine ou ses variants, en milieu légérement alcalin, et d) la purification du conjugué obtenu. Les étapes a), b) et c) de préparation du PEG activé et de sa condensation sur le peptide sont effectuées dans les conditions opératoires décrites précédemment. L'étape d) de purification du conjugué PEG-hirudine obtenu est généralement effectuée par chromatographie en deux étapes: dl) par chromatographie sur échange d'anions pour éliminer l'excès de PEG qui n'aurait pas réagit, suivie d'une d 2) chromatographie de phase inverse pour séparer le conjugué obtenu de l'hirudine libre résiduelle. La résine échangeuse d'anions employée pour dl) est avantageu- sement une D-sépharose ou Q-sépharose, et la phase inverse de d 2) une phase RP 300 ou RP 8. Le rendement en hirudine conjuguée obtenue est supérieur à 60 %. D'une manière avantageuse, le procédé selon la présente invention est employé sur le variant de l'hirudine HV 2-Lys 47. Enfin, la présente invention concerne également les conjugués PEG- hirudine obtenus par le procédé décrit précédemment et leur emploi comme agent thérapeutique destiné à traiter les thromboses. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer la présente invention, pour la préparation du PEG activé, celle d'un conjugué PEG-hirudine et l'activité anti-thrombotique du conjugué obtenu. EXEMPLE 1: préparation du monométhyléther PEG ( 5000) (MPEG 5000) activé. Toute la réaction d'activation du MPEG 5000 s'effectue en milieu anhydre Il convient donc dans un premier temps d'éliminer toute trace d'eau pouvant être présente dans les constituants du milieu réactionnel Les stocks de MPEG 5000 (Merck) et de N-N, Carbonyldiimidazole (CDI) (Aldrich) sont conservés dans un dessicateur contenant du gel de silice pour capter l'eau Du tamis moléculaire de 5 A (Prolabo) est séché dans un four monté à 400 C, puis on laisse descendre la température à 50 C et on ajoute le tamis moléculaire à 500 ml de dioxane (SDS) pour capter l'eau présente dans le solvant. g (environ 4 mmoles) de MPEG sont ajoutés à 8,lg (environ 50 mmoles) de CDI et le mélange est lyophilisé au moins 2 h La poudre séchée est alors reprise dans 50 ml de dioxane et la réaction d'activation du MPEG 5000 par le CDI (figure 1) s'effectue pendant 2 h à 37 C sous agitation Les molécules de MPEG 5000 n'ayant qu'un seul groupement hydroxy libre, elles n'ont qu'un seul site d'activation possible. La récupération du MPEG 5000 activé se fait par précipitation à l'éther Lorsque la température du milieu de réaction est descendue à 20 C ou moins, on ajoute 2 volumes d'éther en agitant ce qui fait précipiter instantanément le MPEG 5000, alors que le CDI en excès et l'imidazole libéré lors de la réaction restent en solution La solution est ensuite filtrée sur un filtre Whatmann 44, le filtre est lavé avec de l'éther et le précipitat de MPEG 5000 activé lyophilisé est repris dans 50 ml de dioxane et reprécipité par de l'éther comme décrit ci-dessus Après filtration, le MPEG 5000 activé est lyophilisé toute la nuit, puis il est conservé dans un dessicateur contenant du gel de silice de façon à le préserver de l'eau. EXEMPLE 2: Préparation du PEG 50 000 activé. Toute la réaction d'activation du PEG 50 000 s'effectue en milieu anhydre Pour éliminer toute trace d'eau, le PEG 50 000, le CDI et le dioxane sont traités comme décrit dans l'exemple 1. 19,2 g (environ 384 ipmoles) de PEG 50 000 sont ajoutés à lg (environ 6 mmoles) de CDI et le mélange est lyophilisé au moins 2 h La poudre séchée est alors reprise dans 50 ml de dioxane et la réaction d'activation du PEG 50 000 par le CDI s'effectue pendant 15 h à 60 C sous agitation Les molécules de PEG 50 000 ont deux groupements hydroxy libres, il y a donc deux sites potentiels d'activation par molécules de PEG 50 000. Le PEG 50 000 activé est récupéré par précipitation à l'éther comme décrit dans l'exemple 1 On récupère 18,6 g de PEG 50 000 activé. EXEMPLE 3: Couplage du MPEG ( 5000) activé avec de l'hirudine r HV 2-Lys 47. A Conjugaison du MPEG 5000 à r HV 2-Lys 47 3 g (environ 0 5 mmole) de MPEG 5000 activé de l'exemple 1 sont mélangés à 15 mg (environ 2 pmoles) de r HV 2-Lys 47 dans 25 ml de tampon borate 100 m M à p H 8,4 Le milieu de réaction est laissé 12 h à 4 C sous agitation Le MPEG 5000 activé se désactivant rapidement au contact avec l'eau, on rajoute 3 g de MPEG 5000 activé dans le milieu de réaction environ toutes les 12 h, 4 fois de suite Après la quatrième addition de MPEG 5000 activé, le milieu de réaction est laissé encore 48 h à 4 C. B Purification du conjugué MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 La purification du conjugué MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 se fait en 2 étapes i) une chromatographie d'échange d'anions permet déliminer l'excès de MPEG 5000 qui n'est par retenu alors que le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 et r HV 2-Lys 47 libre sont adsorbés sur la colonne. ii) une chromatographie de phase inverse permet de séparer r HV 2-Lys 47 libre résiduelle du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47. 1 Chromatographie d'échange d'anions sur Q-Sépharose. 10 ml de phase sont coulés dans une colonne Biorad de 14 mm de diamètre, et équilibrés avec 50 ml de tampon d'équilibration: borate 10 m M à un débit de 1 ml/min Toute la chromatographie s'effectue à un débit de 1 ml/min Le milieu de réaction contenant du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 obtenu en B est dilué au 1/10 avec de l'eau de façon à avoir une solution à 10 m M borate On obtient un échantillon d'environ 250 ml qui est déposé sur la colonne de Q-Sépharose La colonne est lavée avec 50 ml de tampon d'équilibration, puis l'élution s'effectue avec 10 ml de tampon borate 10 m M p H 8,5, Na CI 1 M, et la colonne est rééquilibrée dans du tampon d'équilibration On récupère un échantillon de 20 ml contenant r HV 2-Lys 47 libre et le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47, qui correspondent aux 10 ml de l'élution plus les 10 premiers ml de la rééquilibration de la colonne. 2 Chromatographie sur phase inverse RP 300. Toute la chromatographie se fait à un débit de 1 ml/min On utilise une colonne Aquapore RP 300 de diamètre 95 mm et de longueur 250 mm (Applied Biosystems) et une HPLC Hewlett Packard HP 1090. Le p H de l'échantillon obtenu en 1, contenant r HV 2-Lys 47 libre et du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47, est abaissé à 2 avec du tampon d'équilibration TFA m M dans l'eau, ce qui augmente le volume à 35 ml final 5 ml d'échantillon sont injectés sur la colonne R 300, puis la colonne est lavée avec du tampon d'équilibration de façon à éliminer les sels présents dans l'échantillon L'élution s'effectue alors par un gradient de 40 min, allant de O à 100 % acétonitrile, contenant du TFA 10 m M, puis la colonne est lavée avec 10 à 20 ml de tampon d'équilibration L'élution des protéines est suivie par une mesure de la DO à 215 nm L'opération est effectuée 7 fois de façon à chromatographier les 35 ml de l'échantillon Un chromato- gramme est présenté à la figure 1 2 fractions sont récupérées la fraction 1 correspond au pic dont le temps de rétention est de min et contient r HV 2-Lys 47 libre. la fraction 2 correspond aux pics dont les temps de rétention sont compris entre 19 et 22 min, et contient le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47. La comparaison des pics d'élution de r HV 2-Lys 47 (fraction 1) et du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 indique que plus de 95 % de r HV 2-Lys 47 est couplé au MPEG 5000. Les 7 fractions I contenant r HV 2-Lys 47 libre obtenus lors des 7 chromatographies sont mélangées, puis lyophilisées toute la nuit, et reprises dans du tampon PBS (voir tableau) On procède de la même façon pour les 7 fractions 2 contenant le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47. La séquence N-terminale du conjugué obtenu a pu être déterminée normalement, ce qui indique que le MPEG 5000 activé ne se fixe pas sur la fonction amine terminale de r HV 2-Lys 47. EXEMPLE 4: Couplage du PEG 50 000 activé avec de l'hirudine r HV 2-Lys 47. A Conjugaison du PEG 50 000 à r HV 2-Lys 47. 2 g (environ 40 prmole) de PEG 50 000 activé de l'exemple 2 sont mélangés à 2 mg (environ 280 nmoles) de r HV 2-Lys 47 dans 5 ml de tampon borate 100 m M à p H 8,4 Le milieu de réaction est laissé 24 h à 4 C sous agitation Le PEG 50 000 activé se désactivant rapidement au contact avec l'eau, 2 g de PEG 50 000 activé contenus dans 5 ml de tampon borate m M sont rajoutés dans le milieu de réaction toutes les 24 h, 4 fois de suite On récupère 36 ml d'une solution de PEG 50 000-r HV 2-Lys 47. B Purification du conjugué PEG 50 000-r HV 2-Lys 47 Comme pour le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47, la purification du conjugué PEG 50 000-r HV 2-Lys 47 se fait en 2 étapes i) une chromatographie d'échange d'anions et, ii) une chromatographie de phase inverse. 1 Chromatographie d'échange d'anions sur Q-Sépharose. ml de phase sont coulés dans une colonne Biorad de 14 mm de diamètre, et équilibrés avec 50 ml de tampon d'équilibration: borate 10 m M à p H 8,5 à un débit de 1 ml/min Toute la chromatographie s'effectue à un débit de 1 ml/min Le milieu de réaction contenant du PEG 50 000- r HV 2-Lys 47 obtenu en B est dilué au 1/10 avec de l'eau de façon à avoir une solution à 10 m M borate On obtient un échantillon d'environ 360 ml qui est chromatographié sur la colonne de Q-Sépharose en 3 fois 120 ml d'échantillons sont déposés sur la colonne de Q-Sépharose qui est ensuite lavée avec 50 ml de tampon d'équilibration, puis l'élution s'effectue avec 10 ml de tampon borate 10 m M p H 8,5, Na CI I M, et la colonne est rééquilibrée dans du tampon d'équilibration On récupère un échantillon de ml contenant r HV 2-Lys 47 libre et le PEG 50 000-r HV 2- Lys 47, qui correspondent aux 10 ml de l'élution plus les 30 premiers ml de la rééquilibration de la colonne. 2 Chromatographie sur phase inverse Lichrosphère RP 8 Toute la chromatographie se fait à un débit de 1 ml/min On utilise une colonne Lichrosphère RP 8 5 li (Hewlett Packard) de diamètre 4 mm et de longueur 125 mm et une HPLC Hewlett Packard HP 1090. Le p H de l'échantillon obtenu en 1 contenant r HV 2-Lys 47 libre et du PEG 50 000-r HV 2-Lys 47 est abaissé à 1, 5 avec 200 p I de TFA pur La colonne est équilibrée dans du tampon d'équilibration TFA 10 m M, eau 20 ml d'échantillon sont injectés sur la colonne RP 8, puis la colonne est lavée avec du tampon d'équilibration de façon à éliminer les sels présents dans l'échantillon L'élution s'effectue alors par un gradient en 40 min, allant de 0 à 100 % acétonitrile contenant du TFA 10 m M, et la colonne est lavée avec à 20 ml de tampon d'équilibration L'élution des protéines est suivie par une mesure de la DO à 215 nm L'opération est effectuée 2 fois de façon à chromatographier les 40 ml de l'échantillon Un chromatogramme est représenté à la Figure 2 2 fractions sont récupérées: la fraction 1 correspond au pic dont le temps de rétention est de 15 min et contient r HV 2-Lys 47 libre. la fraction 2 correspond aux pics dont les temps de rétention sont compris entre 20 et 30 min et contient le PEG 50 000-r HV 2-Lys 47. La comparaison des pics d'élution de r HV 2-Lys 47 (fraction 1) et du PEG 50 000-r HV 2-Lys 47 (fraction 2) indique que plus de 70 % de r HV 2- Lys 47 est couplé au PEG 50. Les 7 fractions I contenant r HV 2-Lys 47 libre obtenus lors des 2 chromatographies sont mélangées, puis lyophilisées toute la nuit, et reprises dans du tampon PBS On procède de la même façon pour les 2 fractions 2 contenant le PEG 50 000-r HV 2-Lys 47. EXEMPLE 5: quantification et activité des conjugués obtenus La quantification des conjugués obtenus dans les exemples 3 et 4 a été effectuée par 3 méthodes différentes: la chromatographie analytique sur phase inverse (HPLC analytique), le test d'activité antithrombine, et l'analyse des acides aminés a) Chromatographie analytique On utilise une colonne Lichrosphère RP 8 5 p (Hewlett Packard) de diamètre 4 mm et de longueur 125 mm et une HPLC Hewlett Packard HP 1090 Le débit est de I ml/min pendant toute la chromatographie. La colonne Lichrosphère RP 8 est équilibrée dans un tampon d'équilibration acétonitrile 30 %, TFA 10 m M, eau 70 % Environ 25 pg de PEG-r HV 2-Lys 47 contenus dans 500 pl de PBS sont injectés sur la colonne, et après lavage de la colonne avec le tampon d'équilibration L'élution s'effectue par un gradient en 40 min allant de 30 à 65 % acétonitrile dans de l'eau contenant du TFA 10 m M, puis la colonne est rééquilibrée dans le tampon d'équilibration L'élution des protéines est suivie par une mesure de la DO à 215 nm, caractéristique des protéines La surface des pics d'élution présents sur le chromatogramme est proportionnelle à la quantité de protéine injectée sur la colonne Une chromatographie d'une quantité connue de r HV 2-Lys 47 dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, permet de corréler la surface du pic d'élution à la quantité de r HV 2-Lys 47 injectée. b) activité anti-thrombotique L'activité de l'hirudine est dosée par un test d'inhibition de la thrombine Le substrat utilisé dans ce test est du chromozyme PL (Tosyl- glycyl-prolyl-lysine-4-nitranilide acétate) qui est clivé par la thrombine et libère un chromophore qui absorbe la lumière à 410 nm. La vitesse d'apparition du chromophore dépend de la quantité de thrombine active présente dans le milieu de réaction En présence d'hirudine, la thrombine est inhibée et la vitesse d'apparition du chromophore est plus lente. Produits utilisés pour le test d'activité r HV 2-Lys 47: 2,5 mg/ml conservé dans la glace Thrombine: 3,3 pg/ml (l U/ml), dans du tampon cinétique, conservée dans de la glace Chromozyme PL (Boehringer): 6,66 mg/ml conservé à température ambiante Tampon cinétique: Tris HCI 50 m M Na CI 0,1 M 0,1 % PEG 6000 p H 7,9 Thermostaté à 37 C. La réaction est suivie à 410 nm dans un spectrophotomètre thermostaté à 37 C par un bain marie Entre 0 et 100 pl d'hirudine sont mélangés, dans une cuve de spectromètre en plastique de Iml, à 50 p I de thrombine dans le tampon de cinétique de façon à avoir un volume final de 980 pl Les cuves sont préincubées 3 min à 37 C pour que l'hirudine puisse se fixer à la thrombine 20 p I de chromozyme sont rajoutés dans chaque cuve et, après agitation la DO est lue à 410 nm toutes les minutes pendant 3 minutes Le résultat est donné en DO/min. L'activité spécifique de r HV 2-Lys 47 étant connue ( 15 000 ATU/mg), le dosage de l'activité du conjugué permet de le quantifier. c) analyse des acides aminés L'analyse d'acides aminés est effectuée de manière classique Le conjugé est hydrolysé par des vapeurs d'HCI 6 N, puis les acides aminés sont conjugués au Phénylisothiocyanate (PITC) dans du n-heptane à 5 %, qui absorbe la lumière à 254 nm Les conjugués d'acides aminés sont injectés sur une colonne de phase inverse C 18, puis sont élués en utilisant un gradient permettant de séparer les différents conjugués La conjugaison des acides aminés au PITC et la chromatographie se font sur un analyseur d'acides aminés Applied Biosystems 130 A Le temps de rétention sur la colonne de phase inverse, est spécifique de chaque conjugué d'acide aminé. Une solution standard de conjugués d'acides aminés permet de définir ces temps de rétention et de quantifier les acides mainés présents dans l'hydrolysat du conjugué de r HV 2-Lys 47 Connaissant la composition en acides aminés de r HV 2-Lys 47, on peut déterminer la quantité exacte de r HV 2-Lys 47 ainsi analysée. Les résultats obtenus pour les conjugués des exemples 3 et 4 sont donnés dans le tableau I ci-dessous. l TABLEAU I Quantificati N (en tig) Exemple Volume HPCL Test Analyse m I analytiqued'acitivité d'acides aminés 3 17 8200 8000 9194 4 1,7 1688 1070 1208,8 Le fait que pour ces deux exemples, les tests d'activité donnent des résultats de quantification, voisins de ceux obtenus par HPLC analytique ou analyse d'acides aminés montre clairement que près de 100 % des conjugués PEG-hirudine obtenus sont actifs (entre 85 et 98 % pour l'exemple 3 et entre 63 et 88 % pour l'exemple 4). Ces résultats permettent d'envisager leur emploi ultérieur comme agent anti-thrombotique sans nécessiter une purification supplémentaire des conjugués actifs. EXEMPLE 6: Mesure de la constante d'inhibition de l'hirudine r HV 2-Lys 47 et de ses deux conjugués du MPEG 5000 et du PEG 50 000. L'analyse de la constante d'inhibition est effectuée selon la méthode décrite par R S Stone et 3 Hofsteenge dans Biochemistry, 1986, 25, pages 4628, et Biochemistry, 1991, 4, pages 295-300. L'hirudine inhibe la thrombine selon un mécanisme de type compétitif La constane d'inhibition peut donc être calculée comme suit: Ki = Ki Ki' KM S Ki' I+S/KM avec = constante d'inhibition, = constante d'inhibition apparente, = 3, 63 p M = constante de Michaëls, et = concentration de substrat. Ki' et S peuvent être mesurés. Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau II ci-dessous. TABLEAU II Inhibiteur K'i (p M) Ki(p M) r HV 2-Lys 47 29,30 + 1,77 1,03 MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 28,78: 1,43 1 PEG 50 000-r HV 2-Lys 47 34,12 X 1,04 1,19 La fixation de MPEG 5000 ou de PEG 50 000 n'affecte pas la constante de dissociation du complexe r HV 2-Lys 47-thrombine Ces résultats montrent que les conjugués PEG-hirudine sont des inhibiteurs de la thrombine aussi efficaces que l'hirudine libre. EXEMPLE 7: Tests de pharmacocinétique in vivo Pour évaluer la demi-vie de r HV 2-Lys 47 libre et du PEG-r HV 2- Lys 47 dans le plasma des rats, 2 types d'expériences ont été effectuées: expérience sur une courte période: elle ne dure que 5 à 6 h maximum pendant lesquelles les rats sont anesthésiés; expérience sur une longue période: elle dure 48 h et les rats sont conscients pendant toute la durée de l'expérience. Pour les expériences on utilise des rats de la souche Sprague Dawley de 300 g 5 jours avant le début des expériences, les rats sont séparés dans des cages individuelles, ils sont acclimatés à un cycle jour-nuit de 13 h, et ils ont de l'eau et de la nourriture à volonté. Les échantillons de sang sont récoltés dans des tubes en plastique contenant une solution de citrate de sodium 3,2 %, à un rapport de 1 volume pour 4 volumes de sang. Le plasma est préparé à partir du sang dans les 10 min suivant la collecte par une centrifugation à 4000 g pendant 5 min à température ambiante Les échantillons de plasma sont stockés à -801 C Le conjugué employé est le MPEG 5000-r HV 2-Lys 47. a) Expérience sur une courte période Chaque expérience est effectuée en parallèle sur 2 rats Le jour de l'expérience les rats sont anesthésiés par une administration de pento- barbital de sodium ( 50 mg/kg) par voie intrapéritonéale Un cathéter est placé dans la veine jugulaire droite pour administrer 500 pg de r HV 2-Lys 47 sous forme libre (contrôle) ou conjuguée Un second cathéter est placé dans la cariole gauche pour collecter les échantillons de sang. Des échantillons de sang sont collectés avant l'injection de r HY 2-Lys 47 ou de PEG-r HV 2-Lys 47 (t), et à 5 min, 10 min, 20 min, lh, 2 h, 4 h, 5 h et 6 h après l'injection. b) Expérience sur une longue période Chaque expérience est effectuée en parallèle sur 2 rats Le jour de l'expérience 500,ug de r HV 2-Lys 47 sous forme libre (contrôle) ou conjuguée, sont administrés dans la veine de la queue des rats Les échantillons de sang sont collectés sous une anesthésie douce à l'éther, à partir de la veine de la queue du rat, avant l'injection de r HV 2-Lys 47 ou de PEG-r HV 2-Lys 47 (to), et à 5 min, 8 h et 24 h après l'injection Excepté à ces moments, les rats sont conscients pendant toute la durée de l'expérience. c) Analyse des échantillons de plasma La quantité de r HV 2-Lys 47 sous forme libre (contrôle) ou conjuguée est déterminée par un test ELISA et par un test d'activité On effectue une gamme étalon avec une solution de r HV 2-Lys 47 ou de MPEG 5000-HV 2-Lys 47 bien quantifiée, diluée dans du plasma récolté à to, de façon à être dans des conditions similaires à celles des échantillons prélevés Les échantillons de plasma sont dilués dans du tampon cinétique pour que la concentration en r HV 2-Lys 47 soit comprise dans la gamme étalon Les résultats de ces analyses sont donnés sur les graphes représentés Figure 3 pour les essais sur une courte période, et Figure 4 pour les essais sur une longue période Il existe une dégradation C-terminale de r HV 2-Lys 47 dans le plasma, ce qui explique la différence de résultats de quantification obtenus par le text ELISA et par le test d'activité En effet, un des 2 anticorps utilisés pour le test ELISA reconnait la partie C-terminale de r HV 2-Lys 47, et ne reconnaît donc plus les molécules dégradées restées actives. Le temps de demi-vie du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 par rapport à celui de r HV 2-Lys 47 n'est pas augmenté de manière significative. Cependant on observe que, pour une même quantité de r HV 2-Lys 47 injectée aux rats sous forme libre ou sous forme de conjugué au MPEG 5000, la concentration plasmatique de MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 est 7 à 8 fois supérieure à celle de r HV 2-Lys 47 libre Pour une même efficacité d'inhibition, on peut donc injecter 7 à 8 fois moins de MPEG 5000-r HV 2- Lys 47 que de r HV 2-Lys 47 libre Le coût de production du MPEG 5000- r HV 2-Lys 47 préparé selon l'invention n'étant que faiblement augmenté par rapport au coût de production de r HV 2-Lys 47 libre, l'utilisation du MPEG 5000-r HV 2-Lys 47 en pharmacologie peut être d'un coût nettement diminué par rapport à l'utilisation de r HV 2-Lys 47. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un conjugué polyéthylèneglycol(ou dérivés)peptide (PEG-peptide) comprenant les étapes d'activation du polyéthylèneglycol ou ses dérivés (PEG) dans un solvant anhydre approprié, de récupération du PEG activé et de couplage du PEG activé avec le peptide, caractérisé en ce que la récupération du PEG activé est effectuée par précipitation à partir du mélange d'activation à l'aide d'un solvant organique hydrophobe. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophobe est choisi parmi les solvants aprotiques apolaires ou peu polaires. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophobe est choisi parmi les éthers aliphatiques et les hydrocarbures. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophobe est sélectionné parmi l'éther éthylique, le pentane, l'hexane ou l'heptane, de préférence l'éther éthylique. Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que le précipité est ultérieurement filtré puis lyophilisé. 6 Procédé selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que la réaction d'activation est effectuée dans un solvant anhydre approprié choisi parmi les solvants aprotiques polaires. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le solvant anhydre est choisi parmi le dioxane, le diméthylformamide, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde ou le tétrahydrofurane. 8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le PEG a un poids moléculaire compris entre 2000 et 100 000, avantageu- sement compris entre 2000 et 5000, et est choisi parmi le polyéthylène- glycol et les esters aliphatiques en C 1-C 6 du polyéthylèneglycol. 9 Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le PEG est activé à l'aide d'un agent d'activation choisi parmi le carboxydiimidazole, le N-hydroxysuccinimide, et le 2,3,5trichloroformiate. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le rapport molaire entre l'agent d'activation et le PEG est compris entre 5 et 50, de préférence compris entre 10 et 20. Il Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent d'activation est le carboxydiimidazole. 12 Procédé selon l'une des revendication 1 à 11, caractérisé en ce que le peptide est de l'hirudine ou un de ses variants. 13 Procédé de préparation d'un conjugué polyéthylèneglycol(ou dérivés)hirudine (PEG-hirudine) comprenant: a) l'activation du polyéthylèneglycol ou ses dérivés (PEG) par réaction avec le carboxydiimide dans un solvant anhydre approprié, b) la récupération du PEG activé par précipitation à l'aide d'un solvant hydrophobe, c) la condensation du PEG activé sur l'hirudine ou ses variants en milieu faiblement alcalin, et d) la purification du conjugué obtenu. 14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la réaction d'activation est effectuée dans un solvant anhydre approprié choisi parmi les solvants aprotiques polaires. 15 Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que le solvant anhydre approprié est sélectionné parmi le dioxane, le diméthylformamide, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde ou le tétrahydro- furane. 16 Procédé selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophobe est choisi parmi les solvants aprotiques apolaires ou peu polaires. 17 Procédé selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophobe est choisi parmi les éthers aliphatiques et les hydrocarbures. 18 Procédé selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que le solvant hydrophobe est choisi parmi l'éther éthylique, le pentane, l'hexane ou l'heptane, de préférence l'éther éthylique. 19 Procédé selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le carboxydiimidazole et le PEG est compris entre 5 et 50, de préférence est compris entre 10 et 20. Procédé selon l'une des revendication 13 à 19, caractérisé en ce que le conjugué obtenu est purifié par les deux étapes successives suivantes: de chromatographie sur échange d'anions pour éliminer l'excès de PEG qui n'aurait pas réagit, et de chromatographie de phase inverse pour séparer le conjugué obtenu de l'hirudine libre résiduelle. 21 Procédé selon l'une des revendications 13 à 20, caractérisé en ce que le PEG a un poids moléculaire compris entre 2000 et 100 000, avantageusement compris entre 2000 et 50 000 et est choisi parmi le polyéthylèneglycol, ou les monoesters aliphatiques en C 1-C 5 du poly- éthylèneglycol. 22 Conjugué polyéthylèneglycol(ou dérivés)-hirudine (PEG-hirudine), caractérisé en ce que le polyéthylèneglycol ou ses dérivés (PEG) est lié à l'hirudine sur au moins une fonction amine du peptide, différente de la fonction amine terminale, à l'exception de cette fonction amine terminale. 23 Conjugué selon la revendication 22, caractérisé en ce que plus de % en poids des conjugués ont une activité anti-thrombotique. 24 Conjugué selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que le PEG a un poids moléculaire compris entre 2000 et 100 000, avantageusement 2000 et 50 000, et est choisi parmi le polyéthylèneglycol, ou les monoesters aliphatiques en C 1-C 6 du polyéthylèneglycol. Conjugué selon l'une des revendications 22 à 24, obtenu selon le procédé de l'une des revendications 13 à 21. 26 A titre de médicament, le conjugué selon l'une des revendications 22 à 24, pour le traitement des thromboses.