Brevet FR2691975A1 — publié le 19931210

L'invention concerne un procédé de production avec alimentation continue d'une composition de sophorolipides comprenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés et la composition de sophorolipides ainsi obtenue II a été mentionné dans les brevets US 3205150 et US 3312684 qu'une quantité de sophorolipides était produite par un procédé de fermentation mettant en jeu une culture de Torulopsis bombicola, souche actuellement classée Candida bombicola. II a par ailleurs été décrit dans la demande de brevet français de la Demanderesse sous le numéro d'enregistrement 90/16211 un procédé de production de sophorolipides par fermentation dans une zone de réaction avec une alimentation en sucre et avec une alimentation continue (fedbatch) en esters d'acides gras ou en huiles. Les sophorolipides obtenus sont considérés comme étant un mélange de composés représentés par les formules (1) et (2), la formule (1) représentant la forme acide et la formule (2) la forme lactone. Dans ces formules, R1 représente l'hydrogène ou un groupe acétyle et R2 I'hydrogène ou un reste alkyle comportant 1 à 9 atomes de carbone, lorsque R3 est un reste 2 hydrocarboné saturé à 7 à 16 atomes de carbone, ou bien R2 représente l'hydrogène ou un groupe méthyle, lorsque R3 est un reste hydrocarboné insaturé à 13 à 17 atomes de carbone. Jusqu'à présent, les procédés de préparation des produits décrivent un ensemble de nombreux homologues et la séparation de l'une des formes principales (acide ou lactone) requiert par exemple des extractions par de l'alcool (EP - B 209783) qui sont longues et coûteuses. Par ailleurs, l'extraction par un solvant spécifique ne donne pas toujours de bons résultats car la solubilité de l'ensemble des homologues dans un solvant peut différer sensiblement, ce qui affecte la qualité des produits obtenus. D'autre part, les réactions de méthanolyse en présence de catalyseur acide ne donnent pas de meilleurs résultats et c'est très souvent un mélange d'acides ou d'esters désacétylés qui est obtenu. De plus, I'art antérieur (US 4197166) mentionne qu'il est extrêmement difficile de préparer par fermentation un produit désiré ayant un rapport donné d'homologues. Enfin, il est connu que les liaisons acétyl dans les sophorolipides sont chimiquement instables et sont très facilement hydrolysées par le chauffage ou le stockage prolongé au voisinage de la neutralité ou même à température ambiante dans des conditions faiblement alcalines, ce qui conduit à l'obtention de la forme acide totalement désacétylée. II est donc extrêmement difficile par la fermentation ou la chimie d'obtenir un seul produit et à fortiori un produit acétylé. Par ailleurs, dans les applications pétrolières liées par exemple à la récupération assistée du pétrole, il est nécessaire de pouvoir créer des émulsions eau dans huile et donc de pouvoir disposer de produits émulsifiants plus hydrophobes qu'hydrophiles, ce qui ne peut être le cas des produits acides désacétylés. II existe donc une demande dans l'industrie, pour des produits présentant une fonction acide gras et une structure saccharidique comportant des fonctions acétylées, masquant les groupements hydroxyles très hydrophiles, notamment sur des produits obtenus par fermentation et comprenant une structure saccharidique telle que le sophorose. On a donc découvert un procédé de production en fedbatch d'une composition de sophorolipides comprenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés dans des conditions particulièrement avantageuses et répondant aux inconvénients cidessus. Plus particulièrement, on met en culture au moins une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu de culture comprenant une source d'azote et éventuellement du sucre dans des conditions appropriées telles que l'on produit ladite souche et l'on soumet ladite souche cultivée dans une zone de réaction à une alimentation en sucre et à une alimentation en au moins un substrat approprié dans des conditions d'aération, de température, de pH, adéquates et on réalise au moins une fois la séquence suivante a.On effectue en continu l'alimentation de la souche en ledit substrat à un débit d'alimentation dans la zone réactionnelle comprise entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial et pendant une durée d'alimentation tels que la concentration résiduelle en ledit substrat dans la zone réactionnelle soit maintenue à une valeur au plus égale à 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant ladite durée d'alimentation ; et b. On récupère la composition de sophorolipides produits. De manière plus précise, avant l'étape de mise en culture, on effectue au moins une étape de préculture de la souche dans des conditions de préculture appropriées dans un milieu de préculture contenant - au moins une source d'azote, et - au moins une source de carbone choisie dans le groupe comprenant au moins un hydrate de carbone, au moins un ester d'acide gras saturé ou insaturé de 10 à 24 atomes de carbone, au moins un hydrocarbure aliphatique saturé ou insaturé de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un alcool aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un acide aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone et leurs mélanges ; la proportion d'hydrate de carbone étant au plus égale à 20 % par rapport au milieu de préculture et la proportion pondérale d'ester, d'hydrocarbure, d'alcool et/ou d'acide étant au plus égale à 0,5 % ; et on ensemence le milieu de culture avec le milieu de préculture. De manière préférée, le milieu de préculture peut comprendre au moins un hydrate de carbone et au moins une autre source de carbone choisie dans le groupe comprenant au moins un ester, un hydrocarbure, un alcool, un acide définis ci-avant. Selon une caractéristique du procédé, on peut effectuer la ou les étapes de préculture à une température de 18 à 40"C et de préférence de 20 à 30"G, durant une période de temps de 12 à 72 heures chacune et plus particulièrement de 24 à 36 heures. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé, L'ester d'acide gras, I'hydrocarbure aliphatique, l'alcool aliphatique, L'acide aliphatique peut être dans une proportion pondérale de 0,1 à 0,30 % par rapport au milieu de préculture et l'hydrate de carbone dans une proportion pondérale de 2 à 12 % par rapport au milieu de préculture. De préférence, on préconise l'ester éthylique ou méthylique de l'huile de colza, de tournesol, de palme ou de soja. On a obtenu des résultats particulièrement intéressants avec une concentration pondérale en hydrate de carbone de 6 à 10 % dans le milieu de préculture. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé, la source de carbone peut être choisie dans le groupe comprenant lesdits esters d'acides gras de 16 à 18 atomes de carbone, lesdits hydrocarbures de 16 à 18 atomes de carbone, lesdits alcools de 16 à 18 atomes de carbone et les acides de 16 à 18 atomes de carbone. La source d'azote utilisée dans l'étape de préculture est généralement une source d'azote minéral sous forme d'ions ammonium et/ou azote organique, par exemple sous forme d'urée, d'aminoacides tels que notamment l'extrait de levure, la peptone de soja, des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de maïs, des hydrolysats de gluten de blé, des extraits de viande. L'addition d'éléments minéraux tels que par exemple le potassium, le sodium, le magnésium et d'oligoéléments comme le fer, le manganèse, le molybdène sous forme de leurs sels (sulfates, phosphates, chlorures) peuvent permettre également d'améliorer encore la croissance. Le milieu de culture peut comprendre au moins un sucre tel que le glucose ou le saccharose et/ou des esters d'acides gras aliphatiques tels que ceux que l'on introduit dans l'étape de préculturn La propagation de la souche est généralement réalisée par ensemencement d'un milieu de préculture en petit volume à partir d'un tube gélosé utilisé pour la conservation de cette même souche. Ce milieu de préculture, après une période d'incubation sur table d'agitation est ensuite transféré dans un réacteur de production dans lequel la mise en oeuvre du procédé peut être réalisée selon le protocole opératoire déjà décrit dans la demande de brevet français de la Demanderesse (EN 90/16211). Le procédé de production des sophorolipides est en règle générale conduit selon la technique de fed-batch et mis en oeuvre dans les conditions décrites par exemple dans la même demande de brevet français : température 18-35"C, pH 2,5 à 8,0. avantageusement 3,0 à 4,0, début d'aération 0,2 à 2 VVM sous une pression absolue de 1 à 5 bar et de préférence 1 à 2 bar (1 bar = 0,1 MPa). Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, l'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape de mise en culture peut comprendre la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides, la neutralisation à un pH voisin de la neutralité du moût et l'élimination de l'eau par chauffage et sous pression réduite. Selon une autre variante, L'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape de mise en culture peut comprendre la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides et l'élimination de l'eau sous pression réduite. Cette élimination de l'eau sous pression réduite est de préférence réalisée par lyophilisation. Par le procédé selon l'invention, on obtient généralement plus de 55% de sophorolipides acides sous forme acétylée et de préférence au moins 60% par exemple 60 à 70%. La caractérisation des formes structurales des sophorolipides est habituellement effectuée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) du mélange obtenu, équipée d'un détecteur par exemple réfractométrique. Le taux d'acétylation des forme acides est en règle générale déterminé par chromatographie liquide haute performance, équipée d'un détecteur par exemple à diffusion de lumière. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre l'invention La souche utilisée est la levure Candida bombicola CBS 6009 qui est conservée par des repiquages mensuels sur un milieu gélosé de composition suivante Peptone pepsique (Biothione BIOMERIEUX) 1 0 g/l Extrait de levure 5 g/l Ester éthylique de colza 15 g/l Gélose 30 g/l La propagation de la souche est effectuée sur le milieu de préculture suivant Glucose 100 g/I (NH4)2SO4 4 g/l KH2PO4 1 g/l MgSO4,7H2O 0,5 g/l Liqueur séchée de macération de maïs 5 g/l Ester éthylique de colza 2 g/l Pour la préparation de ce milieu de préculture, on stérilise ensemble à 1200C pendant 25 minutes le glucose, L'ester éthylique de colza, MgSO4, 7H O dans la moitié de l'eau 4' 2 nécessaire, tandis que KH2PO4, (NH4)2SO4 et la liqueur de macération de maïs, sont stérilisés, avec le même barême de stérilisation, dans l'autre moitié d'eau. Le milieu de préculture est reconstitué, après refroidissement à la température ambiante, par mélange des deux solutions. On ensemence une fiole d'Erlenmeyer de 200 ml de capacité contenant 30 ml de milieu de préculture. Après 40 heures d'incubation sur table d'agitation, à la température de 25"C, on transfère la totalité du milieu contenu dans la fiole d'Erlenmeyer dans une fiole de Fernbach d'une capacité de 2 litres contenant 200 ml d'un milieu dont la composition est identique à celle de la fiole d'Erlenmeyer. Cette deuxième étape de préculture est accomplie comme la première étape sous agitation, à la température de 25OC. La fermentation de production est effectuée avec le milieu de culture dans un réacteur de quatre litres de capacité contenant un volume réactionnel de deux litres. L'agitation du milieu est provoquée par une turbine RAYNERI dont la vitesse de rotation est fixée à 1000 tours/min. L'aération est de 0,5 VVM d'air sous pression atmosphérique. Le milieu de culture a la même composition que celui employé pour la chaîne de préculture à l'exception de l'ester éthylique de colza qui est ajouté en continu, dès l'ensemencement, à une vitesse d'alimentation de 1,0 gramme par heure et par litre de milieu. L'ensemencement du réacteur est effectué avec la totalité du contenu de la fiole de Fernbach. Après autoacidification de la culture, le pH du milieu est maintenu constant à la valeur de 3,5 par une addition de soude 4 N contrôlée avec une électrovanne asservie à un pHmètre. En cours de fermentation, on procède à 4 additions de glucose sous forme solide, chacune d'elles étant égale à 50 g par litre de milieu. Ces additions sont effectuées après respectivement 24, 48, 72 et 96 heures de culture. On arrête la culture après 120 heures. On élimine les cellules de la souche de levure par centrifugation et on lyophilyse la phase liquide. On récupère ainsi par litre de milieu, 162 g d'un solide renfermant 146 g de sophorolipides. L'analyse des formes structurales des sophorolipides est effectuée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec une colonne Hypersil C-18 de 15 cm de longueur (Interchim, Montluçon, France) et un détecteur réfractométrique. Le solvant utilisé pour l'élution est un mélange d'acétonitrile et d'eau dans le rapport 70/30 (v/v) à un débit de 0,7 ml/min. Les formes acides des sophorides acétylées ou non, sont éluées en tête, suivies par les formes lactones. Pour déterminer le taux d'acétylation des formes acides, on utilise un chromatographe en phase liquide équipée d'une colonne identique à la précédente et un détecteur à diffusion de lumière. La résolution des formes acides est obtenue avec un gradient d'élution acétonitrile/eau. Le mélange éluant contient 98 % d'eau au début de l'analyse. L'intervention du gradient linéaire amène la composition de l'éluant à 30 % d'eau après 48 minutes. La composition du mélange éluant est ensuite maintenue constante pendant 14 minutes supplémentaires.On détermine ainsi que le mélange de sophorolipides est constitué par 110 g/l de formes acides (soit 75,3 % des sophorolipides totaux) et que, parmi celles-ci, les formes acétylées acides représentent 95 g par litre de milieu de culture initial (soit 86 % des acides totaux). EXEMPLE 2 comparatif On répète l'exemple 1 en augmentant la quantité d'ester éthylique de colza mise en oeuvre dans les deux étapes de la préculture. Celle-ci est portée de 2 g/l à 10 g/I. Dans ces conditions on obtient 170 g/l (quantité rapportée au volume initial) d'un solide renfermant 156 g/l de sophorolipides. Les formes acides en représentent 48 g/l (30,7 % des sophorolipides totaux) et parmi celles-ci les formes acétylées sont de 39 g/l (81,2 % des acides totaux). EXEMPLE 3 On répète l'exemple 1 en remplaçant l'ester éthylique de colza utilisé dans les deux étapes de la préculture, par l'ester méthylique de tournesol. On obtient à la fin de l'essai 158 g/l d'un solide renfermant 142 g/l de sophorolipides. La quantité de sophorolipides sous forme acide est de 106 g/l (soit 74,6 % des sophorolipides) dont 92 g/l d'acides acétylés (soit 95 % des formes acides). EXEMPLE 4 (comparatif de l'exemple 3) On répète l'exemple 3 en augmentant dans les deux étapes de la préculture la concentration de l'ester méthylique de tournesol de 2 g/l à 8 g/l. On obtient ainsi 160 g/l d'un solide renfermant 145 g/l de sophorolipides. Les formes acides représentent 37 g/I (soit 25% des sophorolipides totaux) dont 19 g/l de formes acétylées (soit 51% des formes acides). EXEMPLE 5 On répète le protocole de fermentation décrit dans l'exemple 1 en remplaçant l'ester éthylique de colza par l'huile de colza. En fin de fermentation, on centrifuge le moût et on élimine les cellules de levure. On neutralise jusqu'à pH 7,0 le moût clarifié avec une solution de soude 4 N et on évapore à sec sous pression réduite dans un Rotavapor. On récupère de cette manière 105 g/l de résidu sec contenant 85 g/I de sophorolipides. Parmi ceux-ci, on dose 68 g/l de formes acides (soit 80 % des sophorolipides totaux) dont 54 g/I sous formes acétylées (soit 79 % des formes acides). EXEMPLE 6 On répète l'exemple 1, en remplaçant l'ester éthylique de colza par une coupe de nalcanes de longueur de chaînes comprises entre 12 et 18 atomes de carbone. On récupère à la fin de l'essai 70 g/l de produit contenant 65 g/l de sophorolipides. Parmi ceux-ci on dose 52 g/l de formes acides (soit 80 % des sophorolipides totaux) dont 37 g/l de formes acétylées (soit 71 % des formes acides) REVENDICATIONS 1. Procédé de production en fedbatch d'une composition de sophorolipides comprenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés, dans lequel on met en culture au moins une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu de culture comprenant une source d'azote et éventuellement du sucre dans des conditions appropriées telles que l'on produit ladite souche et l'on soumet ladite souche cultivée dans une zone de réaction à une alimentation en sucre et à une alimentation en au moins un substrat approprié dans des conditions d'aération, de température, de pH, adéquates et on réalise au moins une fois la séquence suivante a.On effectue en continu l'alimentation de la souche en ledit substrat à un débit d'alimentation dans la zone réactionnelle comprise entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial et pendant une durée d'alimentation tels que la concentration résiduelle en ledit substrat dans la zone réactionnelle soit maintenue à une valeur au plus égale à 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant ladite durée d'alimentation ; et b.On récupère la composition de sophorolipides produits le procédé étant caractérisé en ce que, avant l'étape de mise en culture, on effectue au moins une étape de préculture de la souche dans des conditions de préculture appropriées dans un milieu de préculture contenant - au moins une source d'azote, et - au moins une source de carbone choisie dans le groupe comprenant au moins un hydrate de carbone, au moins un ester d'acide gras saturé on insaturé de 10 à 24 atomes de carbone, au moins un hydrocarbure aliphatique saturé ou insaturé de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un alcool aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un acide aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone et leurs mélanges ; la proportion d'hydrate de carbone étant au plus égale à 20 % par rapport au milieu de préculture et la proportion pondérale d'ester, d'hydrocarbure, d'alcool et/ou d'acide étant inférieure à 0,5 %, et on ensemence le milieu de culture avec le milieu de préculture. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la préculture est effectuée à une température de 18 à 40"C, de préférence de 20 à 30"C. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la durée de préculture est 12 à 72 heures et de préférence de 24 à 36 heures. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel l'ester d'acide gras, I'hydrocarbure aliphatique, l'alcool aliphatique, L'acide aliphatique est dans une proportion pondérale de 0,1 à 0,3 % par rapport au milieu de préculture et l'hydrate de carbone dans une proportion pondérale de 2 à 12 % par rapport au milieu de préculture. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel l'ester d'acide gras, I'hydrocarbure aliphatique, L'alcool aliphatique, L'acide aliphatique renferment 16 à 18 atomes de carbone. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel l'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape de mise en culture comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides, la neutralisation à un pH voisin de la neutralité du moût et l'élimination de l'eau par chauffage et sous pression réduite. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel l'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape de mise en culture comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides et l'élimination de l'eau sous pression réduite. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel le milieu de préculture comprend un hydrate de carbone et au moins une autre source de carbone choisie dans le groupe des esters, des hydrocarbures, des alcools et des acides de la revendication 1. 9. Composition de sophorolipides contenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés, obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8. 1 0. Composition selon la revendication 9 dans laquelle la proportion d'acides acétylés est supérieure à 55 % et de préférence supérieure à 60 %.