Brevet FR2692268A1 — publié le 19931217

NOUVEAUX POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEVEUR NMDA. ACIDES NUCLEIOUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISAITONS La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et le matériel génétique permettant leur expression. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur NMDA. L'acide glutamique (glutamate) est un acide aminé dit excitateur, dont l'activité se manifeste par son interaction avec des récepteurs spécifiques. Parmi ces récepteurs, un sous-type, désigné récepteurs NMDA (N-méthyl-D-aspartate) semble impliqué, dans le système nerveux central des mammifères, dans de nombreux processus tels que la plasticité neuronale, la potentiation à long terme, ainsi que la mort neuronale ou certains désordres dégénératifs. Des études pharmacologiques et de biologie moléculaire ont recemment permis la mise en évidence et le clonage de récepteurs NMDA de rat, le récepteur NMDAR1 (Moriyoshi et al., Nature 354 (1991) 31) et le récepteur NMDAR2 (Monyer et al., Science 256 (1992) 12), et d'un récepteur NMDA de souris (Yamazaki et al., Febs Lett. 300 (1992) 39). La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur NMDA. Bien qu'appartenant à la famille des récepteurs liés à des canaux ioniques, ces nouveaux polypeptides diffèrent des récepteurs NMDA déjà décrits du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique. Plus particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caractérisation de nouveaux polypeptides, désignés GR33, ainsi que du matériel génétique permettant leur expression ou leur identification. L'invention réside également dans la préparation de sondes et de cellules recombinées permettant I'exploitation des polypeptides GR33 dans le diagnostic et la mise au point de nouvelles molécules actives. Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides comprenant tout ou partie de la séquence peptidique présentée sur la figure 1 ou d'un dérivé de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique présentée sur la figure 1. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité.Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide de la figure 1, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De tels polypeptides homologues peuvent être obtenus par des expériences d'hybridation et/ou de PCR comme décrit dans les exemples. Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont des polypeptides possédant la capacité de lier le glutamate. Encore plus préférentiellement, il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur NMDA. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont susceptibles d'être reconnus par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique complète présentée sur la figure 1. Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par le polypeptide GR33 comprenant toute la séquence peptidique présentée sur la figure 1. Comme indiqué dans les exemples, ce polypeptide peut être exprimé dans les oeufs de Xénope pour former un récepteur au glutamate fonctionnel, présentant toutes les caractéristiques pharmacologiques d'un récepteur NMDA: - la présence de 100 I de NMDA induit un courant entrant; - l'absence de glycine du milieu inhibe presque complètement la réponse au NMDA; - les réponses au NMDA sont réduites en présence d'antagonistes compétitifs tels que l'AP5 (acide D-2-amino-5-phosphonovalérique) ou l'AP7 (acide D-2-amino 7-phosphonoheptanoïque);; -la concentration en NMDA donnant 50 % de la réponse maximum (ED50) est de 10 FM environ, ce qui correspond aux valeurs déterminées dans les cas du récepteur NMDAR1 - parmi les autres acides aminés excitateurs testés (glutamate, kainate, quisqualate, homocysteate), le glutamate et l'homocysteate sont ceux qui induisent les plus fortes réponses. Par ailleurs, les résultats obtenus montrent que le polypeptide GR33 comprenant toute la séquence peptidique présentée sur la figure 1 présente des particularités par rapport aux autres récepteurs NMDA connus. Notamment, le magnésium n'a qu'un effet inhibiteur partiel (30-70 io) alors qu'il inhibe complètement l'activité des récepteurs NMDA connus, et le calcium a un effet inhibiteur alors qu'il stimule l'activité des récepteurs NMDA décrits. De plus, ces particularités pharmacologiques sont liées à des particularités structurales. En effet, le polypeptide GR33 de la figure 1, qui comprend 288 acides aminés et possède un poids moléculaire de 33 kDa environ, ne comporte qu'un seul domaine hydrophobe (20 à 23 résidus non chargés du coté C-terminal).Ce polypeptide comporte également 2 sites potentiels de glycosylation (Asn 115 et 134) et 4 cystéines qui pourraient être impliquées dans la formation de structures secondaires. Un autre mode particulier de réalisation de l'invention est représenté par un polypeptide comprenant la séquence présentée sur la figure 2. Cette séquence correspond à un fragment d'un récepteur homologue au polypeptide de la figure 1, obtenu à partir d'une banque de cerveau humain. Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base des séquences données sur les figures 1 et 2 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier (synthèse peptidique en phase solide ou liquide, etc), ou par une combinaison de ces techniques. Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont désignés par polypeptides GR33. La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide GR33. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence choisie parmi: (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique présentée sur la figure 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence donnée sur la figure 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des phosphoramidites, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques. A titre d'exemple de séquences hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'invention, on peut citer la séquence présentée sur la figure 2. Un autre exemple de séquence homologue est représenté par le clone génomique humain décrit sur la figure 3, également isolé par hybridation. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour la production des polypeptides GR33 tels que définis précédemment. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi.S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides GR33 de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveroinyces, Pichia, Schwanniornyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser- les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou St-eptomyces . Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes permettant la détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de récepteurs NMDA dans des échantillons biologiques et la mise en évidence d'anomalies génétiques (polymorphisme, mutations) ou d'expressions aberrantes. L'inhibition de l'expression de certains gènes par des oligonucléotides antisens s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les oligonucléotides antes en sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les oligonucléotides antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides GR33. De tels oligonucléotides peuvent être constitués par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il s agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides de l'invention.De tels oligonucléotides peuvent être obtenus à partir des séquences données dans les figures 1 et 2, par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique. Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides GR33 de l'invention, ou avec les ARNm correspondant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression d'un récepteur du glutamate GR33, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Compte tenu des activités multiples des récepteurs du glutamate, les sondes de l'invention peuvent ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs GR33.Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33 tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent comporter jusqu'à l'intégralité de la séquence présentée sur les figures 1 ou 2 ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples. Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide GR33 tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier, compte tenu des enseignements donnés dans la présente demande. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par (1) immunisation d'un animal contre le polypeptide GR33 dont la séquence est donnée sur la figure 1 ou 2, ou tout fragment ou dérivé de ceux-ci, (2) prélèvement du sang, et (3) isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ainsi obtenus peuvent notamment être utilisés pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33 tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Ils peuvent également être utilisés pour la mise en évidence et l'isolement de polypeptides GR33. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées capables d'exprimer à leur surface un ou plusieurs polypeptides GR33. Ces cellules peuvent être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie cidessus codant pour un polypeptide de I'invention, puis culture desdites cellules dans des conditions d'expression de ladite séquence. Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour mesurer la capacité de différentes molécules à se comporter comme ligand ou comme modulateur des polypeptides de l'invention. Plus particulièrement, elles peuvent ainsi être utilisées dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de modulateurs des polypeptides de l'invention, et, plus préférentiellement, d'agonistes et d'antagonistes du glutamate. Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention. Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes du glutamate pour les polypeptides de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence etlou d'isolement de modulateurs des polypeptides de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule, en présence de glutamate, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et le glutamate, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du glutamate sur ledit polypeptide de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs GR33. L'invention concerne également tout médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un peptide de l'invention. Préférentiellement la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé décrit précédemment. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Figure 1 : Séquences nucléotidique et peptidique du récepteur GR33 de rat. Figure 2 : Fragment de la séquence nucléotidique et peptidique du récepteur GR33 humain. Figure 3 : Carte de restriction du clone génomique humain portant une séquence homologue à la séquence de la figure 1. EV=EcoRV; El=EcoR1; H=HindIll; P=PstI; S=SmaI; B=BamHI. Figure 4 : Profil d'hydrophobicité du polypeptide GR33 de 288 acides aminés. Figure 5 : Etude pharmacologique et électrophysiologique du polypeptide GR33 de 288 acides aminés de la figure 1. Les résultats sont exprimés en % du courant induit par 200 ,uM de NMDA seul. GLUT = glutamate; HCA = homocysteate 200 I1M; KA = kainate 300 mM; QA = quisqualate 50 FM; NM-gly = 200 ,uM de NMDA en l'absence de glycine; NM+Mg = 200 ,uM de NMDA en présence de 200 iM de Mg2+; AP7 = 200 ,uM de NMDA en présence de 10 ,uM d'AP7. Chaque point représente un moyenne de 5 mesures au moins effectuées sur des oeufs de xénope différents. Figure 6 : Mise en évidence de séquences homologues par Northern blot sur des ARNm polyA (1 ,ug) de cervelet (piste 1), cortex (piste 2), striatum (piste 3) et hippocampus (piste 4). La sonde utilisée correspond à l'ADNc complet de la figure 1. Figure 7 : Mise en évidence de polypeptides homologues par Western blot sur des membranes synaptosomales. Techniques générales de clonage Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Les plasmides de type pBR322, pUC, Agtll, pGEX et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale. Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de 1'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-87643 en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR Lolymérase-catalyzed Chain réaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence normales sont généralement les suivantes : hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à 650C; lavage: 0,5 x SSC à 65 "C. 1. Clonage de l'ADNc H500 de la figure 2. Cet exemple décrit le clonage d'un ADNc de 500 pb environ à partir de cerveau humain, codant pour une partie d'un polypeptide GR33. Cet ADNc a été obtenu par criblage d'une banque de cerveau humain au moyen d'anticorps dirigés contre des protéines liant le glutamate. 1.1. Préparation de protéines liant le glutamate purifiées. Des membranes synaptosomales ont été préparées selon la technique décrite par Michaelis et al. (J. Neurochem. 42 (1984) 397) et solubilisées en présence de sodium-déoxycholate. Les membranes ainsi solubilisées ont ensuite été soumises à une chromatographie d'affinité sur une colonne de glutamate. Les protéines liant le glutamate ont été éluées par une solution NaCl 1M, et dialysées contre un tampon Tris-HCl en présence de 0,05 % de sodium-déoxycholate. 1.2. Production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines liant le glutamate obtenues ci-dessus ont été préparés chez la souris. Pour cela, des souris BALB/C ont été immunisées avec 50-100 Mg des protéines liant le glutamate obtenues ci-dessus en présence d'adjuvant complet de Freund. Les injections subséquentes (tous les 8 à 10 jours) ont été faites avec 50 g des protéines liant le glutamate, mais sans adjuvant complet de Freund. Après 5 injections, les sérums ont été collectés et conservés congelés. 1.3. Criblage d'une banque de cerveau humain. Les anticorps préparés ci-dessus ont été utilisés pour cribler une banque de cerveau humain réalisée dans le vecteur lambda gtll (Clontech). Deux millions de clones de cette banque ont ainsi été criblés immunologiquement, selon la technique décrite par Sambrook, Fritsch et Maniatis (Cf techniques générales de clonage). Les clones positifs identifiés ont ensuite été purifiés à homogénéité par plusieurs étapes successives de criblage. A partir de ces clones, un ADNc de 500 pb environ a été obtenu et séquencé sur les 2 brins. La séquence de cet ADNc, désigné H500, est présentée sur la figure 2. Aucune homologie particulière n'a été trouvée entre cette séquence et celles accessibles dans les banques. 2. Clonage de l'ADNc codant pour le polypeptide GR33 de la figure 1. Cet exemple décrit le clonage d'un ADNc de 1,7 kb environ à partir de cerveau de rat, codant pour le polypeptide GR33 présenté sur la figure 1. Cet ADNc a été obtenu par criblage d'une banque de cerveau de rat en utilisant comme sonde l'ADNc H500 radiomarqué. L'ADNc codant pour le polypeptide GR33 de la figure 1 a été obtenu par criblage d'une banque de cerveau de rat construite dans le vecteur lambda ZAP (Stratagène). Cette banque a été criblée avec 1'ADNc H500 préalablement marqué au 32P par la technique du "random priming" (Feinberg et Vogelstein, Analytical Biochemistry 132 (1984) 6). L'hybridation a été réalisée dans les conditions de stringence élevée suivantes : hybridation à 65"C, 3-4 x SSC, 5 x Denhardt's, rinçage à 65"C, 0,1 x SSC, 1% SDS. Environ 1 million de clones de la banque ont ainsi été analysés. Un clone positif a été isolé et purifié.Le plasmide porté par ce clone a été excisé de llADN du lambda ZAP au moyen d'un phage helper (Stratagene), et l'ADNc de 1,7 kb porté par ce plasmide a été séquencé sur les 2 brins. Une partie de la séquence ainsi obtenue est présentée sur la figure 1. 3. Traduction in vitro de l'ADNc de 1.7 kb L'ADNc de 1,7 kb isolé ci-dessus a été traduit in vitro dans le système des réticulocytes de lapin (Promega). Ceci a permis de mettre en évidence une protéine exprimée ayant un poids moléculaire de 35 kDa environ. La protéine déduite de la séquence présentée sur la figure 1 possède un poids théorique de 33,2 kDa. Le profil d'hydrophobicité de la protéine de 288 acides aminés résultante a été analysé selon le programme de Kyte et Doolittle (J. Molec. Biol. 157 (1982) 105). Le profil obtenu est présenté sur la figure 4. I1 indique que le polypeptide GR33 comprenant la séquence entière de la figure 1 ne possède qu'un domaine hydrophobe. 4. Expression du polypeptide GR33 de la figure 1 dans les oeufs de Xénope et étude pharmacologique et électrophysiologi que. Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 2 a été transcrit en ARNm et microinjecté dans des oeufs de Xénope. Les oeufs microinjectés ainsi obtenus ont ensuite été testés pour leur capacité à lier certains ligands de récepteurs NMDA marqués ou pour leur comportement vis-à-vis de modulateurs de ces récepteurs. 4.1. Transcription in vitro Le plasmide contenant l'ADNc de 1,7 kb codant pour le polypeptide GR33 de la figure 1 a été linéarisé en présence de l'enzyme SmaI, puis soumis à une étape de transcription en présence de L'ART polymérase du phage T7. La transcription a été effectuée en utilisant le Kit Stratagene, selon les recommandations du fabricant. 4.2. Microinjection L'ARN synthétique obtenu ci-dessus en solution dans l'eau stérile a été utilisé (5 ng) pour être injecté dans des oeufs de xénope matures (stades V et VI) dans un volume de 50 nl. Les oeufs ont ensuite été maintenus 3 jours à 19 C dans des plaques multi-puits dans un milieu Barth supplémentée d'antibiotiques (Miledi et Sumikawa, Biomed. Res. 3 (1982) 390). 4.3. Etude pharmacologique et électrophysiologique Les oeufs ainsi obtenus ont ensuite été testés pour la présence à leur surface de récepteurs NMDA fonctionnels. Pour cela, les oeufs ont été transférés en milieu OR-2 modifié, dépourvu de magnésium, de composition : NaCl 88 mM, KCl 2,5 mM, CaC12 1 mM, tampon HEPES 10 mM, pH 7,4 ajusté avec de la soude. Les différentes drogues (ligands ou modulateurs) ont été appliquées par perfusion (10 ml/mn) pendant 10-30 secondes, sous une différence de potentiel imposée de -80 ou 90 mV. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que: - l'application de glutamate (0,1-1 mM) ou de son agoniste, le NMDA (200 FM), induit un courrant "inward", alors que d'autres agonistes du glutamate dont le kainate (300 mM) et le quisqualate (50 pM) n'ont que peu ou pas d'effet. Ces résultats indiquent que les oeufs injectés présentent à leur surface des récepteurs au glutamate couplés à des canaux ioniques fonctionnels, de type NMDA. - la réponse induite par le NMDA (200 FM) est abolie lorsque le milieu ne contient pas de glycine, ou lorsque les antagonistes du NMDA, AP5 ou AP7, sont appliqués (200 I1M) simultanément au NMDA. Ce résultat indique que la réponse au NMDA des oeufs injectés est pharmacologiquement comparable à celle d'un récepteur NMDA natif. - la réponse induite par le NMDA (200 CLM) est diminuée lorsque l'on ajoute du magnésium (200 I1M) dans le milieu, ou lorsque l'on augmente la concentration externe en calcium (2,5 mM). 5. Recherche de séquences nucléotidiques et de polypeptides homologues dans d'autres tissus La séquence nucléotidique présentée sur la figure 1 a ensuite été utilisée comme sonde pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus. Pour cela, 2 techniques ont été utilisées: - l'hybridation en Northern blot, - l'hybridation in situ. Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homologues sont les suivants d'origine murine : cervelet, cortex, striatum, hippocampus. 5.1. Recherche en Northern Blot Les ARNm-polyA ont été préparés à partir des tissus indiqués ci-dessus selon la technique à l'isothiocyanate de guanidinium décrite par Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979) 5294), suivie d'un passage sur colonne d'oligodT-cellulose. Ces ARNm ont ensuite été fractionnés sur gel d'agarose, puis transférés sur membranes de nylon (Hybond N+) La sonde utilisée pour l'hybridation correspond à l'ADNc de 1,7 kb entier décrit dans l'exemple 2 (figure 1) préalablement marqué au 32P selon la technique décrite par Maniatis et al (Cf techniques générales de clonage). L'hybridation avec les différents tissus a été réalisée dans des conditions de stringence élevées : hybridation à 42"C, 6 x SSC, 50% formamide, 1 x Denhardt's, rinçage à 65"C, 0,1 x SSC, 1% SDS. Cette étude a permis de mettre en évidence des fragments d'ADN spécifiques homologues dans tous les tissus étudiés (figure 6). 5.2. Recherche par hybridation in situ Les expériences d'hybridation in situ ont été réalisées sur des sections cryostatées de cerveau de rat selon la technique décrite par Hafen et al. (EMBO J. 2 (1983) 617). La sonde utilisée pour ces expériences correspond à l'ADNc de 1,7 kb entier décrit dans l'exemple 2 (figure 1) préalablement marqué au moyen de déoxyuridine triphosphate marquée à la digoxigénine (dig-U, Boehringer Mannheim) selon la technique décrite par Dumas et al. (J. Neurosci. Res. 25 (1990) 569).Ce marquage non radioactif ainsi que la détection des hybrides ont été réalisés par test immuno-enzymatique en utilisant des anticorps anti digoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline, qui sont révélés en présence d'un substrat chromogénique de l'enzyme, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate et le sel de tétrazolium du "nitroblue" en suivant les recommandations du fabricant (Boehringer Mannheim). L'hybridation avec les différents tissus a été réalisée dans des conditions de stringence élevées : hybridation à 42"C, 6 x SSC, 50% formamide, 1 x Denhardt's, rinçage à 65 C, 0,1 x SSC, 1% SDS. Cette étude a permis de mettre en évidence des séquences homologues selon l'invention notamment dans les cellules de Purkinje et dans les cellules granulaires du cervelet, dans les cellules pyramidales des régions CA1 et CA3 de l'hippocampus, et dans certaines régions du cortex. I1 est entendu que les même expériences peuvent être répétées en utilisant d'autres tissus et notamment des tissus d'origine humaine, et d'autres sondes. Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et/ou amplifiées par les techniques classiques de biologie moléculaire. 6. Utilisation d'anticorps anti-polvpeptides GR33 pour la mise en évidence de séquences nucléotidiques et de polypeptides homologues dans d'autres tissus Des anticorps polyclonaux anti polypeptides GR33 ont été préparés et utilisés pour la mise en évidence par des expériences de Western blot de polypeptides homologues à partir d'autres tissus. 6.1. Préparation des anticorps. Un fragment de l'ADNc contenant la région codant pour le polypeptide GR33 de la figure 1 décrit dans l'exemple 2 a été généré par PCR au moyen des oligonucléotides spécifiques suivants: (i) TAATACGACTCACTATAGGATCCGACCCCGGCCTCCAGCA (ii) GCAATTAACCCTCACTAAAGAATTCCCGATGTGTG GGGAGG Ces oligonucléotides correspondent respectivement aux positions 124 et 1104 sur la séquence de la figure 1. Le produit de cette amplification a ensuite été sous cloné dans le vecteur d'expression d'E.coli pGEX-2 (Smith et Johnston, Gene 67 (1988) 31) de manière à permettre son expression sous forme d'une protéine de fusion avec la glutathion-Stransférase (GST-GR33). La protéine de fusion ainsi produite a ensuite été purifiée et utilisée comme antigène pour préparer des anticorps chez le lapin. Pour cela, les lapins ont été immunisées avec 50-100 ,ug d'antigène en présence d'adjuvant complet de Freund. Après 3 semaines, une nouvelle injection a été faite avec 50 g d'antigène, mais sans adjuvant complet de Freund. Après 2 injections, les sérums ont été collectés et conservés congelés. 6.2. Mise en évidence de séquences homologues Des membranes synaptosomales ont été préparées selon la technique décrite par Michaelis et al. (J. Neurochem. 42 (1984) 397) et solubilisées en présence de 0,5% de sodium-déoxycholate. Environ 50 g de protéines ainsi obtenues ont été soumises à une analyses électrophorétique sur gel SDS à 10%. Les protéines ont ensuite été transférées sur nitrocellulose et mises en contact avec les anticorps préparés en 6.1. ci dessus. Les anticorps liés ont ensuite été révélés au moyen du système de détection ECL (Amersham). Comme il apparait sur la figure 7, cette étude a permis de mettre en évidence dans les membranes synaptosomales différents polypeptides comprenant tout ou partie de la séquence peptidique présentée sur la figure 1 et ayant des poids moléculaires de 35 kDa, 69-70 kDa, 97-98 kDa et 110 kDa environ. 7. Isolement et caractérisation d'un clone génomique humain codant pour un polypeptide GR33. Cet exemple décrit l'isolement et la caractérisation d'un clone génomique humain codant pour un polypeptide GR33. Ce clone a été obtenu par criblage d'une banque humaine en utilisant comme sonde l'ADNc H500 radiomarqué. Le clone humain de la figure 3 a été obtenu par criblage d'une banque génomique humaine construite dans le vecteur lambda EMBL3 (Clontech). Cette banque contient des inserts génomiques de 13 kb environ insérés dans le site SalI du vecteur lambda EMBL3. Cette banque a été criblée avec l'ADNc H500 préalablement marqué au 32P par la technique du "random priming" (Feinberg et Vogelstein, Analytical Biochemistry 132 (1984) 6). L'hybridation a été réalisée dans les conditions de stringence élevée suivantes : hybridation à 65"C, 3-4 x SSC, 5 x Denhardt's, rinçage à 650C, 0,1 x SSC, 1% SDS. Environ 2.105 clones de la banque ont ainsi été analysés. Un clone positif a été isolé et purifié. Le plasmide ainsi obtenu (RE17) porte un insert génomique de 12 kb environ, dont une carte de restriction est présentée sur la figure 3. La séquence codant pour le polypeptide GR33 est située dans le fragment 3' HindIII-PstI de 6,5 kb du plasmide Bye17. REVENDICATIONS 1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique présentée sur la figure 1 ou d'un dérivé de celle-ci. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier le glutamate. 3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur NMDA. 4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique complète présentée sur la figure 1. 5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique présentée sur la figure 1. 6. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence peptidique présentée sur la figure 2. 7. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides ayant un poids moléculaire de 35 kDa, 69-70 kDa, 97-98 kDa et 110 kDa décrits sur la figure 7. 8. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Séquence selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: (a) tout ou partie de la séquence nucléotidique présentée sur la figure 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. 10. Séquence selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques. 11. Séquence selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence donnée sur la figure 2. 12. Séquence selon l'une des revendications 8 à 11 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. 13. Oligonucléotide antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7. 14. Oligonucléotide selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est constitué par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9. 15. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 8 ou avec l'ARNm correspondant. 16. Sonde selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases. 17. Sonde selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence présentée sur la figure 1 ou de la séquence présentée sur la figure 2 ou de leur brin complémentaire. 18. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 15 à 17 pour la détection de l'expression d'un récepteur GR33; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épis sage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs GR33; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33. 19. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7. 20. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un ou plusieurs polypeptides selon l'une des revendications 1 à 7. 21. Cellule selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes. 22. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 20 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 7 ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide. 23. Procédé selon la revendication 22 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes du glutamate pour les polypeptides de l'invention. 24. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 20 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 7 ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule, en présence de glutamate, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le glutamate, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du glutamate sur ledit polypeptide. 25. Utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé des revendications 22 à 24 comme médicament. 26. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7. 27. Médicament selon la revendication 26 caractérisé en ce que la molécule est un ligand identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 22 ou 23, ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé de la revendication 24.