Brevet FR2696754A1 — publié le 19940415

METHODE D'ISOLEMENT DE CELLULES A PARTIR D'UN ORGANE ET DISPOSITIF POUR SA MISE EN OEUVRE La présente invention est relative au domaine de l'isolement de cellules ou de groupes de cellules à partir d'un organe ou d'une fraction d'organe. Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode d'isolement selon laquelle l'organe ou la fraction d'organe à digérer est placée dans une chambre de digestion à l'intérieur de laquelle on fait circuler une solution enzymatique permettant de séparer l'organe en cellules ou groupes de cellules. L'invention a également pour objet un dispositif de mise en oeuvre de la méthode proposée. Une méthode et un dispositif de ce type sont déjà proposés dans l'art antérieur. Ainsi, la demande de brevet WO 88/09667 décrit une méthode et un dispositif d'obtention de cellules à partir d'un organe digéré grâce à l'utilisation d'une solution contenant des enzymes protéolytiques. Selon ce document, L'organe à digérer est tout d'abord distendu par injection à basse température d'une solution contenant de la collagénase. On place ensuite l'organe distendu dans une chambre de digestion munie d'une entrée ainsi que d'une sortie sur laquelle est adapté un filtre permettant le passage des cellules désirées.L'entrée de la chambre est reliée par une canalisation munie d'une pompe et de moyens de chauffage à un récipient contenant la solution de protéase la sortie de la chambre est elle aussi reliée au récipient contenant de la protéase, mais par une canalisation pourvue de moyens d'abaissement de la température, afin d'inactiver la protéase qui circule à l'intérieur de la chambre de digestion. Lorsqu'on estime que l'action de la protéase a été suffisante pour digérer correctement l'organe, L'entrée de la chambre de digestion est mise en communication avec une source de solution de Hanks fraîche alors que la sortie de la chambre est reliée à un récipient collecteur.Un circuit ouvert est ainsi créé permettant de recueillir dans le récipient collecteur les cellules désirées capables de traverser le filtre placé à la sortie de la chambre de digestion. La méthode proposée dans ce document présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes proposées antérieurement, mais n'est cependant pas complètement satisfaisante. En effet, un des points critiques dans l'isolement de cellules est la détermination du moment où la digestion de l'organe est optimale et où il faut donc faire cesser l'action de la protéase. Si l'action de la protéase n'est pas suffisante, il n'y aura pas suffisamment de cellules isolées . le rendement sera donc mauvais. Si, au contraire, la recirculation de la protéase est maintenue trop longtemps, un certain nombre de cellules seront trop digérées et ne seront plus fonctionnelles. Selon l'enseignement de la demande de brevet WO 88/09667, I'arrêt de la digestion est décidé lorsqu'une observation microscopique sur un échantillon du liquide qui sort de la chambre de digestion permet d'estimer que l'état de digestion du pancréas est suffisamment avancé. Un inconvénient de cette méthode est que l'échantillon observé peut ne pas être représentatif de l'état de l'ensemble du pancréas. En outre, la décision d'arrêter la phase de digestion sur la base de cette observation est une décision arbitraire qui dépend entièrement de l'opérateu r. II est donc souhaitable de disposer d'une méthode d'isolement définie où le caractère subjectif lié à l'opérateur est supprimé. Un but de l'invention est de proposer une telle méthode. Un autre but de l'invention est de proposer une méthode d'isolement qui puisse faire l'objet d'une automatisation. Un autre but de l'invention est de proposer une méthode d'isolement ayant un bon rendement, c'est-à-dire permettant d'obtenir un grand nombre de cellules non endommagées par le procédé d'isolement. Pour atteindre ces différents buts, la présente invention a pour objet une méthode d'isolement de cellules ou groupes de cellules à partir d'un organe ou d'une fraction d'organe, du type consistant - à disposer l'organe ou la fraction d'organe à digérer à l'intérieur d'une chambre de digestion munie d'au moins une entrée et une sortie sur laquelle est adaptée un filtre apte à laisser passer les cellules ou groupes de cellules à isoler, - à faire circuler au travers de la chambre une solution apte à permettre la digestion de l'organe ou de la fraction d'organe en cellules ou groupes de cellules à isoler, - à recueillir en continu dans au moins un récipient la solution provenant de la chambre de digestion et comportant les cellules ou groupes de cellules digérés ayant traversé le filtre, caractérisée en ce qu'elle consiste - à effectuer une digestion totale de l'organe ou de la fraction d'organe, - et à effectuer régulièrement la séparation entre les cellules ou groupes de cellules et la solution ayant permis la digestion. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la présente méthode est caractérisée en ce que l'étape de séparation entre les cellules ou groupes de cellules recueillis et la solution provenant de la chambre consiste notamment à centrifuger la solution recueillie en provenance de la chambre de digestion, et à remettre en suspension le culot de centrifugation contenant les cellules ou groupes de cellules digérés. Ainsi, la solution enzymatique ayant digéré l'organe ou la fraction d'organe peut être rapidement éliminée ou récupérée pour une phase de digestion ultérieure, et il est en outre facile de déterminer le point de digestion totale qui se traduit par une absence de culot de centrifugation. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le culot de centrifugation est remis en suspension dans une solution dépourvue d'enzyme digestive. Grâce à cela, les cellules ou groupes de cellules isolés sont rapidement mis en contact avec un milieu qui leur est favorable et peuvent ainsi conserver le maximum de leur fonctionnalité. La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de la méthode proposée, comprenant - au moins une chambre de digestion munie d'une entrée et d'une sortie sur laquelle est adapté un filtre apte à laisser passer les éléments dont la taille est celle des cellules ou groupes de cellules à isoler, - une source de solution, - au moins une canalisation reliant l'entrée de la chambre de digestion à la source de solution, - des moyens de chauffage de la solution, - un premier moyen de recueil de la solution provenant de la chambre de digestion. Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend en outre - au moins un second moyen de recueil de la solution, - des moyens pour diriger la solution provenant de la chambre de digestion vers le premier moyen de recueil puis vers au moins le second moyen de recueil. De nombreux avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, en référence à la figure unique qui illustre de façon schématique et sans échelle déterminée, un mode de réalisation de l'invention. Le dispositif représenté sur la figure comporte une chambre de digestion 1 munie d'une entrée 2 et d'une sortie 3. La sortie 3 est équipée d'un filtre 4 dont la maille est de 1 mm2. L'entrée 2 de la chambre est reliée à une canalisation d'alimentation 5 pourvue d'une pompe 6. Cette canalisation 5 est munie d'un circuit de dérivation 7 à l'intérieur duquel le liquide est réchauffé avant son entrée dans la chambre 1 ; cette dérivation 7 est reliée à la canalisation 5 par deux vannes 3-voies 8 et 9. La canalisation 5 est pourvue, en amont de la pompe 6, d'une vanne 12 permettant de la mettre en communication sélectivement avec une éprouvette 11 ou une éprouvette 10. Ces deux éprouvettes 10 et 11 sont maintenues dans de la glace pilée pour que leur contenu soit à une température sensiblement égale à 4"C. La sortie 3 de la chambre de digestion est reliée à une canalisation de collecte 14 dont une portion est plongée dans de la glace pilée. Cette canalisation 14 est reliée aux éprouvettes 11 ou 10 par l'intermédiaire d'une vanne 3-voies 13. Un tel dispositif peut être utilisé pour l'isolement d'îlots de Langerhans à partir d'un pancréas, ainsi que cela est décrit ci-après. La position des vannes 12 et 13 est commandée pour mettre les canalisations 5 et 14 en communication avec l'éprouvette 11 contenant une solution telle que la solution UW. La canalisation 5 est tout d'abord reliée directement à la canalisation 14 ; les vannes 8 et 9 sont orientées pour permettre la circulation de la solution UW dans la dérivation 7. Grâce à la mise en oeuvre de la pompe 6, I'ensemble du circuit est peu à peu rempli de solution UW dont la température est portée à 30 C ; on alimente l'éprouvette il en solution UW jusqu'à ce que le circuit soit totalement rempli. Après avoir injecté dans le pancréas à digérer, 100 ml de solution UW contenant de la collagénase, on le place dans la chambre 1 dont l'entrée 2 est alors reliée à la canalisation 5 et la sortie 3 à la canalisation 14. On fixe le débit de la pompe 6 à 100 ml/min et on soumet la chambre de digestion 1 à une agitation grâce à un dispositif adapté (non représenté). Une sonde de température (non représentée) placée à l'intérieur de la chambre permet de surveiller que la température optimale d'action de la collagénase (soit 37-38 C) soit maintenue. Lorsque la température dépasse cette valeur, on inverse la position des vannes 8 et 9 afin d'éviter que le liquide emprunte la dérivation chauffante 7. Puis, lorsque la température est trop basse, on positionne à nouveau les vannes 8 et 9 pour permettre la circulation du liquide dans la dérivation chauffante 7. Ainsi, la chambre de digestion 1 est thermostatée autour de 37-38 C, ce qui permet d'obtenir une activité optimale de la collagénase. La digestion de l'organe placé dans la chambre 1 s'effectue alors grâce à la collagénase injectée dont l'action est augmentée au moyen de la montée de la température, assurée par la circulation de la solution UW qui traverse la chambre 1. Une fraction de la collagénase est alors diluée dans la solution UW en circulation. Grâce au passage de la canalisation 14 dans de la glace pilée, la solution UW contenant de la collagénase est refroidie, ce qui permet d'inhiber l'action de l'enzyme. Le circuit de circulation de la solution UW contenant la collagénase est alors constitué par l'éprouvette 11, la canalisation 5, le circuit de dérivation 7, la chambre de digestion 1, la canalisation 14 et à nouveau l'éprouvette 11. Le niveau d'arrivée de la canalisation 14 à l'intérieur de l'éprouvette 11 est inférieur au niveau de départ de la canalisation 5 de l'éprouvette. Ainsi, lorsque l'action de la collagénase est suffisante pour digérer certains îlots, ceux-ci sont entraînés par le flux de solution à travers le filtre 4, dans la canalisation 14 puis dans l'éprouvette 1 1 au fond de laquelle ils se déposent. Selon une caractéristique de l'invention, lorsque le dépôt devient assez important, c'est-à-dire par exemple après 5 min de recirculation, on manoeuvre les vannes 12 et 13 pour mettre les canalisations 5 et 14 en communication avec l'éprouvette 10 préalablement remplie de solution UW. La recirculation s'effectue alors de la même façon que précédemment, avec pour seule différence, le remplacement de l'éprouvette 11 par l'éprouvette 10. Pendant ce temps, on centrifuge le contenu de l'éprouvette 11. Le surnageant, constitué par la solution UW contenant de la collagénase provenant du pancréas, est récupéré et remis dans l'éprouvette 11 alors que le culot qui contient les îlots digérés est remis en suspension dans une solution UW ne contenant pas de collagénase et maintenue à 40C ; les îlots sont ainsi conservés dans un milieu protecteur en attendant l'étape ultérieure de purification. L'éprouvette 1 1 remplie de solution de collagénase récupérée est replacée dans la glace pilée et lorsque le dépôt de tissu à l'intérieur de l'éprouvette 10 est suffisant, on manoeuvre à nouveau les vannes 12 et 13 afin de recommencer un nouveau cycle où les canalisations 5 et 14 sont en communication avec l'éprouvette 1 1 ; on centrifuge alors le contenu de l'éprouvette 10 qui est traité de la même façon que précédemment. La digestion se poursuit ainsi par alternance de cycles où la collecte des îlots digérés est réalisée dans le récipient 10 et de cycles où la collecte des îlots digérés est réalisée dans le récipient 11. La décision d'arrêt de cette étape de digestion est prise, de façon objective, lorsqu'il n'y a plus de culot lors de la centrifugation, ce qui signifie que l'ensemble du pancréas a été digéré. La méthode proposée par l'invention présente l'avantage d'éviter l'étape, nécessaire dans l'art antérieur, de rinçage et de récupération du matériel digéré par un volume important d'une solution saline telle que la solution de Hanks, ce qui a pour conséquence de réduire également le nombre de centrifugations à effectuer. La méthode proposée permet également la récupération de la solution de collagénase, ce qui entraîne une réduction importante des coûts. En outre, selon l'invention, on optimise le temps de contact entre le tissu et l'enzyme de digestion qui est la collagénase. En effet, dès que la digestion de l'îlot est suffisante, L'effet combiné de l'agitation de la chambre 1 et du flux de solution entraîne le passage de l'îlot hors de la chambre vers le récipient de collecte constitué par l'une ou l'autre des éprouvettes 10 et 11. La durée maximale de séjour à l'intérieur du récipient de collecte est déterminée de manière à ne pas nuire à la qualité des îlots digérés. On a ainsi pu remarquer qu'un changement d'éprouvettes toutes les 5 min permettait d'obtenir des îlots de très bonne qualité. En effet, on observe après 18 h de mise en culture une très bonne réponse insulinosécrétrice à une stimulation au glucose et même après 6 jours de mise en culture un deuxième pic d'insulino-sécrétion en réponse à une deuxième stimulation au glucose lors d'un test en périfusion. Le fait d'effectuer une digestion totale de l'organe permet d'augmenter le rendement de la méthode tout en supprimant la décision subjective d'arrêt de la phase de digestion. On a ainsi pu multiplier par 3 (voire 4) la moyenne des îlots obtenus par la méthode selon la présente invention par rapport à la méthode décrite dans l'art antérieur WO 88/09667. La présente invention peut faire l'objet de nombreuses variantes. II est par exemple possible de varier le nombre de récipients de collecte du tissu digéré. Ainsi, on peut notamment utiliser un seul récipient reliée à un dispositif de purification des îlots en prévoyant le transfert périodique ou continu du tissu déposé au fond de l'éprouvette vers le dispositif de purification. On peut également accroître la capacité de la chambre de digestion afin d'y entreposer plusieurs organes à digérer, ou multiplier le nombre de chambres. La nature de l'organe à digérer ainsi que la taille des éléments que l'on veut obtenir n'est pas un élément critique au regard de l'invention; il convient d'adapter la maille du filtre 4 et la nature de la solution enzymatique utilisée en fonction de l'organe et du degré de digestion souhaité. II est également possible de prévoir la mise en circulation d'une solution contenant de l'enzyme digestive en plus ou à la place de l'enzyme injectée dans l'organe à digérer. REVENDICATIONS 1. Méthode d'isolement de cellules ou groupes de cellules à partir d'un organe ou d'une fraction d'organe, du type consistant - à disposer l'organe ou la fraction d'organe à digérer à l'intérieur d'une chambre de digestion (1) munie d'au moins une entrée (2) et une sortie (3) sur laquelle est adaptée un filtre (4) apte à laisser passer les cellules ou groupes de cellules à isoler, - à faire circuler au travers de la chambre (1) une solution apte à permettre la digestion de l'organe ou de la fraction d'organe en cellules ou groupes de cellules à isoler, - à recueillir en continu dans au moins un récipient (10, 11) la solution provenant de la chambre de digestion (1) et comportant les cellules ou groupes de cellules digérés ayant traversé le filtre (4), caractérisée en ce qu'elle consiste - à effectuer une digestion totale de l'organe ou de la fraction d'organe, - et à effectuer régulièrement la séparation entre les cellules ou groupes de cellules recueillis et la solution provenant de la chambre. 2. Méthode d'isolement selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en outre à recueillir les cellules ou groupes de cellules successivement dans au moins deux récipients (10, 11) et à effectuer la séparation des cellules ou groupes de cellules recueillis dans un premier récipient (10) (respectivement un second) pendant qu'on recueille les cellules ou groupes de cellules provenant de la chambre (1) dans un second récipient (11) (respectivement un premier). 3. Méthode d'isolement selon une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle consiste à transférer périodiquement les cellules ou groupes de cellules recueillis vers un dispositif apte à effectuer la séparation des cellules ou groupes de cellules digérés de la solution provenant de la chambre. 4. Méthode d'isolement selon une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle consiste à transférer de façon continue les cellules ou groupes de cellules recueillis vers un dispositif apte à effectuer la séparation entre les cellules ou groupes de cellules digérés et la solution provenant de la chambre. 5. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'étape de séparation entre les cellules ou groupes de cellules recueillis et la solution provenant de la chambre consiste notamment à centrifuger la solution recueillie en provenance de la chambre de digestion (1), et à remettre en suspension le culot de centrifugation contenant les cellules ou groupes de cellules digérés. 6. Méthode d'isolement selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle consiste en outre à récupérer après centrifugation le surnageant constitué essentiellement par la solution apte à permettre la digestion. 7. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la solution apte à permettre la digestion est une solution contenant une enzyme digestive telle que la collagénase. 8. Méthode d'isolement selon une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que le culot de centrifugation est remis en suspension dans une solution dépourvue d'enzyme digestive. 9. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle consiste à conclure à la digestion totale de l'organe ou de la fraction d'organe lorsque la solution recueillie en provenance de la chambre de digestion (1) est dépourvue de cellules ou de groupes de cellules. 10. Méthode d'isolement selon une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle consiste à conclure à la digestion totale de l'organe ou de la fraction d'organe lorsqu'il n'y a plus de fraction d'organe dans la chambre de digestion (1). 11. Méthode d'isolement selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle consiste à conclure à la digestion totale de l'organe ou de la fraction d'organe lorsqu'il y a absence de culot de centrifugation. 12. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle consiste à injecter à l'organe ou à la fraction d'organe à digérer une solution contenant une enzyme digestive telle que la collagénase, avant de le placer dans la chambre de digestion (1). 13. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle consiste en outre à agiter l'organe ou la fraction d'organe à l'intérieur de la chambre de digestion (1). 14. Méthode d'isolement selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle consiste à isoler des cellules pancréatiques ss ou des îlots de Langerhans à partir d'un pancréas ou d'une fraction de pancréas. 15. Dispositif pour la mise en oeuvre de la méthode selon une des revendications précédentes, comprenant - au moins une chambre de digestion (1) munie d'une entrée (2) et d'une sortie (3) sur laquelle est adapté un filtre (4) apte à laisser passer les éléments dont la taille est celle des cellules ou groupes de cellules à isoler, - une source de solution (10, 11), - au moins une canalisation (5) reliant l'entrée (2) de la chambre de digestion (1) à la source de solution (10, 11), - des moyens de chauffage (7) de la solution, - un premier moyen de recueil (11) de la solution provenant de la chambre de digestion (1), caractérisé en ce qu'il comprend en outre - au moins un second moyen de recueil (10) de la solution, - des moyens (12, 13) pour diriger la solution provenant de la chambre de digestion (1) vers le premier moyen de recueil (11) puis vers au moins le second moyen de recueil (10). 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens pour maintenir lesdits moyens de recueil de la solution à une température sensiblement égale à 4"C.