Brevet FR2694765A1 — publié le 19940218

La présente invention est relative à une séquence d'acide nucléique hybride comportant une séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal et notamment, le récepteur ssl-adrénergique, à des mammifères transgéniques non-humains possèdant une telle séquence, ainsi qutà une méthode de production desdits mammifères transgéniques non-humains (rongeurs, notamment) exprimant ledit récepteur humain. La présente invention est également relative aux cellules et aux tissus de mammifères transgéJniques non-humains, dans lesquels l'expression dudit récepteur humain est contrôlée, ainsi qu'à un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité cardiaque et à une méthode d'évaluation de médicaments utiles dans les troubles du rythme. Les récepteurs membranaires et notamment les récepteurs -adrénergiques du myocarde humain jouent un râle important dans les effets inotropes et chronotropes des hormones circulantes. La présence de noradrénaline au niveau des récepteurs ss-adrénergiques (ss-RA) postsynaptiques entraîne une modification du rythme et de la force des contractions cardiaques, modulée par le système transmembranaire ss-RA-adénylate cyclase, qui est sous le contrôle des protéines G. En augmentant le taux intracellulaire d'AMP cyclique, les protéines G de stimulation traduisent les résultats du stimulus agoniste en une réponse physiologique, telle que l'activation d'une kinase et la phosphorylation subséquente des canaux ioniques. Le courant Ca2 f sensible au voltage joue un rôle central dans la régulation de l'excitabilité cardiaque et de la contractilité. La stimulation des récepteurs ss-adrénergiques myocardiques (ventriculaires et auriculaires) augmente la contractilité cardiaque et modifie le rythme cardiaque. Deux sous-types distincts de récepteurs adrénergiques ss (ss1-RA et 52-RA) sont impliqués dans la réponse biologique aux catécholamines et sont impliqués dans l'insuffisance chronique cardiaque (ICC), chez 1 'Homme. L'ICC, qui est l'une des maladies graves les plus fréquemment rencontrées dans les sociétés occidentales, a comme étiologie majeure, l'hypertension artérielle et/ou l'insuffisance coronarienne ; il s'agit d'une maladie mortelle (survie à 5 ans), soit par défaillance mécanique, soit du fait des troubles du rythme. Elle fait généralement suite à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG), compensée. Le traitement actuel, lorsqu'il ne peut être étiologique, ce qui est rare, est palliatif et combine inotropes positifs, vasodilatateurs et anti-arythmiques. Il est maintenant bien admis que les troubles du rythme, en particulier, sont une des conséquences de l'hypertrophie cardiaque elle-même, et que, pîiis précisément, ils sont dûs au réarrangement des protéines membranaires et de la matrice extra-cellulaire, qui caractérise le cardiocyte hypertrophié. Ces troubles sont indépendants de l'étiologie et sont distincts des arythmies d'origine ischémique. L'arythmogénicité du coeur hypertrophié apparaît comme l'un des problèmes majeurs de la cardiologie contemporaine. La complexité des relations entre les différents mécanismes arythmogènes et l'absence de modèle animal rendent les améliorations du diagnostic et de la thérapie difficiles ; en effet les animaux transgéniques décrits dans la littérature, concernant le domaine cardiovasculaire, ne sont pas adaptés à l'étude du rythme et de la contractilité cardiaque et à l'établissement d'une relation fonction physiologique/modification de l'expres- sion génique de différents paramètres, notamment in vivo [L.J. FIELD, (Science, 1988, 239, 1029-1032)]. Afin de résoudre ce problème, les Inventeurs ont cherché à mettre au point un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité cardiaque ainsi qu'un modèle de physiologie à l'envers", bien adapté à l'étude du rythme et de la contractilité cardiaque et à l'établissement d'une relation fonction physiologiquemodification de llexpression génique de différents paramètres impliqués. La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire humain, impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend un fragment du gène codant pour un récepteur ss-adrénergique humain, de préférence le récepteur l-adrénergique humain et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes, apte à contrôler l'expression dudit récepteur ss-adréner- gique humain, en particulier dans le tissu auriculaire d'animaux transgéniques non-humains. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence hybride comprend au moins la séquence codant pour ledit récepteur Dl-adrénergique humain et au moins le promoteur humain du facteur atrial natriurétique (FAN) ou un fragment de celui-ci. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend les régions régulatrices et un fragment du promoteur humain du facteur atrial na triurétique (FAN), d'environ 0,56 kb, apte à contrôler l'expression dudit récepteur humain, dans un tissu auriculaire non-humain. Un tel fragment de 0,56 kb, est notamment un fragment BamHI-XbaI. Conformément à cette modalité, ladite séquence hybride comprend le fragment de 0,6 kb du promoteur hu main du facteur atrial natriurétique et un fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène ssl-RA, laquelle séquence hybride présente une longueur totale d'environ 4 kb. Le fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène ssl-RA est avantageusement un fragment BstEII-HindIII. Conformément à cette modalité, ladite séquence comprend, en outre, un fragment de jonction XbaI-BstEII d'environ 45pb entre le fragment correspondant au promoteur humain du facteur atrial natriurétique et le fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène pl-RA. Au sens de la présente invention, ladite séquence hybride englobe également ses séquences complémentaires. La présente invention a également pour objet des cardiocytes auriculaires de mammifère non-humain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acide nucléique hybride telle que définie ci-dessus, incluant la séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, lesquels cardiocytes non-humains expriment ledit récepteur membranaire humain. La présente invention a également pour objet des fragments de tissu auriculaire de mammifère non-humain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acide nucléique hybride telle que définie ci-dessus, incluant la séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, lesquels fragments de tissu auriculaire non-humain expriment ledit récepteur membranaire humain. La présente invention a également pour objet des mammifères transgéniques non-humains, notamment des rongeurs, caractérisés en ce qu'ils possèdent, dans leurs cellules germinales et somatiques, une séquence hybride telle que définie ci-dessus (transgène), c'est-à-dire incluant un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes et un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal humain et en ce qu'ils expriment ledit récepteur membranaire humain dans leurs oreillettes. Conformément à l'invention, de tels animaux transgéniques sont susceptibles d'être obtenus par une méthode de production de mammifères non-humains transgéniques qui comprend l'introduction d'au-moins une copie de la séquence nucléique hybride telle que définie cidessus, dans les cellules d'un embryon de mammifère nonhumain à un stade précoce, de préférence dans l'un des pronuclel de l'oeuf fertilisé (obtention d'un transgène). La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité, ainsi que des arythmies cardiaques physiologiques de la sénescence, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cardiocytes, des fragments de tissu auriculaire ou des animaux non-humains transgéniques, conformes à l'invention. La présente invention a, en outre, pour objet une méthode d'évaluation des effets antiarythmiques ou proarythmiques de substances chimiques et notamment de médicaments anti-arythmiques, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) la mise en contact de cardiocytes, de fragments tissulaires auriculaires de mammifères non-humains ou d'animaux transgéniques non-humains, porteurs de séquences d'acides nucléiques (transgènes) telles que définies ci-dessus et exprimant un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, conformément à la présente invention, avec un produit à tester et (2) l'évaluation des modifications du rythme cardiaque et/ou de la contractilité, liée à exaction de ladite substance. La présente invention a, de plus pour objet une méthode de production d'animaux transgéniques non-humains, exprimant au moins un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) l'introduction d'au moins une copie de la séquence hybride ou transgène tels que définis ci-dessus, dans les cellules d'un embryon de mammifère non-humain à un stade précoce, de préférence dans l'un des pronuclel de l'oeuf fertilisé, et (2) la détection d'au moins une copie dudit transgène chez les animaux transgéniques obtenus, par hy hybridation avec une séquence complémentaire dudit transgène. En variante, ladite détection est réalisée après amplification à l'aide d'amorces choisies de telle sorte qu'elles permettent uniquement l'amplification des transgènes avec l'amorce sens dans la région du promoteur du FAN (5' AGGCAGAGAGGGGCTGTGACAAGCCC 3') et l'amorce anti-sens (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGCTGTCC 3'), dans la région codant pour le récepteur Bl-adrénergique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. De manière inattendue, les séquences hybrides conformes à l'invention, comprenant un promoteur d'un gène exprimé spécifiquement dans les oreillettes, notamment le promoteur humain FAN et au moins un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire humain, impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal permet de cibler l'expression du récepteur humain transgénique obtenu, entraînant notamment, en ce qui concerne les récepteurs ssl-adrénergiques humains, une surexpression d'un facteur de l'ordre de 5-10 des récepteurs ssl-adr- énergiques humains totaux dans les oreillettes de souris transgéniques ; les récepteurs humains ainsi exprimés sont, en outre, fonctionnels et rendent de tels animaux transgéniques, particulièrement intéressants, comme modèles d'étude du rythme et de la contractilité cardiaques et à l'établissement d'une relation fonction physiologique/modification de l'expression génique de différents paramètres impliqués dans l'ICC. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Construction du gène chimérique. Un fragment BamHI-BstEII, correspondant à la partie 5' du gène du récepteur ssl-adrénergique humain,(Frielle T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 7920-7924) cloné dans un plasmide pUC18 au niveau des sites BamHI-HindIII, est échangé avec un fragment BamHI XbaI du promoteur FAN humain, de 0,56 kb ; les deux parties sont liées à l'aide d'un fragment oligonucléotidique qui reconstitue le site XbaI, le codon d'initiation et la région codante 5' du gène du récepteur ssl-adrénergique (CTAGATGGGCGCGGGGGTGCTCGTCCT GGGCGCCTCCGAGCCCG). Le gène hybride obtenu, est sous-cloné dans le plasmide pUC18 le fragment d'ADN hybride de 4 kb BamHI-HindIII est isolé et purifié par électroélution, pour réaliser les microinjections. On peut également utilisé tout autre fragment du promoteur du FAN ou le promoteur entier (+ de 3 kb), pour réaliser le gène chimèrique, conforme à l'invention. EXEMPLE 2 : Production de souris transgéniques. Elle est réalisée par microinjection de 1'ADN tel que préparé à l'exemple 1, dans des pronuclei d'oeufs fertilisés de souris femelles (génération F1) superovulées (C57Bt/6 X DBA) et la réimplantation chez des souris femelles pseudogestantes (B 6X CBA), est réalisée comme décrit dans HOGAN B.L.M. et al. (Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY). Les animaux fondateurs transgéniques sont détectés par la méthode de Southern (hybridation avec une séquence complémentaire du transgène), après extraction de I'ADN à partir de biopsies de queues, digestion avec des enzymes de restriction appropriées. Des lignées transgéniques sont produites par croisement entre des souris transgéniques issues d'un même fondateur, puis les animaux transgéniques porteurs du transgène sont détectés, après amplification par PCR de 1'ADN extrait, comme précisé ci-dessus. Les amorces sont sélectionnées de telle sorte qu'elles permettent uniquement l'amplification des transgènes conformes à l'invention : amorce sens dans la région du promoteur du FAN (5' AGGCAGAGAGGGGCTGTGAC AAGCCC 3') et amorce anti-sens (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGC TGTCC 3'), dans la région codant pour le récepteur 1- adrénergique. Les conditions de la PCR sont les suivantes dénaturation : 1 min 30 à 93 C hybridation : 2 min à 55 C élongation : 2 min à 72 C pendant 30 cycles avec 2,5 U de Taq polymérase dans un tampon standard additionné de formamide 5 % et de DMSO 10 W. - Résultats a) Le gène de fusion (transgène FAN-B1) contient les régions régulatrices et le promoteur du gène du FAN humain (0,56 kb), lié à la région codante et à la région 3' non-codante du gène du récepteur l-adréner- gique (figure la : transgène FAN1). Quatre fondateurs transgéniques, porteurs du transgène FAN-ss1 ont été détectés. Deux de tes fondateurs (ne15 et n 42), présentant des copies multiples dudit trans gène sont révélés par la méthode de Southern ; les deux autres fondateurs (ne17 et n'19), porteurs d'une simple-copie du transgène FAN-l sont détectés, après criblage PCR (figure lb). Cette figure lb représente le résultat de l'amplification par PCR de l'ADN des 4 lignées (15, 17,19 et 42), la détermination du nombre de copies de transgènes dans la descendance de chaque lignée et le contrôle de 11 expression de 1'ARNm dans le myocarde par RT-PCR lARN total (0,5 Wg) des lignées 15, 19 et 42 est traité à l'ADNase, incubé avec la transcriptase inverse et amplifié en présence d'-amorces spécifiques (du transgène ou de l'a-actine). Le fondateur n"17 ne transmet pas le transgène à sa descendance ; en conséquence des animaux transgéniques homozygotes sont dérivés à partir des trois autres lignées transgéniques fondatrices. Le nombre de copies de transgènes FAN-1 varie de 2 à 20. Les sites d'intégration des transgènes sont différents pour les trois lignées fondatrices (profils de restriction différents, par la méthode de Southern). Après six mois, les souris transgéniques homozygotes ne présentent pas un phénotype de mort prématurée ou de n'importe quel autre comportement anormal. b) Analvse de 1'ARN : spécificité tissulaire Pour analyser l'expression du transgène et la spécificité tissulaire du promoteur FAN, 1'ARN total est préparé selon la méthode de LIVELLI et al. (J. Biol. Chem., 1982, 257, 6782), à partir de plusieurs tissus (coeur, foie, cerveau, rein et poumon) de souris transgéniques hétérozygotes et homozygotes âgées de 4 mois et de souris témoins. Les échantillons d'ARN (0,5 Ag) sont soumis à une PCR inverse, utilisant des amorces oligodT, pour générer de l'ADNc en présence de transcriptase inverse (VERES G. et al., Science, 1987, 237, 415-417). Les amorces utilisées au cours de la PCR sont choisies de manière à amplifier seulement l'ARNm transgénique mais sont différentes de celles utilisées pour le criblage transgénique : brin sens (5' GGGACAGACGTAGGCCAA GAGAGGG 3') et brin anti-sens (5' GCACAGCACGTCCACTGA GGTCCA 3'). Les conditions de la PCR sont celles décrites précédemment, dans un tampon comprenant Tris-HCl pH 8,4 10 mM, MgC12 2,5 mM, Tween 20 0,025 %, NP40 0,25 %, formamide 5 % et DMSO 10 %. Pour analyser la surexpression auriculaire spécifique du transgène, 1'ARN est préparé à partir d'oreillettes, selon CIVELLI et al., cité, et la détection est réalisée par PCR inverse comme précisé ci-dessus. Les taux d'expression des transgènes sont déterminés pour les trois lignées et la figure lb illustre le fait que le taux d'expression n'est pas corrélé avec le nombre de copies. La lignée 15, qui a le plus grand nombre de copies transgéniques, ne donne pas un signal supérieur à la lignée 19, qui présente une seule copie du transgène. Ce phénomène est souvent observé chez les animaux transgéniques et est supposé être le résultat d'une modulation, induite par les régions adjacentes au site d'intégration. La lignée transgénique 42 est celle qui présente le meilleur taux d'expression d'ARNm dans le myocarde. La présence d'ARNm transgénique a été recherchée dans différents tissus, pour vérifier la spécificité cardiaque du promoteur FAN (figure 2) ; le transgène n'est détecté que dans le myocarde des souris transgéniques. La figure 2 confirme cette spécificité. On sait que le FAN est exprimé à des taux relativement bas dans le rein et dans certaines parties du cerveau (VESELY D.L. et al., Peptides, 1992, 13/1, 165-170). Cependant, même à 20 Ag d'ARN, le transgène FAN-l n'est pas détecté dans le rein de souris transgéniques bien que la limite de détection soit inférieure à 0,1 Wg d'ARN dans le coeur. Ceci suggère que le taux d'expression chez l'animal transgénique est au moins 50 fois supérieur dans le coeur que dans le rein. Ce rapport est en accord avec l'expression de FAN endogène dans les tissus non-cardiaques (inférieur à 1 t) (VESELY et al., cité). Le taux d'expression du transgène est également estimé séparément sur les préparations d'ARN d'oreillette et de ventricule (figure 3). Le transgène se révèle être spécifiquement exprimé dans les oreillettes. Cette figure 3 illustre la spécificité de l'expression auriculaire du transgène. L'ARN total des oreillettes et des ventricules a été soumis, séparément à une RT-PCR, avec des amorces spécifiques au transgène : A : oreillettes ; V : ventricules ; T : coeur total. La quantité relative d'ARN, dans chaque échantillon, est comparée, en utilisant un témoin interne RT-PCR, lla-ac- tine. c) Détermination de la surexoression des récenteurs : La quantification relative est réalisée par PCR inverse (RT-PCR), utilisant des amorces ssl-AR correspondant à des zones conservées d'espèces, de manière à amplifier 1'ADNc ssl-AR total (humain et murin) (amorce sens 5' TCGTGTGCACCGTGTGGGCC 3' et amorce anti-sens 5' AGGAAACGGCGCTCGCAGCTGTCG 3'). Une discrimination plus poussée des séquences amplifiées humaines et murines est réalisée par séquen çage direct après la PCR (CALDERONE A. et al., Circulation Res., 1991, 69/2, 333-343). Le taux relatif d'expression de l'ARNm de 51- AR chez les souris transgéniques, compare à celui de sou ris témoins non-transgéniques, est estimé par amplification PCR inverse des régions B1 et a-actine (figure 4). Le profil PCR montre que l'expression de I'~n~RNm m de 51-AR est plus important dans les oreillettes transgéniques que dans les oreillettes normales et correspond à un produit d'origine humaine comme le confirme le séquençage direct après la PCR. Dans la figure 4, la colonne 1 correspond à une séquence d'a-actine amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes transgéniques ; la colonne 2 correspond à la séquence amplifiée d'a-actine à partir d'ARN d'oreillette non transgénique ; la colonne 3 correspond à la séquence de 1-AR amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes transgéniques et la colonne 4 correspond à la séquence de ssl-AR amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes témoins non transgéniques. Les poids moléculaires des fragments sont respectivement de 236 pb (actine) et de 264 pb (il). d) Analvse Drotéicue - Quantification des récepteurs transgéniques dans des tests de liaison sur des préparations membranaires La détection de la surexpression de protéine 51-AR humaine est réalisée à l'aide d'un test de liaison sur des homogénats auriculaires et ventriculaires, avec un ligand spécifique radiomarqué Ç125I]-cyanopindolol (ICYP), à une concentration proche du KD B1 (50 pM). Le radioligand est incubé pendant 90 min à température ambiante avec des préparations membranaires et -les échantillons sont filtrés à travers des filtres Whatman GF/F, lavés trois fois avec un tampon froid (Tris-HCl 12,5 mM pH 7,5). Ensuite, les filtres sont comptés dans un compteur 7. Dans le test de liaison, sur des membranes auriculaires, l'une des expériences correspond à un mélange oreillette droite et oreillette gauche de trois souris. Les valeurs correspondent aux moyennes des trois expé riences réalisées en double. La liaison non-spécifique est déterminée avec du (+) propranolol 1 WM et la spécificité de la liaison au récepteur Bl-adrénergique est déterminée en utilisant des ligands sélectifs 1 (CGP 20712A) ou ss2 (ICI 118551) respectivement à 500 et 20 nM, une concentration qui entraîne un blocage total des sites ssl ou 52. Au niveau de 1'ARN, on a montré (voir c)) que le transgène FAN-B1 est surexprimé, en comparaison du récepteur 1 murin. Ce résultat indique que le promoteur est fonctionnel mais ne prouve pas que les étapes post-transcriptionnelles et post-traductionnelles sont réalisées correctement. La détection de récepteurs fonctionnels est étudiée à l'aise du test de liaison tel que défini cidessus, qui permet la détermination du nombre de récepteurs et du pourcentage de récepteurs dans un état de forte affinité, couplés à la Gs (DE LEAN A. et al., J. Biol., Chem., 1980, 255, 7108-7117). La protéine humaine codée par ce trans gène FAN-B1 est détectée. Le test de liaison de 1'ICYP tel que défini ci-dessus sur des préparations membranaires permet la détermination du nombre de récepteurs ssl-adrénergiques (120 + 30 fmol/mg de protéine), qui correspond à l'augmentation de l'ordre de 5-10 fois celle des récepteurs pl-adrénerglques dans les cardiocytes auriculaires des souris transgéniques, par rapport à des souris témoins.(figure 5). Cette figure 5 illustre la liaison spécifique de l'ICYP sur des préparations membranaires de cellules auriculaires et ventriculaires. Comme spécifié ci-dessus, 1'ICYP est utilisé à une concentration proche du KD. Aucune augmentation du nombre des récepteurs BT;-adrénergiques n'est trouvée dans les ventricul, ceci confirmant à nouveau l'expression auriculaire spécifique du transgène. Ces résultats ont été obtenus lorsqu'on utilise des préparations membranaires selon CALDERONE et al., cité, mais ne sont pas aussi tranchés, lorsque d'autres procédures sont utilisées. e) Essais de liaison sur des couses de coeur intact : Pour visualiser le taux élevé de récepteurs l-adrénergiques dans les oreillettes de- souris transgéniques par rapport aux souris normales, des expériences de liaison sont réalisées sur des coupes de coeur. Les coeurs sont congelés à -80'C, coupés avec un cryotome (épaisseur : 20 Wm) et fixés sur une coupe de microscope avec de la gélatine à -20'C et stockés à -80'C jusqu'à leur utilisation. Les essais de liaison sont réalisés avec de 1'ICYP 80 pM pendant 90 min à température ambiante dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MgC12 0,5 mM et acide ascorbique 0,05 %. Les liaisons non-spécifiques sont déterminées comme précisé ci-dessus. Après incubation, les coupes de coeur sont lavées trois fois pendant 15 min à 37'C avec un tampon Tris 40 mM, pH 7,6. L'ICYP lié est visualisé après autoradiographie pendant 9 jours avec un Hyperfilms Amersham. L'analyse quantitative est réalisée par densitométrie à l'aide d'un programme d'analyse statistique et les valeurs obtenues correspondent aux moyennes obtenues à partir de 10 coupes différentes. La surexpression auriculaire du récepteur transgénique est confirmée par cette méthode (figure 6) et montre une augmentation d'un facteur 3,5 du nombre de récepteurs Bl-adrénergiques dans les oreillettes transgéniques, alors qu'il n'y a pas d'augmentation significa tive dans les ventricules (figure 6B). La figure 6 illustre le taux d'expression élevé du transgène dans le myocarde de souris, visualisé par la liaison spécifique de 1'ICYP sur des sections de coeur ; figure 6A : T représente des coupes de coeurs de souris transgéniques et N représente des coupes de coeurs de souris normales ; la liaison de 1'ICYP total est représenté en T1 et N1 et les liaisons non spécifiques sont représentées en T2 et N2 ; figure 6B : quantification par ordinateur, après lecture des films. f) Etude de la fonctionnalité des récenteurs ssl-adréneraiaues transaéniaues Pour vérifier si les récepteurs 131-adréner- giques sont effectivement fonctionnels, des tests de compétition de liaison de 1'ICYP sont réalisés avec l'isoprotérénol, agoniste sélectif vis-à-vis des récepteurs B. Les courbes d'inhibition compétitive de l'ICYP sont réalisées, en utilisant des concentrations en iso protérénol comprises entre 10-10 M et 10 4 M, en présence de 20 nM d'ICI 118551, une concentration qui entraîne un blocage total des sites 2 et peuvent s'interpréter par l'existence de deux classes de récepteurs (récepteurs à forte affinité et récepteurs à faible affinité). Les conditions de liaison sont celles décrites ci-dessus, en présence d'un tampon de liaison complémenté avec de l'acide ascorbique 1 mM. Les courbes de compétition obtenues sont illustrées à la figure 7. L'analyse informatique desdites courbes révèle deux types de sites Bl-adrénergiques pour l'isoprotérénol : sites à forte affinité, avec un KH de 5nM et sites à faible affinité, avec un KL de 400 nM (voir tableau I, ci-après). Lorsque les résultats sont exprimés en pourcentage de l'inhibition de la liaison, les sites à forte affinité correspondent à 30 % des sites totaux pour les récepteurs transgéniques contre 50 % pour les récepteurs normaux. Lorsque les résultats sont exprimés en fmol/mg de protéine, les sites à forte affinité sont augmentés d'un facteur 3 pour les récepteurs transgéniques par rapport aux récepteurs normaux. TABLEAU I Sites 5-RA Sites de haute affinité (KH) totaux fmol/mg W fmol/mg Animaux transgéniques oreillettes 120 + 30 30 + 5 35 + 5 - ventricules 6,8 Animaux non transgéniques - oreillettes 18 + 6 50 + 10 12 + 3 ventricules 6 Ces résultats indiquent que les récepteurs transgéniques peuvent se coupler aux protéines G mais que le taux de récepteurs couplés à la protéine G peut dépendre de la quantité de protéines G libres capable de réagir avec les récepteurs stimulés par l'agoniste. Les récepteurs sont, en outre, fonctionnels. Leur surexpression entraîne une sensibilité accrue du tissu auriculaire aux catécholamines et représente un avantage supplémentaire dans l'utilisation d'animaux porteurs de tels récepteurs, comme modèles de l'arythmie cardiaque. En effet, la liaison d'un agoniste aux récepteurs '31-adrénergiques, dans les cardiocytes, accroît le taux intracellulaire en AMPc, activant la protéine kinase dépendant de l'AMPc et phosphorylant un peptide associé aux canaux calciques de type L. L'activation des canaux calciques augmente le courant des ions Ca2+ qui initialisent et propagent les potentiels d'action. La stimulation des récepteurs ssl-adrénergiques auriculaires accélère la conduction nodale atrioventriculaire. Dans la mesure où la fonction nodale atrioventriculaire joue un rôle crucial dans un certain nombre d'arythmies, comme précisé ci-dessus, ces souris transgéniques surexprimant les récepteurs '31-adrénergiques présentent un intérêt particulier notamment pour l'étude des évènements moléculaires en cascade associés à l'arythmie auriculaire et plus particulièrement pour le criblage et la sélection de médicaments anti-arythmiques in vivo. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Séquence d'acide nucléique hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire humain, impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal humain et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes. 2') Séquence hybride selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment du gène codant pour un récepteur '3-adrénergique humain et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes, apte à contrôler l'expression dudit récepteur '3-adrénergique humain. 3') Séquence hybride selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence codant pour le récepteur Bl-adrénergique humain. 4') Séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence codante du récepteur 51- adrénergique humain et au moins le promoteur humain du facteur atrial natriurétique (FAN) ou un fragment de celui-ci 5') Séquence hybride selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite séquence comprend les régions régulatrices et un fragment du promoteur humain du facteur atrial natriurétique (FAN), d'environ 0,56 kb, apte à contrôler l'expression dudit récepteur. 6') Séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment de 0,56 kb du promoteur humain du facteur atrial natriurétique et un fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène 1-RA, laquelle séquence hybride présente une longueur totale d'environ 4 kb. 7') Séquence hybride selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un fragment de jonction, d'environ 45pb entre le fragment cor respondant au promoteur humain du facteur atrial natriurétique et le fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène '31-RA. 8') Cardiocytes auriculaires de mammifère nonhumain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lesquels cardiocytes non-humains expriment ledit récepteur membranaire humain. 9 ) Fragments de tissu auriculaire de mammifère non-humain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acide nucléique hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lesquels fragments de tissu auriculaire non-humain expriment ledit récepteur membranaire humain. 10-) Mammifères non-humains transgéniques, caractérisées en ce qu'ils possèdent, dans leurs cellules germinales et somatiques, une séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 (transgène) et en ce qu'ils expriment ledit récepteur membranaire humain. 11') Animaux transgéniques selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par une méthode de production de mammifères transgéniques non-humains, qui comprend l'introduction d'au moins une copie de la séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans les cellules d'un embryon de mammifère non-humain à un stade précoce. 12") Animaux transgéniques selon la revendication 11, caractérisés en ce que ladite introduction est réalisée de préférence dans l'un des pronuclei de l'oeuf fertilisé. 13') Modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité cardiaque, ainsi que des arythmies cardiaques physiologiques de la sénescence, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cardiocytes, des frag ments de tissu auriculaire ou des animaux non-humains transgéniques selon l'une quelconque des revendications 8 à 12. 14') Méthode d'évaluation des effets antiarythmiques ou proarythmiques de substances chimiques et notamment de médicaments anti-arythmiques, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) la mise en contact de cardiocytes, de fragments tissulaires auriculaires ou d'animaux transgéniques non-humains, porteurs de séquence d'acide nucléique hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et exprimant un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, avec un produit à tester et (2) l'évaluation des modifications du rythme cardiaque et/ou de la contractilité, liée à l'action de ladite substance. 154) Méthode de production d'animaux transgéniques non-humains, exprimant au moins un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) l'introduction d'au moins une copie de la séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans les cellules d'un embryon de mammifère non-humain à un stade précoce, de préférence dans l'un des pronuclei de l'oeuf fertilisé, et (2) la détection d'au moins une copie du transgène chez les animaux transgéniques obtenus, par hybridation avec une séquence complémentaire dudit transgène. 16') Méthode de production d'animaux transgéniques selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite détection est réalisée après amplification à l'aide d'amorces choisies de telle sorte qu'elles permettent uniquement l'amplification des transgènes avec l'amorce sens dans la région du promoteur du FAN (5' AGGCAGAGAGGGGCTGTGACAAGCCC 3') et l'amorce antisens (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGCTGTCC 3'), dans la région codant pour le récepteur pl-adrénergique.